Автор: Безбородов А.М.
Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология микробиология химия биология биохимия
Год: 1984
Текст
НМИЧГХКИЕ
hi imiU
wн нчн юго
I lUlll ’A
A. M. Безбородов
БИОХИМИЧЕСКИЕ
ОСНОВЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО
СИНТЕЗА
Допущено Министерством высшего и среднего
специального образования СССР в качестве учеб-
ника для студентов вузов, обучающихся по спе-
циальности «Технология микробиологических про-
тш К ВЛ
I I К \Я И ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»
ББК 28.4
Б 39
УДК576.8.005(07)
Рецензенты; кафедра технической микробиологии Белорусского
ордена Трудового Красного Знамени технологического института
Безбородов А. М.
Б 39 Биохимические основы микробиологического
синтеза. — М.: Легкая и нишевая пром-сть, 1984.—
304 с.
2810000000—085
844(01)—84
ББК 3ft
ПРЕДИСЛОВИЕ
Микробиологический синтез выступает сегодня как составная
и важнейшая часть современной биотехнологии. Практически все
основные достижения биотехнологии получены прямо или косвен-
но при участии микроорганизмов или продуктов их обмена.
Прд микробиологическим синтезом понимают синтез структур-
ных компонентов микробных клеток или продуктов их метаболизма
из низкомолекулярных соединений. Основные особенности микро-
биологического синтеза заключаются в следующем- 1) синтез осу-
ществляется ферментными системами самой клетки и происходит
преимущественно внутриклеточно вне зависимости от локализации
целевого продукта после проведения технологических операций по
его получению, 2) синтез происходит из низкомолекулярных пред-
шественников, которые в ходе реакций синтеза, как правило, долж-
ны быть активированы; 3) синтез является энергозависимым про-
цессом; 4) пути синтеза связаны с катаболизмом, но могут суще-
ственно отличаться от них и в большинстве своем осуществляются
другими ферментными системами.
Задача микробиологического синтеза состоит в том, чтобы по-
лучить максимум целевого продукта и минимум других продуктов.
Для достижения сверхсинтеза необходимо нарушить нормальную
регуляцию путей метаболизма Этого можно добиться с помощью
генетических методов, в частности методов генетической инжене-
рии, или путем изменения условий культивирования. Обычно эф-
фекта сверхсинтеза достигают комбинацией этих методов
Представление, которое сформировалось в последние годы о
том, что практически любой метаболит выполняет функции регу-
ляторов, повлекло за собой существенное изменение господство-
вавших ранее взглядов на влияние компонентов среды и их ката-
болитов на ход процесса. Взаимосвязь продуктов обмена веществ
в клетке, множественность функций одного и того же метаболита
в различных физиологических условиях, наличие шунтовых мета-
болических путей, обмен коферментами и кофакторами в сопря-
женных ферментативных реакциях и т. п осложняют интерпрета-
цию и прогноз хода микробиологического синтеза
Получение и использование новых мутантных штаммов, скон-
струированных методом генетической инженерии, не избавляет от
необходимости знать механизмы биохимических реакций и меха-
низмы их регуляции. Даже если речь будет идти о конструирова-
нии совершенно нового генома, то функционировать должны из-
вестные ферментные системы, работа которых осуществляется в
соответствии с основными положениями биохимии. И наконец, ес-
ли совершается попытка конструирования нового генома, то эле-
ментами новой «конструкции», по крайней мере, в обозримом бу-
дущем должны стать ныне известные системы
Существенной особенностью реакций биосинтеза, как было от-
мечено выше, является активирование низкомолекулярных мета-
болитов или промежуточных продуктов для осуществления очеред-
ной ферментативной реакции Главнейшие из них: образование
КоА-ацильных производных, образование аденилатов, фосфорили-
рование в реакциях с АТФ с последующим расщеплением проме-
жуточного продукта фосфатазой
Известно, что многие продукты микробиологического синтеза
относят ко вторичным метаболитам. Мы не пользуемся этим тер-
мином, поскольку сегодня нет строгого определения, какие продук-
ты относятся к их числу.
Синтез ферментов и их поступление во внешнюю среду подчи-
няются закономерностям, отличным от закономерностей, харак-
терных для синтеза низкомолекулярных метаболитов. Для синте-
за ферментов применимы общие представления о синтезе белков.
Известно, что многие ферменты синтезируются в виде своих неак-
тивных предшественников, а затем приобретают свою активную
конформацию. Осуществление большинства ферментативных реак-
ций невозможно без коферментов. Их дефицит может привести
к торможению ферментативной реакции, где кофермент выполня-
ет функции переносчика соответствующих функциональных групп
в реакции
Для технологов важен вопрос локализации ферментных бел-
ков, поэтому особое внимание должно быть уделено механизмам
секреции ферментных белков.
Материал курса в значительной мере базируется на информа-
ции, которую студенты получили, слушая лекции по органической
и биологической химии, генетике и микробиологии В основу' курса
положены лекции, которые были прочитаны автором на кафедре
технологии микробиологических производств Московского ордена
Трудового Красного Знамени технологического института пищевой
промышленности.
К сожалению, объем информации неравноценен для всех глав.
Многие из затронутых проблем только намечены. Не исключено,
что какие-то разделы к моменту выхода книги устареют. Прогресс
в развитии современной биологии весьма ощутим.
Любые замечания и пожелания по улучшению содержания кни-
ги автор примет с благодарностью
Часть первая. ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ХИМИИ
микробной клетки
ГЛАВА 1. КЛЕТОЧНЫЕ СТЕНКН МИКРООРГАНИЗМОВ
1. ПОВЕРХНОСТНЫЕ СТРУКТУРЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
Клеточная стенка — один из важнейших структурных элемен-
тов Ее основная функция состоит в защите содержимого клетки
от внешних воздействий н сохранении характерной для организма
формы. Однако клеточная стенка не является метаболически инерт-
ной структурой. Она активно функционирует в течение всего жиз-
ненного цикла бактериальной клетки и располагается непосред-
ственно над цитоплазматической мембраной, защищая ее от раз-
рыва. На долю клеточной стенки приходится от 10 до 50 % сукой
биомассы микроорганизмов. Толщина стенок у бактериальных
культур находится в пределах 10—80 мкм. При старении организ-
ма клеточная стенка может становиться относительно толще. По-
верхностные структуры клеток определяют их контакт с внешней
средой
Жгутики довольно широко распространены у низших орга-
низмов. Жгутики бактерий представляют собой полую труб-
ку, состоящую из спирально уложенных глобул специфического
белка флагеллина. Флагеллин имеет молекулярную массу около
40000. В белке отсутствует цистеин, мало ароматических амино-
кислот, много дикарбоновых кислот: глутаминовой и аспарагино-
вой. Медицинские микробиологи часто используют антигенные
свойства жгутиков с целью диагностики, так как они являются
местом локализации специфических Н-антигенов. По функциям
флагеллин часто сравнивают с миозином мышечных тканей (со-
кратительным белком), обеспечивающим подвижность. При дви-
жении бактериальной клетки жгутик вращается вокруг своей оси.
Движение самого жгутика обеспечивается вращением базального
тела, находящегося у основания жгутика и расположенного в мем-
бране. В отличие от большинства известных сократительных бел-
ков, функция которых связана с расщеплением АТФ, базальное
тело некоторых бактерий вращается вокруг своей оси за счет из-
менения мембранного потенциала, обусловленного градиентом про-
тонов.
Поверхность некоторых бактерий покрывают фимбрии (вор-
синки или волоски). Число их на одну клетку достигает иногда
нескольких тысяч. Они тоньше и короче жгутиков. Химическая
природа фимбрий мало исследована. Кроме фимбрий клетки мно-
гих бактерий содержат половые, волоски, или Г-пили Их не более
1—2 на клетку. Пили имеют ббльший диаметр и длину, чем фим-
брии. Иногда пили заканчиваются шарообразными утолщениями.
Капсулы и слизь расположены поверх клеточной стенки.
Капсулы многих микроорганизмов хорошо изучены По внешнему
виду они представляют собой студенистую массу, где основным
компонентом является вода. Органическое вещество капсул и сли-
зи у большинства известных культур представлено полисахарида-
ми. Природа химических связей, посредством которых капсула и
слизистый слой связаны с клеточной стенкой, неизвестна. Пола-
гают, что имеют место как ионные, так и ковалентные связи. Ха-
рактерным представителем микроорганизмов, образующих внекле-
точный полисахарид—декстран, является культура Leuconostoc
mesenteroides из группы гетероферментативных молочнокислых
бактерий. Декстран представляет собой гомонолисахарид, в кото-
рый входит до 300 тыс остатков глюкозы Молекулярная масса
молекулы декстрана может достигать (5•?-6)108 дальтон (единица
массы, равная массе одного атома водорода) Остатки глюкозы
соединены между собой по 1-му и 6-му углеродным атомам, т. е.
декстран представляет собой а-1,6-глюкан. Одновременно в моле-
куле встречаются связи между 1-м и 3-м, 1-м и 4-м атомами уг-
лерода, но в крайне ограниченном количестве.
Гриб Aurobasidium pulluians (Pulluiana) образует полисаха-
рид пуллулан, линейный полимер, состоящий из остатков a-D-глю-
копиранозы, которая связана 1,4- и 1,6-связями. Имеются также
фосфорилированные гомополисахариды. Так, у некоторых дрож-
жевых культур, относящихся к Hansenuia, идентифицированы фос-
фоманнаны, у которых остатки маннозы соединены фосфодиэфир-
ными связями Большинство внеклеточных полисахаридов содер-
жат остатки более чем одного типа сахара, т е. являются гетеро-
полисахаридами. Один из видов Pseudomonas синтезирует и вы-
деляет кислый полисахарид, содержащий остатки D-глюкозы, D-
галактозы, D-маннозы, L-рамнозы и D-глюкуроновой кислоты.
В состав капсулы Aerobacter aerogenes входит полисахарид, где
повторяющейся структурной единицей является следующий олиго-
сахарид:
I —D-глюкоза—D-глюкуроновая кислота—L-фруктоза—"I
D-глюкоза
В культуре Acetobacter xylinum, накапливающей уксусную кис-
лоту, обнаружено при определенных условиях роста накопление
внеклеточной целлюлозы в виде микрофибрилл.
2. СТРОЕНИЕ И ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КЛЕТОЧНЫХ
СТЕНОК ПРОКАРИОТОВ
Химический состав клеточных стенок микроорганизмов перво-
начально привлекал внимание исследователей в области система-
тики. Основанием тому служили данные о качественных отличиях
в составе клеточных компонентов между эукариотными и прока-
риотными организмами, а также среди прокариотов между грам-
положительными и грамотрицательными (табл. 1-1). По-видимому,
для разграничения крупных таксономических единиц такой подход
вполне оправдан. Тем не менее следует отметить, что морфология
стенки и состав входящих в нее компонентов зависят от условий
< jKscra бахтерЕЙ. фазы роста и скорости роста.
Гликопептиды. Основными компонентами структуры клеточной
стенки бактерий являются гликопептиды, или, как их иногда на-
зывают, мукопептиды, пептидогликаны, муреины. Все известные
до настоящего времени гликопептиды состоят из чередующихся
звеньев N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты (3-0-
эфир N-ацетилглюкозамина и D-молрчной кислоты), связанных
(3-1—4-связями. Характерной особенностью гликопептидов являет?
ся наличие в их составе диаминокислот, из которых наиболее часто
встречаются лизин, а-е-диаминолимелиновая кислота, З-окси-2—6-
диаминопимелиновая, орнитин. Их присутствие обязательно, так
как они Обеспечивают образование двух пептидных связей между
пептидными группировками в молекуле Из других аминокислот в
состав полимера обычно входят D-аланин, L-аланин, ‘D-глутамино-
вая кислота, L-серин, глицин. С-концевой аминокислотой субъеди-
ницы обычно бывает D-аланин Пептидная часть молекул соеди-
нена с остатком молочной кислоты, наиболее часто с ней связан
остаток L-аланина. Фрагмент молекулы представлен ниже.
Не все остатки молочной кислоты полимера замешены пептид-
ными субъединицами В зависимости от частоты замещений ме-
няется плотность трехмерной структуры пептидогликана. Жест-
кость структуры создают связи между пептидными субъединицами.
Существует несколько типов такой связи. Одна из них непосредст-
венно объединяет две пептидные субъединицы, образуя пептидную
связь между е-аминогруппой L-лизина субъединицы и С-коицевого
D-аланина другой. Для иного типа связи характерно наличие «мо-
стов», в качестве которых выступают монотонные олигопептиды
глицина. В качестве примера на рис. 1-1 изображен гликопептид
клеточной стенки Staphylococcus aureus. У некоторых фнтопатоген-
ных бактерий обнаружен мост между аминогруппой остатка D-глу-
таминовой кислоты одной субъединицы и карбоксильной группой
С-концевого остатка D аланина другой субъединицы. Такие мосты
состоят из остатков диаминокислот.
Выше было сказано о стабильности химического состава кле-
точных стенок (это в первую очередь относится к гликопептиду),
состав которых практически не зависит от условий внешней среды.
Рис. 1-1 объемный и дает наглядное представление о том, что
имеется неограниченная возможность для пространственного мно-
гообразия построения трехмерной структуры макромолекулы гли-
копептида. Подсчитано, что одна гигантская макромолекула гли-
копептида грамположительной бактерии имеет молекулярную мас-
су, равную примерно 5-1010 дальтон. Полагают, что грамположи-
тельные бактерии имеют более сложную структурную организацию
гликопептида, чем грамотрицательные, вследствие чего обладают
большей жесткостью и устойчивостью к различным факторам, на-
рушающим структуру.
Молекула гликопептида погружена в так называемый матрикс,
который состоит из белка, липидов и полисахаридов. Наиболее хо-
рошо изучен матрикс грамотрицательных микроорганизмов. В его
состав входят все три названных компонента. Слой гликопептида
прилегает непосредственно к цитоплазматической мембране пли
отделен от нее слоем белка. На примере Е соН показано, что на-
ружный слой клеточной стенки состоит из бляшковидных, неплот-
но упакованных структур липопротеида; далее следует слой липо-
полисахарида. ниже — слой белка и, наконец, гликопептид. Име-
ются данные, что он отделен от цитоплазматической мембраны
белком. Основным компонентом матрикса являются липополиса-
хариды (рис. 1-2).
Липополисахариды наиболее хорошо изучены у грамотрицатель-
ных микроорганизмов, к числу которых относится Е. coil, предста-
вители рода Salmonella и др. Липополисахариды представляют
собой макромолекулы .состоящие из трех ковалентносвязанных ча-
стей: липидной единицы (липид А), центральный кор-олигосаха-
ридной единицы, О-специфического полисахарида В качестве при-
мера приведена структура липополисахарида из Salmonella tiphi-
miirium (рис. 1-3). Кор-олигосахарид в значительной степени схо-
ден у многих видов грамотрицательных бактерий. Он обычно пред-
ставляет собой разветвленный декасахарид, состоящий из пяти
моносахаридов? N-ацетил-В глЮкозамина, D-глюкозы, D-галактозы,
L-глицеро-В-манногептозы и кетодезоксиоктановой кислоты
Количество белков в матриксе может достигать 20—30, но ос-
новную массу (до 70%) составляют 1—2 белка Так, у Е. coli
преобладающим является один белок с молекулярной массой
44000. Обнаружены и более крупные молекулы белков. У одной из
культур Pseudomonas найдены белки, имеющие молекулярную мас-
су более 2-107 дальтон В ряде случаев белки клеточной стенки
имеют каталитическую природу и являются автолитическими фер-
ментами. Они принимают непосредственное участие в обновлении
стенки, делении и росте клетки. Регуляторами активности автоли-
тических ферментов могут быть тейхоевые кислоты (см. ниже).
10
С одним из компонентов матрикса, липопротеидом, гликопептид
имеет ковалентную связь. У Е. coii эта связь осуществляется так:
пептидогликан — лизил — аргинил — липопротеид. Однако помимо
связанных встречаются липопротеиды в свободной форме. У грам-
положительных бактерий матрикс представлен в осповпом поли-
сахаридами. Строение их пока мало изучено. Известно, что они
ковалентно связаны с гликопептидами.
Тейхоевые кислоты. В клетках грамлоложительных бактерий и активомице-
со стенкой Более детальный анализ показал, что онв находятся и в мембранах.
ОН н | Ан он А он н | Ан Ан н Ан A j Ан он и он
Рис. /-^^рагмент структуры тейхозвой кислоты клеточной стенки Act. strepto-
По химической природе тейховые кислоты представляют собой полимеры,
содержащие фосфодиэфирныс группы, полиол и сахарный компонент, который
не всегда присутствует, а также D аланнп или органическую кислоту, которые
как правило, уксусная кислота По типу входящего в полимер полиола *т ейхое-
стенках обнаружены оба типа, а в цитоплазматической мембране—только по?
К рибиттейхоевым кислотам относятся полимеры, в которых фосфодиэфир-
ные группы соединяют 1 с и 5 е положения соседних рибитаых единиц Рибит-
ные остатки объединяются с сахарными компонентами с помощью гликозид-
вается фосфомоноэфнрной группой, расположенной в пятом*5положении конеч-
ной рибитной единицы, с другой — свободным или замещенным рибнтным остат-
кнелоты с хороню идентифицированной структурой из некоторых актлномице-
тов. Рнбитте1гхосвая кислота клеточной стенки Actinomyces streptomycin ЛС-1
отношение глюкоэилрибитных и аминоглюкозилрибнтных единиц равно 1 • 2.
глицерина имеют связь между первым и вторым
углеродными атомами, а не между первым и треть-
им, как в предыдущем случае. Здесь каждый С-3-
атом глицериновой единицы имеет заместителем
дисахарид, состоящий из галактозы и Ы-ацетилга-
лактозамина Связь дясахарида с полимером осуще-
ацстилгалактоэамина Связь между галактозой и
N-ацетилгалактозамином в дисахариде 1—4 В со-
став полимера входит уксусная кислота, присоедн-
ванвых глщерофосфатяых единиц. В оттнчие от
приведенных выше структур существуют полимеры, у
'нимают участие как подпольные, так й углеводные
единицы Примером таких тейхоевых кислот могут
служить полимеры, выделенные из клеточной стен-
ки Вас. licheniformfs АТСС 8945 (p*to- 1-5, г). Одна
иии 2 1.08 1,1 1,1 Характерно, что в цепь лоли-
сдиненный через фосфор к глицерофосфату (рис.
иди ^белками мембран Полиглицерофссфатная цепь
низывать стенку и ^достигать поверхности клетки
позначного” ответа на втот вопрос нет Возможно,
стенки Staphylococcus lactis 1з (см рве. 1-6),
гпйколеттидои посредством фосфоднэфирной^ связи.
Тейхоееые кислоты несут многочисленные физиологические функции В част-
ности,- фосфатные группы тейхоевых кислот служат местом связывания ионов
магния. Контроль за связыванием осуществляется с помощью присутствующего
в молекуле D-алаиина. Последний частично нейтрализует зарид фосфатной груп-
Известно, что двухвалентный нов магния важен для многих физико-химических
и энзиматических процессов,
проходят на цитоплазматической мембрв-
местио с анионными полимерами клеточной стенки создают для мембранных
катион-зависимых ферментов постоянное окружение из дивалентных катионов.
автолитических ферментов. Было показано, что сахарные компоненты тейхое-
вой кислоты ответственны за связывание фага с клеточной стенкой. Если по
каким-либо причинам тейхоевая кислота теряет гликозильные заместители, то
бактериальная клетка становится фагоустойчивой. Липотейхоевые кислоты у
Piic. 1-8. Характер саязи гликопептида с тейхоевой кислотой в культуре Staphy-
lococcus lectis 1г, ац-^-ацетил, ала — аланин
3. КЛЕТОЧНЫЕ СТЕНКИ ЭУКАРИОТОВ
В состав клеточных стенок дрожжей входят преимущественно
полисахариды, структурными единицами которых в основном яв-
ляются глюкоза и манноза. К числу полисахаридов, состоящих из
глюкозы, может быть отнесен глюкан клеточных стенок хлебопе-
карных дрожжей. Состоит он из основы, скелета, где остатки глю-
козы соединены р-1—6-связями. Боковые цепи имеют р-1—3-связи.
Число повторяющихся единиц в боковой цепи может достигать
семи. Схематически такой полисахарид приведен ниже, буквой «Г»
обозначен p-D-глюкопиранозный остаток Не исключено, что в
структуре скелета могут быть р-1—3-связи. Число структурных
единиц в молекуле глюкана не всегда удается точно определить
из-за трудностей при его выделении. Полагают, что их число мо-
жет быть от нескольких десятков до нескольких сотен.
Скелет другого полисахарида — маннана, выделенного из кле-
точных стенок хлебоиекарных дрожжей, содержит остатки манно-
зы, соединенные между собой а-1—6-связями. Структура и связи
между остатками в боковых цепях могут иметь большее разнооб-
разие, чем у глюканов. Маннан хлебопекарных дрожжей имеет
много ответвлений от линейной структуры, в которых остатки ман-
нозы соединены между собой как а-1—2-, так и а-1—3-связями.
На приведенной ниже схеме буквой «М» обозначены остатки
a-D-манНопиранозы:
16
культуре Candida albicans скелет также состоит из остатков
маннозы, соединенных а-1—6-связями. В боковых цепях количест-
во остатков маннозы может быть различным. В качестве примера
дан фрагмент структуры маннана из Candida albicans-
Молекулы маннана у некоторых микроорганизмов интересны
также тем, что в вх составе одновременно встречаются а* и р-свя-
зи. Ниже приведен фрагмент структуры маннана из Pichia pastoris:
м
I up
м
I 120
М
| 1.2а
М
Некоторые маннаны имеют в своем составе фосфор. При мяг-
ком гидролизе одного из маннанов была изолирована фосфорили-
рованная манноза. Полагают, что фосфорилированию подвергает-
ся конечный остаток маннозы. Отношение числа молей фосфата
к числу молей маннозы у различных организмов колеблется от 10
до 150
Помимо гомополимеров в клеточных стенках дрожжей содер-
жатся гетерополимеры, в которых, в частности, кроме остатков
маннозы, присутствует галактоза Фрагмент структуры такого ге-
терополисахарида из Trichosporon fermentans приведен ниже
.(ГАЛ — остаток ct-D-галактопиранозы).
В данном случае отношение остатков маннозы к остаткам га-
лактозы составляет 65:35, в культуре Torulopsis gropengiesseri —
69:21; в культуре Torulopsis magnoliae — 76:24 Такие гетеропо-
лимеры называю! галактоманнанами. Кроме глюканов и манна-
нов в состав стенок дрожжей входит аминополисахарид хитин.
Структура хитина приведена на с 19.
В клеточных стенках дрожжей содержатся белки. Их состав
и локализация в стенках изучены плохо. Какие-либо закономерно-
сти количественных отношений также не установлены. Для куль-
туры Saccharomyces cerevisiae преобладающими аминокислотами
оказались дикарбоновые. Возможно, это свойственно лишь дайной
культуре.
Из фракции клеточных стенок некоторых дрожжевых организ-
мов были изолированы маннан-белковые фракции, где между по-
лисахаридами и белком была химическая связь. Полагают, что
эта связь может осуществляться между гидроксильной группой
нозиль“Х<™П₽,Ме₽' Се₽"На) " О-ма»-
CHjOH.
/f~~<\NHCOCH2CHCO.. ..
4----И NH............беле
иНСОСНд
основам ZZ^ZZ микроскопических грибов (микромицетовУ
^=те“а™Т^”Р??1,’аНеЮИ'н является
дезокс" D " °" c°ciom ,IS °™™°в 2-ацегамидо-2-
SS ' “яз=™“х между “«<=" ₽-1-4-гликозидиыми
сн2он
NHCOCHa NHCOCH;;
=.,,к;=:зх“х-.“
а яаЖ=УрД₽Д I, P „ B M ₽a ₽ ₽aaB
турах орг™1'1’а',<Чг',‘“аЦ'111 B Разл,™ых морфологических струк.
2J™ “Ртаиама, Зависит от характера роста культуры в част-
вост,, дрожжеиодобвото или гифальиого. Так. содержание хЛина
19
в спорах клеток Mucor rouxii составляет 2,1 %, а в спорангиенос-
цах 18,0 % от массы сухой массы стенки.
По химической природе целлюлоза представляет собой линей-
ный полимер, состоящий из D-глюкопиранозных мономеров, соеди-
ненных между собой р-1—4-гликозидными связями.
В клеточных стенках целлюлоза расположена в виде микро-
фибрилл, каждая из которых имеет длину несколько тысяч нано-
метров. Фибриллы образуются из многочисленных цепей целлю-
лозы, которые идуг параллельно друг другу.
Как и в дрожжевых организмах, в клеточных стенках грибов
содержатся глюканы и маннаны. По своей структуре глюканы гри-
бов весьма разнообразны. Так, в культуре Aspergillus nidulans
был иидентифицирован глюкан, в котором обнаружены а-1—3-;
о-1—4-; р-1—3-глюкозидные связи. Менее изучены нейтральные
полисахариды, в состав которых входят галактоза, фукоза, рам-
ноза, ксилоза.
При рассмотрении компонентов клеточных стенок как одного
из критериев для классификации грибов по крупным таксонам бы-
ло установлено, что многие из них в основе строения имеют ха-
рактерные пары полисахаридных полимеров. Грибы, относящиеся
к Hyphochytridiomycetes, имеют в качестве, такой пары в стенке
целлюлозу и хитин; Homobasldiomycetidae и Chytridiomycetes —
хитин и f-глюкан; Oomycetes—целлюлозу и р-глюкан; Zygomy-
cetes— хитин и хитозап; Hemiascomycetidae — маннан и р-глюкан;
Heterobasidiomycetidae— хитин и маннан.
Количественный состав компонентов клеточных стенок может
меняться в известных пределах, причем на различных участках ми-
целия Nenrospora crassa содержание глюкозамииа и галактозами-
на было неодинаковым. Концентрация галактозамина на растущих
участках мицелия была ниже чем в более зрелых зонах, а кон-
центрация глюкозамииа была относительно постоянной везде. Раз-
личен состав спор и мицелия микромицетов. Так, в культуре Ре-
nicillium notatum в клеточных стенках покоящихся и набухающих
спор не был идентифицирован галактозамин, который появлялся
только в прорастающих спорах и возрастал в мицелии в 2,5 раза.
Особенно наглядно изменение содержания глюкозамииа Количе-
ство его в стенках той же культуры на разных стадиях развития
культуры можно выразить соотношением количество глюкозамииа
в мицелии: в прорастающих спорах: в набухающих спорах в по-
20
коящихся спорах 1:0,8: 0,25.0,025 Для Penicillium notatum и Pen. chrysogenum приведены результаты анализа содержания нейтральных углеводов при различных состояниях культуры (табл. 1-2). Таблица 1-2. Содержание нейтральных углеводов в клеточных стенках (% к массе сухих стенок) при прорастании спор и в мицелии
Уг-Ийда
Покоящи- | Набухаю- 1 Прораста- Покоящиеся еся споры щае споры Мицелий
Глюкоза 13,3 17,9 24,5 27,1 0,5 0,7
Галактоза 22,2 7,3 8,2 8,6 2,6 2.7
Манноза 8,8 6,1 5,7 6.2 1,4 1,0
Очевидно, Данные таблицы не могут считаться абсолютными
для всех культур. Тем не менее, имеющиеся различия между угле-
водным составом компонентов клеточных стенок при различном
функциональном и морфологическом состоянии культуры нагляд-
но свидетельствуют о динамике химических изменений в клетке в
связи с процессом дифференциации. Спора и клетка неизменно
привлекают внимание исследователей как наиболее четкие морфо-
логические состояния организма при изучении скрытых состояний
в ходе клеточной дифференциации.
Помимо углеводных компонентов в клеточной стенке присутст-
вуют белки, образующие полисахарид-белковый комплекс. Пола-
гают, что между ними существует ковалентная связь. Аминокис-
лотный состав белков стенки спор и мицелия у Penicillium notatum
тоже имеет различия, как и в примере с углеводами. В конкрет-
ном случае с названной культурой относительное содержание ами-
нокислот в стенке спор было выше, чем в мицелии.
У микромицетов различают первичную и вторичную клеточные
стенки. Первичная клеточная стенка образуется на кончике гифы
и по мере ее роста становится внутренним слоем зрелой клеточ-
ной стенки. На примере Trichophyton mentagrophytes было пока-
зано, что клеточная стенка строится в две стадии. Первая стадия
соответствует первичной, хитиновой, клеточной стенке, вторая —
появлению вторичного слоя, включающего глюкан и маннан, рас-
положенные на первичной клеточной стенке
ГЛАВА II. МЕМБРАНЫ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК
1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ХИМИЧЕСКОМ СОСТАВЕ
И СТРОЕНИИ МЕМБРАН
Клетка любого организма содержит многочисленные мембраны,
различающиеся морфологически и функционально Непосредствен-
но под клеточной стенкой расположена цитоплазматическая мем-
21
брана, или, как ее иначе называют, плазмалемма. Цитоплазмати-
ческая мембрана покрывает цитоплазму. В .жизни клетки она име-
ет большое значение, выполняя роль не только структурного мор-
фологического компонента. Мембрана является осмотическим барь-
ером организма, регулирующим осмотическое давление внутри
клетки. Через мембрану осуществляется избирательный транспорт
питательных веществ из среда в клетку и выход из нее продуктов
обмена. Мембрана представляет собой место, где происходит био-
levopaHe локализован и с мембраной ассоции-
рован ряд ферментов Мембрана играет первостепенную роль в
редупликации и делении клеток.
присутствуют другие мембранные структуры, непосредственно с
ней связанные или лежащие свободно в цитоплазме Так, мембра-
ны эндоплазматической сети представляют собой глубокие склад-
ки, непосредственно примыкающие к внешней мембране, а мембра-
ны митохондрий и лизосом с цитоплазматической наружной мем-
браной не связаны.
Классической структурой мембраны признана модель Даниел-
ли — Даусона—Робертсона (рис П-1) Внутренний слой мембра-
ны состоит из липидов, у которых, как известно, имеется полярный
конец, способный к ионизации, и неполярный, представляющий со-
бой по химической природе углеводородную цепь Липиды в мем-
бране ориентированы углеводородными концами друг к Другу, по-
лярными концами — наружу, т е. образуют бимолекулярный слой.
С полярными концами соприкасается мономолекулярный слой не-
липидпой природы В большинстве случаев это белок. Недаром
структуру мембран сравнивают с бутербродом, называя «двойной
бутерброд».
Липиды, составляющие вместе с белками структуру мембран,
представлены в основном фосфолипидами и гликолипидами.
В мембранах сосредоточена основная часть липидов многих бакте-
риальных клеток На долю мембран приходится до 80 % всех ли-
пидов грамположительных бактерий. У грамотрицательных орга-
низмов эта величина меньше, так как липидами богата их клеточ-
22
глицерин и фосфатидилэтаноламин Фосдатидилхолин, фосфати-
дилинозит, дифосфатидилглицерол (кардиолипин) встречаются ре-
же. Фосфолипиды содержат в своей молекуле фосфор, связанный
двумя эфирными связями. В их состав входит один общий компо-
нент— глицерин, с которым соединены эфирной связью Две жир-
ные кислоты с длинной цепью и то или иное фосфорсодержащее
соединение. Гликолипиды являются углеводными производными
липидов. В состав мембран входят также гликопротеиды.
Сравнптельный анализ фосфолипидного состава бактерий не
позволяет выявить какой-либо .общий принцип распределения фос-
фолипидов в отдельных группах бактерий. Так, количество фосфа-
тидилглицерола у Sarcina lutea достигает 89,6 %, а у Micrococcus
varians — 88,1 % от общей суммы фосфолипидов. Содержание кар-
диолипина у исследованных культур колеблется в широких преде-
лах—от 1,1 % у Sarcina lutea до 78,8% у Micrococcus lysbdeikti-
cus (табл. 2-t).
Таблица П-1. Содержание некоторых фосфолипидов у различных бактерий-,
находящихся в стационарной фазе, % к общему количеству идентифицированных
Micrococcus caseolyticus
При изучении химического состава липидного компонента мем-
бранной фракции одного из актиномицетов было показано, что в
процессе роста доля фосфолипидов возрастала, изменялось также
соотношение основных фосфолипидов — фосфатидил этаноламина
и кардиолипина. Спектр жирных кислот фосфолипидов в процессе
роста не изменялся. У дрожжевых культур количество фосфолипи-
дов составляет 3—7 % к массе Сухих клеток. Для фосфолипидов
дрожжей характерно высокое содержание жирных кислот.
Относительно низкое количество липидов характерно для мем-
бран, участвующих в осуществлении lex или иных метаболических
процессов и находящихся вследствие этого в непосредственном
структурном контакте с различными молекулярными комплексами
цитоплазмы и матрикса. К таким мембранам обычно относят внут-
ренние мембраны митохондрий, мембраны эндоплазматического
ретикулума у эукариотов, бактериальные мембраны.
он
о
CHjtCHj)
Как следует из приведенных формул фосфолипидов и гликоли-
пида, в их состав входит по два остатка жирных кислот. Наличие
двух неполярных остатков жирных кислот в составе мембранных
структур является их характерной особенностью. У бактериальных
культур состав липидов, в том числе фосфолипидов, характеризу-
ется преобладанием насыщенных жирных кислот (главным обра-
зом С14—С!8) с прямой или разветвленной цепью (табл. П-2). Не-
предельные кислоты являются моноеновыми, реже диеновыми кис-
лотами. Некоторая часть жирных кислот может находиться в мем-
бране в свободном виде. Полиеновые кислоты у бактерий отсут-
ствуют.
3,1 — 7,0 — —
4,0 2,8 15,5 2,9 13,1
Следы — 4,2 18,2 —
Bacillus subtilis
Следует обратить внимание на присутствие в мембранах среди
жирных кислот соединений с разветвленной цепью, что особенно
хорошо изучено на примере сарцин и микрококков. Разветвленные
жирные кислоты не могут объединяться в компактные структуры
в результате ослабления гидрофобного взаимодействия между уг-
леводородными цепочками
Наличие ненасыщенных углеводородных цепей обеспечивает
клетке большую гибкость и эластичность структур. Можно пола-
гать, что присутствие в составе мембран разветвленных и ненасы-
щенных жирных кислот ведет вследствие указанных причин к луч-
шей ее проницаемости Гибкость и эластичность мембраны обеспе-
чивается также благодаря присутствию циклопропановых кислот,
которые встречаются у некоторых бактерий. Из них следует на-
звать цис-} 1 — 12-метиленоктадекановую кислоту
Считается, что одним из признаков, отличающих бактериаль-
ные липиды от липидов всех других микрорганизмов, является от-
сутствие стеринов у бактерий.
Кроме липидов, содержащих глицерин в качестве связующего
звена между полярной и неполярной частями молекул, в некото-
рых соединениях присутствует этиленгликоль. Такие липиды на-
званы диольными В больших концентрациях диольные фосфоли-
пиды разрушают мембраны. Однако в очень ограниченных количе-
ствах они лишь меняют ее свойства, например повышают прони-
цаемость для небольших молекул и ионов Видимо, некоторые
25
клетки используют это свойство: начинают интенсивно синтезиро-
вать диольные липиды в период быстрого роста и прекращают син-
тез, когда рост замедляется. Возможно, это связано с тем, что в
период роста клеток их мембраны должны быть более подвижны-
ми и более проницаемыми
Помимо липидов в структуру мембран входят белки. Они со-
ставляют структурную основу мембран. В зависимости от функции
мембран соотношение между количеством липидов и белков мо-
жет колебаться Некоторые мембранные структуры содержат до
70—80 % белков Белки, входящие в состав мембран, различают-
ся как по величине молекул, так и по количественному содержа-
нию. По-видимому, молекулярная масса большинства мембранных
белков бактерий невелика и находится в пределах 1-Ю4—2-105
дальтон.
Наибольшее количество белков содержится в мембранах, при-
нимающих участие в осуществлении каталитических функций.
Структура белковых молекул, входящих в состав мембранного
комплекса, определяет характер их взаимодействия с липидами.
Наличие полярных участков в молекулах белков и липидов ведет
к возникновению электростатических сил, обусловленных притя-
жением противоположно заряженными частями ионизированных
молекул. И липиды, и аминокислотные боковые цепи белков бога-
ты ионизируемыми группами Примерами таких групп служат сво-
бодные карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кис-
лот, входящих в состав белка, е-аминогруппа лизина или амино-
группа. фосфатидилэтаноламипа и фосфатные группы всех фосфо-
липидов. Многие из этих групп ионизируются при физиологиче-
ских значениях pH.
Взаимодействие между белками и липидами осуществляется
пугем образования ковалентных связей за счет электростатическо-
го, полярного и гидрофобного взаимодействия. Три последних фак-
тора могут оказаться весьма существенными при формировании
термодинамически наиболее выгодной белково-липидной структу-
ры, т. е. структуры с минимальной свободной энергией. Водород-
ные связи, имеющие значение для поддержания третичной струк-
туры белка, не играют такой большой роли при образовании комп-
лекса между белками и липидами, поскольку свободная энергия
водородных связей не изменяется при переходе от водного окру-
жения к липидному
Молекулы фосфолипидов и белков не сохраняют фиксирован-
ной ориентации, но находятся в постоянном движении внутри осто-
ва данной мембраны. Соприкасающиеся друг с другом в какой-то
определенный момент молекулы могут достигать противоположной
стороны клетки диаметром 10 мкм в течение примерно 1 ч. Мем-
браны в связи с этим можно рассматривать как двухмерные жид-
кости, все компоненты которых постоянно находятся в диффузи-
онном движении. Мембранные белки подразделяют обычно на два
типа: периферические и интегральные Периферическими называют
белки, легко вымываемые из мембраны мягкими детергентами или
даже дистиллированной водой и связанные с поверхностями мем-
браны. В противоположность периферическим интегральные белки
погружены (в большей или меньшей степени) в толщу мембраны,
а иногда пронизывают ее насквозь Обычно интегральные белки
находятся в комплексе с липидами Белки двух указанных типов
должны различаться по распределению гидрофобных аминокис-
лотных остатков. Поверхность периферических белков гидрофиль-
на (эти белки, как правило, растворимы в воде), а гидрофобные
аминокислотные остатки погружены внутрь белковой глобулы.
В интегральных белках гидрофобные остатки локализованы на
поверхности, обеспечивая максимальное взаимодействие с непо-
лярной средой внутри мембраны. Однако у части интегральных
белков полярные группы располагаются на поверхности и взаимо-
действуют с полярными группами липидов и с периферическими
белками.
По биологическим функциям мембранные белки обычно услов-
но относят к трем группам: 1) "белки, обладающие энзиматической
активностью; 2) белки, специфически связывающие различные ве-
щества, необходимые для клетки, т. е несущие рецепторную функ-
цию; 3) структурные белки.
Ферменты, расположенные на мембранных структурах, могут
проявлять каталитическую активность, как правило, только тогда,
когда они находятся во взаимодействии с липидами мембраны
Липиды, по-видимому, определяют необходимое конформационное
состояние белковой молекулы, при котором становится возможным
образование фермеит-субстратного комплекса. В частности, липи-
ды препятствуют возникновению нежелательных гидрофобных
взаимодействий, которые неизбежно появляются при избытке гид-
рофобных участков. Проявление энзиматической активности по-
лиферментных комплексов, вероятно, возможно только на мем-
бранах, так как здесь каждая из каталитических единиц комплек-
са может находиться в упорядоченном состоянии относительно
друг друга в определенной последовательности и тем самым обес-
печить специфичность реакции Что касается локализации таких
комплексов, то предполагают, что в фосфолипидном слое есть
«гнезда», в которых молекулы ферментов расположены мозаично,
образуя каталитически активные ансамбли.
В настоящее время мы располагаем очень ограниченной инфор-
мацией относительно энзиматической активности, связанной с
мембранами. Это обстоятельство объясняется, в частности, рядом
методических трудностей, неизбежных при изучении мембран и
ассоциированных с ними белков. Тем не менее очевидным фактом
является присутствие в мембранах всех без исключения организ-
мов, как прокариотов, так и эукариотов, в том числе высокоорга-
низованных, фермента, отщепляющего одну фосфатную группу от
АТФ, т. е< АТФазу. Что касается других ферментов, ассоциирован-
ных с мембранами, то подчас трудно сказать, присущи они соб-
ственно мембранам или, например, лизосомам, которые могут быть
фракционированы вместе с цитоплазматической мембраной. Имея
в виду оговорки, сделанные выше, можно считать, что у грампо-
ложительпых организмов с мембранами связаны дегидрогеназы
янтарной, яблочной и молочной кислот, некоторые НАД-зависимые
оксидазы, а также ферменты, участвующие в синтезе фосфолипи-
дов и диглицеридов.
Структурные белки мембран в химическом отношении мало изу?-
чсны. Известно, что все они плохо растворимы в воде вследствие
наличия обширных гидрофобных участков Это обстоятельство
создает условия для образования прочных структур с липидами —
липопротеидов, а также позволяет белковым молекулам объеди-
няться в водной среде в крупные, трудно расщепляемые агрегаты
Представителями рецепторных белков, связанных с мембранами,
являются пермеазы. Свободных углеводов в клеточных мембранах
очень мало, и большинство углеводных остатков входит в состав
гликолипидов и гликопротеидов. В их составе одни и те же основ-
ные моносахариды' D-галактоза, D глюкоза, N ацетилт’люкозамин,
N-ацетилгалактозамин, D-фукоза, D-манноза, D-ксилоза. В глико-
протеидах моносахариды обычно образуют гетерологические по-
следовательности из нескольких единиц; олигосахариды связаны
О-гликозидной связью с гидроксильными группами серина и тре-
онина или N-гликозидной связью—с аспарагином.
В структуру мембран входят ионы двухвалентных металлов.
Предполагается, что они образуют с фосфолипидами хелатные
комплексы и тем самым придают мембране необходимую проч-
ность за счет большей компактности. Ионы служат мостиками,
связывающими между собой карбоксильные группы фосфолипи-
дов и белков, например фосфолипид—R—СОО—Mg—ООС—R—
белок. Удаление катионов из мембран приводит к их деструкции
вследствие повышения гидрофильности, возникающем в результа-
те появления свободных карбоксильных групп.
Для функции мембран крайне важным является вопрос об их
строении, о взаимной ориентации и укладке входящих в нее ком-
понентов, т. е., как принято говорить, об их молекулярной архи-
тектуре Поскольку достаточно надежных методов, позволяющих
получить данные о прижизненном состоянии мембран, нет, появи-
лись гипотезы, основанные на результатах косвенных физико-хи-
мических анализов.
Как было сказано выше, одной из первых моделей строения
мембран была модель «бутерброда» (см. рис. 11-1), где липиды
взаимодействуют с белками своими полярными группами, а гид-
рофобные концы липидов остаются в середине По мере получения
новой информации о физико-химических свойствах входящих в
мембраны компонентов представления об их молекулярной архи-
тектуре усложнялись. Общие соображения о характере взаимодей-
ствия входящих в состав мембран структурных компонентов были
приведены выше. Следующим вариантом модели мембран являет-
ся «липопротеиновый ковер», структура которого как бы соткана
из белковых и липидных нитей. Здесь полярные головки липидных
молекул находятся у поверхности и соприкасаются с водой, а хво-
28
сты уложены вдоль белковых нитей. Такая укладка может воз-
никнуть под действием тех же сил гидрофобного взаимодействия,
которые заставляют агрегировать липиды (рис. П-2).
Другой тип укладки назван мозаичным При атом во взаимо-
действие с белковыми глобулами вступают не отдельные молеку-
лы липидов, а их мицеллы. Такая мембрана должна состоять из
неплотно упакованных молекул белков, свободное пространство
между которыми заполнено молекулами липидов (рис. 11-3). Все
компоненты такой мембраны подвижны и находятся в состоянии
непрерывной реорганизации
Рассмотренные три варианта молекулярной организации мем-
бран удовлетворяют не всем физико-химическим критериям, ко-
торые были к ним предъявлены. Например, мозаичная модель не
учитывает того, что в состав мембран входят различные белки и
между ними тоже возможно взаимодействие. Количественные со-
отношения между белками и липидами у различных мембран раз-
личны и т. п. В настоящее время предложен усложненный вари-
ант мозаичной мембраны (рис. П-4)
Интегральные белки пронизывают мембрану насквозь, они при-
креплены к липидным головкам с помощью электростатических
29
сил взаимодействия. Периферические белки находятся во взве-
шенном состоянии в липидном слое, при этом большая часть гло-
булы погружена в мембрану, а меньшая часть — в окружающую
мембрану водную среду В состав мембраны входят также глико-
яротеиды, углеводные цепи которых располагаются в водной фазе.
Детали, связанные с молекулярной архитектурой мембран, уточ-
няются, многочисленные работы, проводимые в этом направлении,
вызывают необходимость пересматривать существующие представ-
ления и приводить их в соответствие с обнаруженными фактами.
2.. СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ
МЕМБРАН ПРОКАРИОТОВ И ЭУКАРИОТОВ
яё имеют никаких иных мембранных структур, кроме плазмалеммы. Однако
на рибосомах, связанных с мембраной, биосинтез фосфолипидов, прикрепление
У грамположительных организмов обнаружена структура грушевидной фор-
мы. Как и мезосома, грушевидная структура не постоянна. Она образуется de-
novo на месте контакта ДНК с -цитоплазматической мембраной. Этот участок
цитоплазматической мембраны, к которому крепится ген — репликатор ДНК»,
является местом локализации фермента-ннициатора, запускающего процесс де-
ления клеток. Репликация ДНК идет параллельно с синтезом мембран в райо-
В заключение следует отметить, что между клеточной стенкой и цитоплаз-
матической мембраной можно обнаружить пространство, которое называют пе-
риплазматическим. Здесь происходит временное депонирование веществ, прони-
Мембраны у эукариотов представляют собой более сложную систему, чем
у прокариотов. Рассмотрение мембрац будет ограничено здесь только дрожже-
выми организмами Нуклеолемма, плазмалемма, мембраны эндоплазматического-
ретикулума и аппарат Гольджи связаны друг с другом в единую систему, обес-
печивающую пластические и метаболические функции дрожжевой клетки.
Данные об общем составе выделенных из Candida albicans и Е. coli мем-
бран свидетельствуют об их существенном различии Так, содержание белков
(в % к массе сухой биомассы) у Candida albicans составляет 47,4 у Е. coll —
65,5, липидов — соответственно 44,0 и 15,7, РНК — 3.9 и 7,9; ДНК—1,5 и 2,8..
РНК, как известно, не входит в состав мембран. Возможно, что она присут-
ствует как примесь, обусловленная наличием связанных с мембранами рибосом.
Для такой связи батее* благоприятным является повышенное содержание белка:
в мембране, как это имеет место в данном случае у Е coli. Различия в жирно-
кислотном составе мембран Candida albicans и Е. coli показаны в таблице П-3.
Таблица П-3. Состав жирных кислот липидов мембран Candida albicans и
Escherichia coli, % от метиловых эфиров всех жирных кисмт
1,46
0,42
4,4
5,74
23,4
~1’С7
33,4
Нет
Нет
нальны. В частности, они являются местом образования лизосом После того как
лизосомы отшиуровываются от ашшрата^Гольджи, они располагаются в цито-
31
ществу, всю метаболическую активность, свойственную митохондриям. Наруж-
митохондрпй более прочная, она не содержит ферментов дыха-
Двумя мембранами ограничены от цитоплазмы митохондрии. Внутревняя
митохондриальная мембрана образует складки — кристы, которые увеличивают
и углеводородов. Образующийся при этом пиноцнтирующий пузырек, вероят-
ГЛАВА III. БЕЛКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
1. содержание белков в МИКРОБНЫХ КЛЕТКАХ
Микробные клетки как прокариотов, так и эукариотов содер-
жат значительное количество белков. В процентном отношении
к массе сухой биомассы1 содержание белков колеблется, достигая
40—80 % в зависимости от условий культивирования, организма
и возраста популяции (или фазы роста). Хорошо изученная куль-
тура Е. coll содержит в одной клетке около Ю7 молекул белка.
В ДНК Е. coh зашифрована структура примерно 3000 разных по-
липептидных цепей. Если бы все 3000 генов в одинаковой степени
участвовали в осуществлении функции ДНК, т. е. все типы кле-
точных белков синтезировались в одинаковом количестве, кансдая
клетка содержала бы число копий каждой белковой молекулы,
составляющее частное от деления 107 на 3000 Однако анализ от-
поверхности или объема местообитания. При культивировании микроорганизмов
32
иосительного количества различных белков в клетке показал, что,
в то время как содержание некоторых из них не превышает 10 мо-
лекул, количество других доходит от 5- Ю5 молекул на клетку Ра-
зумеется, это частный пример Можно лишь представить себе, что
число индивидуальных белков в клетке любого микроорганизма
исключительно велико, исходя хотя бы из их функциональной ро-
ли в обмене веществ На примере Saccharoinyces cerevisiae было
показано, что средняя молекулярная масса полипептидов в клет-
ках составляет 57-103 дальтон Такой полипептид содержит 533
аминокислоты Синтезируется он за 78 с, что соответствует сред-
ней скорости элонгации 6,9 аминокислоты в секунду. Как прави-
ло, время, необходимое для синтеза того или иного полипептида,
не пропорционально его длине.
Белки имеют первостепенное значение при формировании
структуры клетки, а также обеспечивают проявление ее жизнен-
ных функций. Именно белки являются теми молекулярными ин-
струментами, с помощью которых реализуется генетическая ин-
формация Большая часть белков наделена специфической катали-
тической активностью и функционирует в качестве ферментов;
остальные являются структурными элементами клетки, служат за-
пасными питательными веществами и средством транспортировки
различных веществ. Суммарное количество белков обычно выше
у молодых клеток Культуры, находящиеся в стационарной фазе
роста, менее богаты белками В ходе роста культуры происходит
изменение белкового состава клеток, деградация одних белков и
синтез других Вероятно, концентрация белка в бактериальных
клетках в большей степени есть ^функция процессов синтеза, и
весьма вероятно, что она контролируется в первую очередь изме-
нениями величин скоростей этих процессов
Энзиматической деградации сначала подвергаются раствори-
мые белки У бактерий скорость распада белков регулируется ско-
ростью роста. На голодной среде распад во много раз ускоряется.
Ингибиторы протеолиза у бактерий угнетают образование новых
ферментов, что свидетельствует о роли белков, подвергающихся
распаду в синтезе ферментов de novo Фактором, определяющим
скорость деградации белков как в клетке, так и вне ее, может
быть изменение конформации белковых молекул. Нерастворимые
белки предохранены от деградации вследствие ассоциации с кле-
точными компонентами Для некоторых культур было показано,
что интенсивная смена белковых компонентов клетки происходит
в период, предшествующий споруляции.
Дефицит белка, который коснулся многих стран мира, заста-
вил наиболее развитые государства начать исследовапня широкого
спектра белоксодержащих веществ с точки зрения возможности их
применения прежде всего в качестве корма. Одним из объектов
такого изучения оказались микроорганизмы
Детальный анализ суммарного содержания амипокпелот в мик-
робных клетках показал, что микробные белки качественно не от-
личаются по аминокислотному со<^йу“;от“Дру^иД'гпрЁйставителей
2 А. М Безбородов 5 £ »*•- j;"1 Л 33
РНК
лнк
животного мира и мира растений. Общая характеристика амино-
кислотного состава клеток микроорганизмов, которые рассматри-
ваются как источники кормового белка, приведена в табл. II1-1.
В этой же таблице даны некоторые сведения относительного со-
держания ДНК, РНК, липидов и пр.
В качестве кормовых добавок наиболее часто используют дрож-
жи Экономисты считают, что введение I т дрожжей в корма по-
зволяет получать дополнительно 700—800 кг свинины, или 1,5—
2,5 т мяса птицы, или 15—35 тыс. шт. яиц и сэкономить 3,5—5 т
зерпа или других высококонцентрированных кормов. Культуры.,
которые потенциально могут быть использованы в качестве кор-
мовых добавок к рациону, отбирают, как правило, исходя из ами-
нокислотного состава белков, обращая особое внимание на содер-
жание лизина, триптофана, метионина, аминокислот, количество
которых в кормах часто бывает недостаточным для сбалансиро-
ванного питания животных. Сопоставление аминокислотного со-
става кормовых дрожжей с рыбной мукой и соевым шротом, кото-
рые часто используются в рационе животных, дапо в табл. Ш-2.
Таблица Ш-2. Аминокислотный состав кормовых дрожжей,
Аммхжпсло» "“Я-™- '""о™ Соевой трот
Триптофан 1,5 1,0—3,0 1,0 1,4 Лизин 6,8 5,0—8,0 8,9 6,3 Метионин 1,7 0,5—1,5 2,9 1,3 Лрткнин 5,6 4,6—5,7 6,7 7,6 Гистпднн 2,4 1,6—2,1 2,3 2,4 Треонин 4,2 3,3—6,7 4,5 3,9 Валин 5,1 4,6—5,6 5,8 5,3 Изолейцин 4,5 3,4—4,8 5,5 5,5 ЛеГшта 7,6 5,2—8,5 8,0 7,7 Фенилаланин 4,2 2,5—5,0 4,5 4,9 Цистин 1,3 1,8 1,9 1,4 Очевидно, кормовые дрожжи, выращенные как на углеводороде
так и на растительных гидролизатах, не уступают по содержанию
большинства аминокислот другим бёлкам
Получение мутантов дрожжей, бедки которых богаты той или
иной необходимой аминокислотой, пока представляется не столь
латкой задачей- Одна из причин трудностей заключается в огра-
ниченности наших знаний о тонкой структуре генома дрожжей и
механизмах регуляции его функции. Как было сказано выше, ами-
нокислотный состав суммарного белка меняется в зависимости от
возраста культуры, однако уловить какую-либо закономерность,
позволяющую регулировать процесс, пока достаточно сложно.
В последние годы в различных странах предпринимаются по-
пытки использовать в качестве добавок к пищевому рациону не
микробную массу, а отдельные се фракции, содержащие преиму-
щественно белки Белки, входящие в эти фракции, должны хоро-
шо ассимилироваться организмом, а также иметь в своем составе
незаменимые аминокислоты.
2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
Среди 20 аминокислотных остатков, входящих в состав белков,
имеются гидрофильные и гидрофобные. Установлена степень гид-
рофобности всех аминокислот Ее мера — разность свободных
2*
энергий растворения аминокислоты в этиловом спирте и в воде,.
Ниже приводятся эти величины.
3000
2970
2870
2650
2600
2420
1690
1500
1400
1300
730
730
650
550
540
440
40
О
—10
—100
Гидрофобность убывает от триптофана к ..........., _„г____
десять аминокислот можно считать гидрофобными, остальные -
гидрофильными Каждая из аминокислот вносит свой специфиче-
ский вклад в строение белковой молекулы, исходя из своих фи-
зико-химических свойств Остаток глицина обладает присущими
ему свойствами, связанными с тем, что у него отсутствует боковая
цепь. В частности, в звене, содержащем этот остаток, возможны
резкие изгибы полипептидной цепи Алифатические остатки, со-
держащие гидроксильные группы, обладают несколько более спе-
цифической реакционой способностью. Алифатический гидроксил
может играть роль донора при образовании водородной связи.
Помимо того определенные гидроксильные группы остатков сери-
на некоторых ферментов активно действуют в качестве нуклео-
фильных агентов.
Кислые аминокислотные остатки при физиологических значе-
ниях pH несут единичный отрицательный заряд и поэтому могут
глутамину Первые
нательный вклад в общий заряд белковой молекулы. Они могут
участвовать также в образовании водородных связей. Неионизи-
рованная карбоксильная группа служит хорошим донором водоро-
да, а карбоксил ат-ион- хорошим акцептором. Амиды, образуемые
этими карбоксилатными группами (остатки глутаминовой и аспа-
рагиновой кислот), могут участвовать в образовании водородных
связей точно так же, как и амидные группы полипептидных цепей
Основные аминокислотные остатки в их протонированной фор-
ме являются катионами, поэтому они также участвуют в ионных
взаимодействиях Эти остатки вносят положительный вклад в об-
щий заряд белковой молекулы Гуанидиний-ион аргинина несет
особую функцию, образуя стабильную ионную пару с карбоксилат-
ионом в неполярных областях белковой молекулы. е-Аминогруппа
лизина может обратимо реагировать с карбоксильными соедине-
ниями с выделением воды и образованием основания Шиффа. Кро-
ме того, протонированные атомы азота могут служить донорами,
а депротонированные формы остатков лизина — акцепторами в об-
разовании водородной связи, хотя при физиологических значениях
pH лишь азот имидазола гистидинового остатка имеет значение
как акцептор. В своей непротонированной форме имидазольное
кольцо гистидина содержит два атома азота с совершенно раз-
личными свойствами, один из них является нуклеофильным, а
другой — электрофильным Протонирование приводит к потере
нуклеофильной активности.
Содержащие серу аминокислотные остатки имеют важное зна-
чение в связи с особыми химическими свойствами серы. Высокая
поляризуемость атома серы делает серосодержащие группировки
особенно эффективными в реакциях нуклеофильного замещения
(в качестве как замещаемых, так и замещающих группировок).
Тиоловая группа цистеина является отличным нуклеофильным
агентом. Тиоэфирная группа метионина также обладает нуклео-
фильными свойствами, о чем свидетельствует ее способность к об-
разованию сульфониевых производных типа S-аденозилметионина.
Цистеин легко окисляется в дистин. Эта реакция в белках служит
единственным способом образования истинно ковалентной (в дан-
ном случае дисульфидной) связи между разными полипептидны-
ми цепями или между остатками одной цепи.
Ароматические остатки составляют неоднородную группу со-
единений, в которую входят аминокислоты, содержащие бензоль-
ное кольцо. Все эти остатки способны к Ван-дер-Ваальсовым взаи-
модействиям и обладают сильно выраженными гидрофобными
свойствами. Фенольная группировка остатка тирозина способна
помимо того участвовать в качестве донора в образовании водо-
родной связи. Индольное кольцо триптофана является единствен-
ным остатком в белковой молекуле, способной в качестве донора
легко вступать в реакцию образования комплекса с переносом за-
ряда. Важное значение насыщенных гетероциклических остатков
пролина и оксипролина обусловлено их стереохимическими свой-
ствами. Полипептидные цепи, содержащие эти циклические вто-
ричные сс-аминокислоты, образуют более жесткие структуры, чем
цепи, содержащие только первичные «-аминокислоты Вторичная
структура представляет собой пространственную организацию це-
пи или ее участка
Частным случаем вторичной структуры является п-спираль.
Белковая цепь свернута в виде винтовой спирали благодаря внут-
ренним поворотам вокруг единичных связей С—С и С—N. Опре-
деленная спиральная конформация удерживается, не превращаясь
в беспорядочный клубок, благодаря водородным связям между
NH-группой одной пептидной связи и СО-группой другой пептид-
37
p-форма. Соседние
структуре
ной связи. В спирали водородные связи (на рис. Ш-1 показаны
пунктиром) соединяют первую пептидную группу с пятой, вто-
рую— с шестой и т. д. Водородные связи направлены вдоль оси
спирали.
Другая часто встречающаяся конформация белковой цепи —
0-форма. Соседние цепи располагаются в грснс-конформациях,
образуя почти плоские системы. Цепи соеди-
няются водородными связями, направлен-
ными в этом случае перпендикулярно к
транс-цепочке. При нагревании белка, из-
менении его окружения (воздействие кис-
лот, щелочей, мочевины и т. д.) вторичная
структура, в частности а-спираль, разру-
шается. Происходит переход спираль —клу-
бок. Здесь имеет место кооперативное яв-
ление, подобное фазовому переходу. Из-
вестно, что из всех возможных многочис-
ленных конформаций каждый полимер
всегда принимает только одну, а именно ту,
которая обеспечивает минимум свободной
энергии. Трехмерная конфигурация пред-
ставляет собой энергетически наиболее вы-
годную организацию полипептидной цепи.
Третичная структура белков однозначно
определяется (в надлежащей среде) после-
довательностью аминокислот.
Третичная структура белка определяется
большой компактностью и жесткостью мо-
лекулы. Легкость, с которой эта компакт-
ность может быть нарушена, свидетельст-
вует о том, что структура стабилизирована
не ковалентными связями. Стабилизация
плотно свернутой третичной структуры гло-
булярных белков достигается за счет взаи-
модействия боковых цепей аминокислотных
остатков, обладающих указанными выше
свойствами. Силы взаимодействия, каждая
в отдельности, невелики: ионное взаимодей-
ствие, водородные связи, гидрофобное взаимодействие и Ван-дер-
Ваальсовы силы. Но поскольку число этих связей очень велико и
все они действуют одновременно по всей структуре белка, она
обладает достаточной устойчивостью при обычной температуре
(рис. Ш-2).
Значительная внутренняя область белковой молекулы практи-
чески не контактирует с водным раствором и недоступна для со-
держащихся в нем малых молекул. Существование такого недо-
ступного ядра повышает стабильность белковой структуры. Ядро
может иметь такую физико-химическую природу, при которой во-
дородные связи, гидрофобные взаимодействия и вообще все типы
38
взаимодействий, стабилизирующих вторичную и третичную струк-
туры, оказываются гораздо более сильными, чем в водном раст-
воре.
Третичная структура обычно крайне нерегулярна. Практически
ни один белок не существует в форме простой спирали: во многих
белках имеются как спирализованные, так и неспиралнзованные
участки, а в некоторых белках слирализованных участков, по-ви-
димому, вообще нет. Существует ряд стереохимических причин,
по которым (несмотря на почти регулярное расположение водо-
родных связей в остове) участки с конфигурацией а-спирали и
другими регулярными конфигурациями встречаются в цепи отно-
сительно не столь часто. Одна из таких причин — неспособность
пролина к образованию водородных связей, поэтому там, где сто-
ит пролин, регулярное расположение водородных связей наруша-
ется. Другая причина состоит в образовании дисульфидных мости-
ков между остатками цистеина. Когда эти остатки принадлежат
одной и той же полипептидной цепи, спиральная конфигурация
оказывается нарушенной.
39
Однако, пожалуй, самой важной причиной наличия в молекуле
белка участков с нерегулярной структурой является различная
природа боковых групп. Каждая боковая группа стремится к об-
разованию энергетически наиболее выгодных вторичных связей с
другими группами Например, свободная гидроксильная группа
тирозина стремится занять положение, удобное для образования
водородной связи. Значительная энергия, которой обладает такая
связь, была бы потеряна, если бы, например, эта группа оказалась
расположенной вблизи гидрофобной боковой группы изолейцина.
Трехмерная структура белка является необходимым условием,
чтобы макромолекула могла быть носителем энзиматической ак-
тивности. В этом случае остатки аминокислот, определяющие
структуру активного центра и расположенные далеко друг от дру-
га в первичной структуре, четко фиксированы в их строгой ори-
ентации в третичной структуре. Более того, близкое расположение
нескольких аминокислот, составляющих активный центр, напри-
мер в одном декапептиде, не позволило бы создать необходимую
для проявления активности геометрическую ориентацию
Со структурой белков тесно связана их термостабильность. При
сравнительном изучении белков, выделенных из мезофильных и
термофильных организмов, было показано, что остатки глицила,
серина, лизина и аспарагиновой кислоты в белках мезофильных
организмов могут быть замещены соответствено па остатки а-ала-
нина, греонина, аргинина и глутаминовой кислоты в белках тер-
мофильных организмов. Таким образом, увеличение термостабиль-
ности может быть достигнуто путем таких аминокислотных за-
мещений, которые не вызывают существенных изменений конфор-
мации полипептидпой цепи белка. Эти замещения ведут прежде
всего к увеличению внутренней и снижению внешней гидрофобно-
сти белковой глобулы, а также к усилению тенденции к слирали-
зации участков цепи.
Для препаративного получения белков из микробной биомассы
на первом этапе технологического процесса необходимо прежде все-
го разрушить клеточные степки Белки могут быть переведены в со-
левой раствор, а затем фракционированы из него, например путем
осаждения. Для проведения этой операции желательно знать изо-
электрическую точку белка, подлежащего осаждению. В изоэлек-
трической точке молекулы белка не несут суммарного заряда и,
следовательно, между соседними молекулами белка отсутствует
электростатическое отталкивание. При значениях pH выше или
ниже изоэлектрической точки все молекулы белка имеют суммар-
ный заряд одного знака, вследствие чего они отталкиваются друг
от друга Таким образом, именно в изоэлектрической точке, ха-
рактеризуемой определенной величиной pH раствора, белки об-
ладают наименьшей растворимостью. Поскольку разные белки
имеют разные изоэлектрические точки, белки можно отделить друг
от друга с помощью приема, известного как изоэлектрическое
При достижении значения pH, соответствующего изоэлектри-
40
ческой точке одного из компонентов белковой смеси, он полно-
слью или почти полностью выпадает в осадок, тогда как белки,
изоэлектрические точки которых лежат при более низких или бо-
лее высоких значениях pH, остаются в растворе. На растворимость
белков сильное влияние оказывает концентрация солей. Нейтраль-
ные соли в низких концентрациях повышают растворимость мно-
гих белков. Этот эффект не зависит от природы нейтральной со-
ли, он зависит от концентрации соли и числа зарядов каждого из
ионов, присутствующих в растворе.
Соли, содержащие двухвалентные ионы, например MgCU или
MgSO4, значительно эффективнее повышают растворимость бел-
ков, чем такие соли, как NaCl, NH4CI и КС1. Повышение раство-
римости вызывается изменениями в степени диссоциации ионизи-
руемых групп белка При значительном повышении концентрации
нейтральных солей растворимость белков начинает опять пони-
жаться, и при очень высоких концентрациях соли белок может
полностью выпасть в осадок Это явление называется высалива-
нием Физико-химическая основа высаливания до конца не выяс-
нена Для препаративных целей чаше других используют сульфат
аммония. Насыщая последовательно раствор, содержащим белки,
удается получать различные его фракции Для освобождения от
солей проводят диализ, иногда против буферной системы, которая
для данного белка наилучшим образом обеспечивает сохранение
его нативной структуры.
Для осаждения .белков применяют также смешивающиеся с
водой органические растворители, из которых чаще других исполь-
зуют метанол, этанол и ацетон. В основе этого явления лежит на-
блюдение, что растворимость белков при определенных значениях
pH и ионной силы зависит от диэлектрической постоянной среды
и от способности добавленного растворителя понижать степень
гидратации ионных групп У метапола, этанола и ацетона диэлек-
трическая постоянная ниже, чем у воды, (у воды — 80, у метано-
ла— 33, у этанола — 24, у ацетона — 21,4) При снижении ди-
электрической постоянной силы притяжения между двумя проти-
воположными зарядами возрастают и создаются условия для об-
разования ионных пар.
Указанные выше метанол, этанол и ацетон способствуют агре-
гации белков, т. е. снижают их растворимость Путем изменения
концентрации названных растворителей можно фракционировать
белки из их смеси. Метод, правда, имеет некоторые ограничения,
так как при воздействии органических растворителей часто возни-
кают конформационные изменения белков. Особенно это опасно
при выделении ферментных белков
Индивидуальные белки, входящие в состав микробных клеток,
изучены недостаточно. Исключение составляют ферментные белки.
У некоторых из них установлена первичная структура, у многих
полученных в гомогенном состоянии определен аминокислотный со-
. став Установление первичной структуры белковых молекул ведет
к получению ценной информации, касаюшс • ся не только собствен-
по белка. Ряд фундаментальных работ, выполненных совместными
усилиями биохимиков и генетиков, позволил привлечь данные о
первичной структуре белков к расшифровке последовательности
нуклеотидов на определенных участках генома, ответственных за
синтез данного белка.
ГЛАВА IV. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
I. ФУНКЦИИ нуклеиновых кислот в микробных
КЛЕТКАХ
Нуклеиновые кислоты в отличие от других полимеров обла-
дают универсальной функцией, состоящей в хранении и передаче
генетической информации. Нуклеиновые кислоты принято делить
на два класса — рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеино-
вые (ДНК) — в зависимости от входящего в их состав углеводно-
го компонента рибозы или дезоксирибозы. Все они представляют
собой линейные полимеры нуклеотидов, соединенных друг с дру-
гом фосфодиэфирными связями. В состав каждой из нуклеиновых
кислот входят четыре нуклеотида. Нуклеотиды состоят из трех
компонентов: пиримидинового или пуринового основания, углево-
да и фосфата, ^тарифицирующего сахар преимущественно по С—
5'-атому. В состав РНК входят аденин (6-амипопурин) и гуанин
(2-амино-6-оксипурин), урацил (2,4-диоксипиримндин) и цитозин
(2-окси-4-амипопиримидин). В состав ДНК вместо урацила входит
тимин (5-метил-2,4-диоксипиримидин). При написании последова-
тельностей оснований в ДНК и РНК пользуются сокращениями,
обозначая основания первыми буквами, например аденин—А и
У большинства живых существ хранителем наследственной ин-
формации служат наиболее консервативные по структуре и свой-
ствам двухцепочечные ДНК- Лишь у наиболее просто организо-
ванных живых существ — вирусов генетическими нуклеиновыми
кислотами могут являться двухцепочечные РНК, а также одноце-
почечные ДНК и РНК- Как носитель генетической информации
ДНК выполняет две основные фуккции: I) дает точные копии са-
мой себя в процессе репликации, или удвоения; 2) передает зако-
дированную в ней информацию молекулам мРНК в процессе
транскрипции.
Транскрипция представляет собой процесс синтеза с помощью
фермента РНК-полимеразы нити РНК, которая является компле-
руются три типа РНК: информационная, или матричная (мРНК),
рибосомальная (рРНК) и транспортная (тРНК). Информацию о
синтезе специфических белков несет только одна из двух цепей.
Вторая цепь в процессе транскрипции осуществляет контролирую-
щую, стабилизирующую и восстановительную функции. На этом
основании одна цепь называется несущей, другая—регулирующей
генетическую информацию. Из этого следует, что геи построен ио
принципу самоконтролируемой программы. Таким образом, био-
логическая сущность двунитевой ДНК связана с ее саморепродук-
цией, самоконтролем и самовосстановлением генетической инфор-
мации.
Генетическая ДНК в зависимости от характера хранимой на-
следственной информации входит у эукариотов в состав различных
клеточных структур: хромосом, ядрышка, митохондрий, цитоплаз-
матических генетических структур и т. п. Однако ДНК эукариотов
преимущественно локализуется в ядре, где она входит в состав
хромосом и ядрышка Содержание ДНК в любой клетке или ор-
ганизме строго постоянно и не зависит от условий внешней сре-
ды, от питания или от воздействия различных факторов, влияю-
щих на метаболизм клетки.
Эта особенность ДНК вполне отвечает представлениям о ней,
как о носителе генетической информации. Общее содержание ДНК
в клетке, как правило, увеличивается с возрастанием сложности
клетки и, следовательно, с необходимостью возрастания количест-
ва 1енстической информации (табл. 1V-1). Существует также по-
Т а блиц a IV-1.
Т4
Mycoplasma gallisepticum
1,6X106 5,5-Ю2
80X10» 4,5 10*
130x10е 2-10»
14X10° 2,1-10*
0,2X10° 0,3-10»
1,3X10° 2,1-10»
2,8X10° 4,6 10е
6,3X10° 10,5 10»
6,5X10® 10 10*
10X10” 16 10»
1,5X10” 2,3-10»
1.8X10” 2,8-10»
нятие «величина генома», которая представляет собой суммарный
объем генетической информации организма Ее можно выразить
как количество ДНК на одно гаплоидное ядро (если это эукариот)
или на геном прокариотного организма. Эта величина варьирует
в пределах от 10-15 г у бактерий до 10-12 у млекопитающих. В от-
личие от многих других молекул, входящих в состав клеток, мо-
лекула ДНК стабильна: атомы, однажды включенные в ее состав,
не покидают молекулу, пока поддерживается нормальный рост
клетки У бактерий все это количество ДНК сосредоточено в хро-
мосоме, представляющей собой длинную двухцепочечную моле-
кулу.
43
Наиболее хорошо изучена хромосома Е. coli. Молекулярная
масса молекулы около 2,8 109 дальтон, а длина превышает 1,2 мм.
Такая гигантская молекула полимера замкнута в кольцо, имею-
щее диаметр приблизительно 2 нм. Молекула ДНК содержит бо-
лее 4 млн. пар нуклеотидов, молекулярная масса каждой нуклео-
тидной пары равна приблизительно 600. ДНК бактерий состоит,
по-видимому, только из уникальных, не повторяющихся последо-
вательностей нуклеотидов Напротив, для высших форм с их боль-
шим количеством ДНК характерно существование повторяющихся
последовательностей, которые могут составлять более половины
всего генома. Хромосомы бактерий находятся в тесной связи с
мембранами. Связь эта имеет не только структурное значение.
Она оказывает существенное влияние на функциональную актив-
ность ДНК-
Оценивая функциональный вклад каждой из нуклеиновых кис-
лот в синтез белка, следует остановиться на схеме, которая изо-
бражена ниже и получила название центральный догмы Крика.
Применительно к микроорганизмам, у которых генетическая
информация заключена в молекуле ДНК, эта схема справедлива
и по сей день, К их числу относятся практически все промышлен-
ные продуценты, как прокариоты, так и эукариоты. Однако этот
классический путь был поставлен под сомнение, когда была уста-
новлена функция РНК как носителя генетической информации и
открыта полимераза, использующая в качестве матрицы РНК. На
этой матрице сначала строится одна нить ДНК, а затем компле-
ментарная ей цепь, в результате образуется двухцепочечная ДНК-
Катализирующий реакцию синтеза ДНК фермент представляет
собой РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Его тривиальное назва-
ние обратная транскриптаза Встречается она обычно у лейкови-
русов. Молекулы мРНК синтезируются на двухцепочечной ДНК-
матрице обычными ДНК-зависимыми РНК-полимеразами
У неонкогенных РНК-содержащих вирусов происходит непо-
средственная репликация РНК за счет активности реиликазы
(РНК-зависимой РНК-полимеразы) Сначала происходит обра-
зование двухцепочечной (+/—) промежуточной формы РНК-
Комплементарная минус-цепь (—) этой промежуточной формы
служит затем матрицей в многократном синтезе новых (+)-цепей
В связи с этим в центральную догму Крика в настоящее время
внесены некоторые поправки. Изображают ее так
44
I*HK>
Путь синтеза белка, обозначенный сплошными линиями, ничем
не отличается от приведенного ранее. Пунктирными линиями (/)
показан механизм, связанный с функцией обратной транскрипта-
зы, (2) —с функцией реиликазы.
Незыблемым в догме Крика остается положение, согласно ко-
торому, «если информация перешла на белок, она не может быть
получена обратно». Это значит, что информация не может пере-
даваться с белка на белок и с белка на нуклеиновую кислоту Ин-
формация о синтезе белка в молекуле ДНК закодирована в вцде
триплетов. Образующаяся в ходе транскрипции комплементарная
мРНК служит объектом трансляции Поэтому триплеты генетиче-
ского кода принято представлять в виде рибонуклеотидов Из че-
тырех нуклеотидов, составляющих молекулы РНК для триплетно-
го кода, можно иметь 64 кодона.
Известно, что в построении белка участвуют 20 аминокислот
Кодирует аминокислоты 61 триплет из 64. Большинство амино-
кислот имеют не более одного кодирующего триплета (табл. IV-2).
Какой аминокислоте будет соответствовать данный кодоп, опре-
деляют главным образом два первых нуклеотида Главную смыс-
ловую нагрузку несет дублет, стоящий в начале кодона Если два
кодона имеют два одинаковых первых нуклеотида и их третьи
нуклеотиды принадлежат к одному классу (пуриновому или пи-
римидиновому), то они кодируют одну и ту же аминокислоту,—
в этом суть вырожденности кода
Вырожденность кода нельзя рассматривать как излишество
Она имеет существенное значение для повышения устойчивости и
передачи генетической информации к различным повреждающим
и мутационным воздействиям В тех случаях, когда происходит
все же замена третьего основания пуринового на пиримидиновое
или наоборот и смысл кодона меняется, не происходит, как прави-
ло, изменения полярности радикала кодируемой аминокислоты.
Таким образом, неполярный радикал замещается неполярным, а
полярный — на полярный. В свою очередь это уменьшает возмож-
ные искажения структуры синтезируемых полипептидных цепочек.
Три из 64 триплетов — УАА, У АГ, УГА—не кодируют какие-либо
аминокислоты, и их называют поэтому бессмысленными, нонсенс-
кодонами. Все они служат сигналами завершения синтеза полипеп-
тида Два кодона: один из валиновых — ГУГ и метиониновый
АУГ—имеют дополнительные функции Если они находятся ь
। 45
начале считываемой области мРНК, то к ним присоединяется
тРНК, несущая формилметионин. Таким образом, кодоны ГУГ и
АУГ служат инициаторами синтеза пептидной цепочки. Если же
они не стоят первыми, то не отличаются по функциям от других
кодонов, обеспечивая включение в полипептндную цепь валина и
метионина.
Кодон является низшим звеном сложной системы хранения
генетической информации. Последовательность кодонов, идентич-
ная последовательности аминокислот в белках, образует цистро-
ны и гены. До педавнего времени характер взаимосвязи между
генами и белками было принято формулировать так: «Один геи —
один белок (фермент)». Сейчас признание получила другая фор-
мулировка- «Один ген—одна полипептидная цепь». Когда белок
состоит более чем из одной полипептидаой цепи, каждая цепь син-
тезируется отдельно, и лишь затем они соединяются в готовый
продукт.
46
2. ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В МИКРОБНЫХ КЛЕТКАХ
Абсолютное содержание ДНК и РНК, соотношения между ни-
ми, а также доля нуклеиновых кислот по отношению к другим ком-
понентам клетки варьируют очень широко. Тем не менее сущест-
вует нижний предел содержания ДНК (или генетической РНК ви-
русов) на одну клетку. Для каждого вида микроорганизмов это
строго определенное количество ДНК, составляющее геном клет-
ки. Чем интенсивнее протекает обмен веществ в клетке, и в осо-
бенности чем интенсивнее происходит в ней синтез белков, тем
РНК/ДНК должно быть выше Косвенно это доказывает также
увеличение числа рибосом в расчете на клетку.
Изменение количественного содержания нуклеиновых кислот
отвечает физиологическому состоянию клетки, фазе роста попу-
ляции в целом как следствие условий культивирования. В период
лаг-фазы, то есть фазы подготовки клеток к делению, и особенно
к ее концу отмечается интенсивный синтез ДНК. Перед самым
началом деления клеток отмечается удвоение содержания ДНК.
В период экспоненциальной и стационарной фаз роста отмечает-
ся постоянство содержания ДНК в расчете на клетку. Количество
РНК обычно считают суммарно для всех присутствующих РНК
в клетке. Как было отмечено выше, преобладающей здесь будет
рРНК. Количество РНК подвержено заметным колебаниям. В пе-
риод лаг-фазы происходит интенсивный синтез РНК После дости-
жения определенного уровня в клетке начинается синтез белка.
Характерной особенностью лаг-фазы является преобладание
синтеза РНК над синтезом белка. В экспоненциальной фазе роста
популяции наблюдается, как правило, прямая зависимость между
содержанием РНК в клетках, интенсивностью роста и скоростью
белкового синтеза. При этом синтез РНК и белка происходит бо-
лее или менее параллельно, постепенно замедляясь. Таким обра-
зом, количество РНК в клетке уменьшается при замедлении ско-
рости роста и соответственно скорости синтеза белка. Максималь-
ное количество РНК наблюдается в период наиболее интенсивного
роста или непосредствено ему предшествует. В период, когда
скорость роста постоянна, содержание РНК в расчете па одну
клетку также приблизительно постоянно
3. ХРОМАТИН
В клетках эукариотных микроорганизмов хромосома располо-
жена в ядре. Здесь ДНК входит в состав хроматина — структуры,
состоящей из примерно равных количеств ДНК, гистонов и кис-
лых хромосомных белков. Хроматин представляет собой препарат
очищенных интерфазпых хромосом Состоит хроматин из длинной
молекулы ДНК, накрученной на глобулы, сформированные из ги-
стонов. С каждой глобулой связано примерно 170—200 пар осно-
ваний, образующих в целом сферическую частицу, называемую
47
нуклеосомой Диаметр нуклеосом 12,5 нм. Нуклеосомы соедине-
ны мостиками, состоящими из 30—60 пар оснований ДНК Нук-
леосомная цепь напоминает нитку жемчуга или бус. Надмолеку-
лярная структура нуклеосом обусловлена физико-химическими
свойствами входящих в нее элементов: ДНК и гистонов
Гистоны. Представляют собой сильноосновные белки, экстра-
гируемые при pH 0,5—1,0 из очищенного хроматина. Положитель-
ный заряд гистонов обусловлен высоким содержанием в них трех
основных аминокислот: аргинина, лизина и гистидина, в боковых
цепях которых имеется вторая аминогруппа На их долю прихо-
дится почти 25 % всех аминокислот гистонов. Они состоят из един-
ственной полипептидной цепи и, следовательно, не имеют четвер-
тичной структуры. В настоящее время достоверно известно нали-
чие пяти различных гистонов, различающихся молекулярными
массами и преобладапием в молекулах той или иной основной
аминокислоты- В табл 1V-3 приведены важнейшие характеристики
1(Н1)
.•Udi
zi:(ll2K)
З(НЗ)
4(Н4)
F2b
гз
F2al
21 000
14Б00
13700
15300
Богатые остатками аргинина
гистонов, а также дана их номенклатура со всеми синонимами, ко-
торые можно встретить в литературе
Важной особенностью структуры гистонов является наличие
ацетилированных а-аминогрупп N-копцевых остатков серина и так-
же некоторых е-аминогрупп лизина. Общее число ацетвльных
групп может, видимо, составлять 2—4 на молекулу Уровень аце-
тилированности может меняться, когда гистон уже входит в со-
став хроматина При этом общее сродство гистона к системе ме-
няется незначительно, но сам акт ацетилирования гистонов мо-
жет рассматриваться как один из элементов системы регуляции
транскрипции Часть е-аминогрупп лизина метилирована. Степень
метилирования отдельных фракций может меняться. Значение ме-
тилирования для регуляции менее очевидно и пока мало изучено.
Особую роль играют в гистонах остатки серина По ОН-группам
серина может происходить фосфорилирование гистонов за счет
активности специального фермента гистонкиназы По-видимому,
фосфорилирование гистонов является одним из активно действую-
щих процессов, регулирующих транскрипцию.
Поскольку гистоны в ДНК составляют единую структуру, су-
щественно важное значение имеет наличие в их составе группи-
48
ровок, осуществляющих взаимодействие с молекулами ДНК Ве-
роятно, наибольший вклад осуществляют боковые аминогруппы
полипептидной цепи гистонов и фосфатные группы полинуклсотид-
ной цепи ДНК Определение первичной структуры многих гисто-
нов позволило получить информацию об асимметричном распре-
делении основных остатков в молекулах Участками, где преоб-
ладают остатки основных аминокислот в молекулах гистонов Н2В
и Н4, является N-копцевая область молекулы, для HI — С-конце-
вая, а для Н2А и НЗ остатки основных аминокислот локализованы
в обоих концах молекулы.
В молекулах некоторых гистонов, несмотря на уникальность
их первичных структур, был установлен ряд гомологичных участ-
ков в первичной структуре Отмечается, например, сходство N-
концсвых последовательностей в молекулах гистонов Н2В и Н4.
Кроме того, гистон Н4 имеет несколько внутренних гомологичных
последовательностей. Гистон НЗ, очевидно, имеет дупликацию пеп-
тида около N-конца. Гистоны Н2А, Н2В и Н4 способны взаимо-
действовать друг с другом, но сила их взаимодействия зависит от
гого, какие гистоны в нем участвуют. Наиболее прочная связь осу-
ществляется между гистонами НЗ и Н4 Гистоны Н2А и НЗ взаи-
модействуют слабее, и самые слабые связи образуются в парах
гистона Н2А с гистопом Н4 и гистона Н2В с гистоном НЗ. Соот-
ношение прочности связи между разными гистонами показано на
рис. IV-1 Сильное взаимодействие между гистонами НЗ и Н4 и
гистонами Н2А и Н2В привело к появлению гипотезы, что гисто-
новый остов субъединиц хроматина построен из тетрамера (НЗ:
Н4)2 и олигомеров (Н2А-Н2В)П. Соотношение по массе гистонов
и ДНК сохраняется более или мепее постоянным в клетках са-
мого различного происхождения, в то время как соотношение
массе ДНК и негистоновых белков или ДНК и РНК варьирует
в широких пределах. Рассчитано, что если каждый из гистонов
представлен в хроматине в эквимолярном количестве, то на каж-
дый участок молекулы ДНК длиной в 100 нуклеотидных пар в-
среднем приходится по одной молекуле гистона каждого типа.
Гистоны стабильно присутствуют в составе дезоксирибонуклеопро-
теида и распадаются с такой же скоростью, что и ДНК.
Нуклеосома. Изложенные выше свойства гистонов позволили
представить, а затем получить экспериментальные доказательства
о строении нуклеосомы (рис IV-2). По две молекулы каждого из
гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 взаимодействуют между собой цент-
ральными областями, образуя глобулярную структуру При этом
положительно заряженные концевые участки молекул гистонов
остаются свободными и способны связываться с ДНК Таким об-
разом, большая часть ДНК в нуклеосоме как бы навита снаружи
на белковое ядро. Видимо, ДНК обвивает белковое ядро нуклео-
сомы не плавно, а с изломами через каждые 20 пар нуклеотидов,
сохраняя в промежутках между ними почти нс нарушенную двуспи-
ральную конформацию. Наружное расположение ДНК имеет, ве-
роятно, большое функциональное значение. При таком располо-
экепии ДНК более доступна для взаимодействия с различными
.компонентами системы регуляции.
Относительно функции гистона Н1 существует несколько пред-
положений. Расположен он снаружи по отношению к нуклеосоме,
за связывание с ДНК отвечает его С-концеиой участок. Возможно,
•он участвует в упаковке нуклеосомных цепей в еще более слож-
ные структуры. Предполагают также, что гистон Н1 контролирует
растягивание и уплотнение хромосом в ходе митотического цикла.
Помимо белков, имеющих основный характер, в состав хрома-
тина входят негистоновые белки, где в их молекулах дикарбоно-
вые аминокислоты существенно преобладают над основными.
В отличие от гистонов в составе негистоновых белков имеется
триптофан. Они различаются не только содержанием разнообраз-
ных аминокислот, но и по изоэлектрическим точкам и молекуляр-
ным массам. Роль негистоновых белков в хромосоме скорее всего
связана с регуляцией работы генов посредством их связывания
со специфическими участками ДНК либо с какими-то определен-
ными транскриптами РНК Исключение могут составлять белки,
ответственные за энзиматические процессы в хроматине. Сюда мо-
гут быть для различных организмов отнесены ферменты, осуще-
ствляющие редупликацию, репарацию, транскрипцию и химиче-
скую модификацию ДНК, а также гистонов, например их фосфо-
рилирование, ацетилирование и метилирование.
50
При фракционировании хроматина одновременно выделяется
небольшое количество РНК. Часть ее представляет собой продукт
текущих процессов транскрипции генов. Однако здесь же имеют
место и регуляторные РНК. В частности, описана специфическая
РНК, обладающая сродством к гистонам и способностью активи-
зировать транскрипцию, связывая гистоны.
4. РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Рибосомальная РНК, как неоднократно упоминалось, состав-
ляет основную часть всех известных рибонуклеиновых кислот в
клетке. Ее количество в цитоплазме достигает 80—90 % всего ко-
личества клеточной РНК. Сосредоточена рРНК в рибосомах. Каж-
дая бактериальная рибосома содержит три молекулы рРНК, раз-
личающиеся по константе седиментации S и соответственно по
молекулярным массам и числу нуклеотидов. Так, 23S-pPHK име-
ет молекулярную массу 1,1 «106 и 3300 нуклеотидов в молекуле,
I6S-pPHK— соответственно 0,56-106 и 1700 нуклеотидов и 5S-
рРНК—4-Ю4 и 120 нуклеотидов. В клетках все три молекулы
рРНК существуют в форме моленул-предшественников большой
молекулярной массы (пре-рРНК), содержащих избыточные нук-
леотидные последовательности как с 3'-, так и с 5'-концов. У Е. co-
li, например, идентифицированы два предшественника 5S-PHK,
один из которых содержит 150 нуклеотидов, а другой —180.
Полагают, что в хромосоме Е. coli существует приблизительно
шесть участков, кодирующих рРНК Каждый из них представляет
собой одну транскрипционную единицу, содержащую по одному
гену для каждого из трех видов рРНК. У некоторых штаммов об-
разуется единый транскрипт с константой седиментации 30S. Он
расщепляется на более мелкие молекулы пре-рРНК под действи-
ем специфической эндонуклеазы (РНКаза III). В клетках эука-
риотвых микроорганизмов местом синтеза рРНК является ядрыш-
ко. Известно, что в ядре может быть одно или несколько ядры-
шек Рибосомы эукариотных клеток содержат четыре различных
типа молекул рРНК.
5000
2000
150
120
Молекулы 28S-, 18S- и 5,8S-pPHK образуются из высокомоле-
кулярной 45S (молекулярная масса 4,1 • 10е) пре-рРНК Этот пред-
шественник транскрибируется в центральной зоне ядрышка. При
выходе молекулы пре-рРНК в наружную область происходит фер-
ментативный процесс формирования молекул, входящих в состав
рибосом:
(0*9-10*) (0,65-10®)
Ген рибосомальной 5S-PHK у эукариотов не связан с геном
45S-PHK и локализован не в ядрышке
Транспортная РНК наиболее хорошо изучена из всех извест-
ных РНК микробных клеток Молекулы тРНК имеют константы
седиментации, близкие к 4S, с молекулярными массами порядка
25—26 тыс. и числом нуклеотидных остатков в пределах 70—80.
В настоящее время для многих тРНК эукариотов известна полная
нуклеотидная последовательность. В отличие от других рибонук-
леиновых кислот тРНК содержит много модифицированных нук-
леотидов (минорных оснований), в частности 2'-О-метилнуклеоти-
дов. Характерной особенностью тРНК является присутствие в мо-
лекулах тРНК псевдоуридина (ф), в котором рибозный остаток
присоединен не к азоту в 1-м положении, а к углероду — в 5-м:
Транспортная РНК способна специфически связывать амино-
кислоту, узнавать кодон в молекуле мРНК, транслировать его и
обеспечивать связывание аминокислот в растущей полипептидной
цепи В большинстве изученных клеток эукариотных организмов
идентифицировано до 56 различных тРНК, хотя протеиногенных
аминокислот всего 20. Следовательно, количество различных
тРНК скорее отражает число возможных кодонов, нежели коди-
руемых ими аминокислот. тРНК, связывающие одну и ту же ами-
нокислоту, носят название изоакцепторных.
Модель вторичной структуры тРНК традиционно представляют
в виде клеверного листа (рис IV-3) На З^-ОН-конце молекулы
расположен триплет фЦфЦфАон, к которому присоединяется ами-
нокислота, триплет отделен одним основанием от двухцепочечного
52
участка, называемого акцепторным стеблем Этот стебель содер-
жит 7 нуклеотидных пар, и в его состав входят 7 последних осно-
ваний 5'-конца молекулы Далее, если следовать в направлении
от 3'-конца к 5'-концу, находится Т-фЦ-петля, содержащая 7 нук-
леотидов и примыкающая к двухцепочечпому ТфЦ-стеблю, состоя-
щему из 5 пар оснований Затем имеется дополнительная ветвь,
длина которой варьирует, и за ним следует антикодоновый сте-
бель. Последний состоит из 5 пар оснований и заканчивается пет-
ечнеа моноцистропного предшествен-
ника тРНК
Рис IV-3 Обобщенная модель кто
ричной структуры тРНК' б'-копец
лей из 7 нуклеотидов, в центре которой находится антикодон —
три нуклеотида, «узнающие» кодон мРНК Далее в направлении
расположен четвертый участок дигидроурндиловый, ко-
торый содержит D стебель из 3—4 спаренных оснований и D-петлю
из 8—12 нуклеотидов. Согласно этой обобщенной модели вторич-
ной структуры тРНК приблизительно половина молекулы долж-
на быть двухцепочечной.
Формирование активной молекулы тРНК происходит в резуль-
тате процесса созревания, изображенного схематично на рис IV-4
Рост цепи происходит в направлении 5'-*-3z и завершается по-
сле присоединения нескольких нуклеотидов за З'-концевым нук-
леотидом зрелой молекулы. Так, в случае тирозиновой тРНК
Е coli присоединяются три нуклеотидных остатка. Затем проис-
ходит отщепление «лишних» нуклеотидов на З'-конце под дейст-
вием специфической экзонуклеазы. После этого в цитоплазме по-
средством фермента нуклеотидилтрансферазы происходит присо-
единение общего для всех тРНК терминального триплета
фЦфЦфАон. Лишние нуклеотиды на б'-конце предшественника
впоследствии специфически отщепляются РНКазой Р Удаленный
фрагмент далее деградирует до мононуклеотидов с участием экзо-
нуклеазы. После формирования молекулы тРНК, а в ряде случаев
и в ходе процессинга (созревания) может происходит энзимати-
ческая модификация входящих в состав молекулы оснований, в
результате чего и возникают упомянутые выше минорные осно-
вания
Известно, что матричная, информационная, РНК (мРНК) вы-
полняет важнейшую функцию в передаче информации о первич-
ной структуре синтезируемых клеткой белков. Транскрибируемая
в бактериальной (прокариотной) клетке мРНК сразу становится
доступной для рибосом, которые присоединяются к ней и начина-
ют процесс трансляции, продвигаясь по матрице от 5'-> к З'-концу.
Таким образом, освобождающий б'-конец мРНК может связывать-
ся с рибосомами, которые начинают трансляцию, в то время как
сама матрица находится еще в процессе синтеза. Присоединение
к мРНК новых рибосом происходит через интервалы примерно в
80 нуклеотидных остатков. Взаимосвязь транскрипции и трансля-
ции у бактерий не ограничивается лишь морфологическим объеди-
нением этих процессов. Возможно, что движение РНК-полимера-
зы вдоль ДНК, а следовательно, и скорость транскрипции, зави-
сят от присоединения рибосом к синтезирующейся мРНК- Срав-
нение скоростей включения аминокислот в белки и транскрипции
мРНК у Е. coli in vivo показывает, что скорость движения рибо-
сом в трансляции и скорость движения РНК-полимеразы в транс-
крипции одинаковы. Этот факт является предпосылкой гипотезы,
согласно которой у растущей культуры бактерий транскрипция и
трансляция— два сопряженных процесса Полагают также, что
присоединение рибосом к еще не завершенной молекуле мРНК
способствует отделению вновь синтезированной РНК от ДНК.
Структура генома у эуцариотных организмов отличается от
структуры генома прокариотов Это обстоятельство находит свое
отражение и в реализации механизмов транскрипции и трансляции
мРНК в формировании молекул предшественника информацион-
ной РНК и молекулы, обеспечивающей процесс трансляции.
В эукариотных клетках концы молекул многих мРНК прикрыты
специфическими кэп структурами, имеющими 7-метилгуанозин в
виде биполярного иона. Формирование кэп-структуры, или конце-
вого «колпачка», происходит следующим образом. Известно, что
на 5г-конце РНК-транскрипта первоначально находится трифос-
фатная группа, поскольку при инициации транскрипции затравкой
служит нуклеозидтрифосфат. Концевая фосфатная группа может
у него отщепляться, после чего дифосфат взаимодействует с ГТФ.
В результате происходи! метилирование азота, находящегося в
7-м положении пуринового основания, за счет S-аденозилметиони-
иа при помощи соответствующей метилазы. В общем виде струк-
туру кэпа записывают так; м7Г(5,)ффф(5/)ХмфУм, где Хи У лю-
бые метилированные азотистые основания, а м—метильная груп-
па. Метилированию подвергается также 2'-ОН остаток рибозы па
б'-конце:
функций кэпа: одпа из них — предо-
Предполагают несколько ______..... _ ----------- -г-
хранение мРНК от деградации с б'-коица, другая — повышение эф-
фективности трансляции матриц за счет более быстрого и прочного
связывания содержащих кэп мРНК с рибосомами. На одном из
этапов процессинга, т. е. формирования функционирующей моле-
кулы мРНК, к З'-концу пре-мРНК -присоединяется молекула по-
лиадениловой кислоты. Размер молекулы может сильно варьиро-
вать: число нуклеотидов составляет 30—250. Полиаденилатный
концевой фрагмент выполняет, как полагают, ряд функций- 1) за-
щита собственно мРНК от действия нуклеаз, которая осуществля-
ется совместно со специализированными белками, присоединяю-
щимися к поли (А); 2) определенное влияние на процесс выхода
мРНК из ядра, 3) обеспечение строго определенного числа цик-
лов трансляции данной мРНК
Каким образом представляется реализация третьего из пере-
численных предположений о функции поли (А)? Предполагается,
что после каждого акта трансляции, когда мРНК покидает рибо-
сому, от ее З'-конца отщепляется один или несколько нуклеотидов.
Состояние, когда все остатки адениловой кислоты уже израсхо-
дованы, служит клетке сигналом для разрушения мРНК- Возмож-
но, что лишенная поли (А) мРНК более доступна действию внут-
риклеточных рибонуклеаз. К полиадениловой нити и некоторым
другим участкам РНК присоединяются специализированные ядер-
ныс белки, образуя так называемые ядерные информосомы. Все
они или большая их часть относятся к так называемым информо-
мерам — глобулярным образованиям массой около 1-Ю6 дальтон,
состоящим в свою очередь целиком или преимуществено из нден-
тичных белковых молекул с молекулярной массой 40 тыс Белок
этот — информации отличен от гистонов, ч нем преобладают кис
лые аминокислоты.
Полагают, что информомеры способствуют отделению синтези
руемой РНК от ДНК-матрицы и транспортировке до мембраны.
Часть ядерных белков-носителей оставляет мРНК в момент ее пе-
рехода в цитоплазму, и мРНК вступает в комплекс с транспортны-
ми белками цитоплазмы, образуя цитоплазматические ипформосо-
ДНК—
мРНК. Нуклеотидные последователь-
ности интронов А и В в мРНК от-
мы Последние содержат мРНК и белок в соотношении 1.3-=-1 - 4.
Возможно, именно в форме информосом накапливается в цито-
плазме нереализованная, но транскрибированная информация.
В формировании молекул рибонуклеиновых кислот в эукарио-
тических клетках существенное место занимает процесс их созре-
вания, или процессинг. Наибольшее число экспериментальных дан-
ных было получено с мРНК Одним из главных выводов, получен-
ных в результате изучения механизма процессинга мРНК, был
вывод о характере расположения генетической информации в мо-
лекуле ДНК. Ранее неоднократно отмечался факт значительного
избытка генетического материала в ДНК по сравнению с реально
получаемой информацией. В настоящее время предложена модель,
согласно которой молекула ДНК состоит из чередующихся участ-
ков, называемых экзонами и интронами (рис. 1V-5)
Из приведенного рисунка следует, что в транслируемой моле-
куле мРНК реально присутствуют нуклеотидные последователь-
ности, комплементарные трем экзонам Области ДНК, соответст-
вующие интронам А и В, в транслируемой молекуле мРНК не об-
наруживаются.
—экзон 1 - ааауа|аг|гу|гагцц—интрон А—
—экзон 2—А1'ЦУЦАГ|ГУАЦАГА—нитрон Б—
—экзон 3—ЦЦУГЦЦА|ГУААГУ У—интрон Д—
—экон 4—ЛЦААЛУГ|ГУААГГУ—интрон Е—
—экзон 5—ГАЦУГАГ|ГУАУАУТ—интрон Л—
—экзон 6— УГАГЦАГ|ГУАУГГЦ—интрон М—
В настоящее время получены экспериментальные доказатель-
ства механизма процессинга. Первоначально внутри ядра проис-
ходит осуществляемый РНК-волимеразой энзиматический процесс
транскрипции как интронных, так и экзонных участков в той по-
следовательности, в которой они расположены на молекуле ДНК
Из образовавшейся молекулы предшественника мРНК (пре-
мРНК) происходит ферментативное удаление интронных участков,
а экзонные соединяются вместе в соответствующей последователь-
ности. Такой механизм формирования мРНК получил название
сплайсинг. После этого вновь собранная пить мРПК переходит из
•ядра в цитоплазму, где и осуществляется синтез белка Предпо-
лагается, что сходный механизм функционирует при созревании
молекулы рРНК и тРНК, однако в каждой из типов РНК разме-
ры интронных областей могут быть различны. Детали энзиматиче-
ских процессов, имеющих место в ходе сплайсинга, в настоящее
время пристально изучаются, равно как и энергетические харак-
теристики процесса
При изучении механизма действия ферментов при сплайсинге
существенно важным является вопрос об узнавании места разры-
ва. Очевидно, для ответа на него должна быть расшифрована по-
следовательность нуклеотидов в пограничных экзон интронных
•областях. Оказалось, что в областях, близких к началу и концу
интрона, имеются повторяющиеся нуклеотидные последователь-
ности (рис 1V-6)
В первичном транскрипте мРНК (пре-мРНК) интронная об-
ласть начинается с дуплета ГУ н заканчивается АГ Наличие боль-
шого числа повторяющихся последовательностей в ДНК и соот
ветствепно пре-мРНК не позволяет однозначно ответить на воп-
рос о возможности фермента детектировать место разрыва Пред-
полагается, что определенная последовательность нуклеотидов в
сочетании с вторичной и третичной структурами участков, подвср-
- АУУАЦ|АЛгу|угУУ— 3™ 2—
УА«’ЦАг|УГУГГЦ-экэо1| 3—
—УУУАЦАГ|ГААУАЦ—экзон 4—
—ЦУУАААГ|ГААУУЦ—экзон 5—
—УЦУЦЦАГ|ЦААГАА—экзон 6—
г |
ЦУУГЦАГ|цУУГАГ—экзон 7—
ся с ГУ и заканчивасгся АГ
гающихся ферментативному расщеплению в пограничной экзон-
интронной области, обеспечивают необходимую точность.
Феномен сплайсинга имеет место только у эукариотических
клеток. Он обусловлен наличием ядерной мембраны и разобщени-
ем по времени и месту процессов транскрипции и трансляции, в.
отличие от прокариотных организмов. Очевидно, подобный процесс
должен происходить в митохондриях в ходе реализации инфор-
мации, кодируемой митохондриальной ДНК.
5. ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ДНК
Плазмиды. Бактериальные клетки могут содержать кроме хро-
мосомы и другие генетические элементы, дополняющие основной
наследственный аппарат клетки К их числу относятся в первую-
очередь плазмиды и эписомы. Плазмидой называется любой ге-
нетический элемент, способный стабильно существовать в авто-
номном, т. е. внехромосомном, состоянии. Эписомой называют
плазмиду, способную объединиться с хромосомой. Вполне возмож-
но, что некоторые плазмиды являются на деле эписомами, хотя
явные доказательства этого отсутствуют. Процесс объединения
плазмид с хромосомой называется включением в хромосому или
интеграцией.
Смысл существования плазмид состоит в том, что для популя-
ции бактерий выгодно существование некоторых наследственных
элементов в форме подвижных, легко передаваемых структур. Они
кодируют биосинтез систем, которые относительно редко бывают
необходимы бактериям, но отсутствие Которых может внезапно
оказаться роковым для популяции в целом. Клетку освобождают
от плазмид, выращивая культуру в присутствии профлавина, ами-
ноакридина или этидиумбромида. Интерес к бактериальным плаз-
мидам возрос в последние годы в связи с тем, что они стали ве-
дущими объектами в работах по генетической инженерии. Пер-
спективность использования плазмид в генетической инженерии
определяется следующими причинами
1) с помощью специфических ферментов эндонуклеаз рестрик-
ции (рестриктаз) может быть сконструирован новый геном клетки;
2) плазмиды могут передаваться в клетки желательных реци-
пиентов при конъюгации, трансформации и трансдукции;
3) с помощью плазм нд, находящихся в клетке в большом ко-
личестве копий, можно во много раз увеличить число необходимых
генов и добиться эффекта сверхсинтеза целевого продукта био-
синтеза.
Все известные бактериальные плазмиды представляют собой
кольцевые двунитевые молекулы ДНК. По их молекулярным мас-
сам и количеству копий в клетке все ныне известные плазмиды
можно разделить на две большие группы- 1) крупные плазмиды
с молекулярной массой 30—100-106, как правило, трансмиссивные,
обладающие способностью передаваться из клетки в клетку конъ-
югационным путем, которые обычно находятся в клетке в неболь-
Б8
алом количестве копий, — по одной-две на хромосому; 2) малые
нетрансмиссивные плазмиды с молекулярной массой (1-г-10) 10е,
число которых составляет 10—15 и более копий на хромосому.
Репликация бактериальных хромосом происходит, по-видимому,
благодаря активности полимераз клеток хозяина. Полимеразы, ко-
дируемые самими плазмидами, пока не обнаружены. Вопрос об
использовании плазмид как инструмента в генетической инжене-
рии будет рассмотрен ниже. Здесь необходимо остановиться на
плазмидной ДНК в качестве носителя информации и регулятор-
ных функций в клетках различных микроорганизмов. До настоя-
щего времени нет четких данных о конкретной функции плазмид
в синтезе вторичных метаболитов Однако имеются примеры кор-
реляции между их синтезом и содержанием плазмид в клетках
продуцента. Регуляторную функцию выполняют, видимо, плазми-
ды в культурах Streptomyces nmosus и Streptomyces venezuelae,
синтезирующие соответственно антибиотики окснтетрациклин и
хлорамфеникол. Частично или полностью обусловлен плазмидами
синтез антибиотика метиленомицина А (2-метиленциклопептан-З-
©Н-4,5-ЭПОКСИ-4,5-диметил-1 -карбоновая кислота) одним из штам-
мов Streptomyces coelicolor и антибиотика низина, представляю-
щего собой линейный полипептид, состоящий из 34 остатков ами-
нокислот и синтезируемого бактериальной культурой Streptococcus
В геноме плазмид может быть закодирована информация о
ферментах, осуществляющих модификацию ДНК и рестрикцию.
Так, в клетках одного из штаммов Е coli обнаружена плазмида,
контролирующая метилирование ДНК по остаткам цитозина.
В данном случае в плазмидной ДНК, вероятно, содержится ин-
формация о специфической метилазе, осуществляющей метилиро-
вание хозяйской и фаговой ДНК. Описаны плазмиды, содержа-
щиеся в клетках Е. coli и кодирующие синтез эндонуклеазы ре-
стрикции EcoRI.
Наибольшее количество различных по свойствам плазмид вы-
явлено у многочисленных представителей рода Pseudomonas. Ха-
рактерно, что они содержат информацию о синтезе ферментов,
осуществляющих деградацию некоторых ароматических соедине-
ний. Плазмиды различных штаммов Pseudomonas putida содержат
информацию о ферментах, окисляющих салициловую кислоту до
пировиноградной кислоты, камфору — до изомасляпой, нафтали-
на—до катехола. Плазмиды культуры Pseudomonas (putida) аг-
villa mt-2 участвуют в катаболизме толуола и ксилола, а плаз-
мида из культуры Pseudomonas oleovarans—н-октана до октано-
вой кислоты. Широко известна роль плазмцд в возникновении ле-
карственной устойчивости. Идентифицированы плазмиды, которые
несут информацию об аденилировании или фосфорилировании
молекулы стрептомицина, вызывающие его инактивацию Плаз-
мидное происхождение имеет также р-лактамаза (пенициллиназа),
разрушающая р-лактамную структуру молекулы пенициллина и
вызывающая инактивацию антибиотика
Митохондриальная ДНК (мтДНК).
«скул ДНК. Они могут быть различными по форме, чаще — кольцевые моле-
ляется иетрас.чируемой Такими продуктами являются рРНК и тРНК,
примерно 20 тРНК и около
Репликация мтДНК
ной ДНК в мтДНК
6. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНЖЕНЕРИИ
Огромные успехи п области молекулярной генетики способст-
вовали возникновению нового научного направления — генетиче-
ской инженерии, которая открыла возможности создания искусст-
венных генетических структур с новыми наследственными свойст-
вами По определению акад. А. А. Баева, «генетическая инжене-
рия— ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности и
способы создания лабораторным путем генетических структур и
наследственно измененных организмов»*. Ее содержание состав-
ляет система экспериментальных приемов, позволяющих конструи-
ровать в лаборатории искусственные генетические структуры
Основные процедуры генетической инженерии сводятся к то-
• «Природа», 1976, № 1, с. 8—17.
ео
му, что из набора полученных под воздействием ферментов фраг-
ментов ДНК, содержащих необходимый ген, in vitro собирают но-
вую генетическую структуру—рекомбинантную ДНК и затем
вводят ее в микробную клетку Как известно, под рекомбинантны-
ми ДНК понимают структуры, которые имеют признаки, ранее
отсутствовавшие у родительских организмов. Новая генетическая
информация приводит к изменению обмена веществ клетки, и в
результате получают либо значительное количество введенных
генов, либо продуктов синтеза, которые они программируют Про-
ведение таких операций вызвано тем, что гибридизация у высших
организмов, как правило, осуществляется только между близко-
родственными формами У бактерий гибридизация посредством
передачи плазмид и сексдукции, т. е. переноса генов из хромосом"
бактерий, в некоторых случаях не ограничена рамками даже круп-
ных систематических групп. Тем не менее сочетать в одной клетке
генетический материал из разных видов до последнего времени
было весьма трудно.
При создании из чужеродных фрагментов ДНК новых, способ-
ных к репликации молекул ДНК методом генетической инженерии
необходимо располагать методами выделения молекул ДНК из
различных организмов и получения фрагментов выделенной ДНК,
несущих необходимую генетическую информацию. Нужно уметь
«сшнть» ДНК различного происхождения в единую молекулу,
т. е. получить гибридную молекулу ДНК- Необходимо знать спо-
соб введения гибридной молекулы ДНК в реципиентную клетку.
Манипуляции с генами стали возможными после того, как в рас-
поряжении исследователей оказались пригодные для работы с ге-
нетическим материалом ферменты. "
Комплекс методов, применяемых для встраивания и закрепле-
ния нового гена в бактериях, получил название клонирования.
В данном случае это означает выделение необходимой специфи-
ческой последовательности ДНК в одном организме, который за-
тем размножается, образуя популяцию идентичных потомков,
т е. клон.
Для получения рекомбинантных молекул, таким образом, не-
обходимо иметь фрагмент ДНК, несущий необходимый ген, и
способную к репликации молекулу ДНК, в которую встраивается
названный выше фрагмент ДНК с геном Молекулу ДИК, в кото
рую встраивается ген, называют вектором. Векторы являются
специфическими в отношении клетки-хозяина и способными к
репликации структуры, которые могут включать в себя те или
иные гены и переносить их в другие клетки В качестве векторов
наиболее часто используют плазмиды или вирусы Для получения
фрагмента ДНК, способного встроиться в вектор, и вектора, спо-
собного к гибридизации, необходима их обработка специфиче-
скими ферментами эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами).
Рестрикционные эндонуклеазы расщепляют молекулы двуспи-
ралыюй ДНК в отличие от других нуклеаз в местах, характери-
зующихся специфической последовательностью нуклеотидов. Фер-
ni
мент «узнает», как правило, 4—8 пар нуклеотидов и разрезает
молекулу так, что появляются одноцепочечные концы всегда с
одной и той же последовательностью Одной из наиболее извест-
ных является рестриктаза Е. coli (EcoRI). Эта эндонуклеаза рас-
щепляет молекулу ДНК, образуя однонитевые «липкие» концы
(рис. IV-7).
между гуаикиом
(Г) и аденином (А), образуя липкие
При помощи рестриктаз получают фрагменты ДНК, содержа-
щие, в частности, необходимые для клонирования последователь-
ности, а также вектор, имеющий липкие концы. Количество фраг-
ментов молекулы ДНК, возникающих при действии рестриктазы,
зависит от того, сколько в этой молекуле участков, специфических
для данной рестриктазы. Для конструирования гибридных моле-
кул предпочтительны векторы, которые имеют только одну спе-
цифическую последовательность, узнаваемую рестриктазой. В этом
случае происходит только один разрыв. После этого в место раз-
рыва можно встроить фрагмент ДНК, имеющий комплементарные
липкие концы па одпоцепочечном участке. «Сшивка» липких кон-
цов осуществляется полинуклеотидлигазами (лигазами). Послед-
ние катализируют образование фосфодиэфирной связи между сво-
-бодным б'-фосфатным концом олиго- или полинуклеотида и З'-ОН-
груипой второго соседнего олиго или полинуклеотида (рис. IV-8).
По-видимому, реакция проходит с обязательным образованием
промежуточного комплекса лигазы с АМФ. В клетках Е. coli 11
В. subtilis этот комплекс образуется путем взаимодействия лига-
зы и НАД, а в клетках млекопитающих и в клетках, зараженных
•фагами, лигаза взаимодействует с АТФ. Существенно расшири-
лись в последнее время технические возможности соединения
ДНК-вектор с ДНК-геном. Так, оказалось, что полинуклеотидли-
газа в определенных условиях способна соединять фрагменты ДНК,
не имеющие липких концов (соединения «тупыми» концами, blunt
Jigation). Применяют так называемые адаптеры, фрагменты ДНК
природного или синтетического происхождения, содержащие спе-
цифическую для какой-либо рестриктазы нуклеотидную последо-
вательность. Такие фрагменты присоединяются к другим фрагмен-
там ДНК, образук искусственные липкие концы нужной специ-
фичности.
«62
Сконструированная рекомбинантная молекула ДНК обычно не
проходит через клеточную степку бактерий. Однако некоторые
соединения, например раствор хлорида кальция, делают клетку
проницаемой. После смешивания обработанных клеток с ДНК.
гибридной плазмиды молекулы проникают в некоторые бактери-
альные клетки. После специальной обработки, например антибио-
тиками, остаются колонии, содержащие одинаковые копии новой
последовательности в рекомбинантной плазмиде.
НАД
Рис. IV-8 Предполагаемая схема действия ДНК-лигаз
Пока мы не можем рассчитывать на включение искусственно
созданных или изолированных из клетки структур или фрагментов
ДНК в хромосому клетки-хозяина, приходится пользоваться век-
торами Векторы являются теми компонентами рекомбинантных
ДНК, которые обеспечивают их репликацию и экспрессию. Боль-
шая часть используемых сейчас векторов создается на основе бак-
териальных плазмид, фагов и вирусов животных. Они сообщают-
гибридной молекуле способность воспроизводиться в бактериаль-
ной клетке независимо от хромосомы. Вместе с вектором прони-
кает в бактериальную клетку связанная с ним чужеродная ДНК,
потому некоторые американские исследователи называют вектор'
«повозкой» (vehicle). Наиболее часто в качестве векторов исполь-
зуют плазмиды Как следует из изложенного выше, вновь сконст-
руированная рекомбинантная кольцевая ДНК должна сохранять
репликативные свойства исходной плазмиды. Свойство репликона
имеет решающее значение для использования вектора в генети-
ческих манипуляциях, так как оно обеспечивает репликацию ре-
63?
комбинантных ДНК в бактерии. Плазмиды и фаги используют реп-
ликативную систему клетки хозяина, и лишь немногие белки, не-
обходимые для репликации, кодируются собственным геном. Кро-
ме того, вектор должен иметь генетический маркер, позволяющий
.вести отбор рекомбинантных клонов.
Самым простым вектором можно считать плазмиду CoIEI. Это
образованное ДНК колечко имеет небольшую молекулярную мас-
су— 4,2-106 дальтон Она рас
(ECoRI) только в одном месте.
эту плазмиду, присутствует до
20—25 ее копий Воспроизведе-
ние данной плазмиды в клетке
протекает автономно от хромо-
сомы хозяина В присутствии
антибиотика хлорамфеникола,
когда включается биосинтез
хромосомы кишечной палочки,
репликация плазмиды CoIEI
продолжается в течение при-
близительно 12—16 ч, и число
копий на клетку достигает I
3 тыс Все это делает плаз-
миду CoIEI весьма перспектив-
ным вектором.
Общая схема получения ре-
комбинантных молекул показа
на на рис. IV.9
Полученная гибридная мо-
лекула благодаря вектору
представляет собой репликон.
Оказавшись внутри бактери-
альной клетки, она начинает
реплицироваться, в результате
может быть получена гибрид-
ная ДНК или продукты, ею
образованные, например белки,
в том числе ферменты, в препа-
ративных количествах. Сверх-
продукция у бактерий, т. е. по-
вышенный синтез какого-либо компонента, может быть достигнута
.либо повышением дозы гена, либо более эффективной экспрессией
гена. При генетических манипуляциях сверхпродуктивность может
быть достигнута любым из этих путей. Повышение дозы гена до-
стигается использованием многокопийных плазмидных векторов —
потомков плазмиды CoIEI или векторов Х-фага.
Из числа реальных практических достижений генетической
инженерии может быть названо конструирование генома, обеспе-
64
чивающего микробиологический синтез инсулина, интерферона,
гормона роста, аминокислоты треонина и т д Перспективы гене-
тической инженерии практически не имеют ограничений
7. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ ДЛЯ СВЕРХСИНТЕЗА
ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
Современная промышленность микробиологического синтеза
работает на специально полученных культурах, обладающих спо-
собностью к сверхсинтезу целевого продукта. Обычно такие куль-
туры получают в результате специальных манипуляций, направ-
ленных на изменение механизмов регуляции. Клетки микроорга-
низмов обрабатывают мутагенами, представляющими собой хими-
ческие вещества или излучения, например ультрафиолетовый свет,
гамма-лучи. Затем отбирают мутанты с нужными свойствами Му-
танты можно рассматривать как новые организмы, отличные от
родительских исходных культур. В результате мутации наступают
изменения, передающиеся по наследству.
Основная трудность получения мутантов-сверхсинтетиков за-
ключается в том, что мутагены действуют на наследственную мо-
лекулу ДНК неспецифически. С равной вероятностью в результате
действия мутагенов может быть поврежден любой ген. Селекцио-
нер должен отобрать штамм, у которого большинство генов, обес-
печивающих нормальное функционирование клетки, не затронуто
мутациями, а повреждены лишь несколько генов, ответственных
за синтез определенного метаболита или метаболитов. И. П. Аш-
марин предлагает классифицировать мутагены по характеру их
действия на молекулу ДНК:
1) факторы, способные воздействовать на покоящуюся нере-
плипируюшую ДНК, репликация может быть необходима лишь
для закрепления мутации По механизму действия это модифика-
торы оснований ДНК, под действием которых не происходит уда-
ления оснований и образования поперечных сшивок цепей ДНК.
В основном, к их числу относятся химические вещества, азотистая
кислота и некоторые другие окислители и восстановители, гидро-
ксиламин;
2) факторы, действующие только при репликации ДНК- К ним
в первую очередь должны быть отнесены аналоги оснований ДНК,
а также агенты, вызывающие при репликации вставку или исклю-
чение пары оснований. Из химических соединений таким агентом
может быть назван акридин и вещества близкой к нему структуры;
3) факторы комбинированного действия — ингибиторы систем
репарации ДНК, повышающие частоту спонтанных мутаций, а
именно излучения, вызывающие образование делеций, а для неко-
торых видов излучений—хромосомных перестроек. К их числу от-
носятся производные нитрозомочевины и нитрозогуанидина. Акти-
вацию лизосомальных нуклеаз и образование вируспецифичных
энзимов, повреждающих ДНК и искажающих синтез оснований,
могут вызывать некоторые вирусы.
65
В обычных условиях существования организма возникают так
называемые спонтанные мутации Они вызываются главным об-
разом ошибками при редупликации ДНК. Одним из наиболее изу-
ченных механизмов воздействия на молекулу ДНК является дей-
ствие азотистой кислоты Азотистая кислота вызывает окислитель-
ное дезаминирование оснований в ДНК:
RNH2 + HNOr->-R—ОН+ N2+ Н2О.
В результате реакций аденин превращается в гипоксантин, ци-
тозин — в урацил, гуанин — в ксантин.
При репликации ДНК, обработанной HNO2, гипоксантин об-
разует лару с цитозином, и далее формируется пара ГЦ, т. е. про-
исходит замена АТ—>-ГЦ. Превращение цитозина в урацил приво-
дит к замене ГЦ->АТ.
Сказанное выше целесообразно рассмотреть на конкретном при-
мере. Триплет ТАЦ, кодирующий синтез метионина, под действи-
ем азотистой кислоты превращается в ТГкЦ, который при после-
дующей редупликации достраивает комплементарный триплет
АЦГ (рис IV-I0) Однако на данном этапе происходит лишь пре-
мутация При дальнейшем рас-
хождении цепей двойной спи-
рали триплет АЦГ естественно
спаривается с ТГЦ. Таким об-
разом, вместо исходного три-
плета ТАЦ в молекуле ДНК
возникает триплет ТГЦ, коди-
рующий треонин Иными сло-
вами, теперь вместо метионина
в молекулу белка будет вклю-
чаться треонин
Изменение последовательно-
сти аминокислот в структуре
белка может вести к измене-
нию его третичной структуры,
что в свою очередь может при-
вести к серьезным нарушениям
в системе метаболической ре-
к сверхсинтезу некоторых про-
дуктов обмана веществ
S СВЯЗЬ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ ДНК и СИСТЕМАТИКОЙ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Известно, что специфичность биологических макромолекул, в
частности нуклеиновых кислот, может иметь несколько различных
характеристик. Одной из первых может быть названа первичная
структура, т. е. последовательность расположения нуклеотидов в
молекуле. Установление первичной структуры нуклеиновых кис-
лот—достаточно сложная задача, выполнение которой мод силу
высокоспециализированным современным лабораториям. Далее
может быть названа третичная структура макромолекулы. Однако
ее успешная расшифровка может быть осуществлена лишь при
наличии надежной информации о первичной структуре. Пользуясь
иммунологическими методами, удается определить видоспецифич-
ность белков и использовать это свойство для систематики, в част-
ности микроорганизмов
В начале 50-х годов Э. Чаргафф показал, что дезоксирибонук-
леиновые кислоты, как и белки, видоспецифичны В результате
многочисленных анализов очищенной ДНК из различных, дале-
ких, в частности по систематическому положению, объектов им
было сформулировано несколько важнейших положений, извест-
ных ныне как правила Чаргаффа. Эти правила сегодня положены
в основу одного из критериев для систематики микроорганизмов.
Суть их в том, что в молекуле ДНК всегда наблюдаются следую-
щие количественные соотношения
1) молярные доли пуриновых и ш пиримидиновых нуклеотидов
равны, т е. (А+Г)/(Т+Ц) = 1,
2) содержание аденина и тимина одинаково, т. е. А=Т или
А/Т=1;
3) количество гуанина и цитозина одинаково, т е. Г=Ц или
Г/Ц=1;
4) содержание 6-аминогрупп равно содержанию 6-кетогрупп:
(Г+Т)/(А+Ц) = 1;
5) количество Г+Ц и А+Т может варьировать в довольно зна-
чительных пределах. В связи с этим для ДНК характерна воз-
можность изменения состава и последовательности расположения
оснований в молекулах различных организмов
Из последнего пункта правил вытекает важный вывод о том,
что процент пар гуанин — цитозин, изменяющийся в процессе эво-
люции, видоспецифичен и может иметь таксономическое значение.
Следует, однако, отметить, что абсолютное подобие нуклеотидного
состава ДНК является необходимым, но отнюдь не достаточным
условием действительного генетического родства между парами
организмов. Тем не менее метод сыграл большую роль в пересмот-
ре вопроса о принадлежности некоторых микроорганизмов к тем
или иным таксономическим группам. В настоящее время он явля-
ется одним из обязательных критериев при определении система-
тического положения микроорганизмов. В качестве примера ниже
представлено содержание в ДНК различных микроорганизмов
суммы Г+Ц в молярных процентах Иногда в качестве показателя
специфичности ДНК используют отношенче (Г+Ц)/(А+Т).
Candida lipol'yti.
Saceharoniyces carlsbergensis
>актерва '
Azotebacter agilis
Lactobacillus casei
Micrococcus lysodeikticus
Propionibacterium schermanii
Ad. ravens
Нуклеотидный состав ДНК—признак крупномасштабный. Мо-
гут встречаться случайные совпадения состава ДНК у далеко от-
стоящих родов, поэтому для решения более тонких вопросов в
филогенетических отношениях между организмами применяют ме-
тод молекулярной гибридизации ДНК. Суть этого метода состоит
в том, что в обычную хроматографическую колонку помещают
денатурированную ДНК, включенную в агаровый гель, а затем
через колонку пропускают раствор денатурированной ДНК другого
вида (рис IV-1I). От степени близости отдельных видов будет
зависеть комплементарное взаимодействие двух различных цепей
ДНК в единую «гибридную» молекулу ДНК. Совершенно ясно,
что чем ближе виды, тем у них больше одинаковых последова-
тельностей и, значит, тем больше они будут взаимодействовать с
образованием нового гибридного комплекса. Если у одного из ви-
дов ДНК будет мечена каким-либо изотопом, то по степени вклю-
чения изотопа в гибридный комплекс можно делать количествен-
68
ные заключения о степени взаимодействия цепочек ДНК двух
различных видов. Таким образом, с помощью этого метода можно
устанавливать гомологию (комплементарное сходство) в нуклео-
тидной последовательности в цепях ДНК у различных видов.
Очень высокой является степень гомологичности первичных струк-
тур ДНК у близкородственных видов. Чем дальше отстоит один
вид от другого, тем процент гомологий становится меньше. Так,
ДНК бактерий, как правило, почти не гибридизуется с ДНК из
высших организмов и даже с ДНК из высших организмов и даже
с ДНК дрожжей
ГЛАВА V. УГЛЕВОДЫ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК
1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ
В микробных клетках углеводы представлены в основном по-
лисахаридами. Они выполняют две основные функции- одна из
них структурная, другая — сохранение запасных питательных ре-
сурсов. Как было показано выше, ряд полисахаридов принимает
участие в формировании структуры клеточных стенок Из поли-
сахаридов, создающих резерв углеводов, может быть назван глико-
ген, синтезируемый дрожжами. Здесь же следует упомянуть вне-
клеточные полисахариды, в частности образующие капсулы, на-
пример декстран. В отличие от молекул нуклеиновых кислот мо-
лекулы полисахаридов не несут никакой информации.
Полисахариды построены либо из одинаковых структурных
единиц (моносахаридов), либо из чередующихся блоков этих еди-
ниц двух или более (реже — больше четырех) типов. Наличие не-
скольких гидроксильных групп в молекулах моносахаридов созда-
ет возможность формирования большого числа различных струк-
тур. Так, теоретически из двух молекул гексоз может быть полу-
чено 56 дисахаридов. Кроме того, между моносахаридами могут
быть а- или p-связи, что также увеличивает число возможных
структур полимеров. Правда, в природе не встречается столь
большое разнообразие в структуре одной молекулы полисахари-
дов. Большинство микробных полисахаридов построены из одного
вида моносахаридов и имеют одну и ту же межмолекулярную
связь на протяжении всей молекулы. Имеются полисахариды, со-
стоящие из повторяющихся олигосахаридных звеньев. В таких
случаях достаточно установить структуру повторяющегося участ-
ка, доказать его регулярную повторяемость, чтобы представить
структуру полисахарида в целом. Некоторые затруднения в уста-
новлении структуры могут возникнуть в тех случаях, когда поли-
сахариды имеют точки ветвления, как, например, в амилопектине
Полисахаридам свойственна высокая степень конформацион-
ной подвижности как в мономерном звене, так и в полимерной
цени в целом Для полисахаридов характерна большая гидрофиль-
ность молекул. Наличие в углеводах карбоксильных групп, ами-
ногрупп и др. позволяет полисахаридам вступать в связи с други-
ми структурами или компонентами клетки, а также иметь четко
дифференцированные элсктроиодонорные характеристики отдель-
ных участков молекул.
Особый интерес представляют полисахариды и их комплексы
с другими полимерами клетки для медицинских микробиологов
при постановке и изучении иммунологических реакций. Структура
и особенности строения некоторых полисахаридов были рассмот-
рены ранее в гл. I. Мы коснемся здесь других полисахаридов,
имеющих иную локализацию.
Резервный полисахарид дрожжевых клеток — гликоген пред-
ставляет собой разветвленный полимер, напоминающий амило-
пектин. В отличие от последнего молекула гликогена более ком-
пактна и имеет большую молекулярную массу — до 1 млн. Струк-
турную основу гликогена составляют остатки D-глюкозы, соеди-
ния— а (!->6)-связями. Точки ветвления располагаются в моле-
куле в среднем через каждые 8—10 остатков.
Некоторые непатогенные бактериальные культуры при росте
на средах, содержащих сахарозу, образуют внеклеточные поли-
фруктозиды, называемые леванами. Основу структуры леванов
составляют метоксилироваиные остатки фруктофуранозы:
Слизистые полисахариды, подобные леванам и декстранам, об-
разуют также некоторые почвенные бактерии По-видимому, эти
полимеры выполняют определенную роль в создании структуры
почвы, а также обеспечивают сохранение влаги Капсульные по-
лисахариды некоторых азотфиксирующйх бактерий, например
клубеньковые Rhizobiuni radicola, отличаются тем, что в своем
составе наряду с глюкопиранозными имеют остатки глюкуроновой
кислоты.
В последние годы уделяется большое внимание изучению и
анализу внеклеточных полисахаридов, не связанных структурно
с клеточной стенкой. Об их большом разнообразии свидетельст-
вуют результаты исследований химической структуры. Так, вне-
клеточный полисахарид Е. coli № 1768 представляет собой гете-
рополимер, в котором соотношение между остатками глюкозы,
маннозы и рамнозы составляет 5:3:2. Внеклеточные полисахари-
ды Alternaria solani содержат галактозу, глюкозу и маннозу. В од-
ном из них молярное соотношение названных углеводов состав-
ляет 2,2 3,1:1,0, в другом 1,0.1,7:2,0. В состав гетерополисаха-
рида Fusarium solani входят галактоза, глюкоза, манноза, глюку-
роновая кислота и рамноза в молярном соотношении 10,5 • 10,6:
О большом разнообразии структур полисахаридов и включении
в их состав различных компонентов, иных, чем моносахариды, мо-
жет свидетельствовать, например, малоногалактан, выделенный из
Penicillium citrinum (рис; V-1)
Олигосахариды редко находят в микробных клетках. Исклю-
чение составляет специфический для дрожжей дисахарид трега-
лоза. Количество его может достигать в клетках 15—20%. В от-
личие от других известных углеводов он лишен гликозидного гид-
роксила и поэтому не восстанавливает фелингову жидкость:
2. БИОСИНТЕЗ ПОЛИСАХАРИДОВ
Синтез полисахаридов происходит при непременном участии
нуклеозиддифосфатсахаров (НДФ-сахар), являющихся донорами
углеводных остатков в реакции. Акцептором служит растущая
полисахаридная цепь. Собственно энзиматическую реакцию выпол-
няют ферменты, относящиеся к гликозилтрансферазам. Они специ-
фичны как к донору, так и к акцептору. Специфическая последо-
вательность присоединения отдельных моносахаридов или олиго-
сахаридов определена генетически, однако детали механизма по-
ка не установлены. Простейшей, наиболее общей реакцией явля-
ется образование гликозида в реакции
НДФ-сахар+R—OH->R—О—С -1 -сахар + НДФ.
Из наиболее хорошо изученных нуклеотид-гликозильных доно-
ров могут быть названы в качестве примеров следующие:
УДФ-глюкоза, участвующая в синтезе гликогена, крахмала,
целлюлозы, сахарозы, трегалозы;
УДФ-2-ацетамидо-2-дезоксиглюкоза— в синтезе хитина;
АДФ-глюкоза — в синтезе <х-1,4-глюкана;
УДФ-галактоза— в синтезе лактозы,
ГДФ-глюкоза — в синтезе целлюлозы (наряду с УДФ-глюко-
ГДФ-манноза — в синтезе глюкоманпана;
ГДФ-рибитол — в синтезе фосфо-В-рибиттейхоевых кислот;
УДФ-ксилоза — в синтезе ксиланов и т. д
Оказалось, что биологическая активность НДФ-сахаров тесно
связана со способностью к образованию достаточно стабильной
вторичной структуры. В водных растворах и, очевидно, в цито-
плазме НДФ-сахар а существуют в виде определенной скрученной
72
конформации, скрепленной водородными связями между гетеро-
циклическим ядром и функциональными группами углеводного
остатка (рис. V-2).
Примером микробиологического синтеза полисахарида может
служить биосинтез гликогена дрожжами. Известно, что гликоген
имеет сс(1->4)- и а (1—>6)-связи. На синтез линейных а(1-*-4)-свя-
зей работает фермент гликогенсинтетаза, которая переносит гли-
козильный остаток с УДФ-глюкозы. Однако гликогенсинтетаза не
способна катализировать образование (1,4->6) -связи, характерной
для точек ветвления цепей гликогена Существует специальный
фермент ветвления гликогена — амило(1,4-*1,6)-трансгликозилаза.
Он катализирует перенос концевого олигосахаридного фрагмента,
состоящего из 6 или 7 глюкозильных остатков, с конца главной
цепи гликогена на 6-гидроксильную группу остатка глюкозы той
же или другой цепи гликогена таким образом, что образуется
п(1-»-6) -связь и появляется точка ветвления (рис. V-3).
Если происходит синтез гетерополисахарида, то можно пред-
ставить себе два возможных пути- либо регулируемое чередова-
ние последовательно присоединяемых мономерных единиц, либо
предварительный синтез ди- или олигосахаридов и далее полиме-
ризация этих более сложных структур. Как было относительно
недавно установлено, в таких реакциях синтеза принимает участие
промежуточный перепосчнк (фосфат высшего изопреноидного
спирта), так называемый липидный переносчик (рис. V-4).
74
Полисахаридом, содержащим остатки глюкозы, соединенные
на линейных участках молекулы а (1-*-6) -связями, является декст-
ран. Последний представляет собой внеклеточный полисахарид,
синтезируемый многими молочнокислыми бактериями. Известно
несколько типов декстранов, различающихся тем, что помимо
а (!-»-)-связей в их молекулах имеются а(1->3)- и -связи,
хотя их на всю молекулу по сравнению со связями сс(1—>-6) зна-
чительно меньше Синтез декстрана осуществляется декстранса-
харазой (а-1,6-глюкан: П-фруктоза-2-глюкозилтрансфераза). В ка-
честве исходного компонента реакции служит сахароза. Фермент
отщепляет от сахарозы молекулу глюкозы и передает ее на ак-
цепторную молекулу, без образования каких-либо промежуточных
соединений, в частности фосфорсодержащих, что весьма характер-
но для этой реакции. Наиболее активным акцептором являются
низкомолекулярные декстраны, несущие на одном из концов фрук-
тофуранозный остаток. Ниже представлен фрагмент молекулы
декстраны с фруктофуранозным остатком на конце:
Суммарно реакция выглядит так:
Ф—О—Г-г (Г—О—Ф)п-»-(Г—О)п—Г—О—Ф+Ф—ОН.
ГЛАВА VI. ЛИПИДЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
1 ВЛИЯНИЕ УСЛОВИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА СИНТЕЗ
ЛИПИДОВ
Липиды микроорганизмов являются главными структурными
компонентами мембран, входят в состав некоторых структур кле-
точных стенок, а также представляют собой полимеры, источники
резервных энергетических ресурсов клетки. Липиды не являются
информационными молекулами, так как их компоненты — жирные
кислоты построены из повторяющихся идентичных двууглеродных
единиц. В большинстве клеток содержатся лишь следы свободных
жирных кислот Бактериальные клетки и клетки актиномицетов
содержат липиды преимущественно в мембранах и клеточных
стенках. В культурах эукариотиых организмов липиды выступают
как запасные питательные вещества, образуют в цитоплазме струк-
75
турно обособленные «капельки» или входят в комплексы с дру-
гими полимерами клетки. Липидный состав митохондрий напоми-
нает состав липидов мембран бактериальных клеток, т. е наи-
больший удельный вес занимают фосфолипиды — эфиры фосфати-
дилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола, кар-
диолипина. Как и при синтезе липидов, расположенных в цитоплаз-
ме, липидный состав митохондриальных мембран значительно из-
меняется в зависимости от культуральной среды и условий выра-
щивания. Роль липидов в митохондриальных мембранах связыва-
ют с функцией ферментов дыхательной цепи Известно, что при
нарушении целостности липидов в митохондриальных мембранах
под действием липолитических ферментов, а также при удалении
липидов происходит ингибирование активности ферментов дыха-
тельной цепи. При внесении липидов активность может быть вновь
восстановлена
Высокий уровень содержания липидов в дрожжевых клетках
позволяет рассматривать некоторые культуры как продуценты ли-
пидов. К их числу относятся представители родов Candida, Hanse-
nula, Debaryoniyces, PuII'uIana, Saccharomyces и др. Наряду с вы-
сокой продуктивностью по жиру многих микроорганизмов получе-
ние липидов микробиологическим синтезом может иметь ряд преи-
муществ: быстрота роста дрожжей, возможность направленного
изменения жирнокислотного состава и т п. В дрожжевой клетке
липиды могут находиться в свободном состоянии, точнее, доступ-
ном для экстрагирования различными органическими растворите-
лями, и в связанном, когда они находятся в виде комплексов или
окружены защитной пленкой.
Таблица VI-1 Фрикционный состав липидов Lipomgces
культивирования, % от общих липидов
78,5
7,2
6,1
77,5
Существенное влияние на соотношение липидных фракций
зывают источники углеродного питания (табл. VI-2), В лиги
Таблица VI-2, Фракционный состав липидов дрожжей Lipomyces
starkeyl и Spnrobolomyces roseus. культивируемых на различных
Стерины
Свободные жирные кислоты
Эфиры стеринов и воска
1*2
73 J
З2’о
1,2
45,9
33,1
Фосфолипиды
Стерины
Свободные жирпые кислоты
w’l
2’1
82*5
дается увеличение относительной доли фосфолипидов При культивировании на
же время фраационный состав липидов Sporobolomyces roaeus на макните не-
Особое влияние на биосинтез дрожжами липидов оказывают
соединения, которые сами являются компонентами липидов, та-
ких, как глицерин и некоторые жирные кислоты. Использование
глицерина как компонента среды обычно приводит к резкому воз-
растанию содержания липидов в клетках по сравнению с глюко-
зой. При использовании в качестве источника углерода некоторых
жирных кислот в дрожжевых липидах резко увеличивается со-
держание именно этих кислот. Так, введение олеиновой кислоты
в среду привело к увеличению ее количества в липидах почти в
1,5 раза по сравнению со средой, содержащей глюкозу. Влияние
азотсодержащих компонентов среды на количество липидов в
клетках имеет косвенный характер и связано с неодинаковой сте-
пенью усвояемости дрожжевой клеткой различных азотсодержа-
щих соединений.
Заметное влияние природы источника азота сказывается лишь
при использовании синтетических сред. Первостепенное значение
имеет количественное соотношение источников углерода и азота,
присутствующих в среде, обычно обозначаемое N:C (или C:N).
Соотношение N:C максимального липидообразования при одно-
временном высоком выходе биомассы неодинаково для различных
видов дрожжей и источников питания Так, для Rhodotorula gra-
cilis при росте на глюкозе соотношение N:C составляет 1:76
(0,6 г азота на 100 г глюкозы), при росте на средах с ксилозой и
глицерином — N : С=1:40-5-1’50, В случае использования в каче-
стве источника углерода н-алканов наиболее стабильнее накопле-
ние дрожжами Candida sp. липидов наблюдалось при соотноше-
2. ЛИПИДНЫП СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ
жира в микроскопических мицелиальных грибах может колебаться и очень ши-
1ия При
Dppii, Ob'
Таблица VI-3 Содержание -наиболее часто встречаемых природных кислот
е липидах дрожжей, % к общему количеству
Candida lipolytica
Обобщая данные по физико-химическим свойствам внутрикле-
точных липидов у дрожжевых и грибных культур, можно прийти
к выводу, что они занимают промежуточное положение между жи-
вотными и растительными жирами Помимо внутриклеточных ли-
пидов дрожжи могут содержать в культуре внеклеточные (экстра-
целлюлярные) липиды. Количество внеклеточных липидов состав-
ляет от нескольких десятков миллиграммов до 2,0 г/л среды Опи-
сано большое число культур, где идентифицированы экзолипиды,
к ним относятся представители родов Torulopsis, Pullularia, Rho-
dotorula, Hansenula и т. д. Среди экзолипидов найдены жирные
кислоты, гликолипиды, сфинголипиды, эфиры жирных кислот и
полиолов.
В частности, в отличие от внутриклеточных липидов были най-
дены эфиры жирных кислот и Cs—Сб-полиолов (арабита, сорбита,
маннита).
Синтез жиров микроорганизмами происходит согласно обще-
распространенной схеме, постулированной Ф. Линеном, через ма-
лонил-КоА на мультиэнзимном комплексе.
ГЛАВА VII. ПОЛИФОСФАТЫ
I. СТРУКТУРА И КЛАССИФИКАЦИЯ
В клетках многих микроорганизмов обнаружены полимерные
фосфорсодержащие соединения, основу структуры которых состав-
ляют остатки ортофосфорной кислоты, соединенные между собой
фосфоангидридными связями с образованием неразветвленной ли-
нейной структуры:
(п+2-Г
Полифосфаты имеют общую формулу
(Me1+Н) (п+2)Р«С)з(п+1)-
Их анионы представляют собой цепи, в которых атомы фосфо-
ра соединены между собой только через два атома кислорода, об-
разуя, таким образом, линейную, неразветвленную структуру.
Полифосфаты — богатые энергией соединения. При гидролизе
связи Р—О—Р в высокополимерных линейных полифосфатах нат-
рия выделяется энергии примерно 42 кДж/моль, т. е. такое же
количество, как и при гидролизе терминальных фосфоангндридных
связей в молекуле АТФ. В зависимости от степени полимеризации
79
полифосфаты различаются по некоторым физико-химическим свой-
ствам, в частности по способности извлекаться из клетки водными
растворами кислот, солей и щелочей.
Наиболее изучены полифосфаты дрожжей, а у грибов — поли-
фосфаты у представителей родов Neurospora и Penicillium. На их
примере показано, что из клеток может быть изолировано пять
фракций: кислоторастворимая ПФ] (растворитель 1 %-ная три-
хлоруксусная кислота; температура 0-4°C), содержащая в сред-
нем пять остатков фосфорной кислоты; солерастворимая ПФ2 (на-
сыщенный раствор NaCIO«, 0—4°C) — 20 остатков; щелочераство-
римая ПФЭ (NaOH; pH 9; 0—4 °C)—55 остатков; щелочераствори-
мая ПФ< (NaOH; pH 12; 0—4 °C) — 260 остатков; экстрагируемая
горячей хлорной кислотой ПФБ (10%-ная НС1О4; 100°С) — от
290 остатков и выше.
Вопрос о том, каким образом полифосфаты связаны с клеточ-
ными структурами, не имеет достаточно четкого ответа. Не оправ-
дались предположения о том, что полифосфаты имеют прочные
ковалентные связи с РНК. Возможно, что высокополимерные по-
лифосфаты или во всяком случае большая их часть вообще никак
не связаны с нуклеиновыми кислотами. С внутриклеточными поли-
мерами— нуклеиновыми кислотами, белками, фосфолипидами,
кислыми полисахаридами — полифосфаты могут связываться, об-
разуя хелатные мостики через ионы Са2* и Mg2+.
Локализация различных фракций полифосфатов была выявле-
на в опытах с культурами Neurospora crassa и Endomyces magnu-
sii Предполагается, что полученные данные могут быть отнесены
ко всем микроорганизмам и без сомнения к грибам. Экстрагируе-
мые горячей хлорной кислотой и щелочными растворами наибо-
iee полимерные полифосфаты располагаются по периферии клетки
в области цитоплазматической мембраны и, может быть, даже свя-
заны с ней. Менее полимерные, солерастворимые полифосфаты в
основном локализованы внутри клетки: частично в составе клеточ-
ных ядер, а частично в волютиноподобных гранулах Наименее
полимерные кислоторастворимые полифосфаты, по-видимому, це-
ликом локализованы в цитоплазме, в гранулах волютина. Не иск-
лючено, однако, что часть солерастворимых полифосфатов также
может входить в состав волютина грибов. Остается открытым воп-
рос о том, только ли полифосфаты присутствуют в гранулах во-
лютина или они находятся там наряду и в связи с другими, в пер-
вую очередь органическими, компонентами '
2. МЕТАБОЛИЗМ
Для синтеза молекулы полифосфата необходимо иметь доста-
точное количество фосфора н источников энергии Фосфор посту-
пает в клетки из среды. Основными энергодающнмк процессами,
обеспечивающими интенсивное накопление полифосфатов, являют-
ся брожение, дыхание, фото- и хемосинтез. Основным субстратом
биологического окисления, дающего энергию, служит глюкоза и в
80
некоторых случаях различные компоненты цикла Кребса. Акцент
на необходимость источников энергии при биосинтезе сделан по-
тому, что, как сказано было выше, полифосфаты являются макро-
эргическимн соединениями. Детали энзиматических механизмов
биосинтеза полифосфатов пока не расшифрованы. Известно не-
сколько реакций, в частности сопряженных с другими реакциями
синтеза, специфически обусловленными локализацией полифосфа-
Одной из наиболее общих и вероятных ферментных систем,
участвующих в синтезе, является полифосфаткиназа, открытая
А. Корнбергом:
АТФ+ПФп^АД Ф+ПФп+1.
Для осуществления реакции требуется Mg2+. При синтезе по-
лифосфатов происходит перенос только одной терминальной фос-
фатной группы АДф ингибирует реакцию, вследствие чего проис-
ходит ее сдвиг влево. Возможность замены АТФ другими нуклео-
тидами не доказана
И. С. Кулаевым открыт фермент, принимающий участие в син-
тезе полифосфатов, который переносит фосфатную группировку от
1,3-дифосфоглицериновой кислоты (1,3-ДФГК). Фермент был вы-
делен из культуры Neurospora crassa и получил название 1,3-ди-
фосфоглицерат • полифосфат-фосфотрансфераза-
соо~©
СНОН + ПФЯ
1.3-ДФГК-позвф«сф« СООН
СНОН + ПФЛ
LijO©
Анализ динамики распределения радиоактивной метки 32Р по-
казал, что первоначально происходит синтез высокополимерных
полифосфатов, имеющих периферическую локализацию. Полага-
ют при этом, что кислоторастворимые полифосфаты могут пред-
ставлять собой продукты энзиматической деградации высокополи-
мерных полифосфатов Тем не менее такое утверждение не может
считаться абсолютным, так как имеются и противоположные до-
казательства, свидетельствующие об отсутствии биогенетической
связи между отдельными фракциями полифосфатов. Так, имеют-
ся косвенные данные о связи между синтезом полифосфатов соле-
растворимой фракции, локализованной в ядрах эукариотных орга-
низмов, и синтезом нуклеиновых кислот. Не исключено, что взаи-
мосвязь этих двух процессов, происходящих в ядрах, может осу-
ществляться по предложенной Й. С Кулаевым, И. А. Крашенин-
никовым и Ю, А. Тырсипым схеме. Эта схема подразумевает, что
сопряжение биосинтеза РНК н полифосфатов может происходить
через промежуточное образование пирофосфата. Как полагают
8Г
авторы.
синтез полифосфатов из пирофосфата может происходить
за счет фосфотрансфер азной реакции, осуществляемой пирофос-
фатазой:
Другой возможный сопряженный механизм биосинтеза поли-
фосфатов связан с синтезом полисахаридов клеточной стенки и
с синтезом наиболее полимерных фракций полифосфатов. Схема
эта также предложена И, С Кулаевым. Она постулирует возмож-
ность переноса одного, а возможно, и обоих остатков фосфорной
кислоты молекулы пирофосфата па полифосфат:
ПФ„+АМФ^АДф+ПФп+1.
при достаточно высокой концентрации АМф в клетке. Это обстоятельство мо-
В реакцию входит только концевая фосфатная группа полцфосфата, т. е.
фосфорилируя ание глюкозы идет ступенчато с конца цепи. У некоторых микро-
ПФ„+Н2О->ПФЯ^ । ^ортофосфат
среде ионов Мп’+ ц Со’*. Эндополйфосфатазв (полифосфат-полнфосфогидрола-
ГТФ+яН2О=л пентофосфат.
форной кислоты Существует точка зрения, что энергия, выделяющаяся при
разрыве молекулы полифосфата, расходуется на перенос фрагментов, образо-
вавшихся из исходной молекулы через мембрану внутрь клетки, если фермент
риферин клетки
При изучении динамики изменений количественного содержания полифос-
чепы на примерах грибных и дрожжевых культур. Отмечено, что интенсивный:
тетические процессы, связанные с образованием нуклеотидов и нуклеиновых
кислот. Аналогичные явления наблюдаются также тогда, когда начинается ив-
средствеино участие в?синтезе принимает, видимо, фракция полифосфатов, ло-
кализованная в ядре. Как в логарифмическую, так н в стационарную фазы ро-
ста полифосфаты четко идентифицируются в клетках. В связи с тем что син-
тетазные процессы в стапионарной фазе сведены до минимума, здесь происходит
состава среды для культивирования и в первую очередь от концентраций фос-
ке. Полагакл'^например, что синтез низкиполимерной фракций ПФ, зависит от
хода реакций гликолиза, так как основной ферментной системой, участвующей.
Гипотетическую схему превращения полифосфатов у грибов,
предложил И. С. Кулаев — один из ведущих ученых в области
изучения полифосфатов (рис. VII-1).
Таким образом, полифосфаты представляют собой не просто:
депо фосфора, а резерв активированного фосфата, высокореакци-
онноспособного и легкомобилнзуемого для обеспечения метаболи-
ческих нужд клетки. Как полагает И. С Кулаев, наличие поли-
8£
фосфатов в заметных количествах только у низших организмов
связано с присущей им чрезвычайно высокой скоростью биосин-
теза нуклеиновых кислот и белка, что приводит в свою очередь
ж очень быстрому делению клеток. Возможно, что только поли-
фосфаты. являясь концентратом больших количеств фосфора и
энергии, могут обеспечить такую высокую скорость клеточного
деления.
ГЛАВА VIII. МИНЕРАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА И ВОДА
1. МИНЕРАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ
РОЛЬ В ОБМЕНЕ ВЕЩЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Наряду с органическими компонентами в клетках микроорга-
низмов содержатся соединения, составляющие обширную группу
минеральных веществ. Содержание их различно, многие обнару-
жены в микроколичествах. Чтобы определить, какие элементы
входят в состав микробных клеток, проводят сжигание биомассы
(озоление), а затем анализируют золу, применяя специфические
химические реакции или спектральные методы. Наличие в клет-
84
ках гех или иных ионов обусловлено их присутствием в среде и
способностью переноса из среды в клетку. На перенос оказывает
влияние как общая композиция среды, так и отдельные ее ком-
поненты.
Спектральный анализ мицелия одного из актиномицетов по-
зволил обнаружить в ощутимых количествах кальций, магний,
натрий, кремний, железо, калий, а стронций, алюминий, литий,
Рис. VIll-l. Изменение содержания общего Mg’+ и свободного Mg’+ в процес-
рубидий, марганец, свинец — в виде следов. Примерно такие же
элементы были обнаружены в золе мицелия гриба Aspergillus ni-
ger, где помимо названных элементов были идентифицированы
медь, висмут и серебро. Еще большее число элементов было най-
дено в дрожжевом экстракте. А1, В, Cd, Со, Сг, Си, Fe, Ga, Mg,
Мп, Mo, Ni, Pb, Sn, Sr, Ti, Vi, Zn.
В частном случае в культуре Penicillium chrysogenum общее
«содержание ионов Mg2+ в мицелии зависит от концентрации этого
иона в среде При увеличении концентрации Mg2+ вне клетки про-
исходит повышение его содержания в биомассе. Дефицит Mg2+ в
среде может привести к частичной потере ранее накопленного
.клеткой этого иона.
85
Общее содержание Mg2+ зависит от фазы роста (рис. V1I1-1).
На этом же рисунке показана общая тенденция в изменении со-
держания Mg-" в зависимости от сопутствующих катионов. При
низкой концентрации Fe3+ в среде наблюдается накопление MgT2
во все время роста гриба Высокие концентрации Fe8+ способст-
вуют накоплению Mg2+ в молодой культуре.
Контролирующим фактором содержания ряда катионов слу-
жит также ортофосфат.
На основании строгих количественных показателей для некото-
рых катионов доказана возможность транспорта из среды в клет-
ку против градиента концентрации. Например, в культуре Penicil-
lium chrysogenum Mg2+ накапливается против градиента в соот-
ношении I : 50. При резком увеличении внеклеточной концентрации
ионов магния не происходит пропорционального увеличения его
содержания в клетках. Так, при увеличении концентрации Mg2+
в среде в НО раз уровень свободного Mg2+ в клетках Penicillium
chrysogenum возрастает в 3 раза, в клетках Е. coli общее содер-
жание Mg2+ возрастает вдвое при увеличении в 2500 раз количе-
ства внеклеточного Mg2+.
Особое место среди элементов занимает сера, которая в клет-
ках редко присутствует в виде минеральных соединений Обычно
она входит в состав аминокислот, таких, как метионин, цистеин
(цистин), или включена в некоторые вторичные метаболиты, в
серусодержащие гетероциклические соединения, а также витами-
ны (тиамин и биотин).
При
изучении влияния минеральных компонентов
_.г_ —, ...... .............................. среды на
рост культуры или биосинтез какого-либо метаболита необходимо
иметь в виду, что практически мы всегда вносим в среду значи-
тельное и подчас неучтенное их количество. Возможными источни-
ками минеральных веществ могут быть компоненты сред расти-
тельного или животного происхождения, химические реактивы, по-
севной материал, вода, аппаратура, посуда и пр При анализе не-
которых компонентов сред, например глюкозы, спектральным ме-
тодом было обнаружено в виде примесей до i7 элементов; суль-
фатов магния и цинка — до 9 элементов Вода в зависимости от-
источника богата различными солями, особенно часто солями же-
леза, кальция и магния.
Широко применяемый в промышленности кукурузный экстракт
содержит, по данным спектрального анализа, следующие элемен-
ты: Al, As, В, Са, Сг, Со, Си, Fe, Pb, Li, Mg, Мп, NI, К, Si, Ag,
Sn, W, Zn. Одна из партий кукурузного экстракта имела следую-
щее содержание некоторых элементов (в % на сухую массу):
марганца — 0,04, калия — 0,5—1,5; меди — 0,001; магния — 0,5—
1,0; цинка — 0,005; кальция — 1,0—2,0.
Минеральные компоненты имеют различное физиологическое
значение. Одной из существеннйх функций является стабилизация
физико-химического состояния коллоидов цитоплазмы. Однако, ве-
роятно, наиболее важное значение ионов металлов в функциони-
рующих биологических системах связано с ферментативными ре-
акциями. Белки, содержащие в своем составе металлы, называют
металлопротендами Ферменты, содержащие в структуре металлы,
называют металлоэнзимами В большинстве случаев это металлы
с переменной валентностью Как правило, они входят в активный
центр фермента. Многие ферменты являются металлозависимыми.
Наличие металла необходимо для осуществления акта катализа.
В этих случаях металл создает или стабилизирует определенную
конформацию молекулы фермента, необходимую для обеспечения
каталитического действия. Металл может воздействовать на суб-
страт, изменяя электронную структуру таким образом, что он лег-
че вступает в ферментативную реакцию. Металл обеспечивает при-
соединение кофермента к апоферменту или активацию кофермен-
та, а также выполняет функцию «мостика», связывающего фермент
и субстрат при образовании из них'промежуточного соединения
Прочность соединения металла с ферментом обычно определя-
ют путем диализа Если после диализа сохраняется активность,
то фермент является металлопротеидом. Если активность теряет-
ся, то это свидетельствует об отсутствии прочной связи между ме-
таллом и белком. Чтобы установить, принимает ли участие металл
в ферментативной реакции, используют специфические реагенты,
которые связывают его и вызывают угнетение ферментативной ак-
тивности. Если путем введения ингибитора в сферу ферментатив-
ной реакции удается подавить действие фермента, а затем при
введении того же металла происходит реактивация, то этот факт
может свидетельствовать об участии металла в ферментативном
катализе.
41'1 ,
««В..грВГ-.?ХТ™?”,Хи.ТХ^™Р””"е™ ” 1»“Л ™“.
ро *р в к 0Р „
активируются вообще или активируются незначительно К+ Rb* или NH+
Здесь „
гои координации карбоксильной rnvnnw Т ' Роль заключ®етси в стро-
фосфорильный остаток ориеитиру;, “ д‘£'а 6”™W» «у Его
нои атаки. ру надлежащим образом для нуклеофиль-
АТФ + СНаСОСООН
АДФ + СН2=С—СООН
интрига, kJSmIVt’™ нитрата да
(НЛДф.Н ил. НЛДН) ииридаииуклоотилои
Леи При этом молибден /.О,'1 восстании™. Л1 «елок содержащий иолвб-
Ществляот восстановление нитрата да ™“ “ ' В,0Р«“ «™ осу-
N0“
Мо®
-ио2-+Н2о
нияи и вслсдстХ"™» быв”а»т Егеобтод™’ТТ' ” 1"?“™’»»™ роаи-
могу, быть названы магний мадаан™ " "че™' "«„оненгов сданы,
ста. в ферментативных ро’акХ“"да™ ’ Хда™®"' ” ’ « Помимо у,а:
В частности, ионы металлов оказывают ряд ииых Фувкций.
функцию нуклеиновых кислот Так ионы ^етал wr ° гП”»ИЯНИе На стрУктУРУ и
ными группами ДНК, стабилизируют Ге ств^Х Д = ™JBB£OU*№^ с фосфат-
щиеся с азотистыми основаниями вьцшвХ,металлов, связываю-
Определенная концентрация ионов Х»+ ИеГб1о^имяЛ^НЬШ эффект
чивои структуры рибосом При сниже.™ ДЛЯ сохРа«ения устой-
Ризомы Мр он-
тельное измеГсн^в ^наф»щцйонной°и рентака6 наблюдаться значи-
ядра Специфическую роль.^ероятно оказывае? нГн .актиивости клеточного
полимеразах. Полагают, что бпагодаоя Z ® с DtoP«x нуклео-
3 ОН терминальной группы растущей яии пгпа»ичию» происходит активация
и™, кобальта к Тг"' Н“'™ ”
синтезу витамина В(2 Гцианкобаля«икА Р едсг к повышенному
подобную часть структуры витамина R то? ко®альта входит в порфирино-
гетероциклическими элементами молекулы'2’ 6ра3уя К00Рдинационные связи с
ингибирующшЧ^ффект.^Так, ^Седеленныевкпш1₽ТаЛЛ°В оквз“ва,от выраженный
биосинтез пенициллина грибом PenicuIMum ciirvsoXnom S°* 7На0 УгнетаюЧ'
ток железа ингибирует одну из энчимя^^ g 5ак полагают, избы-
.««™,н. Иной механизм
"Хс с дада^т ™V ™ «в» »" ”„7
одинаковом количестве желеЕа". „„„3^?“’““ Х=.*е”к",к?£1
2. ВОДА В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Вода составляет до 80 % от массы сухих веществ, содержащих-
ся в вегетативных микробных клетках. Содержание воды в спорах
значительно меньше. Несмотря на преобладающее количественное
содержание, далеко не раскрыты ее многочисленные и разнооб-
разные функции в живых системах. Цода представляет собой иск-
лючительно реакционноспособное вещество, обладающее необыч-
ными свойствами По химическим и физическим свойствам она
отличается от большинства других жидкостей Вода и продукты
ее диссоциации являются важнейшими факторами, определяющи-
ми структуру и функцию биополимеров клетки, в том числе бел-
ков и нуклеиновых кислот. В результате различных превращений
воды на мембранных структурах может происходить конформация
составляющих компонентов, вследствие чего, в частности, меня-
ется проницаемость мембран.
Как известно, воде присуще свойство образования водородных
«вязей. Они возникают между любыми электроотрицательными
атомами (кислорода, азота) и атомами водорода, ковалентно свя-
занными с другими электроотрицательными атомами. Водородные
связи могут образовываться между двумя молекулами или между
двумя различными частями одной и той же молекулы. В отличие
от полярных молекул, которые в различной степени растворимы
в воде, неполярные нерастворимы в ней, так как они не могут об-
разовывать водородных связей с молекулами воды.
Для биологических систем водородные связи имеют исключи-
тельно большое значение. Скорость образования и разрыва водо-
родных связей в водных системах значительно превосходит та-
89
ковую большинства ковалентных связей. Именно поэтому водо-
родные связи обладают существенным преимуществом по сравне-
нию с ковалентными связями, с точки зрения возможности реа-
лизации различного рода биомолекулярных процессов.
Существует общее правило, согласно которому большинство
молекул в клетке способно образовывать устойчивые «слабые»
связи лишь с небольшим числом типов молекул Частично это
объясняется тем, что все молекулы в биологических системах су-
ществуют в водном окружении Образование связи между какими-
либо молекулами в клетке зависит не только от того, способны
ли эти молекулы вообще связываться друг с другом, но также и
от того, обеспечит ли образование данной связи максимальное
число водородных связей в водном растворе.
Состояние воды в микробных клетках может рассматриваться
с различных позиций. С прикладной точки зрения, отвечающей
интересам биотехнологии, наиболее важен принцип использования
энергии связи, которой вода ассоциирована со структурами или
метаболитами клетки. Исходя из этого, может быть предложено
три вида связи.
1) химически связанная вода; здесь энергия связи достигает
наибольшего значения. Практически эта вода не удаляется, если
не применять каких-либо специфических методов. При тепловой
сушке она сохраняется в клетках;
2) вода, имеющая физико-химическую форму связи. Сюда мож-
но отнести адсорбционно связанную и осмотически связанную
воду;
3) вода, связанная механически Она, как правило, не входит
в состав самой клетки и легко удаляется из биомассы при филь-
трации или под вакуумом при слабом нагревании.
Адсорбционно связанная вода образует, как правило, мономо-
лекулярный слой Она отличается рядом свойств от обычной воды.
В адсорбционно связанной воде не растворяются те вещества»
которые растворимы в свободной воде, удельная теплоемкость
первой меньше единицы, замерзает адсорбционно связанная вода
при температуре значительно ниже нуля. Часть ее не замерзает
даже при —78 °C. Связанная вода имеет повышенную плотность.
Количество осмотически связанной воды во много раз больше
количества адсорбционно связанной. По физико-химическим свой-
ствам осмотически связанная вода пе отличается ничем от сво-
бодной воды. Содержание первой регулируется благодаря струк-
турным и функциональным особенностям цитоплазматической
мембраны и зависит от концентрации растворимых компонентов
клетки, в частности минеральных соединений. Иными словами пе-
ремещение воды через мембрану из одной части системы в другую
вызывается двумя основными причинами. 1) повышением гидро-
статического давления в одной из частей системы; 2) увеличением
в другой ее части концентрации растворенного вещества, для ко-
торого мембрана менее проницаема, чем для воды. Осмотически
связанная вода может быть удалена при сушке биомассы.
90
Часть вторая. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ
МИКРООРГАНИЗМОВ И ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ
ЕГО РЕГУЛЯЦИИ
ГЛАВА IX. ТРАНСПОРТ КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ В КЛЕТКИ
МИКРООРГАНИЗМОВ
1. ФУНКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ГИДРОЛАЗ В ПОДГОТОВКЕ
ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ . СУБСТРАТОВ К ТРАНСПОРТУ
В КЛЕТКУ
Энзиматические процессы микробиологического синтеза, как
известно, протекают в клетках. Основными компонентами реак-
ций синтеза являются низкомолекулярные метаболиты В средах,
где происходит культивирование, обычно присутствуют как высо-
комолекулярные, так и низкомолекулярные органические соеди-
нения наряду с минеральными компонентами Органические со-
единения поступают в клетку, когда имеют относительно неболь-
шой размер молекулы В связи с этим высокомолекулярные со-
единения подвергаются в среде ферментативному гидролизу благо-
даря активности экзоферментов микроорганизмов К ним в первую
очередь относятся гидролитические ферменты. Ферменты, относя-
щиеся к гидролазам, наиболее просто организованы, они не требуют
для проявления активности кофакторов или коферментов Лишь
часть из них нуждается в присутствии некоторых катионов.
Расщепление пептидной связи осуществляют протеолитические
ферменты, относящиеся к подклассу пептид-гидролаз В результа-
те реакции образуются аминокислоты или олигопептиды, которые
способны проникать в клетку благодаря наличию систем перено-
са В зависимости от специфических особенностей обмена веществ
культуры внеклеточные протеолитические ферменты работают в
широком интервале pH — от 2,5 до li,O. Гидролиз полисахаридов
осуществляют ферменты, имеющие обшее название гликозидазы.
Они имеют строгую специфичность относительно характера связи
и углеводного остатка Учитывая химическую природу углеводов,
входящих в состав среды в качестве ее компонентов, наибольшее
значение имеют амилазы, гидролизующие полисахариды типа
крахмала; целлюлазы, если среди компонентов присутствует клет-
чатка; полигалактуроназа -для пектина и т п Конечными про-
дуктами, образующимися в результате действия названной группы
ферментов, являются олиго- или моносахара и уроповые кислоты.
Нуклеиновые кислоты расщепляются благодаря активности
внеклеточных нуклеодеполимераз. Известны неспецифические к
природе углеводного компонента нуклеазы, действующие на ДНК
и РНК, дезоксирибонуклеазы, гидролизующие ДНК, и рибонук-
леазы, гидролизующие РНК- Последние могут иметь специфич-
ность к природе оснований, около которых происходит разрыв
фосфодиэфир ной связи У микроорганизмов преимущественно об-
91
наружены гуанил-специфичные РНКазы. Известны РНКазы» про-
являющие свое действие в кислом или щелочном интервале pH.
Конечными продуктами действия названных ферментов являются
нуклеотиды. Последние могут подвергаться дальнейшей деграда-
ции. Отщепление фосфатной группы происходит благодаря актив- .
ности фосфомоноэстеразы (фосфатазы). Нуклеозидазы расщепля-
ют нуклеозиды до оснований и углеводов.
Жиры в свободном виде редко присутствуют в среде. Исклю-
чение составляют производства, где их вводят в среды в качестве
пеногасителей. Обычно жиры входят в состав необезжиренных
растительных продуктов, вводимых в среды в качестве компонен-
тов. Основной группой ферментов, осуществляющих гидролиз жи-
ров, являются гидролазы, действующие на эфирные связи. По-
скольку основную массу жиров составляют триглицериды жирных
кислот, наибольшее значение имеет триацилглицерол-липаза, или
просто липаза, как ее принято называть в повседневном обиходе.
В результате деятельности этого фермента происходит гидролиз
эфирных связей и образование глицерина и жирных кислот.
В отличие от большинства культур дрожжи обладают очень
низкой активностью внеклеточных гидролаз и, как правило, нуж-
даются в готовых низкомолекулярных компонентах среды
2. ТРАНСПОРТНЫЕ БЕЛКИ (ПЕРМЕАЗЫ)
Поступление отдельных компонентов среды в клетку, как пра-
вило, не является простым физико-химическим актом, который
происходит в результате разностей концентраций или диффузии.
В большинстве своем перенос веществ из среды в клетку проис-
ходит против градиента концентраций, т. е. активный транспорт,
требующий определенных энергетических затрат и наличия спе-
циального «переносчика». В результате этого акта в клетке будут
содержаться вещества, концентрации которых во много раз выше
их концентраций во внешней среде. Переносчики имеют белковую
природу, во многом они сходны с ферментами, в частности по ме-
ханизмам фермент-субстратного взаимодействия Функция таких
переносчиков, которые называют пермеазами, может быть описа-
на уравнением Михаэлиса — Ментен и т. и
Синтез пермеаз находится под контролем генетического аппа-
рата клетки Если вследствие мутаций нарушается синтез опреде-
ленной пермеазы, клетка может потерять способность использо-
вать тот компонент среды, за перенос которого отвечает данная
пермеаза. Вопрос о субстратной специфичности пермеаз обстоя-
тельно исследуется. Известны многочисленные факты конкуренции
за переносчик между близкими по химической природе вещества-
ми. Регуляция активности транспортных систем, подобно регуля-
ции ферментативной активности, может происходить путем конт-
роля по механизму обратной связи. Как и в случае синтеза фер-
ментных белков, различают конститутивный и индуцибельный ме-
ханизмы. Первый широко распространен у пермеаз аминокислот,
92
второй—у углеводов. Детали механизма переноса и его регуля-
ции у эукариотов и прокариотов могут различаться вследствие
различий в строении генома и различий химического состава и
строения клеточной стенки. Существенно важно, что при активном
транспорте не наблюдается химической модификации переносимо-
го вещества.
Схема транспорта с участием переносчика в самом общем ее
виде показана на рис IX-1 Согласно этой схеме имеется, по край-
ней мере, четыре этапа при переносе субстрата из внешней среды
в клетку: I) рецепция, т. е. образование комплекса с активным
центром переносчика; 2) собственно перенос, или транслокация;
3) диссоциация комплекса с освобождением субстрата; 4) регене-
рация транспортной системы. В настоящее время некоторые транс-
портные белки получены в гомогенном состоянии. Известные
транспортные белки имеют молекулярную массу 30—35 тыс., хотя
есть некоторые исключения. Большинство из изученных белков
устойчивы к температурным воздействиям, слабо инактивируются
этанолом, несколько более устойчивы к кислотам, чем к щелочам.
В их составе не найдено каких-либо небелковых кофакторов.
В табл. IX-1 представлен аминокислотный состав некоторых
из этих белков Характерно, что соотношение полярных и непо-
лярных аминокислот у этих белков аналогично их соотношению
у глобулярных белков. Механизм связывания белков с субстратом
требует своего детального анализа на изолированных системах.
подвергаются обстоятельному изучению Можно допустить суще-
ствование нескольких систем. Одна из них предполагает движение
переносчика в мембране по типу поплавка, другая — обращение
переносчика вокруг некой условной оси, третья — перемещение суб-
страта по переносчику за счет его конформационных изменений в
процессе гранспорта Возможно, все они имеют место у одного
организма, но действуют при переносе различных субстратов.
Таблица IX-I. Аминокислотный состав и молекулярная масса некоторых
транспортных белков
специфичной существует п
л. XIV).
центрами
ние мембран
вать с водой Р>’РРРР РУ
Аминокислоты, поступившие в клетку, пополняют ее метаболический фонд,
присуща функция синтеза белка, другому — катаболические процессы, третье-
му— регуляция Возможно, вследствие этого многие аминокислоты имеют не-
собой конкретные субстанции, принимающие участие в регуляторных механиз-
мах клетки как за счет регуляции активности, так и за счет репрессии синтеза
репрессии систем синтеза пермеаз, увеличивая тем самым их количество в клет-
клепш эукариот путем^свободной диффузии Поступающие в клетки аминокис-
с метиламмояием. Аминокисиоты, как правило. Неспособны блокировать эту сис-
вания предварительный гидролиз внеклеточными пептидазами до аминокислот
с их последующим транспортом или непосредственный транспорт олигопептидов
собственную транспортную систему, так к, через пермеззу олигопептидов Пен
тидазная транспортная система является конститутивной, однако ее активность-
транспорт возможен в том случае, когда аминогруппа при а-углероде остается
т е. не обладают специфичностью по* отношению к природе составляющих их
ну Имеется в виду, в частности^перенос генетической информации, заключен-
су около 10000 и ^является видоспецифичиыь! На ^поверхности бактериальной
клетки он связывается рецептором, молекулярная масса которого 50000, и, взаи-
модействуя с ним, «включает* процессы, необходимые для восприятия транс-
"белок, а также образуется агглютинин, который, связываясь с цитоплазмати-
ческой мембраной, изменяет ее поверхностные свойства. Достигнув цитоплаз-
матической мембраны, ДНК адсорбируется па ее поверхности подобно вирус-
ной «тастане. Этот процесс необратим и осуществляется без затрат энергии
Затем происходит «втягиваиве» ДНК внутрь, требующее затрат энергии, к да-
лее. если ДНК гомологична, встраивание ее в хромосому бактерии. Аналогич-
ным образом noi лощение белноп происходит, очевидно, лишь при наличии на
поверхности клеточной мембраны специфического репептора. Этот рецептор так
изменяет локальную проницаемость мембраны, что через пее могут проходить
Представляется весьма вероятным, что при связываний макромолекулы
манию," что молекула получает возможность ^проининуть₽ внутрь илеткиД %та
деформация может быть вызвана либо локальными физическими силами (на-
пример, поверхностным натяжением или гидрофобным взаимодействием в
мембране). Поскольку белок связынается с подвижным мембранным рецегго-
рой, неудивительно^ что процессы переориентации и вращения всего комплекса
образие транспортных систем, специфечных по "отношению к различным Рсаха-
рам В связи с этим кинетика транспорта при иестедовании на целых клетках
хаэляса—Ментен. Причина этого явления заключается в том, что в раелич-
стемами. Об этом свидетельствуют константы Михаэлиса, вычисленные для
•от концентрации углеводов может быть различной. Из транспортных систем,
осуществляющих перенос углеаолов, хорошо изучена [1 галактозидпермеаза. Она
стилист также перенос других Р-галактозидов. Фермент, как правило, имеет
индуцибельную природу и не синтезируется без индуктора.
Известен н хорошо изучен ген, контролирующий синтез Р-га1актоз«дпер-
лактозвдпермеазы одновременно происходит синтез Р-галактозидазы, расщеп-
ляющей лактозу ив глюкозу н галактозу. Молекулярный механизм этого явле-
ния изложен в гл. XIV Мутации, затрагивающие указанный ген, приводят к
место так называемая облегченная диффузия вместо активного транспорта.
Кроме р-гзлактоэидов большинство других углеводов также имеет перме-
азные системы, обеспечивающие их перенос без нарушения структуры в клетку.
В отличие, от других углеводов глюкозанакапливается в клетке в виде фосфо-
мембрану Ни примере двух прокариотов Salmonella typhimunum и Е coli было
показано, что внешняя мембрана, а не гликопентид служит диффузионным барь-
ером, определяющим размер проникающих через стенку гидрофильных молекул
случае индуктивней природы синтеза пермеазы роль индуктора может выпол-
углевоюв Особенно это относится к органическим кислотам цикла Кребса
Как известно, ряд органических кислот вступает в реакции синтеза в виде
3. ФОСФОЕНОЛПИРУВАТ-ФОСФОТРАНСФЕРАЗНАЯ
СИСТЕМА
В результате функционирования системы в клетке накаплива-
ются углеводы в измененной молекулярной форме по сравнению
с их состоянием в среде. Процесс идет с потреблением энергии.
Активность системы связывают с наличием фосфоенолпирувата,
вследствие чего ее называют фосфоенолпнруват-фосфотрансфераз-
ной системой. Состоит она из нескольких белковых компонентов.
В мембране локализован фермент II. Его активность связана, по
крайней мере, с наличием двух белковых фракций, одна из кото-
рых обладает функцией узнавания специфического углеводного
компонента реакций. В цитоплазме находятся фермент I и белок
НРг. Оба он» ответственны за реакцию фосфорилирования.
Происходящие в результате активности названных ферментных
систем реакции обычно описывают двумя уравнениями. В реакции,
катализируемой ферментом I, цитоплазматический белок НРг
фосфорилируется за счет фосфоенолпирувата. Эта реакция не-
обычна в двух отношениях. Во-первых, в ней в качестве непосред-
ственного донора фосфатной группы используется фосфоенолпиру-
ват, тогда как в большинстве реакций фосфорилирования донором
служит АТФ. Во-вторых, молекула белка фосфорилируется по
первому атому азота имидазольного кольца одного из двух остат-
ков гистидина В другой реакции принимает участие фермент II,
который имеет центр, реагирующий с белком НРг. Когда они свя-
зываются, образуется единый комплекс, фермент II — углевод —
фосфорилированный НРг. Здесь донором фосфатной группы для
транспортируемых углеводов служит фосфорилированный белок
(НРг):
Существует, вероятно, несколько различных по субстратной
специфичности молекулярных форм фермента II. Кроме того,
имеются факты, которые дают серьезное основание полагать, что
в реакции фосфорилирования участвуют не один, а два специфи-
ческих по отношению к углеводам белка Поэтому не исключено,
что в ближайшие годы детали процесса получат уточнение. Из
известных акцепторов фосфатной группы в этой системе следует
назвать D-глюкозу, D-галактозу, D-фруктозу, а также некоторые
пентозы, глюкозиды и галактозиды. Стало быть, эта система мо-
жет обеспечивать их транспорт в клетку. Схематически процесс
$8
' показан на рис. IX-2. На рисунке приведена обобщенная модель,
предложенная Розенманом, где отведено также место процессу
облегченной диффузии и активного переноса. На этапе а происхо-
дит взаимодействие субстрата с центром связывания мембранного
фермента II. В результате его конформационного изменения
/этап б) углевод оказывается на внутренней стороне цитоплазма-
тической мембраны. При высоких скоростях диссоциации комплек-
са поступление углевода в клетку (этап в) осуществляется путем
облегченной диффузии. На этапе г происходит связывание белка
Ец
Й*8
S -субстрат '
НРг ферментом II. В таком состоянии благодаря активности
фермента I (этап д) осуществляется фосфорилирование имида-
зольного остатка гистидина белка НРг.
Перенос фосфатной группы с фосфорилированного белка на
углевод ведет к транслокации радикала, в результате в клетку
поступает фосфорилированный углевод (этап е). Такой механизм
переноса часто называют транслокацией. Согласно этой схеме
ферменты I и II, НРг-белок выступают как компоненты единой
пермеазной системы. Рассматривая схему и понимая ее как на-
глядное изображение процесса переноса путем транслокации, сле-
дует отметить, что первая из названных в тексте реакций, соответ-
ствующая этапу д, происходит в цитоплазме, а вторая — между
фосфорилированным белком и углеводом — на мембранной систе-
ме (этап е).
Процесс переноса углеводов неизбежно должен быть связан
со скоростью их ферментативного превращения в клетке, что в
свою очередь связано с ростом биомассы. Если скорость поступле-
ния углевода в клетку низкая, то клетки при этом не могут расти
с достаточной интенсивностью Если перенос происходит очень бы-
стро, то это приводит к непроизводительной затрате энергии и
4* 99
накоплению токсичных для клетки концентраций фосфорных эфир-
ных углеводов. Отсюда следует, что интенсивность гликолиза
должна контролировать поступление углевода в бактерии Функ-
цию контроля поступления углеводов в клетку выполняют также
аминокислоты
В Связи с обсуждением вопроса о внутриклеточном энзимати-
ческом фосфорилировании углеводов возникает другой вопрос —
о возможности переноса глюкозо-б-фосфата. Было показано, что
в культуре Е. coli его транспорт может осуществляться без пред-
варительного отщепления фосфата. Щелочная фосфатаза не имеет
отношения к транспорту глюкозо-6*фосфата, в его присутствии
синтез этого фермента репрессируется.
4 пиноцитоз
Механизм транспорта в микробные клетки посредством пиноци-
тоза, по-видимому, мало распространен. Обычно благодаря пино-
цнтозу в клетки поступают достаточно крупные частицы Каким
путем происходит сквозь наружные слои клеточной стенки мик-
роорганизмов транспорт этих частиц, сказать трудно. Когда они
достигают цитоплазматической мембраны, происходит сорбция
проникшей частицы, мембрана образует некоторое подобие меш-
ка, обращенного внутрь клетки. Затем края его смыкаются, в ре-
зультате образуется пиноцитарный пузырек, который отрывается
от наружной мембраны и мигрирует внутрь клетки. Здесь мембра-
на пузырька растворяется, и захваченные клеткой частицы оказы-
ваются взвешенными в цитоплазме. Нет достаточной ясности об
энергетических процессах, связанных с механизмом пиноцнтоза.
В тех клетках, которые содержат лизосомы, возможно, происходит
слияние с ними пиноцитарных пузырьков, после чего за счет ак-
тивности гидролитических ферментов мембрана пузырьков разру-
шается.
5 МЕМБРАННЫЕ ИОНОФОРЫ
микроорганизмов.
представляют интерес при изучении функции ’мембран.
ный из трех идентичных фрагментов, каждый из которых последовательно
стоит из остатков D-валина, L-валнна, L-молочной кислоты. D-окснизовалериа-
100
—л
рш.ии,м>жшшии внутри мембраны. Дальше комплексный катион -мигри-
рует вдоль градиента потенциала к противоположной стороне мембраны, где
описанные выше превращения повторяются в обратном порядке
Энииатины имеют вдвое меньший размер цикла, чей валнномицян, у ник
нет грувн NH. образующих в ваяиномициповых комплексах жесткую систему
водородных связей Энниатины представляют интерес как комплексоны широко-
го спектра действии, способные связывать и транспортировать новы разных
размеров и валентностей. В молекулах эпянатина и иалиномицииа ион удер-
живается в молекулярной полости ион-дипольным взаимодействием с шестью
Энниатин
А —остатки D-a-оксиизовалеривновой кислоты и М-ме.тилЕ-изо-
В — остатки D-ц-оксиизовалериановой кислоты н N-метил L валина
молекула представляет собой 15-члепныЙ линейный пептид, построенный из
остатков гидрофобных аминокислот со строго чередующимися конфигурация-
ми асимметрических центров (за ясключе тем оптически неактннного глицина).
102
сн2
—ТШСНСО—NHCHCO—NHCIICO—NHCHCQ—NHGHCO—NH
ГЛАВА X. АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ КОМПОНЕНТЫ СРЕДЫ
И ИХ АССИМИЛЯЦИЯ МИКРООРГАНИЗМАМИ
1. АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ КОМПОНЕНТЫ СРЕДЫ
Всем живым организмам, в том числе микроорганизмам, со-
вершенно необходим азот. Земная атмосфера содержит его на-
много больше, чем нужно для удовлетворения потребностей жи-
вых существ. Однако азот химически устойчив, он с трудом окис-
ляется. Круговорот азота в природе ’представляет собой сложный
цикл, в ходе которого первоначально должна быть нарушена хи-
мическая инертность азота. Ряд микроорганизмов обладает спо-
собностью поглощать свободный азот воздуха и связывать его в
виде органических соединений. Промышленно важные культуры,
как правило, не являются фиксаторами атмосферного азота. Иск-
лючение составляют те производства, где для нужд сельского хо-
зяйства готовит бактериальные препараты азотфиксаторов В сре-
дах для культивирован ня необходимо иметь такие азотсодержа-
щие вещества, которые могут быть усвоены микроорганизмами.
А это значит, что они должны иметь такую структуру, которая
способна проходить через клеточную стенку. Клетка должна иметь
ферментные системы, которые обеспечат включение этого соеди-
нения в обмен веществ.
Кроме того, азотсодержащие вещества, равно как и другие
компоненты среды, должны удовлетворять следующим условиям:
обеспечивать достаточно высокий выход биомассы или синтезируе-
мого продукта, быть выгодными экономически.
Азот питательной среды идет главным образом на синтез бел-
ков микроорганизмов. Белки, как известно, состоят из аминокис-
лот. Могут быть два принципиально различных пути для удовлет-
ворения потребности в аминокислотах: получение готовых амнно-
103
кислот извне и самостоятельный синтез аминокислот из компо-
нентов среды.
Азот в средах для культивирования может присутствовать в
минеральных соединениях или входить в состав органических ве-
ществ, содержащихся в растительных или животных продуктах.
Для лабораторных опытов или получения особо важных или до-
рогих продуктов микробиологического синтеза могут быть исполь-
зованы мясные среды Однако они имеют крайне ограниченные
области применения Может быть использована рыбная мука. Хо-
рошим для многих процессов продуктом является молочная сыво-
ротка, однако не решены некоторые вопросы, связанные с ее кон-
центрированием и транспортировкой Из растительных продуктов
довольно широко распространены кукурузный экстракт, соевая,
арахисовая, кукурузная мука, различные жмыхи и шроты.
В последние годы получает распространение среда из дрожжей,
выращенных на углеводородах или гидролизатах древесины.
Дрожжи обычно предварительно подвергают ферментативной или
химической обработке для получения растворимых продуктов.
Существенным недостатком этих продуктов является непостоянст-
во их химического состава и отсутствие возможности сколько-ни-
будь надежно стандартизировать их. Из азотсодержащих соеди-
нений здесь преобладают белки, пептиды, свободные аминокисло-
ты, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды н т. д
В кукурузном экстракте примерно половина количества по мас-
се приходится на воду; содержание общего азота колеблется в
пределах 3,0- 8,0 % (в пересчете на сухую массу); аминного азо-
та — 1,0—3,0 %. Этот экстракт содержит все протенпогенные ами-
нокислоты. Количество отдельных аминокислот существенно ко-
леблется в зависимости от степени зрелости, сорта, места произ-
растания и метода обработки кукурузы. Последнее в равной сте-
пени относится и ко всем другим растительным продуктам. Куку-
рузный экстракт в отличие от других природных продуктов, ис-
пользуемых в качестве компонентов сред, содержит относительно
немного белковых веществ и больше свободных аминокислот или
низкомолекулярных пептидов.
Белковыми веществами более богата соевая мука Необходимо
иметь в виду, что все перечисленные вещества одновременно слу-
жат источниками углерода. Общая характеристика химического
состава некоторых из названных продуктов дана в табл. Х-1. Как
было отмечено в предыдущей главе, содержащиеся в среде белки
прежде чем поступить в клетку должны быть гидролизоваиы до
аминокислот или олигопептидов В ряде случаев, когда у культу-
ры отсутствует транспортная система для тех или иных аминокис-
лот, они подвергаются дезаминированию Ферментативный гидролиз
белков среды осуществляют внеклеточные протеазы и пептидазы
У различных микроорганизмов в зависимости от их генетических
особенностей и физиологического состояния синтезируются и вы-
деляются в среду ферменты, действующие в различных интервалах
pH и обладающие избирательной специфичностью.
104
Таблица Х-1. Химический состав кормовые дрожжей, рыбкой
Белок (N X 6,25) 43—58 48-58 48-62 46
Липиды 0,3—4,0 1,0—5,0 2,0—11,0 1,5
Углеводы 11—23 ' 10—22 — 28
Зола 6,0—11,0 6,0—12,0 32 8
% к белку (N X 6,25)
Из минеральных соединений азота в состав сред вводят солц,
содержащие ион аммония или нитрдт-ион. Непосредственно в об-
мел веществ микробной клетки включается ион аммония. В связи
с этим если в среду введен нитрат-нон, то он должен быть восста-
новлен. Восстановление нитрат-иона до нитрита происходит в нит-
рат-редуктазной реакции, осуществляемой молибденсодержащей
нитрат-редуктазой (см. гл. VIII). Ферментные системы, катализи-
рующие ход реакций от нитрита до аммиака, не описаны. Пред-
полагается, что промежуточными продуктами здесь являются ги-
поинтрит и гидроксилам ин. Однако они не были идентифицирова-
ны как продукты данной реакции в микробных клетках:
NH/JH
гидроксил^ии
Применение солей азотной кислоты может вызывать резкий
сдвиг pH среды в щелочную зону. Происходит это вследствие ин-
тенсивного использования азота и несбалансированного накопле-
ния катиона, который был внесен вместе с солью. При введении
в среды аммонийных солей наблюдается сдвиг pH в кислую об-
ласть. Чтобы избежать закисления, в среду добавляют мел. Ион
105
Ca2+ образует co многими анионами нерастворимые соли. Если
в качестве конечного готового продукта используется биомасса, то
этот метод непригоден, так как нерастворимые соли кальции оста-
нутся на фильтре.
2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АССИМИЛЯЦИИ
Аммонийный азот, попадая в клетку, включается путем ами-
нирования в органические соединения, образуя аминокислоту. Та-
кими органическими соединениями в первую очередь являются
кислоты, содержащие нетогруппу: пировиноградная, а-кетоглута-
ровая, щавелевоуксусная. Синтез глутаминовой кислоты происхо-
дит благодаря активности глутаматдегидрогеназы:
НООССН2СН5СОСООН+НАД (Ф) h+h-h+niw
^HOOCCHaCHsCH (NHj) СООН-* НАД (Ф)++Н2О.
Имеется точка зрения, что система НАДФ функционирует тог-
да, когда происходит синтез аминокислоты, а НАД—в случае ка-
таболического процесса.
Глутаматдегидрогеназа является аллостерическим ферментом,
что крайне важно в связи с центральным местом, которое она за-
нимает в обмене аминокислот Из глутаминовой кислоты посредст-
вом ряда ферментативных реакций синтезируется пролин, арги-
нин, а также ряд других аминокислот с помощью реакции транс-
аминирования (см. ниже).
У многих микроорганизмов глутаматдегидрогеназа является
единственной ферментной системой, которая осуществляет вклю-
чение аммонийного азота в молекулу органического вещества. Че-
рез пировиноградную кислоту происходит синтез с-аланина. Ала-
яиндегидрогеназа осуществляет следующую реакцию:
НООССОСНз+НАДН+ Н++N Н3^
Ч^НООССН (NH2)CHs+НАД++ Н2О.
Вопрос о непосредственном энзиматическом включении иона
аммония в молекулу щавелевоуксусной кислоты остается откры-
тым. Аспарагиновая кислота образуется из фумаровой кислоты
и иона аммония. Ферментативный катализ осуществляет аспартаза
^аспартат-аммиак-лиаза):
НООС—СН
СООН
I
сн-соон сн2
chnh2
соэн
Как в реакциях анаболизма, так и катаболизма аминокислот
участвуют трансаминазы (аминотрансферазы), осуществляющие
106
перенос а-аминогруппы аминокислоты к ц-углеродному атому пи-
ровиноградной, а-кетоглутаровой или щавелевоуксусной кислот.
В результате реакции образуется а-кетоаналог аминокислоты, а
а-кетокислота превращается в соответствующую а-амннокислоту:
R,—CH (NH2)— COOH+R2COCOOH^
^RiCOCOOH+RsCH- (NH2)COOH.
Реакции, катализируемые трансаминазами, легко обратимы, н
их константы равновесия обычно близки к единице. Для всех из-
вестных трансаминаз коферментом служит пиридоксальфосфат.
Выше было отмечено, что ввиду отсутствия транспортных сис-
тем для переноса аминокислот в клетку может происходить энзи-
матическое отщепление аминогрупп. Полагают также, что этот
механизм позволяет культуре создавать необходимую буферную
систему в среде. Известно несколько ферментных систем, осуще-
ствляющих дегидрогеназные реакции на алифатических аминокис-
лотах, в результате чего одним из продуктов реакции являетси ион
аммония:
L—R—CH(NHb) СООН+Н2О+НЛД^
->RCOCOOH+NH3+HAAH.
В этих реакциях функцию акцептора выполняет НАД+ или
НАДФ+
Существуют также ферментные системы, где акцептором слу-
жит кислород. Это оксидаза L-аминокислот:
L—R—CH (NH2) СбОН + Н2О+О2->-
->R СОСООН + NHs + НгОз-
При сдвиге pH в кислую зону отмечается реакция декарбокси-
лирования аминокислот с образованием аминов:
R—CH (NH2) cooh->rch2nh2+co2.
Среди аминов встречаются высокотоксичные вещества, обра-
зующиеся при. декарбоксилировании лизина и орнитина, соответ-
ственно кадаверин и путресцин; нз гистидина — гистамин, сильное
средство, оказывающее влияние на кровяное давление. У бакте-
рий и актиномицетов имеются ферментные системы декарбоксили-
рования глутаминовой кислоты. При этом в зависимости от того,
какая из карбоксильных групп подвергается декарбоксилирова-
нию, образуется а- или у-аминомасляная кислота.
Ароматические аминокислоты проходят более сложный путь
катаболизма, чем алифатические, превращаясь в метаболиты, ко-
торые легко ассимилируются клеткой. Эти ферментные системы
обычно находятся внутри клетки
При изучении возможности использования аминокислот в ка-
честве источников углеродного и азотного питания в состав среды
107
вводят исследуемую аминокислоту, затем определяют ее количест-
венное содержание по ходу культивирования. Параллельно про-
водят наблюдение за ростом культуры. При использовании комп-
лексных сред, содержащих продукты неопределенного химическо-
го состава (дрожжевой экстракт, соевая мука и т. п.), часть ами-
нокислот находится в свободном состоянии, часть —в связанном.
В этом случае очень трудно установить, какие из присутствующих
в среде аминокислот наиболее интенсивно включаются в метабо-
лизм Белок среды в течение некоторого времени остается не пол-
ностью гидролизованным протеазами микроорганизма. Амино-
кислоты постепенно освобождаются при гидролизе белка, поэтому
для оценки интенсивности включения аминокислот в обмен ве-
ществ создают синтетические среды, состоящие из индивидуаль-
ных аминокислот. Анализ содержания аминокислот в таких средах
показывает, например, что в опытах с актиномицетом рапыпе дру-
гих из среды исчезают глутаминовая и аспарагиновая кислоты и
а-аланин Такие опыты позволяют учесть возможное взаимодейст-
вие между аминокислотами.
Влияние источника азота на биосинтез продукта или рост био-
массы зависит не только непосредственно от конкретного источ-
ника азота, но также и от общей композиции среды. Существен-
ное значение здесь имеет отношение присутствующего в среде
азота к углероду (N t С). Применительно к каждому штамму-про-
дуценту и целевому продукту эта величина будет различной.
ГЛАВА XI. АССИМИЛЯЦИЯ УГЛЕВОДОВ
МИКРООРГАНИЗМАМИ
1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ АССИМИЛЯЦИИ
УГЛЕВОДОВ
g
Обмен углеводов призван удовлетворять три основные потреб-
ности клетки: 1) получение энергии; 2) образование предшествен-
ников, необходимых для синтезов; 3) создание окислительно-вос-
становительных механизмов для превращения этих предшествен-
ников в соответствующие промежуточные или конечные продукты,
-которые могут быть использованы в качестве клеточных компо-
нентов.
Углеводы вводят в среды в виде чистых сахаров, из которых
чаще других применяют глюкозу, сахарозу, лактозу или техниче-
ские продукты, богатые углеводами, например гидрол, представ-
ляющий собой маточник после кристаллизации глюкозы, крахмал
(как технический, так и входящий в состав муки, отрубей и т. п.),
мелассу. Все они содержат преимущественно гексозы, обычно в
виде полимеров. При использовании отходов гидролизного произ-
водства в средах присутствуют пентозы В последние годы в ка-
честве компонента среды применяют молочную сыворотку, содер-
жащую лактозу. Если вводят отходы растительных продуктов, в
частности свекловичный жом, то в них присутствуют уроновые
'108
кислоты. Иногда компонентами сред яаляются многоатомные спир-
ты, например манннт.
Несмотря на разнообразие возможных углеводов, присутствую-
щих в средах, все они вступают на путь, характерный для ката-
болизма глюкозы. Имеются ферментативные механизмы, которые
осуществляют этот процесс. Поэтому обычно, когда рассматрива-
ют пути включения углеводов в метаболизм клетки, в качестве
исходного продукта принимают глюкозу. Известны три пути ас-
симиляции глюкозы I) гликолиз; 2) гексозомонофосфатный путь
/пентозный, пентозофосфатный); 3) путь Энтнера — Дудорова, ко-
*-АДФ
неру—Дудорову
L---'НАД®
' Ь—«-НАДФ-Н
2-жето-3-дезокси-6-фосфоглюко-
вовая к-та (КДФГ)
СНО
нА—ОН
I О
СНО©
альдегид
торый часть именуют КДФГ-путь по наличию характерного для
него продукта обмена — 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовой кис-
лоты (рис. Х]-1). Первые два пути осуществляются практически
2СНвСН,0Н этавол
t»~2Hs0
£
2 СН.СН2О адетальдегд
2 ИСОН
н/OPOj2 2НАД* гнАД-и Н2СОР10
Рис. XI-2. Сбраживание глюкозы, или гликолиз
у всех промышленно важных микроорганизмов, относящихся как
к прокариотам, так и к эукариотам.
Гликолиз представляет собой совокупность анаэробных фер-
ментативных процессов распада глюкозы. Биологическое значение
гликолиза заключается в том, что в результате распада углево-
дов образуются богатые энергией фосфорные соединения и веще-
ства, используемые для синтеза, а также являющиеся основными
субстратами для окисления. Один из главных субстратов окисле-
ния — пировиноградная кислота (рис. XI-2).
2. ГЕКСОЗОМОНОФОСФАТНЫИ ПУТЬ
Другой путь ассимиляции глюкозы в отличие от анаэробного—
окислительный, центральным звеном которого является образова-
ние пеитоз (рис. XI-3), поэтому этот путь называют пентозным.
110
Пентозный, или гексозомонофосфатный, путь метаболизма глюко-
зы играет существенную роль в реакциях синтеза. Особое значе-
ние пентозный путь имеет в формировании циклических структур,
в частности азотсодержащих. К основным функциям цикла отно-
сят следующие: 1) он поставляет восстановленный НАДФ, необ-
ходимый для синтетических процессов; 2) поставляет энергию;
при полном окислении всех восстановленных молекул НАДФ на
одку молекулу окисленной глюкозы образуется 36 молекул АТФ;
3) осуществляет взаимопревращения гексоз и пентоз. Пентозный
путь обычно функционирует одновременно с гликолитическим.
В результате их взаимодействия создаются возможности для об-
ратимых взаимопревращений трех-, четырех-, пяти-, шести- и се-
миуглеродных сахаров путем обратимого переноса двух- и трехуг-
леродных фрагментов (гликоальдегидных или диоксиацетоновых
групп).
Первая реакция пентозного пути осуществляет дегидрирование
первого углеродного атома глюкозо-6-фосфата, катализируемое
гл юкозо-6-фосфат дегидрогеназой. В результате образуются 6-фос-
фо-глюконо-б-лактон и НАДФ-Н. Лактон гидролизуется лактона-
зой до 6-фосфоглюконата. На следующей стадки 6-фосфоглюконат
подвергается окислительному декарбоксилированию при участии
6-фосфоглюконатдегидрогеназы, в результате образуется кетопен-
тоза: D-рибулозо-б-фосфат. Эта реакция сопровождается образова-
нием еще одной молекулы НАДФ-Н. При участии изомеразы и
эпимеразы возникают ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат. Да-
лее транскетолазная реакция приводит к образованию седогепту-
тулозо-7-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата. Транскетолаза, со-
держащая связанный с ней кофермент тиаминпирофосфат, осуще-
ствляет перенос гликоальдегидной группы (СН2ОН—СО—) от
О-ксилулозо-5-фосфата к D-рибозо-б-фосфату. В этом процессе
гликоальдегидная группа сначала переносится от D-ксилулозо-б-
фосфата к связанному с ферментом тиаминпирофосфату:
112
Седогептулоэо-7-фосфат и глицеральдегид-З-'фосфат в резуль-
тате действья трансальдолазы образуют фруктозо 6-фосфат н эрит-
розо-4-фосфат. В трансальдолазной реакции происходит перенос
диоксиацетоновой группы к D-глицеральдегид-З-фосфату:
ОНО
нЬэн
I
неон
сн2оро’_
Повторяющаяся транскетолазная реакция между ксилулозо-5-
фосфатом и эритрозо-4-фос.фатом приводит к образованию фрук-
тозо-6-фосфата н глицеральдегид-3-фосфата— характерных про-
дуктов гликолитического пути распада углеводов. 3-фосфогл и цери-
ловый альдегид, изомеризуясь в диоксиацетонфосфат, дает с по-
следним под действием фруктозобифосфат-альдолазы фруктозо-1,6-
дифосфат. Гексозоднфосфатаза превращает фруктозо-1,6-дифос-
фат во фруктозо-6-фосфат:
Глюкозофосфатизомераза превращает последний в глюкозо-6-
фосфат.
В результате функционирования пентозного пути из 6 молекул
глюкозо-6-фосфата, вступивших в реакцию, образуется пять моле-
113
кул фруктозо-6-фосфата, изомеризующихся в пять молекул" Глю-
козо-б-фосфата.
Итоговое уравнение:
6(Г-6-Ф) + 12НАДФ-
►бСОа+5(Г-6-Ф) + 12НАДФ-Н+ Ф„'+ 121Р
Сильным ингибитором гексозоизомеразной реакции является
эритрозо-4-фосфат. Следовательно, если в системе ферментов пен-
тозного пути образовались промежуточные продукты гликолиза
(фруктозо-6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат), то превращение
фруктозо-6-фосфата в глюкозо-б-фоцфат исключено до тех пор,
пока присутствует эритрозо-4-фосфат, и дальнейшие превраще-
ния фруктозо-6-фосфата могут идти лишь гликолитическим
путем.
Исключительно важное значение имеет механизм переключе-
ния ассимиляции глюкозы с одного пути на другой. Одним нз ре-
гулирующих факторов, направляющих глюкозу иа путь гликоли-
за, или пентозофосфатный путь, является присутствующий в сре-
де фосфат. Его избыток угнетает активность глюкозо-6-фосфат-
дегидрогеназы, ключевого фермента пентозофосфатного цикта, а
посему вместо 6-фосфоглюконата в результате активности фосфо-
гексозоизомеразы образуется фрунтозо-6-фосфат.
Таким образом глюкоза вступает на путь гликолиза. Какая
часть введенной в среду глюкозы подвергается распаду по тому
или иному нз названных путей, удается легко определить, приме-
няя меченые радиоактивные соединения. Замечено, что у Aspergil-
lus niger, в культурах которого происходит интенсивное споро-
образование, преобладает гликолитический путь, в то время как
у молодого неспорообразующего—пентозофосфатный. У другой
культуры — Aspergillus nidulans—было обнаружено значительное
повышение функциональной активности пентозофосфатного пути
в период экспоненциальной фазы роста, т. е. тогда, когда потреб-
ность в восстановленных коферментах НАДФ для целей биосин-
теза очень велика.
Для выяснения вопроса о том, какая доля глюкозы ассимили-
руется по гексозомонофосфатному пути, какая по гликолитическо-
му, используют методы с применением изотопной метки. Одну
часть пробы инкубируют с ,4С-1-глюкозой, другую — с ,4С-6-глю-
козой. Затем отмечают момент появления метки в молекулах СОг,
образующихся в результате окисления обоих субстратов. Если в
клетках окисление глюкозы идет по глико чнтическому пути, а
затем через цикл трикарбоновых кислот, то метка должна появ-
ляться в молекулах СО2 в обоих вариантах одновременно. Если
ассимиляция происходит через гексозомонофосфатный путь, то
метка будет появляться в COj сначала только в первом варианте,
т. е. с 14С-1-глюкозой.
114
3. ВКЛЮЧЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ,
отличных от глюкозы
Как было сказано выше, соединения, отличные от глюкозы,
например уроновые кислоты или многоатомные спирты, чтобы
включиться в метаболизм, должны претерпеть ряд энзиматических
превращений. Так, при введении D-манннтола (маннита) в среду
имеются две возможности его включения в гликолиз: 1) благода-
ря активности маннитолкиназы с образованием маннитол-I -фос-
фата и далее НАД зависимая- манннтол-1-фосфатдегидрогеназа
превращает его в D-фруктозо-б-фосфат; 2) альтернативный путь
обеспечивает одна из маннитолдегидрогеназ (с НАД или НАДФ
в коферментной части). Здесь образуется фруктоза, которая фос-
форилируется до D-фруктозо-б-фосфата. Последняя, как известно,
легко превращается в D-глюкозо-б-фосфат при участии глюкозо-
фосфатизомеразы. Таким образом маннит вступает на путь гли-
колиза. Очевидно, не исключено, что часть его может включиться
в обмен по пентозофосфатному пути.
Другим примером может послужить D-галактуроповая кислота,
мономер пектовой кислоты, простейшего представителя пектино-
вых веществ. В результате ряда последовательных реакций про-
исходит ее энзиматическое превращение — л'----------"--------
альдегида и пировиноградной кислоты:
до фосфоглпцеринового
(КФ 2,7.1.57)
Манпитолдегидрогеназа (КФ 1.1.1.67) имеет в качестве кофер-
мента НАД+, маннитолдегидрогенаэа (КФ 1.1.1.138)—НАДФ+-
115
состав среды иногда вводят лактозу в виде чистого или тех-
вического продукта, или лактоза входит в сырье, применяемое в
качестве одного из компонентов сред, например в молочную сыво-
ротку. Лактоза первоначально расщепляется р-галактозвдазой на
галактозу и глюкозу. Для ассимиляции галактозы предложены
два пути:
1) галактоза+АТФ^±галактоэо-1-фосфат+АДФ; D-глюкозо-!-
фосфат-рУТФ^УДФ-глюкоза-|-фФи; галактозо-1-фосфат+_УДФ»
глюкоза=тылюкозо-1-фосфат-I-УД Ф-га л актоза;
УДФ-галактоза=₽г=УДФ-глкжоза.
Рш. XI-4. Роль УДФ-углеводов при образовании различных моносахаридов ;
116
Другой моносахарид, входящий в состав лактозы,—глюкоза
участвует в этих реакциях в виде своего фосфорилированного про-
изводного — глюкозе-1 -фосфата;
2) галактоза + АТФч±галактозо-1-фосфат+АДФ;
галактозе-1-фосфат+УТФ**УДФ-галактоза + ФФ8;
УДФ-галактозаз^УДФ-глюкоза;
УДФ-глюкоза+ ФФвч*глюкозо-6-фосфат+ УТФ.
Роль УДФ-углеводов при образовании производных различных
моносахаридов показана на рис. Х1-4.
В результате катаболических процессов превращения глюкозы
образуется один из важных продуктов обмена веществ — пирови-
ноградная кислота Последняя является субстратом многочислен-
ных реакций, особенно при брожении Формально пировиноградная
кислота не входит в цикл три карбоновых кислот, однако в резуль-
тате серии реакций пируватдегидрогеназного комплекса образует-
ся ацетил кофер мент.
4. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Цикл трикарбоновых кислот, осуществляемый на последнем
этапе катаболизма глюкозы, одновременно служит для клетки ис-
точником исходных продуктов для реакций биосинтеза. Здесь
практически сходятся все пути катаболизма. Общая схема цикла
и названия ферментов, осуществляющих процесс, представлены
на рис Х1-5-- Основная функция цикла заключается в дегидриро-
вании уксусной кислоты, что в итоге приводит к образованию двух
молекул COs и четырех пар атомов водорода В цикле происходит
также образование НАД-Н и АТф, идущих на энергетические
нужды. Как полагают, большинство реакций цикла обратимы Тем
не менее, основным направлением течения энзиматических реак-
ций в цикле можно считать путь в сторону образования щавеле-
воуксусной кислоты через а-кетоглутаровую, янтарную, фумаро-
вую кислоты. Это положение следует из-за отсутствия доказатель-
ства функционирования а-кетоглутаратдегидрогеназного комплек-
са в направлении синтеза а-кетоглутаровой кислоты из сукцина-
та и СОз. Полагают, что реакцией, лимитирующей скорость обо-
рота цикла, является окисление изолимонной кислоты' до а-кето-
глутаровой, катализируемое аллостерическим ферментом изодит-
ратдегидрогеназой. Для эукариотов характерна локализация фер-
ментной системы цикла в митохондриях, у прокариотов, не имею-
щих митохондрий, — в цитоплазматической мембране Митохонд-
риальная мембрана обладает способностью к избирательной про-
ницаемости метаболитов цикла- Так, интактные (неповрежденные,
неразрушенные) митохондрии не пропускают НАД в востановлен-
ной форме. Непроницаема митохондриальная мембрана для аце-
тил-КоА. Последний факт, естественно, вызывает вопрос о том,
что же является источияком ацетил-КоА, который идет на синтез.
Продуктом цикла, легко переходящим в цитоплазму сквозь мем-
117
брану, является лимонная кислота. Она же служит исходным про-
дуктом внемитохондриального синтеза ацетил-КоА:
цитрат-ь АТФ4- HSKoA^t
^±ацетил-КоА+ оксалоацетатч-АДФ+Фн.
Вторая реакция проходит с участием ацетаттиокиназы:
ацетат+АТФ+HS КоАчаацетил-КоА+АМФ+ФФ„.
Высокие концентрации углеводов, присутствующих в среде,
могут подавлять окислительные процессы, вызывать повышенную
нымв линиями. Участвующие в цикле ферменты:
активность ферментов гликолиза, и далее усиление процессов бро-
жения. В связи с этим, если путь биосинтеза целевого продукта
связан с функционированием цикла Кребса, необходимо сбалан-
сировать исходную концентрацию углеводов и фосфатов в среде.
Как правило, из цикла Кребса на нужды биосинтеза уходит зна-
чительное количество промежуточных метаболитов (например, на
синтез глутаминовой кислоты из а-кетоглутаровой: ацетил-КоА+;
щавелевоуксусная кислота—«-лимонная кислота-на-кетоглутаровая
кислота-»тлутаминовая кислота).
В результате такого процесса из цикла будет уходить щавеле-
воуксусная кислота, и цикл перестанет функционировать. Од-
нако этого не происходит, поскольку существуют специальные фер-
ментативные механизмы, пополняющие фонд промежуточных про-
дуктов цикла. Такие реакции называют анаплеротическими (воз-
мещающими). Одна из таких анап теротических реакций — карбо-
ксилирование пирувата с образованием щавелевоуксусной Кис-
СН3С0С00Н+АТФ+со2+н2о
-иН00СС0СН2С00Н +АДФ+НзРО4.
Очевидно, ее концентрация должна всегда поддерживаться на
достаточно высоком уровне, необходимом для эффективного функ-
ционирования цикла. Она необходима как акцептор ацетил-КоА.
S. ГЛИОКСИЛАТНЫЙ ПУТЬ
Анаплеротическую функцию выполняет действующий одновре-
менно с-циклом Кребса глиоксилатный шунт (цикл). В отличие от
первого, где происходит окисление уксусной кислоты, в глиокси-
латном цикле уксусная кислота идет на синтез. Для функциони-
рования этого цикла необходимо иметь два фермента: изоцитрат-
лиазу, расщепляющую изолимонную кислоту на янтарную и глио-
ксиловую, и малатсинтазу, катализирующую присоединение Глио-
ксиловой кислоты к ацетил-КоА с образованием яблочной кисло-
ты (см. рис. XI-5) При каждом обороте глиоксилатного цикла две
молекулы ацетил-КоА включаются в цикл. Суммарный результат
реакций, показанных на схеме, заключается в превращении этих
двух молекул ацетата в молекулу щавелевоуксусной кислоты. Од-
новременно образуется одна молекула янтарной кислоты. Эта кис-
лота идет на биосинтез, одна пара атомов водорода переносится
от яблочной кислоты к кислороду через дыхательную цепь, регу-
лятором чего является окислительное фосфорилирование АДФ.
Таким образом, глиоксилатный цикл поставляет для различных
процессов биосинтеза как энергию, так и четырехуглеродные про-
межуточные продукты.
Особое значение приобретает цикл Кребса в тех случаях, ког-
да рост микроорганизмов происходит на ацетате ити субстратах,
119
налр“!?> жв₽™ «
«У КоА >»^.0£^^^=ак™ую фор-
ществ. 5 А j веяно включается в обмен ве-
жга™ цикла
SX “В’хН“”1^7“ S«™ns:
активности ферментов цикла Эти механизмы вхпя^’Х. Меланизмы регуляции
но реакции цикла, но и широкий круг“смежных “ голько явствен-
хательвач цепь а систеиа « таких- как
Сложность проблемы усугубляется тем что X /L ви«янгетические реакции,
стви механизмов, влияющих как на актиннлет/л!?™ <1Существляется при уча-
их биосинтеза, т. е. на7Япш|Udob^ JepMeHT0B- ™ « «а процессы
ацетил-КоА, является окислительное ипигпе: рвои Ре8КЧней, вводящей в цикл
руемое лируватдегвдрогеиазиым коммеЖ°Крвг^ХИНе пкрувата- «ятализи-
существенное значение, так как опоеделярт нэип уляция ®го активности имеет
>тм кота, кс иож„ .ктши„0£“" JX Wy™». Фер-
в гляколиз, может конкурентно °Р метаболитами, входящими
ми — НАДН+ н ацетил КоА Так уи₽пипеципСЙ^СВОИмИ с°бстиен,,ыми продукта-
3 вызывает 90 %-вое сниже1.иГ'е^п^ отношения НАДН/НАД+ от I до
'«“"кк-КоА’/КоА „рш,м„ к ,™уРм кф&"“- * у“”«™ гаоаеки
Р= - »*. КА^Н'ДЯ ”Р
~я~
ври ккрсоталкротт пироовиоХм „Р ™“ иимеаоувдау» кисло/у
женой лируваткарбоксилазы основными регулят^ашТя^п!^ АТф- Для др01к'
форилироваиия, ацетил-КоА и асП80тат₽ я^ляются потенция т фое-
на нируваткарбоксилазу так и на тл1сйя^»»Т'2<ИЧе'жи^ за₽яд действует как
«УЛиРУет нируваткарбоксилазу « khXCSEvb^SJ ЭТ°И сти'
КоА также активирует йирувэткарбоксшЛ^6:1 вир> ватДекарбокаиИзу. Ацетил-
ен СО2 с биотинсодержащим ферментом н\^бйт^тВп°6₽аЭО0авИИ/омплек‘
как продукт реакция. Специфическим W "«Руватдекарбоксилазу
ется L-аспарзгшгоаая кислот® образующаяся °₽°” ™РУва'гкарбоксилазы яВля-
ровавия щапелеиоуксусной кислоты. В ₽езу'га,тате реакции переамини-
ной кислотой, кгтализщ^мия^ратХвдТо'й4^ ТО 1вдв«левоуМ5'с-
является главным контролирующим звниом ’™пЛм№КТИВН0СТЬ ЦитРатсянтязы
Никле. Применительно к дрожжам Д“яюшим скорость потока в
скорость Цитратсинтазной рАРХТзаП(н^т ^жаОе в^ШИНс+в1' аУ^Р‘^ов)
велевоуксусной кислоты п ацетил Ко а % ,в₽ежде всег<> от концентрации ща-
воуксусвдй кислоты из Яблочвдй являетсятеп«^п«ИЯХ' ОбРвэоеаняе щавеле-
акцней. и является термодинамически невыгодной ре-
Цитрасинтааная реакция представляет cofinii nan«.us
лядин ие только в ЦТК, но и в связХых омкпп™ьм^ваЖ!!Ое эве«о регу-
ную роль В интеграции клеточного обмена С питпят^ ЛЛаЮЩИХ пеРиос'1е’1ен-
ИпАСКНГа ЖИ₽Оа’ так как нитрат явХ5 И ' £ ”а-
КоА образованный в митохондриях транспоотип^Х’ оЛ.^Де которой адетил-
мембрану и поступает в цитоплазму. В цотопЕ пи «„^^Х°НЛриалья>гк>
ацетвл-КоА при учасгал АТФ-зависимой цотра-миАы iF™ превРашается в
клетках играет нажяую роль в поояаприни т,=^.-г^Э8Ы' Ч^Р07 ® дрожжевых
можеяии брслшгьной^активноста дЛТиирм вастсровского эффекта, т е. в тор-
ром фосфофруктоииназы (см. гл. XIV). ЯЯСЬ аллосге₽ичесним ингибнто-
120
ты. Ингибирующий эффект на цнтратсиятазу оказывают НАДН и сукцнйил-КоА.
Но основдое влияние на скорость синтеза цитрата оказывает поступление суб-
обратимые взаимопревращения цитрата, qnc-аконитата и изоцитрата
формы изоцитрат дегидрогеназы, ^различающиеся по коэнзимной специфичности,
Одна из них,ЦАД-зависимая. локализована исключительно в митохондриях, дру-
/АМФ.^Всякая функциональная активность^ приводящая к уменьшению АТФ/АМФ,
вызывает активацию цикла трикарбоиовых кислот за счет увеличения актнв-
новятельных эквивалентов в дыхательную цепь имеет своим следствием увели-
чение АТФ/АМФ Это В стою очередь приводит к торможению цикла трикар-
ров или активации глюконеогенеза Возможен также синтез н других метабо-
литов, имеющих ацетил-КоА в качестве исходного продукта реакции синтеза.
Как было сказано выше, у микроорганизмов изоцитрат подвергается пре-
вращениям либо через изоцитратдегидрогеназу, либо через изоцитратлиазу по
глиоксилатпому пути. У многих микроорганизмов активация глноксилатпого пу-
ти наблюдается при выращивании их на средах, содержащих в качестве основ-
репрессни^ферментов глиоксилатиого цикла), на среду с ацетатом в аэробных
ток Candida tcopicalis со среды, содержащей гйюкозу, па ереду с гексадеканом
также сопровождается значительной активацией названных ферментов. «Гек-
садекановые» дрожжевые клетки характеризовались также значительно более
Для а-хетогяутаратдегидрогеназы положительным эффектором является
АМФ. Снизывание АМФ уменьшает константу Михаэлиса для а-кетоглута
рата в 10 рев. В области физиологических концентраций сукцинил КоА и НАДН
са Субстраты сукцинатдегидрогеназы и иэоцитратдегидрогеиазы выполняют
функцию положительного аллостерического эффекторе.
Важным ферментом цикла трикарбоиовых кислот, с точки зрения его регу-
малатдегидрогеназу. и активирует митохондриальную форму АТФ, наоборот,
ингибирует митохондриальную форму малатдегидрогеиазы. С ЦТК связан лишь
ъгитохондриальяый фермент, являющийся конститутивным ферментом Цитоплаз-
Анализ последовательных стадий цикла v микроорганизмов позволяет за-
ключить, что ЦТК является, универсальным механизмом для окисления ^пита-
рий, неспособные окислять компоненты ЦТК вследствие нарушений в индиви-
дуальных реакциях цикла, имеют низкий уровень ввек чего итого АТФ. Помимо
энергетической и биосинтетической функций цикл имеет и регуляторное значе-
ние, осуществляя связь между соединениями, находящимися на перекрестке важ-
ных метаболических путей.
121
для оптимального его функционирования, так как непрерывная работа ЦТК
ГЛАВА ХИ. АССИМИЛЯЦИЯ ЖИРОВ
МИКРООРГАНИЗМАМИ
1. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ЖИРОВ
При культивировании микроорганизмов в состав сред могут
входить жиры. Они присутствуют как компоненты необезжиренных
растительных веществ, например соевой или кукурузной муки.
В промышленности, где к готовым продуктам предъявляют высо-
кую степень чистоты, жиры вводят в среды в качестве пеногасите-
лей. Расщепление жира и его ассимиляция микроорганизмами на-
чинается с воздействия фермента липазы, выделяемого клетками
в среду. Липаза представляет собой эстеразу, гидролизующую
эфирные связи между кислотой и спиртом, в частности для тригли-
церидов,— между глицерином и высокомолекулярными жирными
кислотами:
СНг—О—ОС—R, СН8-ОН
СН—О—ОС—R2+3H2O СНОН + RjCOOH
1 । л I
СНг—О—ОС—R3 СН2ОН Р2СООН
RjCOOH
Такая эстераза именуется по современной номенклатуре—три-
ацилглицероллилаза. По ходу ферментации липаза почти нацело
разрушает жир на глицерин и жирные кислоты. В дальнейшем
происходит фосфорилирование глицерина с образованием 1-глице-
ролфосфата, после чего последний включается в обмен веществ
микрооргаинзма.
В культурах микроорганизмов, по-видимому, содержится не-
сколько липаз, действующих в различных интервалах pH. Присут-
ствие в среде жиров ведет, как правило, к повышению липолити-
ческой активности культуры, хотя детальный молекулярный ме-
ханизм такого эффекта не раскрыт. Не показано, какое конкретно
вещество является истинным индуктором процесса сверхсинтеза
фермента. Возможно, в случаях с эукариотными организмами
происходит разрушение мембран у лизосом, поскольку одновре-
менно повышается уровень других кислых гидролитических фер-
ментов.
При анализе содержания жиров и их компонентов по ходу
культивирования было показано, что для большинства культур ха-
рактерна более интенсивная ассимиляция ненасыщенных кислот.
Было детально изучено потребление различных фракций кашало-
122
2. fi И а-ОКИСЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
тового жира при росте культуры Penicilliuin nigricans. Исходная
среда содержала 5 % каталогового жира. Из нее прежде всего
исчезали триглицериды, при этом одновременно увеличивалась
фракция свободных жирных кислот. Только после истощения три-
глицеридов и свободных жирных кислот происходило усиление
потребления спермацета. Из жирных кислот наиболее интенсивно
использовались непредельные жирные кислоты: олеиновая, лино-
левая, линоленовая, арахидоновая. Так, количество олеиновой кис-
лоты в культуральной жидкости за время культивирования умень-
шалось почти в 6—10 раз. Жиры могут практически полностью
заменять углеводы при ферментации некоторых антибиотиков и
продуцентов липазы. Присутствие’жиров в среде даже в качестве
пеногасителей, т. е. в относительно невысокой концентрации, ве-
дет к замедлению ассимиляции углеводов.
цепи актвирует жирные кислоты, содержащие от 4 до 12 атомов углерода.
Тиокиназа жирных кислот с длинной цепью активирует жирные кислоты, со-
держащие от 12 до 22 и более атомов углсродв. Реакция идет в присутствии
СООН+АТФ+KoASH-»-R—С—S—Ко А+АМФ+ФФН
жирных кислот, является аденилат жирной кислоты-
активацией, начинается с ферментативного дегидрирования по а- и р-атомам
углерода, в результате чего получается КоА-эфир ненасыщенной кислоты
(Д2-а-гра«с-еноил-КоА) Известны четыре различные ФАД-еодержащие анил-
КоА-дегидрогеназы, каждая из которых обладает специфичностью по отноше-
Рис. X1I-1. Реакция, катализируемая
Д8>-ццс-Д2-8 - трычс-еноил КоА-изоме-
разсй
-»-CHs— (СН2)„—СН= CHCOSKo А4- Е—ФАД геа.
ляется благодаря активности еноилгидратазы. Происходит гидратация ^присо-
единение воды) по двойной Д2>3-транс-связи еноил-КоА с образованием L-3-ок-
сиаимл-КоА:
CHs(CH2)„CH=CHCOKoA+H5O->CHs(CH2)„CHOHCH2COSKoA
Далее КоА-зфир L-3-оксикислоты деградирует, образуя 3-кето-ацил-КоА.
Катализирует реакцию НАД* зависимая L-3-оксиацил-КоА-дегидрогеназа, где
CHs(CH2)„CHOHCH2COSKoA+HAA+^CH3(CH2)„COCH2COSKoA+HAAH+H+.
Последняя стадия катализируется 3-кетоацил-КоА тиолазой. З-Кетоацнл-
КоА реагирует со свободным КоА, й результате происходит образование КоА-
эфира двууглеродного фрагмента — ацетил КоА эфира жирной кислоты, укоро-
сторону.
СНЭ (СН2)иСОСНгСО8Ко А-p KoASH^CH3COSKoA-|- СН2(СН2) „COSKoA
ния ненасыщенных жирных кислот принципиально не отличается от окисления
насыщенных. Однако двойные связи
природных ненасыщенных жирных
та Р-окисления насыщенных жирных
кислот—еноил-КоА, имеющего транс-
коифегурацию двойных связей Кро-
ме two. двойные связи большинства:
ненасыщенных жирных кислот рас-
родные фрагменты ведет к образова-
нию Дзл-ацил КоА, а не Д28-ацил-
КоА. как при р-окнсленпи насыщен-
____ ________г______________ осуществлять.
гае происходит ферментативная реакция, катализирующая переме-
зй связи из положения 3—4 в положении 2—3 и ивменение кои-
—S—KcA
щение двой..^..
Д2-э<гралс-еноил-КоА-ивомераза (рис. Ж).’ тот ермент называется ци
Дальнейший процесс происходит, как описано выше. Ненасыщенные жир-
ные кислоты, у которых количество двойных связей больше, чем одна, напри-
мер линолевая, также подвергаются действию этого фермента (рис ХП-2)..
дг.г-ненасыщенная ^жирная Кислота, двойная связь которой имеет цис-конфи-
гурацию. В результате гидратации такого рода связи возникает D-стереоизомер’
З-оксиацил-КоА. Чтобы дальнейшее окисление молекулы продолжалось, D-изо-
124
мер должен быть превращен в L-изомер. Эту функцию выполняет эпим
Образовавшийся L-3-оксиацнл-КоА, как и было сказано выше, подвер!
окислению под действием L-специфичной 3-оксиацйл-КоА-дёгидрогеназы;
Н
+*М> I
СН3 (СН2)п СНл—СН=СН СО—S КоАCH3(CHs)n—С—СН2—СО—S]
125
C«J у некоторых организмов могут пад^Дся также а 0 йслогы <С'<- С« и
процесс окисления начинается с декарбокмл^овя^а а-°к.ислению. При этом
происходит под действием особо?ZSZ “ ^™Р,*0И кяслоты- №тоР°е
тете образуется соответствующий водорода. В реэуль-
атом меньше, чем исходная жирная KacS A if щии на один УглсР°лный
лению под действием специфической Далее п°Лвергается окис-
торои является НАД. Образуется жипияяДВДр0ГеиазЫ' коФеРментом ко-
родный атом меньше, чем исходнаяР Пил»*, «к ’ сояеР>кац|.ая на одни угле-
может снова подвергнуться оппгяннлы» Образовавшаяся жирная кислота
дуюшнм окислением образовавшегося альдета^я дека₽СоксилиРованИ1° с пос.че-
В процессе образования альдегида п кяч’ргтпв ..
появляется с-оксикнслота По-вндимомл, дч^1ве пР°“ежУточиого продукта
лення заключается в образовании р0ЛЬ пРоцесса а-окис-
углерода, мирных кислот с нечетным числом атомов
3. ПЕНОГАСИТЕЛИ
» '• ° »»”% “ акбк°, л р» • »
вещества коллоидной природы. Кроме того ВСегда со^Р,«атся
рующие образовавшиеся пузырьки пены R ‘жтЛп^^’1 соединсния. стабилизи-
странение синтетические пеногасители 'Bw₽«fSf^W,e ГОДЫ ПОЛУЧИЛИ респро-
культуральиой жидкости. Среди так™х натяжение
органические полимеры (силоксаныР ялк^^^Т*6 названы кпемниЙ-
лученные на основе полиэтилена в^также содединейая- ио-
нии полиэтилена с полиппопялшюи оспове совместной полимсриза-
«ущества сннтеТ1«еских "* МН0Г№ миологические прен-
Некоторые из них пропинол наппимеп ^»еНеНИе т подчас ограничивается,
иикают через цитоплазматач’ескую Spa^vTXa^i'^'’’1'01'0 с₽0ЛС1Ва ПР°-
ствие на клетку, угнетая неспепнЛш™? У оказывают токсическое воздей-
Другаи серьезная опасность - BoaiftS попадщ1ИЯФ1₽Тс=?НЫе РеаКЦИИ-
как большинство ив известных ^е~кик S готовый продукт, так
ферментативному распаду ческих пеногасителей ме подвергается
няют годсолн^Х^аДТи^ое^Тевое иГ°живп™«Й наи6олее часто приме-
пых Эфиров одноатомных спиртов с большим чистом атоуп^гп₽пЛМ ‘гг’ сл£ж"
общего количества жиров, в соевом_____до 50% и? <2>твп1ч.,Д СЯ до ®т
™«.” „,и:а об„аружека
л,„л « ,oVp™l“°“
126
ГЛАВА XIII. АССИМИЛЯЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ,
ЭТАНОЛА, МЕТАНОЛА И АЦЕТАТА МИКРООРГАНИЗМАМИ
1. АССИМИЛЯЦИЯ УГЛЕ БОДО Р.0 ДО В
В последние годы в ряде экономически развитых стран мира
возникла новая отрасль микробиологической промышленности, ос-
новное назначение которой — получать дополнительные кормовые
продукты, богатые белком и витаминами. Из микроорганизмов,
как правило, наиболее часто используют дрожжи, а основным уг-
леродсодержащим компонентом среды являются углеводороды,
преимущественно н-алканы. Ассимиляция углеводородов имеет
свои специфические особенности не только по механизму окисле-
ния и-алканов, но и по механизму транспорта, а также локализа-
ции в клетке По-видимому, дрожжевые клетки, относящиеся к ро-
дам Candida и Torulopsis, не имеют специальных пермеазных сис-
тем, осуществляющих транспорт н-алканов из среды в клетку. Тем
не менее клетка не безразлична к присутствию н-алканов в среде.
Дрожжевые клетки, выращенные на них, имеют некоторые морфо-
логические отличия от клеток, выращенных на глюкозе.
(рис. Xlll-1. XUl-Z)
редвижение через^всю клеточную оболочку до цитоплазматической^мембр
либо углеводный компонент, то, как правило,
а на средах
гают сорбционное равновесие и создают соответствующий сорбционный гр
Рассматривая вопрос о биохимических механизмах окисления
углеводородов необходимо иметь в виду, что н-алканы выделяются
среди органических веществ своей инертностью. Особенность их
строения заключается в том, что все звенья (—СНя—- и CHg—)'
молекулярной цепи не имеют свободных электронных пар или ва-
128
кантных электронных орбит, служащих обычно объектом электро-
фильных или нуклеофильных атак.
Наиболее детально изучена ферментная система окисления уг-
леводородов в аэробных условиях у бактериальных культур, от-
носящихся к Pseudomonas Она содержит три белковые фракции,
которые составляют цепь переноса электронов, напоминающую ды-
хательную цепь в системе окислительного фосфорилирования.
В качестве доноров водорода, служащих источниками электронов,
здесь выступают НАД-Н. (возможно НАДФ-Н). Самый первый в
цепи компонент представляет собой фермент НАД-Н- рубредо-
ксин-оксидоредуктазу (рубредоксин-НАД+-редуктазу), относящий-
ся к флавопротеинам. Фермент восстанавливает окисленный рубре-
доксин:
НАД-Н+окисленный рубредоксин-»-
НАД++восстановленный рубредоксин.
Рубредоксин представляет собой низкомолекулярный железо-
содержащий белок В его. состав входят 1—2 атома железа, свя-
занных с входящими в молекулу остатками цистеина. Окислитель-
но-восстановительные реакции могут осуществляться вследствие
переменной валентности железа. По своим свойствам рубредоксин
напоминает белок ферредоксин из фотосинтезирующих организ-
мов. Заключительный этап осуществляет фермент со-гидроксилаза.
Назван фермент так вследствие своей способности гидроксилиро-
вать н-карбоновые кислоты, полученные из жиров в ы-положении
Гидроксилаза принимает электрон от рубредоксина, передавая его
на субстрат:
2 рубредоксина (Fe2+) + О2+КСНз->-
2 рубредоксина (Fe3+)+Н2О + СН2ОН.
Здесь R— алкильный или о-карбоксильный остаток. Дальней-
ший процесс включения в обмен веществ образовавшегося спирта
происходит через образование альдегида и жирной кислоты. По-
следняя подвергается р-окислению, как описано выше (см. гл. XII).
Таким образом в анаболические реакции в клетке включаются
двууглеродные соединения, активированные КоА Очевидно, наря-
ду с этим могут иметь место случаи, когда образовавшиеся жир-
ные кислоты не подвергаются f-окислению, а непосредственно
включаются в липиды. Такой факт был, в частности, отмечен в
культуре Candida lypolytica 4—1 для пальмитиновой кислоты,
идентифицированной в триглицеридах. Наличие такой грехкомпо-
нентной системы не является уникальной для окисления н-алка-
нов. Аналогичная трехкомпонентная система найдена у Pseudomo-
nas putida, гидроксилирующая метиленовую группу камфары.
Здесь железосодержащий белок получил название путидаредокси-
на. В надпочечниках содержится Fe-белок адренодоксин, катали-
зирующий p-гидроксилирование дезоксикортизона в 11-м положе-
Полагают, что парафинокисляющие ферменты отличаются вы-
сокой специфичностью. Они гидроксилируют только СНз-группы у
парафинов, причем изопарафины, как правило, не ассимилируют-
ся микроорганизмами. Существенное значение имеет длина цепи
парафина. Так, ферментная система Pseudomonas oteovorans, вы-
ращенная на н-гексане, с максимальной скоростью окисляет октан
и нонан, с меньшей — гептан и декан и совсем слабо окисляет бо-
лее короткие или более длинные углеводороды. Ферментная систе-
ма из Candida tropicatis, индуцированная выращиванием культуры
на среде с н-тетрадеканом, предпочтительно окисляет более длин-
ные углеводороды (Сю), чем более короткие (Се, Сю), хотя для
того же ферментного комплекса из Pseudomonas oteovorans вы-
явлена способность гидроксилировать циклогексан.
Помимо гидроксилирования н-алкавы, вероятно, могут подвергаться пред-
навыРв то же время ^хромосома культуры-хозяина кодирует синтез ^ко^ститу-
2. ВКЛЮЧЕНИЕ ЭТАНОЛА И АЦЕТАТА
В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ
Эти работы привели к тому, что были найдены культуры, хорошо растущие
на этаноле и уксусной кислоте (или как на том. так и на другом субстрате)
Оказалось возможным получать не только биомассу, но м некоторые продукты
но^в виде соли аммония Начальные концентрации обычно не превышают 1—
2 %, однако по ходу культивирования ироизводитси дробная добавка ацетата,
к дробным добавкам Пути ассимиляции этанола и уксусной кислоты сходятся
на ацетил КоА Как видно из приведенной ниже схемы, из этанола образуется
130
t НАД* НАД+Н* > К 7 л . ПЕКсА НАД+ji* СНзСН^ОН. сн8сно J
X <p'*' CH3COSKoA АТФ АДФ -HSKoA Щ,соон .Ъ„~~сн-со°® 3. АССИМИЛЯЦИЯ МЕТАНОЛА Помимо уксусной кислоты и этанола в^качестве возможного потенциаль- рибулозо-й-фоофат Тёкёулоэофотфасинтвза *" гекоулозо-6-фосфат НАД(Ф)Н фосфотлюковидегкдаогевааа фруктозо-^б-фосфат В-фоефог™ «.«. . — НАД(Ф)Н + Н* НСНО4-2НАЩФ)* + НгО —— СО2 + 2НАД(Ф)Н + 2Н* Рис ХШ-3 Гексулозофосфатиый цикл окисления формальдегида
но, птероилглутамат Согласно одной из теорий, птеридиновый кофактор функ- ная группа метанола может связываться с №-атомом птеридинового кольца и окисляться до N5-|0-метиленового производного птеридина при добавлении ак- цептора электронов. Возможно также, что метанол слизывается с дигидрофор- мой птеридина, образуя б-метилгадропроизводвое. В результате последующих внутримолекулярных перестроек образуется № ,0-метииентетрагидропроизводное птеридина, которое может затем реокисляться в даипдропроиэводное в присут- ствии акцептора электронов № ,0-метилпроизводное птеридина либо гидроли- зуется до свободного формальдегида, либо окисляется до № “-метилидинпро- Следовательно, птеридин может действовать как аналог ФАД или ФМН во флавопротепдных ферментах или составлять часть молекулы, подобной фолие- вой кислоте, выступая в роли С|-переносчика и акцептора электронов. Таким образом, феназинметасульфатзависимая метаиолдегпдрогеназа является ключе- вым ферментом в метаболизме метанола у метанолиспользующих бактерий. Продукт окисления метанола — формальдегид поступает далее в биосинте- тические пути или окисляется до муравьиной кислоты. Известно несколько фер- ментов. способных окислять формальдегид до формиата Кроме того, имеется 5* 131
НСООН+НАД+-+СОа+НЛДН+Н+.
циклическим путь окисления формальдегида до COj и HjO при участии пеитозо-
и гексозофосфатов (рис XII1-3). Наиболее распространенным ферментом, окис-
ляющим муравьиную кислоту, является НАД-зависимая формиатдегидрогеназа.
Фермент локатнзован в растворимой фракции клеток, ои катализирует слсдую-
Дудорова).
ГЛАВА XIV ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ
ОБМЕНА BE ШЕСТ В У МИКРООРГАНИЗМОВ
1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ
РЕГУЛЯЦИИ
В микробных клетках функционируют различные системы ре-
гуляции обмена веществ. Принципиальные различия между ними
заключаются в следующем: посредством одной из них происходит
регуляция синтеза ферментов, посредством другой - регуляция их
активности. Посредниками в осуществлении этих механизмов яв-
ляются низкомолекулярные соединения, которые либо синтезиру-
ются клеткой, либо поступают в клетку из окружающей среды.
Основные данные о механизмах регуляции были получены на
мутантных штаммах или в опытах in vitro на моделях Последние
не всегда в состоянии воспроизвести условия, близкие к in vivo.
Например, в большинстве лабораторных исследований использу-
ют разбавленные водные растворы ферментов. В таких исследова-
ниях обычно молярность субстрата в 1 • 106 раз выше, чем у фер-
мента, тогда как становится все более очевидным, что концентра-
ции ферментов, субстратов и молекул-регуляторов близки для
большинства метаболических путей. Модельные системы также
почти не- учитывают фазовое состояние системы, изменения кине-
тических характеристик в условиях, напоминающих гели, влияние
концентрационных эффектов. Поэтому некоторые наши представ-
ления, полученные в опытах in vitro, не всегда могут быть пере-
несены на живые организмы.
133
При оценке различных факторов регуляции необходимо пом-
нить о взаимоотношении молекул в клетке в условиях непрерывно
протекающего обмена веществ Например, высокая концентрация
белка в клетке влияет на локализацию свободных метаболитов.
Так, до 90 % внутриклеточного фруктозо-1,6-дифосфата может
быть адсорбировано на альдолазе.
Существенное влияние на метаболизм, как положительное, так
и отрицательное, могут оказывать слабые белок-белковые взаи-
модействия. Для ферментов гликолиза, в частности, возможно су-
ществование комплекса, что, по-видимому, положительно сказы-
вается на функции системы
С другой стороны, реальная величина ферментативной актив-
ности в клетке может быть значительно меньшей, чем свидетель-
ствуют об этом данные, полученные in vitro. Происходит это от
тенденции многих внутриклеточных ферментов к связыванию с
отдельными клеточными структурами
2. ИНДУКЦИЯ И РЕПРЕССИЯ СИНТЕЗА ФЕРМЕНТНЫХ
БЕЛКОВ
Информация о синтезе ферментов, равно как и других белюн,
записана в геноме Принято считать, что клетка имеет два типа
ферментов, различающихся по механизму регуляции их синтеза:
конститутивные и индуцибельные. Индуцибельные ферменты син-
тезируются клеткой в ответ на воздействие определенного фактора
внешней среды. Такими факторами внешней среды, как правило,
бывает какой-либо компонент среды для культивирования или
среды обитания. Наличие такого вещества в среде приводит к зна-
чительному ускорению синтеза ферментов, отвечающих за его рас-
щепление и утилизацию. Такая индукция происходит в результате
усиления матричной активности соответствующих генов, т. е, акти-
вирования процесса.
Непосредственный акт индукции синтеза ферментов в клетке
происходит под действием иекаталитяческих аллостерических бел-
ков, которые являются продуктами определенных регуляторных
генов. Белки контролируют синтез ферментов негативно, т. е свя-
зываются с бактериальной хромосомой на каком-то участке вбли-
зи структурных генов, детерминирующих синтез этих ферментов,
и препятствуют их транскрипции. В соответствии со сказанным
выше не возникает, по-видимому, трудностей во взаимодействии
внутриклеточных субстратов катаболизма с регуляторной систе-
мой клетки прокариотных организмов. Иначе обстоит дело с ин-
дукторами, находящимися вне клетки Чтобы индуктор проник в
клетку, необходимо иметь соответствующую транспортную (пер-
меазную) систему Известно, что транспорт высокомолекулярных
питательных веществ в клетку из среды ограничен, обычно пред-
варительно происходит их ферментативный гидролиз, ферменты,
осуществляющие гидролиз, также в большинстве своем индуци-
бельные, т. е. требуют индуктора. Предполагается, что для подоб-
134
Р'^ных иНдуцибельных ферментов существует механизм синтеза, не
•йВдверженный индукции. Обычно количество синтезированных та-
• ким путем молекул фермента крайне незначительно, они состав-
ляют так называемую базальную активность Ее оказывается до-
статочно, чтобы осуществить гидролиз незначительной части вы-
сокомолекулярного внеклеточного субстрата, низкомолекулярные
продукты гидролиза которого могут быть перенесены в клетку и
вызвать эффект индукции синтеза соответствующего экзофермен-
та. К числу таких индукторов, например, относятся аминокислоты
(или аминоацил-тРНК) при синтезе протеолитических ферментов,
мальтоза — при синтезе а-амилазы.
В большинстве случаев истинные индукторы неизвестны. Сиг-
. нал, присутствующий вне клетки, или должен быть энзиматически
трансформирован, чтобы стать внутриклеточным индуктором, или
он является только первым звеном сигнала, вызывающим нараста-
*' ние или падение концентрации индукторов в клетке. Поэтому наи-
более удачным нам кажется определение, предложенное С. Р. Мар-
дашевым и А. Я. Николаевым для таких сигналов Под индукто-
ром и репрессором (вместе обозначаются как эффекторы) следу-
ет понимать вещества, которые приводят к изменению скорости
синтеза белков при добавлении их к культуре (физиологические
сигналы) При этом, возможно, е регуляторным аппаратом взац
модействует не само добавленное вещество, а его метаболит или
даже вещество другого происхождения, концентрация которого
повышается в присутствии добавленного в среду вещества. В боль-
шинстве случаев в качестве таких индукторов используют субстрат
действия фермента.
В настоящее время система регуляции синтеза иидуцибельных
ферментов детально изучена на примере р-галактозидазы Е. coli.
Сегодня очевидно, что данная система во всех деталях может рас-
сматриваться только для прокариотных микроорганизмов В свя-
зи с этим описание системы дано на примере iac-оперона, ответст-
венного за синтез р-галактозидазы, расщепляющей р-галактозид-
ную связь в молекуле дисахарида лактозы. Система регуляции
была исследована с помощью мутантных штаммов Е coli фран-
цузскими учеными Жакобом и Моно.
Гены, детерминирующие структуру ферментов с близкими
функциями, сгруппированы в бактериальной хромосоме в единич-
ный оперон, что обеспечивает возможность координированного
контроля их выражения в соответствии с нуждами клеток. В со-
став названного выше 1ас-оперона Е. coli входят три гена
(рис. XIV-1). Ген z кодирует аминокислотную последовательность
р-галактозидазы, катализирующей расщепление лактозы на глю-
козу и галактозу. Ген у—структурный ген для пермеазы, необхо-
димой для транспорта лактозы в клетку. Третий—а-тен служит
структурным геном для транс-ацетилазы, фермента с неопределен-
ной функцией. Все три структурных гена образуют одну транс-
крипционную единицу, которая под действием одного и того же
эффектора транскрибируется в виде одной так называемой поли-
135
генной (полицистронной) мРНК. Оперой находится под контро-
лем специального участка молекулы ДНК, расположенного в на-
чале оперона (на З'-конце матричной цепи) Первая часть этого
регуляторного участка известна под названием промотора
Промотор—это участок ДНК, на котором происходит присо-
единение РНК-полимеразы, чтобы начать транскрипцию полиген-
яого фрагмента генетической информации, т. е. инициировать син-
тез мРНК-
Молекулярные основы взаимодействия между промотором н
РНК-иолимеразой пока что не выяснены. Можно предполагать,
что в ходе присоединения фермент должен узнавать какие-то спе-
цифические особенности структуры двойной спирали ДНК и что
яз трех разных субъединиц, образующих молекулу фермента, в
процессе узнавания участвует, по-видимому, о-субъединица. Таким
образом, представления о количественном контроле гетерокатали-
тической функции заключается в том, что транскрипция каждого
гена зависит от его промотора Последовательность пуриновых и
пиримидиновых оснований в промоторе определяет, с какой часто-
той молекулы РНК-полимеразы будут к нему присоединены, и.
следовательно, задает максимальную скорость, с которой может
происходить транскрипция данного гена. Непосредственно по со-
седству с промотором расположен оператор, место связывания
репрессора.
Репрессоры представляют собой олигомерные аллостерические
белки, содержащие в каждой субъединице по два специфических
центра. Один яз этих центров обладает сродством ко всей или ча-
сти нуклеотидной последовательности оператора, воспринимаю-
щего репрессор, а другой, специфический центр — к молекуле ин-
дуктора Присоединение индуктора к репрессору во втором алло-
стерическом центре ведет к изменению конформации репрессор-
ного белка, вследствие чего снижается сродство первого аллосте-
рического центра к оператору. При этом оператор освобождается
от репрессора.
В случае синтеза р-галактозидазы индуктором, связывающим-
ся с репрессором, оказалась не сама лактоза, а аллолактоза, в
136
л
Вн остатки галактозы и глюкозы соединены р-галактозидной
। между 1-м и 6-м углеродными атомами, а не t-м и 4-м,
гактозе (р-О-гал-(1-Ч>)В-глк).
иез репрессорного белка детерминирует регуляторный гещ
:ае.: 1ас-оперона — локализованный непосредственно перед
ен.
5людения, касающиеся взаимоотношений в системе регуля-
цик гас-олерона, привели Жакоба и Моно к постулированию сле-
дующего механизма его деятельности. В отсутствие индуктора
F 'синтез ферментов деградации Лактозы подавлен. Белок-репрессор
| связан с оператором, структурные гены блокированы, их транс-
> .'жрипция не происходит, В присутствии индуктора конформация
репрессора изменяется и сродство репрессорного белка к оперону
. нарушается. Оператор при наличии индуктора не блокирован,
। происходит транскрипция структурных генов и далее — синтез фер-
. ментов в соответствии с информацией, переданной мРНК, на ри-
босомы.
Термину «индукция» может соответствовать термин «дерепрес-
' сия». Это название обусловлено, очевидно, тем, что не подвержен-
J ный репрессии оператор, дерепрессированный оператор, обеспечи-
вает процесс транскрипции.
Рассматривая дальнейшие возможные пути метаболизма про-
дуктов катаболизма лактозы, в частности галактозы, следует яя-
Р метить, что последняя в свою очередь индуцирует ряд ферментов,
осуществляющих ее ассимиляцию, т. е имеет место косвенная
(вторичная) индукция ферментов метаболизма галактозы Такая
_ сложная система индукции называется последовательной ицдук-
Наряду с индукцией (дерепрессией) синтеза известна отрица-
тельная ферментативная адаптация, или репрессия синтеза фер-
ц меитов: синтез фермента, вместо того чтобы индуцировать-
ся субстратом, угнетается в присутствии продукта реакции, кото-
рую он катализирует Эти наблюдения были сделаны на примере
синтеза аминокислот, триптофана и гистидина Очевидно, для
клетки невыгоден сверхсинтез метаболита Механизм репрессии
синтеза ферментов распространен среди реакций биосинтеза мик-
робных метаболитов. Ферменты, синтез которых тормозится в
присутствии конечного продукта соответствующей цепи реакций,
называются репрессируемыми ферментами. Конечные продукты,
присутствие которых специфически останавливает синтез какого-
либо определенного фермента, называются корепрессорами. Та-
ким корепрессором. изображенным па рис. XIV-2. является гисти-
дин.
В случае репрессибельного оперона репрессор находится в не-
активном состояний, он не способен соединиться с оператором,
следовательно, транскрипция структурных генов имеет место
(рис. XIV-2, а). Как только количество конечного продукта достиг-
нет определенной критической величины, репрессор переходит в
активную форму, присоединяется к оператору, блокируя транс-
137
крипцию, т. е тогда, когда происходит взаимодействие корепрес-
сора с репрессором (рис. XIV-2, б).
Между репрессором и соответствующими индукторами и ко-
репрессорами не образуется никаких ковалентных связей. Форма
части молекулы каждого репрессора комплементарна определен-
ной части своего индуктора (или корепрессора), и они соединя-
ются за счет слабых вторичных связей (водородные связи, солевые
мостики, Ван-дер-Ваальсовы силы). Поскольку эти связи слабы,
они быстро образуются и разрушаются, что позволяет репрессору
быстро переходить из активного состояния в неактивное и об-
ратно.
3. КОНСТИТУТИВНЫЙ СИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ \-
В клетках микроорганизмов имеется много белков, количество
которых не зависит от факторов окружающей среды. К числу та-
ких белков относятся, в частности, некоторые ферменты, которые
получили название конститутивных. Скорости синтеза у них не ре-
гулируются ни индукторами, ни корепрессорами. Конститутивный
синтез наблюдается при мутациях, вызывающих утрату репрессо-
ра или оператора Уровень конститутивного синтеза зависит от
ряда моментов, из которых важнейшие следующие: последователь-
ность оснований в промоторе, скорость прикрепления рибосом к
стартовой точке в мРНК, скорость, с которой считывается сама
матрица, времени жизни данной матрицы Поскольку еще очень
мало известно о факторах, влияющих на каждый из названных
процессов, трудно оценить абсолютное или хотя бы относительное
значение каждого из них
В качестве примера ферментов, синтез которых осуществляется
конститутивно, могут служить ферменты метаболизма углеводов,
которые являются общими для большинства организмов. В про-
тивоположность им синтез ферментов, ответственных за использо-
вание источников углеводов среды, индуцибельный.
138
Примером гена, выражение которого не контролируется актив-
ным репрессором в клетке, может служить ген, который сам детер-
минирует первичную структуру репрессорного белка. Благодаря
низкой скорости синтеза белка репрессора в клетке синтезируются
всего 10 молекул белка-репрессора 1 ас-опер она. Поскольку 10 мо-
лекул активного репрессора на клетку достаточно для того, что-
бы закрыть оператор, в клетке не возникает необходимости син-
тезировать репрессор с большей скоростью. Следовательно, низкая
постоянная скорость выражения гена-регулятора должна быть за-
программирована в ДНК с помощью какого-то другого механизма.
Регуляторные гены являются чувствительными участками для
мутаций. В результате мутации в регуляторном гене происходит
синтез дефектного репрессора, который не способен более связы-
ваться с оператором. В этом случае контроль транскрипции будет
нарушен и произойдет усиленный неконтролируемый синтез соот-
ветствующей мРНК- Такой штамм становится продуцентом фер-
ментов с конститутивным механизмом регуляции. Мутации могут
происходить также на операторном участке ДНК- В результате
изменения последовательности нуклеотидов репрессор оказывает-
ся неспособным связаться с оператором.
4. КАТАБОЛИТНАЯ РЕПРЕССИЯ
Микробиологам издавна был хорошо известен так называемый
глюкозный эффект, когда высокие концентрации глюкозы тормо-
зили рост или затрудняли ассимиляцию медленно расщепляющих-
ся источников энергии Сущность этого процесса состоит в инги-
бировании (катаболитом) транскрипции генов, детерминирующих
синтез ферментов, необходимых для катаболизма лактозы или
других энергетических субстратов, когда в среде присутствует
глюкоза — более эффективный источник энергии. Сама по себе
глюкоза не оказывает непосредственного ингибиторного действия.
Ингибитор, ответственный за глюкозный эффект в клетках Е. coli,
является продуктом расщепления, т. е. катаболитом глюкозы, а
само явление получило название катаболитной репрессии. Какой
именно продукт расщепления глюкозы обусловливает катаболит-
ную репрессию, до сих пор не установлено.
К числу углеводов, на ассимиляцию которых оказывает влия-
ние катаболитная репрессия, могут быть отнесены не только лак-
тоза, но и галактоза, мальтоза и т. и Такой регуляторный меха-
низм обусловлен биохимическими особенностями ассимиляции уг-
леводов, отличных рт глюкозы. Известно, что любой из названных
углеводов, прежде чем включиться в метаболизм по гликолитиче-
скому пути, должен подвергнуться энзиматическим превращениям
до одного из начальных продуктов гликолиза, например глюкозо-6-
фосфата или фруцтозо-6-фосфата. Значит, такое превращение вы-
зовет необходимость синтезировать ферменты, обеспечивающие об-
разование названных продуктов. Вместе с тем наличие глюкозы
в среде исключает такую необходимость.
139
Примером, подтверждающим сказанное, является классический
опыт Моно, который выращивал Е. coli в синтетической среде, со-
держащей в качестве источников углерода я энергии глюкозу и
лактозу. В этих условиях рост бактерий происходил в течение не-
которого времени с периодом генерации около 50 мин (рис. XIV-3).
Однако внезапно рост останавливался примерно на 20 мин, а за-
тем возобновлялся с более длинным периодом генерации (около
80 мин), характерным дли роста на лактозе. Определение актив-
ности р-галактозидазы показало, что фермент появляется только
Рис. X1V-3. Диауксический
Временное
прекращение роста прнмер-
после исчезновения из среды глюкозы, что яа рисунке соответст-
вует периоду задержки роста. Именно в этот период происходит
индукция ферментов ассимиляции лактозы, клетки возобновляют
рост. Следует отметить, что эффективность действия какого-либо
источника углерода в качестве катаболитного репрессора зависит
не от его химической структуры, а исключительно от его эффек-
тивности как источника питания. Поэтому соединения, являющие-
ся наиболее активными катаболитными репрессорами у одного ор-
ганизма, могут быть сравнительно мало активны у другого.
При рассмотрении механизма действия описанных выше явле-
ний было обнаружено, что у бактерий, растущих на средах, ли-
шенных глюкозы, как наиболее подходящего источника питания,
увеличивается содержание в клетке циклического аденозин-З'-б'-
монофосфата (цАМФ). Повышение содержания цАМФ приводит
в свою очередь к интенсивному биосинтезу адаптивных ферментов,
необходимых для усвоения других источников питания. Сам факт
увеличения уровня цАМФ в клетке свидетельствует о недостатке
источников питания. Обычно концентрация цАМФ в клетке очень
мала и составляет десятые доли наномоля на грамм На 1000 мо-
лекул различных адениловых производных приходится не более од-
ной молекулы цАМФ. Каким образом уровень энергетического ка-
таболизма влияет на внутриклеточное содержание цАМФ в клет-
ке, в деталях неизвестно Имеющаяся гипотеза состоит в том, что
какой-то продукт гликолиза, образующийся на одной из стадий
после глюкозо-6-фосфата, подавляет действие аденилатциклазы
(рис. XIV-4) и таким образом уменьшает скорость образования
цАМФ нз АТФ. Возможно также, что этот (или другой) продукт
140
гликолиза сткмулйрует гидролиз цАМФ под действием фосфоди-
эстеразы, приводящей к образованию нециклического АМФ
Характерной особенностью цАМФ является ее способность
снимать катаболитную репрессию при добавлении к бактериаль-
ным клеткам, подверженным катаболитной репрессии. Логическим
развитием было предположение, что наличие цАМФ является не-
обходимым условием для индукции Iac-оперона и что, следователь-
но, продукт катаболизма глюкозы подавляет образование фермен-
тов, ассимилирующих лактозу за счет понижения содержания вну-
триклеточного цАМФ
Далее было установлено, что цАМФ стимулирует инициацию
транскрипции многих оперонов у бактерий. Эта реакция протека-
ет с участием специального связывающего САР-белка (catabolyie
activator protein), белка активатора катаболизма (БАК). Комп-
лекс БАК—цАМФ, по-видимому, связывается с промотором' на
участке. Прилегающем к месту связывания РНК-полимеразы.
В присутствии связанного с промотором комплекса БАК—цАМФ
происходит более легкое присоединение РНК-полимеразы за счет
повышения сродства фермента к участку связывания на промо-
В схематическом диде механизм, посредством которого пАМФ
осуществляет контроль активности, показан на рис. XIV-5. При
увеличении содержания цАМФ в клетке происходит обратимое
связывание нуклеотида с
БАК (этап 1-й) При этом
белок претерпевает такие
конформационные измене-
ния, которые сообщают ему
способность связываться с
•за промотором (этап 2-й). Это
обстоятельство ведет к при-
соединению РНК-полимера-
зы к соответствующему
участку промотора (этап
3-й). Если оператор не свя-
зан с репрессором, РНК-по-
лимераза свободно переме-
щается вдоль матрицы и
осуществляет транскрипцию
Таким образом, оказа-
лось, что транскрипция lac-
оператора находится под по-
зитивным и негативным
контролем. Положительный
контроль осуществляет
комплекс БАК-цАМФ, соз-
давая условия для связыва-
ния РНК-полимеразы От-
рицательный контроль осу-
ществляет репрессор, про-
располагаясь на операторе,
----- ИНИцИацию мРНК
дукт регуляторного гена, который, г_____
препятствует РНК-полимеразе осуществить
(рис. XIV6).
142
5 ПОЗИТИВНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ИНДУКЦИИ СИНТЕЗА
ФЕРМЕНТОВ
Большинство известных до сих пор систем индукции синтеза
ферменты метаболизма арабинозы у Е. со!! синтезируются под
контролем репрессора, который может осуществлять как позитив-
ную, так и негативную регуляцию (рис. XIV-7).
В клетках Е. coli, растущих в отсутствие арабинозы, три фер-
мента, участвующие в ее расщеплении, присутствуют в ничтожных
количествах. При добавлении арабинозы количество всех этих
ферментов одновременно возрастает. Процесс индукции контроли-
руется четвертым геном с, который находится вблизи трёх других
генов и отделен от них только промотором -арабинозного опёрона.
Арабинозный репрессор всегда связан с хромосомой, а его влия-
ние на процесс транскрипции изменяется при связывании индук-
тора арабинозы. Когда арабиноза отсутствует, репрессор блокирует
транскрипцию точно так же, как это делает лактозный репрессор.
143
Однако, связавшись с арабинозой, репрессор претерпевает конфор-
мационные изменения, в результате чего превращается в актива-
тор и, присоединяясь к особому участку ДНК, который условно
может быть назван инициатором, включает транскрипцию
Следует дополнить, что арабинозный оперой относится к чув-
ствительным к глюкозе оперонам, и, следовательно, синтез мРНК
на нем зависит от связывания БАК с арабинозным промотором.
Другими словами, для интенсивного функционирования арабиноз-
ного оперона необходимы два позитивных регуляторных сигнала,
один из которых сообщает о присутствии арабинозы, другой—об
отсутствии глюкозы. С физиологической точки зрения позитивная
и негативная регуляции неразличимы. Их можно различить толь-
ко путем тщательного изучения мутаций, влияющих на действие
регуляторного гена.
6. ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМА РЕГУЛЯЦИИ В КЛЕТКАХ
ЭУКАРИОТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Клетки эукариотных микроорганизмов имеют более сложную,
чем у прокариотных организмов, структуру оперона, и его регу-
ляция значительно сложнее. В настоящее время нет установив-
шихся взглядов относительно механизма регуляции эукариотного
генома. Очевидно, механизмы, предложенные в схеме Жакоба и
Моно для прокариотов, не могут быть автоматически перенесены
на организмы, имеющие обособленное ядро. Неизвестно, в част-
ности, существует ли у эукариотов система ген—регулятор — бе-
лок-репрессор— оператор и посредством какого механизма осуще-
ствляется у них индукция или репрессия. Очевидно только, что ре-
гуляция на уровне транскрипции имеет место Тем не менее боль-
шое значение имеет регуляций и на уровне трансляции. Связано
это с тем, что эукариоты-» отличие от прокариотов имеют доста-
точно стабильную мРНК. В связи с этим в случае выключения
только этапа транскрипции трансляция может продолжаться, т. е.
'синтез ферментных белков не будет нарушен
Как и в случае транскрипции, на уровне трансляции имеет
место позитивная и негативная регуляция. Суть позитивной регу-
ляции заключается в способности рибосомы узнавать начало со-
ответствующего цистропа у данной мРНК. Для связывания с мат-
рицей есть специальный белок SI Если его удалить, то малая
субчастица рибосомы не свяжется с матрицей. Для специфическо-
го связывания необходимы белок S12 и I6S РНК Последняя обе-
спечивает комплементарное спаривание с прединициаторной по-
следовательностью. Регуляция инициации трансляции, возможно,
основана на двух принципах: 1) регуляции доступности мРНК;
2) использовании специфических факторов инициации, узнающих
только сдою мРНК. Предполагается, в частности, чго существуют
особые РНК, которые стимулируют инициацию трансляции мРНК
своей клетки н це позволяют трансляцию посторонних мРНК.
Негативная регуляция трансляции представлена, например, те-
144
ми случаями, когда существуют белки-репрессоры, которые могут
нарушать трансляцию
Общие принципы регуляции на уровне транскрипции были
предложены Бриттеном и Дэвидсоном. В их основе лежит прин-
цип положительной регуляции, причем регуляторная функция от-
водится молекулам РНК, которые не покидают клеточного ядра.
Эта модель предполагает наличие участков ДНК четырех типов,
взаимодействие которых составляет систему положительного конт-
роля (рис. X1V-8). Ген, продуцирующий мРНК, представляет со-
бой функциональный аналог структурного гена бактериального
оперона. Данный участок ДНК является кодирующим. Смежным
с каждым структурным геном будет,*по крайней мере, один ре-
цепторный участок Молекула РНК-активатора узнает рецептор-
ный участок, взаимодействует с ним, после чего может произойти
транскрипция структурного гена. Здесь, даже если функцию акти-
ватора выполняет не РНК, формально модель остается такой же.
Локус, который кодирует РНК-активаторы, называется геном-
интегратором. Если контрольную функцию выполняют белки, а не-
РНК, то транскрибируемая РНК служит матрицей для этих бел-
ков. Гены-интеграторы функционально однозначны регуляторным
генам бактериальных оперонов. Активность гена-интегратора эука-
риотной ДНК контролируется смежным сенсорным участком. Ген-
интегратор может быть транскрибирован только тогда, когда конт-
ролирующий его сенсорный участок находится в активном состоя-
нии. Сенсорные участки распознаются агентами, которые изменя-
ют картину экспрессии генов. О природе этих сигнальных агентов-
у микроорганизмов достоверная информация отсутствует. Возмож-
но, что существенная роль принадлежит здесь негистоновым бел-
кам хроматина. Согласно другим теориям имеется специфическая
ядерная РНК, обладающая особым сродством к гистонам, благо-
даря связыванию которых включается механизм транскрипции
Здесь опять-таки возникает вопрос о первичном сигнале, аналоге
индуктора у прокариотов.
7. АУТОГЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
Основным принципом системы аутогенной регуляции является
контроль экспрессии гена белком, продуктом его собственного
структурного гена. Аутогенная система представляется более ра-
циональной в том смысле, что в отличие от системы со специали-
зированным репрессором не требуется существования и действия
особого регуляторного гена. Тем не менее, видимо, аутогенная ре-
гуляция не является единственным способом контроля системы.
Как следует из рис XIV-9, репрессором здесь является один из
ферментов, синтезируемых данным опероном (Х4), но лишь в со-
четании с конечным продуктом соответствующего метаболического
пути (Х6). Например, транскрипция ilv-оперона, ведающего син-
тезом изолейцина, лейцина и валина, ингибируется комплексом,
состоящим из треониндегндратазы, одного из первых ферментов,
контролируемых этим опероном, и изолейцнл-тРНК. Фермент в
этой роли называют апорепрессором, а конечный продукт цепи
реакции (изолейцил-тРНК, Хе— на рис. XIV-9) — корепрессором.
Такой комбинированный репрессор блокирует оперон в области
оператора.
8 АУТОИНДУКЦИЯ
Как неоднократно упоминалось, весьма сложно бывает опре-
делить истинный регулятор, непосредственно вступающий в кон-
такт с генетическим '-аппаратом клетки. Одним из методических
приемов, пригодных для выявления метаболитов, осуществляющих
контроль, является «голодание» микроорганизмов, вследствие чего
интенсифицируются эндогенные процессы В опытах Ф. Теруи с
культурой Aspergillus niger взвесь гриба была помещена в буфер-
146
г
р ный раствор в условия азотного голодания, т. е. дефицита необ-
ходимого источника азота. При этом происходила существенная
перестройка и активное включение в метаболизм клеточных бел-
ков, и одновременно резко увеличивалась активность внутрикле-
точных протеолитических ферментов Индуктор формируется в са-
мой клетке за счет энзиматических реакций, происходящих внутри
клетки.
В приведенном примере с Asp. niger при азотном голодании
был выделен индуктор, содержавшийся в пептидной фракции вод-
ного экстракта из мицелия. Будучи добавлена в среду, эта фрак-
ция вызывала двух-трехкратное увеличение активности кислой
протеазы. Выделенная теми же методами фракция из мицелия»
который не подвергвлся азотному голоданию, индуцирующей ак-
тивностью не обладала. Одновременно с увеличением протеолити-
ческой активности в клетке возрастала активность рибонуклеаз.
Продолжительность синтеза мРНК для кислой протеазы голодав-
ших (аутоиндуцированных) клеток было более коротким, чем у
клеток, не подвергающихся голоданию. Веществами, тормозящими
синтез индуктора, были различные источники азота, они же пре-
пятствовали синтезу рибонуклеазы.
Таким образом, сущность явления аутоиндукции заключается
в перестройке метаболизма клетки в направлении синтеза опреде-
ленных ферментов путем формирования индукторов синтеза за
счет своих внутриклеточных компонентов. Процессы, происходящие
в клетке, схематически показаны ниже
Индукций р>йш<уклеазы
мРНК для синтеза
кислой протеазы
9. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Аллостерические белки выполняют важнейшие функции в ре-
гуляции каталитической активности, что было рассмотрено выше
на примере репрессора 1ас-оперона, а также сами являются носи-
телями каталитической ферментативной активности. Аллостериче-
ские белки — это белки, свойства которых меняются при связыва-
нии специфических низкомолекулярных молекул-эффекторов. Сле-
довательно, аллостерические белки выполняют функции посредни-
ков в регуляции метаболизма вследствие изменения концентрации
147
эффекторов. Аллостерические ферменты, как правило, имеют чет-
вертичную структуру. Это означает, что их молекулы построены
из нескольких глобул, субъединиц. Каждая субъединица имеет, по
крайней мере, два пространственно разобщенных связывающих
участка. Один из них каталитический, является активным центром
фермента, другой — регуляторный, или аллостерический. Именно
на аллостерическом участке происходит присоединение эффектора,
вызывающего изменение конформационной структуры фермента.
Эти изменения затрагивают активный центр таким образом, что
пространственное взаиморасположение аминокислот, составляю-
щих активный центр, меняется. Вследствие этого может происхо-
дить либо увеличение ферментативной активности, либо ее угне-
тение. Таким образом, подобное изменение конформации можно
рассматривать как перепое информации от регуляторного к ката-
литическому участку. Эффектор (регулятор) не имеет структурно-
го сходства с субстратом, и фермент проявляет высокую специфич-
ность по отношению к молекуле регулятора В связи с этим моле-
кулы субстрата и регулятора не могут конкурировать за один и
тот же участок молекулы фермента
Механизмы регуляции активности ферментов при помощи ал-
лостерических эффекторов, по-видимому, являются наиболее рас-
пространенными в микробных клетках. Одним из проявлений алло-
стерического механизма является активация фермента предшест-
венником. Метаболит, действующий как аллостерический эффек-
тор, «включает» фермент, катализирующий превращение либо это-
го же метаболита, либо продукта, находящегося немного далее в
цепи превращений;
А _> в -> С* D -> Е
I________________________!
Так схематически можно представить позитивную аллостери-
ческую регуляцию метаболитом, предшествующим в цепи биосин-
теза (буквы — метаболиты, стрелки — ферменты)
Более распространенным типом регуляции, чем активация пред-
шественником, является ингибирование по типу отрицательной
обратной связи, когда накопление избытка конечного продукта
данной метаболической цепи приводит к «выключению» необходи-
мых для его синтеза ферментов. Чаще всего подавляется актив-
ность первого фермента, занимающего ключевое положение в дан-
ной биосинтетической цепи. В то же время продукт часто подав-
ляет активность более чем одного фермента цепи. Регуляция по
принципу отрицательной обратной связи имеет огромное физио-
логическое значение. Ретроингйбирование является мгновенным
физиологическим ответом клетки на обеспеченность ее этим «ко-
нечным» продуктом синтеза «начального» фермента. Нарушение
системы саморегуляции биосинтеза в микробной клетке тех или
иных соединений, в частности аминокислот, является основным
приемом получения промышленных продуцентов:
148
т___।
в
Так, схематически можно представить регуляцию однофунк-
ционального неразветвленного пути биосинтеза путем аллостери-
ческой регуляции по принципу обратной связи (буквы — метабо-
литы, стрелки — ферменты).
Если клетка синтезирует два или более изоферментов, специ-
фический эффект ингибирования происходит только относительно
одного нз них. Например, продукт Р подавляет активность только
одного из двух изоферментов, катализирующих превращение А в
В, активность другого контролируется путем энзиматической мо-
дификации, т. е путем ферментативной реакции деградации моле-
кулы белка или включения новых функциональных групп
Схема регуляции по принципу обратной связи одного из изо-
ферментов, катализирующих превращение вещества А в В, выгля-
дит примерно так:
Конкретный пример приведен на рис XIV-10. Здесь превраще-
ние аспартата в р-аспартил фосфат, исходный продукт метаболиче-
ской цепи синтеза треонина, изолейцина, метионина и лизина, ка-
тализируют три изофермента Как показано па рисунке, каждый
изофермент ингибирует какой-то один из продуктов цепи. Следу-
ет отметить, что не все микроорганизмы для синтеза названных
.аминокислот имеют в данной точке изоферменты
Многие биосинтетические пути дают два или более конечных
продуктов. Ингибирование таких путей конечным продуктом носит
более сложный характер. Особенно это сказывается на разветвлен-
ных многофункциональных путях биосинтеза. Одним из способов
регуляции подобных систем является поливалентное (мультива-
лентное) подавление, при котором активность первого фермента,
общего для образования нескольких конечных продуктов, подав-
ляется определенным сочетанием -- --------- — — ---------
этих продуктов, но не каждого
чипу обратной связи. Оба продукта
G и Е действуют на разные алло-
Рис. X1V-12. Кооперативное
ингибирование (буквы — мета-
В отдельности (рис XIV-Н) Примером может служить синтез ли-
зина и треонина у культур Micrococcus glutamicus, Brevibactenum
flavum. Вас. subtilis и ряда других В этом случае блок по одно-
му из ферментов пути синтеза треонина не скажется на синтезе ли-
зина в мутантных штаммах. Разрегулированная аллостерическая
система регуляции будет способствовать сверхсинтезу лизина По-
добный механизм регуляции наблюдается при кооперативном (со-
гласованном) ингибировании (рис. XIV-12) В этом случае каждый
из конечных продуктов является слабым ингибитором первого об-
щего фермента, тогда как их комбинация обладает более чем ад-
дитивным ингибирующим эффектом
Данная система регуляции характерна для подавления актив-
ности первого фермента пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов
de novo фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы АМФ и ГМФ'
в отдельности частично подавляют активность данного фермента,
а их комбинация вызывает аддитивный эффект (рис. XIV-13).
На некоторых разветвленных метаболических путях, приводя-
щих к образованию большого числа конечных продуктов, один
аллостерический фермент содержит эффекторные участки для всех
конечных продуктов. Каждый из конечных продуктов лишь частич-
но ингибирует активность фермента. Скорость реакции, катализи-
руемой этим ферментом, определяется числом (и концентрацией)
различных конечных продуктов данного пути, присутствующих в
среде. Такую регуляцию называют кумулятивным ингибировани-
ем по принципу обратной связи.
Помимо реакций ингибирования, связанных с изменением уров-
ня активности первого фермента цепи метаболизма, имеет место
150
последовательное (каскадное) ингибирование (рис XIV-14)
В этом случае конечные продукты (F, I, К) регулируют посредст-
вом ингибирования соответствующих ферментов эффективность
использования промежуточных продуктов (D, G). В свою очередь
они подавляют активность первого фермента, общего для развет-
вленного пути биосинтеза. Примером системы каскадного контро-
ля может служить синтез изолейцина в культуре Rhodopseudomo-
Рис XIV-14 Последовательное ин-
nas spheroldes. На приведенной ниже схеме видно, что изолейцин
подавляет активность треониндезаминазы, что приводит к накоп-
лению треонина. Последний ингибирует активность гомосеринде-
тидрогеназы. Из-за подавления деятельности этого фермента про-
исходит накопление ₽-полуальдегида аспарагиновой кислоты, ко-
торый конкурентно с аспарагиновой кислотой и АТФ подавляет
активность аспартаткиназы (схемы и детали данного метаболиче-
ского пути см. в гл. XX).
Возможен также механизм регуляции, в котором сочетаются
процессы активации и ингибирования. Наиболее наглядным мо-
жет быть пример, когда происходит включение метаболита, синте-
зируемого посредством одного метаболического пути в другой
{рис. XIV-15). В данном случае метаболит В является общим для
151
двух путей, конечными продуктами которых оказывают Ли/.
Вещество В ингибирует аллостерический фермент, ответственный
за синтез вещества В из А, а вещество F является активатором
того же фермента.
Таким образом избыток вещества В угнетает активность фер-
мента, действующего на участке Л->В. Недостаток продукта В
вызывает накопление продукта F, что в свою очередь приводит к
активации того же фермента (участок А-*-В) Количество веще-
ства В становится достаточным для синтеза конечного продукта /.
Наоборот, если имеется продукт /, биосинтез продукта г останав-
ливается. В результате внутриклеточная концентрация F падает,
и активность фермента на участке А-+В снижается. Система двой-
ного контроля приводит к тому, что при всех условиях роста ко-
личество промежуточного метаболита В присутствует в сфере ре-
акции в концентрациях, обеспечивающих синтез конечных про-
дуктов.
Конкретным примером такого механизма может быть коорди-
нированный синтез АТФ и ЦТФ (рис. X1V-I6). Известно, что нук-
леозидтрифосфаты содержатся в клетках в количествах, необхо-
димых для их функции. Как и во всех подобных случаях имеется
аллостерический фермент в цепи биогенеза, являющийся точкой
приложения эффекторов В данном случае ингибирующее действие
па аспартат-транс-карбамилазу (АТКаза) оказывает избыток ЦТФ
(линия 1). Активирующий эффект оказывает АТФ (линия 2).
10. ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ МЕМБРАН
НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ
Существует большая труппа структурно связанных с мембранами фервдн-
шанших ее нзме-
11. БЕЛКИ-ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ
АКТИВНОСТИ
систем регуляции активное™ ферментов микробных клеток пред-
турной гомологии
нулярная масса больше 10000, то молекула ингибитора существует в виде ди-
пых клеток нет Предполагается, что внутриклеточные ингибиторы регулируют
меров, выполнивших свою функциональную роль на определевном этапе раз-
вития клетки Например, рибонуклеазы разрушают мРНК, выполнившую свою
154
12. pH СРЕДЫ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ
При составлении прописи среды обычно стараются добиться ее сбаланси-
водило бы’ к хорошему росту культуры, накоплению определенного продукта
необходимого продукта. Одним из способов регулирования pH является подбор
компонентов в концентрациях, создающих необходимый ^интервал при росте
ровать^рН среды.РТак, бактерии, образующие при сбраживании углеводов ней-
50 60 7.В Р>
Рис XIV-17 Влияние pH среды
на рост мицелия Penicillium chry-
На практике во избежание закис-
лоты, синтезированные культурой и вы-
ника азота Потребность микроорганиз-
мов в сере обычно значительно маныве, чем в азоте {если эти организмы не
специфические сульфатредуиирующие) Следовательно, избыток свободного
сульфат-иона приведет к снижению pH Обратный эффект, очевидно, возиика-
ет, когда в среду вводят нитрат натрия или калия. В этом случае нитрат после
восстановления будет ассимилирован клеткой, а щелочные ионы калия или нат-
рия могут вызвать сдвиг pH в щелочную зону
От величины pH, очевидно, будет зависеть степень диссоциации присутст-
вующих в' среде солей Если несколько упростить имеющиеся на сей счет пред-
ставление, то можно сказать, что в кислой среде слабые кислоты оказываются
в виде целых молекул, а в щелочной — в виде ионов, так как соли слабых кис-
лот сильно диссоциированы, а сами кислоты — слабо При этом для каждой
кислоты и соли есть определенная критическая эона pH, в которой кислота
может переходить из диссоциированного состояния в неднссоциированное. В ка-
честве примера можно привести данные, полученные при исследовании влияния
различных факторов внешней среды на рост Penicillium chrysogenum (рис
XIV-17) при культивировании на синтетической среде Было показано, что при-
сутствие уксусной кислоты в недиссоциированном виде в среде в течение фазы
роста оказывало токсическое действие на рост триба
Довольно часто ври проведении биосинтеза того или иного продукта воз-
никает необходимость изменить pH среды Одним из евмых распространенных,
достаточно эффективных методов яаляется путь периодических добавок. Если
идет защелачивание, вводят раствор соляной кислоты Как правило, втот про-
цесс автоматизирован, кислота подается по сигналу датчика, связанного С
систвмой измерения pH. По достижении необходимого pH система подачи от-
При получении глутаминовой кислоты по ходу процесса вводят раствор
мочевины Помимо того ито мочевипа является источником азота, обеспечи-
155
13. СООТНОШЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИСТОЧНИКОВ
УГЛЕРОДА И АЗОТА В СРЕДЕ
Среде фосфора, и необходимо убедиться, что культура ^способа а усваивать дан-
ный источник углерода.
14 РЕГУЛИРУЮЩАЯ ФУНКЦИЯ ФОСФАТОВ
И АДЕНИЛОВЫХ НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ
При биосинтезе большинства продуктов обмена веществ мик-
роорганизмов в состав сред входит неорганические фосфорсодер-
жащие соединения в виде фосфат-ионов. Они являются необходи-
мыми для роста микроорганизмов, осуществления синтеза многих
жизненно важных соединений. Однако фосфат-ион, если он при-
сутствует в избытке, может оказывать отрицательное влияние на
активность некоторых ферментных систем. Применительно к син-
тезу вторичных метаболитов такое отрицательное влияние выяв-
лено при получении стрептомицина, хлортетрациклина, нистатина,
алкалоидов, при биосинтезе ферментов. Особенно заметно оно про-
является по отношению к ферментам нуклеинового обмена. Фос-
фат, по-вндимому, может иметь различные пути воздействия на
фермент, осуществляющий ту или иную реакцию В приведенных
выше примерах действие фосфата косвенное. Он воздействует на
известные ферментативные реакции, связанные с синтезом конеч-
ното продукта Так, в примере с хлортетрациклином причина от-
рицательного влияния фосфата на синтез антибиотика, а в равной
мере и синтез близких по структуре тетрациклина и окситетрацик-
лина обусловлен тем, что избыток фосфата тормозит активность
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, фермента, переключающего ме-
156
таболизм глюкозы на гексозомонофосфатный путь. Последний ну-
жен для синтеза данных продуктов, так как при его функциониро-
вании образуется восстановленный никотннамидадениндинукле-
отнд, необходимый в реакциях восстановления поликетидных ме-
таболических предшественников тетрациклиновых структур.
В реакциях синтеза молекулы стрептомицина участие фосфата
сказывается также в формировании метаболических предшествен-
ников. В частности, при синтезе стрептидиновой части молекулы
образуются фосфорилированные производные (см. гл. XXIV) Су-
ществует точка зрения, что фосфат-ион тормозит реакции фосфо-
рилирования. С другой стороны, не исключается, что торможение
имеет место на уровне фосфатазы, дефосфорилирующей промежу-
точные продукты, вследствие чего происходит их накопление и,
как следствие, последующие реакции в цепи биогенеза исключа-
Наличие фосфат-иона в среде для культивирования совершен-
но необходимо для осуществления ассимиляции глюкозы гликоли-
тическим путем (см. рис. XI-2). Известно, что образующийся в хо-
де гликолиза фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется на два фраг-
мента, содержащих по три атома углерода. После изомеризации
одного из этих ферментов образуются две молекулы фосфоглице-
ринового альдегида. Именно на этой стадии в процесс включается
неорганический фосфат. В его отсутствие процесс останавливает-
ся на стадии образования фосфоглицеринового альдегида.
Фосфат выступает как аллостерический регулятор некоторых
ферментативных реакций, где реакции катализируют олигомерные
ферменты, как, например, в регуляции процесса гликолиза. Од-
ной из ключевых реакций в гликолизе 'Является реакция фосфори-
лирования D-фруктозо-бгфосфата с образованием В-фруктозо-1,6-
дифосфата. Реакция осуществляется 6-фосфофруктокиназой. Здесь
неорганический фосфат служит аллостерическим эффектором, по-
вышающим активность 6-фосфофруктокиназы, активность которой
подавляется избытком АТФ. Фосфат снимает также подавление
активности гексокиназы глюкозо-6-фосфатом
Одной из функций АТФ является регуляторная Так, АТФ при-
нимает участие на разных уровнях клеточного метаболизма и, зна-
чит, обладает большим регуляторным потенциалом. Некоторые
ферменты, очевидно, чувствительны к абсолютным концентрациям
АТФ и АДФ, другие—к соотношению двух данных нуклеозидфос-
фатов Ряд таких ферментов формально чувствителен к общей сте-
пени фосфорилирования адениловых соединений, т. е. к энергети-
ческому заряду, определяемому как отношение
(АТФ + у, АДФ)
(АТФ + АДФ + АМФ)
Ферменты, ответственные за выработку энергии, подавляются
высоким энергетическим зарядом, тогда как ключевые ферменты
биосинтеза стимулируются Энергетический заряд бактериальных
клеток является примерно одинаковым при значительно различаю-
157
адихся условиях роста. Это обстоятельство наводит на мысль и
том, что данный механизм очень важен .в балансе выработки и ис-
пользования энергии. Ряд других примеров регулирующей функ-
ции нуклеозидфосфатов приведен на с. 171—172
15. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА ПРОДУКТОВ,
НАКАПЛИВАЮЩИХСЯ ВО ВТОРОЙ ФАЗЕ
Многие промышленно важные продукты биосинтеза накапли-
ваются в культуре продуцента после того, как основные компонен-
ты среды израсходованы, а скорость роста биомассы замедлена,
т. е. если пользоваться терминологией акад. В. Н. Шапошникова,—
во вторую фазу. Представления о двухфазности микробиологиче-
ского синтеза были им впервые сформулированы на примере аце-
тоно-бутилового брожения. Позже английский ученый Д. Бу-Локк
•предложил первую (ростовую) фазу называть трофофазой, а вто-
рую (продуктивную) — идиофазой.
Терминология, предложенная Д. Бу-Локком, вошла в зарубеж-
ную научную литературу Наиболее хорошо двухфазность и ее за-
кономерности изучены для некоторых брожений и при биосинтезе
вторичных метаболитов, например антибиотиков. В основе зако-
номерностей синтеза лежат механизмы регуляции, посредством
•которых ферменты синтеза вторичных метаболитов начинают функ-
ционировать в клетке только в конце трофофазы. До наступления
этого времени определенные участки генов (олероны), контроли-
рующие синтез ферментов идиофазы, находятся в состоянии ре-
прессии, вследствие чего не происходит считывания необходимой
информации для синтеза, т е. не происходит транскрипции После
того как произойдет депрессия, наступит синтез ферментов мета-
болитов идиофазы. Назвать какой-либо один механизм регуляции
затруднительно. Возможно, что один и тот же процесс регулиру-
ется посредством нескольких систем:
1) индуктор накапливается в конце (или после) трофофазы
или введен извне, чтобы дерепрессировать гены, функционирую-
щие в период идиофазы;
2) какой-то продукт первичного метаболизма вызывает подав-
ление активности одного из ферментов, расположенных на путях
биогенеза вторичных метаболитов. Исчезновение этого соединения
ведет к дерепрессии генов, активных в период идиофазы;
3) рост на легко утилизируемом источнике углерода подавляет
гены идиофазы путем катаболитной репрессии. При исчезновении
этих катаболитов происходит дерелрессия генов идиофазы;
4) активность ферментов идиофазы подавляется вследствие вы-
сокого уровня АТФ в клетке;
5) РНК-полимераза во время трофофазы может инициировать
транскрипцию только генов трофофазы вследствие того, что фер-
мент не может реагировать с премоторным участком оперона, ра-
ботающего на синтез ферментов, участвующих во вторичном ме-
таболизме После завершения трофофазы происходит конформаци-
158
F синее изменение РНК-полимеразы, что дает ей возможность взай-
ь модействовать с промоторным участком, инициируя транскрипцию
• и синтез ферментов идиофазы.
Для биосинтеза некоторых антибиотиков, в частности пеницил-
4 лина, показан механизм регуляции по принципу обратной связи.
Регулирующим агентом в данном случае является аминоацил-L-
лизин Поскольку формирование молекул различных микробных
' метаболитов проходит через многочисленные биогенетические пу-
ти, вероятнее всего имеет место одновременное функционирование
нескольких регуляторных систем при синтезе того или иного про-
дукта.
16. СЕКРЕЦИЯ ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Внеклеточные ферменты являются основными ферментами,
представляющими промышленный интерес, поэтому изучение ме-
ханизма их выброса из микробных клеток заслуживает определен-
ного внимания.
Многие ферментные белки синтезируются вначале в виде своих
неактивных предшественников .и лишь далее под действием спе-
цифических ферментов или за счет внутримолекулярных модифи-
каций подвергаются так называемому процессянгу, в результате
формируется молекула активного фермента. Поэтому вопросы сек-
реции и процессинга ферментов можно рассматривать как частный
случай регуляции синтеза. Под внеклеточными понимают белки
(ферменты), которые секретированы за пределы цитоплазматиче-
ской мембраны без каких-либо нарушений в ее структуре в про-
цессе нормального роста и развития микроорганизмов. Белки, рас-
положенные с наружной стороны мембраны и связанные с кле-
точной стенкой или выделенные в среду культивирования, можно
Белки, предназначенные для транспорта наружу, синтезируются
на полисомах, связанных с мембранами, тогда как белки, предна-
значенные для нужд самой клетки, образуются в свободных по-
лисомах. Однако это не значит, что все белки, образующиеся на
рибосомах, связанных с мембранами, обязательно секретируются.
Процесс транслокации белка через мембрану является одним
из решающих этапов в формировании молекулы внеклеточных
зываемая «сигнальная гипотеза», сформулированная Г Блобелем.
Предполагается, что секретируемый белок должен иметь «сигналь-
ный пептид», обеспечивающий акт секреции. Согласно этой гипо-
тезе мРНК секреторных белков несут информацию об аминокис-
лотной сигнальной последовательности Подобные сигнальные ко-
доны отсутствуют в мРНК, кодирующих информацию для внутри-
клеточных белков.
После синтеза белка, содержашего сигнальную последователь-
ность, происходит взаимодействие системы мембрана — рибосо-
ма— сигнальный пептид. Такое взаимодействие осуществляется.
/59
вероятно, за счет расположенных на мембране рецепторных бел-
ков. Такое взаимодействие должно привести к образованию в мем-
бране пор. При этом сигнальный пептид с частью синтезирован-
ной цепи образует спускающуюся петлю (рис. XIV-18). Затем спе-
цифической пептидазой происходит отщепление сигнального пеп-
тида. Пептидаза локализована в районе петли с внутренней сторо-
Рис XIV-18 Транслокация секреторных белков через цитоплазматическую мем-
ны мембраны. После завершения трансляции и транслокации син-
тезированной молекулы белка, как предполагается, должно прои-
зойти отсоединение рибосомы от мембраны. Вследствие диффузии
компонентов мембраны при этом исчезает пора.
Оказалось, что полипептидные цепи проникают через цитоплаз-
матическую мембрану только во время их синтеза, когда рибосомы
прикреплены к внутренней поверхности мембраны. Отщепление
сигнального пептида входит в систему процессинга.
Наиболее существенное влияние на секрецию белков оказыва-
ет структура мембраны. Проникая в мембрану, вновь синтезируе-
мая цепь ферментного белка подвергается различным гидрофоб-
ным взаимодействиям с мембранными белками и липидами
ГЛАВА XV. МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ФОНД
МИКРООРГАНИЗМОВ
1. АМИНОКИСЛОТЫ ФОНДА
Среди многочисленных продуктов обмена веществ микроорга-
низмов, находящихся внутри клетки, существенное значение для
жизнедеятельности имеют низкомолекулярные компоненты мета-
болического фонда (пула), к числу которых относятся аминокисло-
ты, куклеОтиды и их производные, кислоты цикла Кребса и т. п.
Состав этих компонентов очень изменчив и зависит как от возра-
ста клетки и популяции, так и от состава среды, в которой они на-
160
ходится. Компоненты метаболического фонда участвуют в важ-
нейших процессах, происходящих в клетке, — в реакциях конст-
руктивного и энергетического обмена, а также выполняют функции
регуляторов ферментативных реакций
Состав и динамика. Аминокислоты метаболического фонда ка-
чественно те же самые, что входят в состав белков. Различие име-
ет место только при количественной оценке этих аминокислот.
Если в аминокислотном составе суммарного белка различных мик-
роорганизмов трудно найти какие-либо общие характерные при-
знаки по преобладанию содержания той или иной аминокислоты,
то для фонда такую закономерность можно назвать У большин-
ства исследованных микроорганизмов независимо от их видовой
специфичности преобладают глутаминовая кислота и а-аланин, да-
лее— аспарагиновая кислота и лейцины. Относительно биомассы
аминокислоты фонда составляют сравнительно небольшую вели-
чину— 1—5 мМ на 1 г сухой биомассы.
Суммарное содержание а-аминоазота свободных аминокислот,
как правило, относительно невысоко у молодых клеток, достигает
максимума к середине или чаше к концу экспоненциальной — на-
чалу стационарной фазы роста и затем уменьшается. Незначи-
тельное количество аминокислот пула у молодых культур объяс-
няется большой скоростью роста и усиленным синтезом белка
В культуре Actinomyces rimosus, где было отмечено возраста-
ние количества а-аминоазота свободных аминокислот после сни-
жения их содержания в пуле, подобный факт связывается с фи-
зиологическими особенностями данного актиномицета, у которого в
период интенсивного синтеза антибиотика возникают молодые ги-
фы («вторичный рост»).
Могут иметь значение специфические особенности азотного об-
мена микроорганизмов, при которых приведенные закономерности
несколько иные. Например, в культуре азотобактера наибольшее
возрастание количества свободных аминокислот совпадает с на-
чалом интенсивной азотфиксации. В культурах микромицетов, об-
разующих конидии, также найдены свободные аминокислоты. У од-
ной из культур, относящихся к роду Penicillium, преобладал глу-
тамин, количество которого доходило до 37 % от общего содержа-
ния аминокислот фонда
Аминокислоты, которые не участвуют в построении белка, иден-
тифицируются довольно редко, однако при изучении метаболиче-
ского фонда некоторых дрожжей были обнаружены гомоссрип, ор-
нитин, цитруллин, этаноламин, а-аминомасляная кислота. У ряда
дрожжевых культур в составе фонда найдены D изомеры амино-
кислот.
Для понимания биохимических механизмов, функционирующих
в фонде, весьма важно иметь представление о том, какая нз ами-
нокислот синтезируется первой, если культура выращивается па
синтетической среде без органических азотсодержащих соедине-
ний. Для решения этого вопроса применяются обычно опыты с
использованием радиоактивной метки 15N, содержащейся в каком-
либо минеральном компоненте среды. Наиболее убедительные
данные были получены в опытах с Penicillium gnseofulvum, где
через час инкубации 88 % активности «метки» обнаруживалось в-
глутаминовой кислоте и глутамине Сходная закономерность про-
явилась в культуре Candida tropicalis.
Весьма обстоятельно вопрос о распределении радиоактивной
метки среди аминокислот фонда был решен при использовании
иС-фруктозы в культуре Candida utilis и 1 —14С-октадекана также
у одного из представителей рода Candida В метаболическом фон-
де Candida utilis наибольшая радиоактивность приходилась на
глутаминовую кислоту и далее — па аланин, изолейцин-лейцин, ар-
гинин, валин, лизин, глицин, цистин (цистеин), аспарагиновую
кислоту, треонин, пролин, серин Величина радиоактивности глу-
таминовой кислоты была в 55 раз выше радиоактивности серина
и в 44 раза выше таковой треонина, пролина и аспарагиновой кис-
лоты *
При использовании октадекана первыми включали метку в
фонд глутаминовая и аспарагиновая кислоты (через 33 мин после
его введения в среду). Количество радиоактивного углерода, по-
ступающего в единицу времени в аминокислоты глутаминовую,
аспарагиновую, аланин и серив, распределялось в соотношении
46:24:11:2,3. Таким образом, имеется достаточно оснований по-
лагать, что глутаминовая кислота, а также аланин и аспарагино-
вая занимают доминирующее положение в фонде благодаря их
высокой метаболической активности. Необходимо отметить, что,
когда в качестве компонентов среды выступают аминокислоты, со-
став аминокислот пула не является копией аминокислотного со-
става среды
Наиболее существенное влияние на количественный аминокис-
лотный состав фонда оказывают присутствующие в среде их мета-
болические предшественники Наличие в среде о-кетоглутаровой
и пировиноградной кислот в кратковременных опытах с отмытыми
клетками актиномицетов привело соответственно к 1,5—3,5-крат-
ному увеличению содержания в фонде глутаминовой кислоты и
а-аланина Объяснение этому можно найти в проявлении актив-
ности а-кетоглутар ат дегидрогеназы и аланиндегидрогеназы, а так-
же реакций трансаминирования, которые происходят в клетке
между аминокислотами фонда и поступившими из среды кетокис-
лотами. При введении в среду а-аминоадипиновой кислоты суще-
ственно возрастало количество свободного лизина в дрожжевых
культурах Saccharomyces cerevislae и Candida utilis.
Одним из способов регулирования содержания аминокислот
пула может служить культивирование в условиях хемостата при
различных лимитирующих факторах и скоростях разбавления
(табл. XV-1). В конкретном примере наиболее существенные раз-
личия отмечаются по глутаминовой кислоте, лизину, серину, гли-
Очевидно, величина фонда является функцией концентрации
азота, способного ассимилироваться культурой, а также СООТНО-
СЯ
в пум Saccharomyces cereoisiae 1
Аиинокжслот» Скорость риСашичшя,
0,1 | 0,25
лимит по глюкозе
vraunnnnp ч 35,6 135,4 146,8
Треонин 13,5 25,8 30,6
Аспарагиновая 10,7 11,2 16,3
Лизин 11,5 25,8 76,5
[ / : 5,7 10,0
Серил 15,1 13,2 34,8
Глицин 8,6 12,0 40,1
сТ:• 17,9 54,9 63,9
9,3 24,0 1.9 26,4
Лейтон 7,2 6,4 7,9
ЛрГИЬ'И" 45,5 67,5
ГвивдИн 2,8 11,2
Сумма 144,3 380,9 529,2
тения доступных к ассимиляции азота и углерода. Другие лими-
тирующие факторы, например РО43~ и Mg2+, тоже могут оказы-
вать влияние на количество аминокислот фонда (табл. XV-2).
Состав аминокислот фонда может зависеть от содержания витаминов в
среде. Избыток пиридоксальфосфата способен вызывать декарбоксилирование
глутаминовой кислоты с образованием у-аминомасляной кислоты Недостаток
тиамина может приводить к избытку свободных аминокислот. Это действие
а кстоглутаратдсгндрогеназном комплексах: *> недостаток*1 тиамина *ведет к на
Известна функция биотина как регулятора накопления аминокислот при их
лот в срсде^зависит от их первоначальной локализации в метаболическом фои-
гатой биотином среде. Это связывают с повышенной проницаемостью клеточных
стенок культур, выросших на бедной биотниом среде. Исследование липидного
•состава мембран клеток, бедных и богатых биотином, показало, что мембраны
первых, способных к сверхсинтезу' глутаминовой кислоты, содержат больше
насыщенных жирных кислот, чем ненасыщенных, в противоположность богатым
фосфолипидов, чем у богатых биотином
нокислот, в частности глутаминовой, регулируя тем самым ^состав и объем ме-
таболического фонда. Имеются доказательства, что в некоторых случаях амн-
ноацил-тРНК-сннтетазы включаются в репрессию путей биосинтеза родствен-
ных аминокислот Согласно существующим гипотезам, объясняющим это со-
стояние, считают, что аминоацил-тРНК в большей мере, чем соответствующая
6‘ 163
Сумма 33,2 100,0 336,0 J00,0 273,2 100,0 404,1 100,0-
поацил-тРНК синтетаза.
Фактором, регулирующим содержание аминокислот пула, могут
быть специфические антибиотики, тормозящие белковый синтез в
клетке, при сохранении функции ферментных систем, синтезирую’
щих аминокислоты. Увеличение содержания отдельных аминокис-
лот в фонде может иметь хотя и ограниченное, но практическое
значение, когда необходимо обогатить культуру одной из них. На-
пример, один из мутантных штаммов Candida sp. накапливал на
40 % больше метионина в пуле, чем исходный вариант. Такой путь-
может оказаться более доступным, чем изменение аминокислотно-
го состава клеточных белков.
164
Примером таких, компартмснтов могут быть два различных фонда аминокнс-
числе ^объектов, можно считать, что в цитоплазме преобладают дикарбоновые
кислоты, аланин, а в вакуолях — аргинин, цитруллин, орнитин, кпутгмт и
между аминокислотами этих фондов крайне ограничен.
Таблица XV-3- Состав аминокислот пула клеток
Орнитин
Аспарагиновая
Аланин
глицин, валин,
лейцин, гистидин
По-видимому, активную роль в регуляции обмена аминокислот между ком-
куолей. В изолированных из клеток дрожжей вакуолях обнаружено существо-
вание транспортных систем, отличных от систем транспорта аминокислот в
клетки дрожжей. Применительно к транспорту аргинина в вакуоли особенность
заключается в независимости системы от А ГФ Уровень градиента накопления
аршнипа очень высок, он достигает отношения 200-1. С большей легкостью
тральные аминокислоты, чем аминокислоты, имеющие основный характер.
Для некоторых дрожжевых культур доказано наличие трех метаболических
фондов аминокислот вакуолярно! о, мнтохон триального и цитоплазматического,
фонда клетки, в цитоплазматическом — 33 %, а в митохондриальном — 7%.
В данном случае вакуолярный компартмент также является основным ци-
тологическим компартментом аминокислотного пула дрожжевой клетки. Он
аминокислоты — глутаминовая, аспарагиновая и аланин — локализовали н зна-
чительных количествах в цитоплазме. В митохондриальном компартменте обна-
к3| иазва«”ы}<^ятоплазматических компартмеитов гетер гелей в
стравстве 'бактериальной клетки. Полагают, что они в основном идут на синтез
пептидогликанов стенки. В частности, здесь содержится значительное воляче-
165
тидные структуры, например в синтезе антибиотиков, относящихся к актштоми-
Регуляторные функции аминокислот фонда проявляются до-
статочно широко на различных путях метаболизма. Их содержа-
ние в фонде определяет прежде всего собственный синтез; уровень
активности ферментов или их синтез de novo; кроме того, если
аминокислоты поступают из среды в клетку, — синтез или актив-
ность пермеазных систем. Свободные аминокислоты, очевидно, вы-
полняют существенную роль в регуляции синтеза РНК. Несколько
лет назад чехословацким ученым И Халупкой была высказала ги-
потеза, которая сводится к тому, что свободные тРНК являются
ингибиторами синтеза РНК, в первую очередь рибосомальной
РНК, за счет угнетения активности РНК-иолимеразы. «Занятая»
аминокислотой тРНК может функционировать, по крайней мере,
в некоторых случаях как эффектор, участвующий в репрессии фер-
ментов, синтезирующих соответствующую аминокислоту.
Таким образом, если молекулы тРНК остаются свободными в
результате нехватки свободных аминокислот, синтез РНК стано-
вится угнетенным и образование ферментов, синтезирующих ами-
нокислоты, восстанавливается. При достаточном количестве сво-
бодных аминокислот увеличивается количество занятой тРНК,
сокращается синтез ферментов, способствующих образованию ами-
нокислот, и усиливается образование РНК- И. Халупка рассмат-
ривает функцию аминокислотного пула как буферную систему,
компенсирующую нарушение равновесия аминоацил-тРИК/тРНК.
В культуре Lactobacillus acidophilus показана регулирующая функ-
ция аминокислот фонда на процесс репликации ДНК-
Триптофан выполняет функции регулятора в синтезе эргоал-
калоидов в культуре Claviceps paspale, лизин у Penicillium chry-
sogenum — в синтезе пенициллинов. Вакуолярные аминокислоты,
166
очевидно, принимают участие в процессах клеточной дифферен-
циации дрожжевых культур У бактериальных культур одним из
типичных проявлений дифференциации является спорообразова-
ние и процесс прорастания спор. В опытах, где изучали прораста-
ние спор Вас. megaterium и Вас. licheniformis, содержание сво-
бодной глутаминовой кислоты за 30 с уменьшалось почти вдвое:
от 12 до 7.7 мкг на 1 мг сухих
В настоящее время компарт-
ментализацию рассматривают
как частный случай регулятор-
ного механизма, действующего
на различных уровнях клеточ-
ной организации. Предпола-
гается, что в дрожжевой клет-
ке вакуолярный компартмеит
может выполнять функции ре-
гуляторного механизма в мета-
Свободные внутриклеточ-
ные аминокислоты выполняют
функцию субстратов эндоген-
ного дыхания микробных кле-
ток. В результате этого про-
цесса в клетках может накап-
ливаться значительное коли-
чество кетокислот
Метаболический аминокис-
лотный фонд клетки служит
источником накопления ами-
нокислот среды при микробио-
логическом синтезе аминокис-
лот. Когда синтез белка в
культуре практически прекра-
щен, а синтез аминокислот продолжается, продукты синтеза по-
ступают во внешнюю среду (рис. XV-1). У продуцента лизина Вге-
vibacterium sp. 22 отмечается высокое содержание лизина в ме-
таболическом фонде.
2. НУКЛЕОТИДЫ ФОНДА
Состав и динамика. Под метаболическим фондом нуклеотидов
обычно понимают низкомолекулярные кислоторастворимые про-
дукты, экстрагируемые из микробных клеток. Анализ количествен-
ного содержания нуклеотидов относится к числу весьма трудо-
емких и тонких методов, поэтому нуклеотиды являются наименее
изученными в сравнении с другими компонентами низкомолекуляр-
ного фонда. В фонд входят все нуклеотиды, составляющие струк-
туру ДНК и РНК, их ди- и трифосфатпроизводные, а также со-
167
Регуляторные функции аминокислот фонда проявляются до-
статочно широко на различных путях метаболизма. Их содержа-
ние в фонде определяет прежде всего собственный сиптез; уровень
активности ферментов или их синтез de novo; кроме того, если
аминокислоты поступают из среды в клетку, — синтез или актив-
ность пермеазных систем Свободные аминокислоты, очевидно, вы-
полняют существенную роль в регуляции синтеза РНК- Несколько
лет назад чехословацким ученым И. Халупкой была высказана ги-
потеза, которая сводится к тому, что свободные тРНК являются
ингибиторами синтеза РНК» в первую очередь рибосомальной
РНК, за счет угнетения активности РНК-полимеразы. «Занятая»
аминокислотой тРНК может функционировать, по крайней мере,
в некоторых случаях как эффектор, участвующий в репрессии фер-
ментов, синтезирующих соответствующую аминокислоту.
Таким образом, если молекулы тРНК остаются свободными в
результате нехватки свободных аминокислот, синтез РНК стано-
вится угнетенным и образование ферментов, синтезирующих ами-
нокислоты, восстанавливается. При достаточном количестве сво-
бодных аминокислот увеличивается количество занятой тРНК»
сокращается синтез ферментов, способствующих образованию ами-
нокислот, и усиливается образование РНК. И. Халупка рассмат-
ривает функцию аминокислотного пула как буферную систему,
компенсирующую нарушение равновесия аминоацил-тРНК/тРНК.
В культуре Lactobacillus acidophilus показана регулирующая функ-
ция аминокислот фовда на процесс репликации ДНК-
Триптофан выполняет функции регулятора в синтезе эргоал-
калоидов в культуре Claviccps paspale, лизин у Penicillium chry-
sogenum — в синтезе пенициллинов. Вакуолярные аминокислоты,
166
очевидно, принимают участие в процессах клеточной дифферен-
циации дрожжевых культур. У бактериальных культур одним из
типичных проявлений дифференциации является спорообразова-
ние и процесс прорастания спор. В опытах, где изучали прораста-
ние спор Вас. megaterium и Вас. licheniformis, содержание сво-
бодной глутаминовой кислоты за 30 с уменьшалось почти вдвое:
от 12 до 7,7 мкг на 1 мг сухих
В настоящее время компарт-
ментализацию рассматривают,
как частный случай регулятор-
ного механизма, действующего
на различных уровнях клеточ
ной организации Предпола-
гается, что в дрожжевой клет-
ке вакуолярный компартмент
может выполнять функции ре-
гуляторного механизма в мета-
Свободные внутриклеточ-
ные аминокислоты выполняют
функцию субстратов эндоген-
ного дыхания микробных кле-
ток. В результате этого про-
цесса в клетках может накап-
ливаться значительное коли-
Метаболический аминокис-
лотный фонд клетки служит
источником накопления ами-
нокислот среды при микробио-
логическом синтезе аминокис-
лот Когда синтез белка в
культуре практически прскра
щен, а синтез аминокислот продолжается, продукты синтеза по-
ступают во внешнюю среду (рис XV-1). У продуцента лизина Вге-
vibacterium sp. 22 отмечается высокое содержание лизина в ме-
таболическом фонде.
2. НУКЛЕОТИДЫ ФОНДА
Состав и динамика. Под метаболическим фондом нуклеотидов
обычно понимают низкомолекулярные кислоторастворимые про-
дукты, экстрагируемые из микробных клеток. Анализ количествен-
ного содержания нуклеотидов относится к числу весьма трудо-
емких и тонких методов, поэтому нуклеотиды являются наименее
изученными в сравнении с другими компонентами низкомолекуляр-
ного фонда. В фонд входят все нуклеотиды, составляющие струк-
туру ДНК и РНК, их ди- и трифосфатпроизводные, а также co-
ze?
ответствукяцие основания и нуклеотид-сахара. Кроме того, в со-
став фонда могут входить метаболические предшественники нук-
леотидов и продукты их энзиматической деградации, например
производные инозина, ксантина, гипоксантина и т. и. К числу ме-
таболитов фонда могут быть отнесены цАМФ, цГМФ и соединения
типа ффГфф (гуапозин-5'-дифосфат, З'-дифосфат) и подобные им
вещества.
Как и аминокислотный фонд, фонд нуклеотидов очень дина-
мичен, и его состав зависит от специфических особенностей куль-
туры, фазы роста популяции, условий культивирования, в частно-
сти состава среды. Как правило, количество дезоксирибонуклеоти-
дов в клетках значительно меньше, чем рибонуклеотидов, хотя это
обстоятельство не сказывается на формировании полноценного
генома (если, разумеется, микроорганизм не является каким либо
специфическим мутантом).
Локализация. Одним из наиболее сложных и малоизученных
является представление о внутриклеточной локализации нукле-
отидов и о формах связи со структурными элементами клетки,
ферментами и какими-либо другими веществами, близкими по мо-
лекулярной массе к нуклеотидам. Исключение составляют веще-
ства, в которые нуклеотиды входят как фрагменты молекулы, со-
единенные с остальной частью ковалентными связями. Детальное
исследование, которое было проведено с культурой Penicillium
chrysogenum, показало, что большая часть кислоторастворимых
нуклеотидов находится в мицелии в связанном состоянии. Причем
значительная часть из них, вероятно, связана с другими соедине-
ниями ковалентными связями. В связанном состоянии, очевидно,
находятся и нуклеотид-коферменты
Работы с модельными системами, которые в какой-то степени
могли бы восполнить отсутствие информации на уровне клеток,
не могут полностью учесть всю сложность внутриклеточных взаи-
модействий. Поэтому правильнее говорить о тех возможностях,
которыми обладают нуклеотиды или их производные, исходя из
известных для них физико-химических свойств или свойств ком-
понентов клетки, так или иначе соприкасающихся с нуклеотида-
ми. Применительно к взаимодействию между структурными эле-
ментами клетки, между различными макромолекулами и нукле-
отидами ведущая роль принадлежит, вероятно, водородной связи.
Хорошо известно, что клеточные структуры и многие метабо-
лически активные макромолекулы содержат атомные группиров-
ки, обладающие гидрофильными свойствами, наличие которых в
значительной степени может предопределить способность вещест-
ва образовывать водородные связи с другими соединениями. Ак-
цепторами многих низкомолекулярных соединений могут быть, в
частности, белковые молекулы, имеющие заряженные группировки
NH3+- и СОО~. Наличие водородных связей ведет также к стаби-
лизации вторичных структур как у самих нуклеотидов (или их
производных), так и у макромолекул, с которыми нуклеотиды
оказываются связанными. Нуклеотиды оказывают существенное
168
влияние на стабильность спиральной конформации щелочных по-
липептидов
По способности к стабилизации полипептидов нуклеотиды рас-
полагаются так- ГМФ>ИМФ>АМФ>ЦМФ>УМФ При этом
сами нуклеотиды, ориентированные вокруг полипептидной цепи,
претерпевают конформационные изменения. Специфичность поли-
пептидов при взаимодействии с нуклеотидами определяется при-
родой боковой цепи Примером может служить взаимодействие
между гуанидиновой группировкой аргинина и нуклеотида:
В,—NH—С
М
Водородные связи имеют место также и при взаимодействии
между нуклеотидами. Между основаниями наблюдаются гидро-
фобные взаимодействия.
Кроме водородных связей в любой живой системе действуют
Ван-дер-Ваальсовы силы, возникающие между нейтральными ато-
мами й молекулами вследствие их поляризации Есть основания
полагать, что на нуклеотиды и их производные также распростра-
няется действие сил Ван-дср-Ваальса, хотя функционально они,
вероятно, менее значимы.
Форма связи нуклеотидов со структурными компонентами клет-
ки зависит от их локализации Локализация нуклеотидов связана
с их функцией По данным локализации нуклеотидов и их произ-
водных в клетках можно косвенно судить о топографии биохими-
ческих процессов. Такие данные пока весьма ограниченны. Мож-
но привести результаты, полученные с протопластами Neurospora
crassa. Было показано, что после удаления клеточной стенки ко-
личество уридиловых нуклеотидов уменьшается более чем в 4 ра-
за, адениловых — в 3 раза и примерно в 2 раза—цитидиловых
Эти результаты дают основание полагать, что большая часть
уридиловых и значительное количество адениловых и цитидило-
вых нуклеотидов, по-вндимому, расположены в наружных слоях
клетки Предполагают, что исчезающие вместе с клеточной стен-
кой нуклеотиды либо связаны с клеточной стенкой, либо распо-
ложены в пространстве между клеточной стенкой и внешней ци-
топлазматической мембраной Возможно, они связаны с какими-то
компонентами клеточной мембраны Не исключено, что их лока-
лизация связана с биохимическими функциями в клетке: участие
в синтезе компонентов клеточной стенки (уридиловые нуклеоти-
ды), мембран (цитидиловые нуклеотиды), проницаемостью в клет-
ку различных компонентов среды (адениловые нуклеотиды).
Довольно характерный спектр нуклеотидов имеют митохондрии.
В митохондриях разного происхождения содержатся преиму-
щественно НАД, ЦАДН, НАДФ, НАДФИ, АМФ, АДФ, АТФ, со-
169
ставляющие в сумме до 80 % всех нуклеотидов митохондрий. Пи-
ридиновые нуклеотиды найдены главным образом в восстановлен-
ной форме Как правило, в клетках культуры Endomyces magnusii
вие митохондрий восстановленные пиридиновые коферменты вооб-
ще не обнаружены Постоянно присутствуют в митохондриях гуа-
ниловые производные, принимающие участие в функции сукцинат-
тиокиназы, локализоваииой в митохондриях. Полное отсутствие в
митохондриях УФ-сахаров и ГДФ-маннозы, обнаруженных в зна-
чительных количествах в целых клетках, свидетельствует о лока-
лизации процессов синтеза полисахаридов вне митохондрий. Ха-
рактерно, что цитидиловые и уридиловые нуклеотиды иногда так-
же выявляются в митохондриях, но это не всегда обязательно и
вероятнее всего связано со специфической направленностью обме-
на веществ у того или иного организма.
Функции свободных фосфорилированных нуклеозидов в клет-
ке. Основными функциями свободных фосфорилированных нукле-
озидов микробных клеток являются участие в синтезе нуклеино-
вых кислот и коэнзимная регулятор ная функция. Поскольку участие
фосфорилированных нуклеозидов, в частности АТФ, в энергетиче-
ских процессах, фосфорилировании и ряде других широко осве-
щается в различных курсах биохимии, здесь будет рассмотрен
сравнительно узкий круг вопросов, касающихся нуклеотидного
фонда микроорганизмов.
Как известно, нуклеозидтрифосфаты являются структурным
материалом для синтеза РНК. На примере Вас. subtilis было по-
казано, что мРНК непрерывно синтезируется из свободных нукле-
озидтрифосфатов и снова распадается с временем полужизни око-
ло 2 мин. Синтез рРНК из того же фонда протекает значительно
медленнее. Нуклеотидный фонд микробных клеток служит также
исходным материалом для синтеза фаговых нуклеиновых кислот
ПО
продуктов^ происходит ^соответстани с приведенной на рис. XV-2 схемой На-
. .1 । р<>Д}К1Ов деградации рРНК₽на* синтез ДНК* происходит па^уровне нук-
Как известно, in vitro под действием рибонуклеазы нз мононуклеотидов
синтезируются олигонуклеотиды. Однако в клетке, очевидно, синтеза нет, так
страта, которые внутри клетки не встречаются Р Р СУ
вать энергетическим зарядом (Э) клетки, который можно вычислить при* по-
мощи следующего уравнения
Э = 1/2-(АДФ + 2АТФ)/(ЛМФ + АДФ + АТФ).
Поскольку АМФ, АДФ и АТФ выполняют регуляторную функцию для
многих ферментов, а величина энергетического заряда является расчетной,
: i. :- (рис XV-З^. ^Стационарному состоянию метаболизма, при котором скорость
ускоряются, поскольку активность регуляторных ферментов зависит от кон-
центраций АТФ, АДФ и АМФ. Одновременно процессы, сопровождающиеся
использованием _АТФ, тормозятся. Если энергетический заряд системы иревы-
Таким образом, система АТ—АДФ —АМФ способствует поддержанию
состоянию системы соответствует случай, когда все содержащиеся в клетке
адецоэнпфосфаты находятся в форме пм,ъ R
э 05 =
шерге/пическии заряд сисгпены
Рис. XV-3 Зависимость ско-
ходованию (7/J АТФЛ от
энергетического заряда сис-
темы АТф — АДФ — АМФ,
Нуклеотиды и нуклеозиды являются регуляторами ферментативных реак-
ций. Помимо регуляции по типу отрицательных обратных связей в синтезе
пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, некоторые из них служат аллостери-
ческими регуляторами, где участвуют вещества как нуклеотидной, так и не
нуклеотидной природы. В реакциях синтеза дезоксприбонуклеотимов из Б'-три-
фосфатов путем прямого замещения 2'-ОН-группы па водород (рибопукзеоти-
дредуктаза) скорость процесса регулируется нуклеозидтрифосфата мн (НТФ) и
дезоксинуклеозндтрифосфатами (дНТФ), играющими роль аллостерических
эффекторов
Из реакций, где принимают участие вещества по нуклеотидной природы,
было выявлено, что декарбоксилаза мезо-а-е-диамниолимелиновой кислоты, в'
результате активное™ которой образуется лизин, у штамма Вге\ ibacterinm
sp. 22 представляет собой аллостерический фермент, активируемый и ингиби-
руемый АМФ. Изменения концентрации нуклвозвдтрифосфатов в фонде может
служить регуляторным сигналом для деления клеток. Под контролем фонда
находится синтез некоторых вторичных метаболитов
Наиболее подробно изучена функция нуклеотидов как ингибиторов рибо
нуклеазы. Анализ механизма действия нуклеотидов как конкурентных ингиби-
торов рибонуклеазы показал, чго мононуклеотиды образуют с ферментом
комплекс, изменяя его конфигурацию Предполагается, что при этом имеет
место взаимодействие между фосфатным анионом мононуклеотида и катион-
ным (имидазольными) группами активного центра фермента, причем конфор.
мациопныс изменения происходят, по крайней мерс, па 9 участках рибо-
нуклеазы.
К числу метаболитов нуклеотидной природы, присутствующих в микроб-
ных клетках, относятся антибиотики нуклеозиды В большинстве своем они
являются производными пуринов. В настоящее время большинство антибиоти-
ков рассматривают как вещества, регулирующие функции различных фермент-
ных систем Подобную функцию в клетках выполняют, вероятно, и нуклеознд-
Компоненты нуклеотидного фонда принимают участие в синтезе некоторых
физиологически активных веществ, в частности рибофлавина В культуре
Eremothecium ashbyii с началом накопления рибофлавина отмечается особенно
заметное уменьшение количественного содержания АТФ и ГТФ в фонде Регу-
172
Часть третья. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
БИОСИНТЕЗА МИКРОБНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
ГЛАВА XVI. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ
ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ
1. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ БРОЖЕНИЕ
Органические кислоты в культурах микроорганизмов образу-
субстрата Собственно к брожению относятся те процессы получе-
ния энергии, при которых отщепляемый от субстрата водород пе-
реносится в конечном счете на органические акцепторы. Брожение
отличается от анаэробного дыхания Последнее протекает также
в отсутствие кислорода, но при этом водород передается через ды-
хательную цепь на такой конечный акцептор, как нитрат или суль-
фат. В зависимости от конечных или преобладающих продуктов
различают спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, ацетонобу-
таноловое и некоторые другие виды брожений В результате не-
полных окислений образуются уксусная, лимонная, глюконовая,
итаконовая и ряд других кислот. Иногда эти процессы называют
окислительными брожениями, однако слово «брожение» носит
здесь не биохимический, а технологический характер.
Лимонная кислота. Получение Лимонной кислоты путем бро
жения является одним из наиболее старых микробиологических
производств Осуществляет1 процесс, как правило, культура Asper-
gillus niger, специально селекционированная для получения высо-
ких выходов продукта В производстве в равной мерс могут ис-
пользоваться как поверхностные, так и глубинные культуры. В ка-
честве углеродсодержащего компонента применяют обычно мелас-
су Кроме углеводного компонента меласса содержит ряд орга-
нических кислот глюконовую, яблочную, янтарную, адипиновую,
фумаровую и сахарную, часть которых сохраняется по ход}' процес-
наружены адипиновая, глюконовая, сахарная, щавелевая. В зави-
симости от исходного химического состава применяемых меласс
в сброженных растворах были обнаружены яблочная, малоновая,
фумаровая, аконитовая, янтарная и молочная кислоты (рис. XVI-1)
лассы Применение сахарозы приводило к накоплению в среде
меныпего качественного разнообразия кислот. Здесь идентифици-
ровались кроме лимонной щавелевая, глюконовая и сахарные кис-
лоты, а в некоторых случаях незначительные количества винной
кислоты
173
Биохимический механизм синтеза лимонной кислоты хорошо
известен Образуется она в результате функционирования цикла
Кребса В равной мере это относится ко всем другим указанным
выше кислотам, которые входят в цикл Кребса. Схема образова-
ния щавелевой и малоновой кислот, присутствующих в бродильной
среде, приведена ниже.
СООН
СООН
СООН
СН8
COCH
Другой путь — через функционирующий у продуцента глиокси-
латный шуит.
СООН
С=О 4- НАДФ + Н*
SKoA
СООН
I
СООН
HSKoA
В последней реакции коэнзим А передается на янтарную кис-
лоту с образованием сукцинил-КоА. Реакция обратима, поэтому
синтезированная щавелевая кислота может через глиоксилатный
путь вступить в цикл Кребса. Щавелевая кислота обычно накап-
ливается в тот период, когда pH среды ближе к нейтральному зна-
чению. Процесс брожения с образованием лимонной кислоты про-
текает при низких значениях pH. Это имеет несомненные техно-
логические выгоды- в кислой среде (pH 3—4) весьма незначитель-
на активность ферментов, которые могут синтезировать нежела-
тельные побочные продукты, посторонняя воздушная бактериаль-
ная микрофлора, попав в среду, не способна расти.
174
г Малоновая кислота может образоваться путем ферментатив- ного окислительного декарбоксилирования щавелевоуксуспой кис- СООН СООН 1 1 СН2 СН> +со2. 1 1 СО СООН 1 СООН Годов. п _ водов^ в первую^очередь различные мелассы или технические углеводсодсржа
1 щие продукты, например гидрол и т п БьГли попытки применять продукты HSC—СООН 2 НаС—СООН Н8С—СООН HgC + НО—i-COOH -» С—СООН —СО, С—СООН Ю=С—СООН Н2—С—СООН НС-СООН ЩС-СООН Н2С—СООН лиионная к-та цис авиатиия ита»и«и» Уксусная кислота. Получение уксуса является одним из самых древних пищевых производств. В качестве сырья могут быть ис- пользованы самые разнообразные продукты, экономически выгод- ные в той или иной местности Предпочтение отдают тем видам сырья, которые помимо углеводов содержат ароматические и вку- совые компоненты Например, в США широко распространен яб- лочный уксус, а в районах выращивания винограда в Европе — виноградный. Среди источников сырья могут быть названы также абрикосы, персики, инжир, финики и т д. Для производства уксу-
са требуются два различных микробиологических процесса. Сырье
сначала подвергается спиртовому брожению, а затем образовав-
шийся этиловый спирт окисляется до уксусной кислоты. Спирто-
вое брожение проходит по классической, широко известной схеме..
Кроме этанола среди продуктов брожения в незначительных ко-
личествах могут присутствовать глицерин, муравьиная, уксусная,
молочная и янтарная кислоты, ацетилметилкарбинол, а также кис-
лоты и эфиры, характерные для конкретного вида сырья, пигмен-
ты, пентозаны и т. п. Другим способом получения уксусной кисло-
ты является непосредственное окисление этанола, которое осуще-
ствляет культура Acetobacter и ряд других бактерий. В обоих
случаях образование уксусной кислоты из этанола происходит сле-
дующим образом:
CUgCHjOH
НАД* ИАДФ*+Н*
СН3СООН
Известен также у ряда бактерий иной путь-
Только что сброженный продукт имеет резкий запах и вкус..
Обычно его подвергают выдерживанию в бочках или чанах, так
называемому старению При этом происходит ряд дополнительных
реакции, облагораживающих вкусовые качества Одной из наи-
более распространенных реакций является этерификация, в част-
ности образование ацетоэтилового эфира.
СНзСООН + СНзСНгОН—СНЯСООСН2СН3 РНаО.
2 МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ
Молочнокислое брожение осуществляют бактериальные орга
низмы, относящиеся к родам Lactobacillus, Streptococcus, Leuco-
nostoc, Pedicoccus. Морфологически они гетерогонии; встречаются
палочки и кокки; как правило, неподвижны, не образуют спор,
грамположнтельные, беспигментные; отсутствует каталаза и ци-
тохромная система Правда, описаны культуры, которые образу-
ют споры и имеют каталазу. Все они 'отличаются сложными по-
требностями в ростовых веществах, витаминах, аминокислотах,
поэтому многие из этих бактерий используются в качестве инди-
каторных культур. Ни одна из культур молочнокислых бактерий
ле может расти на минеральной среде с глюкозой в качестве един-
ственного источника углерода и с солью аммония как единствен-
ного источника азота. Основным свойством молочнокислых
бактерий, по которому их объединяют в отдельную группу, явля-
ется способность образовывать в качестве главного Продукта бро-
жения молочкую кислоту Различают гомофермептативное и ге-
тероферментативное брожение. Это деление фактически отражает
коренные различия в путях расщепления углеводов
Гомоферментативное брожение. Формально характеризуется
тем, что единственным продуктом брожения является молочная кис-
лота В общем виде реакция может быть записана так (исходя из
глюкозы) •
С6Н12О6+2Фн+ 2АДФ-*-2СН3СНОНСООН I- 2АТФ + 2Н2О
При этом выход продукта может достигать 98 %. Столь высо-
кий выход обусловлен тем, что процесс сбраживания углеводов
находится в крайне незначительной связи с процессами конструк-
тивного обмена Углеводы очень мало или совсем ле используются
в конструктивном обмене, так как последний в основном построен
на использовании готовых аминокислот субстрата. Таким обра-
зом, в условиях гомоферментативного молочнокислого брожения
конструктивный и энергетический обмены в противоположность
большинству других брожений в материальном отношении наибо-
лее отграничены один от другого. При данном типе брожения глю-
коза включается в метаболизм по классическому пути гликолиза
по схеме Эмбдена—Мейергофа Детально здесь приведена лишь
часть этой схемы (от фруктозо-1,6-днфосфата), так как происхо-
дящие согласно части этой схемы реакции имеют непосредствен-
ное отношение к образованию молочной кислоты (рис. XVI-2).
OCHjGHOHCHO
2 (Ф)—UCHjCHOHCOO @
1,3-фГК
2 АДФ
2 ОСН^СНОНСООН
3-ФГК
HOOLCOCKO©
2 aigCHOHcooH
2 носн2сно(ф>—COOH
2-ФГК
o@
2 CHaCOCOOH
Как видно из схемы, наиболее связана с непосредственным обра-
зованием пировиноградной кислоты стадия окисления фосфогли-
церинового альдегида, в результате функционирования которой
восстановленная форма НАДh участвует в реакции, осуществляе-
мой лактатдегидрогеиазой: пировиноградная кислота—^молочная
чия лактатрацемазы зависит, какой образуется продукт D (—),
L (+) или DL-молочная кислота
Гетероферментативное брожение. Характеризуется тем, что об-
разуется не только молочная кислота, но и ряд других продуктов,
например уксусная кислота, этанол и пр., имеющие родственную
биогенетическую связь с пировиноградной кислотой. Бактерии,
для которых характерно гетероферментативное брожение, осуще-
ствляют начальное расщепление глюкозы исключительно по пен-
тозофосфатному пути. У них отсутствует фруктозо-бифосфат-аль-
долаза, активность которой обеспечивает образование 3-фосфогли-
церинового альдегида и диоксиацетонфосфата из фруктозо-1,6-ди-
фосфата. Нет также триозофосфат-изомеразы, фермента, обеспе-
чивающего взаимопревращения 3-фосфоглицеринового альдегида и
диоксиацетонфосфата. З-Фосфоглицериновый альдегид образуется
у них из ксилулозо-5-фосфата ------------------------- **——
толаза:
Катализирует реакцию фосфоке-
С=О О=С—О—@
но—С—н ———н2о
Н2—С—О© j^H
н—с—он
н2с—о©
Ацетилфосфат отдает фосфат на АДФ, превращаясь в уксусную
кислоту. 3-Фосфоглицерииовый альдегид подвергается ферментно-
му превращению в пировиноградную кислоту, как и в схеме Эмб-
дена— Мейергофа. Из последней образуется как молочная кисло-
та, так и этанол
Промышленными источниками углеводного компонента при
молочнокислом брожении являются меласса, гидрол, патока, мо-
лочная сыворотка.
Помимо получения молочной кислоты молочнокислые микроор-
ганизмы применяются для получения сыров, кисломолочных про-
дуктов и т. п В сельском хозяйстве молочнокислые бактерии, оби-
тающие на растениях, играют большую роль при силосовании
кормов.
т
3 БРОЖЕНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ КЛОСТРИДИЯМИ
Спорообразующие бактерии, относящиеся к роду Clostridium,
вызывают различные бродильные процессы. Все они происходят в
анаэробных условиях. В аэробных условиях культуры не растут.
Токсическое действие кислорода связывают с отсутствием у клост-
ридий цитохромов и каталазы и с высоким содержанием флавино-
вых ферментов. Последние переносят водород от субстратов на
кислород с образованием перекиси, которая накапливается в ток-
сических концентрациях При
брожении образуются в раз-
ных соотношениях кислоты
{масляная, уксусная, молоч-
ная), спирты (бутанол, этанол,
изопропанол), а также ацетон
и газы (водород и СО2). Суб-
стратами брожений служат
глюкоза, некоторые полисаха-
риды, органические кислоты и
спирты. Клостридии расщепля-
ют глюкозу гликолитическим
путем.
На рис. XVI-3 показаны пу-
ти биогенеза масляной кисло-
ты, н-бутанола, ацетона, изо-
пропанола, этанола, уксусной
кислоты, начиная от ацетил-
КоА В восстановительных реакциях, где участвует водород, не-
посредственным донором служит восстановленная форма НАД,
образованная при превращении 3-фосфоглицоринового альдегида
в 1,3-фосфоглицериновую кислоту
Синтез того или иного продукта зависит в основном от куль-
туры, однако некоторые сдвиги в направлении процесса можно вы-
звать, меняя физиологические условия культивирования Так, у
Clostridium acetobutihciim при сбраживании глюкозы вначале об-
разуется масляная кислота Однако при подкислении среды про-
<Б 24 52 40 48 5b
продуктов брожения Clostridium occtobuiiiiaim
Бутанол
411,5
102,1
44,5
222,3
230,7
22,4
13,2
/Я/
являют активность ферменты, ответственные за образование аце-
тона и бутанола, — ацетатацегатдекарбоксилаза и фермент, дегид-
рирующий бутанол (рис. XVI-4). При брожении в щелочной среде»,
например в присутствии СаСО3, соотношение между продуктами
реакции меняется (табл. XVI-1).
ГЛАВА XVII. БИОСИНТЕЗЫ ЧЕРЕЗ АЦИЛ-КоА
I. АЦЕТИЛ-КоА, ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКА
И БИОГЕНЕЗ
Многие микробные метаболиты, несмотря на кажущуюся слож-
ность их структур, построены из нескольких структурных единиц.
К их числу относятся так называемые ацетатные единицы Они яв-
ляются метаболическими предшественниками кислот цикла Креб-
са, участвуют в биосинтезе липидов, а также многочисленных про-
дуктов, которые принято относить ко вторичным метаболитам. За-
кономерности включения ацетата в те или иные синтетические ре-
акции определяются генетическими особенностями культуры, на-
личием соответствующих ферментных систем, спецификой в про-
явлении их активности, физиологическим состояпием клетки. В ре-
акциях синтеза уксусная кислота выступает обычно в виде своего.
КоА-производного — ацетил-КоА. Метаболическим предшественни-
ком ацетил-КоА является пировиноградная кислота. Реже, как
вторичный процесс, она образуется из жирных кислот в резуль-
тате р-окисления:
Ацетил-КоА входит в метаболический фонд клеток Пул ацил-
КоА в 20—30 раз выше у высокопродуктивных штаммов, чем у
низкопродуктивных, если в синтезе структур целевых продуктов
участвуют активированные ацил производные Специфическая ак-
182
тивность аццл-КоА синтетаз у высоко- и низкопродуитивных штам-
мов, как правило, не различается. Имеется больше оснований счи-
тать, что пул ацил-КоА производных проявляет регуляторную-
функцию относительно тиоэстераз, т. е ферментов, разрушающих
тиоэфирпую связь между коэнзимом А и ацильной группировкой.
О потенциальной возможности синтеза через ацил-КоА косвен-
но можно также судить ио содержанию в среде пировиноградной
и молочной кислот. Их наличие может свидетельствовать о том,
что окислительное декарбоксилирование пировиноградной кисло-
ты ограниченно.
Как было сказано выше, непосредственно в реакции синтеза
включается ацетил-КоА. Известно несколько путей образования
ацетил-КоА в организмах. Одним из источников может служить-
пировиноградная кислота. Образование ацетил-КоА из пирови-
ноградной кислоты проходит ряд стадий Известно, что в декарбо-
ксилировании пировиноградной кислоты принимает участие ти-
аминпирофосфат. В этой системе кетокислота в необратимой ре-
акции присоединяется к углеродному атому тиазольного кольца
тиаминпирофосфата с образованием производного сс-оксикислоты.
Последнее соединение далее декарбоксилируется с образованием
альдегида и тиаминпирофосфата. В специфическом случае ниру-
ватдекарбокенлазы сначала из пирувата образуется а-лактил-2/-
тиамиппирофосфат («активированный пируват»), а затем а-окси-
этил 2,-тааминпирофосфат («активированный ацетальдегид»),
который переносится затем на линоевую кислоту.
Образование ацетиллпноевой кислоты представляет собой
окислительно-восстановительную реакцию, в которой липосвая кис-
лота восстанавливается, а ацетальдегид окисляется. Затем в рс
зультате переэтерификации ацетильная труппа переносится с аце-
тиллипоевой кислоты на коэнзим А Восстановленная липосвая
кислота снова окисляется в дисульфидную форму при участии
дегидрогеназы. Все ферменты, участвующие в этой цепи реакций,
образуют мулыиферментный комплекс Липоевая кислота присо-
единяется к ферментному белку ациламидной связью Схема ре-
акций показана па рис XVII-1.
В реакциях синтеза ацетил-КоА может непосредственно участ-
вовать уксусная кислота В его образовании принимают участие
ацетат, АТФ и КоА У большинства бактерий активация уксусной
кислоты осуществляется через ацетилфосфат, а почти у всех дру-
гих организмов через ацетиладенилат В обоих случаях синтез
происходит в две стадии, промежуточными продуктами соответст-
венно выступают ацетил фосфат и ацетиладенилат.
Существенной особенностью всех перечисленных реакций яв-
ляется образование тиоэфира (СН3СО—SKoA). Известно, что
тиоэфиры более активны, чем их кислородные аналоги, так как в
отличие от тноэфиров они хорошо стабилизированы резонансом
Это обстоятельство делает тиоэфиры более реакционноспособны-
ми в биохимических процессах. Группировка С-О приобретает кар-
бонильный характер, вследствие чего атом кислорода имеет отри-
184
+ ЛДФ
+ HSKoA—
дательный заряд, атом углерода — положительный. Этот положи-
тельный заряд вызывает в о-атоме углерода отрицательный заряд,
что в свою очередь ведет к ослаблению С—Н-связи и К легкой от-
ацепляемости протона. Таким образом сам ацетил-КоА выступает
в электрофильной и нуклеофильной формах. В электрофильной
форме положительно заряженный карбонильный углеродный атом
открыт для нуклеофильной атаки-
снз—С—SKoA
В нуклеофильной форме отрицательно заряженная метильная
группа открыта для атаки электрофильно заряженных веществ.
Очевидно, что образование двойной связи с атомом серы невоз-
можно, вследствие чего проявляется тенденция, направленная на
диссоциацию смежной а-метильной группы в карбанион и протон^
CHs-O—SKoA-fH~.
Из наиболее распространенных реакций нуклеофильного заме-
щения ацетил-КоА можно назвать реакцию фосфорилирования
яцетил-КоА с образованием ацетилфосфата Как известно, при
.нуклеофильной атаке атакующее соединение подходит к атакуе-
мому со своей парой электронов
СН,—С—S—КоА
О=Р—ОН fl-r
он
185
В качестве нуклеофильного реагента ацетил-КоА выступает в-
одной из реакций цикла Кребса при образовании лимонной кисло-
ты, когда электрофильное замещение осуществляет щавелевоук-
сусная кислота. В этом случае входящий фрагмент связывается
электронной парой атакуемой молекулы:
сщсоон
2. МАЛОНИЛ-КоА
Как нуклеофильное соединение ацетил-КоА проявляет себя,
когда происходит карбоксилирование с образованием малоннл-
КоА в биотинзависимой реакции (рис. XVI1-2). В результате этой
реакции атом углерода молекулы СО2 становится атомом углеро-
да свободной карбоксильной группы малонил-КоА Катализирую-
щая эту реакцию ацетил-КоА-карбоксилаза способна также кар-
бокси.чировать пропионил-КоА с образованием мстил-малонил-
КоА, однако эта реакция протекает со значительно меньшей ско-
186
ростью Активировать процесс карбоксилирования ацетил-КоА мо-
гут цитрат, изоцитрат, а-кетоглутарат, являющиеся положитель-
ными аллостерическими стимуляторами.
В реакциях полимеризации, где формальной структурной еди-
ницей молекулы вновь синтезированного вещества выступает аце-
тат, обычно реально участвует малонат. Образование малопата
является ни чем иным, как формой активации молекулы ацстил-
КоА, обеспечивающей возможность реакции полимеризации. Ис-
ходным для синтеза соединения может быть ацетил-КоА Рост
цепи начинается с карбоксильной группы ацетил-КоА путем после-
довательного ее увеличения на два углеродных атома. Каждые
последующие два углеродных атома (или ацетильные остатки/
берут свое происхождение от малонил-КоА. В ходе реакций атом
углерода, принадлежащий свободной карбоксильной группе, те-
ряется в виде СОе. Ацетил-КоА в этой реакции выступает в элек-
трофильной форме, а малонил-КоА — в нуклеофильной, т. е. про-
дсходит электрофильная атака:
сЛ О
Л _ II
CHS—С—S КоА + СООН- -CH- -C-S КоА + Н* ->
fi*
О о
-> СНа—С—СН2—С—S КоА + Н S КоА + С08.
Таким образом, свободная карбоксильная группа каждого но-
вого остатка малонил-КоА замещается * на карбоксил растущей
цепи ацил-КоА. В результате декарбоксилирования происходит
активация концевой группы вследствие возникновения отрицатель-
ного заряда.
Помимо реакции карбоксилирования ацетил-КоА малонил-КоА
может происходить из щавелевоуксусной кислоты. В результате
ее декарбоксилирования образуется малоновая кислота, к кото-
рой присоединяется коэнзим А. Щавелевоуксусная кислота может
выступать в реакции в----------—'----- ....г. ——
Катализирует реакцию
качестве донора' карбоксильной группы,
фермент фосфопируваткарбоксикиназа:
/67
—Е+ЛПБ—SH—Малонил—S— АПБ+Е—ОН.
ьН^СО—S—АПБ -i- SH—Еч=ьСН8СО—SE+АПБ—SH,
СН3СО—S—Е +НООС—СНгСО—S—АПБчл
ОН
СНзСОСПЛО-Б—АПБ4-НАДФП+Н+->-СН5,С1Н—CHsCO—S—АПБ+НАДф
Как полагают, участие малонил-КоА в синтезе и выделение-
СОа в результате реакции имеет принципиальное значение для ее
хода Если бы в синтезе ацетоацетил-производного принимали уча-
стие две молекулы активного ацетата, т. е без выделения COg, то-
возникла бы необходимость обеспечить реакцию значительным
количеством энергии, а ее равновесие было бы сильно сдвинуто1
влево Наличие малонил-КоА в сфере реакции ведет к ее сдвигу
в сторону синтеза и выделению тепла. Таким образом, декар-
боксилирование малонильного остатка обеспечивает сильный тер-
модинамический «толчок» в направлении синтеза, в частности
жирных кислот. В том случае, когда в сфере реакции отсутствует
11АДН, вместо жирных кислот может синтезироваться лактон,
состоящий из трех ацетатных единиц. Из молекулы ацетил-КоА
в структуру входят С6 и метильная группа при Се, остальные, че-
тыре углерода происходят из малонил-КоА.
ОН
188
г. Дальнейшая конденсация, по-видимому, невозможна. Лактон
стабилизируется и теряет связь с ферментным белком. Тиольные
f группы АПБ восстанавливаются.
3. ЦИКЛИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ
Общие закономерности синтеза. Ацетатная теория синтеза по-
лучила распространение также на синтез циклических структур,,
в частности фенолов. Первоначально было высказано предполо-
жение, что происходит конденсация ацетатных единиц но типу
связи «голова — хвост», или, иными словами, посредством взаи-
модействия карбоксильной группы одной молекулы с метильной
группой другой. Позже было показало на примере синтеза 6-ме-
тилсалициловой, что в реакции принимают участие одна молекула
! ацетил-КоА и 3 молекулы малонил-КоА, а также одна молекула
НАДФН. Несмотря на то что большинство ферментов, осуществ-
ляющих реакции, не описаны, синтез можно представить в виде
ряда последовательных реакций:
CH3COS—KoA+2HOOCCH2CO—SKoA ----1
=₽ьСНзСОСН2СОСН2СО—SE+2CO2+3HSKoA;
CH3COCH2COCH2CO—SE+НАДФН +Н+-»
->CHSCOCH2CH (OH) CH2CO—SE+НАДФ+;
CH3COCH2CH (OH) CH2CO—SE=₽*
=^ch3coch=chch2co-se+h2o;
СНзСОСН-CHCH2CO—SE+HOOCCH2CO—S КоАчt
Синтетаза 6-метилсалициловой кислоты выделена в гомоген-
ном состоянии. По молекулярной массе фермент отличен от син-
тетазы жирных кислот (1,3-10в), но сходен с последней по опти-
муму pH, ингибированию реагентами на SH-группу и по способ-
ности синтезировать триацетатлактон. Нет прямых доказательств,
того, когда происходит дегидратация. Однако, очевидно, она име-
ет место после восстановления при одном из атомов углерода.
В обобщенной форме, без деталей и промежуточных этапов, син-
тез фенолов и их производных может быть представлен в сле-
дующем виде:
18S-
«СЛОН + 3CH3COOI-
r’co'cIIj CO’CUj CO’cilJ соон
н’со6сп" cu=‘ch’co!cii' cooir
Как наглядно показано на схеме, в результате реакций может
45ыть обеспечено достаточно большое разнообразие продуктов:
о—ацильное производное флороглюцина; в—г ацильное производ-
ное резорцина; г — можно рассматривать как производное м-кре-
зола или салициловой кислоты.
Существенной особенностью процесса синтеза циклических
структур в отличие от синтеза жирных кислот является то, что
растущая алифатическая цепь в известных пределах поддержива-
ется без восстановления. Характерна также невозможность иден-
тификации поликетометиленовых производных в синтезе арома-
тических продуктов. Это обстоятельство дает серьезные основания
полагать, что имеет место серия реакций, связанных с молекулой
фермента. Основными причинами, способствующими синтезу цик-
лических структур, вероятно, следует считать отсутствие баланса
между азотом и углеродом с преобладанием последнего. Фермен-
ты, принимающие участие в формировании исходных метаболи-
тов,— ацетил-КоА и малонил-КоА— всегда присутствуют в мице-
лии. Направление реакций определяется генетическими особенно-
стями культуры.
Тетрациклиновые антибиотики. Как и в случае синтеза отно-
сительно простых циклических соединений, исходным продуктом
для биосинтеза антраценовой структуры тетрациклиновых аити-
•биотиков являются те же КоА-производные, что и при сянтезе
жирных кислот Необходимо, однако, отметить различия, которые
наблюдаются в ходе реакций. В отличие от синтеза жирных кис-
лот карбонильные группы конденсирующихся единиц малонил-
КоА не восстанавливаются. Промежуточные поликетиды, имеющие
тиоэфирную связь с ферментным белком, остаются полностью или
190
частично окисленными и на последующих этапах конденсации.
Поэтому здесь на начальных этапах синтеза не требуется НАДФН;
не проявляет активности дегидратаза, образующая двойную
связь. Ее активность проявляется уже после формирования цикли-
ческой структуры.
Для синтеза полной молекулы тетрациклина необходимо иметь
всего 3 моля НАДФН, тогда как для синтеза молекулы пальми-
тиновой кислоты —14 молей НАДФН. Причем реакции с его уча-
стием могут происходить и на циклической структуре. Кроме ска-
занного можно отметить, что липогенез и биосинтез антибиотика
проходят на разных этапах роста культуры, поэтому конкуренции
за исходные продукты синтеза не происходит.
Исходными структурными единицами для биосинтеза молеку-
лы тетрациклина служат 8 молекул малонил-КоА и одна молеку-
ла мвлонамил-КоА. Последний образуется из аспарагина. Можно
представить себе два пути превращения аспарагина в малонамид.
В первом из них амидная группа аспарагина сохраняется в про-
цессе образования малонамида, во втором — амидная группа ма-
лонамида происходит из аминогруппы аспарагина. Образовавший-
ся малонамид активируется, в результате чего сначала происхо-
дит синтез ациладенилата, а затем малонамил-КоА
знищ conh2 + С04 + HSO
boon
СООН СО~АМФ СО—SKoA
I I SHKoA 1
СН2 + АТФ-----СН2 + ффп-----------— сн2 +- АМФ
ioNH2 OONHj conh2
191
| OK' %
1кСб
тетрациклин
Рис. XVII-4. Схема биогенеза антибиотиков тетрациклиновой группы
Детали биогенеза молекулы тетрациклина (рис. XVI1-3) неиз-
вестны, хотя чисто теоретические, рассуждения о возможных реак-
циях привели 3. Ванека и 3. Гошталека к заключению, что путь
от ацетил-КоА к гипотетическому нонакетиду включает в себя
взаимодействие примерно 50 ферментных систем. Дальнейшие
реакции превращения нонакетида в тетрациклин (или хлортетра-
циклин) контролируются 11 ферментативными реакциями. Общая:
схема биогенеза показана на рис. XVII-4.
После синтеза нонакетида, когда дальнейшая поликонденса-
ция, очевидно, становится невозможной, происходит циклизация
с одновременным введением в Се-положение метильной группы.
Механизм метилирования рассмотрен отдельно Здесь следует
лишь отметить, что мутанты, синтезирующие 6-деметилтетрацик-
лин, обычно дефицитны по параамипобензойной кислоте. Приве-
денные на схеме промежуточные продукты биосинтеза стали из-
вестными благодаря получению мутантов, у которых был блоки-
рован путь биогенеза на различных его этапах. На схеме показа-
но, что один из промежуточных продуктов может подвергаться
хлорированию. В этом случае дополняется лишь одна эта реак-
ция. Все остальные реакции на хлорированном ядре происходят
так же, как и на нехлорированном. В итоге синтезируется тетра-
циклин или хлортетр ациклин. Как в том, так и в другом случае
основными реакциями, принимающими участие в формировании
молекулы, следует назвать следующие: циклизация, метилирова-
ние в Q-положении, гидроксилирование кольца А в С4, гидрокси-
лирование при Си с одновременным восстановлением двойной
связи (4а—12а), аминирование в С4, хлорирование (в случае син-
теза хлортетрациклина), N-метилирование при С«, гидроксилирова-
ние при Се и восстановление двойной связи 5а— 11 а
Во многих реакциях синтеза и, в частности, при синтезе цик-
лических структур исключительно важное значение имеет восста-
новленная форма НАДФ, которая образуется в результате ряда
ферментативных реакций. Основным поставщиком НАДФН® явля-
ются реакции пентозофосфатного (гексозомонофосфатного) пути,,
а в данпом случае — малатдегидрогеназа НАДФ-зависимая де-
карбоксилирующая (рис. XVII-5, XVII-6)
Весьма полезно при оценке потенциальной синтетазной актив-
ности культуры обращать внимание на ход реакций, в результате
которых образуются восстановленные формы НАД В конкретном
случае синтеза тетрациклиновых структур основные реакции, в
результате которых образуется НАДН2, проходят раньше, чем
идет синтез антибиотика. Поскольку «стартовые» реакции синте-
за связаны с циклом Кребса, детальному анализу подвергались
продукты цикла, присутствующие в культуре продуцента, и фер-
ментативные реакции, осуществляющие их взаимопревращения.
Как общая закономерность был постулирован факт, что чем ниже
уровень ферментативных реакций в цикле Кребса, тем выше выход
тетрациклина Полагают, что продуктивный штамм имеет дефект
в своем энергетическом обмене, судя по низкому уровню АТФ и
194
Рис. XVI 1-5
Рис XVII-5. Метаболизм дикарбоновых кислот у Streptomyces eureofaciens
195
низкой активности ферментов цикла. Результатом этого являет-
ся усиление утилизации ацетата для синтеза вторичных метабо-
литов.
Известно, в частности, что при синтезе лимонной кислоты из
щавелевоуксусной и ацетил-КоА необходима АТФ. Тормозит ак-
тивность ферментов цикла Кребса бензилтиоцианат (роданистый
бензил), который обычно применяют в качестве компонента среды
при ферментациях тетрациклинов. Вследствие того что биосинтез
тетрациклина происходит при пониженной активности основной
энергетической системы клетки, процесс следует вести при жест-
ком контроле содержания фосфата в среде, хотя сам процесс об-
разования ацетил-КоА требует АТФ (см с. 183). Важное значение
в формировании структуры имеет щавелевоуксусная кислота, при
декарбоксилировании которой образуется малоновая кислота и да-
лее ее КоА-производное—малонил-КоА.
Согласно рис. XVII-1, ацетил-КоА может иметь происхождение
из пирувата благодаря активности пируватдегидрогеназы. Однако
у некоторых продуктивных культур ее активность относительно
невысока
Выше говорилось о несовпадении по времени липогенеза и син-
теза тетрациклинов. Вероятно, узловым пунктом, который обу-
словливает переход ко вторичному метаболизму, в данном слу-
чае— синтезу тетрациклина, является не окончание роста культу-
ры, а замедление синтеза белка. Следовательно, синтез вторичных
тетрациклиновых олигокетидов может рассматриваться как шун-
товый метаболизм ацетата в период, когда замедляется синтез
белка и когда ацетат перестает использоваться в цикле Кребса в
качестве промежуточного продукта в биосинтезе аминокислот.
Таким образом, биосинтез вторичных олигокетидов рассматрива-
ется, ио существу, как генетически фиксированный шувтовый ме-
таболизм ацетата. Полиацетильный полимер может быть конеч-
ным метаболитом, принимать на себя различные функциональные
группы, конденсироваться с продуктами иных метаболических пу-
тей, такими, как сахара, ароматические кли гетероциклические
структуры, происходящие от шикимовой кислоты.
Гризеофульвин. Молекула антибиотика гризеофульвина синте-
зируется из одной молекулы ацетил-КоА и шести молекул мало-
нил-КоА (рис. XVI1-7).
Первоначально здесь синтезируется поликетидное соединение,
которое циклизуется в производное бензофенона. Затем происхо-
дит ряд реакций на циклической структуре Сначала метилирова-
ние, далее хлорирование, повторное метилирование с образовани-
ем гризеофенона А. Последний этап — гидрирование дает молеку-
лу гризеофульвина. Хлорирование обеспечивается присутствующим
в среде хлоридом калия
4. МЕТИЛМАЛОНИЛ-КоА, ЕГО БИОГЕНЕЗ И УЧАСТИЕ
в реакциях синтеза
Другой структурной единицей, участвующей в биогенезе мно-
гих природных соединений, кроме ацетил-КоА является пропионо-
вая кислота в виде КоА-производного. Пропионил-КоА в культу-
рах микроорганизмов может синтезироваться различными путями.
Основные из них показаны на рис. XVII-8 Как и при синтезе че-
рез ацетил-КоА, когда участвует малонил-КоА, здесь в реакцию
вступает соединение, имеющее на один углеродный атом больше,
чем пропионил-КоА—метилмалонил-КоА Метилмалонил-КоА об-
разуется в результате зависимой от кобамида ферментативной ре-
акции мутации сукцинил-КоА, осуществляемой метилмалонил-КоА-
мутазой При этом происходит перемещение карбонильной тио-
эфирной группы к соседнему углеродному атому и возникновение
метильной группы вследствие перемещения атома водорода. Не
исключено и собственно карбоксилирование пропионил-КоА благо-
197
даря активности биотинзависимой карбоксилазы. Реакция эта воз-
можна, так как с-С-атом пропионовой кислоты имеет ярко выра-
женный нуклеофильный характер и может замещаться электро-
фильными реагентами. Именно таким электрофильным реагентом
является СОа, вступающий в реакцию в виде карбоксибиотина.
Пропионил-КоА может накапливаться в культуре в результате
функционирования системы р-окисления нечетных жирных кислот,
а также при ферментативной диссимиляции изолейцина. Источни-
ком метилмалонил-КоА могут быть аминокислоты валин и изолей-
цин. Очевидно, в реакциях синтеза они имеют меньшее значение
и включаются в процесс лишь в случае избытка в метаболическом
фонде.
198
Простейшим примером синтеза с участием названных соедине-
ний может служить реакция между пропионил-КоА и метилмало-
нил-КоА, являющаяся исходной для синтеза многих соединений.
Здесь имеет место электрофильная атака:
СН8—CH8—СО—S КоА + НООС—CH—СО—S—КоА
нуклеофильный
-> СН,—(И2—СО—CH—СО—S КоА + СО2 + Н S КоА
СН3
Более крупную молекулу образует одна молекула пропионил-
КоА и 6 молекул метил малонил-КоА при синтезе молекулы мак-
ролидного антибиотика эритромицина. Первоначально синтезиру-
ется лактон эритронолид В, который далее циклизуется и перехо-
дит в эритромицин при присоединении кладинозы и диметиламино-
гексозы—дезозамина (рис XVII-9). Как полагают, реакции про-
ходят на одном мультиферментном комплексе, от которого моле-
о
199
куда отщепляется только после полного завершения ее синтеза.
Возможно одновременное участие в синтезе нескольких различных
структурных единиц. Некоторые микобактерии, например, образу-
ют Сзг-микоцерозиновую кислоту из 10 молекул активного ацета-
та и 4 молекул активного пропионата:
Более сложной молекулой, в формировании которой принимают
участие не только ацетат и пропионат, является антибиотик маг-
намицин (рис. XVII-10)
пропионовой кислоты участвовать в синтезе раз-
Способность ..г________ ________ J_________ - ------- г —
личных метаболитов может быть использована на практике при
направленном биосинтезе. При ферментации эритромицина ее
можно вводить в среды в виде солей или амида. Однако практиче-
ски вводят пропиловый спирт, как менее токсичное, чем кислота,
вещество. Применение пропилового спирта с изотопными метками
по углероду в различных положениях показало, что он включает-
ся в молекулу аритронолида. Помимо того что при биосинтезе
эритромицина пропанол может включаться как структурная еди-
ница в молекулу, он, очевидно, является индуктором карбоксила-
зы пропионил-КоА. В настоящее время достаточно убедительно
показано, что введение пропанола в среду по ходу ферментации
может при соответствующих технологических режимах резко по-
высить выход антибиотика.
У продуцента Str. erythrens процесс активации пропионата яв-
ляется двуступенчатой реакцией, т. е. сначала происходит киназ-
ная реакция, как в случае с ацетатом, а затем реакция переноса
ацильной группировки Киназы относятся к числу ферментов,
имеющих невысокую специфичность. Однако специфичные кина-
200
| г
Г зы все же существуют. Специфичная в отношении пропионата ки-
наза у продуцента эритромицина. Она избирательно фосфорилиру-
ет пропионат, поэтому отбор высокопродуктивного штамма эрит-
ромицина может происходить, в частности, по критерию специфич-
ности киназы к пропионату. У некоторых известных штаммов—
продуцентов эритромицина высокая специфическая киназная ак-
тивность относительно пропионата коррелирует с высокой продук-
тивностью микроорганизма
Примером достаточно сложной структуры, сформированной из
ацетата, малоната и метилмаловата/ может служить антибиотик,
рифамицин. Распределение названных соединений по углеродной
структуре антибиотика показано на рис. XVH-11. Предполагается,
что поликетидная цепь образуется путем линейной конденсации
8 метилмалонатных единиц и 2 малонатных единиц с последующей
этерификацией гидроксила ацетатом G—25-атома. В формиро-
вании хромофорной части принимают участие глюкоза и глицерат,
судя по распределению меток. Реальными метаболическими пред-
шественниками, вероятно, являются промежуточные метаболиты
общего пути биосинтеза ароматических соединений, однако не ши-
кимовая кислота. Только 7 углеродных атомов в рифамицине про-
исходят не из пропионата или ацетата.
5. МЕВАЛОНОВАЯ КИСЛОТА, ЕЕ БИОГЕНЕЗ И УЧАСТИЕ
В РЕАКЦИЯХ СИНТЕЗА
Каротиноиды. Среди продуктов обмена веществ микроорганиз-
мов встречаются такие, структура которых формально отвечает
повторяющимся изопреновым единицам. Одной из важнейших
структур подобного рода являются каротиноиды. По классическо-
му определению, каротиноиды это желтые или красные пигмен-
ты алифатического или алициклического строения, состоящие из
201
изопреновых остатков (обычно из восьми). Последние соединены
таким образом, что две ближайшие к центру молекулы метильные
группы находятся в положении 1:6, тогда как все другие боко-
вые метильные группы расположены в положениях 1:5. Ряд со-
пряженных двойных связей составляют хромофорную систему ка-
ротиноидов (рис. XVI1-12). Наибольшее значение имеет и пред-
ставляет практический интерес (З-каротин. Молекула его содержит
две р-иононовые группировки.
Изучение закономерностей биосинтеза каротиноидов проводи-
лось в основном с культурами Blakeslea trispora и Phycotnyces
blakesleeanus и некоторыми дрожжами. Наиболее интенсивно син-
чески закончен (рис. XVII 13). Каротиноиды имеют внутриклеточ-
ную локализацию. У названных выше культур грибов они ассо-
циированы с липидами, реже— с белками Каротиноиды могут
быть включены в структуру цитоплазматических мембран, распо-
лагаясь в жировых гранулах. Вследствие хорошей растворимости
в жирах каротиноиды могут быть в комплексе со свободными ли-
пидами клетки
Биосинтез каротиноидов слагается из следующих этапов-
ных Сад-соединсний из С6-предшественника, 3) формирование мо-
лекул различных каротиноидов путем дегидрирования бесцветного
предшественника; 4) циклизация
Первый этап можно рассматривать как частный случай синте-
за через ацетил-КоА, поскольку именно этот продукт принимает
участие в первых трех реакциях Продуктом этих реакций явля-
ется 3-окси-З-м.етилглутарил-КоА, который в результате НАД-за-
висимого энзиматического восстановления превращается в мева-
лоновую кислоту (3,5-диокси-3-метил-валериановая кислота). Про-
межуточным продуктом, который не выступает в свободной фор-
ме, оказывается мевальдиновая кислота. Восстановление являет-
ся практически необратимой реакцией Мевалоновая кислота
обычно рассматривается как прямой и специфический предшест-
венник изопреновых производных. Следует отметить, что мевало-
новая кислота может быть получена при культивировании одного
из мутантных штаммов микро-
организма Endomyces fibuli-
ger
Далее в цепи биогенеза ка-
ротиноидов мевалоновая кис.
лота подвергается фосфорили-
рованию АТФ, протекающему
в три этапа. На-первом из них
образуется 5 фосфомевалоно-
вая кислота, далее — 5-пиро-
фосфомевалоновая. Третья ре-
акция фосфорилирования соп-
ровождается декарбоксилиро
ванием, в результате которого
образуется изопентенилпиро-
фосфат Последний может под-
вергаться изомеризации в
3,3- диметилаллилпирофосфат.
Биосинтез бесцветных С^-сое-
динений из С5-предшественни-
ка начинается с образования геранилпирофосфата, что происхо-
дит при нуклеофильной атаке диметилаллилпирофосфата изопен-
тенилпирофосфатом.
Дальнейшие трансферазные (синтетазные) реакции приводят
к образованию фарнезилпирофосфата, соединения, содержащего
15 углеродных атомов и геранилгеранилпирофосфата с 20 углерод-
ными атомами (рис. XVII-14). Димеризация последнего приводит
к получению первого бесцветного С^-предшественника р-кароти-
на — фитоина В результате последовательно протекающих реак-
ций дегидрирования фнтоина образуются фитофлуин, 5-каротин,
нейроспорин, ликопин. В ходе реакций фнтоин ступенчато теряет
8 атомов водорода (рис. XV1I-15).
Согласно схеме лйкопип выступает в качестве конечного про
дукта, однако в некоторых организмах, вероятно, могут функцио-
нировать ферментные системы, осуществляющие его превращение
в p-каротин. Конечным этапом биосинтеза каротинов является
циклизация с образованием а- и р-иононовых колец (рис. XVII-16)’.
Процесс циклизации начинается с присоединения протона к треть-
ему углеродному атому, восстановления двойной связи между вто-
рым и третьим углеродными атомами с одновременным образова-
203
204
кием связи между вторым и седьмым атомами Последняя реакция
ведет к восстановлению двойной связи между шестым и седьмым
углеродами. Далее, в случае образования р-иононового кольца про-
исходит отщепление водорода от седьмого атома углерода. При
формировании р-иононовой структуры атом водорода отщепляет-
ся от рятого углеродного атома. Соответственно между 6-м и 7-м,
5-м и 6-м атомами углерода возникают двойные связи.
I
Рис. XVII-15. Схема образования Р-каротина из геранилгераиилпнрофосфата
205
р-иоион
О-ион₽н
Большой вклад в установление промежуточных продуктов био-
синтеза каротиноидов внесли опыты по изучению действия инги-
биторов и стимуляторов. Наиболее известным соединением, при
добавлении которого в среду происходит угнетение синтеза каро-
тиноидов, является дифениламин:
Последний, по-видимому, препятствует процессу дегидрирова-
ния, вызывая накопление более насыщенных соединений, в пер-
вую очередь фитоина и фнтофлуйна.
1—-3%- В культуре Phycomyces blakesleeanus р иовои" выполняет функцию не-
Опыты с Blakeslea trispora^ привели к доказательству увеличения синтеза
каротина, белка и РНК при добавлении Р-ионона к растущей культуре, причем
было сделано заключение, что стимуляция процесса осуществляется на уровне
Ж
Р-каротина (табл. XVII-1). ? *
NRRL 2456(4-1 I NRRL 2457 (—) I NRRL 2456x2457
Масло1
420 •
560
390
1550
24
820
470
400
320
390
420
1080
75
1490
1980
4000
1760
640
11000
6500
280
12960 ‘
*соон
Триспоровые кислоты A — R-цдс или транс СМе СН(СН2)гСН3;
В—R-цис-илн транс СМе CHCH2CH,COCHj;
С—R цис- или траяс-СМе СНСН»СН2СНОНСНг.
щим одну из, стадий репродукции, но и инициатором образованная каротина у
Предполагают, что триспоровые кислоты стимулируют синтез ферментов,
действующих на этапе от ацетил-КоА до p-каротина. Механизм действия три-
споровых кислот заключается в том, что они являются дерепрессором гена.
207
Рис. XV11-17 Структура гибберввлинов грибного (Z) и растительного (Я) про-
исхождения
и концентрации триспоровых кислот, которая для достижения положительного
эффекта должна быть достаточно высокой, порядка 250—500 мкг на 1 мл
среды.
Гиббереллины. К числу продуктов, синтезируемых через меналоновую кис-
лоту, относятся гиббереллины Они представляют собой группу физиологически
активных соединений, регуляторов роста растений, имеющих гормональную
природу., В настоящее время описано около сорока различных соединений, объ-
единенных общим названием гиббереллины.
208
Промышленное получение гиббереллинов осуществляют при культивирова-
нии грибов, преимущественно различных штаммов Gibberella fujikun. представ-
ляющих собой конидиальную стадию Fusarium momliforme По химической при-
роде все они являются тетрациклическими карбоновыми каслотами, относящи-
мися к терпеноидам (рис XVII 17).
Гибберелляны обозначают символом А с цифрой справа внизу, порядковым
яомсром, который присваиваегса каждому новому гиббереллину по мере выде-
ления и идентификации В зависимости от числа углеродных атомов гибберел-
лины делят на две группы К одной из них относятся соединения, имеющие
20 атомов углерода. Это истинные дитерпены, число атомов углерода в их мо-
лекуле кратно пяти К Другой группе принадлежат Си углеродные соединения,
которые своим биосинтетическим происхождением обязаны Сго-пронзводным
-Основные различия. между гиббереллинами наблюдаю гея в отношении заместм-
Наиболее распространенным и одним из самых ^физгюлогическн активных
гиббереллинов янлнется вещество А3> которое получило название гибберелловой
(гиббереллиновой) кислоты Начальные этапы синтеза ее молекулы проходят по
путл, сходному с путем । каротиноидов Общий конечный продукт с обоих про
зация геранйлгеранилпирофосфата приводит к образованию бициклической струк
туры, имеющей энантиомер Депротеинизация последнего дает лабалиенолпиро-
•фосфат (лабадиеп), который далее циклизуется до пимарадиена. ' Последний
кауреновая кислота, 7-оксикауреновая^кислота (рис. XVH-18). ’
•сжатием одного кольца от^ которого отщепляется атом углерода. ^Переход от
Cso к Cis-гнббановой структуре происходит с образованием -у лактона, двойной
ГЛАВА XVIII БИОСИНТЕЗ ЦИКЛИЧЕСКИХ СТРУКТУР
ЧЕРЕЗ ГЕКСОЗОМОНОФОСФАТНЫИ ПУТЬ
ОБМЕНА УГЛЕВОДОВ
I. СИНТЕЗ ЧЕРЕЗ ШИКИМОВУЮ КИСЛОТУ
Гексозомонофосфатный путь ассимиляции^ углеводов ведет к
синтезу циклических структур, в частности некоторых гетероцик-
лических соединений Исходной реакцией, которая лежит в основе
-синтеза циклических структур, является взаимодействие между
фосфоенолпируватом и С>-эридрозо-4-фосфатом. Благодаря присо-
единению карбонильной группы сахара к двойной связи энолпиру-
вата из них вначале образуется 3-дезокси-0-арабиио-гептулозо-7-
фосфат, причем фосфатная группа фосфоенолпировиноградной
кислоты теряется. 3 Дезокси-В-арабино-гептулозонат 7-фосфат цик-
лизуется в 5-дегидрохинную кислоту На этом этапе возможны
промежуточные реакции с участием НАД+ и НАД-Н
Посредством отщепления воды из 5-дегидрохипной кислоты об-
разуется 3-дегидрошикимовая кислота (ее прежнее название 5-де-
гидрошикимовая кислота), которая затем восстанавливается в
щикимовую кислоту- После фосфорилирования в 3-м положении
210
л отрадная к-та
нон
7-фосфо-2-кето-3-д.езокси-С.-араСивогептонат
к НАД*
НАД-II Н*
соон
©Оорт™,
HOQH JDHOH
с©
|*“фк
21t
D-шикпмат-З-фосфаг
(прежнез название шлкимат-5~фосфат)
ос—соон
iis
шикимовая кислота реагирует с фосфоенолпируватом, в результате
образуется шикимат-5-енол-пируват-З-фосфат. При отщеплении
остатка ’фосфорной кислоты это соединение переходит в хоризмо-
вую кислоту (рис. XVIII-1). Последняя является исходным про-
дуктом для синтеза антраниловой, n-аминобензойной, о- и п-окси-
бензойной кислот, равно как и аминокислот фенилаланина, тиро-
зина, триптофана (рис. XVIII-2).
Хоризмовая кислота является исходным ж _ синтеза
-убихинонов. Известно, что убихиноны принимают участие в пере-
носе электронов в дыхательной цепи По химической природе они
являются бензохинонами, имеющими гидрофобные изопреновые
боковые цепочки.
В результате ферментативного отщепления пировиноградной
кислоты от хоризмовой образуется п-оксибензойкая кислота. По-
следняя вступает в реакцию с пренилпирофосфатом, при этом те-
ряется карбоксильная группа п-оксибензойной кислоты. Возникаю-
щий пренилгидрохинон гидроксилируется, метилируется и т. п. в
последующих реакциях. Все метильные и метоксильные группы
происходят из метионина. Синтез лренилпирофосфата осуществля-
ется по пути, свойственному каротиноидам, через мевалоновую
кислоту (рис. XVIII-3).
он
Одной нз существенных метаболических функций хоризмовой
кислоты является ее способность к аминированию, в результате че-
го появляются продукты, содержащие в своей структуре азот.
К ним относятся в первую очередь антраниловая и п-аминобензой-
ная кислоты. Как при синтезе антраниловой, так и при синтезе
п-аминобензойной кислоты донорами аминогрупп могут быть глу-
тамин (амидотрансферазная реакция), отдающий свою амидкую
группу или ион аммиака. Однако, видимо, решающее значение
имеет глутамин как более специфичный донор. Для обеих реак-
ций требуется магний, а при синтезе п-аминобензойной кислоты
необходим гуанозин. Полагают, что между исходным веществом,
хоризмовой кислотой и конечными продуктами имеются промежу-
точные метаболиты, которые не были выделены, поэтому изобра-
женные па рис. XVIII-4 реакции не дают представления о всех де-
талях процесса.
214
Исходным веществом для биосинтеза феноксазиновых произ-
водных также является хоризмовая кислота. В данном случае в
результате ряда реакций происходит формирование гетероцикл и-
КИСЛОТЫ
чёской структуры. В качестве одного из наиболее известных ве-
ществ, в основе которого лежит феноксазиновая структура, мо-
жет быть назван актиномицин D, синтезируемый культурой Strep-
tomyces antibioticus. Актиномицин D хорошо известен как ингиби-
тор активности РНК-лолимеразы. После аминирования хоризмо-
вой кислоты образующаяся антраниловая кислота гидроксилирует-
си, в результате возникает 3-оксиантраниловая кислота. После ее
метилирования происходит присоединение пептидной группировки
С образованием пептидлактона-З-окси-4-метилантраниловой кисло-
ты. Две молекулы пептидного лактона конденсируются с образо-
215
ванием феноксазинона, производными которого являются актино-
мицины (рис. XVIII-5):
Из антраниловой кислоты происходит синтез хинолиновых про-
изводных, в частности алкалоидов, относящихся к псевданам, име-
нуемым так по родовому названию продуцирующих культур бак-
терий Pseudomonas. В реакцию вступает антраниловая кислота
в виде своего КоА-производного. Другим компонентом реакции
служит также КоА-производное fj-кетокислоты, число углеродных
атомов которой зависит от их количества в боковой nehii псевда-
на (рис. XVIII-6).
При рассмотрении путей синтеза продуктов, образованных че-
рез антраниловую кислоту, особенно вторичных метаболитов, не-
обходимо иметь в виду, что возможным метаболическим предше-
ственником для них может быть триптофан. В этом случае антра-
ниловая кислота также участвует в синтезе, но она происходит из
триптофана в результате его ферментативного распада.
Одним из метаболитов актиномицетов является антибиотик но-
вобиоцин С точки зрения механизма биогенеза, новобноцин ин-
тересен тем, что в формировании его молекулы принимают участие
продукты, возникающие в результате функционирования гексозо-
монофосфатного пути, и производное глюкозы—новиоза. Из ши-
216
антраяопл-КоА КоАэфир {j-кето- 2-яякил 3-карбо-
Рис. XVI1I-6. Синтез псевдана из антраиоил-КоА
Рис. XVH1-7. Метаболические предшественники молекулы новобиоцина
кимата возникают промежуточные метаболиты синтеза З-амиио-
4,7-диокси-8-метилкумарин и 4-окси-З (З-метил-2-бутенил) -бензой-
ная кислота (рис. XVII1-7).
2. ВВЕДЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП
В ЦИКЛИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ
введение новых функциональных групп. Несколько таких реакций было показа-
но при рассмотрении механизма биогенеза молекулы тетрациклина. Важным ата-
витамина К и ряда других продуктов, имеющих происхождение из \иикимовой
Метилирование. Реакция метилирования может происходить в процессе фор-
иыеющвя поликетиды в качестве промежуточных метаболитов, С-метнлирование
происходит перед замыканием кольца, до освобождения ароматического про-
2/7
дукта от связанного с лим фермента. Вероятно, на этом же уровне происходит
присоединение любого другого алкильного радикала, хотя допускают, что алки-
лирование может идти и на сформированных ароматических соединениях где
в реакцию вступают углеродные атомы, имеющие нуклеофильный характер’ Ак-
цепторами метильных групп могут быть соединения, содержащие аминогруппы
или замещенные аштогруппы (—NH2, -NHR, -NR-R,). гидроксильные
(—ОН) или сульфгидрильные (—SH) группы.
Основным источником метильных групп служит метионин в своей активной
форме в виде S аденозилметноиниа.
СООН
JffiNH
За счет активности метилтрансферазы происходит перевес метильной группы
ь ядевозилметионина к соответствующему акцептору, в результате чего S-аде-
иозилметиоинн превращается в S аденозилгомоцистеин. Метилтрансферазы раз-
личаются по своей специфичности к определенным акцепторам. Коферментом
при переносе одноуглеродных соединений, в частности метильной группы, служит
восстановленная форма фолиевой кислоты — тетрагцдрофолиевая кислота Де-
тальное рассмотрение механизма переноса изложено в главе о коферментах
(см гл. XXV)
J—NH
соон
СО — NHCHCHjCHjCOOH
Здесь следует обратить внимание на то, что в состав фолиевой кислоты и
соответственно тетрагидрофблата входит п-аминббензойиая каслота. Ее анти-
метаболит™ является сульфаниламид, имеющий структурное сходство с этой
вить реакции метилирования, то в сферу реакции, в данном случаев среду,
вводят сульфаниламид Вследствие структурного сходства с п-аминобензойной
инслотой, он аходит вместо нее в реакцию, искажая структуру кофермента и
превращая его в неактивное соединение. Именно таким путем можно пользо-
ваться, если надо получить деметилированное производное тетрациклина'
218
происходить реакции введения гидроксильных заместителей. Энзиматический
процесс гидроксилирования осуществляют монооксигеназы, которые включают
один атом кислорода из молекулы Ог на молекулу субстрата, а другой атом
освобождают через воду В качестве переносчика водорода, простетической
группы, они содержит птеридин или флавин. Они катализируют реакции, в ко-
торых —Н или —СООН замещается на —ОН, Примером могут служить реак-
ции гидроксилирования 4-оксибензойиой кислоты, в результате образуется про-
токатеховая кислота и салициловая кислота, которая превращается в пирокате-
хин. В первом случае реакцию осуществляет п-оксибензоат гидроксилаза, во
втором—галипилат гидроксилаза.
+ О2 + НАДФН +НТ
+ НАДН + Н
Н2О + НАД* + С02
Другим примером подобных реакций служит синтез м-оксибензойной кис-
лоты и антибиотика патулина (ркс XVIII-S). Механизм синтеза 6 метилсали
циловой кислоты приведен выше (см с. 189). В этих реакциях принимают уча-
стие 6-метилсалицилатдекарбоксилаза; м-крезолгидроксилаза; дегидрогеназа, ка-
тализирующая обратимое превращение м-окссбензола в соответствующий альде-
гид, м-оксибепзол гидроксилаза Обеим названным гидроксилазам требуется
инслород и НАДФН для проявления активности
лина и гризеофульвина содержатся атомы хлора В связи е этим для синтеза
назааииых соединений в среде должно присутствовать минеральное хлорсодер-
жащее соединение. Обычно вводят соли калик или натрия. Хлорирование про-
исходит тогда, когда циклическая структура уже сформирована. Эпзиматиче-
Более сложной является задача получении соединения, лишенного хлора, в
Поскольку ион хлора практически всегда присутствует в компонентах среды
219
строго определенных концентрациях, так как высокое их содержание в среде
При введения в среду бромидов все же ие удается получить 100%-ный вы-
ход тетрациклина^ Около 10 % продукта приходится на хлортетрациклии. Для
220
Здесь X—S, —SH. SR, — NH,, - NHR, —NRR (R — метил.
ГЛАВА XIX СИНТЕЗ ВИТАМИНА Bl2.
СУКЦИНАТ-ГЛИ ЦП НОВЫЙ ЦИКЛ
1. СТРУКТУРА ВИТАМИНА Bi2
Биосинтез витамина В)2 осуществляется культурами актиноми-
цетов и бактерий. Наибольший промышленный интерес представ-
ляют пропионовокислые бактерии, в частности Propionibacterium
shermanii- Витамин удерживается в клетках пропионовокислых
бактерий на протяжении всего процесса ферментации. Наивысшая
продуктивность бактерий в отношении витамина В12 отмечается у
молодой культуры. Наибольшее количество витамина синтезиру-
ется в анаэробных условиях культивирования. Особенно вредное
влияние на биосинтез оказывает -выращивание бактерий в аэроб-
ных условиях в начале культивирования Что касается роста, то
в аэробных условиях бактерии накапливают не меньше биомассы,
чем в анаэробных,
Как известно, молекула витамина B!Z состоит из двух частей'
кобальтсодержащей (порфириноподобной) и нуклеотидной
Порфириноподобная структура является хромофорной, дли нее
характерно наличие атома кобальта и нианогрупиы, образующих
координационный комплекс. Четыре из шести лигандных положе-
ний этого комплекса занято четырьмя атомами азота тетрапиррол-
подобной коррнновой кольцевой системы. Одна позиция соединена
с азотом нуклеотидного основания, последняя из названных пози-
ций содержит в качестве заместителя CN-группу. Корриновая
структура, как и все порфирины, состоит из четырех азотистых ге-
тероциклов типа пиррола, соединенных системой конъюгирован-
ных двойных связей. В целом хромофорное ядро молекулы вита-
мина наиболее близко по строению к уропорфирину III, Это сход-
ство особенно проявляется в отношении природы и порядка рас-
22/
положения боковых цепей в пиррольных кольцах. Однако в отли-
чие от порфиринов молекула витамина В|2 более восстановлена
и содержит 6 дополнительных метильных групп, стабилизирую-
щих восстановленное состояние всего макрокольца. [.-Заместите-
лями в молекуле витамина В12 являются амиды уксусной и про-
пионовой кислот, а не свободные кислоты. Кольца А и D соеди-
нены ковалентной связью непосредственно, а не через метиковый
мостик. Пропионамид кольца содержит изопропаноламинный
•остаток, являющийся частью нуклеотидного лиганда
Нуклеотидное ядро состоит из пуринового основания, рибозы
и остатка фосфорной кислоты. Нуклеотидное ядро соединяется
с кобальтом через азот основания и с корриновым кольцом —
через аминопропаноловый мостик, который обычно выделяют как
самостоятельный структурный элемент молекулы Пуриновое
основание соединено с рибозой необычный N-a-гликозидной
связью в отличие от N-p-гликозидной связи, которая, как правило,
встречается в нуклеозидах природных пуринов и пиримидинов.
222
Основание нуклеотида, 6,6-диметил бензимидазол, не найдено в
других природных соединениях, кроме как в витамине В12.
В отличие от стабильного химического состава корринового
кольца состав нуклеотидного ядра варьирует Наряду с витами-
ном В12, который называют цианкобаламином, могут синтезиро-
ваться его аналоги- окси-, хлоро-, сульфате-, нитрито-кобал амины.
Если в нуклеотидной части молекулы вместо 5,&диметилбензими-
дазола содержится аденин, метиладенин, гипоксантин или их про-
изводные, вещество не обладает биологической активностью для
человека и животных. Его называют псевдрвитамином Преимуще-
ство получения витамина В12 с помощью пропионовокислых бак-
терий по сравнению с получением этого витамина с помощью ак-
тиномицетов заключается в том, что первые синтезируют исклю-
чительно истинный витамин В)2
Изучение производных витамина Bi2, синтезируемых пропио-
новокислыми бактериями, позволило установить, что он находит-
ся в основном в так называемой коэнзимной форме, которая со-
ставляет до 75—80 % суммы кобамидов. Эти формы характеризу-
ются тем, что место цианогруппы занимает молекула 5'-дсзоксн-
аденозина, присоединенная к атому кобальта Со—С-связью.
Цианкобаламин не обладает коэнзимной активностью и после
введения в организм человека должен трансформироваться в
свою коэнзимную форму. Однако при некоторых патологических
состояниях организма этого превращения не происходит. Призна-
но, что применение коэнзимной формы В)2 для медицинских целей
более оправдано, нежели цианокобаламина
2. СУКЦИНАТ-ГЛИЦИНОВЫЙ ЦИКЛ
Структурное сходство корринового кольца молекулы витами-
на В12 и уропорфирина III позволило выдвинуть гипотезу об общ-
ности начальных этапов биогенеза порфиринов и корриноидов.
Синтез порфиринов тесно связан с продуктами цикла Кребса.
В начальные реакции синтеза вступает янтарная кислота (сукци-
нат) в виде своего производного (сукцинил-коэнзима А) или а-
кетоглутаровая кислота. Сукцинил-КоА дает начало реакциям,
которые Шемин назвал сукцинат-глициновым циклом Исходной
реакцией этого цикла является конденсация сукцинил-КоА с гли-
цином по его а-углеродному радикалу. Предполагают, что продукт
конденсации а-амино-р-кетоадипиновая кислота декарбоксилиру-
ется, в результате образуется б-аминолевулииовая кислота
(б-АЛК) Ферментная система, осуществляющая эти превращения,
является пиридоксальфосфатзависимой Согласно предложенной
схеме (рис. XIX 1) сначала происходит образование стабилизиро-
ванного карбонневого иона при взаимодействии глицина и пири-
доксальфосфата через потерю протона. Затем следует конденса-
ция, при которой карбанион взаимодействует с электрофильным
карбонил-углеродным атомом сукцинил-КоА.
Ферментная система 6-АЛК-сиптетазы репрессируется кислоро-
дом. Фермент синтезируется только молодыми, находящимися в
логарифмической фазе роста клетками. С возрастом синтетическая
способность Propionibacterium shermanii снижается, и 96-часовая
культура вообще не образует б-АЛК.
Рис Х1Х-1. Сукцннат-глицнйовый никл
Наряду с сукцинат-глициновым циклом доказана возможность
синтеза б-аминолевулиновон кислоты исходя из а-кетоглутаровой.
В этом случае происходит НАДН-зависимое восстановление 1-кар-
боксильной группы а-кетоглутароиой кислоты с образованием
4,5-диоксивалериановой кислоты, а затем переаминирование этого
продукта с L-a-аланином до б-амннолевулиновой кислоты:
СООН СООН СООН
I I I
сн2 сн, сн3 сн, сн3
Д СН2 +СН—NH.-.CH, + <!=О
С=О До СООН С-0 Дэн
I_____ .1 а-вл»нкк | пировияо-
СООН НС=О СН3—МН2 градаая
Следующим этапом синтеза является образование монопирол-
ла — порфобилиногена из двух молекул б-аминрлевулиновой кис-
224
А-АЛК-дегидратааа активируется глютатионом и цистеином и
ингибируется солями тяжелых металлов и меркаптидами, что ука-
зывает на важную роль SH-групп в катализе. б-АЛК-дегидратаза
имеет аллостерическую природу. Активность ее ингибируется ге-
мом, конечным продуктом биосинтетического пути ;витамин Bi2
не оказывает ингибирующего действия.
По-видимому, у аэробных организмов основным источником
сукцинил-КоА является окислительное декарбоксилирование а-ке-
тоглутарата, тогда как у анаэробов возможно преимущественное
его образование из сукцината через сукцинил-КоА-синтетазную
реакцию или через метил-малонйл-КоА-изомеразную реакцию. Ис-
точником сукцината может быть восстановление фумаровой кис-
лоты
3. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЭТАПЫ БИОСИНТЕЗА
ВИТАМИНА В12
метилированные производные уропорфирина III, несущие метильные группы в
Существенный вклад в расшифровку заключительных атепов биосинтеза
занимают место между
(рис. XIX-2). Таким образ
кислотой
Метаболическим предшественником нуклеотидной части вита-
мина (5,6-диметилбеизимидазола) является рибофлавин. Меченый
рибофлавин и его предшественник 6,7-диметил-8-рнбитиллюмазнн
включаются в кобаламин бесклеточными экстрактами Propionibac-
terium shermanii. Разложение рибофлавина до 1,2-диамино-4,5-ди-
метилбензена происходит в аэробных условиях, что объясняет не-
обходимость аэрации во второй половине ферментации, если про-
цесс ведут без добавления предшественника.
Рибитольная часть рибофлавина не включается в рибозу. Име-
ются доказательства, что нуклеотидная часть кобаламина образу-
ется из свободного 5,6-днметнлбевзимидазола и рибозофосфата.
Достаточно сложным и малоизученным является вопрос о ме-
ханизмах регуляции синтеза молекулы витамина Bi2 и веществ, на-
ходящихся на общих путях биосинтеза. Установлено, что гем осу-
ществляет координированную репрессию ферментов, каталнзи-
225
рующих образование б-АЛ К, порфобилиногена и уропорфириноге-
на III, угнетая тем самым биосинтез как порфиринов, так и вита-
мина В]2, для которых все три перечисленные выше стадии явля-
ются общими (рис. XIX-3). Витамин В|2 не влияет на эти фермен-
ты, а его действие направлено на энзиматические системы, участ-
вующие в метилировании молекул уропорфириногена III. Эту ре-
прессию оказывает лишь нуклеотидсодержащая коэнзимная форма
битамина, поэтому включение основания в молекулу витамина яв-
ляется одним из факторов регуляции
Для синтеза витамина необходим ион аммония. Заменять его
могут только аминокислоты, которые подвергаются интенсивному
дезаминированию В реакции амидирования молекулы витамина,
вероятно, может принимать непосредственное участие глутамин.
Амидированию подвергаются остатки уксусной и пропионовой кис-
лот в ходе формирования молекулы витамина. В12.
4. ОБРАЗОВАНИЕ ВИТАМИНА В|2 ПРИ МЕТАНОВОМ
БРОЖЕНИИ
групп, которые ведут вваимосвязанпый и сложный процесс расщепления орга-
нических веществ до углекислоты и метана. К этим группам относятся угле-
226
8» 227
228
ГЛАВА XX. БИОСИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ
1. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОСИНТЕЗА
АМИНОКИСЛОТ
В последние годы широкое применение в народном хозяйстве,
медицине и сельском хозяйстве находят различные аминокислоты.
Особое значение они имеют для покрытия дефицита в азотном пи-
тании. Некоторые пищевые и кормовые продукты не содержат в
своем составе необходимое количество незаменимых аминокислот,
в частности лизина. К таким продуктам относятся широко распро-
страненные пшеница, кукуруза, овес, рис и ряд других. Для лик-
видации возможного дисбаланса аминокислоты используют в чи-
стом виде или вводят в состав премиксов. Поэтому основной сфе-
рой применения аминокислот следует считать создание рационов,
позволяющих снизить содержание растительных белков в кормах.
Показано, что искусственные смеси аминокислот позволяют сни-
зить на 15—2О°/о содержание белка в кормах. Мировой уровень
производства аминокислот достигает в настоящее время несколько
миллионов тонн в год Ведущее место занимает микробиологиче-
ский синтез.
Микробиологический синтез аминокислот сегодня является
перспективным и экономически выгодным способом производства.
В процессе ферментации непосредственно синтезируются L-амино-
кислоты.
Кроме микробиологического синтеза аминокислоты можно по-
лучать путем гидролиза природного белоксодержащего живот-
ного и растительного сырья и химическим синтезом. Первый из
названных способов является наиболее старым. Например,
в странах Юго-Восточной Азин моноглутамат натрия получают
из соевого шрота (обезжиренной соевой муки). Описаны способы
получения аминокислот из клейковины пшеницы и кукурузного
глютена, остающегося после отмывки крахмала. В равной мере
могут быть названы и другие белки, однако их использование
для получения аминокислот экономически невыгодно.
Химический синтез аминокислот достаточно эффективен, од-
нако его недостатком является получение готовых продуктов
в виде рацематов. В настоящее время еще не найдены достаточно
эффективные и дешезые пути разделения аминокислот на опти-
ческие изомеры. В связи с этим химический синтез остается рен-
табельным для получения тех аминокислот, которые могут быть
использованы в виде рацематов. В последние годы начинает за-
нимать прочные позиции комбинированный химико-микробиологи-
ческий метод синтеза, при котором исходное соединение получают
329
в результате химических реакций, а конечная стадия осуществля-
ется за счет активности энзиматических систем соответствующих
штаммов микроорганизмов.
Среди аминокислот, получаемых методом микробиологическо-
го синтеза, наибольший удельный вес имеет лизин. Метионин по-
лучают преимущественно путем химического синтеза. Занимаю-
щая видное место в мировом производстве глутаминовая кислота
используется в основном в виде мононатриевой соли для улучше-
ния вкуса пищевых продуктов. К числу дефицитных аминокислот
относится триптофан Однако вопрос о ликвидации его дефицита
может быть решен- путем регуляции обмена веществ через никоти-
новую кислоту.
мическим группам
л, обнаружено 20 % бактерий (из 650 исследованных),
(из 372), 30 «
синтезу одного на метаболитов (см ниже схемы биосинтеза ливина).
Наиболее распространенными продуцентами являются бактери-
альные культуры, относящиеся к родам Brevibacterium, Micro-
coccus, Microbacterium, Corynebacterium, Arthrobacter. Все они
грамположительные, палочковидные, не образуют спор. Аминокис-
лоты накапливаются в среде. Они не являются продуктами фер-
ментативного распада белков среды. Ферментативные реакции
синтеза протекают внутри клеток. Первоначально аминокислоты
накапливаются внутри клеток в виде свободных аминокислот. На
ранних этапах роста культуры они включаются в конструктивный
обмен. Активное накопление аминокислот в среде происходит с
середины экспоненциальной фазы роста культуры, достигая мак-
симума к ее концу.
2. ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
При биосинтезе глутаминовой кислоты непосредственным мета-
болическим предшественником является а-кетоглутаровая кисло-
та. которая возникает благодаря функционированию в клетках
230
цикла Кребса. Синтез глутаминовой кислоты происходит в ре-
зультате ферментативного восстановительного аминирования а-ке-
тоглутаровой кислоты за счет НАД- или НАДФ-зависимой глута-
м атдегидрогеназы:
НООССН2СНССООН
2 II
-----НАДЦ+(ф)+Н
-----*- НАД(Ф)
Тн’
нооссн2сн2снсоон
а-Кетоглутаровая кислота может также вступать в реакцию пе-
реаминирования с аминокислотами, осуществляемую трансамина-
зами. Коферментом в реакции переаминирования служит пиридо-
ксаль-5'-фосфат:
HOOCCH2CHSCCOOH+r—ссоон -
О NHa
HOOGCHjCHsCHCOOH + R ССООН
В цикле Кребса а-кетоглутаровая кислота образуется из изо-
лимонной кислоты под действием фермента изоцитратдегидроге-
назы. Согласно приведенной ниже схеме, один и тот же коэнзим
НАДФ специфичен для двух дегидрогеназ: изоцнтратдегидрогена-
зы и глутаматдегвдрогеназы. Таким образом, необходимый для
синтеза глутаминовой кислоты коэнзим постоянно регенерируется
при окислении изолимонной кислоты в а-кетоглутаровую.
Изолимовиая к-та --- -------НАДФ+ -*—. —>Ъ-Глутаминовак к-тв
Изоцитратлегидрсгеназа
Глутаматдегидрогеназа
+ СОг *—I 4-NHa
Анализ ферментных систем цикла Кребса у продуцирующего
глутаминовую кислоту штамма показвл, что в культуре имеются
все ферменты, кроме а-кетоглутаратдегидрогеназы, превращаю-
щей а-кетоглутаровую кислоту в сукцинил-КоА (рис. ХХ-1).
231
Не менее важным фактором является понижение активности
НАДФНг-терминалыной оксидазной системы, которая окисляет глу-
таминовую кислоту, что позволяет почти количественно сохранить
синтезированный продукт.
Для некоторых культур, продуцирующих глутаминовую кисло-
ту, например Brevibacterium flavum, показало, что при функцио-
нировании цикла Кребса происходит угнетение ферментативной
активности его собственными метаболитами. В частности, цис-ако-
ннтовая кислота угнетает активность цитратсиитетазы, а-кетоглу-
таровая — изоцнтратдегидрогеназы При этом функция глиокси-
латного пути не нарушается, на активность изоцитратлназы мета-
болиты цикла Кребса, видимо, не влияют.
Одним из первых методов микробиологического синтеза глу-
таминовой кислоты была энзиматическая трансформация а-кето-
глутаровой кислоты за счет высокой глутаматдегидрогеназной ак-
тивности некоторых культур. При этом в реакционную систему
вводили соль аммония, а-кетоглутаровую кислоту или ее соль, бу-
фер, обеспечивающий оптимум энзиматической реакции, и взвесь
232
глутаминовой
а-кето-
культуры, несущей глутаматдегидрогеназную активность. Метод
этот не получил развития и был вытеснен более выгодной эконо-
мически ферментацией. Одной из существенных причин, заставив-
ших отказаться от метода трансформации, послужило быстрое ис-
чезновение из сферы реакции кофермента, восстановление которо-
го возможно за счет функционирования соответствующих НАД-
зависимых сопряженных систем, в частности цикла Кребса Одно-
временное внесение этого ко-
фермента в систему трансфор-
мации слишком дорого.
При ферментации глутами-
новой кислоты в качестве источ-
ника углевода можно вводить
глюкозу, крахмал; из техни-
ческих продуктов — мел ассу,
гидрол. В последние годы в
качестве углеродного компонен-
та среды начали использовать
углеводороды, этанол, мета-
нол, уксусную кислоту; из ис-
точников азота — соли аммо-
ния или мочевину. Концентра-
ция углеводов в средах при
получении глутаминовой кис-
лоты обычно довольно высока,
до 5—10 % • Исходная концент-
рация источников азота низ-
кая. Прй таком соотношении
азота и углерода в среде неиз-
бежно закисление и снижение
pH. Вместе с тем такое соот
ношение ведет к ограниченно-
му росту биомассы, по, с дру-
гой стороны, к накоплению ме-
таболического предшественника
глутаровой кислоты. Чтобы включить в реакцию синтеза а-кста-
глутаровую кислоту, в среду периодически вводят раствор мочеви-
ны. Последняя, разлагаясь уреазой продуцента, образует аммиак,
глутаминовую кислоту. Введение раствора мочевины осуществля-
ется автоматически, когда уровень pH в среде достигает некоторой
контрольной величины (рис. ХХ-2). Как следует из рисунка, на-
копление глутаминовой кислоты происходит только тогда, когда
рост культуры закончен.
HjNCOCHjCH^HCOOH
NH,
НООССН2СН2СНСООН
nh2
3. лизин
Микробиологический синтез. Осуществляют мутантные штам-
мы, относящиеся к родам Micrococcus и Brevibacterium. Как пра-
вило, они проявляют дефицит к одной из аминокислот: гомосери-
ну, треонину, изолейцину, метионину или их сочетанию, а также
к биотину и тиамину. На рис. ХХ-3 дана схема биосинтеза лизина,
на которой показаны продукты, синтезируемые по общему с ли-
зином пути — из аспарагиновой кислоты, а на рис ХХ-4 детали-
зирован путь от полуальдегида аспарагиновой кислоты. Помимо
этого пути эукариотные организмы имеют еще один путь синтеза
234
• • f лизина через та-аминоадипиновую кислоту (рис. ХХ-5). В соответ- ствии со схемой для биосинтеза лизина и его накопления необхо- димо создать, такие условия, при которых будет ограничен синтез
! аланина, глутаминовой и молочной кислот, но интенсифицирован синтез аспарагиновой кислоты. В основе биохимического механизма регуляции синтеза лизи- на лежит принцип отрицательной обратной связи. Согласно этому принципу избыток конечного продукта реакции ингибирует свой собственный синтез (см гл XIV) В одном случае подавляется активность одного или ряда ферментов, происходит ретроингибиро- вание, связанное с аллостерическим эффектом, в другом — прекра- щается синтез самого фермента, имеет место репрессия. Отсюда
F t i » I' ! ? очевидно, что ряд аминокислот в среде должен присутствовать в строго ограниченном количестве, достаточном только для роста культуры. Узловым ферментом в синтезе лизина является аспартаткина- за. Угнетают ее лизин и треонин при их совместном действии, так как аспартаткиназа представляет собой мультивалентный фермент. Треонин ингибирует у Micrococcus giutamicus дегидрогеназу по- луальдетида аспарагиновой кислоты и гомосериндегидрогеназу. Метионин по отношению к гомосериидегидрогеназе является ре- прессором. Изолейцин ингибирует треониндегидрогеназу. Приведенные данные показывают, что продукты обмена ве- ществ, угнетающие различные ферменты, которые участвуют в синтезе лизина, должны быть выведены из сферы реакции. Имен- но поэтому дефицитные штаммы являются наиболее удобными для производства. Так, культура, лишенная активности гомосерин- дегвдрогеназы, обеспечивает достаточно высокие выходы лизина. Дефицитные аминокислоты, которые необходимы для роста, вно- сят со средой. Они обычно содержатся в природных продуктах, на- пример в мелассе Но количество этих аминокислот должно конт- ролироваться, чтобы не были созданы условия, при которых ами- нокислоты выступят в качестве регуляторов процесса. Одним из компонентов среды, оказывающим влияние на ход биосинтеза, является фосфор в виде фосфат-иона. При увеличении оптималь- ной для накопления лизина концентрации фосфора в 10 раз ко- личество лизина снижалось на 40 %, а содержание других амино- кислот, особенно валина, значительно увеличивалось. При изучении механизмов регуляции синтеза целевых продуктов особое вни- мание обычно обращают на конечные этапы биосинтеза, как это было показано выше на примере лизина. Вместе с тем крайне важно знать весь путь биосив- тивностй ферменте® гликолиза, цикла Кребса и синтезом лизина В непосред- 235
nhcoch2ch2cooh
1ю<>сунснл:н/'н^.'|к:сюи
nh2
М-сукцинил-Х,-2,6 диамикопимелиновая к-та
-HOCCCHjCHjCOOIi
HOOCCHCHjCIIjCHiCHCOOH
Ан2
NHS NH2
HOOCCHCHjCIIjCHj-CHCOOH
H2NCH2 CIIjCHjCHjCH (NHj)COOH
Рис. XX-4. Схема биосинтеза лизина через диаминопимелиновую кислоту
ственной связи с этим вопросом находится представление о влиянии концепт-
центрации углеводов в среде выше некой оптимальной, эмпирически устанив-
от многих показателей, и в частности в значительной степени от интенсивности
перемешивания среды. Максимальная лизиисинтезирующая активность проду-
цента Brevibacterium sp. 22 обычно наблюдается при высоких значениях актив-
са, но "высотах уровнях активности ферментов гликолиза и гексозомонофос^ат-
ного пути ассимиляции углеводов. При переключении от интенсивного роста к
условиям, благоприятствующим синтезу лизииа, т е. при переходе к замедлен-
ному росту одновременно отмечается повышение уровня активности ферментов
рой они поступают в клетку продуцента.
|л-н20
:H2CH2CUOH
JH соон
DH(OH)COOH
l- НАДЮГ
|*-ИАД(Ф)-Н+Н*
CH4CH2C00H
сн СООН
сосрон
HOOCCHj сн2снгсосоон
2ЯЯ
I
HOOCCHaCHuCH2CH(NH2)COOH
--НАД-Н+Н*
Z- АТФ
адинатрадуктавв Mgs*
X*- АМФ+ФФЯ
^“НАД*
OHCCHjCHjCH jCH (NiycoOH
• HjNCHCHjCHjCOOH
уоон
N—CHCH2CH2COOH
_HC—CHjCHjQIjCHfNI-ycOOH
НАД(ф)+Н*
-НАД(Ф)+
<j»OH
NH—CHCHjCHgCOOH
CH^HjCHjCH ,CH (NHj)COOH
дорадуктааа
HjNaijCHgCHjaijOKNiycoOH
Энзиматические методы. Одним из способов получения лизина
является энзиматический метод, где в качестве субстрата служит
мезо-изомер a-е-диаминопимелиновой кислоты, в качестве фермен-
та — диаминопимелинатдекарбоксилаза. Практически используют
взвесь микробных клеток (в частности, продуценты лизина Brevi-
bacterium 22), предварительно выращенных на соответствующей
239
среде. Иногда микробные клетки предварительно обрабатывают
ацетоном, получая «ацетоновый порошок». Однако его примене-
ние не всегда возможно, особенно в тех случаях, когда а-е-диами-
нопимелиновая кислота не способна проникать в клетки микроор-
ганизма, где протекает реакция декарбоксилирования. В таком
случае рекомендуется проводить дезинтеграцию клеток в услови-
ях, исключающих инактивацию фермента. Декарбоксилаза культу-
ры Brevibacterium 22 представляет собой аллостерический фер-
мент с несколькими активными центрами. Для проявления фер-
ментативной активности необходим пиридоксальфосфат Культура
сама его синтезирует. Прежде чем пройдет реакция декарбоксили-
рования, субстрат должен быть переведен в мезо-форму. В усло-
виях ферментации культура сама переводит его в мезо-форму из
LL-изомера за счет активности диаминопимелинатэпимеразы-
NH2
НО0С^НСН2СН2СН2СНСООН
NHS
NH2 NHj
ноосснсн2си2ен2^ясоои
IL2NCH2CH2CrijCH2CHNH2COOH
Предложено несколько технических способов перевода в мезо-
форму, например тепловая обработка при 200°C, пропускание че-
рез сульфокатионнт в Н+-форме и т. п. Разработаны методы куль-
тивирования Brevibacterium 22, обеспечивающие высокую декар-
боксилазную активность Закономерности, наблюдаемые при вы-
ращивании культуры, показаны на рис. ХХ-6. Наибольшая удель-
ная активность фермента на полусинтетической среде наблюда-
лась на 18—20-й час роста, т е в конце логарифмической фазы
роста; на мелассной среде — в середине логарифмической фазы
роста.
Помимо использования а-е-диаминопимелиновой кислоты в ка-
честве субстрата ферментативного декарбоксилирования при по-
лучении лизина показана возможность ферментативной конверсии
в лизин DL-ct-амино-е-капролактама Для осуществления процесса
первоначально путем химических реакций из циклогексана полу-
чают DL-a-амино-е-капролактам, который на стадии ферментатив-
ного гидролиза превращается в L-лизин. При этом происходит раз-
деление оптических изомеров, которое является наиболее сложным
и дорогим процессом при химическом синтезе всех L-аминокислот.
Этот метод предполагает участие двух энзиматических реакций:
рацемизацию D-c-амино-в-капролактам а и гидролиз L-аминолак-
тама (рис. ХХ-7). Проду-
центами гидролазы L-a-
амино-е-капролактама слу-
жат некоторые штаммы
дрожжей, относящихся к се-
мействам Cryptoccoccus,
Candida, Trichosporon Куль-
тивирование ведется в аэ-
робных условиях при тем-
пературе 20—40 °C, pH 6—
10 иа среде, содержащей
глюкозу, соль аммония, фос-
фаты, соли магния и мар-
ганца Непременно должен
присутствовать DL-u-ами-
но-е-капролактам (или L-
изомер).
Источником фермента
для осуществления техноло-
гического процесса гидроли-
за может служить био-
масса клеток, взятых сра-
зу после культивирования, клетки, обработанные ацетоном; клетки
после сублимационной сушки; клеточный экстракт и очищенный
фермент L-a-амино-Е-капролактамгидролаза. Реакция проходит в
щелочпой зоне pH, при температуре 40—50 °C. При более высокой
температуре активность падает Активаторами фермента являются
ионы Mn2+, Mg2+, Zn2+. По окончании реакции полученный лизин
извлекают из реакционной смеси каким-либо известным способом.
Оставшийся D-o-амино-е-капролактам подвергается рацемизации.
241
Рацемазу получают при культивировании бактерий, относящихся
к семейству Achromobacter, Flavobacterium и др. Продуценты вы-
ращивают при температуре 32°C в течение суток и pH среды 7,3.
Непременным компонентом среды, как и в предыдущем случае,
является DL-a-амино-е-капрол актам или его хлоргидрат. Принцип
действия фермента, по-видимому, одинаков с таковым рацемаз
аминокислот, требующих в качестве кофактора пиридоксаль-5-
фосфат.
При получении L-лизина целесообразно совместное действие
двух ферментов на субстрат. Для этого в водный раствор DL-a-
амино-е-капрол актама вводят необходимое количество дрожжевых
и бактериальных клеток, несущих гидролазную и рацемазную ак-
тивности. Для совместного действия двух ферментов наиболее бла-
гоприятным является pH среды 8,0—8,5, температура 30—50 °C.
В результате реакции DL-a-амино-е-капролактам количественно
переходит в L-лизин. Изложенный способ получения L-лизина ин-
тересен тем, что оба фермента можно получить в иммобилизован-
ной форме.
Помимо чистого лизина и его хлористоводородной соли про-
мышленность выпускает так называемый кормовой лизин. По-
следний представляет собой порошок, полученный путем сушки
культуральной жидкости продуцента лизина в распылительной
сушилке. В порошке содержится лизин, продукты метаболизма
продуцента и его клетки
Для повышения кормовой ценности препарата в ферментер,
где происходит биосинтез лизина, предложено добавлять культуру
Кормовых дрожжей. Они ассимилируют компоненты среды, кото-
рые не используют продуцент, быстро размножаются и тем самым
вносят в препарат некоторое дополнительное количество белка.
4 ТРИПТОФАН
корязмовая к-та
coon
антраниловая к-та
Кфф„
3H—CI12O@
Ь-НОСН2СН(МН2)СООН
- OHCCH(OH)CfljO@+Н2О
H2CH(NHj)COOH
Рис. ХХ-8. Схема биосинтеза триптофана из антраниловой кислоты
243
5. ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ
Одним из способов разделения рацематов аминокислот на L-
и D-изомеры является энзиматический путь с использованием мик-
роорганизмов, обладающих специфической L-ацилазной активно-
стью. Ацилазы разрывают пептидную связь у ацилпроизводных
аминокислот или пептидов, в результате Образуются соответствую-
щие свободные аминокислоты и пептиды, а также органическая
кислота (вертикальный пунктир показывает место действия аци-
лазы) :
R—СО—NH—CH—СО NH—СН—СООН--
R-COOH+NHeCH-CONH снсоон
К—CO—NH—СН—соон -
R-COOH + NHjCH—соон
При культивировании микроорганизмов, содержащих ацилазы,
необходимо соблюдать ряд условий, в частности вводить в среды
индукторы Как правило, ими являются вещества, близкие по
природе к субстрату действия ацилаз, например в случае работы
с лизином в-ацетил-Ь-лизин. Ацилазы грибов и дрожжей находят-
ся внутри клеток, поэтому их необходимо предварительно подвер-
гать дезинтеграции, возможно, с применением ультразвука.
Основой использования микробных ацилаз для гидролиза ацил-
производных аминокислот является специфичность их действия от-
носительно оптической конфигурации и структуры субстрата.
244
В соответствии с характером асимметрического деацетилирова-
ния субстрата различают L- и D-ацилазы, причем у микроорганиз-
мов наиболее часто обнаруживаются L ацилазы. В зависимости
от характера отщепляемого ацильного радикала различают, в
частности, ацетил-, бензоил-, хлорацегил-, сукцинил- и другие про-
изводные аминокислот. Поскольку наиболее распространенными
являются ацетил- и бензоилацилазы,. именно такие производные
аминокислот предпочтительно использовать в реакциях. Необхо-
димо иметь в виду специфичность ацилазы к аминокислотному
остатку. Указанные особенности ацилаз позволяют использовать
их для выделения нужной аминокислоты из смеси многих ацилпро-
изводных:
Остающиеся ацил-рацемат и ацил-D-аминокислота легко отде-
ляются-от оптически активной аминокислоты вследствие различий
в их физико-химических свойствах, например растворимости в ор-
ганических растворителях и воде, способности сорбироваться на
ионитах. Использование D-изомеров теоретически возможно, если
иметь в виду дальнейшее применение рацемаз (ферментов класса
изомераз) или химических способов Например, некоторые Ы-аце-
тил-П-амииокислоты могут легко превращаться в Ы-ацетил-П-ами-
нокислоты путем нагревания в присутствии уксусного ангидрида.
Процесс рацемизации может быть реализовав с высоким выходом
путем применения иммобилизованных ферментов.
6. КОМПОНЕНТЫ СРЕДЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ синтез
245
мальные концентрации биотина в среде' обычно в 5—10 раз выше, чем при по-
Рис ХХ-9 Изменение активности
культивирования Breyibacterium в за-
висимости от концентрации биотина
в среде:
Как было сказано выше, аминокислоты первоначально накапливаются в
клетке, составлия аминокислотный пул, или фонд Было отмечено, что аминокис-
лотный пул клеток Brevibacterium flavum, выросших на бедной биотином среде,
показало, что мембрана «бедных» клеток, способных накапзивать глутаминовую
кислоту, содержала больше насыщенных жирных кислот, чем ненасыщенных,
в противоположность «богатым» клеткам. Кроме^того, в мембране клеток^ бед-
образом, одна' из функций биотипа сводится к синтезу ненасыщенных жирных
) В этом^случае снижается выход глутаминовой кис-
С целью повышения проницаемости клеточных стенок рекомендуют вводить
в среды некоторые янтибиотизи, в частности калиевую соль бензилпенициллина.
Увеличение прозицаемости происходит, по-видямому, вследствие нарушения
иврушает образование «мостиков» в пептидной части структуры.
Повышение проницаемости клеточной стенки возможно также при введении
в среды поверхностно-активных веществ. Некоторые из детергентов, будучи
добавленными к бактериальным суспензиям, вызывали интенсивную «утечку»
из клеток аминокислот, нуклеотидов и прочих низкомолекулярных метаболитов
Изучение мехазиэма взаимодействия ионных детергентов с клеточными струк-
турами показало, что поверхностно-активные вещества зиионного типа взаимо-
действуют, по-внднмому, с кетоимидными труппами мембранных белков и ами-
ногруппами в аминополисахаридах, вещества катионного типа — с карбоксиль-
ными группами белка. Из наиболее известных агентов, влияющих на проницае-
мость клеток и выход глутаминовой кислоты, следует назвать твин-40 (поли-
оксиэтилен сорбитан мОиопальмитат), твин 60 (полиоксиэтилен сорбвтан стеарат),
полиэтвленгликоль ыоностеарат, N-миристонлглицин. Рекомендуется совместное
применение пенициллина с поверхностно-активными веществами
ГЛАВА XXI. СИНТЕЗ ПЕНИЦИЛЛИНОВ
И ЦЕФАЛОСПОРИНОВ
1. ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Одними из наиболее известных и распространенных продуктов
микробиологического синтеза являются пенициллины, группа ан-
тибиотических веществ, имеющих одинаковое для всех ядро и раз-
личные заместители Ядро представляет собой 6-аминопепицилла-
новую кислоту, структуру которой составляют две аминокислоты:
цистеин и валин. Боковой радикал посредством пептидной связи
присоединен к р-лактамному кольцу, углеродсодержащая часть
которого сформирована из остатков цистеина. Формально 0-лак-
там является кетопроизводным триметиленимина Различают пе-
нициллины по радикалам (табл. XXI-1). Пенициллины способны
синтезировать многие культуры грибов. Ведущее положение при-
надлежит мутантным штаммам, полученным из Pen. chrysogenum.
Помимо природных радикалов, синтезировать которые спосо-
бен сам продуцент в процессе ферментации, известны так назы-
ваемые пОлусинтетические пенициллины. Они представляют собой
производные 6-амннопенициллановой кислоты с различными ациль-
ными радикалами, отличными от природных, введение которых в
молекулу осуществляется путем химического или энзиматического
синтеза
Механизм биосинтеза молекулы пенициллинов. Культуры, про-
дуцирующие пенициллины, могут одновременно синтезировать со-
шилин (пенициллин X)
(пенициллин F)
н-Каприлпл
и-Капронил
247
единения с различными заместителями. Однако ряд технологиче-
ских приемов, основанных на знании биохимических механизмов
биогенеза молекулы, позволяет получать продукты с радикалами,
которые обеспечивают препарату необходимые качества
Детали биогенеза пенициллинов до конца не установлены. Из-
вестно, что в мицелии продуцента содержится изопенициллин N,
наиболее вероятный метаболический предшественник различных
пенициллинов. Он представляет собой трипептид: б-(1-а-амино-
адипил)-Ь-цистеинил-О-валин. Энзиматический механизм биогенеза
молекулы изопенициллина N в деталях не изучен, поэтому прихо-
дится пользоваться известными аналогиями.
Описано несколько ферментных систем, которые без рибосом
осуществляют синтез соединений пептидной природы. В частности,
хорошо изучена система синтеза трипептида глутатиона (глутами-
нилцистеинилглицин). В случае синтеза глутатиона на первом эта-
пе принимает участие у-глутамилцистеинсинтетаза. При синтезе
пенициллина фермент не идентифицирован, однако есть основания
полагать, что реакция идет сходным образом, только вместо глу-
таминовой кислоты участвует а-аминоадипиновая. Весьма вероят-
но, что имеется специфическая ферментная система б-аминоади-
пинилцистеин — синтетаза. Реакция протекает с участием АТФ-
NH2 CHSH
COOH^HCH^H^CHXOOH+NH.CHCOOH АТФ---------------
а-вминоадипнновая к-та цистеин АДФ+ФИ
NH, CHSH
-► СООНСНС.Н.СЦСН.СО-МНСНС.ООК
Следующая реакция энзиматического присоединения L-валина
к дипептиду в деталях не описана В приведенном выше случае с
глутатионом в качестве промежуточного соединения перед при-
соединением глицина образуется фосфорилированное производное
дипептнда. Не исключено, что при биосинтезе трипептнда [б-(а-
аминодипинил)-цистеинил валина] —предшественника пеницилли-
на — реакция происходит сходным образом.
Реакция описана на основании опытов с грубым ферментным
препаратом из мицелия продуцента пенициллина Для присоеди-
нения L-валина к дипептнду были необходимы АТФ, фосфоенол-
пируват и пируваткиназа. Присутствие двух последних, возможно,
было обусловлено только тем, что ферментный препарат не был
гомогенным. Ферментная система получила название б-(а-амино-
адипил)-цистеин— валин — синтетаза. Далее в трипептиде проис-
ходит дегидрирование, в результате возникает ₽-лактамное коль-
цо, затем образуется двойная связь. Наличие двойной связи обес-
печивает возникновение новой структуры — тиазолидинового коль-
ца. В этой структуре валин приобретает D-конфигурацию. На ка-
ком конкретном этапе происходит превращение L-валина в D-изо-
248
мер, достоверно неизвестно. Отсутствуют также достоверные дан-
ные о, казалось бы, очевидном этапе отщепления а-аминоадипино-
вой кислоты и замены ее на иной радикал (рис. XXI-1)
Синтез пенициллина тормозит высокая концентрация лизина,
присутствующая в метаболическом фонде продуцента. Возможно,
что этот эффект обусловлен ингибирующим действием лизина на
синтез а-аминоадипиновой кислоты, являющейся его метаболиче-
249
ским предшественником. Работает механизм регуляции по принци-
пу обратной связи (см. рис. ХХ-5).
Из природных пенициллинов наибольшим терапевтическим
действием обладает бензилпенициллин Технологическим приемом,
обеспечивающим синтез пенициллина с нужным радикалом, явля-
ется ферментация с метаболическим предшественником При этом
в среду вводят соединения, очень близкие по структуре к радика-
лу. Соединения, которые полностью или с незначительными изме-
нениями входят из питательной-среды в молекулу антибиотика,
называют предшественниками. Для получения бензилпенициллина
н среду для ферментации обычно вводят фенилуксусную кислоту
или фенилацетамид. При биосинтезе феноксиметилпенициллина
.(пенициллина V) предшественником боковой цепи молекулы мо-
гут быть ^-феноксиэтанол и феноксиуксусная кислота:
Полусинтетические пенициллины. Помимо пенициллинов, полу-
чаемых путем ферментации с предшественником, существуют так
называемые полусинтетические пенициллины. Арсенал их достаточ-
но велик. Основные преимущества этих пенициллинов по сравне-
нию с природными заключаются в устойчивости при различных ин-
тервалах pH, способности угнетать устойчивые к другим антибио-
тикам формы бактерий, расширенный антимикробный спектр Для
получения полусинтетических пенициллинов предварительно ведут
ферментацию с предшественником, например фенилацетамидом.
Из полученного бензилпенициллина путем ферментативного гид-
ролиза получают кислоты 6-аминопенициллановую и фенилуксус-
ную (рис. XXI-2).
250
Фермент, осуществляющий данную реакцию, носит названия
пенициллинамидаза, пенициллин — амидогйдролаза или ацил-
КоА: 6-аминопенициллановая кислота ацилтрансфераза. По меха-
низму действия фермент является ацилазой. Он обладает обрати-
мостью действия, осуществляя в зависимости от величины pH ре-
акцию гидролиза или ацилирования, — переноса ацильной груп-
пировки. Благодаря ацилазе происходит присоединение радикала
щсоки-^н-сн
соон
•СН—СН С\
| I учи.
сн,—соон
соон
как при-ферментации пенициллина, так и при получении полусин-
тетическпх пенициллинов. До ацилирования образуется КоА-про-
изводиое. Например, при получении бензилпенициллина в реакцию
вступает фенилацетил-КоА
Ацилазы широко встречаются у микроорганизмов, так как аци-
лирование является одной из наиболее распространенных анаболи-
ческих реакций. Они могут иметь разную локализацию, прояилять
активность в различных интервалах pH, отличаться специфично-
стью относительно субстратов ацилирования или ацильной груп-
пировки. В качестве ферментного препарата часто используют
взвесь микробных клеток, несущих данную активность. Необходи-
мым условием, предъявляемым к взвесям, равно и к ферментному
препарату, является отсутствие активности пенициллиназы. По-
следняя представляет собой р-лактамазу, разрушающую р-лактам-
ное кольцо. В результате его разрушения молекула вещества те-
ряет антибиотическую активность.
Ферментный препарат ацилазы может быть иммобилизован ня
носителе и заключен в колонку. При соответствующих технологи-
ческих режимах, когда в систему вводят 6-аминопенициллановую
кислоту и будущий заместитель, происходит ферментативный син-
тез. В качестве заместителей обычно используют р-производные
алифатических кислот. К числу наиболее известных полусинтети-
ческих пенициллинов относятся устойчивые к стафилококковой
пенициллиназе: метициллин, оксациллин, нафциллин; антибиотик
1ЧН2ИИЙ СООН
широкого спектра действия, активный против грамотрицательных
организмов, ампициллин (рис. XXI-3).
Считают, что существует два типа пепициллиноамидогидрола-
зы. К первому типу относят фермент, гидролизующий преимуще-
ственно феноксиметилпенициллин (пенициллин V), основными
продуцентами его являются клетки эукариотных микроорганизмов,
ко второму — бензилпенициллин (пе-
нициллин G). Последний синтезирует-
ся главным образом грамотрицатель-
ными бактериями. Классификация эта
довольно условпа. В последнее время
предложено выделить в особый тип
ампициллинацилазу, продуцентом ко-
торого являются культуры рода Pseu-
domonas.
Широкая распространенность аци-
лаз в микробном мире заставляет сом-
неваться, что все описанные ныне пе-
нициллинамидогидролазы имеют уз-
кую специфичность применительно к
гидролизу производных 6-аминопени-
циллановой кислоты. Об этом же, хо-
тя и косвенно, могут свидетельство-
вать различия в молекулярных массах
ферментов. Так, ацилаза из Е. coll
имеет молекулярную массу 70000, из
Вас. megatenum 120000, Fusarium
semftectum — 65000, Kluyvera citophi-
la —• 63000. Ферменты второго типа,
синтезируемые бактериальными куль-
турами, чаще применяются на прак-
тике. Наиболее изучен фермент Е. coli.
В его клетках фермент расположен в
пер плазматическом пространстве, т. е
между клеточной стенкой и цитоплаз-
матической мембраной. Гидролитиче-
скую функцию фермент осуществляет
при pH 7,8—8,0, синтетазную — при
pH 5,0—5,5. Оптимальная температура 45—50 °C.
При изучении синтетазного действия фермента было показано,
что скорость реакции ацилирования 6-аминопенициллановой кис-
лоты значительно возрастает при использовании замещенных кар-
боновых кислот типа R— СО — NH — R| или R — СО — SRi, в
частности производных с глицином и тиогликолевой кислотой, на-
пример фенил ацетилглицип, фенилацетилтиогликолевая кислота.
При гидролизе помимо бензилпенициллина бактериальные фермен-
ты легко гидролизуют различные N-фенилацетил-производные
L-аминокислот. Полагают, что фермент имеет большее сродство к
N-фенилацетильной группе, чем к 6-аминопенициллановой к-те.
252
При выращивании продуцентов ..пенициллинамйдогидролаз не-
обходимо иметь в виду, что активность культуры существенно по-
вышается, если в среду вводить фенилуксусную кислоту. Введение
феноксиуксусной кислоты имеет аналогичный эффект, но уровни
активности обычно несколько ниже. Угнетение синтеза фермента
происходит при температуре культивирования выше 37 °C. Угне-
тают синтез высокие концентрации растворенного кислорода в
среде. Характерной особенностью пенициллинамндогидролазы
Е. coii является регуляция ее синтеза посредством механизма ка-
таболитной репрессии Абсолютным репрессором синтеза является
глюкоза, ацетат частично репрессирует синтез Репрессирующий
эффект полностью снимает циклический 3', 5'-адеяозинмонофосфат.
Ферментация пенициллина. Продуцентами пенициллина служат
грибы рода Peniciliium В настоящее время практически всюду ис-
пользуют мутантные штаммы Peniciliium chrysogenum. Для фер-
ментации пенициллина обычно употребляют среды, в состав ко-
торых входят кукурузный экстракт, глюкоза или гндрол, лактоза
или технический полуфабрикат в виде сиропа Из минеральных
компонентов в среды вводят соли аммония, тиосульфат, фосфаты
калия или натрия, соли магния, марганца, цинка, натрия, меди
и т. п. Для регулирования pH в ходе ферментации в среду вносят
CaCOs. Помимо указанных компонентов для направленного био-
синтеза пенициллина с определенным радикалом в состав среды
вводят предшественник. Среда для ферментации отличается от
среды для получения посевного материала. Основное отличие по-
следней от среды для ферментации — отсутствие или меньшая кон-
центрация лактозы, некоторых минеральных компонентов и пред-
шественников.
Динамика количественного изменения компонентов среды на
фоне роста биомассы и накопления в среде пенициллина показана
на рис. XXI-4. В начальный период роста культуры происходит
интенсивное включение в метаболизм глюкозы и содержащейся в
кукурузном экстракте молочной кислоты. Ассимиляции лактозы
не происходит. Быстро ассимилируется азот минеральных и орга-
нических компонентов среды Интенсивный синтез антибиотика
начинается в конце логарифмической фазы роста мицелия. Не-
сколько раньше, когда концентрация глюкозы станет незначи-
тельной, культура начинает использовать лактозу. Полагают, что
ассимиляция лактозы в присутствии глюкозы невозможна вслед-
ствие того, что имеет место катаболитная репрессия.
Как было отмечено выше, в среды обычно вводят метаболиче-
ские предшественники радикала молекулы пенициллина. Вещест-
вами, эффективно включающимися в молекулу пенициллина, яв-
ляются, как правило, различные 0-замещенные уксусной кислоты;
а-метиленовая группа уксусной кислоты при этом должна быть
свободной. Предшественники, используемые при биосинтезе бен-
зилпенициллина и феноксиметилпенициллииа, помимо основного их
назначения — формирования радикала — могут включаться в об-
мен веществ и использоваться продуцентом как источник питания
2БЗ
В связи с этим желательно иметь в качестве предшественни-
ков такие соединения, которые не подвергались бы активному фер-
ментативному разрушению продуцентом. В частном случае при
синтезе бензилпенициллина лучше применять фенил ацетамид, а не
фенилуксусную кислоту, так как последняя достаточно быстро
О 25 50 75 100
Время,ч
Рис. ХХ1-4. Биохимические показатели культуры Penicijlium chrysogenutn при
ферментации пенициллина;
подвергается окислению; фенилацетамид окисляется более мед
леннр. Предварительно происходит его дезаминирование до обра-
зования фенилуксусной кислоты, которая затем входит в состав
молекулы бензилпенициллина
2. ЦЕФАЛОСПОРИНЫ
Цефалоспорины синтезируются преимущественно грибами, относящимися к
роду Cephalosponum Особенно ценными они являются в тех случаях, когда
патогенная микрофлора резистентна к пенициллинам. Цефалоспорины' имеют
общие с пенициллинами пути биосинтеза.
254
Энзиматический гидролиз могут осуществлять ферменты раз-
личных микроорганизмов. Некоторые из них, например в культуре
Kluyvera citrophila, способны вести гидролиз в щелочном интер-
вале pH, а ацилирование — в кислом. Помимо 7-аминоцефало-
спориновой кислоты субстратом ацилирования может быть 7-ами-
но-деацетоксицефалоспориновая кислота:
соон
Полусинтетические цефалоспорины могут быть получены фер-
ментативным методом, как и полусинтетические пенициллины:
ГЛАВА XXII. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ
1. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПЕПТИДЫ,
ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА И ФУНКЦИЯ В КЛЕТКАХ
гш2
Среди низкомолекулярных пептидов, продуцируемых микроор-
ганизмами, широко известны депсипептиды, т. е. пептиды, в сос-
тав которых наряду с а-амино- входят а-оксикислоты: мембран-
ные ионофоры валиномицин и энниатин'—вещества, осуществляю-
щие транспорт катионов через клеточные мембраны. Большую
Группу составляют низкомолекулярные пептиды у актиномицетов».
обладающие ингибиторной активностью по отношению к проте-
азам. Наиболее известные из этих пептидов — лейпептин, пепста-
тин, антипаин. В их состав входят низкомолекулярные кислоты
жирного ряда, не содержащие азота. Можно предполагать, что они
обладают функцией регуляторов в клетках, синтезирующих эти
соединения.
257
Ферментная система, осуществляющая синтез низкомолекуляр-
ных пептидов, обладает относительно широкой субстратной специ-
фичностью, в отличие от рибосомального синтеза белка. В резуль-
тате вместо одного пептида может синтезироваться группа близ-
ких по амкиокислотному составу пептидов, различающихся одной-
двумя аминокислотами. Например, в тироцидине В и С в отличие
от тироцидина А фенилаланин замещен на триптофан. Известны
четыре типа тироцидина и несколько типов актиномицинов, 'у ко-
торых в пептидной части разные заместители в двух положениях
Кроме протеиногенных аминокислот в состав молекулы низко-
молекулярных пептидов включаются метил-, окси-, дегидро-
и иминопроизводные; ₽-, аллб-, изо- и треоизомеры, а также орни-
тин, диаминопропионовая, диаминомасляная кислота и др.
В биосинтезе биологически активных соединений, содержащих
кроме пептидной части другие компоненты, как, например, фено-
ксазиновая структура актиномицетов, координированно принима-
ет участие несколько ферментных систем. Очевидно, существует
общий регулирующий механизм, обеспечивающий одновременную
•функцию всех ферментов, участвующих в синтезе молекулы. Не-
смотря на большую информацию о механизмах биосинтеза моле-
кул низкомолекулярных пептидов, было бы ошибочным думать,
что известны все детали, связанные с функцией ферментных сис-
тем, участвующих в биосинтезе
258
2. БИОСИНТЕЗ МОЛЕКУЛ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ
ПЕПТИДОВ
Исходвде структурные единицы биосинтеза — аминокислоты,
как правило, находятся в цитоплазме клетки, составляя ее мета-
болический фонд. В свободном виде они представляют собой хи-
мически довольно инертные соединения, обладающие слабыми
нуклеофильными свойствами. Активация аминокислот для синтеза
пептидов происходит так же, как и при биосинтезе белков: за
счет ферментативного взаимодействия между карбоксильной груп-
пой активируемой аминокислоты и АТФ. Реакцию осуществляют
аминоацилсинтетазы, в результате чего образуется аминоациладе-
нилат с выделением свободного пирофосфата:
Аминокислота в виде аминоациладенилата переходит в элек-
трофильную форму Можно считать, что сущность активации ами-
нокислот заключается в превращении нуклеофильного реагента в
электрофильный*
H(N*—СНСОО-
В этой форме они проявляют способность к ферментативному
переносу на какой-либо куклеофил (NH2—; ОН—; HS— и т. д.).
Активированная ацильная группа переносится к акцептору с од-
новременным выделением АМФ. При биосинтезе пептидов харак-
терной особенностью является образование тиоэфирной связи с
акцептором. По своему энергетическому потенциалу тиоэфирная
связь оказывается равной фосфорильной связи в АТФ. Перенос
аминоацильных (Аа) групп с аденилата до тиоловой группы фер-
мента происходит при обменной реакции АТФ—АМФ. которая
идет в присутствии аминокислоты:
- Да-АМФ
L S-—Аа
Нарастание цепи пептида происходит, как и при рибосомаль-
ном синтезе, от N-терминального конца путем присоединения сле-
дующей аминокислоты к активированному С-концу.
В белковом синтезе аминоациладенилат вступает в реакцию с
тРНК, присоединяясь к терминальному остатку аденозина, обра-
зуя эфирную связь через 2 - или З'-гидроксильную группу Эта ре-
акция, катализируемая аминоацил-тРНК-синтетазой, отличается
высокой специфичностью. Аминоацил-тРНК-синтстазы настолько
тонко различают природные аминокислоты, что вероятность ошиб-
ки в условиях, существующих внутри клетки, значительно меньше
1 на 10000
Таким образом, аминокислоты, которые часто называют непро-
теиногенными, т. е не входящими обычно в структуру белка, не
могут быть распознаны аминоацил-тРНК-синтетазой и включены
в белок (за очень небольшими исключениями) В молекулах низ-
комолекулярных пептидов, в частности антибиотиков и ингибито-
ров ферментативных реакций, такие аминокислоты встречаются
довольно часто. Одной из непротеиногенных аминодислот, входя-
щих в молекулу декапептида грамицидина С, является L-орнитин
В ходе синтеза пептида происходит образование аминоацил-аде-
нилата орнитина. Включения аминокислоты в белок не происхо-
дит, так как нет соответствующей специфической аминоацйл-тРНК-
синтетазы.
Система синтеза пептидов существенно отличается от таковой
белков. Главное отличие заключается в том, что при синтезе пеп-
тидов первичная структура детерминирована белковой матрицей,
тогда как при синтезе белков — мРНК. Важным для понимания
процесса биосинтеза низкомолекулярных пептидов служит пред-
ставление о механизме, который обеспечивает присутствие в мо-
лекуле D-форм аминокислот Имеется достаточное число фактов
утверждать, что исходными метаболическими предшественниками
D-форм аминокислот в пептидах являются L-формы. Представле-
ния о деталях процесса не во всех отношениях очевидны Тем не
менее можно считать установленным, что инверсия L-аминокис-
лот при а-углеродном атоме не связана с дезаминированием. Ра-
цемизация происходит на уровне аденилового производного, свя-
занного с ферментом, или на уровне тиоэфира аминокислоты с
ферментом Оба этих варианта схематически показаны ниже.
L-фёи-АМФ—*-D-фсп-АМФ
L-феи-АМФ
Пример дан для L-фенилаланина при синтезе грамицидина С.
При элонгации (удлинении) пептидной цепи рацемизация, веро-
260
ятно, происходит на уровне пептидных полупродуктов. Характер-
но, что здесь вместо пиридоксальфосфата, кофермента в реакциях
рацемизации, требуется АТФ. Известно несколько мультифермент-
ных комплексов, синтезирующих низкомолекулярные пептиды. Они
обеспечивают полный синтез полимера, осуществляя активацию
аминокислот, рацемизацию и полимеризацию. В их составе, оче-
видно, встречаются сходные ферментные системы, в частности те,
которые превращают L-изомеры в D-формы и являются иниции-
рующими в синтезе молекул, например фенилаланинрацемаза,
принимающая участие в синтезе грамицидина С и тироцидинов^
Существует точка зрения, что некоторые D-аминокислоты могут
непосредственно включаться в молекулу пептида. Однако этот
факт все же требует тщательных доказательств Пока не описаны
ферментные системы, обеспечивающие синтез активированных аде-
ниловых производных D-аминокислот
Поскольку рацемазы аминокислот обладают способностью к
обратимости реакций, весьма вероятно, что при использовании ме-
тода «покоящихся клеток» первоначально происходит рацемиза-
ция D-форм в L-формы. Далее аминокислота вступает в реакцию,
как описано выше, и затем вновь переходит в D форму Такое
предположение не отрицает экспериментальных данных, получен-
ных с «меткой», она остается на своем первоначальном месте.
В связи с этим реальным доказательством факта включения D-ами-
нокислоты в молекулу пептида может считаться лишь энзимати-
ческая реакция. В синтезе некоторых дипептидов D-аминокислотЫ
могут принимать участие, однако там «работает» иная фермента-
тивная система синтеза. Так, при синтезе дипептида, содержащего
два остатка D-a-аланина, работает D-аланилаланинсиитетаза Для
осуществления реакции требуется всего одна молекула АТФ. Ре-
акция происходит следующим образом: АТФ + О-а-аланин-ЬО-а-
аланин=АДФ+ортофосфат+D аланил аланин.
Как известно, в состав клеточной стенки бактерий входит пеп-
тидогликан (см гл. I), его пептидные остатки, соединенные с уг-
леводным компонентом, имеют поперечные сшивки. У культуры
Staphylococcus aureus такую сшивку осуществляет пеитаглицин
Синтез пентаглицина происходит через образование глицил-тРНК,
хотя рибосомы в биосинтезе участия, вероятно, не принимают. По-
лагают, что первый остаток глицина с глицил-тРНК передается
на е-аминогруппу остатка L-лизина, входящего в состав связанно-
го с липидом метаболического предшественника пентаглицина. Да-
лее происходит последовательное присоединение всех остальных
остатков глицина. Механизм нерибосомального синтеза пептида с
участием тРНК требует тшательного экспериментального под-
тверждения.
Остается открытым вопрос о механизмах биосинтеза депсипеп-
тидов, к числу которых относятся ранее названные валиномицин
я энниатины. В частности, неизвестно, как происходит реакция
образования сложноэфирной связи между а-оксикислотами и
«-аминокислотами, каким образом происходит циклизация
261
Грамицидин С. Синтез грамицидина С осуществляют два фер-
ментных белка, имеющих молекулярные массы 280000 (фракция
I) и 100000 (фракция II).
Фермент с большей молекулярной массой связывает 4 молеку-
лы АТФ и четыре аминокислоты: L-пролин, L-валин, L-орннтин и
L-лейции. Аминокислоты образуют аминоацил аденилаты L-npo-
АМФ; L-вал— АМФ; L-орн —АМФ; L-лей — АМФ; затем амино-
кислотные остатки, получившие энергию от гидролиза АТФ, пере-
носятся на SH-группы того же фермента, ио-видимому, на SH-
группы цистеина. Аминокислоты не конкурируют за фермент, так
как фермент имеет четыре независимых активных центра, каждый
из которых участвует в активации только одной определенной ами-
нокислоты.
L-про IL-npo—АМФ L-про—S—|
Ej + 4АТФ + L-вал „ [L-вал—АМФ , ..-L-вал—S— L ,
т E.L я,<л + 4ФФт }Е,4-4АМФ.
L-орн * IL-ори—АМФ L-opH—S—[ 1 *
L-лей (L-лей—АМФ L-лей—S—]
В таком состоянии фракция I способна строить полкую пептид-
ную молекулу после того, как фракция II с меньшей молекуляр-
ной массой инициирует этот процесс. Фракция II представляет
собой фенилаланинрацемазу (АТФ-гидролизующую). Фермента-
тивный акт начинается с сиптеза L-фенилаланинаденилата, амино-
кислотный остаток которого переносится на SH-группу фермента.
Выше приведены два возможных варианта механизмов рацемиза-
ции. Относительно того, где происходит рацемизация L-фенилала-
нина, существует две взаимоисключающие точки зрения.
Собственно инициация начинается с переноса активированного
остатка D-фенилаланина с фенилаланинрацемазы на аминогруппу
остатка L-пролина, находящегося на ферменте Ец Все дальнейшие
превращения при построении молекулы грамицидина С сопровож-
даются образованием фракций I и состоят из одинаковых после-
довательных реакций. Сущность их заключается в переносе строя-
262
щегося пептида на аминогруппу очередного аминокислотного ос-
татка. Для полимеризации в этом состоянии не нужны никакие
дополнительные белковые соединения и источники энергии. Опти-
мум pH биосинтеза пептида на Ei составляет 7,8, что примерно
соответствует рК аминогрупп аминокислотных остатков, находя-
щихся на ферменте. На стадии образования тиоэфира пентапеп-
тида реакция останавливается. Последний этап синтеза происхо-
дит на молекуле того же фермента Ej; он заключается в реакции
конденсации пентапептидов в циклический декапептид в результа-
те антипараллельной реакции удвоения, происходящей между дву-
мя пентапептидными субъединицами.
Детальный анализ процесса, происходящего на молекуле Ej,
показал, что строящийся пептид сяязан тиоэфирной связью с
4'-фосфопантотеином :
О СН, ОН О О
И I I II И
ОН—Р—О—СН2—С------СН—С—NH—СН2—СН2—С
он сн,
—NH—СН,—СН2—SH.
Оказалось, что фосфопантотеин участвует в переносе пептида
с SH-групп белка в процессе его элонгации. По аналогии с био-
синтезом высших жирных кислот, у которых промежуточные
ацильные остатки активированы образованием тиоэфирной связи
с фосфопантотеином, предложена схема построения молекулы
грамицидина С. Согласно этой схеме, дипептид D-фен-Ь-про с SH-
группы подвергается транстиолированию на SH-группу фосфопан-
тотеина, молекула которого «протянута» из центра фермента к его
периферии, куда обращена SH-группа. Если рассматривать эту
схему как чисто механическую модель, то можно считать, что пен-
тидилфосфопантотеин, поворачиваясь по окружности вокруг некой
условной центральной оси фермента к следующей аминоацил-S-
группе, переносит пептид по поверхности фермента. В результате
Пептид с фосфопантотеина переносится на аминогруппу аминоацил-
фермента, образуй пептидную связь
Так, в молекуле грамицидина С последовательно происходит
перенос дипептида О-фен-L-npo на остаток L-валина, затем пере-
нос образовавшегося трипептида на остаток L-орнитина и далее —
тетрапептида на L-лейцин (рис. ХХП-1). Одним из регулирующих
факторов при синтезе грамицидина С является наличие в сфере
реакции АМФ, который служит конкурентным по отношению к
АТФ ингибитором при образовании аминоациладенилатов, что
убедительно показано в опытах в присутствии L-валина. •
такжё требует наличия двух ферментных фракций: АТФ и Mg!+ Одна из фрак-
253
новой кисиоты и е-аминогруппой лизина может возникать после образования
линейного додекапептила
цидина С Вторая^ фракция (молекулярная^масс^ 230000) содержит в активи-
помиципов" дано па с. 216. Особое внимание привлекает^сегодня актиномицин D.
вступают два предшественника, пептидные цепи которых различаются только
265
расположению аминокислот пептидной цепочки. Состав и строение образующе-
дуцента, но и от условий, в которых происходит его культивирование. На ами-
нокислотный состав пептида могут оказывать влияние аминокислоты среды При
тидной части молекулы подвергается место, занимаемое валином и изолейци-
ном. J В связи с этим наибольшее воздействие на строение актиномицинов ока-
тида, не установлено. 1
ГЛАВА XXIII. СИНТЕЗ НУКЛЕОТИДОВ,
ИХ ПРОИЗВОДНЫХ И ФЛАВИНОВ.
I. БИОСИНТЕЗ ОСНОВАНИИ
Пурины. Синтез мононуклеотидов происходит у всех организ-
мов по общим путям Одной из стадий является синтез основа-
ний. Опыты с соединениями, имеющими изотопную метку, позво-
лили получить данные об участии различных веществ в форми-
ровании ароматического пуринового кольца (рис. XXIII-1):
Рис XXIII-1. Происхождение атомов пуринового кольца
Исходным веществом в биосинтезе пуринов служит б'-фосфо-
рибозил-1-пирофосфат (ФРПФ), который принимает у-аминогруп-
пу глутамина и превращается в б'-фосфорибозиламин (ФРА)
(рис. XXI П-2) Реакция катализируется фосфорибозил пирофос-
№л'0форки- ТГФ
267
фат-амидотрансферазой. Следующая далее реакция ФРА с гли-
„щшом приводит к образованию глицинамидорибонуклеотида
(ГАР) — соединения нуклеотидной природы, в котором амидная
группа находится в положении, обычно занимаемом пуриновым
или пиримидиновым основанием. Реакция ГАР с N-формилтетра-
гидрофолиевой кислотой приводит к его формилированию с обра-
зованием формил-ГАР Последующая стадия взаимодействия ГАР
с глутамином ведет к синтезу формилглицинамидинрибонуклеотн-
да (формил-ГАМ).
После замыкания кольца образуется имидазол содержащее со-
единение 5-аминоимидазолрибонуклеотид (АИР). При карбокси-
лировании этого соединения формируется рибонуклеотид 5-ами-
ноимидазол-4-карбоновой кислоты (карбокси-АИР). Далее обра-
зуется соответствующий амид, 5-амино-4-имидазол-карбоксиамид-
рибонуклеотид (АИКАР). Последнее соединение представ-
ляет собой продукт двух реакций, протекающих через образова-
ние промежуточного соединения — 5-аминоимидазол-4-сукцинокар-
боксамидрибонуклеотида (сукцино-АИКАР). Завершается по-
строение пуринового кольца в реакции с N-формилтетрагидрофо-
лиевой кислотой, формильная группа которой присоединяется к
5-аминогруппе имид азол карбоксамид-рибонуклеотида. Образовав-
шийся рибонуклеотид представляет собой инозиновую кислоту
(инозин-5'-монофосфэт, ИМФ) и является предшественником всех
остальных пуриновых нуклеотидов.
Аминирование ИМФ в АМФ происходит в две стадии с образо-
ванием в качестве промежуточного соединения аденилоянтарной
кислоты (адевдлсукцината) (рис. XXII1-3) Образование ГМФ из
НООС—ун—ch2gooh
ИМФ также является двустадийной реакцией, в ходе которой сна-
чала образуется ксаитозин-б'-монофосфат (КМФ), затем происхо-
дит его аминирование и образование ГМФ (рис. ХХШ-4). Оба
пуриновых нуклеотида, АМФ и ГМФ, фосфорилируются киназа-
ми, проходят стадию образования дифосфатов и превращаются в
АТФ и ГТФ:
268
АТФ + А1МФ=АДФ+АДФ,
АТФ-J- ГМФ=АДФ+ГДФ;
АТФ+НДФ=АДФ+НТФ.
Пиримидины. Исходными соединениями, участвующими в син-
Рис ХХШ-4. Образоеа-
гуанозиифосфат (ГМФ)
карбамоилфосфат, которые под действием аспартат-карбамоил-
трансферазы превращаются в карбамоил аспартат (рис. XXI П-5).
После замыкания пиримидиновое кольцо подвергается действию
дигидрооротазы, в результате образуется дигидрооротовая кисло-
та. В НАД-зависимой реакции происходит отщепление двух ато-
мов водорода, при этом формируется молекула оротовой кислоты.
Вслед за этим в реакцию вступает 5-фосфорибозил-1-пирофосфат
(ФРФФ), являющийся, как было отмечено выше, важнейшим про-
269
межуточным метаболитом в синтезе нуклеотидов. Происходит пй-
рофосфорилазная реакция, в ходе которой к оротовой кислоте при-
соединяется рибозо-5-фосфат, присутствовавший в сфере реакции
как структурный компонент ФРФФ. В результате образуется оро-
тидин-5'-монофосфат (ОМФ) и освобождается неорганический пи-
рофосфат. Декарбоксилирование оротидин-5'-монофосфата приво-
дит к образованию уридин-5'-монофосфата (УМФ), предшествен-
соои
ника других пиримидиновых нуклеотидов. Далее в присутствии к»
паз УМФ превращается сначала в уридин-5'-дифосфат (УДФ), а
затем в уридин-5'-трифосфат (УТФ). Превращение урацила в ци-
тозин происходит на уровне нуклеозидтрифосфатов и осуществля-
ется под действием ЦТФ-синтетазы:
УТФЦ-МНз+АТФ- >ЦТФ 1-АДФ4 Ф„
2. микробиологический синтез
НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ
Микробиологический синтез нуклеотидов и их производных
входит в Жизнь в сйлу необходимости иметь эти весьма специфи-
ческие соединения в повседневной практической деятельности.
Первые шаги были связаны с необходимостью иметь природные
соединения, придающие вкус и аромат пищевым продуктам До
сих пор одной из основных перспективных сфер их применения
рассматривается искусственная пища. Нуклеотиды и их производ-
ные могут иметь применение как лечебные препараты, восполняя
недостаток в них того или иного организма, особенно в качестве
кофакторов или коферментов. Широко используются они в лабо-
раторной биохимической практике.
270
Микробиологический синтез нуклеотидов отличается от многих
классических ферментационных процессов необходимостью вносить
в среду метаболические предшественники синтезируемых продук-
тов. В ряде процессов микробные клетки выполняют функции но-
сителей определенных ферментативных активностей, обеспечиваю-
щих синтез. Здесь процессы роста клеток и синтеза продукта раз-
общены. Наряду с собственно микробиологическим синтезом нук-
леотидов и их различных производных видное место могут зани-
мать ферментативные превращения одних нуклеотидов в другие,
а также энзиматическое расщепление нуклеиновых кислот с по-
следующим фракционированием полученных продуктов гидролиза.
Аденозинтрнфосфорная кислота (АТФ). Получение адепозинди
фосфата и аденозинтрифосфата основано на осуществлении куль-
турой микроорганизма реакции фосфорилирования аденина или
адениловой кислоты (б'-АМФ).
Используемая культура Brevibacterium ammoniagenes АТСС
6872 растет на среде, содержащей глюкозу высокой концентрации,
мочевину, дрожжевой экстракт, соли фосфора, магния, кальция и
бнотин. По ходу культивирования вносят аденозин, который под-
вергается энзиматическому фосфорилированию с образованием
адениловой кислоты, АТФ и АДф. В аналогичных условиях куль-
тивирования, но при внесени гуанозина можно получить гуанило-
вую кислоту, ГДФ и ГТФ Фосфорилирующим агентом, по-види-
мому, выступает образующаяся в сопряженных реакциях АТФ.
Накопить ее в сфере реакции без передачи на акцепторную молеку-
лу внесенного извне аденозина не удается.
Другйм микробным источником ферментативных систем, осу-
ществляющих фосфорилирование б'-АМФ, могут служить хлебопе-
карные дрожжи, взятые в виде гомогената или ацетонового порош-
ка. Реакционная смесь содержит б'-АМФ, глюкозу, фосфатный
буфер (pH 7,0) и дрожжи, подготовленные, как было сказано вы-
ше. Реакция протекает довольно быстро, без встряхивания, при
37°С (рис. ХХШ-6). Вслед за истощением глюкозы, при мини-
мальном количестве неорганического фосфора отмечается макси-
мум содержания АТФ. По достижении максимума АТФ наблюда-
ется его распад до АДФ и АМФ при одновременном повышении
уровня неорганического фосфора. На выход продукта существен-
ное влияние оказывает концентрация фосфата, присутствующего
в виде фосфатного буфера. Отклонение от некой оптимальной
величины может привести к ряду нежелательных реакций на мо-
лекуле субстрата и вызвать образование инозиновой кислоты,
и гипоксантина
Предложена следующая схема фосфорилирования АМФ:
D-глюкоза+2АДФ+2Фн-»-2С2Н5ОН+2СО2-1- 2АТФ (гликолиз);
АМФ+АТФ->2АДФ.
в АТФ. Одновременно может происходить ряд других реакций.
271
5-АМч>
В частности, под действием нуклеотидазы аденйдОвая кислота
может распадаться до аденозина и неорганического фосфата. Аде-
нозин, в свою очередь, благодаря активности аденозинкиназы
подвергается фосфорилированию с образованием АМФ и АДФ.
Вследствие отмеченных выше взаимных переходов затруднительно
доказать последовательность происходящих реакций.
Вероятно, вносимая извне адениловая кислота нужна для
осуществления «затравочной» реакции. Очевидна необходимость
иметь в сфере реакции высокую
концентрацию глюкозы и сбалан-
сированное количество фосфата.
В аналогичных условиях фосфо-
рилируются ГМФ, ЦМФ и УМФ.
По несколько иному пути
происходит синтез АТФ, когда в
среду для культивирования вво-
дят аденин В этом случае клю-
чевой реакцией должна быть
N-рибозидация адевина. Процесс
обычно проводят как типичную
аэробную ферментацию с добав-
лением предшественника Проду-
центами могут служить Brevibac-
terium ammoniagenes или Coryne-
bactenum sp. Здесь также необходимо иметь среду с глюкозой вы-
сокой концентрации. На первом этапе синтеза происходит образо-
вание АМФ за счет внесенного в конце экспоненциальной фазы рос-
та культуры аденина и синтезированного клеткой б'-фосфорибо-
зил-1'-пирофосфата (ФРФФ, 5-фосфо-п-П-рибозо-1-дифосфат).
Реакцию осуществляет аденинфосфорибозилтрансфераза:
ФРФФ+аденин АМФ + ФФ«
Дальнейший процесс происходит так же, как показано выше
для АМФ. В результате реакции, происходящей между рибозо-5-
фосфатом (Р-5-Ф) и АТФ в клетках образуется ФРФФ. Реакция
происходит при посредстве АТФ: D-рибоза-б-фосфат пирофосфат-
трансферазы. АТФ и Р-5-Ф образуются в результате катаболизма
глюкозы, Р-5-Ф — в ходе функционирования ГМФ-пути, а АТФ —
как продукт гликолиза (рис. XXII1-7).
Здесь же может иметь место сверхсинтез соответствующих нук-.
леозидфосфатов из отличных от аденина оснований: гуанина, ги-
поксантина, ксантина, уранила, 6-меркаптопурина, 8-азагуанина,
4-тиоурацила.
В последние годы большой интерес вызывает синтез АТФ или
его регенерация с участием иммобилизованных ферментов, выде-
ленных из микроорганизмов, или иммобилизованных микробных
клеток. Одна из ферментных систем, карбамилфосфокиназа, была
выделена из культуры Streptomyces faecalis и иммобилизована на
алкиламинном пористом стекле в присутствии глутарового альде-
272
гида. Для регенерации АТФ из АДФ раствор последней на фосфат-
ном буфере (pH 5,5) в присутствии соли магния пропускали через
колонку.
В другой системе синтеза АТФ из АМФ клетки Saccharomyces
cerevisiae были иммобилизованы путем их механического включе-
ния в полиакриламидный гель или микрокапсулированием в этил-
целлюлозу. При микрокапсулировании удается иммобилизовать
на единицу объема в 5—6 раз больше клеток и сохранить в 4—
5 раз более высокую ферментативную активность. При непрерыв-
ном получении АТФ из АМФ активность препарата хотя и пони-
жалась со временем, но составляла более 50 % от исходной через
10 дней
Инозиновая кислота. Известны два способа микробиологиче-
ского синтеза инозиновой кислоты, один из них—с использовани-
ем метаболического предшественника, нуклеозида. При другом
методе необходимо иметь ауксотрофный мутант, поскольку из-
вестно, что инозиновая кислота представляет собой метаболиче-
ский предшественник важнейших пуриновых нуклеотидов — аде-
ниловой и гуаниловой кислот.
При осуществлении первого из названных способов в сферу
реакции вводят нуклеозид—инозин и источник фермента, фосфо-
рилирующий инозин в б'-положении рибозного остатка. Источни-
ками фосфорилирующего фермента — нуклеозидцифосфаттрансфе-
разы могут служить многие микроорганизмы, относящиеся к ро-
дам Flavobacterium, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas. Доно-
рами фосфора в этой реакции могут быть нуклеотиды, а также
иеприродные соединения: н-нитрофенилфосфат (н-НФФ), бензил-
фосфат, фенилфосфат. В нашей стране в качестве источника фос-
форилирующего фермента предложен одни из штаммов Pseudo-
monas trifoli. Культуру предварительно выращивают на среде, со-
держащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт. В качестве фер-
10 А М. Безбородов 273
меитного препарата, осуществляющего реакцию, используют жи-
вые клетки, клетки, высушенные под вакуумом или ацетоном, а
также замороженные клетки, поскольку локализация фермента
внутриклеточная. Из названных выше доноров фосфатов лучшим
считается п-нитрофенилфосфат. Реакция происходит в ацетатном
буфере при pH 4,0 в присутствии ионов меди и цинка, заметно
увеличивающих выход готового продукта.
Наиболее важными факторами, определяющими активность
реакции фосфорилирования инозина, являются концентрация до-
нора фосфора, акцептора (инозина) и количество клеток исполь-
зуемой культуры. При оптимальных соотношениях п-НФФ и ино-
зина клетки Ps. trifoli могут фосфорилировать до 90 % инозина
в реакционной смеси. Выход инозиновой кислоты может быть по-
вышен, если к реакционной смеси добавить поверхностно-актив-
ные вещества, в частности различные твины Их концентрации
должны быть подобраны опытным путем.
Как и во всех других случаях, когда в качестве энзиматиче-
ских препаратов используют клетки микроорганизмов, возникает
необходимость оценить активность ферментов при деградации це-
левых продуктов синтеза. В данном случае нежелательны для ино-
зиновой кислоты активные фосфомоностераза и б'-нуклеотидаза.
Если невозможно подавить их активность ингибиторами, то сле-
дует выбрать условия, при которых она будет наименьшей. В пер-
вую очередь к таким условиям, наиболее легко регулируемым, от-
носится температура и pH среды, где происходит реакция.
Инозиновую кислоту выделяют в виде соли бария и путем
ионообменной хроматографии. Как было сказано выше, одним из
способов получения инозиновой кислоты является ее синтез му-
тантными штаммами с определенными генетическими нарушения-
ми регуляторных механизмов, что ведет к сверхсиитезу продукта.
В качестве продуцентов применяют адениловые ауксотрофы Вге-
vibacterium amrnoniagenes. Для них характерна низкая величина
нуклеотиддеградирующей активности Одной из важнейших осо-
бенностей таких культур должна быть хорошая проницаемость
клеток для выброса в окружающую среду ряда внутриклеточных
метаболитов. По сложившимся представлениям синтезированная
в клетках инозиновая кислота расщепляется в них, образуя осно-
вание— гипоксантин, который затем выходит из клетки. Ресин-
тез инозиновой кислоты происходит вне клетки. Для его осуще-
ствления необходимо иметь рибозо-5-фосфат и АТФ. Синтез ино-
зиновой кислоты происходит в данном случае согласно механизму,
описанному выше для АМФ, через образование ФРФФ. Реакцию
осуществляет ги поксаитипфосфорибозилтрансфераза:
ФРФФ4-гипоксантин 5'—ИМФ+ФФНН.
Одним из условий нарушения клеточной проницаемости для
большинства известных продуцентов инозиновой кислоты являет-
ся недостаток марганца в среде. Чувствительность таких штаммов
к ионам марганца делает невозможным их использование в про-
мышленных условиях, так как сырье для сред обычно содержит
значительное количество ионов двухвалентных металлов, в част-
ности марганца. В СССР во ВНИИгенетика получен мутант,
устойчивый к ионам марганца. Для восполнения дефицита адени-
на не возникает необходимости вводить его в среду для культи-
вирования. Использование кукурузного экстракта в качестве од-
ного из компонентов среды восполняет потребность штамма в аде-
нине. Последний контролирует синтез инозиновой кислоты по ти-
пу отрицательной обратной связи на одном из начальных этапов
биосинтеза пурниовых оснований. Абсолютная величина концент-
рации аденина для оптимального хода процесса зависит от ряда
факторов: температуры, уровня аэрации, содержания неорганиче-
ского фосфата, наличия гистидина и т п.
Помимо микробиологического (ферментативного) синтеза ино-
зиновой и гуаниловой кислот возможно сочетание микробиологи-
ческого и химического синтеза При использовании дефицитного
по аденину мутанта Bacillus subtilis в среде накапливается ино-
зин, а в случае пурин-дефицитного мутанта Вас. inegaterium —
5'-фосфорибозил-5-амипо-4-имвдазол -карбоксамид (АИКАР).
Дальнейшие этапы осуществляют путем химических превращений:
1) инозин->-2,-3,-С)-изопропилдиенинозин->2'3,-О-изопропилди-
енинозин б'-фосфордихлорид-^б'-ИМФ;
2) АИКАР^2-меркаптоинозин-»-гуанозин--»-5'-ГМФ.
Никотинамидадениндинуклеотцд (НАД). Микробиологический синтез проис-
ходит путем культиаироваиня продуцента Brevibacteriwn ammoniagenes с пред-
АТФ.
кальция и биотин Предшественниками НАД в среде’могут быть никотиновая
кислота или никотинамид, а также адевии.' Предшественники в условиях опыта
На рис ХлШ-9
Рис. ХХШ-8 Динамика накопле-
ния НАД при культивировании
(Стрелкой показано время внесе-
фосфорилированное производное ^Н^Д —
дающая фосфорный остаток от АТФ на
НАД. Для получения НАДФ предложена
также система, в которой в качестве фер-
точный продукт синтеза
формирующим
10* 275
В СССР разработан синтез НАД в культуре
дрожжей.
из взвеси дрожжевых клеток (SO %) в растворе, содержащем фосфаты, соли
магния, аденин и никотинамид в качестве предшественников, а также глюкозу
кормовых дрожжей. При этом
mobacter aceris. Иммобилизованные и свободные клетки образуют максимальное
количество НАДФ при pH 7,0 и температуре 45 °C. Однако иммобилизованные
276
нторов в многочисленных биохимии
паратиаиого получения этих веществ
культуре Brevibacterium
--------„ .—.>(,пч. ,~.™вали гуанозпн-й'-монофос*
фат или ксантозин-Й'-монофосфат Штамм представляет собой мутант, требую-
Цсантовин-Б'-монофосфат является метаболическим предшественником гуа-
иия глутамином в присутствии АТФ (см. рис. ХХШ-4).
полифосфатов в среде накапливается й'-ГМФ, й'-ГДФ, й'-ГТФ, однако гуано-
зинполифосфаты образуются в более узком интервале pH и при ином темпе-
©-©-сн^л^
НО О-------©
гуаиозиптетрафосфат (ффГфф)-
Фермент АТФ нуклеотид пирофосфаттрансфераза, осуществляющий пере-
нос пирофосфатных остатков из АТФ на акцепторные молекулы, был выделен из
Streptomyces adephospbolyticus Продуктами реакции здесь могут быть нукле-
ознн-3'-дифосфат-5'-моно (ди- и три-)фосфаты, такие, как фффГфф, ффГфф,
фГфф, а также производные аденина и ниозина фффАфф, фффИфф
3. БИОСИНТЕЗ ФЛАВИНОВ
К числу важнейших флавиновых соединений, синтезируемых микроорганиз-
мами, относятся рибофлавин и флавиновые: кофермект фланинмононуклеотнд
(ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Некоторые бактерии, дрожжи и
дрожжеподобные грибы способны образовывать очень большие количества фла-
вине», что дает возможность использовать их для промышленного получения
Метаболическим предшественником рибофлавина является гуанозпнгри-
фосфат, который под действием пиклогидролаэы II превращается в производ-
ное пиримидина. / (рис. XXIII* 10) Рибнтильная боковая цепь рибофлавина про-
продукт J превращается через стадию II в 4-рибитвламино 5-амипоурацка. По-
следний конденсируется с С«-пронзводным, вероятно, диацетилом, с образова-
нием б.Т-диметил-В-рибигпллумазина
синтетазы в рибофлавин. Для образования одной молекулы рибофлавина не-
обходимы две молекулы 6,7-днметил-8-рибитнллумаэина В данной реакции 6-й
н 7-й углеродные атомы вместе с обеими присоединенными к ним метильными
группами одной молекулы перевесятся на вторую молекулу 6,7-димегнл-8-ри-
Рибофлавин может взаимодействовать с высокоэнергетическими фосфатами,
277
Рис. ХХ1Ц-10. Биосинтез рибофлавина, ФМН и ФАД
ГЛАВА XXIV. БИОСИНТЕЗ СТРЕПТОМИЦИНА
1. БИОСИНТЕЗ СТРЕПТИДИНА
Синтез стрептомицина осуществляют культуры, относящиеся к
актиномицетам, главным образом различные мутанты Actinomyces
streptomycini Молекула стрептомицина состоит из двух частей:
стрептидина и стрептобиозамина. Стрептидин является производ-
ным инозита, содержащим гуанидиновые группы. Стрептобиозамин
представляет собой дисахарид. Он состоит из стрептозы (пенто-
зы) и Ы-метил-Ь-глюкозамина. В стрептобиозамине остаток N-ме-
тил-Ь-глюкозамина соединен с остатком стрептозы гликозидной
связью, а связь между остатками стрептидина и стрептобиозами-
на осуществляется за счет гликозидного гидроксила стрептозной
части стрептобиозамина.
Кроме стрептомицина (рис. XXIV-1) среди продуктов метабо-
лизма продуцента встречаются два весьма близких по структуре
соединения. Одно из них—дигидрострептомицин, в молекуле ко-
торого вместо альдегидной группы стрептозы находится оксиме-
тил ьная группа; другое маннозидострептомицин. Последний от-
личается от стрептомицина наличием D-маннозы, соединенной гли-
козидной связью с 4-м углеродным атомом N-метилглюкозамина.
Здесь будут рассмотрены биохимические механизмы синтеза
структурных единиц, составляющих молекулу стрептомицина. Они
интересны и важны не только применительно к синтезу стрепто-
мицина, но и потому, что встречаются в риду других природных
соединений, синтезируемых микроорганизмами
Исходным продуктом синтеза стрептидина (рис. XXIV-2) яв-
ляется глюкоза (/), которая подвергается фосфорилированию с
образованием глюкозо-6-фосфата (II). В результате активности
глюкозо-6-фосфатциклазы образуется мио-инозитол-фосфат (III),
который под действием специфической инозитол-1-фосфатазы де-
фосфорил изуется до мио-инозитола (IV). Последний подвергается
дегидрированию благодаря активности инозитол-2-дегидрогеназы
при одновременном восстановлении НАД+ с образованием кето-
сцилло-инозитола, имеющего кето-группу (V), крайне важную для
последующей трансаминазной реакции. Донором аминогруппы
здесь служит глутамин, отдающий свою аминную группу.
В реакции участвует пиридоксальфосфатзависимый фермент
L-глутамин. кето-сцилло-инозитол аминотрансфераза Продуктами
реакции являются 1 -амино- 1-дезокси-сцилло-инозитол (VI) и 2-ке-
тоглутарамид. Характерной особенностью реакции, которая при-
водит к образованию N-амидинопроизводного, является необходи-
мость иметь в качестве акцепторного соединения фосфорилирован-
27S
ное производное. Таким фосфорилированным производным явля-
ется п-фосфорил-сцилло-инозамин (V//), который возникает в ре-
зультате активности сциллоинозаминкиназы (АТФ: инозамин фос-
фотрансфераза). В реакции трансамидирования участвует арги-
нин. Он отдает амидиновую группу. Полагают, что амидинотранс-
фераза (L-аргинин: инозаминфосфат амидинотрансфераза) изби-
рает в качестве акцептора аминогруппу, расположенную в пара-
положении относительно фосфатной группы. В результате обра-
зуется п-фосфорил-Ы-амидино-сцилло-инозамин (VIII) и орнитин.
Дальше следуют реакции, которые имели место ранее: дефосфо-
рилирование, продуктом которого был N-амидино-сцилло-инозамин
(IX), дегидрирование с образованием кето-производного, N-ами-
дино-3-кето-сцилло-инозамина (X). В реакции трансаминирования
кето-производного на этом этапе принимает участие а-аланин. Бла-
годаря активности L-аланпн: 1-П-1-гуанидино-1-дезокси-3-кето-
сцилло-инозитол аминотрансферазы происходит синтез N-амиди-
нострептамина (XI). Затем вновь происходит фосфорилирование;
280
Рис. XXIV-2. Биосинтез
281
фосфатный остаток располагается в пара-положении относительно
аминогруппы (п-фосфорил-Ы-амидинострептамин, XII). Трансами-
наза и фосфатаза завершают формирование молекулы стрептиди-
-на (XIII—XIV). Однако в реакции синтеза молекулы стрептоми-
цина, возможно, участвует не свободный стрептидин, а его фос-
Следует обратить внимание на эмпирическое наблюдение, ко-
торое касается ингибирующего эффекта фосфата на биосинтез
стрептомицина при его ферментации. Теперь известно, что фосфат
ингибирует дефосфорилирование фосфорилированных промежуточ-
ных продуктов синтеза стрептомицина, в результате чего они ак-
кумулируются в среде или в клетке. Этот факт дает возможность
предположить, что свободный стрептидин, в частности, не явля-
ется физиологически нормальным промежуточным соединением,
хотя не исключено, что стрептидиновый остаток повторно подвер-
гается фосфорилированию на уровне сформированной молекулы
стрептомицина
2. БИОСИНТЕЗ N-МЕТИЛГЛЮКОЗАМИНА
И СТРЕПТОЗЫ
аминирующим
сокиназой с образованием глюкозо-6-фосфата, далее—глюкозофосфатизомераз-
пая реакция, в результате которой получается фруктозо-6-фосфат (рис. XXIV-3).
Последний служит субстратом аминирования. Эту реакцию осуществляет гек-
282
(рис. XXIV-4).
Механизм сборки молекулы стрептомицина из трех структур-
ных единиц также достоверно неизвестен. Исходя из известных
принципов биогенеза, можно сказать, что в реакции должны уча-
ствовать сахара в виде нуклеозиддифосфатов. Если предположить,
что в реакции принимает участие дТДФ— диоксистрептоза, то
продуктом реакции может стать дигидрострептомицин. Именно
дигидрострептомицин обнаружен как единственный внутриклеточ-
ный аналог стрептомицина. Возможно, что окисление диоксистреп-
тозы до стрептозы происходит на наружной поверхности мембраны
при выходе молекулы из клетки продуцента или за счет экзофер-
мента в среде. Иными словами, дигидрострептомицин рассматри-
вается как непосредственный метаболический предшественник
стрептомицина.
3. ФАКТОР А
283
ГЛАВА XXV. КОФЕРМЕНТЫ И ИХ ФУНКЦИИ
Многие ферменты являются двухкомпонентными, т. е. состоят
из белка и связанного с ним кофермента (коэнзима) — термоста-
бильного органического соединения небелковой природы. Белко-
вая часть двухкомпонентного фермента называется апоферментом
В результате ферментативных реакций коферменты, как правило,
не подвергаются изменениям и этим отличаются от субстрата. По-
скольку коэнзимы выполняют свои функции в определенных ти
пах биохимических реакций, целесообразно рассмотреть их в тоь
порядке, в каком классифицируют ферменты.
1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ
К этому классу принадлежат все ферменты, катализирующие
окислительно-восстановительные реакции. Субстрат, подвергаю-
щийся окислению, рассматривается как донор водорода или элек-
тронов.
ХН2+Y:?*X+yh2.
В качестве непосредственных переносчиков выступают нико-
тинамидадениндинуклеотид (НАД) или его фосфорилированное
производное (НАДФ), флавинмононуклеотид (ФМН) или фла-
винадениндинуклеотид (ФАД), а также цитохромы, содержащие
простетическую группу, в которую входит ион железа, металла с
переменной валентностью. В среды для культивирования микро-
организмов иногда вводят витамины. В организмах витамины мо-
гут превращаться в коэнзимы за счет специфических реакций, на-
пример аденилирования, поэтому наряду с коэнзимами здесь по-
казан соответствующий витамин
Цитохром представляет собой гемопротеид, характерная функ-
ция которого состоит в переносе восстановленных эквивалентов,
связанном с обратимой сменой уровней окисления простетической
группы. Все известные типы цитохромов в соответствии с их
Структурой разделены на 4 группы.
Роль цитохрома состоит в том, что его окисленная форма за-
бирает электрон от водородного атома, отнятого дегидрогеназой
284
onh2
ФАД
> • *2H
(ФМН ве имеет АМФ) ФАД-»^ ФАДН»
©
от окисляемого субстрата и содержащегося в дигидроформе фла-
виновой дегидрогеназы. В результате эти водородные атомы пре-
вращаются в ионы водорода Н+, а цитохром из окисленной формы
переходит в восстановленную, причем содержащееся в нем железо
из трехвалентного превращается в двухвалентное. В дальнейшем
285
отнятый от водородного атома электрон через систему переносчи-
ков электронов передается атому кислорода; при этом последний
приобретает способность реагировать с ионизированными водород-
ными атомами, образуя воду:
Образовавшийся в ходе реакции кислород далее участвует в
реакции окислительного фосфорилирования, поставляющего орга-
низму энергию в виде АТФ:
НАДН^-ь V2O2+ЗАДФ + ЗФн+НАД + Н2О-|- ЗАТФ.
Примеры дегидрогеназ.
лакттатдегидрогеназа
СН3СНОНСООН+НАД:£ СН3СОСООН + НАДН2;
алкогольдегидрогеназа
СН3СН2ОН+НАД СН3СНО+НАДН2;
сукцинатдегидрогеназа
СООНСН2СН2СООН+ФАД СООНСН - СНСООН+ фадн2.
К числу коэнзимов, участвующих в метаболизме ферментов,
которые относятся к первому классу, принадлежит липоевая кис-
лота, способная выступать как переносчик водорода и как пере-
носчик ацильных групп Ее дисульфидная связь легко разрыва-
ется с образованием двух сульфгидрильных групп. Благодаря это-
му легко происходит окисление и восстановление липоевой кис-
лоты, на чем и основана ее коферментная функция:
Липоевая кислота участвует впируватдегидрогеназной реакции:
Пируват ^-окисленный липоат-86-ацетилгидролипоат+COg;
CHgCOCOOIJ
2. ТРАНСФЕРАЗЫ
Трансферазы —ферменты, переносящие ту или иную группу
от одного соединения к другому соединению, которое рассматри-
вается как акцептор. Во многих случаях донором является ко-
фактор, который присоединяет группу, подлежащую переносу.
XR+Y^YR+X,
где R— ацил-амино-, формил-, метил-, гликозил или фосфат.
ам-@-@-сн2
сн—с—сн3
£нон
(Ко ASH)
реакция
KoASH ^±^KoAS~COB
Примером действия трансферазы может служить реакция, осу-
ществляемая фосфотрансацетилазой-
СНзСО ~ S КоА'+ Фн СН3СО ~ Ф + Ко A SH.
237
Пиридоксальфосфат является коэнзимом в различных реакци-
ях метаболизма аминокислот, в том числе участвует в реакциях
трансаминирования:
Примеры трансаминирования:
Ьно
репкц'ия
fHs
СНг
CHNH
СООН
CH2NH3
пиррдоксами-
пофосфат
3HNHa
Глутаминовая кислота+пировиноградная кислотам
ч^а-кетоглутаровая кислота 4- аланин;
б-Аминолевулинсинтетаза (пиридоксальзависимый фермент)’ СООН сн3
СООН сн2
сн2 соон I +KOASH " с=о +со2
сн2 + ch2nh2 сн2
СО SKoA 4н,
сукцииил-КоА глицин б-амиволввулшюввя к-та
288
В переносе одноуглеродных фрагментов (формил-, формамино-,
оксиметил- и метильных групп) принимает участие 5, 6, 7, 8-тет-
рагидрофолиевая кислота (ТГФ). Она входит в качестве коэнзи-
ма в различные трансформилазы, оксиметилтрансферазы, метил-
трансферазы. Наиболее важным источником одноуглеродных еди-
OHHjC---
превращения К6-№°-метилеэтетрагидрофолиевой
fl гидрой
ниц служит серин. В присутствии ТГФ эта аминокислота может
быть расщеплена серин-оксиметилтрансферазой с образованием
глицина и №, №°-метилен-ТГФ. При гидролизе последнего соеди-
нения образуется ТГФ и формальдегид. В результате окисления
№. №°-метилен-ТГФ может быть превращен в Ы10-формил-ТГФ
28»
Пример переноса 1-С-фрагмеита:
ТГФ+CH2OHCHNH2COOH^=
=^CH2NH2COOH+№,N10-метил ci i-ТГФ
К этому же классу трансфераз относятся киназы, переносящие
фосфатную группировку от нуклеозид ди- пли трифосфатов к ак-
цептору. Однако специальных коэнзимов для этой реакции не
описано.
Пример действия гексокиназы-
Глюкоза+АТФ-»-глюкозо-6-фосфат+АДФ.
290
3. ГИДРОЛАЗЫ
X—Y+НОН—X—Н+Y—ОН.
В отличие от всех других классов ферментов гидролазы не
нуждаются в коэнзимах.
4. ЛИАЗЫ
Лиазы — ферменты, которые разрывают С-С, С-О, C-N и иные
связи в реакциях, не являющихся гидролитическими или окисли-
тельными Эти ферменты отличаются от других тем, что в ката-
лизируемых ими реакциях в одном направления участвуют два
субстрата, а в обратном — только один. При действии на один
субстрат от него отщепляется молекула с образованием ненасы-
щенного остатка. К числу ферментов, относящихся к лиазам, при-
надлежат декарбоксилазы, дезаминазы, альдолазы н кетолазы.
Реакция
R—СОСООНЧ-ТФФ^-(РСНО-ТФФ) + СО2.
Некоторые декарбоксилазы и транскетолазы используют тиа-
минпирофосфат в качестве коэнзима.
Пример действия декарбоксилазы:
СНзСОСООН+ТФФ-*-(СНзСНО • ТФФ) + СО2
СНаСНО + ТФФ
Транскетолаза:
RCHOHCO СН2ОН+R'CHO RCHO+R'CHOHCOCH2OH.
Некоторые дезаминазы используют в качестве коэнзима пири-
доксальфосфат.
Примеры действия сериидегидратазы:
CB2OHCHNH2COOH-> СН2=С ( ЫН2) СООН+ Н2О
СНзСОСООН+NHs — CHsC(=NH)COOH
Цистеиидесульфураза -
CH2SH С НЫН2СООН->СН2=С (NH2) СООН+H2S
СНзСОСООН+ЫНз -----— СНзС(-ЫН)СООН
5. ИЗОМЕРАЗЫ
Изомеразы катализируют превращения, происходящие в пре-
делах одной молекулы:
XR—YS XS—YR.
К их числу относятся рацемазы и эпимеразы, например ала-
-ринрацемаза:
D-Аланин --------------
L-аланин.
Присутствия кобамидного кофермента требуют некоторые му-
тазы, например метиласпартатмутаза или метилмалонил-КоА му-
232
АМФ '+
Х+ АТФ —X - АМФ + @
X- АМФ + у —*Х—Y + АМФ
Примеры действия изомераз, в которых участвует коэнзим Bi2:
6СООН
«СН. ®соон
SCH^ ; SCHS—*СН
2СН2 ®СН
’СООН СООН
*COSKoA
СООН
СНд—Ч(!н
>СО—SKoA
6. ЛИГАЗЫ (СИНТЕТАЗЫ)
Лигазы представляют собой ферменты, катализирующие сое-
динение двух молекул, сопряженное с гидролизом пирофосфатной
связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата. Образуе-
мые при этом связи часто являются высокоэнергетическими:
H2NCHCO'
н.ж:нсо—тРНК + АМФ
аинвоацил- тРНК
293
H»NCHCOOH + тРНК + АТФ —* HgN.CHCO—ГРНК + АМФ + @
СО» + АТФ + биотин —Е биотин — СО» - Е + АДФ + (ф)
биотин-СО.-Е + CHjCOCOOII COOHCIIjCOCOOH + биотин —Е
АДФ t @
Пример действия ферментов, активирующих аминокислоты:
АТФ + Y—*" АДФ + Y©
В данном случае фермент имеет биотин в качестве простети-
ческой группы. Карбоксильная группа биотина связана с e-NHa-
группой остатка лизина в молекуле фермента.
список рекомендуемой литературы
Минск Наука и техника^1979. — 149 с?
пизмамй.— Л Медицина, 1969.—245 с.
Ьевбородов А М Метаболиты внутриклеточного фонда микроорганизмов,—
М. Наука, 1974—76 с.
1978 —231 с/' Е ВвеЛеНИе Е биотехнолотию м - Пищевая промышленность,
ность, 1981 —294 с.
В,2.—М.- Изд во МГУ, 1976 —264 с. еР Р
1982—165 с™ ' ’ Мяк₽обяологическии сввтез витаминов . зд во М
1982.—309НсРаТЬеВОИ’ ПеР‘ Г‘ Мирошниченко, . реслени. ир,
Егоров Н. С Основы учения об антибиотиках.—2-е изд., перераб. и доп.—
М Высшая школа, 1969—479 с.
химии, 1979, т 20, с *214—228 РУ ₽ Р
34^'с°‘ А' Чизмаджева’ Пер Ю‘ А- Е₽маков’ А- М- Юркевич 1 |980-
МП^*1975. —246 с. ” е у йр ф ф О
ченко, И Р. Циммерман. — М." Мир, 1979 —548 с.
Л. М Гинодмана, Е С. Северина —М* Мир, 1980. т. 1-408 с., т II—606 с.,
т. III—488 с
ков —М.. Мир, 1981.—215 с.
2S5
Стейнаер Р, Збельберг, Дею. Ингрем. Мир микробов: перевод с английско-
го/под ред. Е Н Кондратьевой и С. В. Шестакова. — М.. Мир, 1979 —т. I—
318 с, т II —334 с., т. III—486 с.
ханяна, пер. Ю. Н.^Зограф, Т. С. Ильина, В. Г. Никифоров. — М₽ Мир, 1981.—
В. А. Энгельгардта. — М.. Мир, 1978.—720 с.
1948.—<«Тс**”* В' Н Те™ическая ми ₽° ’ я' М" е с 1
* ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Валик 166, 847.^863^
297
s
123. 259
300
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ХИМИИ МИКРОБНОЙ
Предисловие
Часть первая
КЛЕТКИ .
1. Поверхностные структуры клеточной стенки
пенни мембран
осфотрансферазная система
•4. Рибонуклеиновые кислоты .
5 Внехромосомные ДНК
7. Получение мутантов для сверх
8. Связь между структурой ДНК
Глава VIII Минеральные вещества и вода...........
I. Минеральные вещества и их функциональная роль в обмене
микроорганизмов..................................
2 Вода в клетках микроорганизмов.................
Часть вторая.. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ
И ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ . .
I. Функции внеклеточных гидролаз в подготовке высокомолекулярных
2.
302
6. Особенности механизма регуляции в клетках эу
в циклические структуры .
1. Ацетил-КоА, его характеристика и биогенез
2. Малонил-КоА .
3. Циклические структуры
4. Метвлмалоннл-КоА. егс
2. Нуклеотиды т_ „
Часть третья. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ БИОСИНТЕЗА МИК
РОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
7. Аутогенная регуляция
8. Аутоиндукция .
1. Общие закономерности биосинтеза аминокислот
3. Лизин
Лава XIX Синтез витамина В». Сукцинат-глициновый цикл ,
1. Структура витамина Ви
6. Компоненты среды, регулируют е микробиологический синт
4. Пенициллины................... ₽.
2. Цефалоспорины.............................
Глава ХХП. Микробиологический синтез пептидов .
Глава XXIII. Синтез нуклеотидов, их производных и флавинов
1. Биосинтез основвннй..........................
2. Микробиологкческ! й синтез луклеозвдфосфатов .
АЛЕКСЕИ МИХАИЛОВИЧ БЕЗБОРОДОВ
БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА
Художник М. В Носов
ИВ № 179