ЖИЕКУЙРНЛЯ
БИОФИЗИ М
МОЕЕСНЕАК ВЮРНУ81С8

ьу

В1СНАКО В. 8ЕТЬО\У

Оак МаНопа1 ЬаЬога1огу
апй

ЕПКЕ8Т С. РОЕЬАПО

Тке Репп&у1х>аша 81а1е 1]пгоегзИу



АОО15ОН - 5УЕ8ЬЕУ РОВЫЗН1М6 СОМ РАМУ, 1МС
КЕАЫМС, МА55АСНЕ15ЕТТ8, О. 5. А.
ЬОМООМ, ЕМСЬАМО

1 96 2
Р. Сетлоу, Э. Поллард

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

Перевод с английского

Д. А. Денисова, Л. Н. Дроздова-Тихомирова
и Б. В. Рыбакова

В

Под редакцией и с предисловием

проф. Д. А. Франк-Каменецкого

ИЗДАТЕЛЬСТВО

Москва 1964
Применение методов молекулярной физики к исследова-
нию свойств живого вещества становится на наших глазах одной
из центральных проблем науки. Книга Сетлоу и Полларда
специально посвящена этому кругу вопросов. Она задумана
и написана не как монография, а как довольно элементарный
учебник для студентов, не требующий от читателя высокого
уровня предварительной подготовки. В частности, в ней поч-
ти отсутствуют математические выкладки. В то же время
книга написана на вполне современном научном уровне;
в ней содержится много данных из новейшей литературы,
представляющих интерес не только для учащихся, но и для
хорошо подготовленного читателя.

Предназначена для широких кругов биологов и физиков,
в первую очередь для студентов.

Редакция биологической литературы
ПР ЕДИСЛОВИЕ

К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ

Широкий интерес к применению в биологии идей и методов современной
физики стимулирует появление ряда книг по этим вопросам. Если в начале
своего развития биофизика занималась только физическими процессами
в высокоразвитом многоклеточном организме с его сложными регулирую-
щими системами, то в последнее время особенно много внимания уделяется
физике процессов, протекающих на клеточном и субклеточном уровне. Про-
роческое определение Энгельса: «Жизнь есть форма существования белко-
вых тел» нашло блестящее подтверждение и развитие в успехах современной
молекулярной биологии.

Настоящая книга не охватывает полностью весь этот круг вопросов.
В ней не рассмотрены детали химического механизма тех процессов, которыми
занимается молекулярная биология. Не вдаваясь в обширную область
биохимии и биофизической химии, авторы сосредоточили свое внимание
на чисто физических методах и идеях. При этом нужно отметить, что основ-
ную ценность этой книги составляют не столько идеи, сколько описание
физических методов исследования. Книга является введением в изучение
всего широкого арсенала этих методов: световой и электронной микроскопии,
метода меченых атомов, использования ионизирующего излучения для иссле-
дования субклеточных структур (метод мишеней), спектров поглощения
и спектров действия, рентгеноструктурного анализа и физических методов
определения размеров и формы макромолекул. Наряду с этим даны также
основные методы физических расчетов, позволяющих оценить количествен-
ные характеристики клеточных процессов на основе статистической физики,
теории информации, теории молекулярных сил и кинетики химических
реакций. Интересны примеры подобных расчетов, носящие по необхо-
димости приближенный характер, но тем не менее приводящие к очень
полезным выводам. Более подробное изложение многих из рассмотренных
здесь вопросов можно найти в более специальной литературе1. Но то, что
эти вопросы подобраны и рассмотрены именно с точки зрения приложений
к молекулярной биологии, конечно, очень облегчает труд читателя, при-
ступающего к изучению этой области знания.

Поскольку в биофизике речь идет о пограничных областях исследова-
ния, в которых соприкасаются разные науки, терминология здесь не всегда
является установившейся, и иногда из разных дисциплин приходят раз-
личные термины для одних и тех же понятий. Мы стремились там, где это
возможно, опираться на терминологию ядерной физики, для которой
имеется специальный тщательно составленный словарь2. Так, при воздей-

1 В дополнение к приводимым в тексте литературным ссылкам по отдельным
главам мы прилагаем к настоящему предисловию список литературы на русском языке
как по общим основам молекулярной биологии, так и по частным вопросам биохимии
ферментов, спектроскопии и микроскопии.

2 Д. И. Воскобойник и М. Г. Циммерман. Англо-русский ядерный словарь,
Физматгиз, М., 1960.
ствии ионизирующего излучения на вещество ионы образуются не отдель-
ными парами, а целыми группами, содержащими в среднем по три пары
каждая. В нашей литературе такую группу именуют самыми разными тер-
минами: «сгусток», «рой» и даже «пачка». Мы приняли термин «сгусток ионов»
согласно цитированному выше словарю. Из соображений ясности мы отка-
зались от двух терминов, используемых в подлиннике, хотя они проникли
и в нашу литературу: речь идет о терминах «первичная ионизация» и «линей-
ная передача энергии». Везде и всюду «вторичной» называют ионизацию,
производимую вторичными электронами. Соответственно, «первичной»
должна называться ионизация, производимая непосредственно исходным
излучением. Но в то время как «одной ионизацией» называют обычно обра-
зование одной пары ионов, под «одной первичной ионизацией» подразу-
мевают образование целого сгустка ионов. Во избежание недоразумений
мы заменили термин «одна первичная ионизация» вполне однозначным:
«один сгусток ионов». Что касается «линейной передачи энергии», то под
ней подразумевается энергия, расходуемая на ионизацию на единице длины
пути. Но так как расход энергии на одну пару ионов постоянен, то эта
величина означает фактически просто плотность ионизации, как мы ее
и именуем.

Книга написана на вполне современном уровне и дает широкую ориен-
тировку в вопросах молекулярной биофизики. Быстрый темп развития этой
области науки заставил, видимо, авторов столь же быстрыми темпами гото-
вить книгу к печати, что кое-где отразилось на ее качестве. В отдельных
местах книга несколько недоработана и содержит опечатки и мелкие ошиб-
ки, которые мы старались по мере возможности исправлять. Мы позволили
себе исключить краткий параграф, касающийся молекулярной генетики,
поскольку по этому вопросу имеется обширная литература, более доступ-
ная для начинающего читателя. Мы исключили также задачи, введение
которых в подобный курс кажется нам преждевременным.

В книге, посвященной столь бурно развивающейся, еще не устоявшейся
области знания и охватывающей такое разнообразие материала, трудно
достичь безупречной строгости изложения. Если читатель не будет предъяв-
лять к этой книге подобных требований, то по широте охвата, смелости
постановки вопросов и чувству общей перспективы она вполне его удов-
летворит.

Д. А. Франк-Каменецкий

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
НА РУССКОМ ЯЗЫКЕ

1.	Бреслер С. Е., Введение в молекулярную биологию, Изд-во АН СССР, 1963.

2.	Пасынский А. Г., Биофизическая химия, Высшая школа, 1963.

3.	Современные проблемы биофизики, сб. под ред. Г. М. Франка, ИЛ, 1961.

4.	Диксон М. и Уэбб Э., Ферменты, ИЛ, 1961.

5.	Нортроп Д., Кунитц М., Херриот Р., Кристаллические ферменты, ИЛ, 1950.

6.	Нейландс Дж., Штумпф П., Очерки по химии ферментов, ИЛ, 1958.

7.	Актуальные вопросы современной биохимии, т. 2, Медгиз, 1962.	_

8.	Современные проблемы биохимии, сб. под ред. В. А. Энгельгардта, ИЛ, 1961.

9.	Владимиров Г. Е., Лызлова С. Н., Энзимология, Изд-во Ленинградского универ-
ситета, 1962.

10.	Пятый международный биохимический конгресс, симпозиум IV, «Молекулярные
основы действия и торможения ферментов», Изд-во АН СССР, 1961.
11.	Брей Дж. и Уайт К., Кинетика и термодинамика биохимических процессов, ИЛ,
1959.

12.	Лангебек В., Органические катализаторы и их отношение к ферментам, ИЛ, 1961.

13.	Азимов И., Химические агенты жизни, ИЛ, 1958.

14.	Герцберг Г., Спектры атомов и молекул, ИЛ, 1949.

15.	Герцберг Г., Колебательные и вращательные спектры многоатомных молекул, ИЛ,
1949.

16.	Применение спектроскопии в химии, сб. под ред. В. Веста, ИЛ, 1959.

17.	Гиллем А. Э., Штерн Э. С., Электронные спектры поглощения органических соеди-
нений, ИЛ, 1957.

18.	Кросс А., Введение в практическую инфракрасную спектроскопию, ИЛ, 1961.

19.	Тумерман Л. А., Применение спектроскопии в биологии и биохимии, УФН 68(1),
93 (1959).

20.	Успехи спектроскопии, сб. под ред. Томпсона (стр. 269—330), ИЛ, 1963.

21.	Тумерман Л. А., Применение люминесценции к исследованию биологических про-
цессов, Изд-во АН СССР, сер. физ., 26(1), 84 (1962).

22.	Ельяшевич М. А., Атомная и молекулярная спектроскопия, Физматгиз, 1962.

23.	Альтшулер С. А., Козырев Б. И., Электронный парамагнитный резонанс, Физ-
матгиз, 1961.

24.	Горди В., Радиоспектроскопия (пер. с англ.), ГИЗ Тех.-Теор. Лит., 1955.

25.	Ингрэм Д., Спектроскопия на высоких и сверхвысоких частотах, ИЛ, 1959.

26.	Лейзеганг Э., Электронная микроскопия (пер. с нем.), ИЛ, 1960.

27.	Михель К-, Основы теории микроскопа (пер. с нем.), Гостехиздат, 1955.

28.	Франсон М., Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы, Физмат-
гиз, 1960.

ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРОВ

Биофизика, в сущности, не является новой областью науки. С давних
пор ученые стремились применять идеи и методы физики при изучении био-
логических явлений. Однако как самостоятельная научная дисциплина
биофизика сформировалась только в последнее время, когда под влиянием
успехов современной физики повысился интерес и к этой области науки.
В настоящее время число ученых, изучающих биологические явления с точки
зрения законов физики, значительно возросло. Организовано Биофизиче-
ское общество. Происходит быстрое увеличение числа биофизических отде-
лений при университетах, и все шире вводятся курсы биофизики.

Конечно, в эгои книге так же невозможно изложить всю биофизику,
как охватить в одной серьезной книге весь материал, относящийся к физике.
Не задаваясь подобной целью, мы сосредоточим наше внимание на молеку-
лярных аспектах биофизики. Молекулярная биофизика стремится объяс-
нить свойства биологических систем, исходя из свойств больших и малых
молекул, образующих эти системы. В этой книге не рассматриваются биофи-
зические проблемы, связанные с физиологией (физиологическим аспектам
биофизики посвящена, например, книга Стейси «ЕззепБаН о! Ыо1оЯ1са1
апс! гпесНса! рйузкз»1).

По степени трудности книга доступна студентам старших курсов
и аспирантам. Для ее чтения нужно обладать некоторыми познаниями
в математике, физике, химии и биологии, выходящими за рамки элемен-
тарных сведений. Так как уровень большинства студентов не удовлетворяет
этим требованиям, книга построена так, чтобы студент, хорошо подготовлен-
ный хотя бы в двух из перечисленных областей, не встретил трудностей
при изучении соответствующего материала.

Книга разбита на пятнадцать глав. Первые три главы: «Физика и био-
логия», «Живая клетка с точки зрения биофизика» и «Энергетические
и статистические закономерности в живой клетке» — являются вводными.
Они посвящены строению клеток и их составных частей и обсуждению воп-
роса о применимости законов термодинамики (в частности, законов сохра-
нения энергии и возрастания энтропии) к живым клеткам. В конце гл. III
помещено краткое изложение теории информации и примеры ее применения
для описания свойств биологических систем. Таким образом, эти главы
служат введением в круг вопросов, составляющих предмет молекулярной
биофизики.

Следующие четыре главы: «Физические методы определения размеров
и Формы молекул», «Рентгеноструктурный анализ биополимеров», «Внутри-
молекулярные и межмолекулярные силы» и «Спектры поглощения и строе-
ние молекул»—посвящены описанию различных методов изучения строения
молекул. Только сочетание этих методов позволяет получить ясное пред-

1 Р. Стейси, Д. Уильямс, Р. Уорден, Р. Мак-Моррис, Осно-
вы биологической и медицинской физики, М., ИЛ, 1959.— Прим. ред.
ставление о структуре и функциях таких сложных объектов, как макромо-
лекулы живых систем. В этих главах приведены также основные данные
по физике и химии биологически активных макромолекул.

Затем следуют главы: «Ферменты», «Спектры действия и квантовые
выходы» и «Действие ионизирующего излучения на компоненты клетки»,—
посвященные соотношению структуры и функции молекул. В них рассмот-
рены данные о действии различных физических агентов (тепла, света,
ионизирующего излучения) на структуру и функции молекул, а также
обсуждаются возможности получить какие-либо сведения о строении моле-
кул на основе изучения этих эффектов. Для полноты картины мы решили
включить сюда же описание методов исследования ферментативных реак-
ций и строения молекул ферментов. При этом обсуждается действие света
и других излучений на молекулы, а также на вирусы и микроорганизмы.
Таким образом, здесь сделаны первые попытки синтеза биологических
свойств из свойств отдельных молекул.

С той же точки зрения ведется изложение материала и в следующих
трех главах: «Применение ионизирующего излучения для изучения строе-
ния клетки», «Микроскопы» и «Изотопные индикаторы». В этих главах
описаны методы классической микроскопии и современной интерферен-
ционной микроскопии, а также электронной микроскопии ультратонких
срезов. С помощью этих методов можно изучать связь между структурными
и функциональными элементами клетки. Описано также применение мече-
ных атомов для определения скоростей обмена веществ и распределения
меченых молекул в последовательных поколениях клеток.

В последних двух главах: «Молекулярная биофизика и изучение мышц,
нервов и глаза» и «Физика клеточных процессов» — делается попытка
использовать сведения, изложенные в предыдущих главах, для описания
на молекулярном уровне свойств мышц, нервов, глаза, а также процессов,
связанных с механизмом передачи генетической информации в клетках.

В книге дается как теоретический, так и экспериментальный материал.
Таким образом, с одной стороны, показано, как при анализе биологических
процессов могут быть использованы принципы физики, а с другой — описа-
но большое число эффективных физических методов, позволяющих иссле-
довать связи между структурой и функцией биологических систем.
Глава I

ФИЗИКА И БИОЛОГИЯ

Биофизик — это тот, кто по роду своей
деятельности должен обладать способно-
стью мыслить и как физик, и как биолог.

1.	Введение. Наука помогает человеку достигнуть двух целей — упра-
вления природой и познания природы. Обычно мы сначала приобретаем
возможность управлять тем или иным явлением, тогда как представление
о его сущности остается весьма ограниченным. Быть может, ни одно явле-
ние природы еще не объяснено до конца. Одной из труднейших задач,
когда-либо стоявших перед человеком, является проблема познания жиз-
ненных процессов и управления ими. Хотя проблемы космологии и атом-
ного ядра также еще не решены, трудности, с которыми сталкиваются иссле-
дователи в этих областях, связаны скорее с получением необходимых экспе-
риментальных данных о соответствующих объектах, чем со сложностью
самих этих проблем.

В результате поразительно терпеливой и искусной работы биологов,
заключающейся в классификации, микроскопических наблюдениях, срав-
нительном изучении зрения, изучении дыхания, нервной и мышечной дея-
тельности, в результате биохимических открытий, приведших к устано-
влению общности между многими организмами, наконец, благодаря рас-
пространению учения об органической эволюции в биологии была устано-
влена определенная система. Это имело огромное значение для современной
науки. В настоящее время не вызывает сомнений, что единство жизненных
процессов так же очевидно и универсально, как единство геологических
явлений (многие крупнейшие биологи считают, что оно выражено даже
более ярко). Поэтому генетики, работающие на дрозофиле или на нейро-
споре, нетерпимы к скептикам, сомневающимся в общем значении их
открытий. По той же причине седалищный нерв лягушки служит моделью
для нейрофизиологов, а яйцо морского ежа используют для исследований
в области эмбриологии. При известии о новой ферментной системе у каж-
дого биолога прежде всего возникает мысль об ее общем значении, и спе-
цифические ферменты, действующие только в ограниченной группе организ-
мов, интересны именно с этой точки зрения.

Таким образом, в наше время выражение «жизненные процессы»
имеет вполне четкий и ясный смысл, а не вызывает представления о чем-
то таинственном и неопределенном. Под жизненными процессами под-
разумевают деление хромосом, ферментативную активность, передачу
электрохимической энергии по нерву, гормональную регуляцию роста и
физико-химический перенос энергии, лежащий в основе обмена веществ.
Ни один из этих процессов пока еще не описан до конца. В самом деле,
известно, что хромосомы растут, делятся и расходятся, но каким образом
происходит их рост? Почему они делятся? Почему они при этом соедини-
ются в пары? Известно, далее, что фермент соединяется с субстратом,
катализируя реакцию. Но каков механизм ферментативного катализа?
Почему действие фермента специфично? Перечень подобных вопросов-
можно было бы продолжить.

Сейчас мы очень близки к пониманию этих явлений, что делает совре-
менную биологию захватывающе интересной. Однако в настоящее время
под «полным» описанием подразумевается нечто более точное, чем сто лет
назад. Такое описание должно основываться на представлениях атомной
физики и химии, т. е. быть правильным на атомном уровне. Выполнение
этой задачи поможет лучше понять жизненные процессы и управлять ими.

Описание биологических процессов ведется преимущественно на языке
химии. Именно поэтому биохимикам принадлежат наиболее сенсационные
открытия всех времен. Тем не менее совершенно ясно, что не все биологиче-
ские процессы имеют химическую природу. В самом деле, например, клетка
обладает определенной структурой, играющей большую роль в ее жизни
и, следовательно, не является аналогом пробирки, в которой идут химиче-
ские реакции. Большое значение имеет выяснение относительного распо-
ложения компонентов клетки; это уже задача физика, работающего в обла-
сти биологии. К вопросам, которые должны решать физики, относятся
также определение физических свойств составных частей клетки, выясне-
ние характера их взаимодействия друг с другом, наблюдение за их изме-
нением в процессе роста и выяснение той роли, которую эти изменения игра-
ют в жизни клетки. Для наступления на эту область науки физика предо-
ставляет мощное оружие. Напротив, пренебрежение этим оружием сильно
ослабляет позиции исследователя.

Речь идет о знании законов природы: законов движения, законов элект-
ричества и магнетизма, квантовой механики и статистической физики.
В принципе, как интуитивно чувствуют физики и физико-химики, в этих
законах заключено все необходимое, т. е. они лежат в основе биологических
процессов и могут быть использованы для-их объяснения так же, как для
объяснения явлений в области химии и спектроскопии. Однако практически
непосредственное применение этих законов возможно только в случае
четко определенных систем, для которых можно провести точное исследо-
вание и расчет. В других же случаях можно лишь утверждать, что законы
физики действуют, но нельзя ни проследить, каким образом они действуют,
ни использовать эти законы для управления системой. Итак, первая задача
биофизики •— дать с помошью законов физики ясное и простое описание
тех немногих важных биологических систем, для которых это возможно
сделать.

С течением времени число биологических объектов, к которым приме-,
ним такой физический подход, увеличивается. Например, оптическая систе-
ма глаза и методы коррекции ее дефектов при помощи внешних линз — все
это относится к почти сформировавшейся области биофизики, в которой
используются законы физической оптики (законы преломления и распро-
странения света). Физические законы приложимы здесь столь непосред-
ственно, что некоторые физики, работающие в этой области, и не подозре-
вают, что они становятся биофизиками. Для понимания функций глаза
необходимо знать физическую оптику в значительно большем объеме, чем
ее изучают при прохождении общего курса физики.

Однако объяснение биологических явлений с помощью законов физики
уместно далеко не во всех случаях, хотя многие физические законы, напри-
мер гидродинамические законы течения или общие энергетические соот-
ношения, успешно применялись в биологии. Физику одному, без помощи
биолога, трудно найти биологический объект, к которому был бы приме-
ним физический подход, а биологи часто бывают слишком углублены в свои
собственные исследования, чтобы думать о таких проблемах. Задача био-
физика состоит в том, чтобы путем изучения литературы, размышлений
и эксперимента найти те области биологии, которые можно исследовать
методами физики. Краткий очерк истории биофизики вплоть до нашего
времени поможет проследить, как были открыты подобные области биологии.

2.	История биофизики. Хотя историю творят люди, пишут ее обычно
историки. Адекватного рассмотрения истории биофизики до сих пор не было
проведено; частично это объясняется тем, что сама биофизика находится
еще в стадии формирования. Однако даже беглое ознакомление с историей
биофизики показывает, что она богата волнующими открытиями.

Прежде всего упомянем о работах Гальвани, хотя его вряд ли можно
считать биофизиком в современном смысле этого слова. Экспериментируя
с мышцей лягушки, подвешенной с помощью медного крючка на стальной
проволоке, Гальвани обнаружил, что при замыкании электрической цепи
мышца сокращается. Часто говорят, что Гальвани наткнулся на это явление
случайно. Однако это не так; по-видимому, еще до этого открытия Галь-
вани изучал действие статического электричества на мышцу. Он правильно
связывал «гальваническую» форму электричества с контактом между различ-
ными металлами и пытался, исходя из чисто физических соображений,
объяснить появление электрического тока, проходящего через мышцу
и контактную пару. Открытие Гальвани, относящееся к 1786 г., привело
к рождению двух больших научных областей, интенсивное исследование
которых продолжается и в наше время.

Научная деятельность Томаса Юнга не ограничивалась биофизикой.
Среди прочих достоинств он в 14 лет знал 7 языков. В 1796 г. Юнг полу-
чил степень доктора медицины в Геттингене, а в 1801 г. был назначен про-
фессором физики в Королевском институте. Складывается впечатление,
что он обладал всеми возможными талантами. Ему принадлежит первая
волновая теория света, теория цветного зрения, идея о гидродинамической
природе сердечной деятельности; к тому же он был одним из первых, кто
занимался расшифровкой древнеегипетской письменности. Любая задача
вызывала в нем острый интерес и при этом он обладал большим талантом
экспериментатора. К числу его заслуг принадлежит также объяснение
процесса аккомодации глаза и в значительной мере — выяснение элемен-
тарной геометрической оптики глаза.

Может быть, первым настоящим биофизиком был Юлиус Роберт Майер
(1814—1878), медик по образованию. Плавая на голландском судне в тро-
пиках в качестве судового врача, он обратил внимание на то, что венозная
кровь у жителей этих мест оказалась ярче, чем он мог предполагать, исходя
из опытов, проведенных в более холодном климате. Стараясь установить
причину этого явления, Майер пытался путем размышлений понять, не
вызвано ли оно работой в условиях жаркого климата и связанными с этим
изменениями физиологических процессов. Это привело его к представлению
о том, что обмен веществ в организме связан с химическими превращениями
и производимой при этом механической работой. По-видимому, он первым
понял, что, отрицая общность закона сохранения энергии для всех форм
энергии, в том числе для тепловой, световой, химической энергии и меха-
нической работы, мы неизбежно придем к признанию существования жиз-
ненной силы. Последнее было для него неприемлемо. Майер обладал доста-
точной проницательностью для того, чтобы воспользоваться эксперимен-
тами Реньо по измерению теплоемкости газов при постоянных давлении
и объеме для определения механического эквивалента тепла. Эта величина
(4,2 дж/кал) была получена им в 1842 г. с поразительной точностью. Далее,
ему принадлежит установление закона сохранения энергии как некоего
общего закона. Исходя из этой идеи, он предположил, что источником сол-
нечной энергий является гравитационная энергия падающих на Солнце
метеоритов. Позднее аналогичная теория была предложена Кельвином.

Хотя точные опыты Джоуля подтвердили положения Майера (выска-
занные за два года до проведения этих опытов), его формулировка закона
сохранения энергии не встретила одобрения среди физиков, особенно
у Томсона и Тэйта. Только позднее два выдающихся биофизика, Тиндаль
и Гельмгольц, высказались в поддержку его взглядов, что несколько попра-
вило дело. Однако даже в наши дни биофизики должны быть готовы защи-
щать свои открытия от скептицизма некоторых ученых, работающих в более
разработанных областях науки.

Таким образом, несомненно, что впервые закон сохранения энергии
был распространен на биологию Майером. В биологических системах
превращенце энергии происходит, вероятно, более интенсивно, чем где-либо
еще на земле, и только специалисту в области механики может показаться
удивительным, что именно биолог первым проник в тайну превращения
энергии из одной формы в другую. После открытия Майера наступают
годы быстрого развития биофизики. Крупнейший биофизик того времени
Герман Людвиг Фердинанд Гельмгольц (1821—1894) начал свою деятель-
ность в том же 1842 г., в котором Майер вычислил механический эквивалент
тепла. Гельмгольцу принадлежит очень много глубоких исследований как
в биологии,' так и в физике. Одно перечисление этих работ заняло бы
целую главу. Он изучал мышечное сокращение, измерял скорость передачи
нервных импульсов, внес свой вклад в обоснование закона сохранения
энергии, изобрел офтальмоскоп (прибор, с помощью которого можно рас-
сматривать сетчатку глаза), создал вполне разумную теорию зрения и зани-
мался изучением природы слуха. Труды Гельмгольца послужили началом
изучения некоторых научных проблем, детально рассмотренных- в этой
книге. Кроме того, он сыграл определенную роль в открытии электромаг-
нитного излучения, так как опыты Герца велись в его лаборатории и в какой-
то степени под его влиянием. Гельмгольц был величайшим ученым, всю
жизнь ему сопутствовал успех в научных исследованиях.

Современник Гельмгольца Тиндаль прославился как талантливый
лектор. До сих пор его лекции о тепле как форме движения производят
чарующее впечатление на читателя. При этом он умел блестяще продемон-
стрировать эксперимент. Эти качества очень ценны там, где ясное и много-
стороннее мышление важнее, чем способность к глубокому проникновению
в суть какого-либо одного вопроса; особенно нужны они ученому, работаю-
щему в области биофизики. Круг интересов Тиндаля был очень широк.
Например, от изучения рассеяния света субмикроскопическими частицами
он перешел к проверке представления Пастера о природе действия бакте-
рий. В то время Королевский институт находился в серьезном затруднении,
вызванном появлением жизнестойких ВасШиз зиЫШз, не поддающихся сте-
рилизации кипячением. Тиндаль вышел из положения, применив метод,
заключавшийся в чередовании нагревания и охлаждения, что обеспечи-
вало уничтожение В. зиЬННз и сохранение пищи. Тиндаль верил в плодо-
творность изучения биологических явлений методами физики и был одним
из первых физиков, внесших существенный вклад в микробиологию.

После работ Тиндаля и Гельмгольца в биофизике наступил период
затишья, продолжавшийся до 1930 г. Это, вероятно, объясняется тем, что
такие первоклассные физики, как Гельмгольц и Галлстрэид (имеющий фун-
даментальные труды по офтальмоскопии), в конце XIX в. переключились
на чистую физику. В это время уже начался период стремительного разви-
тия атомной физики, длившийся до; 1930 г. Атомная физика привлекла
к себе внимание всех выдающихся физиков того времени. Одновременно
был сделан большой шаг вперед в развитии биохимии — науки, которой
принадлежит важнейшая роль в изучении биологических явлений. Таким
образом, в то время как развивались атомная физика и квантовая механика,
с одной стороны, и биохимия ферментов, витаминов и гормонов — с дру-
гой, биофизика оказалась вне сферы внимания ученых.

В 1930 г. положение уже начало изменяться. В это время Хилл при-
ступил к изучению тепловых и энергетических процессов в мышцах. Эти
исследования продолжаются и в наше время. Астбюри применил рентгено-
структурный анализ для изучения строения волоса и волокон шелка и шер-
сти и открыл три формы фибриллярных белков. С помощью этих методов,
продолжающих быстро развиваться в наше время, получены довольно точ-
ные данные о строении инсулина, гемоглобина, миоглобина и дезоксири-
бонуклеиновой кислоты, выделенной из тимуса. Примерно в 1930 г. Гейтс
начал работы по изучению биологических спектров действия; в это же время
Гехт приступил к биофизическому исследованию чувствительности глаза,
а Луфборо и Холидей занялись изучением спектров поглощения биоло-
гически активных веществ, выделенных и очищенных к тому времени.
В тот же период Касперсон определил соотношение белков и нуклеиновых
кислот в клетке, используя различия в спектрах поглощения этих двух
типов биологических полимеров.

Быстрое развитие электрофизиологии началось благодаря работам
Коула, Эдриана и Бронка. Тогда же Хартлайн приступил к изучению связи
между механизмом зрения и электрической реакцией глаза. Позднее поя-
вились работы Ли, посвященные применению ионизирующего излучения
(для которого характерна очень высокая проникающая способность) для
определения размеров и строения ферментов, вирусов, генов и хромосом.
Этот метод оказался многообещающим; им пользуются все чаще и чаще.

Таким образом, биофизика переживала настоящее возрождение и от нее
можно было ожидать новых волнующих открытий.

3.	Жизнь — порядок или хаос? Когда физик (в особенности экспери-
ментатор) впервые изучает биологию, его больше всего поражает много-
численность оговорок, которые необходимо делать, применяя к рассмат-
риваемым системам основные законы природы. Биолог же инстинктивно
чувствует невозможность свести биологические процессы к чему-то про-
стому и понятному, так как этим процессам присуща внутренняя слож-
ность и они не поддаются контролю со стороны человека. Следует разобрать-
ся в том, как возникает такое убеждение и насколько оно соответствует
тому, что мы знаем о живых системах.

Начнем с рассмотрения совершенно хаотических форм материи. Харак-
терным примером системы такого рода служит газ, поведение которого
можно очень хорошо описать, основываясь только на понятии вероятности
и на условиях сохранения энергии и числа частиц. В такой системе невоз-
можны ни непрерывные процессы превращения энергии из одной формы
в другую, ни упорядоченный рост, ни воспроизведение, т. е. эта система,
находящаяся в состоянии хаотического движения, не обладает ни одним
из признаков живой материи. Нужно иметь необычайно богатую интуицию,
чтобы объяснить жизненные процессы исходя из законов, описывающих
поведение таких абсолютно беспорядочных систем.
В качестве следующего шага рассмотрим несколько более упорядочен-
ную систему, а именно газ во внешнем поле. Молекулы такого газа распре-
делены в пространстве по определенному закону (экспоненциальному для
атмосферы). Однако, по-видимому, это не тот тип упорядоченности, кото-
рый характерен для живой материи. Хотя сложная система изменяющихся
градиентов концентраций несомненно играет роль в работе клетки, вряд ли
правильно считать их единственными определяющими факторами, полагая,
таким образом, что они являются одновременно и причиной и следствием.
Следовательно, крайняя точка зрения, согласно которой в основе жизни
лежат хаотические по своей природе процессы, мало правдоподобна.

Перейдем теперь к рассмотрению противоположной точки зрения
и предположим, что жизненные процессы высоко упорядочены, подчи-
няются известным законам природы и протекают в соответствии с одним
или двумя дополнительными общими принципами, т. е. что они упорядочены,
но сложны. Попытаемся понять, какая степень сложности соответствует
тому, что мы наблюдаем в растениях, бактериях и в организме человека.

Для ответа на этот вопрос рассмотрим многообразие существующих
типов атомов и молекул. В основе представления о строении атома лежат
следующие принципы:

1)	законы электродинамики и квантовой механики;

2)	принцип Паули;

3)	условие минимума полной энергии.

Число существенно различных типов атомов можно считать равным
8—10 (внутри каждой такой группы имеются разновидности). Это число
слишком мало, чтобы искать здесь какую-либо аналогию с жизненными про-
цессами.

В основе представлений о структуре молекул лежат те же три принципа
с той лишь разницей, что структура молекул зависит не только от силовых
полей, действующих на электроны, но и от сочетаний самих атомов. Это
приводит к гораздо большему разнообразию молекул по сравнению с ато-
мами. Однако, за исключением очень редких случаев, вещество, состоящее
из молекул, не обладает такими характерными признаками жизни, как
непрерывный круговорот энергии, способность к росту и делению, а также
дифференцировка, благодаря которой появляются новые функции. Посколь-
ку упомянутые выше три принципа обеспечивают большое разнообразие
типов молекул, можно ожидать, что число дополнительных принципов,
которым подчиняются жизненные процессы, невелико (возможно, не более
двух).

Один из них уже открыт биологами в результате эмпирического изу-
чения характерных черт живого мира. Это принцип органической эволюции
вместе с современной теорией генетического механизма мутационного про-
цесса, согласно которой окружающая среда воздействует на системы, обла-
дающие способностью расти, делиться и дифференцироваться, таким обра-
зом, что происходит отбор определенных типов этих систем. Разумеется,
этот механизм действует как при рассмотрении макроскопических процес-
сов, так и на клеточном уровне. Возможно, что одного этого дополнитель-
ного принципа уже вполне достаточно, однако возможно также, и с точки
зрения статистики весьма вероятно, что по крайней мере еще один важный
принцип остается неоткрытым.

4.	Краткие выводы. В заключение рассмотрим две схемы, приведенные
ниже. На первой схеме, законченной, но сильно упрощенной, изображено
развитие химии, вторая представляет' собой незаконченную схему раз-
вития биологии. Параллельное развитие химии и атомной физики показано
в общих чертах на первой схеме. В то время как в химии Лавуазье и Берцелиус
занимались изучением свойств химических элементов, законов, по которым
они вступают в соединение друг с другом, и обоснованием атомной теории,
в физике Ньютон, Кавендиш и Фраунгофер устанавливали законы механики,
оптики и электричества и наблюдали спектры элементов. После того как
была установлена применимость атомной теории и изучены атомные спектры,
области физики и химии начали перекрываться. Химики открыли периоди-
ческую систему элементов, представляющую собой отражение свойств
атомов, а физики создали модель атома (модель Резерфорда — Бора), поло-
жившую начало объяснению природы спектров. Однако долгое время связь
этой модели с периодической системой элементов оставалась непонятой.
Поэтому в 1912—1914 гг., наряду с «физическим атомом» Резерфорда —
Бора в физике, в химии существовал «химический атом» Льюиса и Ленгмюра.
Обе науки, в особенности физика, испытали кризис в связи с неудачами,
постигшими классическую квантовую теорию при изучении атома гелия,
структуры молекул и радиоактивности (мы ограничимся только тремя
примерами). Эта теория не могла быть также использована для обоснования
простого понятия валентности, распространенного в химии. Как химия, так
и физика нуждались в новых идеях. Развитие квантовой механики и уста-
новление принципа Паули не только позволило понять многие физические
и химические явления, но и способствовало значительному сближению
этих наук. Развитие физики и химии можно изобразить следующей схемой:

Физические законы движе-	Химическая характеристика

ния,и законы электростатики	элементов

! 1

Спектры элементов	Законы образования химиче-

ских соединений; открытие
атома

Электроны и атом Резер- <-----Первый конфликт ——> Валентность и периодиче-

форда—Бора	ская система

Кризис классической кван- <— Конфликт, требующий -—> Противоречия в понятии
товой теории	для своего разрешения	валентности

I	новых идей

*----------------> Квантовая механика <-

и принцип Паули

Аналогичная схема изображает развитие физики и биологии:

Физические законы

Атомная и молекулярная физиче-
ская химия

Теория межмолекулярных сил,
теория строения кристаллов и га-
зов

Природа таких макромолекул, как <— Конфликт? —>
белки и нуклеиновые кислоты

I_______________________

Характеристика живых существ

Клетка как единица биологиче-
ских систем

Органическая эволюция

Менделевская генетика

2 Заказ № П68
Эта схема по необходимости носит еще более общий характер. Конфликт
может начать развиваться в результате детального анализа менделевской
генетики, с одной стороны, и выяснения природы макромолекул, предпо-
лагаемых носителей наследственности — с другой. Или допустим, что
свойства этих молекул вполне соответствуют их генетической задаче и конф-
ликт может возникнуть на уровне большей сложности. Вполне вероятно,
что никакого конфликта вообще не возникнет. Во всяком случае именно
в области молекулярной биологии, этой бурно развивающейся новой области
науки, достигнуто наибольшее сближение между физикой и биологией.

Совершенно очевидно, что именно в наше время незаполненная область
в нижней части схемы должна представлять наибольший интерес для иссле-
дователя. По-видимому, правильный путь состоит не в попытках изучения
все более сложных вопросов, а в более глубоком понимании уже известных
явлений, либо в признании необходимости сформулировать всего один или
два дополнительных принципа. Даже при рассмотрении самых фундамен-
тальных, почти философских сторон биологии становится ясно, что объеди-
нение физики с биологией приводит к самым тонким современным пробле-
мам познания. Хотя правильная постановка этих проблем сопряжена с боль-
шими трудностями, все эти проблемы относятся к биофизике. Они очень
интересны и решение их имело бы чрезвычайно большое значение.

В этой книге мы рассмотрим только одну ветвь биофизики — молеку-
лярную биофизику. Начав в первых двух главах с общего обзора этой
области, мы займемся затем конкретными вопросами, а в конце книги вновь
перейдем к обобщениям.

ЛИТЕРАТУРА

1.	8 сЬ г б <1 1 п г Е., Шйа! 15 Ше? СатЬпб^е ИгйуегаШ Ргезз, 1944.

(Э. Шредингер, Что такое жизнь? М., ИЛ, 1947.)

2.	Н 1 1 1 А. V., 1Уйу В1орйу51С5, 8с!епсе, 124, 1233 (1956).

3.	Е 1 5 а 5 5 е г IV. М., Тйе Рйу51са1 РоипбаНопз о! Вю1о§у, Рег^ашоп Ргезз, Иеу/

Уогк, 1958.
Глава II

ЖИВАЯ КЛЕТКА

С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ БИОФИЗИКА

Открытие клетки имело для изучения живого такое же большое зна-
чение, как установление атомарного строения материи для развития физики
и химии. Так же как понятие об атоме существенно упрощает физику
и химику подход к изучению объектов своей науки, понятие клетки делает
возможным научный подход к изучению такого сложного объекта, как
живой организм. Мышцы, нервы, мозг, листья, трава, дрожжи и бактерии —
все построено из клеток. Понятие о клетке как универсальной единице
живого — одно из самых крупных обобщений в биологии.

На клетку можно смотреть по-разному, акцентируя внимание на тех
или на других сторонах ее строения и функционирования. Генетиков, на-
пример, особенно интересуют ядро и хромосомы, эмбриологов — взаимодей-
ствие клеток друг с другом, а биохимиков — химические компоненты
клетки. Биофизический аспект изучения клетки имеет свои особенности,
которым, собственно, и будет посвящена эта глава. Но сначала мы в самых
общих чертах расскажем, что представляет собой клетка по данным, накоп-
ленным цитологами. При этом нам по необходимости придется использо-
вать ряд терминов и понятий, о которых более подробно пойдет речь в после-
дующих главах. Содержание этой главы будет касаться в основном внеш-
них, видимых форм и структур живой клетки, а не протекающих в ней про-
цессов. Можно было бы сказать, что речь пока пойдет о сцене и декора-
циях, а не о самой пьесе, для представления которой они подготовлены.

1.	Общие характеристики типичной клетки. На фиг. 1 можно видеть
схемы клеток трех типов: растительных, животных и бактериальных. Для
растительной клетки характерно наличие твердой целлюлозной оболочки,
имеющей определенную форму. Большая часть клетки занята вакуолью,
представляющей собой пузырек жидкости, в котором видны кристаллики.
В клетке почти всегда имеется ядро. Очень характерным является также
наличие системы хлоропластов, играющих важную роль в фотосинтезе
сахаров. Отчетливо видны митохондрии. О роли, которую играет каждая
из перечисленных структур, будет сказано позже.

В отличие от растительной животная клетка (фиг. 1, Б) обычно не имеет
жесткой оболочки и в этом отношении похожа скорее на бактериальную,
чем на растительную клетку. В ней также отсутствует огромная вакуоль,
видная в растительной клетке. В ядре находится гетерохроматин, играющий
главную роль в явлениях наследования и содержащий ДНК, и ядрышки,
в которых находится РНК- Под электронным микроскопом видно, что ядер-
ная мембрана имеет довольно сложную структуру. В ней имеются поры,
через которые, возможно, осуществляется связь содержимого ядрасцито-
плазмой. Очень важными структурами цитоплазмы являются микросомы,
которые самым непосредственным образом связаны с синтезом белков.
Ультраструктуру микросом, по-видимому, образуют двойные мембраны,

Фиг. 1. Схематическое изображение вида клеток в обычном микроскопе#

А — растительная клетка: 1 — вакуоль, 2 — мембрана вакуоли, 3 — митохондрия, 4 — хло-
ропласт, 5 — ядрышко, 6 — ядерная мембрана, 7 — хроматин, 8 — клеточная оболочка;
Б — животная клетка: 1 —-гранулы зимогена, 2 — центриоли, 3 — митохондрии, 4 — аппарат
Гольджи, 5 — ядро, 6 — ядрышко, 7 — гетерохроматин, 8 — микросомы; В— бактериальная
клетка: 1 — ядерные тельца; 2 —включение, 3 — цитоплазма, 4 — слизистый слой, 5 — жгутики.

к которым прикреплены рибосомные гранулы. Не менее важными струк-
турными единицами являются митохондрии, содержащие систему окисли-
тельных ферментов. Митохондрии имеют довольно жесткую структуру
(видимую под электронным микроскопом), определяющую, по-видимому,
их высокую окислительную активность. Клетки животных обычно выпол-
няют определенную функцию, связанную с содержащими ферменты секре-
торными (зимогеновыми) гранулами и аппаратом Гольджи, который играет
роль системы переноса.

Для бактериальной клетки (фиг. 1, В) очень характерно высокое содер-
жание полисахаридов в клеточной оболочке. Это сообщает оболочке извест-
ную жесткость. С внешней стороны оболочки имеется слизистый слой, содер-
жащий белок и полисахариды, а с внутренней она ограничена плазматиче-
ской мембраной. Многие свойства клеток проще изучать на протопластах. —
клетках, у которых оболочка разрушена и плазматическая мембрана являет-
ся единственной границей между средой и клеткой. Бактериальные клетки
снабжены жгутиками, которые обеспечивают их подвижность. Внутри

клетки можно видеть ядерные образования. В них
содержится большая часть, а может быть и вся, ДНК
клетки.

Каждая клеточная структура имеет интересное
и сложное микроскопическое строение. В последние
годы детали этих структур интенсивно изучаются бла-
годаря успехам электронной микроскопии ультратонких
срезов. Работы в этой области способствуют быстрому
накоплению наиболее существенных сведений о струк-
туре клетки. Электронномикроскопическими исследова-
ниями установлено, что ядерная мембрана состоит из
переплетенных крест-накрест нитей, каждая из которых
имеет длину около 10 000 А и диаметр 500 А. В мембране
видны поры с диаметром около 1000 А, заполненные
каким-то плотным материалом. Естественно, возникает
вопрос, могут ли эти поры избирательно контролиро-
вать диффузию; однако он пока еще не получил ответа.
Интересное строение имеют на электронных микрофото-
графиях реснички и жгутики — двигательные струк-
туры бактерий. Их сложное строение четко видно
на поперечных срезах (фиг. 2). В ресничках всегда име-
ются девять периферических пар миозиновых волокон

Ф и г. 2. Схема-
тическое изобра-
жение поперечно-
го сечения ресни-
чки,показывающее
правильное распо-
ложение миозино-
вых волокон.

Этот тип структуры
не является чем-то
редким и выдающим-
ся, он приведен для
иллюстрации упоря-
доченности, которая
обнаруживается в
живых системах на
макромолекулярном
уровне.

и одна центральная. В жгутиках миозиновые волокна объединены по три.

Как в ядерных, так и в клеточных оболочках под электронным микро-
скопом обнаруживаются двойные мембраны, имеющие толщину около
100 А. Появляется все больше данных, говорящих в пользу того, что эти мем-

браны представляют собой важный элемент различных клеточных струк-
тур. Их обнаруживают и в митохондриях, и в пластидах растительных кле-
ток, и в аппарате Гольджи, и в гранах хлоропластов.

Цитоплазма клетки представляет собой вязкую жидкость с необыч-
ными физическими свойствами. Она может то превращаться в довольно
плотный гель, то снова приобретать свойства жидкости. Это, несомненно,
связано с изменением характера взаимодействия мельчайших структурных
единиц цитоплазмы. На фиг. 3 представлена электронная микрофотография
среза бактериальной клетки. Хорошо видна клеточная оболочка и плаз-
матическая мембрана. В цитоплазме отчетливо видны многочисленные
гранулы. Эти гранулы, по-видимому, представляют собой микросомы. Их
можно выделить, центрифугируя бактериальный гомогенат. Кроме пере-
численных структур, на микрофотографии виден целый ряд крупных частиц.
Это ядерные образования с уплотненными участками, возникшие, по-ви-
димому, в результате повреждений ядра при приготовлении препарата.

В клетках почти всех типов имеется ядро. Важнейшей частью ядра
являются хромосомы. С этими длинными нитевидными образованиями,
вероятно, связаны все наследственные свойства клетки. Хромосомы не обна-
руживаются лишь в ядрах бактерий. Это, кажется, единственное исклю-
чение, причем его нельзя считать бесспорно установленным.
2.	Клеточные органеллы. В известном смысле составные элементы
клетки должны быть более простыми и универсальными, чем сами клетки.
Можно ожидать, что развитие электронной микроскопии тонких срезов

Фиг. 3. Делящаяся клетка Е. соИ 15 Т"П_, фиксиро-
ванная формалином и четырехокисью осмия, залитая
в метакрилат и окрашенная гидроокисью свинца
( х 40 000).

Цитоплазма содержит большое число маленьких гранул, по-ви-
димому рибосом. Видны также гранулы несколько больших раз-
меров (500—600 А), которые проявляются после окраски свин-
цом или лантаном. В области ядра обнаруживаются тонковолок-
нистые структуры, в ряде мест близко прилегающие к цито-
плазме. Не видно никаких признаков существования ядерной
мембраны. Хорошо заметна двухслойная структура клеточной
оболочки. В нескольких местах видны клеточные мембраны.

даст нам в этом окончательную уверенность. Сейчас электронная микро-
скопия позволяет идентифицировать две основные универсальные струк-
туры в самых разнообразных типах клеток. Это — митохондрии и микро-
сомы. Митохондрии являются теми частями клетки, где с помощью соот-
ветствующих ферментов протекают процессы клеточного дыхания. Их
можно найти в клетках самых различных типов. Тонкое строение митохонд-
рий все еще является предметом спора между различными исследователями,
однако многое можно считать твердо установленным. Так, например, извест-
но, что митохондрия, по форме напоминает цилиндр. Диаметр этого цилиндра
равен примерно 0,5 р (или 5000 А.), а длина может быть различной и дохо-
дит в некоторых случаях до 10 р. Поперек цилиндра расположен ряд двойных
мембран, вероятно связанных с наружным слоем (так называемые кристы).
Строение митохондрий каким-то образом обусловливает наиболее целесо-
образное пространственное расположение работающих в них ферментов.
Открытие принципов, которые лежат в основе пространственного строения
митохондрий, является одной из насущных задач молекулярной биофизики.
Микросомы клеток различных
но, как митохондрии. Основой их
довольно сложной конфигурации,

типов построены не столь единообраз-
строения являются двойные мембраны
на поверхности которых прикреплены

Ф и г. 4. Картины, полученные при центрифугировании разрушенных кле-
ток ВасИ1и$ зиЫШз на разных стадиях развития от споры до активно деля-
щихся клеток (по данным Возе, Ленгриджа и Моровица).

Цифры означают время развития в минутах. Снимок, обозначенный словами «Логарифми-
ческая фаза*» относится к активно делящимся клеткам. Ясно видно, что сложность
состава рибосомной фракции увеличивается со временем.

частицы диаметром порядка 300 А. В микросомах (рибосомах), по всей
вероятности, происходит синтез белка.

Следует упомянуть также о клеточных мембранах, так как и здесь
начинает выявляться единообразие строения в клетках самых различных
типов. Установлено, что они состоят из двойных молекулярных слоев бел-
ков и липидов и имеют совершенно одинаковую толщину. Клеточные мем-
браны обладают очень интересными функциональными свойствами, в част-
ности переменной проницаемостью. Изучение природы этого явления
представляет собой одну из важнейших проблем молекулярной био-
физики.

Важным направлением цитологии является выделение определенных
фракций клетки. Для этого требуется предварительное разрушение клетки,
чего можно добиться разными средствами, например путем обработки
специфическими ферментами, расщепления с помощью ультразвука и т. п.
Выделение определенных компонентов из полученного гомогената можно
также производить различными способами. Прекрасным методом фракцио-
нирования служит центрифугирование. Центрифугированием можно срав-
нительно легко разделить клеточные оболочки и мембраны, митохондрии,
микросомы, микросомные частицы и другие еще более мелкие молекулярные
фракции. При разумном выборе метода фракционирования, как правило,
удается выделить и исследовать определенный компонент клетки. Мито-
хондрии, например, относительно легко выделяются центрифугированием.
Фракционирование же на ионообменной колонке дает лучшие результаты
для макромолекулярных составляющих, чем для больших органелл.

Пример использования фракционирования на центрифуге приведен
на фиг. 4. На этих фотографиях показано распределение плотности при
центрифугировании гомогената прорастающих спор ВасШиз зиЫШз на
разных стадиях роста. Центрифугирование разделяет компоненты микро-
сом — рибосомы. Фотографии показывают, что в покоящихся спорах видно
только два таких компонента. По мере приближения к стадии активного
деления число компонентов растет.

Существенное достоинство фракционирования на центрифуге состоит
в том, что этот метод обеспечивает возможность физико-химического анализа
различных фракций клетки. Он позволяет определить химический состав,
например,, белков, липидов, полисахаридов или нуклеиновых кислот и,
кроме того, измерить такие их физические параметры, как скорость седи-
ментации, спектр поглощения, светорассеяние и т. д. Таким образом, откры-
вается возможность проведения довольно тонкого анализа составных частей
клетки.

В ряде случаев удалось подобрать такие условия, в которых выделен-
ные компоненты клетки продолжают функционировать почти так же, как
и в неразрушенной клетке. Например, хлоропласты растительных клеток
сохраняют способность к фотосинтезу, а микросомы печени продолжают
включать аминокислоты в белковоподобные молекулы. Исследования на
таких бесклеточных экстрактах очень плодотворны, и им принадлежит
выдающаяся роль в успешном развитии наших знаний о механизмах кле-
точных процессов.

3.	Молекулярный состав клетки. Само название этого раздела доста-
точно характеризует весьма общий подход, типичный для этой главы.
Так как клетки различных видов отличаются друг от друга и, кроме
того, изменяются на протяжении истории своей жизни, вариации их моле-
кулярного состава могут быть очень значительными. Однако, с другой
стороны, бактериологи, физиологи растений, энзимологи и даже клини-
цисты интересуются одними и теми же соединениями, число которых весьма
невелико. У физика, работающего в области низких температур, меньше
общих интересов с ученым, занимающимся ядерной физикой, несмотря на
то что они коллеги по профессии, чем у бактериолога и физиолога живот-
ных, даже если оба они занимаются совершенно разными вещами. Именно
благодаря удивительному единству живых систем мы можем отважиться
на описание клетки вообще.
Например, при химическом анализе бактериальной клетки, весьма
удобной для этой цели, в типичном случае получаются следующие
результаты:

Размеры клетки:	
длина	Зр(3-10-в Л1)
диаметр	1 р (10~6 Л1)
объем	2,25^8(2,25-10-18 жЗ)
Сухой вес	6,7-10-13 г
Компоненты клетки:	
вода	~ 70%
ДНК	3,5-10—14 г, или 5% сухого веса
РНК	7-10-14 или ю% сухого веса
липиды	4,2-Ю-14 г, или 6% сухого веса
фосфолипиды	2,6-10-14 Й1 или 4% сухого веса
полисахариды	~ 5% сухого веса
белки	~ 4,7-10-13 г

Чтобы выяснить, какое количество молекул перечисленных соединений
находится в клетке, нам необходимо иметь представление об их молекуляр-
ных весах. Молекулярный вес нуклеиновых кислот обоих типов приблизи-
тельно равен 106, следовательно, вес 6-Ю28 молекул составляет^ 106г,
а вес одной молекулы— 1,66-10"18 г. Для молекул липидов и фосфоли-
пидов нет каких-либо определенных данных, поэтому примем, довольно
произвольно, что их молекулярный, вес равен 103; тогда вес каждой частицы
будет составлять 1,6- 1С 23 г. Молекулярный вес полисахаридов имеет
величину порядка 2,0-104, для веса одной молекулы в этом случае полу-
чаем 3,3-Ю-20 г. Для белка средний молекулярный вес можно принять
равным 6-Ю4 и вес молекулы 10-1® г. Ниже мы приводим число моле-
кул разного типа в бактериальной клетке.

ДНК	2,1-104
РНК	4,2-104
Липиды	2,5-10’
Фосфолипиды	1,6-10’
Полисахариды	1,0-106
Белки	4,7-106

Обращает на себя внимание, что эти числа настолько малы, что распре-
деление указанных типов молекул, по-видимому, не может подчиняться
законам статистики. Это означает, что исходя из случайного характера
движений молекул следует ожидать довольно больших флуктуаций в распре-
делении материала клетки при делении; в общем случае величины флуктуа-
ций будут определяться корнем квадратным из числа молекул. При этом
регулярность в распределении ДНК и РНК, по-видимому, не может пре-
вышать 1%, и очень часто будут встречаться флуктуации еще большей
величины. Это расходится с тем фактом, что бактерии, например, очень
точно воспроизводятся спустя много поколений. Именно это противоречие
привело в свое время Шредингера к мысли о том, что регулярность в биоло-
гических системах не является по своей природе молекулярно-статистиче-
ской, а существенным образом связана со свойствами индивидуальных моле-
кулярных структур. Таким образом, совершенно очевидно значение иссле-
дования такого рода структур в клетке; это следует из самого элементар-
ного арифметического расчета. Следовательно, одним из важнейших напра-
влений биофизики является изучение молекулярной структуры ДНК, РНК,
липидов, фосфолипидов, полисахаридов, белков и нахождение соотноше-
ния между ними.

Выбор бактериальной клетки в качестве объекта рассмотрения, разу-
меется, до известной степени нас ограничивал. В растительной клетке,
например, имеется большое количество целлюлозы — сложного полимера,
элементарной единицей которого является молекула сахара. Таким образом,
ограничившись рассмотрением бактериальной клетки, мы пропустили
большой раздел физиологии растений. Мы сделали это намеренно, потому
что, как будет показано далее, основные проблемы молекулярной био-
логии связаны именно с шестью типами молекул, описанными выше.

В следующем разделе мы коротко остановимся на этих шести типах
молекул.

4.	Биологические молекулы и их основные свойства. В таких описа-
тельных дисциплинах, какой была биология на ранних стадиях своего
развития, довольно часто даются названия объектам, детальное строение
которых еще не известно, а известны лишь их наиболее общие и важные
свойства. Одним из примеров таких названий является термин «протоплаз-
ма»,. и, хотя до сих пор строение протоплазмы еще не изучено до конца, это
понятие сыграло очень важную роль. Оно подчеркивало общность основ-
ных компонентов различных клеток и предвосхитило то, что компоненты
протоплазмы различных клеток, как будет показано далее, действительно
обладают удивительным единообразием.

Белки. Белки построены из двадцати аминокислот, которые распола-
гаются в той или другой линейной последовательности, образуя полипеп-
тидную цепь. Общая химическая формула аминокислоты может быть запи-
сана в следующем виде:

К
!
н2н—с—соон
н

При определенных условиях аминокислота может принять форму

К
I
+Н2Ы — с—соон-
н

представляющую собой амфотерный ион. Способность к образованию таких
ионов является одной из наиболее важных характеристик белков.

Полипептидная цепь может быть изображена следующей структурной
формулой:

О	К	Н

И	I	I

НС 'С нн...

\/ \ /|\ / \|/

....с ине с
I	I	II	I

к	н	о	к

К в этой формуле изображает тот или другой аминокислотный остаток.
Такая цепь образуется путем связывания большого числа аминокислот-
ных остатков, причем каждый акт присоединения аминокислоты сопро-
вождается образованием одной молекулы воды. Есть все основания думать,
что существует матрица, на которой аминокислоты располагаются в неко-
тором определенном порядке и затем в процессе биосинтеза связываются
друг с другом в полипептидную цепь. Такое представление об образовании
трипептида иллюстрирует схема, приведенная на фиг. 5. Совершенно ясно,
что строение матрицы (заштрихованная часть на фиг. 5) представляет

ОН СН3 О СН2СеНе СН28Н

с-с-м—с-с-мн—с- с— мн2
ж \	I	II I

он	н	он

Ф и г. 5. Процесс соединения трех аминокис-
лот — аланина, фенилаланина и метионина — с
образованием трипептида аланилфенилаланилме-
тионина.

большой интерес. Не менее интересно также, как и при помощи каких хими-
ческих агентов осуществляется синтез пептидной связи и удаление Н2О.
Позже мы вернемся к этому процессу, называемому синтезом, белка.

Приведем названия двадцати аминокислот и их химические формулы:

Глицин

Аланин

Валин

Лейцин

Изолейцин

Серин

Треонин

Цистеин

Метионин

Глутаминовая кислота

Аспаргиновая кислота

Н2И—СН—Н
I
соон

Н2И—сн—СНз

I
соон
,сн3

—сн<
хсн3
/СН3

— СН2СН<
хсн3
СН2-СН3

—снф
хсн3

— СН2ОН

— снон—сн3

— СН28Н

— СН2СН28СН3

—сн2—сн2—соон

—сн2—соон
Лизин

Аргинин

Фенилаланин

Тирозин

Триптофан

Г истидин

Цистин

Пролин

Оксипролин

—(СН2)8—СН2ЫН2

.МН

-(СН2)3—МН-С<
хмн2

~СН2 -<( У

н

—сн2—с=сн
I I
м мн

н

СН2—8—8—СН2

н2м—сн	сн—соон

I	I

соон	мн2

Н2С—сн2

Н2С сн—соон

н

ноне—сн2
I I

Н2С сн—соон

н

У всех аминокислот имеется общая группа Н2КСНСООН; к первому угле-
роду этой группы у разных аминокислот присоединены различные боковые
цепи. Поэтому в приведенном выше списке для всех аминокислот, за
исключением глицина, -аланина, цистина, пролина и оксипролина, ука-
заны только боковые цепи. Хотя в наши планы не входит более детальное
описание аминокислот, нам кажется бесспорным, что каждый биофизик
должен быть хорошо знаком с этими соединениями, поскольку они в извест-
ном смысле составляют алфавит биологии. Большое значение имеют хими-
ческие и полярные свойства этих веществ, но физику также необходимо
иметь представление об их спектрах поглощения и размерах. Эти характе-
ристики будут более подробно обсуждены в дальнейшем.

Белки имеют молекулярные веса в пределах от 3-103 (грамицидин) до
сотен тысяч (миозин). Формы их молекул могут быть самыми различными.
Среди важнейших свойств белков следует указать их способность к спе-
цифическому катализу. Белки, обладающие этим свойством, называют
ферментами. Ферментативные процессы несомненно играют ведущую роль
в биологических системах.

Нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК- Физик, привыкший к глубоким
размышлениям над основными закономерностями своей науки, пораженный
разнообразием и изменчивостью живого мира, будет, по-видимому, удивлен
тем, что белок построен сравнительно просто. Ведь двадцать аминокислот —
это в конце концов немногим более числа элементов в двух столбцах перио-
дической таблицы. Удивление физика возросло бы еще больше, если бы
он познакомился с нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновые кислоты пред-
ставляют собой высокомолекулярные соединения из пуриновых и пири-
мидиновых оснований, сахара и фосфорной кислоты. Однако число «строи-
тельных кирпичиков», образующих эти полимеры, очень невелико и равно,
вообще говоря, шести, а в подавляющем большинстве случаев всего лишь
четырем. Различают два вида нуклеиновых кислот — рибонуклеиновую
(РНК) и дезоксирибонуклеиновую (ДНК). Они отличаются друг от друга
типом входящих в их состав сахаров и тем, что в РНК вместо тимина имеется
урацил.

Элементарной единицей полинуклеотидной цепи, аналогичной ами-
нокислоте в полипептиде, является группа

Основание—Сахар—Фосфат.

Связь между этими группами осуществляется через сахара и фосфаты
следующим образом:

Основание—Сахар

I

Фосфат

I

Основание—Сахар

I

Фосфат.

Составные части нуклеиновых кислот часто рассматривают как само-
стоятельные соединения. Так, соединение основания с сахаром (рибозой
или дезоксирибозой) называют нуклеозидом. А если к нуклеозиду присое-
динить фосфат, то получим нуклеотид. Приведем структурные формулы
оснований и сахаров, содержащихся в ДНК и РНК:

Пиримидины

Цитозин

а-Оксиметилцитозин
(встречается в некоторых
случаях в вирусной ДНК)

КН2
1
С

\

И сн

I II
с сн
// \ /
о и

н

ИН2
I

с

ХС—СН2ОН

I II

с сн

н
Урацил (только в РНК)

Тимин (только в ДНК)

Пурины

Аденин

Гуанин

ньГ^с—И

I II \

Н2ИС с сн

\/\/
и и
н

Сахара

Рибоза

СН2ОН

ОН С-С

I I

ОН ОН

Дезоксирибоза

н х°ч

| / \ СН2ОН
с с /
|\Н Н/\Н
онс-с
Эти основания, соединенные с сахаром и фосфатом, связываются в огромные
молекулы с молекулярным весом порядка нескольких миллионов. Струк-
тура нуклеиновых кислот постепенно выясняется, и каждое новое открытие
в этой области сопровождается буквально сенсационными успехами моле-
кулярной биологии. Взаимоотношения нуклеиновых кислот с белком и меж-
ду собой еще до конца неясны. Почти достоверно известно, что нуклеиновая
кислота и служит той матрицей, на которой аминокислоты располагаются
в строго определенном порядке при синтезе белка. Позже мы рассмотрим,
каким образом это происходит.

Связи между основаниями, сахарами и фосфатами в нуклеиновых кис-
лотах схематически показаны на структурной формуле (фиг. 6). Благо-

Тимин О

н
ы—с

о=с к

\	/ \Н н

с—сн с—с

ЧСН2

оЧо он

\1/ л.

. ;Р Фосфат

/	/	Н\/

СНз О	С Дезоксирибоза

с •-"=

/ \ н \

ни с—и	о пн

I II \	\/он

НгМ(чЛ/сн °=р №
ы и

Гуанин \Н Н А
С—С

О	С Дезоксирибоза

Фиг, 6. Схема соединения оснований, сахаров и фосфатов в молекуле ДНК.
Основания расположены относительно основной углеводио-фосфатной цепи таким образом, что
могут образовываться водородные связи между положительно заряженными ИН-группами и отри-
цательно заряженными С=О-группамн (в трех местах в случае гуанина и цитозина и в двух —
в случае аденииа и тимина). Эти связи устанавливаются между основаниями двух сплетенных
цепей ДНК. Они сообщают известную жесткость огромной линейной молекуле ДНК которая,
судя по всему, обеспечивает генетическое управление жизнью клетки.

даря такой структуре молекула способна принимать форму двойной спи-
рали, которая рассмотрена в гл. V.

Отметим снова, что для этих шести оснований, составляющих вместе
с 20 аминокислотами биофизический алфавит, очень важно знать не только
химические, но и физические свойства — поглощение в ультрафиолете,
размер и форму, деформируемость ит. п. Более подробно на этих свойствах
мы остановимся в дальнейшем.

Липиды. Липиды — это соединения жирных кислот с длинной цепью
и глицерина. Проиллюстрировать строение липидов ожно, например,
следующей структурной формулой;

О

Н2С—О—С—(СН2)16—СН3

о
II
НС - О - С - (СН2)16 - сн3

Н2С-О-С-(СН2)16-СН3

II

о

Липцды имеют молекулярный вес порядка 103. Они используются в клет-
ке в качестве запасов пищи, а также входят в состав ее структурных эле-
ментов.

Фосфолипиды. Это также соединения жирных кислот с длинной цепью
и глицерина, только вместо третьей жирной кислоты в состав фосфоли-
пидов входит фосфорная кислота, которая может соединяться с различными
основаниями. Приведем формулу одного из фосфолипидов — лецитина:

О

I!

СН2О-С-(СН2)16-СН3

о

II

СНО—С—(СН2)14—сн3

о

СН2О—Р—О—СН2—СН2—Ы(СН3)3 он

I

он

В данном случае основание представляет собой холин:

НО - (СН2)2- Н(СН3)3-ОН.

Полисахариды. Было замечено, что небольшие сами по себе молекулы
сахара могут образовывать полимеры с очень большим молекулярным весом.
Образующиеся в результате такой полимеризации полисахариды играют
в клетке очень важную роль. Они могут специфически соединяться с неко-
торыми белками и часто обнаруживают высокую антигенную активность.
Среди таких полисахаридов можно назвать: гликоген, разветвленный гомо-
полисахарид, достигающий молекулярного веса порядка 106; гепарин —
сульфированный полисахарид, являющийся эффективным антикоагулян-
том, и гиалуроновую кислоту, мономерная единица которой изображена
ниже. Это — соединение ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты.
Весьма вероятно, что полисахариды играют важную роль в явлениях,
протекающих на поверхностях раздела. Так, полисахариды находятся
в слизистом слое бактерий и являются компонентами капсулы некоторых
штаммов пневмококков.

Читатель, особенно разбирающийся в биохимии, будет, очевидно,
неудовлетворен тем, что мы ограничимся только описанием указанных
выше биологически активных молекул. Он спросит: «А где же небольшие
молекулы — ионы, соли, витамины и гормоны?» На это можно ответить,
что они, конечно, имеются, но в чрезвычайно малых количествах. В дрож-
жах, очень богатых белком, лишь 5% азота аминокислот приходится на
свободные молекулы этих соединений. То, что в клетке обнаруживается
незначительное количество низкомолекулярных веществ, объясняется в ос-
новном двумя причинами. Во-первых, они входят в состав высокомолекуляр-
ных соединений и весьма интенсивно расходуются при реакциях их синтеза;
во-вторых, малые молекулы, такие, как витамины и гормоны, довольно
часто играют определенную роль в некоторых биохимических процессах,
но при этом достаточны, по-видимому, весьма малые концентрации этих
веществ. Подобным образом некоторые металлы могут играть существенную
роль в образовании целого ряда структур, присутствуя в очень незначи-
тельных количествах. Таким образом, хотя изучение низкомолекулярных
веществ клетки и имеет огромное значение для биохимии, мы отложим до
другого времени знакомство с ними, так как сейчас нас занимает биофизиче-
ский обзор основных компонентов клетки — «сцены» как мы выразились
во введении.

5.	Рост и деление клетки. Никакое словесное описание процесса роста
п деления клетки не может заменить непосредственного наблюдения этой
картины в микроскоп. Каждому биофизику очень полезно понаблюдать про-
текающие в клетке процессы при помощи фазово-контрастного микроскопа.
Едва ли целесообразно рассматривать здесь различные формы клеточного
деления. Мы намерены привлечь внимание читателей пока лишь к некото-
рым важнейшим сторонам этого явления, а более подробное его описание
будет дано позже.

При наблюдении за живой клеткой в первую очередь обращают на себя
внимание ее рост и деление. Когда клетка находится в подходящей среде,
то при соответствующей температуре она непрерывно растет, т. е. вещества,
проникающие через ее мембрану, все время превращаются в специфические
белки, нуклеиновые кислоты, липиды, витамины и т. д.; другие вещества,
ненужные для нормального баланса внутриклеточных процессов, выбра-
сываются за пределы клетки. Эти процессы превращения веществ предста-
вляют очень большой интерес и успешно изучаются биохимией. Особенно
ценным в такого рода исследованиях является широко применяемый в на-
стоящее время метод меченых атомов. Использование меченых сахаров,
аминокислот, пуринов и пиримидинов позволило произвести настоящую
революцию в представлениях о природе биологических процессов. Приме-
няемые для этой цели методы и первые полученные с их помощью данные
будут рассмотрены в следующих главах.

Большинство работ по изучению клетки проделано на микроорганиз-
мах: бактериях, дрожжевых клетках, плесневых грибах (актиномицетах),
что объясняется естественным желанием иметь дело с клетками макси-
мально простых типов. Кроме того, перечисленные организмы можно выра-
щивать на искусственной среде определенного химического состава, что
имеет очень большое значение. Выращивание на такой среде позволяет,
например, проводить исследования с мутантами, утратившими способность
3 Заказ № 1168
рого происходит синтез

Ф и г. 7. Схематическое изобра-
жение интервала времени 8, в те-
чение которого клетка синтези-
рует ДНК.

Синтез происходит во время приблизи-
тельно одной трети цикла и не идет
ни иепосредственио перед клеточным
делением М (участок &2)> ни сразу после
него (участок Сам процесс деления
происходит за короткое время и имеет
две стадии — разделение хромосом
и собственно деление клетки.

к синтезу определенных соединений, необходимых для жизнедеятельности.
Исследования, основанные на такой методике, способствовали интенсивно-
му развитию генетики микроорганизмов. Сравнительно недавно удалось
показать, что, подобрав среду соответствующего состава, можно таким же
образом выращивать и отдельные клетки, извлеченные из тканей млекопи-
тающих. Это открытие, сделанное Паком и Маркусом, было использовано
для изучения чувствительности этих клеток к облучению. Удалось также
показать, что в таких высокоразвитых клетках синтез ДНК не продолжает-
ся непрерывно во время всего цикла деления, а происходит в соответствии
с циклическим процессом, изображенным на фиг. 7. Время, в течение кото-
занимает только одну треть времени жизни
поколения. Непосредственно перед деле-
нием и сразу после него синтез ДНК
никогда не наблюдается. Сам процесс деле-
ния происходит очень быстро и занимает
по времени около 5% времени жизни
поколения. У бактерий ЕзскепсИга со11
синтез ДНК идет с переменной скоростью
в течение 85% времени клеточного цикла.

При наблюдении деления клеток чаще
.всего приходится сталкиваться либо с про-
стым делением (микроорганизмы,) либо
с митозом (клетки высших организмов).
С процессом мейоза, при котором число
хромосом в наборе уменьшается вдвое,
нам приходится иметь дело не очень часто.
Мейоз имеет большое значение в цитоге-
нетике, а со временем безусловно будет
показано, что он интересен и с биофизи-
ческой точки зрения. Однако физическая

природа ни одного из процессов деления клеток или клеточных органелл
пока еще не ясна, поэтому мы должны в первую очередь сосредоточиться
на наиболее простых и хорошо освоенных системах.

Рост клетки. Клетка растет за счет использования внешнего материала
и превращения его во внутриклеточные компоненты. Скорость обмена
веществ и синтезов в клетке обычно очень велика. Растущая бактериальная
клетка может синтезировать до 40 000 аминокислот одного вида в секунду.
За то же время она может создать до 150 000 пептидных связей, и если рост
происходит в благоприятных условиях (не происходит накопления мета-
болитов), то клетка может усвоить количество вещества, по весу в 50 раз
превосходящее вес клетки в начале клеточного цикла. Очевидно, что одной
из проблем биофизики является выяснение вопроса о том, могут ли стати-
стические процессы, такие, как диффузия, обеспечить эту чрезвычайно
высокую скорость роста и синтезов в живой клетке.

Рост бактериальной культуры, помещенной в соответствующие условия,
описывается кривой, представленной нафиг. 8,А. Математически такая
кривая может быть записана в форме

М = /.2П,

где Л7 — общее число имеющихся клеток (вся популяция), I — начальное
число клеток ил — номер поколения. Это выражение можно записать также
в виде


где 10— продолжительность одного цикла деления, а — время, про-

шедшее с начала роста культуры.

Очевидно, что п = 1Ц0- Действитель-
ное поведение популяции бактериаль-
ных клеток несколько сложнее, так
как условия, в которых развивается

Фиг. 8. Кривые роста различных клеток.

Л- Рост Е. соН на минимальной среде как функция времени. Можно видеть, что
большую часть времени численность популяции растет по логарифмическому закону.
Отступление от этого закона наблюдается лишь тогда, когда культура становится
слишком плотной и сильно изменяется ее соотношение со средой. Если I — началь-
ное число клеток на 1 мл и — продолжительность жизни поколения, то выпол-
няется равенство М = /-2^0.

Б. Рост клеток НеЕа в культуре ткани.

популяция, не сохраняются неизменными, что, разумеется, отражается на
кривой роста. Увеличение популяции, например, приводит к «перенаселе-

нию» и, следовательно, к замедлению роста
популяции. Однако в большинстве случаев про-
цесс роста следует простому экспоненциальному
закону.

На фиг. 8, Б, где изображен рост культуры
клеток НеЬа в среде постоянного состава (работа
Пака), можно видеть тот же тип адаптации
и экспоненциальный характер роста, что и на
фиг. 8, А. Отличие состоит лишь в большей
продолжительности цикла деления клеток НеЬа.

Продолжительность цикла деления бакте-
риальных клеток сильно зависит от темпера-
туры, что можно видеть из кривой на фиг. 9.
В температурном интервале в несколько гра-
дусов скорость синтеза изменяется в десятки
раз. Такого рода зависимость типична для хими-
ческих реакций, требующих преодоления энер-
гетического барьера, в физических же процессах
она обычно не имеет места. Следует отметить,
что температурная зависимость скорости фермен-
тативных реакций имеет вид, напоминающий
кривую на фиг. 9. Таким образом, общая зависи-
мость скорости роста клетки от температуры

Ф и г. 9. Зависимость вре-
мени жизни поколения бак-
териальных клеток в куль-
туре от температуры.

Время жизни поколения опре-
деляется кинетикой химических
процессов обмена веществ. Ха-
рактер изменений типичен для
процессов, требующих энергии
активации (например, для мно-
гих ферментативных реакций),
а не для таких физических про-
цессов, как диффузия.

связана с тем, что белки

клетки играют роль катализаторов.

Эффективным для изучения синтезов в бактериях является метод,
при котором один из необходимых компонентов питания добавляется в среду
в небольшом количестве (заведомо недостаточном для нормального развития).
При этом синтез продолжается, но скорость его определяется скоростью
поступления указанного компонента. В такого рода опытах было уста-
новлено, что бактерия может усвоить около х/4 лимитирующего рост ком-
понента питания, а после этого скачком приобретает способность обойти
созданное затруднение и начинает использовать для роста другой механизм
синтеза, вследствие чего скорость роста быстро увеличивается. Это явление
связано с образованием адаптивного фермента, или с «индукцией». Его
изучение дало чрезвычайно ценные сведения о важнейших чертах
клеточных процессов.

Деление клетки. Рассмотрим теперь деление клетки — явление, нераз-
дельно связанное с процессами жизнедеятельности. Рост клетки не про-
должается постоянно. После наступления определенной стадии (завися-
щего от ряда факторов) клетка делится и образуются две новые клетки.
Деление клетки — очень сложное явление, и его нельзя рассматривать как
простой физический процесс, связанный только с расходом определенных
количеств поверхностной и объемной энергии. Эти факторы, разумеется,
вносят свой вклад, но они имеют, по-видимому, лишь второстепенное значе-
ние в цепи прекрасно согласованных во времени явлений деления.

Деление клетки — не просто деление на две части. Существует целый
ряд условий, которые должны быть выполнены при делении. Компоненты
ядра, хромосомы и связанные с ними структуры должны поделиться поровну
между дочерними клетками. Компоненты цитоплазмы также должны быть
разделены приблизительно поровну. Это означает, что до того, как про-
изойдет видимое деление клетки, происходит целый ряд субмикроскопиче-
ских удвоений генетически важных структур и субъединиц, принимающих
участие в реакциях синтеза. Процесс этот строго упорядочен. Например,
было установлено, что нуклеопротеидные нити хромосом перед делением
располагаются парами, причем в каждой паре подавляющее большинство
генетически родственных участков обеих нитей оказывается расположен-
ным точно друг против друга. Хромосома может разделиться на части и вос-
соединиться в другом порядке, и тем не менее спаривание соответствую-
щих генов будет происходить в максимально возможной степени. Это указы-
вает на существование некоторого специфического взаимодействия между
генами. Выяснение природы этого взаимодействия представляет собой
очень интересную проблему. В настоящее время появляется большое число
гипотез, в которых содержатся попытки объяснить это взаимодействие
с позиций физики.

Тот факт, что порванные хромосомные нити обладают способностью
«срастаться», как говорят цитогенетики, ставит еще одну физическую про-
блему. Одинакова ли природа сил, восстанавливающих разорванную
хромосому и длинную молекулу вируса? Или, может быть, хромосома может
«срастаться» только в клетке и это — свойство всей клетки в целом, а не
только особенность структуры хромосомы? В чем же заключается природа
этого явления?

6.	Вирусы. В настоящее время изучение вирусов вполне можно назвать
отраслью молекулярной биофизики. За короткое время с тех пор, как
впервые были обнаружены инфекционные частицы, проходящие через филь-
тры, задерживающие бактерии (отсюда термин «фильтрующиеся вирусы»),
наука о вирусах сделала большой шаг вперед. В наши дни строение отдель-
ных вирусных частиц может быть описано самым детальным образом. Со-
ставлены генетические карты вирусов. Наука о вирусах достигла совре-
менного состояния благодаря широкому использованию физических мето-
дов исследования— центрифугирования, электронной микроскопии, рас-
сеяния света и рентгеновских лучей, использования ионизирующей радиа-
ции и рентгенографии. В последующих главах вирусы будут упомянуты
еще не один раз. Нам необходимо узнать подробнее, что же представляет
собой вирус, так как, хотя вирусы и не являются нормальной частью клетки,
они тем не менее имеют к ней самое непосредственное отношение, и изуче-
ние системы вирус — клетка дает возможность выяснить характер некото-
рых внутриклеточных процессов.

Вирусы можно разделить на четыре, три или два вида в зависимости
от того, что мы положим в основу классификации. Согласно первому типу
классификации, все вирусы делятся на 4 категории: бактериальные вирусы
(их часто называют бактериофагами), вирусы животных, растительные
вирусы и вирусы насекомых. Но некоторые растительные вирусы живут
также в насекомых, поэтому вряд ли надо выделять растительные вирусы
и вирусы насекомых в два отдельных типа. Вообще, по-видимому, разумно
рассматривать всего две большие группы вирусов: вирусы с одноцепочечной
ДНК или РНК и вирусы с двухцепочечной ДНК. Мы рассмотрим здесь
три типа вирусов.

Строение и действие вирусов лучше всего разбирать на рисунках.
На фиг. 10 схематически изображены бактериальная и растительная вирус-
ные частицы и вирус животных. Детали, изображенные на схемах, нельзя
считать окончательно установленными, и по мере развития науки они
будут уточняться и изменяться, но тем не менее эти схемы помогут нам
получить представление об основных процессах жизненного цикла вируса.

Рассмотрим сначала вирусы животных. В определенном месте внешней
оболочки вирусной частицы имеется молекулярная группа, которая обуслов-
ливает способность частицы прикрепляться к клетке хозяина. Прикрепле-
ние может осуществляться просто за счет электростатических сил между
группами — СОО и —ПН3, расположение которых различно для разных
клеток и разных вирусов. Следующий этап после прикрепления — это воз-
действие определенного «фермента» на оболочку клетки; он обеспечивает
проникновение в клетку инфекционной части вирусной частицы — нуклеи-
новой кислоты — и еще одного или двух пока недостаточно изученных
компонентов. На фиг. 10, Л изображены «модификатор хозяина», который
вынуждает клетк?у начать синтез продуктов, необходимых для роста вируса,
и цепочка нуклеиновой кислоты, намотанная на некую структуру, которую
мы назовем здесь «консервирующей формой»1. Как только реплицирующаяся
часть и модификатор проникнут внутрь клетки, внешняя часть вирусной
частицы, обычно состоящая из белка и липидов, становится ненужной и, как
показано в случае бактериальных вирусов, остается вне клетки.

Развивающиеся вслед за этим процессы с точки зрения биохимии в основ-
ном выяснены. Сначала происходит интенсивный синтез некоторых необ-
ходимых ферментов. Для многих вирусов этот этап, вероятно, не является
обязательным. Затем с очень большой скоростью начинает реплицироваться
нуклеиновая кислота. В случае бактериальных вирусов, например, за 8 мин
образуется около 1000 новых реплик нуклеиновой кислоты. Если считать,
что процесс репликации осуществляется за счет удвоения при развертыва-
нии двойной спирали нуклеиновой кислоты, то за 8 мин должно произойти
около 10 удвоений, т. е. на образование одной новой молекулярной цепи
требуется приблизительно 50 сек. Совершенно ясно, что с этим процессом
связан целый ряд чрезвычайно интересных физических проблем, но сам
процесс все еще остается загадочным.

1 Авторы, стремясь к наглядности, а не к строгости изложения, вводят термино-
логию, которая не принята в специальной литературе.— Прим. ред.
После того как нуклеиновая кислота готова, синтезируются и соеди-
няются вместе остальные компоненты вируса: структура, консервирующая
нуклеиновую кислоту, белковый стержень, лизирующий оболочку хозяина,

Ф и г. 10. Схематическое изображение строения и функциональ-
ных элементов вируса.

А — животный вирус, например внрус гриппа; 1 — репликативная часть;
2 — модификатор хозяина; 3 — часть, обусловливающая прикрепление к клет-
ке-хозяину; 4 — часть» проникающая в клетку-хозяииа; 5 — оболочка;

6 — структура» консервирующая репликативную часть.

Б — бактериальный вирус» например фаг Т2; 1 — структура, консервирую-
щая репликативную часть; 2 — репликативная часть; 3 — модификатор
хозяина; 4 — часть, обусловливающая проникновение и впрыскивание
в клетку-хозяина; 5 — часть, обеспечивающая проникновение в клетку-
хозяина; 6 — часть, прикрепляющаяся к клетке-хозяину; 7 — часть, прони-
кающая в клетку-хозяина.

В — растительный вирус» например вирус табачной мозаики: 1 — центральная
часть (почти полая); 2 — спирализованиая РНК; 3— многослойная оболоч-
ка, построенная из большого числа белковых молекул.

модификатор клетки-хозяина и оболочка. В бактерии все эти процессы раз-
виваются менее чем за 15 мин. Эти вторичные компоненты первоначально
отсутствуют в клетке, так что копирование их невозможно, и тем не менее
они воспроизводятся абсолютно точно. Процесс их синтеза индуцируется
проникшей в клетку нуклеиновой кислотой вируса. Совершенно ясно, что
в данном случае мы имеем дело с процессом переноса информации. Сущ-
ность этого процесса заключается втом, что молекулярная структура нуклеи-
новой кислоты направляет метаболическую деятельность клетки таким
образом, что в клетке синтезируются белки определенной, точно заданной
молекулярной структуры. Процесс переноса информации — одна из наи-
более глубоких проблем, стоящих перед молекулярной биофизикой.

Все, что было сказано о вирусах животных, в равной мере относится
и к бактериальным вирусам, с той лишь разницей, что о бактериальных
вирусах, особенно о фаге Т2 бактерии Езс/гепсЬла соИ, известно значительно
больше. Подобно многим бактериальным вирусам, фаг Т2 имеет головку
и хвостовой отросток (фиг. 10, Б). В головке содержится довольно большое
количество ДНК, причем ДНК фага отличается от ДНК бактерии: вместо
цитозина в ее состав входит оксиметилцитозин, и, кроме того, она имеет
необычное содержание сахара. Отросток фага состоит из двух частей, каж-
дая из которых в свою очередь имеет сложное строение. На первом этапе
процесса прикрепления нижняя внешняя область отростка раскручи-
вается на четыре жгутикоподобных волокна, которые хаотически движутся,
пока не прикрепятся к бактерии. После этого верхняя часть отростка сокра-
щается и выталкивает содержимое вируса в клетку-хозяина, в результате
чего нуклеиновая кислота вируса попадает в клетку. Так как нуклеиновые
кислоты клетки и бактериофага не вполне соответствуют друг другу по своим
компонентам, то, прежде чем начнется синтез компонентов вируса, должен
произойти синтез по крайней мере двух ферментов, отсутствующих в клетке
хозяина.

Бактериальные вирусы могут существовать в двух совершенно различ-
ных формах. Первый, вирулентный тип нами уже описан. Второй тип свя-
зан с,явлением лизогении; в этом случае вирус находится в бактериальной
клетке как составная часть молекулярной структуры ее ДНК- Такую форму
называют профагом. Под действием ультрафиолета, ионизирующего излу-
чения, химических агентов, а иногда даже спонтанно, профаг может отде-
литься от ДНК хозяина и покинуть бактериальную клетку. Если побли-
зости окажутся чувствительные к заражению клетки, то такой фаг прони-
кает в них и действует как обычный вирулентный бактериофаг. Этот процесс
указывает на существование некоторой внутренней связи между нуклеино-
выми кислотами вируса и клетки, и нет ничего удивительного в том, что для
молекулярной биологии изучение профага представляет большой интерес.

С бактериальными вирусами связано явление трансдукции. Бактериаль-
ная клетка, у которой отсутствует определенный ген, может восстано-
вить свои генетические свойства при заражении вирусом, несущим этот ген.
Для этого бактерия, с одной стороны, должна обладать проницаемостью
для вируса, а с другой — должна быть устойчива к его действию.

Здесь мы позволим себе небольшое, но интересное отступление, касаю-
щееся процесса конъюгации у бактерий при их скрещивании. Конъюгация
у бактерий происходит сравнительно редко. При этом процессе нить ДНК
бактерии-донора проходит через короткий «канал», образующийся при
конъюгации, и таким образом генетический материал передается бакте-
рии-реципиенту. Это явление было открыто Ледербергом (он и Циндер
открыли также и трансдукцию). Жакоб и Вольман продолжили изучение
этого процесса, используя очень простой и удачный прием. Размельчая
конъюгирующие бактерии в смесителе Уоринга при высоких скоростях,
им удавалось разделять бактерии спустя различное время после начала
скрещивания и тем самым разрывать нить ДНК, проходящую через канал
в различных местах. Таким образом, было установлено относительное
расположение генетических маркеров. Очень схематично процесс конъюга-
ции показан на фиг. 11. Некоторый интерес представляет физический аспект
разрыва нити ДНК и возможность изучения упругого натяжения нити
при ее прохождении через канал. В настоящее время интерес к такого
рода, казалось бы, отвлеченным биофизическим проблемам начинает оку-
паться.

Бактериальные вирусы и ряд вирусов животных содержат ДНК- Анало-
гичным компонентом в растительных вирусах является РНК- По-видимому,

Фиг. 11. Схематическая картина
конъюгации двух штаммов Е. соИ,
основанная на электронных микро-
фотографиях Андерсена, Вольмана
и Жакоба.

Бактериальная «хромосома», представля-
ющая собой, согласно данным генети-
ческого анализа, замкнутую петлю,
переходит от одной бактерии к другой.
Нить может быть порвана под действием
гидродинамических сил, вызывающих раз-
деление конъюгирующих бактерий.

в вирусе табачной мозаики молекулы
РНК состоят лишь из одной цепочки.
Известны также виды бактериальных
вирусов, у которых имеется одноцепо-
чечная ДНК- Процент нуклеиновой
кислоты в вирусах меняется от 5%
в случае больших вирусов животных
до 45% в случае бактериофага Т2.
Диаметр вирусов меняется от 200 А для
вируса ящура и бактериофагов до 1800 Л
для вирусов бешенства и осповакцины.
Вирусы животных имеют примерно сфе-
рическую форму. Для бактериальных
вирусов типичны довольно длинные от-
ростки. Растительные вирусы имеют
палочкообразную или сферическую фор-
му. Вирусы насекомых напоминают по

форме цилиндры с небольшим отношением длины к диаметру.

Этот раздел мы закончим несколькими замечаниями о форме некоторых
наиболее изученных вирусов. Кейзберг сравнил очертания тени на элект-
ронных микрофотографиях препаратов некоторых растительных вирусов

Ф и г. 12.

А — двойная тень вируса Тгрикц сфотографированная при помощи электронного
микроскопа [13]; Б — аналогичная световая тень модели икосаэдра.

с тенями, отбрасываемыми моделями правильных кристаллов. Вирус насе-
комого Т1ри1а рсйид-оза, изученный Вильямсом и Смитом, оказался, напри-
мер, точным икосаэдром, что хорошо видно из фиг. 12, если сравнить элек-
тронную микрофотографию тени этого вируса, полученной напылением метал-
ла под двумя углами (60°), с обычной световой тенью модели икосаэдра.
Образование структуры такой безупречной геометрической формы является
интересной кристаллографической проблемой, а так как эта структура обра-
зуется в результате жизнедеятельности клетки, то можно думать, что пости-
жение процесса ее образования будет способствовать пониманию целого
ряда других жизненных процессов.

7.	Молекулярная биофизика. Биофизик, знакомясь с живой клеткой,
неизбежно приходит к необходимости изучения молекулярных процессов,
лежащих в основе ее функционирования. По содержанию этой главы мы
могли видеть, что химическое строение и размеры, форма и физико-химиче-
ские свойства биологических молекул представляют значительный интерес.
Однако это лишь самое начало молекулярной биофизики, потому что, хотя
мы знаем, что отдельные соединения, участвующие в синтезе, каким-то
образом попадают туда, куда следует, нам требуется выяснить, как
это происходит и где. Для того чтобы это понять, потребуется еще очень
много усилий. Необходимо разобраться в принципах построения таких
молекулярных структур, как двойные слои клеточных мембран, сетчатки
глаза и различных органелл клетки. Потребуется понять строение хромо-
сомы и ответить на ряд вопросов, касающихся формы хромосом и их рас-
положения в клетке. А когда будут решены эти проблемы, возникнет необ-
ходимость выяснить, какого рода процессы позволяют биологическим моле-
кулам выполнять предназначенные им функции, — происходит ли это за
счет диффузии, электрического поля или же связано с химической деструк-
цией и ресинтезом. Для ответа на эти вопросы потребуются почти все све-
дения о формах движения, которыми располагает современная физика.

Но и после того как мы выясним, где и как происходят элементарные
биохимические процессы, останется еще нерешенной проблема упорядочен-
ных движений на молекулярном уровне, связанных, например, с точным
спариванием хромосом, образованием веретена во время митоза или резким
разрывом границы при делении клетки. Ко всему этому следует еще доба-
вить фундаментальную проблему процессов переноса энергии — процессов,
очень специфичных для жизни.

Все темы, затронутые в последующих главах, относятся к молекуляр-
ной биофизике. В отличие от таких дисциплин, как генетика или квантовая
механика, в молекулярной биофизике количество хорошо понятых явлений
составляет лишь небольшую часть от понятых только отчасти и требующих
объяснения. Критически настроенному читателю полезно вспомнить, что
без открытия химических элементов, например водорода и его спектров
излучения, было бы невозможно создание такой науки, как квантовая
механика. Поэтому, описывая в последующих главах основы биофизики
клетки, мы не будем извиняться на каждом шагу за современное состояние
этого предмета. Мы уверены, что в конечном счете молекулярная биофизика
приобретет красоту и точность квантовой механики, хотя сегодня эти ее
черты и скрыты от нашего воображения. Задача нашей книги заключается
в том, чтобы пробудить интерес к исследованиям в этой области и собрать
воедино начальные сведения, полученные современной молекулярной био-
физикой.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Р о 1 1 1 8 I е г А. АУ., «Су1осЬепнса1 Азрес1з о! Рго1еш 8уп1Ье515», 1п Иупаггпсз
о! СгоиТЬ Ргосеззез, ей. Ьу Е. Вое11., РгшсеАоп ИшуегзНу Ргезз, Рг1псе1оп,
И. У., р. 33, 1954.

2.	Клауз! С., «ТЬе 81гис1иге о! 1Ье Вас1епа1 Се11», 1п Вас1епа1 РЬуз1о1о^у, ей.
Ьу С. АУ. АУегктап апй Р. АУ. АУПзоп, Асайепис Ргезз, М. У., р. 29, 1951.

3.	<3 и а 5 1 1 е г Н., 1п(огта11оп ТЬеогу 1п В1о1о§у, ИшуегзЙу о! ПИпсиз Ргезз,
ИгЬапа, 111., 1953.
4.	Тке Р1пе 81гис(:иге о? Се11з, 8утроз1ит а1 8111 Соп^гезз о! Се11 В1о1о§у, Ье1деп,
1954, Р, Г4оогдко1, Сгопт^еп, Ие1кег1апдз.

5.	Р о п 1 е с о г V о О., 1п 81гис!ига1 АзресН о! Се11 Ркуз1о1о§у, Асадеппс Ргезз,
И. У., 1954, апд 1п Тке В1о1оЁ1са1 КерНсаНоп о! Масгото1еси1ез Асадеппс
Ргезз, 14. У., 1958, Во1к аге риЬНсаНопз о Г 1ке 8ос1е1у о! Ехрептеп1а1 В1о11-
§1з1з.

6.	Р о 1 1 а г д Е., Тке Ркузгсз о! Упизез, Асадеппс Ргезз, 14. У., 1953.

7.	А д а т з М. Н., ВаНепорка^ез, 1п1егзс1епсе РиЬИзкегз, К. У.,	1959.

(М. Адам с, Бактериофаги, М., ИЛ, 1961.)

8.	Вепгег 8., «Тке Е1егпеп1гу ИпИз о! НегесШу», 1п Тке Скеписа! Ваз1з о! Неге-
дку, ед. Ьу МсЕ1гоу апд С1азз, Локпз Норк1п8 Ргезз, ВаШтоге Мд., 1957. (Хими-
ческие основы наследственности, стр. 56, М., ИЛ, 1960.)

9.	Вигне! Е., 8 1 е п 1 е у АУ. Н., Тке Уггизез, Асадепис Ргезз, И. У., 1959.

10.	Н е г с 1 к Р., В1оркуз1с дег Вас1ег1орка^еп, УЕВ Веи1зскег, Уег1а^ дег АУйзепзскаГ-
1еп, ВегНп, 1959.

11.	Ласок Р., IV о 1 I гл а п Е. Е., «Тке Ке1аЬ'опзк1р ВеТгчееп 1ке Ргорка^е апд
1ке Вас1епа1 Скгошозоте 1п Ьузо§етс ВасЛепа», 1п Кесеп! Рго^гезз 1п М1сго-
Ыо1о§у, ед. Ьу О. ТипеуаП, С. С Ткотаз, 8рг1п§еПе1д, 111., 1959.

12.	А п д е г з о п Т. Р., ИМ 1 гп ап Е. Б., Л а с о Ь Р., Вас1сг1а1 Соп)и§аНоп,
Апп. 1пз1. Раз1еиг, 93, 450 (1957).

13.	АУ 1 1 1 1 а т з К- С., 8 т 1 1 к К- М., В. В. Ас1а, 28, 464 (1958).
Г лава III

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ И СТАТИСТИЧЕСКИЕ
ЗАКОНОМЕРНОСТИ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ

1.	Введение. Одной из характерных особенностей живой системы
является ее способность к использованию и превращению энергии. Напри-
мер, энергия, потребляемая в единицу времени только одним граммом
культуры Е&сНег1сЙ1а соН, которая в этом отношении не отличается сущест-
венно от других бактерий, равна 0,6 вт. Важно знать, каким образом проис-
ходит превращение этой энергии из одной формы в другую и как осущест-
вляется ее перенос. При рассмотрении энергетики биологических процес-
сов большую пользу может принести применение одной из важнейших обла-
стей физики — термодинамики. До сих пор вклад термодинамики в биоло-
гию был мало ощутим, если не считать ее применения в качестве своего рода
бухгалтерии. В этой главе мы рассмотрим современные представления
о возможностях применения термодинамики при изучении биологических
процессов.

Классическая термодинамика основана на двух основных принципах.
Первый — это обобщенный закон сохранения энергии, согласно которому
величина энергии изолированной системы остается постоянной, хотя внутри
такой системы могут происходить превращения энергии из одной формы
в другую. Если энергия привносится в систему извне (например, при осве-
щении системы или потреблении ею пищи), увеличение энергии системы
точно равно энергии, получаемой от внешней среды. Этот принцип, назы-
ваемый первым законом термодинамики, всегда применим и используется
во многих областях науки. В механике с его помощью оценивают количество
механической энергии, которое можно получить в определенном процессе.
В электротехнике он применяется для расчета величины химической энер-
гии, которую можно превратить в электрическую (например, в гальвани-
ческом элементе), или механической энергии, превращаемой в электриче-
скую (в динамо-машине). В химии этот закон применяется для вычисления
химической энергии, выделяемой или поглощаемой в ходе химических
реакций в результате изменения сост; ва и строения молекул. Последнее
применение уже довольно близко к биологии. В дальнейшем мы остано-
вимся на нем несколько подробнее.

Другой принцип классической термодинамики, с-которым мы будем
иметь дело, носит название второго закона термодинамики. При формули-
ровании этого закона, установленного Клаузисом и Кельвином в связи
с анализом работы идеальных тепловых машин, впервые был введен термин
энтропия для обозначения физической величины, определяемой, по Клаузи-
су, с помощью идеального процесса передачи тепла. Гиббс и Больцман
показали, что энтропия есть мера статистической вероятности состояния
системы. Применяя принцип возрастания энтропии, Гиббс установил ряд
законов, относящихся к системам, пребывающим в химическом равновесии.
На этом уровне своего развития классическая термодинамика оказалась
полезной при изучении работы мышц.

В XX веке появилась новая формулировка второго закона, основанная
на понятиях молекулярной статистики. Дальнейшее обобщение формальной
термодинамики было проведено в теории информации, которая дала воз-
можность классифицировать клетки и клеточные структуры с точки зрения
количества заключенной в них информации и определять изменение коли-
чества информации в ходе различных процессов в клетке.

Следует помнить, что термодинамика и в той же мере теория информа-
ции не претендуют на создание точных моделей. Термодинамика в своей
первоначальной форме основана, напротив, на отказе от детального опи-
сания процессов — она просто предоставляет количественные критерии
для оценки возможности осуществления той или иной последовательности
событий. Поэтому в этой главе мы не можем анализировать вопросы, свя-
занные с выяснением природы молекулярных комплексов или механизма
каких-либо биологических функций. Однако мы можем рассмотреть приме-
нимость основных принципов термодинамики к молекулярной биофизике
и оценить пригодность некоторых гипотез.

2.	Сохранение энергии при биологических процессах. В настоящее
время общепризнано, что закон сохранения энергии в его обобщенной форме
применим к биологическим системам. Такая точка зрения нашла экспери-
ментальное подтверждение еще в работах Лавуазье и Лапласа в 1777 г.,
затем в серии исследований Рубнера, начатых в 1885 г., и позднее в опытах
Бенедикта, Этуотера и Роза.

Лавуазье и Лаплас помещали в изолированной камере, в которой
находилось животное, кусок льда. По скорости таяния льда они рассчиты-
вали величину энергии, отдаваемой животным в виде тепла, и сопоставляли
с ней количество пищи, которое животное поедало в ходе эксперимента.
Позднее Рубнер калориметрически определял количество тепла, которое
переходило от собаки в среду, и параллельно измерял количества кислорода,
потребляемого собакой, а также количества выделяемых ею двуокиси углеро-
да и воды. Последние два вещества являются как бы продуктами горе-
ния, благодаря которому поддерживается энергетический обмен в живом
организме. Ниже показано, как по количеству этих продуктов можно рассчи-
тать величину химической энергии, потребляемой организмом.

В каждой области науки имеются свои методы измерения энергии.
Например, при изучении электрических процессов удобно измерять энер-
гию, вычисляя произведение напряжения на ток и на время. В ядерной
физике мерой энергии служат скорости частиц, испускаемых в ходе реак-
ций. В биологии измерение энергии, освобождающейся в процессе биохими-
ческих реакций, основано на определении количеств потребляемого кисло-
рода и выделяемого углекислого газа.

Поскольку основными компонентами в живом организме являются
углерод и водород, именно их превращения определяют энергетику биохими-
ческих реакций. Иными словами, количество освобождающейся энергии
зависит от того, как изменяется отношение углерод/водород в процессе
реакции. Об этом изменении можно судить по отношению количества обра-
зующегося в ходе реакции СО2 к количеству поглощаемого О2. Это отноше-
ние называется дыхательным коэффициентом. Например, при окислении
1 моль углерода по реакции

С6Н12Ов+6О2 —> 6СО2-рбН2О-1-678 ккал

180 г 134,4 л 134,4 л 108 г
отношение объема СО2 к объему кислорода равно единице, и на 1 л СО2
приходится 5,05 ккал выделяемой энергии.

При окислении жиров расчет более сложен. Даже в случае очень про-
стого липида, например

О

Н2С—О—С—СН2 - - СН3

О

II

НС—О—С—сн2—сн3

I

н2с—о—с—сн2—сн3

II

о

реакция приводит к соединению его молекулы с 37 молекулами О2, в резуль-
тате чего образуется 30 молекул СО2 и 26 молекул Н2О. Таким образом,
дыхательный коэффициент равен 30/37, или 0,81. Среднее значение для
жиров равно 0,71. При таких реакциях окисления на каждый литр потреб-
ляемого кислорода освобождается 4,69 ккал, а на каждый литр образую-
щегося СО2 — 6,6 ккал.

В отличие от углеводов и жиров белки содержат большое количество
азота. Поэтому количество потребляемого белка определяют по количеству
выделяемого при этом азота. Величину освобождаемой при этих реакциях
энергии устанавливают с помощью расчета. В качестве типичного примера
приведем результаты экспериментов с собакой, вес которой равнялся
12,75 кг.

Полное количество СО2, выделяемое в 1 час	3,44 л

Полное количество О2, потребляемое в 1 час	4,35 л

Количество СО2, связанное с белком	0,647 л

Количество О2, связанное с белком	0,805 л

Небелковый дыхательный коэффициент	0,79

Число калорий на литр О2 при дыхательном коэффициенте 0,79	- 4,789 ккал

Энергия, выделяемая при превращении небелковых соединений	16,86	ккал

Энергия, выделяемая при превращении белка	3,60	ккал

Полная энергия, рассчитанная по химическим реакциям	20,46	ккал

Полная энергия, определенная с помощью калориметрических измерений 20,92	ккал

Наблюдаемое расхождение, связанное с экспериментальными погрешно-
стями, равно 2,3%. С помощью большого числа подобных экспериментов
удается проверить выполнение закона сохранения энергии с точностью
до 0,2%.

Проводить эксперименты над меньшими организмами сложнее из-за
необходимости измерять в этих случаях малые количества тепла. Действи-
тельно, предположим, что мы собираемся экспериментировать с одним грам-
мом культуры бактерий. Приблизительное измерение выделяемого ими
количества тепла не представляет трудности. Но точные измерения затрудни-
тельны, так как, с одной стороны, нужно обеспечить точный контроль за
дыханием и химическим обменом веществ, для чего система должна быть
открытой для доступа газа, с другой же стороны, для точного контроля
за возрастанием температуры желательно, чтобы система была закрытой.
Конечно, можно было бы использовать современную микрокалориметрию,
которая могла бы обеспечить необходимую точность, но до сего времени это
не сделано, в значительной мере из-за отсутствия сомнений в применимости
закона сохранения энергии в биологии.

3.	Метаболизм, или обмен веществ и энергии. В то время как изучение
применимости закона сохранения энергии в биологии вряд ли имеет прак-
тическое значение, исследование дыхания и различных форм обмена веществ
представляет интерес для всех физиологов. Ниже рассматриваются неко-
торые результаты подобных исследований. Применение меченых атомов
для изучения молекулярных процессов описано в гл. XIII.

Установлено, что для млекопитающих количество тепла, производимого
на единицу поверхности в единицу времени, является постоянной вели-
чиной. Например, как для мыши, так и для слона эта величина равна
1700 ккал/м2 за 24 час. Изучение срезов тканей млекопитающих приводит
к выводу, что скорость обмена веществ в различных органах не одинакова.
С наибольшей скоростью обмен происходит в мозгу и в корковом веществе
почек и довольно медленно в легочной ткани. Часть тепла производится
в мышцах (особенно у малых животных). Например, дрожь помогает регу-
лировать соотношение между величиной производимой энергии и ее отда-
чей в окружающую среду.

Энергетический обмен в клетках.. Остановимся на одном существенном
обстоятельстве, которое следует учитывать при изучении процессов пере-
дачи энергии в клетках. Как указал Мак-Ильвейн, скорость синтеза вита-
миноподобных молекул в бактериальных клетках очень мала (табл. 1).
Этот синтез идет при участии ферментов, и почти для всех ферментов число
образующихся молекул на молекулу фермента порядка- 100 в 1 сек или
больше. Если исходить из этой величины, то из данных табл. 1 следует, что
для обеспечения скорости реакции достаточно одной или двух молекул
фермента, катализирующего синтез витамина. Таким образом, возможно,
что в каждой клетке присутствует лишь одна молекула даного фермента.

Таблица 1

Соединение	Организм	Число молекул на клетку	Число молекул, обра- зующихся в клетке за 1 сек (средняя ско- рость синтеза)
Рибофлавин  Биотин  л-Аминобензойная кис-  лота	АегоЬастег аегоаепез  АегоЬас1ег аего^епел Е. соИ	7000—11 000 400-1800  17 000	1,4—2 0,08—0,34  3,3

К аналогичным выводам приводит изучение индукции синтеза фер-
ментов (об этом явлении мы уже говорили в гл. 2). В клетках Е. соИ,
обычно выращиваемых на глюкозе, содержится фермент ^-галактозидаза.
Если клетки выращиваются на лактозе, происходит адаптивный синтез
этого фермента и в результате количество фермента может увеличиться
в 1000 раз и стать равным приблизительно 1 % от полного количества белка
в клетке. Исходя из этих данных легко рассчитать вес фермента, содержа-
щегося в клетке до адаптации. Он должен равняться 1/100 000 от полного
веса белка в клетке после адаптации, что составляет 5  10"18 г. В то же
время вес одной молекулы фермента, молекулярный вес которого 400 000,
равен 400 000-1,67- 10 м, т. е. приблизительно 7-10"19 г. Таким образом,
на одну клетку приходится не более девяти молекул фермента.
В связи с этим возникает мысль о том, что некоторые клеточные про-
цессы (вероятно, лимитирующие) происходят только вблизи одной молекулы.
Где находится эта молекула в клетке, каким путем идет к ней субстрат,
к каким последствиям приводит образование второй молекулы,— все это
интереснейшие вопросы, заслуживающие большого внимания. Ясно, что
обычная статистика неприменима при изучении процесса, катализируемого
одной-единственной молекулой, так как в статистике используется допу-
щение, что число частиц велико. Поэтому можно ожидать, что химические
и энергетические процессы в живой клетке отличаются по своей природе
от процессов в обычных тепловых машинах. Ниже мы остановимся на при-
роде химической (конфигурационной) энергии и ее передаче.

Передача энергии в молекулярных системах. Для того чтобы понять
сущность процессов передачи энергии, нужно сначала познакомиться
с характером межатомных сил. Этот вопрос детально рассматривается
в гл. VI. Здесь мы приведем лишь самые общие соображения.

По своей природе межатомные силы являются электрическими. Но
проявление этих сил определяется законами атомной физики. Сильное
притяжение или отталкивание между атомами возникает в том случае,
если они имеют общий электрон, что приводит к перераспределению их
электрического заряда. Если атомы не имеют общих электронов (например,
из-за ограничений, накладываемых на максимальное число электронов
на одной орбите), то наблюдается только слабое притяжение. На очень
малых расстояниях между атомами всегда возникает сильное отталкивание.
Возможны и промежуточные типы взаимодействий, соответствующие про-
межуточным электронным конфигурациям.

Предположим, что между атомами, входящими в состав большой моле-
кулы, существует слабое притяжение. Эти атомы будут совершать колеба-
ния около некоторого среднего положения, и для того, чтобы разорвать
связь между ними, достаточно небольшой энергии. Если, однако, в резуль-
тате воздействия второй большой молекулы происходит смещение электро-
нов связи и благодаря этому между рассматриваемыми атомами возникает
сильное притяжение, то их колебания становятся быстрыми, а энергия,
необходимая для их разделения, большой. В случае двухатомных молекул
такие процессы возможны, только если разность между энергиями слабо
и прочно связанного состояния отводится путем излучения или столкно-
вения с другой молекулой. В больших молекулярных системах, где каждая
пара атомов окружена большим числом других атомных пар, одна из них
может отдавать энергию, переходя в более прочно связанное состояние,
а другая — забирать ее, переходя в более слабо связанное состояние.
Таким путем происходит миграция энергии по большой молекуле. Биоло-
гические процессы обычно сопровождаются миграцией энергии, проис-
ходящей именно по такой схеме, и благодаря этому обеспечивается несрав-
ненно более точная быстрая и эффективная передача энергии, чем при ста-
тистических процессах передачи от одной хаотически движущейся совокуп-
ности молекул к другой.

Хорошим примером конфигурационной энергии, передача которой
может происходить в соответствии с описанным выше механизмом, служит
энергия так называемой «макроэргической фосфатной связи». По своей
природе это в действительности довольно слабая связь. Взаимодействие
кислорода с фосфором осложняется тем, что вблизи находится второй атом
кислорода. Вследствие этого происходит смещение электрона связи и,
соответственно, ослабление связи между фосфором и кислородом. Тем не
менее эта конфигурация стабильна, т. е. атомы кислорода и фосфора совер-
шают колебания около некоторого положения равновесия. Предположим
теперь, что молекула трифосфата, находящаяся в соединении с аденином
или рибозой (А на фиг. 13), сталкивается с большой молекулой, к которой
в определенном месте присоединена определенным образом ориентированная
молекула воды. В результате присоединения воды к трифосфату образуется
новая система: дифосфат + ортофосфорная кислота, которая более ста-
бильна. Освобожденная при этом энергия передается к определенному месту
возбуждения на большой молекуле, откуда она, оставаясь по своей природе
конфигурационной энергией, может пере-
даваться дальше. Такая передача очень
эффективна. При этом процесс приводит,
с одной стороны, к образованию ортофос-
форной кислоты, имеющей очень стабиль-
ные связи, а с другой — к тому, что
в каком-то месте большой молекулы воз-
никает новая связь, богатая энергией.
В некоторых случаях процесс сопровож-
дается образованием нескольких новых
связей в большой молекуле. При этом
может измениться форма большой молекулы
и энергия, первоначально запасенная в
виде скрытой химической энергии (лучше
сказать, в виде скрытой энергии конфигу-
рации атомов), может быть истрачена на
работу, которую большая молекула, со
кращаясь, производит над внешней си-
стемой.

Существует обширная биохимическая
литература, в которой рассматриваются
специфические «богатые энергией» связи.
Следует отметить, что, если молекула
• обладает альтернативными атомными кон-
фигурациями, между которыми имеется
связь, то возможна быстрая и эффективная

передача энергии. Именно в связи с такими процессами в дальнейшем в этой
книге будут довольно подробно рассмотрены межмолекулярные силы.

Отметим теперь одно обстоятельство, относящееся к интерпретации
процессов синтеза и распада в живой клетке с точки зрения физической
химии Обычно химические реакции происходят в результате столкновения
реагирующих молекул, причем в этих столкновениях должны быть обеспе-
чены как контакт между реагирующими молекулами, так и условия для
отвода энергии, освобождающейся в результате взаимодействия. В слу-
чае же биохимических процессов дело обстоит иначе. Как мы знаем, струк-
тура клеток такова, что катализаторы, являющиеся большими молекулами
(белками), расположены определенным образом в определенных слоях клет-
ки. Так как эти белковые молекулы могут обеспечивать передачу энергии,
то второе из указанных выше обстоятельств, играющих роль при столкно-
вении молекул, теряет свое значение. При этом возникает новый вопрос-
попадает ли данный метаболит в соответствующее место клетки в результате
диффузии, или клетка синтезирует его на месте' Так как в клетке суще-
ствует огромная ферментативная поверхность и химические структуры ее
компонентов близки, такой процесс может оказаться более быстрым. Одна
из задач молекулярной биофизики состоит в том, чтобы исследовать быст-

Большая молекула

А—О—Р-О-Р

'*б': • о

>---:сьр-он

он он

ОН

*’Богатый энергией ” трифосфат

Область „ высокой
энергии''в большой
молекуле

Д—О-Р-О-Р— он

ОН ОН

Дифосфат

но—р—са

ОН

Монофосфат

Ф’и г. 13. Схематическое изо-
бражение процесса переноса
энергии, заключенной в хими-
ческой связи (перенос, связан-
ный с перестройкой атомных
конфигураций).

О

о о

О
роту и эффективность обоих процессов — как передачи материала от точки
к точке в клетке путем диффузии, так и биосинтеза его ш зПи.

4.	Статистическая термодинамика и биология. Привычный для физика
путь использования второго закона термодинамики не применим в биоло-
гии. Физик использует второй закон для анализа работы тепловых машин,
совершающих полезную работу благодаря существованию разности тем-
ператур. В биологии такие разности температур не наблюдаются. Если бы
в клетке возникла разность температур даже в 10°, это привело бы к столь
сильному изменению скоростей химических реакций, что в лучшем случае
могли бы сохраниться лишь немногие функции клетки. Возможность
быстрых превращений энергии, без заметных разностей температур, харак-
терная для живых систем, заставляла некоторых физиков сомневаться
даже в применимости второго закона термодинамики к живым системам.
У химика таких сомнений нет, так как хорошо известны химические реак-
ции, при которых превращения энергии происходят при отсутствии темпе-
ратурного градиента.

На самом деле, ни старые идеи, относящиеся к тепловым машинам,
ни подход Гиббса, используемый в химии, неприменимы к живым систе-
мам, характерной чертой которых является необратимость или, другими
словами, отсутствие в них равновесия. Поэтому все, что можно сделать,—
это исследовать живые системы методами статистики, как это делается
в современной термодинамике, и применить полученные результаты для
характеристики поведения клеток. Применение статистики полезно не
только при классификации и сравнении клеток, но и для изучения некоторых
особенностей влияния на клетку окружающей среды. В конце главы этот
вопрос рассматривается с точки зрения теории информации, поскольку он
уже не относится к области обычной молекулярной статистики. Возможно
также использование термодинамики необратимых процессов для систем,
находящихся в стационарном состоянии.

Термодинамический подход заключается в описании явлений с помо-
щью термодинамических функций (например, энергии и энтропии) и пара-
метров состояния (таких, как давление и температура). Первоначально
эти величины определяли в термодинамике чисто экспериментальным
путем. Для термодинамического подхода была характерна независимость
от модели системы, и это обстоятельство помогало в прошлом избегать
ошибок, связанных с чисто спекулятивным характером предположений
о механизме процессов. Смысл термодинамических величин, однако, прояс-
няется, если их определить с помощью некоторой схематической модели
системы. Такие модели оказались плодотворными в атомной и молекуляр-
ной физике, и было бы неправильно рассматривать их как чисто спекулятив-
ные. Перейдем теперь к краткому рассмотрению некоторых термодинами-
ческих величин и их определению с помощью модели, основанной на сущест-
вовании энергетических уровней.

Начнем с конкретной системы — молекулы белка. Любая молекула
белка независимо от ее структуры состоит из полипептидных цепей (фиг. 14).
Как видно из фиг. 14, в молекуле белка имеются 3 типа связей: ковалент-
ные, благодаря которым существует молекулярная цепь, водородные —
между атомными группами в цепи молекулы (которая, согласно Полингу,
Кори и Брэнсону, имеет форму спирали) и ван-дер-ваальсовы — между
группами в различных цепях. При статистическом описании возникает
задача учета колебаний, соответствующих различным связям. На фиг. 14
молекула для удобства изображена в развернутом виде, но нужно всегда
помнить, что в любой спиральной или свернутой форме группы С = О
4 Заказ № 1168
и ЫН связаны водородными мостиками. В этой главе можно ограничиться
простым перечислением трех главных типов связей, так как рассмотрению
различных связей посвящена гл. VI.

НСЕ Е сн нс[к~!
о=Е	с=о о=с/

НН ни	Ен

вен	нсПГ] ПГ|сн

С = О	€ = О

ни	ин нЕ

НС|У| [к] с	НС	ПЛ

=с	с=о о=с

нн нн"	\н

вен	нс И [в~|сн

с=о о=с/	Хс=о

НН	НН нЕ

нс[ В ПГ|СН	нс| в ~|

Ф и г. 14. Часть белковой макромолекулы.
К — аминокислотный остаток.

Существование связи между атомами означает, что взаимодействую-
щие атомы находятся в положении равновесия друг относительно друга.

в

Фиг. 15. Колебательные энергетические уровни для
атомов, связанных ковалентной связью (А), водородной
связью (Б) и ван-дер-ваальсовыми силами (В).

Если они сближаются, возникает отталкивание, если расходятся — при-
тяжение. Каждая такая пара атомов колеблется около этих положений
равновесия, причем, согласно законам квантовой механики, энергия коле-
баний квантуется, принимая ряд дискретных значений, называемых энер-
гетическими уровнями. Чем сильнее связь, тем глубже и дальше друг от дру-
га располагаются энергетические уровни. Три основных типа энергетиче-
ских уровней для белковой молекулы изображены схематически на фиг. 15.
Число пар атомов, обладающих энергией, соответствующей некоторому
энергетическому уровню, называется числом заполнения данного уровня.
Например, на фиг. 16, где изображена только одна система уровней, число
заполнения для г-го энергетического уровня обозначено . Рассматривая

ИН-группы, можно обозначить через Лф число
заполнения, соответствующее основному состоя-
нию г — О (^0 равно числу связанных с атомом
азота атомов водорода, энергия колебаний кото-
рых имеет наименьшее значение), число запол-
нения следующего энергетического уровня г = 1
можно обозначить через и так далее. Если
аналогично пронумеровать значения энергий
для всех уровней (Ег для г-го уровня), полная
энергия запишется в виде

МоЕо + \Е± ЛфЕФ + М%Е3 4- - • • + 1^ГЕГ.

или '^1\1ГЕГ.

При этом следует учитывать, что в молекуле
белка существует множество типов связей и,

Л--------ъ--

Е-----------

И-------©---

Ег-----еее--

Е,----ее-ее—

Ео-—е оо о оо

л/5 = /

Л/л = 0

Н3 = 1

Нг = 3

Н, = 4

Н0^б

Фиг. 16. Числа заполне-
ния для одиночной системы
энергетических уровней.

Полная энергия такой системы
равна сумме произведений чисел
заполнения на соответствующие
значения энергии уровней.

следовательно, множество энергетических уровней, которые могут влиять
друг на друга. Поэтому сейчас речь идет скорее об основах метода, чем
об его практическом применении. Тем не менее излагаемая идея вполне
может быть доведена до практического осуществления. Если учитываются
все энергетические уровни и значения чисел заполнения правильны, можно
вычислить основную термодинамическую функцию — внутреннюю энергию:

и=ънТЕТ.

Из этой простой и ясной формулы сразу видна целесообразность описанного
подхода.

Очень важно знать возможные значения чисел Мт. Более того, можно
сказать, что единственной задачей термодинамики является определение
чисел Лф, поскольку энергетические уровни и атомные конфигурации
устанавливаются с помощью соображений, касающихся валентностей и меж-
атомных взаимодействий. В основе теоретического определения относи-
тельных значений Лф лежит допущение, что макромолекула при данном
значении ее полной энергии и при данной конфигурации находится в наибо-
лее вероятном состоянии. Это предположение позволяет получить формулу

~ ^е-Ет/кТ »

(3.1)

где Л7 — полное число вибраторов, к — постоянная Больцмана, Т — абсо-
лютная температура и суммирование производится по всем возможным зна-
чениям г. Таким образом, основной переменной, определяющей значение
Лф, является множитель Больцмана, е~Ет1кт, который играет большую роль
в молекулярной статистике. Мы будем встречаться с ним при любых
теоретических рассмотрениях, относящихся к биофизике.

При равновесии, т. е. когда значения Лф не изменяются во времени,
отношение чисел вибраторов, находящихся на двух различных энергети-
ческих уровнях, дается распределением Больцмана. Например, отношение
числа вибраторов на уровне г к числу вибраторов на нулевом уровне равно

— ^(.Ет-Ед/кТ
Ми

Полагая, что нижнему уровню соответствует нулевое значение энергии,
получаем

= Ео = 0. (32)

IV Л	' '

Полное число вибраторов выражается как

д/ = 2Д/г = д/02е-Ег/^.

(3-3)

Если из уравнения (3.3) определить 0 и подставить выражение для него
в (3.2), то получим Формулу (3.1).

Применяя полученные выше формулы, следует помнить, что при их
выводе использовались два предположения: 1) что молекула находится
в наиболее вероятном состоянии и 2) что значения Е достаточно велики,

поскольку при выводе факториалы этих чисел были заменены их прибли-
женными значениями. Для одной молекулы белка эти допущения сомни-

С--------

-------

Е‘-------

д;-------

------=0

Конфигурация В

тельны, но они безусловно оправданны для
системы, состоящей из большого числа
белковых молекул. Тем]не менее применение
статистики к одной молекуле белка также
интересно, но при этом нужно учитывать
возможность противоречий из-за недоста-
точно обоснованных приближений. Таким
образом, читатель должен отдавать себе

Конфигурации А

Фиг. 17. Возможное располо-
жение уровней для двух конфи-
гураций большой белковой мо-
лекулы (или другой макромо-
лекулы).

Схема поясняет смысл принятых для
энергетических уровней обозначений,
с помощью которых описывается равно-
весное распределение по двум воз-
можным состояниям молекулы.

отчет в том, что, рассматривая о помощью
статистики систему из одной макромоле-
кулы, мы делаем грубое приближение.

Введем две важные функции. Первая,
называемая статистической суммой (раг-
Шюп ГппсНоп) 2, равна сумме больцма-
новских множителей по всем возможным
энергетическим уровням:

2 =

Ее называют также «суммой состояний» (ХшКапсКзигигпе). Значение этой
функции ясно уже из формулы (3.1). Остановимся еще на одном обстоятель-
стве, связанном с этой функцией, значение которого чувствуется интуитивно.
Средняя энергия колебания при данной температуре равна кТ. Функция
еЕТ1кт имеет величину, отличную от нуля, только при значениях Ет,
ненамного превышающих кТ. Действительно, уже е~4= 0,03, а е-10=
= 4,5-КГ5. Таким образом, суммируя эти экспоненты, мы суммируем по
всем доступным состояниям, т. е. по состояниям, для которых числа запол-
нения отличны от нуля. Распределение чисел заполнения происходит
именно по этим состояниям. Отсюда и название «сумма состояний».

Статистическая сумма играет большую роль постольку, поскольку
полное число молекул в данной конфигурации пропорционально статисти-
ческой сумме системы. Предположим, что имеется равновесие и что мы хотим
сравнить число молекул, конфигурация которых изображена на фиг. 15,
с числом молекул, конфигурация которых такова, что цепи разорваны.
Обозначим мойекулы первого типа белка через А, уровни их энергии —
через Е^ и числа молекул на каждом уровне — через для молекул
второго типа введем индекс В. Соответствующая схема энергетических уров-
ней приведена на фиг. 17. Проводимый нами анализ является вполне общим
и применим не только к белкам, но и к любым другим системам. Так как
для каждой конфигурации выполняется распределение Больцмана, то

^==ЕАе-Ег/ЕТ'

Полное число молекул типа А равно

ЕА = 2МА =

Из определения функции следует, что

ЫА = ЫАХА.	(3.4)

Таким образом, полное число молекул пропорционально статистической
сумме.

Применяя эти соображения к молекулам типа В, нужно учитывать,
что значение энергии, соответствующее нижнему энергетическому уровню
молекулы, в этом случае уже нельзя считать равным нулю (см. фиг. 17).
Мы обозначим его через ЕБ. Имеем

^ = ^е-<Е?-Е^кТ

и

№ =	= Ыв%е-(Е?-Е^/кТ = ЫВеЕ%,ктЪе-Е?,кТ = ЫБеЕ*,кт7в. (3.5)

С помощью распределения Больцмана можно получить выражение для
отношения чисел молекул на нулевых уровнях

л^_ = е--Е?/м’

Подставляя это выражение в уравнение (3.5), получаем

(3-6)

Следовательно, отношение полных чисел молекул А и В, называемое кон-
стантой равновесия К, равно

ХБ
кА

гБ _ %е-Е?,кТ

7,а ^-ЕА/кТ

(3-7)

Как мы уже отмечали, отношение полных чисел молекул зависит от
величин всех уровней энергии, а не только от разности энергий
ЕА и ЕБ. Измеряя равновесное распределение, мы получаем, следовательно,
данные не об энергетических уровнях, а только о статистических суммах.
В связи с этим имеет смысл с помощью статистической суммы ввести другие
функции, которые также можно определять экспериментально. Одной
из таких функций является свободная энергия Гельмгольца на 1 моль (Л),
которая полезна при анализе реакций и определении условий равновесия
при постоянном объеме. Она имеет вид

А = - ЕокТ 1п 7 = — АТ1п 7,

где Мо — число Авогадро, 7? — газовая постоянная. Статистическая сумма
является безразмерным числом, а А имеет размерность энергии. Можно счи-
тать, что А равно произведению полной средней энергии 01гТ на множи-
тель, зависящий от числа заполненных уровней. Используя выражение
для А, уравнение (3.7) можно записать в следующем виде (при постоянном
объеме):

- АВ/ВТ

К — -______— „-<.ав-аа);пт _ р-ДА/вт

Л-е-АА/йТ-С	~е

где

отсюда

ДЛ = -РТ1пК.

(3-8)

Таким образом, определяя константу равновесия при постоянном объеме,
можно определить изменение свободной энергии Гельмгольца.

При исследовании большей части биологических систем выполняется
условие постоянства давления. В этих условиях энергия молекулы белка
может изменяться не только при изменении распределения по энергетиче-
ским уровням, но также из-за изменения ее объема; величина приращения
энергии в последнем случае равна рДУ (АГ — изменение объема, р —вели-
чина постоянного давления). До сих пор мы пренебрегали этим членом.
Дополнительная энергия, приходящаяся на каждый уровень, равна рУ/ 0,
где V — объем моля рассматриваемой молекулярной системы. Следова-
тельно, каждый член в статистической сумме должен быть умножен
на	е-уу/вт_ Выражение для константы равновесия при постоян-

ном давлении имеет вид

К

— рУБЩТуВ	7в

®= е-рДУЖТ А
е--Г,УА1В.Т2А	2А ’

(3.9)

где ДУ = УБ—УА. Чтобы придать этому выражению вид, аналогичный
уравнению (3.8), введем новую функцию — свободную 'энергию Гиббса1
на 1 моль (Р):

Р = рУ — КТУ12Г *	(3.10)

При постоянном давлении ДР = Рв—РА= рАУ— рТ-1п

тельно,

е-АР/ВТ=К = №1МА,

ИЛИ

ДР= — ЯТЧпД.	(3.11)

Именно это выражение мы стремились получить. Из него видно, что вели-
чина ДР определяет константу равновесия. Поэтому при анализе биологи-
ческих систем мы часто будем встречаться с этой функцией.

Как видно из формулы (3.11), размерности ДР и РТ совпадают. Их изме-
ряют в эргах на моль, калориях на моль, эргах на молекулу или электрон-
вольтах на молекулу.

В классической термодинамике исходной функцией служит энтропия 5.
Свободную энергию Гиббса вводят с помощью соотношения

Р = Д + рУ —75.

1 В нашей литературе эту функцию часто называют термодинамическим потен-
циалом.— Прим. ред.
При нашем статистическом рассмотрении в качестве исходной функции
мы используем свободную энергию, которая для наших целей является
более важной функцией, и с ее помощью мы получаем выражение для энт-
ропии. Этот порядок рассмотрения термодинамических функций не при-
водит, конечно, ни к каким изменениям в основных формулах термодина-
мики.

Отметим теперь важное свойство энтропии, которое остается невыяв-
ленным при формальном определении энтропии через внутреннюю и сво-
бодную энергии. Пусть нас интересует вероятность того, что рассматривае-
мая молекулярная система находится в некотором состоянии. Эта вероят-
ность тем больше, чем большим числом способов можно достичь осуществле-
ния этого состояния. Обозначим число этих способов через №. Оно связано
с энтропией простым соотношением

л

Следовательно, можно считать, что энтропия зависит от упорядоченности
системы, так как, чем меньше число способов осуществления данного состоя-
ния, тем упорядоченнее рассматриваемая система и тем меньше энтропия.
Поэтому энтропию можно рассматривать как меру беспорядка. Комната,
в которой поддерживается порядок, обладает мал’ой «энтропией». Эта энтро-
пия может быстро увеличиться в результате появления в комнате детей.

Заметим, что, строго говоря, № — это не вероятность, а только свя-
занная с ней величина. Мы не будем вычислять энтропию с помощью этой
величины, а ограничимся приведенной выше формулой, поясняющей смысл
и значение энтропии.

5.	Теория абсолютных скоростей реакций. Многие биологические
и биохимические реакции могут быть описаны с помощью теории абсолютных
скоростей реакций, которая в первоначальном виде была сформулирована
Вигнером и Поляни. В дальнейшем Эйринг и его сотрудники проявили
большую изобретательность и проницательность, работая над развитием
этой теории. Интересно, что объяснить сущность теории абсолютных ско-
ростей реакций легче, рассматривая макромолекулы, а не более «простые»
системы.

В качестве примера рассмотрим весьма искусственный процесс. Пред-
ставим себе, что происходит распад цепи молекулы белка, изображенной
на фиг. 14. Как рассчитать вероятность распада в единицу времени для
такого процесса? Если кг— вероятность распада за секунду для такого
процесса, то для интервала д1 вероятность равняется к±д1. Для числа непо-
врежденных молекул п выполняется уравнение

Интегрируя, получаем

1п—= —
«о

где Ио— начальное число молекул белка при I = 0, а / — время, протек-
шее от начала процесса. Так как в формулу входит только отношение — ,
по
то этому уравнению подчиняются и величины, пропорциональные п, напри-
мер активность фермента или скорость осаждения антител. В рассматривае-
мом простейшем случае нет необходимости знать абсолютное значение п.

Эйринг исходил из простой идеи, согласно которой акт распада можно
рассматривать как трансляционное, т. е. прямолинейное, одномерное дви-
жение. Сначала молекула должна прийти в состояние, когда для распада
ее достаточно такого трансляционного движения. После этого акт распада
заключается в движении по малой области пространства. Вероятность этого
акта на единицу времени не зависит от размеров выбранной области про-
странства и дается выражением:

кТ
й ’
где 1г — постоянная Планка. Последняя входит в это выражение потому,
что даже и поступательное движение в малой области пространства является
квантованным, и это следует учитывать при вычислении скорости движения.

До сих пор мы предполагали, что цепь молекулы белка, изображенная
на фиг. 14, уже находится в таких условиях, когда для ее разрыва доста-
точно простой трансляции, которая может произойти в результате случай-
ного теплового возбуждения. Однако необходимо также знать относитель-
ную вероятность перехода в это,нестабильное состояние. Последняя зави-
сит не только от относительной вероятности локализации определенной
величины энергии в связях вблизи правой цепи, но и от числа форм моле-
кулы, соответствующих такой флуктуации энергии. Поэтому для харак-
теристики условий, при которых может произойти отделение цепи, целе-
сообразно рассматривать свободную энергию, представляющую собой
сложную функцию, включающую как энергетический член, так и член,
зависящий от числа возможных энергетических состояний. Согласно терми-
нологии Эйринга, состояние молекулы, в котором для ее распада достаточно
одной трансляции, называется активированным, состоянием. Относительная
вероятность того, что система находится в активированном состоянии,
определяется разностью свободных энергий, соответствующих начальному
и активированному состояниям (эта разность обычно обозначается как
А/7*). С помощью описанного выше прямого статистического метода нахо-
дим, что эта вероятность, равная относительному числу молекул, находя-
щихся в активированном состоянии, выражается как

е-дг*/вт^

Следовательно, выражение для константы скорости реакции разрыва
цепи имеет вид

=	(3.12)

Обычно Л/7* выражают в калориях на моль, причем в этом случае для 7?
следует брать значение 1,98 кал!моль/К°. Единица кал/моль имеет широкое
распространение в химии и очень удобна, хотя применение ее приводит
к столь странным терминам, как «моль» бактерий или даже «моль»
кузнечиков.

Если реакция обратима, может произойти возвращение отделившейся
правой цепи молекулы к первоначальной конфигурации. Конечно, для
обратной реакции должны выполняться те же самые требования. Поэтому
константа обратной реакции /г2 аналогичным образом связана с соответ-
ствующей свободной энергией активации ДР*

к2 = ^е~^^Т.

При равновесии скорости прямой и обратной реакции равны, т. е.
^1^1— й2п2, где «1 и п2— числа молекул белка различных типов при рав-
новесных условиях. Следовательно,

”2 _	_ е-(ДК*-ДК1)/ЯТ _ е-дк/вт

-га1 к%
где АР — разность свободных энергий молекул в первоначальной и раз-
деленной формах. Таким образом, отношение равновесных концентраций
не зависит от величин констант скорости.

Величины, о которых шла речь, при определенных ограничениях
довольно легко измерить. Одной из областей биологии, удобных для коли-
чественного изучения, является исследование изменений, происходящих
при воздействии тепла и заключающихся в инактивации, денатурации
и смещении равновесия. Важно знать, что можно извлечь из подобных
экспериментов. Для анализа такого эксперимента нетрудно построить гра-
фик изменения свободной энергии (фиг. 18), который служит вместе с тем

Координата реакции (например,!)

Фиг. 18. Кривая зависимости свободной энергии от
координаты реакции.

Понятие координаты реакции является весьма общим. Ее смысл
в одном из частных случаев поясняется с помощью вставки
справа.

хорошей иллюстрацией к изложенной выше идее о переходе через потен-
циальный барьер. Здесь уместно напомнить, что в данном случае речь идет
об изменениях свободной энергии, которая зависит не только от энергии
системы, но и от того, как эта энергия распределена по энергетическим
уровням.

В связи с этим рассмотрим полипептидную цепь (см. фиг. 14). Если эта
цепь входит в состав большой молекулы белка, то концевые группы не могут
свободно колебаться. В результате целый класс колебаний становится
невозможным, что приводит к уменьшению свободной энергии. На фиг. 19
изображены два аминокислотных остатка и схема соответствующих энер-
гетических уровней при существовании и отсутствии связи между остатками.
В первом случае расстояние между уровнями настолько велико, что только
одно из значений ЕТ вносит вклад в Ет!кт И( следовательно, в Р. После
разделения групп энергетические уровни сближаются и в статистической
сумме появляется уже несколько членов, что приводит к увеличению сво-
бодной энергии.

Из сказанного видно, что группы близко расположенных уровней
сильно влияют на величину Р. Их число увеличивается при развертывании
цепей1, но особенно сильно — вследствие вращения малых молекул. Напри-
мер, вода состоит из малых молекул, которые могут вращаться вокруг

1 Имеется в виду переход от спиральной или зигзагообразной конфигурации,
скрепленной водородными связями, к свободной.— Прим., ред.
трех осей, причем это вращение подчиняется законам квантовой механики.
Уровни энергии, соответствующие каждому из типов вращения, располо-
жены очень близко друг к другу. Поэтому вода как в свободном, так и в свя-
занном состояниях заметно изменяет величину Ет1м и, следовательно, Р.

Ф и г. 19. Пример, иллюстрирующий характер изменения сво-
бодной энергии при разделении атомных групп внутри макромо-
лекулы.

В случае Б возможны колебания, соответствующие слабой связи, для которых
характерно большое число близко расположенных уровней. В случае А связь
между боковыми цепями делает колебания более жесткими, что означает
большую степень разделения энергетических уровней. Заполнение таких
уровней затруднено по сравнению со случаем Б. Поэтому в случае
Б соответствующие члены в 1п 7 болыце, чем в случае Л.

Вот почему при значениях ДР, отличающихся от ожидаемых для данной
системы, подозрение падает прежде всего на свободную или связанную
воду.

При инактивации ферментов значения ДР*, рассчитанные по уравнению
к, = е~ьр*^т

к

в ряде случаев линейно зависятоттемпературы. Для объяснения этих резуль-
татов можно воспользоваться термодинамическими соотношениями

Е = и + рУ — Т8 или Р = Н-Т8,

где Р — свободная энергия Гиббса, Н — энтальпия. Так как эксперименты
обычно проводятся при постоянной температуре и давлении, имеем

ДГ* = ЫР 4- рД V* — ТДХ* = ДД* — 7ДХ*.

При высоком давлении член'р ДУ* становится большим. ДР* обычно выра-
жают через ДД* и ДХ*. Рассмотрим очень простой случай, когда имеется
только один уровень энергии. При этом

7 = е-Е/^,1п7= — Е/кТ,

Р = —МокТ\п2.= + ЕЫо.
Таким образом, в этом случае свободная энергия равна числу связей, умно-
женному на это значение энергии. Это единственный случай, когда сво-
бодная энергия выражается непосредственно через энергию и не зависит
от распределения по уровням.

В выражении ДЕ* = ЛЯ*— ЕД5* первый член имеет смысл прира-
щения энергии, тогда как второй в большей степени зависит от характера
распределения по уровням. Следует, однако, иметь в виду, что такая интер-
претация в значительной мере иллюзорна. На самом деле ЛЯ* связано не
с одним энергетическим уровнем, а представляет собой взвешенное среднее
по многим уровням, и, таким образом, его нельзя отнести к какому-либо
одному процессу. С другой стороны, энтропийный член зависит не только
от изменения распределения по уровням, но и от изменения энергий. Однако
величины ЛЯ* и Д5* все же полезны при характеристике и сравнении
реакций. Например, для тепловой инактивации ферментов величина ЛЯ*
часто получается равной 60 000 кал/моль, а Л5 — 30 кал!моль Г\А. Отождест-
вление ЛЯ* с каким-либо одним энергетическим переходом эксперименталь-
но не оправдано. Теория также не требует такой корреляции.

6.	Тепловая инактивация. Поведение ферментов при различных тем-
пературах будет описано в гл. 8. В этой главе мы лишь кратко рассмотрим
данные о тепловой инактивации ферментов. Для большой группы биоло-
гических объектов (вирусов, бактерий, ферментов, антител) потеря биоло-
гической активности описывается следующим простым соотношением:

1п4=-^>	(3-13)

где А — активность числа объектов, выживших за время I, В — активность
начального числа объектов (при 1 = 0). Величины к1 были измерены-во
многих экспериментах. Результаты этих измерений можно проанализиро-
вать с помощью изложенной выше теории, которая позволяет рассчитать
значения ДЕ*. При этом наблюдается следующая простая закономерность.
Если инактивация проводится в сухом состоянии, значения ДР* либо
очень мало зависят от температуры, либо совсем от нее не зависят. Для
влажных веществ наблюдаются различные типы зависимости ЛЕ* от темпе-
ратуры, причем чаще всего эта величина при увеличении температуры
довольно быстро уменьшается.

Эти результаты интересны как в- практическом, так и в теоретическом
отношениях. С практической точки зрения уменьшение ЛЕ* означает высо-
кую степень тепловой нестабильности выше определенной температуры.
Действительно, вирусы, например вирус гриппа, во влажном состоянии при
повышении температуры примерно на 10° переходят от довольно стабиль-
ного состояния к состоянию инактивации в течение 1 мин. В сухом виде
вирусы выдерживают значительно большие изменения температуры. Так,
вирус табачной мозаики в сухом состоянии остается активным при инку-
бации в течение нескольких минут при 150°. Тот факт, что у сухого вещества
ЛЕ* постоянно, означает с теоретической точки зрения, что при увеличении
температуры свойства молекулы существенно не изменяются, если не счи-
тать освобождения нескольких колебательных уровней благодаря тепло-
вому расширению. Совершенно ясно, что при инактивации во влажном
состоянии большое влияние на ЛЕ* должна оказывать величина гидратации.
Так как эта величина уменьшается при увеличении температуры, можно
предполагать, что свободная энергия активированного состояния суще-
ственно не меняется, а свободная энергия нормального состояния увели-
чивается. Это увеличение может происходить из-за разбухания гидрати-
рованной молекулы, что создает более благоприятные условия для коле-
баний или вращений молекул воды. В табл; 2 приведено несколько значе-
ний констант тепловой инактивации.

я	Таблица 2

Значения Д/7* и Л5* для некоторых биологических процессов,
зависящих от температуры

Процесс	АН*-, кал/моль	Д«5*, кал/моль
Инактивация вируса табачной мозаики		
(ВТМ):		
сухой			27 000	0
влажный		40 000	18
Денатурация ВТМ 		195 000	410
Инактивация бактериофага Т1:		
сухой			27 500	0
влажный		95 000	207

7.	Перенос энтропии в живых организмах. В последних разделах мы
отклонились от рассмотрения вопроса о скоростях реакций и их связи со зна-
чениями свободной энергии. Обсудим теперь роль свободной энергии и энт-
ропии в процессах, протекающих в живых системах.

Рассмотрим культуру бактерий, находящихся в фазе максимального
роста. Характер происходящих при этом процессов схематически пояснен

Фиг. 20. Схематическое изображение бактериальной клетки и ее
внешней среды.

Обмен веществ и рост клетки происходит за счет использования довольно большого
количества малых молекул из среды и включения их в различные клеточные струк-
туры. Этот процесс сопровождается изменением свободной энергии и энтропии.

на фиг. 20. Бактериальная клетка постоянно растет, производя специфиче-
ские полимеры (белки и нуклеиновые кислоты), Из которых строятся орга-
неллы и хроматиновые нити. Так как клетка является организованной
структурой, ее энтропия должна быть низкой. Поэтому первый вывод заклю-
чается в том, что живая клетка уменьшает энтропию. Поскольку, согласно
второму закону термодинамики, энтропия всей системы, включая как
клетку, так и внешнюю среду, либо не изменяется, либо увеличивается,
убыль энтропии внутри клетки должна компенсироваться увеличением
энтропии внешней среды. На это обстоятельство указал Шредингер в 1944 г.
Таким образом, материалы, потребляемые клеткой для поддержания ее
жизни и роста, имеют малую энтропию, которая увеличивается в процессе
обмена веществ. Шредингер называет это «потреблением отрицательной
энтропии».

Линшитцу принадлежит очень интересный расчет величины энтропии
в бактериальной клетке, основанный на двух термодинамических предпо-
сылках: 1) энтропия полной системы, изображенной на фиг. 20, должна
оставаться постоянной или увеличиваться, т. е.

А5г + Д$о 0,

где и 50— соответственно внутренняя и внешняя энтропия, и 2) полная
свободная энергия должна оставаться постоянной или уменьшаться, что
можно записать в виде неравенства

ДГ\ +ДГ0<0.

Индексы I, о имеют тот же смысл, что и выше. Для выкладок нам удобнее
оперировать с равенствами. Хотя на самом деле имеет место некоторое
уменьшение свободной энергии, эффективность процессов весьма высока
и мы не сделаем большой ошибки, если будем исходить из предельного слу-
чая, когда последнее соотношение можно считать равенством. В этом случае

др.= _дГ0.

Обычно в опыте непосредственно измеряется не свободная энергия, а теплота
реакции, т. е. величина приращения Н:С помощью соотношения Р = Н—Т8
получаем

ДЯг-ТД5г = — ДА0

или

Д5г = А^+-АГ° .

Аутотрофные бактерии могут расти на очень простых средах. Линшитц
рассматривал ВасШиз, руспоИсиз, которые используют в качестве источника
энергии Н2 (что позволяет рассчитать ДР0) и в качестве источника углерода
СО2 (в виде бикарбоната), что позволяет вычислить Д/7;. Используя дан-
ные по теплотам реакций

2Н2 + Оа —> 2Н2О; Д/7 = —56 ккал на 1 моль Н2

и

6СО2 -)- 6Н2О —> С6Н12О6 4- 6О2; А/7 = - 675 ккал,

а также учитывая, что на 1 моль СО2 приходится 8 моль Н2, находим вели-
чины на 1 г углерода (т. е. на х/12 моль).

=	— 56)=—37,4 ккал/г,

ВН = ^ - 675 = 9,4 ккал/г.

Заметим, что 72 — это молекулярный вес углерода, включенного в глю"
козу, и для 1 г берется поэтому от молярной теплоты.

При Т = 300е К величина Д5г, следовательно, равна

л с 9,4 — 37,4	—28 ккал	по , т ,

Лд/ =----зоб— = —“зоб—= —УЗ кал/грао на 1 г углерода клетки.
Принимая, что приблизительно 10% клетки состоит из углерода и что масса
клетки равна 10-12 г, находим для массы углерода в клетке значение 10“13 г.
Отсюда энтропия клетки равна —9,3-10 12 кал/град.

Как указал Моровитц, прямые измерения Аф — количества тепла,
затрачиваемого при создании одной клетки Е. соИ,— были осуществлены
в опытах Бейн-Джонса и Риса, которые получили для этой величины при
экспоненциальном росте значение 4 -10*10 кал на клетку при 37,5°. Если
принять, что 5 = —у‘и Т = 310,5° К, то 5 = —1,3-10-12 кал/град Это
довольно близко к результатам Линшитца, особенно если учесть, что речь
идет о различных бактериях. Приведенные величины интересны не только
сами по себе. Ниже мы покажем, как с помощью теории информации можно
на основании этих величин получить некоторое представление о внутренней
сложности клетки.

8.	Теория информации. Связь между информацией и энтропией. Разви-
тие современной электроники и средств связи привело к представлению
о существовании некоторых общих закономерностей, относящихся к тому,
что можно было бы назвать «набором картин». Картина может представлять
собой, например, изображение на экране осциллографа, возникающее под
действием токов, создаваемых принимаемым сигналом в вакуумных лампах,
или быть набором звуковых колебаний различных частот и амплитуд,
воздействующих на ухо. Подобные проблемы связаны друг с другом общими
закономерностями, которые были рассмотрены Шенноном в новой теории,
называемой «теорией информации».'

Применение теории информации далеко выходит за рамки вопросов
телеграфной связи. Использование ее в биологии освещено в ряде статей
сборника, составленного Кастлером [7]. Прежде чем излагать математиче-
ский аппарат и определения, применяемые в этой теории, мы остановимся
на тех возможностях, которые она открывает. Пожалуй, одна из наиболее
интересных особенностей теории информации состоит в том, что она позво-
ляет количественно описать сложность системы. Исходя из простого факта,
что существует, скажем, 600 видов ферментов, можно произвести количествен-
ную оценку специфичности фермента. Результат можно затем сравнить
с данными, скажем, о специфичности взаимодействия антиген — антитело,
полученными с помощью подобного же расчета. При рассмотрении чрезвы-
чайно сложных систем теория информации позволяет получить представле-
ние о степени их сложности. В этом отношении она ценна тем, что с ее
помощью можно начать количественный расчет, который может быть про-
должен и окончен совсем с другой точки зрения. Кастлер указал, что в био-
логии теория информации, использующая только одно измерение, может
быть применена к модели, имеющей трехмерные стерические ограничения,
которые трудно наглядно представить. Поэтому она служит удобным сред-
ством для отбрасывания гипотез. Она не говорит нам, как делать что-либо,
а скорее позволяет понять, насколько трудно это делать.

После этого краткого введения мы перейдем к конспективному изло-
жению теории информации и некоторых ее применений в биологии.

Определение информации. Если до получения сообщения вероятность
какого-либо события равнялась р, а после него стала равной р', то коли-
чество информации Н, содержащейся в этом сообщении, равно

н = 1о§2-^- .

Рассмотрим пример. Пусть нам нужно выбрать одну букву из 16. Перед,
выбором р=1/1б, после того, как буква выбрана, р'= 1, и, следовательно,
р7р=16. Поскольку 16=24 и 1о§216=4, одна буква несет 4 бит информа-
ции. Таким образом, величина Н определена выше в единицах, называемых
«.битами».

Это определение информации, как легко видеть, аналогично определе-
нию энтропии 5=к1п№, где IV7— мера вероятности. В 1929 г. Сциллард
указал, что уменьшение энтропии связано с передачей информации, а в
1951 г. Бриллюен предложил считать, что накопление отрицательной энтро-
пии количественно соответствует информации, необходимой для такого умень-
шения энтропии. Бриллюен показал также, что, если информация получена
с помощью какого-либо физического метода (например, путем освещения
молекул вспышкой), то это не приводит к уменьшению энтропии.

Соотношение между энтропией и информацией может быть выведено
различными способами. Вероятно, простейшим является вывод Линшитца,
который мы приводим ниже. Мерой вероятности можно считать число кон-
фигураций Р, соответствующих данному состоянию молекулы. Следова-
тельно, энтропия равна 5—к1пР. Для того чтобы определить, какая конфи-
гурация существует на самом деле, нужно сделать Н двоичных выборов,,
причем

2Н — Р, или Н1п2 = 1пР.

Следовательно,

5 = &Н1п2, или Н = -г#^.
к 1п2

Значения Н и 5 относятся к одной молекуле. Обычно к выражают в эргах
на градус. Если 5 выражено в калориях на моль на градус, то

где 7? =1,98 кал!моль/град.

Мы использовали простейший путь для определения информации.
Если возможные состояния не равновероятны, то определение информации
изменяется следующим образом:

Н= — Хрг1о§2рг-,

где рг— вероятность того, что молекула находится в г-м состоянии1.

Можно показать, что изменение энтропии, связанное с выбором и исклю-
чением какого-либо определенного состояния, равно по величине и обратно
по знаку информации, связанной с этим состоянием.

Таким образом, имеются два способа определения информации: во-
первых, непосредственно, через двоичные выборы или с помощью соотно-
шения Н=—р 1о§2 р и, во-вторых, через изменения энтропии.

9.	Количество информации в некоторых биологических системах. Сна-
чала применим метод двоичных выборов. В качестве примера рассмотрим
молекулу белка, состоящую из одной или нескольких полипептидных цепей.
Число типов таких цепей не очень велико, по-видимому порядка восьми.
Чтобы выбрать цепь определенного типа из восьми, нужно сделать три

1 Заметим, что в предыдущем случае, когда все состояния предполагались равно-
вероятными, Рг— 1/р во всех случаях и

Н= — X у 1о§2 у = — Ху (1о§21— 1о§2р) =

= '2 ± 1о§2 р = Р• у 1о§2р = 1о§2р.
двоичных выбора, что соответствует 3 бит. Предположим, что нужно выб-
рать 1000 аминокислотных остатков 20 типов. Выбор одной аминокислоты
требует около 4 бит информации. (Точно 4 бит требовалось бы в том слу-
чае, если бы существовало 16 типов аминокислот, но поскольку распро-
страненность аминокислот не одинакова, можно считать, что выбор наибо-
лее распространённой аминокислоты белка требует несколько менее 4 бит.)
Так как такой выбор должен быть сделан 1000 раз, получаем, что в рас-
сматриваемом белке содержится 4 • 103 бит информации, без учета типа
цепи. Для выбора типа цепи нужно еще 3 бит, что практически не меняет
результата. Таким образом, можно считать, что число 4 • 103 соответствует
(весьма приближенно) количеству информации в белке.

В случае молекулы нуклеиновой кислоты необходимо выбрать одно
основание из четырех, что требует 2 бит информации. Таким образом, коли-
чество информации в молекуле нуклеиновой кислоты любого типа равно
удвоенному числу нуклеотидов. Так как молекулярный вес нуклеотида
приблизительно 250, молекула нуклеиновой кислоты, имеющая молеку-
лярный вес 106, состоит из 4000 нуклеотидов, т. е. в ней заключена информа-
ция, равная 8000 бит. Интересно, что количество информации в молекуле
нуклеиновой кислоты приблизительно равно количеству информации в моле-
куле белка, молекулярный вес которого в пять с лишним раз меньше. Если
между молекулами нуклеиновой кислоты и белка существует соответствие
в отношении количеств заключенной в них информации (что необходимо, если
учесть роль нуклеиновой кислоты в синтезе белка), то, как указал Кастл ер,
молекула нуклеиновой кислоты должна быть больше, чем молекула белка.
Учитывая, как это предполагается в некоторых моделях ДНК, возмож-
ность корреляции пуринов с пиримидинами, получаем, что на один нуклео-
тид будет приходиться всего 1 бит информации и для равенства количеств
информации молекула ДНК должна быть в 10 раз больше молекулы белка.
Приблизительно такое соотношение и наблюдается на опыте.

Рассмотрим теперь другие вопросы, связанные с информацией, заклю-
ченной в белке. Сюда относится, например, вопрос о количествах инфор-
мации, связанных с образованием фермент-субстратного комплекса или
соединения антигена с антителом. В одном или двух частных случаях на
эти вопросы можно дать прямой ответ. Пусть, например, ферментом являет-
ся уреаза, а субстратом — мочевина. Предположим, что для образования
комплекса необходимо, чтобы молекула мочевины была определенным обра-
зом ориентирована и чтобы ее размеры удовлетворяли определенным тре-
бованиям. Тогда мы можем рассуждать следующим образом. Спецификация
мочевины, молекула которой состоит из 8 атомов, связана со спецификацией
числа атомов, что требует 3 бит, и идентификацией каждого атома, требую-
щей около 1 бит на атом,— всего 13 бит. Еще 4 бит нужно для выбора
изо всех возможных комбинаций 10 атомов той, которая соответствует моле-
куле мочевины. Таким образом, выбор субстрата связан приблизительно
с 17 бит информации.

Возможен совершенно другой подход, принадлежащий также Каст-
леру. В отличие от предыдущего метода, позволяющего найти количество
информации при каком-то одном способе операции, этот подход позволяет
поставить вопрос о биологически необходимом количестве информации неза-
висимо от типа операции. Количество информации в ферменте можно
определять либо исходя из числа существующих в природе ферментов,
либо исходя из числа возможных субстратов и считая, что фермент дол-
жен иметь информацию, необходимую для выбора одного из них. В первом
случае, принимая, что существует 600 ферментов, получаем, что для выбора
одного из них нужно 9 бит информации. Во втором случае нужно оценить
относительную концентрацию субстратов. Кастлер отмечает, что в 90%
сухого веса содержатся субстраты только 61 класса, а в 99% сухого веса —

I Элементы, участвую-
р щие во взаимодействии

Элементы, несущест-^
венные для взаимодейст-
вия фермент-субстрат

Фермент

Субстрат

Элементы, не-
^существен-^
ные для взаимо-
действия фер-
мент-субстрат

Специфичность

[— взаимодейст --О-
вия фермент-субстрат

Элементы, участвую- I
щие во взаимодействи: -

Элементы, определяющие

•>— антигенные свойства -

Антиген

Возмож-\ г „	|

ностьпеД Специфичность
рекрестноир— вза имооеиствия—]
реакции антиген-антитело
-----Элементы, участ-----н

вующие в реакции I

Антитело

Возможность

•— перекрестной -
реакции

Элементы, не
^имеющие —
отношения к
антигенным
свойствам

Фиг. 21. Схематическое изображение элементов, определяющих взаимосвязь фер-
мента с субстратом (Л), антитела с антигеном (Б) и генотипа с фенотипом (В) (по Каст-
леру).

субстраты 300 классов. Таким образом, выбор одного субстрата связан с 7 бит
информации. Учитывая результаты обоих методов, можно сказать, сле-
довательно, что с точки зрения, биологической необходимости процесс
взаимодействия фермента ссубстратом связан с 7—9 бит информации.

5 Заказ № 1168
Конечно, эта цифра ничего не говорит нам о том, как действует фер-
мент. Однако, основываясь на этих результатах, можно предположить,
что, если эволюция привела к простейшему способу обеспечения необходи-
мой степени специфичности, следовательно, конфигурационное соответствие
не обязательно должно быть очень точным. Этот вопрос будет вновь рас-
смотрен с другой точки зрения в гл. VIII.

С помощью подобного метода Кастлер получил сходные величины и для
взаимодействия антиген — антитело и для соотношения генотип — фено-
тип. Как видно из фиг. 21, Кастлер в каждом случае исходит из того, что
одни особенности структуры вообще не связаны со специфичностью или,
возможно, имеют лишь отдаленное отношение к ней, а другие как раз и соот-
ветствуют тем 7—9 бит, которые связаны со специфичным взаимоотноше-
нием.

10.	Количество информации в бактериальной клетке. Интересно оценить
количество информации в бактериальной клетке, которая является наи-
меньшим объектом, обладающим всеми основными свойствами живого (ви-
рус в этом отношении непредставителен, так как он является облигатным
паразитом, т. е. способен размножаться только в живой клетке). Одна из
таких оценок принадлежит Моровитцу, который получил ее непосредствен-
но с помощью теории информации, другая —- Линшитцу, исходившему из
связи энтропии с информацией.

При прямом подходе задача аналогична составлению инструкции для
сооружения здания из каких-либо частей. Если здание сооружается из кир-
пичей, можно представить себе трехмерную решетку, подобную пчелиным
сотам. Чтобы установить, должен или не должен некоторый кирпич нахо-
диться в клетке, требуется одна единица информации. Конечно, при этом
существенно, являются ли клетки в такой воображаемой решетке боль-
шими или малыми, так как решетка может быть либо слишком грубой для
того, чтобы с ее помощью можно было описать конструкцию здания, либо
слишком мелкой, что привело бы к рассмотрению небольших трещин в кир-
пичах, которые не имеют отношения к задаче. Несмотря на затруднения,
связанные с этими вопросами, такая оценка величин информации приводит
к интересным результатам.

Бактериальная клетка состоит из воды и твердого материала. Известно,
что на стадии споры бактерия может полностью лишиться входящей в ее
состав воды и тем не менее сохранить жизнеспособность. Поэтому вполне
разумно, как предположил Моровитц, рассматривать количество информа-
ции, считая, что клетка высушена. Проблема определения информации
сводится к правильному выбору атомов и их правильному расположению.
Количество информации — это соответствующая инструкция, заданная
в двоичной форме.

Наш метод вычисления, который мы сейчас опишем, позволяет быстро
произвести оценку, хотя он и не столь строг, как метод Моровитца.

Чтобы выбрать какой-либо из 60 типов атомов (не все типы атомов встре-
чаются в клетках), нужно приблизительно 6 бит. Однако в действительно-
сти не все элементы встречаются с равной вероятностью, поэтому среднее
число двоичных выборов, необходимых для идентификации атома, равно
1,5. Далее необходимо определить число атомов. Можно принять, что сред-
ний атомный вес равен 6 и, значит, средняя масса равна 6-1,67-10“24 г.
Следовательно, 6-Ю”13 г сухого веса соответствуют 6-1010 атомов. Теперь
рассмотрим вопрос о тонкости клеточной структуры. Будем считать,
что ее можно характеризовать величиной 2-10“10 см, которая равна ампли-
туде колебаний ядер. Среднее расстояние между атомами равно прибли-
зительно 2 А. Соответственно объем области неопределенности для атома
равен 8 А3, или 8-10“24 см3, а амплитуде колебаний соответствует объем
8-10“3° см3. Следовательно, число клеток в наших воображаемых сотах
равно 8-10 24/8-10~3° = 106. Для устранения соответствующей неопределен-
ности нужно 20 двоичных выборов. Таким образом, всего на 1 атом прихо-
дится 21,5 бит информации. Так как полное количество атомов равно
6-Ю10, то полное количество информации равняется 1,3-1012 бит или, если
округлить, 1012 бит.

По оценке Линшитца, величина энтропии бактериальной клетки состав-
ляет 9,3-10“12 кал/град или 9,3-10 12 -4,2 дж/град. С помощью соотно-
шения Н=5/&1п2 находим количество информации:

9,3-10-12-4,2

1,4-10-23-0,69

4-1012 бит.

Моровитц, исходя из данных, полученных Бейн-Джонсом и Рисом,
получил меньшее значение, равное 5,6-1011 бит, которое все же близко
к 1012 бит. Таким образом, совершенно различные методы приводят к согла-
сующимся результатам.

Следует учитывать, что оба метода дают завышенные результаты. Если
значения энтропии, рассчитанные по значениям теплот, характеризующих
процесс питания, действительно сильно завышены, то для оценки информа-
ции следовало бы пользоваться меньшими значениями. Далее, вполне воз-
можно (и это нужно учитывать при более точных оценках), что положение
многих атомов не влияет существенно на процессы жизни. Как показал
Холтер, амеба, у которой в результате центрифугирования произошло
расслоение ее составных частей, тем не менее продолжала жить.

Даже при учете этих факторов величина 1012 бит все-таки очень вели-
ка. Моровитц показал, что вероятность образования бактерии из составля-
ющих ее атомов в результате беспорядочного процесса действительно очень
мала. Тем, кто увлекается спекуляциями о происхождении жизни, необхо-
димо это учитывать.

Вернемся к описываемому методу оценки количества информации. Ясно,
что решающее значение имеет характер процесса образования структуры.
Прибегая к аналогии с постройкой здания, можно утверждать, что если
стены сооружаются путем заливки цемента в формы (блоки), а не способом
«кирпич к кирпичу», то необходимое количество информации меньше. Возмо-
жно, что количество информации в клетке определяется закономерностями
ее роста. Так, если бы для образования клетки было достаточно лишь поме-
стить нуклеопротеидную нить в смесь нескольких молекул ферментов, со-
лей и аминокислот, то требуемое количество информации значительно умень-
шилось бы. По вычислениям Данкова и Хастлера, исходивших из подоб-
ного допущения, для бактерии получается величина 104 бит. Если, таким
образом, живые системы в своей основе относительно просты, то ясно, что
необходимо всеми силами изучать процессы синтеза, приводящие к обра-
зованию клетки.

Возможно, что после выявления таких процессов окажется, что они
протекают в согласии со следующим общим-принципом, впервые сформу-
лированным Данковым. Каждый из идущих один за другим процессов слу-
жит источником ошибок. Можно считать, что либо эти процессы очень точ-
ны, так что никакая ошибка недопустима, либо общие требования к каж-
дому последовательному процессу таковы, что для каждого из них установ-
лена определенная максимальная ошибка. Другими словами, если для того,
чтобы клетка работала, должно быть синтезировано 100 молекул определен-
5*
кого белка, то можно представлять себе это как процесс, при котором либо
точная матрица обеспечивает синтез всех 100 молекул, причем в каждом
случае из ста в систему может быть внесена ошибка, либо каждый белок
делится в присутствии специального ингибитора, предотвращающего деле-
ние любого неправильного белка. В последнем случае синтез неправильного
белка ограничивается и преобладает синтез правильно построенных белков.
Следовательно, при процессе второго типа имеется своего рода контроль.
Данков предположил, что из гипотез, относящихся к клеточным процессам,
наиболее правильной следует считать ту, которая, удовлетворяя имеющимся
данным, допускала бы наибольшее отклонение от предсказываемых ею зако-
номерностей.

Этот принцип можно применить для того, чтобы выяснить, происходит
ли быстрое обновление белков, т. е. замена аминокислот, входящих в сос-
тав белковой молекулы, на свободные аминокислоты среды. Если мы допу-
скаем, что такой процесс связан с ошибкой, то много раз в секунду должна
возникать опасность, что в результате обмена в молекулу белка будет вне-
сена «неправильность». Поэтому либо предположение об обновлении не-
приемлемо, либо в клетке имеется какой-то чрезвычайно эффективный кон-
тролирующий процесс. Этот процесс должен протекать столь интенсивно,
что он был бы заметен при биохимических экспериментах. И до тех пор,
пока он не обнаружен, вряд ли может существовать уверенность в том,
что быстрое обновление аминокислотного состава белков действительно
происходит. Работа Моно и Шпигельмана по образованию адаптивных фер-
ментов подтверждает эту точку зрения.

В заключение этой главы приведем некоторые интересные цифры,
на которые нам указал Кастлер.

Предположим, что аналитическая химия позволяет идентифицировать
одно вещество из 107 других. Это соответствует 23 бит информации. Так
как биологическая информация, содержащаяся в молекуле ДНК, равна
по порядку величины 104 бит, создается впечатление, что биологическое
действие ДНК- вряд ли можно понять с помощью аналитической химии.
Вместе с тем рентгеноструктурный анализ позволяет легко получить 104 бит
информации при работе с кристаллом размером 1 мм в поперечнике. Следо-
вательно, применение структурного анализа в биофизике следует считать
весьма перспективным.

Если принять, что на бактериальную клетку приходится 1012 бит
информации, то при росте и развитии бактерии должно производиться 109
бит информации в секунду. Это настолько большая величина, что кажется
вполне вероятным предположение о существовании контроля за этим про-
цессом, осуществляемого какой-то группой нуклеопротеидных молекул.
Наименьшее значение информации, производимой при росте бактерии, 1000
бит в секунду. Интересно сравнить эту величину с величиной информации,
сознательно используемой человеком, которая, по Кастлеру, составляет
25 бит в секунду. Страница печатного текста содержит около 104 бит, но
при этом нужно учитывать, что авторы часто бывают склонны к чрезмерному
многословию.

ЛИТЕРАТУРА

1.	ЗсЬгбЛп^ег Е , \\Ъа1 15 Ьйе? СатЬпйре ИшуегзЛу Ргезз, 1944. — 81а-
Нз11са1 Тйегтойупапнсз, СатЬгИ^е ИтуегзИу Ргезз, 1951. (Э. Шредин-
гер, Что такое жизнь? М., ИЛ, 1947.)

2.	Сигпеу К., Ап ТгйгойисИоп 1о 81аНвНса1 Месйатсз, МсСгаит-Н111 Воок Со.,
И. V., 1949.
3.	Локпзоп Р. Н., Е у г 1 г. 2 Н., Р о 1 1 1 8 а г М. .1., КдпеИсз о( Мо1еси1аг,
В1о1о2у, ЛоЬп ЛУПеу, К. V., 1955.

4.	М с 1 1 XV а I и Н., ТЬе Ма^пйийе о! М1сгоЫа1 КеасНопз 1пуо1у1п§ УйапмпИке
Сотроипйз, Ма1иге, 158, 898 (1946).

5.	<2 и а а Н е г Н., 1п(огтаИоп ТЬеогу гп ЕИо1о§у, ИтуегзИу о! ИНпогз Ргезз,
ргЬапа, 111., 1953.

6.	М о г о XV 1 1 х Н., 8оте Огйег-Е18ог(1ег СопзгдегаНопз 1п 1Лхчп§ ЗузТегпз, Ви11.
Ма111. Вюркуз., 17, 81 (1955).

7.	(2 а з 1 1 е г, 1П Зутрозшт оп ШогтаНоп ТЬеогу 1гГВ1о1о2у, ей. Н. Яаскеу, 1956.
(Теория информации в биологии, М., ИЛ, стр. 8, 1960).
Г лаба IV

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
РАЗМЕРОВ И ФОРМЫ МОЛЕКУЛ

1.	Введение. Процессы, лежащие в основе обмена веществ, самовоспро-
изведения, дифференцировки и раздражимости (этих четырех характерных
признаков живых организмов) представляют собой взаимодействие огром-
ного числа различных молекул, составляющих организм. Во многих из
этих взаимодействий или реакций участвуют макромолекулы, молекуляр-
ный вес которых превышает 10 ООО. Более того, структурные элементы жи-
вого вещества состоят из агрегатов макромолекул. Очень интересно и важ-
но определить физические характеристики этих молекулярных структур^
Так, для выяснения механизма действия ферментов в первую очередь нужно
иметь данные о размерах, форме и структуре белковых молекул.

В настоящее время для изучения макромолекул применяется целый
ряд экспериментальных методов. Однако один метод может дать лишь скуд-
ную информацию, не позволяющую нам предсказать поведение разных ви-
дов молекул. Для получения же однозначных сведений о структуре или
поведении полимерных молекул необходимо сочетать по крайней мере два
метода.

Самым плодотворным методом исследования структуры молекул являет-
ся дифракция рентгеновских лучей. В то же время этот метод наиболее
трудоемок, вследствие чего к настоящему времени получено лишь ограни-
ченное количество точных данных.

Структура молекул гемоглобина, миоглобина, инсулина, химотрипсина
и рибонуклеазы изучена довольно подробно, но только о первых двух полу-
чены более или менее полные данные. В скором времени, по-видимому, та-
кие исследования будут производить машины, и расшифровка рентгено-
грамм кристаллических белков будет значительно ускорена.

В табл. 3 перечислены некоторые методы исследования молекул и ука-
заны те сведения, которые могут быть получены с помощью этих методов.
Различие их состоит не только в том, что они дают информацию о различ-
ных сторонах структуры молекул, но и в тех требованиях, которые предъяв-
ляются к величине и чистоте образцов. Например, применяя метод рассея-
ния света, пользуются растворами с концентрацией около 1 мг!мл, а при
изучении дифракции рентгеновских лучей берут кристаллические образцы
весом около 1 мг.

Методы, перечисленные в табл. 3, могут быть разделены на две группы.
К первой относятся методы, с помощью которых мы наблюдаем движение
или ориентацию совокупности частиц или воздействие этих частиц на излуче-
ние того или иного типа. Ко второй группе (пп. 17 и 18) мы относим методы,
позволяющие изучать изменения, производимые падающим излучением
в самой частице. Такой подход характерен для современной физики. Он
состоит в том, что в систему, состоящую из атомов или молекул, вводится
определенное количество известного вида энергии и исследуется реакция
этой системы.

Таблица 3

Физические методы исследования макромолекул

Метод	Получаемая информация	Необходимая чистота образца
1. Осмотическое давление	Молекулярный вес	Очень высокая
2. Диффузия	Молекулярный объем, если есть	В разных случаях
3. Скорость седиментации	данные о форме и о количест- ве связанной воды  Молекулярный объем, если есть	разная  Промежуточная
4. Седиментационное равно-	. данные о форме и о количест- ве связанной воды  Молекулярный вес	Высокая
весне		
5. Вязкость	Форма, если есть данные о свя-	>
6. Двойное лучепреломление	занной воде  Форма, если есть данные о свя-	>
в потоке  7. Двойное лучепреломление	занной воде  Форма, если есть данные о свя-	»
в электрическом поле  8. Дисперсия диэлектриче-	занной воде  Форма, если есть данные о свя-	»
ской проницаемости  9. Дисперсия	оптического	занной воде  Доля спиральной формы	»
вращения		
10. Рассеяние света	Молекулярный вес, анизотропия	Очень высокая
11. Рассеяние рентгеновских	Размеры и форма	То же
лучей  12. Электрофорез	Связь заряда с размерами и фор-	Промежуточная
13.	Электронная микроскопия  14.	Рассеяние электронов	мой  Размеры и форма  Межатомные расстояния	Высокая
15. Рентгеноструктурный ана-	Положение атомов	Очень высокая
ЛИЗ		
16. Поглощение электромагнит-	Внутримолекулярные	силы	Высокая
ного излучения  17. Облучение заряженными	и ориентация  «Чувствительный объем» и его	Низкая
частицами  18. Облучение фотонами	локализация  Упорядоченность структуры	»

Здесь невозможно проанализировать все методы первой группы. Мы
выберем в качестве примеров методы диффузии, седиментации, двойного
лучепреломления в потоке, дифракции рентгеновских лучей и поглощения
света. Первые три метода довольно сложны. Однако с их помощью можно
изучать основные свойства молекул, определяющие их поведение в клетке
(к этому вопросу мы возвратимся в гл. XV). Эти методы дают возможность
выяснить большую часть интересных для нас черт структуры молекул.
Последние два метода рассмотрены в гл. X и IX. Для получения более под-
робных сведений следует обратиться к литературе, приведенной в конце
соответствующих глав.

2.	Хаотическое движение. На поведение молекулы в клетке влияют
электрические силы и короткодействующие ван-дер-ваальсовы силы, кото-
рые мы будем обсуждать в гл. VI. Основным же фактором, определяющим
поведение молекул, является беспорядочность их движения, обусловлен-
ная столкновениями с окружающими молекулами. Рассмотрение хаотическо-
го движения в жидкой фазе представляет большие трудности, чем в газовой,
так как движению макромолекул в жидкости препятствуют силы трения.
Теоретически и экспериментально можно показать, что для малых скоро-
стей молекул в растворе сила трения Р пропорциональна скорости. Если
мы обозначим коэффициент пропорциональности, который называется коэф-
фициентом трения, через /, то при скорости V получим:

Сила трения = Р=—/V,	(4-1)

где Р — сила трения. Знак минус означает, что векторы Р и V направлены
в противоположные стороны. Коэффициент трения / тесно связан с разме-
рами и формой молекул и с вязкостью среды. Например, если молекула,
движение которой мы рассматриваем, представляет собой сферу радиуса
а, движущуюся в среде с вязкостью т], то мы будем иметь [=6пца. Прежде
чем вникать в тонкости определения /, рассмотрим хаотическое движение
молекул более подробно, так как определить коэффициент трения непосред-
ственно на основе равенства (4.1) практически невозможно.

Мы хотим узнать нечто о движении молекулы или частицы, на которую
действует сила трения /о, в том случае, когда средняя кинетическая энергия
частицы равна средней кинетической энергии молекул окружающей среды.
Из молекулярно-кинетической теории известно, что средняя кинетическая
энергия молекулы с массой т, равная ^-, связана с абсолютной темпера-
турой Т следующим соотношением:

где &=1,38-10-23 дж/° К —константа Больцмана. Средняя кинетическая
энергия, приходящаяся на одну степень свободы, например на перемещение
вдоль оси х, равна:

Ёк=±7^х = ^кТ.	(4.2)

Поскольку средние скорости определять трудно, равенство (4.2) не
может быть использовано для нахождения массы частицы. Но, как показа-
ли Эйнштейн и Сэзерленд, существует возможность частично преодолеть
возникающие здесь трудности. Среднее смещение х в одном направлении
равно, конечно, нулю. Если бы это было не так, движение не было бы хао-
тическим. Но среднее значение квадрата смещения х2 не равно нулю; эта
величина связана с формой молекулы, но не зависит от ее массы, как мы
сейчас покажем.

Предположим, что из-за беспорядочных столкновений с молекулами
среды макромолекула в момент 1=6 начинает двигаться со скоростью
в направлении х. Под действием силы трения —/й скорость ее будет убывать
в соответствии со вторым законом Ньютона:

(IV с

тРи =
Разделяя переменные в этом уравнении и интегрируя его, получаем для
скорости в момент I

V — цое' т' .

Мы предположили, конечно, что в течение времени I никаких статисти-
чески неуравновешенных столкновений частицы с молекулами среды не
происходило. Это ограничение не повлияет на конечный результат, так
как оно исчезает при усреднении. Кинетическая энергия выражается сле-
дующим образом:

Ей=|/от2 = |т^е( 2 =Ей,оД

Кинетическая энергия, усредненная по промежутку времени т, будет равна:

Ек ЕкМ =у о 2 т'> (11 =
о	о

Для больших промежутков времени т экспоненциальным членом можно
пренебречь. Для промежутков времени, больших 10-6 сек, получаем

Ей=^-^-.	(4.3')

Соотношение между х2 и Ек может быть найдено следующим образом. Сме-
щение молекулы за время т будет выражаться так:

х=^у(И = у0^е^	(И = и0ЕЕ

о	о

и для т>10-6 сек

(4.4)

Для каждой молекулы число таких случайных элементарных смещений
очень велико, и вследствие того, что смещение в любую сторону равнове-
роятно, ъ0 —0 и х=0. Но

2 _ от2°Ц   %т 1	_2т р	/4 су

X — р	р 2 р Ль, о-

Исключая отсюда Ек,0 при помощи равенства (4.3'), получаем

х2 = ф-т.	(4.5')

Если мы усредним это выражение по многим молекулам (или для одной
молекулы по многим промежуткам времени), то, учитывая равенство (4.2),
найдем

х2 —2^-т.	(4.6)

Это и есть результат, который мы хотели получить. Он представляет собой
решение задачи о «хаотическом движении» с данной средней квадратичной
скоростью. Измерив х2, мы сможем найти Д Этот результат был впервые
применен Перреном для определения числа Авогадро по наблюдаемым сме-
щениям коллоидных частиц известной величины. Аналогичные равенства
имеют место и для у- и 2-направлений, так что среднее значение квадрата
смещения при движении во всех трех направлениях в течение времени т
имеет вид

?=72+^+? = 6^т.	(4.6')

Фактическое расстояние, которое может пройти молекула, много больше,
чем корень квадратный из величины, даваемой равенством (4.6'), так как
направления элементарных смещений случайны. Значение этого факта обсу-
ждается в гл. XV.

Мы вычислили среднее квадратичное значение смещения. Но эта величи-
на не может характеризовать движение всех молекул в растворе, так как
смещения отдельных молекул разбросаны около этого среднего значения
в соответствии с нормальным (гауссовым) распределением. Пусть Р(х)дх
есть вероятность того, что величина смещения окажется между х и х-рдх.
Если среднее значение квадрата смещения равно х2, то

_ х2

Р(х)с1х = г^-е ^дх.	(4.7)

Множитель перед экспонентой выбран так, что

СО

Р (х) сЬс = 1.

—со

Отметим, что положительные и отрицательные смещения равновероятны,
т. е. Р (х)=Р (—х).

3.	Диффузия. Проведенный анализ хорош во всех отношениях, за исклю-
чением того, что его результаты не могут быть использованы непосредствен-
но, так как мы не можем проследить за отдельной молекулой и, следова-
тельно, не можем прямо измерить х2. Молекулы белков и нуклеиновых кис-
лот, например, имеют размеры в пределах от 1.0 до 1000 А. Поэтому нужно

Фиг. 22. Случай одномерной диффузии.

1 — постоянный градиент концентрации, направление которого совпадает
с направлением оси х\ он вызывает результирующий поток частиц в про-
тивоположном направлении; II — скачок концентрации при х = 0
вызывающий результирующий поток частиц налево; величина потока может
быть определена с использованием уравнения (4.6).

определять величину х2 косвенным способом, путем измерения коэффициента
диффузии. Диффузией называется переход молекул из области с более высо-
кой концентрацией в область с более низкой концентрацией. То, что мы обсу-
ждали выше, есть проявление хаотического движения молекул. Хотя части-
цы с одинаковой вероятностью могут двигаться как в одном, так и в другом
направлении, большее число частиц будет выходить из области высокой кон-
центрации, чем входить в нее, просто потому, что число частиц в этой обла-
сти больше.

Классический способ рассмотрения проблемы диффузии состоит в при-
менении закона Фика (1855 г.), который связывает перенос вещества с гра-
диентом концентрации, т. е. с изменением концентрации в пространстве.
Рассмотрим диффузию молекул в трубке, параллельной оси х (см. фиг. 22).
При возрастании концентрации слева направо результирующий поток мо-
лекул будет направлен справа налево. Если <1п/с11 обозначает число моле-
кул, проходящих в секунду через поперечное сечение А, а дс/дх — градиент
концентрации, то по закону Фика

= — ВА-^-.	(4.8)

М	ох	'	'

Коэффициент пропорциональности В называется коэффициентом диф-
фузии. Определим его размерность:

ГП1 _ Г 1 А1 —_______________1	. Число молекул	2.	г

I |_ Ас/х I 4	„ Число молекул 1 сек.

м* •------о------- —

м3	м

Прежде чем заняться соотношением между коэффициентом диффузии
и молекулярными параметрами, обратим внимание на некоторые типичные
величины коэффициентов диффузии (табл. 4). Основная особенность этих

Таблица 4

Типичные значения коэффициента диффузии для молекул,
диффундирующих в воде при 20° С

Молекула	Принятый молекулярный вес	О, (м2/сек)  1011
Глицин 		75	95
Аргинин 	 		174	58
Цитохром с		13 000	10,1
Пепсин		35 000	9,0
Карбоксигемоглобин		68 000	6,2
Уреаза		480 000	3,5
Вирус табачной мозаики . . .	40 000 000	0,53

коэффициентов диффузии состоит в том, что они мало меняются при изме-
нении молекулярного веса. Например, при возрастании молекулярного
веса в 104 раза коэффициент диффузии уменьшается всего в 30 раз» Перед
тем как перейти к экспериментальным методам, с помощью которых можно
определить эти величины, рассмотрим ту простую связь, которая сущест-
вует между хаотическим движением и диффузией. Следующий далее вывод
является довольно грубым, но с его помощью получаются те же резуль-
таты, что и при более строгом анализе.

Представим себе длинную трубу, параллельную оси х (фиг. 22, II).
В начальный момент времени концентрация частиц на 1 м3 справа от начала
координат равна с2 и слева — с1. Предположим, что щ < с2. За неболь-
шое время т частицы претерпят среднее квадратичное смещение, выражаю-
щееся уравнением (4.6), и, таким образом, за этот промежуток времени поло-
вина частиц, находящихся на расстоянии х2 от начала координат, пересечет
начало координат (половина потому, что частицы двигаются в обоих напра-
влениях). Числа частиц, перешедших направо и налево, соответственно
равны:



и

и результирующий поток за секунду в положительном направлении оси х

равен

<1п п С±—С2

А_
т

V х2 •

По мере того как в течение времени т молекулы совершают случайные
движения, градиент концентрации меняется. В конце этого промежутка
времени устанавливается равномерный перепад концентрации от с1 до с2
на расстоянии 2]/^х2; таким образом, конечный градиент равен .

Средний за период т градиент концентраций оказывается равным

дс   С2— С1
у хТ:

подставляя это выражение в предыдущее уравнение, получаем

__ А —2 дс

<11 2т Л дх

Это уравнение имеет ту же форму, что и закон Фика (4.8). Сравнение урав-
нений (4.6) и (4.8) показывает, что

О = и х2 = 2ПС	(4.9)

Эти уравнения содержат ответы на наши вопросы, так как, измерив О, мы
сможем вычислить» коэффициент трения /, а величина коэффициента трения
дает возможность сделать заключения относительно формы молекулы. Зна-
ние коэффициента диффузии достаточно для определения х2. Это следует
из выражения (4.9), которое дает формальную связь между хаотическим
движением и диффузией. Более строгий вывод соотношения между средним
квадратичным смещением и коэффициентом диффузии дается в разд. 4.

Предположим, что диффундирующие молекулы имеют сферическую
форму. По закону Стокса коэффициент трения для шара радиуса а, движу-
щегося в жидкости с вязкостью тр равен

/=6лца.	(4-10)

Вязкость воды при 20° С равна 10-2 единиц СГС или пуаз. 1 пз равняется
0,1 единицы вязкости в системе МКС. Таким образом, зная П, можно
вычислить ср тогда, если р — плотность и /V — число Авогадро, масса мо-
лекулы выражается формулой

т — ^л,а3^,	(4-П)

а молекулярный вес

М =	.

О
Отсюда следует, что коэффициент диффузии обратно пропорционален корню
кубическому из массы, чем и объясняется небольшой диапазон изменения
О в табл. 4. (При диффузии газов, когда коэффициентом трения можно пре-
небречь, коэффициент диффузии обратно пропорционален корню квадрат-
ному из массы.)

Этот способ определения размеров молекул впервые был применен
в 1905 г. Сэзерлендом. Он экспериментально показал, что при экстрапо-
ляции данных по диффузии малых молекул на большие молекулы, подобные
молекулам белков, произведение коэффициента диффузии на корень куби-
ческий из объема граммолекулы оказывается величиной постоянной. Исполь-
зуя затем данные Грэма по диффузии яичного альбумина, полученные при-
мерно в 1860 г., Сэзерленд нашел, что объем граммолекулы белка равен
27 000 см3. Зная молярные объемы отдельных единиц яичного альбумина
и процентный состав его молекулы, он в результате получил для молекуляр-
ного веса значение 33 000. Совпадение этой величины с принятой в настоя-
щее время (50 000) до некоторой степени случайно. Тем не менее Сэзерленд
был на правильном пути. Рассматривая совместно уравнения (4.9), (4.10)
и (4.11), находим, что У1/з 7) =сопзЕ Как ни странно, двадцатью годами
позже Эйлер, произведя аналогичный расчет, предположил, что произве-
дение коэффициента диффузии на корень квадратный из молекулярного
веса является константой. В результате вычисленный им вес инвертазы
оказался равным 20 000, тогда как из уравнений (4.9), (4.10) и (4.11)
получается величина 120 000.

Все величины молекулярных весов, определяемые таким образом, полу-
чаются завышенными по сравнению с принятыми молекулярными весами,
которые находят по осмотическому давлению, седиментационному равнове-
сию или рассеянию света. Это объясняется двумя причинами. Во-первых,
уравнения (4.9) и (4.10) выведены в предположении, что частицы имеют
сферическую форму. Если же частицы имеют эллипсоидальную форму (это
единственная форма, которую можно легко рассмотреть математически),
то нетрудно показать, что для частиц одинакового объема коэффициент тре-
ния в случае эллипсоидальной формы больше, чем в случае сферической.
Если же отнести малое значение коэффициента диффузии за счет большого
радиуса, вычисленный молекулярный объем будет слишком велик. Конечно,
в том случае, когда известна форма молекулы, можно, используя данные
по диффузии, получить правильные значения для молекулярного объема.
Более детальное рассмотрение этого вопроса читатель найдет в книге Кона
и Эдсолла [2].

Вторая причина того, что с помощью уравнения (4.11) получаются
неверные значения, заключается в связывании молекулами белка молекул
воды. Поскольку белковая молекула содержит многочисленные боковые
заряженные группы, на диполи воды действует сильное местное электри-
ческое поле. Это приводит к тому, что диффундирующие молекулы окружены
плотным слоем молекул воды. В результате сила трения увеличивается,
и вычисляемый молекулярный объем относится скорее к гидратированной
молекуле, чем к негидратированной. Если известна степень гидратации,
то легко сделать количественную поправку на связанную воду. Обычно
количество гидратационной воды лежит в пределах от 0,20 до 0,50 г Н2О
на 1 а белка. Эти величины можно найти, измеряя количество воды, адсорби-
рованной на высушенном белке, а также определяя, какая часть воды в рас-
творе белка остается доступной для растворения в ней солей.

Плотность сухого белка составляет около 1,27 г/см?, но когда 1 а белка
растворяют в воде, происходит увеличение объема раствора не на
1/1,27=0,78 см3, а на величину, близкую к значению 0,75 см3. Эта величина
получила название «кажущегося удельного объема» белка. Она меньше
величины обратной плотности сухого белка, вследствие того что силы при-
тяжения между молекулами воды и белка ограничивают свободу движения
молекул воды. Иначе можно представить себе, что молекула белка имеет
на своей поверхности углубления, которые могут заполнить молекулы во-
ды. Хотя эти нерегулярности не вытесняют воду, они включаются в изме-
ренный «сухой объем».

Если принять в качестве среднего значения для количества связанной
белком воды величину 0,35 а Н2О на 1 г белка, то отношение коэффициентов-
диффузии для гидратированной (Огпд) и негидратированной (О0) сфер может
быть получено из формулы

Следовательно, для отношения молекулярных весов получается выра-
жение

Л40	/' О гид	1	. . Мгид

. и = ( —=;   = -7~77 ИЛИ /Ио =  , .с ,
МГид Ч °о У 1,46	0	1,46 ’

где Мгид И Мо — молекулярные веса гидратированной и негидратированной
сфер соответственно. Этот поправочный коэффициент на связанную воду
(1/1,46) сохраняется также и для нссферических молекул. Если ввести эту
поправку в данные, представленные в табл. 4, то получатся величины, приве-
денные в табл. 5. Для несфернческих молекул, а также в том случае, когда
поправка на связанную воду введена неверно, эти результаты согласуются
плохо. Особенно ясно это видно на примере вируса табачной мозаики (ВТМ),
который, как известно, представляет собой длинный тонкий стержень дли-
ной 2800 А и диаметром 150 А.

Таблица 5

Значения молекулярного веса, полученные с помощью уравнения (4.1)

Молекула или частица	Принятый мол. вес	Мол. вес [вычислен- ный и а основании уравнения (4.1)]	Мол. вес после введения поправ- ки (деление на 1.46)
Гемоглобин ....	68 000	130 000	89 000
Цитохром с		13 000	32 000	20 000
Пепсин 		35 000	43 000	29 000
Уреаза 		480 000	770 000	530 000
ВТМ 		40-106	230-106	160-106

Следует учесть, что наши знания о взаимодействии между молекулами
воды и белков далеко не полны; вполне возможно поэтому, что как вслед-
ствие приближенности теоретических предпосылок, так и из-за неточностей
эксперимента величина поправочного коэффициента определена неточно
(ошибка может составлять до 20%).

Из измерений коэффициента диффузии ясно видно, что молекулы натив-
ных белков не имеют формы вытянутой полипептидной цепи. Так, при дена-
турации сывороточного альбумина под влиянием мочевины коэффициент
его диффузии значительно понижается. Поскольку измерения осмотическо-
го давления указывают на отсутствие распада молекул, можно предполо-
жить, что размер молекул белка в растворе колеблется в пределах от 20
до 100 А. Даже для. белков с меньшим молекулярным весом длина молекул
превышала бы 500 А, если бы они находились в форме вытянутой полипеп-
тидной цепи.

Может показаться, что на метод, дающий очень скудные результаты,
затрачено слишком много времени. В оправдание мы можем указать на то,
что знание коэффициента диффузии очень важно при изучении обмена ве-
ществ в клетке и, кроме того, при сочетании этого метода с ультрацентрифу-

Ф и г. 23. Объем /Дх, через ко-
торый происходит диффузия.

г-	/дс \

Градиент концентрации равен
(дс X	.

5 начале координат и \^/дхпРи

меняется. Однако если при-

гированием можно получить точные значения для молекулярных весов.
Нужно еще учесть, что в данное время
очень трудно найти какой-нибудь один
точный метод исследования, поэтому надо
использовать все знания, какие мы только
можем получить, и пытаться объединять
самые различные данные для получения
наилучшего результата.

4.	Измерение коэффициентов диффу-
зии. Мы говорили относительно исполь-
зования коэффициентов диффузии для
получения данных о размерах молекул,
однако до сих пор ничего не было сказано
об измерении этих констант. Выражение (4.8)
нельзя использовать непосредственно для
расчета коэффициента диффузии, так как
в процессе диффузии градиент концентраци

нять, что число диффундирующих молекул сохраняется, то можно вывести
более пригодное для наших целей выражение.

Пусть диффузия происходит вдоль оси х. Сосчитаем прирост числа моле-
кул внутри объема Л Ах, показанного на фиг. 23. Если обозначить градиенты
концентрации при х=0 и х=Дх через (дс/<Эх)0 и (йс/<9х)Дж соответственно,
то для прироста числа молекул в объеме ЛДх из уравнения (4.8) получим

__ __ ДГ)

кп-сш-

В этом уравнении частные производные используются потому, что концен-
трация изменяется не только с расстоянием, но и со временем. Если градиент
концентрации возрастает линейно с увеличением х, что действительно имеет
место, когда Дх стремится к нулю, получаем

\дх у дх у ох у0 дх \дх у0

Подставим это выражение в предыдущее уравнение:

---•= Аи =-( -з- ) Дх.
а.1 дх \дх у 0

Но величина дпЦАйх) есть прирост концентрации, выражаемый через
число частиц на 1 №. Таким образом, при Дх, стремящемся к нулю, полу-
чаем

дс____д2с

~д1~ дх2'

(4-12)

Это уравнение в частных производных отражает тот факт, что концентрация
и, следовательно, градиент концентрации изменяется во время диффузии.
Аналитическая форма решения этого уравнения зависит от граничных уело-
вий. Решение, удовлетворяющее граничным условиям, как раз и представ-
ляет собой общее решение исследуемой проблемы.

Удобным граничным условием для теоретического рассмотрения, но не
для реализации на практике, является предположение, что в момент вре-
мени /=0 все молекулы находятся в начале координат и с течением времени

д — зависимость концентрации от расстояния; Б — зависимость градиента концентрации
от расстояния для разных моментов времени. Перед началом диффузии чистый раствори-
тель находился слева от начала координат.

они в результате случайного движения уходят на бесконечность, так что если
со, то с->0 для всех х. Решение, удовлетворяющее уравнению (4.12)
и этим условиям, дается выражением

г —	1	,—л;2/4Пг

/4^

ОО

Численный коэффициент 1/]/4л выбран таким образом, чтобы с(1х— 1.

—00

Следовательно, значение с в данной точке для определенного момента вре-
мени представляет собой вероятность того, что за этот промежуток времени
молекула диффундирует к этой точке, поэтому это уравнение должно совпа-
дать с уравнением для случайного движения (4.7). Совпадение получим,
положив х2=2.СЛ. Таким образом, мы приходим опять к уравнению (4.9),
но только более сложным путем.

Более подходящее для практического использования граничное усло-
вие состоит в том, что в момент 1=0 в начале координат имеется скачок
концентрации, так что с=0 при х<0 и с=с0 при х>0. По мере того как
происходит диффузия, граница расплывается, и при ^->со величина с—>с0/2
дс

для всех х. На фиг. 24 это условие изображено графически. Г рафик	пока-

дс

зывает, насколько резкой является граница. Если ^—>0, то со , а если

, •	дс „

со, то з-> 0.

дх

Решения, удовлетворяющие уравнению (4.12), графики которых пока-
заны на фиг. 24, даются выражениями:

х/ С41Л

с=Н1+7^ 5	<4лз>
И

дс _ со р-х^/^И1
дх У 4лБ1

Интеграл в выражении (4.13), называемый интегралом ошибок, есть функ-
ция верхнего предела интегрирования. Совершенно ясно, что он тесно свя-
зан с функцией (4.7). Для удобства его использования на практике можно
изобразить этот интеграл графически (фиг. 25).

Ф и гв 25. Значения интеграла ошибок в зависимости от верхнего пре-
дела интегрирования.

Интеграл ошибок — функция нечетная.

Выражение для градиента концентрации приводится' в явной форме
потому, что эту величину можно непосредственно измерить с помощью мно-
гих экспериментальных устройств, польз/ясь хорошо разработанными опти-
ческими методами. Некоторые из этих методов будут описаны в разд. 8.

Фиг* 26. Схема установок для проведения опытов по измере-
нию скорости диффузии.

А — сосуды можно сдвигать друг относительно друга так, что в мо-
мент времени I — 0 оба раствора приводятся в контакт и при этом
получается резкая граница; Б — растворы разделены пористой диа-
фрагмой.

Для определения коэффициента диффузии нужно определить форму кривой,
показанной на фиг. 24, или измерить (с помощью аналитических методов)
полное количество вещества, которое прошло через начало координат к извест-
СО

ному моменту времени. Эта величина равна сйх.

о

6 Зака» № 1168
Для того чтобы измеренное значение коэффициента диффузии соответство-
вало действительности, должны быть выполнены два условия: распростра-
нение вещества действительно должно происходить по закону случая
и начальная граница должна быть резкой. Резкой границы можно добиться,
помещая раствор и растворитель в отдельные кюветы так, чтобы их можно
было затем совместить в момент времени й=0, сдвигая друг относительно
друга, как показано на фиг. 26, А. Можно обойти проблему получения рез-
кой границы, используя для разделения двух сред диск из пористого стек-
ла, как показано на фиг. 26, Б. В этом случае коэффициент диффузии нельзя

определить непосредственно, так как сопротивление трения в стеклянных

Фиг. 27. Значения коэффициента диф-
фузии для карбоксигемоглобина при рН
6,8 и разных концентрациях.

порах неизвестно. Поэтому пори-
стую диафрагму нужно откали-
бровать, используя вещества с из-
вестным коэффициентом диффузии.

Необходимо тщательно следить
за тем, чтобы механические воз-
мущения и температурные градиен-
ты были сведены к минимуму. Так
как диффузия происходит пример-
но в течение дня, то за это время
действие подобных факторов может
совершенно исказить картину. На-
пример, может оказаться, что заря-
, женная молекула белка диффунди-
рует значительно быстрее, чем
такая же незаряженная молекула.
Объяснить это можно тем, что если
молекула белка заряжена положи-
тельно, быстро диффундирующие
ионы ОН“ создают электрическое

поле, ускоряющее перемещение молекул белка в область низкой концен-
трации. По этой причине измерения диффузии молекул белка следует
проводить в изоэлектрической точке, и для большей гарантии нужно
добавлять достаточное количество электролита (~0,1%). Это приведет
к тому, что электрическое поле, которое могло бы возникнуть, быстро будет

нейтрализовано ионами низкомолекулярного вещества.

Для того чтобы движение растворенных молекул было случайным, моле-
кулы должны двигаться независимо друг от друга. Это означает, что нужно
экстраполировать значения коэффициента диффузии в область бесконеч-
ного разведения. Это достаточно просто сделать, если только растворенное
вещество не диссоциирует при низких концентрациях. Пример такой диссо-
циации показан на фиг. 27. При низких концентрациях молекула карбокси-
гемоглобина диссоциирует на части с молекулярным весом 68 000.

5.	Седиментация. При обычном способе определения массы наблюдают
движение частиц под действием известной силы, так как, согласно рабочему
определению массы, отношение масс двух тел равно отношению ускорений,
приобретаемых под действием одной и той же силы. Удобнее всего исполь-
зовать силу тяжести, но в случае небольших частиц эта сила настолько
мала, что действие случайных соударений с молекулами окружающей среды
значительно перевешивает направленное действие силы тяжести. Это можно
очень просто проиллюстрировать, рассчитав разность энергий в поле тяже-
сти для молекулы с молекулярным весом 105 между двумя точками, расстоя-
ние между которыми по вертикали равно 1 см. Массу такой молекулы полу-
чим, разделив 105 на число молекул в 1 кг-моль:

105

6,03- 1026

0,16-10’21 кг.

Если взять округленное значение ускорения силы тяжести 10 м/сек2, то
разность потенциальных энергий будет равна

Е-р = т§И = 0,16-Ю'21-10• 10’2=1,6• Ю’23 дж.

Но 1 эв=1,6-10_1В дж, следовательно:

Р _ 1,6-10-23 дж _______<

— 1,6-10-16 дж/эв ~ ш

эв.

Отметим, что энергия теплового движения равна кТ, где к — постоянная
Больцмана и Т — абсолютная температура; таким образом, при комнатной
температуре:

кТ = 1,38-10-23-2,93-102^^ = 4-10-21 дж = 1/40 эв.

Потенциальную энергию силы тяжести невозможно обнаружить экспе-
риментально, так как она почти в 200 раз меньше энергии теплового движе-
ния. В действительности полученное нами значение потенциальной энергии

Фиг. 28. Направления сил, действующих ня
частицу при седиментации в центробежном поле.

оказалось даже завышенным, так как мы не учитывали при расчетах выталки-
вающую силу среды, которая уменьшает эффективную массу молекулы.

Возникшее затруднение можно преодолеть, увеличив потенциальную
энергию до величины, превышающей кТ. Это можно сделать, если поместить
частицы в сосуд, вращающийся с большой скоростью. В такой системе час-
тица движется по направлению от оси вращения. Некоторое затруднение при
решении практических задач возникает в связи с тем, что ускорение частиц,
движущихся в центробежных полях, меняется с изменением расстояния
от оси. Если обозначить угловую скорость через со рад/сек и расстояние от
оси через г, то линейное ускорение, направленное по оси, будет равно а~
= со2/*.

Предположим, что частица с массой тис плотностью р движется в рас-
творителе, имеющем плотность р0, под действием «гравитационной» силы
тсо2/* (центробежная сила во вращающейся системе координат). Кроме того,
на частицу будет действовать сита трения и выталкивающая сила. Напра-
вление всех этих сил показано на фиг. 28. Выталкивающая сила, выражен-
ная в динах или ньютонах, равна весу жидкости, вытесненной данной части-
цей:

Выталкивающая сила = — росо2г
и, следовательно, результирующая «гравитационная» сила равна

т®2г

Таким образом, в среде с плотностью р0 частица ведет себя так, как будто
она имеет массу

т' = т^1—(4.14)

Трудность, возникающая при использовании уравнения (4.14), состо-
ит в нахождении правильного значения плотности частиц р. Предположив,
что частицы представляют собой пористые сферы, полые внутри, плотность

Фиг. 29. Схематическое изображение
распределения частиц при седиментационном равновесии.

можно было бы найти, разделив вес некоторого числа этих шаров на их пол-
ный объем. Ясно, однако, что полученная величина не соответствовала бы
нужному для нас значению р, так как р в выражении (4.14) определяется
объемом воды, вытесненной данной частицей. Однако на поверхности шара
есть отверстия, и, следовательно, объем вытесненной жидкости равен объему
сферической оболочки, а не объему всего шара. Таким образом, на самом
деле нужно определять плотность сферической оболочки. Эту величину
можно найти единственным способом — измерить объем вытесненной сфе-
рой жидкости. Вместо плотности нужно использовать величину, обратную
парциальному удельному объему. Парциальный удельный объем — это изме-
нение объема на единицу массы для бесконечно малой массы. Измерение
этой величины также сопряжено с трудностями, как мы уже видели при
рассмотрении связанной воды.

6.	Метод седиментационного равновесия. Есть два разных способа осу-
ществления опытов по седиментации. В методе седиментационного равнове-
сия исследуют распределение концентрации частиц в поле силы тяжести.
В методе скорости седиментации (разд. 7 гл. IV) измеряется средняя ско-
рость движения молекул по направлению от оси вращения. Проанализи-
руем условия, которые выполняются при седиментационном равновесии.

На молекулы действует результирующая гравитационная сила, и все
они оказались бы на дне сосуда, если бы не было броуновского движения,
или диффузии. При достаточно долгом осаждении (примерно в течение дня),
когда средняя скорость становится равной нулю, распределение молекул
в пространстве, схематически показанное па фиг. 29, становится больцманов-
ским. Обозначим через пг и п2 число молекул растворенного вещества в еди-
нице объема на расстояниях и г2 от оси вращения. Если энергия молекул
на расстояниях г± и г2 равна Е1 и Е2, то получаем
Это уравнение показывает, что распределение частиц зависит от соотноше-
ния между энергией гравитационного поля и тепловой энергией. Так как
кинетическая энергия молекул одинакова, то разность Ег—Ё2 представляет
собой разность потенциальных энергий. Разность же потенциальных энер-
гий равна работе, которую нужно совершить против результирующей силы
тяжести, т'(й2г, при передвижении частицы от г2 до г±. Таким образом,
с учетом знака, получаем

г

Ег — Ег= — т'со2тс?г = /^- (г| — г~).

Если мы подставим это значение в выражение распределения Больцмана,
то получим

«1	Г т'сй2 . 2	2x1

~ —ехр	2кТ (г2 гт) ] ,

или

111 П1 2кТ 17

(4-15)

В случае соответствия экспериментальных данных выражению (4.15) мож-
но быть вполне уверенным в том, что достигнуто равновесие. Тогда, решив
это уравнение относительно т', можно, используя (4.14), найти т. Так
как при выводе уравнения (4.15) ничего не говорилось ни о форме молекул,
ни о количестве связанной воды, молекулярный вес, полученный из этого
уравнения, не зависит от этих параметров. В этом заключается преимуще-
ство данного метода. При его использовании не требуется знать ничего,
кроме эффективной массы, так как форма молекул и количество связанной
воды влияют только на скорость достижения равновесия, но не на оконча-
тельное распределение.

Сейчас имеет смысл дать почувствовать реальные значения упомянутых
величин. Предположим, что ротор центрифуги вращается с угловой скоро-
стью 1000 рад/сек (~10 ООО об/мин) и что средний радиус равен 10 см. Сред-
нее значение центробежного ускорения го2г равно 10Б м/сек2. Так как эта
величина примерно в 104 раз превышает ускорение силы тяжести, то ее
выражают как Ю4ц. Если молекулярный вес центрифугируемого вещества
равен 10Б и (1—ро/р)=О,25, то в соответствии с расчетом, произведенным
в разд, бэтой главы, т'=0,4-10“22 кг и отношение числа частиц, находя-
щихся на расстоянии 10,0 см от оси вращения, к числу частиц на расстоя-
нии 9,8 см может быть получено из уравнения (4.15):

П<«9,8 У “2.1,38-10-23 <Эж/°К-3-102°К	0,96) лг 1,9

или

•^=6,6.

«9,8

Для этой системы концентрация меняется с расстоянием слишком быстро,
что затрудняет проведение точных измерений. При более высоких угловых
скоростях практически все частицы осядут на дно кюветы.

Большие центробежные силы, действующие на макромолекулы, с успе-
хом используются в методе седиментационного равновесия при центрифу-
гировании в градиенте плотности. Такой градиент можно получить, если
центрифугировать раствор соли с большой плотностью, скажем СзС1, до тех
пор пока не наступит равновесие, условие которого выражается уравнением
(4.15). Вследствие различных концентраций соли в верхней й нижней части
кюветы возникнет градиент плотности. Если плотность молекулы центри-
фугируемого вещества лежит между двумя крайними значениями плотно-
сти раствора, то такие молекулы будут стремиться занять в кювете положе-
ние, отвечающее минимальной энергии. Минимум энергии соответствует
положению, в котором эффективная масса, вычисляемая по уравнению
(4.14), равна нулю. В этой точке р0=р. Пик, соответствующий распределе-
нию около этой точки при больших скоростях вращения, получается очень
резким; разрешение достаточно для того, чтобы отделить ДНК, содержа-
щую изотоп азота М1Б, от нормальной ДНК с Ы14.- Месельсон, Сталь и Вино-
град [17] выращивали Е. соИ в среде, содержащей Ы15. Плотность ДНК
при этом была выше нормальной. Перенося бактерии в среду, содержащую
М14, они показали, что выделенная после этого ДНК имеет только три
фракции, отличающиеся по плотности: Ы15-ДНК, Ы14-ДНК и одна проме-
жуточная фракция. Количество Ы14-ДНК увеличивается со временем,
а количество промежуточной фракции остается постоянным. Наличие толь-
ко одной промежуточной по плотности фракции говорит о том, что макро-
молекулы ДНК не подвергаются изотопному обмену, новые же моле-
кулы строятся в виде больших фрагментов и происходит объединение
между старыми и новыми фрагментами.

7.	Метод скорости седиментации. В другом варианте седиментацион-
ного метода измеряется скорость седиментации. При этом не нужно долгое
время ждать, пока установится равновесное распределение. Вместо этого
используется тот факт, что одинаковые молекулы двигаются с одной и той
же скоростью по радиусу от оси вращения. Так как силы трения растут
с увеличением скорости, то три силы, показанные на фиг. 28, довольно
быстро уравновешиваются. В этом случае получаем

та ^1 —=

Средняя скорость равна

<4Л6)

В опыте известны и средняя скорость и ускорение. Их отношение называется
константой седиментации

Константа седиментации имеет размерность [(м/сек)/(м/сек2)] = [сек]. Зна-
чение 8=10“13 сек принято за единицу и получило название 1 сведберг. Под-
ставляя константу седиментации в уравнение (4.16) и решая его относи-
тельно т, находим:



т

1—(ео/е)'

(4.17)

Описанный нами метод применим только в том случае, когда седиментация
преобладает над диффузией, так что плотные осаждающиеся частицы дви-
гаются по направлению от оси вращения и между раствором и растворите-
лем образуется резкая граница. По мере центрифугирования диффузия
приводит к размыванию этой границы, но при этом средняя скорость по-
прежнему выражается уравнением (4.16) (так как средняя скорость диф-
фузии равна нулю).
Определение молекулярного веса из уравнения (4.17) сопряжено с те-
ми же трудностями, которые возникают при использовании для этой цели
коэффициента диффузии. Происходит это потому, что форма молекул, так
же как и количество гидратированной воды, влияет на величину силы тре-
ния. При отсутствии других данных можно опять воспользоваться сфери-
ческой моделью, приняв, кроме того, что количество гидратированной воды
равно 0,35 а на 1 а белка. Получим, как и раньше:

1,13,

1.0

где /о=6лг|С — коэффициент трения для шара. Так как в выражении (4.17)
масса прямо пропорциональна /, то молекулярный вес, полученный изме-
рением скорости седиментации, нужно делить на 1,13. Здесь влияние свя-
занной воды меньше, чем в методе, основанном на измерении коэффициента
диффузии. Проблему, возникающую в связи с отсутствием данных о форме
молекул и о количестве связанной воды, можно разрешить очень просто.
Зная коэффициент диффузии, получаем значение / и затем подставляем его
в уравнение для седиментации. Из выражения (4.9) находим

I = кТ/О.

Подставляя это значение / в (4.17), получаем
кТк
т~А[1-(е0/е)]-

(4.18)

Или, умножая обе части уравнения на число Авогадро, вместо веса отдель-
ной частицы т можно определить молекулярный вес М (если вместо посто-
янной Больцмана Л ввести газовую постоянную 7?, равную 8,3-103 дж-кг X
X моль° К):

М =-----—-----,

о[1-(е0/е)] ’

где д — по-прежнему величина, обратная парциальному удельному объему
Таблица 6

Данные по диффузии и седиментации для некоторых молекул и вирусов
(в единицах МКС)1

Молекула нли частица	1 б	5-1013 (±2%)	о - км (±5%)	Мол. вес  (±54-1 0%)	1 /о
Цитохром с 		0,707	1,9	10,1	15 600	1,29
Миоглобин		0,741	2,04	и,з	17 200	1,11
Рибонуклеаза 		0,709	1,85	13,6	12 900	1,04
Пепсин 		0,750	з,з	9,0	37 000	1,08
Г емоглобин		0,749	4,41	6,3	68 000	1,24
Уреаза		0,73	18,6	3,46	480 000	1,19
Гемоцианин 		0,738	98,9	1,38	6 600 000	1,24
Вирус кустистой карликовости . .	0,739	132	1,15	10 600 000	1,27
Вирус табачной мозаики 		0,73	193	0,53	32 000 000	3,1
Нуклеогистон		0,658	31	0,93	2 100 000	2,5

1 Молекулярный вес, найденный с помощью комбинации этих двух методов, хорошо согласует-
с я с данными, полученными из измерений осмотического давления, а также с помощью методов се-
д имеитационного равновесия и по светорассеянию.
Комбинация методов диффузии и седиментации крайне эффективна.
С помощью одного из методов можно получить только соотношение между
тремя неизвестными величинами: размером частиц, их формой и количест-
вом связанной воды. Комбинация же обоих методов может дать точное зна-

чение для размера, а также соотношение между двумя остальными величи-

нами. В табл. 6 приведены некоторые типичные данные.

Форму молекулы и количество связанной воды обычно определяют

с помощью отношения коэффициентов трения, ///о, где / — измеренный
коэффициент трения, а /0 — коэффициент трения, рассчитанный для сферы
такой же массы. Величина /7/0>1 ука-

Концентрация белка , мг/мл

Фиг. 30. Значения константы седи-
ментации для химотрипсина (7) и химо-
трипсиногена (77) при разных концен-
трациях- [19].

зывает на присутствие связанной воды
и на отклонение от сферической фор-
мы. Значения /7/0, не превышающие
1,1, можно отнести за счет связанной
воды. Более высокие значения можно
объяснить тем, что молекула имеет
эллипсоидальную форму. Молекуле
пуклеогистона теленка, например,
нужно было бы приписать отношение
осей 40: 1. На самом деле нет причин
считать форму этих молекул эллипсо-
идальной. Известно также, что форма
частицы ВТМ гораздо ближе к цилин-
дрической. Измерения константы седи-
ментации, так же как и коэффициента
диффузии, следует проводить в некото-
ром диапазоне концентраций. Экстра-
поляция к бесконечному разведению

дает величину, входящую в уравнения

(4.17) и (4.18). На фиг. 30 показана такая экстраполяция для химотрипси-
ногена, не обладающего ферментативной активностью, и доя получающе-
гося из него активного фермента — химотрипсина. Экстраполяция данных,

полученных для химотрипсиногена, приводит однозначно к величине 5,
соответствующей молекулярному весу 25 000. Для химотрипсина же.полу-

чаются различные значения 5 в зависимости от того, начинаем ли мы экстра-
поляцию от низких или от высоких концентраций. Если экстраполировать
к нулевой концентрации от концентраций, меньших 10 мг/мл, то для моле-
кулярного веса получается значение 22 000. Экстраполяция же от высоких
концентраций дает значение примерно вдвое большее. Очевидно, при
высоких концентрациях химотрипсин образует димеры.

8.	Аналитические центрифуги и оптические методы. Ротор центрифуги
можно приводить в движение потоком воздуха или масла с помощью элек-
трических моторов, а также вращающимися магнитными полями. В слу-
чае высоких скоростей, необходимых при измерении скоростей седимента-
ции, вращение ротора должно происходить в откачанной камере, чтобы
свести к минимуму нагревание. На фиг. 31 приведены фотография обычного
ротора и чертеж кюветы, в которой производится седиментация. Так как
центробежная сила направлена по радиусу, кювета сделана в форме сектора
так, чтобы оседающие частицы шли вдоль радиусов и на них действовали
только сила трения и гравитационная сила. Окошки в кювете позволяют
производить наблюдение за образцом во время центрифугирования. Такие
роторы, как изображенный на фиг. 31, могут вращаться со скоростями
вплоть до 60 000 об/мин, что соответствует 300 000 Прибор такого типа
дает разрешение, позволяющее различить молекулярные веса 20 000 и 40 000.
Положение движущейся границы можно проследить с помощью одного из
оптических методов. Конечно, эти же методы можно использовать при изме-
рении коэффициента диффузии, не вводя дополнительного осложнения,
связанного с вращением кюветы. В центрифуге можно наблюдать образец

Фиг. 31. Типичный ротор аналитической центрифуги и схема кюветы.

только в течение очень короткого промежутка времени, пока он проходит
мимо окошка, проделанного в коробке ротора. Применяемые оптические
методы основаны либо на разнице в поглощении света между раствором
и растворителем, либо на различии показателей преломления. Общие прин-
ципы и методы очень похожи на те, которые применяются в микроскопии
для получения контрастного изображения. .

Поглощение света. Предположим, что оседающие в центрифуге моле-
кулы в какой-то момент времени распределены по кювете так, как показа-
но на фиг. 32,Л. Если освещать кювету светом, который поглощается веще-
ством, то интенсивность выходящего света распределяется, как показано
на фиг. 32, Б. При использовании оптической системы, изображенной на
фиг. 32, В, с помощью линз на фотографической пластинке получается
изображение кюветы. Имея данные о поглощении света (см. гл. VI), можно
построить зависимость концентрации от положения. Получив такие снимки
для нескольких различных моментов времени, можно найти константу седи-
ментации или коэффициент диффузии. Так как белки (в которых отсутству-
ют порфириновые кольца или другие сопряженные группы) и нуклеиновые
кислоты хорошо поглощают свет только в ультрафиолетовой области, т. е.

Фиг. 32. Оптическая система, применяемая для нахождения распределения кон-
центрации вещества с помощью измерения поглощения.

А — возможная зависимость концентрации от расстояния; Б — зависимость интенсивности света,
выходящего из кюветы, от расстояния; В— схема оптической системы. Линза Б% дает изобра-
жение кюветы на фотопластинке. Входная щель лежит в фокальной плоскости линзы Бу.

при длинах волн меньше 3000 А, то оптические приборы и кюветы должны
быть сделаны из кварца. Если луч света проходит в кювете путь, равный
1 см, то для нуклеиновых кислот нужно брать концентрации порядка
20 ра/жл, а для белков — 200 ра/лгл. Некоторые данные, полученные этим
методом, показаны на фиг. 33.

Теневой метод. Целый ряд оптических методов основан на том, что пока-
затель преломления раствора больше показателя преломления растворителя.
Вследствие этого плоская волна, пройдя через среду с градиентом концентра-
ции, теряет свою плоскую форму. В области с большей концентрацией пока-
затель преломления больше, т. е. скорость света меньше и, следовательно,
фронт волны будет отставать от фронта, проходящего через область с мень-
шей концентрацией. Предположим, что седиментация или диффузия проис-
ходит в направлении оси у, и, как показано на фиг. 32, А, концентрация
меняется при перемещении вдоль этого направления. Если показатель пре-
ломления растворенного вещества пропорционален его концентрации
и коэффициент пропорциональности дп!дс не
зависит от с, то кривая зависимости п от у,
в соответствующем масштабе, будет идентична
кривой, изображающей зависимость с от у,
так как

. дп
п = п„ + -— с,
0 ос

где п0 — показатель преломления растворителя.
Плоская волна, пройдя через кювету, будет
выглядеть, как показано на фиг. 34. Для раствора
белка в воде п =1,33 и дп/дс=0,18 на 1 г!мл.
Ясно, что на фиг. 34 зависимость п от у и форма
фронта выходящей волны сильно преувеличены.
Как показывает простой анализ, наклон норма-
ли к фронту выходящей волны пропорционален
градиенту концентрации.

Горизонтальное смещение фронта волны х
в кювете толщиной I равно Ап1 или, в общем
случае, 1{дп/ду)(1у\ /. Таким образом,

Фиг. 33. Зависимость кон-
центрации от расстояния
для разных промежутков
времени при центрифугиро-
вании карбоксигемоглобина
при 115 000 § [20].

Граница с течением времени
расплывается.

тт	дх , дп , дп дс

Наклон нормали — ^ = / ~ду~ *~дс'~ду ’ т‘ е’ пРопоРционален дс/ду.

Можно легко обнаружить места с большим градиентом концентрации,
используя оптическую систему, показанную на фиг. 35. Линза превращает

А — падение плоской волны на кювету, концентрация вещества в которой
и показатель преломления меняются, как показано на графике; Б — соот-
ветствующая форма фронта выходящей волны. Стрелками показано направле-
ние нормали к фронту волны.

пучок света, выходящего из щели, в параллельный. После прохождения
через кювету плоский фронт волны приобретает такую форму, как, напри-
мер, показано на фиг. 34, Б. Те-части пучка света, в которых нормаль сохра-
нила свое первоначальное направление, такие, как а и с, попадают в фокус
линзы Ьг и, проходя дальше, дают на экране перевернутое изображение кю-
веты. Часть пучка света, проходящая через область Ъ, область максималь-
ного градиента концентрации, прошла бы ниже фокуса. Если за фокусом
линзы Тг расположить непрозрачный экран с острым краем, так называе-
мый «нож Фуко», то все отклонившиеся лучи будут отрезаны и свет от обла-
сти Ъ не попадет на экран. При использовании этой оптической системы

Ф и г. 35. Система теневой фотографии для обнаружения областей
с высоким градиентом концентрации.

Линза Ь*2 Дает изображение кюветы на экране или фотопластинке. Ножевая диа-
фрагма вырезает из изображения область Ъ. Объяснения см. в тексте.

Фиг. 36. Оптическая система, предназначенная для определения зависимости гра-
диента концентрации от расстояния.

А — расположение оптических деталей и получающееся на фотопластинке изображение; Б — на-
клонная щель в фокальной плоскости линзы Г-а- Объяснения см. в тексте.

области резкого изменения показателя преломления появляются на экра-
не в виде теней, откуда и название «теневой метод». По мере того как про-
исходит седиментация, граница движется вниз, а тень вверх. При измере-
нии коэффициента диффузии область градиентов концентрации размывается
и тень расширяется.
Специальная оптическая система, изобретенная Филпотом 118], позво-
ляет преобразовать вертикальное распределение освещенности (в преды-
дущей установке изменение наклона нормали приводит к появлению тени) в
горизонтальное отклонение светового пучка. Оптическая система при этом
отличается от предыдущей тем, что вместо «ножа» в фокальной плоскости

линзы 1.2 ставится наклонная щель и добавляется цилиндрическая линза

Т3, устанавливаемая таким образом, чтобы фокальная плоскость линзы

12 фокусировалась на экран. Схема оптической системы показана на

фиг. 36. В отсутствие нак-
лонной щели и цилиндри-
ческой линзы, на экране
получится просто перевер-
нутое изображение кю-
веты и область с боль-
шим градиентом кон-
центрации заметить не
удастся. Это объясняется
тем, что мы имеем не то-
чечный, а протяженный ис-
точник, которым в данном
случае является входная
щель. Через области а,Ъ и с
проходят пучки от различ-
ных участков щели, име-
ющие поэтому различное
направление. Изображе-

Мениск

Ф и г. 37. Результат фракционирования экстракта
Е. со11 при центрифугировании [21].

Пики 495 и 255 характеризуют частицы, содержащие
РНК и белок. Пик 8в соответствует ДНК, 5з — белку.

ния щели в пучках, про-

ходящих через область Ъ, получаемые в фокальной плоскости линзы
1.2, не будут резкими. Они будут представлять собой размытое пятно,
и в плоскости фотопластинки (экрана) область градиента концентрации
не будет видна. Цилиндрическая линза, которая фокусирует промежу-
точное изображение щели на экран, не обладает фокусирующим свойством
в вертикальном направлении, поэтому положение участков а,Ъ и с в изо-
бражении останется на прежнем уровне. Если же в фокальной плоскости
линзы 1.2 поставить наклонную щель, то лучи, проходящие через участ-
ки а, & и с, дадут на экране изображения в виде точек (р, г, /). (На-
клонная щель вырезает из каждого горизонтального изображения неболь-
шой участок, который с помощью цилиндрической линзы дает на экране
картину в виде точки.) Эта оптическая система преобразует вертикаль-
ные отклонения нормалей волнового фронта в горизонтальное отклонение

пучков.

Области, промежуточные между а, Ь и с, тоже дадут на экране изобра-
жения в виде точек, которые вместе с точками р, г, / образуют непрерывную
кривую; отклонение ее в направлении г пропорционально отклонению норма-
ли волнового фронта от горизонтали, в свою очередь пропорциональному
градиенту показателя преломления. Площадь же под этой кривой будет
пропорциональна величине концентрации.

Обычно наклонную щель заменяют непрозрачной полоской шириной
в 1,5 мм, наклон которой можно регулировать. При этом на экране полу-
чается негативное по отношению к описанному выше изображение. Такое
видоизменение описанного метода, помимо большей простоты, имеет еще
и то преимущество, что можно наблюдать интерференционные полосы, полу-
чаемые вследствие дифракции на полоске при монохроматическом освеще-
нии. Интерференционные полосы довольно резки, и их положение изме-
рить гораздо легче, чем положение широкого центрального максимума.
В этом случае можно определить константу седиментации с точностью,
превышающей 1%. Наименьшая концентрация вещества, которую можно
определять, пользуясь этим методом, составляет около 0,1%, или 1 мг
белка на 1 мл.

На фиг. 37 изображена картина, полученная с помощью описанной
установки при седиментации экстракта из Е. соИ. Несколько пиков, ско-
рость седиментации которых можно измерить, идентифицированы как опре-
деленные компоненты Е. соИ. Сюда входят: ДНК, рибосомные частицы,
содержащие РНК и белок, а также белковая фракция. ДНК дает довольно
острый пик, так как значение коэффициента диффузии для ее молекул
очень мало.

9.	Вращательная диффузия и двойное лучепреломление. Коэффициент
диффузии и константа седиментации зависят от размера и формы молекулы,

Ф и г. 38.

А — система координат, используемая при определении коэффициента вращатель-
ной диффузии; Б — вытянутый эллипсоид вращения.

а также от количества связанной ею воды. Однако, как мы уже видели
из табл. 4 и 6, обе эти константы не очень чувствительны к изменениям
молекулярных параметров. Поэтому с их помощью трудно получить данные
о форме таких длинных и тонких молекул, как миозин или ДНК- Вместе
с тем коэффициент вращательной диффузии очень сильно зависит от длины
тонких вытянутых молекул. Этот коэффициент 6 определяется тем же спо-
собом, что и коэффициент линейной диффузии в выражении (4.8). Рас-
смотрим конус, изображенный на фиг. 38, А, образующая которого состав-
ляет угол <р с осью х. Если число молекул, направления осей которых лежат
между углом <р и <р+Д<р, равно с1п, то плотность их на единицу телесного
угла определяется выражением р(<р)=дп/д<р; тогда скорость изменения чис-
ла молекул, у которых направление осей лежит внутри конуса, равна

(4-19)

Знак минус, как и раньше, отражает тот факт, что диффузия происходит
по направлению к области меньшей концентрации. Коэффициент вращатель-
ной диффузии 6 имеет размерность [сек'1].

Так же как и для линейной диффузии, коэффициент вращательной диф-
фузии зависит от размеров и формы молекулы. Можно показать, что для
тонкой длинной молекулы, которую можно представить себе как вытянутый
эллипсоид (фиг. 38), значение коэффициента вращательной диффузии для
вращения вокруг оси Ъ выражается формулой

дп/сИ = — 6 4^-.

ЗкТ

6	16лт]а3


в которой буквенные символы имеют свои обычные значения. Размер малой
оси Ъ входит в эту формулу только под знаком логарифма, и поэтому при
большом изменении Ъ величина 0Ь меняется лишь незначительно. Приведем
значения 6 для некоторых биологически важных молекул:

Молекула

6, сек-1

Гемоглобин

ВТМ

ДНК

Миозин

6-106

5,5-102

37

7

Из этих данных следует, что величина 6 для разных видов молекул
очень различна. Такое большое изменение этой величины по сравнению

Направление

распростране-
ния света

Направление
поляризации света
после прохождения
через поляризатор

Направление поляризации
света,прошедшего через
анализатор

Ф и г. 39, Взаимная ориентация поляризатора, направления осей молекул
и анализатора.

Молекулы расщепляют электрическое поле падающего света на две компоненты: Вц
н В | г

с коэффициентом линейной диффузии объясняется тем, что значение 0 обрат-
но пропорционально кубу линейного размера молекулы, а в выражение
для Е) эта величина входит в первой степени. Таким образом, с помощью
коэффициента вращательной диффузии можно определять длину молекулы.
При этом точно так же, как в рассмотренных ранее методах, необходимо
выбрать известные граничные условия или приложить к молекулам ориенти-
рующую силу. Преимущественную ориентацию совокупности длинных тон-
ких молекул можно обнаружить, освещая образец поляризованным светом
и измеряя поглощение или показатель преломления света для разных напра-
влений поляризации. Оба эти метода будут детально рассмотрены
в гл. VII и XII, однако здесь мы все-таки приведем краткое описание этой
методики.

Предположим (фиг. 39), что некоторое число молекул ориентировано
таким образом, что их оси составляют угол 0 с осью х. Падающий на моле-
кулы свет, поляризованный в направлении оси у, разделится на две ком-
поненты: Е|, и Еу. Это объясняется тем, что показатель преломления имеет
разные значения для колебаний в этих направлениях. Известно, что ориенти-
рованный образец обладает двойным лучепреломлением. Если электричес-
кий вектор падающего электромагнитного поля равен Ео, то Е\\=Е0 соз 0
и Е±=Е$ 51П 0. Свет, прошедший через ориентированные молекулы, должен
затем пройти через анализатор, который установлен таким образом, чтобы
пропускать только компоненту, поляризованную по направлению оси г.
Если угол 0 равен нулю или ~, то расщепления света на две компоненты
не произойдет; в этом случае свет, падающий на анализатор, будет поля-
ризован в направлении оси у, а через анализатор свет не будет проходить.
При всех других значениях углов ориентации некоторое количество све-
та пройдет через анализатор. В случае неполной ориентациии углы
6 = 0 и 6 = 4г будут соответствовать минимальной проходящей энергии.

Лучше всего ориентировать молекулы под действием электрического
поля или в потоке. Измерение двойного лучепреломления показывает,
что под действием электрического поля молекулы ориентируются в гораз-

Ф и г. 40. Направления сил, действующих на длинную молекулу
в потоке с градиентом скорости йъ/йу.

А — скорость течения жидкости относительно неподвижного наблюдателя; Б —
скорость течения жидкости относительно центра молекулы, движущейся со сред-
ней скоростью потока. При рассмотрении вращения относительно центра масс оба
описания эквивалентны.

до меньшей степени, чем в потоке. В жидкости, слои которой движутся
с разными скоростями, длинные тонкие молекулы вследствие действия
на них крутящего момента стремятся вытянуться по направлению потока.
Как показано на фиг. 40, на разных концах молекулы (по отношению
к центру масс) жидкость движется в противоположных направлениях.
Очевидно, что крутящий момент зависит от градиента скорости и от длины
молекулы. Даже без детального математического анализа ясно, что распре-
деление молекул по углам, образуемым их осями с направлением потока,
будет зависеть от градиента скорости и от коэффициента вращательной
диффузии. Чем больше градиент скорости, тем ближе будет наиболее веро-
ятное направление оси длинной тонкой молекулы к направлению потока.
Точное распределение вокруг этого направления можно найти, решая
уравнение для вращательной диффузии, аналогичное уравнению (4.12).
Получение явного решения завело бы нас слишком далеко в сторону.

Есть два способа создания градиента скорости. В первом раствор
прогоняется через капиллярную трубку. Скорость течения жидкости равна
нулю у стенок и максимальна в центре капилляра. Однако, поскольку
градиент при этом меняется (он равен нулю в центре и максимален у сте-
нок), такой способне очень удобен в аналитической работе. Гораздо лучше
использовать два коаксиальных цилиндра, вращающихся один относительно
другого. Если диаметры цилиндров отличаются не сильно, то градиент
скорости близок к постоянному. Схема такой установки показана
на фиг. 41, А. При скорости вращения 100 об/мин получается градиент
скорости около 20 сек-1. В зависимости от градиента скорости и коэффици-
ента вращательной диффузии молекулы устанавливаются под углом % к оси
вращения, как показано на фиг. 41, Б.

Если раствор поместить между скрещенными поляризатором и анали-
затором, то минимум интенсивности света будет наблюдаться в тех участках,
где наиболее вероятное направление осей молекул совпадает с направлением
плоскости поляризации либо поляризатора, либо анализатора. Из фиг.
41, В легко установить, что наиболее вероятный угол между осью молекулы

Фиг. 41. Двойное лучепреломление в потоке.

А — схема установки; Б — средняя ориентация молекул; В — картина, получаемая
прн наблюдении через скрещенные поляризатор и анализатор- Объяснения см. в тексте.

Ф и г. 42. Среднее направление
ориентации молекул ДНК при
разных градиентах скорости [22].

и направлением потока равен углу между плоскостью поляризации падаю-
щего света и направлением на минимум интенсивности. По мере увеличе-
ния градиента скорости угол % уменьшается. На фиг. 42 показано влия-
ние увеличения градиента скорости на ориентацию молекул ДНК в солевом
растворе. Вследствие того что ДНК во
взятом образце не была гомогенна, а также
потому, что при высоких градиентах ско-
рости температура растет, угол % отличен
от нуля. Однако, поскольку распределение
числа молекул по углам <р (см. фиг. 41, Б)
зависит от и 6 (формулу, описывающую

, (IV
эту зависимость, мы не приводим) и
нам известно, подобные измерения позво-
ляют получить значения коэффициента
вращательной диффузии.

Произведя измерения при разных зна-
чениях температуры и вязкости, можно
определить степень жесткости молекул

изучаемого вещества. Действительно, в том случае, если гибкая частица
имеет форму беспорядочного клубка, можно ожидать, что при увеличении
градиента скорости ее длина будет увеличиваться и, следовательно, значе-
ние коэффициента вращательной диффузии будет уменьшаться. При изу-
чении растворов вируса табачной мозаики, например, выяснилось, что.его
частицы ведут себя как жесткие палочки. Эта же особенность характерна,
по-видимому, и для молекул двухцепочечной ДНК.

10.	Заключение. Мы детально рассмотрели три метода, с помощью кото-
рых можно определить некоторые общие физические свойства макромолекул.
Эти же данные могут быть получены и другими методами, например методом
рассеяния света, измерением вязкости и диэлектрической постоянной.
Используя данные, полученные из разных источников, мы можем достаточно
хорошо представить структуру молекулы в целом. Так, например, мы зна-
7 Заказ № 1168
ем, что многие белковые молекулы имеют форму шара с радиусом от 15 А
(соответствующий молекулярный вес равен примерно 11 000) до 70 ./(.(моле-
кулярный вес —106). Другие молекулы можно с гидродинамической точки
зрения рассматривать как тонкие длинные эллипсоиды. Все эти сведения
существенны для понимания роли макромолекул в живом организме, но
они далеко не достаточны. Необходимо выяснить внутреннюю структуру
этих сферических и эллиптических агрегатов, прежде чем высказывать
предположения о том, как они работают. Для иллюстрации возникающих
трудностей рассмотрим молекулу гликогена. Она состоит из цепочек моле-
кул сахара, которые соединены таким образом, что конец одной связан
с началом другой, либо таким образом, что при соединении образуются боко-
вые ветви. Эта молекула напоминает дерево, и ее вряд ли можно назвать
сферической. Однако по мере увеличения числа и длины ветвей цепочки
становятся упакованными более плотно и форма молекулы приближается
к сферической, так что для больших молекул гликогена только что
использованное приближение, вероятно, вполне применимо.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	В ц 1 1 Н. В., Рку81са1 В1оскепп81гу, 2пй ей. \\Шеу, И. У., 1951.

2.	С о к п Е. 5., Е й з а 1 1 .1. Т., Рго1е1пз, Агш’по Ас1йв, апй РерНйев, Ке1пко1й,
И. У., 1943.

3.	6 1 а 8 в е г О., Ей., Мей1са1 Ркув1св, Уеаг Воок РпЬИвкегв, 1пс., СЫса§о, 111.
Уо1. 1 (1944); Уо1. 2 (1950).

4.	ИЬег Г. М., Ей., В1'оркув1са1 Незеагск Ме!койв, 1п1егзс1епсе, И. У., 1950.

5.	НацгоиИ? КР-, Скет1в1гу апй В1о1о§у о! Рго1е1п8, Асай. Ргев8, И. У., 1950.

6.	8уейЬег§ Т., Рейегвеп К- О., Тке ИИгасепЦПи^е, Ох(огй ИпАегзНу
Ргевв, 1940.

7.	ОиНгеипй Н., «РгорегПев о/ 8о1иНоп8 о! Бащс Мо1еси1е8», Рго§. В1оркув.,
1., 1 (1950).

8.	8 а й г о п С., «Ме!койв ей Ве1егппп1п§ 1Ье Рогт апй В1теП81опв ей РагНскз
1п 8о1иНоп, А СгШса1 8игуеу», Рго§. Вюркуз., 3, 237 (1953).

9.	XV е Ь е г С., «РсйаНопа! Вготетйап МоПоп апй РсйапхаНоп ей 1ке Р1иоге8сепсе
о! 8о1пНоп8», АЙV. Ргсйет Скет., 8, 416 (1953).

10.	О г о 5 1 1 п § Б. й., «Меазнгетеп! апй 1п1егрге1а11оп ей ВЩиз1с1П СоеН1с1еп(в
о! Ргсйешз», Айу. Ргсйет Скет., 11, 430 (1956).

11.	Р о 1 1 а г й Е. С., Тке Ркуз1сз ей ХЛгизез, Асайепис Ргезз, И. У., 1953

12.	8 р г 1 п § а 11 Н. В., ТЬе 81гис1нга1 Скет1з1гу ей Ргсйешв, Асай. Ргез8, И. У., 1954.

13.	Иогтап А., Е е 1 й й. А., «Е1ес1пс В1геГпп§епсе 81цй1ез ей 1ггай1а1ей Веоху-
г1Ьопис1е1С Ас1й», Агск. В1оскет. Вюркуз., 71, 170 (1957).

14.	МоИШ XV., Р 1 I 1 8 В., К 1 г к XV о о й й., «СгШдие ей 1ке Ткеогу ей ОрНса!
АсИуйу о! Не11са1 Ро1утегз», Ргос. ИаБ Асай. 8сБ, 43, 723 (1957).

15.	8 1 а с еу К- А., Б1§Ы 8саНепп§ ш Ркузюа! Скет1з1гу, Асай. Ргевз, И. У., 1956.
16. Е й б а 1 1	й., XV у т а п й., В1оркуз1са1 Скет1з1гу,	Асайеппс Ргезв,	И.	У.,	1958.

17.	М е в е 1 в	о п, 8 I а к 1, V 1 п о § г а й.,	Ргос.	№1.	Асай.	8сБ,	43,	581	(1957).

18.	Р к I 1 р о	1, ИаШге, 141, 283 (1938).

19.	8 ау е г I,	й. В1о1. Скет., 179, 655 (1949).

20.	8уейЬег§, М1ско1з, й. Ат. Скет. 8ос., 49, 2920 (1927).

21.	8 с к а с к т а п Н. К-, Р а г й е е А. В., 81 ап!ег К. V-, Агск. В1оскет
В1орку8., 38, 245 (1952)

22.	8ск кап йег Н., С е г I К., Не1у. Ск1т. Ас1а, 34, 436 (1951).
Глава V

Р-ЕНТГЕН0С7РУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ
БИОПОЛИМЕРОВ

. 1. Введение. В предыдущей главе мы говорили об определении разме-
ров и формы больших молекул. Как было показано опытами по седимента-
ции и диффузии, молекулы белка имеют приблизительно сферическую или
эллипсоидальную форму с размерами около 30—200 Л. Исследование двой-
ного лучепреломления показывает, что молекулы ДНК имеют вид длинных
и тонких нитей. Однако такие эксперименты не дают никакой информации
относительно внутренней структуры макромолекул, взаимного располо-
жения их составных частей и удерживающих их связей. Расположение
отдельных атомов в молекуле можно изучать двумя методами. Один из них—
химический анализ, с помощью которого установлено, что белки, например,
построены из аминокислот, связанных между собой полипептидными свя-
зями, а молекула ДНК относится к полинуклеотидам (см. гл. II). Типичный
белок обладает структурой вида

К1

С

о
н II Кз]
МНС с

+н3лнс с мнсоо-
II к2 н
о

где К1, К2 и т. д.— боковые цепи, образованные различными аминокис-
лотами (см. стр. 27).

У некоторых белков, например у инсулина и рибонуклеазы, при помощи
метода, впервые предложенного Сэнджером, удалось определить порядок
следования аминокислот в полипептидной цепи. Метод Сэнджера заклю-
чается в том, что белки расщепляют на фрагменты различными путями,
анализируют хроматографически получающиеся в каждом случае фрагменты
и затем на основании результатов анализа умозрительно синтезируют
из этих фрагментов первоначальную молекулу. Определенный таким обра-
зом порядок расположения аминокислот в молекуле инсулина показан
на фиг. 43, а структура рибонуклеазы — на фиг. 135. Однако свойства
макромолекулы определяются не только порядком следования отдельных
ее фрагментов. В гл. VI и VIII на примере реакций антитело — антиген,
а также специфических свойств ферментов будет показано, что не менее
существенна и пространственная конфигурация таких молекул. Но даже
в тех случаях, когда известен порядок следования аминокислот в полипеп
тидной цепи или нуклеотидов в цепи ДНК, мы еще не всегда имеем пред-
ставление о конфигурации этих цепей. Установить относительное располо-
Гли
Илей

Вал

Глу МН.
Цис
Нис
Тре
Сер
Илей
Цис

8

Лей

Тир
Гл у
Лей

Гли

Асп пн2

Тир
Цис

Асп мНа

8"3

- - Фея

— Вал

- - Аса МН2
- - Глу МН2
--Гис

-- Лей

Сер

-- Гис
- - Лей

-- Глу
- - Ала
- - Лей
- - Тир
--Лей
— Вал
— Цис
- - Гли
- - Глу
- - АрГ
— Гли
- - Фен
- - Фен
- - Тир
-- 1ре
- - Про
-- Лиз
-- Ала

Фиг. 43. Расположение амино-
кислот в молекуле инсулина.

8—8

жение атомов в молекуле, т. е. конфигурацию, удается посредством второго
метода изучения молекулярных структур — рентгеноструктурного анализа.

Можно представить себе три структурных уровня таких больших
молекул, как белки. Последовательность расположения отдельных фраг-
ментов полимерной молекулы, например аминокислот в полипептидной
цепи, называют первичной структурой. Термин вторичная структура
относят к относительной ориентации соседних фрагментов цепи, например
к закручиванию полипептидной цепи в
а-спираль. Третичная структура связана
с относительным расположением целых
цепей, обусловливающим внешнюю форму
частиц. Наилучшим методом определения
вторичной и третичной структуры явля-
ется рентгеноструктурный анализ.

В простых случаях, например при
исследовании хлористого натрия, можно
без особого труда точно установить поло-
жения атомов в кристаллической решетке.
В случае более сложных кристаллов, в
частности кристаллов белка, это, конечно,
не так; но и здесь рентгеноструктурный
анализ дает все же значительно больше,
чем любой другой метод.

Для исследования биологических
структур могут быть использованы раз-
личные явления, наблюдаемые при вза-
имодействии рентгеновского излучения
с веществом, а именно поглощение, рас-
сеяние и дифракция рентгеновских лучей,

а также инактивация биологических объектов под их влиянием.

Последний метод подробно обсуждается в гл. XI. Первый метод, осно-
ванный на том, что коэффициент поглощения рентгеновских лучей при
постоянной длине волны быстро меняется с атомным номером (или с длиной
волны при постоянном атомном номере), позволяет определять атомный
состав поглощающего материала. Поскольку длинноволновое рентгенов-
ское излучение сильно поглощается, можно надеяться, что рентгеновские
микроскопы будут давать хорошие контрастные изображения. Однако
анализ этой методики выходит за рамки данной книги. Читателей, инте-
ресующихся этим вопросом, мы отсылаем к обзорной статье Энгст-
рома [3].

В методах рассеяния и дифракции используются волновые свойства
рентгеновского излучения. Длины волн в этом случае имеют порядок атом-
ных размеров (~1А), т. е. малы по сравнению с размерами интересующих
нас молекул. Рентгеновские лучи, рассеиваемые атомами, входящими
в состав молекулы, интерферируют и дают картину, на которой положения
и интенсивности максимумов зависят как от положения атомов в молекуле,
так и от взаимного расположения молекул. Если молекулы расположены
хаотически, как, например, в разведенных растворах, то рассеяние зависит
в основном от их размеров и формы. Зависимость рассеяния от внутренней
структуры молекул в этом случае практически исчезает.

Рентгеноструктурный анализ этого типа мы в дальнейшем рассмат-
ривать не будем и перейдем к дифракции рентгеновских лучей — явлению,
наблюдаемому- в случае упорядоченного расположения молекул.
В настоящее время дифракция рентгеновских лучей широко исполь-
зуется для анализа биологических систем, ибо улучшилась техника выра-
щивания хороших кристаллов, появились новые экспериментальные при-
емы, помогающие определять структуры, и созданы быстродействующие
вычислительные машины, упрощающие анализ данных. В идеальных усло-
виях дифракция рентгеновских лучей позволяет определить местополо-
жение всех атомов, за исключением атомов водорода, обладающих слиш-
ком малой рассеивающей способностью. Но информация относительно
атомов водорода может быть получена с помощью инфракрасных спектров
(см. гл. VII),

2.	Получение монохроматического пучка рентгеновских лучей. Рент-
геновское излучение возникает в результате торможения быстрых элетронов
в каком-либо веществе, обычно в металле. Спектр рентгеновского излучения

Фиг. 44, Механизм возникновения характеристического рент-
геновского излучения в меди.

Последовательные стадии процесса обозначены (1), (2), (3).

состоит из двух частей — сплошной, возникающей в результате (клас-
сического) торможения электрона, и характеристической, зависящей
от уровней энергии атомов тормозящей среды. Механизм возникновения
характеристических линий меди схематически изображен на фиг. 44. Как
видно из схемы, падающий электрон в результате неупругого столкновения
с атомом меди может выбить электрон из внутренней или, как ее обычно
называют, К-оболочки атома. На это место может перейти один из элек-
тронов, находящихся на внешних оболочках. При этом электрон теряет
энергию АЕ, которая переходит в энергию излучаемого фотона^частоты т,
причем эти величины связаны соотношением

АЕ = /гт.

Вводя длину волны фотона X и скорость света с, написанное соотноше-
ние можно переписать в виде

» _ с _ кс

Излучение с длиной волны, соответствующей переходу с Е-оболочки на
К-оболочку, называют Ка-линией. Если переход осуществляется с 7И-обо-
лочки, то аналогичная величина называется /Ср-линией. Е-серия соответ-
ствует переходам на /.-оболочку с более высоких уровней. Изменения
энергии для переходов /.-серии меньше соответствующих изменений для
К-серий, поэтому первое излучение имеет большую длину волны, чем второе.
Например, для меди длины волн линий /.-серий равны примерно 13А,
а К-серий —1,4 А.
Излучение, соответствующее Ка-линиям меди, в самой меди сильно
не поглощается, так как невозможно переместить /(-электрон на целиком
заполненную Л-оболочку. Однако поглощение может происходить за счет

выбивания электронов из и более высоких оболочек. Фотоны рентгенов-

Фиг. 45. Спектр поглощения рент-
геновского излучения в меди.

Указаны длины волн некоторых линий ис-
пускания.

ских лучей поглощаются лишь в том
случае, если их энергия превышает
энергию связи какого-либо из атомных
электронов. Все процессы, связанные
с дальнейшей судьбой энергии погло-
щенных рентгеновских лучей, будут
детально обсуждаться в гл. X, а для
понимания материала этой главы нужно
знать лишь соотношение

‘о

связывающее интенсивности падающего
(/0) и прошедшего (/) через слой ве-
щества толщиной х излучения. Вели-
чина [1, называемая коэффициентом
поглощения, для заданного вещества
зависит от длины волны и атомных
характеристик этого вещества. Зави-

симость коэффициента поглощения от
длины волны падающего излучения показана на фиг. 45, из которой

видно, что спектр поглощения явно отличается от спектра испускания.

Алина волны, А

Ф и г. 46. Относительная интенсивность рентгеновского излу-
чения различных длин волн, испускаемого при бомбардировке
меди электронами с энергией 30 кэв.

1 — нефильтрованное излучение; II — излучение, прошедшее через нике-
левый фильтр (Д-край 1,48 А); III — излучение, прошедшее через ко-
бальтовый фильтр (Д-край 1,60 А). В рамке показана монохроматическая
часть спектра, выделяемая сочетанием никелевого и кобальтового фильтров.

Длины волн, при которых коэффициент поглощения резко меняется, носят
название краев поглошения. Фотоны рентгеновских лучей, длины волн
которых лежат слева от /(-края, обладают энергией, достаточной для выби-
вания электрона из К-оболочки, те же фотоны, длины волн которых нахо-
дятся справа, обладают слишком малой энергией, чтобы ионизовать эту
оболочку.

Аналогичная ситуация имеет место и для других краев поглощения,
что дает возможность получать- почти монохроматические пучки рентге-
новских лучей путем соответствующего подбора фильтров. А-край у никеля
лежит при 1,48 А, поэтому никелевый фильтр пропустит Ка-линию меди
и сильно поглотит /Ср-линию. Следующим элементом периодической таб-
лицы является кобальт, у которого /С-край лежит при 1,60 А, следовательно,

Фиг. 47. Схема установки для получения коллимированного пучка
рентгеновских лучей.

1 — нить; 2 — анод; 3 — тонкое окошко из фольги; 4 — фильтр; 5 — свинцовый
коллиматор; 6 — исследуемый кристалл; 7 — экран.

этот элемент будет сильно поглощать обе /(-линии меди. Можно так подо-
брать толщины фильтров из этих двух металлов, что разность их пропус-
каний будет представлять собой монохроматическую линию — Ко.-линию
меди. На фиг. 46 изображен спектр испускания меди до и после фильтра.
Схема установки, на которой получают коллимированный пучок монохро-
матических рентгеновских лучей для исследования кристаллов, представ-
лена на фиг. 47.

3.	Дифракция рентгеновских лучей. Вскоре после открытия рентге-
новских лучей Лауэ, Фридрих и Книппинг (1912) показали, что картину
дифракции рентгеновских лучей можно анализировать исходя из того,
что в каждой точке дифракционной картины интенсивность равна сумме
интенсивностей лучей, дифрагированных на отдельных атомах или рас-
сеивающих центрах. Если рентгеновское излучение падает на два рассеи-
вающих центра А и 5, то наблюдаемая интенсивность рассеянного излуче-
ния будет зависеть от величины результирующего электрического поля
в месте наблюдения. Интенсивность 1 пропорциональна (Ел+Ев)2- Если
разность хода между рассеивающими центрами и некоторой точкой экрана
равна целому числу длин волн, то возникает интерференционный максимум.
При наличии большого числа рассеивающих центров результирующую
интенсивность можно записать в виде I = (^.Е*)2, где Ег — поле рассеянной
волны, создаваемой Ам центром. В качестве простого примера рассмотрим
рассеяние от ряда одиночных атомов (одномерная решетка), расположенных
параллельно фронту волны падающего рентгеновского излучения (фиг. 48).

В этом случае можно считать, что каждый атом является источником
волн, испускаемых во всех направлениях. Эти волны могут интерферировать.
Для того чтобы в направлении, характеризуемом углом <р, возникли интер-
ференционные максимумы, надо, чтобы разность хода волн, идущих от сосед-
них атомов, равнялась целому числу длин волн. Если Ь—расстояние между
атомами, то это условие можно записать в виде

&зш<р = Ы,, к —0, 1, 2___	(5.1)

При заданных Ь и X только определенные углы удовлетворяют этому соот-
ношению.

Анализировать подобным же образом трехмерную совокупность рас-
сеивающих центров было бы очень сложно. Способ, сильно упрощающий

Ф и г. 48. Дифракция рентгеновских лучей на одно-
мерной атомной решетке.

решение этой задачи, был найден Брэггом. Он предложил трактовать
получающуюся картину как результат отражений пучка рентгеновских
лучей от совокупностей атомов, лежащих в параллельных плоскостях

Фиг. 49. Схема, поясняющая вывод закона Брэгга.

(фиг. 49). Как и в предыдущем случае, для возникновения интерферен-
ционных максимумов разность хода волн, отраженных от соседних пло-
скостей, должна быть равна целому числу длин волн. Из схемы легко видеть,
что разность хода в этом случае равна 2Й 5Ш 0 и условие Брэгга формально
выглядит так же, как и (5.1):

пХ = 2б/зтО, п = 0, 1, 2,___	(5.2)

Несмотря на внешнее сходство, уравнение (5.2) имеет совсем иной
смысл, чем (5.1). Разница состоит в том, что угол 0 (см. фиг. 49) есть угол
отражения, а не рассеяния, как <р. Поэтому когда плоскости кристалла
определенным образом ориентированы относительно падающего пучка,
этот угол фиксирован. Если произвольно выбрать кристалл, источник
монохроматических рентгеновских лучей и угол 0, то в общем случае интер-
ференционные максимумы будут отсутствовать, ибо X, й и 0 будут фикси-
рованы независимо друг от друга. Для того чтобы дифракционные макси-
мумы возникали, можно либо использовать немонохроматическое излу-
чение, либо вращать кристалл. В первом случае в сплошном спектре всегда
найдутся такие длиды волн X, которые на данном кристалле (фиксирован-
ные й и 0) будут удовлетворять условию (5.2), однако для сложных решеток

чающегося кристалла.

Ось вращения перпендикулярна плоскости чертежа. Изображен одни набор
плоскостей.

анализ подобной дифракционной картины, называемой лауэграммой, невоз-
можен. Во втором случае при вращении кристалла (на фиг. 50— вокруг
оси, перпендикулярной плоскости чертежа) угол 0 будет меняться в широких
пределах; в частности, он будет принимать значения 6,, 02,... (называемые
брэгговскими углами), которые обращают (5.2) в равенство при и — 1,2...,
в результате чего появляются дифракционные максимумы. На фиг.
50 в целях упрощения изображен только один набор плоскостей. Как упо-
миналось выше, в кристалле имеется ряд различных наборов плоскостей
каждый из которых будет давать свои дифракционные максимумы. Из урав-
нения (5.2) видно, что малым значениям д. соответствуют большие углы.
Так как наибольшее значение зт 0 равно 1, наименьшее расстояние между
кристаллическими плоскостями, при котором будет возникать интерферен-
ция, определяется равенством

Ямин— 2 •

Если в качестве монохроматического излучения используется Ка-линия
меди, то б/МИ11 = 0,7 А.

4.	Структура кристалла и элементарная ячейка. Кристалл представляет
собой упорядоченную трехмерную систему, состоящую из атомов, молекул
или групп частиц. Наименьшая структура, сохраняющая все свойства
данного кристалла, называется элементарной ячейкой. Таким образом,
можно сказать, что кристалл построен из упорядоченно расположенных
элементарных ячеек. На фиг. 51 изображены элементарные ячейки некоторых
двумерных систем и прямоугольной трехмерной системы.
Понятие элементарной ячейки важно для рентгеноструктурного ана-
лиза по следующим причинам:

1.	Положение максимумов интенсивности определяется размерами
элементарной ячейки.

2.	Интенсивность максимумов зависит от распределения электронов
в элементарной ячейке.

3.	Угловые размеры максимумов определяются степенью ориентации
элементарных ячеек и числом элементарных ячеек, составляющих кристалл.

В табл. 7 приведены размеры некоторых элементарных ячеек кристал-
лов белка. Эти размеры, которые определяются методами, описанными
в следующем разделе, можно использовать для вычисления точных зна-
чений молекулярных весов. Для этого по известным размерам и плотности

Фиг. 51. Элементарные ячейки двумерной (Л) и трех-
мерной (5) решеток.

находят массу элементарной ячейки. Затем, пользуясь приближенным
значением молекулярного веса, найденным при помощи других методов,
например из опытов по седиментации и диффузии, определяют число молекул
в элементарной ячейке и точную массу молекулы. Умножая последнюю
на число молекул в 1 моль (число Авогадро, равное 6,02-1023), получают
точное значение молекулярного веса.

В случае влажных кристаллов при подобных расчетах требуется знать,
какую часть их массы составляет вода. При определении молекулярных
весов можно также использовать и обезвоженные кристаллы, однако полу-
чаемые при этом результаты обычно менее точны, чем в предыдущем случае.

Как было показано выше, при анализе дифракционной картины мы
исходим из того, что дифракцию рентгеновских лучей на кристаллах можно
трактовать как результат отражения лучей от наборов плоскостей кристал-
лической решетки. Таких наборов в кристалле может быть очень много.
Ориентация каждого из них по отношению к падающему пучку определяется
тем, что угол между отраженным лучом и продолжением падающего равен
20 и плоскости ориентированы так, что угол между плоскостью и падающим
лучом равен 6 (см. фиг. 49). Если число атомов в таком наборе плоскостей
велико, интенсивность отраженного излучения в максимуме будет высокой;
в случае же малого числа атомов дифракционный максимум будет практи-
чески ненаблюдаем. Выберем одну из вершин элементарной ячейки (скажем,
точку 0 на фиг. 51) за начало координат, а три ребра, пересекающиеся
в этой точке, за оси координат. Тогда положение любой кристаллографи-
ческой плоскости можно определить по точкам пересечения ее с осями
а, Ь и с (см фиг. 51).

Таблица 7

Размеры элементарной ячейки [18]

Вещество	а	Ь	С	₽ град.	Число молекул в элемен- тарной ячейке	Молеку- лярный вес
Инсулин сухой 		49,2 А	57,6 А	39,5 А		4		.
влажный .	44А	51,4А	30,4 А		—	—
Химотрипсин сухой			49,6 А	67,8А	66,5 А	102°	4	—.
влажный		45А	62,5 А	57,5 А	112°	—	21 500
Г емоглобин  сухой . .	. .	109 А	63,2 А	54,2 А	111°	2	—
влажный		102А	56А	49А	134°		66 700
Рибонуклеаза сухая . .	30,9 А	38,8 А	54,1А	106°	2	13 000
влажная	29.1А	30,1 А	51,0А	114°	—	—

а I) с	1	/	/

Эти точки определяются координатами и у , где п, к, I — целые
числа, называемые миллеровыми индексами данной плоскости; каждый
набор кристаллографических плоскостей может быть представлен соответ-
ствующим набором индексов. Плоскости, параллельные заданной оси,
например оси с, пересекают эту ось в бесконечности, и поэтому такие пере-

сечения обозначаются индексом I = 0. Расположение некоторых кристал-
лографических плоскостей показано на фиг. 52. Читателю предоставляется
самому показать, что отражения от набора плоскостей (2Л2Л2/) идентичны
отражениям от плоскостей (ИМ) при и = 2.

У системы параллельных плоскостей с данными индексами задано
не только расположение их в пространстве, но и расстояние с1 между плос-
костями. Например, для кубического кристалла

1_ к? м

Д2 — а2 + {,2 + с2 •

(5-3)

Поскольку брэгговские углы определяются расположением плоскостей
и расстоянием между ними, размеры ячейки однозначно определяют поло-
жение максимумов интенсивности на дифракционной картине.

5.	Слоевые линии и поликристаллы. Выше были получены два соотно-
шения, связывающие размеры кристаллической ячейки и направления,
в которых наблюдаются дифракционные максимумы. Первое соотношение
(5.1) определяет вертикальное отклонение <р лучей, дифрагирующих на одно-
мерной решетке с постоянной И. Второе уравнение (5.2) связывает полное
угловое отклонение луча, 20, с расстоянием между плоскостями д. Для
заданной длины волны и расстояния Ъ все максимумы, определяемые зако-
ном Брэгга пк = 2<Дт 0, должны лежать на конических поверхностях
Фиг. 52. Расположение некоторых кристаллографических плоскостей с различ-
ными индексами (Ик1).

В плоскостях с большими значениями (НкП плотность фатомов меньше.
§1п <р= сопз( (см. фиг. 48). Таким образом, дифракционные максимумы,
получаемые при вращении кристалла вокруг оси, параллельной од-
ному из ребер ячейки, лежат на параллельных линиях, называемых

Фиг. 53. Дифракционная картина для кристалла,
вращающегося вокруг оси, параллельной одному из
ребер элементарной ячейки.

Вертикальное отклонение слоевых линий задается углом Ф,
а отклонение различных дифракционных максимумов —углом 20.

слоевыми линиями (фиг. 53). Вертикальное отклонение этих линий задается
кк т-г

углом ат фл= -у  Поэтому измерение расстояния между линиями поз-

воляет найти один из размеров ячейки — Ь.

проведенные при вращении кри-
сталла вокруг осей, параллельных
ребрам а и с, позволяют полно-
стью определить размеры элемен-
тарной ячейки. Если кристалл по-
ворачивать вокруг оси, непарал-
лельной ребру ячейки, то слоевые
линии на экране не будут перпен-
дикулярны оси вращения.

Вместо вращения кристалла
вокруг осей, параллельных ребрам,
можно использовать образец, состо-
ящий из множества беспорядочно
расположенных кристаллов, т. е.
кристаллический порошок. Каждый
из мелких кристаллов дает отра-
жение, если для него выполнено

Аналогичные измерения,

Ф и г, 54. Дифракционная картина для
кристаллического порошка.

условие Брэгга пЛ=2г/зт 6. Как

уже указывалось ранее, большая часть кристаллов вообще не "будет
давать никакого отражения. Однако при условии, что число их

достаточно велико, все же найдутся и такие, которые будут образовывать

нужные углы с падающим пучком и, следовательно, появятся дифракцион-
ные максимумы. Вследствие того что расположение кристаллов беспоря-
дочно, дифракционная картина будет такой, как если бы слоевые линии
вращали вокруг оси пучка, т. е. она будет состоять из концентрических ок-
ружностей (фиг. 54). Заметим, что внутренние круги соответствуют большим
с! и что отражения различных порядков, обусловленные разными периодами,
перемешиваются между собой. Анализ такой рентгенограммы обычно дает
только расстояние	зш 0г-)> но иногда оказывается возможным

определить размеры и форму ячейки.

Если у всех мелких кристаллов одна из осей, скажем ось о, параллельна
некоторой оси, перпендикулярной падающему пучку (ориентация двух
других осей произвольна), то получится та же картина, что и при вращении

Ф и г. 55. Возможные случаи ориентации кристаллографичес-
ких плоскостей. —число плоскостей, у которых угол нор-
мали с заданным направлением лежит между а и а р <2а.

I — совершенная ориентация; II — несовершенная ориентация, характери-
зуемая некоторым распределением; III — хаотическое расположение.
В случае I рентгенограмма имеет вид пятен, расположенных иа слоевых
линиях, в случае II пятна превращаются в дуги» в случае III эти дуги
сливаются в окружности.

отдельного кристалла вокруг этой оси (см. фиг. 53). Если ориентация не
совершенна и может быть описана некоторым распределением, например
кривой II на фиг. 55, то точки на слоевых линиях превратятся в дуги или
в предельном случае—при хаотическом распределении — в окружности.
Длина дуг может служить критерием ориентированности отражающих
плоскостей.

6.	Амплитуда и ширина дифракционных максимумов. Измерение поло-
жений дифракционных максимумов позволяет получить ценные сведения
о строении решетки кристалла. Для получения сведений о распределении
электронной плотности в кристаллической ячейке необходимо иметь данные
об интенсивности дифракционных максимумов.

Интенсивность всякого электромагнитного излучения, в том числе
и рентгеновского, пропорциональна квадрату амплитуды поля. Дифрак-
ционная картина образуется в результате наложения полей, обусловлен-
ных рассеянием на каждом атоме. Поэтому надо научиться вычислять
амплитуду результирующего поля. Электрические поля, о которых идет
речь, могут быть записаны в виде

Е = Рсо = 2лт,	(5.4)

где <о — круговая частота, связанная простым соотношением с частотой
колебания V, а Р—амплитуда. Если рассмотреть вектор длины Р, враща-
ющийся с угловой скоростью со вокруг оси, перпендикулярной плоскости
чертежа, то проекция Р на горизонтальную ось и представит характер
изменения поля Е во времени. Удобство такого представления станет ясным,
если мы попытаемся определить сумму двух или более, простых гармони-
ческих колебаний разных амплитуд, если их частоты одинаковы, а фазы
различаются на угол б. Пусть требуется вычислить сумму Е = Е1 + Е2,
где

Е1 = Г1со8и^; Е2 — Р2С0& (ш^ + б).

Решение задачи методом векторного сложения и Р2 представлено
на фиг. 56. Вектор Г = Рг и Р2 вращается с той же частотой, что и вектора-
слагаемые, а его проекция на горизонтальную ось соответствует изменению

| Г. + Г2|2	+ ?? + 2Н Гг соз Ь

Фиг. 56. Сложение векторных амплитуд двух простых гармони-
ческих колебаний, сдвинутых по фазе на угол б

Е во времени. Средняя интенсивность I пропорциональна среднему по вре^
мени от Е2, т. е.

/ — (Р2)ср = Г2 (соз2 йОср = 4 р2'

Рассмотрим другой пример. Пусть требуется вычислить зависимость
угловой ширины дифракционного максимума от числа отражающих плос-
костей К в кристалле. При углах 0в, удовлетворяющих соотношению

Результирующая амплитуда &={}

Б

Фиг. 57. Сложение векторных амплитуд волн, отраженных
от кристаллографических плоскостей.

А — угол отражения равен углу Брэгга бв; Б — угол отражения равен
6В + Аб, причем значение Аб таково, что результирующая амплитуда равна
нулю.

Брэгга нА = 2 б/ зт 0в, векторные амплитуды отраженных волн Р4, Р2)-.-,
Рм лежат на одной прямой (фиг. 57, Л) и результирующая амплитуда равна
их сумме. Рассмотрим, что происходит под углами, превышающими брэг
говский угол на величину Д0в- В этом случае амплитуды волн, отраженных
от последовательных плоскостей, будут сдвинуты по фазе на малый угол б.
Из фиг. 57, Б ясно, что результирующая амплитуда, а следовательно,
и интенсивность, будут равны нулю, если разность хода между соседними
плоскостями равна что соответствует б=(2л/А)(А/Д'). Для меньших
разностей хода интенсивность будет промежуточной между максимальной
и нулевой, и зависимость ее от угла аналогична зависимости, показанной
в гл. XII нафиг. 193. Интенсивность равна нулю при разности хода, равной

пЛ ф- ~ = 2(181П (0д 4- АО) = 2(1 (8Ш 0в соз АО 4- соз 0в 81п АО).

В силу малости АО

2Й8Ш0В + 2Й АО со8 0в.

Заменяя 2(1 зш 0в через пЛ, окончательно получаем

и аналогичное выражение для—АО. Тогда полная угловая ширина вы-
ражается формулой

Л'й соз 0	( соз о«

где 1 = ТУЙ — толщина кристалла. Из формулы (5.6) видно, что кристаллы
размером более 10~лсм дают значения ширины максимума порядка десятков
угловых секунд — много меньше, чем обычно получаемая аппаратурная
ширина. Следовательно, этот метод дает возможность изучать дифракцию
на кристаллах микроскопических размеров, в частности на очень мелких
кристаллах, образуемых вирусами или белками.

7.	Распределение плотности электронов внутри элементарной ячейки.
Метод дифракции рентгеновских лучей открывает возможность вычислить
распределение плотности электронов внутри элементарной ячейки. Зная
эту функцию распределения с точностью примерно до 1 Л, можно сделать
определенные заключения о положении всех атомов в ячейке (за исключени-
ем водородных) и, следовательно, определить структуру молекул, составля-
ющих эту ячейку. Однако найти распределение плотности далеко не просто.
В частности, для белков эта задача до сих пор полностью не решена. Для
того чтобы составить представление о всей сложности решения трехмерной
задачи, рассмотрим некоторые простые одномерные случаи.

Основные положения, на которых основан структурный анализ, доста-
точно просты. Вспомним, что максимумы интенсивности получаются только
в том случае, когда выполняется соотношение Брэгга. Это означает, что
наблюдение производится только в направлениях, характеризуемых индек-
сами (/М) плоскостей. В качестве примера возьмем плоскости (100), которые
отсекают на оси а отрезки 0, а, 2а... и параллельны осям Ь и с. У лучей,
отраженных от соседних плоскостей этого набора, разность хода равна X,
или разность фаз составляет угол А. Однако тот факт, что плоскости
данного семейства отстоят друг от друга на расстоянии а, не означает,
что местоположения всех атомов характеризуются только числами 0 и а;
между плоскостями 0 и с может существовать сложное распределение
атомов. Общее выражение для амплитуды рентгеновских лучей Г (100),
отраженных от плоскостей (100), есть

Г (100) Г, (100),

Где — векторные амплитуды излучения,- рассеянного индивидуальными
атомами в направлении (100). В общем виде для направления [Ш] эта
величина равна

Г(ЛЛ/) = ЗЙ (ЛЛ/).

г

(5.7)

На фиг. 58 представлен случай, когда рассеивающий центр «/» поме-
щается между плоскостями 0 и с. Если разность хода при рассеянии от этих
плоскостей равна К, то разность хода при рассеянии от 0 и «/» есть К (хфа),
или соответствующая разность фаз есть (2л/Л) Л (хг/а) = 2л (х,/о). Если

а --------------

। Центр I

О-----*------



/о;

Фиг. 58. Фазовые соотношения при рассеянии от плоско-
стей (100) и произвольного центра г, расположенного между
ними.

Векторная диаграмма показывает относительные фазы при рассея-
нии от плоскостей 0 и а н от центра I.

наблюдение производится в направлении [ЛОО], то разность фаз будет
иметь значение 2лЛ (хг/а). Если обозначить | Е (ЛОО) | =Е (ЛОО) = Д,
то, используя уравнения (5.7) и фиг. 58, можно получить следующие выра-
жения для компонент Рх и Еу:

Рх (ЛОО) = 2 Д соз 2лЛ ,

Ру (ЛОО) = 2 Л зш 2 лЛ	(5.8)

(обращаем внимание на то, что оси X и У суть координаты электрического
поля, а х, у, г— координаты точки в элементарной ячейке).

Если результирующая амплитуда составляет с осью^Х угол а, выра-
жения (5.8) можно записать в виде

Рх (ЛОО) = | Г | соз а,

Ру (ЛОО) = |Г | эта.	(5.9)

|Г|2 = Ех+Еу, =

Величина Г, называемая структурным фактором, зависит от рас-
пределения плотности электронов в ячейке и направления [ЛЛ/]. Ясно,
что если известно распределение плотности, то структурный фактор можно
вычислить для любого направления. И обратно — знание структурного
фактора для всех направлений позволяет найти распределение плотности
электронов. Как видно из выражений (5.8) и (5.9), для определения вектор-
ного структурного фактора необходимо знать амплитуду |Г| и фазу а.
Поэтому в общем случае найти этот множитель на основании только одной
рентгенограммы нельзя, ибо интенсивность дифракционного максимума
I (ЛЛ/) пропорциональна квадрату амплитуды, но не зависит от фазы

I (Ш) ~ | Г (ЛЛ/) |2.

Для понимания того, насколько важно знать фазу результирующей
амплитуды, рассмотрим простой пример. Пусть две ячейки обладают оди-
8 Зак аз № 1168
наковым размером а, но разным распределением плотности электронов
(фиг. 59). Если размер а достаточно мал, то отражения будут наблюдаться
только в направлениях (100), (200) и (300). В этом случае модули резуль-
тирующих амплитуд будут одинаковы для обеих ячеек и дифракционные
картины в направлениях [Л00] будут казаться идентичными, так как раз-
личие фаз проявляться не будет. Однако существуют некоторые приемы,
в которые мы не будем вдаваться, помогающие находить также и фазы.

Применим метод векторных амплитуд к анализу дифракционной кар-
тины, получаемой от системы спиральных структур, имеющих очень важное

Г,

*2

*3

а

За/4
а/2

а



х

О

О

-л

г

100

Г

200

Г, = г

Ё~-Зп/2

300 ,

Фиг. 59. Случай двух различных распределений плотности
электронов и результирующая амплитуда отраженного из-
лучения, когда /1 = /г = /з-

значение в биологии. Пусть имеется спираль с шагом а, на каждый виток
которой приходится целое число похожих, но не обязательно одинаковых,
структурных единиц, скажем нуклеотидов. Схематически подобная
структура представлена на фиг. 60. Для определенности число единиц
взято равным 6. В направлении (100) разность фаз между максимумами
равна 2л, а соответствующая разность фаз между соседними структурными

6

единицами равна 2л = у . Векторная су.имаУ] Тг=0. Для отражения
1=0

второго порядка (200) разность фаз равна у , а структурный фактор и в этом
случае равен нулю. Аналогичным образом Р (300), Р (400) и Р (500) также
равны нулю. Первой ненулевой амплитудой в направлении [ЛОО] будет
амплитуда, соответствующая отражению шестого порядка от плоскостей,
отстоящих друг от друга на расстоянии а.

Вычисление структурных Лакторов для направлений, отличных от
[ЛОО], представляет более сложную задачу. Например, амплитуда для
отражений от плоскостей (1Л/) и (7Л/) отлична от нуля, тогда как в случае
Л=/=0 она равна нулю. Однако можно показать, что в областях, лежащих
под углом Р (угол спирали) к вертикальному (или меридиональному) нап-
равлению, дифракционные максимумы наблюдаться не будут. Интенсив-
ность максимумов на слоевых линиях с 1 по 7 (как видно на фиг. 62), в мери-
диональном направлении равна нулю. Для спирали, имеющей структур-
ных единиц на виток, первые (А—1) слоевых линий не будут иметь дифрак-
ционных максимумов в меридиональном направлении. Такой тип дифрак-
ционной картины распознается очень легко.

г,

600 г = 6(

г2	% {е

А	р

Фиг. .60.

А — набор спиралей с шагом а. На шаг спирали приходится 6 структурных единиц;
Б — векторное сложение амплитуд, дающих структурные факторы Г(/г00) для соот-
ветствующих направлений.

8.	Рентгенограммы фибриллярных белков. Исследования Эстбери
показали, что по характеру дифракционной картины фибриллярные белки
можно разделить на две группы. К первой относятся фибриноген (белок,
обусловливающий свертываемость крови), кератин (белок, содержащийся
в эпидермальной ткани) и миозин (мышечный белок). Вторая группа'вклю-
чает в себя белки, содержащиеся в соединительной ткани,— так называ-
емую группу коллагенов. На фиг. 61 изображены наиболее существенные
дифракционные максимумы, получаемые при рентгеноструктурном анализе
нерастянутого и растянутого волоса; соответствующие структуры носят
название а-кератина и р-кератина. На фиг.' 61, А показано взаимное рас-
положение максимумов, соответствующих периодам (межплоскостным
расстояниям) 9,7 и 5,2 А. При, повороте волоса (фиг. 61, Б) максимум,
соответствующий периоду 5,2 А, усиливается. Если предположить, что
величина 5,2 А есть расстояние между плоскостями, расположенными
главным образом перпендикулярно оси волоса, и что распределение их
ориентаций может быть описано кривой того же типа, что и изображенная
на фиг. 55, то этот результат можно ожидать заранее. Действительно, если
волос наклонен, то большая часть плоскостей ориентирована так, что
соотношение Брэгга имеет место для б/=5 А.
Как будет показано далее, меридиональное расстояние связано с пери-
одом идентичности вдоль полипептидной цепи. Период 9,8 к соответствует
расстоянию между соседними полипептидными цепями, которые ориенти-
рованы вдоль оси волоса. Размеры максимумов позволяют судить о степени

Фиг. 61. Расположение дифракционных максимумов на рентге-
нограммах волоса.

А — нерастянутый волос (с-кератин); Б — нерастянутый волос, наклоненный
по отношению к пучку рентгеновских лучей; В — растянутый волос
(₽-кератин).

ориентации полипептидных цепей; в частности, рентгенограммы, приве-
денные на фиг. 61, показывают, что в данном случае цепи ориентированы
далеко не полностью.

Дифракционная картина, соответствующая Р-кератину (фиг. 61, В),
типична для растянутого волоса, фиброина шелка и (в грубых чертах)
кератина, содержащегося в перьях. В направлении, параллельном волосу,
имеется максимум, соответствующий периоду 3,3 А, в перпендикулярном
направлении — два максимума, при 9,8 и 4,6 А. Плоскости, соответствующие
последним, действительно перпендикулярны друг другу, что можно показать,
сжимая растянутый волос. О действительной конфигурации аминокислот,
образующих а- и [3-кератины, будет подробно сказано ниже (разд. 12),
после того как будет описан другой мощный метод анализа — метод построе-
ния пространственной модели (разд. 10).

Рентгенограмма коллагенов содержит значительно больше деталей,
чем рентгенограмма волоса. На ней видны отражения под очень малыми
углами, соответствующие периоду 100 А, и отклонения по азимуту, соответ-
ствующие периоду 10 А.

Большие периоды прекрасно выявляются на электронных микрофото-
графиях окрашенных препаратов. Например, на электронной микрсфото
графин коллагена (фиг. 63, Б) видно, что большие периоды, равные 640 А,
обладают сложной структурой. Области наибольшей плотности электронов
носят название полос, а более прозрачные области — промежутков. За под-
робными сведениями о структурных особенностях коллагенов мы отсылаем
читателя к соответствующим руководствам (см., например, [И]), а здесь
приведены лишь основные результаты.

Коллаген построен из молекулярных фибрилл, или протофибрилл,
диаметром примерно 12 л. Промежутки соответствуют упорядоченным
областям фибрилл, а полосы — областям меньшей упорядоченности. При
растяжении нитей коллагена в дифракционной картине наблюдаются
характерные изменения. Прежде всего изменяется положение максимумов,
соответствующих малым углам (или большим межплоскостным расстояниям);
этот сдвиг свидетельствует об увеличении периода, пропорциональном
удлинению нити. Картина, соответствующая большим углам, остается
неизменной до тех пор, пока удлинение не превысит 3%; после этого наблю-
даются медленные изменения, свидетельствующие об увеличении межплос-
костных расстояний.

По мнению Коуэна, Норса и Рэндолла, межплоскостные расстояния,
соответствующие малым углам, увеличиваются благодаря упорядочению
индивидуальных фибрилл в нити. Однако растяжение нити не может про-
исходить целиком за счет этого процесса, ибо начальная неупорядоченность,
судя по угловой ширине дифракционных максимумов, слишком мала. Частич-
но вытягивание может происходить за счет удлинения плохо упорядоченных
областей. Периоды, соответствующие большим углам, отражают детальную
структуру протофибрилл. Как можно видеть из фиг. 63, А, многие мери-
диональные отражения отсутствуют при больших углах, что указывает
на спиральный тип структуры. Первая дужка в меридиональной плоскости
соответствует периоду 2,95 А. Третья слоевая линия соответствует периоду
° 1

10 А. Таким образом, на один виток спирали приходится 3-$- единицы перио-
дической структуры, т. е. целое число структур приходится на 3 витка,
или на 30 А. Повторяющиеся структуры представляют собой, очевидно,
аминокислоты, из которых построен коллаген.

Рентгенограмма коллагена содержит слишком мало деталей, чтобы
можно было установить места отдельных атомов в его протсфибриллах.
Рич и Крик, а также Рамачандран и Карта на основании работы Полинга,
Кори и Брэнсона по структуре кератина предложили модель коллагена,
которая, по-видимому, соответствует наблюдаемой рентгенограмме. По их
представлениям, частицы коллагена состоят из трех спиральных полипеп-
тидных цепей (с тремя аминокислотными остатками на виток), которые
плавно закручены одна вокруг другой в направлении, обратном закру-
чиванию спиралей; в результате получается сплетение, в котором на длину
10 А приходится более трех остатков, как этого и требуют данные рентгено-

структурного анализа.

Подобная структура специфична для веществ такого типа, как поли-

глицин, полипролин и коллаген, у которых часто встречается последова-

тельность аминокислот -гли-про-опро.

9.	Структура глобулярных белков. Глобулярные белки в противопо-

ложность фибриллярным образуют кристаллы, рентгенограммы которых
содержат много деталей. Хотя ни одной

55

Давление пора * лчм рт. ст.

Фиг. 64. Размеры элементарной
ячейки в направлении, перпен-
дикулярном плоскости аЬ, для
сухого кристалла метгемоглобина

рентгенограммы кристаллического белка
не удалось еще расшифровать полностью,
такой анализ позволяет установить струк-
туру глобулярных белков, хотя бы в общих
чертах. Наиболее обстоятельное исследо-
вание структуры глобулярных белков
принадлежит Перутцу и его сотрудни-
кам, работавшим с метгемоглобином ло-
шади. Об объеме проделанной ими работы
можно судить по цитате из статьи Пе-
рутца [19]: «В дифракционной картине
влажных кристаллов гемоглобина наблю-
даются отражения, соответствующие очень

лошади, находящегося в равно- малым межплоскостным расстояниям
весии с водяным паром, при раз- (вплоть до 2,5 А). Но расстояния менее
личной относительной влажности. 2,8 А не индицировались, ибо соответст-
вующие им отражения очень слабы и не-
многочисленны. Однако даже и при этом условии сфера ограничения
содержит 62 700 узлов обратной решетки (отражающих плоскостей), которые

условиями симметрии сводятся к 7480 отражениям, подлежащим анализу.
Работа по фотографированию, индицировалию, измерению, коррекции
и сопоставлению примерно 7000 отражений была столь продолжительной
и утомительной, что лучше было бы об этом не упоминать... Значения

интенсивности определяли по рентгенограммам, полученным методом качаю-
щегося кристалла. Было проведено 3 серии опытов (в каждой 45 рентгено-
грамм), соответствующих направлениям [100], [001] и [102] осей зон.
Диапазон качания составлял 3° с одноградусным перекрытием для соседних
снимков».

3 настоящей книге нет возможности подробно описывать особенности
анализа глобулярных белков, однако некоторые моменты, которые пона-
добятся для понимания структуры гемоглобина, все же будут отмечены.
Изменение размеров кристалла гемоглобина после высушивания можно
видеть из табл. 7. В направлении, перпендикулярном плоскости аЪ (фиг. 64),
эти изменения более значительны, чем в остальных двух направлениях,
что свидетельствует о наличии жидких пленок, параллельных плоскости
аЬ. Если кристаллы поместить в раствор сульфата калия, то массивные
ионы калия диффундируют в эти жидкие пленки; в результате наблюдается
такое изменение в распределении интенсивностей дифракционных макси-
мумов, которое указывает на то, что на элементарную ячейку приходится
лишь одна жидкая пленка. Изменение размеров ячейки после высушивания
происходит в результате соскальзывания одной молекулы по другой, а не из-
за перестроек внутри отдельных молекул.

Картина дифракции под большими углами связана с межатомными
расстояниями в молекуле. Анализ интенсивности дифракционных макси-
мумов в этом случае позволяет найти два важных периода структуры
гемоглобина. В плоскостях, параллельных плоскости аЬ, обнаруживаются
области с высокой плотностью электронов, имеющие вид палочек, парал-
лельных оси а. Есть все основания идентифицировать эти палочки как
полипептидные цепи. Расстояние между ними составляет 10 А. В пределах
каждой из них период идентичности равен 5,1 А. Отметим, что эти два

I*------------65 К------------

® = -8Н

Ппоекция на

Фиг. 65. Схематическое изображение молекулы гемоглобина [21].

Стрелкой показана ось симметрии. Положение групп гема — одно из четырех возможных,
но ориентация их правильна.

периода совпадают с теми, которые были получены из рентгенограмм
«-кератина. Это очень важное обстоятельство, так как оно означает, что
столь различные структуры, как фибриллярные и глобулярные белки,
подчиняются общим правилам.

Схема молекулы гемоглобина показана на фиг. 65. Положения 8—Н-
трупп найдены путем замещения атомов водорода атомами ртути. Такое
замещение не изменяет элементарной ячейки и, следовательно, не влияет
на положение максимумов; меняется лишь распределение интенсивности.
Подобный прием известен под названием метода изоморфного замещения.
.Наблюдаемое изменение интенсивности можно использовать для вычис-
ления изменения структурного фактора, что позволяет установить положе-
ние атомов ртути и, что более важно, дает некоторые сведения о фазах
•структурных факторов.

Перечислять результаты рентгеноструктурного исследования гемо-
глобина очень легко. Гораздо труднее было получить их. Сложность задачи
можно оценить из того, что первоначально было обнаружено 4 слоя палочек,
тогда как в настоящее время установлено, что этих слоев 5 (см. фиг. 65).
Раньше молекулу гемоглобина считали цилиндром с диаметром 57 А и высо-
той 34 А. Согласно современным представлениям, эта молекула обладает
эллипсоидальной формой с отношением осей 1,18, что совпадает с данными,
полученными на основании опытов по седиментации и диффузии. С помощью
.дифракции рентгеновских лучей форму молекулы определить очень трудно,
Ь

Ф и г. 66. Возможная модель кристалла инсулина
(вид «с торца» [5]).

Каждая молекула состоит из двух цепей А и двух цепей В.

^10 Дн

ибо молекулы расположены в кристалле настолько плотно, что трудно
сказать, где кончается одна и начинается другая.

Интенсивно изучаются и три других кристаллических белка — инсулин,
рибонуклеаза и миоглобин. Есть данные, что первые два построены из парал-
лельных или почти параллельных палочек. Экспериментальная модель
инсулина представлена на фиг. 66. Здесь также структура полипептидных
цепей неизвестна, хотя порядок расположения аминокислот в цепи установ-
лен.

Молекула миоглобина содержит 152 аминокислотных остатка, а моле-
кулярный вес его равен 17 000. Пространственная вторичная и третичная
структура миоглобина
была определена с помощью
рентгеноструктурного ана-
лиза, причем для выявле-
ния фаз различных отра-
жений применялся метод
изоморфного замещения.
Соответствующие распре-
деления плотности были
вычислены с точностью до
2. А (для этого потребовался
анализ рентгенограмм, со-
державших 10 000 отраже-
ний), что позволило опре-
делить общее расположение
цепей. Модель молекулы
миоглобина, построенная
с разрешением в 2 А, пред-
ставлена на фиг. 67. Основ-
ная ее особенность — от-

сутствие симметрии полипептидных цепей. Эти цепи, находящиеся при-
мерно на 10 А друг от друга, лишь более или менее параллельны между
собой и сложены так, что образуют нечто вроде плоского диска.

10.	Структура полипептидных цепей. Описанный выше метод опреде-
ления структуры кристалла состоит в том, что на основании дифракцион-
ной картины (положение и интенсивность максимумов) устанавливают
локализацию всех атомов, из которых построен кристалл. Для простых
кристаллов это сравнительно несложная задача. Построить же таким спо-
собом модель сложного кристалла почти невозможно, и до конца эта задача
доведена только для миоглобина, хотя попутно были получены ценные
сведения о строении многих молекул. Другой метод состоит в том, что
сначала определяется точная структура аминокислот, входящих в молекулу
исследуемого белка, а затем строится модель самой молекулы, учитывающая
ограничения, налагаемые установленной конфигурацией ее компонен-
тов.

Этот метод, впервые примененный Полингом, Кори и Брэнсоном,
оказался очень плодотворным. Он открыл новый подход к изучению струк-
туры биологических объектов (построение модели при заданных ограни-
чениях).

Методы, которые Полинг, Кори и Брэнсон использовали для изучения
а- и ^-кератинов и искусственных полипептидов, были затем применены
для изучения коллагена и нуклеиновых кислот (см. разд. 13).
Рентгеноструктурный анализ аминокислот в кристаллическом состоянии
позволил не только определить межатомные расстояния, но и установить,
что основной элемент полипептидной цепи — амидогруппа С(СО) (ЫН)С—
имеет плоскую конфигурацию. Этот весьма важный для определения струк-
туры белка факт доказывается очень просто. Наблюдаемое расстояние

Фиг. 67. Трехмерная модель молекулы миоглобина (по Кендрью).

При данном разрешении, А, можно идентифицировать большинство отдельных амино-
кислот. Полипептидная цепь показана жирной белой линией. Справа вверху — группа
гема с атомом железа в центре.

между атомами углерода и азота равно 1,32 А. Если бы связь между этими-,
атомами была простой, то расстояние было бы равно 1,48 А, а если двойной,
то — 1,28 А. Наблюдаемое расстояние соответствует наполовину двойному,
характеру связей и обусловлено резонансом (см. гл. VI) двух форм:

Н	с	Н	с

сГХ и 'м+ = С/Х
с	о	с	о-

Добавочная устойчивость, сообщаемая пептидной связи этим резонан-
сом, соответствует повышению энергии связи примерно на 1 эв. Далее будет
показано, что у групп с двойной связью минимум потенциальной энергии
достигается в том случае, когда группа плоская. Отклонение на 10° должно
вызывать увеличение энергии на 0,9 ккал/моль, а на 20°—. на 3,5 ккал/моль,.
или 0,15 эв. Поэтому наиболее устойчивой будет плоская или почти плоская
конфигурация. Учитывая этот факт и величины межатомных расстояний
у аминокислот, можно прийти к такой структуре растянутой полипептидной
цепи/которая показана на фиг. 68. Такая растянутая конфигурация не обя-
зательно самая устойчивая, ибо, судя по данным инфракрасной спектроско-
пии, в молекулах этого типа имеется большое число водородных связей.
Есть основания полагать, что чем больше в молекуле водородных связей,
тем устойчивей ее конфигурация.

Задача установления формы полипептидной цепи есть, по существу,
системы с минимальной энергией при заданных рас-
стояниях и углах между связями, указанных на
фиг. 68. Полинг, Кори и Брэнсон предположили,
что возможные структуры должны обладать высокой
степенью симметрии, а именно иметь спиральную
форму, но не нашли оснований требовать целого числа
аминокислот на один виток спирали (что несколько
усложняет симметрию молекулы). Переход от одного
аминокислотного остатка к другому требует у таких
структур, кроме вращения, еще и смещения вдоль
оси спирали. В модели Полинга и его сотрудников
учтено также, что для достижения минимального
уровня энергии молекула должна содержать большое
число сильных водородных связей. Водородная связь
(см. гл. VI) представляет собой электростатическое
взаимодействие между водородом и электроотрица-
тельными атомами или группами, например атомами
кислорода. В белках такой тип взаимодействия может
иметь место между —И—Н- и —СО-группами (—И—

Н....О=С) при условии, что эти группы соответствующим образом распо-
ложены. Наибольшего значения энергия водородной связи достигает в том
случае, когда атомы К, Н и О лежат на прямой. Расстояние между ато-
мами азота и кислорода обычно равно 2,75 + 0,05 А, и вряд ли можно
ожидать очень больших отклонений от этого значения. Если угол между
направлениями ПН и ПО не превышает 30°, водородная связь обладает
энергией более -у эв.

Среди множества возможных структур условию минимума энергии
удовлетворяют только три, а именно две структуры складчатого типа и одна
спиральная, называемая а-спиралью.

11.	Структуры складчатого типа и 0-кератин. Белки типа [3-кератина
имеют структуру, напоминающую лист бумаги, сложенный гармошкой.
Как было указано выше, полипептидные цепи построены из плоских
амидогрупп С—СОНН—С, связанных тетраэдрическим атомом углерода.
Один из возможных способов расположения этих групп показан на фиг.

1

69. Период вдоль оси г у [3-кератина в силу складчатости равен ^--6,7А=
=3,3 А, тогда как в полностью растянутой полипептидной цепи он составляет
3,6 А. Период 4,7 А соответствует расстоянию между соседними цепями,
а период 10 А — длине боковых цепей аминокислот, направленных вверх
и вниз от плоскости ху. Каждая из ЫН- и СО-групп принимает участие
в водородной связи. В данной модели водородные связи образуются между
группами, лежащими в разных цепях, и, судя по спектрам поглощения
поляризованного инфракрасного излучения, расположены перпендикулярно

задача нахождения

й-(-С)Н

1ы° \15Г12г
).-/ ’(с=о

7.27 А

Н-И о

1.47 А

Н—С—Н'

Д.53 А
о=с °
. 9отгЧ.32 А
\ 120'

120°(ьф Н

/ 120°
Е"—С—Н

'Фиг. 68. Параметры
растянутой полипеп-
тидной цепи.

Последовательность ато-
мов ССМС лежит в од-
ной плоскости.
оси волокна. Представленная на фиг. 69 модель неполна в том смысле
что на ней не указано, как направлены последовательности аминокислот
ж соседних полипептидных цепях — параллельно или антипараллельно.
Каждая из возможностей приводит к складчатой структуре указанного
типа и каждая может соответствовать структуре р-кератина.

Ф и г. 69. Различные структуры полипептидной цепи.
А — растянутая полипептидная цепь — основа модели {3-кера-
тина в виде структуры складчатого типа. Пунктирными линиями
показаны водородные связи; Б — полипептидные цепи, обра-
зующие структуру складчатого типа.

12.	а-Спираль иа-кератин. Если систему плоских амидогрупп, из кото-
рых построены полипептидные цепи, вращать вокруг а-углеродных атомов
таким образом, чтобы угол поворота от плоскости к плоскости был одина-
ковым, то получится спираль. (Структуры складчатого типа, рассмотренные
в предыдущем разделе, могут рассматриваться как частные случаи спирали.)
Так называемую а-спираль легко себе представить, если взять игральные
карты и склеить их краями в соответствии с параметрами вращения, при-
веденными ниже:

Угол поворота между аминокислот- 97,2°

ними остатками

Число остатков на'виток	3,69
Смещение на остаток

Угол между осью и ЫН-группой

Радиус спирали

Угол №—Н—О

Шаг

1,47 А
12°

1,81А

10°

5,44 А

Некоторые структурные элементы а-спирали изображены на фиг. 70..
Каждая С—О- и Ы—Н-группа принимает участие во внутрицепочечной водо-
родной связи, причем направление ИН составляет угол 12° с осью цепи.

Фиг. 70. Некоторые структурные элементы
а-спирали.

А — вид сверху на три последовательных амидогруппы;

Б —цилиндр, поверхности которого касаются плоские
амидогруппы. В — развертка цилиндра.

На один виток спирали приходится не целое число аминокислотных остат-
ков, а 3,7 остатка. Небольшие колебания в расстояниях между атомами,
образующими водородную связь, могут слегка сказываться и на размерах
всей спирали. Так, можно ожидать, что на 13 витков придется 48 остатков,
на 3 витка —11, на 4 витка —15 и на 5 витков —18. Некоторые из приведен-
ных отклонений от размеров~простой а-спирали могут показаться большими;
тем не менее они не исключены в реальных молекулах и могут быть обуслов-
лены влиянием Е-групп и взаимодействием между соседними спиралями.

У а-спирали имеется одна особенность, которой нет ни в какой другой
модели структуры белка. Этой особенностью является период 1,5 А вдоль
оси, соответствующий осевому смещению соседних аминокислот. Этот
период был действительно найден в волосах, иглах дикобраза, волокнах
мышц и гемоглобине. (Столь малые расстояния соответствуют очень боль-
шим углам, которые не фиксировались на ранних рентгенограммах гемогло-
бина.) Открытие этого периода в фибриллярных белках и гемоглобине
явилось большим успехом модели и показало, что а-спираль составляет
важную, хотя и не единственную часть структуры бел ков такого вида. Однако
далеко не все глобулярные белки содержат а-спираль. Например, в рентге-
нограмме рибонуклеазы период 1,5 А не обнаружен.

Простую а-спираль нельзя считать полноценной моделью даже и для
а-кератина. Во-первых, плотность такой а-спиральной структуры, равная
1,15 г! см?, хотя и близка к соответствующей величине для синтетических
.полипептидов, все же слишком мала по сравнению с 1,3 г! см? для а-кератина.

Фиг. 71. Предполагаемое строение а-кератина.

I — отдельные а-спиралн, из которых образуется структура типа «кабеля»;

II — поперечный разрез волокна а-кератина;

Во-вторых, а-спираль не должна давать вдоль оси периода 5,2 А, наблю-
даемого у а-кератина. Обе эти трудности были сняты в модели, предложен-
ной Полингом и Кори. Они предположили, что длина водородной связи
может претерпевать малые систематические изменения, обусловленные,
например, порядком следования аминокислот. Если такие изменения имеют
место у каждой седьмой аминокислоты (через каждые неполные два оборота
а-спирали), то ось а-спирали должна сама образовать спираль диаметром
10 А с большим шагом (200—400 А). Шесть таких спиральных а-спиралей
навиваются на центральную а-спираль, образуя нечто похожее на семижиль-
ный кабель (фиг. 71). Такая структура обладает плотностью 1,3 г/см? и объяс-
няет наличие периода 5,2 А в меридиональной плоскости. В самом деле,
если каждая седьмая водородная связь отличается от остальных, то вдоль
оси должен существовать период, равный 7-1,47 А= 10,36 А. Он не наблю-
дается из-за малой интенсивности соответствующего максимума и к тому
же еще замазан диффузным максимумом, соответствующим расстоянию
между спиралями. Максимум второго порядка, напротив, очень интенсивен
и наблюдается под углом, эквивалентным половине периода 10,36 А, т. е.
5,2 А. Следовательно, период 5,2 А не относится к внутренней структуре
а-кератина, и максимумы в меридиональной плоскости, соответствующие
этому периоду, отражают лишь закручивание а-спиралей в «сверхспираль».

Методы рентгеноструктурного анализа белков быстро совершенству-
ются, и информация, получаемая с их помощью, имеет первостепенное
значение для выяснения роли белков в процессах, изучаемых молекулярной
биофизикой.
13.	Структура нуклеиновых кислот. Среди веществ, изучаемых моле-
кулярной биофизикой, особенно важное значение имеют нуклеиновые
кислоты ДНК и РНК- Роль ДНК в передаче генетической информации
уже отмечалась в гл. И, а роль РНК и ДНК в синтезе белков будет описана
далее в гл. XV. В последние несколько лет были достигнуты огромные
успехи в изучении структуры этих полимеров. Особенно хорошо в настоящее
время изучено строение ДНК, и в дальнейшем речь будет идти в основном
о строении именно этой кислоты.

Для определения размера молекул ДНК применяют различные ме-
тоды — измерение двойного лучепреломления, рассеяния света или вяз-
кости растворов. Результаты показывают, что ДНК представляет' собой
длинную, тонкую и относительно жесткую структуру с молекулярным
весом 6*106, хотя отдельные генетические единицы имеют много меньшие-
размеры. Плотность сухой ДНК, равная 1,6 г/см3, указывает на плотную
упаковку пуринов и пиримидинов. ДНК очень гигроскопична и ее плотность
при 75% относительной влажности равна 1,47 г/см3. Химический анализ
показывает, что группы РО4 обладают очень высокой реакционной способ-
ностью, а группы—КН2 или — СО с трудом поддаются титрованию.

Одно время считали, что все четыре основания — тимин, аденин,
цитозин и гуанин — присутствуют в молекуле ДНК в равных количествах.
Позднее Уайт и Чаргаф показали, что это неверно и что на самом деле
содержание тимина примерно равно содержанию аденина, а содержание
цитозина — содержанию гуанина (табл. 8).

Таблица 8

Содержание пуринов н пиримидинов в некоторых ДНК (молярные отношения) [22]

	Аденин	Тимин	Гуанин	Цитознн	5-Метнл- цитозин
Тимус^те ленка		1,13	1,П	0,86	0,85	0,05
Сперма быка . . 		1,15	1,09	0,89	0,83	0,05
Сперма барана 		1,15	1,09	0,88	0,84	0,04
Костный мозг крысы		1,15	1,14	0,86	0,82	0,04
Молоки сельди		1,11	1,10	0,89	0,83	0,08
Зародыш пшеницы .......	1,06	1,08	0,94	0,69	0,23
Е. соН		0,92	1,10	0,96	1,03	0,00
Непарный шелкопряд 		0,84	0,80	1,22	1,13	0,00
Многогранный вирус тутового					
шелкопряда 	  .	1,17	1,12	0,90	0,81	0,00'
Фаг Т2 [23]		1,29	1,31	0,73	0,00	0,00
					(0,66)*-

* 5-Оксиметилцитозин.

Анализ данных по поглощению поляризованного инфракрасного-
излучения показал, что группы—-ЫН2и —С = О, входящие в состав основа-
ний, ориентированы перпендикулярно оси молекулы, а группы Р = О рас-
положены так, что составляют с этой осью угол 55°. Измерения поглощения
ультрафиолетовых лучей показали, что сами основания ориентированы
так, что их плоскости перпендикулярны оси молекулы; расстояние между
ними, как показали рентгенограммы, полученные Эстбери, равно 3,4 А;
Решающее значение для выяснения структуры ДНК имели три рабо-
ты. Франклину и Гослингу удалось получить превосходные рентгенограммы
ориентированных нитей ДНК, выделенной из тимуса теленка. Уилкинс,

Ф и г. 72. Рентгенограмма литиевой соли ДНК при 66-процентной относительной
влажности.

Верхняя часть отличается от нижней из-за наклона нити-.

Стокс и Уилсон установили идентичность рентгенограмм для ДНК бакте-
риофага, головок сперматозоидов и трансформирующего фактора пневмо-
кокков. На фиг. 72 приведена в качестве примера рентгенограмма волокна
литиевой соли ДНК, полученная Уилкинсом. Нетрудно увидеть, что эта
четкая дифракционная картина соответствует спиральной структуре. Рассто-
яния между слоевыми линиями отвечают периоду 43 А, а первый максимум
в меридиональном направлении обнаруживается на десятой слоевой линии,.
т. е. соответствует периоду 3,4 А. Таким образом, шаг спирали ДНК равен
34 А, причем на один ее оборот приходится 10 повторяющихся единиц.

Детальное изучение интенсивности дифракционных максимумов и
необходимость согласования модели с экспериментальными данными,
свидетельствующими о высокой плотности ДНК, привели к заключению,

Глубокая бороздка

Аденин Н

Тимин

Н Н

М—Н--0

С—Н

С —С

н И

С	С—С

Мелкая бороздка

Цитозин

Глубокая бороздка
Гуанин	II

Т 1

Н	М О-—Н—Ы	Н

\ У X У \	/

С 4 С—С	С—С

Ю // \	\

К—с	к—н—и	с—н

с—г/

Мелкая бороздка

Фиг. 73. Образование специфических пар
тимин — аденин и цитозин — гуанин с по-
мощью водородных связей (пунктирные
линии).

Стрелками показаны участки возможного образо-
вания других водородных связей в мелкой
глубокой бороздках двойной спирали (см.
фиг. 74).

что структура ДНК представляет собой совокупность двух полинуклеотид-
ных цепочек, образующих правовинтовые спирали радиуса 8,5 А, сдвинутые
на полшага одна относительно другой.

Природа сил, связывающих эти спирали, была выяснена в работе
Крика и Уотсона, в которой изучались возможные конфигурации попарно
связанных оснований. Пользуясь известными из работы Фюрберга межатом-
ными расстояниями в этих основаниях, они показали, что пурины и пири-
мидины, принадлежащие двум цепочкам, могут быть связаны единственным
образом, а именно парами тимин — аденин и цитозин — гуанин. Члены
каждой пары обладают комплементарной структурой, благоприятствующей
образованию водородных связей (фиг. 73), причем энергия этих водородных
Ось спирали

Мелкая
бороздка

Мелкая
бороздка

54А

( Глубокая

* бороздка

Глубокая \

бороздка 9

и г. 74. Схематическое изо-

связей максимальна в случае антипараллельного расположения спиралей.
Структура молекулы такова, что углеводно-фосфатные остовы спиралей
расположены снаружи, а связанные с ними основания — внутри; водород-
ные связи направлены поперек оси двойной спирали. Таким образом, спи-
рали ДНК в противоположность белко-
вым спиралям, удерживаемым связями
внутри цепи, скрепляются посредством
межцепочечных водородных связей. Двойная
спираль ДНК схематически изображена
на фиг. 74. В силу того что спирали ан-
типараллельны, а атомы фосфора не лежат
в плоскости оснований, распределение
массы вдоль двойной спирали не одно-
родно. Из фиг. 74 видно, что вокруг моле-
кулы имеются как бы две спиральные
выемки различной глубины. Эти выемки;
по-видимому, играют важную роль в струк-
туре нуклеопротеидов, ибо в них имеются
участки, в которых возможно образование
водородных связей (см. фиг. 73).

Структура в виде двойной спирали
обладает рядом свойств, позволяющих лег-
ко объяснить роль ДНК в качестве хра-
нилища наследственной информации, а так-
же механизм дупликации генетического
материала. Эти вопросы будут рассматри-
ваться в гл. XIII и XV.

14.	Структура нуклеопротеидов. В жи-
вой клетке нуклеиновые кислоты обычно
образуют комплексы с белками, называе-

мые нуклеопротеидами. Специфические взаимодействия нуклеиновых кис-
лот и белков, несомненно, являются важными факторами в процессе жиз-
недеятельности, и структурный анализ нуклеопротеидов позволяет непо-
средственно исследовать эти взаимодействия. Хорошие рентгенограммы
дают, например, волокна нуклеопротамина — нуклеопротеида, который
может быть извлечен из головок сперматозоидов многих видов. Белок
протамин (относящийся к основным белкам) на две трети состоит из ами-
нокислоты аргинина, формула которой имеет вид

I

НМ

I	Н+

НС—СН2—СН2—СН9—Ы—С—ЫН?

I	- II

с=о	ы

I	Н+

Анализ последовательности аминокислот показывает, что в ней очень
часто встречается фрагмент арг-арг-арг-арг-КК', где К и К'— неосновные
группы. Аргинин несет большой положительный заряд, и между ним и отри-
цательно заряженной фосфатной группой ДНК возникают большие силы
притяжения. Структура, удовлетворяющая данным рентгеновского и хими-
ческого анализов, показана на фиг. 75. Неосновные остатки встречаются
парами и образуют складки в полипептидной цепи таким образом, что каж-
дая основная боковая цепь электростатически связана с ДНК.

9 Заказ №	168

Ф

бражение молекулы ДНК.

Две спирали изображают углеводно-
фосфатный остов, горизонтальные от-
резки — основания, а точки — атомы
фосфора. Пунктиром очерчен контур
молекулы.
Для детального изучения связи более сложных белков с обеими нуклеи-
новыми кислотами, ДНК и РНК необходимо знать структуру этих соедине-

Ф и г. 75. Схема структуры ну-
клеопротамина [14].

Молекула протамина закручена вокруг
молекулы ДНК.

ний. Эта задача очень трудна, однако успеш-
ное ее решение будет иметь неоценимое
значение для молекулярной биологии.

15.	Структура вирусов. Выше мы упо-
минали о трудностях определения струк-
туры РНК и нуклеопротеидов. К счастью,
в природе существуют системы, идеально
подходящие для этой цели. Такими систе-
мами являются кристаллы вируса. Напри-
мер, вирусы растений представляют собой
комплексы РНК и белка, которые легко
могут быть получены в чистом виде в боль-
ших количествах. На рентгенограммах ви-
русных кристаллов обнаруживается слож-
ная регулярная дифракционная картина,
указывающая на наличие одинаковой сим-
метричной структуры. Анализ этих рентге-
нограмм может привести нас к пониманию
структуры нуклеопротеидов и РНК раньше,
чем будет завершен анализ этих же сое-
динений, выделенных из клеток.

Большое число исследований было
проведено на вирусе табачной мозаики
(ВТМ), представляющем собой, длинную
тонкую, частицу диаметром 150 А и длиной
3000 А, содержащую 6% РНК и 94% белка.
Инфекционным началом вируса является
нуклеиновая кислота, которая способна
вызывать образование новых вирусных
частиц в клетке организма-хозяина. Выде-

ленная из такой клетки вирусная РНК может рекомбинировать с соот-
ветствующим белком, образуя снова целые вирусные частицы. Очевидно,
что исследования действия вируса как системы РНК — белок важны для
выяснения специфических сил, возникающих между нуклеиновой кисло-
той и белком, и того механизма, посредством которого РНК индуцирует
образование новых вирусных частиц в клетке. На фиг. 76 изображена
очень хорошая рентгенограмма ориентированного геля вируса табачной
мозаики, на которой ясно видна дифракционная картина, соответствующая
спирали. На каждой третьей слоевой линии находятся меридиональные
отражения, расстояние между которыми определяет период, равный 69 А.
Дальнейший анализ рентгенограммы в совокупности с химическими данны-
ми относительно конечных групп белка указывает на то, что последний
состоит из 2130 групп, размещенных так, что на 3 оборота спирали (69 А)
приходится 49 групп. Молекулярный вес групп равен 18 000. Местополо-
жение атомов фосфора в РНК вируса было определено путем, сравнения
рентгенограммы вируса с рентгенограммой белка, входящего в его состав.
На фиг. 77 схематически изображена часть вируса табачной мозаики.
Средний радиус, измеренный с помощью электронного микроскопа, и рас-
стояние между частицами в сухих образцах меньше максимального
значения, найденного с помощью рентгеноструктурного анализа. На
основании этих данных было сделано заключение, что на наружной
Фиг. 76. Рентгенограмма 20-процентного
ориентированного геля вируса табачной
мозаики, полученная при помощи /Са-из-
лучения меди.

Ось частицы

0

-»] Максимальный радиус 90 А

О

] Средний радиус 75 А

Нуклеиновая
кислота (расстояние
40 А от оси спирали)

Шаг спирали 23 А

Период 69/1 содержащий 49субъединиц

О

Радиус полости 20 А

Ф и г. 77. Схематическое изображение небольшого отрезка частицы вируса табач-
ной мозаики [15].

Частица разрезана пополам вдоль. Видны спирально расположенные белковые субъединицы,,
положение РНК» центральная полость и наружная спиральная бороздка.
поверхности вируса имеется спиральная «бороздка», ясно видимая на
рисунке.

Однако спиральной структурой обладают далеко не все вирусы. Напри-
мер, кристаллы растительного вируса кустистой карликовости томата
имеют сферическую форму. Рентгенограмма этого вируса, полученная
Каспаром 125], показывает, что вирусная частица обладает высокой степенью
симметрии и построена из групп, число которых кратно 12 или, возможно,
60. Химические данные указывают, что это число равно 300.

16. Заключение. Задача молекулярной биофизики состоит в объяснении
биологических явлений на основе реакций между простыми и сложными
молекулами, из которых состоит живой организм. Метод дифракции рент-
геновских лучей дает в руки исследователя одно из наиболее мощных средств
для познания деталей молекулярной структуры. Поэтому у этого метода
поистине необозримое будущее.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	Ео п в й а 1 е К-, СгузЕа1з апй Х-гауз, Уап НозЕгапй, И. У., 1949.

2.	К и й а 1 1 К. М., «РгшйатепЕа! ЗЕгисЕигез 1П В1о1о§1са1 ЗузЕетз», Ргоц. Вюр-
куз., 1, 39 (1950).

3.	Еп^зЕгот А., «Изе оЕ Зой Х-гауз 1п Еке Аззау оЕ В1о1о&1са1 МаЕег1а1з»,
Рго§. ВхорЬуз., 1, 164 (1950).

4.	РгезЕоп К. В., «Вюркуз1са1 АзресЕз о! Ро1узаскапйе ЗЕгпсЕпге 1п Р1ап1з»,
Рго§. Вюркуз., 2, 17 (1951).

5.	Ео В., «Тке ЗЕгпсЕиге апй СопЕ1§игаЕюп оЕ Атто Ас1йз, РерИйез апй РгоЕетз»,
т Тке РгоЕетз: СкепЛзЕгу, В1о1о1Цса1 АсНуЦу, апй МеЕкойз, Уо1. I, РагЕ А,
ей. Ьу Н. ИеигаЕк апй К- Ва11еу, Асайепис Ргезз, И. У., 1953.

6.	Кепйгетс Л. С., В а 1 1 е у К., «ЗЕгпсЕиге РгоЕетз», 1п Тке РгоЕе1пз: СкегшзЕ-
гу, Вю1о§1са1 АсНуй-у, апй МеЕкойз, Уо1. II, РагЕ В, ей. Ьу Н. ИеигаЕк апй
К- ВаПеу, Асайепис Ргезз, И. У., 1954.

7.	Кеп йге^ 5. С., «Тке СгузЕаПте РгоЕетз: ЦесепЕ Х-гау 81ий1ез апй ЗЕгисЕига!
НуроЕкезез», Рго§. Вюркуз., 4, 244 (1954).

8.	8 р г 1 п § а 1 1 Н. В., Тке ЗЕгисЕига! СкеггнзЕгу о! РгоЕетз, Асайепис Ргезз,
И. У., 1954.

9.	С г 1 с к Р. Н. С., XV а Е з о п I. В., «Тке Сотр1етепЕагу ЗЕгисЕиге оЕ Веохуп-
Ьопис1е1с Ас1й», Ргос. Роу. 8ос., А223, 80 (1954).

10.	8 с к т 1 й Е Р., КаезЬег^ Р., В еет а п XV. XV., «8та11-ап^1е Х-гау 8саЕ-
1ег1щ» Егот Тигшр Уе11ои'Моза1с Уйиз», ВюсЫт. еЕ Вюркуз. АсЕа, 14, 1 (1954).

11.	РгЬгоиз РгоЕетз апй Тке!г Вю1о§юа1 ЗЦщгПсапсе, 8утроз1а о! Еке 8ос1еЕу Гол
ЕхрептепЕа1 В1о1о§у, Ио. 9, Асайетю Ргезз, И. У., 1955.

12.	Н 1 с к А., С г г с к Р. Н. С., «Тке 8ЕгисЕиге оЕ Со11а§еп», ИаЕиге/ 176, 915
(1955).

13.	С г 1 с к Р. И. С., XV а Е з о п 3. В., «8ЕгисЕиге оЕ 8та11 У1гизез», НаЕиге, 177,
473 (1956).

14.	Тке ЗЕгисЕиге о! Г4ис1ею Ас1йз апй Тке1г Ко1е 1п РгоЕет 8упЕйе818, Вюскеписа!
8ос1еЕу 8утроз1а, Ио, 14, ей. Ьу Е..М. Сгоок, СатЬпй^е ИЩуегзйу Ргезз, 1957.

15.	Тке НаЕиге о! Уйизез, ей Ьу Л. апй А. СкигскШ, С1Ьа РоипйаЕюп 8утроз1а,
'	1957.

16.	Р а и 1 1 п я Ь., С о г е у К. В., Вгапзоп Н. К., «Тке ЗЕгисЕиге о! РгоЕетз:
Тгу© Нуйго§еп-Вопйей НеНса! СопЕ1§игаЕ1опз оЕ Еке Ро1урерЕ1йе Скахп», Ргос.
ИаЕ. Асай. Зек, 37, 205 (1951).

17.	Р а и 1 1 п § Ь., С о г е у К. В., «Тке Р1еаЕей 8кееЕ, а Не\у Бауег Сопй^игаИоп
оЕ Ро!урерЕ1йе Ската», Ргос. ИаЕ. Асай. Зек, 37, 251 (1951).
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

18.	Кепйгеш л. С., Рго§. Вюркуз., 4, 244 (1954).

19.	Рег и! г’з, Ргос. Коу. 8ос., А195, 474 (1949).

20.	8 1 о к е 5 А. Ц., «Тке Ткеогу о! Х-гау ПЬге И1а§гатз», Рго§. В1оркуз, 5, 140
(1955).

21.	В г а 2, Н о ду е 1 1 а, Р е г и 1 г, Ас(а СгузЕ, 5, 135 (1952).

22.	I п § г а т, С 1 Ь з о п, Р ег и 1 г, Иа1иге, 178, 906 (1956).

23.	у а I I С. Ц., 1п СкепнзЕу апд Ркуз1о1о§у о! 1ке Ь1ис1еиз, ед. Ьу V. Т. Во\уеп,
Асадеппс Ргезз, Ы. У., 1952.

24.	Со1д 8рпп§ НагЬог 8утр. <2иагЕ В1о1., 18, 133 (1953).

25.	С а з р а г И. Ь. И., Иа1иге, 177, 475 (1956).
Г лава VI

ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ

И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ

Структура молекул любого вещества зависит от характера сил, дейст-
вующих между атомами и молекулами. Структура живой системы,- которую
можно рассматривать как большой агрегат молекул, зависит не только
от внутримолекулярных сил, но и от сил, определяющих взаимодействие
молекул между собой. При рассмотрении системы, состоящей из большого
числа различных молекул, детальный анализ всех взаимодействий затрудни-
телен. Поэтому в связи с изучением живых систем мы остановимся, во-пер-
вых, на конкретных типах сил, действующих между соседними молекулами,
и, во-вторых, на общих свойствах взаимодействия между большим числом
молекул. В последнем случае возможно применение статистической механи-
ки или методов теории информации. Однако, прежде чем применять наши
знания об атомных и молекулярных взаимодействиях к живым системам,
необходимо рассмотреть физические законы, управляющие межмолекуляр-
ными и внутримолекулярными силами. В настоящее время есть все основа-
ния считать, что сложные и разнообразные процессы, протекающие в живых
системах, можно рассматривать как результат действия известных сил.
Поэтому пока противоположное не доказано, следует стремиться исполь-
зовать наши знания в области физики для объяснения жизненных процессов.

1.	Прочные и слабые связи. Силы, которые мы будем рассматривать,
соответствуют связям двух типов: прочным и слабым. Основанием для
такого разделения является сравнение с энергией теплового движения.
Так, прочной связью называют такое взаимодействие между двумя группа-
ми атомов, которое не нарушается под влиянием беспорядочного теплового
движения, т. е. при столкновениях с молекулами окружающей среды.
Одна слабая связь не может обеспечить такой устойчивости, но в настоящее
время известны системы с большим количеством слабых связей, действую-
щих согласованно, и поэтому эквивалентных прочной связи. Скелет, или
первичная структура такой большой молекулы, как белок, скреплен проч-
ными связями. Относительная же конфигурация (вторичная структура)
этого скелета как в случае вытянутой цепи, так и в случае а-спирали опреде-
ляется слабыми связями. При денатурации белка путем нагревания прежде
всего рвутся слабые связи и, следовательно, разрушаются его вторичная
и третичная структуры, причем полипептидная цепь теряет характерную
для нее форму и ее конфигурация становится неупорядоченной. Химическое
же строение цепи при этом не нарушается.

Хотя, конечно, нельзя непосредственно измерять силы, действующие
между такими малыми объектами, как атомы или молекулы, во многих
случаях энергию их взаимодействия можно определить, измеряя с помощью
различных химических и физических методов потенциальную энергию,
которая освобождается при сближении притягивающихся Друг к Другу
атомов. Поэтому непосредственно измеряемой величиной является энергия
взаимодействия, а не сила. Силу же можно вычислить, зная зависимость
Энергии от расстояния между частицами. Если V — энергия взаимодействия,
являющаяся функцией координат х, у, г, то составляющие силы в соответ-
ствующих направлениях равны

Гх=-^-,	Рг=	(6,1)

х дх у ду '	дг 1	' * '

или в векторных обозначениях

Г=—-УК	(6.1')

Поэтому правильнее употреблять выражение «сильное взаимодействие»,
чем «большая сила».

Энергия теплового.беспорядочного движения одной частицы опреде-
ляется величиной кТ, т. е. произведением постоянной Больцмана, к =

= 1,38- 10~23 дж/° К, на абсолютную температуру1. Средняя тепловая
энергия 1 моль частиц имеет порядок 1/Т, где Я — газовая постоянная,
равная 1,98 кал/моль. При комнатной температуре для тепловой энергии
одной частицы получаются значения

кТ = 1,38-10"23 дж/°К-3-102°К = 4,14-1СГ21 джъ

= 2,59.10"а эв = ^эв,

1	40

ИЛИ

0,60 ккал/моль.

Соотношение между различными единицами энергии приведено в табл. 9.

Таблица 9

Соотношение различных единиц энергии

	дж на частицу	эв на частицу	ккал1моАЪ
1 дж на частицу	.—.	6,2-1018	—.
1 эв на частицу	1,60-10-19	—	23
1 ккал!моль. . .. .	—	0,044	—

С точки зрения физики удобно пользоваться единицами, характери-
зующими взаимодействие отдельных частиц. Поэтому мы в качестве единиц
измерения будем использовать большей частью 1 эв на частицу. Более
того, мы стараемся не выражать энергию в единицах на моль, чтобы не соз-
давать впечатления, что реакции в живых системах происходят обязательно
с участием большого числа молекул.

2.	Принцип неопределенности и принцип Паули. Чтобы понять природу
прочных связей между атомами, необходимо познакомиться с некоторыми

1 Это тепловая энергия, приходящаяся на две классические степени свободы.

Полная тепловая энергия частицы идеального одноатомного газа равна ъ/^кТ-, для
частиц же, имеющих внутренние степени свободы, она становится сложной функцией
температуры.— Прим. ред.
особенностями строения атомов и их энергетических уровней. Конечно,
детальное изучение этих вопросов увело бы нас слишком далеко в сторону.
Для простейшего описания атома водорода Достаточно теории Бора, однако
она приводит к неправильному представлению о локализации электронов
на орбитах. Правильный подход к описанию атома водорода заключается
в определении электронной плотности в каждой точке атома. Таким обра-
зом, следует подчеркнуть, что нельзя говорить о каком-либо определенном
положении электрона в атоме водорода. Речь может идти только о вероят-
ности нахождения электрона в различных точках пространства. Один
из способов определения степени такого размазывания электрона связан
с применением принципа неопределенности, согласно которому произведе-
ние неопределенности в локализации, Ах, на неопределенность в импульсе,
А (тоД, частицы всегда больше или равно постоянной Планка, деленной
на 2л. Это можно изобразить следующим образом:

Ах-А (то*) >^-=-6’63 —°6 ^ж'сег''= 1,05-10-34 дж-сек.

Если электрон находится в пределах малой области пространства Ах,
неопределенность в импульсе и, следовательно, средний минимальный
импульс очень велики. Соответственно велика и кинетическая энергия
электрона, и поэтому, если нет сильного понижения потенциальной энергии,
значение полной энергии велико. Принцип неопределенности тесно связан
с волновой природой частиц. Простейшим примером применения принципа
неопределенности к атомной системе служит определение минимальной
энергии атома водорода. Если электрон, имеющий массу т и заряд е,
находится на расстоянии г от ядра, то полная энергия атома, слагающаяся
из потенциальной и кинетической энергии, в единицах МКС равна

—е2 , 1	2	е2 . (то)2

4яеог 2	4леог 2т

(6-2)

где

1

(4ле0).

= 9-109.

Полная энергия имеет наименьшее значение, когда обе величины — г и то —
минимальны. Однако ясно, что нижним пределом для них являются величи-.
ны их неопределенности. Легко показать, например, что средний импульс
не может быть меньше, чем неопределенность в импульсе. Используя
равенство гмнн-(термин = /1/2 л и уравнение (6.2), получаем

__е2	/г2

Минимальная полная энергия = -.-----------1-----5—.

4ле0гмин 8л2/пгмин

Соответствующие значения гЫЛн находят, приравнивая нулю производ-
ную от этого выражения по г и решая полученное уравнение относитель-
но Г миц.

Таким путем находим

Гмин = е0 ~~2~ — 6,5 • 10-10 м.

мип и яте2

и, следовательно,

Минимальная полная энергия = — ^^2= — 2,16-Ю-18 дж=—13,5 эв.

Эта величина совпадает с определенной экспериментально. Следовательно,
принцип неопределенности можно применять для нахождения минимальной
энергии атомных систем. Неопределенность в положении электрона при-
близительно равна среднему расстоянию электрона от ядра, поэтому пра-
вильным. является представление об атоме как о системе, в которой заряд
электрона размазан. Распределение заряда в атоме может быть рассчитана
с помощью волнового уравнения Шредингера для исследуемой атомной систе-
мы (т. е. с помощью волновых функций), которые тесно связаны с волновой
природой частиц. Пространственное изменение волновой функции зависит
от энергетического состояния атомной системы, т. е. от того, находится

Ф и г. 78. Волновые функции атома водорода.

А — основное состояние; Б — первое возбужденное состояние, для которого
момент количества движения равен нулю.

ли атом в основном или в возбужденном состоянии, а вероятность нахожде-
ния электрона в объеме пространства, ограниченном координатами х, у,$г
и х + (1х, у + (1у, г + йг, равна произведению квадрата волновой функции
на величину элемента объема, т. е. равна фа (х, у, г) дх ду <1г. На фиг. 78
показана зависимость ф от г для двух состояний атома водорода. Для’состоя-
ний атома с моментом количества движения, отличным от нуля, волновые
функции имеют более сложный характер и не обладают сферической сим-
метрией. Хотя наши рассуждения относились к атому водорода, простей-
шему из атомов, аналогичные выводы справедливы для всех атомов. Однако
необходимо введение еще одного общего принципа, так как, если исходить
только из условия минимума энергии, то в случае атомов с большим числом
электронов пришлось бы считать, что все электроны могут находиться
на одном и том же среднем расстоянии от ядра. Мы знаем, что это не так.
Этим добавочным принципом является принцип запрета Паули. Наиболее
распространенная формулировка этого принципа гласит, что в одном и том
же энергетическом состоянии могут находиться не более чем два электрона,
причем их спины, т. е. моменты количества движения, должны иметь про-
тивоположные направления. Так, например, если выделить одно из напра-
влений в пространстве, совпадающее с направлением магнитного поля,
проекция спина электрона в атоме водорода в этом направлении равна
либо з =	либо —%Л/2л (фиг. 79, А).

В случае атома гелия, имеющего два электрона, спины электронов
в основном состоянии имеют противоположные направления и полный
спин атома равен нулю, как показано на фиг. 79, Б (этот тип состояния
называется синглетным, поскольку проекция полного спина на данное
направление принимает только одно значение, равное нулю). Если спины
электронов в атоме гелия параллельны, как на фиг. 79, В, то электроны
находятся в различных энергетических состояниях и энергия атома больше
минимальной. В этом случае полный спин атома равен /г/2л; это состояние
называется триплетным, так как проекция полного спина в заданном
направлении может иметь три значения: /г/2л, —/г/2л или 0. У атома сле-
дующего элемента периодической системы, лития, только два электрона
находятся на нижнем энергетическом уровне, а третий расположен на сле-
дующем уровне. Таким образом, с помощью принципа Паули и условия

или

I ---

V 2 2>г

для
электрона I

для
электрона 2
= 0

Л

27Г

V

или 0

л

Ь

2я

Возможные ое-~
личины проекции

В

Фиг. 79. Возможные ориентации спина электрона по отношению
к определенному направлению г в пространстве (например, к на-
правлению магнитного поля).

А — две возможные ориентации спина в случае одного электрона, Б — два
электрона с антипараллельными спинами; В —два электрона с параллельными
спниами. В этом случае суммарный момент спина равен Д/2л. Три значения «2
соответствуют трем возможным ориентациям спинового момента.

минимума энергии можно объяснить порядок расположения и свойства
элементов периодической системы. Довольно часто мы будем говорить
об электронах как о частицах, находящихся в определенном месте прост-
ранства. Однако такое представление весьма нестрого. Следует помнить,
что электрон не может быть локализован точно. Он размазан по всему
атому, и его энергия и способность связывать атомы зависят от характера
распределения вероятности его нахождения в различных точках про-
странства.

Прочные связи

3.	Ковалентная связь. Простейшим примером сильного межатомного
взаимодействия может служить взаимодействие двух водородных атомов,
образующих молекулу водорода. При сближении этих атомов спины их элек-
тронов могут быть либо параллельными, либо антипараллельными. Далее,
так как невозможно отличить один электрон от другого, нельзя утверждать,
что электрон 1 всегда связан с ядром А, а электрон 2 — с другим ядром.
Каждый электрон принадлежит обоим ядрам. Согласно принципу Паули,
оба электрона могут находиться на низшем энергетическом уровне, только
когда их спины антипараллельны. Волновая функция для двухэлектронной
системы с антипараллельными спинами изображена на фиг. 80, I. Так
как в молекуле водорода электроны связаны с двумя ядрами, область
пространства, в которой может находиться каждый электрон, больше,
чем в том случае, если бы он был связан только с одним ядром. Следователь-
но, здесь неопределенность в положении больше, чем в том случае, когда
атомы разделены, и в соответствии с принципом неопределенности средний
импульс и кинетическая энергия меньше, чем для разделенных атомов.
При сближении атомов кинетическая энергия электронов сначала умень-
шается, поскольку электроны взаимодействуют уже с обоими ядрами,
т. е. из-за обмена электронов между ядрами. При очень малом расстоянии
между ядрами кинетическая энергия возрастает, так как объем системы
снова уменьшается. Таким образом, при каком-то определенном значении
межатомного расстояния полная энергия должна иметь минимум. Мы слиш-
ком упростили рассмотрение, не учитывая, что в полную энергию входит
также электростатическая потенциальная энергия. Однако и при учете
этого члена наш вывод о существовании минимума энергии при определен-
ном расстоянии между ядрами остается правильным. Обменное взаимодей-
ствие было впервые рассмотрено Гейтлером и Лондоном, которые рассчитали

Фиг. 80. Волновая функция для двух атомов во-
дорода.

I — спины электронов антипараллельны; II — спины электро-
нов параллельны.

гго величину для Н2. Оно возникает благодаря тому, что электрон принадле-
жит обоим атомам. Взаимодействие такого типа называется ковалентной
связью.

Если, однако, электроны обоих атомов водорода, находящихся в основном
состоянии, имеют параллельные спины, взаимодействие носит совершенно
иной характер. Из принципа Паули следует, что эти электроны не могут
находиться в одном и том же состоянии. Это условие сказывается на харак-
тере соответствующей волновой функции, изображенной на фиг. 80, II.
Значение волновой функции между ядрами в этом случае равно нулю
(так как электроны не могут находиться в одном и том же состоянии).
Вследствие этого неопределенность в положении' каждого электрона мала
и соответственно, неопределенность в величинах их импульсов велика.
Поэтому при сближении атомов, в которых спины электронов параллельны,
энергия системы увеличивается, т. е. они отталкиваются Друг от
Друга. ~

Наглядно эти результаты можно изобразить в виде графика, выражаю-
щего зависимость энергии от расстояния между ядрами. На фиг. 81 приведе-
ны соответствующие кривые для параллельной и антипараллельной ориента-
ции спинов. Для состояния с параллельными спинами (триплетного) энер-
гия не имеет минимума, т. е. атомы всегда отталкиваются. В устойчивом
состоянии, когда спины антипараллельны, ядра совершают колебания
в определенных границах. Так как полная энергия осциллятора равна
максимальной потенциальной энергии, кривые на фиг. 81 называются
кривыми потенциальной энергии. Энергию, необходимую для удаления
ядер друг от друга, т. е. перевода их из наиболее устойчивого положения
(низшего энергетического уровня) в бесконечность, называют энергией
диссоциации или энергией связи.

Таков же механизм взаимодействия более сложных атомов, например
углерода, кислорода и азота, для которых число пар взаимодействующих
электронов больше, чем в случае атома водорода. Обычно пару взаимодей-
ствующих электронов изображают с помощью черты, проведенной^ между

Фиг. 81. Кривые зависимости энергии взаимо-
действия двух атомов водорода от расстояния
между ядрами.

Если спины электронов антипараллельны, образуется
стабильная молекула (7). Если спнны параллельны, то
между атомами возникает отталкнвание (II). Энергия
атомов, находящихся на бесконечном расстоянии друг
от друга, принята равной нулю.

рассматриваемыми ядрами. Энергии диссоциации этих ковалентных связей
могут быть очень велики. Типичные значения энергий диссоциации привс
дены в табл. 10.

Таблица 10

Энергии диссоциации для наиболее типичных связей

Связь	Энергия диссоциации, эв
н—н	4,40
ж 1 о /|\	2,55
уС—н	3,80
	2,13
(пептид)	3,03
/С==С\	4,35
/С=О	6,30
— с = с—	5,35

4.	Ионная связь. Ионная связь представляет собой предельный
случай ковалентной связи, когда распределение электронов между атомами
настолько асимметрично, что взаимодействие можно считать чисто электро-
статическим. Характерным примером такого взаимодействия является
молекула хлористого натрия. Электростатическое взаимодействие можно
уменьшить, если, например, поместить молекулы в среду с высокой диэлек-
трической проницаемостью, такую, как вода. В результате этого происхо-
дит диссоциация. Действительно, согласно закону Кулона, энергия электро-
статического взаимодействия V двух зарядов, д1 и <72, находящихся на рас-
стоянии г друг от друга в среде с диэлектрической проницаемостью 8, равна

у __ <№2

5.	Резонанс. Поскольку система ядер и электронов может находиться
в нескольких почти равновероятных состояниях, то нельзя считать, что
ее реальное состояние соответствует какой-либо одной конфигурации.
Это обстоятельство связано с неопределенностью в положении электрона.

Фиг. 82. Примеры так называемых резонанс-
ных структур.

I — комбинация, описывающая структуру бензола;
II — комбинация, описывающая пептидную связь; III —
распределение плотности' нелокализованных электронов
в бензоле.

Вследствие этого конфигурацию системы следует рассматривать как сумму
всех возможных конфигураций, в которую каждая из них входит с опреде-
ленным весом. Это приводит к увеличению области, в которой могут нахо-
диться электроны, так как вероятность возникновения каждой из этих
конфигураций очень велика. Рассуждения, аналогичные примененным
в случае молекулы водорода, приводят к выводу, что благодаря этому
обстоятельству энергия системы должна уменьшаться. Лучшим примером
описываемого эффекта служит, конечно, молекула бензола. Ей следует
приписать структуру, представляющую собой комбинацию форм А и В,
изображенных на фиг. 82, /, а не какую-либо из этих основных форм в от-
дельности (так называемый резонанс). Благодаря резонансу молекула
бензола оказывается намного устойчивее, чем каждая из структур А и В.
Термин «резонанс» не означает, что конфигурация молекулы бензола пере-
ходит из одной возможной формы в другую. Суть дела именно в том, что
электронная конфигурация молекулы бензола представляет собой, как
указано выше, комбинацию этих двух форм. Только из-за упрощений,
связанных с нашим способом изображения ковалентных связей, мы изо-
бражаем молекулу бензола с помощью формул, подобных приведенным
на фиг. 82. Существование резонанса подтверждается не только вызывае-
мой им дополнительной стабилизацией молекулы, но и данными по длинам
связей, полученными с помощью рентгеноструктурного анализа. Например,
обычно длина связи С — С равна приблизительно 1,54 А, а С = С —1,34 А,
для бензола же расстояние между атомами углерода составляет 1,39 А,
1то обусловлено явлением резонанса.
Для пептидной связи расстояние между атомами С и М составляет
1,32 А, тогда как для других соединений связь С — И имеет длину 1,48 А
и С — П —1,28 А. Это подтверждает существование резонанса и в случае
пептидной связи. При этом дополнительная энергия стабилизации, обусло-
вленная этим явлением, равна примерно 1 эв, или 23 ккал/моль.

Мы рассматривали образование молекул как результат взаимного
притяжения атомов. При объяснении и расчете этого притяжения исполь-
зовались волновые функции (орбитали) атомов и зависимость этих функций
от расстояния между ядрами. Во многих случаях, втом числе и при резонансе,
описанном выше, в процессе взаимодействия атомные орбитали изменяются
настолько сильно, что результирующая молекулярная волновая функция
(молекулярная орбиталь) оказывается мало связанной с первоначальными
атомными орбиталями. Поэтому более разумным подходом является экспе-
риментальное определение положений ядер и расчет электронного распреде-
ления уже для наблюдаемой ядерной конфигурации. Такой способ расчета
называется методом молекулярных орбит. Этот метод дает возможность
установить, что молекула бензола имеет шесть нелокализованных электро-
нов, т. е. шесть электронов, связанных скорее с бензольным кольцом
в целом, чем с индивидуальными ядрами. Эти электроны локализованы
в кольцах выше и ниже плоскости молекулы (см. фиг. 82, III).

Слабые связи

6.	Взаимодействие диполь — диполь. Слабые взаимодействия между

молекулами и атомами аналогичны силам, действующим между молекула-

Ф и г. 83. Схематическое
изображение диполя в элек-
трическом поле.

На диполь действует момент си-
лы, равный Г1 81П &=Ец1 ЯП 0=
\рЕ мп е.

ми веществ, находящихся в газообразном состоя-
нии (это те силы, которые обусловливают от-
клонения от законов идеальных газов). Так как
эти силы могут быть определены эксперимен-
тально с помощью уравнения состояния Ван-дер-
Ваальса, их часто называют ван-дер-ваальсовыми
силами. Простейшим примером ван-дер-ваальсо-
вых сил служит сила, действующая между
двумя электрическими диполями, называемая
силой диполь — диполь. Диполем называются
два одинаковых по величине, по противополож-
ных по знаку заряда, находящиеся на некото-

ром расстоянии друг от друга. Дипольный момент р равен произведению
величины одного из зарядов диполя на расстояние между зарядами



Приведем типичные значения дипольных моментов:

Молекула	р, к-м-10йи
со2  НС1  н2о  МНз  Глицин  Яичный альбумин	0,00  3,4  6,0  5,0  50  830

Если диполь находится в электрическом поле Е (см. фиг. 83), то на него
действует крутящий момент, стремящийся установить диполь параллельно
полю. Чтобы повернуть диполь, параллельный полю, на угол 0, нужно
совершить работу. Вычислив величину этой работы, можно на основании
распределения Больцмана определить число диполей, направленных под
углом 0 по направлению к полю. Для того чтобы повернуть диполь из поло-
жения 0 в положение 0 + с!0 с помощью внешних сил, нужно совершить
работу, равную

йй7 = + рЕ 81П 0

Полагая, что при 0=0 потенциальная энергия равна нулю, получаем
выражение для потенциальной энергии при величине угла, равной 0:

е	е

Уе =	== рЕ \ зт 0 й0 == рЕ (1 — соз 0).	(6.3)

о	о

Благодаря тепловому движению диполи распределены вокруг энергетиче-
ски низшей конфигурации по закону Больцмана:

«е = е-ие/йт
«о	’

где ие и 770— числа диполей, направленных под углом 0 и 0 к направлению

поля, кТ — средняя тепловая энергия. С помощью уравнения (6.3) получаем

— р—-рЕ/кТ. ррЕ соз е/ЬТ	С0

ПО		К ’

Так как первый экспоненциальный член постоянен, то угловое распределе-
ние определяется множителем ерЕ С0Вв/кТ. Число диполей, составляющих
с полем угол 0, уменьшается при увеличении 0 от 0 до л.

Для малых молекул или для величин электрических полей, с которыми
обычно работают в лаборатории, ~ равно приблизительно единице, так
как в этих случаях кТ велико по сравнению с рЕ. Например, если Е =
= 3-107 в/м и р = 3,3- 1СГ30 к-м, то рЕ = 10-22дж. При комнатной темпера-
туре кТ = 4,1-10“21дж, рЕ/кТ — 0,024 и ерЕ1р'г = 1,02.

Теперь мы можем решить интересующую нас задачу, а именно опреде-
лить энергию взаимодействия (притяжения или отталкивания) двух дипо-
лей — р! и р2. Диполь Р1 создает электрическое поле БД благодаря которо-
му на диполь рг действует ориентирующий его крутящий момент. Этот
диполь стремится повернуться так, чтобы его энергия была минимальной.
В результате такой ориентации энергия двух взаимодействующих диполей
меньше, чем прй бесконечном расстоянии между ними, т. е. они притяги-
вают друг друга. Для упрощения расчетов мы воспользуемся грубым
приближением. Из фиг. 84, А видно, что электрическое поле Б\ диполя
р1 зависит от ориентации р1 относительно прямой, соединяющей диполи
р1 и рг; мы возьмем в качестве среднего электрического поля, создаваемого
диполем Р1, величину

г —

1 4легЗ ’

где 8 — диэлектрическая проницаемость среды. Далее, вместо выражения
для энергии взаимодействия V = —р2Е1со& 0 мы используем приближенное
значение V — —РъЕ^. Тогда формула для энергии взаимодействия дипо-
лей Р1 и рг будет иметь следующий вид:
Если р1 = рг = Ю“29к-л, а г = 5 А, то получаем для энергии
взаимодействия приблизительно 0,02 эв (в вакууме). Эта величина близка
к значению средней тепловой энергии молекулы (0,025 эв). Поэтому ясно,
что необходимо также учитывать беспорядочность ориентации диполей
обусловленную свободным вращением под влиянием теплового движения.
При этом притяжение и отталкивание будут в среднем равновероятны.
Результирующее взаимодействие определяется тем, что, как легко убедить-
ся, энергия конфигурации, соответствующей отталкиванию диполей, превы-
шает энергию конфигурации, при которой между диполями существует

*-----г------*•	-------г-------- у Л

Р^ г 2р	Л *"	Л Рг

1	4 ЛЕГ3

'''Х Ь

А	Б ...

Фиг. 84.

А —электрическое поле иа расстоянии г от диполя р2', В—ориентация
диполя р%, находящегося в состоянии с наименьшей энергией, под дей-
ствием поля, создаваемого диполем р±.

притяжение, на 2р1р2/4лег3. Таким образом, антипар аллельная конфигу-
рация является более предпочтительной благодаря действию электрического
поля, равного р1/4лвг3. Этот эффект может быть рассчитан с помощью
распределения, описываемого уравнением (6.4).

Для оценки степени преимущественной ориентации диполей пользуют-
ся значением проекции среднего дипольного момента рг в направлении Е1.
Если взаимодействие мало по сравнению с тепловой энергией, т. е. ръЕ^ <
< кТ, то, как легко показать,

Р2

_ 1

3 кТ *

(6-5)

Таким образом, энергия взаимодействия двух диполей, испытывающих

относительно сильное воздействие тепловых возмущений, равна

V = — р2Е! =

1 е1р1

3 кТ

I р1 I

3 (4ле)2 кТ г6

(6.6)

Это выражение описывает взаимодействие двух слабых диполей, а также
двух сильных диполей, находящихся на большом расстоянии друг от друга.

Рассматривая уравнение (6.6), следует обратить внимание на две
существенные закономерности. Во-первых, взаимодействие быстро ослабе-
вает с увеличением г. Действительно, так как сила взаимодействия диполь—
диполь обратно пропорциональна г6, эффективный радиус этого взаимо-
действия не превышает нескольких ангстрем. Во-вторых, взаимодействие
пропорционально обратной величине квадрата диэлектрической проницае-
мости. Для воды при большом расстоянии между диполями е/е0— 80.
Если диполи сближаются вплотную так, что между ними не остается места
для молекул воды, диэлектрическая проницаемость в пространстве между
ними близка к единице. Такая зависимость е от расстояния также обуслов-
ливает короткодействующий характер рассматриваемых сил. Быстрое
изменение энергии взаимодействия с расстоянием показано на фиг. 85.
Минимум на этой кривой обусловлен возникновением отталкивания дипо-
лей на малых расстояниях, на которых электронные облака начинают
перекрываться.

7.	Взаимодействие постоянных и индуцированных диполей. Силы,
действующие между молекулами, нельзя свести только к взаимодействию
типа диполь — диполь. Между такой молекулой, как Н2О, обладающей

Расстояние между ядрами,

двух постоянных диполей, рассчитанная с по-
мощью уравнения (6.6), от расстояния между
ними (Р1 = р2=3,3-10”30 К'М, Т — 300°К, е/е0 =
= 80).

Пунктирная кривая схематически описывает эффект, свя-
занный с уменьшением эффективной диэлектрической
проницаемости иа малых расстояниях. На расстояниях,
меньших примерно 2а, начинает играть большую роль
отталкивание электронных облаков, что приводит к воз-
растанию энергии взаимодействия.

постоянным "дипольным моментом, и неполярной в отсутствие поля моле-
кулой СОг также существует взаимодействие, которое связано с возникно-
вением у молекулы СО2, Находящейся в поле молекулы Н2О, индуцирован-
ного дипольного момента. Поле постоянного диполя в точке, занимаемой
неполярной молекулой, равно Е1 = р1/4лег®, и индуцированный диполь-
ный момент выразится следующим образом:

р2 = аЕ1.	(6.7)

Коэффициент пропорциональности а называется поляризуемостью
молекулы. С помощью этой формулы получаем

(6.8)

Грубая оценка а может быть произведена следующим путем. При
взаимодействии двух постоянных диполей средний дипольный момент
одной из молекул, находящейся в поле другой молекулы, задается уравне-
нием (6.5). Коэффициент пропорциональности в этом случае равен | р\/кТ.
Таким образом, «поляризуемость» постоянного диполя равна приблизи-
тельно квадрату дипольного момента, деленному на среднюю энергию
этого диполя. Будем теперь рассматривать неполярную молекулу как
10 Заказ № 1168
совокупность распределенных некоторым образом флуктуирующих заря-
дов; среднее значение этого распределения может быть представлено
с помощью функций, подобных приведенной на фиг. 78. Дипольный момент
молекулы можно записать как где е — заряд электрона, а й2— размер
атома или молекулы. Величина этого дипольного момента подвержена
флуктуации, причем ее среднее значение равно нулю. Энергия, обусловлен-
ная таким диполем, также флуктуирует. Полная энергия диполя в рассмат-
риваемом случае колеблется около значения, равного энергии связи элект-
рона в молекуле (а не кТ, как это имело место ранее). Энергия связи равна
приблизительно потенциалу ионизации атома Ув,- С ее помощью можно
оценить поляризуемость аналогично тому, как это было сделано выше
[уравнение (6.5)]:

(«*2)2

Ув

(6-9)

Таким образом, взаимодействие постоянного и индуцированного дипо-
лей, как следует из уравнения (6.8), может быть описано следующим выра-
жением:

6	(6.10)

(4ле)3г6 Ув	'	’

Это взаимодействие также зависит от 1/е2г6 и, следовательно, является
короткодействующим. Энергия связи валентных электронов большинства
атомов составляет примерно 10 эв, а средняя тепловая энергия равна 1/40 эв;
отсюда следует, что влияние температуры на силы такого типа ничтожно.
Взаимодействие постоянного диполя с индуцированным может, конечно,
вносить свой вклад также и в том случае, когда взаимодействующие молеку-
лы обладают постоянными диполями.

8.	Взаимодействие переходного и индуцированного диполей. Описан-
ных выше дипольных сил недостаточно даже для объяснения очень простых
физических явлений. Действительно, притяжение имеет место и в случае
частиц, не имеющих постоянных диполей, например между неполярными
молекулами водорода или атомами благородных газов, строение которых
симметрично. Наблюдаемое взаимодействие молекул Н2 в 100 раз сильнее,
чем их взаимодействие, связанное с квадрупольными моментами, а благо-
родные газы вообще не имеют мультипольных моментов. Кроме того, силы,
обусловленные постоянными диполями, не аддитивны. Два диполя, притя-
гивающиеся друг к другу, не могут уже притягивать третий диполь. Эффек-
ты, которые не связаны с наличием у молекул постоянных диполей, объяс-
няются существованием сил взаимодействия между переходными и индуци-
рованными дипольными моментами. Ван-дер-ваальсовы силы такого типа
обусловливают взаимодействие неполярных атомов, которые также следует
рассматривать как совокупность распределенных некоторым образом
электронных зарядов, флуктуирующих во времени. Флуктуации заряда
вызывают флуктуации энергии, которые совершаются около некоторого
среднего значения, равного приблизительно потенциалу ионизации. В неко-
торых случаях один из неполярных атомов может иметь большой переход-
ный дипольный момент. Этот диполь создает электрическое поле, индуцирую-
щее средний дипольный момент во втором атоме. Благодаря этому диполи
притягиваются друг к другу с силой, определяемой выражением, аналогич-
ным уравнению (6.10), с той только разницей, что постоянный дипольный
момент р1 должен быть заменен флуктуирующим дипольным моментом
атома или молекулы 1, равным есц. Частота этих флуктуаций ~ 1015 раз
в секунду, что приблизительно равно частоте колебаний видимого или
ультрафиолетового света. Поэтому молекулы окружающей среды не успе-
вают поворачиваться, и при расчете диэлектрической проницаемости е/е0
ее следует выражать через квадрат показателя преломления п. Так как
все это верно также по отношению к атому 2, дипольный момент которого
индуцируется полем атома 1, выражение для энергии взаимодействия

имеет вид

У^

(ещ)2 (еа2)2

(4зге0)2 пМ (Ищ+Увг) ’

С помощью уравнения (6.9) получаем

а1а2ЦВ1

У ~ (4ле0)2пМ (ЦВ1 + 1/в„) •

(6.Н)

(6.1 Г)

Как и в предыдущих случаях, это взаимодействие пропорционально
1/г6. Для малых молекул с малыми постоянными дипольными моментами
силы, возникающие при взаимодействии переходных и индуцированных
диполей, особенно велики. В растворах эти силы преобладают для молекул
любых размеров, так как в этом случае и4 намного меньше,' чем е2/е°. Для
воды е2/е2 = 6400 и п4= 3,2. Уже одно это увеличивает член, связанный
с переходным дипольным моментом, в 2000 раз. Так как частоты флуктуаций
в выражении для силы, обусловленной переходным дипольным моментом,
эквивалентны частотам световых колебаний, то константы в уравнении
(6.11) можно рассчитывать, исходя из данных по дисперсии света, т. е.
из зависимости показателя преломления от частоты. Поэтому эти силы
называют также дисперсионными', поскольку впервые они были рассмотрены
Лондоном, их называют иногда силами Лондона.

Таблица У7

Коэффициенты при —1/г6 в уравнении (6.12) для различных молекул* [7]

’ Молекула	X Ю+18	а, X Ю+24	«Энергия связи», эв	4 Р4/*7, X10+60	2р2а, ХЮ»	4  X 1 0+60
со	0,12	1,99	14,3	0,0034	0,057	67,5
Н1	0,38	5,4	12	0,35	1,68	382
НВг	0,78	3,58	13,3	6,2	4,05	176
НС1	1,03	2,63	13,7	18,6	5,4	105
кн3	1,5	2,21	16	84	10	93
н2о	1,84	1,48	18	190	10	47

=* €/80=1. Применена электростатическая система единиц СС8, но «энергии связей» выра-
жены в эв. 7=293° К-	<

Значение дисперсионных сил становится ясным при рассмотрении
табл. 11, в которой приведены величины различных дипольных взаимо-
действий между одинаковыми молекулами в газовой фазе. В этом случае
диэлектрическая проницаемость и показатель преломления равны единице.
Даже для молекул с большими постоянными дипольными моментами диспер-
сионные силы очень велики. Полная энергия взаимодействия рассчитывается
с помощью выражения, представляющего собой результат суммирования
уравнений (6.6), (6.10) и (6.11); однако в них подставляются более точные
10*
значения множителей. Конечное выражение имеет вид

I/_____Г 1 Л Р1Р2 । _2„ । п2„ Л ।__________1	3	VВ11хВг 1

г -	гб [ (4ле)2 <	3 кТ +^С'2-г/?2а1> + (4л80)2И4	2	УВ1+Увг 4	‘

(6.12)

На первый взгляд коэффициенты, приведенные в табл. И, малы. Напом-
ним, однако, что при вычислении энергии взаимодействия эти величины
делятся на г6. Если г = 1 А, то

-эрг-см? = 10-12эрг=0,6эв.

Эта энергия очень велика по сравнению с кТ.

9.	Дисперсионные силы, действующие между большими молекулами.
Взаимодействие переходного и индуцированного диполей двух атомов
или двухатомных молекул определяется, согласно табл. 11, выражением
типа

V ——где В10“58 эрг-см? = 10~77 дж-м6. (6.12')

Если две большие молекулы находятся близко друг от друга, то каж-
дый атом одной молекулы притягивает каждый атом другой и, обратно.

Фиг 86. Определение параметров
для притягивающихся сфер, энер-
гия взаимодействия которых опре-
деляется из уравнения (6.13)
в = д./а = (Н -\-2а)/а.

каждый атом второй молекулы притя-
гивает каждый атом первой. Эти силы
аддитивны. Следовательно, суммарное
взаимодействие пропорционально квад-
рату числа атомов в 1 слг3 (А2). Величина
взаимодействия, конечно, зависит, кроме
того, от формы рассматриваемых моле-
кул. Так, например, при вычислении
полного взаимодействия двух сфер
с одинаковыми радиусами следует учиты-
вать взаимодействия между всеми па-
рами атомов. Этот метод расчета до не-
которой степени аналогичен тому, кото-
рый применяется для гравитационных

сил, с одной только разницей: в случае ван-дер-ваальсовых сил необходимо
учитывать, что масса сферы распределена по всему ее объему, а не сосре-
доточена только в центре. Это связано с тем, что энергия ван-дер-ваальсова
взаимодействия зависит не от первой степени расстояния между атомами,
как в случае гравитации, а от шестой. Для сфер, изображенных на фиг. 86,
энергия взаимодействия выражается следующим образом:

лВ2В С 2	2	1П82— 4\

6 <82-4 1 52 1	«2	) ’

(6.13)

где В — константа взаимодействия двух атомов. Если расстояние И между
сферами значительно меньше радиуса сферы, то энергия взаимодействия
приблизительно равна

17 _лВ -В а

у^н-	<6ЛЗ>

Следовательно, на малых расстояниях взаимодействие двух сфер зависит
не от шестой степени расстояния, а от первой. Эта зависимость затем пере-
ходит в зависимость типа \/Н2 и носит такой характер вплоть до расстоя-
ний порядка -^- =0,4. Это объясняется следующим образом. При удалении
сфер друг от друга сила притяжения между атомами уменьшается пропор-
ционально г7. В то же время составляющие этих сил в горизонтальном
направлении (см. фиг. 86) увеличиваются, а так как результирующая
сила равна сумме горизонтальных составляющих сил между атомами, она
уменьшается медленнее, чем силы, действующие между отдельными атомами.

Казалось бы, при увеличении размеров сфер энергия взаимодействия
может расти до бесконечности. Однако это не так. Для сфер большого

размера время распространения
электрического поля начинает иг-
рать весьма существенную роль;
оно становится сравнимым со вре-
менами флуктуации электронных
облаков. Поэтому в случае больших
объектов колебания индуцируемых
диполей не совпадают по фазе и
силы становятся неаддитивными.
Для предельного случая можно
произвести следующую грубую
оценку. Частота флуктуации элек-
тронного облака равна примерно
1016 в 1 сек. За 10~1В сек свет
проходит расстояние в 3-10-7 лг,
или 3000 А. Это расстояние соот-
ветствует полному периоду флук-
туации. Поэтому, чтобы силы
были аддитивными, расстояние
между молекулами должно быть
несколько меньшим — порядка
1000 Л (0,1 ц). Из-за конечной вели-

Н/ Объем

Фиг. 87. Зависимость энергии ван-дер-
ваальсового взаимодействия от отношения
расстояния между молекулами (Н) к кор-
ню кубическому из объема молекулы [9].
Обе шкалы логарифмические. Предполагается
также, что рассматриваемые молекулы имеют
одинаковые объемы, но отличаются по форме
(форма молекул указана на графике). Величина
принята равной 3- !0~12 эрг.

чины скорости света ваи-дер-вааль-

сово взаимодействие даже для очень больших объектов может быть не очень
сильным. Однако для расстояний, не превышающих по порядку 1000 А,
можно утверждать, что ван-дер-ваальсовы силы между большими части-
цами действуют на большом расстоянии. Для малых частиц эти силы
не обладают таким дальнодействием.

Расчет притяжения между большими молекулами связан с трудностями
геометрического характера при суммировании пар сил. Волд [9] получила
следующий важный результат: энергия притяжения является величиной

того же порядка, что и тепловая энергия, если расстояние между частицами
составляет приблизительно кубический корень из объема молекулы. Она
показала также, что эта энергия не очень сильно зависит от формы частиц,
хотя, конечно, две плоские частицы притягиваются сильнее, чем две сферы.
Например, с помощью уравнения (6.13'), полагая Н = 2а, получаем
V = —л№В/24. Если А = 1023 атомов на 1 см3, то лА25 = 3-10 12эрг
и V приблизительно равно 1,2-10"13 эрг, или 0,08 эв. На фиг. 87 изображена
зависимость энергии взаимодействия от расстояния для трех различных
форм молекул.

10.	Водородная связь. По-видимому, из всех короткодействующих сил
самая важная роль в биологии принадлежит водородным связям. Их приро-
да довольно проста. Группы ковалентно связанных атомов — ОН и \ын

имеют большие дипольные моменты. В области ядра водорода существует
избыточный положительный заряд, так как плотность электронов около
более тяжелого ядра выше. Поскольку атом водорода имеет только один
электрон, отрицательно заряженные группы других молекул (или отрица-
тельно заряженные концы других диполей) или той же самой молекулы
могут приблизиться к протону вплотную (насколько позволяет отталкива-
ние электронных облаков). Возникающее при этом электростатическое
взаимодействие называется водородной связью. Зависимость подобной силы

взаимодействия зарядов от расстояния между ними при малых расстояниях
имеет вид 1/г2, так как диэлектрическую проницаемость для малых рас-

Ф и г. 88. Зависимость энер-
гии взаимодействия от расстоя-
ния между ядрами кислорода
для связей типа—О—Н...О<\

стояний можно считать равной единице.
Энергия водородной связи может достигать
величины 10 ккал/моль, или 1/2 эв на частицу.
Обычно водородную связь между группами.

подобными — ОН и

С= О изображают

в

виде — О — Н . . . О =	. Именно суще-

ствованием связей такого типа объясняют

отличие физических свойств воды от свойств
других жидкостей.

Значение водородных связей для био-

логически важных молекул связано с тем,
что в белках, нуклеиновых кислотах и поли-
сахаридах содержится большое число групп,
способных образовывать связи этого типа.
В ряде случаев первичная структура молекул

такова, что эти группы располагаются в

специфическом правильном порядке. Так как энергия молекулы
должна быть минимальной, то число водородных связей в ней должно

быть максимальным, если только их образование не приводит к увеличению
энергии или деформации других связей. Поэтому понятно, что водородные
связи должны играть важную роль при образовании вторичной и третичной
структур. В гл. V мы видели, что водородные связи обусловливают возник-
новение структур складчатого типа или типа « спирали в белках, а также

образование пар между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями
в двойной спирали ДНК. Процессы жизнедеятельности протекали бы совер-
шенно иначе, если бы не было водородных связей.

Влияние водородных связей на энергетические уровни отдельных
атомных групп можно обнаружить спектроскопически. Этот вопрос будет
рассмотрен более подробно в гл. VII. На фиг. 88 приведена зависимость

энергии водородной связи типа — О — Н . . . О

от расстояния между

ядрами кислорода [И].

11.	Взаимодействие флуктуирующих зарядов. Большие молекулы,
находящиеся в растворе, содержат большое число ионизованных групп,
в частности —СОСГ и —ПН*. В каждый определенный момент времени
часть этих групп полностью ионизована (хотя, если иметь в виду среднее
по времени, можно считать, что частично ионизована каждая группа).
Поэтому протоны переходят (более или менее беспорядочно) от одной груп-
пы к другой, что приводит к флуктуациям дипольного момента всей моле-
кулы. Так же как в случае дисперсионных сил, такая флуктуация момента

индуцирует диполи в соседних молекулах и приводит к возникновению
притяжения между молекулами [10]. Поскольку частоты этих флуктуаций
относительно невелики (приблизительно 107г^), в знаменатель выражения
для этого поля должен входить квадрат диэлектрической проницаемости.
Подобно другим слабым силам связи, эти силы являются короткодействую-
щими.

Молекулы в растворе

12.	Теория Дебая — Гюккеля. Между большими молекулами в рас-
творе действуют ван-дер-ваальсовы силы. Однако силы взаимодействия
между молекулами в растворах не сводятся только к ним. Большую роль

Ф г и. 89. Зависимость потенциала равномерно заря-
женной сферы от расстояния г.

А — в отсутствие свободных ионов в среде; Б — при наличии
свободных зарядов в среде.

играют также силы, обусловленные существованием зарядов на поверх-
ности молекул. Анализ роли этих сил очень труден. В общем случае эта
проблема еще не решена, однако мы можем дать представление о под-
ходе к ее решению.

Представим себе большую молекулу, например молекулу белка или
нуклеиновой кислоты, находящуюся в растворе. Если молекулы раство-
рителя полярны, как в случае воды, многие группы в молекуле, в частности
группа СО.ОН, могут быть ионизованными, так как в среде с большой ди-
электрической проницаемостью ионные связи ослабляются. В ионизован-
ном состоянии энергия молекулы больше, чем в неионизованном. Заря-
женная молекула притягивает к себе из раствора ионы противоположного
знака. Эти так называемые противоионы «облепляют» большую молекулу,
создавая тем самым двойной электрический слой, который состоит из заря-
дов самой молекулы и зарядов противоположного знака, находящихся
в прилегающем к молекуле слое раствора. Таким образом, в растворе две
заряженные молекулы отталкиваются друг от друга с меньшей силой, чем
при равных условиях в воздухе, так как противоионы уменьшают электри-
ческое поле, окружающее каждую молекулу. На фиг. 89 показана зависи-
мость электрического потенциала от расстояния для равномерно заряжен-
ной сферы в среде, не содержащей свободных ионов (А), и для той же сферы
в среде, содержащей свободные положительные и отрицательные ионы (5).

В не содержащей ионы среде потенциал поля сферы радиуса а по мере
удаления от нее уменьшается пропорционально <?/4л;ег, где ? — заряд сферы.
В проводящей же среде ионы противоположного знака стремятся «обле-
пить» заряженную сферу. В отсутствие теплового движения заряды рас-
твора нейтрализовали бы заряд сферы и поле вне сферы было бы поэтому
равно нулю. В действительности же ионы раствора испытывают столкнове-
ния с частицами окружающей среды, что вызывает флуктуации зарядов
в каждой точке среды. При повышении температуры эти флуктуации увели-
чиваются. Тем не менее в растворе вблизи положительно заряженной сферы
существует избыток отрицательного заряда, а на большом расстоянии
от нее — избыток положительного. Если бы мы знали величину электри-
ческого потенциала V в каждой точке раствора, то, конечно, можно было бы
определить силу, действующую на любой заряд, находящийся в этом растворе,
так как величина сйлы, действующей на единичный заряд, нам известна
[уравнение (6.1)]. Наша задача, таким образом, сводится к следующему:
в растворе, содержащем большие молекулы  и ионы, нужно определить
зависимость потенциала от положения выбранной точки. Итак, мы при-
ходим к рассмотрению теории Дебая — Гюккеля.

Пусть раствор содержит ионы различных типов, например Иа+, С1“, .
ОН”, 8О~ и т. д. Обозначим заряд иона /-го типа через <7г, а число таких
ионов в единице объема — через щ. Если потенциал (т. е. потенциальная
энергия единичного заряда) в какой-либо точке пространства х, у, х равен V,
то число ионов щ типа I в этой точке можно определить с помощью обычного
распределения Больцмана:

«г

е~^1ПТ,

 -оУ/ЪТ

ИЛИ Пг — П^е г ,

(6-14)

где пг— среднее число ионов типа I на единицу объема (т. е. число ионов
на единицу объема в точке, для которой выполняется условие V = 0, также
равно «г)- Плотность заряда определяется из выражения

6=2^ п'г

(6.15)

Важно с самого начала отметить, что число зарядов на единицу объема п’г,
плотность зарядов р и потенциал V являются функциями координат точки
и (в среднем) не зависят от времени:

п’г = п’г (х, у, х)\ р = р (х, у, х); V = V (х, у, г)

Теперь определим зависимость потенциала от плотности зарядов. Поскольку
мы имеем дело с непрерывным потоком электрических зарядов, можно
использовать для этого уравнение Пуассона

(6-16)
дх2 1 ду2 дг2	е ’	4	'

где е, как и раньше, — средняя проницаемость среды. Исключая из этого
уравнения плотность зарядов с помощью уравнения (6.15) и п с помощью
уравнения (6.14), получаем

(6.17)

е г

Таким образом, мы пришли к уравнению, в котором фигурируют электриче-
ский потенциал V, заряды ионов, среднее число ионов каждого типа на еди-
ницу объема и координаты. Решив это уравнение относительно V, можно
было бы определить потенциал в каждой точке раствора, а зная потенциал,
можно рассчитать плотность зарядов и число ионов в различных точках
раствора.

При решении уравнения (6.17) нужно учитывать граничные условия,
т. е. значения потенциала в определенных точках пространства, подобно
тому как при решении уравнения диффузии мы исходили из значений кон-
центраций в определенные моменты времени. Эти условия зависят от харак-
тера решаемой задачи. Ложно, например, вычислять поле одиночной заря-
женной сферы, потенциал которой известен; при этом значение потенциала
в бесконечности можно положить равным нулю. Если нас интересует
взаимодействие двух сфер, в качестве граничных условий можно выбрать
значения потенциала на поверхностях этих сфер, а потенциал в бесконеч-
ности считать равным нулю и т. д.

Уравнение (6.17) ни в одном из этих случаев не имеет простого реше-
ния. В общем случае его следует решать приближенными методами. Для
того чтобы получить представление о характере искомой функции, по-
лезно (хотя, конечно, не обязательно1) воспользоваться приближенным
методом решения. Если предположить, что потенциальная энергия дУ
заряда <7г во всех точках.среды мала по сравнению с кТ и полный заряд
системы равен нулю (т. е. раствор нейтрален), то

У„Л1 = 0 и

Таким образом, уравнение (6.17) принимает вид

г

ИЛИ

г

Обозначив

(6-18)

получим

?2 * *У — к-У = О.	(6.19)

Это приближенное уравнение в некоторых простых случаях решается очень
легко. При выполнении граничного условия V = Уо на бесконечной пло-
скости, совпадающей с плоскостью ух, имеем

\Т — Уое~кх.

При отсутствии свободных зарядов потенциал V должен уменьшаться в зави-
симости от расстояния линейно. Если в растворе находится заряженная
сфера радиуса а, на поверхности которой потенциал равен Ео, то в среде

У = У0-^е-Мг-а).

Это уравнение кривой, изображенной на фиг. 89,Б.

Грубо говоря, \/к равно расстоянию, на котором потенциал уменьшается
до е-1 = 0,37 своего начального значения. В табл. 12 приведены некоторые
значения к. Уравнения (6.18) и (6.19) показывают, что важным параметром

1 Здесь авторы не правы: в действительности это не только полезно, но и обя-

зательно, так как в теории Дебая — Гюккеля среднее значение функции заменяется

функцией от среднего значения, что допустимо только в линейном приближении.—

Прим. ред.
при определении распределения потенциала является	Поэтому

свойства растворов различных составов следует сравнивать при одном
и том же значении этого параметра. Величина	называется ионной

силой раствора. Ионная сила Ш раствора ИаС1 равна единице, а \М раствора
Мр8О4 — четырем.

Таблица 12

Значения к для нескольких концентраций

Концентрация, моль [л	к, м-1	
	одновалентная соль	двухвалентная соль
10-5	107	2-10?
10-3	108	2-108
10-1	10»	2-109

Результирующая сила, действующая между двумя одинаковыми заря-
женными молекулами в растворе, равна сумме ван-дер-ваальсовой силы
притяжения и силы электрического отталкивания. Как показывает уравне-
ние (6.12), ван-дер-ваальсова сила стремится к бесконечности при расстоя-
нии между молекулами, близком к нулю. Однако на очень малых расстоя-
ниях притяжение нейтрализуется отталкиванием, вызванным перекрыва-
нием электронных облаков двух молекул. Мы не будем рассматривать эти
силы отталкивания на очень малых расстояниях. Вместе с тем силы электро-
статического отталкивания не стремятся к бесконечности при сближении
молекул, так как потенциал на поверхности молекулы конечен. Поэтому
на малых расстояниях всегда преобладает сила притяжения, и в этой обла-
сти кривая зависимости суммарной силы от расстояния имеет минимум.
Мы знаем, как рассчитываются ван-дер-ваальсовы силы притяжения для
двух сфер. Вычисление же электростатических сил отталкивания, действую-
щих между двумя сферами, связано с решением уравнения (6.17) при соот-
ветствующем граничном условии. Результат этого довольно сложного
расчета представлен на фиг. 90 как сумма двух упомянутых выше взаимо-
действий при различных концентрациях соли и различных поверхностных
потенциалах сфер. Как видно из рассмотрения этих кривых, при больших
концентрациях соли (т. е. для больших к) всегда преобладает притяжение,
тогда как при малых концентрациях на больших расстояниях сильнее
отталкивание. При высоких концентрациях соли белок осаждается из ра-
створа. Это осаждение происходит при различных солевых концентрациях
в зависимости от размера, формы и зарядов осаждаемых молекул, поэтому
его используют для очистки белков (высаливание). При промежуточных кон-
центрациях солей на всех кривых зависимости энергии взаимодействия
от расстояния имеется минимум, соответствующий очень большому рас-
стоянию между молекулами. Это связано с тем, что сила отталкивания
уменьшается быстрее, чем сила притяжения. Именно благодаря существо-
ванию этих минимумов частицы вируса табачной мозаики в концентриро-
ванных растворах располагаются в определенном порядке. При неболь-
ших изменениях в концентрации соли величина максимальной энергии
взаимодействия значительно изменяется, и, поскольку вероятность столкно-
зения двух частиц зависит от вероятности перехода их через этот энерге-
тический барьер, вероятность реакции между одинаковыми молекулами
сильно зависит от концентрации соли. Следует подчеркнуть, что из-за труд-
ностей при решении некоторых уравнений этой теории до сих пор рассмот-
рены только самые простые случаи — взаимодействие двух бесконечных
параллельных плоскостей и двух идентичных сфер.

Существование ван-дер-ваальсовой силы притяжения между плоскими
пластинами было установлено путем прямых измерений величины этой
силы 112] при различных расстояниях между пластинами.

Фиг. 90. Зависимость взаимодействия двух одинако-
вых сфер радиуса 10~5 см от расстояния между ними
(наименьшего расстояния между их поверхностями)
при различных концентрациях соли и различных
значениях потенциала на поверхности сфер [4].

Потенциал 32 мв соответствует полному заряду поверхности,
равному заряду 20 протонов.

13.	Силы взаимодействия между антигенами и антителами как пример
короткодействующих сил. Взаимодействия между большими молекулами
в растворе могут осуществляться с помощью дальнодействующих сил; в то
же время между малыми молекулами или малыми и большими молекулами
действуют только короткодействующие силы. Эти короткодействующие силы
зависят от потенциала притяжения, пропорционального 1/г6. Водородные
связи также могут служить примером короткодействующих сил. В биоло-
гии взаимодействие Двух молекул часто носит специфический характер.
Например, фермент действует только на какой-то определенный субстрат,
причем, если конфигурация субстрата меняется, то фермент перестает на
него действовать. Рассмотрению взаимодействия фермент — субстрат посвя-
щена гл. VIII. В этой же главе, мы познакомимся со специфическим взаимо-
действием другого типа — взаимодействием антиген — антитело.

При введении чужеродного вещества в организм животного в нем начи-
нают вырабатываться белковые антитела, структура которых в известной
мере соответствует структуре молекул введенного белка (называемого анти-
геном). Если роль чужеродного белка играет, например, вирус, то моле-
кулы антитела, вырабатываемого в организме животного, способны соеди-
няться с вирусом, подавляя его инфекционность. Образование антител имеет
огромное значение для выживаемости организмов. Однако механизм их син-
теза еще не изучен до конца. Изучая реакции между антигенами и антите-
лами, можно получать весьма ценные биохимические данные, так как эти
Количество введенного яичного альбумина
на 1 мг сыворотки, рг

Фиг. 91г Масса осадка, образующегося
при смешивании различных количеств
яичного альбумина (антигена) с определен-
ным количеством соответствующего анти-
тела.

Область левее максимума называется областью
избытка антитела, а область правее максимума —
областью избытка антигена.

реакции отличаются высокой специфичностью, а структура многих анти-
генов хорошо известна.

Роль антигенов могут играть молекулы довольно малых размеров-
(например, с молекулярным весом 15 000), молекулы же антитела обычно-
гораздо крупнее. Так, антитела,
содержащиеся в у-гл обул иновой
фракции сыворотки крови кролика-,
имеют молекулярный вес около
150 000.

Если сыворотку кролика, кото-
рому был введен антиген, смешать
в пробирке с этим антигеном, то
выпадает осадок. Такой осадок
содержит как антигены, так и ан-
титела, синтезированные в орга-
низме кролика в ответ на введение
чужеродного белка. Количество
осадка зависит как от концент-
рации антигена, так и от концен-
трации антитела. На фиг. 91 изо-
бражена зависимость количества
осадка от количеств введенного
антигена (яичного альбумина) при
постоянном количестве антитела.
При малых количествах антигена
образуется небол ьшое кол ичество
осадка. С увеличением количества антигена количество осадка увеличи-
вается, достигает максимума, а затем снова уменьшается. Эти результаты
можно объяснить, предположив, что в молекулах антитела и антигена име-
ется лишь какое-то определенное число участков (не менее двух),

Л 1 Б	В

Фиг. 92. Сцепление антигенов с антителами.

А — при избытке антител; Б — при равном их количестве;
В — при избытке антигена.

в которых может осуществляться их взаимодействие. При этом молекулы
антитела могут образовывать мостики между молекулами антигена, в резуль-
тате чего получаются очень крупные комплексы, выпадающие в осадок
(преципитация). Однако при введении в раствор очень большого количе-
ства антигена все молекулы антитела соединяются с избыточными моле-
кулами антигена, и, следовательно, соединительные мостики между моле-
кулами антигена уже не могут образовываться.

На фиг. 92 схематически изображены комплексы антиген—антитело для
трех областей кривой осаждения. Для простоты предполагается, что каж-
.дая молекула антитела имеет два места соединения с молекулами антигена,
т. е. «двухвалентна». В действительности антитела могут быть «поливалент-
ными».

Антигены можно синтезировать путем присоединения специфичных
химических групп к белкам, например к яичному альбумину. Эти группы,
называемые гаптенами, сами по себе не могут вызвать синтеза специфи-
ческих антител в организме животного. Однако, соединяясь с большой
молекулой, например с молекулой белка, гаптены приобретают такую спо-
собность. Антитела, возникающие после введения таких комплексов гап-
тен — белок, неоднородны. Некоторые из полученных антител вступают

Антитело

Антиген

Гаптен

Ф п г. 93. Схема, изображающая подав-
ление преципитации гаптеном при реакции
комплекса гаптен — белок с антителом.

в реакцию только с белком, другие — со всем комплексом. Эту смесь анти-
тел можно разделить, осаждая из нее с помощью соответствующего белка
только антитела к белку. После этого в растворе остаются только антитела
против комплекса гаптен — белок. Если антигеном служит соединение,
в которое в качестве гаптена входит пара:-азобензол арсенат (ПАБА)

—Ы = И—5>—АзОзН-

то преципитация антител, очищенных описанным выше способом, будет
происходить в соответствии с механизмом, изображенным на фиг. 92.
Тот же нара-азобензоларсенат, не связанный с белком, при введении в ра-
створ конкурирует за места связи на молекуле антитела с антигеном (гап-
тен— белок). Молекулы антитела, соединившиеся с гаптенами, уже не
могут участвовать в реакции осаждения. Поэтому количество осадка умень-
шается с увеличением количества вводимого в раствор гаптена. На фиг. 93
изображена схема этого процесса. Такое явление конкуренции дает воз-
можность оценивать степень специфичности взаимодействия антигена с анти-
телом. Для того чтобы произвести такую оценку, нужно, чтобы в организме
животного образовались антитела, специфически реагирующие с извест-
ным веществом, например ПАБА, что достигается путем введения живот-
ному комплекса гаптен — белок и адсорбции антител, специфичных к белку,
с помощью описанного выше метода. Раствор антител (специфичных к ПАБА)
смешивают с ПАБА — белком и различными гаптенами, такими, как орто-
азобензоларсенат и л/ета-азобеизоларсенат. Затем определяют количества
образующегося осадка в зависимости от концентрации конкурирующего гап-
тена. Уменьшение количества осадка в результате введения в раствор гап-
тена может служить мерой специфичности антитела по отношению к анти-
гену, вызвавшему его образование. На фиг.94 приведены данные о степени
подавления различными гаптенами реакции образования осадка. Как и сле-
довало ожидать, наибольшее ингибирование наблюдается в случае гапте-
нов, структура которых близка к структуре гаптена, вызывающего образо-
вание антител, т. е. ПАБА.

Используя гаптены с разной структурой, можно изучать детали взаи-
модействия антитела с антигеном. Количественной мерой специфичности:
этого взаимодействия служит свободная энергия связи гаптена и антитела
А/7. Чем больше абсолютная величина АЯ, тем сильнее взаимодействие..

Ф и г. 94. Ингибирующее влияние различных
гаптенов на образование осадка при реакции
ПАБА—белка с индуцированным им антителом [6].

В табл. 13 приведены некоторые данные по исследованию конкурентных:
реакций такого типа, а на фиг. 94 приводятся графики зависимости инги-
бирования от концентрации гаптенов для двух типов антител. По этим кри-
вым можно найти относительные значения АТ7, соответствующие данным
табл. 13, для определения же абсолютного значения этой величины необхо-
димо знать константу равновесия К, и в этом случае АТ7 определяется по,
формуле

АА = -ЯПпК.

Как видно из табл. 13, антигены отличаются друг от друга только по
относительному положению арсенатной группы. В то же время антитела,
соответствующие разным антигенам, ведут себя совершенно различно. Напри-
мер, антитела, специфичные в отношении ортоантигена, реагируют преиму-
щественно с орто-соединениями. Более того, эти антитела сильнее всего
взаимодействуют с гаптенами, в которых арсенатная группа соединена
с бензольным кольцом непосредственно, а не через промежуточную группу.
Кроме того, очевидно, что взаимодействие гаптена с антителом зависит не
столько от положения АзО3Н-, сколько от конфигурации гаптена.

Эти результаты можно объяснить, исходя из предположения о том,
что в процессе образования антител часть молекулы предшественника анти-
тела «обволакивает» молекулу антигена. Представим себе, что в молеку-
лах антител имеются «впадины», форма которых соответствует форме неко-
торых частей молекулы антигена. Тогда взаимодействие гаптена с молеку-
лой антигена должно зависеть от соотношения между размерами гаптена
и этих впадин. Разумеется, очень большой гаптен не может войти во впа-
дину. В этом случае ван-дер-ваальсовы силы, которые обратно пропор-
циональны шестой спепени расстояния, электростатические силы и силы..
обусловленные образованием водородных связей, будут очень малыми. Если
гаптен значительно меньше впадины, ван-дер-ваальсовы силы также будут
слабыми. Следовательно, специфичность взаимодействия антител с анти-
генами обусловлена существованием сил очень малого радиуса действия

Таблица 18

Относительные значения свободной энергий связи для соединений различных гаптенов
с антителами к ор/ио-азобензоларсенату (ОАБА)
и пара-азобензоларсенату (ПАБА)

Конкурирующий гаптен

Свободная энергия связи (ккал/молъ)
в опытах с антителами к

ОАБА

ПАБА

- АзОоН-

— НО3 Аз

— АзО3Н_

АзО3Н

АзО3Н~

О2Ы-;

ЫО2

АзО3Н~

СН3

АзОзН-

у— СН2— АзО3Н-
СН3АзОзН-

—1 360

+500

+2 820

—970

+1 520

—690

+980

+4 500

-1-109

—720

—1 410*

+280 

—950

+860

—350

>5000

>5000

О

0

* Абсолютное значение 7700 кал/моль.

между малыми молекулами. Исходя из такого представления, можно схе-
матически изобразить конфигурацию реагирующих участков молекулы
антитела (фиг. 95). Учитывая высокую спепень соответствия между анти-
геном и антителом, отношения между ними сравнивают с отношением ключа
к замку. При хорошем соответствии молекул антигена и антитела энергия
связи минимальна. Следовательно, именно короткодействующие силы, упо-
мянутые выше, обусловливают специфичность взаимодействия антигена
с антителом. Поэтому при увеличении расстояния между молекулами анти-
гена и антитела это взаимодействие становится все менее специфичным.
Уже на расстоянии в 10А. молекулы антитела к орто-азобензоларсенату
вряд ли взаимодействуют с его молекулами сильнее, чем с молекулами
пара-азобензоларсената. Как мы увидим далее (гл. VIII), это утверждение

Антитело к

пр то-азобензоларсендту

— Возможные	Парагаптен

водородные связи

А	Б

Ф и п 95«

А — схема, поясняющая комплементарность строения антитела и антигена; Б — ослабление
взаимодействия между антителом и конкурирующим гаптеном [6].

справедливо и в отношении специфичности ферментов. При изучении реак-
ций между структурными элементами клеток и при работе с ними следует
помнить о существовании короткодействующих сил такого рода.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	Р аи! 1п§ Ь., ТЬе На(иге о! !Ье СЬеписа1 Вопб., Согпе11 НшуегзНу Ргезз,
ИЬаса, И. У., 1948. (Есть перевод более раннего издания: Л. П а у л и н г,
Природа химической связи, М., ГХИ, 1947.)

2.	В о г п М., А1огп1с РЬузкз, СЬар!ег 8, 6!Ь еб., НаГпег РиЬИзЬш^ Со., И. У., 1957.

3.	К 1 се Р., Т е 1 1 е г Е., ТЬе 8!гис!иге о! МаНег, ^/Пеу, М, У., 1949.

4.	V е г XV е у Е., О V е г Ь е е к Л., ТЬеогу о! 1Ье 8!аЫ1Иу о! ЬуорЬоЬ1С Со11о1бз,
Е1зеу1ег Ргезз, Ноиз1оп, Техаз, 1948.

5.	В ооН1 Р., «Кесеп! \Уогк ш !Ье АррНсаНоп о! 1Ье ТЬеогу о! !Ье 1ошс ПоиЫе
Ьауег 1о СоПоМа! 8уз1етз», Рго§. ВюрЬуз., 3, 131 (1953).

6.	Ргеззтап П., «АпНЬосИез аз 8ресШс СЬегтса! Кеа§еп!з», Абу. В1о1. Меб.
РЬуз., 3, 99 (1953).

7.	Еопбоп Р., «ТЬе Сепега! ТЬеогу о! Мо1еси1аг Рогсез», Тгапз. Рагабау 8ос.,
33, 8 (1937).

8.	Б е б е г Ь е г § Л., «Сепез апб АпПЬобхез»,’8с1епсе, 129,' 1946 (1959).

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

9.	V о 1 б М., Л. Со11о1б 8с1епсе, 9, 451 (1954).

10.	К 1 г к ху о о б Л. О., 8 Ь и т а к е г Л. В., Ргос. На!. Асаб. 8сь, 38, 855 (1952).

11.	Ь 1р р 1 псоН Е. К., ЗсЬгоебег К., Л. СЬет. РЬуз., 23, 1099 (1955).

12.	Р г о з 1 е г А. Р., КП сЬ епег Л. А., На!иге, 178, 1339 (1956).
Глава VII

СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ
И СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛ

1.	Введение. Для исследования структуры молекул физика и химия
используют обширный арсенал средств. Один из типичных физических под-
ходов состоит в том, что изучаемой системе сообщается некоторая энергия
и исследуется результат. В случае макросистем энергия может быть сооб
щена любым из возможных способов. Каждый из них позволяет получить
лишь ограниченную информацию, и поэтому чем больше способов мы можем
применить, тем лучше. В физике к таким способам воздействия относятся:
1) нагревание (тепловая энергия); 2) облучение инфракрасными, видимыми,
ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами (энергия электромагнитных
колебаний); 3) воздействие заряженными частицами, скажем протонами
и а-частицами; 4) воздействие незаряженными частицами (нейтронами);
5) воздействие электрическими полями и 6) воздействие магнитными полями.
В этой главе внимание будет сосредоточено лишь на некоторых результа-
тах, касающихся взаимодействия электромагнитных волн с молекулами,
на интерпретации этого взаимодействия и влияния на него таких внешних
факторов, как магнитное поле. Тепловое действие электромагнитных волн,
в частности, рассматриваться не будет. В целом проблема взаимодействия
излучения с веществом очень сложна, поэтому рассмотрение будет прове-
дено с максимальными упрощениями.

Электромагнитное излучение имеет квантовый характер. Энергия его
проявляется дискретными порциями. Каждая порция, или фотон, несет энер-
гию, равную Иу, где И— постоянная Планка (6,63-10“34 дж-сек), ат—ча-
стота излучения, которая равна скорости света, деленной на длину волны.
Так как в прошлом длины волн узких спектральных линий умели измерять
точнее, чем скорость света, установился обычай представлять относитель-
ные энергии фотонов не через частоты, а через величины, обратные длине
волны. Эти величины получили название волновых чисел у. Чтобы полу-
чить частоту, волновое число надо умножить на скорость света.

и у — ^ — су.	(7.1)

Таким образом, имеем

Е — Иу = = Ису .

Л

Инфракрасное излучение с длиной волны 30 000 Л имеет волновое число
3,3- Ю5^1. Энергия такого кванта равна

Е =

6,6-10 84 йж>сек-3- 108л/сек
3-10-6 м

= 6,6-10-20 дж.

11 Заказ № 1168
1 эв = 1,6-10'19 дж\ следовательно, энергия рассматриваемого инфракрас-
ного фотона равна 0,4 эв. Подобным же образом можно рассчитать энер-
гию фотона излучения с длиной волны 2500 А. Энергия такого фотона
(у = 4- 106л-1) равна 5,5 эв. Фотон с энергией в 1 эв имеет волновое число,
равное 8,067 • 105 лГ1.

2.	Уровни энергии атома. Квантовым характером обладает не только
электромагнитное излучение. Энергия атомов и молекул, поглощающих
свет, также квантована, т. е. может принимать лишь определенные дискрет-
ные значения. Например, значения энергии, которыми может обладать
атом водорода, описываются формулой

р __ те4 1

вера’д2 ’

(7.2)

где т и е —- масса и заряд электрона, И — постоянная Планка, п — целое
число. Каждое из значений п (1, 2, 3, . . .) определяет одно из возможных
значений энергии атома водорода Еп. Энергия Еп является отрицательной
величиной, так как за нуль энергии принято ее значение в том случае, когда
электрон удален на бесконечное расстояние от ядра, т. е. при п—>со. Поло-
жительные значения энергии, соответствующие ионизованным атомам, не
квантованы. Целое число п называют квантовым числом. Каждое такое
число, если оставаться в рамках классических представлений, определяет
орбиту, по которой совершает движение электрон. С точки зрения принципа
неопределенности представление об электроне, движущемся по заданной
орбите, некорректно, так как точное положение электрона невозможно
определить по принципиальным соображениям. В связи с этим в дальней-
шем нет необходимости интересоваться пространственным расположением
составных частей атомов и молекул, и все внимание может быть сосредото-
чено на точных значениях энергий. Тем не менее, чтобы придать наглядность

этим уровням энергии, придется представить ядро и электрон как частицы
с определенными координатами в пространстве. Конечно, читатель не дол-
жен забывать, что эта картина имеет лишь условный характер.

Атом водорода состоит из ядра, несущего один элементарный положи-
тельный заряд, и электрона, притягиваемого к ядру кулоновской силой.
Величина этой силы пропорциональна произведению зарядов ядра и элект-
рона и обратно пропорциональна квадрату расстояния между ними. Если

считать, как это принято при рассмотрении атомных систем, что система
обладает нулевой энергией при бесконечном расстоянии электрона от ядра,

то по мере приближения электрона к ядру энергия системы, определяемая

выражением Ер=-^^,

будет приобретать большие отрицательные

значения, т. е. становиться все меньше. Из кривой потенциальной энергии
такой системы (фиг. 96) видно, что когда электрон находится очень близко от
ядра, его потенциальная энергия очень мала. Если иметь в виду только это,
то, казалось бы, можно считать, что чем ближе к ядру электрон, тем ниже по-
тенциальная энергия итем стабильнее конфигурация системы. Но если вспом-
нить о принципе неопределенности, становится ясно, что вопрос на самом
деле сложнее. Дело в том, что когда электрон подходит к ядру так близко,
что его потенциальную энергию можно считать очень малой, неопределен-
ность его положения также должна уменьшиться, а, стало быть, неопреде-
ленность скорости должна увеличиться. Очевидно, что величина скорости
не может быть меньше, чем ее неопределенность. Следовательно, можно ска-
зать, что по мере приближения электрона к ядру его потенциальная энер-
гия уменьшается, скорость же, а значит, и кинетическая энергия, возра-
стает. В результате, наиболее стабильной будет вовсе не та конфигурация,
при которой электрон находится в одной точке с ядром.

Если изложенной выше аргументации придать количественную форму,
можно рассчитать нижний уровень энергии атома водорода. Это было сде-
лано в гл. VI. Результат этого расчета согласуется с теорией атома водорода
Бора и с более обоснованным квантовомеханическим расчетом. Уровни
энергии атома водорода показаны на фиг. 96. Глубина самого нижнего уровня
равна 13,5 эв. В обычных условиях атомы водорода находятся в основном

Фиг. 96. Кривая потенциальной энергии атома водорода.
Горизонтальные линии обозначают уровни разрешенной полной
энергии. Континуум положительных значений Е показывает
зону, где энергия не квантуется.

состоянии, т. е. на нижнем уровне. Если на совокупность атомов водорода
падает свет всех длин волн, то поглощаться будут лишь некоторые длины
волн, а именно те, которые будут соответствовать переходам из основного
состояния в одно из возбужденных. В общем случае поглощенные частоты
удовлетворяют уравнению Ну — Еп — Ех. Это простое равенство лежит
в основе всех расчетов, связанных с применением спектроскопии для иссле-
дования структуры атомов и молекул. Очевидно, что частоты излучения,
поглощаемого или излучаемого данным атомом или молекулой, определены
в каждом случае уровнями энергии системы. Простое сопоставление пока-
зывает, что различные атомы и молекулы имеют различные спектры. Боль-
шие молекулы также имеют свои характерные спектры, изменяющиеся от
молекулы к молекуле, хотя на практике обнаружить эти различия далеко
не просто.

Потенциал ионизации водорода равен 13,5 эв. Как видно из табл. 14,
эта величина потенциала ионизации характерна почти для всех элементов
с небольшим атомным весом, за исключением атомов щелочных металлов.
Фотоны с энергией 13,5 эв соответствуют излучению с длиной волны около
900 А. Воздух практически непрозрачен для излучения с длиной волны
< 1900 А, поэтому кванты света, с которыми имеют дело в обычных усло-
виях, не достаточны для ионизации атомов. При поглощении света атом-
переходит в возбужденное состояние и через некоторое время (10-8 сек
или менее) вновь теряет приобретенную энергию тем или иным способом
(в частности, посредством излучения).
В действительности водородоподобные атомы обладают не одиночными,
как это следует из формулы (7.2), а двойными уровнями энергии. Дублетный
характер этих уровней связан с двумя возможными ориентациями (парал-
лельная и антипараллельная) спина электрона по отношению к его орби-
тальному моменту. Как было показано в гл. VI, направление спина элект-
рона имеет существенное значение при образовании ковалентной связи.

Таблица 14

Потенциалы ионизации различных веществ [17]

Атом или молекула	Потенциал ионизации, эв	
	для первого электрона	для второго электрона
н	13,5	
с	н,з	24,4
м	14,5	29,6
о	13,6	35,1
№	5,14	47,3
Р	и,о	19,7
5	10,4	23,4
СО	14,0	
ИО	9,5 [18]	
н2	15,4	
ы2	15,58	
О2	12,2	
сн	Н,1	
сн4	13,0 [19]	
С2Н5ОН	10,5 [19]	
Фенол	8,5 [19]	
Метиламин	9,0 [19]	

Наличие спина у электрона необходимо учитывать также для понимания
тонкой структуры спектров поглощения. Однако в спектрах больших моле-
кул тонкая структура не представляет интереса, за исключением одного
случая, а именно спектров парамагнитного резонанса. Электрон, помещен-
ный в магнитное поле, может иметь две ориентации магнитного момента
относительно направления поля (параллельное и антипараллельное напра-
вление спина). Этим различным ориентациям соответствуют различные
энергии. Разница между ними в поле напряженностью 104 гс соответствует
излучению с длиной волны 1 см. Если электрон неспаренный, эта разность
энергий может быть поглощена при переходе электрона из одного состояния
в другое. Более детально о спектрах парамагнитного резонанса, а также
о влиянии на них ядерных магнитных моментов, будет сказано в разд.
19 и 20.

3.	Уровни энергии молекул. В молекулах могут иметь место более слож-
ные виды движений, чем в атомах, и поэтому энергетические уровни обла-
дают более сложной структурой. С достаточным основанием можно счи-
тать, что энергия молекулы суммируется из трех независимых частей:
1) части, определяемой расположением электронов, 2) части, обусловлен-
ной колебаниями ядер около положения равновесия, и 3) части, связанной
с вращением молекулы как целого. Электронная энергия имеет величину
порядка нескольких электронвольт, колебательная — порядка десятых
долей электронвольта и вращательная —• порядка сотых долей электрон-
вольта.

В качестве простейшего примера рассмотрим уровни энергии двухатом-
ной молекулы. Такую молекулу схематически можно представить как две
точечные массы, находящиеся на расстоянии г. Кинетическая энергия моле-
кулы, обладающей моментом инерции 1 и вращающейся относительно центра
масс с угловой скоростью со, равна

„	1,2	(7<в)2 (Вращательный момент)2

- у /со —2Г —	27	•

Согласно квантовой механике,

Вращательный момент =	7 (7 + 1),	(7.4)

где 7 — целое число, принимающее значения 0, 1, 2, ...; 7 называют вра-
щательным квантовым числом. Поскольку простой ротатор не имеет потен-
циальной энергии, его полная энергия равна его кинетической энергии
и из соотношений (7.3) и (7.4) следует

/г2

Вращательная энергия = Ет =	№ + !)•	(7-5)

Написанное выражение дает величину энергии вращения относительно
двух осей, перпендикулярных к линии, соединяющей ядра. Энергия вра-
щения относительно оси, проходящей через ядра, в это выражение не вклю-
чена. Момент инерции двухатомной молекулы относительно этой оси опре-
деляется только электронами. Поскольку масса электронного облака суще-
ственно меньше массы ядер, момент инерции относительно оси, проходя-
щей через ядра, мал и, как можно видеть из (7.5), энергия, соответствующая
этому движению, велика. Энергия, связанная с вращением около этой оси,
зависит от распределения электронов, и, таким образом, ее следует отнести
не к вращательной, а к электронной части полной энергии молекулы. По-
этому, в частности, при расчете теплоемкости двухатомных газов требуется
учитывать лишь две вращательные степени свободы.

Если на простой ротатор падает световая волна, то он может поглощать
энергию этой волны. Величины поглощаемых им энергий ограничены опре-
деленными законами, называемыми правилами отбора. В случае простого
ротатора правило отбора имеет вид Д7 = ± 1. Таким образом, лишь те
фотоны будут поглощаться или излучаться, которые изменят энергию
ротатора на величину, соответствующую изменению вращательного кванто-
вого числа на ± 1. Вращательная энергия, как правило, очень мала по
сравнению с обычными тепловыми энергиями. Например, в молекуле йода
пришлось бы возбудить семьдесят пятый вращательный уровень, чтобы
достичь энергии, сравнимой с тепловой.

Применение вращательных спектров для изучения структуры моле-
кулы основано на зависимости спектра от формы молекулы. Поскольку
уровни вращательной энергии не зависят от взаимодействия между ато-
мами, они отражают общую геометрию молекулы, которая проявляется
здесь через ее момент инерции. Анализ вращательных спектров трехмерных
структур представляет собой, естественно, во много раз более трудоемкую
процедуру, чем в случае двухатомных молекул. Однако в тех случаях, когда
соответствующая работа была проделана, удалось получить значения трех
основных моментов инерции молекулы. Поскольку даже у простейших много-
атомных молекул моменты инерции очень велики, наиболее подходящей
областью спектра для исследования их вращательных спектров является
микроволновая область, соответствующая длинам волн более 1 мм. На
фиг. 97 приведены межатомные расстояния и углы для молекулы метило-

Ф и г. 97. Размеры молекулы метило-
вого спирта, полученные из спектро-
скопических данных [26].

вого спирта, полученные из спектро-
скопических данных.

4.	Колебательные уровни энер- '
гии. Ядра двухатомной молекулы
могут не только вращаться, но и коле-
баться около центра масс. Легче всего
рассмотреть простой гармонический
осциллятор, в котором сила, возвра-
щающая в положение равновесия, про-
порциональна смещению. Так как, со-
гласно теореме Фурье, более сложные
типы периодических движений могут
быть представлены как сумма (воз-
можно, бесконечная) движений ряда
простых гармонических осцилляторов,
анализ простого гармонического
осциллятора (ПГО) представляет ин-
терес для рассмотрения и более слож-

ных случаев.

Рассмотрим двухатомную молекулу, состоящую из атомов с массами
т4 и т2 (фиг. 98). Если и |2.— расстояния от ядер до центра масс, то по
определению центра масс — т2^2- Сила, возвращающая ядра в поло-
жение равновесия, пропорциональна их смещению и равна

Р = —к (г—г0),

(7.6)

где г — расстояние между ядрами, г0 —равновесное расстояние (значе-
ние г, для которого Р = 0) и к — константа пропорциональности в едини-
цах ньютон/метр (н!м). Система из двух колеблющихся масс, показанная

Г=-Л^г-г0;,

Н—1-€г-|

Эквивалентно

1=± + —
т?

Фиг. 98. Схема двухатомной молекулы, демонстрирующая
расположение ядер.

Движение и около центра масс» принятого за начало координат,
эквивалентно колебаниям одиночной массы (приведенной массы) около
неподвижной стенки.

на фиг. 98, эквивалентна одной колеблющейся массе р (называемой приведен-
ной массой), которая определяется соотношением

и

ГП} 1712

(7.7)
и смещение которой равно х = (г — г0). (Это объясняется тем, что смещения
двух ядер, если их отсчитывать от центра масс и считать, что центр масс
покоится, имеют противоположные направления и по величине обратно
пропорциональны массам атомов. Движение центра масс определяет посту-
пательную энергию молекулы в целом, которая нас здесь не интересует.)
Классическая частота колебаний ПГО описывается формулой:

'=&]>• (7'8)

Классический колеблющийся диполь должен излучать и поглощать излу-
чение такой частоты.

Квантовомеханическое решение задачи о простом гармоническом осцил-
ляторе связано с использованием потенциальной функции V, которая пред-
ставляет энергию взаимодействия атомов. Интегрирование равенства (7.6)
дает

К = 1^(г-г0)2.	(7.9)

Полученная параболическая потенциальная функция графически изобра-
жена на фиг. 99. Движения ядер строго ограничены данной потенциальной

кривой, и в результате возможные значения
полной энергии системы квантованы. Разре-
шенные уровни энергии можно получить из
формулы:

Колебательная энергия =	+	,

(7.Ю)

где V — целое квантовое число, равное 0, 1,
2, . . , а ^0—классическая частота осциллято-
ра, определяемая выражением (7.8). Пунктир-
ные горизонтальные линии на фиг. 99 изобра-
жают полную энергию системы. Можно пред-
ставить себе, что осциллятор колеблется
вдоль этих линий. В крайних точках его пути
полная энергия совпадает с потенциальной,
в серединёЪути целиком переходит в кинети-

Ф и г. 99. Кривая потенциаль-
ной энергии и разрешенные
уровни энергии (пунктирные
линии) для простого гармони-
ческого осциллятора.

ческую. Полная энергия осциллятора равна

максимальному значению его потенциальной энергии. Амплитуда колеба-

ний имеет величину порядка 0,1 А. Такая картина соответствует классиче-

ским представлениям, однако неудовлетворительна с точки зрения кван-
товой механики. Тот факт, что осциллятор не может иметь энергию, рав-
ную нулю, связан с принципом неопределенности, и его нельзя объяснить
в рамках классической теории.

Правило отбора, позволяющее установить возможные изменения коле-
бательного квантового числа гармонического осциллятора при излучении
или поглощении, имеет следующий вид:

Ао=± 1.

Таким образом, для частот, которые может излучать или поглощать ПГО,
можно написать

V = 1ЬЕ = | [ /и>0 (у +- Иу0 (ц + 4) ] = ^0.

Частота Vо- является классической частотой осциллятора.
Двухатомная молекула не может быть простым гармоническим осцил-
лятором, так как энергия диссоциации ПГО (значение V--при г—*со)

стремится к бесконечности. Кривая потенциальной энергии реальной моле-
кулы имеет форму, показанную на фиг. 100. Потенциальная яма в этом слу-
чае шире, чем у гармонического осциллятора, и соответственно уровни энер-
гии располагаются несколько ниже. Разность между соответственными уров-
нями реальной молекулы и гармонического осциллятора возрастает с уве-
личением колебательного квантового числа. При энергиях, превышающих
энергию диссоциации, система уже не является связанной и ее энергия может

Фиг. 100, Кривая потенциальной энергии
реальной молекулы.

Пунктирные горизонтальные линии обозначают
разрешенные уровни полной энергии

иметь любое положительное значение. Колебательные уровни реальной
молекулы можно характеризовать колебательными квантовыми числами,
так же как мы это делали в случае гармонического осциллятора, однако
теперь энергия уровней не будет выражаться через V простым соотноше-
нием (7.10).

Приведенное выше правило отбора для ПГО также не годится для ангар-
монического осциллятора. Каждая Фурье-компонента осциллятора под-;
чиняется своему правилу отбора, что для V приводит к условию

До = ± 1, ±2, ± 3, ...

Большие значения Ло, хотя и возможны, очень маловероятны, и практиче-
ски нельзя, например, вызвать диссоциацию молекулы, бросив на нее квант
света с энергией, достаточной для перехода от V = 0 в зону непрерывных
положительных значений энергии. Большая часть молекул находится на
уровне V — 0, поскольку распределение их по уровням колебательной
энергии является больцмановским. Если ангармоничность невелика, то
нижняя часть потенциальной кривой, изображенной на фиг. 100, будет
довольно близка к параболе и нижние уровни энергии будут разделены оди-
наковыми интервалами. Поскольку переходы с Ап = 1, 2, . . . разрешены,
в спектре будут присутствовать частоты т0, 2т0..Спектральная линия

с частотой 2т0 (первый обертон) будет значительно менее интенсивной, чем
основная спектральная линия с частотой т0. Более высокие обертоны не
являются точно кратными т0, однако отношения частот настолько близки
к целым числам, что различать обертоны довольно просто (см. ниже).
Для того чтобы энергия падающего пучка света была поглощена рота-
тором или осциллятором, необходимо, чтобы в пучке имелись такие фотоны,
энергия которых соответствует переходам, разрешенным правилами отбора.
Однако это условие необходимо, но не достаточно, поскольку очевидно,
что, кроме того, ротатор или осциллятор должен иметь возможность взаимо-
действовать со световой волной. Наиболее важным типом взаимодействия
является взаимодействие электрического поля световых колебаний Е и ди-
польного момента молекулы р. Молекула, не имеющая дипольного момента,

X	Ес

Направление
распространения
света

н

Р

Компоненты, взаимодействующие
с вращением:
с колебанием :

Фиг. 101 Различные случаи взаимодействия компонент
падающей световой волны с ориентированными ди-
полями.

Свет распространяется в направлении 2 и имеет компоненты
и А — диполи ориентированы по направлению |распро-
странения света; Б — диполи ориентированы перпендикулярно

к направлению распространения света.

например молекула Н2 или Ы2, вообще не поглощает сильно в инфракрас-
ной области. Для того чтобы осциллятор поглощал энергию, электрическое
поле падающего света должно иметь составляющую, параллельную его
дипольному моменту. Аналогичное условие ротатора состоит в том, чтобы
падающий свет имел составляющую, перпендикулярную оси вращения моле-
кулы.

Итак, осциллятор, скажем молекула НС1, не будет поглощать энергию,
если электрическое поле падающего света не имеет составляющей, парал-
лельной диполю. В газах такого положения не будет даже и для поляризо-
ванного света, так как молекулы газа ориентированы случайно. Если же
падающий свет поляризован, а поглощающие диполи ориентированы, то
можно подобрать такие условия, что взаимодействия фотон — осциллятор
или фотон — ротатор не будут осуществляться, а следовательно, не будут
происходить и переходы. Таким образом, использование поляризованного
излучения, как мы вскоре увидим, может давать информацию не только об
уровнях энергии, но и об ориентации поглощающих диполей. На фиг. 101
показаны возможные случаи взаимодействия составляющих электрического
поля падающей световой волны (Ех и Еу) с дипольным моментом Р ротатора
и осциллятора (если волна имеет соответствующую частоту).

5.	Колебания многоатомных молекул. Молекулы, состоящие из трех
атомов и больше, могут испытывать довольно сложные колебательные дви-
жения. Однако эти движения можно разложить на независимые простые
гармонические колебания, сумма которых и определяет наблюдаемую слож-
ность движения молекулы (мы будем предполагать, что ангармоничность
пренебрежимо мала). Разложение колебания молекулы на простые гармо-
нические, или нормальные, колебания существенно упрощает картину, хотя
сама по себе эта задача может оказаться довольно сложной.

Если молекула состоит из Ы атомов, то для определения положения
всех атомов потребуется 3^ координат. Число ЗУ называют числом сте-
пеней свободы. Три степени свободы связаны с поступательным движе-
нием всей молекулы (трансляцией) и три — с ее вращением. Остающееся
число, ЗУ— 6, равно числу колебательных степеней свободы, или числу
нормальных колебаний, суперпозиция которых дает действительное движе-
ние молекулы. Например, все сложные двухмерные периодические движе-
ния материальной точки, представленные в фигурах Лиссажу, могут быть

®—* ~О у3=2,35-105м-’

Фиг. 102. Нормальные колебания молекулы СО2.
Центр масс остается неподвижным при каждом коле-
бании. Длина стрелок указывает относительное смеще-
ние ядер. Знаки плюс и минус обозначают движение
«к читателю» и «от читателя» по направлению распростра-
нения света.

'разложены на два простых гармонических колебания, вообще говоря, нерав-
ной частоты, амплитуды и фазы в нулевой момент времени. При каждом
нормальном колебании все атомы молекулы колеблются с одинаковой часто-
той и фазой, но имеют различные амплитуды, причем такие, что в процессе
колебания центр масс молекулы не испытывает смещений. Частоты различ-
ных нормальных колебаний, как правило, различны. Энергия, которой
может обладать каждое из нормальных колебаний, определяется соотноше-
нием, подобным уравнению (7.10). При взаимодействии с излучением До.ь
т. е. изменение каждого из квантовых чисел VI, относящихся к каждой нор-
мальной координате, должно равняться 0 или ± 1. Если имеет место погло-
щение или излучение, то хотя бы одно из Д^ отлично от нуля. Общая коле-
бательная энергия многоатомной молекулы равна сумме энергий ее нор-
мальных колебаний, т. е.

згс-е

г=1

где	—• частота г-го нормального колебания.

У линейной молекулы, так же как и у двухатомной, с вращением всей
молекулы связаны лишь две степени свободы. Следовательно, линейная
молекула имеет ЗУ — 5 колебательных степеней свободы. На фиг. 102
показаны в качестве примера нормальные колебания линейной молекулы
СО2. Колебания, обозначенные символами V2а иV2ъ, имеют одинаковые ча-
стоты и, как говорят в таких случаях, являются вырожденными. В электри-
ческом поле такое вырождение снимается. В инфракрасных спектрах погло-
щения проявляются не все нормальные частоты. В частности, в спектре СО2
отсутствует частота так как с этим колебанием не связано изменение
дипольного момента. Эта частота может быть обнаружена в переходах, свя-
занных с одновременным изменением и г?2 или и о3 (так называемые
«комбинационные полосы»), или в спектрах комбинационного рассеяния
(см. разд. 7). С классической точки зрения нетрудно понять, почему частота
колебаний т2 много меньше частоты или т3. Это связано с тем, что при
небольших смещениях ядер в направлении, перпендикулярном оси моле-
кулы, расстояния между ядрами изменяются сравнительно мало, т. е. мал
коэффициент к, равный возвращающей силе при смещении ядер из положе-
ния равновесия на единицу длины. Из уравнения (7.8) следует, что соот-
ветствующая частота будет небольшой. Этот вывод справедлив по отноше-
нию ко всем частотам подобного типа, которые принято называть деформа-
ционными в отличие от валентных, обозначенных и т3. Анализ спектров
поглощения простых органических молекул приводит к очень важному
выводу, а именно что в группах типа

С	С

'с=с'
сУ С

содержащих двойные связи, все атомы находятся в одной плоскости (пло-
.ская структура}.

Молекула белка с молекулярным весом 10 000 содержит около 1000
атомов, и, чтобы полностью описать ее колебания, требуется 3000 нормаль-
ных координат. Однако отыскать их невозможно, так как не все детали строе-
ния белка известны; даже если бы они и были известны, разрешение и точ-
ность экспериментально получаемых спектров не позволили бы провести
соответствующий анализ. Спектр даже наименьшей из аминокислот, гли-
цина, у которой имеется 24 нормальных колебания, не может быть полно-
стью проанализирован тем способом, который мы обсуждаем. Для практиче-
ских целей приходится использовать полуэмпирический метод отыскания
частот, характеристических для определенных связей и мало зависящих
от того, в какой молекуле эти связи находятся.

6.	Характеристические частоты связей. Колебания многоатомной моле-
кулы могут быть описаны с разной степенью точности. Мы можем рассматри-
вать движения многоатомной молекулы не как суперпозицию нормальных
колебаний, а как сумму колебаний большого числа двухатомных осцилля-
торов. Такой подход может быть эффективным лишь в том случае, если при
переходе от одной молекулы к другой частоты двухатомных осцилляторов
не будут меняться. Это требование выполняется тогда, когда рассматри-
ваемые группы достаточно изолированы от остальной части молекулы и когда
частота их собственных колебаний не слишком близка к собственным ча-
стотам других связей. Если последнее условие не выполняется, полоса погло-
щения сдвигается из-за взаимодействия осцилляторов. Если же не выпол-
няется первое условие, то характеристическая частота вообще может исчез-
нуть. Для того чтобы существовала характеристическая частота, прежде
всего необходимо, чтобы силы, связывающие два атома, не зависели (в пер-
вом приближении) от влияния соседних атомов.

Изложенный выше критерий лучше всего выполняется для концевых
-групп молекул. Соседние атомы очень слабо влияют на колебания группы,
в которую входит водород. Из-за его малой массы колебания атома водо-
рода можно рассматривать как колебания около стенки с бесконечной мас-
сой. У такого осциллятора, как видно из выражения (7.7), приведенная
масса не зависит от массы стенки. Для определения характеристических
частот связей снимают спектры большого числа соединений и устанавливают
между ними соответствие. Правильность отождествления может быть про-
верена путем изотопного замещения. Например, согласно уравнению (7,8),.
замещение водорода на дейтерий в связи = С — Н должно уменьшить
частоту колебаний водорода в 1/|/2 раз. Значения характеристических
частот, полученных в исследованиях с газами (в которых отсутствует взаи-
модействие молекул и водородные связи) и с жидкостями (где есть водород-
ные связи), приведены в табл. 15. При определении состава и структуры не-
известных молекул использование этих и других характеристических
частот, конечно, крайне полезно. Наряду с этим очевидно, что данные по
поглощению в инфракрасной области не могут дать полной картины строе-
ния молекулы.

Таблица 15

Некоторые характеристические частоты газообразных
и жидких соединений [20]

Группа	Валентные коле- бания, СМ~1 (с точностью до 100 см-1)	Группа	Деформ а ционные колебания, см-1 (с точностью до 100 см-1)
=с—н	3300		
		=с-н	"00
=с—н	3020		
		Н-,	
			
—с—н	2960	=с :	1100
у/		•	
—О—н	3680	Н'	
	(3400)*	_ - _	
—8—В	2570	с—см:	300
—К—Н	3500		
	(3300)*		
—0=0	1700	—к—н /	1600
—с=ъг—	1650		
—о=с—	2050		
Хчс=с/	1650		
^с—	900		
.>=0	1250-1300(21]		

* Для групп, связанных водородными связями (жидкое состояние) [3]. Все остальные значения—
для групп, не связанных водородными связями.
В качестве примера соответствия характеристических полос поглоще-
ния отдельных групп в различных соединениях в табл. 16 приведены инфра-
красные спектры урацила и некоторых других веществ.

Таблица 16

Полосы поглощения урацила и других соединений* [22]

Ацетамид** О  II	Фенол** ОН  С|	Урацил Н	5-Хлорурацил  !1 1	Тимин г?	Колебания, обусловливающие полосу
СН3СКН2	V	1,1 /НН	С1 ин  о	Нзс нн  Х'||/ о	
6700  5710  5000	7000  5980  4670	6670  6060  5020  4700	«  6670  6060  5020  4700	6620  5950  5710  5000  4670	ОН (1-й обертон 2-3400)  НН (1-й обертон 2-3300)  СН в кольце (1-й обертон 2-3020)  СН алифатическое (1-й обертон 2-2960)  С=О (2-й обертон 3-1700)  Комбинационное колебание  3020 и 1700

* Для простоты идентификации положение максимумов полос поглощения дано в волновых
числах.

** Приведено для контроля правильности интерпретации.

7.	Спектры комбинационного рассеяния и биполярная природа амино-
кислот. Мы видели, что, зная частоты, при которых поглощают молекулы
некоторого вещества, можно идентифицировать его поглощающие группы.
В одних случаях эти частоты можно получить из непосредственных изме-
рений, в других они могут быть найдены из спектров комбинационного рас-
сеяния.. Свет, падающий на вещество, рассеивается на его молекулах, при-
чем большая часть рассеянного света имеет ту же частоту, что и падающий
•свет (интенсивность этого рассеяния зависит не столько от деталей строения
молекулы, сколько от интегральных свойств всей молекулы в целом, обсу-
жденных в гл. IV). Но у некоторой части рассеянных фотонов в результате
частичного поглощения их энергии молекулами частота понижена по сравне-
нию с частотой падающего света. Если частота падающего кванта равна
а рассеянного V8, то энергия, поглощенная молекулой, будет равна

ДЕ = Их г — Ихе — ЙД V.

На основании величин Ду можно определить энергетические уровни рас-
сеивающих молекул. Полученные результаты можно также выразить в вол-
„	Д'4’	,

новых числах —— и использовать для идентификации рассеивающих групп
(см., например, табл. 15). С помощью комбинационного рассеяния была
обнаружена биполярность аминокислот в растворах [23]. В спектре комби-
национного рассеяния уксусной кислоты СНзСООН наблюдается сильная
линия 1730 см~\ которая соответствует колебаниям > С = О. Вместе с тем
в спектре натриевой соли эта линия отсутствует, так как соль полностью
диссоциирована и ее структура может быть представлена двумя резонирую-
щими формами:

„ /°

СН3С и СН3С = О

Таким образом, в соли мы имеем дело не с С = О-группой, а с группой, про-
межуточной между С = ОиС — О. В спектрах аминокислот при нейтраль-
ных рН полоса > С = О также отсутствует, что указывает на ионизован-
ное состояние группы СООН. Аналогичным путем установлено, что группа
— ЫН2 также ионизована. Таким образом, следует считать,что в нейтраль-
ных растворах аминокислоты имеют следующую структуру:

Н

+Н3М—С—СОО-.

к

8.	Колебательные спектры белков. При работе с растворами изучение
спектров комбинационного рассеяния дает хорошие результаты, но мето-
дика получения спектров довольно трудоемка и требует больших количеств

Фиг. 103. Спектры поглощения полифенилаланинлейцина
и кератина, на которых показана идентификация отдельных
полос [27].

вещества. Прямые измерения поглощения позволяют обходиться очень''ма-
лыми количествами вещества (меньше 10“3 г), но вместе с тем при работе
с водными растворами биологических соединений возникают большие труд-
ности из-за очень сильного поглощения инфракрасного излучения 1 одой.
Поэтому пользуются образцами в виде волокон или тонких пленок. На
фиг. 103 показаны спектры поглощения белков и синтетических полипеп-
тидов. Как и следовало ожидать, большая часть характеристических групп
содержит атом водорода. Отличительной чертой этих спектров являются
полосы валентных колебаний И — Н-групп при 3300 и 3100 см-1, которые
имеют пониженные частоты по сравнению с колебаниями этой же группы
в газовой фазе (3500 слТ1), что указывает на наличие водородных связей.
Эти данные инфракрасной спектроскопии служат наиболее строгим экспе-
риментальным доказательством существования водородных связей в бел-
ках и полипептидах. Тот факт, что поглощение, соответствующее колеба-
ниям не связанных водородными связями М — Н-групп, очень мало, ука-
зывает, что огромное большинство этих групп участвует в водородных свя-
зях. В связи с тем что состояние водородного атома легко определить по

инфракрасным спектрам поглощения,
представляется важным рассмотреть бо-
лее детально, как влияет на это состоя-
ние взаимодействие водородного атома
с соседними группами.

9.	Энергетические уровни структур,
связанных водородными связями. Рас-
смотрим энергетические уровни ОН-
группы, которая благодаря положитель-
ному заряду на водороде притягивается
к электроотрицательному атому, напри-
мер Ы, О или С1. Взаимодействие между

Фиг. 104. Кривые потенциальной
энергии и уровни энергии для ОН-
группы в отсутствие (7) и при нали-
чии (//) водородной связи.

Для наглядности нулевые точки обеих
кривых совмещены.

водородом и электроотрицательным ато-
мом увеличивает ширину кривой потен-
циальной энергии, описывающей коле-
бания ОН-группы. На языке класси-
ческой теории это эквивалентно умень-
шению силовой константы осциллятора.

Как следует из принципа неопределенности, увеличение размеров области,
в которой может находиться атом водорода (фиг. 104), приводит к пониже-
нию уровней энергии. Изменение энергии при переходе между двумя
соседними уровнями, очевидно, будет меньше для конфигурации, связан-
ной водородной связью, и поэтому соответствующая полоса поглощения
сдвигается в сторону более низких частот. В действительности из-за рас-
щепления энергетических уровней картина может быть и более сложной,.

чем та схема, которую мы только что рассмотрели.

Сдвиг полосы поглощения при образовании водородной связи хорошо
виден на спектрах поглощения фенола, о-хлорфенола и 2,4,6-трихлорфе-
нола, показанных на фиг. 105. У фенола первый обертон лежит в области
7100 см1, что приблизительно равно удвоенной частоте 3600 см'1, приве-
денной в табл. 15. У о-хлорфенола появляется новый интенсивный пик
при 6900 см1 (2-3450сл1-1), связанный с поглощением ОН-группы, участвую-
щей в водородной связи с атомом хлора. Поскольку ОН-группа обладает
более или менее свободным вращением около связи С — О, существует
достаточно большая вероятность, что атом водорода окажется на стороне,
противоположной от хлора. В этом случае энергетические уровни будут
соответствовать нормальной ОН-группе и будет наблюдаться характерная
для нее полоса поглощения. В 2,4,6-трихлорсреноле атом водорода в любом
случае участвует в водородной связи, и в поглощении наблюдается лишь

пониженная частота.

Внутримолекулярная водородная связь в о-хлорфеноле слаба, что
видно по двойному пику в его спектре, показанном на фиг. 105. Зная, что
водородная связь имеет энергию порядка г/4 эв (5,8 ккал!моль}, из формулы
больцмановского распределения можно найти отношение числа молекул

Ф и г. 105. Спектры поглощения, соответствующие первому
обертону валентных колебаний ОН-группы (переход с До = 2), для
фенола, о-хлорфенола и 2,4,6-трихлорфенола [28].

Пунктирные линии показывают направления, по которым могут устанавли-
ваться водородные связи. Молярный коэффициент поглощения пропор-
цией алей числу поглощающих молекул.

без водородной связи к числу молекул с водородной связью. Предполагая,
что статистические веса обеих конфигураций приблизительно одинаковы,

имеем

Ф и г. 106. Соотношение
между сдвигом полосы по-
глощения и энергией водо-
родной связи для связей
— О — Н ... О — [29].

Кривая построена на основании
данных, полученных для боль-
шого числа различных соеди-
нений.

АД 1/4

/гне связ. кт __е 1/40 _ е-ю ]0 4,
^евпв.

В этом случае уже не будут наблюдаться две
полосы поглощения, а произойдет сдвиг частоты,
как, например, у белков. Величина энергии
водородной связи определяет не только относи-
тельную высоту пиков поглощения, но и вели-
чину сдвига частоты. На фиг. 106 приведено
соотношение между энергией водородной связи
и величиной сдвига частоты для связи типа
— О — Н . . . О. Если допустить, что эти дан-
ные применимы для случая о-хлорфенола, то
получим, что сдвигу • 200 см~1= 100 см'1 соот-
ветствует энергия водородной связи 900 кал/моль,
т. е. немногим больше 600 кал/моль — энергии

теплового движения.

10.	Сечение и коэффициент поглощения. Из фиг. 103 и 104 видно, что
полосы поглощения веществ в твердом и жидком состояниях не столь узки,
как в газовой фазе. Это объясняется тем, что энергетические уровни осцил-
ляторов расщепляются под действием сильных местных полей на большое
число компонент, и в наблюдаемом спектре полосы, соответствующие пере-
ходам, между многими основными и возбужденными уровнями, сливаются
между собой. Такие широкие полосы полезно характеризовать не только
частотой, но и коэффициентом поглощения.

Для расчета зависимости между коэффициентом поглощения света
и параметрами молекулы воспользуемся здесь методом, который позже
применим при рассмотрении явлений, связанных с действием излучения
на биологические системы. В настоящий момент мы ограничимся лишь рас-
смотрением действия поглощающей системы на излучение.

Предположим, что на поглощающую среду толщиной дх и площадьью А
падает I монохроматических (ротонов в секунду на единицу площади (фиг.
107). Часть падающих фотонов будет поглощена, а часть I + д! — про-
пущена, Разумеется, число прошедших фотонов меньше числа падающих,

Фиг. 107. Параметры, описывающие поглощение света тонкой
пластинкой толщиной йх (Л) и пластинкой конечной толщины х,
которую можно рассматривать как составленную из бесконечно
тонких пластинок толщиной йх (Б).

так что д! является отрицательной величиной. Число поглощенных в секун-
ду фотонов, отнесенное к единице площади, равно —д1. Поглощенная энер-
гия либо превращается в тепло, либо вновь излучается во все стороны.
Пользуясь введенными обозначениями, мы можем написать, что вероятность
поглощения равна-----у-. Предположим, что в поглощающей среде на еди-

ницу объема приходится п молекул, распределенных и ориентированных
случайно. Пусть а обозначает среднюю площадь поперечного сечения этих
молекул. Эту величину можно представлять себе как площадь поперечного
сечения электронного облака молекулы. Величина занятой молекулами
площади (на единицу площади среды) будет равна площади, занятой отдель-
ной молекулой а, помноженной на общее число молекул пА дх и деленной
на площадь А, т. е. а-пАдх!А = п-а-дх. Эта величина равна вероятности
того, что фотон попадет в молекулу. Однако, даже попав в молекулу, фотон
не обязательно вызовет в ней переход (если он вызовет переход, то это будет
означать, что он поглощен и исчез). Может случиться, что фотон не обла-
дает энергией, соответствующей разрешенному переходу, или пролетает
слишком далеко от соответствующей молекулярной группы, например ПН,
чтобы своим полем воздействовать на эту группу. Кроме того, энергии
осцилляторов данного типа, находящихся в различных частях молекулы,
могут слегка различаться из-за влияния электрических полей соседних
групп. В этом случае не все П — Н-группы будут поглощать при одной
и той же частоте, и в результате взаимодействие фотон — осциллятор будет
12 Заказ № 1168
слабым из-за низкого значения вероятности перехода. Мы можем учесть
все эти эффекты формально, обозначив через Р вероятность поглощения
фотона при прохождении через молекулу. Это теоретическое значение
вероятности поглощения мы можем теперь записать в виде

р (п-а-с1х) = п-ра'-йх.

Назовем ра сечением поглощения 5 и приравняем значения эксперимен-
тальной и теоретической вероятностей поглощения:

’	~ = П8(1Х.	(7.11)

Из этого уравнения или его интегральной формы, приведенной ниже, опре-
деляют сечение поглощения 5.

Область длин волн содержа-

Ф и г. 108. Соотношения между 1п ///0 и пх для монохроматиче-
ского и немонохроматического света.

А — контур линии поглощения; Б — 1п 1/1$ для излучения двух типов.

Пусть поглощающий образец имеет конечную толщину х и на него па-
дает свет интенсивности 10 (см. фиг. 107, Б). Интегрирование уравнения
(7,11) дает

I	к

С 01	Г	.

\ у - — \	п8 ах,

10	0

1п ~ = — пкх, или /- = е~П5Х.	(7.12)

7о	‘о

Полученное соотношение, показывающее, что интенсивность проходя-
щего света экспоненциально падает с увеличением концентрации и длины
пути в образце, известно под названием закона Ламберта — Бера. Экспо-
ненциальная форма зависимости связана со статистической природой про-
цесса поглощения.

При выводе уравнения (7.12) или его дифференциальной формы, урав-
нения (7.11), были сделаны следующие три предположения: 1) поглощающие
единицы независимы друг от друга; 2) поглощающие единицы расположены
и ориентированы хаотически; 3) падающий свет монохроматичен. Легко
видеть, что эти предположения действительно необходимы, чтобы выполня-
лись написанные выше уравнения. Предположим, что полоса поглощения
имеет форму, изображенную в координатах 5, А на фиг. 108, А. Если эта
полоса исследуется с помощью монохроматического света, то уравнение
(7.12) выполняется (пунктирная линия на фиг. 108, Б). Если же падающий
свет содержит достаточно широкий набор длин волн, то соотношение между
1п 1Ц0 и пх будет описываться сплошной кривой на фиг. 108, Б, так как
некоторое количество света совсем не будет поглощаться, какой бы толщины
образец мы ни взяли. Для монохроматического света при выполнении усло-
вий 1 и 2 уравнение (7.12) справедливо всегда, и при любой длине волны
1п 1/10 будет пропорционален величине пх (которая представляет собой
число молекул, приходящихся на единицу площади), или поверхностной
плотности поглощающего вещества. Наклон касательной к сплошной линии
нафиг. 108, Б равен—5. Изображенная графически зависимость я от 7 и есть
то, что называют спектром поглощения.

Существует много различных форм записи соотношения, выраженного
уравнением (7.12). Одной из наиболее часто встречающихся является запись
в виде

У§,у-=—сс1, или у-=10~еС(,	(7.13)

70	10

где I —толщина образца в сантиметрах, с — концентрация в молях на литр,
е — молярный коэффициент поглощения. Простой подсчет показывает, что

5 = 3,8- 10~21еслг2.	(7-14)

В ряде случаев при измерении поглощения может быть неизвестна либо
концентрация (которую нельзя определить, не зная веса поглощающего
вещества и его молекулярного веса), либо толщина образца. В этом случае
спектр поглощения представляют в виде графической зависимости Ш ///о
от 7, так как 1§ 1/10 пропорционален 5. Величина 1§ 1/10 называется опти-
ческой плотностью образца. Она зависит не только от свойств молекул,
но также и от толщины образца. Для удобства в табл. 17 приведены наиболее
употребительные названия некоторых параметров спектров поглощения.

Таблица 17

Некоторые термины, принятые в адсорбционной спектроскопии*

Термин	Определение
Оптическая плотность  Молярный коэффициент поглощения  Молярное сечение поглощения	О=1ё70/7  з= — 1п10/1 пх у

* В приведенных формулах с выражено в молях на литр, х — в сантиметрах, п означает число
молекул на 1 см3.

Нетрудно видеть, что для выполнения закона Ламберта — Бера (7.12)
совершенно необходимо, чтобы распределение и ориентация молекул были
хаотичными. Действительно, представим себе, что молекулы распределены
не хаотично, а собрались в одной из половин кюветы; тогда по меньшей мере
50% падающего света в любом случае пройдет насквозь. Точно так же, если
бы оказалось, что все дипольные моменты молекул ориентированы парал-
лельно друг другу, в образце поглотилось бы не больше 50% падающего
света (если он не поляризован). На роли ориентации мы более подробно
остановимся в разд. 12, после ознакомления с экспериментальной техникой
измерения поглощения. Необходимо отметить, что, если сечение поглощения
зависит от концентрации, уравнение (7.12) в общей форме не выполняется,
но экспоненциальная зависимость интенсивности проходящего излучения
от длины пути в образце сохраняется и в этом случае.

11.	Экспериментальная техника измерения поглощения. Здесь мы не мо-
жем детально описывать приборы различных типов, используемые для изме-
рений поглощения. Нам придется ограничиться лишь описанием в общих
чертах одного из наиболее распространенных спектрофотометров, имеющего
много общего с другими аналогичными приборами,— спектрофотометра

Бекмана. Во всех приборах такого рода имеется источник монохроматиче-
ского излучения с изменяемой длиной волны, система измерения, обеспе-
чивающая определение 1/1о, и поглощающий образец. Для получения моно-
хроматического пучка света лучше всего использовать источник, излучаю-
щий в широком спектральном интервале, и спектрограф, подобный изобра-
женному на фиг. 109, А. Свет от источника фокусируется на входную щель
спектрографа при помощи зеркал ту и т2. Если щель находится в фокаль-
ной плоскости вогнутого зеркала М, то падающий на него из щели свет
формируется в параллельный пучок, который направляется на кварцевую
призму с алюминированной задней поверхностью, эквивалентную 60-гра-
дусной призме. Преломленный свет возвращается почти точно по пути
падающего, составляя с ним лишь очень небольшой угол. Падая далее
на зеркало М, преломленный свет фокусируется ниже входной щели, в пло-
скости выходной щели. Таким образом, в плоскости выходной щели фоку-
сируется изображение спектра, а размеры щели определяют величину
спектрального интервала, пропускаемого монохроматором. Этот свет про-
ходит через образец и попадает на приемник света, например фотоэлемент.
Длину волны проходящего через монохроматор света можно менять посред-
ством вращения призмы. Так как вся остальная оптика прибора состоит
из отражающих поверхностей, то при изменении, длины волны расфокуси-
ровки прибора не происходит.

Если поглощающее вещество растворено или диспергировано в какой-
либо среде, например воде, то возникает задача определить отношение
интенсивности света, прошедшего через раствор, I, к интенсивности света,
прошедшего через растворитель, 10. Самый простой способ состоит в том,
чтобы измерить отношение усиленных фототоков, соответствующих свету,
прошедшему через раствор, и свету, прошедшему через растворитель.
Но более точные результаты дает использование усилителя в качестве
индикатора нуля (схема показана на фиг. 109, Б). Электроны, освобожден-
ные падающим светом, проходят через большое сопротивление 2-109 ом,
на котором возникает разность потенциалов ДУ = /-2-109. Когда регули-
руемое напряжение на потенциометре имеет значение, равное ДУ, сигнал
на выходе усилителя равен нулю и величина регулируемого напряжения
в этот момент пропорциональна интенсивности света, так как фототок равен
I = а1. Для большего удобства при практическом применении этого метода
переменная часть потенциометра 7? может быть прокалибрована так, чтобы
можно было считывать значения пропускания непосредственно в процентах.
Это можно сделать следующим образом. При закрытой шторке ползунок
потенциометра устанавливается на «0», и ту регулируется так, чтобы скомпен-
сировать темновой ток фотоэлемента. После этого устанавливают на пути
луча кювету с растворителем, ползунок потенциометра ставят на «100»,
открывают шторку и при помощи регулировки сопротивления г2 или интен-
сивности света (изменением ширины щели) снова компенсируют ток фото-
элемента. Таким образом, потенциометр прокалиброван так, что «0» соответ-
ствует отсутствию света, а «100» соответствует 10. Если теперь поместить
на пути луча поглощающий образец, то для компенсации фототока ползунок
потенциометра потребуется установить в некоторое промежуточное поло-
жение. Если разбить шкалу потенциометра на 100 равных частей, значение
IIIо можно будет считывать непосредственно в процентах.

В спектрофотометрах других типов в качестве диспергирующей системы
может быть использована не призма, а дифракционная решетка, а в качестве
приемников излучения — термопары, фотосопротивления или фотоумно-
жители. Источниками света при работе в инфракрасной и видимой областях
обычно служат раскаленные твердые тела. В ультрафиолетовой области
источниками служат водородные газоразрядные лампы. При некоторых
способах измерения поглощения (например, в случае, упомянутом в гл. XII
в связи с описанием отражательного микроскопа) используется фотографи-
ческая регистрация.

12.	Влияние ориентации диполей на поглощение света. Мы уже видели,
что во многих случаях положение полос поглощения и их интенсивность
позволяют определить химическое строение поглощающего вещества и коли-
чество поглощающих молекул. Так, положение полос поглощения белков,
связанных с ИН-группой, указывает на то, что атом водорода этой группы
образует водородную связь. Если бы эти ПН-группы были расположены
параллельно оси молекулы и сами молекулы были бы ориентированы, то по-
глощение света, электрический вектор которого параллелен осям молекул,
отличалось бы от поглощения света, в котором электрический вектор пер-
пендикулярен к ним. Иными словами, для неполяризованного света закон
Ламберта — Бера (7.12) в этом случае выполняться не будет, хотя он и вы-
полняется для обеих его компонент — /(( и 1^. Представим себе, что все
поглощающие диполи расположены параллельно друг другу и находятся
в плоскости, перпендикулярной направлению падающего луча (фиг. НО, Л).
Если падающий свет поляризован так, что его электрический вектор состав-
ляет с осью х угол 0, то его компоненты по осям х и у можно представить
в виде

(Ех)о = Еосоз0, (Еу)0 = Ео зт 0.
Посколькутакие приемники, как фотоэлемент, регистрируют интенсивность
света, которая пропорциональна квадрату амплитуды электрического
вектора, имеем

(4)о = 1о соз2 6, (1У)О = 10 зш2 6
и

|Дх:)о + (^з/)о = ПО-

БОЛИ падающий свет неполяризован, то обе компоненты равны по величине,
т. е. (1х)о — (Л/) о- Обе компоненты ослабляются по экспоненциальному

Ф и г. ПО. Взаимодействие света, электрический вектор которого имеет
компоненты Ех и Еу, с различными распределениями ориентированных
диполей.

А — все диполи расположены параллельно оси х; Б — диполи образуют фиксирован-
ный угол а с осью х, угол <р принимает произвольное значение.

закону и, обозначив через Зц сечение поглощения для света, поляризованного
параллельно оси симметрии (ось х), а через з^ — сечение поглощения для
света, поляризованного перпендикулярно этой оси, мы получим следующие
"оотношения:

(IIТ	1	^111	1

— ^ — П8\\О,2 И-------^. = 08^02.

*х	*у

При идеальной ориентации, как на фиг. ПОЛ, значение з_[_ будет равно нулю.
Интегрирование написанных выше равенств дает

4 = (7х)ое-П8пг и 4=(4)0.

Суммарная интенсивность прошедшего света, таким образом, равна

/ = 7х + 7г/ = (7х)ие-П8пг + (4)о,

из чего совершенно очевидно, что закон Ламберта — Бера не выполняется.

Распределение диполей, с которым мы встречаемся на самом деле, ближе
к тому, которое показано на фиг. НО, Б. При этом распределении все погло-
щающие диполи составляют фиксированный угол а с осью х и имеют случай-
ное распределение по азимутальным углам ср. Таким распределением можно
описать ориентацию групп —И—Н .. 0= в а-спирали, если ось а-спирали
совместить с осью х. Пусть (рЕх) и (рЕу) обозначают углы между диполем
и соответствующими компонентами электрического вектора, а з0 — сечение
поглощения диполя р, ориентированного параллельно Е. В этом случае
уравнение (7.Н) можно записать в виде

= — П80 соз2 (рЕх) (1г = — П8и (1г,

= —П8О соз2 (рЕу) (1г = — П8± (1г,

'у
где обозначения имеют прежний смысл, а черта над соз2 указывает, что
взято среднее значение. Усреднение дает

соз2 (рЕх) = соз2 а,

соз2 (рЕу) = у з1п2 а,
откуда

1Х = (4)о е~™"г	(8ц = з0 соз2 а)

Г ч \	(7.15)

(8±:=%з1п!а).

Удобной характеристикой степени ориентации диполей поглощающего
вещества служит отношение з^/зц, называемое дихроическим отношением
и не зависящее от толщины образца. Это

отношение можно найти из эксперимента,
определив отношение оптических плот-
ностей для света, поляризованного па-
раллельно оси симметрии и поляризо-
ванного перпендикулярно этой оси. Ди-
хроическое отношение есть функция рас-
пределения диполей. Для идеальной
ориентации, являющейся крайним слу-
чаем конического распределения, ди-
хроическое отношение бесконечно, что
очевидно из качественного рассмотре-
ния. Для конического распределения

в общем случае дихроическое отноше-

2 тт - ш	_	Фиг. 111. Зависимость дихроиче-

ние равно ^2а . На фиг. 111 показана Ского отношения от угла а для кони-
зависимость дихроического отношения от ческого распределения, показанного
г	на фиг. 110, Б.

угла а между осью и образующей ко-
нуса. Другие мыслимые распределения,
например гауссово распределение направлений диполей относительно оси х,
дадут, разумеется, другие результаты. Для конуса с углом 55° дихроиче-
ское отношение равно 1 и, следовательно, коэффициенты поглощения для
обеих компонент электрического вектора будут равны. В а-спирали,
описанной в гл. V, группы —	— Н . . . О = составляют с осью спирали

угол 12° и дихроическое отношение теоретически должно быть равно 44.

Здесь уместно сделать два предостережения, касающихся интерпрета-
ции данных по поглощению поляризованного света. Во-первых, наблюдае-
мое дихроическое отношение зависит не только от ориентации диполей в мо-
лекуле, но и от ориентации самих молекул относительно друг друга. Из этого

следует, что дихроическое отношение, рассчитанное для параллельно ориен-
тированных молекул, никогда не будет наблюдаться в экспериментах, так
как на самом деле молекулы не расположены параллельно. Во-вторых,
направление поглощающего диполя не обязательно совпадает с направлением
связи, потому что многоатомные молекулы лишь приближенно можно

рассматривать как сумму двухатомных осцилляторов.

13.	Дихроическое отношение для белков и нуклеиновых кислот. Чтобы
воспользоваться измерениями дихроизма биологически важных молекул
для установления их структуры, необходимо иметь поляризованный свет
и найти метод ориентации молекул. Поляризованный инфракрасный свет
можно получить за счет отражения или пропускания света через тонкую
(4 р) селеновую пленку, установленную под соответствующим углом к нап-
равлению падающего пучка. Ориентации молекул легче всего добиться,
используя полимеры аминокислот. Их растворяют в легко летучих раство-
рителях и наносят раствор на металлическую пластинку. Когда раствори-
тель испарится, полечившуюся тонкую пленку растягивают или прокаты-
вают, что сообщает полимерным цепям определенную ориентацию. После

1.0

Волнооь'е числа , см~‘

Фиг. 11-2 Спектр поглощения поли-а-бензилглутамата для света, поля-
ризованного параллельно (пунктир) и перпендикулярно (сплошная кривая)
оси молекулы [30].

Данные рентгеноструктурного анализа говорят о том. что эта молекула по типу
близка к а-кератину.

этого полимер исследуют методами рентгеноструктурного анализа и поля-
ризационной спектроскопии. Спектр поглощения растянутой пленки поли-
а-бензилглутамата

соосн2/ \ соосн2/ \ соосн2 /______________у

сн2	<!;н2	сн2

I	I	I

сн2	о	сн2	сн2

I II I н I

Н2М—С — С — Ы — С---------С—соон

Н Н I	н

для света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси молекул,,
приведен на фиг. 112. Характер дифракции рентгеновских лучей указы-
вает на то, что структура этой пленки подобна в основных чертах структуре
а-кератина и соответствует по типу а-спирали, описанной в гл. V. Спектр
поглощения, приведенный на фиг. 112, оказался очень полезным при уста-
новлении этой структуры. У этой свернутой полипептидной цепи валентные
колебания групп — И — Ни >С = О проявляются более сильно при осве-
щении светом, поляризованным параллельно осям молекул. Это свидетель-
ствует о том, что группы —-И — Ни >С = О расположены параллельно
оси молекулы. Дихроическое отношение при 3300 сдГ1 равно 14, что близко,
к теоретическому значению 44 для а-спирали. Такая большая величина
дихроического отношения исключает возможность структур, у которых
И — Н-группы образуют с осью молекулы угол больше 20°. Для деформа-
ционных колебаний И — Н-группы, как и следовало ожидать, дихроиче-
ское отношение меньше единицы, так как эти колебания должны преиму-
щественно возбуждаться светом, поляризованным перпендикулярно направ-
лению И—Н-связи.
Спектр волокна денатурированного инсулина в области валентных коле-
баний С = О и деформационных колебаний Ы •— Н показан на фиг. 113, А.
Поляризационные спектры таких волокон (относящихся к тому же типу
развернутых полипептидов, что и р-кератин) имеют характер, прямо про-
тивоположный характеру спектров полипептидов свернутой формы, пред-
ставленных на фиг. 112. Это доказывает, что группы С = О и И — Н в-этом
случае расположены перпендикулярно к оси молекулы и что водородные-

Ф и г. 113. Участок спектра поглощения белка в поляризованном инфра-
красном свете.

Л — волокно денатурированного • инсулина [31]; Б — кристалл гемоглобина в воде
(левая шкала). В нижней части фигуры показан спектр после вычитания погло-
щения воды (правая шкала) [32].

связи в развернутой структуре полипептидов имеют надмолекулярный-
характер.

Данные по поглощению поляризованного света для ряда известных
структур собраны в табл. 18.

Таблица 18

Поляризационные свойства полос поглощения белка*

Полоса поглощения		Дихроизм и частота полосы,	
		свернутая цепь	развернутая цепь
м—н	(деформационные колебания)	01545	л1525
С—О	(валентные)	л 1660	С1640
М— н	(валентные)	лЗЗОО	сЗЗОО
ы—н	(комбинационная полоса)	с4830	л4825

* Л означает, что сильнее поглощается свет, поляризованный параллельно оси молекулы;

сг — что сильнее поглощается свет, поляризованный перпендикулярно осн.

• Большая часть приведенных нами спектров получена на пленках или
волокнах, а не в водных растворах, так как очень сильное поглощение
воды закрывает интересующую нас область. Однако у белков существует
одна область поглощения, которую можно изучать на фоне поглощения
воды. В этой области лежит полоса 4825 слГ1, связанная с комбинационными
деформационными и валентными колебаниями К — Н-группы. Эта полоса
обладает такими же поляризационными свойствами, как и полоса деформа-
ционных колебаний К’ — Н, и ее можно использовать для изучения ориен-
тации групп К — Н в кристаллах белка. На фиг. 113, Б показана эта
область спектра для кристалла гемоглобина. Из кривых видно, что погло-
щение сильнее для света, поляризованного параллельно оси Ь кристалла,
и, следовательно, водородные связи ориентированы перпендикулярно этой
оси. Поскольку гемоглобин скорее всего имеет свернутую структуру с водо-
родными связями, параллельными оси, то данные фиг. 113, Б говорят о том,
что полипептидные цепи в этом кристалле преимущественно ориентированы

Фиг. 114. Спектр поглощения тонкой пленки ДНК для света, поляризо-
ванного параллельно (сплошная кривая) и перпендикулярно (пунктир) оси
молекулы 133].

На кривых указаны связи, которым приписываются отдельные полосы поглощения.

перпендикулярно оси Ь, что согласуется с интерпретацией рентгенострук-
турных данных, приведенной в гл. V.

Метод поляризационных инфракрасных спектров применим также
и к анализу структуры нуклеиновых кислот. На фиг. 114 показан спектр
поглощения тонкой пленки ДНК- Положение полос поглощения К — Н-
и О — Н-групп указывает на то, что эти группы участвуют в водородных
связях.-Дихроизм групп К — Н, О — Н иС = О говорит о преимуществен-
но перпендикулярной ориентации водородных связей относительно оси моле-
кулы. По-видимому, эти связи имеют межмолекулярный характер. Группы
Р — О — С также имеют компоненту, перпендикулярную оси молекулы,
но отсутствие дихроизма в полосе поглощения Р — О (1250 см 1) заставляет
думать, что они ориентированы, как показано на фиг. ИЗ, под углом 55°
к оси молекулы. Структурная модель ДНК, обсужденная в гл. V, находится
в согласии со всеми этими данными.

14.	Электронные уровни энергии. Даже такой простой атом, как а гом
водорода, обладает неограниченно большим числом возможных электрон-
ных состояний. Если представить себе молекулу в процессе ее образования
из атомов, то уровни энергии молекулы, связанные с конфигурацией элек-
тронного облака, можно представить как функцию межядерных расстоя-
ний (как это сделано на фиг. 82). Когда два атома, находящиеся в основном
состоянии, сближаются, исходный синглетный уровень энергии расщепляет-
ся на два молекулярных уровня. Один уровень соответствует конфигурации
; параллельными спинами, другой — с антипараллельными. Если в моле-
кулу объединяются Л/ атомов, то исходный синглетный уровень расщепится
на /V компонент, отвечающих различным комбинациям спинов. Очевидно,
что в многоатомных молекулах электронная структура становится очень
сложной. Она усложняется еще больше за счет того, что переходы молекулы
в возбужденное состояние могут происходить не только из тех ее состояний,
когда атомы находятся в своих основных состояниях, но также за счет пере-
ходов в атомах, первоначально находившихся в одном из возбужденных
состояний. Все это говорит о том, что число возбужденных электронных
состояний молекулы значительно превосходит число электронных состояний
исходных атомов, из которых она составлена.

Рассмотрим простейшую молекулу — молекулу Н2- В двухатомной
молекуле энергия связи и форма потенциальной кривой зависят от распре-
деления электронов, и, следовательно, каждое электронное состояние

характеризуется своей потенциальной кривой. Если мы представим энергию
молекулы в виде суммы электронной и колебательной энергий (такое пред-
ставление возможно, потому что электроны движутся много быстрее ядер
и колебательные движения можно рассматривать как медленные пульсации
электронного облака), то каждой потенциальной кривой будет соответство-
вать система колебательных уровней энергии. Некоторые потенциальные
кривые молекулы водорода с системой колебательных уровней представлены
на фиг. 115, А. Как мы уже видели на фиг. 82, суммарный спиновый момент
в основном состоянии равен нулю. Так как проекция нулевого спинового
момента на любое заданное направление равна нулю, это состояние называют
синглетным. В первом возбужденном состоянии оба электрона имеют парал-
лельные спины. Проекция суммарного спинового момента этого состояния
на какое-либо выделенное направление принимает три значения: 1, 0 или
—1, поэтому такое состояние называют триплетным. На фиг. 115, А изо-
бражено только одно из синглетных возбужденных состояний, получаемых
соединением нормального и возбужденного атомов. В действительности
таких состояний очень много. Выше первого неустойчивого триплетного
состояния имеется целый ряд устойчивых триплетных уровней. Для моле-
кул, состоящих из М атомов, вместо потенциальных кривых, которые
рисовались для двухатомных молекул, следует рассматривать (ЗИ — 6)-
мерные потенциальные поверхности, но в этой книге мы не будем на этом
останавл иваться.

При поглощении излучения двухатомной молекулой суммарный спин
молекулы, как правило, не изменяется. Поэтому если основное состояние
синглетно, то поглощенный фотон переведет молекулу в синглетное же воз-
бужденное состояние. Переход из одного электронного состояния в другое
сопровождается изменением электронных волновых функций (распределения
электронов), при этом правил отбора для колебательного квантового числа
не существует. Вероятность того или другого изменения колебательного
уровня при электронных переходах определяется принципом Франка —
Кондона. На языке классической теории этот принцип можно изложить
следующим образом. Время, требуемое для изменения электронной конфи-
гурации при излучении или поглощении фотона, значительно меньше харак-
терного времени колебания ядер (период колебания ядер ~10“13 сек, а время
перестройки электронного облака ~10~16 сек). Таким образом, положения
ядер и их скорости не изменяются за время изменения электронной конфи-
гурации. Это означает, что на потенциальных кривых электронные переходы
изобразятся в виде вертикальных линий. Так как вероятность встретить
молекулу у краев потенциальной ямы, где ядра имеют нулевую скорость,
максимальна, переходы из этих точек будут наиболее вероятными. В кван-
товой механике вероятности переходов определяются степенью перекрытия
волновых функций. Для высших колебательных уровней такое рассмотрение
дает те же результаты, что и классическое. Однако для уровня с V = 0 наибо-
лее вероятное положение осциллятора — центр уровня, а не его крайние
точки, и с наибольшей вероятностью переходы будут происходить именно
отсюда. Так как при комнатной температуре большая часть молекул нахо-
дится на уровне с V = 0, почти все переходы с поглощением света начинаются
из этой точки.

В соответствии с принципом Франка — Кондона поглощение света
на фиг. 115, Б обозначено вертикальной стрелкой, направленной вверх.
Если молекула не растратит энергию возбуждения при столкновениях, она
снова вернется в основное состояние по пути, указанному одной из пунк-
тирных стрелок, с излучением света. Как можно видеть, энергия этого
флуоресцентного излучения всегда меньше энергии поглощенного света.
Время жизни такого возбужденного состояния ~ КГ8 сек. (Это время не сле-
дует путать со временем перестройки электронной конфигурации.) Если
поглотившая излучение молекула находится в тесном контакте с другими
молекулами, то за время, пока поглощенная энергия будет вновь излучена,
может произойти большое число столкновений. При частоте колебаний
1013 сек'1 за время 10'8 сек произойдет 105 колебаний или столкновений
с соседними молекулами. Это означает, что молекула, находившаяся перво-
начально в возбужденном электронном состоянии, скажем, на уровне
с V = 3 (как показано на фиг. 115, Б) и имевшая более высокую колебатель-
ную энергию, чем ее соседи, потеряет эту избыточную энергию раньше,
чем произойдет излучение поглощенной энергии. Этот процесс потери
избыточной колебательной энергии (переход ее в тепло) называют безызлу-
чательным переходом. В результате этого процесса возбужденная молекула
переходит на нижний колебательный уровень энергии, и уже с этого уровня
происходит флуоресценция (на фиг. 115, Б этот переход показан сплошной
стрелкой, направленной вниз). Таким образом, преобразование энергии,
поглощенной жидкостями и твердыми телами, осуществляется по следующей
схеме: поглощение фотона; переход молекулы на один из высших колеба-
тельных уровней возбужденного электронного состояния; передача избы-
точной колебательной энергии окружающим молекулам; излучение фотона
с переходом молекулы на высокий колебательный уровень основного состоя-
ния; потеря «горячей» молекулой в ее основном состоянии избыточной коле-
бательной энергии путем передачи ее окружающим молекулам.

15.	Электронные спектры многоатомных молекул. Большие успехи
спектроскопии двухатомных молекул связаны с возможностью получать

Фиг. 116.

А — спектр и структура ^-каротина; Б — спектр гемоглобина в видимой области
и структура простетической группы (протогема)-

спектры испускания этих молекул, возбуждая их, например, в газоразряд-
ной трубке. К сожалению, в случае многоатомных молекул этого нельзя
сделать, не разрушив самую молекулу, и мы вынуждены обращаться к спек-
трам поглощения и флуоресценции. С изменением электронных состояний
молекул связаны спектры поглощения в ближней инфракрасной, видимой
и ультрафиолетовой областях. В ближней инфракрасной и видимой областях
поглощают такие молекулы, как каротины и порфирины (спектры поглоще-
ния фикоэритрина и хлорофилла см. на фиг. 157). Спектры и структуры
каротина и гемоглобина приведены на фиг. 116. Поглощающие группы
в этих молекулах представляют собой большие резонирующие структуры
с большим числом сопряженных связей. Электроны, осуществляющие
химическую связь, не локализованы, но являются общими для всей струк-
туры. В подобных случаях можно с достаточной уверенностью предсказать
характер их спектров поглощения.

В качестве простейшего примера рассмотрим, как производится расчет
энергетических уровней группы М электронов, заключенных в одномерный
ящик длины Ь. Такая модель довольно хорошо имитирует цепь р-каротина,
если длину цепи принять заЛ, а число атомов в цепи — за так как в каро-
тине на каждый атом приходится около одного свободного электрона. Длина
волны электрона определяется соотношением Де-Бройля

Х = | ,	(7.16)

где И — постоянная Планка, а р — импульс электрона. У свободного элек-
трона потенциальная энергия равна нулю, и, следовательно,

р2

Общая энергия=Кинетическая энергия =	,	(7.17)

где т — масса электрона. Если электрон заключен в ящик длины Л, то пред-
ставляющие его волны должны исчезать на краях ящика, т. е. в этих местах
должны находиться узлы. Из сказанного следует, что

1 = ^, п=1, 2, ....	(7.18)

Мы можем разрешить уравнения (7.16) и (7.18) относительно импульса /_\
выразив его через А и подставив это значение в уравнение (7.17). Проделав
это, мы получим выражение для разрешенных уровней энергии

При изменении квантового числа от п до п + 1 энергия изменится на

йЕ=ет[('1+1)!-»21=ету<2л+1)-	<7-20>

Так как для электронов в ящике должен выполняться принцип Паули,
то они заполнят (предполагая, что М четное) самых низких уровней..
Таким образом, наименьшее возможное значение п в уравнении (7.20) равно
Д/	Л г-

—=- и для минимального значения ЕЕ мы имеем

ЛЕмнн = ^(М + 1).	(7.21).

Из простых рассуждений, которые привели нас к уравнению (7.21),.
вытекает одно важное следствие. Длина цепи пропорциональна числу
атомов в цепи и, следовательно, числу свободных электронов ЛЕ Таким обра-
зом, минимальная энергия перехода в молекуле должна быть приблизительно
обратно пропорциональна Ь, т. е. в небольших сопряженных структурах,
где энергетические уровни достаточно далеко отстоят друг от друга, макси-
мум поглощения должен лежать при более коротких длинах волн. Эта зако-
номерность подтверждается на опыте. Так, например, гем, входящий в состав
гемоглобина, имеет основной максимум поглощения при 4000 А. Более мел-
кие структуры с сопряженными связями, такие, как аминокислоты тирозин
и триптофан, имеют максимумы поглощения при 2800 и 2200 А. Пептидная
связь, имеющая лишь частично резонансный характер, поглощает при 1900 А,
а переходы, связанные с одиночными связями, проявляются в поглощении
при еще более коротких длинах волн. На фиг. 117 показаны спектры погло-
щения некоторых аминокислот и нуклеиновых кислот.

Фиг. 117. Спектры поглощения некоторых аминокислот и нуклеино-
вых кислот при нейтральных рН или в сухом состоянии.

Так как вода и другие растворители становятся непрозрачными ниже
1800 А, для получения спектров в более коротковолновой области нужно

пользоваться сухими образцами.
Но большая часть имеющихся
в продаже спектрометров не по-
зволяет продвигаться в коротко-
волновую область за 2000 А,
и поэтому спектроскопические
данные по биологическим соеди-
нениям относятся в основном к
более длинноволновой области.

16.	Ультрафиолетовые спек-
тры поглощения белков и ну-
клеиновых кислот. Почти все
соединения имеют характерные
спектры поглощения в ультра-
фиолетовой области, но мы оста-
новимся лишь на двух классах
соединений — белках и нуклеи-
новых кислотах. Судя по дан-
ным, представленным на фиг. 117,
можно ожидать, что максимумы

Л.А

Ф иг. 118. Спектр поглощения типичного
белка — бычьего сывороточного альбумина
(7) — и нуклеиновой кислоты (77) при рН 7
в ультрафиолетовой области.

поглощения белков будут ле-

жать в области 2800 А и 1900 А, а нуклеиновых кислот — при 2600 А.

Как видно из фиг. 118, это действительно так. Оптические плотности,

приведенные на этой фигуре, были рассчитаны по данным, получен-

ным для сильно разведенных растворов в предположении, что выполняется
закон Ламберта — Бера (7.12). В длинноволновом ультрафиолете оптиче-
ская плотность нуклеиновых кислот в 20 раз больше, чем у белков (при рав-
ной весовой концентрации). Это объясняется тем, что доля ароматических
аминокислот в белке невелика и поэтому белки очень слабо поглощают при
длинах волн более 2100 А. Благодаря сильному и характерному поглоще-
нию нуклеиновых кислот в ультрафиолетовой области их очень просто обна-
ружить. С помощью ультрафиолетового микроскопа, описанного в главе
XII, можно определять локализацию нуклеиновых кислот в клетке. Спектры

Фиг. 119. Спектры поглощения сывороточного глобулина
(Л) и ДНК (Б) [41].

Сплошные кривые — до гидролиза, пунктир — после гидролиза.

нуклеопротеидов представляют собой результат наложения спектров белка
и нуклеиновой кислоты. Например, вирус табачной мозаики, в котором 6%
по весу составляет РНК, а„ остальное белок, приблизительно одинаково
поглощает при 2600 и 2800 А.

Спектр поглощения большой молекулы, такой, как молекула белка
или нуклеиновой кислоты, в длинноволновой ультрафиолетовой области
связан с электронными переходами в молекулярных группах сравнительно
небольшого числа типов, а именно в пуринах, пиримидинах и ароматиче-
ских аминокислотах; в поглощении эти группы проявляются практически
независимо друг от друга, так как в молекулах они находятся на сравни-
тельно больших расстояниях одна от другой, вследствие чего их волновые
функции разделяются и не влияют одна на другую. Таким образом, можно
ожидать, что сечение поглощения § большой молекулы равно сумме сечений
поглощения 5г ее компонентов:

(7.22)
г

Фиг. 119 позволяет сравнить спектр белка со спектром составляющих его
аминокислот и спектр ДНК со спектром эквивалентной суммы нуклеотидов.
Мы видим, что для белка уравнение (7.22) выполняется очень хорошо,
и, следовательно, по спектру поглощения белка можно судить об относи-
тельном количестве содержащихся в нем тирозина и триптофана. При такого
рода определении спектр поглощения белка измеряется в растворах с кис-
лыми и щелочными рН. В растворах со щелочным рН фенольная группа
тирозина ионизуется и ее спектр изменяется. Сопоставление этого спектра
со спектром белка при кислом рН позволяет произвести однозначное опре-
деление количеств тирозина и триптофана. Небольшой сдвиг в длинно-
волновую область, видный на фиг. 119, А, объясняется тем, что в
нативном белке ОН-группа тирозина участвует в водородной связи, кото-
рая несколько понижает электронные уровни энергии группы

—ОН.

4,2	3,8 ЗЬ 3,0 *104

Волновые числа ,см~‘

Ф и г. 120. Спектры поглощения тонкой
пленки тимина при комнатной температуре
(пунктир) и при температуре жидкого азота
(сплошная кривая) [34].

Эти изменения особенно заметны в случае такого белка, как рибонуклеаза,
которая содержит тирозин и не содержит триптофана. Указанный сдвиг
можно использовать для оценки того, насколько сохранилась третичная
структура нативного белка. Что касается поглощения ДНК, то, как показы-
вает фиг. 119, Б, поглощение деполимеризованной ДНК примерно на 30%
больше поглощения высокополимерной формы. Из этого следует, что в двой-
ной спиральной структуре ДНК основания не являются независимыми,
а находятся сравнительно близко друг от друга и связаны водородными
связями. Это дает нам простой метод определения степени взаимосвязи
оснований, используемый, например, при определении активности ДНК-азы.
Изменения спектра, подобные
показанным на фиг. 119, Б,
наблюдаются в соответствующих
условиях и при взаимодействии
полиадениловой и полиуридило-
вой кислот. Таким образом,
спектроскопия дает возможность
наблюдать взаимодействие между
этими двумя полимерами 124].

17.	Тонкая структура спек-
тров. Большая часть спектров,
которые мы видели, не обладает
заметной структурой. Даже если
бы для получения этих спектров
был использован строго монохро-
матический свет, в них все же
не удалось бы увидеть узкие
полосы или линии, так как ла
поглощающую молекулу всегда
влияют случайные и изменяю-
щиеся во времени поля окру-

жающих молекул. Можно ожидать, что при понижении температуры
эти случайные возмущения станут меньше, все молекулы перейдут в основ-
ное состояние и в спектре поглощения появится тонкая структура. Для
некоторых соединений были получены спектры поглощения при температуре
жидкого воздуха и жидкого водорода. Из соединений, сильно поглощающих
в ультрафиолетовой области, пиримидины, в частности,обнаруживают при
низкой температуре очень узкие полосы поглощения. На фиг. 120 показан
один из таких спектров. Полосы поглощения в нем расположены приблизи-
тельно через равные интервалы (выраженные в волновых числах), что и сле-
довало ожидать, предполагая, что полосы связаны с переходами электронов
с нулевого уровня основного состояния на последовательные колебательные
уровни возбужденного состояния.

13 Заказ № 1168
18.	Поляризованное ультрафиолетовое излучение. Тогда как погло-
щение поляризованного инфракрасного излучения может дать некоторые
сведения об ориентации специфических групп в нуклеиновых кислотах и бел-
ках, поглощение видимого и ультрафиолетового излучения не связано с каки-
ми-либо определенными связями в молекулах, за него ответственны целые
группы атомов. Например, гем является большой плоской молекулой, опи-
сываемой большим числом резонансных структур. Грубо говоря, эту группу
атомов можно представить себе как кольцо, в котором циркулирует элек-
тронный газ. Следует ожидать, что электроны такой группы будут погло-
щать излучение лишь в том случае, когда электрический вектор падающего

Фиг. 121. Спектры поглощения поляризованного света в видимой
и ультрафиолетовой областях.

А — кристалл метгемоглобина лошади весом 10-9 г [35]; I — ГЦ оси Ь, II — Л|| оси а.
Б — нуклеиновая кислота из тимуса (пленка при влажности 90%) [36]; I — Е
перпендикулярно направлению мазка; II — Е параллельно направлению мазка.

света будет лежать в плоскости кольца. Но это, конечно, не единственная
возможность; полосы поглощения могут возникать и благодаря изгибам
плоскости кольца, возникающим при колебаниях, перпендикулярных
плоскости кольца. Оба предположения могут быть проверены эксперимен-
тально, Если правильно последнее предположение, то должно существовать
одно направление с большим поглощением и два направления, перпендику-
лярные первому, с малым поглощением. Если же сильно поглощается излу-
чение с электрическим вектором, лежащим в плоскости кольца, то должно
быть два направления с большим поглощением и одно с Малым. Данные,
полученные в видимой области спектра, говорят о том, что излучение сильно
поглощается тогда, когда его электрический вектор лежит в плоскости коль-
ца. На фиг. 121, А показан спектр поглощения кристалла гемоглобина
при двух направлениях поляризации падающего света. Эти спектры получе-
ны лишь для двух направлений поляризации, но другие данные, относящиеся
к области 4000 А, указывают, что ось & эквивалентна оси с. Таким образом,
группы гема сильнее всего поглощают тот свет, электрический вектор кото-
рого лежит в плоскости Ьс этих групп. Точные данные относительно ориен-
тации этих групп, представленные в гл. V, получены с помощью метода
парамагнитного резонанса, описанного в следующем разделе. Данные
по поглощению при 2800 А указывают, что ароматические аминокислоты
также ориентированы своими плоскостями параллельно оси Ь.

Если гель ДНК размазать по пластинке в определенном направлении,
то длинные молекулы ДНК расположатся в направлении мазка. При этом
наиболее сильно поглощается свет с электрическим вектором, перпендику-
лярным направлению мазка (фиг. 121, Б). Это доказывает, что плоскости
пуринов и пиримидинов расположены почти перпендикулярно к оси цепи,
что соответствует модели, изображенной на фиг. 73. При низких значениях
относительной влажности дихроизм уменьшается, потому что плоскости
оснований в этом случае составляют меньший угол с осью молекулы.

Применение поляризованного ультрафиолетового света для исследова-
ния структуры вируса дало результаты, сходные с результатами, полу-
ченными для гемоглобина [5]. Для получения ориентированных частиц
вируса их пропускали через тонкий капилляр, после чего получали спектры
поглощения для света, поляризованного параллельно и перпендикулярно
направлению потока. Было установлено, что в первом случае коэффициент
поглощения в области 2800 А больше, чем во втором. Это означает, что
плоскости ароматических аминокислот расположены параллельно оси вирус-
ной частицы.

19.	Электронный парамагнитный резонанс. Как было замечено в начале
главы, молекулы с неспаренными электронами (свободные радикалы) погло-
щают в области длин волн — 1 см. Это поглощение связано с электронным
парамагнитным (спиновым) резонансом (ЭПР), т. е. с переориентацией спина
неспаренного электрона во внешнем магнитном поле при воздействии
на молекулу электромагнитным излучением подходящей частоты. Метод
ЭПР можно использовать не только для измерения числа неспаренных элек-
тронов в образце, но также и для определения внутренних магнитных
полей, влияющих на энергетические уровни. При помощи ЭПР был иссле-
дован ряд биологических систем, в частности: облученные хлоропласты,
белки, содержащие группу гема, окислительно-восстановительные системы
и белки, подвергнутые воздействию рентгеновских лучей.

Случай свободных электронов. Спин электрона может быть ориентирован
параллельно или антипараллельно направлению приложенного магнитного
поля Н. Следовательно, магнитный момент электрона ре, имеющий направ-
ление, противоположное спину вращающегося отрицательного заряда,
также будет ориентирован параллельно или антипараллельно Н. Двум
различным ориентациям магнитного момента соответствуют различные
энергии. Такая система может поглощать электромагнитное излучение
с частотой т, если АЕ = йт. Энергия взаимодействия магнитного диполя
ре с полем Н определяется выражением, аналогичным выражению для
энергии взаимодействия электрического диполя с электрическим полем:

Е = реД (1 — соз 6),

где 0 — угол между ре и Н. Возможные ориентации магнитных моментов
показаны на фиг. 122. Так как 0 = 0 или л, то очевидно, что

ДА = 2реД.	(7.23)

Падающая электромагнитная волна благодаря своему переменному магнит-
ному полю может взаимодействовать с электроном в том случае, когда
энергия ее фотонов равна ДА, или

йт = 2реА.	(7.23')

Случай связанных электронов. В действительности электроны жидких
или твердых соединений нельзя считать свободными. Их энергии зависят
не только от приложенного внешнего поля, но и от взаимодействия со всеми
окружающими электронами, обусловленного внутренними магнитными
полями, которые создаются электронами исследуемой молекулы. Таким
образом, уравнение (7.23) неточно описывает расщепление уровней энергии
во внешнем магнитном поле Н и его следует заменить уравнением, близким
по форме, которое обычно записывается так:

&Е = §р.йН.	(7.24)

Величина р0, называемая магнетоном Бора, представляет собой магнитный
момент классического вращающегося заряда е, момент количества движения
которого, тег, равен й/2л. В электростатических единицах системы СО8
эта величина равна еН/^лтс = 9,3-10-21 эрг/гс. В единицах МК8 величина

/У

5

Ее

Е=0

—-—» Спин

Магнитный

* ~ момент
Ее

2цеН

Ф и г. 122. Возможные ориентации спина
и магнитного момента электрона в маг-
нитном поле У/

р0 равна 9 ,3 .10 24 дж1вб1мг. (Электрон имеет спин —^л, и тем не менее
его магнитный момент весьма близок по величине к ц0.) Константа р, так
называемый фактор Ланде, введена для объяснения характера расщепления
спектральных линий в магнитном поле. Величина отношения -^-= 1,001,

1	Во

так что для свободных электронов в уравнениях (7.23) и (7.24) фактор
= 2,002. Общее выражение для частоты, которую будет поглощать моле-
кула, имеет вид

. у = ^Н.	(7.24')

Определение у при заданном значении Н или определение Н при фиксиро-
ванном значении V позволяет найти величину фактора ^'Для переходов, свя-
занных с поглощением. По величине фактора § можно судить, насколько
близка исследуемая система к системе свободных электронов и насколько
сильно молекулярная структура влияет на уровни энергии. Уравнение
(7.24') позволяет рассчитать, что для поля Н = 104 гс

г =	5-г/?± •104 гс = 2.8 • 1010 сек1.

6,6-10““27 эрг-сек

Аппаратура. Для получения спектров ЭПР используются совершенно
иные физические принципы и экспериментальная техника, чем в оптической
спектроскопии, хотя основные идеи в обоих случаях одни и те же. Образец
помещают в магнитное поле известной напряженности и измеряют интен-
сивность прошедшего через образец излучения. На фиг. 123 показана схема
простого, но не очень чувствительного прибора. На практике трудно исполь-
зовать вариацию частоты падающего излучения у для достижения равенства
(7.24'). Обычно для этой цели используют изменение магнитного поля при
фиксированной частотен и затем из (7.24') определяют Все абсорбционные
линии имеют конечную ширину, и поскольку Ат — А//, обычно вычерчивают
зависимость поглощения от приложенного магнитного поля Н, а не от часто-
ты. Можно также представить поглощение как функцию значения фактора
Чувствительность метода ЭПР очень высока. С его помощью при ширине
линии поглощения — 1 ас удается определять 1013 неспаренных электронов
в 1 см3 или около 10“8 молъ/л. Для электронов, дающих более широкие
линии, чувствительность меньше.

Фиг. 123. Блок-схема установки для получения спектров ЭПР.

Само-
писец

Результаты. Спектры ЭПР были получены для ряда окислительно-
восстановительных систем, играющих важную роль в биохимических про-
цессах, в частности для системы окисления гидрохинона до хинона через
свободный радикал семихинона,

Свободный радикал

а также в реакциях, катализируемых алкогольдегидрогеназой, цитохромом с,
цитохромредуктазой и цитохромоксидазой [25].

ЭПР наблюдается в высушенных и свежих хлоропластах при облучении
их светом [25]. Это указывает на то, что связанные с облучением стадии
фотосинтеза включают в себя явления полупроводимости, переход в три-
плетные состояния или образование свободных радикалов. На фиг. 124
показан спектр ЭПР сухих хлоропластов. Ширина этих полос поглощения
около 20 гс. Фактор § в максимуме полосы поглощения для освещенных
хлоропластов имеет значение 2,002, т. е. такое же, как для свободных элек-
тронов. Этот факт служит подтверждением полупроводниковой теории
процессов, протекающих в хлорофилл-липопротеидном комплексе. Тонкая
структура, намечающаяся в спектрах ЭПР неосвещенных хлоропластов,
означает, что по крайней мере некоторые электроны не вполне свободны,
а испытывают возмущающее действие со стороны окружающей молекулярной
структуры.

Спектр ЭПР групп гема в белках зависит от ориентации магнитного век-
тора падающего излучения. Значение фактора у изменяется при изменении
угла по той же причине, по которой изменяется значение оптического
коэффициента поглощения. Таким образом, измерения на отдельном кри-
сталле балка, содержащем группы гема, позволяют точно определить ориен-
тацию этих групп, поскольку фактор р имеет минимум в направлении, пер-
пендикулярном плоскости гема. На фиг. 125 показано изменение фактора р
для миоглобина при изменении угла. Миоглобин является мышечным бел-
ком, и его молекулярный вес составляет х/4 от молекулярного веса гемо-
глобина. Молекула миоглобина содержит лишь одну группу гема, но в еди-
ничной ячейке кристалла содержится две молекулы миоглобина. Так как
группы гема обеих молекул непараллельны друг другу, в спектре имеется,
как показано на фиг. 125, две линии поглощения, или два значения фактора р,
для каждой из ориентаций кристалла. Минимальное значение фактор р

• Фиг. 124. Спектры ЭПР дпя хлоро-
пластов в темноте и на свету при
V = 9,000-109 сек-1. Внизу изображен
разностный спектр свет—темнота [25].

Фиг. 125. Значения фактора § для
одиночного кристалла миоглобина при
различных ориентациях в плоскости аЬ
относительно приложенного магнитного
поля [37].

имеет для угла 23° по отношению к оси а. Следовательно, нормаль к плоско-
сти гема (направление, по которому фактор р имеет минимальное значение)
составляет угол 23° с осью а. Аналогичным образом находят углы между
нормалью к плоскости гема и другими кристаллографическими осями.
Сведения об ориентации гема в миоглобине и гемоглобине, приведенные
в гл. V, были получены именно таким путем. Совершенно очевидно, что метод
электронного парамагнитного резонанса найдет множество полезных приме-
нений в молекулярной биофизике.

Ядерный магнитный резонанс. Как мы видели, характер взаимодействия
электронов в молекулах можно исследовать по расщеплению уровней
энергии в магнитном поле, если электроны, которые мы рассматриваем,
имеют отличный от нуля суммарный спин. Расщепление уровней зависит
от магнитного момента электронов, который в свою очередь зависит от осо-
бенностей их взаимодействия. Ядра также могут иметь механический момент,
или спин, а следовательно, и магнитный момент. У протона спин равен Уг,
но его магнитный момент много меньше магнитного момента электрона из-за
меньшей угловой скорости. Ядерные магнитные моменты обычно выражают
через спин ядра /, ядерный ^-фактор рп и ядерный магнетон Бора =
= ек/^лМс, где М — масса протона.

Ядерный магнитный момент — рп1\\.п.
С различными возможными ориентациями ядерного спина во внешнем маг-
нитном поле связаны несколько отличающиеся друг от друга значения
энергии. Если на такую систему воздействовать излучением с соответствую-
щей частотой, то в ней могут происходить переориентации ядерпых спинов,
которые будут сопровождаться поглощением или излучением энергии. Это
явление называют ядерным магнитным резонансом (ЯМР). Энергия фотонов,
поглощаемых при переориентациях ядерных спинов, много меньше, чем

Фиг. 126. Спектры ядерного магнитного резонанса не-
которых соединений [38].

Л — спектр СН3СН2ОН, полученный с высоким разрешением
на частоте 30-106 сек-1; Б — спектры воды и 1,6-процентного
раствора ДНК в воде на частоте 30-106 сек-1.

в ЭПР, поскольку ядерный магнитный момент примерно в 2000 раз меньше
магнитного момента электрона (рп= 5,05-10”24 эрг!гс, ^протона = ^2,
а ёп = 2,79).

Разность энергий протонов, ориентированных параллельно и анти-
параллельно полю, определяется выражением, аналогичным (7.23)^ или
(7-24):

ДЕ = 2ёп1^пН-,

так как I = х/2,

ДЕ —	.

(7.25)

Поскольку ядерный магнетон р„ мал, резонансные частоты в ЯМР
много меньше, чем в ЭПР. При магнитном поле 104 гс резонансная частота V
ЯМР имеет величину порядка 107 сек-1, тогда как для ЭПР эта величина
равна 3-1010 сек-1. Экспериментальная техника ЯМР подобна той, которая
используется для получения спектров ЭПР. Каждый тип ядра имеет свое
значение магнитного момента, и в спектре ядерного магнитного резонанса
будут проявляться линии поглощения, отражающие ядерный состав иссле-
дуемого образца. Характеристические линии поглощения ядер имеют, кроме
того, тонкую структуру, которая открывает дополнительные возможности
исследования молекулы. Тонкая структура возникает вследствие того,
что магнитное поле, определяющее частоту резонанса, складывается из внеш-
него поля и поля, создаваемого связанными электронами. Так как различ-
ные электронные конфигурации создают различные поля, тонкая структура
отражает строение химического соединения. На фиг. 126 показаны два спек-
тра ЯМР. В спектре этилового спирта при высоком разрешении видны три
типа линий поглощения, связанных с магнитным моментом протона. На спек-
тре ДНК вводе видна тонкаялиния, обусловленная свободной водой, и широ-
кая полоса, связанная со всеми другими протонами. Локальные возмущения
в большой молекуле размывают здесь тонкую структуру так же, как это
наблюдается в спектрах других типов.

Поскольку разность энергий для ядер, имеющих различную ориентацию
спинов, очень мала, для получения спектров ЯМР требуются образцы боль-
ших размеров — порядка 1О20 ядер. По этой причине в установках ЯМР
требуются магнитные поля, которые были бы однородны в значительно
большем объеме, чем в установках ЭПР.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	Нагг1зоп 6. Е., Б о г й К. С., Е о о I Ь о и г о \у Л. К., РгасНса! 8рес!го-
зсору, РгепНсе-Но11, И. У., 1948.

2.	8рес!гозсору апй Мо1есп1аг 81гис1иге апй ОрНса1 Мейюйз о! 1пуе8Н§аНп§ Се11
81гис1иге, Рагайау 8ос. В1зс. (1950).

3.	8 и 1 11 е г 1 а п й О. В. В. М., 1п1гагей Апа1уз1з о{ 1Ье 81гпсЩге ей Апнпо Ас1Й8,
Ро1урерНйез, апй Рго1е1пз, Айу. Ргсйеш СЬет., 7, 291 (1952).

4.	В е а V е п О. Н., Н о 1 1 й а у Е. К., ИИгаукйе! АЬзогрНоп 8рес4га о! Рго1е1п8
апй Апнпо Ас1й8, Айу. Рго1е1п СЬет., 7, 320 (1952).

5.	8 ее йз XV. Е., Ро1апхей БИгау1о1е4 М1сго8рес1:го§гарЬу апй Мо1еси1аг 81гпс1пге,
Рго§. В1ор11у8., 3, 27 (1953).

6.	Р г а 8 е г К. Б. В., ТЬе ТпГгагей 8рес1га о! В1о1о§1са11у ХтроНап! Мо1есп1ез,
Рго§. В1огЬуз., 3, 47 (1953).

7.	Б а у 1 е 8 Н. С., XV а 1 к е г Р. М. В., М1сгозрес1готе1гу о! Б1ут§ апй Р1хей
Се118, Рго§. В1орЬуз., 3, 195 (1953).

8.	В 1 о и 1 Е. К., ИИгау1о1е1 М1сгозсору апй Б1Кгау1о1е1 М1сгозрес1гозсору, Айу.
Вю1. Мей. РЬуз., 3, 286 (1953).

9.	8 р г 1 п § а 1 1 Н. Б., ТЬе 81гис1пга1 СЬепизЬу о! РгоТе1пз, Асайепнс Ргезз,
И. У., 1954.

10.	8 1 п з Ь е 1 т е г Н. Б., «ИИгау1о1е1 АЬзогрНоп 8рес1га», 1п НаЛаНоп В1о1о§у,
Уо1. II, р. 165, ей. Ьу А. НоПаепйег, МсСга\у-НП1, И. У., 1955.

11.	Р 1 а 4 I I. К. «Е1ес1готс 81гпс!иге апй ЕхсПаНоп о! Ро1уепез апй РогрЬуппз»,
ш Най1аНоп В1о1о§у, Уо1. III, р. 71, ей. Ьу А. НоПаепйег, МсСгагу-НШ,
Ы. У., 1956.

12.	Н 1 з к е у С. Р., «АЬзогрНоп 8ресНо8Согу», т РЬуз1са1 ТесЬтдиез 1п В1о1о§1са1
НезеагсЬ, Уо1. I, р. 74, ей. Ьу О. Оз1ег апй А. XV. Ро1Из1ег, Асайепнс Ргезз,
И. У., 1955.

13.	8 с о I I Л. Р., «И11гау1о1е1 АЬзогрНоп 8ресНорЬо!оте1гу», 1п РЬуз1са1 ТесЬтдиез
1п В1о1о21са1 НезеагсЬ, Уо1., I, р. 131, ей. Ьу О. Оз(ег апй А. XV. Ро1Из1ег, Асайе-
пнс Ргезз, И. У., 1955.
14.	С 1 а г к С., «ЛнГгагеё 8рес1гозсору», 1п РЬуз1са1 ТесЬн1диез 1н В1о1о§1са1 КезеагсЬ
Уо1. I, р. 206, её. Ьу О. Оз1ег анй А. XV. РоШ81ег, Асаёегшс Ргезз, Ы. У., 1955.

15.	8 о § о Р. В., Т о 1 Ь е г 1: В. М., Ь1ис1еаг анё Е1ес1гон Рагата^неНс Резонансе
апё Из АррИсаИон к> В1о1о§у, Аёу. В1о1. Меё. РЬуз., 5, 1 (1957).

16.	Р г а з е г К. В. В., 1н1егрге1аНон о! 1н1гагеё В1сЬго1зт ш Ах1а11у Ог1еп1её Ро1у-
тегз, Я. СЬет. РЬуз., 28, 113 (1959).

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

17.	Н е г 2 Ь е г § С., А1от1с 8рес1га, Воуег РиЬНсаНопз, 1944, ан с! 8рес1га о! В1а-
1от1с Мо1еси1ез, У’ан ИозНапё, 1950.

18.	Н а 2 з I г и т Н. В., Т а 1 е Л. Л., РЬуз. Кеу., 59, 354 (1941).

19.	V/ а 1 а н а Ь е К-, Л. СЬет. РЬуз., 26, 542 (1957).

20.	Н е г 2 Ь е г § О., 1п1гагеё анё Катан 8рес1га, В. Уап Ио81ганё, 1945.

21.	боге К. С., Рагаёау 8ос. В1зс. (1950).
Глава VIII

ФЕРМЕНТЫ

1.	Введение. Живая клетка представляет собой высокоорганизованную
систему реагирующих веществ. Это означает, что в отличие от неживых
систем химические реакции в клетке протекают упорядоченно, т. е. каждая
реакция происходит в соответствующий момент времени, и, по-видимому,
в соответствующем месте клетки. Например, при росте клетки накопление
нуклеиновой кислоты происходит в определенных частях клетки и преиму-
щественно в течение определенных фаз роста. Процессы окислительного
обмена веществ локализованы в основном в малых гранулах, называемых
митохондриями. Однако эти и другие реакции, происходящие в такой
высокоорганизованной системе, как живая клетка, должны быть не только
упорядоченными, но и достаточно быстрыми, поскольку в противном случае
рост клетки был бы невозможен из-за тепловой деградации. Большая часть
химических реакций в клетке происходит при участии биологических ката-
лизаторов — ферментов. Их можно обнаружить в любом месте клетки,
хотя некоторые типы ферментов (например, окислительные) сосредоточены
преимущественно в определенных структурах. Понять механизм фермен-
тативного катализа чрезвычайно важно, поскольку, как уже говорилось
выше, все важнейшие биохимические процессы в клетке, связанные с обме-
ном энергией и структурными перестройками, катализируются ферментами.
По-видимому, в клетке для каждой цели существует свой фермент. Конечно,
рассматривать все эти ферменты нет необходимости, да это и невозможно.
Ниже мы остановимся на свойствах некоторых ферментов, принадлежащих
к различным ферментативным классам, с тем чтобы составить представле-
ние об основных закономерностях ферментативного катализа.

Ферменты представляют собой белки. Физические и химические свой-
ства многих ферментов, полученных в кристаллическом виде или очищенных
другими способами, хорошо изучены. Можно надеяться, что методы, опи-
санные в предыдущих главах, позволят установить первичную, вторичную
и третичную структуры молекул ферментов и выяснить связь этих структур
с ферментативной активностью.

2.	Зависимость кинетики ферментативных реакций от температуры.
Так как фермент является катализатором, то, во-первых, ускоряя реакцию,
он сам не изменяется в ходе реакции и, во-вторых, он не влияет на равновес-
ную концентрацию реагентов и продуктов реакции. При работе с фермен-
тами ускорение реакции можно наблюдать даже при очень малых концен-
трациях этих катализаторов (порядка мг/см? и менее). Для того чтобы понять
сущность каталитического действия фермента, рассмотрим реакцию гидро-
лиза мочевины

(ЫН2)2СО4-Н2О ±7 2МНз+СО2.
Молекула воды при столкновении с молекулой мочевины должна обла-
дать достаточной кинетической энергией, чтобы преодолеть силу отталкива-

ния между этими молекулами, т. е.
С более общей точки зрения, изложен-
ной в гл. III, молекула воды при при-
ближении к молекуле мочевины долж-
на преодолеть барьер свободной энер-
гии.

Если энергия сталкивающихся
молекул достаточно велика, то в ре-
зультате столкновения происходит
реакция расщепления мочевины, и
затем молекулы продуктов реакции
диффундируют от места столкновения
молекул реагентов. Согласно фиг. 127,
скорость прямой реакции зависит от
вероятности прохождения молекул
через барьер свободной энергии слева
направо, а скорость обратной реак-

преодолеть потенциальный барьер.

Фиг. 127. График изменения свободной
энергии при превращении реагентов
в продукты реакции (величина ДГ
принята положительной).

ции — от вероятности прохождения

через барьер справа налево. Как следует из уравнения (3.11), константа
равновесия К, равная отношению концентрации продуктов реакции к кон-

центрации реагентов, равна

д- = е-дк/вт

(8-1)

где Е — молярная газовая постоянная, Т — абсолютная температура
и ДЕ (см. фиг. 127) — разность свободных энергий на моль между продуктами
реакции и реагентами. Следовательно, в то время как скорость, с которой
достигается равновесие, зависит от высоты барьера, равновесное состояние
определяется разностью минимумов свободной энергии по обе стороны
от барьера. Роль фермента состоит в том, что он либо снижает высоту барье-
ра, либо заставляет реакцию идти другим путем, на котором барьер ниже.
В любом случае фермент ускоряет реакцию в обоих направлениях.

Фермент уреаза катализирует не только расщепление мочевины,
но и образование мочевины из аммиака и двуокиси углерода. Однако сво-
бодная энергия аммиака и СОг приблизительно на 11 000 кал/ моль меньше,
чем мочевины. Учитывая, что при комнатной температуре Р.Т = 600 кал/моль,
получаем для константы равновесия величину

= е-(-11 000/600) — е+18,5 — 10+8.

Поэтому при равновесии концентрация мочевины была бы равной 10“8
от концентрации аммиака; обнаружить столь малое количество образовав-
шейся мочевины было бы невозможно. При расщеплении бензоил-Ь-тиро-
зилглицинамида на бензоил-Ь-тирозин и глицинамид под действием химо-
трипсина обратная реакция также не может быть обнаружена из-за большой
величины константы равновесия. Тем не менее во многих случаях обратная
реакция наблюдается. С помощью того же химотрипсина легко осуществить
синтез бензоил-Ь-тирозилглицинанилида из бензоил-Ь-тирозина и глицин-
анилида, потому что получающийся в ходе реакции анилид нерастворим.
В результате химическое равновесие не достигается, что приводит к накоп-
лению анилида. По той же причине идет синтез неспецифических нераство-
римых белков под действием трипсина в растворе специфического белка,
гидролизованного пепсином.

Если скорости реакций, катализируемых ферментом, известны при раз-
личных температурах, то с их помощью можно вычислить величины теплоты
активации ДЯ* и энтропии активации Д5* для суммарной реакции, характе-
ризующие в какой-то степени процесс катализа. ДЯ* определяет зависимость
скорости реакции от температуры. Действительно, как было показано
в гл. III, константа скорости имеет вид

=	(8.2)

Так как

ДЕ* = ДЯ*-7Д5«,
то

ДА* Д/7*	Д5*

РТ Р~ ’

Таким образом, температурная зависимость скорости реакции определяется
членом, содержащим ДЯ, но не Д5. Температурную зависимость часто выра-
жают в виде отношения скоростей реакции при температурах, разделенных
интервалом в 10° С, т. е.	Эта величина, обозначаемая как ф)0,

связана с ДЯ* следующим соотношением:

(21о = е+дн*/18600.

Для реакций, катализируемых ферментами, значения ДЯ* обычно
меньше 16 000 кал!моль (табл. 19). Эти данные трудно использовать для
выяснения механизма катализа, так как они относятся к суммарной реакции,
тогда как в действительности ферментативная реакция идет в несколько
стадий. При этом скорость реакции лимитируется скоростью лишь одной
из ее стадий, но во многих случаях неясно, какой именно.

Таблица 19

Температурная зависимость скоростей некоторых реакций,
катализируемых ферментами

Катализатор или фермент	Субстрат	<2ю	АН*, кал]моль
Трипсин	Стурин	1,8	11 000
Эмульсин	Салицин	1,15	2 600
Люцифераза	Люциферин	2,3	15 000
Инвертаза	Сахароза	1,5	7 400
Н+	»	4,0	26 000
Пепсин	Казеин	2,4	16 000
НС1	»	з,о	20 600
Амилаза	Крахмал	1,9	12000

Таким образом, данные табл. 19 сами по себе не представляют очень
большой ценности; они лишь показывают, что теплота активации понижается
ферментами. Это уменьшение до какой-то степени компенсируется умень-
шением энтропии активации. Тем не менее скорость ферментативных реак-
ций обычно на много порядков больше скорости тех же самых реакций,
идущих без участия ферментов при том же значении рН раствора.

Реакции, катализируемые ферментами, как и любые другие, подразде-
ляются на реакции первого, второго и нулевого порядков. Не рассматривая
строго кинетику реакций этих трех типов, отметим, что большое значение
имеет изучение зависимости скорости реакции от концентрации фермента
и природы и концентрации субстратов. Изучение такого рода зависимостей

важно для понимания связи каталитичес-
кой активности фермента со структурой
его молекулы.

3.	Комплекс фермент — субстрат.
Основное исходное вещество в реакции,
катализируемой ферментом, называют
субстратом. Например, сахароза явля-
ется субстратом в реакции, катализируе-
мой ферментом инвертазой:

Сахароза-рНгО	Фруктоза Ц-Глюкоза.

Концентрация воды в ходе этой реакции
практически не изменяется. Действи-
тельно, при концентрации сахарозы
0,05 М на одну молекулу сахарозы при-
ходится 1000 молекул воды. Скорость
реакции пропорциональна концентрации
сахарозы, т. е. реакция следует кинетике

Концентрация сахарозы, М

Фиг. 128. Зависимость скорости
гидролиза сахарозы от ее концен-
трации при различных концентра-
циях инвертазы (указана на кривых).

первого порядка.

При более высоких концентрациях
субстрата реакция первого порядка пере-
ходит в реакцию нулевого порядка, т. е.

скорость реакции становится независи-

мой от концентрации сахарозы. Фиг. 128 показывает, как изменяется
скорость гидролиза сахарозы в зависимости от концентрации субстрата
и фермента. Удовлетворительная теория, описывающая изменение скорости
ферментативной реакции при изменении концентрации субстрата, была
предложена Мйхаэлисом и Ментен в 1913 г. Согласно этой теории, расщепле-
ние, например, сахарозы, катализируемое инвертазой, происходит в две
стадии: первая — обратимое образование промежуточного комплекса фер-
мент — субстрат, вторая — необратимый распад этого комплекса на фер-
мент и продукты реакции. Для этих этапов можно написать следующие кине-

тические уравнения:

рп

Еф-8 Г_'Е8, Е8—> Продукты-рЕ,
Й2

где к — удельные константы скорости, а Е, 8 и Е8 — фермент, субстрат
и комплекс фермент — субстрат. Эта схема описывает реакцию, идущую
по стадиям, и ее анализ приводит к следующим результатам. Пусть СЕ, С$
и СЕ§ — полная концентрация фермента, субстрата и фермент-субстратного
комплекра в молях на литр. Обычно много больше, чем СЕ§. Следова-
тельно, образование фермент-субстратного комплекса сопровождается умень-
шением концентрации свободного фермента на СЕ — СЕ§, а концентрация
субстрата при этом практически не изменяется. Через небольшой промежу-
ток времени (обычно порядка секунд) после начала ферментативной реакции
с1Р
скорость появления продуктов, - = /г05Е8, становится достоянной во вре-
мени, т. е. сЮде/сН = 0. В этом случае скорость образования фермент-
субстратного комплекса должна равняться скорости распада, т. е,

(Се —Сей) Сд = (&2 + &0) Сез-	(8-3)

Введем, как это обычно делают, новую константу, называемую кон-
стантой Михаэлиса, связанную с константами скорости соотношением

(8.4)

Из уравнения (8.3) получаем, что

Ст?-С17с

гу	ЛЬ Л1О

ЬЕ8
т. е.

Се5= к Л •	(8.5)

^ттЧ)

Скорость появления продуктов, таким образом, равна

~= /йДей = к0 -	(8.6)

При очень высокой концентрации субстрата (С8 > К,п) весь фермент свя-
зан в фермент-субстратном комплексе и уравнение (8.6) переходит в урав-
нение

=	(«-Л

При очень низких концентрациях субстрата (С3 « Кт)

АР _&оСЕС8 к1к0СЕС8

~0Г~ кт ~ Л2+*о '	1 '

Описываемая этими уравнениями зависимость скорости реакции от кон-
центрации субстрата объясняется следующим образом. При низких кон-
центрациях субстрата скорость реакции лимитируется скоростью образо-
вания фермент-су бстратного комплекса. При высоких концентрациях суб-
страта скорость реакции лимитируется скоростью распада этого комплекса,
так как в этих условиях все молекулы фермента связаны с молекулами
субстрата. Действительно, как показывает уравнение (8.7), скорость реакции
не зависит от концентрации субстрата при больших значениях последней.
В этом случае наблюдается реакция нулевого порядка, и полное количество
субстрата, распадающегося за данное время, пропорционально концентра-
ции фермента. Это используется в большинстве методов определения
ферментативной активности. Скорость реакции, определяемая уравнением
(8.6), достигает половины своего максимального значения при С8 = Кт.
Следовательно, таким способом можно легко определить Кт- Для системы
уреаза —мочевина Кт равно 2-10“2 моль! л.

Хотя теория Михаэлиса — Ментен в ее первоначальном виде не охва-
тывала целого ряда явлений, например конкурентного и неконкурентного
торможения, и поэтому потребовала значительного усовершенствования,
ее основные идеи сохраняют свое значение и в настоящее время.

4.	Наблюдение фермент-субстратного комплекса. Триумфом теории
Михаэлиса — Ментен явилось экспериментальное обнаружение фермент-
субстратных комплексов в системах, содержащих каталазы и пероксидазы.
Эти катализаторы принадлежат к типу ферментов, простетической группой
которых служит гем. Поэтому их спектры (фиг. 129) подобны спектрам гемо-
глобина и дыхательных ферментов (спектр действия последних приведен
на фиг. 154). Каталаза катализирует распад перекиси водорода на воду
и кислород;

2Н2О2 -э- 2Н2О+О2.

Кинетика этой реакции, конечно, не столь проста, как при распаде сахарозы,

поскольку в этом случае в ходе реакции соединяются две молекулы перекиси

водорода. Поскольку спектры поглоще-
ния у комплекса фермент — субстрат
и у свободной каталазы различны
(фиг. 129), по виду спектра можно не
только установить существование этого
комплекса, но и судить о ходе фермен-
тативной реакции. Скорость таких реак-
ций очень велика (для полного заверше-
ния реакции требуется не более 1 мин),
поэтому кинетические исследования со-
пряжены с известными трудностями.

Прибор, примененный для этой цели
Чансом (см. [3]), схематически изобра-
жен на фиг. 130, А. При опускании
двойного плунжера шприца реагенты
быстро смешиваются в смесительной
камере и идут вниз к наблюдательной
камере со скоростью порядка 10 м!сек.
Существует два метода исследования
кинетики реакции с помощью такого
прибора. Один из них состоит в том, что
плунжеры вдвигают очень быстро и уже
после остановки потока наблюдают за

Ф и г. 129. Спектр поглощения ка- -
талазы, комплекса каталаза — пере-
кись водорода и комплекса катала-
за — гидроперекись метила [12}.

течением реакции по изменению

спектра. В этом случае роль прибора сводится к тому, что он дает возмож-

ность точно зарегистрировать момент начала реакции. Если же реакция
протекает очень быстро (т. е. завершается за время порядка 30 мсек), за
ней можно следить, опуская плунжеры непрерывно и измеряя поглощение
света в различных точках наблюдательной камеры; каждая точка соответ-
ствует определенному моменту времени после смешивания. Таким способом

можно контролировать течение реакции за очень малые промежутки време-
ни, что видно из следующего простого расчета. Скорость V движения рас-
твора в трубке равна отношению объема V жидкости, проходящего мимо
какой-либо точки за 1 сек, т. е. , к площади поперечного сечения А
трубки. Время А/, за которое раствор проходит расстояние 8 вдоль трубки,
равно

V ~~ сЦ//<Н ‘

Если подставить в это уравнение разумные численные значения, то полу-
чим, что минимальный интервал времени, в течение которого можно следить
за ходом реакции, равен 0,5-10"3 сек.

Очевидно, что правильный, выбор длины волны или длин волн дает
возможность измерить относительную концентрацию каталазы и комплекса
каталаза — перекись водорода. Минимальная концентрация фермнэта равна
(по порядку величины) 5-10 7 моль геминового железа на лптр. При работе
с каталазой, содержащей четыре группы гема на молекулу, это соответствует
по порядку величины 10“7 моль фермента. Ферментативная реакция сопро-
вождается довольно малыми изменениями в пропускании света.
На фиг. 130, Б показано изменение пропускания при образовании и распаде
комплекса каталаза — гидроперекись метила. Для записи таких малых
изменений нужно иметь прецизионную аппаратуру. Скорость потока реа-
гентов легко измерить с помощью дифференциальной схемы, изображенной

Наблюдатель -
ная камера

Шприц
1см3

Монохромати-
ческий сеет

Усили-___ Само-

писец

тели

Фотоэлемент

Усили-
тели '

Само-
писец

Диффенцирующая
схема

Время

20мсек

г месите пиная
камера

Время после остановки потока, сек

„„0 1	2 3

0,0	—

-0.01 

-0,02

Каталаза + перекиси

Свободная
каталаза

Фиг. 130.

А — схем_ прибора для исследования быстрых реакций спектроскопическими мето-
дами; х Б""—|образец записи_1реакции при быстром опускании плунжеров. Подроб-
ности см. в тексте.

на фиг. 130, А. При вдвижении плунжера изменяется разность потенциалов
на емкости С и соответственно — заряд на пластинах конденсатора. Это обу-
словливает появление тока, величина которого пропорциональна скорости
изменения потенциала на пластинах конденсатора и, следовательно, ско-
рости плунжера. Этот ток в свою очередь создает напряжение на сопротив-
лении 7?, равное /Д, которое усиливается и записывается, а затем калиб-
руется в величинах скорости потока.

Мы не будем здесь рассматривать все результаты, полученные при изу-
чении реакции каталазы с перекисью Водорода. Однако следует остановиться
на некоторых чертах этой реакции, имеющих значение для понимания дей-
ствия ферментов. Каталитическое разложение перекиси под действием ката-
лазы происходит в несколько этапов, описываемых уравнениями

Е'8 Д±Е8, Е8Ц-8	Е-{-Продукты реакции,

&2
где, как и раньше, 8 и Е — соответственно субстрат и фермент. Кинетиче-
ская константа к^ для реакции образования комплекса фермент — субстрат
зависит от типа субстрата, как это видно из следующих данных:

Субстрат	к±, моль-1-]сек-1
Н2О2	5-106
СН3ООН	8-105
СН3СН2ООН	2-104

Приведенные здесь значения к1 для трех субстратов отличаются друг
от друга очень сильно, и, следовательно, различие их нельзя объяснить
диффузией. По-видимому, можно считать, что они связаны с различиями
в свободных энергиях активации при образовании комплекса.

Фермент-субстратный комплекс может спонтанно распадаться на фер-
мент и субстрат (соответствующая константа скорости обозначена через
/г2). Эта реакция подчиняется простому экспоненциальному закону, как все
реакции первого порядка, причем константа скорости для этого процесса
равна 0,02 сек-1. Такая обратная реакция в рассматриваемом случае намного
медленнее, чем прямая. Полагая константу равновесия К равной е ЛГ/ДТ,
можно рассчитать разность между свободными энергиями реагентов и ком-
плекса фермент — субстрат. Поскольку константа равновесия равна отно-
шению констант скоростей к^к2, получаем для Н2О2 величину К = 5 х
X 10е/0,02 = 2,5-108; следовательно, Л/7 = —11 000 кал!моль. Знак минус
перед величиной Л/7 следует понимать как указание на то, что комплекс
более стабилен, чем система, содержащая отдельные его компоненты.

До сих пор при анализе системы каталаза — перекись водорода мы
дошли лишь до этапа образования фермент-субстратного комплекса. В дан-
ной системе комплекс фермент—-субстрат не диссоциирует на фермент и про-
дукты реакции. Для того чтобы образовались вода и кислород, к комплексу
должна подойти другая молекула перекиси водорода и вступить с ним
в реакцию. Следовательно, вторым этапом при каталитическом расщеплении
перекиси водорода является бимолекулярная реакция между перекисью
водорода и комплексом фермент — перекись водорода. Ясно, что эта реак-
ция не укладывается в классическую схему, рассмотренную Михаэлисом
и Ментен. Для второго этапа реакции в том случае, когда субстратом служит
Н2О2, кинетическая константа к$ = 1,8-107	^сек"1. Таким образом,

реакция второй молекулы Н2О2 с комплексом фермент — субстрат является
наиболее быстрым этапом суммарной реакции, что согласуется с данными
для реакций с синтетическими моделями каталазы (см. разд. 6).

Каждая из этих констант скоростей может быть использована для вычис-
ления свободной энергии активации соответствующей реакции. На фиг. 131
приведены результаты расчета энергий активации и разности между сво-
бодными энергиями продуктов и реагентов. Как видно из графика, в ходе
реакции свободная энергия уменьшается.

В отношении рассматриваемой ферментной системы существенно выяс-
нить также, каков механизм второго этапа реакции. Взаимодействует ли
вторая молекула перекиси водорода с комплексом фермент — субстрат
в том же самом участке фермента, где присоединяется первая молекула
перекиси водорода (или вблизи от него), или она присоединяется к одной
из трех других геминовых групп каталазы? Большая часть данных, и в част-
14 Заказ №1168
ности результаты исследований по прямому действию излучения на ката-
лазу, свидетельствует в пользу первого предположения.

Применение меченых субстратов дает возможность измерить отношение
концентрации субстрата, связанного с ферментом, к концентрации свобод-
ного субстрата. Величина этого отношения равна константе равновесия,

Фиг. 131. Свободная энергия системы каталаза + 2Н2О2
для различных этапов ферментативной реакции.

Значение Г для ЕЧ-28 принято равным нулю- Звездочкой отмечено
активированное состояние.

и, следовательно, с ее помощью легко вычислить ДЕ. Такой эксперимент
был проделан для фермента химотрипсина и меченного по кислороду синте-
тического субстрата ацетил-3,5-дибромо-Ь-тирозина

ОН

Вг'^/'Вг

Н |

Н3С—С —Ы —СН —СО18ОН

II

о

Этот субстрат соединяется с ферментом, но не расщепляется им. Как пока-
зали эксперименты (положение метки указано в приведенной формуле),
фермент стимулирует обмен меченого кислорода с кислородом воды. Поэтому
это соединение можно считать субстратом химотрипсина, катализирующего
в данном случае реакцию обмена. Если атомы брома радиоактивны (Вг82),
то можно при различных температурах установить, какое количество
радиоактивного брома связано с ферментом и какое количество находится
в растворе. Это измерение осуществимо благодаря тому, что в данном случае
комплекс фермент — субстрат не расщепляется на продукты, так как реак-
ция заключается лишь в замещении атома кислорода. Разность между сво-
бодными энергиями реагентов и комплекса можно определить при различ-
ных температурах и, таким образом, вычислить Д5 и ДЯ непосредственно
из выражения ДР = ДЯ — 7Д5. Значения ДЯ и ТД5, полученные таким
способом, приведены на фиг. 132. Малые отрицательные значения ДР сви-
детельствуют о слабой связи фермента с субстратом. При низких рН энер-
гия связи возрастает, что связано с уменьшением энтропийного члена Д5
благодаря перераспределению энергетических уровней. Значение рН, при
котором химотрипсин наиболее эффективен по отношению к субстратам тако-
Фиг.- 132. Термодинамические кон-
станты для комплекса химотрипсинЯ
-)-ацетил-3,5-дибромо-Ь-тирозин при
различных рН [13]

отдельных фермент-субстратных
иметь в виду два существенных

го типа, равно 7,8. Этому значению рН соответствует меньшая абсолютная
величина Л/7, что означает более слабое связывание, а также отрицательные
значения ЛЯ и Л5. Уменьшение энтро-
пии, по-видимому, связано с уменьше-
нием числа степеней свободы при рас-
щеплении комплекса фермент—субстрат.

5.	Тепловая инактивация и строе-
ние ферментов. При изучении механи-
зма ферментативных реакций возможны
два подхода. Во-первых, можно углуб-
ленно изучать действие какого-либо
одного фермента на определенный класс
субстратов и затем на основании полу-
ченных данных устанавливать какие-то
общие закономерности. Во-вторых, можно
изучать свойства, общие для всех срер
ментов. При современном уровне знаний
представляется более плодотворным пы-
таться понять механизм ферментативного
катализа, рассматривая общую картину,
и затем переходить к изучению свойст
комплексов. Говоря о ферментах, следуе

факта: во-первых, они являются белками, и, во-вторых, в большинстве слу-
чаев они проявляют высокую специфичность по отношению к субстратам.
Рассмотрению специфичности ферментов посвящен разд. 7.

Активность фермента существенно зависит от целостности структуры его
молекулы (во всяком случае, какой-то большой ее части). Как показано ниже
(гл. IX и X), цистиновые связи в белке легко разрушаются под воздействием
излучения. В результате изменяется третичная структура молекулы фер-
мента, что приводит к его инактивации. Вместе с тем имеются ясные экспе-
риментальные доказательства того, что ферментативная активность связана
только с частью молекулы фермента (см. разд. 6).

Благодаря тому что ферменты являются высокоспецифическими ката-
лизаторами, можно точно зарегистрировать момент изменения их физиче-
ского или химического состояния. При нагревании растворов белков послед-
ние становятся нерастворимыми (так называемая денатурация}. Нагре-
вание ферментов приводит к уменьшению ферментативной активности, кото-
рое либо следует за уменьшением растворимости, либо предшествует ему.
Определяя удельную константу скорости уменьшения ферментативной актив-
ности, можно, как показано в разд. 6 гл. III, найти свободную энергию,
энтропию и теплоту активации для процесса тепловой инактивации. Как
видно из табл. 20, инактивация ферментов в растворе обычно связана с боль-
шой величиной энтропии активации. Вместе с тем при инактивации сухих
ферментов энтропия активации мала. Таким образом, здесь мы встречаем-
ся стой же закономерностью, что и в случае инактивации вирусов (гл. Ш).
Следует помнить, что такие эксперименты позволяют определять характер
активированного состояния, а не конечного состояния денатурированного
белка.

При инактивации ферментов в растворе большей величине ЛЯ соответ-
ствует большая величина Л5. Стерн [14] объясняет это следующим образом..
Предположим, что инактивация происходит в результате разрыва одной
—5—5-связи и некоторого числа п водородных связей. Это предположение
разумно, так как, если считать, что в результате тепловых соударений
происходит разрыв только — 8 — 8-связи,, а водородные связи остаются
неповрежденными, то велика вероятность восстановления этих дисульфид-
ных связей и возвращения, таким образом, молекулы в первоначальное
состояние. При одновременном же разрыве нескольких связей вероятность

Таблица 20

Тепловые константы, характеризующие инактивацию ферментов при нагревании [15]

Фермент	ДЯ*, кал/моль	Д5*, кал/моль_/°1<
В водной растворе1)		
Инсулин	35 600	23,8
Трипсин	40 200	44,7
Каталаза	50 500	81
Пепсин	55 600	ИЗ
Инвертаза	110 400	263
Каталаза в тяжелой воде'[16]	125 000	300
Пероксидаза (из молока)	185 300	466
В сухом состоянии [17]		
Уреаза	20 800	—22
Каталаза	21 500	— 16
Трипсин	 21 600	—24
Инвертаза	30 000	0
Химотрипсин	30 000	0

1) Эти величины зависят от рН и ионной силы.

сохранения третичной структуры ничтожно мала. При разрыве одной
— 8 — 8-связи энергия активации АЯ*-з-8- = 20 000 кал!моль и энтропия
активации А8* = 0, а при разрыве одной водородной связи А ЯГ- =
~ 4 000 кал!моль и А8Г = 12 кал/молъРК. Число водородных связей, раз-
рыв которых обусловливает инактивацию фермента, можно определить
из выражения

ДЯ*—20 000 .

П ~	4000	’

энтропияСинактивации равна, следовательно,
А8* = 12н=12^=^-°.

Это выражение хорошо согласуется'с данными табл. 20. Как следует из этих
данных, при инактивации фермента в сухом состоянии ни одна водородная
связь не должна переходить в активированное состояние, а число связей,
разрываемых при инактивации каталазы в П2О, отличается от числа связей,
разрыв которых вызывает инактивацию в Н2О. Нужно отметить также, что,
хотя этот анализ, по-видимому, правилен, величина АР* доступна для
измерения лишь в определенных пределах. Действительно, при А/7* <
< 20 000 кал/моль реакция идет с большой скоростью, т. е. вещество очень
нестабильно, тогда как при АР* > 30 000 кал/моль оно отличается большой
стабильностью. Белки при обычных температурах нельзя считать ни абсо-
лютно стабильными, ни абсолютно нестабильными. Следовательно, изме-
римые значения АР* инактивации лежат в довольно узких пределах. Так
как значение АР*, равное АЯ* — ТА8*, таким образом, фиксировано, меж-
Ф и г. 133. Величины Д/7 и 7Д5 при
тепловой инактивации ингибитора трип-
сина из соевых бобов для активирован-
ного и конечного состояний [18].

ду ЛЯ* и Д$* должно существовать определенное соотношение.- Не исклю-
чено, что это соотношение имеет определенный физический смысл, о котором
говорилось выше; но возможно также, что оно просто вытекает из ограниче-
ний, наложенных на численные значения этих величин.

Есть тип инактивации, для которого имеются данные как об активи-
рованном, так и о конечном состояниях. Например, ингибитор трипсина
из соевых бобов после его инактивации при мягких условиях находится
в неактивной форме. При низкой температуре это неактивное соединение
может снова превратиться в нормальный активный белок. В этом^'случае
можно измерить не только скорость
рейдции в одном направлении, но
и равновесие между двумя формами
и получить, следовательно, данные
о термодинамических константах,
связанных со всеми этапами этой
реакции. На фиг. 133 приведены
значения этих констант. Из графика
можно видеть, что энтропия моно-
тонно увеличивается при переходе
фермента из активной формы в не-
активную. Разумно предполагать,
что это увеличение связано с по-
степенным развертыванием моле-
кулы.

6.	Связь между структурой
фермента и его функцией. Актив-
ность фермента не всегда связана
со всей белковой молекулой. Во
многих случаях некоторые участки

белковых молекул оказываются в этом отношении бесполезными. В дру-
гих случаях их целостность необходима для сохранения активности
и, наконец, иногда ' тот или иной участок молекулы играет даже
роль ингибитора. Например, ферменты трипсин и химотрипсин получают
из неактивных в ферментативном отношении предшественников — трипси-
ногена и химотрипсиногена. После обработки этих предшественников неко-
торыми протеолитическими ферментами, в частности тем же трипсином, они
превращаются в активный фермент, причем в процессе превращения от бел-
ковой молекулы предшественника отделяется полипептид. На фиг. 134 схе-
матически показаны структурные изменения, происходящие в молекуле
трипсиногена при переходе его в трипсин под действием трипсина. Для того
чтобы фермент был активным, остатки серина и гистидина, как предпола-
гается, должны находиться в определенном положении на небольшом рас-
стоянии друг от друга. Из фиг. 134 видно, что в трипсиногене это невозмож-
но, так как из-за сильного электростатического взаимодействия остатков
аспарагиновой кислоты с остальной частью молекулы гистидин оказы-
вается смещенным относительно серина. После того как от молекулы трипси-
ногена отщепляется гексапептид, часть молекулы, ранее находившаяся
в растянутом состоянии, принимает спиральную форму, соответствующую
минимуму энергии для всей молекулы. Вследствие этих структурных изме-
нений молекула становится активной.

Часть белковой молекулы, к которой присоединяется субстрат, назы-
вают активным центром. Как мы указывали, ферментативная активность
зависит от трехмерной конфигурации активного центра. Однако эта конфи-
гурация может зависеть и от строения других частей молекулы. Например,
если под действием ультрафиолета одна из — 8 — 8 связей, изображенных
на фиг. 134, будет разорвана, конфигурация активного центра изменится.
В результате молекула потеряет свою каталитическую активность, хотя
при этом поглощения энергии в самом активном центре не произойдет.

Трипсиноген
(неактивен)

Трипсин
(октивен)





Фи’г. 134. Схема превращения трипсиногена в трип-
син под действием трипсина [19}.

А — аспарагиновая кислота; В — валин. Г — гистидин. Гл —
глицин, И — изолейцин, Л — лизин, С — серин, X — центр
специфичности.

В качестве другого примера связи между функцией фермента и строе-
нием его молекулы рассмотрим рибонуклеазу (РНК-азу). Последователь-
ность аминокислот в молекуле этого фермента изучена довольно хорошо.

Активность утрачена о
результате указанных обработок

— 8-8-сзязи
водородные связи

Ф и г. 135. Схема, иллюстрирующая связь изменений в структуре
РНК-азы с изменением ее ферментативной- активности [10}.

Он сохраняет активность даже в том случае, если от его молекулы отщепить
несколько аминокислот или подвергнуть ее действию таких веществ, как
8 7И раствор мочевины. Некоторые возможные изменения в структуре и фер-
ментативной активности РНК-азы схематически изображены на фиг. 135.
г

Если от С-конца молекулы фермента отщепить валин, серин и аланин, актив-
ность сохраняется. Но при отщеплении следующего аминокислотного остат-
ка, аспарагиновой кислоты, происходит инактивация. К тому же резуль-
тату приводит фотоокисление гистидина и расщепление молекулы фермента
под действием субтилизина (разрыв цепи в этом случае происходит у 20-го
остатка от Ы-конца). По данным Ричардса [20], после того как М-концевой
пептид и белковая часть соединяются вновь, ферментативная активность

восстанавливается, даже если такое соединение
достигается путем рекомбинации (т. е. без восста-
новления разорванной пептидной связи)' Несомнен-
но, что каталитическая активность этого фермента
связана с большой частью его молекулы. При
обработке фермента 8 М. раствором мочевины водо-
родные связи разрываются, но дисульфидные мос-
тики остаются неповрежденными. Хотя, судя по
измерениям вязкости, в этих условиях происходит
частичное развертывание белковой молекулы (см.
фиг. 135), фермент сохраняет свою каталитическую
активность. Вероятно, это связано не с тем, что
молекула в таком развернутом состоянии активна,
а с тем, что под действием ее субстрата, РНК,
она переходит в состояние с первоначальной кон-
фигурацией [21].

При обработке более сильными средствами,
например надмуравьиной кислотой, расщепляю-
щей — 8 — 8-связи, молекула развертывается
еще сильнее и полностью утрачивает фермента-
тивную активность.

Фиг. 136. Структура
одного из синтетических
катализаторов—комплек-
са триэтилентетрамина и
Ре (III).

Две связи, обозначенные
жирными линиями, могут

участвовать в реакции • с
Н2О2.

Лучшим доказательством того, что ферментативная активность связана
лишь с некоторой частью молекулы, служат опыты, проведенные над про-
теолитическим ферментом папаином. Если путем обработки другим фермен-
том, отщепляющим аминокислотные остатки от М-конца, отделить от моле-

кулы папаина 2/3 общего числа его аминокислотных остатков (всего в моле-
куле папаина 180 остатков), то папаин все же сохраняет каталитическую
активность [22].

Другой подход к исследованию связи между структурой и функцией
фермента заключается в синтезе небелковых катализаторов, свойства кото-
рых аналогичны свойствам ферментов. Ванг [23] синтезировал катализа-
торы, эффективность которых всего в 1000 раз меньше эффективности ката-
лазы (но в 1000 раз больше эффективности гемоглобина). Эти катализаторы
не относятся к соединениям типа гема, которые совершенно неэффективны,
а представляют собой полиаминоферрохелаты. На фиг. 136 изображена
структура наиболее эффективного из них — комплекса триэтилентетр амина
и Ее (III), а на фиг. 137 схематически показан процесс катализа в щелочном
растворе (из шести связей атома железа изображены только две участвующие
в реакции). Комплекс фермент -— субстрат имеет вид

ОНт++

Судя по тому, что расстояние между ядрами атомов кислорода равно здесь
приблизительно 1,3 А, тогда как для Н2О2 оно составляет 1,5 А, связь
— О — О — комплекса находится в напряженном состоянии. При сближе-
нии второй группы [ООН]- с комплексом Е8 происходит быстрая реакция
между комплексом и атомом Н, ведущая к отделению О2. Если считать, что
каталаза действует аналогично, то можно сделать вывод, что при катализи-
руемом ею расщеплении Н2О2 две молекулы перекиси водорода присоеди-
няются к одной и той же группе гема, а освобождаемая молекула О2 отры-
вается от одной из реагирующих молекул Н2О2.

ОН-1+

Ч-н+роон-

ОН -1+

4-НН4-ОН-

он

Ре:

ООН

ОН-|

он

Н+4-ООН-+ Ре:

+ ОН-

ОШ

О

или

2Н2О2	2Н2О-|-О2

Ф и г. 137. Схема реакции каталитического расщепления
Н2О2 под действием синтетического катализатора [24].

7.	Специфичность ферментов. Можно было бы привести очень много-
примеров специфичности ферментов, но мы ограничимся лишь несколькими.
Уреаза действует на мочевину, но не на тиомочевину или метилмочевину.
Специфичность геминовых ферментов имеет свои особенности, причем решаю-
щее влияние в этом случае оказывает, по-видимому, характер химической
связи, а не какие-либо другие факторы. Трипсин катализирует расщепление
только тех пептидных связей, в образовании которых участвуют остатки
аргинина и лизина. Эту специфичность трипсина используют при изучении
порядка расположения аминокислот в белках, применяя его в качестве аген-
та, вызывающего разрыв определенных связей в пептидных цепях. Химо-
трипсин катализирует разрыв (указанный пунктиром) связи в соединениях
типа

КСО — МН—СН(К')СО—Нк",

где КСО — бензоил, гликоль, ацетил или аланин, К'—триозин, фенил
или триптофан, К" — амид или этиловый эфир. Независимо от того, к како-
му типу относится гидролизуемая связь — к амидному или эфирному,
возможность реакции зависит от типа окружающих групп. Такой тип спе-
цифичности, требующий присутствия трех определенных групп или типов,
групп в субстрате, можно понять допустив, что контакт субстрата с фермен-
том при образовании комплекса происходит в трех точках (так называемая
«посадка на три точки»). Такой контакт очень специфичен: для того чтобы
он осуществлялся, все взаимодействующие группы должны быть располо-
жены соответствующим образом. Представление о посадке на три точки —
это, по существу, просто наглядный способ выражения идеи о связи специ-
фичности с трехмерной структурой фермента и субстрата.

Вполне возможно, что во многих системах необходимости в трехточеч-
ном контакте нет — для них достаточно двух или даже одной точек контакта.
Однако представление о контакте в трех точках крайне привлекательно,
и в последующем анализе мы будем предполагать, что такой контакт действи-
тельно осуществляется. •
На фиг. 138 схематически изображено взаимодействие фермента ацетил-
холинэстеразы, играющего важнейшую роль в нервной деятельности, и его
субстрата ацетилхолина

ОН(СН3)3НС2Н4ОСОСН3.

Схема построена на основании данных о подавлении активности фер-
мента различными ингибиторами, строение молекул которых известно
(аналогичные эксперименты с гаптенами были описаны в гл. VI). Роль
трехмерной структуры в связывании фермента с субстратом, которая не отра-
жена на фиг. 138, подтверждается тем, что в образовании связи играют роль

Присоединенный субстрат

Ф и г. 138. Гипотетическая схема взаимодей-
ствия ацетилхолинэстеразы с ее субстратом —
ацетилхолином [5].

Взаимодействие с анионным центром является электро-
статическим, а с эфирным центром фермента субстрат
образует ковалентную связь-

также метильные группы, присоединенные к атому азота. Взаимодействие,,
обусловленное этими группами, электростатическое взаимодействие у ани-
онного центра и ковалентная связь — у эфирного соответствуют трем точ-
кам контакта. Ниже приведен предполагаемый детальный механизм этого-
ферментативного процесса:

О

Н—С4-СН3С—ОК

Фермент Субстрат
<3+	н

II	I

С—О“4-Н9О	Н—о

I
СНз

н—с+	с+

К —О—С—О-	КОНЧ-С —о-

I	I

СНз	СН3

С+	Н—6+	„ г

II	I	н-.с.

С —О-	Н—О—С —О-4-СН3СООН

I	I	Отрыв от поверх-

СН3	ОН3 ности фермента

или

где

СН3СООК+Н2О —> СН3СООН-РКОН,

К=(СНз)зН+СН2СН2—.

Согласно этому механизму, реакция идет в три этапа; первый из них —‘
ацилирование фермента, второй — отрыв части молекулы субстрата и
последний — деацилирование фермента.

Представление о контакте в трех точках подтверждается данными,
полученными при изучении путей реакции синтеза лимонной кислоты из СОг
под действием гомогенатов печени. Хотя лимонная кислота

СН2—СООН

НОС —СООН
имеет симметричное строение, ее расщепление до а-кетоглутаровой кислоты
под действием находящихся в печени ферментов происходит несимметрично
[25]. За ходом реакции следили по радиоактивной метке, С14, введенной
в виде С14О2. Реакция идет по следующей схеме:

Гомогенат
печени

сн2—соон	сн2—соон

нос—соон -------------—> сн,

к	Гомогенат	х “

сн2—соон печени с—соон

Лимонная кислота

сс-К.етоглутаровая
кислота

СООН

сн2

* I +СО2

сн2

соон

Янтарная кислота

----------->

Нефермеита-
тивное рас-
щепление

Установлено, что последний этап реакции можно записать в виде (С14
обозначено С*)

/СН2— СООН	сн2—соон

СН,	—> I	+С*°2

\С —С*ООН	СН2—СООН

о^

иными словами, вся радиоактивность переходит в СОг. Отсюда следует, что
радиоактивным являлся последний атом углерода в а-кетоглутаровой кисло-
те. Хотя молекул а а-кетоглутаровой кислоты несимметрична, она получается
из лимонной кислоты, которая симметрична, и казалось бы, что даже если
бы метка находилась только на одном атоме углерода, получаемая а-кето-
глутаровая кислота не должна метиться асимметрично. На самом деле схема
реакции, по-видимому, имеет вид

СН,—СООН	СН,—соон	сн2—соон

I “	I “	I

с*о,------> носоон ------------* сн,	—> сн2-соон-рс*о,.

Фермент ]	Фермент \

с*н2—соон	^с-с^оон

о

Если только не предполагать участие черной магии, то остается допу-
стить, что лимонная кислота с самого начала была мечена асимметрично.
Однако представить себе, каким образом появляется асимметричная метка
в такой симметричной молекуле, как молекула лимонной кислоты, довольно
трудно. Если же исходить из представления о трехточечном контакте,
то объяснение получается совершенно естественным. Предположим, что
первый шаг при распаде лимонной кислоты состоит в присоединении суб-
страта, в данном случае молекулы лимонной кислоты, к поверхности фер-
мента в трех точках, как показано на фиг. 139. Так как молекула лимонной
кислоты не обладает осью симметрии третьего порядка и связывающие точки
на поверхности фермента не эквивалентны, ясно, что скорость реакции для
одной из групп СООН может быть значительно большей, чем для другой.
Таким образом, исходя из предположения о существовании трех связываю-
щих точек можно заключить, что источником всей радиоактивной СО2
служит не симметричная молекула лимонной кислоты, а асимметричный
фермент-субстратный комплекс. Это позволяет понять наблюдаемую асим-
метрию в полном цикле реакции. Очевидно, что если распад лимонной кис-
лоты идет асимметричным путем, то и образование ее под действием фермен-
та также должно происходить асимметрично. С точки зрения изложенных
выше представлений о характере поверхности фермента молекула СОг,
встраиваемая в результате реакции в молекулу лимонной кислоты, входит
только в одну из двух ее групп, идентичных, когда молекула лимонной

Ф и г. 139. Гипотетическая схема снизы-
вания лимонной кислоты с поверхностью
фермента [26}.

Если точки Ъ и с неэквивалентны, то комплекс фер-
мент — субстрат асимметричен.

кислоты находится в растворе, но неидентичных, когда эта молекула нахо-
дится в комплексе с ферментом.

Мы подчеркиваем все время трехточечный характер связывания по той
причине, что для задания плоскости необходимы именно три точки, а не две
или одна. Поэтому для деформации молекулы, связанной в трех точках, тре-
буется значительно меньшее нарушение ее конфигурации, чем для молекулы,
фиксированной в двух точках. К этому замечанию мы вернемся ниже,
а сейчас остановимся еще на некоторых загадках специфичности.

Должны ли мы для объяснения связывания субстрата ферментом искать
какие-то новые, неизвестные нам силы? Каков радиус действия этих сил
и какова величина соответствующей энергии связи? На первый вопрос можно
ответить, что, кроме ковалентных связей, мы не знаем других высокоспе-
цифичных сил. Ответ на второй вопрос состоит в том, .что все эти силы
являются короткодействующими. Как показано в гл. VI, они меняются
обратно пропорционально высокой степени расстояния между притягиваю-
щимися группами. Энергия такого взаимодействия пропорциональна 1/г6.

Очевидно, что величина силы притяжения или энергии взаимодействия
между ферментом и субстратом должна лежать в довольно узких пределах.
Если она слишком мала, фермент-субстратный комплекс не сможет образо-
ваться. Если она слишком велика, то возникнет опасность, что продукты
реакции будут «прилипать» к ферменту и тормозить ферментативную реак-
цию. Заметим, что распределение заряда по молекуле белка зависит от рН
раствора, и, следовательно, активность фермента очень сильно зависит
от рН.

Представление о том, что субстрат и белок соединяются друг с другом
в трех точках, полезно также по следующим двум соображениям. Во-первых,
это увеличивает вероятность деформации молекулы субстрата; во-вторых,
благодаря существованию нескольких точек связывания субстрат может
оказаться прочно связанным с ферментом до реакции и слабо — после нее.
Если энергия связи на точку контакта соответствует энергии слабой водо-
родной связи, свободная энергия которой равна 2000 кал/моль, то при свя-
зывании в одной точке вероятность того, что при комнатной температуре
связь в этой точке (или области) окажется нарушенной, равна е-200°/600 =
= е~3>3 = 3,6-10“2. При наличии же трех связей, участвующих в образова-
нии фермент-субстратного комплекса, вероятность того, что все три точки
контакта свободны, равна е-600°/600= е 10 = 4,6-10’5. Поэтому из существо-
вания трех точек контакта следует, что фермент и субстрат большую часть
времени связаны друг с другом. Вероятность того, что хоть одна из групп
участвует в’связи, равна 0,96, а вероятность того, что все три труппы свя-
заны с субстратом, равна (0,96)3 = 0,89. Так как силы, обусловливающие
эти связи, являются короткодействующими, они обеспечивают высокую
специфичность взаимодействия, так же как в случае реакций антиген —
антитело, рассмотренных в гл. VI; только при образовании специфического
соединения фермента с субстратом все значения 1/г6, соответствующие раз-
личным точкам контакта, максимальны. Соответственно энергия взаимодей-
ствия для всей трехмерной области, в которой происходит взаимодействие,
будет максимальна только для такого комплекса, что и обусловливает
специфичность фермента.

Тесная взаимосвязь между строением молекул и их физическими свой-
ствами выявляется, например, при сравнении нормального гемоглобина
с гемоглобином серповидных клеток. Эти два типа гемоглобина отличаются
только тем, что остаток глутаминовой кислоты, присутствующий в обеих
половинах молекулы нормального гемоглобина, в мутантном гемоглобине
замещен остатком валина. Такого малого изменения достаточно для того,,
чтобы изменилось распределение заряда в молекуле гемоглобина; освобо-
дившись от кислорода, эти молекулы соединяются в агрегаты, в результате
чего эритроциты приобретают характерную серповидную форму.

8.	Механизм действия ферментов. Попытаемся набросать полуспеку-
лятивную картину того, как действует фермент. Роль фермента состоит
в понижении барьера свободной энергии, стоящего на пути превращения
субстрата в конечные продукты. Это осуществляется либо за счет снижения
энергии активации, как в случае расщепления Н2О2 под действием синтети-
ческих катализаторов, либо, напротив, за счет внесения того, что можно-
было бы назвать конфигурационной энергией в форме энтропии. Второй
путь также приводит в конечном счете к уменьшению свободной энергии
активации ДЕ*. В настоящее время нельзя сказать, какой из этих путей
важнее; нет также никаких оснований считать, что все ферменты одинаковы
в этом отношении. Существенно, однако, что при любом предположении
на структуру молекулы фермента накладываются ограничения одного и того
же типа. Пусть, например, имеет место только уменьшение энергии актива-
ции, т. е. энергии, необходимой для разрыва определенной связи в субстрате.
Для простоты описания предположим, что энтропийный член равен нулю.
Рассмотрим систему уреаза — мочевина, предполагая, что мочевина при-
крепляется к поверхности фермента в трех точках, как показано на
на фиг. 140, А. До взаимодействия фермента с субстратом мочевина имеет
плоскую конфигурацию, после взаимодействия ее конфигурация уже
не является плоской.

Когда молекула субстрата приближается к молекуле фермента, она
притягивается к ней и соответственно потенциальная энергия системы
уменьшается (кривая / на фиг. 140, Б). Если бы при этом форма субстрата
не изменялась, энергия комплекса уменьшилась бы сильнее (кривая II
нафиг. 140, Б), поскольку часть энергии идет на увеличение потенциальной
энергии связи в субстрате (Е' на фиг. 140, В); кроме того, часть энергии
выделяется в виде тепла или переходит в потенциальную энергию фермента,
поэтому ЕЕ' < ЕЕ. Как показано на фиг. 140, Г, свободная энергия актива-
ции для реакции воды с субстратом уменьшается при деформации субстрата.
Так как зависимость скорости реакций от высоты барьера свободной энер-
гии иосит экспоненциальный характер, даже небольшие изменения в ЕЁ*

Ф и г. 140. Схема реакции расщепления мочевины под действием уреазы.
А — конфигурация мочевины до ее взаимодействия с поверхностью фермента, при-
водящего к образованию фермент-субстратного комплекса, и после образования
этого комплекса; Б — кривые потенциальной энергии для взаимодействия фер-
мента с неплоским (У) и плоским (II) субстратом; В — кривая потенциальной энер-
гии связи — С в мочевине при неплоской (I) и плоской (II) конфигурации
субстрата; Г — изменение свободной энергии при реакции мочевины с водой
случае неплоской (I) и плоской (II) форм мочевииы.

играют существенную роль. После расщепления субстрата его составные
части удерживаются у молекулы фермента теми же силами, что и ранее.
Однако теперь взаимодействие субстрата с белком становится менее проч-
ным, так как три связывающие группы действуют уже не согласованно,
а по отдельности, и поэтому под действием беспорядочной тепловой бомбар-
дировки продукты будут отрываться от поверхности фермента. Если силы
притяжения настолько велики, что такого отрыва не произойдет, то насту-
пит «отравление» фермента. Действительно, продукты ферментативного
катализа очень часто действуют как ингибиторы.

9.	Минимальный размер молекулы фермента. Из рассуждений, прове-
денных в разд. 8, вытекает, что на структуру фермента накладываются
очень жесткие требования, поскольку предполагается, что в результате
взаимодействия фермента с субстратом последний деформируется, тогда
как фермент остается в прежнем состоянии. Следовательно, молекула белка
должна иметь очень прочный каркас. Если этот каркас должен сохранить
свою форму, то необходимо, чтобы вся структура была довольно жесткой.
Из этих соображений легко определить пределы для минимального размера
фермента. Принимая в качестве модели для белка а-спираль Полинга,
в которой на один виток приходится 3,7 аминокислотных остатка, и считая,
что средний молекулярный вес остатка равен 120, получаем для молеку-
лярного веса на один виток приблизительно 500. Можно легко сообразить,
что для того, чтобы спиральная структура была стабильна по отношению
к местному деформирующему действию субстрата, она должна иметь по мень-
шей мере около пяти витков. Верхний и нижний витки могут играть роль
стабилизирующих участков цепи, обеспечивающих стабильность структуры
молекулы после присоединения субстрата к ее центральной части. Действи-
тельно, если бы активный центр, или связывающий участок фермента, нахо-
дился у концов молекулы, фермент после соединения с субстратом был бы
очень нестабилен по отношению к тепловому разрушению. Разумно также
предположить, что молекула фермента должна состоять из нескольких
цепей, так как в противном случае при прикреплении субстрата к трем точ-
кам одной и той же цепи опять-таки можно было бы ожидать довольно
быстрого распада молекулы. Несомненно, что структура из трех цепей,
поддерживаемая водородными связями и дисульфидными мостиками, намно-
го более стабильна. Такие три спирали имели бы в сумме 15 витков. Если
молекулярный вес на один виток равен 500, то полный молекулярный вес
составит около 7000. Это число характеризует только порядок величины
минимального молекулярного веса фермента, катализирующего разложение-
субстрата, стабильного в обычных условиях. Стабильность спиральных
форм такого типа подтверждается тем, что денатурированные белки разла-
гаются гораздо легче, чем глобулярные. Например, пепсин переваривает
денатурированный пепсин.

Если исходить из противоположного допущения, считая, что барьер
свободной энергии снижается не за счет уменьшения энергетического члена,
а благодаря увеличению энтропии системы, связанному с разрывом некото-
рых связей в ферменте, то мы снова придем к тому же самому выводу отно-
сительно размеров молекулы белка. Если она слишком мала, то разрыв
нескольких связей приведет к развертыванию молекулы (этот процесс можно
сравнить с действием застежки-молнии). Такие соображения также приво-
дят к выводу, что минимальный молекулярный вес, при котором обеспечи-
вается стабильность фермента, равен 7000. Заметим, что если высказан-
ные соображения хоть в какой-то степени правильны, то о взаимодействии
фермента с субстратом можно было бы судить по инфракрасным спектрам
комплексов фермент — субстрат. Действительно, если при взаимодействии
между ферментом и субстратом последний изменяется, то его инфракрасный
спектр также должен измениться. Если же при этом взаимодействии измене-
ния происходят в молекуле белка, то в его инфракрасном спектре должен
быть отмечен сдвиг полос, соответствующих водородным связям белка.
Однако наблюдать такие изменения труднее.	*

Можно назвать еще одну причину, по которой большие молекулы сле-
дует считать более подходящими для роли катализатора, чем малые. В боль-
шой молекуле, содержащей много связей, значительно больше вероятность
того, что некоторая часть молекулы обладает энергией, несколько превос-
ходящей среднюю. Кроме того, большая молекула чаще, чем малая, полу-
чает энергию от сталкивающихся с ней молекул воды, обладающих избыточ-
ной энергией. Так как белок обладает очень сложной и организованной
структурой, вполне возможно, что эта избыточная тепловая энергия в конце
концов передается субстрату и локализуется в том месте, где находится раз-
рываемая связь.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	И о г 1 Ь г о р Л. Н., К и п 1 1 2 М., Негг 1оН Р. М., Сгу81аШпе Епгутез,
2пЛ ей. Со1итЫа ИтуегзНу Ргезз, И. У., 1948.

2.	8 нт пег Л В.,8отег5 О. Р., СЬегтзЗгу апй МеьЬоЛз о! Епгутез, АсаЛеггпс
Ргезз, И. У., 1947.

3.	8и т пег Л. В., М у г Ь а с к К-, ЕЛз., ТЬе Епгутез, АсаЛегтс Ргезз, И. У.,
1951.

4.	В а 1 Л XV 1 п Е., Вупагтс АзресЗз о! ВюсЬет1з1гу, СагцЬпЛ^е ИшуегзИу Ргезз,
1952.

5.	М с Е 1 г о у XV. В., О 1 а з з В., ЕЛз., ТЬе МесЬатзт о[ Епгуте АсИоп, ЛоЬпз
Норкгпз ЫтуегзИу Ргезз, ВаШтоге, МЛ., 1954.

6.	С о 1 о ху 1 с к 8. Р., Кар! ап И. О., МеИгоЛз 1п Епгуто1о^у, АсаЛеггпс Ргезз,
И. У., 1955. ’

7.	Л о 1 у М., «Ресеп! 81иЛ1е8 оп 1Ье Реуегз1Ые Вепа1игаЦоп оГ Рго1е1пз», Рго§.
ВюрЬуа., 5, 168 (1955).

8.	Каскег Е., «Епгутез аз Реа^еп1з», 1п СиггепЗз 1п В1осЬет1са1 РезеагсЬ, еЛ.
Ьу В. Огееп, 1п1егзс1епсе РиЬВзЬегз, И. У., 1956

9.	А 1 Ь е г 1 у Р. А., «Епгуте ЦтеНсз», гп СиггепЗз 1п В1ос11ет1са1 РезеагсЬ, еЛ.
Ьу В. Огееп, 1п1егзс1епсе РиЬИзЬегз, И. У., 1956.

10.	А п 1 1 п з е п С. В., Р е Л Н е 1 Л Р. Р., Рго1е!п 81гис1иге 1п Ре1аНоп 1о Рипс-
Ноп апЛ В1озуп111ез1з, АЛу. РгоЗет СЬет., 11,1 (1956).

11.	6аеЬ1ег О. И., ЕЛ., Епгутез. ИпИз о{ В1о1о^1са1 81гис1иге апЛ РипсНоп,
Непгу РогЛ НозрЛа! 8утроз1ит 4, АсаЛеппс Ргезз, И. У., 1956.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

12.	СЬапсе В., НегЬег! В., ВюсЬет. Л., 4, 402 (1950).

13.	В о Ь е г 1 у В. С., V а з 1 о хх' Р., Л. Ат. СЬет. 8ос., 74, 931 (1952).

14.	8	1 е	а	г	п	Е. А., АЛу.	ЕпгутоЕ, 9, 25 (1949),

15.	8	1 е	а	г	п	Е. А., АЛу.	ЕпгутоЕ, 9, 25 (1949).

16.	О	и 1	1	Л	XV. Р ., уап Т	и Ь ег § е п Р. Р., 8с1епсе, 125, 939 (1957).

17.	Р	о 1	1	а	г	Л Е., Ат. 8с1епИз1, 39, 99 (1951).

18.	К и п 1 1 г М., Л. Оеп. РЬузюЕ, 32, 241 (1948).

19.	Ыеиг а!Ь Н., В 1 хоп О. Н., РеЛ. Ргос., 16, 791 (1957).

20.	Р 1 сЬ а г Л з Р. М., РИА8 44, 162 (1958).

21.	АпИпзеп С. В., Лг., РеЛ. Ргос., 16, 783 (1957).

22.	Н 1 1 I Р. Б., 8тИЬ Е. М., В1осЫт. е! В1орЬуз. Ас1а, 19, 376 (1956).

23.	XV а п § Л. Н., Л. Ат. СЬет. 8ос„ 77, 4715 (1955).

24.	Л а г п а § 1 п Р. С., XV а п § Л. Н., Л. Ат. СЬет. 8ос., 80, 786 (1958).

25.	Р о 1 I е г V. р., Н е 1 Л е 1 Ь е г § е г С., Иа!иге, 164, 180 (1949).

26.	О ё а I о п А. О., ИаЗиге, 162, 963 (1948).
Глава IX

СПЕКТРЫ ДЕЙСТВИЯ
И КВАНТОВЫЕ ВЫХОДЫ

1.	Введение. Взаимодействие света с молекулами можно исследовать
двумя путями: изучая действие молекул на свет или изучая действие света
на молекулы. Изучение спектров поглощения света позволяет, в частности,
определять уровни энергии молекул, состав молекул и их структуру. Иссле-
дуя же изменения молекул под действием света, мы получаем сведения о меха-
низме миграции энергии в макромолекулах, о внутримолекулярных пере-
стройках, происходящих в этих макромолекулах в результате поглощения
световой энергии, и о той роли, которую макромолекулы и их части играют
в процессе обмена веществ. В этой главе мы рассмотрим действие света на
молекулы, вирусы и клетки.

Действие света может вызвать изменения в структуре молекул данного
вещества только в том случае, если молекулы поглощают этот свет. Кроме
того, необходима, чтобы энергия светового кванта была достаточно велика.
Известно, что энергия света квантуется, причем величина энергии кванта
равна кх, где к — постоянная Планка (6,63-1б"34 дж-сек), а х—частота
света. Значения кх для квантов, соответствующих различным длинам волн,
приведены ниже.

Длина волны, А	Энергия, эв
10 000 (инфракрасная область спектра)	1,24
7 000 (видимый свет)	1,77
4 000 (видимый свет)	3,1
2 000 (ультрафиолет)	6,2
1 000	12,4

Длина волны света, применяемого в опытах с живыми объектами и биоло-
гически активными веществами, как правило, больше 2000 А, т. е. энергия
кванта меньше 6,2 эв. Следовательно, энергии квантов света в этих опытах
меньше потенциалов ионизации, равных по порядку 10 эв (см. табл. 14),
но лежат в области типичных значений энергий диссоциации 2—5 эв
(см. табл. 10). Из приведенных данных ясно, что при поглощении инфракрас-
ного излучения изменяются лишь молекулярные конфигурации со слабыми
связями. Ниже будут рассмотрены процессы диссоциации и молекулярных
перестроек под действием света.

Изучение взаимодействия света с веществом служит удобным методом
исследования в молекулярной биофизике, так как при поглощении кванта
света молекулой известна величина сообщаемой ей энергии, а вероятность
поглощения фотона для различных длин волн может быть определена
по спектру поглощения. Например, при длине волны 2800 А фотоны погло-
щаются главным образом ароматическими кислотами, а при 4000 А — геми-
новыми группами. Соответственно изменяется и характер процессов, вызы-
ваемых светом. Следовательно, изучая зависимость действия света от длины
волны и сравнивая полученные результаты со спектрами поглощения, можно
установить, какие соединения участвуют в наблюдаемых процессах.

Однако не всегда поглощение фотона, даже если его энергия достаточно
велика, приводит к диссоциации какой-либо группы; поглощенная энергия
может также расходоваться на другие процессы, например на флуоресцен-
цию или колебания. Вместе с тем в некоторых случаях молекулы после погло-
щения света возвращаются к своим первоначальным конфигурациям или
столь мало изменяются, что наша экспериментальная техника не дает воз-
можности наблюдать эти изменения. Поэтому детали процессов, вызываемых
действием света, еще очень мало изучены.

Впервые действие света на живые организмы обнаружил в 1779 г.
Ингенхуз, установивший зависимость выделения кислорода при фотосинтезе
от освещения зеленых частей растений. Экспериментальные исследования
по изучению ингибирующего действия света на рост бактерий были начаты
во времена Пастера. Хотя эти ранние работы большей частью носили качест-
венный характер, уже тогда было установлено, что свет с длиной волны
3000 А убивает микроорганизмы и что более коротковолновый свет в этом
отношении еще более эффективен. С тех пор как были проведены эти первые
исследования, наука накопила большой материал по действию облучения
на малые молекулы, белки, вирусы и микроорганизмы. В частности, изуча-
лись следующие эффекты, вызываемые действием света: фотосинтез, гибель
клеток, мутации, задержка деления, инактивация ферментов, изменение
скорости роста, серологической активности, растворимости и вязкости,
спектров поглощения, а также запаха.

Для того чтобы успешно изучать действие света на молекулярные
системы, необходимо знать следующие параметры, характеризующие про-
цесс облучения: 1) длину волны света, 2) среднюю интенсивность падающего
света, 3) время облучения и 4) условия окружающей среды. Последнее озна-
чает знание температуры, рН и обработки, которой была подвергнута
система до и после облучения. Например, бактерии, которые после облу-
чения ультрафиолетом теряют способность к размножению, вновь приобре-
тают ее, если их облучить сильным видимым светом или подвергнуть воздей-
ствию температуры, превышающей нормальную.

В интересующей нас области длин волн энергия фотона намного превос-
ходит среднюю тепловую энергию колебаний, равную эв. Это означает,
что для большинства облучаемых систем изменения температуры оказывают
ничтожное влияние на процессы, вызываемые поглощением кванта. Для
большинства фотохимических процессов (До = 1,0. Как всегда, исключения
из правила представляют особенно большой интерес. Можно назвать три
случая, в которых изменение температуры в ходе облучения играет сущест-
венную роль.

1.	Если энергия падающего фотона недостаточна для того, чтобы вызвать
процесс, то за счет небольшого увеличения температуры может быть полу-
чена дополнительная колебательная энергия, благодаря которой реакция
с энергетической точки зрения становится более вероятной. Де Фриз [15]
произвел в связи с этим героический эксперимент. Для того чтобы повысить
свою чувствительность к красному свету, он принимал горячую ванну, повы-
шая свою температуру до 102° Р (38,9Р С).

15 Заказ № 1168
2.	Благодаря изменению температуры процесс деградации поглощен-
ной энергии может пойти другим путем, что вызовет изменение вероятности
диссоциации. Так, белки, облучаемые при 90° К (—183° С), значительно
менее чувствительны к ультрафиолету, так как в этом случае значительная
часть возбужденных молекул находится в относительно стабильных состоя-
ниях, из которых энергия теряется не путем диссоциации, а за счет фосфо-
ресценции.

3.	Роль температуры важна также тогда, когда за поглощением света
следуют темновые реакции. Именно это явление имеет место при фотосин-
тезе. Если стадией, определяющей скорость процесса, является темновая
реакция, то малые изменения в температуре благодаря их влиянию на темно-
вую реакцию могут вызвать большие изменения в характере действия света.

Фиг. 141. Спектры поглощения некоторых веществ,
применяемых в экспериментах по облучению биологи-
ческих систем [10].



Температура не является единственным существенным параметром,
характеризующим влияние среды. Поэтому эксперименты со светом, как
и вообще любые эксперименты, должны происходить в условиях тщатель-
ного контроля.

Поскольку изучение взаимодействия света с компонентами живых кле-
ток может быть весьма плодотворным, имеет смысл остановиться на техни-
ческой стороне экспериментов такого рода. В частности, в опытах по облу-
чению необходимо применять монохроматический свет,. так же как при
спектроскопических измерениях. Установки, применяемые для исследований
по облучению, состоят из трех частей: источника света (разд. 2), приспособ-
лений для выделения узкой спектральной области из спектра этого источ-
ника (разд. 3) и устройства для измерения интенсивности (разд. 4).

2.	Источники света. Для видимой области спектра существует целый
ряд удобных источников света, испускающих как непрерывный спектр
(лампа накаливания, угольная дуга), так и отдельные спектральные линии
(ртутная и натриевая лампы). Работу в ультрафиолетовой области ограни-
чивает непрозрачность обычного стекла при длинах волн, меньших 3000 А.
Источники ультрафиолета должны быть заключены в кварцевую оболочку
или вообще неоиметь никакой оболочки. Кварцевое стекло можно исполь-
зовать до 1850 А. При исследованиях в более коротковолновой области окош-
ки прибора делают из фторидов лития или кальция. Однако следует помнить,
что ниже 2000 А начинается область сильного поглощения кислорода. Вода
также становится непрозрачной при этих длинах волн. На фиг. 141 приво-
дятся спектры поглощения различных веществ при различных длинах волн.
В качестве источника сплошного ультрафиолетового спектра используется
газовый разряд в водороде или ксеноне или дуговой разряд в ртутных парах
высокого давления. Ртутная дуговая лампа низкого давления служит
источником линейчатого спектра.	р.

В бактерицидных лампах используют разряд в парах ртути, находя-
щихся под давлением 6-10’3 мм рт. ст. При этом давлении почти все кванты
света излучаются в результате энергетических переходов одного определен-
ного типа. Этому переходу соответствует так называемое резонансное излу-
чение ртути — линия 2537 А. Дуги такого типа отдают при этой длине волны

Ртутная лампа Н-6 (ЮООвт)

Ксеноновая лампа
высокого давления (500вт)

Кратер электрода угольной дуги

Бактерицидная лампа (8вт)

? /о4

с

10

Ртутная лампа Н-4 (100от)

е ь

3

5

1УТБ-Нг

1

2400	2800	3200 3600 4000

О

Л ,4

Фиг. 142. Спектры излучения в ультрафиолетовой области
для источников различных типов.

Лампа МТБ— Нг того же типа, что и применяемая спектрофотометре
Бекмана. Полный энергетический выход зависит от площади дуги.

около 90% полной энергии излучения и 20% входной мощности. Остальная
энергия идет на излучение преимущественно в видимой области спектра. Эти
лампы отличаются от флуоресцентных лишь тем, что в них отсутствует
люминофор и они заключены в оболочку, пропускающую линию 2537 А,
но не пропускающую свет более коротких длин* волн. Такие источники
света при исследованиях в ультрафиолетовой области являются по существу
монохроматическими источниками, поэтому очень многие количественные
эксперименты проводились при этой длине волны. Мощность полезного излу-
чения этих ламп на единицу поверхности дуги приведена на фиг.| 142. Для
всех ламп этого типа выход энергии на единицу поверхности приблизительно
одинаков. Мощные лампы отличаются от маломощных просто большими раз-
мерами.

3.	Монохроматоры. Монохроматических источников, подобных натрие-
вой или ртутной лампам, для всех частей спектра не существует. Поэтому
приходится работать с источником, испускающим свет различных длин
волн, избавляясь тем или иным способом от нежелательных частей испускае-
мого спектра. Для выделения ярких линий спектра ртути в видимой области
можно применять стеклянные поглощающие фильтры. Эти фильтры пропу-
скают около' 10% падающего света. Через них проходит довольно широкая
полоса длин волн, и поэтому они пригодны только при работе с источниками
линейчатых спектров. Фильтры с узкой полосой пропускания, которые мож-
но применять для источников непрерывного света, изготовляют путем напы-
ления тонких диэлектрических слоев между полуотражающими покры-
тиями. Такие фильтры, называемые интерференционными, представляют
собой резонансную полость для света — они пропускают только резонансную
частоту или одну из ее гармоник. Для остальных частот эта область непро-
ницаема, так как они исчезают благодаря интерференции между многочис-
ленными фронтами волн. Интерференционные фильтры используют при
работе с параллельными пучками света, когда требуется обеспечить малую
полосу пропускания (соответствующая полуширина порядка 100 А); мак-
симальное пропускание в пике равно 30%. На фиг. 143 изображена кон-
струкция фильтров такого типа и приведены их характеристики. Для ультра-
фиолетовой области спектра не существует таких удобных фильтров. Однако

Фиг 143.

А — конструкция интерференционного фильтра; показан только
один из параллельных лучей падающего света; Б — кривая
пропускания интерференционного фильтра. Отношение длин
воли, соответствующих двум максимумам пропускания, не рав-
но двум' так как показатель преломления диэлектрика зависит
от длины волны.

для выделения относительно широких участков спектра можно применять
различные растворы. Такие фильтры, конечно, не могут быть монохромати-
ческими и, кроме того, они нестабильны по отношению к действию ультра-
фиолета. Сравнительный обзор этих фильтров, а также фильтров других
типов, можно найти в статье Молера и Луфбороу [16].

Для каждой длины волны нужно применять свой фильтр. В ультрафио-
летовой области выделение узкой спектральной области с помощью фильтров
затруднительно или даже невозможно. Поэтому для выделения различных
спектральных областей при работе с ультрафиолетом удобнее применять
монохроматоры. Нафиг. 144 изображены схемы монохроматоров двух типов.
Свет от источника излучения проходит через входную щель, находящуюся
в фокальной плоскости зеркала АД, поэтому лучи, отраженные от этого
зеркала, образуют параллельный пучок. При прохождении через призму свет
благодаря дисперсии разлагается на*спектральные компоненты и,отражаясь
от второго зеркала, образует в плоскости выходной щели изображение вход-
ной щели. Облучаемый образец помещают за выходной щелью на пути выхо-
дящего монохроматического светового пучка, длина волны которого может
быть изменена путем вращения призмы. Таким образом, степень монохро-
матичности света зависит от дисперсии прибора и ширины входной и выход-
ной щелей. В монохроматоре с решеткой (фиг. 144, Б) используется плоская
дифракционная решетка, на которую падает слегка сходящийся пучок света.
В результате после фокусирования получается дифракционная картина,
сильно растянутая в пространстве. С помощью такого прибора можно облу-
чать светом различных длин волн одновременно несколько образцов. При
этом интенсивность (но не полная энергия) будет меньше, чем для моно-
хроматора, изображенного на фиг. 144, А. Существует большая установка
[17], в которой расстояние между решеткой и спектром равно примерно
15 м. Эти монохроматоры очень похожи на обычные спектрографы. Однако

Фиг. 144. Типичные схемы монохроматоров.

А — призменный монохроматор с фокусным расстоянием объектива, рав-
ным ^5=1 м\ Б — монохроматор с решеткой (расстояние от решетки до спект-
ра 15 м).

требования к оптике монохроматора гораздо ниже, чем в случае спектро-
графа. Например, монохроматор, вьщеляющий спектральную полосу шири-
ной 50 А, можно считать вполне удовлетворительным. В таком монохроматоре
приемлема точность ± 10 А, тогда как в обычных оптических системах это
совершенно недопустимо.

При проектировании монохроматора мы ограничены, однако, довольно
жесткими условиями. Например, для ультрафиолетовой области спектра
в качестве материала для призм можно применять только кварц и заполнен-
ные водой призмы. Выбор материала призмы и фокусного расстояния зеркал
равнозначен заданию дисперсии прибора, которая равна линейному расстоя-
нию между двумя областями спектра в плоскости выходной щели. Например,
60-градусная водяная призма ои зеркало с фокусным расстоянием 100 см
обеспечивают дисперсию в 25 А на 1 мм. Для выделения области шириной
50 А необходима щель шириной 2 мм. Так как для эффективного применения
монохроматора нужно, чтобы источник света был достаточно большим для
обеспечения заполнения светом входной щели, ширина этой щели не должна
быть слишком большой. В крайнем случае размер источника может быть
равным ширине щели. У большей части источников ширина щели меньше
2 мм. Поэтому, если мы хотим увеличить количество света, проходящего
через монохроматор, необходимо увеличить площадь поверхности зеркал
и диспергирующего элемента. Увеличение этих размеров в направлении,
перпендикулярном направлению распространения света, эквивалентно
увеличению телесного угла прибора, т. е. повышению эффективности. Изме-
нение фокусного расстояния зеркал не имеет большого значения. Это может
показаться странным, так как с уменьшением фокусных расстояний зеркал
возрастает количество собираемого света. Однако в то же время, чтобы раз-
решающая сила прибора не изменилась, необходимо уменьшить размер
щели. Оба фактора — более эффективное использование света, падающего
на щель, и уменьшение количества проходящего света из-за уменьшения
ширины щели — почти полностью компенсируют друг друга. Удобные
и простые приборы имеют одно вогнутое зеркало в качестве фокусирующего
элемента и плоское зеркало, помещенное под свободной поверхностью воды,
выполняющее роль диспергирующего элемента. Монохроматоры такого типа
недороги, но имеют один важный недостаток. При работе с ними интенсив-
ность побочного света может составлять несколько процентов от интенсив-
ности света в данной спектральной области. Обычно это не ведет к каким-
либо затруднениям, если только побочный свет не обладает большей актив-
ностью по отношению к биологическим объектам,чем основная спектральная
полоса.

4.	Измерение интенсивности света. Интенсивность имеет размерность
энергия/площадь/время. Эту величину обычно выражают в эрг/см?/сек,
вт/см? и фотон/см?/сек. Абсолютную интенсивность света определить труд-
но. Для этого требуется прибор типа термобатареи, прокалиброванный неза-
висимо от длины волны света. На фиг. 145 изображена термобатарея, состоя-
щая из маленьких зачерненных приемников, к которым подсоединены
контакты отдельных термопар. Энергия света, падающего на термобатарею,
поглощается системой зачерненных приемников, температура которых
при этом повышается. Рост температуры продолжается до тех пор, пока ско-
рость притока энергии за счет поглощения света не компенсируется скоро-
стью потери тепла за счет теплопроводности и излучения. Если тепло-
емкость термобатареи очень мала, то тепловое равновесие может быть достиг-
нуто за время порядка 0,1—10 сек. При небольшой разности температур меж-
ду контактами (порядка 0,001°С) в термопарах возникают э. д. с., которые
можно измерить с помощью чувствительного гальванометра; в отсутствие
чувствительного прибора можно применить усилитель. Термобатарея
представляет собой источник тока постоянного напряжения, обладающий
низким (~10 ода) сопротивлением. Для усиления напряжения постоянного
тока, которое имеет величину порядка нескольких микровольт, применяют
специальные усилители. В некоторых приборах малый сигнал постоянного
тока поступает в коммутатор (приводимый в движение мотором), с помощью
которого направление тока в цепи изменяют с частотой 8 раз в 1 сек. Полу-
чаемое переменное напряжение усиливают с помощью резонансного усили-
теля. Напряжение на выходе последнего может быть выпрямлено и измерено
прибором постоянного тока. Чувствительность термобатареи равна при-
близительно 1 це/цвт/см2. Минимальная интенсивность, доступная измере-
нию, ограничена существованием тепловых шумов в термобатарее и в свя-
занных с ней измерительных приборах. По порядку величины она состав-
ляет 0,01 цвш/сда2.

Большое преимущество термобатареи перед другими измерительными
устройствами заключается в том, что она одинаково пригодна для измерения
интенсивности любых длин волн. Для калибровки термобатарею можно
освещать светом от стандартной лампы. Так как ее показания не зависят
от длины волны, она реагирует даже на тепловые излучения, дуновения воз-
духа и появление людей, проходящих через комнату. Поэтому применение
термобатарей требует специальных предосторожностей.

В отличие от термобатарей фотоэлементы очень просты в обращении.
Действие их основано на том, что фотоны, падающие на металлическую
поверхность фотоэлемента, выбивают из нее электроны, благодаря чему
в цепи возникает ток, который можно измерить с помощью гальванометра
или усилителя. Фотоэлемент обладает высоким сопротивлением и служит
источником постоянного тока. В качестве примера рассмотрим фотоэлемент,
изображенный на фиг. 146, А. Как видно из схемы, фотоэлектрический ток
(равный 0,1 цй) проходит через сопротивление в 1 Мом и изменяет напря-
жение на сетке усилительной лампы. Величина фототока пропорциональна
интенсивности света. Вместо этой схемы можно применить фотоумножи-
тель (фиг. 146, Б), в котором усиление получается за счет вторичной эмиссии

Фиг. 145. Компенсированная термобатарея, сое-
диненная со входом усилителя, находящегося
в цепи с прерывателем. Свет падает на за-
черненные приемники.

НеосЕещаемые спаи закрыты от падающего света и ис-
пользуются для компенсации изменений температуры
в комнате.

электронов. Фотоэлектроны, выбитые светом, летят к первому электроду
Ударяясь о него (при ударе их энергия равна приблизительно 100 эв), они
вызывают эмиссию вторичных электронов, число которых приблизительно
вдвое превышает число первичных (точное значение числа вторичных
электронов зависит от величины ускоряющего напряжения и природы
поверхности). Этот процесс умножения идет последовательно на 10 элек-
тродах, и в конечном счете достигается усиление порядка 106. Очевидно,
такое устройство можно применять непосредственно с микроамперметром.
Усиление, достигаемое с его помощью, зависит от величины прилагаемого
напряжения. Поэтому фотоумножитель должен быть снабжен источником
стабильного высокого напряжения. Если этот фотоумножитель применяется
в режиме большого усиления, обычная термоионная эмиссия при комнат-
ной температуре может вызвать появление на выходе больших токов. Их мож-
но устранить, если охладить фотоумножитель до низкой температуры.
В таких условиях чувствительность достаточно велика, а тепловые шумы
достаточно малы, чтобы можно было использовать фотоумножитель как
счетчик фотонов.

Фотоэлемент и фотоумножитель реагируют на полное число фотонов,
падающих на чувствительную поверхность. Поэтому, строго говоря, фото-
элемент не измеряет непосредственно интенсивности, так как показания его
не зависят от площади чувствительной поверхности, на которую падает
свет в каждом конкретном случае. Для определенности лучше всего ставить
перед фотоэлементом ограничивающую диафрагму. Как видно из фиг. 146, В,
фотоэлементы по-разному реагируют на действие различных длин волн.
Следовательно, их нужно калибровать для каждой длины волны с помощью
термобатареи или ее эквивалента. Так как чувствительность фотоэлемента
сильно зависит от длины волны, важно знать спектральную чистоту света,

Ф и г. 146.

А — схема применения фотоэлемента и усилителя для измерения интенсив-
ности света. На гальванометр подается напряжение компенсации. Поэтому
при отсутствии света, падающего на фотоэлемент, его отсчет равняется нулю;
Б — схема измерения интенсивности с помощью фотоумножителя. Внешние
соединения, идущие к промежуточным электродам, не изображены; В — ти-
пичные кривые чувствительности фотоэлемента.

измеряемого с помощью фотоэлемента. Предположим, например, что для
измерения интенсивности в области 5000 А применяется натриевый фото-
элемент, обладающий максимальной чувствительностью в области 3000 А.
Тогда даже в том случае, если всего 1% света, выходящего из монохрома-
тора, будет иметь длину волны около 3000 А, интенсивность будет измерена
с большой ошибкой (см. фиг. 146, В). Поэтому, насколько это возможно,
следует работать с фотоэлементом, чувствительность которого максимальна
для измеряемой области спектра. Несмотря на необходимость всех этих
предосторожностей при работе с фотоэлементами, они, несомненно, являются
наиболее удобными устройствами для измерения интенсивности света.

Для определения полной энергии падающего света могут быть исполь-
зованы многие химические реакции, идущие в растворе. Например, можно
воспользоваться реакцией разложения уранилоксалата под действием уль-
трафиолета, эффективность которого по отношению к этой реакции известна.
Методы такого рода требуют калибровки с помощью термобатареи. Они
довольно трудоемки по сравнению с применением фотоэлементов. В отличие
от других методов в этом случае измеряется полная энергия падающего
света, а не его интенсивность.

5.	Спектры действия. В табл. 21 указан порядок величин энергии света,
вызывающей те или иные изменения в различных системах.

Таблица 21

Типичные величины, характеризующие потребление энергии при некоторых
биологических процессах, проходящих под действием света

Процесс	Масса вос- принимающе- го объекта* кг	Энергия све- та, падаю- щего на едини- цу площади, дж/м%	Число поглощенных фотонов
Зрение	—	10-13	2
Фотосинтез, образование 1 молекулы выдели-	—	—	10
ющегося О2			
Фотосинтез, образование 1 г углевода	—	—	1023
Пигментация кожи (загар)	—	3 102	—
Гемолиз эритроцитов кролика	—	—	10Ю
Инактивация бактерий	10-15	10	106
Инактивация вирусов	10-19	10	104
Инактивация ферментов	10-22	104	102
Диссоциация карбоксимиоглобина	3-10-23	—	1

Как правило, для процессов инактивации или активации, связанных
с изменением определенных функций, требуется меньшая энергия, чем для
процессов разрушения, подобных, например, гемолизу эритроцитов. Далее,
число фотонов, поглощение которых вызывает в облучаемом объекте опреде-
ленный эффект, уменьшается при переходе к объектам меньших размеров.
Так, для инактивации молекулы фермента нужно гораздо меньше квантов
(поглощенных), чем для инактивации бактерии. Для числа падающих фото-
нов наблюдается совершенно другая закономерность, так как молекулы
фермента поглощают только малую часть падающего на них света. Как
мы видели в гл. VII, вероятность поглощения фотона молекулой белка рав-
на приблизительно 0,001. Это означает, что для инактивации фермента число
фотонов в падающем свете должно достигать 105 на молекулярное сечение.
Бактерия поглощает свет намного сильнее, чем молекула фермента, так как
сечение поглощения фотонов пропорционально молекулярному весу. В то же
время число фотонов, поглощение которых вызывает инактивацию, при
увеличении массы объекта растет довольно медленно (табл. 21). В результате
инактивация бактерий происходит при значительно меньших интенсивно-
стях падающего света, чем инактивация ферментов, хотя в последнем случае
эффективность поглощаемого света гораздо выше. Действительно, энергия
падающего света, вызывающего инактивацию ферментов, по порядку вели-
чины равна нескольким тысячам дж/м2, для инактивации же вирусов и бак-
терий достаточно 10 дж!м2. Следовательно, при выборе мощности источника
излучения необходимо учитывать характер исследуемой биологической
системы.
Энергия поглощенного света расходуется следующим образом: 1) пре-
вращается в тепло или вновь излучается благодаря флуоресценции; 2) сти-
мулирует сложную цепь реакций, как, например, при фотосинтезе; 3) идет
на разрушение молекулярных структур, например при инактивации ультра-
фиолетом клеток, вирусов и ферментов. Кривую зависимости эффекта,
производимого падающим светом, от длины волны называют спектром
действия. Перейдем теперь к рассмотрению теории спектров действия.

6.	Теория спектров действия. Предположим, что действие облучения
на биологическую систему приводит к эффекту, который мы обозначим через
Е. Этот эффект может заключаться, например, в инактивации вирусных
частиц или фотореактивации бактерий. Скорость изменения эффекта во вре-
мени зависит от таких величин, как интенсивность падающего света, длина
волны, время, в течение которого свет действует на образец, а также
от свойств облучаемой системы, например от числа неповрежденных частиц
и температуры среды. Так как энергия света квантована, интенсивность
следует измерять в числе фотонов, падающих на единицу площади в единицу
времени. Введем следующие обозначения: I — интенсивность, / — время,
— длина волны, — параметры, описывающие остальные свойства систе-
мы, Е — эффект, тогда имеем

X, л ^),	(9.1)

где / — функция перечисленных переменных, подлежащая определению.

Сравним относительную эффективность двух различных длин волн:
и Х2. Из уравнения (9.1) следует, что для обеих длин волн

§ = /(Л,	^=#(/2, К, /2Л2).	(9.2)

Подразумевается, что при обеих длинах волн эффект имеет одну и ту же при-
роду, поэтому в обоих случаях фигурирует одна и та же функция /. Все
приведенные ниже рассуждения относятся только к этому случаю.

Относительную эффективность длин волн и Х2 можно оценить следую-
щим образом. Пусть соблюдается условие постоянства свойств облучаемой
системы, так что = ^2. Далее, пусть = /2. В общем-случае йЕ1/сИ ф
=А йЕ^/сИ. Если интенсивности Ц и /2 выбрать так, чтобы дЕ^/д.1 = АЕ^сИ,
то относительную эффективность можно определить как отношение.

Относительная эффективность при Х1__

Относительная эффективность при Х2'	11	\

где

йЕ

= сопз!, I = сопз!, = сопз!.

Если такое определение относительной эффективности имеет смысл, то отно-
шение (9.3) должно сохранять свою величину при различных /. Как следует
из формула (9.3), чем меньше интенсивность света, при которой наблюдает-
ся данный эффект, тем больше эффективность этого света. Если все эффек-
тивности отсчитываются относительно эффективности при определенной
длине волны Хо, то можно построить график зависимости относительной
эффективности от длины волны, который носит название спектра действия
для эффекта Е. Мы покажем, что при выполнении некоторых простых усло-
вий спектр действия коррелирует со спектром поглощения молекулы.

Нафиг. 147 изображен облучаемый образец толщины дх и площади А,
содержащий п поглощающих частиц на 1 ж3 (облучаемыми частицами могут
быть молекулы, вирусы, бактерии и т. п.). Если обозначить интенсивность
падающего света через I, то д! — это та часть света, которая поглощается
при прохождении света через образец. В гл. VII мы показали, что

—Ф1 — 18Пс1х,	(9.4)

где а — сечение поглощения. Хотя из-за поглощения интенсивность света,
проходящего через вещество, уменьшается, мы будем предполагать в даль-
нейшем, что это поглощение мало, и считать, что интенсивность света, дей-

ствующего на различные молекулы,
одинакова. Полное число квантов,
поглощаемых в 1 сек, равно произве-
дению — с11 на площадь, т. е.

Число фотонов, поглощенных
за 1 сек— 1епА(1х —	,	(9.5)

где М равно произведению п (число
частиц на 1 ж3) на А дх (элемент
объема). Ы представляет собой полное
число облучаемых объектов. Как мы
уже говорили, квант света не всегда
изменяет поглотившую его частицу,
так как поглощенная энергия может

(число фотонов
на !сек)

Ф и г. 147. Схема, поясняющая про-
цессы, описываемые уравнением (9.5).

рассеиваться, не вызывая поврежде-

ния. Предположим, что отношение числа эффективных фотонов к полному

числу фотонов равно <р. Тогда

Число молекул, поврежденных за 1 сек=^з1М.	(9.6)

Величина <р называется квантовым выходом или квантовой эффективностью.
Она равна вероятности того, что поглощенный квант будет эффективен.

_ Число поврежденных молекул	у.

Число поглощенных квантов '	' /

Разумно предположить, что скорость изменения эффекта есть функция
числа частиц, повреждаемых за 1 сек. В этом случае уравнение (9.1) при-
нимает вид

^ = ^(<р5^).	(9.8)

В функцию § входят факторы, отражающие влияние среды. Зависимость
от длины волны сказывается на 8 и <р, а М равно общему числу частиц в мо-
мент времени Л Если при двух длинах волн (обозначенных индексами
1 и 2) наблюдаются одинаковые эффекты, т. е. = то

— (р2$2^ 2^ 2-

Для относительной эффективности из уравнения (9.3) получаем следующее
соотношение:

Относительная эффективность при Л1_12_	/п

Относительная эффективность прн Лг Ъ <Р2«2 ’

где

-^- = сопз1, Лг = соп81.

а1
Выражение (9.9) имеет важнейшее значение для исследований, связанных
с изучением спектров действия, так как из него вытекает, что, зная относи-
тельную эффективность как функцию длины волны (т. е. спектр действия)
и зная, как <р изменяется с длиной волны (чаще всего, за исключением
некоторых важных случаев, <р не зависит от длины волны), мы можем опре-
делить зависимость сечения поглощения 5 от длины волны. Если квантовый
выход постоянен, то спектр действия коррелирует со спектром поглощения.
Следовательно, спектры действия можно применять для идентификации
некоторых соединений, играющих решающую роль в процессах, вызываемых
светом.

7. Инактивация белков и нуклеиновых кислот. Во многих случаях,
например при инактивации ферментов, о действии света можно судить
не по вторичным эффектам, а по изменению свойств молекул, на которые
непосредственно действует свет. Число молекул, инактивируемых в единицу
времени, определяется уравнением

+ ^- = ' — (рзЖ или — <(>81(11.	(9.10)

Путем интегрирования получаем

1п7У = — (рзЛ + С.

Константу интегрирования определяем из начального условия: при I = 0
А = Ао, где №0 — исходное число активных молекул. Следовательно,

Шту—= —ф8/Л

или

(9.11)
/Уо

Величину о = ф>5 называют сечением инактивации, а И есть доза падающего
излучения (число фотонов/ж2); обозначив ее Е>, получаем

(9.12)

Сечение инактивации равно относительной вероятности инактивации моле-
кулы падающим фотоном, подобно тому как сечение поглощения света равно
относительной вероятности поглощения молекулой падающего фотона.
Размерность сечения инактивации — площадь/число фотонов.

Уравнения (9.11) и (9.12) описывают простой случай, когда относитель-
ное число выживающих единиц зависит только от произведения интенсив-
ности света на время облучения, т. е., иными словами, когда высокая интен-
сивность при малом времени действия и низкая интенсивность при большом
времени приводят к одинаковому эффекту (так называемый «закон взаимо-
заменяемости»), Выполнение этого закона было экспериментально доказа-
но для инактивации ферментов при изменении интенсивности в 105 раз.
Конечно, он неприменим для быстро изменяющихся систем или в тех
случаях, когда после поглощения света начинаются медленные темновые
реакции, приводящие к наблюдаемым эффектам.

Уравнение (9.12) типично для случайных процессов, при которых для
изменения структуры достаточно одного события (поглощения одного фото-
на). Аналогичное уравнение мы встречали при изучении тепловой инактива-
ции. Различные способы графического представления процессов инактива-
ции приведены на фиг. 148. Как видно из этих графиков, зависимость
1п от С описывается прямой. Такой метод построения графиков
позволяет легко провести среднюю прямую по экспериментальным точкам.
Наклон прямой на фиг. 148, Б, как следует из уравнения (9.12), равен

Ф и г. 148. Три способа графического представления данных,
описываемых уравнением (9.12). .

А —зависимость Й//Цс от дозы; Б — график зависимости 1п Л//ЛЧ от
дозы. Тангенс наклона прямой равен — О; В — зависимость отношения
И/ К о (отложенного в логарифмическом масштабе) от дозы. О равно обратной
величине дозы, при которой ?//.№<,= 0,368.

—о. С помощью графика на фиг. 148, В легко определить сечение инактива-
ции. Из того же уравнения вытекает, что если о© = 1, то М/Мо= Че =
= 0,368, или 37%. Следовательно, о есть величина, обратная дозе, вызы-
вающей инактивацию 37% молекул.

Ф и г, 149. Инактивация трипсина, облучаемого в сухом состоя-
нии, при различных длинах волн ультрафиолета.

А — облучение при 300° К (27° С); Б — облучение при 90° К(—183° С).

На графике фиг. 149 представлены данные по инактивации сухого трип-
сина ультрафиолетом при различных температурах. Они показывают, что
при температуре жидкого воздуха инактивация фермента происходит
медленнее и сечение инактивации при низких температурах меньше, чем
при комнатной температуре.

Сечение и квантовый выход инактивации легко рассчитать следующим
образом. Из фиг. 149 видно, что при 2537 А доза, соответствующая инактива-
ции в е раз, составляет 12,0-103 дж/м\ Отсюда получаем для сечения инак-
тивации значение

0 = 7-^— =0,83-

*Л)»368

Удобно выражать о в единицах мъ1фотон. При 2537 А для числа джоулей
на 1 фотон получаем величину

6,63-10—34 дж-сек-3-108 м/сек.	7 с щ-19 дж

2,537. ю-7 Л	= /, о • 11) фотон 

Таким образом, о будет иметь значение:

0,83-10’4^--7,8-КГ19 = 6,5-10"23	.

дж	фотон	фотон

Для определения квантового выхода нужно знать также сечение поглоще-
ния. Измерения, проведенные с растворами трипсина, показывают, что
при 2537 А и концентрации трипсина 1 мг!мл оптическая плотность равна
0,47. Если считать, что молекулярный вес трипсина равен 34 000 (в настоя-
щее время наиболее достоверным значением считается 23 000), то с помощью
уравнений (7.13) и (7.14) для з можно получить следующее значение:

5 = 0,6-10 16 -^-=0,6-10 20-г^-.
фотон	фотон

Таким образом, используя уравнение (9.12), квантовый выход можно выра-
зить следующим образом:

о 6,5-10—23]
8 ~ 0,6-10-2°	•

На фиг. 150 для сравнения приведены кривые зависимости сг трипсина
от длины волны при комнатной температуре и температуре жидкого воздуха,
а также спектр поглощения трипсина. Эти графики показывают, что кванто-
вый выход инактивации зависит от длины волны, поскольку в рассматривае-
мом случае спектры поглощения и спектры действия не совпадают. Изме-
нение квантового выхода инактивации при изменении длины волны вызвано
тем, что вероятность инактивации зависит не только от числа поглощенных
квантов, но и от того, какие именно аминокислоты в белке поглощают свет.
Наиболее чувствительной к инактивации аминокислотой является цистин,
играющий важную роль в поддержании третичной структуры молекулы.
Спектры действия на фиг. 150 можно представить себе как результат нало-
жения спектров действия цистиновых компонентов, для которых квантовый
выход равен 0,05, и спектров действия ароматических аминокислот с кван-
товым выходом 0,005. Форма спектра действия для белка, приведенного
на фиг. 150, типична для фермента с большим содержанием цистина. У фер-
ментов с низким содержанием цистина спектры действия коррелируют
со спектрами поглощения. Следовательно, при 2537 А квантовый выход
инактивации фермента должен зависеть от содержания цистина в молекуле,
поскольку относительная величина коэффициента поглощения цистина
при этой длине волны максимальна (фиг. 117). Нафиг. 151 приведен график
зависимости квантовых выходов инактивации различных ферментов от отно- 
шения числа полуцистиновых остатков к полному числу аминокислотных
остатков в молекуле белка. Функциональная зависимость выявляется очень
четко.

Рассмотренные выше данные, а также ряд других данных, относящихся
к инактивации белков, позволяют сделать следующие выводы.

1.	Квантовый выход при инактивации ферментов по порядку величины
равен 1СГ2—10“3.

2.	Квантовый выход при низких температурах (—183е С) в 3 раза мень-
ше, чем при комнатной температуре (27° С).

3.	Квантовый выход пропорционален относительному количеству
цистина в молекуле и приблизительно обратно пропорционален молеку-
лярному весу.

4.	При изменении поперечного сечения поглощения в 104 раз в интер-

вале от 1800 до 3000 А квантовый

выход инактивации изменяется меньше
чем в 10 раз. Поэтому в первом при-
ближении спектры действия для всех
белков коррелируют с их спектрами
поглощения.

5. В случае белков с высоким
содержанием цистина форма спектра

Фиг. 151. Эмпирическое соотноше-
ние между квантовым выходом при
2537 А и относительным содержа-
нием полуцистиновых остатков в мо-
лекуле фермента.

Различные точки соответствуют различным
белкам. Например, Р — точка, соответ-
ствующая РНК-азе, а К — каталазе.

Фиг. 150. Сравнение спектра
поглощения трипсина (II) со спект-
ром действия его инактивации (I),
полученным при двух различных
температурах.

О — спектр действия при 300° К (27° С)
(единицей сечения действия служит
10-1» см2/квантУ, X — спектр погло-
щения при 90° К (—183° С) (едини-
цей сечення поглощения служит
10-16сл«2/квант).

действия несколько отличается от формы спектра поглощения. Квантовые
выходы инактивации для таких белков имеют максимум при 2500 А.

6. Свет с длиной волны меньше 1215 А- вызывает ионизацию. Квантовый
выход инактивации при этом близок к единице.

В отличие от инактивации ферментов, происходящей в результате фото-
окисления некоторых входящих в их состав аминокислот в присутствии
красителей (например, метиленового синего), инактивация, вызываемая
ультрафиолетом, происходит скорее из-за нарушения структуры всей моле-
кулы в целом, чем из-за изменений в каких-либо отдельных аминокислотах.
Так, разрыв 8 — 8-связей вызывает развертывание молекулы белка, что
приводит к потере каталитической активности. Такой процесс инактивации
схематически изображен на фиг. 152, где наверху помещена схема наиболее
вероятного процесса инактивации, вызванного разрывом 8 — 8-связи,
а внизу изображены менее вероятные процессы — разрыв пептидной связи
и фотоокисление тирозина. Последний процесс приводит к инактивации
лишь в том случае, если тирозин входит в состав активного центра или если
окисление ведет к изменению третичной структуры.

Как указал Макларен [18], из вывода 3 (см. выше) следует, что все
белки с низким молекулярным весом содержат большое количество цистина.

Фиг. 152. Механизм инактивации белков под дей-
ствием ультрафиолета.
Объяснение см. в тексте.

Это в общем подтверждается экспериментальными данными. Здесь мы стал-
киваемся со случаем, когда работа в одном направлении приводит к неожи-
данным результатам в другой области.

Что касается нуклеиновых кислот, то об их структуре и составе мы зна-
ем гораздо меньше, чем о структуре и составе белков. Поэтому характер
действия света на нуклеиновые кислоты выяснен в значительно меньшей
степени. Нуклеиновые кислоты имеют либо одноцепочечную структуру,
как, например, РНК, либо представляют собой двойную спираль, типичную
для молекулы ДНК. Можно изучать как физические, так и биологические
изменения, производимые в этих полимерах действием света. К изменению
физических свойств в результате облучения относится, прежде всего, умень-
шение вязкости. Естественно предположить, что уменьшение вязкости при
облучении РНК происходит из-за того, что свет вызывает разрывы связей
в ее молекулах. В случае же ДНК распад структуры может быть вызван лишь
разрывом близко расположенных связей в каждой из цепей, молекулы.
Действительно, если в двухцепочечной молекуле ДНК разорвана только
одна связь, то структура молекулы при этом сохраняется благодаря водо-
родным связям. Естественно ожидать, что для разрыва нескольких связей
в двух цепях ДНК потребуются большие дозы излучения. Квантовый выход
для уменьшения вязкости составляет около 1СГ6, что подтверждает это
предположение. Облучение ДНК в сухом состоянии при последующем рас-
творении приводит к противоположному процессу — образованию раствора
с высокой вязкостью. При этом процессе цепи молекулы ДНК, разорванные
в результате поглощения света, соединяются с цепями других молекул
ДНК, образуя трехмерную структуру. Вероятность такого процесса зави-
сит от длины волны падающего света, а соответствующий спектр действия
коррелирует со спектром поглощения. Образование геля происходит при
низких температурах (90° К). По сравнению с дозами света, необходимыми
для инактивации белка, дозы света, вызывающие этот процесс, очень малы.
Так, при 2652 А доза 5 дж!м? превращает в гель 37% всего количества ДНК.
Эти результаты понятны, так как сечения поглощения для нуклеиновых
кислот в 20 раз больше, чем для белков, если сравнивать одинаковые массы.
В то же время при превращении ДНК в гель квантовый выход, равный 10~2—
10~3, лишь немного превосходит квантовые выходы инактивации ферментов.

Наши сведения о действии света на биологически активные нуклеино-
вые кислоты весьма ограниченны. Приведем данные, относящиеся к транс-
формирующему фактору пневмококков. Двухцепочечная ДНК, извлечен-
ная из штамма, устойчивого к стрептомицину, может трансформировать
другой штамм, чувствительный к действию этого антибиотика, в штамм,
устойчивый к нему. Инактивация ДНК, устойчивой к стрептомицину, дает
кривую, которая может быть представлена как сумма двух экспонент. Для
более чувствительного компонента 37-процентная доза составляет около
1,5-102 джЛи2 при 2537 А. При температуре 77° К (196° С) чувствительность
примерно вдвое меньше. Для того чтобы определить квантовый выход инак-
тивации этой активной части молекулы ДНК (генетического маркера),
требуется знать ее размер. Данные по кинетике потери трансформирующей
активности при обработке ДНК-азой показывают, что генетический маркер
состоит из 1,6-103 нуклеотидов. Из этих данных получается квантовый
выход -~1СГ3 [19]. Для разных генетических маркеров квантовые выходы
могут несколько различаться.

Были также проведены опыты, в которых выделенную из вируса табач-
ной мозаики инфекционную РНК облучали светом с длиной волны 2537 А.
Квантовый выход инактивации оказался равным 3-Ю’1 [20].

Суммируем сказанное о действии ультрафиолетового излучения на нук-
леиновые кислоты.

1.	Для процессов образования гелей ДНК спектры действия и погло-
щения имеют одинаковую форму.

2.	Сечение инактивации для нуклеиновых кислот в 10—100 раз превос-
ходит сечения инактивации для белков.

3.	Значения квантового выхода варьируют в зависимости от изучаемых
процессов от 10-2 до 10'6.

8.	Действие света на дыхательные ферменты. Спектры действия впервые
были применены Варбургом, который определил с их помощью спектр
поглощения соединения цитохромоксидазы (фермента, переносящего кисло-
род) с окисью углерода. Таким способом он установил, что этот фермент
является геминовым белком. Далее излагаются принципы и методы, с по-
мощью которых он пришел к этому выводу.

Окись углерода подавляет дыхание дрожжей. При освещении ингиби-
рованных таким путем дрожжевых клеток их дыхание становится более
интенсивным. Этот эффект зависит не только от интенсивности падающего
света, но и от длины волны. Кинетику этого процесса можно описать с помо-
щью следующей упрощенной схемы. Предположим, что окись углерода
конкурирует с кислородом за порфириновые группы белков дыхательной
системы.

РеСО-]-О25> РеО2-фСО.
При поглощении света равновесие может сдвинуться вправо, что приве-
дет к изменению скорости дыхания. Если давление газа велико и его величи-
на поддерживается постоянной, то в темноте:

^(РеО2)
М

кт (РеСО) — к (РеО2),

где константы к? и к — удельные константы скоростей реакции. Первый
член справа соответствует прямой реакции, а второй — обратной реакции.

Фиг. 153. Поглощение кислорода Фиг. 154. Спектр действия вос-
дрожжами в присутствии СО и влия- становления дыхания дрожжей,
ние света на скорость дыхания дрож- ингибированных СО [1].

жей [ 1].

При равновесии в темноте отношение концентраций равно

РеО2 кт

РеСО ~~к~'

Действие падающего света заключается в увеличении константы скорости
прямой реакции до величины (Лт + ксв), поэтому при равновесии под
действием света имеем

[РеО2] __ Ат-|-/гсв

[РеСО] - к

Предполагая, что скорость дыхания Д пропорциональна концентрации
ЕеО2, и учитывая, что Дыакс в отсутствие газа СО пропорциональна полной
концентрации железа, т. е. РеО2 + РеСО, получаем

К ____ ^Т~Р^СВ__

Диаке

Константа ксв равна числу актов диссоциации РеСО в 1 сек под действием
падающего света. Она определяется с помощью формулы (9.6) как <рз/,
где 5 — поперечное сечение поглощения для РеСО, <р — квантовый выход
и I — интенсивность. Таким образом,

К____ кт+(рз1

Диаке

Это выражение представляет собой частный случай более общего уравнения
(9.8). Из него следует, что относительная скорость дыхания зависит от интен-
сивности света. На фиг. 153 показаны типичные данные по потреблению
кислорода дрожжами под действием света в присутствии СО.
Наклон кривых определяет скорость дыхания. Величины к, к? и <рз
можно определить, измеряя скорость дыхания при различных интенсивно-
стях света. Таким путем получают спектр действия (т. е. зависимость <р от А,
изображенную на фиг. 154) для процесса ослабления ингибирующего
влияния окиси углерода на дыхание дрожжей. Если принять, что квантовый
выход постоянен и равен единице, как в случае более простых молекулярных
систем, описанных ниже, то можно считать, что спектр действия на фиг. 154
соответствует спектру поглощения пигмента, ингибируемого окисью угле-
рода. Этот спектр очень напоминает спектры белков, содержащих железо
(сравн. с фиг. 116, Б), если учесть другой масштаб. Отсюда можно сделать
вывод, что в состав цитохромоксидазы входит порфирин.

Аналогичные данные можно получить для более простых систем, напри-
мер для соединений окиси углерода с различными железосодержащими
веществами, в том числе с гемоглобином. В этих случаях мы не только можем
измерить количество окиси углерода, отщепляемой от молекулы (т. е. опре-
делить срз), но и, зная абсолютные значения сечения поглощения молекул,
определить квантовый выход <р.

Самый интересный пример — расщепление карбоксимиоглобина под
действием света. Миоглобин — это мышечный белок красного цвета с моле-
кулярным весом 17 000, в молекуле которого содержится одна группа гема.
Структура его описана в гл. V. О диссоциации карбоксимиоглобина под
действием света можно судить по разнице в спектрах поглощения карбо-
ксимиоглобина и оксимиоглобина. Ниже мы приводим результаты, полу-
ченные Бюхером и Касперсом при изучении квантового выхода для диссо-
циации карбоксимиоглобина [22].

*	Длина волны, А	Квантовый выход, ±3% 
	5460	0,91
	3660	0,99
	3340	1,09
	3130	0,97
•	2800	1,01

Из этих данных видно, что квантовый выход не зависит от длины волны.
Значение этого результата понятно, если учесть, что при наиболее корот-
кой из применявшихся при исследовании длин волн, 2800 А, почти поло-
вина поглощаемого света поглощается ароматическими аминокислотами,

Гем

Ф и г. 155. Схема процесса отрыва СО от геминовой группы под
действием света, поглощенного белком.

тогда как фотоны других длин волн поглощаются гемом. Это свидетельствует
о передаче энергии, достаточной для отщепления СО, от белка к простети-
ческой группе. Аналогичные результаты были получены для групп гема,
связанных с полипептидными цепями, содержащими фенилаланин в каче-
стве поглощающей группы [22]. Схематически этот процесс изображен на
фиг. 155. Большая эффективность передачи энергии, поглощенной при
2800 А, обусловлена, вероятно, механизмом, аналогичным «сенсибилизиро-
ванной флуоресценции», поскольку и пептидная связь и гем сильно погло-
щают в одной и той же области длин волн и, следовательно, их энергетиче-
ские уровни перекрываются.

Выводы, к которым можно прийти на основании работы Варбурга
и его сотрудников с железосодержащими белками, заключаются в том, что
для процесса отрыва СО под действием света квантовый выход приблизи-
тельно постоянен, а спектр действия совпадает по форме со спектром погло-
щения. Однако нет оснований считать эти выводы справедливыми для дру-
гих систем. Например, зрительный пигмент родопсин, состоящий из белка
и соединенной с ним простетической группы, обесцвечивается под действием
света, но соответствие между спектрами действия и спектрами поглощения
в этом случае наблюдается только в видимой области. Свет, поглощаемый
белковой частью молекулы, либо совсем не вызывает эффекта, либо дей-
ствует очень слабо. Однако из этих данных нельзя делать вывод, что белко-
вый компонент не играет существенной роли в механизме зрения.

9.	Фотосинтез. Наряду с пигментацией кожи, вызываемой солнечным
загаром, фотосинтез представляет собой наиболее известный эффект, вызы-
ваемый действием света. Фотосинтез состоит в восстановлении СО2 с обра-
зованием углевода и молекулярного кислорода. Процесс фотосинтеза пред-
ставляет собой сложную цепь биологических явлений, одно из которых
заключается в накоплении энергии поглощенного света. Общая схема реак-
ции, протекающей в хлоропластах зеленых растений, имеет вид

СО2+2Н2О (СН2О)+О24-Н2О,

где (СН2О) — образующийся в результате реакции углевод. Две молекулы
воды в левой части уравнения указывают на то, что выделяемый кислород
отбирается у воды, а не у СО2. Скорость поглощения СО2 из окружающей
среды (равная скорости выделения кислорода) зависит от интенсивности
света или от скорости поглощения света. Зная теплоту сгорания для обрат-
ной реакции, можно рассчитать наименьшее число фотонов, необходимых
для полного восстановления молекулы СО2. Количество энергии, необходимое
для восстановления 1 молекулы СО2 до углевода, составляет 112 ккал!моль,
или 4,9 эв на 1 молекулу. Фотосинтезопротекает особенно интенсивно под
влиянием света с длиной волны 7000 А (энергия фотона— 1,77 эв). Таким
образом, для восстановления 1 молекулы СО2 до углевода необходимо по мень-
шей мере 4,9/1,77=2,8 фотона. Так как это число не целое, то на самом деле
для этого процесса нужно не меньше трех фотонов. Определение максималь-
ного квантового выхода фотосинтеза представляет большие сложности,
так как для этого необходимо контролировать состав и количества газов,
поглощаемых и выделяемых в ходе эксперимента. Эти измерения имеют
большое значение, поскольку фотосинтез наряду с реакцией, происходя-
щей под действием света, включает в себя целый ряд темновых реакций
>(на которых мы не будем останавливаться). В связи с определением кван-
тового выхода фотосинтеза возникло много горячих споров. 'Варбург и
его сотрудники получили величины выходов порядка 1/4, тогда как боль-
шинство других исследователей — х/8- В любом случае, таким образом,
можно считать, что световая энергия используется при фотосинтезе доста-
точно эффективно.

Фотосинтез происходит в растениях, содержащих хлорофилл. Вполне
возможно, что другие пигменты также участвуют в этом процессе, однако
«они не могут действовать в отсутствие хлорофилла. Хлорофилл содержится
в гранах хлоропластов; для того чтобы фотосинтез был эффективен, эти
граны должны иметь определенную величину. Если разрушить граны уль-
тразвуком на более мелкие фрагменты, то у этих фрагментов способность
катализировать реакцию Хилла, заключающуюся в освобождении О2
при восстановлении солей трехвалентного железа по уравнению

/IV

4Ре+++-|-2Н2О	4Ре+++О2-ф4Н+,

оказывается пониженной. Способность катализировать реакцию Хилла зави-
сит от среднего размера гран, как видно из фиг. 156. Минимальный диаметр,

Ф и г. 156. Скорость выделения О2 в реакции
Хилла для гран, разрушенных на фрагменты
определенных размеров [12].

при котором граны ере способны катализировать эту реакцию, составляет
приблизительно 100 А. В такой частице содержится 100 молекул хлоро-
филла. Эти результаты показывают, что большую роль при реакции фото-
синтеза, происходящей под действием света, играет характер взаимного
расположения молекул хлорофилла, белка и липидов внутри граны хлоро-
пласта. Однако механизм использования световой энергии еще не' ясен
во всех деталях.

Для большинства зеленых растений кривая зависимости скорости фото-
синтеза от длины волны (так называемый спектр действия фотосинтеза)
довольно хорошо совпадает со спектром поглощения хлорофилла. Однако
существует много водорослей, для которых это не соблюдается. У этих
водорослей спектр действия фотосинтеза коренным образом отличается
от спектра поглощения хлорофилла. На фиг. 157 изображен спектр действия
фотосинтеза для красной водоросли. Можно считать, что этот спектр состоит
из двух частей: неэффективной части, связанной с поглощением хлорофилла,
и высокоэффективной части, обусловленной присутствием фикоэритрина
(это вещество определяет цвет водорослей). Фикоэритрин, по-видимому,
не участвует в фотосинтезе, а поглощаемая им энергия передается хлоро-
филлу. Участвуя в фотосинтезе, хлорофилл использует эту дополнитель-
ную энергию. В подобных случаях спектр действия фотосинтеза напоми-
нает скорее спектр поглощения всего растения, чем какого-либо одного
вещества. Однако было бы неправильно, исходя только из формы спектра
действия, делать вывод, что фикоэритрин играет существенную роль в про-
цессе фотосинтеза. Это утверждение может показаться тривиальным; тем
не менее его следует иметь в виду при всех попытках определить по спектру
действия, какие именно молекулы играют наиболее важную роль в изу-
чаемых процессах. Спектр действия может соответствовать спектру погло-
щения всей системы даже в том случае, когда решающую роль играет только
одна молекула. Изменение этой молекулы может быть результатом либо
прямого поглощения энергии, либо косвенного, как в случае системы хло-
рофилл — фикоэритрин.

Процесс передачи энергии от одной молекулы к другой при фотосин-
тезе у красных водорослей напоминает диссоциацию карбоксимиоглобина
в результате поглощения света белковой частью молекулы. Механизм пере-
дачи энергии в этих случаях может заключаться, например, в столкновении
возбужденной и невозбужденной молекул, в передаче электронов через
полосы проводимости дайной структуры, в излучении и вторичном погло-
щении излучения или в так называемой сенсибилизированной флуоресценции.

А — спектр действия фотосинтеза у красной водоросли и спектры поглощения краси-
теля фикоэритрина и клеток водоросли [26]; I — спектр поглощения фикоэритрина,
/I — спектр действия; III — спектр поглощения таллома водоросли.

Б — спектр поглощения хлорофилла в метиловом спирте; I — спектр поглощения
хлорофилла а, II — спектр поглощения хлорофилла Ь.

Этот последний процесс, по-видимому, играет наиболее важную роль при
фотосинтезе.

10.	Сенсибилизированная флуоресценция. Сенсибилизированной флу-
оресценцией называют процесс, при котором обмен энергией между двумя
молекулами происходит благодаря перекрыванию их энергетических уров-
ней. Этот процесс нельзя рассматривать как излучение и вторичное погло-
щение света, так как такая передача энергии происходит на расстояниях,
меньших длины световой волны. В действительности две соседние моле-
кулы с близкими энергетическими уровнями не являются независимыми
друг от друга и мы не в состоянии сказать, в какой из них локализована
энергия фотона. Тем не менее в первом приближении можно считать, что
энергия поглощается одной молекулой и передается другой. Эффектив-
ность передачи энергии зависит от расстояния между молекулами и близо-
сти их энергетических уровней. О близости уровней можно судить по пере-
крыванию спектра флуоресценции одного вещества и спектра поглощения
другого. Молекула, получившая энергию благодаря процессу сенсибили-
зированной флуоресценции, может потерять часть этой энергии в резуль-
тате безызлучательного перехода (фиг. 115, Б), причем оставшаяся энер-
гия будет недостаточной для того, чтобы вернуть эту молекулу, первона-
чально богатую энергией, в возбужденное состояние.

Процесс передачи энергии при фотосинтезе у сине-зеленых водорослей
(хлорелла) был рассмотрен количественно [23]. У этих водорослей свет
поглощается двумя пигментами — хлорофиллом и фикоцианином. Соотно-
шение между поглощениями этих компонентов зависит от длины волны.
Так, при 6000 А 20% света поглощается хлорофиллом и 80% — фикоциа-
нином. Если обозначить квантовые выходы фотосинтеза для света, погло-
щенного соответственно хлорофиллом и фикоцианином, через <рх и <рф, то
для наблюдаемого квантового выхода (0,078 при 6000 А) можно написать
следующее равенство:

0,78 = 0,20<рх -*- 0,80срф-

Для света с длиной волны 6760 А, при которой поглощение в основном
обусловлено хлорофиллом, имеем

0,085 = 0,94срх + 0,06<рф.

Решая эти уравнения, получаем

срх = 0,086, <Рф = 0,076.

Следовательно, свет, поглощаемый фикоцианином, эффективен почти
в той же степени, что и свет, поглощаемый хлорофиллом.

Фиг, 158. Спектры действия инактивации бактериофага Т1.

А — для раствора вирусов [27]; Б — р,л.я сухой пробы вирусов при двух температурах [28].

Молекулы, подобные фикоцианину, растрачивают поглощаемую ими
энергию на тепло или флуоресценцию. Если, кроме этих процессов, про-
исходит также резонансная передача энергии (сенсибилизированная флуорес-
ценция), то обычная флуоресценция, заключающаяся в излучении света,
уменьшается. При облучении в растворе 20% энергии, поглощаемой фико-
цианином, идут на флуоресценцию, а остальные 80% переходят в тепло.
Но при облучении в клетке только 1—2% энергии расходуется на флуорес-
ценцию и 4—-8%, по-видимому, рассеивается в виде тепла. Это означает, что
ш ущо хлорофиллу передается за счет резонансной передачи около 90—95%
энергии, поглощаемой фикоцианином. Такая высокая эффективность соот-
ветствует большому значению срф. Расчет, основанный на знании энергети-
ческих уровней и концентраций этих двух пигментов, показывает, что
эффективность процесса резонансной передачи, определенная теоретиче-
ски, достаточна для объяснения наблюдаемых результатов.
11.	Фаги и микроорганизмы. На фиг. 158 изображены некоторые спект-
ры действия инактивации бактериофага Т1. Спектр действия для суспен-
зии фаговых частиц очень близок к спектру поглощения фага, что говорит
о независимости квантового выхода от длины волны. Фаг содержит 30% ДНК
и 70% белка. Его сечение поглощения при 2650 Л равно 1,5-10“13 см2.
Для квантового выхода, который можно рассчитать по этим данным, полу-
чается значение 6- 10А Сечение инактивации фага для длин волн 2800
и 2300 Л, определенное при температуре жидкого воздуха, меньше, чем
при комнатной температуре. При этих длинах волн коэффициент поглощения
белка довольно велик по сравнению с коэффициентом поглощения нуклеи-
новой кислоты. Белки при 90° К (—183° С) менее чувствительны к инактива-
ции, чем нуклеиновые кислоты; этим, по-видимому, и объясняется малая
величина сечения инактивации фага при низких температурах.

Однако такие подробные спектры действия необходимы далеко не во
всех случаях. Очень часто важные выводы можно сделать, основываясь
лишь на самом простом определении связи между энергией падающего
света и функцией клетки. Например, некоторые дрожжи в обычных усло-
виях не могут усваивать галактозу. Однако, если поместить их в среду,
содержащую галактозу, они через короткое время приобретают способность
усваивать этот сахар. Облучение ультрафиолетом подавляет этот процесс
адаптации. Соответствующие опыты проводились с суспензией дрожжей,
содержащей 2-Ю8 клеток на 1 мл, которую помещали в кварцевую кювету
и облучали снизу монохроматическим ультрафиолетовым светом. Ниже
мы приводим значения минимальных количеств энергии, необходимых для
прекращения адаптации дрожжевых клеток к галактозе по меньшей мере
на 4 часа [24]. Из приведенных значений следует, что облучение в области

Длина волны» А	Доза, эрг/нм*
2345	3 400
2537	1 700
2654	1 700
2804	3 400
3025	1 400
3130	750 000

2600 А более эффективно подавляет адаптацию, чем облучение светом дру-
гой длины волны. Таким образом, кривая чувствительности дрожжей к облу-
чению напоминает спектр поглощения нуклеиновых кислот с (а не белков,
для которых максимум поглощения находится вблизи 2800 А). Адаптация
дрожжевых клеток, в результате которой эти клетки приобретают способ-
ность усваивать углевод, который они раньше использовать не могли,
представляет собой очень сложный процесс. Значения энергии, приведенные
выше, показывают, что такая адаптация тесно связана с нуклеиновыми
кислотами. Это свидетельствует о том, что нуклеиновые кислоты управ-
ляют синтезом белков.

12.	Кооперативные эффекты при действии света; распределение Пуас-
сона. Как мы уже отмечали при теоретическом рассмотрении спектров
действия, во многих случаях выполняется закон, согласно которому эффект
действия света зависит от произведения интенсивности на время, т. е. ско-
рость нарастания этого эффекта пропорциональна интенсивности света.
Однако нет оснований считать, что этот закон должен выполняться во всех
случаях. Например, при облучении культуры растущих бактерий ультрафио-
летом очень низкой интенсивности вызываемая последним инактивация
настолько мала по сравнению со скоростью роста, что эффект инактива-
ции бактерий заметить очень трудно. Напротив, если интенсивность облу-
чаемого света очень велика, то одна и та же молекула может поглотить
в течение очень малого промежутка времени два фотона, в результате чего
вероятность молекулярной перестройки будет значительно выше, чем в том
случае, когда молекула поглощает эти кванты в различные моменты вре-
мени. Закон взаимозаменяемости может не выполняться и в ряде других
случаев. Поэтому при всех исследованиях, связанных с облучением, осо-
бенно при облучении светом, а не заряженными частицами, необходимо
проверять, подчиняется ли этому закону наблюдаемое явление. Если оно
не подчиняется, то анализ получаемых данных очень сложен, так как трудно
добиться того, чтобы эксперименты при различных длинах волн проводились-
при одинаковых интенсивностях падающего света.

Закон взаимозаменяемости может соблюдаться и в тех случаях, когда
наблюдаемый эффект является результатом нескольких событий, хотя ко-
оперативные эффекты играют при этом важную роль Пусть, например
для того, чтобы вызвать определенный биохимический процесс, необходи-
мо инактивировать путем облучения оба гена гомозиготной пары, причем
зависимость инактивации от дозы излучения в случае повреждения только
одного гена будет отлична от той, которая наблюдается при повреждении
обоих генов в процессе инактивации. Теперь рассмотрим еще более сложный
случай. Предположим, что молекулярная перестройка, которую мы.можем
обнаружить, происходит в результате не одного события, или «удара»,
а в результате р ударов. При этом либо все р ударов должны попасть в одну
и ту же молекулу (мишень), либо имеется р мишеней, в каждую из которых
нужно попасть. Второе предположение, согласно которому существует
большое число мишеней, более обоснованно с точки зрения физики. Перей-
дем теперь к анализу, считая, что закон взаимозаменяемости выполняется.

Предположим, что число попаданий в каждую мишень в результате
облучения велико, причем их среднее число равно х. Для одних мишеней
число попаданий будет больше х, для других — меньше. Распределение
попаданий по мишеням описывается законом Пуассона

уРр—х

(9-13)

где Р (р) — вероятность того, что число попаданий в мишень равно р (при
среднем числе попаданий х). Можно написать явное выражение для этой
функции при значениях р, равных 0, 1, 2 и т. д., и показать, что сумма
вероятностей, соответствующих изменению р от нуля до бесконечности,,
равна единице

Р(0) = е-\ Р(1) = хе~х, Р(2)=^-е~х.

Вероятность отсутствия попаданий Р (0) = е~х равна относительному числу
облученных мишеней, в которые не произошло попаданий. Для таких про-
цессов, как инактивация ферментов, относительная активность, опреде-
ляемая уравнением (9.12), равна

Это выражение представляет собой вероятность того, что молекула фер-
мента не получила ни одного инактивирующего удара, т. е. оно равно-
Р (0). Отсюда следует, что среднее число попаданий в мишень (х) равно <г1).

Среднее число ударов на молекулу = оО.	(9.14)

Это соотношение удобно использовать для вычисления среднего числа
попаданий в мишень при любой дозе, поскольку, как будет показано в даль-
нейшем, аВ найти очень легко.

Предположим теперь, что для инактивации микроорганизма под влия-
нием ультрафиолета нужно, чтобы квант света попал в два специфических
центра активности, например в два гена. На каждую из этих двух мишеней
должно приходиться по удару. Для простоты будем считать, что все мишени
одинаковы, т. е. им соответствует одно и то же сечение о. Вероятность того,
что одна из этих мишеней не будет поражена, равна Отсюда вероят-
ность попадания в одну мишень равняется 1—е~аГ>. Для инактивации
микроорганизма необходимо попасть в две мишени; вероятность этого
события равна произведению вероятностей попадания в одну мишень,
т. е. (1—е~сВ)2. Вероятность выживания, или доля выживших частиц,
равна единице минус вероятность попадания в обе мишени

В более общем случае, когда необходимо попасть хотя бы по одному разу
в р мишеней, это выражение принимает вид

Легко видеть, что в модели, предусматривающей большое число уда-
ров, зависимость 1п \'/от 7? имеет нелинейный характер; при 1)=0 тан-
генс угла наклона кривой равен 0, и лишь при больших дозах облучения
зависимость становится линейной и описывается прямой, тангенс угла накло-
на которой равен — о. Такая закономерность понятна, если учесть, что при
очень малых дозах число микроорганизмов, в которые уже произошло одно
попадание и для инактивации которых достаточно поэтому еще только одного
удара, ничтожно мало. Напротив, при больших дозах почти все выжившие
организмы уже получили по одному повреждению, и для такой популяции
инактивация происходит уже в результате одноударного процесса.

Анализ кривых выживания при многоударных процессах довольно
прост, хотя и трудоемок. Сечение инактивации в этом случае можно опре-
делить по наклону кривой, изображающей зависимость логарифма выжи-
вания от дозы, при высоких дозах. Экстраполируя поэтому прямолинейному
участку к нулевой дозе, можно по длине отсекаемого отрезка установить
множественность процесса.

В качестве примера применимости многоударной модели рассмотрим
фиг. 159, на которой приведены данные по инактивации спор В. виЫШб
под действием ультрафиолетового излучения с длиной волны 2537 А. При
облучении в сухом состоянии закон взаимозаменяемости выполняется при
изменении интенсивности в 12 раз и кривая инактивации лучше всего
согласуется с двухударной моделью. Если вещество находится во влажном
состоянии, то закон взаимозаменяемости не выполняется, так как множест-
венность, которой соответствует кривая выживания при облучении во влаж-
ном состоянии, зависит от интенсивности излучения. Найти удовлетвори-
тельное объяснение этих данных с физической точки зрения пока не удалось.

Моровитц получил спектры действия инактивации и мутационного
процесса при облучении ультрафиолетом сухих спор, для которых выпол-
няется закон взаимозаменяемости. Мутации заключались в возврате био-
химических мутантов к дикому типу. Такая обратная мутация приводит
к появлению колонии, способной расти на минимальной среде. Спектры
действия инактивации и мутаций коррелируют со спектром поглощения,
причем сечение поглощения изменяется в рассматриваемой области спектра
в 1000 раз. Отсюда следует, что квантовый выход не зависит от длины волны.
Экспериментальные данные как будто согласуются с представлением о том,
что для инактивации бактерии необходимо два попадания в любую часть
•бактериальной споры. Спектр действия мутационного процесса подобен

Фиг 159. Кривые инактивации спор В. зиЫШз, облучаемых при
2537 к [29].

Л — облучение спор в сухом состоянии; Б — облучение влажных спор при интен-
сивностях излучения, изменяющихся в отношении Л :	= 12:2:1.

спектру действия инактивации. Это приводит к мысли, что инактивацию
можно рассматривать как летальную мутацию.

Мы должны всегда помнить, что большая часть поглощенных фотонов
не производит заметного эффекта. Так, при облучении В. енЫШе на мил-
лион поглощенных фотонов приходится только одна пара эффективных
фотонов. Мы не можем сейчас сказать, попадают ли эти два фотона в неко-
торые критические области клетки или их энергия растрачивается по како-
му-то особо эффективному пути. Даже в случае таких малых объектов,
как молекула фермента, мы не можем дать ответ на этот вопрос.

Другим примером, когда эффект возникает в результате большого
числа попаданий, может служить изменение свойств вируса гриппа под
действием ультрафиолета. В частности, вирусы теряют при этом инфек-
ционность, а также способность вызывать агглютинацию эритроцитов.
Уменьшение инфекционности в зависимости от дозы падающего света носит
экспоненциальный .характер. Соответствующий спектр действия имеет
максимум при 2600 А. Это еще раз указывает на важную роль нуклеиновых
кислот в процессах биосинтеза, так как, хотя вирусы гриппа в значительной
мере состоят из белка, квантовый выход инактивации максимален в обла-
сти наибольшего поглощения нуклеиновых кислот, т. е. при 2600 А. Данные
по гемагглютинации представлены на фиг. 160. По оси ординат отложены
значения разведений, при которых еще наблюдается осаждение; при этом
сильное разведение соответствует высокой концентрации агглютинирующей
части вируса. Все приведенные кривые согласуются с многоударной моделью.
Максимальная чувствительность наблюдается при 2800 А, причем вели-
чины доз падающего света для этого эффекта в 104 раз больше, чем для ана-
логичного уменьшения инфекционности. Можно, по-видимому, считать, что
способность вируса к гемагглютинации обусловлена существованием

нескольких критических областей на

Ф ч г. 160. Инактивация вирусов грип-
па в отношении гемагглютинации при
облучении ультрафиолетом различных
длин волн [30].

Каждой длине волны соответствует свое число
мишеней, которое можно определить с по-
мощью кривых, проведенных, по эксперимен-
тальным точкам. Для 2800 А число мише-
ней — 5, для 2652 А — 40, для 3023 А — 10
[30]

поверхности вирусной частицы и опре-
деляется свойствами вирусного белка,
а не нуклеиновой кислоты.

Эксперименты по действию уль-
трафиолета на Т-фаги, в результате
которых было получено много инте-
ресных данных, показали, что среднее
число попаданий на одну частицу рав-
но произведению сечения инактивации
на дозу [25]. Отправной точкой этого
исследования послужила работа Дель-
брюка и Бейли, которые показали,
что число стерильных пятен, образуе-
мых выжившими после облучения фа-
говыми частицами, зависит от соотно-
шения между числом фаговых частиц,
и бактерий в высеваемой смеси. Если
добавить 0,1 мл фага к 1 мл суспен-
ции Е. со!л и затем перед распределе-
нием по чашкам разбавить эту смесь
в 104 раз, то число стерильных пятен

будет больше, чем в том случае, когда раствор вируса разбавляют до добав-
ления его к бактериальной суспензии. Это явление называется множествен-
ной реактивацией. Полный анализ этой проблемы увел бы нас слишком дале-

Ф и г. 161. Схема, поясняющая гипотезу о существовании
субъединиц вируса, инактивируемых ультрафиолетом.

Объяснения см. в тексте.

ко в сторону. Однако ясно, что одно из возможных объяснений такой реак-
тивации основывается на том, что каждая фаговая частица состоит из боль-
шого числа отдельных единиц. После адсорбции фаговой частицы на бак-
терии и проникновения ДНК фага в клетку для выработки новых фаговых
частиц необходимо, чтобы в клетке присутствовали все эти единицы. Можно-
предположить, что две неактивные фаговые частицы вместе содержат все
субъединицы, необходимые для выработки нового фага. На фиг. 161 схе-
матически изображены четыре различным образом инактивированные вирус-
ные частицы. Каждая частица сама по себе не способна к воспроизведению.
Однако комбинации этих частиц, в частности (/, II) и (/, III, IV), могут
обеспечить появление новых фаговых частиц. Такая рекомбинация наблю-
дается при смешивании концентрированной суспензии в значительной сте-
пени инактивированных фаговых частиц с чувствительными клетками
хозяина.

Опыты, проведенные при низких концентрациях фага в культуре
Е. соН, в которых число частиц, адсорбированных на одной бактерии, не
превышало единицы, показывают, что выживание составляет е~аГ>. В дан-
ном случае о соответствует суммарному действию на все субъединицы фага,
так как при таких условиях реактивация невозможна. Если бы число субъеди-
ниц в фаговой частице было равно п, то выживание для каждой из них
составило бы е~аЬ1п. Следует подчеркнуть, что поскольку среднее число
попаданий на одну фаговую частицу, оО, известно, то, зная число
субъединиц в одной частице, можно определить среднее число попаданий на
субъединицу, равное оР/п.

Предположим, что мы увеличили концентрацию фаговых частиц по срав-
нению с концентрацией бактерий, так что в среднем каждая бактерия теперь
адсорбирует к частиц. Чему равна вероятность того, что субъединица А
останется неповрежденной? Расчет приводит к выражению

Выживание для единицы А = 1 — (1 — е~а1>1п)к;

так как число типов единиц равно п, то

Выживание = [1 — (1 — еа10/п)к]п.

Изменяя экспериментально оР и к независимо друг от друга, можно
определить как ц, так и п. Подставляя экспериментальные данные в напи-
санное выше выражение, получаем величины, приведенные в табл. 22.

Таблица 22

Параметры, определенные в опытах по множественной реактивации бактериофагов

Фаг	Размер, А		п	Относительная величина о
	головка	отросток		
Т1	500	1200-100	8	1/10
Т2	600-800	1000-200	40	1
Т4	600-800	1000-200	30	1/4
Т5	900	1700-150	15	1
Тб	600-800	1000-200	50	1
Т7	450	150-100	8	1/10

Анализ, проведенный нами для объяснения множественной реактива-
ции, основан на допущении, что каждая бактерия адсорбирует одно и то же
число вирусов, равное среднему числу вирусов на бактерию, к. На самом
деле число вирусов, адсорбирующихся на бактерии, следует определять
с помощью распределения Пуассона, которое позволяет учесть различия
в размерах бактерий. Это существенно, поскольку вероятность столкновения
вируса в результате диффузии с крупной бактериальной клеткой больше,
чем вероятность ее столкновения с мелкой бактериальной клеткой.

13.	Фотореактивация. Рассмотрение действия света на организмы,
вирусы и ферменты было бы неполным без упоминания о возможности про-
цесса, обратного инактивации. Как установил Келнер, микроорганизмы,
инактивированные ультрафиолетом, можно «реактивировать», облучая
их видимым светом высокой интенсивности или ближним ультрафиолетом.
До сих пор не удалось наблюдать фотореактивацию вирусов или ферментов
самих по себе. Однако, если инактивированный вирус инкубировать с клет-
кой-хозяином, фотореактивация удается. По-видимому, фотореактивация
вируса связана с обменом веществ в организме хозяина, а не с первичной

Фиг. 162. Спектры фотореактивации
Е. соИ В/г и фагов Т2, адсорбированных на
бактериях [31].

Инактивация производилась при 2537 А. При
дозах 1,8-1015 эрг/см? для бактерий и 2,7х
Х104 эрг/см2 для вирусов выживание составляет
0,1 %.л Прн облучении светом длины волны
3500 А, вызывающим фотореактивацию, выжива-
ние повысилось до 1% при дозах 3,5-106 эрг/см2
для. бактерий и 1,3-106 эрг/см2 для вирусов.

молекулярной перестройкой, вызы-
ваемой в вирусной частице види-
мым светом. Это подтверждается,
тем, что спектры действия фото-
реактивации Е. соИ и бактериофага
Т2 (после его адсорбции на Е. соИ)
совпадают (фиг. 162).

Фотореактивация — сложный
процесс, один из этапов которого
состоит в поглощении фотона..
Остальные реакции этого процесса
являются темновыми и их скорость
можно определить, применяя пре-
рывистое освещение интенсивным
светом. Спектр действия фотореак-
тивации недостаточно четок, чтобы
его можно было приписать какому-
либо определенному поглощаю-
щему пигменту. По-видимому, про-
цесс фотореактивации заключается
в устранении повреждения в ядре
(или в каких-то изменениях в нем),
а не в действии на цитоплазму.
Например, фотореактивация не-
наблюдается при утрате подвиж-
ности Рагатеаа под действием

ультрафиолета (спектр действия инактивации в этом случае напоминает
спектр действия при облучении содержащего цистин белка). В то же-
время при подавлении деления ультрафиолетом спектр действия аналоги-
чен спектру действия инактивации нуклеиновых кислот и фотореактива-
ция возможна. Известно также, что при облучении яиц осы фотореак-
тивация обеспечивает устранение повреждений ядра, но не устраняет
повреждений в цитоплазматической РНК.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	XV а г Ь и г § О., Неауу Ме1а1 РгозЩеНс Сгоирз апб Епгуте АсНоп, ОхГогЛ
Ишсегзйу Ргезз, 1949.

2.	МсЬагеп А. И., «Рйо1осЬет1з1гу о! Рго1е1пз, Епгутез, апб ХЯгизез», Ас1у.
Епгуто1., 9, 75 (1949).

3.	ЬооГЬоигои' Л Н. «ЕНес1з о{ ИКгаукЯе! КаЛаНоп оп Се11з», ОгоиЧИ 8утр.,
12, 75 (1948).

4.	В 1 и т Н. Р., ш В1орЬуз1са1 КезеагсЬ МеФодз, ед. Ьу Р. М. ИЬег, 1п1ег8с1епсе-
РиЬ. Со , И. У., 1950.

5.	О 1 е з е А. С., «РпЯохоа 1П РЬо1оЫо1офса1 КезеагсЬ», Р11уз1о1офса1 2оо-, 24,1 (1953).

6.	Р о 1 1 а г д Е. С., ТЬе РЬуз1с5 о! У1гизез, Асадепмс Ргезз, И. У., 1955.
7.	Е г г е г а М., «Мескашзтз о! В1о1о^1са1 АсНоп о! Н11гау1о1е! апд У1з1Ые Яад!а-
Нопз», Рго§- В1орЬу8., 3, 88 (1953).

8.	НоНаепйег А., Ед., Кад1аНоп В1о1о§у, Уо1з. II, III, МсОгаш-НШ РиЬ..
Со., И. У., 1955, 1956.

9.	8 е I 1 о XV К., «АсНоп 8рес1го8сору», Аду. В1о1. Мед. РЬуз., 5, 37 (1957).

10.	К о 1 1 е г Ь- ₽., Н11гау1о1е1 1?ад1аНоп, УУЛеу, И. V., 1952.

11.	С а 1 V I п М., 1п Сиггегдз 1п В1осЬет1са1 КевеагсЬ, 1956, ед. Ьу Вау1д Сгееп,
1п1ег8с1епсе РиЬ. Со., Ы. У., 1956.

12.	ТЬотаз 1. В., «81гис1иге апд РипсНоп о! 1Ье СЫогор1а8Ь>, Рго§. В1орЬу8.,
5, 109 (1955).

13.	XV I I I 1 п § Ь а т С. Р., «СЫогор1аз1 81гис1иге апд Епег^у Сопуег81оп ш РЬо1о-
8уп1Ье818», Рго§. В1орЬуз., 7, 319 (1957).

14.	1 а § § е г 1., «РЬо!огеас11уаНоп», Вас1ег!о1. ₽еу., 22, 99 (1958).

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

15.	Ве V г 1 е 8, ЕхрегепНа, 4, 357 (1948).

16.	М о Ь 1 е г	Ы. М.,	Ь о о I Ь о и г о XV Л. К , Ат. I. РЬу81с8, 20,	499,	579	(1952).

17.	М о п к О.	8., Е Ь	г е 1 С. Р., Яад!а11оп ЦевеагсЬ, 5, 88 (1956).

18.	М с Е аг еп А. В., В1осЫт. е! ВторЬуз. Ас1а, 18, 601 (1955).

19.	Еег т ап	Ь. 8., Т о 1 т а с Ь Ь. Л., В1осЫт. е! В1орЬу8. Ас1а,	33,	371	(1959).

20.	Мс Е аг еп А. В., ТакаЬавЬ! XV. И., Над1аНоп ЯевеагсЬ, 6, 532 (1957).

21.	В г о 8 е г XV., ЕаиНсЬ V/., 2. Ма1иг1ог8сЬ., 11Ь, 453 (1956).

22.	В й с Ь е г Т., К а8 р е г 8 1., В1осЫш. е! В1орЬуз. Ас1а, 1, 21 (1947).

23.	А г п о 1 д XV., Ор репЬехтег Л. Ц., Л. Сеп. РЬу81о1., 33, 423 (1950).

24.	8 е л 8 о п Р. А., Ргос. На11. Асад. 8с1 , 36, 699 (1959).

25.	кипа 8. Е„ Ргос. Иа1. Асад. 8с1., 33, 253 (1947).

26.	Н а х о	Р. Т., В 1 1 п	к 8 Ь. К., Л. Оеп. РЬуз1о1., 33, 389 (1950).

27.	2 е 1 1 е	М.	₽., Н о 1	1 а е п д е г А, Л. Вас1ег1о1., 68, 210 (1954).

28.	Р 1 и к е В. Л., 1?ад1аНоп КезеагсЬ, 4, 193 (1956).

29.	М о г о	I 1	х Н. Л.,	АгсЬ. В1осЬеш. ВюрЬу8., 47, 325 (1953).

30.	Татт	I.,	Р 1 и к е	В. Л., Л. Вас!еГ1о1., 59, 449 (1950).

31.	Л১ег Л., Е.а1аг)е1 ₽., Апп. 1пз1. Ра81еиг, 91, 858 (1956).
Глава X

ДЕЙСТВИЕ

ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
НА КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

1.	Введение. Со времени открытия рентгеновских лучей и радиоактив-
ности внимание исследователей было привлечено к их способности прони-
кать в живые организмы. Большой интерес, который вызвали у исследова-
"епей явления, наблюдаемые при действии ионизирующего излучения на жи-
вые системы, объясняется отчасти тем, что эти эффекты ни в коей мере не
соответствуют величине энергии, сообщаемой системе. Например, увеличе-
ние температуры при летальной дозе облучения настолько мало, что его
почти невозможно измерить. Таким образом, независимо от применения иони-
зирующего излучения для диагностики повреждений и заболеваний изуче-
ние его представляет интерес и само по себе. Все более широкое применение
ионизирующего излучения в медицине и промышленности, а также создание
ядерного оружия привлекли внимание к вопросам, имеющим важнейшее
значение и для молекулярной биологии. Так, на конгрессе, посвященном
действию излучения на живые организмы, одной из основных проблем,
подвергшихся обсуждению, была проблема существования порога при
действии ионизирующего излучения. После ознакомления с этой главой
читателю станет ясно, что правильный ответ на этот и другие вопросы, став-
шие предметом широкого обсуждения, можно будет дать лишь при условии
глубокого изучения, во-первых, свойств и функций макромолекул, опре-
деляющих наследственность организма, а во-вторых, механизма синтеза
белков и углеводов. Именно поэтому столь важными стали комплексные
исследования по молекулярной биологии и по действию ионизирующего
излучения.

Существует также иной аспект исследований, связанных со свойствами
ионизирующего излучения и некоторыми эффектами, возникающими при
его действии на клетку; цель таких исследований может состоять не столько
в том, чтобы узнать что-либо новое об излучении, сколько в расширении
наших знаний о клетке. Так как работа авторов в течение нескольких лет
была связана преимущественно с этой областью, мы остановимся на этой
специальной теме отдельно в гл. XI.

При прохождении ионизирующего излучения через вещество в опре-
деленных точках его пути происходит интенсивное выделение энергии.
Из квантовой механики и теории строения атома известно, что обмен энер-
гией между излучением и веществом носит дискретный характер, причем
во многих облучаемых областях излучение вообще не передает свою энергию
веществу. Эти области, следовательно, «не знают» о том, что облучение
имело место. Таким образом, нам нужно выяснить, что же происходит
с клеткой или системой клеток при выделении энергии излучения в неко-
торых очень малых областях клетки, в то время как подавляющая часть
клетки не поглощает энергии. Чтобы ответить на этот вопрос, естественно
обратиться сначала к физике ионизирующего излучения, затем к данным
о его действии на макромолекулы и системы макромолекул и после этого
попытаться составить представление о характере его действия на клетку
в целом, допускающее проверку на опыте. Читатель скоро убедится, что,
хотя при физическом описании мы стоим на твердой почве, уже при рассмот-
рении молекулярных эффектов она становится довольно зыбкой, а наши
попытки добиться успеха на клеточном уровне вообще оказываются пока
мало состоятельными.

2.	Природа ионизирующего излучения. Два широко известных типа
излучения, рентгеновские лучи и нейтроны, сами по себе не вызывают иони-
зации. Хотя это утверждение может привести читателя в некоторое заме-
шательство, легко объяснить, в чем тут дело. Ионизация производится
почти исключительно быстрыми заряженными частицами. Рентгеновские
лучи и нейтроны называются «ионизирующими» потому, что при прохожде-
нии через вещество сни вызывают образование быстрых заряженных частиц.
Наиболее важные особенности действия этих излучений, к рассмотрению
которых мы обратимся в первую очередь, связаны на самом деле с их вто-
ричным действием, т. е. с действием этих частиц. Первичные процессы,
заключающиеся в образовании быстрых заряженных частиц при воздействии
рентгеновских лучей и нейтронов, будут описаны в разд. 4.

К рассмотрению действия летящей заряженной частицы на вещество
можно подойти с двух сторон. Может быть, естественнее всего исходить из
представления о соударении. Первая теория, основанная на этом предста-
влении, была создана Бором в 1915 г. При таком подходе воздействие, ска-
жем, быстрого электрона на атом рассматривается как результат соударе-
ния его с электроном атома или атомным ядром. Существует два типа соуда-
рений: упругое, при котором кинетическая энергия сохраняется, и неупру-
гое, когда часть кинетической энергии растрачивается на возбуждение или
ионизацию' Теоретически эти процессы были полностью проанализированы
Бете в его монументальном труде (1930), в котором он приводит расчеты
для прохождения быстрых частиц через атомарный водород. Методы, разви-
тые в этой работе, позволили получить выражения, которые могут быть
применены не только к атомарному водороду, но и к другим веществам
(хотя один из параметров, входящих в формулы Бете, не может быть опре-
делен теоретически).

Другой метод, эквивалентный первому, состоит в том, что летящую
частицу рассматривают как источник электрического поля. Дело сво-
дится просто к тому, что при прохождении через вещество эта частица
отрывает электроны из ближайшего атома, отталкивая их, если она сама
является электроном, или притягивая, если это протон или дейтрон, заря-
женные положительно. Хотя эта примитивная картина полезна, она нуж-
дается в уточнении, приводящем к существенным результатам. Фиг. 163
схематически иллюстрирует различные особенности действия излучения.
На фиг. 163, А линией изображен путь летящей заряженной частицы при
ее прохождении через область с большой плотностью атомов. Стрелками
отмечена ионизация атомов (в данном случае двух), а пунктирным кружком—
возбужденный атом. На фиг. 163, Б изображена траектория частицы при
прохождении ее мимо одного из атомов. На фиг. 163, В вычерчена зависи-
мость поля, действующего в атоме, от положения частицы, а на фиг. 163, Г—
зависимость этого поля от времени, прошедшего после приближения части-
цы к атому. Для медленной частицы это поле существует длительное время.
17 Заказ № 1168
для быстрой — оно сначала резко возрастает, а затем быстро уменьшается.
Наконец, на фиг. 163, Д показано, как изменяется кривая потенциальной

А

А — частица проходит через некоторую совокупность атомов, произ-
водя несколько ионизаций и возбуждений; Б — атом и частица, про-
ходящая мимо него; В — зависимость электрического поля, создавае-
мого в атоме быстрой заряженной частицей, от положения частицы;
Г — зависимость того же поля от времени; Д — кривая потенциаль-
ной энергии атома до наложения дополнительного поля и при учете
влияния быстрой частицы, создающей дополнительное поле. Подроб-
ности см. в тексте.

энергии атома, находящегося в основном состоянии, при наложении внеш-
него поля, под действием которого атом может перейти в то или иное воз-
бужденное состояние, в том числе и в несвязанные состояния, т. е. состоя-
ния, соответствующие ионизации (последние обозначены пунктирными
кружками).

Остановимся теперь на некоторых обстоятельствах, связанных с дей-
ствием такого дополнительного поля. Во-первых, каждый атом, вблизи
которого проходит быстрая частица, испытывает временное возмущение.
Во-вторых, это возмущение существует тем дольше, чем медленнее частица.
В-третьих, частицы, несущие несколько зарядов (например, а-частицы),
вносят большее возмущение. В-четвертых, поле быстрой частицы содержит
более высокочастотные составляющие, чем поле медленной. В-пятых, вели-
чина массы быстрой заряженной частицы вообще не играет никакой роли.

На основании всего сказанного можно сделать ряд теоретических пред-
сказаний. Остановимся сначала на качественной стороне рассматриваемых
явлений. При возмущении атомов возникает вероятность перехода их
в возбужденные состояния. Другими словами, одна часть атомов перейдет
в возбужденные состояния, а другая останется в прежнем состоянии, причем
свойства последних не изменятся. Вероятность ионизации или возбуждения
атомов зависит от длительности и интенсивности возмущения. Поэтому
медленные частицы вызывают больше переходов, чем быстрые, а многократно
заряженные — больше, чем однократно заряженные. Вместе с тем поле
быстрых частиц содержит более высокочастотные составляющие, чем поле
медленных, поэтому быстрые частицы могут вызывать переходы между
состояниями, сильно отличающимися по энергии. Наконец, масса летящей
частицы не оказывает влияния на рассматриваемые эффекты.

Остановимся на некоторых частных случаях. Во-первых, если частица
двигается со скоростью, близкой к скорости света, то ее поле сжато с боков
и поэтому действует более резко и интенсивно. При расчете вероятностей
переходов это нужно учитывать. Во-вторых, так как движущийся электрон
и электрон в атоме тождественны, следует учитывать возможность обмена,
что также влияет на величину вероятностей переходов.

Теория, основанная на этих представлениях, была развита Ферми,
Гаунтом и наиболее полно Блохом в 1933 г. Эти авторы пришли к тем же
результатам, что и Бете. Действие частицы на атомы, находящиеся на неко-
тором расстоянии от ее траектории, легче рассчитывать по методу Блоха,
а для оценки энергии выбитых электронов более удобен метод Бете. Оба
метода в принципе совершенно эквивалентны. Непосредственно теория дает
величину потери энергии на единицу пути. Если Е — энергия летящей части-
цы, движущейся со скоростью о в направлении оси х, то для тяжелых частиц

аЕ
(1х

4ле4х2Л^
гт2

(В),

(10.1)

где

—1п(1-₽2)-₽2] .

Здесь

е — заряд электрона;

г — число элементарных зарядов быстрой частицы;

— число атомов в 1 см3 вещества;

т — масса электрона в граммах;

Р = о/с, где с — скорость света;

I о— средний потенциал ионизации или возбуждения атома, определяе-
мый экспериментально;

7 — число электронов в атоме.

Теперь наши качественные соображения можно обосновать количест-
венно. Действительно, член е4а2 в уравнении (10.1), очевидно, соответ-
ствует взаимодействию между зарядом и полем (это становится еще яснее,
если записать его в виде (ге-е)2, т. е. в виде квадрата произведения заряда
летящей частицы на заряд электрона в атоме). Зависимость от скорости
определяется в основном первым множителем, в который входит 17о2, так
как во втором множителе скорость входит в медленно изменяющуюся функ-
цию 1п 2то2. В формуле фигурирует только масса электрона, которая вхо-
дит в него как масса возбуждаемой в атоме частицы. Масса летящей частицы
не входит в формулу. Потеря энергии зависит от К, числа атомов в единице
объема на пути частицы, и от числа электронов в атоме, 2. Боковое сжатие
электрического поля при больших скоростях учитывается с помощью членов,,
зависящих от 0 — отношения скорости частицы к скорости света.

Единственный член в уравнении (10.1), значение которого нельзя
получить теоретически, это /0— «средний потенциал ионизации». Хотя
в принципе /0 можно рассчитать с помощью статистической теории элек-
тронных оболочек, т. е. используя волновые функции, практически такой
расчет слишком труден. Но экспериментально определить 10 довольно легко.
Эта величина очень мало зависит от V для любого элемента, и поэтому для ее
определения достаточно измерить дЕ/дх при прохождении частиц, имею-
щих определенную скорость, через вещество известного состава. Так как
скорость частиц можно измерить независимо одним или двумя методами,
определение /0 не связано с трудностями. Некоторые значения /0 приведены
ниже:

Элемент	эв

Н	16,0

С	64,0

Ы	81,0

О	99,0

Р	165,0

В связи с уравнением (10.1) возникает очень важный вопрос о харак-
тере распределения энергии, идущей на ионизацию.

Растрачивается ли она преимущественно на большое число малых
возбуждений и лишь в небольшой степени на выбивание электронов, или
этот процесс носит другой характер? Ответ был дан в 1915 г. Бором, который
получил следующее выражение для распределения энергии:

. / 1 1 \ , ,,п о.

ап~ то* (1Г/ УГг)аХ’	(Ю.2)

где дп — число теряемых частицей порций энергии, заключенных между
и В дифференциальном виде имеем

, X ап ~\	а№	п

=	----ТГ2--	<10-3)

Для любого процесса, связанного с передачей энергии, скорость потери
энергии частицей равна № д(дп/ дх). Поэтому полная убыль энергии равна

макс

(•	2ле422Ж а\Р

IV

мин

где №макс и 1Етиа— максимальная и минимальная величины теряемой энер-
гии. Хотя это выражение кажется простым, с определением 1ЕМИ,Т связаны
некоторые трудности. Определить 1Емакс несложно, так как это есть макси-
мальная энергия, отдаваемая при прямом соударении; она определяется
из условия сохранения количества движения, что приводит к выражению
И7макс = (4т/М)Е, где М — масса летящей частицы, а Е — ее энергия.
В нерелятивнстском случае Е=^Мо2 и, следовательно, 1Емакс= 2 то2.
Значение же 1УМИН зависит от характера переходов в атоме. Если же обозна-
чить через 1т произвольно выбранное значение для минимальной переда-
ваемой энергии, то получим следующее выражение для потери энергии:
2тпг2

АЕ	2ле4г2/У7 Г ЩГ

д.х	то2	3 11/ ’

1т

ИЛИ

аЕ	2п&2М2	Л 2тУ2 \

ах ~ то2	\ 1т ) '

Последняя формула очень напоминает уравнение (10.1). Однако /т, наи-
меньшая величина отдаваемой энергии, не равна 1й, т. е. средней энергии
возбуждения электрона. Если предположить, что Iо есть среднее геометри-
ческое между максимальным (2 то2) и минимальным (1т) значениями отда-
ваемой энергии, то

(7о)2 = /т-2/тщ2,

или

I - <7о)2
т 2тУ2 '

Таким образом,

аЕ 2ле4е^2. / 2тУ2 \2	4ле4?2Л,2 , 2ту2

=---------2--- 1° ( -7--- )	=---------2--1П ---Г-- >

ах	то2 \	/0	у	гад2	10

что в точности совпадает с формулой (10.1), приведенной ранее для нереля-
тивистского случая.

Эти выражения служат основой для понимания действия излучения
на ферменты, нуклеиновые кислоты и гормоны. В качестве примера рас-
смотрим белок в твердом состоянии, имеющий молекулярный состав С4Н8МО2.
Его плотность можно считать равной 1,3 и для него легко определить М —
число атомов различного типа на единицу объема. Для оценки потерь энер-
гии мы используем закон аддитивности Брэгга, согласно которому атом
каждого типа обусловливает определенную степень энергетических потерь
независимо от существования химических связей между атомами. Вводя
обозначения Ас, и 1с Для углеродных атомов, ЛД, 2Н и /д Для водорода
и т. д., получаем следующее выражение для частицы, несущей один заряд
(2=1):

аЕ 4ле4 Л Л, „ . 2тъ2 , „,	, 2ту2 ,

17 = -	С ^с2с 1П -ТЕ- +	1П +

+ ЛД2д 1п-1^ + 7Уо2о 1п .

Вычисления, связанные с этими формулами, несложны, хотя и громоздки.
В качестве примера некоторые результаты расчетов приведены в табл. 23.

При рассмотрении этой таблицы сразу же видно, что вероятность изме-
нений в молекуле в результате прохождения через нее быстрой заряженной
частицы очень велика. Действительно, а-частица с энергией в 4 Мэв, про-
ходя через молекулу белка толщиной в 30 А, отдает ей 390 эв энергии.
Так как энергия нормальной химической связи равна 3 эв, полученная моле-
кулой энергия достаточна для разрыва, по крайней мере временного, 100 свя-
зей. Это почти наверняка должно привести к изменению молекулы белка.
Сопоставляя этот факт с соображениями, развитыми в гл. III, в которой
подчеркивалось важное значение очень небольшого числа некоторых моле-
кул в клетке, мы видим, что эффект, вызываемый повреждением отдельных
участков клетки (возможно, следует говорить даже об одном участке) под
действием ионизирующего излучения, может быть очень большим. Как
станет ясно из дальнейшего, эта тема заслуживает тщательного изучения.

Таблица 23

Энергия	Тип частицы	Потеря энергии на 100 А белка, эв
10 Мэв	а-Частица	662
	Дейтрон	93
	Протон	57
	Электрон	2,9
4 Мэв	а-Частица .	.	1300
	Дейтрон	....	194
	Протон ...	117
	Электрон	....	2,6
1 Мэв	а-Частица	2520
	Дейтрон 		540
	Протон 		320
	Электрон	2,5

Хотя данные табл. 23 очень полезны, остается неясным, каким образом
происходит выделение энергии. Как показали еще эксперименты Вильсона
с камерой, наполненной пересыщенным паром, частица теряет энергию
путем дискретных переходов и большими порциями, что согласуется с пред-
сказаниями атомной теории. Вильсону принадлежит также следующий
опыт. Производя расширение через некоторый промежуток времени после
прохождения быстрой частицы через камеру, он давал тем самым возмож-
ность образовавшимся ионам диффундировать и расходиться в простран-
стве. В результате были получены картины, на которых видны следы инди-
видуальных ионов, образующихся в отдельных актах выделения энергии.
Вильсон установил, таким образом, что они образуются сгустками, причем,
хотя число ионов в сгустке может быть различным, среднее число пар ионов
в сгустке равно трем. Его результаты, а также результаты более современной
работы Беекмана были проанализированы Хатчинсоном (см. [9]), который
приводит следующие значения относительной частоты различных чисел
пар ионов:

Число пар ионов Частота таких собы-

в сгустке	тий, %

1	50

2	*	25

3	10

4	5

5 и больше	10

Как следует из этих данных, процессы, при которых теряются малые пор-
ции энергии, происходят чаще, что согласуется с уравнением (10.2). Из ряда
опытов с камерой Вильсона можно определить среднюю энергию, расхо-
дуемую на образование одного сгустка ионов. Мы примем для нее значение
НО эв.
На фиг. 164 изображена зависимость числа актов передачи энергии,
величина которой заключена в пределах V/ и 117+ ШГ, от величины №. Мак-
симальное значение передаваемой энергии, определяемое из условия сохра-
нения количества движения, равно 2то2 для тяжелой частицы и то2 для
электрона. Нижний предел как для ионизации, так и для возбуждения зави-
сит от свойств электронных уровней атома.

Фиг. 164. Зависимость числа актов передачи энер-
гии от величины энергии.

Обратимся теперь к фиг. 165, на которой схематически изображена пере-
дача энергии быстрой заряженной частицей. Области первичной ионизации
обозначены буквой а. Наибольшая энергия теряется частицей в области

Фиг. 165. Схема, иллюстрирующая передачу энергии
на траектории тяжелой частицы.

Объяснение см. в тексте.

«(6); при этом выбивается вторичный электрон, имеющий довольно большую
энергию. Эти электроны называются 6-излучением (см. также разд. 10).
Первичное возбуждение отмечено индексом Ъ. Акты передачи энергии беспо-
рядочно распределены по траектории частицы.

Масштаб фиг. 165 зависит от расстояния, которое проходит частица
между актами передачи, т. е. от ее заряда и скорости. Так, для а-частицы
с энергией 4 Мэв расстояние АВ соответствует 31 А, что равно приблизи-
тельно толщине молекулы белка.

Приведенная картина не совсем согласуется с высказанным выше утвер-
ждением о том, что энергия, передаваемая молекуле а-частицей, «достаточна
для разрыва 100 связей». Действительно, энергия выделяется лишь в неко-
торых точках и большими порциями, что сильно влияет на характер проис-
ходящих при этом явлений.
Другой важной величиной является средняя энергия, теряемая на одну
ионизацию (производимую первичным или выбитым вторичным электроном).
Ее можно определить, измеряя число ионов, образующихся в определенном
объеме газа, если известна энергия, затрачиваемая на их образование. Для
воздуха эта величина составляет 32,5 эв на ионизацию.

3.	Единица дозы излучения — рентген. В радиологии и радиобиоло-
гии дозы рентгеновского и у-излучения измеряются обычно в рентгенах
(г). Рентген — это такое количество рентгеновского или у-излучения, при
котором сопряженная с ним корпускулярная эмиссия (т. е. электроны) созда-
ет в 1 см3 воздуха (точнее, в 0,001293 г воздуха) ионы, несущие по одной
электростатической единице заряда обоих знаков. При этом предполагается,
что переходные эффекты на границе рассматриваемого объема отсутствуют.
Следовательно, 1 см3 воздуха мы должны считать как бы окруженным очень
плотной воздушной средой.

При переходе фотона высокой энергии через границу двух сред ско-
рость потери энергии вблизи этой границы изменяется и соответственно изме-
няется число местных ионизаций («переходный эффект»). Характер изме-
нения зависит от типа и энергии вторичных частиц, а также от начальной
энергии фотона. Можно ввести поправку, учитывающую это изменение,
и таким образом получить возможность проводить абсолютные измерения
дозы ионизирующего излучения в ограниченных объемах.

Существуют единицы дозы, приблизительно эквивалентные рентгену.
Так, доза любого ионизирующего излучения, при которой в 1 г воды погло-
щается столько же энергии (примерно 93 эрг}, что и при действии 1 г рент-
геновских лучей, называется физическим эквивалентом рентгена (гер). При
поглощении 100 эрг на 1 г ткани доза равна 1 гай. Полезно знать, что при
дозе 1 гер на 1 см3 белка приходится 6,13-1011 первичных ионизаций, на
1 см3 нуклеиновой кислоты — 7,54-1011 первичных ионизаций.

4.	Ионизация, производимая рентгеновскими лучами, у-лучами и нейт-
ронами. Поглощение рентгеновских и у-лучей происходит в основном за счет
фотоэффекта и комптон-эффекта. Первый заключается в полном поглоще-
нии фотона рентгеновского или у-излучения с испусканием быстрого элект-
рона, во втором случае фотон теряет только часть своей энергии. Оба про-
цесса и, конечно, процесс передачи энергии нейтронами являются вероят-
ностными. Для любого вероятностного процесса передачи энергии выпол
няется соотношение, выведенное в разд. 7 гл. IX для поглощения света:

(10.4)

где /0 и / — значения интенсивности до и после прохождения излучения
через слой толщины х, — число поглощающих .частиц (атомов, элект-
ронов, ядер), 5 —сечение поглощения.

При фотоэффекте энергия фотона затрачивается на ионизацию атома,
для чего требуется энергия №, и на сообщение выбиваемому электрону (ско-
рость которого V) кинетической энергии :

Их =	то2 + И7,

где № — энергия ионизации атома. Сечение этого процесса равно (в см2)
5ф=(2,04- КГ30) Ц- (1 +0,0087),
Треп фотоэлектрона

© Фотоэлектроны

V Электроны отдачи

1Ьсм

Б

1мм

А

Фиг. 166. Ионизация в случае фо-
тоэффекта (Л) и комптоновской отда-
чи (Б).

Объяснение см. в тексте.

где 2 — заряд ядра атома, а Е — энергия фотона в Мэв. Таким образом,
вероятность фотоэффекта тем больше, чем ниже энергия фотона Е и чем
больше заряд ядра 2. Существенная особенность фотоэффекта состоит в том,
что энергия выбиваемых электронов одинакова.

При комптон-эффекте фотон взаимодействует с электроном таким обра-
зом, что электрон можно считать свободным. При этом фотон рассеивается,
т. е. поглощения его не происходит. Однако в результате этого столкновения
часть энергии фотона передается электрону, который может быть выбит
из атома. Фотон, претерпевший столкновение комптоновского типа, в конце
концов обычно поглощается за счет фотоэффекта. На фиг. 166 схематически
изображены два случая ионизации.
На фиг. 166, А картина соответствует
ионизации в веществе, плотность ко-
торого немного больше плотности во-
ды, производимой рентгеновскими
лучами с энергией фотона 100 кэв при
дозе 4- тгаб. На схеме изображены
беспорядочно расположенные треки
фотоэлектронов; изображение отдель-
ного трека помещено наверху. Хотя
часть фотонов претерпевает также
комптоновскую отдачу, их число в
данном случае настолько мало, что
соответствующие эффекты на схеме
не отражены. На фиг. 166, Б (здесь
масштаб в 100 раз меньше, так как
эта область значительно больше по
размерам, чем первая) изображена
картина, соответствующая ионизации,

производимой у-излучением с энергией фотона 1 Мэв при дозе 10'7 гад.
Отдача энергии осуществляется здесь преимущественно путем комптон-
эффекта, хотя в конечном счете рассеянные фотоны поглощаются за счет
фотоэффекта. Поэтому картина представляет собой смесь довольно длин-
ных треков и почти такого же числа коротких треков, аналогичных тем,
которые обусловлены фотоэффектом; последние, однако, выглядят здесь
совершенно иначе, чем на фиг. 166, А, так как масштаб сильно изменен.

Сечение комптон-эффекта довольно слабо зависит от энергии фотона
и прямо пропорционально числу электронов в атоме. Излучения с энергией
более 0,3 Мэв поглощаются в биологических объектах в основном за счет
комптон-эффекта.

В случае у-излучения очень высокой энергии (большей 1 Мэв) погло-
щение происходит также за счет еще одного явления, до некоторой степени
аналогичного фотоэффекту. Мы имеем в виду образование пар электрон —
позитрон. Однако при облучении биологических объектов этот эффект мал,
поскольку в этом случае обычно мало значение 2.

Поглощение нейтронов обусловлено исключительно их взаимодействием
с ядрами. Так как размеры ядер малы, поглощение нейтрона является
маловероятным событием. Существует различие между действием медленных
и быстрых нейтронов. Рассматривая два крайних случая (что не совсем
оправдано при облучении биологических систем), можно сказать, что энер-
гия медленных нейтронов равна энергии теплового движения, а энергия
быстрых превосходит 500 кэв. Превращения, вызываемые медленными ней-
тронами в биологических объектах, относятся преимущественно к двум
основным реакциям (вторая реакция была открыта Ли):

1)	7№4+п—>6С14-|-1Н1-|-0,6 Мэв
и

2)	п-НН1—>1О24-2Мэв.

Первая реакция происходит чаще, причем большая часть освобождающейся
в ней энергии передается благодаря обмену импульсами возникающему
ядру водорода. Таким образом, действие медленных нейтронов заключается
более чем на 90% в выбивании протонов с энергией 600 кэв. Остальная
часть энергии излучается в виде фотонов с энергией 2 Мэв согласно второй
реакции. Итак, медленные нейтроны специфичны в том отношении, что вызы-
ваемая ими ионизация происходит в основном в результате действия мед-
ленных частиц большой массы, для которых,скорость потери энергии соот-
ветствует 5 первичным ионизациям на 100 А.

Быстрые нейтроны вызывают более разнообразные процессы. Они
передают свою энергию главным образом ядрам водорода за счет обмена
импульсами, в результате чего образуются быстрые протоны. Кроме того,
они теряют часть своей энергии при неупругих столкновениях, ведущих
к испусканию фотонов большой энергии, и в конечном счете вступают в ядер-
ные реакции. Мы видим, что картина довольно сложна. Однако можно
утверждать, что основной эффект, производимый быстрыми нейтронами, —
это возникновение быстрых протонов отдачи.

Сечения реакций с медленными нейтронами равны: 1,76- 1СГ24 сж2
для реакции ГЛ4 (п, р)С14 и 3,13- 1СГ25 сж2 для реакции Н1 (п, у)В2. Приве-
денные данные получены для нейтронов, летящих со скоростью 2,2-10® см/сек
(скорость определялась по реакции захвата водородом). В каждом из этих
случаев сечение обратно пропорционально скорости нейтронов.

Сечения для быстрых нейтронов при процессах передачи энергии водо-
роду за счет упругих столкновений равны: 1,5-10-23 см2 для нейтронов
с энергией 200 кэв и 5-10“24 см2 для нейтронов с энергией 1 Мэв.

5. Дозиметрия. После ознакомления с изложенными выше сведениями
о характере действия быстрых заряженных частиц, электромагнитного
излучения и нейтронов возникает вопрос, как определять характер действия
любого ионизирующего излучения и как оценивать его действие количест-
венно.

Область измерительной техники, к которой относятся эти вопросы, назы-
вается дозиметрией. Методы точной дозиметрии довольно сложны, и, хотя
они хорошо разработаны, применение их требует определенной квалифи-
кации. На эту тему существуют обширные руководства, и каждый год
в каталогах появляются описания новых приборов. К счастью, во многих
случаях можно ограничиться приближенными методами измерений, что
очень важно для развития радиобиологии.

Обычный прием, применяемый в приближенной дозиметрии, заклю-
чается в выборе какого-либо эффекта, вызываемого облучением, который
легко оценить количественно и для которого наблюдается простая зависи-
мость от дозы (например, линейная). Определив раз навсегда зависимость
выбранного эффекта от дозы, можно затем судить об измеряемой величине по
результатам измерения этого эффекта. Приведем примеры величин, исполь-
зуемых для приближенной дозиметрии.

1.	Время облучения в определенном положении (в случае таких радио-
активных источников, как радий или кобальт).
2.	Время и ток при известном напряжении на рентгеновской трубке.
Предполагается, что облучаемый объект находится на определенном рас-
стоянии от мишени.

3.	Ионизация, производимая в ионизационной камере стандартного
типа, находящейся на определенном расстоянии от источника излучения
и облучаемой в течение определенного промежутка времени.

4.	Величина тока, обусловленного заряженными первичными части-
цами, например быстрыми электронами или дейтронами, в течение опре-
деленного промежутка времени.

5.	Количество ионов двухвалентного железа, окисленных в стандарт-
ном растворе в ионы трехвалентного железа.

6.	Количество вируса или фермента, инактивированного при данной
продолжительности облучения.

7.	Предельный ток через кристалл сульфида кадмия, подвергаемого
облучению.

8.	Число отсчетов в счетчике Гейгера, установленном на определенном
расстоянии от источника излучения.

9.	Число треков в фотографической эмульсии, обусловленных протона-
ми отдачи, выбитыми под действием нейтронов.

10.	Ток в ионизационной камере, наполненной В10Р3, при прохожде-
нии через нее потока медленных нейтронов.

Хотя это список далеко не исчерпывающий, он дает представление
о многообразии существующих методов. Очень распространен метод изме-
рений с помощью наперстковой ионизационной камеры и электрометра.
Этот очень удобный прибор представляет собой ионизационную камеру,
в которой находится изолированный стержень. Конец стержня находится
в воздушном пространстве камеры, покрытом специальной пластмассой;
одна из поверхностей его является проводящей. Изолированному стержню
тем или иным способом сообщают электрический заряд, скажем, при помощи
трения, и затем вводят его в зону облучения, где он в течение определенного
времени облучается.

Благодаря току ионизации стержень разряжается до величины
заряда, зависящей от количества образовавшихся ионов. Дозу облучения
можно определить по напряжению на электрометре, который обычно
калибруют прямо в рентгенах. Применяя для калибровки стандарт-
ные источники излучения, можно добиться точности около 2%. Для биоло-
гических целей в большинстве случаев этого достаточно.

Зная характер физических и химических процессов, происходящих
под действием излучения, можно численно определить величину поглощен-
ной энергии, что особенно важно, когда количественно оценивается биоло-
гическое действие излучения.

Рассмотрим простейший случай — воздействие быстрыми электронами,
когда дозу можно определить физически по току, переносимому электро-
нами, времени и облучаемой площади. Зная скорость электронов, атомный
состав и плотность облучаемого материала и применяя формулу для потерь
энергии (10.1), а также закон аддитивности Брэгга, можно вычислить потерю
энергии на 1 см\ поскольку площадь также известна, то таким образом
можно определить и величину энергии, теряемой в единице объема, т. е.
основную величину, требуемую при любом количественном анализе биоло-
гического действия излучения. Например, если нас интересует число пер-
вичных ионизаций на единицу объема (которое в дальнейшем мы будем
обозначать через /), то его можно определить, деля величину потерь энеогии.
в 1 см? (в электронвольтах) на 110 эв.
Измерение дозы у-лучей, рентгеновских лучей и нейтронов предста-
вляет собой значительно более сложную задачу. Во многих случаях она
настолько сложна, что точное исследование действия облучения становится
трудным и даже невозможным. Действительно, для определения дозы, необ-
ходимо знать величину поглощенной энергии фотонов или нейтронов и харак-
тер ее распределения, т. е. число возникающих при облучении фотоэлектро-
нов и электронов отдачи и их распределение по энергиям, число актов пере-
дачи энергии нейтронов ядрам водорода для различных значений переда-
ваемой им энергии, число возникающих у-фотонов и их дальнейшую судьбу
и т. д. Согласно оценке, произведенной для у-лучей, в 1 г «ткани» при дозе
в 1 г выделяется 93 эрг. Под тканью в данном случае подразумевается мате-
риал с плотностью, равной единице, атомный состав которого соответствует
среднему атомному составу биологических тканей. Но даже после получе-
ния всех этих данных многое еще остается неопределенным. Так, мягкие
рентгеновские лучи вызывают появление сильно ионизирующих медленных
электронов. При этом нет оснований считать, что потери энергии распреде-
лены равномерно, и поэтому необходимо изучить распределение актов
передачи энергии вдоль треков этих электронов. Ли [ 11 в своем очень важ-
ном труде рассмотрел и протабулировал различные случаи потери энергии
и распределения ионизаций. Читатель, желающий углубить свои знания
по этим вопросам, может ознакомиться с этой книгой, а также с другими
работами, ссылки на которые приведены в конце этой главы.

После этих несколько пессимистических замечаний отметим, что в на-
стоящее время гораздо легче выбрать источник излучения нужного типа,
чем это было 20 лет назад, причем сейчас эти источники намного дешевле.
Так, сейчас легко осуществить облучение быстрыми электронами или тяже-
лыми быстрыми заряженными частицами, при котором многие из упомяну-
тых выше трудностей не возникают. Общедоступными стали источники
с Со60, испускающие у-лучи с энергией 1,1 Мэв. Эти лучи вызывают эффекты;
обусловленные в основном быстрыми электронами, что позволяет провести
довольно точный анализ. Таким образом, в настоящее время можно произ-
водить относительно точно контролируемое облучение с помощью удобных
источников и анализировать результаты его действия. Связанные с этим
затраты не больше, чем в случае ультрацентрифугирования или электрон-
ной микроскопии.

6.	Действие ионизирующего излучения на молекулярные системы.
Действие ионизирующего излучения заключается прежде всего в ионизации.
На возбуждение атомов и молекул идет, по-видимому, лишь небольшая
часть энергии летящей частицы, так как эти процессы менее вероятны.
Это становится очевидным, если наблюдать (с помощью зеркал) свечение,
вызываемое лучом из циклотрона, проходящим в воздухе. В этом случае
пучок дейтронов с энергией 10 Мэв и интенсивностью 10 р.а теряет энергию
100 вт на расстоянии примерно 1 м. Интенсивность испускаемого при этом
света намного меньше интенсивности света лампы той же мощности, в кото-
рой используется светящийся разряд. Следовательно, в первом и довольно
хорошем приближении мы можем ограничиться рассмотрением ионизации,
с тем чтобы установить, к каким конечным молекулярным эффектам она
приводит.

В малых молекулах, например аминокислотах или спиртах, в резуль-
тате ионизации происходит разрыв связей; по-видимому, этот процесс
носит почти случайный характер. Измеряя выход образующихся осколков
молекул, можно определить число осколков каждого типа на 100 эв погло-
щенной энергии (число О в радиационной химии). Оно обычно близко к еди-
нице, хотя встречаются и другие значения, лежащие в пределах
ют 0,1 до 4. В некоторых экспериментах наблюдаются цепные реакции, при
которых получаются большие величины С, но для биологических молекул
это не характерно, так как они, по-видимому, не относятся к системам,
в которых возможны цепные реакции. Образующиеся в первый момент
осколки обычно обладают высокой реакционной способностью. В гомоген-
ных экспериментальных системах они могут вступать в реакции друг с дру-
гом. Но в биологических тканях более вероятно их взаимодействие с дру-
гими молекулами клетки.

Очень важной малой молекулой является молекула воды. Действию
ионизирующего излучения на воду посвящено много работ. Фрике в 1927 г.
открыл, что облученная вода химически активна, и предположил, что
вода под действием излучения становится «активированной». Этот термин
и до сих пор не потерял смысла. В настоящее время считают, что в резуль-
тате облучения в воде появляются свободные радикалы — вторичные про-
дукты, образующиеся после первых актов ионизации по следующей схеме:

Н2ОН2О+Ц-е— (первый процесс ионизации).

Затем идут следующие реакции:

Н2О+—>ОН+Н+

е“"-]-Н2О—-> ОН-Ц-Н.

Появляющиеся ионы ориентируют полярные молекулы воды и становятся
благодаря этому сольватированными. В этом состоянии они представляют
собой нормальные ионы Н* и ОН", причем их концентрация настолько мала,
что они не играют никакой роли. Большее значение имеют радикалы Н и ОН.
В конечном счете они либо рекомбинируют с полупериодом 2-1СГ6 сек
(в обычной воде), либо соединяются друг с другом, образуя Н2 или Н2О2.
Если в растворе присутствует кислород, то возможно также образование
НО2 (полупериод жизни 0,1 сек).

Точное определение концентраций этих химических агентов предста-
вляет значительные трудности. Концентрация свободных радикалов Н и ОН
в местах первичной ионизации в чистой воде равна примерно 10“5 М, а кон-
центрация молекул Н2О2, возникающих под действием электронов с энер-
гией ’1 Мэв (по данным Эберта и Боага),— примерно 1,5-109 М. Все про-
дукты, образующиеся при действии излучения на малые молекулы, могут
удаляться посредством диффузии, и поскольку клетки представляют собой
большей частью системы очень малых размеров, диффузия в данном случае
имеет, вероятно, очень важное значение.

Перейдем теперь к рассмотрению больших молекул, играющих осо-
бенно важную роль в живых системах. Здесь мы сталкиваемся с совершенно
иным положением вещей. В больших молекулах с молекулярным весом
более 100 000 имеется около 10 000 химических связей. Такие структуры
больше напоминают малые кристаллы, чем малые молекулы. Поэтому здесь
ионизация не приводит обязательно к разрыву связей и распаду молекулы.
Но, как показывают исследования, описанные в следующем разделе, при
поглощении энергии более 100 эв молекула утрачивает свою биологическую
функцию. Посмотрим, каким образом это может произойти.

В полипептидной цепи (фиг. 167) атомы связаны ковалентными свя-
зями, обусловленными обменом электронов между двумя соседними ато-
мами. Предположим, что в результате ионизации атом углерода, отмеченный
на фиг. 167 звездочкой, теряет электрон, который обусловливал связь
этого атома с соседним. В малой молекуле такое событие привело бы к рас-
паду молекулы. Но в большой молекуле благодаря целостности ее структуры
атом, потерявший электрон, останется на своем месте (по крайней мере
в течение какой-то доли секунды). Рассматриваемый атом углерода несет
теперь положительный заряд, как показано на фигуре. Поэтому электрон
соседнего атома стремится перейти к этому атому углерода. Такому движе-

нию электрона соответствует движение положительного заряда в противо-
положном направлении, например к атому азота. Затем положительный

заряд может мигрировать дальше, к следующему атому углерода или в боко-
вую цепь. Каждый из этих процессов занимает время, требуемое для одного
электронного перехода, т. е. примерно 10“15 сек. Благодаря этой мигра-

Ф и г. 167. Схематическое
изображение пол и пептидной
цепи, в одной из точек кото-

рой произведена ионизация.

ции зарядов положительный заряд может
прийти к любому доступному месту в цепи
в течение 10“12 сек. Такая миграция положи-
тельного заряда приводит к разрыву одной
или нескольких слабых связей, в результате
которого может измениться конфигурация
молекулы. Многочисленные эксперименталь-
ные данные говорят о том, что, кроме опи-

санного, существует еще несколько путей
образования молекул с «неправильными»

связями. Важно лишь одно — что для миграции энергии возбуждения
такого типа вдоль цепей с ковалентными связями существуют самые бла-
гоприятные условия, тогда как передача этой энергии за пределы моле-

кулы маловероятна.

Предположение о том, что малые области молекулы могут служить
ловушками для энергии в соответствии с описанным выше механизмом,
было высказано Дессауэром [14] в 1923 г. Его терминология отличалась
от использованной нами; например, он применял термин «точечный нагрев».
Тем не менее не вызывает сомнений, что он исходил из тех же самых пред-
ставлений о благоприятных условиях для миграции энергии, существую-
щих внутри большой молекулы, и его статью можно рассматривать как
первый важный шаг в этом направлении.

Какова судьба выбитого электрона? Он быстро теряет свою энергию
и может, конечно, также вызывать ионизацию. Если такой электрон захва-
тывается атомом, он может играть такую же роль в отношении разрыва
связей, что и положительно заряженный атом, причем этот процесс также
связан с миграцией энергии. В течение очень короткого времени, порядка
10-12 сек, оба заряда рекомбинируют, вызывая сильное местное возбуждение.
Затем эта энергия переходит из одной формы в другую, пока не превратится
в тепловую энергию колебаний, которая уже может переходить от одной
молекулы к другой. Следовательно, на этом «пленение» энергии возбуждения
одной молекулой кончается.

Отложим на некоторое время рассмотрение вопроса о том, каким обра-
зом разрушается структура молекулы, и рассмотрим теперь некоторые экспе-
риментальные результаты, относящиеся к действию излучения на большие
молекулы.

7.	Экспериментальные данные о воздействии ионизирующего излуче-
ния набольшие биологически важные молекулы. При облучении вирусов,
бактерий и ферментов рентгеновскими лучами, у-лучами, дейтронами и т. д.
обычно выполняется закон, согласно которому логарифм «выживаемости»
пропорционален «дозе». Чтобы смысл этого утверждения был ясен, опишем
простой эксперимент.
Предположим, что мы имеем дело с простым ферментом — инвертазой.
Раствор этого фермента наносят пипеткой на серию покровных стекол
и высушивают. Две такие пробы оставляют для контроля, а остальные

подвергают воздействию ионизирующего
излучения, например пучка дейтронов
из циклотрона. Эти пробы подвергают раз-
личным экспозициям, определяя при этом
дозы в числах дейтронов на 1 см2 сечения
луча. Если облучение производится рент-
геновскими лучами, то величины доз изме-
ряют в рентгенах. После облучения опре-
деляют активность фермента и находят
отношение активности после облучения
к активности до облучения, используя
контрольные пробы. Это отношение назы-
вается выживанием. Многочисленные эк-
сперименты показали, что если для и/гс0
использовать логарифмический масштаб,
то график зависимости выживания п/п0 от
дозы, приблизительные значения которой

Ф и г. 168. Инактивация фер-
мента инвертазы при облучении
дейтронами (поданным Пауэлла)

получают описанным выше

способом, имеет вид прямой. Подобная прямая для инвертазы показана
на фиг. 168. Из графика видно, что процесс удовлетворяет следующему

уравнению:

1п — = — (Постоянная)  (Доза).

Такая зависимость наблюдается при самых различных процессах

инактивации. Например, подобное же соотношение, как было показано

Ф и г. 169. Инактивация
бактериофага Т1 при
облучении электронами
с энергией 2 Мэв (по
данным Флюке).

Логарифмический закон для
инактивации выполняется
в очень большом интервале
изменений дозы.

в разд. 5 гл. III, выполняется при инактивации
вирусов, вызываемой нагреванием при постоянной
температуре, если варьировать время нагрева.
Эту закономерность легко объяснить, предполо-
жив, что в молекуле фермента существует какая-то
критическая точка, например одна из связей,
которая может претерпеть разрыв в результате
случайного процесса. Логарифм выживания про-
порционален дозе в том случае, если активность
фермента пропорциональна числу таких связей,
сохранившихся после облучения.

Приведем три примера характерных эффектов,
наблюдаемых при действии ионизирующего излу-
чения на биологические объекты. В качестве
первого примера можно рассмотреть действие
быстрых электронов на бактериофаг Т1 Е. со1л
(фиг. 169.) Линейное соотношение между лога
рифмом выживания и дозой выполняется в этом
случае при изменении активности более чем в

миллион раз.

Второй пример относится к действию излучения на Е. соИ. На фиг. 170
приведены кривые, описывающие различные эффекты, вызываемые дей-
ствием ионизирующего излучения на эти бактерии. Кривая I изображает
влияние рентгеновских лучей на способность облученных бактерий образо-
вывать колонии при помещении на питательную среду из агара. Бактерии
очень чувствительны к облучению и теряют способность к образованию
колоний очень быстро. Второй метод наблюдения за ростом бактерий,
основанный на определении оптической плотности их суспензии, позволяет
установить, что бактерии, потерявшие способность образовывать колонии,

тем не менее могут расти. Микроскопирование показывает, что бактерии

Фиг. 170. Влияние рентге-
новских лучей на некоторые
свойства клетки Е. соИ (по
данным Кеннеди и Кемпнера).
I'— способность образовывать ко-
лонии; II и III — потребление
фосфата и сульфата; IV — рост
бактерий (определяемый по изме-
нению оптической плотности);
V и VI — потребление сульфида
и метионина. Подробности см.
в тексте.

при этом не делятся, а образуют длинные
нити.. Потеря способности к делению в ре-
зультате облучения происходит не по про-
стому логарифмическому закону, а более
сложным образом. Обусловлено ли это несо-
ответствием измеряемых величин эффекту
или же вытекает из самой сущности происхо-
дящих биологических явлений, пока неясно.

В отношении процессов биохимического
обмена веществ установлено, что облучение
сильно влияет на способность включать ра-
диоактивный фосфат и в меньшей степени на
способность включать сульфат. Если радиоак-
тивная сера вводится в виде сульфида, чув-
ствительность к облучению значительно
меньше, чем при включении сульфата
На фиг. 170 изображена начальная часть
кривой, показывающей уменьшение способ-
ности включать меченую аминокислоту — ме-
тионин. Как видно из этой кривой, прекраще-
ние потребления аминокислоты вызывается
только очень большими дозами облучения.
Эти данные показывают, что действие облу-
чения на бактерию отличается' от действия
на одиночную молекулу, поскольку реакции
бактерии на облучение могут быть самыми раз-
нообразными в зависимости от условий иссле-
дования. Об этом никогда не нужно забы-
вать, оценивая действия излучения.

В качестве третьего типичного эффекта, вызываемого облучением, рас-
смотрим действие облучения на малые колонии бактерий. Малые дозы не
влияют на последующий рост этих колоний, которые развиваются так,

как если бы облучения не было, но, начиная с некоторой дозы, число коло-
ний неожиданно начинает уменьшаться. Это объясняется тем, что, если
не все бактерии в колонии инактивированы, колония может вырасти заново.
Поэтому действие облучения не проявляется до тех пор, пока в каждой
колонии существует хотя бы по одной жизнеспособной клетке.

Перейдем теперь к теоретическому анализу рассмотренных графиков,
описывающих различные реакции клетки на облучение.

8.	Теория мишени. Идея о критической точке, упоминавшаяся в пре-
дыдущем разделе, используется в так называемой теории мишени, пред-
ложенной впервые Дессауэром, Кроутером, Кондоном и Терриллом. В раз-
витии теории мишени принимали участие многие ученые, в том числе Ли
и позднее Циркл и Тобиас. Согласно этой теории, процесс инактивации
заключается в поражении «мишени», или чувствительной области, имеющей
объем V. Чцсло инактивирующих событий на единицу объема будем обозна-
чать через I. Хотя основы этой теории были изложены нами в разд. 12
гл. IX, мы вернемся к ним здесь еще раз, применяя терминологию, более
подходящую для рассмотрения действия ионизирующего излучения. В своей
простейшей форме теория мишени исходит из понятия о вероятности «абсо-
лютного непопадания» и из предположения, по которому для выживания
необходимо, чтобы в молекуле, входящей в мишень, не происходило иони-
зации.

Среднее число попаданий или «ударов», обусловленных актами иониза-
ции, равно произведению чувствительного объема на число инактивирую-
щих событий в единице объема, т. е. VI. Для нахождения вероятности опре-
деленного числа (и) попаданий в объем V можно применить формулу
Пуассона. Таким образом, если эту вероятность обозначить через Р(п), то

Р^= е~1УщУ)П--	•	(10-5)

При п= 0 ионизации в чувствительном объеме не происходит, т. е. имеет
место выживание. Для этого случая получаем (учитывая, что 0!= 1 и что
вероятность непопадания равна экспериментально определяемой вели-
чине М/ЛД):

М/М0 = е-1У

или

1пМ/М0=-/К	(10.6)

Как мы уже видели (см. фиг. 167), это соотношение подтверждается экспе-
риментально. Если выразить «дозу» через число инактивирующих событий
на единицу объема, то можно найти объем V.

Таким образом, если выполняется логарифмическое соотношение, то
из уравнения (10.6) можно определить параметры, имеющие определенный
биологический смысл.

В 1944 г. Ли, Смит, Холмс и Маркхэм применили уравнение (10.6) при
изучении инактивации рибонуклеазы и миозина под действием рентгенов-
ских лучей. Исходя из допущения, что инактивация происходит в резуль-
тате одной ионизации, хотя, как установил Вильсон, последние всегда
образуют группу из трех ионизаций, эти авторы определили значения V
для указанных белков. От чувствительного объема можно перейти к более
привычной величине — «молекулярному весу». Молекулярный вес равен
массе 6,03-1023 частиц. Если считать плотность рассматриваемых двух
белков равной 1,3, то молекулярный вес, соответствующий чувствительному
объему, равен

М = V-1,3-6,03-1023.

Для молекулярных весов рибонуклеазы и миозина были получены таким
путем значения 30 000 и 230 000. Это совпадает по порядку величины с истин-
ными молекулярными весами этих белков. К этому исследованию примыкает
работа, проведенная группой исследователей в Иэльском университете (Пол-
лард, Форро, Сетлоу, Пауэлл и Хатчинсон), из которой следует, что зна-
чения V для ферментов и антигенов, облученных в вакууме в сухом состоя-
нии, характеризуют размеры либо всей молекулы белка, либо ее субъеди-
ницы или полимера. Мы вернемся к этому в разд. 11, а теперь остановимся
на некоторых уточнениях теории мишеней.

Будем исходить из соображений, изложенных в этой главе и в разд. 12
гл. IX. Если для инактивации нужно не одно, а п попаданий (многоудар-
ный случай), то вероятность выживания определяется из выражения

Р(0) + Р(1) + Р(2)+ ...Р(п—1).

18 Заказ № 1168
Отсюда получаем для выживания

^=^Г1+/у + <ф1+<Щ.+ ...4

или в более сжатой форме

1У0 Д| М *

(/У)«-1 п

(п-1)!

(Ю.7)

Сумма в правой части уравнения (10.7) представляет собой разложение
в ряд функции е~1У, оборванное при конечном числе членов. Поскольку
множитель не оборван, при больших IV он доминирует, т. е. кривая
при больших IV удовлетворяет простому соотношению ^0= е~1У.

Мы рассмотрели случай одной малочувствительной мишени. Пред-
положим теперь, что имеются т мишеней. Пусть колония перестает расти
лишь в том случае, когда поражаются все мишени (так может обстоять дело
при инактивации дрожжей, бактерий или скоплений вирусных частиц,
а также при стерилизации облучением). Можно утверждать, что вероят-
ность попадания в мишень равна единице (сумме вероятностей всех собы-
тий) минус вероятность выживания, т. е.

п—1

Р (попадания) — 1 — е~1у 2	-

о

Если для инактивации нужно попасть в р мишеней, то вероятность ее
рпределяется следующим выражением:

71—1

Вероятность инактивации = 1 — е~1у У,

о

Если нас интересует выживание, которое часто легче измерять (но не всегда,
так как мутация не есть «выживание»), то вероятность того, что хотя бы
один облучаемый объект выживет, равна единице (вероятность всех собы-
тий) минус вероятность инактивации р. Таким образом,

(10.8)

о

Это выражение можно использовать при изучении действия излучения на
популяции. Для одноударного случая из него следует

^- = 1-(1-е-лу.	(10.9)

Всем этим соотношениям соответствуют аналогичные выражения для
инактивации под действием ультрафиолета. Как читатель может убедиться,
просматривая разд. 12 гл. IX, мы уже фактически выводили выраже-
ние (10.9).

9.	Влияние плотности ионизации. Прежде чем вернуться к рассмотре-
нию действия ионизирующего излучения на большие молекулы, остановимся
на опытах с применением излучений, характеризуемых различной плот-
ностью ионизации. Зависимость эффекта от плотности ионизации позволяет
определить второй важный характерный размер мишени, а именно ее тол-
щину. Наиболее прямой метод анализа таких явлений состоит, по мнению
авторов, в следующем.
Рассмотрим тяжелую ионизирующую частицу, за которой остается
плотная полоса ионизации (трек). В первом приближении будем считать
плотность ионизаций бесконечной. Треки распределены по площади слу-
чайным образом. Используя подход, аналогичный тому, который мы при-
меняли выше при рассмотрении действия беспорядочной бомбардировки,
мы будем приписывать чувствительной области площадь 5, которую по
аналогии с другими процессами, изучаемыми в атомной и ядерной физике,
называют сечением. Если теперь выражать дозу как среднее число частиц
на единицу площади В, то среднее число частиц, попадающих на данную
площадь, равно В5. Так же как и раньше, вероятность п попаданий, т. е.
Р(п), равна

' '	п!

Если для инактивации достаточно одного попадания в данную площадь,
то следует рассчитать вероятность того, что число попаданий равно нулю.
Эта вероятность равна Р(0)=е-8с. Отсюда выживание определяется из вы-
ражений

или 1п-т^-= — 80.
АТ

Следует отметить, что как V (объем области инактивации), так и 5 (пло-
щадь сечения) характеризуют теоретические модели. Чтобы установить,
имеют ли они какой-либо физичес-
кий смысл, нужно сравнить их ве-
личины с известными размерами
молекул.

Если плотность ионизаций,
создаваемых частицей, очень
велика и извне энергия переда-
ваться в молекулу не может,
то 5 представляет собой сечение
самой молекулы. Изменяя энергию
частицы, можно убедиться, что в
некоторых случаях сечение инак-
тивации с увеличением плотности
ионизации увеличивается, причем
эта зависимость становится все
слабее по мере увеличения послед-
ней. В качестве примера можно
привести кривую для инвертазы
(фиг. 171), из которой видно, что
сечение, возрастая с плотностью
ионизации, асимптотически приб-
лижается к некоторому предель-

ному значению. Это предельное значение соответствует геометрическому
сечению чувствительного объема молекулы. Отсюда видно, что избыток
энергии сверх необходимой для инактивации не приводит к возрастанию
эффекта. Нахождение предельного значения затруднено тем, что энергия
частиц в значительной степени идет на создание вторичных электронов
(6-излучения), имеющих большую длину пробега и также вызывающих
инактивацию. Кривая II на фиг. 171 проведена с учетом поправки на вто-
ричные электроны. Приближенный расчет этой поправки довольно прост
(см. разд. 10).

Ф и г. 171. Изменение сечения инакти-
вации инвертазы при уменьшении энергии
дейтронов в пучке (потери энергии дейтро-
нов в инвертазе при этом увеличиваются).
I — без поправки на вторичные [электроны;

II — с учетом поправки.
Теоретический анализ кривой I на фиг. 171 можно провести, пред-
полагая, что 5 определяется вероятностью прохождения частицы через
молекулу, не сопровождаемого ионизацией. Предположим, что среднее
число первичных ионизаций в слое толщины х равно рх, где р — среднее
число первичных ионизаций на единицу длины (таким образом, р характе-
ризует плотность ионизации). Вероятность Р(у), что число этих ионизаций
равно у, определяется выражением

Так же как и раньше, мы считаем, что молекула остается неповрежденной
только при том условии, что не происходит ни одной ионизации. В этом
случае имеем

р (0) =

Таким образом, вероятность того, что по крайней мере одна первичная иони-
зация имеет место, равна вероятности суммы всех событий (единица) минус
вероятность отсутствия ионизаций, т. е. 1—е~рх. Эффективность частицы
в этом случае пропорциональна множителю 1—е~рх, так что

5 = 50(1-е-ря),	(10.10)

где 5 о — «истинное» сечение при бесконечной плотности ионизации, а
5 — измеряемое сечение. Заметим, что из кривой зависимости 5 от р можно
определить х — важный дополнительный размер.

10.	Действие вторичных электронов (6-излучение). Если бы такие тяже-
лые частицы, как дейтроны, протоны и а-частицы, производили ионизацию
только вдоль своих треков, то облучение этими частицами явилось бы
самым эффективным методом изучения биологических систем, поскольку
эти частицы играли бы роль «линейных зондов», эффективность которых,
как было показано в предыдущем параграфе, можно было бы изменять.
К сожалению, ионизация вдоль трека —• это в лучшем случае только глав-
ный вид ионизации, производимой частицей. Значительная часть ее энер-
гии передается вторичным электронам с большой длиной пробега (так
называемое ^-излучение). Поскольку нет оснований считать, что вторичные
электроны не будут возникать при облучении систем беспорядочно ориенти-
рованных молекул, только в самом первом приближении можно не учи-
тывать ионизации такого рода. Метод рассмотрения эффектов, вызываемых
вторичными электронами, был разработан Ли [1]. Относительно длин про-
бега медленных электронов существуют некоторые расхождения; послед-
ние прямые измерения пробегов медленных электронов в белке, произве-
денные Дэвисом [15], дали следующие результаты:

Энергия электрона, эв  300  600  900  1200  1500  2000	Длина пробега, А  50  90  230  400  620  ИЗО

Судя по этим данным, величины поправок, данные Ли, должны быть
несколько уменьшены.

Величину поправки в первом приближении можно, определить с помо-
щью уравнений (10.1) и (10.3) следующим образом. Прежде всего на осно-
вании приведенных выше данных о величине пробега можно установить,
при каких энергиях треки будут выходить за пределы мишени. Пусть
мишенью является вирус, радиус которого равен 200 А. Если трек первичной
частицы проходит через центр вируса, то вторичные электроны с энергией
1000 эв могут уже производить ионизацию за пределами вируса. Для моле-
кул ферментов наименьшая энергия электрона, трек которого выходит за
пределы рассматриваемого объекта, будет намного меньше. Обозначим эту
энергию через Е. С помощью уравнения (10.3) вычислим энергию, ушедшую
на образование вторичных электронов, энергия которых больше Е и меньше
максимальной энергии 2 то2, определяемой из условий сохранения энергии
и импульса. Деля энергию, затраченную на образование вторичных электро-
нов, на среднюю энергию, приходящуюся на одну первичную ионизацию,
можно найти плотность первичных ионизаций, дающих вторичные элек-
троны с достаточно большой длиной пробега.

Так как вторичные электроны летят во все стороны и претерпевают
рассеяние, производимые ими акты ионизации беспорядочно распределены
по объему. Поэтому их инактивирующее действие также можно оценивать
с помощью представления о мишени, имеющей объем V. Этот эффект нужно
учесть наряду с инактивацией, обусловленной первичной ионизацией,
и внести соответствующую поправку в значение сечения инактивации.

Найдем с помощью уравнения (10.3) величину Еа — энергию, затра-
чиваемую быстрой частицей на 1 см пути на образование быстрых элек-
тронов:

2тъ2	2ту2

е4 = \	•

Э \. йх У	3 Ц7

Е	Е

2ле4г2Л'2 ,	2тг>2

-----9 1п —=—

на 1 см пути.

(10.11)

Если Ер есть потеря энергии на один сгусток ионов (ПО эв), то число сгуст-
ков на сантиметр, создаваемых одним дейтроном и дающих быстрые вто-
ричные электроны, равно Е<ЕЕР. Если на 1 см2 приходится О дейтронов,
число сгустков на единицу объема равно Ё)-Ел1Ер. Эта величина эквива-
лентна I в уравнении (10.6). Поэтому для выживания получаем уравнение

1п —- = — 8Е — У1 = -8О-УО-^- = —О(5+	

«о	ер	\ ер У

Если известна величина объема мишени У, то можно подсчитать, какая
часть наблюдаемой инактивации обусловлена первичной ионизацией
и какая — вторичными электронами.

Ценность таких расчетов заключается не столько в вычислении самой
поправки, сколько в том, что они позволяют выявить роль влияющих на нее
факторов. Для частицы, несущей два заряда, поправка будет в 4 раза больше,
чем для частицы с одним зарядом при равных значениях скоростей. С умень-
шением скорости частицы поправка растет, но строгой обратно пропорцио-
нальной зависимости не наблюдается, так как логарифмический член
несколько уменьшает этот эффект. Чем больше мишень, тем больше поправка
по абсолютной величине. Однако, поскольку предельное значение энергии Е
для большой мишени больше, поправка не столь существенна, если пло-
щадь 5 велика. Кривая II на фиг. 171 проведена с учетом поправки для
объема в 1,5-10”19 см3 и значения Е, равного 400 эв.

11.	Действие излучения на большие молекулы. С точки зрения моле-
кулярной биофизики очень важно понять истинную природу действия иони-
зирующего излучения на большие биологические молекулы. Многочислен-
ные исследования, посвященные действию излучения на ферменты, анти-
гены, нуклеиновые кислоты и вирусы (см. разд. 7), позволили набросать
предварительную схему, объясняющую наблюдаемые явления. Так же как
в гл. IX, мы сначала перечислим некоторые достоверные, как нам кажется,
результаты, а затем попытаемся объяснить их с помощью этой схемы.

1.	Для инактивации объема, близкого к объему молекулы, требуется
от одной до четырех ионизаций.

2.	При уменьшении температуры чувствительный объем может умень-
шиться примерно вдвое. Увеличивая температуру, можно увеличить этот
объем в 3 раза, причем это увеличение происходит особенно резко при тем-
пературе, соответствующей началу тепловой инактивации.

3.	Чувствительность молекулы, как правило, уменьшается (но может
даже и увеличиваться) при адсорбции ионов и других молекул.

4.	Присутствие кислорода, даже если объект находится в сухом состоя-
нии, может увеличивать эффективность облучения.

5.	Облучение, не приводящее к инактивации молекулы, может тем
не менее вызывать в ней изменения, т. е. частично повреждать молекулу.

6.	Существуют убедительные данные, показывающие, что повреждения
в молекуле, обусловленные облучением, проявляются только при ее пере-
ходе в растворе.

В разд. 6 мы говорили о том, что положительный заряд, образовав-
шийся в результате ионизации, может мигрировать, причем условия для
миграции особенно благоприятны при существовании в молекуле ковалент-
ных связей. Горди, Ард и Шилдс в своих важных исследованиях, произве-
денных методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), показали,
что облученный белок дает сигналы ЭПР, характерные для одной или двух
аминокислот и определенных связей. Например, таким путем можно уста-
новить наличие связи —СН2— 8*— 8 —СН2— как в облученном цистине,
так и в облученном белке. Горди указал, что связь такого типа с физической
точки зрения представляется весьма прочной. Химически она, однако,
может быть очень реактивной, в особенности в отношении воды и кислорода.
Действие ионизации с этой точки зрения объясняется следующим образом.
Структура макромолекулы, ионизированной облучением, такова, что мест-
ное изменение, вызванное ионизацией, может мигрировать, пока оно в конце
концов не окажется локализированным у одной из нескольких связей,
обладающих повышенной реакционной способностью (особенно по отноше-
нию к воде). В результате химической реакции, обусловленной существо-
ванием этого радиационного повреждения, в молекуле происходят изме-
нения, которые могут отразиться на ее биологических свойствах. Как
показывает эксперимент, в большинстве случаев химические изменения
связаны с изменением биологических свойств.

В белках механизм действия излучения скорее всего близок к описан-
ному выше. В отношении нуклеиновых кислот этого нельзя утверждать
столь категорически. По всей вероятности при действии излучения на моле-
кулу нуклеиновой кислоты происходит либо разрыв молекулярной цепи
(опять-таки в результате химического действия воды), либо возникает
поперечная связь с соседней молекулой нуклеиновой кислоты.

Как установлено в настоящее время, нуклеиновые кислоты (как ДНК,
так и РНК) сохраняют свои биологические свойства лишь при условии
целостности довольно больших участков молекул. Таким образом, повре-
ждение этих участков под действием ионизирующего излучения, хотя оно
и не затрагивает всей молекулы, может резко изменить ее свойства.
Данных о действии излучения на полисахариды почти нет, и в этой
области необходимо провести дальнейшие исследования.

12.	Молекулярные эффекты, вызываемые диффундирующими агентами.
Выше при рассмотрении действия облучения на молекулы мы учитывали
только факторы, определяющие действие облучения на вещество в сухом
состоянии. Нужно учитывать, однако, что некоторые продукты, образую-
щиеся при облучении воды, а также малых молекул и их соединений, диф-

Влияние этих

фундируют в пределах клетки.

Ф и г. 173.

биологические

молекул на

О

Схема, поясняющая

связь между

Активные агенты
Молекулы фермента

концентрацией фермента и действием коротко-
живущих активных агентов (время их жизни
мало потому, что они могут рекомбинировать
или соединяться с другими молекулами).

Только в случае С активные агенты действуют с пол-
ной эффективностью (см. фиг. 172).

Фиг. 172. Зависимость инакти-
вации фермента (в расчете на 1 г)
при облучении в разбавленном ра-
створе от концентрации фермента.
При концентрации, которой соответст-
вует точка А, расстояние между мо-
лекулами фермента настолько велико,
что вероятность их попадания в об-
.ласти с большой концентрацией ради-
калов мала. В точке В эта вероятность
довольно велика. Точка С соответствует
•такой большой концентрации фермента,
при которой все образовавшиеся ради-
калы могут прореагировать с молеку-
лами фермента.

эффекты, обусловленные излучением,
к сожалению, почти совершенно не изу-
чено. В этом разделе мы рассмотрим не-
которые данные о характере их дей-

ствия.

Инактивация ферментов в растворе. Инактивацию ферментов в рас-
творе под действием рентгеновских лучей наблюдали впервые много лет
назад Хасси, Томпсон и Нортроп. Дейл первым понял в 1940 г., что этот
процесс связан с миграцией определенных агентов. С тех пор благодаря
работам самого Дейла и ряда других исследователей была изучена инакти-
вация самых разнообразных ферментов. Хотя она подчиняется обычному
логарифмическому закону, получающийся по теории мишени «чувстви-
тельный объем» оказывается столь большим, что его нельзя считать ни
в коей мере связанным с размером молекулы. Один из методов анализа
процесса инактивации в этом случае состоит в определении степени инакти-
вации при определенной дозе в зависимости от концентрации фермента
(фиг. 172). Абсолютный выход инактивации растет как 1—е~х, пока не дости-
гается плато. На фиг. 173 схематически изображено расположение молекул
-фермента и активных агентов при различных концентрациях фермента.
Большие круги на этой схеме изображают сферы, в пределах которых нахо-
дятся активные агенты (вероятно, свободные радикалы) до тех пор, пока
они не исчезают, рекомбинируя друг с другом или соединяясь с какими-либо

посторонними молекулами.

Из опытов по инактивации монослоев каталазы и бычьего сывороточ-
ного альбумина (в этом случае геометрические условия позволяют довольно
просто рассчитать диффузию) Смит [16] получил для полупериода жизни
активных агентов в воде средней чистоты величины 2-10*® сек. Это значе-
ние согласуется с кривой зависимости выхода от концентрации, изобра-
женной на фиг. 172. Весьма вероятно, что истинное время жизни свободных
радикалов в очень чистой воде больше. Применяя интенсивный импульсный
источник электронов, Хатчинсон [17] получил для полупериода жизни
величину 1,6- 10-е сек. В клетке полупериод жизни радикала зависит от
вероятности его столкновений с находящимися в ней химически активными
молекулами и составляет по порядку величины КГ9 сек.

Можно также определить выход, соответствующий плато на фиг. 172,
и рассчитать число инактивируемых молекул фермента на каждые 33 эв
энергии излучения. Эти величины приведены в табл. 24, взятой из работы
Хатчинсона.

Таблица 24
Типичные величины выходов ионизации для ферментов в разбавленных
растворах

Фермент	Выход, число моле- кул на 33 зв	Источник данных
Инвертаза 		0,05	[18]
Каталаза		0,03	[19]
Цитохром с	'		0,10	[20]
Рибонуклеаза		0,48	[21]
Алкогольдегидрогеназа		0,93	[19]
Кофермент А		0,90	[21]

Инактивация нуклеиновых кислот в растворе. Влиянию ионизирую-
щего излучения на физические свойства нуклеиновых кислот, например
на вязкость, посвящен целый ряд работ.Поскольку в последнее время было
установлено, что трансформирующий фактор пневмококков представляет
собой чистую ДНК, оказалось возможным, облучая ДНК в растворе,
изучать действие излучения на процесс трансформации. Первые результаты
на этом пути были получены Эфрусси-Тэйлор и Латарже, которые произво-
дили облучение после введения в раствор экстракта дрожжей. Они пришли
к выводу, что трансформирующий фактор очень чувствителен к «непрямому
действию» излучения. Численное значение О (выход на 100 эв) в их статье
не приводится. Более поздние работы Гилда и Де Филиппа показали, что
при переходе к более чистым препаратам величина О возрастает до очень
высокого значения 0,6 (если предположить, что молекулярный вес инакти-
вируемой молекулы равен 106). Таким образом, можно сделать вывод,
что нуклеиновые кислоты очень чувствительны как к прямому, так и к непря-
мому действию излучения.

13.	Защита от диффундирующих агентов. Во многих случаях инакти-
вацию, вызываемую диффундирующими агентами, можно предотвратить
или, во всяком случае, ослабить. Если она обусловлена каким-либо опре-
деленным диффундирующим агентом, то можно использовать очень простые
средства «защиты». Так, действие перекиси водорода значительно ослаб-
ляется в присутствии каталазы. Реакции, вызываемые окисляющими
радикалами, могут быть заторможены с помощью цистеина, тиомочевины
или глутатиона. Вообще говоря, защитное действие может оказывать любой
инертный в биологическом смысле материал, если он химически реагирует
с диффундирующими агентами. Защитное действие бульона на препараты
вируса было установлено в 1941 г. Луриа, Экснером, Фридвалдом и Андер-
соном. Дейл установил, что некоторые агенты оказывают защитное дей-
ствие при облучении ферментов. Достаточных количественных данных,
позволяющих описать механизм защитного действия, в настоящее время
еще нет. По-видимому, в качестве грубого приближения можно считать,
что мерой защитного действия служит площадь органической молекулы,,
выполняющей роль защитного агента. Теоретическое рассмотрение этих
вопросов и- создание ценных числовых таблиц было начато Ли. В дальней-
шем большую роль сыграли работы Дейла.

Количественной оценке защитного действия были посвящены работы
Росса и Хатчинсона, а также Оженстина. На фиг. 174 представлены резуль-
таты облучения метиленового синего в дистиллированной воде при различ-
ных концентрациях тиомочевины. Добавление 10 цг мочевины на 1 мл.

Концентрация метиленового синего, рг/мл

Фиг. 174. Изменение степени инактивации
метиленового синего в дистиллированной воде
при введении различных количеств тиомо-
чевины (указаны на кривых).

Защитное действие тиомочевины ясно выражено.

раствора приводит к тому, что
доза, необходимая для полу-
чения данного эффекта, увели-
чивается примерно втрое.

Можно также получить
количественные данные, харак-
теризующие вероятность того,
что при столкновении диффун-
дирующего радикала с молеку-
лой растворенного вещества про-
изойдет реакция, в результате
которой радикал будет удален
из раствора. По вычислениям
Хатчинсона для метиленового
синего, кофермента А, тиомоче-
вины, сульфаниламида, инвер-
тазы и алкогольдегидрогеназы,
эта вероятность во всех случаях
имеет примерно одно и то же
значение, равное 0,5. Оженстин,
основываясь на высокой реак-
ционной способности радикалов,
оценил, какая часть молекул
фермента ответственна за его

функцию. Пусть, например, число инактивированных при облучении
молекул фермента равно 0,4 на каждые 100 эв. Число пар радикалов,
образующихся в воде от этой дозы, можно принять равным 6. Отсюда
след} ет, что для инактивации одной молекулы трипсина достаточно
15 радикалов, т. е. что только г/1Ъ часть молекулы трипсина существенна для
его ферментативной функции.

Важно отдавать себе отчет, что довольно неопределенный термин
«диффундирующие агенты» охватывает частицы, сильно отличающиеся
по своей природе. Даже если молекула белка или нуклеиновой кислоты
действительно может выдержать воздействие 20 (или около того) активных
радикалов, не потеряв своей активности, вполне вероятно, что при этом
образуются малые осколки молекул, существование которых еще не уста-
новлено. Эти осколки могут быть очень активными и для защиты от них
могут понадобиться специальные меры. Предстоит провести целый ряд
исследований, прежде чем будет понята природа всех биологически актив-
ных радикалов, возникающих при облучении. Пока эти вопросы не выяс-
нены, трудно предсказывать результат действия излучения на биологиче-
ские объекты.

Чувствительность клетки к облучению может быть изменена не только
в результате защиты от диффундирующих агентов. Опыты по облучению-
сухих ферментов и антигенов показывают, что физическое соединение двух
молекул (например, фермента и субстрата или фермента и ингибитора)
может изменять их чувствительность к облучению. Это может играть очень
существенную роль в изменении чувствительности клетки в разных фазах
ее жизнедеятельности. '

14.	Кислородный эффект. Установлено, что кислород, находящийся
в среде, может значительно усиливать действие облучения. Этот эффект
был открыт Тодеем и Ридом при изучении процесса разрыва хромосом
в У/с1а }аЬа и подтвержден Джайлсом и Рили, изучавшими разрывы хромо-
сом в ТгайезсапИа. О величине эффекта можно судить по тому, что при уда-
лении кислорода из среды чувствительность к облучению уменьшается
в 2—3 раза. Этот эффект наблюдается во многих простых системах (напри-
мер, при инактивации сухого трипсина), но в некоторых случаях, в част-
ности при действии рентгеновских лучей на разбавленные растворы фер-
ментов, он почти отсутствует. При большой плотности ионизации кисло-
родный эффект выражен значительно менее резко. Мы не ставим перед
собой цели объяснить здесь природу этого эффекта, но хотим лишь отметить,
что если процессы инактивации молекул белка действительно заключаются,
как мы предполагаем, в первичной ионизации, за которой следует хими-
ческое действие, то влияние находящихся в среде химических агентов на эти
процессы представляется вполне естественным. Окись азота, как устано-
вили Говард-Фландерс и Йокки, действует аналогично кислороду. Согласно
исследованиям Эберта, Хорнси и Говарда, кислородный эффект можно
уменьшить, вводя инертные газы, в частности ксенон, причем их влияние
пропорционально их растворимости в жирах. Возможно, это связано с тем,
что в кислородном эффекте каким-то образом участвуют биологические
мембраны. В чем бы ни заключалась причина кислородного эффекта, совер-
шенно очевидно, что при любом эксперименте по облучению следует учи-
тывать присутствие кислорода и характер его действия.

15.	Теоретический анализ действия излучения на клетку. Не претен-
дуя на то, что проводимый ниже анализ полностью объяснит механизм
действия ионизирующего излучения на клеточном уровне, мы попытаемся
количественно проанализировать инактивирующее действие дозы 1000 г
на бактериальную клетку. Сравнение результатов такого анализа с наблю-
даемым действием излучения покажет, насколько точны наши расчеты.

Предположим, что бактериальная клетка имеет следующий состав:
70% воды, 2,1-104 молекул ДНК, 4,2-104 молекул РНК, 4,7- Ю6 молекул
белка, 2,5-107 молекул липидов и 1,6-107 молекул фосфолипидов. Пусть ее
объем равен 2,25-10-12 см3.

Принимая во внимание, что 1 г эквивалентен 6,1-1011 первичных иони-
заций на 1 см3 белка, можно довольно легко рассчитать повреждения, обу-
словленные выделением энергии без учета диффузии. Примем, что молеку-
лярный вес нуклеиновых кислот обоих типов равен 106, белка любого типа —
100 000 и липида любого типа — 1000 и что объемы их молекул равны
соответственно 1,1 • 10"18, 1,28-10"1® и 1,7-10“21 см3. В разд. 2 было указано,
что одного сгустка ионов, т. е. ПО эв выделившейся энергии, достаточно для
инактивации любой молекулы нуклеиновой кислоты или белка. Мы будем
предполагать, что значительно меньшая по размерам молекула липида
при воздействии такой энергии также утрачивает все свои специфические
функции. Поэтому можно считать, что вероятность инактивации любой из
этих молекул равна вероятности того, что сгусток ионов образуется в объеме,
занятом этой молекулой. При дозе 1000 г эта вероятность для нуклеино-
вых кислот равна 6,1 • 1014-1,1 • 10“18 — 6,7-10~4, для белков 7,8-10“6 и для
л ип идов 1,04 • 10-6.
Сравнивая эти величины с числом соответствующих молекул в клетке,
получаем, что число инактивированных молекул ДНК равно 2,1 • 104- 6,7х
X 10~4=14. Для РНК это число равно 28, для белков — 3,7-102, для липи-
дов —26 и для фосфолипидов — 17. Полученные значения поразительно
малы. Поэтому на первый взгляд кажется, что облучение должно очень мало
влиять на клетку.

Теперь рассмотрим влияние диффундирующих агентов. В этом отно-
шении -теоретический анализ особенно ненадежен, так как неизвестно, что
собой представляют эти диффундирующие агенты, сколько их образуется
и насколько они эффективны. Поэтому мы вынуждены использовать при-
ближенный расчет. Предположим, что в клетке возникают те же диффунди-
рующие агенты, что и в облученной воде, и действие их в количественном
отношении то же, что в воде. Остается еще одна трудная проблема. Нужно
определить относительное распределение инактивирующих агентов по моле-
кулам клетки. В первом приближении их можно распределить соответствен-
но поверхности молекул. Если считать, что длина молекулы нуклеиновой
кислоты составляет 2300 А, а ее диаметр равен 23 А, то поверхность моле-
кулы равна 1,67-1011 см2. Полагая, что молекулы белков и липидов имеют
сферическую форму, получаем, что их поверхности равны соответственно
1,22-10-12 см2 и 5,6-10"14 см2. Таким образом, имеем для суммарных пло-
щадей:

ДНК .............. 3,5-10-7	сж2

РНК ........	7,0-10-7	»

Белок ............ 5,7-10—6	»

Липиды ........... 2,3-10-6	„

Малые молекулы . .	2,4-10—6 »

В объеме воды, равном 0,7-2,25-КГ12 см3, при облучении дозой 103 г выде-
ляется 5,8-1014-0,7-2,25-10'12= 910 порций энергии по 100 эв. Заметим,
что это число невелико по сравнению с числом молекул в клетке. Эти пор-
ции энергии распределятся в клетке следующим образом (в соответствии

с нашей гипотезой):

ДНК............ 28

РНК ......	56

Белок......... 460

Липиды........	182

Малые молекулы	190

Вспомним теперь, что, как показывают измерения, на 100 эв приходится
1,7 инактивированных (в отношении трансформирующей способности) моле-
кул нуклеиновой кислоты. Используя эту единственную имеющуюся у нас
величину, характеризующую радиационную чувствительность нуклеиновой
кислоты, получаем, что под влиянием диффундирующих агентов инакти-
вируются 28-1,7 = 48 молекул ДНК и 96 молекул РНК-

Что касается белка, то уже было указано, что каждые 100 эв инакти-
вируют в среднем 0,5 молекулы. Таким образом, в общей сложности будут
повреждены 230 молекул белка. О липидах нам ничего неизвестно. Мы будем
предполагать, что на инактивацию одной молекулы липида нужно 100 эв.

Все результаты этого расчета, основанные на результатах наиболее
надежных измерений, проведенных к настоящему времени, приведены
в табл. 25.

На первый взгляд данные табл. 25 свидетельствуют об очень слабом
действии дозы 1000 г на бактериальную клетку. Однако если действительно
верно, как указал Мак-Ильвейн, что образование многих молекул, играю-
щих важную роль в клетке, например витаминов, происходит под действи-
ем лишь одной или нескольких молекул фермента определенного типа, то
вполне возможно, что среди 600 поврежденных белковых молекул может
оказаться именно эта молекула. В результате запас витаминов в клетке

Таблица 25

Число поврежденных молекул в клетке при дозе 1000 г

Тип молекулы	Число молекул в клетке	Число молекул, поврежденных в результате иони- зации в пределах молекулы	Число молекул, поврежденных в результате действия агентов, образующихся в воде	Общее число поврежденных молекул
ДНК 		2,1-104	14	48	62
РНК		4,2-104	28	96	124
Белок 		4,7-10®	370	230	600
Липиды 		4,1-107	43	182	225

будет постепенно уменьшаться. Если он не поддерживается за счет притока
извне, клетка перестанет расти и в конце концов погибнет. Это означает,
что непосредственное действие облучения на клетку носит скрытый харак-
тер, приводя лишь к нарушению синтеза некоторых веществ; лучевое пора-
жение становится явным лишь тогда, когда кончается запас молекул, важ-
ных для жизнедеятельности клеток.

Эти соображения приобретают особенно большое значение, если учесть
роль нуклеиновой кислоты в синтезе белка. Поскольку за время между
делениями клетки (30 мин) в ней синтезируется около 5 миллионов моле-
кул белка, на каждую молекулу нуклеиновой кислоты приходится очень
большая нагрузка. Известно, что синтез белка происходит с участием РНК,
и можно считать, что каждая молекула РНК в промежутке между деления-
ми клетки участвует в синтезе 114 молекул белка. Таким образом, повре-
ждение 96 молекул РНК означает, что в процессе деления в нужный момент
времени будет не хватать примерно 10 000 молекул белка. Это более чем
в 10 раз превосходит повреждение в результате непосредственного действия
излучения.

Те же рассуждения применимы в отношении синтеза рибонуклеиновой
кислоты, в котором участвует ДНК- Повреждение 62 молекул ДНК озна-
чает, что будет нарушен синтез 124 молекул РНК-

Таким образом, в процессе биосинтеза очень малые эффекты, вызы-
ваемые облучением, значительно усиливаются, что может привести к очень
серьезным повреждениям клетки. Почти все такие повреждения относятся
к категории отдаленных эффектов облучения, из которых и складывается
характерная картина лучевого поражения.

В разд. 6 мы отметили, что в живых клетках цепные реакции малове-
роятны. Под «цепной реакцией» мы подразумеваем химический процесс,
в котором продукты одной реакции вызывают вторую такую же реакцию
и т. д. Для этого необходима совершенно однородная среда, так как в про-
тивном случае может оказаться, что продукты реакции будут окружены
молекулами, неспособными вступать в такие реакции. Из всех компонен-
тов клетки этому условию удовлетворяют только полипептидные цепи
белка, полинуклеотидные цепи нуклеиновых кислот и углеродные цепочки
липидов; все остальные не обладают достаточной однородностью. А так
как в белках, нуклеиновых кислотах и липидах цепные реакции до сих
пор обнаружить не удалось, приходится сделать вывод, что в клетке хими-
ческие цепные реакции (в отличие от биологических) маловероятны.

Интересно сравнить результаты проведенного анализа с эксперимен-
тальными данными. Установлено, что при дозе 1000 г число клеток Е. соИ,
способных к образованию колоний, уменьшается на 20%. Таким образом,
.лишь одна клетка из пяти получает повреждение, вызывающее инактива-
цию. Если считать, что инактивация обусловлена действием только на
молекулы нуклеиновых кислот, то это должно означать, что при поврежде-
нии примерно 1000 молекул ДНК и РНК (186-5, см. табл. 25) вероятность
гибели клетки близка к единице.

Итак, радиобиологические исследования ясно показывают, что клеточ-
ные процессы находятся под контролем небольшого числа молекул. Из про-
веденного нами анализа следует, что достаточно повредить несколько сот
молекул (даже не разрушая их полностью), чтобы вызвать ощутимый эффект
и даже привести к прекращению деления клетки. Хотя об этом уже неодно-
кратно говорилось, мы еще раз подчеркиваем это.

В связи с изложенным выше расчетом интересно отметить результаты,
полученные Эррера [7]. Анализируя данные по действию излучения, отно-
сящиеся к 19 ферментным системам, Эррера пришел к выводу, что ионизи-
рующее излучение оказывает прямое действие только на ДНК-

Укажем теперь на ряд несомненно важных факторов, которые не были
учтены нами в приведенных выше рассуждениях. Во-первых, мы не рассма-
тривали роли молекулярной организации клетки. Действительно, хотя
в клетке имеются ферменты РНК-аза и ДНК-аза, их действие на субстраты
не соответствует тому, что можно было бы ожидать, исходя из их фермента-
тивной активности. Вероятно, во многих случаях взаимодействие молекул
фермента и субстрата не может произойти из-за того, что либо фермент,
либо субстрат находятся в клетке в связанном состоянии. Однако выше,
рассматривая действие диффундирующих агентов, мы предполагали, что
возможен доступ к любой молекуле. Далее, как известно, синтез белка в клет-
ке происходит в рибонуклеопротеидных гранулах. Очевидно, что если
.две такие гранулы по какой-либо причине соединяются, то чувствитель-
ность их к облучению изменится. Аналогичные соображения приложимы
и к синтезу ДНК. Кроме того, мы предполагали, что диффузии в клетке
ничто не препятствует. Между тем это, несомненно, слишком грубое при-
ближение.

Неопределенность, связанная со всеми этими факторами, затрудняет
понимание действия излучения. Если, однако, нам удастся получить коли-
чественные данные о влиянии облучения на белковый синтез в бесклеточных
системах и при этом фиксировать параметры, от которых зависит эффектив-
ность облучения (расстояния, которые проходят молекулы в процессе
.диффузии, чувствительность молекул и т. д.), то изложенный метод может
оказаться весьма плодотворным. Хотя наш анализ носил ограниченный
характер, он позволил понять значение целого ряда факторов. Пусть мы не
учли всех факторов, но полезно уже то, что удалось оценить относительную
эффективность некоторых из них. При написании этого раздела мы руковод-
ствовались именно'этими соображениями.

16.	Действие ионизирующего излучения на хромосомы. В разд. 15
рассматривалось действие излучения на бактериальную клетку, в которой
хромосомы и митотический аппарат выявлены не столь четко, как в расти-
тельных и животных клетках. В настоящем разделе мы кратко опишем
действие ионизирующего излучения на хромосомы. Этой теме посвящено,
очень много работ, но кратко рассказать об их результатах невозможно,
так как они сложны и многочисленны. Мы остановимся лишь на некоторых
явлениях, относящихся к действию излучения на хромосомы, которые заслу-
живают внимания в настоящий момент. Подчеркнем сразу же, что такое
серьезное повреждение, как разрыв хромосомы, почти неизбежно ведет
к повреждению всей клетки.

Физическое строение хромосом неизвестно. Возможно, что именно с по-
мощью радиационных исследований уцастся изучить их структуру. По-види-
мому, хромосомы состоят из многих нуклеопротеидных нитей, находящихся
в особой высокоспецифичной среде, обеспечивающей возможность сохра-
нения и воспроизведения важнейших частей этой хромосомной структуры.
Отсутствие данных о физическом строении хромосом сильно затрудняет
выяснение механизма действия ионизирующего излучения на эти компо-
ненты клетки. Можно высказать несколько соображений, касающихся
существенных особенностей строения хромосом, чтобы указать направле-
ние, в котором следует работать.

По всей вероятности, хромосомная нить от деления к делению почти
полностью сохраняет свою целостность. Рассмотрим, отвлекаясь пока от
действия излучения, два существенных момента, связанных с разрывом
, хромосомы, причем для толщины хромосомы примем значение 1000 А,
данное Саксом [22]. Прежде всего отметим, что вдоль двух новых поверх-
ностей разорванной хромосомы образуется слой из молекул воды. Как было
показано в разд. 4 гл. III, изменение свободной энергии равно —И йПп2,
где 2 — статистическая сумма (2е~-Ег/й7’). Молекулы воды, находящиеся
у поверхности хромосомы, теряют способность к свободному вращению.
Поэтому в результате разрыва происходит изменение свободной энергии,
соответствующее изменению вращательных степеней свободы при образо-
вании двух слоев молекул воды. Значение 2 для вращения, согласно про-
стому квантовомеханическому расчету [23], равно (8ла/^7')/А2, где I —
момент инерции вращающейся молекулы воды, равный 10~40 г-см2-, поэтому
Для 2 получается величина порядка 75. Следовательно, свободная энергия
на молекулу воды составляет — кТ 1п 75, или —4,3 кТ. Если же молекулы
воды связаны, то величина свободной энергии равна нулю. Таким образом,
в результате разрыва хромосомы свободная энергия увеличивается. Это уве-
личение очень велико, поскольку число молекул воды, связанных с новыми
поверхностями, составляет 10®, что дает для изменения свободной энергии
величину 104 эв. Возможно, что это значение завышено, так как, во-первых,
нужно учесть энергию связи и, во-вторых, молекулы воды, вероятно, не
могут свободно вращаться в среде клетки. Поэтому будем исходить из зна-
чения 103 эв. Используя соотношение Т8=1}—Р и учитывая, что энтропия,
как было показано выше, либо не изменяется, либо увеличивается, прихо-
дим к выводу, что энергия должна быть не меньше 103 эв. Иными словами,
для разрыва хромосомы нужна энергия не менее 103 эв. Для этой величины
получилось бы другое значение, если допустить, что хромосома состоит из ря-
да частей, между которыми находятся молекулы воды. На этом предполо-
жении мы остановимся позднее. Возможно также, что основная часть хромо-
сомы намного меньше.

Второе обстоятельство, которое можно использовать для анализа,
связано с тем, что вероятность разрыва цепи генов в процессе деления,
которые нарушили бы ее строение, очень мала. Можно предположить, что-
99% цепи не претерпевает разрыва. Допустим, что имеется 1000 областей,
в которых разрыв может произойти. Если / — вероятность разрыва в такой-
области, то вероятность, что разрыв в ней не произойдет, равна 1— /. Отсю-
да вероятность того, что ни в одной из 1000 областей не произойдет разры-
ва, равна

(1-/)юоо==о>99
и, следовательно,

/=10"5.

Используя распределение Больцмана

/ = е~Е1кТ,

находим, что Е = 11,5 кТ, т. е. около 0,3 эв. Возможно, правильнее было
бы оценивать значение Е, исходя из скорости реакции спонтанного разрыва
хромосом, которая была оценена Котвалом и Греем [24]. По их данным, эта.
скорость равна примерно 0,003% в год, т. е. удельная скорость реакции
по порядку равна 10”12 в 1 сек. Учитывая, что разрыв может происходить
в 1000 областей, имеем, согласно теории абсолютных скоростей реакций,

10"15 = ехр — Г .

1 У кТ У

Для ЬР*/кТ получаем отсюда значение 63, т. е. ДЕ* «= 2,1 эв. Это хорошо
согласуется со значением энергии активации 1,3 эв (ДЕ* в уравнении Арре-
ниуса), полученным при изучении влияния температуры на мутации.

Таким образом, для энергии активации разрыва хромосомы расчет
дает величину 2,1 эв. Это значительно меньше энергии, необходимой для
образования двух поверхностей, связывающих воду. Возможно, дело в том,
что хромосомы представляют собой агрегаты, состоящие из отдельных
единиц, полностью гидратированных (включая поверхность) и связанных
друг с другом физическими силами, величина которых обусловлена скорее
относительно большой площадью связывающих поверхностей, чем специ-
фическим химическим взаимодействием.

Вернемся теперь к действию излучения. По-видимому самые важные
данные по разрыву хромосом были получены Котвалом и Греем, которые
облучали пыльники ТгайезсапИа с помощью радонового газа в растворе;
таким образом, облучение производилось а-частицами, вызывающими иони-
зацию большой плотности. Определялось число разрывов хромосом различ-
ного типа при разных экспозициях. Дозу, т. е. энергию, выделяющуюся
на единицу объема, рассчитывали по времени экспозиции и концентрации
радона. Пыльники после облучения помещали в воду на 24 час, после чего
фиксировали для цитологических исследований. Наблюдения производи-
лись над клетками, находящимися в метафазе, причем подсчитывалось,
число нормальных клеток, а также число клеток, в которых происходили
различного рода разрывы и перестройки.

Простой пример анализа данных Котвала и Грея дан на фиг. 175, где
изображена зависимость доли нормальных клеток от числа а-частиц на 1 сл-г2.
Кривая соответствует знакомому нам логарифмическому закону. Применяя
метод расчета, описанный в разд. 9, находим, что сечение разрыва хромосо-
мы при бомбардировке а-частицами равно 6,0-10”7 см2. Таким образом,
чувствительная площадь, сквозь которую должна пройти а-частица, состав-
ляет менее половины площади ядра микроспоры ТгайезсапИа, равной 11,3 X
X 10~7слг2. Покажем, как можно использовать эти данные для расчета толщи-
ны хромосом. Общая длина хромосом в ядре равна 972ц, причем их можно
представлять себе как беспорядочно ориентированные нити чувствитель-
лого к облучению материала. Заметим, что эффективная площадь такой
мишени меньше, чем ее истинная площадь. Простой геометрический рас-
чет показывает, что эффективная площадь равна истинной, умноженной
ла у. Следовательно, истинное сечение больше наблюдаемого в раза, т. е.
равно 7,6-КГ7 см2. Если I—толщина хромосомы, то имеем

9,72-10"2/ = 7,6-10"7,

отсюда

/ = 7,8-10-6 см = 780/.

По данным Сакса, толщина хромосомы равна 1000 А. Следовательно,
эффективная мишень, по-видимому, немного меньше, чем хромосома.

Этот простой анализ уже дает размеры мишени, достаточно близкие
к размерам хромосомной нити. Полученное выше значение слишком мало,
так как среди клеток без разрывов есть на

Фиг. 175. Зависимость числа
неповрежденных ядер в микро-
спорах ТгайезсапНа от дозы ос-час-
тиц (по данным Котвала и Грея).

самом деле такие, где произошли разрывы
с последующим воссоединением. Оценить
такое воссоединение количественно очень
трудно. Согласно Котвалу и Грею, которые
очень тщательно проанализировали свои
собственные данные и данные, полученные
другими исследователями, вероятность
того, что разрыв действительно можно
будет наблюдать, равна 0,35. Это увели-
чивает сечение в 1/0,35 раз, т. е. позволяет
принять для толщины хромосомы значение
2200 /, что примерно в 2 раза больше, чем
по оценке Сакса. Таким образом, можно
считать, что разрыв происходит всякий
раз, когда сс-частица проходит сквозь хро-
мосому или на расстоянии не более 600 А
от нее.

В настоящее время нет других удовле-
творительных данных, с помощью которых
можно было бы провести простой расчет.

Тодей и Джайлс получ тли вполне определенные результаты, изучая разрыв
хромосом под действие нейтронов. Правда, нейтроны не вызывают иониза-
цию такого простого типа, каксс-частицы. Тем не менее не вызывает сомнений,
что для нейтронов, производящих протоны отдачи с энергией 3 Мэе, сечение,
рассчитанное по кривым, подобным кривой на фиг. 175, намного меньше, чем
для а-частиц (примерно 3-1СГ8 см2 вместо 6,0-Ю-7 с\'2 для а-частиц).
Поскольку а-частицы хапактеризуются приблизительно в 12 раз большей
плотностью ионизации, чем нейтроны, приведенные величины позволяют
считать, что в грубом приближении сечение растет пропорционально плот-

ности ионизации. Такая же закономерность наблюдалась при инактивации

некоторых бактериофагов и доожжей

Наряду с разрывом хромосом наблюдается их воссоединение. Эти
процессы происходят в клетсе и в норме. И^Ьнщ? разрыв л и воссоединение
хромосом при мейозе обусловливают явление кэоссинговеэа. Поэтому те
цитологические нарушения, которые мы наблюдаем, могут быть гораздо
менее значительными, чем те повреждения, которые на самом деле были

нанесены клетке облучением. Это доказано экспериментами, при которых
доза сообщалась порциями (рентгеновские лучи давались импульсами
с определенными интервалами). Результаты показывают, что разрыв хромо-
сомы существует в течение примерно 5 мин, а затем происходит ее восста-
новление. Сакс установил, что число наблюдаемых разрывов можно увели-
чить, применяя очень мягкое центрифугирование.

В тех случаях, когда для обнаружения цитологического поврежде-
ния необходимо, чтобы произошли два разрыва и одно воссоединение, эф-
фект, вызываемый слабо ионизирующим излучением, например у-лучами,
пропорционален квадрату дозы, что указывает на двухударный характер
процесса. Излучение, характеризуемое большой плотностью ионизации,
с большой вероятностью дает пары разрывов, и эффект его пропорционален
первой степени дозы.

В одной из своих первых работ Сакс провел качественный анализ про-
цессов, связанных с действием ионизирующего излучения на хромосомы.
Ли пытался провести подобный анализ количественно. Он пришел к выво-
ду, что в таком малом объеме, как объем хромосомы (порядок его составляет
1ц3), достаточно 20 ионизаций, чтобы вызвать разрыв, и что из этих разры-
вов большая часть воссоединяется с образованием инверсий или транслока-
ций. С этими результатами согласны далеко не все. Нам остается только
заметить, что любой аккуратно проведенный количественный анализ пред-
ставляет определенную ценность, поскольку его можно проверить экспе-
риментально. Отметим, что до сих пор, по-видимому, нет данных, противо-
речащих гипотезе Ли.

Энергия, соответствующая 20 ионизациям, намного меньше энергии,
необходимой для разрыва хромосомы с образованием двух поверхностей,
связывающих воду. Таким образом, данные по действию излучения на хро-
мосомы приводят нас к представлению о хромосоме как об агрегате нуклео-
протеидных единиц, связанных друг с другом посредством ван-дер-вааль-
совых сил. Стабильность таких агрегатов ослабляется силами отталкива-
ния, обусловленными ионной атмосферой, и зависит от концентрации метал-
лических ионов. Излучение может каким-то образом изменить одну из этих
единиц, что вызовет изменение сил притяжения на ее границе и приведет
в конечном счете к разрыву. Механизм этого процесса еще не известен. Так
или иначе, учитывая большую величину чувствительной области (500 А
вокруг нити плюс сама нить), следует думать, что чрезвычайно высокая
эффективность действия ионизирующего излучения на живые системы долж-
на быть обусловлена действием на хромосомы. По этому вопросу существу-
ет обширная литература, к которой мы отсылаем читателя, желающего
углубить свои знания в этой области.

17.	Действие ионизирующего излучения на организм человека. Суще-
ствует несколько довольно авторитетных обзоров по действию ионизирую-
щего излучения на организм человека. Не собираясь отговаривать читате-
ля от намерения ознакомиться с этими обзорами (напротив, это было бы
•полезно), мы хотим здесь вкратце остановиться на теоретических сообра-
жениях, касающихся некоторых эффектов, обусловленных излучением.

Коснемся двух важных вопросов, относительно которых существуют
весьма противоречивые точки зрения — вопроса о наличии пороговой дозы
и вопроса об отдаленных эффектах облучения.

Известно, конечно, много эффектов, для которых существует порог.
Один из них — покраснение кожи при облучении. Однако значительно
более важный вопрос состоит в следующем: если эффект линейно зависит
от величины дозы, превышающей 10 г, будет ли такая линейная зависимость
выполняться при дозе 0,01 г. Мы полагаем, что на этот вопрос следует отве-
19 Заказ № 1168
тить утвердительно по следующим соображениям. Во-первых, величина
каждой передаваемой при облучении порции энергии не зависит от дозы.
Во-вторых, эффекты, вызываемые облучением, обусловлены, по-видимому,
действием на молекулярные клеточные структуры, размеры которых редко
превышают 0,1р.; расстояние же между точками, в которых происходят
первичные процессы передачи энергии при дозе Юг, в 6 раз больше. Таким
образом, при дозах, для которых заведомо выполняется линейная зависи-
мость, эти расстояния превосходят размер структур, поражаемых излуче-
нием. Можно ожидать, что вероятность поражения в результате облучения
будет уменьшаться пропорционально увеличению этих расстояний. Поэто-
му утверждение, что эффект, линейный при средних дозах, не должен
быть линейным при малых дозах, мы оставим на совести тех, кто его выска-
зывает. Быть может, оно и верно, но это было бы очень странно.

Одна из печальных особенностей действия излучения состоит в том,
что иногда через много лет после облучения возникают такие серьезные
заболевания, как лейкозы или опухоли костей. Нам кажется, что их возник-
новение можно было бы объяснить следующим образом. Допустим, что при
определенной дозе (скажем, 1 г) 1 % клеток утрачивает способность к пра-
вильному делению. Эта потеря должна быть возмещена за счет нормально
делящихся клеток. Однако есть основания сомневаться в том, что в резуль-
тате нормального деления оставшихся клеток появятся точные копии утра-
ченных. Ведь сам процесс дифференцировки предусматривает неидентич-
ность потомков одной и той же материнской клетки. Стимуляция клеточно-
го деления под влиянием облучения равноценна ускорению процесса старе-
ния, а следовательно, она должна привести к преждевременному проявле-
нию заболеваний, обычно наблюдаемых в пожилом возрасте. Можно пред-
сказать, что при таких темпах увеличения продолжительности жизни,
какие наблюдаются за последние 50 лет, проблемы, связанные с отдаленным
действием излучения, станут значительно более актуальными.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	Б е а В. Е., АсНопз о( Рай1аНоп оп Е(уш§ Се11з, СагпЬпй^е Ипхуегзйу Ргезз,
1956.

2.	Т I то (ее 1 Г-Р еззоузку И. XV., 2 ( т тег К. О., Саз Тгейег Рппг(р
ш йег В1о1о§1е. Н(гге1, Ее(рг1§, 1947.

3.	8утрозшт оп Рай1оЫо1о§у, ей. Ьу Л. Л. ГЛскзоп, Лойп ХУПеу апй 8опз, И. У.,
1952.

4.	В а с ч 7. М., А 1 е х а п йег Р., Еипйатеп1а1з о! Рай(оЬ(о1о§у, Асайеппс
Ргезз, М. У., 1955 (Есть перевод второго издания: Бак и Александер,
Основы радиобиологии, М., ИЛ, 1963).

5.	С г а у Е. Н., 1п АсКопз СЫиндиез е! Ь1о1о§(чиез йе гай(аНопз, ей. Ьу На18з(пзку,
Маззоп, Рапз, 1955.

6.	Р о 1 1 а г й Е. С., О и 1 1 й XV. I?., Ни1с11(пзоп Е., 8 е 1 1 о ту К. В.,
«ТЬе С1гес1 АсКоп о( Тотг(п§ рай(а1(оп 1П Епгутез апй АпН^епз», Рго§. В(о-
рЬуз. апй Вгорйуз. СЬет., 5, 72 (1955).

7.	Е г г е г а М., Н е г V е А., Месйатзтез йе 1’асКоп Ью1о§(дие йез гайхаКопз,
Маззоп, Рапз, 1951.

8.	С а 1 е XV. М., О г а у Б. Н., М е г е й ( 1 й XV. Л., РЫ1. Тгапз. Роу., 8ос.,
А 242, 33 (1949).

9.	Ни 1 ей 1пзоп Р., Атепсап НаЩгаПз!, 94, 59 (1960).

10.	В(о1о§(са1 ЕИесЬ оГ А1от(с Рай(аКоп, Рерог! оГ МаКопа! Асайету, ЫаКопа!
Резеагсй СоипсН, 1956.
11.	Ц. 8. Соп^геззгопа! Неапп^з оп Ма1иге о! ЦасИаНоп Ра11ои1 агк! Из Ейес1з оп Мап
(1956). Нерог! о! 1Ье ЫпИед МаНопз 8с1епНПс Сотгшйее оп 1Ье ЕНес1з о! А1о-
т!с КасНаНоп, Мелу Уогк, 1958.

12.	А п д г е лу з Н. Ь., НадгаНоп В1орЬу81с8, РгепНсе-НаП, Еп§1е\уоод СНИз, И. Л.,
1961.

13.	СопГегепсе опМо1есп1аг апд КасИаИоп В1о1о§у, Ед. К. А. Веегш;?, РпЬИсаНоп 823,
МаНопа1 Асадету—МаНопа! НезеагсЬ СоипсИ, 1961.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

14.	Веззаиег Н., 7еИ. 1йг РЬуз., 20, 288 (1923).

15.	В а V 1 з М., РЬуз. Неу., 94, 243 (1954).

16.	8 т 1 1 Ь, АгсЬ. ВюсЬет апд ВюрЬуз., 50, 322 (1954).

17.	Н	и 1 с Ь I	п з о п, Над1аНоп НезеагсЬ, 9,	13 (1958).

18.	В	е Г 1 1 1	р р е з Р., иприЬНзЬед да!а.

19.	В	а г г о п	Е. 8. С., Апп. И. У. Асад. 8с1., 59, 578 (1955).

20.	В	а | е ху з	к у Н., бег Ь ег О., Р а и 1 у	Н., Аду. 1п	Вад1оЫо1оЯУ, ОИуег апд

Воуд, Ьопдоп, р. 25, 1957.

21.	Н и 1 с Ь 1 п оп Р., К 0 58 В. А., Вад1аНоп НезеагсЬ, 10, 477 (1959).

22.	Зах К-, СепеНсз, 23, 496 (1938).

23.	ЛоЬпзоп, Е у г 1 п& Р о 1 1 1 з а г, ТЬе КепеНсз о! Мо1еси1аг В1о1ояу,
ЛоЬп АУНеу, Мелу Уогк. СЬар. IV, 1957.

24.	К о I у а 1 I. Р., С г а у Ь. Н., доигпа! о! СепеНсв, 48, 135 (1947).


Г лава XI

ПРИМЕНЕНИЕ

ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРОЕНИЯ КЛЕТКИ

1.	Введение. Ионизирующее излучение, проникающее в клеточную
оболочку или в поверхностный слой вирусной частицы, может не вызвать
никаких изменений. Проникновение же ионизирующего излучения внутрь
клетки сопровождается выделением очень больших порций энергии. Как
указывалось в предыдущей главе, ионизирующее излучение оказывает
более сильное действие, чем можно было бы ожидать исходя из того, что
величина полной энергии, передаваемой клетке, довольно мала. В гл. X
мы объясняли это, учитывая основные представления молекулярной
биологии о существовании небольших молекулярных структур, регулирую-
щих клеточные процессы. Выделение энергии в одной из таких структур
может вызвать большие изменения в клетке.

Возможны два аспекта исследований действия излучения на живые
системы: 1) изучение эффектов, вызываемых облучением, необходимое для
решения таких важных вопросов, как лечение рака или обеспечение без-
опасности населения в случае ядерной войны; 2) исследования с применением
ядерной физики и рентгеновских лучей, позволяющие делать определен-
ные выводы о механизме клеточных процессов на молекулярном уровне.
Этот второй аспект мы и рассмотрим в настоящей главе.

В сущности у казанные два аспекта исследований совершенно различны,
несмотря на имеющуюся между ними связь. В самом деле, для научного
работника, посвятившего себя борьбе с заболеваниями раком, наибольший
интерес представляет действие излучения на нормальные и опухолевые
клетки. Исследователь же, применяющий излучение для расширения своих
знаний о клетке, стремится работать с такими системами, изменения кото-
рых под действием излучения наиболее хорошо изучены, т. е. с бактериаль-
ными спорами, вирусами и ферментными системами бактерий. Естественно,
что все связанное с действием излучения на организм живейшим образом
интересует человека из чисто «эгоистических» побуждений, между тем
как второй аспект того же явления представляет для него, так сказать,
лишь академический интерес. По этой причине большая часть исследова-
ний в этой области была посвящена не столько самой клетке, сколько дейст-
вию излучения на клетку. Тем не менее статистическое изучение поврежде-
ния клеток при действии ионизирующего излучения использовалось
и используется в настоящее время для получения совершенно определен-
ных данных о структуре клетки. В этой главе мы дадим краткий обзор совре-
менных достижений в этой области, которая, по нашему убеждению, являет-
ся одной из многообещающих ветвей молекулярной биофизики.
2.	Основа метода. Ни в одной другой области существенное различие
в биохимическом и биофизическом подходах не проявляется в такой степе-
ни, как при применении ионизирующего излучения для изучения клетки.
Рассмотрим в качестве примера биохимического подхода использование
хлорамфеникола для подавления синтеза белка. В данном случае неизвест-
ны ни пути проникновения этого химического агента в клетку, ни детали
его действия на клетку. Несмотря на это, биохимикам известно, что хлорам-
феникол подавляет синтез белков в клетке и что изменение поведения клет-
ки, обработанной хлорамфениколом, можно использовать для получения
многочисленных сведений о процессах, происходящих с участием нуклеи-
новых кислот. Изящество'экспериментов с хлорамфениколом обусловлено
односторонним характером его действия на клетку. Применение его в каче-
стве агента, вызывающего определенные изменения в клетке, дает биохи-
мику замечательную возможность изучать процессы обмена веществ, приро-
ду предшественников и т. д. в системе, которая хотя и изменена, но пред-
ставляет определенный интерес. При этом нельзя получить никаких прямых
данных о физических размерах и структуре компонентов клетки, однако
этот пробел, присущий биохимическим исследованиям вообще, не мешает
и в данном случае.

Существует много различных путей (можно назвать не менее де-
сяти), по которым ионизация действует на биологические молекулы.
Обосновать предположение о том, что облучение приводит к прекращению
какого-то одного процесса, не вызывая других эффектов, гораздо труднее,
чем при обработке клетки хлорамфениколом. Однако, в чем бы ни
состояли эффекты, вызываемые излучением, их распределение носит ста-
тистический характер; это означает, что они с равной вероятностью могут
проявиться в любой точке независимо от распределения химических веществ
в клетке. Если такие местные эффекты способны вызвать определенную
реакцию клетки, то, естественно, возникает вопрос, какова вероятность
того, что при данном статистическом распределении этих эффектов будет
затронута именно та часть клетки, которая обусловливает эту реакцию.
Один из простых подходов к определению этой вероятности заключается
в оценке относительного размера чувствительной области. Действительно,
применение ионизирующего излучения при изучении клетки может ока-
заться полезным именно в отношении получения сведений о размерах, фор-
ме и распределении тех компонентов клетки, которые определяют ее жизне-
деятельность. Эти вопросы относятся непосредственно к биофизике.

Принцип метода, основанного на применении ионизирующего излу-
чения, можно легко понять с помощью фиг. 176. На этой фигуре клетка
изображена в виде параллелепипеда с квадратным сечением, ширина кото-
рого равна 1000, а толщина 100 А. Кружок внутри клетки изображает кле-
точную структуру, которая может быть либо системой, синтезирующей
определенный тип белка, либо ферментом, либо системой, управляющей
процессом синтеза белка. Если клетка получает дозу 10 000 г, то на область,
изображенную на схеме, приходится в среднем один акт ионизации. Эффек-
ты, вызываемые этой ионизацией в цитоплазме, могут передаваться на рас-
стояние, равное примерно 30 А. На фиг. 176, А такая миграция изображена
с помощью маленького пунктирного кружка вокруг места ионизации.
В этом случае вероятность того, что рассматриваемая клеточная структура
останется неповрежденной, составляет 98 °6. При построении схем, приве-
денных на фиг. 176, мы использовали прием, обычно применяемый в теории
столкновений, а именно: считая ионизации точечными, увеличили размер
мишени на 30 А. Совершенно ясно, что при увеличении дозы вероятность
того, что клетка останется неповрежденной, уменьшается. Зная величину
дозы, для которой эта вероятность составляет примерно 0,5 (точнее, 0,37
или е-1), можно получить представление о размере системы, повреждение
которой существенно.

Таким образом, план действия заключается в следующем. Мы исходим
из некоторого свойства клетки, которое может изменяться под действием
излучения, например из ее способности синтезировать какой-либо опреде-
ленный белок. Далее, мы определяем, сохраняется ли это свойство при
различных дозах облучения; зная же распределение ионизаций при опреде-
ленной дозе, мы можем сделать вывод о размерах объекта, определяющего
эту способность клетки. Позднее мы остановимся на способах, позволяю-
щих также находить форму определенной области клетки. Обсудим теперь
более подробно, каким образом можно определять размер такого объекта.

Фиг. 176. Схема, поясняющая увеличение
вероятности поражения мишени при увеличении
дозы ионизирующего излучения.

Вероятность выживания зависит также от размеров чув-
ствительного объема, который можно оценить с помощью
статистического анализа эффектов, обусловленных облу-
чением. Подробности см. в тексте.

Для этого очень важно располагать точными сведениями о процессах,
происходящих в молекулах клетки при действии ионизирующего излуче-
ния. К сожалению, наши знания в этой области совершенно недостаточны.
Известно, что как белки, так и нуклеиновые кислоты и в сухом виде и в
растворах очень чувствительны к действию ионизирующего излучения.
Большое число экспериментов, подобных описанным в предыдущей главе,
показывает, что образование сгустка ионов в любой из этих молекул приво-
дит к потере ее биологической активности. Доказано также, что нуклеино-
вые кислоты в равной степени чувствительны к эффектам, возникающим
при ионизации воды, при условии, что ионизированные частицы могут мигри-
ровать к молекулам нуклеиновых кислот. В отношении белков труднее
делать какие-либо утверждения общего характера, поскольку чувствитель-
ность белков к облучению изменяется от одного белка к другому7.

Можно было бы продолжать экспериментальные исследования, не пы-
таясь понять механизма действия излучения. К счастью, дело обстоит го-
раздо лучше. Есть основания полагать, что молекулы нуклеиновых кислот
представляют собой длинные нити, легко разрывающиеся в результате иони-
зации или реакции со свободным радикалом. Если такая нить имеет форму
клубка, так что ее соседние участки находятся на малом расстоянии друг от
друга, то между ними могут возникать поперечные связи, что также приво-
дит к инактивации молекулы. В случае белка положительный заряд, обуслов-
ленный ионизацией, может мигрировать по молекулярной цепи благодаря
существованию системы ковалентных связей. В результате этой миграции
он занимает в молекуле статистически наиболее вероятное положение.
В итоге, по-видимому, происходит реакция этой части молекулы с водой,
что приводит к повреждению всей молекулы. Следовательно, с некоторыми
оговорками, мы можем исходить из допущения (впервые использованного
Ли), что один сгусток ионов инактивирует одну молекулу, и сравнить,
насколько оно согласуется с экспериментальными результатами. Как мы
покажем далее, в большинстве случаев можно считать, что это допущение
оправдано.

Для того чтобы миграция свободных радикалов не помешала оценить
размеры чувствительной области, желательно проводить облучение сухих
веществ, в которых не может происходить свободная диффузия. Это вполне
возможно при работе с вирусами, спорами и некоторыми компонентами
клетки (например, ферментами)'. Однако это ограничение является слиш-
ком жестким (хотя не более, чем те требования, которые предъявляются при
электронномикроскопических исследованиях), так как желательно изучать
действие излучения на вещество в условиях, возможно более близких к усло-
виям в живой клетке. Поэтому в качестве рабочей гипотезы мы примем
допущение Хатчинсона о том, что миграция радикалов увеличивает эффек-
тивный радиус мишени на 30 А. Это предположение основано на изучении
инактивации ферментов в сухих и влажных клетках. Во многих случаях
этот вклад еще меньше. В табл. 26 приведены данные некоторых исследова-
ний Полларда и Барретт по инактивации ^-галактозидазы в сухом виде
и в клетках, выращиваемых на минимальной среде.

Таблица 26

Инактивация Р-галактозидазы

В сухом состоянии			На среде с минимальным содержанием углерода		
доза, х 1 Об г	выживание, %	объем, опреде- ленный из опыта,  X 1 0-19 сл3	доза, X 1 Об г	выживание, %	объем, опреде- ленный из опыта, X10-19 см3
2,8	39	5,5	0,8	81	6,5
8,4	10	4,5	1,6	55	7,5
11,5	3,7	4,7	2,1	35	10,0
14,2	2,1	4,5	3,2	21	9,8
17,4	1,1	4,3	8,6	8	5,9
Средний объ<  Радиус (ес имеет сфер форму)  Можно		  ли частица ическую  показать,	4,7-10-19 слз  48 А что увеличен	не радиус	а мишени,	7,9-10-1» см3  57 А обусловленное

миграцией радикалов после облучения, не превышает 30 А. Очень вероятно,
что этот фермент входит в состав какой-либо мембраны и отчасти защищен
ее поверхностью от повреждений, наносимых извне.

Заметим, что любой экспериментальный метод исследования структуры
клетки предполагает ее частичное разрушение. Даже при работе с обычным
микроскопом, имеющим разрешение, которое позволяет различать струк-
туру клеточных органелл, необходимо использовать ультрафиолет, кото-
рый оказывает на клетку разрушающее действие. При электронной микро-
скопии работа ведется только на мертвых и соответствующим образом фикси-
рованных объектах. Методы, основанные на использовании клеточных
компонентов, полученных при действии на клетки ультразвука, перепада
давления или обработки ферментами, позволяют значительно расширить
наши знания о некоторых клеточных процессах, но обладают тем недостат-
ком, что структура клетки при этом оазрушается. Поэтому необходимо
использовать данные, полученные различными методами, с тем чтобы теоре-
тически воссоздать картину жизнедеятельности клетки. Такие свойства
излучения, как проникающая способность и локальное выделение энергии,
делают его очень ценным агентом при изучении структуры клетки. Оно
также вызывает нарушение структуры клетки, которая в результате утра-
чивает свои функции, но характер этого разрушения иной, чем при наруше-
нии целостности клетки путем центрифугирования или аналогичных воздей-
ствий. Именно это отличие обусловливает ценность методов, основанных
на применении ионизирующего излучения.

3.	Первые работы по изучению структуры с помощью ионизирующего
излучения. Еще в 1932 г. Циркл обнаружил, что чувствительность спор
папоротника к а-частицам зависит от направления, в котором производится
облучение. Это открытие хорошо согласовалось с допущением, что ядра
этих спор расположены ацентрически и, следовательно, более доступны
воздействию а-частиц с одной стороны, чем с другой. В 1925 г., приблизи-
тельно в то время, когда составление генетических карт имело уже твердую
основу, Меллер обнаружил, что рентгеновские лучи вызывают разрывы
хромосом. Таким образом, был открыт агент, позволивший установить
связь между группами сцепления и хромосомами, существование которых
может быть доказано физическими методами.

Гауэн и Гей в 1933 г., а затем Ли в 1940 г. пытались применять ионизи-
рующее излучение для оценки размеров и числа генов. Они облучали рент-
геновскими лучами дрозофилу, определяя выживание и цастоту мутантов
определенного типа на единицу дозы. Приводимый ниже расчет основан
на допущении, что выживание определяется частотой летальных мутаций
(одного или нескольких типов), а появление специфической мутации обу-
словлено локальным воздействием только в одном определенном участке.
Так, при облучении дрозофилы дозой 4000 г выживание составляет 37ж
Поскольку 1 г эквивалентен 6,1-Ю11 сгустков ионов на 1 см8, из со-
отношения 1п п/'п0=—VI получаем, что V=4,1-10“16 см3 (что эквивалент-
но молекулярному весу 3,2-108). С другой стороны, так как на 500 мух,
выживших при этой дозе, приходится одна специфическая мутация, то веро-
ятность того, что это облучение вызовет данную мутацию, равна 0,001
(учитывая, что часть мух погибает). Если число мутаций среди п мух равно
йп, то, предполагая, что мутация обусловлена ионизацией в области объе-
ма V, получаем

с1п!п = в(11,

где <11 — число ионизаций на единицу объема, а всП — среднее число
«ударов». Отсюда для V получаем величину 4,1 • 10“19 см3, соответствующую
молекулярному весу 320 000. Считая, что число генов приблизительно
равно У/с, первые исследователи получили для него значение 1000. В насто-
ящее время считается, что число генов равно 3000. (При оценке молекуляр-
ного веса гена возникает вопрос, что подразумевается под понятием «ген».)
Сравнивая эту величину со значениями, полученными в первых работах,
мы видим, что использованные в них представления не очень сильно отли-
чались от современных.
Предположение о том, что образование одного сгустка ионов внутри
молекулярной единицы вызывает в этой единице наследуемое изменение, яв-
ляется чисто гипотетическим и его довольно трудно обосновать. Тем не ме-
нее несомненно, что любые агенты, действие которых связано с ионизацией,
действуют в ограниченном объеме. Поэтому, в чем бы ни заключалась при-
чина мутации, то, что первоначальный источник энергии представляет
собой ионизирующее излучение, обусловливает местный характер эффекта.
Таким образом, мы можем с полным основанием считать, что гены занимают
объем, соответствующий объему молекулы с молекулярным весом 300 000,
и что их число представляет собой величину порядка 1000. Однако не сле-
дует относиться к этим цифрам догматически, учитывая, что точное значе-
ние приведенных величин не может быть установлено, пока не будет понят
механизм мутаций, вызываемых ионизирующим излучением.

Другое интересное исследование, проведенное с помощью ионизирую-
щего излучения, было осуществлено Преером в связи с изучением фактора
«каппа» у парамеции. Фактор «каппа» представляет собой внеядерный
агент, который совместно с соответствующими генами обусловливает способ-
ность парамеции производить токсичные вещества, летальные для других
организмов. Преер установил, что активность фактора «каппа» снижается
до 37% по сравнению с ее первоначальным значением в результате облуче-
ния дозой рентгеновских лучей, равной 3500 г. Отсюда он сделал вывод,
что чувствительный к облучению объем должен быть довольно большим.
Последующие исследования с помощью микроскопа подтвердили это. Грей
получил для диаметра объема, чувствительного к излучению, величину
1,15 р. Эта величина меньше, чем размеры наблюдаемой частицы. Нет со-
мнений, что точные исследования фактора «каппа», основанные на примене-
нии излучения, дали бы очень много сведений о его внутренней структуре.

Другим важным направлением, связанным с применением ионизирую-
щего излучения, явилось определение размеров вирусов. Наиболее важный
этап в развитии этих работ, которые велись в различных местах, наступил
в период второй мировой войны. В условиях военного времени ученые раз-
ных стран были разобщены и нередко проводили аналогичные исследова-
ния независимо друг от друга. В результате работ Гауэна, Луриа и Эксне-
ра в США, Холлвека и Лакассаня во Франции, Ли и Салзмана в Англии
были созданы основы метода определения размера и — до некоторой сте-
пени — структуры вирусов. Один из первых обзоров на эту тему, в котором
имеется описание очень простого метода облучения вирусов в растворе
путем растворения радона, был опубликован Боне-Мори [10]. Он показал,
что между сечением инактивации вирусной частицы и ее размерами суще-
ствует вполне определенная зависимость. В следующем разделе мы остано-
вимся на размерах и структуре вируса более подробно, принимая во внима-
ние самые последние данные.

4.	Применение ионизирующего излучения для изучения строения виру-
сов. В результате открытий, сделанных за последние 20 лет, в настоящее
время сведения о вирусах далеко не исчерпываются утверждением, что
они являются «инфицирующими агентами». Рассмотрим хорошо известный
вирус животных — вирус ньюкастльской болезни (ВНБ), вызывающий очень
серьезную форму гриппа у цыплят. Эта болезнь наводила ужас на ферме-
ров, занимающихся разведением домашней птицы, до тех пор, пока не была
получена эффективная вакцина. Известны следующие свойства ВНБ:

1)	способность размножаться на хориоаллантоисной оболочке зароды-
ша цыпленка, а также на клеточных пластах в культуре ткани, на которых
бляшки особенно хорошо заметны;
2)	способность агглютинировать эритроциты,

3)	способность лизировать эритроциты;

4)	способность соединяться со специфическим антителом;

5)	способность вызывать образование антител в организме животного.
Это далеко не полный перечень известных свойств этого вируса, однако

для начала мы можем им ограничиться.

Первое из этих свойств, называемое просто инфекционностью, может
быть в значительной мере ослаблено при действии излучения. Уменьшение

Ф и г. 177. Изменение сечения инак-
тивации вируса ньюкастльской болезни
в зависимости от плотности ионизации.

— без учета действия б-лучей; II — после
внесения поправки на б-лучи. Две области
чувствительности, обнаруживаемые на гра-
фике, соответствуют особенностям строения

инфекционности при облучении рент-
геновскими или у-лучами Со60 проис-
ходит по хорошо известном1/ логариф-
мическому закону. Объем инактива-
ции, определенный с помощью мето-
дов, описанных в гл. X, равен 1,27х
X 1 (Г16 см3. Если считать в первом при-
ближении эту область сферической,
то дл я ее радиуса получается значение
310 А. Это значительно меньше, чем
величина 550 А, полученная с по-
мощью электронного микроскопа. По-
видимому, это указывает на то, что ви-
русная частица обладает в какой-то
степени дифференцированной внутрен-
ней чувствительностью. Содержание
РНК в вирусной частице обычно со-
ставляет 3% ; совершенно очевидно, что
между количеством РНК и уменьше-
нием размеров области, чувствитель-

ЕИруса-	ной к облучению, имеется определен-

ная связь (при этом известно, что если
вся РНК собрана в центре вирусной частицы, то размер радиуса занимаемого
ею объема равен 170 А). Эта корреляция между содержанием нуклеиновой
кислоты и чувствительностью к облучению, на которую впервые указал
Эпштейн, в первом приближении обычно выполняется (хотя существуют
и исключения из этого правила) и представляет большой интерес для иссле-

дователя.

В дальнейшем для изучения этой дифференцированной чувствительно-
сти были использованы два метода. Первый заключается в облучении части-
цами с различной плотностью ионизации, с тем, чтобы оценить сечение чув-
ствительной1 области при большой плотности ионизации. Первые экспери-
менты такого рода были выполнены Возе и одним из авторов этой книги.
Наиболее же полные измерения были произведены Вилсоном. Его резуль-
таты, приведенные на фиг. 177, показывают, что при большой плотности
ионизации чувствительность описывается уравнением

1п -5П,
«о

где 5 — сечение, а О — доза, выраженная в числе частиц на 1 слг.
Как видно из фиг. 177, вычисленное сечение изменяется довольно
сложным образом. По-видимому, существуют два уровня чувствительности:
первый, соответствующий сечению 3,5-10-11 слг2, и второй, для которого
сечение достигает значения 10-1СГ11 см2. Объем чувствительной области
можно оценить по начальному наклону кривой при малых плотностях иони-
зации (пунктирная прямая на графике) с помощью уравнения (10.6). При
этом величина I равна произведению О (дозы на единицу площади) и плот-
ности ионизации на 1 см2. Показанное на фиг. 177 «сечение» равно в этой
области чувствительному объему, умноженному на плотность ионизации.
Однако использование теории мишени будет иметь смысл лишь после того,
как будет понят сложный ход кривой при больших плотностях ионизации,
которым мы теперь и займемся.

Одна очень простая и тривиальная причина, обусловливающая кажу-
щееся увеличение сечения при больших плотностях ионизации, заклю-
чается в том, что только часть энергии выделяется на треке. Значительная

часть энергии может передаваться на
вдали от трека ионизирующей части-
цы. Один из способов внесения поправ-
ки, учитывающей это явление, был
описан в гл. X. Ли предложил другой
метод, более удобный при больших
чувствительных объемах. Однако
и после внесения поправки остается
заметное плато при 2,5-1СГ11 см2, за
которым следует подъем при более
высоких скоростях потери энергии.
В связи с этим можно предположить,
что вирус имеет малочувствительную
внешнюю оболочку и значительно
более чувствительную внутреннюю
область, которая, по-видимому, пред-
ставляет собой нуклеопротеидную час-
тицу, имеющую плотную структуру.

Очень интересный метод изучения
зависимости чувствительности вирус-
ной частицы от глубины проникнове-
ния излучения в ее структуру заклю-

треках вторичных электронов, т. е.

Фиг 178 Относительная чувстви-
тельность вируса ньюкастльской болез-
ни при облучении электронами различ-
ной энергии (т. е. различной проникаю-
щей способности).

Из графика следует, что чувствительная
внутренняя область окружена малочувстви-
тельной оболочкой.

чается в бомбардировке препаратов вирусов электронами малой энергии.

Более подробно этот метод, впервые предложенный Хатчинсоном, будет

описан в разд. 6 этой главы. В тех случаях, когда можно получить очень
стойкие препараты вируса в виде монослоев, инфекционность которых
при высушивании падает не очень сильно, можно производить облуче-
ние электронами столь низкой энергии, что они могут проникать только
в верхние слои поверхности вируса. Увеличивая энергию электронов, мы
увеличиваем глубину проникновения до тех пор, пока не достигнем чувстви-
тельной области (если таковая существует). При проникновении в чувстви-
тельную область эффективное сечение для электронов резко возрастает.
Результаты подобных экспериментов, полученные Вилсоном, приведены
на фиг. 178. Как показывают эти данные, электроны низкой энергии оказы-
вают очень слабое влияние до тех пор, пока глубина проникновения не
достигает 250 А. После этого эффективность электронов значительно увели-
чивается. Зависимость эффективности электронов от их энергии и, следова-
тельно, от глубины, на которую они проникают в белок, изучала Дэвис.
Полученные ею данные позволяют оценить глубину проникновения элек-
тронов в вирусную частицу. Эти результаты показывают, что в центре
вирусной частицы имеется чувствительная область, радиус которой равен
280 А, окруженная менее чувствительной областью, толщиной 230 А. Таким
образом, полный радиус вирусной частицы равен 510 А.
Рассмотрим теперь другие свойства выбранного нами вируса. Особенно
интересна его способность агглютинировать эритроциты. Установлено, что
подавить эту способность путем облучения- очень трудно — во много раз
труднее, чем уменьшить инфекционность вируса. Исследования Возе пока-
зали, что способность к агглютинации связана со структурной единицей,
имеющей эффективный молекулярный вес 500 000. Одновременно Возе
определял, как действует облучение на способность вируса соединяться

с антителом (как известно, в результате

560А

1020А

250А

' Гемагглютинин

80А

Гемолизин

Оболочка,
устойчивая
к облучению

Фиг. 179. Схематическое изображение вируса
ньюкастльской болезни, основанное на резуль-
татах радиационных исследований.

Центральная чувствительная область окружена областью,
в которой находятся структуры, обусловливающие спо-
собность вируса агглютинировать эритроциты и визы-

такого соединения вирус теряет

Область,чувствитель'
пая к облучению и опре-
деляющая инфекционность

вать их лизис.

способность агглютинировать
эритроциты). Было установле-
но, что чувствительность ви
руса в этом отношении ровно
вдвое меньше чувствитель-
ности его агглютинирующей
способности. Поэтому есть ос-
нование считать, что агглю-
тинация обусловлена двумя
субъединицами вируса, распо-
ложенными приблизительно
друг против друга, которые,
следовательно, могут созда-
вать связь между двумя эри-
троцитами. С помощью имею-
щихся данных трудно оценить
число таких единиц.

Интересно, что Баззел,
Брэндон и Лоффер установи
ли, что чувствительная об-
ласть вируса гриппа занимает
приблизительно 1/8 вирусной
частицы и что чувствительный

радиус гемагглютинина равен
95 А при числе субъединиц,

равном трем. Это также указывает на то, что способность к агглютина-

ции связана приблизительно с двумя субъединицами.

Перейдем к работам по изучению способности ВНБ лизировать эри-
троциты цыпленка. Вилсон установил, что при облучении, достаточном для
того, чтобы полностью подавить способность вируса лизировать эти клетки,
кривая инактивации соответствует многоударному процессу (необходимо
около 15 попаданий). Наклон кривой при малых плотностях ионизации,
с помощью которого можно определить объем чувствительной области,
соответствует значению молекулярного веса 350 000. Применяя бомбарди-
ровку частицами, вызывающими большую плотность ионизации, Вилсон
установил, что сечение при этом больше, чем можно было бы ожидать для
измеренного объема чувствительной области. Он пришел к выводу, что
способность к гемолизу связана с молекулами, имеющими форму дисков,
число которых равно приблизительно 15. Эти молекулы распределены
по поверхности вирусной частицы. Изображение ВНБ, составленное с уче-
том всех рассмотренных факторов, приведено на фиг. 179. Читатель должен
помнить, что такая картина носит лишь умозрительный характер. Напри-
мер, сейчас нет никаких оснований утверждать, что гемолизины не сосре-
доточены на одной стороне вирусной частицы. На схеме они размещены,
таким образом, чисто произвольно. Однако вполне вероятно, что число этих
частиц велико и что они выглядят приблизительно так, как мы их изобра-
зили.

Изучение ВНБ с помощью электронной микроскопии было проведено
Морганом, Роузом и Муром. Они показали, что размеры вирусной части-
цы значительно больше, чем следует из экспериментов по облучению. Инте-
ресно, что в сечении вирусной частицы как будто обнаруживаются два
кольца. Возможно, что внутренняя область определяет инфекционность
вируса, а внешнее кольцо состоит из вещества, обусловливающего способ-
ность вызывать агглютинацию и лизис эритроцитов.

Бактериальные вирусы служат удобными объектами для изучения
с помощью ионизирующего излучения. Очень легко проводить исследова-
ния на бактериофаге Т1 (развивающемся на Е. соН) благодаря его высокой
стабильности в сухом виде. Используя ионизирующее излучение, можно изу-
чать многие свойства вируса. Ниже мы приводим перечень уже изученных
свойств (многие исследования в этой области были проведены авторами
книги):

1)	способность заражать бактерии и образовывать бляшки в чашках
с культурой растущих бактерий;

2)	способность соединяться с антителом;

3)	способность прикрепляться к бактерии;

4)	способность вызывать гибель клетки-хозяина;

5)	способность передавать генетические маркеры другому штамму
вирусов (если бактерии заражены обоими штаммами вирусов);

6)	способность вызывать синтез специфического белка.

Чувствительность всех этих свойств по отношению к действию облуче-
ния совершенно различна. Способность фага заражать бактерии и способ-
ность вызывать гибель клетки-хозяина при облучении различными видами
излучения изменяются одинаково. При этом в обоих случаях при бомбарди-
ровке быстрыми электронами чувствительный объем инактивации мал,
а при облучении плотно ионизирующими частицами сечение увеличивается
довольно неравномерно. Чувствительность ВНБ к излучению в отноше-
нии способности вызывать гибель клетки-хозяина примерно в три раза
меньше, чем в отношении инфекционное™ этого вируса. Пожалуй, эти
данные можно наилучшим образом объяснить, предполагая, что чувстви-
тельная часть вируса, ответственная за оба свойства, представляет собой
длинную тонкую структуру с диаметром меньше 50 А, а длина равна при-
близительно 3000 А в случае йнфекционности и 1000 А для способности вызы-
вать гибель бактерии.

Совершенно иначе изменяется под действием облучения способность
соединяться с антителом у фага Т1. Для того чтобы наблюдать в этом слу-
чае какой-либо эффект, нужно облучать эти вирусы очень большой дозой.
Проведенные исследования приводят к выводу, что способность соединять-
ся с антителом связана со свойствами поверхности многих малых частиц.
Способность вирусной частицы прикрепляться к клетке-хозяину также
изменяется при облучении относительно мало, хотя и в большей степени,
чем способность соединяться с антителом. Согласно существующему пред-
ставлению о том, что бактериофаги прикрепляются к бактериям своими
отростками, следует считать, что структурная единица, определяющая спо-
собность вирусной частицы к прикреплению, представляет собой часть
кончика отростка.

Способность этих бактериальных вирусов передавать свои генетические
маркеры очень чувствительна к облучению. Тилл [11] установил, что чув-
ствительность в этом случае составляет 60% по сравнению с чувствительно-
стью в отношении инфекционное™. Это свидетельствует о присутствии в
нити какого-то чувствительного материала, ответственного за генетические
свойства. Если происходит разрыв этой нити или образование поперечных
связей, то передача генетической информации другому вирусу становится
невозможной. Шестое свойство — способность вызывать
синтез вирусного (чужеродного) белка — также очень чув-
ствительно к действию облучения. Уитмор [12] нашел, что
чувствительность в этом случае составляет примерно 40%
от полной чувствительности в отношении образования
бляшек.

Фаг Т1 был выбран для изучения зависимости инфек-
ционное™ от облучения электронами малой энергии. Это
объясняется тем, что он очень чувствителен к облучению
и что его легко получить в сухом виде. Соответствующее
исследование провела Дэвис [13]. Она установила, что эф-
фект очень мал до тех пор, пока напряжение не достигнет
990 в, что соответствует проникновению электронов на 125 А.
Отсюда можно сделать вывод о том, что у фага Т1 также
имеется нечувствительная внешняя оболочка. Подобные
оболочки были обнаружены у ВНБ (см. выше), а также у
фага Т2 (Херши). Толщина отростка вирусной частицы,
измеренная под электронным микроскопом, равна 150 А-
Следовательно,. в отростке нет инфекционного матери-
ала, так как электроны могут проникать более чем на поло-
вину его толщины, не вызывая при этом никакого эф-
фекта.

На фиг. 180 схематически изображен фаг Т1 на осно-
вании данных о структуре вирусной частицы, полученных
с помощью электронного микроскопа.

ДНК вируса состоит из двух частей: одна из них
определяет способность вызывать гибель бактерии и синтез
вирусного белка, другая же связана с генетическими свой-
ствами, а также, как предполагают, со способностью к реп-
ликации. Способность вируса соединяться с антителом
(охарактеризованная количественно Сетлоу и Поллар-
дом, которые определяли способность облученного вируса
блокировать антисыворотку) зависит, по-видимому, от тех
мелких структурных единиц, из которых построена бел-
ковая оболочка вируса (см. фиг. 180).

В заключение приведем табл. 27, в которой суммирована значительная
часть данных, полученных при исследованиях вирусов с применением иони-
зирующего излучения. Хотя эта таблица дает представление об объеме
полученной информации, многие из этих результатов еще нуждаются в под-
тверждении (или в опровержении) другими методами. Таким образом,
в молекулярной биологии радиационные методы не отстают от других мето-
дов исследования.

5. Действие облучения на бактерии. Простота строения вируса делает
его очень привлекательным объектом для биофизического исследования,
однако необходимо помнить, что по-настоящему вирус становится интерес-
ным только тогда, когда он начинает взаимодействовать с клеткой-хозяи-
ном и когда весь интерес, по сути дела, сосредоточивается именно на клетке-
хозяине. Таким образом, несмотря на то что клетка значительно сложнее

Ф и г. 180.

Схематическое
изображение
фага Т1, осно-
ванное на ре-
зультатах ра-
диационных ис-
следований.

/ —'единица, обу-
словливающая се-
рологическую ак-
тивность; 2-—спи-
рализованная еди-
ница, ответствен-
ная за реплика-
цию; 3 — часть,
вызывающая ги-
бель бактерии;

4 — единица, обу-
словливающая
способность фага
прикрепляться к
клетке-хозяину и
проникать в нее.
Характеристика вирусов на основании их инактивации облучением

Название вируса	Свойство	Размеры чувствительной области				Эквива- лентный мол. вес	Источ- ник дан- ных
		объем, А3	длина, А	толщина, А	радиус, А		
	Инфекционность	3,8-107	420	420	—	З-Ю7	[И]
Вирус гриппа	Интерференция	2-106	250	40	—	1,6-108	[15]
	Г емагглютинация	3,4-105	140	21	—	190 00С	[14]
	Инфекционность	—	—	—	280	8-Ю7	[16]
	Г емагглютинация	5,8-105	—	50	—	44-105	[18]
ВНБ	Гемолиз ....  Способность со-  единяться с сы-	—	—	20	120	7-Ю5	[17]
	воротной . . .	—	—	—	—	2,2-105	[18]
Вирус полио- миелита	Инфекционность	—	—	—	140		[22]
втм	Инфекционность  Способность со-  единяться с ан-	3,1-107	3070	100	—	—	[19]
	тителом ....	—	—	—	8	—	[21]
Вирус южной мозаики фа-	Инфекционность  Способность со-  единяться с ан-	3,4-10в	—	—	—	—	[20]
СОЛИ	тителом ....	—	—	—	11	6 000	[21]
Вирус осповак-	Инфекционность	—	—	—	240	—	[27]
ЦИНЫ	Г емагглютинация	•—	—	—	45	—	[27]
	Инфекционность  Способность при- крепляться к	1,9-10°	(Длин- ный)	(Тонкий)	—-	—	[23]
	клетке-хозяину  Способность выз- вать гибель бак-	—	177	504	—	326 000	[25]
Фаг Т1	терии ....  Длительность латентного пе-	0,6-10°	(Длин- ный)	(Тонкий)		—-	[24]
	риода 	  Способность со- единяться с сы-	1,9-10°	—	—	—	—	[23]
	вороткой . . .	—	86	22	—	25 000	[26]
вируса, мы должны начать изучение именно с нее, даже если нас интере-
сует только вопрос о деятельности вируса. Использование ионизирующей
радиации в последних работах, проведенных на бактериях и клетках мле-
копитающих в культуре ткани, дало много ценных сведений о клетке.

В этом и следующем разделах мы

Ф и г. 181. Действие у-лучей на вклю-
чение меченого пролина в суммарную
и кислотонерастворимую фракцию
Е. соИ.

А — необлученные клетки; Б — клетки, облу-
ченные дозой 317 000 г; В — клетки, облучен-
ные дозой 950 000 г. 1 — включение в суммар-
ную фракцию; 11 — включение в< кислотоне-
растворимую фракцию.”

коротко расскажем об экспериментах
такого рода и о некоторых вытекаю-
щих из них выводах.

Интенсивно исследовалось влия-
ние ионизирующего излучения на две
функции бактериальных клеток: спо-
собность к делению и образованию ко-
лоний на агаре и способность к росту,
о которой можно судить по рассеянию
света. Первая функция более чувстви-
тельна к облучению. Однако процесс
поражения нельзя в этом случае опи-
сать с помощью представления об од-
ной большой мишени. Известно, что
чувствительность к облучению сильно
зависит от культуральной среды. Это
не удивительно, поскольку в клеточ
ном делении участвует много различ-
ных процессов и, следовательно, дол-
жно существовать множество уязви-
мых мест. Пока эти эффекты недоста-
точно хорошо поняты, было бы прежде-
временным делать далеко идущие
выводы на основе изучения образова-
ния колоний на поверхности питатель-
ной среды.

Рост клеточной массы, измеряемый
обычно по оптической плотности при
помощи обычного спектрофотометра,
значительно менее чувствителен к

облучению, чем деление. Суспензия
клеток, в которой способность обра-
зовывать колонии понизилась под дей-
ствием облучения в тысячи раз, сохра-
няет способность к росту. Такой рост
приводит к образованию в основном
клеток уродливой вытянутой формы.
На конце одной из таких «нитей»
обладающая способностью
Совершенно очевидно, что
облучению, чем процесс

может случайно возникнуть нормальная клетка,
делиться и образовывать нормальные колонии.

процессы синтеза и роста менее чувствительны к

деления клетки.

Упомянутые исследования касаются интегральных характеристик кле-
точных процессов. Для получения заметного эффекта облучения (влияние
на способность клетки к включению специфических аминокислот или
оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот, а также к усвоению
глюкозы) необходимы очень высокие дозы. На фиг. 181 приведены кривые
зависимости включения радиоактивного пролина в клетки Е. соИ от дозы
при облучении Со60, полученные Кемпнером. Верхние кривые показывают
общее количество аминокислоты, включающейся в бактериальную клетку.
Нижние же кривые показывают количество аминокислоты, включившейся
в кислотонерастворимую фракцию клетки (растворитель — холодная три-
хлоруксусная кислота, ТХУ). Можно видеть, что даже после облучения
дозой в 10е г происходит заметное включение пролина во фракцию, нераство-
римую в холодной ТХУ, т. е. можно предположить, что пролин включается
в какие-то крупные молекулы. Клеточные структуры, ответственные за
включение пролина, как следует из этих результатов, по-видимому, сравни-
тельно невелики. Кемпнер провел сравнительное исследование влияния у-
лучей, дейтронов и а-частиц на включение в клетки различных аминокислот
и урацила, а также на усвоение глюкозы. Как было указано в предыдущей
.главе, из данных по облучению -у-лучами можно определить величину
чувствительного объема, а используя излучение с большой плотностью
ионизации, можно получить представление о площади и толщине этого
объема. Исследование показало, что в случае глюкозы, урацила и метионина
площадь мишени получается приблизительно такой, как можно было ожи-
дать, исходя из представления о сферической мишени, в то время как для
включения других аминокислот площадь мишени получается значительно
меньшей, а толщина — гораздо большей, чем можно было бы ожидать, счи-
тая мишень сферической. В табл. 28 приведены значения объема, толщины
и линейных размеров мишеней для включения упомянутых веществ. Есте-
ственно предположить, что длинные и тонкие мишени — это рибонуклео-
протеидные молекулы в развернутом виде, а сферические мишени — те же
рибонуклеопротеидные нити, свернутые в компактную форму. И те и дру-
гие, вероятно, представляют собой структуры, входящие в состав рибосом.

Таблица 28

Размеры мишеней для включения различных веществ

Соединение	Объем, 10-18 СМ$	Длина, р	Радиус, А
Глюкоза *			5,9	—	80
Урацил *		15,1	—	155
Метионин *	 .	10,0	—-	130
Пролин 		8,6	1,8	12,2
Аргинин ...			5,3	1,5	10,5
Гистидин 		4,8	1,0	12,2
Лейцин 		5,6	1,5	10,9
Изолейцин 		6,9	0,94	15,5

* Молекула имеет сферическую форму.

Изучение действия ионизирующего излучения на жизнедеятельность
клетки можно проводить с помощью различных вариантов метода меченых
атомов, подробно описанного в гл. XIII. Легче всего изучать включение
какого-либо простого метаболита, например фосфата или сульфата. Резуль-
таты такого исследования, проведенного на Е. соИ, показаны на фиг. 170.
В данном случае представляют интерес два факта. Первый заключается
в том, что некоторое время после облучения в поведении клетки незаметно
каких-либо изменений, котовые можно было бы обнаружить по включению
меченого метаболита. Затем, как было замечено Вилленом, происходит
20 Заказ №1168
довольно резкое изменение, которое наступает тем раньше, чем больше была
интенсивность облучения. Это изменение состоит в том, что включение
происходит теперь по линейному, а не по экспоненциальному закону, при-
чем наклон линейного участка тем меньше, чем выше доза облучения. Это хо-
рошо видно из кривых, приведенных на фиг. 170. На кривой, построенной
на основании данных по включению сульфатов, перелом наступает несколь-
ко раньше, чем на кривой для включения фосфатов; линейные же участки
в обоих случаях параллельны друг другу. Вторым интересным фактом

является довольно высокая чувствительность скорости включения этих

Ф и г. 182. Влияние рентгеновских
лучей на индукцию синтеза лизинде-
карбоксилазы.

простых метаболитов к облучению; эта
чувствительность значительно превы-
шает чувствительность скорости вклю-
чения отдельных аминокислот, однако
она несколько ниже, чем чувствитель-
ность способности образовывать коло-
нии. Представляется вполне вероятным,
что облучение разрушает какую-то орга-
низованную систему в клетке (какую
именно, в настоящее время еще не из-
вестно). Можно предположить, напри-
мер, что нарушается сложная фермент-
ная система, восстанавливающая пли
активирующая включаемое вещество,
или ядерная оболочка.

Несколько раньше и параллельно
этим исследованиям Биллей, Степлтон
и Холлендер [28] сделали очень инте-
ресные наблюдения, касающиеся влия-
ния облучения на дыхание Е. соИ.
Оказалось, что облучение очень слабо

отражается на дыхании. Это говорит о юм, что функция дыхания осу-
ществляется очень многими единицами сравнительно небольших размеров,

распределенными по всему объему клетки.

Все описанные до сих пор эксперименты касались роста, деления, вклю-
чения радиоактивной метки или дыхания. При изучении образования адап-
тивного фермента наблюдают за суммарным синтезом используемого белка.
Впервые такие исследования провели Биллен и Лихтштейн [29], изучав-
шие влияние облучения на синтез гидролазы муравьиной кислоты в клет-
ках Е. соН и установившие, что 37-процентная доза1 составляет 30 000.
Очень тонкие измерения влияния излучения на синтез лизиндекарбоксил-
азы в В. сайаиепз выполнили Паули, Раевский и Букер. На фиг. 182 приве-
дены некоторые из полученных ими результатов. Можно видеть, что для
снижения уровня синтеза до 37% от нормы требуется весьма значительная
доза излучения, равная приблизительно 70 000 г. Хотя эта цифра значи-
тельно превышает величину дозы, достаточной для прекращения деления,
она все-таки несколько меньше, чем величины доз, необходимых для пода-
вления включения аминокислот, найденные Кемпнером. Поллард и Вег-
лер исследовали влияние у-лучей на синтез р-галактозидазы. Они показали,
что существенное значение имеет при этом время, прошедшее после облу-

1 37-процентной называется доза, снижающая рассматриваемую функцию в «е»
(основание натуральных логарифмов) раз, т. е. до 37% нормы; при этом величина
IV или 80 равна единице.— Прим. ред.
чения. Синтез этого фермента можно изучать либо на бактериях, которые
росли на лактозе и приобрели способность синтезировать (3-галактозидазу,
либо на бактериях, которые первоначально росли на глюкозе и должны
испытать процесс индукции, прежде чем они смогут синтезировать этот
фермент. В первом случае немедленное влияние облучения на процесс синте-
за незначительно: для получения немедленного эффекта требуются, по-
видимому, дозы того же порядка, что и для подавления способности к вклю-
чению аминокислот. Однако сказанное справедливо лишь для измерений,
проводимых непосредственно при облучении или вскоре после него. Если
же измерять количество синтезируемого клеткой фермента спустя некото-
рое время после облучения, то эффект облучения оказывается весьма значи-
тельным. При адаптации клеток к новому источнику углерода синтез
нового фермента первое время после облучения также изменяется незна-
чительно, однако спустя три часа после облучения дозой 45 000 г наступает
резкое подавление этого синтеза.

То, что действие облучения наступает лишь спустя некоторое время,
разумеется, требует объяснения. Руководствуясь принятым в настоящее
время представлением о том, что носителем генетической информации в клет-
ке является ДНК и что с ДНК эта информация каким-то образом передает-
ся на РНК, а РНК управляет синтезом ферментов, использующихся в даль-
нейшем для осуществления процессов обмена и различных синтезов, мы
можем шаг за шагом проследить, что происходит в клетке после облучения.
Мы будем исходить из того, что большое количество энергии, выделяющееся
при ионизации, разрушает некоторую молекулярную систему, случайно
оказавшуюся в этом месте, однако структуры, находящиеся в других мес-
тах, остаются при этом незатронутыми. Изучая инактивирующее действие
облучения на уже готовый фермент по изменению его активности в отно-
шении некоторого субстрата, мы получим очень большие значения для
дозы, дающей заметный эффект (3-10® г). Это позволяет думать, что такие
малые дозы, как 50 000 г, не оказывают влияния на функцию отдельного
фермента и что действие излучения на отдельный фермент, по-видимому, не
связано с задержкой во времени. Вернемся теперь немного назад и заметим,
что повреждение системы, ведущей синтез белка, приводит к запаздываю-
щему воздействию на суммарную ферментативную активность клетки. При
таком повреждении количество новых ферментов, образующихся в клетке,
уменьшится, однако на клеточных процессах это скажется лишь спустя
некоторое время, определяемое скоростью белкового синтеза. Проведен-
ные недавно исследования показывают, что скорость этого синтеза в бакте-
рии такова, что новая молекула белка синтезируется за время, меньшее
1 мин. Более длительные задержки действия облучения, таким образом,
не согласуются с этим значением времени синтеза молекулы белка. Пони-
жение включения аминокислот после облучения происходит обычно за вре-
мя, меньшее 10 мин, поэтому естественно заключить, что действие облуче-
ния на этот процесс связано с поражением механизма синтеза белка. Мы
с удовольствием отмечаем, что с таким предположением хорошо согласуют-
ся данные табл. 28.

Запаздывание же действия облучения, измеряющееся минутами или
часами, должно быть обусловлено повреждением какой-то другой системы.
Попробуем теперь объяснить существование долгих задержек на основе
процесса передачи информации от ДНК к РНК, а также самого процесса
синтеза ДНК- Оба эти процесса лежат в самом начале цикла остальных
клеточных процессов и поэтому могут проявляться с большой задержкой.
Синтез ДНК замедляется уже при облучении сравнительно. небольшими
дозами (табл. 29). Исходя из этого факта можно построить теорию, объясня-
ющую запаздывание действия облучения на клетку. Корнберг с сотрудни-
ками [30] показал, что ДНК синтезируется с помощью сравнительно про-

Фиг. 183. Включение Р32 и 835 в необ-

лученные и облученные клетки.

Скачла различие отсутствует, затем вклю-
чение в облученные клетки происходит по
линейному закону.

(36 000 г) клетки от времени (фиг
о соотношении количеств ДНК в

стого фермента полимеразы. Но так
как известно, что малые дозы не влия-
ют на функцию отдельного фермента
высокая чувствительность синтеза
ДНК к облучению кажется удивитель-
ной. Можно предположить, что эта чу-
вствительность обусловлена разруше-
нием уже построенной ДНК, что при-
водит к синтезу измененной ДНК и,
следовательно, отражается на пере-
даче информации от ДНК к РНК-
Важным доказательством влияния
излучения на клеточные процессы
являются результаты, полученные
Поттером и его группой [31], прово-
дившими исследования с синхронизо-
ванными клетками регенерирующей
ткани печени крысы. Для иллюст-

рации наблюдавшихся ими задержек
мы приводим кривые зависимости
включения меченого фосфата и суль-
фата в необлученные и облученные
183). В табл. 29 приведены данные
облученных и контрольных клетках

в различное время после облучения различными дозами, полученные Пол-
лардом и Веглером.

Таблица 29

Зависимость отношения количеств ДНК в облученных и необлученных клетках Е. соИ
от времени после облучения и от дозы

Время, мин  Доза, г	0	30	60	90	120
13 000	1	0,96	0,84	0,85	0,83
21 000	1	1,00	0,87	0,73	0,59
26 000	1	0,90	0,84	0,80	0,61
39 000	1	0,90	0,60	0,62	0,49
52 000	1	0,90	0,80	0,78	0,58
78 000	1	0,92	0,77	0,46	0,42

В табл. 30 собраны результаты исследований влияния ионизирующего
излучения на различные функции клетки. В этой таблице приведены объемы
мишеней, связанных с нарушением различных функций клетки. Для сравне-
ния под таблицей указаны объемы некоторых клеточных структур. Кроме
того, приводятся данные для запаздывающих эффектов. В настоящее время
еще нельзя дать ясную интерпретацию полученных экспериментальных
результатов. Наиболее чувствительная область, при поражении которой
нарушается функция деления, по-видимому, связана с элементами структу-
ры клеточного ядра. Радиационные исследования заставляют предполагать,
что в ядрах (даже бактериальной клетки) имеется довольно тонкая структу-
ра, разрушение которой вызывает подавление деления и может также при-
водить к освобождению профага из бактериальной хромосомы. Вместе с тем
ясно, что существует резкое отличие между чувствительностью ДНК,
находящейся внутри клетки (выражающееся в изменении биологической
активности клетки), и чувствительностью ДНК как трансформирующего
начала при облучении ее вне клетки. Объяснение этого несоответствия
представляет собой одну из задач радиобиологических исследований. В клет-
ках бактерий меньших размеров объем чувствительной области (мишени)

Таблица 30

Чувствительность различных свойств бактерии Е. соИ к действию
ионизирующего излучения

Свойство	Чувствитель- ный объем, СМ%	Предполагае- мая форма	Предполагаемая клеточ- ная структура
Образование колоний	  Чувствительность к заражению	8,5Ю-1в	Нить	Ядерная мембрана, или часть ДНК
фагом Т1	  Чувствительность к заражению фа-	1,73-10-17	»	Часть ДНК
гом Т2		1,2-10-18	»	Часть ДНК
Освобождение профага	4-10-18	»	Ядерная оболочка или часть ДНК
Включение Р32 с задержкой . . . Включение 8О4 на поздних ста-	1,4-10218	Неясна	
днях после облучения .... Включение аминокислот сразу	9,5-10-17	Нить	
после облучения 	  Усвоение глюкозы сразу после об-	5-10-18	»	«Несвернутая» рибо- сома
лучения 		6-'10-18	Сфера	Рибонуклеопротеид- ная частица
Дыхание спустя два периода де-			•
ления 	  Образование адаптивного фермента	7,2-10-18	—	Группа ферментов?
с задержкой  Ферментативная активность р-га-	95-10-17	—	Часть ДНК?
лактозидазы 		4,3-10-1»	Близка к сфе- рической	Молекула фермента

Для сравнения: обший объем клетки 1,5-10_12 см3;
объем ДНК	5,0-10—15 см3;

объем ядра	1,1-10—13 смз-

объем одной рибосомы 4-10-18 см3.

довольно близок к объему ДНК- Интересно, что чувствительная область,
связанная со способностью заражаться бактериальным вирусом, имеет
другой объем. В случае бактериофага Т2 эта область составляет очень малую
часть клетки, тогда как для фага Т1 она имеет значительно большую величи-
ну. Это, очевидно, связано с аномальными свойствами нуклеиновой кисло-
ты фага Т2, которая, по-видимому, сама в состоянии проводить большую
часть необходимых для синтеза фага процессов, в то время как для синтеза
фага Т1 требуется участие большого числа различных синтетических меха-
низмов клетки.

Запаздывание реакции клетки на облучение указывает на то, что изме-
нения самых основных процессов воспроизведения в клетке проявляются
не сразу, а спустя некоторое время после действия облучения. Вполне
возможно, что тщательный количественный анализ влияния различных
доз облучения на ход целого ряда клеточных процессов во времени может
дать нам многоценных сведений о природе самих процессов воспроизведения.

6.	Облучение бактерий частицами с ограниченной проникающей спо-
собностью. Метод изучения толщины белковой оболочки вируса, описанный

Фиг. 184. Влияние облучения электронами
низких энергий на выживание спор В. зиЫШз.

в разд. 4 этой главы, может быть очень эффективно использован для опре-
деления локализации различных чувствительных к излучению компонентов
в бактериальных клетках. Сложность задачи заключается в сохранении
жизнеспособности объекта, помещенного в виде монослоя на металличес-
кой пластинке в высокий вакуум. По-видимому, этот вопрос можно разре-
шить единственным путем — использованием в качестве объекта бактериаль-
ных спор. Результаты исследований, проведенных Дэвис и Хатчинсоном
на спорах В. зиЫШз, приведены на фиг. 184. На графиках показано, как
изменяется по сравнению с контролем выживание (способность к обра-
зованию колоний) спор, облученных электронами различной энергии. Ясно
видно, что нормальная логарифмическая зависимость выживания от дозы
наблюдается лишь при энергиях электронов, больших 900 эв. При меньших
энергиях происходит инактивация некоторой части спор и дальнейшее уве-
личение дозы не дает эффекта. Это говорит в пользу предположения о том,
что спору окружает тонкая оболочка, практически нечувствительная к дей-
ствию ионизирующего излучения. Чтобы вызвать радиационное поражение,
частицы должны проникнуть через эту оболочку. Тот факт, что часть спор
инактивируется частицами меньшей энергии, говорит либо о неоднородности
популяции, либо о том, что в каждой клетке есть участок, отличающийся
по чувствительности от остальной части клетки. Это предположение мож-
но пояснить следующим образом. Допустим, что в одном месте толщина
устойчивой к облучению оболочки меньше, чем в других местах. Так как
споры расположены хаотически, у части из них тонкий участок будет

Фиг. 185 Предполагаемая структура споры
В. быЫШб, объясняющая результаты, приведенные
на фиг 184.

Объяснение см. в тексте.

находиться сверху, а у части — снизу. Последние будут защищены от мед-

ленных электронов, в то время как первые будут поражаться. В пользу
того, что такая картина отвечает действи-

тельности, говорит следующий эксперимент.
Если споры после облучения отмыть с под-
ложки, ресуспендировать и снова подвергнуть
облучению, то кривые зависимости выживания
от дозы будут иметь точно такой же вид, как
у исходных спор. Это говорит о том, что ника-
кого отбора по выживанию среди клеток попу-
ляции произвести нельзя.

Изложенные представления о строении
спор В.зиЫШз поясняются схемой (фиг. 185).
Обол очка споры имеет толщину 230 А повсю-
ду, за исключением особой области, где тол-
щина меньше. Внутри споры, по-видимому,
нет структуры, аналогичной хроматиновой
нити или ядру. Это, конечно, не означает,
что в споре нет функциональной единицы,
которая выполняла бы роль ядра. Это говорит
лишь о том, что спора не имеет генетической
области, чувствительной к облучению и ло-
кализованной на хроматиновой нити или в
ядре. Изменения могут возникать при дей-
ствии излучения на любые участки споры

Как было показано в аналогичном ис-
следовании Кнаусса, проведенном на спорах
В. те§а1егшт, не все споры имеют такие
свойства, как споры В. зиЬНИз. В случае
спор В. те§а1ег1шп выживание равномерно
убывает с увеличением энергии электронов
и простой анализ послойного строения невоз-
можен. Толщина оболочки в этом случае,
по-видимому, равна 1500—2000 А.

Фиг. 186. Результаты иссле-
дований Прайса по влиянию
облучения электронами раз-
личной энергии на инвертаз-
ную активность дрожжей.

Отсутствие эффекта при облучении
электронами низких энергий указы-
вает на наличие защитного слоя.
Резкое падение активности начиная
с некоторых энергий свидетель-
ствует о том, что инвертаза распо-
лагается непосредственно за за-
щитным слоем. Прайс считает, что
толщина слоя инвертазы не боль-
ше 500 А.

В то время как сохранение жизнеспособности клеток представляет
собой очень трудную задачу, ферментативная активность многих клеток
при приготовлении из них монослоев и последующем высушивании в вакууме
сохраняется. Работая с большими количествами клеток в вакуумной каме-
ре соответствующих размеров, Прайс исследовал локализацию инвертазы
в дрожжевых клетках. На фиг. 186 показаны результаты его опытов. Прайс
пришел к выводу, что дрожжевые клетки имеют защитную оболочку тол-
щиной около 500 А и что инвертаза заключена в прилегающем к оболочке
слое, также имеющем толщину 500 А. Было найдено, что каталаза распре-
делена в более глубоких слоях клетки, внешняя граница которых нахо-
дится на расстоянии приблизительно 2000 А от поверхности клетки. Ана-
логичные исследования могут быть проведены для изучения локализации
целого ряда ферментов в самых разнообразных клетках.

7.	Изучение ориентации. Если удается ориентировать биологический
препарат, ориентацию внутренней структуры можно изучать с помощью

Ф и г. 187. Влияние изменения ориентации палочек вируса
табачной мозаики по отношению к направлению пучка
частиц на величину сечения инактивации.

1 — вирусная частица может быть наклонена под различными
углами к пучку, и сечение изменяется в зависимости от синуса
этого угла; 2-— никаких изменений сечения при изменении
угла 6 не обнаруживается. Этот эксперимент ясно показывает,
что мишень является реальностью, а не статистическим пара-
метром.

облучения частицами с большой плотностью ионизации. Исследования
такого рода были проведены Уитмором на препарате вируса табачной моза-
ики (фиг. 187). Очевидно, что чувствительная область этой вирусной час-
тицы, имеющей форму длинной и тонкой палочки, также вытянута в длину.
Это подтверждается тем, что сечение инактивации вируса при бомбардиров-
ке а-частицами меньше в случае расположения вирусных частиц вдоль
направления пучка, чем при расположении, перпендикулярном к напра-
влению пучка. Если провести аналогичные опыты с фагами, частицы кото-
рых имеют длинные отростки, то можно обнаружить влияние ориентации
на функции этих отростков. Предварительные результаты показывают,
что инфекционность (способность размножаться в клетке-хозяине) не зави-
сит от ориентации препарата. Возможно, что эта зависимость будет найде-
на при изучении влияния ориентации на множественную реактивацию
или на способность вызывать лизис бактерии.

8.	Заключение. Читатель может спросить, заслуживают ли резуль-
таты описанных в этой главе исследований тех усилий, которые были при-
ложены для их получения. Конечно, по сравнению с той наглядной инфор-
мацией, которую дает электронный микроскоп, результаты, выведенные
косвенным путем из данных эксперимента, выглядят довольно скромно.
Однако следует напомнить, что описанные здесь методы еще только разви-
ваются и что электронная микроскопия достигла такой универсальности
применения, которая далеко превосходит ограниченные попытки приме-
нения методов с использованием ионизирующего излучения. Кроме того,
следует также напомнить, что оба упомянутых метода в значительной сте-
пени дополняют друг друга. Электронная микроскопия не позволяет опре-
делить, какие функции выполняет наблюдаемый структурный элемент;
она может только констатировать факт его существования. Методы с при-
менением ионизирующего излучения, напротив, по самому своему суще-
ству всегда связаны с определением функций тех или других частей орга-
низма. Следовательно, радиобиологические исследования могут давать цен-
ную вспомогательную информацию. К тому же размеры, которые можно
определить, применяя ионизирующее излучение, значительно меньше раз-
меров, определяемых с помощью микроскопа. Таким образом, использова-
ние ионизирующего излучения обладает большими потенциальными возмож-
ностями и этот метод представляет собой одно из наиболее плодотворных
направлений в биофизике.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	Р о 1 1 а г й Е. С., «1огпх1п§ РаЛаНоп Ме1коЙ8 Тог Ве1егпип1п§ В1о1о§1са1 8<гис-
1пге», РгосееЛп§з о! Нелу Уогк Асайету о! Зс1епсез, 59, 469 (1955).

2.	Р о 1 1 а г й Е. С., «1ош2ш§ РаЛаНоп апй Уйизез», Айу. У1гиз Резеагск, II,
109 (1954)

3.	Р о 1 1 а г й Е. С., «Изе оГ 1оп1г1п§ РаЛаНоп (о 81ийу У1Ш8 81гис1иге», 1РЕ Тгап-
засНопз оп Мей1са1 Е1ес1гошсз РОМЕ-6, 56 (1956).

4.	Р о 1 1 а г <1 Е. С., «1ош21п§ РаЛаНоп апй Се11 81гис1иге», Реу. Мой. Ркуз., 31,
273 (1959).

5.	О а V 1 з М., «1ггай1а11оп о! Вас1епа1 Зроге8 луйк Болу-УоИа^е Е1ес1гоп8», Агск.
Вюскет. апй Вюркуз., 48, 469 (1956).

6.	К п а и 8 8 Н. Р., «Репе1гаНоп о! 81оту Е1ес1гопз Ткгои^к 8роге ХУа118 о! ВасШив
те^а1ег1игт>, 8с1епсе, 124, 182 (1956).

7.	Л а § е г Л., Р о 1 1 а г й Е. С., «1пасНуа11оп \уйк Раз! Скаг^ей РагНс1ез о!
1пГесНуйу апй Нет১1иНпа11оп 1п ЫПиепга А Уйпз», Рай., Рез., 4, 1 (1956).

8.	XV 1 1 з о п И., Р о 1 1 а г й Е. С., «РаЛаНоп 8ШЛе8 оп 1ке 1пГес1юи8 Ргорейу
оГ НелусазНе В18еазе У1ги8», Рай. Рез., 8, 131 (1958).

9.	Р г е 1 з з Л. XV., «Тке БосаНгаНоп оГ 1пуег1а8е 1п 1ке Уеа8! Се11 луйк Боху-УоИа^е
Е1ес1гопз», Агск. В1оск. Вюркуз., 75, 186 (1958).

10.	В о п е 1-М а и г у Р., «Б’1Л1га-М1сго8сор1е 8!а!18Ндие йез Уйиз», Реуие Сапа-
Леппе Йе Вю1о§1е, 5, 489 (1946).

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

11.	Т 1 1 1 Л., Р о 1 1 а г Й Е., РаЛаНоп Резеагск, 8, 344 (1958).

12.	XV к 1 I гл о г е О., Р о 1 1 а г й Е., РаЛаНоп Резеагск, 8, 392 (1958).

13.

14.

15.

16.

17.

О а у 1 з М., Агск. Вюск. Вюркуз., 49, 417 (1954).

Л а § § е г	Л.,	Р о	1 1 а г	й Е.,	Рай. Рез., 4,	1—19	(1950).

Р о лу е 1 1	XV.	Р.,	Р о 1	1 а г <1	Е., У1го1о@у,	2, 321	(1956).

XV 1 1 з о п	В.	XV.,	Р о 1	1 а г й	Е., Рай. Рез., 8, 131 (1958).

XV 1 1 з о п	И.	XV.,	Рай.	Рез., 8, 142 (1958).

18.	XV о е з е С., Р о 1 1 а г й Е., Агск. Вюск. Вюр., 50, 354 (1954).
19.	Р о 1 1 а г й

20.	Р о 1 1 а г й

21.	Р о 1 1 а г й

22.	В е п у е 8 й

23.	Р о 1 1 а г й

Е., Оппопй А. Е., Рйу1ора1:йо1о2у, 46, 214 (1956).

Е-, Рйуз1сз ей Укизез, Асайеппс Ргезз, IV. V., 1952, р. 84.

Е., Рйу81сз ей У1гизез, Асайеппс Ргезз, К. У., 1952, р. 137.

М. е! а!., У1го1о§у, 5, 257 (1958).

Е., Айуапсез 1п У1гиз Резеагсй, 2, 129 (1954).

24.	Р 1 и	к е	О.	I.,	Р о 1 1 а г й Е., Апп. М. V.	Асай. Всё,	59,	489	(1955).

25.	Р о 1	1 а г	й	Е.,	8еН о V й., Най Рез., 4,	87 (1956).

26.	Р о 1	1 а г	й	Е.,	8 с 1 1 о те й., Агсй. В1осй.	В1ор., 50,	376	(1954).

27.	МсСге	а	й. Р., Апп. К. У. Асай. 8сь, 83,	692 (1960).

28.	В 1 1 1 е п, 81ар1 е(оп, Но! 1 а е п йег, й. Вас1ег1о1., 65, 131 (1953).

29.	В 1 1 1 е п, Ь 1 с й I з I е 1 п, й. Вас1ег1о1., 63, 533 (1952).

30.	Еейтап, В е з з т ап, 5 1 т т з, К о г п Ь ’е г й. В1о1. Сйет., 233, 163
(1958).

31.	В о 1 1 и т Р. й., Апйеге^ё й. XV., М с Е 1 у а А. В., Р о 1 1: е г V. Р.,

Сапсег Резеагсй, 20, 138—143 (1960).
Глава XII

МИКРОСКОПЫ

1.	Введение. Задача молекулярной биофизики состоит в том, чтобы
объяснить функции живых организмов исходя из свойств молекул (нукле-
иновых кислот, аминокислот, сахаров) и ионов. Мы видели, что для про-
цессов жизнедеятельности важнейшее значение имеет способность этих
соединений при определенных условиях образовывать полимеры — ДНК,
белки и полисахариды. Однако для понимания процессов, которые нас
интересуют, одних только сведений о строении полимера, состоящего из
малых молекул, явно недостаточно. Существует более высокий уровень
организации, который играет важнейшую роль в клеточных процессах.
К этому уровню относятся структуры, образованные правильно располо-
женными большими полимерными молекулами. Эти структуры могут иметь
размеры до 100 Л и больше. Длд исследования строения на этом уровне
такие экспериментальные методы, как седиментация, диффузия или рентге-
ноструктурный анализ, непригодны; исключение составляет метод рассея-
ния рентгеновских лучей под малыми углами, который можно использовать
для измерения больших периодов в мышцах и коллагене. Таким образом,
мы вынуждены вернуться к хорошо известному микроскопу, который дает
увеличенное изображение микрообъектов и позволяет изучать их строение
при помощи глаза. В этой главе будут коротко рассмотрены как световые,
так и электронные микроскопы. В обоих случаях внимание будет сосредо-
точено на трех важнейших характеристиках микроскопов — увеличении,
разрешении и контрасте изображения. Эти характеристики тесно связаны
между собой, хотя мы и будем рассматривать их раздельно. Там, где это
возможно, анализ микроскопов обоих типов будет проводиться совмест-
но, так как основные принципы, на которых они построены, являются об-
щими.

2.	Увеличение. Нормальный глаз в состоянии разрешить два объекта,
если угловое расстояние между ними составляет не менее одной дуговой
минуты (3-10“4 рад). В противном случае они не будут восприниматься
глазом как раздельные; объект со сложной структурой, размеры которого
соответствуют таким малым углам, будет восприниматься как бесструктур-
ный. Разрешение глаза определяется дифракцией на зрачке, аберрация-
ми хрусталика и угловым расстоянием между колбочками (30 дуговых се-
кунд).

Если объекты находятся на расстоянии 25 см от глаза (самое меньшее
расстояние, на котором без особенных усилий еще можно четко видеть
предмет), то разрешение их возможно лишь в том случае, если расстояние
между ними составляет не менее 0,07 мм. Если мы хотим увидеть детали
меньших размеров, то необходимо, чтобы угол, под которым их изобра-
жение проецируется на сетчатку, был больше одной дуговой минуты. Тако-
го эффекта можно добиться, применяя простое увеличительное стекло
(фиг. 188), если поместить объект в фокусе линзы. В этом случае свет падает
на глаз так, как будто предмет находится в бесконечности. Отношение
углов, под которыми изображения объекта, находящегося на расстоянии
25 см, проецируются на сетчатку, очевидно, равно 25// (если считать все
углы малыми). С такой простой системой, однако, невозможно получить
большое увеличение и достаточную интенсивность света и вместе с тем
исключить такие аберрации, как сферическая аберрация, астигматизм,

Фиг. 188. Простое увеличительное стекло.

Так как объект в этом случае находится ближе к глазу, то угол, под
которым он виден (Р), больше, чем в отсутствие линзы (а).

кома и хроматическая аберрация, присущие однолинзовым объективам.
Некоторые простые линзы Левенгука имели увеличение 250, но из-за аберра-
ций их разрешение было много меньше теоретического (см. разд. 3).

Большие увеличения со значительно меньшими аберрациями и иска-
жениями можно получить, комбинируя несколько линз (микроскоп). На
фиг. 189 показаны упрощенные схемы использования комбинации линз
в световом и электронном микроскопах. В обоих приборах имеются 1) кон-
денсор для освещения объекта, 2) объектив, который проецирует увели-
ченное изображение (Ц) объекта (О) на плоскость первого изображения, и
3) проекционная линза, которая проецирует увеличенное изображение /2 на
плоскость второго изображения. В световом микроскопе проекционной
линзой служит окуляр и глаз или объектив фотоаппарата.

В современных световых микроскопах на месте каждой из простых
линз, показанных на фиг. 189, находится целая система линз (фиг. 190),
что продиктовано необходимостью добиться большой апертуры (важной
для достижения высокого разрешения) и свести к минимуму аберрации.
Увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и про-
екционной линзы. Для микроскопов, показанных на фиг. 189, увеличение
будет равно
Л	25	V	25	V	25	.	,

------т- =	(для	светового	микроскопа)

О	/ е	М	1	/ 0	/е

или

= — (для электронного микроскопа),

где О — длина объекта. В электронном микроскопе вклад обеих линз в сум-
марное увеличение микроскопа приблизительно одинаков, в световом микро-
скопе основное увеличение создается объективом. Максимальное полезное

Фиг. 189. Схема оптического (Л) и электронного (Б) микроскопа (не в масштабе).

увеличение в обоих случаях ограничивается дифракцией, как будет пока-
зано в разд. 3, и составляет для электронного микроскопа х 200 000, а для
светового х 2000.

Между электронным и световым микроскопами существует большая
разница в методе фокусировки; существенное различие состоит также в том,
что в электронном микроскопе образец должен находиться в вакууме.
В световом микроскопе отклонение лучей обусловлено разницей показате-
лей преломления используемых материалов, и фокусировку можно осу-

Ф и г. 190.

А — высококачественный объек-
тив, состоящий из нескольких
различных линз; Б — окуляр
Рамсдена.

ществлять, лишь изменяя расстояние между
объективом и рассматриваемым объектом.
В электронном микроскопе отклонение электрон-
ного пучка осуществляется при помощи магнит-
ных линз, магнитное поле которых, а следова-
тельно, и фокусное расстояние можно менять-
непрерывно, изменяя величину электрического
тока через обмотки магнитов. Принцип работы
магнитной линзы, разумеется в самых общих
чертах, показан на фиг. 191. Магнитные линзы
могут быть только собирающими, поэтому в элек-
тронном микроскопе нельзя корректировать-
аберрации, применяя наряду с собирающими
линзами рассеивающие, как это делается в све-
товом микроскопе. Вследствие этого входная

апертура электронного микроскопа равна

5-10~3 рад, тогда как в световом микроскопе эта величина равна 1,7 рад..
Если в небольшой области пространства создать неоднородное магнитное-
поле, то оно будет представлять для электронов линзу с малым фокусным

Фиг. 191. Принцип работы магнитной линзы.

А — однородное магнитное поле, дающее увеличение 1:1; электроны,
движущиеся параллельно Н, не отклоняются. Б — неоднородное маг-
нитное поле, дающее увеличение больше единицы; электроны, движущиеся
параллельно оси симметрии, собираются в одну точку (фокусируются).

В — сильная магнитная л низа (сечение).

расстоянием. На фиг. 191, В показано сечение такой линзы. Магнитное-
поле, создаваемое магнитной обмоткой, концентрируется в области между
полюсами, которые фиксируются в заданном положении при помощи вкла-
дышей из бронзы.

3.	Разрешение. Нужно всегда помнить, что микроскоп имеет предел
полезного увеличения. Нет никакого смысла добиваться большего увели-
чения изображения объекта, если принципиальные причины делают невоз-
можным разрешение деталей этого объекта. В микроскопе такой принци-
пиальной физической причиной является дифракция. Ни свет, ни электрон
не следуют по идеально прямым линиям при прохождении через отвер-
стие. Чем меньше размеры отверстия, тем большей величины достигают
дифракционные искажения. Если дифракционные картины от двух источ-
ников существенно перекрываются, то их изображения сливаются и воспри-
нимаются как изображение одного источника. Величина дифракционной
картины зависит от отношения длины волны к размерам отверстия. Это
отношение имеет очень разную величину для света и для электронов. В опти-
ке используется область длин волн от 2000 до 7000 А. Длина же волны элек-
трона при тех энергиях электронов, которые используются в наши дни,.

Фиг 192. Дифракционная картина, даваемая плоской волной
в фокальной плоскости линзы диаметром а.

меньше 0,1 А. Волны, связанные с электронами, интерпретируют как волны
вероятности. Если длина волны электрона равна 0,01 А, то нам, очевидно,
не удастся установить его координату с точностью, большей 0,01 А. Таким
образом, соображения относительно дифракции и разрешающей силы, при-
меняемые в случае оптических приборов, в равной степени применимы
и к электронному микроскопу, а также и к другим микроскопам, в которых
используются элементарные частицы. Длина волны электрона определяет-
ся из соотношения Де-Бройля Л=Л/то, где 1г—постоянная Планка,
а то — импульс. Электрон с энергией 50 кэв имеет импульс 1,3-КГ7 а-слг/сек1,
что дает для длины волны величину 0,05 А.

Проанализируем дифракционные явления как для света, так и для
электронов несколько подробнее. Когда свет от удаленного источника
проходит через круглую линзу, изображение, получаемое в фокальной пло-
скости, представляет собой не точку, а дифракционную картину, состоящую
из серии концентрических колец. На фиг. 192 показана относительная
интенсивность дифракционных колец как функция их углового расстояния
от оси линзы. Угловое расстояние между центральным максимумом и пер-
вым минимумом (если считать углы малыми) равно 1,22 К/а, где Л — длина
волны света или частицы, а о — диаметр линзы. Эта дифракционная карти-
на возникает вследствие интерференции различных участков волнового
фронта, проходящего через апертуру линзы. Если имеются два источника
света, то каждый из них даст свою дифракционную картину и распределе-
ние интенсивности в фокальной плоскости будет результатом сложения

1 Для этих величин следует пользоваться релятивистским выражением; это
один из немногих случаев, когда теория относительности имеет отношение к биофизике.
этих двух картин. Разрешение линзы определяют как ее способность давать
раздельное изображение источников, расположенных близко друг к другу.
Согласно критерию, предложенному Рэлеем, считается, что два источника
разрешены в том случае, если максимум дифракционной картины одного
совпадает с первым минимумом дифракционной картины другого. Угловое
расстояние между максимумами обеих дифракционных картин, как можно
видеть из фиг. 193, равно при этом А0= 1,22 — . На практике оказывается

Фиг, 193. Дифракционная картина от двух источни-
X
ков, разделенных угловым расстоянием Л0 = 1,22— .

возможным разрешить два изображения, если они разделены даже несколь-
ко меньшим углом, а именно АО = — .

Из критерия Рэлея становится совершенно ясно, почему для достиже-
ния высокого разрешения необходимо использовать короткие длины волн
(например, электроны) и большие апертуры. Влияние уменьшения аперту-
ры линзы на ее разрешающую силу показано на фотографиях на
фиг. 194.

Применить критерий Рэлея для определения того минимального угло-
вого расстояния, которое может быть разрешено микроскопом, труднее,
так как в микроскопе мы не имеем дело с плоской волной, дающей изобра-
жение объекта в фокальной плоскости объектива. В этом случае в объек-
тив попадает расходящийся пучок от объекта, который фокусируется на
расстоянии V от главной плоскости объектива (фиг. 195). Так как расстоя-
ние V значительно больше мы можем в первом приближении считать,
что свет, выходящий из объектива, сходится не на расстоянии о, а в беско-
нечности. Если мы теперь мысленно переменим направление распростра-
нения света на противоположное, то получим ситуацию, аналогичную изо-
браженной на фиг. 192 и 193, где свет от бесконечно удаленного источника
фокусируется в фокальной плоскости линзы с апертурой а, и сможем вос-
пользоваться критерием Рэлея для определения минимального разрешимо-
го углового расстояния. Угол 6 в микроскопах очень велик, так как объект
располагается очень близко от объектива (и может быть меньше 1 мм).
Угол <р имеет много меньшее значение, поскольку расстояние V обычно
около 160 мм. При таких углах с достаточной точностью 5Шф= 1§ф и связь
Фиг. 194. Дифракционные картины от четырех точечных источников, полученные
с круговыми диафрагмами различных диаметров, установленными перад линзой [12].
А — апертура так мала, что два источника справа едва разрешены согласно критерию Рэлея;

* Б и В — разрешение улучшается при увеличении апертуры.

21 Заказ № 1168
между апертурой, V и ф выражается равенством
а— 2г>з1Пф.

(12.1)

Если две точки изображения, I и Г, должны быть разрешены, то,
использовав прием обращения лучей, упомянутый выше, получаем необхо-
димое для этого значение Аб:

Аб =1,22^.	(12.2)

Из фиг. 195 видно, что этот угол равен углу, под которым объект 00' виден
с главной плоскости объектива. Для того чтобы рассчитать, какие мини-

Ф и г. 195. Схема, поясняющая вывод формулы разрешающей
силы микроскопа.

Угол 6 велик, ф — мал, Аб — очень мал.

мальные размеры могут быть разрешены микроскопом, мы поступим сле-
дующим образом.

Поскольку Аб очень мало, можно написать

де = —=	1,22-.	(12.3)

и V	а	'	'

Если объект находится в среде с показателем преломления п, а изображе-
ние — в среде с показателем преломления, равным единице, то, согласно
общему соотношению, полученному Гельмгольцем,

п-(00') ат 6 = (1Г) з!п ф.

(12.4)

Комбинируя уравнения (12.1), (12.3) и (12.4), мы получим следующее
выражение для минимального разрешимого расстояния:

00' = пАб = V

1,22%	81П Ф 1,22%	1,22%

—----— у ----.-----'-----— __:—_—

а П31П0 2г)51’пф	2м81п0 ’

(12.5)

.или

00'= 0,61

%
П81П0

Величина п зшб называется числовой апертурой системы. Таким обра-
зом, минимальное разрешимое расстояние равно 0,61 от длины волны,
деленной на числовую апертуру. Как уже упоминалось раньше, определяе-
мое согласно критерию Рэлея разрешение оказывается несколько зани-
женным, поэтому мы имеем полное основание записать полученное выше
выражение в следующем более простом виде":

И (минимальное разрешимое расстояние) = 0,5 Чис^вая ~ , (12-6)
апертура

т. е. минимальное разрешимое расстояние равно длине волны, деленной на
удвоенную числовую апертуру. О микроскопе, который способен разрешать
малые объекты, не совсем удачно говорят, что он имеет высокое раз решение.
Из уравнения (12.6) очевидно, что для получения высокого разреше-
ния следует использовать короткие длины волн и большие числовые апер-
туры. Максимальное возможное значение угла 6 равно 90°. Если при этом
объект находится в воздухе или вакууме (для которых п=1), то минималь-
%

ное разрешимое расстояние будет равно	. Для зеленого света с длиной вол-

ны 5000 А это расстояние будет равно 2500 А, или 0,25 щ что равно прибли-

зительно х/4 размера клетки Е. соН. Для ультрафиолетового микроскопа,
работающего на длине волны 2500 А, при

числовой апертуре, равной единице, /г=0,12 ц.
Помимо высокого разрешения, ультрафиоле-
товый микроскоп обладает еще одним, даже
более важным достоинством: поскольку та-
кие вещества, как белки и нуклеиновые кис-
лоты, очень сильно поглощают в ультрафио-
лете, изображение образцов получается с хо-
рошим контрастом. Контраст, т. е. различие
в интенсивности прилегающих участков изо-
бражения, служит очень важной характери-
стикой изображения и будет специально
рассмотрен в разд. 4—11. Здесь достаточно

/ Вклад
к аберраций



ю -

отметить, что если изображение имеет слабый

контраст, то минимальное разрешимое рас-
стояние может значительно превзойти то,
которое определяется уравнением (12.6).

Высокая разрешающая сила электрон-
ного микроскопа объясняется тем, что в нем
используются волны (электроны) значительно

^30

а
е

5

5

/ Вклад

/ дифракции

0	2	4	6 8 10 • 10~3

Угловая апертура О, рао

Фиг. 196. Зависимость раз-

решения электронного микро-
скопа от величины апертур-
ного угла^б (сплошная кривая).
Пунктирные кривые показывают
вклад дифракции и аберраций.

более короткие, чем види-

мый свет. Теоретически при числовой апертуре, равной единице, элек-
троны с длиной волны 0,05 А (что соответствует^ энергии 500 000 эв)
могут обеспечить разрешение интервала 0,02 А. Разрешение современных
электронных микроскопов приблизительно в 500 раз хуже этой идеальной
величины и составляет ~10 А. Однако это не такое уж плохое разрешение:
оно по меньшей мере в 100 раз лучше, чем у светового микроскопа. Низкое

по сравнению с теоретическим значением разрешение электронного микро-
скопа обусловлено большими аберрациями магнитных линз. Линзы боль-
шой апертуры настолько сильно искажают изображение, что разрешение
фактически ухудшается при увеличении числовой апертуры. На фиг. 196
показана зависимость разрешения электронного микроскопа от входной
апертуры его объектива. Наилучшее разрешение, 10 А, получается при
апертуре 5-10“3 рад или 15 дуговых минут. Световой микроскоп при столь
малой числовой апертуре имел бы при оптимальных условиях контраста
разрешение не лучше 50 р, т. е. был бы немногим лучше глаза, разрешение
которого ~ 100 р. В электронном микроскопе высокое разрешение, несмотря
на малую числовую апертуру, достигается благодаря использованию очень
коротких длин волн.

Числовая апертура электронного микроскопа ограничена аберрациями
линз и очень мала, в световом микроскопе она может достигать значений
даже больше единицы. С этой целью объект помещают в среду с показате-
лем преломления больше единицы. Обычно в качестве иммерсионной среды
используют кедровое масло, показатель преломления которого равен 1,4.
В этих условиях минимальное разрешимое расстояние при использовании
света с длиной волны 5000 А будет равно 0,18 щ тогда как без иммерсии
оно равно 0,25 р. Другим, не столь очевидным достоинством применения
иммерсии является отсутствие в этом случае сферических аберраций,
поскольку пластинка, объект, масло и линза объектива имеют одинаковый
показатель преломления (фиг. 197). Это благоприятное обстоятельство
позволяет использовать линзы, обладающие хорошим дифракционным
разрешением, но не скорректированные в отношении сферических абер-
раций.

Имеется еще два интересных аспекта, связанных с числовой апертурой.
Количество света, проходящего через микроскоп, увеличивается пропор-
ционально квадрату числовой апертуры, глубина же резкости с ростом чис-
ловой апертуры уменьшается. Глубиной резкости называют тот интервал

по глубине объекта, который четко виден без дополнительной фокусировки
микроскопа. Величина этого интервала, обозначаемого ©, может быть
определена из следующего приближенного выражения:

(12.7)

где /г — минимальное разрешимое расстояние, определяемое уравнением
(12.6), а 0 — входная угловая апертура. В световом микроскопе с боль-
шим 0 (большая апертура) глубина резкости может приближаться по вели-
чине к минимальному разрешимому интервалу. В этом случае единственный
способ рассмотреть все детали объекта состоит в том, что поочередно про-
сматривают 'большое число его сечений. Электронный микроскоп имеет
большую глубину резкости, поскольку его угловая апертура очень мала.
Действительно, так как 0 мало, мы можем считать, что 0 = зш 0 =	0,

и из уравнений (12.6) и (12.7) получаем:

Глубина резкости электронного микроскопа = -03- .

Если X = 5-10~2 А, а 0 = 5-10 3, то О = 2; Ю3 А, что в 200 раз больше
минимального разрешимого интервала 10 А.

Нижний предел разрешения, которое может обеспечить микроскоп,
естественно, определяет также то максимальное увеличение, которого еле-
дует добиваться. Нет никакого смысла получать увеличение больше того
при котором минимальный разрешимый интервал увеличен до размеров,
вдвое превосходящих минимальное разрешение глаза. Для светового микро-
скопа минимальный разрешимый интервал равен примерно 0,2 р. Так как
глаз способен разрешить 0,1 мм, или 100 р, то для световых микроскопов
достаточно увеличение X 500. Удобнее, однако, использовать увеличения
X 1000 или х 1500, так как при этом глаз работает с меньшим напряже-
нием, чем при работе в предельном режиме. Для электронного микроскопа
с разрешением 10 А необходимо увеличение 10®, чтобы минимальный раз-
решимый интервал увеличился до уровня, на котором он разрешим невоору-
женным глазом. Полное необходимое увеличение* не обязательно должен
давать сам микроскоп. Изображение может быть получено на фотографи-
ческой пластинке, а затем увеличено до 10-кратного размера.

4.	Контраст. Мы еще не обсудили один из самых важных вопросов,
связанных с микроскопической техникой: вопрос о контрастности изобра-
жения. Чтобы быть видимым, объект должен отличаться от окружающей
среды. Если этого нет, то самое высокое разрешение в мире окажется бес-
полезным. Разницу интенсивностей изображений объекта и окружающей
среды называют контрастом. Для увеличения контрастности изображения,
даваемого микроскопом, было придумано немало остроумных методов.
Некоторые из них описаны в последующих разделах, правда лишь в самых
общих чертах.

5.	Окрашивание. Если отдельные части объекта избирательно окра-
шиваются каким-либо красителем, то это скажется на поглощении света
различными частями объекта и, следовательно, на распределении интен-
сивности света в изображении. Можно подобрать красители, специфичные
к определенным химическим группам, и таким образом выявлять локали-
зацию различных соединений в клетке. В большинстве случаев при окра-
шивании клетки погибают. Для электронной микроскопии разработана
специальная техника окрашивания (см. разд. 12).

6.	Флуоресценция. Объект, способный флуоресцировать, освещают
интенсивным пучком ультрафиолетовых лучей, обычно 3650 А, в резуль-
тате чего он начинает светиться и становится видимым. Если возбуждающий
свет мешает наблюдению, то его следует отфильтровать (фиг. 198, А).
Большая часть составных частей клетки — белки, нуклеиновые кислоты
и различные структурные элементы — совсем не флуоресцирует, или флуо-
ресцирует очень слабо. Поэтому флуоресцентный метод применяют либо
для исследования клеточных пигментов, либо для наблюдения локализации
нефлуоресцирующих! молекул, к которым прикреплены флуоресцирующие
группы. На фиг. 198, Б приведена фотография, показывающая распреде-
ление флуоресцирующих антител.

7.	Поляризация. Объект, в котором имеются асимметричные области
или ориентированные молекулярные структуры, прозрачен для неполяри-
зованного света, но по-разному ослабляет поляризованный свет, проходя-
щий через его ориентированные и неориентированные участки. В прин-
ципе метод заключается в том, что объект помещают между скрещенными
поляризаторами. Если он изотропен, то будет наблюдаться темное поле.
Анизотропные области будут видны как светлые участки в плоскости изо-
бражения. Идеи метода были уже коротко обсуждены при рассмотрении
двойного лучепреломления в потоке в гл. IV.

Оптическая схема прибора показана на фиг. 199. Поляризатор и ана-
лизатор расположены так, что направления поляризации проходящего
через них света перпендикулярны друг другу. Обозначим через 10 интенсив-
Фиг. 198.

А — схема флуоресцентного микроскопа: 1 — ртутная лампа; 2 — фильтр
возбуждающего света; 3 — фильтр, пропускающий свет флуоресценции и не
пропускающий возбуждающий свет; Б — фотография, демонстрирующая
один из случаев применения флуоресцентной микроскопии. Миофибриллы
цыпленка были растянуты, экстрагированы глицерином и обработаны анти-
телами к миозину, меченными флуоресцеином. Меченый антимиозин локали-
зовался лишь в Л-дисках саркомер.
ность света, прошедшего через поляризатор и попадающего на образец.
Анизотропный объект делит этот свет на две равные компоненты (мы пред-
полагаем, что объект расположен по отношению к электрическому вектору
световой волны так, как показано на фиг. 199):

7 — 7 —

1 хо —1 цо-2" '

Входя в объект, обе компоненты находятся в фазе друг с другом, так что
можно записать

Ех = Ех0 зш со/, Еу = Еу0 зш со/,

где со равна частоте света, помноженной на 2 л. Интенсивность пропорцио-
нальна квадрату напряженности, и, следовательно, амплитуды компонент
будут равны

с ___г _ А)

сх0 —	•

Так как свет плоско поляризован, отношение напряженностей обеих ком-
понент остается все время постоянным, пока они не попадают в объект.

Направление
колебаний,
протускаеглых'к^К
полиризаторол1\/

Асимметричный
объект

Направление
колебаний,
пропускаемых
анализатором

—------2

направление
распростране-
ния света



Направление
распростране-
ния света

Фиг. 199. Принцип работы поляризационного микроскопа.
Для простоты угол между направлением поляризации падающего света
и выделенным направлением ориентированной структуры взят равным 45°.

Поскольку мы предполагаем образец анизотропным, одна из компо-
нент будет распространяться с большей скоростью, чем другая. Если мень-
ший коэффициент преломления имеет х-компонента, то она будет иметь
большую скорость и ^-компонента отстанет от нее на некоторую долю д
периода колебаний. Когда обе компоненты выйдут из образца, их напря-
женности могут быть записаны в виде

= Ех0 зш со/, Еу — Еу0 81П (со/— 6).

Теперь обе компоненты попадают на анализатор. Чтобы найти интенсив-
ность света, прошедшего через анализатор, определим величины составляю-
щих Ех и Еу, параллельных направлению анализатора.

Вклад Еж=-р=-8Ш со/— -^-зшсо/,

Вклад Еу=--------з1п(со/— 6) = —^-зш(ы/— д).
Результирующее электрическое поле за анализатором, воздействующее
на наблюдателя, имеет напряженность

Ед = ^- [зти/ — 8ш(ы/ — §)] =
Г С I	. б

= Ьо соз ( <и1—) 8Ш ~2 •

Как видим, амплитуда поля за анализатором пропорциональна зш .
Если среда изотропна, то обе волны проходят через образец с одинаковой
скоростью, 6 = 0 и интенсивность прошедшего света равна нулю. Если
одна волна отстанет от другой на , или 180°, интенсивность прошедшего

Фиг. 200.

А — система параллельных стерженьков, обладающая текстурным двойным
лучепреломлением; Б — зависимость двойного лучепреломления от показателя
преломления среды.

света будет максимальной. Таким образом, если поместить клетку между
скрещенными поляризатором и анализатором, то анизотропные области
клетки будут казаться светлыми.

Поляризационный микроскоп может быть использован для количест-
венного определения разности фаз между различно поляризованными ком-
понентами. Для этого разность фаз, вносимую исследуемым веществом, ком-
пенсируют, вводя в пучок света кварцевые пластинки, вносящие известную
разность фаз.

Вещества, в которых скорость света зависит от направления его поля-
ризации, называют двоякопреломляющими. Двойное лучепреломление может
быть связано с анизотропией самих молекул (собственное, или внутрен-
нее, двойное лучепреломление) и может быть следствием асимметричной
ориентации изотропных молекул (текстурное двойное лучепреломление).
Текстурное двойное лучепреломление зависит не от строения молекул,
а лишь от их взаимной ориентации в веществе. При заданном распределении
молекул по направлениям (например, оно может быть таким, как показано
на фиг. 200, Л) величину двойного лучепреломления подобного типа можно
рассчитать. Если показатель преломления среды равен п%, а ориентирован-
ные в ней нити (например, нити ДНК) имеют показатель преломления п1г
то такая среда будет анизотропной (сами нити при этом не обязательно
должны быть анизотропными). Колебания, электрический вектор которых
параллелен направлению нитей (Др), будут распространяться через обра-
зец с меньшей скоростью, чем колебания, у которых электрический вектор
перпендикулярен направлению нитей (Ду). Пусть «ц и п± обозначают соот-
ветственно показатели преломления для световых колебаний, параллель-
ных и перпендикулярных направлению симметрии. (Напомним, что п есть
отношение скорости света в вакууме к его скорости в данной среде.) Раз-
ность фаз между двумя компонентами, 6, будет равна разности оптических
путей, помноженной на , где X — длина волны в вакууме. Разность
оптических путей равна («ц — п±), помноженной на толщину образца I.
Таким образом, имеем

6 = ™(пП-»±)^-	(12.8)

Величины 6, X и I могут быть измерены, и по ним можно определить вели-
чину двойного лучепреломления (пц — п±).

Если изменять коэффициент преломления среды /г2, то будет изменяться
величина двойного лучепреломления. При п2 = текстурное двойное
лучепреломление исчезнет и останется двойное лучепреломление, связан-
ное лишь с анизотропией самих молекул. На фиг. 200, Б показано, как

изменяется наблюдаемая ве-
личина двойного лучепрелом-
ления при изменении п2-
Белки обладают положитель-
ным внутренним двойным
лучепреломлением, а нукле-
иновые кислоты — отрица-
тельным. Последнее объяс-
няется тем, что плоскости
оснований, содержащихся в
этих молекулах, расположены
перпендикулярно молекуляр-
ным осям, подобно стопке
параллельных пластинок.
Структуры подобного рода
всегда характеризуются отри-
цательным двойным луче-
преломлением.

8.	Ультрафиолетовый ми-
кроскоп. Мы уже указывали,
что использование более ко-
ротких длин волн позволяет
получить более высокое раз-
решение. Другая причина
интереса к ультрафиолетово-
му микроскопу связана с тем,

Фиг. 201. Схема ультрафиолетового микрос-
копа с преломляющей оптикой.

1 — источник света; 2 — входная щель; 3 — ультрафио-
летовый микроскоп; 4 — изображение 2; 5 — проек-
ционная линза: 6 — изображение 1; 7 — объектив;

8 — объект; 9 — конденсор; 10 — призма полного внут-
реннего отражения; 11 — выходная щель; 12 — ультра-
фиолетовый монохроматор.

что такие компоненты клетки,

как нуклеиновые кислоты и белки, сильно поглощают в ультрафиолето-
вой области спектра, благодаря чему изображение получается контрастным
без всякого специального окрашивания. Конструирование микроскопа
с преломляющей оптикой, ахроматичной в достаточно широкой ультра-
фиолетовой области, представляет собой чрезвычайно сложную задачу.
Первый микроскоп, который был сконструирован Касперсоном, требовал
отдельной фокусировки для каждой длины волны. Кроме того, неахрома-
тичность оптики подобного микроскопа требует, чтобы освещение объекта

осуществлялось монохроматическим светом.
Схема экспериментальной установки для ультрафиолетовой микроско-
пии клетки показана на фиг. 201. Ультрафиолетовое излучение
(источником его может служить, например, ртутная лампа) проходит через

Ф и г. 202. Конденсор и объектив отражатель-
ного микроскопа Барча.

М о и Мс — асферические зеркала, тв и тс — сфе-
рические. Числовая апертура очень велика (0,65).

монохроматор и затем падает
на объект, расположенный
на столике микроскопа с квар-
цевой оптикой. Увеличенное
изображение объекта реги-
стрируетсяфотоэлектрическим
или фотографическим спо-
собом. Минимальные разме-
ры участка объекта, пропус-
кание которого может быть из-
мерено, определяются не толь-

ко разрешением микроскопа,
но и рассеянием света в объ-
екте. Диаметр такого мини-
мального участка равен при-
мерно 0,6 р.

Трудности, возникающие перед ультрафиолетовой микроскопией, в кото-

рой используется преломляющая оптика, легко преодолеваются, если
использовать отражательную оптику. Действительно, зеркала имеют оди-

Ф и г. 203. Схема отражательного ультрафиолетового микроскопа [3].

•2 — источник света; 2 — объект; 3 — объектив; 4 — зеркало; 5 — щель; 6 — спектрограф;

7 — фотопластинка, на которой получается изображение щелн.
маковое фокусное расстояние для света любой длины волны; следовательно,
если их сфокусировать для видимого света, то фокусировка сохранится
и для ультрафиолетового и инфракрасного излучения. Однако здесь тоже
есть свои трудности, связанные с тем, что, используя простые сферические
отражатели, нельзя получить большие числовые апертуры, так как сфери-
ческие зеркала большой апертуры имеют большие аберрации. Такие зер-
кала не собирают параллельный пучок лучей в одну точку. Для отража-
тельного микроскопа разработаны специальные асферические зеркала,
в которых эти недостатки устранены. На фиг. 202 схематически изображена
система конденсора и объектива в микроскопах такого типа. При исполь-
зовании масляной иммерсии такой объектив может иметь числовую апер-
туру, близкую к единице. Преимущества микроскопа подобного рода осо-
бенно очевидны при исследовании поглощения клеток или отдельных участ-
ков клеток в достаточно широком интервале длин волн.Так как фокусировка
при изменении длины волны в этом случае не изменяется, изображение
можно проецировать прямо на щель спектрографа. Спектрограф разлагает
свет На его спектральные компоненты, и в результате получается ряд изо-
бражений вырезанной щелью части объекта в различных длинах волн.
Такие изображения можно получить за сравнительно короткое время и тем
самым снизить до минимума повреждающее действие ультрафиолетового
излучения на изучаемый объект. На фиг. 203 показано изображение эри-
троцита лягушки, полученное с помощью описанного прибора. Хорошо
видно поглощение гемоглобина, имеющее максимум вблизи 400 жр, и погло-
щение ядра с максимумом в районе 260 жр. Отражательный микроскоп
может быть использован не только для изучения спектров поглощения
клетки; он совершенно незаменим при изучении спектров поглощения
маленьких кристаллов и волокон. Некоторые кривые поглощения, приве-
денные в гл. VII, были получены именно этим методом.

9.	Интерференционный микроскоп. Большая часть объектов, как уже
говорилось выше, в видимом свете обладает низким контрастом, в связи
с чем применяются специальные
методы для увеличения контрас-
та. Основная трудность состоит
в том, что биологические объекты
в основном слабо поглощают в
видимой области. Однако их
показатель преломления может
отличаться от показателя пре-
ломления среды, благодаря чему
в плоскости изображения свет,
прошедший через объект, будет

не в фазе со светом, образующим фон. Но из-за того, что амплитуды
того и другого света одинаковы, обычные приемники света, такие, как
глаз, фотоэлемент или фотопластинка, не смогут обнаружить разницы
между фоном и изображением объекта. Для того чтобы «фазовое» изобра-
жение стало видимым, его надо превратить в «амплитудное». Такое прев-
ращение осуществляется в интерференционном микроскопе за счет интер-
ференции двух световых пучков в плоскости изображения. Фазово-кон-
трастный микроскоп, как мы увидим ниже, представляет собой специаль-
ный и в некоторых отношениях худший вариант интерференционного ми-
кроскопа.

Предположим, что мы хотим увидеть бактерию размером 10 4 см, кото-
рая имеет показатель преломления 1,34 и находится в среде с показателем

Фронт
выходящей волны

Фиг. 204. Искажение плоской волны, про-
шедшей через неоднородный тонкий объект.

Среда с показателем
преломления 1,33

Объект с показателем
преломления 1,34-
преломления 1,33 (фиг. 204). Разность оптических длин путей в этом слу-
чае будет равна 1СГ4Х (1,34—1,33) = 10~6 см. Для зеленого света (длина
волны 5-10° см) разность фаз между светом, прошедшим через объект,
и светом, прошедшим через среду, будет равна ~ (разность оптических
длин путей) = 0,126 рад = 7°. Существует ряд схем, позволяющих превра-
тить это небольшое различие в фазе в разность амплитуд; одна из них пока-
зана на фиг. 205. Свет источника при помощи полупрозрачного зеркала 5Г
расщепляется на два пучка. Один пучок идет по пути через объект,
попадает на второе полупрозрачное зеркало 52 и отражается в окуляр.

Фиг. 205. Одна из схем интерференционного микроскопа

1 — источник света; 2 — пучок сравнения; 3 — пластинка сравнения; 4 — оку-
ляр; 5 — объект; 6 — прямой пучок. Объяснение см. в тексте.

Другой пучок (пучок сравнения) идет по пути 81М2 и через полупрозрач-
ное зеркало 82 также попадает в окуляр. Наблюдаемое изображение полу-
чается таким образом, как и в обычных интерферометрах, в результате
интерференции двух пучков. Преимущество расположения, показанного
на фиг. 205, состоит в том, что в этом случае пучок сравнения находится
под контролем экспериментатора, который по желанию может менять его'
амплитуду и фазу. Трудность изготовления такого микроскопа опреде-
ляется не только тем, что необходимо очень точно расположить оба объек-
тива, но также и тем, что оба объектива должны быть идентичными, посколь-
ку изображения, даваемые ими, должны точно совмещаться.

Принцип работы интерференционного микроскопа удобнее всего описы-
вать, пользуясь векторными диаграммами. Амплитуда света, идущего
из определенной части объекта, изображается при этом абсолютной вели-
чиной вектора, а фаза — его направлением. На фиг. 206 показаны вектор-
ные диаграммы, изображающие соотношение между падающим на объект
и прошедшим через него светом в случае поглощающего объекта (имеющего
одинаковый с окружающей средой показатель преломления) и в случае
фазового объекта (имеющего одинаковый с окружающей средой коэффи-
циент поглощения). Наблюдаемая интенсивность пропорциональна квадра-
там амплитуд. Таким образом, интенсивность изображения фазового объек-
та, равная квадрату Ор (см. фиг. 206, Б), равна интенсивности фона,
т. е. квадрату ОА. Изображение объекта отличается от фона лишь тем, что
образующий его свет отстает по фазе на угол <р. Предположим, что пучок
сравнения запаздывает по отношению к О А на угол 180‘ + <р. В этом

Фиг. 206. Векторное представление световых волн.
А — поглощающий объект; Б — фазовый объект. О А — свет,
падающий на объект; Ор — прошедший свет.

случае результирующее изображение, возникающее вследствие интерферен-
ции прямого пучка и пучка сравнения, не будет иметь ту же амплитуду,
что и фон, и появится амплитудный контраст (фиг. 207). На практике вовсе

180+у>

Амплитуда

" пучка сравнения
00,—ОА

Амплитуда
падающего
света и фона

Амплитуда света,
прошедшего
через объект

Фиг. 207. Суммирование света, прошедшего фазовый объект,
и пучка сравнения, имеющего разность фаз 180° +ф с падающим
светом ОА, в результате чего получается изображение, ампли-
туда которого отлична от амплитуды фона.

не всегда требуется так регулировать запаздывание пучка сравнения, чтобы
полностью погасить прошедший пучок. Общий случай рассмотрен на

Окружность
изображе - /

ния

Окружност
объекта
10М1 >|0Р|

Амплитуда изображения

ОО1+Ор = ОР

Амплитуда фона
оо,+од=ом

Фиг. 208. Векторный анализ работы интерферен-
ционного микроскопа.

Объяснение см. в тексте.

фиг. 208. Сплошной круг представляет геометрическое место концов
векторов, соответствующих свету, прошедшему через объект. Радиус этого
круга ОА — а. Вектор ОО! изображает амплитуду и фазу света пучка
сравнения. Результирующая амплитуда изображения будет равна сумме-
векторов^ 001 4 Ор = ОР. Легко видеть, что точка Р всегда будет рас-
полагаться на окружности с центром в 01 и радиусом, равным а — | О А |.
Эта окружность изображена на фиг. 208 пунктирной линией. Все возмож-
ные непоглощающие объекты изображаются точками р, а соответствующие
им изображения — точками Р. Эта схема показывает, как различие в фазе
(при постоянной амплитуде | Ор |) может быть преобразовано в различие
амплитуд | ОР |.

В объектах достаточной толщины могут существовать области, в кото-
рых <р > 360°. В этом случае в интервале между изображениями участков
малой и большой толщины появятся интерференционные полосы, т. е. обла-
сти чередования высокой и низкой интенсивности, что объясняется изме-
нениями ОР при повороте Ор на угол ф > 360°. Измерение запаздывания
по фазе дает более или менее прямой способ определения поверхностной
плотности объекта, т. е. массы вещества, приходящейся на единицу поверх-
ности. Величина запаздывания по фазе дается выражением, аналогичным
соотношению (12.8):

Ф = ^ГДп,	(12.8')

где I — толщина объекта, а Ап — разность, показателей преломления среды
и объекта. В гл. IV мы уже упоминали о том, что показатель преломления
раствора пропорционален концентрации с. Для белка = 0,18 г!см?.
Таким образом, обозначив коэффициент пропорциональности через а,
мы имеем

Дп = ас.

Подставляя это выражение в формулу (12.8"), получим

2л ,

Ф = -т-а1с.

К

Так как /с есть концентрация, отнесенная к единице поверхности, или
поверхностная плотность а, то окончательно имеем

Измеряя ф, мы можем определить а (причем знать толщину клетки не тре-
буется), а зная величину сечения клетки А, получим разницу между мас-
сой клетки и массой равного объема окружающей среды, Дт = Аа; таким
образом можно определить сухой вес клетки.

Интерференционный микроскоп может быть сконструирован и по Дру-
гой схеме, отличающейся от приведенной на фиг. 205. Можно использовать
один объектив вместо двух и ввести специальное устройство, расщепляющее
пучок света перед объектом на два, причем так, что через объект пройдет
лишь один из этих двух пучков.

10.	Фазово-контрастный микроскоп. Другой способ визуализации про-
зрачных объектов был предложен Цернике и получил название метода
фазового контраста. Микроскоп, в котором используется этот метод, пред-
ставляет собой разновидность интерференционного микроскопа. В фазово-
контрастном микроскопе изображение получается в результате интерферен-
ции дифрагировавшего и недифрагировавшего света, тогда как в описан-
ных выше интерференционных микроскопах изображение получалось вслед-
ствие интерференции всего прошедшего света со световым пучком, пришед-
пшм в ту же точку по совершенно другому пути. Как мы увидим, фазово-
контрастному микроскопу присущи недостатки, которые, вообще говоря,
не свойственны приборам интерференционного типа, однако простота и лег-
кость наладки фазовых микроскопов искупают до известной степени их
несовершенство. Теория метода фазового контраста прекрасно иллюстри-
рует, насколько сложно происходит образование изображения в микроско-
пах. Чтобы получить некоторое представление о том, как работает фазово-
контрастный микроскоп, нам придется несколько глубже познакомиться
с теорией образования изображения.

Фиг. 209. Изображение амплитудной дифракционной решетки, получаемое с помощью
простой линзы.

Рассмотрим очень простой и несколько искусственный случай, когда
объектом служит дифракционная решетка с расстоянием между прозрач-
ными областями, равным <1, на которую падает параллельный монохро-
матический пучок света. Как показано на фиг. 209, линза дает увеличен-
ное изображение этой так называемой «амплитудной» решетки на расстоя-
нии, которое можно найти из обычного уравнения линзы:

±-Д=Х

и ~ V /

Всякий, кто знаком с дифракционными решетками, вспомнит, что в допол-
нение к изображению решетки, которое не рассматривается в теории диф-
ракционной решетки, в фокальной плоскости линзы появится дифракцион-
ная картина. Если падающий свет монохроматичен, эта дифракционная
картина состоит из большого числа светлых линий, положение которых
определяется уравнением

&% = с/81п6.	(12.9)

Цифры, проставленные около этих линий на фиг. 209, соответствуют раз-
ности хода двух соседних пучков, проходящих через отверстия решетки.
Если каждый пучок, выходящий из отверстия решетки, мы изобразим
вектором, то максимумам дифракционной картины будет соответствовать
параллельное расположение векторов (фиг. 210). При к = 1 разность фаз
между векторами, изображающими пучки, выходящие из двух соседних
отверстий решетки, равна 2л и т. д. Заметим, что дифракционные максимумы
имеют ту же фазу, что и центральный максимум. Световые пучки, собираю-
щиеся в каждом из дифракционных максимумов, приходят из всех частей
дифракционной решетки, которую мы в данном случае рассматриваем как
объект. Поэтому каждый дифракционный максимум в фокальной плоскости
линзы мы можем считать новым источником света. Эти новые источники
образуют в плоскости изображения картину, которая является просто
увеличенным изображением объекта. Проводя это весьма упрощенное рас-
смотрение, мы хотели обратить внимание на то, что свет, образующий

Су/има-* - • —

Сумма

Результирующая.

--------• амплитуда

К = I

К - О

Ф и г. 210. Сложение векторов амплитуд при образовании
дифракционных максимумов в случае амплитудной решетки.

изображение, приходит из всех дифракционных максимумов. Свет от каждо-
го максимума равномерно заполняет всю плоскость изображения, и только
благодаря тому, что осуществляется интерференция, мы видим изображе-
ние объекта. Таким образом, изображение очень малого объекта в микро-
скопе образуется светом, идущим от всех частей объекта. В случае когда
объект очень велик, дифракционная картина состоит практически из одного
литш, нулевого, или центрального, дифракционного максимума и образова-
ние изображения можно полностью описать исходя из законов геометри-
ческой оптики. Но подчеркнем еще раз, что в случае микроскопических
объектов в образовании любого участка изображения принимает участие
свет, выходящий из всех точек объекта.

Дифракционная картина, образующаяся в фокальной плоскости объек-
тива, имеет прямое отношение к разрешающей силе микроскопа. Если
углы 0 для максимумов, соответствующих &>1, столь велики, что выхо-
дят за пределы рабочих углов микроскопа, то в образовании изображения
будет принимать участие лишь свет от дифракционных максимумов, для
которых к = 0, ±1, что приведет к потере ряда деталей в изображении.
Здесь можно провести аналогию с представлением сложного колебания
в виде суммы Фурье-компонент: чем большим числом Фурье-компонент
мы пренебрежем, тем менее точное приближение получим. Если период
решетки настолько мал, чтоу>1, то, как видно из уравнения (12.9),
через оптическую систему пройдет лишь центральный дифракционный мак-
симум и только он один будет участвовать в образовании изображения.
Такое изображение эквивалентно изображению, получаемому от одного
точечного источника, и не имеет ничего общего с объектом. Следовательно,
решетка с таким маленьким периодом не будет разрешена. Полученный
выше критерий разрешения = 1 подобен уравнению (12.6). Различие
этих выражений обусловлено прежде всего тем, что мы рассматривали слу-
чаи, когда дифракционная решетка освещена параллельным, а не расхо-
дящимся пучком света; кроме того, дифракционная решетка представляет
собой совокупность правильно расположенных микрообъектов, а не один
микрообъект.

Вернемся теперь к нашему основному вопросу, а именно к вопросу
получения фазовых изображений. Пусть объект, который мы хотим рас-

Ф и г, 211. Изображение фазовой дифракционной решетки, получаемое с помощью
простой линзы.

смотреть, представляет собой не совокупность чередующихся прозрачных
и непрозрачных участков, как в случае амплитудной дифракционной
решетки, а состоит из правильно чередующихся участков с большей и мень-
шей толщиной или с большим и меньшим значением показателя преломле-
ния (фиг. 211). Между лучами, прошедшими через участки с различной

Амплитуда света,
прошедшего	-* -----► -*

Амплитуда света,
прошедшего п212

Результирующая
амплитуда

Фиг. 212. Сложение амплитуд при образовании дифракционных
максимумов к = 0 и к = 1 в случае фазовой решетки.

Угол ф = Предполагается, что (п212— имеет малую величину.

оптической длиной пути (скажем, п2^2 > возникнет разность фаз.
Предположим, что разность (н2/2— нЦ1) мала. Свет, прошедший через
решетку, образует в фокальной плоскости линзы дифракционную картину.
Векторная диаграмма, показывающая образование этой картины, приве-
дена на фиг. 212. Центральный максимум имеет большую интенсивность
(так же, как в случае амплитудной решетки), но вторичные максимумы
22 Заказ № 1168
слабы, так как при к = 1

с! 2Ш 0 = X

и разность фаз между областями и равна 180° — ф, т. е. они почти
нацело гасят друг друга. (В амплитудной решетке это гашение отсутствует,
потому что там области соответствует нулевая амплитуда.) Следую-
щее различие между амплитудной и фазовой решетками заключается в вели-
чине разности фаз между дифракционными максимумами. Как было пока-
зано на фиг. 210, в случае амплитудной решетки все дифракционные мак-
симумы находятся в фазе. В случае фазовой решетки центральный макси-
мум отличается по фазе от всех остальных на 90° (см. фиг. 212).

Более подробно описывать характер дифракционной картины фазовой
решетки мы не будем. Важно запомнить одно — эта дифракционная кар-
тина такова, что изображение увидеть нельзя, поскольку в нем отсутствуют

Фиг. 213. Схема фазового микроскопа.

Пропускание умень-
шено напылением
металлической плен-
ки для ослабления,
прямого пучка

вариации амплитуды. Если бы, однако, мы смогли изменить дифракцион-
ную картину фазовой решетки (см. фиг. 212) так, чтобы она стала похожа
на дифракционную картину амплитудной решетки (см. фиг. 210), то дифра-
гировавший свет образовал бы видимое изображение с переменной ампли-
тудой. Именно это и осуществляется в фазово-контрастном микроскопе.

Схема фазово-контрастного микроскопа показана на фиг. 213. Под кон-
денсором, в его фокальной плоскости, помещается диафрагма с кольцевым
отверстием. Параллельный пучок света, выходящий из конденсора, про-
ходит через объект, попадает в объектив и идет дальше к месту образова-
ния изображения. На этом пути он попадает в фокальную плоскость объек-
тива. В этой плоскости изображается кольцевая диафрагма, центральный
максимум дифракционной картины объекта и вторичные максимумы. Поло-
жение вторичных максимумов зависит от объекта, однако центральный
максимум, т. е. изображение кольцевой диафрагмы, всегда находится на
одном и том же месте. Это позволяет поступить следующим образом. В фо-
кальной плоскости объектива можно поставить пластинку с кольцевой
канавкой, оптическая толщина которой на четверть длины волны меньше,,
чем оптическая толщина пластинки, и совместить канавку с изображением
кольца диафрагмы. В этом случае неотклоненный свет пройдет через кольцо
и опередит дифрагировавший свет на четверть длины волны. Можно также
уменьшить интенсивность центрального максимума (до величины, близкой
к интенсивности вторичных максимумов, см. фиг. 212), для чего на канавку
напыляют полупрозрачный металлический слой. Не обязательно создавать
опережение точно на четверть волны: можно задерживать прямой пучок
на любую другую малую часть длины волны. Во всех случаях конечной
целью является получение максимального амплитудного контраста, вос-
производящего различия показателей преломления в отдельных частях
объекта.

Векторное представление метода фазового контраста. Проведенные
нами рассуждения относятся к специальному типу объекта — к дифрак-
ционной решетке. При описании принципа работы интерференционного

Ор - свет, прошедший через объект ор=ОД +АР

ОД - падающий, свет и свет	г

центрального максимума

Фиг. 214. Векторное представление метода фазового контраста.

А — запаздывание фазы прошедшего света; Б — представление прошедшего света
в виде суммы неотклоненной и дифрагированной компонент; В — результат поло-
жительного сдвига фазы неотклоненного света на 90°.

микроскопа мы пользовались простым и изящным методом, основанным
на векторном представлении. Этим методом мы можем воспользоваться
и теперь. Обозначим падающий свет вектором ОА (фиг. 214). Этот же вектор
будет изображать неотклоненный свет, образу ющий центральный макси-
мум в фокальной плоскости объектива. Свет, прошедший через объект,
отстанет по фазе на <р; его мы обозначим вектором Ор. Если предположить,
что поглощение отсутствует, то | ОА) = | Ор |. Как показано на фиг. 214, Б,
свет, прошедший через объект, можно представить в виде суммы неоткло-
ненного света и компоненты Ар, обозначающей дифрагировавший, или
рассеянный, объектом свет:

Ор = ОА-}-Ар.

Заметим, что дифрагировавший под малыми углами свет отличается
по фазе от неотклоненного света приблизите чьно на 90°. Если применить
способ, показанный на фиг. 213, то фаза неотклоненного света сдвинется
на 90° (что соответствует опережению на четверть длины волны) и для
амплитуды изображения мы получим (см. фиг. 214, В):

ОР = ОА! -|- А^Р = О^р = О| А + Ар.

На фиг. 214 изображен случай, когда амплитуда изображения | О1р [ меньше
амплитуды фона |О1А|. Таким образом, различие в фазах преобразовано
в различие амплитуд, т. е. интенсивности, и фазовое изображение сделано
видимым.
Метод фазового контраста, в котором неотклоненному свету сообщается
положительный сдвиг фазы на 90°, называется методом позитивного кон-
траста. В этом случае объект, имеющий несколько большую оптическую
длину пути, чем окружающая его среда (т. е. <р отрицательно, как пока-
зано на фиг. 214), будет на изображении темнее фона. При помощи вектор-
ного представления можно легко проанализировать и другие варианты
метода фазового контраста, в которых используется другая (не 90°) вели-
чина фазового сдвига ОА, а также изменяется амплитуда ОА (путем нане-
сения на фазовую пластинку поглощающего слоя).

Из проведенного векторного рассмотрения очевидно, что фазово-кон-
трастный микроскоп представляет собой частный случай интерференцион-
ного микроскопа, причем он обладает рядом недостатков. Например, в нем
невозможно полное разделение прямого и рассеянного пучков. Максималь-
ное разделение, а следовательно и лучший контраст, получается для малень-
ких объектов, границ или резких переходов внутри объектов. Изображение
в фазово-контрастном микроскопе окружено гало, возникающим вслед-
ствие дифракции на кольце фазовой пластинки.

11.	Электронная микроскопия. Электронный микроскоп обладает зна-
чительно большей разрешающей силой, чем световой, но и здесь проблема
контрастности изображения требует большого внимания. Чтобы исполь-
зовать высокое разрешение электронного микроскопа, необходимо, чтобы
в изображении существовал контраст между частями объекта и окружаю-
щим фоном.

^Электронный пучок не поглощается объектом, а рассеивается им. Боль-
шая часть электронов, выходящих из объекта, не проходит дальше через
систему линз электронного микроскопа. Поскольку числовая апертура
сильно ограничена сферическими аберрациями и имеет величину не более
5-Ю*3 рад, фотопластинки, находящейся в плоскости изображения, дости-
гают лишь слабо отклоненные электроны. Чтобы избавиться от рассеян-
ных электронов, в фокальной плоскости объектива можно поставить непро-
зрачный диск с отверстием порядка 50 р в диаметре. Неотклоненный пучок
проходит через это отверстие, размеры которого во много раз превосходят
размер дифракционной картины. Интенсивность рассеяния зависит от элек-
тронной плотности объекта, а следовательно, контраст — от различия этой
плотности при переходе от одного участка объекта к другому. В биологиче-
ских объектах электронная плотность обычно мало меняется от одной точки
к другой, к тому же их плотность близка к плотности подложки, на кото-
рой их располагают. Таким образом, контраст исходного объекта ничтожен
и его необходимо усиливать при помощи специальных методов. Существует
два метода увеличения контраста — напыление и окрашивание. Перед
их описанием мы коротко остановимся на способе приготовления препа-
ратов.

Во избежание рассеяния электронов на молекулах воздуха образцы
для электронной микроскопии помещают в вакуум. Если желательно полу-
чить высокое разрешение, то образец и подложка, на которой он распо-
ложен, должны иметь малую толщину, чтобы потери энергии при прохо-
ждении электронного пучка через образец были минимальными. Если на
пути через образец электроны теряют слишком много энергии, то они
не будут фокусироваться в плоскости изображения из-за «хроматических»
аберраций в магнитных линзах, изображение будет расплываться и раз-
решение будет низким. Максимальная толщина образца вместе с подлож-
кой, которая приемлема для получения разрешения 20 А (предполагается,
что контраст образца и юстировка микроскопа соответствуют задаче), равна
200 А для электронного пучка, ускоряемого напряжением 50 кв, и примерно
вдвое больше для пучка, ускоряемого 100 кв. Использование пучков с боль-
шой энергией, как мы видим, дает известные преимущества. Имеется и дру-
гая причина, не связанная с увеличением разрешения, из-за которой также
следует отдать предпочтение тонким образцам. Теоретическая глубина
резкости электронного микроскопа очень велика (около 1000 А). Следова-
тельно, в изображении толстого образца все детали объекта будут спрое-
цированы в одну плоскость, и по такому изображению чрезвычайно трудно

Злектри- К насосу
веские
выводы

Напыленный
образен,

Электронная
микрофотография

Фиг. 215. Схема метода напыления.

Размеры объектов сильно преувеличены. Объяснение см. в тексте.

восстановить трехмерную внутреннюю структуру объекта. Для преодоле-
ния этой трудности получают два снимка, соответствующие двум различ-
ным углам наклона образца по отношению к электронному пучку. Если
два таких снимка рассмотреть в стереоскоп, то прекрасно видна трехмер-
ная структура. Именно таким способом Андерсону [13] удалось увидеть,
что фаговые частицы прикрепляются к оболочке бактерии своими отрост-
ками.

Препараты для электронной микроскопии помещают на тонкие (100—
200 А) пленки коллодия или формвара или на еще более тонкие (50 А) угле-
родные пленки. Такие тонкие пленки получают, давая капле растворенного
в амилацетате коллодия растечься по поверхности воды или напыляя угле-
род в вакууме на чистую поверхность, с которой затем пленку можно снять;
затем пленку закрепляют на тончайшей проволочной сетке, имеющей до
80 проволочек на 1 мм.

Объект (например, препарат вируса) может быть нанесен на подложку
в виде небольшой жидкой капли, которую затем высушивают. Недостаток
такого метода приготовления препарата состоит в том, что при удалении
жидкости объект может быть искажен в результате действия поверхностных
сил в момент, когда через него проходит поверхность жидкости. Силы
Фиг. 216. Очищенная суспензия бактериофага Тб [14]
Обратите внимание на некоторое количество пустых белковых обо-
лочек, нли теней. X70 000-0,88.

Фиг. 217. Вирус табачной мозаики, обработанный горячим
детергентом [15].

Видны нуклеопротеидные палочки (и фрагменты палочек) вируса
толщиной 150 А.. Тонкие волокнистые структуры представляют собой,
по всей видимости, отдельные нити РНК.

Большие белые круги — изображения шариков латекса, размеры кото-
рых известны. Х65 000-0,7.
поверхностного натяжения велики и могут вызвать заметное уплощение
•объекта. Один из способов обойти эту трудность — лиофильное высушива-
ние образцов, другой — использование такой жидкости, как СО2; послед-
нюю можно удалить, подвергнув образец давлению и температуре, лежа-

Ф и г. 218. Жгутики бактерий [16].

Видно, что по своему строению они напоминают канат, свитый
из отдельных прядей. Х50 000-0,72.

сцим выше критической точки, и таким образом обеспечить переход в га-
зовую фазу без образования границы между жидкой и газовой фазами.

Контраст, которым обладают

изображения объектов, осажден-
ных из раствора на подложку, не-
велик, если объекты имеют малую
толщину. Для того чтобы увели-
чить контраст и одновременно
сообщить изображениютрехмерный
вид, на объект напыляют тонкий
слой атомов тяжелых металлов
(палладия или урана). Метод на-
пыления, разработанный Вильям-
сом и Быковым, позволяет ясно
увидеть внешние очертания объек-
тов, однако внутреннее их строе-
ние может остаться скрытым. Схе-
ма аппаратуры для напыления
приведена на фиг. 215. Поскольку

Ф и’г. 219. Схема ультрамикротома [9].
1 — образец; 2 — ванночка с жидкостью; 3 —нож;
4 — электрический нагреватель; 5 — эксцентри-
чески закрепленная колонка образца; 6 — пре-
цизионные подшипники; 7 — противовес колон-
ки образца.

в высоком вакууме атомы напыляе-

мого металла летят по прямым, металл закрывает подложку всюду,
за исключением областей, находящихся позади объекта. В этих областях
электронный пучок, падающий па обработанный таким образом препарат,
рассеиваться не будет и на снимке изображение их будет черным, тогда^как
остальные места будут выглядеть светлыми. Снимок выглядит так, как
если бы объекты отбрасывали тень от источника света, помещенного в точку,
из которой производилось напыление. По длине тени можно определить
высоту объекта, если угол напыления известен. На фиг. 216—218 приве-
дены электронные микрофотографии препаратов, напыленных металлом
для выявления формы объектов.
> Так как для получения высокого разрешения требуются тонкие образ-
цы, было предпринято много усилий для усовершенствования микротомов,
с помощью которых можно было бы получать с хорошей воспроизводимо-
стью достаточно тонкие срезы, минимально повреждая образец. В настоящее
время получение таких срезов является обычным делом. Образец (ткань
или, скажем, бактерию) сначала фиксируют в четырехокиси осмия при
рН около 7. Четырехокись осмия служит не только фиксатором (причем
действие ее связано с минимальными нарушениями структуры объекта),
но и красителем, поскольку она обладает высокой электронной плотностью.
Клеточные компоненты, поглотившие осмий, хорошо рассеивают электроны

Фиг 220. Электронная микрофотография тонкого среза
через базальную область ацинозной клетки поджелудочной
железы крысы [17].

Буквой т обозначена митохондрия. Остальная часть поля зрения
занята эндоплазматической сетью, имеющей вид полос, ограни-
ченных мембранами. Видны также мелкие частички с диамет-
ром ^150 А, расположенные на внешних поверхностях мембран
и между ними. Эти частички содержат РНК и белок. Окраска
четырехокнсью осмия, х 50 000-0,78.

и прекрасно видны на электронных микрофотографиях. После фиксации
образец обычно пропитывают легко полимеризуемым мономером, обычно
метакрилатом. Затем, добавляя катализатор, мономер полимеризуют, чтобы
получить твердый блок, который может быть использован для получения
тонких срезов. Небольшое и равномерное перемещение микротома в период
между двумя срезами может быть получено за счет теплового расширения
металлического стержня со скоростью порядка 104 А в 1 мин. Если полу-
чать один срез в секунду, то при этих условиях средняя толщина среза
будет составлять 160 А. Схема ультрамикротома, сконструированного
Шёстрандом, показана на фиг. 219. Мимо ножа, представляющего собой
кусок стекла или специально заточенное бритвенное лезвие, один раз
в секунду проходит закрепленный на эксцентрике держатель образца.
Подача образца осуществляется за счет теплового расширения стержня.
Получившиеся срезы попадают на поверхность жидкости, наполняющей
прикрепленную к ножу ванночку, откуда их извлекают стеклянной лопа-
точкой и переносят на подложку. Нафиг. 3 и 220 показаны электронные мик-
рофотографии двух тонких срезов, полученных при помощи ультрамикро-
тома. В качестве красителей для электронной микроскопии, кроме осмия,
могут быть использованы соединения других тяжелых металлов. Так,
например, при исследовании волокон коллагена отличный результат дает
обработка фосфовольфрамовой кислотой (см. фиг. 63).

Электронная микроскопия развивается очень быстро. Сведения, касаю-
щиеся конкретных деталей методов и экспериментальной техники, чита-
тель может найти в литературе [1, 5, 9].

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	Апйегзоп Т. Р., «Е1ес(гоп Мтсгозсору о! Мгсгоог^ашзтз», тп РЬуз1са1 ТесЬ-
тдиез 1п В1о1офса1 Кезеа4сЬ III, ей. Ьу 6. Оз1ег апй А. V/. Ро111з1ег. Асайегтс
Ргезз, И. А., 1956.

2.	Багет К., «РЬузе—соп!газ1, 1п1ег!егепсе— соп!газ( апй Ро1уг1гш§ Мт’сгозсору»,
1п Апа1уНса1 Су1о1о§у, ей. Ьу К-С. МеИогз, МсОгагу—НП1, И. У., 1955. (Методы
цитологического анализа, М., ИЛ, стр. 109, 1957).

3.	В а г е г К-, «Мтсгозсору», 1п Су1о1о§у апй Се11 [РЬуз1о1о§у, ей. Ьу С. Воигпе,
ОхТогй ИптуегзИу Ргезз, И. У., 1951.

4.	В 1 о и 1 Е. К-, «ИИгау1’о1е1 Мтсгозсору апй ИИгаут’оЫ М1сгозрес1готе1гу», Айу.

В1о1. Мей. РЬуз., 3, 285 (1953).

5.	6е(1 пег М. Е., О г п з I е 1 п Ь., «М1сго(оту», тп РЬузтса! ТесЬшдиез 1п
В1о1о§1са1 КезеагсЬ III, ей. Ьу С. Оз!ег апй А. АУ. РоШз1ег, Асайегтс Ргезз
И. У., 1956.

6.	О з I е г О., «ВтгеТпп^епсе апй ШсЬгот'зт», 1п РЬузт'са! ТесЬш'дпез 1п В1о1офса1
КезеагсЬ I, ей. Ьу 6. Оз1ег апй А. АУ. Ро111з1ег, Асайегтс Ргезз, И. У., 1955.

7.	Оз!егЬег§ И., «РЬазе апй 1п!ег1егепсе Мтсгозсору», ш РЬузтса! ТесЬшдиез
тп В1о1офса1 КезеагсЬ I, ей. Ьу С. Оз(ег апй А. АУ. Ро111з(ег, Асайегтс Ргезз,
И. У., 1955.

8.	К тсЬ агйз О. АУ., «Ниогезсепсе Мтсгозсору», 1п Апа1уНса1 Су1о1о§у, ей. Ьу
К. С. Ме11огз, МсСгагу—НШ, Ы. У., 1955.

9.	8 ) б з I г а п й Р. 8., «Е1ез!гоп М1 егоз сору о! СеП апй Ттззпез». 1п РЬузка! ТесЬ-
шдиез 1п В1о1о§1са1 КезеагсЬ III, ей. Ьу С. ОзАег апй А. АУ. РоШз1ег, Асайегтс
Ргезз, И. У., 1956.

10.	Н а 1 1 С. Е., 1п1гойпсНоп 1о Е1ес!гоп Мтсгозсору, МсОгатлт—НШ, И. У., 1953.

11.	АУ у с к о I I К- АУ. С., Е1ес!гоп Мтсгозсору, 1п!егзс1епсе РиЬИзЬегз И. У., 1949.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

12.	8 е а г з Р. М., Хет а п з к у М. АУ., Со11е§е РЬузтсз, ТЫгй ЕйШоп, Аййтзоп—
АУез1еу, 1960.

13.	Апйегзоп Т. Р., Со1й 8рпп§ НагЬог 8утр. оп фиапЕ В1о1о§у, XVIII, 197
(1953).

14.	АУ у с к о 11 К. АУ. С., ТЬе АУоНй о/ (Ье Е1ес!гоп Мтсгозсоре. Уа1е ИптуегзИу
Ргезз, Неи' Науеп, 1958.

15.	Наг 4 К. АУ., ВтосЬтт. е( ВторЬуз. Ас1а, 28, 457 (1958).

16.	Ь а Ь а V Е. АУ., М о з 1 е у V. М., ВюсЫт. е! ВюрЬуз. Ас1а, 15, 325 (1954).

17.	Р а 1 а й е О. Е., 1п Мт'сгозота! РагНс1е8 апй Рго!еш ЗупЬЬевтз, ей. Ьу К. В. КоЬеНз.
Рег^атоп Ргезз, Не\у Уогк, 1958.
Глава XIII

ИЗОТОПНЫЕ ИНДИКАТОРЫ

1.	Введение. Ядра атомов построены из нейтронов и протонов. Вокруг
положительно заряженного ядра расположены электроны, образующие
отрицательно заряженную оболочку, которая определяет валентность
и химические свойства каждого атома. Структура электронных оболочек
атома зависит только от числа протонов. Масса и устойчивость1 атома
(определяемые исключительно ядром) зависят как от числа нейтронов,
так и от числа протонов.

Тот факт, что химические свойства атома зависят только от числа
протонов в ядре, открывает возможность изменять вид атома в какой-либо
молекуле без изменения ее химических свойств. Такие видоизмененные
атомы называют изотопами. Методы, связанные с использованием изото-
пов, носят название методов меченых атомов, хотя, как мы увидим,
возможность метить атомы далеко не исчерпывает того полезного, что могут
дать эти методы в изучении клетки.

Прежде чем перейти к вопросу об использовании этих необычных ато-
мов (изотопов) в биологических исследованиях, кратко опишем строение
атомного ядра и его поведение в том случае, когда оно неустойчиво.

Нейтроны и протоны в ядре образуют очень компактную систему,
в результате чего в ядре достигается самая высокая плотность вещества,
какая только может существовать. К любой ограниченной атомной системе
применимы законы атомной физики, и нет основания полагать, что они не
будут выполняться также внутри ядра. Нейтроны и протоны занимают
в ядре различные уровни энергии, причем число тех и других на каждом
уровне определяется принципом Паули. Это хорошо известное положение
имеет очень важные последствия. Плотность ядра настолько огромна
и силы, действующие между частицами, так велики, что для того, чтобы
вынудить протон или нейтрон занять более высокий энергетический уро-
вень, требуется значительное увеличение энергии ядра. Во многих слу-
чаях это будет означать также, что для других комбинаций чисел протонов
и нейтронов при том же общем их числе полная энергия ядра будет значи-
тельно меньше. Тогда превращение нейтрона в протон (или наоборот)
в ядре становится энергетически выгодным, а это открывает возможность
перехода одного ядра в другое. Механизм такого перехода, объясненный
Ферми, заключается либо в превращении нейтрона в протон, электрон
и нейтрино, либо в превращении протона в нейтрон, положительно заря-

1 Имеется в виду устойчивость по отношению к радиоактивному распаду.—
Прим. ред.
женный электрон (позитрон) и нейтрино. Этот переход предусматривает раз-
ницу в энергии, положительную для превращения нейтрона в протон
и отрицательную, если превращается протон. Во всех этих процессах ней-
трино непосредственно не обнаруживается, хотя оно уносит энергию,
импульс и вращательный момент.

В результате такой способности ядра изменять свой характер осуще-
ствляется процесс, изображенный схематически на фиг. 221. В верхней
части схемы показано покоящееся ядро трития Н3 — радиоактивного
изотопа водорода; пунктирной линией обозначена примерная область дей-
ствия ядерных сил. Заметим, что область действия ядерных сил — это,
по-видимому, наилучшая характеристика, которая может быть исполь-
зована для описания границ ядра. В нижней части схемы показан сам

Фиг. 221. Схема превращения Н3 в Не3.
Объяснение см. в тексте.

момент перехода. Реально этот переход заключается в превращении ней-
трона в протон внутри ядра. При этом превращении испускаются электрон
и нейтрино, а ядро, намного более тяжелое, чем эти частицы, приобретает
импульс отдачи. Освобождаемая энергия распределяется между тремя
движущимися элементами процесса в сильной степени неравномерно: льви-
ную долю энергии забирают более легкие частицы. Энергия, уносимая
нейтрино, непосредственно необнаружима, так как взаимодействие его
с веществом очень слабо; вследствие этого появляется неожиданная на пер-
вый взгляд неопределенность в энергии электрона.

Рассмотрим последний, завершающий этап радиоактивного процесса.
Новый заряд, появившийся в результате рождения нового протона, при-
тянет дополнительный электрон из окружающего вещества. Это будет
почти наверное не тот электрон, который возник в рассматриваемом про-
цессе, а другой электрон, освобожденный каким-либо способом из окружаю-
щего вещества. Свободные электроны для такого процесса всегда имеются.
Таким образом, конечным итогом рассматриваемого процесса будет появле-
ние нейтрального атома гелия, который займет свое место среди прочих
атомов окружающего вещества. Этот последний этап рассматриваемого
процесса показан (в другом масштабе) в нижнем левом углу фиг. 221.

Радиоактивные изотопы, испытывающие такого же рода превращения,
существуют и у других элементов. Вероятность, с которой происходит рас-
пад, сильно меняется от элемента к элементу. Вероятность распада в еди-
ницу времени называется постоянной распада и обозначается X. Закон
радиоактивного распада выражается хорошо известной формулой

-^= — МП,
Ы	'

или, в интегральной форме,

1п (У/Уо) = — М.

Если через Т\/2 обозначить время, при котором М становится равным
1/2^о, то мы получим, что Т1/2 = (1п2)/Х. Величина 'Л/2, или период полу-
распада, выражается в единицах времени и служит более наглядной харак-
теристикой вероятности распада. Период полураспада для различных изо-
топов варьирует от малых долей секунды до нескольких миллиардов лет
и является наиболее важной характеристикой радиоактивного изотопа.

Во многих случаях ядро, образовавшееся после распада, находится
в возбужденном состоянии. Такое ядро будет быстро переходить в основ-
ное состояние в результате испускания электромагнитного у-излучения.
Поэтому у-излучение иногда является важной характеристикой радиоак-
тивного процесса.

Устойчивые тяжелые ядра содержат больше нейтронов, чем протонов,
причем условия устойчивости ядра могут выполняться для нескольких
значений числа нейтронов в ядре. Такие ядра, содержащие одинаковое
число протонов, но разное число нейтронов, существенно различны в отно-
шении ядерных свойств, но имеют одинаковый заряд. Атомы, имеющие
такие ядра, ведут себя в химическом отношении одинаково, но имеют раз-
личные массы; это различие в массах может быть использовано не только
для идентификации, но и для разделения изотопов.

Таким образом, устойчивые изотопы, использованные в необычных
концентрациях (необычных по сравнению с естественной смесью изотопов
в данном элементе), при наличии какого-либо метода определения масс
могут быть применены в качестве изотопных индикаторов для исследования
различных биохимических процессов. То же самое можно, конечно, сде-
лать и с помощью радиоактивных изотопов, причем в этом случае опреде-
лять массу атомов для их идентификации не требуется, так как радио-
активные атомы очень легко обнаружить.

Заканчивая введение, мы можем сказать, что при изучении различных
химических процессов в качестве индикаторов могут быть использованы
как радиоактивные, так и устойчивые изотопы; первые обнаруживают по
их радиоактивности, вторые — посредством определения концентрации
изотопов в образцах.

2.	Обнаружение и количественное определение изотопов. Вероятно,
ни в одной другой области экспериментальной техники не была проделана
такая большая работа, как в технике идентификации изотопов и измере-
ния радиоактивности. Почти невероятно, чтобы читатель ничего не знал
об этом; более того, возможно, что он уже владеет некоторыми методами
регистрации ядерных частиц и, весьма вероятно, имеет определенное мне-
ние относительно их достоинств и недостатков. Экспериментальная тех-
ника в этой области развивается столь быстро, что рассмотреть всю массу
существующих в настоящее время приборов — задача вряд ли выполни-
мая. Но надо сказать, что, несмотря на огромный объем каталогов промыш-
ленной аппаратуры, существует всего несколько очень простых принципов
регистрации изотопов. Так как это имеет прямое отношение к биофизиче-
ским экспериментам, мы кратко обсудим их здесь.
Для регистрации радиоактивности используются процессы ионизации
и возбуждения атомов при прохождении быстрой заряженной частицы через
вещество. При этом вещество играет двоякую роль: с одной стороны, оно
выступает как поглотитель, а с другой — как необходимый фактор, без
которого регистрация не может быть осуществлена. Если количество
вещества, лежащего на пути частицы к той точке, где завершается акт реги-
страции, слишком велико, то частица не может быть зарегистрирована.
Это имеет особенно большое значение, если энергия частицы мала (как,
например, в случае С14 или трития). Один из наиболее простых методов
регистрации — это измерение (скажем, с помощью электроскопа) иониза-
ционного 'Тока, возникающего в газе в результате ионизации, производимой
частицей (или группой частиц в том случае, если активность источника
достаточно высока).

Такой метод очень трудно применить к регистрации одиночных актов
распада, или, другими словами, к счету отдельных частиц. Его можно моди-
фицировать, заменив золотой лепесток или кварцевую нить в электроскопе
электронным усилителем (ламповый электрометр), но в этом случае возни-
кает дополнительное осложнение, заключающееся в появлении флуктуа-
ций усиленного электронными лампами тока. Такой метод усиления иониза-
ционных токов может найти применение в тех лабораториях, где преду-
смотрены необходимая защита и стабилизация источников питания. Там же,
где усложнение аппаратуры нежелательно, целесообразнее применять две
модификации этого метода. Первая заключается в том, что газ, в котором
протекает ионизационный ток, заменяется прозрачным твердым кристал-
лом, испускающим свет, когда через него проходит быстрая частица. Во вто-
рой модификации для усиления первоначального ионизационного тока
используется явление ионизации при соударении.- Первое устройство
получило название сцинтилляционного счетчика, второе имеет две разно-
видности — пропорциональный счетчик и счетчик Гейгера — Мюллера.

В сцинтилляционных счетчиках используется способность некоторых
веществ (люминофоров) испускать свет при действии на них ионизирую-
щего излучения. Прохождение быстрой частицы вызывает в люминофоре
короткую вспышку света (сцинтилляцию). Люминесцирующее тело, пред-
назначенное для регистрации быстрых частиц по вызываемым ими сцинтил-
ляциям, называют сцинтиллятором. Сцинтиллятор прикрепляют к поверх-
ности фотоэлектронного умножителя так, чтобы свет сцинтилляций падал
на фотокатод умножителя. Сцинтилляции вызывают появление электрон-
ных импульсов на выходе фотоэлектронного умножителя, которые доста-
точно велики, чтобы их можно'было зарегистрировать с помощью обычной
электронной схемы. Конкретная конструкция сцинтилляционного счетчика
зависит от его целевого назначения. Если он предназначается для счета
жесткого у-излучения, то должен иметь большие размеры и плотность,
чтобы передача энергии от у-кванта высокой энергии электрону проис-
ходила бы с относительно высокой вероятностью. Схематический чертеж
сцинтилляционного счетчика показан на фиг. 222. Люминофором может
служить кристалл йодистого натрия, который обладает достаточной плот-
ностью и может быть выращен до больших размеров (свыше 10 см3).
В настоящее время доступен также йодистый цезий. Это отличный сцин-
тиллятор для счета жестких у-квантов (например, у-излучения изотопов
натрия и кобальта). В других конструкциях применяют пластические
сцинтилляторы, представляющие собой прозрачную пластмассу с добав-
кой люминофора. Эти сцинтилляторы удобно соединять со светопрово-
дом, который может огибать различные препятствия. Такой счетчик может
быть использован для измерения радиоактивности внутри тела животных
и был даже однажды помещен в мозг человека. Наконец, в ряде случаев
применяют жидкие сцинтилляторы.

Принцип действия счетчиков второго класса (пропорциональных счет-
чиков и счетчиков Гейгера — Мюллера) состоит в том, что под влиянием

Фиг. 222. Схема, иллюстрирующая принцип
действия сцинтилляционного счетчика.

у-Квант входит в люминофор (йодистый натрий), и его
энергия в результате комптоновского рассеяния пере-
дается электрону и более длинноволновому фотону
видимого света. Некоторые из этнх фотонов достигают
фотокатода, где они дают начало электронной лавине
в фотоумножителе.

очень сильного электрическо-
го поля электроны, освобож-
денные прошедшей частицей,
ускоряются до энергий, при
которых они сами начинают
в свою очередь ионизовать
молекулы газа. В результате
такой ударной ионизации
первоначальный ионизацион-
ный ток, созданный частицей,
проникшей в чувствительный
объем счетчика, возрастает
во много раз. На фиг. 223
схематически изображено дей-
ствие счетчиков с ударной
ионизацией. Рассмотрим сна-
чала пропорциональный счет-
чик. Быстрая частица, попа-
дая в счетчик в точке А, вы-
зывает ионизацию газа; выби-

тые ею электроны летят по
направлению к положительно заряженной нити, а положительные ионы
движутся к стенкам цилиндра. На своем пути к нити электрон испытывает

многократные столкновения с молекулами газа; если при таких столкнове-
ниях он не встретится с электроотрицательными молекулами примесей

Фи г . 223. Схема работы пропорционального
счетчика (Л) и счетчика Гейгера — Мюллера (Б)

(т. е. такими молекулами, которые сами охотно присоединяют к себе элек-
трон), то он достигнет области вблизи нити, где напряженность электриче-
ского’поля очень высока и где он может между двумя соударениями с моле-
кулами газа приобрести энергию, достаточную для того, чтобы в свою оче-
редь вызвать ионизацию. Таким образом возникает электронная лавина.
В результате вблизи нити образуется облако отрицательного заряда, кото-
рый уменьшает создаваемое ею электрическое поле. Это приводит к пре-
кращению процесса лавинной ионизации. Электроны собираются на нити,
изменяя ее потенциал. Примерно через 1СГ5 сек процесс заканчивается
и счетчик готов к регистрации следующей частицы.

Поскольку изменение потенциала нити мало, необходимо дальнейшее
усиление полученного сигнала радиотехническими средствами. Однако
некоторое усиление осуществляется уже за счет вторичной ионизации в газе
(так называемое газовое усиление), и поэтому необходимый для регистра-
ции усилитель в техническом отношении не сложен. В пропорциональном
счетчике мощность лавины, а следовательно, и изменение потенциала нити
в среднем пропорциональны первоначальной ионизации. Это в одних слу-
чаях удобно, а в других — нет. Увеличивая напряжение между электродами,
можно довести мощность лавины до такой величины, чтобы из анода выби-
валось достаточное количество фотонов для освобождения хотя бы одного
фотоэлектрона из внешней стенки (катода), в результате чего разряд в счет-
чике возобновляется. Разрядный механизм такого рода эффективно решает
проблему регистрации, так как в этом случае потенциал нити при протека-
нии разряда может измениться на несколько сот вольт. Этот разряд, однако,
нужно погасить, для того чтобы мог начаться следующий. На этом прин-
ципе основано действие счетчика Гейгера — Мюллера; для гашения раз-
ряда либо применяют электронную схему гашения, либо наполняют счет-
чик специальной газовой смесью, содержащей гасящие вещества. Ввиду
того что разряд сильно меняет условия в камере, восстановление перво-
начальных условий в этом счетчике требует времени порядка миллисекунды
(мертвое время). Это в свою очередь означает, что при скоростях счета
более 100 ими/сек счетчик Гейгера дает ошибочные результаты, так как
некоторые частицы, попадающие в чувствительный объем в мертвое время,
«просчитываются», т. е. не регистрируются. Пропорциональный счетчик,
у которого мертвое время не столь велико, можно использовать при гораздо
больших скоростях счета.

Радиоактивный распад представляет собой явление, подчиняющееся
закону случая. Поэтому для получения статистически значимых результатов
измерений в каком-либо эксперименте необходимо сосчитать большое число
распадов. Если скорость счета не очень велика, то на это требуется много
времени; если же скорость счета будет слишком большой, то механический
регистратор вовсе не будет считать, так как вполне естественно, что он обла-
дает некоторой инерционностью. Для преодоления последнего затруднения
существуют различные переснетные схемы, в настоящее время ставшие
общедоступными, так как их выпускает промышленность.

При наличии соответствующего счетчика, пересчетной схемы и реги-
стрирующего устройства обнаружение и количественное измерение радио-
активности оказывается гораздо более простой процедурой, чем точное взве-
шивание, и примерно такой же простой, как отмеривание объемов жидкости
с помощью пипетки.

Что касается устойчивых изотопов, то использование их в качестве
изотопных индикаторов представляет большие трудности, так как два
таких изотопа отличаются друг от друга только массой. Рассмотрим, каким
образом различие в массе можно использовать для обнаружения и измере-
ния различного содержания отдельных изотопов. В случае очень легких
изотопов отношение масс сравнительно велико, поэтому методы измере-
ния относительно просты. Так, измеряя скорость падения капли воды
во фтортолуоле (который имеет плотность, близкую к плотности воды,
и не смешивается с ней), можно определить количество дейтерия в водном
образце с точностью до 1 /500 000. Дальнейшим развитием этого метода диф-
ференциального измерения плотности является использование градиента
плотности в ультрацентрифуге. Например, проводя измерения в градиенте
плотности раствора СзС1, удалось различить два сорта молекул ДНК, один
из которых был помечен изотопом Ы15.

В общем случае для идентификации и измерения относительного содер-
жания таких изотопов, как С13, К1'5 и О18, необходим масс-спектрометр.
В этом приборе газовая смесь изотопов, находящаяся при низком давлении,
ионизована. Эти ионы подвергаются воздействию электрических и магнит-
ных полей, тщательно подобранных таким образом, чтобы на выходную
щель падал сфокусированный пучок ионов, имеющих определенное отно-
шение заряда к массе. В этом случае проходящий через щель ток будет про-
порционален количеству ионов данного сорта, а при соблюдении соответ-
ствующих условий и количеству данного изотопа, содержание которого
желательно определить.

Для эффективного разделения пучков различных ионов путь ионов
должен быть достаточно большим, щель — узкой; если учесть, что при этих,
условиях измеряемый ток очень мал, то ясно, что требуется очень тщатель-
ная регулировка. Область, где производится ионизация газовой смеси,
должна находиться при сравнительно высоком давлении, а вся остальная
система — при очень низком; это требует большого мастерства в откачке
и в устройстве системы входных щелей. Все эти факторы, вместе взятые,
делают масс-спектрометр дорогостоящим прибором, довольно сложным
в эксплуатации. Тем не менее разрешение всех этих трудностей не лежит
за пределами возможностей биологических лабораторий, в особенности
если они располагают достаточными средствами. Излагать детали масс-
спектроскопии мы здесь не можем и отсылаем читателя к литературе, при-
веденной в конце главы.

3.	Использование изотопных индикаторов в экспериментальных иссле-
дованиях. Революционная по своей природе биохимия сама претерпела
революцию в результате применения изотопных индикаторов. Взяв на-
удачу один из номеров журнала Лоигпа! оГ Вю1о§1са1 СйеппзДу за 1955 год,
мы нашли, что 40% статей так или иначе имеют отношение к методу изо-
топных индикаторов. Таким образом, можно сказать, что литература
по изотропным индикаторам — это, по существу, вся литература по био-
химии. Поэтому ясно, что рассмотреть все области, в которых нашли при-
менение изотопные индикаторы, мы не сможем.

Вместо этого мы обсудим несколько конкретных экспериментов, пред-
ставляющих особый интерес для биофизики: 1) исследование проницае-
мости клеточной мембраны для небольших меченых молекул (разд. 4),
2) изучение включения аминокислот (разд. 5), 3) изучение индуцирован-
ного синтеза ферментов (разд. 6), 4) изучение репликации ДНК (разд. 8)
и, наконец, 5) инактивация фага при распаде включившегося Р32 (разд. 7)
Так как в этих пяти экспериментах использованы далеко не все доступные
радиоактивные изотопы, в разд. 9 мы приведем в виде дополнения краткий
обзор изотопов, нашедших наиболее широкое применение в молекулярной
биофизике.

4.	Проницаемость бактериальной клетки для молекул низкомолекуляр-
ных веществ. Проницаемость клетки представляет собой одну из самых
привлекательных проблем для изучения с помощью радиоактивных инди-
каторов. Одно из первых исследований в этой области (изучение проницае-
мости эритроцитов) было проведено с радиоактивными изотопами, получен-
ными на циклотроне в лаборатории одного из авторов этой книги. С тех пор
в этом направлении сделано очень много.
В этой главе мы рассмотрим серию работ группы ученых Института
Карнеги в Вашингтоне в составе Робертса, Абельсона, Кауи, Болтона и Брит-
тена [5], результаты которых можно считать вполне убедительными. Эти
исследования проводились, главным образом, на двух объектах: Е. соИ
(кишечная палочка) и Тоги1ор&18 иЫИз (дрожжи).

Методика их опытов была очень проста. Получив концентрированные
культуры клеток, их затем охлаждали для того, чтобы остановить деление,
промывали и переносили на питательную среду, содержавшую, например,
сульфат натрия, меченный 835. После непродолжительного выдерживания
в радиоактивной среде клетки осаждали центрифугированием при 14 000 §.
Надосадочную жидкость сливали, а осадок, содержащий бактерии, промы-
вали солевым раствором. Содержание радиоактивной метки в осадке опре-
деляли следующим образом: определенную часть осадка переносили
на бумажный фильтр, покрытый слоем детергента, и измеряли его активность
на торцовом счетчике с тонким окошком. Активность клеток (отнесенная
к 1 мл) составляла 72% от активности, приходящейся на 1 мл среды; время
выдерживания в радиоактивной среде не превышало 8 мин. Следовательно,
72% полного клеточного объема является пространством, доступным для
сульфата. В других экспериментах эта величина достигала 75%. При
высушивании же таких клеток потеря воды составляла почти 75% объема.
Отсюда вытекает, что для сульфата равно доступна вся вода клеток, т. е.
вода, находящаяся внутри клеток, в промежутках между клетками, и даже
вода, связанная со структурными элементами клетки. При переносе бак-
терий в среду, содержащую меченый белок, авторам удалось определить
объем воды, находящейся в промежутках между клетками; при этом оказа-
лось, что он составляет не более одной трети всего объема клеточного осадка.
Отсюда можно заключить, что внутри клетки имеется свободно доступная
область, занимающая значительную часть объема клетки. Таким образом,
на основании этих экспериментов можно с полным основанием сделать вывод,
что проницаемость клеток представляет собой исключительно сложное явле-
ние, по крайней мере для данного вида бактерий и использованного в опы-
тах сульфата.

Подобного рода эксперименты были проведены для широкого класса
меченых веществ, включая ионы фосфатов, глюкозо-1-фосфат, фруктозе-1-
фосфат, ионы калия, рубидия, цезия и натрия, меченный по 8 цистин,
меченный по 8 метионин, меченную по С глутаминовую кислоту и меченный
по 8 глутатион — вещество, состоящее из глутаминовой кислоты, цистеи-
на и глицина. Для всех этих веществ, за исключением глутатиона, отно-
шение радиоактивности клеток к радиоактивности среды составляло 75%.
В случае же глутатиона это отношение было несколько меныпим (около
63%). В более поздних экспериментах для этого отношения были полу-
чены значения, примерно вдвое меньшие, чем те, которые были най-
дены в описанных опытах. Но, даже принимая во внимание эти последние
данные, трудно объяснить тот факт, что у некоторых бактериальных кле-
ток клеточная оболочка не выполняет функции отбора по отношению
к малым молекулам, участвующим в жизнедеятельности клетки. Скорее
она просто представляет собой скопление больших структурированных
молекул, входящих в состав клетки. Таким образом, мы приходим к выводу,
что в протекающих в клетке процессах синтеза и ферментативных процес-
сах свободно могут участвовать молекулы небольших размеров и что они
удерживаются клеткой только в том случае, если произошел какой-либо
процесс, приведший к включению такой молекулы в клеточные структуры.
Это было показано для очень ограниченного числа организмов, и никак
23 Заказ № 1168
нельзя утверждать, что существование мембран такого типа' представляет
собой общий случай. Однако сам факт отсутствия избирательности мем-
браны представляет большой интерес.

5.	Включение аминокислот; изотопная конкуренция. Эксперименты,
описанные выше, были проделаны на покоящихся клетках и их целью
являлось изучение проницаемости клеточной мембраны. Можно осущест-
вить аналогичные- исследования с использованием метки для изучения
путей, по которым протекает обмен веществ. В этом направлении было
проведено большое число работ, и их результаты уже оказали огромное
влияние на развитие биохимии клеточных процессов. Мы опишем здесь
общую методику исследования включения аминокислот в клетки Е. соИ
и приведем некоторые результаты общего характера.

Очевидно, что при изучении обмена веществ необходимо обеспечить
активный рост клеток. Поэтому подобные эксперименты проводят на быстро
делящихся бактериальных клетках; при этом используют наиболее под-
ходящие температурные условия и соответствующие питательные среды.
В среду добавляют радиоактивный компонент, выбор которого опреде-
ляется целью опыта. (Заметим, что методика эксперимента не зависит от
выбора радиоактивного компонента.) После этого клетки оставляют в среде
на некоторое время, определяемое целями данного исследования; при этом
в них протекают все нормальные процессы обмена веществ. Затем полу-
ченную массу бактериальных клеток центрифугируют или отфильтровы-
вают и подвергают специальному анализу. Один из таких стандартных ана-
лизов заключается в следующем.

1.	Клетки обрабатывают 5-процентной трихлоруксусной кислотой
в течение 30 мин при температуре 5° и центрифугируют. Получающаяся
при этом надосадочная жидкость состоит из одной фракции и содержит моле-
кулы низкомолекулярных веществ, таких, как глюкоза и аминокислоты.

2.	Оставшийся осадок обрабатывают 75-процентным этиловым спир-
том в течение 30 мин при температуре 45°, снова центрифугируют и отделяют
надосадочную жидкость. В ней содержатся пептиды, некоторые белки
и липиды.

3.	Осадок нагревают при температуре 100° с 5-процентной трихлор-
уксусной кислотой в течение 30 мин и снова центрифугируют. В состав
надосадочной жидкости в этом случае входят нуклеиновые кислоты.

4.	Осадок, остающийся после обработки горячей трихлоруксусной
кислотой, по-видимому, в основном представляет собой белок.

Такое деление на 4 стадии может быть весьма полезно. Однако, вос-
пользовавшись методом двухмерной хроматографии, мы можем добиться
еще большего эффекта. Хроматографическое разделение основано на том,
что различные вещества имеют разные растворимости в одном и том же рас-
творителе; поэтому, если смесь нескольких веществ (например, амино-
кислот) нанести на фильтровальную бумагу, то растворитель будет вымы-
вать их с различной скоростью. При этом может быть произведено разде-
ление отдельных фракций данной смеси, так как растворитель, поднимаясь
по фильтровальной бумаге (вследствие капиллярного эффекта), проходит
через пятно смеси аминокислот и переносит с собой ее отдельные компо-
ненты. Процесс вымывания разных аминокислот (элюция) происходит
с различной скоростью. При этом возможно, что элюция одной аминокис-
лоты уже закончится, тогда как для другой аминокислоты этот процесс
еще не наступит. В этом случае для каждого компонента образуется движу-
щаяся вверх полоска. Обычно такая полоска содержит смесь нескольких
аминокислот, разделение которых не прошло до конца. Если же, повернув
бумагу на 90° и подобрав другой растворитель, повторить процесс, то можно
получить еще более полное разделение.

Такой хроматографический анализ представляет собой очень важный
методический прием; он используется в большинстве лабораторий, работаю-
щих с аминокислотами и вообще с биологическими низкомолекулярными
веществами. Хроматографический анализ особенно удобен для работы
с радиоактивными индикаторами, так как в этом случае, приложив к хро-
матограмме лист фотобумаги, можно по ее почернению определить локали-
зацию радиоактивной метки. Кроме того, радиоактивное пятно (после опре-

деления его локализации
и сосчитать его активность
на торцовом счетчике Гей-
гера. Радиоактивный хро-
матографический анализ
очень эффективен, и неуди-
вительно, что благодаря
его использованию мы уже
можем объяснить некото-
рые процессы, протекающие
в клетке.

Таким образом, ход
эксперимента должен быть
следующим. В культураль-
ную среду вводят опреде-
ленное радиоактивное ве-
щество и на этой среде
выращивают исследуемые
клетки; после соответ-
ствующего увеличения их

фотографическими методами) можно вырезать

\ Аргинин

] 255

Дизин

90 о, Метионин
сульфат

О Треонин
ПО

Изолейцин
108

Глицин /у

12 Глутаминовая кислота

О Аспарагиновая кислота

100

Ф и г. 224. Радиоавтограф хроматограммы гидро-
лизата культуры Е. соИ, выращенной на среде
содержащей С14О2 и глюкозу [5].

Числа означают активности, соответствующие различным
аминокислотам.

числа (или титра), обычно

измеряемого по изменению оптической плотности, клетки центрифу-
гируют, гомогенизируют и разделяют описанным выше методом. Лока-
лизацию радиоактивности определяют по хроматограмме; точность такого
определения довольно велика. Прекрасным примером использования
этого метода служат работы Робертса и других сотрудников Института
Карнеги, касающиеся выяснения вопроса о пути включения С14О2
в клетки Е. соН, растущие на среде, содержащей глюкозу. На фиг. 224
воспроизведен радиоавтограф хроматограммы продуктов гидролиза
белковой фракции, полученный Робертсом. На схеме показаны поло-
жения различных аминокислот. С достаточной для практических целей
точностью можно считать, что оптическая плотность пятен примерно соот-

ветствует их активностям.

Мощным методом изучения характера процессов клеточного синтеза,
является метод изотопной конкуренции, использованный группой исследо-
вателей из Института Карнеги. Этот метод заключается в том, что к куль-
туральной среде добавляется избыток какой-либо аминокислоты, не содер-
жащей радиоактивную метку. Благодаря высокой проницаемости клеточ-
ной оболочки молекулы этой аминокислоты проникнут в клетку, где они
будут конкурировать с молекулами аминокислоты, синтезируемой в клетке
из глюкозы и меченой СО2. Если данная аминокислота не требуется в сво-
бодном виде для протекания. наиболее важных процессов жизнедеятель-
ности клетки, никакого эффекта наблюдаться не будет. Обычно заранее это
неизвестно. Вместе с тем, если данная аминокислота необходима для обра-
зования других аминокислот, то они будут синтезироваться главным обра-
зом из находящейся в избытке нерадиоактивной аминокислоты, а не из той
аминокислоты, которая образовалась в клерке в процессе биосинтеза.
На фиг. 225 показаны результаты такого процесса конкуренции, возникаю-
щего при добавлении избытка треонина, не содержащего радиоактивной
метки. В этом эксперименте использовался тот же метод фракционирования,
что и в работе Робертса. В результате была получена хроматограмма, при-
веденная на фиг. 225. Эта хроматограмма отличается от предыдущей отсут-
ствием треонина и изолейцина. При этом отсутствие меченого треонина

Фиг 225. Радиоавтограф хроматограммы гидро-
лизата культуры Е. соИ, выращенной в присутствии
меченых СО2 и глюкозы при избытке в среде неме-
ченного треонина [5].

Сравнение с фиг. 224 показывает, что включение метки
в треонин и изолейцин в этом случае подавлено. Это
означает, что треонин необходим для синтеза изолейцииа.

вполне естественно; оно
объясняется конкуренцией
с находящимся в избытке
нерадиоактивным треони-
ном. Отсутствие же изолей-
цина можнообъяснитьлишь
исходя из предположения
о том, что эта аминокислота
каким-то образом синтези-
руется из треонина.

С помощью этого ме-
тода можно относительно
быстро осуществить глу-
бокие и интересные иссле-
дования. В табл. 31 приве-
дены данные по подавлению
включения метки в некото-
рые аминокислоты при до-
бавлении различных ве-
ществ. Уже из одной этой
таблицы видно, что суще-

ствуют определенные пути
синтеза аминокислот. Однако можно еще детальнее изучить процессы
биосинтеза, применяя в тех же экспериментах другие источники радио-
активного углерода. Например, при использовании меченого уксусно-
кислого натрия было показано, что добавление избытка глутаминовой
кислоты заметно подавляет включение радиоактивного углерода в пролин,
аргинин, лизин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту (что
можно было заранее ожидать) и треонин и не влияет на процесс включения
радиоактивного углерода в лейцин.

С помощью этой методики было осуществлено за сравнительно корот-
кий срок множество экспериментов; в результате суммирования их резуль-
татов было найдено, что синтетический цикл клеток Е. соИ близок
к циклу Кребса (см. фиг. 226). Из приведенной схемы видно, что уксусная
кислота, которая входит в цикл уже после прямого синтеза аспарагиновой
кислоты, принимает непосредственное участие в образовании глутаминовой
кислоты, а не в образовании аспарагиновой кислоты. Опыты, в которых
в качестве конкурентов использовались различные кислоты этого цикла,
подтвердили обоснованность приведенной схемы. В действительности такие
эксперименты могут дать еще больше — они позволяют оценивать скорости
различных процессов синтеза в клетке. Такие исследования обнаружили
одну очень важную особенность бактериального обмена веществ — его
гибкость. Добавление глутаминовой или аспарагиновой кислоты, а также
других аминокислот, образующихся из них, немедленно изменяет течение
процесса. Если клетки растут в отсутствие воздуха и глюкоза служит для
них главным источником углерода, то в обмене используется очень неболь-
шое количество глюкозы и выделяется очень мало СО2. Изменение скорости

Таблица 31

Процент подавления включения радиоактивной метки в некоторые аминокислоты
при добавлении различных веществ

Вещество	Аргинин	Аспара- гиновая кислота	Глута- миновая кислота	Изолей- цин	Лизин	Метио- нин	Пролин	Треонин
Аминомасляная кислота ....	0	0	0	90	0	0	0	0
Аргинин ....	100	0	0	0	0	0	0	0
Аспарагиновая кислота ....	20	60	60	60	70	60	60	60
Гидролизат казеи- на 		100	60	90	100	100	100	90 	90
Цитруллин . . .	100	0	0	0	0	0	0	0
Глутаминовая кислота ....	30	60	90	60	70	60	90	60
Гомоцистеин . .	0	0	0	0	0	80	0	0
Гомосерин . . .	0	0	0	90	0	90	0	90
Изолейцин . . .	0	0	0	100	0	0	0	0
Лизин 		0	0	0	0	100	0	0	0
Метионин ....	0	0	0	0	0	100	0	0
Орнитин 		65	0	0	0	0	0	0	0
Пролин 		0	0	о	0	0	0	90	0
Треонин 		0	0	0	100	0	0	0	90

процессов этого цикла может явиться также результатом адаптации орга-
низма в целом. Таким образом, хотя за счет цикла Кребса происходит
синтез таких важных метаболитов, как глутаминовая кислота (а также
пролин и аргинин) и аспарагиновая кислота (а также треонин, изолейцин,
метионин, лизин и пиримидины), синтетическая активность клетки опре-
деляется не только этим циклом. Эксперименты, проведенные на клет-
ках других микроорганизмов, показывают, что аналогичный цикл играет
в их обмене веществ столь же важную роль.

Возвращаясь к теме включения аминокислот, мы можем поставить
вопрос о том, что происходит с аминокислотой после того, как она или обра-
зовалась в процессе синтеза или же проникла в клетку через клеточную
оболочку из внешней среды. Ответ на этот вопрос до некоторой степени
дают опыты Бриттена по исследованию кинетики быстро протекающих
процессов с использованием меченых пролина и метионина с большим содер-
жанием радиоактивности. На фиг. 227 представлена зависимость скорости
счета от времени (в минутах) для двух фракций; из графиков видно, что ско-
рость включения метки в белок очень велика и что для низкомолекулярной
фракции достигается максимум, а затем происходит быстрый спад. Для
того чтобы включение пролина или метионина происходило с большой ско-
ростью, в среде должна содержаться глюкоза. Таким образом, если в клетке
идет активный обмен веществ, то скорость включения аминокислот очень
велика. Известно, что даже при температуре, близкой к 0°, аминокислоты,
Уксусная
кислота

СН3

Шавёлево- со.он

СО2. уксусная	\

\ кислота	\

\ СООН	\

Лимонная
кислота

СООН

Пировиио*
градная
кислота

'2

со

соон

соон

сонсоон

сн2

соон

Яблочвая
кислот а

<^ООН
СН2
СНОН
СООН

Фумаровая
кислота

СООН
СН .

СООН
СН2
снмн2
соон

цис- Аконитовая
кислота

СООН

сн

с—соон

сн2

Аспарагиновая
кислота

СООН

СНМН2 Глутаминовая
(СН2)2 кислота
СООН

сн \
соон с00г1

сн2

сн2
соон
Янтарная
кислота

со

сн2

сог

СООН
СО
СНСООН
СН2
СООН

соон

СООН

СНОН Изолимонвая

СНСООН кислота

СН2

СООН

Щавелевояитараая
кислота

сн2

СООН
ск^Кетогл ут а ров а я
кислота

Фиг. 226. Один из синтетических циклов — цикл Кребса.

Используя различные вещества, участвующие в этом цикле, в качестве
конкурентов в опытах по включению метки, можно показать, что для синте-
тических процессов в Е. соИ эта схема правильна. Можно также оценить
количества данного компонента, образующегося в цикле, и определить
таким образом, влияют ли изменения питательной среды на функцию цикла.

о

Ф и г., 227. Скорость включения пролина, меченного С14, в Е. соИ.
Характер кривой полного включения метки в течение первых 3 мин похож
иа характер кривой включения метки в белковую фракцию, в то время как
включение в низкомолекулярную фракцию сначала растет, а затем очень
быстро падает. I—включение в клетки; II—включение в белковую фракцию;
III — включение в низкомолекулярную фракцию.
проникшие в клетку, могут проходить в ее специфические участки и связы-
ваться там достаточно прочно для того, чтобы не происходила свободная
диффузия обратно за пределы клетки. Показано, что связывание в такого
рода рецепторных участках специфично, однако природа этого явления
еще не выяснена. Бриттен нашел, что хотя в клетке в фонде метаболитов,
предназначенных для белкового синтеза, может содержаться 75 000 моле-
кул пролина, лишь 25 из них находятся в свободном состоянии, т. е. могут
участвовать в процессе диффузии.

В этих опытах не было получено никаких данных, говорящих о присут-
ствии дипептидов или трипептидов. Исходя из проведенных в этой области
исследований можно сделать вывод о том, что, по-видимому, в процессе
•синтеза белка молекулы аминокислот прикрепляются к некоторой поверх-
ности, принимающей участие в этом синтезе, и удерживаются на ней до тех
пор, пока синтез белка не пройдет полностью. Некоторые дополнительные
данные указывают на то, что имеет место промежуточная стадия взаимо-
действия аминокислот с растворимой РНК (з-РНК). Вместе с тем специаль-
ными опытами было показано, что отсутствие одной аминокислоты полно-
стью прекращает образование любого вида белка. Этот общий взгляд на меха-
низм синтеза белков подтверждается работами по индуцированному синтезу
ферментов, которые будут описаны в следующем разделе. Мы хотим обра-
тить внимание читателя на то, что при изложении общепринятого взгляда
на механизм биосинтеза белков мы отнюдь не рассматриваем его как догму.
Мощная методика, которую мы только что описали, еще вовсе не исчерпала
себя и последнее слово в этой области далеко еще не сказано.

6.	Индукция адаптивных ферментов. Уже давно было известно, что
бактерии заметно отличаются по своей способности расти на разных сре-
дах. Клетки таких бактерий, как, например, ТШоЬасШиз ШоохИапз,
могут расти на среде, содержащей неорганические соли и серу, вырабаты-
вая в результате своей жизнедеятельности серную кислоту. На первый
взгляд такие системы напоминают химический завод, построенный из спе-
циальных не поддающихся коррозии материалов и имеющий специализи-
рованную технологическую схему. На самом же деле эти бактерии синте-
зируют белки с теми же самыми аминокислотами, как и у большинства
других бактерий, и используют при этом в общем такие же нуклеиновые
кислоты, как и другие бактерии. Это говорит о том, что, по-видимому, рас-
сматриваемые бактерии содержат большое число разнообразных эффективно
работающих ферментов, необходимых для того, чтобы происходили те уди-
вительные химические превращения, которые связаны с процессами роста
и деления. В то же время бактерии, жизнедеятельность которых обычно
локализована в каком-либо определенном органе животного, пользуются
более богатой питательной средой и не содержат такого большого набора
ферментов, так как могут рассчитывать на получение многих аминокислот
из внешней среды. С помощью некоторых ухищрений можно приготовить
среды, в которых будет отсутствовать каждый в отдельности из необхо-
димых ингредиентов и на которых клетки бактерий не будут расти. Одной
из причин отсутствия роста может быть отсутствие фермента, который мог
бы синтезировать из материалов среды необходимый метаболит и, таким
образом, компенсировать его отсутствие. Исследуя рост бактериальных
клеток, Моно и Спигелман обнаружили, что бактериальная популяция,
находящаяся в стадии покоя из-за отсутствия какого-либо фермента, может
тем не менее вдруг начать нормально расти. При этом детальное исследо-
вание показывает, что в этой новой культуре образовался необходимый
фермент, и, следовательно, культура адаптировалась.
Этому интересному явлению было посвящено много исследований,
в которых опыты с мечеными атомами сыграли очень важную роль. Было
найдено, что процесс адаптации в значительной степени ускоряется, если
в среде присутствуют молекулы индуктора, которым может быть субстрат
фермента, необходимый для компенсации недостающего ингредиента, или
другое вещество, напоминающее этот субстрат. Этот индуктор вызывает
образование того белка (фермента), который необходим для осуществления
процессов роста и развития.

Было проведено большое число работ по индукции Р-галактозидазы —
фермента, который гидролизует лактозу и делает возможным ее усвоение
в качестве источника углерода в Е. соИ. Добавление лактозы к среде, перво-
начально ее не содержавшей, вызывает огромное увеличение количеств*
данного фермента. Для объяснения механизма этого процесса можно было
бы просто предположить, что новый фермент получается в результате
некоторых изменений в уже существовавшем белке или, по крайней мере,
в его полипептидном предшественнике и что воздействие индуктора заклю-
чается лишь в том, что он добавляет недостающую низкомолекулярную-
группу и тем самым завершает формирование фермента. Однако исследо-
вания с применением меченых атомов показали, что это не так. Если среда
богата 835, то развивающиеся на ней клетки будут синтезировать белки
с высоким содержанием радиоактивности. Так как [3-галактозидаза содержит
серу, она также будет включать метку. Если же клетки на время индукции
переносятся на нерадиоактивную среду, в которую добавляется индуктор —
лактоза, то вновь образовавшаяся [3-галактозидаза оказывается нерадио-
активной. Этот опыт служит сильным аргументом в пользу того, что фер-
мент, появляющийся после индукции, образуется вновь, а не в резуль-
тате модификации существовавшего ранее предшественника. Эксперимент
такого рода можно проделать и в обратном направлении — выращивать
клетки на нерадиоактивной среде, а индукцию проводить в радиоактивной
среде. Было показано, что получающаяся при этом ^-галактозидаза радио-
активна. Все эти эксперименты подтверждают выводы, вытекающие из;
исследований обмена веществ, о которых говорилось выше, а именно что
предшественниками в синтезе белка являются, по-видимому, молекулы
низкомолекулярных веществ и что, вероятно, белок образуется очень
быстро в результате процесса одновременной «сборки».

Метод введения радиоактивной метки в сочетании с другими методами
становится мощным средством исследования биохимических процессов.
Недавно был разработан метод разрушения бактериальных клеток и выде-
ления из них микросомных частиц, или рибосом посредством центрифуги-
рования. Рибосомы по аналогии с микросомными частицами клеток печени
должны, по-видимому, играть важную роль в синтезе белков. Для изуче-
ния вопроса о распределении метки среди различных рибосомных фрак-
ций Робертс применял кратковременную метку длительностью всего 4 сек.
Меченые аминокислоты, по-видимому, сначала включаются в болылие-
микросомные частицы, а затем уже в другие фракции. Если эксперименты,
проведенные при других условиях, дадут те же результаты, то будет окон-
чательно доказано, что синтез белка происходит в основном в рибосомах.
Таким образом, необходимо изучить физическую структуру рибосом,
и несомненно, что, когда эта книга выйдет в свет, в этой области уже будут
сделаны важные открытия.

7.	Влияние включения Р32 на жизнеспособность бактериальных виру-
сов. Радиоактивные изотопы фосфора, серы и углерода сыграли важную-
роль в изучении развития и роста вирусов. При изучении вирусов
растений, которые можно получать в большом количестве, применяли
также М15.

Одним из первых и наиболее важных исследований по изучению разви-
тия бактериального вируса была работа Коэна (1947), в которой он пока-
зал, что фосфор, идущий на построение вирусных частиц, во время роста
вируса в инфицированной клетке почти полностью берется из питательной
среды, так что фосфор, содержавшийся в клетках бактерий до заражения
их вирусом, используется сравнительно мало. За этим последовало важное
открытие Путнэма и Козлова, которые установили, что при заражении
бактерии радиоактивным вирусом в потомстве первого поколения оказы-
вается 359о всего радиоактивного фосфора. Уотсон и Мало проделали то же
самое для второго поколения и показали, что в потомстве второго поко-
ления содержится 50% Р32.

Так как Р32 может очень эффективно включаться в клетки вируса просто
при выращивании этого вируса на бактериях, развивающихся на радио-
активной среде, то было бы интересно выяснить, не будет ли включенный
Р32 вызывать какие-либо повреждения в результате своего радиоактивного
распада (превращения в 832). Такое воздействие может осуществляться
тремя путями. Во-первых, при радиоактивном распаде 832 испускается
ионизирующее 0-излучение, которое может вызывать повреждение клеток
вируса в результате обычного процесса ионизации. Во-вторых, изменение
химической природы атома (превращение фосфора в серу) может вызвать
изменения структуры макромолекул. В-третьих, ядра отдачи 832 могут
выбивать распавшийся атом из молекулярной структуры и, таким образом,
также вызывать повреждения.

Инактивация под влиянием распада включившегося Р32 (что часто
называют «радиоактивным самоубийством») была показана в 1951 г. Хер-
ши, Каменом, Кеннеди и Гестом. Они обнаружили, что бактериофаги Т2
и Т4 Е. соП, выращенной на среде с высокой удельной активностью, при
хранении в течение нескольких недель теряют свою активность, причем,
эта потеря активности происходит в точном соответствии с константой рас-
пада Р32. Если предположить, что каждый распавшийся атом может инак-
тивировать фаговую частицу с вероятностью а, что на каждую фаговую
частицу приходится А/* таких распадов и что в настоящий момент имеется 8
жизнеспособных фаговых частиц, то можно ожидать, что
аз	аы* с

---Д7~ = а'
аг	аг

По закону радиоактивного распада	— ЕЕ*', таким образом, полу-

чаем

-^=а#П8.
а1

Теперь, если мы обозначим через М* число радиоактивных атомов, при-
ходящееся на 1 фаговую частицу в момент времени I = 0, то по закону
радиоактивного распада

Отсюда

_^ = аД7*Х8е-Ч

Интегрируя это уравнение, получим

1п 8 = —	+ сопзЕ *
Если предположить, что 5 = 50 при I — 0, то получим

1пЗ= —аЩе~и + 1п50 + аУУо,
или

1п(5Л50) = аЛ^(1 — е~м).

Исходя из этого соотношения, график зависимости 1п (5/50) от (1 — е~м)
должен иметь вид прямой, наклон которой определяется значением а ТУ*.
Такие прямые были получены на опыте. Величину можно определить,
зная удельную радиоактивность среды и полное число атомов фосфора,
приходящееся на 1 вирусную частицу (если принять во внимание данные
Коэна, согласно которым фосфор, включенный в вирусную частицу, берется
из культуральной среды). В результате такого расчета можно получить
величину а. Она, как оказалось, исключительно велика и составляет при-
близительно 0,1.

Рассмотрим причину инактивации. Прежде всего мы покажем, что
вероятность инактивации фаговой частицы под влиянием ионизирующего
излучения явно меньше 0,1. Допустим, что длина свободного пробега Р-час-
тицы с энергией 0,7 Мэв (средняя энергия [3-спектра Р32) в веществе типа
белка равна 3 мм. При прохождении такой |3-частицы через вирусную час-
тицу диаметром 10"5 см это будет соответствовать потере энергии порядка
(1СГ5/0,3)-7-105 = 23 эв. Опыты по облучению вирусов такими |3-частицами
показали, что при случайном распределении актов ионизации в частице
вируса вероятность ее инактивации составляет лишь 1/30. Таким обра-
зом, в большинстве случаев инактивация происходит, по-видимому, в резуль-
тате либо возникновения ядер отдачи, либо изменения химической природы
распавшегося атома, либо, наконец, от того, что каждый акт ионизации
затрагивает саму ДНК вируса.

В ряде более поздних экспериментов Стент и Фюрст повторили работу
Херши и провели те же исследования на фагах Т5, Т1, ТЗ, Т7 и 7. В каждом
случае были определены величины а. В дополнение к этому было найдено,
что величина ос зависит от температуры хранения фага. Это последнее
обстоятельство, а также то, что ос может достигать 0,35, показывает, что
вряд ли величина ос равна 0,1, потому что только одна десятая часть всех
распадов происходит в «жизненно важной» части нуклеиновой кислоты.
Скорее можно предположить, что некоторые положения фосфора более
благоприятны для повреждения генетической структуры вируса, чем дру-
гие. Тесман показал, что для очень малого фага фХ174 эффективность
«радиоактивного самоубийства» равна 1. Он связывает это с тем, что в этом
'фаге ДНК имеет одноцепочечное строение. Таким образом, можно утвер-
ждать, что метод «радиоактивного самоубийства» является новым мощным
методом изучения развития вирусов.

8.	Радиоавтографические исследования биологической репликации.
Введение в микроорганизмы Р32 с высокой удельной активностью и исполь-
зование меченных тритием тимидина и уридина позволяет изучать тонкие
.детали процесса репликации методом радиоавтографии, с помощью которого
можно исследовать распределение радиоактивности после того как процесс
репликации уже закончился. Радиоактивный анализ такого типа был
использован в .работах Левинталя, Форро и Тейлора.

Работа Левинталя, проведенная на фаге Т2, наиболее проста для изло-
жения и поэтому будет описана первой. Прежде всего выращивали куль-
туру фага Т2 с высоким содержанием радиоактивного изотопа. Для этого
заражение бактерий этим фагом проводили в среде с высоким содержанием
радиоактивной метки. Культуру фага отделяли затем от остатков бактерий
и тщательно очищали. После такой подготовки ее использовали для зара-
жения бактерий, выращенных на нерадиоактивной среде. Получающийся
«лизат», содержащий большое количество вновь синтезируемых фаговых
частиц, смешивали с небольшим количеством жидкой ядерной фотоэмуль-
сии; эту смесь наносили на стеклянную пластинку и давали ей возмож-
ность высохнуть. Через несколько дней эмульсию проявляли и, рассматри-
вая ее под микроскопом, определяли число треков р-частиц, связанных
между собой. Так как в каждой фаговой частице, содержащей радиоактив-
ный изотоп, происходит много актов радиоактивного распада, то можно
было ожидать, что будет наблюдаться заметное число «звезд», т. е. треков
р-частиц, исходящих приблизительно из одной точки (в месте локализации
фаговых частиц), и малое число отдельных треков. В своих опытах Левин-
таль наблюдал именно такую картину. Возникает вопрос: по какому закону
распределяется число треков, приходящееся на одну «звезду»? Если бы
радиоактивность исходного фага распределялась равномерно среди всего
его потомства, то можно было бы ожидать, что будут преобладать звезды
с очень малым числом Р-треков, а «звезды» с большим числом треков будут
встречаться лишь изредка. В действительности характер распределения
числа треков между звездами оказался совсем другим.

Для исходных радиоактивных фаговых частиц число треков, приходя-
щихся на одну «звезду», составляло приблизительно 100. Для тех же фагов,
которые получались после заражения бактерий, выращенных на нерадио-
активной среде, число треков на «звезду» снизилось до 20. Если, однако,
проводился еще один цикл выращивания на нерадиоактивной среде, то
дальнейшего пятикратного уменьшения числа треков на «звезду» не полу-
чалось', это число продолжало оставаться равным 20. Итак, падение числа
треков на «звезду» в первом цикле от 100 до 20 в дальнейшем уже не наблю-
далось. Левинталь обнаружил также, что если вместо интактной фаговой
частицы проделать тот же опыт с частицей, подвергнутой осмотическому
шоку (процессу разрушения оболочки фаговой частицы в результате быстро-
го переноса ее из среды с высокой концентрацией солей в дистиллирован-
ную воду), то наблюдается не 100, а 40 Р-треков на «звезду». Воздействие
осмотического шока как на фаги первого, так и на фаги второго поколения,
выращенные в нерадиоактивной среде, не уменьшает числа треков, прихо-
дящегося на одну «звезду». На основании этих результатов был сделан
вывод о том, что существует какой-то жизненно важный для фага большой
участок ДНК, составляющий 40% всей ДНК. После первого деления этот
участок полностью сохраняет свою метку в последующих циклах роста.

Отсюда, по-видимому, следует вывод, что реплицирующаяся часть
вируса, которая у фага Т2 представляет собой ДНК, состоит из двух час-
тей. Одна часть — это крупный фрагмент, содержащий 4096 первоначаль-
ного фоссЬора, остальная же часть ДНК либо способна к многократному деле-
нию, либо с самого начала представлена в виде мелких фрагментов. Боль-
шая единица может делиться только один раз, а в дальнейшем сохраняет
свою целостность, давая «звезды» с 20-процентной активностью. Левинталь
связывает это с двухцепочечной структурой ДНК, предложенной Уотсоном
и Криком, считая при этом, что при делении каждая нить сохраняется
в своем первоначальном виде. Из изложенного ясно, что описанный метод
может стать мощным средством изучения природы молекулярной репликации.

Форро использовал для такого рода исследования другой, вполне
равноценный метод. Клетки МЛсгососсиз сгуоркИиз с высоким содержанием
радиоактивной метки после соответствующей процедуры очистки перено-
сили на предметное стекло с нерадиоактивной средой. Затем под микроско-
пом выбирали одну клетку и за ней наблюдали до тех пор, пока не начина-
лось ее деление; после этого дочерние клетки отделяли друг от друга. Далее
следили отдельно за каждой дочерней клеткой и повторяли те же самые
манипуляции разделения вновь образовавшихся клеток до тех пор, пока
не удавалось выделить 256 клеток, которые все были получены от одной
радиоактивной родительской клетки в результате последовательных деле-
ний в нерадиоактивной среде. Затем предметное стекло покрывали на
несколько недель фотоэмульсией, которую затем проявляли. После этого
ее также просматривали под микроскопом для того, чтобы установить,
наблюдаются ли • статистически достоверные отклонения распределения
радиоактивности среди клеток потомства от равномерного распределения.
Отличие от работы Левинталя состояло в том, что в работе Форро измеря-
лось не число треков, а число проявленных зерен фотоэ лульсии. В резуль-
тате было установлено следующее. Во-первых, значительная часть Р32
действительно переходит в клетки потомства; во-вторых, распределение Р33
среди клеток потомства совсем не таково, как -можно было бы ожидать,
исходя из статистического распределения всего Р32 между отдельными
поколениями.

Для объяснения этих результатов проще всего было бы предположить,
что метка, включенная в РНК, распределяется равномерно среди всего
потомства, в то время как часть метки, входящая в ДНК, остается в виде
сравнительно больших единиц, которые в значительной степени сохраняют
свою целостность при делении.

Исследования биологической репликации методом радиоавтографии
приобрели особенно широкий размах после того, как было показано, что
радиоактивный тритий может быть легко введен в молекулу тимидина
посредством каталитического обмена, причем введенный тритий остается
связанным с молекулой тимидина. Меченный тритием тимидин был весьма
плодотворно использован в работах Тейлора, а затем Пейнтера, Форро
и Хьюза. Так как деление бактерий было нами уже рассмотрено, мы можем
начать с изложения работы Пейнтера, Форро и Хьюза. Большое преиму-
щество применения трития в падиоавтографии заключается в том, что
р-частицы трития обладают малой энергией и, следовательно, малым про-
бегом п поэтому на проявленной пленке получается плотное пятно огра-
ниченных размеров, позволяющее точно определить место, где произошел
радиоактивный распад. Кроме того, при использовании меченного тритием
тимидина можно гарантировать, что метка входит только в ДНК и не вхо-
дит в РНК, так как РНК не содержит тимина. Таким образом, метод радио-
автографии в сочетании с использованием меченного тритием тимидина дей-
ствительно обладает огромными возможностями. Пейнтер, Форро и Хьюз
выращивали Е. соИ, на среде, содержащей малые количества тимидина;
затем в среду вводили меченный тритием тимидин и таким образом получали
интенсивно меченные бактерии. Результаты одного из самых простых
и наиболее показательных экспериментов этой серии можно видеть на
фиг. 228, где показана полученная с помощью фазово-контрастного микро-
скопа фотография радиоавтографа микроколонии клеток Е. соЕ, развив-
шейся из радиоактивной бактерии в нерадиоактивной среде. На фотогра-
фии хорошо видно, что в основном только две бактерии сохранили метку,
из чего следует, что процесс репликации заключается в синтезе нового мате-
риала, а не в многократном делении старого. Можно представить себе, что
подлинник закодированной наследственной информации (молекула ДНК)
остается неизменным (интактным) и на самом деле служит реальной матри-
цей, по которой могут строиться новые копии.
Результаты эксперимента другого типа приведены на фиг. 229. В этом
эксперименте клетку, содержащую большое количество радиоактивной
метки, помещали в нерадиоактивную среду и наблюдали под микроскопом.
После деления дочерние клетки разделяли с помощью микроманипулятора
и продолжали наблюдать за ними до тех пор, пока они в свою очередь
не делились. Эту процедуру повторяли в течение нескольких поколений

Фиг. 229. Диаграмма поколений клеток (отобран-
ных в результате последовательных микроманипуля-
ций), ведущих свое происхождение от одной интенсивно
меченной тритированным тимидином клетки, выра-
щенной на нерадиоактивной среде [8].

На диаграмме обозначены деления и число зерен фотоэмульсии,
приходящееся на одну клетку. Преобладание разделения по
принципу «все или ничего» означает, что существуют сохраняю-
щиеся фрагменты молекулы ДНК- Тот факт, что иногда проис-
ходит и дробное разделение, говорит о том, что возможно также
существование своеобразного механизма обмена.

•и в результате получали большое количество клеток, происхождение кото-
рых было полностью известно. Этот набор клеток фиксировали и произво-
дили радиоавтографирование. Далее, для клеток последнего поколения
подсчитывали число проявленных зерен фотоэмульсии. Терпение исследо-
вателя было вознаграждено тем, что теперь можно было по схеме, подоб-
ной приведенной на фиг. 229, вернуться назад к первоначальной клетке.
Форро проследил большое число таких последовательных делений; здесь же
мы выбрали наиболее простой эксперимент. Из схемы фиг. 229 видно, что
при первых трех делениях сохраняется простой характер распределения
ДНК, при котором она переходит в дочерние клетки целыми единицами.
Однако при четвертом делении в одной из ветвей этот принцип нарушается.
Таким образом, Форро показал, что, по-видимому, имеет место деление
.пополам, но что это совсем не является абсолютным правилом. Эти выводы
находятся в согласии с данными двух совершенно независимых экспери-
ментов, один из которых проделан Мезельсоном и Сталем на бактериях,
а другой Тейлором на корешках боба.

Эксперимент Мезельсона и Сталя основан на том, что плотность мечен-
ной К15 ДНК сильно отличается от плотности обычной ДНК, содержа-
щей К14. Используя в качестве источника азота №5Н4С1, содержащий

л-У/5
л/

Ф и г. 230. Изменения полностью меченной ЬД5 бактериаль-
ной ДНК в процессе роста на среде, содержащей только ГД4 [12].
Бактериальную ДНК выделяли, подвергали очистке и затем центрифуги-
ровали в течение многих часов в градиенте плотности СзС1 в ультрацентри-
фуге. Показано распределение поглощения ультрафиолета в зависимости от
плотности. В последующих поколениях полностью меченные молекулы ДНК
переходят сначала в гибриды, а затем образуется смесь гибридных и немече-
ных молекул (см. правую часть фигуры) Объяснения см. в тексте.

96,5% К15, эти авторы давали клеткам Е. соИ расти до тех пор, пока ДНК
не становилась полностью меченной. Затем клетки разрушали и ДНК тща-
тельно экстрагировали и очищали, после чего помещали ее в концентри-
рованный раствор СзС1 и центрифугировали в течение многих часов при
140 000 §. При центрифугировании раствора СзС1 в нем возникает градиент
плотности и ДНК сосредоточивается в том участке пробирки, где плотность
раствора СзС1 соответствует ее плотности. Поэтому в этой части раствора
будет наблюдаться характерное для ДНК интенсивное поглощение ультра-
фиолетового излучения. Если фотопластинку со следом изображения щели,
полученным при прохождении пучка ультрафиолетовых лучей через про-
бирку, промерить на денситометре, то получится картина, изображенная
на схеме фиг. 230, А. Как видно из этой схемы, для полностью меченной
ДНК наблюдается один пик. Если теперь повторить эксперимент с клет-
ками, которые после включения метки Й15 выращивались на среде, содер-
жащей Л?14, то для первого поколения пик остается одиночным, однако его
положение не соответствует ни И14-ДНК, ни №5-ДНК; он находится точно
посередине между ними. Для следующих поколений образуется новый пик,
соответствующий Н14-ДНК, но пик, соответствующий ДНК, содержащей
ЬР5 и И14, остается. Графики, соответствующие 0, 1, 2,5, 3,0 и 4,1 поколе-
ниям, приведены на фиг. 230 а — д, соответственно. Из приведенных дан-
ных можно сделать вывод о том, что ДНК разделяется лишь один раз
и затем образуются только гибриды или полностью лишенные метки моле-
кулы. Этот вывод совпадает с результатами Форро, полученными в опытах
совершенно другого рода. На фиг. 230 помещена диаграмма, иллюстрирую-
щая этот процесс.

В качестве последнего примера экспериментов с мечеными атомами
мы приведем прекрасную работу Тейлора, который изучал препараты кон-
чика корешка конских бобов, обычно используемые при цитологических
исследованиях. На давленых препаратах этих корешков можно под микро-
скопом наблюдать хромосомы. Если при этом корешки конских бобов выра-
щивать на меченном тритием тимидине, то тритий будет входить только
в хромосомы и его можно легко обнаружить методом радиоавтографии.
Для одного цикла роста можно считать, что метка включается в течение той
части цикла, которая соответствует синтезу ДНК, и хромосомы после
деления оказываются одинаково и в основном полностью меченными. Далее
можно использовать простую цитологическую методику. Она заключается
в подавлении клеточного деления колхицином, который, однако, не пре-
пятствует разделению хромосом, и, таким образом, число хромосом в клет-
ке удваивается. В этом случае клетка, подвергнутая обработке колхицином,
будет иметь двойной набор хромосом, если произошла одна репликация,
и четыре набора, если было две репликации. Таким образом, на радиоавто-
графе препарата после обработки колхицином можно наблюдать распре-
деление радиоактивности в клетках с двумя и четырьмя наборами хромосом.
Из характера этого распределения можно выяснить, каким путем происхо-
дит деление материала хромосомы. Радиоавтограф клетки, первоначально
полностью меченной и после обработки колхицином перенесенной в нерадио-
активную среду, будет отражать судьбу метки, включенной в хромосому.
Результаты, полученные Тейлором, показывают, что распределение радио-
активности при новых делениях меченной хромосомы (в нерадиоактивной
среде) не имеет случайного характера. Уже при первом делении наблю-
дается фактически неравномерное распределение метки. При втором же
делении уже многие из образовавшихся хромосом совсем не содержат метку,
а соответствующий им партнер включает всю метку. Не меньший интерес
представляет тот факт, что при втором делении (в том случае, если разде-
ление метки происходит) метка распределяется между «большими кус-
ками». При этом радиоактивными или нерадиоактивными оказываются
комплементарные участки хромосом. Это эквивалентно обмену сестринскими
хроматидами и обозначает, что структура и механизм репликации хромо-
сом должны быть такими, чтобы этот процесс мог бы осуществляться. Полу-
ченные результаты находятся в согласии с данными более поздней работы
Форро, проведенной на бактериях.
Эти исследования дали возможность построить модели хромосомы.
Одна из них, предложенная Тейлором, показана па фиг. 231. Тейлор пред-

лагает отбросить маловероятную гипотезу существования огромной единой
молекулы ДНК и предполагает, что хромосомы представляют собой рас-

положенные в определенной последовательности небольшие молекулы
ДНК, торчащие в сторону от центральной двухслойной основы. Такая
модель, безусловно, не идеальна и наверняка слишком упрощена. Но она

Фиг. 231. Схематическая
модель хромосомы, предло-
женная Тейлором, при по-
строении которой исполь-
зовались данные, получен-
ные при радиоавтографи-
ческих исследованиях.

Нити ДНК прикрепляются к
белковым единицам, являю-
щимся частями общей белковой
основы, которая может делиться
пополам.

может служить основой для дальнейшей раз-
работки.

Как мы уже отмечали, перечисленные выше
примеры использования метода изотопных ин-
дикаторов составляют лишь небольшую часть
всех проведенных в этой области работ. Поток
новейших публикаций только подтверждает
этот вывод. Нужно уяснить себе, что биофизик
должен быть хорошо' знаком с явлением радио-
активности и методами работы с радиоактив-
ными изотопами и что лишь при глубоком
понимании этих методов он сможет творчески
применять их в своей исследовательской работе.
Этот вопрос, как нам кажется, нашел свое отра-
жение в данной книге. Мы закончим эту главу
перечислением некоторых наиболее широко
используемых изотопов и кратко охарактери-
зуем каждый из них.

9. Некоторые широко используемые изо-
топы. Дейтерий. Это очень дешевый, легко
доступный изотоп; его содержание можно
очень просто определить методом измерения
плотности. На тяжелой воде можно выращи-
вать довольно крупные организмы, и изучение
результатов происходящего при этом изотоп-

ного замещения должно дать очень интересные
сведения. Так как колебательные уровни связанного атома дейтерия сильно
отличаются от колебательных уровней водорода, то, по-видимому, должна
наблюдаться ^азшща в характере протекания химических реакций водорода
и дейтерия с молекулами белка или РНК. Действительно, если ^адиабати-
ческие переходы из состояния, где малая молекула может перемещаться
и вращаться, в состояние, где она является частью большой фиксированной
системы, играют важную роль в биологических процессах (это предположе-
ние мы выдвигаем в последней главе этой книги), то исследования с при-
менением дейтерированных соединений должны дать целый ряд сведений
по этому вопросу. Константы тепловой инактивации ферментов в обычной
и тяжелой воде также должны отличаться друг от друга.

Тритий. Самой важной характеристикой этого изотопа является
очень малая энергия испускаемых им [3-частиц (максимальная энергия
[3-спектра равна 18 кв). Такие |3-частицы можно легко зарегистрировать
с помощью любых устройств, в которых отсутствует поглощение [3-излучения
стенками или окошками, например с помощью фотоэмульсии или счетчика
Гейгера с введением трития внутрь. В настоящее время тритий в основном
используют в виде тритированного тимидина, с помощью которого можно
специфически метить ДНК. Нужно помнить, что тритированный тимидин
представляет серьезную опасность по той причине, что он специфичным
образом включается в клетки организма и воздействует на их генетический
аппарат, поэтому при работе с ним необходимо применять соответствующую
технику безопасности.

Углерод-13, азот-15 и кислород-18. Эти три стабильных изотопа эле-
ментов, из которых построены все биологически важные вещества, вполне
доступны. Два первых изотопа могут быть получены в концентрациях
вплоть до 96% и поэтому их можно применять в исследованиях, в которых
необходимы вещества с высоким содержанием метки. Как уже описывалось
выше, Мезельсон, Сталь и Виноград использовали метод седиментации
в градиенте плотности для изучения поведения М15-ДНК после деления
клеток в среде, содержащей только обычный азот (К14); этот метод дал
прекрасные результаты. Несмотря на то, что при этом потребовалось дли-
тельное ультрацентрифугирование, что вызывало износ подвески ротора,
полученные результаты полностью окупают все связанные с этим затраты.

Углерод-14. Этот легко доступный изотоп с периодом полураспада
около 5000 лет, испускающий р-частицы с максимальной энергией 130 кв,
применяется в биологических исследованиях особенно часто. Его легко
можно вводить в целый ряд биологически важных молекул. При регистра-
ции р-частиц, испускаемых С14, необходимо иметь в виду, что пробег их
в воздухе составляет всего около 15 см, и поэтому из-за конечной толщины
образца и окошка счетчика будут возникать соответствующие ошибки
в счете радиоактивности. Несмотря на большой период полураспада, при
попадании в организм С14 относительно безопасен; предельно допустимое
содержание С14 в организме равно 250 рк. В лаборатории, где широко
ведется работа с С14, необходимо пользоваться дозиметрами.

Натрий-24. Это относительно короткоживущий (и, следовательно,
очень активный) изотоп имеет период полураспада 15 час и излучает р-час-
тицы с максимальной энергией 1,4 Мэв и два у-кванта с энергией 2,8 Мэв
и 1,4 Мэв. Он легко доступен и может быть использован в тех эксперимен-
тах, где необходимо исследовать поведение натрия. Натрий легко иони-
зуется и, следовательно, быстро обменивается. Поэтому с этим изотопом
обычно нельзя проводить такие исследования, в которых необходимо про-
следить путь определенного метаболита, содержащего Па24.

Натрий-22. Этот изотоп имеет больший период полураспада (2,6 года)
и испускает позитроны с максимальной энергией 0,54 Мэв и у-кванты
с энергией 1,3 Мэв. Достать его значительно труднее, так как его получают
на ускорителе, используя реакцию М§24 (<М) На22.

Фосфор-32. Этот изотоп не менее важен для биологических исследова-
ний, чем С14; в некотором смысле Р82 самый идеальный изотоп для исполь-
зования в качестве изотопного индикатора. Максимальная энергия его
Р-частиц равна 1,6 Мэв, что позволяет легко регистрировать их; он не испу-
скает у-излучения, и поэтому его можно использовать в сравнительно боль-
ших количествах без особых мер предосторожности. Период полураспада
Р32, равный 15 дням, позволяет использовать его при изучении отно-
сительно длительных биохимических процессов, причем по окончании про-
цесса этот изотоп все еще сохраняет достаточно высокую активность. Суще-
ствуют два способа получения Р82. Первый — облучение фосфора нейтро-
нами — позволяет получать очень высокие активности. Но, к сожалению,
при этом остается также большое количество нерадиоактивного фосфора.
Второй способ состоит в облучении серы быстрыми нейтронами (с энергией
более 1 Мэв). Нейтроны с такой энергией получаются в реакторе, но в мень-
шем количестве, чем медленные нейтроны. Образующийся Р82 можно пол-
ностью отделить от исходного вещества (серы), что дает возможность полу-
24 Заказ №1168
чать таким способом изотоп с очень высокой удельной активностью; в таком
виде его обычно и применяют в молекулярной биологии. Малое время полу-
распада затрудняет, к сожалению, заблаговременное приготовление и хра«
нение соединений, содержащих Р32, например радиоактивных фосфатов-
нуклеиновых кислот и оснований. Однако эти соединения могут быть син-
тезированы в лабораторных условиях, что в настоящее время и делается.

Фосфор-33. Этот исключительно интересный изотоп был открыт совсем
недавно. Он имеет период полураспада, равный 25 дням, и испускает только
р-частицы с энергией 250 кв. Р35 получают обычно в результате реакции
захвата нейтрона ядром 833 и удельная активность его может быть очень
высокой. Р33 всегда сильно загрязнен Р32, который образуется при облу-
чении нейтронами основного изотопа 832, сопутствующего изотопу 833.
В настоящее время еще нет достаточных количеств 833 для того, чтобы полу-
чать чистый изотоп Р33. Эксперименты же с использованием двойной метки
(Р32 и Р33), по-видимому, можно осуществить.

Сера-35. Этот изотоп очень близок по своим характеристикам к С14,
но имеет при этом значительно меньший период полураспада (30 дней).
Его можно использовать в качестве важного индикатора при исследова-
нии белков, так как почти все белки содержат серосодержащие аминокис-
лоты — метионин, цистеин и цистин. Нуклеиновые же кислоты никогда
не содержат серу. Поэтому 835 может служить индикатором любых процес-
сов, в которых участвует белок, даже если важную роль при этом играет
ДНК- 835 — довольно доступный изотоп: его получают при реакции
С135 (п, р) 835, проводимой в реакторах.

Железо-55 и железо-59. Изотоп Ге5® имеет период полураспада 2,9 года
и распадается с К-захватом электрона; Ре59 с периодом полураспада 45 дней
имеет более сложную схему распада: он испускает |3-частицы с энергиями
0,46 и 0,26 Мэв и у-кванты с энергиями 1,3 и 1,1, Мэв. Ре55 сравнительно
трудно регистрировать по той причине, что он в основном испускает рент-
геновское излучение, связанное с переходом электрона на К-уровень атома,
освобождающийся в результате захвата Д-электропа при распаде ядра
Ре55. Поэтому для Ре®5 толщина окошка счетчика имеет большое значение
и эффективность регистрации, как правило, невысока. Это компенсируется,
однако, тем, что этот изотоп доступен в больших количествах. Оба изотопа
нашли широкое применение главным образом в гематологических иссле-
дованиях. С помощью Ре55 и Ре59 можно легко осуществить эксперимент
с применением двойной метки. Именно поэтому метод двойной метки значи-
тельно чаще применяется с изотопами железа, чем с изотопами других
элементов.

Резюме. До сих пор попытки подвести итог развитию методов изотоп-
ных индикаторов были не особенно успешны. Сравнительно еще недавно,
в 1942 г., один из авторов настоящей книги опубликовал работу, в которой
излагались скорее перспективы развития исследований в этом направлении,
чем их итоги. Представим себе, что химик, писавший в 1830 году, попытался
бы подвести итог использованию в химии точного взвешивания — метода,
развитие которого в последующие годы изменило основные представления
химии, поставило на твердую почву атомную теорию строения вещества,
способствовало возникновению теории валентности и, в конечном итоге,
построению периодической системы элементов. Роль меченых атомов в био-
логии и биохимии почти столь же велика. Даже сейчас, когда успела вырасти
целая отрасль промышленности, связанная с применением изотопов, иссле-
довательские работы находятся еще в той стадии, когда рано с уверенно-
стью подводить итог или делать какие-либо определенные заключения.
Можно сказать, что природа, сущность и последовательность процессов,
происходящих в клетке во время ее роста и развития, будут скоро система-
тизированы. Правда, еще не известно, сможем ли мы тогда сказать, что
достигли понимания работы этой системы. Однако метод изотопных инди-
каторов обладает такими огромными возможностями, развивается настолько
быстро и интерес к нему так велик, что будущее рисуется нам в светлых
тонах.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Со ш аг С. Ь., Кас11О15о1ореь ш Вю1о§у апд А^псиИиге, МсСгаи-—НШ, И. У.,
1955.

2.	К а т е п М., Кад1оасНуе Тгасегз 1п ВюШ^у, Асадепчс Ргезз, И. У. 1951.

3.	8 1 г 1 XV. Е., 1зо1ор1с Тгапсегз 1п В1осЬет1з1гу апд РЬуз^оШ^у, МсСгаи-—НШ,
И У., 1946.

4.	8 а с к з 3 , 1зо1ор1с Тгасегз ш В1осЬет1з1гу апд РЬу81о1о§у, МсСгалу—НШ,
Ы. У., 1953.

5.	К о Ь ег I з, АЬепзоп, Сот» 1 е, В о И о п, В г И 1 еп, 81ид1ез о! В1о-
зуп1Ьез1з ш Е$сИег1сИ1а СоИ. Сагпе^е 1пз1. РиЬНсаНоп 607, ХУазЫп^оп, В. С.,
1957.

6.	Ри( пат Е. XV., «Вас1ег1огЬа§ез: №1иге апд КергодисНоп», Адуапсез т Рго-
1е1п КезеагсЬ VIII, 177 (1953).

7.	I еу1 пН1 а1 С., ТЬотаз С. А., Зг., Мо1еси1аг Аи1огад1’о§га§Ьу, ВюсЫт.
с.1 В^орЬуз., Ас! а 23, 453 (1957).

8.	Е о г г о Е., Зг., ТЬе В1з!г1ЬиНоп о! КадгоасНуе РЬозрЬогиз Атоп§ Ше Рго^спу о!
а 81п§1е ЬаЬе1ед Вас1егшт, Ехр. Се11 КезеагсЬ, 12, 333 (1957).

9.	Р а 1 п 1 е г К- В., Рогго Е., Зг., Н и § Ь е з XV Ь., В!з1г1ЬиНоп о! ТпНит
ЬаЬе1ед ТЬупндте т Е. СоИ Вигт^СеП МпШрйсаНоп, На! иге, 181, 328 (1958).

10.	Рогго Е., XV е г 1 Ь е 1 т е г 8., ТЬе] Ог^ашзаЬоп апд КерИсаНоп о! Веоху-
НЬопис1е1с Аыд ш ТЬупндте ВеНыеп! 81га!пз о! Е. соИ. В1осШт. е! В1орЬуз.
Ас!а 40, 9 (1960).

11.	Т а у 1 о г 3. Н., ТЬе ВирЕсаНоп о! СЬготозотез, 8с!еп1Шс Ат., Зиле 1958, р. 36.

12.	М е з е 1 з о п М., 8 1: а Ь 1 Е. XV., V 1 п о § г а д 3., Ргос. На11 Асад. 8с1епсе,
43, 581 (1957).

13.	Мезе1зоп М., 8 1 а Ь 1 Е. XV., ТЬе КерЬсаНоп о! ВНА ш Е соИ, Ргосед.
ИаН. Асад. ЗЛепсе 44, 671—682 (1958).
Г лава XIV

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

И ИЗУЧЕНИЕ МЫШЦ, НЕРВОВ И ГЛАЗА

«Четыре десятилетия научных исследований не оставляют
у автора сомнений, что жизнь и живая материя едины во всем
разнообразии их форм, функций и проявлений. Мы сами —лишь
новые листья, недавно появившиеся на этом старом дереве жи-
зни. Пусть жизнь приспособилась к новым условиям, выбрала
новые формы поведения — и все-таки повсюду снова и снова
она использует те же старые принципы. По существу, не так уж
велика разница между травой и тем, кто ее косит. Для сокра-
щения мышц косца используются те же вещества, что и для
роста травы, — калий и фосфат. Это одно из простых и порази-
тельных свидетельств фундаментального единства живой материи.
Таким образом, не так уж важно, какой конкретный живой
объект мы изучаем — трава это или мышца, вирус или мозг.
Если наш взгляд не задержится на поверхности, мы в каж-
дом случае доберемся до фундаментальных принципов, лежащих
в основе жизни и обеспечивающих ее развитие».

Сцент-Дьёрдьи

1.	Введение. В этой книге мы довольно редко обращались к физиоло-
гии. Это связано с тем, что до сих пор практически не затрагивались
вопросы функционирования большого организма, связанные с процессами
мышечной деятельности, передачи нервных импульсов, зрения, секреции,
дыхания и пр. В основном нас интересовала молекулярная и клеточная
структура. Читатель уже заметил, что вопросов, связанных с функциони-
рованием клетки, мы впервые коснулись лишь в предыдущей главе и то
в весьма иллюстративной манере. В известной степени нас оправдывает то,
что весь изложенный ранее материал необходим для понимания молеку-
лярной биофизики. Мы, конечно, были не в состоянии охватить все аспекты
изучения живых систем, но мы и не первые, кто встретился с этой трудно-
стью. Кроме того, нужно отметить, что задачи физиологии существенно
отличаются от наших, хотя, возможно, по мере развития науки эти задачи
и сблизятся. Физиология сделала гигантский скачок, когда было устано-
влено, что по нерву распространяются электрические импульсы, постоян-
ные по амплитуде, но меняющиеся по частоте в зависимости от интенсив-
ности раздражения. Тем самым был установлен тот единственный, из боль-
шого числа потенциально возможных, специфический способ передачи
сообщения по нерву, который реализован в живых организмах. Не удиви-
тельно поэтому, что изучению нервных импульсов посвящено огромное
число экспериментальных работ.

Тем не менее человеку, интересующемуся клеточными процессами —
ростом, делением, дифференцировкой,— может легко показаться, что подоб-
ного рода исследования являются расточительным уходом в сторону от
основного вопроса. При изучении нервных импульсов исследователь не
сталкивается ни с молекулярной генетикой, сосредоточивающей наш инте-
рес на репликации ДНК, ни с проблемами синтеза белка, где интерес кон-
центрируется на связи последовательности аминокислот с последователь-
ностью генетических единиц, ни с вопросами энзимологии. Например,
вопрос о том, как растущая система располагает вновь синтезированные
продукты в требуемом порядке, не является первоочередным для электро-
физиолога. В связи с этим неудивительно, что существует довольно четкое
деление биофизиков на две группы. Те биофизики, которые работают с клет-
кой, вирусами, макромолекулами, имеют мало общего с биофизиками,
занятыми разработкой усилителей, регистрирующих устройств, термопар
и прочей аппаратуры, используемой при детальном изучении природы
нервных и мышечных процессов.

Нам кажется, что резкая граница между этими двумя направлениями
сохранится недолго. Дело в том, что сейчас изучение мышечных процессов
идет уже на уровне исследования молекулярных структур мышечного
волокна и связанных с мышечными процессами механизмов переноса энер-
гии. Едва ли можно сомневаться, что выяснение сущности мышечных явле-
ний облегчит понимание целого ряда процессов, протекающих и в менее
специализированных клетках, и в конечном счете будет способствовать
разрешению проблем синтеза и роста, являющихся первостепенными про-
блемами биофизики клетки.

Учитывая все сказанное, мы нашли целесообразным изложить свое
понимание работы мышц, нервов и глаза, хотя наш собственный опыт
в области биофизики ограничен исследованием макромолекул и простых
клеток. Вероятно, некоторые наши взгляды покажутся наивными, но тем
не менее можно надеяться, что такое вторжение в «чужую» область не будет
бесполезным для обоих направлений биофизики.

МЫШЦЫ

2.	Мышечное' волокно как модель. Существуют мышцы различных
типов. Наибольшее число исследований относится к скелетным мышцам
позвоночных, прикрепленным к костям и управляемым центральной нерв-
ной системой. Гладкие мышцы (например, мышцы стенок желудка) не кон-
тролируются центральной нервной системой, и строение их отлично от строе-
ния скелетных мышц. Разумеется, у тех и у других есть целый ряд общих
черт. Мы ограничимся простой констатацией существования различных
типов мышц и не будем проводить их сравнительного описания, так как
это затронуло бы область, в которой мы не компетентны. В дальнейшем
наше внимание сконцентрировано лишь на общих сторонах функциониро-
вания мышц различных типов. Рассмотрение проводится на примере пояс-
ничной мышцы кролика и портняжной мышцы лягушки.

Мышца состоит из пучков мышечных волокон, заключенных в общую
оболочку, называемую эпимизием. Каждый пучок внутри мышцы имеет
свою оболочку, которую называют перимизием. Пучки состоят из отдель-
ных волокон, представляющих собой сильно вытянутые многоядерные
клетки, одетые в особую оболочку, или сарколемму. Между волокнами
в мышце обычно располагаются капиллярные кровеносные сосуды. Каждое

мышечное волокно соединено с нервным волокном (так называемая нервно-

Ф и г 232. Схематическое изобра-
жение участка отдельного мышечного
волокна (нервно-мышечная пластинка
не показана).

Такую картину можно видеть в обычный
микроскоп. Участок между двумя 7-пла-
стинками, называемый саркомером, имеет
длину приблизительно 2,5 ри

мышечная пластинка), что обеспечивает
управление мышечной деятельностью со
стороны нервной системы.

Характерным элементом мышцы яв-
ляются волокнистые структуры. Мышца
разделяется на пучки волокон, послед-
ние можно расщепить на отдельные
волокна, и, наконец, внутри волокон
можно видеть вытянутые молекулярные
структуры — миофибриллы., закономер-
ности строения которых были впервые
изучены Холлом и его сотрудниками.
В связи с таким строением мышцы воз-
никает естественный вопрос: как связаны
процессы, происходящие в субъедини-
цах, с наблюдаемым сокращением всей
мышцы? Можно ли считать, что субъе-
диницы представляют собой в некото-
ром смысле уменьшенную модель мыш-
цы? Оказалось, что на этот вопрос можно
ответить положительно. Таким образом,
мышца представляет собой замечатель-
ный объект для молекулярной биофи-

зики, так как выяснение молекулярных

процессов, происходящих в субъединицах, позволило бы довольно быстро

разобраться во всем, что связано с работой мышцы в целом.

Имея это в виду, мы не будем рассматривать мышцы в целом, а огра-

ничимся одиночным мышечным волокном. На фиг. 232 схематически изо

бражена картина, видимая в обыч-
ный микроскоп. Волокно представ-
ляет собой многоядерную структуру
с характерными продольными нитями
(миофибриллами), расположенными
в определенном порядке. Темные
линии (2), пересекающие миофиб-
риллы, изображают так называемые
саркомеры, длина которых (строго
не фиксированная) равна примерно
2,5 ц. Область между миофибриллами

Ф и г. 233. Схематическое изображе-
ние тонкой структуры миофибриллы.

заполнена саркоплазмой, содержащей, как и цитоплазма любой другой
клетки, митохондрии (или саркосомы) и эндоплазматическую сеть.

Можно описать миофибриллы более детально. В частности, на фиг. .233
приведена такая более подробная схема. Известны и еще более тонкие

детали строения миофибрилл, однако, прежде чем говорить об этом, обра-
тимся к некоторым вопросам биохимии мышц.

3.	Биохимия мышцы. Уже беглого взгляда на фиг. 232 достаточно,

чтобы предположить, что биохимически мышечная клетка отличается от
менее специализированных клеток. Большая часть мышечной клетки сос-
тоит из специфических белковых молекул, которые так или иначе участвуют
в процессе мышечного сокращения. Относительное содержание воды
в мышечной клетке, так же как и содержание белка, практически соответ-
ствует содержанию их в рассмотренной в гл. II бактериальной клетке.
Что касается нуклеиновых кислот, то их значительно меньше, чем в бакте-
риальной клетке, а рибонуклеиновой кислоты нет почти совсем. Белки
мышечной клетки приблизительно на две трети состоят из белков, непосред-
ственно участвующих в сокращении, а остальная часть связана с внутри-
клеточными ферментативными процессами.

Так как процесс мышечного сокращения все еще не понят до конца,
можно предположить, что нам, по-видимому, еще не известны одно или
несколько соединений, играющих в этом процессе важную роль. Вместе
с тем ряд соединений, чрезвычайно важная роль которых совершенно оче-
видна, уже хорошо изучен. Во-первых, это комплекс актина и миозина —
белков, находящихся в саркомере. Во-вторых, это аденозинтрифосфат,
АТФ, осуществляющий, как считают, перенос энергии, без которого невоз-
можно мышечное сокращение. И в-третьих, это фактор Марша —- Кэндел-
ла, являющийся ингибитором процесса расщепления АТФ. На каждом
из перечисленных соединений следует остановиться несколько подробнее.

То, что мышца состоит из высокомолекулярного белка, называемого
миозином, было известно уже много лет назад. Однако только в 1939 г.
Энгельгардт и Любимова открыли, что миозин представляет собой фер-
мент, катализирующий превращение АТФ в дифосфат (АДФ) с освобожде-
нием или переносом энергии. Более тщательное исследование, проведен-
ное Банга и Сцент-Дьёрдьи, показало, что «миозин» на самом деле состоит
из двух белков, а именно актина и миозина, которые образуют комплекс,
называемый актомиозином. Изменения, которые происходят с этим ком-
плексом в определенных условиях, напоминают сокращение мышцы. После
разделения и очистки этих белков было установлено, что молекула мио-
зина имеет молекулярный вес порядка 450 000, отношение осей около 50
и общую длину 1600 А, а молекула актина соответственно — 60000,
12 и 290 А.

Недавно был найден еще третий белок, тропомиозин, молекула кото-
рого имеет молекулярный вес порядка 50 000, отношение осей 25 и длину
385 А. Этот белок имеет сильную тенденцию к полимеризации и очень стаби-
лен. Пока непонятно, каковы его функции в мышце, что, разумеется,
не очень удивительно, так как работа мышцы хоть и ясна в самых общих
чертах, но еще совершенно не понята в деталях.

Эти белки составляют 15—20% веса миофибрилл (остальное приходится
на воду и соли). Строение миофибрилл будет описано позже. Миофибриллы
окружены саркоплазмой, которая, по-видимому, частично проникает также
внутрь них. Саркоплазма содержит 20—30% от общего количества мышеч-
ных белков и занимает около 20% объема мышечной клетки. Она даже
.более насыщена белками, чем миофибриллы. Саркоплазма содержит мито-
хондрии, или саркосомы (эти два термина взаимозаменяемы), в которых
размещены ферменты, катализирующие окисление метаболитов (в частно-
сти, гликогена) и синтез АТФ. В тех мышцах, где окислительные процессы
протекают очень интенсивно (например, в летательных мышцах и мышцах
сердца), митохондрии имеют большой размер и размещены в правильном
порядке вдоль А-дисков. Исследования, проведенные с С14-глицином,
показали, что в миофибриллы глицин практически не 'включается, тогда
как в саркоплазматическую фракцию он включается с обычной скоростью.

Если саркоплазму подвергнуть центрифугированию, то можно отде-
лить митохондрии от растворимой фракции. Сактор показал, что большая
часть ферментативной активности, определенной по окислению промежу-
точных продуктов цикла трикарбоновых кислот, связана с митохондриями,
однако для окисления некоторых других субстратов, в частности гликогена,
наряду с митохондриями требуется присутствие растворимой фракции.
Миофибриллы не принимают никакого участия в процессах окисления, из
чего следует, что процессы, обеспечивающие мышечную клетку энергией,
целиком протекают в саркоплазме.

Средний диаметр белковой молекулы саркоплазмы равен приблизи-
тельно 50 А. Некоторые из этих молекул могут проникать в миофибриллы,
так как между ними и саркоплазмой не обнаружено никакой мембраны.

Заканчивая этот краткий раздел по биохимии мышц, скажем несколько
слов об АТФ, в общих чертах уже описанном в гл. III. АТФ представляет
собой трифосфат аденина и рибозы. Его структурная формула имеет вид

При гидролизе АТФ образуется дифосфат и ортофосфорная кислота. Этот
процесс сопровождается освобождением энергии. Если АТФ в момент
гидролиза связан с молекулой белка и существует механизм передачи
энергии в молекуле белка, то освобожденная энергия будет мигрировать
в белковой молекуле до тех пор, пока не перейдет в другую форму. Досто-
верно установлено, что АТФ и его гидролиз самым непосредственным обра-
зом связаны с процессами мышечного сокращения. Однако, что предста-
вляет собой сам процесс, как уже было сказано, еще до конца не ясно.

К действию АТФ имеет отношение некоторый белок, природа которого
пока не выяснена. Известно, что он обладает способностью ингибировать
действие АТФ в миофибриллах и, по-видимому, наделен некоторыми фер-
ментативными свойствами. Этот белок, называемый фактором Марша —
Бэнделла, является компонентом саркоплазмы. Вполне вероятно, что это —
комплекс двух относительно низкомолекулярных белков, потому что его
свойства таковы, как будто он имеет одну компоненту, очень чувствитель-
ную к температуре, а другую, напротив, очень стабильную. Выяснение
природы этого фактора — одна из насущнейших задач, стоящих перед
исследователями.

Таким образов, мы видим, что в мышечном волокне находится мио-
зин — фермент, катализирующий расщепление АТФ (а также и других
нуклеозидтрпфосфатов),— и белок или группа белков, которые тормо-
зят этот катализ. Пользуясь уже только этими сведениями, можно в общих
чертах представить себе процесс сокращения и расслабления мышцы.
4.	Молекулярное строение мышечного волокна. В распоряжении иссле-
дователя имеется достаточно много биофизических методов, которые можно
применить для изучения молекулярной структуры мышечного волокна.
Действительно, мало какой другой биологический объект столь же удобен
для исследования его физическими методами, как мышца. Мышечные волок-
на представляют собой двоякопреломляющие структуры. Их можно расцеп-
лять на волокна все меньших и меньших размеров и исследовать под элек-

тронным микроскопом, используя, в частности, метод ультратонких срезов.

Белковые компоненты мышцы
могут быть исследованы при
помощи центрифугирования
и электрофореза. Определен-
ные сведения о строении
мышц дает рентгеноструктур-
ный анализ.

Совокупность этих мето-
дов в состоянии обеспечить
глубокое проникновение в
тайны строения мышцы. Мы
уже приводили данные о мо-
лекулярных весах актина
и миозина и о примерной фор-
ме их молекул. В настоящее
время наука располагает зна-
чительно более детальными
сведениями. Особенно важное

Фиг. 234. Молекулярная структура скелетной
мышцы по Г. Хаксли и Хэнсону.

Саркомер (интервал между 2-пластинками) построен
из правильно чередующихся молекулярных нитей |ма-
лого и большого диаметра. Поперечное сечение внеш-
ней части Л-диска приведено справа вверху, сечение
области Н — справа внизу. Согласно представлениям
А. Хаксли, нервный импульс распространяется по сар-
колемме вдоль ^-пластинки. Г. Хаксли предполагает,
что при раздражении тонкие молекулярные нити ак-
тина вдвигаются в промежутки между толстыми
нитями миозина.

открытие было сделано с по-
мощью электронной микро-
скопии ультратонких срезов,
когда было показано сущест-
вование двух типов ультра-
структур в мышце (фиг. 234
и 235). На первой фигуре
представлена структура ске-
летной мышцы (Хаксли и

Хэнсон), а на второй — летательной мышцы насекомого (Ходж).

Рассматривая структуру скелетной мышцы, можно видеть, что она
имеет очень строго упорядоченное молекулярное строение. Сарколемма

имеет толщину около 200 А и покрыта снаружи рыхлым слоем из волокон
коллагена. Она прикреплена к Х-пластинке. Согласно Хаксли и Тейлору,

сарколемма, в нормальном состоянии электрически поляризованная, при
получении сигнала из области нервно-мышечной пластинки резко изменяет
свою поляризацию. Это изменение распространяется вдоль сарколеммы
и передается в миофибриллы через 2-пластинки; таким образом, сигнал
передается молекулярной структуре, что приводит к сокращению мышеч-

ного волокна.

Сама миофибрилла представляет собой сложную структуру, тонкие
актиновые нити которой прикреплены к Х-пластинкам и в области Н пере-
слаиваются большими молекулами миозина. Д-диск представляет собой
продление миозиновых волокон в каждый саркомер, /-диск определить
несколько труднее, так как он частично связан с молекулами актина и ча-
стично — с молекулами миозина. Позже мы увидим, что способность
мышцы сокращаться и удлиняться связана в основном с /-диском.
Ф и г. 235. Схема строения летательной
мышцы насекомых (по Ходжу).

Эта схема отличается от схемы скелетной мышцы,
предложенной Хаксли и Хэнсоном, тем, что здесь
/-диски короче, имеются поперечные мостики, отсут-
ствует утолщение в области Н и, самое важное, от-
сутствует переслаивание нитей. Летательная мышца
по своему назначению должна очень быстро разви-
вать напряжение при очень небольших сокращениях.

Обращаясь теперь к летательной мышце насекомого (см. фиг. 235),
мы видим, что основные черты ее строения сходны со строением скелетной
мышцы, но вместе с тем существуют некоторые довольно четкие различия,
/-диски у летательной мышцы короче, не видно переслаивания, но зато
имеется ясно видная «мостиковая» структура в А- и /-дисках. Эти мостики
особенно четко видны на отлич-
ных электронных микрофотогра-
фиях, полученных Ходжем, ко-
торые дают одно из наиболее
полных представлений о моле-
кулярной структуре живой си-
стемы. Вполне возможно, что
отмеченные различия отражают
различие в функциях этих мышц.
Летательные мышцы насекомых
должны развивать большие
усилия при небольших переме-
щениях, совершаемых несколько
сот раз в секунду, и поэтому
должны быть особенно прочны;
для этого, вероятно, и нужны
поперечные связки.

Оговоримся, что широкое
рассмотрение различных мышеч-
ных препаратов и демонстрация
общности в их строении не яв-
ляются нашей основной задачей;
как биофизикам, нам следует
сосредоточить свое внимание на
тех возможностях интерпретации

работы мышц, которые нам предоставляют молекулярные модели. Имея
это в виду, мы можем познакомиться со свойствами мышцы и подумать,
как их можно объяснить с точки зрения ее молекулярного строения.

5.	Свойства мышцы. Мышечная ткань относится к числу тех биологи-
ческих систем, которые легко изолировать для исследования. Мышца, поме-
щенная в насыщенный кислородом солевой раствор, может неделями сохра-
нять свои важнейшие свойства, и ее можно использовать для работы в тече-
ние одного — двух дней. Основными сведениями о свойствах мышц мы обя-
заны Хиллу и Фенну, проявившим исключительное экспериментальное
мастерство при изучении различного типа зависимостей напряжения мышцы
от ее длины, а также от температуры.

При исследованиях на препаратах целой мышцы было обнаружено,
что при раздражении мышцы возникает сравнительно медленно распростра-
няющаяся волна возбуждения, или, пожалуй, более точно — волна деполя-
ризации. При 0° скорость распространения этой волны равна примерно
30 см!сек. При такой низкой скорости различные участки мышцы приходят
в возбужденное состояние в различные моменты времени, что существенно
усложняет некоторые экспериментальные методы исследования мышц,
особенно те, в которых используются короткие временные интервалы.
Одиночное раздражение вызывает одиночное сокращение, которое запа-
здывает в мышце лягушки на ~45 мсек при 0° и на ~ 10 мсек при повыше-
нии температуры до 20°. Если частота раздражения становится очень
большой, то мышца переходит в состояние тетануса (состояние непрерыв-
ного сокращения). При повышении температуры напряжение при одиноч-
ном сокращении уменьшается, а напряжение в тетанусе увеличивается.
Увеличение гидростатического давления приводит к возрастанию напря-
жения при одиночном сокращении. Интересно, что если длина мышцы во
время сокращения не уменьшается, а остается равной исходной длине
(изометрическое сокращение), то напряжение, развиваемое мышцей, мак-
симально. Это максимальное напряжение Р о, отнесенное к сечению мышцы,
равно примерно 5 кг/см2. При неизометрическом сокращении мышца разви-
вает напряжение Р < Ро. Зависимость Р от скорости изменения длины
мышцы открыта Хиллом и описывается уравнением Хилла, которое он наз-
вал «характеристическим уравнением»:

(Р + а)(У+Ь) = Р0Ь,

где Ро — максимальное значение развиваемого мышцей напряжения, V —
скорость укорочения, а и Ь — константы, характерные для каждого типа
мышечного препарата. Величина отношения а/Ро приблизительно постоян-
на для самых разнообразных мышечных препаратов — от мышц черепахи
.до мышц человека. Уравнение Хилла строго выполняется лишь в том слу-
чае, если V есть начальная скорость изменения длины покоящейся мышцы.
Эднако соотношения аналогичной формы могут быть написаны и для любого
промежуточного момента сокращения мышцы. Для этого вместо Ро в урав-
нение следует подставить значение максимального напряжения для той
.длины мышцы, которую она имеет в рассматриваемый момент. Константы а
и Ь сохраняют прежнее значение.

Важной характеристикой мышечных процессов служит выделение
тепла. Точно измерить количество выделяющейся теплоты очень трудно,
так как связанное с этим повышение температуры очень мало и сравнимо
по величине с подъемом температуры, сопровождающим ряд тривиальных
тепловых эффектов. Например, при движении мышцы термопара прихо-
дит в соприкосновение с новой областью, температура которой может быть
отлична от температуры изучаемого участка. Сильное изменение местной
температуры может также вызвать испарение. Благодаря многолетним
исследованиям А. Хилла, в которых он проявил виртуозную изобретатель-
ность, мы теперь имеем довольно ясное представление о тепловых процес-
сах в мышце. О них можно сказать в общих чертах следующее. Выделение
теплоты в мышце складывается из трех различных процессов: выделение
теплоты покоя связано с процессами обмена веществ в живой мышце
и не имеет отношения к функционированию мышцы как таковой; выделение
теплоты сокращения непосредственно связано с процессом сокращения
мышцы при раздражении и выделение теплоты, восстановления связано
<с процессами, обусловливающими возвращение мышцы в исходное со-
стояние.

Теплотой покоя называют теплоту, выделяющуюся при нормальных
процессах обмена веществ в мышечной клетке. До некоторой степени ее
величину определяет состояние мышцы. Она зависит от величины натяже-
ния и от ионной природы солевого раствора. Типичное значение теплоты
.покоя равно 2-1СГ4 кал/г.

Теплота сокращения состоит из двух частей — теплоты, поддержания
и теплоты укорочения. Если вычертить зависимость количества выделяемой
теплоты от времени после нанесения раздражения для случая изометриче-
ского сокращения, то вначале кривая довольно круто идет вверх, а затем
этот подъем становится более пологим. Это и есть теплота поддержания
состояния сокращения. Если мышце дать возможность укорачиваться,
то количество выделяемой ею теплоты увеличится. Эта избыточная теплота
есть теплота укорочения. Скорость выделения теплоты укорочения строго
пропорциональна степени укорочения и не зависит от испытываемой мыш-
цей нагрузки, что кажется весьма удивительным. Максимальное увеличе-
ние температуры при одиночном сокращении равно (3-10 3) °С, что соответ-
ствует выделению 3-10-3 кал на 1 а мышцы. Если мы выразим скорость
выделения теплоты в единицах энергии, то соотношение между количе-
ством теплоты, выделяемой в единицу времени (Е), и скоростью укорочения
мышцы У можно написать в следующем виде: Е = аУ + аЬ. В этом выра-
жении а обозначает ту же константу, которая входит в уравнение Хилла,
а аЬ равно теплоте поддержания.

Полное количество выделяемой мышцей энергии равно сумме выделяе-
мой ею теплоты й производимой работы; эта величина линейно умень-
шается с увеличением напряжения Р следующим образом:

Полное количество энергии = Е + РУ —

= аУ + аЬ + Р0Ь — РЬ — аУ —

= аЬ -\-Р0Ь — РЬ.

Подставляя вместо Р его значение из характеристического уравнения
Хилла, можно получить более сложное по форме соотношение между пол-
ной энергией и У.

Остановимся теперь коротко на процессах, связанных'с выделением
теплоты восстановления. Кратковременная потребность в энергии во время
сокращения мышцы обеспечивается за счет гидролиза АТФ, а также креа-
тинфосфата, запас которых должен быть затем пополнен. Во время процесса
восстановления выделяется теплота. Очень интересно, что процесс релак-
сации, который не следует путать с процессом восстановления, не связан
с затратой энергии (кроме работы, затрачиваемой на возвращение в исход-
ное состояние). Теплота восстановления во много раз (примерно в 20) уве-
личивается в присутствии кислорода.

Важной характеристикой мышечных процессов служит коэффициент
полезного действия, определяемый как отношение величины совершенной
мышцей работы к сумме этой работы и выделенной теплоты; величина его
равна примерно 20%.

6.	Молекулярная биофизика мышечных процессов. Теперь остается
задать себе следующий вопрос: может ли дать что-нибудь молекулярная
биофизика для понимания работы мышцы? Вопрос можно поставить еще
более прямо, а именно: приведет ли расщепление мышцы на волокна, воло-
кон — на миофибриллы и далее вплоть до актомиозиновых нитей к такой
системе, которая будет еще напоминать мышцу? И если да, то доказывает ли
это необходимость вести исследования на молекулярном уровне? На оба
эти вопроса после некоторых колебаний можно ответить «да»; разумеется,
в устах убежденного апологета молекулярной биологии это «да» прозвучит
воинственно и без тени сомнения. Прежде чем приступить к рассмотрению
молекулярной биофизики мышцы, неплохо напомнить о принципах, которых
мы будем придерживаться. Любой попытке объяснить биологическое явле-
ние на молекулярном уровне должен предшествовать мысленный синтез
соответствующей системы и анализ возможного поведения синтезированной
модели. Таким образом, мы с самого начала наталкиваемся на серьезные
трудности. Краткий обзор свойств мышцы показывает, что, вероятно,
работу мышцы можно имитировать с помощью сравнительно простой модели.
Конечно, такая простая модель вряд ли позволит добиться полного успеха
при объяснении мышечных процессов на молекулярном уровне. Но, при-
держиваясь изложенного принципа, мы имеем меньше шансов заблудиться
в экспериментах и напрасно потерять много времени.

За открытием Энгельгардта и Любимовой, которые обнаружили, что
миозин катализирует гидролиз АТФ, последовало открытие Сцент-Дьёрдьи,
показавшего, что актомиозиновые нити весьма заметно сокращаются при
добавлении АТФ. Это открытие было сделано во время второй мировой
войны и в свое время не было оценено по достоинству из-за отсутствия связи
между учеными воюющих стран. Тем не менее оно побудило Сцент-Дьёрдьи
и его школу искать простые модели мышцы на молекулярном уровне; эти
поиски оказались не напрасными. В настоящее время существуют самые
разнообразные препараты, моделирующие мышечную деятельность; при-
мером могут служить глицериновые экстракты поясничной мышцы кролика
и молекулярная система актомиозин —- АТФ. Очень полный и обстоятель-
ный обзор результатов исследования таких препаратов дали Вебер и Порт-
цел, являющиеся ведущими исследователями в этой области. Исследуя
свойства различных моделей и сравнивая их с такими свойствами целой
мышцы, как эластичность, развиваемое напряжение, двойное лучепреломле-
ние, скорость сокращения, коэффициент полезного действия, Вебер и Порт-
цел пришли к выводу, что между моделями и мышцей существует большое
сходство. Однако они указывают также на существование различий. Так,
в живой мышце все время присутствует АТФ, который в состоянии покоя
не расщепляется, тогда как в молекулярных препаратах АТФ всегда рас-
щепляется; скорость сокращения, а также скорость расщепления АТФ
в живой мышце гораздо выше, чем в молекулярных препаратах. Учитывая
все сказанное, можно думать, что в ближайшем будущем удастся описать
некоторые важнейшие стороны работы мышцы с позиций молекулярной
биофизики.

Среди результатов, полученных на простейших молекулярных моде-
лях, а именно на актин-миозиновых смесях, можно упомянуть влияние
АТФ на вязкость, на двойное лучепреломление в потоке и на рассеяние
света. Резкое падение вязкости и двойного лучепреломления в потоке при
добавлении АТФ было отмечено рядом авторов. Джонсон и Ландольт наблю-
дали уменьшение рассеяния света при добавлении АТФ. Тсао применил
для изучения мышцы очень интересный метод — измерение деполяризации
света флуоресценции. Он окрашивал актин флуоресцирующим красителем
и по наблюдаемой скорости деполяризации света флуоресценции определял
время релаксации молекул. Время релаксации зависит от молекулярного
объема, отношения вязкости к температуре и от фактора формы, вводимого
для несферических молекул. Зависимость между величиной, обратной сте-
пени поляризации света флуоресценции, и отношением температуры к вяз-
кости, оказывается линейной, что позволяет найти время релаксации
и молекулярный объем. Экспериментальные данные могут быть получены
с достаточной точностью, и время релаксации удается измерить с погреш-
ностью примерно ± 1 %.

Таким образом, измерение деполяризации флуоресценции оказывается
очень эффективным методом, позволяющим оппеделить способность моле-
кулы к вращению и, возможно, также оппеделить размеры вращающейся
части. На фиг. 236 приведены результаты Тсао по изменению поляризации
актомиозина при добавлении АТФ. Можно видеть, что при добавлении АТФ
деполяризация резко уменьшается. Это указывает на затрудненность
вращения, связанную, по-видимому,' с увеличением размеров молекул.
К таким же выводам пришел Моралес, проводивший исследования с помо-
щью центрифугирования и изучения рассеяния света. Можно думать, что
АТФ способствует образованию димеров. Еще интереснее, что во всех слу-
чаях деполяризация слишком велика, чтобы ее можно было объяснить
вращением всей молекулы актомиозина, имеющей молекулярный вес около
миллиона. Очевидно, комплекс актина и миозина нельзя считать простым
жестким образованием.

О характере молекулярных процессов, протекающих в мышцах, было
сделано немало предположений. Поскольку авторы не считают себя круп-
ными специалистами в этом вопросе, они вряд ли смогли бы изложить по-

Время

Ф и г. 236. Деполяризация света
флуоресценции актомиозина (по наблю-
дениям Тсао).

Резкое изменение деполяризации при добав-
лении АТФ» вероятно, указывает на образо-
вание димеров. В любом случае деполяриза-
ция всегда слишком велика, чтобы ее можно
было объяснить броуновским движением та-
кого большого молекулярного агрегата,
каким является комплекс актина и миозина.

являвшиеся гипотезы в их хроноло-

гическом порядке, да это и не соот-
ветствовало бы целям книги. Кроме
того, ни одна из предложенных гипо-
тез не получила всеобщего признания,,
которое свидетельствовало бы о не-
сомненном успехе, так что мы не по-
грешим против истины, если произве-
дем некоторый отбор. Заранее огово-
римся, что этот отбор отражает наши

интересы как специалистов по моле-
кулярной биофизике и не может слу-
жить объективной оценкой значи-
мости той или иной работы..

Начнем с гипотезы Райзмана и
Кирквуда, выдвинутой в 1948 г. Сог-
ласно этой гипотезе, актомиозиновая
нить в состоянии покоя растягивается
электростатическими силами, что
препятствует броуновскому движению

нити, выражающемуся в многочисленных изгибах длинной молекулы и, сле-
довательно, в уменьшении ее средней длины. Пытаясь найти механизм обра-
зования электростатических зарядов, авторы обратили внимание на высо-

кий процент аминокислот с гидроксильными группами — серина и трео-
нина (они составляют 9% от всех аминокислот миозина) — и предполо-
жили, что АТФ фосфорилирует эти аминокислоты и что НгРО4 при рН 7
становится однократно ионизованной и приобретает отрицательный заряд..
Эти заряды удерживают актомиозиновую нить в развернутом состоянии.
Когда мышца получает сигнал к сокращению, АТФ подвергается фермен-
тативному расщеплению и актомиозиновая нить дефосфор ил ируется.
В результате молекула актомиозина сворачивается в клубок и происходит
сокращение. Таким образом, при сокращении происходит выигрыш в кон-
фигурационной энтропии.

Райзман и Кирквуд рассчитали расстояние между фосфорилированными
группами, пользуясь следующими рассуждениями. Если при изменении
заряда в п местах цепи на величину е происходит образование клубка
и если молекула линейная и имеет молекулярный вес 7И, а структура обла-
дает плотностью р и среднее расстояние между молекулами в ней равно Т,
то изменение модуля упругости, соответствующее переходу в клубок, равно

АТ-

8Л,рп2г2

ЗМБеЬ ’

где А — число Авогадро, а Ре — эффективная диэлектрическая проницае-
мость. Подставляя значения АТ = 106 дин/см2, у = 1, М - 10е, Т = 104 А.
и /?е = 100 (несколько завышенное значение), они получили, что п = 100,
т. е. что расстояние между фосфорилированными группами равно ~100 А.
Это вполне правдоподобно для распределения аминокислот, однако не согла-
суется с тем, что, как известно, на единицу актомиозина с молекулярным
весом 360 000 приходится одна молекула АТФ. Так как этот расчет не пре-
тендовал на высокую точность, то было бы неправильным на этом основа-
нии выносить приговор теории, тем более что, как показал Поллисар, боль-
шая часть расхождений может быть устранена, если для расчета брать

меньшее значение диэлектри-
ческой проницаемости.

Моралес и Боттс, тща-
тельно проанализировав раз-
нообразные эксперименталь-
ные данные, предложили
теорию, сходною в основных
чертах с теорией Райзмана
и Кирквуда и отличающуюся
от нее лишь в деталях, каса-
ющихся происхождения элек-
трических зарядов. Они
предполагают, что в состоя-
нии покоя молекулы акто-
миозина вытянуты за счет
электростатического отталки-
вания адсорбированных на
них двухвалентных катионов.
Анион АТФ, связываясь с
миозином, нейтрализует эти
заряды и вызывает сокраще-
ние, поскольку силы, выпрям-
лявшие молекулы, исчезают.
Миозин канализирует превра-
щение АТФ в АДФ, который

90%

Фиг. 237 Схема Хаксли, поясняющая харак-.
тер изменений I и Л-дисков при сокращении
мышцы.

I диски, по-видимому, скользят внутри Л-дисков.

75%

60%

не связывается с актомиозином, и тогда

начинается выпрямление молекул, т. е. релаксация мышцы.

Несколько другой механизм предложили Г. Хаксли и Хэнсон. Они
обратили внимание на то, что во время сокращения /-диск, состоящий из тон-
ких молекул актина, сильно изменяется в длине, тогда как А-диск не испы-
тывает никаких изменений. Картина процесса, как ее представляет себе
Хаксли, схематически показана на фиг. 237. Можно видеть, что сокраще-
ние и возвращение в исходное состояние связано с изменением характера
/-диска. Электронно-микроскопическое исследование внешней части А-дис-
ка в нормалвных условиях показывает упорядоченную картину из воло-
кон двух типов (см. фиг. 234). Хаксли предполагает, что тонкие нити —
это актин, а толстые — миозин и что мышечные процессы связаны с вдви-
жением одной системы нитей в другую

На электронных микрофотографиях настолько ясно видна почти кри-
сталлическая структура мышечного волокна и это настолько хорошо под-
тверждается рентгеноструктурными исследованиями,что упомянутая выше
гипотеза «сплетенных пальцев», основанная на этих представлениях, заслу-
живает более детального рассмотрения. (Термин «сплетенные пальцы»
появился потому, что для демонстрации механизма, предложенного Хак-
сли, любой лектор использует пальцы обеих своих рук, сплетая их и пока-
зывая, как они могут скользить друг относительно друга.) Существование
толстых и тонких нитей можно считать хорошо доказанным фактом. Не под-
лежит также сомнению, что толстые нити представляют собой миозин и что
между нитями существуют поперечные мостики, хотя крайне важная деталь-
ная структура этих мостиков еще не известна. Согласно гипотезе Г. Хаксли
и Дж. Хэнсона, поперечные мостики принадлежат молекулам миозина

Миозин —----

Миозин

Ф и г. 238. Схема, поясняющая механизм
относительного движения тонких нитей
актина и толстых нитей миозина за счет
броуновского движения и временных
соединений между определенными участ-
ками нитей.

Места, между которыми устанавливаются вре-
менные связи, обозначены буквами Д, М, А' и
М', а пружины условно обозначают возможность
колебательного броуновского движения соответ-
ствующих групп на нитях. Модель позволяет
объяснить уравнение Хилла и рассчитать
количество выделяющегося в мышце тепла.

и могут прикрепляться к опреде-
ленным местам тонких нитей ак-
тина. Возможно, они могут совер-
шать колебательное движение,
пока не произойдет их прикрепле-
ние к определенному участку тон-
кой нити, причем при прикрепле-
нии каким-то образом осуществ-
ляется принцип храпового колеса,

так что движение может происхо-
дить только в одном направлении.
В прикреплении мостиков и сме-
щении нитей участвует молекула
АТФ, которая в этом процессе
теряет фосфатную группу и за
счет этого обеспечивает процесс
энергией. В секунду должно про-
исходить около 100 таких актов,
что соответствует скорости, с кото-
рой миозин расщепляет АТФ на
АДФ и фосфат.

А. Хаксли развил эту идею
в довольно стройную теорию, хоро-

шо объясняющую экспериментальные соотношения, полученные Фенном и
Хиллом. Поскольку модель явления, которую А. Хаксли положил в основу

своей теории, допускает проведение количественных расчетов, мы изложим
основной ход его рассуждений. Модель, о которой идет речь, изображена
на фиг. 238. Предполагается, что процесс вдвижения нитей осуществляется
за счет «сцепления» участка М на миозине с участком А на актине. Сцеп-
ление управляется константой скорости /, а освобождение — константой
скорости Последний процесс связан с выделением энергии связи, напри-
мер макроэргической фосфатной связи, что записывается как реакция
АМ + ХР, где ХР — некоторое фосфатное соединение. Третья реакция
заключается в расщеплении соединения АХР на его составные части. Сим-
волически эта схема может быть записана следующим образом:

Аф-Л4—->АМ	(константа скорости /),

АМ + ХР —» АХР ф- 7И (константа скорости §),
АХР —>А + Х + Р.

В отсутствие раздражения «сцепление» происходить не должно. Как пред-
полагает Хаксли, это в основном связано с тем, что не может осуществляться
третья реакция. Раздражение снимает запрет с этой реакции и тогда сцеп-
ление может происходить в соответствии с относительными расстояниями
и хаотическим тепловым движением. На фиг. 238 тепловое движение участ-
ка М наглядно представлено в виде толкающих этот участок пружин. Чтобы
ввести принцип храпового колеса, а также учесть конечный радиус действия
молекулярных сил, Хаксли предполагает, что константа § имеет большую
величину слева от центральной точки и также слегка увеличивается вправо
от нее, а константа ) слева от центральной точки равна нулю и растет линей-
но вправо от нее до расстояния ДА, после чего становится равной нулю.
Справа I всюду больше^ вплоть до И. Обозначим через п число сцепленных
участков. Скорость изменения п равна скорости образования новых сцеп-
лений минус скорость их распада, т. е.

аап(=(1-п)1-пё.

(^Х

Вводя скорость смещения каждой нити V — —	, получим

Если саркомер имеет длину 5, а скорость укорочения всей мышцы равна V,
то V = у (лишь половина скорости приходится на актин). Таким образом,

ОТ ЙП г /г ,	.

- 2 -Л	+

Чтобы рассчитать количество энергии, освобождающейся в этом про-
цессе, мы умножим число реагирующих участков, приходящихся на еди-
ницу объема мышцы (т), на величину энергии фосфатной связи (е) и на число
раз, которое каждый участок 7И участвует в процессе. На расстоянии (1х

Ах
число участков, которые могут принимать участие в процессе, равно у ,
где I есть среднее расстояние между участками А. В секунду, следовательно,
1 Ах	ТТ „

реагируют участков. Действительное число актов сцепления, равно
произведению этого выражения на число элементов, вступающих в реак-
цию, на константу скорости и на приращение времени, т. е.

"Г ~ й/’1или у $ И1 — «)

Пределы интегрирования определяются природой I и могут быть приняты
равными минус и плюс бесконечности.

Напряжение, развиваемое мышцей, можно рассчитать, если ввести
к — модуль Юнга мышцы. Работа, производимая одним сцепленным участ-
ком, равна в этом случае \ кхйх и соответственно для п сцепленных участ-
ков — кпхйх. Пределы интегрирования опять-таки зависят от природы
ограничений движения в мышце и могут быть приняты равными бесконеч-
ности. Среднее напряжение, развиваемое сцепленными участками, равно
частному от деления общей величины работы на перемещение /, т. е. равно
у пкхдх. Для 1 см3 мышцы суммарное развиваемое напряжение равно,
таким образом, произведению полученного выражения на число реагирую-
щих участков в половине саркомера. Отнесенное к единице сечения, это
число будет равно ~. В результате для Р получаем

„ тзк С ,
Р = —у \ пхах.

Вводя подходящие значения для § и / (а именно полагая § = Для
отрицательных х и ё = ё1 ~ для положительных х, а / = 0 для отрица
25 Заказ № 1168
тельных х и х > И, и / = для 0 < х < /г), Хаксли выполнил интегри-
рование и получил выражение, содержащее два параметра. Подобрав эти
параметры так, чтобы наилучшим образом описать результаты Фенна
и Хилла, он получил очень близкое совпадение, хотя имеется некоторое
различие в характере функций. Так, Хилл дает линейную зависимость,
тогда как функции Хаксли имеют некоторую кривизну. Однако, как можно
видеть из табл. 32, расхождение теории с опытом не превосходит ошибки
эксперимента.

Таблица 32

Сопоставление экспериментальных данных (по Хиллу)
с результатами теоретического расчета (по Хаксли)*

Напряжение	Скорость сокращения	
	по Хиллу	по Хаксли
0,0	1,0	1,о
0,2	0,44	0,41
0,4	0,23	0,21
0,76	0,066	0,006

* Все величины даны в относительных единицах.

На основании выведенных им выражений и с учетом ряда экспери-
ментальных данных Хаксли рассчитал значения к (размер зоны «сцепле-
ния»)о и / (расстояние^ между участками Л). Для й он получил значение
156 А и для I — 153 А. Хотя на самом деле I должно быть больше й, чему
найденные значения противоречат, эти цифры представляют интерес и могут
быть сопоставлены с результатами исследований молекулярного строения
миозина и актина.

Модель «сплетенных пальцев» очень привлекательна, и предположе-
ния, на которых она основана, довольно убедительны. В ней, однако,
имеется ряд трудностей, связанных с тем, что, с одной стороны,
мышца может укорачиваться до четверти своей нормальной длины,
а с другой — развивать напряжение и тогда, когда она растянута
настолько, что нельзя предполагать перекрывания нитей. Возможно, что
со временем эти трудности будут преодолены, но в настоящее время
они существуют.

В начале этой главы мы привели очень выразительные слова Сцент-
Дьёрдьи, который связывает изучение работы мышцы с изучением процес-
сов жизни вообще. Посмотрим, что же дает для понимания жизни изу-
чение мышцы, или, более конкретно,— ее молекулярно-биофизическое изу-
чение. Бросается в глаза, что изучение мышцы привлекает внимание очень
большого числа исследователей. Это говорит о возможности и полезности
проведения исследований на препаратах, все более и более изолирован-
ных от живого организма, для получения осмысленных и воспроизводи-
мых результатов. Выясняется, что мышца имеет сравнительно простое
строение и ее можно расщепить на элементарные молекулярные единицы,
сохраняющие все свойства мышечного волокна. Развивается биохимиче-
ский анализ, и данные, которые он дает, не являются безнадежно непонят-
ными, хотя, вероятно, здесь еще многое нужно сделать. И, самое главное,
становится ясным, что, исследуя функционирующую физиологическую еди-
ницу, мы вовсе не теряем времени зря, стараясь выяснить ее молекуляр-
ное строение и связь между ним и функциями этой единицы.

Здесь мы встречаемся с одной из проблем, с которыми сталкивается
наука в невидимом мире микрообъектов. Никакой один эксперимент, ника-
кое одно безупречное исследование не раскроют нам природу мышцы. Во
всей молекулярной и атомной физике нельзя вообразить такого экспери-
мента, который бы сам по себе давал нам представление об атоме или моле-
куле. Для формирования такого представления необходим синтез резуль-
татов множества разнообразных экспериментов. То же самое можно ска-
зать и о мышце. Это означает, что мы должны быть очень терпимыми по отно-
шению к спекуляциям и гипотезам. Необходимо поощрять исследования
в области теоретической биологии, помня, что хорошая теория всегда
хороша, даже если она не является всеобъемлющей. Как физики, авторы
могут привести в качестве примера ту казавшуюся безнадежной пута-
ницу удачных и неудачных теорий, которая была характерна для пер-
вых тридцати лет развития атомной физики после открытия электрона.
В настоящее время эта путаница разрешилась, в некоторых случаях, вероят-
но, даже самым банальным образом с точки зрения первых эксперимента-
торов. Этот пример дает основания думать, что нечто подобное ожидает
нас в понимании мышечных процессов. Так что, если какое-либо объяс-
нение правильно описывает одни стороны явления и не подходит для дру-
гих, оно может все же оказаться ценным при синтезе полной картины.
Когда этот синтез будет произведен (возможно, это время уже недалеко),
молекулярная биофизика мышцы окажется существенным вкладом в науку
о жизни.

Нервы

Нервная система представляет собой систему, координирующую работу
отдельных частей целостного организма. Таким образом, изучение нервного
волокна — это не просто исследование любопытных свойств возбудимой
ткани; оно служит отправной точкой для изучения поведения живого суще-
ства как целого, и его значение для физиологии крайне велико. Изучение
нервного волокна представляет интерес и для биофизики, так как техниче-
ская революция в радиоэлектронике затронула этот раздел биологии в боль-
шей степени, чем какой-либо другой. Подавляющую часть аппаратуры для
биофизического исследования нервов составляют электронные приборы,
и поэтому в электрофизиологической лаборатории физик чувствует себя
в своей стихии. Но исследователю, интересующемуся биофизикой нерва на
молекулярном уровне, вся эта аппаратура дает довольно мало, поскольку
легко измеримые потенциалы возникают, к сожалению, при протекании
самых разнообразных молекулярных процессов. Таким образом, несмотря
на изобилие экспериментальных данных, относящихся к процессам в нер-
вах, анализировать и объяснять их пока значительно труднее, чем данные,
относящиеся к мышцам.

7.	Клеточные мембраны. Электрическое сопротивление и емкость суспен-
зии клеток впервые исследовал Фрике в 1924 г. Он обобщил формулу Макс-
велла для удельного сопротивления суспензии сферических частиц на слу-
чай сфероидов и применил полученное выражение для расчета сопротивле-
ния суспензии эритроцитов. В своей работе он рассмотрел также электри-
ческую емкость суспензии сфероидов, поверхностный слой которых пред-
ставляет собой тонкую изолирующую мембрану, и вывел следующее соот-
ношение:

С = а(1-^-)9С0,

где а — величина, зависящая от отношения осей сфероида, г — сопротивле-
ние суспензии, Г1 — сопротивление среды, д — главная ось сфероида и Со —
емкость на 1 см2 мембраны. Измеряя емкость при различных концентра-
циях, Фрике определил значение Со, которое оказалось чрезвычайно боль-
шим. Усовершенствовав в дальнейшем этот метод, Фрике и Кол показали,
что для разнообразных клеточных мембран емкость на 1 см2 близка к 1рф.

Чтобы понять, о чем это говорит, рассмотрим плоскопараллельный
конденсатор, у которого емкость на единицу поверхности равна Со и диэлект-
рическая проницаемость — /С Для такого конденсатора

С - К

если емкость измерять в электростатических единицах, или

Со = 8,8-^-,

если Со измерять в микрофарадах, ай — в ангстремах. Можно видеть, что
мы могли бы рассчитать й, толщину мембраны, если бы знали ее диэлектри-
ческую проницаемость. К сожалению, ничего определенного о диэлектри-
ческой проницаемости мембраны, так же как и о природе самой мембраны,
неизвестно. Но если предположить, что изолятором служит слой липидов
(что вполне правдоподобно), то для диэлектрической проницаемости можно
принять значение 3; тогда толщина мембраны равна 26 л. Полученная вели-
чина гораздо меньше толщины любой мембраны, которую можно видеть
в микроскоп, и многие годы было неясно, как примирить этот результат
с известными данными о клетке. Работы последних лет по электронной микро-
скопии ультратонких срезов практически разрешили этот конфликт, по-
скольку в настоящее время, по-видимому, выясняется, что действитель-
ная толщина клеточной мембраны очень мала. Согласно представлениям
Даниелли, мембрана состоит из двойного слоя липопротеидных молекул,
причем толщина слоя липидов составляет примерно 30 А, а общая толщина
слоя вместе с белками — около 100 А.

К- Кол предполагает, что мембрана типичной клетки в состоянии покоя
имеет емкость 1рф/сл-г2, сопротивление утечки ЮООои-сл.2 и на ней создается
отрицательная по отношению к наружной части разность потенциалов, рав-
ная 70 мв. Внутренняя часть клетки, согласно современным данным, по
электрическим характеристикам более или менее однородна и имеет удель-
ное сопротивление, равное 100 ом-см.

Кертис и Кол измерили электрические характеристики одиночного
нервного волокна кальмара и нашли для емкости на 1 см2 то же самое зна-
чение, что и приведенное выше. Это позволяет считать, что мембраны нерв-
ных клеток не представляют исключения и построены из тонких липопро-
теидных слоев того же типа, что и мембраны других клеток.

8.	Электрические явления в мембранах. Как ни привлекательно было
бы нарисовать ту картину мембраны, которую мы только что описали, в этой
|'лаве мы сознательно будем воздерживаться от подобной иллюстрации.
.Ведь все, что мы бы могли изобразить, было бы повторением картины, опи-
санной в гл. II, где было указано, что в мембране имеются довольно боль-
шие отверстия, или поры, через которые могут проходить даже крупные
молекулы. Сначала нам следует посмотреть, может ли двойной молеку-
лярный слой, даже содержащий довольно большие отверстия, вызвать
какие-либо электрические эффекты в клетке. И прежде всего нужно разъяс-
нить, почему мы ожидаем найти в клетке электрические явления и почему

они могут иметь какое-то значение.

Как известно, любое электрическое явление связано с разделением
зарядов. Например, в случае разряда разделение зарядов происходит за
счет сильного электрического поля; при условии, что длина свободного
пробега достаточно велика, электрон, ускоряемый этим полем, ионизует

атомы или молекулы, с которыми он сталкивается.
В генераторе сравнительно слабое поле, создавае-
мое при движении проводника в магнитном поле,
действует на свободные электроны, имеющиеся
в металле; так как число их очень велико, это
слабое поле вызывает заметный эффект.

Ни тот ни другой процесс нельзя, конечно,
использовать для объяснения электрических явле-
ний, наблюдаемых в клетке. Но существует еще
один механизм разделения зарядов, который вполне
пригоден для этой цели, а именно механизм, осу-
ществляемый в ионных растворах. К нему мы
и перейдем. У многих веществ атомные конфигура-
ции таковы, что они могут удерживать избыточные
электроны или, наоборот, легко отдавать свои
(примером могут служить, соответственно галогены
и щелочные металлы). Очень часто эти вещества
образуют молекулы, связанные ионными связями

Фиг. 239. Схема иона
с сольватной оболочкой.
Положительный ион окру-
жен оболочкой из поляр-
ных молекул воды. Такой
комплекс имеет сравнитель-
но большие размеры.

(хлористый натрий). В полярных растворителях, например в воде, могут
образовываться другого рода агрегаты, в которых заряженный атом, или
ион, окружен поляризованными молекулами растворителя (фиг. 239). Такой

сольватированный ион, очевидно, много больше исходного иона, и меха-
низм, посредством которого он перемещается, представляет для нас боль-

шой интерес.

Поскольку нет никаких сомнений, что в живой клетке и ее окружении
такие ионы имеются, необходимо рассмотреть, какие электрические эффекты
могут быть с этим связаны. Прежде всего посмотрим, существуют ли хими-

ческие реакции, в результате которых происходит разделение зарядов.
На этот вопрос можно, конечно, ответить положительно. Действительно,
любой элемент, валентность которого больше единицы, обладает такой потен-
циальной способностью. Теперь вспомним, что для разделения двух атомов,
связанных ионной связью, требуется затратить энергию — 3 эв. Не многие
биологические процессы, катализируемые ферментами, в состоянии обе-
спечить такую большую энергию. Вместе с тем, если речь идет не о полном
разделении зарядов, а лишь об их перераспределении, то процессов, кото-
рые вызывают такое перераспределение, можно указать достаточно много.
Таков, например, переход от РеС12 к РеС13, при котором атом хлора, легко
принимающий электрон и превращающийся в отрицательный ион, присое-
диняется к атому железа посредством ионной связи. Это приводит к изме-
нению существовавшего равновесия зарядов и появлению эффекта, кото-
рый нас интересует.

Другим примером может служить ионизация амино- или карбоксиль-
ных групп, влияющая на распределение зарядов. Присоединение водород-
ного иона к аминогруппе сообщает ей положительный заряд, удаление про-
тона из карбоксильной группы делает ее заряженной отрицательно. Иони-
зация этих групп зависит прежде всего от величины рН, различным зна-
чениям которого соответствует различное число и различная локализация
зарядов. В добавление к сказанному следует напомнить, что любой про-
цесс, изменяющий водородные связи в белковой молекуле, влияет также
на распределение локальных зарядов. Таким образом, существует ряд про-
цессов, в результате которых могут измениться не только ионные концентра-
ции, но и распределение зарядов на молекулах белка в мембранах. Теперь
посмотрим, какие следствия вытекают из этих двух возможностей.

Прежде всего, отметим, что между областями, в которых находится
какое-либо ионизуемое вещество в различных концентрациях, всегда суще-
ствует разность потенциалов. Если исходить из того, что по обе стороны
мембраны существует разность концентраций, и обозначить через и и V под-
вижности положительных и отрицательных ионов соответственно, а через и
с2 — их концентрации, то выражение для разности потенциалов в милли
вольтах будет иметь следующий вид:

ДЕ= 58-^=^	.

При —	10 и существовании некоторой разницы в подвижности ионов

с2

разность потенциалов будет иметь величину порядка нескольких милли-
вольт. Многие биопотенциалы, величины которых имеют примерно то же
значение, обусловлены, скорее всего, именно этой причиной.

Коснемся теперь причин, определяющих размер сольватированного иона.
Сольватированный ион занимает значительно больше места, чем ион того же
рода в кристаллической решетке. Чем больше места занимает ион в кристал-
лической решетке, тем меньше будет размер сольватированного иона, так
тем более тонкой сольватной оболочкой он будет окружен в растворе. Дей-
ствительно, энергия притяжения зарядов противоположного знака тем
меньше, чем дальше они удалены друг от друга, т. е. чем больше их размеры.
Следовательно, энергия поляризации молекул воды, образующих сольват-
ную оболочку больших ионов, будет меньше, т. е. сама оболочка будет
тоньше. В табл. 33 приведены радиусы ионов для трех щелочных металлов.
Можно видеть, что хотя в отношении химических свойств между щелочными
металлами имеется большое сходство, физические свойства их ионов в рас-
творе совершенно различны.

Таблица 33

Элемент	Радиус иона, А	
	в кристаллической решетке	в растворе
ы+	0,78	3,66
	0,98	2,81
К+	1,33	1,88

Рассмотрим теперь фиг. 240, где схематически изображена липопро-
теидная мембрана (по Даниелли), помещенная в среду, содержащую ионы
различных типов. Ионы калия и натрия изображены на схеме в приблизи-
тельно правильном относительном масштабе, и нетрудно видеть, что калий
будет диффундировать сравнительно легко, тогда как для натрия будет
•существовать большой градиент концентрации. Этот градиент концентра-
ции будет, как было указано выше, создавать разность потенциалов, изме-
ряемую величинами порядка нескольких милливольт.

Теперь мы можем вернуться к другому свойству мембраны — к ее
способности изменять распределение поверхностных зарядов при измене-

нии числа ионизованных карбок-
сильных и аминогрупп. Последнее
может быть обусловлено либо вну-
тренними причинами — измене-
нием связей в белковой молекуле,
приводящим к изменению концен-
трации водородных ионов, при ко-
торой имеет место ионизация, либо
внешними — за счет изменения рН
или ионной силы. Если такие из-
менения возникают, то мы можем
наблюдать эффект, показанный на
фиг. 241, где в сильно увеличенном
виде изображено электрическое
поле в поре липопротеидной мем-
браны (знаками + и — обозначены
ионизованные карбоксильные и
аминогруппы). Совершенно ясно,
что процесс проникновения ионов
через мембрану может зависеть от
изменений, происходящих в бел-
ковых молекулах. Тот' факт, что
ускоряющие и замедляющие дви-
жение ионов участки полей череду-
ются и, следовательно, заставляют

Фиг. 240. Схематическое изображение
липопротеидной клеточной мембраны в сре-
де, содержащей ионы с сольватными обо-
лочками различных размеров, например
ионы Иа+ и К+.

В узкие промежутки могут проходить маленькие
комплексы и не проходят большие- Таким обоа-
зом. на мембране возникает разность потенциалов.

ионы двигаться то вперед, то назад, означает, что характер движения
ионов, имеющих разные сольватные оболочки, будет различным и, по-види-

мому, существенно различным.

Фиг. 241. Схема расположения зарядов в белковой
части поры мембраны.

При движении иона через пору скорость его должна то увели-
чиваться, то уменьшаться. Такой процесс может привести к из-
бирательной проницаемости поры для ионов, резко зависящей
от- их размеров и знака заряда.

Для изучения некоторых вопросов, касающихся пористого строения
клеточных мембран, Соломон и его сотрудники применили метод меченых
атомов. На основании закона Пуазейля для течения вязкой жидкости в узкой
трубке и простого закона диффузии они рассчитали радиус пор в мембра-
нах различных клеток. В табл. 34 приведены результаты такого рода расче-
тов, взятые из статьи Соломона. Можно видеть, что результаты для различ-
ных объектов получаются различными. Этот факт представляет большой
интерес, поскольку он свидетельствует о разнообразии типов пор. Соломону
принадлежит образное сравнение мембраны с кастрюлей макарон, которую
непрерывно встряхивают, в результате чего отверстия то открываются,
то закрываются.

Таблица 34

Ткань

Эквивалентный радиус
пор, А

Наружная мембрана нервного волокна кальмара
Эритроциты человека ........................

Икринка лягушки (из яичника)................

Икринка лягушки (из полости тела)...........

Амеба.......................................

Слизистая оболочка желудка лягушки (два раз-
мера) ......................................

16

3,5

29

2,2

2,0

60 (7%)

2,5(93%)

Последний вопрос, который мы должны были рассмотреть в этом раз-
деле,— это вопрос о значении электрических явлений. Следует сразу ска-
зать, что как «индикаторы» они крайне удобны, так как для их обнаружения
и измерения существуют отличные приборы; результаты таких измерений
могут служить одним из доводов, на которые мы можем опираться, выдви-
гая ту или иную гипотезу относительно клеточных процессов, лежащих
в основе электрических явлений. Вместе с тем основное значение для выяс-
нения молекулярного механизма электрических явлений имели бы сведе-
ния о распределении зарядов, но для получения этих сведений требуется
слишком большое число данных о значениях потенциалов. По нашему мне-
нию, именно наличие этой трудности объясняет, почему мы до сих пор не
можем дать строгого описания молекулярных механизмов биоэлектриче-
ских явлений вообще и нервного возбуждения в частности. После этого не
очень оптимистического замечания мы приступаем к очень краткому обзору
сведений о нерве и механизме передачи нервных импульсов.

9.	Нерв и нервная клетка. Нервы, благодаря которым мы можем играть
на рояле, слышать, видеть и наслаждаться вкусной пищей, представляют
собой сложные многоклеточные образования; при этом составляющие их
клетки в свою очередь сложны как по своей структуре, так и в отношении
своих функций. То, что мы небрежно называем нервом,— это комплексное
образование, состоящее из ряда воспринимающих и передающих импульсы
единиц,, которые все в чем-то похожи, но вместе с тем чем-то отличаются
друг от друга. Нервы обусловливают тонкость восприятия; это они обеспе-
чивают способность дирижера улавливать нежелательные обертоны отдель-
ного инструмента в оркестре или определяют тонкое чувство цвета у талант-
ливого художника. Изучая нервные процессы, биофизика начинает вносить
свой вклад в понимание личности как системы. В сущности, неудивительно,
что вклад в разрешение этого вопроса вносят исследования, предпринимае-
мые с самыми различными целями.

Нервная клетка, или нейрон, резко отличается от обычной  клетки,
которую мы описывали выше. Ее ядро с аппаратом воспроизведения, играю-
щие чрезвычайно важную роль в обычных клетках и в сущности имеющие
огромное значение и в нервной клетке, как бы сдвинуты на второй план.
Клетка имеет множество отростков, называемых дендритами, которые рас-
положены довольно хаотично. Самый длинный отросток, аксон, имеет особое
строение. Нервные клетки образуют сенсорную и коммуникационную сеть,
основная функция которой, повторяющаяся много раз, заключается в пере-
даче сигнала по аксону к другому нейрону. Способ осуществления этой
функции и удивительное разнообразие результатов, достигаемых путем
такого, казалось бы, сравнительно простого повторения одного и того же
процесса, показывает, что принципы, лежащие в основе строения и функции

живых существ, и их реализация
представляют собой высшую сте-
пень совершенства.

Приходится сознаться, что
по сравнению с тем, что нам из-
вестно о функциях нервной си-
стемы, наши сведения о ее моле-
кулярной структуре ничтожны.
Нам известно кое-что об аксоне;
мы знаем также, каким образом
аксон реагирует на раздражение
и что представляют собой сиг-
налы, которые он передает. Но
мы не знаем молекулярной при-
роды всех этих процессов, хотя
некоторые интересные соображе-
ния на этот счет уже имеются.
К сожалению, для того чтобы
действительно можно было напи-
сать этот раздел, надо было бы
провести еще много исследова-
ний. Поэтому мы ограничимся
описанием принципов передачи
возбуждения по аксону. Начнем

Фиг 242. Схемы, иллюстрирующие строение
нерва.

А — пучок из двух нейронов; Б — основные черты
строения аксона, покрытого миелиновой оболочкой;
В — поперечное сечение пучка, состоящего из боль-
шого числа нейронов.

со схемы нерва, представлен-

ной на фиг. 242. Нерв состоит из большого числа аксонов (фиг. 242, В).
Не следует думать, что нейрон — это настолько специализированная

клетка, что ее ядро и цитоплазма резко отличаются от ядра и цитоплазмы
обычной клетки. Содержимое аксона, так называемая аксоплазма, непре-
рывно перемещается по нему и требует постоянного пополнения. Для син-
теза самых разнообразных компонентов аксоплазмы, в том числе фибрил-
лярного белка, необходимо наличие очень активной цитоплазмы со всем
аппаратом, участвующим в процессах синтеза, — митохондриями, рибосо-
мами и эндоплазматической сетью. Нервная деятельность по своему харак-
теру, безусловно, требует активного обмена веществ, и самый серьезный
пробел в наших знаниях — это вопрос о том, каким образом активный мета-
болизм обеспечивает работу нервной клетки.

Аксон сам по себе — сложная структура. Во многих нервах покрываю-
щая аксон миелиновая оболочка разбита на отдельные сегменты, интер-
валы между которыми называются перехватами Ранвье. Структуру миели-
новой оболочки в настоящее время начинают выяснять. Очень хороший
обзор по этому вопросу дал Ф. Шмитт. Миелиновая оболочка спирально
закручивается вокруг аксона, образуя многослойный футляр; каждый слой
представляет собой липопротеидную структуру толщиной немного менее
200 А, содержащую различные липиды, например, фосфатидилсерин, холе-
стерин, цереброзид и сфингомиелин, молекулы которых образуют правильно
построенную молекулярную систему. Такая упорядоченная молекулярная
структура, несомненно, имеет значение для нервной активности и сейчас
интенсивно изучается.

Если нерв извлечь из организма и поместить в солевой раствор, то он
сохраняет способность возбуждаться при раздражении его электрическим
током (для чего к одному из его концов подводят так называемый раздра-
жающий электрод). Поместив второй (регистрирующий)электрод на другой
участок нервного волокна, по ходу распространения нервного импульса,
и соединив его с соответствующим усилителем, мы зарегистрируем скачок
потенциала, связанный с распространением возбуждения по нерву. Форма
регистрируемой таким образом волны зависит от электродов, и надежные
результаты можно получить только в том случае, если конструкция и раз-
мещение электродов тщательно продуманы. Подробно обсуждать электро-
физиологические электронные приборы мы не будем, поскольку это сугубо
специальная область. Реакция, которую можно зарегистрировать в нерве,
состоящем из большого числа аксонов, имеет длительность около 1 мсек.
и содержит очень большой начальный компонент. После проведения более
тонких экспериментов на одиночном аксоне было установлено, что в этом
случае форма реакции гораздо проще, что она распространяется по волокну
диаметром 1 р, со скоростью 6 м/сек и что ее рефрактерный период равен
0,6 мсек, а амплитуда — 50 мв. Проведение возбуждения по нерву скорее
напоминает горение бикфордова шнура, чем прохождение электрического
тока. Последнее замечание адресовано специально физикам, которые, воз-
можно, впервые знакомятся с нервными процессами.

Электрические свойства аксона можно исследовать при помощи соот-
ветствующей радиоэлектронной аппаратуры. Емкость мембраны аксона
равна примерно 1 рф/см2. При составлении эквивалентной схемы, характе-
ризующей импеданс аксона, обычно принимают, что параллельно с емко-
стью включены омическое сопротивление и электродвижущая сила. В заме-
чательных опытах Кола и Кертиса показано, что изменение импеданса
тесно связано с потенциалом действия; эти данные подтверждают представ-
ление о том, что работа нерва связана с изменением ионной проницаемости
его мембран.

Функция аксона состоит в том, что он передает при помощи физиче-
ских, химических и электрических процессов импульс, который распро-
страняется в материале, специально подготовленном для этой цели пред-
шествовавшим обменом веществ. Процесс подобного типа может быть пред-
ставлен только схематически (фиг. 243). Аксон изображен на схеме в виде
трубки — поляризованной оболочки, заполненной аксоплазмой. При дей-
ствии на аксон соответствующего раздражителя (последний должен быть
достаточно сильным при кратковременном воздействии и может быть сла-
бее при более длительном воздействии) нерв как бы «воспламеняется»,
что выражается в обращении поляризации активной области. В областях,
остающихся позади той точки, через которую в данный момент проходит
импульс, происходит восстановление мембранного потенциала в резуль-
тате соответствующих процессов обмена веществ. Такая реакция по типу
«все или ничего» очень удобна для передачи двоичного кода (типа включено—
выключено, белое — черное).

Обращение поляризации мембраны четко коррелирует с содержанием
натрия и калия в аксоплазме. В невозбужденном нерве существует резкое
различие в распределении ионов калия и натрия. Концентрация ионов нат-
рия гораздо больше снаружи, ионов калия — внутри клетки. Процесс,
обеспечивающий такое распределение, называют «натриевым насосом»,
хотя он не только препятствует проникновению в клетку ионов натрия,
но также способствует проникновению в нее ионов калия. Механизм этого
процесса не ясен. Не вызывает сомнений лишь то, что он связан с метабо-
лической активностью, но осуществляется ли он за счет изменения заряда
в порах, за счет ассоциации ионов с большими молекулами или каким-
либо другим способом,— об этом
пока ничего сказать нельзя.
Протекание этого управляемого
обменом веществ процесса резко
изменяется, если через нервное
волокно пропустить электриче-
ский ток. Изменение наступает
внезапно при некоторой раз-
ности потенциалов, величина ко-
торой зависит от продолжитель-
ности возбуждения; эта крити
ческая разность потенциалов
тем меньше, чем больше продол-
жается возбуждение. Такое вне-
запное изменение обусловлено
обратимой деполяризацией, вы-
зывающей резкий скачок от обыч-
но отрицательного потенциала
к положительному; возвращение
в исходное состояние происходит
спустя 1—2 мсек. Этот «пиковый
потенциал», или «потенциал дей-
ствия», распространяется по
нерву со скоростью, зависящей
от типа аксона. В аксонах, по-
крытых миелиновыми оболоч-
ками с перехватами Ранвье,
скорость распространения выше.

Процесс распространения
потенциала действия связан с
совершенно иными свойствами

нерва — с так называемыми «кабельными» свойствами. Передача им-
пульса в обычных электрических линиях осуществляется при помощи
механизма, поддерживающего величину электрического поля в про-
воднике по пути движения импульса. Этот механизм обусловлен взаимо-
связью электрического поля, вызывающего ток, и магнитного поля, инду-
цированного током. Чем меньше сопротивление проводника, тем дальше
может быть передан импульс. В электрических линиях передачи сопротивле-
ние можно сделать очень малым и передачу по ним можно осуществлять
на очень большие расстояния. Нерв был бы кабелем очень плохого каче-
ства из-за очень высокого сопротивления. Однако мембраны нерва имеют
удельную емкость 1 \гф/см2, что открывает замечательную возможность
накопления электрической энергии в малом объеме. Рассмотрим очень про-
стую цепь, составленную из емкостей, параллельно присоединенных с одной
стороны к общей шине, а с другой — к длинному сопротивлению (см.
фиг. 243, Б). Если одна из емкостей заряжена, то ток от нее потечет к соседней
емкости и далее ко всем остальным. В данном случае нет механизма поддер-
жания потенциала по пути импульса, как в случае проводника, но тем не

Б

Фиг. 243. Схематическая модель процесса
нервного возбуждения.

Процесс начинается при некоторой минимальной
интенсивности раздражения. В течение небольшого
промежутка времени после начала процесса нерв
нечувствителен к новым раздражениям (рефрактер-
ный период). Затем ои снова приобретает способность
«загораться». С увеличением интенсивности раздра-
жения увеличивается частота импульсов, но ампли-
туда отдельного импульса не меняется. Таким обра-
зом, нерв хорошо приспособлен для передачи инфор-
мации посредством двоичного кода.
менее, если в этой цепи зарядить одну емкость, то через некоторое время
зарядятся и остальные. Напряжение в такой цепи падает очень быстро;
переходя на масштабы нерва, можно сказать, что оно резко упадет уже на
длине, измеряемой долями миллиметра, но при этом все же создаются необ-
ходимый пороговый потенциал и ток, способные «зажечь» неактивную
область. Ток действует также и на те участки, по которым импульс уже про-
шел, но в них еще не восстановлены условия для «зажигания», так как соот-
ветствующие процессы обмена веществ требуют некоторого конечного вре-
мени. Таким образом, потенциал действия распространяется по нерву только
в одну сторону. В случае аксонов с миелиновой оболочкой, разделенной на
отдельные сегменты перехватами Ранвье, каждый сегмент действует как
отдельная емкость, что обеспечивает более высокую эффективность и скорость
передачи.

Это все, что мы собирались сказать о свойствах нервов. Учитывая
ограниченность наших собственных познаний в этой области, нам хотелось
бы закончить этот раздел высказыванием А. Хилла, взятым из его статьи в
«Со1с1 8рпп^ НагЬог Зутрозшт», уо1. 1:

«Я не знаю, сколько чувствительных и двигательных нервных волокон
имеется в человеческом организме, но попытаемся прикинуть. Предполо-
жим, что все волокна весят 100 г, что их средняя длина 50 см и средний диа-
метр 14 ц. Это дает для числа волокон величину порядка миллиона. Я думаю,
что действительное число волокон даже больше. Представим себе бегуна
-на четырехсотметровой дистанции, напрягающего все свои силы до пре-
дела. Я думаю, мы можем принять, что через каждое волокно проходит
в среднем до 10 импульсов в секунду. Следовательно, по всем волокнам
проходит до десяти миллионов импульсов в секунду. Этот ураган согласо-
ванных импульсов бушует внутри нашего бегуна. Даже в состоянии покоя,
когда, по-видимому, число импульсов примерно в 20 раз меньше, остается
порядка полумиллиона импульсов в секунду. С помощью современной радио-
электронной аппаратуры каждый из этих импульсов может быть обнаружен
и записан или даже сделан слышимым. Все импульсы имеют один и тот же
общий характер. Каждый из них имеет смысл и предназначен для опреде-
ленной цели. Свойства газа также определяются поведением его молекул,
однако в этом случае поведение системы управляется статистическими зако-
нами. Поведение человека является результатом огромного числа нервных
импульсов, но в отличие от газа, где каждая молекула движется хаотиче-
ски, все импульсы строго согласованы и целесообразны».

Глаз

10.	Глаз как модель. Всякому, у кого имеется серьезное' желание
заняться рассмотрением искусственных конструкций, воспроизводящих функ-
ции живого организма, полезно поразмыслить над природой глаза. Глаз
как орган зрения и как оптическая система настолько поражает своим совер-
шенством, что заслуживает самого внимательного рассмотрения. Чувстви-
тельность глаза такова, что он может обнаруживать отдельные кванты
света. Замечательно, что глаз воспринимает воздействие как некую кар-
тину лишь в том случае, если на него падает достаточное количество кван-
тов, чтобы можно было считать, что они действительно образуют часть
некоторой картины. Глаз может работать в диапазонах интенсивностей света,
различающихся в 109 раз. Как оптическую систему глаз характеризует
поразительно широкое поле зрения (более 180°); кроме того, он обладает
способностью молниеносно изменять свое фокусное расстояние от несколь-
ких сантиметров до бесконечности. Наряду с широким полем зрения глаз
обладает узкой областью наиболее ясного видения для рассматривания тон-
ких деталей; все это объединено вместе и работает совершенно автомати-
чески. Таким образом, повторяем еще раз, глаз — это интереснейший объект
для размышлений.

Схематически глаз можно представить как линзу, фокусирующую
изображение на а сетчатку. Размеры глаза были определены с помощью

Фиг. 244 Поперечный разрез сетчатки (схема).

1 — палочки и колбочки; 2 — наружный ретикулярный слой;
3 — внутренний ядерный слой; 4 — свет; 5 — слой зрительных
волокон; 6 — внутренний ретикулярный слой; 7 — волокни-
стый слой; 8 — наружный ядерный слой; 9 — мембрана; 10 —
пигментный слой. Обратите внимание на. направление распро-
странения света.

узкого пучка рентгеновских лучей. Длина глазного яблока по оптической
оси у людей с нормальным зрением равна 22,9 мм. У близоруких эта длина
равна 24,9 мм, а у дальнозорких —21,3 мм.

С глазом связано множество проблем, представляющих интерес для
биофизика. Это и геометрическая оптика глаза, требующая достаточно
серьезного знания физики, и проблема остроты зрения, связанная с опре-
делением наименьшего разрешимого угла, и вопросы, связанные с восприя-
тием поляризованного света, и проблема предельной чувствительности
глаза и целый ряд других проблем. Мы начнем с краткого рассмотрения
гистологии сетчатки, или, точнее, элементов сетчатки, и затем изложим
квантовую природу зрения в том виде, как она истолковывается сейчас
молекулярной биофизикой.

11.	Сетчатка. На фиг. 244 схематически показан поперечный разрез
сетчатки. Мы предполагаем пользоваться этой схемой как своего рода кар-
той для первого ознакомления с неизвестным континентом. На следую-
щих двух фигурах более детально показаны отдельные элементы сетчатки —
палочки и колбочки, играющие основную роль в работе глаза, но сами непо-
средственно с нервной системой не связанные. Эта связь осуществляется через
промежуточную группу нервных волокон. Судя по гистологическим дан-
ным, колбочки и палочки, по-видимому, не имеют индивидуальных кана-
лов связи и один канал обслуживает целую группу колбочек или палочек.

Для большинства физиков, впервые знакомящихся со строением глаза,
вероятно, наиболее удивительным на фиг. 244 покажется направление света.
Пусть это послужит предостережением тем, кому кажется, что живые

Фиг. 245. Схема сетчатки, показы-
вающая относительное расположение
палочек и колбочек, а также сеть нер-
вов, клеток и волокон, образующих
сетчатку.

системы представляют собой лишь логи-
ческое развитие принципов, используе-
мых при конструировании физических

Фиг. 246. Схема строения па-
лочки (по данным Шестранда и
де Робертиса).

Палочка состоит из большого числа
пластинок, заключенных в мембрану
и соединенных с ресничкой. Послед-
няя в свою очередь связана с внут-
ренним сегментом палочки, содержа-
щим длинные тонкие митохондрии и
эндоплазматическую сеть. 1 — рес-
ничка палочки; 2 — пластинки;
3 — эндоплазматическая сеть; 4 —
поперечный разрез реснички.

приборов.

Палочек в сетчатке значительно больше, чем колбочек. Наиболее чув-
ствительной областью глаза является центральная ямка, где плотность чув-
ствительных элементов максимальна. В центре ямки плотное гь колбочек
составляет 10® на 1 мм2, уменьшаясь до 6 -103 на расстоянии 3 мм от центра.
Недалеко от края ямки начинает резко увеличиваться плотность палочек
(в центре ямки палочки отсутствуют), достигая величины 2-105 на 1 мм2,
после чего она по мере удаления от краев ямки постепенно уменьшается до
величины 3-104 на 1 мм2. Таким образом, в областях с наибольшей плот-
ностью на 10 р2 приходится примерно одна колбочка или палочка.

Более детально расположение элементов сетчатки показано на фиг. 245.
Этот рисунок показывает общий вид палочек и колбочек, хотя, как мы
увидим на фиг. 246, тонкая их структура значительно сложнее, чем можно
было ожидать сначала.

Одним из первых значительных успехов электронной микроскопии
тонких срезов было установление тонкой структуры палочек. Во многих
отношениях сходная структура была найдена и у колбочек. На фиг. 246,
заимствованной у Шестранда, который первым установил основные черты
строения палочек (с некоторыми дополнениями, согласно де Робертису)
показана микроструктура палочки, найденная с помощью электронного
микроскопа. Можно видеть, что каждая палочка состоит из двух частей,
причем рецепторная часть отделена от остальной части клетки. Связь между
ними осуществляется через ресничку, на поперечном сечении которой видны

девять пар канальцев; оно очень напоминает сечение реснички парамеции.
Рецепторная часть представляет собой стопку пластинок, заключенных
в мембрану. Пластинки кое-где соединены с ресничкой, а также друг с дру-
гом. Детальное строение этих пластинок показано на фиг. 247.

Внутренняя часть палочки представляет собой более или менее нор-
мальную клетку с большим числом длинных тонких митохондрий и элемен-
тами эндоплазматической сети. Пластинки рецепторной части содержат

липиды и белки в отношении два
к трем. Их молекулярная структу-
ра показана на фиг. 247. Шёстранд
полагает, что многослойное строе-
ние рецепторной части увеличивает
вероятность поглощения фотона; в
результате поглощения возбуж-
дается мембрана одного из эле-
ментов, и это возбуждение через
другие элементы передается вну-
тренней части палочки.

Согласно предположению Шё-
странда, липиды, расположенные,
как показано в ранних поляриза-
ционных исследованиях Шмидта,
параллельно оси палочки, образу-
ют двойные слои и лежат внутри
пластинок. Очень интересно, что

поляризационные исследования
Шмидта привели его еще в 1934 г.
к предположению о существовании

Двойной. яипийиый.
слой.

Мембрава

Фиг. 247. Молекулярная структура пла-
стинок палочки, предположенная Шёстран-

дом.
Поскольку их ширина может быть различной,
масштаб не указан.

пластинок и о различном расположении липидных и нелипидных компо-
нентов. Рисунки, приведенные в его статье, очень напоминают структуры,
которые были позже обнаружены с помощью электронной микроскопии.

Заслуживает внимания тот факт, что хлоропласты растений — системы,
в которых также происходит поглощение света,— обладают структурой,
подобной структуре палочек сетчатки. Сравнительные исследования Вол-
кена показали, что в хлоропластах Ещ?1епа, хотя их фоторецепторы больше
по размерам и толще, чем фоторецепторы палочек сетчатки лягушки, на
один фоторецептор приходится то же число молекул пигмента и молекуляр-
ный вес этих молекул того же порядка, что и у пигмента фоторецептора
лягушки.

12.	Квантовая природа зрения. С давних пор известно, что адаптиро
ванный к темноте глаз обладает чрезвычайно высокой чувствительностью.
Этим свойством глаза пользовались пионеры атомной и ядерной физики для
наблюдения отдельных радиоактивных частиц. Тщательно изучив чув
ствителыюсть глаза к сцинтилляциям, вызываемым а-частицами, Харитон
и Ли пришли к заключению, что при максимальной чувствительности глаз
может обнаруживать световые импульсы, состоящие из 17—30 фотонов.
Эти довольно низкие цифры говорят о том, что глаз должен обладать чув-
ствительными приемниками света, способными реагировать на очень неболь-

шое число квантов.
Очень тщательное и детальное исследование чувствительности глаза
провели Гехт, Шлеир и Пиренн в 1941 г. В своей работе они учитывали
расположение участка наиболее ясного видения на сетчатке. Специальное
устройство позволяло экспериментатору посылать одиночный импульс света
любой желаемой длины волны путем нажатия кнопки. Второй эксперимен-
татор мог изменять интенсивность импульсов, так что количество света
в каждом импульсе было всегда известно. Регистрируя число случаев, когда
световой импульс был виден, авторы измерили чувствительность глаза
и нашли, что минимальная обнаружимая глазом энергия, измеренная у рого-
вицы, равна 2,1-10'10 — 5,7 40*10 эрг, что соответствует 58—148 фотонам
света с длиной волны 5100 А. Чтобы оценить действительное количество
света, поглощенного палочками, нужно учесть потери при отражении от
роговицы (4%), поглощение на пути в глазе (50%) и пропускание сетчатки
(80%). С учетом этих данных мы получаем, что палочка реагирует на 5—
14 квантов.

Очень интересное подтверждение полученным цифрам и одновременно
четкое указание на квантовую природу зрения было получено при исследо-
вании зависимости частоты наблюдения импульса от его интенсивности.
Действительно, если такое малое количество, как 5 квантов, уже может
быть обнаружено, то можно воспользоваться тем обстоятельством, что им-
пульс, состоящий в среднем из 5 квантов, будет испытывать сильные флук-
туации. Эти флуктуации описываются формулой Пуассона, уже хорошо
известной читателю, и, следовательно, можно сравнить статистику, полу-
ченную при наблюдении столь малых импульсов, с ожидаемой.

Чтобы получить ожидаемое распределение флуктуаций, предположим,
что среднее число фотонов в импульсе равно а. Тогда вероятность того,
что на самом деле в импульсе будет п фотонов, равна Р (п), где

Теперь, если мы примем для п произвольное конкретное значение, можно
определить ряд значений величины Р (п), соответствующих различным а,
т. е. средним значениям числа фотонов в импульсе, которые задаются вто-
рым экспериментатором. Например, для среднего числа квантов, равного 10,
вероятность того, что на самом деле в импульсе будет всего 5 фотонов, равна
1,80. Такой импульс не будет воспринят наблюдателем, если порог для
его фоторецепторов равен 6 квантам. Импульсы с числом фотонов, мень-
шим 5, также не будут восприниматься, и соответственные вероятности необ-
ходимо просуммировать. Эта задача вполне проста, поскольку функция
Пуассона табулирована для большого интервала значений а и п, и поэтому
нетрудно получить ряд теоретических кривых, описывающих зависимость
вероятности восприятия импульса от среднего числа квантов в нем при
различных предположенных значениях квантовой чувствительности. Гехт,
Шеир и Пиренн получили ряд таких кривых, выражающих зависимость
теоретической вероятности восприятия импульса от логарифма среднего
числа квантов, падающих на роговицу (т. е. без учета поглощения и отраже-
ния). Результаты, полученные Гехтом в одном из экспериментов, приведены
в табл. 35, из которой видно, что совпадение с теорией оказалось очень
хорошим. Это очень убедительное независимое доказательство высокой
чувствительности глаза. По данным Шлеира, пороговая чувствительность
глаза равна 7 фотонам, а по данным Пиренна — 5 фотонам.

Экспериментальным определением порога чувствительности сечатки
занимались также и другие авторы. В частности, Бауман и ван-дер-Вельден
пришли к выводу, что порог чувствительности может быть равен двум
фотонам.

Таблица 85

Число квантов света, падающих на роговицу	Доля зарегистрированных импульсов, %	
	экспериментальные данные	теоретические значения для п=6
46,9	0,0	0,05
73,1	9,4	10,0
113,8	33,3	33,3
177,4	73,5	76,0
276.1	100,0	96,0
421,7	100,0	100,0

Знакомясь с гистологией сетчатки, мы видели, что ни одна палочка
не связана непосредственно со зрительным нервом и что эта связь осуще-
ствляется через сеть промежуточных нервных клеток. Это дает нам, по-
видимому, основания считать, что для возбуждения одной палочки доста-
точно одного фотона.

13.	Биохимические процессы, лежащие в основе чувствительности сет-
чатки к свету. Чувствительность сетчатки к свету связана со светочувстви-
тельными пигментами. Один из них — родопсин, содержащийся в палоч-
ках,— представляет собой белок, молекула которого имеет диаметр порядка
40 Л, и, следовательно, может легко вписаться в мозаику, образуемую пла-
стинчатыми структурами палочек (см. фиг. 247). Компонентом родопсина
является каротиноид ретинен, формула которого изображена на фиг. 248

СН3 СН3 СН3

I Н I н | н
с с с с с с

НС



с с сн с с о

I I Н
НС с—сн3

н н

Фиг. 248. Одна из структур ретинена.

Отметить большое число конъюгированных двойных связей.

Под действием света ретинен отщепляется от родопсина. Образующийся
остаток называется опсином. Ретинен затем восстанавливается до витами-
на А с участием алкогольдегидрогеназы и зимазы. Обратный процесс не тре-
бует света и может протекать в полной темноте. В результате этого процесса
способность сетчатки реагировать на свет восстанавливается.

Основными сведениями по биохимии сетчатки мы обязаны Уолду.
Ему принадлежит предположение (в качестве одного из возможных вариан-
тов), что в отсутствие света активность зрительного пигмента, который пред-
ставляет собой фермент, подавлена ретиненом. Действие света «откупори-
вает» фермент, удаляя ингибитор, после чего освобожденный фермент может
произвести соответствующие химические изменения и вызвать появление
26 Заказ № 1168
сигнала в цепи промежуточных нервных клеток, расположенных вблизи
палочек или колбочек.

Приняв это предположение, мы можем понять, почему пороговая интен-
сивность раздражения сетчатки должна составлять более одного фотона.
Действительно, если бы уже одна белковая молекула, освобожденная от
ингибитора светом, могла индуцировать процесс нервного возбуждения,
при котором в нервных волокнах возникнет целая серия импульсов, то
нужно было бы учесть возможность случайного термического освобождения
белковой молекулы от ингибитора. Вероятность такого процесса можно рас-
считать. Если энергия связи белковой молекулы с ингибитором равна 1,5 эв,
а средняя энергия теплового движения 1/30 эв, то эта вероятность будет
равна е-45, или 10"19. В сетчатке имеется 108 палочек, в каждой из которых
по 1000 слоев, содержащих приблизительно 1000 молекул родопсина каж-
дый. Таким образом, в сетчатке около 1014 чувствительных единиц. Следо-
вательно, вероятность того, что за счет чисто случайных процессов тепло-
вого движения произойдет возбуждение одной из палочек сетчатки, равна-
примерно 1014-10-19, т. е. 10-5. .Так как глаз, очевидно, может реагировать
на процессы, происходящие за 0,001 сек, а может быть, даже и за более корот-
кое время, то он посылал бы в нервные центры бессмысленные сигналы при-
близительно каждую секунду и поддерживал бы мозг в состоянии постоян-
ного ненужного напряжения.

Благодаря такой воспринимающей системе, при которой сигнал посы-
лается в мозг только в том случае, если одновременно осуществляется не
менее двух возбуждений, глаз избавляет мозг от ложных сигналов. Здесь
осуществляется тот же принцип, что и при регистрации ионизирующих
частиц в ядерной физике, где критерием, позволяющим отличить импульсы
сцинтилляционных счетчиков, соответствующие попаданию частицы, от
случайных импульсов, также служит совпадение во времени импульсов
от двух счетчиков. Таким образом, глаз не только обладает предельной чув-
ствительностью, но и снабжен средствами для наиболее эффективного ее
использования.

Этот очень кратк.-й бзор работы глаза рассчитан лишь на то, чтобы
пробудить хотя бы у части читателей интерес к биофизике зрения. Ни один
физиологический орган не поражает физика совершенством своего строения
так сильно, как глаз. Глаз и его работа заслуживают глубокого изучения
при помощи самых разнообразных научных методов.

Заключение

Заканчивая эту главу, мы вернемся к замечаниям, сделанным нами
в самом начале. Мы выбрали для обсуждения в этой главе мышцы, нервы
и глаз, потому что они связаны с хорошо знакомыми нам физиологическими
функциями. Нам хотелось показать, какие возможности открывает био-
физика для объяснения работы такого рода физиологических систем. При
рассмотрении мышечных процессов мы показали, что сокращение мышцы
можно связать с изменениями на молекулярном уровне и попытаться объяс-
нить энергетику мышцы с точки зрения молекулярных процессов передачи
энергии. В вопросе о нервных процессах наши знания более поверхностны,
однако и здесь тот факт, что толщина мембраны очень мала и ее свойства,
несомненно, определяются процессами на молекулярном уровне, допускает
подход с позиций молекулярной биофизики. И, наконец, глаз с его почти
кристаллической структурой рецепторных участков палочек и предельной
• квантовой чувствительностью также безусловно является объектом, работу
которого можно объяснить только на молекулярном уровне. Полное объясне-
ние работы этих трех органов требует дальнейшего развития молекулярной
биофизики, причем именно молекулярной биофизики, а не физиологии.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Н и х 1 е у Н. Е., «Мизсгйаг Соп!гасНоп», Епйеауоиг, 15, 177 (1956).

2.	Р е г г у 8. V., «Ре1а1гоп Ве1и’ееп СЬетгса1 апй Соп1гас!г1е РипсНоп апс! 81гис-
1иге о! !Ье 8ке1е1а1 Ми8с1е Се11». РЬу8го1. Веу., 36, 1 (1956).

3.	8 2 е п 1-0 у о г § у 1 А., СЬетг81гу о! Ми8си1аг СопТгасНоп, Асайетгс Ргезз,
Иеху Уогк, 1951.

4.	В о и г п е О. Н., ей., 8!гисйгге апй РипсНоп о! Мизс1е, Асайетгс Ргезз, Иеху
Уогк, 1960.

5.	М о г а 1 е з М., В о 1 1 з Л., «А Мойе1 !ог Нге Е1етеп1:агу Ргосезз гп Мизс1е Ас11-
оп», АгсЬ. ВгосЬет. ВгорЬуз., 37, 283 (1952).

6.	Н г 1 1 А. V., Ргос. Роу. 8ос., В126, 136 (1938).

7.	Н г 1 1 А. V., е! а!., Ргос. Роу. 8ос., В137, 40—87 (1950).

8.	Н о <1 § е А. Л., «8!ийгез оп Нге 8!гис!иге о! Мизс1е», Л. ВгосЬет. ВгорЬуз. Су1о1.,
1, 361 (1955).

9.	Р г г с к е Н., Со1й 8рггп{? НагЬог 8утро81а, 1, 117 (1933).

10.	В а у з о п Н., В а п 1 е 1 1 1 Л. Р., ТЬе РегтеаЫШу о! Набига! МетЬгапез,
СатЬггй^е Ипгуегзйу Ргезз, 1952.

11.	В и 1 I ег Л. А. V., Е1ес!ггса1 РЬепотепа а! 1п(ег1асез, МеНшеп, Ьопйоп, 1951.
8ее, рагНси1аг1у, аг!гс1ез Ьу XV. Е. Р1оуй, Н11ей «МетЬгапе Ро!епНа1з апй
Е1ес1ггса1 РгорегНез о! Ьгугп§ Се11з» апй «Е1ес1пса1 РгорегНез о! Иегуе апс!
Мизс1е».

12.	В а V з о п Н., А Тех1Ьоок о! Сенега! РЬузго1о§у, ЬШ1е, Вгохуп апй Со., Воз!оп
1959.

13.	Т е о г е 1 1 Т., «Тгапзрог! Ргосеззез апс! Е1ес1ггса1 РЬепотепа гтг 1ошс МетЬгапез,
Рго§. ВгорЬуз., 3, 305 (1953).

14.	Р г г е п п е М. Н., «СиапЛшп РЬузгсз о! Угзгоп». Рго§. ВгорЬуз., 2, 193 (1952).

15.	8 I е г п т а п п Е., 8)оз!г ап й Р. 8., «ЫИга 81гис!иге о! СЫогор1аз<:8»,
Ехр. Се11. Вез., 8, 17 (1955).

16.	Йе В о Ь е г 1: г з Р., «Е1ес1гоп Мгсгозсоре ОЬзегуаНоп оп !Ье 8иЬтгсгозсоргс
Ог^апггаНоп о! 1Ье ВеНпа1 Войз»., Л. ВгосЬет. ВгорЬуз. Су1о1., 2, 319 (1956).

17.	Со 1 е К. 8., «ТЬе Е1ес1ггс 81гис!иге апй РипсНоп о! Се11з», Ргосеейгп^з о! !Ье
Ргг81 ИаНопа! ВюрЬубгсз СопЛегепсе, Уа1е ИпгуегзНу Рге88, 1959, р. 332.

18.	8 о 1 о т о п А. К., «Еднгуа1еп! Роге Вгзси88гоп8 гп Се11и1аг МетЬгапез», Ргосе-
ейгпяз о! !Ье Рггз! ИаНопа1 ВгорЬузгсз Соп!егепсе, Уа1е ОпгуегзНу Рге^з, 1959,
р. 314.

19.	Аг!гс1ез Ьу 8 с Ь т г 1 1 Р. О., Н о й § е А. Л., Мо г а 1 е з М. Р., -В е п п е ! 1! Н. 8.,
Н п х 1 е у А. Р., К а I г В., С о п п е 1 1 у С. М., гп «ВгорЬузгса! 8сгепсе;
А 8!ийу Рго^гат», Кеу. Мой. РЬуз., 31, Ио8. 1 апй 2, 1959.

г
Глава XV

ФИЗИКА КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ

1.	Введение. В этой главе мы попытаемся произвести некоторый синтез
наших знаний о составных частях клетки и о физических принципах их рабо-
ты. Мы хотим на время выйти из привычных нам масштабов, почувствовать
себя в невидимом субмикроскопическом мире клетки и посмотреть, как
он выглядит. Мы никогда не видим этот мир таким, каков он есть. Многие
из наших наблюдений — это, по-видимому, не что иное, как артефакты,
поскольку даже те картины, которые дает нам электронный микроскоп,
не лучше египетских мумий, сохраненных «фиксацией» для сотен поколений,
позволяют нам судить об истинном положении вещей. Все же мы хотим
попытаться построить, пользуясь всей суммой наших знаний в области био-
логии, физики и химии, картину процессов в клетке и затем посмотрим,
насколько поведение такой модели будет напоминать поведение живой
клетки. То, чем мы хотим заняться, можно назвать попыткой подхода к тео-
ретической биологии. Мы должны напомнить, что такого рода попытки
стоят затраченного на них времени и что все наши знания в области атомной
физики и химии, начиная с первых измерений весов и объемов, сделанных
Лавуазье и Авогадро, являются теоретическими. И если когда-нибудь
мы сможем понять, что действительно происходит в клетке, то только бла-
годаря теории — теории, направляющей эксперимент и проверяемой коли-
чественными наблюдениями.

К сожалению, теоретическую биологию едва ли можно назвать наукой,
и, конечно, в настоящее время не существует авторитетных руководств
по этому вопросу. Нам приходится сделать попытку дать начальный толчок
развитию этого направления.

Основные клеточные процессы, которые следует рассмотреть,— это
рост, репликация., деление и дифференцировка. Мы начнем с процесса роста.

2.	Рост. Придерживаясь принципов количественного описания, рас-
смотрим некоторые данные о скоростях роста. Бактерия ЕзскеНМа соИ
при оптимальных условиях делится один раз в 20 мин, т. е., округляя,
один раз в 1000 сек.. За это время она синтезирует свою массу, равную
2,5-10“13 г, удваивает свою длину, равную 2-1074 см, и удваивает площадь
своей наружной поверхности, равную 10 7 см2. Поскольку на белок прихо-
дится около 60% сухого веса клетки, это Означает, что за 1000 сек синте-
зируется около 1,5-10“13 г белка. Если принять, что молекулярный вес белка
равен 100 000, тогда вес одной молекулы будет составлять 1,6-10“18 г, т. е.
клетка способна синтезировать (округленно) 1000 молекул белка за 1 сек.
Известно, что в каждой белковой молекуле содержится около 1000 амино-
кислот, размещенных в строгом порядке. Все это означает, что клетка
обладает весьма эффективным механизмом синтеза. К природе процессов,
связанных с этим механизмом, мы йернемея в разд. 3, а сейчас обратимся

к процессу роста.

Рост живой клетки — это явление, существенно отличное от роста кри-
сталла или расширения пузырька газа. Хотя факторы, управляющие этими

двумя процессами, по-видимому, встречаются и в процессах клеточного

роста, однако здесь они подчинены высокоспецифичным законам, харак-
терным лишь для живой материи. Для пояснения этого соображения рас-

смотрим процесс роста клеточной
мембраны. Насколько нам извест-
но, мембрана растет лишь в одной
плоскости. Следовательно, мате-
риал для роста должен подаваться
в мембрану таким образом, чтобы
толщина сохранялась постоянной
во всех точках поверхности. Этот
материал должен иметь иной ма-
кромолекулярный состав, чем на-
ружная или внутренняя части
клетки—это специфический мате-
риал мембраны. К тому же, в про-
цессе роста мембрана сохраняет
определенную геометрическую фор-
му, не идеально точно, разумеется,
но тем не менее палочковидная
бактерия сохраняет свою форму
на протяжении всего периода ро-
ста. Напрашивается очень инте-
ресный вопрос: как же растет такая
мембрана?

Не давая пока ответа на этот во-

200/

Горчила (РИК,
йалол и липид)

•Мелкие
молекулы

Сгси белковых

Аюлекул

Фиг. 249. Гипотетическая схема строе-
ния наименьшей единицы эндоплазмати-
ческой сети, как она могла бы выглядеть
под электронным микроскопом (/) и ее
предполагаемое строение на молекуляр-
ном уровне (5).

Гранула изображена в виде цилиндрической
рибонуклеопротеидной частицы (по-видимому, в ее
состав входят также липиды), способной син-
тезировать белковые молекулы (изображены
в виде маленьких гантелей) из аминокислот,
находящихся внутри и вне мембраны. Как только
белковая молекула образовалась, она тотчас
включается в своего рода двухмерный кристалл,
которым является сама мембрана. На фигуре
структура показана в сеченни; следует пред-
ставлять себе, что на самом деле образуется
замкнутая поверхность, а не петля.

прос, мы попытаемся представить,

пользуясь развиваемыми дальше идеями (которые в свою очередь требуют
серьезной экспериментальной проверки), как происходит рост мембраны.
Напомним сначала некоторые сведения о структуре клетки, изложенные
в гл. II; в частности, вспомним о двойных мембранах, являющихся частью
эндоплазматической сети. Одно из свойств этих двойных мембран (которое,
впрочем, еще должно быть окончательно доказано) — это их замкнутость.
Мы можем сделать предположение, что эти замкнутые двойные мембраны
представляют собой тип биологических элементарных единиц, способных

к росту.

На фиг. 249 показана одна из наших умозрительных схем элементарной
единицы эндоплазматической сети. Такая элементарная единица представ-
ляет собой двойную замкнутую поверхность с прикрепленной к ней «гра-
нулой». Такие гранулы довольно часто видны в эндоплазматической сети,
и мы сознательно выбрали для рассмотрения эту простейшую единицу.
На электронных микрофотографиях она выглядит так, как показано
на фиг. 249, А. Гипотетическая схема ее строения представлена
на фиг. 249, Б.

По-видимому, центром процессов синтеза является «гранула», состоя-
щая, вероятно, из РНК и белка. Она представляет собой составную часть
единого непрерывного слоя белка, хотя не обязательно связана с ним кова-
лентными связями. Эта гранула как бы «сшивает» аминокислоты, объединяя
их в определенном порядке в белковые молекулы, изображенные в виде
маленьких гантелей на фиг. 249, Б. Как только синтез молекулы белка
закончен, она, естественно, занимает свое место в мембране, чем обусловли-
вается рост последней. В мембране белковые молекулы удерживаются лишь
за счет сил типа ван-дер-ваальсовых, т. е. они соединены в достаточной сте-
пени лабильно. При разрастании такая мембрана может стать рыхлой.
Тогда, если за счет других синтетических процессов образуется избыточное
число гранул, они могут включаться в рыхлую мембрану, так что число
гранул на единицу поверхности мембраны увеличится. Благодаря этому
процессу отдельные элементы частиц эндоплазматической сети могут расти
до значительных размеров.

Предложенная схема роста мембраны — это лишь один из возможных
механизмов; однако это также и один из наиболее правдоподобных механиз-
мов. Полезно рассмотреть физические процессы, лежащие в основе приве-
денной модели. При рассмотрении вопроса мы убедимся, что такие же физи-
ческие процессы придется рассмотреть при анализе почти любой модели
роста. Поэтому гипотетический характер нашей схемы не обесценивает
результатов ее физического анализа.

Рассмотрим сначала силы взаимодействия между белковыми молеку-
лами, образующими эндоплазматическую сеть. Каждая молекула окружена
со всех четырех сторон такими же молекулами и испытывает с их стороны
притяжение. Можно считать, что эти силы не должны быть очень специфич-
ными. По-видимому, молекулы мембраны связаны не чрезмерно плотно;
в противном случае слишком малое расстояние между ними устраняло бы
возможность- диффузии аминокислот и воды, необходимых для синтеза
белка. Силами, подходящими для осуществления такой связи, являются
лондоновские дисперсионные силы, относящиеся к тому же типу сил, что
и ван-дер-ваальсовы силы (см. гл. VI). Детальное изучение природы этих
сил провели Вервей и Овербек. Расчет показывает, что для простых молекул
потенциальная энергия взаимодействия обратно пропорциональна шестой
степени расстояния. В случае макромолекул эти, казалось бы, ничтожные
силы приобретают большое значение, поскольку, пока нет необходимости
использовать запаздывающие электрические потенциалы, силы между всеми
парами атомов складываются аддитивно. Таким образом, если и о2 —
объемы двух частиц, содержащих д атомов на единицу объема, то их потен-
циальная энергия будет равна

у_____С (1у1 с!у2

«2 «1

где г — расстояние между двумя элементами объема, а X — константа
Лондона для дисперсионных сил.

Силы притяжения, действующие между сферами и параллельными пла-
стинками, рассчитал Хэмекер и детально рассмотрели Вервей и Овербек.
Как мы уже упоминали в гл. VI, серию очень интересных расчетов недавно
провела М. Волд. Она рассмотрела значения потенциальной энергии, полу-
чаемые из приведенной выше формулы, для различных типов палочек
и пластинок. На фиг. 250 приведены результаты сравнения величин потен-
циальной энергии для различно ориентированных по отношению друг
к другу палочек, имеющих длину I, ширину щ и толщину I. Видно, что энер-
гия притяжения всегда больше при таком расположении, когда большая
часть расстояний между частицами максимально приближается к среднему.
В случае длинных параллельно расположенных палочек энергия притяже-
ния равна примерно 3 кТ при расстоянии между поверхностями палочек,
равном 0,1 их диаметров. Если мы имеем дело с параллельно ориентиро-
ванными белковыми молекулами с диаметром около 40 А, то дисперсионные
силы будут удерживать их достаточно прочно при расстояниях между
молекулами 4 А. Такое расстояние вполне достаточно для того, чтобы амино-
кислоты и молекулы воды могли легко проникать через мембрану. При любом

другом взаимном расположении молекул энергии дисперсионного взаимо-

действия было бы недостаточ-
но для удержания молекул
вблизи друг друга.

Таким образом, уже пред-
варительный анализ процесса
роста привел нас к представ-
лению, что физические силы,
которые могли бы обеспечить
образование и рост стабиль-
ной мембраны, при условии
осуществления синтеза белка,
действительно существуют.
Прежде чем мы перейдем к
другому предмету, укажем
еще на некоторые следствия,
вытекающие из участия ука-
занных физических сил в
процессах роста.

Можно предположить, во-
первых, что молекулы белка

Ф и г. 250. Относительные значения энергий
притяжения для различных ориентаций палоч-
ковидных частиц (по расчетам М. Волд)

Можно видеть, что параллельное’расположение всегда
выгоднее.

не должны быть разделены-

Если мы рассматриваем простые силы типа сил Лондона — Хэмекера,

то притяжение будет наибольшим в том случае, когда две молекулы
находятся в непосредственном контакте. При таком сближении молекул

непонятно, как может аминокислота, скажем триптофан, проникнуть
через мембрану. По-видимому, это и не может произойти, и мы тогда должны
сделать вывод, что синтез белка происходит на внешней стороне двойной
мембраны эндоплазматической сети. Это маловероятно. Следовательно,
мы должны заняться поисками таких сил, которые вызывали бы отталкива-
ние молекул белка таким образом, чтобы потенциальная энергия была
минимальной при отличном от нуля расстоянии между молекулами. Такими
силами могут быть, например, силы Дебая — Гюккеля, которые вызываются

взаимодействием зарядов белковых молекул и противоионов в окружающей
среде, как это описано в гл. VI. Если такие силы существуют, в чем нет
оснований сомневаться, то вызываемое ими отталкивание будет наклады-
ваться на притяжение, обусловленное дисперсионными силами. Используя

эти представления, можно получить для расстояния между молекулами
белка достаточно большую величину и объяснить, почему молекулы воды
и метаболитов могут проникать через мембрану.

Из всего сказанного ясно, что при изменении концентрации соли
в клетке мембрана открывает и закрывает свои молекулярные поры, тем
самым вызывая значительные изменения концентрации различных молекул
внутри двуслойных мембран эндоплазматической сети. Такого рода процесс
играет, по-видимому, важную роль в жизни клетки; известно, что изменение
солевой концентрации может серьезно изменять конфигурацию таких
полиионных структур, как полинуклеотиды или рибосомы. Если изменения
свойств мембраны при различной солевой концентрации связаны с измене-
нием оптимальных расстояний (соответствующих минимуму потенциальной
энергии) между белковыми молекулами мембраны, то это должно быть под-
тверждено следующим эффектом: ионы с двойным зарядом должны быть
в четыре раза (или более) эффективнее, чем ионы с одиночным зарядом.

Поверхностное натяжение клеточной мембраны также заслуживает
рассмотрения. Используя величины поверхностного натяжения клеток,
определенные Гарвеем и другими, мы, вероятно, можем получить некоторые
указания на характер связи белковых молекул в мембране. Эксперимен-
тальное значение величины поверхностной энергии клетки равно 5 эрг/см2.
Если принять, что радиус белковой молекулы равен 25 А, то в 1 см2 содер-
жится ‘5-1012 молекул; следовательно, доля энергии, приходящейся на одну
молекулу, равна 1,25-10“12эрг. Так как при 300° К (27° С) кТ равно 4,5х
X 10"14 эрг, для энергии связи двух молекул получаем величину, равную
30 кТ. Следует сказать, что величина 5 эрг/см2 получена в экспериментах
на амебе, оболочку которой нельзя считать монослоем; поэтому на самом деле
несоответствие полученной нами цифры с расчетом Волд гораздо меньше,
чем кажется.

Второй существенной чертой рассматриваемого нами процесса роста
белкового слоя является синтез белка. Нам кажется разумным выделить
рассмотрение синтеза белка в отдельный раздел и провести рассмотрение
с возможно большей тщательностью, с тем чтобы убедиться, что в нашей
схеме роста нет глубоких противоречий.

3.	Синтез белка. Открытие существования адаптивного или, точнее,
индуцированного синтеза ферментов, а также использование меченых ами-
нокислот для изучения включения аминокислот в белки, сильно отразилось
на современных идеях, касающихся процессов синтеза белка. Как указы-
валось в гл. XIII, Спигелман и Моно обнаружили, что адаптивный фермент
заново синтезируется из отдельных аминокислот, а не образуется из како-
го-то ранее существовавшего белка. Работы Робертса, Коуви, Бриттона
и Болтона показали, что пептиды, которые могли бы быть промежуточными
продуктами при синтезе белка, присутствуют, по-видимому, в ничтожно
малой концентрации. В течение последнего десятилетия постепенно накап-
ливались факты, говорящие о том, что одним из мест синтеза белка являются
рибосомы. Обзор ранних работ, приводящих к этому важному заключению,
был сделан Лофтфилдом. Из работ последнего времени можно указать иссле-
дования, проведенные на ретикулоцитах кролика Динтцисом, Борсук
и Виноградом [8], а также исследования Мгк-Квилен, Робертса и Бриттена
[9] на Е. соИ. По-видимому, рибосомы представляют собой нуклеопротеид-
ные матрицы, на которых осуществляется сборка молекулы белка из отдель-
ных аминокислот. Одна из моделей механизма этого процесса принадлежит
Замечнику, Хогленду и их сотрудникам:

Фермент-{-АК-|- АТФ Фепмент (АМФ—АК.)~ГПФ	(а)

8-РНК—АК4-Фермент-]-АМФ (б)

4

АК в белке	(в)

В схеме, приведенной выше, (а)—стадия активации аминокислоты, (б)—
соединение ее с РНК, (в) — перенос аминокислоты на рибосому. Каждая
аминокислота сначала активируется, соединяясь с АТФ в присутствии фер-
мента; в активированной форме она соединяется с 5-РНК, или растворимой
РНК (ее молекулярный ьес сравнительно невысок — 25 000), называемой
также РНК-переносчиком. Каждой аминокислоте соответствует специфиче-
ская 8-РНК, а место прикрепления к рибонуклеопротеидной матрице опре-
деляется специфическими парами оснований матричной РНК рибосомы,
и 8-РНК — АК [11]. Таким образом, аминокислота доставляется на матрицу
при помощи весьма специфического переносчика и присоединяется к другим
аминокислотам недостроенной цепочки белка, удерживаемая 8-РНК во вре-
мя этого процесса. 8-РНК, таким образом, действует как «адаптер» между
матрицей и аминокислотой.

Эта модель синтеза белка принята не всеми, но нам она удобна тем,
что позволяет провести физический анализ процесса. Тот факт, что в рас-
сматриваемой модели процесс синтеза складывается из нескольких стадий,
позволяет считать этот процесс в целом сравнительно медленным. Как мы
увидим, скорости молекулярных процессов при ближайшем рассмотрении
достаточно высоки, так что процесс может протекать по изложенной схеме

4.	Случайные столкновения и специфический отбор. Нам неизвестно,
как работают живые системы. Согласно широко распространенному пред-
ставлению живые системы представляют собой специализированные органи-
ческие химические системы, причем, разумеется, понятие «органические»
употребляют в его современном смысле, весьма отличном от того, котовый
ему придавали до проведения Еелером синтеза мочевины. Эти химические-
системы работают в соответствии с законами физики и химии и то, что мы
называем их живыми, связано с особенностями их природы, а не с тем, что
они функционируют согласно каким-то совершенно неведомым принципам.
Можно задать вопрос, сохранится ли это представление по мере развития
наших знаний о живых системах? Процессы синтеза дают нам возможность
испытать, насколько физические понятия подходят для объяснения свойств
живых систем. Физические процессы, связанные со специфическим синтезом,
двойственны по характеру; с одной стороны, по-видимому, молекулы, пред-
ставляющие собой части будущей макромолекулы, двигаются совершенно
беспорядочно, испытывая большое число столкновений с молекулами раз-
личных типов и с поверхностями клеточных органелл; с другой стороны,
все эти хаотические столкновения дают в конечном счете соединения с чрез-
вычайно специфическим строением. Следовательно, из огромного числа столк-
новений механизмы, работающие в клетке, отбирают лишь те, которые
нужны, и отвергают ненужные.

Этот двойственный процесс, который можно назвать процессом случай-
ных столкновений и специфического отбора, может действовать быстро
и точно при синтезе белка. Если мы проведем количественный расчет, то смо-
жем убедиться в этом сами. Схема Хогленда, дополненная представлением,
что синтез идет на рибосомах, очень удобна для проведения такого расчета.
Схематически рассматриваемую картину синтеза можно записать следую-
щим образом:

АК —> АК —> 8-РНК — АК —> Матрица Белок,
^Фермент7^

где звездочкой отмечена активированная аминокислота. Мы можем рас-
смотреть механизм этого процесса в двух аспектах: с точки зрения коли-
чества необходимого для синтеза материала в районе рибосомы и с точки
зрения возможной скорости синтеза.

5.	Содержание веществ в районе рибосомы. В клетке Е. соИ насчиты-
вается около 104 рибосом. Суммарный объем, приходящийся на рибосомы,,
вели исключить объем ядра, равен в среднем 10“12 слг3. Таким образом, объем
здной рибосомы составляет 10~16 см3. Табл. 36 дает представление о том,.
что находится в этом объеме. Прежде чем обратиться к ней, мы дадим ряд
дополнительных пояснений. Во-первых, хотя аминокислоты и содержатся
в довольно высокой концентрации, их суммарная масса весьма невелика;
поэтому они не упомянуты в таблице. Во-вторых, предложенное нами число
молекул 8-РНК—АК (80) будет обосновано соображениями, развитыми
далее; однако и без них его следует признать вполне разумным, поскольку
для обеспечения различных комбинаций аминокислот в синтезируемой цепи
за счет случайных столкновений необходим избыток 8-РНК—АК- Мы пред-
положили четырехкратный избыток (принимая, что существует 20 амино-
кислот). В-третьих, мы предполагаем, что приблизительно 20 готовых моле-
кул белка будут оставаться вблизи рибосомы, прежде чем клетка найдет
им применение в процессах роста. Нравятся или нет читателю наши послед-
ние два предположения, ясно одно: несмотря на то что в районе рибосомы
находится очень много различных соединений, концентрация их здесь
не выше, чем в среднем по клетке. Следовательно, мы не сделали никаких явно
абсурдных предположений о рассматриваемом процессе. Если мы переусерд-
ствуем и добавим по три активирующих фермента на каждую аминокислоту,
или три дополнительных стадии ферментативного синтеза, то перед нами
возникнет проблема нехватки места. При принятых допущениях этого
затруднения не возникает.

Таблица 36

Концентрация различных компонентов в районе рибосомы

Компонент	Количество	Объем, см	Относительный объем, %
Рибосомы 			1	4,2-10-18	4,2
Ферменты, активирующие аминокис-			
ЛОТЫ 				20	2,4-10-18	2,4
5-РНК — АК 		80	2,4-10-18	2,4
Другие ферменты 		20	2,4-10-18	2,4
Белковые молекулы		20	2,4-10-18	2,4
			13,8

6.	Случайные столкновения и скорости стадий синтеза. Анализ скоро-
стей четырехступенчатого последовательного процесса, в котором участвуют
20 различных аминокислот, очевидно, сложен и труден. Синтез белковой
молекулы происходит с удивительно высокой скоростью. В разд. 2 мы рас-
считали, что бактериальная клетка производит около 1000 молекул белка
в 1 сек. Это означает, что 1 рибосома за 10 сек синтезирует 1 молекулу белка.
По самым скромным подсчетам при такой скорости синтеза 1 рибосома спо-
собна произвести сборку около 100 аминокислот за 1 сек. Эта скорость
огромна. Поэтому следует рассмотреть, при каких условиях наши предпо-
лагаемые процессы будут протекать со скоростями, достаточными для
объяснения наблюдаемых скоростей синтеза. Проведение такого рассмотре-
ния поможет нам проверить правдоподобие нашей схемы и выяснить некото-
рые условия, которые должны существовать в работающей клетке.

Рассмотрим сначала две прямые стадии: активацию аминокислот
и последующее образование комплекса 8-РНК—АК. Поскольку мы не рас-
полагаем данными по кинетике этих процессов, мы можем произвести неко-
торые приблизительные оценки, основываясь на данных Стротера и Аккер-
мана [19] по действию каталазы на перекись водорода. Стротер и Аккерман
изучали молекулярную природу этой реакции, исследуя влияние очень
важного параметра — вязкости среды. Оказалось, что при малых вязкостях
рассматриваемая реакция не лимитируется диффузией; однако высокая
вязкость может стать важным лимитирующим фактором. Их выводы хорошо
согласуются с представлением, что реакция происходит в результате доста-
точно точных столкновений. Размер мишени очень невелик — ее радиус
равен приблизительно 0,6 А,— но тот факт, что диффузия может служить
лимитирующим фактором реакции, причем наблюдается соответствие с тео-
рией соударений, обосновывает наш подход к вопросу. Примем разумное
значение для размера мишени (позаботившись преувеличить его, а не пре-
уменьшить) и посмотрим, какие выводы мы сможем сделать из рассмотрения
крайних случаев.

Перед тем как приступить к этой задаче, нам необходимо познакомиться
с вариантом теории соударений, который будет использован в этом иссле-
довании. В теории реакций, протекающих в коллоидных растворах, разви-
той Смолуховским, а также Коллинзом и Кимбаллом [13], проблема расчета
скорости реакции несколько усложняется из-за расходования реагентов
в ходе реакции. Однако в случае клетки расходуемые аминокислоты попол-
няются за счет процессов обмена веществ; поэтому сохраняется приблизи-
тельно стационарное состояние, что существенно упрощает задачу. Таким
образом, мы можем рассмотреть трехмерное броуновское движение. Для
того чтобы рассчитать число соударений в единицу времени, необходимо
определить критический объем, в котором должны происходить соударения,
использовать выражение для вероятности таких соударений и проинтегри-
ровать это выражение по всем возможным расстояниям. Если мы попробуем
это проделать, то сразу же выявится важная роль очень малых расстояний
и станет ясно, что определение наименьшего расстояния связано с большой
степенью произвола. Выход из положения указал Смолуховский, заметив,
что выражение для вероятности соударений по форме совпадает с уравне-
нием диффузии

дс__р. X д2с . д2с [ д2с \

~дГ~и < сК2'1 'ду2 ' ~дг2 ) ’

где с — концентрация, И — коэффициент диффузии, а граничные условия
определяются рассматриваемым процессом. Если предположить, что соуда-
рение происходит в области с радиусом А и что при соударении метаболиты
тотчас же удаляются, то концентрация метаболитов в области с радиусом 7?
будет равна нулю. Значение этой концентрации при бесконечном расстоянии
между частицами можно принять равным с0. При этих условиях очень про-
сто показать [14], что число соударений в единицу времени <р описывает-
ся выражением

ф —4лПАс0.	(15-1)

Полученный результат применим к случаю соударения двух молекул,
имеющих одинаковые радиусы А, сумма коэффициентов диффузии которых
равна П. Когда малая молекула с радиусом А сталкивается с большой
молекулой, например рибосомой, рибосома доступна лишь с одной стороны,
и это уменьшает число столкновений в единицу времени вдвое. Кроме того,
в этом случае в качестве А следует брать радиус меньшей молекулы.

Мы можем, следовательно, для описания процессов соударения исполь-
зовать слегка измененное уравнение (15.1). Следующая задача заключается
в том, как описать специфичность. Мы можем предположить, что взаимо-
действие сталкивающихся молекул определяется силами двух типов. Силы
первого типа — это аддитивные лондоновские силы, не зависящие от того,
вращается лимолекула при приближении; эти силы действуют на расстоянии,
равном приблизительно радиусу стаикивающейся молекулы, как это было
показано расчетами Волд, упомянутыми в разд. 2.

Силы второго типа являются специфичными. Это ковалентные, ионные
и водородные связи, которые могут прочно связать между собой только
определенные молекулы. Так, для образования ковалентной связи необхо-
димо, чтобы у одного из атомов большой молекулы был электрон, который
мог бы стать общим для него и одного из атомов ударяющей молекулы. Это
произойдет лишь в том случае, если орбиты двух атомов будут перекры-
ваться, для чего необходимо сближение атомов на расстояние порядка 1,5 А.
Аналогичные соображения применимы и к образованию ионных и водо-
родных связей, также предполагающих тесное сближение атомов.

Из сказанного следует, что мы можем учесть специфичность, предполо-
жив, что лишь определенный участок сталкивающейся молекулы является
«активным» и что размеры этого участка сравнительно невелики. Чтобы
составить представление о том, насколько мал должен быть этот участок,
мы можем воспользоваться соображениями теории информации (см. гл. III)
по отношению к анализу специфических реакций. Для определения специ-
фичности требуется от 7 до 9 бит информации. Не вся эта информация может
быть выражена просто через отношение размеров «активного» участка
ко всей остальной части, однако если для этой части информации мы примем
величину 6 бит, то для упомянутого отношения получим величину, равную
1/64- Это означает, что лишь те соударения будут эффективными, при кото-
рых участок сталкивающейся молекулы, равный приблизительно 1/64
от всей ее поверхности, придет в соприкосновение с нужной областью
на поверхности фермента или рибосомы. Пользуясь изложенными сообра-
жениями, мы можем переписать уравнение (15.1) в следующей форме:

Ф =	(15.2)

где § — фактор, учитывающий специфичность.

Зная скорости синтеза, значения 7? для молекул и, насколько это
возможно, величину!), мы можем использовать уравнение (15.2) для вычис-
ления с0. Рассчитанная таким образом концентрация даст нам представле-
ние о той концентрации, которая должна существовать в клетке для обес-
печения наблюдаемых скоростей синтеза. Если эта концентрация будет зна-
чительно превышать наблюдаемую в клетке, то, естественно, возникнет
вопрос об адекватности применяемой модели. Перед тем как приступить
к расчету, укажем, что уравнение (15.2) можно использовать как с учетом
вращения молекул, • ак и без его учета. Последнее проще, и мы проделаем
расчет именно в этом варианте. В полученном решении будет нетрудно затем

учесть влияние вращения.

Можно, воспользовавшись теоретическим выражением для /), упро-
стить уравнение (2). Примем, что Тд =	, где т] — коэффициент вязкости.

Подставив это выражение в (15.2), получим

Ф = &.
г Зт]

Для температуры 37е С, или Т = 310° К, получим
ф = ^о. 1,4-]0-и

(15.3)

(15-4)
Для а можно принять значение 1/64, и нам остается лишь решить вопрос
о значении коэффициента вязкости т]. Для протоплазмы бактерий Е. соЬ,
разрушенных под действием давления, вязкость, согласно неопублико-
ванным данным Гарднера, несколько превышает 6 пз. Такое высокое зна-
чение, вероятно, частично обусловлено присутствием денатурированной
ДНК из разрушенных бактериальных ядер. По-видимому, реальное значение
1] для цитоплазмы равно примерно 1 пз. Теперь мы можем рассчитать, какое
значение концентрации дает уравнение (15.4).

Предположим, что 20 молекул ферментов активируют каждая по 5 моле-
кул аминокислот за 1 сек на каждую рибосому. Такая скорость необходима
для обеспечения наблюдаемой скорости синтеза белка на рибосоме. Подстав-
ляя ф= 5 в уравнение (15.4), для с0 получим значение 2,3-Ю16 молекул
в 1 см8. Так как объем клетки можно считать равным 10“12 см3, для числа
молекул аминокислоты определенного типа получим величину 2,3- ГО4,
а для общего числа молекул аминокислот—4,6-105. Общая масса аминокис-
лот в белках клетки составляет 1,5-10“18 г. Если принять, что средний моле-
кулярный вес аминокислоты равен 150, то для числа молекул аминокислот,
связанных в белках клетки, получим величину, равную 9-108, т. е. рассчи-
танное нами количество свободных аминокислот в клетке составляет меньше
1% от аминокислот, связанных в белках, что, конечно, вполне вероятно.

Скорость процесса прикрепления комплекса 5-РНК—АК к матрице
должна быть такой же, как и скорость процесса, рассмотренного выше,
а следовательно, и для концентрации этого комплекса мы получим то же
самое значение. Однако молекулярный вес 5-РНК более чем в 100 раз выше
среднего молекулярного веса аминокислоты, и, по-видьмому, рассчитанное
количество 5-РНК будет слишком большим. Это заставляет думать, что либо
теория неправильно описывает в общем правильную схему явления, либо
сама схема неверна. Мы увидим, что многие трудности устраняются, если
учесть возможности вращения и образования весьма короткоживущих
неустойчивых соединений.

7.	Образование короткоживущих комплексов. В гл. VIII было введено
представление о фермент-субстратном комплексе. Там же это представление
было использовано для описания кинетики ферментативных реакций.
Мы уже упоминали о том, что лондоновские силы не являются специфичными
и радиус их действия сравнительно велик. Если теперь предположить, что
сталкивающаяся с ферментом молекула на короткое время удерживается
около него за счет действия лондоновских сил и при этом она имеет возмож-
ность свободно вращаться, то вероятность совмещения активного участка
молекулы и специфического места на поверхности фермента (или рибосомы)
увеличится. Чтобы пояснить, почему в этом случае получается большой
выигрыш в скорости, мы напомним, что, по расчету Волд, притяжение
между двумя молекулами становится ощутимым, когда расстояние между
их поверхностями становится приблизительно равным их радиусам. Теперь
мы рассмотрим два вопроса: 1) сколько времени потребуется молекуле при
диффузионном движении, чтобы пройти расстояние 7?, и 2) на какой угол смо-
жет она повернуться за это время за счет броуновского движения. Такое
рассмотрение приводит к интересным и простым результатам, показываю-
щим, что взятое выше значение д безусловно является слишком малым 115].

Расстояние х, на которое переместится в рея льтате диффузии сфериче-
ская молекула с радиусом Е за время I, может быть определено из уравне-
ния (4.6)

—о 2кТ ,

Х — Р.-5*^
Очень похожее выражение для угла поворота сферической молекулы с радиу-
сом 7?, обусловленного броуновским движением, было получено Эйнштейном

02= Т—.р

8лт]/?з

Используя это уравнение для вычисления угла поворота за время, необхо-
димое молекуле, чтобы продиффундировать на расстояние 7?, мы получим
3

что О2 = — независимо от величины вязкости и 7?. Таким образом, сталки-
вающаяся с ферментом молекула, находясь в поле его притяжения, описы-
вает угол, равный примерно 1 рад. Полный поворот равен 2 л рад и, следо-
вательно, для § можно принять значение даже если не образуется ника-
ких других комплексов, кроме рассмотренных выше. Любое увеличение вре-
мени пребывания молекулы около фермента, обусловленное силами притя-
жения, будет увеличивать значение §, приближая его к единице. Таким
образом, учитывая вращение молекулы, получаем увеличение скорости рас-
сматриваемого процесса по крайней мере в 10 раз. Это означает, что вычис-
ленные раньше концентрации завышены приблизительно в 10 раз. Следова-
тельно, для количества 8-РНК мы будем теперь иметь 4,6-104 молекул
на клетку, или по весу '2-10“15 г на клетку. Это еще довольно много, но уже
приемлемо.

Мы видим, что высокие скорости синтеза достаточно хорошо объясняют-
ся на основе простых предположений о том, что синтез осуществляется
за счет беспорядочных случайных движений, характеризуемых разумным
значением коэффициента диффузии, и за счет специфического отбора нужных
соударений среди массы соударений, не ведущих к цели. Разумеется, ско-
рость реакции определяется не только числом соударений. Тут уместно
вспомнить, что много лет назад Мелвин-Хьюз проделал аналогичный расчет
для скорости ферментативных реакций и пришел к заключению, что дей-
ствительные скорости заметно меньше, чем это следует из теории соударе-
ний. Это легко объяснить, если вспомнить о существовании энергии актива-
ции. В ряде случаев с помощью измеренных на опыте энергий активации
можно объяснить скорости реакций без детального рассмотрения соударе-
ний и процессов диффузии. Наличие потенциального барьера любого типа
или появление любого другого фактора, уменьшающего вероятность реак-
ции, даже если произошло «правильное» соударение, будет резко уменьшать,
скорость реакции и соответственно увеличивать значение концентрации,
необходимой для обеспечения быстрого синтеза. Приведенные выше цифры
позволяют предполагать, что энергия активации процесса прикрепления
8-РНК—АК к рибосомной матрице очень невелика.

Перед тем как закончить рассмотрение белкового синтеза, остановимся
ненадолго на общей проблеме диффузии в клетке и посмотрим, какое влия-
ние оказывают электрические поля на скорость диффузионного переноса,
в клетке.

8.	Скорость диффузии в клетке. За время I молекула, имеющая коэф-
фициент диффузии В, переместится на расстояние х, среднее квадратичное
значение которого равно

х2 = 2Ш.

Это выражение, представляющее собой небольшое видоизменение уравнения
(4.6), применимо для одномерной диффузии. Для диффузии на поверхности
(двухмерный случай) среднее квадратичное значение смещения будет равно
4Е>/, а в трехмерном случае — 6Д/. Для глицина в воде Д равно 9,6х
X \0г&смЧсек, следовательно, среднее смещение молекулы глицина за 1 сек
примерно 10~2 см. Ясно, что поддерживать концентрацию таких малых моле-
кул в каком-либо одном участке клетки невозможно, поскольку они могут
легко диффундировать из одной части клетки в другую за сотые доли секун-
ды. На первый взгляд все выглядит так, как будто перенос метаболитов
за счет диффузии происходит весьма эффективно. Несомненно, в клетке
не может существовать сколько-нибудь существенной разницы концентра-
ций низкомолекулярных метаболитов, если ее не поддерживает какое-либо
силовое поле. В следующем разделе мы обсудим явление электрофореза
как пример наложения такого поля.

В разд. 6 мы исследовали один специальный случай белкового синтеза
в бактериальной клетке. При рассмотрении этого случая мы придержива-
лись представления, что решающую роль в реакции играют столкновения
молекулы, имеющей радиус /?, с некоторой специфической поверхностью.
Если считать, что соударения могут происходить в небольшом элементе
объема на расстоянии г от рассматриваемого метаболита, то мы получим
картину, управляемую законами диффузии, или, точнее, законами трехмер-
ного броуновского движения. Эта проблема была рассмотрена Рэлеем [16],
использовавшим обычные математические методы, а также анализировалась
Чандрасекаром [17] с применением теории цепей Маркова. Для вероятности
столкновения внутри объема с1х на расстоянии г от исходной точки они полу-
чили выражение \Е(г)<Д, где

1Е(г) = ——(15.5)

(4л О/)2

При заданном г это выражение имеет малую величину и для малых,
и для больших I, поскольку при малых I будет очень мал экспоненциальный
множитель, что соответствует малой вероятности перемещения на требуе-
мую величину за малый промежуток времени, а при больших I будет мал
з

член 1/(4я1)/)2, так как он отражает отношение объема «мишени» ко всему
объему, захваченному диффузией. 1Е(г) в выражении (15.5) имеет максимум
при 6/7/ = г2. Будем считать, что г — это расстояние, на которое должен
продиффундировать некоторый метаболит, чтобы попасть в активную зону
(Ьермента. Оказалось, что 1Е(г) при уменьшении г растет пропорционально
~. Следовательно, быстрая реакция зависит от наличия метаболитов вблизи
активной поверхности фермента. Если реакция начнется в районе с равно-
мерной концентрацией молекул метаболита, то вскоре около активной зоны
йермента концентрация метаболита понизится и возникнет градиент концен-
трации. Возникнет процесс, рассмотренный Смолуховским и описываемый
 равнением (15.1). В клетке, однако, какой-либо данный метаболит может
гкнтезироваться довольно далеко от активной поверхности, с которой
он должен взаимодействовать. Эффективность синтеза в этом случае резко
понизится и рост клетки замедлится; но тогда участок клетки, производя-
щий данный метаболит, должен заполнять своими продуктами всю клетку,
чтобы каждая молекула своевременно включалась в процесс синтеза.

Вполне вероятно, что в клетках, значительно больших, чем клетки
актерий, существует некоторый дополнительный механизм, способствую-
_ни более эффективному использованию процессов диффузии. Это, например,
слоистые структуры, описанные в разд. 2. Слои образуют области, внутри
торых метаболиты могут перемещаться от одной точки к другой по зна-
ггельно более коротким траекториям, чем при броуновском движении
в однородной среде. Тот факт, что к этим слоям очень часто прикреплены
микросомы, говорит в пользу сделанного предположения и позволяет думать,
что слои ограничивают движение метаболитов двумя измерениями, позволяя
перемещаться лишь вдоль своих поверхностей до тех пор, пока метаболит
не подойдет к частице, на которой осуществляется синтез. Двухмерное
броуновское движение описывается выражением, подобным (15.5), только
левая часть этого равенства уменьшается пропорционально . Вероят-
ность интересующих нас соударений при этом увеличивается, и, следова-
тельно, клетка может теперь поддерживать нормальные скорости синтеза
при меньших концентрациях метаболитов. Таким образом, эндоплазмати-
ческая сеть выполняет важную роль, превращая трехмерное броуновское
движение метаболитов в двухмерное.

Перед тем как завершить рассмотрение диффузии, мы должны еще раз
напомнить об очень важном вопросе, а именно о том, каким, образом прибли-
жается сталкивающаяся молекула к поверхности фермента или к иной
области, где она должна вступить в реакцию. Полагая, что изменения угла
и расстояния, обусловленные броуновским движением, представляют собой
процессы одного типа, мы получим следующие два соотношения:

62 = 20/

и

х2 = 2П/,

где 0 есть коэффициент вращательной диффузии, который для сферической
молекулы с радиусом 7? равен

0 = -^.

8лт]/?з

Отношение квадрата угла поворота за время / к квадрату расстояния
пройденного молекулой за это же время, равно . Для сферической моле-
кулы теоретическое значение этой величины будет равно 0,86/Д. Таким
образом, молекуле требуется продиффундировать всего лишь на расстояние,
равное 10 ее радиусам, чтобы повернуться практически любым своим участ-
ком в заданном направлении. Для небольших молекул такое расстояние
находится в пределах радиуса действия сил притяжения. Для больших
молекул это может быт не так, но лондоновские силы, как уже говорилось
раньше, могут проявляться и в этом случае.

На первый взгляд кажется, что в биологических системах лишь элек-
тростатические силы имеют большую величину. В следующем разделе мы спе-
циально рассмотрим те эффекты, которых можно было бы ожидать от дей-
ствия этих сил.

9.	Влияние электрических сил на процессы диффузии. До сих пор
мы не рассматривали каких-либо механизмов, повышающих концентрацию
близ поверхности, что могло бы обусловить увеличение эффективной мишени
для столкновения. Повышение концентрации в определенных участках
клетки может происходить за счет силового поля. По-видимому, единствен-
ное поле, которое может играть такую роль,— это электрическое поле,
Едва ли можно ожидать, что магнитные или гравитационные силы сущест-
венны в одиночной клетке, хотя для больших организмов гравитационные
силы, наприглер, имеют значение. Электрический характер многих клеточ-
ных процессов не вызывает сомнений. В частности, прикрепление фага
к бактерии на первой стадии обусловлено электростатическими силами.
Нас интересуют два вопроса. Во-первых, как велики электрические
ноля, возникающие в живых организмах? Во-вторых, каково действие,
оказываемое этими полями, на движение различных типов молекул в биоло-
гических системах?

Рассмотрим сначала вопрос, касающийся величины электрических
полей. Важной характеристикой аминокислот и белков, как мы уже подчер-
кивали раньше, является наличие функциональных групп •—МН2 и —СООН,
которые могут легко обмениваться протонами с раствором. В результате

такие группы и, следо-
вательно, целые моле-
кулы приобретают поло-
жительный или отрица-
тельный заряд. Чтобы

Фиг. 251. Схематическое изображение распределения
зарядов у участка поверхности белковой молекулы.
Предполагается, что в области слева образовалось три поло-
жительных заряда, а справа — один отрицательный. Вблизи

увидеть, к чему это
может привести, прове-
дем небольшой расчет.
Предположим, что один
положительный элемен-
тарный заряд возникает
на каждой единице
структуры с молекуляр-
ным весом 1000. Тогда

гтттг^тлтлтл г»ттпй	ддыт заряженного участка поверхности группируются ионы противо-

ПЛОСКИИ СЛОИ оелка МЫ	по^ОЖНОго знака, что приводит к образованию не очень четко

можем рассматривать ограниченного, в целом нейтрального двойного слоя. Следуя
г о г	Гельмгольцу, толщина этого слоя условно принята равной т.

как заряженный слои с
поверхностной плотно-
стью, равной примерно одному элементарному заряду на 100 А2. Напря-
женность электрического поля вблизи плоской поверхности равна 2ло/К,
где о — поверхностная плотность заряда, а К — диэлектрическая прони-
цаемость. Значение о равно 4,8-10~10/10~14, т. е. 4,8-104 эл. ст. едГсм?.

Отсюда для напряженности электрического поля получаем величину по-
рядка 1 000 000 в/см, т. е. весьма внушительную величину.

В живых организмах таких сильных полей в действительности не
существует. Однако приведенный расчет говорит о возможностях, которые
в некоторых условиях могут осуществляться. Отсутствие в живых организ-
мах таких больших полей объясняется существованием ионной атмосферы,
обусловленной присутствием ионов различной валентности в среде, окру-
жающей молекулу. Изучение такого рода ионного окружения было начато
в свое время Гельмгольцем, который считал, что около молекулы могут
образовываться двойные слои ионов противоположного знака. Движение
частиц в ионной среде было рассмотрено Смолуховским, а первая прибли-
женная теория ионных растворов, как уже указывалось в гл. VI, принадле-
жит Дебаю и Гюккелю. Рассмотрим характер распределения зарядов
вблизи молекулы белка (фиг. 251). Предположим, что рассматриваемый
участок белковой молекулы имеет слева три —ГСН|-группы, несущих
положительные заряды, и справа одну группу —СОСг, несущую отрица-
тельный заряд. Как показано на фигуре, около такого участка будут груп-
пироваться ионы, образуя довольно рыхлый двойной электрический слой
толщины т. В теории Гельмгольца принимается для простоты, что этот слой

дмеет вполне определенную толщину.

Если мы теперь приложим электрическое поле X, направленное справа
н> лево. то белок будет стремиться двигаться влево, а ионы раствора — впра-
в: Это вызовет противоток ионов, который будет увеличиваться, пока
не достигнет величины, определяемой вязкостью среды. Относительное
движение приведет к установлению градиента скорости, величина которого
связана с силой, действующей на единицу поверхности и обусловленной
действием электрического поля на заряды, так же как в обычном случае
течения в вязкой среде.

Пусть о обозначает заряд, приходящийся на единицу поверхности,,
а о0 — скорость движения белковой молекулы относительно двойного слоя.
Градиент скорости будет равен — . Мы можем написать следующее соотно-
шение между величиной силы на единицу поверхности и параметрами вяз-
кого движения:

Хс — т]— ,
1 т

или

о0 = ^-от,	(15.6)

где и — коэффициент вязкости.

Величина от была названа Гельмгольцем моментом двойного электри-
ческого-слоя. В настоящее время соотношение (15.6) чаще записывают
в другой форме:

где — это так называемый дзета-потенциал, определяемый соотношением
?_________________________________4лат

Однако, переходя от (15.6) к (15.7), мы всего лишь заменяем произ-
ведение практически неизвестных нам величин заряда и толщины слоя
на произведение также неизвестных величин потенциала и диэлектрической
проницаемости. Положение почти безнадежное, если не считать того, что
весьма точно может быть измерена величина о0, а следовательно, и

Отношение называют подвижностью.

Если мы теперь предположим, что молекула белка представляет собой
сферу радиуса г и что смещение происходит на расстоянии, также равном г,
то для мы получим

* Кг ’

где — полный заряд молекулы.

Если для описания двойного слоя использовать подход Дебая —
Гюккеля, то толщину двойного слоя следует увеличить на множитель 1 -\-кг,
где к — параметр Дебая — Гюккеля, равный



Здесь 8 — величина элементарного электрического заряда, щ — число
ионов типа г в 1 см9, а — число элементарных зарядов, которое несет ион
1-го типа. Для одновалентного электролита, имеющего молярную концен-
трацию с,

ъ— Л____

3-10-8 •
Теперь, используя уравнение (15.7), получим

»о =

х<2

4лт]г (1 -1- кг)

(15.8)

Если рассматриваемая сферическая молекула достаточно мала, то вязкий
поток, обтекающий сферу, можно считать практически ламинарным и мы
можем использовать подход, аналогичный применяемому при выводе
закона Стокса. Для этого случая

°° бэту (1	*

(15.9)

В дальнейшем для расчетов мы будем пользоваться формулой (15.9).

Электрофоретическая подвижность различных белков довольно хорошо
изучена. На фиг. 252 показаны значения подвижности для сывороточного

1,0-
0.5 -

О -
-0,5-
-1,0 -

-1---(-4—<----1----н рН

1.0 2,0\3.0 А,О 5,0

Ь -Аспарагиновая кислота

Фиг. 252 Влияние рН на электрофоретическую подвижность
сывороточного альбумина, псевдоглобулина и Е-аспарагиновой
кислоты. При изменении рН меняется число — МНф- и СОО~-групп.

альбумина, псевдоглобулина и Ь-аспарагиновой кислоты. Изменение рН
заметно влияет на заряд и подвижность молекул. Хорошо известно, что этот
эффект связан с образованием —НН*- и —СОО“-групп. Значения подвиж-
ности не кажутся на первый взгляд очень большими, однако достаточны
для того, чтобы заметно ускорить перенос аминокислот в клетке.

Измеренные значения электрофоретической подвижности позволяют
нам предсказать, как будет двигаться заряженная молекула в заданном
электрическом поле в среде с заданной вязкостью. Однако они ничего
не говорят нам о том, какие величины полей можно ожидать. Для ответа
на этот вопрос мы должны использовать некоторые из приведенных выше
уравнений и рассчитать поле вокруг белковой молекулы, создаваемое рас-
положенными на ней зарядами. Если принять, что молекула сывороточного
альбумина представляет собой сферу радиуса 3,3-1СГ7 см, а одновалентные
ионы присутствуют в среде в концентрации 10“2 моль, что для 1г дает значение
3- 10е, то для из уравнения (15.9) получим величину, несколько превышаю-
щую 5 элементарных зарядов. Тогда потенциал вблизи такой сферы, соглас-
но теории Дебая — Гюккеля, равен

(Х-а>

(Кх) (1-^Ах) ’

Значение потенциала V на расстоянии х = 5- 1СГ7 см при принятых выше
условиях и предположении, что К. = 80, составит 4-1СГ4 в. Это существенно
меньше измеренных во многих случаях значений дзета-потенциала. Для
АУ	«

величины электрического поля-^- , опять-таки очень приблизительно, будем

иметь 300 в!см. Таким образом, можно считать, что вблизи молекул, несу-

Ф щг. 253. Показано, как об-
ласть высокого заряда вблизи
одной из белковых молекул в не-
которой структуре может создать
большое электрическое поле и
способствовать концентрированию
определенной  аминокислоты
около этого белка.

ложены, как изображено на

щих заряды, могут существовать вполне
ощутимые электрические поля. Можно ожи-
дать, что аминокислоты при благоприятных
значениях рН будут иметь направленную
скорость миграции около 3-10 2 см!сек.
Очевидно, было бы неразумно не учиты-
вать электрические эффекты и считать, что
они не влияют на беспорядочные диффу-
зионные процессы в клетке.

Можно предположить, что в митохонд-
риях регулярно расположенные молекулы
ферментов создают электрическое поле.
Изоэлектрические точки ферментов, вероят-
но, различны (под изоэлектрической точ-
кой понимается величина рН, при которой
полный заряд белка равен нулю), и экви-
потенциальные линии, по-видимому, распо-
фиг. 253. Такое поле будет обусловливать

различную подвижность различных аминокислот и может создать усло-
вия, при которых в определенном участке будет происходить преиму-
щественное накопление метаболитов определенного типа.

10.	Специфичность процессов переноса. Специфичность в процессах
диффузии связана лишь с размерами частицы, да и то не очень сильно.
Например, коэффициент диффузии РНК-азы всего в 10 раз меньше коэффи-
циента диффузии уксусной кислоты, а минимальное и максимальное значе-
ния коэффициентов диффузии аминокислот отличаются не более чем в два

Изоэлектрические точки (р!) аминокислот

Аминокислота	р/	Аминокислота	р!
Глицин 		5,97	Аспарагиновая кислота	2,77
Аланин 		6,00	Глутаминовая кислота	3,22
Валин 		5,96	Аргинин 		10,76
Лейцин 		5,98	Гистидин 		7,59
Изолейцин 		6,02	Цистеин 		5,07
Серин 		5,68	Цистин 		5,05
Пролин 		6,30		

раза. Мы видели выше, что электрофорез может играть важную роль в ряде
процессов специфического переноса. Вполне вероятно, что в клетке этот
процесс используется. Отметим, что если это на самом деле так, то на рост
клетки можно оказать воздействие приложением внешнего электрического
поля. Такие данные известны. Было бы интересно проверить, существует ли
здесь корреляция с изменениями рН, поскольку изменение последнего долж-
но сильно сказаться на заряде белковой молекулы. Влияние рН действитель-
но наблюдалось, но область значений рН в интенсивно растущих организмах
такова, что широкое участие электрических эффектов в процессах специ-
фического переноса маловероятно.

Изоэлектрические точки некоторых аминокислот даны на стр. 420.
Можно видеть, что изоэлектрические значения рН колеблются в пределах
5 единиц. Как следует из фиг. 252, электрофоретическая подвижность
Б-аспарагиновой кислоты меняется очень быстро при изменении рН; это
означает, что изменение рН может служить механизмом специфического
отбора аминокислот. Однако, поскольку рН также влияет на активность
фермента. непосредственное обнаружение эффекта отбора оказывается
затруднительным.

Попытаемся провести расчет для того, чтобы определить, насколько
большое увеличение концентрации можно получить за счет электрофореза.
Предположим, что молекуле следует пройти расстояние в 1000 А. За счет
одной диффузии молекула пройдет этот путь за время I, которое мы найдем
из уже знакомого нам уравнения ё2 = 60/. Подставляя в эту формулу для
ё значение 1000 А, или 10'° см, получим для I (для молекулы с коэффициен-
том диффузии 10'5) округленно 1,7-10'6 сек. Предположим теперь, что
эффективная концентрация этих молекул такова, что на сферу с радиусом
10“Б см приходится 1 молекула. При электрофорезе молекула должна пройти
фактически меньший, чем за счет диффузии, путь, равный точно 1000 А,
т. е. за время 1,7-10'6 сек молекула пройдет путь, больший 1000 А.

Обозначим электрофоретическую подвижность через т, а напряженность
электрйческого поля через X в/см. Тогда добавочное расстояние, пройден-
ное за счет электрофореза, будет равно Хт-1,7-10'6 см. Если X равно
300 в/см, а электрофоретическая подвижность — 10'3 см/сек!в, то искомая
величина составит 5-10'7 см. Это означает, что размеры сферы, на которую
приходится одна молекула, уменьшились с 1000 А до 950 А, и, следователь-
но, концентрация увеличилась в (1000/950)3 раз, или на 20%. Если расстоя-
ние, проходимое частицами в результате диффузии, в 10 раз больше, то коэф-
фициент увеличения эффективной концентрации будет равен 8. Таким
образом, электрофорез действительно способен создать некоторую селектив-
ность, которая, хотя и не является полностью специфичной, однако может
играть важную роль в клетках больших размеров. Но при малых диффу-
зионных расстояниях, лишь тогда, когда напряженность поля вблизи
матрицы имеет значение более 3000 в/см, может наблюдаться двукратное
избирательное увеличение концентрации. В связи с этим маловероятно, что
эффекты типа электрофореза играют сколько-нибудь важную роль в бакте-
риальных клетках.

11.	Флуктуации в клетке. Рассматривая механизм, при помощи кото-
рого может осуществляться синтез белка, нам полезно познакомиться
с одним важным аспектом подхода к биологическим процессам. Шредингер
впервые указал, что точное самовоспроизведение организма требует присут-
ствия механизма, исключающего флуктуации. Он предположил, что в гене
такой механизм обеспечивается за счет правильности строения апериоди-
ческого кристалла при передаче наследственной информации следующему
поколению. Это общее требование, по-видимому, применимо не только
к процессам передачи наследственности. Попробуем проанализировать
все основные клеточные процессы и посмотреть, смогут ли они нормально
осуществляться, несмотря на флуктуации.

Посмотрим, какие параметры клетки могут испытывать флуктуации.
Начнем с рН. При рН 7 концентрация ионов водорода равна 10-7 М, т. е.
в 1 сж3 около 6-1013 ионов. Объем бактерий 2-Ю’12 сж3, следовательно,
в ней присутствует в среднем около 120 ионов водорода. Это число столь
мало, что рН в бактерии уже нельзя считать постоянным, поскольку число
ионов водорода в результате флуктуации легко может измениться, скажем,
в два раза. Таким образом, при среднем значении, равном, например, 7,
рН будет флуктуировать в пределах 6,7—7,3. Около отдельных молекул
белка могут происходить еще большие флуктуации рН. Поэтому даже и при
действии специфического механизма электрофореза возможны все же
нарушения в концентрировании аминокислот.

Рассмотрим теперь витамины, обычно присутствующие в клетке в низ-
ких концентрациях. Биотин, например, активен уже при концентрации
одной молекулы на клетку. Едва ли можно гарантировать, что в результате
процессов диффузии эта молекула обязательно окажется там, где она в дан-
ный момент нужна. Значит, клетка должна продолжать развиваться,
используя процессы, индуцированные биотином в предшествующие моменты
времени. Эти соображения касаются также ионов различных металлов,
содержащихся в клетке в малых концентрациях.

Изменение заряда на молекуле белка будет создавать электроосмо-
тическое давление. Если поверхность молекулы белка составляет 1012сж2,
то изменение заряда на одну элементарную единицу приведет к изменению
поверхностной плотности приблизительно на 500 эл. ст. ед. на 1 сж2, что
приведет к местной флуктуации давления на 100 атм. Такое изменение дав-
ления может мгновенно нарушить некоторые процессы; следовательно,
клетка должна обладать способностью легко преодолевать эти нарушения.

Можно представить себе много других форм флуктуаций. Систему
такого небольшого объема, какой характерен для клетки (здесь количество
молекул часто исчисляется тысячами или даже меньшим числом), нельзя
рассматривать без учета флуктуаций. Между тем, несмотря на подвержен-
ность клетки столь большому числу различных флуктуаций, клетка функцио-
нирует в сущности с очень большой правильностью.

Некоторое представление о точности, требуемой при синтезе белка,
можно составить, обратившись к данным по последовательности аминокис-
лот в инсулине и рибонуклеазе. Доказано, что изменение более чем одной
аминокислоты приводит к резкому изменению ферментативных свойств
рибонуклеазы. Таким образом, мы можем сделать заключение, что погреш-
ность при синтезе белка не должна превышать одной аминокислоты надвести.
Разумеется, следует учитывать, что дефектный фермент будет влиять
на функционирование клетки лишь в том случае, если он активно синтези-
рует вредные продукты или если все молекулы фермента данного типа ока-
жутся дефектными. Вполне вероятно, что ощутимая часть белков в нормаль-
но функционирующей клетке имеет дефекты. По-видимому, сделанная нами
выше оценка погрешности при синтезе белка близка к истине.

Единственным механизмом, обеспечивающим высокую точность при
синтезе белка, приходится в настоящее время считать механизм, предло-
женный Шредингером. Аминокислоты должны специфически связываться
в нужных местах и отталкиваться во всех других. Тогда флуктуации будут
изменять лишь скорость включения в данной точке, но не повлияют на конеч-
ный результат включения. Хогленд конкретизировал эту схему, предполо-
жив существование 20 видов з-РНК; каждый вид 5-РНК может специфиче-
ски связываться с данной аминокислотой и с определенным местом на рибо-
соме. Процесс специфического связывания представляет большой интерес.
С одной стороны, он не требует высокой точности соударений, так как, хотя
скорость образования комплексов РНК—АК и рибосома — РНК—АК
весьма низка, нужная скорость синтеза обеспечивается за счет высокой
концентрации обоих комплексов. С другой стороны, этот процесс должен
быть достаточно точным, чтобы повышение концентрации случайных амино-
кислот из-за флуктуаций в зоне синтеза не вызвало ошибки при включении
аминокислот в белок. Читатель мог видеть, что синтез белка связан с весьма
тонкими молекулярными биологическими процессами, которые для своего
исчерпывающего объяснения требуют очень детального знания природы
молекулярных явлений.

12.	Репликация. Вторым фундаментальным процессом, о котором мы
уже раньше говорили в этой главе, является репликация. Несомненно,
что в основе этого процесса лежит удвоение хромосом. Мы ограничимся
рассмотрением более простого процесса — репликации ДНК. Здесь, как

п д ТТ Ф

д ТМФ

дГТФ
дАТФ

-[-ДНК-затравка —» ДНК

д ГМФ
д АМФ

+пПФ

п дЦТФ

Фиг. 254.

дЦМФ

п

п

и всюду в этой главе, мы считаем неправомерным встать на путь догмати-
ческого изложения или отстаивать какую-либо одну точку зрения. Основные
факты, относящиеся к репликации ДНК, получены лишь в самые последние
годы; мы почти уверены, что после выхода этой книги из печати в ближай-
шее время будут сделаны не менее важные открытия. Не так давно для изо-
бражения репликации ДНК использовался символ V, согласно представле-
нию, что двухцепочечная ДНК, разворачиваясь с одного конца, превра-
щается в две двухцепочечные ДНК- В настоящее время предполагают, что
при репликации синтез начинается с двух противоположных концов ДНК,
и символ для изображения этого процесса должен, очевидно, выглядеть
иначе. Мы отберем лишь те сведения о ДНК, которые можно считать твердо
установленными, и, кроме того, ограничимся только биофизическим анали-
зом процесса репликации, не вдаваясь в излишние подробности.

Данные о биохимической природе ДНК (см. гл. II) можно считать
вполне надежными. Нет также оснований сомневаться, что ДНК может
существовать в виде комплекса двух комплементарных цепей, как предпо-
ложили Уотсон и Крик. Из работ Мармура и Лейна [18] и Доти и др. [19]
непосредственно следует, что цепи ДНК могут разделяться и рекомбини-
ровать, причем рекомбинация может происходить даже между ДНК раз-
ных видов бактерий. Работы Дж. Сетлоу и Р. Сетлоу [20] по действию уль-
трафиолета позволяют предполагать, что ДНК фага вскоре после заражения
клетки распадается. Корнберг, Леман, Бесман и Симс на бесклеточных систе-
мах показали существование ферментной системы синтеза ДНК- Синтез
в такой бесклеточной системе требует присутствия ДНК-затравки и может
давать увеличение массы ДНК более чем в 20 раз по отношению к исходному
материалу. Эта ферментная система в настоящее время достаточно подробно
изучена. Мы начнем свой анализ, приняв, что репликация ДНК осущест-
вляется полимеразой Корнберга, которая,, по его словам, «управляется
матрицей». Мы предполагаем дать краткое описание упомянутой фермент-
ной системы и проанализировать ее с биофизической точки зрения.
На фиг. 254 представлена реакция синтеза ДНК. дТТФ, дГТФ, дАТФ
и дЦТФ — это дезокситимидинтрифосфат, дезоксигаунозинтрифосфат, дез-
оксиаденозинтрифосфат и дезоксицитозинтрифосфат соответственно. Симво-
лом ПФ обозначен пирофосфат. ЛУеханизм этой реакции, предложенный

Ф и г. 255. Постулированный Корн-
бергом механизм, за счет которого
'происходит удлинение цепи ДНК-
Первая фосфатная группа присоеди-
няется к свободному сахару и проис-
ходит отщепление пирофосфата.

Корнбергом, приведен на фиг. 255. Нам
сейчас важно, что реакция происходит
у свободной пентозы на одном конце
цепи ДНК- Это означает, что процесс
всегда начинается только с определен-
ного конца цепи и, следовательно, реп-
ликация У-типа не может происходить.

Теперь мы можем проанализировать
следующие аспекты проблемы, относя-
щиеся к репликации ДНК: 1) скорость
синтеза, обусловленная броуновским
движением и отбором, 2) скорость рас-
кручивания, 3) точность расположения
оснований в новой ДНК и 4) переход от
вращения к колебаниям.

13.	Броуновское движение и спе-
цифический отбор при синтезе ДНК-
Подход, который мы применили при

рассмотрении синтеза белка, можно
применить также и при рассмотрении
синтеза ДНК- Рассматриваемый процесс
довольно прост: основание ДНК-затрав-
ки каким-то образом прикрепляется
к ферменту, и благодаря этому служит
как бы «коферментом». Соединенный

с основанием фермент будет реагировать лишь с комплементарным
основанием. Например, если «коферментом» является аденин, то только
тимин присоединится к концу формирующейся цепи ДНК- Основания
затравки должны соединяться с ферментом в строгой последовательности,
и мы можем оценить, во-первых, общую скорость процесса и, во-вторых,
вероятность неправильных включений в цепи, обусловленных неточной рабо-

той фермента и затравки.

Рассмотрим сначала вопрос о скоростях. Е. соИ на синтетической среде
за 50 мин синтезирует 8-10’15 г ДНК, т. е. в 1 сек происходит включение
приблизительно 5-Ю3 нуклеотидов. Приблизительно такие же величины
получаются для-фага Т2. В случае фага Т2 процесс синтеза ДНК занимает
немногим меньше половины латентного периода, т. е. около 10 мин, или
600 сек. Луриа [21] показал, что этот процесс носит экспоненциальный
характер. Во время латентного периода подготавливается внезапное появле-
ние приблизительно 1000 фаговых частиц, т. е. за 600 сек синтезируется
количество молекул ДНК, достаточное для 1000 фаговых частиц. Если
х — число генераций, тогда 2х = 1000, откуда получаем х = 10. Таким
образом, одна молекула ДНК синтезируется примерно за 60 сек. Если
принять, согласно Левинталю (см. гл. XIII), что молекулярный вес ДНК
равен 6-107, то для скорости включения нуклеотидов получим 2-105 нуклео-
тидов за 60 сек, или 3 • 103 нуклеотидов в 1 сек, что хорошо согласуется с вели-
чиной, полученной для Е. соИ.

Мы можем теперь согласовать эти скорости с представлениями о слу-
чайных соударениях и специфической мишени. О характере мишени можно
составить представление из фиг. 255. Кислород и фосфор должны сблизить-
ся на очень малое расстояние, и для площади сечения мишени мы можем,
по-видимому, принять величину, равную 1 А2. Радиус молекулы трифосфата
равен приблизительно 4,7 А, а общая площадь ее поверхности — 280 А2,
следовательно, значение § будет довольно низким, если только не происхо-
дит образования временного комплекса со свободным вращением. Если мы
предположим, что такой комплекс не образуется и что р = 1/300, то для син-
теза в одной точке из уравнения (15.4) будем иметь

3-103 = 1,4-	с0

или
_ 9-106	6,4-1080

С° ~ 1,4-10-14 — СЛ4з •

Рассчитанная концентрация составляет приблизительно 1 714, т. е. 6,4-108
молекул нуклеотидов (или 5-10"13 г) на 1 клетку, что во много раз превосхо-
дит разумное значение. Если принять, что^ равно единице, что соответствует
образованию комплекса с временем вращения, достаточным для попадания
в мишень, то необходимая концентрация будет в 300 раз меньше (1,6-10“15 г
нуклеотидов на клетку), т. е. все еще слишком высокой. Это приводит нас
к заключению, что синтез должен осуществляться не в одной точке, а по край-
ней мере в 10. Было отмечено [22], что фермент, необходимый для белкового
синтеза у Е. соИ, составляет примерно 1% от всего клеточного белка. Это
должно соответствовать приблизительно 10 000 отдельных единиц, если
только молекула фермента не имеет необычно больших размеров или если
скорость процесса в клетке ненамного больше, чем в бесклеточной системе.
В связи с этим вполне вероятно, что предложенное нами число молекул
ферментов (100) не слишком завышено.

Обратимся к проблеме раскручивания ДНК [23]. Если принять, что
для фага Т2 скорость включения составляет 7-103 нуклеотидов в 1 сек
(мы уже знаем, что одна пара нуклеотидов повернута относительно другой
на угол, равный приблизительно 30°), то вращение, обеспечивающее раскру-
чивание, должно происходить со скоростью 580 об/сек. Может показаться
удивительным существование такого движения в спокойной, по общему пред-
ставлению, среде клетки. И тем не менее эта цифра не является абсурдной.
Действительно, вникая в детали молекулярных процессов, мы видим, что
движения молекул кажутся подобными взрыву. Они таковы на самом деле.
Мы должны учитывать, что в делящейся клетке происходят чрезвычайно
энергичные движения. Один из видов такого движения — быстрое враще-
ние. Для большей убедительности наших рассуждений приведем результаты
простого расчета. Кинетическая энергия вращения 1/г/аг (где I — момент
инерции, а со — угловая скорость) для молекулы с молекулярным весом
6-107 и радиусом 10 А равна 6-10“24 эрг, тогда как величина кТ при комнат-
ной температуре 4-10“14 эрг. Возникает совсем другая проблема, а именно:
каким образом осуществляется столь медленное вращение ДНК, несмотря
на значительно более интенсивное броуновское движение, и почему это
последнее не нарушает синтез ДНК?

Эта проблема связана с другой проблемой,— с вопросом о точности
синтеза ДНК- Известно, что дезоксирибозидтрифосфаты, в которых урацил
замещен на 5-бромурацил или 5-йодурацил, при синтезе ДНК могут вклю-
чаться вместо тимидинтрифосфата, а 5-бромцитозинтрифосфат может заме-
щать цитозинтрифосфат. Следует заметить, что замена оснований происхо-
дит только в случае очень близких по структуре аналогов.

28 Заказ 1168
к
Таким образом, хотя возможна небольшая «неточность» при включении
оснований, однако ее результаты значительно менее важны, чем при вклю-
чении какого-либо из нормальных оснований в неправильном месте цепи
ДНК- В этом последнем случае последствия ошибки гораздо серьезнее.
Джирер и Мандри [24] показали, что уже изменение одного основания
в инфекционной РНК вируса табачной мозаики ведет к возникновению
мутации. Аналогичные факты (см. раздел 7) наблюдаются и для ДНК-
Исходя из этого, мы можем предположить, что процент случайных мутаций
в культуре бактерий отражает число ошибок при синтезе новой ДНК.
Новик и Сцилард [25] определили частоту появления мутантов, устойчивых
к фагу Т5; можно принять, что эта частота равна 10“8 на 1 бактерию (время
генерации 50 мин). Предположим, что эта мутация связана с изменением
одного основания в цистроне, состоящем, допустим, из 1000 нуклеотидов.
Тогда, если изменение любого одного основания приводит к мутации, выра-
жающейся в устойчивости к фагу Т5, то вероятность неправильного включе-
ния нуклеотида будет составлять 10-11. Скорость включения нуклеотидов
равна приблизительно 5-103 нуклеотидов в 1 сек. Если мы будем считать,
что в клетке имеется 100 ферментных систем, или локусов, занятых полиме-
ризацией нуклеотидов, то получим, что каждый локус производит включение
50 нуклеотидов в 1 сек. Таким образом, если время является определяющим
фактором, то изменение от одного «кофермента» к следующему должно про-
исходить за 10’т1/50 или 2-1013 сек.

Столь короткое время автоматически исключает две гипотезы о меха-
низме процесса, основанные на чисто физических представлениях. Действи-
тельно, если предположить, что ДНК-затравка реально движется относи-
тельно фермента так, что основания последовательно приходят в соприкос-
новение с активным центром, и если считать, что молекулярный вес затравки
не меньше 6-106, то можно рассчитать энергию одного «скачка». При «скач-
ке» расстояние между нуклеотидами, равное 3,4 А, должно преодолеваться
за 2-10“13 сек, что требует скорости 1,7- 10® см1сек и кинетической энергии
9-104 эв, т. е. безусловно фантастических значений. Даже если предполо-
жить, что движется фермент, а не затравка, все равно требуемая величина
кинетической энергии окажется не меньше 100 эв. Таким образом, мы видим,
что если рассматривать процесс специфического синтеза ДНК как результат
непрерывной бомбардировки активного центра четырьмя нуклеозидтрифос-
фатами при изменяющемся скачками критерии специфического отбора,
то скорость изменения этого критерия, необходимая для того, чтобы избе-
жать ошибочного включения оснований, должна быть столь высока, что это
недостижимо ни при каких реальных перемещениях затравки или фермента.

Мы можем также исключить предположение, что выход из положения
можно найти в раскручивании ДНК-затравки. Раскручивание требует пово-
рота на 30° для перехода к следующей паре оснований. Для того чтобы осу-
ществить такой поворот за время 2-10’13 сек, требуется угловая скорость
2,5-1012 рад/сек, т. е. энергия вращения молекулы ДНК должна быть
2,0-105 эв.

Столь жесткие ограничения, накладываемые на время, вызывают естест-
венное желание воспользоваться соотношением неопределенности. Исполь
зуя его в форме

ДЕ-Д/~^,

где ДЕ — неопределенность в энергии, а Д/ — во времени, мы получим, что
ДЕ не может быть меньше 5-10’15 эрг, т. е. около 1/10 кТ. Следовательно

«
процесс включения должен характеризоваться некоторой сравнительно
большой «шириной полосы».

Из приведенного рассмотрения напрашивается следующий вывод [15]:
физическое описание системы Корнберга можно дать, предположив, что
в синтезе одной новой молекулы ДНК участвует много ферментов или что
затравка и фермент прикрепляются друг к другу сразу по всей длине и обра-
зуют большое число работающих активных центров, обладающих различной
специфичностью. Можно также предположить, что ферментативный процесс
не возникает, пока не будет готов новый кофермент. Во всяком случае ясно,,
что быстрый и точный синтез на движущейся нити не может иметь места,
если только не предположить, что движение нити происходит с невероятно
высокой скоростью.

Продолжим наш физический анализ и рассмотрим некоторые квантово-
механические проблемы, связанные с процессом прикрепления нуклеотидов.
Не так давно Сцент-Дьёрдьи очень убедительно писал о необходимости
«субмолекулярной биологии». Какого же рода проблемы возникают перед
нами при обсуждении только что рассмотренных процессов? Ясно, что спе-
цифическое включение при случайных соударениях связано с весьма малыми
размерами мишени, настолько малыми, что требуется рассматривать, каким
участком своей поверхности сталкивается молекула. Из разд. 8 мы видели,
что соударение между соответствующим участком поверхности молекулы
и активным центром обеспечивается за счет вращательного броуновского
движения. В действительности движение такого рода, которому мы приписы-
ваем среднюю энергию кТ, квантовано, и в момент соударения молекула
обладает определенной энергией. После прикрепления ненаправленное вра-
щение молекулы прекращается и переходит в новые формы движения
с квантованной энергией, в частности в колебательные движения.

На переходы такого рода накладываются ограничения, эквивалентные
правилам отбора. Например, если новое состояние прикрепленной молекулы
требует изменения ориентации спина электрона, то прикрепление будет
весьма маловероятным процессом. Насколько нам известно, теория такого
рода процессов очень мало разработана и, по-видимому, разработка ее свя-
зана с очень большими трудностями. Можно сделать три следующих пред-
положения. Во-первых, прикрепление происходит к связи, около которой
после прикрепления возможно свободное вращение, ибо в этом случае
отсутствует жёсткое требование мгновенной передачи энергии из одной фор-
мы движения в другую. Во-вторых, прикрепление преимущественно происхо-
дит в две стадии, причем на первой стадии связь осуществляется слабыми
силами, такими, как ван-дер-ваальсовы силы или силы водородных связей;
из-за большой массы прикрепленной молекулы будет наблюдаться появле-
ние довольно тесно расположенных колебательных уровней, и, стало быть,
переход от тесно расположенных вращательных уровней к колебательным
не будет слишком резким. Ктому же, энергия первого колебательного уровня
неравна нулю, а описывается выражением

1	. 2?

2	2эт V т ’

где к' — силовая константа, ат — величина колеблющейся массы, поэтому
этот уровень будет лежать достаточно низко и будет хорошо согласовываться
со значениями вращательной энергии. В-третьих, для уменьшения ограни-
чений, накладываемых обсуждаемыми правилами отбора на переходы моле-
кулы отвращения к колебаниям,требуются большие значения АЕ, т. е. боль-
шие ширины линий, которые следуют из принципа неопределенности.
Затронутые выше проблемы, обрисованные нами, разумеется, лишь
в самых общих чертах, позволяют присоединиться к высказыванию Сцент-
Дьёрдьи о важности создания субмолекулярной биологии.

14.	Образование рибосом. Серьезным пробелом в наших знаниях о цик-
ле клетки, в котором генетическая информация, заключенная в ДНК,
через РНК используется для синтеза ферментных белков, служит раздел,
относящийся к синтезу РНК на ДНК. Почти наверняка в ближайшем
будущем мы получим значительно больше сведений о процессе образования
РНК на ДНК или на самой РНК. Однако сейчас наши знания весьма бедны,
^особенно в отношении самого механизма, при помощи которого ДНК опре-
деляет синтез специфической РНК- Фермент, катализирующий синтез поли-
рибонуклеотидов, был найден Очоа с сотрудниками. Этот фермент оказался
очень полезным при получении синтетических материалов для биофизиче-
ских исследований. Тем не менее ясно, что какое-то важное звено еще не най-
дено. Но несмотря на недостаток сведений, мы можем, оценив скорость образо-
вания рибосом, обсудить возможность того, что белок и РН К синтезируются
в разных местах и затем мигрируют друг к другу, объединяясь в рибосомы.

Так как в клетке содержится 104 рибосом и промежуток времени между
делениями клетки равен 1200 сек, то можно принять, что рибосомы образуют-
ся со скоростью 10 рибосом в 1 сек. Предположим, что в клетке на поверхно-
сти ядра образуется 10 молекул РНК в 1 сек. Попробуем подсчитать, какой
должна быть концентрация белка, чтобы обеспечить образование рибосом
со скоростью 10 рибосом в 1 сек. Количество молекул белка, приходящихся
на одну молекулу РНК в рибосоме, можно считать равным 10; в рибосоме
количества белка и РНК равны, а размер белковой молекулы приблизи-
тельно в 10 раз меньше размера молекулы нуклеиновой кислоты. Таким
образом, за 1 сек с 1 молекулой РНК должно соединяться 10 молекул белка.
Используя уравнение (15.4) и подставляя §= 1 и т]=1, находим

10= 1,4-10~14со, с0 = 7-10м,

т. е. в клетке для обеспечения необходимой скорости образования рибосом
должно быть около 700 молекул белка. Полученное значение вполне разум-
но. Если, однако, предположить, что д значительно меньше единицы, т. е. что
большая часть столкновений не эффективна, то клетка должна обладать
способностью накапливать белковые молекулы до концентрации, необхо-
димой для обеспечения нужной скорости. Вопрос о специфичности связы-
вания белка с РНК при образовании рибосомы, очевидно, весьма важен.
Вполне возможно, что этот процесс вовсе не специфичен.

15.	«Дальнодействующие» силы. Из того, что было сказано выше, для
читателя должно быть ясно, что очень желательна некоторая направлен-
ность сил, действующих между молекулами и активными центрами фермен-
тов. Многие биологи внутренне убеждены, что в один прекрасный день будут
найдены «дальнодействующие» силы. Физики же пока не допускают мысли
о существовании таких сил и появляющиеся время от времени сообщения
об их существовании встречают очень скептически. В наших предыдущих
рассуждениях мы также исходили из того, что таких сил не существует.
Возможно, мы были слишком строги. Обычные электростатические силы
действуют на довольно большие расстояния, но мы их отбросили, поскольку
их нейтрализует действие ионов противоположного знака. Однако возмож-
но, что ионная оболочка вблизи синтезирующейся молекулы РНК в опреде-
ленных условиях уменьшается. В этом случае электрические силы могли бы
способствовать приближению нужной молекулы, что существенно увели-
чило бы эффективный объем мишени для специфического соударения. По-ви-
димому, будет возможно поставить эксперименты для выяснения, так ли это
на самом деле, особенно когда бесклеточные системы синтеза станут более
доступными в лабораториях.

Лондоновские и ван-дер-ваальсовы силы хотя и не являются дально-
действующими, тем не менее благодаря свойству аддитивности могут обес-
печить слабое, но вполне заметное влияние одной молекулы на другую.
Измерение величин ван-дер-ваальсовых сил, действующих в клетке, имело
бы большое значение для оценки их роли в синтетических процессах.

В этой связи очень интересно рассмотреть чисто гидродинамические
следствия того, что каждую секунду 200 аминокислот уходит из среды и кон-
центрируется в области, площадь которой, вероятно, не больше 100 А2.
Скорость потока равна приблизительно 10 А в 1 сек; она слишком мала для
того, чтобы вызвать какие-либо изменения. Если бы по какой-либо причине
скорость синтеза была выше (например, если бы синтез осуществлялся одно-
временно малым числом рибосом), то, несомненно, вблизи определенных
мест возникало бы направленное течение жидкости, которое обеспечивало бы
доставку аминокислот с необходимой скоростью. Как обнаружить движения
жидкости в бактериальных клетках,— вот та экспериментальная проблема,
которая еще ждет своего разрешения.

16.	Клеточное деление. В начале этой главы мы выделили клеточное
деление в отдельную тему. В этой области все еще очень мало надежно уста-
новленных данных, годных для биофизического анализа. Мы можем тем
не менее коротко обсудить этот вопрос. Процесс дифференцировки, о кото-
ром также упоминалось, здесь рассматриваться не будет.

Все факты говорят о том, что процесс деления клетки во многих отно-
шениях отличается от уже описанных. Этот процесс наиболее чувствителен
к действию ионизирующего излучения, тогда как, например, процесс син-
теза клеточных мембран и оболочек устойчив к нему, о чем говорит появле-
ние после облучения гигантских клеток. Мы можем, следовательно, пред-
положить, что постоянное увеличение цитоплазматической мембраны обес-
печивается за счет описанного ранее процесса роста. Эта мембрана в свою
очередь играет определенную роль при образовании клеточной оболочки.
В момент, когда последняя пара оснований ДНК «проходит» через полиме-
разу, обе нити оказываются полностью разделенными на очень короткий
момент времени. Новые цепи ДНК должны «найти» себе новые полимеразы.
Этот процесс может длиться всего несколько секунд, но он дает возможность
разделиться двум ядрам. Мгновенное прекращение синтеза приведет к боль-
шому числу изменений: изменится местная температура, будут накапливать-
ся трифосфаты, все регулярные движения могут прекратиться или изме-
нить свою форму. Это вызовет изменения, затрагивающие всю клетку.
Можно предположить, что в этом состоянии синтез мембран преобладает
над всеми другими процессами роста. Это приведет к сморщиванию мембра
ны, причем складки могут быть направлены только внутрь клетки из-за
сдерживающего действия оболочки. Продолжая расти внутрь, складка
соединится; образуются две раздельные цитоплазматические мембраны.
Клеточная оболочка, которая также непрерывно синтезируется, начинает
расти вдоль цитоплазматических мембран внутрь и полностью разделяет
клетку на две части, после чего происходит отделение двух вновь образо-
вавшихся клеток друг от друга.

Фиг. 256 поясняет изложенные соображения. Мы хотим подчеркнуть,
что схема приведена единственно с тем, чтобы дать толчок размышлениям
в этом направлении, которые, наверное, приведут к созданию лучшей схемы
явления. В этой связи мы процитируем высказывание Робертса по поводу
различных моделей, предложенных группой Карнеги. Он пишет: «Такие
модели приносят значительную пользу, поскольку они связывают большое
число фактов, казалось бы не имеющих отношения друг к другу, и дают
идеи постановки новых экспериментов. На этой стадии модель следует

□ Белок

Функционирующая

*----1 рибосома

Складывающаяся
рибосома

Большая молекула
рибосомной РНК

Незаконченная

*—1 рибосома

Аминокислоты

*. ;< и другие низка-
’  ’ молекулярные вещества

Фиг. 256. Гипотетическая модель Е. соН, в которой используются
некоторые идеи относительно структур и процессов.

Слева — часть клетки во время деления, справа — вид клетки во время нор-
мального роста. Предполагается, что имеются два типа рибосом: одни прикреп-
лены к мембране и осуществляют синтез белка, а другие, только что образо-
вавшиеся, находятся в свернутом состоянии и имеют сферическую форму.
В правой части изображены полимеразы, осуществляющие синтез ДНК и РНК-
Мы изобразили их довольно длинными в соответствии с представлением, что
зона синтеза движется вдоль поверхности фермента н что перемещения самого
фермента не происходит.

считать удачной, если она не противоречит известным фактам и является
эвристической, хотя совсем не обязательно, чтобы она представляла собой
точное изображение живой клетки».

17.	Заключение. Наши рассуждения по проблемам теоретической био-
логии представляют собой смесь тривиальных и довольно глубоких сообра-
жений. Тривиальных в том смысле, что всякий, у кого хватит терпения
собрать численные данные о клетке, ее составе, размерах, скорости роста
и т. д. и у кого появится желание поразмыслить над природой клеточных
процессов, сможет повторить, расширить и изменить сказанное нами в этой
главе. Занятия подобного рода увлекательны и приносят удовлетворение,
и мы надеемся, что наш пример вдохновит других заняться работой в этом
направлении. То глубокое, с чем мы имели дело в этой главе, привнесено
неизобретательностьюфизика и тонкостью математической интуиции, а идет
от самой природы. Полным глубокого значения и неизбежным представляет-
ся то, что красоту, согласованность и порядок неживой природы превосхо-
дят своей гармонией лишь развитые формы живых существ. Вход в мир про-
цессов, происходящих в живой клетке, с его удивительной красотой и упо-
рядоченностью лежит, особенно для физика, через численное описание.
Попытайтесь заглянуть в этот мир, и он проступит через страницы рисунков,
наброски моделей и поднимающиеся струйки дыма в аудиториях для семи-
наров. И потому, что обязательно наступит день, когда теоретическая моле-
кулярная биология станет общепризнанной и общепринятой наукой о живой
клетке и ее поведении, а ее выводы будут, безусловно, отличаться удиви-
тельной красотой и стройностью, биофизики испытывают глубокое побуж-
дение продолжать свои первые, пусть пока не очень уверенные, попытки
построить картину явлений, происходящих в живой клетке.

«Имеющий глаза, да увидит». Глаза биофизика — это рентгенострук-
турный анализ, хроматография, анализ с применением центрифуг, щелчки
гейгеровского счетчика, бляшки на агаре, цифры расчетов, химеры полу-
фантастических моделей, и мы горячо верим, что эти глаза могут видеть.

ОБЩАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.	V е г ту е у Е. 3. IV., О у е г Ь е е к Л. Тк. О., Тке ТЬеогу о! !ке 8!аЫИ!у о!
БуоркоЫс Со11о1дз, Е1зеу1ег РиЬНзЫп^ Со., 1пс., Нету Уогк, 1948.

2.	Ц г и у ! Н. К., ед., Со11о1д 8с1епсе, уо1. I, Е1зеу1ег РиЫ1зк1п§ Со., 1пс., Ией?
Уогк, 1952.

3.	Бо1!11е1д К. В., «Тке В1озуп!кез1з о! Рго!е1п», Рго§. Вюркуз. апд Вюркуз.
Скегп., 8, 348 (1957).

4.	Нис1ерго!е1пз. 1 Ик 8о1уау СопГегепсе, 1п!егзс1епсе РиЫ1зк1п§ Со., Нету Уогк, 1960.

5.	КогпЬег^ А., «В(озуп!кез1з о! ВеохупЬопис1е1с Ас1д», 8с1епсе, 131, 1503
(1960).

6.	8 г е п !-С у о г § у 1 А., 1п!годис!1оп !о а 8иЬто1еси1аг В1о1о§у, Асадеппс Ргезз,
Нету Уогк, 1960.

7.	М а ) о г 1 е Л. V., «Уап дег Шаак АИгасНоп ВеНуееп Ап18оте!г1с Раг!1с1ез>,
Л. СоИ. 8с1„ 9, 451 (1954).

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

8.	В 1 п ! 2 1 з Н. М., В о г 8 о о к Н., V 1 п о § г а д Л., 1п МКгозота! Раг11с1ез
апд Рго!е1п 8уп1кез18, Регратоп Ргезз, Меху Уогк, 1958.

9.	М с О и 1 1 1 е п К., Ко Ь е г ! з К- В., Вг И (еп К. Л., Ргос. На!. Асад. 8с1.,
45, 1437 (1959).

10.	Н о а § 1 а п д М. В., т Тке Нис1е1с Ас1дз, уо1. III, ед. Ьу Е. Скаг§а11 апд
Л. Н. Вау1дзоп, Асадегтс Ргезз, Н. У., р. 349 (1960). (Нуклеиновые кислоты
стр. 291, М., ИЛ., 1962.)

11.	С г 1 с к Р. Н. С., 8ушр. 8ос. 1ог Ехр. В1о1., 12, 138 (1958).

12.	8!го!кег С. К., Аскегтап Е., В1оск1т. е! Вюркуз. Ас1а, 47, 317 (1961).

13.	С о 1 1 1 п з Р. С., К 1 т Ь а 1 1 С. Е., Л. СоИ. 8с1., 4, 425 (1949).

14.	О у е г к е е к Л. Тк. С., 1п Со11о(д 8с1епсе, ед Ьу Цгиу!, Е18еу1ег РиЬНзкш^ Со.
1пс., Иеху Уогк, 1952.

15.	Р о 1 I а г д Е., Л. Ткеог. В1о1. (1961), 1п ргезз.

16.	К а у 1 е 1 § к, 8с1еп!1Пс Рарегз, уо1. 6, СатЬпдз’е ОшуегзПу Ргезз, рр. 604—626
(1920).

17.	Скапдгазеккаг 8., Кеу. Мод. Ркуз., 15, 2 (1943).

18.	М а г т и г Л., Б а п е В., Ргос. На!. Асад. 8сБ, 46, 452 (1960).

19.	В о I у Р., М а г т и г Л., Е 1 § п е г Л., 8 с к 1 1 д к г а и I С., Ргос. На!.
Асад. 8с1„ 46, 461 (1960).

20.	8 е I 1 о XV Л. К., 8 е ! 1 о ту К- В., Ргос. На!. Асад. 8с1., 46, 791 (1960).

21.	Б и г 1 а 8. Е., Со1д 8рг(п§ НагЬог 8утроз1а Оиап!. В1о1., 16, 463 (1951).

22.	Ко Ь е г ! з К. В., М с О и 1 1 1 е п К., К о Ь е г ! з I. 2., Апп. Кеу. М1сго-
ЫоБ, 13, 1 (1959).

23.	Б е у 1 п ! к а 1 С., С г а п е Н. К-, Ргос. На!. Асад. 8сБ, 42, 436 (1956).

24.	С 1 е г е г А., М и п д г у К. IV., На!иге, 182, 1457 (1959).

25.	Н о у 1 с к А., 8 г 1 1 а г д Б., Ргос. На!. Асад., 8сБ, 36, 708 (1950).
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗА! ЕЛЬ

Агенты диффундирующие 279—281

Аденин 30

Аденозинтрифосфат 375, 376

Азот-15 369

Аксон 393

Актин 375

Актомиозин 375

Аланин 27

Аминокислоты 26, 27

Антиген 155

Антитело 155

Апертура числовая 322

Аргинин 28

Атом 16

— водорода 162

— водородоподобный 164

— модель Резерфорда — Бора 17, 136

— уровни энергии 162

Бактериофаг 37

Бактерия 302, 310

Белки глобулярные 118

—	инактивация 236

—	кажущийся удельный объем 78

—	колебательные спектры 174

—	молекулярный вес 28

—	окисление 45

— отношение дихроическое 183

— синтез 20, 27, 408

— ультрафиолетовые спектры погло-
щения 191

— фибриллярные 115

Биосинтез 27

Биофизика, история 13

Бит 63

Больцмана множитель 51

— постоянная 51

— распределение 52, 84

Брэгга закон аддитивности 261

— условие 104

Вакуоль 19

Валин 27

Взаимодействие обменное 139

Вирусы 36, 297—303, 360

— бактериальные 39, 40,	360

— геометрическая форма 40

— животных 37, 40

— насекомых 37, 40

Вирусы растительные 37, 40

— структура 130

Витамины 333

— синтез 46

Вода связанная 77, 78, 87, 88

Волокно миозиновое 21

	— мышечное 373

—	— кристаллическая структура 382

—	— молекулярное строение 377

Выход квантовый 224, 235, 238, 239

Гальвани опыт 13

Гаптены 157

Гены 36, 421

Гепарин 32

Гетерохроматин 19

Гидроксиметилцитозин 29

Гидроксипролин 28

Гипотеза «сплетенных пальцев» 383

386

Гистидин 28

Глаз 396

Гликоген 32

Глицин 27

Гольджи аппарат 20

Гомогенат клеточный 24

Гормоны 33

Гранулы зимогеновые 20

—	рибосомные 20

—	секреторные 20

Движение броуновское 424

Двойной слой, момент 418

Дебая — Гюккеля теория 151, 417

— — параметр 418

Дейтерий 368

Денатурация 211

Дендрит 392

Дзета-потенциал 418

Диполь 142

— индуцированный 145, 150

— ориентация 181

— переходной 146

Дифракционная решетка, амплитудная

335

— — фазовая 337

Диффузия 74

— в клетке 411, 412, 414, 416

— вращательная 94

— коэффициент 75, 79, 82, 94

— уравнение 79, 411
Диффузия, граничные условия 80

ДНК 19, 28, 129

— синтез 34, 424

Дозиметрия 266

Дыхание клеточное 22

Железо-55 370

Железо-59 370

Зрение, квантовая природа 399

Излучение ионизирующее 256, 257, 292

— — действие на бактерии 302

— — — — клетки 256, 272

—	— — — молекулярные системы
268, 271, 277

—	— — — организм человека 289

—	— — — хромосомы 285

— — трименение для изучения клет-
ки 292

---— — — вирусов 297—302

— рентгеновское, дифракция 100, 103

—	— коэффициент поглощения 100

—	— монохроматическое 101

— — поглощение 100, 102

—	— рассеяние 100

—	— сплошной спектр 101

—	— характеристический спектр 101

— ультрафиолетовое поляризованное
194

— электромагнитное 161, 163

— — поглощение 163, 173, 174

—	— поляризованное 169

—	— — поглощение 185

Изображение, контраст 323, 325

—	теория образования 335

Изолейцин 27

Изоморфного замещения метод 119

Изотоп 346

Инактивация 236

—	сечение 236

—	тепловая 59, 211

Индикатор йзотопный 346, 352

Инсулин 120

Интеграл ошибок 81

Информация, количество в молекуле бел-
ка. 63

—	— — бактериальной клетке 66

—	перенос 38

—	теория 44, 62

Ионизация у-лучами 264

—	нейтронами 264

—	потеря энергии 259—261

Камера ионизационная 267

Кератины 122, 123

Кислород-18 369

Кислота аспарагиновая 27

—	гиалуроновая 32

—	глутаминовая 27

—	нуклеиновая 28

Кислота аспарагиновая, дихроическое от-
ношение 183

— — инактивация 236, 240

— — ультрафиолетовые спектры погло-
щения 191

Клетка 19

—	бактериальная 20

—	— жгутики 21

—	— проницаемость 352

—	— реснички 21

—	— химический состав 25

—	действие ионизирующего излучения
256

—	деление 33, 36, 429

—	диффузия материала 48, 414

—	животная 14

—	молекулярный состав 24

—	оболочка 21

—	распад 48

—	растительная 19

—	 рост 33, 34, 404

—	— роль диффузии 34

—	синтез 48

—	температура 49

—	энергетический обмен 46

Колбочки 398

Комптон-эффект 265

—	сечение 265

Конкуренция изотопная 355

Константа равновесия 53

Конъюгация у бактерий 39

Коэффициент дыхательный 44

Кристалл 105

—	апериодический 421

—	структура 105

—	элементарная ячейка 105

Кристы 22

Панде фактор 196

Лейцин 27

Лизин 27

Линия слоевая 109

Липиды 31

Лучепреломление двойное 96, 328

"Лагнетон Бора 196, 198

Марша — Бэнделла фактор 375

Мейоз 34

Мембрана клеточная 23, 387

-— — емкость 388, 394

— — электрические явления 389, 391

Метаболизм 46

Метионин 27

Меченых атомов метод 33

Микрокалориметрия 46

Микроскоп 315

—	глубина резкости 324

—	интерференционный 331

—	поляризационный 325, 327

—	световой 316, 318

—	— разрешение 318

— — увеличение 315

— ультрафиолетовый 323, 329

— фазовс -контрастный 334, 338

— флуоресцентный 325, 326
Микроскоп электронный 316, 340

— -— аберрации магнитных линз 323

— — разрешение 318, 323

— — числовая апертура 323, 324

Микроскопия электронная 21, 340

Микросомы 20, 22, 23

Миллеровы индексы 107

Миоглобин 120

Миозин 375

Миофибриллы 374

Митоз 34

Митохондрии 19, 20, 22, 202, 375

Михаэлиса константа 206

Михаэлиса — Ментен теория 205

Мишени теорйя 272

Молекула, активированное состояние 56

—	- внутренние магнитные поля 195

—	вращение 165

—	- дипольный момент 169

—	диффузия 74

—	длина 96

—	колебания 47, 50, 57, 164, 169

—	— нормальные 170

—	масса 76

—	миграция энергии 47

—	молекулярный вес 76

—	момент инерции 166

—	определение размеров и формы 70, 88

—	поляризуемость 145

—	спектры вращательные 165

—	— колебательные 166

—	— электронные 186, 189

-	— среднее квадратичное смещение 72

—	степень жесткости 97

—	структура 98, 112, 134, 161

—	уровни энергии 164

—	физические методы исследования 71

Молекулярных орбит метод 142

Монохроматор 227

—	призменный 229

—	с решеткой 229

Мышца 373, 378

—	биофизика 380

—	биохимия 374

— волна деполяризации 378

—	модуль Юнга 385

—	напряжение 385

—	теплота восстановления 379

—	— поддержания 379

—	—покоя 379

—	— сокращения 379

— —- укорочения 379

Натрий-22 369

Натрий-24 369

Нейрон 392

Нейтрино 346

Нейтроны быстрые 265, 266

— медленные 265, 266

— поглощение 265

Неопределенности принцип 135

Нерв 387, 392

— кабельные свойства 395

Нуклеиновые кислоты, структура 126

Нуклеозиды 29

Нуклеопротеиды 129

Нуклеотиды 29

Оболочка миелиновая 393

Образование пар 265

Органической эволюции принцип 16

Основания 29

Осциллятор ангармонический 168

— гармонический 166

—	— правила отбора 167

—	—• частота 167

Отбор специфический 409

Отношение дихроическое 183

Палочки 399

Параметр состояния 49

Паули принцип 16, 17, 137, 346

Переход безызлучательный 188

Перимизий 373

Пиримидины 29

Плотность оптическая 179

Поглощение, коэффициент 176

—	— молярный 179

—	полоса 178

—	сечение 176

— тонкая структура спектров 164, 193

Подвижность 118

Поколение бактерий, время жизни 35

Полинуклеотидная цепь 29

Полипептидная цепь 26, 122

—	— структура 120

Полисахариды 32

Пролин 28

Противоионы 151

Протоплазма 26

Протопласты 21

Профаг 39

Пуассона распределение 249

—	уравнение 152

Пурины 30

Равновесия седиментационного методТ84

Радиоавтография 362

Ранвье перехваты 393

Распад радиоактивный 347

—	— постоянная 347

Рассеяние комбинационное 173

Раствор, ионная сила 154

Реакция, теория абсолютных скоростей 55

—	ферментативная 202

—	— температурная зависимость ско-
рости 202

Резонанс магнитный ядерный 198

—	парамагнитный 164

—	— электронный 195

—	химической связи 142

Рентген 264

Рентгеноструктурный анализ 100, 431

Репликация 423

Рибоза 30

Рибосомы 23, 409, 428

РНК 19, 28

Ротатор 165
Ротатор правила отбора 165

Рэлея критерий 320

Сарколемма 374

Саркомера 374

Саркосома 375

Саркоплазма 374—376

Сахара 30

—	фотосинтез 19

Свет, взаимодействие с веществом 224

—	действие на живые организмы 223

—	— — дыхательные ферменты 241

—	интенсивность 230

—	источники 226

—	поглощение 224

Связь, богатая энергией 48

—	ван-дер-ваальсова 49, 142

—	водородная 49, 149

— — межцепочечная 129

—	ионная 140

—	ковалентная 49, 138

—	прочная 13, 48

— слабая 134, 142

—	фосфатная макроэргическая 47

—	характеристические частоты 171

Седиментация 82

—	константа 86

—	скорость 84, 86

Сера-35 370

Серин 27

Сетчатка 397

—	биохимия 401

Силы внутримолекулярные 134

—	дальнодействующие 428

—	дисперсионные 147, 148

—	Лондона 147

—	межатомные 47

—	межмолекулярные 134

—	ядерные 347

Скорости седиментации метод 84, 86

Состояние синглетное 137, 187

—	триплетное 138, 187

Спектры действия 224, 233

—	— теория 234

Спектрофотометр 180

а-Спираль 123

Сплетенных пальцев гипотеза 383, 386

Стокса закон 76

Столкновения случайные 409, 410

Структура вторичная 100, 134, 150

—	первичная 100, 150

—	складчатая 122

—	третичная 134, 150

Сумма состояния 52

—	статистическая 52

Схемы пересчетные 351

Счетчик Гейгера—Мюллера 349, 350

—	пропорциональный 349, 350

—	сцинтилляционный 349

Сэнджера метод 99

Теневой метод 90

Теплота реакции 61

Термобатарея 230

Термодинамика 43

—	второй закон 43

—	необратимых процессов 49

—	первый закон 43

Тимин 30

Тирозин 28

Трансдукция 39

Трение, коэффициент 72, 88

— сила 72

Треонин 27

Трипептид 27

Триптофан 28

Тритий 368

Тропомиозин 375

Углерод-13 369

Урацил 30

Уровень энергетический 51

—	— электронный 186

Фаг 248

Фактор структурный 113

Фенилаланин 28

Фермент 28, 202

—	адаптивный 36, 359

—	— индукция 359

—	механизм действия 220

—	минимальный размер молекулы 221

—	окислительный 20, 202

—	специфичность 216

—	строение 211

Фермент — субстрат (комплекс) 205, 206,

216, 218, 219

Фика закон 75

Фильтр интерференционный 228

Флуоресценция 188

— сенсибилизированная 246

Фосфаты 31

Фосфолипиды 32

Фосфор-32 369

Фосфор-33 370

Фотон 161

Фотореактивация 253

Фотосинтез 19, 244

Фотоумножитель 23

Фотоэлемент 231

Фотоэффект 264

—	сечение 264

Фракционирование' 24

Франка — Кондона принцип 188

Функция волновая 137

—	термодинамическая 49

Хилла реакция 245

—	характеристическое уравнение 379

Хлоропласты 19, 399

Хлорофилл 244

Хроматография 354, 431

Хромосомы 21, 36, 285—288

—	срастание 36

Центр активный 213

Центрифуга аналитическая 88, 431
Цистин 28

Цитозин 29

Цитоплазма 19, 21

Число заполнения 51

—	квантовое 162

—	— вращательное 165

Шредингера волновое уравнение 137

Экстракты бесклеточные 24

Электрон в ящике 190

—	вторичный 276

—	магнитный момент 195

Энергия взаимодействия 135

—	внутренняя 51

-	— закон сохранения 13, 14, 44

Энергия конфигурационная 47

—	миграция 47, 224

—	передача в клетках 46

—	— в молекулярных системах 47

—	свободная Гельмгольца 53

—	Гиббса 54, 57, 58

—	связи 139

Энтальпия 58

Энтропия 43, 54, 59, 60, 62

Эпимизий 373

Эффект кислородный 272

Эффективность квантовая 235

—	относительная 235

Ядро атомное, строение 346

—	клетки 19

—	— оболочка 21

Ямка центральная 398
ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие к русскому изданию...	5

Дополнительный список рекомендуемой литературы на русском языке 6

Предисловие автора .................................	» » . .	9

Глава I. Физика и биология .	.......... . .	.	11

Глава II. Живая клетка с точки зрения биофизика .	. .	....	19

Глава III. Энергетические и статистические закономерности в живой
клетке ..................................................... 43

Глава	IV. Физические методы определения размеров и формы молекул	70

Глава	V. Рентгеноструктурный анализ биополимеров.......... 99

Глава	VI. Внутримолекулярные и межмолекулярные силы....... 133

Глава	VII. Спектры поглощения и строение молекул......... 161

Глава	VIII. Ферменты.....................   202

Глава	IX. Спектры действия и квантовые выходы.......... 224

Глава	X. Действие ионизирующего излучения на компоненты клетки	256

Глава	XI. Применение ионизирующего излучения для изучения строе-
ния клетки 	 292

Глава	XII. Микроскопы ....	    315

Глава	XIII. Изотопные индикаторы................. 346

Глава	XIV. Молекулярная биофизика и изучение мышц, нервов и глаза	372

Глава	XV. Физика клеточных процессов........-	404

Предметны йуказатель .........................................432
Р. Сетлоу, Э. Поллард

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

Редакторы А. Б. Левина и Е. П. Ребиндер
Художник Б. В. Трифонов
Художественный редактор Н. В. Зотова
Технический редактор Т. Л. Сухорукова

Сдано в производство 227X1 1963 г.

Подписано к печати 31/1П 1964 г.
Бумага 70Х1081/1б=13,9 бум. л

38 печ. л., в т/ч 2 вкл.

Уч.-изд. л. 34. Изд, № 4/2190

Цена 2 р. 59 к. Зак. 1168

ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»

Москва, 1-й Рижский пер., 2

Московская типография №16
«Главполиграфпрома»

Государственного комитета
Совета Министров СССР по печати
Москва, Трехпрудиый пер., д. 9
Фиг. 62. Оптическая имитация рентгенограммы
спирали с шестью структурными единицами
на виток [20].
Фиг. 63.

А — рентгенограмма слегка растянутого коллагена, выделенного из сухожилий
крысиного хвоста. Видна тонкая структура максимумов, соответствующих ма-
лым углам. Б — электронная микрофотография коллагена, окрашенного
фосфовольфрамовой кислотой. X 125 000. Период равен 640 А.
Фиг. 228. Фазово-контрастная микрофотография радиоавтографа коло-
нии Е. соН, полученной от одной клетки, сильно меченной тритированным
тимидином, при выращивании ее на нерадиоактивной среде.

Такое распределение трития среди клеток, по-видимому, объясняется тем, что лишь не-
большое число фрагментов ДНК сохраняет свою целостность при делении клетки.