Молекулярная иммунология - Кульберг А.Я.

Автор: Кульберг А.Я.
Теги: физиология сравнительная физиология молекулярная биология медицина иммунная система издательство высшая школа иммунитет адаптивный иммунитет патология иммунитета
Год: 1985
Похожие
Иммунология
Иммунология: учебное пособие
Иммунология
Текст
                    А. Я. КУЛЬВЕРТ

А. Я. КУЛЬБЕРГ
Молекулярная
иммунология
. Москва
* «Высшая школа»
1985
ББК 28.070
К 90
УДК 612
Рецензенты:
кафедра иммунологии 2-го Московского медицинского института
им. Н. И. Пирогова (зав. кафедрой акад. АН СССР, проф.
Р. В. Петров); кафедра биохимии Киевского государственного
университета им. Т. Г. Шевченко (зав. кафедрой
проф. Н. Е. Кучеренко);
д-р хим. наук, проф. А. А. Богданов (Московский государственный
университет им. М. В. Ломоносова)
Рекомендовано Учебно-методическим управлением
по высшему образованию Министерства высшего и среднего
специального образования СССР для использования
в учебном процессе
Кульберг А. Я.
К90 Молекулярная иммунология. Учеб, пособ. — М.:
Высш, шк., 1985. — 287 с., ил.
В пер.: 95 к.
В книге впервые системно изложены основы молекулярных имму-
нологических реакций. С позиций физико-химической биологии рас-
смотрены значение реакций иммунитета в регуляции постоянства
внутренней среды организма, принципы организации иммунной систе-
мы, химия антигенов и антител, строение и биосинтез иммуноглобули-
нов, вопросы взаимосвязи между строением и функцией антител, хи-
мия и биохимия системы комплемента и др. Отдельный раздел посвя-
щен описанию важнейших методов современной иммунологии.
2007020000—358	ББК 28.070
к 001(01)—85	99—85	57.04
© Издательство «Высшая школа», 1985
Предисловие
За последние десятилетия молекуляр-
ная иммунология стала одной из ведущих областей сов-
ременной биологии. Как составная часть иммунологии
эта дисциплина сегодня привлекает внимание очень
боль.шого числа исследователей. Достаточно сказать, что
работы по вопросам иммунологии печатаются более чем
в 900 изданиях. Впечатляющие результаты исследований,
их влияние на самые различные области биологии и ме-
дицины, возможность эффективного приложения резуль-
татов многих исследований для нужд здравоохранения,
ветеринарии, биотехнологии привлекают в иммунологию
все новых и новых специалистов. В этих условиях обоб-
щение накопленных знаний в форме руководства, учеб-
ных пособий — задача актуальная.
По вопросам общей иммунологии в нашей стране и
за рубежом опубликован в последние годы ряд отличных
руководств. Молекулярной иммунологии «не повезло».
Несмотря на публикацию обзорных статей по частным
вопросам, руководств, обобщающих обширный фактиче-
ский материал в этой области, по существу еще не изда-
валось. Достаточно сказать, что одна из наиболее
значительных книг по иммунохимии вышла в свет в
50-х годах
В предлагаемой читателю книге обобщены основные
сведения о молекулярных основах реакций иммунитета.
Содержание руководства находится в соответствии с
учебными программами курсов иммунологии и иммуно-
химии, преподаваемых на медико-биологическом факуль-
тете 2-го Московского медицинского института им.
Н. И. Пирогова и в Московском государственном универ-
ситете им. М. В. Ломоносова (биологический факуль-
тет). Пособие рассчитано на студентов, знакомых с осно-
1 См. Кэбот Э., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.,
1968.
3
вами органической химии, биохимии, молекулярной био-
логии.
В книге обсуждаются основные вопросы клеточной
иммунологии и многие иммунологические феномены, од-
нако она не подменяет собой руководств по общей имму-
нологии. Именно молекулярные аспекты иммунологии
являются ее основным содержанием. В пособии пред-
ставлены прежде всего те разделы современной иммуно-
логии (строение антигенов и антител, биосинтез антител,
эффекторные функции иммуноглобулинов, система ком-
племента), где уже осуществлен глубокий анализ явле-
ний на молекулярном уровне. Рассматриваются также
молекулярные аспекты регуляции иммунного ответа и
некоторые проблемы иммунопатологии. В книгу вошел
также раздел, знакомящий читателя с методологией им-
мунохимического эксперимента, возможностями молеку-
лярной иммунологии для решения ряда задач современ-
ной молекулярной биологии и биохимии. Последнее
представляется необходимым, чтобы показать, сколь ве-
лики возможности молекулярной иммунологии в облас-
тях, во многом определяющих прогресс биологии.
Автор
Введение
Молекулярная иммунология— научная
дисциплина, изучающая химические, биохимические и
молекулярно-биологические основы реакций иммунитета.
Как способ научного мышления молекулярная иммуно-
логия и прежде всего иммунохимия возникла одновре-
менно со становлением иммунологии как отрасли биоло-
гии. Первые попытки создания искусственных антигенов;
на основе химически модифицированных белков были
предприняты еще в 1906 г. Э. Пиком (Е. Pick). Первая,
во многом предвосхитившая наши современные пред-
ставления теория образования антител была сформули-
рована выдающимся химиком XX столетия Паулем Эр-
лихом (Р. Ehrlich, 1903). Несколько позже большой ин-
терес к иммунологии проявил выдающийся физико-химик
Сванте Аррениус, который ввел в научную литературу
термин иммунохимия (S. Arrhenius, 1904). В 10—30-х
годах исследованиями К- Ландштейнера, М. Гейдельбер-
гера, В. Бойда, Э. Кэбота (K.Landsteiner, М. Heidelber-
ger, W. Boyd, E. Kabat) и другими был создан фундамент
современной молекулярной иммунологии.
Успехи молекулярной иммунологии в решающей сте-
пени связаны с успехами в изучении химии белка и дру-
гих биополимеров, общей биохимии и молекулярной био-
логии. Молекулярная иммунология не только базируется
на этих дисциплинах, но и активно влияет своими мето-
дическими подходами на успех наиболее быстро разви-
вающихся областей биологической науки: изучение
структуры и функции белков, молекулярной генетики
эукариот, дифференцировки клеток и тканей.
Оценка реакций иммунитета с химических позиций
позволяет выявить принципиальные особенности этой си-
стемы регуляции постоянства внутренней среды организ-
ма. В основе реакций иммунитета, как и других реакций
организма, необходимых для обеспечения его жизнедея:-
тельности, лежит специфическое (избирательное) взаи-
модействие одних макромолекул с другими макромоле-
5
кулами или низкомолекулярными соединениями. Не об-
суждая здесь химических основ специфического взаимо-
действия, отметим ли.шь, что мерой специфичности слу-
жит скорость реакции, например, скорость реакции фер-
мент-субстрат, антиген (гаптен)-антитело, лиганд-кле-
точный рецептор и др.
Константа скорости такой важнейшей в биологичес-
ком отношении реакции, как фермент-субстрат, достига-
ет значений порядка 106—108 м-1 с-1. Аналогичные значе-
ния константы скорости характерны для реакции антител
с антигенами или гаптенами. Но между сравниваемыми
реакциями существуют очень важные различия. В слу-
чае ферментативного катализа за счет изменения хими-
ческого строения субстрата сродство образующегося про-
дукта к активному центру фермента крайне мало по
сравнению с субстратом. В силу этого активный центр
становится доступным для реакции с новой молекулой
субстрата. Напротив, комплекс антиген (гаптен)-антите-
ло не подвергается внутренним превращениям, которые
могли бы привести к освобождению активного центра
антитела. Аналогично протекает реакция антигена с по-
верхностными рецепторами клеток иммунной системы.
Вследствие этого судьба антител (рецепторов) — это их
распад в процессе катаболизма комплекса. Следователь-
но, протекающие в иммунной системе химические реак-
ции, определяющие ее роль в гомеостазе, по существу
необратимы. Это отличает их как от реакции фермент-
субстрат, так, видимо, и от других менее изученных в
кинетическом плане реакций, регулирующих гомео-
стаз: специфической рецепции клетками субстратов, раз-
нообразных медиаторов и другими реакциями.
Сказанное выше служит иллюстрацией роли химичес-
кого анализа для глубокого понимания биологической
сущности реакций иммунитета. ТехМ самым молекуляр-
ная иммунология, изучая на основе всех достижений фи-
зико-химической биологии систему иммунитета, вносит
значительный вклад в биологическую теорию. В свою
очередь, разнообразные методы иммунохимического ана-
лиза, сочетающие в себе высокую специфичность с точ-
ностью химического и физического экспериментов, уже
нашли и продолжают находить все более широкие сферы
приложения в самых различных областях биологии и ме-
дицины.
6
ГЛАВА
Система, иммунитета
В настоящей главе кратко рассмотрены
некоторые наиболее важные сведения о системе иммуни-
тета и феноменологии иммунологических реакций. Изло-
женные ниже материалы необходимы для последующе-
го детального обсуждения основных проблем молекуляр-
ной иммунологии.
1.1. Клетки и органы иммунной
системы
Реализацию специфических реакций им-
мунитета обеспечивают два основных типа клеток —
лимфоциты и макрофаги, или А-клетки. Их созревание
под влиянием различных индукторов, включая антигены,
происходит в органах иммунной системы. Органы им-
мунной системы по морфологическим признакам не без
основания отождествляют с лимфоидными органами, так
как основным типом клеток в них являются лимфоциты,
их предшественники и потомки. Лимфоидные органы
подразделяют на центральные и периферические. Цент-
ральные органы — это костный мозг, фабрициева сумка
у птиц и ее аналог у млекопитающих (см. ниже), а так-
же тимус (вилочковая железа). Периферические органы
включают селезенку, лимфатические узлы и многочис-
ленные рассеянные по всему организму скопления лим-
фоцитов, находящихся на различных стадиях дифферен-
цировки (рис. 1).
Лимфоциты—основные клетки, ответственные за спе-
цифическую иммунореактивность. Они возникают из
стволовых клеток (stem cells) 1 кроветворной ткани.
У млекопитающих до рождения (ad utero, или в антена-
тальный период) основным органом кроветворения
1 Некоторые основополагающие понятия даны также на англий-
ском языке для облегчения работы с иностранной литературой.
Рис. 1. Лимфатическая система человека
(гемопоэза) служит печень. Здесь как и в костном моз-
ге, находятся полипотентные стволовые клетки и проте-
кают первые этапы лимфопоэза. После рождения (пост-
натальный период) печень полностью утрачивает функ-
ции органа гемопоэза и в том числе лимфопоэза. В этот
период стволовые клетки кроветворной ткани, включая
предшественники лимфоцитов, находят только в костном
мозге. Именно за счет этих клеток происходит пополне-
ние числа лимфоцитов как в норме, так и после гибели
значительного числа лимфоцитов в результате действия
радиационного облучения или различных агентов.
Зрелые лимфоциты подразделяют на две популяции:
В- и Т-лимфоциты. В-лимфоциты возникают в ходе анти-
геннезависимой дифференцировки стволовых клеток в
фабрициевой сумке у птиц или ее эквиваленте у млеко-
питающих. Они обязаны своим название^м первой букве
латинского слова bursa — сумка. У птиц фабрициева
сумка представляет собой лимфоэпителиальный орган,
расположенный в задней стенке клоаки. Точная локали-
зация аналога фабрициевой сумки у млекопитающих не
известна. Допускают, что это образование находится в
стенке толстой кишки.
Т-лимфоциты появляются в процессе антигеннезави-
симой дифференцировки стволовых клеток в тимусе (по
первой букве которого они и названы). Тимус — лимфо-
эпителиальный орган, находящийся в передней верхней
части средостения. Убедительно доказано, что, будучи од-
ним из центральных органов лимфоидной системы, ти-
мус является также органом эндокринной системы.
Продуцируемые им гормоны — тимозин, тимопоэтин, ти-
мостимулин и ряд других участвуют в дифференцировке
лимфоцитов Т-ряда на всех трех «территориях», содер-
жащих клетки лимфоидного ряда, — костном мозге, ти-
мусе и периферических лимфоидных органах. Имеется
ряд доказательств в пользу того, что тимические гормо-
ны продуцируются эпителиальными клетками тимуса.
На тесную взаимосвязь между лимфоцитами, «заселяю-
щими» тимус, — тимоцитами и окружающими их эпите-
лиальными клетками указал впервые А. Максимов
(1923). Позднее значительный вклад в изучение эндо-
кринной функции тимуса, структуры и функции его гор-
монов внесли А. и Дж. Гольдштейны и Н. Трайнин
(A. Goldstein, G. Goldstein a N. Trainin) (1974—1983).
Предполагают, что фабрициева сумка и ее аналог у
млекопитающих также продуцируют вещества со свойст-
9
вами гормонов, регулирующие созревание В-лимфоци-
тив.
Лимфоидные органы, в гом числе и центральные, на-
ходятся иод контролем всей эндокринной системы, а так-
же управляющими ею органами центральной нервной си-
стемы. Нейроэндокринные влияния на дифференциров-
ку стволовых клеток (за исключением гормонов тимуса
и гипотетических гормонов фабрициевой сумки) носят
неспецифический характер и аналогичны их эффекту на
клетки других систем организма. Специфическую направ-
ленность дифференцировке стволовых клеток крове-
творной системы придают, по-видимому, корогкодистант-
ные по механизму действия факторы, продуцируемые
стромальными элементами органов лимфоидной системы
(А. Фриденштейн, Е. Лурия, 1980). Эти проблемы еще
только начинают разрабатывать и их значение для био-
логической теории трудно переоценить.
В- и Т-лимфоциты, не отличаясь заметно по морфо-
логии, имеют существенные отлиция в метаболизме, что
находит свое отражение в их физических свойствах,
строении ассоциированных с цитоплазматической мем-
браной рецепторов, включая рецепторы-для, антигена.
Д^лцмфоцигы несут больший отрицательный заряд по
сравнению-z В-лимфоцитами, благодаря наличию на их
поверхности значительно большего числа остатков с-иа-
ловой кислоты. На этих различиях основан один из ме-
тодов разделения Т- и В-лимфоцитов с помощью элект-
рофореза.
Т-лимфоциты при центрифугировании смеси клеток в
градиенте плотности располагаются в более плотных
слоях градиента.
Т-лимфоциты (мыши) несут на своей поверхности ха-
рактерные антигены (антигенные маркеры). В их числе
так называемый Thy-1-антиген, антигены семейства Lyt
и др. Образование маркера Thy-1 находится под контро-
лем тимозина, тимопоэтина и тимостимулина, а марке-
ров семейства Lyt — преимущественно тимозина.
В-лимфоциты синтезируют рецепторы для антигена,
которые лишь в небольшой степени отличаются от сыво-
роточных иммуноглобулинов по своему строению (рис.
2). Антигенсвязывающие рецепторы Т-лимфоцитов пред-
ставлены белками, не относящимися к семейству имму-
ноглобулинов.
В-лимфоциты могут содержать на своей поверхности
рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов всех клас-
10
сов. Эти рецепторы, называемые Fс-рецепторами, экс-
прессированы не на одной клетке, а на различных суб-
популяциях В-лимфоцитов, но все они принадлежат к
лимфоцитам В-ряда. На Т-лимфоцитах найдены рецеп-
торы для иммуноглобулинов классов G, М, А и Е.
Рис. 2. Рецепторы и антигенные маркеры В-лимфо-
цита:
IgD и IgM — иммуноглобулиновые рецепторы соответствую-
щего класса, 1а — антиген, Fc и Fc — рецепторы для
7 Iх
Fc-участков иммуноглобулинов G и М, CR — рецептор для
активированного третьего компонента комплемента.
MBLA — дифференцировочный антиген B-лимфоцитов мы-
ши
Только В-лимфоциты имеют на своей поверхности ре-
цепторы для продуктов частичного протеолиза третьего
компонента системы комплемента — СЗЬ и C3d.
В-лимфоциты экспрессируют мембранный дифферен-
цировочный антиген, который в случае В-лимфоцитов
мыши получил название MBLA. На поверхности Т-лим-
фоцитов (человека) существует особый антиген —
HTLA, синтез которого контролируется одним из факто-
ров, продуцируемых тимусом — FTS (от франц. — facteur
thymique serique).
На цитоплазматической мембране В-лимфоцитов
(мыши) содержится в большом количестве 1а-антиген —
продукт одного из локусов 1-района генов основного
комплекса гистосовместимости.
11
Совокупность указанных и некоторых других приз-
наков позволяет с большой достоверностью дифференци-
ровать in vitro лимфоциты Т- и В-рядов. Но между эти-
ми клетками существует также принципиальное функ-
циональное отличие, выявить которое удается лишь в хо-
де их антигензависимой дифференцировки. Только
В-лимфоциты способны превращаться в клетки, продуци-
рующие_ иммуноглобулины (антитела). Что касается
'Т-лимфоцитов, то они под действием антигена превраща-
ются в клетки, ответственные за реакции клеточного,
вернее клеточно-опосредованного (cell-mediated) имму-
нитета, и клетки, регулирующие силу реакций в эффек-
торных звеньях гуморального и клеточного иммунитета.
Сказанное выше указывает на принципиальные раз-
личия в организации и экспрессии структурных генов для
белков, определяющих функции Т- и В-лимфоцитов в им-
мунных реакциях. Причем эти различия возникают в
процессе антигеннезависимой диференцировки стволовой
клетки в центральных лимфоидных органах. Лишь за-
вер.шающие стадии дифференцировки клеток лимфоид-
ного ряда, происходящие при участии антигена, осущест-
вляются в периферических, или вторичных, лимфоидных
органах. Лимфоциты поступают сюда из центральных
органов с кровью или лимфой. В-лимфоциты оседают в
селезенке и лимфоузлах, в то время как значительная
' часть Т-лимфоцитов продолжает циркулировать, нахо-
дясь как в крови (лимфе), так и в лимфоидных органах.
В результате свыше 2/3 лимфоцитов, циркулирующих в
крови, представлены Т-лимфоцитами.
В периферических лимфоидных органах Т- и В-лим-
фоциты находятся в различных зонах, расположение ко-
торых видно на схеме лимфатического узла (рис. 3).
Т-лимфоциты располагаются в так называемой тимусза-
висимой зоне коры; последняя прилегает к той части ор-
гана, где его ткань пронизана питающими лимфатичес-
кий узел кровеносными сосудами. Ближе к капсуле на-
ходится тимуснезависимая зона, содержащая плотные
скопления лимфоцитов (преимущественно В-лимфоци-
тов). Эти скопления называются фолликулами или пер-
вичными фолликулами. В ходе иммунного ответа первич-
ные фолликулы значительно увеличиваются в размере
(вторичные фолликулы) за счет пролиферации клеток.
При этом образуется так называемый зародышевый
центр (germinal center).
12
Около 95% лимфоцитов, содержащихся в лимфатиче-
скОхМ узле или других периферических лимфоидных орга-
нах в отсутствие иммунного стимула, представлены клет-
ками, происходящими из крови и лимфы. Иными слова-
ми, все эти клетки возникают в центральных лимфоид-
ных органах, где идет интенсивный лимфопоэз. Проник-
Корковый
слой
Мозговой
слой
Афферентный
лимфатический проток
Эфферентный
лимфатический проток
Рис. 3. Общая структура лимфатического узла:
СКС — синус коркового слоя, ДКС — диффузный корковый слой,
СМС — синус мозгового слоя, ПФ — первичный фолликул, ВФ —
вторичный фолликул, М — мантия, ЗЦ — зародышевый центр,
ПКВ — посткапиллярные венулы, МШ — мякотные шнуры
новение лимфоцитов в кровеносное русло связано с про-
хождением через стенки посткапиллярных венул. Это
происходит путем прикрепления клеток к определенным
структурам сосудистой стенки, чувствительным к дейст-
вию трипсина и гликозидаз, и последующей миграции че-
рез щели между клетками эндотелия. Аналогичным пу-
тем осуществляется перемещение лимфоцитов из цирку-
ляции в периферические лимфоидные органы (селезен-
ку). В лимфатические узлы лимфоциты поступают через
афферентные лимфатические протоки, пронизывающие
ткани в непосредственной близости от лимфоузла.
1.2. Иммунный ответ
При введении антигена местно (напри-
мер, в кожу) он попадает первоначально в близлежащий
(регионарный) лимфатический узел, где происходит его
13
первый контакт с лимфоцитами В-ряда. Но еще прежде
в афферентных лимфатических протоках произойдет
контакт антигена с Т-лимфоцитами, большая часть кото-
рых, как указывалось, рециркулирует, находясь в крови
и лимфе. Поэтому при попадании в кровь антиген всту-
пит в контакт также с Т-лимфоцитами.
Вне лимфоидных органов антиген контактирует так-
же с фагоцитами и прежде всего макрофагами. Эти клет-
ки, возникающие в ходе дифференцировки из особых кле-
ток-предшественников, которые находятся в костном
мозге, заселяют все без исключения органы и ткани. На
промежуточной стадии своей дифференцировки они сох-
раняют способность циркулировать (моноциты). Затем
эти клетки становятся малоподвижными и в большом
числе прикрепляются к поверхности клеток, выстила-
ющих стенки мелких сосудов.
Антигены, находящиеся в крови, фиксируются на по-
верхности макрофагов вне зависимости от того, где рас-
положены эти клетки. Так как вся кровь проходит через
печень, где находится большое число макрофагов (наз-
ванных купферовыми клетками), значительная часть ан-
тигена оказывается в печени. Остальной антиген находят
в почках, селезенке, легких. Однако только та часть ан-
тигена, которая окажется в селезенке, будет в качестве
специфического индуктора стимулировать иммунный от-
вет. Ниже показано распределение меченных 51Сг эри-
троцитов барана в организме неиммунизированного кро-
лика (эритроциты вводили внутривенно в дозе 5Х108,
определение радиактивности проводили через 2 ч):
Объект исследования Радиоактивность, %
Кровь........................ О
Печень...................... 79
Селезенка.................. 10,3
Почки......................... 6,5
Легкие........................ 4,2
При внутривенном введении в периферические лим-
фоидные органы попадает лишь ограниченная часть ан-
тигена; однако в случае местного введения антиген прак-
тически целиком пройдет через регионарный лимфатиче-
ский узел. Поэтому располагая небольшим количеством
антигена, целесообразно вводить его местно (в кожу, в
окружающую лимфатические узлы жировую клетчатку
или, когда это возможно, непосредственно в лимфатичес-
кий узел). При иммунизации кроликов часто прибегают
14
к введению антигена в подколенные лимфатические уз-
лы. Для того чтобы обеспечить депонирование раствори-
мого антигена (например, белка) в лимфатическом узле,
желательно сорбировать его на инертном носителе (час-
то А1(ОН)3) или приготовить в виде водно-масляной
эмульсии. В такой форме антиген наиболее эффективно
захватывается макрофагами, которые перенесут его за-
тем в лимфатический узел.
^Только тот антиген, который будет захвачен макро-
фагами, способен вызвать иммунный ответ В случае
'растворимых белковых антигенов макрофагам и з а хв аты-
вается лишь несколько процентов от всего количества
белка, причем та его часть, которая представлена спон-
танно возникающими агрегатами. Неагрегированный бе-
лок продолжает оставаться в циркуляции до того момен-
та, пока в кровь не начнут поступать синтезированные
против этого белка антитела. В комплексе с антителами
чужеродный белок будет быстро поглощаться макрофа-
гами.
Белок в мономерной форме, остающийся в циркуля-
ции после «отсеивания» макрофагами агрегатов того же
белка, вызывает противоположное иммунному ответу со-
стояние, называемое иммунологической толерантностью
(см. гл. 11). Это было установлено путем переноса сыво-
ротки животных, получивших за несколько часов до это-
го растворимый белковый антиген непосредственно в
кровоток, сингенным реципиентам, т. е. животным, тож-
дественнЫхМ донору в генетическом отношении (Р. Frei,
1965). Способность белка в мономерной форме индуци-
ровать иммунологическую толерантность обусловлена в
частности тем, что он без участия макрофагов вступает
в контакт с лимфоцитами. Таким образом, в наиболее об-
щей форме картина выглядит следующим образом. Если
^анщ£ен_ будет захвачен макрофагами и через их посред-
ство станет взаимодействовать с лимфоцитами, возник-
нет иммунный ответ. Если антиген не может быть захва-
чен макрофагами, но способен непосредственно контакти-
ровать с лимфоцитами, возникнет состояние иммуноло-
гической толерантности, т. е. специфической иммуноло-
гической ареактивности.
^Макрофаги взаимодействуют с антигенами неспепИ:
^^фически:, один и тот же макрофаг связывает самые раз-
личные антигены. Связанный макрофагами антиген оп-
ределенным образом перерабатывается (процессируется).
В результате переработки антигена (см. раздел 10.1) на
15
поверхности макрофага появляется продукт, состоящий
из фрагментов молекулы антигена и белков, контролиру-
емых генами основного комплекса гистосовместимости
(см. раздел 10.1). Такой макрофаг вступает в контакт с
Т-лимфоцитами, что служит необходимым условием для
реализации процесса антигензависимой дифференциров-
ки лимфоцитов как Т-, так и В-ряда.
Одно из первых проявлений реакции па антиген со-
стоит в значительном уменьшении числа лимфоцитов, по-
кидающих лимфатический узел по эфферентному лимфа-
тическому сосуду и значительному увеличению числа де-
лящихся клеток. Спустя 24—48 ч в органе появляются
лимфобласты — потомки лимфоцитов, отличающиеся от
них высокой метаболической активностью. Эти клетки
имеют по сравнению с лимфоцитами значительно боль-
ший объем цитоплазмы, содержащей большое число по-
лирибосом. Если лимфобласты являются потомками
В-лимфоцитов, на полирибосомах происходит синтез по-
липептидных цепей иммуноглобулинов, которые скапли-
ваются в цитоплазматических вакуолях. После сборки из
изолированных цепей молекул иммуноглобулинов (анти-
тел) они экскретируются клетками. Следовательно, с
этого периода в периферических лимфоидных органах
появляются клетки, продуцирующие антитела.
Нетрудно представить, что интенсивность продукции
антител будет возрастать как по мере увеличения в ре-
зультате деления клеток, участвующих в их синтезе, так
и совершенствования в ходе дифференцировки аппарата
синтеза и секреции антител. Такими клетками являются
плазматические клетки — конечная стадия дифференци-
ровки В-лймфоцитов. Эти клетки имеют чрезвычайно
развитую сеть так называемого шероховатого эндоплаз-
матического ретикулума — заполненных иммуноглобули-
нами «цистерн», на наружной поверхности которых в
большом количестве фиксированы полирибосомы. Плаз-
матические клетки в полном смысле слова — «фабрика»
для продукции иммуноглобулинов (антител). Плазмати-
ческие клетки утрачивают такие важнейшие функции
лимфоцитов, как рецепцию антигенов, связывание через
Fc-рецепторы иммуноглобулинов взамен единственной
функции — продукции антител. Значительное число этих
клеток гибнет в процессе секреции антител, так что про-
должительность жизни многих из них едва ли превыша-
ет несколько суток.
16
Одним из важнейших признаков высокой степени диф-
ференцировки плазматических клеток является то, что
они продуцируют антитела только против одной детер-
минантной группы антигена. Эти антитела относятся
только к одному классу (подклассу) иммуноглобулинов
со строго определенным аллотипом полипептидных це-
пей и характерным идиотипом (см. гл. 3).
Антиген обеспечивает рост клона клеток В-ряда, пре-
коммитированных в ходе их антигеннезависимой диффе-
ренцировки к синтезу антител против этого антигена.
Только часть дочерних лимфоцитов, принадлежащих к
данному клону, превращается в антителопродуцирую-
щие клетки. Остальные сохраняют морфологические
признаки лимфоцитов. К их числу принадлежат клетки
иммунологической памяти, способные при контакте с тем
же антигеном быстро превратиться в клетки, продуциру-
ющие антитела.
Целесообразно охарактеризовать количественно не-
которые параметры иммунного ответа, например, при им-
мунизации мышей оптимальной для продукции антител
дозой чужеродных эритроцитов. Если антиген введен
впервые (первичный иммунный ответ), максимальное
число антителопродуцирующих клеток в ответ на внут-
дишенную инъекцию антигена накапливается в селезенке
к 4—5-му дню. На 106 ядросодержащих клеток селезещ"
ки оно составляет порядка 100—400. В этот же период
число лимфоцитов, связывающих использованный для
иммунизации антиген, составляет порядка 2Х104/106
клеток селезенки. К 8—9-му дням после иммунизации
число антителопродуцирующих и связывающих антиген
клеток резко уменьшается (рис. 4). Уменьшение числа
антителопродуцирующих клеток объясняется в том числе
малым сроком жизни плазматических клеток. Уменьше-
ние числа лимфоцитов, связывающих антиген, объяснить
той же причиной нельзя, поскольку у лимфоцитов в
среднем более продолжительное время жизни. Этот фе-
номен в последнее время получил объяснение на основе
представлений о способности фиксированных на поверх-
ности лимфоцитов комплексов антиген-антитело как бы
выполнять функцию антигенсвязывающих рецепторов
(см. гл. 9). Необратимо теряя фиксированные на их по-
верхности комплексы, лимфоциты теряют вместе с тем
способность связывать антиген.
Дифференцировка В-лвмфоцитов в антитщюпродуци-
рующие клетки требjиг в би-шр/ин^ичу'нарв участия
помимо макрофагов (А-клетки) также определенного ти-
па Т-лимфоцитов— помощников (Т-хелперы, или Тх).
Взаимодействие различных типов клеток в ходе иммун-
ного ответйтполучило название клеточноТ^пшиКёрацииГ
Кооперацйзг В-лимфоцитов и-Т-хелперов строго спе-
цифична. Каждая из этих клеток имеет рецепторы для
антигена, хотя распознаваемые ими структуры в моле-
куле антигена различны (см. гл. 2). Макрофаги, как уже
указывалось выше, связывают антиген неспецифически.
Антигены, требующие участия Т-хелперов для индукции
'антитёлообразования, получили название тимусзави^н.-
Соответственно ответ на эти антигены также назы-
вают тимусзависимым. К тимусзависимым антигенам от-
носятся большинство глобулярных белков, синтетичес-
кие полипептиды, ксеногешШё и аллогенные клетки. 'Ге
биополимеры и их синтетические аналоги, которые со-
держат регулярно повторяющиеся идентичные структу-
ры, способны индуцировать антителообразование без
участия Т-хелперов. Такие антигены называют тимусне-
3aeu£LUMJ2lMn, а ответ на них — тимуснезависимым h
В число тимуснезависимых антигенов входят полисаха-
риды, агрегатылбелков регулярного строения и др.
Под действием антигена в периферических лимфоид-
ных органах протекают сложные процессы дифференци-
ровки Т-лимфоцитов. Они идут в двух направлениях.
Одно из них связано с активацией предшественников вы-
сокоспециализированных Т-лимфоцитов-эффекторов, уча-
ствующих в различных реакциях клеточного, а точнее,
клеточно-опосредованного иммунитета. Другое — сопря-
жено с накоплением и активацией ряда субпопуляций
лимфоцитов, регулирующих активность как В-лимфоци-
тов, так и предшественников Т-клеток-эффекторов. Од-
новременно накапливаются клетки иммунологической
памяти, относящиеся к Т-лимфоцитам. При этом клетки
памяти существуют как для регуляторных, так и эффек-
торных лимфоцитов.
К реакциям клеточно-опосредованного иммунитета,
возникающим под действием различных категорий Т-эф-
фекторов, относятся: реакция гиперчувствмтельности за-
медленного типа (delayed hypersensitivity); реакция от-
1 Этот термин нельзя признать удачным, так как в настоящее
время нет сомнений в том, что ответ на все без исключения антиге-
ны регулируется теми или иными субпопуляциями Т-лимфоцитов.
18
торжения аллогенного трансплантата (allograft rejecti-
on); реакция трансплантат против хозяина (graft-versus-
host reaction); цитотоксическая реакция против транс-
формированных онкогенными вирусами клеток или кле-
ток, на поверхности которых представлены антигены
иммунизации
Рис. 4. Динамика антителопродуцирую-
щих клеток (/) и лимфоцитов, связыва-
ющих антиген (2), в селезенке мыши,
иммунизированной эритроцитами бара-
на (5Х107 клеток)
внутриклеточных паразитов — некоторых видов бактерий
(микобактерии туберкулеза, листерии, бруцеллы), прос-
тейших, некоторых патогенных грибов.
К числу Т-лимфоцитов, регулирующих и модулирую-
щих иммунный ответ, принадлежат различные виды
Т-хелперов, Т-лимфоцитов, специфически подавляющих
реакции гуморального и (или) клеточного иммунитета
(Т-супрессоры, или Тс), Т-лимфоцитов, отменяющих или
модулирующих функцию Т-супрессоров.
Индуцированная антигеном активация и дифференци-
ровка Т-лимфоцитов столь же сложный процесс, как и
процесс антигензависимой дифференцировки В-лимфоци-
тов. Многие его аспекты еще требуют детального изуче-
ния как специалистами в области клеточной иммуноло-
гии, так и иммунохимии. В последующих главах мы рас-
смотрим ряд иммунохимических аспектов кооперативно-
го взаимодействия клеток иммунной системы.
ГЛАВА
Антигены
Антигенами называют биополимеры или
их синтетические аналоги, способные при введении в ор-
ганизм или в культуре лимфоидных клеток вызвать им-
мунный ответ: продукцию антител, появление клеток-эф-
фекторов тимического происхождения, формирование им-
мунологической памяти. Антитела или клетки, появляю-
щиеся в ходе иммунного ответа, специфически взаимо-
действуют с антигеном или химическими веществами
сходного строения. Последние могут не обладать свойст-
вом вызывать иммунный ответ. Такие вещества называ-
ют_гаптенами. При определенных условиях антигены
способны вызвать состояние специфической безответст-
венности — иммунологической толерантности (см. гл.
11).
Антигенами являются, как правило, чужеродные для
реципиента вещества, к которым принадлежат белки, по-
лисахариды, нуклеиновые кислоты и их комплексы. Из-
меняя путем химической модификации природные био-
полимеры, можно получить так называемые конъюгиро-
ванные антигены. Конъюгированные антигены могут
быть получены на основе белков, принадлежащих само-
му реципиенту. Аутологичные белки, денатурированные
физическими или химическими методами, также приоб-
ретают антигенные свойства.
Синтетические полипептиды как аналоги белковых
антигенов способны индуцировать иммунный ответ, но
при этом совсем не обязательно они должны быть подоб-
ны по первичной и пространственной структуре какому-
то определенному белку. Существенным для появления
у них антигенных свойств является формирование устой-
чивой пространственной структуры. По этой причине го-
мополимеры, т. е. полимеры, образованные тотько из од-
ной аминокислоты, антигенными свойствами не облада-
ют. Эти свойства появляются у полипептидов, в образо-
20
вании которых участвуют две аминокислоты и более
различного строения.
В классической иммунологии словом антиген обозна-
чают в том числе целые клетки бактериального или жи-
вотного происхождения. С химической точки зрения это
неверно, так как клетка состоит из большого числа бел-
ков, нуклеиновых кислот, полисахаридов. Каждый из
этих полимеров, полученный в очищенном виде, может
быть использован для индукции иммунного ответа, спе-
цифичного в отношении этого полимера. Рассматривая
очищенный биополимер как индивидуальный антиген,
любое сочетание последних в какой-либо надмолекуляр-
ной структуре, например клеточной мембране, следует
характеризовать как семейство индивидуальных антиге-
нов. Этот термин может быть использован и для обозна-
чения спонтанно агрегирующего (полимеризующегося)
индивидуального антигена. Так флагеллин — сократи-
тельный белок из жгутиков грамотрицательных бактерий
рода Salmonella может находиться в мономерной форме
(молекулярная масса 40000 дальтон1) и в полимеризо-
ванном виде. В обоих случаях этот индивидуальный ан-
тиген способен индуцировать образование антител, хотя
условия для этого различны: мономер флагеллина яв-
ляется тимусзависимым. а полимер — тимуснезависимым
антигеном.
Несомненно существует связь между молекулярной
массой биополимера и его антигенной активностью, но
такую связь можно установить, только сравнивая веще-
ства одного класса, например, различные белки с одно-
типной вторичной и третичной структурами: глобулярные
или фибриллярные. При соблюдении этих условий уда-
ется установить прямую зависимость между молекуляр-
ной массой и способностью биополимера индуцировать
образование антител. Эта закономерность не абсолютна
и зависит от ряда других свойств антигена, как биологи-
ческих, так и химических.
Выраженность антигенных свойств белков как наибо-
лее обширного и значимого класса антигенов зависит от
того, насколько удалены в эволюционном отношении до-
нор, от которого получен белок, и реципиент, которому
1 Согласно Международной системе СИ молекулярная масса из-
меряется в атомных единицах массы (а. е. м.); 1 а. е. м.« 1,66057 X
Х10“эт кг. В биохимии молекулярную массу макромолекул принято
выражать в дальтонах; 1 дальтон = 1 а. е. м. В дальнейшем изложе-
нии размерность молекулярной массы не указывается.
21
этот белок вводят в качестве антигена. Сравнительный
анализ будет корректен лцшь в том случае, когда для
сравнения используют однотипные белки. Так, если им-
мунизировать мышей альбумином из сыворотки челове-
ка и крысы, то на альбумин человека будет более выра-
женный ответ (большая продукция антител), чем на
альбумин кры?ы.
В том случае когда биополимер (или его синтетичес-
кий аналог) обладает высокой чувствительностью к рас-
щеплению, его антигенные свойства выражены в мень-
шей степени, чем у более устойчивого к ферментативному
гидролизу вещества. Так, при использовании в качестве
антигенов синтетических полипептидов или конъюгатов
белков с олигопептидами более выраженный ответ полу-
чают на полипептид, в состав которого входят неприрод-
ные D-аминокислоты.
Иммунный ответ в решающей степени зависит от ге-
нотипа реципиента. Эта проблема будет рассмотрена
ниже.
Участки молекулы биополимера,' его синтетического
аналога или конъюгированного антигена, распознавае-
мые антигенсвязывающими рецепторами В-лимфоцитов
и антителами, обозначают как детерминантные группы.
В молекуле антигена, как правило, содержится несколь-
ко различных по строению детерминантных групп, каж-
дая из которых может повторяться по нескольку раз.
Если в молекуле какого-либо вещества существует толь-
ко одна детерминантная группа определенного строения,
образования антител против этой детерминанты не прои-
зойдет. По мере увеличения в молекуле антигена числа
идентичных детерминантных групп (рпитопная плот-
ность) иммунный ответ на эту детерминанту^астет, но
до определенного предела, вслед за чем снижается и мо-
жет вовсе не наблюдаться. Это явление было изучено
при использовании конъюгированных антигенов с раз-
личным числом заместителей, выполняющих функцию де-
терминантной группы. Исчезновение иммунного ответа на
антигены с очень высокой эпитопной плотностью связано
с механизмом активации В-лимфоцитов и будет рассмат-
риваться в гл. 10.
2.1.	Конъюгированные антигены
Исследование этого класса антигенов
сыграло важную роль для понимания организации детер-
22
минантных групп природных антигенов, реальной оценки
информационной «емкости» иммунной системы в филоге-
незе и онтогенезе.
Ниже приведен пример синтеза конъюгированного ан-
тигена на основе реакции азосочетания диазобензолсуль-
фоновой кислоты с остатками тирозина в молекуле бел-
ка, например, бычьего сывороточного альбумина:
Сутьфанилов.’.я
кислош
2 н, о
Осчаюк шрснина
Диаюбен юл-
сульфоновая
кислота
Диаюбензолсульфоновая
кислота
кислота
При иммунизации кроликов таким конъюгатом обра-
зуется несколько видов антител, реагирующих как с бел-
ком, так и с остатком сульфаниловой кислоты. Наличие
антител к сульфанилату можно установить, синтезировав
тест-антиген и аналог детерминантной группы — гаптен.
Тест-антиген получают, конъюгировав с диазобензол-
сульфоновой кислотой другой тирозинсодержащий белок;
последний не должен иметь сходства антигенной струк-
туры с белком — носителем детерминантной группы, ис-
пользованным для иммунизации. В избранном нами
случае таким белком может быть яичный альбумин. Ес-
ли при добавлении тест-антигена к исследуемой антисы-
воротке образуется преципитат, существование антител
против сульфаниловой кислоты можно считать доказан-
ным Ч
1 Помимо реакции преципитации может быть использована лю-
бая другая реакция антиген-антитело: пассивная гемагглютинация,
связывание комплемента и др. (см. гл. 12).
23
Для точной оценки структуры детерминантной груп-
пы синтезируют гаптены. В рассматриваемом примере
гаптеном послужит конъюгат тирозина с сульфаниловой
кислотой. Такой гаптен не преципитирует антител, но,
соединяясь с ними, блокирует активные центры. В ре-
зультате антитела утратят способность взаимодейство-
вать с тест-антигеном. Реакция ингибирования — эффек-
тивный метод тестирования антител против простых по
химическому строению гаптенов.
Реакцию низкомолекулярного гаптена с антителами
можно оценить с помощью прямых реакций, среди кото-
рых наибольшее применение получил метод равновесно-
го диализа (см. гл. 12). Полученные в эксперименте дан-
ные позволяют рассчитать константу равновесия (Л) в
системе гаптен-антитело (см. гл. 4 и 12). Если опреде-
лять величины константы равновесия при реакции анти-
тел к определенному конъюгированному антигену с ря-
дом сходных по строению гаптенов, можно оценить
вклад каждого радикала в структуру детерминантной
группы. При этом удобно сопоставлять сродство к анти-
телу какого-то аналога детерминантной группы со срод-
ством наиболее близкого к ней по строению гаптена (ре-
ференс-гаптен). Таким способом получают относитель-
ную величину константы связывания (Лоти): Лотн =
= ЛХ/ЛР.Г, где Кх — константа связывания исследуемого
аналога, Лр.г — константа связывания референс-гаптена.
Ниже приведены величины ЛОтн для ряда нитрофе-
нильных производных, реагирующих с антителами кро-
лика против динитрофенилированного гемоцианина, т. е.
степень сродства антидинитрофенильных антител кролика
к различным гаптенам. Антиген получали, модифицируя
белок по е-аминогруппахМ лизина динитрофенилсульфоно-
вой кислотой. Поскольку е-динитрофениллизин наиболее
близок по строению детерминантной группе использован-
ного конъюгированного антигена, его использовали в ка-
честве референс-гаптена.
Из анализа приведенных ниже данных следует, что ан-
титела распознают как ДНФ-группу, так и аминокислот-
ный остаток, к которому эта группа присоединена. При
замене лизина на любую другую аминокислоту сродство
антител к гаптену резко снижается. Даже в случае Ис-
пользования в качестве гаптена е-динитрофениллизина, в
котором взят неприродный оптический изомер (D-лизин),
отчетливо заметно снижение константы связывания. Осо-
бенно низкая константа связывания найдена в случае
24
отсутствия в молекуле гаптена аминокислотного остатка
(динитрофенол). Практически не связываются с изучае-
мыми антителами мононитрофенильные производные
аминокислот. Данные, аналогичные описанным вы,ше,
были получены и для других антител к конъюгированным
антигенам.
Гаптен
е-ДНФ-Ь-лизин1................1,0
е-ДНФ-В-лизин.................0,52
а-ДНФ-Ь-аланин................0,39
а-ДНФ-Ь-фенилаланин...........0,13
а-ДНФ-аминокапроновая	кислота	.	1,2
у-ДНФ-аминомасляная кислота . .	1,0
ДНФ-глицин....................0,2
2,4-динитрофенол............0,01 1 2
1 ДНФ — динитрофенил.
2 Котн — рассчитано на основе приведенной в тексте формулы
с использованием в качестве референс-гаптена е-ДНФ-Ь-лизина.
В 20—40-е годы было синтезировано большое число
самых разнообразных антигенов, представляющих собой
белки, конъюгированные с разнообразными ароматичес-
кими соединениями, гетероциклами, включая пуриновые
и пиримидиновые основания, аминокислотами и олиго-
пепти,дами,-моно- и олигосахаридами, органическими кис-
лотами, стероидами. Все перечисленные вещества в со-
ставе антигена способны индуцировать образование вза-
имодействующих с ними антител. Обширный фактиче-
ский материал, в накоплении которого особенно значи-
телен вклад К- Ландштейнера и его сотрудников, открыл
исключительные возможности для понимания принципов
распознавания антигенных детерминант антителами.
Необходимость стерического соответствия антиген-
ной детерминанты и активного центра — антидетерми-
нанты — антитела со всей очевидностью вытекает, в
частности, из того факта, что антитела, направленные к
орто-, мета- и пара-аминобензойным кислотам, практи-
чески не реагируют перекрестно. Антитела также отчет-
ливо различают право- и левовращающие изомеры вин-
нокаменной кислоты. Менее очевидным является факт
строгой специфичности распознавания антителами
р-аминобензойной и р-аминофенилсульфоновой кислот:
25
соон
SC -II
/-Аминобетойная	р - Аминосульфоновая
кислота	кислота
Оба ароматических соединения имеют в пара-положе-
нии отрицательно заряженный заместитель. Заместители
отличаются степенью своей нуклеофильности, которая у
сульфогруппы ощутимо выше, чем у карбоксильной груп-
пы, что приводит к более выраженному смещению обла-
ка л-электронов ароматического кольца в направлении
заместителя, представленного сульфогруппой в сравне-
нии с карбоксильной группой. Это обстоятельство и раз-
личия в размере замещающей группы достаточны, оче-
видно, для того, чтобы каждое соединение реагировало
только с направленным к нему антителом.
Вопрос о размере детерминантной группы конъюги-
рованного антигена, вкладе в ее специфичность различ-
ных радикалов был изящно проанализирован II. Шехте-
ром (I. Schechter, 1970). В качестве антигена использо-
вали конъюгаты белка с олиго-О-аланином (пептиды
присоединяли к белку через свободную карбоксильную
группу). Реакцию между антителами к поли-Б-аланину
и тест-антигеном ингибировали с помощью различных по
размеру олигопептидов из D- и L-аланина. Как оказа-
лось, ингибирующий эффект гаптенов нарастал от ди- к
тетра-Б-аланину. Дальнейшее увеличение длины пепти-
да не усиливало его ингибирующих свойств. Тетра-Ь-ала-
нин был совершенно не активен как ингибитор. Эти дан-
ные означают, во-первых, что антитела четко различают
олигопептиды из право- и левовращающих аминокислот,
не имеющие регулярной вторичной структуры. Во-вто-
рых, очевидно, что активный центр антитела соответству-
ет по размеру тетрапептиду.
Дальнейшие опыты показали, что вклад каждого ос-
татка аланина в связывание тетрапептида антителом да-
леко не одинаков. Были синтезированы аналоги гаптена,
в которых один из остатков аланина заменяли на глицин
(табл. 1). В случае замены N-концевого аланина на гли-
цин константа связывания такого гаптена по сравнению
с тетрааланином уменьшалась в 100 раз. Напротив, за-
26
Таблица 1. Исследование специфичности антител к поли-Ь-алани-
ну с помощью тетрапептидов различного строения
Пептиды	Концентрация для 50% ингибирования, ммоль	A2F’, кДжХмоль— 1
Ala Ala Ala Ala	0,09	- -
Ala Ala Ala Gly	0,09	0
Ala Ala Gly Ala	0,18	1,76
Ala Gly Ala Ala	0,70	5,25
Gly Ala Ala Ala	2,9	8,82
> AF — см. раздел 4.3.
мена С-концевого аналина на глицин почти не сказыва-
лась на величине константы связывания. Поскольку пеп-
тиды присоединяли к белку-носителю через С-концевую
группу, можно заключить, что решающий вклад в свя-
зывание гаптена антителом вносит наиболее удаленный
от молекулы белка-носителя участок присоединенного к
ней пептида: в рассматриваемом случае метильная груп-
па N-концевого аланина. Такая группа в молекуле гап-
тена получила название иммунодоминантной.
Конъюгированные антигены оказались весьма полез-
ными для изучения многих ключевых проблем клеточной
иммунологии, вопросов регуляции иммунного ответа.
Применение конъюгированных антигенов для решения
указанных задач мы рассмотрим в соответствующих раз-
делах.
2.2.	Белки и синтетические
полипептиды
Изучение антигенной структуры белков
осуществляют с помощью нескольких методов: 1) иссле-
дованием продуктов ограниченного протеолиза, 2) хими-
ческой модификацией различных боковых аминокислот-
ных остатков с последующим анализом антигенного
строения образующегося продукта, 3) разрушением при-
сущей данному белку вторичной и третичной структуры.
Каждый из перечисленных методов имеет свои ограниче-
ния, в силу чего достаточно полная информация о строе-
нии детерминантных групп белков может быть получена
лищь при сочетании ряда методов.
При расщеплении мономера флагеллина (молекуляр-
ная масса 40 000) по остаткам метионина с помощью
бромциана образуются 4 фрагмента, размер которых
27
приведен на рис. 5. Фрагмент Л, составляющий менее по-
ловины молекулы, имеет в своем составе все антигенные
детерминанты этого белка (вероятно, три), так как пол-
ностью ингибирует реакцию антител против нативного
флагеллина с нерасщепленным флагеллином. Существен-
но, что указанный фрагмент в отличие от остальной час-
ти молекулы содержит относительно резистентные к дей-
8	Д	3 С
Н2 N I----------1------------1—---1-----1СООН
Рис. 5. Фрагменты, образующиеся при расщеплении флагеллина
бромцианом
ствию пепсина и трипсина участки полипептидной цепи.
Это согласуется с заключением, согласно которому ре-
зистентность к ферментативному гидролизу служит фак-
тором, благоприятствующим проявлению антигенных
свойств биополимера.
У глобулярных белков с большим содержанием
а-спиральных участков антигенные детерминанты распо-
лагаются в местах изгиба скрученной в спираль цепи.
Так, в миоглобине кашалота (sperm whale myoglobin)
детерминанты располагаются между остатками 15—29,
56—69, 70—76, 77—89, а также в С-концевой части мо-
лекулы (рис. 6). Эти данные были получены при анализе
продуктов гидролиза миоглобина трипсином и химотрип-
сином.
Как и в молекуле миоглобине, у стафилококковой нук-
леазы антигенные детерминанты расположены на поверх-
ности молекулы преимущественно в тех участках, где
между спирализованными отрезками пептидной цепи на-
ходятся неспиралпзованные участки.
При антигенном анализе продуктов протеолиза бел-
ков желательно использовать антисыворотки от несколь-
ких животных, полученные в различные сроки после им-
мунизации. Так, в случае изучения антигенной структу-
ры белка вируса табачной мозаики было установлено,
что индивидуальные антисыворотки кроликов реагируют,
как правило, с С-концевым декапептидом, но часть анти-
сывороток соде'ржит антитела против N-концевого дека-
пептида. Антитела к С-концевому декапептиду от неко-
торых кроликов взаимодействуют с пептидом, от которо-
го отщеплен С-концевой аргинин, в то время как антите-
ла от других кроликов распознают детерминанту только
28
при наличии С-концевого аргинина. Для наглядности
приводим структуру указанного пептида:
H2N—Thr—Thr—Ala—Al a —Glu—Leu—Asp—Ala—Thr—Arg—COOH
Полученные в ранние сроки после иммунизации анти-
тела кролика против растворимого коллагена из кожи
крыс реагируют с детерминантами в С-концевой части
молекулы, а «поздние» антитела взаимодействуют также
с N-концевым участком.
При иммунизации кроликов лизоцимом из яиц кур
антитела появляются впервые через 10 дней. Но только
через 2—3 месяца накапливаются определимые их коли-
чества, реагирующие с пептидами, которые включают ос-
татки с 1 по 20 и с 60 по 83, поперечно связанные ди-
сульфидной связью с остатками 123—129.
29
Закономерен вопрос, нельзя ли избежать отмеченных
выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от
традиционной техники получения антител в результате
иммунизации и оперируя вместо этого моноклональными
антителами, полученными с помощью гибридомной тех-
ники (см. гл. 12). Очевидно, что для детального анализа
антигенной структуры, например белков, необходимо ис-
пользование большого числа индивидуальных клонов.
Чтобы учесть генетические особенности иммунного отве-
та индивидуальных реципиентов, придется производить
слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток
от генетически неидентичных особей, отбор которых мо-
жет быть ли,шь случайным. Тем самым степень неопреде-
ленности задачи не уменьшится.
Продолжив рассмотрение вопроса о строении детер-
минантных групп белков, проанализируем один из широ-
ко применявшихся для этих целей методов, связанных с
химической модификацией боковых аминокислотных ос-
татков в глобулярных белках. Такое воздействие оказы-
вает влияние на их антигенные свойства. В результате
модификации изменяется, как правило, конформация мо-
лекулы. Так, модификация с помощью ангидрида янтар-
ной кислоты (сукцинилирование) 32 и 57 аминогрупп в
мс яекуле бычьего сывороточного альбумина уменьшает
способность белка взаимодействовать с антителами на 8
и 65% соответственно. Измерение при этом объема моле-
кулы модифицированного альбумина, оцененное по вели-
чине стоксовского радиуса, показало, что в первом слу-
чае он возрастает на 27%, а во втором—уже на 78%.
Следовательно, увеличение степени гидратации модифи-
цированного белка за счет роста его отрицательного за-
ряда при определенной степени модификации несомнен-
но связано со значительным изменением нативной кон-
формации. Последнее выражается и в разрушении детер-
минантных групп. То, что это заключение справедливо и
инактивация белка как антигена в описанном выше при-
мере не обусловлена лишь замещением аминогрупп, под-
тверждается данными, полученными при антигенном ана-
лизе бычьего сывороточного альбумина, в молекуле ко-
торого было амидинировано 58 аминогрупп. При таком
способе модификации заряд белковой молекулы не изме-
няется. Не изменяется при этом и стоксовский радиус.
Антигенная структура модифицированного таким спосо-
бом белка также практически полностью сохраняется.
30
Убедительные свидетельства существования как в
глобулярных, так и в фибриллярных белках антигенных
детерминант, структура которых зависит от пространст-
венной конформации молекулы (эти детерминанты назы-
ваются конформационными или конформационнозависи-
мыми), были получены при сравнении антигенных свойств
нативных и денатурированных белков.
В случае восстановления внутрицепьевых дисульфид-
ных связей в молекуле рибонуклеазы в присутствии кон-
центрированной мочевины такой белок утрачивает, по
данным физических методов исследования, нативную
конформацию. Одновременно происходит разрушение
его антигенных детерминант, поскольку денатурирован-
ный белок не реагирует с антителами против нативного
белка. Однако восстановление двух из четырех дисуль-
фидных связей в молекуле рибонуклеазы, выполненное в
отсутствие денатурирующих агентов, не сказывается на
антигенных свойствах фермента. Аналогичные данные
были получены при изучении пепсина, папаина, иммуно-
глобулина G. Следовательно, сама по себе дисульфидная
связь не определяет структуры антигенных детерминант,
если при ее разрыве не разрушают стабилизирующих
вторичную и третичную структуру нековалентных свя-
зей.
Не только третичная, но и четвертичная структура
белков определяет их антигенное строение (по крайней
мере структуру некоторых антигенных детерминант).
Детерминанты, в образовании которых участвуют две
или три полипептидные цепи, в том числе цепи различно-
го строения, найдены, в частности, в молекуле гемогло-
бина, коллагена, иммуноглобулина G. При диссоциации
молекулы белка на изолированные цепи такие детерми-
нанты разрушаются. В случае спонтанной рекомбинации
пептидных цепей с восстановлением активной конформа-
ции восстанавливается также структура антигенных де-
терминант, в образовании которых участвуют две или
'более цепей.
Даже незначительные изменения конформации белка
способны повлечь за собой ощутимые изменения его ан-
тигенной структуры. Так, удаление гема из молекулы
метмиоглобина (обработкой на холоду подкисленным
ацетоном) приводит к появлению свободного от гема
белка — апомиоглобина. Последний отличается от на-
тивного белка уменьшением содержания а-спиральных
участков с 56—64 до 42—49%. Одновременно происхо-
31
дит небольшое набухание молекулы, увеличение ее асим-
метрии. Увеличивается чувствительность белка к протео-
лизу, доступность для модификации остатков тирозина и
гистидина. Эти и другие данные указывают на меньшую
конформационную устойчивость апомиоглобина по срав-
нению с метмиоглобином. Антитела к метмиоглобину
имеют низкую степень сродства к апомиоглобину. Если
путем добавления гема к апомиоглобину реконструиро-
вать молекулу метмиоглобина, восстанавливается также
и его антигенная структура.
Вообще спонтанное восстановление конформации де-
натурированного белка ведет к восстановлению его ан-
тигенной структуры. Это продемонстрировано на совер-
шенно различных по степени сложности структурной ор-
ганизации белках, в том числе на таких, как рибонук-
леаза и иммуноглобулин G. Тем самым антигенный ана-
лиз может служить одним из надежных методов оценки
степени ренатурации белка.
Особо следует рассмотреть вопрос о специфичности
антител, образующихся при иммунизации денатуриро-
ванными белками. Они взаимодействуют только с дена-
турированным белком, причем антитела к одному из де-
натурированных белков взаимодействуют с другим дена-
турированным белком. Это наблюдается и в том случае,
когда изучаемые белки в нативном виде не имеют анти-
генного родства. Здесь надо иметь в виду, что, утратив
определенную конформацию вследствие денатурации, бе-
лок приобретает некоторую другую конформацию, чаще
всего хаотического клубка (random coil), которая допус-
кает возникновение у разных белков статистически ве-
роятных пространственных структур, мало зависящих от
их первичной структуры. Скорее всего именно благода-
ря этим структурам возникает антигенное родство раз-
личных денатурированных белков.
Как отмечалось в предыдущем разделе, конъюгиро-
ванные антигены, имеющие в качестве детерминантных
групп пептиды, например пептиды из D-аланина, инду-
цируют образование антител, реагирующих с тетра- и
даже триаланином. Подобные пептиды не имеют устой-
чивой конформации. Следовательно, антитела в этом
случае распознают лишь определенную аминокислотную
последовательность. Такого типа детерминанты, полу-
чившие название секвенциальных, по-видимому, крайне
редко встречаются в глобулярных белках. Даже короткие
отрезки пептидных цепей глобулярных белков, с которыми
32
реагируют антитела, например, С-концевой гептапептид
миоглобина, имеют определенную пространственную кон-
формацию. Однако в фибриллярных белках есть участки
пептидных цепей, лишенные вторичной структуры. Так,
большая часть кроличьих антител против гетерологично-
го коллагена направлена против коротких неспиральных
N-концевых участков цепей. Эти антитела реагируют так-
же с \-концевыми участками полипептидных цепей дена-
турированного растворимого коллагена.
Одним из основных доказательств принадлежности
антигенной детерминанты белка к секвенциальному типу
служит наличие иммунодоминантной группы в виде кон-
цевого аминокислотного остатка. Иммунизируя кролика
Fab-фрагментом аутологичного иммуноглобулина G
(см. гл. 3), можно получить антитела, реагирующие
только с этим фрагментом, но не с целой молекулой им-
муноглобулина. Антитела практически полностью утра-
чивают способность реагировать с фрагментом после об-
работки последнего карбоксипептидазой (Л. Бартова,
Г. Д!аргулис, 1985). В использованных для протеолиза
условиях от одной из пептидных цепей Fab-фрагмента
отщепляется только С-концевой лейцин. Последний слу-
жит иммунодоминантной группой детерминанты секвен-
циального типа, находящейся в С-концевой части фраг-
мента.
Важным подтверждением существования антител про-
тив конформационных и секвенциальных детерминант
послужили эксперименты с синтетическими полипепти-
дами, выполненные в лаборатории М. Села (М. Sela,
1968). Были использованы два типа пептидов, каждый
из которых имел в своем составе трипептид: Туг — Ala —
Glu (TAG). Один пептид обладал разветвленной струк-
турой, будучи образован сополимером аланина и лизина
(—A—L—), к е-аминогруппам которого апериодически
были присоединены указанные трипептиды —TAG. Вто-
рой пептид представлял собой периодический полимер в
форме а-спирали с формулой (TAG) п. Как видно из рис. 7,
при различной структуре оба полипептида имели в
своем составе блоки TAG; они характеризовались сход-
ными молекулярными массами.'
Каждый из полипептидов был использован в качестве
антигена для иммунизации кроликов. Полученные анти-
тела не реагировали перекрестно со сравниваемыми по-
лимерами. Трипептид—TAG блокировал реакцию меж-
2—1258
33
ду разветвленным полимером (TAG)—А—L— и антите-
лами к нему, но не влиял на реакцию (TAG)n с направ-
ленными к нему антителами. В качестве гаптенов —
аналогов (TAG)„ — синтезировали олигопептиды с раз-
личным числом регулярно повторяющихся блоков TAG.
Выраженной способностью связываться с антителами
против (TAG)n обладал пептид из 9 блоков,т.е. (TAG)g.
Рис. 7. Разветвленный полипептид
аланина и лизина и периодический
Glu)n
на основе поли-D, L-
полимер (Туг — Ala —
Такой петид еще не формирует устойчивой а-спирали. Но
согласно данным, полученным методом циркулярного
дихроизма, взаимодействие (TAG)g с антителами ведет
к его спирализации. Следовательно, антитела способны
оказать конформирующее влияние на гаптен (оно было
особенно выражено в случае пептида (TAG) 13).
Совокупность данных о строении ряда белков, лока-
лизации в их молекулах детерминантных групп, общих
представлений об организации антигенных детерминант
белков позволили синтезировать пептиды, соответствую-
щие детерминантным группам природных белков. Эти
пептиды либо индуцировали образование антител, реаги-
рующих с нативным белком, либо реагировали с антите-
лами к нативному белку. Так, периодический полимер из
трипептидов: Pro — Gly — Pro, формировавший харак-
терную для коллагена тройную спираль, индуцировал
образование антител, реагировавших с коллагеном, вы-
деленным от рыб, крысы и морской свинки. На твердо-
34
фазном носителе был синтезирован пептид, воспроизво-
дящий последовательность с 64-го по 82-й остатки лизо-
цима из куриного яйца (рис. 8). Полуцистиновые остат-
ки в позициях 64 и 80 были замкнуты в дисульфидную
Ш////////Л — Дисульфидная связь
Рис. 8. Структура молекулы лизоцима куриного яйца. Окруж-
ностью отмечена петля полипептидной цепи, стабилизирован-
ная внутрицепьевой дисульфидной связью (loop peptide)
связь, после чего образовавшуюся петлю (loop peptide)
присоединяли к носителю в виде линейного полимера:
поли-ПЕ-А1а-поли-Ь-Еу5. В • результате иммунизации
таким антигеном были получены антитела, реагировав-
шие с нативным лизоцимом, а в пределах его молекулы
именно с тем участком, который соответствовал синтези-
рованной петле. В свою очередь антитела к нативному
лизоциму реагировали с синтезированным пептидом
(рис. 9). Восстановление внутрицепьевой дисульфидной
2*
35
связи, превращавшей синтезированный пептид в петлю,
так изменяло его конформацию, что он утрачивал спо-
собность реагировать не только с антителами против на-
тивного лизоцима, но и с антителами, полученными про-
тив того же пептида, но в виде петли. Следовательно,
Рис. 9. Структура петли (loop peptide)
молекулы лизоцима
пептид в форме петли представляет собой типичную кон-
формационную детерминанту.
Оцепить размер конформационной детерминанты до-
статочно сложно. Ее могут образовывать аминокислот-
ные остатки, удаленные друг от друга в первичной струк-
туре. но сближенные в пространстве после образования
третичной структуры. Так, замена двух аминокислотных
остатков (позиции 153 и 191) в молекуле легкой (х) це-
пи иммуноглобулина G человека сопровождается измене-
нием структуры только одной антигенной детерминан-
ты. Указанные остатки находятся в двух различных пет-
лях пептидной цепи, однако они сближены в пространст-
ве таким способом, что контактируют между собой. Из
рассматриваемого примера следует, что у конформацион-
ной детерминанты есть остов, или каркас, который стаби-
лизирует в пространстве расположенные на поверхности
молекулы боковые аминокислотные остатки, определяю-
щие специфичность детерминанты.
Определить размер детерминант секвенциального ти-
па значительно проще, используя, например, технику
ингибирования реакции между исследуемым антигеном и
антителами к нему с помощью различных по размеру
36
Таблица 2. Размер секвенциальных детерминант
Антиген	Детерминанта	Размер активного центра, нм3
Полиаланин-БСА 1	Тетрааланин	2.5X1,1X0,65
Полилизин-БСА1	Пентализин	2,7 X 1,7X0,65
Полиглутаминовая кислота-БСА 1	Гексаглутаминовая кислота	3,6X1,ОХ 0,6
Сополимер: Glu5SLys48Tyr6	Пентадиамин	—
Декстран	Изомальтогексаоза	3,4Х1,2ХО,7
Денатурированная ДНК	Пентануклеотид	2,8X1,ОХ 1,0
1 БСА — сывороточный альбумин быка, использованный в качестве белка
носителя.
пептидов. Обращает на себя внимание тот факт, что у
самых различных соединений размер секвенциальных
детерминант незначительно отличается друг от друга
(табл. 2). В таблице указаны приближенные размеры
активных центров антител, рассчитанные на основе моле-
кулярных параметров детерминанты.
2.3.	Нуклеиновые кислоты
и синтетические полинуклеотиды
С целью получения антител к нуклеи-
новым кислотам для иммунизации используют нуклео-
протеины пли очищенные нуклеиновые кислоты, кова-
лентно связанные с белком-носителем или адсорбирован-
ные на метилированном сывороточном альбумине. Таким
путем можно получить антитела, реагирующие с двуспи-
ральной РНК, денатурированной или одноцепочечной
ДНК, но не двуспиральной ДНК. Несмотря на это можно
получить антитела, реагирующие с синтетическими дву-
спиральными дезоксирибонуклеотидами. Так, полидезо-
ксигуанил-дезоксицитидиловая кислота (поли-dGdC),
комплексировавная с белком, индуцирует образование
антител, реагирующих с полп-dGdC. В то же время не-
возможно получить антитела против поли-dAdT (полп-
дезоксиаденил-дезокситимидиловая кислота), используя
этот дезоксирибонуклеотид в качестве детерминантной
группы конъюгированного антигена.
Ранее считали, что нуклеиновые кислоты способны
быть только гаптенами и антитела к ним можно получить
37
лишь после комплексирования с белком. Однако позднее
было показано, что некоторые синтетические полинуклео-
тиды способны индуцировать образование антител сами
по себе. Так, морские свинки отвечают образованием ан-
тител в ответ на введение полиинозпловой и полицити-
диловой кислоты (поли-1-поли-С) и полиадениловой и
полиуридиловой кислот (поли-А-поли-U). У мышей раз-
личных ппбредных линий можно индуцировать продук-
цию антител IgG-класса против поли-1-поли-С. Если вво-
дить указанный двуспиральный полинуклеотид с адъю-
вантом (см. гл. 11), происходит также образование
антител. Более вероятно получить IgG-аититела против
синтетических полинуклеотидов, используя для иммуни-
зации их конъюгаты с белком.
Иммунный ответ па полп-1-поли-С тпмуснезависим:
неонатальная (в момент рождения) тимэктомия не подав-
ляет ответ на этот полинуклеотид. Более того, при любом
способе элиминации у мышей клеток тимуса их иммун-
ный ответ па полп-1-поли-С даже усиливается.
Здесь мы сталкиваемся с важным иммунологическим
явлением: обусловленным Т-супрессорами подавлением
иммунного ответа. Изучение причин низкой иммунореак-
тивности в отношении нуклеиновых кислот и их синтети-
ческих аналогов и практически полного отсутствия в
норме ответа против нативной ДНК выявило большое
число присутствующих в норме Т-супрессоров, специфи-
чески подавляющих ответ против нуклеиновых кислот.
Объяснить этот феномен удалось, изучая иммунологиче-
ский статус мышей со спонтанно возникающим аутоим-
мунным процессом: новозеландских черных мышей
(XZB), гибридов первого поколения (Fi) этих мышей с
новозеландскими белыми мышами (NZW) и мышей ли-
ний MRL и BxSB.
Новозеландские мыши клинически нормальны в тече-
ние первых трех месяцев жизни. Позднее у них возника-
ют нарушения в процессе созревания Т-лимфоцитов — в
отличие от более молодых особей той же линии у них
крайне ослаблены реакции трансплантационного иммуни-
тета, практически полностью подавлена продукция гормо-
нов тимуса. В этот период спонтанно появляются антите-
ла против клеток тимуса, убивающие их в присутствии
комплемента. Следствием всех этих процессов является
дефицит рециркх пирующих Т-лимфоцитов.
На фоне дефицита Т-клеток у мышей XZB, NZW,
MRE и BxSB появляются антитела против ДНК и РНК.
38
Появление антител против двуспиральной ДНК может
быть связано с вирусной инфекцией. Они имеют наиболь-
шее сродство к РНК вирусного происхождения, мень-
шее— к поли-1-поли-С и еще меньшее — к рибосомаль-
ным и транспортным РНК. Появление антител к натив-
ной ДНК может быть результатом неспецифической акти-
вации всех без исключения клонов В-лпмфоцитов (так
называемая поликлональная активация). Этот процесс
обусловлен действием на В-лимфоциты неспецифическпх
стимуляторов их митогенеза, ио реализуется он лишь по-
тому, что происходит резкое уменьшение числа Т-супрес-
соров.
Процесс, сходный с таковым у мышей, наблюдается
при одном из тяжелых аутоиммунных заболеваний че-
ловека— системной красной волчанке (systemic lupus
erythematosis) (см. гл. 11). У этих больных в сыворот-
ке присутствуют антитела против РНК и нативной ДНК,
причем содержание антител коррелирует с тяжестью за-
болевания.
Экспансия клона клеток, прекоммитированных к син-
тезу антител против ДНК, может возникать при опухоле-
вом процессе у человека — так называемой множествен-
ной миеломе. Клетки аналогичной опухоли мышей (плаз-
мацитома) продуцируют иммуноглобулины, специфичес-
ки взаимодействующие как антитела с рядом пуриновых
и пиримидиновых оснований.
2.4.	Полисахариды
Полисахариды составляют большую и
важную в биологическом отношении группу антигенов.
Они входят в состав капсулы и клеточной стенки микро-
бов, определяя их антигенную специфичность. Выражен-
ными антигенными свойствами обладают полисахариды
растительного происхождения. Будучи составной частью
цитоплазматической мембраны клеток животного проис-
хождения, полисахариды играют важную роль в форми-
ровании их антигенной структуры. В меньшей степени
изучены антигенные свойства углеводных компонентов
растворимых глобулярных белков.
Большинство полисахаридов микробного происхожде-
ния устойчиво к гидролизу ферментами млекопитающих,
что, как уже упоминалось, служит важным фактором
реализации антигенных свойств биополимеров.
39
Иммунохимия полисахаридов может быть детально
рассмотрена на примере полисахаридов, входящих в со-
став стенки грамотрицательпых бактерий. Они являются
составной частью липополисахаридного комплекса
(ЛПС), который, в свою очередь, образует комплекс с
белками и фосфолипидами кефалинового типа. ЛИС
представляет собой соматический антиген, в силу чего
на основе особенностей его строения осуществляется
EthN
bthN	(р)
GIcNAc Gal	©	KDO
III	I
Gk—Gal—Glc—Hep — Hep — KDO— KDO—Липид A
Многократно
повторяющийся
трисакарид
-♦Внешний кор-
Скетет—► (встроен
во внешнюю
Внутренний кор---клеточную
мембрану)
R-антигсн
Полный О-антиген
Полный ЛИС -♦—---------------
Рис. 10. Строение липополисахарида (ЛПС) из грамотрицатель-
ных бактерий кишечной группы:
Glc — глюкоза. Gal — галактоза, Нер — гептозы, KDO — 2-кетодндезоксиок-
танат, GIcNAc—N-ацетилглюкозамин, EthN—этапотамин
иммунологическая (или серологическая) классификация
грамотрицательных бактерий. Значительный вклад в
пммунохимическое изучение ЛПС внес в 60—70-е годы
О. Вестфаль с сотрудниками (О. Westphal).
ЛПС подразделяют на три района. Район I — так на-
зываемый О-специфический полисахарид, образован
многократно повторяющимися единицами, образованны-
ми трпсахаридами. Он отличается большой вариабельно-
стью— разнообразные сахара могут находиться в различ-
ных комбинациях и соединяться разными типами глико-
зидных связей. Район II образован олигосахаридом,
общим для ЛПС всех бактерий рода Salmonella, что оп-
ределило его название: основной кор (basal core). Район
III — липид А, гликолипид, содержащий глюкозамин,
жирные кислоты и фосфаты. Общая схема строения ЛПС
представ лена на рис. 10.
Несколько описанных выше единиц ЛПС, как прави-
ло три, образуют одну большую структурную единицу в
40
стенке бактерий. Молекулы ЛПС объединены фосфо-
эфирными связями посредством липида А.
ЛПС получают фенольной экстракцией бактериаль-
ной массы. В результате обработки ЛПС горячей уксус-
ной кислотой удаляют липид А, хотя при этом происхо-
дит частичная деградация полисахарида. Последний
получил название полисахарида Фримана.
Качественные особенности углеводного компонента
ЛПС называют хемотипом. Изучение свыше 150 штам-
мов Salmonella и Escherichia coll позволило охаракте-
ризовать несколько десятков хемотипов. Они образуются
за счет различных комбинаций 3,6-дпдезоксигексоз (ти-
велоза, паратоза, абеквоза, колитоза), 6-дезоксигексоз
(рамноза, фукоза), гексоз (глюкоза, галактоза, манноза
в форме а- или ^-пиранозида), дезоксипентозы (2-дезок-
си D-рибоза в фуранозной форме), гексозампнов (глю-
козамип и галактозамин).
На рис. 11 представлены повторяющиеся единицы
некоторых полисахаридов сальмонелл. На основную цепь
«навешены» боковые цепи. Структура цепей установлена
путем сравнительного химического изучения различных
мутантов. При сочетании такого исследования с антиген-
ным анализом удается охарактеризовать иммунодоми-
нантные группы, или О-факторы. Их роль выполняют
концевые сахара боковых цепей. Что касается структу-
ры всей детерминантной группы, то в ее образовании
помимо боковой цепи участвует сахар из основной цепи,
к которому присоединена боковая цепь. Таким образом,
имеется известное сходство в строении детерминант раз-
ветвленных полисахаридов и конъюгированных антиге-
нов па основе модифицированных белков (см. разд. 2.1).
Природа иммунодоминантных групп у некоторых под-
групп сальмонелл представлена на рис. 12.
Большое значение в иммунологических исследова-
ниях приобрели капсульные полисахариды пневмококков.
Как и другие капсульные полисахариды, они содержат
большое количество уроновых кислот. На основании осо-
бенностей антигенных свойств капсульных полисахаридов
идентифицировано свыше 70-типов пневмококков.
В полисахаридах пневмококков весьма велико разно-
образие аминосахаров, находящихся в форме N-ацетиль-
иых производных. Пз нейтральных сахаров встречаются
только три, причем наиболее часто L-рамноза. Очень ши-
роко используемый в иммунологических исследованиях
41
пневмококковый полисахарид SIII имеет следующую ре-
гулярно повторяющуюся единицу:
3 Глюкуроновая	1,4 Глюкоза 1
---—г кислота-----------*	-*•
₽
Многократно повторяясь, такие структуры образуют нел-
лобиуроиовую кислоту, минимальная молекулярная мас-
Рис. 11. Основные структурные элементы О-антигенов саль-
монелл различных подгрупп:
Abe — абеквоза, Man — манноза, Glc — глюкоза, Gal — галактоза,
Туv — тивелоза, Rha — рафиноза
са которой приблизительно равна 60 000. Антитела про-
тив SIII распознают указанную выше структурную едини-
цу полисахарида, о чем свидетельствует, в частности, тот
факт, что частично окисленный хлопок, содержащий цел-
лобиуроновую кислоту, реагирует с антителами против
SIII.
Большое значение для выяснения структуры детерми-
наитиых групп полисахаридов имело изучение декстра-
42
нов. Это экзополпсахариды, продуцируемые некоторыми
грамположительными бактериями (Leuconostoc mesen-
troides, Leuconostoc dextranicuni, Streptococcus viridans)
Подгруппа D
Подгруппа P
Подгруппа С2
Рис. 12. Концевые моносахариды, выполняющие функцию иммунодо-
минантных групп О-антигенов у некоторых видов грамотрицательных
бактерий
лярной массой, превышающей 106. В основном скелете
связь преимущественно а=1,6, а в боковых цепях —
(/—1,2, а—1,3 и а=1,4. Весьма значимые для иммунохи-
мии работы по изучению декстрана были выполнены
Э. Кэботом (Е. Kabat, 1959), использовавшим, в частно-
сти, в качестве источника антител против декстрана соб-
ственную сыворотку. Оценивая реакцию с антидекстра-
новыми антителами различных по длине цепи олигоса-
харидов, удалось установить размер детерминантной
43
группы декстрана. Максимальной связывающей способ-
ностью обладали гекса- и гептасахарпды. Опыты выпол-
няли с олигосахаридами, имеющими а=1,6 или а=1,4
связи (как и в боковых цепях декстрана). Последние
оказались менее активными, исходя из чег*о можно заклю-
чить, что у декстрана иммуподомппантным служит кон-
цевой «-связанный глюкозидный остаток.
В других опытах декстран фиксировали па нераство-
римой основе и на полученном сорбенте специфически
связывали антитела. Для их элюции использовали раз-
личные по длине цепи олигосахариды. Были элюированы
две фракции антител: первая — комплементарная изо-
мальтотриозе, и вторая — изомальтогексаозе. Изомаль-
тогексаоза эффективно ингибировала реакцию обеих
фракций антител с декстраном. Следовательно, антитела
неоднородны по размеру активных центров.
Олигосахариды различного размера конъюгировали
с белком 1 и иммунизировали полученными конъюгатами
кроликов. Антитела против производных а-мальтозы
реагировали с а-1,6 декстраном, а антитела против про-
изводных «-глюкозы— нет. Это означает, что антитела
к декстрану направлены к детерминантам, образованным
несколькими глюкозидными остатками.
Один из эффективных методов изучения детерминант-
пых групп полисахаридов состоит в анализе перекрестно
реагирующих полисахаридов. В случае реакции с антите-
лами пневмококковых полисахаридов — SIII и SVIII эф-
фективными ингибиторами служат гекса- и октасахариды
соответственно. При перекрестном анализе реакцию уда-
ва. ось заблокировать тетра- и даже дисахаридом целло-
бнуроновой кислоты. Поэтому дисахарид можно рассмат-
ривать как общую для обоих полисахаридов иммунодо-
минаптпую группу. Другим примером может служить пе-
рекрестная реакция стрептококка группы А с антителами
против стрептококка группы L и наоборот. Иммунодоми-
1 Это можно осуществить, в частности, путем реакции азосоче-
тания диазотированного производного — аминофенилфлавазола с лю-
бым олигосахаридом (R):
R
т - А м и нофенилф. тана зол
44
пантной группой, общей для обоих полисахаридов детер-
минанты, служит N-ацетилглюкозамин.
Бактериальные полисахариды с регулярно повторяю-
щимися струюЬурными единицами принадлежат к числу
тимуснезависимкх антигенов. Их способность индуциро-
вать образование^антител прямо зависит от степени поли-
меризации. Так, чистый О-полпсахарид грамотрицатель-
ных бактерии имеет молекулярную массу, приблизительно
равную 10 000—20 00(1 и не способен индуцировать синтез
антител. В то же вре\1я высокополимериый ЛПС или
тот же полисахарид, входящий в состав полного О-анти-
гена (О-антиген помимо^цолисахарида содержит липид
А и белок), обладает выраженными антигенными свой-
ствами. Как ЛПС, так и полный О-антиген склонны к
агрегации и образуют мицеллы с молекулярной массой
в несколько миллионов (в присутствии бивалентных ка-
тионов). Иммунный ответ на ЛПС прямо зависит от сте-
пени агрегации.
Крайне важным при индукции биосинтеза антител на
полисахариды является правильный выбор дозы антиге-
на. Классические опыты, иллюстрирующие зависимость
реакции организма от дозы полисахарида, выполнены на
мышах, которым вводили пневмококковый полисахарид
SIII (L. Felton et al., 1942).
Очень низкая доза SIII (0,5—1,0 мкг) защищает мы-
шей от последующего инфицирования пневмококком.
Большая доза (500 мкг) вызывает специфический имму-
нологический паралич и полностью исключает возмож-
ность защиты мышей от инфекции данным типом пневмо-
кокка. Такой типоспецифический паралич наблюдается
у мышей на протяжении 15 месяцев. В течение всего этого
периода полисахарид сохраняется в организме, посколь-
ку полисахарид очень устойчив к ферментативному гидро-
лизу. Во время указанного срока полисахарид удается
выделить как из печени, так и из селезенки мышей. Не
обсуждая здесь причины возникновения иммунологиче-
ского паралича на SIII (см. гл. 11), отметим лишь, что
именно персистенипя полисахарида — основная причина
продолжительности иммунологического паралича. Это
продемонстрировали опыты с ферментами Вас. palustris,
расщепляющими SIII до гексосахарпдов. Если SIII вво-
дили в большой дозе, а затем тем же животным инъеци-
ровали ферменты Вас. palustris, у мышей развивался
иммунный ответ. Помимо прочего этот результат означа-
ет, что для индукции иммунного ответа достаточен кратко-
45
срочный контакт антигена с иммунокомпетентными клет-
ками. В противном случае ответ не возник ры из-за рас-
щепления всего введенного антигена.
Полисахариды как антигены действуют на прекомми-
тпроваиные к ним В-лимфоциты и способны трансформи-
ровать их в антителопродуцирующие клетки без участия
Т-хелперов. Отвечающая па полнса/аридные антигены
субпопуляция (В]) способна превращаться преимущест-
венно в клетки, продуцирующие IgM-антитела. Ответ на
полисахариды не контролируется генами иммунного от-
вета (см. раздел 2.5).
Бактериальные липополисахариды являются митоге-
нами для В-лимфоцитов. Так, ЛПС из Salmonella typlii,
штамм 0901, способен вызвать поликлональную актива-
цию В-лимфоцигов, т. е. пролиферацию и дифференциров-
ку в антителопродуцирующие клетки В-лимфоцитов,
нрекоммитированных к синтезу самых разнообразных ан-
тигенов. На поверхности В-лимфоцитов находятся спе-
циальные рецепторы для ЛПС. Эти рецепторы не имеют
иммуноглобулиновой природы и существуют независимо
от антигеираспознающих рецепторов иммуноглобулино-
вой природы (см. гл. 9).
В составе субпопуляции В-лимфоцитов (Вг), отвечаю-
щих на тимусзависимые антигены, присутствуют клетки,
распознающие олигосахариды. Об этом свидетельствует
возможность получения антител против конъюгатов бел-
ков с сахарами. Ответ на подобные антигены, как указы-
валось в разделе 2.1, тимусзависим. Во многих случаях
конъюгаты белка с сахарами, являющимися иммунодо-
минантными в природных полисахаридах, индуцируют
антитела, не реагирующие с соответствующими полиса-
харидами. Это, очевидно, связано с тем, что в образова-
нии детерминанты конъюгированного антигена велик
вклад бокового аминокислотного остатка белка-носите-
ля, к которому присоединен заместитель (см. раздел
2.1). Так, в частности, антитела кролика против конъю-
гата белка с р-азофенил-а-3,6-дидезоксигексапиранози-
дом не реагируют с ЛПС энтеробактерий, имеющих в
качестве иммунодоминантных групп сахара в форме
а-пиранозида.
2.5.	Групповые антигены крови
Олигосахариды, ассоциированные с
поверхностью эритроцитов человека, участвуют в фор-
мировании антигенов, которые обозначают как группо-
46
вые вещества крови. Сюда относят системы ABO, Rh,
Lewis, MN, l\l\ell, Duffy, Kidd. Наиботее важными из
них в практическом отношении являются АВО(Н) и Rh,
так как эти системы в первую очередь ответственны за
совместимость эритроцитов различных индивидуумов, а
следовательно, за возможность переливания крови.
Групповые вещества системы АВО(Н) и фактор
Lewis (Le) очень близки по химическому составу: боль-
шое число олигосахаридных испей, присоединенных к
полипептиду, выполнякицему функцию скелета. Все це-
почки олигосахаридов построены из пяти сахаров:
D-галактозы, L-фукозы, Ы-ацетил-В-глюкозамииа, N-аце-
тилгалактозамина и сиаловой кислоты. Как и в других
полисахаридах, антигенная специфичность определяется
концевым моносахаридом и характером его связи. Если
концевым сахаром служит D-фукоза, образующаяся
структура не аитигенна для нормальных индивидуумов,
поскольку все они содержат на поверхности эритроцитов
подобную детерминанту. Такой антиген получил название
Н-субстанции (рис. 13). Фермент фукозилтрансфераза,
ответственный за присоединение концевой фукозы, нахо-
дится под контролем Н-гена, отличного от системы АВО-
генов. Однако Н-субстанция — обязательный предшест-
венник для формирования детерминант, соответствующих
А- и В групповым веществам. Соответствующие гены кон-
тролируют синтез ферментов, обеспечивающих присоеди-
нение к концевой галактозе Н-субстанции N-ацетплгалак-
тозамииа (A-субстанция) или D-галактозы (В-субстан-
ция). Фактору Le соответствует концевая фукоза (рис.
13). Различные индивидуумы экспрессируют различные
структурные гены для ферментов, обеспечивающих при-
соединение соответствующего той пли иной субстанции
концевого моносахарида.
У некоторых индивидуумов не происходит синтез фу-
козилтрансферазы, необходимой для образования
Н-субстанции. По этой причине у них невозможно так-
же формирование детерминант, соответствующих суб-
станциям А и В. Индивидуумы с подобной мутацией
(обозначается как фенотип «Bombay») способны образо-
вывать антитела против Н-субстанции, в связи с чем им
невозможно перелить кровь ни одной группы. У нормаль-
ных индивидуумов, имеющих группу крови А (экспрес-
сирующих А-субстанцию), в крови присутствуют антите-
ла М-класса против группового вещества В, и наоборот.
Индивидуумы, не экспрессирующие групповых веществ
47
А п В (но экспрессирующих Н-субстанцию), составляют
группу крови 0. В их сыворотке содержатся антитела
против групповых веществ А и В. Исходя из описанной
O-a-N-ацет 1-о-галактозаминил-(1-*3)-[0-а-Е-ф\ко1ил-
(I-*~2)]-О-/?- D-галак го зил-(1—4)-N-ацетил-D-глюко зам ин
0-а-В-галактозил-(1-*~3)-(0-а-к-фукозил(1-*2)]-0-
Д-В-галакгозил-(1—»-4)-N -ацет л-D-глюко зам ин
Рис. 13. Строение олигосахаридов, определяющих антигенную специ-
фичность групповых веществ крови А(/) и В (II) (эритроцитов чело-
века); стрелками указаны остатки, которыми две детерминанты раз-
личаются между собой
закономерности, при переливании крови, как правило,
используют гомологичную кровь или кровь «универсаль-
ных доноров» — индивидуумов, имеющих группу 0.
Гликопротеины с детерминантами системы АВО(Н)
обнаружены в различных биологических жидкостях —
слюпе, моче, сперме. На поверхности эритроцитов оли-
48
госахариды, определяющие антигенную специфичность
групповых веществ, присоединены не к полипептиду, а
к липиду. В им\унохимическом изучении системы АВО(Н)
большая роль принадлежит Э. Кэботу, В. Моргану и
В. Уоткинсу (Е. Kabat, W. Morgan, W. Watkins, 1953—
1966).	\
Резус-фактор (ШФсистема) эритроцитов не имеет ан-
тигенного родства с\АВ0(Н) системой. Он получил
название в свете данных К. Ландштейнера, показавше-
го, что кроличьи антитела против эритроцитов обезьян
макак резусов агглютинируют эритроциты у 80% здоро-
вых людей. Иммунохимиче^ки Rh-система изучена пока
недостаточно. Ясно только, что она представляет собой
большую группу антигенов сходного строения. Наиболее
сильным антигеном системы является антиген D (RhD
или Rh0). При выявлении этого антигена на поверхности
эритроцитов человек считается резус-положительным.
Концентрация RhD-антигена на поверхности эритроци-
тов значительно ниже, чем антигенов системы АВО. В си-
лу стерических причин бивалентные антитела против
RhD-антигена не способны эффективно «сшить» между
собой резус-положнтельные эритроциты, что является
необходимым условием возникновения реакции гемаг-
глютинации (см. гл. 12). Из-за этого антирезусные
антитела ошибочно называют «неполными».
2.6.	Детерминанты антигена,
распознаваемые В- и Т-лимфоцитами
Лимфоциты В-ряда, взаимодействую-
щие с антигеном с помощью рецепторов иммуноглобули-
новой природы (см. гл. 9), распознают те же детерминан-
ты, что и антитела, продуцируемые дифференцированны-
ми потомками этих клеток — плазмобластами и плазма-
тическими клетками.
Рецепторы для антигена на поверхности Т-супрессо-
ров сходны, если не идентичны, по специфичности с ре-
цепторами В-лимфоцитов и антителами, что было убе-
дительно продемонстрировано в опытах с конъюгирован-
ными антигенами. Достоверные сравнительные данные
о сродстве (аффинность) антигенсвязывающих рецепто-
ров В-лимфоцитов и Т-супрессоров к простым гаптенам
еще не получены.
Рецепторы для антигена на Т-хелперах распознают
участки молекулы антигена, не совпадающие по прост-
49
ранствениой локализации и химическом)’ строению с ан-
тигенными детерминантами, реагирующими с антитела-
ми, В-лимфоцитами и Т-супрессорами. Очевидные непря-
мые свидетельства этого были получены при изучении
иммунного ответа на тпмусзависимые' антигены, принад-
лежащие к группе конъюгированных.
Мышей сенсибилизировали диритрофенилировапным
бычьим сывороточным альбумином (ДНФ-БСА). Если
повторно вводили тот же антиген, наблюдали продукцию
антител как против динитрофенильной группы, так и про-
тив белка-носителя. В том случае, когда для второй
инъекции использовали динитрофенилированный яичный
альбумин, синтеза антител против динитрофенильной
группы не происходило только потому, что белок-носитель
для второго антигена не имел структурного сходства с
белком-носителем первого антигена. Третьей группе мы-
шей, получивших ранее инъекцию ДНФ-БСА, дополни-
тельно вводили чистый яичный альбумин, а спустя неко-
торое время динитрофенилированный яичный альбумин.
Мыши этой группы продуцировали антитела как против
динитрофенильной группы, так и против нового белка-
носителя— яичного альбумина (N. Mitchison, 1968). По-
лученные данные означают, что Т-хелперы распознают
детерминанты белка-носителя, но не реагируют с динит-
рофенильной группой. После достаточной для иммунного
ответа пролиферации и активации Т-хелперов, специфиче-
ски распознающих новый белок-носитель (яичный альбу-
мин), животные третьей группы оказались способными
продуцировать антитела против динитрофенильной груп-
пы, присоединенной к яичному альбумину.
При изучении иммунного ответа на различные белки
продемонстрировано, что структуры, распознаваемые
Т-хелперами, и антигенные детерминанты, распознавае-
мые В-лимфоцитами и антителами, пространственно изо-
лированы. Так, в молекуле ферредоксина (молекулярная
масса 5800) N-концевая половина молекулы содержит
детерминанты, распознаваемые В-клетками, а С-концевая
половина — Т-хелперами. Аналогично расположены
структуры, распознаваемые В-лимфоцитами п Т-хелпе-
рами, в молекуле глюкагона (молекулярная масса около
3500). Если указанные белки расщепить на N- и С-кон-
цевые половины, продукция антител на изолированные
половины молекул не происходит. Для получения полно-
ценного антигена обе половины молекулы необходимо
50
соединить даже с использованием в качестве мостика
между ними другого белка.
УбедителыГым примером структурных отличий меж-
ду детерминантами, распознаваемыми В-лимфоцитамп и
Т-хелперами, служат результаты изучения проколлагена
(Н. Rohde et ah, 1&.78). Первый тип этого белка имеет
два вида структур: коллагеноподобную и глобулярную,
причем каждый участок образует самостоятельный до-
мен. Глобулярный участок образует р-складчатую струк-
туру, стабилизированную пятью дисульфидными связями.
Антитела против проколлагена реагируют именно с этим
участком. Распознаваемые ими детерминанты принадле-
жат к конформационному типу — после восстановления
дисульфидных связей в присутствии денатурирующих
агентов они разрушаются. Коллагеноподобный участок
распознается Т-хелперами, причем нативная конформа-
ция этого участка для этих клеток не существенна. Пос-
ле необратимого раскручивания спирализованного по
типу коллагена домена в 8М. мочевине пли в результате
прогревания при 55иС детерминанты для Т-хелперов не
разрушаются.
Отсутствие связи между пространственной конформа-
цией белков и способностью Т-хелперов специфически
распознать их доказано в опытах с денатурированными
различными способами лизоцимом, мономерной формой
флагеллина, коллагеном, p-цепью инсулина. Эти данные,
а также некоторые факты, указывающие на возможность
распознавания Т-хелперамп коротких пептидов, изолиро-
ванных из глобулярных белков, позволяют предположить,
что детерминанты для Т-хелперов подобны секвенциаль-
ным. Проблему нельзя считать решенной.
Антигены, индуцирующие биосинтез антител, способ-
ны индуцировать также реакции клеточного (клеточно-
опосредованною) иммунитета. Следовательно, опреде-
ленные структуры этих антигенов должны распознавать-
ся специфически предшественниками эффекторных
Т-лимфоцитов и собственно Т-эффекторами. Детерми-
нанты антигена для этих клеток, очевидно, не совпадают
по структуре с детерминантами, распознаваемыми анти-
телами (рецепторами В-лимфоцитов).
Существуют данные о том, что специфичность детер-
минант для эффекторов реакции гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ) не зависит от конформации
белкового антигена. Так, если нативную и денатуриро-
ванную формы глобулярного белка, например лизоцима,
51
использовать для индукции биосинтеза антител, образу-
ющиеся антитела не реагируют перекрестно. В то же
время нативный и денатурированный белки реагируют
перекрестно в реакции ГЗТ. Аналогично, восстановлен-
ные и карбоксиметилированные fi-цепи инсулина не реа-
гируют с антителами против нативного инсулина, но вы-
зывают кожные реакции замедленного типа у морских
свинок, сенсибилизированных нативным инсулином.
2.7.	Антигенная специфичность
и генотип реципиента
Вся информация об антигенной струк-
туре биополимера пли его синтетического аналога может
быть получена на основе корреляции данных о его строе-
нии и специфичности антител — антигеираспознающих
рецепторов лимфоцитов. Однако даже в пределах одного
биологического вида отдельные особи распознают, а за-
тем отвечают продукцией антител на различные антиген-
ные детерминанты. На практике сравнивают специфич-
ность антител не отдельных особей, а животных различ-
ных инбредных линий одного биологического вида.
При иммунизации морских свинок линий 2 и 13 инсу-
лином было установлено, что животные линии 2 образуют
антитела против антигенных детерминант N-концевых по-
ловин его полипептпдных цепей, а линии 13 — против
С-концевых.
У мышей линии C57BL/6 образуется в 10 раз больше
антител против разветвленного полипептида (TG)—А—
L—, чем у мышей линии СВА. Если заменить в полипеп-
тиде тирозин на гистидин, то иа пептид со структурой
(HG)—А—L— мыши линии СВА отвечают значительно
сильнее, чем мыши C57BL/6. В том случае, когда гисти-
дин заменяли на фенилаланин, образующийся полипептид
со структурой (PG)—А—L — индуцировал примерно рав-
ные количества антител у мышей сравниваемых линий.
Иммунный ответ Fi гибридов СВА на C57BL/6 и гиб-
ридов, полученных при возвратном скрещивании, показал,
что способность к биосинтезу антител на (TG)—А—L—
наследуется. Ген, ответственный за иммунный ответ на
этот антиген, равно как и аналогичные гены, контро-
лирующие иммунный ответ на различные белки, поли-
пептиды, конъюгированные антигены, получили
название гена иммунного ответа (immune response gene,
1г) (В. Benacerraf, 1976). У мышей эти гены найдены в
52
17-й хромосоме. Они сцеплены с генами основного комп-
лекса гистосовместимости (Н-2), располагаясь в 1-районе
Н-2-ком плекса (см. гл. 10).
Как каждый из 1г-генов, Ir-ген, контролирующий от-
вет на разветвленный полипептид, является аутосомным
доминантным геном, аллели которого контролируют от-
вет на детерминанты, образованные Туг—Glu, His—Glu
и Phe—Glu. Наибольшие генетически контролируемые
различия наблюдаются при вторичном ответе на сравни-
ваемые разветвленные полипептиды. Эти различия пол-
ностью исчезают при использовании для иммунизации
комплекса полипептида с белком — метилированным
бычьим сывороточным альбумином. Следовательно, гене-
тически детерминированные различия иммунного ответа
определяются природой носителя детерминантной груп-
пы. Как показано в разделе 2.4, структуру носителя рас-
познают Т-хелперы. Из этих и других экспериментов со
всей очевидностью вытекает, что 1г-гены контролируют
ответ на тпмусзависимые антигены и что этот контроль
осуществляется на уровне Т-клеток, регулирующих им-
мунный ответ (см. также гл. 10).
К настоящему времени описано свыше двадцати 1г-ге-
нов у мышей. Подобные гены найдены у морских свинок,
крыс, обезьян (макак резусов) и человека. Идентифика-
цию Ir-генов осуществляли с использованием синтетиче-
ских потипептидов сходного строения, белковых антиге-
нов (которые вводили в низких дозах с целью обнаруже-
ния ответа только на наиболее иммуногенные детерми-
нанты) , а также аллоантпгенов, лишь в незначительной
степени отличающихся по своему строению от аналогич-
ных собственных биополимеров. Не обнаружено ни од-
ного тимусиезависимого антигена, иммунный ответ на
который находился бы под контролем 1г-генов.
Один и тот же 1г-ген может контролировать иммун-
ный ответ на несколько антигенов, различающихся с точ-
ки зрения классической иммунологии по антигенной спе-
цифичности. Это значит, что к сравниваемым антигенам
образуются антитела, не реагирующие между собой пе-
рекрестно. Однако, как уже обсуждалось выше (см. раз-
дел 2.4), антитела распознают в антигене иные структу-
ры, чем Т-хелперы. Л именно участие Т-хелперов в им-
мунном ответе контролируют Ir-гены. Следовательно,
если один и тот же Ir-ген контролирует ответ на два ан-
тигена, значит у этих двух антигенов сходны те участки
молекул, которые распознают Т-хелперы.
53
Ir-гены контролируют также реакции клеточного им-
мунитета. В частности, показано, что вызванная антиге-
ном пролиферация Т-лимфоцитов у мышеи, ранее имму-
низированных нативным миоглобином, детерминирова-
на двумя 1г-генамп: одни контролирует ответ на N-koh-
цевои участок молекулы, другой — на С-концевой (фраг-
менты молекулы миоглобина получали с помощью пепти-
долиза бромцианом по остаткам метионина). Интересно,
что указанные 1г-гены локализованы в разных субрайо-
нах 1-райоиа Н-2-комплскса.
Все накопленные к настоящему времени факты свиде-
тельствуют о том, что у одной особи данного вида невоз-
можно индуцировать синтез антител ко всем антигенным
детерминантам определенного антигена, равно как и по-
лучить сильный ответ на серию различных антигенов.
Путем направленной селекции можно резко усилить от-
вет на некоторые антигены (антигенные детерминанты).
Так, например, путем селекции двадцати поколений мы-
шей удалось, в частности, получить линии, отличающиеся
по силе иммунного ответа на эритроциты барана в 200
раз. Подобный эффект не достигается посредством много-
кратной иммунизации, в результате которой можно вооб-
ще подавить ответ из-за возникновения так называемого
иммунологического паралича (см. гл. 11).
Иммуноглобулины
Иммуноглобулины представляют со-
бой семейство сывороточных белков со сходной струк-
турной организацией молекул, способных в качестве ан-
тител специфически взаимодействовать с антигеном.
Исходя из определения, к белкам иммуноглобулиновой
природы следует отнести также аитигенсвязывающие ре-
цепторы В-лимфоцитов.
54
Иммуноглобулины подразделяют на классы, а в пре-
делах каждого класса на подклассы. Известно пять клас-
сов иммуноглобулинов, обозначаемых как IgG, IgM, IgA,
IgE и IgD. У человека, мыши и некоторых других живот-
ных в пределах IgG, IgM и IgA описано несколько под-
классов.
3.1.	Структурная организация
иммуноглобулинов
На рис. 14 представлены принципиаль-
ные схемы строения различных классов и подклассов
иммуноглобулинов человека. Иммуноглобулины других
Рис. 14. Субмолекулярная структура различных иммуноглобулинов
человека:
IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4—подклассы IgG; I—Z-цепь. входящая в состав
IgM и IgA; СК — секреторный компонент IgA; пунктиром показаны дисуль-
фидные связи
биологических видов построены аналогично. Из схемы
видно, что иммуноглобулины — это белки с четвертич-
ной структурой, т. е. их молекулы построены из несколь-
ких полипептидных цепей. В состав молекулы иммуно-
55
глобулинов каждого класса входит кратное двум число
разноименных полипептидных цепей—легких (L) и
тяжелых (Н). Легкие цепи с молекулярной массой
22 000 идентичны по своему строению у иммуноглобули-
нов всех классов и подклассов. Тяжелые цепи имеют
характерные особенности строения у каждого класса
(подкласса). Молекулярная масса тяжелых цепей варьи-
рует от 51 000—52 000 до 72 000—76 000 (табл. 3).
Таблица 3. Свойства иммуноглобулинов человека
Изучаемый параметр	IgG	IgA	IgM	IgD	IgE
Молекулярная масса, тыс. дальтон 		150	150—350	900	180	190
Константа седиментации, S20 	7	7(9—15)	19	7	8
Легкие цепи (молекулярная масса, тыс. дальтон) . . .	22	22	22	22	22
Тяжелые цепи (молекулярная масса, тыс. дальтон) . . .	52—60	56	70	70	70
Углеводы, %		3	7	12	12	12
Время циркуляции (1/2), сутки	21	6	5	3	2
Концентрация в сыворотке, мг/100 мл		1100	250	100	3	0,01
Все иммуноглобулины, за исключением IgM и IgA,
представлены в сыворотке крови в виде мономеров, со-
стоящих из двух симметричных половин, каждая из кото-
рых, в свою очередь, образована одной легкой и одной
тяжелой цепью. Константа седиментации мономера 7—
8,5S. Молекула IgM образована пятью 7S мономерами,
объединенными между собой дисульфидными связями.
IgA встречается в сыворотке как в виде мономера, так и
полимера из двух—пяти 7S субъединиц. Тяжелые цепи
иммуноглобулинов обозначают греческими буквами: у, ц,
а, е, б. Легкие цепи на основании определенных различий
первичной структуры и антигенных свойств подразделяют
на два типа: х и Z. Важно, что в одной молекуле иммуно-
глобулина имеются легкие цепи только одного типа, а тя-
желые цепи, характерны только для одного класса
(подкласса). Ниже представлены молекулярные форму-
лы сывороточных иммуноглобулинов человека (в молеку-
лу полимерных форм иммуноглобулинов М и А входит
по одной J-лепи):
56
Класс
IgG .
IgM .
IgA .
IgE . .
IgD .
Формула
y2><2 или y2^2
(И2И2)5 ИЛИ (Ц2?"2)5
U2X2 ИЛИ «2^2
(е2х2)2 ИЛИ (е2х2)2
б2Х2 ИЛИ 62^2
Полипептидные цепи объединены в молекуле 7S моно-
мера ковалентными дисульфидными связями и некова-
лентными связями, прежде всего гидрофобными. В моле-
куле иммуноглобулина различают два вида межцепьевых
дисульфидных связей: между одноименными тяжелыми
цепями и между легкими и тяжелыми цепями. Дисуль-
фидные связи между тяжелыми цепями IgG расположены
в районе, получившем название «талии» молекулы (hinge
region) Как видно из рис. 14, число дисульфидных свя-
зей между тяжелыми цепями неодинаково у иммуногло-
булинов различных классов, равно как у иммуноглобули-
нов различных подклассов одного класса. Это один из
отличительных признаков соответствующего подкласса.
Разорвав дисульфидные связи в районе талии, молекулу
IgG мономера можно разделить на две половины. Диссо-
циация происходит в слабокпслой среде (pH 3,0—3,5).
Если вслед за этим нейтрализовать раствор, обе полови-
ны молекулы вновь соединятся за счет нековалентпых
связей между С-концевыми половинами тяжелых цепей
(A. Nisonoff, 1963).
Для получения в изолированном виде полппептидных
цепей иммуноглобулинов первоначально разрывают все
межцепьевые дисульфидные связи. Это можно осущест-
вить с помощью различных восстановителей: 2-меркапто-
этанола, цистеина. Существенно, что в отсутствие денату-
рирующих агентов внутрицепьевые дисульфидные связи,
играющие важную роль в стабилизации третичной струк-
туры легкой и тяжелой цепей, не разрываются.
Разрыв нековалентных связей между полипептидны-
мп цепями происходит либо в концентрированной (ЮМ)
мочевине, либо в 1М растворе уксусной, пропионовой или
масляной кислоты. Третичная структура цепей в этих ус-
ловиях не претерпевает необратимых изменений бтагоца-
ря сохранению каркаса внутрип.епьевых дисульфидных
связей.
С помощью гель-хроматографии в буфере с тем или
иным диссоциирующим агентом легкие и тяжелые цепи
могут быть разделены с достаточной степенью полноты.
Если до удаления диссоциирующего реагента смешать
57
эквимолярные количества легких и тяжелых цепей, а за-
тем удалить диссоциирующий реагент диализом, произой-
дет спонтанная рекомбинация цепей и реконструкция
мономера. После замыкания сульфгидрильных групп по-
луцистиновых остатков в межцепьевые дисульфидные
связи (для чего достаточно насытить воздухом раствор
белка при pH 7,8—8,0) образуется молекула, совпадаю-
щая по всем основным элементам структуры с первона-
чальной. Обнаружение в иммуноглобулинах нескольких
типов полипептидных цепей, разработка методов их дис-
социации и открытие спонтанной рекомбинации осущест-
влены прежде всего Дж. Эдельманом, Р. Портером и
Ф. Франеком (J. Edelman, R. Porter, F. Franek, 1959—
1961).
Принцип самосборки молекулы иммуноглобулина из
изолированных цепей закодирован в третичной структуре
полипептидных цепей. На его основе происходит сборка
молекул иммуноглобулинов в клетках, участвующих в их
синтезе (см. гл. 5).
Важную роль в изучении структуры и функции иммуно-
глобулинов сыграли методы фрагментации молекулы с
помощью различных протеназ. Рассмотрим строение и
свойства фрагментов на примере продуктов протеолиза
IgG кролика.
Молекула этого белка имеет единственную дисуль-
фидную связь между тяжелыми цепями. При протеоли-
зе папаином в нейтральной среде в присутствии низких
концентраций восстановителей молекула IgG кролика
распадается на три фрагмента в связи с расщеплением
тяжелых цепей в районе талии и разрывом дисульфид-
ной связи между ними (рис. 15). Все фрагменты имеют
одинаковые величины константы седиментации — 3,5S.
Они могут быть разделены с помощью ионообменной
хроматографии на карбоксиметпл-целлюлозе. Если для
расщепления использовали IgG-антитела, например
против яичного альбумина, то два из трех полученных
фрагментов способны специфически соединяться с анти-
геном, третий нет. Первые два фрагмента получили на-
звание Fab (fragment antigen binding). Третий фрагмент,
благодаря своему свойству легко кристаллизоваться из
дистиллированной воды или нейтральных буферных рас-
творов низкой ионной силы, получил название Fc (frag-
ment crystaliiziable).
Fab-фрагмент образован легкой цепью и амнноконце-
вой половиной тяжелой цепи. В образовании Fc-фрагмен-
58
та участвуют С-концевые половины тяжелых цепей, объе-
диненных только нековалентными связями. Изучение Fab-
и Fc-фрагментов было осуществлено Р. Портером (1959).
Протеолиз IgG кролика пепсином при pH выше опти-
мума активности этого фермента (pH 4,0) приводит к
Рис. 15. Фрагменты молекулы IgG, полученные в результа-
те ограниченного протеолиза. Жирным обозначены домены,
входящие в состав соответствующего фрагмента
образованию одного крупного фрагмента с константой
седиментации 5S и молекулярной массой 105 000, еще
одного фрагмента с молекулярной массой около 25 000
и серии низкомолекулярных пептидов. Фрагмент типа
F(ab')2 представляет собой димер фрагментов, очень
близких по строению Fab, которые объединены дисуль-
фидным мостиком. Его разрыв приводит к образованию
двух 3.5S фрагментов. Последние обозначают как Fab',
а димер — как F(ab')2- Фрагмент Fc' с молекулярной
массой 25 000 (константа седиментации 2,4S) образо-
ван двумя отрезками тяжелых цепей, каждый из кото-
рых равен примерно четвертой части ее длины (рис. 15).
59
Изучение продуктов протеолиза IgG пепсином осущест-
вил А. Нисонов с сотрудниками (A. Nisonoff et al.,
1960—1963).
Рис. 16. Субмолекулярная структура IgM.
В одной из 7S субъединиц обозначены домены легкой н тяжелой (ц) цепей,
внутрицепьевые н межцепьевые дисульфидные связи; J—/-цепь; пунктиром
обозначены Fab- F(ab')2 и (ГсЦ-фрагменты
Таким образом, два симметричных участка молекулы
IgG—Fab-участки принимают участие в формировании
активных центров антитела; Fc-участок отвечает за ос-
новные эффекторные функции антител (см. гл. 6).
Иммуноглобулины других классов, хотя и отличают-
ся значительно в чувствительности к протеолизу, также
могут быть расщеплены на Fab- и Fc-фрагменты. Раз-
личные фрагменты IgM, в частности, представлены на
60
рис. 16. Схематическое изображение IgM с центральным
ядром, образованным Рсм-участками, и расположенными
на периферии РаЬц-участкамп в большой степени соответ-
ствует данным электронно-микроскопического изучения
этого очень крупного по размеру белка с молекулярной
массой около 900 000.
Рис. 17. Субмолекулярная структура IgA:
/, 11 — возможные вариации замыкания межцепьевых дисульфид-
ных связей; а — тяжелая цепь IgA, СК—секреторный компонент,
1—/-цепь; точками обозначены вариабельные районы легкой и тя-
желой цепей
IgM и полимерные формы IgA (рис. 17) имеют допол-
нительную полипептидную цепь с молекулярной массой
12 000, получившую название /-цепи (соединяющая, от
англ, joining). В ее состав входит большое число полу-
цистпновых остатков, остатков пролина, глутаминовой и
аспарагиновой кислот. Указанная цепь принимает, оче-
видно, участие в формировании полимерных форм имму-
ноглобулинов.
Отличительной особенностью иммуноглобулинов клас-
са А является их присутствие в различных секретах: мо-
лозиве, секретах верхних дыхательных путей, желчи,
отделяемом толстого кишечника. IgA, поступающий в сек-
реты, синтезируется лимфоидными клетками, рассеянными
в форме скоплений под цилиндрическим эпителием. Он
приобретает способность проникать в секреты после при-
соединения так называемого секреторного компонента,
который синтезируется клетками серозного эпитетия.
Этот белок (секреторный компонент) с молекулярной
61
массой около 70 000 встречается в составе только секре-
торного IgA. Секреторный IgA представляет собой димер,
в котором IgA-моиомсры (7S) «состыкованы» конец в
конец своими Fc-участками. Последние обвиты секретор-
ным компонентом (рис. 17). Между Fc-участками распо-
лагается также J-цепь. Копстанта седиментации всего
комплекса 11S, а молекулярная масса 380 000—390 000.
Необходимо особо подчеркнуть, что сывороточный IgA
никогда не превращается в секреторный.
Еще одна отличительная особенность IgA, а именно
его второго подкласса — IgA2 (Am+) (см. раздел 3.4) со-
стоит в отсутствии дисульфидных связей между легкими
и тяжелыми цепями и существовании дисульфидной свя-
зи, объединяющей легкие цепи (см. рис. 14).
Говоря об особенностях строения отдельных классов
иммуноглобулинов, следует отметить очень высокую чув-
ствительность иммуноглобулина D к расщеплению папаи-
ном и другими нейтральными протеиназами. При хране-
нии на холоду даже в течение нескольких дней сыворот-
ки, содержащей IgD, последний расщепляется до Fabg- и
п Fcfi-фрагментов. При сравнении скоростей расщепления
папаином, трипсином или плазмином моноклональных
иммуноглобулинов человека оказалось, что наиболее
быстро распадается IgD. Остальные белки по чувстви-
тельности к протеолизу располагаются в следующий ряд:
IgGl>IgG2>IgM>Ig\. Расщепление IgG в сыворотке
происходит, очевидно, за счет следов плазмина, так как
процесс гидролиза тормозится в присутствии ингибитора
плазмина е-аминокапроновой кислоты. IgG человека так-
же может расщепляться при хранении на холоду приме-
сью плазмина, содержащегося в сыворотке или коммер-
ческих препаратах гамма-глобулина. Прежде, когда не
было известно строение иммуноглобулинов, считали, что
в этих условиях происходит разрушение гамма-глобули-
на (антител). Сегодня очевидно, что под влиянием плаз-
мина идет лишь ограниченный протеолиз с образованием
Fab-фрагментов.
Все иммуноглобулины являются гликопротеинами. Со-
держание углеводного компонента неодинаково у различ-
ных классов, достигая 10% и выше в иммуноглобулинах
классов М и А. Олигосахарид присоединен через остаток
аспарагина к тяжелым цепям в области Fc-фрагмента.
Более детальная локализация углеводного компонента
будет представлена в следующих разделах этой главы.
62
3.2.	Первичная структура
полипептидных цепей
иммуноглобулинов
Иммуноглобулины одного класса п да-
же подкласса продуцируют многие плазматические клет-
ки, а точнее, клоны плазматических клеток. Каждый из
этих клонов синтезирует молекулы, отличающиеся друг
от друга по аминокислотной последовательности. Это бы-
ло доказано при сравнительном изучении миеломных им-
муноглобулинов, т. е. иммуноглобулинов, синтезируемых
клетками больных множественной миеломой или клетка-
ми перевиваемой плазмацитомы мышей. И те и другие
опухоли образованы клетками одного определенного кло-
на плазматических клеток. В том случае, когда индивиду-
альные миеломы (плазмацитомы) продуцируют иммуно-
глобулины одного и того же класса и подкласса, пред-
ставляется возможным сравнить первичные структуры
легких и тяжелых цепей моноклональных белков.
Анализ большого числа легких цепей моноклональных
иммуноглобулинов показал, что молекулу цепи, с точки
зрения особенностей первичной структуры, можно разде-
лить на две равные части. Если С-концевые половины лег-
ких цепей одного типа (х или л), синтезируемых различ-
ными клонами клеток, практически полностью совпадают
по аминокислотной последовательности, то N-концевые
половины имеют существенные различия. Наибольшей
степенью вариабельности отличаются три участка после-
довательности: 24—34, 50—56 и 89—97. Практически не
существует двух моноклональных иммуноглобулинов, лег-
кие цепи которых совпали бы по аминокислотной после-
довательности в указанных участках. На основании этих
данных N-концевые половины легких цепей получили на-
звание вариабельных (variable) в отличие от С-концевых
половин, названных константными (constant). Сокращен-
но их обозначают как V- и С-районы соответственно.
Участки последовательности с наибольшей степенью ва-
риабельности первичной структуры получили наименова-
ние гипервариибельных. Напротив, участки V-района,в
которых первичная структура' достаточно устойчива, на-
зывают консервативными, а аминокислотные остатки в
них инвариантными.
При сопоставлении аминокислотных последователь-
ностей V-районов индивидуальных х- или л-цепей можно
обнаружить, что у ряда цепей сходство последовательно-
63
степ больше, чем у других. Осуществляя подобную груп-
пировку, установили наличие трех подгрупп V\ и пяти
Vx у человека. У мышей пока трудно оценить верхнюю
границу числа Ух-подгрупп. Минимальное их число со-
ставляет 9. Что касается Z-цспей мышиного иммуногло-
булина, то их содержание в норме не превышает 5% от
общего количества легких цепей. Это выражается и в
крайне низком содержании миеломных иммуноглобули-
нов мыши с легкими цепями /.-типа.
В пределах каждой подгруппы у всех цепей в одних
и тех же позициях существуют вставки и делеции. Они
соответствуют позициям 27—30 и 90—100. Поэтому об-
щее число остатков в цепях колеблется от 210 до 223.
Степень гомологии между вариабельными и констант-
ными районами очного типа легких цепей крайне невели-
ка и составляет, например, для Z-цепей человека всего
15%. Напротив, гомология константных районов и- и
2^-цепей высокозначнма и достигает 40%. Она в два раза
выше, чем для VH- и Ул-районов, и соответствует прибли-
зительно гомологии а- и |3-цепей гемоглобина.
С эволюционной точки зрения подгруппы являются,
очевидно, устойчивым образованием. Об этом свидетель-
ствует следующий факт: высокую степень гомологии об-
наруживают между подгруппой I Н-цепей человека и
подгруппой II Н-цепей мыши. Гомология между ними
существенно выше, чем между подгруппами I и II Н-це-
пей человека (G. Rechavi el al., 1983).
Что показали данные, полученные при изучении пер-
вичной структуры легких цепей? Прежде всего, что син-
тез цепи каждого типа контролируют не менее двух струк-
турных генов: один — для вариабельного, другой — для
константного районов. Следовательно, генетический за-
кон, открытый при изучении прокариот и сводящийся к
правилу: один ген—одна полипептидная цепь, не обяза-
тельно выполняется у эукариот, в частности, при синтезе
иммуноглобулинов. Во-вторых, стало ясно, что должно
существовать большое число генов для V-района (V-re-
нов), каждый из которых контролирует структуру вариа-
бельного района легкой цепи, синтезируемой индивиду-
альной плазматической клеткой. С учетом данных, свиде-
тельствующих о локализации в разных хромосомах Сн- и
С;.-генов, это указывало на существование в геноме двух
больших наборов V-генов. Эти выводы, еде чанные только
на основе данных по первичной структуре легких цепей,
нашли полное подтверждение при изучении структурных
64
генов иммуноглобулинов методами молекулярной генети-
ки (см. гл. 5).
Тяжелые цепи каждого класса (подкласса) иммуно-
глобулинов также состоят из вариабельного (Ун) и кон-
стантного (Сн) районов. V-район включает в среднем
114—124 остатков с N-конца (а-аминогруппа, как прави-
ло, заблокирована остатком пироллидонкарбоновой кис-
лоты). В случае у-цепи в ее состав входит 450 аминокис-
лотных остатков. Следовательно, константный район
приблизительно в три раза больше вариабельного.
V-райоп включает три гипервариабельных участка, в
целом симметричных аналогичным участкам легких цепей
(остатки 31—37, 51—68 и 101—110). Делении и вставки
особенно характерны для последнего гипервариабельного
района.
Подобно Уц-районам Vn-районы можно разделить на
подгруппы, число которых для миеломных иммуноглобу-
линов человека составляет четыре. Необходимо подчерк-
нуть еще раз основное правило структурной организации
тяжелых цепей: все без исключения подгруппы вариа-
бельного района присущи не какому-либо определенному
классу (подклассу), а могут встречаться в ассоциации
с Сн-районами любого класса тяжелых цепей (у, ц, а,
е, б).
Константные районы тяжелых цепей различных клас-
сов иммуноглобулинов наряду с определенным сходством
первичной структуры имеют и характерные особенности.
Прежде всего, константный район тяжелой цепи каждого
класса образован пз нескольких равных по протяженно-
сти участков (за исключением района талии). Число та-
ких участков в константном районе у-цепи равно трем.
Каждый из них содержит НО—120 остатков, т. е. столько
же, сколько Ун-район. Каждый район ограничен внутри-
цепьевой дисульфидной связью и при формировании про-
странственной структуры образует компактную глобулу,
названную, по предложению Дж. Эдельмана, доменом.
Ун-район также сворачивается в пространственно авто-
номный домен, стабилизированный внутрицепьевой ди-
сульфидной связью. Домены константного участка тяже-
лой цепи IgG обозначают в направлении С-конца как
Си 1 (Cv 1), Сн2 (Сг2), СнЗ (СуЗ).
Тяжелая ц-цепь IgM длиннее у-цепи на 130 остатков,
находящихся в константном районе и образующих допол-
нительный домен. Следовательно, в См-районе четыре до-
мена: Сц1, Ср.2, Ср.3, См4.
3—1258
65
Также по четыре домена в константных районах е- и
6-цепей IgE и IgD. В сывороточном и секреторном IgA
константный район у-цепи состоит из трех доменов.
Сравнение аминокислотных последовательностей до-
менов константного района у-цепп свидетельствует о вы-
сокозначимой гомологии в сравнении с гомологией меж-
ду Vn- и Су-районами (40—60% против 15%). Гомология
между доменами константного района тяжелой цепи по-
добна таковой между константными районами х- и /.-це-
пей. Статистически значима также гомология между
константным доменом легкой цепи и константными доме-
нами тяжелой цепи. Эти данные дают основание для пред-
положения о том, что константный район тяжелой цепи
контролируют гены, которые произошли от предкового
гена, общего для константных районов легкой и тяжелой
цепей.
Сопоставление первичных структур константных рай-
онов тяжелых цепей различных подклассов IgG человека
без учета структуры талии указывает на чрезвычайно вы-
сокую степень гомологии, достигающей 85—90%. Однако
даже небольших различий первичной структуры достаточ-
но для проявления у различных подклассов разных эф-
фекторных функций, зависящих от строения Сн2- и СнЗ-
доменов Fc-участка молекулы (см. гл. 6).
Важная роль для проявления биологических свойств
иммуноглобулинов принадлежит району талии — отрез-
кам тяжелых цепей, объединяющих V- и С-участки моле-
кулы. Этот район обладает уникальными особенностями
строения, отличающими его от других участков тяжелых
и легких цепей.
Район талии включает отрезки тяжелых цепей длиной
от 15 до 60 остатков. В пределах этого отрезка тяжелой
цепи участок из 15—16 аминокислотных остатков может
быть неоднократно дуплицирован. Так, в IgG3 человека
он повторен четыре раза.
В пределах района талин, как уже говорилось в разде-
ле 3.1, находятся полуцистиновые остатки, участвующие в
образовании дисульфидных связей между тяжелыми це-
пями. Число таких связей зависит от числа повторяющих-
ся блоков сходной аминокислотной последовательности.
Так, в уже упомянутом IgG3 число полуцистиновых ос-
татков достаточно для образования между тяжелыми це-
пями 11 дисульфидных связей.
Удивительной особенностью района талии является
очень высокое содержание остатков пролина. В IgGl че-
66
ловека здесь расположено пять остатков пролина, а в
IgG крс шка — даже восемь (рис. 18). Как видно из ри-
сунка, существует участок цепи, где подряд расположено
три остатка пролина. Остаток пролина препятствует фор-
мированию регулярной вторичной структуры и взаимодей-
ствию гомологичных участков соседних тяжелых цепей.
Ниже мы вернемся к особенностям конформации района
талии. Здесь же следует подчеркнуть, что особенности со-
става и пространственной структуры района талии опре-
деляют высокую чувствительность образующих его участ-
ков тяжелых цепей к действию протеолитических фер-
ментов. Без участия каких-либо денатурирующих агентов
IgG расщепляют в этом районе папаин, трипсин, пепсин
(рис. 18), плазмин, бромелин, катепсин С и даже такой
высокоспецифичный в отношении субстрата фермент, как
коллагеназа.
Район талии у-цепей не обнаруживает статистически
значимой гомологии с доменами константного и вариа-
бельного районов. Этот факт следует иметь в виду в связи
с проблемой организации структурных генов для тяжелых
цепей иммуноглобулинов (см. гл. 5). Уже на основании
сведений, полученных при изучении первичной структуры,
закономерно заключить, что район талии кодирует ген,
имеющий иное филогенетическое происхождение, нежели
гены, кодирующие Vh- и Сн-домены. Ген для района та-
лии эволюционировал независимо от С-генов, и в ходе
его эволюции сформировалось семейство сходных в
структурном отношении генов, кодирующих соответст-
вующие районы иммуноглобулинов различных классов
(подклассов). Несомненное близкое структурное родство
по крайней мере группы генов, кодирующих районы та-
лии IgG человека различных подклассов, следует из того
факта, что гомология по этому району достигает 70%.
Подобие первичной структуры районов талии у IgG и IgA
человека очевидно. Оба подкласса IgA содержат три по-
луцпетиновых остатка и богаты пролином. Заметна ду-
пликация небольших сегментов последовательности в
IgA 1: Pro—Ser—Th г—Pro—Pro—Thr—Pro.
Константные домены тяжелых цепей различных клас-
сов заметно отличаются по первичной структуре, однако
степень гомологии между ними статистически значима,
достигая, например, 30% для у- и ц-цепей. Это указывает
на происхождение всех генов для константных районов
тяжелых цепей иммуноглобулинов от одного предкового
гена. Возникшие в ходе эволюции изменения в структуре
3*
67
Thr-Cys—Scr—Lys—Pro-Thr-Cys-Pro-Pro-Pro—Glu—Lcu-Lcu-Glu-Glu—Pro-Scr—Vai—Phc—lle-Phe-Lys—Pro—Pro—Pro—Lys—Asp-Thr-Lcu—Met-lle—
fit	II
T	Ilan	II	т	CNIIr
Рис. 18. Места расщепления молекулы IgG кролика в районе талии с
помощью папаина (Пап), пепсина (П), трипсина (Т) и
бромциана (CNBr)
Сн-генов и, как следствие этого, возникновение различий
в структуре константных районов иммуноглобулинов оп-
ределили характерные для них особенности биологиче-
ских свойств (см. гл. 6).
3.3.	Пространственная структура
легкой и тяжелой цепей
и организация четвертичной
структуры иммуноглобулинов
Как было показано в предыдущем раз-
деле, вариабельные и константные районы легкой и тя-
желой цепей формируют автономные, компактно сфор-
мированные домены, стабилизированные внутрицепьевы-
ми дисульфидными связями. Основной тип вторичной
структуры — анишараллельная ^-складчатая. Одно из
первых доказательств такого типа вторичной структуры
в иммуноглобулинах было получено Г. Троицким и
В. Завьяловым (1972).
Реитгеноструктурный анализ свидетельствует о том,
что каждый домен имеет примерно цилиндрическую
форму. Определенная пространственная асимметрия
обусловлена тем, что одна из сторон цилиндра образо-
вана тремя антипараллельиыми р-складками, а другая —
четырьмя. Несмотря на большое сходство, в упаковке
V- и С-домепов имеются существенные различия: в Vl-
и У’и-доменах расположена дополнительная петля поли-
пептидпой цепи (рис. 19). Упаковка Vh- и Уь-доменов
мало чем отличается друг от друга. Очень сходна про-
странственная упаковка Cl-, Сн1- и СцЗ-доменов. Что
касается Сн2-домена, то определенное своеобразие ему
придает присоединенная разветвленная цепь олигосаха-
рида.
Между доменами находятся короткие, ио достаточно
гибкие отрезки цепей, допускающие расположение доме-
нов в молекуле иммуноглобулина под некоторым углом
друг к другу (рис. 20). В отличие от собственно доменов,
характеризующихся значительной устойчивостью к про-
теолизу, соединяющие их отрезки цепей более доступны
для протеиназ. Степень доступности отдельных междо-
мепных пространств для протеиназ возрастает после
кратковременной инкубации белка в кислой среде. После-
дующий протеолиз плазмином, в частности, приводит к
отщеплению от молекулы IgG СнЗ-доменов. Лишенный
их фрагмент, получивший название Facb (см. рис. 15),
69
равно как и тандем СнЗ-домепов, служат важными объ-
ектами для изучения локализации и структуры центров,
ответственных за эффекторные функции иммуноглобули-
Рис. 19. Третичная структура доменов
полипептидных цепей IgG человека:
Kern и Oz — положения антигенных марке-
нов (см. гл. 6).
Гидролиз пепси-
ном Fab-фрагментов
мышиного IgA, про-
дуцируемого плазма-
цитомой МОРС 315,
приводит к отщепле-
нию Cl- и Сн-доме-
нов и сохранению
нерасщепленн ы м и
Vl- и Ун-Доменов,
находящихся между
собой в контакте.
Этот фрагмент по-
лучил название ва-
риабельного — Fv
(см. рис. 15). Белок,
продуцируемый пла-
змацитомой 315, об-
ладает активностью
антидпнитрофенил ь-
ного антитела. Его
Fv-фрагмент полно-
стью сохраняет всю
гаптенсвязывающу ю
активность, прису-
щую нерасщеплен-
ному иммуноглобу-
лину. Эти данные,
полученные Д. Гиво-
ров, находящихся в константном домене лег-
кой цепи; S—S — внутридоменная дисульфид-
ная связь; точками обозначена дополнитель-
ная петля пептидной цепи, имеющаяся в ва-
риабельных доменах; цифрами обозначены
номера аминокислотных остатков
лом с сотрудниками
(D. Givol et al.,
1972), послужили
бесспорным доказа-
тельством того, что
в формировании активного центра антитела участвуют
только Уц- и Уц-домены.
Еще меньшие по размеру осколки молекулы антите-
ла, соответствующие по молекулярной массе только одно-
му домену (13 000± 1200), также способны, хотя и с мень-
шим сродством, связывать антиген. Такие фрагменты
были получены в результате протеолиза папаином дена-
70
Рис. 20. Взаимное расположение доменов легкой и тя-
желой цепей IgG. Заштрихован углеводный компонент,
присоединенный к Сц2-доменам тяжелых цепей
турированных в мочевине Fab-фрагментов IgG кролика
еще до открытия доменной организации иммуноглобули-
нов (А. Кульберг, И. Тарханова, 1962). Эти данные, а
также факт обнаружения в моче осколков молекулы ан-
титела с константой седиментации 1,2S, способных связы-
вать антиген (J. Remington, 1962), явились первым важ-
ным для химии белка доказательством значительной
структурной автономии лигандевязывающих участков
молекулы антитела.
Между доменами в пределах одной цепи существуют
продольные (пли цис), а между доменами прилегающих
цепей — поперечные (латеральные, или транс-) взаимо-
действия. Поперечные взаимодействия сопровождаются
формированием модулей: VL—Vh, Cl—Сн1, СцЗ—СцЗ.
Модуль СнЗ—СнЗ соответствует фрагменту Fc'. Фраг-
мент Fv представляет собой модуль Vl—Vh. О сущест-
вовании модуля Сь—Сн1 помимо данных рентгенострук-
турного анализа свидетельствуют весьма важные для
понимания механизмов самосборки молекулы иммуногло-
булина эксперименты К. Доррингтона с соавторами
(К. Dorrington et al., 1982).
Изолированный Ун-домен моноклонального IgM чело-
века был получен путем расщепления изолированной у-це-
пи по 127-му остатку (полуцистин, участвующий в обра-
зовании связи между у-цепью и L-цепью) в результате
S-цианилирования 2-нитро-5-тиоцианбензойной кислотой.
Изолированный Ун-домен образовывал бимолекулярный
комплекс с L-цепью из аутологичного моноклонального
иммуноглобулина. Величина константы связывания до-
статочно велика: 107 М-1. Но она существенно ниже, чем
в случае взаимодействия изолированных аутологичных
L- и у-цепей: 1010 М-1. Такое увеличение константы свя-
зывания служит несомненным доказательством формиро-
вания модуля Cl—Сн1 и важной роли взаимодействия
этих доменов при самосборке молекулы иммуноглобу-
лина.
Весьма существенно, что домены Cl и Сн1 обеспечи-
вают взаимодействие легких и тяжелых цепей, продуци-
руемых разными клонами плазматических клеток и даже
легких и тяжелых цепей разного видового происхожде-
ния. В то же время вариабельные домены легкой и тяже-
лой цепей взаимодействуют с образованием тандема,
только если они получены из одной и той же молекулы
иммуноглобулина. Такая высокая специфичность взаимо-
действия вариабельных доменов предполагает заметный
72
вклад в этот процесс по крайней мере одного из гиперва-
риабельных участков от каждого домена. Латеральное
взаимодействие доменов происходит главным образом за
счет гидрофобных связей, причем в контактные участки
вхопят остатки триптофана и тирозина.
Для понимания принципов функционирования молеку-
лы иммуноглобулина как единого целого существенно, что
при латеральном взаимодействии доменов контактные
участки меньше по своей протяженности, чем собственно
домен (его длинная ось). Взаимодействующие домены
разноименных цепей повернуты друг к другу под углом.
В свою очередь, расположенные вдоль одной цепи доме-
ны также находятся под углом друг к другу (рис. 20).
Очевидно, они также повернуты вдоль соединяющих их
отрезков цепи приблизительно па 180°. Последнее выте-
кает, в частности, из того факта, что Vl- и Vn-домены
взаимодействуют теми сторонами, которые образованы
тремя антипараллельными р-складкамп, а Сн1 и Сь—
четырехскладчатыми. Все вместе эти особенности чет-
вертичной структуры Fab-участка указывают на сущест-
вование тесного продольного и поперечного взаимодей-
ствия образующих его доменов (R. Polyak, М. Huber,
J. Diesenhoier, 1975—1981).
Рентгеноструктурный анализ со всей очевидностью
свидетельствует о том, что Сн2-домены соседних у-цепей
не контактируют между собой, поскольку в пространстве
между ними расположены две цепочки разветвленных
олигосахаридов, обеспечивающих гидратацию междо-
менного пространства. Вместе с тем существует лате-
ральное взаимодействие между СнЗ-доменами. В свою
очередь, за счет ковалентной сшивки тяжелых цепей ди-
сульфидными связями в районе талии они здесь тесно
сближены между собой. Тем самым в Fc-участке молеку-
лы IgG формируется кольцо, замкнутое с N- и С-конца
Сн2-доменов. Структура имеет напряженный характер, о
чем свидетельствует ряд факторов, обсуждаемых в гл. 6.
Напряженный характер четвертичной структуры IgG,
как и, по-видимому, других иммуноглобулинов, имеет
большое значение для возможности передачи сигнала из
N-концевой части молекулы, где расположен активный
центр, в С-концевую половину (Fc-участок), в пределах
которой находятся центры, ответственные за эффекторные
функции иммуноглобулинов (см. гл. 6). Это особенно
существенно, если учесть, что общая длина молекулы
IgG достигает 24 нм.
73
Когда речь идет о длине молекулы иммуноглобулина
любого класса, включая IgG, необходимо иметь в виду
возможность перемещения в пространстве Fab-участков
относительно друг друга и относительно Fc-участка.
Гибкость молекуле придает район талии. Полипролино-
вые сегменты, будучи относительно ригидными структу-
Рис. 21. «Сшивание»
корпускулярного ан-
тигена (эритроцитов)
бивалентными IgG-
антителами:
Э — эритроцит, на по-
верхности которого ус-
ловно обозначены детер-
минантные группы; мо-
лекулы IgG в составе
комплекса имеют Т-об-
разную форму; Fc-учас-
гок молекулы зачернен.
Fab-участки — заштрихо-
ваны
рами, имеют па флангах гибкие сегменты, о чем убеди-
тельно свидетельствуют данные реитгеноструктурного
анализа. Поскольку ось вращения Fab- и Fc-участков
проходит через район талии, его иногда называют шар-
нирным участком.
В водном растворе молекула IgG имеет У-образную
форму. Угловое расстояние между Fab-участками может
колебаться от 5—10 до 180°. Крайние значения эта вели-
чина принимает, согласно данным электронной микроско-
пии, когда антитела находятся в комплексе с антигеном
или бивалентным гаптеном. Расстояние между Fab-участ-
ками молекулы антитела зависит от молекулярного со-
става комплекса. В точке эквивалентности системы (см.
74
гл. 12) угловое расстояние между Fab-участками наи-
большее, что обеспечивает бивалентным антителам воз-
можность «сшивания» наибольшего числа молекул
антигена (рис. 21).
У иммуноглобулинов различных классов, а в преде-
лах одного класса--у молекул различных подклассов
гибкость далеко пе одинакова и зависит от протяженно-
сти района талии и числа межцепьевых дисульфидных
связей (зависимость носит обратный характер). Не уди-
вительно, что значительной ригидностью характеризует-
ся IgG3, у которого полипролиновый сегмент может до-
стигать в длину 10 нм. Поскольку реализация антпген-
зависимых эффекторных функций иммуноглобулинов
связана в том числе и с гибкостью молекулы, эти свой-
ства у различных иммуноглобулинов неодинаковы (см.
гл. 6).
3.4.	Антигенное строение
иммуноглобулинов
Особенности строения различных
участков молекулы иммуноглобулина, равно как и имму-
ноглобулинов различных классов (подклассов), находят
отражение в их антигенной структуре. Помимо ва жной
роли антигенного анализа иммуноглобулинов для сравни-
тельного изучения их строения и понимания структурных
основ генетически детерминированной неоднородности,
антигенный анализ иммуноглобулинов позволил раскрыть
важные принципы дифференцировки клеток В-ряда и ре-
гуляции иммунного ответа. Наконец, на основе данных об
антигенном строении иммуноглобулинов созданы методы
их качественного и количественного определения, а также
многие так называемые непрямые иммунологические
{серологические) методы (см. гл. 12).
Все антигенные детерминанты иммуноглобулинов
подразделяют на четыре типа. Одни из них характерны
для изотипа иммуноглобулина. Они отражают в своем
строении классоспецпфические особенности иммуногло-
булина данного биологического вида. Другие зависят от
особенностей строения тех участков молекулы иммуно-
глобулина данного класса (подкласса), которыми этот
белок от одного индивидуума данного биологического
вида отличается от белка, синтезируемого другим инди-
видуумом того же вида. Тем самым эти антигенные де-
терминанты характеризуют аллотип иммуноглобулина.
75
Третьи антигенные детерминанты отражают те особен-
ности строения иммуноглобулина, которыми белок, про-
дуцируемый одним клоном клеток, отличается от белка
того же класса (подкласса), продуцируемого другим
клоном клеток того же индивидуума. Эти детерминанты
определяют идиотип, иммуноглобулина. Наконец, чет-
вертый тип антигенных детерминант характеризует наи-
более общие, независимые от индивидуальной или клено-
вой принадлежности свойства иммуноглобулинов данного
вида, принадлежащие к любому классу (подклассу). Эти
детерминанты характеризуют вариотип иммуноглобули-
нов. Ниже рассматриваются способы выявления, локали-
зации и строение перечисленных антигенных детерминант.
Изотипические детерминанты. Для выявления этих де-
терминант получают антитела, иммунизируя соответст-
вующими иммуноглобулинами данного вида особей друго-
го биологического вида. Тем самым выявляются различия
в строении соответствующих иммуноглобулинов донора и
реципиента. Из этого вытекает, что чем более удалены
друг от друга на эволюционной лестнице донор и реципи-
ент, тем большее число изотипических детерминант удаст-
ся выявить в иммуноглобулине донора. Так, для наиболее
полного анализа изотипа иммуноглобулинов млекопита-
ющих следует получать антитела против них, иммунизи-
руя птиц. На практике однако чаще используют анти-
изотипические сыворотки млекопитающих. При этом для
анализа того или иного иммуноглобулина целесообразно
использовать антисыворотки от различных в видовом от-
ношении реципиентов. Видовые различия в ответе на
изотипические детерминанты отчетливо видны из следую-
щего примера: при иммунизации козы IgG кролика обра-
зуются почти исключительно антитела против детерми-
нант Fc-участка молекулы; при иммунизации тем же бел-
ком осла образуется примерно равное количество антител
против Fab- и Fc-участков молекулы.
Если иммунизировать кролика высокоочищенным IgG
человека, то полученная антисыворотка будет содержать
антитела двух основных типов. Одни из пих направлены
к детерминантам, имеющимся только в IgG человека, в
то время как другие распознают детерминанты, общие
для иммуноглобулинов человека различных классов.
Структурное сходство иммуноглобулинов, оказывающее
наибольшее влияние на их антигенное родство, определя-
ется легкими цепями, общими, как известно, у всех имму-
ноглобулинов. После специфической адсорбции антисыво-
76
ротки изолированными легкими цепями в ней остаются
почти исключительно антитела против детерминант, ха-
рактерных для IgG. Эти детерминанты расположены в
пределах константного района тяжелой цепи. В адсорби-
рованной легкими цепями антисыворотке могут содержать-
ся в небольшом количестве антитела против детерминант
Ун-райопа, определяемых строением как гипервариабель-
пых, так и консервативных участков. Ниже мы оста-
новимся на их точной локализации и строении. Наконец,
в антисыворотке гетерологичного животного содержатся
.антитела против детерминант IgG, в формировании кото-
рых участвуют как легкая, так и тяжелая цепи. Естест-
венно, такие детерминанты разрушаются при разделении
разноименных цепей, в силу чего антитела против них
нельзя удалить путем адсорбции антисыворотки только
изолированными легкими цепями. В связи со сказанным,
наиболее специфичный для IgG набор антител может
быть получен после адсорбции антисыворотки против IgG
с помощью Fab-фрагментов. Остающиеся антитела будут
направлены только против детерминант, локализованных
в пределах Fc-фрагмента.
Из сказанного логично заключить, что высокоспеци-
фшчную для IgG, равно как и для иммуноглобулинов дру-
гих классов, антисыворотку целесообразно получать, ис-
пользуя в качестве антигена изолированные Fc-фрагмен-
ты. Однако практически это нецелесообразно ввиду того,
что Fc-фрагмент, полученный, например, с помощью па-
паина, очень трудно отделить от примеси Fab-фрагментов.
Напротив, получение Fab-фрагментов, свободных от при-
меси Fc-фрагментов, не встречает больших трудностей.
Таким образом, антисыворотка против детерминант,
строго характеризующих данный изотип иммуноглобули-
на, т. е. уникальные для иммуноглобулина данного клас-
са (подкласса) видовые особенности, содержит антитела,
реагирующие с детерминантами С-концевой половины тя-
желой цепи 1. Такую антисыворотку называют моноспеци-
фической.
При получении моноспецифических антисывороток
против иммуноглобулинов человека в качестве антигенов
используют белки от больных множественной миеломой.
В сыворотке таких больных в большом количестве содер-
1 Сн1-домен, входящий в состав Fab-фрагмента, также несет
изотипические детерминанты, но в целях получения строго специфич-
ной антисыворотки антителами к ним часто приходится пренебречь.
77
жатся иммуноглобулины определенного класса (подклас-
са), не отличающиеся по своему строению (в том числе
антигенному) от соответствующих нормальных иммуно-
глобулинов. Использование сывороток больных множест-
венной миеломой значительно облегчает получение в чис-
том виде иммуноглобулинов и практически решает задачу
получения иммуноглобулинов, содержащихся в норме в
следовых количествах (IgD, IgE). При получении анти-
сывороток против иммуноглобулинов мыши, как правило,
используют в качестве антигенов моноклональные имму-
ноглобулины, продуцируемые клетками перевиваемых
мышиных плазмацитом. Аналогично получению антисыво-
роток против иммуноглобулинов человека для получения
моноспенифпческпх сывороток против мышиных иммуно-
глобулинов их адсорбируют легкими цепями или Fab-
фрагментамп.
Мопоспецпфпческпе гетерологичные антисыворотки
против иммуноглобулинов человека нашли самое широ-
кое применение для количественного определения этих
белков в норме и патологии. При определении трех основ-
ных классов: IgG, IgM и IgA — применяют метод ради-
альной иммунодиффузии; IgD и IgE определяют с помо-
щью радиоиммунного или иммуноферментного метода (см.
гл. 12).
Большая степень гомологии первичной структуры у
одноименных иммуноглобулинов близких в эволюцион-
ном отношении биологических видов находит свое отра-
жение в сходстве части их антигенных детерминант. Так,
кроличьи антитела против IgG человека эффективно пе-
рекрестно реагируют с IgG обезьяны и менее эффектив-
но с IgG лошади и крысы. Подобные перекрестные ре-
акции используют для выявления иммуноглобулинов,
содержащихся в сыворотке в следовых количествах, на-
пример IgE. Для выявления этого белка у лабораторных
животных используют антисыворотку против миеломно-
го IgE человека.
Моноспецифические антисыворотки против изотипи-
ческих детерминант иммуноглобулинов человека наш пи
важную область применения при сравнительном анти-
генном анализе иммуноглобулинов сыворотки крови и
антигенсвязывающих рецепторов лимфоцитов (см. гл. 9).
Ниже рассматривается вопрос об антигенном строе-
нии легких цепей и его связи с первичной структурой.
Антитела против легких цепей человека могут быть
получены как при иммунизации изолированными из мо-
78
лекулы иммуноглобулина цепями, так и при использова-
нии в качестве антигена белков Бенс-Джонса. Послед-
ние представляют собой мономеры или димеры легких
цепей, содержащиеся в моче некоторых больных множе-
ственной миеломой; такие опухолевые клетки способны
синтезировать в большом избытке легкие цепи и секре-
тировать их.
	112		114		152		163		190	216
	Л 1а		Ser		Ser		Tyr		Arg	
											с о о H
										
	Ala		Ser		Gly		Tyr		Arg	
										COOH
										
	Ala		Ser		Ser		Tyr		Lys	
										COOH
										
	Leu		Tyr		Gly		Lys		Arg	
											COOH
<
Рис. 22. Аминокислотные замены, соответствующие изотипическим
маркерам Л-цепей иммуноглобулинов человека
В иммуноглобулинах человека имеются четыре ва-
рианта Z-цепей, отличающихся определенными антиген-
ными детерминантами. Эти детерминанты можно выя-
вить с помощью гетерологичных антисывороток, которые
не дают перекрестных реакций. Указанные детерминан-
ты не имеют ничего общего с аллотипическими (см. ни-
же), так как все четыре варианта найдены у всех людей.
На рпс. 22 представлены данные о различиях в ами-
нокислотной последовательности константных районов
Z-цепей каждого из различающихся в антигенном отно-
шении вариантов. Различия найдены только в пяти пози-
циях. Специфичность двух антигенных маркеров — де-
терминант Kern и Oz— определяется заменами в пози-
циях 152 и 190 соответственно. Если в позиции 152 на-
ходится глицин, цепь имеет детерминанту Kern ( + ). Ес-
ли в той же позиции находится серин, то Kern (—). Ана-
логично лизину в позиции 190 соответствует детерминан-
та Oz ( + ), а аргинину — Oz-(—). Поскольку, как указы-
валось, все варианты Z-цепей присутствуют у каждого
индивидуума, им должны соответствовать четыре одно-
временно функционирующих структурных Cz-гена.
Аллотипические детерминанты. Антигенные детерми-
мпнанты, структура которых определяется аллельными
79
различиями в строении иммуноглобулинов, получили
название аллотипических. Аллотипы отражают генетиче-
ски контролируемый полиморфизм иммуноглобулинов,
в силу которого идентичные иммуноглобулины одного
видового происхождения, но принадлежащие различным
индивидуумам, различаются по своему строению.
Для выявления аллотипических детерминант можно
получить антисыворотку, иммунизируя определенным
иммуноглобулином одного животного другое животное
того же вида, отличающееся от донора по генотипу. Так
как каждая молекула иммуноглобулина имеет несколько
различных аллотипических детерминант (или аллотипи-
ческих маркеров), для получения антисыворотки только
против одного маркера реципиент должен содержать
все аллотипические маркеры донорского иммуноглобули-
на, за исключением этого маркера. При изучении алло-
типов генетически однородных животных (например, ли-
нейных мы,шей) мышей одной линии иммунизируют им-
муноглобулином мышей другой линии.
Антитела против аллотипических детерминант могут
содержаться также в гетерологичных антисыворотках.
Чтобы такая антисыворотка приобрела свойства анти-
аллотипической, из нее методом специфической сорбции
должны быть удалены антитела против изотипических
антигенных детерминант, характерных для иммуногло-
булина данного класса. Для адсорбции в качестве анти-
гена может быть использован иммуноглобулин того же
класса и видового происхождения, но от индивидуума,
отличающегося по аллотипу от тестируемого иммуно-
глобулина. В качестве антигенов для получения антиал-
лотипических сывороток часто служат моноклональные
миеломные иммуноглобулины определенного класса, изо-
лированные полипептидные цепи или фрагменты, полу-
ченные путем протеолиза.
Изучение аллотипов иммуноглобулинов в сочетании с
данными о первичной структуре составляющих их поли-
пептидных цепей сыграло большую роль в понимании
организации структурных генов для иммуноглобулинов.
В свою очередь, знание аллотипических маркеров имму-
ноглобулинов весьма существенно для ряда областей
прикладной иммунологии. Ниже кратко излагаются све-
дения об аллотипических маркерах иммуноглобулинов
человека, кролика и мыши.
Иммуноглобулины человека. Маркеры обнаружены в-
Сь-районе х-цепи, Си-районах тяжелых цепей IgG, IgM,
80
IgA и их подклассах. Маркеры легих цепей получили
название Inv.
Ниже приведены обозначения аллотипических марке-
ров тяжелых цепей иммуноглобулинов человека:
Тип цепи	Маркер
х . . .	.	Inv
X .... Не установлен
Yi—Y4 .	.	Gm
di .... Не установлен
СН1	Сн2
Тип цепи Маркер
а.2	... .	Am
ц	....	Mml
6	.... Не установлен
в	. . . .	»	»
С»3
IgGl
Gm(4)
Gm(17)
Gm(l) Gr..(-1)
Gm(2)
Gm (23)
Gm (-23)
IgG3
Gm(5) Gm(—5)
Gm(15)
Gm(21) Gm(~21)
Gm(6) Gm(13)
Gm(ll) Gm(—11)
Gm (14)
IgG 4
Gm(4a) Gm(4b)
Рис. 23. Локализация Gm-маркеров в константных доменах тяжелых
цепей IgG человека различных подклассов
Рисунок 23 дает представление о локализации алло-
типических маркеров в доменах константного района тя-
желых цепей у различных подклассов IgG. Каждому
подклассу присущ характерный набор Gm-факторов
(маркеров). Некоторые маркеры идентичны в различных
подклассах. Каждому маркеру Gm-системы, как и мар-
81
керам системы Inv, соответствуют определенные особен-
ности первичной структуры. Их удается выявить в каж-
дом из трех доменов у-цепи. Различия аминокислотной
последовательности, связанные с определенными
Gm-маркерами, выражаются в заменах единичных ами-
нокислотных остатков. Так, например, детерминанте
Gm(4) соответствует в позиции 214 (Сн1 -домен) остаток
аргинина, а детерминанте Gm(17)—остаток лизина.
В позиции 358 (СнЗ-домен) IgGl с детерминантой
Gm(l) имеет остаток лейцина, а аллельный вариант то-
го же иммуноглобулина с детерминантой Gm(—1) —ос-
таток метионина. Структура части Gm-маркеров, распо-
ложенных в СнЬдомене — Gm(4) и Gm(17), зависит от
конформирующего влияния прилегающего константного
домена легкой цепи. Напротив, структура детерминант,
расположенных в С-концевых половинах тяжелых цепей
(образующих Fc-фрагмент), не зависит от влияния од-
ноименной цепи. Это не удивительно для детерминант,
локализованных в Сц2-домене, поскольку одноименные
домены двух цепей не контактируют друг с другом (см.
раздел 2.3). Однако СнЗ-домены образуют устойчивый
домен подобно тандему Сн1—Сь- При этом следует
иметь в виду, что, судя по данным рентгеноструктурного
анализа, сама компактность упаковки отдельных кон-
стантных доменов неодинакова. Это, по-видимому, и оп-
ределяет вклад прилегающего домена (иными словами,
латерального взаимодействия) в структуру аллотипичес-
кой детерминанты. Обсуждаемые данные, равно как и
приводившиеся выше о зависимости первичной структу-
ры цепей и их аллотипической специфичности, не остав-
ляют сомнений в том, что детерминанты, определяющие
аллотип, принадлежат к числу конформационнозависи-
мых.
Изучение аллотипической специфичности IgM пока-
зало, что его маркер Mml представляет собой детерми-
нанту, структура которой зависит от взаимодействия
двух прилегающих друг к другу ц-цепен. Изолированные
р-цепи не реагируют с анти-Mml антителами. IgA2, в мо-
лекуле которого обнаружена аллотипическая детерми-
нанта Ат(1) и ее аллельный вариант Ат(—1), имеет
необычную для иммуноглобулинов структуру: дисуль-
фидные связи между легкими и тяжелыми цепями от-
сутствуют, но сами легкие цепи связаны дисульфидным
мостиком (см. раздел 2.1). Существует ли связь между
этими особенностями четвертичной структуры IgA2 и его
82
аллотипической специфичностью, не известно; она не ис-
ключена, если учесть, что один из аллотипических мар-
керов этого белка — А2т(2) находится в пределах
N-концевой половины a-цепи и, следовательно, может
испытывать на себе влияние легкой цепи.
В легких цепях иммуноглобулинов человека аллоти-
пические маркеры обнаружены только в х-цепях. Их на-
зывают, как уже упоминалось, Inv-факторами. Описаны
три Inv-фактора, причем у большинства индивидуумов
маркер Inv(l) сцеплен с маркером Inv(2). Напротив,
маркеры Inv(l) и Inv(3) не удается обнаружить в одной
и той же х-цепи.
Установлена взаимосвязь между особенностями пер-
вичной структуры х-цепи (ее константного района) и ти-
пом Inv-фактора. В случае маркеров Inv(l, 2) в позиции
191 находится лейцин, а в случае Inv(3) — валин. Не-
смотря на гомологичность замены (в обоих случаях ами-
нокислоты с алифатическим радикалом), конформация
участка цепи, несущего детерминанту, или соседних
участков, по-видимому, не одинакова. В результате это-
го, возможно, происходят опредетенные изменения участ-
ка цепи, посредством которого она 'взаимодействует с
тяжелой цепью. Влияние последней на структуру
Inv-детерминант весьма велико, так как для выявления
этих детерминант в изолированных легких цепях требу-
ется в пять раз большая их молярная концентрация по
сравнению с интактным IgG.
Хотя легкие цепи у иммуноглобулинов одного класса
и подкласса в пределах одного вида одинаковы, их спо-
собность в составе молекулы иммуноглобулина индуци-
ровать образование антител различна. Так, среди под-
классов IgG она наименее выражена у IgG2 и IgG4. На
этом основании можно заключить, что в различных под-
классах IgG константный домен легкой цепи в разной
степени испытывает на себе влияние Сн1 -домена, что за-
висит от тонких особенностей их конформации. Так ан-
тигенный анализ позволяет более глубоко проникнуть в
тайну структурной организации иммуноглобулинов.
Иммуноглобулины кролика. Для х- и Х-цепей иммуно-
глобулинов кролика характерно наличие двух разных
групп маркеров: b и с, которые не имеют между собой
антигенного родства. Около 70—90% всех иммуноглобу-
линов у кролика содержат легкие цепи х-типа; в их со-
ставе выявлено четыре аллотипических маркера: Ь4, Ь5,
Ь6, Ь9. Структура двух последних сходна. Фактически
83
каждому из указанных маркеров соответствует несколь-
ко антигенных детерминант в пределах одной цепи. Экс-
прессия аллотипов группы b подчиняется у здоровых
кроликов следующей количественной закономерности:
Ь4>Ь5>Ь6>Ь9. Аллельным вариантам х-цепей кролика
соответствуют многочисленные аминокислотные замены
в пределах константного района.
Маркеры л-цепи кролика — С7 и С21 контролируются
генами, которые, видимо, тесно сцеплены. Однако оба
маркера никогда не выявляются в пределах одной и той
же цепи, что несомненно указывает на существование
двух аллельных форм С^-гена.
Определение аллотипических маркеров очищенных
антител гетерозиготного кролика имеет существенное
значение для оценки степени их однородности. Если ан-
титела содержат легкие цепи одного типа и с единствен-
ным аллотипическим маркером, это служит важным сви-
детельством участия в синтезе антител одного или всего
нескольких клонов клеток.
Для тяжелых цепей иммуноглобулинов кролика ха-
рактерны две группы аллотипических маркеров. Одна из
них локализована в Vn-районе и контролируется тремя
аллельными генами: al, а2 и аЗ. Соответствующие им
детерминанты можно обнаружить практически в 90%
тяжелых цепей иммуноглобулинов различных классов.
Наиболее характерные для указанных маркеров амино-
кислотные замены приходятся на участок цепи, включа-
ющий 29 остатков с аминоконца. Как известно (см. раз-
дел 2.2), в пределах этого сегмента находится один ги-
первариабельный участок. Однако аллотипические де-
терминанты находятся, естественно, вне этого участка,
ибо в противном случае их структура отражала бы не
индивидуальный полиморфизм генов особей данного ви-
да, а клоноспецифическую гетерогенность иммуноглобу-
линов, т. е. их идиотип (см. ниже).
Сведения об аллотипических маркерах иммуноглобу-
линов кролика и их локализации (табл. 4) служат неза-
висимым подтверждением полигенного контроля за их
синтезом (см. гл. 5). Ведь только для Сграйона сущест-
вуют две независимые группы маркеров, ассоциирован-
ных с участками молекулы, значительно отличающимися
и по первичной, и по пространственной структуре. Анти-
генная специфичность маркеров группы d определяется
как аминокислотными заменами в позиции 225, так и
расположенной в районе талин дисульфидной связью
81
Таблица 4. Аллотипы иммуноглобулинов кролика
Локус	Детерминанты	Класс имму- ноглобулина		Локализация
а	al, а2, аЗ	Все классы		Вариабельный район Н-цепи
х, У	х32, v33	»	»	То же
Ь	Ь4, Ь5, Ь6, Ь9	»		Константный район и-цепп
с	с7, с21	»	»	Константный район Z-цепи
d	dll, dl2	IgG		Константный район у-цепи	(участок «талии» молекулы IgG)
е	е14, elo	»		Константный район у-цепи (Fc-участок молекулы IgG)
f	169, 170, 171, 172, 173	IgA		Константный район а-цепи
g	g74, g75, g76, g77	»		То же
?1	Msl, Ms2, Ms4, Ms5, Ms6	IgM		Константный район ц-цепп
?1	n81, n82	»		То же
* Локус неизвестен.
между тяжелыми цепями. Зависимость структуры анти-
генных детерминант, соответствующих d маркеру, от
межцепьевой дисульфидной связи указывает на несом-
ненное кооперативное взаимодействие тяжелых цепей в
районе талии независимо от своеобразия их первичной
структуры (см. раздел 2.3). Существование такого взаи-
модействия подтверждает также рентгеноструктурный
анализ.
Гены, контролирующие аллотнпические маркеры ва-
риабельного и константного районов тяжелой цепи,
тесно сцеплены между собой, что согласуется с данны-
ми о нахождении структурных генов для обоих районов
в одной и той же хромосоме (см. гл. 5).
Аллотипические детерминанты Сц- и Са-районов конт-
ролируются аллельными генами двух независимых локу-
сов каждый. В свете современных представлений об ор-
ганизации структурных генов для тяжелых цепей (см. гл.
5) это означает, что М- и n-маркеры ц-цепи и f- и g-мар-
керы a-цепи расположены в различных константных до-
менах соответствующих цепей, а их синтез контролиру-
ется различными сегментами Сц- и Са-генов. Как и для
85
у-цепей, для ц- и a-цепей характерно тесное сцепление
маркеров вариабельных и константных районов.
Иммуноглобулины мыши. Данные об аллотипических
маркерах иммуноглобулинов мыши приведены ниже.
Тип цепи	Маркеры
z..................Не	установлены
л.................. »	»
Yj	4а-1)1 с> е- 11
у2а.............	]а,	Ь,	с, е,	f, g, h
y2'b .......	3а.	ь.	е, d.	f. g. h
Тз	Не	установлены
.	2a’	b>	c-	e- n g- b
6................5a-	b
,u...............6a>	b
Почти все идентифицированные маркеры находятся в
С-концевых половинах молекул. Структура маркеров
каждого из подклассов IgG контролируется генами раз-
личных локусов. Гены каждого локуса определяют струк-
туру большого числа детерминант (например, Ig-1 ло-
кус— более десяти). Мыши различных линий могут
иметь несколько идентичных детерминант. Если мыши
двух разных линий содержат одинаковый маркер в под-
классе IgGl, у них будут также одинаковые маркеры в
подклассах IgG2a, IgG2b, IgA. На этой основе построена
номенклатура аллелей локусов Ig-1, Ig-2, Ig-3, Ig-4, с ко-
торой можно часто встретиться в литературе. Так, на-
пример, если все линии мышей с аллелями Ib-la, Ig-lc,
Ig-lh локуса Ig-1 идентичны по специфичности с детер-
минантами локуса Ig-З, аллель этого локуса обозначает-
ся как Ig-3a’c>h. О чем свидетельствует указанная зако-
номерность? Прежде всего о том, что все семейство
С-генов эволюцинирует как единое целое, причем важ-
ным групповым признаком семейства служат аллотипиче-
ские маркеры. Осуществляя селекцию как лабораторных,
так и сельскохозяйственных животных, даже по одному
аллотипическому маркеру константного района иммуно-
глобулинов можно судить о степени близости новой ли-
нии (породы) прототипу. Это один из примеров того,
сколь существен может быть вклад молекулярной имму-
нологии 1 в современную биологию и сельское хозяй-
ство.
1 Нашими знаниями аллотипов иммуноглобулинов мы обязаны
многим исследователям, но прежде всего Ж. Удену (J. Oudin),
Р. Граббу (R. Grubb), С. Дрею (S. Dray), А. Келусу (A. Kelus),
Л. Герценбергу (L. Herzenberg), С. Селу (S. Sell).
86
Идиотипические детерминанты. Термин идиотип, впер-
вые введенный Ж. Уденом (J. (Dudin, 1966), обозначает
индивидуальную антигенную специфичность антител,
миеломных белков и белков Бенс-Джонса. Антигенные
детерминанты этого типа (идиотипические детерминан-
ты) могут быть выявлены с помощью гетерологичных, го-
мологичных и изологичных (аутологичных) антител.
Приведем в качестве примера способ получения гетеро-
логичных антител.
Если иммунизировать кролика индивидуальными мие-
ломными иммуноглобулинами человека, образуются ан-
титела, реагирующие как с иммуноглобулином, исполь-
зованным для иммунизации, так и с другими миеломны-
ми белками и нормальными иммуноглобулинами челове-
ка. После адсорбции этой антисыворотки использован-
ным для иммунизации антигеном она полностью утрачи-
вает способность реагировать с любым иммуноглобули-
ном человека. Однако в случае адсорбции антисыворот-
ки смесью нормальных иммуноглобулинов или смесью
разнообразных индивидуальных миеломных белков, в
числе которых нет иммуноглобулина, использованного в
качестве антигена, полного извлечения из антисыворотки
всех антител не произойдет. В ней останутся антитела,
реагирующие только с тем иммуноглобулином, который
использовали в качестве антигена. Антигенные детерми-
нанты, к которым направлены эти антитела, расположе-
ны в Fab-участках молекулы иммуноглобулина, а точ-
нее — в пределах вариабельных доменов легкой и тяже-
лой цепей.
Уникальность строения идиотипической детерминан-
ты определенного миеломного белка иммуноглобулино-
вой природы была установлена при использовании анти-
идиотипической сыворотки для сравнительного анализа
большого числа индивидуальных миеломных иммуногло-
булинов. Так, в частности, исследовали 160 иммуногло-
булинов, продуцируемых перевиваемыми плазмацитома-
ми мышей линии BALB/c. Кроличья антиидиотипичес-
кая сыворотка была получена к одному из белков, входя-
щему в число изучаемых. Ни один из иммуноглобулинов,
кроме того, который использовали для иммунизации, и
еще одного, не реагировал с данной антисывороткой.
Как оказалось, перекрестно реагирующие два из 160 бел-
ков имели как антитела идентичные лигандсвязывающие
свойства — оба реагировали с пневмококковым полиса-
харидом одинакового строения.
87
Для оценки идиотипической специфичности антител
кролика использовали гетерологичные и гомологичные
антисыворотки. Последние получали, вводя повторно
кроликам-реципиентам очищенные антитела определен-
ной специфичности от индивидуальных доноров. Подби-
рали доноров и реципиентов таким образом, чтобы они
совпадали по основным аллотипам иммуноглобулинов
(последнее желательно, чтобы избежать процедуры ад-
сорбции антисыворотки нормальными иммуноглобулина-
ми донора). Показано, что антитела одной и той же
специфичности, но от разных доноров различаются
строением идиотипических детерминант.
Вместе с тем миеломные белки от различных индиви-
дуумов, специфически реагирующие с одним и тем же ан-
тигеном, могут иметь в ряде случаев сходные идиотипы.
Так, кроличья антисыворотка против антител к пара-
азофениларсонату, полученных от одной из мышей линии
A/J, реагировала с антителами той же специфичности
многих мы.шей этой линии.
Значительный интерес представляет возможность по-
лучения антител к идиотипическим детерминантам
аутологичных иммуноглобулинов. В одном из подоб-
ных экспериментов в качестве антигена служили
Р(аЬ,)г-фрагмеиты кроличьих антител против пара-ами-
нофенил-Х’-триметиламмония. Фрагменты антител от ин-
дивидуальных доноров полимеризовали глутаральдеги-
дом и вводили тем же кроликам спустя 6 месяцев после
получения антисывороток. В этот период у животных
уже не удавалось обнаружить антител указанной специ-
фичности. Методом непрямой преципитации с радиоме-
ченым антигеном (см. гл. 12) у каждого из подопытных
кроликов были обнаружены антитела против Р(аЬ')г-
фрагментов собственных антител. Поскольку эти анти-ан-
титела не реагировали с Р(аЬ')2-фрагментами антитела
в присутствии специфического гаптена, можно было за-
ключить, что они направлены к детерминантам непосред-
ственно в районе активного центра антитела. Именно в
этом районе находятся детерминанты, определяющие
идиотип иммуноглобулина (L. Rodkey, 1974).
Важный факт установили Л. Клюскенс и Г. Кёлер
(L. Kluskens, Н. Kohler, 1974) при исследовании сыворо-
ток мышей BALB/c, многократно иммунизированных
пневмококком R3GA (так называемый фосфорилхолино-
вый антиген). В сыворотке одновременно выявлялись как
антифосфорилхолиновые антитела, так и анти-антитела
88
со свойствами антиидиотипических, т. е. направленных к
детерминантам в Fab-фрагменте.
Как в гетерологичной, так и в изологичной антиидио-
типической сыворотках содержатся антитела к детерми-
нантам, находящимся непосредственно в активном цент-
ре антитела, а также детерминантам, удаленным от него.
Первые из указанных анти-антител не взаимодействуют
с антителом после блокирования его активного цент-
ра гаптеном. Используя этот методический прием, уда-
лось показать, что в гетерологичной антисыворотке свы-
ше 90% антител направлено к детерминантам, удален-
ным от активного центра, в то время как в изологичной
антисыворотке содержатся преимущественно анти-анти-
тела к детерминантам, непосредственно примыкающим к
активному центру. Следовательно, гетерологичные и изо-
логичные антиидиотипические антитела направлены к
различным, хотя и близко расположенным детерминан-
там.
Исследование изолированных полипептидных цепей
иммуноглобулинов и реконструированных из них моле-
кул указывает на то, что большинство идиотипических
детерминант образовано при участии как легкой, так и
тяжелой цепи. В частности, установлено, что изолирован-
ные легкие цепи миеломного иммуноглобулина не реаги-
руют с антителами, полученными против идиотипических
детерминант целой молекулы белка. При реконструкции
молекулы из изолированных цепей структура идиотипи-
ческих детерминант восстанавливалась только в том слу-
чае, если легкие и тяжелые цепи принадлежали иммуно-
глобулину, который служил антигеном при получении
антиидиотипической сыворотки. Последнее не удивитель-
но в свете уже обсуждавшейся в разделе 3.3 работы
К. Доррингтона, в которой было показано, что при рекон-
струкции молекулы иммуноглобулина из легких и тяже-
лых цепей, взятых из разных молекул (разных монокло-
нальных иммуноглобулинов), связывание легкой цепи
идет за счет ее константного домена, а вариабельные до-
мены легкой и тяжелой цепей не взаимодействуют меж-
ду собой.
Идиотип иммуноглобулина подобно другим особенно-
стям его строения определяется в конечном счете амино-
кислотной последовательностью образующих идиотипи-
ческую детерминанту участков полипептидных цепей.
Эти участки, несомненно, расположены в вариабельных
районах тяжелой и легкой цепей и у иммуноглобулинов
89
со сходной идиотипической специфичностью имеют сход-
ную или тождественную первичную структуру. Это нахо-
дит подтверждение в многочисленных данных, в том чис-
ле полученных Дж. Капра и Дж. Кейе (J. Capra, J. Kehoe,
1975). Исследовали два моноклональных иммуногло-
булина М и G класса, . продуцируемых одним клоном
плазматических клеток. Белки совпадали по идиотипиче-
ской специфичности и не имели никаких различий в ами-
нокислотной последовательности гипервариабельных рай-
онов тяжелых цепей. У этих белков совпадала также по-
следовательность 38 аминокислотных остатков аминокон-
цевых участков легких цепей. То, что иммуноглобулины
двух различных классов, продуцируемые одной клеткой,
должны обязательно иметь идентичные вариабельные
районы, представляется сегодня единственно возможным
в свете наших знаний об организации структурных генов
иммуноглобулинов и их перегруппировках (см. гл. 5).
Мы не заканчиваем здесь обсуждение проблем идио-
типии и продолжим его в гл. 10.
Вариотипические детерминанты (framework determi-
nants). Термин был предложен Ю. Бен-Нейрахом, П. Ло-
наи с соавторами (Y. Ben-Neriah, Р. Lonai et al., 1978)
для обозначения описанных ими детерминант вариабель-
ных доменов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов
мы,ши, структура которых в отличие от идиотипических
определяется не гипервариабельными, а инвариантными
(консервативными) участками последовательности. Ан-
титела можно получить в результате иммунизации кро-
ликов изолированными вариабельными доменами обеих
цепей. Последние получают из Fv-фрагмента. Чем заме-
чательны вариотипические детерминанты? Тем, что они
идентичны в антителах самой различной специфичности,
полученных у животных одного вида. Тем, что локализу-
ются в контактных участках доменов и поэтому антите-
ла к ним не реагируют ни с одним из иммуноглобулинов.
Они не реагируют также с изолированными Fab-фраг-
ментами, взаимодействуя только с изолированными ва-
риабельными доменами. Вариотипические детерминанты
образованы, видимо, короткими (из пяти — семи остат-
ков) отрезками пептидных цепей. Вопрос о биологиче-
ской значимости таких детерминант и антител к ним
только предстоит установить.
ГЛАВА
Активный центр
антитела
Активным центром антитела называют
участок молекулы, пространственно комплементарный
детерминантной группе антигена (гаптена). Комплемен-
тарность (пространственное соответствие) активного
центра антигенной детерминанте обеспечивает большое
число нековалентных связей, возникающих между ли-
гандом и образующими активный центр отрезками пеп-
тидных цепей антитела. Эти нековалентные связи стаби-
лизируют комплекс. Хотя между детерминантной груп-
пой (гаптеном) и аминокислотными остатками в актив-
ном центре не возникают ковалентные связи, однако за
счет большого числа слабых связей образуется относи-
тельно мало диссоциирующий комплекс. В силу этого
равновесие в системе антиген-антитело сильно смещено
вправо:
Аг4~Ат^АгАт,	(1)
где Аг — антиген, Ат — антитело.
Если принять во внимание, что антигены поливалент-
ны, т. е. содержат в молекуле несколько идентичных де-
терминантиых групп, а антитела как минимум бивалент-
ны, становится очевидным второй важный фактор ста-
бильности формирующихся комплексов антиген-антите-
ло. Согласно второму закону термодинамики
AF = AH-TAS,	(2)
где AF — изменение свободной энергии системы в ходе
реакции, АН — изменение энтальпии, или общей энергии,
AS—изменение энтропии (мера неупорядоченности си-
стемы). В ходе реакции антиген-антитело в силу взаимо-
действия по нескольким точкам возрастает роль энтро-
пийного члена, поскольку в момент диссоциации по од-
ной точке комплекс остается стабильным за счет связи
по другим точкам. Подробнее термодинамические осо-
бенности реакции антиген-антитело рассматриваются
ниже.
91
4.1.	Организация активного центра
Активный центр, или антидетерминанта,
представляет собой щель, расположенную между вариа-
бельными доменами легкой и тяжелой цепей. Оба доме-
на участвуют в формировании антидетерминанты. Вклад
•каждого из них не одинаков, о чем можно судить по
сравнительному изучению антиген (гаптен)-связываю-
щих свойств изолированной легкой цепи и аминоконцевой
половины тяжелой цепи (Fab-фрагмент), выделенных из
какого-либо антитела. Изолированные легкие цепи прак-
тически не связывают антиген (гаптен). Fd-фрагменты 1
антител, растворимость которых повышена за счет кар-
боксиметилирования части аминогрупп монойодацетатом
(А. Кульберг, И. Тарханова, 1968) или присоединения
коротких цепочек полиаланина — полиаланилирования
(J. С. Jaton et al., 1968), специфически связывают анти-
ген или гаптен. Однако связывающая способность Fd-
фрагмента намного уступает таковой Fab-фрагмента и
даже Fv-фрагмента.
История изучения строения антидетерминанты вклю-
чает несколько этапов. Первый этап, начавшийся откры-
тием Р. Портером (R. Porter) в 1958—1959 гг. Fab-фраг-
ментов, увенчался доказательством выраженной струк-
турной автономии участка молекулы, образующего ак-
тивный центр: получен в изолированном виде низкомо-
лекулярный фрагмент антитела, сохраняющий по край-
ней мере частично антигенсвязывающие свойства
(А. Кульберг, И. Тарханова, 1962). Размеры этого фраг-
мента (13 000+1000) полностью совпадают с размерами
изолированного домена, установленными Д. Инбаром
(D. Inbar) с соавторами только в 1972 г. Важно подчер-
кнуть, что получить меньшие по размеру лигандсвязы-
вающие фрагменты молекулы антитела невозможно. Но
это стало понятно лпщь теперь, когда выяснилось, во-
первых, что домен — очень компактное структурное об-
разование, во-вторых, что в образовании антидетерми-
нанты участвуют гипервариабельные участки, разбросан-
ные по всей длине отрезка цепи, сформированного в ва-
риабельный домен.
Второй этап изучения антидетерминанты — доказа-
тельство самосборки активного центра при реконструк-
ции молекулы антитела из изолированных цепей
1 Fd-фрагмент — аминоконцевая половина тяжелой цепи.
92
(Ф. Франек, Р. Незлин, 1964; J. Edelman, 1963). Тогда
же была продемонстрирована возможность спонтанной
реконструкции антидетерминанты из полипептидных
цепей, развернутых предварительно под влиянием дена-
турирующих агентов в присутствии восстановителей
(М. Fridman, М. Sela, 1966). Именно с этого момента
можно считать окончательно утратившими значение
идеи о прямом участии антигена (гаптена) в формирова-
нии полости антидетерминанты.
Третий этап—создание метода «метки по сродству»
с целью идентификации аминокислотных остатков непо-
средственно в активном центре (L. Wofsy, И. Metzger,
S. Singer, 1962—1964). Сущность метода состоит в том,
что гаптен в форме реакционноспособного производного,
связываясь с высокой скоростью в активном центре спе-
цифичного к нему антитела, обеспечивает взаимодейст-
вие реакционноспособной группы с радикалами непос-
редственно в активном центре.
Рис. 24 схематически иллюстрирует механизм метки
по сродству на примере азопроизводного динитрофениль-
ной группы. К настоящему времени синтезировано боль-
шое число различных реакционноспособных производ-
ных гаптенов, избирательно реагирующих с разными
аминокислотными остатками. В ходе реакции образуются
устойчивые ковалентные связи, поэтому, разделив поли-
пептидные цепи и фрагментировав их, можно точно ло-
кализовать меченый аминокислотный остаток. Таким
способом удалось установить, что оба вариабельных до-
мена (от легкой и тяжелой цепей) участвуют своими
аминокислотными остатками в формировании полости
активного центра и что полость центра «выстилают» от-
резки цепей, соответствующие гипервариабельным участ-
кам. Данные, накопленные с помощью метода «метки
по сродству», были дополнены результатами, полученны-
ми методами дифференциальной спектрофотометрии и
электроннопарамагнитного резонанса (см. гл. 12), а так-
же химической модификации определенных аминокис-
лотных остатков в молекуле антитела. Для ряда гапте-
нов гидрофобного характера . (например, нитрофениль-
ные производные) было доказано присутствие в актив-
ном центре антитела остатка триптофана, продемонстри-
рован гидрофобный характер полости антидетерминанты.
Для других гаптенов установлена локализация остатков
гистидина, лизина, тирозина и точно определено их мес-
тоположение в каждой цепи.
93
Рис. 24. Метод «метки по
сродству». А — изображение
активного центра (аншде-
терминанты) антитела к ди-
нитрофенильной группе и
места фиксации азопроиз-
водного динитрофенильной
группы на остатке тирозина
в активном центре; Б — ло-
кализация некоторых гап-
тенов в легкой и тяжелой
цепях соответствующих ан-
тител при использовании
для мечения азопроизвод-
ных гаптенов
Заключительный этап изучения антидетерминанты —
получение в кристаллической форме Fab-фрагментов мо-
ноклональных иммуноглобулинов, специфически связы-
вающих определенные гаптены, и рентгеноструктурный
анализ кристаллов, образованных комплексами фрагмен-
та антитела с соответствующим гаптеном. В этих иссле-
дованиях, выполненных в последние годы, были под-
94
тверждены п развиты представления, сформ; лированные
на основании многих работ по структуре антител.
Рентгеноструктурный анализ подтвердил участие ги-
первариабельных сегментов в формировании полости ан-
тидетерминанты. Примером может служить изучение
Fab-фрагмента моноклонального миеломного иммуногло-
булина человека New, который в числе ряда лигандов
связывает также гидроксильное производное витамина
Ki, имея к этому лиганду сравнительно высокое сродст-
во (Ка = Ю5М-1). Как следует из рис. 25, гипервариа-
бельные участки образуют неглубокие выемки, так что
центр имеет размеры 1,6X0,7 нм2 при глубине 0,6 нм.
Ароматическая менадионовая группа гаптена находится
в непосредственном контакте с остатками ароматических
аминокислот: тирозином и триптофаном. Этим остаткам
принадлежит, очевидно, основная роль в «удержании»
менадионовой группировки (2-метил-1,4-нафтохинон) в
полости активного центра.
Кристаллографический анализ Fab-фрагмента мыши-
ного моноклонального IgA, продуцируемого плазмацито-
мой МсРсбОЗ в связывающего фосфорилхолин, показал,
что активный центр имеет клиновидную форму с разме-
рами 1,5x20 нм2 и глубиной 2,0 нм (рис. 26). Из шести
гипервариабельных участков (имеющихся в двух вариа-
бельных доменах) в образовании центра участвуют пять:
первый и третий легкой цепи и все три тяжелой. Второй
гипервариабельный участок легкой цепи «вытеснен» из
полости центра петлей легкой цепи, образованной первым
гипервариабельным участком и петлей третьего гиперва-
риабельного участка тяжелой цепи. Большая глубина
полости центра, связывающего фосфорилхолин, в сравне-
нии с центром для витамина Ki (см. выше) обусловлена
большей длиной петель гипервариабельных сегментов:
первого легкой цепи и третьего тяжелой цепи — на три
остатка каждого. Замечательно, что фосфорилхолин зани-
мает только часть полости активного центра; это (как бу-
дет обсуждаться ниже) вообще типичное явление, служа-
щее структурной основой полиспецифичности антител,
т. е. способности антитела к определенному лиганду свя-
зывать еще и другие не родственные первому лиганду со-
единения.
Различия не только состава гипервариабельных
участков, но и их длины обеспечивают структурное мно-
гообразие активных центров. Наиболее вариабельны по
длине первый гипервариабельный участок легкой цепи
95
(может варьировать на 6 остатков) и третий гипервариа-
бельный участок тяжелой цепи (см. ниже). При этом,
как правило, указанные гипервариабельные участки
структурно связаны между собой. Не менее значимо, по-
Рис. 25. Гаптен (витамин KiOH) в полости антидетер-
минанты моноклонального IgG человека (New):
Li, L3, Hi, Hj и — петли гипервариабельных районов легкой
и тяжелой цепей. Два конденсированных шестичленных кольца
(менадион) связаны вверху в неглубокой полости (1.6Х0.7Х
Х0.6 нм3); фитиновый хвост гаптена расположен под остатком
менадиона и продолжается дальше почти на всю длину поло-
сти антидетермннанты
видимому, взаимодействие первого гипервариабельного
участка тяжелой цепи с третьим гипервариабельным
участком легкой цепи. Иллюстрацией этому служит им-
муноглобулин плазмацитомы S107, связывающий фос-
форилхолин. В активном центре этого белка взаимодей-
ствуют остаток глутаминовой кислоты, находящийся в
96
Рис. 26. Полость активного центра моноклонального IgA мыши
МсРс 603 с расположенным в нем гаптеном — фосфорилхолином
(выделен жирной линией); обозначения те же, что и на рис. 25.
4—1258
97
позиции 35 тяжелой цепи (первый гпперварпабельный
участок), и остаток тирозина в позиции 94 третьего ги-
первариабельного района легкой цепи. Благодаря этому
стабилизируется конфигурация полости, в которой рас-
полагается лиганд—фосфорилхолин. То, что это дейст-
вительно так, показывает изучение иммуноглобулина,
продуцируемого мутантом U4 плазмацитомы S107. Он
отличается от иммуноглобулина, о котором шла речь вы-
ше, только одной аминокислотной заменой: остаток глу-
таминовой кислоты в позиции 35 тяжелой цепи заменен
аланином. И этого достаточно, чтобы мутантный белок
не связывал фосфорилхолин (S. Rudikoff et al., 1981).
Возможно, что конфигурационная асимметрия вариа-
бельных участков легкой и тяжелой цепей (обусловлен-
ная неодинаковой протяженностью и различиями строе-
ния) служит причиной полиспецифичности антител — не-
полного структурного соответствия центра единственно-
му лиганду. В качестве примера можно привести уни-
кальный белок, продуцируемый клетками миеломы Rei и
состоящий из димера двух вариабельных доменов легкой
(х) цепи. Димер удается получить в кристаллическом
виде вместе с лигандом — тринитрофенильной группой.
Симметрично расположенные петли гипервариабельных
участков образуют глубокий щелеподобный карман.
Тринитрофенильная группа заполняет этот карман цели-
ком, оказываясь в непосредственном контакте с остатка-
ми тирозина в позициях 49, 91 и 96 (на каждой из «сте-
нок») и 36 (на «дне»). Не удивительно, если бы с по-
мощью дифференциальной спектрофотометрии в полосе
поглощения гаптена был бы обнаружен длинноволновый
сдвиг, характерный для комплекса с переносом заряда
между остатками тирозина в активном центре и тринит-
рофенильной группой как акцептором электронов (см.
гл. 12).
Далеко не всегда активный центр представляет собой
отчетливо выраженную впадину или щель. Примером
служит моноклональный белок Koi, для которого не из-
вестен специфический лиганд. Это представляется зако-
номерным, поскольку со стороны тяжелой цепи в область
молекулы, обычно занимаемой активным центром, вда-
ется весьма длинная петля третьего гипервариабельного
участка. Она длиннее на шесть остатков соответствую-
щей петли иммуноглобулина, продуцируемого клетками
миеломы М603, и на восемь остатков того же участка
белка New (табл. 5).
98
Таблица 5. Аминокислотная последовательность гипервариабельных районов
Vn-домена некоторых моноклональных иммуноглобулинов человека, кодируемых
D-сегментом структурного гена для тяжелых цепей иммуноглобулинов
	Номера остатков
Велок	96	[7	98	99	100	101	a'	b	с	d	е	f	g	Ь	I	k	102 (102) (103) (104) (105) (106) (107) (108) (109) (110) (111)	(112)
М603	— Cys — Ala — Arg—Asn —Tyr — Tyr—Gly—Ser — Thr —	—Туг—
New	— Cys — Ala —Arg—Asn—Leu — He — Ala — Gly— Cys —He—	—Vai—
Ей	— Cys'— Ala — Gly—Gly — Tyr—Gly — He —	— Tyr—
M2I	— Tyr — Pro — Trp—Tyr — Ala—Met —	—Tyr—
Ко!	— Cys — Ala — Arg—Asp—Gly — Gly — His — Gly — Phe — Cys — Ser — Ser — Ala—Ser—Cys—Phe—Gly
1 a—k — дополнительная аминокислотная последовательность в белке Ко1.
Дополнительный отрезок цепи скручен таким обра-
зом, что заполняет целиком пространство между петля-
ми других гипервариабельных участков легкой и тяже-
лой цепи, т. е. гипотетическую полость активного центра.
Активный центр в форме глубокой впадины появился бы
в этом участке, если «вырезать» из третьего гипервариа-
бельного участка «лишний» пептид, формирующий анти-
параллельную р-шпильку. Другие иммуноглобулины, по-
добные Koi, не изучали методами рентгеноструктурного
анализа, однако они, несомненно, существуют. Например,
иммуноглобулин мыши М141. Он не связывает каких-ли-
бо известных лигандов и характеризуется более длин-
ным, чем у известных моноклональных антител, третьим
гипервариабельным участком тяжелой цепи. Логично,
что и в этом случае полость активного центра заполнена
петлей этого длинного гипервариабельного участка.
Интересно допустить, что заполнение пространства
между петлями гипервариабельных участков удлинен-
ной петлей одного из них, как бы выполняющей функцию
лиганда, — более частое явление, чем наличие иммуно-
глобулинов (антител), содержащих полость, соответст-
вующую активному центру. С энергетических позиций
наличие полости невыгодно, так как в отсутствие лиган-
да структура недостаточно устойчива. Заполнение пото-
сти вклинившейся в нее петлей цепи существенно повы-
шает устойчивость всей этой области, а следовательно,
энергетически выгодно.
Предлагаемая мною гипотеза, конечно, нуждается в
дополнительных подтверждениях. Но она служит осно-
вой для далеко идущих предположений общебиологичес-
кого плана. Например, проблемы так называемых неспе-
цифических или нормальных иммуноглобулинов. Имму-
нологам хорошо известно, что одновременно с синтезом
антител образуется большое количество иммуноглобули-
нов, которые никакие известные лиганды, в том числе и
использованный антиген, не связывают. Число продуци-
рующих их клеток может намного превышать число ан-
тителбпродуцирующих клеток (Е. Сидорова и др., 1981).
По всем признакам (общий план строения, антигенный
анализ) нормальный иммуноглобулин отличается от ан-
тител только одним: он не связывает известных лиган-
дов. На основании обсуждавшихся данных рентгено-
структурного анализа мы ставим на обсуждение предпо-
ложение о том, что нормальные иммуноглобулины — это
энергетически устойчивая конформация молекулы имму-
100
ноглобулина, в которой полость центра заполнена длин-
ной петлей одного (скорее всего третьего тяжелой цепи)
из гипервариабельных районов. Данные генетики имму-
ноглобулинов хорошо согласуются с этим предположе-
нием. Не повторяя здесь материалов гл. 5, скажем лишь,
что появление более длинных петель гипервариабельных
участков и прежде всего третьего тяжелой цепи совсем
не требует участия особого структурного гена. Этот уча-
сток кодируют три стыкующихся сегмента — Vn, D и J,
разделенные интронами в эмбриональном геноме. Ре-
арранжировка генов в процессе дифференцировки может
сопровождаться «сдвигом рамки» — сочленением сегмен-
тов с некоторым сдвигом относительно друг друга. Это
тем более вероятно в свете данных И. Куросава и С. То-
негава (У. Kurosawa, S. Tonegawa, 1982) о существова-
нии трех различных семейств D-сегментов, кодирующих
три, пять и семь аминокислот.
Данные рентгеноструктурного анализа, согласно ко-
торым гаптен (фосфорилхолин) заполняет в белке
МсРсбОЗ только часть полости активного центра, в пре-
делах которой может разместиться в принципе еще один
лиганд, хорошо согласуется с данными о полиспецифич-
ности моноклональных и? муноглобулинов. Ценность об-
суждаемых результатов особенно велика в силу именно
моноклонального происхождения белков и, следователь-
но, высокой степени их однородности. По данным Г. Ай-
зена с соавторами (Н. Eisen et al., 1968), моноклональ-
ный иммуноглобулин класса А мышиной плазмацитомы
МОРС315, имеющий высокое сродство к динитрофениль-
ной группе, связывает также менадион и динитронафтол.
Сравнение структуры этих трех сильно связуемых лиган-
дов позволяет предположить существование в полости
активного центра белка МОРС315 двух, а возможно и
трех частично перекрывающихся участков для указан-
ных лигандов, имеющих, как видно из их структурных
формул, лцшь незначительную степень сходства:
2-Мешл -
1.4-1К1фн>м1пон
(менадион.)
101
В другом случае для моноклонального белка, связы-
вающего два лиганда, достоверно показано, что соответ-
ствующие участки активного центра перекрываются лишь
в малой мере. Мышиный моноклональный иммуноглобу-
лин, продуцируемый плазмацитомой МОРС460, связыва-
ет динитрофенильную группу и менадион. Если обрабо-
тать иммуноглобулин 4,3 М раствором солянокислого
гуанидина, способность связывать динитрофенильную
группу утрачивается, хотя полностью сохраняется свой-
ство связывать менадион. Обратный эффект наблюдает-
ся при воздействии на белок 2%-ного раствора диметил-
сульфоксида. В свою очередь, химическая модификация
сульфигидрильной группы внутри центра (или в непо-
средственной близости от него) приводит к потере срод-
ства к менадиону, но не динитрофенильной группе.
Существует также наблюдение о наличии в пределах
одного активного центра IgG человека участков для свя-
зывания Fc-фрагмента гомологичного IgG и ДНК. Пол-
ное отсутствие структурного сходства между перечислен-
ными лигандами очевидно.
Полиспецифичность моноклональных иммуноглобули-
нов предполагает существование полиспецифичности и у
антител, синтезируемых под влиянием определенного ан-
тигена. При этом имеется в виду, что антиген-индуктор
имеет только одну детерминантную группу, с которой
может взаимодействовать полиспецифичное антитело.
Из этого вытекает, что иммунный ответ практически ни-
когда не бывает строго специфичен, т. е. направлен толь-
ко против антигенных детерминант антигена-индуктора.
Обсуждаемая проблема имеет по крайней мере еще
два важных аспекта. Теоретический аспект состоит в
том, что разнообразие антител в отношении их специ-
фичности (равно как и разнообразие специфичности ан-
тпгенсвязывающих рецепторов лимфоцитов), очевидно,
существенно больше числа структурных генов для ва-
риабельных районов легкой и тяжелой цепей, так как в
структуре каждого из них закодирована, по-видимому,
структура участков, комплементарных нескольким не-
родственным по строению детерминантным группам.
Практически значимая сторона проблемы полиспеци-
фичности антител состоит в том, что никакими способа-
ми (в том числе и гибридомной техникой (см. гл. 12) не
представляется в принципе возможным гарантировать
узкую специфичность антител, поскольку она вряд ли за-
программирована на генетическом уровне.
102
4.2.	Организация структуры
антидетерминанты
Детерминанта включает в себя не толь-
ко гипервариабельные участки цепей, но и опорные
структуры, стабилизирующие ее конфигурацию. Эти
опорные структуры образуются инвариантными участка-
ми аминокислотной последовательности V-районов. Сте-
пень участия каждого из них в стабилизации антидетер-
минанты не известна. Не вызывает сомнения, что боль-
шой вклад в формирование антидетерминанты вносят
короткодействующие неполярные связи. Значительная
роль принадлежит ароматическим остаткам и в первую
очередь остаткам триптофана. Так, показано, что изби-
рательное окисление остатков триптофана N-бромсук-
цинимидом в мочевине приводит к разрушению антиде-
терминанты вне зависимости от специфичности антител.
Выше упоминалось, что находящийся в активном
центре лиганд оказывает стабилизирующее влияние на
структуру центра. Изящное подтверждение этому было
получено, в частности, А. Гроссбергом с соавторами
(A. Grossberg et al., 1965), изучавшими чувствитель-
ность к протеолизу химотрипсином очищенных антител
против р-азофениларсоната и р-азофенилтриметиламмо-
ния до и после добавления гаптена. Антитела метили ра-
диоактивным иодом и об интенсивности протеолиза су-
дили по появлению низкомолекулярных меченых пепти-
дов. При этом свободное антитело метили одним радио-
изотопом иода (1311), а связанное с гаптеном — другим
(1251). После 5 ч переваривания 10% радиоактивности на-
ходилось в составе низкомолекулярных пептидов, содер-
жащихся в гидролизате свободных антител, и 7% — в
гидролизате при проведении реакции в присутствии гап-
тена.
Увеличение резистентности антитела к протеолизу в
присутствии гаптена продемонстрировано также на дру-
гих моделях с использованием как химотрипсина, так и
субтилизина. Показано, что гаптен влияет на чувстви-
тельность к протеолизу именно Fab-фрагмента, более
точно участки расщепления не были локализованы. По-
лученные результаты интерпретируют как доказательст-
во изменения конформации активного центра под влия-
нием гаптена и стабилизации конформации участка мо-
лекулы антитела, содержащего антидетерминанту.
103
4.3.	Кинетика и термодинамика
реакции гаптен-антитело
Получение экспериментальных данных,
необходимых для вычисления основных параметров ре-
акции антитела со специфическим лигандом, возможно
с достаточной точностью лишь в том случае, когда ли-
ганд одновалентен и как всякий одновалентный гаптен не
'ведет к образованию больших по размеру и сложных по
составу агрегатов. В случае образования комплексов, со-
стоящих из нескольких молекул антигена и антитела,
система настолько усложняется, что реакция не может
быть описана простыми уравнениями.
Источником антител для оценки кинетических пара-
метров реакции служили до последнего времени очищен-
ные антитела против простых гаптенов и моноклональ-
ные миеломные иммуноглобулины с гаптенсвязывающей
активностью. Первые из них неоднородны в том числе и
по степени сродства (скорость реакции) с лигандом. Поэ-
тому в подобных случаях получают лишь усредненные
значения тех или иных параметров.
В ходе реакции гаптен-антитело (когда гаптен имеет
небольшую молекулярную массу и одновалентен) не
происходит никаких взаимных превращений гаптена и
антитела. Поэтому о их взаимодействии судят с помощью
различных физических и физико-химических методов.
Эти методы основаны на оценке количества связанного
гаптена по изменению диффузионного равновесия по-
следнего в присутствии антитела (метод равновесного
диализа1) или по изменению оптических свойств гаптена
после его связывания антителом.
Из-за очень большой скорости прямой реакции и зна-
чительных технических трудностей одновременной оцен-
ки скоростей прямой и обратной реакций (уравнение 1)
на практике измеряют не величины kx и k% — константы
скоростей прямой и обратной реакций, а константу рав-
новесия, или константу сродства Ка, т. е. отношение кон-
стант скоростей прямой и обратной реакций:
Ka=kxlk2.	(3)
Наиболее эффективный способ оценки скорости реак-
ции, потребовавший использования уникального оборудо-
вания, был предложен и апробирован в Институте им.
1 Принципы методов подробнее описаны в гл. 12.
104
Макса Планка (ФРГ). Этот метод основан на оценке
скорости изменения равновесия в системе гаптен-антите-
ло пр,и дискретном увеличении температуры за крайне
короткие промежутки времени. Сконструированная ап-
паратура на основе гигантского конденсатора (10 000
эрстед) при его разряде за 0,1 мкс позволяла повысить
температуру смеси гаптен-антитело на 10°С. За это вре-
мя успевало установиться равновесие, что свидетельст-
вует об очень высокой скорости реакции, реальное изме-
рение которой сложно с технической точки зрения.
Одна из наиболее изученных в кинетическом отноше-
нии систем — это система с антителами против динитро-
фенильной группы. Многочисленные измерения с исполь-
зованием очищенных антител или миеломного мышиного
•иммуноглобулина 315 с динитрофенильной активностью
дали величину прямой реакции порядка Ю7—108М-1с-1,
а обратной — от 1 до 50 с~\ Рассчитанная на основе этих
данных оказалась порядка 105—106М.-1.
Величина /с2 отражает время нахождения гаптена в
полости активного центра (обычно оценивают период по-
лужизни гаптена в активном центре). Если принять ве-
личину /г2 равной 1 с-1 (что соответствует реальным зна-
чениям), то период полужизни составит 0,69 с. Для пря-
мой реакции при величине /г1 = 2Х109М~1 с-1 время полу-
жизни гаптена в активном центре составит около 30 с.
Столь большие различия периодов полужизни гаптена
в активном центре при прямой и обратной реакциях хо-
ро.шо согласуются с фактами, указывающими на значи-
тельную трудность удаления гаптена из активного цент-
ра, например, с помощью диализа.
На основе сведений, полученных при оценке констан-
ты равновесия при нескольких значениях температуры,
можно вычислить основные термодинамические парамет-
ры реакции гаптен-антитело.
Константа равновесия связана со стандартной сво-
бодной энергией уравнением AF° =—RTlnK, где R — га-
зовая постоянная, Т — абсолютная температура. На ос-
новании этого уравнения были найдены значения AF°
для единичной связи гаптен-антитело в самых различ-
ных системах. Как показано ниже, величины AF° для
различающихся по своему строению гаптенов и соответ-
ствующих антител незначительно отличаются друг от
друга (были использованы антитела кролика против ди-
нитрофенильной группы). Они не превышают —37,8
Дж/моль и весьма невелики по сравнению с величинами
105
AF° при образовании, например, двух кислород-водород-
ных связей в молекуле воды (—229,53 кДж/моль).
Гаптен,	—AF°,
кДж/моль-1
е-ДНФ-Ь-лизин.......... 43,26
е-ДНФ-В-лизин.......... 41,16
а-ДНФ-Ь-аланин......... 40,32
а-ДНФ-Ь-фенилаланин	....	37,76
ct-ДНФ-аминокапроновая	кислота	43,26
Динитрофенол........... 31,50
Изменения энтальпии (ДН°) можно рассчитать из
уравнения Вант-Гоффа:
In	=(AH°/R) (1 /Тг — 1/Т2),
где и К2— константы равновесия при двух темпера-
турах: ?! и Т2. Следовательно, для расчета ДН° необхо-
димо измерить константу равновесия минимум при двух
температурах. Из уравнения 2-го закона термодинамики:
AF°=AH°—TAS°
можно вычислить изменение стандартной энтропии пос-
ле определения значений ДР° и ДН°. Поскольку антитела
неоднородны и варьируют в определенных пределах по
величине сродства к гаптену, все определяемые термоди-
намические параметры представляют собой усредненные
величины. Исключение составляют миеломные монокло-
нальные иммуноглобулины.
С учетом сказанного оценим основные термодинами-
ческие параметры реакции гаптен-антитело. При относи-
тельно небольших значениях ДР° (см. выше) изменения
энтальпии весьма велики. Например, для реакции анти-
динитрофенильных антител с динитрофенильным гапте-
ном они составляют —73,5 кДж/моль и мало объяснимы.
Следует еще учесть, что величина ДН°, рассчитанная на
основании уравнения Вант-Гоффа, в два раза ниже (ме-
нее отрицательна), чем при оценке теплоты реакции ме-
тодами прямой калориметрии, т. е. определением коли-
чества выделенного при реакции тепла. Вероятная при-
чина этого — неоднородность антител, эффект которой
может быть неодинаков при разных температурах. В са-
мом деле, величины ДН°, полученные расчетным путем
и на основании прямой калориметрии, практически сов-
падают в случае изучения реакции между гаптеном и мо-
ноклональным иммуноглобулином. Для иммуноглобули-
нов, продуцируемых мышиными плазмацитомами
МОРС 315 и 460, связывающих ди- и тринитрофенильную
106
группы, значения ДН° составляют от —84 до —50,4
кДж/моль. Отрицательное значение ДН° означает, что
реакция протекает с выделением тепла.
Поскольку при взаимодействии антитела с гаптеном
подвижность реагирующих соединений (обусловленная
броуновским движением в растворе) уменьшается, а
вместе с этим уменьшается степень неупорядоченности
системы, следует ожидать изменения конфигурационной
энтропии. При этом величины AS° должны были бы при-
нимать отрицательные значения. Однако в силу того, что
некоторые гаптены имеют заряд, величина которого
уменьшается при взаимодействии с антителом, в ходе
реакции высвобождается часть связанной гаптеном и ан-
тителом воды. Кроме того, при реакции гаптен-антитело
изменяется общая конфигурация молекулы антитела,
обусловленная изменением подвижности Fab-участков
относительно Fc-участка (см. гл. 3). Этот факт также
способен повлиять на степень гидратации молекулы ан-
титела вне зависимости от заряда гаптена. Обусловлен-
ное высвобождением воды положительное изменение
энтропии способно в отдельных случаях полностью ком-
пенсировать уменьшение энтропии системы за счет самой
реакции гаптен-антитело. В свете сказанного сравнитель-
ные оценки величин AS° для реакции различных по спе-
цифичности антител со своими гаптенами вряд ли право-
мерны.
Вопросы, касающиеся реакции антител с поливалент-
ными антигенами, будут рассмотрены в гл. 12.
МАВА
Биосинтез
иммуноглобулинов
5.1. Организация структурных генов
Анализ строения полипептидных цепей
иммуноглобулинов со всей очевидностью свидетельствует
в пользу множественности генов, кодирующих структу-
ру этих белков, и существовании сложной системы их
107
организации. Разработка методов изучения структуры
генов высших организмов, анализ их строения и пере-
группировки в онтогенезе осуществляются в настоящее
время в значительной мере на основе знаний, получен-
ных при изучении структурных генов иммуноглобулинов.
Начальный этап изучения генетики иммуноглобули-
нов был связан с разработкой общей теории, которая
наиболее рационально объясняла бы на генетическом
уровне высокую степень вариабельности аминоконцевых
районов легких и тяжелых цепей. В 1965 г. В. Дрейер и
Дж. Беннет (W. Dreyer, J. Bennet) сформулировали ги-
потезу, согласно которой вариабельные и константные
районы легких и тяжелых цепей кодируются раздельно и
что существует большое число генов для вариабельных
районов (V-генов), но только одна копия гена для кон-
стантного района легкой цепи каждого типа и констант-
ного района тяжелой цепи каждого класса (подкласса).
Очевидным следствием из этого предположения был вы-
вод, согласно которому определенный ген для констант-
ного района способен за счет реарранжировок генетичес-
кого материала объединяться с одним из многих генов
для вариабельного района. Один из первых гипотетичес-
ких механизмов реарранжировки V-C-генов был предло-
жен Дж. Эдельманом (G. Edelman) в 1969 г.
Значительный прогресс в изучении генетических основ
биосинтеза иммуноглобулинов достигнут в результате
решения трех основных методических проблем:
1)	получение и поддержание в культуре большого чи-
сла клонов трансформированных (опухолевых) плазма-
тических клеток, продуцирующих однородные иммуно-
глобулины;
2)	разработка методов получения моноклональных
антител на основе гибридомной техники;
3)	отработка техники молекулярного клонирования
ДНК из иммуноглобулинпродуцирующих клеток в бак-
териальных векторах и последующий анализ ее структу-
ры с использованием бактериальных рестриктаз, разде-
ления сегментов в гель-электрофорезе, гибридизации
рестриктированных сегментов с высокоочищенными
мРНК для пептидных цепей иммуноглобулинов и, нако-
нец, секвенировании сегментов ДНК с определением
нуклеотидной последовательности сегментов, содержа-
щих структурные гены для иммуноглобулинов.
Нетрудно заметить, что первые два методических
принципа привнесены из клеточной биологии, а третий
108
лежит в основе всех современных исследований по моле-
кулярной генетике.
Наши современные сведения об организации иммуно-
глобулиновых генов основаны по существу только на
данных, полученных в опытах на клетках мышей. Одна-
ко есть достаточно оснований считать, что полученные в
этих опытах результаты отражают закономерности, ха-
рактерные и для других млекопитающих, включая чело-
века, а возможно, и для всех позвоночных.
Рис. 27. Структурные гены для х- и л-цепей иммуноглобулинов че-
ловека:
С^1—С^4 — неаллельные варианты генов для константных районов Л-цепей,
размеры интронов указаны в килобазах (kb)
При обобщении полученной к настоящему времени
информации об организации структурных генов для им-
муноглобулинов складывается следующая картина.
Гены для х-цепи мышиного иммуноглобулина нахо-
дятся в шестой хромосоме. Около 400 генов (сегментов
ДНК) формируют пул Vx-генов. Они объединены в 50 се-
мейств, каждое из которых содержит не более восьми ге-
нов со сходной, но не идентичной нуклеотидной последо-
вательностью. В той же хромосоме в направлении З'-кон-
ца обособленно (на расстоянии 1,3—1,4 kb 1) от Vx-генов
находится группа из коротких /-(joining) сегментов,
имеющих высокую степень гомологии. Далее в направле-
нии З'-конца на довольно значительном расстоянии
(2,5—4,5 kb) расположен ген, кодирующий константный
участок х-цепи (Сх-ген).
Таким образом, гены, кодирующие соответствующие
участки х-цепи: Vx-ген (1—95), /-сегмент (96—108) и
Сх-ген (109—214)—разделены между собой нетрансли-
1 1 kb — тысяча оснований.
109
руемыми последовательностями. Последние называются
интронами, а кодирующие сегменты генома—экзона-
ми. Расположение структурных генов для легкой цепи в
хромосоме изображено на рис. 27.
В ходе дифференцировки эмбриональных клеток в
зрелые лимфоидные клетки происходит перегруппировка
генетического материала, приводящая к объединению
одного из Vx-генов с J-сегментом в той же хромосоме и
сближению объединенного VJ-сегмента с С-геном. Одна-
ко и в дифференцированной лимфоидной клетке УЛ- и
С-гены разделены интроном (рис. 27). Эксперименталь-
ные доказательства в пользу интронирования структур-
ных генов для легких цепей и их перегруппировки были
получены в 1978—1979 гг. в разных лабораториях
С. Тонегавой, П. Лидером и Л. Худом (S. Tonegawa;
F. Leder; L. Hood).
Гены для A-цепи мышиного иммуноглобулина нахо-
дятся в шестнадцатой хромосоме. Число наследуемых
(germline) Ух-генов равно двум. Значительная разница
в числе наследуемых Ух- и Vx-генов выглядит не так впе-
чатляюще, если принять во внимание, что в пуле мыши-
ных иммуноглобулинов число молекул с легкими цепями
A-типа составляет едва ли 5%. Число Сх-генов равно че-
тырем, причем каждому из них соответствуют J-сегмен-
ты. Интрон между J-сегментом и 5'-концом Сх-гена ра-
вен 1,3—1,4 kb. Из четырех Сх-генов, по-видимому, экс-
прессируются только три.
В эмбриональной клетке V-ген включает в себя один
интрон, разделяющий нуклеотидные последовательности,
кодирующие лидерный пептид (см. ниже) и собственно
V-район. Величина этого интрона в Vx-гене равна 93
нуклеотидам.
Гены для тяжелых цепей мышиных иммуноглобули-
нов локализуются в двенадцатой хромосоме (у челове-
ка— в четырнадцатой). Число наследуемых Ун-генов
достигает 100—250. За ними в направлении З'-конца
располагаются первоначально Dh-(diversity), а затем
Лн-сегменты. Наконец вслед за Лн-сегментами находятся
гены для константных районов всех без исключения
классов и подклассов иммуноглобулинов (рис. 28).
Гены для константных районов (мыши) располага-
ются в такой последовательности: 5'—Сц—С6—Ст3—
СТ1—СТ2Ь—Cv2a—Се—Са—3'. Как и в хромосомах, коди-
рующих легкие цепи, в двенадцатой хромосоме Ун-гены,
Dh- и Лн-сегменты, а также все семейство С-генов интро-
110
нировано. Для того чтобы представить себе масштаб
расчлененности генов того локуса хромосомы, где он
расположен, приводим размеры интронов, обратив вни-
мание на то, что расстояние между двумя прилегающими
константными генами становится короче в направлении
З'-коица: 5'—JH—(6,5 kb)—Сц—(4,5 kb)—Q—(5,5 kb)—
Cr3 — (34 kb) —CV1 — (21 kb) —Cv2b — (15 kb)—CT2a—
(14,5 kb)—Ce—(12,5 kb)—Ca—3'.
\i|l \i|2 \|П I) Ju	(g C?3 Cyl Cy2b C-z-2a (.£
Рис. 28. Гены для тяжелых цепей иммуноглобулинов в клетках
эмбриона
Каждый ген для соответствующего константного рай-
она тяжелой цепи, в свою очередь, интронирован по чис-
лу доменов. Таким образом, в составе Сц-гена насчиты-
вается четыре изолированных сегмента. То же число сег-
ментов находится в составе Се-гена. В составе Ст и Са-ге-
нов содержится по три изолированных сегмента. Суще-
ствует также изолированный сегмент ДНК, кодирующий
структуру района талии (HI). Вслед за сегментом для
четвертого домена ц-цепи расположены короткие нукле-
отидные последовательности для С-концевых участков
д-цепи, содержащихся в секретируемом клетками или
мембранассоциированном (рецепторном) IgM (см. гл.
9). На рис. 28 представлена схематически структура ге-
нов для константных участков тяжелых цепей.
Для того чтобы оценить размер участка хромосомы,
включающего все Ун-гены, Йн-сегменты, число которых
достигает 10, Лн-сегменты (четыре) и Сц-гены, следует
учесть, в частности, что расстояние между двумя приле-
гающими Уц-генами может достигать 10—14 kb. В ре-
зультате только район, занимаемый Ун-генами (с уче-
том всех интронов), составляет примерно 1500—3000 kb,
а D-Л-С-район— около 150 kb. Эти величины инте-
ресно сопоставить с размером транскрипционных единиц
для у- и ц (6)-цепей, составляющих соответственно при-
близительно 6,5 и 14 kb. Из сравнения очевидно, сколь
значительные реарранжировки генетического материала
предшествуют процессу считывания структурных генов
для тяжелых цепей иммуноглобулинов.
111
- . I
Открытие Dh-> Jl- и Зн-сегментов значительно про-
двинуло вперед вопрос о происхождении многообразия
антител (под многообразием понимают число лигандов,
распознаваемых антителами).
В случае легкой цепи х-типа J-сегменты кодируют 13
С-концевых остатков вариабельного района. Один или
два остатка, кодируемые Jb-сегментом, входят в состав
третьего гипервариабельного района легкой цепи. В за-
висимости от того, с каким из J-сегментов произойдет
интеграция определенного Уи-гена, будет зависеть струк-
тура одного из районов легкой цепи, участвующего в об-
разовании активного центра. Отсюда следует, что если
число V-генов для х-цепей равно 400, а число экспресси-
руемых Ль-сегментов равно четырем (из пяти закодиро-
ванных), то число возможных вариантов аминокислот-
ной последовательности вариабельного района х-цепи,
наследуемых эмбрионом мыши, достигает 1600.
В тяжелых цепях D-сегменты кодируют остатки с
100 по 107, J-сегменты — остатки 108—123 Ун-участка.
Фактически это только средние величины, поскольку,
как уже упоминалось в разделе 4.2, Вн-сегменты имеют
разную длину (10, 17 и 23 пары оснований), что обеспе-
чивает кодирование 3, 5 и 7 аминокислот. Однако и это
чисто теоретический расчет, поскольку реально соответ-
ствующие им участки вариабельного района тяжелой це-
пи в ряде случаев короче геномных, а в ряде — значи-
тельно длиннее. Сказанное выше показывает, сколь ве-
лико разнообразие аминокислотных последовательно-
стей, возникающих в результате интеграции Ун-генов
только с Он-сегментами. Но D-сегменты интегрируют и с
J-сегментами. Их тоже четыре и участок, которым они
состыковываются с D-сегментом, строго не зафиксиро-
ван (см. ниже). Вся область, кодируемая Dn-сегментом,
а также J-сегментом, соответствует третьему гипервари-
абельному району тяжелой цепи, обеспечивая исключи-
тельно большую степень его разнообразия как по соста-
ву, так и по протяженности.
Процесс рекомбинации сегментов (экзонов) связан с
взаимодействием З'-концевого участка одного экзона с
5'-концевым участком следующего экзона. На З'-конце
У-гена находятся два блока из 9 и 7 нуклеотидов с ком-
плементарной последовательностью. Указанные блоки
удалены друг от друга на строго определенные расстоя-
ния (11 или 22 пары нуклеотидов). Вся структура, на-
пример, для Нн-сегмента выглядит следующим образом:
112
N—S—H—D—H—S—N, где N-нонамер, S-спейсер (из
11—12 или 22—23 нуклеотидов), Н-гептамер, D—6н-сег-
мент.
Соединение Ун-гена с Dh и Лн-сегментами протекает
в два этапа:
5'-Vh-H-S23-N-3' + 5'-N-S12-H-D-H-
— S12 — N — 3'--*5' — yH — D — H — S12 — N — 3'-|-5' — N —
- S23 - Н - Лн - 3'— 5' - VhDJh - 3'
Можно предположить три причины вариаций после-
довательности в местах соединения Ун-, Dh- и Лн-сег-
ментов.
1.	Образование альтернативных триплетов (кодонов}
в участках двух соседних собирающихся экзонов.
2.	Добавление или деления триплетов в участках объ-
единения.
3.	Участие различных Ун- и Он-сегментов в образо-
вании единого сегмента с одним Лн-геном.
Если внутрихромосомные перестройки, протекающие
в процессе клеточной дифференцировки, обеспечивают
слияние всех сегментов гена для вариабельного района
легкой или тяжелой цепи, то по мало понятным пока
причинам слияние полного гена для Ун-района с С-ге-
ном не происходит. Наблюдается лишь значительное
уменьшение интронируемой последовательности. В ре-
зультате образуется транскрипционная единица (tran-
scription unit), которая в случае гена для легкой цепи
включает УЛ-сегмент, интронируемый сегмент ДНК и
С-ген (рис. 29).
По тому же принципу протекает реарранжировка ге-
нетического материала, приводящая к появлению тран-
скрипционной единицы для тяжелой цепи. В отличие от
генов для легкой цепи в этом случае на стадии полного
гена для вариабельного района происходит, как говори-
лось, двойная реарранжировка, приводящая к «состы-
ковке» Ун-гена с Е)ц- и Лн-сегментами, а затем уже
сближение полного Ун-гена с одним из Сц-генов за счет
делеции части интронирующего сегмента хромосомы.
Эта последняя стадия протекает значительно сложнее,
чем в случае генов для легких цепей, уже по той причи-
не, что один и тот же Ун-ген способен в принципе сфор-
мировать транскрипционную единицу с любым предста-
вителем семейства Сц-генов, а число этих генов доста-
113
точно велико. Кроме того, хорошо известно, что экспрес-
сия различных классов иммуноглобулинов как в период
антигеннезависимой дифференцировки лимфоидных кле-
ток В-ряда, так и на стадии дифференцировки последних
под действием антигена подчиняется строгим закономер-
ностям. Напомним, что у млекопитающих в антенаталь-
Рис. 29. Процесс сплайсинга первичного транскрипта генов для лег-
кой цепи иммуноглобулинов (пре-мРНК):
L — лидерный полинуклеотид, (А)п—полиадениловый З'-конец (нетранслиру-
емый); цифрами обозначены размеры копий интронов (пре-мРНК) и трансли-
руемых копий сегментов ДНК (мРНК)
ный (внутриутробный) период предшественники В-лим-
фопитов способны синтезировать только IgM, который
можно обнаружить лишь внутри клеток.
Появляющиеся во внутриутробный период В-лимфо-
циты способны первоначально синтезировать только
мембранассоциированный (рецепторный) 8S IgM, а позд-
нее, к моменту рождения, также мембранассоцииро-
ванный IgD. При индукции иммунного ответа тимус-
зависимым антигеном бласты и плазматические клетки
первоначально синтезируют и секретируют только IgM,
а позднее, в зависимости от природы антигена и частоты
его введения, IgG-антитела или антитела других клас-
сов. Поскольку антитела разных классов и иммуноглобу-
линовые рецепторы могут нс отличаться по специфично-
сти (т. е. иметь в составе транскрипционных единиц од-
1:1,4;
ни и те же Vn-гены), механизм переключения с синтеза
одного иммуноглобулина на другой должен включать в
себя механизм реарранжировки С-генов.
По аналогии с рекомбинационными участками на
концах Vh-, Dh- и Лн-сегментов было установлено суще-
ствование у каждого С-гена «района переключения»:
S-района (от англ, swith region). Каждый S-район состо-
ит из тандема повторяющихся нуклеотидных последова-
тельностей, расположенных в 5'-концевом участке соот-
ветствующего С-гена. Так, нуклеотидная последователь-
ность 5ц-района может быть представлена как
(САССТ)я(ССССТ)те,
где п варьирует от одного до семи (наиболее часто три),
а т имеет значение порядка 150. Все другие S-районы
(Sv, Se и т. д.) также содержат тандемы повторяющихся
последовательностей, которые отличаются друг от друга,
но имеют сходные с Su-районом короткие последователь-
ности GAGGT и GGGGT.
Различия между S-районами необходимы, очевидно,
для функционирования специфических ферментов, требу-
ющихся для узнавания соответствующего С-гена и ре-
комбинации запрограммированной для данной стадии
дифференцировки S—S-районов. Такая S—S-рекомби-
нация приводит к выключению участка хромосомы меж-
ду уже собранным геном для вариабельного района и
С-геном, участвующим в образовании транскрипционной
единицы на данной стадии дифференцировки. Существу-
ют две точки зрения по этому вопросу. Одна состоит в
том, что S—S-рекомбинация происходит между сестрин-
скими хромосомами по типу кроссинговера. Согласно
другому предположению в результате S—S-рекомбина-
ции исключаемый сегмент ДНК формирует петлю, кото-
рая вырезается (рис. 30). Известны аргументы в пользу
той и другой модели. То, что делеция, несомненно, име-
ет место, следует из данных табл. 6.
Изучали сегменты ДНК, содержащие Сн-гены из
клеток плазмацитом мышей. Использовали обратные
транскрипты очищенных мРНК, которые гибридизовали
с фрагментами ДНК, содержащими Сн-гены. Оказалось
(S. Cory, J. Adams, 1980), что в клетках, продуцирую-
щих IgM, содержатся гены для константных районов
других классов (подклассов) иммуноглобулинов. Напро-
тив, в клетке, продуцирующей IgA, имеется только Са-
ген. Если обратиться к схеме, иллюстрирующей порядок
115
*Ан«ри<Н1з.1Ы1ая
С,». С,Д.С-Д.( -.2h.C,2a.C£
> ' ------------------------
Vn-П-'н-
соедннение
'll"
Иммунокомпеии! ный
B-лимфоцит
Переклю-
чение
Ср-ранонов
И 1аппи11ческая клетка

Г) J|11 JH1 J|(1 J114 Sjx (. g
Si
1
мяк


'll	'll О J|I	Сfl
Sa C3
Функциональная единица 1ранскрипции для д-цспсй
Су2Ь
Су2а
11 |шш/ш
г
С
функциональная единица |ранскрнпции для а-цсией
Деления сегменга
хромосомы (12()kh)
Перегруппиров-
для тяжелых
иммупоглобули-
Рис. 30.
ка генов
цепей
нов, происходящая в он-
тогенезе. Схематически
изображен гипотетиче-
ский механизм формиро-
вания единицы транс-
крипции для ц-цепей IgA
Таблица 6. Структурные гены для тяжелых цепей иммуноглобу-
линов в клетках мышиной плазмацитомы
Плазмацитома	Синтез 1g	Наличие структурных генов для:					
		Р-	тз	Т1	Т2Ь	Т2а	а
НРС 76	IgM	+	-I—	4-	+	+	4-
МОРС 21	IgGl	—	—	4-	+	-f-	4-
МРС 11	lgG2B	—	—	-—	+	4-	4-
МОРС 173	lgG2a	—	—	—	—•	-1-	4-
МОРС 315	IgA	—	—	—	—	—	+
расположения константных генов для тяжелых цепей
(см. рис. 28), становится ясно, что для того, чтобы воз-
никла транскрипционная единица для ц-цепей, нет необ-
ходимости в делении части Сц-генов, так как Сц-ген рас-
положен ближе всего к З'-концевому участку VhDhJh-
гена. В то же время Са-ген наиболее удален от Ун-гена
и возникновение транскрипционной единицы для а-цепей
потребует делении участка хромосомы от См до СЕ-генов.
Остается неясным, каков механизм рекомбинации
строго определенных S-районов на каждой стадии диф-
ференцировки клеток В-ряда. Возможно, существуют
особые ферменты — рекомбиназы (class switch recombi-
nase), распознающие негомологичные последовательно-
сти соответствующих S-районов.
Особого внимания заслуживает вопрос о механизме
одновременной экспрессии иммуноглобулинов двух клас-
сов или одновременной экспрессии мембранассоцииро-
ванного и секретируемого иммуноглобулинов одного
класса. Первое, как правило, имеет место в зрелых
В-лимфоцитах, синтезирующих мембранассоциированные
иммуноглобулины двух классов — М и D (см. гл. 9).
Второе наблюдается на промежуточных стадиях диффе-
ренцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку.
В обоих случаях иммуноглобулины двух разных классов
не различимы по антигенной специфичности — способно-
сти распознавать одну и ту же антигенную детерминан-
ту. Следовательно, при их синтезе экспрессируются один
и тот же Ун-ген, D- и J-сегменты. Если бы формирова-
ние двух единиц транскрипции происходило с участием
разных Сн-генов, в геноме потребовались бы две иден-
тичные копии Ун-генов, D- и J-сегментов. Этого никто
не наблюдал. В то же время ряд фактов свидетельству-
ет о том, что мРНК, необходимые для одновременной
117
экспрессии двух иммуноглобулинов с идентичными ва-
риабельными и разными константными районами, возни-
кают в ходе «созревания» (процессинга) пре-мРНК в
результате так называемого альтернативного сплайсинга
(см. раздел 5.2).
5.2.	Процессинг пре-мРНК
Наличие интронирующих сегментов
в единицах транскрипции для легкой и тяжелой цепей
указывает на то, что существует механизм, обеспечива-
ющий вырезание из первичного транскрипта участков,
являющихся копиями интронов. В первичном транскрип-
те легких цепей (РНК-овая копия единицы транскрип-
ции) таких участков два или даже три. Один является
копией интрона между Vl- и Сь-генами и эквивалентен
2,5—4 kb. Второй соответствует интрону между последо-
вательностями, кодирующими лидерный пептид и Vl-
райоп (эквивалентен примерно 130 парам оснований).
Что касается третьего участка, то он, по-видимому, слу-
жит копией интрона, разделяющего последовательность,
кодирующую лидерный пептид (см. рис. 29). Размер по-
следнего участка равен 4—6 kb.
В ходе считывания единицы транскрипции, как и в
ряде других известных случаев для пре-мРНК, эукариот,
происходит модификация 5'-конца и присоединение
«липкого» поли-А нуклеотида к З'-концу. В результате
появляется пре-мРНК, которая для легких цепей х-типа
имеет константу седиментации 40S и состоит приблизи-
тельно из 10 000 нуклеотидов. За счет «вырезания»
(сплайсинг) удаляются участки, соответствующие интро-
нируемым сегментам. Этот процесс протекает, по край-
ней мере, в два этапа: вначале появляется промежуточ-
ный транскрипт с константой седиментации 24S (около
4800 оснований), а затем «зрелая» единица трансляции,
состоящая из 1300 оснований и имеющая константу се-
диментации 13S. Только в этот момент мРНК покидает
ядро и переходит в цитоплазму, принимая участие в фор-
мировании полирибосомального комплекса, необходимо-
го для синтеза х-цепей. Интересно соотношение различ-
ных форм мРНК в ходе ее процессинга. В плазматиче-
ской клетке содержится (в ядре) 540 молекул 40S пре-
мРНК (время полужизни около 10 мин), 900 молекул
24S пре-мРНК (время полужизни порядка 18 мин) и
118
4200 молекул ядерной 13S мРНК (время полужизни
20 ч).
Появлению «зрелых» мРНК для тяжелых цепей так-
же предшествует поэтапный сплайсинг. Число интрони-
рующих последовательностей в единице транскрипции
для любой из тяжелых цепей значительно больше, чем
для легкой хотя бы за счет интронов между сегментами
С-гена для отдельных доменов. Поэтому процессинг
мРНК для тяжелых цепей протекает, по-видимому, с
большим числом этапов. Особенности транскрипции ге-
нов для тяжелых цепей можно проследить на примере
альтернативного сплайсинга, позволяющего, как упоми-
налось в разделе 5.1, обеспечить при наличии в клетке
только одной копии Vn-гена синтез иммуноглобулинов
одной специфичности, но разных классов.
В обсуждаемом случае после перегруппировки эмбри-
ональной ДНК, приводящей в ходе дифференцировки
лимфоидных клеток В-ряда к рекомбинации определен-
ного Ун-гена с D- и J-сегментами и делеции части интро-
на между Ун-геном и Сц-геном, появляется единица
транскрипции. Она включает (см. рис. 29) помимо Уп-
гена все сегменты интронированных генов для констант-
ных участков ц- и 6-цепей (С;1- и Сс-гены расположены
последовательно).
Надо специально отметить, что в единицу транскрип-
ции входят сегменты обоих константных генов, кодирую-
щих С-концевые последовательности как секретируемых
форм IgM и IgD, так и мембранассоциированных форм
этих белков (см. раздел 5.1, а также гл. 9). При считы-
вании всей этой единицы транскрипции вначале образу-
ется гигантская пре-мРНК. Сплайсинг ее различных ко-
пий может пдти двумя путями. В одном случае сегмент,
кодирующий Ун-район, соединяется с сегментом, коди-
рующим константный район IgM, встраивающегося в
мембрану лимфоцита. В другом случае с тем же сегмен-
том мРНК для Ун-района соединяется сегмент, кодиру-
ющий участок мРНК для мембранассоциированной фор-
мы IgM. Аналогично происходит сплайсинг для секрети-
руемых иммуноглобулинов различных классов, но одина-
ковой специфичности. В ходе сплайсинга вырезаются ко-
пии многочисленных интронирующих последовательно-
стей, а также последовательностей, соответствующих
исключаемому константному гену.
«Зрелые» мРНК для секретируемого и мембранассо-
циируемого IgM образованы соответственно 2400 и 2700
119
основаниями. Отличия упомянутых мРНК заключаются
в З'-концевых участках, кодирующих С-концы соответ-
ствующих [т-цепей. Так, у секретируемой формы С-конец
p-цени образован 20 аминокислотными остатками, рас-
положенными сразу вслед за Сц4-доменом. Также рас-
положен С-концевой участок мембранассоциированного
IgM, но структура его совершенно иная. Особенности
структуры встроенного в мембрану IgM. обсуждаются в
гл. 9.
На поверхности клеток иммунологической памяти,
относящихся к лимфоцитам В-ряда, способны экспресси-
роваться одновременно идентичные по специфичности
рецепторы двух классов, но в различных сочетаниях —
IgM, IgG, IgM, IgE и др. Закономерен вопрос, как воз-
никает единица транскрипции, включающая общий Ун-
ген, Сц- и Са-гены, если два последних отделены друг от
друга всеми остальными константными генами? Пред-
ставляется, что возникновению такой единицы предшест-
вуют две серии реарранжировок ДНК: рекомбинация
Ун-> D- и J-сегментов и деления части интрона между
V- и Сц-генами, а после этого (или одновременно) S—S-
рекомбинация между С6- и СЕ-генами с последующей де-
лецией этого участка генома. Вероятно, два процесса ра-
зобщены во времени, так что второй протекает в процес-
се антигензависимой дифференцировки В-лимфоцитов в
клетки иммунологической памяти.
5.3.	Трансляция легких и тяжелых
цепей иммуноглобулинов
В зрелой плазматической клетке,
синтезирующей иммуноглобулины определенного класса
(изотипа), существует два вида полирибосом: одни — с
мРНК для легких цепей, а другие — для тяжелых. Их
скорость седиментации составляет 200S и 300S соответ-
ственно и позволяет разделить их с помощью градиент-
ного центрифугирования. Полирибосомы для легких це-
пей состоят из 4—5, а для тяжелых цепей — из 11—18
рибосом. Время трансляции составляет для легкой цепи
1 мин, а для тяжелой — 2 мин.
В мРНК для легкой цепи находятся два участка,
которые не транслируются. Это участок из 150 нуклео-
тидов на б'-конце, который предшествует сегменту, ко-
дирующему Уь-район, и участок из 200 нуклеотидов в
З'-копцсвой области между сегментом, кодирующим Сц-
120
район, и «липким» З'-концевым полнаденилатом (см.
рис. 29). Появляющаяся после трансляции нолипептидная
цепь отличается от легкой цепи, входящей в состав мо-
лекулы иммуноглобулина, большей молекулярной мас-
сой за счет дополнительной аминокислотной последова-
тельности из 15—20 остатков в аминоконцевой части мо-
лекулы. Этот гидрофобный отрезок цепи необходим, по-
видимому, для ассоциации полирибосомного комплекса,
на котором синтезируется цепь, с мембраной эндоплаз-
матического ретикулума, на наружной поверхности ко-
торого фиксирована полирибосома. Указанный отрезок
предшественника легкой цепи отщепляется в результате
его процессинга в просвете цистерн эндоплазматического
ретикулума, куда поступает новообразованный предшест-
венник. Помимо протеолитического отщепления N-конце-
вого экстрапептида именно в цистернах окончательно
формируется третичная структура легкой цепи и замы-
каются внутрицепьевые дисульфидные связи.
Процесс трансляции тяжелых цепей и посттрансляци-
онного процессинга их предшественника в целом подо-
бен процессу, описанному для легких цепей.
Находящиеся в цистернах эндоплазматического рети-
кулума легкие и тяжелые цепи начинают взаимодейст-
вовать между собой сначала за счет нековалентных свя-
зей. Сборка четырехцепочной молекулы с формулой
L2H2 протекает за 5—15 мин. Завершению сборки пред-
шествует формирование ряда промежуточных продук-
тов, состав которых зависит как от класса синтезируе-
мых иммуноглобулинов, так и от принадлежности белка
к соответствующему биологическому виду. У мышей
большая часть молекул IgG имеет промежуточную фор-
му Н2, а молекул IgM—HL. В первом случае достройка
идет за счет присоединения легких цепей, во втором —
путем димеризации двух половин 7S субъединицы. По
мере сборки молекулы замыкается каркас межцепьевых
дисульфидных связей.
Как уже говорилось в гл. 3, иммуноглобулины при-
надлежат к числу гликопротеинов. Гликозилирование
полипептидных цепей начинается уже на стадии транс-
ляции, когда к растущей цепи присоединяются префор-
мированные блоки будущей олигосахаридной цепи. При
этом фосфорилированный олигосахарид (манноза-N-aue-
тилглюкозамин-долихолфосфат) функционирует как ко-
суЗстрат. К у-цепям растущая углеводная цепь присое-
диняется через остаток аспарагина в позиции 297.
121
Окончательное формирование углеводного компонен-
та происходит уже в цистернах эндоплазматического ре-
тикулума на стадии, предшествующей секреции иммуно-
глобулина клеткой. Он представляет собой разветвлен-
ный олигосахарид, содержащий до 12 моносахаров,
включая N-ацетилглюкозамин и N-гликолилнейрамино-
вую кислоту.
5.4.	Секреция новообразованных
иммуноглобулинов
После завершения синтеза изолиро-
ванные полипептидные цепи остаются еще около 5 мин
на месте синтеза, т. е. в месте прикрепления полисом к
поверхности мембран эндоплазматического ретикулума.
Вслед за этим цепи попадают в просвет цистерн, где
происходит, как указывалось, сборка молекулы иммуно-
глобулина. По мере достройки углеводного компонента
уже собранная молекула переходит из шероховатого эн-
доплазматического ретикулума в аппарат Гольджи. Вы-
ход иммуноглобулинов из клетки имеет, очевидно, ряд
особенностей, отличающих этот процесс от секреции, на-
пример, гормонов. Последние по мере их синтеза в соот-
ветствующих клетках обосабливаются в секреторных
вакуолях, содержимое которых выбрасывается из клетки
после слияния вакуоли с внутренней поверхностью цито-
плазматической мембраны. Акт дегрануляции требует
участия микротубулярного аппарата, блокада которо-
го, например, цитохалазином В исключает секрецию
белка. В случае секреции иммуноглобулинов плазмати-
ческими клетками цитохалазин не оказывает влияния на
выброс белка клеткой. Создается впечатление, что имму-
ноглобулины просто выдавливаются из цистерн через
поры в местах присоединения вакуолей аппарата Голь-
джи к цитоплазматической мембране и что сигналом
для этого служит переполнение цистерн.
Коротко следует сказать о сборке полимерных форм
иммуноглобулинов: IgM и IgA. Их сборка из 7S субъ-
единиц осуществляется непосредственно перед секре-
цией при обязательном участии J-цепей, синтез которых
также происходит в плазматических клетках, причем
вне зависимости от того, какой класс иммуноглобулинов
продуцируют эти клетки.
ГЛАВА
Эффекторные функции
иммуноглобулинов
Иммуноглобулинам (антителам) при-
сущи многие биологические функции. Некоторые из этих
функций зависят прежде всего от принадлежности имму-
ноглобулина к определенному классу (подклассу) вне за-
висимости от его свойства взаимодействовать с антиге-
ном в качестве антитела. Другие реализуются только
после специфического взаимодействия с антигеном. На-
конец, третьи удается выявить только у продуктов огра-
ниченного протеолиза иммуноглобулинов (см. гл. 7).
Реализация иммуноглобулинами, продуктами их про-
теолиза или комплексами антиген-антитело биологиче-
ских функций выражается в том пли ином эффекте, фе-
номене, реакции. Вот почему биологические функции
иммуноглобулинов, складывающиеся часто из несколь-
ких более простых реакций, целесообразно обозначать
как эффекторные, подразумевая под ними наиболее про-
стые реакции. Что касается взаимодействия антител с
антигеном (гаптеном), то если исключить биологические
последствия этого взаимодействия, эту функцию имму-
ноглобулинов можно назвать афферентной.
Каждая эффекторная функция иммуноглобулинов
зависит от особенностей строения определенного участ-
ка молекулы. Этот участок по аналогии с активным
центром (антидетерминантой) называют эффекторным
центром. В одних случаях этот центр подобно антидетер-
минанте связывает определенный лиганд и (или) сам
служит лигандспецифичсской структурой, распознава-
емой другим, неродственным иммуноглобулину белком.
В других случаях под эффекторным центром подразу-
мевают ту область молекулы, от которой зависит ини-
циация каскада реакций, приводящих к сложному био-
логическому эффекту.
Изучение химических основ эффекторных функций
иммуноглобулинов весьма значимая для теории и прак-
тики область молекулярной иммунологии.
123
6.1. Антигеннезависимые эффекторные
функции
Преодоление плацентарного барьера.
IgG человека (все его подклассы) обладает этим свойст-
вом. Иммуноглобулины других классов не проходят в
норме через плаценту.
Преодоление плацентарного барьера — активный
процесс, начальная стадия которого связана с фиксацией
IgG на выстилающих плаценту клетках — трофобластах.
На трофобластах не фиксируются Fab- или F(ab')2-
фрагменты и даже Facb-фрагмент (см. рис. 15), пред-
ставляющий собой, как говорилось, молекулу IgG, ли-
шенную С-концевых СуЗ-доменов. В то же время димер
(тандем) СуЗ-доменов в изолированном виде способен
конкурировать с нерасщепленным IgG за фиксацию на
трофобластах. Из этого следует, что эффекторный центр,
обеспечивающий фиксацию IgG на трофобластах, нахо-
дится в пределах СуЗ-доменов. Подобная структура от-
сутствует в иммуноглобулинах других классов.
Скорость прохождения плацентарного барьера у
различных подклассов IgG неодинакова. Она минималь-
на у IgG4. Различия связаны со способностью фиксиро-
ваться на трофобластах. Однако они нивелируются, если
сравнивают связывающие свойства СуЗ-тандемов, выде-
ленных из IgG различных подклассов. Это позволяет
предположить, что эффекторный центр, обеспечивающий
фиксацию IgG человека на трофобластах, расположен в
той части СуЗ-доменов, которая прилегает к С>-2-доме-
нам. Последние, в зависимости от особенностей своей
структуры, равно как и конформации всей молекулы,
могут в разной степени экранировать эффекторный
центр на СуЗ-доменах. Справедливость этого вывода
подтверждает тот факт, что расщепление дисульфидных
связей между тяжелыми цепями в районе талии молеку-
лы IgG резко снижает сродство этого белка к трофо-
бластам. Как известно (см. гл. 3), различные подклассы
IgG человека сильно отличаются по структуре района
талии.
Реабсорбция в извитых канальцах почек. Все сыворо-
точные белки в процессе фильтрации крови через почки
(почечные клубочки) реабсорбируются затем из первич-
ной мочи в извитых канальцах. Не представляют собой
исключения и иммуноглобулины. Благодаря глубокому
изучению субмолекулярной структуры иммуноглобули-
124
нов получены достоверные данные о структурных осно-
вах столь важной биологической функции этих белков,
как способность продолжительное время находиться в.
кровеносном русле.
Г. Шпигельбергер и В. Вейгл (G. Spigelberger,
W. Weigle, 1966) сделали важное наблюдение: монова-
лентные и бивалентные Fab-фрагменты гомологичного
IgG, введенные в кровоток, очень быстро исчезают из
него. Так, показано, что изолированные Fab- и F(ab)2'-
фрагменты практически полностью исчезали из кровото-
ка за 4 ч (Н. Шмелева, 1972); при введении радиомече-
ного фрагмента, радиоактивность оказывалась в моче
(напомним, что период полувыведения IgG составляет
для мыши несколько суток, а для человека — до трех
недель).
Причина быстрого выведения Fab-фрагментов — не-
способность к реабсорбции в извитых канальцах. В опы-
тах на крысах блокировали канальцы некоторыми жир-
ными кислотами и вводили в кровоток гомологичный
Fab-фрагмент; последний при этом продолжительное
время оставался в кровотоке. Аналогичный эффект ока-
зывает перевязка обоих почечных артерий, т. е. полное
прекращение почечной фильтрации.
Подобно Fab-фрагментам Facb-фрагменты, лишенные
только С-концевых Сг3-доменов, также не реабсорбиру-
ются в извитых канальцах. Тандем Су3-доменов, как и
Fc-фрагменты, находится в кровотоке примерно столько
же, сколько нерасщепленный IgG. Следовательно, эф-
фекторный центр, ответственный за продолжительную
циркуляцию IgG, бесспорно находится в Fc-участке мо-
лекулы, точнее — в СуЗ-домене. Очевидно, на клетках
эпителия, выстилающего извитые канальцы почек, рас-
положены рецепторы, распознающие определенные
структуры Ст3-домена.
Доказательства существования эффекторного центра,
отвечающего за продолжительную циркуляцию иммуно-
глобулинов, получены на модели IgG, но нет сомнения
в том, что аналогичные центры есть в пределах Fc-участ-
ков молекул других иммуноглобулинов. По-в,идимому,
структура этих центров, равно как и структура распоз-
нающих их клеточных рецепторов, неодинакова. Это
обеспечивает селективность контроля за уровнем имму-
ноглобулинов каждого класса в кровотоке. Конечно, об-
суждаемый механизм гомеостатической регуляции уров-
ня иммуноглобулинов один из нескольких (о других пой-
125
дет речь ниже). Но все эти механизмы, безусловно, се-
лективны, а следовательно, связаны со специфическим
распознаванием иммуноглобулина (его эффекторного
центра) рецепторами клеток, контролирующими гомео-
статическое равновесие этого показателя на уровне це-
лого организма. Исследования в этой весьма важной в
общебиологическом плане области только начинаются.
В заключение этого раздела следует особо отметить,
что продолжительность времени циркуляции монова-
лентных фрагментов антител может резко возрастать,
если фрагменты находятся в циркуляции в комплексе с
антигеном (Spigelberger, Weigle, 1966). Это имеет пря-
мое отношение к проблеме клиренса антигенов в иммун-
ном организме, и мы вернемся <к ней ниже в этой главе.
Фиксация на тучных клетках и базофилах. Иммуно-
глобулины двух классов: Е и G обладают сродством к
указанным клеткам. На этом основании, а также из-за
способности фиксированных на клетках иммуноглобули-
нов этих классов вызывать после контакта с антигеном
высвобождение из тканей субстанций анафилаксии, по-
добные иммуноглобулины названы цитотретинами. Со-
ответственно антитела названы цитотропными. Иммуно-
глобулины, фиксирующиеся на гомологичных (или ауто-
логичных) клетках, получили название гомоцитотропи-
нов.
Основным классом цитотропных антител, ответствен-
ных за возникновение и развитие ряда заболеваний че-
ловека (аллергических), являются IgE-антитела. Еще
одно часто употребляемое название их — реагины. IgE
обнаружены у человека и многих животных (обезьяны,
кролики, собаки, крысы, мыши). IgE присутствуют в сы-
воротке в следовых количествах (см. табл. 3). Их удает-
ся выявить с помощью высокочувствительных методов
также на поверхности тучных клеток и базофилов.
Связывание IgE тучными клетками — основное усло-
вие возникновения каскада биологических реакций,
обозначаемых термином — реакции гиперчувствительно-
сти немедленного типа. Эти реакции возникают после
взаимодействия поливалентного антигена {аллергена) с
фиксированными на клетках IgE-антителами. В этом
разделе мы рассмотрим лишь проблему связывания ци-
готропинов клетками. Процесс высвобождения субстан-
ций анафилаксии под влиянием комплекса антиген-цито-
тропины мы обсудим ниже.
Важной особенностью IgE, отличающей их от цито-
126
тропинов IgG-класса, является высокая степень срод-
ства к клеткам-мишеням. Они остаются связанными с
поверхностью клетки на протяжении многих дней (воз-
можно, недель). IgG в любом избытке не вытесняет IgE
с поверхности тучных клеток. Последнее не удивительно,
поскольку фиксация IgE происходит через специальный
для этого иммуноглобулина рецептор. Этот рецептор по-
лучил наименование FcER. Уже из названия следует,
что IgE связывается своим Fc-участком и, следователь-
но, в его пределах находится структура, ответственная
за цитотроппые функции этого иммуноглобулина. Ни
изолированные е-цепи, ни Fab-фрагменты IgE с тучными
клетками не связываются. Не связывается с ними pFc-
фрагмент — С-концевой осколок Fcg-фрагмента, образую-
щийся при гидролизе IgE пепсином. В то же время сам
Рсе-фрагмент прочно фиксируется на клеточной поверх-
ности, конкурируя за FcER тучных клеток с нерасщеп-
ленным IgE. Это означает, что центр, ответственный за
связывание IgE клетками, находится не в концевых до-
менах е-цепи (напомним, что в константной части е-цепи
имеется четыре домена). Как показал Р. Хамбургер
(R. Hamburger, 1975), за связывание IgE тучными клет-
ками отвечает СЕ3-домен, а в его пределах участок по-
следовательности с 320 по 324 остатки. Изолированны
пептид Asp — Ser — Asp — Pro — Arg способен конку-
рентно блокировать связывание IgE тучными клетками.
Выяснение строения участка молекулы IgE, опреде-
ляющего его цитотропные свойства, вселило надежду на
возможность успешной борьбы с аллергическими заболе-
ваниями, которые обусловлены IgE-реагинами. Пред-
ставлялось, что с помощью пептида окажется возмож-
ным вытеснять реагины с поверхности тучных клеток.
Однако, хотя не существует технических трудностей для
синтеза подобного пептида, его испытание в клинике не
проводили. Вероятно, дело в том, что сродство IgE к ре-
цепторам на тучных клетках столь велико, что вытесне-
ние их пептидом практически недостижимо, особенно в
организме.
Структура, определяющая цитотропные свойства IgE,
весьма чувствительна к термической денатурации. Уже
после прогревания при 56°С цитотропины класса Е инак-
вируются, в то время как IgG-цитотропины сохраняют
способность связываться с клетками-мишенями. Следует
иметь в виду этот простой тест для дифференцирования
гомоцитотропинов различных классов.
127
Гомоцитотропины обоих классов после внутрикожно-
го введения гомологичным или близкородственным реци-
пиентам фиксируются на клетках и после взаимодейст-
вия с антигеном (который вводят, как правило, внутри-
венно) обеспечивают возникновение реакции пассивной
кожной анафилаксии (см. раздел 6.2). Однако латент-
ный период, необходимый для оптимальной сенсибилиза-
ции клеток-мишеней, неодинаков в случае IgE- и IgG-ro-
моцитотропинов. Если для IgG этот срок равен 1—4 ч,
то для IgE — 48—72 ч. В чем причина этих различий?
Скорее всего не в скорости реакции гомоцитотропинов с
клеточными рецепторами. По-видимому, для проявления
у IgE-цитогропинов свойства обеспечивать при реакции
е антигеном высвобождение из клетки субстанций ана-
филаксии необходима конформационная перестройка
молекулы. В результате проявляется так называемый
«активирующий ткани центр». Эта конформационная пе-
рестройка, очевидно, протекает достаточно медленно.
Не только структура, но и биосинтез IgE-антител су-
щественно отличается от биосинтеза IgG-антител. Преж-
де всего необходимо подчеркнуть, что тимуснезависимые
антигены не способны вызвать продукцию антител IgE-
класса и, следовательно, вызвать аллергические реак-
ции. Существуют факты, указывающие на существова-
ние особой субпопуляции Т-хелперов и Т-супрессоров,
регулирующих синтез именно IgE-антител. Антиген, сти-
мулирующий синтез IgE-антител, должен иметь некото-
рые особенности структурной организации именно тех
участков, которые распознают Т-хелперы. Так, если вве-
сти реципиентам одного и того же вида конъюгаты ди-
нитрофенильной группы с бычьим сывороточным альбу-
мином или белками круглых глистов (Ascaris suis, на-
пример), то в первом случае произойдет синтез IgG-ан-
тител, а во втором — IgE. И те и другие антитела на-
правлены против динитрофенильной группы. В свою оче-
редь, синтез IgE-антител подавляют клетки селезенки
сингенных доноров, иммунизированных гомологичным
антигеном (динитрофенилированными белками аскари-
ды), но не клетки селезенки доноров, иммунизированных
динитрофенилированным альбумином (Т. Tada et al.,
1971).
Независимая от антигена дифференцировка пре-В-
димфоцитов сопровождается появлением В-клеток —
предшественников плазматических клеток, синтезирую-
щих IgE. Процесс протекает по тем же законам, что и
128
процесс, связанный с появлением клеток-предшественни-
ков для синтеза антител других классов. Клетка-предше-
ственник для IgE-антител несет рецепторы для антигена,
имеющие свойства IgM (р 4-лимфоцит). В дальнейшем
эта клетка превращается в В-лимфоцит с рецепторами
двух классов: IgM и IgE (ц4-е4-лимфоцит). Такой ли л-
фоцит уже в процессе антигензависимой дифференци-
ровки превращается в плазматическую клетку, продуци-
Рис. 31. Механизм дифференцировки В-лимфоцитов, экспрессирую-
щих рецепторный IgM (ц+ лимфоциты) в плазматические клетки,
секретирующие IgE
рующую и секретирующую IgE (рис. 31). В-лимфоциты,
несущие одновременно иммуноглобулиновые рецепторы
р- и е-типов, были найдены Й. Кумагаи и др. (Y. Kuma-
gai et al., 1982) в селезенке мышей, иммунизированных
круглыми глистами Nippostrongylus brasiliensis. Суще-
ствование единого предшественника, несущего рецепто-
ры p-типа, для плазматических клеток, которые проду-
цируют иммуноглобулины всех классов, включая IgE,
подтверждают также опыты по супрессии изотипа (см.
гл. 10).
Гомоцитотропины со свойствами IgG имеют наиболь-
шую электрофоретическую подвижность по сравнению с
IgG других подклассов. К ним относятся IgGl морской
свинки, IgGl мыши, IgGa крысы. Молекулярная масса
этих белков, как и других IgG, 160 000 (IgE— 185 000).
Их содержание в сыворотке примерно в 1000 раз превы-
шает содержание IgE (1—3 мг/мл против 2 мкг/мл).
IgG-гомоцитотропины образуются при иммунизации са-
мыми различными антигенами -и способны сенсибилизи-
ровать in vitro ткани животного того же вида (обычно
фрагменты легких), лейкоциты, тучные клетки. В ре-
зультате контакта сенсибилизированных этими антите-
лами тканей с антигеном из клеток высвобождаются
биогенные амины и другие субстанции анафилаксии.
5—1258	129
В опытах in vivo IgG-гомоцитотропные антитела вызы-
вают реакцию пассивной кожной анафилаксии.
Характерной особенностью IgG-гомоцитотропинов яв-
ляется образование относительно легко диссоциируемо-
го комплекса с рецепторами клеток-мишеней. Эти рецеп-
торы распознают структуры, расположенные в Fc-участ-
ке молекулы, и, следовательно, относятся к Fcy-рецепто-
рам. Прочность фиксации IgG-гомоцитотропинов на
клетках существенно возрастает в присутствии антигена.
Аналогичное явление наблюдается при связывании гете-
рологичных и гомологичных антител IgG-класса с Fcv-
рецепторами лимфоцитов. Причины этого явления об-
суждаются ниже.
Центр, ответственный за взаимодействие IgG-антител
с тучными клетками, находится в Fc-участке молекулы;
в его организации участвует не только С?3-, но и С?2-до-
мен. Так, после гидролиза IgG пепсином (что приводит
к разрушению С-^2-доменов) в составе продуктов гидро-
лиза не удается обнаружить фрагментов, способных кон-
курентно ингибировать связывание нерасщепленных
IgGl-гомоцитотропинов клетками. На основании всех
имеющихся данных можно заключить, что центр форми-
руется при участии Cv2- и СуЗ-доменов.
IgG кролика, собаки и человека способны фиксиро-
ваться в коже и тканях морской свинки. После взаимо-
действия с антигеном или анти- IgG-антителами фикси-
рованные на тучных клетках морской свинки чужерод-
ные для этого животного IgG вызывают высвобождение
субстанций анафилаксии. Такие гетероцитотропные ан-
титела в отличие от IgG-гомоцитотропинов имеют мень-
шую электрофоретическую подвижность, способны акти-
вировать систему комплемента по классическому пути
(см. гл. 8). Их содержание в сыворотке достаточно вели-
ко: 3—5 мг/мл. Среди подклассов IgG человека способ-
ностью фиксироваться клетками морской свинки облада-
ют все подклассы, за исключением второго.
При изучении IgG кролика была продемонстрирова-
на зависимость цитотропных свойств от общей конфор-
мации молекулы. Как показали И. Тарханова с соавто-
рами (1975), расщепление в молекуле IgG кролика
только одной дисульфидной связи в районе талии моди-
фицирует белок таким способом, что он менее эффектив-
но фиксируется в коже морской свинки in vivo (рис. 32)
и полностью теряет способность связываться изолиро-
ванными тучными клетками. Это происходит несмотря
130
на то, что центр для связывания IgG тканями морской
свинки находится не в районе талии молекулы IgG, а в
пределах Fc-участка. Действительно, полученный с по-
мощью папаина Fc-фрагмент молекулы IgG эффективно
конкурирует с нерасщепленным IgG за рецепторы на
клетках-мишенях. Следовательно, инактивация гетеро-
цитотропного IgG после разрыва дисульфидной связи в
Число $Н- групп, высво-
бодившихся при вос-
становлении
Рис. 32. Влияние восстановления дисуль-
фидной связи между тяжелыми цепями
IgG кролика (IgG-антитела против яич-
ного альбумина) на способность этого
белка вызывать реакцию пассивной кож-
ной анафилаксии у морских свинок
районе талии (эта связь в молекуле IgG кролика един-
ственная) — результат изменения общей конформации
молекулы. Такие изменения, как об этом свидетельству-
ют данные о строении IgG, могут быть обусловлены уве-
личением свободы движений Су2-доменов относительно
друг друга и С73-доменов (см. рис. 20). Как будет про-
демонстрировано ниже, расщепление дисульфидной свя-
зи в районе талии оказывает большое влияние на реали-
зацию многих эффекторных функций IgG.
Фиксация на макрофагах (моноцитах) и лимфоцитах.
Указанная функция присуща прежде всего IgG и IgE.
IgM способен фиксироваться только на одной из субпо-
пуляций Т-лимфоцитов.
5*
131
На макрофагах (моноцитах) обнаружено несколько
видов рецепторов для IgE и IgC, причем последние спе-
циализированы в отношении связывания белка в моно-
мерной и агрегированной формах. В свою очередь, ре-
цепторы для нативного IgG подразделяются по специ-
фичности на рецепторы для разных подклассов IgG.
В агрегированной форме (например, в виде комплекса
антиген-антитело) IgG с равной эффективностью связы-
вается как гомологичными, так и гетерологичными мак-
рофагами. Связывание нативного IgG видоспецифично.
Важные данные получены при определении констан-
ты связывания мономерной формы IgG гомологичными
макрофагами (R. Leslie, М. Alexander, 1982). Проанали-
зировано взаимодействие в гомологичных системах IgG
человека, кролика, морской свинки, мыши. Как видно из
табл. 7, константа связывания Аа в различных системах
колеблется на два порядка (от 6Х105 -М-1 до 1,ЗХ
Х108 М-1). Число связывающих центров, т. е. Ест-рецеп-
торов, на поверхности макрофагов варьирует от 2Х104 до
4.5Х106. При этом величина Ка тем больше, чем меньше
число связывающих центров. Реакция IgG с макрофага-
ми — это экзотермическая реакция, в силу чего с повы-
шением температуры (от 20 до 37°С) величина Ка сни-
жается приблизительно на 30%. Тем не менее при вели-
чине Ка порядка 105—107 М 4 (при 37°С), свыше 95%
Fcy-рецепторов макрофагов для IgG заняты фиксирован-
ным на них IgG в мономерной форме.
Таблица 7. Константа связывания и число рецепторов для IgG
на перитонеальных макрофагах
Вид	Подкласс IgG	Темпера- тура инку- бации, °C	(X10-5M-J)	Число рецеп- торов и a клетку (XJO-5)
Морская свинка	IgGl	20	6,1±1,5	13,3±1,8
	IgG2	20	14,6±4,5	25,0±4,0
Кролик	IgG	20	5,9±1,6	46±21
Мышь	IgG2a	4	1300	4,4
	IgG2e	4	90	2,9
Остается открытым вопрос, необходимо ли in vivo
вытеснение мономерного IgG с поверхности макрофагов
для связывания этими клетками иммунных комплексов?
Проблема существенна, так как без ее решения невоз-
132
можно объяснить с современных позиций важнейший ме-
ханизм иммунитета — освобождение организма от комп-
лексов антител с самыми разнообразными антигенами,
включая патогенные бактерии, вирусы, простейшие.
Среди подклассов IgG человека с моноцитами из кро-
ви человека связываются в мономерной форме только
IgGl и IgG3 (с нейтрофилами связываются все четыре
подкласса IgG человека). На макрофагах мыши сущест-
вуют специальные рецепторы для двух подклассов IgG:
IgG2a и IgG2b. Центр для связывания IgG человека мо-
ноцитами находится в СуЗ-домене. После расщепления
из этого домена выделили пептид из 10 аминокислот, ко-
торый конкурирует с IgGl и IgG3 за связывание на мо-
ноцитах.
В IgG2a мыши центр для связывания макрофагами
•находится между Сн2- и СнЗ-доменами, а в IgG2b — в
Сн2-домене.
В-лимфоциты способны образовывать легко диссоци-
ирующие комплексы с IgG в форме мономера, однако
они прочно связывают IgG только в комплексе с антиге-
ном (J. Miller et al., 1972). В'идовая принадлежность ан-
тител при этом не имеет значения. Помимо В-лимфоци-
тов Fcy-рецептор обнаружен на некоторых Т-лимфоци-
тах. У человека Т-лимфоцйтам с Fcy-рецепторами
(FcvR) приписывают свойства Т-супрессоров, а Т-лимфо-
цитам с рецепторами для IgM(FcnR) —свойства Т-хел-
перов.
На некоторых субпопуляциях В- и Т-лимфоцитов
найдены рецепторы для IgE. Число В-лимфоцитов, свя-
зывающих IgE, возрастает у людей, страдающих аллер-
гическими заболеваниями, а также у инфицированных
патогенными глистами животных, имеющих повышенный
уровень IgE.
То обстоятельство, что IgG-антитела в комплексе с
антигеном обладают значительно большим сродством к
Fc-рецепторам В-лимфоцитов, чем IgG в мономерной
форме, вряд ли можно приписать кооперативности взаи-
модействия нескольких Fc-участков с соответствующим
числом Ес^ецепторов. Так, комплексы антигена (яич-
ный альбумин) с кроличьими IgG-антителами практиче-
ски утрачивают сродство к Fc-рецепторам лимфоцитов
после расщепления единственной дисульфидной связи в
районе талии (И. Тарханова и др., 1973). Модифициро-
ванные таким способом антитела полностью сохраняют
антигенсвязывающие свойства. Поэтому представляется,
133
что усиление сродства IgG-антител к Fc-рецептору пос-
ле образования ими комплекса с антигеном обусловлено
конформационными изменениями в Fc-участке молеку-
лы. После расщепления дисульфидной связи в районе
талии антигензависимые изменения в Fc-участке моле-
кулы не происходят. Справедливость этого предположе-
ния подтверждают данные сравнительного изучения комп-
лексов бивалентного гаптена с нативными IgG-антите-
лами и теми же антителами с восстановленной дисуль-
фидной связью в районе талии. По данным спектрофлу-
ориметрии, образование иммунного комплекса нативны-
ми антителами приводит к конформационной перестрой-
ке в Fc-участке молекулы. Эти изменения не происходят,
если в молекуле антитела расщеплена дисульфидная
связь в районе талии (J. Schlessinger et al., 1975).
Обобщая существующие к настоящему времени дан-
ные о взаимодействии иммуноглобулинов с клетками,
необходимо подчеркнуть следующие основные положе-
ния.
1.	Взаимодействие иммуноглобулинов с клетками
обусловлено наличием на поверхности клеток специаль-
ных рецепторов, распознающих характерные для имму-
ноглобулинов данного видового происхождения, класса
и подкласса структуры в Fc-участках их молекул.
2.	В одной и той же молекуле иммуноглобулина мо-
жет находиться два ,и более не перекрывающихся прост-
ранственно (или только частично перекрывающихся)
центров для связывания с различными типами клеток.
3.	Центр, ответственный за связывание иммуноглобу-
лина клетками, образован (в нескольких изученных слу-
чаях) коротким отрезком пептидной цепи из 5—10 ами-
нокислот. Выделенные из состава молекулы иммуногло-
булина, эти пептиды способны функционировать авто-
номно.
4.	Несмотря на очевидную простоту структурной ор-
ганизации центров, отвечающих за связывание иммуно-
глобулинов клетками, они испытывают на себе влияния
со стороны других участков молекулы. Связь с общей
конформацией молекулы может выражаться либо экра-
нированием, либо, наоборот, большим экспонированием
центра на поверхности молекулы.
Связывание Clq субкомпонента первого компонента
комплемента. Этой важной в биологическом отношении
функцией обладают IgG и IgM. Прочное связывание
134
Clq служит необходимым условием активации системы
комплемента по классическому пути (см. гл. 8).
Clq — белок с молекулярной массой около 400 000,
состоит из шести идентичных субъединиц (рис. 33), каж-
дая из которых содержит структуру, обеспечивающую
взаимодействие с IgG или IgM (см. гл. 8).
Рис. 33. Структура Clq субкомпонента первого компо-
нента системы комплемента
Будучи в растворе, IgG в мономерной форме образу-
ет легко диссоциирующий комплекс с Clq. При большом
избытке IgG, сдвигающем равновесие реакции в сторону
образования комплекса, наблюдали формирование 15S
компонента, состоящего приблизительно из четырех мо-
лекул IgG, ассоциированных с одной молекулой Clq.
Высокодиссоциируемый комплекс с эквимолярным соот-
ношением реагентов в нем образуется в растворе между
IgM и Clq.
Сродство IgG к Clq резко возрастает при проведении
реакции в гетерофазной системе, когда IgG фиксируют
предварительно на инертном носителе (присоединяя, на-
пример, ковалентно к бромциансефарозе). Прочность
связи между иммобилизованным IgG и Clq столь вели-
ка, что позволяет выделить Clq из плазмы количествен-
135
но. Для элюции Clq приходится применять растворы
алифатических диаминов (этилендиамин, гексаметилен-
диамин) или водные растворы аммиака.
Предполагают, что для прочного связывания Clq не-
обходима определенная конформационная перестройка
IgG. Это предположение базируется на том, что IgG в
форме комплекса с антигеном, а также IgG, агрегирован-
ный иными способами (прогреванием при 63°С, сшивкой
бифункциональными реагентами), прочно связывает
Clq. IgM прочно связывает Clq также после его агрега-
ции. Но это условие не является обязательным. Как
убедительно показали Х.-Ч. Чианг и М. Кошланд
(Н.—Ch. Chiang, М. Koshland, 1979), даже комплекс IgM-
антител с одновалентным гаптеном имеет высокое сродст-
во к Clq. Хотя агрегации IgM не происходит, наблюдают-
ся вызванные гаптеном изменения конформации иммуно-
глобулина, в том числе Fc-участка молекулы. Все эти
данные позволяют предполагать лишь, что связывание
Clq — кооперативный процесс, и прочная фиксация до-
стигается скорее всего в случае соединения Clq с имму-
ноглобулинами по нескольким точкам. Так как в моле-
куле IgG два центра для связывания Clq, но стерически
доступен, по-видимому, только один, для связывания
Clq по нескольким точкам необходимо сближение в про-
странстве нескольких эффекторных центров. Это дости-
гается при агрегации IgG или его фиксации на нераст-
воримом носителе. В молекуле IgM пять доступных для
Clq центров. Поэтому кооперативный эффект при взаи-
модействии может быть достигнут даже при формирова-
нии эквимолекулярного комплекса, но при условии, что
все центры для связывания Clq в молекуле IgM будут
располагаться в пространстве наиболее благоприятным
образом для фиксации лиганда. Этому, очевидно, спо-
собствует гаптен, связывающийся с IgM-антителами.
Прочное связывание Clq иммуноглобулинами — не-
обходимое условие для фиксации на молекуле Clq и по-
следующей активации двух субкомпонентов первого ком-
понента системы комплемента: С1г и Cis. Молекула Clq
при прочной фиксации иммуноглобулинами классов G и
М претерпевает конформационные изменения, которые
служат необходимым предварительным условием для
связывания С1г и Cis (см. гл. 8).
Изолированный Fc-фрагмент молекулы IgG в агреги-
рованной форме фиксирует Clq. Этим свойством не об-
ладает полученный с помощью пепсина Fc'-фрагмент —
136
димер СуЗ-доменов. Уже это позволило заключить, что
центр для связывания Clq расположен в пределах Сн2-
доменов.
Следующим этапом в изучении центра для связыва-
ния Clq было выделение пептида из 60 аминокислот,
входящего в состав Сн2-домена IgG мыши, который
обладал способностью связывать Clq после адсорбции
на латексе полистирола. Затем был синтезирован ряд
олигопептидов, воспроизводивших отдельные участки
Сн2-домена в районе, где расположен центр для Clq.
Оказалось, что пептид состава: Lys — Ala — Asp —
Trp — Туг — Vai — Asp—Gly не только связывает Clq,
но и обеспечивает реализацию последующих этапов акти-
вации комплемента (R. Boakle et al., 1979). По данным
Т. Люкакс и соавторов (Т. Lukacs et al., 1979), центр
для связывания Clq расположен в пределах декапепти-
да между 282 и 292 остатками Сн2-домена IgGl челове-
ка. Рентгеноструктурный анализ указывает на то, что
центр для Clq расположен, очевидно, на наружной по-
верхности Сн2-домена, не экранированной углеводным
компонентом (см. рис. 20). Предполагаемый участок
Сн2, где находится центр, достаточно гибок, что, вероят-
но необходимо для связывания Clq.
Подробно останавливаясь на проблеме взаимодейст-
вия IgG (молекулярная масса 150 000) с Clq (молеку-
лярная масса около 400 000), мы стремимся обратить
внимание читателей на два существенных в биологиче-
ском плане аспекта проблемы. Первый заключается в
том, что при малой площади собственно участков контак-
та (для IgG, как было показано, этот участок ограничен
отрезком цепи из 10 остатков) удержание рядом друг с
другом таких крупных молекул только за счет слабых
нековалентных взаимодействий при условии их интен-
сивного броуновского движения в растворе требует
именно кооперативности взаимодействия. Последнее об-
легчается поливалентностью реагирующих молекул: соб-
ственно Clq с шестью центрами, IgM, имеющим до пяти
функционирующих (активных) центров, в различной ме-
ре агрегированного IgG.
Второй аспект проблемы связан с первым *и состо-
ит в том, что происходящий вслед за фиксацией Clq
каскад реакций, протекающих при активации компле-
мента, требует предварительных конформационных изме-
нений в молекуле Clq, причем в участке, удаленном при-
мерно на 100—150 нм от участка молекулы, с которым
137
связывается антитело. Индуцируемый антителом кон-
формационный переход в молекуле Clq допустим с энер-
гетической точки зрения только при большом выигрыше
в энергии на этапе формирования комплекса Clq-анти-
тело. А это, в свою очередь, возможно прежде всего за-
счет кооперативности процесса взаимодействия, предъяв-
ляющего большие требования к пространственному со-
ответствию реагирующих молекул. Так, пространствен-
ная организация макромолекул (которую на языке клас-
сической биологии можно было бы назвать морфологией
молекулы), предетерминированная генетически, обеспе-
чивает течение крайне важных в биологическом отноше-
нии реакций без участия катализаторов.
Центр для связывания Clq, имеющийся в молекуле
IgM, расположен в третьем константном домене. Увели-
чение сродства IgM-антитела к Clq после связывания
антителом антигена (гаптена) можно объяснить проис-
ходящими при этом изменениями конформации молеку-
лы антитела, наблюдаемыми даже при связывании од-
новалентного гаптена. Если обратиться к схеме,
изображающей структуру IgM (см. рис. 16), становится
очевидным, что, несмотря на существование нескольких
центров для связывания Clq в молекуле IgM, они не
способны одновременно взаимодействовать с нескольки-
ми центрами одной молекулы Clq. Причина этого лежит
в большом диаметре молекулы IgM и (или ) простран-
ственной недоступности Fcg-участков для Clq (см. рис.
33). Именно в этих условиях важна роль антигена, из-
меняющего конформацию молекулы IgM-антитела та-
ким образом, что число пространственно доступных для
Clq центров возрастает.
Связывание СЗ. Иммуноглобулины тех классов, кото-
рые не связывают Clq и, следовательно, не способны
обеспечить активацию комплемента по классическому
пути (см. гл. 9), способны активировать комплемент по
альтернативному пути, благодаря их свойству связывать
ключевой компонент альтернативного пути — СЗ, вернее
модифицированный СЗ — СЗЬ. Этими свойствами обла-
дают агрегаты сывороточных IgA, IgE, а также агреги-
рованный IgG человека. Центр для связывания СЗЬ рас-
положен в С-концевой части Fab-участка, граничащего
с районом талии. За это свидетельствуют данные о спо-
собности пепсиновых Fab'- и F(ab') 2-фрагментов, но не
папаинового Fab-фрагмента активировать систему ком-
племента без участия совершенно необходимых для
138
классического пути активации С4 и С2 (А. Кульберг
и др., 1971; A. Sandberg et al., 1971). Получены также
прямые доказательства связывания СЗЬ с помощью
Fab'- и Р(аЬ')г-фрагментов.
Связывание белка A Staphylococcus aureus. Белок А
клеточной стенки Staphylococcus aureus (штамм Cowan
содержит его в наибольшем количестве) образован од-
ной полипептидной цепью с молекулярной массой 42 000.
У большинства штаммов стафилококка белок ковалент-
но связан с клеточной стенкой через пентаглициновый
мостик пептидогликана. Он может быть отщеплен и по-
лучен без углеводного компонента путем переваривания
лизостафином. Отдельные варианты S. aureus при куль-
тивировании на жидкой среде высвобождают белок А в
культуральную жидкость. Последняя служит источни-
ком для получения белка А в очищенном виде
В молекуле белка А содержится четыре идентичных
центра для связывания IgG различных биологических
видов. Каждый центр входит в состав отдельного доме-
на белка А, причем домены характеризуются структур-
ной автономией. Все подклассы IgG человека, за исклю-
чением IgG3, взаимодействуют с белком А. Некоторые
моноклональные иммуноглобулины классов М и А так-
же связывают белок А, но это скорее исключение.
Центр для связывания белка образован при участии
Сн2- ‘и СнЗ-доменов IgG, что было независимо установ-
лено D. Stanworth и И. Тархановой с А. Руденским в
1979—1980 гг. Этот вывод вытекает из того факта, что
из фрагментов IgG: Fab, Fc, Fc', Facb только Fc-фраг-
мент связывает белок А. Обсуждая локализацию центра
для связывания белка А, существенно упомянуть, что
белок А и Clq не конкурируют между собой за центры
связывания (центр для связывания последнего находит-
ся на наружной поверхности Сн2-домена).
Определение точной локализации центра для белка А
достигнуто после получения в кристаллическом виде мо-
номолекулярного комплекса Fc-фрагмента и одного из
четырех доменов белка А — FB. Центр действительно
располагается в месте контакта Сн2- и СнЗ-доменов
(J. Diesenhofer, 1982).
Связывание IgG белками клеточной стенки кокков1
представляет далеко не академический интерес. Во-пер-
1 Помимо стафилококка белки, реагирующие с Fc-участком мо-
лекулы IgG, обнаружены также у стрептококков.
139
вых, эта реакция оказалась очень удобной для выявле-
ния IgG (в том числе IgG антител) в таких условиях
(в частности, в клеточных культурах), где для той же
цели потребовались бы значительно более трудоемкие и
дорогостоящие методы. Во-вторых, реакция между пато-
генными кокками и IgG происходит, очевидно, в инфи-
цированном ими организме. Если формирование комп-
лекса происходит в масштабах, достаточных для индук-
ции иммунного ответа, могут появиться антитела против
аутологичного IgG (антиантитела) за счет срыва имму-
нологической толерантности перекрестно-реагирующим
антигеном (см. гл. 11). Появление антител против IgG,
в том числе и гетерологичного, отмечается, в частности,
при иммунизации стрептококком.
6.2. Антигензависимые эффекторные
функции
Биологические реакции, возникающие
в результате взаимодействия антител с антигеном как в
биологических жидкостях, так и на поверхности клеток,
лежат в основе многих явлений, которые наблюдаются
при инфекционных и аллергических заболеваниях, ос-
ложнениях, возникающих при вакцинации, а также при
аутоиммунном процессе. Их возникновение обусловлено
реализацией антигенсвязывающих и эффекторных функ-
ций иммуноглобулинов. Рассмотрим основные эффектор-
ные функции, характерные для комплекса антиген-анти-
тело.
Активация системы комплемента. Каскад фермента-
тивных реакций, инициация которого осуществляется
комплексами антиген-антитело, служит одним из важ-
нейших механизмов регуляции гомеостаза. Значение
процесса активации комплемента тем более велико, по-
скольку он сопряжен с активацией фибринолитической
системы и системы свертывания крови, высвобождени-
ем нз клеток биогенных аминов и других биологически
активных соединений. Механизм активации комплемен-
та и роль этого процесса в иммунном гомеостазе рас-
сматриваются в гл. 8.
Нейтрализация бактериальных токсинов. Многие мик-
роорганизмы в процессе жизнедеятельности выделяют в
среду белки, имеющие сильное токсическое действие на
организм млекопитающих. Подобные вещества — экзо-
токсины — образуют, как правило, патогенные для чело-
140
века анаэробные -бактерии: Вас. tetanus, Вас. diphteria,
Вас. botulinus, а также несколько видов бактерий, вызы-
вающих у человека газовую гангрену (Вас. perfringens,
Вас. oedematiens). Не обсуждая здесь вопрос о механиз-
ме действия токсинов, отметим, что каждый токсин име-
ет так называемую токсофорную группу, от блокирова-
ния которой зависит нейтрализация токсина. Блокиров-
ка достигается химическим путем, например обработкой
формальдегидом, в результате чего образуется так назы-
ваемый анатоксин. Последний не отличается по антиген-
ному строению от токсина, но лишен токсических
свойств. При иммунизации анатоксином образуются ан-
титела — антитоксины, специфически нейтрализующие
токсины в организме и животного, и человека.
В настоящее время достоверно установлено, что са-
ма токсофорная группа не содержит антигенной детер-
минанты !.
Значит, нейтрализация токсина может произойти
только в результате пространственного экранирования
токсофорной группы антителами, присоединяющимися к
участкам молекулы токсина, который находится вне ток-
софорной группы. Уже на основании этого можно пред-
положить, что блокирование токсофорной группы будет
более эффективным, если в этом процессе участвует не
только содержащий активный центр Fab-участок моле-
кулы, но и Fc-участок.
Это предположение экспериментально проверили
И. Тарханова с соавторами (1972), сравнивая на моле-
кулярной основе нейтрализацию столбнячного токсина
верасщепленным IgG-антитоксином кролика, а также
его F(ab')2- и Fab'-фрагментами. Не отличаясь по срод-
ству к токсину, фрагменты были соответственно в 3 и 6
раз менее активны по сравнению с нерасщепленным ан-
титоксином. Полученные результаты подтверждают важ-
ную роль всех участков молекулы антитоксина в реали-
зации его токсиннейтрализующего действия, равно как
и важное значение в этом процессе бивалентного харак-
1 Приводим убедительный эксперимент, подтверждающий это.
Л. Бартова с соавторами (1972) иммунизировали кур высокоочи-
щенными столбнячным токсином и анатоксином. Иммунизация ток-
сином оказалась возможной, так как куры не чувствительны к стол-
бняку. Сравнение антисывороток к токсину и анатоксину путем их
перекрестной сорбции на иммуносорбентах показало полное совпаде-
ние сравниваемых антител по специфичности.
141
тера антител. Но полученные результаты трактуются не-
однозначно, и вот почему.
Оценку нейтрализующего действия антител и их
фрагментов проводят, вводя приготовленные в пробирке
комплексы высокочувствительным к столбнячному ток-
сину животным — белым мышам. Как уже говорилось в
разделе 6.1, комплексы антигена с Fab-фрагментами ан-
тител циркулируют продолжительное время и не захва-
тываются фагоцитами. Из материалов гл. 4 ясно, что да-
же при высоком сродстве антител к антигену (гаптену)
комплекс в ограниченной степени диссоциирует. Следо-
вательно, в случае комплекса токсин-РаЬ'-фрагмент ан-
титоксина за период циркуляции комплекса все время
высвобождается токсин, который быстро фиксируется
высокочувствительными к нему клетками нервной систе-
мы. Со временем, там накопится достаточно токсина,
чтобы вызвать заболевание у животного. Разумеется,
комплекс токсина с нерасщепленным антитоксином так-
же диссоциирует. Но время его циркуляции крайне не-
велико вследствие захвата фагоцитами. Здесь мы подхо-
дим к рассмотрению вопроса об определяющей роли фа-
гоцитирующих клеток в обеспечении защитного дейст-
вия антитоксических, антибактериальных и противови-
русных антител. Молекулярные аспекты этой проблемы
рассматриваются в следующем разделе.
Роль антител в усилении фагоцитоза. Вирусы, риккет-
сии, бактерии, простейшие способны фиксироваться на
поверхности фагоцитов (макрофагов и сегментоядерных
лейкоцитов), а затем поглощаться клетками. Связыва-
ние носит неспецифический характер, т. е. на поверхно-
сти фагоцитов нет специализированных рецепторов толь-
ко для какого-нибудь определенного вида микроорганиз-
мов. Один и тот же фагоцит способен в принципе связы-
вать самые разнообразные микроорганизмы. .
Число фагоцитированных микроорганизмов и ско-
рость фагоцитоза значительно возрастают в том случае,
когда микроорганизмы предварительно инкубируют с
направленными против них IgG-антителами. Такие анти-
тела получили название опсонинов, а обусловливаемый
ими эффект — опсонизирующим. Только IgG-антитела,
как гомологичные, так и гетерологичные, усиливают фа-
гоцитоз и, следовательно, обладают опсонизирующими
свойствами. Ни F(ab')2-, ни Fab'-фрагменты опсонинов
фагоцитоз не усиливают. Это позволило предположить,
что опсонины усиливают фагоцитоз за счет того, что
142
обеспечивают фиксацию корпускулярного антигена на
поверхности фагоцитов, в том числе и через Fc-рецепто-
ры (см. раздел 6.1).
В последнее время убедительно доказана роль Fc?-
рецептора макрофагов в реализации действия IgG-опсо-
нинов (И. Сычева и др., 1983). Были получены антитела
против Fcv-рецепторов макрофагов мыши. Эти антитела
и их .Fab'-фрагменты обладали свойством экранировать
Fcy-рецепторы, препятствуя взаимодействию последних
с IgG в агрегированной форме. Обработка перитонеаль-
ных макрофагов Fab'-фрагментами антител против
Рст-рецепторов полностью отменяла опсонизирующее
действие IgG-антител против бактериальных клеток
Salmonella typhimurium (табл. 8). Те же фрагменты со-
вершенно не влияли на фагоцитоз не обработанных оп-
сонинами бактерий. Следовательно, экранирование Fc?-
рецептора — основной фактор, препятствующий . дейст-
вию опсонинов. А это, в свою очередь, означает, что,
именно благодаря наличию в молекуле IgG-антитела эф-
фекторного центра для Fcy-рецептора реализуется важ-
нейший механизм иммунологической защиты — ускорен-
ное очищение макроорганизма от инфекционных аген-
тов.
Таблица 8. Влияние Fab'-фрагментов из анти-Рс^К-антител на
фагоцитоз Salmonella 1ур1шпипит перитонеальными макрофагами
Фагоцитируемый объект	Необработанные макрофаги		Макрофаги, обработан- ные фрагментами из ан- ти-Fc 7 R2	
	Клетки, содержащие бактерии, % М±ш	Фагоци- тарный индекс 1	Клетки, содержащие бактерии, % М±ш	Фагоци- тарный индекс 1
5. typhimu.riu.tn S. typhimurium сенсибилизирован- ные IgG-антителами	38,0± 1,40 63,0±2,52	1,43 1,91	42,0±1,12 27,0± 1,26	1,24 0,72
1 Фагоцитарный индекс •— число бактерий, поглощенных единичным мак-
рофагом.
2 В контрольных опытах макрофаги обрабатывали Fab'-фрагментами из
неродственных антител. Это не оказывало никакого влияния на фагоцитоз.
Нейтрализация вирусов антителами. Хотя фагоцитоз
опсонизированных антителами вирусов служит, по-види-
мому, важнейшим механизмом клиренса находящегося
143
вне клеток вируса и купирования тем самым вирусной
инфекции, понимание этого процесса требует установле-
ния взаимосвязи между строением комплекса вирус-ан-
титело и способностью вируса к заражению клеток. Дело
в том, что комплексы вирусов с антителами, сохраняющие
еще инфекционную активность (т. е. способность прони-
кать в чувствительные клетки и размножаться в них), были
обнаружены в кровотоке при ряде вирусных инфекций,
например, у мышей, зараженных лактатдегидрогеназным
вирусом или вирусом лимфоцитарного хориоменингита
при так называемой алеутской болезни норок. Имеются
сведения о возможности циркулировать вируссо-
держащих иммунных комплексов при гепатите В у чело-
века. Персистенция комплексов вирус-антитело, облада-
ющих инфекционной активностью, служит одним из су-
щественных факторов, обусловливающих хроническое те-
чение ряда вирусных заболеваний.
Следует особо подчеркнуть, что защитное действие
противовирусных антител будет зависеть в конечном сче-
те от двух их качеств: способности экранировать те уча-
стки вирусной частицы, которыми последняя фиксирует-
ся на чувствительных к данному вирусу клетках, и
опсонизирующих свойств противовирусных антител. По-
скольку нейтрализацию вируса антителами можно про-
верить in vitro, оценивая действие комплекса вирус-ан-
титело на клеточные культуры, две отмеченные выше
стороны действия антител можно разграничить Ч
Опыт показывает, что моновалентные Fab- или Fab'-
фрагменты противовирусных антител значительно усту-
пают нерасщепленным антителам в нейтрализации ви-
руса в культуре клеток. Такие данные в опытах с полио-
вирусом получены, в частности, Ю. Первиковым с соав-
торами (1975, 1976). Добавление к комплексу вирус-
Fab-фрагмент нерасгцепленных противовирусных антител
не обеспечивало полной нейтрализации вируса. По-
следнее связано, очевидно, с блокированием антиген-
ных детерминант вируса Fab-фрагментами, которые са-
ми по себе не обеспечивают эффективного экранирова-
ния вириона. Но почему? Из-за того ли только, что моле-
кула фрагмента меньше по размеру молекулы антитела,
1 Другой традиционный способ оценки защитного действия про-
тивовирусных антител, связанный с введением комплекса вирус-ан-
титело куриным эмбрионам, по сути аналогичен методу оценки за-
щитного действия антител в культуре клеток.
144
или потому, что моновалентный фрагмент не способен
«сшить» вирусные частицы, агрегировав их?
Последнее, несомненно, существенно, что было пока-
зано Н. Гутман и А. Кульбергом (1973). К вирусу грип-
па А прибавляли специфические противовирусные анти-
тела в количестве, недостаточном для полной нейтрали-
зации вируса. Если затем к комплексу добавляли
антитела против иммуноглобулинов, эффективность
блокирования вируса возрастала в 8—16 раз. Можно
было предположить, что обнаруженный эффект связан
с более плотным «укутыванием» поверхности индивиду-
альных вирусных частиц. Однако это неверно по следу-
ющим причинам. Так, оказалось, что при одной и той
же дозе вирусспецифических и антиглобулиновых анти-
тел усиливающее действие последних в реакции нейтра-
лизации не изменялось при увеличении заражающей до-
зы вируса в 100 и даже 1000 раз. Если бы результат
действия антиглобулиновых антител был связан с более
эффективным экранированием каждой индивидуальной
вирусной частицы при отсутствии между ними мостиков
из антител, для нейтрализации большего числа вирус-
ных частиц потребовалось бы больше как противови-
русных, так и антииммуноглобулиновых антител. И, на-
конец, Fab-фрагменты антииммуноглобулиновых антител
значительно менее эффективно усиливают нейтрализу-
ющее действие противовирусных антител по сравнению
с нерасщепленными антителами. И это несмотря на то,
что на каждую молекулу противовирусного антитела
как поливалентного антигена присоединяется несколько
(не менее 3—5) молекул Fab-фрагментов антииммуно-
глобулиновых антител.
Таким образом, не за счет «покрывания» антитела-
ми индивидуальных вирионов, а благодаря образованию
достаточно жесткой «решетчатой» структуры посред-
ством «сшивания» антителами вирусных частиц (по типу
решетчатой структуры преципитата, см. гл. 12) обеспе-
чивается эффективная нейтрализация вируса; разумеет-
ся, это происходит при наличии у антитела опсонизиру-
ющих свойств, т. е. принадлежности к иммуноглобули-
нам класса G и сохранения Fc-участка молекулы.
Участие антител в высвобождении биогенных аминов
из тучных клеток. Процесс высвобождения биогенных
аминов, как упоминалось в разделе 6.1, лежит в основе па-
тофизиологических реакций, возникающих у человека
при аллергии, а в эксперименте — при анафилаксии.
145
Высвобождению аминов (гистамин, серотонин, так
«взываемая медленно реагирующая субстанция анафи-
лаксии— SRS-A), предшествует взаимодействие фикси-
рованных на поверхности тучных клеток цитотропных
IgE- или IgG-антител с антигеном (аллергеном). Те же
процессы возникают при реакции фиксированных на
клетках цитотропных иммуноглобулинов указанных
классов с антителами против IgE и IgG. Активация ме-
таболических процессов в тучных клетках, предшеству-
ющая высвобождению вазоактивных аминов, происходит
.лишь в том случае, когда антиген поливалентен, а анти-
иммуноглобулиновые антитела — бивалентны. Так, фра-
гмент aHTH-IgE-антител не вызывает высвобождения
.аминов (дегрануляция) тучных клеток, сенсибилизиро-
ванных IgE. Причины того, что «сшивание» нескольких
молекул IgE или IgG цитотропных антител необходимо
.для активации клетки, связаны как с влиянием этого
процесса на цитоплазматическую мембрану, так и с кон-
формационной перестройкой молекулы фиксированного
.антитела и появлением эффекторного центра. Этот
центр обозначен Д. Стенвортом (D. Stanworth, 1971)
как активирующий ткани центр. Центр возникает под
влиянием антигена в молекуле IgE-антитела, отличаясь
по структуре и локализации от центра, отвечающего за
фиксацию IgE на клетке-мишени.
Высвобождение вазоактивных аминов из тучных кле-
ток под действием комплекса цитотропных антител с ан-
тигеном протекает в диапазоне pH 7,5—7,9 при 37—38°С
и требует присутствия в среде Са2+. Необратимое по-
давление процесса происходит при 45°С. В активации
клеток участвует сериновая протеиназа (процесс блоки-
рует диизопропилфторфосфат). Дегрануляцию подавля-
ют также ингибиторы гликолиза. Накопление в тучных
клетках циклического аденозинмонофосфата (цАМФ)
препятствует процессу дегрануляции. Это наблюдается,
например, в присутствии простагландинов. В свою оче-
редь, метилксантин, подавляющий активность фосфоди-
эстеразы цАМФ, тормозя распад этого метаболита, бло-
кирует одновременно высвобождение вазоактивных ами-
нов из тучных клеток, несущих на своей поверхности
комплекс цитотропных антител с антигеном.
Зависимая от антител клеточная цитотоксичность.
Если инкубировать с лимфоцитами неиммунизированных
животных какие-либо клетки, обработанные IgG-антите-
лами против антигенов этих клеток, происходит гибель
146
сенсибилизированных антителами клеток-мишеней. Эф-
фект наблюдается при 37° С в отсутствие комплемента.
Антитела могут быть как гетерологичными, так и гомо-
(изо) логичными. Однако во всех случаях это должны
быть нерасщепленные антитела, а не их Fab- или
F(ab')2-фрагменты. Участвующие в реакции лимфоциты
несут на своей поверхности Fcy-рецепторы, но не имеют
маркеров, характерных для В- и Т-лимфоцитов (см.
гл. 1). Эта малочисленная субпопуляция (не превыша-
ющая нескольких процентов от общего числа лимфоци-
тов) получила название нулевых (т. е. не содержащих
маркеров) или К-клеток (от англ. Killer).
В описываемом феномене антитела выполняют роль
посредников между клеткой-мишенью и К-клеткой. По-
следняя не имеет рецепторов для клетки-мишени и рас-
познает ее через Fc-участки антител, присоединенных к
клетке-мишени.
Убедительно продемонстрированный в модели in vitro
феномен, очевидно, имеет определенное значение и in vivo-
для элиминации, например, клеток с персистирующими
в них микроорганизмами или вирусами, если на поверх-
ности зараженных клеток появятся новые антигены, син-
тез которых контролирует геном паразита. Можно до-
пустить также участие антител и К-клеток в аутоиммун-
ном процессе.
Связывание лимфоцитами иммунных комплексов,
in vivo. Содержащиеся в крови здорового человека лим-
фоциты фиксируют на своей поверхности иммуноглобу-
лины (Н. Dikcler и др., 1975). Адсорбированные иммуно-
глобулины отличают от иммуноглобулинов, синтезиру-
емых В-лимфоцитами и выполняющих функцию антиген-
связывающих рецепторов, с помощью простого теста-
После кратковременной инкубации (0,5—2 ч) лимфоци-
тов при 37° С иммуноглобулины, сорбированные клетка-
ми, исчезают с их поверхности, а иммуноглобулины, про-
дуцируемые клеткой и выполняющие функцию рецепто-
ров, сохраняются.
Иммунные комплексы, возникающие во всех случаях
антигензависимой индукции биосинтеза антител, также
способны фиксироваться на лимфоцитах. Появляясь в;
циркуляции, комплексы могут попадать в селезенку. Этот
процесс требует участия комплемента и лимфоцитов
(N. Rooijen van, 1976) и протекает, очевидно, в две ста-
дии. Первоначально комплексы антиген-антитело, нахо-
дясь в циркуляции, связывают комплемент: Clq и СЗ.
147
Связывание СЗ повышает степень дисперсности комплек-
са (G. Miller, V. Nussenzweig, 1975). Высокодисперсные
иммунные комплексы накапливаются в красной пульпе
селезенки. Здесь происходит их фиксация на поверхности
лимфоцитов, которые переносят комплексы в зародыше-
вые центры. «Лимфоциты, переносящие иммунные ком-
плексы в белую пульпу, принадлежат, очевидно, к В-лим-
фоцитам, имеющим Fc-рецепторы и рецепторы для СЗ
(N. Rooijen van, 1976).
Принципиальное значение имеет вопрос о функции
лимфоцитов, содержащих на своей поверхности адсорби-
рованные иммуноглобулины (антитела) или комплексы
антиген-антитело. Как показано в гл.1, при иммуниза-
ции в селезенке быстро накапливается большое число
клеток, способных связывать антиген, использованный
для иммунизации. Их число в селезенке мыши, иммунизи-
рованной гетерологичными эритроцитами, достигает 2—
2,5% от общего числа ядерных клеток селезенки. Затем
в течение 3—4 дней число этих клеток снижается в
10 раз. Такая кинетика антигенсвязывающих лимфоцитов
дала основание предположить (А. Кульберг и др., 1974),
что большая их часть принадлежит к клеткам, сорбиро-
вавшим на своей поверхности комплексы антиген-анти-
тело. В составе сорбированных комплексов часть актив-
ных центров антител свободна и сорбированные ком-
плексы за их счет связывают антиген. Проверка этого
предположения была осуществлена Б. Юриным с соав-
торами (1976, 1977). Очищенные лимфоциты селезенки
мышей культивировали in vitro в течение 20 ч. Клетки
получали на 5-й и 9-й дни после иммунизации эритроци-
тами барана. Пятый день соответствует максимальному
содержанию в селезенке лимфоцитов, связывающих ан-
тиген, а 9-й — времени резкого снижения их содержания.
Через различные сроки после начала культивирования
определяли число лимфоцитов, связывающих эритроциты
барана (антиген) и общее содержание иммуноглобу-
линов на поверхности клеток, с помощью радиоиммунно-
го анализа (см. гл. 12). Часть проб культивировали в
присутствии циклогексимида — ингибитора биосинтеза
белка.
Из рис. 34 следует, что за 20 ч культивирования лим-
фоцитов, полученных на 9-й день после иммунизации, со-
держание клеток, связывающих антиген, не изменялось.
Не изменялось и содержание иммуноглобулинов на кле-
точной поверхности за 4 ч культивирования (срок на-
148
блюдения). При культивировании в присутствии цикло-
гексимида число связывающих антиген лимфоцитов за
4 ч уменьшилось наполовину. Этот срок соответствует
времени полуобмена иммуноглобулиновых рецепторов
лимфоцитов, установленному Е. Витетта и Дж. Уром
(Е. Vitetta, J. Uhr, 1972). Все это означает, что на 9-й день
после иммунизации в се-
лезенке содержатся толь-
ко такие лимфоциты, ко-
торые связывают антиген
за.счет иммуноглобулино-
вых рецепторов, синтези-
руемых этими клетками.
Совершенно иная кар-
тина наблюдалась при
культивировании лимфо-
цитов, полученных на 5-й
день после иммунизации
(рис. 34). Уже через 1 ч от
момента начала культиви-
рования число клеток,
связывающих эритроциты
барана (антиген), умень-
шалось в два раза. За
этот же срок почти вдвое
уменьшалось содержание
иммуноглобулинов на по-
верхности лимфоцитов. В
то же время за последую-
щие 16 ч дальнейшего
уменьшения числа клеток,
связывающих антиген, не
происходило, за исключе-
нием проб, в которые был
внесен ингибитор белко-
вого синтеза
Рис. 34. Число лимфоцитов, свя-
зывающих антиген в культуре
лимфоцитов из селезенки мыши на
5-й день (Л) и 9-й день (Б) после
иммунизации эритроцитами бара-
на:
1,3 — культивирование без циклогек-
симида, 2, 4 — в присутствии цикло-
гексимида
Таким образом, все лим-
циклогексимид.
фоциты на 5-й день после иммунизации можно разделить
на две группы: необратимо теряющие свои антигенсвя-
зывающие рецепторы (и одновременно часть поверхно-
стных иммуноглобулинов) и способные поддерживать на
постоянном уровне содержание антигенсвязывающих
рецепторов. Вывод из этих опытов очевиден: в селезенке
иммунизированного животного есть много лимфоцитов,
связывающих антиген за счет сорбированных антител
(комплексов антиген-антитело).
149
Позднее аналогичные данные были получены Т. Ка-
киучи с сотрудниками (Т. Kakiuchi et al., 1981). Они об-
наружили комплексы антиген-антитело на Fc-рецепторах
лимфобластов из селезенки мышей на 7-й день после им-
мунизации эритроцитами лошади. Десорбция иммунных
комплексов с поверхности клеток происходила, как и в
описанных выше опытах, при краткосрочной (30 мин —
1 ч) инкубации клеток при 37° С в среде с низким содер-
жанием сыворотки.
Таким образом, можно считать установленным факт
сорбции in vivo на поверхности лимфоцитов комплексов
антиген-антитело. В свете этого факта закономерно воз-
никают два вопроса: насколько долго могут находиться
на клеточной поверхности иммунные комплексы в орга-
низме и какова функция лимфоцитов, сорбировавших им-
мунные комплексы?
Большая скорость десорбции антител (иммунных ком-
плексов), установленная в опытах in vitro, возможно,
связана с их расщеплением протеиназами, находящимися
в лимфоидных клетках. Этому благоприятствуют условия
культивирования клеток, а именно, низкая концент-
рация сыворотки в среде, поскольку при этом низка кон-
центрация содержащихся в сыворотке ингибиторов проте-
иназ. Действительно, инкубация при 37° С клеток селе-
зенки иммунизированных мышей в цельной изологичной
плазме крови резко замедляет процесс десорбции с по-
верхности клеток антител (иммунных комплексов). Зна-
чит, в организме антитела или их комплексы с антигеном
могут продолжительное время оставаться сорбированны-
ми на поверхности лимфоцитов. Такие клетки способны
взаимодействовать с антигеном, не будучи прекоммити-
рованными к синтезу антител и рецепторов к этому анти-
гену.
В настоящее время далеко не все известно о функции
лимфоцитов, чьи антигенсвязывающие свойства обуслов-
лены сорбированными на их поверхности антителами
(иммунными комплексами). Судя по некоторым фактам,
эти клетки у мышей, иммунизированных оптимальной для
продукции антител дозой антигена, могут выполнять
функцию супрессоров реакции гиперчувствительности
замедленного типа (Л. Черноусова и др., 1981, 1982), т. е.
реакцию клеточного иммунитета. Тем самым вскрывается
один из механизмов, регулирующих соотношение реак-
ций гуморального и клеточного иммунитета на один и
тот же антиген.
150
Исследования в описанной области не завершены и
полученные данные не окончательны, однако мы считаем
необходимым обратить на них внимание также и с мето-
дологических позиций. Дело в том, что эти работы пока-
зывают, в частности, как не прост путь от закономерно-
стей, установленных в модельных опытах в пробирке, к
выяснению вероятности реализации этих закономерностей
в целом организме. Путь этот труден, но безусловно пло-
дотворен, так как на нем лежит разгадка крайне много-
образных связей отдельных биологических явлений.
В следующем разделе мы приведем еще один пример то-
го, как, только сочетая сведения, полученные хотя и в
смежных, но различных разделах иммунохимии, удается
наметить подходы для понимания закономерностей те-
чения иммунного процесса в организме.
Интерференция эффекторных функций иммуноглобу-
линов. При изучении каждой в отдельности эффекторной
функции иммуноглобулинов (антител) исследователь не
всегда принимает во внимание, что реализация этих
функций в организме будет происходить при одновремен-
ном присутствии в среде нескольких различных лигандов,
причем в условиях, благоприятных для реакции одной
и той же молекулы антитела с разными лигандами. На-
пример, комплекс антигена с IgG-антителами способен
связывать содержащийся в крови Clq, а также фиксиро-
ваться на Рст-рецепторах макрофагов, нейтрофилов или
лимфоцитов. Центры для Clq и Fc-рецептора находятся,
как известно, в Fc-участке молекулы IgG и пространст-
венно разобщены. Но достаточно ли удалены эти центры
друг от друга, чтобы исключить их взаимное стерическое
экранирование? Вопрос существен для оценки возможно-
стей реализации эффекторных функций в условиях цело-
го организма и, в частности, для оценки иммунопатоло-
гических свойств комплексов антиген-антитело.
В самом деле, если концентрация Clq в циркуляции
будет достаточной для замещения большинства центров
в молекулах IgG-антител, входящих в иммунный ком-
плекс, то из-за больших размеров молекулы Clq (см.
рис. 33 и табл. 9) может пройзойти экранирование цен-
тра для Fc-рецептора. Это сделает невозможным фикса-
цию комплексов на фагоцитах, их захват этими клетка-
ми и, следовательно, выведение из циркуляции. Насколь-
ко опасна такая ситуация в случае продолжительного ио
времени образования иммунных комплексов, например
при аутоиммунных заболеваниях, мы обсудим ниже.
151
Здесь мы хотим продемонстрировать, что интерференция,
эффекторных функций (термин предложен нами) дейст-
вительно имеет место и ее можно продемонстрировать,
например, оценивая влияние Clq на связывание иммун-
ного комплекса клетками селезенки и перитонеальными
макрофагами (А. Кульберг и др., 1985).
В описываемых опытах в качестве иммунного ком-
плекса использовали эритроциты барана, обработан-
ные субагглютинирующей дозой IgG-антител кролика
против эритроцитов барана. Полученные комплексы до-
полнительно инкубировали с высокоочищенным Clq че-
ловека, после чего избыток этого компонента компле-
мента удаляли. Обработанные с помощью Clq иммунные
комплексы в отличие от необработанных не фиксирова-
лись на перетонеальных макрофагах мыши и на клетках
из селезенки мыши. Степень торможения связывания
иммунного комплекса клетками прямо зависела от дозы
Clq. Более того, уже фиксированные на поверхности кле-
ток сенсибилизированные антителами эритроциты отде-
лялись от клеточной поверхности в присутствии Clq. Все
это может означать, что Clq, присоединяясь к антителам
в составе иммунного комплекса, не только препятствует
связыванию комплекса с Гс7-рецепторами клеток (неза-
висимо от их происхождения), но и вытесняет присоеди-
ненный комплекс. Последнее возможно, конечно, потому,
что фиксация на Fc-рецепторах иммунных комплексов но-
сит обратимый характер.
Описанное явление может, как представляется, реа-
лизоваться в организме прежде всего при увеличении
уровня Clq в крови за счет ускорения его синтеза. Это,
в частности, характерно для аутоиммунного процесса
(см. гл. 8). Если в результате нарушения процесса фик-
сации иммунных комплексов на фагоцитах их выведение
из организма будет замедленно, такие комплексы начнут
откладываться вокруг, мелких сосудов почек и других ор-
ганов, что приведет к тяжелой патологии, характерной
для ряда хронических заболеваний с синдромом болезни
иммунных комплексов - (системная красная волчанка
и др.).
Катаболизм
иммуноглобулинов.
Биологические
свойства продуктов
расщепления
г	Как и другие белки, иммуноглобулины
подвергаются катаболитическому распаду. Его скорость
зависит от химического строения иммуноглобулина —
принадлежности к определенному классу и подклассу
(см. табл. 3). У различных биологических видов ско-
рость катаболизма неодинакова и находится в обратной
зависимости от собственной массы особи. Так, у мышей
период полувыведения IgG около трех дней, у кролика —
7, у человека — 21—23 дня. На скорость распада оказы-
вает прямое влияние концентрация иммуноглобулина,
причем даже чужеродный иммуноглобулин может уси-
лить скорость распада собственного иммуноглобулина.
Однако и в этом случае сохраняется эффект классоспеци-
фичности процесса катаболизма иммуноглобулинов
(J. Fahey, A. Robinson, 1963).
Основную роль в катаболизме иммуноглобулинов,
как, впрочем, и других сывороточных белков, играет
печень. В захвате и распаде иммуноглобулинов принима-
ют участие также макрофаги различной органной лока-
лизации (в том числе селезенки). Расщепление иммуно-
глобулинов происходит в воспалительных очагах за счет
действия главным образом тканевых протеиназ, действу-
ющих на содержащиеся в тканевом воспалительном эк-
судате иммуноглобулины.
Изучение состава белков мочи, содержимого лизосом
клеток печени и фагоцитов, а также продуктов, содержа-
щихся в воспалительных очагах, позволило составить
представление о природе промежуточных продуктов рас-
пада иммуноглобулинов и их биологических свойствах.
Многие из изученных продуктов обладали той или иной
биологической активностью, не свойственной нерасщеп-
ленному иммуноглобулину. Тем самым удалось заметно
расширить представления о биологических свойствах им-
муноглобулинов, описав группу «скрытых» эффекторных
153
центров, т. е. центров, появляющихся только после рас-
щепления молекулы иммуноглобулина в определенных
участках.
Фрагменты типа Fab'—F(ab')2. Белки, подобные
Fab'-фрагменту по молекулярной массе, антигенному
строению, пептидным картам, были обнаружены многи-
ми исследователями у человека и кролика в моче и сыво-
ротке крови (Л. Бартова и др., 1962, 1963; J. Remington,
1962; Е. Merler, 1963). А. Кульберг с соавторами (1968,
1970) получили убедительные доказательства катаболи-
тического происхождения этих фрагментов. Кроликам
вводшГи внутривенно гомологичный столбнячный IgG-
антитоксин, после чего в их моче появлялись Fab-фраг-
менты антитоксина, специфически нейтрализовавшие
столбнячный токсин. В других опытах нормальным кро-
ликам вводили IgG-антитела кролика против яичного
альбумина. Во фракции лизосом клеток печени этих кро-
ликов содержались Fab-фрагменты антител к яичному
альбумину. Fab-фрагменты были обнаружены в экстрак-
тах клеток селезенки и субклеточных фракциях клеток
печени крысы, содержащих катепсины (F. Tsuji et al.,
1969).
Приведенные данные, а также факт отсутствия среди
продуктов биосинтеза и неполной сборки иммуноглобу-
линов в плазматических клетках фрагментов типа Fab
(см. гл. 5) служат несомненными доказательствами обра-
зования Fab-фрагментов при внутриклеточном распаде
гомологичного (аутологичного) IgG и других иммуно-
глобулинов. Обнаружение этого фрагмента в лизосомах,
имеющих высокое содержание катепсинов, согласуется с
многочисленными наблюдениями, свидетельствующими
об относительно высокой устойчивости Fab-фрагмента к
более глубокому расщеплению, в том числе и катепси-
нами.
Несмотря на то, что у здоровых особей в крови при-
сутствуют лишь следовые количества Fab- или F(ab')2-
фрагментов, они при определенных условиях могут
накапливаться. Так их содержание возрастает при экс-
периментальном повреждении печени — частичной ге-
патэктомии (Д. Евнин и др., 1971—1976). Своим появле-
нием в этих условиях они обязаны тканевым протеина-
зам. Fab-фрагменты были найдены в гнойном содержимом
абсцессов у человека (М. Waller, 1973).
К настоящему времени установлены две, возможно
взаимосвязанные, эффекторные функции Fab-фрагмен-
154
тов. Как показали Г. Маргулис с соавторами (1977—
1980), Fab'-и F(ab')2-фрагменты IgG кролика и человека,
а также полученный с помощью папаина Fab-фраг-
мент IgG кролика подавляют in vitro бласттрансформа-
цию лимфоцитов крови человека, индуцированную фито-
митогенами — фитогемагглютинином и конканавалином
А. Как известно, под влиянием фитомитогенов резко ус-
коряется синтез ДНК в лимфоцитах; этот процесс можно
зарегистрировать по включению радиомеченого предше-
ственника — 3Н-тимидина в ДНК через 48—96 ч после
добавления индуктора. Fab-фрагменты в 2—3 раза по-
давляют включение тимидина в активированные лимфо-
циты, причем эффект не связан с влиянием фрагмента на
проникновение радиомеченого тимидина в клетки. Фраг-
менты не токсичны для клеток, не оказывают влияния на
пролиферацию фибробластов кожи человека. Они не
влияют на так называемую спонтанную трансформацию
лимфоцитов, т. е. процесс биосинтеза ДНК в покоящих-
ся клетках в отсутствие внешних индукторов. Все это оз-
начает, что влияние Fab-фрагментов испытывают на себе
только те лимфоциты, которые активированы митогеном.
Позже Ю. Первиков и др. (1981) установили, что Fab-
фрагменты подавляют также индуцированную антигеном
бласттрансформацию лимфоцитов человека, происходя-
щую в том случае, когда клетки получают из крови лю-
дей, ранее иммунизированных этим антигеном.
Существенно, что предварительная инкубация лимфо-
цитов с Fab-фрагментом (с последующим промыванием
клеток) не оказывает никакого влияния на процесс ак-
тивации лимфоцитов митогенами. Вместе с тем тот же
фрагмент способен подавить активацию клеток митоге-
ном даже после добавления его спустя 24 и 48 ч после ми-
тогена (уровень включения радиометки оценивали спустя
72 ч после добавления митогена). Установлено также,
что Fab-фрагменты высокоочищенных антител кролика
против-динитрофенильной группы не отличаются по спо-
собности подавлять бласттрансформацию от аналогич-
ных фрагментов нормального IgG. Это указывает на
отсутствие каких-либо реиммуноглобулиновых примесей
в составе препарата фрагмента.
Fab-фрагменты подавляют биосинтез ДНК в активи-
рованных лимфоцитах на протяжении всего периода, в
течение которого фрагмент находится в среде (рис. 35).
Тормозящее действие проявляется в ранней фазе S-пе-
риода клеточного цикла и выражается в том, что фраг-
155
мент препятствует вхождению части стимулированных
лимфоцитов в S-период.
Наблюдаемые эффекты проявляются несмотря на то,
что сколько-нибудь заметное связывание лимфоцитами
меченного по тирозину 1251 Fab-фрагмента обнаружить не
удается. Да это и неудивительно, так как рецепторов для
Fab-участка иммуноглобулинов, очевидно, не существует.
Возможный механизм
Время} ч
Рис. 35. Влияние Fab'-фрагмента
на включение 3Н-тимидина в ДНК
лимфоцитов крови человека, сти-
мулированных фитогемагглюти-
нином:
/ — культивирование без Fab'-фрагмен-
та, 2 — то же, в присутствии Fab'-
фрагмента, 3—влияние Fab'-фрагмен-
та на спонтанную активацию лимфо-
цитов
вают иммунный
ответ на тимусзависимые антигены
действия Fab-фрагментов
на лимфоциты обсужда-
ется ниже в этой главе.
Вторая функция фраг-
ментов из Fab-участка
молекулы IgG связана с
неспецифической регуля-
цией ими биосинтеза анти-
тел. Образующиеся в ор-
ганизме фрагменты типа
Fab' и полученные с по-
мощью пепсина F(ab')z-
фрагменты гомологичного
IgG усиливают in vivo и в
культуре клеток селезенки
кролика антигензависи-
мую пролиферацию анти-
телопродуцирующих кле-
ток (Л. Бартова, Д. Бе-
нин, А. Кульберг, Г. Мар-
гулис, 1976—1983). Ука-
занные фрагменты усили-
(ге-
терологичные эритроциты, гетерологичный гамма-глобу-
лин), но не влияют на ответ в отношении такого тимус-
независимого антигена, как липополисахарид из грамот-
рицательных бактерий кишечной группы. Свойство Fab'-
фрагментов усиливать иммунный ответ не связано с их
антигенсвязывающими свойствами. С наибольшей оче-
видностью это следует из того факта, что полученный с
помощью папаина Fab-фрагмент из нормального IgG
лишен свойства усиливать иммунный ответ, хотя этим
свойством обладает Fab'-фрагмент, полученный из того
же препарата IgG. Последнее имеет принципиальное зна-
чение для выяснения строения участка молекулы фраг-
мента, определяющего его свойство усиливать иммунный
ответ.
156
В самом деле, как видно из рис. 18, фрагменты, полу-
ченные с помощью пепсина и папаина, отличаются друг
от друга только отрезком тяжелой цепи в районе талии,
который образован шестью аминокислотными остатками
(три из них — остатки пролина). Роль этого участка под-
тверждена следующими опытами. Были получены гомо-
логичные антитела против детерминанты IgG кролика,
образованной с участием последовательности, отлича-
ющей пепсиновый Fab'-фрагмент от папаинового. Было
продемонстрировано, что иммунодоминантной группой
этой детерминанты секвенциального типа служит С-кон-
цевой лейцин (Л. Бартова, Г. Маргулис, 1985). Антитела
против указанной детерминанты, добавленные в культуру
клеток селезенки, полностью отменяют эффект F(ab')2-
фрагмента на иммунный ответ.
Для понимания механизма действия F(ab') 2-фрагмен-
та на иммунный ответ существенно, что он практически
полностью отменяет неспецифическое конкурентное по-
давление иммунного ответа неродственным антигеном.
Этот хорошо известный иммунологический феномен обус-
ловлен накоплением под действием первого из двух по-
следовательно введенных антигенов неспецифических.
Т-супрессоров (М. Taussig, 1974; R. Gershon et al., 1978).
He обсуждая здесь функциональной роли Т-супрессоров
и их классификации (см. гл. 10), отметим лишь, что уси-
ление иммунного ответа F(ab') 2-фрагментом (а точнее,
олигопептидом из его С-концевой части) может быть
следствием подавления фрагментом (пептидом) актива-
ции Т-супрессоров.
Изучение эффекторных функций Fab-фрагментов убе-
дительно иллюстрирует возможности молекулярной им-
мунологии в расширении существующих представлений
о гомеостатических механизмах регуляции биосинтеза
белка у высших организмов. В самом деле, до выяснения
функции промежуточных продуктов катаболизма имму-
ноглобулинов j биосинтезе иммуноглобулинов был экспе-
риментально доказан только один механизм регуляции
биосинтеза иммуноглобулинов по типу обратной связи:
подавления биосинтеза антител IgG-антителами той же
специфичности (см. гл. 10). Описанный в этом разделе
механизм усиления биосинтеза антител фрагментом
(пептидом) из Fab-участка молекулы IgG также отно-
сится к механизмам регуляции биосинтеза белка по типу
обратной связи. Ведь фрагменты типа Fab — промежу-
точные продукты катаболизма иммуноглобулинов, а по-
157
этому их содержание отражает интенсивность распада
иммуноглобулинов в организме, их убыль. Усиливая син-
тез иммуноглобулинов (антител) при участии специфиче-
ского индуктора — антигена, они (Fab'-фрагменты) обес-
печивают восстановление уровня иммуноглобулинов. Ес-
ли учесть, что скорость распада иммуноглобулинов прямо
зависит от их концентрации (J. Fahey, A. Robinson, 1963),
а самые разнообразные антигены постоянно поступают в
•организм через пищеварительный тракт, дыхательные пу-
ти и даже кожу, этот механизм регуляции биосинтеза им-
муноглобулинов имеет, очевидно, большое значение.
Другая сторона обсуждаемой проблемы — ее методо-
логический аспект, к которому хотелось бы привлечь вни-
мание будущих исследователей. Для решения этой зада-
чи, как и, впрочем, большинства других интересных
задач современной молекулярной иммунологии, потребо-
валось использование самых различных методов, а для
построения рабочих гипотез — знания в области химии
•белка, энзимологии, клеточной иммунологии.
Изучение механизма усиления биосинтеза антител
Fab'-фрагментами не завершено. Сегодня все более оче-
видно, что этот процесс многоэтапен. Опыты in vivo по-
казывают, что под действием фрагмента происходит об-
разование фактора неиммуноглобулиновой природы, на-
капливающегося в сыворотке и способного при переносе
интактному реципиенту вместе с антигеном усилить у него
иммунный ответ на этот антиген (И. Елистратова и др.,
1982). Все имеющиеся данные можно обобщить в виде
следующей схемы:
Иммуноглобулины Расщепление в фагоцитах -* F (ab')2 -*
-♦-Переработка Индукция продуктами расщепления Р(аЬ')г
А-клетками синтеза регулятора активности Т-супрессоров
Fc-фрагмент IgG. Fc-фрагменты были найдены в моче
здоровых людей. После введения добровольцам меченно-
го 1311 гомологичного IgG в их моче появлялся ме-
ченый белок, имеющий антигенное родство с Fc-фраг-
ментом (J. Vaughan et al., 1967). Результаты опытов
in vitro свидетельствуют об относительно высокой чув-
ствительности Fc-участка молекулы IgG к расщеплению
в кислой среде (см. гл. 3). Поэтому можно было предпо-
ложить, что при расщеплении иммуноглобулинов в лизо-
сомах с помощью катепсинов Сн2-домены разрушаются.
В силу этого основным промежуточным продуктом ката-
158
болизма IgG служат фрагменты типа Fc', т. е. тандем
С-концевых СнЗ-доменов.
Интенсивное расщепление Fc-участка IgG с помощью
катепсинов было продемонстрировано К. Фером и др.
(К. Fehr et al., 1970). Fc'-фрагменты были найдены в мо-
че и сыворотке (следы) новорожденных телят после по-
лучения ими молозива (В. Kickhofen et al., 4971). Ката-
болитическое происхождение этих фрагментов не вызыва-
ет сомнений, так как у жвачных животных иммуногло-
булины не передаются от матери к плоду через плаценту;,
поэтому до получения молозива новорожденные живот-
ные не имеют в крови иммуноглобулинов. Все сказанное
выше свидетельствует о том, что не Fc-фрагмент, а толь-
ко его С-концевая половина (т. е. Fc'-фрагмент) с моле-
кулярной массой около 20 000 служит промежуточным
продуктом катаболизма IgG.
Фрагменты типа Fc' продолжительное время нахо-
дятся в циркуляции благодаря наличию в их составе цен-
тра, ответственного за реабсорбцию IgG в извитых ка-
нальцах почек (см. гл. 6). Мало вероятно, что у этого
фрагмента отчетливо выражены другие эффекторные-
функции. Что же касается всего Fc-фрагмента, то на-
дежных оснований считать его промежуточным продук-
том катаболизма иммуноглобулинов нет. Нельзя однако
исключить, что такие фрагменты все же появляются в
циркуляции в следовых количествах и даже в этих усло-
виях проявляют свою биологическую активность. То, что
Fc-фрагменты, полученные при протеолизе, имеют ха-
рактерные эффекторные свойства, убедительно доказано..
Как показали М. Берман и У. Вейгл (М. Berman,.
W. Weigle, 1976), полученные с помощью папаина Fc-
фрагменты IgG мыши и некоторых других млекопита-
ющих вызывают усиление синтеза ДНК и бласттранс-
формацию В-лимфоцитов мыши в культуре. Fc-фрагмен-
ты, выделенные из иммуноглобулинов других классов
(IgA>IgM>IgD), но не IgE, также активируют В-лим-
фоциты. Одно из проявлений активации этих клеток со-
стоит в появлении бластов, продуцирующих различные-
по специфичности антитела; антигены в этом участия не
принимают. Поэтому можно заключить, что Fc-фрагмент
вызывает антигеннезависимую поликлональную актива-
цию В-лимфоцитов. Существенно, что нерасщепленный
IgG такими свойствами не обладает. Поэтому описанное
свойство Fc-фрагментов принадлежит к числу скрытых;
эффекторных функций иммуноглобулинов.
159
В серии работ Е. Морган и У. Вейгл (Е. Morgan,
W. Weigle, 1979—1984) показали, что Fc-фрагмент акти-
вирует В-лимфоциты только в присутствии макрофагов
(А-клеток). Эти клетки расщепляют фрагмент, после че-
го в культуральной жидкости появляются его осколки,
активирующие В-лимфоциты мыши. Осколок молекулы
Fc-фрагмента, обладающий активностью, имеет довольно
большие размеры (молекулярная масса около 14000).
Он происходит из С-концевой части Fc-фрагмента. Это
весьма существенно, поскольку, как говорилось в этом
разделе выше, фрагменты из С-концевой половины Fc-
участка молекулы IgG служат промежуточными продук-
тами катаболизма этого белка. В последнее время теми
же авторами был синтезирован пептид из 23 аминокислот-
ных остатков, воспроизводящий аминокислотную после-
довательность у-цепи IgG человека, начиная с остатка
335. Этот пептид способен активировать В-лимфоциты,
заменяя собой Т-хелперы.
Помимо А-клеток в процессе поликлональной актива-
ции В-лимфоцитов Fc-фрагментом участвуют также
Т-лимфоциты. Их функция состоит лишь в определенном
усилении эффекта Fc-фрагмента, который и без их помо-
щи способен индуцировать процесс поликлональной ак-
тивации В-лимфоцитов.
Из изложенного с очевидностью следуют принципи-
альные различия в эффекте Fab'- и Fc-фрагментов на им-
мунный ответ. Первый из фрагментов несомненно служит
промежуточным продуктом катаболизма иммуноглобу-
линов, а второй — нет. Хотя для проявления свойства
сравниваемых фрагментов влиять на активность В-лим-
фоцитов необходима помощь А-клеток, образующиеся
продукты совершенно различны по строению и свойст-
вам. Активный олигопептид из Fab'-фрагмента имеет ха-
рактерные для талии молекулы особенности строения
(богат пролином). А как явствует из данных по первич-
ной структуре IgG (см. гл. 3), район талии уникален по
аминокислотному составу и не гомологичен другим уча-
сткам молекулы, в том числе и Fc-участку. Что касается
активного осколка Fc-фрагмента, то он при относитель-
но большой молекулярной массе тяготеет к С-концевой
части фрагмента. Наконец, действие активных пептидов
в обоих случаях совершенно различно. Олигопептид из
Fab'-фрагмента, как и сам фрагмент, влияет на актив-
ность Т-супрессоров. А пептид из Fc-фрагмента практи-
чески без участия Т-клеток действует на В-лимфоциты.
160
Процесс поликлональной активации В-лимфоцитов
под действием Fc-фрагмента может иметь, по-видимому,
значение в патологии при продолжительной персистенции
в организме иммунных комплексов. Действительно, мо-
дельные опыты показали, что аналог иммунного ком-
плекса— прогретый при 63° С гамма-глобулин человека
активирует мышиные лимфоциты подобно изолирован-
ному Fc-фрагменту (W. Weigle et al., 1976—1978). Как ус-
тановили те же исследователи, активный осколок Fc-уча-
стка агрегированного IgG образуется после захвата аг-
регированного белка макрофагами и его частичного
переваривания в этих клетках.
Фрагменты молекулы IgG, усиливающие фагоцитоз.
При протеолизе IgG трипсином среди продуктов гидроли-
за появляется фрагмент, способный усиливать фагоцитоз
бактерий сегментоядерными лейкоцитами. Под его влия-
нием увеличивается и число захваченных фагоцитами
микробных тел и эффективность их разрушения в фаго-
лизосомах. Путем многократной очистки удалось выде-
лить активный фактор и проанализировать его структуру
(W. Najjar et al., 1969—1974). Это оказался тетрапептид:
Thr—Lys—Pro—Arg. Позже было показано, что эта по-
следовательность соответствует остаткам 289—292 в
Сн2-домене IgG. Пептид, получивший название «тафт-
син» (открывшие его исследователи работали в универси-
тете им. Тафта, США), является продуктом катаболизма
IgG, так как он может высвобождаться также при дей-
ствии на IgG протеолитического фермента, содержащего-
ся в мембране сегментоядерных лейкоцитов — лейкокина-
зы, а также эндокарбоксипептидазы. Активность тафтсина
определяется всеми входящими в его состав амино-
кислотными остатками. Отщепление одного из концевых
остатков лишает пептид активности.
После того как тафтсин был синтезирован искусствен-
но, были также синтезированы его многочисленные ана-
логи. Почти все замены в структуре тетрапептида вели к
снижению его активности. В свете этих данных эволюци-
онно-приспособительный характер взаимосвязи между
структурой и катаболизмом иммуноглобулинов, с одной
стороны, и активацией одной из важнейших защитных
систем организма — фагоцитоза, с другой, здесь прояв-
ляется особенно ярко.
Тафтсин был испытан как терапевтический агент при
гнойно-септическом процессе (есть сообщения о положи-
тельном эффекте лечения). В настоящее время этот пре-
6—1258
161
парат доступен для лабораторных исследований. Сам
факт производства тафтспна вне зависимости от того, ка-
кой в конечном итоге будет результат его применения в
клинике, является своего рода революцией в иммуноло-
гии. Спустя десятки лет после появления коммерческих
препаратов гамма-глобулина для целей профилактики и
лечения инфекционных заболеваний выпускается в про-
дажу синтезированный в заводских условиях осколок
молекулы гамма-глобулина, предлагаемый для защиты
от инфекции, но как неспецпфнческий стимулятор.
Тафтсин не уникален по своей функции усиливать фа-
гоцитоз. Существуют наблюдения о способности этого
пептида и некоторых его аналогов усиливать также им-
мунный ответ.
Сравнительно недавно в составе СнЗ-домена был об-
наружен участок (с 345 по 348 остатки), синтетический
гомолог которого подобен по свойствам тафтсину (Г. Чи-
пенс с соавторами, 1980—1982). Поскольку исследовате-
ли работают в г. Риге, они назвали этот пептид «ри-
ги ном».
Фрагменты иммуноглобулинов с хемотактическими
свойствами. К хемотактическим факторам относят веще-
ства, вызывающие перемещение различных клеток крови
(моноциты, сегментоядерные лейкоциты, лимфоциты) по
направлению градиента концентрации фактора. Хемо-
тактические факторы служат одним из важнейших ин-
струментов процесса воспаления, без преувеличения,
главной защитной неспецифической реакцией организма
на повреждающие воздействия.
К настоящему времени описаны многие хемотактиче-
ские факторы, причем их появление во многих случаях
связано с протеолитическим расщеплением белков, неко-
торые из фрагментов которых обладают хемотактпческой
активностью (см. также гл. 8).
Иммуноглобулины также служат источником ряда
хемотактических факторов. Первый из описанных хемо-
тактических факторов получил название лейкоэгрессин
(leukoegressin). Он был обнаружен И. Йошинага с со-
авторами (I. Yoshinaga et al., 1972) в очагах воспаления,
а также в сыворотках животных, которым вводили ком-
плексы антиген-антитело. Источником лейкоэгрессина
служат те подклассы IgG, которые относительно более
устойчивы к расщеплению SH-зависимыми протеиназа-
ми. Это IgG2 и IgG4 человека, а также IgG кролика
162
с высокой электрофоретической подвижностью. Образу-
ющийся в организме лейкоэгрессин, как и аналогичный
ему продукт, полученный при протеолизе in vitro с по-
мощью папаина или тканевых катепсинов, имеет моле-
кулярную массу около 140 000, заметно не отличается от
IgG по антигенному строению, но в отличие от нерасщеп-
ленного IgG обладает выраженной хемотактической ак-
тивностью в отношении сегментоядерных лейкоцитов. Об-
наружение лейкоэгрессина в очагах воспаления, где в эк-
судате содержатся IgG и тканевые протеиназы, отсутст-
вие хемотактической активности у нерасщепленного IgG
несомненно свидетельствуют о том, что хсмотактическая
активность этого продукта протеолиза IgG определяет-
ся существовав нем в молекуле последнего скрытого эф-
фекторного центра; его демаскирование происходит при
катаболитическом расщеплении IgG в патологических ус-
ловиях (например, в воспалительном очаге).
Если в качестве субстрата для SH-зависимых ткане-
вых протеиназ выступает IgM, образуются в том числе
фрагменты с молекулярной массой около 14 000, которые
обладают хемотактической активностью для лимфоцитов.
Фрагменты чувствительны к дальнейшему протеолизу, в
результате которого они теряют активность. Сам IgM.
какой-либо хемотактической активностью не обладает.
Протеолиз IgG SH-независимой протеиназой, выде-
ленной из лейкоцитов, сопровождается появлением недо-
статочно полно охарактеризованных фрагментов, которые
служат хемотактическнми факторами для моноцитов.
Таким образом иммуноглу болины классов G и М слу-
жат источником трех различных хемотактических факто-
ров, способных привлечь к месту их образования сегмен-
тоядерные лейкоциты, моноциты и лимфоциты. Разуме-
ется иммуноглобулины — не единственный источник
хемотактических факторов воспалительного очага, но, по-
виднмому, весьма существенный.
Продукты распада иммуноглобулинов и воспаление.
В предыдущем разделе мы уже отметили роль продуктов
распада иммуноглобулинов в возникновении процесса
воспаления — образование хемотактических факторов.
Однако, как оказалось, продукты расщепления иммуно-
глобулинов способны быть не только медиаторами, но и
индукторами реакции воспаления. Такие свойства при-
суши в организме Fab' и F(ab') 2-фрагментам гомологич-
ного и даже аутологичного IgG. Фрагменты могут быть
6*
163
Общие лейкоциты, тыс/мм5	Комплемент, СИ
Рис. 36. Патофизи-
ологические изме-
нения, возникаю-
щие у кролика по-
сле внутривенно-
го введения ему
0,5 мг Fab'-фраг-
мента гомологич-
ного IgG:
1 — изменения гемо-
литической активно-
сти комплемента сы-
воротки крови. 2 —
изменение содержа-
ния фибриногена з
плазме крови, 3 —
содержание лейко-
цитов крови в норме
(суточные колеба-
ния),, 4— то же, пос-
ле введения Fab'-
фрагмента, 5 — изме-
нения температуры
тела в норме (суточ-
ные колебания). 6 —
то же, после введе-
ния Fab'-фрагмента
получены с помощью пепсина in vitro. Аналогичными
свойствами обладают подобные им фрагменты, выделен-
ные из печени кролика.
При внутривенном введении кролику 0,5 мг Fab-фраг-
ментов аутологичного IgG у него в течение последующих
2—6 ч регистрируются следующие реакции: кратковре-
менная лейкопения, сменяющаяся лейкоцитозом, совпа-
дающее с периодом лейкопении повышение температуры
тела, снижение уровня комплемента и повышение фибри-
нолитической активности крови (Н. Шмелева и др., 1971).
Эти явления вызывают именно Fab'- и Р(аЬ')2-фрагмен-
ты, в то время как нерасщепленный IgG и полученный с
помощью папаина Fab-фрагмент такими свойствами не
обладают. Характер патофизиологических реакций в от-
вет на введение аутологичного Fab'-фрагмента иллюст-
рирует рис. 36.
В свете сказанного закономерно заключить, что опре-
деляющая роль в возникновении указанных реакций при-
надлежит С-концевому участку Fab'-фрагмента, которым
этот фрагмент отличается от аналогичного фрагмента,
полученного с помощью папаина (см. рис. 18).
Все описанные выше реакции, характерные для про-
цесса воспаления, возникают только при дискретном уве-
личении концентрации Fab' в циркуляции. Введение топ
же дозы фрагмента по частям в течение часа не приводит
к каким-либо реакциям. Это объясняет тот факт, что,
будучи естественными промежуточными продуктами ка-
таболизма IgG, фрагменты типа Fab' не вызывают в нор-
ме нарушений гомеостаза, так как они поступают в цир-
куляцию постоянно в небольших количествах. Однако,
если возникают условия для одномоментного расщепле-
ния ощутимых количеств IgG (например, высвобождение
тканевых протеиназ при ранениях и других повреждениях
тканей) и появления больших количеств Fab'-фрагмен-
тов, они способны стать важным фактором в развитии
воспалительной реакции. При этом важно иметь в виду,
что IgG крайне чувствителен к протеолизу именно по
району талии молекулы.
А. Роусон с сотрудниками (A. Rawson ct al., 1969) об-
наружили воспалительный процесс, напоминающий арт-
рит у человека после введения в суставную сумку здо-
рового кролика Fab'-фрагмента гомологичного IgG. Ана-
логичный процесс наблюдали К. Фер с соавторами
(К. Fehr et al., 1976), вводя в сустав кролика F(ab')2-
фрагмент, полученный с помощью тканевой протеина-
165
зы — катепсина D. Следовательно, Fab'-фрагменты спо-
собны вызвать и локальный воспалительный процесс.
Разумеется, Fab'- и F(ab')2-фрагменты — далеко не
единственные эндогенные факторы, участвующие в раз-
витии воспалительного процесса. Но тот факт, что такие
свойства присущи продукту катаболизма IgG, выявляет
новые взаимосвязи между естественной резистентностью
(реакция воспаления — один из важнейших ее механиз-
мов) и специфической иммунореактпвностью, в обеспече-
нии которой иммуноглобулины (антитела)—один из ос-
новных факторов.
Комплемент
Комплементом называют многокомпо-
нентную самособирающуюся систему белков крови, ко-
торая играет одну из ключевых ролей в поддержании
иммунного гомеостаза. Инициация процесса активации
(самосборки) системы комплемента может осуществлять-
ся двумя путями: классическим и альтернативным, при-
чем в первом случае инициирующим фактором яв-
ляется комплекс антиген-антитело. Инициация процесса
активации комплемента комплексом антиген-антитело не
единственный, но важнейший в биологическом отноше-
нии путь активации, так как в значительной степени
именно посредством системы комплемента антитела при
участии антигена способны очень глубоко влиять на са-
мые различные системы поддержания гомеостаза много-
клеточных организмов: фибринолитическую систему и
систему свертывания крови, регуляцию проницаемости
сосудистого русла, хемотаксис, образование и высвобож-
дение пептидов, управляющих сократимостью гладкой
мускулатуры, и ряд других систем.
166
8.1. Химия комплемента
Компоненты классического пути акти-
вации комплемента (их число равно 11) обозначают циф-
рами от С1 до С9. Три субкомпонента С1 получили на-
именование Clq, Clr, Cis.
Так называемые концевые (терминальные) компонен-
ты классического пути (СЗ, С5, С6—С9) участвуют также
в активации комплемента альтернативным путем. Кроме
них реализацию альтернативного пути обеспечивают
еще ряд компонентов, основные из которых указаны в
табл. 9. Компоненты альтернативного пути имеют бук-
венные обозначения: Р (пропердин), В и D. Исключение
составляет СЗ. Необходимо знать, что если над литерой,
обозначающей тот или иной компонент, стоит черточка
(СЗ, Р), это означает, что соответствующий компонент
активирован.
Таблица 9. Основные характеристики белков системы
комплемента
Наименование белка	Молекулярная масса, дальтон	Концентрация, мкг-мл
Классический путь активации		
Clq	390 000	190
Clr	83 000	□
Cis	83 000	120
С4	209 000	430
С2	117 000	30
Альтернативный путь активации		
Р	220 000	25
D	23 500	?
В	100 000	240
СЗ	190 000	1300
Терминальные компоненты		
СЗ	190 000	
С5	206 000	75
С6	95 000	60
С7	120 000	55
С8	163 000	80
С9	79 000	160
Связь между компонентами классического и альтер-
нативного пути демонстрирует схема на рис. 37. Очевид-
но, что ключевым компонентом является СЗ. Его актива-
ция, связанная с частичным расщеплением и, как следст-
вие этого, появлением фрагмента СЗЬ, достигается двумя
различными путями. С появлением СЗЬ начинается ак-
167
Классический
путь СЗ
Рис. 37. Компоненты
сического
го путей связывания комп-
лемента
клас-
и альтернативно-
тивация терминальных компонентов — эффекторного зве-
на всего каскада.
Прежде чем перейти к детальному рассмотрению всех
звеньев активации системы комплемента, отметим общее
основное положение: важнейшие этапы активации связа-
ны с процессом ферментативного катализа, причем мно-
гие компоненты комплемента, будучи активированными,
обладают активностью про-
теиназ или эстераз. Для осу-
ществления всего каскада
реакций не требуется внеш-
них (вне системы компле-
мента) источников фермен-
тов. В силу крайне малой
продолжительности жизни
компонентов в активирован-
ной форме образующиеся
при активации комплемента
протеиназы или эстеразы не
оказывают определяемого
влияния на другие субстра-
ты, присутствующие в крови
(например, другие сыворо-
точные белки). Следователь-
но, ферменты системы ком-
племента «настроены» для
работы только на компонен-
ты системы.
Другое важное положе-
ние состоит в том, что про-
цесс активации носит харак-
тер гетерофазного катализа,
т. е. каждый новый фермент каскада функционирует пос-
ле спонтанного связывания с клеточной поверхностью.
Последняя защищает фермент от инактивации либо осо-
быми, регулирующими активность системы ферментами,
либо ферментами, образующимися на предшествующей
стадии активации системы.
и их взаимосвязь
8.2. Классический путь активации
Инициация процесса связана с образо-
ванием комплекса антиген-антитело. Только два класса
антител: IgG и IgM—обеспечивают активацию благода-
ря наличию в их молекулах эффекторных центров для
168
Clq — первого субкомпонента первого компонента си-
стемы (см. гл. 6).
Прежде чем перейти к детальному рассмотрению во-
проса о механизме активации комплемента с участием
*	Clq.r.s: Са2+
s—_	2=^
SAC 1
C4a+(C4b)i
SACl,4b
С4
(C2a)i+C2b
SACl,4b.2a
С2; Mg'
C3a+(C3b)i
C3
SAC 1,4b,2a, 3b
CC 5,6,7
C5a+(C5b,6,7)i
н
SACT, 4b, 2a, 3b, 5b, 6,7
C8
SA CT, 4b, 2a, 3b, 5b, 6,7,8
I C9
Лизис	’___________
эритроцита -*----SAC1,4b, 2a, 3b, 5b, 6,7,8,9
Рис. 38. Классический путь активации компле-
мента:
S — антиген (эритроциты), А— антитела против эритро-
цитов (IgG или IgM)
комплекса антиген-антитело, представляется целесооб-
разным изложить в схематической форме современные
взгляды на процесс активации комплемента по классиче-
скому пути в хорошо изученной системе: эритроцит —
IgG-антитело кролика.
Согласно схеме (рис. 38) первоначально к комплексу
антиген (S)-антитело (А) присоединяется комплекс С1,
169
состоящий из трех компонентов: Clq, Clr, Cis. В ре-
зультате образуется фермент — Cl-эстераза (Cis). Под
действием С1-эстеразы возникает энзиматически актив-
ный комплекс четвертого и второго компонентов компле-
мента (С4, 2), обозначаемый также как СЗ-конвертаза.
Этот фермент расщепляет третий компонент комплемен-
та— СЗ на два фрагмента: СЗа, обладающий свойства-
ми анафилатоксина (см. ниже) и хемотактической ак-
тивностью, и СЗЬ, способный взаимодействовать с С4,2.
Неколагенопо-	Колагеноподобный участок	Глобулярный
дойный у час-	(78 аминокислотных	участок (105-
ток (2-8 а ми-	остатков]	'108 амино-
накис латных	к ислотнь /х
i статкоВ)	остатков)
Рис. Особенности первичной структуры полипептидных
цепей Clq субкомпонента системы комплемента
В результате образуется фермент с активностью пепти-
дазы, действующий на С5. Комплекс С4, 2,3, находящий-
ся на поверхности клетки, обеспечивает фиксацию на
клеточной мембране активированного пятого компонента
комплемента, а затем С6 и С7. Эти три компонента, дей-
ствующие как одна функциональная единица, способству-
ют фиксации С8 и С9. После присоединения первого из
них эритроцит становится высокочувствительным к осмо-
тическому лизису. Действие С8 усиливает С9, вызыва-
ющий необратимые повреждения структуры мембраны.
Головной компонент классического пути активации —
Clq представляет собой один из интереснейших по строе-
нию белков. Он имеет молекулярную массу 400 000 и об-
разован 18 полипептидными цепями (см. рис. 33). В каж-
дой цепи около 200 аминокислотных остатков, но первич-
ная структура их хотя и сходна, но не идентична. Их
можно разделить на три типа: А, В и С. Аминоконцевые
половины каждой из цепей подобны по структуре колла-
гену, так как образованы повторяющимися аминокислот-
ными триплетами X—-Y—Gly. Лишь короткий отрезок
цепи непосредственно в районе аминоконцевого остатка
не имеет подобной структуры (рис. 39). С-концевая часть
170
каждой цепи (103—108 остатков) имеет третичную
структуру, характерную для глобулярного белка. По дан-
ным электронной микроскопии, все полипептидные цепи
сформированы в шесть субъединиц, причем вся молекула
напоминает по внешнему виду тюльпан (см. рис. 33).
Шесть лепестков (или головок) образованы С-концевы-
ми глобулярными областями цепей, а коллагеноподобные
участки скручены в каждой субъединице в трехспираль-
ную структуру. Все вместе они образуют структуру, по-
добно стеблю (stulk), будучи объединены непосредствен-
но в районе аминоконцевого участка межцепьевыми ди-
сульфидными связями. Глобулярные участки отвечают за
взаимодействие с антителами IgG- и IgM-классов, а кол-
лагеноподобный участок — за связывание С 1г и Cis.
Как показано в гл. 6, Clq образует с IgG в мономер-
ной форме сильно диссоциирующий комплекс. В составе
такого комплекса Clq не способен связать комплекс из
двух молекул С 1г и Cis. Только при прочной фиксации
этого комплекса на Clq происходит расщепление и, как
следствие этого, активация С 1г, что, в свою очередь, не-
обходимо для расщепления Cis и превращения его в ак-
тивный фермент (эстеразу). Лишь после связывания Clq
двумя или большим числом головок с антителами (что
достигается агрегацией последних антигеном) возникают
условия для формирования энзиматически активного
комплекса С1. Почему это происходит? Существуют дан-
ные, что после связывания с агрегированным IgG в моле-
куле Clq происходят определенные конформационные
изменения, затрагивающие коллагеноподобный стебель
молекулы. Возможно, эти изменения касаются области,
с которой взаимодействует Clr2-Cls2 комплекс, и бла-
годаря им сродство к этим лигандам возрастает.
Как С 1г, так и Cis образованы каждый одной полппеп-
тидной цепью с молекулярной массой около 83 000. Оба
белка в отсутствие Clq образуют стабильный тетрамоле-
кулярный комплекс с молекулярной массой 340 000. Для
формирования комплекса требуются ионы кальция. После
фиксации этого комплекса на Clq образуется структура
с молекулярной массой 740 000 и константой седимента-
ции 16S (рассчитано при образовании комплекса из
чистых компонентов в растворе).
В составе комплекса С1 каждый из субкомпонентов —
С 1г и Cis расщепляются на два связанных дисульфидной
связью фрагмента с молекулярными массами, приблизи-
тельно равными 60000 и 30 000. Отличаясь по антпгенно-
171
му строению, Cl г и Cis сходны по физико-химическим
и химическим свойствам. После активации каждый из
них превращается в так называемую сериновую протеи-
назу (эстеразу), т. е. фермент, в активном центре которо-
го находится остаток, серина. Как все ферменты этого
типа, он инактивируется дпизопропилфторфосфатом, при-
чем каждый из меньших по размеру фрагментов активи-
рованного С1г или Cis связывает по 1 молю ингибитора.
Это указывает на наличие одного активного центра на
полипептидную цепь.
Как говорилось, С1 действует па С4. Последний пред-
ставляет собой гликопротеин с молекулярной массой
209 0G0. Он образован тремя цепями: а — с молекулярной
массой 93 000, р — 78 000 и у — 33 000. Четвертичная
структура стабилизирована дисульфидными связями и не-
ковалентными связями.
Активация С4 с помощью С1 связана с отщеплением
от аминоконцевой части a-цепи пептида с молекулярной
массой 7000—11 000. Его обозначают как С4а, а всю ос-
тальную часть молекулы — как С4Ь (рис. 40). Фрагмент
С4Ь имеет пять функций: 1) необратимо связывается с им-
мунным комплексом и мембраной клетки через появля-
ющийся в ходе активации новый N-концевой участок
а-цепп; 2) связывается с клеточными рецепторами, от-
ветственными за так называемое иммунное прикрепление
(см. ниже); 3) взаимодействует с С1, что обеспечивает
более эффективное расщепление С2; 4) связывается с ак-
тивированным С2; 5) взаимодействует с СЗЬ, что приво-
дит к формированию тройного комплекса — С4Ь2аЗЬ, яв-
ляющегося С5-конвертазой классического пути актива-
ции.
Содержащаяся в сыворотке крови протеиназа С4Ь-ин-
активатор способна отщепить от а-пепи С4Ь (когда он
находится в жидкой фазе) пептид — C4d, превращая С4
в продукт, обозначаемый как С4с. Последний сохраняет
все свойства С4Ь, за исключением одного — способности
связываться со специальным участком цитоплазматиче-
ской мембраны. Тем самым С4 выводится из основной
реакции, ведущей к комплемситзависимому повреждению
мембран клеток-мишеней. По сути С4-инактиватор вы-
полняет роль гомеостатического регулятора. Ниже будут
представлены данные об аналогичных по функции инак-
тиваторах СЗЬ и С5Ь.
Как уже указывалось, активация С2, одноцепочечно-
го белка с молекулярной массой 120 000, связана с его
172
расщеплением с помощью Cis на два фрагмента — С2Ь
(молекулярная масса 5000) и С2а (молекулярная масса
£5 000). Последний из фрагментов, являющийся амино-
концевой частью молекулы С2, обладает протеиназной
активностью после присоединения к С4Ь в присутствии
СЗа	СЗЬ
C3d СЗе	С$с
Ci-Конёертоза - СЗЬ - Инактиватор
]«
С4
С4а	С4Ь
№cL * С4с ’
II- , —
4 Н	s	s
‘ S	S	5
I------- - ,
I	I	5
J I	о	S
Cis С4Ь-Инактиватор г----£----.
Рис. 40. Структура третьего (СЗ), четвертого (С4)
и пятого (С5) компонентов комплемента и фраг-
менты, образующиеся при их активации и после-
дующей инактивации
Mg2+ (СЗ-конвертаза). Комплекс разрушается в резуль-
тате прогревания при 56° С с образованием инактивиро-
ванного С2а. Однако после этого С4Ь сохраняет свойство
присоединять новую молекулу С2а, вновь превращаясь в
СЗ-конвертазу.
Расщепление СЗ-конвертазой классического пути
третьего компонента комплемента сопровождается отде-
лением от аминоконцевой части молекулы этого компо-
нента (его a-цепи) небольшого фрагмента СЗа, с молеку-
лярной массой около 9000 (рис. 40). В результате появ-
173
ляется ключевой компонент как классического, так и
альтернативного путей активации — СЗЬ с молекулярной
массой 171000 (см. рис. 40). СЗЬ, связываясь с комплек-
сом С4Ь2а, становится устойчивым к действию протеина-
зы СЗ-инактиватора, содержащейся в сыворотке. Если
СЗЬ остается в жидкой фазе (например, избыток этого
компонента), инактиватор отщепляет от его a-цепи один
или два пептида (C3d и СЗс). Остающийся фрагмент уже
Рис. 41 Функционально-активные комплексы, образующиеся при ак-
тивации классического пути связывания комплемента IgG антитела-
ми против антигенов клетки:
7, II, III — центры связывания на клеточной поверхности
не способен участвовать в образовании С5-конвертазы.
Этот фермент каскада в виде комплекса С4Ь2аЗЬ фикси-
руется на особом участке клеточной мембраны, не сов-
падающем по своей локализации с местом фиксации пер-
вого компонента, включая Cis (рис. 41). Тем самым на
мембране клетки-мишени при классическом пути актива-
ции комплемента формируются два каталитических цен-
тра с различными по специфичности протеиназами.
С появлением С5-конвертазы на поверхности клет-
ки-мишени начинает собираться так называемый мемб-
ранатакующпй комплекс, состоящий из пятого — девято-
го компонентов комплемента. Место фиксации этого
комплекса на клетке-мишени не совпадает в пространст-
ве с упомянутыми выше каталитическими центрами
(рис. 41).
Активация С5 (молекулярная масса 206 000)—про-
цесс, подобный процессу активации С4 и СЗ (см. рис. 40).
От одной из полипептидных цепей С5, a-цепи, отщепля-
174
ется пептид (G5a) с мо екулярной массой 11 000. Ос-
тальная часть молекулы, С5Ь-фрагмент, способна связы-
ваться соответствующими структурами цитоплазматиче-
ской мембраны. Пос де фиксации С5Ь на мембране к нему
присоединяются С6 ихС7. Оба они связываются с фик-
сированным на мембраце С5Ь без каких-либо каталити-
ческих превращений. Сформировавшийся тримолекуляр-
ный комплекс С5Ь—С7 фиксирует С8, а затем шесть
молекул С9. Общая молекулярная масса декамолекуляр-
ного комплекса достигает 106. Все его компоненты, за ис-
ключением С5, в ходе активации не подвергаются ката-
литическим превращениям. Но появление у них способ-
ности в составе комплекса атаковать мембрану несом-
ненно связано с внутримолекулярными конформацион-
ными превращениями, происходящими, очевидно, уже
после их фиксации на мембране.
Если последовательно формировать из очищенных
компонентов мембранатакующнй комплекс, тримолеку-
лярный комплекс — С5Ь—С7 не повреждает мембраны.
Но после присоединения С8 начинается медленно проте-
кающий процесс цитолиза, который значительно усили-
вается в присутствии о-фенантролплина или 2,2-дипири-
дина. В модельных опытах показано, что липидный бислой
холестерина и сфингомиелина дезорганизуется пос-
ле того, как к комплексу С5Ь—С7 добавляют С8. С9
только усиливает действие С8. На основе всех данных,
включая электронно-микроскопические, представляется,
что вклинившийся в мембрану комплекс С5Ь—С7 позво-
ляет С8 войти в непосредственный контакт с мембраной,
вызвать дезорганизацию ее регулярных структур и, на-
конец, привести к образованию спиралевидных транс-
мембранных каналов, которые подобны каналам, обра-
зуемЫхМ в клеточной стенке антибиотиком грамициди-
ном А.
8.3. Альтернативный путь активации
Из сказанного выше следует, что эффекторная дуга
каскада реакций, именуемых активацией комплемента,
реализуется после появления' продукта распада третьего
компонента системы, а именно СЗЬ. Благодаря фермен-
тативным свойствам этого компонента (С5-конвертаза)
возможно формирование мембранатакующего комплекса
<25Ь—С9. Кинетические исследования показывают, что
лимитирующим фактором при реализации основного эф-
175
фекторного механизма системы комплемента, его цито-
литического действия, является СЗЬ. Поскольку собст-
венно СЗ содержится в плазме кровп в концентрациях,
намного превышающих содержание других компонентов
комплемента (см. табл. 9), субстратных ограничений для
образования СЗЬ в значительных количествах не сущест-
вует. Существует также возможность активации СЗ с об-
разованием СЗЬ не только с помощью СЗ-конвертазы
классического пути (см. раздел 8.2), но и СЗ-конвертазы
так называемого альтернативного пути.
Альтернативным рассматриваемый путь активации
комплемента называют в силу того, что для появления
фермента, активирующего СЗ, не требуются первые три
компонента классического пути: Cl, С4 и С2. Кроме того,
инициация реакций альтернативного пути, ведущая к ак-
тивации СЗ, может происходить без участия комплекса
антиген-антитело. Впервые концепция активации компле-
мента без участия иммунного комплекса была сформули-
рована Л. Пиллемером (L. Pillemer) в 1954 г. В основу
ее было положено наблюдение, что какой-то из белков
сыворотки, взятой от нормальных индивидуумов, спосо-
бен взаимодействовать с разнообразными полисахарида-
ми и липополисахаридами, что обеспечивает активацию
комплемента. Этот белок, названный пропердином (Р),
обладает активностью только в присутствии Mg2+ и тре-
бует для участия в активации комплемента помощи двух
других белков — фактора D, чувствительного к обработ-
ке гидразином, и фактора В. Ниже мы рассмотрим свой-
ства каждого из белков, участвующих в реализации аль-
тернативного пути.
Пропердин (Р)—сывороточный белок с молекуляр-
ной массой 220 000 и электрофоретической подвижно-
стью, близкой к гамма-глобулину. Нативный пропердин
образует высокодиссопипрующпе комплексы с СЗЬ. Пос-
ле активации (см. ниже) сродство пропердина к СЗЬ воз-
растает. Нативный и активированный пропердин состоят
из идентичных субъединиц (четырех) и не отличаются
друг от друга по электрофоретической подвижности, N-
и С-концевым аминокислотам. Следовательно, активация
связана с конформационными превращениями этого бел-
ка, не обусловленными отщеплением фрагментов, как это
происходит при активации СЗ и ряда других компонен-
тов. Субъединицы пропердина связаны только некова-
лентно, в силу чего их диссоциация достигается в соля-
нокислом гуанидине. Удаление последнего сопровождает-
176
расщеплять СЗ до СЗЬ. Его
Рис. 42. Петля усиления альтер-
нативного пути связывания комп-
лемента (зачернена)
гомологичен аминоконцевой
ся образованием димеров, обладающих примерно 50%
активности нативнрго белка.
Фактор В — сывороточный белок с молекулярной мас-
сой 100 000 и электрофоретической подвижностью р-гло-
булина. Молекула образована одной полипептидной
цепью. Его содержание в сыворотке довольно велико —
200 мкг/мл. В присутствий СЗЬ и Mg2+ фактор В спосо-
бен с небольшой скорость
активность резко возра-
стает после расщепления
с помощью активирован-
ного фактора D(D). Об-
разующийся фрагмент ВЬ
имеет молекулярную мас-
су 80 000 и электрофорети-
ческую подвижность у-
глобулина. Он активен
только в комплексе с СЗЬ,
и именно этот комплекс:
СЗЬВЬ характеризуется
свойствами СЗ-конверта-
зы альтернативного пути.
Следует подчеркнуть, что
фактор В является струк-
турным и функциональ-
ным аналогом С2. По пер-
вичной структуре фактор i
части a-цепи С2а, т. е. активированного С2 со свойствами
СЗ-конвертазы. В состав входит 550 аминокислотных ос-
татков, причем по ряду особенностей первичной струк-
туры это типичная сериновая протеиназа.
Фактор D — в активной форме (D) является конвер-
тазой СЗ проактиватора. Это одноцепьевая сериновая
протеиназа с молекулярной массой около 24 000. Под
влиянием D происходит образование ВЬ, а вслед за этим
бимолекулярного комплекса СЗЬВЬ. В норме в плазме
крови содержится активированный фактор D, что обес-
печивает в присутствии следовых количеств СЗЬ возмож-
ность генерировать с помощью комплекса СЗЬВЬ новые
количества СЗЬ за счет расщепления СЗ (рис. 42). Тем
самым D принимает участие в образовании петли усиле-
ния (amplification loop), обеспечивающей высокую эф-
фективность превращения СЗ — ключевого компонента
альтернативного пути. Что касается пропердина, откры-
тие которого положило начало изучению альтернативного
177
пути, то его функция заключается в стабилизации комп-
лекса СЗЬВЬ. Связываясь с СЗЬ, пропердин повышает ус-
тойчивость его комплекса с ВЬ, очевидно, за счет конфор-
мирующего влияния на белок.
Каков механизм инициации альтернативного пути ак-
тивации комплемента? Прежде всего необходимо пере-
числить вещества, способные активировать комплемент
альтернативным путем. Это полисахариды бактериально-
го и растительного происхождения, ЛПС из грамотри-
цательных бактерий, инулин, агароза, сефадекс (попереч-
но сшитый декстран). Другая группа активирующих
субстанций (практически не изученных в химическом от-
ношении) находится на поверхности вирусных частиц, ин-
фицированных вирусами клеток, опухолевых клеток, па-
разитов. Активацию альтернативного пути обеспечивают
комплексы антигена с антителами классов IgA и IgE, не
имеющих, как известно, эффекторных центров для Clq,
неспецифически агрегированный IgG и комплексы
F(ab')2-фрагментов антител с антигеном (Н. МйПег —
Eberhard, R. Schreiber, 1980; К. Reid, R. Porter, 1981).
Наконец, активация комплемента по альтернативному
пути происходит под влиянием эритроцитов кролика (но
не других эритроцитов). Некоторые белки, появляющие-
ся в сыворотке человека при патологии, также активиру-
ют комплемент по альтернативному пути. В их числе так
называемый нефритический фактор, присутствующий в
крови больных хроническим гломерулонефритом.
Как увязать многообразие факторов, активирующих
систему комплемента по альтернативному пути, с очевид-
ным фактом ключевой роли СЗЬ в инициации всего кас-
када реакций? В настоящее время представляется, что
СЗЬ непрерывно образуется спонтанно, поскольку тпо-
эфпрные связи в нативном СЗ чувствительны к спонтан-
ному гидролизу (рис. 43). Экспериментально доказано
(x\I. Pangburn et al., 1980, 1981), что скорость гидролиза
этих связей составляет в физиологических условиях 0,2—
0,4%/ч. Образующийся продукт, обозначенный СЗ(11гО),
подвергается медленной поэтапной трансформации
вплоть до конформации, характерной для СЗЬ. В какой-
то момент появляется короткоживущий комплекс
СЗ(НгО) с фактором В, обладающий свойствами СЗ-кои-
вертазы. Последний уже обеспечивает появление СЗЬ
ферментативным путем. Роль активаторов заключается
в таком случае в фиксации СЗЬ. Следствием этого явля-
ется предохранение СЗЬ от инактивации в жидкой фазе
178
и создание тем са^ым условии для генерации все новых
количеств СЗЬ согласно описанному выше механизму
(см. рис. 42).
Компонент
Молекулярная
масса, дальтон
Cl г
83000
Образование активного фрагмент
(помечен ‘везлочкой)
С1 г
56000	2'000	„
----------1---Г------------*	Г1
s—s
Cis
83000
С! г
56000	27OUO
S----S
-СООН
108000
/C!s
34000 л ’’4000
NH? С2Ь	С2а
— соон
фактор В
Факюр D1
Фактор I1
92000
25000
88000
,D
32000 г 60000
Ва	ВЬ
50000
‘СООН
—* СООН
38000
*соон
1 Сериновые протеиназы. учасзвующие в активации и конгро ie сисземы
комплемента.
Рис. 43. Структурное подобие ряда компонентов классического и
альтернативного путей связывания комплемента и фрагментов, обра-
зующихся при их активации
8.4. Регуляторные белки системы
комплемента
Несколько белков, содержащихся в сы-
воротке крови, способны с большой избирательностью
инактивировать протеиназы, появляющиеся в процессе
активации комплемента.
179
Ингибитор Cl (Cl INH)—одноцепьевой белок с мо-
лекулярной массой 105 000; до 35% его массы составля-
ют углеводы. Ингибитор связывается быстро, прочно и
необратимо с легкой цепью Cis, входящего в состав три-
молекулярного комплекса Clqrs. В результате С1 утра-
чивает ферментативную активность, что исключает про-
текание последующих стадий активации комплемента по
классическому пути. Связываясь с С1, ингибитор, кроме
того, диссоциирует тримолекулярный комплекс. В резуль-
тате высвобождается Clq, фиксированный иммунным
комплексом.
Инактиватор СЗЬ (СЗЬ INA, или фактор I) — белок с
молекулярной массой 93 000, состоящий из двух цепей,
объединенных дисульфидной связью. СЗЬ INA расщепля-
ет a-цепь СЗЬ, находящегося в свободном виде, но не
способен гидролизовать его в составе бимолекулярного
комплекса СЗЬВЬ, являющегося СЗ-конвсртазой альтер-
нативного пути активации. Следует отметить, что под
действием СЗЬ INA не происходит отщепления от СЗЬ
никаких пептидов, кроме СЗс (см. рис. 40). Отщепление
еще одного фрагмента от u-цепи СЗ, а именно C3d, про-
исходит под действием протеиназ, не входящих в систему
комплемента, например плазмина.
Инактивация С4Ь и С5Ь, связанная с дальнейшим
гидролизом a-цепей этих компонентов, осуществляется с
помощью особых протеиназ. Одна из них — фактор I
способна быстро расщеплять в двух местах a-цепь С4,
но только после того, как этот компонент свяжется с
особым кофактором: С4-связывающим белком. Это са-
мый большой по молекулярной массе белок системы
комплемента (около 600 000), образованный десятью
идентичными полипептидными цепями.
Бета-1-Н (р-1-Н)1 — белок с молекулярной массой
150 000, обладает свойством вытеснять ВЬ из комплек-
са— СЗЬВЬ. Это благоприятствует расщеплению свобод-
ного СЗЬ с помощью фактора I. Существенно, что фактор
I эффективно расщепляет СЗЬ как в жидкой фазе, так
в связанной форме только в присутствии фактора Н.
Фактор Н регулирует также связывание активированно-
го С5 на клеточной мембране, препятствуя тем самым
формированию мембранатакующего комплекса.
1 В последнее время обозначают как фактор Н.
180
Помимо фактора Н в процесс фиксации мембраната-
кующего комплекса вмешивается так называемый бе ок
S. Этот гликопротеин с молекулярной массой 88 000 спо-
собен подобно сывороточному липопротеину низкой плот-
ности связываться комплексом С5Ь67, конкурируя за
центр, посредством которого этот тримолекулярпый ком-
плекс связывается с клеточной мембраной (см. рис. 41).
8.5.	Биологически активные пептиды
Классический путь активации компле-
мента связан с появлением продуктов протеолиза С4, С2,
<23 и С5. Фрагменты С4Ь, С2а, СЗЬ и С5Ь вовлечены в
каскад реакций собственно системы комплемента. В то
же время низкомолекулярные фрагменты — СЗа и С5а
обладают независимой биологической активностью. Со-
вокупность присущих им свойств дала основание назвать
их анафилатоксинами. Указанные фрагменты способны
вызвать высвобождение гистамина из тучных клеток,
обеспечить направленную миграцию (хемотаксис) поли-
морфноядерных лейкоцитов, вызвать сокращение глад-
кой мускулатуры. При внутрикожном введении СЗа и
С5а быстро вызывают отек и покраснение (эритема) в
связи с нарушением проницаемости сосудов, их расши-
рением и, как следствие, нарушением гемодинамики. Ак-
тивность пептидов очень велика: эффективная доза СЗа
составляет 2Х 10~12 моль, а С5а — 10-15 моль.
СЗа обладает молекулярной массой приблизительно
9000 и является, как указывалось, N-концевой частью
«-цепи СЗ. Пептид образован 77 аминокислотными остат-
ками, в число которых не входят триптофан и свободные
сульфгидрильные группы. Согласно данным циркуляр-
ного дихроизма 40—45% цепи закручено в а-спираль.
Для сравнения отметим, что в СЗ содержится не более
10% а-спиральных структур, а в СЗЬ их вовсе нет. Это
может означать, что расщепление a-цепи СЗ сопровож-
дается конформационным переходом отделившегося пеп-
тида, что приводит к увеличению в его молекуле доли
регулярной «-спиральной структуры.
Активность СЗа в значительной степени связана с
С-конпевым аргинином. Его отщепление карбоксипепти-
дазой В приводит к полной потере биологической актив-
ности, хотя каких-либо изменений вторичной структуры
при этом не возникает. Следовательно, С-концевой арги-
нин входит в состав активного центра СЗа.
181
Интересно, что в молекуле С5а, пептиде, сходном по
функции с СЗа, С-концевой аминокислотой также явля-
ется аргинин. И в этом случае его отщепление карбокси-
пептидазой лишает С5а биологической активности. Мо-
лекула С5а подобно СЗа имеет около 40% а-спиральных
структур. Третичная структура С5а стабилизирована ди-
сульфидной связью. В присутствии 2-меркаптоэтанола
активность пептида резко снижается наряду с уменьше-
нием степени его спирализации. После удаления вос-
становителя структура и функция С5а спонтанно восста-
навливаются.
Карбоксппептпдаза В является естественным инакти-
ватором анафилатоксинов СЗа и С5а. Так как этот сы-
вороточный фермент инактивирует также брадикинин,
его обозначают как кининазу 1.
8.6.	Эффекторные функции
системы комплемента
Выше мы уже познакомились с двумя
эффекторными функциями системы комплемента: цито-
токсическим действием и общим патофизиологическим
эффектом анафилатоксинов: СЗа и С5а. Эти эффекторные
функции системы комплемента реа шзуются при участии
антител любого класса в комплексе с любым поливалент-
ным антигеном. Действительно, формирование мембран-
атакующего комплекса С5а6789 и появление анафилаток-
синов СЗа и С5а происходит при активации комплемен-
та и классическим, и альтернативным путем.
Протеиназы, появляющиеся при активации компле-
мента, несмотря на их субстратную специфичность, спо-
собны активировать другие ферментные системы крови:
систему свертывания и систему кининообразования. Ос-
новная роль здесь принадлежит, по-видимому, СЗЬ.
Связь СЗЬ с системой свертывания крови заключается в
том, что под действием СЗЬ изменяется поверхность тром-
боцитов, которые участвуют в активации факторов свер-
тывания крови.
Взаимодействуя с комплексом антиген-антитело, ком-
поненты системы комплемента способны изменять физико-
химические свойства этого комплекса и, таким образом,
влиять на его судьбу в организме. Способность компле-
мента увеличивать степень дисперсности (уменьшать сте-
пень агрегации) иммунных комплексов была впервые
продемонстрирована Г. Миллером и В. Нюссенцвейгом
182
(G. Miller, V. Nussenzweig, 1975). Среди компонентов
комплемента этими свойствами обладают, очевидно,
СЗЬ и Clq. Первый из упомянутых компонентов реагиру-
ет с Fab-участком молекулы. В этом случае при опти-
мальных условиях приблизительно 200 молекул СЗЬ при-
соединяются на 1000 молекул IgG пли F(ab')2 в составе
иммунного комплекса (К. Gadd и К- Reid, 1981). Увели-
чение степени дисперсности иммунного комплекса пос-
ле присоединения СЗЬ обусловлено скорее всего увели-
чением степени его гндрппщпп. Менее очевидны причины
увеличения степени дисперсности иммунных комплек-
сов после присоединения Clq. По-видимому, из-за боль-
ших размеров молекулы Clq создаются стерические пре-
пятствия для наиболее эффективного «сшивания» антите-
лами молекул антигена.
Присоединение Clq к иммунному комплексу, образо-
ванному с участием IgG-антител, препятствует его связы-
ванию Fc-рецепторами клеток селезенки и перитонеаль-
ных макрофагов (А. Кульберг и др., 1985). Причины это-
го феномена обсуждаются в гл. 6. Очевидным следстви-
ем уменьшения сродства иммунных комплексов к Fc-ре-
цепторам фагоцитов будет уменьшение эффективности
их фагоцитоза.
Благодаря наличию на различных клетках рецепторов
для модифицированного третьего компонента комплемен-
та (СЗЬ и C3d) иммунные комплексы, связавшие моди-
фицированный СЗ, способны через него фиксироваться
на клеточной поверхности. Феномен пол}чил название
иммунного прикрепления (immune adherence) (D. Nel-
son, 1963). К числу клеток, несущих рецепторы для СЗ
(C3R), у человека относятся эритроциты, полиморфо-
нуклеары (нейтрофилы и эозинофилы), макрофаги и
В-лимфоциты. Фиксация иммунного комплекса на C3R
требует связывания комплексом только СЗ и протекает
без участия двухвалентных катионов. Строение C3R об-
суждается в гл. 9.
Связывание иммунных комплексов фагоцитами через
C3R служит фактором, благоприятствующим их захвату
клетками. Если иммунный комплекс фиксирован на по-
верхности фагоцита, но не может быть поглощен клет-
кой, последние высвобождают наружу содержащиеся в
лизосомах ферменты (этот процесс обозначают как эк-
зоцитоз). Свойством секретировать содержащиеся в клет-
ке вещества (прежде всего биогенные амины: гистамин
и серотонин) под влиянием иммунного комплекса, при-
183
крепившегося к клетке через C3R, обладают также тром-
боциты. Однако C3R выявлен пока что только на тром-
боцитах грызунов. Иммунные комплексы можно заме-
нить в экспериментах с тромбоцитами какими-либо час-
тицами, покрытыми СЗ, например клеточными стенками
дрожжей (последние эффективно связывают СЗЬ).
Хотя факт фиксации на поверхности В-лимфоцитов
комплексов антиген-антитело, связавших СЗЬ, безуслов-
но доказан, значение этого феномена в иммунологических
реакциях не очевидно: модельные опыты показали, что
иммунные комплексы, фиксированные через C3R на лим-
фоцитах, быстро высвобождаются с клеточной поверхно-
сти при 37° С в присутствии избытка СЗ. Этот феномен
связан, очевидно, с появлением большого избытка СЗЬ
в результате активации СЗ альтернативным путем. Не
удивительно поэтому, что введенные в кровоток комплек-
сы антиген-антитело, хотя и фиксируются первоначаль-
но на циркулирующих в крови лимфоидных клетках, ис-
чезают с их поверхности в течение первых пяти минут
(G. Miller, V. Nussenzweig, 1975). Эти данные служат
одним из примеров того, как ошибочно переносить ре-
зультаты опытов in vitro на целостный организм без спе-
циальных экспериментов in vivo.
Хемотактические свойства активированных компонен-
тов комплемента проявляются у С5а, гемолитически не-
активного комплекса С5Ь67, содержащегося в жидкой
фазе, и у ВЬ в составе комплекса СЗЬВЬ (СЗ-конверта-
за). С5а вызывает миграцию нейтрофилов, эозинофилов
и моноцитов, а комплекс С5Ь67 только нейтрофилов. Эти
свойства активированных компонентов комплемента в со-
четании со свойством анафилатоксина (СЗа или С5а)
увеличивать проницаемость сосудов и вызывать их рас-
ширение определяют их роль в развитии воспаления —
важнейшей приспособительной реакции естественного
иммунитета, направленной на ограничение действия по-
вреждающих факторов, будь то физические (тепловое
или ультрафиолетовое облучение), химические или биоло-
гические (токсины микробного и растительного проис-
хождения) и др. Роль отдельных компонентов системы
комплемента в реализации различных эффекторных
функций проиллюстрирована на рис. 44.
Из предыдущего изложения ясно, что система комп-
лемента играет значительную роль в регуляции гомеоста-
за и в том числе в естественной резистентности организ-
ма к различным воздействиям. Исследована также роль
184
системы комплемента и ее отдельных компонентов в спе-
цифической реакции на антиген. Так, М. Пепис (М. Ре-
pys, 1976) обнаружил, что введение мышам так называ-
емого фактора из яда кобры (CoF) подавляет продук-
цию антител на тимусзависимые антигены. CoF имеет
непосредственное отношение к системе комплемента, так
Рис. 44. Биологические реакции, возникающие при активации систе-
мы комплемента:
Аг — антиген, Ат — антитело
как, влияя на активность ферментов альтернативного пу-
ти, он способен резко снижать в организме содержание
СЗ. Вслед за этим наблюдением были предприняты уси-
лия оценить в культуре клеток селезенки влияние СЗ и
продуктов его активации на первичный иммунный ответ.
Оказалось, что собственно СЗ и антисыворотка против
него влияют на антигензависимып синтез антител, уси-
ливая и подавляя его соответственно.
Недавно Л. Черноусова с соавторами (1982—1984)
получили свидетельства в пользу того, что Clq участвует
в регуляции процесса переключения иммунологических
реакций с клеточных на гуморальные и наоборот. Как
указывалось в гл. 1, при иммунизации таким тимусзави-
симым антигеном, как эритроциты барана, на пике пер-
вичного иммунного ответа около 2% клеток селезенки
способны специфически связывать антиген. Примерно
70% этих клеток (морфологически относящихся к лим-
185
фоцитам) связывают антиген за счет сорбированиих ими
комплексов антиген-антитело (см. гл. 6). После инкуба-
ции с Clq эти клетки утрачивают антигенсвязывающие
свойства. В свою очередь, показано, что Clq инактивиру-
ет супрессоры реакции гиперчувствительностп замедлен-
ного типа (ГЗТ). Чувствительные к Clq клетки находи-
лись в селезенке мышей, иммунизированных эритроцита-
ми барана, в дозе, оптимальной для продукции антител
(5Х Ю7—5X108 клеток).
Клетки-супрессоры ГЗТ принадлежат к числу лимфо-
цитов, сорбировавших иммунные комплексы (Л. Черно-
усова и др., 1980—1984). Отсюда можно заключить, что
Clq инактивирует супрессоры ГЗТ, поскольку взаимодей-
ствует с иммунными комплексами на их поверхности.
А все вместе это означает, что Clq способен влиять на
течение такой реакции клеточного иммунитета, как ГЗТ.
8.7.	Биосинтез компонентов
комплемента
Трудности высокочувствительной инди-
кации отдельных компонентов комплемента создали
проблемы для точной оценки места их синтеза. Лишь в
последнее время с получением моноспецифических, а так-
же моноклональных антител против компонентов компле-
мента стало возможным приступить к решению пробле-
мы.
В настоящее время не вызывает сомнения, что важ-
ная роль в синтезе ключевых компонентов как класси-
ческого, так и альтернативного путей активации компле-
мента принадлежит клеткам моноцптарно-фагэдитарной
системы: собственно макрофагам и полиморфноядерным
лейкоцитам. Так, макрофаги синтезируют Clq, С4, С2,
СЗ, С5, пропердин, факторы В и D. Клетки паренхимы
печени, вероятно, синтезируют СЗ, С5 и С9. Способы
изучения синтеза компонентов комплемента можно про-
следить на примере Clq.
Перитонеальные макрофаги мыши культивируют в
среде, содержащей все аминокислоты, кроме глицина
(элективная среда). В среду добавляют меченный 14С
глицин и через различные промежутки времени опреде-
ляют содержание в культуральной среде радиомеченого
Clq. Последний извлекают из среды с помощью иммоби-
лизованных на сефарозе антител кролика против Clq мы-
ши. Как видно из рис. 45 (Н. И. Кулагина и др., 1985),
186
скорость синтеза Clq макрофагами возрастает во време-
ни, что предполагает индуцибельный характер его синте-
за. Одним из индукторов синтеза Clq в организме слу-
жит агрегированный IgG, о чем убедительно свидетель-
ствуют, в частности, опыты, выполненные II. Тархановой
с соавторами (1984).
Рис. 45. Синтез Clq пе-
ритонеальными макро-
фагами мыши, культиви-
руемыми in vitro
Рис. 46. Изменение биосинтеза
Clq у мыши, получившей одно-
кратную инъекцию аналога им-
мунного комплекса — агрегиро-
ванного при 63°С IgG
Мышам вводили однократно внутривенно агрегиро-
ванные при 63° С изологичные иммуноглобулины (ана-
логи комплекса антиген-антитело). Спустя различные
промежутки времени оценивали содержание в плазме
радиомеченого Clq (за 4 ч до каждого взятия крови
внутривенно вводили радиомеченый глицин; указанный
срок соответствует максимальному включению радиоак-
тивной аминокислоты во вновь синтезированный Clq).
После введения агрегированных иммуноглобулинов син-
тез Clq быстро возрастает и только спустя 48 ч возвра-
ту
щается к норме (рис. 46). Параллельно оценивали об-
щее содержание в плазме Clq с помощью метода ради-
альной иммунодиффузии (см. гл. 12), используя антите-
ла против Clq мыши.
Как следует из рис. 47, сразу после введения агреги-
рованных иммуноглобулинов содержание Clq в крови
резко снижается, что можно объяснить его связыванием
Рис. 47. Содержание Clq (по методу Манчини) в
плазме крови мыши после инъекции аналога им-
мунного комплекса — агрегированного при 63°С
IgG
иммуноглобулинами в форме агрегата. Затем содержа-
ние Clq увеличивается и превышает в течение несколь-
ких суток нормальные значения. Из этих опытов несом-
ненно следует, что агрегаты иммуноглобулинов, имею-
щих эффекторные центры для Clq, способны усилить
синтез этого компонента комплемента. В этой связи зна-
чительный интерес представляют данные тех же авторов»
согласно которым после иммунизации мышей оптималь-
ной дозой эритроцитов барана синтез Clq на короткий
срок усиливается (рис. 48). Очевидно, ускорение синте-
за Clq у иммунизированных животных совпадает с по-
явлением у них в циркуляции иммунных комплексов,
связывающих Clq.
188
Иммунные комплексы, вероятно, регулируют синтез
не только Clq, но и С2, а возможно, и других компонен-
тов комплемента (Me. Phadden et al., 1981, 1982).
Основным органом, участвующим в синтезе СЗ, С6,
С8 и фактора В, служит печень. По крайней мере 90%
всего количества этих компонентов, содержащихся в кро-
ви, синтезировано клетками
печени. В синтезе участвуют
собственно гепатоциты. Опу-
холевые клетки печени чело-
века Нер2 синтезируют в
культуре и секретируют
функционально активные
С 1г, С Is, С2, СЗ, С4, С5,
фактор В, С1-ингибитор,
фактор /, небольшие количе-
ства С6 и С8. Вместе с тем
не установлена продукция
клетками печени Clq, С7 и
С9 (С. Alper, F. Rosen,
1981). Кроме упомянутых ти-
пов клеток в синтезе компо-
нентов комплемента участву-
ют фибробласты (С1 и СЗ) и
эпителиальные клетки (С1).
Многоцепьевые компо-
ненты комплемента синтезп-
мунизаири, сутки
Рис. 48. Изменение содержания
Clq в плазме крови мыши по-
сле иммунизации эритроцита-
ми барана (5Х108 клеток)
руются в виде одноцепьевого
предшественника. Это было
установлено для С4, СЗ и С5. Одноцепьевые предшест-
венники найдены в лизатах клеток гепатомы, а также
при изучении синтеза С4 в бесклеточной системе гомо-
генатов клеток печени. Про-С4 обладает молекулярной
массой, равной 200 000. После ограниченного протео-
лиза про-С4, как и про-СЗ и про-С5, превращался в мно-
гоцепьевой белок. Процесс «созревания» предшествует
секреции белка клеткой. И тем не менее до 3% от общего
количества белков системы комплемента присутствует в
крови в виде одноцепьевых предшественников.
При патологических состояниях, связанных с продол-
жительным периодом персистенции в организме иммун-
ных комплексов, синтез компонентов комплемента, взаи-
модействующих с иммунным комплексом, как, по-види-
мому, и других компонентов комплемента, существенно
изменяется. Это было продемонстрировано при оценке
189
скорости синтеза и общего содержания Clq у мышей
(NZB/\ZW)Fi разного возраста (А. Кульберг и др.,
1985). У этих мышей в возрасте 6—8 месяцев наблюда-
ется выраженная аутоиммунная патология и, в частно-
сти, продукция антител против нативной ДНК, собствен-
ных эритроцитов и тимоцитов (см. также гл. 2 и 11). При
сравнительном определении общего содержания Clq в
плазме мышей (NZB/\ZW)Fi в возрасте 8 месяцев и
1 месяц оказалось, что у первых его количество крайне
невелико: по крайней мере в 4 раза ниже, чем у молодых
мышей той же липни. Напротив, скорость биосинтеза
Clq у взрослых новозеландских мышей была значитель-
но большей, чем у молодых. Новообразованный Clq, как
было показано, находится преимущественно в связанной
форме в составе иммунных комплексов.
Приведенные сведения представляют интерес в двух
аспектах. Во-первых, они служат подтверждением пред-
положения, что Clq и, очевидно, другие компоненты
комплемента синтезируются под контролем индукторов,
важнейшим из которых, вероятно, является комплекс ан-
тиген-антитело. Во-вторых, представляется обоснованным
следующее заключение. При заболеваниях, связанных с
персистенцией иммунных комплексов, из-за большой про-
дукции Clq последний насыщает эти комплексы. Поэто-
му их элиминация фагоцитами затруднена вследствие эк-
ранирования Clq компонентом эффекторных центров
IgG для Fc-рецепторов (см. раздел 6.2).
Интенсивное потребление комплемента происходит
даже в норме, поскольку в норме непрерывно идет об-
разование антител (например, к антигенам бактерий-сим-
бионтов кишечного тракта), а следовательно, образуют-
ся иммунные комплексы. В силу этого компонентам комп-
лемента присуща необычно высокая для сывороточных
белков скорость катаболизма. При внутривенном введе-
нии высокоочищенных радиомеченых С4, СЗ, С5 и факто-
ра В человека скорость их катаболизма составляет
2%/ч пли 50%/сутки. Для сравнения напомним, что IgG
человека распадается на 50% за 21 день. Эти и другие
приведенные в этом разделе данные свидетельствуют в
пользу большой динамичности системы комплемента, что
в еще большей степени повышает ее роль в регуляции
гомеостаза.
Рецепторы
лимфоцитов
Лимфоциты содержат на своей поверх-
ности рецепторные белки, способные в качестве лигандов
связывать антигены, иммуноглобулины, компоненты сис-
темы комплемента, медиаторы иммунного ответа, различ-
ные гормоны. Некоторые виды рецепторов лимфоцитов-
те же, что и у других клеток. Это относится не только к
рецепторам для гормонов, имеющимся па клетках самых
различных органов и тканей, но и Fc-рецепторам и ре-
цепторам для комплемента. Так, Fc-рецепторы характер-
ны для фагоцитов (макрофаги и полиморфноядерные
лейкоциты), клеток паренхимы печени, трофобластов
плаценты. На многих типах клеток имеются рецепторы
для комплемента (см. гл. 8). Однако только лимфоциты
В- и Т-ряда синтезируют рецепторные белки, обеспечи-
вающие специфическое связывание этими клетками анти-
генов. Поэтому основное внимание в этой главе будет
уделено именно этому виду рецепторов.
9.1.	Рецепторы для антигена
В-клетки. Наличие антигенсвязываю-
щих рецепторов иммуноглобулинового типа — характер-
ный признак клеток В-ряда. У взрослых индивидуумов
В-лимфоциты могут иметь антигенсвязывающие рецеп-
торы, подобные по изотипу любому из известных сыворо-
точных иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE. Ка-
ких-либо иммуноглобулинов, отличающихся по пзотипу
от сывороточных иммуноглобулинов, лимфоидные клет-
ки В-ряда не продуцируют.
На поверхности индивидуальной клетки (малого лим-
фоцита) могут быть представлены иммуноглобулиновые
рецепторы не более двух пзотипов. В-лимфоциты, не яв-
ляющиеся потомками клеток, контактировавших ранее с
антигеном, обладают рецепторами двух изотипов: IgM и
IgD. В-лимфоциты, принадлежащие к дочерним клеткам
191
лимфоцитов, уже стимулированных антигеном, могут
иметь рецепторы, соответствующие по пзотипу одному из
подклассов IgG в сочетании с IgM или IgA, только IgA,
IgG или IgE. Функционально эти лимфоциты относятся
к клеткам иммунологической памяти. Принципиально
важным является то, что предшественники лимфоцитов,
несущих рецепторы изотппов IgG, IgA и IgE, имеют ре-
цепторы изотипа IgM.
У мышей лимфоциты с рецепторами IgM-изотипа по-
являются на стадии эмбриона и локализуются в печени.
К моменту рождения у мыши содержатся В-лимфоциты,
экспрессирующие только этот изотип. Абсолютное чис-
ло лимфоцитов, несущих иммуноглобулиновые рецепто-
ры, у новорожденной мыши значительно меньше, чем у
взрослой особи. Однако число антигенов, специфически
распознаваемых лимфоцитами новорожденной мыши,
приблизительно то же, что и у взрослой особи того же
генотипа (N. Klinman et al., 1976—1980).
Ко второй-третьей неделе жизни плотность иммуно-
глобулиновых рецепторов на В-лпмфоцитах мыши воз-
растает до 104—105 на одну клетку. Увеличение абсолют-
ного числа иммуноглобулиновых рецепторов происходит
в том числе за счет того, что клетки приобретают способ-
ность продуцировать помимо рецепторов изотипа IgM
также рецепторы изотипа IgD. У человека В-лимфоциты,
несущие рецепторы IgD-изотппа, появляются, очевидно,
уже у плода. При этом находящиеся на поверхности од-
ной клетки рецепторы изотипов IgM и IgD имеют один
и тот же тип легкой цепи (х или 7.) и одну и ту же ан-
тигенную специфичность (N. Warner, 1974; S. Fu, Н. Кин-
ке!, 1974).
Период экспрессии рецепторов IgD-изотипа совпада-
ет по времени с функциональным созреванием В-лимфо-
цитов, а именно с их способностью превращаться под
влиянием антигена и клеток-помощников: Т-хелперов и
А-клеток в антителопродуцирующие клетки.
На стадии лимфобласта на поверхности клетки сохра-
няются иммуноглобулиновые рецепторы, хотя такая клет-
ка уже способна секретировать иммуноглобулины (анти-
тела) (F. Moddaber, A. Coons, 1971). Зрелые плазмати-
ческие клетки, интенсивно продуцирующие и секретиру-
ющие иммуноглобулины, лишены иммуноглобулиновых
рецепторов.
Сам факт существования клеток, способных одновре-
менно продуцировать иммуноглобулины как в секрети-
192
руемой форме, так и в форме ассоциированных с мембра-
ной рецепторов, говорит о независимости путей синтеза
секретируемых и ассоциированных с мембраной иммуно-
глобулинов. Этот вывод подтверждают два факта: струк-
турные различия тяжелых цепей двух сравниваемых форм
иммуноглобулинов в случае принадлежности их одному
изотипу, а также существование для мембранассоцииро-
ванных иммуноглобулинов собственной информационной
РНК для тяжелых цепей (J. Rogers et al., 1980) и осо-
бых полисомальных комплексов (F. Melchers, 1980).
Тяжелые ц-цепи мембранассоципрованного IgM име-
ют ту же структуру, что и сывороточного IgM, за исклю-
чением С-концевого участка, расположенного за С4-доме-
ном. В направлении С-конца этот отрезок цепи образован
коротким связывающим участком из 12 гидрофильных
аминокислотных остатков, за которым идет отрезок из
26 остатков (локализующихся внутри мембраны) и, на-
конец, С-концевой трипептид Lys — Vai — Lys — COOH,
погруженный в цитоплазму (рис. 49). С-концевой участок
6-цепи и, по-видимому, тяжелых цепей других мембранас-
социированных форм иммуноглобулинов построены одно-
типно. Во всех случаях между двумя гидрофильными от-
резками находится гидрофобный участок, погруженный
в мембрану клетки.
Как обсуждалось в гл. 5, структурные гены для тя-
желых цепей содержат особый сегмент, контролирующих
синтез мембрапассоциированной формы иммуноглобули-
нов. Он отделен от сегментов, контролирующих синтез
доменов тяжелой цепи интроном.
Синтезируемые на особых полисомальных комплексах
тяжелые цепи рецепторного IgM после объединения с
легкими цепями образуют 8S мономеры, накапливающи-
еся в особых вакуолях. Последние морфологически и
структурно отличимы от системы цистерн, куда поступа-
ют пептидные цепи и собираются из них секретируемые
клеткой иммуноглобулины. 8S мономеры рецепторного
IgM не объединяются в 19S пентамер. По-видимому, это
связано с особенностями строения С-концевых отрезков
тяжелых цепей и отсутствием в вакуолях, где идет сбор-
ка 8S мономеров, J-цепей. Именно в форме 8S мономера
рецепторный IgM встраивается в цитоплазматическую
мембрану.
Одновременно с синтезом и встраиванием новых им-
муноглобулиновых рецепторов с клеточной поверхности
высвобождаются ранее синтезированные молекулы ре-
7—1258
193
Рис. 49. Строение рецепторного IgM В-лимфоцитов
цепторов. Время полуобмена (смена на 50%) иммуногло-
булиновых рецепторов у малых лимфоцитов из селезен-
ки неиммуннзнрованных мышей составляет 4—6 ч
(Е. Vitetta, J. Uhr, 1972). С той же скоростью происхо-
дит обмен антпгенсвязывающпх рецепторов лимфоцитов
из селезенки мышей на 9-й день после иммунизации эри-
троцитами барана (Б. Юрин и др., 1976, 1977). Важен
194
факт, что скорость обмена иммуноглобулиновых рецеп-
торов резко возрастает при активации лимфоцитов и пре-
вращении их в бласты (Е. Unanue, 1975).
Если обработать В-лимфоциты на холоду антпимму-
ноглобулиновыми антителами, меченными флуорохро-
мом, можно наблюдать в люминесцентном микроскопе
равномерное краевое свечение большинства клеток. Из
этого следует, что иммуноглобулиновые рецепторы до-
статочно равномерно распределены по поверхности клет-
ки. Если в течение короткого срока проинкубировать при
37° С клетки, обработанные антителами против иммуно-
глобулинов, выявится различная степень неравномерно-
сти распределения рецепторных иммуноглобулинов: от
мелких скоплений (patches) или полулуний, до располо-
женных на одном из полюсов клетки «шапочек» (caps).
Это означает, что при 37° С бивалентные антииммуногло-
булиновые антитела вызывают латеральные перемещения
рецепторов по мембране. Такой эффект вызывает только
бивалентные антииммуноглобулины пли их Е(аЬ')г-
фрагменты, но не одновалентные Fab'- или Fab-фрагмен-
ты. Следовательно, латеральная подвижность рецепторов
возникает только после их «сшивания» между собой. Та-
кую «сшивку» вызывают также поливалентные антигены
или бивалентные гаптены, но не одновалентные гаптены,
поэтому последние не вызывают перемещения рецепто-
ров.
Если на поверхности лимфоцита находятся рецепторы
двух изотипов (например, IgM и IgD), то с помощью
моноспецифпческпх антиизотипическпх сывороток можно
вызвать перемещение и формирование шапочек только
из рецепторов одного изотппа, т. е. рецепторы каждого
изотппа не связаны между собой. Иммуноглобулиновые
рецепторы структурно независимы и от других мембран-
ных белков, например Fc-рецептора, 1а-антпгена и др.
(F. Loor, L. Forni, В. Pernis, 1972).
Перемещение иммуноглобулиновых рецепторов по
клеточной поверхности требует энергетических затрат.
Процесс можно подавить ингибиторами клеточного дыха-
ния.
Агрегаты рецепторов либо поглощаются лимфоцитом
(engulfing), либо сбрасываются в среду (shedding).
Вслед за этим на поверхности клетки появляются ново-
образованные рецепторы.
Поперечная «сшивка» иммуноглобулиновых рецепто-
ров поливалентными лигандами или бивалентными анти-
7*
195
иммуноглобулиновыми антителами — важный этап в ак-
тивации лимфоцитов. Так, в частности, антиизотипиче-
скпе антитела, добавленные к В-лимфоцитам, вызывают
их поликлональную активацию. В том случае, когда в
качестве мишеней служат В-лимфоциты, взятые от доно-
ра, ранее иммунизированного каким-то антигеном, анти-
ц-антитела способны, подобно антигену, стимулировать
биосинтез антител (Т. Kishimoto, К. Ishizaka, 1975;
S. Friedman et al., 1976). Но в этом случае будут стиму-
лированы не только клетки иммунологической памяти к
определенному антигену, но и все остальные В-лимфоци-
ты. В результате активация лимфоцитов будет носить по-
ликлональный характер. Такая поликлональная актива-
ция, сопровождающаяся продукцией больших количеств
иммуноглобулинов, представляет собой сложный биохи-
мический процесс. Одним из факторов, регулирующих
его, служат циклические нуклеотиды. Накопившийся в
первые часы посте активации лимфоцитов циклический
аденозинмонофосфат (цАМФ) подвергается затем рас-
щеплению фосфодиэстеразой цАМФ. Только при сниже-
нии уровня цАМФ возможна активация синтеза белка.
При продолжительном увеличении в активированных
клетках концентрации нАМФ они утрачивают способ-
ность к пролиферации и биосинтезу иммуноглобулинов.
Сказанное выше служит основанием для понимания мно-
гих особенностей биологии лимфоцитов, в том числе фе-
номена супрессии изотипа.
Если новорожденным мышам вводить регулярно мо-
носпепифические антитела против IgM мыши (анти-ц),
наблюдается полное подавление синтеза IgM и резкое
снижение продукции IgG и IgA. Состояние иммуноде-
прессии можно поддерживать периодическим введением
анти-ц. В противном случае постепенно начинает восста-
навливаться сначала синтез IgG, IgA и вслед затем IgM
(D. Manning, 1976). Подавление продукции иммуногло-
булинов под действием анти-ц обусловлено исчезновени-
ем В-лимфоцитов, несущих на своей поверхности IgM,
IgG, IgE и IgA, а также плазматических клеток, проду-
цирующих эти иммуноглобулины. Супрессия изотипа обу-
словлена наличием на поверхности В-лимфопитов ново-
рожденных мышей рецепторного IgM. Эти клетки слу-
жат мишенями для анти-ц. Поскольку их блокирование
и элиминация исключают в дальнейшем продукцию не
только IgM, но и иммуноглобулинов всех других классов,
это доказывает, что В-лимфоциты с рецепторами IgM-
196
изотипа служат предшественниками клеток, продуциру-
ющих иммуноглобулины всех других классов.
Кроме анти-р способностью подавлять продукцию им-
муноглобулинов всех других классов обладают только
антитела против IgD. Последние оказывают иммуносу-
прессивный эффект при введении новорожденным живот-
ным. Это не удивительно, если принять во внимание, что
клетки новорожденных экспрессируют одновременно ре-
цепторы изотипов М и D. Что касается антител против
IgG (анти-у) или IgA (антп-а), то они вызывают подав-
ление продукции иммуноглобулинов только того изотипа,
против которого они направлены.
Супрессия изотипа может быть воспроизведена в
культуре клеток селезенки неиммунизированного доно-
ра. II в этом случае анти-р-антитела подавляют антиген-
зависимую продукцию антител различных классов (Ig М,
IgG, IgA), а анти-у и анти-а— только антител соответст-
вующего класса. Отсутствие строгой специфичности про-
является лишь в случае испытания супрессивного дейст-
вия антител против отдельных подклассов IgG: анти-
IgGl-антптела подавляют синтез как IgGl, так и IgG2,
и наоборот (С. Pierce, 1972).
Считали, что Механизм супрессии изотипа может за-
ключаться в элиминации путем фагоцитоза лимфоцитов,
прореагировавших с чужеродными антиизотипическими
антителами. Процесс, очевидно, более сложен. Уже гово-
рилось, что супрессия наблюдается лишь при действии
антител на незрелые В-лимфоциты. Причина этого уста-
новлена при культивировании in vitro В-лимфоцитов эм-
бриона или новорожденного в присутствии анти-р-анти-
тел. Анти-р-антитела вызывали быстрое исчезновение с
поверхности клеток рецепторов IgM-типа. Этому пред-
шествовал процесс агрегации рецепторов и образования
«шапочек». Различие в поведении незрелых и зрелых
В-лимфоцитов в присутствии анти-р заключалось в том,
что незрелые клетки на продолжительный срок (5 суток
наблюдения) теряли способности ресинтезпровать рецеп-
торы. Зрелые лимфоциты полностью восстанавливали эту
способность через 48 ч после удаления антп-р-аптвтел
(М. Raff, 1975; С. Sidman, Е. Unanue, 1975).
Влияние анти-р-антител не ограничивается подавле-
нием синтеза IgM-рецепторов, но затрагивает также про-
цессы синтеза некоторых мембранассоцпированных бел-
ков, в частности 1а-антигена( см. гл. 10), рецепторов для
бактериального «ЛПС (см. ниже). Существенно, что по-
197
добно антп-ц-антителам на незрелые В-лимфоциты дей-
ствует поливалентный антиген (разумеется, только
на В-лимфоциты, имеющие рецепторы к этому антигену)
(С. Bruyns, 1976). Очевидно, «сшивка» между собой им-
муноглобулиновых рецепторов служит трансмембранным
сигналом, который в незрелых клетках блокирует синтез
рецепторов и других мембранных белков. Причиной этого
может быть недостаточно эффективная регуляция в не-
зрелых клетках процесса метаболизма цАМФ, вследст-
вие чего его уровень после воздействия анти-р-антител
остается продолжительное время высоким.
Иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов до-
статочно строго рестриктированы по аллотипу, т. е. у ге-
терозиготного индивидуума иммуноглобулиновые рецеп-
торы индивидуальной В-клетки имеют, как правило, лег-
кие п тяжелые цепи одного аллотипа. Способность клет-
ки экспрессировать полипептидные цепи иммуноглобули-
нов только одного из двух возможных аллотипов полу-
чила название аллельного исключения (S. Sell, 1977).
Аллельное исключение не абсолютно, так как небольшое
число В-лимфоцитов экспрессирует оба аллотипа, если
эти клетки принадлежат гетерозиготным особям. Однако
их число уменьшается после антигенной пли митогенной
стимуляции. Зрелые плазматические клетки синтезируют
иммуноглобулины только одного аллотипа (см. гл. 1).
Необходимо особо подчеркнуть, что лимфоциты способ-
ны экспрессировать неаллельные варианты генов, конт-
ролирующих аллотипическую специфичность разноимен-
ных полипептидных цепей. Так, в случае одновременной
экспрессии двух изотипов (например, рецепторов IgM- и
IgD-пзотипов) па поверхности лимфоцита выявляются
аллотппические маркеры, характерные для ц- и 6-цепей
(см. гл. 3).
Антитела против аллотипов легких и тяжелых цепей
способны вызвать in vitro и in vivo супрессию аллотипа.
Так, если до рождения гетерозиготные кролики с легки-
ми цепями Ь4Ь5 получали от матери, имеющей аллотип
Ь4 анти-Ь5-антптела, у новорожденных было резко сниже-
но содержание иммуноглобулинов с легкими цепями ал-
лотипа Ь5 и В-лимфоцитов с иммуноглобулиновыми ре-
цепторами аллотипа Ь5 (S. Sell, 1976). Одновременно
компенсаторно увеличивалось число клеток с рецептора-
ми, содержащими легкие цепи противоположного алло-
типа. Длительность супрессии достигала 15 недель.
В опытах in vitro показано, что преинкубация клеток
198
селезенки гетерозиготных доноров с антиаллотипически-
ми антителами или их Р(аЬ'')2-фрагментами приводит к
подавлению продукции иммуноглобулинов с цепями су-
пресспруемого аллотипа. Было доказано, что плазматиче-
ские клетки не являются мишенями для антиаллотипиче-
ских антител. В качестве мишеней для них служат толь-
ко лимфоциты, причем эффект антител не связан с их
цитотоксическим действием на клетку.
Изучение механизма супрессии аллотипа позволило
глубоко проанализировать механизмы дифференцировки
В-клеток, роль в этом процессе регуляторных Т-клеток.
На модели хронической супрессии аллотипа у мышей бы-
ло установлено, что феномен супрессии связан с актива-
цией определенной категории Т-супрессоров (L. Herzen-
berg et al., 1967). Эти клетки подавляют активность
Т-хелперов, необходимых для дифференцировки В-кле-
ток с соответствующим аллотипическпм маркером. Су-
прессоры реализуют свое действие за счет продукции гу-
морального супрессорного фактора. Вся система: Т-хел-
пер— Т-супрессор, по-видимому, специфична для каждо-
го аллотипа. Действие антиаллотипических антител свя-
зано с активацией Т-супрессоров, контролирующих экс-
прессию данного аллотипа. При этом В-клетки, способ-
ные к экспрессии данного аллотипа, не исчезают.
Крайне интересно в этой связи, что Т-клеткп способ-
ны, по-видимому, экспрессировать гены, продукты кото-
рых сходны по своему строению Vb-доменам (см. ниже).
Возможно поэтому антиаллотипическпе антитела, на-
правленные к маркерам, которые расположены в вариа-
бельных участках молекулы иммуноглобулина, могут
действовать на Т-клеткп.
Помимо маркеров, характеризующих изотип и алло-
тип, иммуноглобулиновые рецепторы каждой индивиду-
альной В-клетки несут строго определенные идиотипиче-
ские детерминанты. При этом индивидуальная клетка
В-ряда экспрессирует только один идиотип вне зависимо-
сти от числа экспрессируемых пзотипов и аллотипов. Это
означает, в частности, что все молекулы иммуноглобули-
новых рецепторов, продуцируемых индивидуальными
В-лпмфоцитами, имеют идентичные вариабельные райо-
ны легких и тяжелых цепей ’. Так, в случае экспрессии
1 Редкие случаи обнаружения В-лимфоцитов с иммуноглобули-
новыми рецепторами, направленными к разным антигенам, не обсуж-
даются нами.
199
В-лимфоцитом двух различающихся по изотипу иммуно-
глобулиновых рецепторов (например, IgM и IgD) и тот
и другой идентичны по идиотипу. Это не удивительно,
если вспомнить, что идиотипические детерминанты лока-
лизуются в вариабельных районах легкой и тяжелой це-
пей (см. гл. 3). Кроме того, в индивидуальной В-клетке,
как правило, экспрессируется только один Уц- и один
Уь-гены (см. гл. 5). А появление двух видов мРНК для
тяжелых цепей, отличающихся по константным районам,
но совпадающих по вариабельным, происходит в процес-
се сплайсинга (см. гл. 5).
Антитела, продуцируемые плазматическими клетка-
ми, имеют тот же идиотип, что и иммуноглобулиновые
рецепторы родительских В-лимфоцитов.
Проблема идиотипической специфичности антиген-
связывающпх рецепторов касается не только иммуногло-
булиновых рецепторов В-лимфоцитов, но и антигенсвя-
зывающих рецепторов Т-лимфоцптов, поэтому мы обсу-
дим ее в следующем разделе.
Т-клетки. Все субпопуляции Т-лимфоцитов, как эф-
фекторных, так и регуляторных, которые специфически
взаимодействуют с антигеном и реагируют на него, несут
на своей поверхности рецепторы для антигена. Эти ре-
цепторы не имеют иммуноглобулиновой природы,
поскольку клетки Т-ряда не способы синтезириовать
иммуноглобулины. По-видимому, в некоторых Т-клет-
ках функционируют гены, сходные с VL- и Jt-сегмен-
тамп и Ун-сегментом генов д я полипептидных цепей
иммуноглобулинов, но об этом несколько позже.
В отличие от В-лимфоцитов не все субпопуляции Т-
лимфоцптов способны связывать водорастворимые анти-
гены. Этими свойствами не обладают Т-хелперы и Т-кил-
леры. Рецепторы этих клеток распознают антигенную
детерминанту в сочетании с детерминантами антигенов
основного комплекса гистосовместимости, например мак-
рофагов, процессировавших антиген (см. гл. 10). Напро-
тив, Т-супрессоры, очевидно, имеют достаточно большое
и поэтому убедитепьно регистрируемое сродство к рас-
творимым антигенам и гаптенам. Сказанное выше объяс-
няет причины значительных трудностей в химическом
изучении структуры антигенсвязывающих рецепторов
Т-лимфоцитов. Все же благодаря применению методов
аффинной хроматографии (иммуносорбцпя) клеток на
твердофазном сорбенте, содержащем известные гаптены,
200
удалось выделить антигенсвязывающие рецепторы Т-кле-
ток, имеющих высокое сродство к гаптену (U. Krawinkel
et al., 1977, 1979). Таким же способом были выделены
антигенспецпфические факторы, продуцируемые и секре-
тируемые Т-супрессорами (Т. Tada, К. Okumura, 1979).
Принципиально важно, что, подобно иммуноглобули-
новым рецепторам В-лимфоцитов и антителам, рецепторы
Т-супрессоров и продуцируемых ими антигенспецифиче-
ских супрессорных факторов совпадают по идиотипу и
распознают одну и ту же детерминантную группу
(U. Krawinkel, Н. Wigzell, Н. Binz, 1975—1980). Помимо
идиотипических маркеров рецепторы Т-супрессоров несут
аллотппические детерминанты, характерные для консер-
вативных участков последовательности Vn-района. Вся
совокупность этих данных позволяет заключить, что
Т-супрессоры экспрессируют продукт Ун-гена, который
входит в состав их антигенраспознающего рецептора.
Новые данные о строении антигенсвязывающих ре-
цепторов Т-лимфоцитов получены в последнее время при
изучении молекулярно-генетическими методами Т-клеток
человека и мыши, в том числе гибридов Т-хелперов с
клетками плазмацитомы. Такие клетки приобретают спо-
собность продуцировать в больших количествах белки,
принадлежащие к числу рецепторных. Исследования, вы-
полненные двумя научными коллективами на основе
сходных методических принципов, дали во многом сход-
ные результаты (У. Yanagi et al., 1984; S. Hedrick et al.,
1984). Из клеток выделяли очищенную мРНК, методом
обратной транскрипции получали ее ДНКовую копию и
анализировали нуклеотидную последовательность этой
ДНК и первичную структуру белка, синтезированного
при использовании указанной ДНК как матричной. Син-
тезированные полипептидные цепи имели два участка:
вариабельный и константный. Вариабельный участок
имел большую степень сходства первичной структуры с
вариабельным участком легких цепей иммуноглобулинов.
Крайне интересно, что С-концевые участки полипептид-
ных цепей указанных рецепторных белков Т-лимфоцитов
человека и мыши имели сходство аминокислотных после-
довательностей, достигавшее 80%• Это свидетельствует
о том, что в обоих типах клеток был идентифицирован
один и тот же ген. Так как константные участки были
сходны по своему строению с константными доменами
иммуноглобулинов, авторы пришли к заключению, что
рецепторные белки Т-лимфоцитов, обладающих хелпер-
201
ними функциями, подобны по своему строению легким
цепям иммуноглобулинов. Вместе с тем эти белки имеют
ряд особенностей, не позволяющих отождествить их с
легкими цепями иммуноглобулинов. Кроме того, суще-
ствуют несомненные отличия строения генов для этих
белков и генов для легких цепей иммуноглобулинов.
Дальнейшие исследования в этом направлении сулят
важные результаты.
Так как идиотипические детерминанты представлены
на В- и Т-лимфоцитах, последние могут стать мишенями
для действия антиидиотипических антител. Как в опытах
in vivo, так и при изучении биосинтеза антител в клеточ-
ных культурах с помощью антиидиотипических антител
удается получить два противоположных эффекта: подав-
ление продукции антител данного идиотипа (супрессия
идиотипа) или усиление экспрессии того же идиотипа.
Супрессия идиотипа может быть результатом прямого
воздействия антиидиотипических антител на В-клетки с
рецепторами данного идиотипа или на Т-клетки, экспрес-
сирующие тот же идиотип. Механизм супрессии различен
в зависимости от возраста реципиента, дозы использован-
ных антиидиотипических антител, их видовой принадлеж-
ности и эффекторных свойств. Как продемонстрировал
К. Эйхман (К. Eichmann, 1974, 1975), для супрессии
идиотипа обязательно наличие Fc-участка в молекуле
антитела и благодаря этому способности фиксироваться
на поверхности фагоцитов.
С другой стороны, антиидиотипические антитела спо-
собны усилить синтез антител данного идиотипа и даже в
отсутствие антигена индуцировать их синтез. Это воз-
можно, по данным К. Эйхмана и К. Раевского (К. Eich-
mann, К- Rajewski, 1975), при воздействии антпидиоти-
пнческих антител на клетки иммунологической памяти.
Для понимания биологической значимости феномена
супрессии идиотипа важно то обстоятельство, что в орга-
низме происходит спонтанное образование антиидиотипи-
ческих антител. Возникая при иммунизации, антиидиоти-
ппческие антитела могут играть существенную роль в ре-
гуляции иммунного ответа и прежде всего в изменении
идиотипической специфичности антител. Обобщив имею-
щиеся факты, Н. Ерне (N. Jerne, 1974) сформулировал
так называемую теорию сети (network), отводящую ауто-
логичным антиидиотипическпм антителам важную роль
в ауторегуляции иммунной системы.
202
9.2.	Fc-рецепторы
В гл. 6 уже рассказывалось об Fc-ре-
цепторах лимфоцитов и других типов клеток, обеспечи-
вающих фиксацию на клеточной поверхности иммуно-
глобулинов различных классов. Сходные по функции
Fc-рецепторы находятся на поверхности лимфоцитов,
макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов, фибробла-
стов, клеток паренхимы печени (гепатоциты), трофобла-
стов плаценты и др. Однако не следует думать, что
Fc-рецепторы всех этих клеток идентичны по своему
строению. Об этом свидетельствуют данные, приведенные
ниже в этом разделе.
В случае клеток лимфоидного ряда Fc-рецепторы на-
ходят главным образом на малых лимфоцитах В-ряда.
Лимфобласты того же ряда также несут Fc-рецепторы.
Зрелые плазматические клетки не связывают иммуногло-
булины через Fc-рецептор. Избирательность связывания
иммуноглобулинов Fc-рецепторамп отчетливо выражена,
и перекрестные реакции могут быть только между от-
дельными подклассами. Поскольку классо- (подклассо-)
специфические особенности строения иммуноглобулинов
определяются строением константных участков тяжелых
цепей, распознающие их Fc-рецепторы обозначают как
Fcv, Рсц, Fca, Fce.
Индивидуальный лимфоцит имеет Fc-рецепторы толь-
ко одного типа и, следовательно, способен связывать им-
муноглобулины только одного класса (подкласса). Анти-
тела в составе иммунного комплекса также связываются
Fc-рецепторами; они фиксируются значительно прочнее,
чем иммуноглубины в монодисперсной форме (A. Basten
et al., 1972, 1974).
Существует несколько, хорошо зарекомендовавших
себя методов выявления Fc-рецепторов. Антитела опре-
деленного класса можно использовать для сенсибилиза-
ции такого корпускулярного антигена, как ксеногенные
эритроциты. После смешивания избытка сенсибилизиро-
ванных антителами эритроцитов с лимфоцитами образу-
ются так называемые розетки: лимфоциты, окруженные
эритроцитами (рис. 50). Число лимфоцитов, образующих
розетки, соответствует числу лимфоцитов с Fc-рецепто-
рами к иммуноглобулинам того класса, которые исполь-
зовали для сенсибилизации эритроцитов. Если пометить
иммуноглобулины с помощью флуорохрома, то лимфоци-
ты с Fc-рецепторами можно увидеть по краевому свече-
203
нию с использованием люминесцентного микроскопа. При
использовании радиомеченых иммуноглобулинов для вы-
явления клеток с Fc-рецепторами используют технику
радиоавтографии.
Fc-рецепторы не взаимодействуют с Fab- и F(ab')2-
фрагментами и легкими цепями, но реагируют с изолиро-
ванными Fc-фрагментами, полученными с помощью па-
паина. Последние способны конкурировать с нерасщеп-
Рис. 50. Выявление
Рс7-рецепторов лим-
фоцитов (Л) с помо-
щью радиомеченого
агрегированного
IgG (/) или техники
розеткообразования с
использованием эри-
троцитов (Э), обра-
ботанных IgG-анти-
телами (//)
ленными иммуноглобулинами соответствующего класса
за Fc-рецептор.
Если на В-лимфоцитах обнаружены Fc-рецепторы к
иммуноглобулинам всех классов, за исключением IgD, на
Т-лимфоцитах человека найдены Fcv- и Есц-рецепторы.
Есц-рецепторы характерны для Т-хелперов, а Fcy-рецеп-
торы — для Т-супрессоров. Для Т-лимфоцитов мышей ха-
рактерны те же по специфичности Fc-рецепторы, что и
для В-лимфоцитов.
При иммунизации число лимфоцитов, несущих Fc-ре-
цепторы, возрастает. Так, при иммунизации мышей эри-
троцитами барана число лимфоцитов с Есг-рецепторами
возрастает в селезенке более чем в два раза. При зара-
жении крыс нематодами Nippostrongylus brasiliensis,
индуцирующими синтез антител IgE-класса, значительно
возрастает число лимфоцитов, несущих Рсе-рецептор
(Т. Honjo, 1982). В этой связи существенно, что в куль-
туре лимфоидных клеток in vitro иммуноглобулины оп-
ределенного класса, например IgE, IgA, индуцируют син-
тез лимфоцитами соответствующих Fc-рецепторов: Fce
или Fca (К. Yoboi et al., 1982; Y. Gebel, 1982). Очевидно,
сами иммуноглобулины служат индукторами для синте-
за Fc-рецепторов.
204
Изучение природы Fc-рецепторов сопряжено со значи-
тельными трудностями, обусловленными изоляцией этих
ассоциированных с мембраной клетки белков без их де-
градации. Наиболее перспективны методы аффинной
хроматографии, когда переведенные с помощью детерген-
та в раствор рецепторы связывают на иммобилизованных
агрегированных иммуноглобулинах. Несмотря на извест-
ную противоречивость полученных данных, большинство
исследователей сходятся на том, что Fc-рецепторы пред-
ставляют собой гликопротеины с молекулярной массой
около 50 000—60 000. Хотя в ряде случаев выделяли более
тяжелый материал, он представлял собой, видимо, диме-
ры или более интенсивно агрегированные рецепторы. Не
исключено, что Fc-рецептор состоит из нескольких иден-
тичных субъединиц, связанных дисульфидными мостика-
ми или нековалентно. Значительный интерес представля-
ют данные, что Fc-рецептор, по крайней мере для одного
из подклассов IgG мыши (IgG2b), ассоциирован с фер-
ментом — фосфолипазой Аг, причем активность послед-
ней существенно возрастает при взаимодействии Fc-ре-
цептора с иммуноглобулином (Т. Suzuki et al., 1982). Воз-
можно, такой комплекс, встроенный в мембрану клетки,
обеспечивает трансмембранную передачу сигнала после
связывания клеткой иммуноглобулинов через Fc-рецеп-
тор. В самом деле, расщепляя фосфоэфпрные связи, иг-
рающие крайне важную роль в организации цитоплаз-
матической мембраны, активированная через посредство
Fc-рецептора фосфолипаза способна обеспечить, в част-
ности, локальное впячивание мембраны.
Здесь мы переходим к проблеме функциональной ро-
ли Fc-рецепторов клеток иммунной системы. К настояще-
му времени только в одном случае доказана роль
Fc-рецептора лимфоцитов в иммунологических реакциях,
а именно, в зависимой от антител клеточной цитотоксич-
ности (см. гл. 6). Лимфоциты, участвующие в реакции,
имеют Fc-рецептор, но лишены ряда маркеров, характер-
ных для В-лимфоцитов. Их относят к «нулевым» клет-
кам, или К-клеткам (killer cells). Феномен, впервые про-
демонстрированный Г. Мёллером (G. МбПег, 1972),
состоит в цитотоксическом действии К-клеток на
клетки-мишени, сенсибилизированные IgG-антителами,
/(-клетки прикрепляются к клеткам-мишеням через
Fc-участок молекулы антитела. Реакцию блокируют
Fc-фрагменты. Описанный процесс может реализоваться
in vivo при аутоиммунных заболеваниях и опухолевом
205
росте. Он может иметь существенное значение при неко-
торых инфекционных заболеваниях, связанных с внутри-
клеточным паразитизмом бактерий, грибов, простейших,
когда некоторые антигены возбудителя экспрессированы
на поверхности зараженной клетки макроорганизма: на-
пример, пастереллезе, кандидозе, лейшманиозе.
Вопрос о роли Fc-рецепторов макрофагов и других
клеток в иммунологических реакциях рассматривался
в гл. 6. 3 .есь следует лишь сказать, что сравнительное
изучение строения рецепторов лимфоцитов и макрофагов
оказалось полезным инструментом для понимания орга-
низации их молекул. Из-за трудностей, связанных с на-
коплением достаточного количества материала для хи-
мического изучения особое значение при исследовании
структуры Fc-рецептора приобрел метод антигенного ана-
лиза. Приведем схематически результаты такого анализа,
выполненного И. Сычевой с соавторами (1982, 1983).
К изолированным аффинной хроматографией Fc-ре-
цепторам клеток селезенки мыши получали антитела на
кроликах. Эти антитела и их Fab- и F(ab')2-фрагменты
обладали способностью экранировать рецептор, препят-
ствуя взаимодействию с ним агрегированного IgG, ме-
ченного радиоактивным иодом. Fab-фрагменты анти-
FcR-антптел экранировали также Fc-рецепторы перито-
неальных макрофагов мыши. После адсорбции препарата
Fc-фрагментов с помощью макрофагов в препарате оста-
вались еще фрагменты антител против FcR-лимфоцптов
селезенки. Это позволяет заключить, что при иммуниза-
ции клетками селезенки образуются по крайней мере две
группы антител: одни против FcR-лимфоцптов, другие —
против FcR макрофагоподобных А-клеток. Так как после
адсорбции макрофагами экранирующее действие Fab-
фрагментов из aHTii-FcR-антител в отношении рецепторов
лимфоцитов уменьшалось, значит в каждом из изучаемых
Fc-рецепторов есть две группы антигенных детерминант.
Одна из них сходна или даже идентична у Fc-рецепторов
лимфоцитов и макрофагов. Вторая — специфична для
каждого вида рецепторов.
В развитие описанных исследований было сделано
важное наблюдение: антитела против Clq мыши реаги-
руют с Fc-рецептором лимфоцитов и макрофагов мыши,
и наоборот. При изучении реакции aHTii-FcR-антптел (а
точнее их Fab-фрагментов) с Clq было установлено, что
обработанный фрагментом Clq способен фиксироваться
комплексом антигена с IgG-антителами, но, будучи свя-
203
зан комплексом, не способен фиксировать Clr-Cls и обес-
печивать тем самым иммунный гемолиз. Как описано
в гл. 8, Clq связывается с IgG своими глобулярными об-
ластями (головками), а фиксация С1г и Cis происходит
коллагеноиодобной областью молекулы Clq (или стеб-
лем). Это послужило основанием для заключения, что
в молекуле Fc-рецептора, как и в молекуле Clq, сущест-
вует коллагеиоподобный участок. То, что часть антител
против Fc-рецептора и Clq реагирует перекрестно с кол-
лагеном (И. Сычева и др., 1983, 1984), служило еще
одним подтверждением указанного заключения. В его
пользу свидетельствуют также данные М. Лууза (М. Lo-
os, 1980) о подавлении синтеза Fc-рецепторов в при-
сутствии ингибиторов метаболизма оксипролпна, со-
держащегося, как известно, в коллагене. Наконец, на
это указывали данные аминокислотного анализа очищен-
ного Fc-рецептора одной из перевиваемых лимфоидных
линий, выявившего необычно высокое содержание в этом
белке пролина, глицина и лизина (Т. Suzuki, 1981).
В свете всех этих данных представляется, что молекула
Fc-рецептора состоит из двух частей, одна из которых
глобулярная, а другая — коллагеноподобная. Заманчиво
предположить, что коллагеноподобная часть сходна у
Fc-рецепторов, экспрессируемых различными клетками,
а глобулярная, посредством которой связывается Fc-уча-
сток иммуноглобулина, уникальна.
9.3.	СЗ-рецептор
На поверхности лимфоцитов, макрофа-
гов и некоторых других клеток (например, эритроцитов
и тромбоцитов некоторых биологических видов, клеток
паренхимы почек) находятся рецепторы для модифици-
рованного третьего компонента комплемента. Модифици-
рованными принято называть образующиеся при актива-
ции СЗ фрагменты: СЗЬ и C3d (см. гл. 8).
Выявление рецепторов для модифицированного СЗ
осуществляют с помощью техники розеткообразования,
напоминающей технику выявления Fc-рецепторов (см.
раздел 9.2). Используют эритроциты, сенсибилизирован-
ные субагглютинирующей дозой IgG-антител (рис. 51).
К ним прибавляют очищенные первый, четвертый, второй
и третий компоненты комплемента. Сенсибилизирован-
ные эритроциты инициируют активацию классического
пути связывания комплемента (см. гл. 8). Образуется
207
комплекс сенсибилизированных антител с активирован-
ными С1, С4, С2 и СЗ. К этому комплексу можно приба-
вить еще очищенные белки, участвующие в дальнейшем
расщеплении СЗЬ, а именно СЗЬ-инактиватор
(C3h.INA, или фактор /), а также piH. Посколь-
Рис. 51. Выявление рецепторов, к активированным компонентам
комплемента техникой розеткообразования. А— получение тест-ре-
агентов: эритроцитов с фиксированными на их поверхности различ-
ными комплексами активированных компонентов комплемента и ре-
гуляторных белков; Б — формирование комплекса лимфоцита, имею-
щего рецепторы для активированных компонентов комплемента с
эритроцитами, связавшими комплемент (С'):
Э — эритроцит, Л — лимфоцит
ку при участии двух последних компонентов и какой-либо
сериновой протеиназы (например, плазмина) идет рас-
пад СЗЬ до СЗс и C3d, последние, будучи связанными с
сенсибилизированными эритроцитами, образуют еще два
реагента для выявления СЗ-рецепторов. Добавляя ука-
занные комплексы к лимфоцитам или другим клеткам-
208
мишеням, можно получить розетки (разумеется, если на
клетке есть соответствующий рецептор).
Как следует из табл. 10, В-лимфоциты (человека)
имеют рецепторы для СЗЬ, C3bINa, C3d, pIH. Помимо
лимфоцитов подобными рецепторами обладают эритро-
циты и лейкоциты.
Таблица 10. Рецепторы для комплемента на клетках крови
человека
Клетки крови	Рецепторы для:			
	СЗЬ	C3bINA	C3d	щн
В-лимфоциты	 1  —-|—	+ +	—1	1-	-|	1—
Моноциты	+ +	-|—	J—	+ +
Нейтрофилы	“Ь “Ь	—1	1-	—	++
Эозинофилы	—1	1-	+ +	—	“1—р
Эритроциты	“1—р	—	—	—
Рецептор, связывающий СЗЬ, представляет собой гли-
копротеин, который удалось очистить из солюбилизиро-
ванных детергентом мембран эритроцитов, В-лимфоцитов
и моноцитов человека с помощью аффинной хроматогра-
фии и некоторых других методов (D. Fearon, 1980). Очи-
щенный белок обладает свойством ингибировать образо-
вание розеток между эритроцитами, покрытыми СЗЬ, и
различными клетками, несущими СЗЬ-рецептор, включая
В-лимфоциты. Изолированный рецептор утрачивает это
свойство после обработки нейраминидазой или перйода-
том, в то время как инкубация с трипсином или кратко-
срочное прогревание при 85° С не приводило к его инак-
тивации. Это свидетельствует об определяющей роли уг-
леводного компонента в связывании рецептором СЗЬ.
Более того, удалось установить, что реакцию между ре-
цептором и СЗЬ блокируют D-глюкоза, D-галактоза,
D-фукоза, L-фукоза и D-ксилоза. L-глюкоза, L-галактоза,
L-ксилоза и D-манноза не влияли на реакцию. Следова-
тельно, СЗЬ-рецептор принципиально отличается не толь-
ко от антигенсвязывающпх рецепторов лимфоцитов, но и
от Fc-рецептора, поскольку активность последнего опре-
деляется именно его белковой частью (Т. Suzuki, 1981).
Молекулярная масса СЗЬ-рецептора окончательно не
установлена. Полученные различными авторами величи-
ны колеблются от 55 0000 до 205 000. Поскольку очищен-
209
ный СЗЬ-рецептор лимфоцитов обладает молекулярной
массой 50 000, можно предположить, что эта величина со-
ответствует минимальной функциональной единице ре-
цептора для комплемента.
По-видимому, СЗЬ в форме димера или более круп-
ного агрегата способен активировать in vitro ряд биохи-
мических процессов в лимфоцитах, макрофагах и тучных
клетках. Он увеличивает включение 3Н тимидина в ДНК,
усиливает клеточное дыхание, способствует высвобожде-
нию ряда ферментов (р-галактозидазы, дезаминазы),
хемотаксических факторов (М. Dierich, 1983).
Интерес к функциональной роли СЗЬ-рецептора
В-лимфоцитов в иммунном ответе определяется тем, что
этот рецептор начинает экпрессироваться В-лимфоци-
тами мыши примерно к 14-му дню после рождения в пе-
риод функционального созревания В-клеток. Именно
в этот период под влиянием антигена В-лимфоциты спо-
собны превратиться в антителопродуцирующие клетки.
Посредством СЗЬ-рецептора на поверхности лимфо-
цита могут фиксироваться иммунные комплексы, связав-
шие комплемент. При этом существенное значение имеет
содержание комплемента в среде. В случае избытка ком-
племента при 37° С происходит быстрое высвобождение
с поверхности лимфоцитов иммунных комплексов, фикси-
рованных через СЗЬ (см. гл. 8). Только будущие исследо-
вания позволят достоверно оценить функциональную
роль различных по специфичности рецепторов для моди-
фицированного СЗ (см. рис. 51).
9.4.	Другие рецепторы
К настоящему времени получены убе-
дительные доказательства существования на В-лимфоцп-
тах рецептора для липополисахарида (ЛПС) из грамот-
рицательных бактерий. Связываясь с этим рецептором,
ЛПС в качестве поликлонального митогена активирует
В-лимфоциты.
В-лимфоциты активируются на поликлональной осно-
ве также а-1,3-декстраном и имеют, видимо, рецепторы
для этого полисахарида. Распознавание указанного вида
декстрана весьма специфично, так как а-1,6-декстран нс
активирует В-лимфоциты (A. Coutinho et al., 1980).
На лимфоцитах Т- и В-ряда находятся рецепторы для
некоторых белков растительного происхождения, облада-
210
ющих митогенным действием. К числу этих митогенов от-
носятся фитогсмагглютинин (ФГА), конканавалии А
(КонА) и многие другие белки. Помимо митотической
активности у этих белков выражено свойство агглютини-
ровать лимфоциты и некоторые другие клетки (прежде
всего эритроциты). Общее наименование этих соедине-
ний — лектины было предложено еще в 40-х годах В. Бой-
дом (W. Boyd). Клеточные рецепторы для лектинов со-
держат углеводный компонент, определяющий их специ-
фичность. Лектины способны взаимодействовать с разно-
образными гликопротеинами, в том числе с теми иммуно-
глобулинами, содержание углеводов в молекуле которых
достаточно велико. В частности, иммобилизованный на
сефарозе КонА связывает иммуноглобулины класса А.
Т- и В-лимфоциты различаются по набору рецепторов
для лектинов. Так, ФГА обладает митогенной активно-
стью только для Т-лимфоцитов, а КонА, действуя преиму-
щественно на Т-лимфоциты, способен активировать и
В-лимфоциты (J. Stobo, 1972).
Известно несколько сообщений о наличии на поверх-
ности лимфоцитов человека рецептора для Clq компонен-
та комплемента. Ксеногенные эритроциты, «нагружен-
ные» Clq, образуют розетки с лимфоцитами, находящи-
мися в циркуляции (A. Tenner, N. Cooper, 1980, 1981;
R. Gupta et al., 1978). Каких-либо достоверных сведений
о природе и функциональной роли рецепторов не полу-
чено.
Некоторые вирусы имеют высокое сродство к лимфо-
цитам. Так, вирус Эпштейн-Барр (EBV), вызывающий
инфекционный мононуклеоз, связывается всеми лимфоци-
тами из крови и миндалин человека, имеющими иммуно-
глобулиновые рецепторы и рецепторы для третьего ком-
понента комплемента. Практически все эти клетки при-
надлежат к В-лимфоцитам. Не исключено, что рецепто-
ром для этого вируса служит рецептор для СЗЬ. Действи-
тельно, моноклональные антитела к этому рецептору спо-
собны препятствовать фиксации EBV на лимфоцитах.
К числу вирусов, имеющих специфическое сродство к
Т-лимфоцитам, относятся вирусы кори и герпеса.
Г71АВА
Ю
Индукция и регуляция
иммунного ответа
Процессы, протекающие с момента по-
ступления антигена в организм до появления в перифери-
ческих лимфоидных органах антителопродуцирующих
клеток и антигенреактивных Т-лимфоцитов, относят к ин-
дуктивной фазе иммунного ответа. В этот период проис-
ходят протекающие с участием макрофагов (А-клеток)
превращения антигена в высокоиммуногенную форму, ак-
тивация Т-лимфоцитов, регулирующих иммунный ответ и,
наконец, антигензависимая дифференцировка предшест-
венников антителопродуцирующих клеток и эффекторных
Т-лимфоцитов.
10.1.	Процессинг антигена
Переработка антигена в макрофагах
(процессинг антигена) служит необходимым условием
для реализации тимусзависимого иммунного ответа —
как гуморального, так и клеточно-опосредованного. Роль
макрофагов в антигенспецифпческой активации Т-лимфо-
цитов убедительно демонстрируют опыты in vitro. Для
этого используют взвесь клеток селезенки или лимфати-
ческого узла, из которой удалены А-клетки, что легко осу-
ществить благодаря способности этих клеток прикреп-
ляться к поверхности стекла пли пластика при 37° С.
Лимфоидные клетки остаются при этом во взвеси. Если
к лимфоидным клеткам, свободным от А-клеток, доба-
вить антиген и культивировать их в полноценной пита-
тельной среде, ни цитологическими методами, ни по
включению 3Н-тимидпна в ДНК не удается зарегистриро-
вать пролиферации Т-лимфоцитов. Она наступает только
после добавления сингенных А-клеток. При этом А-клет-
ки (или макрофаги) не удается заменить интенсивно
фагоцитирующими сегментоядерными лейкоцитами
(нейтрофилами) и, например, хороню прикрепляющими-
ся к стеклу или пластику фибробластами.
212
Процесс захвата и переработки растворимого антиге-
на макрофагами протекает в две стадии. Первая — мо-
жет протекать при температуре ниже 37° С и не требует
энергетических затрат. Этот процесс состоит в неспеци-
фической адсорбции молекул антигена на цитоплазмати-
ческой мембране. Вслед за этой фазой наступает вто-
рая— зависимая от температуры. Если на этой стадии
макрофаги поместить в среду без глюкозы, содержащую
2-дезоксиглюкозу и азид натрия (вещества, блокирующие
анаэробное и аэробное дыхание соответственно), процес-
синг антигена не произойдет, и макрофаги окажутся не-
способными активировать Т-лимфоциты. В свою очередь,
если после адсорбции антигена на поверхности макрофа-
гов при 4° С проинкубировать клетки с трипсином, про-
изойдет десорбция антигена, однако макрофаги сохранят
способность связать новую порцию антигена. Но если об-
работку трипсином произвести после адсорбции антигена
при 4° С и последующей инкубации клеток при 37° С, то
удалить антиген с клеточной поверхности не удастся.
Антиген находится в такой форме, что нечувствителен к
действию протеиназы и не может быть экранирован ан-
тителами к нему для рецепторов Т-лимфоцитов (A. Ro-
senthal, 1978). Все это указывает на несомненные кон-
формационные превращения антигена в ходе температу-
розависимой фазы процессинга.
Описанные выше эксперименты выполняли с исполь-
зованием в качестве антигенов глобулярных белков. Ан-
тигенные детерминанты последних, распознаваемые ан-
тителами и иммуноглобулиновыми рецепторами В-лим-
фоцитов, практически целиком относятся к числу кон-
формационнозависимых (см. гл. 2). Закономерно предпо-
ложить, что в ходе процессинга антигена в макрофагах
конформационнозависимые детерминанты разрушаются.
Сохраняются лишь детерминанты, распознаваемые Т-хел-
перами, структура которых мало зависит от пространст-
венной конформации нативного белка (см. гл. 2).
Достоверно установлено, что макрофаги, проинкуби-
рованные прп 37° С с антигеном, способны присоединять
к себе лимфоциты, образуя in vitro клеточные скопле-
ния— кластеры. В том случае, когда с макрофагами, об-
работанными данным антигеном, взаимодействуют лим-
фоциты, полученные от животного, иммунизированного
тем же антигеном, клетки образуют устойчивый кластер,
не разрушающийся в течение 24—72 ч. Оба типа клеток
должны также иметь родство по 1-району основного ком-
213
плекса гистосовместимости. Кластеры не разрушаются
под действием трипсина. Лимфоциты, входящие в состав
кластера, принадлежат к Т-клеткам, в составе кластера
они начинают пролиферировать.
В зависимости от природы антигена для пролифера-
ции Т-лимфоцитов в кластерах необходимо совпадение
макрофагов и лимфоцитов либо по одному (I-A), либо по
Рис. 52. Процессинг антигена в макрофагах. А— молекула ан-
тигена в фаголизосоме после захвата макрофагом; Б — слия-
ние лизосомы, содержащей фрагменты молекулы антигена, с
цитоплазматической мембраной макрофага:
1а — белок, Д1 и Д2 — фрагменты молекулы антигена с разными де-
терминантами
двум (I-A и I-C) субрайонам 1-района основного ком-
плекса гистосовместимости (рис. 52). Например, в случае
такого антигена, как миоглобин, пролиферативный ответ
Т-лимфоцитов требует совпадения макрофагов и лимфо-
цитов по двум субрайонам, если идет речь об ответе на
два антигенных фрагмента: с l-ro по 32-й остатки и с l-ro
по 53-й остатки. При совпадении только по одному суб-
району удается получить пролиферативный ответ Т-лим-
фоцитов только на процессированный макрофагами фраг-
мент с 1-го по 55-й аминокислотные остатки.
Как уже указывалось в гл. 2, Ir-гены контролируют
ответ на тимусзависимые антигены, поскольку генетиче-
ски детерминированные различия иммунного ответа оп-
ределяются строением участка молекулы антигена, яв-
ляющегося носителем детерминантных групп (в случае
конъюгированных антигенов). Эти детерминанты распо-
знают Т-хелперы, но прежде они должны быть представ-
лены (презентированы) макрофагами. Значит, функция
генов иммунного ответа (Ir-генов) реализуется скорее
всего на уровне макрофагов, представляющих антиген
Т-клеткам. В этой связи большой интерес представляют
следующие опыты.
214
Изучали способность макрофагов морских свинок ли-
ний 2 и 13 и их Fi-гибридов процессировать инсулин
свиньи и активировать затем Т-хелперы. В случае макро-
фагов линии 13 активация Т-хелперов, необходимая для
продукции антител против инсулина или на присоединен-
ные к его молекуле дпнитрофенильные группы, зависит
от строения аминоконцевого пептида [3-цепи (пепти i
включает 16 аминокислотных остатков). Макрофаги ли-
нии 2 не способны представлять указанный фрагмент ин-
сулина лимфоидным клеткам. В этой связи существенно,
что пептид с 1-го по 16-й остатки р-цепн и даже с 5-го по
16-й — определяет специфическую пролиферацию Т-хел-
перов в той же мере, как и вся молекула инсулина. Сле-
довательно, в пределах пептида, ограниченного 5-м —
16-м остатками [3-цепи инсулина, находится та детерми-
нанта этого антигена, которая после презентированпя пеп-
тида макрофагами распознается Т-хелперами. При этом,
по видимому, только одна аминокислота в позиции 10 (ги-
стидин) является критической для определения ответа
Т-хелперов. С учетом сказанного выше и данных, изло-
женных в гл. 2, можно заключить, что Т-хелперы рас-
познают очень маленькие фрагменты антигена, простран-
ственную структуру которых трудно оценить. Число де-
терминант для Т-хелперов в молекуле белкового антигена
существенно меньше числа детерминант, распознаваемых
иммуноглобулиновыми рецепторами В-лимфоцитов, от-
вечающих на тот же антиген. Крайне существенно, что в
пределах структуры, распознаваемой Т-хелперами,
отсутствуют во многих случаях детерминанты для
для антител и рецепторов В-лимфоцитов. Это слу-
жит объяснением того факта, что антитела против дан-
ного антигена не способны экранировать детерминанты
процессированного макрофагами антигена, который рас-
познают Т-хелперы.
Чем же определяется генетический контроль иммун-
ного ответа на уровне представляющих антиген макрофа-
гов? Как вытекает из данных генетического анализа,
роль 1г-генов сводится к контролю синтеза 1а-белков
(продуктов генов 1-района основного комплекса гистосо-
вместимости), которые в мембране макрофага вступают
в ассоциацию с фрагментами молекулы процессирован-
ного антигена.
Ia-белки представляют собой неоднородную группу
гликопротеинов, являющихся интегральными компонен-
тами цитоплазматической мембраны макрофага, В-лим-
215
фоцита, активированного Т-лимфоцита. Молекула обра-
зована двумя полипептидными цепями с молекулярными
массами 33 000 и 28 000, обозначаемыми как а- и р-цепи;
p-цепь (в большей степени неоднородная) кодируется
структурным геном, локализованным в 1-А-субрайоне
(p-ген), а-цепь — в зависимости от строения в I-A- или
1-С-субрайонах (ц-ген).
В чем состоит генетическая рестрикция (от англ,
restriction — ограничение) иммунного ответа на уровне
макрофагов, представляющих антиген? В том, что обра-
зующиеся фрагменты молекулы антигена объединяются
на поверхности макрофага с соответствующими 1а-бел-
ками. Гипотетический механизм процесса изображен на
рис. 52. Возникающую структуру распознают Т-лимфоци-
ты. Их рецепторы связывают не только антиген, но и
аутологичный la-белок. Действительно, если после про-
цессинга антигена обработать макрофаги антителами
против 1а-белка, такие клетки не способны активировать
Т-лимфоциты.
Из рис. 52 следует, что на поверхности одного макро-
фага формируются комплексы la-белков с разными фраг-
ментами молекулы антигена. Макрофаг способен пред-
ставлять несколько различных антигенов или несколько
различных фрагментов одного антигена. В силу того, что
ответ на отдельные детерминанты даже одного антиге-
на контролируется разными 1г-генами, различные анти-
генные детерминанты должны быть представлены в ком-
плексе с разными 1а-белками (продуктами 1г-генов).
А из этого, в свою очередь, следует, что один и тот же
макрофаг способен экспрессировать продукты различных
Ir-генов, т. е. различные по строению 1а-белки.
Соответствующие la-белки образуют комплексы с
разными фрагментами молекулы антигена (или разными
антигенами). Но в таком случае необходимо постулиро-
вать, что взаимодействие la-белков с разными фрагмен-
тами антигена носит специфический характер, т. е. между
ними должна существовать определенная комплемен-
тарность (см. рис. 52). Вариабельность первичной струк-
туры p-цепи 1а-белка, как и в случае иммуноглобулинов,
допускает существование значительного числа компле-
ментарных структур, образуемых la-белком (Н. Me De-
vitt, 1981).
Обсуждавшиеся выше проблемы являются одной из
наиболее «горячих точек» современной иммунологии. Зна-
комя читателя с рядом фактов и гипотез, мы, в частности,
216
ставим перед собой цель побудить интерес к ознакомле-
нию с текущей научной литературой в этой захватываю-
щей воображение области молекулярной иммунологии.
10.2.	Функция Т-хелперов
Макрофаги, несущие антиген, и находя-
щиеся с ними в кластере Т-лимфоциты продуцируют гу-
моральные медиаторы, управляющие пролиферацией
лимфоидных клеток. Один из таких факторов — интер-
лейкин 1 (IL1) — белок с молекулярной массой около
15000—25 000, продуцируемый в небольших количествах
покоящимися макрофагами. Его продукция резко возрас-
тает, если макрофаги стимулированы. Стимулирующий
эффект оказывает как собственно антиген, так и Т-лим-
фоциты, взаимодействующие с макрофагом на специфи-
ческой основе. Интерлейкин 1 способствует пролифера-
тивному ответу Т-клеток на антиген. В свою очередь, ин-
терлейкин 1 индуцирует в Т-клстках фенотипа Ly 1+2~3_
продукцию другого медиатора — интерлейкина 2 (IL2),
который поддерживает уже начавшуюся пролиферацию
Т-клеток под действием антигена (или митогена). Клет-
ки указанного выше фенотипа, продуцирующие интер-
лейкин 2, относятся к Т-хелперам.
Значительный интерес представляет тот факт, что
активированные антигеном или митогеном Т-клетки об-
разуют рецепторы для интерлейкинов обоих типов. По-
этом у действие антигена подготавливает клетку к дей-
ствию интерлейкинов, которые уже поддерживают начав-
шийся процесс активации (S. Howie, W. Me Bride, 1982).
Активированные Т-хелперы способны продуцировать
антигенспецифический Т-хелперный фактор (TFh), кото-
рый способен заменить Т-хелперы в культуре клеток in
vitro и обеспечить в присутствии антигена активацию
В-лимфоцитов. Указанный фактор не содержит структур,
соответствующих константному участку тяжелой цепи
иммуноглобулина, но он имеет идиотипические детерми-
нанты, совпадающие по структуре с такими же детерми-
нантами антител и иммуноглобулиновых рецепторов, и
реагирует с антителами против 1а-белка. Поэтому можно
предположить присутствие в его структуре вариабельного
участка тяжелой цепи и 1а-белка. Видимо, описываемый
фактор концентрируется на поверхности В-лимфоцита с
помощью антигена.
217
Помимо TFh на В-лимфоциты действует продуцируе-
мый Т-клетками (очевидно, хелперами) так называемый
замещающий Т-клетки фактор (T-cell replacing fac-
tor-TRF). Фактор представляет собой белок с молеку-
лярной массой 40000, который вовлечен в процесс анти-
гензавпсимой дифференцировки В-лимфоцитов в анти-
телопродуцирующие клетки. TRF — антигенпеспецифичен
и может продуцироваться другими Т-клетками, нежели
те, которые продуцируют специфический Т-хелперный
фактор. Не исключено, что участие интерлейкинов в ре-
гуляции активности В-лимфоцитов осуществляется при
участии у-пнтерферона, синтез которого Т-хелперами сти-
мулируют IL-2.
Перечисленные факторы, в изучение которых наи-
больший вклад внесли М. Тауссиг с соавторами
(М. Taussig et al., 1978), А. Шимпль, Е. Веккер, Р. Гер-
шон и др. (A. Schimpl, Е. Wecker, 1975; R. Gershon,
С. Metzler, 1978), С. Мизель (S. Mizel, 1981, 1983), Дж.
Уотсон (J. Watson, 1981, 1983), не единственные медиа-
торы кооперативного взаимодействия Т- и В-лимфоцитов,
описанные за весь период изучения проблемы. Исследо-
вания в этом направлении являются одной из «горячих
точек». Полученные результаты открывают новые воз-
можности для регуляции иммунологических реакций в
норме и патологии. Этому будет несомненно способство-
вать получение на основе методов генной инженерии ин-
терлейкинов и интерферонов. Практические шаги в этом
направлении уже сделаны.
Достаточно ли участие гуморальных факторов (спе-
цифических и неспецифических) и антигена, чтобы обес-
печить превращение В-лимфоцитов в антителопродуци-
рующие клетки? По-видимому, нет. Существуют данные,
что В-лимфоциты можно разделить на две субпопуляции,
одна из которых обязательно требует прямого взаимодей-
ствия с Т-хелперамп, чтобы превратиться в антнтелопро-
дуценты, а другая — нет. Эти свойства коррелируют с
экспрессией мембранного антигена, обозначенного как
Lyb 5. Не имеющие его Lyb 5- В-клетки нуждаются в
прямом взаимодействии, в то время как Lyb 5+ В-клетки
могут обходиться без него (J. Asano, 1981). В чем сущ-
ность этих различий, пока не ясно. Но даже в том случае,
когда прямой контакт не требуется, для реализации дей-
ствия антигенспецифического Т-хелперного фактора нуж-
ны макрофаги.
218
10.3.	Клеточно-опосредованная
супрессия
Одновременно с активацией Т-хелперов
антиген вызывает накопление и активацию другого клас-
са регуляторных лимфоцитов — супрессоров. Подавляю-
щая часть клеток-супрессоров принадлежит к Т-лимфо-
цитам. О них в основном пойдет речь в этом разделе.
В конце его мы кратко остановимся на проблеме В-су-
прессоров.
Супрессия, осуществляемая Т-клетками, может быть
специфической (только ответ на данный антиген) и не-
специфической; т. е., подобно Т-хелперам, Т-супрессоры
могут осуществлять антигензависимую и антигеннезави-
симую регуляцию иммунного ответа.
Наиболее общие отличительные особенности Т-су-
прессоров и Т-хелперов состоят в следующем. Супрессоры
удается обнаружить через короткий срок (48 ч) после
иммунизации, причем первоначально в тимусе, а затем в
селезенке. Хелперы первоначально выявляются в лимфо-
узлах и селезенке иммунизированного животного. Супрес-
соры существенно более чувствительны к радиационному
облучению и действию таких цитостатиков, как циклофос-
фан. Супрессоры и хелперы отличаются по антигенным
маркерам. Хелперы принадлежат к фенотипу Ly 1+2~3_,
супрессоры — к Ly 1_2+3+. Хелперы и супрессоры отли-
чаются по строению антпгенсвязывающих рецепторов и
продуцируемых ими внеклеточных регуляторных факто-
ров.
Появление первоначально в тимусе специфических
Т-супрессоров служит одним из признаков того, что ак-
тивация Т-супрессоров антигеном в отличие от Т-хелпе-
ров происходит, по-видимому, без участия макрофагов.
Об этом также свидетельствует тот факт, что белковые
антигены, не содержащие агрегатов и по этой причине
неэффективно захватываемые макрофагами (см. также
гл. 11), обусловливают появление Т-супрессоров. Види-
мо, антиген в свободном виде непосредственно стимули-
рует предшественники Т-супрессоров — Т-лимфоциты фе-
нотипа Ly 1+2+3+.
Способность Т-супрессоров распознавать антиген и
взаимодействовать с ним определяется наличием на по-
верхности этих клеток антпгенсвязывающих рецепторов
(данные о строении этих рецепторов обсуждались в гл. 9).
Напомним лишь, что есть ряд признаков того, что тяже-
219
лая цепь рецептора Т-супрессоров кодируется Vn-геном
(возможно, с участием D- и J-сегментов) и еще одним ге-
ном, не имеющим родства с Сц-генами. Тандем генов,
кодирующих такую поллпептидную цепь, может возник-
нуть в результате транслокации Ун-гена в другой локус
хромосомы, чем тот, где находятся Сн-гены, или в ре-
зультате переноса сегмента ДНК, содержащего Уц-ген,
в другую хромосому (что допустимо с генетических пози-
ций). Предположение о том, что V-гены могут экспресси-
роваться не только в иммуноглобулинах, но и белках не-
иммуноглобулиновой природы (нашедшее теперь под-
тверждение при изучении рецепторов для антигена на
Т-лимфоцитах), было высказано А. Кульбергом в 1975 г.
Специфическая супрессия иммунного ответа реализу-
ется лишь в случае совпадения Т-супрессора и В-клетки
по I-рапону генов основного комплекса гистосовмести-
мости. Однако в отличие от В-лимфоцитов и Т-хелперов,
экспрессирующих на своей поверхности белки, кодируе-
мые I-A-субрайоном, Т-супрессоры экспрессируют детер-
минанты, кодируемые I-J-субрайоном. Эти белки, по-ви-
димому, ассоциированы на молекулярной основе с анти-
генраспознающим белком, о чем свидетельствуют данные
о строении продуцируемого Т-супрессорами фактора
(факторов), обозначаемого как TsF (см. гл. 9).
Тонкий механизм специфической супрессии иммунно-
го ответа изучен пока недостаточно. По крайней мере,
одной из клеток-мишеней для Т-супрессоров (продуци-
руемых ими супрессорных факторов) служат Т-хелперы.
Значительный вклад в изучение внеклеточных факто-
ров, продуцируемых Т-супрессорами, внесли М. Тауссиг
(М. Taussig, 1975), Т. Тада с сотрудниками (Т. Tada et
al., 1979, 1980) и др. Приведем одно из интересных с им-
мунохимической точки зрения исследований Т-супрессор-
ного фактора (L. Adorini, G. Doria, Р. Riccardi-Gasta-
gnoli, 1982). Изучавшийся фактор подавлял у мышей от-
вет против лизоцима куриного яйца. Подавление было
строго специфичным (фактор, в частности, не оказывал
влияния на ответ против тринитрофенилированного лизо-
цима). Фактор супресснровал ответ не против всей мо-
лекулы лизоцима, а только против детерминант, локали-
зованных в N-концевой и С-концевой частях молекулы.
Причем в отношении этих детерминант супрессия осуще-
ствлялась только при совпадении Т-супрессоров с други-
ми клетками, участвовавшими в иммунном ответе по
1-району генов основного комплекса гистосовместимости.
220
Продуцируемые Т-супрессорами факторы неоднород-
ны и по структуре, и по функции. Так, очищенные с по-
мощью иммуносорбции факторы, взаимодействующие с
азофениларсаниловой кислотой и подавляющие иммун-
ный ответ на эту детерминанту, можно разделить на два
основных типа. Один из них рестриктирован в отношении
генов основного комплекса гистосовместимости (активен
при совпадении клеток по 1-району), другой действует в
обход барьера гистосовместимости. Наконец, есть супрес-
сорный фактор, который распознает не антигенную детер-
минанту, а идиотипическую детерминанту антигенсвязы-
вающпх рецепторов В-клеток (возможно, и Т-хелперов).
Опосредованная Т-клетками супрессия иммунного
ответа может быть и неспецифической по отношению к
антигену. Отвечающие за неспецифпческую супрессию
клетки появляются в селезенке вскоре после антигенной
стимуляции и обладают свойством подавлять иммунный
ответ в опытах in vitro или in vivo на антигены, не имею-
щие родства с тем, который послужил индуктором су-
прессоров. Неспецифической Т-супрессии приписывают с
достаточным основанием реализацию механизма подавле-
ния иммунного ответа на один антиген с помощью дру-
гого, не родственного первому антигену (R. Gershon,
1978; М. Taussig, 1978). Указанный феномен, получивший
название феномена конкуренции неродственных антиге-
нов, имеет не только теоретическое, но и несомненное
практическое значение, так как благодаря ему при вак-
цинации многокомпонентными антигенами, входящими в
состав вакцинных препаратов, одни антигенные компо-
ненты вакцины могут препятствовать продукции антител
на другие.
10.4.	Супрессия антителами
После появления в ходе иммунного от-
вета антител последние сами по себе или в комплексе с
антигеном начинают оказывать супрессирующее воздей-
ствие на биосинтез антител. Этот феномен можно про-
демонстрировать в модельных экспериментах, либо им-
мунизируя животных комплексами антиген-антитело,
либо сочетая процедуру иммунизации с введением
антител.
При иммунизации иммунными комплексами, приго-
товленными в избытке антитела, интенсивность иммун-
ного ответа оказывается заметно меньшей, нежели при
221
введении только антигена пли комплексов антиген-анти-
тело, содержащих молярный избыток антигена. Казалось
бы, объяснение этому очень простое — антитела просто
экранируют антигенные детерминанты, которые должны
быть распознаны иммунокомпетентными лимфоцитами.
Однако анализ феномена показывает, что супрессия на-
блюдается и в том случае, когда в иммунном комплексе
экранированы не все детермпнантные группы антигена.
Более того, эффективность ингибирующего действия ан-
тител даже снижается, когда все или почти все детерми-
нантные группы антигена экранированы (J. Uhr,
G. Moller, 1968). Кроме того, иммуносупрессия наблюда-
ется в том случае, когда для образования иммунного
комплекса используют не целую молекулу IgG-антитела,
а бивалентные Р(аЬ,)2-фрагмснты, хотя последние
формируют преципитат и агглютинируют корпускуляр-
ные антигены (бивалентные фрагменты в 100—1000 раз
менее эффективны в подавлении иммунного ответа, неже-
ли нерасщепленные антитела, если из тех и других приго-
товить иммунные комплексы) (N. Sinclair, 1969).
IgG-антитела способны специфически подавить им-
мунный ответ, если они введены за 24—48 ч до антигена.
Эффект наиболее выражен при первичном иммунном от-
вете на самые разнообразные по природе антигены: как
корпускулярные, так и растворимые. Торможение выра-
жается в полном отсутствии у иммунизированных живот-
ных IgM- и IgG-антител или значительном снижении их
содержания. В лимфоидных органах резко снижено чис-
ло антителопродуцирующих клеток. Оба эти факта ука-
зывают на то, что иммуносупрессия обусловлена в зия-
нием введенных антител на процесс антигензависимсй
пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов.
Специфичность иммуносупрессивного действия анти-
тел не очень велика. Так, например, при подавлении им-
мунного ответа на конъюгированный антиген монокло-
нальными антителами против гаптена они способны так-
же частично подавить продукцию антител против белка-
носителя (М. Briiggemann, К. Rajewsky, 1982). Другие
факты свидетельствуют о том, что IgG-антитела подавля-
ют иммунный ответ как в отношении экранированных,
так и оставшихся свободными антигенных детерминант.
Если допустить, что эти детерминанты доступны для ан-
тител в той же мере, что и для иммуноглобулиновых ре-
цепторов В-лимфоцитов, необходимо заключить, что
подавление иммунного ответа антителами происходит нс-
222
смотря на то, что антиген может быть распознан предше-
ственниками антителопродуцирующих клеток и (или) ре-
гуляторными Т-лимфоцитами.
Прямое экранирование антителами детерминантных
групп антигена, вероятно, не служит единственным
фактором, определяющим их участие в регуляции био-
синтеза антител. Это вытекает из данных сравнительного
изучения иммуносупрессивного действия IgG-антител и
их F(ab')2-фрагментов. Если бы иммуносупрессивное
действие антител сводилось к экранированию детерми-
нантных групп антигена и агрегации последнего бива-
лентными антителами, то F(ab')2-фрагменты антител не
отличались бы от нерасщепленных антител по способно-
сти подавлять иммунный ответ. Однако при использова-
нии препаратов фрагментов, тщательно очищенных от не-
расщепленных антител, оказалось, что они почти в
1000 раз менее активны, чем нерасщепленные IgG-антите-
ла. Причина этого не в быстрой элиминации F(ab')2-
фрагментов из организма (см. гл. 7). Сравнительное изу-
чение влияния IgG-антител и их F(ab')2-фрагментов на
синтез антител в культуре клеток селезенки также пока-
зало, что фрагменты характеризуются крайне низкой ак-
тивностью (R. Lees, N. Sinclair, 1973).
Переходя к рассмотрению молекулярных и клеточных
механизмов регуляторного действия антител в иммунном
ответе, необходимо в первую очередь подчеркнуть, что
иммуносупрессивное действие антител не связано с необ-
ратимым блокированием предшественников антителопро-
дуцирующих клеток. Обработанные антителами клетки
селезенки неиммунизированной мыши способны эффек-
тивно отвечать на антиген в организме облученного син-
генного реципиента (J. Haughton, R. Nash, 1969; A. The-
ophilopulos, F. Dixon, 1979). Предварительная обработка
антителами клеток селезенки, освобожденных от А-кле-
ток, не оказывает влияния на способность лимфоцитов
отвечать в присутствии макрофагов на антиген продук-
цией антител in vitro (С. Pierce 1969; G. Haughton,
J. Adams, 1970).
Таким образом, антитела -не препятствуют реакции
на антиген В-лимфоцитов и, как следует из многих дан-
ных, Т-хелперов. Вместе с тем ряд фактов свидетельст-
вует о том, что точкой приложения действия антител мо-
гут служить клетки макрофагального ряда. Установлено,
что перитонеальные клетки от нормальных мышей и мы-
шей, получивших инъекцию IgG-антител против эрптро-
223
цитов барана, не отличаются по своей способности за-
хватывать эритроциты. I1о если проинкубированные с
антигеном макрофаги интактных доноров индуцируют
у сингенных интактных доноров продукцию антител, ана-
логично обработанные антигеном макрофаги от доноров,
получивших антитела, не вызывают иммунного ответа
(R. Ryder, R. Schwarts, 1969; G. Haughton, J. Adams,
1970). Только макрофаги (но не лимфоидные клетки)
после обработки их антителами теряют способность под-
держивать иммунный ответ в культуре клеток селезенки
(С. Pierce, 1969). Существенно, что подавление иммун-
ного ответа, вызванное IgG-антителами, удается отме-
нить в результате введения сингенных (но не аллоген-
ных) макрофагов от предварительно иммунизированных
доноров.
Одно из предположений состоит в том, что антитела
влияют на процесс презентации антигена А-клетками
(макрофагами). Что произойдет, если проинкубировать
с антителами макрофаги, уже процессировавшие антиген?
Через Fc-рецептор антитела могут присоединиться к по-
верхности макрофага. Одновременно своими активными
центрами они способны связаться с доступными для них
детерминантами процессированного антигена. Следстви-
ем этого будет впячивание участка поверхности макрофа-
га и превращение его в фаголпзосому, как это произошло
бы в случае фагоцитоза опсонизнрованых антителами
антигенов (см. гл. 6).
Ряд фактов, полученных в последнее время, свиде-
тельствует в пользу другого механизма подавления им-
мунного ответа антителами. Антитела в комплексе с ан-
тигеном способны индуцировать синтез антиидиотипиче-
скнх антител, а также вызывать появление Т-супрессо-
ров, специфичных к тем же идиотипическим детерминан-
там (М. Caulfield et al., 1983). Особенно эффективным
индуктором в обоих случаях могут быть макрофаги,
несущие на своей поверхности комплекс антиген-антитело.
Антиидиотипические антитела и продуцируемый указан-
ными Т-супрессорами идиотипспецифический Т-супрессор-
ный фактор реагируют с идиотипическими детерминанта-
ми рецепторов В-лимфоцитов, ответственных за продук-
цию антител данной специфичности и инактивируют их.
Все сказанное выше приобретает особое значение в
свете фактов, свидетельствующих, что в физиологических
условиях антитела действительно оказывают специфиче-
ское угнетающее воздействие на продукцию антитет той
224
же специфичности. Один из убедительных экспериментов
выполнен М. Графом и Дж. Уром (М. Graf, J. Uhr, 1969).
Кроликов иммунизировали внутривенно бычьим сыворо-
точным альбумином и бактериофагом. Через 2—3 неде-
ли у животных брали кровь, форменные элементы крови
отделяли, а плазму пропускали через колонку с иммуно-
сорбентом, представля-
ющим фиксированный
на нерастворимой осно-
ве бычий альбумин.
После удаления из
плазмы антител к аль-
бумину ее смешивали с
форменными элемента-
ми крови и вновь вводи-
ли кролику. Указанную
процедуру повторяли
4—6 раз с интервалом
в 1 ч. Таким способом у
подопытного кролика
удаляли до 80% анти-
тел к альбумину, не из-
меняя сколько-нибудь
содержание антител
против бактериофага.
Через 1—2 дня содер-
жание антител к бычье-
время} сутки
Рис. 53. Синтез антител к бычьему
сывороточному альбумину (/) и бак-
териофагу (2) у кролика до и после
избирательного удаления из его сы-
воротки антител к бычьему сыворо-
точному альбумину (момент извлече-
ния антител указан стрелкой)
му альбумину начина-
ло возрастать, достигая максимума к 5-му дню после кро-
вопускания (рис. 53). Уровень антител против бак-
териофага не изменялся. Тщательно выполненные экс-
перименты и контрольные опыты показали, что наблю-
даемое увеличение синтеза антител обусловлено лишь
удалением антител из циркуляции.
Возможность специфического подавления продукции
антител за счет введения антител той же специфичности
уже нашла практическое применение для предотвраще-
ния гемолитической болезни новорожденных, вызванной
несовместимостью матери и плода по D-антигену Rh-си-
стемы. В случае резус-положительного плода у резус-от-
рпцательной матери при первой беременности образуют-
ся крайне низкие уровни антирезусных антител, но в
момент родов при возникновении ретроплацентарных кро-
воизлияний за счет вторичного ответа содержание анти-
резусных антител резко возрастает. В случае повторной
8—1258
225
беременности эти антитела проникают через плаценту,
что приводит к возникновению гемолитической болезни
у новорожденных. За счет введения матери антирезусных
антител сразу после родов удается подавить образование
у нее собственных антител против Rh (D)-антигена. Анти-
резусные антитела получают от резус-отрицательных
мужчин — добровольцев, иммунизированных резус-поло-
жительными эритроцитами.
10.5.	Усиление биосинтеза антител
Усиление антителами. Индуцированный
антигеном биосинтез антител начинается, как правило,
с синтеза IgM-антител. Это характерно и для тимусне-
зависимого, и для тимусзависпмого иммунного ответа.
В отличие от IgG-антител IgM-антитела имеют более
низкое сродство к антигену, не обладают цитофильными
свойствами, а в силу большой молекулярной массы и
стоксовского радиуса молекулы не проникают так быст-
ро, как IgG, в экстраваскулярное пространство. По этим
причинам защитное действие IgM-антител менее выра-
жено, чем у IgG-антител и ускоренный переход на синтез
именно IgG-антител биологически оправдан, в связи с
чем представляется закономерным, что IgM-антитела не
подавляют, а усиливают иммунный ответ. Этот феномен
впервые убедительно продемонстоирсвали К. Генри и
Н. Ерне (С. Henry, N. Jerne, 1968), изучавшие влияние
IgM-антител на пролиферацию антителопродуцпрующих
клеток против эритроцитов барана. Механизм этого
явления изучен недостаточно, но его специфичность не
вызывает сомнения. Возможно, эффект IgM-антител свя-
зан с их способностью как поливалентного антитела эф-
фективно концентрировать антиген и тем самым способ-
ствовать его процессированию в макрофагах.
IgA-антитела также способны усиливать иммунный
ответ (С. Stokes et al., 1981). Этими свойствами облада-
ет, по-видимому, не только циркулирующий IgA, но и
секреторный IgA, присутствующий в молозиве. А это оз-
начает, что поступающие сразу после рождения вместе с
молозивом IgA-антитела обеспечивают не только пассив-
ную защиту, но п в качестве иммуностимулятора повы-
шают иммунореактивность новорожденных млекопитаю-
щих.
IgA-антитела присутствуют в циркуляции не только в
мономерной, но и в полимерной форме (см. гл. 3). По-
226
этому антитела этого класса способны, как и IgM, кон-
центрировать антиген. Как для IgA, так и для IgM на
поверхности макрофагов нет Fc-рецепторов. Все сказан-
ное позволяет предположить, что механизм усиления им-
мунного ответа с помощью IgA- и IgM-антител одина-
ков.
Адъюванты. Вещества, нсспецифически усиливаю-
щие иммунный ответ, получили название адъювантов.
К их числу относятся соединения, концентрирующие
антиген на месте введения и обеспечивающие тем самым
его более интенсивный захват макрофагами. Этим свой-
ством обладает сорбирующая белки А1(ОН)3 или раз-
личные масла, образующие с водным раствором белко-
вого или другого антигена устойчивые эмульсии. В экс-
перименте для усиления иммунного ответа (прежде все-
го гуморального) используют некоторые виды бактерий.
В их числе аттенуированный (ослабленный) бычий
штамм туберкулезной палочки (Mycobacterium tuberculo-
sis), называемый также бацилла Кальметт-Герена (Ва-
cilus Calmette-Guerin), или БЦЖ (BCG), коклюшная па-
лочка (Bordetella pertussis), ЛПС грамотрицательных
бактерий и ряд других. Адъюватными свойствами обла-
дают некоторые синтетические полимеры, как аналоги
биополимеров (полинуклеотиды), так и неприродные
соединения (полианионы, поликатионы, полиамфолиты).
Значительный интерес представляет изучение механизма
действия последней группы веществ, открывающее но-
вые подходы к пониманию механизма иммунного ответа
и сулящее большие перспективы для иммунопрофилак-
тики. Р. Петровым с соавторами (1983) изучено влияние
на иммунный ответ ряда соединений указанного типа:
поливинплпиридина, сополимера акриловой кислоты и
N-винилпирролидона и некоторых других.
Установлено, что полиэлсктролиты способны усили-
вать антпгензависимую пролиферацию антителопродуци-
рующих клеток, а в случае тимусзависимых антигенов
замещать Т-хелперы. Об этом, в частности, свидетельст-
вуют демонстративные эксперименты на бестнмусных
мышах nude, у которых сополимер акриловой кислоты и
N-винилпирролидона обеспечивали эффективную проли-
ферацию антителопродуцирующих клеток при иммуниза-
ции тимусзависнмым антигеном — эритроцитами бара-
на. Как оказалось, тот же сополимер обеспечивает более
эффективное взаимодействие макрофагов с лимфоцита-
ми, а также вызывает ряд других эффектов. На основа-
8*
227
нии всех этих данных Р. Петров, Р. Хаитов и др.
(1977—1983) разработали и исследовали ряд искусст-
венных антигенов. В качестве детерминант служили
различные ароматические соединения, белки, комплекс-
ные бактериальные антигены. Было показано, что комп-
лексы простых гаптенов и белков с поликатионами обес-
печивают тимуснезависимость иммунного ответа. Углуб-
ленное изучение действия поликатионов на лимфоидные
клетки и в первую очередь на цитоплазматическую
мембрану (Р. Атауллаханов и др., 1983) позволит рас-
шифровать молекулярные механизмы, определяющие
особенности действия этих соединений при иммунном
ответе.
Молекулярные основы
иммунологической
толерантности
и аутоиммунных
болезней
11.1. Иммунологическая толерантность
Иммунологической толерантностью
называют приобретенную под влиянием антигена неспо-
собность данного индивидуума отвечать реакциями гу-
морального плп клеточно-опосредованного иммунитета
на этот антиген; при этом другие особи данного биологи-
ческого вида способны отвечать на этот антиген.
Из определения следует, что иммунологическая то-
лерантность не имеет ничего общего с генетически
предетерминпрованной неспособностью отвечать на тот
или иной антиген, например, из-за отсутствия соответст-
вующих генов иммунного ответа. Состояние толерантно-
сти индуцирует антиген, который в иных условиях был
бы способен вызвать у того же индивидуума иммунный
ответ. Значит, главное условие возникновения толерант-
ности — соблюдение ряда условий при контакте антиге-
на с клетками, участвующими в иммунном ответе. Хотя
к настоящему времени экспериментально проверено мно-
го схем индукции иммунологической толерантности,
228
выделим здесь всего несколько из них, чтобы охаракте-
ризовать ряд главных условий, необходимых для индук-
ции рассматриваемого состояния.
1.	Любой по химической природе антиген в свобод-
ном виде или как компонент клетки способен индуциро-
вать специфическую иммунологическую толерантность у
новорожденных, в то время как у взрослых особей того
же вида он вызывает иммунный ответ. Именно этим
можно в первую очередь объяснить то обстоятельство,
что в норме не возникают реакции гуморального и кле-
точно-опосредованного иммунитета на свои собственные
антигены — важное условие выживания биологических
видов, имеющих хорошо развитую иммунную систему.
Следовательно, явление иммунологической толерантно-
сти столь же важно, каки иммунореактивности, и именно
благодаря обоим этим явлениям высшие организмы спо-
собны высокоэффективно поддерживать свой антигенный
гомеостаз.
2.	Иммунологическую толерантность можно индуци-
ровать у взрослых особей, лишь варьируя в широких
пределах дозу вводимого антигена. В случае тимусзави-
симых антигенов состояние толерантности возникает при
использовании крайне низких доз растворимых антиге-
нов, например, глобулярных белков. Толерогенная доза
антигена в этом случае ниже дозы, способной вызвать
иммунный ответ. Как в случае тимусзависимых, так и
тимуснезависимых антигенов (в частности, бактериаль-
ных полисахаридов), иммунологическую толерантность
можно индуцировать, используя очень большие дозы ан-
тигена, значительно превышающие дозу, оптимальную
для иммунного ответа. Такие формы иммунологической
толерантности, которые зависят от дозы вводимого ан-
тигена, обозначают как низкозонную и высокозонную,
что соответствует низкой и высокой дозам вводимого ан-
тигена.
3.	При одной и той же специфичности (одинаковой
структуре антигенных детерминант) толерогенными для
взрослых особей свойствами будет обладать антиген с
более высокой, чем у иммуногенной формы того же ве-
щества, эпитопной плотностью (например, конъюгиро-
ванный антиген с большим числом гаптенных групп).
В свою очередь, более выраженными толерогенными
свойствами будет обладать антиген с высокой устойчи-
востью к действию гидролитических ферментов (напри-
мер, антигены, содержащие неприродные D-аминокисло-
229
ты). Еще одна особенность строения антигена, благо-
приятствующая проявлению его толерогенных свойств,—
отсутствие в составе белкового антигена агрегатов.
4.	Состояние иммунологической толерантности у
взрослых животных может быть вызвано сочетанием
антигенной стимуляции с иммуносупрессией. С целью
подавления иммунореактивности используют радиаци-
онное облучение, а также вещества, токсичные для
быстроделящихся клеток, например циклофосфан, мето-
трексат, 6-меркаптопурпн.
На первый взгляд кажется, что перечисленные выше
условия для индукции толерантности мало связаны меж-
ду собой и не могут быть сведены в единую систему. Ни-
же мы постараемся продемонстрировать такую связь.
Здесь же хотелось бы подчеркнуть, что изучение меха-
низма иммунологической толерантности имеет несомнен-
ное значение для развития теоретической иммунологии.
Что касается прикладных аспектов проблемы, то они бо-
лее, чем значимы, так как прямо связаны с решением
проблемы пересадки органов и тканей, выяснения при-
чин и поиска путей профилактики и терапии аутоим-
мунных заболеваний и ряда других проблем.
Индукция и поддержание специфической иммуноло-
гической толерантности обусловлены влиянием антигена
(толерогена) как на Т-, так и В-лимфоциты, экспресси-
рующие рецепторы к этому антигену. Кроме того, в воз-
никновении и поддержании состояния толерантности
несомненная роль принадлежит А-клеткам (макрофаги).
Конечным выражением возникшего состояния толерант-
ности в отношении антигенов, способных индуцировать
биосинтез антител, является неспособность прекоммити-
рованных к данному антигену В-лимфоцитов превра-
щаться в антителопродуцирующие клетки. Этот специ-
фичный по отношению к данному антигену процесс мо-
жет быть обусловлен прямым избирательным действием
антигена (толерогена) на В-лимфоциты. Опосредованное
толерогенное действие антигенов, принадлежащих к чис-
лу тимусзависимых, связано с их влиянием на Т-лимфо-
циты. Основной клеткой-мишенью здесь выступают
Т-супрессоры. Наконец, в силу особенностей физико-хи-
мических свойств толерогенов их процессирование в
А-клетках протекает иначе, чем антигена, индуцирующе-
го иммунный ответ. Если принять во внимание все ска-
занное и ряд не обсуждавшихся здесь фактов, можно
заключить, что в случае тимуснезавпсимых антигенов
230
клетками-мишенями при индукции толерантности слу-
жат В-лимфоциты и А-клетки. При индукции толерант-
ности к тимусзависимым антигенам в возникновении и
поддержании этого состояния могут быть заинтересова-
ны все три типа клеток.
Каковы причины того, что в поздний антенатальный
период и сразу после рождения антиген проявляет себя
как толероген? Причина кроется в особенностях биоло-
гии лимфоцитов на определенном этапе их созревания в
онтогенезе.
У мышей удается индуцировать толерантность толь-
ко в тот период эмбрионального развития, когда В-лим-
фоциты уже экспрессируют рецепторный IgM. Следова-
тельно, эти клетки способны специфически распознавать
антиген. Будучи поливалентным, антиген «сшивает»
между собой антигенсвязывающие рецепторы незрелых
В-клеток. Последствия этого, видимо, идентичны тако-
вым после «сшивания» иммуноглобулиновых рецепторов
эмбриональных В-лимфоцитов с помощью антиизотипи-
ческих анти-ц-антител (см. гл. 3). Напоминим, что при
«сшивании» иммуноглобулиновых рецепторов, незрелых
В-лимфоцитов клетка, потеряв рецепторы, на продолжи-
тельное время теряет способность их ресинтезировать.
Зрелые В-лимфоциты в тех же условиях эффективно ре-
генерируют антигенсвязывающие рецепторы. Подобно
антиизотипической сыворотке на В-лимфоциты эмбриона
влияет поливалентный антиген. Продолжительное подав-
ление синтеза иммуноглобулиновых рецепторов В-клет-
ками эмбриона после контакта с толерогеном может
стать причиной ареактивности к данному антигену. Это,
по-видимому, связано, в свою очередь, с недостаточно
эффективной регуляцией обмена циклических нуклеоти-
дов в незрелых В-клетках и сохранении на продолжи-
тельный срок высокого уровня цАМФ в клетках после
«сшивания» рецепторов.
Процесс биосинтеза иммуноглобулиновых рецепторов
В-клеткам и может нарушаться также у взрослых живот-
ных при индукции толерантности с помощью полисахари-
дов регулярного строения в качестве толерогенов. Ана-
логичная ситуация может иметь место при индукции
толерантности к медленно метаболирующим конъюгиро-
ванным антигенам, например полплизину, большое чис-
ло боковых аминогрупп в молекуле которого замещено
динитрофенильными радикалами. В опытах in vitro уста-
новлено, что обработка лимфоцитов антигенами регу-
231
лярного строения с высокой эпитопной плотностью при-
водит как бы к «замораживанию» иммуноглобулиновых
рецепторов (М. Feldmann, Е. Diener, 1970). Будучи
жестко связанными на относительно больших участках
клеточной поверхности, иммуноглобулиновые рецепторы
в этих условиях не способны к перемещению по клеточ-
ной поверхности. Поэтому толерогены указанного строе-
ния не вызывают in vitro при 37°С агрегации клеточных
рецепторов, формирования «шапочек» и в конечном сче-
те исчезновения рецепторов с поверхности. Хотя биохи-
мические следствия описанного явления (т. е. «замора-
живания» рецепторов) не изучены, предполагают, что
отдаленным (на несколько суток) следствием «замора-
живания» рецепторов будет утрата на продолжительный
срок способности к экспрессии рецепторов.
По-видимому, далеко не безразлично для индукции
толерантности, с какими по изотипу иммуноглобулино-
выми рецепторами взаимодействует толероген. Избира-
тельное удаление IgD-рецепторов с поверхности зрелых
В-лимфоцитов (за счет обработки клеток папаином)
способствует возникновению состояния ареактивности в
.популяции В-клеток под действием толерогена (J. Cam-
bier et al., 1977).
Если на клеточном уровне ареактивность иммуноком-
петентных клеток можно вызвать непродолжительным
.(от нескольких часов до 3—5 суток) контактом лимфо-
цитов с толерогеном, то в условиях организма необхо-
дим более продолжительный контакт с толерогеном.
Сущность различий может состоять главным образом в
лом, что in vivo идет непрерывное пополнение пула им-
мунокомпетентных В-лимфоцптов в ходе антигеннезави-
•симой дифференцировки стволовых клеток (см. гл. 1).
Поэтому для более эффективного достижения состояния
лолерантности необходимо хотя бы частичное истощение
пула предшественников В-лимфоцптов, прекоммитиро-
ванных к данному антигену. А для этого требуются либо
большие дозы антигена (частое его введение), либо ис-
пользование в качестве толерогена медленно метаболи-
рующего вещества (например, пневмококкового полиса-
харида) .
В случае тимусзависимых антигенов важнейшая роль
в возникновении и поддержании состояния толерантно-
сти принадлежит Т-супрессорам. Стало очевидным после
наблюдения Р. Гершона и К. Кондо (R. Gershon,
К. Kondo, 1971), что толерантность к эритроцитам бара-
232
на можно вызвать у нормального животного, перенося
ему клетки селезенки от толерантных к этому антигену
сингенных доноров. Те же авторы показали, что клетки
селезенки, ответственные за перенос толерантности, при-
надлежат к Т-лимфоцитам, специфичным к антигену,
использованному для индукции толерантности. Позднее
эти данные были многократно воспроизведены для раз-
ных тимусзависимых антигенов и было доказано, что
упомянутые Т-клетки относятся к Т-супрессорам (см.
гл. 1 и 10).
Активацию Т-супрессоров вызывают белковые анти-
гены, свободные от примеси агрегатов. Как показано вы-
ше, в этой форме такие антигены вызывают состояние
толерантности. Синтетические полипептиды и получен-
ные на их основе конъюгированные антигены в условиях,
благоприятствующих возникновению состояния толе-
рантности (см. выше), также активируют Т-супрессоры.
Точный механизм активации не известен.
Клетками-мишенями для продуцируемого Т-супрессо-
рами фактора (см. гл. 10) служат Т-хеллеры. Функцио-
нально выключая их, этот фактор тем самым препятст-
вует активации В-лимфоцитов антигеном.
Помимо Т-супрессоров определенное влияние на под-
держание состояния толерантности оказывают антитела
и их комплексы с антигеном. Сам факт возникновения
антител у толерантных животных не противоречит пред-
ставлению о том, что состояние рассматривается как
специфическая иммунологическая ареактивность. Био-
синтез антител в ограниченных количествах, очевидно,
совершенно необходим для поддержания состояния то-
лерантности, а механизм их действия может быть подо-
бен уже рассматривавшемуся в гл. 10 механизму имму-
носупрессии, обусловленному антителами. Так, IgG-ан-
титела (а именно антителам этого класса приписывают
основную роль в поддержании толерантности — G. Voisin,
1971; G. Voisin, et al., 1972) могут, как обсуждалось в
гл. 10, сами по себе или в комплексе с антигеном подав-
лять иммунный ответ. Если исходить из гипотезы, со-
гласно которой иммуносупрессивное действие IgG-анти-
тел связано с уменьшением под их влиянием доли пред-
ставленного А-клетками антигена (см. раздел 10.4),
можно понять их роль в поддержании толерантности.
Действительно, уменьшая долю представленного анти-
гена, антитела опосредованно увеличивают долю свобод-
233
ного антигена, который способен активировать предше-
ственники Т-сунрессоров (см. гл. 10).
Состояние иммунологической толерантности вне за-
висимости от использованного метода индукции всегда
ограничено во времени. Оно завершается спонтанно в
том случае, если не предпринимаются специальные уси-
лия для поддержания толерантности. Спонтанный выход
из состояния толерантности обусловлен полной элими-
нацией из организма толерогена. Взамен ареактпвных
иммунокомпетентных клеток в периферических лимфо-
идных органах появляются функционально полноценные
лимфоциты — потомки недифференцированных предше-
ственников. По этой причине выходу из состояния толе-
рантности будут способствовать любые эксперименталь-
ные приемы, усиливающие регенерацию лимфоидной
ткани, например умеренные дозы радиационного облуче-
ния, цитостатики типа циклофосфана. Тот же эффект да-
ет перенос сингенных лимфоидных клеток от нормаль-
ных доноров.
Прекращение состояния толерантности, обусловлен-
ное так называемыми перекрестно реагирующими анти-
генами, мы рассмотрим в следующем разделе.
11.2. Аутоиммунные болезни
Утрата иммунологической толерантно-
сти к антигенам собственных клеток и тканей влечет за
собой аутоиммунную реакцию, т. е. реакцию иммунной
системы организма против собственных антигенов. При
продолжительной во времени аутоиммунной реакции за
счет эффекторной активности комплекса антиген-анти-
тело возникают разнообразные патофизиологические
состояния. В зависимости от органной локализации про-
цесса (природы антигенов, к которым утрачено состоя-
ние толерантности) возникает характерный патологиче-
ский процесс, являющийся фенотипическим проявлением
данного аутоиммунного заболевания.
Какие обстоятельства способствуют утрате иммуно-
логической толерантности? В предыдущем разделе при-
водились некоторые способы прекращения состояния то-
лерантности. Эти результаты, полученные в эксперимен-
те, в принципе значимы для объяснения возникновения
аутоиммунного процесса. Так, при хронической лучевой
болезни достаточно часто наблюдаются аутоиммунные
реакции (Р. Петров, Ю. Зарецкая, 1970; R. Schwartz,
234
1965). Аутоиммунные заболевания часто коррелируют с
лимфопролиферативными процессами у человека и жи-
вотных (F. Burnet, 1970).
Важное место в развитии аутоиммунных болезней
принадлежит, по-видимому, срыву толерантности к соб-
ственным антигенам под влиянием перекрестно реаги-
рующих антигенов. Рассмотрим этот феномен.
В качестве толерогена может быть использован анти-
ген (например, белок или конъюгированный белковый
антиген, содержащий несколько, условно три, детерми-
нант). Эти детерминанты распознаются В-лимфоцитами.
Допустим, столько же детерминант распознается Т-хел-
перами. Использованный антиген тимуезавиенм, и по-
этому толерантность, выражающаяся в отсутствии синте-
за антител против детерминант А, Б и В, обусловлена
блокированием Т-хелперов, распознающих детерминан-
ты X, У, Z (Т-хелперы блокируются, как уже обсужда-
лось, активированными толерогеном Т-супрессорами).
Теперь толерантному животному вводят другой белок с
детерминантами А, Д и Е, распознаваемыми В-клетка-
ми, и детерминантами X, V, W, распознаваемыми Т-хел-
перами. Т-хелперы, распознающие детерминанты V и W,
не блокированы при индукции толерантности к первому
антигену и способны оказать помощь В-клеткам, отвеча-
ющим на все детерминанты второго антигена, включая
и детерминанту А, общую для первого антигена — толе-
рогена и второго — перекрестно реагирующего с толеро-
геном. Поскольку толерантность на Т-зависимые антиге-
ны не обусловлена блокированием В-лимфоцитов, будет
происходить продукция антител, направленных к детер-
минанте А. Тем самым перекрестно реагирующий анти-
ген прервет состояние толерантности по отношению к
первому антигену. Если от абстрактной модели перейти
к конкретному эксперименту, можно показать, напри-
мер, возможность срыва толерантности к динитрофенн-
лированному IgG быка (толероген) с помощью динит-
рофенилированного IgG человека. Срыв толерантности
выражается в синтезе антител против динитрофениль-
ной группы благодаря подключению к ответу Т-хелпе-
ров, распознающих детерминанты, общие для IgG чело-
века и быка.
Число примеров срыва толерантности перекрестно
реагирующими антигенами можно значительно увели-
чить. Некоторые подобные случаи имеют важное значе-
ние для патологии, поскольку как микроорганизмы, так
235
и собственные антигены с измененной структурой могут
служить источником перекрестно реагирующих антиге-
нов. В случае собственных антигенов изменения их
структуры могут носить конформационно-зависимый ха-
рактер. Примером может служить детерминанта (или
детерминанты), появляющаяся в молекуле IgG-антите-
ла после образования последним комплекса с антигеном.
Новые детерминанты, возникающие в Fc-участке моле-
кулы (С. Неппеу, К. Ishizaka, 1968), способны в принци-
пе обусловить срыв толерантности по отношению к соб-
ственному IgG и появление аутоантител к собственному
IgG. Такая ситуация имеет место при тяжелом аутоим-
мунном заболевании человека — ревматоидном артрите.
Аутоантитела к собственным иммуноглобулинам, цир-
кулирующие у таких больных, получили название рев-
матоидного фактора. Антииммуноглобулины синтезиру-
ются и при других хронических заболеваниях человека,
характеризующихся образованием иммунных комплек-
сов.
Одна из ситуаций, приводящих к появлению новых
антигенных детерминант, — формирование надмолеку-
лярных структур, в частности структур на клеточной
поверхности, когда клетки заражены вирусами, патоген-
ными грибами, простейшими, некоторыми видами бакте-
рий (бруцеллы, пастереллы). Причина появления новых
детерминант — экспрессия на цитоплазматической мем-
бране некоторых антигенов инфекционного агента.
Таким образом, как сами инфекционные агенты при
внеклеточном паразитизме, так и контролируемые их
геномами антигены в сочетании с антигенами хозяина
(внутриклеточный паразитизм) служат источником пе-
рекрестно реагирующих антигенов, способных сорвать
состояние толерантности к собственным антигенам мак-
роорганпзма.
Принимается, что такие важнейшие аутоиммунные
заболевания человека, как ревматизм, ревматоидный
артрит и др., возникают под влиянием инфекционных
агентов. В случае ревматизма — это патогенные стреп-
тококки, некоторые из антигенов которых перекрестно
реагируют с антигенами тканей сердца (И. Лямперт
и др., 1975; М. Kaplan et al., 1971). В индукции патоло-
гического процесса при ревматоидном артрите важную
роль отводят вирусу Эпштейн — Барр. Размножаясь в
В-лимфоцитах, он становится источником ДНК, образу-
ющей комплекс с коллагеном. В результате конформа-
236
ционных изменений последнего возникают новые анти-
генные детерминанты, а как следствие этого — новый пе-
рекрестно реагирующий антиген. Процесс на этом, по
мнению X. Фаденберга (Н. Fudenberg, 1978), не закан-
чивается, так как с появлением аутоантител к коллагену
в комплексе с последним они изменяют свою конформа-
цию и теперь сами служат источником перекрестно реа-
гирующего антигена. Так появляются антииммуноглобу-
лины — ревматоидный фактор, о котором шла речь вы-
ше. Изложенная выше концепция, хотя и не принадле-
жит к общепринятым, представляет значительный инте-
рес как пример широкого биологического мышления им-
мунолога.
В заключение этого раздела необходимо подчеркнуть
роль генетических факторов в возникновении аутоим-
мунных заболеваний. Их возникновение прямо связано
с активностью Т-системы иммунитета и прежде всего
тех ее механизмов, которые отвечают за генерацию
Т-супрессоров. Дефицит последних несомненно способст-
вует возникновению аутоиммунной патологии, разумеет-
ся при наличии в том числе перекрестно реагирующих
антигенов. Большую помощь в понимании этих важных
вопросов оказывают работы по изучению аутоиммунных
заболеваний лабораторных животных. В гл. 2 уже гово-
рилось о новозеландских мышах (NZB и NZW) и неко-
торых других линиях мышей, у которых спонтанно воз-
никает аутоиммунный процесс. При этом доминирует
иммунный ответ против ДНК и собственных эритроцитов
с образованием соответствующих по специфичности ан-
тител. Существенно, что эти мыши инфицированы виру-
сом мышиного лейкоза. Выделенный из мышей NZB
переносит подобное заболевание нечувствительным ре-
ципиентам. Предположение, что вирус нарушает процесс
генерации Т-супрессоров, представляется нам весьма
перспективным для понимания патогенеза аутоиммун-
ных заболеваний.
Улучшение техники выявления Т-супрессоров в соче-
тании с генетическим анализом будет способствовать
выяснению ведущих этиологических факторов аутоим-
мунных заболеваний человека.
ГЛАВА
Методология
иммунохимического
эксперимента
В этой главе мы ставим задачу рас-
смотреть принципы основных методов, используемых в
иммунохимии, и охарактеризовать области применения
иммунохимических методов в биохимии и молекулярной
биологии.
12.1.	Очистка иммуноглобулинов
и антител
Практически во всех исследованиях,
где применяется реакция антиген-антитело, целесооб-
разно использовать в качестве источника антител не ан-
тисыворотку, а выделенные из нее иммуноглобулины
(желательно одного класса) пли очищенные антитела.
Применение цельной антисыворотки нежелательно по
трем основным причинам. 1. Концентрация антител в
ней может быть недостаточна, чтобы ебеспечить необхо-
димую чувствительность реакции для выявления лиган-
да (антигена, гаптена). 2. Антисыворотка, полученная
даже против индивидуального белка, содержит набор
антител против разных антигенных детерминант этого
белка, а также антитела против следовых примесей дру-
гих белков. Вместе с тем исследователю часто необходи-
мо использовать антитела только против какой-либо
одной детерминанты или одного белка. 3. Реакция анти-
ген-антитело высокоспецифнчна, но далеко не всегда
способ регистрации реакции (например, агглютинация,
преципитация) достаточно специфичен, чтобы без по-
становки целого ряда контролей исключить ложные
(кажущиеся) проявления реакции. Вероятность таких
ложных проявлений реакций наиболее велика при ис-
пользовании в качестве источника антител антисыворот-
ки, содержащей десятки различных белков и других сое-
динений, способных в ряде случаев влиять на течение
реакции антиген-антитело.
238
Далеко не всегда можно получить антитела в очи-
щенном виде (см. ниже). Поэтому прибегают к выделе-
нию лишь иммуноглобулиновой фракции сыворотки или
иммуноглобулинов одного из классов (как правило,
IgG). Кратко рассмотрим особенности применяемых ме-
тодов выделения сывороточных иммуноглобулинов.
Высаливание. Иммуноглобулины и прежде всего IgG
характеризуются наименьшей степенью гидратации сре-
ди белков сыворотки. Поэтому они прежде других бел-
ков выпадают в осадок при прибавлении к сыворотке
солей, энергично связывающих воду и в силу этого раз-
рушающих гидратную оболочку белковой молекулы.
Так, при концентрации сульфата аммония 34—35% на-
сыщения из сыворотки выпадает IgG, не содержащий
практически примеси других белков. Наибольшей полно-
ты осаждения можно достичь при значении pH 7,0—7,2,
т. е. близком к изоэлектрической точке наименее заря-
женных молекул IgG. Осажденные сульфатом аммония
иммуноглобулины обычно полностью растворяются по-
сле удаления соли диализом. Простота метода и воз-
можность с его помощью значительно увеличить удель-
ную концентрацию иммуноглобулинов в растворе дела-
ет его одним из наиболее популярных методов выделе-
ния иммуноглобулинов.
Для высаливания иммуноглобулинов используют
также сульфат натрия. IgG осаждают при концентрации
соли, равной 18%. После повторного осаждения белка
в тех же условиях удается получить препараты, содер-
жащие лишь незначительные примеси других сывороточ-
ных белков.
При нейтральных значениях pH IgG осаждается
0,1 М раствором сульфата цинка. Так как при этом не
происходит осаждения IgA, метод нашел применение
для выделения из сыворотки человека иммуноглобули-
нов класса А.
Осаждение спиртом. Фракционирование сывороточ-
ных белков спиртом широко используют в производстве
различных сывороточных препаратов, в том числе ком-
мерческих препаратов гамма-глобулина человека из до-
норской п плацентарной крови. В настоящее время в ла-
бораторной практике метод практически не применяют
из-за его трудоемкости.
Препаративный электрофорез. Предложены различ-
ные модификации метода, позволяющие выделять и
фракционировать иммуноглобулины. Обычно применя-
239
ют методы зонного электрофореза в блоках, содержащих
инертный, водонерастворпмый носитель: специально об-
работанный крахмал, сефадекс, полиакриламид и др.
В виде блока используют также различные гели, глав-
ным образом агара и агарозы. Методом препаративного
электрофореза удается выделить из сыворотки иммуно-
глобулины различных классов, а в сочетании с ионооб-
менной хроматограграфией и отдельные подклассы.
Ионообменная хроматография и гель-фильтрация.
Эти методы получили в настоящее время наибольшее
распространение. Для ионообменной хроматографии, как
правило, используют диэтиламиноэтилцеллюлозу
(ДЭАЭ-целлюлоза) или ДЭАЭ-сефадекс. Ионообменни-
ки уравновешивают буферными растворами низкой ион-
ной силы (0,005—0,02 моль) при pH 7,2—8,2 с целью вы-
деления IgG. В указанных условиях наименее заряжен-
ная часть молекул IgG не фиксируется на ионообменни-
ке, в то время как другие иммуноглобулины и сыворо-
точные белки связаны. Фракционирование можно прово-
дить методом колоночной хроматографии или в объеме.
С целью экономии ионообменника для очистки IgG
целесообразно выделить первоначально из сыворотки
общую глобулиновую фракцию осаждением сульфатом
аммония при 50%-ном насыщении.
При очистке IgG с помощью ионообменной хромато-
графии неизбежны ощутимые потери. Во-первых, по сте-
пени растворимости в растворах низкой ионной силы
IgG, как и ряд других сывороточных глобулинов, состо-
ит из двух видов молекул: высокорастворимых, образу-
ющих фракцию псевдоглобулпнов, и мало растворимых,
составляющих фракцию эуглобулинов. Антитела распре-
делены в обеих фракциях. Однако из-за особенностей
техники ионообменной хроматографии (проведение
процедуры с использсванием растворов низкой ионной
силы) фракция эуглобулинов теряется. Во-вторых, в си-
лу значительной неоднородности IgG по электрическому
заряду (изоэлектрические точки в диапазоне pH 6,6—
7,6) часть молекул связана с ионообменником даже при
хроматографии в буфере pH 6,8—7,2. В результате об-
щий выход IgG едва превышает 50%.
С использованием ионообменной хроматографии на
ДЭАЭ-целлюлозе (сефадексе) можно разделить иммуно-
глобулины IgM и IgA, используя непрерывный (линей-
ный) или ступенчатый градиент концентрации буферно-
го раствора. Разделение достаточно грубое, и для полу-
240
чения очищенных препаратов приходится прибегать к
ряду других процедур: гель-хроматографии на сефадек-
сах G-150 или G-200, ионообменной хроматографии на
карбоксиметилцеллюлозе.
Специфическая очистка антител. Антитела могут быть
извлечены из смеси других белков только с помощью
антигена. При этом антитело определенной специфично-
сти может быть отделено также от других по специфич-
ности антител с теми же физико-химическими свойства-
ми. Процедура состоит из двух частей: получения комп-
лекса антиген-антитело и его диссоциации с последую-
щим разделением антигена и антитела. Рассмотрим ос-
новные методические приемы, используемые для очистки
антител.
Получение комплекса антиген-антитело в нераствори-
мом виде. В случае низкодисперсных антигенов: бакте-
рий, клеток эукариот после сорбции антител достаточно
промыть комплекс, чтобы приступить к элюции антител.
В случае высокодисперсных антигенов, включая раство-
римые в воде биополимеры, комплекс получают в форме
преципитата (см. ниже). Наиболее универсальный спо-
соб состоит в приготовлении иммобилизованных на водо-
нерастворимом носителе антигенов или гаптенов. Носи-
телями служат порошок целлюлозы, сефадекс, сефароза,
биогель. Антигены (гаптены) фиксируют ковалентно.
Предложены десятки способов фиксации антигенов на
носителе, различающиеся в том числе тем, какая группи-
ровка антигена использована для его присоединения к
носителю. Приведем в качестве примера предложенный
А. Гурвичем (1958) метод фиксации белковых антигенов
на целлюлозе с помощью так называемого галлоидоал-
килата:
NO,
Хпористый N (тп -ни Iробей шлоксиметил-пиридинии)
iалондалкила!
Широко в настоящее время применяется метод фик-
сации антигенов на сефарозе (сефадексе), активирован-
ной бромцианом.
Иммобилизованные антигены (гаптены) получили
название иммуносорбентов. В случае применения имму-
241
иосорбентов для колоночной хроматографии этот способ
становится одним из вариантов аффинной хроматогра-
фии, т. е. метода фракционирования, основанного на
высокой степени сродства адсорбируемого вещества к
сорбенту.
Элюция антител. Диссоциацию комплекса антиген-
антитело с целью элюции антител производят либо пу-
тем специфического вытеснения их избытком простого
гаптена, либо неспецифически. В последнем случае в за-
висимости от строения антигена, а следовательно, типа
связей между антигеном и антителом применимы самые
разнообразные способы. О них шла речь в гл. 4. Чаще
других используют буферные растворы с низкими значе-
ниями pH: 2,4—3,0. Реже применяют щелочные буфер-
ные растворы, концентрированные (8—10 М), нейтраль-
ные растворы аминов (мочевины) или растворы с доста-
точно высокой концентрацией хаотропных ионов: I-,
CXS-. Если используют иммуносорбент с ковалентно
связанным антигеном, нет опасности попадания антиге-
на в раствор антител в описанных условиях. Поэтому
достаточно провести диализ элюированных антител про-
тив изотонического раствора хлорида натрия, чтобы за-
вершить процедуру пх выделения. То же относится и к
элюции антител с сорбента с помощью гаптена. Обычно
применяют гаптен с низким сродством к антителу, чтобы
с достаточной полнотой удалить его затем из элюата ан-
тител. Например, при выделении антидпнитрофенпльных
антител используют в качестве гаптена динптрофенол,
константа сродства которого на два порядка меньше,
чем константа сродства к антителу динитрофениллизина.
Динитрофенол можно затем удалить на ионообменнике
(например, дауэкс 1X10). В то же время достаточно
полное освобождение раствора антидннитрофенильных
антител от динитрофениллизина практически невозмож-
но, в силу чего этот высокоэффективный диссоциирую-
щий агент не применяется для получения антндинитро-
фенильных антител.
При использовании в качестве естественных иммуно-
сорбентов низкодпсперсных антигенов велика опасность
загрязнения антигеном элюированных антител даже при
применении достаточно мягких способов элюции послед-
них. Чтобы исключить или уменьшить элюцию антигена,
например, с поверхности бактериальной клетки, находя-
щиеся на ее поверхности высокомолекулярные вещества
фиксируют с помощью глутарового альдегида.
242
При низких значениях pH в концентрированных рас-
творах аминов или в присутствии хаотропных агентов
конформация антител изменяется. Однако эти
изменения носят в основном обратимый характер. О ка-
честве выполнения процедуры очистки можно судить по
двум критериям: специфической активности антител
(т. е. связывание ими антигена или гаптена) и по содер-
жанию агрегированного материала (последнее устанав-
ливают с помощью гель-фильтрации). Присутствие аг-
регатов сигнализирует или о наличии в растворе антител
антигена и, следовательно, иммунных комплексов, или
о денатурации антител.
Хранение антител можно осуществлять в заморожен-
ном виде или после высушивания (лиофилизация).
Предварительно антитела концентрируют, так как хра-
нение в сильно разбавленном виде неизбежно приведет
к их денатурации. Оптимальная концентрация антител
при хранении в замороженном виде 5 мг/мл.
12.2.	Аффинная хроматография
в иммунологии
В предыдущем разделе говорилось об
основном из применяющихся в иммунологии методе аф-
финной хроматографии — выделении антител с помощью
иммобилизованного антигена (гаптена). Кратко охарак-
теризуем другие варианты метода, применяемые в имму-
нологии.
На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза)
могут быть иммобилизованы антитела, так что с помо-
щью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов
определенный антиген. Ковалентное связывание антител
с носителем производят по возможности в мягких усло-
виях, чтобы исключить их денатурацию. В связи с необ-
ходимостью фиксировать большие количества белка для
приготовления пммуносорбента крайне редко использу-
ют очищенные антитела. Обычно используют выделен-
ные из антисыворотки иммуноглобулины.
Емкость сорбентов с антителами значительно ниже,,
чем с антигеном, по следующим причинам: 1. Число ак-
тивных центров в антителах, содержащихся в антисыво-
ротке в наибольших количествах, а именно IgG, равно
двум; число детерминант в молекуле антигена, как пра-
вило, больше. 2. Стерический фактор при иммобилиза-
243
ции антител оказывает значительно большее влияние на
связывание лиганда в случае иммобилизованных анти-
тел, нежели антигена.
С целью уменьшения вероятности пространственного
экранирования активного центра антитела носителем
желательно присоединять антитела к носителю через
«гибкую ножку» (spacer). Функцию ножки могут выпол-
нять бифункциональные реагенты типа бпсдиазобензи-
дина, различные по длине алифатической цепи бромаце-
тильные производные и др.
Если иммуносорбент с иммобилизованными антитела-
ми предполагают использовать прежде всего для извле-
чения из смеси определенного антигена (но не для по-
лучения его в чистом виде), фиксацию антител можно
осуществить по типу «сэндвича». Первоначально иммо-
билизуют на носителе такой же антиген или антиген,
перекрестно с ним реагирующий, а затем к иммуносор-
бенту добавляют большой избыток антител (антисыво-
ротка). Часть активных центров антител, присоединен-
ных к иммобилизованному антигену, окажется свобод-
ными. Именно за счет них «сэндвпч»-сорбент будет свя-
зывать определенный антпген из раствора.
С помощью иммуносорбента для антигена могут ре-
шаться задачи, имеющие существенное значение для мо-
лекулярной биологии. Приведем в качестве примера вы-
деление на иммуносорбенте типа «сэндвич» полирибо-
сом, синтезирующих легкие полипептидные цепи
(Е. Сидорова и др., 1978). Сорбент был «нагружен»
антителами против легких цепей иммуноглобулинов
мыши. Выделенные из клеток мышиной плазмацитомы
полирибосомы для легких цепей (использовали технику
градиентного центрифугирования) содержали растущие
легкие цепи. Как следует из этой и других работ, расту-
щие полипептидные цепи уже имеют, по крайней мере,
часть антигенных детерминант, характерных для данной
полипептидной цепи, поэтому растущая цепь избиратель-
но связывается с иммобилизованными антителами против
этой цепи, а вместе с ней связываются с иммуносорбен-
том полирибосомы, содержащие мРНК для легких цепей.
Теперь остается промыть иммуносорбент, путем феноль-
ной экстракции выделить РНК и очистить мРНК обще-
принятым способом. Описанный принцип или аналогич-
ные методы извлечения мРНК позволяют получить пре-
параты определенной информационной нуклеиновой кис-
лоты свыше 90% чистоты.
244
Используемые в иммунохимии методы аффинной хро-
матографии не всегда основаны на реакции антиген-ан-
титело. Например, исходя из высокого , сродства к
Fc-участку молекулы IgG белка А, продуцируемого
Staphylococcus aureus, можно выделить из сложной сме-
си белков и дру! их самых разнообразных по природе
веществ, содержащихся в питательном бульоне, где вы-
ращивали стафилококк, именно белок А. В качестве
сорбента при этом используют иммобилизованный на
сефарозе IgG человека. Белок А можно затем элюиро-
вать без потери активности раствором роданида натрия
(II. Тарханова, II. Сычева, 1980).
С помощью сорбента с иммобилизованным IgG из
сыворотки (плазмы) можно извлечь Clq, а из лизата
клеток селезенки — Fc-рецептор.
При любом способе аффинной хроматографии боль-
шое внимание должно быть уделено оценке степени
специфичности сорбции лиганда. Здесь целесообразно
привести некоторые примеры неспецифической сорбции
различных веществ на иммуносорбентах, чтобы пока-
зать, какими многообразными знаниями необходимо об-
ладать для выбора адекватного метода исследования.
В период становления техники иммуносорбции (ко-
нец 50-х годов) внимание специалистов привлек амино-
полистирол — коммерческий препарат низкой стоимости,
который без особых затрат и потери рабочего времени
мог быть использован в качестве носителя для фиксации
белковых антигенов. В самом деле, аминогруппы амино-
полистирола можно диазотировать нитритом натрия в
разбавленной соляной кислоте. Затем с помощью реак-
ции азосочетанпя в слабощелочной среде к полимеру
можно ковалентно присоединить любые белки, содержа-
щие тирозин. Однако полученные таким способом имму-
носорбенты связывали неспецифически значительные
количества сывороточных иммуноглобулинов, видимо,
за счет гидрофобных взаимодействий. От этого полимера
как носителя пришлось отказаться.
Другим примером неспеццфической сорбции может
служить связывание третьего компонента комплемента
такими поперечно сшитыми полисахаридами, как сефа-
роза и сефадекс. Последние служат излюбленным носи-
телем для самых разнообразных сорбентов, применяе-
мых в целях аффинной хроматографии. Если сорбент на
основе этих носителей применяется для извлечения како-
245
го-то белка из плазмы или сыворотки крови, может про-
исходить неспецифпческая сорбция третьего компонента
комплемента.
12.3.	Регистрация реакции антиген
(гаптен)-антитело
Разнообразие методов очень велико.
Все их можно разделить на две группы в зависимости
от того, оценивается ли реакция с одновалентным гап-
теном или поливалентным антигеном. В случае реакции
антител с одновалентными гаптенами видимых превра-
щений образующегося комплекса не происходит. В силу
этого для его обнаружения приходится прибегать к раз-
личным физико-химическим пли химическим методам,,
позволяющим оценить молекулярную массу, оптические,
электрохимические или другие свойства реагирующих
соединений и их комплексов. Что касается реакции по-
ливалентных антигенов с антителами, то она может быть
проведена при таких соотношениях реагентов, при кото-
рых возникнут легко регистрируемые визуально продук-
ты: агглютинаты клеток, белковый преципитат (осадок).
Система может быть усложнена за счет комплемента, и
тогда о результатах реакции судят по убыли комплемен-
та в результате его связывания комплексом антиген-ан-
титело.
Реакция гаптен-антитело. Равновесный диализ и его
модификации. Техника постановки реакции состоит в
следующем. В двухкамерном сосуде камеры разделены
мембраной, проницаемой для низкомолекулярного гап-
тена, но не антитела. Гаптен и антитело помещают в
разные камеры. За счет диффузии гаптен, проходя через
мембрану, переходит в камеру с антителом к нему и вза-
имодействует с антителом. В результате в камере, содер-
жащей антитело, будет находиться как связанный, так и
свободный гаптен. Количество последнего после установ-
ления равновесия окажется равным количеству гаптена
в камере, не содержащей антитела. Следовательно, в
камере, содержащей антитело, возникнет инкремент кон-
центрации гаптена, равный его количеству, связанному
антителом. Зная содержание антитела в молях и опре-
делив содержание свободного и связанного гаптена,
можно определить константу равновесия (К) из урав-
нения: rfc=nK—гК, где г—число молей гаптена на
моль антитела, с—молярная концентрация свободного
246
гаптена, п — число активных центров в молекуле анти-
тела. Не обсуждая здесь методы регистрации концент-
рации гаптена (см. ниже), отметим, что отношение г, К
и с нелинейно вне зависимости от степени чистоты анти-
тел в том случае, если последние немоноклональны или,
иными словами, неоднородны по степени сродства к гап-
тену. Следовательно, оперируя поликлональными анти-
телами, можно определить среднее значение величины К
для всей совокупности активных центров. Степень неод-
нородности антител по величине сродства к гаптену (ин-
декс гетерогенности а) можно вычислить по формуле
logr(/z—г) = a log Ко + а log с. Значение величины а = 0,7
достаточно типично. При этом около 25% активных
центров имеет величину константы равновесия, в шесть
раз превышающую среднюю константу связывания Ко-
Остальные 75% антител имеют величины К в пределах
между Ko/Q и 6Ко- Только для моноклональных антител
величина а принимает значение, равное 1.
Сказанное выше применимо также и к оценке резуль-
татов реакции гаптен-антитело другими методами.
Весьма удобная модификация метода равновесного
диализа была предложена Г. Фаирчло и Дж. Фрутоном
(G. Fairchlough, J. Fruton, 1968). Приводим краткое опи-
сание метода. В колонку с сефадексом G-25, уравнове-
шенным раствором, содержащим гаптен (например, ди-
нитрофениллпзин), вносят порцию антител к гаптену.
Для вымывания антител из колонки используют раствор
гаптена той же концентрации, что и в колонке. На стар-
те антитела связывают определенное количество гапте-
на и, перемещаясь в колонке, все время создают в той
зоне, где находятся, инкремент концентрации гаптена.
В то же время в той зоне, откуда антитела ушли, обра-
зуется отрицательный инкремент концентрации гаптена,
и эта зона перемещается вслед за зоной, где находятся
антитела. Перемещение зоны с отрицательным инкре-
ментом концентрации гаптена (или «ямы») соответству-
ет скорости гель-фильтрации гаптена. Профиль элюции
представлен на рис. 54. Оценив по величине отрицатель-
ного инкремента количество - связанного гаптена (г),
можно рассчитать константу равновесия.
Метод равновесного диализа в его различных моди-
фикациях — общепринятый способ оценки реакции анти-
тел с простыми гаптенами. Его чувствительность зависит
только от чувствительности методов оценки концентра-
ции гаптена. Наиболее чувствительным, разумеется, яв-
247
Рис. 54. Гель-фильтрация антител
против динитрофенильной группы на
колонке с сефадексом G-25, уравно-
вешенным буферным раствором, со-
держащим динитросренпллизин:
/ — определение оптической плотности
проб при 360 нм (пик поглощения дини-
трофенильной группы), II—дифференци-
альная спектрофотометрия проб при
280 нм против буфера, содержащего дини-
трофенил лизи н
ляется радиоизотопная техника с использованием мечен-
ных радиоактивными изотопами гаптенов.
Оптические методы. С помощью оптических методов
можно охарактеризовать изменения оптических свойств,
гаптена после образования им комплекса с антигеном.
При реакции антител
с динитрофенил(три-
нитрофенил) лизином в
спектре поглощения
гаптена происходят ха-
рактерные изменения.
С помощью дифферен-
циальной спектрофото-
метрии удается зареги-
стрировать длинновол-
новое (красное) смеще-
ние спектра поглоще-
ния нптрофенильной
группы. Это явление,
которое впервые на-
блюдали Дж. Литл и
X. Айзен (J. Litle,
И. Eisen, 1968), обус-
ловлено образованием
комплекса с переносом
электрона между остат-
ком триптофана в ак-
тивном центре антитела
и нптрофенильной груп-
пой, являющейся акцеп-
тором электрона. Хотя
метод позволяет зареги-
стрировать взаимодействие гаптена с антителом, он мало
применим для изучения кинетики реакции. Следует заме-
тить, что степень переноса электрона, а следовательно, и
характер спектра неодинаковы у антител к нитрофениль-
ной группе от животных разных видов, что само по себе
затрудняет сравнительный анализ.
Гаптены, являющиеся производными фолиевой кисло-
ты, также образуют в активном центре комплексы с ос-
татком триптофана по типу комплекса с переносом элек-
трона. Акцептором электрона в молекуле гаптена высту-
пает птеридиновая группа, а донором электрона — оста-
ток триптофана.
248
Реакция гаптена с антителом может быть зарегистри-
рована с помощью техники спектрофлуорометрии. Как
известно, флуоресценция триптофансодержащих белков
обусловлена почти исключительно индольными остатка-
ми триптофана. Последние, находясь в неполярном мик-
роокружении, флуоресцируют с максимумом при 330 нм
в случае облучения белка ультрафиолетом с длиной вол-
ны 270—290 нм. Если в активном центре антитела нахо-
дится гаптен, одна из полос в спектре поглощения кото-
рого совпадает с полосой поглощения триптофана,
происходит тушение флуоресценции триптофана, содер-
жащегося в молекуле антитела, а следовательно, флуо-
ресценции собственно молекулы антитела (S. Velick et
al., 1963). Такой феномен наблюдается при взаимодей-
ствии нитрофенильных гаптенов с направленными к ним
антителами. Степень тушения достигает 70% для нерас-
щепленного антитела и 90% для его Fab-фрагмента.
Чувствительность метода при использовании чистых ан-
тител очень велика: на одно определение достаточно
50 нг антител.
Тушение флуоресценции антител с помощью гаптена
не обусловлено прямым контактом гаптена с хромофо-
ром. Тем не менее существует тесная связь между срод-
ством антител к гаптену и эффективностью тушения
флуоресценции антитела. Возможно, большая часть ос-
татков триптофана в молекуле антитела осуществляет
безизлучательный переход из возбужденного в основное
состояние, передавая энергию одному пли нескольким
остаткам триптофана в районе активного центра; по-
следние отвечают за флуоресценцию всей молекулы.
Эффективность тушения флуоресценции зависит от
числа остатков триптофана в активном центре антитела.
Их число больше у антител с высокой степенью сродства
к гаптену. В случае антидинитрофенильных антител раз-
личия в числе остатков триптофана в антителах высоко-
го и низкого сродства достигают четырех остатков на
моль.
Спектрофлуорометрия может быть использована для
оценки взаимодействия некоторых полициклических
флуоресцирующих красителей (как гаптенов) со своими
-антителами. Эти соединения характеризуются свойством
при переходе из водной среды в неполярное микроокру-
жение резко увеличивать квантовый выход флуоресцен-
ции. Примером может служить 4-анилинонафталин-суль-
фонат (АНС):
249
4-Анилинонафгалин-!-сульфонат
(АНС)
При взаимодействии АНС со своими антителами ин-
тенсивность флуоресценции гаптена существенно возрас-
тает наряду с коротковолновым смещением спектра флу-
оресценции. Метод очень чувствителен и позволяет ре-
гистрировать реакцию при концентрации антител 10-5
моль и ниже. При этом удается оценить связывающие
свойства антител, сродство которых к лиганду порядка
102—104 M-i
Радиоспектроскопия. Синтез стабильных нитроксид-
ных (иминоксильных) радикалов с различными реакци-
онноспособными группами позволил использовать их, в
частности, для метки гаптенов. Нитроксидные радикалы
содержат неспаренный электрон и могут быть охаракте-
ризованы методом электронно-парамагнитного резонан-
са (ЭПР). Спиновая метка была впервые использована
Л. Стриером и О. Гриффитом (L. Stryer, О. Griffith,
1965) для получения иминоксильных производных дпнп-
тробензола:
Динитрофени.тьное производное
аитроксидного (иминоксильного) радикала
При взаимодействии этого соединения с антидинитро-
фенильными антителами спектр иминоксилыюго радика-
ла, полученный с помощью радиоспектрометра, изменял-
ся. Эти изменения можно было связать с уменьшением
вращательной свободы радикала, наблюдаемым, в част-
ности, при замораживании водного раствора радикала.
250
На основании этих данных была разработана техника
оценки реакции гаптен-антитело методом ЭГ1Р. Данные,
полученные этим и другими методами, совпадают.
Рассматриваемая техника может быть использована
для оценки реакции антитез с самыми разнообразными
гаптенами при условии, что при связывании гаптена в
активном центре антитела будет происходить частичная
или полная иммобилизация иминоксильной метки. Дж.
Сиа и Л. Пьете (J. Hsia, L. Piette, 1969) применили
метод для изучения кинетики реакции р-азобензойной
кислоты и р-азофенилтрпметиламмонпя с соответствую-
щими антителами. При этом оказалось, что существует
прямая зависимость между степенью сродства антител к
гаптену и степенью иммобилизации метки.
Метод нашел практическое применение, в частности,
для массового иммунологического определения морфина
в моче (США). К наркотику были получены антитела и
использованы в тест-системе после присоединения ими-
иоксильного радикала. Пробы мочи освобождали от со-
ли и добавляли к антителам против морфина. Если в
моче содержался наркотик, он блокировал активные
центры антител. Тогда добавленный в качестве компо-
нента тест-системы морфин, меченный имипоксильным
радикалом, оставался несвязанным и спектр метки соот-
ветствовал спектру иминоксила в растворе. При отсутст-
вии морфина в моче происходила иммобилизация имино-
ксила. входящего в состав тест-гаптена.
Меченные импнокспльпыми радикалами гаптены на-
шли применение в изучении размера полости активного
центра антитела (J. Hsia, L. Piette, 1969). Готовили про-
изводные гаптена (например, динптрофенильного), отли-
чающиеся между собой длиной алифатической цепи, к
одному концу которой присоединяли динитрофенильную
группу, а к другому — иминоксильную группу. Длина
соединяющей две группировки «ножки» варьировала от
0,8 до 1,7 нм. При длине «ножки» вместе с динитрофе-
нильной группой, равной 1,0 нм, вращательные движе-
ния иминоксильного радикала в присутствии динитрофе-
нильиых антител существенно ограничивались. Это сви-
детельствовало в пользу иммобилизации радикала в ак-
тивном центре антитела. Но стоило увеличить длину
ножки еще на 0,2 нм, как ограничения для вращатель-
ных движений радикала резко уменьшались. Из этих
опытов следовало, что протяженность центра для динит-
рофенил ьной группы составляет 1,0—1,2 им.
251
питируют антиген антитела
j в В
ь*-------*-!-<
+ + + ±---------------1
-------------±+ + + 2
I___I_____I----1----1----L—-I
О	2	Ч	6	6	10
Номера про5 с возрастающим
количеством антигена,
Рис. 55. Реакция количествен-
ной преципитации:
1 — содержание в пробах свободно-
го антитела, 2 — содержание в
пробах свободного антигена; а—
зона избытка антитела, б — зона
эквивалентности, в — зона избытка
антигена
чие свободных антигена и
Реакция антиген-антитело. Преципитация. Образова-
ние нерастворимого комплекса при смешивании высоко-
дисперсного антигена с антителами называют преципи-
тацией. Этот феномен достаточно сложен по своему
механизму. Выяснено, что наиболее эффективно прени-
М-класса. К ним приближа-
ются по активности антите-
ла, принадлежащие к имму-
ноглобулинам класса G.
М. Гейдельбергер и Д. Кен-
далл (М. Heidelberger,
D. Kendall, 1937) разработа-
ли количественный метод ре-
акции преципитации и опи-
сали основные закономерно-
сти реакции применительно
к антителам IgG-класса.
В том случае, когда к
постоянному количеству ан-
титела добавляют возраста-
ющие количества антигена,
количество преципитата бу-
дет возрастать до определен-
ного максимума. Затем с
увеличением дозы антигена
количество преципитата нач-
нет уменьшаться вплоть до
его полного исчезновения
(рис. 55). Удалив преципи-
тат, в надосадочной жидко-
сти можно определить нали-
антитела. Опыт показывает,
что в пробах, соответствующих левой части кривой
(прежде всего в начальной ее части), весь добавленный
антиген находится в преципитате, а в надосадочной жид-
кости присутствуют антитела. В точке, соответствующей
максимальному содержанию преципитата, весь добав-
ленный антиген и все антитела, содержавшиеся в пробе,
находятся в преципитате. В пробах, соответствующих
правой части кривой, в надосадочной жидкости содер-
жится свободный антиген. Соотношение реагентов, соот-
ветствующее образованию максимального количества
преципитата, называют точкой эквивалентности. Опреде-
лив в этой точке содержание белка в преципитате и вы-
252
чтя из полученной величины количество добавленного
антигена (если это белок), получают содержание анти-
тел в анализируемом объеме антисыворотки.
Приведенные выше расчеты основаны на теории ко-
личественной преципитации, разработанной М. Гейдель-
бергером и Д. Кендаллом. Ими впервые доказано,
что в состав преципитата не вовлекаются никакие сыво-
роточные белки, за исключением антител. Разумеется, в.
состав преципитата могут быть вовлечены компоненты
системы комплемента: Clq и СЗЬ. Чтобы исключить это,
из сыворотки предварительно удаляют комплемент (на-
пример, другим иммунным комплексом) или инактиви-
руют его прогреванием сыворотки при 56СС в течение
30 мин.
Содержание антител в пробе, соответствующей лю-
бой точке зоны избытка антител, можно определить по
формуле АЬп=ах— Ьх2, где АЬп — количество антител в
преципитате, х — количество добавленного антигена, а и
b — константы, величины которых находят по графику.
Величину а находят по точке пересечения экспоненты с
осью ординат. Величина b равна тангенсу угла наклона
экспериментальной кривой к оси абсцисс.
Выразив отношение АЬп/х через R, значение АЬп на-
ходят из уравнения Abn=2Rx— R2a2iA, где А — количе-
ство преципитата в точке эквивалентности.
Указанное уравнение основано на законе действую-
щих масс. Оно применимо для описания реакции количе-
ственной преципитации только в зоне избытка антител и
точке эквивалентности.
Реакция количественной преципитации является пер-
вой иммунологической реакцией, учет результатов кото-
рой является строго количественным, поскольку без
количественного учета реакций невозможно введение хи-
мических представлений в любую биологическую дис-
циплину.
Реакция преципитации не принадлежит к числу чув-
ствительных реакций определения антител (антигена).
Если концентрация антител в пробе ниже 0,5 мг/мл, пре-
ципитат образуется медленно. Для полноты осаждения
комплекса пробы приходится'оставлять на холоду на не-
сколько суток. При низкой концентрации антител преци-
питат вообще не выпадает. Однако агрегация антител
антигеном все же идет и, чтобы ее оценить, прибегают
к технике нефелометрии. Прибор основан на оценке сте-
пени рассеивания света, в качестве источника которого
253
служат либо ртутные лампы, либо лазеры. Благодаря
большой мощности монохроматического излучения, обес-
печиваемого лазером (например, гелий-неонового),
удается зарегистрировать даже небольшую степень рас-
сеяния света.
Согласно принятой технике нефелометрии оценивают
интенсивность светорассеяния при соотношении антиген-
антитело, соответствующему зоне избытка антител.
В этом случае метод используют для количественного
определения не антител, а антигена. Время предвари-
тельной инкубации смеси реагентов от нескольких минут
до 1 ч.
Изучение теоретических основ реакции преципитации
оказалось важной вехой как в изучении строения и
свойств антител, так и в исследовании механизма реак-
ции антиген-антитело. Имеются основания утверждать,
что при взаимодействии антител с поливалентным анти-
геном происходит образование «решетки», напоминаю-
щей кристаллическую (рис. 56). По данным электронной
микроскопии, антитела, участвующие в формировании
пренипитата, имеют Т-образную форму, т. е. угол между
Fab-участками молекулы достигает 180°. Это существен-
но для формирования самой решетки и придания ей до-
статочной степени жесткости. Важная роль принадле-
жит при этом району «талии». При разрушении меж-
цепьевых дисульфидных связей в этом районе антитела
еще сохраняют способность преципитировать антиген, по
время формирования преципитата резко возрастает.
Необходимо подчеркнуть, что антитела разного видо-
вого происхождения, относящиеся к иммуноглобулинам
G, по-разному ведут себя в реакции преципитации. Так,
комплексы, образованные антителами лошад i против
белковых антигенов (например, против бактериальных
токсинов), растворимы в избытке антитела (феномен
прозоны). Это можно связать с большим электрическим
зарядом IgG-антител лошади в сравнении с IgG-антите-
лами кролика той же специфичности и, как следствие
этого, их большей растворимостью.
Реакция преципитации в геле^ Преципитация комп-
лекса антиген-антитело непосредственно в инертном ге-
ле (как правило, агаре или агарозе) нашла широкое
применение для анализа антигенов. Современные моди-
фикации метода основаны на том, что взаимодействие
антигена и антитела происходит непосредственно в тол-
ще геля, куда реагирующие соединения поступают за
254
счет диффузии. Для этого гель не должен быть слишком
плотным, обычно готовят 0,7—1,0%-ные гели.
Широко используемый метод ^двойной диффузии в
агаре^ предложенный О. Ухтерлони (О. Ouchterlony,
1948), состоит в том, что антиген (ы) и антитело (а) по-
мещают в лунки, проделанные в тонком слое геля на
Рис. 56. Структура комплекса, образованного IgW
антителами н поливалентным антигеном (эритроцит):
Э — эритроцит, Д — детерминанта антигена, Ат — антитела
небольшом расстоянии друг от друга. Диффундируя в
гель, антиген и антитело встречаются и возникающие
комплексы образуют преципитат. Преципитат форми-
руется в виде тонкой линии, когда соотношение реаген-
тов близко к точке эквивалентности. Зона преципитации
проницаема для антигенов и антител, не взаимодейст-
вующих с теми, которые образовали преципитат. Б ре-
зультате может образоваться несколько зон преципита-
ции, каждая из которых соответствует индивидуальному
антигену и антителам к нему. Положение зоны преципи-
тации относительно лунок с антигеном и антителом за-
255
висит от двух факторов: коэффициента поступательной
диффузии данного вещества и его концентрации. Коэф-
фициент диффузии определяется, как известно, разме-
ром и формой молекулы. Концентрационная зависимость
зоны преципитации определяется необходимостью дости-
жения эквивалентных отношений реагентов для эффек-
тивного формирования преципигага.
Помимо выявления антигенной неоднородности ме-
тод двойной диффузии в геле позволяет сравнить анти-
генное строение нескольких веществ и выявить наличие
сходства и различий между ними. Как всякий иммуно-
логический метод, метод двойной диффузии в геле имеет
ограничения, основное из которых — спектр антител в ис-
следуемой антисыворотке. Так, в ранних работах при
сравнительном изучении антигенного строения IgG кро-
лика и его Fab- и Fc-фрагментов использовали антисы-
воротку против IgG кролика, полученную от коз. Иссле-
дователям не было тогда известно, что животные этого
вида не образуют практически антител против детерми-
нант Fab-участка молекулы. Поскольку при использова-
нии этой антисыворотки Fc-фрагмент давал реакцию ан-
тигенной идентичности с нерасщепленной молекулой
IgG, сделали ошибочное заключение об отсутствии в
Fab-участке видоспецифическпх антигенных детерми-
нант. Ошибка была исправлена после исследования
фрагментов молекулы IgG с помощью антииммуногло-
булиновых сывороток, полученных от животных других
видов. В антисыворотке осла против IgG кролика содер-
жится примерно равное количество антител против анти-
генных детерминант Fab- и Fc-участком. На этом при-
мере можно еще раз убедиться в необходимости исполь-
зования при антигенном анализе антисывороток,
полученных от животных разных видов (см. гл. 2).
Одним из часто применяемых в настоящее время ва-
риантов реакции преципитации в геле является метод
радиальной им мунодцффузи и. Он был разработан
Дж. Фэйи (J7~Fahey, 1965) и Г. Манчини (G. Mancini,
1965) для количественного определения антигенов. При
постановке реакции этим методом первоначально гото-
вят гель, содержащий антисыворотку в разведенном ви-
де (1 : 50— 1 : 200). В тонком слое такого геля продеты-
вают лунки, в которые вносят антиген в различных кон-
центрациях. Диффундируя в гель, антиген реагирует с
содержащимися в нем антителами и образует преципи-
тат в форме кольца вокруг лунки с антигеном. Так как
256
преципитат выпадает при эквивалентных соотношениях
реагентов, диаметр кольца будет неодинаков вокруг лу-
нок, содержащих различные количества антигена. Чем
больше концентрация антигена, тем больший диаметр
будет у образующегося кольца преципитации (рис. 57).
Л
Рис. 57. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. А — зоны
преципитации в форме колец; Б — график зависимости диаметра
зон преципитации от концентрации антигена
Сравнивая кольцо преципитации образца антигена, кон-
центрация которого не известна, с кольцами преципита-
ции стандартного антигена, по калибровочной кривой
находят его концентрацию. Метод особенно широко при-
меняется с тех пор, как ряд фирм стал выпускать гото-
вые пластины геля с антисыворотками и необходимые
стандарты.
^Иммуноэлектрофорез. Метод, введенный П. Грабаром
(Р. Grabar et al., 1956), сочетает высокую разрешаю-
щую способность электрофоретического анализа макро-
молекул со специфичностью их выявления с помощью
реакции преципитации в геле. Исследуемый образец под-
вергают электрофорезу в геле агара или агарозы. Затем
параллельно оси движения исследуемых веществ в элек-
трическом поле проделывают в геле траншею и заполня-
ют ее антисывороткой. При встречной диффузии в геле
9—1258
257
антитела и антигены, подвергнутые электрофоретическо-
му разделению, образуют зоны преципитации в форме
дуг.
Существует большое число модификаций основного
метода, имеющих целью повысить его чувствительность.
К ним относятся противоточный и двухмерный электро-
форез, радиоиммуноэлектрофорез и др.
Агглютинация. Агрегация низкодисперсных (нераст-
воримых) антигенов с помощью антител называется аг-
глютинацией. Антигенами могут быть бактерии, клетки
крови (чаще всего эритроциты), другие клетки. Если ан-
титела направлены против антигенов, являющихся со-
ставной частью бактериальной стенки или клеточной
мембраны, реакцию обозначают как активную (активная
агглютинация). Пассивной называют агглютинацию кле-
ток антителами против антигенов, сорбированных или
присоединенных ковалентно к клеточной мембране
(обычно эритроцита). Во всех случаях, когда речь идет
об агглютинации эритроцитов, реакцию называют гемаг-
глютинацией (активная или пассивная).
Реакция агглютинации по своему механизму не от-
личается от реакции преципитации. «Сшивка» бивалент-
ными или поливалентными антителами (IgG или IgM)
приводит к формированию «решетки» (см. рис. 21).
В силу несоизмеримо больших размеров корпускуляр-
ного антигена по сравнению с молекулой антитела попе-
речная сшивка, например, двух соседних эритроцитов
может оказаться недостаточной для их фиксации. Устой-
чивость агрегата растет по мере формирования «решет-
ки», обеспечивающей связывание клеток по многим точ-
кам. Именно поэтому поливалентные антитела намного
эффективнее агглютинируют антигены в сравнении с би-
валентными. Так, IgM-гемагглютинины более чем в
1000 раз активнее в реакции гемагглютинации, чем IgG-
гемагглютинины.
Реакция агглютинации не имеет строго количествен-
ного учета. Однако практическая ценность ее столь вели-
ка, что и по сей день она остается важным инструмен-
том как в руках исследователя, так и врача-лаборанта.
Активную агглютинацию используют в практических
целях для определения групп крови, в диагностике ин-
фекционных заболеваний.
Пассивная гемагглютинация — наиболее распростра-
ненный вариант реакции агглютинации, применяемый
главным образом в исследовательской работе. Фиксация
258
растворимых белковых антигенов на поверхности эри-
троцитов осуществляется разными способами. Некоторые
способы основаны на предварительной обработке эритро-
цитов химическими соединениями, повышающими срод-
ство поверхности клетки к белкам. Чаще всего эритроци-
ты обрабатывают танином, СгС1з- В других случаях
Рис. 58. Присоединение к поверхности эритроцита белкового анти-
гена с помощью бис-диазобензидина (БДБ)
«пришивают» белковый антиген к поверхности эритро-
цита бифункциональными соединениями, в числе кото-
рых глутаровый альдегид, диазотированный диаминоди-
фенила.мин, водорастворимые карбодиимиды (рис. 58).
Для получения эритроцитов, «покрытых» полисахарид-
ным антигеном, достаточно проинкубировать их в ра-
створе полисахарида: полисахарид адсорбируется на по-
верхности эритроцитов, не подвергнутых какой-либо об-
работке. Гаптены, содержащие реакционноспособные
группы, можно ковалентно присоединять к поверхности
эритроцита. Так, при обработке эритроцитов динитрофе-
нилсульфоновой кислотой к их. поверхности через свобод-
ные аминогруппы присоединяются динитрофснильныс ра-
дикалы.
Антитела также фиксируют на поверхности эритроци-
тов. Сенсибилизированные антителами эритроциты аг-
глютинируют в присутствии антигена и, следовательно,
могут быть использованы для обнаружения антигенов.
9*
259
Для большей доступности активных центров антител их
присоединяют к поверхности клетки через «ножку». Один
из вариантов такого метода (А. Словников, 1968) связан
с предварительной агрегацией иммуноглобулинов глута-
ровым альдегидом и последующей фиксацией агрегатов
на обработанных глутаровым альдегидом эритроцитах
(агрегат-агглютинация).
Реакция связывания комплемента (PCК). Эта реак-
ция относится к чувствительным непрямым методам ре-
гистрации реакции между антигеном и антителом. Она
применима лишь в случае антител, относящихся к клас-
сам IgG и IgM, которые активируют комплемент по
классическому пути.
Реакцию выполняют в два этапа. Первоначально про-
водят реакцию антиген-антитело в присутствии компле-
мента (обычно это сыворотка морской свинки). После
инкубации смеси определяют содержание несвязавшего-
ся комплексом (пе активированного) комплемента с по-
мощью реакции иммунного гемолиза (см. гл. 8).
Количественный вариант реакции связывания комп-
лемента в одной из принятых модификаций (И. Тарха-
нова, А. Коников, 1957) основан на связывании компле-
мента в зоне эквивалентности системы антиген-антитело.
К равным количествам антител добавляют антиген в воз-
растающей концентрации и комплемент. Пробы оставля-
ют на 1 ч при 37°С или на 18 ч при 0°С. Затем в каждой
пробе определяют количество свободного комплемента
по способности последнего лизировать эритроциты бара-
на, сенсибилизированные IgG-антителами кролика про-
тив эритроцитов барана. Количество связанного компле-
мента выражают в СН50, т. е. количестве комплемента,
необходимом для 50%-ного гемолиза сенсибилизирован-
ных антителами эритроцитов. Если выразить графически
зависимость между количеством антигена в пробе и ко-
личеством связанного комплемента, полученная экспери-
ментальная кривая окажется подобной кривой, описы-
вающей зависимость между количеством белка преципи-
тата и количеством добавленного антигена (см. рис. 55
и 59). В одной и той же системе антиген-антитело соот-
ношение реагентов, соответствующее образованию мак-
симального количества преципитата, с одной стороны, и
максимальному количеству связанного комплемента, с
другой, обычно совпадают. Однако в отличие от реакции
преципитации РСК чувствительнее по меньшей мере в
50—100 раз, т. е. во столько раз можно развести анти-
260
со
12-
ю-
в ~
6 ~
4 -
59.
Рис.
мента в
—I—।—i___I__I_। । ।
0,5 1ft 2,0 4,0 8,0 16,0 ttp ЬЧр
Количество антигена, мкг
Реакция связывания компле-
количественной модификации


$
сыворотку и во столько же раз уменьшить дозу антигена
по сравнению с реакцией количественной преципитации,
чтобы количественно охарактеризовать связывание комп-
лемента в точке эквивалентности системы.
Связывание комплемента иммунным комплексом, со-
держащим эритроциты, нашло широкое применение для
обнаружения клеток, синтезирующих антитела. Метод
локального гемолиза
в геле, предложенный
Н. Ерне (N. Jerne,
С. Henry, 1963), осно-
ван на реакции компле-
мснтзависимого гемо-
лиза эритроцитов после
сенсибилизации эритро-
цитов антителами, про-
дуцируемыми отдель-’
ными клетками. В рас-’
плав агара или агарозы
вносят взвесь клеток
селезенки или лимфо-
узла от животного, им-
мунизированного ксено-
генными эритроцитами.
В агар добавляют также большой избыток тех же эри-
троцитов. Агар разливают тонким слоем в чашки Петри
и инкубируют последние 1 ч при 37° С. За этот срок ан-
тителопродуцирующие клетки секретируют некоторое ко-
личество антител, которые присоединяются к окружаю-
щим клетку эритроцитам. Затем на чашки наслаивают
раствор комплемента и снова инкубируют их при 37° С.
Комплемент диффундирует в агар и, связываясь эритро-
цитами, сенсибилизированными антителами, вызывает их
лизис. При просмотре чашек невооруженным глазом бу-
дут видны круглые зоны просветления в агаре, число ко-
торых соответствует числу антителопродуцирующих кле-
ток. Метод может быть применен для определения кле-
ток, продуцирующих антитела против самых разнообраз-
ных антигенов. Антигены или гаптены при этом фиксиру-
ют на поверхности эритроцитов, засеваемых в агар. Пос-
ле связывания антител против соответствующего антиге-
на эритроциты в присутствии комплемента лизируются
(так называемый пассивный гемолиз).
Радиоиммунологические методы. Это наиболее чувст-
вительные из широко используемых в лабораторной
261
практике методов регистрации реакции антиген-антите-
ло. Существует много модификаций метода, но принцип
един: либо антиген, либо антитела метят радиоизотопа-
ми и судят о протекании реакции, измеряя радиоактив-
ность водонсрастворимого комплекса.
Чаще всего в настоящее время антиген или антитела
метят радиоактивным иодом (1251). Иод включается по
остаткам тирозина, причем, как правило, образуется ди-
иодтирозин. При этом стремятся ввести в молекулу ан-
титела (белковый антиген) следовые количества иода —
несколько атомов на молекулу. В противном случае мо-
жет произойти значительное изменение структуры и
свойств антитела или антигена.
Самый простой случай применения радиомечсного ан-
тигена, например сывороточного альбумина,— определе-
ние антител к этому антигену в исследуемой антисыво-
ротке. Меченый 1251-альбумин прибавляют к антисыво-
ротке. Смесь инкубируют около 1 ч, после чего осаждают
сывороточные иммуноглобулины сульфатом аммо-
ния при 40%-ном насыщении. Поскольку альбумин нс
осаждается указанными концеиграциями сульфата ам-
мония, его присутствие в преципитате может быть след-
ствием только формирования комплекса между альбуми-
ном и антителами к нему.
Часто радиоиммунный анализ основан на принципе
конкуренции меченого антигена с немеченым. Например,
требуется установить, содержится ли в изучаемом препа-
рате данный антиген? Существует тест-система, состоя-
щая из такого же антигена, меченного радиоактивным
подом, и антител к нему. Исследуемый препарат инку-
бируют первоначально с антителом, а затем добавляют
меченый тест-антиген. Затем иммунный комплекс осаж-
дают либо сульфатом аммония, либо антииммуноглобу-
линовой сывороткой. Если радиоактивность в опытной
пробе ниже, чем в контрольной (где содержатся только
компоненты тест-системы), значит в изучаемом образце
содержится антиген, сходный или идентичный радиомс-
ченому антигену тест-системы. Тот же метод может быть
построен на принципах иммуносорбции с использованием
иммобилизованных антител. При этом отпадает необхо-
димость осаждения иммунного комплекса. Методы, ос-
нованные на принципе конкуренции, нетрудно выполнить
на количественной основе. Именно таким способом мо-
гут определяться различные гормоны, причем в количе-
262
ствах, не выявляемых ни одним из известных биохимиче-
ских методов (от 1 до 100 иг вещества).
В биохимии часто возникает задача изучения скоро-
сти биосинтеза различных биологических макромолекул.
Новообразованное вещество, включившее в процессе био-
синтеза радиомеченые предшественники (меченные по
,4С или 3Н аминокислоты, пуриновые или пиримидино-
вые основания, сахара), можно выявить с помощью той
или иной модификации метода радиоиммунного анализа.
При этом наиболее целесообразно использовать антите-
ла против изучаемого вещества, иммобилизованные на
инертном носителе. Ряд примеров такого анализа приво-
дился выше, в частности метод определения скорости
биосинтеза Clq (см. гл. 8). Практически методом радио-
иммунного анализа можно определить место биосинтеза
и скорость биосинтеза любого органического соединения,
против которого можно получить антитела.
Метод инактивации фага. Метод разработан в лабо-
ратории М. Села в конце 60-х годов. Этот метод являет-
ся, видимо, наиболее чувствительным среди других им-
мунологических методов. Чисто теоретически с его по-
мощью можно обнаружить всего несколько молекул
антител или антигена. Принцип метода состоит в инакти-
вации бактериофага, конъюгированного с определенным
антигеном, при помощи антител против этого антигена.
Фаг конъюгируют с антигеном (например, инсулином,
ангиотензином), используя глутаровый альдегид, водо-
растворимые карбодиимиды или другие реаюнты. Конъ-
югацию проводят в мягких условиях, чтобы не инактиви-
ровать фаг. При постановке опыта конъюгированный
фаг и антитело против присоединенного к нему антигена
смешивают с бактериальными клетками-мишенями и за-
ключают в тонкий слой мягкого агара. В качестве конт-
роля используют только конъюгированный с антигеном
фаг. В контроле фаг, заражая бактериальные клетки,
вызывает их гибель. При этом вокруг каждой фаговой
частицы образуется зона просветления в агаре — бляш-
ка (plaque). В опыте за счет взаимодействия антител с
антигеном, фиксированным на поверхности фаговой ча-
стицы, фаг утрачивает способность заражать бактери-
альные клетки. В силу этого число бляшек в опытной
пробе меньше, чем в контрольной. В качестве примера
приведем определение этим методом простагландинов.
С помощью антител против простагландина Ига и бакте-
риофагов, конъюгированных с простагландинами, можно
263
определить 140 пг простагландина Ега и 7><Ю4 пг про-
стагландина Еь Принцип определения ничем не отли-
чается от обсуждавшегося в предыдущем разделе прин-
ципа конкуренции антигенов за антитело тест-системы.
Различия в чувствительности определения сравниваемых
простагландинов прямо коррелируют со степенью их
структурных отличий (напомним, что антитела были на-
правлены против простагландина Ега).
Метод инактивации фага достаточно трудоемок и мо-
жет быть использован только для решения определенных
исследовательских задач.
Иммуноферментный анализ. лМетод широко внедрен в
лабораторную практику в последнее время. В основе ме-
тода— использование антител, меченных ферментами
(чаще всего пероксидазой). Конъюгацию осуществляют
глутаровым альдегидом или другим бифункциональным
реагентом. Реакцию проводят в условиях, исключающих
инактивацию фермента. Техника постановки реакции со-
стоит в следующем. Антиген адсорбируют на поверхно-
сти лунок в пластинах из полистирола. Если антитела,
меченные ферментом, направлены к адсорбированному
антигену, они окажутся фиксированными в лунках. За-
тем в лунки вносят раствор субстрата (если к антителам
присоединена пероксидаза, то это перекись водорода и
индикатор — диаминобензидин). В результате фермента-
тивного превращения субстрата появится цветной про-
дукт. Степень окраски пропорциональна количеству сор-
бированных антител с ферментом.
Иммуноферментный метод пригоден для определения
как антител, так и антигенов в исследовательских лабо-
раториях и клинике. Он не требует дорогостоящего обо-
рудования и во многих случаях может с успехом заме-
нить радиоиммунологические методы.
12.4.	Иммунохимические методы
в биохимии
В этом разделе будут приведены не-
сколько выразительных, примеров использования мето-
дологии современной иммунохимии для решения акту-
альных задач молекулярной биологии и классической
биохимии.
Выделение высокоочищенных мРНК. Сущность под-
хода состоит в использовании антител против соответст-
вующего белка для извлечения полирибосом, содержа-
264
ших растущую полипептндиую цепь этого белка. Экспе-
риментально доказано, что растущая цепь приобретает
антигенную специфичность, характерную для этого бел-
ка, очевидно, за счет постепенного (начиная с N-конца)
формирования ею третичной структуры. Извлечение по-
лирибосом может быть осуществлено с помощью техни-
ки иммуносорбции при использовании иммобилизован-
ных антител (см. раздел 12.2) или путем преципитации
комплекса антитело — растущая полипептидная цепь —
полисома с помощью антииммуноглобулиновых антител
(I. Schechter, 1972). Выделение мРНК из преципитата
осуществляется па основе общепринятых методов.
Изучение топографии компонентов рибосом. Эта за-
дача служит важной составной частью изучения пробле-
мы биосинтеза белка. Одни из перспективных подходов
для ее решения — иммуноэлектронная микроскопия. На-
пример, с 'помощью антител против определенного рибо-
сомного белка можно специфически «сшить» соответст-
вующие рибосомные субчастицы. Выделив затем диме-
ры «сшитых» бивалентными IgG-антителами субчастиц,
их изучают с помощью электронной микроскопии и опре-
деляют локализацию соответствующего белка.
Описанная выше схема исследования по ряду причин
недостаточно эффективна. Во-первых, таким способом
нельзя решить важный вопрос о расположении в субча-
стице РНК, прежде всего ее концевых участков, так как
получить к ним антитела при иммунизации собственно
РНК невозможно. Во-вторых, достаточно трудно полу-
чить в иммунохимически чистом виде различные белки,
входящие в состав рибосомы, что позволило бы иметь
антитела к строго определенному белку. Обе эти трудно-
сти можно обойти в случае модификации рибосомной
РНК и белков гаптенами и последующей димеризации
рибосомных частиц антителами против этих гаптенов.
В качестве примера подобного исследования можно при-
вести работу, выполненную И. Шатским, М. Кожухаро-
вой, Л. Мочаловой и А. Богдановым (1978—1982).
С целью локализации З'-конца 16S РНК малой суб-
частицы рибосомы Е. coll его модифицировали гаптеном
на основе лактозы. В состав гаптена входила алифати-
ческая аминогруппа. После окисления цис-гликольной
группы рибозы в 16S РНК образующийся диальдегид
обрабатывали гаптеном: 6-N-[p- (D-лактозил) -бснзпл]-6-
аминогексиламин и восстанавливали образующееся ос-
нование Шиффа боргидридом. Модифицированную таким
265
способом РНК использовали для реконструкции 30S суб-
частицы. Реконструированные субчастицы обрабатыва-
ли IgG-антилактозидными антителами кролика. При гра-
диентном центрифугировании обработанных подобным
способом субчастиц появлялся «тяжелый» компонеш с
коэффициентом седиментации около 40S. Агрегация ре-
конструированных субчасгиц носила строго специфиче-
ский характер, т. е. была обусловлена антителами к лак-
тозиду, которые взаимодействовали с группировками
гаптена, присоединенными к З'-концам 16S РНК- После-
дующий анализ агрегатов в электронном микроскопе по-
зволил доказать наличие димеров рибосомных часгиц,
«сшитых» антителами, и определить место фиксации по-
следних на субчастице.
С целью разработки метода модификации гаптенами
рибосомных белков был использован белок S12. Исполь-
зовали дпнитрофенильный гаптен, который вводили в мо-
лекулу белка по сульфгидрильным группам. Модифици-
рованный белок использовали для реконструкции 30S
субчастицы. То, что такой белок действительно вошел
при реконструкции в состав субчастицы, было доказано
следующими иммунохимическими методами.
1. Последовательной инкубацией модифицированных
по белку S12 субчастиц с антидинитрофснильными анти-
телами кролика и антителами против IgG кролика, ме-
ченными изотиоцианатом флуоресцеина. После градиент-
ного ультрацентрифугирования методом спсктрофлуори-
метрии было установлено наличие флуорохрома в пике
30S субчастиц. Это доказывает включение модифициро-
ванного белка в реконструированную субчастицу и до-
ступность гаптенной группировки для антител.
2. Обработкой с помощью меченых Fab-фрагментов
антидинитрофснильных антител 30S субчастиц, которые
реконструированы в присутствии белка S12, содержаще-
го динитрофеннльную группу. Радиоактивность была об-
наружена в пике 30S субчастиц.
Тем самым двумя независимыми иммунохимическими
методами доказано включение меченного гаптеном белка
в состав реконструированной рибосомы и доступность
гаптенной группировки для антител. Последнее нашло
также подтверждение в факте формирования димеров
субчастиц, содержащих модифицированный белок S12 в
присутствии антидииитрофенильиых антител.
Метод иммуноэлектронной микроскопии может быть
использован для изучения топографии не только рибо-
266
сом пых частиц, но и самых разнообразных самособнраю-
щихся надмолекулярных структур.
Рецепторы для гормонов. Изучение строения и функ-
ции клеточных рецепторов, в том числе рецепторов для
гормонов,— одна из важных проблем биохимии. Значи-
тельный прогресс этих исследований связан с обнаруже-
нием и изучением свойств аутоантител против клеточных
рецепторов для гормонов. Оказалось, что аутоантитела
к рецептору для инсулина, будучи добавлены к клеткам
печени, вызывают следующие инсулиноподобные эффек-
ты: активируют внутриклеточный синтез гликогена и уси-
ливают транспорт аминокис тот в клетку. Указанные эф-
фекты вызывают только бивалентные антитела или их
бивалентные Р(аЬ/)2-фрагмепты, но не моновалентные
Fab-фрагменты. Последние способны лишь блокировать
связывание инсулина рецепторами (С. Kahn, С. Crunfeld
et al., 1980).
О чем свидетельствуют приведенные данные? Преж-
де всего о том, что важнейшая из известных функций
инсулина — активация синтеза гликогена — зависит от
способности гормона «сшивать» на поверхности клетки-
мпшенп несколько рецепторов для этого гормона. «Сшив-
ка» рецепторов бивалентными антителами имитирует
эффект гормона. Здесь прослеживается прямая аналогия
с влиянием антнидиотипических антител на клетки им-
мунологической памяти. Как обсуждалось в гл. 9, анги-
идиотппическис антитела имитируют в этой ситуации эф-
фект антигена. Иными словами, в обоих сравниваемы?;
случаях очевидно, что роль индуктора (будь то гормон
или антиген) сводится к изменению структурной органи-
зации рецепторов для индуктора на поверхности высоко-
дифференцированной клетки.
Изучение эндокринной регуляции метаболизма с им-
муиохимических позиций получило в последнее время но-
вый существенный стимул. Антитела к некоторым гормо-
нам и медиаторам (инсулину, р-адрснэргическому анта-
гонисту — алпренололу) использовали для получения
антнидиотипических антител и анализировали их способ-
ность конкурировать с некоторыми лигандами или ими-
тировать их действие. Эти антитела реагировали с кле-
точными рецепторами для гормонов или медиаторов
строго специфично, т. е. в зависимости от того, каким по
специфичности антителом они были индуцированы. Су-
щественно, что антиидиотипические антитела против ан-
тител к гормону при добавлении к клеткам имитировали
267
ряд эффектов, инд5 цируемых обычно соответствующим
гормоном (индуктором). Так, антитела против идиоти-
пических детерминант антител к инсулину вызывают по-
добно инсулину усиление поглощения клетками а-амипо-
масляной кислоты (К. Segc, Р. Peterson, 1980). Антитела
против идиотипических детерминант антител к алпрено-
лу, связываясь с р-адренэргическими рецепторами кле-
ток, усиливают активацию аденилатциклазы катехола-
мином (A. Schreiber et al., 1979; Horney et al., 1981).
Из приведенных данных следует, что существует из-
вестное структурное подобие антител к гормонам и кле-
точных рецепторов для гормонов. Посвященные этой те-
ме недавно появившиеся работы, выполненные на стыке
биохимии и иммунохимии, могут стать важным направ-
лением теоретической и прикладной биохимии.
Химия белков и энзимология. Роль иммунохимических
исследований в изучении строения и функции белков со
всей очевидностью вытекает из результатов работ по
анализу антигенной структуры белков, структурно-функ-
циональному изучению антител. Эти вопросы широко ос-
вещались в предшествующих главах. Здесь представ-
ляется целесообразным привести несколько примеров
применения антител для анализа ферментов.
Установлено, что антитела к ферменту способны ока-
зать на него конформируюгцее влияние. Так, антитела к
каталазе способны стабилизировать структуру мутант-
ной формы фермента и повысить его активность. Друюй
пример активирующего действия антител — влияние ан-
тител против рибонуклеазы на частично гидролизован-
ный фермент. Известно, что растепление рибонуклеазы
субтилизином, приводящее к отщеплению N-концевого
пептида из 20 аминокислотных остатков, лишает фермент
активности. Если смешать указанный пептид (S-пептпд)
и остальную часть молекулы (S-бслок, образованный
104 остатками) с антителами против рибонуклеазы, поя-
вится активный фермент, не отличающийся по специфич-
ности от рибонуклеазы (В. Cinadcr, 1971).
Антитела против ферментов не направлены к струк-
турам непосредственно в активном центре, однако они
могут полностью (в случае лецитиназы) пли частично
(в случае уреазы, каталазы, папаина, рибонуклеазы)
экранировать его. В некоторых случаях антитела к фер-
ментам вообще нс оказывают никакого влияния на функ-
цию последних (щелочная фосфатаза, дифенолоксидаза).
Роль антител как стсрического фактора хорошо про-
268
анализирована на примере ацетилхолпнэстеразы. Если
ацетилхолинэстераза из эритроцитов быка не инактиви-
руется антителами против этого фермента, то ацстплхо-
лииэстераза из электрического органа электрического
ската после преципитации специфическими антителами в
зоне эквивалентности проявляет следовую ферментатив-
ную активность. Это выражается в том, что гидролиз
ацетилхолина замедляется примерно в 1000 раз. Если
использовать субстрат с меньшей скоростью диффузии,
чем у ацетилхолина (индофеиилацетат), то активность
фермента в составе преципитата окажется соизмеримой
с активностью свободного фермента. Эти данные позво-
ляют понять результат другого эксперимента, в котором
изучали гидролиз ацетилхолина свободной холинэстера-
зой и холинэстеразой в составе преципитата (в обоих
случаях добавляли также фенил-триметиламмоний—
ингибитор ацетилхолпнэстеразы). При дозе ингибитора,
вызывающей торможение активности свободного фер-
мента на 75%, фермент в составе преципитата был даже
более активен, чем свободный. Из приведенных опытов
следует, что эффект антител против фермента связан
прежде всего с их опосредованным влиянием на доступ-
ность активного центра фермента для субстрата. Основ-
ная причина стерических помех кроется в агрегации фер-
мента бивалентными антителами. В самом деле, монова-
лентные Fab-фрагменты антител против холинэстеразы
вообще не влияют на активность фермента.
Приведенные данные удивительным образом корре-
лируют с наблюдениями, касающимися механизма нейт-
рализации антителами бактериальных токсинов (см.
гл. 6). И дело здесь не только в том, что некоторые бак-
териальные токсины — ферменты. Основное — необходи-
мость межмолекулярных «сшивок» для эффективного
пространственного экранирования активных центров,
будь то ферментов, токсинов или других биологически
активных соединений. Такие «сшивки» могут обеспечить
лишь бивалентные или мультивалентные антитела.
Антитела к ферментам могут быть использованы для
выделения фермента па иммуносорбентс. Это целесооб-
разно как для очистки фермента, так и для удаления его
из реакционной смеси/Ферменты, фиксированные на сор-
бенте с иммобилизованными антителами против фермен-
та, применяют с целью осуществления гетерофазного ка-
тализа. Существует ряд доводов в пользу применения
иммобилизованных ферментов, в том числе фиксирован-
2G9
ных на иммуносорбеите. Наконец, прн использовании со-
пряженных энзиматических систем, где отдельные фер-
менты значительно отличаются по кинетическим харак-
теристикам, может потребоваться снижение скорости
превращения субстрата одним из ферментов; это осу-
ществимо с помощью антиферментных антител.
Эволюционная биохимия. Вопросы, связанные с изу-
ченном сходства строения белков разных биологических
видов, с успехом могут решаться, в том числе с исполь-
зованием методов антигенного анализа. Примером тако-
го анализа служат собственно иммуноглобулины и мно-
гие другие белки.
Биосинтез и катаболизм белков. Использование ра-
дноиммупологичсекой техники для изучения биосинтеза
белков неоднократно обсуждалось на страницах этой
книги. Иммунохимичсскнй анализ промежуточных про-
дуктов катаболизма белков является также одним из ос-
новных инструментов в изучении проблемы (см. гл. 7).
Определение гормонов и других соединений. Различ-
ные варианты иммунологической техники широко приме-
няются в клинике и практически вытеснили какие-либо
другие методы определения гормонов. Расширяется ис-
пользование иммунологической техники для определения
наркотиков, сердечных алкалоидов и других фармаколо-
гических веществ.
12.5. Моноклональные антитела
Неоднородность антител по физико-хи-
мическим свойствам и специфичности служит во многих
случаях непреодолимым препятствием для их изучения
и применения. В крайне редких случаях при иммуниза-
ции животных синтезируются однородные антитела, ко-
торые по всем критериям, включая идиотипическую ха-
рактеристику, являются продуктом только одного клопа
плазматических клеток и, следовательно, моноклональ-
ными. В подавляющем большинстве случаев при имму-
низации развивается поликлональный ответ.
Источником моноклональных иммуноглобулинов (см.
гл. 3) служат клетки множественной миеломы человека
и мышиной тазмацитомы. Многие из них обладают спе-
цифическим сродством к некоторым гаптенам и антиге-
нам. Такие иммуноглобулины могут быть в принципе от-
несены к моноклональным антителам. Однако трудно
270
надеяться отыскать в «библиотеке» моноклональных им-
муноглобулинов те из них, которые будут специфически
связывать лиганды, интересующие в данный момент ис-
следователя.
Как сочетать способность к продукции очень больших
количеств однородных иммуноглобулинов, свойственную
клеткам плазмацитомы, с возможностью продукции та-
кими клетками антител заданной специфичности? Только
соединив достоинства клеток плазмацитомы и селекцио-
нированных антигеном популяций иммунокомпетентных
клеток в одной клетке. Такая возможность сущест-
вует на основе слияния клеток и получения так называе-
мых гибридом. Гибридизацию клеток селезенки от имму-
низированных мышей с клетками мышиной плазмацито-
мы впервые осуществили Г. Келлер и К. Милыптейн в
1975 г. (С. Kohler, С. Milstein). С тех пор работы в этом
направлении получили большой размах, превратившись
в новую отрасль биотехнологии — искусственное получе-
ние моноклональных антител требуемой специфичности,
идиотипа и других наперед заданных свойств.
Техника получения гибридом, анализа продуцируе-
мых ими иммуноглобулинов и другие специальные воп-
росы описаны к настоящему времени в ряде обзоров и
монографий, в том числе и на русском языке (см. реко-
мендуемую литературу). Изложение их не входит в на-
шу задачу. Что касается возможностей применения мо-
ноклональных антител в молекулярной иммунологии, су-
ществующих объективных ограничений при получении
реально моноспецифичных антител, то эти вопросы об-
суждались в различных главах настоящей книги. Не вы-
зывает сомнения, что гибридомная техника обогатила
возможности не только исследователя-иммунолога, но и
специалистов в самых различных областях биохимии, где
могут и должны использоваться иммунохимические ме-
тоды.
Рекомендуемая
литература
Безвершенко И. .4. Аффинная хроматография. Киев, 1978.
Введение в иммуногенетику/Х. Фьюденберг, Дж. Пинк,
Д. Стайтс, Лн-Чуанг-Ванг. М., 1975.
Введение в иммунологию/И. Вейсман, Л. Худ, В. Вуд. М., 1983.
Зотиков Е. А. Антигенные системы человека и гомеостаз. М.,
1982.
Иммуноглобулины/Под ред. Г. Литмена и Р. Гуда. М., 1981.
Иммунологические методы/Под ред. X. Фримеля. М., 1979.
Иммунохимия в клинической лабораторной практике/Под ред.
А. М. Уорда, Дж. Т. Уичера. М., 1981.
Кулъберг А. Я. Иммуноглобулины как биологические регулято-
ры. М., 1975.
Кулъберг А. Я. Антииммуноглобулины. М., 1978.
Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика/
Под ред. Дж. Б. Натвига, П. Перлманна, X. Вигзелля. М., 1980.
Ляшенко В. А., Воробьев А. А. Молекулярные основы иммуно-
генности антигенов. М., 1982.
Механизмы и.ммунопатологии/Под ред. С. Коена, П. А. Уорда и
Р. Т. Мак-Класки. М„ 1983.
Моноклональные антитела/Под ред. Р. Г. Кеннета, Дж. Мак-
Керна, К- Б. Бехтол. М., 1983.
Образование антител/Под ред. Л. Глинна и М. Стюарта. М.,
1983.
Петров Р. В. Иммунология. М., 1982.
Петров Р. В., Хаитов Р. М., Атауллаханов Р. И. Иммуногенети-
ка и искусственные антигены. М., 1983.
Структура и функция антител/Под ред. Л. Глинна и М. Стюар-
та. М., 1983.
Фонталин Л. Н., Певницкий Л. А. Иммунологическая толерант-
ность. М., 1978.
Фриденштейн. А. Я-, Лурия Е. А. Клеточные основы кроветвор-
ного микроокружения. М., 1980.
Чард Т. Радиоиммунологические методы. М., 1983.
Benacerraf В., Unanue Е. R. Textbook of Immunology. Baltimore/
London, 1981.
Gottlieb P. D. Immunoglobulin genes. Mol. Immunol., 1980, vol.
17, pp. 1423—1435.
Handbook of experimental Immunology/Ed. by D. M. Weiz. Ox-
ford/London, 1979.
Immunobiology of proteins and peptides/Ed. by M. Z. Atassi,
A. B. Stavitsky. NY—Ldn, 1977.
Immunology/Ed. by C. F. Bach. NY, 1982.
Katz D. H. Lymphocyte differentiation, recognition and regula-
tion. NY, 1977.
272
Nisonoff A., Hopper J. E., Spring S. B. The antibody molecule.
NY, 1975.
Reid К. B. R. Proteins involved in the activation and control of
the two pathways of human complement. — Biochemical Society Tran-
sactions, 1983, vol. 11, pp. 1—12.
Rosenthal Л. B. Determinant selection and macrophage function
in genetic control the immune response. — Immunol. Rev. 1978, vol. 40,
p. 136.
Sell S. Immunology, immunopathogy and immunity. Maryland/NY,
1975.
Sidman Ch. В-Lymphocyte differentiation and the control of IgM
y,-chain expression. — Cell, 1981, vol, 23, pp. 379—389.
Терминологический
словарь
Аллотипы — индивидуальные струк-
турные особенности легких и тяжелых цепей иммуногло-
булинов данного биологического вида; определяются
различиями первичной структуры, которые находят отра-
жение в различиях антигенного строения (детерминанта
аллотипическая).
Альтернативный путь — механизм активации системы
комплемента, не требующий участия Cl, С4 и С2. При
этом активация СЗ достигается при участии специальных
факторов: В, D и пропердина.
Анафилаксия — системная или местная реакция орга-
низма на комплекс антигена и цитофильных антител
(IgG- или IgE-класса). Обусловлена высвобождением из
тучных клеток вазоактивных аминов (гистамин, серото-
нин) и некоторых других биологически активных ве-
ществ.
Анафилатоксины — фрагменты третьего и пятого ком-
понентов комплемента (СЗа и С5а), вызывающие высво-
бождение вазоактивных аминов, расширение сосудов и
увеличение их проницаемости, изменение тонуса гладких
мышц.
Антигены — биополимеры (белки, полисахариды, ну-
клеиновые кислоты) или их синтетические аналоги, ин-
дуцирующие реакции гуморального и (или) клеточно-
опосредованного иммунитета.
Антигены конъюгированные — антигены, представ-
ляющие собой белки, полисахариды пли различные син-
тетические полимеры, к которым в качестве дстермипант-
ных групп присоединены самые разнообразные органиче-
ские соединения.
Антидетерминанта — участок молекулы антитела,
связывающий детерминанту антигена. Образуется при
участии вариабельных доменов легкой и тяжелой по-
липептидных цепей иммуноглобулинов.
274
Антитела — иммуноглобулины, специфически связы-
вающие антигены или гаптены.
Белок Бенс-Джонса — димеры (реже мономеры) лег-
ких полипептидных цепей иммуноглобулинов, содержа-
щиеся в моче больных множественной миеломой.
Валентность антигена — число антигенных детерми-
нант одинакового строения.
Валентность антитела — число антидстерминапт (ак-
тивных центров) в молекуле антитела. У иммуноглобу-
линов классов G, D, Е и А (в форме мономера) число
антидетерминант равно двум, у иммуноглобулинов клас-
са М — десяти.
Вариабельный район — аминоконцевой участок лег-
кой или тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризую-
щийся значительными индивидуальными различиями
первичной структуры.
Вариотип — структура инвариантных аминокислот-
ных последовательностей в пределах вариабельных рай-
онов легкой и тяжелой цепей. Антигенные детерминанты
этого типа называют также framework.
Гаптен — аналог детерминантной группы антигена,
взаимодействующий с антителами, но не вызывающий их
продукции. Различают одно-, ди- и мультивалентные гап-
тены в зависимости от числа содержащихся в молекуле
идентичных детерминантных групп.
Гены иммуноглобулинов — сегменты ДНК, кодирую-
щие аминокислотную последовательность полипептидных
цепей иммуноглобулинов. Легкие цепи кодируют три сег-
мента: Vl, Jl и Cl. Вариабельный район тяжелой цепи
кодируют три сегмента: Vh, D и Ли. Константные райо-
ны тяжелых цепей кодируют С-сегменты, которые обо-
значают в зависимости от класса цепи как Cv, Сц, Са, Сб
И Се.
Гипервариабельные участки — участки аминокислот-
ной последовательности вариабельных районов с наи-
большими индивидуальными вариациями первичной
структуры.
Детерминанта антигенная, конформационнозависи-
мая— детерминанта, структура которой, а следователь-
но, и специфичность зависят от пространственной кон-
формации антигена. Характерна для глобулярных бел-
ков и синтетических полипептидов регулярного строения,
образующих устойчивую вторичную структуру.
Детерминанта антигенная, секвенциального типа —
детерминанта, структура которой определяется только
275
последовательностью соответствующих аминокислотных
остатков, сахаров или оснований в белках, полисахари-
дах или нуклеиновых кислотах, равно как и их синтети-
ческих аналогах. Крайне редко встречается в белках, но
характерна для разветвленных (branch) синтетических
полипептидов, не имеющих упорядоченной вторичной
структуры, а также для полисахаридов, имеющих в сво-
ем составе разветвленные боковые цепочки олигосаха-
ридов.
Детерминантная группа — структура молекулы анти-
гена, распознаваемая антителами (иммуноглобулиновы-
ми рецепторами В-лимфоцитов). Термин «дстерминант-
ная группа» приложим также к структурам антигена,
распознаваемым Т-лимфоцитами. Последние отличимы
по строению и пространственной локализации от детер-
минант, распознаваемых В-лимфоцитами (исключение —
детерминанта для Т-суппрессоров).
Домены иммуноглобулинов — устойчивые глобуляр-
ные образования, характерные для третичной структу-
ры полипептидных цепей иммуноглобулинов; стабилизи-
рованы дисульфидными и нековалентными связями. Раз-
личают вариабельные (V) и константные (С) домены
легких и тяжелых цепей.
Идиотип — структурные особенности иммуноглобули-
нов, продуцируемых индивидуальными плазматическими
клетками (клонами клеток). Определяются строением
вариабельных районов легких и тяжелых цепей. Идиоти-
пические антигенные детерминанты расположены в непо-
средственной блнзкости от антидстерминанты антитела.
В иммуноглобулиновых рецепторах В-лимфоцитов и аи-
тигенспецифических рецепторах Т-супрессоров также су-
ществуют идиотипические детерминанты, совпадающие
по строению с аналогичными детерминантами антител
той же специфичности.
Изотип — видоспепифическис особенности иммуно-
глобулинов, определяемые строением константных райо-
нов тяжелых цепей. Изотипические антигенные детерми-
нанты характерны для каждого класса (подкласса) им-
муноглобулинов.
Иммуноглоб улины — семейство сывороточных белков,
характеризующихся сходством принципов структурной
организации и способностью в качестве антител взаимо-
действовать с антигенами. Различают пять классов им-
муноглобулинов: IgG, IgM., IgA, IgD, IgE.
276
И ммунодоминантная группа — участок детерминант-
ной группы антигена, который вносит наибольший вклад
во взаимодействие детерминантной группы с антидетер-
мннантой антитела.
Классический путь — механизм активации системы
комплемента. Включает пять характерных для этого пу-
ти инициирующих компонентов: Clq, Clr, Cis, С4 и С2.
К-Клетки — лимфоциты, способные фиксировать ан-
титела через Fc-участок молекулы и обусловливать ре-
акцию антптелозависимой клеточной цитотоксичности
(antibody mediated cell cytotoxicity).
Комплемент — семейство белков сыворотки крови,
способных после их активации, в том числе комплексом
антиген-антитело, вызывать необратимые повреждения
клеток-мишеней и ряд других реакций. Включает 11 бел-
ков классического пути активации и несколько дополни-
тельных компонентов, необходимых для альтернативно-
го пути активации.
Конвертаза СЗ — фермент, активирующий ключевой
компонент системы комплемента СЗ. Различают конвер-
тазу классического пути активации — комплекс активи-
рованных четвертого и второго компонентов комплемента
(С4Ь 2а) и конвертазу альтернативного пути—активи-
рованный фактор В (Вв).
Лимфокины — белки неиммуноглобулиповой приро-
ды, продуцируемые лимфоцитами и обладающие различ-
ной биологической активностью. В числе лимфокинов ин-
терферон и интерлейкины — факторы, регулирующие
пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов.
Лимфоциты — клетки, содержащиеся в центральных
(костный мозг и тимус) и периферических (селезенка,
лимфоузлы) органах иммунной системы, а также в крови
и лимфе. Обусловливают реализацию антигензависимых
реакций гуморального и клеточного иммунитета.
В-Лимфоциты (В-клеткп)—лимфоциты, происходя-
щие из бурсы (фабрпциева сумка) у птиц или се анало-
га у млекопитающих.
Макрофаги — крупные фагоцитирующие клетки, на-
ходящиеся в самых различных органах. Выполняют важ-
ную вспомогательную роль в индукции и регуляции гу-
морального и клеточного иммунитета прежде всего бла-
годаря переработке и представлению (презентация) ан-
тигена лимфоидным клеткам.
Представление (презентация) антигена — процесс за-
хвата и переработки антигена макрофагами, приводящий
277
к появлению на поверхности этих клеток высокоиммуно-
генного комплекса антигена с белками, кодируемыми ге-
нами 1-района основного комплекса гистосовместимости.
Рецепторы для иммуноглобулинов (Fc-рецепторы) —
интегральные компоненты мембраны лимфоцитов, ма-
крофагов и некоторых других клеток, связывающие че-
рез Fc-участок молекулы иммуноглобулины разных клас-
сов. Гликолппопротеины по химической природе.
Рецепторы для компонентов комплемента — глико-
протеины, находящиеся на поверхности В-лимфоцитов и
некоторых других клеток и способные взаимодействовать
с рядом активированных компонентов комплемента и
продуктов их дальнейшей деградации: СЗЬ, C3d.
Рецепторы иммуноглобулиновые — белки иммуногло-
булиновой природы, являющиеся интегральными компо-
нентами мебраны В-лимфоцитов. Способны подобно ан-
тителам специфически взаимодействовать с антигенами
(гаптенами). Отличаются от сывороточных иммуноглобу-
линов строением С-концевых участков тяжелых цепей.
Реагины — антитела IgE-класса у человека, фикси-
рующиеся через Fc-участок своей молекулы на поверх-
ности тучных клеток. Обеспечивают после взаимодейст-
вия со специфическим антигеном высвобождение из туч-
ных клеток вазоактивных аминов и других медиаторов
анафилаксии.
Тиму с зависимый иммунный ответ—иммунный ответ,
требующий участия Т-хелперов и макрофагов. Связан с
особенностями строения антигена, который обозначают
как тимусзависимыи. К числу этих антигенов относятся
глобулярные белки, чужеродные эритроциты и другие
клетки. Контролируется генами иммунного ответа (1г-
генами).
Фактор D — проактиватор СЗ-конвертазы альтерна-
тивного пути активации комплемента.
Предметный
указатель1
Агглютинация 258
Агрегатагглютинация 260
Аллельное исключение 198
Аллергены 126
Аллотип 17
Аллотппические маркеры 80,
81*
Анатоксин 141
Анафилаксия 128
— субстанции 126, 146
Анафилатоксины 181
Антиген, выбор дозы 45
— детермпнантные группы 22
— мембранный дифференци-
ровочный В-лимфоцитов
(MBLA) 11
— поливалентный 198
— соматический 40
— HTLA 11
— 1а 11
О-Антиген полный 40*, 45
Антиген-антитело, комплекс 166,
169, 190
------- получение в нераство-
римом виде 241
----, реакция преципитации
252
— (гаптен) — антитело, регис-
трация реакции 246
Антпгензависимая дифференци-
ровка лимфоцитов 16
Антигенная специфичность 52,
53, 117
— структура белков, методы
изучения 27
Антигенные детерминанты, ти-
пы 75
—	маркеры 10, 11*
Антигенный анализ 32
Антигенраспознающие рецепто-
ры лимфоцитов 52
Антигенсвязывающие рецепто-
ры 17
Антигены 10, 14, 20
—	белки 27
— конъюгированные 20, 22, 27
—	крови групповые 46
—	нуклеиновые кислоты 37
— перекрестно реагирующие
234
—	полипептиды 27
—	полисахариды 39
—	синтетические полинуклеоти-
ды 37
—	тнмусзавнсимые 18
—	тпмуснезависимые 18, 128
Антидетерминанта 25
—	организация структуры 103
Антипммуноглобулпны 237
Антисыворотка моноспецифиче-
ская 77
Антитела 12
— автономия лпгандсвязываю-
- тих участков структурная
72
— активность специфическая
243
1 Звездочкой отмечены страницы, на которых помещены рисунки
или таблицы.
279
— активный центр 91, 92, 94*,
97*. см. также Антидетермп-
нанта
— биосинтез, усиление адъю-
вантами 227
------ антителами 226
— влияние на процесс презен-
тации антигена макрофага-
ми 224
— моноклональные 30, 270
— нейтрализация вирусов 143*,
144
— подавление иммунного отве-
та, механизм 224
— полиспецифнчность 98
— применение для анализа фер-
ментов 268
— продукция 16
— происхождение многообра-
зия 112
— роль в усилении фагоцито-
за 142
— специфичность 32
— тушение флуоресценции гап-
теном 249
— участие в высвобождении
биогенных аминов из туч-
ных клеток 145
— цитотропные 126
Антитоксины 141
Артрит ревматоидный 236
Белки Бенс-Джонса 79
Болезни аутоиммунные 228, 234
----- роль генетических факто-
ров 237
		человека 39
Болезнь новорожденных гемо-
литическая 225
—	хроническая лучевая 234
Вирус Эпштейн-Барр 211, 236
Воспаление 162, 163
—	индукторы 163, 166
Гаптен 20, 24, 25*, 96*
I емагглютинация 49, 258
Гемопоэз 9
Гены иммунного ответа 46, 214
— иммуноглобулиновые, орга-
низация 107. 109*, 111*
— основного комплекса гисто-
совместимости 53
Гепатоциты 189
Гпбридомы 271
Г пперчувствителыюсть замед-
ленного типа 51. 186
— немедленного типа 126
Гомоцптотропины 126, 127, 129
Групповые вещества крови 47,
48*
Детерминангная группа антиге-
на 26
------- структура 41
Детерминанты антигена, рас-
познаваемые В- и Т-лимфо-
цитами 49
— аллотппические 79
— вариотипические 90
— идиотипические 87, 199
— изотипические 76
— конформационные (конфор-
мационнозависнмые) 31
— секвенциальные 32, 33, 36
---- размер 37*
Домен 65, 69, 71*
Идиотип 17
Иммунитет клеточно-опосредо-
ванный 12, 51
Иммунная система 7
---- клетки 7
----органы 7
Иммунное прикрепление, фено-
мен 172, 183
Иммунные комплексы 190
Иммунный ответ 13, 15, 20, 102
----гены 214
---- генетическая рестрикция
216
280
---- генетический контроль
215
----индукция и регуляция 212
----на тимусзависпмые анти-
гены 50
----первичный 17
----подавление 38
------- антителами, механизм
224
----регуляторное действие ан-
тител 223
Иммуноглобулин А, структура
субмолекулярная 61 *
----единица транскрипции, ги-
потетический механизм фор-
мирования 116*
---- рецепторный 196
— D рецепторный 192
— Е рецепторный 129*, 191, 196
— G, третичная структура до-
менов 70*
----фрагменты молекулы, уси-
ливающие фагоцитоз 161
— М, рецепторный 129*. 194*.
196
---- структура субмолекуляр-
ная 60*
Иммуноглобулины 54, 55
—	аллотип 75
—	антигенное строение 75
— антигензависимые функции
140
—	афферентная функция 123
—	биосинтез 107
—	вариабельные участки 63
—	вариотип 76
—	гиперварпабельные участки
63
—	идиотип 76
—	изотип 75
—	интерференция эффекторных
функций 151, 152
—	катаболизм 153
—	консервативные участки 63
—	константные районы 63
— кролика 83
---- аллотипы 85*
— легкие цепи 56
---- пространственная
структура 69
— межцепьевые дисульфидные
связи 57
— моноклональные, полиспеци-
фичность 102
— мыши 86
---- аллотипнческие маркеры
86*
— независимость путей синтеза
193
— неспецифические 100
— новообразованные, секреция
122
— нормальные См. Иммуногло-
булины неспецифические
— организация четвертичной
структуры 69
— полимерные формы, сборка
122
— преодоление плацентарного
барьера 124
— принцип самосборки молеку-
лы 58
— продукты распада и воспа-
ление 163
— реабсорбция в извитых ка-
нальцах почек 124
— рецепторы на перитонеаль-
ных макрофагах 132*
— связывание белка A Staphy-
lococcus aureus 139
----Clq субкомпонента перво-
го компонента комплемента
134
----СЗ 133
— структура первичная поли-
пептидных цепей 63
---- субмолекулярная 55*
— «сшивка» рецепторов 195,
198, 231
— «талия» молекулы 57, 66,
281
68*, 74, 131, 160, 254
	— трансляция легких и тяже-
лых цепей 120
—	тяжелые цепи 56
-------пространственная струк-
тура 69
-	- фиксация на макрофагах
(моноцитах) и лимфоцитах
131
------- тучных клетках и ба-
зофилах 126
— фрагменты с хемотактически-
ми свойствами 162
— человека 81
----молекулярные формулы
57*
---- свойства 56*
•— экспрессии двух классов од-
новременной, механизм 117
— эффекторный центр 123—125
— эффекторные функции 123,
140
-------антигеннезависимые
124
Иммунодоминанта 27
Иммуиодоминантная группа 33
11ммунодоминантные группы
О-антигенов 41, 43*
Иммунологическая защита, ме-
ханизм 143
— толерантность См. Толеран-
тность иммунологическая
Иммунологический паралич 54
Иммунореактивность 7
Иммуносорбенты 241
Интерлейкины 217
Интроны 110
Инфекционная активность 144
Кластеры 213
Л-Клетки Си. Макрофаги
К-Клетки 147
Клетки антителопродуцирую-
щие 17
— иммунологической памяти
17, 120, 192
—	купферовы 14
—	нулевые 147, 205
—	плазматические 16
—	продуцирующие антитела 16
— распознающие полисахари-
ды 46
— стволовые 7, 10
---антигепнезависимая диф-
ференцировка 232
Комплемент, активация систе-
мы 140
— альтернативный путь акти-
вации (связывания) 138, 175
-----------— механизм инициа-
ции 178
----------- петля усиления
177*
-----------фактор В 177
--------------D 177
— биологические реакции при
активации системы 185*
— ингибиторы системы 179
— классический путь актива-
ции 135, 168. 169*
--------- компоненты 167
-----------концевые (терми-
нальные) 167
— классический и альтернатив-
ный пути активации (связы-
вания) 167, 168*
----------------ключевой
компонент 174
----------------структурное
подобие 179*
— компонент системы ключе-
вой 167, 168*
— компоненты, биосинтез 186
---СЗ, С4 и С5, структура
173*
— основные характеристики
белков системы 167*
— продукты протеолиза 181
— регуляторные белки системы
179
— рецепция клетками 207
282
— система 166
— субкомпонент Clq первого
компонента комплемента,
структура 135*, 170*
— химия 167
— эффекторные функции сис-
темы 182
Комплементариость 91
СЗ-Конвертаза 170, 177—180
•— расщепление третьего компо-
нента комплемента 173
Конкуренция неродственных
антигенов 221
Кооперация клеточная 18
Кроветворение, основной орган
7
Лейкоэгрессин 162
Лектины 211
Лидерный пептид ПО, 114*
Лизоцим, «пептид — петля»,
структура 36*
— строение молекулы 35*
Лимфатическая система чело-
века 8
Лимфатический узел, структу-
ра 12, 13*
Лимфобласты 16
Лимфоидные органы 7, 10, 12
Лимфопоэз 9, 13
Лимфоциты 7
— бласттрансформация 155
— рецепторы 191
— связывание иммунных комп-
лексов 147, 150
— спонтанная трансфромация
155
В-Лимфоциты 9, 10, 12
— механизм дифференцировки
129*
— рецептор для липополисаха-
рида из грамотрицательных
бактерий 210
Т-Лимфоциты 9, 10, 12
— активация 19
— антигенсвязывающие рецеп-
торы, строение 201
— дифференцировка 18, 19
Л ипополисахаридный комплекс
40, 45
Макрофаги 7, 14, 153, 160, 230
— роль в антнгенспецифической
активации Т-лимфоцитов
212
Мембранатакующий комплекс
174, 175, 180
Метод антигенного анализа
20.6
— двойной диффузии в агаре
255
— иммуноферментного анализа
78, 264
—	иммуноэлектрофореза 257
—	инактивации фага 263
—	«метки по сродству» 93, 94*
—	 нефелометрии 253
—	равновесного диализа 24,
104, 246
— радиальной иммунодиффу-
зии 78, 256, 257*
—	радиоизотопный 248
— радиоиммунного анализа 78,
261
— радиоспектроскопии 250
— спектрофлуорометрии 249
— специфической сорбции 80
— электронно-парамагнитного
резонанса в иммунологии
250
Методы анализа перекрестно
реагирующих полисахаридов
- 44
— аффинной хроматографии в
иммунологии 243
— пммунохимнческие в биохи-
мии 264
— оптические в иммунологии
248
283
— очистки иммуноглобулинов
и антител 238
Миоглобин, строение молекулы
29*
Моноциты 14
Морфин, определение в моче
251
Нуклеотиды циклические 196
Опсонины 142
Поликлональная активация
В-лимфоцитов 39, 46
Полисахарид Фримана 41
Преципитация количественная,
теория 253
Прозона, феномен 254
Пропердин 176
Простагландины, определение
263
Процессинг антигена 15, 212,
214*
— пре-мРНК 114*, 118
Реагины 126
Реакция азосочетания 23
—	антиген-антитело 91
—	гаптен-антитело 104
—	пассивной кожной анафи-
лаксии 128, 131*
— преципитации в геле 254
— связывания комплемента
260, 261*
Резистентность естественная
166
Резус-фактор 49
S—S-Рекомбинация 115, 117
Референс-гаптен 24, 25*
СЗ-Рецептор 207
Рецепторные белки 191
Рецепторы для антигена, В-
клетки 191
------- Т-клетки 200
--- комплемента на клетках
крови человека 209*
Fc-Рецепторы 11, 203, 204*
—, структура 207
—, функциональная роль 205
Ригни 162
Розеткообразованис, техника
203, 204*, 208*
Секреторный компонент 61
Сингенные реципиенты 15
Система крови АВ0(Н) 47
Системная красная волчанка
152
Сплайсинг 114, 200
— альтернативный 118, 119
Н-Субстанция 47, 48*
Супрессия аллогена 198, 199
— антителами 221
— идиотипа 202
— изотипа 196, 197
----феномен 196
— клеточно-опосредованная
219
Супрессоры 219
Т-Супрессоры 19, 38, 128, 157,
199, 200, 232, 237
— активация 233
Тафтсин 161
Теория сети 202
Тест-антиген 23
Тимозин 9
Тпмопоэтин 9
Тимостимулнн 9
Тимоциты 9
Тимус 8*, 9
Токсины бактериальные, ней-
трализация 140
Токсофорпая группа 141
Толерантность иммунологиче-
ская 15, 20
— срыв 235
Транскрипции единица 119, 120
Участок шарнирный 74
Fab-Участок 73, 138
Fc-Участок 125, 127
284
Фабрициева сумка 9
Фагоцитарный индекс 143*
Фагоциты 14
Фактор, замещающий Т-клетки
218
— нефритический 178
— ревматоидный 236, 237
— Т-супрессорный 220
— Т-хелперный антигенспеци-
фический 217
—	Lewis 47
Fab-Фрагмент 58, 59*, 60, 95
—	эффекторные функции 154
Fab'-Фрагмент, патофизиологи-
ческие изменения после вве-
дения 164*, 165
F(ab') 2-Фрагмент 59*
Fab'—F (ab') 2-Фрагменты 154
—	неспецифическая регуляция
биосинтеза антител 156
— усиление иммунного ответа
на тимусзависимые антигены
156
Facb-Фрагмент 59, 69
Fc-Фрагмент 58, 59*, 60, 158
— антигепнезависимая поликло-
нальная активация В-лимфо-
цитов 159, 161
Fc'-Фрагмент 159
Fd-Фрагмент 92
Fv-Фрагмент 59*, 70
Т-Хелперы 18, 50, 128
— функция 217
Хемотип 41
J-Цепь 61
Цитотоксичность клеточная 146,
205
Цитотропины 126
Экзоны НО
Экзотоксины 140
Экзоцитоз 183
Эпитопная плотность 22
С1-Эстераза 170, 171
Оглавление
Предисловие................................................ 3
Введение .................................................. 5
Глава 1. Система иммунитета................................ 7
1.1. Клетки и органы иммунной	системы.................. 7
1.2. Иммунный ответ.................................... 13
Глава 2. Антигены......................................... 20
2.1.	Конъюгированные антигены.......................... 22
2.2.	Белки и синтетические полипептиды................. 27
2.3.	Нуклеиновые кислоты и синтетические полинуклео-
тиды ................................................. 37
2.4.	Полисахариды...................................... 39
2.5.	Групповые антигены	крови.......................... 46
2.6.	Детерминанты антигена, распознаваемые В- и Т-лим-
фоцитами ............................................. 49
2.7.	Антигенная специфичность и генотип реципиента .	52
Глава 3. Иммуноглобулины.................................. 54
3.1.	Структурная организация	иммуноглобулинов . .	55
3.2.	Первичная структура полипептидных цепей иммуно-
глобулинов ........................................... 63
3.3.	Пространственная структура легкой и тяжелой цепей
и организация четвертичной структуры иммуноглобу-
линов ................................................ 69
3.4.	Антигенное строение иммуноглобулинов.............. 75
Глава 4. Активный центр антитела.......................... 91
4.1.	Организация активного центра...................... 92
4.2.	Организация структуры анти детерминанты.......... 103
4.3.	Кинетика и термодинамика реакции гаптен-антитело 104
Глава 5. Биосинтез иммуноглобулинов...................... 107
5.1.	Организация структурных генов.................... 107
5.2.	Процессинг пре-мРНК.............................. 118
5.3.	Трансляция легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов 120
5.4.	Секреция новообразованных иммуноглобулинов	.	122
Глава 6. Эффекторные функции иммуноглобулинов . .	123
6.1. Антигеннезависимые эффекторные функции........... 124
6.2. Антигензависпмые эффекторные функции............. 140
286
Глава 7. Катаболизм иммуноглобулинов. Биологические
свойства продуктов расщепления................ 153
Глава 8. Комплемент...................................... 166
8.1.	Химия комплемента............................... 167
8.2.	Классический путь активации .................... 168
8.3.	Альтернативный путь активации..................  175
8.4.	Регуляторные белки системы комплемента ....	179
8.5.	Биологически активные пептиды................... 181
8.6.	Эффекторные функции системы комплемента . .	182
8.7.	Биосинтез компонентов комплемента............... 186
Глава	9. Рецепторы лимфоцитов.......................... 191
9.1.	Рецепторы для антигена.......................... 191
9.2.	Fc-рецепторы.................................... 203
9.3.	СЗ-рецептор .................................... 207
9.4.	Другие рецепторы................................ 210
Глава 10. Индукция и регуляция иммунного ответа . . .	212
10.1.	Процессинг антигена............................ 212
10.2.	Функция Т-хелперов............................. 217
10.3.	Клеточно-опосредованная супрессия.............. 219
10.4.	Супрессия антителами........................... 221
10.5.	Усиление биосинтеза антител.................... 226
Глава И. Молекулярные основы иммунологической толе-
рантности и аутоиммунных болезней ....	228
11.1. Иммунологическая т< терантность................ 228
11.2. Аутоиммунные болезни........................... 234
Глава 12. Методология иммунохимического эксперимента	238
12.1.	Очистка иммуноглобулинов и антител............. 238
12.2.	Аффинная хроматография в иммунологии ....	243
12.3.	Регистрация реакции антиген (гаптен)-антитело .	246
12.4.	Иммунохимические методы в биохимии............. 264
12.5.	Моноклональные антитела ....................... 270
Рекомендуемая литература................................. 272
Терминологический словарь................................ 274
Предметный указатель..................................... 279
АЛЕКСАНДР ЯКОВЛЕВИЧ КУЛЬБЕРГ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Заведующий редакцией А Г. Гаврилов. Редактор А. С. Орлова.
Младший редактор Е. И. Попова. Художник В. Н. Хомяков.
Художественный редактор Т. А. Коленкова. Технический редактор
Р. С. Родичева. Корректор С. К.. Завьялова.
ИБ-4885
Изд. № Е-458. Сдано в набор 14.02.85. Подп. в печать 04.07.85.
Т-11633. Формат 84Х108'/з2. Бум. тип. № 1. Гарнитура литературная.
Печать высокая.	Объем 15,12 усл. печ. л. 15.12 уели кр.-отт.
15,82 уч.-изд. л.	Тираж 10 000 экз. Зак. № 1258. Цена 95 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4,
Неглинная ул., д. 29/14.
А4осковская типография № 8 Союзполиграфпрома
при Государственном комитете СССР
по делам издательств, полиграфии и книжной торговли,
101898, Москва, Центр, Хохловский пер., 7.