Текст
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
МЕТАБОЛИЗМ И АНАЛИЗ
ТОКСИКАНТОВ
Под редакцией проф.
H.I/I. Калетиной
Учебное пособие
для вузов
CD
Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа»
СОДЕРЖАНИЕ
Пре u<c.ioRiie....................................................................7
Введение..........................................................................9
Глава I. Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение
в сфере обращения средств медицинского применения, клинико-токсикологического
анализа и судебно-химической экспертизы..........................................15
l.l. Poib Федеральной службы но naJ зору в сг|>срс здравоохранения и социального
развития (Росздравнадзора). Правовые и организационные аспекты.................17
I 2. Организация экспертизы средств медицинского применения....................22
1.3. Организация службы информации о побочных реакциях лекарственных средств
в РФ от фирм производителен, лечебно-профилактических учреждений и пациентов....26
1 4. Стандарт гания методов оценки побочных реакций лекарственных средств.....31
1.5. Правовое регулирова те и регламентирующие току менты в области клинико-
токсикологического анализа и службы судебно-химической эксперпгзы..............38
Глава 2. Классификация токсичных агентов и виды токсического действия............43
2 1. Некоторые понятия, определения, термины, используемые в токсикологии......43
2 .2. Что понимать под зависимостью «етруктура-гокспчиость»0 ... ........... 47
2 .3. Тины классификаций токсичных агентов................................. 53
2 4. Виды токснчност..........................................................56
2.4.1. Понятие о биологических маркерах.... .............................. 56
2.4.2. Гепатотоксичность....................................................59
2.4.3. Гематотоксичиость.................................................. 70
2.4.4. Нефротоксичность......... .......................................... 82
2.4 5. Дерматогоксичиосгь...................................................88
2.5. Понятие о способах детоксикации...........................................95
Глава 3. Некоторые аспекты молекулярной токсикологии; от генома к мстабоюму.......101
3.1. Молекулярные мишени - рецепторные комплексы. Классификация рецепторов
токсичности. Рецепторы, формирующие ионные каналы. Рецепторы, связанные
с G-протсинами. Рецепторы с тирозинкиназной активностью.................... 101
3.2. Механизмы токсического действия и межклеточной коммуникации. Токсиканты и
регуляция апоптоза..............................................................109
3.3. Взаимосвязь между токсикологией н геномикой. Генный но г и морфизм.
.Мегаболомика и мегабономика....................................................131
Глава 4. Метаболизм токсикантов и ш хсмобиокинетнка?......................... 148
4.1. Токсикокинстические характеристики.......................................149
4.2. Абсорбция (резорбция) и распределение токсикантов .......................160
4.3. Ьнотрансформация.........................................................177
4.4. Выделение токсикантов из организма...................... ... .......... 191
4.5. Вторичный метаболизм.....................................................197
Глава 5. Методология химико-токсикологического анализа........................ .200
5.1. Основные направления, пели и задачи химико-токсикологического анализа .. . 200
5.2. Взаимосвязь между этапами анализа (отбор пробы, ее подготовка к анализу.
выбор методов анализа) и интерпретацией результатов исследования ....203
5.3. Взаимосвязь между содержанием токсиканта в анализируемом объекте
и иигерпрсеацией результатов исстелования................................... 215
5.4. Взаимосвязь между способами пробополготонки биообъекта и интерпретацией
результатов анализа. Способы изолирования.................................... 222
5.5. Особенности химике-токсикологического анализа при диагностике острых
отравлений ................................................................. 239
Содержание 5
5 6 Особенности химико-токсикологического анализа при определении наркотиков.242
5.7. Особенное।и интерпретации результатов химико-токсикологического анализа .250
5.8 Обеспечение качества и надлежащая лабораторная практика (нрнниины GLP
в современной лаборатории). Виелренис системы валидации и квалификации
в лаборатории... . ..................................................... 253
Глава 6. Методы определения токсикантов в биоерсдах.............................264
6.1. Рекомендации Международного союза теоретической и прикладной
химии (ИЮПАК).................................................................264
6.2. Иммунохимические методы определения токенкянгов..........................280
6.2.1. Классификация и сущность иммунохимичсских методов............... .280
6.2.2. Принципы ноляри lauiioinioro ф. i оороиммуиоапа-шза.................289
6.2.3. Иммунохимпчсскис методы определения наркотиков и лекарств.......... 303
6.2.4. Иммунохимические методы определения пестицидов, гормонов, токсинов...315
6.2.5. Иммунохимические методы определения металлов и метал тосодержащмх
веществ................................................................ 321
6.3. Хроматографические методы определения токсикантов........................325
6.3.1 Классификация. термины и определения... ............................ 325
6 3.2. Хроматография в тонком слое сорбента................................339
6.3.3. Газовая хромато! рафия... ...................................... 355
6.3 4. Высокоэффективная жи (костная хроматография..... ......... ........38)
6.3.5. Капиллярный элект|юфорез.......................................... 393
6.3.6 Хромато) рафические метилы с масс-спектральным детектированием ......406
6 4. Оптические методы определения токсикантов ....... ... .. ... .. 436
6 4 1 Классификация. термины и определения.............................. 436
6 4 2 Молекулярная спектрометрия...........................................440
6.4.2 I. Спектрометрия в видимой и УФ-области спектра ..................440
6.4.2.2. Спектрометрия в ИК-обласгн спектра, Рамаи-спсктромстрия. ПК Фурье-
спсктромс|рия. ПИВО, МНПВО методы..................................... 455
6.4.3. Атомная спектрометрия и ядерные методы в элементном анализе токсикантов.
Применение комбинированных систем — ВЭЖХ-ИСП-МС. ГЖХ-ИСП-МС.
КЭ-ИСП-МС и гамма-резонансной спектрометрии в биомедицинских
нанотехнологиях............................................................486
6.4 4. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса Применение комбинированных
систем ВЭЖХ-ЯМР и ВЭЖХ-ЯМР-МС в мстаболомике и мстабономике............ .....509
6.5. Электрохимические методы определения токсикантов.................... ....523
Глава 7. Мстаболшм и определение наркотических средств, психотропных
и сильнодействующих веществ в биосубстрагах человека............................540
7.1. Наркотическая и лекарственная зависимость................................540
7.2. Нейробиологнческие основы наркотической и лекарственном зависимости......547
7.3. Основные группы наркотических средств, психотропных и сильнодействующих
веществ.......................................................................555
7.3.1. Опиаты и опиоиды....................................................556
7.3.2. Каннабиноиды................................................ 571
7.3.3. Фенилалкиламины.................................................... 579
7.3.4. Кокаин..............................................................586
7.3.5 Галлюциногены: ЛСД. пси.топин (псилоцибин). фенциклидин (РСР)........596
7.3.6. Другие контролируемые вещества......................................609
7.3.7. Барбитураты . 614
7.3.8. Производные 1.4-бензодиа тепина.....................................634
7.3.9. Нейролептические средства ......................................... 665
7.3.10. Тимолепгики и тимерегики (ангиденрессаты)..........................679
6 Содержание
Глава 8. Mcraooj нам и определение токсикантов различных химических групп
в биосубстратах человека.......................................................697
8.1. Экспертиза алкогольного опьянения..........................................697
8.2. Спирты. Алыгсгмды. Кетоны. Углеводороды. Галотенонропзводные углеводородов.722
8.3. Ядовитые газы...........................................................753
8.3.1. Оксид углерода (II)................................................753
8.3.2. Ссровоюрод. оксиды азота...........................................759
8.3.3. Цианистый водород и цианиды .......................................761
8.4. Пестициды...............................................................767
8.4.1. Классификация пестицидов...........................................767
8.4.2. Физико-химические свойства, метаболизм, токсичность................770
8.4.3. Методы определения.................................................786
8.5. Токсичные и эссенциальные элементы......................................797
8.5.1 Главные факторы токсичности металлов, их биологические мишени.
Металле 1игадгтый гомеостаз...............................................797
8.5.2. Выбор биообъектов для элементного анализа....................... ..820
8.5.3. Химико-токсикологические характеристики элементов............... Х29
8.5 4 Агшлигггческая диагностика профессиональных в экологически зависимых
заболеваний. вызванных действием металлов и металлосодержаишх соединений.<888
8.6. Кислоты, основания. анионы со. ей.......................................898
8.7. Фтор и его соединения............................................... 907
Примеры ситуационных задач................................................. 912
Глава 9. Допинговые средства..... ..................................... 929
Глава 10. Экогоксикатпы........................................................957
Глава 11. Биологическая опасность и биологический терроризм................... 979
H.I. Основные понятия........................................................979
11.2. Природные токсины источники, классификация, токсические
и фармакологические эффекты, хгетоды определения........................... 982
Рекомендуемая литература......................................................1009
Синеок основных сокрашеннн....................................................1013
ПРЕДИСЛОВИЕ
Проблема химической бсзонасности приобрела в наше время глобальное значение. Извест-
но. что общество способно успению про*нпостоять подобным угрозам. если есть возможность
быстрой и падежной диагностики новых отравляющих веществ. а также осуществлять мони-
торинг и профилактику состояния уже имеющихся проблем. Основным фактором, определи
юшим темны и объемы токсикологических исследований в мире, явчяйтся огромное количес-
тво химических веществ, ежегодно поступающих в обращение, многообразие их структур и
свойств, а также связанные с чтим риски
В последние голы значительно возросли требования к возможностям учреждений выпол-
нять на современном уровне развития аналитической техники и методологии бо ыние объемы
специализированных исследований различных но своей природе веществ в рамках сулебно-
химнчсских. клинико-токсикологических. антидопинговых. экологических, криминалистичес-
ких экспертиз, а также в области профпатологии. клинической фармакологии и др При этом
методы обнаружения, идентификации и количественного определения токсикантов постоянно
совершенствуются и усложняются.
Несмозря на осуществляемые в России многочисленные и во мззогом уникальные исследо-
вания в данных областях, публикации научных и методических работ в периодических издани-
ях крайне ограничены, после 1975 г. не было выпущено ни одного отечественного фундамен-
тального руководства для студентов по химико-токсикологическому анализу.
Предлагаемая читателю книга демонстрирует междисциплинарный подход к решению
многофакторных задач по определению гокенкянгов в биообъектах г>го коллективный труд
специалистов в различных областях биологии, химии и медицины применительно к цели и
задачам химико-токсикологического анализа. В кише рассмотрен широкий круч вопросов,
включающих организационные, правовые, методологические и методические аспекты химико-
токсикологического анализа, на современном научно-теоретическом уровне изложен материал
о методах проведения экспертизы наркозиков. лекарств, допингов, природных токсинов, мак-
ро- и микроэлементов, алкоголя, технических жидкостей, пестицидов, а также зачрязнителей
окружающей среды.
Учебное пособие написано четко и логично, хорошо иллюстрировано, содержит большой
информазнзонззызз и методический материал.
В первой части книги обсуждаются механизмы токсического действия ксенобиотиков (мо-
зску зззрные мишени — рецепторные комплексы), метаболизм токсикантов с учетом токенкоге-
нстических факторов, биомаркеры, технологии мстаболомикн н мстабономики. вопросы био-
безопасности Привспсзгы основные сведения о метаболизме мнознх токсикантов в организме
(резорбция из мест поступления, распределение, выведение. био рансформания). без знания
которых становятся невозможными корректная интерпретация результатов, выбор наиболее
информативного биообъекта для анализа. оценка накопления токсиканта в организме и др.
Большое внимание уделено методологии химико-юксико.югнчсского ашыиза. особен-
ностям интерпретации его результатов, а также обеспечению качества анализа, надлежащей
лабораторной практики (принципам GI.P н современной лаборагорни), внедрению системы
валидации и квалификации в лаборатории. Полностью отражено современное состояние ана-
итических исследований токсиказпов в биообъектах, представлены новые и самые разные
способы пробоподготовки биологических образцов, методы определения токсикантов в био-
8 Предисловие
средах различными аналитическими системами (ГХ-МС, ВЭЖХ-МС-ЯМР, ВЭЖХ-ИСП-МС,
ГХ-ИК-Ф\рье. ГРС. КЭ-МС-ИСП и др.).
Вторая часть книги иосвяшена вопросам метаболизма и метол м определения отдельных
трупп токсикантов, в том числе наркотических средств, психотропных и снлытодейе1вующих
вешеств. алкоголя. экотокенкантотз. мсталлосодсржаших соединении, природных токсинов н
др. Дается развернутая хнмико-токсиколот ичсская характеристика многих элементов. соедине-
ния которых могут быть использованы в качестве отравляющих веществ или вызывают токси-
ческое действие при загрязнении окружающей среты.
Впервые рассматривается применение химико-гоксиколот ическото анализа для диагности-
ки профессиональных и экологически зависимых заболеваний, освещаются вопросы хттмико-
токвтколот ическото анализа допинговых средств, а также вешеств. которые могут быть исполь-
зованы при биологическом терроризме. Приведены методы анализа этих тзсшеств.
Студенты и заинтересованные читатели могул проверить свои знания. решая приведенные в
книге ситуационные задачи. вю ючаюшис наборы спектральных, хроматографических, других
аналитических характеристик токсикантов и тестовые вопросы.
Очень важно, что книга имеет электронное приложение, в котором представлены норматив-
ные докхлтенты. информационные материалы. некоторые электронные ресурсы, материалы по
истории сганинления судебной химии в России, экспертные методики и примеры из эксперт-
ной практики пос синих лет ряда профильных лаоорзторзш г. Москвы, работающих в области
судебно-химического, судебно-медицинского. антидопингового. клиники-токсикологического
и крнминхтистического анализа химических веществ, а также приведены сведения об имею-
щемся в их распоряжении специализированном оборудовании.
Химико гоксикачогическис исследования в Российской Федерации имеюг давние традиции —
объективность, надежность и достоверность. II в этой связи следует особо отмстить высокий
теоретический уровень книги, который будет способствовать улучшению качества научных н
экспертных исследований и зкенертиз. проведенных согласно современной методологии хими-
ко-токсикологического анали за.
Кинта, безусловно, полезная и будет востребована не только студентами, обучающимися
по специальности «Фармация», но в равной степени и слушателями факультетов последип-
ломного медицинского и фармацевтического образования. специализирующимися в области
судебно-медицинской экспертной практики, экспертизы средств медицинского применения,
аналитической диат остики токсикантов. Профпаккюгии. токсикологической зколотии и дру
т их смежных специальностей.
Начальник Главною государственною центра
судебно-медицинских в криминалис ических экспертиз МО РФ
главный сутебио-мелиштнеквй эксперт МО РФ
доктор мед. паук, профессор В.В. К/мкутин
Зап Отделом химике токст колот нческнх
и судебно-химических научных и экспертных
исслсдотжний Ф1 У Р11СМЭ Росздрава
доктор фирм, нах к. профессор РУДИ E..W. Саюматин
ВВЕДЕНИЕ
Нашим любимым учителям
М.Д. Швайковой и Б.Н. Степаненко
носвяшастся
В XX веке человек, наконец, начал осознавать. что его здоровье во многом определяется
тем. что он ест. пьет, курит, вдыхает или вводит внутрь.
Ежегодно в мире синтезируется около 10' новых органических соединений Постоянно ус-
ложняются методы их обнаружения, идентификации и количественного определения. Перед
здравоохранением России стоят важные задачи по профилактике и течению заболеваний хи
мической этиологии, приобретающие принципиальный характер в связи с тем, что из п та в
год их причиной являются нс только известные, но и вновь синтезированные или введенные
в оборот всшества и их смеси.
Ьсз достижений в области химии, которые постоянно находятся в сфере внимания каждого
государства и всего мирового сообщества, нельзя себе представить ни одну из сторон жизни
современного человека, особенно касающихся медицины, сельскою хозяйства, строительства,
транспорта и т.д. В то же время постоянно расширяются списки и перечни веществ, оборот
которых ограничен или вообше запрещен. Примером этого являются перечни наркотиков,
списки допингов, используемых в спорте, или списки галогенсолержащих веществ, способных
воздействовать ня о тоновый слой планеты.
В результате научно-технического iipoipccca и биосфере циркулирует все большее чисто
различных чужеродных для человека и животных соединений, происходят существенные изме-
нения в организме человека, составе и качестве ниши, глобальные изменения в окружающей
среде. Эти изменения необходимо контролировать по многочисленным параметрам. что треох
ет постоянного совершенствования аналитических методов. Особую значимость приобретают
токсикологические исследования для установления степени влияния конкретного вещества
или совокупности вешесп! на состояние здоровья людей.
В современном российском обществе злоу тотребтение наркотическими средствами являет-
ся одним из наиболее актуальных вопросов медицины и социальной практики. Постоянный
рост немединниского потребления наркот ических средств, психотропных, сильнодействующих
и одурманивающих веществ приводит к росту числа острых отравлений от передозировки, не-
редко с летальным исходом
Перед специалистами. работающими в области фармации, и в частности химико-токсико-
логического анализа. стоит задача экспрессного и в то же время однозначного определения
широкого крута биологически активных соединений в разных, нередко кардинально отли-
чающихся друг от друга по своим свойствам и характеристикам объектах (например, судеб-
но-химическая экспертиза и диагностика профзаболеваний. клинико-токсикологическое
исследование и экспертиза алкогольного или наркотического опьянения и др.). Указанная
задача может решаться исключительно с привлечением нескольких современных мето юн ис-
следования. результаты которых взаимно дополняют и уточняют друг друга. Применение та-
ких аналитических систем, как газовая хромают рафия с масс-спектральным детектированием
(ГХ-МС). высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектра: ытым дегектирова-
10 Введение
пнем (ВЭЖХ-МС) или в комплексе с ядерно-магиитным резонансом (ВЭЖХ-МС-ЯМР), газо-
жидкостная хрома гография - Фурьс-спектрометрия в инфракрасной области (ГЖХ-ИК-ФС).
Раман- Фурье-микроскопия. индукгивно-спя шинам плазма — Macc-ciieKipoMeipiiH (ИСП-МС)
и других, позволяет получать информацию о содержании ультрзмикроколичеств гоксикалгов в
многокомпонентных бшмог ических образцах (матрице), причем нерезко в режиме реального
времени. Лтя исслеловапия влияния токсикантов, обладающих мутагенными свойствами. ис-
пользуют метлы молекулярной биологии и медицины.
В течение двух последних десятилетий активно внедряются принципиально новые техноло-
гии для исследования биообъектов. Например. высокопропхскпой скрининг (High-throughput
screening — HTS) уже сен гас позволяет проводить тысячи анализов в день, а технология мстг-
боломики и метэбономикп помогает усгановип. бномлркеры ряда заболевании или иигокеика
нии ксенобиотиками различной природы в режиме реальною времени.
Исторически сложи ось так. что в России судебную гокеикологикз называют сутебноп хи-
мией. Становлению судебной химии пре пиесгвова г длительный период проведения отлет иных
судебно-химических экспертиз и химических исследовании (XVI—XVII) Экспертизы прово-
дились от случая к случаю в аптеках, лишь в копие XVIII века были учреждены врачебные
управы, и введена должность штатного (|к1рмацсгзга для проведения химических ггсслслова-
нни и открытия ядов. Члены Петербургской академии наук выдающиеся ученые Н.Н. Зинин.
I L Ловиц. Д.И. Меня леев внесли значительный вклад в развитие химико-токсикологического
анализа как самостоятельного и уникальною направления аналитических исследований — опре-
деления токсикантов в биосретах.
Учебная дисциплина ♦Огкрьиис ядов», или (в современном понимании) судебная хи-
мия входила в курс фармации, преподававшийся на медицинских факультетах Московского.
Дерптского. Харьковского университетов и Медико-хирургической академии. Одним из
первых прог|гессорои химии на медицинском факультете Московского университета был
Л.Л. Иовский — воспитанник Московского университета, читавший на русском я зыке н пери-
од 1826 1843 гт. по сосг.иигеиным им самим руководствам лекции но фармакшгогни. репшну-
ре, токсиколог ни. обшей и аналитической химии в приложении к медицине. И з профессоров
медицинского факультета, принимавших личное участие в производстве судебно-химических
экспертиз и имеющих определенные заеду! и перед судебной химией, необходимо огмегмгь
воспигаииика медицинского факультета доктор.! медицины, химии и физики Н.Э Ляекопско-
го (1816—1871).
Предстакнгелем школы Н.Э. Лясковского является первый
профгессор кафедры медицинской химии в Московском универ-
ситете А.Л. Бульн инскин. давшим медицинскому факультету ряд
учеников и преемников, средн которых но биологической хп
мин был проф. В.С. Гулевич, а по органической химии проф.
А.В. Степанов Педагогическая и научная деятельность А.В. Сте-
панова протекала главным образом в двух областях органической
и судебной химии. А.В. Степанов написал около 100 работ, из
них три учебника (по аналитической. органической и судебной
химии), выдержавших много издании.
Мсдиппнскин фа улы-ет Московского университета многое
сделал для развития судебной химии, создания московской шко-
лы фармацевтом. из среды которых нышел проф. А.В. Степанов,
ставший впоследствии ведущим ученым в области отечествен-
ной судебной химии. Мironic из числа работавших в лаборатории
органической химии учеников А.В. Степанова возглавили само-
стоятслыгыс кафедры различных вузов: А.М. Кузин. Б.Н. Степа-
ненко. Н.А. Преображенский М.Н Щукина. В.Г. 1 сорт невский.
М.Д. Швайкова. М М Шемякин. А.Л. Курсаиов.
В лаборатории кафедры органической химии выросли нс толь-
ко гюбимые ученики, но и соратники А.В. Степанова застуженный деятель пауки РСФ( ’.
проф. МД. Ш Bari к иза и застуженный деятель науки РСФСР, проф Б.Н. Степаненко. которые
по представлению А.В Степанова заняли кафедры судебной и органическом химии (cooi-
Алсксаплр Васильевич
Степанов
Введение 11
Мария Дмитриевна
Шишкова
нсгственно) фармацевтического института. татем факультета 1-го
ММИ (сегодня ММЛ нм. И.М. Сеченова) и успешно руководили
этими кафедрами в течение 40 леи «Повторять слова учителя — не
значит быть сю про,голжателем. Надо помнить ту цель, к которой
шел учитель». — этими словами Д.И Писарева всегда напутство-
вал своих учеников ттроф. Б.Н Степаненко.
А.М. Бутлеров. В.В. Марковпиков. А.Д. Булыгннский. В.С Гу-
левич А.В. Степанов, М.Д. Шва Якова. Б.Н. Степаненко... Прямая
линия «учитель—ученик»... Нс рвется связь времен ..
В начале XX века началось создание сети судебно-медицинских
лабораторий с судебно-химическими отделениями при них. позже
бы. организован Государственный научно-исследовательский ин-
ститут судебной медицины М3 СССР (сегодня — ФГУ Российский
центр судсбно-мелттнтптской экспертизы Росздрава РФ), т ле рабо-
тали и до сих пор успешно работают ученики М.Д. Швайковой.
Большой вклад в развитие судебной химии «несли нссле-
довштия М.Д. Швайковой. а также ее соратников и учеников
А.П. Крыловой. А.Ф. Рубцова, Г.М. Моисеевой, А.А. Василт>евой,
А.В. Акутиной. Н.А. Горбачевой. Л.М Власенко и др. Обоб пе-
ние накопленных материя гов послужило основой для сот ания
МЛ. Швайковой учебника по судебной химии, выдержавшего
3 издания (в 1959. 1965 и в 1975 гг.). Учебник 1975 г. издания уже
имел другое название — «Токсикологическая химия».
Токсикологию сегодня определяют «как учение о токсичности
и токсическом процессе — феноменах, регистр зрусмых при вза-
имодействии химических веществ с биологическими объектами»
(С.А. Купенко). Известный русский фармаколог II П. Кравков на-
зывал фармакологию учением «о действии на организм вообще
всех веществ, способных в той или другой степени растворяться
в нем и всасываться». Почему по сути определения токсиколо-
гии и фармаколог ин так близки? Это связано с отсутствием строю
научного понятия «токсичное химическое вещество». Токсикант
(яд) — прежде всею категория количественная. «Яд — эго хими-
ческое вещество, которое в соприкосновении с живыми организ-
мами в определенных условиях среды обитания и в определенном
количестве способно оказывать повреждающее влияние на живые
организмы, вплоть до гибели» (С.А Куценко). Другие современ-
ные исследователи, как и сам автор определения, не считают его
строгим и полным.
При определении задач токсикологии и се роти в здравоохранении и охране окружающей
среды прежде всею исходят из той реальной ситуации в стране и мире, которая связана с гло-
бальным распространением разнообразных химических веществ и их применением практичес-
ки во всех отраслях хозяйства.
Нельзя не согласиться с мнением известных российских токсикологов Б.А. Курляндского и
В.А. Филона, чю «направления токсикологических исследований многообразны. и в их струк-
туре можно выделить следующие иерархические уровни
• Исследования влияния нсшсств на организм в зависимости от области обращения токси-
канта: нишевая токсикология. промышленная токсикология. лекарственная токсикозогия,
клиническая гоксикологтгя. судебная токсикология, токсикология пестицидов, экологичсс-
кая токсикология, токсикология природных токсинов (токсинология) и др.
• Исследования. связанные с изучением влияния химических веществ на функциональные
системы нммунотоксикология. поведенческая токсикология, токсикология сердечно-сосу-
дистой системы, токсиколо ия развития, токсикология желудочно-кишечного тракта, ток-
сикология печени, токсикология эндокринной системы, токсикология органов дыхания.
Борис Николаевич
Степаненко
12 Введение
почечная токсикология, токсикология репродуктивной системы, химический канцерогенез
и тл.
• Исследования отдельных групп вешеств. таких как микотоксины, лиоксииы. полихлори-
рованные мибензофураны. галогенированные углеводороды. тяжелые металлы, витамины,
микроэлементы и многие трутне».
Молекулярная токснкатоптя и токсикогеномика, а также новейшие нанотехнологии - ме-
габо томика и метабономика. являются приоритетными направлениями токсикологических
исследований. Каждое из направлений, решая свои узкоспециальные задачи, исполызует многочис-
ленные методы определения токсичных веществ в биологических матрицах и резульягаты химико-
токсико огического анализа. Поэтому успехи токсикологии тесно связаны с развитием аналити-
ческой базы исследований.
Приоритетные направления развития науки, технологий и техники в Российской Федера-
ции. утвержденные президентом страны В.В. Путиным 21.05.2006 г., предусматривают внедре-
ние индустрии нанотехноло и И для обеспечения безопасное! и живых систем. Использование
нанотехнологий многократно повышает возможности обнаружения и определения сверххтдлых
количеств различных токсикантов. Например таборатория на чипе (lab on a chip) или микроэлск-
тромеханическис системы (micro electro-mechanical systems — MFMS) и микрофт оиднка — управ-
ление потоками жидкое! и в микронных масштабах. Устройства могут быть помешены на по-
верхности кож I (для анализа вешеств. выделяемых с iioiom) или внутри организма (в полость
рта. желудочно-кишечный тракт, пол кожу или в мышцу).
Во всем мире, как и в России, постоянно растет потребность в квалифицированных кадрах
в области химико-токсикологического анализа. В современной России государсшо выделяет
огромные деньги на выполнение программы по борьбе со неупотреблением наркотиками,
экспертные лаборатории приобретают современное дорогостоящее оборудование. однако оглу-
шается дефицит молодых специалистов, выбирающих специальность эксперта в области хими-
ко-токсикологического аналт за.
В странах Евросоюза. США и Японии студенты. обучающиеся но специальности «Фарма-
ция», изучают в течение 2 семестров нс только ученную дисциплину «Токсикология*, включаю
щую основы химико-токсикологического анализа. но и спецкурсы, например «Биоаналитичсская
химия и токсикология». «Селективная токсичность». «Молекулярные аспекты токсикологии»
и др., входящие в обязаныьнуто нро!рамму. Согласно действующему в РФ учебному плану по
специальности «Фармация», студенты изучают методы определения токсикантов в биосредах
человека в рамках учебной дисциплины «Токсикологическая химия». Химико-токсикологичес-
кие исследования являются одним из инструментов токсикологии. экологии. проф! теологи и.
нарколо! ни. клинической фармакологии, а адекватный выбор объектов и методов исследова-
ния. iiniepiipciaiiHM шнглигических данных подразумевают знание основ токсикологии и фар-
макологии, серьезную химическую подготовку, высокий уровень обшебнологичсских знаний.
В связи с этим в настоящем руководстве наряду с обстоятельным описанием современ-
ных мсголов анализа. нх возможностей и недостатков приведены сведения и по некоторым
разделам токсиколотни. которые необходимы для правильного выбора объекта исследования,
определения времени, прошедшего с момента поступления токсиканта в организм, коррект-
ности интерпретации результатов, возможности прижизненной оценки содержания ток аканта
в организме, диагностики заболевании, вызванных действием врезного вещества.
Учебное пособие состоит из двух частей, включающих II глав. В первой части рассмат-
риваются система тосударственного контроля, организационно-правовое обеспечение в сфере
обращения средств мслтнтннского применения, клннико-токснкологического анализа и судеб-
но-химической экспертизы (глава I): классификация токсичных агентов, виды и биомаркеры
токсического де тсгння (Iлава 2). некоторые аспекты молекулярной токсикологии ( ива 3).
В книге обсуждаются молекулярные мишени — ренепторттыс комплексы, рецепторы, форми-
рующие ионные каналы. связанные с G-протеинами. с iпротиокиназной активностью, и ме-
ханизмы токсического действия, межклеточной коммуникации, регуляции апоптоза а также
взаимосвязь между токсикологией и экспрессией генов, генным полиморфтт мом и индивттлуаль-
иой переносимостью лекарственных препаратов, между геномикой и протеомикой. В главе 4 изла-
гаются основы метаболизма ксенобиотиков как органической, так и неорганической нрироты
в организме человека. Глава 5 иосвяшена методологии химико-токсикологического анализа.
Введение 13
особенностям интерпретации его результатов, а также обеспечению качества анализа, над-
лежащей лабораторной практике (принципам GLP в современной лаборатории). внедрению
системы валндапии и квалификации в лаборатории. Глава 6 отражает современное состояние
аналитических исследований токсикантов в бпоооъектах.
Во второй части обсуждаются метаболизм и методы определения отдельных трупп токси-
кантов. Наибольшее внимание уделено исследованию наркотических средств, психотропных
и сильнодействующих вешсств. контролируемых законохт на территории Российской Федера-
ции (глава 7). При этом рассматриваются нсйробиолотичсскис основы лекарственной и нар-
котической зависимости (боль и опиатные рецепторы: серотонин и депрессия; никотиновая
зависимость и др.). Эксперт а алкогольного опьянения у живых лип — серьезная социальная
и юридическая проблема — должна решаться с помощью надежных современных методов ана-
лиза. которые приведены в главе 8.I. Диагностика отравлений органическими растворителями,
углеводородами и их тало1сиопроизволпымн. спиртами, альдегидами, кетонами рассматрива-
ются в главе 8.2. Классификация пестицидов. их физико-химические свойства. метаболизм,
токсичность и методы определения приведены в главе 8.4. Глава 8.5 посвящена главным фак
торам токсичности металлов, их биологическим мишеням и понятию «металлолигаилный
гомеостаз», химико-токсикологическим характеристикам многих элементов. аналитической
диагностике профессиональных и ткатогическн зависимых заболеваний, вызванных дейс-
твием металлов и металлосо держащих соединений. Особенности и правила допинг-контроля
рассмотрены в главе 9. Наименее кош ротируемой и наиболее опасной утрозой человечест ву
подавляющее большинство экспертов называют биоагрессию, биотерроризм и экологические
войны. Возможности определения эксп оксикаигов в биосредах человека обсуждаются в IO-ii
главе В последней И-й тлавс приведены источники природных токсинов, классификация, их
токсические и фармакологические эффекты, а также методы определения, что имеет особое
значение в случае биологической опасности иди биотерроризма.
В качестве примеров контролирующих заданий приведены ситуационные задачи, содержа-
щие наборы анажитнческих характеристик токсикантов и группы тестовых вопросов, причем
только верный ответ на каждый предыдущий тестовый вопрос позволяет перси ги к следую-
щему и в итоге правильно решить задачу по идентификации и количественному определению
токсикантов. Задачи на определенные труппы токсикантов представлены в учебном пособии
«Токсикологическая химия. Многоуровневые ситуационные задачи и упражнения / Под рсд.
проф. Н.П. Калстиной — М . Гэотар. 2007».
В настоящем пособии авторы стремились дать информацию об основных группах токси-
кантов. представляющих в настоящее время опасность для человека и окружающей среды,
показать, что химико-токсикологический янализ незаменим при решении многих вопросов
правосудия, диагностики и лечения больных с острыми отравлениями, профессиональными
или эколотичсскн обусловленными заболеваниями. оздоровления условий труда, гигиеничес-
кого нормирования врезных веществ в объектах окружающей среды, а также при проведении
экспертизы на алкогольное или наркотическое опьянение, допинг-контроля, эколого-эпиде-
миологических исследований, а также то. что экспертная служба унциальна и защищает инте-
ресы национальной безопасности. Подготовка высокопрофессионального эксперта — трудный
и длительный процесс. Специальности эксперта «научить нельзя, можно только научиться» и
начинать пало со студенческой скамьи.
Авторы благодарны своим коллегам — профессорам и преподавателям московских вузов,
научным сотрудникам и экспертам в области химико-токсикологического анализ* Н А. I орба-
чевоп, А.А. Волкову, И.Ф. Дотмановой. Е В. Красиковой. Р.Р. Красновой. Н.И. Кузнецовой,
Е.М. Саломатнну. В.Е. Саломатину — за поцлержку. полезные дискуссии и рекомендации при
написании книги.
Авторы выражают особую благодарность А А. Тимохову и А.А. Тупикину за выполнение
ряда иллюстраций к книге и искренне признательны Е.С. Вятчаниной за помощь при подго-
товке рукописи к изданию.
Пособие предназначено для студентов вузов, обучающихся по специальности «Фармация»,
одпако приведенный фактический материал и рассматриваемые теоретические проблемы пред-
ставляют интерес для аспирантов, слушателей (факультетов послевузовского медицинского и
фармацевтического образования, специализирующихся в области судебно-химической эксперта-
14 Введение
it>i. к.1инико-токсиксыогического анализа. допинг- и наркоконтрагя. профпатологии. токсикологи-
ческой экологии. общей патологии. клинической фармакологии и других смежных специальностей,
а также Ат студента» ряда химических и экологических специа юностей.
Авторы будут признательны за критические замечания и конструктивные предложения. на-
правленные на улучшение киши (among*mail.nik
Число новых технологий и новых методов анализа стремительно растет, поэтому девизом
книги авторы выбрали стопа китайского историки I века до н.э. Сым Цяна: «Копен и вновь
начало».
Глава 1
СИСТЕМА ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ,
ОРГАНИЗАЦИОННО-ПРАВОВОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
В СФЕРЕ ОБРАЩЕНИЯ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО
ПРИМЕНЕНИЯ, КЛИНИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА И СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ
Риск — вероятность причинения врсаи жизни
или здоровью граждан... с учетом тяжести этого прела.
Федерчинный чакон РФ
«О техническом регулировании»
Cooiношение между безопасностью и эффективностью использования различных хими-
ческих вешеств, а также степень риска для здоровья человека от их применения постоянно
подвергаются переоценке На современном этапе развития науки и техники неизбежно ис-
пользование как на производстве, гак и в быту, широкою крута опасных для человека и окру-
жающей среды .химикатов Ассорп мент таких химикатов и их количество зависит от большого
чис та факторов. среди которых немаловажное значение имеют экономический статус развития
региона. наличие или отсутствие в нем природных или альтернативных источников сырья.
В настоящее время загрязнение среды обитания стало глобальнь м. стабильным и постоянно
действующим фактором, а для отдельных регионов прослеживается устойчивая совокупность
загрязнителей, определяющих хтя них ♦токсическую» сипанию
Значительная часть населения России (около 75%) постоянно проживает в условиях за1ря не-
ния окружающей среды, обусловленного в основном выбросами промышленных предприятий и
автомобильного транспорта, особенно в крупных городах и регионах с высокоразвитой индустри-
ей. В подавляющем числе ерриюрий приоритетными загрязнителями являются органические ве-
щества (полиароматические углеводороды, фенол, формалист ид и др.), тяжелые металлы. оксиды
азота и углерода. диоксид серы Гак, в России около 14 млн человек подвергаются воздействию
бензапирена. Болес 5 млн проживают на территориях с повышенным содержанием в воздухе окси-
да u3ora(IV). сероуглерода. формалита ши и оксида ут терода(И). В атмосферном воздухе городов
России по сравнению с городами Европы и США регистрируются более высокие концентрации
аммиака, бензапирена, стирола. (|хшода. более низкие — оке ua ecpbi(IV). а содержание оксида
ajoTd(IV') и формальдегида такое же. как в европейских странах. Для источников питьевого водо-
снабжения приоритетными загрязнителями являются токсичные вешества. перечень которых во
многом определяется региональными особенностями развития производства. Значительную опас-
ность .тля здоровья населения представляет загрязнение почвы соединениями металлов.
Обязательная регистрация всех вновь поступающих в обращение химических вей еств отечес-
твенного в зарубежного производства в Российском регистре потенциально опасных химичес-
ких и биологических веществ (www.rcgcheni.msk.ru) показывает, что их число па начало 2006 i
составляет более 2500 наименований.
Понятие о риске объединяет две характеристики. С одной стороны, это понятие конкрет-
но: риск от воздействия какого-то фактора или риск для какой-либо возрастной группы и т.д.
С другой стороны, понятие имеет вероятностный характер: каковы последствия реализации
риска, как они соотносятся с другими рисками и т.а. Оценка риска — сложный процесс, на-
правленный на установление, оценку я предсказание возможности причинения вреда здоровью
человека и обществу в целом, подвергнутому действию химикатов и их побочных продуктов
или метаболитов (рис. 1-1).
16 Глава 1
Рис. 1-1. Вки!ч<квя1Ь неблиояриятного влияния токсиканта не здоровье человека. их идентификации
И опенки риски причинения возможного вреда
Опенка риска учитывает несколько основных факторов. Прежде всего, это опасность, веро-
ятноегь экспозиции. соотношение лоза — ответ. восприимчивость организма.
Токсикологичес» ая опенка опирается на многофакторную и обязательно количественную ин-
<|>орм<1Ш1Ю о характере химических вешеств и их действия на биосисгемы. Система популяция —
токсик. hi является открытой неавтономной динамической системой, эволюционирующей во
времени Открытость системы означает наличие потоков биомассы и токсикантов, иеавтоном-
ность — зависимость потоков от времени. Для характеристики риска применяются комбини-
рованные методы определения опасности, зависимости лоза — ответ и опенки во действия.
При этом экстраполируют (распространяют выводы, полученные из наблюдения нал одной
частью явления, на другую сто часты воздействие высокой лозы токсиканта на меныпую дозу,
проявление эффекта воздействия токсиканта у животных — па человека, используя фактор
неопределенности. Обитая схема похо а к опенке риска представлена па рис 1-2.
К настоящему времени на основании обобщения отсчсс!венных и зарубежных данных разрабо-
тана единая система опенки токсичности и опасности хизипеских веществ промышленного проис-
хождения в окружающей среде, интегрирующим критерием в которой яатя гея допустимая суточ-
ная доза (ДСД). Основным количественным токсикометрическим показителем при установлении
ЛСД является пороговая лом хронического действия вещества (иногда в литературе обозначается
как ПДхр> преимущественно при его пероральном поступлении с водой (исключения составляют
высоко, ппофильныс и высоколегучие вещества) Приняты единые законодательные гигиеничес-
кие нормативы в качестве количественных критериев опенки риска. Методология опенки риска
— важнейший элемент многих рахтелон медицины и экологии. По разрабо ке способов управле
пня и передачи зи формации о рисках. эфт|к'К1Ивпых управленческих решений выполнено мно-
жество исследований. Однако эта проблема постоянно нуждается в обсуждении специалистами в
различных областях медицины, экологии, химии, физик I. биологии и других паук, что позволит в
случае необходимости при нить в конкретных условиях оптимальные решения без неоправданных
экономических затрат, дополнительных рисков и ущербов для здоровья человека.
Профилактика нежелательных вомействтЙ! лекарственных средств как химических веществ
и методология оценки риска в токсикологическом аспекте разрабатываются в рамках одного
из направлений токсикологии — лекарственной токсикологии. К задачам. стоящим перед ле-
карственной токсикологией, с сдует отнести определение широты терапевтического индекса
лек решенных средств, их побочных действий и нежелательных событий разработка спосо-
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 17
Рис. 1-2. Аиоршм опенки риска действия токсикант (Куценко С.А.. 2002).
бои предупреждения и лечения лекарственных отравлений. В последние годы к клиническому
направлению токсикологии также относят изучение биологического действия синтетических
материалов. имплантируемых в организм человека (сосудистые протеза. искусственные клапа-
ны серлиа и др.). В б()-е голы XX века в Великобритании было официально признано, что ни
один фармакологически эффективный препарат не может быть совершенно лишен риска и что
не все риски могут быть распознаны до выхода препарата на рынок. С этим тезисом согласны
эксперты ООП и ВОЗ.
В России государственный контроль эффективности и безопасности лекарственных средств (ЛС)
осуществляется в рамках процедур прелрешетрациопно i и пострегистрапионной экспертизы.
1.1. РОЛЬ ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ
ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ (РОСЗДРАВНАДЗОРА).
ПРАВОВЫЕ И ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ
В Российской Федерации доклинические фармако-токсикологические исследования потен-
ция. ьных ЛС осуществляются в соответствии с правилами надлежащей клинической (GCP)
и лабораторной (GLP) практики, а также действующей нормативно-методической базой Со-
временные методы исследования фармаколотических и токсических свойств Л С пхпожены в
18 Глава 1
•1’уковпдсгве но экспериментальному (доклиническому) изхчению новых фармакологических
нанести» 2ЦО5 г. Оно содержи т II методических указаний по изучению безопасное i и ЛС и
42 методических документа но изучению фармакологической активности ЛС различных фар-
мпкотерапепгичсских групп. Отличительной чертой новых методических документов является
их направленность на согласованность с международными стандартами и |ребопаниямн и лом
области. Результаты исследований вместе е проектом протокола клинических исследований и
проектом инструкции прелое г.пм я ются в Росздравнадзор для решения вопроса о возможности
проведения клинических исследований. После чею он поручает экспертной организации или
эксперту провести экспертиза результатов доклинических исследований потенциальною ЛС и
установить целесообразность и возможность проветения клинических исследовании по опре-
деленным показаниям. определенным способам применения, в определенных лоззх. в которых
экспериментально yciaiioiviena эффективность и безопасность применения. Для дальнейшего
изложения материала ниже приведены некоторые термины и определения.
Государственный контроль (надзор) — •проведение проверки выполнения юридическим ли-
пом или индивидуальным предпринимателем их деятельности при осуществлении обязатель-
ных требований к товарам (работам, услугам), установленных федеральными законами (ФЗ)
или принимаемыми в соответствии с ними нормативными правовыми актами» (ФЗ «О защите
пран юридических лиц и индивидуальных предпринимателей при пре ведении госуллрсгмснпо-
ю контроля (надзора)», принят Государственной лумой 14.07.01).
Информация о риске (risk communication) возложена па эксперта или экспертное учрежде-
ние. оценивающие риск и передающие развернхгыс результаты эгий оценки линия (ортапмм).
принимающим решение, общественным природоохранительным движениям и организациям,
а также населению (через средств массовой информации), которым одновременно npenaia-
ются те или иные варианты управления риском (С.А. Куценко. 2002).
Контрснь — проверка, а также постоянное наблюдение н целях проверки или надзора (Оже-
топ СИ., Шведов» Н.Ю.. 2003).
Контроль (control) — наличие власти или полномочий проверять и ли отраничинать; ограничи-
вающее или рету.шруюшее влияние (Оксфордский словарь современного ашлипского языка).
Контроль соответствия:
• предварительный контрот осуществляется посредством установления параметров соответс-
твия. а также еоозвегсгвия документации. процедур и сведений, пре гьявляемым требованиям
(регистрация лекарственного продукта. лицензирование upon изо зспза, аккредитация и т.п.);
• функциональный контроль (надзор) производится в процессе осуществления разрешенной
лея тельное пт посредством опенки соответствия фактических сведений заявленным (мони-
торит безопасности ЛС. надзор за соответствием показателей качества ЛС данным разре-
шения па выпуск н т.п.).
Лекарственные препараты — дозированные ЛС . готовые. к примспеннто (ФЗ «О лекарствен-
ных срединах»).
Лекарственные средства — вс песта. применяемые для профилактики. диагностики. ле-
чения болезни, предотвращения беременности и подученные из крови, плазмы крови, а так-
же органов, гканей человека или животного, растений, минералов методами синтеза или с
применением биологических техполотнй. К ЛС относятся и фирманамическис субетаннни —
вещества растительного. животного или синтетического происхождения, обладающие <}>армако-
логичсской активностью и предназначенные для производства и изготовления ЛС (ФЗ «О лекар-
ственных средствах»).
Лекарственный продукт — лекарственный препарат промышленного производства конкрет-
ного производителя.
Мониторинг — деятельность, заключающаяся в контроле за ходом клинического нее телова
ния. обеспечением его проведения, сбором данных и представлением результатов в соответс-
твии с протоколом, стандартными процедурами, GCP и норма) инными требованиями (ГОСТ
Р 52379-2005).
Надюр — орган, группа лиц для наблюдения за кем-нибудь, чем-нибудь, за соблюдением
каких-нибудь правил (Ожегов С.И., Шведова II.Ю.. 2003)
Надюр (surveillance) — процесс внимательного мониторинга поведения (фактических прояв-
лений) (Оксфордский словарь современпо|о английского языка).
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 19
Неблагоприятная побочная реакция — любая непред намерен пая и вредная лля организма
реакция, которая возникает при использовании лекарстве и ною препарата в обычных лозах с
целью профилактики. лечения и диагностики заболевания (определение ВОЗ)
Не же шмелиные реакции (adverse drug reaction — ADR) — все ншативные реакции, свя-
занные с применением любой юзы лекарственного продукта (относительно ире ipernciраци-
онного клинического применения нового лекарственного продукта или его применения по
новым показаниям, особенно если терапевтические дозы точно не установлены) Термин «не-
желательные реакции, связанные с применением лекарственною продукта» означает, что су-
ществует хотя бы минимальная возможность наличия прпчинно-сзедетвснпой связи между
лекарственным продуктом н нежелательным явлением, т.с. взаимосвязь нс исключена. Для
заршистрнрованных лекарственных продуктов зтот термин означает все пет пивные реакции,
связанные с применением лекарственного продукта в обычных дозах, используемых для про-
филактики. диагностики пли лечения заболевании, а также для изменения физиологических
функций (ГОСТ Р52379-2005: «Оценка данных по клинической безопасности: терминология и
стандарты экспресс отчетности» - руководство 1СН — International Conference on Harmoniza-
tion of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use — Международ-
ной конференции по гармонизации технических требований к регистрации фармацевтических
продуктов, предназначенных для применения человеком).
Регистрационшн' дос е — комплект документов и материалов установленной структуры и
содержания. представляемый имеете с заявкой на регистрацию лекарственного продукта, также
утверждаемый в процессе регистрации.
Регистрация лекарственного препарата — процедура допуска лекарственного продукта на
рынок.
Управление рискам (risk management) — система политических, технических, законодатель-
ных л нормативных решении, направленных на ликвидацию или существенное уменьшение
риска для здоровья населения, которая принимается на б; зе результатов опенки риска с учетом
ранжирования его источников, сравнительной опасности (лля индивидуума и для населения в
целом) возможных неблагоприятных эффектов, численности подвергаемых риску популяций, а
также всех tex факторов политики, экономики и общественного сознания, которые действуют
на принятие решений в заданных условиях места и времени. Разработка различных сценариев
управления рисками предполагает выбор гсх. которые обещают дать тшибольшип Э(|х|к’кт при
наименьших затратах и/или наибе тыпей реализуемости (Куценко С.А.. 2002).
Фармаконадзор (fannacovigilice) — научные исследования и виды деятельности, связанные с
выявлением, оценкой, пониманием и предотвращением побочных эффектов пли любых других
проблем, связанных с препаратом (определение ВОЗ).
Фармаконадзор (Phaniiiicovigilance. Drug surveillance. Drug monitoring) — контроль безопаснос-
ти лекарств — выявление, оттенка и профилактика небгноприятпых побочных реакций ЛС
В результате доклинической экспертизы проводится опенка соответствия выполненных
нее теловаттий действующим требованиям, определяются эффективные и безопасные дозы и
курс применения ЛС. Документами, в которых характеризуется полыа/риск применения ЛС.
являются экспертный отчет, брошюра исследователя, протокол клинических исследований,
инструкция по медицинскому применению.
Всякий раз. когда врач назначает ЛС, он оценивает возможный риск от его применения
н сравниваете ож глаемой вытодой: если ожидаемая выгода не перевешивает потенциальный
риск, использование ЛС не оправдано. При опенке пользы и вреда от назначения лекарства
врачи принимают во внимание тяжесть болезни пациента и воздействие, которое онп оювыва-
ет на качество жизни. Например, относительно небольшой дискомфорт, связанный с кашлем
при простуде, растяжением мышпы или редко возникающей головной ботью. может быть
уменьшен с помощью безрецептурных ЛС. и для этих препаратов допустимы незначительные
побочные реакции. При этом риск побочных реакций может возраст при одновременном
применении других ЛС. Если же ЛС используют для лечения тяжелой или угрожающей жизни
болезни (пнфиркт миокарда, онкологические заболевания. инсульт, отторжение трансплантан-
та). необходимо примиригься с более высокой вероятностью появ. ения серьезных побочных
реакции. Увеличивать вероятность развития побочной реакции на ЛС могут многие факторы.
К факторам риска относятся одновременное использование нескольких ЛС. возраст пациента
20 Глава 1
(маллеины. маленькие лети. пожилые). беременность, некоторые болешн и iiac.ie.iciBeniibie
фак юры.
РосitiptttiHUihop является (|>елералы1ым органом исполнительной власти. осуществляющим
контроль и нал юр в сфере здравоохранения и социального развития
Основная функция Pot здравнадзора: посредством кош роля и нал юра обеспечить соблюде-
ние законности в сфере здравоохранения и социального развития е целью улучшить качество
лиши граждан Российской Федерации. 1 осу rapciвенный контроль качества. зффектпвнос1и
и безопасности срелспз медицинского применения осуществляется на этанах их обращения —
доклинических н клинических исследований. регистрации. производства. применения и гр
Глинный методологический подход в отношении контроля лффектишгости и безопасности ЯС:
лекарственные средства допускаются к медицинскому применению в Российской Фе дерации
в ходе прозрачной регламентированной процедуры на основе доказанности их эффективности
и безопасности. а также перманентного контроля их безопасности после регистрации. В соот-
ветствии с установленными полномочиями тсягетыккть Фе деральной службы направлена, в
том числе и на опенку рисков, связанных с токсическими свойствами средств медицинского
применения.
(опасно постановлению I 1рани1'сльетва Российской Фслерании «Об утверждении положе-
ния о Федеральной службе но надзору в сфере тдраноохрапения и социального развития» от
31)06.04 .V 323 Федералтая служба осуизеств зяет над юр за
• фармацевтической деятельностью
• соблюдением государственных стапяартов. технических условии па продукцию ме тинннс-
кого назначения;
• контроль и ittimp за соблюдением государственных стандартов социального обслуживания.
Фе<>ера.1ышя служба иеушестыяет контрам за:
• поря тком производства медицинской экспертизы
• порядком установления степени уif тты 11|Х>фсссионпльноГ> iрудостюсобности н результате
несчастных случаев па производстве и профессиональных заболеваний:
• порядком организации н осуществления ме гико-сониальной экспертизы, и также реабили-
тацией инвалидов;
• осуществлением су гсбнп-мезиципских и судебно-пснхинрическнх экспертиз;
• производством, изготовлением, качеством. >ф<|к.*ктшшостыо. безопасностью. оборотом и
порядком использования ЯС;
ирон нюдст пом. оборотом н порядком использования изделий медицинского назначения;
• проведением доклинических и клинических исследовании ЛС. а также выполнением правил
лабораторной и клинической практики;
• соблюдением стандартов качества медицинской помощи:
Росздравнадзорорганизует проведение экспертизы качества э<|хректшшостн и безопасности .И
Рос дравнад юр выдаст:
• лицензии на осуществление метннппской и фармацевтической деятельности
• лицензии на осуществление деятельности но оказанию протезно-ортопедической помогите
• лицензии на осуществление деятельности но производству ЯС . за исключением ЛС тля жи-
вотных и кормовых добавок;
• лпиенши на осушссттеине деятельности но проипюлс1ву ме.тиииископ техники;
• разрешение на применение новых медицинских техшмогий;
• разрешение на ввоз ЛС (в части ЛС. применяемых в медицинских целях) на территорию Рос-
сийской Фсяерании в установленном законолагельспзом Российской Фе терапии порядке.
• разрешение ип вывоз ЛС (н части IC. применяемых в медицинских целях) с территории Рос-
сийской Федерации в установтеппом законодательством Российской Федерации порядке.
• разрешение на нноз на территорию Российской Фс герапни тс зарегистрированных ЛС с це-
лью ировелення их клинических исследовании:
• ра зрешепне на iiixnic.ieinie клинических неследовяинй ЛС.
Росздравнадзор выдаст заключение о соответствии организации производства Л С требовани-
ям законодательства Российски i Фслерании при лицензировании ирон июле г па ЛС. Росздрав-
надзор регистрирует: преде |ытые отпускные пены на жизненно необходимые и важнейшие ЛС
в установленном законодательством Российской Федерации норя.ткс: IC и иъгслия медицин-
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 21
екого назначения. Росздравнадзор ведет: государственный реестр ЛС; государственный реестр
йен на жизненно необходимые н важнейшие ЛС. перечень учреждений здравоохранения, име-
ющих право проводить клинические исследования ЛС. Росздравнадзор проводит аттестацию и
сертификацию специалистов, занятых в сфере обращения ЛС, осуществляет в установленном
порядке проверку дея голы юс । и организаций : травоохрапення, аптечных учреждений, органи-
заций оптовой торговли ЛС. организаций. осуществляющих социальную защиту населения,
других организаций и индивидуальных предприннмаголей, осуществляющих деятельность в
сфере здравоохранения и социальной зашиты населения: осуществляет функции главного рас-
порядителя и получателя средств ((юлерального бюджета. предусмотренных на содержание Фе-
деральной службы и реализацию возложенных па нее функций: обеспечивал в и реле tax своей
компетенции защиту сведений, составляющих государственную танго. Росздравнадзор органи-
зует прием граждан, обеспечивает своевременное и полное рассмотрение обращений граждан,
принимает по ним решения и направляет заявителям ответы в установленный законодатель-
ством Российской Федерации срок; обеспечивает мобилизационную подготовку Службы, а
также контроль и координацию деятельности находящихся в се ведении организации по мн-
ой ш защитной подготовке; осуществляет профессиональную подголовку работников Службы,
их переподготовку, повышение квалификации и стажировку.
Росздравнадзор использует следующею методологию оценки риска клинического применения /С:
документированность; предсказуемость, прозрачность процедур; строгие надзор и контроль за
соблюдением соответствия; персонификация ответственности всех должное)пых лиц. прини-
мающих решения в сфере безопасное)и и качеств;) IC Основные принципы контроля и надзора:
презумпция правоты и добросовестности контро шрусмого субъекта; открытость и доступность
документов, устанавливающих обязательные требования, выполнение которых проверяется;
oTHciciBcimocib и беспристрастность контролирующих органов.
Объектами надзора и контроля Росздравнадзора являются: показатели эффективности, бе-
зопасности и качества ЛС па этапе принятия решения о допуске на рынок; показатели м|)
фсктинноетп (для новых препаратов), безопасности и качества в любой период нахождения
лек 1рства на рынке; условия производства и система управления качеством производства Л С,
условия |ранснортировки. хранения и порядок оптовой и розничной продажи ЛС.
Основными субъектами надзора и контроля, ответ огненными за эффективность, безопасность
и качество ЛС, являются отечественные фармацевтические производите.)и и импортеры фар-
мацевтической Продукции. Росздравнадзор осуществляет предвариголытый контроль ЛС и и.х
свойств, установленных в результате доклинических и клинических исследований на стадии
ретистранин Л С. с целью обоснования эффективности и обеспечения безопасности В период
нахождения ЛС па рынке они подвергаются функциональному надзору хчя контроля <|мрма-
кологической безопасности с целью подтверждения заявления о безопасности. Оцениваются
показатели влияния лекарства на организм человека, которые относятся к разряду псжеласмых
и или неожиданных, и устанавливается соответствие или несоответствие тем показателям, ко-
торые ранее были признаны приемлемыми па этане рс)истрании.
В соо1исгснши с ФЗ «О техническом регулировании», принятым Государственной думой
15.12.02. система нормативно-правовой базы регулирования обращения ЛС состоит из техни-
ческих регламентов, национальных стандартов, обязательных к исполнению, и ведомственных
актов рекомендательною характера (методические рекомендации). Технические регламенты
формируются на основе принципов, приоритет международных норм; единообразие техничес-
ких треоованни к самой продукции и к субьсктадт обращения вне зависимое)и от поставщи-
ка и страны происхождения продукции, однозначное толкование требований и максимально
возможное по. робкое описание процедур; механизм реальной ответственности как субьектов
обращения ЛС, гак и государственных органов; по возможное)и расширение роли самих учас-
тников рынка и общественного контроля.
Законы, которые обеспечивают полномочия Росздравнадзора. перечислены ниже. Положе-
ния этих законов направлены на то. чтобы обеспечить следующие условия: вес средства ме-
дицинского применения (ЛС. изделия медицинского назначения, медицинская техника и др.)
должны бы и, безопасными, эффективными, качественными и должны со11ровождаи>ся инс-
трукциями по применению н/или другими согласованными документами, несущими полную и
достоверную шк|юрмаиню. Первичная ответственность за обеспечение безопасности средства
22 Глава 1
мслтишнского применения 11ри11ал.тежиг прои шолителю Роль Росздравнадзора заключается
в том, чтобы кош роли ропать изготовителей таким обратом. чтобы обеспечить потребителям
средств медицинского применения гарантии тою. что прои то титель выполняет требования
действующего тлконо.ытелкгва и свои обязательства. В Российской Федерации в настоящее
время законодательная и нормативно-правовая база оттенки рисков, свя занных с токсичными
свойствами средств медицинского применения, изложена в следующих основных документах:
• ФЗ оз 22.06.98 № Х6-ФЗ (редакция оз 2’08.04) «О лекарственных средствах*. принят 1 осу-
тарез пенной думой РФ 05.06.98:
• «Основы 1аконл1;т1С11х.*тва Российской Федерации об охране здоровья граждан* (утвержде-
ны Верховным Советом РФ 22.07.93 № 5487-1) (редакция от 01.12.04). ст. 43;
• письмо Департамента госконтроля качества. эффективности. безопасности лекарств и ме-
дицинской техники Минздрава РФ от 21.12.98 № 29-4/2370 (редакция от 23.02.2000) («При-
вила государстве! и юн регистрации лекарственных средств*, утверждено Минздравом РФ от
01.12.98 № 01/29-14):
• приказ Минздрава Р<1> от 19.06.03 № 266 «Об утверждении правил клинической практики в
Российской Фелсрнши* (зврегнетрировано в Минюсте РФ 20.06.03 № 4808):
• приказ Мин здрав;! РФ от 19 06.03 V' 267 *06 утверждении правил лабораторной практики*
(зарегистрировано в Минюсте РФ 25.06.03 \h 4809);
• 11.т1тнон<тльнып стандарт Российской Фе терапии ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежашая клини-
ческая практика» (утвержден приказом Федерального агентства по техническому регулиро-
ванию зт метрологии от 27.09.05 № 232-ст.) введен впервые с 01 04.06 с нравом досрочного
введения.
Каждый специалист. работающий в сфере обращения ЛС. должен знать нормативно-право-
вую и методическую базу в этой области со всеми изменениями и дополнениями
1.2. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРТИЗЫ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
К средствам медицинского применения относзггся лекарственные и биологические средс-
тва. в гом числе медицинские иммунобиологические препараты. изделия мелинит.кого назна-
чения. оборулот» тине и приборы - медицинская техника
Основными взаимосвязанными .характеристиками побото средства медицинского приме-
нения. в том числе и ЛС. являются безопасность. эффективность в качество. История ме-
зиннпы изобилует примерами когда разработанные ЛС входили в медицинскую практику
без должной опенки их полезности и безопасности. В результате наносился огромный врел
больным. При разработке и экспертизе нового ЛС преследуется две основные пели — до-
биться его эффективности н безопасности. Понятие «безо наст юс гь» относительно Чем шире
терапевтическая зона бе юпасиости (терапевтическое окно, терапевтический индекс) — диа-
пазон, соотношение между >ф<] ективиоп точенной дозой и дозой приво.'тящей к тяжелым,
опасным для жизни побочным реакциям. — тем безопаснее лекарство (см. гл. 2.1.). Так. на
смену ранее широко использовавшимся барбитуратам, которые могут угнетать дыхание, на-
рушать сердечный ритм и даже приводить к смертельному исходу при передозировке, пришли
снотворные препараты новых поколений, которые имеют бозее широкую терапевтическую
топу безопасности, например имоваи. Важной особенностью ЛС являются многообразные
критерии и условия для опенки соотношения эффектинттосгь/безогжсность и нт польза/риск
конкретного средства, предлагаемого по кот кретным показаниям в конкретной возрастное
труппе. В России, как и за рубежом, к проведению прелрегистрлпионных доклинических
исследовании ЛС юсу таретвом пре. ъявляюгся опре те тенные требования. Место зоксико-
лотических исследований в общем процессе разработки и внедрения новых лекарственных
средств и странах ГС и США ттрелетивлепо на рис. 1-3.
Гярншии эффективного и безопасного применения ЛС обеспечивают разработчик-произ-
водитель. который должен выполнить действующие требования, н уполномоченный государс-
твенный орган, ра трешаюшии новый препарат к применению. Доклинические исследования
безопасности (обтиетокснческое действие и специфическая токсичность) потенциального
ЛС проводятся in vitro и in vivo (на животных). При изучении общетоксического действия
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 23
Синтез активного веществе
Фармакологические " " Фармакокинетические исследования
исследования на животных ме вб°лизмв Данного соединения
(на животных)
Разработка лекарственн х
форм препарата исследовании
стабильности репарата
Токсикологические
! иследования
с однократным
введением препарата
___ ▼______________
Исследования
фарм котенетическ и
Длительные
токсикологически
и хледоеа ия (1 месяц) токсичности препарата
►'Клинические исследования фазы I'm
Клинические иследования фазы Ila s
Фармакокинетические исследования ния лрвларата в твчсии<Г 1 месяца)
метаболизма данного соединения н
(с уч стием добровольцев)
W .А . Ureri
7,-^ т 7 .. исследования (3 месяца)
г Клиническое исследования фазы Па
I (введение препарата в течение 3 месяцев]J у
> метаболизма данного соединения
Длительные токсикологические
Сегмвнт I
Сегмент I
Фармакокинетические исследования с
участием специально подобранных
групп населения и популяционные
фармакокинетич ские исследования
Предварительные исследова «чя
канцерогенности препарата
Клиническое исследования фазы llb/lll
(введение препарата в течение 6 месяцев
Длительные токсикологические
исследования (6 месяцев (
Исследования канцерогенности
препарата
Л
Клинические исследования фазы III
(введение препарата в течение
свыше 6 месяцев)
Длительные
ксикологические
исследования на собаках или
обезьянах (9-12 месяцев)
Сегмент III
► утверждение препарата е МАА (Франция)
в__________________V , ,__________X_____________ „ ,
Утверждение препарата в МАА (Европа) Утверждение ipenapara в NDA (США)
Рис. 1-3. Основные стадии процесса разработки и ннсдреннч новых лекаре 1 венных средств в странах ЕС
и США.
используют физиологические, фармакологические, биохимические, гематологические. пато-
морфологические и другие методы исследования. Исследования токсических эф<|>скто11 па
двух видах животных при однократном (острая токсичность) и повторном (I нел. I. 3 и
6 мес — хроническая токсичность) введении необходимы для юго. чтобы оценить действие
препарата на центральную и вегетативную нервную систему, сердечно-сосудистую систе-
му. желудочно-кишечный тракт, дыхательную. выделительную и эндокринную системы. ЛС,
предназначенные для постоянного применения, исследуют в течение более длительного сро-
ка. Исследования специфической токсичности включают оценку потенциальных мутагенных,
аллергизируютих. иммуиотокснческих. канцерогенных cboi ltb. а также изучение репродук-
тивной токсичности. Современная схема доклинического токсикологического изучения но-
вых Л С. предложенная Е.В Арзамасцевым и Б. И Любимовым в 1994 г остается актуальной
(с незначительными и зменениями) и в настоящее время. Количество используемых лабора-
торных животных ограничивают до минимума, необходимого и достаточного тля достоверной
опенки риска применения нового препарата. Программы исследований оригинальных, ин-
новационных и воспроизведенных ЛС различаются. Однако исследования на животных даже
широко испочьзуюшихся в медицинской практике ЛС могут выявить их новые свойства и
риск использования препарата может быть снижен или повышен. Данная информация долж-
24 Глава 1
на быть внесена в xiicipyxiuHO но применению. Поскольку ЛС являются особым видом това-
ров. опенка эффективности и безопасности (в большем степени безопасности) проводится на
стадиях доклинических и клинических исследований и предрегистранионной доклинической
и клинической экспертизы. Экспертиза качества, эффективности и безопасности ЛС (далее —
экспертиза) осуществляется научными или иными организациями. учеными и специалиста-
ми. привлекаемыми Росздравнадзором. и связана с проведением исследовании, анализом и
оненкоИ объектов экспертизы, подготовкой заключений относшслыю лих объектов. Основ-
ными принципами организации зкеперти/ы являются: не зависимость и правовая защищенность
субъектов экспертизы при осуществлении ими своей профессиональной деятельности; науч-
ный подход, полнота, всесторонность и объективное!ь исследований объектов экспертизы,
обеспечение обоснованности результатов экспертизы; компетентность и высокий професси-
ональным уровень экспертных организаций и экспертов: системность организации эксперт-
ной работы и се мелодическое обеспечение: ориентация на мировой уровень развития науки
и техники, нормы и правила экшюгнчсекой. технической и общественно!! безопасности,
обязательное^ выполнения требований законодательства Российской Федерации и исполь-
зуемых международных и национальных стандартов; гласность результатов экспертизы при
условии сохранения государственной. служебной и коммерческой тайны в соответствии с
законодательством Российской Федерации.
Заключение экспертизы должно быть обоснованным и недвусмысленно отвечать на постав-
тенные в з здании перед экспертной ортанизацией (экспертом) вопросы. К заключению долж -
ны прилагаться изложенные в прои звольной форме особые .мнения экспертов, нс согласных с
принятым заключением Решение Росздравнадзора, противоречащее заключению экспертизы,
может быть принято только руководи icjicm Федеральной службы но надзору в сфере здравоох-
ранения и социального развития. Заключение экспертизы должно храниться в течение 10 лет
при условии. что бзиыпие сроки не устаиавлшзаюгся иными административными реьпмента-
ми Росзлраннад зора.
Серьезными нарушениями правил проведения экспертизы являются: неиредостатыение эксперт -
ной организации (эксперту) информации, необходимой для проведения экспертизы: фальси
фикация материалов, сведений и данных. представляемых на экспертизу. а также сведений
о результатах се проведения; принуждение экспертной организации (эксперта) к подготовке
заведомо ложного включения экспертизы; создание препятствий проведению экспертизы: не-
обоснованность выводов экспертизы: фальсификация выводов экспертизы, сокрытие от Рос-
здравнадзора оснований для отвода экспертной организации (эксперта), прямое или косвенное
вмешагсльство в процесс экспертизы в целях оказания влияния на ход и результат экспертизы;
иные нарушения, ответственность за которые наступает в соответствии с законодательством
Российской Федерации. Основные административные процедуры экспертизы, связанные с оцен-
кой риска применения ЛС н токсикологическом аспекте: организация проведения эксперти-
зы. ос.уще пстяемой в ходе рассмотрения документов и принятия решения о юсу тарсттзсинсн
регистрации ЛС; мониторинг побочных эффектов применения ЛС. Кроме того. Росздравнад-
зор ортаттнзуе*! проведение экспертизы качества ЛС в виде предварительного государственною
контроля, выборочного государственного контроля, повторного выборочного государственно-
го контроля и осуществляет мониторинг качества ЛС. В случае выявления недоброкачест-
венных и фальсифицированных или песоотвсicmyioninx установленным требованиям средств
медицинского применения, в том числе лекарственных средств. Росздравна зор осуществляет
мероприятия по изъятию их из обращения. Схемы проведения экспертизы и pci не Гранин Л С
и медицинской техники в России представлены па рис. 1-4 и 1-э.
Научный центр экспертизы средств медицинского применения (ННЭСМП) по заданию
Росздравнадзора осуществляет подготовку объективной, достоверной и выверенной ин<|юрма-
цип о ЛС. медицинской гекнике и изделиях медицинского назначения, опираясь па которую
Росздравнадзор принимает обоснованные решения в отношении медицинского применения
укэ шитых средств и продуктов.
Основные составляющие работы ////ЭСИ/7.'система экспертизы на этапе pci истрании средств
медицинского применения: система экспертизы досье. заявленных к разрешению клинических
исследований; система мониторинга качеспза. эффективности и безопасности средств меди-
цинского применения в медицинской практике, создание и актуализация банка дншых. со-
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение.. 25
Научный центр
Оценка полноты и достоверности
Оценка соответствия действующим
нормативным документам
Проведения экспертного отчета
и заключения
по результатам экспертизы
Материалы по
лекарственному средству
Согласованные материалы
Экспертный счет НЦ
ЗАЯВИТЕЛЬ
(По поручению заявителя)
РЕШЕНИЕ ПО ЗАЯВКЕ
1. Регистрация
2. Назначение исследований
и экспебги
3. Отказ в регистрации
Комплект
документов и данных
Экспертный отчет НЦ
180-й день
Комплект
документов и данных
Экспертный отчет НЦ
Дата начала
Заключение
экспертов
60-й день
Федеральная служба
(отдел регистрации)
Организация, определение объемов
и сроков экспертизы
Принятие решения по заявке
Внесение данных в государственный
реестр лекарственных средств
Оформление и выдача регйЬт* ивнного'
удостоверения и нормативной
документации заявителю
Формирование архивных материалов
Дата начала
120-й день
Заключение
экспертных
комитетов
75-й День
ВНЕШНИЕ ЭКСПЕРТЫ
Материалы экспертизы
ЭКСПЕРТНЫЙ КОМИТЕТ
Новые л карственные средства внесени । серьезных изменений в регистрационное досье
При несовпадении экспертных заичочг+гии Научного центра и внешних экспертов
Рис. 1-4. Экспсрп та и регистрация лекарственных средств в России
держащего различные базы данных с ин(|юрмацией о ЛС. и тлелиях медицинского назначения,
ipvTHx средств медицинского применения: внутренняя система контроля качества экспертной
деятельности: совершенствование и тучно-методической Сквы в области доклинических и кли-
нических исследовании средств медицинского применения
За pvo жом п соответствии с законодательством Евросоюза (ГС) регистрация ЛС (выдача
тортовой тинензни) проводится Европейской комиссией (European Commission). Прсдретнс-
транионная экспертиза и подготовка проекта решения Европейской комиссии возложены на
Европейское aicHTciBo по опенке лекарств (European Medicines Eval и л ion Agency — ЕМЕА)
В соответствии с законодательством США регистрация ЛС (выдача торгоно т лицензии) прово-
дится Управлением но контролю лекарств и нишевых продуктов (Food and Dnig Administration —
I DA) Министерства здравоохранения и социального обеспечения США (Health and Human
Services — Hl IS). Предрегистрапиониая экспертиза и подтотовка проекта решения FDA пол-
ожены на Центр но оценке и изучению лекарств (Center for Drug Evaluation and Research
CDER)
26 Глава 1
ФГУ «Научный центр
экспертизы средств
медицинского применения»
МЗиСРРФ
4-
НАУЧНО-ЭКСПЕРТНЫЙ СОВЕТ
• Экспертиза документов
Выработка рекомендаций о
регистрации.
видам и объемам испытании
{Заявитель^
1-й ЭТАП
Первичный прием документов
Принятие решения об
открытии заявки
Федеральная служба
по надзору в сфере
здравоохранения и 4
социального развития 4
4-й ЭТАП
▼
Анализ результатов испытаний
Выработка рекомендаций по
еги строчки
ФГУ «Научный центр
экспертизы средств
медицинского применения»
МЗиСР РФ
3-й ЭТАП
Испытательные базы
• Экспертиза образцов
«Выработка рекомендации
по регистрации
Рис. 1-5. Экспертиза и регистрация медицинской техники в России.
1.3. ОРГАНИЗАЦИЯ СЛУЖБЫ ИНФОРМАЦИИ О ПОБОЧНЫХ РЕАКЦИЯХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В РФ ОТ ФИРМ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ,
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ И ПАЦИЕНТОВ
Побочные реакции, связанные с приемом ЛС. отмечаются довольно часто. Например, в
США около 10% госпитализаций вызваны проявлениями у пациентов побочных реакций. По-
бочные реакции на ЛС делят на два основных тина (см. гл. 1.4).
К первому типу относятся реакции, которые представляют собой чрезмерное развитие извес-
тных терапевтических эффектов лекарства. Например, человек, который принимает препарат,
снижающий высокое артериальное давление, может почувствовать юловокружение. если пре-
парат сильно понизит давление. У человека. прыгающего сах грным лиабеп м. xioiyr появиться
слабость. тошнота, тбыточнос потоотделение и сердцебиение, если инсулин или другое ги-
погликемическое средство приведет к резкому снижению содержания сахара в крови. Этот тип
реакций обычно предсказуем, но все же иногда неизбежен. Побочная реакция развивается при
передозировке ЛС. повышенной чувствительности к нему и одновременном приеме других ЛС.
замедляющих метаболизм и тем самым повышающих содержание его в крови (см гл. 4). Эти
реакции, как правило, описаны в инструкциях по медицинскому применению ЛС.
Ко второму типу относят реакции, механизмы развития которых в настоящее время не до
конца понятны. Этот гни побочных реакций на ЛС в значительной степени непредсказуем,
пока v врачей не накопятся сведения о развитии полобн их реакций у достаточно большого
числа пациентов. Примерами таких реакций являются высыпания на коже, желтуха (из-за
повреждающего действия на печень), анемия, уменьшение количества лейкоцитов, поврежде-
ние почек или центральной нервной системы с нарушением функций елххового и зрительного
нервов. Подобные реакции обычно развиваются у папистов, имеющих повышенную чувствн-
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение.. 27
тслыюсть к тому или иному химическому соединению, связанную с генетическими особеннос-
тями организма (см. гл. 3 и 4)
Тяжесть побочных реакций. К основным побочным реакциям на пероральные .ПС относятся
нарушения работы пищеварительной системы, например потеря аппетита, тошнота, вздутие
живота. запор пли диарея.
К легким побочным реакциям обычно огпосягся желудочно-кишечные расстройства, го-
ловная боль, утомляемость, неопределенные боли в мышках. общее недомогание (ощущение
нездоровья или дискомфорт) и нарушение сна. Такие реакции бывают неприятны больному,
ухудшают ею самочувсшие, что может привести к прекращению соблюдения врачебных пред-
писаний но приему лекарств.
Умеренными побочными реакциями считаются те. которые вызывают симптомы, причиняю-
щие пациенту значительное беспокойство К ним относят высыпания на коже (обширные п
стойкие), расстройства зрения (особенно у людей, которые носят контактные линзы), дрожа-
ние мыши, затруднение мочеиспускания (широко распространенное у пожилых людей), любое
заметное изменение настроения или интеллектуальных функций и некоторые изменения со-
става крови, например содержание липидов.
Некоторые J1C вы зывают тяжелые побочные реакции, которые потенциально опасны для
жизни. хотя и огносчгтелыю редки. Пациент, у которого развивается такая реакция, как прави-
ю должен прекратить прием препарата, при этом медики проводят специальные мероприятия
гтя устранения последствий терапии. Однако иногда больные вынуждены принимать ЛС. хотя
зто и сопряжено с высоким риском, например химиотерапевтические средства при онкологи-
ческих заболеваниях или иммунодепрессанты после трансплантации органов. Для уменьшения
тяжести побочных реакций используются специальные меры. Так, для снижения риска разви-
тия инфекции больным с нарушением функции иммунной системы назначают антибиотики,
для предотвращения развития язвы желудка — жидкие антациды или блокаторы Н -рецепто-
ров. при анемии проводят переливание эритроцит ной массы или вводят эритропоэтин. Неко-
торые тяжелые побочные реакции па Л С представлены в табл 1-1
Таблица 1-1. Некоторые тяжелые побочные реакции па лекарственные средства
- - - - . - 1 1 [обочная реакция Я по желудка изн желудочное кровотечение Лекарственные средства Кортикостероиды (нредииххюн. гидрокортизон) внутрь или в визе инъекций Лие1илса«1|п11.тояля кислота и jpyuic ППВП (пбупртмК'н. кстопрофеп. напроксен. индометацин, диклофенак) Противосвертывающие средства (геп ipiin. фенилнн)
Хнсммн (см. гл. 2) Пскогорыс антибиотики (левомицетин) Некоторые ППВП (ин томегаппи. бутжион) Противомалярийные я щютинотуГтеркулезные нреиартпы у папистов с дефицитом г. покою -<|юсф1Плс1н>|ро1еЧ|а1Ы
Уменьшение количества ленкошпон. повы- шающее риск таболеваний. вызванных ин- фекцией тем. гл 2} Некоторые iiciipo.icniBKii (клозапин) Хнмиотера11евп1чсские средства дли течения онкологических таблтс- ваннй Некоторые препараты тля .мнения гиперфункции шитовилноН железы (мерка xcq ict)
Поврежление печени (см. гл. 2) Парацетамол (повторное использонание иди применение в чрезмер- ных дозах) Некоторые противотуберкхлетные препараты (изоииатп.т) Чрезмерное употребление препаратов железа Леклрстнн лрушх фармакологических групп особенно у людей с* пато логией печени или счомютреб imkhuiix алко|о.тем
Повреждение ночек ем и. 2) ППВП (повторное нспотькнинпе или применение в чрептсриых до зах) Лминог.тикошдныс ан1ибиог|ик11 (стрептомицин. гентамицин). Некоторые препараты тая лечения онкологических заболеваний (ЦНе- llJalHll)
Примечание. ППВП - исстсронтпын прот11вовоспа.тнгслы1ый препарат
28 Глава 1
Гиппократу (460-377 it. до п.з.) было известно около 2<Ю лекаре 1 венных рас гений. Ибн Сипа
(\-\1 иск) и фабские врачи иснольюш п< 2600 лекарственных веществ. ткоюрых 1400 были
рас i тельного происхождения Основы лекарствоведения впервые был и наложены в форме зн-
пиклопецическою словаря армянским врачом и есгесгвоисвытсислем XV века Амирлокяагом
Хмас киш. Прообраз современных справочников и официальной информации о лекарствах
содержа.! сведения о физико-химических и фармако нническнх свойствах, лечебном дсйснии
и плаваниях (на 5-6 языках) ЛС растительного (1000 видов), животного (250) происхождения
и минералов (150). О значительном увеличении количества ЛС в XX веке свидетельствует
справочник V. Negxer «Organic-chemical drugs and their synonyms*. В издании 1961 i. ори по-
ятся 2600 наименований индивидуальных спнтстнческ ix лекарственных вешссгв. в 1971 г. —
5276. а в 19X7 г. — более 90<Ю
Большое значение для обеспечения безопасного использованная ЛС. оценки зффектин
пости их применения и риска возникновения побочных м|к|асктов имеют сбор и анализ ин-
формации. полученной от врачей и пациентов о лсисшпп ЛС. а также последующее внесение
дополнений в ипорукнию по медицинскому применению.
Проблемы побочною действия ЛС приобретают мелико-сопналыюе значение в связи с
нарастающим поступлением новых медикаментов и увеличением числа осложнении при их
использовании. Наступа тельная рекламная политика (|к1рмацс1пическнх компании часто усу-
губляй ситуацию. нтк как пациент далеко не всегда может ирз.-видеть результат совместного
действия пескольк ix ЛС.
Основная часть химических соединений, используемых в фармакологии, сишс тирована и
внедрена в практику в последние 30-40 лет. Ежсщдно список новых химических соединений.
1ы базе которых paaptiGi ываются новые ЛС. пополняется 500 -1000 единицами. >го со см-
ет предпосылки pc ikoio увеличения числа неблагоприятных побочных реакций на ЛС. Росту
метикаментозных осложнений способствуют широко распространенное самолечение, прием
одновременно нескольких препаратов. По статистическим данным, чаше всею в стационаре
прихз вися вс грезиться с осложнениями, вы званными противомикробиыми и нрогнвопаразн-
гарпыми препаратами. Большинство осложнении вызывают антибиотики.
1а последние 40 лет из мировою фаЪмзпевгичсского рынка изъято более 130 ЛС в связи с
недостаточной безопасностью. I peri. изъятий происходила и пределах 2. половина — в пре-
делах 5 лет после разрешения медицинского применения. Несмотря на !лобалы!ое внедрение
систем наблюдения ш фармакологической безопасностью, неблагоприятные побочные реак-
ции по-прежнему остаются одной из важнейших причин заболеваемости и смертности во всем
мире. Хорошо оргаппзованпая система обеспечения безопасности лекарственных препаратов
является предпосылкой для раннего выявления риска, связанного с использованием медика-
ментов. и предупреждения неблагоприятных побочных реакций.
В США п I95S I. была создана первая <х|)нппалы1ая opiaim шипя для исследования побоч-
ных л|х|>ск 1 он ЛС — департамент по изучению дискр ши крови, вызываемых лекарствами.
В настоящее время в США собирают и анализируют ипЦюрмапию об я|м|>екгивностн и тен-
денциях исподь'зовпння ЛС, находящихся па рынке, и данные о случаях лекарственных отрав-
лений. расиросцтаняюг информацию о потенциалыюй опасности для коровья человека тех
или иных медицинских средств, продуктов или товаров. Свои функции EDA осушссгн, яс! в
тесном взаимолсйс i вин с подразделениями Службы общественною иравоохраиеиия. л также
с другими ведом твами правительства США. IDA имеет кош.кты е межлу парод ними орга-
низациями здравоохранения, а внутри страны — с общественными организациями, универ-
ситетами, отдельными учеными, частными лабораториями, производигелями лекаре шейной
продхкиии и препаратов. В ФРГ сообщения о нежели тельных побочных реакциях ЛС с I95S i.
шали поступать в комиссию по лекарствам Германского медицинского общества oi врачей,
фармпцептои и производигелей лекарств. В Великобритании в 1963 г. был учроЖлен коми
гет по безопасности лекарств нрн мпнпшерсгве здравоохранения Соединенною Королевства,
а в 1964 I. была начат программа «желтых карг* — спонтанных добровольных ообшений
о нежелательных побочных реакциях. «Желтая карт* — ло специальная форма-извещение
ярко-желтого цвета, которую предлагается заполнить и тирании. (бесплатно) ло почте (или
шиолпить электронную версию карты и отирании» по з.тектропной почте) в случае подо трения
па неблагоприятные побочные реакции в 11.щиональнос агентство ио контролю ia |екарстрами
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение.. 29
и продуктами здравоохранения (Medicines and Healthcare products Regulatory Agency». К числу
лип. которым пре сыпется направлять сообщения, относятся врачи, стоматологи, исследова-
тели. фармацевты медсестры, а также (с недавних пор) и пациенты, для которых разработана
специальная форм г карты Имеется 5 региональных центров, которые функционируют на базе
университетских стационаров. Начиная е 19X6 г., число ежегодно присылаемых сообщении
от медицинских и фармацевтических работников ioctih io 15—20 тыс. Но Франции с 1973 г
существует лепешрали зованная или per повальная система контроля безопасности лекарств
(пор: гка 30 региональных центров), утвержденная законодательно с 19X0 г. Национальный
Петр фзрмаконад юра Франции принимает и шюсгп в базу данных только тс сообщения о
иеже i3re.u.Hiix побочных реакциях ЛС. которые были представлены через региональные цен-
тры. Общее число сообщении и базе данных к 1987 г. превышало 51 тыс. В большинстве
стран (Лвсгралия. Канада, С I1IA. Франция. Германия. Япония и гр национальные пегпры по
контролю безопасности лекарств включены в структуру контрольно-разрешительных систем
ре» гаменгпруюших обращение ЛС В Канале п Ноной Зеландии такие центры функциониру-
ют и как информационные центры по вопросам отравлений что целесообразно поскольку
неб г гоприятная побочная реакция и иптоксик; пня часто взаимосвязаны. В мире существуют
единые принципы лекарственной терапии многих «болеванин. поэтому проблема безопас-
ности лекарств стала пнгернапионалыгой. В ЕС с 1995 г. в соответствии с европейским за-
коне ыгельством была внедрена так называемая централизованная процедура, позволяющая
1 я определенных ,1С имен, единое регистрационное сшпегельсг во. действительное для нссх
стран членов ЕС. Функции и ответственность каждой из сторон — стран ЕС. Еврокомиссии.
ЕМЕА и кчадслыгев свидетельств на регистрацию препаратов, участвующих в наблюдении за
фармакологической безопасшчтью н соответствии с iihiom регистрационного сви лстельстна
установлены законодательно директивой ЕС 2001/83 и нормативным актом 2309/93 с после-
дующими поправками в томе IX правовых актов но применению ЛС у человека и животных
в ЕС Имеется база данных Европейской системы наблюдения за фармакологической безо-
пасностью. Страны. входящие в ЕС. занимаются локальным сбором тайных, реагируют на за-
просы своих национальных ортанов фармаконалзора. обеспечивают обратную связь с местной
общественностью и осуществляют мероприятия по минимизации конкретных рисков с учетом
с'пецнф'йческих особенностей своей страны.
В России в 1936 г. бюро ученого медицинского совета Народного комиссариата здравоох-
ранения РСФСР приняло резолюцию «О порядке испытания новых лекарственных средств и
методик. которые могут представлять опасность для здоровья и жизни человека», в которой
был определен необходимый объем исследований для получения информации о бе ютнтсиости
новых лекарственных препаратов и медицинских методов. В 1969 г. при Минздраве СССР был
согд.н1 отдел учета, систематизации и экспресс-информации о побочном .действии ЛС, кото-
рый в 1973 г. был утвержден в качестве Всесоюзного организационно-методического центра по
изучению побочных действий лекарств.
После талнломидовои трагедии в 1968 г. по инпцийтивс ВОЗ был разработан международ-
ный пилотным исследовательский проект (Pilot Research Project) по мониторингу' лекарств, в
котором участвовало К) стран: Австралия. Великобритания. Канала. Новая Зеландия, Ирлан-
дия. Нидерланды. США. ФРГ, Чехословакия и Шпения. В 1970 г. к программе ВОЗ но между
народному мониторингу лекарств присоедини тнсь сше 8 стран. Необходимость разработки та-
кого проекта была обусловлена гем. что при клинических испытаниях невозможно обпаружтнъ
некоторые редко встречающиеся неблагоприятные побочные эффекты. Это связано, прежде
в< то. с относительно небольшим числом больных, участвующих в клинических исследовани-
ях. Результаты данного проекта подтвердили целесообразность создания при ВОЗ межлуна
р тою центра по мониторингу лекарств и организации национальных центров в различных
странах В настоящее время в программе ВОЗ участвует более 80 стран, в том числе и Россия.
Петр ВОЗ получает 150—200 тыс. сообщений о нежелательных побочных реакциях ЛС в год.
В базе данных ВОЗ содержится более 3 млн сообщений. В последние годы ВОЗ организовала
обмен информацией о безопасности лекарств между национальными центрами разных стран
с номошыо электронных сообщений (система Vigimed). С 1996 г. в Интернете функционирует
специальный сайт программы ВОЗ (http. /wwxv.who-unic.org). В последующем во многих стра-
нах мира, в том числе п тз России, были организованы национальные центры но безопасности
30 Главе 1
лекарств. в задачу которых входит ортаии шипя работы по выявлению, учету н анализу данных
об осложнениях лекарственной терапии, а также разработке предложении по их профилактике
и лечению.
Согласно ФЗ «О лекарственных средствах» от 22.06.98 № 86-ФЗ ст. 41 и I. «субъекты
обращении лекарственных средств обязаны стхтбшать <|зелера.1ьному ортану кснолнптельной
плас пт. в компетенцию которою входит осуществление юсу: трет венною контроля и надзора в
сфере здравоохранения. и его территориальным ортитам обо всех случаях побочных действии
лекарственных средств в об особенности* взтимодействия лекарственных средств с другими
лекарственными средствами, которые не соответствуют сведениям о лекарственных средствах,
содержащимся в инструкциях ио их применению» (и. I в редакции ФЗ от 22.(18.04 .V 122-ФЗ).
Под руководством Федеральной службы по т здзору в сфере здравоохранения и социального
развития ФГУ НЦЭСМП принимает информацию о нежелательных побочных реакциях ЛС.
как тарептстрпроваиных в России, так и находящихся па клинических испытаниях, от субъек-
тов обращения ЛС. С целью получения унифицированной информации о побочном м|и|>екте
ЛС была разработана спепихтьная карта-н тветпенне о таком зффекте. определен порядок и
сроки предоставления информации (рис. 1-6)
Основным метилом сбора птн|юрмации о побочных я|зфекгах ЛС в России является метол
спонтанных сообщении, который зак. ючастся в добровольном предоставлении медицинским
раоотпиком подробной информации по разработанной стандартной форме. Полученная инфор-
мация анализируется. проводится оценка причинно-следственной связи и формируется база дан-
ных. Структурированная информация базы данных по побочным реакциям.IC Ф1У НЦЭСМГ1
Росздравнадзора позволяет получать следующие сведения: побочная реакция на определенное
ЛС. степень достоверности побочной реакции; количество побочных реакции в определенно!!
грхптте ЛС; оценка исходов побочных реакций, оценка побочных рсак тин по тяжести; количес-
тво сообщений из определенною района Российской Федерации и в патом ио стране Посту-
1Ьшж«
Рис. 1-6. Ciicuihl ыны карга извещение дзн сбора учн|<|)иннрованной iiih|x>pmuii>iii о побочном з<|к|х.кге ЛС
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 31
imioi и обрабатыванием сообщения от зарубежных фирм-производителей. в том числе о случаях,
произошедших на территории Российской Федерации. В последние годы отмечена тенденция к
увеличению количества сообщений от зарубежных фирм-производителей.
По резх тьтагам анализа отечественных и зарубежных сведений о нежели вольных побочных
реакциях ЛС из Государственного реестра ЛС были исключены небе «опасные препараты, та-
кие как амидопирин, фенацетин к нперогенныс свойства), астсмизол. терфенаднн (кардно-
токсические свойства — влияние па ишервад Q—Г). ЛС. содержанте ртуть. ЛС, содержащие
«материалы риска* в отношении прионовых заболеваний. и др.
1.4. СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ПОБОЧНЫХ РЕАКЦИЙ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
В настоящее время выделяют 4 типа неблагоприятных реакций. Однако это разделение
носит зачастую условный характер, так как в их развитии одновременно может играю роль не
один, а несколько механизмов. Классификация неблагоприятных побочных реакций представ-
лена в табл. I-2.
Реакции типа А предсказуемы, на их долю приходится около 75% всех нежслате питых по-
бочных реакций на лекарственные препараты. Реакции типа В (анафилактический шок. синд-
ром Стивенса—Джонсона, генетически обусловленные — метгемоглобинемия, порфирия и др.)
возникают редко, не связаны с дозой препарата, часто серьезные, на их юлю приходится около
25% всех зарегистрированных реакций. Реакции типа С часто расцениваются как серьезные,
способные существенно влиять на здоровье человека, и по своей природе зачастую необрати-
мы к моменту их выявления. К ним относятся синдром отмены, лекарегвенная зависимость,
кумулятивные эффекты и эффекты потавления выработки гормонов, толерантность. Диагнос-
тика неблагоприятных побочных реакций типа Г> (неоплазии лекарственною происхождения)
затруднительна, проводится с применением специфических методик.
Основными методами выявления и изучения нежелательных побочных реакций являются:
метод спонтанных сообщений: мониторинг взаимосвязи неблагоприятная побочная реакция —
лекарство с помощью учета выписанных рецептов: исследование типа «случай—контроль»; интен-
сивное мониторирование неблагоприятных побочных реакций в условиях стационара: когортные
исследования: метод, основанный на учете всех медицинских записей о больном; мета-анализ.
Для выявления неблагоприятных побочных реакций и принятия правильных решений в от-
ношении безопасности лекарств целесообразно использовать методы, адекватные определен-
Таб.шна 1-2. Классификация неблагоприятных побочных реакций (ио Wade. Beely. Rawlings. Thomson:
Royer: Астаховой A.B . Леиахину R.K.. 2004)
Тип реакции Проявление
Неб.1.иопр>1М1ные побочные реакции, зависящие от дозы И эбыточиип repaneui ичеекмй эффект
ттип АТ Побочные эффекты:
фар»мкало1 пчеекис
токсические
Вторичные эффскгы
Неблагоприятные побочные реакции, нс зэинснмыс от 1>1мчу1юа.1.1ерп1чсскпс
дозы пин В) Ml-xuiihjm пси вестей
Неблагоприятные побочные реакции пслсдствис ллитсть- Толерантность
ной терапии (гик С) Зависимость
Cflll.ipoM ОТМЕНЫ
Кумулятивные эффекты
Эффекты подавления выработки гормонов
Отсроченные я^иЬскты (тип IT) Mynriciniocn.
K.iHiiepoicmiocTb
Tcp.i ГОГЕН HOCH.
32 Глава 1
ним типам таких реакции. Методы выявления различных неблагоприятных побочных реакции
представлены в табл. 1-3
Одним из наиболее эффективных методов постмаркстингового выявления неблагоприятных
побозных реакции является метод спонтанных сообщении. Но главным принципом является
добровольное или законодательно оговоренное информирование соответствующих резулятор-
ных органов о выявляемых неблагоприятных побочных реакциях. Сообщения не могут быть
анонимными. Спонтанное сообщение о неблагоприятных побочных реакциях не может стать
основанием для профессионального разбирательства или преследования врача, лаже если из
сообщения следует, что эти реакции возникли вследствие врачебной ошибки. Основным пре-
имуществом системы спонтанных сообщении является возможность заршнстрпровать очень
редкие или неожиданные неблагоприятные побочные реакции. Например, поражение к. а-
панов сердца при приеме фенфлурамина зарез нсгрировано через 24 гола после появления
препарата па рынке в основном в связзз с учащением его применения в качестве средства,
вызывающею анорексию. Система спонтанных сообщений позволила выявить такие неблаго-
приятные побочные реакции, как увези при приеме метннранолола. нарушение нолей зрения
при применении вигабатрина и удлинение интервала (7-7’прзз приеме цизаприда.
Существующие системы ф зрмаконадзора. основанные па мен де спонтанных сообзпс-
пиз'з. особенно эффективны в оззределенпн неблагоприятных побочных реакции типов А и В.
С помощью данного метла были выявлены многочисленные побочные реакции, которые яви-
лись в отдельных случаях причиной нзъязия препаратов с фармацевтического рынка. Системы
споит изныл сообщений и акзивного мониторинга неблагоприятных побочных реакций явля-
ются важными инструментами выработки гипотез взаимосвязи между приемом ЛС и побоч-
ными реакциями. Для подтверждения таких ззпзотез или отказа оз них необходимо проводит),
допои нигстызые эпидемиолозические исследования В пострсгистрацззонных исследованиях
безопасности могут бызь проверены конкретные зипотезы. выявлен риск или проведено ак
гиззззос наблюдение прзз повседневном применении ЛС. Фармпрозз зволители в современных
условиях и зз соответствии с действующим в России законодательством янлязозся обязательны-
ми в активными участниками процесса мониторирования безопасное! и выпускаемых ими Л С
и должны представлять в регу шруюшис орзаны периодически обноззляемые отчеты о безопас-
ности (Periodic safety update repons — PSLRs) своих препаратов. PSLR яззляется важным инс-
трументом обобщения и анализа данных о безопасности ЛС. Оненк«з полученной информации
Таблица 1-3. Метены выявления различных исблагоприязиых побочных рсакзззззз (НПР)
Неб шгпирнятные побочные peas ши
НИР тип А /////’ тип В HUP тип С НИР тип 1)
Клинические испытания (ф;иы III и IV) Li Спонтанные сообщения Исследования типа случаи — контроль Исследования типа случай — контроль
Когортные нссэелоиання MoHinopiHH пыписывиемых рецептов Koiopnibie пссле юмши с длительным наблюдением Метод, основынкый на уче- те записей о больном
Мониторинг пыннсымзе- мых рецептов Иеслслоиания иша случаи — контроль Анализ забо.|епаемос111 н по1|Х?блсння лекаре! в с кподьюваписм большого числа пегочннкон ин<|юр- мицин
Спонтанные сообщения Данные ретстрон заболе- вании
Экспсрп ментальные нсстсловп1Н1я. например на жнвои1ых Метол. LiviiuBaiiiiuli ни счете записей о больном. Изучение забо зсвасмости и потребления лекарств с испольэоианием ботыиоцз числа источит коп iiii(|Kip- мацнн
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 33
и проведение необходимых мероприятии официальными инстанциями являются в настоящее
время основными функциями Росздравнадзора. направленными на обеспечение безопасною н
эффективною применения ЛС.
Достижения медицинской науки привели к внедрению огромного ко. пчесгва новых ЛС. Од-
нако проблем безопасности их применения становится все ботыие. Например, в мхлынцеиг-
ровых клинических испытаниях MER11-HI- COMET. OASIS. Al LAS. PREVENTMARS. FATS.
Cl APT. I.RT. EXCEL и ряде других сообщается о значительной распространенности пежсла-
к гьных реакций на ЛС различных групп. Часто развитие таких реакции связано с высокой
концентрацией IC в плазме крови вследствие изменения свойств системы биотрансформации и
транспортеров. К настоящему времени уже многое и зестно о полиморфизме генов, кодирующих
ферменты биогрансформанпн и транспортеров (см. гл. 3.3). В доклинических исследованиях всех
новых ЛС согласно концепции доказательной медицины необходимо учитывать их влияние на
состояние системы бнотрансформании и транспортеров. При проведении клинических испыта-
ний отбор пациентов должен проводиться с учетом генотипа изоферментов метаболизма. США
и страны ЕС при П|х>веденпи эксперт гы всех новых лекарств в обязательном порядке выявляют
основныс факторы, влияющие на ферменты метаболизма. С этой целью проводят генотипиро-
вание пациентов. В этих странах врачи в работе постоянно пользуются результатами новых фар-
макогенетических исследований. Как показывает анализ мировой литературы. для клинического
применения уже доступны около 150-200 генетических гостов. Их широко применяют в различ-
ных центрах США и стран Западной Европы, особенно во Франции, Великобритании и ФРГ. Во
Франции, например. разработана и уже используется в медицинской практике система SESAM.
Она включает компьютерную интерпретацию результатов генетического тестирования, а также
данные биохимических, серологических к иммунологических анализов. В холе се выполнения
уже используют свыше 80 тестов, которые обрабатывают при помощи специальной компьютер-
ной про рам.мы РРМА. Пос едняя включает собственно экспертную опенку, ра целы обучения
и тренинга для практикующих врачей, медицинское консультирование и справочник для на-
селения. Основной упор в данной программе сделан на интерпретацию результатов рамочных
генетических тестов, в первую очередь на определение генов системы детоксикации, отвегствен-
ных за чувствительность человека к раттичным внешним воздействиям, особенно к химическим
веществам. Токсикологические исследования и опенка риска сегодня являются важнейшими
взаимодействующими элементами системы обеспечения химической безопасности, согшалыю-
шненичсското и экологического мониторинга. В России аналогичных программ пока нет. а
число фармакогснстичсских лабораторий пока недостаточно. Однако ра: гичныс предиктивные
генетические тесты уже проводятся в специализированных лабораториях и центрах Москвы.
Санкт-Петербурга. Новосибирска. Томска и Уфы.
Необходимость внедрения в широкую медицинскую и экспертную практику методов гено-
типирования ферментов метаболизма лекарств (см. гл. 3 и 4) отражено в приказе Минздрава
России от 22.10.03 № 494 «О совершенствовании деятельности врачей — клинических фарма-
кологов». Применение фармакогенетнческих тестов и технологии биочипированпя (см. гл. 3.3)
поможет выявлению серий мутантных аллелей. ответственных за изменение ответа организма
(рис. 1-7).
В последние годы во всех развитых странах значительно возросли требования к объему и
качеству токсикогснегичсскон информации. Эго определяет важность сохтания системы на-
дежных экспресс-метолов исследований и позволит в ближайшие голы выработать алгоритмы
критериев необходимости и достаточности генетических исследований при изучении механиз-
ма действия рахгичных токенкантон (см. гл. 3.4.). Ниже представлена база данных по токсико-
геническнм вопросам лекарственной токсикологии
Токсимиенетические ресурсы
ТОКССЕТЬ hnp://toxnet.nlm.nih.gov/indcx.hirni. ТОКССЕI Ь предоставляет искомые ссылки
к многочисленным базам данных, содержащим информацию токсикологического характера.
Сюда включены ссылки на быу данных опасных веществ (БДОС’ ГЕНОТОКС). Система ин-
формации о химической канцерогенности (канцерогенность, мутагенность, развитие опухоли
и сдерживание роста опухоли).
Национальная токсикологическая программа (НГП) hup:/ nip-sener.nrehs.irih.gov/. Наряду
с другими этот сайт содержит ценную информацию о потенциально токсичных химических
34 Глава 1
Рис. 1-7. Схема токсико-генетических исследований (в частности, флрмакогснешческнх). служащих мо-
лекулярной основой обеспечения хкмкче< кой безопасности (Баринов В.С.. 2003; см. гл. 3).
веществах Сюда включены технические доклады НТП ио канцерогенезу, токсикологии н крат-
косрочные лок. алы по токсикологии многочисленных ксенобиотиков.
ba.ii данных о канцерогенном .действии (ЬДКД) littp://polcncy .bcrkcley.edu/cpdh.himl. Излага-
ется информация об экспериментах, включая весь биоанализ Национального института рака —
Наинойыьной токснколошчсскон программы (НИР/HI II) и экспериментальные результаты
из нпературных источников. Имеется информация более чем о КЮО химических вешсствах.
действии токсичных субстанций. База данных факторов воздействия на здоровье (htip://www.
atsdr.cdc.gov/hazdal hlml). включающая список приоритетных опасных субстанций, метаболи-
ты. взаимодействие субстанций, чувствительность населения, биомаркеры.
Гснкарточки htip://gcnome-U'Ww.stanford.edii/gcnccards/. Гснкарточки — информационная
база данных. коюрая имеет отношение к человеческим генам, их продуктам и роли в развитии
различных болезней. Гснкарточки предлагают информацию о функциях всех человеческих ic-
нон. у коюрых имеется соответствующий символ.
McdMiner hitp://dh>(_ ver.nci.nih.gov/icxtniining/riltcrs.lnml. Ишст и организовывает литерату-
ру по генам, ген-гсп-связям и гсн-лекарсизо связям.
Online Mcndciian Inheritance in Man (ОМ IM) htip://wwvv .ncbi.nlni.nih.gov/cnirez/qiicry. ОМ IM —
база данных, содержащая информацию о человеческих генах. Другие ссылки взаимосвязаны
с ресурсами ЧСВ1 Карга гена OMIM представляет цитогенетическую карту-позицию генов
болезней и других генных экспрессий, которые описываются в OMIM.
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 35
База данных гена опухоли http://condor.bcni.tnic.cdu/oncogcne.litnil. База данных содержит
информацию о генах, которые являются причинами раковых мутаций, протоонкогспов и ге-
нов. подавляющих опухоли. Ее задача — обеспечить стандартны и набор характеристик обо всех
известных генах опухоли.
База «чанных ссылок на массивы генов он-лайн (DRAGON) hlip://pevsneriab.kcnnedykrieger.
org/dragon.htm. Комментарий данных генной экспрессии. включающий хромосомную локали-
зацию и сетевую информацию в отношении конкретных генов.
GENATLAS http://www.dsi.univ-pBris5.fr/genatlas/. GENATLAS компилирует информацию о
проекте «Человеческий геном». Эта информация собрана из оригинальных статш в литературе
пли протоколов самостоятельных исследований Сайт позволяет искать информацию о генах,
связанных с конкретной патологией или фенотипом.
Программа «раковой анатомии» генома 11РАГ http://egap.nci.nih.gov/Pathways. Полезные
ссылки па многочисленные пути в ПРЛГ-Веб. которые преi ктанляюгся непосредственно из
Биокарты и КЭГГ (Киотской энциклопедии генов и геномов). Кроме того, каждый энзим
человека в KEI Г связан с соответствующе! информационной страницей о генах ПРАГ и каж-
дый основной метабс шт в КЕГГ связан с соответствующей информационной страницей на
ПРАГ. Биологические путевые карты могут также быть доступны па http://cgap.nci.nih.gov/
Paths/Kegg_Standard_Pathways.
Экспертная система белкового анализа (ЭксСБАи) http://www.expasy.ch/cgi bin/search-
biochcm-index. Допускает поиски метаболических последовательное!ей.
Данные генного выражения микромассивов окружающей среды http://www.mged.org/. Пре
доставляет высококачественные, хороню откомментированные научным сообществом данные,
информацию о стандартах облегчая содранне базы данных и связанного с ней программного
обеспечения. Сюда включена информация о микромасеивах. Кроме того, авторы, редакторы
и рецензенты работ по микромассивной экспрессии гена могут получить справку о наличии
необходимой информации в пуб иканиях по микромассивам.
База данных выраженных ярлыков последовательности (БД ВЯП) http://www.ncbi.nlni.nih.
gov/dbEST/. БД ВЯП — подраздел банка генов, котор! и содержит данные о пос ледова 1сльиос-
тях и другую информацию об «олнокапальпы.х» с ДНК последовательностях или о выраженных
ВЯП из множества организмов.
База данных учинена http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGenc/. Уинген — экспериментальная
система для автоматического разделения последовательностей в банке генов в безызбыточные
установленные ген-орнентнроваиные группы.
Индекс гена TIGR http://www.tigr.org/tdb/tgi.html. Ресурс для структурного, функциональ-
ного и сравнительного анализа геномов и генных продуктов из большого ряда организмов.
LocusLink http://www ncbi.nlm.nih gov/LocusLink/. LocusLink — инструмент, который обь-
елиняет описательную и носдедовагельпую информацию об официальной номенклатуре. псев-
донимах. увеличении последовательности. фентинах, числах OMIM группах унигена, аффс-
лированных иеб-саиtax
RefSeq http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/refseq нт1/. Содержит информацию о геном-
ной последовательности, включая геном ДНК РНК-копии и белковые продукты основных
исследуемых организмов.
Spidcy http://www.ncbi.nlm.nihgov/lEB/Research/Ostell/Spidcy/. Spidey пытается опреле-
ять экзон/ннтронную структуру, предоставляет одну или более моделей геномной структуры,
включая геном РНК.
Ген X http://www.ncgr.org/gencx/. Сотрудничество между Национальным центром геномных
ресурсов и университетом Калифорнии которое имеет целью предоставлять доступные данные
выражения гена в интернет-хранилище.
Массив-экспресс http://www.cbiac.uk/arrayexpress/. С; йт массив-экспресс стал доступным
благодаря Европейскому институту биопнформатикн (ЕИБ) Сайт является of шественным
хранилищем данных о микромасеивах. не 1ь которого — хранение хорошо откомментирован-
ных данных в соответствии с рекомендациями MGED.
\1axd http://bioinf.maH.ac.uk/niicroarray/niaxd/. Maxd — база данных визуального наблюде-
ния за средой геномной экспрессии, собранная университетом Манчестера.
36 Глава 1
Сборник генных зкспрсссин (СТЭ) htip://u-ww.ncbi.nlni.iuh.gov/geo/. СГЭ — хранилище ген-
ных жспрсссни NCBl’s. В нем собираются данные по нуклеотн.шм. uiniiie.iaxi и серийным
анализам по платформам генной экспрессии (SAGE).
.Другая ба mi данных микромассшюв (ДБДМ) htrp://wu-u.microarravs.org/solludre.hinil AMAD —
файл с веб-управляемой базой данных, предназначенной ня генерации ленных но микромасси-
вам. Он написан Майком И юном. Максом Деном. Полом Спслманом и Джозефом де Риш
ЭкспрессДБ http://arep.mcd.hanarcl.edu/ExpresxDB/. )кепрсссДГ> — реляционная база дан-
ных экспрессии РНК Гарвардского университета.
Стенфордская ба i данных но микромассивам (CbM)Iiitp.7/genome-uww5.stanford.edii/
MieroArray/SMD/ СЬМ — приоршег Стенфордского университета но хранению данных зк-
с'нериментом но мнкромассивам. а также файдов ио соответствующим образам. Кроме тою.
С ЬМ предоставляет интерфейс для поиска данных, анализа и визуального наблюдения.
ChipDB hitp-7/st । Ta.ui.mil.edu/chipdb/public/. ChipDB — база данных Массачусетско о тех-
ПОЛО1 ичсского ун и вереи-i era среды обшании дрожжевой генной экспрессии.
Ы Э hllp://wwu,.informatics.j;ix.org/mgihome/GXD/aboutGXD.sliiml. Ба ia данных генной экс-
прессии (Б1 )). которую создала лаборатория Джэксона — обшеензеиный ресурс по ннформа-
ЯШКи ылцлггергаш язырапзршм. мышеи.
Индекс ЧсГЭ hltp://uww.hugeindcx.org/. Индекс генной жспреисни человека имеет целью
предоставлять исчерпывающую oaiy данных для выражения экспрессии человеческих генов в
нормальных тканях Приве :ены измерения уровней экспрессии мРНК тысяч генов
RIKEN база данных экспрессии массивов с ДНК http://read.gsc.riken.go.jp/ База данных вы-
ражения гена поддерживается RIKLN. Институтом физического и химическою исследования
и Японии.
База данных избытка РНК < ЬИР) http://wuw.cbil.upcnr cdu,RAD2/. Бала данных избытка
РНК (БИР) университета Пенсильвании — общественная база данных генной экспрессии,
разработанная, чтобы иметь данные по базирующимся в массивах и не базирующимся в мас-
сивах экснерпмс1нам (SAGE). Нель — провести сравни шльный анализ экспериментов, выпол-
ненных другими лабораториями с использованием иных платформ и био.аш нческих систем
исследования.
SG D http://genomc-uuu4.stanford.cdii/cgi-bin/SGD/cxpression/expressionConncciion.pl. База
данных генной экспрессии Saccharoniyces Стенфордского унпверси1СЛ1 предоставляет во1мож-
ность одновременною поиска нескольких научных работ по микромассивной генной экспрес-
сии для данного гена.
Йельская баи данных но микромассивам (ИБМ) http://info.mcd.y ale.cdu/microarray/. 11БМ —
ба а данных генной экспрессии, разработанная несколькими лабораториями, по большей час-
ти из Йельского университета
Body Мар http://bodyniap.imsii-tokyo.ac.jp/. Bods Мар — банк данных экспрессии человечес-
ких и мышиных генов в разных тканях.
Острота http://www.axon.com/GM_Acnily.html. Содержи г различные исследовательские нис-
грументы. например иерархический, к-срелние и к медианные кластеры. SOM. РС.Х и другие
Профайл экспрессии http://ep.cbi.ac.uk/EP/. ПЭ имеет много полезных модулей с нотмож-
ноегямн кластерного анализа и визуального наблюдения генной экспрессии и данных после-
довательности.
Генкомпаноншик http://rnicroarray.gcnerinker.com/. Это npoipaMMiioe обеспечение содержит
инструмент предварительной обработки данных и оппии анализа например (руппировка.
SOMs. РСА и функции визуального наблюдения. Оно также обеспечивает схемы комментария
различных данных, в также личный прогноз н управляемые алгоритмы классификации.
Spotfire Decision Site http://www.spotrire.com/products/fg.asp. Spotfire Decision Site преллшает
новые возможности анализа. например иерархический и k-срелнин кластерный анализ. РСА.
поиск профайлов. тест на совпадения, нормализацию и множество диалоговых графиков для
визуального наблюдения данных. Имеется вопюжность aociyna к бг зам данных GATC.
Partck Pro http://wuw.piinck.com/htmI/prodiicts/pTOducis.htmL Этот пакет позпо 1яет осущест-
влять исчерпывгпошую обработку, анализ и визул.тыюс наблюдение данных. Вотможности
включают исследовательский анализ данных фатисгическое заключение, модетиротшие про-
глоти и связь с независимой базой данных.
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение. 37
Iснный источник http://www.silicongciietics.com/cgi/SiG.cgi/Prodiicls/GeneSpring/indcx.snif.
Эго программное обеспечение допускает анализ различных типов массива У пего есть хоро-
ший пользовательский интерфейс, который поддерживают кластерный анализ. РСА. SOM и
инструменты статистики.
Rosetta http://www.roscttabio.coni/producis/rcsolver/dcfaiili.htm. Это. в первую очередь, база
данных с возможностями анализа. например ошибка моделирования. статистика качества,
группировка. SOM и многочисленные инструменты визуального наблюдения. Кроме того, он
предлагает алгоритмы прогноза Байесовского класса, ANOVA и алгоритм ROAST, чтобы найти
гены с аналогичными профилями экспрессии.
I сномаксимум http //www.informaxiiic.com/solutions/genomax/indcx htnil Модуль анализа
генной экспрессии в п|теделах GcnoMax содержит исчерпывающую коллекцию кластерных ал-
горитмов и инструментов визуального наблюдения. Он позволяет организовывать и сегменти-
ровать данные в полезные категории, допускающие любую из выбранных грхтш генов, а также
позволяет сохранять любую из них для последующей детальной трассировки и использования.
Программное обеспечение имеет ряд инструментов выбора маркировки гена.
Генный взгляд http://www.biodiscovcry.com/gcnesight.asp. Генный взгляд предлагает модули,
например визуальное наблюдение GencPic, фрагментированные графики 2D н 3D, вычерчи
ванне гистограммы диалогового коэффициента, иерархическую и сетевую группировку. РСА и
др. Ои обеспечивает статистический анализ, обладает возможностью хромосомного наблюде-
ния. имеет коллектор комментариев.
Генная математика http://www.applied-niaths.coni/ge/gc.htm. Этот пакет позволяет осущест-
влять иерархическую группировку, анализ начальной загрузки, имеет инструменты манипули-
рования дендрограммами, самоорганизующиеся карты. РСА и другие возможности.
MA-ANOVA htip://www.jax.oqj/stafr/churchill/labsne/softwarc/aiiova/indcx.htnil. Установка
функций, записанных в Матлаб группой Гари Чачила для дисперсионного анализа в базе дан-
ных микромассивов.
J-Экспрссс Pro http://www.nioimine.com/fniniesct/fniijcxpress.htm Этот пакет позволяет осу-
ществлять, например, иерархическую группировку, к-срсднюю частичную «руниировку. глав-
ный анализ компонентов. поиск сходсгва профайла, имеет самоорганизующиеся карты и инс-
трументальные средства предварительной обработки данных
ТМ4 http://www.tigr.org/software/tni4/. Блок инструментов ТМ4 состоит из 4 основных прило-
жений: Менеджера данных микромассивон (МДМ). TIGRSpolfmder, Системы анализа данных
микромассивов (САДМ) и мультиэкспсрементального наблюдения (МП). Этот блок учитывает
нормализацию данных и различные передаточные коэффициенты лля обнаруж ния различных
экспрессий генов, использует графическое представление результатов. Про1раммнос обеспече-
ние — гибкое, расширяемое и поддерживает ряд входных и выходных форматов.
Исследователь микромассивон (ММИсслелователь) hitp://m:iexplorer.soiirccforge.nct/. Пред-
ставлены возможности методов нормализации, фильтрации данных, фрагментирования тра-
фиков. гиетотрамм, профайлов графиков экспрессии, иерархической группировки, к-срелней
и к-мсдиаиной группировки генов. Имеется возможность применения аналитических методов
пользователя и предлагается прямой доступ к другим геномным базам данных.
BRB Массив Инструменты http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. BRB Массив Инс-
трументы — встроенный пакет лля визуального наблюдения и статистического анализа мик-
ромассивных данных экспрессии тона ДНК. Возможности пакета включают нормализацию,
фрагментированный график, фуппировку. многомерное масштабирование и прогноз.
МассивЛБ http://genome.nhgri.nih.gov/arraydb/. МассивДБ — программный блок, который
обеспечивает интерактивный пользовательский интерфейс для выявления и анализа микро-
массивных данных генной экспрессии.
Группа гена http://www-genonie.wi.niit.cdii/cancer/software/software.htnil. Представлены воз-
можности фильтрации и направления данных различными путями. Инструментальные средс-
тва включают самоорганизующиеся карты. k-ближние соседние (КБС) алгоритмы. выбор гона
и тесты перестановки.
X Кластер http://gciidics.stanrord.cdu/-shcrlock/clu.sicr.hlinl. Профамма второго поколения,
аналогичная программе «Кластер* и самоорганизующиеся карты.
38 Глава 1
Скан Анализ. Группа, Treeview http://rana.lbl.gov/EisenSortwarc.htm. Программное обеспе-
чение, созданное Майком Изенсм с возможностями иерархической группировки, к-срслнсй
группировки. самоорганизующихся карт, главною анализа компонентов (Г/\К). визуального
наблюдения и выделении признаков диагностического класса.
Анализ значения микромассивов (АЗМ) http://www-4ai.staiiford.edu/ tibs/СЭМ ’. Коррели-
рует данные генной экспрессии в ряд клинических параметров, включая обработку, категории
диагноза.
РАМ http:///www-stat.stanford.edu/%7Etibs/. Выполняет классификацию экземпляров из
данных генной экспрессии, оценивает ошибку прогноза через перекрестную проверку и пре-
доставляет список значимых генов, чья экспрессия характеризует каждый диагностический
класс.
1.5. ПРАВОВОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ И РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ ДОКУМЕНТЫ
В ОБЛАСТИ КЛИНИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
И СЛУЖБЫ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ
Острые химические отравления в России выдвигаются па одно из первых мест в числе
причин нетру ^способности. заболеваемости н смертности населения. В 2002 г из 268 5II гос-
питализированных больных с диагнозом острого отравления химической этиологии. включая
43 2 i 3 детей до 14 лет. погибло 52 465 (по данным Минздрава РФ). Причинами большинства
острых отравлений в разных регионах страны являются лекарственные вещества, наркотики,
алкоголь. Кроме того, загрязнение среды обитания увеличивает риск возникновения этиологи-
чески обусловленных заболеваний. Например, во многих регионах особенно в крупных горо-
дах, отмечается рост сердечно-сосудистых заболеваний. бронхиальной астмы, нарушений реп-
родуктивных функций, врожденных пороков развития у детей. нсиро тндокрипной патологии.
По-прежнему высока угроза террористических актов с применением химических веществ.
В последнее время наркомания распространяется в нашей стране но законам эпидемии. Ко-
личество лиц. употребляющих наркотические средства за последние 2 года, составляет 5 млн.
подавляющее большинство из них молодые люди в возрасте до 30 лег Отличительной чертой
современного оборота наркотиков в России является расширение их ассортимента, поскольку
появляются многочисленные легальные лекарственные средства, оказывающие одурманиваю-
щее действие при нсиийьзопании их в больших дозах, кроме того, увеличивается доля незакон
по производимых наркотических препаратов с высоким содержанием действующею начала (см.
гл. 7.1). Поэтому химический фактор является одним из основных при оценке риска причине-
ния вреда жизни или здоровью граждан. Регламентируемая гкопо ателыгыми актами и четко
организованная работа аналитической службы, осуществляющей химико-токсикологический
анализ. позволяет контролировать уголовно наказуемые действия и способствовать оказанию
медицинской помошп при острых отравлениях, а также эффективной диагностике и лечению
больных наркоманией. Конечный результат работы химико-токсикологических лабораторий
преобразуется в юридический ответ. На территории РФ в соответствии с действующим зако-
нодательством и ее международными обязательствами контролируется оборот около 300 инди-
видуальных химических соединений, включая их соли, простые и сложные эфиры, природные
и искусственные смеси, содержащие эти вещества, в гом числе их лекарственные препараты. а
также более 10 низов высших растений, грибов, насекомых и пресмыкающихся, их части, про-
дукты жизнедеятельности, а также продукты их kvc гарт гой или промышленной переработки,
инертный газ неон, различные реактивы и прекурсоры наркотиков. Вес действия, связанные
с законным и незаконным оборотом наркотиков, регламентируются рядом гаконолатсльных
документов, к числу которых относятся Уголовный. Уголовно-процессуальный и Гражданский
кодексы Российской Федерации. Федеральные законы Российской Федерации, постановления
Правительства Российской Федерации, а также ряд нормативных документов соответствующих
ведомств (МВД. ФС1>. Министерства здравоохранения и социального развития — МЗиСР.
Федеральной таможенной службы, ФСКН — Федеральной службы но контролю за оборотом
наркотиков Российской Федерации и др., см. электронное приложение).
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 39
В соответствии с законом РФ «О наркотических средствах и психотропных веществах* 1998 г.
наркотическими средствами и психотропными веществами называются вещества синтетичес-
кого или естественного происхождения, препараты, растения, включенные в «Перечень нарко-
тических средств, психотропных веществ и нх прекурсоров, подлежащих контролю в Российс-
кой Федерации» (далее Перечень).
К наркотическим средствам причисляются вещества и срс сгва, перечисленные в Единой
конвенции ООН о наркотических средствах 1961 г., а к психотропным веществам — Конвенции
ООН о психотропных веществах 1971 г. В cooibctctbiih с Конвенцией ООН о борьбе против
незаконного оборота наркотических средств и психотропных веществ 1988 г. в указанный Пе-
речень внесены прекурсоры наркотических средств и психотропных веществ — вещества, часто
используемые при производстве, изготовлении и переработке наркотиков. Согласно Уголовно-
му кодексу РФ. ответственность за противоправные действия е наркотическими средствами и
психотропными веществами одинакова Действующий в настоящее время Перечень утвержден
ностаноыением Правительства Российской Федерации № 681 от 30.06.98 Все возможные из-
менения и уточнения в Перечне проводятся по предложениям ФСКН РФ и МЗнСР России
Перечень состоит из 4 списков, на которые разбиты включенные н него вещества в соот-
ветствии с уровнем контроля над ними (см. электронное приложение).
Список /. Наркотические средства и психотропные вещества, оборот которых запрещен.
Содержи! около 160 |мименований. В их число входят 42 производных морфинана, около
30 производных фен илал килам и на и амфетамина, 20 производных феннлпинеридина. 16 про-
изводных метадона. 10 производных фентанила, 8 производных индола, все известные произ-
водные фенциклидина. Кроме того, в этот Список включены следующие растения и продукты
их переработки:
• мак снотворный (Papaver soniiTiferuiTi. sp Papaveraceae). а >акже лрушс виды маков: вое
точный, пртшветковый. щетинконосный. содержащие алкалоиды морфин, кодеин, тебаин
или орипавин; млечный сок (опий); маковая солома и экстракт .маковой соломы, содер-
жащие указанные алкалоиды; ацетилированный опий, героин; конопля (Cannabis saliva, sp.
CannabinaceaeY.
• каннабис (марихуана): птшиш (анаша, смола каннабиса); масло каннабиса (гашишное мас-
ло); тетрагидроканнабинолы (все изомеры):
• кат (молодые побеги с листьями вечнозеленого кустарника кат съедобный — Caiha edulis
Forsk)'.
• кокаиновый куст (Eryihroxylon coca L.Y, лист кока, кокаиновая пае та;
• плодовые тела трнбов, содержащие псилоцин и псилоцибин;
• кава-кава (Piper methysticum); чаши растения в cot аве биологически активных добавок к
пище (включены 01.01.04).
Сюда отнесены также все смеси указанных обьсктов. нх изомеры, соли, эфиры, сели сущест-
вование таковых возможно. Использование объектов Списка I допускается только по специ-
альным лицензиям в качестве стандартных образцов (реперных веществ) в нсучной и учебной
работе, экспертной практике и оперативно-розыскной деятельности
Список 2. Наркотические средства и психотропные вещества, оборот которых ограничен
Список 3. Психотропные вещества, оборот которых огра <ичен и в отношении которых допус-
кается исключение некоторых мер контрам В нею включены широко распространенные ЛС
бупренорфин, кодеин, морфин, кокаин, пентазоцин, промедол, просидол, амобарбитал, кета-
мин. хальцион, натрия оксибутират и т.п. (более 60 соединений), а 1акже их соли, сушешвона-
ние которых возможно. Работа с этими средствами проводится по специальным лицензиям, а
разработка, производство, ввоз/вывоз. рОпределение и уничтожение — только специальными
государственными предприятиями и организациями.
Список 4 Список прекурсоров, оборот которых ограничен. В него входят. ангидрид уксусной
кислоты, антраниловая кислота, п-апеги. антраниловая кислота, ацетон, и зосафрол, красный
фосфор лизергиновая кислота п-метилэфелрин, 3.4-мстилсндиоксифенил-2-пропанон, мс-
тил этил кс юн (2-бугаиои), норнсевдоэфедрин. перманганат калия, пиперональ, пиперидин,
псевдоэфедрин, сафрол, серная кислота. исключая се соли, соляная кислота, исключая сс
соли, толуол, фенилуксусная кислота, фенилпронаноламин, 1-фенил-2-11ронанон. эргометрин
(эргоновин), эрготамин, лиловый эфир, эфедрин, включая соли, образование которых солей
40 Глава 1
возможно. В настоящее время уточняется порядок работы с этими реагентами и pi ггворитс.тя-
ми. чтобы и {бежать сложностей на химических предприятиях, в многочисленных лаборатори-
ях. в сфере бытовой химии.
Кроме веществ и средств, приведенных в Перечне, в соответствии с законодательством Рос
сийской Федерации действуют списки сильнодействующих. ядовитых, одурманивающих ве-
ществ, издаваемые Постоянным комитетом по контролю наркотиков (11К КII). а также сводная
забита заключений НККН об отнесении к небольшим, крупным и особо крупным размерам
количеств наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, обнаружен-
ных в незаконном владении или обороте (см. электронное приложение).
В Список сильнодействующих веществ, но состоянию на 01.07.06, включено свыше 100
наименований, среди которых лекарственные средства некоторые виды лекарственного расти-
тельного сырья: рожки спорыньи \Secale согпишт — склероций триба Clavicepspurpurea (Fries),
Tulasne. сем. ClavicipitaceaP\. грана -.эфедры {Herha Ephedrae — молотые побеги следующих видов
кустарника эфедра: хвощевидная, средняя, рослая, двухколосковая) и кава-кава, растворители,
в том числе часть прекурсоров: пиперидин, толуол. хлороформ, этиловый х|эир В этом списке
доминируют производные бензодиазепина (35 наименований). эфедрин. псевдоэфедрин и их
препараты (более 20 наименований), барбитураты (12 наименований). Кроме того, в список
включены известные ЛС: клофе.ши. мепробамат, теофиллин. еолутан. циклодо.т. а также па-
кеты. именуемые «ганские таблетки» для похудения, более 10 анаболических гормонов и их
сложных эфиров и др. Оборот сильнодействующих веществ ре т у. тируете я нормативными доку-
ментами МЗиСР России, а вся деятслытость осуществляется при наличии лицензий.
К списку ядовитых веществ но состоянию на 01.07.06 относят: соли ртути и ртуть метал-
лическую. нромсран. соли мышьяка, в том числе натрия арсенат, стрихнина нитрат а также
следующие растения. животные и продукты их переработки: аконит (различные вилы Асопнит;
реповидный (A. napellus). каракольский (A. karakoHcum). джунгарский (.4 soonporicum)\ и ос
новной алкалоид аконитин; сумму алкалоидов красавки (Atropa belladonna /. и Alropa caucasica
Кг., сем. пасленовые — Solanaceae) и основные алкалоиды: гиосциамин, скополамин: экстракт
чилибухи (Strychnos пих vomica I , сем лотапиевые — loganiaceae) и его основные алкалоиды
бруиин и стрихнин: яд змеиный и пчелиный, а также продукты их переработки п др.
В Список одурманивающих веществ внесены смеси алкоголя в любых соотношениях с кло-
фелином, димедролом, барбитуратами или тропяновыми алкалоидами, а также вызывающие
одурманивание растворители и газообразные вещества: хлороформ, эфир, толуол, хлорэтцд.
закись азота и криптон (см электронное приложение)
Постановление 11равитслт.сгва РФ от 07.02.06 N" 76 «Об утверждении крупного и особо
крупного размеров наркотических средств и психотропных веществ для целей статей 228. 228- 1
и 229 Уголовного кодекса Российской Федерации» (с изменениями от 8.07.2006) утвердило
соответствующие размеры контролируемых веществ
Постановление Правите, ьства РФ ог 08.06.06 № 421 «О внесении изменений в некоторые
постановления Правительства Российской Федерации по вопросам, связанным с оборотом
наркотических средств и психотропных веществ» внесло ряд изменений в Перечень наркоти-
ческих средств и психотропных веществ, которые контролируются на территории Российской
Федерации
Таким образом, всего по Перечню и всем приведенным выше спискам проходит около 300
индивидуальных химических соединений, а также все возможные их соли, простые и сложные
эфиры, природные и искусственные смеси, содержащие эти вещества, более 10 видов высших
растений и трибов. их части, а также продукты их кустарной и промышленной переработки.
Ниже приводится перечень основных нормативных документов, которые регламентируют
проведение жспергиых (судебно-химических и клинико-токсикологических диагностических)
процедур в химико-токсикологических лабораториях (см электронное приложение)
• Уголовный кодекс Российской Федерации от 13.06.96.
• Уголовно-процессуальный кодекс Российской Федерации от 18.12.01
ФЗ от 04.07.03 № 92-ФЗ в кодеке внесены изменения
Обстоятельства работы лабораторий нередко обусловливаю г применение статей Гражданс-
кого и Трудового кодексов РФ. а также кодекса «Об административных правонарушениях РФ»
и ряда других
Система государственного контроля, организационно-правовое обеспечение... 41
Федеральные законы
• ,Np I or 0<S.0l.9S «О наркотических средствах и психотропных веществах»;
• № 73-ФЗ от 3l.05.0l «О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской
Федерации» (с изменениями от 30.0l.0l);
• № Кб от 22.06.9S (редакция от 22.0S.04) «О лекарственных среу гтвах», а также ряд других ФЗ
РФ.
Постановления Правительства РФ
• №23! от 06.05.04 «Об утверждении размеров средних разовых доз наркотических средств и
психотропных всшсств для целей статен 22S, 22X-I и 229 Уголовного кодекса Российской
Федерации:
• № 76 от 07.02.06 «Об утверждении крупного и особо крупного размеров наркотических
средств и психотропных веществ для целей статей 228. 228-1 н 229 Уголовного кодекса Рос-
сийской Федерации», а также ряд других постановлений Правительства РФ.
Приказы М3 РФ
• № 233 от 05.06.96 «Об аккреди тации клинико-лиа) шкл ичсских лабораторий в качестве эк-
спертных»;
• № 2S9 от 05.10.98 «Об аналитической диагностике наркотических средств, психотропных и
других токсичных веществ в организме человека»;
• № 1021 от 25.12.73 «О введении нового перечня токсических веществ, подлежащих судебно-
химическому исследованию в лабораториях бюро судебно-медицинской экспертизы»;
• № 45 от О7.О2.2(ИИ) «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных ис-
следований в учреждениях здравоохранения РФ».
• № 460 от 29.12.2000 «Об утверждении учетной .документации токсикологического монито-
ринга». Дан перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся
при острых отравлениях, и их коды но МКБ-10;
№ 9 от 0S.0l.02 «О мерах по совершспсгвоваиию организации токсикологической помощи
населению РФ»;
• № 238 от 26.07.02 «Об организации лицензирования медицинской деятельности»;
• М 161 or 24.04.03 «Об утверждении инструкции по организации и ирон водству экспертных
исследований в бюро суцсбно-мслипинской экспертизы»;
• № 220 от 26 05.03 Огр гелевой стандарт. Система стандартизации в здравоохранении РФ.
«Правила проведения внутри лабораторного конгро я качества количественных методов
клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов»;
• № 30S от 14.07.03 «О медицинском освилсгелмлвонаиии на состояние опьянения» (с изме-
нениями от 07.09.04).
Приказы МЗиСР РФ
• N I от 10.01.06 «О внесении изменений в приказ МЗРФ от 14.07.03 № 308».
• .\*> 40 от 27.01.06 «Об организации проведения химико-токсикологических исследований
при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоготя. наркотических
средств, психотропных и других токсических веществ».
Письма М3 РФ
• № 10-04/6-ииф. от 12.05.04. Перечень приборов для измерения количества (концентрации)
алкоголя. разрешенных к применению в медицинской практике:
• № 10-04/6-ннф. (дополнение) от 12.05.04 Перечень разрешенных к применению медицин-
ских изделий для скрининговых исследований наличия наркотических средств, психотроп-
ных всшсспз и алкоголя в организме человека.
Следует заметить, что согласно приказу МЗиСР РФ от 10.01.06 № I. концентрация обнару-
женных в моче психотропных вошеств нс имеет значения для вынесения заключения о состо-
яния опьянения при наличии клинических признаков опьянения. Пункт 2.17 Приложения к
приказу гласит: «Заключение о состоянии опьянения в результате употребления наркотических
среде) в. iicnxoipoHHbix или иных вызывающих опьянение веществ выноситсз) при наличии
клинических признаков опьянения и обнаружении при химико-токсикологическом исследо-
вании биологического объекта одного или нескольких наркотических средств, психотрог пых
или иных вызывающих опьянение веществ или их метаболитов вне зависимости от их концен-
трации (количества)». В то же время в РФ отсутствуют официальные или рекомендованные
42 Глава 1
пороги обнаружения наркотических и психотропных веществ в моче применительно к химико-
токсикологнчажому анализу. Утверждение таких порогов крайне необходимо для корректной
интерпретации результатов химико-токсикологического анализа в сочетании с клиническими
признаками опьянения. Необходимо четко разделять такие основные понятия. как факт упо-
требления тех или иных вешеств. концентрация которых в моче может быть крайне низка,
и клиническая картина опьянения, при которой в моче освпдетельствуемых обычно обнару-
живаются относительно высокие их концентрации. За рубежом пороги обнаружения (cut-off)
наркотических и сильнодействующих веществ в моче установлены, но они в разных странах
различны (см. гл. 7.1). В настоящее время правомерность вынесения заключения о состоянии
опьянения, вызванного неустановленным веществом, регламентируется приказом МЗиСР РФ
от 10.01.06 № I. хотя эго и является самым спорным вопросом при медицинском освидетель-
ствовании. Случаи, когда при наличии клинических признаков опьянения в биосрсдах обсле-
дуемого не обнаруживаются психоактивные вещества. могут быть объяснены отсутствием в ла-
боратории современного аналитического оборудования н/илн несовершенством утвержденных
специальных методик. Начиная с 2006 г., медицинское освидетельствование в РФ проводится
на основании приказов М3 РФ от 14.07.03 J\ 308 и МЗиСР РФ от 10.01.06 Nj I Подробные
методические указания в отношении клинико-диагностических тестов, лабораторных методов
исследования и этих приказах отсутствуют, ноэгомх лаборатории в своей работе опираются на
документы прошлых лет. например Методические указания Минздрава СССР от 01.09.88 N
06-14/33-14 «Мелипинское освилетс ьствование лля установления факта употребления алкого-
ля и состояния опьянения» и современную научно-методическую литературу (см. электронное
приложение)
Другой важной проблемой является отсутствие в РФ официального порога содержания ал-
коголя в выдыхаемом воздухе. В настоящее время ГД РФ готовит такой законопроект. За рубе-
жом. практически во всех странах, пороги содержания алкоголя в выдыхаемом воздухе давно
регламентирую!ся и обычно составляют 0.3—0.5 mi/л (см гл. 8.1).
Из жидких биологических сред при освидетельствовании для установления факта употребле-
ния алкоголя и алкоголы ого опьянения обычно исследуется моча. Однако в приказе МЗиСР РФ
от 10.01.06 № I исследование мочи для этих целей нс обозначено, в то же время в приказе
МЗиСР РФ от 27.01.06 N® 40 такое исследование регламентируются. Явное противоречие двух
новых приказов, вышедших в свет в одно и то же время, затрудняет работу лабораторий.
Глава 2
КЛАССИФИКАЦИЯ ТОКСИЧНЫХ АГЕНТОВ
И ВИДЫ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
Ялов в научном смысле нет.
1мбруаз Огюст Тардъе
(1818 1870)
2.1. НЕКОТОРЫЕ ПОНЯТИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ТЕРМИНЫ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ТОКСИКОЛОГИИ
«Всякому известно, что в способе производить анализ, предшествующий наблюдению, один
ум чрезвычайно разнится от другого. Анализ этот составляет сущность акта наблюдения. На-
блюдателем следует назвать нс того, кто только видит находящуюся прел его глазами вещь, а
того, кто видит, из каких она частей состоит Исполнить это хорошо — есть редкое дарование.
Один человек от невнимания или оттого, что надлежащим образом направляет свое внимание,
не замечает половины того, что видит; другой отмечает более того, что видит, смешивая ви-
димое с воображаемым или с выводимым; другой отвечает род всех обстоятельств. но, будучи
неопытен в оценке их степени, оставляет количество каждого обстоятельства неопределенным
и неизвестным: иной хотя и видит целое, по неловко делит его па части, соединяет в одну
массу вещи, которые должны быть отделены, и разъединяет другие, которые удобнее было бы
рассматривать как одну вещь, так что результат тот же. а иногда и хуже того, как ссди бы он и
нс пытался анализировать»*. Редким аналитическим дарованием облачал Л. Тардье. знамени-
тый судебный медик, сумевший химическими методами многократно дока «агь в суде отравле-
ния ядами, идентификация которых и сегодня в ряде случаев бывает затруднительна Однако
именно Л Гардьс на основании своей огромной практики сделал заключение: «Ядов в научном
смысле нет». В практической деятельности судебные медики, судебные химики, токсикологи
нередко используют ермипы «ял» или «ядовитое вещество». Но какое определение можно
дать понятию «ял»? В начале XIX века основоположник научной токсикологии Матье Джозеф
Бонавентура Орфила (1787—1853). химик, физик и врач, i рофессор и декан медицинского фа-
культета Сорбонны, писал: «Яд — вещество, которое в малом количестве, будучи привс епным
н соприкосновение с живым организмом, разрушает здоровье или уничтожает жизнь». Ранее
в XV веке последователь Аристотеля. Гиппократа и Галена выдающийся ученый Филинпус
Аурелиус Теофрасюс Бомбастус фон Гогенхейм — Парацельс сформулировал основы ятро-
хпмни: «яд» по своей сущности является химическим агентом: необходимость и возможность
экспериментальною распознавания химических агентов; обнаружение — необнаружснис ядов
обусловлено дозой химического агента («все есть яд... и только доза отличает яд от лекарства»);
связь между природой химического соединения и их терапевтическим и токсическим дейс-
твием существует. Но задолго до знаменитых слов Парацельса великий иранский поэт Рудаки
(941 г.) написал такие строки: «Что ныне снадобьем слывет, то завтра станет ядом. И что ж?
Лскарсгнох этот яд опять сочтут больные». По мнению извеснюго российскою токсиколога
проф. Н.В. Лазарева, «ялы — суть вещества, которые вызывают повреждение немсханичсским
Мить Джон Сгкмрт ()80Ь—1873) — анивПскии фитософ и психозсн
44 Глава 2
путем» (1936). Согласно определению судебною химика проф. М.Д. 111 лайковой. «ядовитым
веществом или „ялом” называют (условно) такое вещество, которое, будучи введено в орга-
низм в малых количествах и действуя па нею при опредс. спиы.х условиях химически или фи-
зико-химически. способно вы звать'болезнь или смерть» (1965). Каждое из приведенных, к.к и
множество других известных определен и ii. можно подвергнуть критике Авторы солидарны с
мнением токсиколоюв. которые считают, что термин «ял- следует исключить нт определении
современной токсиколоюи и. в частности. с постулатом проф. С.А. Купенко «ядом становится
нобос химическое вещество, если при соприкосновении с организмом оно вызвало заболева-
ние (интоксикацию) или гибель».
В исследовательской и практической деятельности как в РФ. так и за рубежом lopai.io чаше
используются термины «гоксикаиг» и «ксенобиотик* (часто как синонимы). Однако некоторое
различие между этими поняными существует. Токсикант — токсичное химическое вещество
любом химической прироты. способное нарушить гомеостаз биологической системы и оказать
на нее вредное влияние при взаимодействии, вызывая повреждение или гибель.
KteionuomuK — чужеро. юс вещество, введенное любым путем в организм.
В опубликованных в 261*2-2006 гт. российских научно-методических изданиях по токсико-
логии (Лош&ткип Н.А.. Куценко С.А.. Курляндский Б.А.. Филон Н А п лр.) науку токсиколо-
гию трактуют как учение о токсичности н токсическом процессе.
Токсичность — «снопе i во или способность химических веществ, юиствуя па биологические
системы немехзннческим путем, вызвать их повреждение или гибез ь».
Токсичность проявляется как результат взаимодействия па молекулярном уровне Токсично-
го вещества, биосистсмы и окружающей среды. Каждый из учаспзуюших обьекюв сложен, из-
менчив в качественном, количественном и врсмспнбхз отношении. Результат взаимодействия
таких сложных переменных веет да рассматривается с вероятное™ ой точки трения.
Механизмы токсического действия химических соединений па организм человека рассмотре-
ны в главе 3.2. Токсическое действие вешеств. регистрируемое, на попу тяииоппом и биогсопе-
нотачсском уровнях, называют зкотоксичсским (см. гл. К*). Результат токсического действия
вещества и компенсаюрно-приспособигельных реакций (адвитационных возможностей) ор-
ганизма формирует ответ, или токсический процеа.. развитие которого обусловлено многими
факторами (рис. 2-1).
В гибл. 2-1 приведены некоторые примеры влияния различных факторов на проявление
токсического зф<|>екта.
Рис. 2-1 Факторы, определяющие
развитие токсическою пронесен ТВ —
токсическое нсизсетно.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 45
Таблица 2-1. Внтяние различных факторов на проявление токсического эффекта
Факторы влияния Особенности ашяиия
Возраст Устойчивость к гипоксии у детей до 5 лет высокая, у подростков и стариков низкая
Пол Мужчины более чупеннцельны к действию инсулиии. никотина. <|юсфорортаничсских соединении, женщины — к псйствик» СО. мор- фина. барбитуратов, алкоголя
Этническая ириппдлежиосп. Скорость б|1отринефс1рмап1Ш ксенобиотиков определяется лничсс ки.мп различиями. которые связаны с генетическими особетшоешми (см. гл. 3 и 4)
Н»1Д|[1ИО5ШЬ!!ан непереноси- мое и» По данным Американской медицинской ассоциации, побочные ре- акции на прием лекарств занимают 4—6-е место среди причин смерти в США. Решение проблемы: нал гите у каждого человека генетическою иас- по н» (см. гл. 3)
Время суп к 9ч— минимальное (min) содержание глюкозы в крови. 18 ч — мак- симальное (max). 16—18 ч — min содержание темот лобина в крови. 11-13 ч — max. 3—15 ч — утилизация гликогена в печени. 15—3 ч — его накопление. При действий тепатотоксичиых веществ выраженный эффект можно ожидать в 18-20 ч (min гликогена и глюкозы)*
Гипербария При повышенном барометрическом давлении (гипербарпи) усили- вается токсичность СО. алкоголи. пестицидов, мнотнх наркотиков, развивается синдром взаимною отягощения
Уровни шума и вибрации При повышенном шуме и вибрашш усиливается токсичность СО. алкоголя. дихлорэтана. определенных наркотиков и других токсич- ных вешесгв
* В настоящее время есть снедения об изменениях головых и дневных ритмов функциональной актнг пости рецепто-
ров. а также возрастных изменениях рецепторных систем (см 1л. 3).
Токсический процесс проявляется метаболическими, патоморфологическими. клинически-
ми альтерациями (повреждениями), связанными с патогенетическим механизмом, посредством
которого действовало токсичное вещество, совершившее химическую агрессию (см. гл. 2.4—
2.10). Проявления токсического процесса изучают на молекулярно-генетическом, клеточном,
органном, организменном и популяционном уровнях. На организменном уровне токсические
процессы классифицируют как процессы, формирующиеся по пороговому (интоксикация) или
беспороговому (тератогенез) принципу. Последний имеет вероятностный характер
Интоксикация (отравление) — нарушение функции организма под влиянием токсиканта
(яда), которое может привести к расстройствам здоровья или лаже смерти. Механизмы фор-
мирования и особенности течения интоксикации зависят ог природы, дозы, способа введения
токсиканта и других факторов (см. рис. 2-1). Интоксикации могут быть острыми, подострыми
и хроническими
Острая интоксикация развивается в результате однократного или иовюрното действия гзешсств
в течение ограниченного времени. подострая интоксикация — в результате непрерывного или пре-
рываемого во времени действия токсиканта продолжзпе.тыюстью до 3 мсс. хроническая интоксика-
ция — в результате продатжигелытото действия т окен каш a (инот га в течение многих лет).
К настоящему времени в мире зарегистрировано более 10 млн химических веществ, более
60 000 из них используется в быту в виде лскарст венных средств (4000). нишевых добавок (5500).
пестицидов. косметических препаратов, препаратов бытовой химии и тдг. (1500). По данным
на 2002 г., в РФ почва содержит I млрд тони отходов, зарегистрировано 268 511 отравлений.
46 Глава 2
из них 52 465 с летальным исходом (нрпчшм 40 000 из них — алкоголь и лекарства), средний
возраст погибших 27 лег, 82.7% из них погибли на догоспитальном пане.
По степени тяжести интоксикацию подразделяют на тяже гю (угрожающую жизни), сред-
ней тяжести (необратимое повреждение органов и систем, приводящее к инвалидности, дли-
тельное у течению, тяжелым осложнениям) и легкую ('заканчивается полным вы гдоронлением
пострадавшего).
Действие токсиканта может быть местным (процесс р щипается непосредственно на месте
аппликации токсиканта), общим (в процесс вовлекаются многие органы и системы) и избира-
тельным (специфическое поражение органа или системы, имеющих низкий порог чувствитель-
ности к токсиканту).
В профилактической токсикологии приняты такие понятия, как «вредное вещество», пре-
дельно допустимая концентрация (ИДК), порог вредного действия и др. Вредное вещество —
вещество, которое при контакте с организмом человека в случае нарушения требований без-
опасности может вызван* производственные травмы, отравления, профессиональные заболе-
вания или отклонения в состоянии здоровья, обнаруживаемые современными методами ис-
следования как в течение рабочего стажа, так и в отдаленные сроки жизни настоящего и
последующих поколений. Порог вредного действия вещества (острого и хронического) — его
минимальная концентрация (лоза) в объекте внешней среды, при воздействии которой в ор-
ганизме возникают изменения, выходящие за пределы физиологических приспособительных
реакции, или скрытая (временно компенсированная) патология. ИДК вредных веществ в воз-
духе рабочей зоны — это концентрации вредных веществ, которые при ежедневной (кроме
выходных) раооте в течение 8 ч или другой продолжительности, по нс более установленного
законодательством каждой страны, нс могут вызвать заболеваний или отклонений в состо-
янии здоровья, обнаруживаемых современными методами исследования, в процессе работы
или в отдаленные сроки жизни настоящего и последующих поколений. ПДК маскималыгая
допустимая концентрация (МДК). ориентировочный безопасный уровень вещества (ОБУВ)
— юридически утвержденные лозы веществ, признаваемые для человека в условиях повседнев-
ной жизни, аварийных ситуаций. на производстве. Они рассчитываются на основе принятия
концепции пороговости. Дозу, ниже которой современными методами исследования нельзя
обнаружить дег сзвие токсиканта на биообъект, принято обозначать как «пороговая доза».
Зависимость доза-эффект распространяется на все уровни организации биосистем Доза-
эффект — зависимость наблюдаемого изменения в системе от содержания в ней токсичного
вещества или концентрации токсиканта в объектах окружающей среды.
Доза—ответ — частота ветре гае мости наблюдаемых отклонений (ответов), достоверно отли-
чающихся от нормальных уровней в изучаемой биосистеме, в зависимости от дозы токсиканта,
поступившего в систему, или содержания токсиканта в объектах окружающей среды.
Основной параметр зависимости доза—эффект для конкретного токсиканта и определенно-
го биообъекта — ветчина tpe< неэффективной дозы (ED*,) вещества, при действии которой ни
объект развивается эффект, равный 50% максимально возможного.
В клинико-токсикологических н судебно-химических исследованиях интерпретация анали-
тических результатов как юридического ответа невозможна без сравнительной оценки полу-
ченных данных с общепринятыми и представленными в справочной литературе терапевтичес-
кими, токсическими пли летальными концентрациями в биожидкостях и тканях человека.
(ля Л В экспериментально установлено: чем шире терапевтическая зона безопасности (zne-
рапевтическое окно, терапевтический индекс) — диапазон, соотношение между эффективной
лечебной дозой и лозой, приводящей к тяжелым, опасным для жизни побочным реакциям,
тех» безопаснее лекарство. Терапевтический индекс может быть рассчитан по результатам до-
клинических исследований как соотношение дозы, вызывающей фармакологический эффект у
50% животных (ED^, и дозы, вызывающей гибель 50% животных (LD,) О терапевтической
широте прспара а может свилсгс.гьствовагь также и индекс Брока-Шнайдера — отношение
дозы препаразпа. вызывающей токсический зффект у 10% животных (LDI(). к дозе, оказывающей
фармакологическое действие у 90% животных (ED..J. F..B. Арзамасцевым и соавт.. предложено
использовать коэффициент опасности, который обозначает риск (или вероятность) токсичес-
кого дег сгвия вещества при назначении дозы, вызывающей у 90% подопытных животных ле-
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 47
чебиый х|м|тект. Т.А. Гуськовой предложен метол по оценке безопасности применения ЛС в
клинике па основании результатов доклинических токсиколотнческих экспериментов. учиты-
вающий условия применения ЛС в клинике, — терапевтическую дозу для человека и продол-
жительность лечения на основании определения наиболее чувствительных органов или систем
к данному препарату при повторном введении. При изучении хронической токсичности ЛС
определяют наиболее чувствительные органы (ортаны-мишени) к данному препарату. Рассчи-
тывают суммарную дозу препарата в миллиграммах на I кг (мт/кг). вызывающую изменения
структуры органа. Дзя учета скорости окислительных процессов (зависит от вида млекопи-
тающих) используют известные коэффициенты пересчета дозы с каждого вида животных на
человека, собранные в специальные таблицы. Определяют суммарную потенциально безопас-
ную дозу препарата для человека. адекватную дозе, вызывающей патологические изменения
в органах-мишенях у животных. Полученную величину следует разделить па суточную дозу
препарата, рекомендуемую в инструкции, и получить расчетный безопасный курс (РБК) при-
менения препарата в клинике. На основании соотношения РБК препарата и курса его при-
менения. заложенного в инструкции по применению, вычисляется индекс безопасности (ИБ).
величина которого может служить критерием безопасного применения у людей. Чем выше И Б.
тем безопаснее ЛС. На основании величины ИБ лекарственные препараты делят па классы
опасности. Исследования новых потенциальных ЛС направлены на получение одновременно
эффективных и безопасных препаратов.
Терапевтическая концентрация — эти концентрация лекарственного вещества в крови (сы-
ворогкс или плазме) человека, при которой препарат оказывас эффективное клиническое
действие без значительных побочных эффектов. Токсическая концентрация — это концентра-
ция лекарственного тын дру ого химического вещества в крови (сыворотке или плазме) чело-
века. при которой появляются значительные токсические симитомы. Летальная концентрация
— эго концентрация лекарственного или другого химического вещества в крови (сыворотке
или плазме) человека, которая вызывает смерть или настолько превышает терапевтическую
или токсическую концентрацию, что может вызвать смерть. Летальные концентрации лекарс-
твенных веществ в крови трудно определить. Смерть может быть объяснима комплексом раз-
тттчных факторов: отравлением на фотте склеротического поражения органов, интоксикацией
на фоне синдрома абстиненции и др. (см. гл. 5).
Концентрации выражаются в:
• мг/л;
• мг% (миллиграмм-процент), равный мг/дл (миллиграмм на децилитр);
• мкг/мл (микрограмм на миллилитр), равный мг/л (миллиграмм на литр).
Для переведения в:
• мт/мд необходимо концентрацию, выраженную в мт %, разделить на 100;
• мкт мл необходимо концентрацию, выраженную в мкг%. разделить па 100;
• мг% необходимо концентрацию, выраженную в мг/л. разделить на 10.
Для того чтобы выразить концентрацию в единицах СИ в ммоль/л. необходимо концентра-
цию мг/л разде тить на молярную массу вещества.
2.2. ЧТО ПОНИМАТЬ ПОД ЗАВИСИМОСТЬЮ
СТРУКТУРА-ТОКСИЧНОСТЬ?
Знание физико-химических свойств токсикантов позволяет правильно оценить многообра-
зие их химических превращений, происходящих в организме, в том числе при взаимодействии
со структурой-мишенью (см. гл. 3.2). выбрать способ решения аналитической задачи обнаруже
ния и количественного определения токсиканта вбпосредах (см. гл. 5) и при необходимости -
методы детоксикации (см. гл. 2.5).
Химические вещества характеризуются разной токсичностью, которая может различаться в
тысячи и десятки тысяч раз (габл. 2-2).
48 Глава 2
Таблица 2-2. Токсичность различных ве шести при олнокр.пиом поступлении их и оргаптм
Токсикант Токсичность, мг /кг массы тела Мо.тикхлярная масса
Токсин боту шзма А о.шюоз ЧОО (100
Токсин столбняка 0.(ХН)1 150 (100
Риппи 0.02 66 000
Дифтерийный токсин 0.3 72 000
Афлаток к н В 10 312
Курарик 500 696
Cipiixiiiui 500 334
Никотин НИМ» 162
Цианистый натрин 10 ООП 49
Фенобарбитал 1 100 000 232
Природа всшества определяет его токсичность. Можно выделит многие свойства токеияан-
та. влияющие на изменение его токсичности, однако пн одно из них не будет определяющим.
Чю следует понимать, говоря о связи структура—токсичность (активность)? Структура -
строение молекулы вещества, определяющее все его физические и химические cboi спи Био-
орг.шическая химия исследует взаимосвязь структуры с физическими, химическими и биологи-
ческими свойств, мп вещества, учит предсказывать его свойства ио структурной формуле. Необ-
ходимые рекомендации можно наши в современных руководствах но биоорг.шической химии п
базах данных. Активность (в том числе токсичность) — влаимодействие вещества с рецептором.
Действие токсиканта представляет собой сложный мнопктутнитчатый процесс в котором его
ассогшання с рецептором явигястся лишь начальным этаном реализации биологической актив-
ности. за которым следуют дальнейшие события, в конечном счете могущие проявиться и в
виде ииюкеикапин (см гл. 3.2). Поэтому о влиянии строения вещества на его действие умест-
но говорить, только если рассматривается де тствис па рецептор. Трудами многих выдающихся
ученых XX века, в том числе и наших соотечественников, прс.чиожспа обобщенная концепция
регуляторных механизмов функций клетки. «Рецепторы — это генетически детерминированные
мобильные. лабильные главным образом белковые структуры. с|ункнии коюрых заключают-
ся в „узпаваншГ химическою спита и последующей его трансформации в адекватный ответ
клетки» (П.В. Сергеев. 1999). Первоначально имеет место «узнавание* рецептором соответству-
ющего лиганда. которое характеризуется специфическим взаимодействием молекул-партеров с
высоким сроясгвом друг к дрп В результате этого взаимодействия реали (уется вторая функция
репетиров — трансформация полученного сигнала в биохимическую и затем в физиологичес-
кую реакцию живых систем. Рецепция, обеспечивающая восприятие и перс гачу информации
клепке для формирования ад-минной ответной реакции при воздействии какого-либо химичес-
кого сигнала, является важнейшим гомеостатическим механизмом па клеточном и субклеточном
уровнях Большинство реценюров прсдскшляют собой белки, их агрегаты и комплексы с нукле-
иновыми кислотами или определенные низкомолекулярные вещества (см. гл. 3.2). Химический
агент реали зует енот я|х|>ект через взаимодействие с рецептором, который располагается либо на
поверхности клетки, либо в одном или нескольких участках внутри нее В ответ на возбуждение
рецептора изменяется функция многих клеточных органелл и метаболических систем.
Существуют различные классификации рецепторов. Возрастающий уровень знаний в облас-
ти биохимии и топографии реггей торов отражается и в нх ранжировании (сравните табл. 2-3:
2-4 н 3-1).
По принципу выполняемых функции рецепторы делят на две группы (табл. 2-4).
Деление на основные рецепторы и рецепторы-модуляторы достаточно условно, кроме того,
основные рецепторы могут функционировать и взаимосвязанно. Рассмотрение только одного
типа рецепторов недостаточно для понимания всех возможностей регуляции интегрального
ответа клетки.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 49
Таблица 2-3. Клеточная локализация рецепторов и их corp: женпосгь с биострукврами <11 В. CepieeB и
др., 1999)
Лиганды Локализация рецепторов Рспляипя числа репей горов Механизм функшюнирования
Бе иково-иепгидные ормоны. бншенные амины, ацетилхо- лин. бензодиазепины. HMiiiipiiMiiii. опиаты, стероидные гормоны, простагландины* Плазматическая мемб- рана «Рс|у.1япия снизу» вы- явлена во всех случаях (гниерн.'ыимнпгя) Пптукпия образования или ингибирование обра- ю нация нАМФ или нГМФ Пвменение проницаемос- ти для ионов К". Cl . Na* il in Са; Изменение обмена фос- фолипидов
Липопротеины низкой плотности. гликопро- теины. фибрин, коба- ламии П м ^магическая мемб- рана Зависимость связыва- ющей способности от концентрации двухва- лентных ионов Интернализация лиганда в клетку
Стероидные гормоны всех классов** 1 (нтозоль Ялерная транслокация И гмененне зрайскрниини генома
Тиреоидные гормоны Ядро Изменение транскрипции 1 сломи
*,Тля некоторых ненк-стн на плазматических мембранах существуют .«на класса рецепторов. один in которых принимает
участие и опосредовании действия на активность мембранных ферментов и иронгнме.мост1. нонн ах каналов. а лру ш
обеспечите। их интерн сипанию.
••Природа рецепторов стерон.шых гормонов, оносрс lyioiiiia их влияние на активность мембранных <|»ерм нзоп. изу-
чена недостаточно тем. гл. 31.
Таблица 2-4. Классификация рецепторов по принципу выполняемых функции
Основные рецепторы, опосредующие псйсгпне .тиган ов ни эф<|>скторы Рецсггторы-хюдуляторы. опосредующие действие лигаилов на функцию других рецепторов
Адренергические Холинергические Дофаминергические Г ис там инсргичсские Серотонинергические ГАМ Kepi ические. Гормональные рецепторы Опиатные Пуриновые Бен годив гепнновыс Имннрамвнопыс
Примечание. В табл. 3-1 (см. 1Я. 3) показана связь рецепторов, их агонистов н антагонистов. ГАМК — гамма-ами-
номасляная кислота.
Рецепторы не метаболизируют токсикант, а сами претерпевают обратимые химические из-
менения. вызывающие последующие ступенчатые химические процессы, которые в свою оче-
редь и приводят к определенному (например, токсическому) конечному эффекту.
Длительность и селективность взаимодействия определяются особенностями химической
природы и токсиканта, и реиешора. а также типом связей между ними. Это ковалентные,
водородные. ионные связи, дитмь-дипольное или дисперсионное взаимодействие (рис. 2-2). Обра-
зование или разрыв любой из этих связей — химическая реакция, протекающая с заметным
изменениех| энергии. Токсиктгы редко образуют прочную ковалентную связь с рецептора-
ми. Чаще происходит образование клатратов, представляющих собой физическое включение
молекул токсикантов в «карманы» (изгибы) молекул биополимера. Прояв 1ению клатратного
50 Глава 2
ффекта в значительной мере способствует образование пековалеиптых связей. Если (в боль-
шинстве случаев) проявление биолит пчсското эффекта не связано с образованием ковалентной
связи, то метаболизм токсикантов всецело определяется разрывом ковалентных связей в сто
молекуле. Координационная связь является разновидностью ковалентной связи, образование ко-
торой часто происходит в результате многих биохимических реакций. Эю связано с процесса-
ми синтеза, преобразования и разложения бе зков, реальную возможность протекания которых,
их направление и скорость нередко обусловливают ноны металлов (см. гл. 8.5). ВтЬродняе
связи образуются лишь при очень малом расстоянии между взаимодействующими атомами и
достаточно сирого ориентированы в пространстве, поэтому они обладают высокой нзбиратель-
ностыо и направленностью. что очень важно при связывании токсиканта с рецептором. Кроме
юго. водзродные связи во многом ответственны за формирование пространственной структуры
биополимеров (белков, полисахаридом. нуклеиновых кислот) и протекание важнейших биохи-
мических процессов. Связи, образованные электростатическими силами (с большим радиусом
действия), также играют существенную роль при взаимодействии токсикантов с рецепторами.
Этот тип связей обеспечивает легкость обмена ионов. Прочность ионной связи уменьшает-
ся обратно пропорционально квадрату расстояния между разноименными зарядами, не имея
стропой направленное*™ в пространстве В биологических средах. содержащих много конкури-
рующих ионов, продолжительность существования таких связен может составлять ПУ' с имен-
но вследствие ионного обмена. За счет электростатического притяжения могут существовать
связи между ионом и диполем пли между двумя диполями Энергия линоль-дипольного
взаимодействия обратно пропорциональна 3-й степени расстояния между час пн тми. Элект-
ростатическое взаимодействие между токсикантом и рецептором тем не менее может сущес-
твовать в течение длительного времени, особенно если расстояние между ними способствует
образованию еше и короткодействующих связей, таких как диполь-дипомное и дисперсионное
взаимодействие. Последнее возникает между неполярными молекулами в тех случаях, кот та
структура двух молекул лает возможность подойти друг к другу на достаточно близкое рассто-
яние Энергия ван-дер-ваальсовых сил изменяется обратно нронортшон тлыто 6-и степени рас-
стояния между молекулами Наличие в молекуле токсиктнта иони зированной группы способс-
твует сближению молекул до расстояния, па котором начинают действовать ван-дер-ваальсовы
силы. Этот тип связи, но-видимому. имеет первостепенное значение в соединении токсиканта
с рецептором. Временные (наведенные) диполи, образующиеся в атомах за счет колебательной
энергии, индуцируют диполи в других, соседних молекулах, что в конечном счете и приво-
дит к возникновению притяжения между ними. Дисперсионные взаимодействия проявляются
сильнее между* молекулами с длинными цепями. Таким образом, в результате тесного контакта
агента с рецептором между ними могуч возникнуть достаточно прочные дисперсионные взаи-
модействия. Две молекулы могут быть связаны яруг с др ом ионными силами в одной точке
и ван-дер-ваальсовыми — в другой, как. например, при интеркалировании токсикантом ДНК
(см тл. 3.3). что значительно повышает прочность связи.
Хорошо известно (1936). что одна и та же химическая группа в зависимости от своего
химическою окружения может обусловливать действие как агониста, так и антагониста (аце-
тилхолин и губокурарин). С точки зрения теории рецепторных взаимодействий это хорошо
обьяснимо. Агонисты возбуждают рецепторы, антагонисты блокируют их. При действии на
один и гот же рецептор меныттая молекула точно соответствует участку связывания и активи-
рует его. тогда как большая молекула, перекрывая рецептор, оказывает блокирующее дсп гвне.
Известно много химических рядов, низшие гомологи которых являются атонистами. гомологи
с большим числом атомов углерода — антагонистами.
Для проявления биологического действия наиболее важными свойствами являются рас-
пределение электронной плотности и стсрическос строение молекулы токсиканта. От распре-
деления электронной плотности зависит способность молекулы к ионизлиии. облегчающей
или прснягетвуютией взаимодействию вещества с рецептором. Сгсрические свойства молекулы
определяют степень ее комплементарное™ к рецептору Многие токсиканты имеют в своих
молекулах асимметрические атомы углерода и существуют в виде стереоизомеров, часто (но
не ветла) проявляющих различную активность (токсичность). Энаигигмер с более высоким
сродством к рецептору называется эутомсром. противоположный — дистомсром (от греч. ей —
хороший и dis — плохой). Левовращающий R-изомер адреналина (т.е. эугомер) в 15 раз актив-
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 51
кДж/моль
-350 - Ковалентная связь
0.15 нм
Образование один рной
углерод-углеродной связи
109
Молекула свернута
["пример]
-40
-Стабильность белка
-30
Макроэргмческа
~ химическая связь
Молекула мэвернута
АТР - ► AOP+Pt
Phe
Свертывание лизоцима
в воде
Гидролиз АТФ
з
Л
S
т
X
а
§
«3
8
3
-10
Неполярная среда
Гидрофобный
' " эффект
Неполярная;среда
вода
вода
Менее упорядоченная
вода
Н с
Н Переход боковой цепи
q-"' остатка Phe из раствора
внутрь белковой
молекулы
Вода
Lys]
Н—N—Н
Ионная связь лр q
(солевой мостик)
вода
Веда
Н
66 I
Н — N —| Lys| Образование солевого
мостика в белковой
молекуле
-2.5
- Водородная связь С6+
Вода
-Тепловое движение
Н5*
Поступательное
► Тепловое движение
двухатомн й молекулы
Вода
Вода
Образование водородном
связи между двумя
пептидными группами
-1
Электронное
облако
Ван-дер-ваальсоео
аимодействие
межд) двумя а омами
О Вращение
Вандер аальсое^ОЗhi
радиус
Сближение двух атомов
ут вреда из бесконечности
до непосредственного
контакта
Рис. 2-2. Энергия рахшчпых типов химических связей вешсстна с рецептором (Rees Л.. Sicmberg М .
2006) Phe — фенильный оыаток
нее своего оптического правовращающего антипода (дистомера). Один (левовращающий) из
синтетических аналогов каннабиноидов проявляет в 4000 раз более высокую психотропную ак-
тивность чем его правовращающий энантиомер п приблизительно в 100 раз — чем природный
(3 R, 4 К)(-)-Л‘-тетра1илрокаинабпнол (см. гл. 7.1). Принцип трехточечного взаимодействия: в
рецепторе имеются 3 группировки атомов, благодаря которым возможно связывание компле-
ментарных атомных групп (атомов) хирального токсиканта (рис. 2-3).
При любой пространственной ориенышш только один из знай iномеров может связываться
с рецептором полное тою. другой имеет возможность объединения с рецеп ором лишь двумя
своими атомными группами. Рахшчный биологический эффект при взаимодействии рецеп-
тор — токсикант .может наблюдаться при связывании либо с тремя, либо с двумя лигандами.
52 Глава 2
Рис. 2-3. Обоснование различных фармакологических счюиств лннпномеров (no Ldllmann cl в!.. 2(КЮ).
Понятно, что достоверно прогнозирован» ожидаемую активное!ьтрео- и зритроформы стерео-
изомеров. рацематов, я-диастсреомеров или других стереоизомеров. различных конформеров
токсикантов можно только при изучении механизма образования связи с определенным рецеп-
тором или рецепторами.
Многие лекарственные вещества (рубомппип. адриамицин, акрихин и хингамнн и пр.),
имея плоскую часть молекулы, иитеркалпрхтот в ДНК. вклиниваясь между нарами оснований.
Такой комплекс стабилизируется ван-дер-ваальсовыми силами, а также ионными связями с
фосфатными группами ДНК. что препятствует расплетанию цепей ДНК и ее нормальному
функционированию.
Ионы Си?’. Ni2’. Fe , Zn’* и лрутих метанов аффективно конкурируют с протонами за атом
азота Тили серы и кислорода! в содержащих донорные атомы лигандах. Стеричсские особенности
образуемых комплексов способствуют увеличению их проницаемости через клеточные мембра-
ны и модулируют доступность подобных комплексов для разноооразных клеточных рецепторов.
С позиций мстатлоли! аилного гомеостаза (см гл. 8.5) токсичность mhoihx лекарственных ве-
ществ, имеющих в соёГаве молекулы атомы азота. серы, кислорода, объясняется способностью
хелктнродап» ноны металлов. Летальное действие нианил-ионов вызвано образованием коорди-
национной связи е центральным атомом железа. хсла/ировпиным в порфирине.
Рецепторы и токсиканты могут изменять конформации друг друга. Конформации рецепто-
ров (например, гликолипидных) клеточных мембран человека изменяются под действием ток-
сикантов (например, некоторых бактериальных токсинов). Конформационные изменения пе-
редают приносимую биополимерами информацию через клеточную мембрану. Взаимодействие
токсина с псрепеп горными олигосахаридами. являющимися колирующей частью гликолипид-
Классификация токсичных агентов и вицы токсического действия 53
ного рецептора, нс вызывает конформационных изменений в мембране. Другие гликолипиды,
химически родственные активируемым, могут инактивировать токсины, конкурентно ишибн-
руя их связывание с рецепторными молекулами. Одни токсиканты имеют жесткую структуру,
а другие могут деформироваться иод действием рецептора. В свою очередь ото может вызвать
такую геформапию белкового рецептора, что токсикан! входит в им же созданную в рецепторе
полость («инду-киня соответствия»). Принцип «индукции соответствия» может как повышать,
так и значм сльно снижать токсическое действие вещества. Например, предложенный авго-
рами настоящего пособия (Каледина Н.И., 1982, Калстнн Г.И.. 1997) способ N-гликозили-
рования и комплсксообра овация лекарственных азотсодержащих вс шести с рядом мешллов
позволил в 8-10 раз еннзззть токсичность исходных лигандов, в том числе и за счет «индукции
соответствия» гликопротеинового рецептора на мембране клетки.
Степень ионтации токсиканта (зз тон или иной среде организма) определяет возможность
его проникновения через различные типы мембран, всасывания в определенных отделах же-
«удочно-кишечного тракта, взаимодействия с катионными или анионными псиiрамп рецеп-
торов. распределения в тканях и жидкостях организма, выделения из биообъектов с целью
последующего анализа |см. гл. 4 и 5).
Степень ионизации токсиканта ео|к*п1чески зависит oi двух основных параметров: pH сре-
ды и рКа токсиканта. При реальных значениях pH биожцдкостен степень ионизации токси-
канта зависит от многих факторов: липофильности, способности к специфической или не-
спсцифичсской сольватации за счет дипо зь-лннольных или дисперсионных взаимодействий
соответственно, поверхностном активности, окислителыю-воссзановительных превращений:
комплексообразования с белками, металлами и др. Эти <|мзкторы обсуждаются в главах 4 и 5
Огромное число экспериментальных работ и фундаментальных трудов содержат информа-
цию о взаимосвязи токсичности и фармакологической активности определенных классов соеди-
нений с их физико химическими свойствами и структурно-функциональными особенностями
рецензоров физиологически активных веществ. Эта об петь знаний требует междисциплинар-
ного подхода, здесь сходятся интересы специалистов в области молекулярной патологии и
кримина.1ис1ики. физической химии и нанотехнологий. ор1аннческой химии и лекарственного
дизайна, судебной медицины и аналитической химии. Вопросы взаимодействия вещества с
рецепторами (рис. 2-4) обсуждается в главе 3 и во второй части книги при изложении свойств
отдельных токсикантов.
2.3. ТИПЫ КЛАССИФИКАЦИЙ ТОКСИЧНЫХ АГЕНТОВ
Line 16 столетий назад быта известна классификация греческого физика Диоскура: «Яды
делятся на растительные, животные и мин ральные».
И звсстно множество типов классификаций токсичных вешеств. в основу которых положены
разные принципы. Классификации токсикантов делятся на две основные группы: общие, ос-
нованные на принципе, пригодном для всех химических вешеств. и специальные, отражающие
связь между отдельными физико-химическими или другими свойствами веществ и проявлени-
ями токсичности этих веществ
1. Классификация токсикантов как химических соединений, вызвавших отравление. Хими-
ческая классификация, (юнованная на природе вешеечва, предусматривает деление всех токси-
кантов па органические, неорганические и элсмсито-оргаиическис По принятой междупарод-
ной химической номенклатуре опрс еляюгся класс и группа этих веществ.
2. Классификация токсикантов, основанная на их происхождении. По этой классификации
токсиканты телятся на вещества естественного происхождения и синтезированные человеком.
Токсичные вещества ccieeiвенного происхождения в свою очередь полразде зяются на токен
канты биологического происхождения и нсбиояогической природы (схема 2-1).
3. Широко используется классификация токсичных вешеств отр«жаюшая их практическое
использование.
• Промышленные яды. используемые в производстве: органические растворители (дихлор-
этан), топливо (метан, пропан, бутан), красители (анилин), хладагенты (фреон), химические
реагенты (метиловый спирт), пластификаторы и др. (см. гл. 8 и 10).
54 Глава 2
Возбуждающий
нейрон
Na* Са3-
Л к Ингибирование
~ высвобождения
Глутамат
z питяылтя
зтосухсмыил
вальпроевая
кислота
НМДА-
рецептор
___глутамата
фенитоин
ламотриджин
СГ
росо
Инактивацию
повышают
Тормозящим
нейрон
. I вмш тин
вальпроевая
> «слота
ХОСТ
Са2'-каяал
Блокаторы
кальциевых
каналов Т-типа
ГАМКа-
рецвптор
Антагонисты
НМДА-рецелтора
вальпроевая
кислота фелбамат
Потенциал-,
зависимый*
Na'-канал
ГАМК-миметики
бенздиазепины
барбитураты
вигабатрин
тмагэбин
габапентин
Рис. 2-4. Примеры взаимодействия рейс»торов с токеикэшзмн (подробнее см гл. 7) (no Lallmann ct al
2000).
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 55
• Ядохимикаты. используемые для борьбы е
вредителями сельскохозяйственных культур;
хлорорганические пестициды (гексахлоран,
пояихлорпинен). фос<|>орор1дническне ин-
сскпнптды (карбофос, .хлорофос, фосфа-
мил. трихлормстафос-3. мстнлмсркап1о<|х>с),
ртутьортничсские вещества (гранозан), про-
изводные карбаминовой кислоты (есвин).
В зависимости от назначения ядохимикатов
(пестицидов) различают:
— инсектициды — уничтожзюшие насекомых:
— акарициды уничтожающие клешей:
зооциды — уничтожающие грызунов.
— фунгициды — уничтожающие трибы:
— бактерициды — уничтожающие бактерии;
— гербициды — губительно действующий на
растения. К гербицидам относятся также
дефолианты (для удаления листьев расте-
ний). лессиканты (для высушивания рас-
Схема 2-1. Классификация токсичных веществ
естественного происхождения.
гений), репелленты — отнхтиваюшис на-
секомых (см гл. 8.4).
• Лекарственные средства (см. курс фармакологи и гл. 7).
• Бытовые химикаты: пищевые добавки (уксусная кислота), средства санитарии, личной ги-
гиены и косметики: средства ухода за одеждой. мебс ью автомобилем (см. гл. 8).
• Биологические — растительные и животные (см. гл. II)
• Боевые отравляющие вещества (БОВ), зарин, инриг. фост ей. сшпсгичсскис яды военной
химии (см. Лошадкин Н.Л., Курляндский Б.Л.. Военная токсикология. 2006).
Кроме этою, токсиканты классифицируют но патофизиологическому. гигиеническому, на-
юхимическому. токсикологическому (разделение химических всшсств но токсическому дейс-
твию на организм) п другим принципам
4. Общее признание получила гигиеническая классификация ядов;
I степень чрезвычайно токсичные, LD^ 15 мт/кг и ниже;
II степень — высокотоксичныс, LD , — 1>—150 мг/кг;
III степень — умеренно токсичные. LD — 150-1500 мг/кг;
IV степень малочокенчные. LD,„ 1500 мг/кг
LD указана при энтеральном поступлении токсиканта
5. В судебной медицине принята классификация отравлений. основанная на патофизио-
логическом действии ялов. По этой классификации выделяются ялы с резко выраженным
местным действием в области первичного контакта с тканями (едкие яды); резорбтивные ялы,
токсический эффект которых проявляется лишь после всасывания. Резорбтивные ялы подраз-
деляют па ялы крови, приводящие к биохимическим изменениям в ней. и функциональные
яды. обусловливающие главным образом функциональные изменения морфологии органа. Та
кая классификация сугубо условна.
6. Наибольшее значение для клинической токсикологии имеет токсикологическая классифи-
кация — разделение химических веществ но токсическому действию на организм (табл. 2-5)
Таблица 2-5. ГоксикологАческая классификация
Характер токсического воздействия Токсичные вещества
Нернио-парали гичсскос Фосфороорганичехгкие инсектициды, никотин, анабазин. БОН
Кожно-ре зорбти иное Дихлороэглн. гскс« зоран. БОВ мышьяк, ртуть в др.
Обще । окси ческое Синильная кислота, угарный газ, алкоголь и др.
Уду иаютсс Оксиды азота. БОВ
Слезоточивое и раздражающее Хлорпикрин. БОВ
Психотическое Наркотики, атропин. ЬОВ и др
56 Глава 2
7. В зоксиколозпп и судебной медицине использую» также классификацию ядов по из-
бирательной токсичности. Соз.тасно »той классификации яды подразделяю! на сердечные,
нервные, печеночные, почечные. кровяные. желудочно-кишечные, легочные. Избирательное
токсическое действие нс отражает всего мнозообразня клинических проявлений. а нянь ука-
зывает на главную опасность для определенного органа или системы организма — основного
места токсического воздействия.
X. При проведении химико-токсикологических исследований, например судебно-хмззчсскои
зкеперти зы, токсичные веществе классифицируют по методу июлирования их из биологических
материалом (см. гл. 5-11) В соознезстнии с згой классификацией выделяют зруину всшеств.
изолируемых дистилляцией (технические жидкости): группу веществ. изолируемых нолкис-
чеиным спиртом иди подкисленной водой с последующей экстракцией (наркотики, лекарс-
твенные препараты); группу веществ, изолируемых минерализацией (соли металлов): ipynny
веществ, изолируемых лианном (едкие вещества): группу веществ, изолируемых особыми ме-
тлами (фториды).
2.4. ВИДЫ ТОКСИЧНОСТИ
2.4.1. Понятие о биологических маркерах
Изменения в метаболизме предшествуют гистологическим изменениям в тканях. Опреде-
ление индивидуальных реакции организма на воздействие токсиканта до получения достовер-
но фиксированных морфолотнческих или гоксиколотнческих изменений способствует ранней
диагностике повреждений, вызванных химических! веществом.
Количественные характеристики метаболических процессов и их свяи.с геззозиззами. изме-
нениями зз окружающей среде, введением ксснобиознков являются практическими задачами
метаболомики в метабозтомики (ем зл. 3.6). Современный уровень развития таборагорной
зиапзосзики позволяет получим. конкретные резулз.тптза Л’зя каждого индивидуума. одновре-
менно используя принципиально различные методы исследования для определения функцио-
нальной» состояния отдельных систем ортани з.ма. Такой подход к диагностике пре rnoiai.-iei не
механическое накопление показателей. а изучение их взаимных влияний. сочетаний, связи с
жзиззическнми симптомами и корреляции с другими показателями.
Термин бипмаркер (А/озогический маркер) обозначает измеряемое содержание зоксиканта
или его метаболитов, наховяшихся в организме, а также событие. происходящее в биолозичсе-
коп системе. отражающее воздействие токсиканта.
Обычно выделяют три вила биолоз нческих маркеров биомаркеры воздействия. бномаркеры
эффекта и биомаркеры чувствительности
Бномаркеры пеззолыуют с целью:
• определения (или опровержения) иезазивнозо »ффекта. вызванного юксик.зиюм.
• определения индивидуальной гиперчувствительности к конкретным химическим воздейс-
твиям и, таким образом, прогнозирования риска их применения;
• опенки соблюдения требований охразпа окружающей средза либо эффективности профи-
лактических мероприятий (применительно к группам людей, полвершзихся воздействию
токсиканта).
Биомаркеры во здеззезвин и эффекта являются доклиническими нндикаторямзз аномалии,
между ними не существует четкого раззраззичения
Биомаркеры воздействия
Биомарксро.м воздействия может быть гоксиказп или его метаболиты, ирису зегвузоише в
биосубезрат.зх человека (см. зл. 7-11). Широко исно.зьзукися в качестве бпомаркеров аддукты
ДНК — продукты взаимодействия гоксикангон зыи их метаболитов со структурными фрш-
ментамзз ДПК. /Чддукпа ДНК мозут быть обнаружены в клетках крови или зказзей. а специ-
фические фрагхзенты ДНК мозут ззыно.тпться с мочой (см. гл. 3) Друтззе макромодекулза также
мозут ззодззерпзться изменениям з> процессе обрдзозшнпя аддуктов или окисления, например
образование ладукзон земоз зобина при зеиствии ряда токеззказзтов
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 57
Современные аналитические методы (см. гл. С) позволяют достоверно и с высокой точнос-
тью pci нетрнрона। ь биомаркеры воздействия в биологических жидкостях человека
Опенка бномаркеров воздействия проводится с учетом токсикокинетичсских данных (см.
гл. 4) и факторов, влияющих на абсорбцию, распределение, удерживание и биотрансформапию
химических соединений в организме человека.
Биомаркеры эффекта
Биомаркерамн эффекта могут быть эндогенный компонент, изменение (нарушение) функ-
ции органа и ли системы органов, индикаторы нарушения гомеостаза.
Биомаркеры эффекта деляг на специфические и иеспецпфнческие. Специфические био-
марксры указывают на биологический эффект конкретного воздействия. Неспеиифнческие
маркеры не указывают на конкретную причину эффекта, но отражают общий, комплексный
х|и|>екг комбинированною воздействия. Примеры бномаркеров воздействия или биомаркеров
эффекта, используемые в токсикологических исследованиях приведены в табл. 2-6
Таблица 2-6. Биомаркеры воздействия и био.маркеры эффекта, используемые втоксиколо1ичееких иссле-
дованиях
Биоиробы Объем оззределення Цель исследования
Биомарксры впзлсйсззизя
Жиро тая ткань Диоксин Возлезкггние диоксина
Кровь Свинец Воздейсзние снизит
Кост ь Алюминий Воздействие а.ззомнния
Выдыхаемый воздух Тол ум Возлсиствис тоттола
Волосы Ргут ь Длительное воздейезвие ртути
Сынорогзад крови Бензол Воздействие толуоле
Моча Фенол Возлеиез вне фенола
Биомаркеры эффекта
Кровь Карбокеигемоз лобин Воздействие оксида углерода (11)
Эритроциты 11зн1к-11ротопорфззриз1 Воздействие евззина
Сыворотка крови Холинэстераза Возле й ствис <|х)С<|юрорз а н и вески х сосл И J зез з и з)
Моча Мнкроз зобу.ни ня Нефротоксическое воздействие вещества
Леиконищ А^иукты ДНК Воздействие мутагеном
Сыворотка кропи Активносзь холиззэсзсризы Воздействие фосфорорганических иззеекзззпи- .зон з| к зрбамагов
Сыворотки крови Активность* ферментов, прина- длежащих к семейству изпохро- ма Р450 Воздействие органических растворителе!) (зз МНО1ИХ зругих токсикантов)
Сызюрозка крови Содержание белка ме жллогио- ннна Воздейснше кадмия
• \kthuiiocti. ферментоп определяют косвенно in vivo путем ввеасния вещества. тавсломо метабола знрусмозо копкрет
ззым ферментом. а затем продукт i народны илеитцфинирук» н моче или iluumc крови.
Ме1аболические сдвиги в организме наблюдаются и при окислительном стрессе. который
вызывают многие токсиканты различной химической природы, что coupon ждасгся изменением
активности ряда ферментных систем и накоплением продуктов перекисного окисления липи-
дов (ПОЛ) (малонового диальдегида, р-микроглобулина и др.). Например, выведение с мочой
белков с .малой молекулярной массой, таких как альбумин, может быть использовано в качест-
58 I лава 2
ве биомаркера ранней сталии поражения почек. Однако проявление нефротоксичности может
сопутствовать действию гемато- или гепагоксикатнов. Другой пример. Белки iciuoijoro шока
(стрсссориые белки, или белки стресса) часто образуются в ответ на самые различные вредные
воздействия. в том числе химические (см. гл. 3). Существуют объективные высокочувствитель-
ные методы исследования напитых биолот нчсских жидкостей для оценки состояния гомеостаза
на молекулярном и надмолекулярном уровнях, следовательно, и тяжести повреждений. напри-
мер метод лазерной корреляционной спектроскопии, основанный на изменении спектральных
характеристик монохроматического котерептното излучения гелий-неонового лазера в результате
светорассеяния при прохождении через дисперсную систему (плазма, сыворотка крови, моча, ро-
готлоточныс смывы). Взаимодействие лазера со свсторассс икающим и частицами. находящимися
в броуновском движении, расширяет спектр рассеянного света, причем изменение его частоты
происходит пропорционально скорости движения частиц, которая в свою очередт зависит от их
размера. Лазерный корреляционный спектрометр (ИПТОКС. Санкт-Петербург) позволяет опре-
делять свсгорассеиваютцнс частицы размером от I ло 10 000 нм. окирактеризовыпать дисперсный
состав конкретной бнолотичсской жидкости и классифицировать распределение частиц в соот-
ветствии с выделенными информативными зонами спектра. В этот диапазон попадают практи-
чески нее биомолекулы и их ассоциаты. Нарастание площадей ни зко- и среднем элскулярных зон
.1 К-спектров свидетельствует о преобладании процессов биосубстрат пой деградации, а нысоко-
и сверхвысокомолекулярных зон — о преобладании процессов биосубстратной полимеризации.
В зависимости от увеличения (или снижения) пропет иного вклада в светорассеяние частиц той
или иной фракции идентифицируют различные сдвиги в обмене веществ и гуморальном имму-
нитете: интоксикапионно-. катаболически-. дистрофически-, алдерго- и аутоиммунонодобттыс.
При этом каждому симптомокомплскеу соответствует несколько градаций, отражающих степень
выраженности перечисленных спектральных сдвигов: начальную, умеренную и выраженную. Та-
кая технология может подтвердить или опровергпучь наличие метаболических сдвитов, по нс
установить природу токсиканта (см. зсктронное приложение).
Как известно, индивидуальные особенности организма обусловливают различные последс-
твия для здоровья одинакового воздействия малых доз потенциально вредных факторов. По-
этому используют и другие параметры оценки эффекта воздействия токсиканта — генную
диагностику, преимущества и трудности которс и изложены в главе 3.
Биомаркеры чувствительности
Маркер чувствительности независимо от того, является он наследственным или индуци-
рованным. должен быть индикатором того, что человек чувствителен к эффекту токсиканта,
его метаболитов или группы подобных соединений. Хотя особое внимание уделяется генети
чески обусловлен ной чувегви тел ыюс ги. другие факторы итрают не менее важную роль. Ги-
нерчуветвигслыюсть может быть вызвана как наследственными причинами, гак к течением
хронических и инфекционных заболеваний либо факторами окружающей среды. Способ! ость
метаболизировать отдельные химические вещества изменчива и определяется генетически (см.
гл. 1. 3 и 4). Например, окисление чужеродных химических веществ осуществляется главным
образом ферментами. принадлежащими к семейству цитохрома Р45О. Другие ферменты путем
конъюгации способствуют вс дорастворимости метаболитов (например. N-ацегнлтраг сфераза,
глутатион S трансфераза). Активность этих ферментов контролируется генетически и варьи-
рует в широких пределах. Полому восприимчивость к воздействию конкретного токсиканта
свя ывают с генетической предрасположенностью. Однако люди, страдающие хроническими
заболеваниями, более чувствительны к дейепшю профессиональных или экогоксикаптов. чем
здоровые. Если заболевание или предыдущее воздействие токсичных химических нешсспз вы-
звало субклиническое поражение ортанов. то сопротивляемость новым токсическим воздейс-
твиям будет, вероятно, ниже. В этом случае биохимические индикаторы функций органов
могуч быть использованы как биомарксры восприимчивости. Индивидуальные привычки (ку-
рение. аткотоль) и принимаемые лекарства также могут вызывать повышенную восприимчи-
вость к действию токсиканта. Например, при курении сигарет в организм обычно понадает
значительное количество кадмия. При профессиональном воздействии кадмия у курильщика,
в ортанизме которого накопилось достаточное количество лого металла, повышается риск
развития заболеваний почек, связанных с воздействием кадмия
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 59
Существует ряд ограничений при использовании биомаркеров и интерпретации данных,
полученных с их участием. В первую очередь это влияние генети icckh.x факторов. Многие
биомаркеры были определены в опытах на жпвотых. Токсико-к шегическая модель у дру-
гих видов не всегда может быть перенесена на человека (например, грасическис последствия
использования талидомпяа). В некоторых случаях применение бномаркеров воздействия не-
целесообразно (например, для опенки химических bciiiccib с коротким жизненным никлом
in vivo). Другие химические вещества могут депонироваться и длительное время не оказывать
повреждающего действия либо оказывать воздействие на ор аны и системы, опенка которого
затруднена с использованием стандартных процедур (например определенное воздействие на
центральную нервную систему). Так. исследователи Кембриджского университета выявили два
специфических белка-бномаркера. возможно, способные помочь в лиатностнке психических
заболеваний. Образны цереброспинальной жидкости больных шизофренией и психическими
расстройствами, в том числе вызванными рядом токсикантов, были исследованы с помощью
новых технологий — тандемных методов ВЭЖХ-МС-МС-ЯМР* (см. гл. 6). Один из маркеров
установлен — это транстт ретин (transthyretin).
Очень важно знать нуль введения токсиканта, который опреде тяет наличие (преобладание)
в биологических жидкостях тех или иных метаболитов токсиканта, эндогенных маркеров воз-
действия зт влияет па интерпретацию полученных результатов (см. гл. 4 и 5).
Все вышесказанное свидеге тьствуег, с одной стороны, о большой значимости проведения
аналитической диагностики токсикантов и их мезабозитов в биосредах человека, а с другой —
о необходимости учета многих факторов лля адекватной инзерпретации результатов и получе-
ния достоверных выводов при опенке степени воздействия ксенобиотиков. К таким факторам
прежде всего относятся знание закономерностей токсикокинсгики. механизма взаимодействия
между токсикантом и мишенью биосистсмы. а следовательно, структурно-функниональных
особенностей органов и систем орган ззма, наиболее активно участвующих в метаболизме ксе-
нобиотиков и подвергающихся их сильному воздействию. II «тому ниже будут обсуждаться
особо значимые лля решения хка анных выше задач виды токсичности. Во второй части книги
при изложении свойств отдельных токсикантов обсуждаются и другие виды токсичности.
2.4.2. Гепатотоксичность
Промышленные токсиканты, лекарственные средства, природные токсины вызывают раз-
нообразные но клиническим проявлениям и механизмам развития патологические изменения
в печени, ранняя диагностика которых затруднена. Профилактика повреждений печени, вызы-
ваемых действием токсикш та малоэффективна. что в значительной мерс связано с недоста-
точным уровнем знаний медицинских работников о побочном действии лекарственных средств
(см гл. 1 и 7) Многие ксенобиотики способны вызывать разнообразные поражения печени,
являющиеся одной из наиболее распространенных причин изъятия из обращения ранее одоб-
ренных к применению лекарственных препаратов. Во всем мире ежегодно более I м 1Н человек
страдают от I обочных эффектов фармакотерапии, около 180 тыс. вследствие этого умирают, а
экономический ущерб составляет более В6 млрд долларов в год. Частота лекарственных пора-
жений печени неодинакова в разных странах В России острые медикаментозные поражения
печени выявляются у 2.7% госпитализированных больных и чаше всего связаны с приемом
противотуберкулезных, антибактериальных, анальгетических, гормональных, нитостатических.
I ииотснзивн!IX и питиаршмичсских средств. В Англии первое место в этиолоти печеночной
недостаточности занимает парацетамол, оттесняя на второй план острые вирусные гепатиты.
В США ежегодно острые отравления парацетамолом требующие госпитализации, регистриру-
ются с частотой 29 на 100 IMM) населения, в Израиле — 57. в Великобритании — 200. В Европе
за последние нсско i .ко лет 20 препаратов изъяты из обращения в связи с обнаруженными при-
знаками гепатотоксичности. Европейское агентство по опенке лекарственных сре ств (ЕМЕА —
European Medicines Evaluation Age icy) подготовило руководство для специалистов фармацев-
тической отрасли по методам выявления потенциальной гепатотоксичности лекарственных
* В'ЭЖХ МС МС-ЯХЬР высокоэффективная жидкостная хроматография с ганлемным мисс-спсктральным детекти-
рованием и язерно-мш ни 1 ныв резонанс
60 Глава 2
средств до начала их клинических испытаний. До сих нор ни в одном из существующих ру-
ководств не обсуждаются па этапе доклинических исследований методы определения и сбора
сообщений о гепатотоксичности, обус. леченной лекарстве иными средствами К сожалению,
большинство токсических поражений печени протекает скрыто, кд нчически их трудно отли-
чить от других заболеваний печени. Нели лекарственное поражение печени вовремя нс диа-
гностировано и прием медикаментов продолжается, тяжесть поражения многократно возраста-
ет. Смертность при токсических чснатонагнях достигает 5%. а при очравлениях парацетамолом
даже в невысоких дозах (4-12 г) — 19%.
Гепатотоксичность — это действие токсикантов на организм, при котором происходят
структурные и/или функциональные нарушения печени, большому числу соединений различ-
ной химической природы свойственна чепачотокснчность (табл. 2-7).
Таблица 2-7. Гепаготокепка1ны
I руина токсикантов Токснкак1Ы
Промышленные Алифатические углеводороды: гептан
токсиканты Ароматические углсвояоролы бензол, дифенил, нафталин. стирол. толуол, ксилол
1 Алифатические laiiorciiiipoiiaiiiibic углсволоролм: чстыреххлористый углерод. хло- роформ. дибромов орччрогчан. аихяороэтлчч. диброма зган, этилендибромнл. этилечч- ли.хлорил. ме1И.тброми!1. мстилхлорнд. iipoiiH.'icHUiopiui. тстрахлороэтан. чстрахло- роэтилеп. трихлоро ттачч. винилхлорид
Аромачнческз е галогенирочзаиные углеводороды. бензилхлорнд. полихлорирован-
ные дифенилы. хлоробепзо , хлорированные пафччетины. полибромированные ли
фенилы
<Рснол и ею производные: фенол, крезол, пирогаллол
Алкоголи: аллиловый спирт, лиловый спирт эптленхлорпцрпи. гептиловый спирт
этиленгликоль и счо производные
Простые м|)иры н Э1юкс11соединенз1м зиоксап. энихлорчидрин. эгилеччоксид. тио-
ловычч эфир
Карбоновые кислоты, их зичидриды и сложные эфиры: флишевый ачпидрнд. ме- тиланетат. эчидапетат. ироччилаиетат. и юнроииланстат. бутиланстаг. амил-лпечат. этилсалипиллат
Цианиды и нитрилы: лнетонтприл акрилоччитри
Алифатические амины: этано чамичч этилен.чиамии
Ароматические амины: 2-ацст-амнноф.иоран. З.З-лччхлорбеччзччлин. 4-диметтиам1Шо- зобензо.з 4 4-чеп1лснбис-2-хлора111ыи11
Нитропронтволныс. нитрометан. 2 пнтропропап, ннгропарафччны. нитробензол, динчнробеизо ч. Л11111нро1олуо.т. тринитротолуол, чипрофенол. динитрофено.т, пик- риновая KHC.ioia
I А ю гео Держащие соединения различных классов органических веществ: лнмсти.'! ингрозамип. лименыформ мил. гидразин и счо производные, пиридин, ди мстил- аиечамнл
1 Псменилы бор. фосфор, мышьяк, се чен
Галочеиы: бром
Мегилы: бериллий, висмут, кадмий, .хром. мель, чермяиин жслс:ю. никель, таллий, о.чоно и др. Пестициды: дииирнлилы (паракват, дикчзат), ДДТ и др.
Соединения различной природы фосфин. p-npoiiHioiaKioii, сероуглерод, .'ihmciii.i- сульфат. меркаптаны, течрамеiiliтиурам дисульфид
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 61
Окончание табл 2- 7
Природные токсины . Афлатоксины, охратоксины, рубра токсины. аманнпш. фаллонлин и др
Ьаюсриильные iokciiiim; жюгоксины группы к. юспридиум. гсмолнтичсского стреп- тококка, ЭТИОНИНЫ II др.
Лекаре теннис ре тепы Аналыттмики и нестеронлпыс 11рог|1вов<к'11алителы1ые средств ацетаминофен, са- iHuii.ian.i индометацин, фепилбутаэпп. ибупрофен, фенилбутазлн в тр
Анестетики: ппотан. метокси*] тюран. х.юроформ. циклопропан и ip
Ал1нбактерил.тьные средства: нитрофхрэны. сх-льфа1иь1амидпые препараты и др
Антибиотики: хлорамфеникол, рифампицин, тетрациклин > др,
Au।иконку ьсапн.г, фенпютш. фепобврбшал. мегадпон и др.
Сердечно-сосудистые ере тствэ: антпкоатулятпы хинидин, ирокаи тамил, верапа- мил. нифедипин. метилдопа, кппгонри.т. дг хретикн. амиодарон и др.
Противовирусные среде ва питарабпн. ннларабин и др.
Противоопухолевые препараты
Пропизотуберку лезные средства ипклоеерип. изониазид, р-амнносалпшыовая кис юта и др.
Протозооциды: эметин, метронидазол и др. Психотропные прензраты фсногил шны. тпоксаитепы. бутпрофеноны. бензодиазе- пины, ингибиторы МАО, трициклические антидепрессанты и др.
Фун1П11тщы грнзеофульвнп. амфотерицин, 5 флюорошттозин и пр.
Разные: колхицин, аллопуринол, циметидин. лисульфнрам. витамин А 2.3 ли мер кап опропанод, или британский антнлюпзш (БАЛ), пеницилламин и др._
Большой перечень только химических классов веществ. обладающих гепатотоксичностью,
вполне объясним. Печень — основной орт ан ответственный за биотрансформацию абсорбиро-
ванных во внутреннюю среду ксенобиотиков. Биогрансформация токсикантов осуществляется
посредством химических реакций различного механизма действия (см гл. 3 и 4). следствием
которых нередко является повреждение печени.
Вещества, вызывающие поражение печени, можно разделить на две группы.
• Облигатные гепатотоксиканты — вещества, вызывающие дозозавиепмып эффект, воспро
изводимым в опытах на экспериментальных животных. Прогнозируемая и зависимая от лозы
токсичность характерна для веществ, которые мстабошзируются in vivo с образованием не
менее токсичных метаболитов. Такой тип токсичности проявляется при приеме вещества в
дозе, превышающей емкость систем биотрапсформапии (передозировка, дефицит субстра-
тов конъюгации и коферментов, ферментов, необходимых для детоксикации), а также под
влиянием индукторов н/или ингибиторов ферментов (см. гл. 4).
• Идиосинкратические гепатотоксиканты — вещества, повреждающие печень у чувствитель-
ных к определенным соединениям и иди виду умов. Эффект не воспроизводится в экспе-
рименте и нс носит дозозависимый характер. Идиосинкратическая гепатотоксичность не-
предсказуема. связана с образованием гаптенов вызывающих иммунное поражение печени
у чувствительных лиц. и нс зависти от лозы введенного вещества Молекулярной основой
идиосинкратической гепатотоксичности могут быть различия в активности метаболизирую-
щих ферментов дефекты иммунной системы и т.п., например генетически обусловленные
низким уровень цитохрома P4502D6 и/или чефннит ферментов конъюгации, в частности
изоферментов Ml и TI глуiainoH-S-трансфсразы. Идиосинкратическая гепатотоксичность
сопрожлается системными проявлениями гиперчувствигельпости: высыпаниями, лихорад-
кой, эо ннофилней и отличается быстрой регрессией симптомов после прекращения в аи-
модсиствия с токсикантом. Аллергическая гспатопатия далеко не всегда развивается на фоне
£2 Глава 2
системных проявлении (например аминазин. эритромицин. галотан, изониазид, вальпро-
евая кислота нс дают системных реакций). Часто идиосинкратические поражения печени
регистрируют у лиц. работающих на химических и фармацевтических произволе них.
Патолотичсскис состояния печени, обусловленные деиствнем химических веществ раз-
личном природы. можно классифицировать как цитотоксические или холестатические. Ци-
тотоксические повреждения печени проявляются некрозом, стеатозом, канцеротенезом. w-
.сёстатические — нарушением секреции желчи, развитием желтухи. Часто норлж пня печени
химической этиологии имеют смешенную форму. Предшествующие повреждения печени алко-
г элем. вирусной инфекцией повышают чувствительность к гсп.11 огромным ялам. Гокепчсский
эффект усиливается при бактериальной инфекции, дефиците белков в нише.
Морфофункциональная характеристика печени
Кровь в печень поступает подиум сосудам: тртсриалытая кровь — но печеночной артерии
(20-30% получаемой печенью крови), а венозная кровь — по портальной вене (70-80% полу-
чаемой печенью крови), опок крови происходит по печеночной вене Гепатоциты омываются
смешанной кровью. нам гяптейся в синусом их
Морфофункцноналытые единицы печени — классическая и портальная дольки, а также
анинус (рис. 2-5).
Классическая дольиа Эта морфофункпиопялытая единица имеет гексагональную форму.
В центре расположена центральная вена, к которой сходятся печеночные тяжи. состоящие из
гепатоцитов. Между тяж тми залегают синусоиды В области стыков нескольких классических
долек расположена портальная зона.
Рис. 2-5. Кровообращение в печени
(Афанасьев Ю.И. н еоапт.. 2004)
I — печень: 2 — селезенка; 3 — подже-
лудочная железа; 4 — двенадцатиперс-
тная кишка; 5 — поперечная ободоч-
ная квитка; 6 — ннжняя полая вена
7 — брюшная аорта, 8 — печеночная
артерия: 9 — воротная вена; 10 —
обпитТт желчный проток; 11 — селезе-
ночная вена; 12 — верхняя брыжееч-
ная вена. 13 — нижняя брыжеечная
вена: 14 — иена поджелудочной желс-
ты: 15 — вены кишечника: 16 — жел-
чный пузырь; 17 — пузырный проток;
18 — обитай печеночный проток: 19 —
долевые вены. артерии и желчные про-
токи: 20 — сет ментарпые вены, арте-
рии и желчные протоки: 21 — триада
21а — междольковый желчный про-
ток. 216 — междольковая нс на. 21 в —
междольковая артерия; 22 — во крут -
лодыг пая (септальная) вена; 23 — тюк
ру т до । ьковая (сет т i ал ьн тя) артерия: 24—
септальный желчный проток; 25 —
желчный каналец (капилляр) внутри
печеночной балки: 26 — синусоидные
кровеносные капилляры между пече
тючными балками; 27 — центра, ьная
вена; 28 — поддолькоиая (собиратель-
ная) вена; 29 — печеночная вена
Классификация токсичных aieHioe и виды токсического действия 63
Портальная юна (так называемая триала). Междольковые сосуды: межлитьковые артерия,
вена, желчный проток и лимфатический междольковый сосуд: кровь в синусоиды поступает из
междольковых артерии и вены (бассейн воротной вены), а собирается в один коллектор-бас-
сейн нижней полой вены. п.тчина1О1Нпи я от центральной вены.
Синусоиды печени — анастомозирующие пустоты между анастомозирующими тяжами гепа-
тоцитов В синусоидах печени находится смешанная кровь.
Кровь в классическую долькх поступает из междольковой артерии (обогащенная О.) и меж-
дольковой вены (богатая питательными веществами) соответственно по терминальным пече-
ночным артериолам и герминальным воротным венулам. Эти сосуаы открываются в синусо-
иды. по которым смешанная кровь направляется к центральной (терминальной печеночной)
вене и juqiee по печеночным венам попадает в нижнюю полую вену
Пространство Диесе — пространство между гепатоцитами и эндотел пильными клетками
спнусоилов. В пространство Диссе обращены микровореннки тепатонитов. Здесь расположены
ретикулиновые волокна, поддерживающие структуру спнусоилов; встречаются жиронакапли-
вающис клетки.
Портальная долька — структура треугольной формы. Портальная зона образует сс центр, а
нейтральные вены трех смежных классических долек — вершины.
Аиннус — структурно-метаболическая елинипа печени, имеющая форму ромба, вершины
которого образованы центральными венами соседних гексагональны* печеночных долек и
смежными портальными зонами. Часы, анипхеа. расположенная вб изи сосудов, кровоспаб-
жастся лучше друтих его отделов. Наружная же часть ацинуса, локализованная вблизи нейт-
ральных вен. получает менее оксигенированную кровь. Поэтому структуры этой юны ацинуса
более уя вимы при интоксикациях и дефиците питательных веществ.
В настоящее время есть и другое представление об анатомическом строении печени (модель
Раппопорта). Считают, что основной анатомической единицей печени является печеночная
елинипа. разделенная па зоны (рис. 2-6). Зона, примыкающая к маленьким сосудам, ответ-
вленным о! поротой триоды. — это зона I. Клетки в зоне I первыми получают кровь через
синусоиды. Затем кровь поступает в зоны 2 и 3. прежде чем достигнет печеночной венулы. Как
видно па рис. 2-6. зона 3 приблизительно равна иентролобулярнои части классической дольки,
она ближе всех зон к центральной вене. Клетки зоны 3 из примыкающей единицы образуют
звездообразную форму вокруг центрального сосуда. Клетки зоны I окружают конечный аффс
рентный отросток портальной вены и печеночной артерии и часто являются околопортальной
частью, а клетки между зонами I и 3 (i.e. зона 2) — межзональной частью.
Рис. 2-6. Альтернативный взгляд па печеночную лольку. Пояснение в тексте.
64 Глава 2
Базируясь ня гистопатологических и иммужннсгохимических исследованиях. Ломсрс и со-
гни. в 1989 г. предположили. чго зона 3 должна быть крупной. а нс зве лообразнон частью,
окружающей центральную вену. Клетки юны I окружают воротный тракт, а клетки юны 1 из
при 1е)аюшсй печеночной единицы ооьедннякися и формируют сетчатую форму. Аналогично
vio.ic.iii Раппопорта клетки зоны 3 описаны Номере и соавт. как центре збулярпые (что срав-
нительно близко к классически зобу тярнои терминологии), клетки зоны 1 — как околонор-
гальные. а клетки зоны 2 (между ними) — как межзональные.
Повреждения печени имеют определенные топографические особенности, что отражает
структурную и функциональную нсодноро г гост ь мото органа. В зоне I ацинуса гепатоциты
прилежа! к портальному тракту и получаю) больше кислорода и питательных веществ по срав-
нению с гспагошпами зоны 2 и особенно 3. Перипоргалыгые гепатоциты (зона I) содержат
б< 1ыпс митохондрии. и в них более интенсивно протекают энергетические процессы, |)-ок пе-
лен не жирных кислот, обмен аминокислот и синтез мочевины. глюконеогенез В перимсиоз-
ных гепатоцитах (зона 3) в большей мерс представлены процессы окислительного метаболизма
ксенобиотиков при относительное) дефиците антиоксидантных и копьюгируюпгих ферментов.
Вследствие этого в гепатоцитах зоны 3 образуется большее количество реакционно-способных
метаболию» и они труднее обезвреживаются. Поэтому повреждение печени ксенобиотиками,
как и воспалительное, ишемическое, вирусное повреждение, чаше имеет центрилобулярную
локализацию, затрагивая гепатоциты перпвенозной зоны.
Преимущественно неггтро гобхчярпыс поражения вызывают большинство классических
гепаготоксиканов: чегыреххлориегый углерод, хлороформ. галоши. дггмегилгитгрозамин.
бромбензол. парацетамол, Х-мсптлформампд. кумарин и многие другие. Кокаин при легких
отравлениях вызывает пертпгорглльные некрозы, а при фульминантных гепатитах некрозы рас-
пространяются на среднюю и пернвенозиую зоны К токсикантам, вызывающим прсимушсс-
гвенно псрипоргпзгьные некрозы, относят аллиловый спирт, витамин А. а сред не зональные
некрозы копкапатзялип Л Некрозы, вызванные гспатотоксикантами. могут всгречат1>ся кик
в определенной зоне печени, гак и в нескольких зонах (табл. 2-8). Зона некроза, образующаяся
при де lie тип и определенного токсиканта. мож I измениться при введении другого. Например,
кокаин, который обычно вызывает некроз в зонах 2 и 3. при совместном применении с фено-
барбиталом вызывает некроз в зоне I Причина такого изменения пока неизвестна.
TuiLunia 2-8. Токсиканты иызынаюшне зоц.игыгый некроз печени
Область некроза/ Токсиканты
Зона 1 Зона 2 Зона 3
A<|ui:i токсин Бериллий а-Амлгппт. <|киыо11,тиг1. рхбрзюкетг
АЛЛИЛОВЫЙ спи г Кокаин Кокаин
Аллоксан Паракват 11аракнат. ЛЛТ
Сульфат железе *11) Конкзнлвалин А Бромтрихзорометан. гетрахлорвд метана
Соединения магния Двокеан. !1иннни.1овый зфнр
Витамин А Бромобензи 1, хлоробсизи.1. йодобе-нзол
Дишпроиензо.1. шгнитро толуол
Димстзглпигрозамни, кеилилни
Йодоформ, хлорофкр.м. хлоропрен, тртююрнрешан
Зти ген зиДромиЛ' этнлепдихло ид
Нафталин
Фюравсгат. гиозпетамил
Ботулиновый тхжеин
Мышьяк
/\це!амн1кя)н.‘»
Пирпши. инрро.11131!.)>111о|1ыс л к зонды
Тагшиновыс кислоты
Уретан
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 65
Гепатоциты, или паренхимные клетки. составляют приблизительно 75% всех клеток печени
человека. Это сравнительно большие клетки, которые образуют объем печеночной дольки.
Благодаря их количеству и высокой метаболической активности лги клетки — основные мише-
ни для гепаготоксикантов. Синусоиды заполнены эндотелиальными клетками. Эти небольшие
клетки весьма многочисленны. Печеночная микрососудистая сеть содержит макрофаги, на-
званные клетками Купфера. Хотя они относительно нсмногочислены, однако играют важную
роль в фагоцитозе микроорганизмов и чужеродных частим в крови. Несмотря на то что эти
клетки являются частью печени, они шкже и часть иммунной системы. Кроме того, печень
содержит Ито-клетки (жиросодержашие клетки, нарасинусоилные или звездообразные клет-
ки), которые лежат между паренхимными и эндотелиальными клетками. Эти клетки играют
важную роль в продукции коллагена, хранении витамина А и метаболизме токсикантов.
Тины поражения печени зависят от природы химического вещества и продолжите, ьности
действия. Основные мишени гснатотоксикантов представлены в табл. 2-9
Таблица 2-9. Основные мишени гспатотоксикантон
Мншенн гепаготоксикантов Токсиканты Характер повреждений Примечание
Митохондрии Тетрахлорил углерода, кокаин, дихлороэтилен, этионин, гидразин, фос- фор и др. Поврежденная(искрив- ленная тин разорванная) митохондрия теряет спо- собность регулировать водно-солевой баланс Эти органеллы важны для энср1сп1чсскою метабо- лизма и синтеза ЛТФ. Они поддерживают гомеостаз кальция в клегке
Плазматическая мембрана Ацетаминофен, этанол, соединения ртуди. фаяло- идин и др. Ионный баланс наруша- ется из-за повреждении ионных насосов плазма- тической мембраны или из-за потери целостности мембраны Плазма । ическая мембрана окружает гепатоциты и важна для поддержания ионною баланса между цитоплазмой и внешней средой
Эндоплазматичес- кий ре in куду м Ацетаминофен. бром бензол, нитрохлормезан. кокаин и др. Пролиферация Участвует в синтезе про- теинов и фосфолипидов. Локализация эн имов биотрансформации (на- пример. нигохром Р450, см. гл. 4)
Ядро Афл пгоксин 13. бериллий, этионин. 1алактоса.1ин. ншросалин и др. J 1оврежления ЛИ К М 1рфоло1 и чес кос пораже нис ядра проявляется аль- терацией в оболочке ядра, хроматиновой структуре и расположении ядрышка
Известны два механизма гибели клеток — некроз и апоптоз (см. гл. 3). Основными эта-
пами некроза являются повреждение плазматической мембраны, набухание митохондрий и
всей клетки, потеря внутриклеточных компонентов, дезинтеграция ядра с последующим фа-
гоцитозом погибших гепатоцитов. Некротическая смерть кле!ки сопровождается развитием
активного воспалительного процесса и повреждениями окружающих тканей. Непосредствен-
ной причиной некроза являются окислительный стресс и ПОЛ. образование а.1 туктов ксено-
биотиков с биологически важными макромолекулами, повреждение митохондрий, разрушение
цитоскелета. массивный выход кальция и другие факторы. Если большинство клеток печени
входят в зону некроза, это называется массивным некрозом Термин подразумевает, что разру-
шена вся печеночная долька или ее большая часть. Благодаря уникальной способности печени
к саморсгснсраиии. некротические клетки через несколько дней уничтожаются и заменяются
новыми клетками, восстанавливается нормальный вид и функции печени. Если количество
поврежденных клеток слишком велико, способность печени к самовосстановлению подавляет-
ся, что ведет к разрушению органа.
66 Глава 2
Апонто — генетически запрограммированный процесс, при котором клетка сама активно
способствует своей гибели (см. гл. 3) Апоптоз запускается через специальные «рецепторы
смерти* на поверхности клетки или нсренепгорным путем. что велел к активации регулятор-
ных белков, которые останавливают митотическую активность клетки вызывают фрагмента
цию ДНК (эндонуклеазы). деградацию жизненно важных белков (каскад протеолитических
ферментов, каспаз), нарушают связь клетки с внеклеточным матриксом и т.д. Ранним прояв-
лением апоптоза являются падение электрохимического потенциала митохондриальной мем-
браны и повышение продукции активных форм кислорода (АФК) Морфологически апоптоз
характеризуется образованием мембранных пузырей, агрегацией хроматина вблизи ядерной
мембраны, конденсацией и фрагментацией клетки с образованием аггоптоти гсских телец с
последующим их фагоцитозом. В отличие от некроза, при апоптозе не возникает вг.раженной
воспалительной реакции. Радтнчия между некрозом и апоптозом на сталии их инициирования
нс сголь очевидны, и одни и те же факторы (например. АФК. \'О) могут стимулировать оба
пронесся. Гепатотоксиканты вызывают гибель клеток по механизму как некроза, так и апо-
птоза.
Существенное значение для реализации токсического действия ксенобиотиков имеет состо-
яние ферментных систем, участвующих в их метаболической активации и детоксикации. Гене-
тически детерминированный или игмененный вследствие индукции пли ингибирования набор
изоферментов цитохрома Р450. ферментов конъюгации может объяснить раъчичную индивиду-
альную чувствительность к действию гешгготокс и кантов. Показано, чго гепатоциты крыс с вы-
сокой активностью цитохрома P4502EI более чувеппгтельны к четыреххлорпстому углероду и
парацетамолу, чем клетки с низкой активностью Индукторы этого фермента (этанол. анетон.
голодание) усиливают, а ингибиторы (лиэтилпитиокарбзмат и лиметилсульфоксид) ослаб, яюг
токсичность этих вегнеств. Типы токсических повреждений печени представлены в табл. 2-10.
1 абшид 2-10. *1ины токсических гк нреждениИ печени
Гии повреждения Токсиканты Механизм повреждения 11римечзпие
Индукция ([зерментов Барбитураты. фени- тоин. влрфлрив и лр. Стимуляция синтеза бел- ков
Порфирия, гипербилируби- немия Барбитураты, вита- мин К, рифамггнннн и др. Стимуляция синтеза гема
Зональный некроз Алкалоиды ппрро цитидинового ряда, ацетаминофен, аф- латоксин. бериллий, бром обе нзал, гало- тено1С1капы, голо- ин. диклофенак димстияннтро имин, пуромгнгин. фосфор и лр Образование АФК и других свободных разика, он; свя- зывание токсикантов пли их метаболитов с белками, нуклеиновыми кислотами и ненасыщенными жир- ными кислотами мембран клеток, нарушение и га тичсскпх и энергетических процессов, повыше и нс содержания в клетке ионон калыгия Морфологические и гменсния гепатоцитов: огек цитоплазмы, лили гания пи гонца змагическою ретикулума, набухание митозгоп арий с разрывом крист, дегра- дация полисом, разрушение органелл и ядра клетки. стеатоз, повреждение плазматических мембран Повышение концентрации каль- ция в цитоплазме клетки вто- рично приводит к повреждению клето шых мембран и органелл, денатурации структурных ггроге- ннои. 1шактнваипн энзимов (см. табл. 2-2. гл. 3 и 4)
Токсический гсшзпп И 301 ГИЛЛЫ, фени тони, сульфани- ламиды, галог.зн. а-мстиллопа кетоконазол. сульфа- салазин. диклофенак и лр. Образование гаптенов (псолнгигенов) Раишвас гея в результате идио- синкратической реакции. Гис- тологически: днффузныЯ некро • гепатоцитов с моноцитарными и эозинофильными инфильтра- тами и сохраненной дольковой [структурой печени
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 67
Продолжение табл. 2-10
Стеатоз*: микропстикуляр- ный Антибиогики гетра- пиклинового ряда, вальпроэт натрия, тамоксифен, пирок- сикам. аспирин, гид- разин. аминем {ин niarictintH, амиода- рон. пергекенлин. желчные кислоты, оротовая кислота, синтетические эст- рогены. вальпроевая кислота и лр. Миюхондриальное на- рушение р-окислення жирных кислот. которое приводит к их этерифи- кации, образованию и на- коплению триглицеридов, лишает клетку энергии Стеатоз, или жировое пере- рождение печени. — самое раннее проявление токси- ческою повреждения органа, характеризуется и быточным накоплением жира в icnaromi- тах. снижением содержания в плазме крови липидов и липо- протеинов. Микроне изкулярный стеатоз — относительно ред- кий, но более опасный вариант гепатотоксической реакции, гистологически характер»! зуе гея наличием мелких вкраплений триглицеридов внутри гепатоци- тов, нс смещающих ядро
мвкрстсзикуляр- ный Хроническое упо- требление этанола, метотрексат, нифе- дипин. кортикосте- роиды Ускорение стггеза и ак- кумуляция тригл и церилов внутри (сиатоцитов. замед- ление их выхода из клетки J истологичес ки характеризуется единичными большими вакуо- лями триглицеридов, которые смен шот ядро гепагеиита к периферии
Фосфол и пидоз* Амиодарон хлорфентермин. 4,4-диэтилим1111о- эмокснгексаэстрол Образование лизосомаль- ных включений Результат накопления фосфоли- пидов в гепатоцитах. В печени обнаружены увеличенные гепа- тоциты н пористая цитоплазма. Состояние прогрессирует в цирроз
Гс I ia ro канти t н ку - лирный холестаз Ди нитрофенол. 4,4-днамнноди-фс- пид метан. анилин, этанол. аминазин, хлорпромазин. тио- рндазнн. амитрип- тилин, диазепам, галоперидол, барби- тураты, эритроми- цин. фяуклоксацил- лин, тиабендазол. сульфаметоксазол, эналаприл и другие ингибиторы ингно- теиэин-превра та- ющего фермента, амиодарон, пропа- фепон.диклофенак. । |ротивооиухо;1свые препараты, толбута- мид. симвастатин, ранитидин, сульфа- ниламиды. органи- ческие соединения мышьяка, паракват и лр. Повреждение iokchkuhiu- мн каналикулярных мемб- ран и цитоскелета, iiiiih- бирование АТФ-зависимых транспортных механизмов, снижение функции белкон- транспортсров органичес- ких анионов и желчных кислот. В-гликопротеина, белка множественной резистентное!и. наруше- ние гомеостаза кальция и глутатиона. В основе .холестаза дежа! нарушение процессов продук- ции желчи и желчевыведеиня. усиление проницаемости стенки желчевыволяшнх канатов, дисфункция микроворсинок эпителия желчных хоюв. обес- не'шваюшнх юк желчи. Воспаление, повреждение билиарных канальцев приводят к задержке желчи в печени, что сопровождается развн гнем желтухи. Холестазу сопутствует выход в желчь и кровь компонентов каналикулярных мембран, что используется для диатоники холестаза (oi рсдсление актив- ности гамма гдутамилтранс- феразы и ше очной фосфата ы в сыворо1ке крови)
Каналикуляр- ный холестаз Стероидные гормо- ны. пероральные контрацептивы Снижение текучести мем- бран. активности Na’/K1- АТФазы
68 Глава 2
Сил срози РУ ТО- ШИН холангит 5-Фтордезоксиури - дин. 5-фюрурэиил Окончание табл. 2-10 Поражение секу доп. пита- Прогрессирующий фиброз внут- юших желчные протоки ри- или внепеченочных желч- ных протокой вслслспзис ток- сического повреждения ветвей печеночной артерии, кровоснаб- жаюигих желчные протоки
Фиброз (цирроз) TJniHoj (при хрони- ческом алкоголиз- ме). галогенирован- ные углеводороды (СС14. трихлороэги- лен, !,1.1-три\лоро- этан и лр.), иик- л офосфосфа м ид. а'загиоприн, мстил- допа. изониазид, героин, метотрексат, другие цитостатики, гипервитаминоз А Фиброзная ткань отк.1 - Конечный результат хронически дывастся в пространстве. протекающих в печени патоло- Днссе. образуются коллаге- гических процессов пол вол- новые тяжи, ратрушаюшие действием токсикантов нормальную структуру органа, нарушаются жел- чеотделение и кровоток в синусоидах. что приводит к развитию портальной гипертензии
Опухоли (узло- вая гиперплазия, гемангиома, аденома, гепа- тоцеллюлярная карцинома) Винилхлорид, диок- сид тория, мышьяк/ Предполагаемые те патоканиероген ы человека: альдрин. ДДТ. дизльдрин. гептахлор, чегырех- х. гористый углерод, хлороформ, поли- галогенированные дифенилы, трнхло- роэтилен. анаток- сины. стероидные гормоны Нс известен Для большинства природных и промышленных токсикан- тов механизм канцерогенного действия не установлен. Гспа- тотоксиквнгы — инициаторы опухолевого роста, вызывают структурные повреждения моле- кул ДНК (см. гл. 3)
Всноокклюзи онная болезнь, синдром Балда—Киари Циклофосфамил. азатиоприн. бу- сульфан. мслфалан. тиоТЕФ. этопозид. 6-тиогуаннн. ннрро- лилпполые алкало- иды. пероральные контрацептивы Повреждение синусом В основе лежат избирательное дальних клеток, тромбозы поражение токсикантами терминальных венул синусоидальных энлототихть- ных клеток воспалительная реакция и активация сверты- ваемости крови. Приводит к центролобулярным некрозам, нарушению отток л крови раз витию цирроза и печеночной недос точности
• Предложено несколько механизмов повреждающего действия токсикантов на обмен липидов в гепатоцитах:
— нарушение синтеза белка я клетках печени:
— iiupvшеине процессов конъюгации триглицеридов с белками и образования липопротеинов кидкой плотности
(ЛПНП):
— повреждение механизмов транспорта липопротеинов через клеточные мембраны;
— угнетение синтеза фосфолипидов:
— нарушение процессов Р-окпс.зения жирных кислот в митохондриях;
- нарушение энергетических процессов в клетках, необходимых лля осуществления синтеза белка и фосфолипидов.
Оценку степени повреждения печени проводят по ряду показателей, которые приведены в
габд. 2-11,
Классификация токсичных агентов и видь токсического действия 69
Таблица 2-11. Показатели повреждения печени токсикантами
'I'hii исследования Показатели повреждения Примечание
Обшпс симптомы по- вреждения органа* Анорексия (потеря аппетита), тошнота, рвота, усталость. абдоминальные боли, гепатомегалия (увелсчснис печени), аспит (накопление жидкости в брюшной полос- ти) жслтуж
Морфологическая опенка* Узловая гиперплазия. гепатоцеллюлярная карп и нома, гемангиома, аденома Рсзхлыа1ы биопсии печени осо- бенно важны для диагностики рака и хронической печеночной 1 гсдостаточ! юс ги
Определение активности энзимов в плазме кропи (биохимические исследо- вания) Повышение активности** апанииами- нотрансферазы (АЛТ), аспартатами- нотрансферазы (ACT), трансферазы гамма-глутаминовой кислоты (ТГГК). лактатлегилрогеназы (ЛДГ), орпнтннкар- бамоилнитрансферазы (ОСТ) — слсдшвие нарушения целостности гепатоцитов. Отношение А1Т/АСТ выше 1.6 характери- зует цснтродобулярнос жировое перерож- дение печени (см. табл. 2-10). Повышение активное!и щелочной фосфа- тазы (1ЦФ) и 5-нуклсоппазы — индикатор повреждения желчных путей Активность этих ферментов так- же зависит оз характера питания, наличия инфекционного пронес- ся, патологии сер. на. мышечной ткани, легких ОСТ. ТГГК — специфичные .тая печени эн- зимы (на практике наблюдают высокий процент ложноположи- телытых результатов) Активность ЛДГ. тесты на ак- тивность 1ПФ п 5-нуклеотидазы несненифичны
Определение содержания билирубина (биохими- ческие НСС.1СД0В<ЫН1Я) Концентрация сывороточного билирубина может быть увеличена из-за острого гспа- токлсточного и холестатического повреж- дения или желчной обструкции. Следс- твием нарушения связывания и экскрспив билирубина является его накопление в крови, которое приводит к желтухе Повышение уровня билирубина чаще сопутствует острому ин- фекционному поражению пече- ни
Опенка метаболической активности печени (фун- кциональные исследова- ния) С помощью к. ирспс-тестов оценивают клиренс инчонианина-зеленого. анти- пирине. кофеина, фенацетина, ионных красителей, желчных пигментов, они по- зволяют выявить острые и иолосгрыс по- ражения печени Результат измерения содержания коньюга- тов холлевой кислоты и холи глицина — ин- дикатор экскреторной функции печени Содержание конъюгатов ход Не- вой кислоты и активность ШФ коррелируют с другими показа- телями функционального состо- яния печени
Оценка синтетической активности печени (функ- циональные исследова- ния) Определение содержания сывороточно- го альбумина, протромбина, ходестерола. транс<|>еррина как показателей синтети- ческой активноеш печени Только при существенном дефи- ците массы паренхимы органа происходят изменения показа- телей
* Для диагностики нснолыукн компьютерную юмографию и мшниню-резонаиснос сканирование печени.
•• Однако в терминальном периоде массовая ибе.п. гепитонигов часто наблюдается при снижении аыинносгн энзи-
мов в iLiaiMc крови.
Биохимическими методами определяют повышение активности в плазме крови аминотранс-
фераз (ACT. АЛТ), понижение в крови уровня плазменных факторов свертывания крови. Важ
ными диагности* ескими тестами для выявления острой гепатопатии химической этиологии
являются определение содержания билирубина в плазме крови и протромбинового времени.
70 Глава 2
Заключение
• Прямое действие токсикантов на печень реализуется посредством:
— нарушения транспорта веществ через мембраны гепатоцитов и клеточных органелл;
— повреждения систем antpi «обеспечения клеток печени;
— нарушения обмена нуклеиновых кислот в ядрах клеток;
— нарушения эк с крепи и из гепатоцитов естественных метаболитов;
— повреждения органелл клеток печени.
• Опосредованное действие токсикантов на печень наблюдается редко, например при ин-
токсикации кадмием наблюдают активацию уреазы. Уреаза катализирует гидролитичес-
кое растепление мочевины на аммиак и углекислый газ. Каждая молекула уреазы связа-
на с двумя атомами никеля Кадмий, образуя координационное соединение с аммиаком,
сдвигает равновесие реакции вправо, что и приводит к активации уреазы. Кадмий, заме-
щая и высвобождая ионы никеля, способствует работе других ферментов, катализирую-
щих гидролиз глутамина с образованием аммиака, который проявляет гспатотоксическое
действие. Ионы Ni2*. Cd2+ индуцируют ПОЛ. подавляют репарацию ДНК и запускают
синтез противовоспалительного цитокина TNF а, вызывающего апоптоз и некроз кле-
ток-мишеней.
• Механизм стимулянт! аутоиммунных процессов, развивающихся вследствие взаимодействия
токсиканта с макром< ie кулями белка клеток печени, изучен недостаточно (например, по-
вреждение печени при хроническом алкоголизме).
2.4.3. Гематотоксичнооъ
«То кровь кипит, ю сил избыток...» Кровь — особая разновидность ткани мезенхимного
происхождения, обра утешая вместе с лимфой внутреннюю среду организма. Кровь состоит из
межклеточного вещества — плазмы и взвешенных в ней форменных элементов' эритроцитов,
лейкоцитов и тромбоцигов. Объем плазмы составляет 55-60%. а форменных элементов —
40-45%. Плазма крови содержит 90—93% воды и 7—10% сухого вещества. К основным белкам
пла мы огпосят альбумины, глобулины и фибриноген. Из фракции глобулинов выделены ан-
титела. Плазма крови имеет pH 7,36.
Форменные элементы крови — это высокоспениализированпые клетки с различной про-
должительностью жизненною цикла, количество которых в организме сохраняется более и ли
менее постоянным:
• 120 сут — эритроциты, красные кровяные тельца диаметром 7.2—7.5 мкм (ежесекундно в
крови образуется и разрушается около 2,5 млп эритроцитов. количество которых у человека
в I мм' крови равно 4,5—5 млп);
• 5 сут — лейкоциты (лимфоциты, моноциты, базофилы, эозинофилы и нейтрофилы имеют
ядро); лимфоциты (25—40 J всех лейкоцитов крови) сохраняются от нескольких дней до
нескольких месяцев;
• 7—10 суток — тромбоциты (образуются при фрагментации цитоплазмы мегакариоцитов —
полиплоидных костномозговых клеток, возникающих посредством эндомитоза).
Основные функции крови:
• транспортная (перенос веществ получаемых с пищеи. продуктов обмена, гормонов и других
биологически активных веществ);
• дыхательная (доставка О, от органов дыхания к тканям и удаление СО, из организма);
• гомеостатическая (обеспечение совместно с нервной и эндокринной системами постоянс-
тва внутренней среды: регуляция водно-солевого обмена, сохранение кислотно-шелочного
баланса в организме, поддержание постоянной 1емпера1уры тела);
• защитная (обеспечение гуморального и клеточного обмена).
Кроветворение, или гемоцитопоэз — многостадийный процесс образования, развития и со-
зревания клеток крови у животных и человека, т.е. процесс клеточной дифференцировки, в ре-
зультате которой образуются форменные элементы — эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.
Система гемопоэза представляет собой комплекс клеток, реализующих разнообразные функ-
ции и в то же время постоянно регенерирующих. Согласно современной схеме кроветворения.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 71
существуют клетки-предшественницы, обеспечивающие запрос организма на воспроизведение
различных типов форменных элементов. Все специализированные форменные элементы кро-
ви происходят из единого предшественника — полипотентной стволовой клетки крови путем
последовательных этапов дифференцировки и созревания. Полипотентныс стволовые клет-
ки менее специализированные. чем плюрипотентные стволовые клетки. Последние способны
дифференцироваться. давая только определенные линии клеток. Различают две популяции
плюрипотентных клеток — лимфоидные и миелоидные. Лимфоидные плюрипотентные клетки
даюз при дифференцировке В- и Т-лимфоциты Миелоидные дают множество клеток, включая
эритроциты, нейтрофилы, моноциты, переходяшие в макрофаги, дендритные клетки, которые
итрают важную роль в иммунном ответе и являются антшеннесущими клетками, эозинофилы,
базофилы и мегакариоциты, образующие в свою очередь тромбоциты. Эти клетки являются
зрелыми. Они уже не способны к пролиферации. Кроветворение строго регулируется в со-
ответствии с потребностями организма. Известно, что в регуляции кроветворения участвуют
эритропоэтины (с.м. гл. 9), некоторые гормоны и взг шины. Глюкопрогеины — эритропоэтин,
образующийся в перизубулярпых клетках почки, интерлейкины (IL-1.2.3). колонпсобразую
ший гранулоцитарно-макрофагальный стимулирующий (GM-CSF), колонисобра моший гра-
нулоцитарный и инсулиноподобный факторы роста контролируют образование, дифференци-
ровку и созревание эрзпронитов. Образование лейкоцитов также зависит от стимулирования
и управления различных факторов роста. 1L-3 стимулирует все клетки миелоидной системы.
GM-CSF стимулирует образование гранулоцитов и макрофагов. К тому же специфические
G-CSF- и M-CSF-протсины стимулируют систему гранулоцитов и систему макрофагов соот-
ветственно. Эти факторы роста, в отличие от эригро тоэтина. произведены различными клет-
ками. включая Т-лимфоциты. макрофаги и эндогелиалызые клетки. Все факторы роста дейс-
твуют согласованно.
Кроветворение происходит в кроветворных орзапах; образование эритроцитов, зернистых
лейкоцитов (гранулоцитов) и тромбоцитов — в костном мозге, который представлен кластера-
ми гемопоэтических клеток, рассеянных в эпифизах трубчатых костей, плоских костях черепа,
грудине, позвонках, костях таза ребрах; лимфоцитов — в лимфатических узлах, селезенке, ви-
лочковой железе, костном мозге; моноциты и макрофаги — также в клетках костного мозга.
Механизмы, регулирующие темпы размножения и созревания отдельных категорий крове-
творных клеток, в настоящее время в связи с получением новых данных при изучении стволо-
вых клеток требуют уточнений.
Нарушения кроветворения, лежащие в основе патогенеза болезней системы крови, возни-
кают под влиянием внешних (физических, химических, инфекционных ц др.) и внутренних
(гормональных, обменных, врожденных, наследственных и др.) факторов. В зависимости от
характера повреждения кроветворных органов нарушения кроветворения называют гиперплас-
тическими (с избыточным образе анисм элементов кроветворной ткани) и гипо- и апласти-
ческими (с подавлением. нарушением деления зз в меньшей степени созревания кроветворных
клеток). Определяющим в характерззстикс заболевания являются также категория поражаемых
клеток и степень их зрелости (малодифференнированпые. различной степени зрелости клетки,
элементы грануло-, эритро-. тромбоците-, лимфопоэза). Острые и хронические отравления
нередко вызывают нарушения кроветворения и клеточного состава крови. При этом реали у-
ются различные механизмы поврежд пощего действия: изменения обмена ДНК и/нли РНК.
нарушение процесса митотического деления клеток, синтеза белка в клетках эритроидного,
миелоидного и мсгакарпнитарпого ростков.
Вешесгва рахтичной химической природы, избирательно нарушающие функции клеток
крови или се мелочный состав, называют гематотоксикантами, а результат их воздействия —
гематотоксичностью (табл. 2-12).
Снижение числа форменных элементов одного типа при интоксикациях встречается редко
(табл. 2-13). Например, гранулоцитопсния (агранулоцитоз) может возникнуть при химиотера-
пии цитостатиками, антибиотиками (левомицетином), противовоспалительными среде i вами
(бутазолидином). Апластическую анемию, лейкемию, агранулоцитоз, тромбоцитопению токси-
ческого происхождения констатируют в случаях. когда сокращение количества определенного
типа kj шок является основным признаком отравления.
72 Глава 2
Таблица 2-12. Виды гематотокснчиости
Вид гематотокснчиости Краткое описание
Нарушение гемопоэза: । ннсрпластические состояния Выражены при лейкозах н эритремии Клетки костною мола утрачивают способ- ность дифференцироваться. а их пролиферация может бьнь замедлена. Продол- жительность жизни незрелых элементов увеличивается, в кроветворных органах и крови накапливаются клетки различных линий и различной степени зрелости
пню- н апластичес- кие состояния Обслнсниостъ костного мозга кроветворными клетками. Поражаются либо родоначальныс кроветворные клетки, либо наиболее ранние клеточные фор- мы эритро-. ipaHv.io- и тромбоныопоэза. В крови уменьшается количество эритроцитов (уровень гемоглобина), лейкоцитов (гранулоцитов), тромбоцитов (Нию- и апластические анемии, агранулоцитозы, метастазы опухолей в кост- ный моз! и др.). Си.мн1омд1ика; вначале уменьшается количество гранулоцитов и снижается устойчивость к инфекциям, позднее присоединяется тромбоцито- пеническая кровоточивость, в последнюю очередь снижается количество эрит- роцитов (бледность, слабость и одышка при нагрузке)
Изменение числа фор- менных элементов: гемолитические анемии Значительна роль химического фактора в патогенезе Реализуются различные способы повреждений (пояснение в тексте): разрушение мембраны эритроцитов метгемоглобинообразование атаки антителами (IgG) в присутствии комплемента измененных мембран эрит- роцитов образование антигена: комплекс токсикант—бедок плазмы крови (в присутс- твии антител IgM и комплемента) после фиксации на мембране эритроцитов вызывае! их гемолиз
аплазия костного мозга лейкемии* Снижается количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, развивается наншпопсничсский синдром: слабость и усталость (вследствие анемии), ли- хорадка, инфекционные осложнения (результат нейтропении). кровотечения (результат тромбонитоненин). В костном мозге мало клеточных элементов (преимущественно лимфоциты и ретикулярные клетки). Отмечаются жировое перерождение костного мозга, фиброз. В крови снижено количество эритро- цитов (менее 2-10* в 1 мм3), количество лейкоцитов (1500 и менее в 1 м_м'). лимфоцитоз, тромбоцитопения Острия миелоидная лейкемия (ОМЛ). хроническая миелоидная лейкемия, oci- рая лимфоидная лейкемия, хроническая лимфоидная лейкемия. Трудно устано- вить взаимосвязь между действием токсиканта и возникновением лейкемий*
тромбоцитопении Геморрагический синдром (петехии, пурпуре, геморрагические пузыри на сли- зистой оболочке полости рта, желудочно-кишечные и другие кровотечения раз- личной степени тяжести), анемия Количество тромбоцитов снижается до 1000 и менее в 1 мм’ (в тяжелых случаях), в костном мозге число мегакариоцитов снижается незначительно
агранулоцитоз Количество лейкоцитов снижается до 500—300 клеток в мм’ крови, гранулоии- топения (менее 2% общего количества лейкоцитов), лимфоцитоз. В костном мозге снижено количество клеток миелоидного ряда, нейтрофильных мстамис- лонитов и миелоцитов. Клинически: некротические поражения слизистой обо- лочки ротовой полости, некротическая ашина как инфекционные осложнения вплоть до развития сепсиса
Нарушение функции гемотлобнна: метгемогюбинообра- зованне образование карбоксн- I гемоглобина В крови содержится около 14—16 г гемот тобнна Транспорт кислорода осуществляется гемоглобином (эритроциты переносят 20 мл О, на 100 мл крови, плазма — 0,2 мл О, на 100 мл крови. Нарушение транспорта кислорода связывают' с образованием метгемоглобина или карбок- сигемоглобина при действии ряда токсикантов (пояснение в тексте)
•Успехи молекулярной медицины и биологии позволили на основе результатов фено- и генотипического пиан за из-
менить классификацию миелоидных н лимфоидных лейкемий, тнлчитсльно увеличить число их подтипов. Во mhoiiix
случаях нельзя воспользоваться результатами прежних исследований но установлению причинно-следственных связей
между природой вещества н проявлениями гсматоюксичности без детализации лил нота заболела! ия кропи
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 73
Гемолитические анемии
Гемолитическая анемия связана с избыточным разрушением эритроцитов. Плазматическая
мембрана эритроцита — важнейший элемент клетки: она является и механической оболоч-
кой с регулируемыми физическими свойствами, и «диспетчерском» клетки, осуществляющей
координацию работы клетки в зависимости от поступающих физических и химических сиг-
налов. Важнейшие компоненты биологических мембран — белки. Одни из них обеспечивают
транспорт определенных молекул внутрь клетки или из нее. другие являются ферментами и
катализируют ассоциированные с мембраной реакции, третьи осуществляют структурную связь
цитоскелета с внеклеточным матриксом или служат в качестве рецепторов для получения и
преобразования химических сигналов из окружающей среды. Различные нарушения в белках
эритроцитарной мембраны определяют характер и степень повреждений структурно-функнио-
налыюй организации эритроцитов. В силу своей специализации ( юренос кислорода от легких
к 1каням) эритроцит по механическим свойствам является уникальной клеткой, так как. в от-
личие от других клеток, постоянно подпер!аегся выраженным деформирующим воздействиям
в кровеносном русле. Для нормального функционирования эритроцит должен в течение отно-
сительно длительного времени сохранять свою целостность и иметь устойчивость к деформа-
ции: последнее свойство важно прежде всего для нормальной микроциркуляции. Способность
к деформации определяется (|юрмой клетки и эластичностью мембраны.
Свойства мембраны эритроцита и клетки в целом обусловлены наличием белковой мемб-
ранной структуры, именуемой мембранным скелетом клетки н расположен нон на внутренней
стороне мембраны. Плазматическую мембрану эритроцитов следует рассматривать как откры-
тую динамическую структуру, способную специфически и нсспепифичсски связывать белки
плазмы крови и цитозоля эритроцитов.
Белок глобин является частью мембранно-связанного гемоглобина. Домен белка локали-
зован в цитоплазме и траст важную роль в поддержании формы эршрошпа и его метабо-
лизме. N-кониевая последовательность цитоплазматического домена богата аминокислотными
остатками кислого характера. На этом участке находятся центры связывания iндролитичсских
ферментов — иипералывпид-З-фосфатлеппрогеназы. альдолазы, каталазы и др. Цитоплазма-
тический домен является местом локализации мембранно-связанного гемоглобина (см. ниже).
Гемоглобин оказывает стабилизирующее действие на тритроиигарные мембраны. В экспери-
менте на животных доказано, что во фракциях эритроцитарных мембран с большим содержа-
нием гемоглобина разрушение липопротеиновой структуры мембран при их дегидратации про-
исходит намного слабее, чем во фракциях с малым содержанием гемоглобина. В поддержании
структурной целостности эритроцитов большое значение имеют внутренние прпмембранные
белковые слои. В основе изменения условий для структурирования белковообразуюшего прн-
мембранпого слоя внутри эритроцитов может лежать изменение свойств поверхности внешней
стороны. Поэтому всякая модификация как самой мембраны, так и содержащегося в ней ге-
моглобина сопровождается изменением свойств структуры в целом (например, механических —
изменение формы и степени деформируемости).
После разрушения эритроцитов часть гемоглобина находится в плазме крови, сохраняя спо-
собность к связыванию кислорода. Однако гемоглобин, свободно циркулирующий в плазме кро-
ви, является нефротоксикантом. Гемолиз характеризуется также и ускоренным разрушением гемо-
глобина В норме гемоглобин в эритронитах сохраняется практически весь период жизни клетки.
Однако при тяжелых интоксикациях (например, уксусной кислотой) в течение суток уровень его
может снизиться до 30%. При гемолизе повышается содержание белка в плазме (до 20 против 7%
в норме), в связи с этим изменяются осмотические и другие физико-химические свойства крови,
снижается скорость диссоциации оксигемоглобина. Содержание 2.3-дифосфогпицерата — вещес-
тва. обеспечивающего протекание реакции между кислородом и гемоглобином, в плазме крови
значительно ниже, чем в эритроцитах, поэтому при гемолизе уменьшается снабжение тканей кис-
лородом. Токсиканты, вызывающие гемолиз эритроцитов. называются гсмолитиками.
Аутоиммунная гемолитическая анемия — заболевание системы кроветворения, при котором
происходит разрушение эритроцитов. вызванное образованием в организме аутоантител — им-
муноглобулинов. разрушающих собственные эритроциты. Вследствие дефекта иммунной толе-
рантности нормальные эритроциты распознаются иммунокомпетентными клетками как чужие
и на них вырабатываются апппела (рис. 2-7). Они фиксируются на эритроцитах, захватывают-
74 Глава 2
Эритроцит
Макрофа
эритроцит
Рис. 2-7. Схема формирования аутонм-
мунн и гемолитической анемии.
ся макрофагами и подвергаются разрушению (гемолизу) в селезенке, печени, костном мозте.
Если появление аутоантител не удастся объяснить каким-либо определенным заболеванием,
ставится диагноз идиопатического варианта анемии.
Иммуноаллерт ические гемолитические анемии вызывают в основном лекарственные средс-
тва. наиболее употребляемые из них антибиотики (цефалоспорины, пенициллин, рифампицин),
психотропные (хлордиазспоксид. лорпромазин): противотуберкулезные (пара-ампносалииило-
вая кислота, изониазид), нестсроидные противовоспалительные (индометапин. фенилбутазон,
фенацетин), антимикроб тыс и аитипротозонные (сульфаниламиды, хинилии, хинин), гипогли
комические (толбутамид) и другие препараты. Иммуибаллергическис процессы, возникающие
лишь у ограниченного числа людей и связанные с индивидуальными врожденными пороками
мстаботизма. иногда проявляются как гематотоксичносгь.
Нарушение функций гемоглобина
Гемоглобин (НЬ) представляет собой тетрамерный белок (строение гемоглобина подробно
обсуждается в курсах органической и биологической химии). В крови взрослого человека со-
держится гемоглобин А (НЬА). состоящий из а,р-полипептилпых цепей В дополнение к ос-
новному НЬА в крови взрослого человека обнаружен гемоглобин А, (НЬА ). на полю которого
приходится - 2.5% всего гемоглобина. Незначительное изменение аминокислотного состава
глобина, иногда замена лишь одной аминокислоты, оказывается достаточным для полного
изменения свойств гемоглобина. В эритроцитах гемоглобин находится в растворенном состоя-
нии. несмотря па то что его содержится более 30%. При изменении аминокислотного состава
глобина может произойти и изменение его растворимости. В молекуле гемоглобина железо
отстоит от плоскости порфиринового кольца примерно на 0,5—0.6 А°. Из 6 Зб-электронов
железа Fe (II) 2 электрона спарены на одной из низших d-орбиталсй. а 4 электрона зани-
мают оставшиеся d-орбигали, их спиновые моменты, согласно правилу Хунда. параллельны,
суммарный спин равен 2. Магнитный момент гема в этом состоянии равен - 5.5 боровского
магнетона (БМ). а УФ-спсктр поглощения имеет характерную ио юсу с ХП)Л - 556 нм. Реакция
присоединения молекулярного кислорода не является истинным окислением гемотлобипа, гак
как валентность железа в геме при этом не изменяется, и эту' реакцию правильнее называть ок-
сигенацией. Присоединение кислорода ведет к значительным изменениям в пространственном
расположении структуры НЬ. Атом железа в НЬО лежит практически в плоскости порфирино-
вого кольца (расстояние ло плоскости составляет около 0.16 А’). Все 6 d-электронов спарены
на 3 низших d-орбиталя.х. спин равен нулю. ПЬО диамагнитен. УФ-спсктр поглощения имеет
2 характерные полосы с ~ 576 и 542 нм Обратимое пр тсосдинение кислорода (оксигенация),
позволяющее гемоглобину выполнять свою основную функцию переносчика, обеспечивается
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 75
возможностью образовать прочные 5- и 6-ю координационные связи и перенести электрон на
кислород не от Fe (II). а от имидазольного колыта гистидина гема Структурные изменения в
активном центре приводят и к значительным изменениям пространственной структуры всего
белка. При оксигенации (переход от Т-* к R-форме гемоглобина) смешение отдельных амино-
кислотных остатков достигает 7 А“. Как было сказано выше, четвертичная структура миогло-
бина характеризуется ши ичисм 4 полипептидных цепей, образующих 2а- и 2р-субъсдинииы,
которы образуют димеры. Переход от Т- к R- |юрме сопровождается поворотом одного димера
относительно другого на 12—15 А" и в конечном счете приводит к увеличению «карманов», в
которых находятся гемы Эти структурные изменения инициируются присоединением первой
молекулы О, к одному из свободных гемов и распространяются на всю глобулу. Именно поэ-
тому в равновесной смеси всегда присутствуют Т и R-формы. Димеры вТ-форме стягиваются
14 дополнительными (по сравнению с R-формон) связями (водородные. гидрофобные, ван дср-
ваальсовы и лр.). а между субъединицами в 1-форме встраиваются молекулы 2.3-дифосфогли-
нерата. что также приводит к сужению «карманов». Триггером для структурных перестроек при
переходах между Т- и R-формами служит присоединение или отшепление кислорода.
Итак, кислород, взаимодействуя с НЬ, образует нестойкое соединение — оксигемоглобин
НЬО. степень диссоциации которого регулируется 2,3-дифосфоглицератом и зависит от pH
крови, парциального давления О,, а также присутствия в организме ряда ксенобиотиков, вза-
имодействующих с НЬ. Нарушение транспорта кислорода связывают с образованием метгемо
глобина или карбоксигемоглобина. При этом нарушается транспорт кислорода к тканям, что
может привести к развитию гипоксии гемического типа
Образование карбоксигемоглобина
По статистике, в РФ на отравление угарным газом (см тл. 8 3) приходится до 75% смертей
при пожарах.
Карбоксигемоглобин (НЬСО) — соединение НЬ с оксидом углерода (II) ярко-красного цве-
та, которое образуется при воздействии на ортаннзм угарною таза (СО) и карбонилов метал-
лов. Сродство СО к ионам Fe * гемоглобина в 200-300 раз выше, чем у кислорода, а скорость
иссоииания НЬСО в 36(H) раз .мепыпе. чем у НЬО. Поэтому нрн наличии во вдыхаемом воздухе
СО кислород постепенно вытесняется из гемоглобина. Для полною насыщения гемоглобина
О. необходимо парцтта. ыюс давление порядка 12—13 кПа. для насыщения СО — 0.06 кПа. что
приводи к конкуренции между СО и О . Скорость образования НЬСО зависит от парциально-
го давления СО (рСО) во вдыхземом воздухе, времени экспозиции СО. объема дыхания (литр в
I мин) при определенных условиях (температура, влажность воздуха, давление). Стабильность
комплекса НЬСО также зависит от ряда факторов, из которых наибольшее значение имеют
концентрация СО и О но вдыхаемом вохтухе. парциальное давление О, и СО, в крови. СО —
иитотоксикант, не только оказывающий повреждающее действие па систему транспорта О
темот юбином. но и нарушающий работу тканевых биохимических систем, содержащих желе-
зо. Способ поступления СО в организм только один — ингаляционный. Токсический эффект
для человека наблюдается при вдыхании воздуха с концентрацией СО 3-I0’1 г/л в течение I ч.
Гоксикокинетнка. методы идентификации и количественного определения СО в крови пост-
радавших или пятнах крови на вещественных доказазельствах приведены в тлаве 8.3.
Отравление СО характеризуется симптомами поражения центральной нервной системы:
шумом в ушах, головной болью, головокружением, тошнотой, рвотой, слабостью, наруше-
нием сознания, глубокой комой. Вследствие гипоксии развиваются отек мозта, гипертензия,
сменяющаяся гипотонией, отмечаются деструктивные процессы в ткани мозга, приводящие
к формированию стонких нарушений функций центральной нервной системы. Часто острое
отравление СО проявляется изменением окраски кожных покровов (от розовой до алой) и вы-
сыпаниями на коже, тахикардией, аритмией, ишемией, инфарктом миокарда, отеком легких,
последующей почечной недостаточностью.
Тяжесть состояния пострадавших соответствует содержанию НЬСО в крови. Интенсивное
кхрение сигарет может повысить его содержание до 16%. а при концентрации НЬСО 60-70%
• R (от ашл. relaxed) и Т (oi шил. ictue). Состояние R характеризуется высоким, а Т — низким сродством к О т.с.
сильным и слабым связыванием молекулярного кислорода соответственно.
76 Глава 2
возможен летальный исход. В го же время содержание НЬСО в крови, которое определяется
при поступлении больного в стационар, нс может служить надежным критерием определения
тяжести состояния пострадавших. В большинстве случаев содержание НЬСО в крови постра-
давших уже не бывает высоким, в то время как клиническая симптома! ика свидете ibCiByei о
тяжелой степени отравления. Подобное hccootbcictbhc можно ооъяснить тем что со временем
происходит диссоциация комплекса, СО удаляется из организма, поэтому большое диагнос-
тическое значение имеет определение НЬСО в крови, взяюй непосредственно на месте про-
исшествия. Тяжесть клинической картины отравления угарным газом определяется не только
содержанием НЬСО в крови, но и потребностью организма в кислороде, а также интенсивнос-
тью физической активности пострадавшего. Зависимость между концентрацией СО в воздухе
содержанием НЬСО в крови и признаками отравления представлена в табл. 2-13.
Таблица 2-13. Зависимость между концентрацией СО в воздухе, содержанием НЬСО в крови и вризна
ками отравления
СО в воздухе, мг/л НЬСО в крови, % Признаки отравления
0,08-0.11 0-10 Бессимптомно
0.20 10-20 Интоксикация леткой степени тяжести: шум в ушах, голов- ная боль, головокружение. тошнота, кожная гиперемия
0.23-0.46 20-30 Итоксикання средней степени тяжести, сильная головная боль, стук в висках, тошнота
0.46—0.88 30—40 Интоксикация средней степени тяжести резкая головная боль, туман в глазах, слабость. рвота возможен коллапс
0.80-1.35 40—50 Инюкснкапия средней степени тяжести, выраженные рас- стройства дыхания и функции сердечно сосудистой систе- мы. часто наблюдается коллапс
1.26-1.76 1.8-5.7 50—65 Ингокенкання сильной степени тижссгн: кома, судороги, возможна смерть
5,7-14,08 65-90 Смерть наступает менее чем мере з 1 ч тшыхатшя
Более 14,0й 90 Смерть наступает после нескольких минул вдыхания
Карбонилы металлов
Из множества известных карбонилов металлов пеитакарбонид железа |Fc(CO),| и тстракар-
боиил никеля |Mi(CO)4] исно шзуюшиеся для получения чистого жезеза и никеля, а также в
некоторых процессах химической промышленности, прелстаачяют интерес как диверсионные
яды.
Пентакарбонил железа — желтая жидкость с юмнературой кипения 102.7 ’С и температурой
замерзания —20 °C. При обычной температуре, облучении или контакте с актвированным
углем пентакарбонил железа ра лагаегея с выделением СО.
Тетракарбонил никеля — бесцветная жидкость с температурой кипения 43 °C и высоколе-
тучая. Пары Ni(CO)4 в 6 раз тяжелее воздуха. Группы СО в Ni(CO), легко замешаются другими
молекулами и радикалами, например PH,, PFV CN Это неустойчивое соединение, которое
постепенно окисляется на воздухе и выше 60 °C разлагается. Карбонил никеля легко взаимо-
действует с кислоротом, давая оксиды никеля и СО. Смесь паров карбонила никеля с воздухом
самопроизвольно вспыхивает, а иногда и взрывается. Предельно допустимая концентрация его
в воздухе производственных помещений 0,0005 мг/м’.
Карбонилы железа и никеля действуют- как ингаляционные ялы. Вследствие своей высокой
раствори мости в липидах они могут проникать в организм и через кожу В некоторых случаях
картина отравления и механизм токсического действия иные, чем при отравлении СО. По-ви-
димому, их О1рав.1яю!пее действие зависит от того, вдыхают ли собственно карбонил металла
или продукт его разложения, т.е. СО.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 77
Детоксикация отравлений оксидом углерода
Связь СО с НЬ обратима. При удалении пострадавшего из атмосферы, содержащей СО, про-
исходит быстрая элиминация токсиканта из организма, поэтому лечение надо начинать без-
отлагательно. Как только пострадавшего вынесли из помещения, где произошло отравление,
ему дают кислородную маску и держат до тех пор. пока содержание НЬСО в крови не пони-
зится до безопасного уровня (10%) в 2 последовательно взятых пробах. Обычно такого уровня
НЬСО можно достичь при гипербарической оксигенации за 1,5 ч. Это наиболее эффективный
и специфический способ детоксикации, позволяющий значительно ускорить диссоциацию
НЬСО и увеличить содержание кислорода, растворенного в плазме. Критерием для проведе-
ния гипербарооксигенании является содержание НЬСО в крови более 25%. Иногда назначают
внутривенно метиленовый синий в больших лозах — 50—100 мл 1% водного раствора или
1% раствора в 25% растворе глюкозы (препарат хромосмон). В РФ запатентован препарат эпи-
зод [бис-(1-винилимидазол)-иинклиацетат| как антидот при отравлении СО и антигипоксант
при кислородной недостаточности. Анизол может быть использован в качестве профилактичес-
кого и лекарственного средства, а также для экстренной медицинской помоши в чрезвычайных
ситуациях при поражении людей СО и продуктами неполного сгорания органических веществ
в очагах крупномасштабных катастроф или химических аварий. Лекарственная форма: ампулы
I мл 6% водного раствора иди 0,5% раствора в новокаине, предназначенные для внутримы-
шечного введения. Препарат применяется в дозе 60 мг, при тяжелом отравлении допускается
повторное введение анизола через I ч после первой инъекции. При остановке дыхания пока-
заны интубация, использование аппарата искусственной вентиляции легких (под давлением),
псрсливппис крови, симптоматическое лечение. Если пострадавший продолжает оставаться в
коматозном состоянии более 7—8 ч, прогноз неблагоприятный.
Итак, в крови гемоглобин существует по крайней мерс и 4 формах: НЬО. НЬ, НЬСО. метге-
моглобин (МегНЬ). В эритроцитах молекулярные формы гемоглобина способны к взаимопре-
вращению. их соотношение определено индивидуальными особенностями организма.
Образование метгемоглобина
В отличие от НЬО, МегНЬ содержит трсхвалентпос железо, грочно связывает кислород и
поэтому непригоден для его транспорта. В МегНЬ при нейтральных значениях pH место кис-
лорода занимает молекула воды. Fe (!!!) находится значительно ближе к плоскости гема, чем
в НЬО. все 5 d-электронов песпарены и занимают 5 d-орбиталей, суммарный спин равен 5/2,
а магнитный момент — 5.91 БМ. Методом гамма-резонансной спектрометрии (ГРС) установ-
лены конформационные перестройки НЬ при изменении электронного состояния Fe2* в геме
после присоединения 6-го аксиального лиганда — молекулы О (см. выше и гл. 6.4.3) и обра-
зования МегНЬ. содержащего Fe1+.
В норме МегНЬ содержится в эритроцитах в небольшом количестве (0.5—1%), так как при
взаимодействии молекулярного кислорода с НЬ существует некоторая вероятность окисления
последнего: молекула О, может окислить Fc2* гема. Поэтому при дыхании в эритроцитах не-
прерывно образуется и MetHb. В эритроцитах существует специальная ферментная система,
восстанавливающая МегНЬ в НЬ (см. ниже), способствующая конформационным преращени-
ям НЬ и сохранению равновесных концентр, гий НЬ и MetHb. При нарушении работы этой
системы возникает тяжелое заболевание — метгемоглобинемия, при которой НЬ перестает
быть переносчиком кислорода.
Многие лекарственные вещества (например, нитроглицерин, сульфаниламиды, хлорамфе-
никол. ПАСК, антипирин), особенно при их длительном применении в больших дозах, могут
вызывать метгемоглобинемию. Однако у большинства людей после отмены препаратов пол
влиянием метгемогтобинредуктазы происходит восстановление MetHb в НЬ.
МегНЬ в концентрации более 1% способен вызвать гемолиз эритроцитов, что в свою очередь
приводит к падению парциального давления О, в тканях и развитию гипоксии. В присутствии
токсикантов, обладающих окислительной способностью, равновесие нарушается, сдвигаясь в
сторону образования МегНЬ, концентрация которого значительно повышается Если в орга-
низме функция и содержание глутатионпероксидазы находятся в пределах физиологической
нормы, то в эритроцитах происходит восстановление токсикантов, и равновесие реакции НЬ —
МегНЬ не смешается. При нарушении в системе окисление-восстановление глутатиона (см.
78 Глава 2
гл. 3 и 4) токсиканты могут накапливаться в эритроцитах, приводя к умеренной метгемогло-
бинемии и гемолизу. При этом в крови обнаруживают продукты денатурации НЬ (тельца Гей-
нца). Возможно восстановление MetHb в НЬ и с помощью других редокс-ферментных систем:
никотинамидалениндинуклеотида НАД — НАДН (преимущественно) тьи никоптпамидаде-
ниндинуклсотидфосфата НАДФ* — НАДФН (см гл. 3 и 4). При участии гексозо-6-фосфат-
детидрогеназы (Г-6-ФДГ) происходит образование НАДФН. который в присутствии мстге-
моглобипредуктазы восстанавливает как MetHb в ПЬ, гак и глутатион. Степень повреждения
эритроцитов метгемоглобин ообразователями в значительной мере зависит от токсикокинети-
ческих параморов (см. гл 4) ксенобиотиков и/илн их метаболитов при условии близких зна-
чений окислительно-восстановительного потенциала сравниваемых веществ.
Содержание MetHb в крови коррелирует со степенью выраженности симптомов отравления,
например цианоз кожных покровов и видимых слизистых оболочек соответствует содержанию
MetHb в крови более 15%. При концентрации MetHb в крови более 55% дпагносиируют гипо-
ксию. при концентрации более 70% возможна смерть. Определенные токсиканты способству-
ют образованию наряду с MetHb и сульфгемоглобина (SHb). который усиливает диссоциацию
НЬО. В этом случае, как правило, легальные случаи petKB. но цианоз сохраняется даже при
ингаляции кислорода, которая не облегчает ситуацию. Повышенное содержании в крови вос-
становленного НЬ (вследствие усиленного выделения кислорода тканями, плохо снабжаемыми
кровью), наоборот, требует срочного проведения ингаляции кислородом.
Метаболитами многих токсикантов (табл. 2-14) являются произвопныс гидроксиламина.
который провоцирует образование MetHb. Амино- и нитропроизводные бензола в результа-
те гоксикокинстических реакции переходят в феннлгилроксиламин (ФГА) и нитрозобензол
(ИЗБ), способные обратимо превращаться друг- в друга с помощью НАД1—НАДН- и НАДФ4—
НАДФН-зависимых редокс-систем. Окислительно-восстановительный процесс ФГА-НЗБ-ФГА
обладает высокой MctHb-образуюшей способностью. Гидроксиламин- и иитрозобензолдери-
ваты выделены как промежуточные продукты бпотрансформапии анилина. ^алкиданмешнов.
р-фснстидина. р-хлоранилипа. р-иитрохлорбензола, р-аминопропиофенона и многих других
соединений.
/Хктивными окислительными агентами в реакциях превращения НЬ в MetHb являются сво-
бодные радикалы, образующиеся как в процессе окисления ФГА в НЗБ. гак и в процессе вос-
станоатения нитрозогруппы в гидроксиламипогрутгпу. Производные гидроксилам ина и группа
питритсодсржаших соединений (см. табл. 2-14) вызывают в организме неэквивалентные гема-
готоксическне эффекты. Если интриг натрия способствует образованию MetHb. то воздейс-
твие гидроксиламина сопровождается образованием MetHb, SHb, формированием выраженной
гемолитической анемии и гелей Гейнца.
Производные гидроксиламина взаимодействуют с микросомальными цитохромами Р450 с
образованием гидроксиламннооксида, быстро окисляющегося до NO. и ряда супероксидных
радикалов (см. гл. 3), при участии которых и происходит окисление НЬ в МсгНЬ в еще не-
поврежденных эритроцитах. Известно, что эритроциты обладают различными антиоксидант-
ными биологическими механизмами, противостоящими внутриклеточному оксида гивиому
стрессу: системой глутатиона, рядом пероксидаз, супероксилдисмутаз и каталаз. Глутатион
является нс только важным компонентом защиты эритроцитов, но и субстратом для глута-
тион пероксидазы при прямом воздействии свободных радикалов. В эритроцитах отсутствует
белоксиитезируюший аппарат, в них не происходит обновления белковых молекул, в связи
с чем адаптивные свойства этих клеток и их роль в резистентности организма во многом
зависят от соотношения прооксидантов и антиоксидантов. Несмотря на хорошо развитую
антиоксидантную систему, эритроциты все равно повреждаются при окислительном стрессе,
видимо, из-за отсутствия митохондрий и вследствие этого низкой энергетической обеспечен-
ности. Гемолиз эритроцитов может быть следствием альтерации мембранных белков, при-
чем мембранные нарушения инициируют усиленное удаление поврежденных эритроцитов
из крови макрофагами селезенки. Структурные изменения в белках мембран эритроцитов
являются следствием окисления глутатиона, сульфгидрильных групп мембран, образования
специфических комплексов — так называемых смешанных белковых дисульфидов. что и
способствует повреждению мембран и формированию гемолитической анемии вследствие
воздействия гоксикапгов.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 79
Увеличение концентрации MetHb подавляет активность глугатион-5-трансферазы. глутати-
онпероксидазы. мстгемоглобинрелуктазы и ускоряет ПОЛ. Свобошые радикалы (в частности.
NO ) в 1000 раз быстрее реагируют со свободным внеклеточным НЬ. чем с эритроцитами. Выход
НЬ ит эритроцитов и дальнейшие превращения NO инициируют гемолитические процессы.
В формировании телец Гейнца (белковых гранул, образующихся из денатурированного глобина
после диссоциации гемоирогсида на гем и глобин) значительная роль принадлежит смешанным
дисульфидным комплексам глутатиона к НЬ. наличие которых и ведет к изменению нормальной
третичной и четвертичной структуры НЬ. На поверхности НЬ оказываются гидрофобные участ-
ки. которые путем тидрофобпо-тилрофобных взаимодействий (см. гл. 2.2) с липидной матрицей
мембраны образуют мембранно-связанный НЬ. Последний образует со свободными молекулами
НЬ за счет сил адгезии аморфную массу, идентифицируемую в эритрон пах в виде телец Гейнца.
Ветел за появлением мембранно-ассоциированных гемоглобиновых контломератов происходит
нарушение структуры скелетных мембранных белков в 1-й и 2-й мембранопротеиновой цепи и
увеличивается их молекулярная масса. Возможно, эти структур тыс изменения обусловливают
развитие осмотического стресса и гемолиза эритроцитов при воздействии токсикантов. Гид-
роксиламип с НЬ или миоглобином (Mb) образует устойчивый железонитрозильный комплекс
(HbFc2r—ON иди Mb—ON), структура которого установлена методом ГРС (см. гл. 6.4.3). Образо-
вание комплексов HbFe2+—ON или Mb—ON значительно затрудняет образование НЬО и транс-
порт' кислорода к тканям, что приводит к развитию гипоксии.
Известно, что гидроксиламин — эндогенный вазодилататор, гак как. являясь продуктом
жизнедеятельности клеток млекопитающих, опосредованно (из-за образования NO при ме-
таболических превращениях) обладает выраженным сосудорасширяющим свойством. По-ви-
димому, в норме in vivo гидроксиламин превращается в NO преимущественно в эритроцитах
и наряду с NO-синтазой и нитрат-нитритной ксантиноксила’зой служит его допоят ительным
источником. Однако при действии токсиканов. метаоолитами которых являются производные
птдроксиламина. значительно возрастает концентрация NO. что сопровождается окислитель-
ным стрессом и гематотоксичностью.
Иногда предотвратить образование метгемоглобина в крови больных можно введением ан-
тидотов (см. гл. 2.5) Например, внутривенное введение в.чалых дозах (0.1—0.15 мл 1% раствора)
метиленового синего (из расчета I—2 мг/кг) приводит к восстановлению MetHb в НЬ Тетра-
мстилгнонина хлорид — красите >ь мстиленовый синий — обладает окислительно-восстанови-
тельными свойствами и может играть роль акцептора и донора ионов водорода при различных
биохимических превращениях. Прежде чем вводить пострадавшему антидот, необходимо иметь
|абораторныс данные о содержании в эритроцитах Г-6-ФД1 и мстгсмоглобипрсдуктазы. Введе-
ние антидота при их дефиците вызывает вторичное метгсмоглобинообразованис. развивается
гемолиз и нарастает гемолитическая анемия.
При отравлениях угарным газом (см. выше), синильной кислотой и сероводородом (см.
гл. 8.3) назначают внутривенно 50—100 мл 1% водного раствора тын 1% раствора метиленового
синею в 25% растворе глюкозы, что основано па ею способности в больших дозах окислять
гемоглобин в метгемоглобин, образующий с указанными токсикантами устойчивые комплек-
сные соединения.
При наследственной недостаточности метгемоглобинредуктазы в крови больных концен-
трация MetHb повышается до 30—40%. а их чувствительность к действию токсикантов-мет-
гемоглобинообразователей резко возрастает Различают метгемоглобинемии врожденные эи-
зимопснические. обусловленные резким снижением или полным отсутствием в эритроцитах
активности мстгсмоглобипрсдуктазы. и наследственные. развивающиеся в результате наличия
нестабильных или аномальных гемоглобинов, в которых в результате генных мутаций про-
изошла замена аминокислотных остатков в а- или p-цепях глобина (М-гсмоглобинопатни).
Энзимопеничсские метгемоглобинемии у гомозигот наследуются по аутосомно-рецессивно-
му типу Сразу после рождения ребенка па коже и слизистых оболочках, особенно в области
iy6, носа, полости рта. на мочках ушей, ногтевом ложе, выявляется цианоз. Он сохраняется в
течение всей жизни, усиливаясь при охлаждении, приеме метгемоглобинобразующих лекарс-
твенных препаратов (фенацетин, викасол, некоторые сульфаниламиды и др.), употреблении в
питу продуктов, содержащих ни фаты, у женщин может гроявляться в период беременности.
Кровь у таких больных темно-коричневого цвета в результате повышения содержания MetHb.
80 Глава 2
У гетерозигот концентрация MeiHb в крови составляет I— 2%. признаки заболевания отсутству-
ют. Цианоз может появиться после во действия метгемоглобинобрд |уюших вешеств.
М-гемог.тобинопатии наследуются но аугосомно-ломинантному тину; встречаются только
у гетерозигот. У больных с а-непочечным вариантом М-гемоглобинопатии цианоз отмечается
с момента рождения, с р-цепочечным — с 6-мссячпого возраста. Другие проявления болезни,
как правило, отсутствуют. Гомозиготная патология несовместима с жизнью, так как весь син-
тезирующийся в организме НЬ в этом случае представлен MctHb.
При метгемоглобинемии обусловленной дефицитом редуктаз, назначают большие дозы аскор-
биновой кислоты, способной взаимодействовать с токсикантами в эритроцитах. но со значительно
меныпей скоростью, чем метштсиовый синий, применял, который в такой ситуации нельзя.
В табл. 2-14 приведены примеры ряда химических соединении, способных проявлять гема-
тотгоксичность.
Таблица 2-14. Гематотоксиканты*
Гематотоксиканты Примечание
Анилин, его метаболиты и производные Антипирин и его произ- водные Антибиотики: левомици- тии. цитостатического действия (актиномицин, олпвомм- нин. пуромипип) Основной метаболит ароматических аминов — ФГА — ответствен за обра- зование MeiHb. повреждение мембран эритроцитов и развитие гемолити- ческой анемии (см гл. 8.2) Могут наблюдаться граиулонитопсиия и агранулоцитоз Могут наблюдаться тромбоцитопения, лейкопения, агранулоцитоз, апласти чес кая анемия. Не рекомендуется назначать одновременно с лекарственны ми средствами. угнетающими функцию кроветворения (сульфаниламидами, цитостатиками). Чувств» ельны лина с дефицитом глутатиоиредуктазы и Г-6-ФДГ
Ароматические углево- дороды, их метаболиты, интро- и галогенонроиз- волные 1.3-Ьутадиеи Высокая активность в гранулоцитарных элементах костного мозга фер- мента миелопероксидазы, катализирующего окисление метаболита бензола — гидрохинона — в 1.4-бензохиион. сопровождается свободнорадикаль- ными процессами в клетках. Хроническое действие в концентрациях более 100 рр п связано с нарушениями гемопоэза и иммунной системы (лейко- пения. тромбоцитопения, лимфоцитопеиня. панцитопения). Уменьшение числа форменных элементов в крови часто происходит на фоне гиперш зни костного мозга с признаками задержки созревания клеточных эле- ментов эритроидного и миелоидного ряда. Действует на клетки костного мозга, находящиеся в фазе G2 митоза, а в сублетальиых дозах — на клетки в периоде клеточного деления (см. гл. 8.2) (ематологические изменения при длительном воздействии: лейкопения, । ситро! сния. 1ромбоинтопсния. гемолитическая анемия, гипогромбииемия (редко)
Водород мышьяковистый (арсин) Сопровождается снижением содержания глупа шона в эргнроцигах. угне- тением эритроидного ростка коечного мозга. Возможен юксичсскнй отек легких. Чувствию >ьны лица е дефицитом глугатионредуктазы и Г-6-ФДГ (см. гл. 8.5)
Водород сурмянистый (сгибни) Сопровождается вторичным поражением печени и почек: гематурией, тош- нотой. рвоюи, желтухой, шоком, признаками острой почечной недосгаюч- ностн (см. гл. 8.5)
Галогеноироизво. ные углеводородов алифати- ческого ряда См. выше галогенопроизводиые аромашческих углеводородов
Гидразин, метил-1 идразин и его производные, феннл- г ид ратин Чрезвычайно токсичные соединения, вызывающие нейтрофильный лейко- цитоз, лимфопению, эозннопсиию. При остром отравлении вначале уве- личивается количество эритроцитов и гемоглобина, в последующем оно уменьшается в связи с гемолизом. Гидразин оказывает влияние на сверты- вающую систему крови, вызывая инакнитнию фактора VIII (так называе- мого ангигемофилического ыобу.шна), Чувствительны липа с дефицитом глутагионредуктазы и Г-6-ФДГ (см. гл. И)
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 81
Продолжение тиол. 2-/4
Гн |рокснламнн. ФГЛ См.анилин
JjncoH. лиаминолифе- ни 1сулы|юн и другие сульфоны Чувствительны лица с дефицитом гл татнонре влетазы и 1-6-ФЛ Развива- ются как метгемоглобинемия. так и сульфгемо1.1обнпсмня. ic.mo.ihi (спустя неделю после интоксикации!. анемия
Лекарственные всшеста алкилирующего действия Вероятность возникновения (до 2D'?) вторичной ОМЛ эпвиси! от лоз пи- г оста тика и юно.шитсльцого облучения
Соединения. содержащие я ионной форме: медь При остром пероральном отравлении обнаружение гемоыобина в пзмз.мс крови и моче, снижение резистентности эритроцитов. гемолитическая ане- мия. су ч !*фгемоглобинемня. бнлирубннемия
свиней Угнетение эритронпзза всл тстппс нарушения процесса спите ia гема, опо- средованное пот ныеннс активности дегидрогеназы о-аминодевулиновой кислоты и/и ш повреждение мембраны эритроцитов (снижение устойчи- вости эритроцитов). Обнаружение порфирина в моче похший признак интоксикации Диагностические признаки хронической интоксикации — наличие в моче о-аминоленулиново 1 кислоты, в п.шзме крови повышенный уровень синица. Анемия рахтчнон степени тяжести
ЛруГПС См. гл. 8.5
Мспиеповыи скипи Чувствительны лица с дефицитом глузатиоцрелукта.зы н Г-6-ФДГ. В завн- спмосги от дозы — препятствует или способствует образованию метгемо- глобина (см. текст)
Соединения мышьяка При острой интоксикации нарушение созревания мнелоблаетов. проявля- ющееся лейкопенией. при хронической интоксикации развитие лейкемий. Диагностический при так — обнаружение злемента в ilisimc кропи и моче в 1-е сутки (см. 1.1. 8 5)
Нитроня, нитраты* Нитриты — активные мс1гемогтобипообрлюватели: группа риска — липа, имеющие дефицит глутатионрелуктазы и Г-6-ФДГ. Нитраты восстанаитнва- ются в нитриты в печени (при участии системы глутатион—шпратрс тукта- м) и желт ючно-кишечиом тракте (при участии Escherichia со//. Pseudomonas аигш'ено'к! и др.). Факторы, ускоряющие восстановление нитратов: повы- шенный pH среды в желудке, активность микрофлоры в ЖКГ. недостаточ- ная реакционная с юсобность системы НАД* НАДН мстгсмогтобннрс- луктаза Отравление сопровождается гемолизом и гемолитической анемией
Нитрофураны Противопоказаны при дефиците Г-6-ФД1. новорожденным в связи с не- зрелостью ферментных систем и связанным с этим риском возникновения гемо литической анемии
Одон Бпо готические свойства озона нельзя рассматривать как специфические, ибо они проявляются при участии моментально образующихся продуктов озонолиза других пешее! в
Оксид углерода (11) и кар- бониты металлов См текст выше: образование 1 |ЬСО н кропи
X. орсодержашие нест и пилы (.альдрин. лильдрин. ширин, гсксахлорбсн'зот. токсафен, мирекс. хлор- дан. гетахлор. ДДТ) Высокотокспчные. стойкие (см. гл. 8.4). Например, поя влиянием УФ-лу- чен более 90б< гептахлора превращается в эиокись гепгахлора — соедине- ние. которое во много раз токсичнее нсхочного и является канцерогеном
Пиридин и его ирги {пол- ные Вызывают замехтенис скорости оседания эртропнтов. сдвиг лейкошиар- ной формулы влево
Природные токсины См. 171. 11
Сульфан иламиды Чувствительны лица с дефицитом глутагионредукта1ы п Г-6-ФДГ. Возмож- но ра шитие лейкопении (см. аиилин)
82 Глава 2
Окончание тай 2-14
Фенолы. аминофснол (и
его проишо.шые). ппро-
галлол. ги ipoxtiiioii
Хлорит (бромат) калия
(натрия)
Этнленоксид
Органамп-мишсн т.мн у человека для феио.ы и крезе зв. посту iiuuuiitx в ор-
ганизм пероральным путем, яплякмея кровь и ночки, снижается функцио-
нальная .ikiiibhckil ленкониюк. на( тюлается зритропенпя. В .KtiiepiiMciiie
в ишисимосгн от лозы фенола в костном мопс лтпюгных шпеиеншккп.
соз|к.'вания apHipoG.Kicion cHHA.ieiun tun вотрис аег
См. гл. 8.(>
Эфиры >гн leiir.iiiKoля
Мутаген. UHioTOKCiiKHin. можс| вызвать лейкемии рнетичных пшои
Анемии. ip.inyjouHioiieKHH В костном мозге (при нормальных пока кнелях
пери<|и.’рической кропи) признаки мпелои.июи Iнионлазип. ноирсА.к*ннм
стромы костного мопа. енлероЯлаепп (см. i.i 8.2)
‘Изисстны юксикоманни. обусловленные пристрастием к инытяини .iciy-шх н просос пшениц
2.4.4. Нефротоксичность
Вещества различной химичсскс i природы. избирательно вы зываюшие как структурные. (зк
и фу нкннональные нарушения почек, называют нсфроксикантами. а резулыаз их воз действия —
нефротоксичностью.
Нефротоксичность можег бить следствиех! прямою возленечвия (оксиканюв и их метзбо-
H1TOII па клеточные структуры почки или моченого пузыря, чго еопровожтаегся выделением
специфических биомарксров. напрямую связанных с поврежденным сегментом, л шкже следе-
изием нарушения гомеостаза.
Причины, которые вызывают повреждение почек, могут иметь преренальныи (пар шепие
гемодинамики — снижение гемонерфузни почек и лр.). ренальный (попрело сине гкапн ночек)
или птстрснальный (закупорь дистальных канальцев нефрона) характер.
К органам .мочевоп системы относятся почки, .мочеточники, мочевой пузырь и мочеиспуска-
тельный капал. Почки — мочеобразуюшие органы, остальные — мочевыводяшие нуги. Почки
(парный орнзн) массой около 300 г. каждая из которых содержит более 1 млн нефронов, поду-
чают оз 20 до 25$ минутного объема сердечною выброса крови. Структура нефрона — ключ к
пониманию ио функции (рис. 2-8). Па одном койне каждого нефрон з имеется расширение —
круглое образование, называемое мальпигиевым тельном. Оно состоит из двухслойной кап-
сулы Боумена, которая охватывает есть капидяярои. образующих клубочек. Остальная часть
нефрона делится на 1ри части. Ближайшая к клубочку часть — по проксимальный извитой
каналец. Дальше — тонкостенный прямой участок, который, крхто разворачиваю., образует
кеглю (петлю Генле); в пей раыичают (последовательно) нисходящий участок, изгиб, восходя-
щий учнеюк. Третья часть — дистальный взвитой каналец, впадающий вместе с другими дис-
тальными канальцами в собирательную трубочку. Из собирЛе пятых трубочек моча попадает и
почечную лоханку (фактически расширенный копен мочеточника) и далее по мочеточнику в
мочевой пузырь. Из мочевого пузыря по мочеиспускательному каналу моча через определен-
ные промежутки времени выводится наружу. Около 1% нефронов целиком располашются в
корковом веществе, а у 80% нефронов пет ли спускаются в наружную зону мозгового вещества
почки.
Но сосудам коры почки пршекает 91—93% кропи, в наружное мозговое вещество поступает
6-8%. во внутреннее мозговое вещество — менее 1%. Кровоток коры почки в 100 раз интенсив-
нее. чем в покоите шя мьнппе. Особенностью гемодинамики почки, помимо большого крово-
тока. является развитая система его саморегуляции, обусловливающая постоянство кровотока
и объема клубочковой фильтрации при изменении артериального давления в широком диапа-
зоне. Капиллярный юубочек. окруженный капсулой Боумена. — эго сложно организованны (
мембранный филыр. В минуту через обе почки человека протекает около 1200 мл крови (660 xtn
(ыазмы крови). В к.тубочк(х из этого количеств.! плазмы образуется нриблизпie.ii.no 125 мл
ф1ыьгрлп. nocrynaioincio в просвет капюыш (в сутки около 180 л). У здорового человека доля
плазмы. <|>ильтруемоп в клхбочках. та называемая фильтратионная фракция, состшияст 19%,
Классификация токсичных агентов и вилы токсического действия 83
Кровь в клубочек поступает по афферентной артериоле, распадающейся на сеть капилляров,
общая поверхность которых в ночках человека достигает 1.6 м:. В почечном клубочке вола и
растворенные в ней вещества под действием артериального ыатсния выходят из крови через
стенки капилляров. Поры капилляров насюлько малы, чго задерживают кровяные клетки и
белки. Начальный этан мочеобразования — это ультрафильтрация плазмы крови через мем-
брану клубочка, практически непроницаемую для белков, но пропускающую волу и низко-
молекулярные водорастворимые компоненты (большинство продуктов метаболизма ксеноби-
отиков и,пли эндогенных вешеств (шлаков). Такая жидкость называется ультрафильтратом,
клубочковым фильтратом, или первичной мочой. Ультрафильтрат содержит много полезных
для организма веществ (сот. глюкоза, аминокислоты. шгглмины п т.д.). которые подвергают-
ся реабсоронни по мере того, как фильтрат проходит по проксимальным канальцам нефрона.
иокоза например, реабсорбируется ло тех пор. пока полностью не исчезнет из фильтрата, т.е.
пока ее концентрация не приблизится к нулю. Поскольку перенос глюкозы обратно в кровь,
где ее концентрация выше, идет против градиента концентрации. процесс требует дополни-
тельной энергии и называется активным транспортом.
В результгге реабсорбции глюкозы и солей из у тырафилыращ концентрация рае торенных
з нем вешеств снижается. Кровь оказывается более концентрированным раствором. чем филь-
трат. и вода пассивно следует за активно транспортируемыми солями. С помощью активного
пассивного транспорта 7/8 воды и растворенных в ней веществ из содержимого проксималь-
ных канальцев всасываются обратно, причем скорость уменьшения объема филырага лоститет
1 л в час При повреждении почечною фильтра (например, в результате действия токсикантов)
в моче могут быть обнаружены элементы крови и белки плазмы крови (например, иммуно-
• удины. фибриноген н др.). Постоянно протекающие процессы фильтрации и реабсорбции
. ккобствуют концентрированию в определенных отделах нефрона (главным обра юм в прок-
симальных отделах почечных канальнев) и интерстициальной ткани почек во хорастноримых
продуктов метаболизма токсикантов. Поскольку основные транспортные и концентрационные
процессы происходят в проксимальном отделе канальцев (рис. 2-8). именно этот отдел нефро-
на наиболее часто повреждается токсикантами. Кроме того, процессы, проходящие в прокси-
мальных отделах почечных канальнев (реабсорбция воды, секреторные процессы), чрезвычай-
но энергоемки, что делает их весьма чувствительными к ишемии.
Но процесс образования мочи еще не окончен. Следующим сегментом мочеобразования
является петля Генле, где осуществляется дальнейшее концентрирование выводимых мочой
вешеств (солен. метабг тнтов, мочевины и др.) благодаря противоточному концентрирующему
механизму Затем фильтрат поступает в дистальные капа и>иы. где а счет активного транспорта
в него могут перейти и другие вещества, продолжается процесс концентрирования мочи. Далее
фильтрат попадает в собирательные трубочки. На этом этапе, регулируемом наличием или от-
сутствием антидиурстического гормона (АДГ) в крови, формируется pH и определяется обьем
конечной, или вторичной, мочи. Если АДГ в крови недостаточно, то концентрация выводимых
вешеств резко снижается, но обьем мочи остается большим.
Мочевой пузырь
Моча депонируется в мочевом пузыре. Некоторые соединения вызывают серьезные пора-
жения мочевого пузыря (например, рак мочевого пузыря нередко возникает при хроническом
воздействии ароматических аминов).
Э покривит система почек прел ставлена рениновым и простагландиновым аппаратом.
Юкстагломерулярный (рениновый) комплекс, шли аппарат. — особые клетки в стенках при-
носящих артериол почечных клубочков — сскрегпруст в кровь одни из ферментов ренин-ан-
пютензиновой системы — протеолитический фермент ренин (см. рис. 2-8) Действуя на спе-
цифический гликопротеин ангиотензиноген, ренин разрывает в этом белке связь между двумя
остатками лейцина. Образующийся при этом неактивный деканский (ангиотензин-1) пре-
вращается ферментативно в активный гормон ангиотензин-2 (гипертензин, или ангиотопнп).
Юкстагломерулярный аппарат также имеет отношение к выработке эризропоэтинов. Так. при
хронической почечной недостаточности обычно развивается анемия, чаше вызванная умень-
шением синтеза эритропоэтического факзора из-за разрушения ткани почки, отвечающей за
этот синтез.
84 Глава 2
Выносящая
артериола
Проксимальный
каналец
Кортикальный
собирающий
каналец
Клубочек
Кора
Внутренний
мозговой
слой
Внешний
мозговой
слой
Юкстагломерулярный
аппарат
Цвмтро-
СТр».МИТ1 ЬИ I
артериола
Дугообразная
вена
Нисходящая или
тонкая петля Неп)е
Собирающий
проток
Капсула
Боумена
Дуго-
образная
артерия
Рис. 2-8, Скемд строения мочевыде-
чител.иой системы (Афанасьев Ю.И
2004)
Простаыанднноный динара! продуцирует одни из видов простат.шнлинов, оказывающий
антигипертензивное действие Эндокринный комплекс почек участвует в регуляции общего и
почечного кровообращения, а через него оказывает влияние на мочеобразовапие.
Почки шракм ключевую роль в метаболизме витамина D и паратпроидного гормона, а
следовательно, в гермонплыюй регуляции катьння в организме Гидроксилирование витамина
I). происходит iiocaejioiuiieai.iio в печени и почках. При нарушении работы почек изменяется
метаболизм витамина D и паратпроидного гормона, в результате чего может развиться по-
чечная остеодистрофия. чзрактермзукнпаяси заболеванием oiiopiio-jiBiiiaieribiioio аппарата и
гиперплазией парлироилной железы
Мнотне токсиканты, способные и ролу пировать АФК. метаболизируют, хотя и с разной пи-
ichchbiioct ыо. как в пенсии. гак и в почках. Как было указано выше, проксимальный от тел
почечных канальнев в наибольшей ciciichh подвергается воздействию токсикантов, в этой же
области нефрона определяю! достаточно высокий уровень активности цитохром Р450-зависи-
мых оксидаз. При интоксикации препмушест венное поражение юго или иною органа зависит
зп токсико-кинетических .характеристик ксенобиотика. Как правило, орган, который оказы-
вается первым на пути токсиканта. распределяющегося с током крови, получает наибольшее
повреждение. Например, один и тот же токсикант при ингаляционном посту нюнив в большей
степени повреждает почки, при приеме per os — печень. Почки, как и печень, являются орта
памн-мпшенямн для гоксиканюв в силу определенных факторов. К ним относятся:
• тначптельная интенсивность почечного кровотока:
• способность концентрировать ксенобиотики в процессе образования мочи;
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 85
• высокий уровень активности цитохром Р45()-завнспмых оксидаз, обеспечивающих биограис-
формапню токсикантов:
• нарушение структуры и функции органа при гипоксии.
Почки обладают компенса орной способностью. Гели одна ночка ратрушена, оставшаяся
ночка увеличивает скорость клубочковой фильтрации на 40-60%. а каждый нефрон — реабсорб-
цию воды и растворенных веществ. При этом осмотический баланс сохраняйся и функции
opiaiia не и меняются. Другой способ шииты от разрушения почечной ткани включает ип ivk-
нию мсталлотнонсица (МТ) и белков теплового шока (см. гл. 3 и 8.5). МТ — белок, который
выполняет несколько функций в организме. Он участвует в рсчуляннп уровня нинка и мели в
крови, детоксикации ртути. ка мня и других токсичных металлов, развитии и функциониро-
вании иммунной системы и нейронов мозга, синтезе ферментов. Ml модулирует контроль над
поведением, эмоциональную память и социальную адаптацию (см. гл. 8.5).
Нефротоксичность условно имеет биохимическую, иммунологическую и гемодинамическую
природу В конечном счете основой поражения токсикантами являются процессы, протекаю-
щие на молекулярном уровне: их возможные механизмы обсуждаются в главе 3. Тем не менее
с.тепует указать. что повреждение почечной ткани может происходить путем реализации опре-
лс генных этанов событий, на каждом из которых доминирующим может быть как биохимичес-
кий. так и иммупотогический или гемодинамический фактор, чате поражение органа связано
с их суммарным участием.
Антитела н иммунные комплексы — это высокомолекулярные образования, которые могут
присутствовать в гломерулярных структурах почек и приводить к формированию гломеруло-
нефрита или ociporo интерстициального нефрита. ио не к поражению эпителия почечных
клныыгев. Токсикант ы могут инициировать пшериммупную реакцию, проявляя свойст за гап-
тенов и формируя собственный антшен или способствуя поликлональной активации иммуно-
КОМНСТСНН1ЫЧ клегок. либо действуя иным путем.
Гемодинамика — движение крови по сосудам, возникающее вследствие разности гидроста-
тического давления в ра тйчных участках кровеносной системы — зависит ог сопротивления
току крови с гонок сосудов и вязкости самой крови.
Количество крови, протекающее через все участки сосудистой системы в единицу времени,
одинаково. Линейная скорость движения кропи обратно пропорциональна величине суммар-
ного просвета данного отдела сосудистого pycj а. Средняя линейная скорость кровотока в аорте
человека равна 50 см/с. в капиллярах — 0 3 мм/с. в полых венах — 20 см/с. Благодаря упру-
гости артериальных стенок артериолы при систоле расгяпшаюися, вмещая дополнигеяьиое
количество крови, а при диастоле спадаются, способствуя проталкиванию крови в капилляры.
Эго обеспечивает непрерывный ток крови в капиллярах, что важно для обеспечения процесса
формирования первичной и вторичной мочи. Состояние почечного кровотока зависит от взаи-
модействия ваюлилататорных (проста! нплины. оксид азота. претссрлный натри! ур< ический
гормон) и вазоконстрикторных (тромбоксан А,. ангиотензин II катехоламины. эндотелии)
агентов.
Есди объем гломсру тарной фильтрации снижается более чем па 70%. поражение ночек ста-
новии:» необратимым.
Нарушения гемодинамики являются частой причиной развития нефропатий, неледепше
повреждений, вызванных действием токсиканта:
• заку-норки просвета канальцев продуктами распада клеток эни един.
• нарушения реабсорбции гломерулярного фильтрата:
• повышения давления крови в капиллярной coin почечного клубочка;
• гипсрсскрении ренина:
• нарушения поступления кропи в клубочек:
• нарушение гломерулярной фильтрации.
• ишемии почечных каналыгсв;
• наличия в сосудистом русле !ромбоксапов и эндогелипа.
Основные синдромы, развивающиеся в результате острых и хронических интоксикаций по-
чек. представлены в табл. 2-15.
86 Глава 2
Тнаннш 2-15. Основные сигпромы и проявления поражения ночек нс*фрогоке>1КЛ111ЯМИ
Синдром Проявления поражения ночек Примечание
Острая почечная недо- — сюточпосгь (ОПН) Тубу 1О1Ш1Срстипналь- Угнетение функции почек, null к iiniepcTHiiH.Lib- азотемия. олигурия. протс- пый острый нефрит пиурия гломерулярною про- исхождения. . Г DUCipoHpoi рссеирую- (смагуркя п од шурин пи в гломерулонефрит 1 1 ОПП — кратковременное и обратимое наруше- ние функций почек Азотемия: повышение в плазме крови содержа- ния азотсодержащих инлкомолскулярных ве- ществ (мочевина, креатинин, p.-мнкрог обулииы 11 Г-Д). Олигурия: уменьшение количества отделяемой мочи (менее 600 мт в сутки) Протеинурия: появление белка в моче более 0.5 I и еугочиоп пробе; гломерулярная протеинурия укатывает нл рн рушение клубочкового барьера кровь—моча Гематурия: появление крови в моче вследствие повреждения стенки кашгьтярон клубочков Быстро11ро1ресс>|руюпкш почечная иедостагоч- noc'Tt. гот 1 мсс ло 1-2 лет)
Хроническая почеч- ная недостаточность (ХПН) Тубулоинтерстициаль- ный хронический нс- фрш । Перманентное нарушение функции почек, аютемня ацидоз. анемия, гиперген- гия Уремия Различные признаки каналь- цевых дисфункции проге ИНурИЯ KlIlbLIbtlCBOlO гнид. aincioT и снижение удельно- го веса мочи ХПН — синдром. обусло1е|енныи необратимым уменьшением числа и массы функционирующих нефронов, прогресс ирутопшй независимо от пер- вопричины н срок <и 2-3 лет до нескольких де- сятилетий Уремия: совокупносп. кяииико-дабораторных при таков термцнольной сталии ХПН Прогслшурня канллыгево1м типа: и моче иитко молекулярные белки и связи с повреждением нроксима1Ы1ых отделов почечных канальцев Азотемия — см выше
НсфротическиИ синд- ром Нигере ишылыгып це- фри г Гломерулосклероз Тяжелая протеинурия (более 3,5 г белка в суточной моче), гипопротеинемия, отеки, ni- перлинилемия Гипопротеинемия: резкое снижение содержания' белка в кропи Обшнн отск при отсутствии сер- дечной и г стигочности или цирроза печени увя- зывает на гипопротеинемию
быстронро) ресснрую- шпй i померз чоиефрит Гематурия и олтурия Гематурия см выше
Примечание. I инср1Н1Ншсми> ii.tpyiiieliitc жирового обмена. сопровождающееся увеличением сг., ержппня в
iLiaiue кропи общих iuiui.kih. холестерин.!. rpui шиерилои, |l- tuiioiiporeii.toii и up. Citiinn u jiiiiihbhom coeiaiie iujimu
(рлмшчной степени ныр;1Аеи1хн.ти) hiiCliku.hoicm к. к при ОПП гак и ХПН
В 41Ю1ОЧпоенных исследованиях. проведенных в мире за последние 10 лет. приводятся ло
катительства. что причиной поражения органов мочевой системы часто якзястся действие ток
епкантов вследствие лекарственной терапии, случайных иди преднамеренных ингоксикапнй.
производственного пли экологического фактора. Опсипгь количественно вклад каждой из ука
занных причин в общее число регистрируемых хронических и острых нефропатй пока невоз-
можно. Так. в литературе вообщается. что окаю 10% случаев терминальной сталии почечной
недостаточности вызваны химическими факторами нроизволегвеннен среды, ио подтвериить ли
результат достаточно трудно из-за возрастающего неблагоприятного влияния химических фак-
торов окружающей среды, различии в диагностических критериях и часто длительном л« тент ном
периоде между воздействием и проявлением болезни. Например, известно, что ю появлении
очевидно#! клинической картины может быть утрачена <| хнкния 2/3 нефронов обеих ночек.
Частота регистрируемых случаев ОПН около 2 на 1000 человек. Причиной примерно 2Q%
нефронАтий я1стяезея прием тскарственныч средств Например, увогрелтсние нснаркотических
лихтьгетиков и нестеропдпых противовоспалительных препаратов (НПВП) янтяется причиной
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 87
1/3 с.чу’гасв ХПН НПВП относятся к. наиболее часто употребляемым лекарственным средствам
и занимают одно из ведущих мест по количеству и гяжесш побочных зф4>ектов. Серьезной про
блемой. масштабы которой сини очевидными только в последнее время, является НПВП-шшу-
пированпая нефротоксичность. Вероятность развития ХПН возрастает в 2 раза при регулярном
приеме НПВП. в то время как прекращение приема способствует ноесганотыению функцио-
нальных возможностей. Главной причиной развития гемодинамических нарушений в почках
при приеме НПВП является блокада циклооксигеназы с последующим снижением синтеза про-
стагландина HGL и простациклина PG1,. Кроме того, прием НПВП (особенно индометацина)
стимулирует синтез эндотел и на-1 Это приводит к нарушению равновесия между действием ва-
зоконстрикторов н шт золила Тагоров, спа тму сосудов и развитию ишемии. Нарушение почечного
кровообращения вызывает ишемию корковой и мозговой юны и затекает каскад патологичес-
ких изменений, приводящих к нарушению функции и гибели почечных клеток. НПВП могут
оказывать и прямое токсическое воздействие на клетки почечных канальнев. вызывая гибель
клеток канальцевого эпителия. закупорку просвета канальнев продуктами распада клеток эпите-
лия и острый тубулярный некроз. Вследстиие повышения гидростатического давления в каналь-
цах реф .кторно снижается скорость клубочковой ф лырании. что клинически проявляется
ОПН 01IH — процесс обратимый. Нефрон отвечает на ишемическое и токсическое поражение
дифференциацией. пролиферацией и мш ранней сублсталыю пораженных клеток. Неповреж-
денные кишки компенсаторно 1инср1рофнруюгся. Процессы регенерации почек рсзулируюгся
эпидермальным (|kikto[x>m роста, ннсулпноподобным фактором и фактором роста гепатоцитов.
В табл. 2-16 приведены вещества. вызывающие ОПН и ХПН.
!аблмш1 2-16. Веществ:! вызывающие ОПН и ХПН
Металлы и их соединения* Органические раствори- тели, реактивы и техни- ческие жидкости* • Лекарственные препараты Вещества, относящиеся к другим группам
Бериллий Бензидин Антибиотики: цефалоспори- ны. аминоглико зилы. пени- циллины. тетрациклины и тщ. Арсин и другие соединения мышьяка (ем. гл. 8.5)
Висмут Бромобеп юл Антигипертензивные Кошрасгные вещества для радио! рафик
Золото 2-Бромоэтиламнп Метоксифлуран Малеиновая кислота
Кадмии Гсксахлоро-1,3-бута- лиен Мочегонные Наркотики различных групп (амфетамины, героин и др.) (ем. ы. 7.1)
Литий liioKcaii Нснаркотическис анальгети- ки и НПВП Оксид углерода (II) (см. гд. 8.3)
Мель Дихлороане! плен Днхлоролап. трихлоро- этилен Ннтрофурапы и их произ- водные Пестициды: бромомстаи. па- ракват н др (см. гл. 8.4)
Платина Метанол 11poi ивоону холевые cpe/ici ва (цисплатин) Природные токсины: ама- шпин. кангарндпн. рицин фалОНПНН и др. (см. гл. II)
Ртуть Стирол Прои зводные аистилсал и ви- довой КИСЛО!Ы Производные нитрозомоче- вины
Свинеп Толуол 1 lypoMiiiimi Силикон
Серебро Хлорофюрм С.табн тельные Тартраты
Та 1 мп! Ч еты рсххлористы й углерод Сул 1 фа 11 илам илы Фториды (см. гл. 8.6)
Хром JllHX-lOpi ILlpllH Фторхинолопы Оксалаты (см. гл. 8.6)
Уран Этиле)!МИКОЛЬ (( его нрон.жодные Эрготамин и сто производные
• См. |.|. 8.5.
” См. гл. 8.2.
88 Глава 2
Особую роль в опенке токсическою действия вещества nipaci индивиду» тышя восприимчи-
вость того или иною человека, г.е. генетическая основа дифференциальной реакции на хими-
ческие вещества. содержащиеся в лекарствах, пище и загрязнителях окружающей среды. По-
лучение достоверной ин<|юрмации о генетически предопределенном многообразии ферментов,
участвующих в метаболизме токсикантов, позволяет надежно оценивать токсический риск,
связанный с применением многих лекарств или других ксенобиотиков (ем. и. 3). Используя
высокоспецифнчные тесты генной диагностики, уже сегодня лаборатории многих стран Ев-
росоюза и США могут прогнозировать ответную реакцию определенного человека на дейс-
твие ряда нефротокенкапгон. В РФ фармакогенетика также начинает делать успехи. Однако
на практике пока часто используются разнообразные, но нсспепнфичныс тесты: определение
плотности и pH мочи, содержание сахара и крови в моче, опенка скорости гломерулярной
фильтрации ио концентрации креатинина и мочевины в крови, клиренса креатинина. инули-
на. меченных изотонами соединении, определенно состояния канальцевых функций, микро-
скопия мочи н др. Набл. 2-17).
Габины 2-17. Тесты, используемые ли оценки нсфроюкеи inociii
Тесты Показатели теста 11|»)мечаннс
Определение уровня креатинина (креатининовый тест) При снижении скорости гломе- рулярной фильтрации уровень креатинина в плазме крови воз- растает Проба положительна при спи женив скорости гломерулярной филыраиии более чем на 30-50% Зависимость содержание крегпн- нина — недостаточность фнль- граиин — нелинейна
Определение клиренса креати- нина. нпузпша. меченных изото- нам» ксснобношков Пробы положительны, если по- вреждено 50% и более паренхимы почек Нс используются для проведения рутинных нселет званий
Определение в моче относи- тельно высокомолекулярного протеина (например, альбумина) Появление белка в моче — нпи более чувствительный при итак токсическою 11ов|к*жлсння ночек Для puaiosiiaiMHini гломеруляр- ном НЗТОЛО1И11
Определение в моче низкомоле- кулярных протеинов (например, р.-микроглобулнна, рс1иналсвя- зываюшего белка) < подношение содержания в моче низко- и высскомолекулярных белков Для выявления повреждений проксимальных канальцев
Определение лизосомальной JJ-N аист илглюкозамгн шла зы Появление н моче почечных эн- IHMOI1 свидетельствует о иовреж ленив паренхимы органа Высокоактивный и ciaGu 1ьиын в моче тнзим с (одыной молеку- лярной массой иск. >чае1 воз- можность его 'зкстрареиа.1Ы1ого происхождения
Иммунологические нес л ело вапия (например, оирс слепне карбоашилразы. .'ltiihiiimxihho- нентплазы и лр) Наличие почечных антигенов в моче свидетельские! об оетром токсическом процессе в почках Токсическое повреждение по- чечной ткани сопровождается появлением в моче ее структур- ных компонентов, об талаюишх антигенными свопе 1вами
Необходимость диагностики субклпничсскнх форм почечной патологии химической лито-
логии повсеместно признается врачамн-токсикологами, экологами, профнатологами как ак-
туальная задача профилактики ОПН и ХИН. Дальнейшее развитие и широкое использование
новых технологии — метаболом нки и мезобономикн (см. ы. 3 н 6) сделает згу задачу выпол-
нимой.
2.4.5. Дерматотоксичность
Кожа образует внешний покров организма. К производным кожи относят полосы. поп и.
Потовые, сальные и молочные железы. Кожа состоит из 2 частей: эпителиальной и соедини-
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 89
телы|огкинной (дерма с сосочковым и сетчатым слоями». Гиподерма — подкожная жировая
основа — соединяет кожу с поатежашими частями организма.
Эпидермис — многослойный плоский орогонстшюншй эпителий. Клетки эпидермиса прохо-
дят полный жи итепный цикл с появления и т стволовых клеток ба зальною слоя, процессов де-
ления. роста, дифференцировки, постепенной кератиннэешпи. пере тнижения в вышележащие
слои, деструкции органелл и ядер, процессов превращения в ротовые чешуйки и их удаления
с поверхности кожи. На смену закончившим свои жизненный никл клеткам приходят новые.
Обновление клеточного состава эпидермиса происходит непрерывно.
В зависимости от толщины эпидермиса и количества его слоев различают «толстую» и «топ-
кую* кожу. В эпидермисе кожи различают 5 основных сдоев клеток, базальный шиповатый,
зернистым, блестящий п ротовой. Базальный с той, граничащий с дермой, выполняет функцию
росткового слоя Среди Вязальных эпител ионитов имеются стволовые клетки. за счет деления
которых обновляется эпидермис, н и слано ниты — пигментные отростчлтыс клетки невроген-
ною происхождения. В них при окислении аминокислоты тирозина пол влиянием ферментов
тирозина из и диокенфе1шла.1аптп1-оксила ты образуется меланин
Шиповатый слой представлен 5—10 слоями тесно расположенных эпптедионитов полиго-
нальной формы. В бгзалытом и шиповатом слоях содсрж* ся огрустчагые клетки — лендроци-
ты. или внхтриэтнт термальные макрофит тт (старое название — «клетки Лангерганса»), Отти, как
п Т-лимфоппты. мигрируют в эпидермис из дермы и образуют «местную» систему иммунного
надзора.
Зернистый стой состоит из 3—4 рядов уплощенных этппелпальны.х клеток. и цитоплазме
которых имеются рибосомы, митохондрии, лизосомы и их разновидность — кера гиносомы, со-
держащие зерна ксратотиалнна В этих клетках нпчинасюя процесс ороговения. Керагопктлнн
является предшественником ротового вещества кератина.
В следующем. блестящем, слое (3-4 слоя плоских клеток) уже выражены деструктивные
процессы ядер и органелл клеток. Этот слои эпителиоцитов пропитан веществом белковою
характера — элеилином. имеющим высокий коэффициент нрт. томления света.
Самый поверхностный, роговой. слой энндермнея состоит из ороговевших эпителиальных
клеток завершивших свой никл. Роговые чешуйки содержат мягкий кератин н нутыртки воздуха.
Керапит — серосодержащий белок, устойчивый к химическому воздействию Мягкое ороговение
в эпидермисе кожи проходит через промежуточные стадии образования кера т отпадина и элеидп-
на. в отличие от твердою ороговения (без промежуточных стадий), в волосах и иопях. Под вли-
янием некоторых внешних и внутренних факторов процессы ороговения усиливаются (дефицит
витамина А. длительное применение гидрокортизона, механическое воздействие и р.).
Дерма (собственно кожа) подразделяется на сосочковый и сетчатый слои, которые не имеют
между собой четкой границы. Толщина дермы составляет от 0.5 до 5 мм Сосочковый слои рас-
положен сразу под эпидермисом и представлен рыхлой волокнистой соединитетытой гканыо.
выполняющей трофическую функцию. Высокие сослзннпглытотканные сосочки (до 0.2 мм),
юаюшпсся в эпидермис, определяют рельеф кожного рисунка, неповторимого у каждого чело-
век». Здесь встречаются гладкие мышечные клетки, местами собранные в небольшие пучки, как
связанные, так и не связанные с корнем волоса. Сокртшсние последних при уменьшении при-
тока крови снижает теплоотдачу ортанитма. Сетчатый слой, обеспечивающий прочность кожи,
образован плотной псо<|юрмлсннон соединительной тканью с мощными пучками коллагеновых
и сетью лтастичсских волокон. В этом слое р зет изложены кровеносные сосуды, потовые и силь-
ные железы, нервные г кончания. к зрни нолос. Пучки коллагеновых волокон из сопатою стоя
дермы про толжатогся в стой но гкожнои клетчатки, ботатой жировой тканью. — гиподерму. Она
амортизирует гсиствие механических факторов на кожу, участвует и теплорегуляции кожи.
Ваюсы — это ороговевшие энитсли.тлытые нитевидные придатки кожи. Волос растет и сред-
нем со скоростью 1 1.2 см в месяц. Продолжительность жизни волоса от нескольких месяцев
до 2—4 лет. В течение жизни происходит тгерно тическая смена волос
Волосы служат источником информации о поступающих в организм токсикантах, поэтому
нх используют как субстрат (бионробу) при проведении химнко-юкспколоптчсското анализа
(см. гл. 5. 7. 8) Для получения надежных результатов исследования и нх правильной интерпре-
тации важно знать строение волоса Во юсы развиваются из эпидермиса. врастающего в дерму
в виде тяжей на 3-м месяце тмбриоген *за. Пере т рож гением пли сразу после него первые эм-
90 Глава Z
брнональные по. осы выпадают (за исключением области бровей, век и головы), заменяются
пушконнмп. Окончательные более грубые волосы появляются несколько позже. В ник различа-
ют стержень, находящийся на поверхности кожи, и корень, закапчивающийся расширением —
волосяной луковицей, расположенной в тонне кожи. Волосы состоят из мозговою. коркового
вещества и кутикулы. Мозговое вещество, расположенное в центре. — это частично орого-
вевшие клетки с вытянутыми уплотненными ядрами, мягким кера 1 ином, пузырьк ми газа и
пигментом Корковое вещество, прилегающее снаружи к мозговому, представлено плоскими
роговыми чешуйками с твердым кератином, пузырьками газа и пигментом. Кутикула волоса
расположена снаружи от коркового вещества, содержи! твердый кератин и не имеет пигмен-
та. Корень волоса заканчивается расширением - во. осяной луковинен. содержащей мелкие
эпителиальные клетки, способные к размножению. В волосяную луковицу вдается соедини
тетьиотк нныи волосяной сосочек с сосудами и нервами, оказывающими нервно-трофическое
влияние на волосяную луковицу Корень волоса окружен внутренним и наружным эпители-
альными атагалишамн и волосяной сумкой. Внутреннее эпителиальное корневое влагалище,
содержащее мягкий керапш. является проц людным волосяной луковицы и состоит из 3 слоев:
кутикулы, прилежащей к кутикуле корня волоса, внутреннего !ранулосодержашего и наруж-
ного эпителиального слоя. Наружное эпителиальное корневое клагалише образовано богаты-
ми 1ЛПКО1СНОМ клетками базального и шиповатого слоев эпидермиса. Волосяная сумка или
корневое дермальное втагалище волоса состоит из базальной мембраны, к которой снаружи
последовательно прилегает внутренний циркулярный слой соединигельногканпых волокон и
наружный — нролотьныи сдой волокон. В волосяную сумку вплетается мышца, поднимающая
волос, состоящая из гладких миоцитов и идущая в косом направлении к сальной железе.
Ногти, как и волосы, являются объектом исследования в химико-токсикологическом анали-
зе (см. гл. 5, 7). Ноготь — производное эпидермиса — располагается на ногтевом ложе, состо
ятем из эпителия и подлежащей соединительной ткани. Ногтевое ложе с боков и у основания
ограничено кожными складками — задним и двумя боковыми ногтевыми валиками. Ростковый
слой эпидермиса кожи валиков переходит в эпителий ногтевого ложа (пол попевая пластинка)
Роговой слой частично надвигается н.т основание нопя и образует надногтсвую пластинку
Между ногтевым ложем и ногтевыми валиками имеются задняя и две боковые ше.тн. Ногтевая
роговая пластинка, содержащая твердый кератин, своим»! краями и тастся в эти щели и подраз-
деляется на корень, тело и кран, выступающий за пределы ногтевого ложа. Участок эпителия
ногтевою ложа с размножающимися эпителиальными клетками, где расположен корень нопя.
называется ногтевой матрицей. В ней постоянно происходя! деление и ороговение клеток, не-
обходимое для роста ногтей. Образующиеся роговые чешуики смешаются в роговую ногтевую
пластинку, гак как происходит рост ногтя. Соединительная ткань ногтевой матрицы образует
сосочки, в коюрых лежат многочисленные кровеносные сосуды.
Железы кожи. Секреты потовых и сальных желез также являются важными объектам»! хи-
мико-токсикологическою анализа (см. гл 5. 7). Поверхность железистою эпителия ноговы.х
и сальных желез примерно в 600 раз превышает поверхность эпидермиса. Кожные железы
обеспечивают терморс!уляцию (20% тепла отдается организмом путем испарения пота), защиту
кожи от поврежде! ий (жировая смазка предохраняет кожу от высыхания и vaucpamtii водой и
влажным воздухом), выделение из организма нс коюрых продуктов обмена веществ (мочевина,
моченая кислота, аммиак и др.).
Потовые железы встречаются практически во всех участках кожи. Эго трубчатые неразветв-
ленныс железы, концевые отделы которых располагаются в сетчатом слое, а выводные протоки
проходят через оба слоя дермы, эпидермис и открываются на поверхности кожи потовыми но-
рами — штонорообразным»! щелями между эпителиоцитами. Потовые железы подразделяются
на эккриноиыс (мсрокриновые), распространенные по всему телу, и апокриновые, находя
шиеся в подмышечных впадинах, вокруг ануса, па бо!ьших половых губах. Секрет апокрино-
вых желез содержи! больше »зсществ белковой природы и имеет низкую активность щелочной
фосфатазы по сравнению с мсрокриновыми железами. Выделение секрета апокриновыми по-
товыми железами связано с действием половых гормонов. В среднем за сутки потовые же юзы
взрослого человека выделяют 500-600 мл (при определенных обстоятельствах до 2 и даже 10 л)
секрета — пота, содержащего 98% воды и 2% плотного остатка органических ( фодукты белко-
вого распада) и неорганических (хлорид натрия) веществ.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 91
Сальные железы — это альвео ттрине. связанные почти всегда с корнями волос разветв-
ленные железы. Секрет сальных желез (кожное сало) является жировой смазкой для волос и
лпцтермнеа За сутки сальные железы человека в илсляюг около 20 i кожного сала. Железы со-
стоят из выводных протоков и концевых секреторных отделов. В отличие от потовых, сальные
железы располагаются поверхностно — в пограничных отделах сосочковою и сетчатого слоев
термы. Концевые отделы образованы эпителиальными экзокринными клетками — ссбоцита-
ми. Вывозной проток железы состоит из многослойного эпителия и открывается в волосяную
воронку — углубление эпидермиса в месте перехода стержня волоса в его корень. Деятельность
сальных желез регулируется нервной н эндокринной системами. В кожном сале могут накап-
ливаться некоторые лиимпорастворимые токсиканты (например, марихуана), что даст возмож-
ность использовать нитожировые выделения кожи при проведении экспертизы (см. тл. 5. 7).
Кс жа выполняет ряд чрезвычайно важных физиологических функций, к которым относятся:
• зашита организма от небла оприятных внешних вохтсйсгвий. в том числе микробного:
• участие в иодтто-солевом. белковом, углеводном и жировом обмене;
• участие в тепловом обмене с внешней средой (К2сг тепловых потерь происходит через по-
верхность кожи):
• участие в процессе дыхания (за сутки выводится около 2% СО,. в 2 раза больше водяных
паров, чем через легкие, поглощается около I % всего вдыхаемого О,):
• участие в синтезе витамина D иол действием ульграфио теговых (УФ) лучей.
• тепониронанне крови (в сосудах кожи взрослого человека до I л крови).
Через кожу возможны введение лекарств (гранслермальиый путь) it воздействие токе и кап
тон. Вещества различной химической природы, вызывающие повреждение кожных покровов,
называются дсрматогоксикантами. а результат их воздействия — дерматотоксичностью.
Поражение кожи вследствие ее прямого контакта с иарообрззными, жидкими, твердыми ве-
ществами, сопровождающееся воспалительной реакцией, называется химическим дерматитом
(табл. 2-18).
Поражения кожи, возникающие как реакция на прием внутрь. вдыхание или парентераль-
ное введение веществ, являющихся аллергенами и одновременно обладающих токсическим
свойством, называются таксидермией. или токепиодермией (см. табл. 2-18).
1аблииа 2-18. Механизмы. мишени в эффекты воздействия дерматотокенкаитов
Механизм действия токсиканта Мишени токсиканта Эффект воздействия Клинические формы токсиканта поражения
Контактные химические дерматиты исаллсртичсскои природы (простой контактный дерматит)
А Прямое цитотоксичес- кое лейст вне: разрушение белков и липопротеинов эпидермального и дер- мальною слоев, наруше- ние процессов деления клеток базального слоя и созренаиня клеток эпидермиса, изменение кровоснабжения кожи Клетки эпителия, капилляры, нервные окончания Высвобождение ме- диаторов воспаления, транссужтштя плазмы в эпидермис, образова- ние везикул и пу тырей. деструкция и некроз ткани Эритематозная Буллезная или везику- лезная 1 (скрогическая (образо- вание струпа и н л.язв- ления)
Б. Прижигающее ейс- твис (химический ожог): вследствие нарушений физико-химических про- цессов (сдвиг pH) и/илн структурных изменений макромолекул (денатура- ция белка) Прямое повреждение эпидермиса
92 Глава 2
Окончиние таб i 2- /Л
A.Ltcpni*iecKiic дерматиты
A.i.iepi нческке релк
nun KiMexieinioro типа:
взаимодействие низно-
модекулярных веществ
с тканевыми белками,
образование niirtiiciui
(см. текст)
Тканевые бе зкн (сенек-
6ii.hi итор koi и актирует
с о| раничснным y»iaei-
ком кожи)
Пони шеи пая чмнснш
гелыккн. во ши кает по
всему кожному покрову
fliiici (нанки рл спитой
TOKJ (И ШИНН НКЛЮЧЛЯ
открытые участки кожи
Эршемаюзные. буклет-
ные. микроне шкеляр-
ные изменения
В ряде случиев нораже
НИС (JMI
Фо (одер маги гы (<|нп<ноксические к фотал«epiivieCKiie реакции)
Адлер) пческие реакции
(зме.иенною нша при
совместном действии У Ф
к пучения к гокенканга
Сопропожлае гея
нарушением порфирино-
вого оМмсиа и новыше-
нисм содержания порфи-
ринов
Iкансвые белки
Повышение чувстви-
тсл(.нос(и кожных
покровов к солнечным
лучам нол .lexci вием
фотосснсибиш шторок
’ >рн (смз
Буллезный лермигиг
на онсрыгыл у'иелка*
кожи
Токенлермпн
I ((нерершческая реакция
замедленного или немед-
ленною imia. а также их
комбинации п сочетании
с токсикозом
При син (роме хлоракне
пропело ни взаимолейс-
(вне токепкшна с Ah-
рсиентороы. усиление
жснрессии и (ктньаннн
сипглл(.ио(1 системы ре-
цептора л|нлермх(ьно(о
фактора клеточного роста
и дифференцировки, по-
вышение внек.пе10чного
домена <кидсрмх((|ЦО[о
фактора рост к крови и
уровня фак гора некроза
октанам
Гканспые белки
Керанменппя (она
волосяною фолликула и
nLiore.iii.Lii.iuje клетки
батального стоя саль-
ных желе)
Замещение сальных
желез кера г и новы ми
кнетамк. частичная тик
полная .профия желез и
формирование коме о-
нов. (ин утреи
Акисформныс высыпа-
ния (хлорикпе) па коже
лонж, половых opiaooB.
скины, плеч, жишпа.
Пятнистая и/илн ралли
тая зртсма
-)рк1ем.но iHu-бу мел-
кие. всшкуле шыс и
пус1улс(ные поражения
и лр.
Контактный дерматит Контактный дерматит может 6i.rn> обусловлен как иммунными, так
и неиммунными механизмами. В нервом случае (окорят об аллергическом контактном дерма-
тите. во второх) — о простом контактном лермшите. Контактный дерматит составляет |Огт
всех кожных болезней и более 9<)г6 профессиональных кожных боле (ней. Простой контшаный
лерчапп встречаемся гораздо чаше, чем аллергический. Контактный дерматит xioiyi шятвать
фототоксическне и <|юто4илергнческие реакции, при которых поражение кожи возникает нол
лсЛсчкием химического нсшества или гилергена и солнечных лучей
Простой контактный дерматит обусловлен прямым повреждением эпидермиса. Hi попрел
лепных клеток высвобождаются медиаторы воспаления и факторы хемотаксиса, вызывающие
расширение сосудов (эритема), выход жидкости к дерму и эпидермис (отек и волдырь) и кле-
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 93
точную ннфильтрапню. В пораженном участке сначала выявляется лимфоцитарная. затем —
нейтрофильная инфильтрация. Наблюдается внеклеточный и внутриклеточный отек эпидер-
миса. Простой контактный дерматит, вызванный однократным воздействием едкого вещества,
например сильной кислоты или щелочи. на кожу, называют .химическим ожогом. При хи-
мическом ожоге воспаление развивается в течение нескольких минут или часов. Более лег-
кая форма простого контактною дерматита возникает при многократном воздействии слабого
ра дражаюитето вещества, например моющего средства, и может проявиться через несколько
недель или месянен после первого контакта с этим веществом. Некоторые вещества могут вы-
зывать как простой, так и аллергический контактны т дерматит (i тбл. 2-19).
Энергический контактный дерматит обычно обусловлен аллергическими реакциями замед-
ленного пита, которые могут возникать при непосредственном контакте кожи с аллерюнамн.
Адлер!ическис реакции замедленного типа развиваются лишь на вещества с молекулярной
массой более 5000 Д. а неповрежденный роговой слой эпидермиса пропинаем только ня ве-
ществ. молекулярная масса которых пс превышает 500 Д. Поэтому, чтобы вызвать аллергичес-
кую реакцию замешенного тина, низкомолекулярные вещества должны связаться с тканевыми
белками и образован, антиген. Ею захватывают и перерабатывают внутриэпидермальные мак-
рофаги (клетки Лангерганса), а затем пре шавляю! Т-лимфоцитам. Активированные Т-лим-
фоциты и клетки Лангерганса вырабатывают интерфероны. интерлейкины I и 2. усиливающие
иммунный ответ и воспалительную реакцию. Активированные Т-лпмфоииты мшрируют по
лимфатическим сосудам в регионарные лимфатические узлы, в которых они проходят аптн-
гепзавнеимую пролиферацию и дифференцировку. Часть Т лимфоцитов принимает участие
в иммунном ответе, остальные превращаются в клетки нммунолотчсской памяти — Т-клет-
ки памяти. После первого контакта с аллсрюиом происходит накопление рае познаю! них его
Т-лимфоцитов. которое длится обычно 10-14 сут. После лоно Т-лнмфошны выходят из pci и
опарных лимфатических узлов в кровь и заселяю! вес периферические органы иммунной сис-
темы. При повторном контакте с аллергеном происходя! активация Т-клсток памяти и более
быстрое накопление клеток-эффекторов аллергической реакции замедленною типа — макро-
фагов и лимфоцитов CD4 и CDS.
Фототок гические и фотоаi гергические реакции. По на плене зу фототокснческис реакции
сходны с простым контактным, а фотоалзергнческне — с аллергическим копотным де-
рматитом. Однако для развития фототокснческнх и фотоаллергнческих реакций необходимо
действие УФ-излучения. Вещества, вызывающие фототоксическуто реакцию, под действием
УФ-излучения расщепляются с образованием токсичных продуктов, а вещества, вызывающие
фотоаллергическую реакцию, связываются с эндогенными белками-носителями. Фототокси-
чсскис и фотоал.тсргические реакции проявляются такими же гистологическими изменениями,
как простой и аллергический контактный дерматит. Вещества, чаще всего вызывающие фото-
токсические и фотоаллергнческнс реакции, приведены в табз. 2-19.
Основной механизм развития токсидермии аллергический, реже встречается токсичес-
кая реакция (например, на недоброкачественные продукты питания, препараты ртути,
мышька).
При токсидермии наблюдаются повышение активности 8-аминолевулиновой кислоты
и тирозиназы, образование реакционно-способного промежуточного соединения фермен-
та с порфириногспом. вызывающего порфирию, изменение обмена глюкокортикоидов,
повышение активности гормонов этой группы, сенсибилизация к их действию соответс-
твующих цитозольных и ядерных рецепторов тканей организма, избыточный синтез ке-
ратогналипа.
Причиной развития токсикодермии являются лекарственные препараты, продукты питания,
химические вещества (произволегневные и бытовые), обладающие аллергенными н/илн токси-
ческими свойствами (табл. 2-20). Они поступают в организм главным образом через пищевари-
тельный тракт и дыхательные пути. Лекарственные препараты могут быть введены внутривен-
но. внутримышечно, подкожно, внутривагиналызо. уретрально. ректально.
94 Глава 2
lao.uiua 2-19. ккснканты. вы шпаюпше контактный термины
ПРОСТОЙ КОИТакТНЫЙ
Сьцргический контактный дерматит
дерматит
Ароматические и непре-
дельные углсвотороды
Гидроксид аммония
Инршы
Кислоты
Мептлбромид
Оксиды азота и серы
Оксиды щелочных и ще-
лочноземельных MCI ILL IOB
Окислители (нермашаиат
калия, хрома! ы и днхрома-
1ы. пероксид водорода)
Цемент(комбинация сили-
ката кальция с различным
содержанием оксида алю-
миния. алюмината каль-
ция. оксида железа)
Фосфор
Фенол
Щелочи
Комплекс вешесяп. содержащихся н
_и|»чри1.1х маслах и различных час-
тях растении in семейств: сумахоных
(сумах ядоносны (I. сумах укореняю-
щийся. сумах лаковый). сл< жионвет-
ных (хризантема амброзия, пиретр м
девичий). первоцветных (первоцвет
, обршноконическпй). лилейных (тюль-
паны (луковицы)), .iiiciocitoc 1Ы1ЫХ
(мхи), сосновых (сосна и продукты
переработки. например канифоль),
соединения металюв: никеля. хрома,
кобальта. золота. ртути, химические
вещества, входящие в состав резины:
тиурамы, вещества, содержащие судтф-
гидридьную группу карбаматы и др.
Синтетические смолы: эпоксидные. по-
лиакриловые. фенолах рмальде! идные
Отвсртнгсли смол, вещества. исноль-
зуемые лтя вулкани зации резины
Консерванты: формальдегид. ква1ер-
ниум 15. имидаюлидииилмочевпна.
бензалкония хлорил. хноризогиа.зи-
нон, хлорксилснол. эфиры р-окси-
беиэойной кислоты
Вещества, используемые в производи-
те красителей. р-феиилендиамин.
лкрилии. ею производные и др.
(екарственныс epe icnnti ня местного
применения: бани Гранин, бензока-
ин, неомицин, новокаин, тиомсреил.
Фозотоксичсскне и фотоаллсрптчсс
кие реакции
Дегогь и его upon тнолиые
Бсрганлен, ксашомлш. фу року ма-
рины (псорален) и др. — комплекс
веществ, содержащихся в эфирных
маслах и различных частях растений
из семейств: зонтичных (сельдерей,
морковь, мята лимонная, укроп,
пастернак, фенхель, борщевик, дуд-
ник). рутовых (лайм, лимон, рута,
померанец), тутовых (инжир и др.),
сложноцветных (тысячелистник и
др.), других семейств (горчииа. зве-
робои. лапчатка псиная, лкпнк.
нсорался)
Ароматизаторы: мускус. 6-метнлку-
марни п др.
Лекарственные средства: битионол,
тало! епосодержашне сил и ци.та-
ннлиды. ексахлорофсн, грпзе-
оф 1ытнн. дихлорофен. НПВП.
сульфаниламиды. хлортиа зилы,
тетрациклины, (|)спотиа шны
Солнцезащитные средства бензо-
феноны. р-аминобензонная кисло-
та и ее эфиры
Красители: акридин бенгальский
розовы I родамин. ф.тюоресцеип.
эозин
контрацептивы и др.
Другие вещества: нтраиен. ашрахи-
нон. фенантрен, эпысилиамниа дн-
_________________ i iLipox-iopn i и др. _ ____
Таблица 2-20. Облитатныс и ((мкультативные юкенканты, вызывающие гокепке термшо
Облигатные токсиканты* Факультативные токсиканты** ‘ ‘
Дифенилы полихлорированные Лекарстпенные препараты:
анппшрин. салишиппы (аспирин), пенициллин, стрептомицин.
_________________________________сипIOMIHIHII. бнозншин. суйтфинимыилы и др._________________।
Дибснзодиоксины нолн.хлорнрован Соединения мышьяка
ные.______________________________I___________________________________________________________
Дибснзофураиы полихлорированные Соединении ртути
Иприты Соединения пьзлия
Тетрахлоразобензол. теграхлоразо- Соединения свинца
оксибензон
Хлорнафталены Сое цшения висмута
* Облигатные токсиканты — iwlilecrea. вы: ывакминс поражение кожи у всех тип. контактирукмппх с ними.
•• факудьташвныс токсиканты — вещества, вызывикпние поражение кожи у вше повышенной ин.шнилуальнои чувс-
1пшелы1оетью нозникающеи. как iipiinicio, ври лл>11едыюм koi пикте с веществом.
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 95
В 80-х годах XX века бито обнаружено, что среди полихлорированных ароматических угле-
водородов (см. гл. И)) наибольшей потенциальной акнегенной активностью обладает 2.3.7.Х-
геграхлоролибензо-и-тиоксии (ТХДД. диоксин). в то же время его изомеры (21 вещество) не
имеют этого свойства. Пейта- гекса и гепта-хлорпрованные дибензо-п-диоксины. так же как
и полихлорированные дибензофзраиы и дифенилы, хлорированные соединения азобензола и
азоксибеп зола. облазают нотенииатытой акнегенной активностью. 'Эти соединения, включая и
3.4-дих.’ ороаннлин. являются примесями (загрязнителями) гербицидов. Диоксины имеют чрез-
вычайно высоким аффинитет к АЬ-репсптору, члену семейства транскрипционных факторов в
HI II-PAS доменах. Взаимодействие диоксина с Ah-репептором и другими белками обеспечивает
лисрсгулягорное влияние на генную экспрессию и сигнальную трансдукцию. Высокий уровень
\h-peuernopoB обнаружен в эпителиальных клетках сальных желез, что. вероятно, играет роль
в формировании хлоракне: в эпителиальных клетках тимуса и обусловливает его атрофию при
воздействии ГХДД. а также в клетках нечет ш. лстких. лимфоцитах и ряде других к. сток. В голов-
ном мозге, мышцах и семенниках уровень Ай-реиеиторон незначителен. Диоксины, являясь ли-
гандом Ah-рецепторов, опосредуют через эти рецепторы активацию нрогенпкиназы С в клетках,
эндонуклеазы. тирозиназы в меланоцитах. а также индукцию ксапгниоксндазы и ксаитинде-
гидротеиазы. накопление порфиринов. продуцирование АФК, поддерживающих персистенцию
патологического процесса. Нарушения функций плазматических мембран приводят к метаплае-
тическому перерождению клеток (усиленный рост и пролиферация реализуются па фойе нару-
шенной генетической протраммы), генерализованной дисфункции клетки и ее гибели.
Схема формирования комедотм при хлоракне представлена па рис. 2 9
Рис. 2-9. С хсма нормального участки кожи (а) и пораженного хлоракне (б). I — волос: 2 — эпидермис: 3 —
проток еап.ной железы, 4 — фолликул; 5 — сальная железа: 6 — комедои.
Синдрсм хлоракне является специфическим, но нс всегда дозозависимым индикатором ос-
трой или хронической интоксикации диоксинами и лиоксиноподобнымн соединениями, ос-
новным проявлением которого является ^нормирование сальпо-роговой прооки (комедона) в
волосяном фолликуле. гипсрксратоза и гигтерптиментацип. Лечение хлоракне направлено на
использование средств, способных конкурировать с диоксином за место связывания е Ah-pe
цензорами, с обязательным применением антиоксидантов, атппгипоксантов. мсмбраностаби
лизаторов. а также средств и методов, усиливающих элиминацию токсиканта из организма.
2.5. ПОНЯТИЕ О СПОСОБАХ ДЕТОКСИКАЦИИ
•Все заболевания есть отравления, лечение — антидотная терапия», — кредо медицины
сре них веков. «Antidoldnum of Xieolaus» — первый аналог современной фармакопеи: в XVII
столетии «Antidota Specilia» — настольная книга европейского врача.
96 Глава 2
В настоящее время вместо господствующего в 5(>-х годах XX века антидотного принципа
лечения отравлений разработан комплексный метод эфферентной терапии и стимуляции естест-
венной детоксикации организма. В РФ пол рхково ictboxi акад РАМН Е..А. Лужникова сформн
рован алгоритм комплексной детоксикации с использованием физико-химической гемотерапии
как наиболее мошною способа стимуляции естественной детоксикации организма. Эго позво-
лило. используя выявленные ранее физиологические мех иными детоксикации. обеспечить се
управляемое! ь и п зо icirtK.ii.. Первичную ин«|юрмапию о причине, вызвавшей интоксикацию,
получают из клинического описания синдрома огр г пения. Например, аллергический синдром
характеризуется острым гаЫроэитергггом. контактным .Германном, раздражением г.шз. верхних
дыхательных путей и может быть вызван антибиотиками, химическими аллергенами н лр. При
поражении нейтральной нервной системы наб.иоаанмея осгртх* психопатическое состояние,
помрачение сознания, судороги, апоплексичсснй синдромом, кома что может быть обусловле-
но пост менпем наркотических всшеств. алкоголя. нервно-паралитических ядов, соединений
ртути, марганца, мышьяка. сероуглерода, тетраэтилсвинце и других гокепкатпов. На основании
клинико-фуикннонагьиого исследования головного мозга установлены in<|i<|iepcniui;iibiio-.Tiia-
гзгосгичсскне критерии и зменения электроэнцефалограммы пострадавших при острых отр тле-
ниях. Влечении токсического поражения центральной нервной системы особое место занимает
гипербарическая оксигенация. Синдромы поражения органов дыхания х бактеризуются асфик-
еиеп. бронхоспазмами, гипоксией, отеком легких, которые могут быть выгнаны воздействием
хлора, фтора, серы, оксидов азота, хрома, бериллия и трупгх токсикантов. Специфические п
иесиеннфпческне механизмы развития гипоксии вследствие поражения дыхательной системы
при острых отравлениях лежаг зз основе комплексе летокенклниониых и симптома г нческнх ме-
тодов лечения, включая гризногсмогерапню. При токсическом поражении серлечпо-сосу диетой
системы препаратами кардиотрон ног о действия наблютагогся первичный сгтепш|шческии и вто-
ричный несненифическпи карднотбкенческпй эффект. возникающий на фоне жютокеичсского
шока, недостаточность кровообращения, кол тане. Сушествугоишй в РФ алгоритм лечения ток-
сического поражения сердечно-сосудистой системы учитывает возрастные особенности взрос-
лых и етеи. Дифференцированный подход к этно- и патогенетическому лечению токсического
поражения печени и почек, включающему гемо- и лимфосорбцпю, гемо- и перитонеальный
диализ разработан па основе клннико-морфролог насекой классификации тепло- и нефроток-
сичности. обусловленной токсикантами различной природы. Для эндоскопической диагностики
и лечения химических ожогов пищевода и желудка используется да зерогерапня.
Московский центр острых отравлений НИИ ск >рои помощи нм. H.R Склифосовского за-
нимает в РФ гтнрутошее положение в развитии клинической токсикологии. В центре исполь-
зуют методы искусственной дстоксикаппи (МИД) и гемодиализ при отравлениях водораство-
римыми токсикантами. выведение широкого спектра токсичных веществ путем проведения
процедуры замещения крови, перитонеального лшиыгза. широко применяют метод гемосорб-
пии как новое направление в лечении острых отравлений. значительно упрошагошип и ускоря-
ющий очищение крови от ядов. Освоено сочетанное применение сорбционно-диализных МИД
и кишечново лаважа, способствующих значигсльномх сокращению токсикогенной сталии тя-
желых травлений. В связи е внедрением в практику комплексного метода детоксикационной
герлпин легальность на гиснигалытом этапе в РФ значительно снизилась.
Естественным является стремление ускорить выведение поступившего в организм токси-
канта. Специфическая киггнгогная) терапия острых отравлений япыется традиционным мето-
дом. применяемым гга догосгнпальном и госпитальном этанах. Антилотная терапия бывает эф-
фективной только в комплексе с другими методами лечения. Основным залогом позитивного
тенствня антидотов является их. ио возможности, раннее применение. Ан г илоты используют
то строгим показаниям только при наличии клинических признаков отравления тем токсич-
ным веществом, для ко орого предназначен вводимый антидот.
На догоспитальном лапе могут возникну!ь шгрулнения при диагностике отравлений. спе-
цифические признаки которых сразу не проятяются. д для тк твержленггя некоторых призна-
ков интоксикации треохюгся дополнительные методы исследования, например при решении
опроса о введении этанола при отравлении метанолом или этггтен1лггколем. Избирательное
нефротоксическое действие этиленгликоля и поражение зрительного нерпа метанолом как по-
казатели ii.LiiiMiiM ог। ктеипя этими ядами в пергзые часы не выражены, а проявления энцефа-
лопатии могут «згмсчагься и при других отрагсгеииях (дихлорэтан, высшие спирты), при кото-
рых этансм протнтшноктзан Если нет четких. нсо1!ро1зсржимых док гэзтгелг>спт приема метанола
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 97
или этиленгликоля. от введения этажи н сл< iyci воздержаться. Назначение yi шт пола при от-
равлении солями тяжелых металлов допускается по подозрению на ирном указанных выше
токсичных вешеств. Универсального аигнлота нс существует, однако активированный уп ль
и подиеорб МП обладают довольно широким спектром действия. Полисорб МП — неорга-
нический неселекгивный потифункниональный энтеросорбент на основе высокодисиерсного
кремнезема с размером частиц до 0.09 мм обладает выраженными сорбционными и детоксика-
ционными свойствами Наиболее эффективна свежеприготовленная водная взвесь препарата:
I г полнеорба образует нс менее 300 м; активно поглощающей поверхности при площади по-
верхности слизистой оболочки кишечника не более 200 mj.
Когда причина отравления остается неясной или показания для введения какого-то опре-
деленного антидота не выявлены, введение нескольких антидотов одномоментно в расчете н
эффект одного из них иелонусгимо. Антидотная терапия предусматривает использование ан-
тагонистов. которые конкурируют с токсичным веществом за место их действия и/или транс-
формируют токсичные вещества в мснсс опасные и/или быстро выводимые. Рис. 2-10—2-12
иллюстрируют применение некогорых антидотов.
Рис. 2-10. Схемы токсического дейс-
твия визнид-иона и его антидотов —
иитрия гипсу ьфата. DMAP- шмети-
Жмлнофенола. гидроксокобал а ми-
на (кобалина-11. или нсошнамсна)
(по tjillmann et al.. 2000).
Рис 2-11 Опр. зованис хелатов тги-
леилиамннте грауксусвой кислоты
(ЭДТА) с ионами свинпа. кадмия,
кобальта, ртути и других металлов
(но Lilli mann el а!.. 2000).
98 Глава 2
Димеркапол (п/м
Ofe-W-CHr-OH
in in
Ионы мышьяка,
ртути и золота
DMP8 ft
chj-w-chj-s-o*
in Г 8
р.р-Диметилцистаии
хелатирует ионы
Си»* и Ь»*
D-Пеницилламин
Растворение цисти-
новых отложений
Cyttetne-S-S-Cystatne
Рис. 2-12. Примеры ашилотов. ой
рапюшнх хе.i.iгы с токсикантами
(no Lilllmann el al., 2000).
Дммеркаптопрол
Характерно нки отдельных ipynn антидотов и примеры их использования приведены в табл.
2-21.
Таблица 2-21. Характерна икн отдельных ipynn антидоюв и примеры их использования
Группы и представитe.iH антидотных сретств Токсикант Примечание
1. Химические (токсикотронные) средства. Уиипюл 5% раствор Соединения тяжелых металлов и мышьяки (см. гл. 8.5). сердс ныс гликозиды, дихлоро зтан (см. гл. 8.2 В/м н.п) в/в Id xli 4 рам в сутки (суточная лом ИЮ-150 мг ни 1 к) массы)
ЭЛТ А. Ю ратнор Соединения снинна. кадмия, кобальта, ртути (см. гл. 8.5) В/в 20 м । в 5% рлспюре I .поко- ил 2 раза в сутки
llcHiamni 5Гг раствор Соединения свинца (см. гл. 8.5) В в 30 м.1 медленно
Пеницилламин (кумрснил) в кап- сулах или табле жах по 0.25 I Соединения свинца, меди, ртути, железа (см. гл. 8 5) До 2 г в сут ки
Дефе рокса мни (дссферал) Соединения железа (см гл 8 5) Капельно. 15 мг/(кт ч). в/м но 10 st) 10% раствора (максималь- ная лоза в сутки 80 mi /кт) через 3-12 ч
Каяьння хлорид 10% раствор Фториды, оксалаты (см гл. 8.6 и 8 7) В. н согласно ннструкнни
Натрия хлорид 0.9% раствор Натрия гнлрокарбонит 4% рас- тпо Бромиды (см гл. 8 6) Кислоты L В II COl.lilCHO IHlCipyKHini
1 1 Г1атнамипо11о.1иа.1К1С1фос<|юно- выс кислоты Соединения бериллия и храни (см. гл. 8.5) Более зффскшвны. чем ами ноалк1ыкарбоновые кислоты и
в меньшей степени влияют ни
выведение и » орта ни тма микро-
ме ментов
Классификация токсичных агентов и виды токсического действия 99
Продолжение math- 2 21
2. Срсдсим. влияющие на мсти би.пнм токсиканта: Рса ктт пип оры хол и i где тс ра ты (оксимы) ФОС — фос<|юрор| зничсскле соединения (см. гл. 8.4) Диннрокспм (1 мл 15% рас- твора). лнэгексим (5 мл 10%. раствора)
МсПШСИОВЫЙ СИНИЙ (МСТИЛСНО- вая синь) Угарный газ (см. выше и i.i 8.3). цианиды. серопотород (ем гл. 8.3) В/в 50—100 мл 1% полного рас- торг иди 1% раствора метиле- новою синего в 25% растворе глюкозы
Метиленовый синий при набора торно установленном сотержании в jpnrpoiniiax Г-6-ФДГн mctic- |Моглобин еазкзпзы (ем. гл. 2.4.3). Метт емо(. 1оби ноообря зова iv. i it (ем.гл.J 4.3. и 8.2.) В/в в щиых долах (0.1—0.15 мл 1SK раствора) из расчета 1—2 мт/ кг (приводит к восстановлению Mctllb в НЬ)
Амилнтрит (ампулы по 0.5 мл) Цианиды (см гл 8.3) 2 3 капли на кусочек марли (вдыхатъ)
Нитрит нагрия 1—2*₽ раствор Цианиды (см. гл 8.3) В/п 20 мл
Гндроксокобаламип 0.1% раствор Цианиды (см. из 8.3) В/в 5 мл 4 раза в сутки (доза может быть увеличена до 100 мл 1
Натрия тиосульфат 30%, раствор Цианиды, соединения мышьяка ртути, епипна. 6 тма В/и 30—50 мл 2 раза в сутки
Кислород Цианиды. угарный газ (см т.ч. 8.3)
Цитохром С 0.25% раствор Цианиды, та нын газ (см. гл. 8.3) В/п 20—40 мл 2 раза в с тки
Эганол Этнлс1пл11кои1ь. метана] (см. гл. 8.2) Вну грь - 30%. в/в — 5% (1—2 г на 1 кг массы в сутки )
Токоферол (витамин Е как анти- оксидант 30% раствор Чегыреххлориоый yi.icpi i. хло- рофо м, дих-то згаи (см гл. 8 2 В/м 2 мл 2 раза в сутки
Налорфнн 0.5% раствор Наркотические средства опия (морфин. промедол, кодеин) (см. гл. 7) Индивидуально
3. Симптоматические средства: Атропина сульфат 0.1% раствор Фосфорорганические инсектици- ды (см. га. 8.4) Сердечные гаикозилы Клофе лип I розерии Пилокарпин В/в или п/к
Физостигмин 0.1% раствор Амитриптилин, атропин. ДИМСДрОЛ Индивидуально и/или согласно инструкции
Витамин Вй 5% раствор Изониазид, фтивазид. (убазнд пиразин Индивидуально и/ити согласно инструкции
Протамина су ьфа! 1% раствор Гепарин Индивидуально И/ИЛИ согласно инструкции
4. Антитоксиниыс препараты: Прозивоботулпнпчеекяя сывортнка Противозмсиная сыворотка Лнпоевая кис юта Природные токсины (см. гл 11): Ботулинический токсин Яды змей Токсины бледной поганки Coi.iacno инструкции Согласно инструкции 20 30 мг/кг в сутки
5 Антидоты при отравлении бое- выми отравляющими пешее вами (БОВ): Аитициаи. афин. агропин, пслик- сцм. унитаз, Hiirpni нагрия и др. БОВ Подробно см : Лот зкин Н.А.. Курляндский Ь А Военная 1ОКСИКОЛ01ИЯ. — М Мединина. 2006 - 291 с.
100 Глава 2
Окончание fticifi t 2-21
6. Неспеиифичеекис сорбенты Утою* активированный Полисорб МП Лекарственные препараты Растительные ялы Фосфорорт аттические соединения И тр. 30—5т । г ннутрт. 1 г в вилс тпиесн в тюле
Характерные особенности течения отравления, механизмы формирования лтдоюкенкоза
в токсикогенной стадии острых отравлений. а также результаты к-шннко-токсиколотического
анализа ополотнческих сред являются основой для выбора метола течения и вещества (при
необходимости), используемого в качестве истоке и ют та.
Глава 3
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ
МОЛЕКУЛЯРНОЙ ТОКСИКОЛОГИИ:
ОТ ГЕНОМА К МЕТАБОЛОМУ
3.1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МИШЕНИ - РЕЦЕПТОРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ.
КЛАССИФИКАЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ ТОКСИЧНОСТИ.
РЕЦЕПТОРЫ, ФОРМИРУЮЩИЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ. РЕЦЕПТОРЫ,
СВЯЗАННЫЕ С G-ПРОТЕИНАМИ.
РЕЦЕПТОРЫ С ТИРОЗИНКИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Учение без размышления бесполезно,
но и размышление без учения опасно.
Конфуций
«Внешние факторы сами по себе не создают в организме специфических изменений.
Но последние возникнут с неизбежностью, когда внешний фактор найдет себе специфичес-
кое. т.е. адекватное, функциональное и морфологическое преломление. Этим именно путем
в организме возникли и закреплялись тс и.1И иные структуры и приспособительные устройс-
тва». — писал один из основоположников русской школы патологической анатомии академик
И.В. Давыдовский (1962). Органы гм — сложная динамическая полилигандная и полиметалли-
ческая система, для функционирования которой необходимо поддержание металлолиганино-
го гомеостаза (МЛГ) Токсиканты — химические факторы нарушения гомеостаза. Изменения
экспрессии генов далеко не всегда являются результатом непосредственного взаимодействия
токсикантов с ДНК. гораздо чаще это взаимодействие химических и физических агентов с бел-
ками. Модификации белков влияют на белковые сигнальные цепи и факторы транскрипции,
которые регулируют экспрессию генов. Внешние факторы, изменяющие белковые функции,
таким образом сказываются на экспрессии генов.
Современные гехнолоти дали возможность проводить одновременно анализ экспрессии
тысяч генов и облегчили изучение клеток как систем, в которых общая экспрессия всех генов
определяет состояние клетки. Конечно, часто предполагается, что изменения экспрессии топов
отражают в дальнейшем изменения и в нротсомах. Следует иметь в виду, что любой белковый
продукт одного гена может находиться в многообразных формах благодаря постмолнфика-
нионпым видоизменениям, существованию мутаиий и образованию испей. Таким образом,
проявления внезапных реакций могут наблюдаться только на уровне протеома. Генные иссле-
дования и протеомика комплиментарны в гом смысле, что гены определяют образование спе-
цифических протеинов. В I99S г. N.G Anderson писал: «ДНК — это на самом деле не нижняя
точка: любой современный учебник биологии объясняет, что протеины определяют активную
жизнь клетки, в га время как нуклеиновые кислоты представляю г собой только план этой ак-
тивности».
Новые технологии, в том числе нанотехнологии. способны произвести революцию и Ме-
динине, введя в нее новые методы диагностики и лечения, основанные на знании структуры
генома человека. Прек*кт «Генома человека» начат в 1990 г. Первая (черновая) версия после-
довательности нуклеотидов была закончена в 2000 г. (International Human Genome Sequencing
Consortium 2(MH Venter et al.. 2001). Конечная версия, которая больше не будет совершенство-
102 Глава 3
ваться (названная Build35) — закончена в 2004 г В результате проделанной работы вышло две
стятъи: Вснтсра в журнале «Science» и .1 знлера — лидера мировою сообщества — в журнале
Nature» (500 соавторов в 2 статьях!).
Число генов у человека 20—25 тысяч, что немного меньше, чем предсказывалось раньше (от
30 000 ло 40 000 генов). Последняя версия последовательности содержит 2.85 миллиардов пар
нуклеотидов с 341 брешью, г.е. в этих местах по каким-то причинам секвеи кровать геномную
ДНК не удалось. Аккуратность еиквеиса и конечной версии — I ошибка на 100 тысяч позиции
подряд. Erne точнее секвеиировагь весь геном уже никто не будет. Наиболее значимое научное
остнжсиие последних лет — эго картирование генома человека, в результате чего созданы
атлас последовательности нуклеотидов геномной ДНК человека (референтная последователь-
ность) и базы данных:
• о последовательности нуклеотидов транскрибируемых участков ДНК (EST database. EST —
Expressed Sequence Tags):
• о положении и содержании отличий (иолпме рфпзмов. т.е. нуклеотидных замен) других
известных 11оследова1е.1Ы1ос(си ДНК человека or референшой последовательности (SNE
database. SNP — Single Nucleotide Polymorphism)
Отдельный ген занимает конкретное место (локус) в пспочке ДНК в хромосоме и вешла
находится в хромосомах определенного липа. Гены представляют индивидуальные коды для
формирования белков в организме Первоначальная теория, что один ген отве1 пег за синтез
одного бе ка, была признана неверной. Один ген можем отвечать за синтез ряда белков или
через альтернативный сплайсинг*, или через носттрапслянионные модификации.
Расшифровка генома человека привела к возникновению ряда научных направлений прин
нипиалыю новою характера, подучивших собирательное название «пост геномные техноло-
гии» К постгеномным технологиям относятся: геномика, транскриптомнка протеомика и ме-
шболомика — совокупность технических и методических приемов изучения живых систем,
бионнформатика — средство обеспечения информационно-вычислительной поддержки иссле-
дований, нанобиотсхноло!ия — способ практического внедрения полученных результатов и
молекулярная биология как основополагающая наука о жизни.
Протеомика — направление молекулярной биологии, занимающееся сравнительным изуче-
нием клеточных протеомов (наборов белков данной клетки в данной фазе се развития в опре-
деленный момент времени), выросла из геномики. Протеомика изучает взаимодепствне белков
в живых организмах. Перед протеомикой стоит грандиозная задача — определить функцио-
нальную роль отдельных белков путем экспериментального сопоставления их качественного и
количественного состава в метке на разных стадиях и в разных состояниях ес развития, уста-
новить взаимосвязи между структурой бе лка и его функциями. По приблизительному полсчс1у.
количество возможных человеческих белков лежит между 1 и 100 млп. Протеины, конечно,
мшут взаимодействовать друг с другом, и чисто таких взаимодействий не поддается подсчету.
Протеом по аналопш с геномом (совокупность всех человеческих генов) - сумма всех проте-
иновых молекул, сформированных в клетке на определенный момент времени Геном «гово-
рит». какие процессы могут теоретически протекать внутри данной клетки, а прогсом. судя по
имеющимся протеинам, «подсказывает», что в самом деле происходит здесь и сейчас. Проте-
ины определяют активную жизнь клетки. в то время как нуклеиновые кислоты представляют
собой только план этой активности (рис. 3-1). Протеом — это «опись имущества» клетки по
состоянию на данную мину iy или моментальное фото, запечатлевшее одно из мгновений в се
жизни. Протеом постоянно меняется Ведь па состав белковых молекул влияют самые разные
факторы; выбор питательных веществ и приток кислорода, перенесенный стресс и принятые
лек. рсгна. Организм все время реагирует на состояние окружающей среды, пытаясь сохранить
физиологическое равновесие. Внешние факторы, наоборот, стремятся нарушить его. Эю свя-
зано е синтезом, преобразованием и разложением бе ikob. а реальную возможность протекания
таких процессов, их направление и скорость часто определяют ионы металлов.
• Сплиисши (сшивание. ершинванве) — ироиеес вырезания нитронов («ненужных» участков моэскулы РНК) и сра-
iiiiiKiiiiiH экзонов (участков ДНК, несущих информацию о строении белка) при образовании и-РНК. осуществляется
сиепнатю1ымя ферментами.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 103
Динамичная модификация белков — это не-
отъемлемый контрольный механизм в живых
системах. Различные эндогенные процессы,
такие как фосфорилирование ацетилирова-
ние. гликозилирование и убиквишлировапие
(конъюгация белка-мишени и белка убикви-
тина). регулируют многие белковые функ-
ции. взаимодействия и превращения белков.
Повреждающие факторы могуч mi пять на мо-
дификационный статус белков несколькими
путями (схема 3-1). Некоторые токсиканты
Геном ДНК 1 Что МОГЛО случиться
Транскрипция т мРНК I Что может случиться
Протеем V Белки Что встречвется
Рис. 3-1. Взаимосвязь геномики и протеомики
61 трансформируются в активные электрофн-
1Ы которые считаются причинами модифика-
ций. Другие токсиканты могут привести к формированию оксидантов и эндогенных элск-
трофи. ов. которые могут также модифицировать белки Электрофильные взаимодействия,
по-вилимому. играют существенную роль в механизмах токсичное и. Модификации эндо-
генных регуляторных быков весьма чувствительны к изменениям, вызванным факторами
окружающей среды.
Часто можно проследшь зависимость между изменениями нротсома и определенным пато-
логическим состоянием (см. гл. 6.4.4).
Отношение между геномикои и протеомикой — это сложное взаимодействие генов и бел-
ков. которое в конечном счете является молекулярной основой заболевания.
Для судебной токсикологии также важны генетические данные, чтобы адекватно интер-
претировать результаты экспертизы. Например, зная пути и скорость битрансформапни ксе-
нобиотика в opiaHiBMe. можно оценить связь между концентрацией вещества в крови и его
токсической дозой, степень нанесенного врет здоровью пострадавшего. Протеомный подход
предлагает новую технологию изучения действия факторов окружающей среды на белки клет-
ки (см (л. 3 3).
В 2006 г в 3 ведущих научных журналах «Nature». «Naiure Genetics» и «Genome Research»
были одновременно опубликованы результаты исследований 13 научных метров Велико-
британии и Америки, касающиеся генетических различий люден. Теперь ученые считают, что
вариабельность объясняется наличием у людей множества копий некоторых важных генов,
которые образуют человеческий геном. Согласно полученным данным, идентичность людей
может оказаться не 99.9%, а скорее 99%. и этою достаточно. чтобы объяснить множество ва-
ТОКСИКАНТ
♦ Ответ на воздействие
повреждающего фактора
Активные
метаболиты
Активные Эндогенные
оксиданты электрофилы
Регуляторные изменения
Фосфорилирование -------► МОДИФИЦИРОВАННЫЕ
Гликозилирование БЕЛКИ
Аце1илирование и др.
I
Биологические эффекты
Схема 3-1. Взаимосвязь между действием токсикантов к модификацией белков.
104 Глава 3
рнаиий в наших чертах. У „ас не две конин каждого гена — но oaiioii от каждого из родителей,
на самом деле некоторые наши гены умножились в несколько раз. Более того, эти «количества
множественных копий» различны у разных люден, и этим объясняются паши физические и
интеллектуальные отличия. Исслсловагелн предполагают, что вариации в количестве конин ге
нов — это здоровая норма, а потеря либо приобретение копий некоторых важных генов может
провоцировать многие заболевания. Пока трудно отвеппь на вопрос о возможном количестве
копий для одного гена. Например, в журнале «Science» (2006) сообщается, что ген MGC8902.
активность которого отмечена в отделах мозга, связанных с когнитивными функциями (вос-
приятие. хранение, передача информации), представлен в геноме человека в количестве 2I2
копий. Другой пример: в ре зультате полной расшифровки геномов 270 индивидов европейско-
го. азиатского и африканского происхождения удалось обнаружить у них значительные вариа-
ции в числе копий одних и iex же фрагментов ДНК
Фундаиента1ьиые свойства оноа/стемы: метаболизм, пластический и энергетический обмен,
регуляция и раздражимость, репродукция и изменчивость — взаимосвязаны. Токсиканты могут
оказывать повреждающее действие как па организм в целом, так и избирательно па отдельные
фундаментальные свойства системы. Чем выше токсичность ксенобиотика, гем значительнее
выражена избирательность действия.
Объект изучения и задачи анализа определяют выбор методов исследования в токсиколо-
тии. При изучении механизмов действия токсикантов широко используются как биохимичес-
кие. так и физико-химические методы исследования. Они характеризуют молекулярный уровень
взаимодействия токсикантов с рецепторами, ферментами биотрансформаиии. транспортерами
химических веществ, другими макромолекулами. Для определения клеточных повреждений ис-
пользуются разнообразные морфологические (цитогенетические, гисгофизиологичсские. тисто-
химпчсские и др.) методы. Исследование физиологических реакций или патологических про-
цессов на органном или организменном уровне осуществляется с помощью физиологических
методов, например оценка поведенческих тестов является интегральным показателем состояния
организма в целом.
Обычно выделяют следующие уровни организации бносисгем: молекулярный и молекулярных
систем, субклето1 ный. клеточный, органный, целостного организма, популяционный, биогео-
цегтологический. Мишенью для воздействия токсиканта может быгь.тюбая молекула организма.
Молекулярные системы изменяют свои свойснза под влиянием токсикангов, например система
злутатиона принимает непосредственное участие в процессах, связанных с поддержанием внут-
риклеточного гомеостаза. а при воздействии токсикантов играет ведущую роль как биохимичес-
кая система естественно!! иитоп|хнекции. В настоящее время установлена взаимосвязь между
выраженностью цитотоксического действия ксенобиотиков (судорожных ялов, психотропных
веществ. метгсмоглобинобрз|зо1за гелей летучих ялов. алкилирующих агентов, цитостатиков и
других) и тяжестью повреждения системы глутатиона, изменением концентрации восстанов-
ленного глутатиона, сульфгидрильных ipynn белков, малонового днальлршда. диеновых конъ-
югатов. снижением активности глутатионрелукгазы. глюкозо-6-фосфатлспзлрогсназы. глутати-
онпероксидазы, глутатион-8-трансфсразы. каталазы. Молекулярные комплексы, пени или сети.
с(]юрмпрованные из молекулярных систем, участвуют в синтезе и организации более сложных
субклеточных фрагментов, например ядра или митохондрий. Действие токсикантов иногда яв-
лясгея избирательным, и группы токсикангов определяют как цитоплазматические или лизосо
мальные яды. мембрано- и генотоксиканты и т.д. Функциональные или структурные наруше-
ния клеток ведут к развитию токсического повреждения во всем многоклеточном организме.
Различные органы имеют селективную чувствительность к определенным токсикантам, что
связано с эволюционным развитием отдельных систем организма. Токсическое повреждение
органа — это и нарушение целостности организма. С повышением сложности организации био-
системы формируются регуляторные системы, обеспечивающие межклеточное взаимодействие
в организме, например эндокринная система. Организмы объединяются в популяции, консор-
циумы. биогеоценозы взаимодействуют между собой и с окружающей средой. Каждая биоло-
гическая система характеризуется избирательноен.ю к определенным токсикантам Количество
токсичных веществ, способных оказывать повреждающее действие на организм человека, зна-
чительно больше, чем токсикангов. опасных для растений и одноклеточных организмов, но по
мере усложнения биосистемы возрастают и ее адаптационные возможности.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 105
В многоклеточном организме взаимодействие между клеткгмг происходит не только ме-
ханически. но и коммуникационно. Существуют многочисленные механизмы обмена инфо-
манией между клетками. Способность клеток воспринимать внешние сигналы определяется
рецепторами. Рецептор — любой структурный элемент живоп (биологической) системы, с ко-
торым вступает в химическое взаимодсн типе токсикант (Эрлих П.. 1913) Рецепторы имеют
один или несколько центров связывания сигнальных молекул и проявляют высокое сродство
к своим лигандам. Любая клетка, ткань, орган содержит огромное количество потенциальных
рецепторов различных типов, причем связывание лиганда, как эндогенного вещества, так и
ксенобиотика с рецептором данного типа является избирательным лишь в определенном диа-
пазоне концентр гний. Увеличение концентрации лиганда в биосистсмс приводит к расшире-
нию спектра типов рецепторов, с которыми он вступает во взаимодействие, следовательно, к
изменению его биологической активности.
Различные клетки живых организмов имеют характерный набор рецепторов в зависимости
от выполняемых этими клетками функции. Связываясь с рецептором, внеклеточные химичес-
кие посредники воздействуют на протекание в клегке-мишени физиологически важных про-
цессов. В одной н гой же клетке и даже в ее мембране могут быть более десяти разных типов
рецепторов. В настоящее время описаны сотни рецепторов для гормонов, нейромедиаторов,
простагландинов, вирусов, бактериальных токсинов бактерии и простейших организмов. На-
пример. связывание каждого гормона с рецептором — процесс, как правило, независимый
от состояния других рецепторов. В большинстве случаев рецепторы являются белками, гли-
копротеинами. гликолипидами или их фрагментами. Фрагмент молекулы, который химически
взаимодействует с лигандом, называют рецепторной областью
Для поддержания гомеостаза особое значение имссг взаимодействие эндогенных лигандов
с селективными рецепторами, обладающими наивысшим сродством к отдельным биорегулято-
рам Строение и свойства селективных рецепторов генетически кодз руются
Трансформация, преобразование генетического материала (генотипа) редко приводит к из-
менению рецептора на уровне структурно-функциональных особенностей организма (фено-
типа). К числу постоянных селективных рецепторов относятся рецепторы нейромедиаторов и
гормонов (токсиканты могут быть как агонистами, так и антагонистами эндогенных лигандов,
в результате изменяется определенная биологическая функция, находящаяся под конгролем
этих рецепторов), ферментов, транспортных протеинов. Токсиканты, взаимодействующие с
ферментами и транспортерами. могут быть ингибиторами или аллостерическими регуляторами.
Селективные рецепторы к конкретным лигандам — это рецепторы с изменяющейся структурой
(антитела и антигепсвязываюшие рецепторы Т-лимфонитов). которые формируются в клетках-
прс инее г пенниках вследствие индуцированной внешними воз действиями рекомбинации 2—
5 генов, контролирующих их синтез.
Структура и свойства комплексов рецепторно-лигандного взаимодействия зависят от при-
роды токсиканта, конформации рецептора, их содержания в биологической системе, а гакже
факторов среды (pH. ионной силы и т.д.: ем. гл. 2.2).
Структурный компонент биологической системы, взаимодействие которою с токсикантом
не приводит к формированию ответной реакции, определяют как «немой» рецептор.
Активный рецептор инициирует токсический процесс. В этом случае используют термин
•структура-мишснь». В токсикологии принято считать, что воздействие токсиканта выражено
тем сильнее, чем большее количество активных рецепторов (структур-мишеней) вступило во
взаимодействие с ним. а также чем большее значение имеют рецептор и повреждаемая биоло-
гическая система для поддержания МЛ Г.
Мишенями (рецензорами) для токсического воздействия могут быть:
• структурные элеменгы межклеточного пространства (например, связывание и инактивация
структурных элементов межклеточной жидкости и плазмы крови, приводящие к нарушению
осмотического давления, изменению pH);
• структурные элементы клеток организма (белки, нуклеиновые кислоты, липидные элемен-
ты мембран, селективные рецепторы эндогенных биорегуляторов):
• структурные элеменгы систем регуляции клеточной активности
Различают три больших класса рецепторов клеточной поверхности: рецепторы, содержащие
трансмембранный домен; рецепторы, содержащие 7 трансмембранных доменов; рецепторы.
106 Глава 3
содержащие 4 трансмембранных домена. Последний класс рецепторов служит регулятором
работы ионных каналов. В зависимости от механизма передачи сигнала рецепторы клеточ-
ной поверхности подразделяются на 4 класса: рецепторы, сопряженные с G-белками, которые
актпвпрхют или ингибируют специфические вторичные мессенджеры (через G-бедки также
осуществляется регуляция ионных каналов); рецепторы, регулирующие только ионные кана-
лы; рецепторы, ассоциированные с цитозольными гирозиновыми протеинкиназами: каталити-
ческие рсце 1торы. проявляющие ферментативную активность. Все перечисленные механизмы
в той или иной степени связаны с участием попов металлов — макро- и микроэлементов (см.
гл. 8.5.1).
Рецепторы. формирующие ионные каналы. состоят! з нескольких субъединиц, пронизывающих
всю толщу биологической мембраны, участвуют в перс гаче нервных импульсов в центральной
нервной системе и па периферии (рис. 3-2. Б). Одни субъединицы — »то рецепторная область,
другие после взаимодействия рецепторной области с лигандом изменяют свою конформацию
и участвуют в формировании ионного канала Наиболее известные каналообразуюшне рецеп-
торы: никотиичувствителы1ый рецептор пие-тилхолина (Н-холипорспспюр). ГАМКергпческий.
глинипсргический рецепторы. Ионные каналы имеют рецепторную область связывания высо-
котоксичпых ядов животного происхождения, таких, как тетродотоксин. сакситоксин, батра-
хотокенн (см. гл. 11). Сигнальные молекулы — первичные мессенджеры — пересекают плггзмо-
лемму несколькими путями, в том числе путем и зменения ионных каналов.
G-протеины расщепляют о анози и трифосфат (ГГФ) и поэтому называются также ГГФ-аза-
ми. К рецепторам. связанны.» с G-протеинами (регуляторными протеинами). относят мускарин-
чувствитсльныс .холинергические рецепторы (М-холинорспепторы). а- и р-алреиорсцспторы.
дофаминергические, серотонинергические, гнетами нсргичсскнс рецепторы, а также ряд близ-
ких рецепторных структур, различающихся особенностями связывания с липидной мембра-
ной, третичной структурой или конформацией (рис. 3-2. Л).
Стимулирующие G-нротенны активируют в ходе передачи сигнала алепилагпиклязу кле-
ток-эффекторов. а ингибиторные G-протеины угнетают этот энзим. Нол системой сш калькой
трансдукции (ССТ) принято понимать ансамбль взаимодействующих между собой макромо-
лекул. осуществляющий передачу сигналов ио пути, опосредованному G-белкамн. Таким об-
разом. уже само определение ССТ подразумевает наличие в ней как минимум трех молеку-
лярных уровней — уровня сигнального рецепторного белка, уровня си1Налыюго G-бслка и
уровня эффекторного белка (схема 3-2). Процесс передачи внеклеточного сигнала начинается
со связывания лит на со специфическим рецептором плазматической мембраны клетки. Воз-
бужденный рецептор воздействует каталитически на I ГФ-связываюишй белок (G-белок), ус-
коряя обмен связанного с ним ГДФ на ГГФ. В результате происходит яиссоппапия комплекса
а-. р- и у-субъсдиниц G-белка с образованием активированной а-субъслипины. нагруженной
ГГФ. Далее а-субъединина активирует эффекторный белок, который меняет внутриклеточную
концентрацию определенных малых молекул — вторичных посредников. что в свою очередь
приводит к различным клеточным ответам. Токсиканты могут модифицировать описанный
процесс па любом из этанов проведения сш нала, избирательно реагируя с рецепторами дан-
ного тина (например, диэгиламид лизергиновой кислоты — ЛСД. псилоцибин, мескалин. BZ
и т.д.). Вторичные мессенджеры — гормоны, нейромедиаторы и другие агонисты — способны
быстро активировать внутриклеточные процессы. Агонисты взаимодействуют с рецепторами
па наружной стороне клеточной мембраны. ддчес сигнал передается в клетку путем активации
синтеза так называемых вторичных посредников. Перечень вторичных .мессенджеров включает
сАМР (циклический аденозин-3'.5'-моиофосфат). cGMP (циклический гуанозин-3'.5'-мопо-
фосфат). фосфоинозитиды, ионы кальция и прогон (Н ). метаболиты ретиноевой и арахидо-
новой кислот, оксид азота (NO) и другие химические соединения биогенного происхождения.
В результате действия внутриклеточных посредников передачи сигналов включаются процес-
сы фосфорилирования белков, активации их ионами калыгия или другими факторами, что
приводит к ответу на клеточном уровне: секреции, сокращению, индукции различных генов,
пролиферации и др
ССТ опосредует также и внеклеточные сигналы радзичной химической природы или свето-
вые воздействия. Алгоритм действия ССТ постоянен, я резу ьтирующне ответы клеток весьма
разнообразны Отдельные молекулярные компоненты ССТ — рецепторы. G-белки и др. — изу-
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 107
Рис. 3-2. Примеры пзаимо гейсгвия вещество-рецептор.
К — G-бе.ток-опосрелованный рецептор; Б — лнгандзавнеимый ионный канал; В — лигандрегулнруемый
гермент; С — модель репепплн сгсроидных гормонов. Пояснение в тексте
108 Глава 3
S Внеклеточное
пространство
► G-белок Мембрана
________I_____________I___
Цитозоль Л
S - стимул; R - мембранный рецептор;
Е - эффектор фермент,
ионный канал и тд);
М - вторичный мессенджер.
Схема 3-2. Алгоритм действия ССТ.
чены в большом количестве вариантов и вмссче с гем
обнаруживают пос оянство обмен cipykTypno-функнио
иальной организации.
Рецепторы с тнротнкипазнои активностью — ло pe-
ncil юры к ипсу шну и гормону рос гл (рис. 3-2. В). Фос-
форилирование внутриклеточных белков (по молекуле
тирозина) — пусковом момент процессов активации
клетки При нзаимоленечнии с лигандом рецепторная
молекула частично погружается в клетку активируется
тирозинкиназная активность специальной субъединицы
рецептора либо энзима, тесно связанного с ним. Изби-
рательно действующие токсиканты неизвестны.
В М)-\ голах XX века была сформулирована новая
модель рецепции стероидных гормонов (Gorski.
включающая следующие положения
• рецепторы вне зависимости от присутствия гормопа-лнганла локализованы пренмутнеспзен-
по в клеточном ядре;
• распределение рецепторов между ядром и цитоплазмой представляет собой равновесный
про юсе со шачительным сдвигом равновесия в сторону ялернои фракции;
• про птость связывания рецепторов с я черными структурами увеличивается в присутствии
гормона-лиганда в результате образования гормон-реиеигорных комплексон.
Все гормональные рецепторы являются белками. способными некопалешпо связывать гор
мои. и делятся на две группы в зависимости от типа (липофильного или ги трофильною) свя-
зываемою гормона.
Липофильные гормоны (например, стероиды) леч ко проходя i через клеточную мембрану и
связываются с рецептором, как полагали ранее, локализованном либо в цитоплазме, либо в
ядре клетки. Сомасно современной модели рецепции стероидных гормонов, обнаружение ре-
цепторов в цитозоле в отсутствие гормона при проведении биохими icckhx экспериментов объ-
ясняется выходом непрочно связанных с ядром свободных рецепторов н растворимую фрак
иию клетки при гомогенизации ткани вереде с низкой ионной сплои. После взаимодействия с
гормоном рецепторы приобретают дополнительное сродство к ядерным акцепторным структу-
рам и уже нс зкстршируются из ядер растворами с низкой ионной силой, а выходят в раствор
только при высокой ионной силе среды. Таким образом, в свече современных пре тстагмеинн
так называемые цитозольные рецепторы следует рассматривать как легко экстрагируемые из
ядер в экспериментальных условиях свободные формы репен торов. Термином «ядерныс» сле-
дует обозначать рецепторы, которые гак прочно связаны с акцепторными структурами ядра,
что в процессе субклеточного фракционирования эта связь не разрушается
Гигрофильные гормоны, неспособные проникать внутрь клетки, связываются с рецептора-
ми на поверхности клезки. что обеспечивает запуск передачи сигнала внучрь клетки.
Независимо от локализации, рецепторы имеют ряд общих характеристик. Рецепторы об
лапают высоким сродством к соответствующему гормону, так что значительное связывание
происходит при .довольно низкой концентрации гормона, обычно нлблюзасмон в циркуляции.
Рецепторы обнаруживают высокую степень структурной специфичности: рецептор для опре-
деленного гормона будет связывать только этот гормон или близкородственное соединение.
Обычно сущее 1 вус г хорошая корреляция между сродством рецептора к гормональному аналогу
и биологической активностью этого аналога. Рецептор обладает тканевой специфичностью, и
значительное содержание рецептора обнаруживается только в ткани-мишени этого гормона.
Таким образом, тканевая и счруктурт я специфичность рецепторов обеспечивает то. что гор-
мон действует только в своей 1канн-мишсии.
Стероидные гормоны (рис. 3-2. Г) проникают сквозь плазматическую мембрану и соединя-
ются с ядерпыми рецепторами, которые стимулируют транскрипцию их генов-мишеней
Существует еше одна группа рецепторов. Эго рсцешоры. молекулярная масса которых со-
ставляет ока о 30 000—50 (МИ) Д. Они образую! мемсрецептирные сети на поверхности кастой.
например рецепторы к Fc-фр: гмепгу (fragment crystalline) антител (иммуноглобулинов). Об-
разование межрепспгорных сетей lg.E-Fc-pcneiiropoB происходит при связывании агнигена с
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 109
молекулами фиксированных на мембранах тучных клсюк антител. что приводи г к выбросу
гистамина из тучных клеток как основы анафилактических реакций. Из современных мето-
дов изучения локализации рецепторов токсикантов в тканях in vivo используется позитронно-
эмиссионная компьютерная томография.
Ионы кальция и ряда других металлов. например цинка, марганца, кобальта. как свидетельс-
твуют экспериментальные исследования, служат посредником важнейших клеточных реакций,
в том числе секреторных процессов и пролиферации. Изменение концентрации ионов каль-
ция в специализированных клетках приводит к множеству биологических эффектов на уровне
ортанов и тканей. Концентрация ионов катьция в межклеточной жидкости равна примерно
101 М. а в цитоплазме клеток — около 10 ' М. Это обусловлено быстрым выводом кальция из
клеток и поглощением его во внутриклеточных калышевых депо. Выявлено два типа передачи
енгихта посредством ионов кальция Первый из них осуществляется в элсктровозбудимых.
преимущественно нервных, клетках. В них деполяризация плазматической мембраны вызыва-
ет поглощение нервным окончанием кальция через потенциалзависимые кальциевые каналы,
что приводит к секреции нейромедиатора. Второй способ передачи сигнала посредством ионов
кальния осуществляется практически во всех тинах эукариотических клеток. При этом сиг-
нальная молекула связывается с рецептором на поверхности клетки. что приводит к синтезу
вторичных посредников, высвобождению попов кальция из внутриклеточных депо, активации
эффекторных ферменюв и запуску кальиийопосредованных внутриклеточных реакций. Теоре-
тически возможно несколько путей входа Са в клетки при гормональном воздействии — через
ионные каналы, посредством специфического переносчика, путем натрий-кальциевого обме-
на. а также с помощью энлоиитоза Последний процесс может выглядеть как происходящая
в обратном направлении секреция, которая запускается после высвобождения везикулярною
Са; в цитоплазму. В этом случае вход Са:* будет сопряжен с его выбросом из внутриклеточных
депо К настоящему времени твердо установлен канальный путь рецепторзапиенмого входа
Са Агонисты могут регулировать оба известных типа калышевых каналов — репепгорун-
равляемые и потснниалупраатяемыс. При этом воздействие на каналы может осуществляться
несколькими способами — через системы вторичных посредников, через G-белки и путем
прямого сопряжения рецепторов с каналами Рецепторы, их агонисты и антагонисты представ-
лены в табл 3.-1
3.2. МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И МЕЖКЛЕТОЧНОЙ
КОММУНИКАЦИИ. ТОКСИКАНТЫ И РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА
Кому неведомо всегдашнее несоответствие
между тем. что человек ищет и что находит?
Н Макиавелли
Из-за огромною числа потенциальных токсикантов и множества биологических структур
и процессов, которые они могут нарушать, сушествует большое количество путей реализации
токсического действия Обычно токсикант, доставленный к мишени, pc iipyei с ней. вызывая
клеточную дисфункцию. Иногда ксенобиотики не реагируют с конкретной мишенью, а небла-
гоприятно влияют на все биологическое окружение, вызывая дисфункции молекул, органелл,
клеток или органов.
Наиболее полная схема проявления токсичности включает несколько этапов (рис. 3-3).
Сначала токсикант доставляется к цели или целям (этап 1) и взаимодействуете эндогенными
молекулами-мишенями (этап 2а). вызывая изменения функций клетки и/или структур (этап 3),
которые запускают восстановительные механизмы на молекулярном, клеточном, и/или тка-
невом уровнях. Сила воздействия токсиканта может превышать способности механизмов ре-
парации или вызывать «неправильное срабатывание» этих процессов (этап 4). В этом случае
развиваются следующие процессы:
• некроз тканей;
• канцерогенез:
• фиброз;
Таблица 3-1. Рецепторы, их лопины и антагонисты
Рецептор н его местонахождение Хгоиист/Актнва I ор А» 1 агонисту И и । иби I пр
иашаниг местонахождение ветсстио эффект всшесгво эффект
I 2 3 4 5 6
Ацетилхолиновый цикоin H'lyHci ви- тальный рецептор Скелетная мус- кулатура Не |роны I lllKOrilll а-Анатоксип Цитизин Фибрилляции Парил ич Активация нейронов Тубокурарин Лофоюксин Бун («рот оксин а-Коброюксин a-KonoroKcuii р-Эрабугокснп Непрямое действие: Ботулотоксин 1’Ь3 * Общие анестетики Паришч Полатитеипе ней|Х)нгн>- ПОЙ 11КГИННОСП1
Г утаматный ре- цептор Нейроны ИНС N -мстил- D-ac партит Каина г Дом мп Хинолинат Непрямое действие: IICN Активация нейронов - конвульсии. повреждения нейронов (||СЙрОГОКСНЧНОСТ1>) Фенциклидин Кетам ни Общие анесте тики Подавление HeltpoiiiL'ib- ной актитнккти - ансс- те тия Зашита от нейротоксич- ности
ГАМК-рецептор Нейроны ННС Мусцимол Барбитураты Бензо.ша тснины Общие uiiecTciики Этанол Подавление активности — седагнииый эффект, общая анестезия, кома, нолниление жизненно важных петров Бнкукулин Пикротоксин 1 le 1 гл 1лс 11 тетразол Циклолиеновыс иисскти- ш ты Линлан 1 (енрямое деист вис: Нзоина пш Активация нейронов
Глициновый ре- цептор Нейроны L1IIC Двигательные нейроны Общие auecTCiHKH Подавление лвнгате и.пых нейронов-паралич Стрихнин Непрямое лейст вне Столбнячный юкенн Перевозбуждение твита- те.1Ы1ых нейронов — столбняк
110 Глава 3
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 111
П/мкктнетн: niuti.i.
<= Увеличение ЧСС Антидот при интоксика- ции опиоиламн Подавление нейрональ- ной активности - па- ралич Аиесте шя Аитиконву iciiRHoe дейс । nite 11 оли iuie и не i ie и poi iai ь- iioii актиипосш - nu- ралич Усиление нсй|мл»в.'1ьиои н мышечной ukthbhocih - KotiuyaiiCHH С Шим Увеличение сокр;пн- тельпой ешхтюшкти миокарда Повышенная возбудимое!ь нейронов гоем >р
Алиалоилы красавки Атроинтнюдобиыс ве- щее г IW IliWOKcon leipo ююксин р-Конотокснн Местные анестетики ЧЧ-нитоин Хинилин сп-Коиотоксии ГЬ ' 1. Апамнп (пчелппын яд) Дсплротоксин Гликозилы напсрс1янк11 Олеан трин Хлоряекоп (писек ннил, СОЗ)
"Г Уменьшение ЧСС и сокрп- тителыюй способности Подавлен и с нейрональной 41К111НИОСП1 — лшшгезия, но лишение дыхании, коне тикания, задержки мочи Актипшшя нейронов - кон- вульсии хозэгп aimcn^.-Hliio]] tlOlllHOHh и аонофрн кншлипху По1.1штение ак|нниости нейронов и миошпов
Непрямое действие ИнГИбНТОр ХО1И1ГК ТСр.1 И>1 Мо|Х|>И|| и опиоиды Аконитин Bep:iTpit>uiH Граянотоксин Ьатрахот оксин MaiuoioKCHH Лагро юки в «
Сердечная Mbtui- u:i Нейроны LIHC Нейроны внут- ренних органов 11еироиы Мышечные клетки Нейроны Мышечные клетки НсИ|ТОНЫ Мышечные клетки Во всех клегкаи
Ацетилхолиновый М мускариичувст- внтельпый рецеп- тор Опиоидный ре- цептор Потенциал- шви- сп.мыс Na‘-каналы lloieiinirxT-xiBH- симые Са-”-каналы Потенциал - зави- симые К‘-к:1пялы, ПК г и ни р>с мыс CV 1 =5 г:
Окончание mafri. J-1
Аист находи новые М рецепторы Гладкие мышцы Железы Непрямое лсйстиие: Иш иСмггор ХОЛИН ЗС тсразы Гладкомышечный спа>м А,1К|Ь'юнлы красавки Агропнпонодобныс пе- шее! ва Трнннкличсские аитн- аепрессан i ы Расслабление ГМК - расслабление Ж КТ Сухост ь во рту Сух течь кожи
Ане пыхоли новые М -рецепторы Нейроны ШК Оксотреморин (вещество, вызывав- шее страх - анксиогси) Непрямое действие: ИнгиГмиор холшгк- гераты Ак питания нейронов - кон- вульсии То же
а^Алренорсцен- торы ГМК сосулов 11 ор я пн к фр к । ( (норадреналин) Непрямое действие Кокаин Тирамин Амфетамин Трициклические ан- THiiciipeccainN Вазоконстрикция - ишемия, nuiepiciijiiH П ра юзн И Ашнлог при инюксика нии (^-адреномиметнкц- мн
5-Н Г -реиептор Гвыкис мышцы Алкдлоины спорыньи (аргогамнн. арпшо- вин) Вазоконстрикция — ишемия гипертензия Кетан зерни Антидот при отравлении цлк;ь'1О1ьюмн снорыньн
Р-Алренорснеи- итр Сердечная МЫШ- ИЙ Норзиннефрнн Непрямое действие: Кокаин Тирамин Ам(]>е1амнн Грнпикличсские ан- тидепрессанты Увеличение сократи*юсти и ВОзбу.'|ИМОС111 кар.|иомноци- топ Атенолол Метопролол Антидот при интоксика- ции (J,-алреноми мешка- ми
112 Глава 3
Обозначения ИНС — центральная иеринвя система; ЧСС — частота сердечных сокращении непрямое действие, например (вменение coicp-
А.1ННЯ нейротрансмиттеров’ СОЗ — стойкие органические ииряihhtvjh. I МК — i лалко^ышечные клетки сосудов
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 113
• нарушение регулянии апоптоза
Метаболи м токсикантов подробно обсужда-
ется в главе 4 и главах второй части книги.
Этап / — доставка от места воздействия к
мишени
Интенсивность токсического эффекта за-
висит от конценГранин и времени нахождения
конечного токсиканта вблизи мишени. Конеч-
ный токсикант — вещество, которое реагирует
с эндогенной молекулой-мишенью или крити-
чески повреждает биологическое окружение,
инициируя структурные н/или функциональные
нарушения. Конечным токсикантом могут быть
как исходное соединение, так и его метаболиты
(см. гл. 4). а также активные формы кислорода
(АФК), генерированные при биотрзнсформяиии
токсиканта или эндогенной молекулы.
Концентрация конечного токсиканта в ми-
шени зависит от относительной эффективности
процессов, которые увеличивают иди уменьшают
его концентрацию на нелевом участке (рис 3-4).
Транспорт — движение токсиканта из очага
поражения в структуру-мишень в активной фор-
ме — и накопление токсиканта в мишени об-
легчаются процессами абсорбции, диффузии к
мишени, реабсорбции и токсикации (метаболи-
ческой активации) Пресистемная хтимииация.
непосредственное выведение токсиканта из ми-
шени, экскреция и детоксикация противостоят
этим процессам, препятствуют накоплению ко-
нечною токсиканта в мишени (см. гл. 4).
Абсорбция против пресистемной элиминации
Абсорбция — это перемещение химических аген-
тов от О'Гага поражения в системный кровоток (см.
гл. 4).
Пресистемная элиминация. Удаление токси-
канта может прозеходить до проникновения в
системный кровоток. Это характерно для хи-
мических агентов, находящихся в желудочно-
кишечном тракте. Пресистемная лнмииация.
или зффект первого прохождения уменьшает
токсические эффекты ялов, распространяющих-
ся через кровь, но может вызвать повреждения
пищеваригелыюго тракта и печени, поскольку в
этих органах создается повышенная концентра-
ция токсикантов. Эфг|>ект первого прохождения
наблюдается также в легких (см. гл. 4).
Рис. 3-4. Транспорт токсиканта — этап I в развитии
токсического эффекта. Транспорт облегчается про-
цессами. перечисленными слева or стрелки, и тор-
мозится процессами, указанными справа от стрелки.
ЖКТ — желудочно-кишечный тракт. ПК — нуклеи-
новые кислоты: ВМС — высоком»I жулярныс соеди-
нения.
Токсикант
Рис 3-3. Этапы развития токсического эффекта
посте химического воздействия.
114 Глава 3
Диффузия « структуру-мишень и обратная диффузия Во время сталии распределения токси-
кашы in крови проникаюг во внеклеточное пространство и лостнппог мишени - макромоле-
кулы (как правило) на поверхности пли внутри клеток.
Механизмы, облегчающие проникновение в мишень. Коииетрання i окси катов вблизи ми-
шени может бьиь увеличена за счет нескольких факторов (см. гл. 4). например, пористость
капиллярного эндотелия. Эндотелиальные клетки в печеночных синусах и почечных около-
канальпевых капиллярах имеют крупные норы (диаметром 50—150 нм), sepei которые могут
проникать даже связанные с белком ксенобиотики. Эго способствует накоплению токсикантов
в печени и почках (см. гл. 2 и 4).
Специализированный транспорт через мембрану Специализированные ионные каналы и
мембранные транспортеры (см. гл. 4) могут способствовать проникновению токсикантов к
внутриклеточным мишеням. Na*. К'-АТФаш. потенциалзависимые кальциевые каналы, свя-
зывание с промежуточным переносчиком, эндонитоз н рециркуляция мембраны облегчают
iрапспорт токсикантов в определенные клетки — клетки мишени.
Накопление в клеточных органеллах Накопление токсиканта в лизосомах происходит
благодаря pH ловушке Это переход липофильных молекул (например, токсикант с ненрото-
нпрованной аминогрхпио11) через мембрану в кислую среду opiaiicvLi, где аминогруппа про-
тонируется и теряет липофильность, из-за чего молекула уже не может преодолеть мембра-
ну органеллы и перейти в клеточный матрикс. Митохондриальное накопление происходит
вследствие элек1рофореза Аминогруппа протонируетея в межмембрмнном пространстве, затем
ксенобиотик всасывается в матрикс сильным отрицательным потенциалом (—220 мВ), где он
может нарушить процессы р-окислення и окислительного фосфорилирования
Обратимое внутриклеточное связывание. Некоторые вещества, например органические н
неорганические катионы, полициклические ароматические углеводороды. накапливаются i
меланинсодержашнх клетках за счс! связывания с меланином.
Механизмы, препятствующие проникновению токсикантов к мишени. Распределение токси-
кантов в специфические области может затрудняться процессами, описанными ниже.
Связывание с белками плазмы. Чюбы из кровеносного русла проникнуть в клетки, боль-
шинство ксенобиотиков должно высвобождаться из комплекса с белками (ем. гл. 4). Прочное
связывание с белками плазмы пролон1ируст я|х|к*кгы и задерживает элиминацию токсикантов.
Специализированные б|рьеры. В капиллярах мозта мало пор и они очень мелкие, что предо
тврашаст проникновение гидрофильных соединений в мозг любыми путями, кроме активного
транспорта. Снерматогениые клетки окружены клетками Сертоли, которые плотно соединены,
формируя гематотести нальный барьер. Также ограничена проницаемость плаценты для ниро-
фильных соединений. Однако ни одни из этих барьеров неэффективен против липофильных
вешеств (см. гл. 4).
Распределение в депо. Некоторые вещее 1ва способны накапливаться в тканях (в своеобраз-
ных депо), где они не оказывают существенного вохтействия. Этот процесс снижает вероят-
ность и силу воздействия токсиканта на клетки-мишени (см. гл. 4)
Связывание с внутриклеточными белками Образование комплекса с некоторыми внутри-
клеточными веществами, например с металлотионеинамп. временно уменьшает концентрацию
токсиканта в мишени (см. гл. 4 и 8.5).
Удаление из клеток. Внутриклеточные токсиканты могут выделяться во внеклеточное про-
странство посредством АТФ-зависимою мембранного транспортера — гликопротеина Р и фак-
юра мулыилекарсгвенной ре л (с ген I пост и — белка MRP (см. и. 4)
Экскреция против реабсорбции Экскреция — удаление ксенобиотиков из крови и выделение
во внешнюю среду. Это — физический процесс, в то время как биотрансформаиия — хими-
ческий механизм удаления гокенканза (см. гл. 4). Путь и скорость экскреции в значительной
степени зависят от физико-химических свс спз токсиканта. Для высоколипофильпых соеди-
нений нс существует эффективных механизмов шнмннации Такие соединения, устойчивые
к бнотраисформапии, элиминируются очень медленно и имеют тенденцию к накоплению в
организме при повторном вохтействнн. Для элиминации таких соединении существуют три
неэффективных механизма: экскреция с грудным молоком, выделение с желчью и в просвет
кишечника из крови. Летучие соединения, такие как газы и 1етучне жидкости. диффундируют
из легочных капилляров в альвеолы и удаляются при выдохе (см. гл. 4).
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии, от генома к метаболому 115
Реабсорбция. Токсиканты, попавшие в почечные каналыты. могут проникать обратно че-
рез клетки стенок канальцев в околоканалытекые капилляры (см. гл. 2.4.4. и 4). Реабсорбция
пугем диффузии зависит от липофильности и обратно пропорциональна степени ионизации.
Токсиканты, попавшие в желудочно-кишечный тракт с желчью, желудочным и кишечным
соком, слюной, секретом поджелудочной железы, могут реабсорбироваться путем диффузии
через слизистую оболочку Реабсорбция соединений, выделенных в желчь, возможна, если они
достаточно липофильны или превращены в более жирорастворимые формы в просвете кишеч-
ника (см. гл. 4).
Гоксикация ipomue детоксикации. Ьиотрлнсформация токсикатгтов в более ядовитые про-
дукты называется токсикацнсй, или метаболической активацией (см. гл. 4). Иногда вещества
путем биотрансформации приобретают реактивность и структурные признаки, позволяющие
более эффективно взаимодействовать со специфическими рецепторами или ферментами Од-
нако значительно чаще токенкаиня изменяет эндо- и ксенобиотики так. что они приобретают
способность взаимодействовать с функциональными группами мо «скул различных эндогенных
соединений и превращать их в электрофилы: свободные радикалы (химические агенты с не-
спаренными электронами и высокой активностью, такие как супероксид-анион радикал О",
гидроксил-ралткал НО ): нуклеофилы: рсдокс-акливныс частицы.
детоксикация. Детоксикацией называют биотрннсформаиию. в холе которой обезврежива-
ется основной токсикант или предотвращается его образование. I и II фаза биотрансформаиии
подробно обсуждаются в главе 4. В ряде случаев детоксикация может конкурировать с токси-
канней. Детоксикация ксенобиотиков, не содержащих функциональные группы, как правило,
происходит в две фазы. Сначала в молекулу внедряется функциональная группа, например
гидроксил или карбоксил (I фаза), а ззтем к этой группе с помощью трансферазы присо-
единяется эндогенная кислота, например глюкуроновая, серная или аминокислота (II фаза).
За некоторыми исключениями конечные прочукты неактивны, высокогидрофт i тыты и легко
экскретируются. Детоксикация токсикантов-нуклеофилов в большинстве случаев осуществля-
ется путем ко1п>югаиии по нуклеофильным функциональным группам (II фаза биотрзнсфор-
мании). Детоксикация токсикантов-электрофилов обычно включает в себя конъюгацию с нук-
еофилом глутатионом (II фаза биотрансформаиии). Эта реакция может идти спонтанно или
индуцироваться глугатнон-$-трзисфсразой.
Детоксикация свободных радикалов — это прежде всего элиминация суперокснд-анион-ра-
дикала ОТ который может превращаться в тораздо более активные частицы (рис. 3-5)
В первом случае превращение О, в НгО2 идет спонтанно или катализируется SOD. Гомоли-
тический распад пероксида водорода до гидроксид радикала НО' и гидроксид-иона ОН на-
зывается реакцией Фентона и катализируется ионами металлов. Образование гидрокенд-ра-
HKLia обуслоативает чрезвычайно высокую токсичность ксенобиотиков, генерирующих О'.
Во втором случае О^ бзрно реагирует с оксидом азола 'NO. который сип тезируется NO-син-
(ONOOj*
onooco;
NO О, О,
2H* f Fe<ll>- Си(*)- Мп("). Cr(v)- N't”)
Реакция Фентона
, Speflll), Cu(ll), Mn(III), Cr(VI), Ni(lll)
HOOH
Pec. 3-5. Два пути токсического действия супероксид-анион-раднкала Oj через нередикальные продукты
ONOO и Н.О.) и р.1лнкалы ( NO.. СО', и НО'). Пояснение в тексте.
116 Глава 3
газон (NOS), образуя нероксннитрит (ONOO"). Спонтанная реакция нероксиннтрит-иона с
оксидом углерода) IV) приводит к образованию нпгрозоперокси-карбонага (ONOOCO, ). ко-
торын гомолитически распадается до ’NO. — радикала оксин азота (IV) и карбонат-анион-
радикала СО/ . Три ироду Kia (СО,' , НО'. НО-) являются окислителями. NO, — еше и
нитрирующий агент.
Нс существует ферментов, элиминирующих ПО . единственной эффект явной зашитом яв-
ляется предотвращение образования НО' путем трансформации сто предшественника перок-
сида водорода (Н,О.) в воду. Супсроксиддисмутазы (СОЛ, SOD), содержащиеся в иитозоле
(Cu-SOD, Zn-SOD) и митохондриях (Mn-SOD). превращают О,' в Н,О2. которьп затем вос-
станавливается до воды цитозольной глутатионпероксилазой или пероксисомной каталазой
(рис. 3-6)
Пероксинитрит ион (ONOO) не является свободно радикальным окислителем и более ста-
билен. чем НО . Глутатион пероксидаза способна восстанавливать ONOO до нитрита (ONO ).
Кроме того, O.NOO реагирует с оксигемоглобином, гемсо держащими перокелдчзамн и альбу-
мином. Эти реакции важны дня элиминации ONOO Предо!вращение синтеза ONOO воз-
можно путем удаления двух его предшественников (прекурсоров): 'NO — за счет его взаимо-
депеншя с гемоглобином и О; — с супероксиддисмутазой.
Пероксилазогенерированные свобо тыс ра. и калы р. зрушаются путем переноса электронов
с глутатиона. Это сопровождается окислением глутатиона, который регенерируется NADPH
зависимой глутатионредуктазой (рис. 3-7). Таким образом, глутатион играет важную роль в
детоксикации и электрофилов, и свободных радикалов (см. гл. 4).
В детоксикации природных токсинов — ядов животного и растительного происхождения (с.м.
гл. II) — участвуют вне- и внутриклеточные нрогеазы Например, при действии фосфолипазы
происходит Boccrai онление дисульфидной группы эрабутоксина и теряется его активность.
Рис. 3-6. Детоксикация супероксид-аниои-радикая» О; супероксиддисмутазой (SOD), путатионперокси-
лазой (GPO) и каталазой (CAT).
Рис 3-7. Детоксикация исроксцдазогеперировшшых свободных радикалов. например хлорнромазиновогс
свободного радикал (CPZ ") глутатионом (GSH). Побочными продуктами являются гнит-раднкал (GS'J
и глутатионднеу 1ьфнд (GSSG). который регенерируется глутатионредуктазой (GR). Хлорпромазин (ами-
назин) — нейролептик из группы фено i пази ион (см. гл 7) (по Cregus Z.. Klaassen С.. 2003).
Некоторые аспекть молекулярной токсикологии от генома к метаболому 117
Е< и токсикант инактивирует детоксицирующие ферменты, то детоксикация неэффектив-
на. образуются его токсичные метаболи 1Ы. активно идет процесс токсикации.
Этап 2 — взаимодействие конечного токсиканта с молеку юи-мишенью
Обычно токсичность обусловлена реакцией конечного токсиканта с молекулой-мишенью
(см рис. 3-3. этап 2а). Фактически все эндогенные соединения — потенциальные цели для
токсикантов. Наиболее распространенные и токсикологически значимые цели — нуклеиновые
кислоты (особенно ДНК), белки и мембраны клеток. Первой целью для активных метаболитов
часто становится фермент. учас1вующи1 в их синтезе, и внутриклеточные структуры. Коваленг-
ное связывание е белками, не вызывающее нарушения функций структур может быть видом
детоксикации, оберегающим токсикологически значимые пели
Типы реакций
Конечный токсикант может связыв.пься с молекулами-мишенями ковалентно и некова-
.теитно, можс1 повреждать их за счет отщепления ионов водорода и путем перераспределения
хтектронов (см. гл. 2.2)
Нсковаленгное связывание — образование водородных и ионных связей типичны для ток-
сикантов, взаимодействующих с мембранными и внутриклеточными рецепторами, ионными
каналами и некоторыми ферментами. Нековалентное связывание обычно обратимо из-за срав-
нительно низкой энергии связи. Будучи фактически необратимым, ковалентное связывание
полностью повреждает эндогенные молекулы. Образование ковалентного аддукта характерно
ня хзектрофильных токсикантов, реагирующих с нуклеофильными атомами в биологичес-
ких макромолекулах (белках и нуклеиновых кислотах). Свободные радикалы типа НО'. NO;
и С1,С’ могут ковалентно связываться с макромолекулами или отщеплять атомы водорода
от эндогенных соединений, превращая их в радикалы. В результате лих превращений часто
образуются карбонильные соединения, формирующие поперечные сшивки с ДПК или белка-
ми Химические агенты способны участвовать в реакциях окисления-восстановления, обра-
зуя токсичные продукты. Например, окисление токсикантами Ес(П) до Ec(l11) в гемоглобине
вызывает метгемоглобинемию (см. гл. 2.4.3). Природные токсины специфически действуют на
белки-мишени. Например, токсин дифгерии блокирует функцию фактора элонгации 2 в син-
тезе белка, а токсин холеры активизирует G-белок.
Итак, действие большинства конечных токсикантов на эндогенные молекулы зависит от их
реакционной способности, а пути превращения могут значительно различаться.
Нарушение функций и разрушение молекул-мишеней. Некоторые токсиканты активируют мо-
лекулы-мишени. Однако чаще химические агенты ингибируют функции молекул-мишеней,
блокируя рецепторы, ионные каналы или ферменты. Функция белка нарушается при измене-
нии его конформации. Последняя существенно меняется при взаимодействии с токсикантом.
Многие белки содержат субъединицы. которые обеспечивают их активность или способность
соединяться в макромолекулярные комплексы. Ковалентное связывание и/нли окисление
таких субьединин ксе> обиотиками может привести к нарушениям передачи сигнала, энер-
гетического обеспечения клеток и метаболического гомеостаза. Токсиканты могут нарушать
матричную функцию ДНК. Ковхтентное связывание химических агентов с ДНК (образова-
ние аддуктов) вызывает ошибки при репликации. Кроме образования аддуктов, токсиканты
изменяют первичную структуру эндогенных молекул поперечным сшиванием или фрагмен-
тацией. Сшивки изменяют пространственную подвижность и функциональность молекул.
Другие молеку 1Ы-мишени восприимчивы к спонтанной деградации после химической атаки.
Свободные радикалы типа Cl СОО' и НО могут инициировать псроксидное разрушение ли-
пидов путем отщепления от них протонов. Это приводи! к лс|радации липидов в клеточных
мембранах и образованию свободных радикалов жирных кислот и электрофилов, нарушаю-
щих структуру ДНК. Ковалентное связывание токсикантов или их метаболитов с белками
может приводить к образованию антигенов и развитию иммунного ответа. Некоторые хи-
мические агенты (дииитрохлорбензол. пенициллин, соединения никеля) могут спонтанно
связываться с белками. Другие могут получить такую способ тоегь вследствие автоокнелепня
до хинонов (например, аллергены сумаха укореняющегося) или энзиматической биотранс-
форманин.
Некоторые ксенобиотики вызывают токсическую реакцию, не воздействуя на молекулы-
мишени. но изменяя pH среды: нарушая структуру клеточных мембран и приводя к нечезно-
118 Глава 3
пению разносш ионных концентраций; конкурируя с эндогенными молекулами за физиоло-
гически важное пространство.
Этин 3 — клеточная дисфункция и последствия токсичности
Взаимодействие с молекулой-мишенью может нривояшь к нарушению функций клегки —
этап 3 в развитии токсического эффекта (рис. З-S). Каждая клетка в многоклеточном орга-
низме участвует в определенных процессах, контролируемых соогнс)сзиук>шнми системами
организма. Одни программы обеспечивают клеточное деление. дифференцирование и апоптоз,
другие — управляют функциональной деятельностью дифференцированных клеток. Регулиро-
вание рнботы клегки осуществляется с помощью С ГС (см. выше), которая может быть амини-
рована и инактивирована внешними сигнальными молекулами.
Первичная клеточная дисфункция, вызванная токсикаиюм. — нс обязательно окончатель-
ный результат, все зависит от функции молекулы-мишени (см. рис. 3-8). Если молекула-ми-
шень участвует в клеточной регуляции (передаче сигналов). прежде всего происходит днерс-
гуляция экспрессии генов и/или дисрауляпия выполняемой клеткой функции. Однако если
молекула-мишень вовлечена в процессы клеточного жизнеобеспечения, ее повреждение может
привести к гибели клетки Воздействие токсиканта на внутриклеточные структуры, обеспечи-
вающие выполнение внешних функций клетки, может изменить активность других клеток.
Нарушение регумшии к. точных функции. Деятельность клеток регулируется сигнальными
молекулами, которые активируют определенные клеточные рецепторы. Последние передаю)
сигнал регуляторным областям генов и/или функциональным белкам. Таким образом, актива-
ция рецешора можег привести к изменению экспрессии гена и/или химической модификации
определенных белков (обычно путем фосфорилирования). Программы. управляющие жизнью
клеток, прежде всего затрагивают экспрессию генов. Программы, контролирующие функции
Рис. 3-8. Этап 3 в развитии токсического эф<| иаа гаруигение регуляции и гомеостаза клеток.
Некоторые аспекты молекулярной токсиколо ии: от генома к метаболому 119
К.КТОК влияют на деятельность функциональных белков; однако один сигнал часто вызывает
оба ответа из-за переходов и взаимосвязи сетей передачи сигналов.
Дисрегуляция генной экспрессии происходит при возлей гтвин на структуры, принимающие
участие в транскрипции, передаче сигналов, синтезе, хранении или выделении экстрацеллю-
лярных сигнальных веществ.
Нарушение регуляции транскрипции. Транскрипция, представляющая собой передачу генети-
ческом информации от ДНК к мРНК. управляется взаимодействием факторов транскрипции
(TFs) и премоторных участков гена. Токсиканты moivt нарушать этот процесс. Обычно пов-
реждаются I Fs. в связывании и активации которых участвуют природные соединения, напри-
мер гормоны и витамины. Биогенный или чужеродный лиганд может оказывать токсический
эффект в двух случаях — при воздействии в больших дозах и/или в определенные периоды
онтогенеза. .Трутне вещества, взаимодействующие с TFs. могут нарушать дифференцировку
клеток <а счет усиления экспрессии различных генов.
Нарушение процессов передачи сигнала. Экстрацеллюлярные сигнальные молекулы (факто-
ры роста, цитокины. гормоны и нейротрансмиттеры) могут в конечном счете активировать
TFs. воздействуя на мембранные рецепторы и/или внутриклеточную систему передачи сигнала.
На рис. 3-9 показаны такая система и активированные TFs, контролирующие транскрипцию
гена, ответственного за клеточный ни ют. Примером может служить кодируемый с-тус протоон-
когеном с Мус-белок — фактор транскрипции, который способен как активировать, так и реп-
рессировать транскрипцию генов. с-Мус-белок после димеризации с Мах-бслко.м и связывания
комплекса с определенно i нуклеотидной последовательностью. активирует гены циклпнов D и
Е. Последние в свою очередь ускоряют деление клетки, активируя цнклинзависимые киназы.
Синтезированные при этом сигнальные молекулы ускоряют клеточную пролиферацию. Сипни
от мембранных рецепторов до TFs перелается последовательным взаимодействием белок-бе-
лок н изменением конформации белка при фосфорилировании. т.е. сигнальная молекула вы-
зывает фосфорилирование бетка например мнгогенактивируемон киназы (MARK), которая в
свою очередь фосфорилируе) и активирует другой белок. Например, лиганды к мембранным
рецепторам фактора роста (см рис. 3-9. объект 6) запускают процесс аутофосфорнлнровапия
этих рецепторов. Затем уже фосфорилированные рецепторы перелают сигнал на Ras (G-бе-
лок). Активный Ras инициирует каскад MARK, затекая последовательное фосфорилирование
белков киназами и передавая сипит на TFs Передаточные молекулы обычно, но нс всегда ак-
тивируются фосфорилированием (катализируется киназами) и инактивируются дефосфорили-
рованисм (катализируется фосфатазами). Химические arci ты могут нарушать (прекращать или
изврашаш) передачу сигнала путем повреждения структур, участвующих в фосфорилировании
(например. G белков), и в конечном счете влиять на клеточный цикл.
В центре рис. 3-9 показан путь передачи сигнала от рецепторов факторов роста эпидермаль-
ною — FG1 (6). которые действую! на тирозинкнназные рецепторы. Промежуточные белки —
She. Grb2, SOS — не показаны. Эти белки превращают ГДФ-связанный Ras (G-белок, неак-
тивный) в активную П'Ф-форму. Последняя аминирует MAR-киназный каскад (Raf. MARKK.
MARK). On cocioiii из грех иротепнкиназ. Протеинкнназы — ферменты. способные катализи-
ровать реакцию присоединения фосфата к остатку сернна. треонина или тирозина в молекуле
белка, обра уя фосфорилированную форму белка. При этом меняется конформация молекулы
белка, белок активируется или инпгбируется. По-видимому, фосфорилирование — это один из
главных способов регуляции внутриклеточных процессов, и в первую очередь ретуляшш про-
цессов считывания генетической информации (по разным оценкам, существует oi 2000 до 10 000
разных протеннкиназ). 11оследняя стадия изображенного на рис. 3-9 MAR-каскада — образование
активной киназы, называемой MAR-киназой (MARK). 'Этот фермент фосфорилирует и тем
самым меняет активность нескольких белков-мишеней. MARK становится активной киназой
только после тою, как к ней будет присоединен фосфаз Для гою чтобы активировать MARK,
в клетке существует другая (специализированная) киназа, которая умеет фосфорилировать
только MARK— это киназа MARK (MARKK). Исходно этот фермент неактивен, как и MARK,
и в свою очередь тоже активируется присоединением фосфата. Для этою в клетке существует
еше одна протеннкиназ» — Raf ( киназа киназы MAR-киназы). Она исходно тоже неактивна,
но ее ак1ивирует Rus. получивший сигнал извне и проходящий через цепочку внутриклеточной
сигнализации, связанную со вторичными мессенджерами.
120 Глава 3
© © ©
EGF PGFJe TSH
NGF АТ FSH
PDGF 5 НТ LH
9
Мембраны*
рецепторы
ТСГц
+ Р STAU Рк*
РТР
Блок
клеточного
Продолжение клеточного цикла. МИТОЗ
всл
цикла.
АПОПТОЗ
---►DAG+IP
РИА
FBI
Тромби
LPA
Рис. 3-9. Пути пере та in сигнала от мембранных рецепторов к ядсриым факторам транскрипции генов,
нонлечепных в peiyinuiio меточного цикла (К1аа<жеп С., 2003). Звездочкой отмечены активированные
сишалом ялерныс факторы транскрипции. Химические агенты: .As — арсенит; C.ALY — кали кулин А:
FA — жирные кислоты. ГВ) — фумонизин В; MC-LR — микронисти I-LR; ОКА — окалзевая кислота:
MMS — мети 1мстаносулы|)аг, РМА — форб за мирнстш-анетап ROS — активные формы кислорода:
SHR — SH-активные агенты: STAU — стауроспорин. Цифрами от I др 9 обозначены мембранные рецеп-
торы: кружками обозначены G-белки, овалами — киназы, прямоугольниками — факторы транскрипции,
волнистыми линиями — гены, ромбами — иншбиторы (например, фосфатазы — РТР и РР2А). инги-
бирующие белки GAP и IkB. Стрелками обозначен синтез вторичных м:сссн1жсров (например. DAG.
1Р. сАМР, CaJ3 и стимулирующее воздействие, линии, заканч! ваюшнсся короткой поперечной чертой,
обо тачают ингибирование. Фосфорилирование и дефосфорилз рова те обозначены как +Р и —Р соот-
ветственно (но Cregus Z., Klaa sen С., 2003). Пояснение в тексте.
П.-6
PRL TNFa
ЕРО
KOS
-Р
STAI3 |
I ХЯсВ |
UMS
МС4Ж
ОКА
. CAL Y
Фосфорилированная MARK переходит в ядро и фосфорилирует факторы транскрипции,
таким образом позволяя им связаться со специфическими последовательностями промотора
Между bci ми сигнальными системами существует взаимосвязь. Для передачи митогенного
сигнала ог рецепторов 4, 5. 7 используется тот же путь передачи— рецептор F.GF (6) — MARK
Например, рецептор 4 передает сигнал через 0. у-субьсдиннцы G белка и тирозинкиназу Src:
интсгриновый рецептор 5 — его лигандами являются компоненты внеклеточного матрнксг
ЕСМ — скорее всего передает сигнал через G-белок Rho (не показан) и киназу местной адге-
зии (FAK). G-белок — интегрированный рецептор 7 — катализирует синтез вторичных мессен-
джеров через фосфолипазу С (PLC) и приводит к активации протеинкшгазы С (РКС). Мито-
генный сигнал, переданный через рецептор EGF (6). — MARK может быть усилен, например
Ral-кат ынзируемым фосфорилированием белка IkB. который отщепляет транскрипционный
cj ктор NF-kB от ингибирующего белка.
NF-kB — транскрипционный фактор — может активироваться АФК. введением в клетку
фенобарбитала или пролнфераторов пероксисом. Активация происходит опосредованно чере
Ras-Raf-MARKK-MARK сигнальный путь.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 121
Рецептор росювых факторов — белка фак юра роста трансформирующею 0 (транс<|юрми-
руюшего ростового фактора |3) — TGF-(J (9) активирует путем фосфорилирования цитоплазма-
тические медиаторы белки Smad Smad — группа родственных внуфнклсточиых белков, перс
дающих сигнал в ядро oj сверхсемейсгва TGF-p Smad блокирует клеточный цикл. прерывая
путь передачи сигнала MARK-катализпрусмым фосфорилированием Smad митогенный сигнал
можно усилить (рис 3-9).
Митогенный сигнал появляется также при активации прогеннкиназ РКС. СаМК. MARK)
ионами кальция. Некоторые ксенобиотики способны блокировать проведение сигнала. Часть
из них может стимулировать пролиферацию (активация митогенных протсинкиназ. например
РКС инактивация фосфатаз РТР. РР2А. инактивация GAP IkB). Другая часть, например ин-
гибиторы РКС. препятствуют митозу и вызывают апоптоз.
Эта схема упрощена. Фактически все компоненты системы передачи сигналов (например.
G-белков. РКС. MARK) присутствуют в многочисленных, функционально различных формах,
характерных только для определенных клеток Надо помнить что системы, участвующие в
регуляции экспрессии генов, определяют не только жизненный цикл клеток, по также управ-
ляют некоторыми процессами клеточной деятельности. Например. NF-kB стимулирует синтез
белков острой фазы (БОФ)
Химически измененная передача сигнала с пролиферативным эффектом. Ксенобиотики. об-
легчающие фос<|юрилироиаиис элементов цепи передачи сигнала, часто провоцируют усиле-
ние клеточного деления и формирование опухоли Эфиры (|юрбола и фумонизин В активи-
руют протеи и киназу С (ИКС. РКС). подражая дианилглицеролу (ДАГ. DAG) — одному из
физиологических активаторов РКС (см. рис. 3-9). Ионы двухвалентного свинца имитируют
действие другого физноло!ичсского активатора РКС — Са1*. Активированная РКС передает
сигнал далее, запуская киназный каскад и в конпе концов позволяя факторам транскрипции
связаться с участками ДНК. Протеинкиназы могут также активироваться поврежденными
белками. Усиление фосфорилирования белков может быть результатом сниженной актив-
ности фосфа газ. Вероятно, ингибирование фосфатаз является основным механизмом дейс-
твия некоторых химических агентов. Оно происходит и при ультрафиолетовом облучении
Растворимая фосфатаза 2А (РР2А). по-вилимому. отвечает за инактивацию М XRK РР2А де-
Жфорилнрует митозннициируюшую протеинкиназу. Существуют и другие ингибирующие
с<рмснты. например ингибиторный белок IkB. гомодонтный струкг рпому белку аикнрину.
связывается с NF-кВ и предотвращает его проникновение в ядро (блокирование функции
фактора транскрипции).
NF-kB (NF-kappaB) является уникальным средн транскрипционных регуляторных белков.
Он играет роль внутриклеточного медиатора большого количества внешних воздействий в
некоторых типах клеток. Этот цитоплазма тческий фактор транскрипции уникален тем. что
может активироваться большим числом внутриклеточных путей, индуцируемых воспалитель-
ными цитокинами, окисленными липидами, факторами, присутствующими в атероматозных
блшисах. и запускать быструю активацию множества генов. NF-kB — важнып интегрирующий
вктрумент клетки Комбинаторное использование его разных субъединиц приводит к воз-
можности дифференциальной регуляции множества генов с различными функциями в разных
л ма клеюк в разное время. Все эти белки работают в клетке как ДНК-связывзющие транс-
крипционные факторы, активность которых регулируется в значи1ельной степени па уровне
локхлизайми в клетке. MARK Moiyi регулировать транскрипцию, фосфорилируя пнгибиюры
факторов транскрипции В случае NF-kB как раз и осуществляется подобная регуляция. \F-kB
ххшится в цитоплазме в виде KOMivieKca с одним из членов семейства шпибиторных белкон
I-кВ и удсрживае|ся в цитоплазме этим ингибитором за счет белок-белковых взаимодействий
Рать ингибитора состоит в том. что он маскирует сигнал ядерной локализации фактора. Инги-
битор фосфорилирован. но при получении сигнала он фосфорилируется интенсивнее и затем
деградирует. Неизвестно, какие именно из киназ осуществи яют фосфорилирование в ответ на
«.веточные сигналы. Положение осложняется тем. что есть несколько родственных ннгибн
о - и. возможно, разные ингибиторы фосфорилируются разными киназнми. Но как бы там
«м было, фактор NF-kB освобождается и направляется в ядро, где взаимодействует со спснн-
«есимми последовательностями в регуляторных участках генов и активирует транскрипцию
х деленных групп генов
122 Глава 3
Vf'-кВ является важным фактором пролиферации и передачи сигналов пролиферации при
воспалении и реакциях остр и фазы. lkH-дсградаиия и NF-кВ-активания также могут быть
вызваны кислородным голоданием.
Химически нарушенная передача сигнала с антипролифератинным эффектом. Паление интен-
сивности сигнала пролиферации (последовательность, ингибирование Raf белков — уменьшение
лс1раяацни IkB — угнетение процесса связывания NF кВ с ДПК — снижение интенсивности
синтеза белка с-Мус мРНК). возникающего после повреждения клеток, ставит пол угрозу про-
цесс регенерации (рис. 3-9). Нарушение регуляции митогенного сигнала — путь к апоптозу.
Нарушение регуляции синтеза внеклеточных сигнальных веществ. Гормоны передней доли
гипофиза активируют деление и пролиферацию клеток в эндокринных железах. Снижение
уровня секреции гормонов гипофиза приводи! к развитию дегенеративных процессов в пери-
ферических железах и апоптозу.
Нарушение регуляции клеточной активности. Токсиканты могут изменять функции специа-
лизированных клеток путем нарушения любого этапа передачи сигнала.
Нарушение регуляции процессов передачи сигналов в электрически активных клетках. Многие
ксенобиотики влияют на деятельность нейронов, клеток скелетной и сердечной мускулатуры.
Не ротранемнттеры (нейромедиаторы) — химические соединения, которые служат средством
передачи информации от нейрона к другим клеткам: другому нейрону, мышечной клетке,
клетке железы или другим вилам клеток, ( одержание информации, передаваемой неиротране-
мипером. различно. Это может быть управляющая информация. информация о состоянии
обьекта управления, информация о результатах управления. Ike вилы информации необхо-
димы для структурно-функниональнои организации элементов субклеточных систем, клеток,
тканей, органов, систем органов. Химические агенты, влияющие па процессы передачи нервно-
мышечного импульса, представлены в табл. 3-1. Токсикашы могуч изменять концентрацию
нс! ротрансмиттеров. нарушать функции рецепторов, повреждать процессы внутриклеточной
передачи сигналов. Некоторые вещества способны изменять содержание нейротрансмиттеров
в синапсах, вмешиваясь в процессы н.х синтеза, хранения, экскреции и элиминации. Токси-
канты возле Ист ви ют на рецепторы как агонисты (всшества. имитирующие действие нейро-
трансмиттера). антагонисты (вещества, препятствующие активации рецепторов), активаторы
или ингибиторы (последние два вида воздействуют на участки рецептора, удаленные от зоны
связывания с лигандом). Агонисты и активаторы подражают физиологическому действию эн-
догенных шинглов. a антагонисты блокируют его. Многие вещества изменяю) нейрональную
и/или мышечную активность зя счет воздействия на процессы передачи сигнала. Некоторые
токсиканты способны активировать (инактивировать) потенциалзависимые натриевые каналы
(см. табл. 3-1).
Сигнал в клетке формируется за счет изменения тока юн ионов: удаление их посредством
ионных канатов или транспортеров приводит к терминации сигнала. Ишибированис ионных
каналов и транспортеров может продлевать эт|и]>екты вешеств. Токсиканты могут нарушать
процесс терминации сигнала.
Многие изученные механизмы регуляции реализуются и в слабовозбулимых клетках (экзо-
кринных железах, клетках Купера. |Тклетках пои желудочной железы). Повреждение механиз-
мов регуляции в таких клетках мало влияет па функции органов.
Повреждение процессов внутриклеточного жизнеобеспечения: механизмы токсической клеточ-
ной смерти. Для выживания все клетки должны сип тезировать эндогенные молекулы, собирать
макромолекулярные комплексы, мембраны и клеточные органеллы, похчерживать постоянство
внутренней среды. производил, энергию. Агенты, повреждающие эти процессы, ставят под угрозу
само существование клетки. Существуют 3 механизма инициирования клеточной смерти — ис-
тощение запасов АТФ. устойчивое повышение концентрации ионов кальция и избыточная
продукция АФК (ROS1.
Истощение запасов АТФ. АТФ играет нейтральную роль в жизнеобеспечении клетки, ис-
пользуется и как субстрат для биосинтеза, и как главный источник энергии. АТФ необходим
для синтеза нуклеиновых кислот, процесса мышечных сокращении. энергетического обеспе-
чения и деления клеток. А1Ф осуществляет деятельность ионных транспортеров. Химическая
энергия высвобождается при гидролизе АТФ до АДФ или АМФ. АДФ рефосфорилируется в
митохондриях АТФ-сннгетазой.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии от генома к метаболому 123
Многие гоксикангы нарушают этот процесс, называемый окислительным фосфорилиро-
ванием (табл. 3-2). Вещества класса А вмешиваются в процесс транспорта ионов волорола
по иепи передачи электронов. Вешествз класса Б блокируют псрстачу электронов к атомам
кислорода. Класс В — ингибиторы транспорта кислорода к последнему в цепи переносчику
хтектронои — иитохромоксидазе. Класс Г — ингибиторы АТФ-спнгстазы. ключевою фсрмсн-
а окислительного фосфорилирования. Синтез АТФ может ингибироваться в случае прямого
ингибирования АТФ-сингетазы. нарушения доставки неорганического фосфата АДФ. прекра-
щения потока протонов. Класс Д — вещества, разрушающие митохондриальную ДНК
Таблица 3-2. Химические агенты, нарушающие процесс синтеза АТФ
Влияние нп проносе сиггтета АТФ Химические агенты
А. Ингибиторы процессов транспорта протонов по ЦП'-) Арсениты, дичлорвтшнлшгстсин. п-бензохинон. 4-нентаеновая кислота, фторансгат маловат, этанол. пентахлорбутадиеннлциетеин. пероксид водщюла
Б. Ингибиторы транспорта электронов по ЦП Э Амитал. цианиды сроволорол. язилы. формиаты. NO’, фосфин, паракват, миксотназол. лнпнтроанилиновые и лн- (|)С11и.гэ<|шр|1Ы« гербициды. СС12, доксорхошгин
В Ингибиторы транспорта кислорода ио ЦПЭ Депрессанты, конвульсанты. алкалоиды ci орыньп, кокаин, угарный газ. метгемоиюбинообразонателн
Г Ингибиторы фосфорилирования А’1Ф ДДТ. свободные жирные кислоты, амиодарон, валпноми- пнн. граминилин. калышмипин. салинилаты. гнолвазоль- ныс гербгишлы
Д Химические агенты, повреждающие митохондриальную ДНК в нарушающие провесе транскрипции Противовирусные препараты, этанол (при хроническом отравлении)
Примечание. Ш1Э — цепь переноса электронов (переносчиков)
Повышение уровня внутриклеточного кальция Плазменная мембрана непроницаема для ио-
нов кальция. Концентрация калышя регулируется активностью транспортных систем. С их
помощью ионы кальция перекачиваются в эндоплазматический ретикулум (см. гл. 4) и мито-
хондрии.
Токсиканты увеличивают уровень цитоплазматического калышя путем усиления потока
кальция внутрь клетки и/или ослабления потока из клетки. Открытие лиганд- или потенци-
алзависимых кальциевых каналов или повреждение плазменной мембраны привозит к тому,
что в клетку по градиенту концентрации из внеклеточного пространства устремляется калыгий
Ум тиченне уровня может происходить также при выкачивании кальция из эндоплазмати-
ческого ретикулума и митохондрий. Повышенное содержание кальция оказывает токсическое
действие на клетку — проявляющееся истощением энергетических апасов (ингибирование
АТФазы), дисфункцией микрофила.мешов и микронитей (цитоскелет), активацией гидролити-
ческих ферментов и генерацией АФК
Из-за высокого уровня цитоплазматического калышя усиливается поток ионов внутрь
митохондрий. В результате отрицательный потенциал мембраны митохондрий исчезает, что
приводит к остановке процесса синтеза АТФ. Кроме того, химические агенты, окисляющие
NADH. активируют транспортер, выкачивающий кальций из матрикса. Повышенный уровень
цитоплазматического кальция повреждает микрофит а.менты. Происхо шт разрушение актино-
вых ни геи. Or них отделяются инти а актнннна и фодрнна. ответственные за прикрепление
микрофиламентов к плазменной мембране. В результате в мембране появляются разрывы.
Высокий уровень ионов кальция приводит к активации гидролитических ферментов, разру-
шающих белки. <1юсфо.ш1шды и нуклеиновые кислоты. В частности, калыгийактивируемые
нейтральные протеазы разрушают встроенные мембранные белки. Неизбиратсльная активация
сросфо.тшгаз ионами кальция приводит к повреждению клеточной мембраны, одновременно
происходит обрн ованис детергентов из фосфолипидов. Активация Са1*. Mg’*-зависимых эн-
донуклеаз вызывает фртгментаиию хроматина
124 Глава 3
Muonic ксенобиотики способны тенерт рокпь активные <|юрмы кислорода и азога (см. рис. 3-5).
Кальций активирует дегидрогеназы цшраз ного цикла. повышается скорость переноса электро-
нов. в результате чего увеличивается количество О и Н.О,. Лк гиттия NO-ситаз д приводит
к синтезу ONOO .
Последствия нарушении метаболизма Описанные ранее механизмы повреждения клеточных
структур мотут взаимодействовать друг с друзом и усиливаться.
• Истощение клеточных запасов А1Ф приводит к остановке работы ионных насосов клеточной
мембраны и эндоплазматического ретикулума, что вызывает повышение уровня ионов каль-
ция. Ус ил и нас гея поток кальция в митохондрии — исчезает разность потенциалов — бло-
кируется синтез АТФ.
• I ттпсркхтьиисмпя облегчает образование АФК. что в свою очередь инактивирует кальциевые
насосы, тем самым усиливая тннеркалышемию.
• ЛФК гвкже мотут истопить запасы АТФ. NO' — катион пигронпя (нротгизодное NO') инак-
тивирует глиттсртиьдетил-З фосфаттстидротеплзу. ухудшает гликолиз. необрттимо ингиби-
рует часть компонентов иепн переноса электронов.
• Кроме того. ONOO может стимулировать одиночные разрывы испей ДЫК. активируя поли
АДФ-рибозопо.тимеразу (PARP). Этот фермент многократно переносит АДФ-рибозу с НАД
на ядерные белки. В результате уменьшается количество НАД', необходимое для синтеза
АТФ. Для ресинтсза НАД’ необходим А1Ф Недостаток НАД’ приводит к потенцированию
действия ONOO на ДНК.
Нарушение митохондриальных процессов. Некроз. Приток ионов кальция в митохондрию сни-
жает абсолютное значение мембранного потенциала мтпохонлрттн. вызывает генерацию АФК.
разобшение метаболических процессов, регресс синтеза АТФ. lice эттт факторы при водят к
увеличению проницаемости внутренней мембраны митохондрий (до разхтеров частиц 15(10 .1).
Такие изменения обеспечивают переход прототтов в матрикс митохондрии. полностью устра-
няя мембранный потенциал. Поврежденная митохондрия уже не способна синтезпроткгть АТФ.
Но деполяри зация мембран реверсирует ЛТФазу. и она начинает гидролизовать АТФ. Проис-
ходит бессмысленная трата энергии. Теперь под утрозу ставится сем процесс гликолиза, так
как ;1ля некоторых стадий необходим АТФ (гсксокиназа. <|юсфофруктокит1ак1). I спальное ис-
тощение энергетических запасов приводит к лизису или некрозу клетки (см. рис. 3-10).
Друго I результат повреждения митохондрии: апоптоз. Химические атенты способны вы зыват ь
апоптоз клеток. Некротизирующие клетки раздуваются и лопаются (лизируются), aiioinniiipy-
ютпая клетка сжимается, уплотняется. ядерные и
цитоплазматические структуры конденсируются и
фрагментируются, образуя апоптотические тельца,
которые фат «лизируются. Некроз клетки происхо-
дит но различным механизмам, описанным выше.
Атто поз происходит в определенном порядке,
включающем каскад реакций катяболи тма. Ко-
нечным этапом является полный раепчд клетки
Апоптоз схематически представлен на рис. 3-11.
Чаше всего процесс гибели клетки пол действи-
ем токсикантов связан с деградацией митохонд-
рий Другой путь — выход в цитотимзму цитохрома
с (cyt с), гемсодержатттего белка, который обычно
н сходится на поверхности внутренней мембраны в
митохондриальном межмембранном т ространстве.
Сут с — последний компонент ЦПЭ. его отсутст-
вие полностью блокирует синтез АГФ. Происхо-
Рис 3-10. Схема повреждения кдетки. МИ (miioch >п-
dna penncabiliiy transition) — hi рушение пронимаемое-
ni митохондриальных мембран. RO(N)S — акцизные
<|юрмы kuc.iojh ш и/icni азота.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии от генома к метаболому 125
ли уветичспис содержания О;, и начинается процесс некроза. Одновременно свободный cyl
с является запускающим фактором апоптоза (см. рис. 3-I I). Суд с после соединения с АТФ и
специфическим белком может стимулировать протеолитический распад белков под действием
кастмз (цистеиновых протеаз). Некоторые каспазы (например, 2, 8 и 9) активируют прокаспа-
зы. Это ведет к активации так называемых эффекторных каспаз (например. 3. 6 и 7), которые
растопляют определенные клеточные белки, аминируя или инактивируя их
Основные пути клеточной смерти — через повреждение митохондрий и ли запуск суд с — кон-
тролируются семейством белков Вс1-2. Среди этих белков присутствуют те. которые облетают
протекание процессов клеточной смерти, например Вах, Bad и Bid. и тс. которые ингибируют
этот процесс, например Bcl-2. Bcl-xL. Соотношение антагонистических белков является «пе-
реключателем» между жизнью и смертью.
Проапоптичсскис белки Вах и Bid являются инициаторами реакций апоптоза. Они запуска-
ют цепь реакции, ведущих к деградации структуры ДНК. чсрс! активацию мембранных рецеп-
торов ссмсйствз Fas (см. рис. 3-11). Повреждение ДНК вызывает стабилизацию и активацию
р53-белка. который усиливает синтез Вах-бслка (нроанопготического белка), что в конечном
счете связано с риском появления мутаций и канцерогенеза (см. гл. 3.3).
Апоптоз является природным механизмом зашиты. Возбуждение Fas-ренепторов может не-
посредственно активировать каспазы и вовлекать митохондрии в процесс разрушения клеточ-
ных структур — программа каспаззависимой активации Bid (см. рис. 3-11)
Таким образом, апоптоз реализуется разными путями, но везде участвуют каспазы. Реали-
зация анонлоза в каждом конкретном случае зависит от инициирующего фактора и состояния
клетки
Наличие АТФ определяет форму к. еточной смерти. Многие ксенобиотики могут вызывать и
апоптоз, и некроз. Апоптоз обычно индуцируется при воздействии низких концентраций ток-
сикантов. при высоких концентрациях развивается некроз. Исследования показали, что реша-
ющим фактором является количество свободно») АТФ. Коша повреждается небольшая часть
митохондрий, они лизируются и процесс останавливается. Когда же происходит разрушение
значительной части митохондрий, механизм аутолиза нс срабатывает, а высвобождающийся cyl
с запускает процесс активации каспаз и апоптоз (с.м. рис. 3-11). При вовлечении в процесс всех
митохондрий запасы АТФ полностью истощаются и процесс апоптоза не может запуститься
для запуска необходима энергия). Происходит цитолиз.
Этап 4 — восстановление или повреждение
Этап 4 в развитии токсичности обусловлен неадекватным восстановлением поврежденных
структур (см. рис. 3-3). Многие токсиканты повреждают макромолекулы, что увеличивает мас-
штаб альтерации и способствхст развитию токсического эффекта.
Поврежденные молекулы могут быть восстановлены различными способами, например окис-
ление тиоловых белков или метилирование ДНК могут быть полностью хстранены (см. гл. 3.3).
После химического повреждения ДНК и перекисного окисления жиров клетка гидролитически
удаляет поврежденную часть. В некоторых случаях поврежденная молекула полностью дегра-
дирует и необходим повторный синтез.
Восстановление белков. Тиольные группы необходимы для выполнения функций некоторых
белков (см гл. 8.5). Окисленные группы восстанавливаются энзиматически при каталитичес-
ком участии тиоредоксина и глутаредоксина. Восстановление также может происходить при
участии НАДФН. Восстановление окисленного гемоглобина осуществляется путем передачи
электронов с цитохрома Ь5, последний регенерируется при участии НАДН-зависимой цитохром
Ь,-рслуктазы. Молекулы шаперонов (например, белки теплового шока) активно синтезируются
в огеет на денатурацию белков. Они восстанавливают структуру поврежденных белков По-
следние также уничтожаются протеотизоч. АТФ/убихинонзависимыс протеолитические сис-
темы контролируют уровень регуляторных белков (например, рэЗ, IkB. ииклинов). которые
элиминируют поврежденные внутриклеточные белки.
Восстановление жиров. Окисленные жиры восстанавливаются в ходе сложного процесса,
включающего ферменты класса редуктаз, глутатионпероксидазу и глутатионредуктазу. Для ре-
генерации редуктаз необходих! НАДФН.
Восстановление ДНК. I ыгоиря высокой плотности упаковки и наличию механизмов ре-
парации ялерная ДНК довольно устойчива к действию свободных радикалов и электрофилов
126 Глава 3
Разрушение
митохондрий
Гидролиз клеточных белков (например, PARP DFF,
u-фодрина. актина, FAK, SERBP ламинов)
АПОПТОЗ
Рис. 3-11. Пути злотом, инициированные ра (рушением митохондрии, повреждением ДНК и стиму-
ляцией Fas- или TNF (первого шиЛ-рскепторов. DI F — фактор фрагментации ДНК; ГАК — киназа
локальной адгезии; PARP — нодн-ЛЛФ-рнбозополимсраза; SERB!’ — стерольный регулятор связывания
белков, TMFe — фактор некроза опухолей (но Crcgus Z.. Ккиь&сп С„ 2003).
Митохондриальная ДНК не имеет достаточно эффективных механизмов репарации и потому
более уязвима.
Участки ковалентных сшивок пеней ДНК репарнруются ферментами, например ДНК-фою-
лиизой. которая вырезает сшитые УФ-излучением пиримидиновые основания. Этот хромофор-
еодержаший фермент функционирует только при освещении Метильные группы. присоеди-
ненные к 0,,-атому гуанина, удаляются О6-алкт1лгуаиин-ДНК-алкилтрансферазой (см. гл. 3.3).
происходит полное восстановление структуры.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии от генома метаболому 127
Удаление участка ДНК состоит из двух процессов — удаления поврежденных оснований и
нуклеозидов. Незначительные дефекты (не нарушающие спиральную структуру) опознаются
и устраняются опюсителыго специфичной ДИК-гликозилазой (гидролизует ЬНликозидные
связи и образует беспуриновые и беспиримидиновые участки). Эти участки распознаются эн-
донуклеазой, которая гидролизует фосфорно-эфнрныс связи. После удаления поврежденного
участка структура восстанавливается ДНК-пошмеразой п ДНК-лигазон. Крупные участки уда-
ляются АТФ-зависимой нуклеазой. Этот фермент распознает искаженные участки и вырезает
сю вместе с частью неповрежденных нуклеотидов (с обеих сторон от поврежденного участка).
Вырезанный участок ДНК восстанавливается путем вставок нуклеотидов ДНК-полимеразами
и лигазами Вторая нить используется как шаблон
P/XRP вероятно, является важным инструментом репарации Этот фермент присоединяется
и активируется поврежденными участками ДНК. Активная PARP гидролизует НАД* и исполь-
зует освободившуюся АДФ-рибозу для формирования ла ялерных белках целей поли-АДФ-
рибозы. Так как АДФ-рибоза заряжена отрицательно, то получающаяся цепь также заряжается
отрицательно. Цепи ДНК содержат много анионных части Одноименный заряд приводит к
расхождению цепей ДНК и молекул ялерных белков, происходит леконленсапия хроматиновой
структуры. Этот процесс необходим, потому что репарации подлежат только освобожденные от
белков и частично раскрученные цепи ДНК.
Рекомбинационное < построил и каппонное) восстановление. Данный механизм срабатывает,
если реплицируется поврежденная ДНК. Эго предо!вращает синтез дефектных нитей ДНК. Ре-
зультатом репликации являются две двух цепочечные цепи ДНК. одна из них содержит длинный
пострепликанионный участок во вновь синтезированной цепи, другая идентична материнской
ДНК. Последняя путем обмена участками (кроссовером) восстанавливает поврежденную цепь
яругой ДНК. Такой механизм обычно ветре ается при сшивках пеней ДНК
Восстаное ение клеток: периферические нейроны. Восстановление нейронов — крайне мед-
ленный процесс Зрелые нейроны потеряли способность к делению, поэтому нс происходит
замещения поврежденных клеток здоровыми Восстановление повреждений аксонов в пернфе
рических нейронах происходит с участием макрофагов и шванновских клеток, формирующих
миелин. Макрофаги удаляют поврежденный участок, выделяют цитокины и факторы роста
активирующие шванновские клетки, на поверхности которых локализуется белок Par-З и мо-
мент контакта с подлежащим миелинизации аксоном. Полярный белок Раг-3 регулирует, как
было установлено в 2005 г., процесс миелинизации. Клетки Шванна пролиферируют и запус-
кают процесс восстановления нейронов. Дифференцированная клетка Шванна образует канал,
по которому происходит рост аксона, кроме того, она выделяет факторы роста.
В центральной нервной системе млекопитающих избыточное удлинение аксонов предот-
вращается ингибиторными гликопротеинами и хонлроизинсульфатпрогеогликанами, которые
выделяются олигодендроцитами и астроцитами. Повреждение нейронов центральной нервной
системы необратимо, но восстановление функции возможно за счет других нейронов.
Восстановление тканей В тканях, способных к регенерации, дефекты устраняются некрозом
или апоптозом и про шферацией.
Апоптоз является механизмом активною удаления поврежденных клеток и способом вос-
становления структуры ткани. Клеточные органеллы уплотняются и превращаются в апопто-
тические тельца, которые фагошпируются. Воспалительный процесс не развивается Апоптоз
также может предотвращать появление новообразований, уничтожая клетки с опасными из-
менениями в структуре ДНК. Эффективное восстановление структуры тканей и органов при
апоптозе возможно только при смешении удаленных клеток новыми, т.с. в органах с высокой
пролиферативной активностью (костный мозг, дыхательный эпителий, эпителий желудочно-
кишечного тракта, эпидермис) или с относительно высокой активностью (клетки печеночной
и почечной паренхимы). Восстановления же других тканей (нейроны, карлио.миониты, яйцек-
летки) нс происходит в связи с потерей способности к делению.
Пролиферация: регенерация тканей. Ткани состоят из различных клеток и внеклето итого
матрикса. Прикрепление клеток друг к другу обеспечивают кадгерины — семейство трансмем-
бранных кальцийзависимых гликопротеинов. осуществляющих адгезивные межклеточные кон-
такты. Коннексины — нестабильные белки, живущие несколько часов, заполняют пространс-
тво между клетками. Интегрины — поверхностные гетеродимерные белки связывают клетки
128 Глава 3
с внеклеточным м.ттриксом. По лому при восстановлении поврежденных тканей происходят
регенерации клеток и компонс<гтон внеклеточного матрикса, а также реинтеграция новых кле-
ток в ткани и органы
Замена клеток. Почти сразу после повреждения клеток соседние с ними клетки начина-
ют делиться. Покоящиеся клетки (фаза GO) переходят в <|жзу GI Начинается процесс миго-
м В делящихся клетках происходи г изменение экспресс ин генов. Увеличивается экспрессия
предрапних генов, кодирующих факторы транскрипции. Последние также активируют экс-
прессию некоторых генов. Через несколько часов экспрессируются поздние гены, колирующие
белки-регуляторы клеточного никла. Преобладающими процессами клетки становятся синтез
ДНК и митоз.
Регенеративный процесс запускается особыми веществами, выделяемыми поврежденными
клетками. Макрофаги, эндотелии чувствительны к этим сигналам и выделяют свои сигналь-
ные молекулы, инициирующие регенерацию. Фактор некроза опухолей а (ФИО,, или J NFJ и
интерлейкин р (ИЛ-|5) способствуют актимшии покоящихся клеток, далее эти клетки под вли-
янием leiiHTOHHT-pocTOBOir фактора (HGF) и 1 расформирующего ростовою фактора альфа
(TGT-a) переходят к (разе митоза.
Кроме митоза, восстановление ткани возможно за счет миграции клеток. В слизистой обо-
лочке желудочно-кишечного факта эпи процесс происходи i быстрее, чем рост новых клеток.
Восстановление слизистой оболочки управляется факторами роста и цитокинами.
Восстановление внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс состоит из белков, глико
заминогликанов. гликопротеинов и протеогликанов. Активация покоящихся звездчатых клеток
происходит пол влиянием тромбоцитарного ростового фактора (PDGF) и трансформирующего
ростового фактора бета (FGF-|J). которые выделяются при разрушении тромбоцитов. Про-
лиферация звездчатых клеток вызывается сильным митогеном PDGF. в то время как IGF
вызывает усиление сишсза звездчатыми клетками элементов внеклеточного матрикса (колла-
генов. фибронектина, тенаснииа. протеогликанов).
Побочные реакции при повреждении тканей. Макрофаги и эидотслнопиты выделяют большое
количество веществ, среди которых БОФ. приводящие к ра витию воспаления и лихорадки. В от-
вет на повреждение тканей макрофага выделяют шпокины (ФНОа. ИЛ-1), нарушающие процес-
сы микроциркуляции и ciiocoociвуюшие развитию воспаления. Цитокины стимулирую! ближай-
шие стромальные клетки (энлотелиониты. фибробласты), которые начинают выделять медиаторы,
расслабляющие микрокапилляры и вызывающие увеличение проницаемости сосудистой стенки
Активированные эндотелиошны облетают переход лейкоцитов в поврежденные ткани (иод дейс-
твием хемоаттрактантов и молекул клеточной адгезии). Адгезия лейкоцитов к эндотелиальным
клеткам обеспечивается внутриклеточными молекулами адгезии (1CAM-I). Посте фа ля адгезии
происходит выход лейкоцитов через сосудистую стенку в ткани. Он облегчается разностью кон-
центраций хемоаттрактантов, усиливающих синтез в лейкоцитах интегрипов. Хемоаттрактантами
являются хемотаксические шпокины (хсмокины) — производные липидов, например тромбонит-
активируюший фактор (PAF) и лейкотриен В4 (LTB4). Клетка любого типа, находящаяся вблизи
места повреждения, вшеляет 1С.ЛМ -I. которые вызывают выход лейкоцитов в ткани. Лейкоциты
синтезируют медиаторы, способствующие развитою воспалите, ьного процесса.
В процессе воспаления генерируются активные <]юрмы кислорода и азота. В поврежденных
тканях .макрофаи! инициируют процесс, называемый кислородным взрывом. Это выделение
большого количества свободных радикалов и активных ферментов. Мембранная НАДФН-ок-
сшигэн после акт икании микрофагами и/или фаиулонигами также продуцирует свободные ра-
дикалы. например супсроксид-ан ион-радикал, который затем превращается в гидроксид-рали-
к*л. Цитотоксичный свободный радикал — NO* — макрофаги синтезируют путем окисления
api иннна синтазой-NO. Далее радикалы реагируют друг с другом (см. рис. 3-5) и образуют дру-
гие свободные радикалы — NO. и СО;. Гранулоциты выделяют во внеклеточное 1 ростраиство
миелопероксидазу, катализирующую образование HOCI из пероксида водорода и хлорид-нона.
HOCI при взаимодействии с Йе*' или О? образует гидроксид-раликал. Все свободные радикалы
усиливают воспаление, одновременно препятствуя микробному зартжению
Синтез альтерирующих (повреждающих) белков: белки острой фазы. Цитокины микрофагов
и эндотезиопитов — FL1-6. ИЛ-1, ФНОа. действуя па мембранные рецепторы, усиливают экс-
прессию генов, кодирующих БОФ (положительные и отрицательные).
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 129
Положительные БОФ способствуют уменьшению повреждения тканей и запускают про*
нессы регенерации. Одним из способов их действия является iiiirnoiipoimiiiie <и зосомальиых
< ферментов.
Отри нательным и БОФ являются альбумин, rpaiiciiipeniii. трансферрин. некоторые формы
цитохрома Р45О и 1лут:и11О11-$~траисфераты. Эти белки играют важную роль в детоксикации,
л иногда и усилении токсичности ксенобиогнков. поэтому они влияют на концентрацию и
определяют место накопления химических агентов в острую фазу.
Генерализованные реакции. Цитокины активированных макрофагов и энлотелиопитов из-
меняют нейрогормональный статут. ИЛ-1. ФНОа н И.П-б действуют на температурный центр
гипоталамусе. Одновременно ИЛ-1 и ИЛ-6 усиливают продукцию АКИ, стимулирующего
выход кортизола из шшвочечников. Обеспечивается и обратная связь — кортизол ингибирует
синтез нитокпнов.
Системы восстановления иногда не способны выявить повреждение. Регенерации не будет,
если повреждаются кофакторы и ферменты системы восстановления, а также при ковалентном
связывании ксенобиогнков с белками.
Возможен случай, когда системы восстановления усиливают токсический эффект, напри-
мер истощение тапасов НАД' под действием PARP при восстановлении ДНК. расходование
НАДФН на восстановление окисленных белкон Из-за истощения запасов дот оров электронов
од мрозу ставится процесс синтеза АТФ При неконтролируемой пролиферации также воз-
v.ано усиленно токсического эффекта, что может привести к новообразованиям и фиброзу.
Токсичность — следствие отсутствия регенерации. Отсутствие или неэффек явность процес-
сов регенерации может встречаться на всех уровнях (молекулярном, клеточном. тканевом).
Некроз тканей Повреждение клеток заканчивается клеточной смертью при неэффектив-
ности процессов восстановления или необратимости повреждений. Развитие некроза могут
<хттановигь два механизма: апоптоз и пролиферация. Апоптоз предотвращает воспаление. Про-
• феран и я лнускастея вскоре после повреждения ткани. Этот процесс способствует воссьз-
- алению структуры и функций ткани. Чувствительность тканей к повреждающим тракторам
м способность к восстановлению изменяются во времени и определяют выживание клеток.
Эффективность репарации также зависит от концентрации токсик нта. но не только потому,
что токсикант вызывает сильное повреждение клеток, но и из-за нарушения самих ме анизмон
восстановления. Некроз происходит при неэ<|>фективности механизмов восстановления кле-
ток. отсутствии апоптоза и митоза.
Фиброз — патологический процесс, характеризующийся чрезмерным образованием межкле-
точного матрикса ненормального состава. Как уже было сказано, повреждение клеток запускает
?• .ссы про. иферации и ресинтеза компонентов межклеточного матрикса. Если последний
процесс по каким-то причинам не останавливается, то развивается фиброз. Главным факторов
С-иброгенеза является TGF-p. Повышенное образование этого вещества в острую фазу — нор-
мальный ответ на повреждение тканей. Его синтез прекращается по завершении процессов ре-
*енсраинн. Фиброзная активность ТС>Г-р обусловлена стимуляцией синтеза и интибированттем
жтрадапи т компонентов межклеточного матрикса. В процессе фиброза происходит изменение
состава межклеточного матрикса. Непропорционально увеличено количество коллагенов и ла-
минина — адгезивного гликопротеина, полннептидные цепи которого ассоциированы в форме
.«симметричного креста и удерживаются вместе лису тьфидными связями.
канцерогенез. Химические канцерогены нарушают процессы репарации ДНК. апоптоза я
терминации клеточной пролиферации.
Повреждение репарации ДНК: мутации. Химические и физические факторы могут вызы-
вать неопластическую трансформацию клеток генотоксическими и негенотокенческимн мс.ха-
• зчами .Химические агенты, действующие на ДНК. вызывают образование аддуктов, окенле-
-сшивки цепей. Если эти повреждения не хсзраняются. появляются мутации и новые цепи
ДНК хже бхдут отличаться от материнских Наиболее неблагоприятная ситуация — экспрессия
эврежленными генами белков-регуляторов клеточного деления. Гакнс клетки способны к
сверхнормальному росту н вытесняют здоровые структуры Результатом является образование
опухоли
Мутации в протоонкогенах. Протоонкогсны — гены, котирующие бедки-регуляторы кле-
точного цикла. Они включают факторы роста, рецепторы к факторам роста, внутриклеточные
130 Глава 3
системы передачи сигнала (G-белки, нрожинкиназы. иикчипы. пиклинзавиенмыс протеипкн-
назы) и факторы транскрипции. Периодическое увеличение экспрессии этих генов необходимо
для обеспечения клеточного никла. Постоянное уем тение активности протоонкогенов вызыва-
ei неоплазию. Генотоксический механизм — изменение структуры протооикогенов. Повреж-
денный геи (онкоген) запускает процесс усиленного синтеза белков-ре|уляторов. Примером
мутационной акпизлиии онкогенных белков могут служить Ras-бслки. Они расположены на
внутренней новср ноет клеточной мембраны и в их функции входит синтез трансмиттеров в
ответ на действие рецепторов факторов роста (см рис. 3-9). Ras — молекулярный «переключа-
тель». активный в ГТФ-<|юрме и неактивный в ГДФ-форме. Некоторые мутации кодирующего
его теня приводят к снижению актив! ости ГТФазы. Белок более Продолжительное время ос-
тается в форме ГТФ. Постоянный синтез медиаторов приводи! к некой филируемой пролифс
рации и трансформации.
Мутации в оиухольподавляюших генах. Эти гены кодируют белки, замедляющие все фазы
клеточного никла, — ингибиторы никлин зависимых протеинкиназ. факторов транскрипции.
I еп р53 кодирует белок массой 53 000 Д Он активирует экспрессию генов, кодирующих вешес-
тва-ингибиторы клсточно<о цикла. Одновременно он провоцирует апоптоз (бвркала антианоп-
тогичсских факторов и активация проаноптотическпх) Повреждение ДНК и неисправимые
мутации стабилизируют белок р53. Происходи! его накопление, замедляется клеточный пикт,
облегчается репарация или запускается апоптоз.
Взаимодействие нротоопкогенов и онуходыюдавдяюших генов в процессе канцерогенеза.
Накопление мутаций лротоонкогенов и оцухолыюдаиляющих генов — основной механизм
покачественней трансформации клеток. Так как жизнь клеток ретулирустся равновесием ми-
тоза и апоптоза, то любые изменения в генетической программе могут привести к смещению
этого равновесия. Облегчение процессов анонгоза пренятенгуег развитию опухоли и наооорот.
Усиленная митотическая активность провоцирует канцерогенез но трем причинам.
• Увеличивается вероятность мучат и. При сокращении длительности фаз меточного цикла
уменьшается время, достаточное ^ыя репарации
• Избыточный синтез нротоопкотенных белков увеличивает вероятность их связывания с
онкогенными белками. облегчая тем самым неопластическую транс^юрманию. Клетка на
ранних этапах развития опухоли в период многоклональной гиперплазии под воздействием
неких гене тических или других факторов приобретает повышенную наивность mci гы транс-
феразы. что при дальнейшем развитии клонов в опухоли выражается в гинермстнлирова-
ипи. Эго приводит к гранскрипниопной инактивации и теистической нестабильности силь-
но метилированиях участков ДНК. Данные изменения закрепляются и развиваются при
дальнейшей прогрессии опухоли. Следующие последовательные события разбалансировки
метилирования приво гят к подавлению транскрипции генов или потере их функций через
разрушение целостности хромосом, их повреждение и потерю аллелей.
• Клеточные взаимодействия в процессе пролиферации временно прекращаются. Эго приво-
дит к инвазивному росту опухолевых клеток.
Заключение
• Взаимодействие токсиканта с эндотенцыми молекулами-мишенями можс! вызвазь наруше-
ния функции клеток и/или структур или запустить механизмы восстановления па молеку-
лярном. клеточном и/или тканевом уровнях.
• Селективное связывание токсиканта с рецепторами одного типа характерно для небольшого
числа высокотокснчных агентов (например, некоторые фосфорорганические соединения,
ботулотоксин, аманитин).
• Чаще токсикант имеет сродство к нескольким рецепторам, взаимодействие с которыми и
приводит к формированию определенного биологического эффекта.
• Био трансформация, приводящая к образованию токсичных веществ, называется токсикапи-
ей или метаболической активацией.
• Биогрансформания. приводящая к элиминации токсиканта или предотвращение сю обра-
зования in vivo, называется детоксикацией.
• Апоптоз, или зап|Ю1ра.м.мированная к сточная смерть, — жестко контролируемый, троиесс
фрагментации и фагоцитоза клеток макрофатами (в основном) без развития воспалительной
реакции.
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 131
• Повышенное содержание внутриклеточного кальция опасно, оно может приводит!, к ис-
тощению энергетических запасов (ингибирование АТФззы. участвующей в окислительном
фосфорилировании). дисфункции микрофила ментов. активации гпдроли шчсскнх фермен-
тов и генерал и и активных форм кнелоро ia и азота.
• Повреждение клщки ведет к ее некрозу, если молекулярные механизмы восстановления
неэффективны или молекулярное повреждение необратимо.
• Химический карнепогенез включает в себя недостаточность функции различных рспарагнв-
ных механизмов (сбой репарации ДНК. нарушение регуляции апоптоза и сбой процессов
завершения пролиферации).
3.3. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ТОКСИКОЛОГИЕЙ И ГЕНОМИКОЙ.
ГЕННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ. МЕТАБОЛОМИКА И МЕТАБОНОМИКА
I Licit человека — сыпок, на котором
отмечены все даты бытия.
Максимилиан Волошин
Природа проста и не роскошестует
излившимн причинами.
И. Ньютон
Модификация генетическою материала человека химическими или физическими агентами
(например, радиацией) представляет одно из наиболее серьезных последствий их воздействия.
Однако число агентов или процессов, которые извести как приводящие к таким изменениям,
достаточно ограничено.
Генетическая токсикология оценивает результаты воздействия различных факторов как на
ДНК. так и на генетические процессы в живых клетках и орщнизмах Под генотоксичностью
следует понимать способность химических, физических и биологических факторов оказывать
повреждающее денсизие на генетические структуры органи зма. Малая часть поезедоватслыюс-
тн ДНК копируется в иротеинколируемую РНК. Кодируемая последовательность основных
пар назьпзается экзон, пеколнр емая последовательность основных пар — нитрон. Большинс-
тво токсикангов оказывают неблагоприятное воздействие, i рямым или косвенным путем на-
рушающее нормальные процессы передачи сигналов в клетке. Считается, что ксенобиотики
инициируют последовательность событий, которые начинаются с рецептора, сдерживающего/
активизирующего генную и протеиновую экспрессию. Экспрессия гена — активизация транс-
крипции гена, в процессе которой на смысловой нити ДНК синтезируется мРНК. Поскольку
мРНК — предшественники ферментов, измерение их относите ьного содержания в образцах
ткани или клеток. подверженных действию токсиканта, показывает потенциальное вовлечение
генов в этно онио токсичности. Это не новая мысль, однако. согласно гипотезе, основан-
ной на многочисленных исследованиях и наблюдениях, полагают, что механизмы стрессовых
факторов предшествуют возможному повреждению генов. Потенциальные мутагены можно
разделить на физические, биологические химические агенты. Многие характеристики инду-
цированной излучением мутации считаются схожими с таковыми химически ин тунироваиной
мутации. Исследователи выявили химические мутагены в К) классах соединений, включая аро-
матические никлы, эфиры, галогенированные алифатические и ароматические углеводороды,
нитрозамнны. некоторые пестиизшы, эфиры фталевой кислоты, некоторые фенолы, некоторые
полихлорированные дифенилы и ароматические полипиклы. Первые работы в области хими-
ческого мутагенеза относятся к началу 30-х юдов XX века, когда была открыта мукзгенная
активность йода и аммиака (В.В. Сахарой и М.Е Лобашсв). алкалоида колхицина (A. Dumih).
В 1946 г. независимо друг от друга И .А. Рапопорт и Ш Ауэрбах сообщили о способности фор-
мальдегида и иприта индуцировать частоту мутанин, сопоставимую по величине с действием
ионизирующе! радиации. Введение в исследовательскую и аналитическую работу микронабора
ДНК. способного измерять уровень экспрессии в тысячах генов одновременно (1990). принес-
ло новую революционну > информацию. Как микроанализ ДНК может помочь токсикологии?
132 Глава 3
Развитие вредного эффекта
Окружающая среда
► Связывающий рецептор
I Генная экспрессия----►
*
» Выражение модификации
протеина
♦
Развитие повреждения
•т.юмаг-лая
Функция органа - —► (
Раннее
детектирование
Поадное"'
детектирование
Стадия забс( чдаания "
Схема Л-3. Определение »ксщкч.сни генов как
iiiariiocnpiecKHH и iipouiociическии leer.
Образен экспрессии генов является уникальным
по выявлению конкрешых типов повреждении по
сравнению с установлением пли измерением еди-
ничного фермента или метаболита (схема 3-3). гак
как содержание мегабайтов и активность фер-
ментов могут быть изменены под влиянием мно-
гих факторов (см. гл. 4).
И мсрсние генной экспрессии направлено на
увети гепме чувствительности и специфичности
диагностических исследований (рис 3-12)
Однако повышение чувствительности теста не
должно навредить иииненту. 'Гак. некоторые из-
менения в экспрессии (енов нс означают проявле-
ния небт4ноприяттн>1\ эффектов Ответсгвепность
та опенку генной экспрессии лежит на ученом,
который должен учитывать трутне дополнитель-
ные данные для получения наиболее жтекна!ко-
го вывода нт исслелованнЛ. Для однозначной
оценки повреждении органов при клинических
испытаниях новых лекарственных средств нередко возникает необходимость в применении
альтернативных методик Например, высокая активность аланин-амнно1ранеферазы (АЯТ) и
аспартатаминогрансфердзы (ACT) считается признаком гепатоцеллюлярною повреждения
АПТ преимущественно находится в клетк' \ печени, поэтому изменение ее активности бопее
специфично для зяболевннпй печени. ACT присутствует в сервис. скелетных мынных. мозге
почки, печени, а уровень актив» осгн и АЛ Г. и ACT как известно. повышается при инфар-
кте миокарда сердечных нарушениях мышечных заболеваниях. заболеваниях центральной
нервной сишемы и других расстройствах. Количественная оценка имеет малую прогности-
ческую ценность и не всегда соответствует степени повреждения печени (см. гл. 2.4.2). При
детектировании токсических э«|)фектов эти маркеры ^есиспифнчны и могут изменяться пол
Рис. 3-12.1 сны-агрессоры генома человека. п.1няюшне m p i питие различных на» минческих состоянии
(L С Северин и егхнп.. 2004).
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 133
лейст ином других факторов, не относящихся к повреждению печени. Результаты генетических
исследований являются наиболее чувствительными и «специфичными диагностическими и про-
гностическими тестами.
Механизм токсичности ряда ксенобиотиков неизвестен. Высокисненифпчные изменения
экспрессии генов помигают установи>ь механизм токсичности химического агента, например,
нослсд«ва1сльность передачи сигнала (см.выше) или причины иш ибирования ферментных
систем (см. гл. 4). что в дальнейшем ласт возможноегь определи>ь эффективные биомаркеры,
предупредить лекарственные взаимодействия, предвидеть побочные эффекм (см. гл. 1 и 4).
Соотношение экспрессии генов и фенотипа
Совокупность параметров экспрессии генов часто говорит о егкюянии соответствующего
орт ан а. Фенотип может бы гь определен с помощью клинических исследований, функциональ-
ных тестов, измерения компонентов сыворотки крови и гистологической оценки. Связ .шаппе
генной экспрессии с подобными вменениями — ключ к поиску бномаркеров токсических
эф(|>сктон и формирование возможной гипотезы относительно механизма действия токсиканта.
Прежде чем пытаться установить cootт ошенне изменении экспрессии генов и фенотипа, пеоб
холимо разобраться в физиодопш органов (см гл. 2). Например, почка — эго частая мишень
для токсикантов окружающей среды и определенных классов лекарственных соединений. Вос
прпимчнвость почки к повреждению связана с ее уникальным анатомическим строением и фи-
зиологическими функциями. Клетки проксимального канальца реабсорбируют большинство
нопов воды (Na , Са2', К*. СТ. ПСО *. 1’О4') и различных метаболитов. В табл. 3-3 приведены
примеры веществ, проявляющих токсическое действие на почку (по робнее, см. гл. 2).
Таблица 3-3. Примеры веществ, проявляющих токсическое действие на тючку
Металлы Гялогено- иротволшое углеводородов Природные токсины Хнллгетикн Антибиотики Лругне лекарственные препараты
Химий Ьромбепзол Охратоксин А Апстоамннофс нон Гентамицин Цисплатин
Ргуп. Тстрах. >рметап Фумонизин ШИШ* Митомицин
Сви 1 leu Хлороформ Пптрии Циклоспорин
* Нсстсрондныс lipin 11Ю№К'11>с1Н1с.11ные препир.пы
Представленные токсиканты имеют различную химическую природу. По-вплимому, за про-
явление почечной токсичности отвечает не только структур! ая особенность молекулы ксе-
нобиотика. Для оценки изменений генной экспрессии, которые происходят под влиянием
классических почечных токсикантов, были проведены токсикогенетические исследования. Из-
вестно. что мишенью цисплатина — пис-днхлородиамин платины HI)—(CIS) и охратоксина А
(ОТА) является сегмент проксимального канальца S3. CIS токсичен для представителей всех
биологических видов и без ферментативной активации преобразовывается в предельно токсич-
ную форму. CIS имеет изомерную транс-конфигуранию, которая называется «грапсплатин» и
не является токсичной. Гоксичносгь CIS может выявляться несколькими способами, включа-
ющими измерение креатинина плазмы, мочевины крови и т.д
ОТА — токсин, выделенный из особых видов грибов, включающих Aspergillus ochraeus и
Penicillium verrucosum, которые присутствуют во множестве различных продуктов и напитков,
таких как зерновые, орехи, спснии. кофе и красное вино (см. гл 11) 11олобно CIS. 01А вы зы-
ваег повреждение проксимального канальна почки в сегменте S3. Проводили независимые ис-
следования генной экспрессии в почке, на которую воздействовали токсическими дозами CIS
и ОТА. При этом наблюдали почти одинаковые гистопатологические изменения, включающие
некроз ЗЗ-клеток проксимального канальца и рассеянный апоптоз. Оба соединения накаляй
вались в определенной области проксимальною канальца. В этих нес. словапиях гистологичес-
кая оценка явилась отправной точкой проверки взаимосвязи параметров пенной экспрессии п
морфологических повреждений. Анализировали гены крыс, которым вводили CIS. и крыс, ко-
торым вводили ОТА Несмотря па то ч то только 250 генов были включены в исследование, уда-
134 Глава 3
лось об! щужнть несколько функциональных классов генов. которые ответственны за клеточ-
ный транспорт, повреждение ДНК и метаболизм. Из-за того что клетка должным образом не
выполняет своих обычных функций для предотвращения критических процессов, изменяется
экспрессия генов. Острая фаза генного ответа наступает при возникновении соответствующего
количеств;! различных клеточных нагрузок. Таким образом, структурно и фармакологически
разные соединения, делящие одни и тс же токсиколот ические конечные точки. имеют сходство
в экспрессии генов. Такие гены .moivt быть удовлетворительными биомаркерамн. Кандидаты
в биомаркеры должны соответствовать многим требованиям, включая возможность раннего
детектирования, чувствительность и специфичность анализ;!. При этом гены, чьи протеиновые
продукты секретируются в кровяное русло, являются лучшими кандидат* ми. по сравнению с
другими биомаркерами. В настоящее время для обнаружения токсикантов ведущие лабора-
тории мира активно проводят поиск и выбор биомарксров по описанной выше схеме. Высо-
коючныс технологии определения экспрессии генов позволяют находись характерные черты.
уник& ьные для специфичных токсикангов. Ожидается. что эта технология дасг ожеты на
приведенные ниже и многие другие вопросы. Насколько отличается метаболизм клетки раз-
личных тканей в результате чрезвычайно разных ответных реакций на введенный токсикаш?
Различные биологические вилы проявляют лишь частично совпадающие или ипднвидуачьные
черты генного ответа на действие одного и того же токсиканта? Возможно ли использование
полученных данных для определения срока заболевания и оценки риска? Возможно ли исполь-
зовать изменения генной экспрессии как индикаторы ответных реакций на введение сложных
химических смесей? Поможет ли установить эта технология уникальность ответных реакций
организма на хроническое поступление низких лоз токсикантов. которое хар. ктеритуегея со-
вокупностью параметров генной экспрессии? Существует ли возможность обнаружения спе-
цифических характеристик генного полиморфизма, ответственных за повышенную склонность
к экологически обусловленным заболеваниям? В настоящее время совокупность параметров
генной экспрессии уже помогает в выборе генных мишеней. Безусловно, интерпретация из-
менений экспрессии генов возможна лишь в совокупности с данными клинической химии,
гистологических исследований и других параметров, определяющих фенотип.
Одна из самых сложных проблем генетической токсикологии связана с возможностью уве-
личения частоты мутапий в соматических и половых клетках человека в результате воздействия
химических веществ — генотоксикантов. Соматические мутанин. как генные, так н хромосом-
ные. не перс ыются потомству человека, подвергшегося воздействию токсиканта, однако по-
вышение частоты этих мутаций может способствовать развитию приобретенных заболеваний,
в первую очередь рака.
К генотоксикантам относят:
• х утагены — агенты р личного происхождения, вызывающие наследуемые изменения в ге-
номе;
• митогены — факторы или вещества. влияющие на процессы клеточного целения:
• анэугепы — факторы, способствующие увеличению или уменьшению гаплоидного или
диплоидного числа хромосом на одну или более;
• кластогсны — факторы, индуцирующие хромосомные разрывы;
• морфогены — факторы, вызывающие ненаслсдуемыс генетические изменения (морфозы) на
уровне реализации признака в онтогенезе.
Мутация — внезапное изменение в наследственных структур, х (ДНК. ген. хромосома, ге-
ном). Генетический материал организован в иерархию струк1урно-функцн»нальных единиц —
от молску ирных сайтов внутри гена до целых хромосом и геномов. Соответственно сущест ву-
ют разные типы мутаций — от генных до геномных.
Генная мутация — изменение поелсдовагелытостн нуклеотидов в определенном участке
молекулы ДНК. Хромосомная мутация — любое нархшение структуры хромосом (деления,
дупликация, инверсия. |ранелокання). Геномные мутации заключаются в изменении числа
хромосом в кариотипе. Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору хромосом,
называют полиплоидией. Отсутствие или избыточное количество отдельных хромосом объеди-
няют понятием «анэуплоидия». которую подразделяют на гиперплоилию (увеличение числа
хромосом) и гипонлопдию (потерю отдельных хромосом хромосомного набора). Геномные му-
тации возникают за счет повреждений в процессе мейоза. ведущих к нсрасхождению хромосом
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 135
или хроматид но дочерним клеткам. Общая частота геномных и хромосомных мутанин в сома-
тических клетках человека составляет около 1%, а в зародышевых — около 0.5%.
Генные мутации, хромосомные отклонения (морфологические уродства) и апэунлодия —
фикюры. участвующие в развиппз рака. Многие музагепы и кластогсны выступают в роли ини-
циаторов канцерогенеза. Однако мутагены, кластогены и анэугены также мозут вызывать мно-
жественные генетические изменения. Мугании в зародышевых клетках. как и в соматических,
обычно летят на две большие группы — хромосомные (численные и структурные) и генные.
Онкогены — гены, стимулирующие превращение нормальных клеток в раковые. Воздейс-
твие онкогенов является генетически доминантным, что проявляется в том. что единичный
активный онкоген действует лаже в том случае, когда его нормальная аллель присутствует в
гои же клетке. Онкогены возникают, когда гены, называемые протоонкогенамп. участвую-
щие в нормальном процессе роста и развития клеток. подвергаются генетическим измене-
ниям (см. выше). Генные мутанин в гене-подавителе опухоли на хромосоме 17. известном
как р53. возникают при различных вилах раковых опухолей, и молекулярная характеристика
мутаций р53 позволяет связан» некоторые виды рака у человека с влиянием мутагенов. Среди
хромосомных изменений, активирующих нротоонкогены, заметно преобладают транслока-
ции Транслокация может активировать нротоонкозен. переметая его в новое место в хро-
мосоме с более активным промотором, где его действие усиливается. Промотор — регуля-
торный участок гена, с которым связывается РНК-полимераза перед началом транскрипции.
Трансляция — передача наследственной информации: синтез белковой молекулы или пере-
вод но тедоватсльностн оснований мРНК в последовательность аминокислот полинептилноп
цени Опенка риска раковых заболеваний включает в себя исследование чувствительности
различных видов и субпопуляций к индуцированию оззухо зи химическим веществом и нос-
троснис графика зависимости доза—ответ, связывающей количество мутанин и лозу хими-
ческою вещества. Чтобы исследован» генетический риск, оценивается частота генетических
изменений в человеческих зародышевых клетках путем экстраполяции данных, полученных
на соматических клстк зх зз зародышевых клетках грызунов. Для полной опенки генетическо-
го риска необходимо дать статистическую оценку частоты генетических изменений, переда
юшихся потомству.
Сре и аномалий лидирует анэу ыодия. «нем i сдует полиплодия. Гак, апэуплолия может при-
вести к смерти плода и вызвать различные расстройства, например синдром Дауна. Струмурные
отклонения составляют 5% всех генетических нарушений. Большинство хромосомных аномалий,
обнаруживаемых у новорожденных. возникают de novo в зародышевых клстквх родителей.
Механизмы индуцирования генетических изменений. Типы повреждений ДНК варьируются от
разрыва одной или двух спиралей ДНК до пересечений между основаниями ДНК. между учас-
тками ДНК и белками, получения адгтуктов ДНК при взаимолсйс1вин их азотистых оснований
с химическими агентами. Ионизирующее излучение вызывает разрыв одной или двух спиралей
ДНК. а также широкззй спектр повреждений оснований. Относительные пропорции различных
классов повреждений ДНК зависят ог типа радиации. Ультрафиолетовое излучение, относя-
щееся к разряду нсионизируюших излучений, часто вызывает образование низелобутановых
пиримидиновых димеров и продуктов фотоли а Эти повреждения могут быть кл1пчесгвеино
оценены химическими и иммунологическими методами.
Химические вещества могут вызывать изменения оснований либо 11еносрсдст1зсзгно в качес-
тве аддуктов, либо опосредованно через интеркаляцию химического соединения между пар-
ными основаниями (рис. 3 13). Многие ллскзрофилы1ыс химические соединения вступают в
реакцию с ДНК. образуя ковалентно связанные продукты (аддукзы).
Алкилирование основаззшз может привести к его отрыву от ДНК. что образует беспури-
новый иди беенззримидиновый участок, который обычно назьпзастся АП-сайтом (участком).
Включение посторонних осноззаний в Д11-сайт приводит к мутациям. Объемные аддукты в
ДНК распознаются клеткой так же. как и повреждения. вызываемые ультрафиолетовым излу-
чением, и подобным же образом иснраззляются.
Эндозенныс агенты ответсгвс зиы за несколько тысяч повреждений ДНК. ежедневно про-
ззехо ящих зз каждой клетке, преимутцественззо — за изменения осноззаний ДНК (например,
8-оксигуаниновых) зз AI 1-сайтов.
136 Глава 3
Клеточные процессы. которые могут привес)и к повреждениям ДНК — это накопление
ЛФК. дел1М1пн1рова1П1С цнюзинов и/пли S мспииштозннов. приводящее к образованию соот-
ветственно хранила и тимина.
Процесс репликации ДНК чрсзаг возможными ошибками, например полимеразой может
быть добавлено постороннее основание.
Два вида процессов помогают клетке устранять повреждения своей ДНК. Если повреждения
значительны, то клетка может » йти в сталию апопю а (см выше). Если повреждение менее
значительно. го в клетке происходят процессы восстановления: безошибочная или чреватая
ошибками починка (репарация) ДНК
Основные принципы. лежащие в основе большинства процессов починки:
• распознавание повреждения
• устранение повреждения (за исключением разрыва спиралей или растепления пиримиди-
новых димеров):
• синтез репарированной ДНК;
• чи пития (образование связей).
Прямое исправление повреждений. Наиболее частая причина точечных мутаций у человека —
это спонтанное добавление метильной группы — один из типов алкилирования. Такие моди-
фикации исправляются бе । разрушения цепи ДПК ферментами — гликозтитазамн. Фермент
О-6-мстилгуанин-ДНК-метиптраттсфераза (MGMT) защищает клетку от токсических эффек-
тов. производимых алкилирующими агентами. переводя для этого метильную группу из 0-6-
мспигуттннн-ДНК в цистеиновым остаток в MGMT
Починка путем вырезания основания (эксцизионной репарации основания - BLR). Главные
способы, посредством которых происходи) починка оснований ДНК, включают устранение
поврежденного основания, которое осуществляют ферменты нуклеазы. Возникающая лакуна
может быть заполнена ДНК-полимсразой. что сопровождается шпацией с родительской ДНК
Неспаренные
нуклеотиды
АП-сайт
Поврежденное или
мцртфицурсф HOJJ
основание
ЦмклоСутановыи
димер
Слоя анные изменения
ионизирующая радиа ия
актив <ые формы кислорода
Спонтанные изменения,
ионизирующая радиация
Ошибки репликации,
рекомбинация между
аллеями
|а1К I
Ф-облучение
Фрагмент нормальной ДНК
Разрыв в одной цепи Разрыв в обеих цепях
Сшивка целей
Рис. 3-13. Повреждения? которые могут возникать в ДИК спонтанно или ноя действием разных агентов
(Burgers Р MJ. ст а!.. 2001).
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 137
Окислительные повреждения, как основные, так и индуцированные. яв. якися важными при-
чинами для починки оснований ДНК.
Починка путем вырезания нуклеотида (экспизионнои репарации нуклеотида — NER). Систе-
ма \ER обеспечивает способность клетки устранять объех ныс повреждения в ДНК. KI R уда-
ляет содержащий повреждение олигонуклеотид из ДНК посрсдс ном распознавания поврежде-
ния. разреза вырезания. нового повторного синтеза и дигании. ДНК-полимеразы (у эукариот
их известно более 15) различаются но ряду признаков, в том числе по количеству нуклеотидов,
которые они могут встрой и. в растушую непь за один акт связывания с дуплексом ДНК. ДНК-
полнмеразы 0 и X. присоединяют один нуклеотид а при участии белка PCNA (proliferating cell
nuclear antigen) ДНК полимеразы Sue- способны вставить фрагмент необходимой длины.
Повреждения ДНК в активно транскрибирующих генах, особенно в транскрибирующей спи-
рали. чинятся в нервхю очередь и потому быстрее, чем повреждения ДНК в остальной части
тспома Так клетка защищает целостность процесса транскрипции.
Репарация ошибок спаривания — миемзтч репарация (mismatch—ММК) исправляет ошибочно
встроенные неповрежденные основания. которые не образуют нормальное Уотсон-Крт конское
спаривание (А-Т. С -G). Такие ошибки инотда происходят при рспликашш с помощью ДНК-по-
лимсразы. В MMR участвуют фермезпы. вовлеченные в BER и NER. а также специалншрованше
зрерменты С интезЛНК при MMR оехшеепмяетея ДНК-патимеразами б и г.
/омояогичпая рекомбинация У эукариот1 существуют два ос ювные способ, verpa нпь лвухпе-
почечныс разрывы: томолотмчная рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение
негомологичных концов. Прямое соединение сломанных концов требхет спсниальйых <|зермсн-
тов. которые узнают и связывают разорванные копны с последующим их сшиванием. Починка
рпривои двойном спирали (и ратрывов очной спирали) обычно включает в себя продуцирование
трехконечного олноспнралыюго хвоста с помощью экзонуклеаз или геликаз. Посредством инвазии
спирали, при которой односпиральный хносг нтортастся в неповрежденную гомологичную молеку
ту ДНК. син тезируется ДНК. Одновременно образуется гак называемое хаизтлсенское сочленение
в комплексе ДНК. Через промежуток этою сочленения проводятся две молекулы ДНК (как со
структуральным перекрестом, так и без нею). каждая из которых более нс содержит разрывов.
Пегомаиогичное соединение концов — NHEJ (Nonhomologoib End-Joining). Если разорванная
ДНК имеет тупые концы и соединение лз vx фрагментов ДНК происходит случайно, то такая
реп рання называется NHEJ. Г тавным компонентом NHEJ восстановительного комплекса яв-
ляется зависящий от ДНК белок киназа (DNA-PK). или белок Ku — гетеродимерная субъеди-
ница. состоящая из двух белков Кн7() и КззХО. ‘Этот белок служит для выравнивания концов
разорванной ДНК. чтобы упростить процесс их склеивания или выступает в качестве сигналь-
ной молекулы .тля $юбилизаиии других восстанавливающих белков
Нозникнонение генных мутации. Генная, или толковая мутанизз предо зазияет собой измене-
ние последовательности нуклеотидов в пределах одного гена, приводящее к изменению харак-
тера действия гена.
(очковые мутации можно разделить на несколько типов в зависимости от характера моле-
кулярного изменения в гене.
• Missvnse-мугдния. В одном из триплетов происходит замена о тното основания (например.
ИТ1->1 IT), н результате чего измененный триплет кодпрхет аминокислоту, отличную от
той. которую котировал прежний гринлег. Замены основания — это замещение правильно-
го нуклеозида посторонним; они могут далее подразделяться на «переходы», при которых
одно пуриновое основание заменяется другим пуриновым или одно пиримидиновое — дру-
гим пиримидиновым и «траисвсрсии».
• Мутация со с звизом рамки считывания. Если в последовательность ДНК включается новое
основание или пара оснований. то вес лежанше за ними триплеты изменяются, что влечет за
собой изменение синтсзируемото ззолнпезззтзд.-з. Среди згих мутаций наиболее итчитсяыизя
часть продуцируется ошибкамн репликации ДНК.
• Nonsense-мутапия. В результате замены одного основания ззозникает новый гринлег. пред-
ставляющий собой терминирующий кодон В генетическом коде имеется три таких трипле-
та. При такой замене цепь отличается ио своим свойствам от полипептида, который синте-
зировался прежде.
138 Глава 3
• Синонимическая m «cnce-мутапия. Генетический код обладает значительной избыточностью:
два или несколько его триплетов колируют одну и ту же аминокислоту. Поэтому можно ожи-
дать. что в некоторых случаях при замене оснований один триплет заменяется трхгнм — сино-
нимическим. кодирующим ту же аминокислоту. Такие синонимические мугании. вероятно,
довольно обычны.
Относительная частота мутации является результатом состя ания между починкой и репли-
кацией. Чем больше починок, которые производятся перед репликацией, там меньше частота
мутаций для данного количсстш индуцированных повреждений ДНК. Значимыми регуляюра-
ми этого состязания являются проверочные гены клеточного никла (например. р53). посколь-
ку если клетка не допускается для входа в S-фазу ни проверочном пункте GI/S. то возможно
большее число починок, прежде чем клетка начнет воспроизводить свою ДНК.
Оценка генетического риска. Важным моментом в оценке генетических мутаций, индуци-
рованных химическими агентами в зародышевых клетках, является отношение между экспо-
зицией и длительностью репликации ДЫК (г.е. если повреждение нанесено, можег ли оно
быть починено до репликации?). Стволовая клетка спермагогоння является главным объектом
для оценки генетического риска, ибо она. как правило, присутствует в организме мужчины в
течение всего репродуктивного периода. Каждый раз. когда стволовая клетка спермагогоння
делится, она производит диффсрениир /юшннся сперматогоний и новую стволовую клетку. Эта
клетка может I акаплнвать генетические повреждения от хронических экспозиций. В генезисе
яйцеклетки первичный ооцит заканчивает I мсйотическое деление, и дальнейшая S-фаза про-
исходит после образования зиготы. По этой причине ооцит зашишен от генетических мутаций,
вызываемых большинством химических агентов.
Методы обнаружения генетических изменении. Методы генетической токсикологии служат
двум взаимосвязанным, но различным целям в токсикологической опенке химических веществ:
• идентификация мутагенов для определения их опасности,
• характеристика функциональных зависимостей доза—ответ и механизмов мутагенеза.
Некоторые методы определяют прямые мутанин. а другие — обратные мутанин. Прямые мута-
ции — это генетические изменения в первозданном гене, и они обнаруживают себя изменением
фенотипа, вызванном изменением или утратой функции гена. Обратен мутация — это та. которая
восстанавливает функцию гена в мутанте и приводит к возвращению первозданного фенотипа.
Многие соединения, которые сами по себе не янлякнея мутагенными или канцерогенны-
ми. могут превратиться в мутагены и канцерогены вследствие обмена веществ в организме.
К настоя цему времени известно около 2000 аутосомных доминантных признаков у человека.
Частично совпадающие или индивидуальные характеристики генного ответа на определенный
токсикант используют для выработки стратегии лечения экологически обусловленных заболе-
ваний. выбора лекарственной терапии. Для правильной интерпретации результатов судебно-
химической экспертизы или клинико-токсикологического исследования также важны данные
генетического анализа. Вот несколько примеров. Гены алкоголмегидрогспазы печени представ-
лены тремя полиморфными локусами (ADII-1. ADI(-2. ADH-3). альдегиддегндрогепазы — двумя
(Al DH-1 и ALDH-2) Наследственными вариациями в молекулах двух ферментов, расщепля-
ющих этанол, объясняются специфические реакции на алкоголь людей, у которых отсутствует
изоформа ALDH-1. После употребления малых количеств алкоголя немедленно краснеет лшю.
возникают тахикардия, жжение в желудке, мышечная слабость и другие признаки отравления.
У некоторых больных появляется злокачественная гипертермия при ингаляционном наркозе
(фгоротан и лр.). температура гела повышается до 44 С. развиш&отся тахикардия. гипоксия,
апилоз, гиперкалиемия. Причиной злокачественной гипертермии является мутация в гене риа-
нодинового рецептора н других генах. В хирургии для мышечной релаксации применяется пи-
гидии. В норме этот препарат, действующий по типу яда кураре (остановка дыхания), быстро
разлагается сывороточной холинэстеразой. Гели холинэстераза атипичная из-за мугании в со-
ответствующем гене, то при введении дитилина происходит остановка дь хапня на I ч. Больных
можно спасти только искусственной вентиляцией легких в течение этого времени Становится
ясно, что чем более специализировано новое лекарство, тем более вероятно <выпадснис» опре-
деленного числа пациентов из успешного лечения.
Любые фармакогенетические реакции развиваются на основе широкого генетического по-
лиморфизма в человеческих популяциях, эволюционно сформировавшегося до появления но-
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 139
вых фармакологических средств. Успехи токсикогспстики позволили понять толерантность и
повышенную чувствительность к лекарственным препаратам у отдельных лип. От достижений
токсикогенетики ио многом зависит индивидуализация лечебных мероприятий (выбор анало-
га. дозы, способа введения). Хорошо известии зыпчнтельная вариабельность эффективности и
побочных действий лекарству разных групп населения и отдельных лип. Клинические испыта-
ния лекарственных препаратов проводятся для выявления побочных эффектов у I из 500 чело-
век или I из КИЮ человек, и маловероятно, что они учитываются у I из 50 000. При введении
стандартной дозы лекарства его концентрация в крови у одних людей через определенный про-
межуток времени оказывается ниже оптимальной, а у других достигает токсического уровня
Индивидуальная переносимость химических соединений, толерантность организма человека
к токсикантам обусловлены генетическими особенностями каждого индивидуума. Разработан-
ные чувствительные маркеры исполыхюгея при скрининге соединений на этапе клинических
испытаний, чтобы подучить наложные резуль аты Токсикогенстика и токсикогеномика раз-
рабатывают высокопроизводительные технологии анализа генетического материала лля опен-
ки рисков действия различных токсикантов и развития побочных эффектов лекарственной
терапии в зависимости от индивидуального гено- к фенотипа. Выявление генетических осо-
беннос1сй. которые определяют индивидуальные реакции организма на действие химических
вешеств. позволяет целенаправленно прогнозировать побочные эффекты и применять препа-
раты для определенных групп пациентов согласно нх генетическому паспорту. Вариабельность
генома человека (примерно 3 млрд пар оснований), по современным опенкам, составляет 2—
Н» млн пар оснований, часть из которых и определяет индивидуальные особенности ответа на
воздействие препаратов.
Воздействие ксенобиотиков на организм реализуется через реакции, осуществляемые специ-
фическими ферментативными системами клеток (см. гл. 4). В пени метаболических превраще-
нии окисление исходной .молекулы часто называют этапом активации, который осуществляется
в основном изоферментами цитохрома Р450 и. реже, флавинсодержашими монооксигеназами
и алкогольдегидрогепазами (I фаза) Этап детоксикации (П фаза) осуществляется эпокси.;нид-
ролазами. i зутатион-S трансферазами, сульфатазами и др. (см. гл. 4). Хорошо известно, что
вариабельность некоторых цитохромов суперссмсйспза цитохромов Р450 обусловливает раз-
личную скорость биотрансформации ксенобиотиков. Так называемые «быстрая» и «медленная*
группы пациентов отличаются по показателям накопления и выведения химических соедине-
нии в 10— 100 раз. Увеличение эффективности действия лекарез венных препаратов повышаем
з< риск развития побочных э<|)фектов. По данным Американской медицинской ассоциации, в
США в 1994 г. развитие побочных реакций явилось причиной госпитализации 2 млн человек
и НЮ (ЮО смертельных случаев.
Большинство каскадов реакции с участием микросомальных ферментов имеют в качестве
терминальною звена цитохром Р450. В организме цитохром Р450 существует в виде множества
изоформ (на СС1ОДНЯШНИЙ день известно около 400). кодируемых рахтичными генами. Эти
белки обладают рахтичной. иногда перекрывающейся субстратной специфичностью и рахтич-
ными механизмами резуляции экспрессии (большинство изоформ цитохрома являклся инду-
цируемыми. т.с. их количество в клетках значительно увеличивается при появлении субстрата).
В соответствии с принятой номенклатурой семейства обознач потея римскими цифрами, под-
семейства — заглавными буквами латинского алфавита, а отдельные изоформы — арабскими
цифрами. Каждая изоформа имеет специфический спектр метаболизируемых ехбетратозз. По
при эт эм одно и то же соединение может метаболизироваться рахпнчными изоформамн Р450 с
ооразованием как одинаковых, так и рахшчаюшихся продуктов. В зависимости от преобладания
в клетке тон или иной нзоформы может меняться и состав нргнуктов реакции, в частости со-
отношение продуктов активации и детоксикации. У генов ряда изоформ существуют аллельные
варианты с различном ферментативной активностью бе зка-нродукга. Наличие таких аллелей в
значительной степени обусловливает существование внутривидовых и межтканевых различий
в чувствительности к рахзнчным токсикантам Есть 39 генов, которые колируют изоформы ни-
тохрома Р450. Три подсемейства (I. 2 и 3) включают 19 изоформ. Полиморфизм были выявле-
ны в нескольких изоформах (CYP2D6, CYP2C9. CYP2C19. CYP2E1 и CYP3A4). Генетический
полиморфизм, связанный в особенности с CYP2D6. важен с токсикологической точки зрения.
Например, есть препараты, для которых биотрансформаиия в организме регулируется этим
140 Глава 3
ферментом (опиаты. 0-блокаторы. антнаритмичсскис препараты и антидепрессанты). Друше
ксенобиотики действую! как ингибиторы лото фермента (метадон. декс1ронропоксифен) и.
таким образом, увеличивают их токсичность. У пациентов с мутациями в CYP2D6 происхо
дит нарушение метаболизма препаратов, и они имеют тенденцию накапливаться в организме.
Следовательно, значительно возрастает риск токсичности, если доза не подобрана согласно ге-
нотипу Так. главный метаболит кодеина, лскстромсторфаиа и этил морфина — морфии. При-
близительно 1% лиц кавказской национальности имеют дефицит фермента, обеспечивающего
метаболический путь указанных ксснобиошкон. В связи с этим у таких пациентов образуется
недостаточное колнчес во морфина и аналгезируюшнй эффекз проявляется слабее. Другие
примеры. CYP1A1 — ген. колирующий <|крмен1 арилуглеводородкарбокенлазу (АНН — aryl
hydrocarbon hydroxylase) из супсрссмейства цитохромов 1’450. Субстратом для этой изоформы
являются вещества, содержащиеся в табачном дыме, которые при оксигенированпи превраша-
ются в токсичные производные фенола и различные эпоксиды. АНН участвует в метаболиз-
ме эстрогенов и осушсств тает идроксилированис эстрадиола. что приводи! к сю активации.
На сегодняшний лень идентифицировано 4 полиморфизма в гене CYP1AI. Цитохром CYP1A2
участвует в метаболической активации проканиерогенных ариламинов и гетероциклических
аминов, образующихся при термической обработке пиши Фермент клеток печени, который
участвует в метаболизме амфетаминов, сердечных гликозидов, нитрозамипов и ряда друшх
веществ, кодируется геном CYP2D6. У европеоидов в ависнмосги от арсаяа обитания 5—10%
населения гомозиготны по аллелю. при котором данный фермент отсутствует. Примером фер-
мента. нс принадлежащего к группе цитохромов, является NADPH-хиноноксидорсдукгаза 1
(ген NQO1) Этот фермент катализирует превращение хинонов в относительно стабильные
гидрохиноны, подвершюшиеся конъюгации и выведению. При этом предотвращается обра-
зование полухиноновых радикалов с последующим формированием АФК. Экспрессия гена
NQO1 индуцируется окислительным стрессом, влиянием циклических углеводородов табачно-
го дыма и промышленных акрилатов NQO1 играет ключевую роль в детоксикации бензола,
инактивируя хиноны, образующиеся в результате метаболизма. Обнаружено два полиморфных
сайта в гене NQOI: С609Т (NQO1*2) и Г464С (NQOP3). Полиморфизм NQOP2 можно считать
нонсенсмутаиисй. так как он приводит к появлению стоп-кодона и отсутствию белка-продук-
та, однако частота встречаемости его в различных популяциях варьирует (13 30%). Аллель
NQO1*3 встречается реже, его частота не превышает 5%. Для фермента этого аллеля показано
снижение энзиматической активности в 2 раза по сравнению с нормальным ферментом.
Гликопротеин 1’ — транспортный бег ж. основными функциями которою являются пре-
пятствие всасыванию ксенобиотиков в кишечнике и предотвращение их проникновения через
гнстогсматичсскин барьер при попадании в органы м. а также скорейшее выведение в желчь и
мочу (см. гл. 4). Р гликопротеин — А ГФ-зависимый транспортер содержится в печени, кишеч-
нике, почках и эпителиальных тканях, колируется определенным набором генов. С токсиколо-
гической точки зрения, при генетических вариациях взаимодействие лекарств на уровне всасы-
вания или экскреции может привести к накоплению препаратов и увеличению токсичности
Субстрат, окисленный при участии цитохрома Р450 или какою-либо другого фермента, ла-
ice подвергается воздейсшню ферментов коньки аиип. кагал г шруюшнх включение в молекулу
ввшссгва водорастворимых остатков: глутатиона. серной кислоты и др (см. гл. 4). В результате
метаболит становится гидрофильным и выводится из организма с мочой. На этом липе рабо-
тают S-трансфсразы. эноксилгидролазы. УДФ-1.чюкуронил трансферазы и ацетилтрансферазы.
В случае сниженной активности фермента, например вследствие присутствия специфического
аллеля гена, в клетке будет происходить накопление продуктов 1 фазы биотрансформаиии и
соответственно повышаться риск повреждения ДНК. Ряд веществ иод действием ферментных
систем 11 фазы биогрансформаиии. наоборот, способен превращаться в активные каппсро
генные метаболиты. Например, нитрирование эноксил! илрплаыми 7.8-оксила бензапирена до
гидролнола с дальнейшим образован нем из него лиолэпокеида приводит к активации молеку-
лы и превращению се непосредственно в канцерогенный метаболит. Подобный эф<|>ект чаще
проявляется при сниженной активности ферментов альтсрна1мвно|о пут Глюкуронизаиия.
как известно. — важнейшая реакция детоксикации соединений. Два генных семейства коли-
руют изоформы 1люкуронозилтрансферазы: UGT1 и UGT2. Мутация изоформы (UGT1A1)
приводи! к гипербилирубинемии. что связано с последующими нарушениями метаболизма
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 141
Суперсемейство GST — это гтутатиои-5-траисферазы. катализирующие взаимодействие
глутамата с а 1екгрофи.1ып>1мн соединениями, содержащими агомы N. S. О Функциональ-
ная роль глутатион-трансфераз заключается в ферментативной конъюгации сульфгидрильной
(- SH) группы с электрофильным! молекулами самих ксенобиотиков или их метаболитов, об-
рязошшншхея в процессе 1 фазы. Подобная детоксикация траст ключевую роль в обеспечении
резистентности клеток к перекисному окислению липидов, алкилированию белков и другим
процессам с участием свободных радикалов. Существуют несколько классов глутагионтранс-
фераз в зависимости от субстрата и органной принадлежности ферментов. Их синтез контро-
лируется генами, расположенными на различных хромосомах. Для каждого из них описано
несколько видов полиморфизма. который влияет па функциональную <!К1ивнос1ь ферментов.
Глутатионовые .Ч-транв|н»разы участвуют в активации и детоксикации многих ксенобиотиков.
Так, токсичность парацетамола в больших лозах связана с истощением печеночного глутатио-
нового депо. Отмечена высокая распространенность у людей генетического полиморфизма для
нескольких GST. что. как считают специалисты, связано с увеличением риска развития рака,
обусловленного экологическими токсикантами (см. гл. 10). В метаболизме гетероциклических
ароматических аминов у человека важную роль играет арнламин-Ь1-лцстн.тгранс(|>ераза (NAT).
Этот фермент катализирует ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и от-
носится к ферментам II фазы биотрансформации ксенобиотиков. Известны две и оформы
NAT человека — NATI и NAT2. Считается, что NAT2 обладает мсныпей специфичное! ыо и
метабс лизирует более широкий круг веществ. поэт< му именно NAT2 привлекает большее вни-
мание исследователей. NAT2 экспрессируется нреимущешвенно в клетках печени, однако этот
фермент синтезируется и в других тканях, в том числе в тканях молочной железы. По феноти-
пическим прояв. енням активности NAT2 людей можно разделить на быстрые, промежуточные
и медленные ацстнляторы (ранее выделяли только группы быстрых и медленных апетилято-
ров) В настоящее время известно 36 аллелей гена NAT2. которые различаются сочетанием
12 миссенс-мутаний. 4 молчащих мутаций и делении одного нуклеотида, приводящей к сдвигу
рамки считывания. Частоты встречаемости аллелей NAT2 значительно варьируют в разных
попу яииях. К наиболее распростра ценным средн европеоидов медленным аллелях! относятся
кластеры NAT2*5 (T34IC) и NAT2*6 (G590A) (в скобках указана характерная мутация). Клас-
тер N'AT2*7 (G857A) представлен в основном у монголоидов, a NAT2*I4 (GI9IA) — только у
HcipoiuoB. Увеличение скорост ацетилирования связано с токсическими эффектами некото-
рых препаратов. Полиморфизм ацетилирования определяет скорость метаболизма препаратов,
относящихся к арнламинам. гетероциклическим аминам, гидразинам. Сульфатирование и ме-
тилирование — также важные пути метаболизма многих ксенобиотиков. Сульфотрансфсразы
(SULT. SU1 Т1 и SULT2) и метил трансферазы (меплтрансфераза (МТ), катехол меги.прансфе-
раза (СОМТ). мстнлтрансфсраза тиопурина (IРМТ) и тримстилтрансфераза (ТМТ)| катализи-
руют эти реакции. В настоящее время идентифицировано несколько видов полиморфизма для
этих ферментов, но их клиническое проявление сше неясно.
Необходимо отмстить, что степень канцерогенного воздействия химических соединений на
уровне их метаболизма определяется балансом активирующих н детоксифицирующих реакции,
осуществляемых полиморфными (}>ерментными системами. Клеточные защитные механизмы
прот !в АФК включают следующие ферменты: глутатион-псрокеитазу. каталазу и семейство
супероксиддисмутаз. Представителем этого семейства является митохондриальная Mn-SOD
<см.выше и гл. 8.5). Mn-SOD синтезируется в цитозоле и после цостгрансляиионной модифи-
кации транспортируется в митохондрии. Этот фермент катализирует реакцию взаимодействия
двух могекуч супероксид анион радикала с водой с обра ованием пероксида водорода и кис-
лорода. В гене Mn-SOD присутствует однонуклеотидный полиморфизм (GTT—GCT) при-
водящий к замене 16 аминокислоты (Vai — Ala) в сигндльноу! пептиде, теряемом в процессе
посттранс-чяпионной модификации. Было показано, что при подобной замене происходит
изменение вторичной структуры белка (трехскладчатый слой вместо а-спиралн) и нарушается
транспорт фермента в митохондрию.
Анализ генстческого полиморфизма ферментов является основой для определения степени
индивидуальной химической чувствительности (см. гл. 10). Основные локусы rcHoyia отвеча-
ющие за индивидуальную реакцию нациста, хорошо известны. Развитие технологии опреде-
ления нуклеиновых кислот позволило сделать первые шан! по внедрению токсикогеномных
142 Глава 3
тестов в практическое здравоохранение. Существенное значение в современных технологиях
имеют чувствительность. селективность, экспрессное! ь. производительность. стоимость и ин-
формативность анализа. В настоящее время технология биочипов активно используется для
определения экспрессионных нрсм]>илсн работы генов и определения оеноцуклеотидных замен
(вариабельных локусов ДНК). являющихся признаками конкретного генотипа. Эта тсхнолошя
позвс тяст уже сегодня проводить до 300 000 определений в день у одного пациента, составляя
основу генетической паспортизации насе синя. Биочипированне даст возможность определять
индивидуальный полиморфный профиль ферментов, например цитохрома Р450. Один из но-
вейших инструментов биологии и медицины XXI века — биолотнческтте мпкрочипы (biochips)
или. как их чаще называют, — DNA microarrays — организованное размещение молекул ДНК
иа специальном носителе — платформе, пластинке из стекла или п тастика. площадью около I
кв.см, на которой в определенном порядке расположены ячейки (до 1 млн на 1см3). содержа-
щие иммобилизованные одноцепочечные олигонуклеотиды с уникальной последовательнос-
тью оснований. Базовым принципом для создания ДНК-чипов является линейное узнавание
стереокомплементарных основании (А — T/U. G — С) нуклеиновых кислот (ДНК или РНК)
Олигонуклеотиды чина т норидизуются с меченными, например флюоресцентной меткой, на-
борами молекул ДНК или РНК. Спустя некоторое время платформу промывают. Рели в ттаборе
имеется олигонуклеотид. комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними образу-
ется водородная связь, и при промывании он нс будет удален. в отличие от олигонуклеотидов,
которым не нашлось комплементарных оснований. Затем производится детекция наличия ме-
ченых молекул в ячейках. Информация считывается с помощью флюоресцентною микроскопа
из и специальною лазерною хсгройсгва лля чтения. Чины такого тина изготавливают в разных
фирмах, в частности в Москве, в Институте молекулярной биологии. Способы изготовления
биочипов различаются. Одна из круттнеишттх фирм по производству биочипов — Allynielrix
— изготовляет биочипы таким же способом каким изготовляют электро тные чипы, г.е. ме-
тодом фотолитографии с использованием специальных микромасок и лазера. На одном чипе
расположены десятки (а иногда и сотни) тысяч пятен размером в несколько микрон Каждое
пятно — это один уникальный фрагмент ДНК длиной в десятки нуклеотидов. Изготовленный
таким образом биочин в дальнейшем птбрндизуютс меченными красителем молекулами ДНК
После гибридизации на биочипе возникают паттерны — причудливые узоры, различающиеся
у нормальных. ракэвых клеток тип клеток, например, при различных видах лейкозов, или у
ДНК. выделенной от разных больных. По виду паттернов можно с большой вероятностью
предсказать течение болезни на самой ранней се стадии. Таким образом, сопоставив нуклео-
тидные структуры взаимодействующих с исследуемым образном олигонуклеотидов и интен-
сивность сигнала, можно собрать информацию о последовательности меченой молекулы ДНК
(РНК) или о наличии и количестве искомой последовательности в образце.
В настоящее время, после установления структуры геномов ряда организмов, решается
новая задача — как регулируется активность отдельных генов в рамках генома как целого.
Современное развитие технологии биочинов позволяет определить функциональное состо-
яние всех генов, т.е. какие гены работают в данной клетке на какой-либо сталии развития,
а какие находятся в неактивном состоянии, а также установить взаимосвязь сигнальных
регуляторных путей клегки. На биочинах проводят одновременный анализ работы тысяч и
десятков тысяч генов и сравнивают экспрессию этих генов в здоровых н в поврежденных
клетках. Такие исследования номоыют увиде!ь (сразу, за один эксперимент!) влияние раз-
личных факторов (лекарств, экотоксикантов. белков, питания) на работу десятков тысяч
генов, со глава!ь новые лекарственные препараты и быстро выяснять, на какие гены и каким
образом действуют лекарства, прогнозировать их побочные эффекты. Биочины позволяю!
за считанные часы различать формы лейкозов (см. гл. 2.4.3), обнаруживать лекарственно ус-
тойчивые формы туберкуле к», тогда как другие методы требуют нескольких недель или даже
месяцев, следовательно, быстро выбрать нужный способ лечения, диагносиировать многие
виды рака
Биочипы были изобретены в копне 90-х годов XX в. России и в США. История создания
отечественного биочипа связана с именем академика РАН А Мирззбекова. директора Инс-
титута молекулярной биологии (недавно ушедшего из жизни). В настоящее время биочины
успешно производятся несколькими американскими биотехнологическими фирмами, а также
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 143
в России, в Ц нтрс биологических микрочипов Института м< шкудярпой биологии компанией
«Биочип-И МБ» (Biochip IMB)
• hup. 7v>,ww.dnachips.ru/n.issian/main.html сайт, содержащий обширную информацию о теоре-
тических основах, истории создания и областях применения ДПК-чи юв
• htip;//www.cimb.rclam.ru/ — Институт Молекулярной биологии н»м. Энгельгардта:
• http://www/aflyrnetnx.coni/ — фирма «AfTymctrix».
В США для американской армии р< (работали специальный биочин. сигнатизирукминй о на-
пиши бактериальной у1розы. Ес; и на такой бночип попадает ДПК патогенных микробов, то
фрагменты ДНК зондов с прикрепленными к ним микроскопическими час пн ам и золош вы-
страиваются в ряд между электродами идет ток. и биочин сигнализирует об угрозе (рис. 3-14).
В России разработаны биочины, позволяющие определят!» при био; огической угрозе (см
гл. 11) наиболее вероятные для использования в качсспзе биооружия возбудители сибирской
язвы. оспы, чумы и бруцеллеза.
В последние годы произошел значительный npoipccc в методах опрелелени i генотипов
(в SNP-анялизе). Coi iacno принятому определению. SNP — single nucleotide polymorphisms —
это олнонуклеотидные позиции в геномной ДНК. для которых в популяции имеются раз ич-
ные варианты последовательностей (аллели), причем редкий аллель встречается с частотой
не менее 1%. Иногда дополнительно опредетяются «распространенные SNP». для которых
частота встречаемости редкого а теля более 20%. Пракш icckhii интерес к 5NP сильно возрос
в хоте реализации проектов по определению полных нуклеотидных последовательностей ряда
моле (ьны.х организмов. В самом определении SNP заложена ориентация на их использование
в качестве генетических маркеров (ограничение по час юте встречаемости прогивоноставляег
их редким мутациям). Огромное количество SNP в геноме человека (по различным оцен-
кам. 3-10 млн распространенных SNP) позволяет отобрать порядка 100 000 SNP-маркеров;
ОМА BASED BIOCHIP detect* ОНА faun a pathogen by making а
bridge ofgeld panic »e Unking tweelectrodea The bridge complete*
an electrical circort. ia aktg an alarm
Рве. 3-14. Схема биочипа. сшнализирукнцего о наличии бактериальной угрозы (http://www.dnachips.ru/
russian/main.hini)).
144 Глава 3
при этом на каждый известный или предполагаемый ген приходится в среднем по 2 марке-
ра. Никакой другой гип геномных рахитчиЛ не способен обеспечить такую плотность иарти-
ровпния Надежный метод геномного скрининга SNP позволил бы разработать стандартный
подход к исследованию молекулярной природы предрасположенности к различным заболева-
ниям и предсказанию индивидуальной чувствительности к химическим, в том числе лекарс-
твенным веществам. Количество мегодов для SN’P-анали за. появляющихся в лабораториях,
быстро увеличивается. Для идентификации генетических изменений используют различные
методы детекции SNP. например ферментативные, химические (растепление тин лигирова-
ние). методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных
участков ДНК (секвенирование ДНК), хроматографические (ВЭЖХ). масс-спектрометрию,
резонансное тушение флюоресценции и др.
Альтернативой существующим методам детскими полиморфных участков ДНК является
масс-спектрометрическое дифференциальное ссквениромише. Время, затрачиваемое на анализ
каждого образна этим метолом, составляет всего несколько секунд и позволяет оттенить долю
SNP при анализе нескольких образцов одновременно. Ионизированные молекулы ДНК отры-
ваются от поняожки методами MAI DI (matrix-assisted laser desorpiion/ionisaiion) — тазерпой
десорбционной ионизации или ESI (elcctrospray ionisation) — эдектроснрсиион ионизации (см.
гл. 6). Молекулы ДНК разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную
камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скоро-
сти молекулы, которая в свою очередь прямо нропор1шоналы1а отношению массы летящего
молекулярного иона к его заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) уникальны для
каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, по-
этому чувствительность метода чрезвычайно высока Метод позволяет работать с ианолитрамп
образца. Масс-спектромегрическнй анализ успешно применяется для визуализации результа-
тов дсгскпии SNP другими методами.
Использование новых тсхноло т й уже становится реальностью в работе токсикологов, в
том числе и при проведении химико-токсикологического анализа, интсрирста т и результатом
экспертиз.
Посттепомпые технологии — геномика, протеомика, метаболомпка. метабономика дают
большие возможное т для определения качественных и коли т ствепных изменении метлболи
ческпх процессов в организме человека т ри дс тетин токсикантов. Протеомика изучает пол-
ный набор белков, производимых конкретными типами клеток Она включает определение
числа, структуры синтезированных организмом белков, их последовательности белок—белок и
остт| поляг т онных модификаций последовательности белок — другая молекула при в лпмо-
действиг внутри клетки. Таким образом, про-
теем является по ятием. описывающим все
эндогент ыс белки. Мезаболом представляет
собой совокупность всех небатьп тх молекул
или метаболитов в органелле, клетке, ткани,
органе или организме. Простейшая схема вза-
имодействия генов с метаболитами показана
на рис. 3-15. Ге лом определяет нозм жнуто
структуру метабатома, а мстаболом воздейс-
твует (положительно или отрицательно) на
экспрессию этой структуры.
Генетический кол генерирует сигналы
(транскриптом). которые определяют состав
протеома. который в свою очередь у гганав-
литмет к< талитические факторы метаболиз-
ма. Регуляция взаимодействий иикличиа. так
как по существу метаболом регулирует геном
г осредством специальных белково-метабо-
лических взаимодействий, которые прямым
1*мс. 3-15. Схема взаимодействии, от генома до мс-
табоюма.
и пт косвенным путем к нтролируют тенттуто
транскрипцию. В бносистемах существует
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 145
много примеров таких генов, которые регулируются промежуточными или конечными продук-
тами метаболизма посредством обратной связи. Наверное, самыми изученными и описанными
регх. шторным и системами в организме млекопитающих являются метаболизм холестерина и
метаболизм г гюкозы Оксид азота и кислород являющиеся продуктами метаболических пре-
вращении. также участвуют в регуляции фаиекриггции генов. Окружающая среда, лекарства
и продукты ин гания, которые могул содержать ксенобиотики и токсичные вещества, взаи-
модействующие с ДНК. мРНК и белками, определяют конечную метаболическую структуру'
био готических систем, тогда как геном зг прог сом определяют лишь возможную с труктуру
метаботома.
Определение терминов «мстаболомика» гг других «омиков» нс являются строгими в научном
смысле. Слово «метаболомггк» впервые было опубликовано в книге «Effect of Slow Growth on
Metabolism of Escherichia coli. as Revealed by Global Metabolite Pool (metaljolom) Analysis» в 1998
г. Метаболом описывает совокупность метаболических процессов в каждой клетке. ткани, ор-
ганизме или биологической жидкости; следовательно, метаболомика является системой техно-
логии. направленных на объяснение и изучение мстаболомов. Подобно геномам и протеомам.
существуют различные метабозомы, содержащиеся как в клетках одноклеточных организмов,
так и клетках тканей многоклеточных организмов. Также существуют мстаболомы и в биоло-
гических жидкостях — моче, спинномозговой жидкости и плазме В биологических жидкостях
человека и животных можно обнаружить различные метаболиты при норхгалыгых хгетаболичес-
ких пропессах гг при возлснствпи ксенобиотиков на организм.
Нс давно лязг обозначения в биологических жидкостях взаимодействия между метаболически-
ми моделями н ксенобиотиками при различных патологических пропессах было введено слово
метабономика* В токсикологическом определении метабономика — эго изучение множествен-
ных метаболических изменений в биологических жидкостях, при патологии или генетических
модификациях. Ядсрно-мапгитиый резонанс (ЯМР) гг масс-спектрометрия (МС MS), новеггшис
тандемные мстодыСсм. гл. 6) являются основными инструментами новых технологий.
В протеомике часто применяют различные варианты масс-спсктрометрии. используя лазер-
ную десорбционную нонггзпнню — MALD1 иди электросирейнхю ионизацию — ESI (см. гл.
6). Подученные результаты отвечают на вопрос: чем различаются белки больной и нормальной
клетки? Двухмерный гель-электрофорез в настоящее время является самым популярным мето-
дом. Клеточные белки сначала изолируют из клеток или тканей преимущественно биохимичес-
кими и/илм хроматографическими методами. Клеточные белки разделяются на матрице геля
акриламида по рН-градисигу. что позволяет каждый белок в изоэлектрической точке скон-
центрировать гга геле. Начальное разделение на геле (по зарядам) сопровождается повторным
разделением (перпендикулярно к первому) на том же самом геле относительно молекулярной
массы. Используя автоматизированные системы SPOTS или альтернативную технологию, элю-
ируют определяемый белок. Изолированные белки расщепляются трипсином для получения
фрагхгентов пентилов, состоящих из 10—20 остатков аминокислот. Масса полученных пепти-
дов может быть точно определена масс-спектрометрией (см. гл. 6). Тандемная масс-спектро-
метрия (MS-MS. MS2) позволяет фрагментарно определять аминокислотный состав пептида
в небольшой облает гг копни геномной последовательное иг без использования полной длины.
Фрагменты слишком мало различаются по массе, чтобы их можно было определить с помощью
обычной MS. Двухмерный электрофорез имеет низкую воспроизводимость, трудности автома-
тизации и другие существенные ограничения В 2000 г. был представлен новый подход, кого
рыи использует жидкостную хроматографию и повое поколение масс-спектрометров. Сложные
смеси подвергаются протеолизу трипсином (т.е. ферментативному расщеплению). пептиды,
разделенные с помощью жидкостной хроматографии, полаются в масс-спектрометр (ВЭЖХ-
МС) Лля обнаружения пептидов гг белков предпочитают применять MS из-за ее чувствитель-
ности и автоматизации компьютерных алгоритмов, которые способны использовать данные
MS для идентификации закодированного геном пептида.
Прихгеггсние ЯМР в метаболических исследованиях может иметь два подхода. Первый под-
ход может быть объединен под общим названием «метаболомика» — это обнаружение и иден-
тификация всех эндогенных соединений и метаболитов ксенобиотиков. Второй — обнаружение
и идентификация в биолог пческнх жидкостях эндогенных соединений и метаболитов ксено-
биотиков. характеризующих конкретное патологическое состояние организма, построение мо-
146 Глава 3
делен различных патологических состояний. Второн подх иг разработан Д. Николсоном с сотр. и
назван «мегабономика* Видимое различие между мстабаюмикой и метабономикой состоит в том.
•по мстаболомика — это изучение метаболизма в клетк и ткани, а мегабономика — это подход к
изучению метаболизма при испо штопании биологических жидкостей как индикаторов проис-
ходящих (патологических) процессов. При токсико отческом исследовании используются оба
подхода. В конечном счете эти два подхода должны отвечать на ключевой вопрос токсикологии:
какой биохимический вред нанесен клетке и как >го связано с опрелоденным патологическим
состоянием9 «Метаболическое профилирование» и «биохимическое профилирование» — также
широко используемые термины для описания метаболических исследовании М таболическое
профилирование является способом определении качества и/или количества небольших моле-
кул в биологическом объекте. Анализ может включать один или несколько технологических
приемов, таких как высокоэффективная жидкостная хрома тот рафия (ВЭЖХ). газовая хрома-
тография (ГХ), капиллярный электрофорез (КЭ). МС и ЯМР (см. гл. 6). Исторически профи-
лирование эндогенных метаболитов сводилось к опрсдс синю специфических соединений или
типов соединений. Например, после приема красною вина находящиеся ортанические кисло-
ты в моче или флавоноиды в крови могут быть обнаружены несколькими методами — ГХ-МС.
ВЭЖХ-МС или ЯМР Таким образом, получался «снимок» уровня метаболитов в определенное
время и в определенном состоянии. В настоящее время метаболическое профилирование мо-
жет быть рассмотрено уже в составе (системе) метаболома. Современные анд. итические техно-
логии нацелены на качественное и количественное определение всех эндогенных метаболитов
в различных типах клеток, тканей и биологических жидкостей. Пока это трудновыполнимо,
но ученые пытаются найти пути подобного определения. Проблема заключается в разработке
единых (стандартных) аналитических методик определения и регистрации результатов при ис-
следовании биологических объектов.
В течение многих лет определение особенностей метаболизма с помощью скрининга
биологических жидкостей являлось основным методом для обнаружения врожденных ано-
малий метаболизма. Токсттколотам необходимо количественное определение специфичес-
ких метаболитов или классов метаболитов. В настоящее время для обнаружения метабо-
лических маркеров токсичных веществ или лекарственных средств используются самые
современные аналитические методы (см. гл. б) Для онреде. сиия большого количества ме-
таболитов стали испочьзовать МС и ЯМР, их разновидности, комбинированные методы,
например ВЭЖХ МС-ЯМР. Данные, полученные в этих исследованиях для воссоздания
реально происходящих процессов in vivo, опираются на установление полной структуры
определяемых веществ.
Резулыаты анализов позволяю! классифицировать проявление различных типов токсичнос-
ти или аномалий в организме (см. гл. 6.4.4) В литературе, посвященной ЯМР-исследованням.
часто используют графические способы представления данных. Падучают спектральные кар-
тинки. отнесенные к тому или иному мстаболому (ус говно их можно сравнить с характерны-
ми паттернами на биочипах). При этом проявляются явные противоречия, которые касаются
информации о биомаркерах — метаболитах токсикантов в моче, полученной ранее традицион-
ными методами. Во всяком случае, новейшие тандемные инструментальные методы, например
ВЭЖХ-ЯМР. при разделении и определении метаболитов в биологических жидкостях, имеют
большие возможности для понимания токсического действия лекарственных средств и других
химических веществ. Во многих токсикологических исследованиях в результате мониторинга
процессов, нронсхо щщих в opiaiin змс в ответ на действие лекарств, отмечается, что изменения
в метаболизме предшествуют гистологическим изменениям. Очевидно, возможность определе-
ния однозначных индивидуальных ответных реакций до получения достоверно фиксированных
токсикологических или гистологических реакций пронесет несомненную пользу пациентам.
В настоящее время и .тля разработки новых лекарств применяются метаболомнческие ис-
следования Доказательством этому является создание в США. Японии и Евросоюзе неболь-
ших компании с целью выполнения различных метаболомнческих анализов для бо ее крупных
фармацевтических органи тип. Одна из задач этих компаний заключается в быстром получе-
нии ранних метаболических маркеров токсичности (или безопасности)лекарств. что может ис-
пользоваться для оценки качества и безопасности лекарственных средств для людей и живот-
ных Другая задача зак. ючаегся в открытии новых метаболических маркеров, образующихся в
Некоторые аспекты молекулярной токсикологии: от генома к метаболому 147
организме человека в ответ на действие лекареззз, которые могут в дальнейшем использоваться
для выявления людей, реагирующих на то или иное вещество особым образом. По существу
мегзбо.зомззка ускоряет процесс создания лекарств и значительно увеличивает шансы на бе-
зопасное и «ффективное их применение. Мезаболомика и мезабономпка позволяют отличить
«нормальный» метаболизм оз «измененною».
Заключение
• Генетическая токсикология оценивает результаты воздез1сгвия химических зз физических
агентов зза геззезнческнй материал и Генезичеекие процессы в клетке.
• Пронессамзз метаболизма клеток, их делением и дифференцировкой управляет сложная сеть
молекулярных взаимодействий, определяющая урозиззз экспрессии рахзззчззых генов, инфор-
мацию о которых можно получил. е помощью биочипов.
• Новые высокопроизводительные технологии, применяемые в генетической токеззколопзи.
позволяют идентифицировать мззозие мутагены. оценивать риск действия различных зокси-
канюв и развития побочных эффектов лекарственной тсразпззз в зависимоствз от изздивцду-
алызого гено- зз фезютнпа.
• Масс-спектрометрический анализ полиморфизма ДНК — эффективный способ определе-
ния полиморфизма с очень нзззкозз стоимостью одного определения зз высокозз произво-
дительностью. Возможность мультиплексною оззределлзия мутаззий или замен позволяет
определять до I 000 000 зочек в день
• Знание мегаболома будет способствовать ззолззому выявлению структур генома зз ззротео-
ма. и таким образом можззо будет полнее понизь интерактивную природу клеточных реак-
цизз на химические агенты. В насзояздее время разрабазывазот «белковые» микро зипы для
определения протсома. ззо это уже область новой наукзз — протеомики.
Глава 4
МЕТАБОЛИЗМ ТОКСИКАНТОВ
ИЛИ ХЕМОБИОКИНЕТИКА?
И > нсек yc.iyi. которые могут Сын* ока ины науке,
величавшая и з них — нвсленис п се обиход полых идей.
.1. Tnwinih
Бифуркация (от лат. bi — знойной и furca - разинях.)) —
термин, алекпатио оинсыгсношнЛ единичное событие,
коюрос самым решающим образом сказывается на
формировании булуитсго.
Одной из фундаментальных. задач токсикологии является определение молекулярных меха-
низмов отбели клегки при токсических воздействиях. 1 жспкокннегика экзогенных химичес-
ких вешеств в организме и токсиколинамнка нх взаимодействия с бноснстемамн. совместно
формирующие токсикотснез. или процесс отравления (заболевание химической миологии),
характеризуются определенным для копире! hoi о токсиканта патогенезом и симптомокомп ек-
сом морфофункпионалытых нарушении. При этом токсикант и биообъект образуют сложную
систему, которой нрнсуши такие свойства, как иерархичность, не замкнутость, диссипация,
iieycioipiiuiocib. неравновесноегь. нелинейность.
Превращения токсиканта в организме начиная с момента поступления — это процессы,
протекающие во времени и с изменением его концентрации, т.е. кнне1ическне. Термины «фар-
макокинетика» и «токсикокипетика» сложились исторически, и различие между ними связано
со специфическими задачами фармакологии и токсикологи и. Термин «мс1аболи зм» включа-
ет описание всех этапов (абсорбция, распределение. накопление, бнотрансформания и вы-
деление) пребывания токсиканта в организме, но не отражает временную зависимость тече-
ния любого из них Термины -бнотрансформания» и «метаболизм» нс являются синонимами,
хотя нередко в литературе их используют именно так Недавно был предложен новый термин
(Ь.А Курляндский. В.А. Фнлотз) — «хемобиокипетнка» (кинетика химического вешеста в био
логическом объекте). Сотласно определению апто|хтв. хемобиокинетнка — раздел токсикологии
о путях поступления. механизмах всасывания, распределения, бнотринсформапин в организме
и иыведении токсичных химических Bcineeiii. Введение этою емкою термина в номенклатуру
токсикологии, по-видимому, опрашшно. Далее в тексте термины «метаболизм» и «хемобиоки-
иетика» используются как синонимы.
Метаболизм юкенкангов (хемобиокинегика) обусловлен генетически детерминированной
биохимической индивидуальностью каждого человека, пастелственныи полиморфизм которою
сформирован на протяжении эволюции постоянно протекающими процессами мутации генов
и влиянием отбора. У человеки существует генетический контроль нал метаболизмом посту-
наюших в организм химических соединении. Гены прелрасположенттосзи в зависимости от нх
роли в метаболических процессах и особенностей субстратов ферментативных реакций подраз-
деляют на гены метаболизма, гены-триггеры (гены трансдукции, или переноса сигнала) и гены
клеточных рецепторов Понимание механизмов влияния генетических факторов на проявле-
ние токсическою эффекта стало возможным лишь в связи с разни тем методов молекулярной
биа огни и реализацией программы «Геном человека» (см гл. 3). Достижения м лскулярпон
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 149
биологии и медицины нос. одних лет изменили представления о системе биотрансфирмдции и
транспортеров токсикантов, цель <} ункинониронания которой — предотвращение проникнове-
ния токсикантов в системный кровоток, органы и ткани, снижение их биологическом актив-
ности. уменьшение типофи вносит и повышение гидрофильности для облегчения выведения
и удаления (экскреции) из организма. Активность <|>ермс11тов биотрансформапни и системы
транспортеров (спец|и1лизнрованпых белков-переносчиков) — главный лимитирующий (] актор
метаболических процессов в организме. Транспорт ксенобиотиков итрает значительную роль в
разни гни токсического эффекта. Белки, осуществляющие транспорт, являются важными детер-
минантами распределения токсиканта. Один из наиболее изученных транспортных белков —
трансмембранный белок Р-гликопротсин — АТФ-зависимый насос (см. ниже), основными
функциями которого являются препятствие всасыванию токсикантов в тонком кишечнике и
ттре от вращение их проникновения через гиетогематичсскис барьеры при попадании в орга-
низм. а также скорейшее выведение леченью в желчь и почками в мочу Р-гликопротсин яяпя-
ется продуктом гена MDRI. для которого характерен полиморф тзм
I ей MDRI кодирующий Р-гликопротсин, принадлежит к генам, отвечающим за клеточную
защиту. Его гиперэкспрессия определяет устойчивость клетки к ряду химиотерапевтических
препаратов, извесн ую как множественная лекарственная устойчивость. В систему биотранс-
форманин и транспортеров токсикантов включены ферменты I и II фаз бнотрансформзнии. а
также транспортеры органических анионов и катионов, осуществляющие выведение токсикан-
тов печенью в желчь и почками в мочу (см ниже). Для генов. кодирующих зти белки, так же.
как и для гена MDR1, характерен полиморфизм. Вклад генетических факторов в вариабель-
ность ответной реакции организма на введение токсиканта составляет от 20 до 95%. На сегод-
няшний день накоплено множество примеров, показывающих, что эти различия обусловлены
вариантами пуклсоти шой последовательности генов, колирующих ферменты биотрансформа-
пии токсикантов, молскулы-нсреносчнки тскарсгв и рецепторы, взаимодействующие е лекаре-
Рае 4-1. С хсма взаимодействия организм — нжеиклтп.
твами. В отличие от других факторов,
наследственная детерминированность
ответа остается постоянной на протя-
жении всей жизни индивида.
Метаболизм токсикантов (хсмобно-
кинстика) — высококоординнрованная
и целенаправленная клеточная актив-
ность. действие которой обеспечивает-
ся участием многих взаимосвязанных
мультиферментных систем и транспор-
теров, а конечным этапом является вы-
ведение токсикантов из организма
Ноня ис «метаболизм токсикангов».
как указано выше, объединяет процес-
сы гоксикокинетики и бнотра тсформа-
ции ксенобиотиков в органитмс чело-
века и животных (рис. 4-1).
4.1. ТОКСИКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Гокеикок нетика изучает качественные и количественные закономерности резорбции, рас пре-
деления, накопления ксенобиотиков вортанизмс и выделения продуктов их катаболизма. Глав-
ной эилачей токсикокинетнкн является установление, каким образом доза и способ воздействия
вещества на организм влияют на развитие токсического процесса. Появление и развитие этого
раздела токсикологии связаны с разработкой н внедрением в практику современных высокосе-
лективных и специфичных методов обнаружения и количественного определения токсикантов в
биологических ерс ах. Достижения в р; работке методов математического моделирования ток-
еикокинетических процессов оказывают серьезное влияние на развитие гоксикокинетики. Зна-
ние и использование токсикокинети тескнх характеристик вещества позволяет адекватно выбрать
150 Глава 4
ортаны н биологические жидкости. подлежащие химико -токенколо! ичсскому исследованию с
целью обнаружения токен каш а в организме, правильно интерпретировать результаты химико-
токсикологического анализа и решить ряд других важных вопросов, связанных с установлением
причины отравления, а также применить наиб ice эффективный способ детоксикации и ле-
чения. Токснкокинетические исследования необходимы при разработке новых лекарственных
препаратов и форм, а также при проведении их клинических испытаний.
Биотрансформаиии ксенобиотиков — процесс превращения токсичных вешесгв в организме,
конечная цель которого сокращение времени воздействия ксенобиотиков.
Omer метаболических структур и морфофункинональиых комплексов организма на хими-
ческую агрессию носит кооперативный (суммарный) характер, что связано с флюктуациями,
вероятностью появления бифуркации1 и образования диссипативных систем Полому в ток-
сикологии так важно понятие о критических точках — пороговых, эффективных и среднссмер-
гельных дозах и копненiрациях (с.м. гл. 2. 5—11, электронное приложение).
Организм — сложная гетегкленпая система, состоящая из большого числа компартментов
(камер), разделенных биологическими барьерами. HanpiMep, пол гистотематическими барь-
ерами понимают совокупность физиологических механизмов, регулирующих обменные про-
цессы между кровью и тканями и гем самым обеспечивающих постоянство состава и физико-
химических свойств тканевой жидкости, а также задерживающих переход в нес чужеродных
вишестн из крови. Всасывание (абсорбция) — провесе поступления токсиканта из места вве-
дения в системный кровоток происходи г при всех путях введения, кроме внутрисосудистого.
Молекулы или ионы токсикантов, поступая из окружающей среды, проникают в организм
через клеточные мембраны различных биологических систем, а также через сложную систему
энломембран внутри клетки. Все токсикокннстические процессы происходят на молекулярно-
клеточном уровне, поэтому токсикокинетическис характеристики вещества определяются не
только его природой, но и свойствами и функциями клеточных (внутриклеточных) мембран.
Цитоплазматическая мембрана клеток всех живых организмов построена одинаково. В на-
стоящее время наибольшим признанием пользуется жидкостно-мозаичная модель мембраны,
предложенная в 1972 голу Сингером и Николсоном. Мембрана состоит из бислоя липидных
молекул. Молекулы белков встраиваются в слой липидов, располагаясь как на его внешней и
внутренней поверхности, глк и в его толще (рис 4 2). Толщина мембраны равна 7.5—8 нм.
Переход веществ через биологические мембраны осуществляется одним или несколькими
механизмами:
• простой диффузией через мембраны (низкни 1ралиепт концентрации):
• фильтрацией через норы мембран (наличие мембранных белков. формирующих в липидном
слое селективные и несслективные Каналы):
• облегченной диффузией ( наличие специфических белков-переносчиков):
• энлонитозом (пинопнтозом) — активным транспортом, который включает процессы не-
(зеноса. требующие затраты энергии, участия белков-перешкчиков и протекзющие против
градиента концентрации.
Диффузия. Скорость диффузии токсичных веществ через мембрану является функцией гра-
диента концентрации. При этом большее значение имеют площадь поверхности мембраны, ее
толщина и константа диффузии токсиканта. Константа диффузии соединения зависит от его
липофильности, молекулярной массы, пространственной конфигурации, степени диссоциации
(в случае слабого электро., ита).
Процесс диффузии, представленный на рис. 4-3. описывается законом Фика.
dQ, „ J di = -DA- J | С, „1 jdi = ~ D,1( C„ - C,).
где dQ'Jdl — количеотво диффундирующею вещества за единицу времени (скороеib диффу-
зии); D— коэффициент диффузии; А — площадь поверхности мембраны; d /dl - гради-
1 В iicpaRHOiseciloil термодинамике (естественной науке, занимающейся изучением .динамики и эволюции систем в
окружающем нас мире) термин «бифуркация» применяется ляя характеристики фу шментазьной особенности ионе те-
ния сложных систем, подверженных сильным воздействиям и напряжениям в неравновесных состояниях н условиях.
Диссипативные системы — системы, полная энергия которых (сумма кинетической и нтеипих ьнпП aiicpiiiil) при
движении убывает, переходя в труте виды энерти. например втенлогу, i.e. происходи! дпссинаиия энерпш
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 151
1*нс 4-2. Схема строения биологической мембраны.
X Мембранные белки могут пронизывать бислой н-iei возь. примыкать к бислою или Погр жаться в
него.
Б. I — интегральный (пронзающий) белок: 2 — периферический белок: 3 — гликопротеины: 4 — гликоли-
пиды (мембраиообралующие); 5 —холсстсрол; 6 — олшосахаридный фрагмент, ответственный за распо-
знавание внешних ст налов и нмуниый ответ: 7—элементы цитоскелета.
Рис 4-3. Схема пассивной диффузии гоксн-
капгов через мембрану Красные кружки —
нейтральное липофильное вещество; тре-
угольники диссоциированное гигрофиль-
ное вещество (по Liillmann Н. ci al. 2000).
ент концентрации токсичною вещества; (Со—С,) —
концентрация токсичного вещества снаружи и внут-
ри клетки.
Диффузия происходи) н направлении падения
концентрации вещества, ведёт к равномерному рас-
пределению вещества ио всему занимаемому им
объёму, не требует затрат энергии и возможна в
обоих направлениях (как в клетку. )ак и из нее).
С ростом молекулярной массы вещества коэффи-
циент диффузии заметно снижается. Липофильные
токсиканты свободно диффундируют через мембра-
ну. Малые полярные незаряженные молекулы. на-
пример. МН,. 11 О, этанол также диффундируют с
юстаточно большой скоростью
Вещества с очень высокой липофильностью не
нропикаки через мембрану. Для всех ионизиро-
ванных молекул, независимо oi размера, липидная
мембрана нс проницаема. Гидрофильные токсикан-
ты не Moiyr беспрепятственно преодолеть липидный
бислой мембраны Транспорт таких молекул воз-
можен. во-первых, благодаря мембранным белкам,
формирующим в липидном слое каналы (поры),
заполненные воаон. Механизмы проникновения
токсикантов при помощи фильтрации через поры
мембраны (песете ктн иные и селективные каналы)
будут рассмотрены ниже. Во-вторых, наличие спе-
цифических белков-переносчиков (транслоказ), избирательно взаимодействующих с опреде-
ленными лигандами, облетает их перенос через мембрану (облегченная диффузия). Скорость
транспорта вешеств облегченной диффузией завпегп от )радпента концентрации переносимого
вещества и ог количества белков-переноечнков в мембране.
ХКТШП1ЫЙ транспорт веществ через мембрану осуществляется против градиента концентра-
ции. с затратой энергии и при участии специализированных белков — пермеаз, встроенных в
мембрану Механизм работы пермеазы заключается в специфическом связывании переносимо-
152 Глава 4
ю вещества на внешней поверхности мембраны, последующею фосфорилирования с помощью
ЛИР и изменения конформации пермеазы, и результате чего переносимое соединение оказы-
вается внутри клетки.
Ионные насосы —транспортные А ГФлзы. например Na’ . К". Са:*-АТФазы. являются еше
одним важнейшим влрианлтм активного транспорта Принцип действия такою насоса анало-
гичен раооте пермеазы. Белки ионною насоса могут находиться в двух кон<(юрмапиях. В одной
конформации белок связывает, например 3 иона на|рии. и другой —2 иона калия.
Перенос через мембрану макромолекул осушеств. яегся эн тони юзом, механизмы коюрою
отличаются or перечисленных выше Зндонигоз (фагоцитоз и иииоциют) — перенос вещества
из среды в клетку вместе с частью плазматической мембраны <рис. 4-4).
Как видно на рис. 4-4. везикулярный транспорт Л1кдючае1ся в том. что часть мемпраны
klxiui ывяет близлежащий у час I ок внутриклеточной жидкости с рас пюре иным в ней вещес-
твом и далее получившаяся в результате везикула транспортируемся через внутриклеточное
пространетво к противоположной мембране или разрушается специальными органеллами (ли-
зосомами) клетки. подвергая находящееся в ней вещество биотрансформанин.
Более специфичный и независимый от концснтра1ши токсиканта процесс cocioin из не-
скольк! х этанов. В иачапе транспортируемое вещество взаимодействует с рецензором, распачо-
Рне. 4-4 Эндошпоз (активный транспорт) токсикантов через мембрану: траисинтоз (везикулярный транс
поры и моплироваинын репетиром bcioiiiiioi (по Lullmanii Н et al. 2(ЦЮ). Пояснение в тексте.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 153
жснным на внешней поверхности мембраны (см рис. 4-4. 1 и 2). При этом часть рецептора, ко-
торая расположена в цитоплазме клетки, взаимодействует со спеииализированнь м белком (см
рис. 4 4, 3), называемым алаптином (adaptine). Полученный комплекс токсиканта с рецептором
и белком мигрирует в определенную зону хгембраны. на которой уже сконцентрировались другие
аналогичные комплексы, окаймленные специализированным белком — клагрином (clathrin). иг-
рающим одну из главных ролей при образовании везикул (см. рис 4-4. 4). На следующем этапе
«окаймленные ямки» на определенных участках мембраны втягиваются в клетку, отделяются от
мембраны образуя нс икулы — пиношгтозные пузырьки (см. рис. 4 4. 5). Находясь внутри клет-
ки, везикула практически сразу теряет клал риг юную оболочку (см. рис. 4-4. 6) и адаптины (см.
рис. 4 4. 7). Далее разрушается комплекс вещества с рецептором, который возвращается на свое
место на мембране (см. рис. 4-4. 8). Само же вешесгво (см. рис. 4-4, 9). нонан во внутреннюю
область кле ки. целенаправленно достаадяется к месту назначения — ядру, аппарагу Гольджи
или другим органеллам, нс смешиваясь с другими макромолекулами клетки
Экскреция макромолекул из клетки во внеклеточное пространство но аналогичному меха-
низму называется экзоиитоз.
Транспортные белки играют иажисишую роль в регуляции абсорбции, распределения
и экскреции многих токсикантов. Наиболее изученными среди них являются члены
семейства аленозинтрифосфатов (АТФ). Один из них — Р-глико гротенн — колируется геном
человека АВСВ1. именуемым также MDRI. Основной функцией 1* гликопротеина является
энергозависимый трансмембранный транспорт очень многих токсикантов за счет гидролиза
АТФ (см. ниже). Далее в зависимости от рассматриваемых токсикантов будет даваться поясне-
ние о ггреобталагошехг механизме транспорта, действующем в том или ином случае.
Начиная с момента поступления ксегюбиотнка в организм и оканчивая выведением вещества или
прол; ктов сто метаболизма, происходят токсикокинстическне процессы, которые можно разделить
натри фны. Это — абсорбция (резорбция), распределение и выведение вещества (рис. 4-5).
Первая фаза — фаза абсорбции, или резорбции. характеризующаяся проникновением ве-
щества в кровь (см. рис. 4-5 — из желудка и кишечника). В течение зтой фазы концентрация
вешесгва в крови постоянно возрастает и достигает максимума. Вторая фаза (о-фаза) — фаза
рас грс г гения вешеезва по органам и тканям в основном за счет кровотока характеризуется
максимальным эффектом воздействия токсиканта. Концентрация вещества в плазме крови
заметно снижается, в гом числе за счет процессов биогрансформаггии В течение третьей фазы
< 3-фазы) осуществляется выведение вещества или его метаболитов из организма В этот период
скорость уменьшения концентрации вещества в плазме крови снижается.
На токсикокинстическне параметры ксенобиотика оказывают влияние природа токсиканта
и свойства биологнческих структур организма (габ.ч. 4-1). значение которых будет показано
далее на конкретных примерах (см. гл. 7-11. электронное приложение).
Т«блина 4-1. Влияние на токсинокипсзнку всшесгня природы токсиканта и свойств биологических струк
тур орг niiii imj
Природа токсиканта Свойства биологических структур организма Примечание
Киническое строение Наличие химических соединений, способных ветупагь во взаимодейс- твие с токсикантом См. гл. 2
Размер молекулы Свонсгва биологических бармров (например, наличие и размер пор в различных мемо анах От размера молекулы токсиканта заввеш способность вещества гиффунлировать че- рез по ы бш>тогнческой мембраны
Липофильность Л в пофнлыюсть био юг нческих структур Определяет способность вещества накап- ливаться в соответствующих тканях
Способность к иони- зации при определен- ном значении pH Скорость биохимических нроисс сов Соотношение иопи1ир< ванных и пспопи- зированпых форм молекул токсиканта оп- релелясг способ его проникновения через биологические барьеры. Генетические особенности организма оп- ределяют скорость протекания фпзнко-хи мических процессов и организме
154 Глава 4
Рис. 4-5. Асорбиия, распре елснис и выведение ксенобиотика — токсикокннсгические процессы (по
Lullmann Н ci al. 2000).
Распределение. После абсорбции вещества попадают н кровь, а татем в органы и ткани.
Главной характеристикой распределении токсикантов в организме является неравномер-
ность.
Коннентрацик» вещества в плазме крови в нобой момент времени I принято рассчитывать
по формуле:
С = Сие\
где С — концентрация вешеств*» в любой момент времени, моль/л: Со — концентрация ве-
щества в момент введения, мгать/л: К — константа элиминации; t — время, прошедшее после
введения вещества.
Для того чтобы рассчитать С . ну ж то знать тот *>бт м. в котором распределяется нсшсстно.
)то и ешь объем распределения. который нс является фи энологическим обтлмом и может быть
меньше, чем объем плазмы или крови, а для некоторых веществ — больше
С(1 равно количеству вещества в организма, деленному на объем распре деления, поэтому
объем распределения характеризуется отношением общего содержания вешесгна и орнншзме
к содержанию его н плазме.
Объем распред*тения (кажущийся объем распределения вещества) V, — гипо1с1ическнн
обьем жидкостей организма, необходимый для равномерною распределения всей дозы по
ступившего в ор внизм вещества в концентрации. равной его концентрации в крови в момент
исследования.
V выражается в литрах на I кт массы и определяется соотношением:
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 155
V D/С.
где V— объем распределения; D — доза вещества в молярной или массовой концентрации на
I кт массы тела; С— концентрация вещества в крови, моль/.л.
Объем распределения характеризует степень проникновения веществ из плазмы крови и
внеклеточной жидкости в ткани и депонирования в них (табл. 4'2). Для липофильных соеди-
нении, легко проникающих через тканевые барьеры, характерно высокое значение Если
вещество в основном циркулирует в крови. V, имеет низкие величины. Сильное связывание
молекул токсиканта тканями приводит при расчетах к большим значениях! объема распреде-
ления.
Таблица 4-2. Диапазон значений V,
V(, л/кт Примечание
ДоО.Ю ________________ Высокая степень связывания токсиканта с белками плазмы__________
О.>0—0.27 I Удерживание токсиканта внеклеточной жидкостью
<1.27—0.40____________Поступление токсиканта во внутриклеточную жидкость_______________I
0.40—0.53 Равномерное распространение токсиканта в общей вещной среде ортатттгзма ]
Ближе к I Тканевая секвестрация токсиканта
V,используют при определении константы элиминации и периода полужизнн. или периода
полувыведсния вещества I ,.
Элиминация включает процессы, приводящие к снижению содержания чужеродного вещест -
ва в орт итизме. т.е. бпогрансформанню. депонирование и экскрецию. Экскреция — выведение
токсиканта и/или его метаболитов ил организма во внешнюю среду без дальнейшего измене-
ния их химической структуры.
Основные количественные характеристики элиминации устанавливают по графику зависи-
мости концентрации вещества в крови (С) от времени, прошедшею после приема этою вещества
<П. Мерой скорости элиминации вещества является величина угла наклона касательной к кривой
трис 4-6). проведет inofi в интересующей исследователя точке. Скорость элиминации уменыиасг-
ея с течением времени, поскольку умении зется величина С. Однакэ неизменной характеристи-
кой процесса оспстся коэффициент пропортшошътынхти К] На рис 4-6 показана зависимость
концентрации вещества в плазме крови от времени, прошедшего после сто введения, а также
условные границы диапазона концентраций — от недействующих ло токсических и выше.
Период пщувыведения. Скорость выведет ия токсиканта характеризуется периодом полхвы
веления т|Д (или Г|/2).
Диапазон
концентраций
Токсическая
Терапевтическая
Условно действующая
Недействующая
012345 Время
Рис. 4-6. ктвисимосгь концентрации вещества в плазме крови от времени поступления в организм.
156 Глава 4
t|;n — это время, m которое концентрация веществе в плазме крови снижается на 50% По-
этому из формулы С = Сп е“, при i = t, , следует. что С = С,у2.
С(/2-С е "Л In 1/2 =l"'2. t , = Iii2/k = 0.693/к
Период полупи ведения измеряется чаше nccio в часах. Эту ветчину опрс :ляют no графи-
ку зависимости концентрации вещества в крови или плазме от времени
Одновременное введение нескольких токсикантов может стимулировать или подавлять ско-
рость выведения каждою и» них. I зависит и от pH мочи.
Константа элиминации отражас) скорость выведения вещества из организма.
Ьиодоступность
При любом способе поступления токсиканта, кроме внутривенного, далеко нс все коли-
чество вещества достигает кровеносного русла, так как вещество не полностью всасывается в
же ту точно-к и щечном тракте (ЖКТ). а также инактивируется печенью или экскретируется с
желчью. Поэтому используют понятие «био доступ ность». г.е. степень абсорбции 1 жеиканга в
кровь при впесосулистом введении относительно внутривенного введения.
1ля суждения о биодосгуппости обычно измеряют площадь пол кривом (AL С — area under
the concentration versus time curve), отражающем зависимость между концентрацией вещества
в плазме крови и временем, поскольку этот показшель прямо пропорционален количеечву
вещества, попавшему в системный кровоток. Биолосту ниость вещества при внутривенном вве-
дении принимаю) за 1.
Биодосгупносгь токсикантов имеет значения от 0 ю 1. Реальные значения биодоступности
всегда менее I, что отражает частичную абсорбцию вещества в кровь (системный кровоток).
Биодосгупность в зависимости от пути введения токсиканта в организм представлена в
табл 4-3 и на рис. 4-7
Таблица 4-3. Бвопостуниость вещества в зависимости от пути введения
1 1уть введения Биолосту пность. % Примечание
Внуд зивенный 100 (но определению) Наиболее быстрый Э(] зек)
Внутримышечный 75-100 1квможиост1> введения больших объемов препа- ратов; может быгь боле шейным
Подкожный 75 - SI00 Объемы введения меньше, чем при внутримы- шечном может быть болезненным
Прием внутрь (оральный) 5 — <1(Ю Наиболее удобен: может быть значительное снижение ж|м|>скта действия после первого про- хождения 1ОКСИКЗН1Э через печень
Рис. 4-7. Биодоступность вещества в зависимости от пути введения.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 157
Окончание mail 4-3
Ректальный 3(1 - <100 Менее заметен {kJktkt первою прохождения через печень, чем при оральном введении
И|1ГаЛЯН1|ОННЫ|Т 5 - < I0U Часто очень быстрое действие
Транслерма_'1Ы1Ы|| 80 - <100 Обычно очень мспенная абсорбция; пролонги- рованное действие; отсутствие »ф<|>екта первого прохождения через печень ।
Ьиолос тут шесть неорганических веществ варьирует от 0.01 до 1009? и зависимости от их
Природы (СМ. ГЛ. X)
Клиренс (С!) вещества определяется условным объемом плазмы крови (в литрах, миллилит-
рах». из которой пешееию но.» гостью умаляется за единицу времени (секунды, часы). Единицы
измерения CI — л/с. л/мин, л/ч. а при расчете на единицу массы тела — д/(кгс). л/(кг-мип)
л (ктч). CI — величина, характеризующая индивидуальное вешесгво.
Обшпй клиренс (С11о<) объединяет вес процессы участвующие в элиминации.
Клиренс рассчитывается путем деления величины введенной дозы па величину плошали под
кривой зависимости концентрации вещества в плазме крови от времени, прошедшею после
его введения. Следовательно, чем меньше CI. гем медленнее вещество выводится и з организма.
Можно рассчитать отдельно почечный клиренс, клиренс желчью или выдыхаемым воздухом с
учетом количества вещества, выделяемою через ли органы (табл. 4-4).
Таблица 4-4. Респираторный и метаболитическ й клиренс некоторых растворителей у человека (Sato /X .
Xjkaiima I 19X7)
Растворите ть Рее пира торный клиренс Метэбошптческии нитрене
л/ч % л/ч %
Бензол 43 36 75 64
Толуол 22 18 100 82
Ксилол 13 4 116 90
Стирол 6 4 157 96
Хлороформ 33 23 108 77
) 2-Лих.чорозтан 17 12 130 88
Тетрахлорид углерода 140 93 II 7
Трилл ороэтнлен 36 25 104 75
Период полу выведения является функцией объема распределения и скорости элиминации:
1112 • vycL.
Из уравнения следует, что чем больше объем распределения при одном и том же значении
клиренса тем дольше выводится вещество из организма. Увеличение кли|кнса сокращает пе-
риод пату ыведення. Соотношение между значениями клиренса. объема распределения и вре-
мени полувывеления встнссгва для однокамерной модели (см. ниже) выражается формулой:
Qrt=K • Ч - =in2 • vyilzl.
Токсикокинептческие параметры конкретных веществ рассматриваются во второт части кни-
ги тем. гт. 7—11) в связи е методами их обнаружения и определения в биологических обз^кгах.
Камеры Для измерения микро- и нанограммовых концентраций токсикантов используют
методы высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии, масс-спектрометрии, ра-
диоиммунного или иммуноферментного анализа. полярографии, спектрофотометрии н т.л. (см.
гл 6) Н । основании полученных данных строят график, по осн абсцисс которого откладывают
время, а по оси ординат — копнен грацию токсиканта в биологической пробе (наиболее часто
158 Глава 4
в плазме криви) в соответствующих единицах Кривая •концентрация—время» характеризу-
ет гокснкокинсднческие процессы, происходящие с исследуемым веществом (см. рис. 4-6).
На основе полученной зависимости строят зоксикокинетическис модели, используй специ-
альные компьютерные программы математического моделирования В таких моделях принято
выделять комцартменты (камеры, части), являющиеся условным отражением определенных
ejxra и тканей, в которые поступает токсикант. Расчет повеления токсиканта в многокамер-
ных моделях позволяет описывать н предсказывать динамику изменения его концентрации в
крови, моче, ликворе и гканях. Для математического моделирования гоксикококпнетпчсскнх
процессов организм представляют н виде одной или нескольких частей (камер), ограниченных
пропинаемой мембраной. тз которых равномерно распределяется токсикант Понятие «камера»
условно, так как за ним не стоит какое-либо анатомически ограниченное пространство; это
единица формализованной токсикокннетической системы.
Однокамерная модель, при которой организм представлен в виде единой гомогенной каме-
ры. — самая простая токсикокнпстическая модель, пригодная для определения концентра-
ции токсиканта в плазме крови или моче. Такая модель предполагает, что и тменения
концентрации токсиканта в плазме отражают изменения его содержания в гканях. Система
быстро достигает устойчивого динамического равновесия между поступлением токсиканта
в кровь и выходом из нее. Большинство токсикантов поступают в ткани и выходят из
них достаточно медленно. Согласно однокамерной модели, скорость выведения вещества
из организма постоянна, характеризуется Константин выведения, или элиминации (К,), и
пропорциональна его концентрации, что противоречит результатам эксперимента и данным
исследований, полученных при изучении фармакокинетики лекарственных препаратов па
добровольцах. Наиболее приближены к реальности двух- и трехкамерные модели (рис. 4-8). За
центральную (обычно мсныпую) камеру принимают плазму крови, составляющие ее элемен-
ты и хорошо перфузируемые ортатты (сердце, легкие, печень, ночки, эндокринные железы),
за периферическую — плохо перфузируемые органы (мышцы, кожа. жир). В этих камерах
гокенкант распределяется с разной скоростью: быстро — в центральной н медленно — в пе-
риферической. после чего частично выводится
Концентрация токсиканта быстро снижается из- за распределения по органам и тканям («-фаза,
см. выше), те по перп(|н'ричсскнм каме-
рам. Далее наступает Р-фаза — интенсивное
выведение токсиканта и его переход из пс-
риферической камеры снова в центральную
до зех пор. пока между камерами не пасту-
низ состояние динамического равновесия
Кинетика распределения вещества в такой
моде нт характеризуется тремя константами:
константой скорости выведения (kJ. конс-
тантой элиминации из центральной в перн-
фсричсскую камеру (к, . к13). константой
перехода из периферических камер в цен-
тральную (к, к. ,) Выводится токсикант
из организма только через цетпрадьную ка-
меру. периферические служат дополнитель-
ным резервуаром.
к — коэффициент абсорбции токсикан-
та (константа скорости процесса абсорб-
ции токсиканта в камеру 1); ке — коэффи-
циент выведения токсиканта (константа
скорости процесса выведения токсиканта
из камеры 1); к,.,—к , — коэффициенты
скорости обмена веществ между камера-
ми (констатгты скорости процесса рнспрс-
делення токсиканта между центральной и
нершрерическими камерами)
Однокамерная
модель
I к
Двухкамерная
модель
Трехкамерная
модель
Рис 4-8. Камерные токсикокннстичсскне модели По-
яснение в тексте.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 159
Pwc. 4-9. Мотель обмена свинна в органи зче чело-
века. Пояснение в reKCie.
Математическое моделирование предусмат-
ривает прежде всего обоснование выбора ка-
мер и их числа, а также получение численных
значений коммуникационных констант. Для
выбора камер необходимы сведения о харак-
тере распределения токсиканта в организме и
скорости его выведения из органов и тканей.
Пример математического моделирования по-
ведения свинца в органагме человек а.
При построении математической моде-
ли обмена свинна (рис. 4-9). гак же. как
и других элементов, исходят из того, чго
общие закономерности обмена в организме животных и человека (тип распределения, ос-
новные депонирующие органы) тождественны. Поэтому структура модели мстабс тзма
для человека принята аналогичной модели для лабораторных животных и состоит из 4 ка-
мер. Q, — камера, в которой концентрация ионов свинна. содержащегося в крови, посто-
янно увеличивается за с ют ингаляционного и перорального поступлений (Р). Кровь — это
кстема транспорта, обеспечиваю пая поступление свинна в другие ткани (к2| и к, ). его
экскрецию из организма с мочой (к, .) и калом (k, (). Q, и Q — камеры, в которых кон-
центрация свинца соответствует его концентрациям в депонированных тканях. В костях
скелета определяют две концентрации элемента: в камере Q, — лабильную, которая изме-
няется из-за постоянно идущих обменных процессов с кровью (k t и к]_.) и в камере Q,—
относительно стабильную концентрацию, характеризующую долговременное депонирование
свинца н костях (см гл. 8.5). Органы и ткани, нс обладающие тропноегью к свинцу, имеющие
азизкне скорости обмена, объе шнеиы в камеру Q,.
Коммуникационные константы к характеризуют скорости переноса свинца из камеры в
кхмеру, т.е. долю общего содержания токсиканта в камере, переносимую в единицу времени в
другую камеру Модель, описывающая этот процесс, представляет систему линейных диффе-
ренциальных уравнений с постоянными коэффициентами и нмссг вид:
DQ ' '
«« 1
где Q — содержание токсиканта в i-камсре. кч — коммуникационные константы скоростей
переноса токсиканта из одной камеры в другую; Р — скорость поступления токсиканта в кровь
извне; \ — чис ю блоков модели
Поскольку интенсивность обменных процессов животных и человека существенно различа-
ется. то прямой перенос этих данных с животных на человека невозможен. Численные значс-
вхл коммуникационных констант опреясляюг на основании данных литературы, полученных
три обследовании дни. контактирующих' с различными концентрациями свинца в воздушной
среде, и лиц контрольной 1руппы (см. гл. 8.5 и электронное приложение).
Коммуникационные константы модели, предложенные В.С Безелем, приведены ниже
L . = 0.32±0.05:
k, ' = 0.34±0.U4:
к . = 2.35±0.2;
= 35+0.35;
к 2.81:0.48;
к = 0.84+0.24:
к = 0.0021 ±0.0005.
Проверка адекватности приведенной модели путем сопоставления реальных клинических
наблюдений н данных, полученных расчетным путем, показала, что прогноз, получаемый с
□мощью предложенной модели, находится в хорошем соответствии с результатами, полу-
ченнымн при обследовании лип. контактирующих с различными концентрациями свинна в
юздушнои среде, и лиц конiрольной труппы.
160 Глава 4
4.2. АБСОРБЦИЯ (РЕЗОРБЦИЯ) И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИКАНТОВ
Абсорбция (резорбция) — процесс всасывания токсиканта из места поезд пленим в систем-
ный лимфо- и кровоток. Если вещество оказывает повреждающее действие на месте введения
(поступления). го такое воздействие называют местным, например действие сильных кислот и
щелочей на кожу. Всасывание зависит от пути введения и растворимости токсиканта в тканях
в месте его введения а также от скорости кровотока в этих тканях. При внутривенном или
внутриартериальном введении токсикант сразу и полностью попадает в кровоток.
Резорбция ксенобиотиков из мест поступления в кровь характеризуется кт t<|m|>iiiihchtom
резорбции (кр.,). который определяется долей вещества, перешедшего в кровь из места введе-
ния.
По своим химическим и физико-химическим свойствам большое к личеетво вешеств спо-
собно как к местному, так и к резорбтивному, или системному действию.
На скорость н способ резорбции» (поступления) токсиканта в кровяное русло влияют мно-
гие факторы (табт. 4-5).
1аблииз 4-5. Факторы влияющие на скорость и способ резорбции токсикантов в системный кровоток
Факторы Примечание
Организм Морфо.нмнчсскис особенное! и органа, через который осущест- вляется резорбция, площадь реюрбтируюшеЛ поверхности, кровоснабжение органа Также влияют степень наполнения желуд кз и кишечника; состояние кожных по- кровов. верхних дыхательных путей н т.л.
Индивидуальные особенности организма, вчаеп1оси1 вариабель- ная экспрессивность Р-гликопро- геипа Р-тликопротеин оказывает большое влия- ние на экекреппю ксенобиотиков и ме>абе- литов в мочу, желчь и содержимое кшнеч ника (см. ниже). В гематоэнцефалическом барьере мозга (см ниже) P-i шконротеип гирлннчнваст аккумуляцию многих токси- кантов. С варнабс 1ьной экспрессивное >ью Р-гликопротеина в двен«д1Ы1ТН11ерегн1ой кишке ассоциирован синонимичный од- нопуклеотнлнын полиморфизм (полпмор фнзм. который нс изменяетамнпокис ну) в экзоне 26 (3435С-ГГ). Гак. у индивидов, гомозиютнь х но аллелю Т. дуоденальная экспрессия Р-гликонротеипа меньше, чем у люден с ICHOTH1IOM СС
Токсикант Молекулярная масса, физико- химические свойства, наличие геометрических и оптических изомеров, конформационная ус- тойчивость (см. гл. 2.2) и лр. (см. гл. 2.2 н 7- 11) Влияет фирма (раствор аэрозоль. таблет- ки п тл.) введения токсиканта
Количественные ха- рактеристики процесса резорбции Время н плоишь контакта био- объект с веществом, введенная доза токсиканта и тл. Скорость и полнота протекания процесса взаимосвязаны е природой токсиканта и особенностями организма
Условия окружающей среды 1 емперату ра влажное iь воздуха, барометр) 1чсское давление. Время суток в момент воздействия При гипербарни, например, ухичивается резорбция СО алкоголя, пестицидов Н других токсикантов Уш факторы также необходимо рассмат- ривать но взаимосвязи с природой юкси- кднта и особенностями о нанизма
Энергозависимый трансмембранный транспорт очень мношх токсикантов осуществляется
белками-переносчиками. Один из них Р-гликопротеии — расположен на мембранах эпи-
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 161
елиальпых клеток тонкой кишки, новсрхносги желчных канальцев печени, проксима ьных
канальцах ночек и эпителиальных клеток, входящих в состав гематоэнцефалического и гемато-
тестикулярного барьеров. Р-гликопротеин влияет на распределение ксенобиотиков за счет ог-
раничения их абсорбции в кишечнике, облетая выделение путем секрепии с же тчью н мочой
и уменьшая их проникновение в головной мол и яички.
Резорбция через кож\
Поступление вешсств через кожу (см. и. 2.4.5) осуществляется через эпидермис, сальные и
отовые железы или волосяные фолликулы путем пассивной диффузии. Резорбция вешсств.
имеющих среднюю молекулярную массу и умеренно растворимых в воле, подчиняется уравне-
нию Фика.
Основные факторы, влияющие на скорость резорбции токсикантов через кожу, представле-
ны в табл. 4-6.
Габлшта 4-6. Основные факторы, влияющие на скорость резорбции токсикантов через кожу
Основные фаюпры Примечание
Плоишль к<нпакн1 Количество вешеетвя, npoiniK.ifouiero Через кожу, прямо nponopinioiia.it>-
_______________[но площади коншкга токсиканта с кожей
Анат мическос располо- Наибольшей способностью к резорбции обл. ают кожа мошонки, паха и
жение и морфолотчоскос подмышечной впадины. Например, при анссенни на различные участки
состояние участка кожи iichoi реж денной кожи фосфорорганического пестицида паратиона показа-
но. чю по сравнениюс кожей мошонки резорбция этою токсиканте наруж-
ной поверхности предплечья состанляс! 8.6%. волосистой части головы —
32.2%. ладони — 11.8%, лба — 36.5%. аксиллярной области — 64%.
Нарушение роговою слоя зпидер\ пса. снижение жировой смазки, увлаж-
(нснне кожи усиливают резорбцию токсиканта
Интенсивность кроноснаб- Скорость кровотока значительно не влияет на скорость резорбции мере
женин кожу. Однако УФ-облучсннс. температурный режим усиливают резорбцию
_________________________токсикантов (см. гл. 2.4.5)_______________________________________
Природа токсиканта Липофильность, размер молекулы и другие свойства (см. гл. 2.4.5) опре-
деляют скорость резорбции через кожу, например сильно липофильные
соединения не проникают через кожу.
Наличие, в составе токсичного агента вешсств. стимулирующих кожную
'резорбцию. например эмульгатора, растворителя, мазевой основы и т.д..
туымигптваст скорость резорбции токсиканта_________________________
Ipynie причины Повышение парциального танлеиия шза-токепканта в воздухе увеличим
jc.T ciroptx. ib резорбции ксенобиотицр
Резорбция через слизистые оболочки
Топография слизистых оболочек в организме человека разнообразна. Слизистые оболочки
выстилают внутренние органы, сообщающиеся с внешней средой (легкие. ЖКТ. влагалище и
др ). а также глаза. С поверхности слизистых оболочек, как и с поверхности кожи, происходят
всасывание токсикантов и их поступление it системный кровоток.
Многие токсиканты легко резорбируются слизистыми оболочками, которые покрыты вод-
нои или слизистой гидрофильной пленкой. Резорбтивная способность различных слизистых
оболочек во многом близка.
В табл 4-7 представлены морфоаназомичсскис особенности слизистых оболочек человека.
Скорость резорбции большинства токсикантов через слизистые оболочки пшпевзрнтельно-
го тракта во многом определяется нх растворимостью в липидах и способностью к ионизации
при определенном pH среды. Некоторые токсиканты всасываются путем активного транспорта.
При введении токсикантов внутрь скорость их абсорбции в разных отделах ЖКТ различная.
Резорбция в ротовой полости
В хорошо снабжаемой кровью ротовой полости (pH среды 6.6—6.9) происходи г быстрое
всасывание многих находящихся в молекулярной форме токсикантов, которые затем поступа-
ют в сердце, малый крут кровообращения и далее в общий кровоток. При резорбции в ротовой
полости токсиканты распределяются в организме, минуя печень.
162 Глава 4
Таблица 4-7 Мор<1кмнатомичсские особенности лизиегых оболочек (Ю.И Афанасьев. 2004)
Слн 1НСП1Я (димочка Тин эпителия Особенности
Глаз: pOIOIlHHd Многослойны и iLBKKiiii неорог овевающий ув- лажненный секретом слешых я коньюнктивальных желез Толщина «ш гелия 0.8 0,9 мм. радиус кри- визны 7.8 мм. Высокая peieHCptmiiOHiiaH спо- собность н проницаемость для разнообразых жидких и газообразных вешеств. Подвергается значительным вотраенгым изменениям
К(Ш1»к)И>с1ива Многослойный плоский неорого- всваюший Подвергается тзчтельным возрастным вме- нениям
Ротовая полость, гложа, пищевод Многослойный, плоский, увлаж- ненный слизью Толщина 1X0 600 мкм. хорошо кропоснабжа- евся Па апикальном койне вкусовой клетки имеются ворсинки. что значительно увеличи- вает поверхность воспринимающей мембраны, между ворсинками находится жидкость. боиггая фосфата ими. белками и мукопротеинами, кото- рая играет роль iioi.noiiireля пешее i в. полагаю- щих на поверхность я зыка. Площадь всасывания 0.02 м . Высокая способность к регенерации
Желудок Однослойный призматический, выделяет мукоидный секрет Площадь всасывания 0.1—0,2 м1 Токсикант находится в желудке от несколь- ких' минут ло нескольких часов, что зависит от ряда <(тактороп. Воспалитсл) пые процессы значительно снижают скорость резорбции
Тонкая кишка Однослойный при ^магический. Наличие циркулярных складок, ворсинок и крипт Апикальная поверхность югеюк имеет исчер- ченную каемку, обраюваниую микроворсиками (60—90 микроворсинок на 1 мкм2). Это область максимального всасывания с н.тошалыо в ПК) м-. Токсикант находится в тонкой кишке в течение нескольки* часов. Вос пая и тельные процессы значительно снижают скорость резорбции
Толстая кишка Однослойный призматический складна пай. Наличие ниркмяр- ных складок и крипт Площадь всасывания 0,5 1 м Токсикант на- ходится и толстой кишке в течение нескольких часов Воспалительные процессы значительно снижают скорость резорбинн
Прямая кишка Однослойный призма пгческнн. многослойный кубическим и многослойный плоский ороюве- ваюшнй Площадь всасывания 0.04—0.07 м-. Токсикант находится в прямой кишке к течение несколь- ких часов Воспалительные процессы значи- тельно снижают скорость резорбции
Воздухоносные нуги: носовая по- лос г ь. НОСОТЛОТКЯ гортань, трахея Мпогорялный призматический реснитчатый. Содержит секрет, омывающий обонятельные рес- нички Секрет растворяет летучие вещества, которые соединяются с реиешорными белками, нахо- дящимися и мембране ресничек обонятельных клеток. Плошаль всасывания 0.01 м2 Bocna.ru- гельныс процессы значительно снижают ско- рость резорбции
Легкие: бронхиальное дерево н Мпогорялный призматический реснитчагый и однослойный ку- бический Секрет хклажияет пылевые и .трутне частицы, способствует их при пгпанню. обволакиванию и у млению впоследствии во внешнюю срслу
альвеолы Неправильном уплощенной <]>ор- мы с цитоплазматическими иы- ростнми и цилиндрический Общая площадь соприкосновения пастуха с по- верхностью эпителия 70 м;. У взрослого человека 300—400 млн атьвсол. Воспалгпсльныс процес- сы гггач1пе.1ьно снижают ско|хкть резорбции
Среднее ухо ОДНОСЛОЙНЫЙ ПЛОСКИЙ пилннд- ричсскни и реснигьзтый Возрастные изменения значительны, способность к регенерации елпбая
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 163
Резорбции « желудке
Резорбция токсикантов в желудке (pH среды 0,4—2.0) происходит путем простой ди<|м|>узии.
1ипо<|>илы1ые вешества абсорбируются лучше, чем гилрофи ьныс. Кислотность желудочного
солерж! мого определяет особенности всасывания токсикантов.
На рис 4-П) приведены ip-афики зависимости содержания (в процентах) в растворе 3 форм
саднил твой кислоты: псионизироваиная (форма 1). ионизированной по карбоксильной группе
(форма 2) и ионизированной ио карбоксильной и фено плюй группам (форма 3) ог pH среды.
Как зилпо на рисунке, при физиологических значениях pH ж< дудочного сока салициловая
кислота присутствует в недиссоциированной и диссоциированной по карбоксильной группе
форм х. Их конисн1рации примерно равны. хшя и могут быть изменены. В то же время в
H.1IJMV крови салициловая кислот может присутствожпь исключительно во второй форме (см
рис. 4-10) Третья форма вешества ipn физиологических значениях pH среды образоваться не
может. На рис. 4-11 приведены аналогичные кривые зависимости иля морфина. Как видно
на рисунке, у морфина cymecrnyei уже 5 форм. При фи энологических значениях pH среды
ж дудка он присутствует гсключитсльно в протонированной по азоту форме 3. На основании
этого факта можно сделать вывод о том. чю морфии практически нс должен резорб» роняться
из желудка. Данный вывод отлично согласуется с практикой. Аналогичным образом ведет себя
большинство алкалоидов.
Как правило, натощак всасывание в желудке идет интенсивнее, так как взаимодействие
токсиканта с компонентами пиши снижает его копией грацию и соответственно скорость апф-
фу зии в кровь. С дрх ой стороны, прием шипи вызывает изменение pH содержимого желудка и
увелшшвает время эвакуации из желудка, что сопровождается и повышением степени резорб-
ции ряда токсикантов.
Резорбции в кишечнике
Токсиканты всасываются в кровь преимущественно в кишечнике (pH среды топкой
кишки 6.5. сока поджелудочной жсэезы Я.6—9,0; сока тонкой кишки 5,07—7.07; толстой
Рас 4-10. Ионизация салициловой кислоты в зависимости от pH среды и диапазон pH жеду ючногосока.
пла мы крови, ерс ты гонкою кишечника. Расчеты произведены с помощью про1раммы Marvin Sketch
З’Э 5 фирмы ChcmAxon Ltd. http://www chcmaxon.com/marvin. Пояснение в текст с.
164 Глава 4
Рис 4-11. Ионизации м >рфина в зависимости от pH среды и диапазон pH. соогветствуюшип некоторым
СиЮДО1 н таким жидкостям. Пояснение в тексте.
кишки — 6.8). боды пая часть которых — путем пассивной диффузии, остальные — посредс-
твом активного транспорта. В кишечнике не ре орбируются сильные кислоты и основания,
затруднено всасывание ионизированных молекул, содержащих четвертичный азот. Резорбция
слабых кислот определяется величиной их рКг Важно отметит ь, что с увеличением концентра-
ции токсиканта в кишке повышается скорость его всасывания, но при этом сохраняется доля
(процент) всосавшегося вещества.
Если вещество нерастворимо в липи тах. то оно практически не пропик-зет из кишечника в
кровь. Нерастворимые в воле липофильные соединения также не резорбируются в кишечнике.
Размеры мо скул влияют на резорбцию: чем больше молекулярная масса. тем труднее про-
никает вещество через эпителий кишечника.
Токсиканты резорбируются во всех отделах кишечника, что связано с его морфофхнкпио-
нальными особенностями. Наиболее высокая скорость всасывания наблю. тстся в тонкой киш-
ке (см. табл. 4-7).
В Нас । он шее время активно изучается роль Р-гликопротеинотюЙ системы клеточного пере-
носа. расположенной на поверхности эпителиальных клеток гонкой кишки. Установлено. что
Р-тликопротеин является выкачивающим насосом, способным переносить широким спектр со-
единений из внутри клеточного пространства снова во внеклеточный матрикс и таким образом
сииж ть эффективное всасывание токсикантов. Например, если ввести лекарственный препа-
рат лоперамид, опиоид. который обычно не влияет на центральную нервную систему (ЦНС).
одновременно с ктшнидином (ингибитор Р-гликоиротсина). то лоперамид вызывает побочные
эффекты со стороны ЦНС. В экспериментальных моделях на животных ипгпбпровт. и Р-гли-
копротенн, ввоtilth различные лекарственные средства и опре слали их концентрации. При
этом концентрация препаратов повышалась в 10-100 раз по сравнению с контрольной группой
(Lin и Yamazaki. 2003).
В толстой кишке скорость резорбции ниже, так как концентрация токсикантов меньше, чем
в вышерасположенных отделах кишечника (см. табл. 4-7).
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 165
Нсасываиие неорганических ионон зависит от их природы. ве ичнпы заряда и ряде физико-хи-
мических свойств. Чтобы количественно охарактеризовать всасывание подобных токсикантов
из АКТ в кровь и лимфу, пользуются код|гфициенгом всасывания, или резорбции Нс-
всосавшаяся частьтоксиканы через некоторое время удаляется из ЖКТ вместе с содержимым
и слизью, выстилающей стенки кишечника, к* равен отношению концентрации токсиканта,
всосавшегося в плазму крови и лимфу, к сю исходной концентрации при условии однократ-
ного поступления в барьерный орган (ЖКТ)
Значения к^ установлены для большого ко отчества элементов, попадающих в ЖКТ в ион-
ном виде.
Таблица 4 8. Значения к* злеметггов. находящихся п мойном пиле
Положение элементов в перио гической системе Примечание
Ike элементы главных подгрупп 1 и VII групп Вс< элементы периодов 1 и 2. за исключением бери (дня 1.0 1.0
Э смснты главной потгруппы 11 группы (маг- ний. кальций, стронций, барий. ралпй) 0.1-0.3 С увеличением атомной массы элемента доля всосавшегося токсиканта в кровь из ЖКТ спи ждется
Все элеменгы 111 группы за исключением бора И ГДЫНЯ Элементы побочной пс группы IV группы (ти- ган. цирконии, гафний) « 0.05
Элементы данной гцуцруппы IV группы 1-0.05 Степень резорбции снижается с увеличени- ем атомной массы
Элементы главной подгруппы V группы (N. Р Ах), за исключением сурьмы и висмута 1,0 Увеличение металлических свойств и данном случае сопровождается снижени- ем всасывания химических злеменгон из АКТ
Элементы VI группы 0.1—1.0 При jtom к снижается в 10 раз с увеличе- нием массы момента
Приведенные в табл. 4-9 уравнения позволяют расчетным путем получи it ориентировочные
значения к^ неорганических веществ из ЖК1 в кровь.
Для вс1 еств. поступающих через рог. время пребывания их в желудке замедляет резорбцию,
поэтому скоргк-ть перехода веществ из желудка в явснадиагиперс1пую кишку имеет большое
значение. Например, холодные растворы токсикантов часто оказываются более токсичными,
чем теплые, так как быстрее покидают желудок.
На скорость и степень резорбции токсикантов на протяжении всего ЖКТ оказывают вли-
яние ииогенные соединения (ферменты, желчные кислоты, гормоны и др). обьем и состав
пиши (например, стимулирующее действие пиши на секрецию желудочною сока и соляной
кислоты), количество принятой жи(кости. интервал между приемом пиши и введением
токсиканта, курение и прием алкоюля, микрофлора кишечника. Например, прием алкоголя и
курение способствуют увеличению резорбции свинца в кровь почти в 2 раза, лактобактерии
энтерококки, клостридии кишечника деметилируют наркотик метамфешмип. у грудных детей
возможны восстановление питра ов до нигритов под действием микроорганизмов кишечника
и образование метгемоглобина (см. гл. 2.4.2).
При интерпретации результатов химике-юксиколо»ическото анализа различных токсикан-
тов (см гл. 5. 7—11) учитывают феномен их печеночно-кишечной циркуляции, сущность кото-
рого заключается в следующем. Конъюгаты токсикантов с глюкуроновой кислотой (см. ниже)
плохо рас воримы в жирах и хорошо — в воле, в связи с чем их резорбция в кишечнике затруд-
нена При частичном гидролизе конъюгатов концентрация липофильных могскул агликона
(свободного токсиканта или его метаболита) вновь возрастет, и они обратно резорбируются
в кровоток.
166 Глава 4
lao.Tuiia 4-4. Взаимосвязь к^ с физико-химическими свойствами элементов
Положение хгементов в 11ерм<>зичеекой системе Ионы элементов Взаимосвязь с физико-химическими свойствами хтеменюя
Элементы с законченной 8- и 2-электрон ной обо- лочкой i 1 J 1 XI. К*, Rb*. Cs . Г Mg- . Са- Sr1- В;Г . Ra .Al Sc , Lt’-, Ac . Lu ’. Yb . Ti . Zr4*. HP . Се4*. Пт4 I 4 . Pa . Np4'. Pu ’. Чем выше значение ионного noieHiiiuuia, гем меньше к^ . Ионный noieiiuiiiLT определяет энерппо 1ндратаиии иона, по- этому чем сильнее гидрат ipyeгея поп в водных растворах, тем больше становятся его размеры и гем меньше он способен вса- сываться в кровь. Экспериментально установлена к рре шннонная связь между к 1 и теплотой образования фторидов jtoiT группы ионон: lgK^O.2 -(ШИГу*. где у — тс шота образования фторида тою нона, для которою рассчитывается к^
Элементы с закопченной IX- и IX+2-электрошюй оболочкой Cu , Ag . Air Zir*. Cd- Hg- . Ga’ hi’ . TI . Ge4'. Sn’*. Pb- BP Способны легко поляризоваться. сами обладают выраженной |1о.1яри-зую111Сй способностью, образую! плохорастворимые сульфиды. а некоторые из них — хлориты и пшрокенды. Поэ- тому к^ зависит от раствори мости их сульфидов в воле
Элементы с незакончен ной 18-электронной обо- лочкой Crv. Mir*. V4 . 1 e , Fe * Co»*. Ni=*. Cu’*. RtP*. RIP Pd4*. Os“ IP*. Pt4 Известна гависпмостъ между радиусом иона, ионным потении алом н теплотой образования тдрокситоп. Рассчитано уравне- ние линейной ршрессин. характери зуюшее зависимость между kpei и стандартной мольной энтальпией образования гтроксн- дов этих элементов (х): w —1,7 10 ' х
Реюриция в легких
Через легкие в организм поступают сообразные (парообразные, летучие) токсиканты (см.
гл. 8.2). что нередко происходит не только в производственных и лабораторных условиях, по
и в быiy. а также в свят с загрязнением окружающей среды или химическими и другими ка-
тастрофами (см. гл. 10 и II). Поступление веществ при вдыхании их паров зависит от природы
токсиканта и ряда физиологических параметров альвеолярной вентиляции, остаточною обьсма
легких, проницаемости для данного вещества альвеолярно-капиллярной мембраны (барьера),
скорости легочного кровотока, минутного объема сердца, общего объема крови, массы легоч-
ной ткани и других показателей.
Процесс диффузии кислорода через альвеолярно-капиллярный барьер описывается уравне-
нием
Da = O.SuD^S+S)-^.
где Z)n, — скорость диффузии (мл/мин) — абсорбционный коэффициент Бунзена: D — коэф-
фициент диффузии кислорода 5 — площадь поверхности легочного эпителия: S площадь
поверхности эн/киелия альвеолярно-капиллярного 6api«ep* — средняя эффективная го.ннипа
альвеоляр!ю-капнлляр)юго барьера.
Ипгаляциопно в организм могут поступать не только газы и нары, по и аэрозоли. Для ре-
зорбции токсикангов вдыхаемый газ должен вступить в контакт с альвеолярной поверхностью
легких (см. табл. 4 7). Альвеолы разделены тонкими соединительнотканными перегороди ми.
в которых проходят кровеносные кашыляры. Базальная мембрана эндотелия капилляра может
вплотную приб. ижаться к базальной мембране эпителия стенки альвеолы, благодаря чему барь-
ер между кровью и воздухом (аэро!ематичеекий барьер) оказывается очень тонким — 0.5 мкм
Между альвеолами существую! сообщения в тыс альвеолярных пор «ымстром 10—15 мкм.
Альвеолы тесно прилежат друг к другу, и кашьыяры. оплетающие их, одной своей поверхностью
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 167
граничат с одной альвеолой. а другой — с соседней Это обеспечивает оптихшльные условия для
газообмена между кровью. протекающей по капиллярам, и воздухом. заполняющим полости аль-
вео Однако путем простой диффузии газ не может быстро преодолеть расстояние от полости
носа пли ротовой полости то стенок альвеол. Конвекция (механическое перемешивание 1йзов
в дыхательных путях и легких) осушес шляемся за счет последовательно сменяющих друг друга
актов вдоха и выдоха (вепти яппи легких), что обеспечивает постоянный обмен гадами между
внешней срелрй и opi шнзмом В среднем ipcGyvica около 2 мин, чтобы концентрацию газа в
альвеолах довести примерно до 95% исходной, поступившей с вдыхаемым воздухом.
Аэрозоли — дисперсные системы, состоящие из жидких или твердых частиц, нахотяшихся
во взвешенном состоянии в газообразной среде (обычно в воздухе). К аэрозолям относятся
дымы, туманы, ны ш, смог. Размеры част иц в аэрозолях составляют or 0,005 до 100 мкм, чаще
от 0.15 до 5 мкм. При ингаляции аэрозолей глубина их проникновения в дыхательные пути
ИВНСИГО1 размера части, мельчайшие из них достигают поверхности альвеол. Доля вещества,
задержанная в дыхательной системе, зависит от размера частиц, минутного объема и частоты
дыхания Локализация частиц в дь хательиом тракте также определяется их размерами.
Осаждение пылевых частиц к дыхательном тракте происходит в результате трех процессов:
инерционного осаждения, седиментации н лпффу ши.
Инерционное осаждение происходит преимущественно в носовой полости, носоглотке,
гортани н трахее. Воздух в .них отделах движется со сравнительно большой скоростью. При
резком изменении потока воздуха крупные частицы диаметром более 1 мкм продолжают дви-
жение и оседают па слизистых оболочках (см. табл. 4-7). Благодаря механизму инерционного
осаждения верхние дыхательные пути отфильтровывают частицы диаметром более I мкм
Ссднмептапия происходит в бронхиальном дереве, где воздух движется с мспыпей скоро-
стью. Главной причиной осаждения частнп является действие силы тяжести Осаждаются час-
тим диаметром менее I мкм
В легочных альвеолах. пе скорость движения воздуха мала, оседают самые мелкие частицы
(диаметром 0.1 мкм и менее) Механизм осажтения обусловлен броуновским движением и
диффузией
Дальнейшая судьба токсиканта определяется его природой и размером пылевых частиц.
Если вещество хорошо растворяется в жидкостях, выстилающих дыхательные пути, то основ-
ное место занимает резорбция токсиканта в кровеносное русло. Нерастворимые и малорвсто-
римые вещества, депонированные в верхних дыхательных путях, удаляются из них вместе со
слизью движением ворсинок реснитчатого эпителия.
Частицы, осевшие в альвеолярной части легочной ткани, тибо захватываются фагоцитами,
либо переходят с клетками лимфатической жидкости в лимфатические узлы и там отлагаются.
Выделение пылевых частиц из лимфатических узлов происходит в течение нескольких лет.
Резорбция слизистой оболочки глаз
Контакт паров, аэрозолей или капель токсиканта со слизнсмой оболочкой глаза оказывает
как местное, так и системное действие. Например, взаимодействие паров зарина (фосфороор-
ганическос боевое отравляющее вешесгво) со слизистой оболочкой глаза не только вызывает
iiapaj bi мыши зрачка, потерю способности глаза к аккомодации и ослабление зрения, но и
ингибирует действие фермента холинэстеразы (см. гл. 8.4).
Скорость резорбции определяется природой вещества (растворимость в липидах и воле, за-
ряд молекулы, значение рКа, размер молекулы) и особенностями липидного барьера роговицы
глаза (см табл 4-7). через который легко проникают жиро- и водорастворимые вешесша.
I оксикант. контактирующий с роговицей, равномерно распре юдяегся по поверхности скле-
ры п конъюнктивы глаз. Часть его смывается слезной жидкостью, содержащей 1.5% хлорида
н.ирия. 0.5% а. ьбумипа и слизь, в состав которой входит лизоцим
Токсикант задерживас1ся на роговине от нескольких секунд до 6—10 мин, его максимальное
содержание в структурах глаза наблюдается в роговице, минимальное — в хрусталике. Склеро-
тические процессы (в том числе возраешые) в сосудистой сисчсмс глаза нарушают процессы
резорбции
Резорбция из тканей
При подкожном и внутримышечном введении или через раневую поверхность токсикант
также может поступить и кровь. При подкожном введении токсикант попадает в подкожную
168 Глава 4
клетчатку, богатую жировой тканью (см. гл. 2.4.5). выступающей в качес гас депо лля ксенобио-
тика. Скорость резорбции н биолоступ!гость токсиканта значительно меньше, чем при внутри-
мышечном введении, когда вещество вначале постутпст в мышцу, накапливается в ней. а та гем
резорбируется в кровь. В этом случае мышпа служит депо для токсиканта.
Различия в концентрациях токенкаша в месте вве тения. окружающей ткани и крови явля-
ется условием резорбции вещества в кровь и внутренние среды организма. Сеть капилляров
и лимфатических сосудов хорошо развита в подкожной клетчатке и межмышечной соедини-
тельной ткани. Кровеносные капилляры — наиболее многочисленные и самые тонкие сосуды,
имеющие, однако, различный просвет. Наиболее узкие капилляры (диаметром 4.5—7 мкм)
находятся в поперечнополосатых мышцах, легких. нервах и т.д.. более широкие (диаметром 7—
11 мкм) — в коже и слизистых оболочках. В мыпше человека на I мм’насчшывастся 1400—2000
капилляров а в коже на тоД же плошали — 40. Пористость (диаметр нор 3—4 нм) и тонкость
стенок капилляров, огромная площадь их соприкосновения с тканями (более 6000 м2). мед-
ленный кровоток (0,5 мм/с), низкое артериальное давление (20—30 мм рт ст.) обеспечивают
паилучшис условия для обменных процессов (см. гл. 2.4) Поверхность всасывания в тканях
для липофильных соединений в сотни раз больше, чем для водорастворимых веществ, прони-
кающих в кровь только через поры.
Резорбция токсиканта зависит и от процента функционирующих (раскрытых) капилляров
и давления крови в тканях, которое pciy.inpycrc» вазоактивными факторами (эпдотс.1ийзави-
симыс релаксирующие факторы, оксид азот, простагландины. энло1енныс ре1уяягоры — ад-
реналин, норадреналин. ацетилхолин, серотонин). Мембрана капилляра проницаема для водо-
растворимых, а также и высокомолекулярных веществ, если размер их молекул не превышает
размера нор капилляра. Поэтому проникновение очень многих токсикантов в кровь вполне
возможно при их введении в мышцы.
Распределение токсикантов
Токсикант после поступления в кровь неравномерно распределяется кровотоком по органам
(тканям) и досгагаст клсгок-мишсисй. проявляя токсическое свойство (см гл. 3). Накопление
токсиканта далеко не всегда происходит в органс(тка11н)-мишс1ш. что приводит к снижению
токсическою эффекта.
Распределение — динамический процесс, включающий связывание с белками плазмы и фор-
менными элементами крови, проникновение (пспстранию) в эфферентные органы (ткани),
поступление в метаболизирующие или экскретирующие органы, осуществляющие биотраис-
<|юрмацню токсикантов. Некоторые токсиканты избирательно накапливаются в гом или ином
органе (ткани) или клетках определенного типа. Характер распределения токсикантов зависит
oi ряда причин, в том числе и от генетически детерминированных индивидуальных особен-
ное 1сй. что определяет вариацию токсикокипстнчсских параметров и степень развития токси-
ческого эффекта.
Распределение токсикантов осуществляется посредством жидких сред (жидкостей) организ-
ма (табл. 4-10).
Таблица 4-10. Жилкосш орщпнзма человека
Жидкость Описание
Кровь См гл. 2.4.3
Лимфа Все органы, за исключением поверхностных слоев иди. ИНС в костей, иронн кшы густой сетью замкнутых с концов лимфатических капилляров. В них образуется лимфа. Стенки лимфатческих капилляров образова- ны олиос дойным эндотелием. Через стейку лимфатических капилляров в лимфу ЛС1ХО проходят растворы электролитов. углеводы, жиры и белки Лимфа — бесцветная. почти прозрачная жнткость. содержит в 3- 4 раза меньше белков, чем плазма крови. Вслсдс!вис этого вязкость лимфы мень- ше. а относительная плотность ниже, чем плазмы крови. Реакция лимфы щелочная
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 169
Внеклеточная
(жидкость внеклеточного
пространства. жидкость,
содержащаяся пне клеток
оргшнпма)
Внутриклеточная
Окончание шаы. 4-10
Составляем 30—40% общего объема жидкости (жидких сред, организ-
ма. Содержит примерно 1/3 всей ноты организма с растворенными в ней
ионами и малыми молекулами: солями. моносахарами. аминокислотами,
жирными кислотами, витаминами и газами. Различают 3 вила внеклеточ-
ных жидкостей:
межклеточная жидкость (жидкость межклеточных пространств различных
тканей, интерстициальная жи: кость) -22.5—27% массы тела (см. ниже):
межклеточная жи кость г зазмы крови и лимфы 3.7—4.5% массы геля:
трансиеллкыярпыс жидкости -1.3—1.5% массы тела: снипномои-опая жид-
кость. в iHHHCiaM влага глаза. перилимфа и эндолимфа внутреннею уха.
жидкости полостей тела и ЖКТ. жидкости, секретируемые железами.
Омывают клетки и участвуют в осуществлении транспортных функций:
доставке к клеткам питательных веществ. кислорода, ионов макроэлемен-
тов и микроэлементов:
доставке к клеткам юрмонов. передающих координирующие влияния ре-
гуляторов. согласующих разобщенные п пространстве и времени функции
клеток:
улалеппн из среды клеюк конечных продуктов метаболизма. СО токен
кантов или их метаболитов.
Состав сильно отличается or cociaua внутриклеточной жидкое ш (см. ниже).
Первая содержи гболыпос количество катионов натрия и кальция, меньше —
калия и магния, хлорид нон является доминирующим. Копией грация глю-
козы выше, чем во внутриклеточной жидкости. а белков — ниже
Межклеточная, или интерстициальная (тканевая жидкость, внутриткане-
вая жидкость)
Одна из разновидностей внеклеточной жидкости. Дисперсная среда, за-
полняющая межклеточное upocipdHCiBo. — водный раствор неорганичес-
ких солей, питательных веществ и конечных продуктов меттболизма
По составу почти идс1гтична плазме крови, отличается от нее очень низкой
концентрацией белков (-40% концентрации белков плазмы, -1,5—6,0 г/лл).
что обусловливает се коллоидное осмотическое давление -8 мм рт. ст.
Mipaer важнейшую роль промежуточной среды, через которую осущест-
вляется двусторонний обмен веществами между кровью и клетками других
iKuneii
В этом процессе участвуют мнкроциркуляторнос русло н капилляры сис-
темы лимфообращения. Обмен bci тестиами через ннгерстин11«льную жид-
кое 1ь осуществляется 1лавным обрезом путем диффузии и фильтрации
Содержится внутри клеток организма. Составляет приблизительно 2/3 мас-
сы lean. Необходима для осуществлении основных жизненных процессов:
преобразования хранения и использования энергии: гомеостаза; реплика-
ции. выполнения структурами клеток специфических функций.
Состоит из волы с растворенными в ней нонами и малыми молекулами:
солями, сахарами. аминокислотами. жирными кислотами нуклеотидами,
витаминами и i азами
Крупные молекулы — белки. РНК — образуют невязкис (золи) или вязкие
(вели) коллоидные растворы. Объем впучрик к-гочпой жидкости составляет
-60—70% общего объема жидкое!и (жидких сред) организма.
В отдельной клетке внутриклеточная жидкость — растворимая часть тио-
ила мы (цн|о'юл1>). заполняющая пространство между органеллами клетки
В цитозоле |||ютекают основные метаболические реакции, кроме синтеза
нуклеиновых кислой осуществляемого в ядре. В цитозоле резервируются
различные вещества. Для живой клетки характерен активный ток цитозо-
ля. чю отчетливо видно по движению органелл (циклоз). На долю воды в
цитозоле приходится -90%.
Во внутриклеточной жидкости существе пю больше ионон калия и магния,
основным анионом является фосфит Концентрация глюкозы внутри кле-
ток ниже, а белков — выше.
170 Глава 4
Скорость и характер распределения вещества в тканях определяется скоростью диффузии
вещества. через соответствующие мембраны, скоростью перфузии (интенсивностью кровотока),
свойствами клеточных мембран, сродством токсикантов к молекулам-мишеням или другим хи
мичсскпм структурам, находящимся в клетках В различных органах стенки капилляров имеют
различные свойства и. следовательно. различную проницаемость для химических веществ.
В табл. 4-11 приведены свойства, локализация рахнгншх барьеров и влияние, которые они
оказывают на проницаемость веществ.
Зяблина 4-11. СшмТсгпа, локализация и проницаемость различных барьеров оргвинзми (С.А. Куценко,
2004)
Тип барьера Локализация Проницаемость для веществ
Липидная мембрана без пор Слизистые оболочки полости pin. эпителий почечных канальцев, шнтелиЛ кожи, гематоэнцефали- ческий барьер Л ппофильные ннзко^юл скул яр- ныс- вещее i на
Липидная мембраны с норами ма- лого диаметра (0.3—0.8 им) )umv.iim юнкоЙ и laiciui) кишки Липофильные и нпзкомолскуляр пае (ло 200 Д) водорастворимые вещества
Липидная мембрана с порами среднего диаметра (0.8 4 им) С пнистые оболочки глаз, носо- глотки. мочевого пузыря Липофильные и в меньшей сте- пени гидрофильные вещее । на
Липидная мембрана с порами большого диаметра (более 4 им) Почечные капилляры, альвеоляр- но-капиллярный барьер, капил- ляры кожи, мыши Липофильные и гидрофильные вещества с молекулярной массой это 4000 Д
Пористая мембрана Гломерулярный аппарат почек Гидрофильные вещества с моле- кулярной массой до 50 000 .1
Гоксикяпты распределяются в виде молекул и ионов, некоторые из них при физиологичес-
ком значении pH крови образуют коллоидные частицы, становясь третьей формой, которая
содержится в этой жидкости. Молекуты, ионы и коллоиды токсикантов moivi переносится
кровью разными способами (см. гл. 7—11):
• физически юти химически связываясь с элементами крови. главным образом с эритроци-
тами;
• физически растворяясь в плазме в свободном состоянии;
• связываясь с одним или более видом белков плазмы, образуя комплексы, либо прикрепля-
ясь к другим фракциям плазмы
Для большинства токсикантов в крови наблюдается динамическое равновесие между
2 фракциями токсиканта, находящегося в свободном и связанном с бе тками плазмы или эрит-
роцитами крови состоянии.
Некоторые токсиканты переносятся элементами крови, нрежле всего эритроцитами и. реже,
лейкоцитами. Внешняя поверхность мембраны эритроцитов имеет отрицательный заряд из за
наличия молекул мукополисахаридов. Положительно заряженные ионы, особенно содержащие
четвертичный атом азота в молекуле, активно взаимодействуют с поверхностью эрнтроин-
тов. Токсиканты неорганической природы могуч абсорбироваться поверхностью эритроцита
(плпример. мышьяк, цезии, торий, радон, свиней и натрии) либо связываться с лигандами
стромы. Попадая внутрь эритроцита, ксенобиотики могут взаимодействовать с гемом (монок-
сид углерота) или с глобином (2"’Но) и накапливаться в силу этого преимущественно в крови
пострг низших. Один и тот же элемент в зависимости от степени окисления связывается по-
разному: ионы, содержащие Сг (VI), — исключительно с эритроцитами, а ноны СР . неспособ-
ны проникать через клеточные мембраны. Органические соединения ртути (например, мегил-
ртхть) в основном связываются с эритроцитами. а ионы ртути переносятся преимущественно
альбумином плазмы. За перенос цинка конкурируют эритроциты, а также специфические и
песпетитфические белкн-псреносчикп (см. гл. 8.5). Газы и пары могут растворяться в плазме.
большинство токсикантов перенося гея белками плазмы. Плазма крови ч ловека содержит
около 75 мг/мл белка (см. гл. 2.4.3) и представлена альбуминами (35—55 мг/мл). глобулинами
(иммуноглобулинами). белками свертывающей системы крови, белками системы комплемента.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 171
ншпбпгиримп протеолиза..пню- и гликопротеинами (0.9 мг/мл). Белки плазмы имеют общую
поверхность площадью 600—800 км1, способную абсорбировать токсиканты.
Альбумин обладает уникальной способностью связывать многие низкомолекулярные ток-
сиканты. Молекулярная масса альбумина около 66 000 Д. а п>бумин содержит 5X5 остатков
аминокислот, третичная структура белка поддерживается 17 дисульфидными святя ми, при
pH 7.4 находится преимущественно в анионной форме Молекулы а тьбумипа содержат около
109 кзгионных и 120 анионных участков для связывании ионов. Альбумин переносит, напри-
мер. ионизированные формы каких соединений. как лиипгро- и ортокрсозолы. нитро- и гало-
енопроизвочныс аромап|Чсских углегюлорс цтв. барбитураты. витамин С. гистамин и многих
руптх соединений разных классов. Большинство попавших в кровь веществ фиксируется на
альбуминах независимо от того, являются они нейтр гъными. кислыми тин основными соеди-
нениями.
На альбумине человека выделяют несколько связывающих участков (их число точно нс ус-
тановлено. прелполапног более 6). Центры связывания (табл. 4 12) отличаются друг от друга
сродством к веществам с различными рК механизмами взаимодействия с токсикантами, кон-
стантами устойчивости (нестойкости) комплекса белок—токсикант Вещества, связывающиеся
с одним и тем же участком, могут конкурентно (согласно закону действующих масс) вытеснять
другие, что приводит к изменению их копнетранни в плазме крови.
Таили и j 4-12, Основные связывающие учнезки альбумина плазмы крови
Участок Вещества
У исток, связывающий высшие «ирные кислоты Высшие жирные кислоты нсрасгворпмы в плазме кропи при физпо- .топтчееком значении pH 7.4. Жирные кислоты ослабляют связыва- ние гликозидов, бензо [иазешшов и некоторых других веществ с аль- буминами. Связывание жирных кислот с альбумином стабилизирует сто структуру
Бк.Т1трхбипс1зязывию1Ш1н участок Билирубин, образующийся при разрушении гемоглобина (непрямой), нс растворяется в гзоче. Его связывание с альбумином изменяет кон- формацию последнего и как с те ензве сро тство к другим транспор- тируемым молекулам. Многие токсиканты конкурентно вытесняют из альбумина билирубин, что приводит к увеличению сто Konneirrpa- нни в плазме крови и сопровождается интоксикацией (см. гл. 2.4)
Варфарипсвязываюиптн участок Многие низкомолекулярные соединения Связывающая способность стсреоспев ифичпа
Пилот тспязывиюшзш участок Бензодиазепины, l.-тирокснн. тринто<|кзн пеинцилтипы н другие со- единения. Бензодиазепины конкуречМо вытесняю! ряд других ток- сикантов. а также триптофан, повышая их копие праггию в плазме крови
Достаточно часто встречается гипоальбуминсмия. которая нарушает тин изменяет транс-
порт токсикантов.
Молекулы а,-, а,-. 0,-. f},-. у-глобулина переносят малые молекулы соединений (витамины
А. В I). II, К. стероидные гормоны и др.), ионы некоторых металлов (мель, нинк и железо)
и коллоидные частины.
Липопротеины плазмы переносят липофильные токсиканты, акне, как подихдори|ювпн-
ные дифенилы ПХБ (см. гл. 10). Гликопротеины связывают молекулы, обладающие свойства-
ми слабых оснований.
Органические кислоты (молочная, глутаминовая, лимонная; образуют комплексы с некото-
рыми токсикантами (например, катионами |цс.ючно- и редкоземельных алсментов), имеющи-
ми высокую степень диффузии.
Другие белки плазмы — транс<|кррин. мстатлотиоипн. церулоплазмин конкурируют с органичес-
кими кис. снами за перенос кантонов, образуя прочные специфические комплексы (см. гл. 8.5).
В зависимости от степени сосудистой (кровяной) перфу зии организм человека можно раз-
делить на следующие компартменты в нисходящем порядке.
• внутренние органы, включая мозг (75% общею обтсма крови),
• кожа и мышцы:
172 Глава 4
жировые ткани:
• соединительные ткани и кости (около I'? общего объема крови).
Хорошо перфузируемые внутренние органы обычно получают наивысшую концентрацию
1 окси кантон та короткое время. Г1осчуч1ленпе I оке и кантов в ткани с пониженной перфузией
происходит гораздо медленнее. однако степень их удерживании выше и период пребыпапия
(аккумуляция) более нротолжительнын
В табл. 4-13 приведены особенности кровоснабжения различных орчапон и суммарная ччло-
чпчсчь их капиллярною русла.
Таблица 4-13. Особенности кро1юси<|бжени>1 различных органов и суммарная шош.члч. их каннгтярного
русла
Ор»Д)1Ы Масса органа. % Кровоток, нл/мнп Плочмдчь каччнл. ярночо руста см:Т
Ночки 0.3 45т.) 350
Легкие 1 5000 | ’50
Мозч 2 550 240
Печень 2 750 1 250 ______
Мышцы 43 ] 40 70
Важнейшую роль и межклеточном распределении токсикантов ичраеч содержание вмн-и.
липидов и белков в метках различных тканей и органов. Укатанный выше порядок ком-
партмечпов также довольно точно отражает содержание влаги в клетках этих компартментов.
Гидрофильные токсиканты более активно распределяются н ж «костях и клегкач организма с
высоким содержанием влаги. а липофильные гокенкачгчы — в клоках с повышенных содержа-
нием липидов (жировые ткани). Гоксикаччты из крови попадают в органы. Почато снабжаемые
кровью, а зачем они перераспределяются в сзхггвстствпя с дручими свойствами чкаччей на-
пример наличием специальных механизмов захвача вещеепч. высоким содержанием структур,
связывающих ксенобиотик, или соотношением жира и во чы в орчанс или чкани. Ко1чсчпое
распрсдешмчие токсикантов орчанической природы, длительно сохраняющихся в организме, не
зависит от особенностей крочмх:набжения оргаччов.
Высокомолекулярное водорастворимое вещество белковой природы (см. ч.ч. II). циркули-
рующее в крови, нс лиффу щируег в ткани, если размер его молекулы превышает диаметр пор
стенки капчььчяров. Такое же — исключитетыю внутрисосудистое — распределение характерно
.тля комплексов низкомолекулярных всшестчч с белками плазмы крови Нроччесс комччлексооб-
разоваччччя токсиканта с белком подчиняется глобальному закону химии — закону дебет ччучочшчх
масс Полгому по мере диффузии несвязанных молекул чоксиканча ироисхо шт диссоциация
белковых комплсксочз до тех пор. ччокл концентрация свободного чюксиканта не доститеч рав-
новесных значений во внутри- и внесосуднстом пространстве.
Водорастворимые токсиканты, которые свя зываюгся с алчюммчпчамчч и кислыми ч чикопроте-
иччамп. попадают в клетки лишь через поры клеточных мембран диаметр которых значительно
меньше пор стенок каччччлляров (см. табл. 4-11) На способность вешсспз проникать через кле-
точные мембраны влияет чзеличипа рКа Если изменяется кислотность ччлазмы крови (при ряде
заболеваний ччабиюлается алкалоз или аччидоз). то мечзяктгея сооттчошсннс ионизированной и чче-
ионизированной ч|юрм молекул токсикачпа и характер их распределения по тканям и органам.
Среди водорастворимых веществ сеть и такие, которые проходят через стенки капччдля-
ров. но не проникают внутрь чечеток, пакаччлччваясь в экстрацеллюлярном пространстве ткаччей
(сул||фачч4. тиоцианаты и др.).
Токсиканты, хороню растчктряючччччсся в липидах. лечко проникают нс только через гисто-
гематичсские барьеры. но и через клеточные мембраны, попадачот внутри» клегок и накацди
ваются чч жировой ik.iiih (15—20% массы тела, у тучных людей 50% и более) чч тканях, богатых
линиччямзч (ЦНС). например пестициды. галогенопроизводныс алифачнчес'ких и ароматических
углеводородов чч лр. (см. гл. 7 н S), Некоторые зкопачлютючтча (см. чл. 10 ) чч пестициды (ДДТ) —
пракчичсекн ччераепчорнмые чч чзолс вещества — иакаччл11чч»ются в жирах, конце)чтраччия их в
крочччч незначительная, однако прчч снижении содержания жира в орчанизмс такие вещества
носчупают из депо чч крош» и оказывают токсическое деччегвие.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 173
Депонирование токсикантов (соелииелня свинка, кадмия, стронция, фтора и др.) возможно
в костной ткани (см. гл. X) и связано с участием кристаллов гидроксиапатита и внеклеточной
жидкости. омывающей ее.
Лепонирование — разновидность распределения юкепкантон в организме. при котором про-
исходят его накопление и удерживание в определенном органе или ткани в течение некоторого
времени (от нескольких суток до многих лет) при относительно одинаковой концентрации.
Депонирование связано с высоким химическим сродством токсиканта к определенным эндо-
тмгандам (химическим соединениям), содержащимся в депонирующей ткали, и/илн высокой
липофильностью токсиканта.
Накопление токсиканта в конкретном компартменте обычно имеет временный характер, что
связано с рат пнем между скоростью абсорбции и элиминации токсиканта. Нередко накоплению
«сиклнга в (канн сопутствует ею перераспределение в лруше ткани, что част определяется
>нкциональным состоянием органов, гормональным пли мнкроэлементным дисбалансом. обес-
жменностью организма витаминами, приемом лекарственных средств и друтими причинами.
Токсиканты, существующие в плазме крови в виде молекул, ионов, коллоидов, можно раз-
делить на несколько групп в соответствии с их преимущественным удерживанием и накопле-
-мем в конкретном компартменте табл 4-14).
TaLama 4-14. Группы юксикангов, преимущественно накапливающиеся в конкретном компартменте
Гр itia токсикантов Примечание
Тскгиканты. растворимые Однозарядные ноны — лит ни. натрии, калий. рубидий, хлориды, бромиды —
> жэикостях оргсииы.ма равномерно распределяются в компартмеитах в зависимости от содержания
в них воды
1 фильиые токсиканты Неполярные токсиканты, органические растворители, спирты, аз влепим,
кетоны, хлорированные углеводороды, некоторые инертные газы.
Содержание лииттлпои фракции в тканях различно. Головной мозг и все
ткани ЦНС богаты .пиццами. склонны к накоплению липофильных ток-
сикантов, что представляет большую опасность из-та непосредственно!
близости непротокепкантов (анестетики, органические растворители, тет-
раэтилсвинец. ртутьорганические соединения и лр ) к их мишеням
Токсиканты, удерживаемые в богатой липидами ткани знлокртиптых желез,
вызывают гормональные нарушения.
Накопление токсикантов в жировой ткани мсиес опасно из-за отсутствия
мишеней для токсического действия, но при условии сохранения массы
жировой ткани
Токсяканты. об.шлаюшие Около 60 элементов относят к группе остеотропных. например ютлышй,
ккхжой степенью остео- барии, стронции. радон, бериллий алюминий. кадмий, свиней и др (см.
Тсжснканты. образующие Ланган, гафний и некоторые 3- и 4-зарядные ионы ряда элементов захва ына-
шиокдные частицы ются специальными клетками ретнкуло'иитотелиальнои системы определенных
органов и тканей в зависимости ст размера образу мых коллоидных части.
В печени удерживаются преимущественно боыее крупные «истины. Меткие
| коалондные частицы распределяются в селезенке, костном мозге и печени
Барьерные функции — физиологические механизмы, которые обеспечивают защиту ор-
ганизма и отдельных его частей от изменений окружающей среды и сохранение необхо-
димого ня нормальной жизнедеятельности постоянства состава, физико-химических и
биологических свойств ннугренней среды (кровь. лимфа, зканевая жидкость). Например, про-
никновение в L1I1C водорастворимых ионизированных веществ крайне затруднено, что обус-
«но особенностями строения гистогемагического барьера между кровью и тканью мозга —
пематоэниефалического барьера и барьера, отделяющею цереброспинальную жидкость от кро-
нного русла. — тсмаюликворною барьера.
Внутренние барьеры получили название тканевых, гематоичренхиматозных. сосудисто-тка-
нешх и гл. Наиболее распространен термин «гистогематическиП барьер». Особенностью гпе-
тотематмческого барьера является его избирательная иронинаех ость. Большое значение для
жизнедеятельности организма имеют специализированные барьеры. К ним относят гематоэн-
174 Глава 4
iLe<|ML<ni4cx'K>iii барьер (между кровью и 111 К ). 1смак>оф1альмнчсск1)н барьер (между кровью
и HHYipHi.ia >ной жидкостью). 1емагола6ирингный барьер (между кровью и эндол>1М(|>о>'| лаби-
ринта). барьер между кровью и половыми железами. К гпстогематичсскнм барьерам относя)
также барьеры между кровью и жидкими средами организма (цереброспинальной жидкостью,
лимфой. плевральной и синовиальном жидкостью) — лак называемый 1емалоликворныи. гема-
толимфатически п. гсманэплсвральный. юмзпмзнюниплытый барьеры. Барьерными свопе iвами
обладает планенза.
Гемато >нцефи.ическии оаръер (1ЭЬ) — барьер между кровью и молом (blood-brain barrier —
bhb). Капилляры мола в отличие от всех лрушх капилляров, имеют значительно мснынин х|>-
фективный радиус нор. Клетки эпителия н капиллярах плотно прилегают друт к другу Мозг как
центральный орган охраняется особенно iniaieibiio 01 проникновения бо1ынинсгва соедине-
ний. У ниппельных веществ. которые должны попасть в мол (аминокислоты, путины, глюкоза
и т.п.) есть специальные переносчики через мембраны 3fiiiicjfnfl.il.пых клеток капилляров.
В тбл 4-15 приведена характеристика специализированных барьерных механизмов. пре
нятстпуюших проникновению токсикантов н определенные ткани и органы.
Укюкрииные лее./езы Токсиканты поступаю) в клоки желез путем дн<|и]1улн1 через биологи-
ческие липидные пористые мембраны. Кисло) ность секрета желез отличаею» о) кисло шести
плазмы крови, например pH слюны и грудною молока ниже pH крови Иля этанола соотно-
шение содержания в грудном молоке и крови больше I Использование секретов экзокринных
жедез в качестве биологического объекта лля химнко-гоксиколо)ическото анализа (см. гл. 5)
объясняется прямо!) зависимостью между содержанием токсиканте в кропи и секрете желез.
Габ.1ниа 4-15 Характеристика основных барьерных механизмов
Ьары.р Характеристика
Гемлтоэниефалпчес- Самороулнруюцпяся система, мпнеятая от потребностей нервных клеток м
к л и и (емаголиююр- мещбаигк-ских процессов в оршшиме. Проницаемость неолинакова в разных
нын отделах мозга, селективна лля разных веществ и pciy.inpycicH нервными и гумо-
ральными мехинн шами.
Через 6api*cp проникают .1инофил1.ные вещества. низкомолекулярные (нренму
шествеино неорганические ионы) вещества и вешеств,-!. имеющие специальную
транспортную систему (белки-переносчики. см. выше)
Эндотелий капиллярного рус.*# головного мозга — тесно прнлешюпше друг к
другу клегки Эффективный радиус пор капилляров мозш значительно меньше,
чем в других ж< нях. Крупные молекулы не проникают через эндотелиальный
6upi>cp Водорастворимые и заряженные молекулы только малою размера про
ходят через бномембр-аны и иитозьшзму эндотелиальных клеток В норме эндо-
телиальные клетки мозга лишены способности к пшюиипну. Р-глико’нротеин
на холится в эпителиальных клетках структур, пхотяшнх и состав г мзтоэиисф.)-
ЛИЧССК010 барьера, и о1раинчнваст аккумуляцию токсикантов в зависимости от
rcHoimia оршнизма (рис. 4-12)
Морфологические особенности — нхтпчне анатомических элементов, располо-
женных между кровью и нервными клетками (мсжэнлотс.шальные контакты,
охватывающие клетку тесным мольном и препятствующие проникновению ве-
шеств нз капилляров); отросши глиальных клеток шоинсвые ножки астррнцгов).
окружающие капилляр, стягивают сю стенку, что уменьшает фильтрационную
поверхность клшылярз. препятствует диффузии макромолекул*.
В стенках мнкрососулои мозга обнаружены ферменты. способствующие ней-,
тралнзаип» и разрушению поступающих из крови всшесгв. Распределение этих
(]>срментов негынплконо в капиллярах рашых структур мои а. нх активность из-
меняется с возрастом и при патоло)И)1
Поз влиянием алкоголя, при эмоциональном стрессе, перегревании и нсрсох-
|<1ЖЛепни opiainij,Ma, нодаенствип ионизирующего ихтучения защитная барьер-
ная функции снижается
Iемзноликворныя бематоневральный) барьер состоит из стенки капилляра и
клеточной мембраны эпителия xopiioinaibHoio сплетения, окружает перифери-
ческий огдел ЦНС. Переход веществ нз крови в ликвор определяется проницае-
мостью барьера и затру диен .тля водорастворимых и заряженных молекул___
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 175
Окончание mati.i. 4-15
Гематоофчальмичсс- Водянистая влаг.1 глаза осуществляет поставку веществ в хрусталик и pot овину,
кий
не имеющих собе; пенной капиллярной системы.
Избирательно поступают белки, аминокислоты витамин С. «лскгрошты не-
нзбнрагсльно — но гродиензу концентрации путем диффу чин — липофильные
соединения.
Стекловидное тело г.шза накапливает многие нсшестна. в том чи< че наркотики.
При этом сио1но1ненис концентрации веществ в стекловидном теле и плазме
крови близко к 1. а получаемые зкегракты менее 3! i рязнены соэкегракгивпымп
нсщесгнамн. что позволяет нспользовигь стекловидное тело как объект судебно-
химической экспертизы (см. гл. 5)__________ _____ _____ _____
Гемтниплацентарный Кровь матери и идола в норме никогда не смешивайся благодаря наличию ie-
хмтонлапенгарного бартера Он состоит из эндотелия cocy.ioi хориона, его ба-
зальной мембраны, рыхлой сс тиннтсльной ткани, базальной мембраны тро
।фобластичсского эпитыня. Известно бо. ее 600 химических веществ, способных
проникать от матери к плоду и в тон пли иной степени отрицательно влиять ня
его ра звитие.
Волыни не ню чужеродных вешеезв преодолевает плацентарный барьер пут :м
простой Л11<]н|)узип. например ЛСД. фенциклидин. кок шн и ipyiite наркотики,
этанол, органические рзстворнте.ти. иеспин1лы (см. гл. 7, X, 10) Особенность
tLtaueHiaptioro барьера — способность пропускать некоторь е нысокомолскуляр-
иые веществ;!, белки и материнские антитела
* По последним аанныхч. глиальные отростки являются каналам», способным» избирательно экстрагировать из крово-
тока вешества. необходимые для питания нервных кдегок. и ноэнрашчнь в кровь продукты их обмена
Гокеикокинс1нчсские процессы находятся под генетическим контролем. В геноме человека
от *00 до 1200 различных генов ответе!пенны за процессы биотрансформаиии. Индивидуаль-
ные генетические различия между людьми являются серьезным фактором, который следует
учитывать при интерпретации результатов химико-токсикологического анализа. Например,
оценивая концентрацию дигоксина я крови при подозрении на интоксикацию серпе ними
гликозидами, следует иметь ввиду, что концентрация дигоксина достоверно выше у пациентов
с генотипом IT по сравнению с пациента ми. имеющими геиошпы СС и СТ. и это связано с
наличием полиморфного маркера С3435Т гена MDRI. экспрессирующего Р-гликопрогеии.
Итак, липофильные токсиканты, проникнув в эшерошггы. могут вновь «выбрасываться» в
просвет кишечника Р-глпкоиротеином. В знтеропитах, а затем и в гепатоцитах липофильные
токсиканты подвергаются биотрансформаиии до гидрофильных метаболитов, которые либо
попадают в системный кровоток, либо активно секретируются в желчь трансноргерами орга-
Рвс 4- !2. Схема функционирования P-i днкопрогеина в структура гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)
у лиц с ченопшами СС и ТТ (Д.Л. Сычев 2006). Повышение проницаемости ГЭБ вследствие снижения
мкпрессин гена MDRI. приводящего к уменьшению количеств! Р-глнкопрогеина в эндотелноннгах ГЭЬ
» ши с генотипом ТТ, что не наблюдается у лпи с i енот и пом СС. Ф — <|>скс(м|>снал1П1; P-gp — Р-гли-
копротенн.
176 Глава
иических анионов и к тиоиов. Ilaxo шсь в гспвтоиитах. не успевшие метаболизироваться липо-
фильные лекарственные средства также способны активно секретироваться в ж лчь с помощью
P-i.iiiKoiipoieiiiia П|юипкновсиис в ткани липофильных токсикантов затруднено функнпони-
ровапием Р-гликопротеина эндогелноциюн кровеносных сосудов Неметабо ш тировавшиеся
липофильные вещества способны активно секретироваться Р-гликонрогспиом в проксималь
ных почечных канальцах в мочу
Гидрофильные метаболиты токсикантов фильтруются в почечных клубочка* или секретиру-
ются транспортер» ми органических анионов и катионов в проксимальных почечных канальнах
в мочу (см. гл. 2.4.4).
Гидрофильные ТОКСИК1НТЫ путем простои диффузии транспортируются из сосудистого рус-
ла в гепатоциты 1ранепоргсрами органических анионов и катионов (табл. 4-16)
Таблица 4-16. Характеришикя основных транспортеров
Транспортер Яокализапия Функция
Р-глнкопротсип (MDR1) Внешняя поверхность мембра- ны энтсронитов • Выкачивание» из энгероингои в просвет кишечника липофильных токсикантов
Ьа иыатеральнэя мембрана нпппоиитов* Активная секреция липофиль- ных ксенобиотиков и желчь
Баюлаторальная мембрана проксимальных почечных ка- нальцев* Активная секреция липофиль- ных ксенобиотиков в мочх
Внешняя поверхность мембраны эн 1ОТСЛНОЦ1ПОВ. icMiiiooivipH.'ixbitoro. icMUTo- тестнкулярною и 1ематогыа иен гарного блрьерон • Выкачивание» из эпдотелиоиигов в про- свет сосу ti липофильных ксенобиотик в предо прошение их проникновения и L1IIC, яичники, яички и через щцшенгу
OAT Р-С (иошшегпил С. гранспор111руюшн(| органи- ческие анионы) Си нусом дельная мембрана гепатоцитов Поглощение гепатоцитами органических анионов из крови, в гом числе билнру Окна и его глюкуронидов гормонов ши- iobh.ihoii железы, желчных кислот и их глюкуроиировапиых конькиатоп
ОАТР-8 (полипептид 8. трш1спорп|рую1инй ирони- ческие анионы) Сiinxcowuuibinw мембрана гспатониюв Поглощение гепатошгтамн орг гнических анионов из крови
ОЛТ-1 (транспортер 1 органичес ких анионов) Ба юла игральная мембрана проксимальных почечных канальцев Акишная секреция органических анио- нов В MO’IV
ОАТ 3 (транспортер 3 органичес- ких анионов) Базотатеральная мембрана проксимальных почечных канальной Активная секреция органичссю х анн нов в мочу
ОЛТ-4 (транспортер 4 органичес- ких анионов) Внешняя поверхность мемб- раны эпшелиоинтов прокси- мальных почечных канальцев Активная секреция органически* энно- нов в мочу
ОСТ-1 (тршегюртер 1 органичес- ких катионов) Блюла t ера. ьи.ь мембрана гепатоцитов. эпителиоцитов почечных канальцев Ак1ивнля сскрсиим органических катио- нов в желчь и мочу
MRP2 (протеин 2. .ICCOIHIH- роганнып с множественной лекарственной устойчивос- тью) Каналнкулярная мембрана гепатоннтов Активная секреция органических ани- онов. в том числе глюкуронидных ко- нъюгате и коньюг а юн с i.iyrar ионом в желчь
Строение печени и ночек ои. гл. 24 2 и 2.4.4
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 177
4.3. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ
Биотрансформация токсикантов, как правило, приводит к снижению их активности — дез-
активации (детоксикации). Отиако в ряде случаев случаев метаболиты ксенобиотиков стано-
вятся. наоборот, более активными (активация) и лаже более токсичными (токсификания), а
также могут изменить характер токсического действия или инициировать другой токсический
процесс (см. гл. 3). Бнотрансформания — процесс превращения вещества в форму, удобную
лля выведения из организма. Биотрансформация токсикантов — сложный многоплановый
ipouccc. в который вовлечено большое количество вещест. находящихся во взаимодействии
друг с другом, и на течение которого влияет множество факторов
Бнотрансформания токсикантов состоит из двух фаз. каждтя выполняет свои функции, а
в итоге липофильный ксенобиотик превращается в водорастворимую форму, выводимую из
организма. Различают две фазы биотрансформации
I фаза — модификация молекулы токсиканта, создающая или освобождающая функцио-
нальные группы (например. ОН. -NH,, - Sit и ip.) и осуществляемая различными ферментны-
ми системами локализованными в бс тъшей степени в клетках печени (табл. 4-17).
II фаза — конъюгация, или синтетические реакции токсикантов и/или нх метаболитов с
эндогенными веществами. в результате которых образуются конъюгаты — гидрофильные со-
единения (табл. 4-21).
Наиболее часто процесс протекает именно в такой шюлсдоватсльноспт. но природа ряда
токсикантов, прежде всего наличие в молекуле ксенобиотика функциональных групп, способ-
ных к конъюгации, позволяет миновать I фазу.
Бо ыиппетво реакций I и II фазы являются энзиматическим т реобразованием молекул ток-
сиканта. Существую! десятки суиерсеменств ферментов, осуществляющих биотрансфор.мацию
токсикантов, однако изоферментам цитохрома (Р450) принадлежит ведущая роль в окислении
восстановлен и и и гидролизе ксенобиотиков (габ; 4-18)
Рис. 4-13. Фратмент клетки: эндоплазма-
тический ретикулум. I — ядро клетки; 2 —
поры ядерной мембраны: 3 — гранулярный
энлотсшзмитичсскнй ретикулум; 4 — агра-
нулярный эндоплазматический ретикулум;
5 — рибосомы на поверхности гранулярного
эндоплазматического ретикулума; 6 — транс-
портируемые белки; 7 — >рансиор1ные вези-
кулы; 8 — комплекс Гольджи.
Различают печеночную и внепеченочную биотранс-
формацию. Особенно интенсивно процессы метабо-
лизма протекают в печени При прохождении гокси-
кантов через печень большинство из них подвергается
бнотрансформшии в паренхиматозных клетках пе-
чени (см. гл. 2.4.2), что называют эффектом первого
прохождения, или пресистемным метаболизмом.
Метаболиты как I фазы (нередко более токсич-
ные. чем введенный ксенобиотик), так и II фазы
нз печени поступают в кровь, распределяются по
органам и тканям, ферментативная активность ко-
торых значительно ниже, а также реабсорбируются
печенью для последующей экскреции с желчью.
Поскольку почки (см. гл. 2.4 4). легкие, кишечник,
се тезепка. мышечная ткань, акцента. мозг, кровь
(см. гл. 2.4.2) содержат ферментные системы I и II
фазы биотрансформации, то они. хотя и менее ин-
тенсивно. чем печень, по также участвуют в этом про-
цессе. В ряде случаев токсификания ксенобиотиков
в метаболически менее активных органах (например
в мозге) приводит к катастрофическим последствиям
(см. гл. 7 и 8). При внепеченочной биотрат «.форма-
ции могут образоваться отличные от печеночных ме-
таболиты одного и того же токсиканта.
Метаболиты, поступившие с желчью в кишеч-
ник, частично реабсорбируются и вновь поступают
в печень (печеночная рециркуляция).
Основная часть ферментов, участвующих в био-
трансформации. локализована в гладком эндоплаз-
матическом ретикулуме (рис. 4-13).
178 Глава 4
Энлотиштмзтнческнй ретикулум, или эндоплазматическая сеть клетки. — полость сложном
формы, состоящая из соединенных друг с другом мелких вакуолей. уплотненных цистерн и
ветвящихся каналытсв. На рис. 4-13 эндоплазматический ретикулум представлен разветвлен-
ной сетью трубочек и карманов. окруженной мембраной. Эндоплазматический ретикулум не
является стабильной структурен и подвержен частым изменениям. Площадь мембран энло-
ттлазмагнческото ретикулума сснЛагизяст базис половины обшей площади всех мембран клетки.
Полости эндоплазматического ретикулума открываются в межмембраппую полость ялерной
оболочки. Мембраны эндоплазматическою ретикулума обеспечиваю! активный п«нспорз
ряда веществ против ip.mierna копнен ip.iiuin. Поперечный размер Hiiieii. образующих эндо-
ила змагичездий ретику тум. 0.05—0.1 мкм (иногда до 0.3 мкм). то штина двухслойных .мембран
стенки каиальнсв около 0.005 мкм. Эти структуры содержат ненасыщенные фосфолипиды,
холестерин, ефинюлиинды. белки.
I рубочки. лиамстр оторых 0.1—0.3 мкм, заполнены гомогенным содержимым. Их функция —
осушесгилснне коммуникации между содержимым пузырьков эндоплазматического ретикулу-
ма. внешней средой и ядро*! клетки. Два вида эндоплазматического ретикулума — грануляр-
нын и агранулярный (глалкпй) — выполняют различные функции в клетке.
Гладкий эндоплазматический ретикулум клеток печени нриинмаст активное участие в бно-
гр 1нсформлп1111 токсикантов. При непрерывном поступлении токсикантов (в том числе меди
каментов или алкоголя) образуется большее количество агранулярного «плоила зматичсскопз
ретикулума, чго повышает толерантность к токсиканту.
Ферменты, локализованные в цитоплазме, в цитоплазматической мембране, лизосоме или
мембране ядра, также участвую! в биотрапсформлппи.
Многие реакции биотрансформаппи являются НАЛФ'/ НАДФН- или НАД / НАДН-зави-
енмыми (таб.т. 4-17).
Таблица 4-17. Фермой ты I фазы биотрлисформдшш
Окисление токсикантов
Оксидазы смешиинои
функции (микросомдль-
ное НАДФ НАДФН-м-
штеимое окисление)
Семейство шгажрома
Р45(Т участвует в следую-
щих процессах окисления:
11|.ТрОКСИЛ1ТрО№ШШ1
ароматических и лаифя-
гичсскп.х углеводородом
эпоксидировании двой-
ной свя ят
окислении и деалкили-
ровании гетероатомов
(О-. S-.N-. Si-»
\-гизрокснлвро1мпин
аептлриро ваиии
рзтрыве сдожнозфир-
ной связи с последую-
щим окислением
окислительном перено-
се труни
Флпштиео терждщис мо-
ноокси1еназы (ФМО)*:
окисление гетеро-
атомов (Х-. S-, Р )
lipCIBiyillCCTBCHIIO в
гетсрониклях.
арилам инах. пыразп-
IU3. тиокарблмндах
Ги ровероксилазы
Сопряженные процессы,
протекающие ври иос-
craiioivieiitiii Н.О.
в его прои (полных
(соокис тенпет, часто
привозят к токсикатгин
ксенобиотиков (особен-
но в тканях с ив тким
содержанием шпохрома
Р45О)
11 сроке ни за - и рое з si -
। л.ттыин-Н-сингсгя га
активирует тва процесса:
образование гидропе-
рекисей жирных кислот
(прехтглитиииов) из
арахилоиовот кислоты
с 1к)мо1И1.ю циклоок-
сигеназы II ДХЗЫ1СИШСС
их восстановление до
спиртов. При лом окне
ляются друтие субстраты
(в том числе ксеноби-
отики) — еоокислеппе
токсикантов
Дегидрогеназы (НАД /
НАДН-зависимое окис-
ление)
Л.1КО1 от Kiel тирогена та
(АДГ » — цитозольный
фермент. лежали ту ю-
щийея в печени (мак-
симальное содержание),
почках, легких, слизис-
той оболочке желудка,
имеет несколько bii.ioii
I. класс I АД1 -изофер-
ментов (а-АДГ, |)-АДГ.
у-А1Г) у таептует в окис-
лении маната, других
алифатических спиртов
с числом атомов углеро-
да < 5 (см. гл. 8.1)
2. Класс 11 АДГ (л-АДГ)
у час 1 куст в окислении
тын<|ш'П1ческих и арома-
тических спиртов
3. Клосс 1 АДГ
(/-АДГ) — в окислении
алифатических с длин-
ной у тле во ортезной
цепью и ароматических
спиртов
Флавопротеинрс туктаты
Участвуют в окислении
хииоиоп. нитропроиз-
тюлпых ароматических
утленолоролов. бииири-
динов и . ругих токен
кантов с образованием
супсрокснл-ашюИ'ра-
днкалд и других АФК
(ем. кт. 3. 8. 10»
Машбдеионые гидрок-
силазы гксаитипокси-
да за. ал ыс пиокс тыл за.
су.1ы|ипоксидпза) —
флавопротеины
Моиоамииооксидаза с
коферментом флаши 1-
алеиниднную сонном
локддтио ина и ткани
мозга, по внешней
мембране митохондрий
клеток печени, ночек
кишечника и тромбо-
цитах Она участвует в
ле ciMiiiiiipoiiaiiitH лофа-
мииа. nopripenauiiiia.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 179
Окончание niati.i. 4-17
Jlini.lp 1НО.1ЛСП1ДрОГС-
наза из семейства лльдо-
ксю-рсдуктэз учасшус-т
в окислении иолииик-
гпчсских аромат пческих
уг.чсволоролов
Амины или фенолы
окисляются с обра-
зованием свободных
радикалов. способных к
реакции с основаниями
нуклеотидов (см гл. 2.
з.'ю
4. Класе I АДГ (р-АДГ.
о-АДГ) участи т в
окислении решнола
A.ibTcriixi тгидрогена-
3» (АЛДГ) участвует в
НАД’/ ПАДИ-зависи-
мом окислении альдс-
। илов до карбоновых
кислот (см. гл. 4.1)
А.1ЛГ также имеет .сте-
ра тую активность
серотонина, ГАМК с
образованием альдеги-
дов (см. гл. 7)
Восстаноплсине токсикантов
с участием коферментов НАД* /ПАЛИ. НАЛФ* /НАДФН. ФАЛ / ФА.1Н,
Р450 и НАДФН Х1ПЮ-
ноксилоредуктаза. ннг-
р< зоре ту стазы. нитро-
редукта ы. азоредукгазы
участвуют в восстанопяс-
иии азо- и । нтросоеди-
нений нол возденсишем
MiincTiioil флоры и анаэ-
робных условиях
Глутап юн редуктаза.
глупи itoH-S-зранефера-
за участвуют в носста-
иавлении дисульфидов
глутатионом
Карбонильные редуктазы
и АДГ катализируют вос-
становление ряда алмс-
1Н.ТОВ и кетонов
Дсгалогепазы контроли-
руют восстанови тельное
дегало1енировяние али-
фатических н аромати-
ческих утлсволпродов
Гн.1рол!ГП1чсские реакции
В тканях и жпткост х организма содержатся низкоспекифичные эстеразы, гнтро.пыуюшнс эфиры гок
сикаитов разною строения с изменением их биологической активности
Кдрйоксн лэстеразы.
лрилд 11ал кил фосфа т а зз
участвуют в растепле-
нии эфирной и амид-
ной связен в мсыску кьх
токсикантов, производ-
ных. карбоновых кислот
эфиров птоэфиров.
амидов, uni ндрижов.
хлорсм! । гидр! июн)
Ацетилхолин- и всендохэ-
линэстер; зы (см. гл. S 4)
Эноксил! итролз та
катализирует превраще-
ние эпоксидов(напри-
мер. ПАУ. см. гл. 10) и
транедшилродиолы (без
участия кофакторов),
являющиеся субстратом
Р450 (см. выше)
Флюороги трола за
активирует опнеппенис
от атома фосфора в
высокотоксичных ФСК?
фторил-пона. что резко
снижает токсичность
ксенобиотика.
Сати ртути и меди
значительно снижаю!
активность фермента
’Ряд реакций моп I KiriATii тироваться в Р450.
При чечии и е. АФК — актииныс формы кислорода: ПАУ — полициклические ароматические углеводороды:
ФОС — фосфорооркишчсскис соединения.
Цитохром Р450
Гетерогенный фермент иитсхрох! 1*450 (Р450) локализован в эндоплазматическом ретикулу-
ме клеэок печени. незначительные количества фермента обнаружены в легких, ночках и мозге.
В микросомах человека и млекопитающих выявлено более 15 грхпп Р450. Его суперсемейство
обозначают CYP. помечая отдельных представителей буквами и цифрами (например. CYP2C9).
Цитохром Р450 — фосфолнпнлопротогемсульфил-протеиновый комплекс, имеющий в вос-
станоатенной форме сродство к оксиду углерода (II). получил такое названтк вследствие об-
разования с СО прочного комплекса с максимумом поглощения при 450 нм Цитохромы Р450
относятся к группе гемопротеннов типа цитохромов Ь. Роль неспспифическои монооксигеназы
Р450 заключаемся и связывании с субстратом, изменении при aroxi его и своей электронной
структуры, а также активации молекулярного кислорода (рис. 4-14).
Для генов, колирующих Р450. характерен значительный полиморфизм (табл 4-18). В оте-
чественной и зарубежном .иперагурс. электронных базах данных (см. гл. 1.4) собран огромный
экспериментальный и клинический материал о содержании и активности отдельных фермен-
тов Р450. зависящих от генетических, экологических факторов, наличия в организме ингиби-
торов И.Ш индукторов фермента, nanpiixicp лекарственных средств (табл. 4-19).
180 Глава 4
Рис. 4-14. Обобщенная схема циклического многостадийного процесса, в котором участвуют окислен-
ные и восстановленные формы Р45<>. кислород (I Р. G tie nge rich. 2001) Цифры в кружках оботачаюг
Сталин процесса.
Лаблниа 4-18. И «ферменты Р450. их субстраты, ингибиторы и индукторы
Изофермент Локализация субстраты Лекарственные средства ингибиторы нгцукторы
CYPIA2 Микросомы i сна гонтов Теофиллин, кофеин Фторчпнаюны, инмсгидин Рифампицин, фенобарбитал
CYP2C9 Микросомы гепатоцитов НПВС, непрямые ан- тикоагулянты. антаго- нисты ангиотензино- вых рецепторов. псрор.пьные гипогли- кемические средства Циметидин. сульфаниламиды Рифампицин, фенобарбитал
CYP2CJ4 I Микросомы гспатоиитоп Ингибиторы протон- ного насоса. антиконвульсанты Циметидин. xj |рамфеннк<хч Риф|мпицин. фенобарбитал, карбамазеннн
CYP2D6 Микросомы гепатоцитов Р-Адренобзокаторы, антидепрессанты. ней- ролептики Пароксетин, флуоксе- тин. сертралин, амио- дарон. нелекокенб, циметидин
CYP2EI Микросомы гена гони юв Этанол, ппранегамат Дисул ьфирзм. pinoilfllinp Этаном, изониазид
CYP3A4 Микросомы icnaioiuiTon и знтероиигоц Бле каюры медленных калышевых каналов, статны, местные анестетики, оральные контрацептивы, анти- гистаминные средства Макролиды, пропимярибковые средства — произвол ныс азолов, иимеги- Л1П1. сок грейпфрута Ршрампинин. карбамазепин, глюкокортикостероиды, зверобой. фенобарбитал
II р и и с ч п н и е. НПВС - исстсроилныс iiponinoBociiiuiiTC_ibiiUv срслстпп
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 181
Факторы. влияющие на активность изоферментов Р450. участвующих в био трансформации
токсикантов, представлены в табл. 4-19.
Таблица 4-19. Факторы, влияющие на активность изоферментов Р450
Изофермент Полиморфизм генов котирующих Р450 Пол Возраст/активность фермента
CYPIA2* Носительство медленных аллельных вариантов гена CYP1A2 замедляет бнотрансформашпо еофиллнна У мужчин ак- тивность выше К 1-му году жизни составляет 50% активности взрос ых У пожилых снижается более чем на 30%
CYP2C9 Носительство медленных аллельных вариантов гена CYP2C9 з меддяет биотрансформацию непрямых анти- коагулянтов. НПВС. гипогликеми- ческих лекарственных средств Hei различий К 1-му месяцу жизни сравнима с активностью взрослых У пожилых снижается более чем па 25%
CYP2CI9 Носительство медленных аллельных вариантов гЛза C.YP2CI9 замедля- ет биотрансформанию ингибиторов протонного насоса, увеличивает эф- фективность микробной эрадиканин Нет различий Нет данных
CYP2D6** Носительство медленных аллельных вариантов гена CYP2D6 замедляет биотрансформвнию 0-адреноблока- торов. антидепрессантов, нейролеп- тиков Нет различий Через несколько дней после рождения сравнима с активнос- тью взрослых
Носитетьство быстрых аллельных ва- риантов тена CYP2D6 ускоряет био- трансформанию p-адреноблокаторов, антидепрессантов, нейролептиков Нет различи з У пожилых снижается более чем на 45%
CYP3A4** Her занных У женщин ак- тивность выше К 1-му году жизни — 30—10% активности взрос ых. У пожилых снижается более чем на 35%
*Прн беременности активность снижается.
••При беременности активность повышается.
В табл 4-20 приведены примеры модификации структур молекул токсикантов in vivo при
участии ферментов I фазы биотрансформации.
Таблица 4-20. Примеры модификации структур молекул токсикантов in i w при участии ферментов
I фазы биотрансфирманин
Процессы 1 фазы биогрансформации
Г идроксил и рован не алканов, стероидов и др FeO” + -СН — FeO* ♦ -С— Fe*4 + —С-ОН 1 1 1 J
Дегидр» рование спиртов и окисление альдегидов н О —(Д-ОН — 0 Н2О 9Н 9Н HjO ° —— С-ОН — С-ОН == — 'н н 6н 'он
182 Глава 4
Окончание math. 4-20
Дсч илрирошиис ядканоп
FeO**
1е"
RNO. ;----- RNO*
О*"^ О,
Воссгяноюсине нигрола-
руины
RNHOH
Дешлснеиироваиие
Окисление арома i инее кою
П11К.1Л
са4 —cci;*ci‘
Окисление
гстероатома алого
Гидроксилирование
S-содержатпх не шести
Дея-иаиЛроиаине
Дсллкидироиапис
N-содержащих нешее i в
Гнлроксилнронеоне
ароумтическпх нанести
184 Глава 4
А*
R-CHO + R’-NH----- •> R-CH=N-R
Пиридоксаль
Изониазид
Эта реакция необратима. Она препятствует использованию пиридоксаля нервными клетка
ми орг знизма. <по может принести к исйроп.-пии.
2. Фенацетин, подобно ацетанилиду. метаболизируется до анилина и затем до фенилгид-
роксил змина
О
NH-C-CH,
о —
Ацетанилид
Фенил! нлрокснламин превращает гемоглобин в метгемоглобин, что приводит к ра звитию
гемолитической анемии (см гл. 2 4.3).
3. Пенициллин гпдротизуется в водном растворе
“ s сн.
R-ONH ХСН1
/---N--1—соон
о'
о
R-C-NH
А
о он
S .сн
^СН,
NH—СООН
В присутствии первичных аминогрупп аминокислот и белков образуется еледуюппп1 про-
дукт
СН,
сн,
-соон
о
II
R-C-NH-
✓Сх NH
oz NH-R
S сн
сн,
-соон
R — аминокислота или часть белковой макромолекулы
Аминокислоты и белки в этом состоянии нс имеют возможности выполнять свои фуЦ-
KHHH.
4. Биотрансформация мустина — лекаре г венного вещества, применяемого лля лечения раз-
личных видов злокачественных опухолей, происходит ио схеме:
186 Глава 4
Окончание тш. 4-2!
Ацетилирование Цитозоль Ацетил-коэнзим Л
(А-СоА)
Г ivrai иеновая Цитозоль и эндоплазмагнческая Коэнзим A iCo.A*
СС1Ь
Конъюгация с амипокнело- Митохондрии, эилотыазматичсс- Коэнзим А <СоЛ)
гвми кая сеть
Примечание. УДФГК — yT*H.ii(n,im|MKili.niitokyp<iiiciiciM кисло ы: \ФФС — меиот11Н-.Г-<)мкфвг-5’-фк<|кх:ул|.ф.гг.
Первый тип конъюгации
Глюкозидная коныоеация
Глюко зил пая koi мотания проходит и 3 Сталин. На первой сталии образуется актиинронаи-
ный промежуточный продукт — урплиндифосфатглюкоза (УДФГ). на второй — уридпцдифос-
фаплюкчроковая кислота (УДФГК)
УДФГ-пирофосфорилаза
1. 0-тюкоза-1-Р04 + УТФ УДФ -a-D-тюкоза + Р,О*
УДФГ-дегидрогеназа
2. УДФ-ц-Ц-тюкоза + 2 НАД+ + Н20 -------► УДФ -«-D-глюкуроновая кислота* 2 НАДН,
На ipeiuett сталии активный промежуточный продукт УДФГК взаимодействует с агликоном
(субстратом):
УДФГК п-нитрофенол п-нитрофенол-р-О-глюкуронцд
Реакция трс ьси стадии является результатом пую1е(х|>илы1ого замещения (Ss2) в функцио-
нально! f руине cyocrpaia с Вальленонскпм обращением
Возможно образование нескольких типов О-глюкуроиндов
1. Тип простою эфира (субстраты яапиотся первичными, вторичными и третичными спир-
тами. (|>енолами). например:
ОН
О-С„НиО.
+ УДФГК - -*
фенил-3-D-
глюкуронид
2. Тип сложного эфира (субстраты являются карбоновыми кислотами)
СООН
+ УДФГК
бензоил-P-D-
глюкуронид
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 189
S-мети.шрованис
В организме также метилируются различные токсичные металлы — ртуть, свинец, олово,
палладий, таллий, золото и металлоиды — мышьяк, селен, теллур.
Коферментами реакции являются S-аденозилметион и витамин В|2. У ме штатов низкая
ре твори мость в воле.
Аиилирование
Ацетилирование
Экзогенные амины aueiи.тируются ацетил-коэнзимом А (А-СоА) ио схеме
CH COSCoA + 11 NR -> RMICOCH, + CoASH
A-CoA CoA
Реакция приводит к образованию плохо растворимых в воде соединений (труднее выводи-
мых). о знаке менее токсичных Ацетилирование токсичного лекарственного препарата изони
азида, снижающего его способность к комилесообразоваиию с ионами металлов, облегчает его
выведение через ночки
Второй тип конъюгатцти
I птатионовая конъюгация
Известно более 40 различных типов химических соединений. способных образовывать глу-
тзтионовые конъюгаты. Всех их объединяет наличие электрофильного центра, способ ото ре
агмроватъ с SH-группой глутатиона.
Субстраты
Конъюгац тя:
R-X + GSH --GSH-трансфераза » к_5_^н_ф_^_мН-СНа-СООН трансфераза *
NH-C-CH-СН -СН-СООН
и ' ' ।
О NH
Н О цистеинилтнцин Ц
- »• R-S—CH —С—С—NH—СН ,-ССХЭН —№П2^яза „ R-S-Сн С-СООН------>
NH NH
Н
в^илтрансфераза > R £^H _<>€оон
NH-C-CH,
О
Трипептил глутатион содержит аминокислоты глицин, цистеин и глутаминовую кислоту.
Общая схема конъюгации ксенобиотиков, имеющих электрофильные центры, с глутатионом
тредстамяет собой переиососгатка глутаминовой кислоты, опцепленнсглицина и анегилирова-
нис. Нуклеофильнаяатакаглутатион-тиалат-аниона(С5 )элетрофильногоатоматоксиканта—
основной механизм образования тиоэфиров. Токсикант по своей химической природе ре-
агирует с глутатионом неферментазивно. Отнако глутатион S-трансфсраза значительно ус-
коряет процесс за счет депротонироваиия GSH в GS. Ряд ксенобиотиков взаимодействует
с глу а ионом сзсрсосслскзивпо только с участием этого фермента. Реакции конъюгации с
.'.тттатионом явзяются реакциями замещния электроноакцепторной группы или присоеди
нения.
190 Глава 4
8) CHJ + GSH- ► CH,SG
г) CH-COOC.H. CH.-COOC.H.
и + GSH ► ।
CH-COOCjH, CH-COOCA
SG
Возможна конъюгация глутатиона с веществами. содержащими гстсроагомы О, S. X с пос-
ледующим образованием окисленного глутатиона GSSG (см. гл 3. 7. Я).
Конъюгаты глутатиона в почках превращаются в меркаптуровые кислоты (см. гл. 8) и выде-
ляются с мочой. В неизмененном виде зкскрстируюгся с желчью.
Конъюгированис с аминокис. ютами
Эта реакция включает активацию экзогенных карбоновых кислот в присутствии ЛТФ и СоА
до образования производных апи i-S-СоА которые затем ацилируют «-аминогруппу амино-
кислот с образованием конъюгата:
А1Ф
СоЛ-SH + RCOOH -. R-Co-S-CoA
R-CO-S-CoA + Н Х-СН.СООН -» R-CO ХН СН.СООН
гашиш г л и г тин конъюгат
Большую роль в определении характера реакции конъюгации с аминокислотами игра-
ет химическая структура ксенобиотика. Так. ароматические кислоты образуют конъюгаты с
глицином, арилуксусные кислоты — с глутамином. Косубстратом может быть и таурин — се-
росодержащая аминокислота, которая способствует нормализации метаболизма витамина А
Таурин содержится в гканях мыши, сердца, сетчатой оболочки глаза, центральной нервной
системы.
Токсиканты, содержащие фрагмент ароматического гидроксиламипа. образуют конъюгаты
с серином или пролином (см. гл. 8).
Энзимы кишечной флоры
Метаболиты II фазы био|рапеформа1гии. поступая е желчью в кишечник. могул' иод дейс-
твием бактериальных энзимов (гидролаз) гидролизоваться с образованием исходных не конъю-
гированных агликонов, которые вновь подвергаются резорбции.
Нитроароматические соединения в анаэробной среде кишечника под действием бактери-
альных глюкуронидазы и нитрорсдуктазы могут восстанавливаться до аминов, которые, посту-
пая в печень, подвергаются биотрапсформапии, например 2.6 ш нитро юлу от
Прогнозирование метаболических путей ксенобиотика
Зная общие закономерности метаболических превращений и химическую структуру токси-
канта. можно прогнозировать образование его метаболитов. Например, для барбитурата (см.
ниже) можно прогнозировать следующие реакции биотрансформании
1. Дезалкилирование (деметилирование).
2. Десульфирование до оксо- или гидроксогруппы с последующей конъюгацией.
3. Конъюгация (метилирование).
4. Ароматическое гидроксилирование с последующей конъюгацией (образование су ьфата).
5. Укорочение псин с последующим окислением и конъюгацией (образование глюкуронида).
6. Окисление боковой цепи до гидрокси-. оксо-, карбоксигрупп с последующей конъюгаци-
ей (образование глюкуронида).
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика7 191
1
3 4
Примечание.
• Реально реакция протекает преимущественно по какому-либо одному варианту п образуется
важнейший метаболит. При этом параллельно осуществляются другие пути биотраисформа-
пии. но концентрация этих метаболитов будет значительно ниже концентрации основного
метаболита.
• Биотрансформация токсиканта и количество его метаболитов но многом зависят от ско-
рости выведения вещества из организма. Если скорость выведения вещества высокая, то
токсикант будет выводиться или в неизмененном виде, тит в виде своею главною метабо-
лита.
• При прот нознрованни метаболических путей ксенобиотика необходимо учи ывать путь его
введения и локализацию трансформирующих реакций. Так. оральное введение пре усмат-
ривает поглощение из ЖКТ, где вещество может быть подвергнуто частичной биотранс-
формакии кишечной флорой, пищеварительными ферментами и г.д. Из ЖКТ вешесгво по-
ступает прежде всего в печень, где (как правило) и образуются основные метаболиты. Если
метаболиты водорастворимые вещества, то они быстро выводятся, не успевая подвергнуться
другим превращениям. Соединения, сохранившие достаточную липофильность, возвраща-
ются в кровоток и поэтому включаются в последующие пути метаболического превращения.
Вешества. поступившие в организм не из пищеварительного тракта, попадают в артериаль-
ный кровоток, достигают места своего действия и только затем могут попасть в печень, час-
тично трапс<Ьормированные в других органах и тканях, где и произойдут основные реакции
мет болического превращения.
4.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ТОКСИКАНТОВ ИЗ ОРГАНИЗМА
Понятия «элиминация» и «экскреция» обсуждены в начале главы.
Токсиканты мотуг экскретироваться (выводиться из ортант ма в окружающую среду) через
легкие с потом, слюной и желчью, грудным молоком, но преимушечвенно выводятся че-
рез почки. При разных обстоятельствах количество токсиканта, выведенного другими путями,
может быть сопоставимо с выделением через почки. Низкие концентрации ряда токсикантов
«например, наркотиков, металлов. эко поллютантов) депонируются в ногти и волосы, где могут
бытъолре (едены е помощью химике-гоксиколот ического анализа (см. гл. 5, 7—К) и электрон-
ное приложение).
Эндогенные соединения имеют оптимальные механизмы выведения. Эгн же механизмы
действуют и для выведения токсикантов, близких по строению к эндогенным всmcci вам. од-
нако если ксенобиотики значительно отличаются от них ио структуре, то выводятся долго и
трудно, претерпевая значительную (рансформанию своих молекул и ш надолго депонируются
в соответствующих тканях, например как ДДТ ми свинец. Уровень экскреции токсикантов
определяется степенью их метаболических превращений в I и II фазах биогрансформанпи в
более полярные и тем самым более легко вывозимые соединения, а также генетически де-
терминированной активностью Р-гликопротеина и транспортеров органнческ! х анионов и
•дтионов (см. табл. 4-16).
Выделяют 4 этана элиминации токсикантов:
• 0 фаза — препятствие всасыванию токеикангов в кишечнике, осуществляемое Р-ыикопро-
теином и белком MRP.
• I фаза биотрансформаиии;
192 Глава 4
• II <|iara бнотрапсформагши;
• III ф; за — активная секреция токсикангов и или их метаболитов в мочу или же чь. осу-
ществляемая Р-гликопротсином. транспортерами органических анионов и катионов.
Если показатель липофильное!и нелетучего токсиканта позволяет ответить на вопрос,
насколько быстро будет он выведен из организма или не будет экскретирован вовсе, го
величина сто молекулярной массы определяет основной путь выведения ксенобиотика. Со-
единения с молекулярной массой менее 300 Д выводятся в основном с мочой, а с массой выше
500 Д — 1ЖЫШЫМ образом с желчью. Для конъюгированных метаболитов необходимо учиты-
вать увеличение молекулярной массы та счет коньки провинции группы. Так. коньюгании с
глюку ромовой. серной кислотами, глицином и глутатионом уве шчпипет молекулярной массу,
соответственно, на 193. 96. 74 и 306 Д.
Экскреция почками
Почками экскретирхется большинство продуктов нормального мет.збо изма и большая часть
иотяриых токсик ihtob и гидрофильных метаболитов липофильных веществ. Процесс выделе-
ния через почки реализуется 3 механизмами: фильтрацией через тломерулярно-капнлдярныи
барьер, секрецией эпителия почечных канальцев и реабсорбцией клетками эпителия (см. гл.
2.4.4).
Путем фи.||ьг|Х1Пии выделяются все пи зкояолскулярныс вещества, находящиеся в растворен-
ном состоянии в плазме крови. Секреция эпителия почечных канальцев способствует выведе-
нию органических катионов и анионов. Реабсорбция включает пассивную обратную диффузию
всех жирорастворимых веществ. неиони тированных молекул органических кислот, глюкозы,
лактат* аминокислот. мочевой кислоты, электролитов. Большое значение имеет pH мочи.
Клубочковая фильтрация
Около 140 мл плазмы крови в I мни отфильтровывается через гло.меру шрно-катьыяриыи
6api>ep
Выделение в почечных клубочках является первой ступенью образования мочи и представ-
ляет собой пассивную фильтрацию плазмы через поры почечных клубочков. Размеры молекул
токсикантов определяют возможное!ь их прохождение через поры и присутствия в первичной
моче (см. гл. 2.4.4). Вещества, связанные с белками плазмы, не могут проникать через поры.
Фильтрат содержит вес составные части плазмы крови, имеющие размеры меньше, чем размеры
фильтрующих пор базальной мембраны. Скорость фильтрации может меняться в зависимости
от ряда факторов, например увеличиваться при повышении давления крови в гломерулярных
капиллярах или уменьшении содержания белка, особенно альбумина. в плазме крови Лино- н
подорастворимость токсиканта или его метаболита в этом с ivrae не является определяющей
У здоровою человека белки плазмы крови не подлежат фильтрации и через почки выделя-
ются лишь вещества, нс связанные с белками В крови, согласно закону действующих масс,
поддерживается равновесная концентрация свободной и связанной с белком форм токсиканта,
поэтому как только мотекулы несвязанного токсиканта отфильтровываются, равновесие нару-
шается. чго вызывает разрушение комплекса белок—токсикант и высвоСн мление токсиканта,
который опять отфильтровывается через гломерулярно-капиллярный барьер. Некоторые ве-
щества практически полностью отфильтровываются в клубочках почек в течение нескольких
часов. Прочно связанные в комплекс с белком токсиканты высвобождаются медленно. поэто-
му процесс их выделения затягивается (рис. 4-15).
Уровень выведения большинства токсикантов почками в основном зависит от степени
фильтрации в клхбочкдх.
Фильтрация токсиканта в кл] почках зависит от введенной дозы, накопления в тканях ор-
ганизма степени связывания с бедками плазмы крови и полярности соединения. Большое
значение ,ыя выведения имею степень и скорость бпограпеформацпи. Для полярных соеди-
нений распределение ограничивается плазмой крови. Липофильные токсиканты, легко прони-
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 193
Рис. 4-I5. Схема клубочковой филь-
трации токсикантов органической при-
роды.
I — клубочек с порами: 2 — молеку-
ла ксенобиотика, связанная с белком:
• — свободная (несвязанная) молс-
кая через мембраны, распределяются в различных тканях
организма При биотрансформании полярные метаболи-
ты токсикантов возвращаются в кровоток и выводятся в
мочу.
Выведение ксенобиотиков и их метаболитов почками
прелегавляет собой суммарный процесс активного ка-
нальцевого выделения и рН-зависнмон лиффуши. Ка-
нонизированные формы вещества экскретируются клу-
бочковой диффу ней (фильтрацией). а ионизированные
(|юрмы — почечными канальцами.
Канальцевая реабсорбция
(выделение и обратное всасывание
в почечных канальцах)
куда: 4 — иеионизироваиная <(к>рма;
5 — ионизированная форма. Суточный объем первичной мочи содержит большое
количество вешеств, необходимых организму, таких как
глюкоза, аминокислоты, соли. До 99% первичной мочи с содержащимися в ней физиологичес-
ки необходимыми веществами подвергается реабсорбции в почечных канальнах. '-Уто приводит
к значительному повышению концентрации растворенных в моче вешеств и формированию
высокого градиента концентрации вешеств между содержимым канал! нев и плазмой крови, что
является движущей силой обратной диффузии веществ из первичной мочи в кровь. Реабсорб-
ция ксенобиотиков определяется геми же правилами, которые обусловливают проникновение
раничных соединений через клеточные мембраны, т.с. липофильные соединения проникают
через мембраны легче, чем полярные. Липофильные токсиканты длительнее циркулируют в
организме, потому что реабсорбируются в большей степени, чем полярные, а выводятся с мо-
чой । меньшей степени, чем полярные.
Выделение ксенобиотиков в почечных канальцах селективное и может быть активным и
пассивным. Активное выделение, осуществляемое транспортерами органических катионов и
анионов, характерно лля эскреции ионизированных органических основании и кислот, вклю-
чая глюкурониды и конъюгированные сульфаты. Слабые электролиты выделяются по пассив-
ному механизму Эти соединения липофилыгы в нсионнзированной форме. Быстро проникая
через мембраны стенок канальцев, они попадают в канальцевый проток, где часть их ионизи-
руется при величине pH протока и выводится с мочой, а остальная часть реабсорбируется.
Проницаемость канальцевого барьера сопоставима с проницаемостью слизистой оболочки
кишечника, поэтому легко резорбирующиеся вещества при приеме per os с трудом выводятся
через почки, так как реабсорбируются из первичной мочи обратно в кровогок. а затем гшовь
из кровотока в первичную мочу. Барьер, образованный эпителием канальцев, межуточным
веществом и эндотелием капилляров, оплетающих стенку канальцев, затрудняет свободную
диффузию веществ (рис. 4-16).
Полярные токсиканты, легкорастворихпяе в плазме, отделяются от нее в основном за счет
фильтрации в почечных клубочках, концентрируются в канальцах и системой транспортеров
Рис. 4-16. Пассивная лиффуз w в почеч-
ном канальце. Обозначения тс же. что на
рис. 4-15.
194 Глава 4
выводятся в мочу. Р-гликопротеин и транспортеры органических катионов и анионов (см.
табл. 4-16) участвуки в транспорте молекул токсикантов в мочу.
Выделение печенью
Билиарная экскреция обеспечивает удаление ил организма ряда экзогенных и лишенных
веществ, которые не выделятся почками. Желчные кислоты и глутатион являются основными
компонентами билиарной секреции. Печень — основной орган биотрансформаиии токсикан-
тов — выступает и как орган их экскреции в желчь через барьер. образуемый эндотелием пе-
ченочных синусов, базальной мембраной и гепатоцитами (см. гл. 2.4.2).
Экскреция ксенобиотиков осуществляется путем простой ли<|х}>узип или активного транс-
порта (захват молекул токсиканта гепатоцитами и выделение их в желчь). Природа токсикан-
та — определяющий фактор выбора пути экскреции (см. табл. 4-16). Р-гликолрогенп, белок
MRP и транспортеры органических катионов и анионов участвуют в активном транспорте
молекул токсикантов в желчь: Р-гликопротеин переносит преимущественно лнщх])илы1ыс аро-
матические соединения с молекулярной массой 300—500 Д и вещества. имеющие аминогруппу:
МНР транспортируют конъюгаты с УФДК и глутатионом.
Желчь является важным объектом исследования при проведении химико-токснколоптчес-
кого анализа. Для mhoimx токсикантов усганоаюно соотношение между концентрацией ксено-
биотика в крови и желчи (см. гл. 5)
Выделение через кишечник
Соединения, выделяемые с желчью, могут подвергнуться реабсорбции в кишечнике. В пер-
вую очередь будут реабсорбироваться токсиканты, коюрые небыли метаболизированы в пече-
ни. Кишечная экскрекция протекает медленно и является способом выведения токсикантов,
не подвергающихся биотрансформаиии. С фекалиями выделяются вещества, образовавшиеся
в результате бактериальной биотрансформаиии. изменяющей структуру или форму токсикан-
та. В ряде случаев под воздействием кишечной флоры повышается способность токсиканта к
реабсорбции.
Таким образом, неполное всасывание токсиканта или его метаболита в ЖКТ. билиарная
экскреция без последующей реабсорбции в кишечнике или выделение слизистой оболочкой
ЖКТ приводит к кишечной экскреции ксенобиотика или его метаболита в фекалии. Соедине-
ния многих металлов выделяются с калом (см. гл. 8.5).
Выделение через органы дыхания
Легкими выводятся газы, летучие органические жидкости и летучие метаболиты (вешес-
тва. находящиеся при 37 "С в газовой фазе) некоторых нелетучих токсикантов. Летучий яд.
находясь в крови, проникает через альвеолярно-капиллярный барьер по механизму пассив-
ного транспорта и переходит из крови в выдыхаемый воздух. Специфической транспортной
системы экскреции, как полагают, в легких нет. Уровень выделения легкими летучих ялов
будет зависеть от их растворимости в плазме крови, градиента концентрации или парциаль-
ного давления между средами, а также эффективности легочной вентиляции и величины ле-
гочного кровотока. Зввисимосгь между лстучешью токсиканта и его растворимостью в крови
используется, в частности, при экспертизе алкогольного опьянения по выдыхаемому воздуху
(см. гл. 8.1 и электронное приложение).
Возможен способ легочной экскреции альвеолярно-бронхиальным путем. В этом случае
сурфактант, содержащий токсикант, выделяется в просвет тыхатсльных нулей и выводится
вместе с адсорбированными на поверхности эпителия частицами аэрозоля из дыхательных
путей благодаря мукоцилпарному восходящему току в гортань, заглатывается и поступает в
ЖКТ.
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика7 195
Другие пути выведения токсикантов
Выведение токсикантов может осуществляться секре; жми экзокринных желез путем простой
диффузии (грудное молоко, пот. слезы), что позволяет использовать их в качестве бномаркеров
воздействия (см. гл. 2.4.1) и объектов исследования при проведении химико-токсиколоючсс-
кого Анализа (см. гл. 5, 7—10).
Элиминация ксенобиотиков в молоко зависит от продолжительности их нахождения в ор-
ганизме. Липофильные токсиканты с большим периодом нолувыведення. например инсекти-
циды, содержатся в молоке в значительных концентрациях. Доказаны экскреция токсикантов
(наркотиков, многих лекарственных препаратов, этанола и др.) в грудное молоко матери и
возможность таких! образом отравления младенцев при (рудном вскармливании.
Пути выведения токсикантов неорганической природы определяются их физико-химичес-
кими свойствами, сродством к эндогенным лигандам, зависят от многих факторов внешней и
внутренней среды организма. Например, фториды, ионы мышьяка разной степени окисления,
стронция замешают хлорилы, ноны фосфора или кальция соответственно, нарушая тот или
иной важный для организма процесс. Поведение металлов в организме прежде всего связано с
сохранением металлолигандного гомеостаза и баланса элементов (см гл. 8.5). Для одних эле-
ментов основной путь выведения — почки (стронций, ртуть, селен), для других — длительное
депонирование в костной ткани (свинен) или ЖКТ (мышьяк, сурьма). В главе 8.5 подробно
обсуждаются пути превращения в организме и токсичность многих элементов Периодической
системы.
Прогнозирование возможных экологических последствий, разработка эффективных мето-
дов кошроля над состоянием окружающей среды должны основываться на знании законо-
мерностей поведения токсикантов в биосфере, особенностей их миграции по биологическим
цепочкам, обмена в организме животных и человека. Для оценки и npoi нозировдния токсичес-
кого э<|>фекта необходимо знать, как изменяется во времени количество токсиканта в рассмат-
риваемом органе или ткани. Как правило, оно изменяется вследствие накопления и выведения
токсиканта (например, без учета депонирования). При однократном поступлении в барьерный
орган во всех остальных органах вначале преобладает накопление а затем после достижения
максимального значения — монотонное выведение. Во многих случаях функцию удержания
токсикантов от времени можно выразить уравнением:
А, /А,, = I А • ехр
где А, — количество вещества в органе иля ткани ко времени (; А^ — количество вещества в
начале поступления; А, —доля общего количества вещества, которая выводится с константой
скорости Х(; t — время, прошедшее с момента поступления вещества (часы, сутки): S — сумма
экспоненциальных членов.
Выведение из организма остеогропных (депонирующихся в костной ткани) токсикантов
описывается уравнением:
г (() = А, ",
где А — доля вещества, остающаяся в организме к концу 1-х суток: t — время наблюдения
посте однократного поступления; п — параметр, зависящий от вида животного и химических
свойств токсиканта.
Экспоненциальные и степенные функции ранее использовались как удобные для аппроксима-
ции. наблюдавшейся в опыте в зависимости содержания токсикаштон в организме от времени.
В настоящее время для оценки содержания токсикантов в организме используют высоко-
чувствительные методы их определения (например. ИСП-МС). комбинированные (гибрид-
ные) системы (например. ГХ-МС. ВЭЖХ-МС). иммунохимическис и другие методы (см.
гд. 6) Тем не менее указанный выше расчетный способ используют для вычисления текущего,
кумулятивного и полного содержания радионуклидов в организме. Существует и другой метол
получения значений функции удержания г (t) Он основан на результатах экспернментатьного
исследования механизмэв транспорта и метаболизма веществ и последующем моделировании
этих процессов.
196 Глава 4
Вместо заключения
В табл. 4-22 приведены 3 алгоритма предполагаемого поведения в организме токсиканта
органической природы в зависимости от липофильности ксс юбиотика и его способности к
биотрансформаии и.
Табдиш 4-22. Алгоритмы предполснасмлго поведения токсикант* органической природы в организме
Гидрофильные вешества
В результате малой способнос-
ти проникать через липидный
барьер мембран гепатоцитов
и в связи с этим недоступные
для ферментов печени такие
токсиканты практически нс
ме габолизируются
Через системный кровоток
попадают в почки, где филь-
труются п первичную мочу. и.
не реабсорбируясь в почечных
KJIRLIbltaX. вывозятся с мочой
Высокая липофильность. Неспо-
собность к биотрансформ.ити
Легко достигают мстаболптичсскп
активные органы н ткани, в том
числе клетки печени, по в силу
своей химической природы не
способны трансформирования в
более полярные продукты.
Часть веществ, которая подверг-
нется гломерулярной фильтрации,
буле! полностью реабсорбирована
из почечных канальцев, 1ак как
концентрация свободной фракции
этих вешестн в плазме крови бузет
низкой из- за высокого процента
связывания с белками плазмы.
На длительное время останутся в
орпишзме
Липофильные вешества
Средняя липофильное гь. Способ
ностъ к биотранс<|юрмаиии
Продолжительность нахождения в
организме способных к биотран-
сформании вешестн определяется
скоростью образования их гидро-
фильных мезвболнгоп
При высокой скорости бнотране-
формации веществ в печени только
их незначигельная член. попадет
в системный кровоток в неизме-
ненном виде, а оставшаяся чаегь
иодвсршсгся пресистемной эли
мннании. леи ггвпе которой может
быть настолько м|м]>ек1ивным. что
вещества (например, нитроглипс
рин или лидокаин) практически
не будут оказывать воздействия на
организм при принятии per os
Реально влияние многих факторов может изменить в большей и: и меньшей степени модель
поведения вешества. однако обшие закономерности сохранятся.
К факторам, влияющим на метаболизм токсикантов, относят естественные факторы (гене-
тические особенности, пол. возраст, питание, вредные привычки, окружающая среда); пато-
логические изменения органов, изменение активности ферментов под влиянием экзогенных
вешсств (см. электронное приложение).
О влиянии генетических факторов было сказано выше (см. табл. 4-18. 4-19 и гл. 3).
Токсиканты могут быть субстратами, ингибиторами или индукторами ферментов, участ-
вующих в реакциях биогрансформапии. Нередко один и тот же токсикант можно отнести к
нескольким из указанных категорий.
В табл. 4-23 приведена краткая характеристика индукторов и шпибиторов ферментов, вли-
яющих на метаболизм токсикантов.
Tatuum 4-23. Характеристика индукторов и ингибиторов ферментов, влияющих на метаболизм токси-
кантов
Индукторы ферментов
Обшие признаки:
высокая липофильность:
активное пзаимолейепше с ферментами;
длительный Т,,
Самый сильный из известных индукторов моно-
оксигеназ — 2.3.7.8-тетрахлороднбензо-р-диоксип
(Г.ХЛД). эффективная доза I мкг/кг
И1НССПЮ более 250 подобных веществ:
барбитураты,
полициклические и хлорированные;
углеводороды;
дифенилы:
Ингибиторы ферментов
Метирппои. 7,8-бенюфллвои. кобальт. SKF-525
и лр
I Обратимые ншибиторы прямого действия
эфиры, спирты, лактоны, изоцианаты, фенолы,
антиоксиданты, производные пиридина.
2 Обратимые ингибиторы непрямою действия
производные бензола, арнлалкилзмины. алкил-
амнпы. ароматические амины, гидразин.
Оказывают влияние через промежуточные про-
дукты своего метаболизма.
3. Необратимые ингибиторы, ра руишюшнс
шпохром P45D
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 197
Окончание таб.1. 4-23
андрогенные и анаболические стероиды:
глюкокортикоиды:
кеюны:
и лр.
Их делят на 3 группы:
1. Индукторы широкого спек-
гра деЯстпия (барбитураты,
хлору глсиодоролы):
ускоряют метаболизм лили-
«растворимых веществ;
Увеличивают содержание
цитохрома Р450;
увеличивают активноегь
системы НАДФ /НАДФН.
стимулируют процессы
окисления, восстаномения
и реакции глюкуронидной
конькиапни
2. Индукторы узко-
го (избирательного)
спектр; действия,
например полицик-
лические аромати-
ческие yi .тсводороды
стимулируют:
ароматическое
глроксилнро ванне
N-птлрокси пиро-
вание
глюкуронидную
КОНЫ013ЦИЮ
полигалотепированиые алканы, прои тволные
олефинов, ацетилена. ряда серосодержащих
соединений-
4 Интибигоры. тормозящие синтез и ускоря-
ющие распад цитохрома 1’450: ионы металлов,
ортанические соединения, влияющие на синтез
гема, ши ибиторы белковою синтеза метал-
лоорганические соединения евннпа. кадмия,
ртути
Индукторы смешанного типа: полихлорированные
дифенилы
4.5. ВТОРИЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ
Посмертные метаболические процессы, называемые вторичным метаболизмом, по. разделя-
ют на а >робные (тление, мумификация) и анаэробные (гниение, путрификация), п результате
которых претерпевают изменения экзогенные вещества и более 1300 эндогенных соединений.
Пол действием специфических бактериальных гилролш нческих ферментов катепсинов про-
исходит аутолиз — самопсривариванне клеток. Через несколько часов после смерти бактерии
кишечника проникают через его стенку и по кровеносным сосудам распределяются по всемх
трупу, при этом кислотного среды и активность катепсинов возрастают, настукает процесс
тарификации органов и тканей.
Примеры реакций вторичного метаболизма эндогенных соединений.
Жиры, аминокислоты -> СИ ОН, С,Н ОН -»альдегиды -> кислоты
Глюкоза-» С,Н ОН. С4Н4ОН СН,ОН-» альдегиды -» кислоты
Лейкин -» С5НпОН-> альдегиды -> кислоты
Валин -» изо-С4Н„ОН -> альдегиды -» кислоты
Химический сослав продуктов вторичного метаболизма эндогенных соединении (фона) за-
висит от времени разложения трупного материала, наличия влаги, доступе во. уха. бактериаль-
ной флоры п друз их факторов.
Тление — аэробный процесс относительно быстрого разложения — приводит к образо-
ванию всшеств, более токсичных, чем образующиеся при анаэробном процессе — I мнении.
Мумификация сопровождается образованием жиропосковых веществ, и в течение длительного
времени токсиканты сохраняются в неизмененном состоянии
При вторичном метаболизме продолжаются промессы детоксикации ксенобиотиков путем
-тире ксилировання. метилирования, конькиацип и т.д.
Катализаторами этих процессов являются специфические ферменты, образующиеся тан>-
» после смерти. Особенность вторичного обмена — отделение образовавшихся продуктов от
протоплазмы и сохранение (запасание) вне клетки или п метаболически неактивных частях
клетки
При вторичном метаболизме белков идут процессы дезаминирования, декарбоксилирова-
ния. биосинтеза:
198 Глава 4
I. Дезаминирование
R-CH-COOH • ► R-CH-COOH
NH. ОН
2. Декарбоксилирование
► r-ch-nh;+co2
3. Биосинтез, например из
триптамина образуются алкало-
илы гармин и гарман
R-CH-COOH
NH,
Из оротовой кислоты образуются производные бфбигуровой кислоты по схеме
барбитуровая 5-метипбарбитуровая
кислота
кислота
Реакции трансформации различных азотсодержащих веществ приводят к получению ами-
нов:
-NO, -> -NH
N=N- -> -NH
-NO, -> -NH
При проведении первого этапа химики гокс и кол отчее кого анализа (скрининг) разложив-
шегося трупного материала можно получить ложноположительные результаты за счет содер-
жания большого количества низкомолекулярных соединений, дающих с искомым (подоз-
реваемым) юксикангом идентичные результаты Поэтому экспертиза загнившего трупного
материала требует особых способов пробоподготовки образцов (см. гл. 5, 7—11 и электронное
приложение).
Основные процессы превращения токсикантов в трупном материале — окисление, воссга
повлепис, дезаминирование, декарбоксилирование, десул1>фирова!!ис. Сохраняемость токен-
Метаболизм токсикантов или хемобиокинетика? 199
кантов в трупном материале различна и зависит от ряда факторов, в первую очередь от приро-
ды токсиканта:
• органические вещества разлагаются быстрее, чем неорганические соединения:
• органические вещества разлагаются быстрее, чем в живом организме, например сложные
эфиры или амиды в трупном материале практически нс обнаруживаются, за исключением
кокаина и атропина:
• ионы металлов переменной степени окисления восстанавливаются до более низкой степени
окисления.
В табл. 4 24 приведены пр тмеры сохраняемости токсикантов в трупном материале.
Таблица 4-24. Сохраняемость токсикантов в трупном материале
1окенкант Время хранения, % содержание Примечание
Дипразин 3 мес, содержание постоянно снижается Способ консервирования образцов — тобав- ление этанола. По истечении 3 мес полно- стью превращается в суль^юксид
Тиорнлазин 90 дней — 12-22%
Амитриптилин 1 мсс — 32% 6 мес - 6% Может быть обнаружен нс позднее 6 мсс
JiaMniid.1 натрия 1 мес - 20—22.7% 6 мес - 19.R- 20,7% Производные блрби уровой кислоты надежно обнаруживаются в свежем и гнилостно-раз ложившемся материале до 6 мес хранения
Гликозиды диги- талиса Нс более 3 дней I Посмертные процессы в условиях хранения трупного материала при температуре ниже 20 С сушесгвенно не влияют на результат только в первые 2—3 дня с моме тта наступ- ления смерит
Ртутьортаннческпе соединения В процессе гниения со кержаиис обшей ртути нс изменяется, а ртуть- органичсских соединении — снижается Через 3 мсс: мстилртуп. <* 70% этнлртуть •= 45% фснилртуть =• 20% Гидролизуются с высвобождением ионов Hg!'. которые связываются с меркаптокис.то- тами. серосодержащими пептидами и белка мтт Хранение в асептических условиях
X. орофос 3 мес Распадается с образованием дихлофоса, дихлорацстальлст ила. Сохраняемое!ь 'зависит от первоначальной концентрации: чем боль- ше поступило, тем медленнее распад
карбофос 1—3 лия Быстро разлагается в трупном материале
Утанол Динамика содержания этанола во внутренних органах и тканях в разные сроки посмертною периода обусловлена реакцией окисления, диффузней этанола и новообразованием этанола микроорган» змами. Доказано, что этанол сохраняется в течение первых 2 мсс при захоронении летом н 4 мсс — зимой Длительность сохраняемости этанола зависит ог величины его исходной концен- трации. При концентрации более 4%с обнаружение возможно в течение 3 мес летом Н вобразование этанола под действием гнилостной микрофлоры происходит в течение первых 2 мсс Увеличение содержания этанола не превышает в среэнсм 0 4%о (в желудке до 1.1%с) Высокое содержание этанола в ортанах и тканях, подвергшихся гнилостному изменению в отсутствие специфической микрофлоры (дрожжевые, плесневые бактерии), свидетельствует о прижизненном ввел си ни а не о г необразован ти
Глава 5
МЕТОДОЛОГИЯ
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА
Но растет там из открытий лес
Нал бе ионной upoi нс1ьк> ошибок
П. Кузнецов
5.1. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Условия развития современного общества требуют создания нового подхода к анализу био-
логически активных веществ и загрязнителей окружающей среды. Задача достоверного об-
наружения и количественного определения широкого круга вещее!в различной химической
природы в часто кардинально отличающихся друг от друга по своим свойствам и характерис-
тикам объектах при условии дефицита времени может решаться исключительно с привлече-
нием нескольких современных химических, нммупохимическнх и физико-химических методов
исследования, результаты которых взаимно дополняют и уточняют друг друга Химико-ток-
сикологический анализ (ХТА) — систематическое аналитическое исследование. Целью XIЛ
являются идентификация токсикантов и определение их концентрации в био. отческих объ-
ектах. Каждое исследование. проведенное судебным химиком-экспертом, имеет юридические
последствия.
Достоверность и надежность полученных результатов определяются правильностью орга-
низационных мероприятий (отбор пробы, хранение проб, постоянный контроль за работой
оборудования, чистотой реагентов и лр.). чувствительностью и специфичностью используемых
методов, знанием природы и метаболизма вещества (см. 5.8).
Различают (условно) несколько направлений ХТА. каждое из которых имеет свои задачи и
некоторые особенности (табл. 5-1).
ХТА имеет судебно-правовую направленность, которая заключается в том. что юридические
вопросы решаются биоанапгтичсскими методами, а полученный результат на конечной стадии
преобразуется в юридический ответ.
Существуют три варианта проведения XIА в зависимости от копире!пых обстоятельств
дела, клинических. криминалистических и друз их ситуации.
I . Анализ объектов, содержащих известные токсичные вешества (в некоторых случаях даже
известна доза nonainiiero в организм токсиканта). натываюг «iiriiipawieiiiiMM». например
проведение ХТА в клинических лабораториях для контроля хч выведением ксенобиотика,
ходом лечения и т.д.. т.е. случай, когда известны обстоятельств;! дела.
2 Наличие косвенных сведений, указывающих па возможную причину отравления, гипотезы
о химической природе токсичного вещества, построенная на основе клинической клрш-
ны отравления пострадавшего и/или результатов патозюговпатомического вскрытия трупа,
обусловливают некоторые изменения в методических попхотих. применяемых в «направлен-
ном» ХТА
Методология химико-токсикологического анализа 201
Таблица 5-1. Основные направления XI А*
Виа анализа Нель анализа Задачи анализа Особенности анализа
Судебно-хими- ческий анализ (СХА) Установление причин смерш или покушения на жизнь как состав- ная часть судебно-ме- дицинской экспертизы Идентификации и кали- чес гневное определение вешссгпа вызнавшего отравления Судебно-правовая оцен- ка отравления Характер биообъектов Многообразно токсикантов Различное распределение токен кантов по органам и тканям Наличие мешающих агентов Степень разложения трупною ма- териала (вторичный метаболизм)
Клинико-ток- сикологический анализ (КТА) Диагностика отравле- ния для выбора метода лечения Идентификация и коли- чественное определение всшестпа вызвавшего отравление Экспресс-анализ Установление корреляции между терапевтической и токсической дозой
Анализ нар- котических epejciв (АНО 1 Установление факта присутствия наркоти- ческих среде 1 в в био- субс1 разах человека, количественное опре- деление токсикантов (соыасно законода- тельству РФ) Идентификация и ко. и- чественнос определение (нс всегда) средства, вызвавшего наркотичес- кое одурманивание Возможное!ь сокрытия факта упо- требления наркотических средств Возможноетъ фальсификации пробы Возможное! ь использования нескольких наркотических или одурманивающих средств одно- временно (проявление синергизма и антагонизма токсикантов)
Допинг-анализ Установление факта присутствия в био- субсгратих человека вещества, запре- щенного Всемирной антидопинговой ор- ганизацией (WADA), или свидетельства его использования Идентификация и коли- чественное определение запрещенною вещества и ею метаболитов Возможность сокрытия факта упо- требления запретен кого средства Возможность фальсификации пробы Возможность использования не- скольких запрещенных средств одновременно Многообразие потенциальных до- пингов
Терапевтическая доза
Высокая чувствительность мето-
дов анализа
•Криминалистический анализ не является предметом рассмотрения этой книги. Особенности анализа
объектов нсбиоло!нчсского происхождения не наличие наркотиков рассмотрены в разлете 5.6.2.
3 Отсутствие каких-либо снедений о природе токсичного вещества требует принципиально
другой стратегии проведения ХТА. В этом случае используемые аналитические приемы объ-
единяют под названием «ненаправленный» ХТА. Это наиболее сложный случай исследова-
ния. в котором веет да применяют труппы методов анализа, а полученные результаты взаим-
но дополняют и уточняют друг друга.
Стратегия проведения анализа выстраивается в зависимости от особенностей направленно-
го inn ненаправленного исследования. При проведении направленного анализа необходимы
подтверждение наличия известного токсиканта в биосубстратах потерпевшего и определение
количественного содержания токсиканта На основании знания физико-химических свойств
токсического вешества подбираю! условия и технику изолирования, которая позво. яст селек-
тивно отделить анализируемое вещество от биологической матрицы. Как правило, для анализа
в этом случае необходимо небольн ос (по массе) количество биообъ кта. В некоторых случаях
возможно прямое обнаружение токсиканта в биологическом образце. Если в 1-м варианте для
выбора оптимальных условии анализа можно воспользоваться справочной информацией или
данными литературы, то 2-й и 3-й варианты более сложные. Они требуют скрининговой (мно-
гоступенчатой) мсголики изолирования, поскольку необходимо охватить все подозреваемые
202 Глава 5
вешесгва с самым» разнообратными фи тико-химическими свонствами Общим скрининговым
подходом к изолированию вешеств органической природы и случае ненаправленною анализа
является !рупповос выделение токсикантов, основанное на каких-либо общих свойствах. Ме-
тодический прием, называемый скринингом, — это поэтапное обнаружение групповой прина-
длежности токсикант, a моем идентификация и количественное определение индивидуалы io-
го токсичного вешествд. В ХТА принято делить большинство изолируемых агентов на вещества
кислою, нейтрального, сдаооосновного и основного характера. Многоступенчатая схема изо-
лирования требует большого (по массе) количсспта биообъекта. вспомогательных химических
вешеств (растворители, реагенты) и разнообразной техники.
Залами ХТА решаются с помощью скрининговых тестов, позволяющих и минимальное вре-
мя из большою круга токсикантов выявить одно или несколько вешеств. для подтверждения
обнаружения которых палее проводится целенаправленное исследование. Скрининговые тесты
имеют невысокую специфичность. Они применяются только идя определения групповой при-
надлежности. возможно, присутствующего токсиканта.
Во всех случаях ХТА аналитик сталкивается с получением .тожноположигедьных и ложноот-
рицательных результатов. Первые связаны с недостаточной селективностью методов обнаруже-
ния. а вторые — с недостаточной чу вс стельностью выбранных методов анализа.
Выбор аналитических методов исследования определяется тленной задачей анализа — до
биться минимума отрицательных и максимума положительных результатов при определе-
нии токсиканта в биообъектах — и связан с основными характеристиками аналитических
методов — чхвствительностью и специфичностью, гак как этими параметрами определяется
наличие ложноотрицатсльных и ложиоположи тельных результатов соответственно.
Выбор метода с низкой чувствительностью грозит необнаруженном искомою вещества (лож-
поотри нательным результат). Чувствительность аналитического метода (см. гл. 6.1) — отноше-
ние сигнала анализируемою вещества к сигналу базовой линии — выражается в н.тнограммпх
на миллилитр (нг/мл) или в граммах на килофамм (г/кг) бмообьсктт При отрицательном
результате дальнейший поиск токсиканта не провозится. Результат имеет отрицательное су-
дебно-химическое значение. Специфичность метода — ключ к определению искомых веществ
Специфичность аналитическою метола (см. гл. 6.1) позволяет отличать химическую структуру
определенного соединения от структуры ему подобных аналогов. Чувствительность и специ-
фичность — основные характеристики — используемых метопов, формирующие возможность
получения положи тсльных и отрицательных результатов анализа (схема 5-1).
Положительные результаты = истинно положительные + ложноположительные
(ofnxki. содсрдш!!н<1 (объект. нс солержлишй
jiiMjioiipycMik ikhicctm)} (н или шрус mix oemcvr&ot
Отрицательные результаты = истинно отрицательные + ложноегрипательные
(объект, не (.чшсржшииЯ (объект, соаерлиишв
31Ш11Шруемос вешестео) лндли тируемое вещество)
Схема 5-1. Формирование положительных и отрицательных результатов.
Ложноотриштелмый ответ (результат) — это отрицательный ответ па присутствие по-
дозреваемою вещества, полученный при исследовании обьекта. содержащего это вещество.
Ложноофгщазельный ответ образно пропорционален чувствительное! и метода анализа: чем
выше чувствительность, тем меньше ложноофи петельных ответов и больше положительных.
Получение- ложноотрицатстьных результатов связано с недостаточной чувствительностью ис-
пользуемого метола, преднамеренной фальсификацией пробы, недостаточной квалификацией
эксперта, систематическими ошибками исследований. Например, образец, содержащий 1%
героина, смешан с дымным порохом. Тестирование этого образца с применением реагента
Марки, который содержит серную кислоту и формальдегид. может привести к обугливанию
дымного пороха и последующей маскировке кроваво-красного окрашивания
Ложнотыожительный ответ (результат) — это положительный ответ на присучсишс но-
дозр васмого вещества, полученный при анализе обьскга, не содержащего это вещество. Лож-
иоположителы1ыс результаты указывают на возможное присутствие какого-либо токсиканта,
хотя на самом деле его нет. шли па присутствие определенного токсиканта. Toi.ia как присутс-
Методология химико-токсиколо ического анализа 203
твует другое токсичное вешество Ложноположитсльные результаты теста приведут к дополни-
тельным тестам, но не к ложному заключению. Например, примеси и «разбавители» нарко-
тиков могут вызвать изменения цвета образна в результате химической реакции и привести к
ложноположитсльным результатам. Появляющиеся изменения цвета на самом деле не явля-
ются ложными, они лишь отражают присутствие веществ, обнаружение которых не является
задачей конкретного аналитического процесса. Ложноположигельные результаты (их число
может доегшазь 10—15%) обусловлены недостаточной специфичностью используемого метода
за счет перекрестных реакций, слабой профессиональной подготовкой эксперта, системати-
ческими ошибками. затрязненными рсагсншми. плохой ор|анизаиисй труда, некачественной
окументопией. Например, для иммуннохимических метолов(см. гл. 6.2) можно снизить поре»!
обнаружения, или cut-off (термин, применяемый в англоязычной литературе), до порога чувс-
твительности метода, который обычно в несколько раз ниже cut-off. В этом случае снизится
число ложшхтгрицательных результатов, возрастет число положительных, однако одновремен-
но резко возрастет и число ложноположитсльных результатов за счет снижения специфичности
(перекрестные реакции) метода.
Предел обнаружения (см. гл. 6.1) — минимальные концентрация или количество вешества.
которые можно определять данным методом с какой-то допустимой погрешностью.
Проблемы ложноотрипатсльных и ложноположительных результатов выявляются, как пра-
вило. на ранних стадиях аналитического процесса и рационально решаются.
5.2. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ЭТАПАМИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА (ОТБОР ПРОБЫ, ЕЕ ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ, ВЫБОР МЕТОДОВ
АНАЛИЗА) И ИНТЕРПРЕТАЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эффективность определения содержания токсичного вещества снижается из-за манипули-
рования (с умыслом или без) с образцом, отбираемым на анализ (особенно у живых лиц).
Образец может быть разбавлен, подменен или зшрязнен. Имеется широкий выбор ин(|орма
ции о том. как замаскировать тест, начиная от устных рекомендаций до ресурсов Интернета и
популярных журналов. Кроме того, существует достаточное количество данных но премедика
ции. в которых показано, какими способами можно создать интерференцию в тестировании,
например наркотиков для по. учения ложноотрицательных результатов. Нс исключен вариант
выпуска нолпольными паркосиндикагами готовых форм, заведомо содержащих химические
вешества. могущие впоследствии замаскировать употребление запрошенного средства.
В свою очередь для противостояния возможному манипулированию с образном лаборато-
рии должны использовать систему органшационных мероприятий для обеспечения надежнос-
ти результатов тестирования. Они охватывают все этапы ХТА, включая отбор проб, пробопод-
готовку. предварительные и подтверждающие методы анализа.
Способы фальсификации образца. Предот ра цение и фиксирование загрязнения образца у жи-
вых шц
Подмена образца. Чаше всего подмена образца наблюдается при отборе пробы у живых лип.
В СХА. криминалистическом анализе это происходит в результате или злого умысла, или ха-
латности.
В качестве замены донорского образца, взятого у живых лиц, могут выступать образны «чис-
той» мочи членов семьи, друзей и даже животных. Однако при замене реальной мочи сущест-
вует очевидный риск замены се образцом, содержащим какое-либо контролируемое вешество.
В настоящее время существуют специальные подпольные службы, снабжающие наркоманов
синтетической мочой, свободной от наркотиков
Другим общим примером является замена образца жидкостью, схожей с мочой по цвету
и консистенции. Подобная фальсификация может быть осуществлена заменой мочи разбав-
ленным вином, пивом, смесью воды и других веществ, симулирующих мочу (яблочный сок,
сокращенные смеси, разбавленнь и чай и гл.).
Существуют различные технические приемы, когда донор пытается осуществить подмену.
Считывая, что температура отобранной биожидкости должна находиться в пределах 32—38 "С,
204 Глава 5
подмененные образцы часто хранятся на le.rc подозреваемою в гибких контейнерах (презер-
вативы. грелки). Доноры также умеют катетеризовать сами себя, чтобы заменить свою мочу
мочой, свободной от наркотиков. Наконец, некоторые индивидуумы используют подставных
лиц, хотя это трудно сделать если у подозреваемого имеется в наличии паспорт или другой
идентифицирующий документ.
Разбавление обрата. Один из наиболее общих приемов изменения результата тестирования —
значительное разбавление исследуемого образна. Разбавление может уменьшить концентрацию
токсичного вещества в образце по отношению к наиболее ни зкому уровню обнаружения (на-
пример. сиг-оП’для иммуно(|зермснт>!О!о анализа — ИФА — юридически достоверный предел
обнаружения). Используются различные способы разбавления: введение больших количеств
воды в организм, добавление воды в непосредственно отобранный образен, использование ме-
дикаментозных средств или других веществ, которые могут продуцировать диурез. Например,
в качестве веществ, способных вызвать повышенный диурез, применяю) классические диуре-
тики, калинсберегзющие препараты, ингибиторы карбоангидразы, осмотические диуретики,
алкоголь. а.ммоиийхлорид. кофеин, некоторые фитопрепараты. В аборатории разбавление
может эф(|>скгивно контролироваться соответствующими тестами (определение содержания
креатинина, измерение плотности мочи). При отрицательном результате анализа на контро-
лируемое вещество попутное обнаружение вышеуказанных препарата должно насторожить
исследователя в связи с возможной попыткой фальсифицировать результат.
Загрязнение образца. Загрязнители, применяемые подозреваемыми для сокрытия факта зло-
употребления какими-либо веществами, можно разделить па лвс зруппы: используемые in vivo
и in vitro.
Загрязнители, используемые in vivo. — это вешества. которые предназначены для создания
интерференции но время анализа на подозреваемое вещество. Как правило, липа, использу-
ющие этот способ, знают физико-химические основы, возможности и недостатки методов,
применяемых в ХТА. Так. подкисление мочи употреблением больших количеств аскорбиновой
или гиппуровой кислоты (подкисленные фруктовые соки) затрудняет определение слабых ос-
новании (амфетаминов, фенциклидина).
Использование больших доз доступных лекарственных препаразон может также изменить
результат теста. Например, основные мочевые метаболиты аспирина. салициловой кислоты
потенциально будут способствовать получению ложноогришггельных результатов при исполь-
зовании иммунохимических методов (ИХМ). Однако существуют простые приемы, позволяю-
щие специалистам в области иммунохимии определить фальсификацию.
Загрязнение образца in vitro достигается добавлением посторонних веществ к исследуемому
образцу. Хотя априори присутствие загрязнителей приводит к дожноотрпнательным резуль-
татам. окончательный эффект загрязнителей часто непредсказуем, woiyr наблюдаться и лож-
поположительныс результаты. Большинство загрязнителей добавляются с полью повлиять на
нммучгохнмическую реакцию. Загрязнители могут изменить pH и ионную силу определяемого
pactBoixr. пошиягь на химическую структуру обнаруживаемого вешеезва вследствие прямого
химического взаимодействия иди воздействия на биомагрицу, ингибировать связывание ток-
сиканта с антителами, интерферировать с токсикантом па этапе измерения. В первую очередь
эго доступные бытовые химикалии и нишевые продукты — питьевая сода, аммиак, отбелива-
тели. алкоголь, сок лимона, пероксид водорода и т.д.
Для того чтобы предотвратить подмену образца, его разбавление и/илп использование за
грязнигелей. при отборе образна необходимо провес»и несколько простых процедур:
• удостоверить личность донора (документом с фотографией. представителем администрации
или другим лицом, имеющим право пае)инфицировать личное) ь):
• измерзгть температуру образна мочи (в течение 4 мин после отбора образна его температура
сохраняемся в интервале 32—38 С);
• подкрасить воду туалетного бачка (в месте отбора пробы) в голубой (или другой» цвет;
• офанпчить доступность обследуемого к воде, мылу, другим моющим и дезодорирующим
среде итам:
• предоставить возможность прямого или косвенного (видео) наблюдения за донором в мо-
мент отбора пробы:
• произвести четкую маркировку обратил.
Методология химико-токсикологического анализа 205
Кроме того, донор обязан снять верхнюю одежду, сдать личные веши (кошелек, кейс и др.),
вымыть и высушить руки перед сдачей анализа .мочи, а также расписаться в рабочем журнале,
что проба его мочи не фальсифицирована.
Если есть подозрение на разбавление, подмену или загрязнение образна, донор обязан сдагь
повторный анализ пол непосредственным наблюдением со стороны обслуживающего персона-
ла. Оба образна должны быть подвергнуты исследованию в лаборатории.
Внимательный внешний осмотр отобранных биообразцов можег помочь в илентификации
загрязнителей. Так, сильный запах жидкого мыла, отбеливателей, аммиака, уксуса или духов
обычно ошушастся в момент вскрытия контейнера. Цвет мочи, отличающийся от обычного,
наличие осадка в пробе также говорят о возможном присутствии химических загрязнителей.
Кроме того, детергенты и мыла обычно образуют обильную пену при встряхивании.
Бактериальный фон. цвет, запах. pH «бразца и содержание креатинина в моче — важней-
шие характеристики бионробы. Разбавленный образен имеет плотность менее 1.003 и обычно
содержит креатинина менее 20 мг/100 мл.
Обработка первичной информации (в случае стального исхода)
Задачей бюро судебно-медицинской экспертизы (БСМЭ) является исследование причин
внезапной. насильственной. неестествен пой смерти, а также смерти от неопределенной (невы-
ясненной) природы Судебно-медицинский эксперт ответственен за определение причины и
способа наступления летального исхода. Причиной смерти могут быть механические повреж-
дения: травмы (в том числе огнестрельные, кожные и т.д.), интоксикация или болезнь, кото-
рая инициирует процесс, приведший к летальному исходу. Первоначальная причина смерти
может быть нс определена. Смерть может последовать спустя голы после первоначальной по-
пытки убийства, отравления т.д. Классификация причин наступления смерти предусматривает
5 позиций: убийство, самоубийство, несчастный случай, сстссгвенная смерть, невыясненные
причины. При патологоанатомическом исследовании не всегда можно определить причину
наступления летального исхода Для того чтобы установить причину смерти, необходимо полу-
чить наиболее полную информацию относительно каждого частного случая (опенка конечного
исхода, осмотр места действия, милицейские протоколы, социальные и медицинские заключе-
ния. результаты вскрытия, гистологического и токсикологического исследований).
Роль судебного патологоанатома состоит в оценке причин случайной, невыясненной и на-
сильственной смерти. В случае отравления патологоанатом доджей исключить травматичес-
кие или другие (заболевание) возможные причины смерти, выбрать и сохранить необходимые
биообъекты для химико-токсикологического исследования. Некоторые токсиканты настолько
ясно проявляют свою природу, что патологоанатом может определить причину смерти без
предварительных тестоп. например некроз печени, обусловленный использованием фенацети-
на. специфический запах при отравлении цианидами, специфическое повреждение коронар-
ной артерии при использовании кокаина. Однако такие предположения требуют подтвержде-
ния результатами ХТА. Приблизительно 10% объектов, направляемых на токсикологическое
исследование, не имеют какой-либо вспомогательной первичной информации Тем не менее в
процессе ХТА обнаруживают многие токсиканты, а интерпретация результатов химико-токси-
кологического исследования коррелируете результатами вскрытия. Большинство токсикантов
не вызывает специфического повреждения тканей и органов, и их присутствие в трупе может
быть доказано только ХТА.
Отбор и хранение необходимых биообъектов для ХТА я!здяюгся исключительно важным
ляпом вскрытия. Полезность для анализа отобранных биообъектов зависит не только от со-
стояния трупного материала, но и от патологоанатомической техники (приемы, методоло-
гия), Образны должны быть помешены в соответствующие, предназначенные для этих целей
чистые, правильно (в соответствие с приказами, методическими указаниями) маркированные
контейнеры с использованием корректных консервантов.
Целостность образца в процессе хранения является необходимым требованием для дальней-
шего исследования. В тех случаях, когда вскрыл с не позволяет определить причину смерти,
необходимо отобрать адсквалюе количество образцов многих тканей и биожидкостей. Полу-
чение положительного результата может сузить область исследования, в этом случае отпадает
необходимость исследовать каждый объект и анализировать другие образцы. Токсичные ве-
щества иногда могут быть полностью утеряны в процессе бальзамирования — консервации
206 Глава 5
трупа, поэтому если нс будет отобрано достаточное число образцов во время первоначального
исследования трупа, то причина смерти никогда нс будет определена. Ohi(детельегво о смерти
выписывается судебно-медицинским экспертом по указанным выше 5 позициям. Результаты
ХТА образцов трупного материала позволяют установить. являются ли токсичные вешества
причиной смерти или они могли быть ее определяющим фактором.
Большинство судебно-химических отделений БСМЭ имеют унифицированные схемы опреде-
ления токсикантов при исследовании тех или иных обстоятельств смерти. Поэтому патологоана-
том может давать указания, конкретизирующие цель ХТА для каждого конкретного случая.
Убийство. Различие между интоксикацией и насилием хорошо распознается при ХТА в
случае травматического убийства, включая геслы на алкоголь и предписанные нормативными
документами другие токсиканты.
Суицид. При суишишх обычно обнаруживают лекарственные средства, которые могут вы-
звать или обострить депрессию Токсиканты, наиболее часто используемые при суицидах,
включают алкоголь, бензодиазепины. дифенгидрамин. кокаин и другие нелегальные наркоти-
ки. Обычно жертва суицида использует прием нескольких вешсств. чзобы уменьшить шансы
на выживание.
Несчастный случай. Смерть от несчастного случая может быть вызвана различными об-
стоятельствами: утоплением, падением, пожаром, электрошоком, морскими и авиационными
катастрофами, случайной передозировкой лекарственных средств. В очевидных случаях смерти
от несчастного случая, очень важно исключгггь алкоголь и/или лекарственные средства, инду-
цирующие психические расстройства.
Состояние трезвости или интоксикация умершего может быть определяющим фактором в
попытке определить чью-либо вину. Например, водитель становится недееспособным в резуль-
тате сердечного приступа, что приводят к аварии. Химико-токсикологическое исследование п
этом случае становится необходимых» и является частью общего исследования факта смерти.
Обнаружение интоксикации жертвы вместе с другими обстоятельствами может указать, что ин-
цидент был предумышленным. Например, обнаружение большого количества лекарственного
средства (ши средств) в желудке умершего указывает, что передозировка скорее всего была
предумышленной (например, суицид), чем случайной.
Если исследование трупа показало наличие оксида углерода (II) в крови обожженной жер-
твы юн наличие сажи вдыхательных путях, то жертва погибла в самом начале пожара. Такая
картина может наблюдаться в случаях смерти от естественных причин или попыток убийцы
замесги следы Важны осмотр места происшествия и информация об особенностях трудовой
деятельности. Если выделение токсичных вешсств в ходе технологического процесса доказано
и следствие располагает полным перечнем таких веществ, то судебно-химическое отделение
БСМЭ должно провести исследование по их возможному обнаружению и сопоставить резуль-
таты экспертизы с обстоятельствами смерти.
Естественная смерть. При определении причин естественной смерти ХТА может и не пот-
ребоваться. Если вскрытие ясно установило причину смерти, то медицинский эксперт может
решить, что в химико-токсикологическом исследовании нет необходимости. Однако бывают
ситуации, требующие обязательного подтверждения причин смерти результатами ХТА. Напри-
мер. острый инфаркт миокарда у молодых лиц часто ассоциируется с использованием кокаина.
Результаты ХТА в этом случае являются определяющими. Диагноз алкоголизм должен быть
подтвержден биохимическим анализом крови. Диагноз внезапной детской смерти требует п
обязательном порядке тестирования на содержание алкоголя, наркотиков и ряда лекарствен-
ных средств, так как для детей испо ьзованис успокаивающих препаратов (таже в малых дозах)
может быть смертельным.
Когда причина смерти вызывает сомнение, должно быль проведено тестирование на обна-
ружение высоких (токсичных) доз определенных групп лекарственных препаратов. Например,
тяжелобольные люди могут совершить с^иггнд или быть случайно (хмышленно) отравлены.
Поэтому случаи нераспознанных отравлений, замаскированные под естественную смерть от
какого-либо заболевания, часто раскрываются посте проведения ХТА.
Неклассифицированная, неопределенная и.ш невыясненная смерть
В тех случаях. когда после 'завершения исследования и вскрытия причина или способ осу-
ществления смерти остаются невыясненными, необходимо провести гистологические и до-
Методология химико-токсикологического анализа 207
полнительныс химико-токсикологические исследованиям. В этом случае задача ХТА состоит в
том. чтобы определить, присутствуют ли в теле умершего токсичные агенты в количестве, спо-
собном убить человека. Если возможность отравления токсичным агентом определена, даль-
нейшие исследования должны помочь патологоанатому ответить на вопрос, каким образом
токсичный агент был введен в организм, оценить его максимальную дозу и время, в течение
которого токсикант находился в организме перед наступлением смерти. Результаты ХТА наря
ду с другими фактами позволяют сформировать мнение о способе осуществления смерти.
Невыясненная причина отравления. Смерть от отравления или передозировки может быть
случай! ой. наступил!» в результате суицида или убийства. Различные признаки, указывающие
на отравление, могут наблюдаться уже при вскрытии. Наличие пустых конте шеров от лекарств
на месте происшествия также может свидетельствовать о суициде или передозировке. Вскры-
тие способно зафиксировать легочную эмболию, отек мозга или другие повреждения В этих
случаях патологоанатом просит судебно-химическое отделение подтвердить предположение об
отравлении, идентифицировать токсикант и дать информацию о количественном содержании
яда, способном вызвать смерть. Результаты ХТА позволяют определить возможную употреб-
ленную дозу и путь введения токсиканта (см. гл. 4).
Если при проведении реанимационных мероприятий в клинике пострадавший выживает
в течение 24—48 ч до наступления смсрли. то ценность посмертных образцов для ХТА зна-
чительно снижается. Особенно это касается случаев, ко!да подтверждаются данные о смерти,
вызванн и использованием лекарственных средств и наркотиков. В этих обстоятельствах кли-
нические образны (кровь и моча), взятые ранее при жизни для КТА. могут быть неоценимыми
лля СХА и интерпретации результатов. Очень важно, чтобы повторно образцы были иссле-
дованы в лаборатории судебно-химического отделения, так как бывают обстоятельства, когда
результаты КТА нс подтверждаются результатами судебно-химического скрининга.
Исследование скелета, гнилостного и бальзамированного материала проводят только в про-
цессе СХА. Возможности лля отбора образцов в этих случаях ограничиваются доступ! остью
биоматериала, аналитическим оборудованием токсикологической лаборатории и другим!! об-
стоятельствами
Стратегия химико токсикологического исследования посмертного материала
Не существует такого метода анализа, который служил бы методом выбора лля определе-
ния всех образцов, везде и все за, который бы с помощью одной простой процедуры быстро
обнаруживал и достоверно идентифицировал все встречающиеся токсичные вещества при ус-
ловии их низкой концентрации. Поэтому процесс обнаружения и идентификации (см. выше,
варианты 2 и 3) разделен на два методических этапа: первый скрининговый (указательный),
второ!! подтверждающий (идентифицирующим). Методы первого этапа должны обладать высо-
кой производительностью. высоким уровнем чувствительности, достаточно широким охватом
классов токсичных соединении, но не обязательно высокой специфичностью. На этом этапе
нужно получить минимум отрицательных ответов и максимум положительных, однако при
таком методологическом подходе число ложноположительных результатов значительно. При
использовании даже самого чувствительного предварительного метода результаты скрининга
должны быть подтверждены аналитическими методами, основанными на дру!их физико-хи-
мических принципах. Второй этап — удаление всех (в иделлс! ложноположительных результа-
тов.
Подтверждающие методы должны быть выше или равными по чувствительности предвари-
тельным методам лля уменьшения числа ложноотрицатсльных результатов и выше по специ-
фичности лля снижения числа ложноположительных результатов.
Полученные результаты должны отличаться особой надежностью, так как имеют юриди-
ческие последствия. Надежность работы химико-токсикологической лаборатории определяется
способностью достоверно обнаружить химическое вещество, вызвавшее отравление, или его
метаболит в биожидкостях и тканях потерпевшего, а также в объектах небиологического про-
исхождения, с которыми контактировал человек. Не менее важно достоверно нс обнаружить
такие вещества, если отсутствовало их потребление или контакт с ними. Надежность поло-
жительного или отрицательного ответа связана с многочисленными факторами: давностью и
частотой потребления токсичного вещества (контакта с ним), путем попадания его в организм
человека, возрастными, весовым!!, диетическими, динамическими, этническими, особенное-
208 Глава 5
зями поглощения. био трансформации и выведения ксенобиогнков. состоянием печеночной и
почечной функции. pH и объемом мочи (см. гл. 2—4). С другой стороны, надежность правиль-
ного отпел связан» с чунствиге юностью и специфичное! ью используемых методов анализа
(см. гл. 6.1).
Надежность полученного ответа во многом зависит и от правильной ортнизании полу-
чения. приема и хранения объектов исследования (биоматериал. объекты небиологического
происхождения), четкого документирования всего процесса работы, постоянного надзора за
правильностью работы оборудования и чистотой всех реагентов, высокой профессиональной
подготовки кадрового состава лаборатории.
При ответе на вот рос о природе токсиканта (диагностические задачи) аналитик может обой-
тись без образцов сравнения. Если требуется установить химическое строение и количествен-
но определить содержание токсиканта, то необходимо воспользоваться паспортизированными
стандарты ми образцами.
Для подтверждения надежности результатов часто возникает необходимость в моделировании
аналитического процесса, т.е. проведении эксперимента, имитирующего влияние окружающей
среды, условий хранения, пробонодюговки на химический состав объекта исследования.
Основные стадии ХТА:
• отбор пробы:
• подготовка и перевод ее в форму, удобную для анализа:
• разделение и концентрирование пробы:
• обнаружение и количественное определение токсиканта:
• обработка результатов и их интерпретация.
Стадии ХТА должны быть проконтролированы (см. гл. 5.8 и 6.1) применением стандартною
вешества сравнения, проверю й правильности результатов (калибровка проводимых операций),
воспроизводимости результатов (статистическая обработка результатов), условий проведения
анализа (моделирование).
Контроль на стадии отбора пробы проводится в связи с возможным уничтожением вещест-
венного доказательства или фальсификацией объекта, малой по массе пробой, ее загрязнением
или изменением химического состава пол воздействием окружающей среды.
Контроль на стадии пробоподготовки проводится в связи с риском частично i или даже пол-
ной потери определяемых веществ. Эго операция должна состоять из действий, направленных
на сохранение определяемого вещества. Рекомендуется проведение экспрессных тест-анали-
зов. не зребуюишх предварительной подготовки, т.е. непосредственно в бноматериалс и других
объектах (иммунохимические. химические и некоторые другие тесты). Для большинства мето-
дов ХТА стадии пробоподготовки и концентрирования являются обязательными.
Контроль на стадии обнаружения и количественного определения. Выбор совокупности мето-
дов определения токсиканта должен являться алгоритмом проведения той или иной экспертизы
и предполагать применение методов, основанных на разных физико-химических принципах.
Подтверждающие тесты. В ХТА принято первичное обнаружение токсичного вещества
подтверждать с помощью повторных исследований методами, имеющими отличную от иред-
варительных методов анализа физико-химическую природу. При некоторых обстоятельствах
может быть применена система газожидкостной хроматографии (ГЖ.Х) в качестве предвари-
тельного и под!верждаюшсго теста, например, если на втором этапе исследовании использует-
ся дериватизапия (см. ниже) образна (силнлирование или ацетилирование), веду пая к измене-
нию аналитического сигнала ГЖХ — времени удерживания, характерного для токсиката. Однако
подтверждающий анализ с использованием второй системы ГЖХ с подобной, но не идентичной
колонкой обычно непригодно, так как данные об относительном времени удерживания многих
веществ нс будут существенно различаться при переходе к близким условиям хроматот рафирова-
ння (от одной системы к другой), например использование фазы OV-1 или OV-I7 (см. гл. 6.3.2).
Применение радиоиммунного метола (РИА) для подтверждения положительных результатов,
полученных другим иммупохимическнм методом, например поляризационным флюоресцент-
ным иммуноаналнзом — ПФИА не приемлемо, хотя эти два метола и различаются по своей
сущности. Это связано с тем. что вещества, исследуемые первым методом, будут иметь те же
самые перекрестные реакции, что и по втором (специфичные антитела могут реагировать на тс
же токсичные вещества или на вещества, сходные с ними. см. гл. 6.2).
Методология химико-токсикологического анализа 209
Если сравнпвал> надежность тонкослойной хроматографии (ТСХ) и иммунных методов в
скрининговом анализе, то иммунные методы превосходят ТСХ-скрининг в отношении обна-
ружения токсичных вешеств, потребляемых в низких (миллиграммовых и субмтцтлттграхтовых)
количествах, например галлюциногенов. В случаях острых отравлений, летальных исходов, ког-
да лозы токсичного вещества повышены из-за передозировки, TCX-скрннпнг является впол-
не удовлетворительным метолом. Подтверждающими методами являются, в первую очередь,
гибридные методы высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектральным де-
тектированием (ВЭЖХ-МС), газовой хроматографии с масс-спектралытым детектированием
(ГХ-МС) или капиллярного электрофореза с маес-спектральным детектированием (КЭ-МС).
которые соединяют высокоэффективное разделение веществ, содержащихся в образце, с вы-
сокочувствительным масс-селективным детектором (см. гл. 6.3). Что касается использования
ТС\ как подтверждающего метода для иммупохимических тестов и наоборот, единой точки
зрения в этом пег. С одной стороны, ТСХ считается недостаточно надежным поатвержлнюшим
методом при решении юридических задач, но достаточно хорошим для решения клинических
вопросов. Что касается использования ИХМ лля подтверждения данных ТСХ необходимо
помнить, что в большинстве случаев они подтверждают наличие не индивидуального вещес-
тва. а класса вешеств, в котором нередко могут быть вещества, имеющие разное токсическое
действие. Однако в последние годы успехи иммунохимии настолько значительны, что стало
возможным определение ряда индивидуальных вешеств либо узкой группы аналогов. Подроб-
нее о новых возможностях ИХМ изложено в главе 6.2. Повторно использовать иммунофермепг-
ный метол с различной перекрестной реактивностью можно для аргументации первичного
скрининга, например за нсспеиифичпым ИФА с широким спектром перекрестных реакций
на опиаты следует сделать более специфичный иммунный ieci на коньки ированный морфин.
Тем не менее комбинирование ИХМ/ТСХ или ИХМ/ГЖХ требует использования еще одного
подтверждающего метола, например ГХ-МС.
Пол вержденне идентичности обнаруженного вещества в нескольких экстрактах одной и той
*.е пробы является обоснованным и правильным приемом. Подтверждение результата только
в единичном экстракте образца не может быть аргументировано, поскольку не исключена
возможность загрязнения экстракта в процессе пробоподготовки. Использование подтверж-
дающих методов идентификации рекомендуется в отношении всех видов токсичных веществ,
включая этанол и оксид углерода (II).
Метол количественного определения содержания искомого вещества может быть одновре-
менно и ползвержлающнм методом идентификации, если определяемое вещество было изна-
чально обнаружено хетодом, отличающимся по своей природе (например. ПФИА^ГХ-МС).
Внутренний и внешний контроль. Для надежной работы лаборатории важным условием явля-
ется наличие внутреннего и внешнего контроля за всеми этапами рабшы ог получения объекта
исследования до выдачи ответа. Дня внутреннего контроля, проводимого в самой лаборатории,
можно использовать объекты, в которых утке обнаружено го или иное токсичное вещество и
объект, аведомо нс содержавши этого вещества. Желательно, чтобы количество токсичного
вешеезва в контрольных объектах было ниже, на уровне и выше порогового уровня чувстви-
тельности скринингового метода, применяемого в данной лаборатории. Контрольные образны
должны составлять не менее 10% всех исследуемых проб.
Внешний контропь проводится но специальным программам крупными клиническими,
токсикологическими и наркологическими учреждениями и центрами, возтлавляющими службу
ХТА. Проверка работы табораторий проводится открытым способом, когда лаборатории зна-
ют. что они исследуют кон трольные пробы, и скрытым способом, когда лаборатории нс знают,
что отти исследуют контрольные пробы. Открытый способ проверки способствует выявлению
мак имальных технттко-ортаннзаннонных возможностей лаборатории, скрытый — реализации
этих возможностей в рут инном анализе.
Особенности первого этапа химико-токсикологического исследования (стратегия скрининга)
посмертного материала. Первым эганом исследования является анализ первичной информации
(анамнеза) и результатов вскрытия. Если у патологоанатома нел особых сведений для судеб-
ного химика-аналитика. ответственность за решение, какие тесты должны быть проведены,
ежит исключительно на профессиональной компетентности специалиста-химика. Эксперт
руководствуется нормативными документами, регламентирующими его работу (см. гл. 1.5),
210 Глава 5
и составляет план исследования посмертною материя i при невыясненных обстоятельствах
отравления химическ! м агентом.
Каждый биообъект но июргастся ненапрцстенпому анализу. Для скрининга широкого спект-
ра вешсств большинство эффективных схем проведения экспертизы включает сочетание ИХМ с
хром го графическими методами и химическими тестами. В лабораториях судебно-химических
отделений биообразцы анализируются по стандартизованным схемам соййасио методическим
указаниям, утвержденным М3 РФ (ом. гл. I.5). Для скрининга лекарственных средств и токси-
кантов. июлируемых экстракцией. обязательно используются моча, кровь и (в зависимости от
обстоятельств вела} другие обращы (печень, содержимое желудка, желчь, мозг, легкие и лр.).
Скрининг летучих ялов в крови направлен на обнаружение этанола, метанола, изопропанола и
ацетона, галогенированных и вегалогенированных углеводородов.
Иммунохимические методы используют для детектирования вешсств. которые трудно обна-
ружить одним или двумя хроматографическими методами.
Отбор образцов трупного материала
Обрашы трупного материала морфологически рашообратны и вариабельны но содержа-
нию токсиканта. Отбор пора та основан на анамнезе случая, указаниях органов дознания иди
доступности изъятия. В качестве исслсд емых объектов отбираются кровь (н> сердца и пе-
риферическая). вся доступная моча и желчь, стекловидное тело, все доступное содержимое
желудка и ткани органов (в первую очередь печени). При лом выполняются соответствующие
инструкции и приказы об отборе максимального количества образца (табл 5-2). В случаях,
котла вскрытие нс производили. отбираю! ся периферическая кровь, моча и стекловидное те ю.
Выбор биообъекта, его отбор, консервирование и хранение - важнейшие процедуры СХА.
Таблица 5-2 Объекты исслслова шя при проведении СХА
биообъекты Количество образца Примечание
Кровь 50—КЮ мл Источник идентификации Анхли шрустся нсегда Консервант — 2% раствор фторида натрия или оксалата КД.Н1Я Хранить при 4 ’С в течение тестирования и при - 2ч ’С по время длительного хранения Если возможно, го хранить аликпоту без добавления консервантов
Кровь периферическая (из бедренной или подключичной вены) I0-25 мл Источник нлентификаппн Аихчнзнрустся при полном химико-токсикологическом исследовании Консервант — 2% раствор фторида натрия или оксалати КД.1ИЯ Хранить при 4 'С в течение тестирования и при —20 ’С по время длите.и-ного хранения
Кровь, тромб 10—25 мл Аналк шрустся в случаях грзнмы Конссрпант — 2% раствор фторила натрия или оксалата калия Храиитт. при 4 ’С в течение тестирования и при —20 ’С во время длительно!о хранения
Моча Вен Источник илс1пифнкаиин Анализируется всегда Консервирование не обязательно Вы.елнтъ некоторое количество, лаже если общий объем менее 1 мл, .тля иммунохимического скрининга
Методология химико-токсикологического анализа 211
Окончание табл. 5-2
Желчь Вся или нс менее 30 мл Источник идентификации Анализируется всегда Консервирование нс обязательно Перевязать желчный пузырь, чтобы избежать загрязнения, отбирать перед отбором образца печени
Стекловидное тело Все или нс менее 2—3 мл жидкости из каждого глаза у взрослых, около I мл у новорожденных Источник идентификации Аналнзирхсгся всегда Консервирование не обязательно Собрать жидкость из обоих глаз в обычную пробирку
Содержимое желудка Все Анализируется при полном химико-токсикологическом исследовании Консервирование не обязате imio Перевязать желудок. чтобы гпбежать загрязнения из других внутренних органов; отметить общий объем
Печень 50 г Источник 1цен1ификаш1и Анализируется всегда Консервирование не обязательно
I Почки 50 г Ан<ь изируютея на металлы, этиленгликоль Консервирование нс обязательно
Селезенка 50 г Анализируется на СО, CN-иопы Консервирование не обязательно Очень полезное исследование. особенно когда мало крови (об оревшис трупы)
Мозг жировые ткани 50 г Анализируется на ппофильные вешества Консервирование не обязательно Очень полезное исследование в случаях детской смерти
Легкие 50 г Анализируется на летучие ялы Консервирование не обязательно Отбирать в опечатанный контейнер Как можно тщательней отобрать трахеал >выи вохдух
Волосы Связанный пучок с теменной части головы (не всегда) Анализируется при отравлении лекарствами. металлами Консервирование не гребуется Отметить дистальный и проксимальный концы
Судебная защищенность результатов XТА зависит от качества и типа отобранных образцов,
их сохранности и документального оформления. а также контроля во время отбора пробы и
процесса хранения.
Биологические жидкости отбираются новым или химически чистым маркированным шпри-
лм для подкожного введения с использованием иглы нужною размера и длины в соответс-
твии с объектом, из которого отбирается проба Для каждого образна используются только
сана игла и шприц. Случаи повторного использования ширина и иглы возможны только для
отбора образцов со сниженным риском загрязнения отбираемых биопроб и могут быть свя-
заны с у обством и эффективностью работы конкретным набором. Если шприц и игла были
ранее использованы, их необходимо тщательно вымыть и продезинфицировать перед повтор-
ным употреблением. Типичная процедура очистки состоит из 30-минутного вымачивания в
212 Плава 5
дезинфицирующем растворе (например, в 10% водном растворе гипохлорита натрия) с после-
дующим промыванием пеиопогенным детергентом и ополаскиванием большим количеством
дистиллированной воды. Дополнительная дезинфекция может быть осуществлена в автоклаве.
Болес жесткие условия (высокие давление или температура, продолжительность процедуры до
2 ч) необходимы, сечи ширин ранее использовался для отбора проб умерших от инфекционных
болезней.
Кровь. При вскрытии образны крови из трупною материала отбирают из сердца и перифе-
рических сосудов (нс менее 50 мл) аспирационной иглой для подкожного введения. Для этого
околосердечная сумка должна быть удалена, сердце высушено (осушено), образны крови коли-
чественно отобраны ширипем из правого и левого желудочков сердца и обязательно промар-
кированы. Если вскрытие не производили, собирают только периферическую кровь. Образны
псри(|>ерическои крови обычно отбирают нз бедренной вены (иногда из подключичной). Вены
ног предпочтительнее вен головы и шеи. поскольку на этих участках анатомически присутс-
твует большее количество клапанов, ограничивающих движение крови из кишечника. Из бед-
ренной вены легче получить необходимое количество крови. Образны периферической крови
отбирают новым (чистым) шприпем емкостью 10—20 мл для подкожного введения. Тромбы
крови огбираюг при травме головы или в тех случаях. когда другие образны целое гунны. При
определенных обстоятельствах, несмотря на возможные сильные загрязнения образна, исполь-
зуют грудину и брюшную полость.
Моча. Во время вскрытия обратны мочи огбнрают нз мочевого пузыря чистым (новым)
шприпем для подкожного введения непосредственным погружением иглы в пузырь. Если
вскрытие нс производили, образцы отбирают через переднюю стенку брюшной полости или
через лонное сочленение. По возможности должно быть отобрано не менее 100 мл мочи,
при этом для цветных реакций и иммунохимического тестирования достаточно 50 мл нераз-
бавленной мочи. Если мочевой пузырь пуст, пробу отбирают из мочеточника промыванием
минимальным количеством воды (или солевого раствора). Однако разбавление снижает чувс-
твительность скрининговых тестов. В этих случаях на контейнере с образцом должно быть
отмечено происхождение образна и количество использованной воды (солевого раствора).
Желчь. Аспирацию желчи производят из желчного пузыря с помощью чистого (нового)
шприца для подкожного введения. Необходимо отобран» более 15 мл желчи (лучше всю). Обра-
зен должен быть помещен в маркированную стеклянную пробирку с завинчивающейся крыш-
кой.
Стекловидное тело, Этот объект отбирают всегда, когда это возможно, лаже если вскрытие
не производили. Образны стекловидного тела получают прямым аспирированием из каждого
глаза, используя шприц емкостью 5—10 мл с иглой 20 размера. Игла должна быть введена во
внешнни угол глазной щели и аккуратно перемешена в центр глазного яблока. С помощью
такого приема отбирается 2—3 мл жидкости из каждою глаза у взрослых и окаю I мл у но-
ворожденных. Вакуумирование или жесткое отсасывание может быть причиной загрязнения
образца из сетчатки глаза и других тканей. После отбора стекловидного теле рекомендуется
ввести в глаз солевой раствор, чтобы восстановить его внешний вил. Отобранный образец из
каждого глаза отдельно помешают нспециальный маркированный контейнер.
Содержимое желудка. Содержимое желудка отбирают полностью. Если в силу каких-либо
причин это невозможно, то данный факт обязательно отмечают при направлении обьскта на
анализ. Прозектор должен перевязать два конпа желудка, перед тем как отделить его от ис-
следуемого блока. Это делают в первую очередь для уменьшения возможного загрязнения от
других внутренних органов. Поскольку содержимое желудка неоднородно по своему составу,
очень важно отделить желудок целиком от исследуемого трупа и гомогенизировать содержимое
желудка перед делением на аликвоты.
Органы и ткани. Для анализа обычно отбирают печень, почки, мозг, легкие и селезенку.
Образцы тканей в количестве 50 г помешают в индивидуальный маркированный контейнер,
заполняя его под крышку. Поскольку существует опасность загрязнения печени вследствие
посмертного перераспределения токсичных агентов из других отделов желудочно-кишечного
тракта, то образец печени отбирают из ее внутренней части. Пробу из взвешенного образца
замороженной ткани мозга отбирают специальным сверлом. Такой прием более удобен, чем
формирование пробы из влажного объекта особенно в случае зашившего материала. Ткани
Методология химико-токсикологического анализа 213
легких используются в случаях, когда есть подозрение на присутствие летучих агентов, и об-
разец следует как можно быстрее поместить в контейнер. Воздух также может быть отобран
шприцем непосредственно из трахеи и инжектирован в one татанный контейнер для проведе-
ния быстрого исследования. В случаях смерти, вызванной пож ром, селезенка является при-
оритетным объектом, доступным для объяснения причин смерти. Костный мозг не относится к
альтернативным объектам посмертного материала Поскольку биообъект зашишсп от внешне-
го влияния, он может быть использован в тех травматических случаях, когда кровь загрязнена.
Данные, которые .могут быть получены при анализе скелетных мыши, позволяют рекомендо-
вать отбор этих объектов для проведения экспертизы при летальном исходе в результате отрав-
ления (особенно мышиы конечностей). Недосттгком данного объекта является трудность его
гомогенизации.
Анализ тканей начинают со взвешивания отобранного биообъекта. Обычно от 1 до 5 г ткани
разрезают на кусо тки и гомогенизируют с 4 частями воды (или солевого раствора).
Волосы и ногти
По1 готовка проб биосубстратов к анализу на содержание макро- и микроэлементов должна
обеспечивать надлежащее хранение проб, правильные процедуры пробоотбора и извлечения
микро элементов из проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в
лабораторию проб. Все процедуры подготовки проб к анализу должны исключать возможность
внесения в них загрязнений.
Волосы сос тригают с затылочной части головы на всю длину в количестве не менее 0.1 г. Для
снятия поверхностного загрязнения и обезжиривания волос применяется способ подготовки
проб волос, рекомендованный MAIАТЭ Для этого волосы обрабатывают ацетоном в течение
10—15 мин, а затем 3 раза промывают деионизированной водой Сушат волосы при комнатной
температуре в течение 10—15 мин. Для длительного хранения используют обычные бум кные
конверты.
Для проведения анализа ногтей необходимо срезать ногти с обеих рук. Полученное ко-
личество ногтей обрабатывают ацетоном в течение 10—15 мин. а затем 3 раза промывают де-
ионизированной водой. Сушат ногти при комнатной температуре в течение 10—15 мин. Для
длительного хранения используют обычные бумажные конверты.
Фекалии. Этот биообъект анализируется на содержание токсичных вешсств. которые экс-
кретируются вместе с желчью, а также если известно, что они не полностью абсорбировались в
желудочно-кишечном тракте после орл ьного введения. Для длительного хранения пробы замо-
раживают или лиофилизирую), чтобы замедлить действие бактериальной флоры и уменьшить
неприятный запах. Основная преданалитическая обработка состоит в гомогенизации пробы.
Высушенные образны, как правило, дают более воспроизводимые результаты. Основные эн-
догенные соединения — желчные кислоты, стероиды, сахара и порфирины. Из-за присутствия
в биообъекте большого количества экзогенных вешеств. поступивших с пишси. результаты
анаитза отличаются большой вариабельностью.
Личинки. В случае загнившего биоматериала альтернативным образцом для идентификации
токсичных вешеств являются гомогенаты личинок н мясных мух. Выбор места, откуда л лжны
быть отобраны как личинки, так и летающие объекты (мясные мухи), нуждается в дополни
тельном уточнении. Отобранные для анализа личинки (летаюшие объекты) с раатожнвшегося
трупа должны быть заморожены как можно быстрее после их сбора. Даже в условиях охлажде-
ния в личинках может происходить биоэлиминаштя. если объект хранится в течение несколь-
ких педель.
Мекониум По своему состоянию мекониум (первый фекальный материал новорожденных)
нс является однородным образном и должен бытышательно перемешан в процессе формиро-
вания пробы для анализа.
Дина, производящие вскрытие, должны обеспечить чистоту контейнеров, предназначенных
для сбора образца. При загрязнении внешних сторон контейнера они должны быть промыты
водой и 10% раствором гипохлорита натрия.
Для получения воспроизводимых результатов исследования очень важно использовать «пра-
вильные» контейнеры для сбора и хранения образна, соответствующие консерванты образцов.
Наилучшими контейнерами для отбора и хранения трупного материала являются стеклянные
емкости с тефлоновыми пробками. Стекло относительно инертно, не содержит загрязняющих
214 Глава 5
пластификаторов и соответствует требуемым условиям хранения. Если известно, что содер-
жание токсичного агента менее 0,010 мкг/мл. рекомендуется использовать сн.таиизпрованные
стеклянные емкости. Стеклянные пробирки « Pyrex* рекомендуются использовать для длитель-
ною замораживания любых биообъектов. Единственным аргументом против использования
стеклянных контейнеров является гот факт, что они легко разбиваются. Для предохранения
контейнеров .можно использовать специальные сумки для переноса легко бьющейся посуды.
Ооыгм образца и размеры контейнера должны быть достаточны для полного заве днеиия (пол
крышку), чтобы минимизировать потери образна из-за окисления воздухом, находящимся под
крышкой, испарения летучих компонентов и эффекта высаливания за счет добл тления консер-
вантов. Обычно для отбора и хранения образцов крови и мочи используют пробирки емкостью
50 мл. Пробирки емкостью 15, 20. 30 мл используют для сбора небольшого количества крови,
стекловидного тела и образцов желчи.
Многие типы пластиковых контейнеров вполне подходят для отбора и хранения образцов
тканей и содержимого желудка. Образцы тканей в меньшей степени контактируют с материа-
лом пластикового контейнера. Поэтому пластификаторы контейнера в минимальной степени
будут интер<1>ерировать с токсичными агентами содержимого жезудка. Природа и степень за-
грязнения пластификатором контейнера могут быть определены холостым опытом — ннали том
биологической жидкости, не содержащей каких-либо токсичных агентов, хранившейся неко-
торое время и данном контейнере. Пластиковый контейнер должен храниться очень аккуратно,
чтобы избежать его растрескивания при сильной заморозке.
Консервирование образца. Фторид иттрия в образцы крови добавляют для ингибирования
процессов ферментативного превращения глюкозы в этансы. кокаина в бензоилокгонин. pai-
рушення эфира 6-мошииегилморфина — 6-МАМ (биомаркера героина) и других сложных
эфиров. В некоторых случаях используют антикоагулянты. например оксалат калия. ЭДТА
или цитрат натрия в концентрации 5 мг/мл (иногда вместе с консервантом). Консерванты и
антикоагулянты могут быть помешены и пробирку ло начала отбора крови. Однако если ото-
брано небольшое количество крови, то избыток фторида может вызвать увеличение летучести
анализируемого вешества за счет повышения парциальною лжпсиия. Желательно иметь для
анализа два образна — одни с консервантом, другой без консерванта. Наличие двух образцов
полезно для интерцретапни результатов анализа в связи с оценкой потенпиатыюю влияния
микрофлоры на метаболизм токсичных агентов. Низкие температуры ингибируют действие
бактериальной флоры и обычно замедляют многие реакции, например реакцию окисления
этанола н ацетальдегид.
Документирование отобранных биообъектов. Деятельность экспертов судебных химиков стро-
го регламентируется нормативной документацией и законодательными актами. Все операции,
проводимые с обраягами. должны быть документально ск|юрмлсны. что обеспечит сохранность
полученных доказательств. В сопроводи тельных документах каждого образца обязательно есть
ответы на вопросы: какое, кто, когда и почему получил доказательство, где оно хранится. До-
казательство связывает вместе людей, место действия, предметы, которые являются важными в
объяснении сопутствующих делу обстоятельств и т.д. Важность доказательств в криминальных
случаях определяет решение вопроса о жизни или смерти, в гражданских делах — о сумме де-
нег или собственности.
Всякий раз при подписании отчета эксперт подтверждает перед судебным рассмотрением
свою добрую репутацию и правдивость. «Мы сами должны стать геми переменами, которые мы
хотим видеть в мире*. — слова Махатма Ганди актуальны и в наше время.
Биологические образцы, собранные во время вскрытия, являются доказательствами. они
должны быть оформлены юридически правильно и сохранны (охраняемы). В течение иссле-
дования доступ лип к образцам должен быть ограничен только сотрудниками лаборатории,
имеющими пргво на проведение экспертизы Правильность проведения операции с образцом
будез оценена судом. Утвержденные правила документирования охватывают время, в течение
которого образец мог быть уязвим для фа ьсификашги. Неправильное документирование мо-
жет скомпрометировать образен и репутацию лаборатории. исследовавшей образец. В настоя-
щее время документирование ведется в электронном варианте с применением различных форм
кгшиты.
Методология химико-токсикологического анализа 215
Маркировка отобранных биообъектов. Первое условие правильного веления экспертизы со-
стоит в обязательной маркировке контейнеров для образцов. При отсутствии маркировки био-
объект может быть подвержен любому сомнению. В экспертной работе существуют определен-
ные правила организационного характера.
• Необходимо работать с одним образцом от момента его отбора до окончательного оформле-
ния результатов анализа.
• Никогда образец не должен находиться в немаркированном контейнере, поэтому тапатолот
(прозектор) об1 затсльно должен убедиться, проследить, а химик-аналитик vera довить и до-
кументально подтвердить, что образец помешен в маркированный контейнер.
Маркировка образца как минимум должна содержать следующую инфо[ манию:
• идентификационный номер:
• фамилию, имя. отчество потерпевшего или другие сведения о нем;
• дату и время отбора образна:
• подпись танатолога (прозектора);
• тип образна (кровь, моча, печень, почки и тл.);
• место отбора (кровь из бедренной вены и т.д);
• фамилию, имя. отчество специалиста, отбиравшего пробу, с указанием даты отбора образца.
Последнее может иметь значение в тех случаях, когда биообъект не был отправлен на анализ
в .лабораторию немедленно после огбора.
При отсутствии марк 1ровки пли неполной информации об отобра том объекте этот факт
должен быть обязательно отмечен в конечном документе — акте судебно-химической экспер-
тизы.
5.3. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ СОДЕРЖАНИЕМ
ТОКСИКАНТА В АНАЛИЗИРУЕМОМ БИООБЪЕКТЕ
И ИНТЕРПРЕТАЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Необходимо принимать во внимание данные о посмертном высвобождении и/или пере-
распределении токсичных вешсств из ткани в кровь, что может привести к закономерным
разног 1аспям в опенке полученных результатов. Даже при достоверно полученных аналити-
ческих данных есть варианты неверного истолкования (интерпретации) коне 1ных результатов,
например, если концентрация токсичного агента только в образцах крови используется для
объяснения влияния тех или иных обстоятельств на факт смерти в результате отравления.
Кровь. Кровь (см. гл. 2.4.3) является лучшим биологическим объемом для обнаружения,
катичее!венного определения и интерпретации конценграниц токсичного агента. Содержание
токсикантов и их метаболитов в крови у живых субъектов и в крови трупа неодинаково. Качес-
тво пробы зависит о*! правильности отбора. обработки, подютовкн и храпения ее до анализа,
содержания веществ, влияющих па анализируемое вещество. и метабол!iron. Содержание ток-
сичного вешества в артериальной или венозной крови различно, так как меняется качествен-
ный состав и содержание белков в крови. Если токсичное вешество в значительной степени
связывается с белком, это необходимо учитывать. Преданалитической обработке могут быть
подвер! путы цельная кровь, плазма или сыворотка. Если для предотвращения свертываемос-
ти крови использовались антикоагулянты, то необходимо учитывать, что гепарин вытесняет
жирные кислоты из мест их связывания с альбумином. ЭД ТА и фторид натрия, применяемые
при консервации объекта, вызывают осмотическую дегидратацию эритроцитов и разбавляют
П.и1зму. что влияет на количественное определение токсиканта. Для замедления энзиматичес-
кой акшвносги кровь рекомендуется хранить в холодильнике в замороженном виде. Из эндо-
генных соединений, помимо жирных кислот, в крови присутствуют стероидные гормоны (хо-
лсстсрол. тестостерон и др.), которые пах пятся в связанном состоянии с протеинами плазмы.
При инicpnpcгацин количес1веннык результатов учитывают посмертное перераспределение
токсичных агентов из тканей в кровь. Отрицательный результат (ниже установленного предела
обнаружения для анализируемого вещества) может быть интерпретирован как недостаточная
доза для острою отравления этим химическим агентом или как его отсутствие. Наоборот, вы-
216 Глава 5
сокис концентрации токсиканта свидетельствуют о том. что интоксикация ним смерть вызвана
обнаруженным веществом (за исключением. конечно, случаев загрязнения образца) Кроме
того, более высокое содержание исходного токсичного агента по отношению к его метаболиту
в большей степени говорш в пользу острого отравления. Это особенно важно в случае отравле-
ния несколькими лекарствами в сочетании с приемом этанола Наиболее трудна интерпретация
результатов в случаях, когда определяемое токсичное вещество подвержено посмертному пере-
распределению и обнаруженный в обраше крови из сердца токсикант содержится в концстра
пнях между высшей п терапевтической дозой. Тогда анализ периферической крови может быть
определяющим для оценки степени ущерба, нанесенного организму подозреваемым токсичным
ai ентом. Кровь из сердца используется в судебно-химических лабораториях в качестве образца
для первоначального теста, а периферическая кровь — для подтверждающего последующего
ангин за (ко!да это необходимо). При травмах го. овы отбирают кровяной тромб из мозговой
полости, находящейся под твердой мозговой оболочкой подпаутинного пространства. Такие
биообъекты называются временными капсулами. Они позволяют соотнести концентрации ток-
сичного агента (в том числе алкоголя), со временем совершения преступления. Полученные
результаты имеют большое значение лля подлинной опенки возможности выживания после
нанесения травмы. Кровяные тромбы могут быть использованы лля идентификации лекарс-
твенных средств. которые применялись до проведения терапии на госпитальном этапе. Боль-
шинство лабораторий обычно анализируют эти образны на содержание алкоголя, сохраняя их
для последующею (при необходимости) обнаружения других токсикантов.
Кровь из i рудной и брюшной полости отбирают в тех случаях, когда се или незагрязненные
тромбы невозможно отобрать из других участков трупа. Подобные образцы крови, как прави-
ло. сильно загрязнены содержимым желудка и бактериями. Поэтому данные качественного
анализа таких объектов не вссиа имеют ценность.
В крови токсичные агенты мшут концентрироваться в плазме или эритроцитах. Образны
плазмы бесполезны, если использованный химический aiein связан с эритроцитами (напри-
мер. свинец). По этой причине обшей практикой является авали i цельной крови в судебной
химии и анализ плазмы в клинической лабораторной диагностике.
Моча. Моча (см. гл. 2.4.4) является наиболее распространенным объектом исследования па
наличие многих токсичных соединений, которые выводятся из организма в основном с мо-
чой. и считается наиболее простым биообъектом для анализа вследствие низкого содержания
белковых компонентов. Моча, отобранная при вскрытии, потенциально является одним из
важнейших объектов для получения информации о возможном предсмертном использовании
лекарственных средств или друтх токсикантов. Биологическая матриц;! мочи вследствие по-
чечной фильтрации свободна от белков плазмы, липидов и других соединений с относительно
большой молекулярной массой, чтоупрошаст процесс иробонодготовки. Важным показателем
мочи как биообъекта является pH. изменения которого контролируются в процессе работы.
При хранении pH мочи может увеличиваться из-за действия бактериальной флоры, выделя-
ющей аммиак, что можно предотвратить, сохраняя мочу при пониженной температуре, а при
анализе очень лабильных вешеств — в замороженном пиле. Действие бактериальной флоры
можно замедлить также добавлением борной кислоты и других бактериостатических препа-
ратов. Мочу можно лиофилизировать, предварительно переведя летучие соединения и соот-
ветствующие соли. Из эндотенных соединений в моче всег.та содержатся низкомолекулярные
продукты метаболизма аминокислот и углеводов (амины, мочевины, карбоновые кислоты и
др.), небольшое количество пентилов стероидов и ши мента уробилина, окрашивающего мочу
в желтый цвет и мешающего спектрофотометрическому определению ксенобиотиков <A.|W 490 нм).
Аккумуляция токсикантов и их метаболитов в моче в достаточно высоких концентрациях об-
легчает обнаружение потенциальных ядов. ИХМ и цветные тесты используют для прямого
обнаружения и моче определенных групп токсичных агентов. Детектирование зависит or вре-
мени употребления токсикантов. В образцах мочи оно обычно составляет от 24 ч ао 1 мес в
зависимости от химической природы токсичного агента. Образец мочи является идеальным
объектом лля детектирования самого широкою крута соединений, за исключением случаев,
когда временной период наступления смерти очень короткий и агент (по времени) не успевает
поступи гь в выделительный тракт. Обнаружение токсичного агента в моче нс дает однознач-
ной информации о дозе и времени введения сто и организм. Лля достоверной интерпретации
Методология химико-токсикологического анализа 217
результатов (в контексте отравления) параллельно анализируют кровь на содержание веществ,
обнаруженных в моче. Гак. в случаях, когда быстрое наступление смерти связано с передози-
ровкой наркотика (например, наличие иглы в руке умершего), отрицательный анализ образна
мочи должен быть подтвержден обнаружением очень высоких концентраций потенциального
агента в крови.
Слюна. Слюна (см. гл. 4) является секреторной жидкостью (смесь секретов желез ротовой
полости). Отобранную пробу слюны центрифугируют и замораживают. для того чтобы замед-
лить активность находящихся в ней ферментов. Было показано, что нсионизированные формы
токсичного вешества. находящиеся в водном растворе плазмы пассивно диффундируют в слю-
ну (см. гл. 4). Существует зависимость между концентрацией анализируемого вещества в слюне
и его концентрацией в плазме.
А 1чь. Желчь (см. гл. 2.4.2 и 4) является продуктом секреторной деятстьности печени, желч-
ного пузыря и двенадцатиперстной кишки и представляет собой жидкость с большим содержа-
нием воды. В ней содержатся эндогенные вещества, подобные тем. которые находятся в крови,
плазме и сыворотке, а также желчные кислоты и пигменты. Это биожилкость. которую всегда
отбирают при вскрытии, поскольку многие токсиканты и их метаботиты. как правило, аккуму-
лируются в этом биообъекте. Качественное обнаружение присутствующих токсичных агентов
и или их метаболитов в желчи очень важно для установления анамнеза разового или хроничес-
кого отравления (например, при употреблении наркотиков). Желчь как биообъект используют
посте предварительной обработки образца в анализе на алкоголь и для ИХМ (скрининга).
Часто обнаружение токсикантов проводят в желчи, поскольку там их содержание выше, чем в
крови (например, опиатов, и в частт ости морфина, бензодиазепинов и лр.). Желчь различает-
ся по pH. который находится в пределах 6.7—8.3. что заставляет контролировать pH во время
преданалитической обработки. Помимо контроля pH. пробу рекомендуется центрифугировать
при низких скоростях (.для осаждения холестерила) и осадить белки opi эпическим растворите-
лем (спирты, хлороформ или их смесь). Если преланалитическая обработка представляет собой
экстракцию, то желчные кислоты образуют стойкую эмульсию и для разделения фаз необхо-
димо длигслыюс нентрифу пирование. Поскольку большинство токсичных всшссгв выделяется
из желчи в виде конъюгата с глюкуроновой кислотой, желчь предварительно подвергаю! гид-
ролизу и/или обработке ферментом (например. Рнлюкуронидазой). Экстракты из желчи часто
скрашены, что затрудняет их спектрофотометрирование. Предварительное осаждение белков
несколько улучшает чистоту пробы.
Стекловидное тело. В силу своей физиологической функции объект защищен от различных
загрязнений и бактериальной флоры. Результаты анализа стекловидного тела играют важную
аспочотательную роль в объединении всех данных, полученных при исследовании трупного
материала. Анализ объекта помогает различить прижизненное введение алкоголя и его посмсрт -
ное образование, а также установить прижизненную коннентрпнию этанола в бальзамирован-
ных образцах. Найденные концентрации токсичных агентов в стекловидном тете аналогич-
ны концентрациях! этих агентов в циркулирующей крови за I—2 ч до наступления смерти.
Поско ьку стекловидное тело относится к периферическим объектам, увеличение содержания
токсикантов в нем рассматривается как депонирование анализируемых всшссгв. Стекловидное
тело — наиболее удобный объект для анализа трупного материала на содержание глюкозы,
дзота мочи, мочевых кислот, креатинина, ионов натрия и хлорил ионов, что очень важно для
оценки состояния больного диабетом, степени гидратации. баланса электролитов и функции
почек перед смертью. Кроме тою. стекловидное тело является биообъектом для определения
посмертных конненграний дигоксина. Анализ крови из бедренной вены в сочетании с анали-
зом стекловидного тела помогает интерпретировать результаты при оглавлении дигоксином.
Содержимое желудка. Оральное введение является важнейшим путем поступления токси-
кантов. Для интерпретации положительных результатов экспертизы необходимо знать полный
объем жидкости в желудке. Перслозпровка. несчастный случай или преднамеренное отравле-
ние могут быть раскрыты при анализе содержимого желудка. В большинстве случаев найден-
ные в содержимом желудка нераетнорнвшпеся капсулы или таблетки могут быть использо-
ваны п я идентификации. Нелегальные наркотики в лопнувших баллонах или презервативах
часто обнаруживают в желудке у погибших наркокурьеров. При передозировке лекарственных
средств (при оральном употреблении) в содержимом желудка определяют высокие концентра-
218 Глава 5
ции ксенобиотиков, что впоследствии подтверждают анализом образцов крови и/нли тканей
Анализ содержимого желудка дает информацию о не поступивших и кровь, но находящихся и
организме на момент наступления смерти токсичных агентах. Их количество. в 5 раз и более
превышающее терапевтическую дозу, скорее свилетеятствуст о суициде, чем о передозировке
Обнаруженные низкие концентрации токсичных агентов в желудке, особенно метаболитов и
слабых оснований, могут быть связаны с их пассивной диффузией обратно из кропи в содер-
жимое желудка, а нс с оральным введением этих агентов.
Запах содержимою желудка при вскрытии может дать первичную информацию о присутс-
гпии специфических агентов Например, по запаху горького миндаля можно предположить
присутствие цианидов, фруктовые запахи ютюряз о наличии этанола и его пром зводпы.х; запах
синтетического клея — о наличии ксилола, толуола, запах чистящих жидкостей — о наличии
галогенированных углеводородов. сухих грибов — о наличии дихлорэтана, чесночный — о на
личин мышьяка
Органы и ткани. Ткани органов являются лучшими объектами для получения результатов,
сопоставимых с результатами анализа крови. Анализ тканей в рязе случаев может быть более
удобен и полезен, чем анализ биожидкостей, даже для одного и того же обнаруживаемого со-
единения Образцы ткани доступны для анализа трупною материала, в гом числе в разложив-
шихся бпообразпов. В настоящее время получено большое число количественных ланных об
обнаружении токсичных агентов в гканях. прежде всего в тканях печени и почек и в меньшей
степени мозга и легких, а также сравнительных результатов анализов крови из сердил и ткани
печени при определении метаболитов токсикантов. Функции печени (см гл 2.4.2) обуслоззлнва
ют присутспше самых разнообразных экзо- и эндогенных соединений в пробе (аминокислоты,
амины, углеводы, жирные кислоты и многие другие вещества) Пигментный обмен приводи!
к образованию билинозз (билирубин, биливердин, стернобидин. уробилин и лр.) — окрашен-
ных BCH1CC1B, мешающих в сильнейшем спектрофотометрическому определению пробы. Из-за
присутствия разнообразных эндогенных (экзогенных) соединении печень — самый трудный
биообъект для анализа Даже самая длительная и многоэтапная процедура изолирования. на-
пример кислых лекарственных средств, заст в конечном счете в хлороформенном экстракте до
8 разнообразных эндогенных соединений. С другой стороны, ткани печени - один из самых
информативных объектов ХТА. Например, если ко1|гентрации веществ основного характера и
печени достаточно высокие и отношение их концентраций в печени и крови выше К), — это енн-
дегелзл-твуст об отравлении (при отсутствии каких-либо других признаков, вызвавших смерть).
Меныпие значения (лаже при абсолютных высоких концентрациях токсичных агентов в крови
из сердца) юворят о посмертном перераспределении токсичных агентов в крови. При отрав-
лении тяже )ы.мп металлами почки (с.м. гл. 2.4.4) — наиболее часто используемый объект, так
как металлы депонируются в нем. Кроме того, структурные изменения почек, связанные е
присутствием тяжелых металлов ил>г этиленгликоля. мозут быть зафиксированы гистологичес-
ки. Селезенка (см. гл. 2 4.3.) как орган, наиболее богатый кровью, используется тля анализа
монооксида углерода и цианидов, т.е. соединении, нарушающих функцию гемоглобина и вы-
зывающих образование его токсичных производных. Ткани легких (см гл 4 и 8) используются
в случаях, когда имеет место ингаляция летучих ядов (растворителей гни фреона). Мозг (см.
гл. 4 и 7) достаточно защищен от внешнею влияния и посмертного разложения. Этот вил
биообъекта отличается прежде всего высоким содержанием лннидов. фосфолипидов, стери-
нов. продуктов метаболизма белковых веществ (низкомолекулярных пептидов) Из стеринов в
тканях мозги в значительном количестве присутствует холссгсрол особенно в белом всзиестве.
При экезракнни нз тканей мозга необходимо учитывать, что холесгерол хорошо растворим в
ряде органических растворителей (хлоро^юрм > лиэтиловыи эфир > горячий этанол > бензол
> толуол > ацетон). В воде он не растворим, но лез ко набухает, образуя стойкую эмульсию,
вследствие чего может удерживать огромное количество воды, превышающее его массу в 100
раз Отсюда становится очевидной необходимость предвари дельного удаления липидов из про-
бы, в первую очередь разрушения комплекса липид—жирорастворимое токсичное вещество. В
юанях мозга депонируются липофильные токсичные вещества (хлорированные углеводороды
и другие органические летучие соединения, ем. гл. 8 и 10)
Во. юсы Традиционно волосы, как и ногти, исследуют при подозренигг на хроническое от-
равление мышьяком, ртутью или свинцом. Как известно, тяжелые металлы (тиоловые яды)
Методология химико-токсикологического анализа 219
связываются с сульфгидрильными группами молекул цистеина, образуя ковалстныс связи
(см. гл 3.2 и 8.5). Кератин, составляющий основу волос и ногтей, содержит цистеин. Поэтому
эти биологические матрицы являются идеальными обтсктами для обнаружения хронического
отравления многими металлами. Учитывая скорость роста полос, при исследовании сегментов
волос можно определить время поступления токсичного агента в организм.
Используемые в химико-токсикологических лабораториях методы исследования на присутс-
твие токсичных вешеств в традиционных объектах (биологические жидкости или ткани трупа),
обычно дают отри нагельные результаты спустя 1—3 сут, в отдельных случаях спустя педелю и
хде месяц, но не более. Кроме того, нередко при интерпретации полученных результатов воз-
никают определенные трудности Например, обнаружение в конкретной пробе мочи какого-
либо лекарственного вещества или наркотика в низкой концентрации служит доказательством
попадания его в организм человека. Однако эксперт в данном случае затруднится ответить на
вопросы, является ли низкая концентрация токсиканта следствием однократною употреС синя
малой дозы препарата, обусловлена ли низкая концентрация токсиканта достаточно большим
сроком, прошедшим после прекрашения его интенсивного приема. Требуются дополнитель-
ные анамнестические сне (ения. а часто и проведение повторных исследований для усгановле-
- - динамики выведения обнаруженного соединения. При этом следует учитывать, что отбор
овторных образцов бывает по разным причинам затруднен или невозможен. По сравнению с
», ми объектами, как биологические жидкости, пот и секционный материал. дру не обьск<ы —
оэосы и ногти — дольше сохраняют «захваченные» ими токсичные агенты. Внутренние части
•озос менее подвержены механическому, химическому и прочим воздействиям окружающей
суеты При этом здоровые волосы и ногти в значительной степени более устойчивы к таким
аоздействиям. чем больные или поврежденные. Копией грация большинства вешеств в волосач
• ногтях в значительной степени зависит or содержания в них меланина. Любое воздействие на
кексы (обесцвечивание, химическая окраска, перманент, длительное выветривание или вы
ыыванис). изменяющее концентрацию в них мелаиипа. приводит к изменению концентрации
в в волосах или ногтях. При комн гиых условиях рассматриваемые объекты могул
санитъ я длительное время, что не влияет на результазы исследований. В нашей практике об-
. хранились в течение более 1,5 лет и результаты исследования (в пределах ошибки опыта)
ро’ически не различались. В литературе описаны случаи сше более длительного хранения
в Например, приведены факты обнаружения опиатов в волосах ирландского поэта
• 1 Китса, умершего за 167 лет ло времени проведения исследований, морфина — в волосах
» етской мумии, спустя несколько тысяч лег. бензоилэкгонина — в волосах мумии человека
жг«ззшего шетья коки около 2(МЮ лет назад.
Волосы и ногти следует рассматривать как биообъекты, наиболее долго сохраняющие по-
гэ»_: •: в организм человека токсиканта. ле1кодос1уиные для корректного отбора и исследо-
г*В СХА сильно рахтожившегося бпоматериала волосы остаются единственным биообъ-
aa/vw который позволяет провести обнаружение токсикантов или установить причину смерти.
Г г- использовании во.чос лля экспертизы необходимо учитывать внешние условия, в которых
ся трупный материал, условия промывки, пол. этническую принадлежношь и другие
Кожа. ее придатки и выделения (см. гл. 2.4.5) являются перспективными объектами исслс-
оч хля установления факта контакта и употребления человеком наркотических средств
«я» эсихотропных вешеств (см. гл. 5.6 и 7.1). Эти объекты расширяют возможности хими
~ав.икатогических лаборатории, особенно при комплексном обследовании, включающем.
-• -г обычного анализа слюны, крови и мочи, исследование поверхности кожи, волос и not -
т! При таком подходе удается избежать возникновения ряда проблем, характерных для ис-
т:- <2НИЯ мочи или слюны.
Используемые повсеместно в качестве объектов исследования кровь и моча имеют среди
фстп следующие недостатки.
• S - лностъ получения ложноположительпых или ложноотрицательных результатов из-за
угнетенного или случайного загрязнения, разбавления или подмены образцов.
• быстрое рахтожеиис как самих образцов, так и исследуемых вешеств. что обусловливает не-
агЧ димость проведения исследований в возможно более короткие сроки после нх отбора
220 Глава 5
• Сложности в интерпретации результатов при выявлении вешества в концентрации. близкой
к пределу обнаружения
• Узкий временной интервал, в течение которого искомые вещества н; холятся в организме.
В табл. 5-3 приведена сравнительная характеристика мочи, пота и волос как объектов иссле-
дования токсикантов на примере определения наркоз иков.
Таблица 5-3. Сравнигсльиая характеристика мочи, нота и полос как объектов исследования наркотиков
Моча Пог Волосы
Соотношение концентра- ции основных метаболитов кокаина Везззозызэюоннн “ метиловый эфир экго- нина > кока» п Кокаин > метиловый эфир экгонина > бен- зоил экю» ин Кокаин > бензоилэкго- нин > метиловым эфир экгонина
Соотношение концентра- ций основных метаболитов героина Морфин З-глюкуронид > морфин > 6-МАМ Героин = 6 МАМ > морфин Героин > 6-МАМ * морфин
Тип определения Дискретный Кумулятивный Кумулятивный
Период детектирования Несколько дней Недели Месяцы или годы
Требования к условиям хранения и транспорти- ровки образцов Высокие Высокие Низкие
Риск зожноположи тель- ных резу ьтатпв из-за внешних загрязнений во время cf ра образно» или их пассивною контакта с наркотиком Высокий ВЫСОКИ!) Низкий
Риск ложпоположтпель- ных результатов из-за преднамеренною зазрязие мня образцов нариошком Высокий Высокий Низкий
Риск разбавления обратна Высокий Низкий Низкий
Стоимость одною анализа Ни ткан Низкая Высокая
Различный качественный и количественный состав метаболитов токсикантов в моче, поте и
волосах свидетельствует о различных механизмах выделения наркотиков, в частности кокаина
и героина, в биож щкости и волосы Риск ложноположительных результатов значительно сни-
жается при исследовании волос (ногтей), что связано с наличием сталии отмывки поверхности
этих объектов от внешних загрязнений.
Возможность получения данных об интенсивности потребления вещества по результатам
исследования волос практически сводит к нулю часто выдвигаемый на суде адвокатами довод
о неумышленном приеме напитков и пиши, в которых находились наркозики. Исследование
волос и попей позволяет обнаружить факт употребления наркотиков в течение более длитель-
ного вымени, чем исследование мочи (табл. 5-4).
Волосы также используются в дониш-контрою (см. гл. 9) как биообъекты для проведения
экспертизы. Например, исследование мочи на присутствие станозолола (анаболический cie-
роид, зшрещенпый к использованию Между народным олимпийским комитетом в 1974 г.) и
его метаболитов обычно дает отрицательные результаты. "Эю связано со схемой его примене-
нии 4 -18-недельное потребление препарата, прекращение приема нс менее чем за I мес до
Методология химико-токсикологического анализа 221
Таблица 5-4. Сроки обнаружения токсикантов в моче и полосах
Период детектирования
Наркотики и их метаболиты
в моче в волосах
Лмфетамин/метамфетамин До 4—5 лиси До нескольких месяцев и более
Барбитураты До 2—12 лиси То же
Бензодиазепины От 1 яо 14 лиси «
Кокаин До 4—5 дней «
Кодеин, морфии До 2—4 лней «
Героин До 8 ч «
Марихуана От 24 ло 72 ч «
Фенциклидин До 2—J0 дней «
соревнования. однако станозолол может быть обнаружен в волосах спустя гол и более после
прекращения применения Станозолол преимущественно накапливается в окрашенных воло-
сах (отношение концен траций станозолола в окрашенных и неокрашенных волосах составляет
3.4 1.0).
С помощью современных аналитических методов в волосах можно обнаружить практически
любые классы наркотических средств, психотропных, сильнодействующих, одурманивающих
вешеств. металлические ялы и другие токсиканты.
Интерпретация полученных результатов отличается от подходов, применяемых к традици-
онным биообъектам (моча, кровь, ткани и др.).
Кости и костный мозг В течение 24 ч после смерти (т.е. во влажном биообъекте) между
концентрациями токсичного агента в костном мозге и посмертной крови существует линейная
зависимость для большинства токсикантов (трициклические антидепрессанты, барбитураты,
бензодиазепины, этанол).
Как правило, на сталии разложения костный мозг трансформируется из рыхлого красного
материала в коричневую вязкую жидкость или пастообразную субстанцию, что представляет
большие трудности и вносит неопределенность в интерпретацию количественных результатов.
Тем не менее некоторые лекарственные средства могут быть идентифицированы в костном
мозге или скелетных остатках. Содержание тяжелых металлов может быть определено в костях
после озоления (см. гл. 8.5).
Скелетные мышцы. На скелетные мышиы как биообъект часто не обращают должного вни-
мания в судебной токсикологии трупного материала. Существуют критерии идеального судеб-
но-химического объекта: относительная однородность, доступность и малая загрязненность.
Скелетные мышиы удовлетворяют этим требованиям. Проведенные исследования показали,
«гто концентрация токсичного вещества в мышцах бедра аналогична концентрации токсикан-
тов в крови для большинства веществ основного характера и этанола. Исключение составляют
случаи смерти при острых отравлениях, когда концентрация токсиканта в мышцах может быть
ниже. чем в образцах крови, что связано с периодом установления равновесия между тканями
и кровью Анализ бедренной мышечной ткани особенно полезен в случаях, когда вешество.
подозреваемое в причине летального исхода, детектируется в образцах крови сердца. Важно
отобрать мышиы конечностей (если это возможно), так как концентрация токсиканта в других
мышцах увеличивается со временем, а в бедренных остается постоянной Скелетные мышцы
по сравнению с другими тканями лучше сохраняются. Даже кокаин, который известен своей
нестабильностью в крови, может быть идентифицирован в разложившихся, мумифицирован-
ных (сухих) скелетных мышцах. В большинстве случаев скелетные мышцы анализируют для
получения дополнительных данных, помогающих интерпретации результатов.
Личинки. В зависимости от температуры окружающей среды личинки на трупе наблюдают-
ся уже через I—2 дня после наступления смерти При условии, что объекты отобраны с мест,
представляющих их пишевой источник (мышцы, печень только одного трупа), интерпретация
положительных результатов очень полезна. В личинках могут быть обнаружены барбитураты,
бензодиазепины, трициклические антидепрессанты, опиаты, кокаин, малатион н т.д. Установ-
лено соответствие между найденными концентрациями морфзна в гомогенате мясных мух и
222 Глава 5
печени, которой они питались. Если копнен ipaiinn обнаруженных токсичных веществ в ли-
чинках сопоставляются сланными параллельных исследовании тканей, которыми они питают
ся, то такие результаты не подвергаются сомнению. Важен возраст тичинок при определении
токсичных вешеств. Мясные мухи и их личинки элиминируют токсичные вещества после того,
как они покидают источник пиши. Концентрации токсикантов, найденных в личинках, сни-
жаются в течение 5 дней (при хранении объекта). В тех же условиях эксперимента в традици-
онных биообъектах снижение концентрации вплоть до отрицательного результата происходит
а течение I дня.
Через 11 дней наступает III стадия развития личинок (куколка). Если есп> уверенность. что они
питались только трупным материалом. можно предположить срок наступления смерти, например
в суицидных случаях при пере юзировкс. Перед анализом. чтобы избежав возможных загрязнений
(и ошибки), личинки (гомогенаты) должны быть промыты деионизированной водой.
Мскониум. Мскониум — это представительный образец, в котором могут быть обнаружены
летальные дозы лекарственных (токсичных, наркотческих) средств в организме новорожден-
ных. Бноматери1с> достаточно хорошо исследоцкш и при скрининге, н подтверждении отравле-
ния токсичными агентами. Результаты исследования мекониума соиостяш яют с результатами,
полученными при обнаружении токсичных веществ (высоких доз) в матке матери для уста-
новления причины смерч и новорожденного. Анализ биообъекта проводят как можно быстрее
посте рождения, однако в мскониуме токсиканты, в отличие от мочи, где они детектируются в
течение 2—3 дней после родов, сохраняются до 20 нед. Организм новорожденного не способен
метаболизировать токсичное вещество. Гак. описан случай обнаружения кокаина в мскониуме
17-неделыюго зародыша что позволило подтвердить факт употребления больших доз нарко-
тиков во время беременности. Коммерческие их мунодиагпостпческие наборы, используемые
для анализа токсичных вешеств в моче взрослых, пригодны для детектирования большинства
лекарственных средств в мскониуме.
Другие образцы. В ХТА используют н многие другие объекты, среди которых трахеальный
воздух. кровяные пятна па одежде, жировые образования, собранные на участках скелета или
разложившегося трупного материала. и даже зола после кремации. В любых случаях получают
только качественную характеристику (обнаружение), которую используют как дополнительное
пояснение при уешноилении причин и обстоятельств смерти.
Образцы небиаюгического происхождения. Дополнительную информацию о веществе, подоз-
реваемом в качестве причины, вызвавшей смерть, можно получить из объектов небиологичес-
кого происхождения (ширины, табастки. тампоны, баллоны. порошки и т.л.). Исследования
образцов небиодогического происхождения янлгюгся, в основном, вспомотазельнымп. так как
не всегда можно соотнести нахождение в биообъектах трупа токсичных агентов, вызвавших
смерть, с обнаружением каких-либо веществ в окружающих объектах, сопутствующих фак-
ту смерти. Гем не менее обнаружение в объектах небиологической прирозы подозреваемого
токсичного агента позволяет правильно сформулировать заключение о природе токсичного
агента, вызвавшего смерть.
5.4. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ СПОСОБАМИ ПРОБОПОДГОТОВКИ
БИООБЪЕКТА И ИНТЕРПРЕТАЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА.
СПОСОБЫ ИЗОЛИРОВАНИЯ
Существует два направления скрининга токсичных агентов. Одно из них — прямое обна-
ружение (без изолирования к очистки) в образце специфического агента или класса соеди-
нений хромогенными, мнкрокристаллоскопическими. химическими, и.ммунохимнческими и
другими методами. Другой путь — эго изолирование вещества из биоло!ичсской матрицы с
последующим исследованием концентрированного экстракта. Жилкость-жидкосг ная экстрак-
ция (ЖЖЭ). твер. офазная экстракция (ТФЭ), различные виды перегонок, озоление, диализ,
микродиффузия — способы (часто в литературе по ХТА называют методы) изолирования ток-
сикантов. Биожндкости и ткани внутренних органов — сложная биологическая матрица.
Методология химико-токсикологического анализа 223
Можно ли избежать пробополютовки? Новая технология — высокопропускной скрининг
(HTS) позволяет проводить тысячи анализов в день. Однако в большинстве методов иссле-
дования пробононотовка все еще необходима Существуют два методологических подхода к
подготовке проб: выделение аналита с полным разрушением матрицы (при анализе неоргани-
ческих веществ); выделение аналита с частичным разложением или без ран ожения матрицы
(при aiic изс органических всшссгв).
Основная цель пробополютовки — отделение анализируемою вещества (выделение, изоли-
рование) от основной массы экзогенных веществ и биоматртшы — достигается выполнением
ряда важных процедур. К ним относятся: удаление возможных загрязнений. увеличение кон-
центрации аналита, превращение аналита в форму, пригодную для экстракции, разделение и
некоторые другие.
К настоящему моменту нс найдено универсального способа пробоподготовки. позволяю-
щего выделить любой из предполагаемых токсикантов. В исследовании на «неизвестный яд»
традиционным остается использование отдельных аликвот биопроб и определенного способа
пробоподготовки. направленного на выделение той или иной группы токсикантов, различаю-
щихся по физико-химическим свойствам
В ХТА биообъектов основная и наиболее важная (а в некоторых случаях и решающи) ста-
дия состоит в подготовке образна к исследованию. Анализируемые биообъекты, содержащие
токсичные вещества делятся на:
• биожидкости (моча, плазма, сыворотка слюна, слезы, спинномозговая жидкость, лимфа,
сперма и лр.);
• органы и ткани (мышечные и жировые ткани, волосы, ткань зубов, хрусталика глаза, мозга,
печени, почки, легких, яичников и т.п.);.
• небиологические образны (вещественные доказательства, например древесина, чернила,
спиртовые и водные настойки, разнообразные пищевые продукты и лр.).
Не только каждая из этих ipynn. но и каждый биообъект группы имеет морфологические
особенпосш и грсбуег особой аналитической процедуры пробоподготовки. Способы изоли-
рования токсикантов из мочи, крови и тканей значительно различаются Так. этап удаления
белков, обычно необходимый для крови и плазмы, совсем не обязателен для мочи, содержащей
небольшое количество белка. Еше большие сложности представляет пробоиодготовка разло-
жившихся объектов исследования из-за большого количества соэкстрагентов в полученном
экстракте(см. гл. 4.5).
Пробоподготовка включает определенные этапы, некоторые из которых выполняются или опус-
каются в зависимости от конкретной аналитической задачи и природы токсиканта (см. гл. 7—11).
Эта 1ы пробоподготовки
• предварительная обработка;
• гидролиз конъюгированных метаболитов;
экстракция (или другой вид извлечения, например озоление или перегонка с водяным па-
ром, микрол |ффузия или диализ и т.д.);
очистка;
дериватизаиия.
Способы предварительном обработки образцов зависят от выбора методов исследования,
р троды токсиканта, типа биообъекта, других факторов (см. далее) и включают фильтрацию,
центрифугирование, ультразвуковую обработку, разведенке, депротеинизацию (иезьной крови,
плазмы), ферментативную обработку (ткани), гомогенизацию (ткани)
Фильтрация и центрифугирование включают получение плазмы или сыворотки, удаление
твердых частиц, присутствующих в пробе, которые могут засорить катрндж при ТФЭ, повлиять
на результаты ИХА; осушение органических растворителей устранение потерь при фильтра-
ции (смачивание и промывание фильтра).
Улыпрс звуковая обработка повышает выход токсиканта в цельной крови путем разрушения
клеток или конгломератов коагулированных клеток. Ультразвуковая обработка биожидкостей
проводится в соответствующем буфере при комнатной температуре в течение 15 мин е после-
дующим центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин.
Разведение обязательно, когда концентрация аналита выше пределов линейности метода и
ожидаемая концентрация аналита значительно выше предела обнаружения
224 Глава 5
При исследовании ткани для разведения использусися вола гиги разбавленная кислота (для
основных вешеств); при анализе крови и мочи — «отрицательная» кровь и моча, т.е. не содер-
жащая токсикантов.
Депротеинизация. При анализе следовых количеств оксиканта в образцах с высоким со-
держанием белка его осаждение становится необходимым, для того чтобы предотвратить об-
разование эмульсий при экстракции органическими растворителями. Кроме того, депроте-
инизация требуется в случаях необратимого связывания анализируемого соединения с белком.
Только несвязанная фракция токсиканта может проникать через мембраны, воздействовать на
рецепторы, подвергаться биотрапсформании. активному выведению и т.л. (см. гл. 4). Депро-
теинизация достигается добавлением депротеинизирующих агентов (хлорная, вольфрамовая
или грнхлоруксуснвя кислота), органических растворителей (метанол или ацетонитрил). солей
металлов. При депротеинизации анализируемое соединение иногда сорбируется на поверхнос-
ти или в кластерах осадка. Этот эффект может быть сведен к минимуму, если лобчвлягь не
депротеинизирующий аген т к гомогенату, а гомогенат к избытку депротеинизирующего агента.
Для некоторых соединений увеличение фактора извлечения наблюдается в случаях перемеши-
вания на ультразвуковой бане депротеинизирующего агента во время добавления гомогенизи-
рованного образца. Нагревания мя осаждения белков следует избегать вследствие возможного
разрушения анализируемого соединения. В качестве альтернативного способа, позволяющего
решить многие проблемы, связанные с осаждением белков и концентрированием образца, за
рубежом широко раст ространено использование ферментов (пептидаз), разруш ющих только
белковые соединения.
С негативными явлениями, вызванными влиянием липидов, чаше всего сталкиваются при
работе с такими биообъектами, как кровь, ткани печени, мозга и др. Эти трудности заклю-
чаются прежде всего в образовании эмульсий при эксгракции, создании большого фона на
хроматограмме, т.е. в большинстве случаев экстракты липофильных по своему характеру ток-
сичных веществ содержат большое количество липофильных соэкстрагентов. Классическая
схема у тения липидов при изолировании токсичных соединений из биообъекта следующая:
экстракция определяемых микрокомпонентов: реэкстракния в разбавленную кислоту или ос-
нование; доведение pH до значения, при котором соединение находится в неионизированном
состоянии: экстракция органическим растворителем и концентрирование. В последние годы
появились модернизированные приемы уда, сния липидов. Так. водорастворимые лекарствен-
ные соединения рекомендуется после депротеинизации метанолом и упаривания надосадо1 ной
жидкости обрабатывать четыреххлористым углеродом для удаления липидов, а верхний стой
использовать для анализа. Из других способов удаления липидов можно отметить использование
двухмерной ГСХ. В этом случае первая система растворителей — летролейнын эфир — служит
экстрагентом липидов, которые движутся вместе с фронтом растворителя, а вторая — этил-
анстат- метанол—вода — для хроматографического разделения. В некоторых случаях липиды
могут быть удалены вымораживанием биообразца или осаждением тга сорбентах.
В авали тируемом биообразце могут присутствовать и *ругис вещества, нс являющиеся при-
чиной отравления. К ним относятся продукты метаболизма пиши, метаболических превра-
щений эндо- и экзогенных соединений, происходящих в организме, и т.д. По своим физико-
химическим характеристикам они. как правило, очень близки к анализируемым веществам.
Иногда практически невозможно избавиться от их интерферирующего влияния известными
способами очистки. В большинстве случаев очистка достигается экстракцией ионных ассоци-
атов. хелатов и др.
Итак, депротеинизация игреиипитаиия) способствует удалению белков и других эндоген-
ных вешеств из пробы и проводится полярными растворителями (ацетонитрилом и др.) путем
добавления 2—3 частей растворителя на i часть биожилкости (гомогената) с последующим
центрифугированием для отделения иадосадочпой жидкости. Возможна обработка образца
кислотами (муравьиная, трихлороуксусная. хлорная) или неорганическими солями (сульфат
аммония, сульфат пинка и др.). Однако при проведении депротеинизации возрастаю! потери
анолита за счет адсорбции денатурированными (осажденными) белками или химической дегра-
дации (сильными кислотами гиги щелочами).
Измельчение тканей, волос достигается гомогенизацией (например, блендером), химическим
(щелочной гидролиз волос) и ферментативным способами. Химический способ быстрый, де-
Методология химико-токсикологического анализа 225
шевыи. но разрушает нестабильные вешества. Ферментативный способ, например с использо-
ванием трипсина, значительно дороже, медленнее. но сохраняет нестабильные вещества и лает
более надежные результаты.
Г/дролиз конъюгированных метаболитов проводится с пслью получения свободных метабо-
литов и возможности их дальнейшего исследования. Конъюгированные метаболиты из-за вы-
сокой полярности и большой молекулярной массы нельзя анализировать методом ГЖХ: они
|у ше рас воряюгся в воде, чем в органических растворителях, что затрудняет экстракцию.
Кислотный гидролиз проходит быстро, прост в осуществлении. Однако вследствие неспспи-
фичпости реакции расшсплспия ковалентной связи, жестких ус овни проведения гидролиза в
среде концентрированной кислоты при кипячении иди нагревании в автоклаве пол давлением
обратуется большое количество побочных продуктов и теряется информация о некоторых ток-
сикантах (например, разрушение 6-МАМ — бномаркера героина, деградация бензодиазепинов
до метаболитов и др.).
Энзимный гидролиз под действием ферментов (например. Ii-г.тюкуропидазы, p-cvтьфатазы.
трипсина и др.) является специфичным, проходит в мягких условиях, уменьшает образование
побочных продуктов, в результате чего гидролизованный образец получается более чистым.
Способ имеет недостатки, необходимость строгого соблюдения условий (pH. температура, со-
став буфера, активность фермента); длительное время инкубирования (12—20 ч): изменение
активности фермента в зависимости от происхождения и сроков хранения, ингибирование
фермента веществами, присутствующими в пробе (соли).
Аидк ать-жидкостная и твердофазная экстракция Экстракцией могут быть изолированы
токсичные вещества, относящиеся к раз шчным классам и группам химических соединений,
том числе нелетучие органические вешества: наркотики, ядовитые, сильнодействующие ле-
карственные вешества. пестициды и др
Способ жидкость-жилкостной экстракции (ЖЖЭ) основан на последовательном изменении
полярности. pH среды экстрагентов и кислотности (или основности), рахтичнои липофильнос-
ти анализируемых вешсств. Вещества основною характера при щелочных значениях pH среды
находятся в нснонизированной форме, в то время как вешества кислотного характера будут
ионизированы. Нсионизированныс формы сое мнений. как правило, лучше растворяются в
.тапофнтьных органических растворителях, чем в воде. На этохг принципе и основано изоли-
рование токсичных всшсств из биологических объектов.
При выборе методики экстракции необходимо учитывать, с одной стороны, значение рКл.
липофильность (выраженная как Кр при рахтичных значениях pH), расгворимость в водных и
органических средах, значение дипольного момента анализируемого соединения, а также его
гтойчивоегь к воздействию воздуха. света температуры. С другой стороны, выбирая конкрст
чую экстракционную систему, необходимо принимать во внимание характеристики раствори-
•елеи полярность. селективность, дипольный момент, плотность и поверхностное натяжение,
смешиваемость с водой, летучесть органического растворителя и его безопасность для здоро-
вых Как правило, у растворителя, выбранного в качестве экстрагента из группы растворителей,
уэовлетворяющих условиям ЖЖЭ конкретного анализа. не существует особых преимуществ.
Выбор экстрагента — всегда компромисс между видом биообъекта, характером анализируемого
соединения и свойствами раствори геля При выборе схемы экстракции, которая определяется
триродой токсиканта, морфологическими особенностями биообъекта, возможными методами
сслелования. эксперт должен обратить внимание и на потенциальные фоновые соединения
экзогенного и эндогенного характера, присутствие которых в анализируемом образце ггеиз-
гжно Количество фоновых соединений будет определяться видом объекта, условиями его
хранения, особенностями поведения анализируемого образца в нем и др/нтмн факторами.
Обязательным является учет возможного связывания токсичных соединений с макромолекула-
ям биологической матрицы, в основном белками.
Суммарный процесс взаимодействия токсичного вещества с бносистемой определяется
многими факторами и прежде всего химической природой токсиканта (см. гл. 2.2). Процессы
ешьватаиии токсикантов обусловлены их фгггико-химическими свойствами Одни токсиканты
склонны к специфической сольватации — образованию относительно прочных комплексов
между молекулами токсиканта и водой биожгдкосгсй за счет водородных связей, другие — к
«иифичсской сольватации, которая обусловлена слабыми кулоновскими или дисперсной-
226 Глава 5
ными силам». Величина рК, характеризует степень ионизации функциональных групп вешеств.
Токсиканты органической природы содержал различные по силе кислотные и/или основные
центры (например, СН-, SH-. NII-. ОП-кислотныс центры), электронодонорные н/илн элек-
троноакиепторные заместители, влияние которых можно рассчитать при использовании кон-
стан г Гаммста и Тафта и предвидеть их вклад в гнлро<|юбность анализируемого вещества. Для
количественной опенки кислотности и основности токсикантов используют протолитическую
теорию Бренстела и Лоури, теорию жестких и мягких кислот и оснований и др. Эффектив-
ность распределения вещества между органической и волной фазой находится в прямот! за-
висимости от строения экстрагируемого соединения: вила (элсктронодонорный. электроноак-
иеиторпый) и количества заместителей в молекуле, их внутримолекулярных взаимодействий.
кон'Ьорманионных эффектов и т.п. Ъитофилытость вещества во многом определяется видом
и количеством имеющихся функциональных групп и заместителей. Электроноакиеп горные
заместители увеличивают оби ую гидрофобность ароматических соединений. Заместители с - I
эффектом оказывают наибольшее влияние на проявление липофильных свет ств, а заместители
с +1 эффектом (например, алкильные группы) — незначительное. Если заместители способ ты
к делокализации р- и п-электронов, т.е. обладают мезомерным эффектом. то, как правило,
липофильность соединения увеличивается (особенно для ароматических систем). Стсрические
.и|к|>екты анллизирумых вешеств могут был. различными по своей природе. Зашита (экра-
нирование) неполелепнои тхтектроннои пары алкильными труппами приводит к увеличению
липофильности, г.с. к повышению коэффициента распределения (Кр). Так. экранирование
гидроксильной группы алкильными заместигелями уменьшает образование водородных свя зей
с водой. Взаимное отталкивание (пространственное затруднение) функнпон гьных групп мо-
жет уменьшать гп рофобное связывание. Пространственные затруднения могут ингибировать
сопряжение (хгезомерный э<|и|>ект) и уменьшать, таким образом. Кр. Неразветвлснная алифа-
тическая цепь обычно в больше)! степени повышает липофильность соединения, чем развет-
вленная В случаях, когда разветвление непосредственно связано с функциональной группой,
се эффект более выражен. Следует принимать во внимание возможность изменения конфор-
мации органических соединений в растворе Например, когда а ифатическая цепь достаточно
длинная, она приобретает способность свиваться в спираль в растворе, и вещество образует
гак называемые капельки молекулярного масла, что характерно лля соединений с 14 и бо :с
атомов углерода. В молекх.тах монофункциональных соединений с прямой короткой цепью
такая особенность отсутствует. Образование внутримолекулярных водородных связе г приводит
к уменьшению сродства к волной фазе (например, салициловая кислота). Низкие значения рК
указывают на высокую степень ионизации (сильные кислотные свойства). Обратная зависи-
мость характерна для основании. Для расчета степени ионизации вс шеста при опрсделсннохт
значении pH применяют уравнение Генлерсона-Гассельбаха.
Уравнение Гегглерсопа Гассельбаха для буферных систем 1-го типа:
с (соль)
pH рК, + 1g с (кислота)
В обшем случае уравнение Гснлерсогш- I асесльбаха для буферных систем I-го типа:
,, , (сопряженное основание!
Р Р .+ 'ь [кислота]
Для буферной системы 2-го типа, например аммиачной, концентрацию ионов Н' в растворе
можно рассчитать, исходя из константы кислотно-основного равновесия сопряженной кисло-
ты NH ”:
NH/ = ХН + Н*: рК 9. 2:
„ = INHJ |Н |
“ [NH/I
Отсюда получают уравнение Гендерсона—Гассельбаха для буферных систем 2-го типа:
с (основание)
pH = рК + 1g ;---------------------------------г—--
1 1 <• с (сать)
Методология химико-токсикологического анализа 227
Уравнение для буферные систем 2-го типа можно представить и в следующем виде:
с (соль)
pH = 14- рК - 1g . •
н с(основание)
Уравнение I снлерсона—Гасссльбаха позволяет сформулировать ря 1 важных выводов:
• pH буферных растворов зависит от значения отрицательного логарифма константы диссо-
циации слабой кислоты (рК ) или основания (рК ) и логарифма отношения концентрации
компонентов кислотно-основной пары, но практически не зависит от разбавления раствора
водой. С тедует отметить, что постоянство pH хорошо сохраняется при малых концентра-
циях буферных растворов При копнен грациях компонентов выше 0.1 моль/л необходимо
учитывать коэффициенты активности ионов системы.
• Значение рК _ любой кислоты и рКг любого основания можно вычислить по измеренному
pH раствора, если известны молярные концентрации компонентов.
Кроме тою. уравнение Геттлерсона—Гассе тьбаха позволяет рассчитать pH бустерного рас-
твора. если и зсстны значения pKt и молярные кониетпранни компонентов.
• Уравнение Гендерсона—Гассельбаха можно использовать и хзя того, чтобы узнать, в каком
соотношении нужно взять компоненты буферной смеси, чтобы нритотовить раствор с за-
данным значением pH
• Для кислот. 1g отношения концентраций (ионизированных/неиониз трованных форм) =
pH — рК
• Для оснований: 1g отношения концентраций (ионизнрованных/нсионизированных форм) =
рК — pH.
От степени ионизации молекулы зависит се лнпофил >носгь (lg Р). Некоторые вешества со-
держат несколько кислотных п/ндн основных центров, этим объясняется наличие двух и более
значений рК токсикангов. Липцдорпстнорнмые вещества лучше проникают в ткани, быстрее
бтт ^трансформируются и в менынем количестве выделяются в неизмененном состоянии с мо-
чой. Кр зависит от степени ионизации вешества. следовательно, и от значения pH водной фазы
экстрагента. В случае установленного токсиканта значение V как показателя распределения
токсиканта между тканями и другими средами (см. гл. 4) следует взять из справочной литера-
туры. Гели известны период полувывезения и почечный клиренс токсиканта или его клиренс
желчью, выдыхаемым воздухом (см. гл. 4). то эти характеристики также могут быть использо-
ваны при подборе оптимальных условий извлечения.
К внешним условиям. которые оказывают влияние на эффективность экстракции, отиосяг
изменение температуры, добавление каких-либо химических реагентов и влияние pH среды
Изменение температуры влияет на растворимость вещества в каждой фазе, взаимную рас-
творимость органической и водной (|ктз. а также способность вещества образовывать ассоциаты
димеры, тримеры и т.д.). Влияние изменения 1емперагуры на Кр незначительно, если раство-
рители плохо смешиваются друг с другом, и может быть как отрицательным, так и положи-
тельным.
Кр вешества часто выражают как oi ношение ею раствори мости в обеих фазах. Ряд соединений
может уменьшать тын увеличивать растворимость токсиканта как в волной, зак и в ормиичсской
фазах. Снижение раствори мости в водной с^кгзс называют высаживание. а увеличение — всажи-
вание. При экстракции с высаливанием Кр увеличивается, при всалнвашш — уменьшается. Это
связано с тем. что добавление солей изменяет диэлектрическую про тинасмостъ и ионную сиду
раствора.
Значение pH. выбранное для экстракции, коррелирует со значением рКя вещества в уравне-
нии Гендерсона-Гасселибаха
Выделение анашта проводят несмешнваюшимся с водой органическим рас ворнтс.тсм
Кр токсиканта показывает его способность распретеляться между липидной и водной фазой,
если вещество находится в иемонизированном состоянии. Это icopeiнческия величина, так
как большинство вешеств ионизируется (в той или иной мере) при любом значении pH. Кр
зависит от степени ионизации вещества, следовательно, и oi значения pH волной фазы экс-
трагента. При ЖЖЭ отношение концентраций анашта в двух несмешнвающихся фазах при
равновесии определяется Кр.
228 Глава 5
Итак, при проведении процедуры экстракции токсичных соединений из биоготического
материала необходимо разрушить комплекс вещество—протеин, удалить из экстракта низкомо-
лекулярные пентилы. разнообразные липиды и в конечном счете получить экстракт с наиболь-
шей концентрацией анализируемого соединения и наименьшим количеством соэкстрагснтов.
Оптимальный выход токсиканта и селективность выделения достигаются:
• подбором растворителей.
• контролем pH среды.
• соблюдением методики проведения операции.
Подбор растворителей. Полярность раствор! теля выбирают, исходя из конкретных задач
и общего правила: чем меньше полярность растворителя, тем лучше обеспечивается раство-
римость аналита в органической фазе. Неполярные растворители: гексан, гептан, лиэгиловыи
эфир, циклогексан, толуол, хлорофт рм. бутилаистат. хлористый метилен. Относительно по-
лярные растворители: спирты (амиловый, пропиловый, бутиловый), анегон, этилапетат. апе-
тонигрнл. Увеличение полярности растворителя достигается добавлением небольшого объема
относительно полярного растворителя (энтлаиетата. изонронайола) к низкополярной фазе
(гексану). Используют как одиночные растворители, так и многокомпонентные смеси.
Контроль pH среды. Оптимальное значение pH при проведении экстракции ян. яется функ-
цией рК, аналиш (2 единицы ниже рК для кислых bcuiccib, 2 елиинны выше рКв для основных
веществ). Для скрининга кислых и нейтральных веществ используют ацетатные и фосфатные бу-
феры. создающие pH для крови к кровьсодсржаших тканей 4.5—7.4. Более сильное подкисление
влияет на клетки крови и вызывает экстракцию из крови окрашенных экстрактивных bcuiccib.
Дтя скрининга основ! ых и нейтральных всшссгв создают pH 9.0—10,0 добавлением гидрокси-
ла аммония или буфера: карбонад кого, насыщенного боратною, трис-буфера (шдроксиметил)-
аминометана. При исследовании амфотерных bcuiccib (например, морфина) выбирают интервал
pH. предварительно проведя расчеты по уравнению Гендерсона—Гасссльбаха. Для ионизиро-
ванных веществ (четвертичные аммонийные соли) применяется нонно-парная экстракция. При
целенаправленном анализе величина pH рассчитывается с учетом рКл и строго выполняется.
Соблюдение методики проведения операции. Учитывая плотость растворителей, подбира-
ют их так. чтобы токсикант остался в нижнем слое. Легче удалить растворитель, находящийся
в верхнем слое, который затем отбрасывают Если аналит планируют опредс шть инструмен-
тальным?! методами, то экстракцию проволягбез иенотьзовапия делительных воронок Раство-
ритель удаляют пастеровской пипеткой с помошью водоструйного насоса
Добавление инертной нейтр- |ьной соли (высаливание) позволяет уменьшить растворимость
анализа в водной фазе (из-за увс тичения ионной силы), снижает смешиваемость возы с орга-
ническим растворителем (более резкая граница между двумя фазами), возможность образова-
ния эмульсий.
Рекомендуется использование различных буферных растворов при ЖЖЭ для дальнейшего
проведения скринннш веществ кислою, основного и neiiipaльного характера.
Пример. ЖЖЭ вешества основного характера (рК, 8,0) из плазмы крови. Довесит pH плаз-
мы до 10.0 (добавляют щелочь или основной буфер), встряхивают с выбранным органическим
растворителем. Токсикант будет переходигь из водной фазы в органическую, при этом боль-
ШИНС1ВО эндогенных оснований и соединений нейтрального характера также будет переходить
в органическую фазу, сели они обладают достаточной ра< воримоегыо в органическом раство-
рителе. Органическую фазу отделяют от волной специальными приемами: иногда для лучшего
разделения фаз используют центрифугирование.
Дзя веществ, являющихся очень сильными основаниями (или кисло гжми) проводя г допол-
ни тельную очистку — реэкстракцию. Встряхивают органическую фазу с разбавленной кислотой,
например 0.1 Н раствором H.SO4. Вещество основного характера переходит в ионизированную
форму и лучше растворяется в волной фазе и хуже — в фазе органического растворителя. Эндо-
генные основания могут также бы 1ь соэкстрагироваиы Подбор «мнветствуюшеи величины pH
срезы и полярности растворителя позволяет удалить булыную часть соэкстрактпвных аминов
из экстракта. Затем водную кислую фазу подщелачивают добавлением основания, например
2 Н. раствором ХаОН и встряхиваю! с новой порцией оркшического растворителя, чтобы
перевести анализируемое вещество в органическую фазу. Органическую фазу отделяют, упари-
ваю! и анализируют.
Методология химико токсикологического анализа 229
В большинстве случаев, органическую физу. содержащую токсикант, промывают водой. ко-
торую зятем отбрасывают. Этот этап должен быть тщательно проконтролирован. Например,
если анализируемое вешество является сильным основанием, а промывная вода имеет слабо-
кислую среду, то часть анализируемого вещества может перейти в водную фазу и будет наблю-
дат|>ся большой разброс аналитических данных.
Твердофазная экстракция. Концентрирование анализируемого соединения (или группы со-
единений) и удаление фоновых веществ способом ТФЭ обеспечивается использованием спе-
циальных сорбентов. Обычно (но не всегда) в качестве сорбента применяют модификации
силикагеля, содержащие амино-, ширильные. подпольные рунпы. углеводородные привитые
фазы и лр. Носте сорбции биомаюриала фоновые вещества с сорбента вымываются водой
или буферными смесями, а затем осушестатяется десорбция нужных соединений подходящим
орта н и чес ки м раствори гелем.
ТФЭ выполняют с помощью микроколонок, заполненных твердыми сорбентами. Пропус-
кание ашыитов через твердые сорбенты (картриджи или лиски), аналогичные используемым в
ВЭЖХ. основано на гидрофобных, водородных или ионных взаимодействиях. Система для ва-
куумирования позволяет одновременно анализировать серию (8—30) образцов и поддерживать
одинаковые условия изолирования. Очистку производите помощью смеси вода—буфер—орт а-
ничсский растворитель. Аналит элюируют органическими растворителями.
ТФЭ обычно характеризуется почти количественным выходом и хорошей воспроизводимос-
тью. Для выполнения ТФЭ необходимо:
• провести кондиционирование* сорбента:
• нанести пробу при pH 6.0—7.0 (фосфатный буфер)
• промыть воюй (удаление солей);
• подкислить фазу (I М уксусной кислотой):
• промыть 100% ортаничсскнм растворителем (метанол) для удаления кислых и/или ней-
тральных экстрактивных вешеств матрицы;
• элюировать системой .х. ороформ—ацетон (1:1 )-кнслые (нейтральные) веществ
• элюировать подшелочениыхт метанолом (I—29г Х’Н4ОН) для удаления основных (нейтраль-
ных) вешеств;
• собрать элюат со ск зростью 1—2 .мл/мин.
Рис. 5-1. Сущность кондиционирования сорбента.
Л — некошпптионированный; Б — кон.тнпиоиироваииын сорбент.
• Котиишюттироваиие — это потготопка картриджа хтя ТФЭ к взаимоденствию с пробой. те. очистка от загрязнении,
появившихся ио время транспортировки и хранения патронов (рис. 5-1).
230 Глава 5
Ооычно разделение компонентов может происходить тремя способами: примеси и все ме-
шающие комнонешы удерживаются на патроне а определяемые вынести. проходя! через него;
мешающие компоненты проходят через патрон. а определенный компонент сорбируется на
патроне и затем элюируется более полярным растворителем: и определяемые, и мешающие
компоненты сорбируются на патроне, а затем последовательно разделяются на фракции при
ступенчатом элюировании (см. электронное приложение)
Изменяя и подбирая условия лля 1ФЗ (тины сорбентов лля патронов, к iupo.ii> pH. поляр-
ность хпоентов). можно найти нанду» шее решение конкретной аналнти юскои задачи. полу-
чив максимально концентрированные и очищенные экстракты. ГФЭ совместима с любыми
методами, используемыми в ХТА. Каждый индивидуальный згяп ТФЭ записи г 01 вида ана-
лизируемого вещества, типа экстракционной колонки, метода определения и часто включает
контроль ланон i ошибок.
Впервые для очистки оиообразпа были нспольюваны активные угли Но вследствие плохой
десорбции с угля a iалитируемо!о еоедш еиия они не подушин пирокою piuipocrp.ii синя.
Интерес к использованию активных углей для обработки биообразцов постепенно возрождает-
ся. гак как отличная адсорбирующая способность углей делает их привлекательным, а иногда
и HcnpcBKH'Lie тым среди юм В настоящее время к качестве сорбент в патронах для ТФЭ
применяются силикагель и продукты его модификации Для модификации используются ве-
щества. содержащие радш шыс функциональные (нигрзг. иные, диодьпые. амино-, карбокеи-
н сульфоруппы). а также алифатические (Cl — CIS) и ароматические (фенильные) грхнпы.
Большой набор сорбетов — полярных, неполярных, ионообменных — позволяет сорбировать
на них практически все кислые, основные и нейтральные токсичные вещества. Главный кри-
терий правильного выбора твердой <|к1зы тя ТФЭ токсикантов — опенка прочности связей
удерживаюп нх шалит на поверхност сорбента. Как нзвостно. образование ковалентных свя-
зен между молекулами анализа и поверхностью твердой фазы более прочное по сравнению с
водородными связями, линоль-лннолызым н in дисперсионным взаимодсйснзисм (см гл. 2.2).
Для ТФ Э используют патроны (карцзцджи). которые представляют собой колонку размером
2—5 см 1 з различных \1атериалов (стекло, пластик), заноз ценную copOcirroM. или диски В за-
BHCHMociH от применяемых для модификации сорбе па вещей в. которые иеною очередь рас-
считаны на i излечение определенной группы токсикантов из биообъекта, разработаны типы
(виды) патронов для ТФЭ Сорбенты и патроны для 1ФЭ приведены в табл. 5-5.
В табл. 5-6 приведена сравнительная характеристика процедуры ЖЖЭ и ТФЭ.
В связи с ширт ким использованием инструментальных методов анализа технология ЖЖЭ
претерпела изменения: отняла необходимость во фракцией тых разделениях и больших обьсмах
дорогостоящих, опасных для здоровья растворителей, нояви таеь возможность использован
однократную экстр: книю. расходуя зн; чителыто меньшие объемы растворителей и меньн ие по
весу пробы, избегать применения высокотоксичны’ растворителей — бензола и хлороформа.
При этом однократ 11я экстракция позволяет получать воспроизводимые ре у штаты количест-
венного определи ня. Снизить во: можность образования нежелательных эмульсий (при высо-
ком содержании жира в матрице) помогают рациональный выбор растворителя, центрифуги-
рование, номешс! ие пробы в морозильник добавление изооктана.
Основная задача экстракции в ХТА состоит в том. чтобы сделать анализируемый збрйзен
совместимым с аналитическим прибором селективно 0601 атшь пробу интересующим соеди-
нением а также прелохраш гь anaai ги |сское оборудование от загрязнений
Очистка. Как следует из сравнительной характеристики процедуры ЖЖЭ и ТФЭ. очистка
требуется только нос ie проведения ЖЖЭ и юс и гасчся ион гзаниеЛ аналита. удалением ней-
цхьтьных кпрязняюшнх вы пест 11 реэкстракнней. Для этого обрабатывают ana 1 разбавлен-
ной кислотой, а после нолшелачив; ния реэкстрагнруют. В воде остаются белки, в оршни icc-
ком растворителе — липиды I с ш в дашнсишем планируют исследование анадига цетолом
ГЖХ с использованием пламенно-ионизацноиного или азотно-фосфор!юго детектора а также
проведение скрининга токсикантов, которые в кислой среде ра гагаю ся. то проводшь реэкст-
ракт шю не рекомендуется.
Вопрос дополнительной очистки грязных экстрактов решайся компромиссно: оценивает-
ся значимость чисины экстракта но отношению к ишерям трудно зкетрагируемыч веществ.
Обычно такие экстракты высушивают н подвергают очистке перераспределением в гексан или
Методология химико-токсикологического анализа 231
Таблица 5-5. Сорбеты и патроны для ТФЭ
Тип патрона / тип сорбента Токсиканты
Лиапдк С1/гидрофобный с прилитыми углеводо- родными группами Псс1нни.лы. производные бензодиазепина, пепти- ды
Днапак ннтрил/пшрофобныи сорбе it с прнвшы- .ми фенильными [руинами Фенолы. Неи пт иды витамины, производные бсизодиазс шна
Днапак дпол/пирофильиый нейтральный с нривн тымн |иол1»иыми фуппами Вшамипы. метаболиты, фенолы
Диалак ТА; сильпоосновныи анионообменный С привитыми четвертичными аммонийными i рупия- ми Витамины. различные органические (в юм числе высшие жирные) кислоты
Днапак карбоксн/слабокнс.тотный карбоксильный кагиошюбменный I ерСшшды. лекарственные препараты рахшчных групп
Absolut” Nexus/пол и мерный сферический с уни- кальной комбинацией ицрофильных и ги рофоб- ных активных цен трон (универсальный сорбет с жегракиией без кондиционирования) Лекарственные, марко тчсские вешества и их ме- таболиты из биозогичесю х жидкостей (более 20 препаратов или мстаботитоп ia 1 аналитичес- кую операцию)
1 оси&"7унифиинроианныг< полимерный с комби- нацией нырофильных и ншрофобных ак шпых цен 1 ров* Лекарственные. наркотические вешества и их ме- таболиты из плазмы крови и других биологичес- ких матриц для последующего анализа методами ВЭЖХ или ГХ-МС
Bond Hiii MSPD/сочетание сорбентов с разными механизмами удерживания анализов и примесей** Рахтичные группы токсикангов в разнообразных матрицах (в том числе полихлорированные дифе- нилы и диоксины из пищевых продуктов)
Bond Etui Cenify/сочстаиие сорбентов с разными механизмами удерживания аиалитов и примесей (расширенный объем резервуара) Наркотические веществ и их метаболиты из мочи для последующего анализа методами ВЭЖХ. 1X или ГХ-МС
Диски Emporcru/80<? неподвижной фазы С18. С8 и др. запрессовано в матрицу из структурированного тефлона*** Полихлорированные дифенилы. диоксины, хлор и фосфорорганические пестициды, полня терние ароматические соединения, фталаты, триазины
Диски Етроге™/более полярные диски с фазой стирол-лииинилбснзол Высокополярные анализы. следовые количества взрывчатых веществ и |сполов
Clean 5сггсп/сополпмерния фаза на час птах сили- кагеля неправильной формы Лекаре венные вещества: барбитураты, антидепрессанты. нейролептики, производные бензодиазепина, антиаритмнкп
* Извлечение полярных и неполярных аналнто» п одной упрошеннон процедуре Высокий уровень очистки пробы
обеспечивает эффективное определение методами ВЭЖХ-МС и ГХ-МС.
•* Применяется для обрабожн нсжщкнх проб (обрати волос. кремы и мази. ншнсныс продукты и лр.).
Расход pkici пори гелей снижен ил 9Х%. сокращено время пробоподготопки по сравнению с ТФЭ па патронах <ii
счет меньшею гидродинамического сопротивления)
232 Глава 5
Гябтнпя 5-6. Сравнительная характеристика процедуры ЖЖЭ и ТФ 3
Вит экстракции, эффек- тивность МЗВ.№ЧС1ШЯ Преимущества Недостатки
ЖЖЭ. эффективное! ь около 75%. определяется о (ношением раство- римости токсиканта в иесмешинаюшнхся фазах (коэффициент Нсрнсга) Рентабельность Простога извлечения максимального ко- личества токсикантов и их метаболитов в относительно чистом пиле Tpy.lOCMKOCIb Дли тельность Низкий выход очень велярных аттиков Дегрдтания лиалигз при кртк чес ком значении pl 1 Образование неже.м(елы1ых (мульеии Работа с токсичными раствори- телями Трудное!и аитоматизакин
ТФ •). ярфск нт висеть 71—99%, ганнеит о! типа (ШТрОПЛ Высокий выход аналита (п сом числе очень полярного) Получение чистых экстрактов* Хороший выход Меньше записи! от изменении pH Меньше расход растворителей Экологичность Процесс ашо.чагизировнн Неоднородноеть распределения чистин сорбентов ко размеру, что ведет к шачи тельной вариа- бельности скорости IIOIOK.-1 аил кости через сорбен! Более .lopoioii метод Возможна разница между пар- тиями млериала для ГФЭ. что влияет на выход аналита Ограниченная емкость загрузки пробы
* Влияния матричных лемснтв биожи ткостей практически не (тблюисгея. скпсчишми примесями, щюишмн пысо
коин1енс1Ш1ыс пики на хроматограммах (.ВЭЖХ и I Х-МС>. являются (гън;гификшоры (фталаты) и принятые (руины
сорбента.
гептан (наиболее гидрофобные растворители) и Х0% этанол (метанол) или используют гексан
и ацетон» I рил.
Дершшттация. Алгоритм действий при проведении ХТА должен быть разработан исследо-
вателем еше на сталии планирования экспертною исследования. Если в ходе анализа исследо-
ватель предполагает использовать газохромапмрафнчсский метол для определения полярных и
мадолетучих соединении, то необходимо предусмотреть этан их лериватизанни.
Дери вн гн и ни» — реакция получения производных искомою токсиката пу!см преобразо-
вания полярных групп в неполярные без изменения основной структуры молекулы. При этом
нс только исключаются потерн всшссгв из-за низкой летучести и сорбции, но и улучшают-
ся характеристики газохроматогрлфического анализа. При хромато1рафичсском исследовании
токсикологически и биологически важные вещества делят па 3 группы: 1-я — летучие вещества;
2-я — нелетучие или менее летучие вещества, которые после соответствующей дсриватизаиин
становятся достаточно летучими и термически стабильными; 3-я — вещества, которые из-за
высокой молекулярной массы не мот быть летучими даже после лериватизанни (например,
полимеры).
Для веществ, относящихся ко 2-й группе, необходима дериштизання с целью образова-
ния летучих производных. Ее проводят с помощью реакций ацилирования (уксусный ан-
гидрид. грифгоруксусный ангидрид, пентафторпропионовый ангидрид и др.), алкилиро-
вания (например, метилирование дназометаном и др.), силилнрования (ВСА — (N.O-бис
(тримети.теилил)аистамнл. BSTFA — 1% I MCS-6nc(гримепьтсн.'ниИрифторапегамнд + 1%
Методология химико токсикол гического анализа 233
триметилхлоросила. MSTFA — Ч-метил-.Ч-триметп.тсилилтрифторанетамид и др.). При выбо-
ре реагента для дериватизании учитывают устойчивость дериватов: образование для каждого
соединения деривата только одного вила: отсутствие побочных продуктов; эффективность раз-
деления анализируемых компонентов, наличие интенсивных пиков в масс-спектре, обеспечи-
вающих хорошую чувствительность; отсутствие расщепления пикон дериватов на хроматограм-
ме. качество масс-спектра (см. гл. 6.3.2 и 6.3.3). Для дериватизании одного соединения может
быть использовано несколько реактивов в зависимости от числа функциональных групп, не-
обходимых блокировать. Проведение дериватизаипи значительно улучшает определение низ-
ких концентраций анализируемых веществ (в нг/мл) в биологическом материале. Вследствие
пиролитической неустойчивости продуктов дернвагизации. приводящей к послсдовагетыюй
потере введенных групп вплоть до образования пехотных соединений, деривагизацию прово-
дят непосредственно перед газохроматографическим определением.
При сравнении способов дериватизании предпочтение (во многих случаях) отдастся сили-
лированию фторсолсржащими реагентами (например, BSTFA и MSTFA). что практически не
приводит к загрязнению детекторов (азотно-фосфорного. нламснно-ионизационного и масе-
епектрального) газового хроматографа (см. гл. 6.3.2 и 6.3.3).
Триметилсилилирование проводят в мятких условиях, оно универсально, увеличивает моле-
кулярную массу. Складирование функциональных групп токсикантов значительно повышает
надежность количественного определения таких веществ, как морфин (спиртовый и феноль-
ный гидроксилы), бе 13ОИ13К1ОНИН (карбоксильттая ।руина). мстилсндиокеимет-амфтетамии —
МДМА (аминотрушш). фенобарбитал (амидогруппа). Термин «енлилирование» означает заме-
щение подвижного водорода (RCOOH. ROH NH и. и SH) силильной группой для улучшения
хроматографических характеристик и увеличения летучести соединений. Процедура деривати-
зании: выпарить досуха экстракт, полученный после ЖЖЭ или ТФЭ. добавить дериватизирую-
шии реагент, нагреть при 70 С в течение 20 мин и 1—2 мкл ввести в инжектор хроматографа.
В России традиционно используют принятую в начале XX века классификацию объектов
ХТА, ио которой они разделены на 4 группы в зависимости от агрегатного состояния и/или
морфологических особенностей, что. в свою очередь, и определяет соответствующие схемы
(типы) изолирования.
I. Жидкости с небольшим содержанием биологическою хтатериала — моча, промывные
воды желудка и т.д.
2. Жидкости с заметным содержанием био огичсского материала — кровь, содержимое же-
лудка и г.л.
3. Твердые объекты, которые являются индивидуальными соединениями или их смесями. —
таблетки, капсулы, соли, остатки «неизвестного* порошка и гл.
4. Твердые объекты, которые являются сложными смесями, — все виды биологических и
растительных тканей.
Каждая из этих групп требует своей аналитической схемы, так как способы изолирования,
описанные для мочи, не всегда пригодны для крови и тканей. Эти схемы приведены в элект-
ронном учебнике по токсикологической химии (Калетитта И.И.. Симонов Е.А., 2005), а также
изданиях прошлых лет и могут быть доступны читателю (например. Швайкова М.Д.. 1975:
Еремин СК и др.. J993).
В практике судебно-химических лаборатории РФ нередко используют классические спосо-
бы изошрования Сгаса—Опо (настаивание с подкисленным спиртом). Шваиковой—Василье-
вен (настаивание с водой, подкисленной щавелевой кислотой). Валова (для выделения вешеств
кислого характера). Крамаренко (для выделения вешссгв основного характера). Их особеннос-
ти. преимущества и недостатки представлены в табл. 5-7.
Сотласно данным литературы, процесс пробоподтотовкн занимает от 58 до 61% суммарного
времени экспертизы и при этом является причиной более 45% ошибок при количественном
определении в ХТА.
Рекомендации экспертов
• Лля ЖЖЭ должны использоваться наименее полярные растворители, чтобы уменьши гь воз-
можность соэкстрагнрования эндогенных соединений.
• Многие токсиканты (лекарственные средства) настолько липофильны, что мотут экстраги-
роваться неполярными растворителями даже в ионизированной форме. Например, пропри-
234 Глава 5
Таблица 5-7. Особенное!», преимущества и недостатки способов iijo.ii рования токсикантов органичес-
кой природы, используемых в ХТА
Способ Пренмутмп а Недостатки
Экстракция подкисленным спир- том (метод С тиса—Отто) Применим для различных групп образцов Рекомендуется при исследовании дурнопахнущих (загнивших» об- разцов; при определении причин нишевых отравлений Требуется проведение многих стадий Экстракты получают загрязнен- ные в с низким выходом
! Осаждение белков вольфраматом (хетол Валова. хетол Швайко- вой—Васильевой ) (Эг носи тел ьно быстрый мето г экстракты обычно чистые Рекомендуете! для изолирования вешсств кислого и нейтрального харак гера Требуется большой объем орга- ническою растворит едя Экстракция вешеств основного характера менее эффективна, чем при других методах
(Каждение белков сульфатом ам- мония (метод Крамаренко) Умеренно быстрый, экстрак™ веществ основного характера обычно ЧНСГЫС Хорошо дкетрапгруются метабо- лн гы Рекомендуется для извлечения вешеств основного .характера; ис- следования содержимого желудка при пищевых отравлениях Экстракты вешест в кислого ха- рактера загрязненные Низкая открываемое™ веществ кислого харак гора
Прямая экстракция Быстрый метод изолирования Рекомендуется ня извлечения веществ кислого и нейтрального характера Трудно детектируются вещества основного характера, если они присутствуют в НИЗКИХ КОП11СН- граииях
Обработка концентрированными кислотами Более эффективны иля конъюги- рованных токсикантов и их ме- таболитов, а также для веществ, прочно связанных с белком Некоторые вешества раггапнотся при действии кислот и при на- тре вянии
полол — блокатор p-адреноренепторов (pKt 9.5) при использовании буфера pH 7.4. ионизи-
рован бо юс. чем на 99%. Коэффициент его распределения в системе н. октанол—вма (при
pH 7,4 и 37 'О равен 20.2. что говорит о высокой растворимости ионизированной формы в
н. октаноле (неполярном липофильном раствори геле).
• Мноше экстракционные приемы использ от отношение растворитель/волная фаза > I, что-
бы уменьшить образование э.мульенй. Идеальным является отношение растворитсль/образец
10:1 Тем не менее используются приемы, где отношение даже < 1. Образование эмульсин
в этом случае можно избежать или уменьшить насыщением водной фазы неорганическом
солью, например натрия хлоридом. перед экстракцией.
• Эффективность экстракции (фактор извлечения) может быть повышена использованием
смеси органических растворителей, например гсксан-буМнол (9:1) или гексан-изоамиловый
спирт (97:3). Такие растворители также эффективно экстрагируют полярные токсиканты и
их метаболиты.
• Условия экстракции должны быть оптимальными .тля конкретной биологической жидкости
(ткани). Экстра гпрусмость из волы ни кот да нс будет полностью соответствовать таковой из
крови или гомогенатов тканей
Методология химико-токсикологического анализа 235
• Копа условия экстракции оптимизированы, необходимо провести серию опытов в данных
условиях и полном объеме при том. что половина образцов должна быть разбавлена при-
близительно в 10 раз. Хо1я это не всегда приводит к успеху, но по крайней мере достиг ается
дополнительная очистка экстракта.
• Многоэ гпность процедуры ЖЖЭ эффективна при отделении анализируемого вещества от
биообразца. но длительна по времени. ТФЭ — высокоэффективный способ изолирования
(в Европе и США — самый раскроет раненный).
Способы экстракции — сверхкритическая флюидная экстракция, экстракция в микровол-
новом поле, твердофазная микроэкстракния и другие, в том числе экстракция с помощью
имму оаффинной хроматографии обсуждаются ниже и в главах 6.2.4; 7—11.
Сверхкритическая флюидная экстракция (СФЭ) предназначена для выделения и концен-
трирования органических веществ из твердых образцов без применения органических рас-
творителей Эффективность экстракции достигается использованием в качестве растворителя
диоксида углерода в сверхкритическом состоянии при температуре 32—100 *С и давлении 73—
400 ат.м. Метод позволяет в десятки р; з сократить время экстракции и полностью автоматизи-
ровать процесс экстракции. Тверлыт образец помешается в тсрмостатнруемую экстракционную
камеру. Жилкин СО, заполняет цилиндр итприиевого насоса и после переключения клапанов
поступает в экстракционную камеру. Изменением давления и температуры в экстракционной
колонке создаются необходимые (для каждого образца) условия для перехода СО, в сверхкрн-
тическос состояние, при котором начинает*#! процесс экстракции Микропроцессорная сис-
тема насоса позволяет поддерживать необходимый расход СО, через экстракционную ячейку
при заданном давлении и определять кодпчеензо СО,, прокачиваемое через ячейку. Основные
характеристики: скорость подачи насоса 0.005—10 мл/мнн; максимальное рабочее давление
40 МПа; объем шприцевого насоса 150 мл; контейнеры экстракционной камеры — 0.5/3.0
10.0 м;т Метод СФЭ успешно применяется для экстракции: следов тяжелых металлов, дибенз-
тиоксинов, полнароматических углеводородов, пестицидов, терпенов, альдегидов. стеро тдов.
жирорастворимых витаминов А. К К. лекарственных веществ в нативных образцах, остатков
углеводородного топлива из объектов окружающей среды, стабилизаторов и пластификаторов
из । cTxiacc. радиоактивных элементов с целью дезактивации.
Суперкритиче кая жидкостная экстракция < СЖЭ). При СЖЭ используется небольшое коли-
чество растворителей. В качестве сунеркритичсской жидкости — применяется СО. (критичес-
кая температура 31 С). Сунеркритичссме жидкости имеют плотность, близкую к плотности
обычных жидкостей. но меныпую вязкость и высокий коэффициент диффузии, за счет чего
экстрнкиия происходит быстрее, чем в обычных условиях. Это высокосстсктнвнын способ.
Хнтоматизация процесса позволяет проводить экстракцию и очистку быстро и за один прием.
Хорошие результаты получены для неполярных и малополярных пестицидов, ПХБ. диоксинов
тем. гл. 8.4 и 10).
Микроволновая экстракция основана на использовании энергии микроволнового излуче-ния
и позвозяет количественно извлекать органические соединения из матрицы за 10—15 мин с
исиотьзованпсм минимального количества органических растворителей (2—10 мл растворите-
ля на 1 г образца).
Твердофазная мнкроэкстракцин (ТФМЭ) — миниатюризация способа ТФЭ с применением
спени. тьных игл на основе карбовакса, дивиннлбензола. карбокссиа.
Экстракция на жидкостных мембранах Жидкостные мембраны — полупроницаемые жид-
кие фазы, разделяющие два других раствора (донорный и акцепторный). Удобно использовать
жидкостные мембраны из органического растворителя, помещенного в поры полимерной под-
ложки.
Корректные результаты анализа во многом зависят от прела нал итичес кои техники обработ-
ки образна. Для каждого биообъекта необходимо учитывать качественное и количественное
влияние эндогенных веществ в извлечении па результаты анализа. Параметры биологической
матрицы зависят от многих факторов, молекулярными основами которых являются постстрес-
сорные метатлолиган.тные нарушения, обусловленные генной экспрессией (см. гл. 3). Бел-
ки — это основная точка контакта с экзогенными химическими и физическими агентами.
Возникающие при этом модификации белков, изменения протеома и металло.ма влияют на
белковые сигнальные пени и факторы транскрипции, внося свой вклад в токснкокннстику и
236 Глава 5
биотра информацию ксенобиотиков (см. гл. 3.2 и 4) и во многом определяя содержание эндо-
генных вешсств в анализируемом извлечении. Технология мстабономики (см. гл. 3 4). успехи
токсикогенетики (см. гл. 3.3). новые аналитические приемы (см. гл. 6.4.3) в ближайшее время
обеспечат иной подход к исследованиям биологических объектов.
Частные случаи изолирования (изолирование леппчих ядов)
К лстушм ядам относят га ы (СО. H,S. SO, и др.), синильную кислоту и ее производные,
алифатические спирты (алканолы CI— 05). алкилгалогенилы (хзороформ. четырех*. юристы и
углерод. 1.2-дихлорэтан, хлоратьгидрат). альдегиды (формагьдегид), одноатомные фенолы,
крезолы, уксусную кислоту (см. гл. 8). Отнесение их к группе летучих ядов основано на низких
температурах кипения этих вешеств. что и предусматривает методы изолирования — простая
перегонка (дистилляция). перегонка с водяным паром, микрс шффугия. экстракция и сорбция.
Необходимо отметить два обстоятельства не может быть универсальной схемы изолирова-
ния летучих ялов вследствие разнохарактерности анализируемых соединений (см. выше); спо-
соб изолирования всегда выбирают в зависимое)и от последующего аналитического метола, с
помошью которого летучий яд будет исследоваться. Летучие яды. в основном, анализируются
методом 1ЖХ. Особенности подготовки пробы к определению методом Г ЖЖ описаны в главах
6.3.2. 6.3.3 и 8.1-8.3.
Перегонка с водяным паром. Перегонка с водяным паром является одним из классических
методов изолирования. Его применяют для разделения и очистки несмешиваюшихся между
собой компонентов (жидкость — жидкость или жидкость — твердое вешество) и основан на
принципе: давление пара смеси двух несмешиваюшихся компонентов равно сумме давлений
паров чистых вешеств. Температхра кипения смеси при этом ниже температуры кипения само-
го летучего компонента, что позволяет перегонять с паром соединения, которые разлагаются
при температуре кипения. Метол полезен при изолировании вешеств. улетучивающихся с па-
ром. от нелетучих вешсств (жиры, белки и гл.) матрицы. Отогнанные соединения извлекают
из довольно большого объема конденсата жидкостной экстракцией.
В некоторых случаях отгоняемые парообразные смеси представляют собой азеотропы (состав
смеси пара соответствует составу перегоняемой смеси). Этим обстоятельством ноль уются для
селективного изолирования некоторых компонентов при пониженном давлении. Т мггература
перегонки снижается, содержание одного из компонентов азеотропной смеси увеличивается.
Использование метода ограничено из-за оттгоегггелыю небольшого числа вешеств, способных
перегоняться с паром, потерь вещества во время перегонки, большого объема конденсата, что тре-
бует значительного расхода экстра ентов. Перегонка с паром может быть использована для изоли-
рования хлорированных углеводородов, альдегидов. высших спиртов и лр. (см. гл. 8.1 и 8.2).
Метод микродиффузии. Для изолирования летучих вешеств в биообъектах (например, содер-
жимом желудка) или в пищевых продуктах. анализируемых в качестве вещественных дока г-
тельств. используют метод микродиффузии, основанный па законе Рауля. В закрытой системе,
состоящей из двух камер, происходит микродиффузия летучею токсиканта (например, ацетона,
низших спиртов, толуола и лр.) из вытесняющей жидкости одной из камер в абсорбирующую
жидкость другой камеры до выравнивания давления в системе. При этом во второй камере (с
абсорбирующей жидкостью) будет накапливаться извлекаемое всшесгво
Возгонка. Возгонка — процесс перевода твердого вешества в парообразное состояние, минуя
жидкую фазу При охлаждении паров образуются кристаллы чистою вешества. Использование
метода ограничено кругом веществ, способных к сублимации и твердым агрегатным состояни-
ем. Как правило, с помошью возгонки хорошо изолируются производные хинонов, нафталина,
ан грачинона.
Простая перегонка (дистилляция). Метод используется для изолирования жидких токсичных
веществ из биологических жидкостей иди водг ых растворов. Основанная на различии в темпе-
ратуре кипения вешеств. простая перегонка позволяет выделить индивидуальные компоненты,
которые раъгичаюгся но температуре кипения не менее чем на 20 С. В случае смеси веществ
с близкой температурой кипения используют фракционную перегонку.
Частные случаи изолирования (изолирование металлических ялов
Оценка элементного статуса человека важгга для определения влияния на здоровье человека
дефицита, избытка или нарушения тканевого перераспределения макро- и микроэлементов.
Методология химико-токсикологического анализа 237
Чтобы получить адекватные результаты анализа и избежать артефактов. необходимо выбрать
наиболее подходящие для пели исследования биообъекты. Часто для определения элементов
используют кровь, мочу, волосы, ткани органов. например костную. Концентрации элементов
в моче и крови указывают на недавнее прямое или косвенное воздействие токсиканта, либо
нарушение мсталолигапдного гомеостаза вследствие других причин (см гл. 8.5). Для выявле-
ния состояния обмена элементов в организме и/или хронического токсичного воздействия
отдельных металлов широко применяют исследование волос, содержание мокро- и микро
элементов в которых отражается элементный статус организма в целом. Пробы волос явля-
ются нс только интегральным показателем минерального обмена, но и надежным архивным
материалом, что при постоянном совершенствовании аналитической базы открывает > овые
возможности при проведении судебно-медицинской экспертизы во прошествии длительного
времени после отравления (воздействия), а также для сравнительной оценки влияния других
факторов. Однако в ряде случаев большое содержание соединений металла в моче, например
кадмия, является следствием его накопления в почечной ткани при хронической интоксика-
ции Диагностическим тестом может служить содержание металла в конкретной форме. Так.
уровень металлотионеин-кадмия в плазме или моче имеет гораздо большее токсикологическое
значение, чем обшее содержание кадмия (см гл. 8.5). Поэтому цель исследования будет опре-
делять и выбор биообъекта. Изменение содержания элементов. кратковременное по экспози-
ции и значительное по степени отклонения элементного статуса, отражается на концентрации
хлементов в жидких средах организма, которые являются информативными биосредами для
целей как клинико-токсикологического, так и судебно-химического анализа.
Сложность определения микроэлементов в биосистемах связана с чрезвычайно низкими
концентрациями тементов в тканях и биожидкостях при условии их постоянного присутствия
в ортанизме. необх! димою для обеспечения жизнедеятельности. Определение собственно хи-
мических элементов брутто проводят после полной деструкции органической матрицы.
Пробопод готовка к определению элементов в биообъекте состоит из 2 этапов: извлечения
хземенгов из биологических проб путем деструкции биомолекул и перевода их в форму, удоб-
ную для выполнения определения, обычно в раствор. Для того чтобы правильно иптерпретт
ровать содержание .макро- и микроэлементов в биообъект и быть уверенным в корректности и
правильности полученных результатов, необходимо строго выполнять определенные требова-
ния. Правильный отбор проб и строгое следование аналитическим методикам являются реша-
ющими факторами. предотвращающими загрязнение (контаминацию) образцов при анализе.
Биосубстраты человека, используемые для элементного анализа, и способы пробоподготовки
образцов приведены в табл. 5-8.
Таблица 5-8. Биосубстразы человека, используемые дтя элементного анализа, и способы пробе подготов-
ки ойращов
Матрица Типичная пробопогитовка
Сыворотка крови и моча Растворение в деионизированной воде
кровь Растворение в деионизированной воле и осаждение белков
Мышечная ткань Мннерялнэшшя атотной кислотой Сухое озоление
Жировая ткань Растворение в азотной кислоте с последующим добавлением пероксида водорода Сухое озоление
Костная ткань Растворение в азотной кислоте
Волосы Растворение в азогной кислоте Сухое озоление
238 Глава 5
Сталия пробоподготовки. которая называемся минерализацией, одна из самых ответствен-
ных. Цель минерализации — ликвидировать органическую матрицу, не потеряв при лом опре-
деляемые элемен ы. Традиционный (сухой) способ минерализации — прокаливание в муфель-
ных печах (нагревание возможно до температуры 1150 ’С). Образец помешают в платиновый
или керамический тигель и после озоления растворяют в кислоте (HCI). Высокая вероятность
контаминации стенок тигля и муфельной печи не гарантирует получение надежных результа-
тов для элементов, нормальное сотержание которых составляет. например. 10"'%. При сухом
озолении происходит потеря некоторых летучих элементов: Hg. As. (иногда Мп и Ст. РЬ в
присутствии С1). Озоление на воздухе или в атмосфере кислоро л имеет те же недостатки и
всегда приводит к неизбежной потере летучих элементов. Воздействие высокой температуры,
вызывающее деструкцию матрицы, происходит при окислительном сплавлении. например со
щелочами. При этом способе проба сильно загрязнена из-за большого количества шеточи.
потому что все примеси, неизбежно содержащиеся в ней. накапливаются и в пробе. Мокрое
озоление. наиболее распространенный способ минерализации. это обработка образца концен-
трированными кислотами-окислителями. например азотной, серной, иногда хлорной. Окис-
ление азотной кислотой предпочтительнее, поскольку сс можно эффективно очистить. При
проведении мокрой минерал) занип потери микроэлементов снижаются Кислоту (HXIO,) до-
бавляют непосредственно к свежему или высушенному образцу ткани, который затем шнрева-
юг конвекционно при помощи термоблока либо микроволнового поля Для уменьшения риска
коптам ниацин можно использовать фторо! (ластовые реакционные сосуды. Часто мокрую ми-
нерализацию осуществляют в автоклаве. Многие неорганические материалы легко растворя-
ются в кислотах. не производя при этом большого количества реакционных газов. Однако
ооразны, содержащие большое количес во ор)анического вещества, образую) при разложении
значительные объемы побочных газообразных продуктов реакции. При микроволновом на-
греве с.мессй ор|аническо1о материала с азотной кислоюй до температуры выше 140—160 ‘С
реакции разложения становятся экзотермическими, чго приводит к у сличению давления в ав-
токлавах и грсбуег падежного и чувствительного контроля параметров в процессе разложения.
Разложение проб в автоклаве в микроволновой печи имеет много преимуществ:
• количественное переведение в раствор летучих элементов:
• наименьший уровень контаминации:
• высокая скорость разложения (5—15 мин без учета времени остывания);
• гомогенизация смеси (увеличивает скорость рад ожения).
• высокое давление ускоряет процесс разложения
Однако такой способ имеет недостатки. При слишком высоком температуре (выше 250 С),
неудачном выборе параметров процесса может начаться плавление фторопластовых полимеров,
что приведет к потере автоклавами жесткости и их разрушению. Как правило, при разложении
органических матриц 1 ем перату ра не должна превышать 250 'С. дтя бет ковы х и углеводных
матриц достаточно температуры 160 °C, для жиров — 180—200 °C. Способ пробоподготовки об-
разца в автоклаве, размешенном в микроволновой печи, является официально признанным в
рекомендован в аттестовании х методиках. нормативных документах и методических указаниях
(см. этектронное приложение).
При определении макроэ юмептов используют классические методы в современном автома-
тизированном варианте с помощью устройств, оснашенных микропроцессорами. В биомеди-
цинских исследованиях, как правило, определяют общее количество элемента (эссенциального,
условно эссенциального или токсичною), содержащееся в различных биолот нческих обьекта.х.
В зависимости от выбора метода измерения ан; этнического сигнала эффективной может быть
иробонодготовка нс только с полной, но и с частичной деструкцией матрицы (см. гл. 6.4.2).
Вид пробоподготовки определяется тем аналитическим методом, с помощью которого будет
титалнтироваться данный биообъект. Так. при фотоколориметричсском исследовании, осно-
ванном на цветных рс. книях. преимущественно используют минерализацию, при ГЖХ. ТСХ.
ВЭЖХ — миперализаии о с последующим переводом в хелаты, при атомной абсорбции —
минерализацию, при вольтамперометрии и полярографии — минерализацию со специальной
подготовкой пробы, при ИХМ нс используют пробоподготовку (см. гл. 6.2). Из биологических
жидкостей ионы мнотих металлов могут быть экстра)ировдны в виде хелатных комплексов
ЭДТА. алкилтнокарбомагов и других хелатирующих агентов.
Методология химико-токсикологического анализа 239
С позиции ХТА общие подходы к прсданалитичсской пробоподготовкс определяются:
• типом анализа (направленный или ненаправленный. КТА или допинг-контроль и т.д.):
• типом биологической матрицы образна (биолотчсские жидкости, ткани органов и др.);
• физико-химическими свойствами анализируемых вешеств для выбора способа их изолиро-
вания (экстракция, сорбция, перегонка с водяным паром, дистилляция, возгонка и др.);
• частыми задачами ХТА (изолирование летучих и металлических ядов, пестицидов и др.);
• техникой проведения процедуры (лиофилизация, диализ и др.).
В практической деятельности химик-токсиколог при выборе наиболее рациональной техни-
ки изолирования (схемы изолирования), как правило, должен учитывать все 5 позиций.
5.5. ОСОБЕННОСТИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОСТРЫХ ОТРАВЛЕНИЙ
Острые отравления развиваются в резулытне однократного. реже повторного воздействия
токсичною всшсста и характеризуются быстрым проявлением клинической картны. Сим-
птомы отравления и тяжесть течения заболевания зависят от вида, дозы токсиканта и других
причин (см. гл. 2—4). При острых отравлениях необходимо немедленно оказать медицинскую
помошь пострадавшему, начиная с догоспитального этапа и продолжая в стационаре токсико-
логического или реанимационного профиля (см. 1л. 2.5). Хронические отравления развиваются
после многократного воздействия токсичного вещества в малой дозе, недостаточной для раз-
вития острого процесса, но приводящей к формированию стойких патологических изменений
в органах и системах.
При острых отравлениях чаше всего проводят ХТА на стедучошнс группы токсикантов иди
жк отдельные представители.
• Лекарственные препараты психотропного действия: барбитураты, бензодиазепины, феноти-
азины. лепонекс. противосудорожные и другие трициклические антидепрессанты, наркоти-
ческие ana. пеги ки (опиаты и опиоиэы).
• Лекарственные препараты и другие вещества кардиогоксичпого действия: «тдрспоб юкаго-
ры. антагонисты кальциевых каналов, сердечные гликозиды. антиаритмические препараты,
клофетин.
• Лек рственные препараты и другие вещее >ва судорожного действия: тубазид. трицикличес-
кие антидепрессанты.
• Лекарственные препараты и другие вещества аитихолинсргичсского (холиполитичсского)
действия: антигистаминные, ирогивонаркинсоннчсские, алкалоиды белладонны.
• Алкоголь и суррогаты алкоголя, другие спирты: метиловый, этиленгликоль, изопропило-
вый.
• Органические растворители: дихлорэтан. четыреххлористып утлсрот, трихлорэтилен, бензол.
• Прижигающие жидкости: кислоты, щелочи, окислители.
Яды метгемоглобипобразующего дс (сгния: анилин, жираты. нитриты.
Соединения металлов (меди, ртути, железа. свинца и др.), мышьяка и селена.
• Ядовитые грибы.
• Оксид углерода (II), другие газы, включая токсичные дымы.
Газы раздражающего, прижигающего, удушающего действия: хлор. аммиак, оксиды азота и
серы, сероводород.
• Антихотинестеразные яды: фосфорорганические инсектициды, карбама ы. пиретроиды,
физостигмин
• Токсины (яды животного и растительного происхождения).
• Наркотики.
В тех случаях, когда клинические проявления на ранних стадиях развития интоксикации не
зезволяюг установит причину отравления, проводят качественные и количественные исслс-
- лания в возможно короткие сроки (максимум в течение 1—2 ч после поступления больного
240 Глава 5
в стационар). Успех проведения ХТА при диагностике острых отравлении и в конечном счете
успех лечения в значительной степени зависят от качества и скорости обмена информацией
между клиницистом и химиком. Объем и глубина проведения ХТА в большинстве случаев
определяется потребностями клиницистов. Подробное изучение клинической картины отрав-
ления. хартктерттых симптомов отравления отдельными ялами является одним ш основных
условий адекватного выбора методов ХТА. Поэтому химик-токсиколог должен знать главные
симптомы острых отравлений различными токсикантами (табл 5-9-5-11).
Таблица 5-9 Симптомы острых отравлении (примеры)
Клинические прояв_<чшя Симптомы 1 жеикаиты
Нарушения обшею состояния Беспокойся во возбуждение Кокаин, ЛСД. стимуляторы центральной нервной системы
Неподвижность. кома Снотворные средства, органические растворители, соли ЛИЗ ИЯ
Некрологические расстроиствл Нарушения, зафиксированные на хтсктрозицефалотрамме Центральные нейролептики
Нарушения моторных функции Бензодиазепины, алкоголь
Нарушения речи Алкоголь, наркотики
Нарушения двигательных* функции Наркотики, бутирофсноны, карбамазепин, соли лития, этиленгликоль
Нсихзтазрическис расстройезтм Психозы. дезориентация, ступор Нары» ИКП. СИМИЗТОМИМСГИкИ. алкоголь
Измепоззие кровя того Гшюзоння Трициклические антидепрессанты
дпиленис Гипертония Кортикостероиды. стимуляторы центральной нервной снсгсмы
Изменение температуры Г иисртермня ЛСД. ам<|>стами11ы. .шшпрокрезал
зела Гипотермия Алкоголь, бензодиазепины
Нарушение частоты дыхания Депрессия Опиаты, барбитураты, бензодиазепины
Гиновен зндятзия Салицилаты
Расстройства мышечною гонуса Спазм, тетанус Стрихнин, ботулиническим гименн
Офти.чьма1оп(чсскмс нарушения Суженный тричок Окипты. ингибиторы холмил, кризы
Методология химико-токсикологического анализа 241
Таблица 5-10. Изменения цвета кожи при острой интоксикации (примеры)
Цвет кожи 1оксикант или токсический процесс
Синюшный (нианоз) Гипоксия. метгемоглобинемия
Синий Амитриптилин или таблетки хлоралгидрата
Желтуха Нарушения функции печени, алкоголь, бораты, ннгршы, озршыения рыбой или грибами металлы. растворители
Покраснение Оксид углерода (II)
Потемнение (в дальнейшем некроз) Кнслогы. щелочи, внутриартериальное введение веществ
Таблица 5-11. Unci мочи при ос гром инюксикации (примеры)
Цвет мочи Токсикант
К асныи/розоаый Амнишиин, анилин, некоторые ягоды. ибупрофен, свинец. piyn>. фс> итонн. хинин, рифампицин
Оранжевый Варфарин. рифампицин. перец
Ржаво-коричневый Хишамин. нигрофураитоин
КТА проводят в следующих случаях.
• Для у тановлення различия между опьянением и отравлением.
• Для установления информации о пациенте при отсутствии таковой (например, частота и ин-
тенсивность потребления наркотиков, алкоголя. случаи интоксикации в прошлом и т.д.).
• При комплексных отравлениях, например наркотиком и алкоголем или метанолом и этано-
лом и др.
При отравлении без выраженной клинической картины, например при огращ ении параце-
тамолом.
• При судебных разбирательствах.
• По специальному запросу.
• В научно-исследовательских и учебных целях, при сборе статистических данных и т.п.
Когда метод и интенсивность лечения зависят от копне irpamni токсиканта в организме.
• Когда прогноз лечения зависит от концентрации токсикан та в плазме крови, например при
отравлении пестицидами (паракватом).
• При необходимости отличить терапевтические и токсичные концентрации вещества в орга-
низме.
• При комплексных интоксикациях, например инюксикациях наркотиками и этанолом.
• При токсикологическом мониторинге.
• При отсутствии утвержденного метода количественного определения, например при иссле-
довании отравлений растительными сборами.
Объектами КТА при острых отравлениях обычно являются кровь, сыворотка или плазма,
моча, содержимое желудка, слюна. Кровь, сыворотку или плазму в количестве до 10 мл обычно
отбирают при поступлении больного. В большинстве случаев обычный отбор мочи затруднен,
поэтому проводяг катетеризацию и обирают мочу в количестве до 50 мл. В содержимом же-
242 Глава 5
луяка обычно находится действующее вещество в высокой концентрации. поэтому собирают
промывные воды. Слюну отбирают в пробирки.
При экспресс-диагностике острых отравлений применяют различные методы.
• Иммунохроматографичсскне и иммупофсрменгпые (см. гл. 6.2).
• Ферментативные
— определение активности ал коюльде гидро еназы по скорости окисления этанола до ацет-
альдегида (см. гл. 8.1);
— определение активности ацетилхолинэстеразы (см. гл. 8.4) и др.
• Спсктофогомегричсскос определение обшей концентрации пептонов, низкомолекулярных
белков.
• Цветные реакции непосредственно с биообъектами:
— определение фенотиазинов в моче по реакции с FPN-реактивом [хлорид железа (111) в
смеси перхлорной и азотистой кпслотпми|:
— определение салипилагов, параквата, цианидов и других токсикантов в моче:
— определение оксида углерода (11) в цельной крови.
• Биохимические:
— определение глюкозы в плазме крови;
— определение кетонов в моче.
Особенности КТА. При проведении КТА используют (см гл 6) хроматографические (ТСХ,
ГХ. ВЭЖХ). спектральные (УФ спектрометрия, флюоресценция), комбинированные (ГХ-МС.
ВЭЖХ МС) методы исследования. Анализ элементного статуса при подозрении на отравление
металлами проводят в зависимости от показаний методами ат мно-абсорбционной спектро-
мстрии (АЛС). АЭС-МСП млн методом индуктивно-связанной плазмы с масс-спектральным
детектированием — ИСП-МС (см. 1л. 6 и 8.5). ТСХ используют главным образом при исследо-
вании мочи и содержимого желудка (см. гл. 6). Из-за недостатка времени обычно применяют
ограниченное количество хроматографических систем и способ последовательной обработки
пластин различными проявляющими реактивами, используя экспертные системы для ТСХ —
ТОКСИЛАБ или па основе оборудования фирмы CAMAG (Нидерланды).
Анализ спиртов и суррогатов, летучих ялов и газов проводят методом ГЖХ на капиллярных
колонках е пламенно-ионизационным детектором или катарометром.
Анализ лекарственных препаратов и наркотиков проводят методом ГЖХ на капиллярных
колонках с пламенно-ионизационным или азогно-с|юсфорным детектором.
Анализ пестицидов проводят методом ГЖХ на капиллярных колонках с э.тектроно-захват-
ным и/или азотно-фосфорпый детектором.
В клинических лабораториях широко используют метод ВЭЖХ и экспертные системы, обес-
печивающие проведение исследований биообразпов на нескольких колонках с последующим
детектированием в УФ- и видимой части спектра и позволяющие на основе сопоставления
времени удерживания и характеристик помещения света с банком данных по токсикологи-
чески значимых! веществам в автоматческом режиме |ще1ттифицировать и количественно оп-
ределять яо нескольких сотен вешеств н их метаболитов. Примером такой системы является
комплекс RFMFDI (BIO-RAD. Munich. Германия), см. электронное приложение.
5.6. ОСОБЕННОСТИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ НАРКОТИКОВ
Особенности анализа биообъектов на наличие наркотиков у живых лиц
Определение наркотических, психотропных и сильнодействующих веществ в биологических
пробах проводят с целью установления факта их употребления (см. электронное приложение).
Быстро меняющаяся ситуация в области нелегального оборота наркотиков привета к резкому
увеличению числа исследований наркотических и одурманивающих веществ, выполняемых в
последние годы химико-токенкоюгичсски.ми лабораториями (см. гл. 7).
Для определения наркотических и психотропных веществ чаше всего используется мода,
как наиба ее информативный бшхбьект исследования. Образец мочи обычно может быть по-
лучен в достаточном количестве, а концентрация психоактивных веществ или их метаболитов
Методология химико-токсикологического анализа 243
в нем, как правило, относительно высокая. К недостаткам этого биообъекта следует отнести
возможность фальсификации образна. Наиболее типичные способы фальсификации перечис-
лены выше (см. гл. 5.2). Для установления факта употребления наркотика, спустя недели или
месяцы, следует провести исследование колос и hoitch (см ниже) В табл 5- 12 приведены
данные литературы о времени возможного выявления часто используемых наркотических и
психотропных веществ и некоторых их метаболитов в моче.
Таблица 5-12. Время возможного выявления часто используемых наркотических и психотропных вешеств
и некоторых их метаболитов в моче
Вешества Время пошожиого выявления
11снхостнмуляторы: 1
амфетамин 2—3 сут
МДМА (эксташ) 30—48 Ч
метамфетамин (первитин) 48 ч
КОКЛИН 6-8 ч
метаболит кокаина бензоилэкгоннн 2—3 сут
барбитураты* кратковременного действия (ппклобарбитал) 24 ч
среднего действия (пентобарбитал) 48-72ч
длительного действия (фенобарбитал) 7 сут
Производные бензоди зепина: кратковременного дейстдия (триазолам) 24 ч
среднего действия (темазепам. хлордиазсиоксид) 4П-80ч
длительного действия (диазепам, нитразепам) 7 сут
Опиаты: метадон (дозы для поддерживающего лечения) 7—9 сут
кодеин/морфин 24 ч
морфина глюкуронид 48 ч
кодеина глюкуронид 3 сут
пропою нфен норпропоксифсн 6-48 ч
дигидрокодеин 24 4
бупренорфин 48-56ч
соединения бупренорфина 7 сут
Каннабиноиды (марихуана. гашиш): однократное употребление 3 сут
употребление со средней частотой 4 сут
частое употребление (ежедневное) 10 сут
длительное частое употребление 36 сут
Другие: метаквалон 7 сут
фенциклидин (РСР) 8 сут
диэтиламил лизергиновой кис. юты (ЛСД) 24 ч
клофелин (однократное терапевтическое употребление) 48-60ч
244 Глава 5
Подавляющее большинство химико-токсикологических исследовании на наличие наркоти-
ков у живых лип носит ненаправленный характер (см.гл.5.1). Из поступающей сопровошнель-
ной информации известны, как прилило. две позиции: выявлены (не выявлены) наркологом
клинические признаки наркотического опьянения; какое средство (или описание его внешнего
вида) было изъято, если этот факт имел место. Направленность исследования имеет крайне
важное значение, так как определение некоторых веществ нс укладывается в общепринятые
схемы ХТЛ. и следует применить частные методики обнаружения отдельных веществ с исполь-
зованием специального оборудования (см. гл. 7). В соответствии с требованиями надежности,
достоверности и доказательности результатов анализов. а также рекомендациями ВОЗ и об-
щепринятыми мировыми стандартами, лабораторное исследование на наличие наркотических
вешесгн должно состоять из двух этапов: предварительного (скринингового) и подтверждаю-
щего.
( огдасно международным правилам. которые приняты в РФ в мае 2006 тола, методы опре-
деления наркотиков разделяют на 3 категории (табл. 5-13)
Таблица 5-13. Международная классификация методов определения наркотиков
Категория А
VI все -спектрометр ття
И К спектрометрия
Спектрометрия ялерного
магнитного резонанса
Категория Б
Тоикослойная хроматография
М икрокрнстиллоскопическне тесты
Гззоная хроматогр.фия
Жидкостная .хроматография
Спектрометрия ионной
подвижности
Капиллярный хтектрофорез
Только для конопли:
ф-армлкогностнческое макро- и
микроисслсдование
Категория В
Цветные тесты
Имчунохимические методы
Определение точки пляштеиия
УФ-спектроскопия
Измерение флюоресценции
Прслтагаются следующие варианты их использования:
• А + (Л или В, или С);
• В + В+(ВилиС).
Комбинированные методы (ГХ-МС) рассматриваются как два раздельных метода.
В настоящее время наибольшее распространение в ХТА наркотических и психотропных ве-
ществ при скрининювых исследованиях получили иммунохроматографический анализ (ИХА)
на тсст-полосках, ПФИА и ИФА. Современные ИХМ отличаются высокой чувствительностью,
простотой и экспрссеносгью исполнения, одновременно позволяют знали шропать большое
число проб, не требуя дополнительной или специальной их очистки или концентрирования
и поэтому удобны для скрининг-диагностики (см. гл 6.2). При получении положительно-
го результата, т.е. когда концентрация вещества превышает пороговую, необходимо провес)и
дальнейшее исследование образца мочи подтверждающими альтернативными методами. При
отрицательном результате проведения дальнейшего исследования не требуется.
В лабораториях применяют различные комбинации методов категории А. В. С. Вее пробы,
поступающие в лабораторию, подвергаются обязательному предварительному иммунохимнчсс-
кому исследованию на наличие грех основных ipynn наркотических веществ: опиатов и ам-
фетаминов с использованием соответствующих наборов реагентов для ПФИА. каннабиноидов
метолом ИХА на тест-полосках и ПФИА. В случае, когда наркологом выявлена клиническая
каршна наркотического опьянения, но по результатам предварительных исследований опиатов,
амфетаминов и каннабиноидов в образце мочи не обнаружено, данный образец направляется
на дополнительное расширенное иммунохимичсскос исследование на наличие бензодиазепи-
нов, барбитуратов, метадона, кокаина (по бензоилэкгоннну). фенциклидина с дальнейшим
подтверждающим анализом методом ГХ-МС. При направленном исследовании образцов мочи
иа наличие трнметилфептанилд и клофелина в лаборатории используется ИФА с соотвстству-
Методология химико-токсикологического анализа 245
ющими наборами реагентов. Данные вешсстна применяются и крайне малых дозах, поэтому их
определение возможно лишь при использовании высокочувствительного гетерогенного метода
ИФА(см гл. 6.2). Так. при приеме обычной разовой терапевтической дозы клофелина (60—120
мкг) он обнаружг вается с помошью ИФА даже спустя 48—60 ч.
Метол ТСХ является условно подтверждающим только при совпадении с результатами им-
мунохимических исследований. Иногда для получения достоверного результат используется
три метода исследования (до 5% всех проб), что приводит к увеличению срока выдачи ре-
зультатов на 1—2 дня. Например, если при ТСХ не удалось надежно идентифицировать, то
или иное вещество (в большинстве случаев это относи гея к следовым количествам вешсств),
го проба направляется дополнительно на анализ методом ГХ-МС. ГХ-МС является основ-
ным подтверждающим методом химико-токсикологического исследования. Он незаменим при
идентификации следовых количеств наркотиков, а также для веществ, анализ которых други-
ми подтверждающими методами невозможен или крайне затруднителен. Это особенно важно
при обнаружении каннабиноидов, бензоил- и мстилэкгонина (метаболитов кокаина). 6-МАМ
(метаболита героина), фенциклидина, гриметилфешанила, буторфанола (стадола). лекстроме-
торфана, локсиламина (донормила), кетамина, фармакологически активных пищевых добавок
и др. (см гл. 7).
Метод ГХ является подтверждающим для ограниченного числа наркотических и психотроп-
ных веществ. В частности, при серийных анализах он используется для подтверждения основ-
ного метаболита марихуаны в моче — Д’-тетрапшрокапнабиноловой кислоты. Парофазный
метод ГХ применяется при обнаружении и количественном определении летучих токсичных
вешеств в моче и крови токсикоманов после одурманивания органическими растворителями,
клеем «Момент» и др. При этом наиболее часто обнаруживаются толуол, анетон. этилацетат.
Большой трудностью при выполнении химико-токсикологических исследований является
отсутствие необходимых стандартов наркотических веществ. Отечественная промышленность
такой вид продукции не выпускает, заказ по зарубежным химическим каталогам невозможен в
нашей стране из-за запретов П ККН. На сегодняшний день в качестве стандартов наркотических
вешеств официально можно использовать: наборы калибраторов и «коптролей» наркотических
вешсств с низкими концентрациями в моче фирмы «Abbott» и «Varian»; микродиски для ТСХ
с нанесенными веществами в микротраммовых количествах фирмы «\arian»; экшракты мочи
наркоманов, охарактеризованные методом ГХ-МС. При анализе методом ГХ-МС используют-
ся также библиотечные данные характерных масс-спектров наркотических веществ. Сложность
интерпретации полученных результатов исследований связана со следующими моментами:
• об употреблении того или иною вешества свидетельствует присутствие его метаболитов.
однако они могут быть одинаковыми у разных веществ:
• отрицательный результат может быть следствием позднего срока взятия пробы тюле приема
наркотика,
• пороговая чувствительность метода исследования может превышать порот возможного вы-
явления (cut-off) вещества (табл. 5-14);
• состав пробы может быть изменен, фальсифицирован при заборе;
• иногда трудно (требуются дополнительные исследования) отличить запрещенные соедине-
ния и разрешенные лекарственные средства из-за схожести их структуры.
Ввиду высокой чувствительности ИХМ следует осторожно подходи>ь к оценке и интерпре-
тации полученных результатов при анализе образцов с крайне малым содержанием наркоти-
ческих вешсств и возможным влиянием пищевых добавок и общедоступных распространенных
«безобидных» лекарств. Наиболее проблематичная группа веществ в отношении корректной
трактовки результатов — опиаты. Так, например, при умеренном (обычном) употреблении
кондитерских и хлебобулочных изделий с маком ИХМ (особенно ИХА и ИФА) дают положи-
тельный результат на опиаты в образце мочи, собранной спустя 1—8 ч посте употребления.
При анализе метолом ГХ-МС при лом обнаруживается морфин в следовых количествах.
При оценке результатов анализа опиатов необходимо дифференцировать лекарственное
потребление кодеина и нелегальный прием оппатных наркотиков. Очень важно, 1гто после
употребления кодеина, который входит в состав многочисленных противокашлевых лекарс-
твенных препаратов, одним из его метаболитов является морфин (морфин свободный — 1%,
морфина 3-глюкуронид — 5—13%). Несмотря на то что однозначные критерии дифференци-
246 Глава 5
Таблица 5-14. Пороги обнаружения (cui-oiT) (в m/мл) наркотических и психотропных веществ в моче,
рекомендованные ла рубежом
Вещество иди группа вешеств США ЕС Великобритания
ИХ ГХ-МС ИХ ГХ-МС ИХ ГХ-МС
Ам Ьсгимины юоо 300 300
амфетамин 1000 200 юоо 200 юоо 200
метамфетамин 500 500 500 200 500 200
МДМА (зкепгзю 500 ЯХ) 200 500 200
i Опиаты 2000 300 300
морфин 2000 2000 300 200 300 300
кодеин 2000 2000 300 200 300 300
6-МЛМ 10 10 10
Каннабиноиды 50 15 50 15 50 15
(ТГК-СООН)
Кокаин 300 150 300 150 300 150
(бензонлэкгоннн)
Метадон 300 300 300 300 300 300
ФсНЦИКЛИДИН 25 25 25 25
Барбитураты 300 200 300 200 300 200
фснобарои ал 200я
амобарбитал 200я ।
секобарбитал 200я
Бензодиазепины 300 200 300 200 300 200
нордиазепзм 100 1
оксазепам 200*
темазепам 21Х)Я
Г идроксиал ьпро залам 100
• Пеппльгусгся также порог 00 и 300 нг/мл.
рования отсутствуют, наиболее вероятна следующая оценка результатов: при обнаружении ме-
тодом ГХ-МС незначительного количества морфина (менее 30 нг/мл) на фоне срсднетерапсв-
гичсских концентраций кодеина результаты анализа свидетельствуют об обнаружении только
кодеина(см. гл. 7 и электронное приложение).
Еще один важный пример при однократном приеме 1 мл валокордина (содержащего 20 мг
фенобарбитала) возможен полож «тельный результат определения барбитуратов ИХМ даже че-
рез 4—7 дней после уг отреблеиия лекарства.
О|раничсния па применение мочи и крови в качестве объектов исследования на присутс-
твие физиологически активных веществ в организме человека:
• быстрое разложение, как самих образцов, так и исследуемых веществ. что обусловливает
необходимость проведения исследований в возможно короткие сроки после их отбора
• сложности в интерпретации результатов прн обнаружении вешесгв в количествах, близких
к пределу их обнаружения:
• узкий временной интервал, в течение которого возможно обнаружение вещества;
Методология химико-токсикологического анализа 247
• высокая вероятность ложноположительного результата в случае случа» пого или предумыш-
ленного загрязнения образна.
Альтернативными объектами для определения наркотиков являются волосы, hoith и пото-
жировые выделения кожи (см. электронное приложение).
Необходимо проводить раздельное определение веществ, адсорбированных поверхностью этих
объектов, и всшссгв. находящихся in vivo. В случае обнаружения наркотиков на поверхности ис-
следуемых объектов следует провести процедуру отмывки с обязательным контролем чистоты.
Например, после хпотребления наркотиков их концентрация на поверхности кожи, волос и ногтей
обычно составляет !()* — 10’ г, а после отмывки поверхностных загрязнений — 10 s — 10 " г.
Предложены (Симонов Е.А. и др.. 2000) следующая схема пробоподготовки образцов кожи,
волос и ногтей и методы определения в них наркотиков (рис. 5-2).
Поверхность
кожи, ногтей, волос
Очистка поверхности
волос и ногтей от
внешних загрязнений
и компонентов,
способных мешать
дальнейшему анализу
Проверка волос
на во можную
химическую обработку
Внутренние области
ногтей и волос
Газовая
хроматография,
масс-спектрометрия
Отбор потожировых
выделений
Газовая
хроматография
масс-спектрометрия
Рис. 5-2. Схема определения наркотиков в образцах кожи, волос и ногтей.
Особенности анализа объектов небиологического происхождения на наличие наркотиков
Разнообразие видов и форм контролируемых веществ (ем. Перечень 11ККН, гл. 1.5). а также
действия их производителей (противозаконного рода леятелыгость), направленные на маски-
ровку и сокрытие своей родуки ги. обусловливают специфические аспекты криминалистичес-
кого анализа
Для отнесения того или иного объекта к какому-либо виду наркотиков с целью установле-
ния мер контроля нал его оборотом требуется проведение исследований этого объекта несколь-
кими независимыми методами. По сложившейся международной и отечественной практике во
многих случаях достаточно 2—3 методов. Иногда при анализе сложных смесей число методов
значительно увеличивается.
В соответствии с Постановлением Верховного суда Российской Федерации № 9 от 27.05.98
для определения вида средств и всшссгв (наркотическое. психотропное. сильнодействующее
или ядовитое), их названий и свойств, происхождения, способа изготовления или переработки,
а также для установления принадлежности растений к культурам, содержащим наркотические
вещества, требуются спегшальныс познания; суды при рассмотрен!!и дел данной категории
должны располагать соответствующими экспертными заключениями, полученными в соот-
ветствии с методиками, утвержденными ПККН (см. электронное приложение).
Применяемые экспертами методы исследования делятся на предварительные и подтвержда-
ющие (см. табл. 5-13).
К предварительным методам исследования наркотиков относятся капельный химический
анализ, различные виды нммунохимических методов, измерение точки плавления или кипе-
ния, УФ-спектромстрия и различные методы измерения флюоресценции.
248 Глава 5
Значительно бо се информативными считаются ТСХ, ГХ или ВЭЖХ. спектрометрия ион-
ной мобильности, микрокрисншдосконические тесты, а для растительных наркотиков, напри-
мер конопли, макро- и микроскопия.
Методы масс-спектрометрии. ИК-спектромегрии и спектрометрии ядсрного магнитного
резонанса лают информацию о структуре исследуемого вешества и являются арбитражными
для перечисленных выше. В случае недоступности методов структурного анализа использую!
комбинацию как минимум грех методов. Например, для отнесения порошка неизвестного про-
исхождения к наркотическому средству героину достаточно подвергнуть порошок капельному
химическому анализу с помошью селективных реактивов, используемых по соогвегшвукнней
схеме, и метолом хрома io-масс-спсктромслрии. В тоже время для отнесения растительного ма-
териала к наркотическим средствам, подучаемым из конопли, достаточно (но нс всегда), ири-
мснизь капельные химические тесты на эти наркотики. ТХС и пронести фармякогностическое
микро- и макроскопическое определение. При этом эксперт всегда должен помнить о том. что
коноплю наркоманы часто используют в качестве носителя для более тяжелых наркотиков:
многочисленных производных фенилалкиляминов. ЛСД. фенциклидина (см. гл. 7.1).
Перед экспертом после отнесения им того или иного образна вещества. изъятого из неза-
конного оборота, к наркотическим ср< ствам или психотропным веществам, обычно встают
следующие вопросы: составлял ли ранее этот образен единую массу с другими образцами,
изъятыми у данного субъекта? существует ли связь между этими образцами и каким-либо ус-
тановленным дилером? сели такая связь существует, то какую полезную информацию можно
получить о пени распространения наркотика на местном. региональном или международном
уровне? кустарного пли заводского производства данные образцы? во<можпо ли установить
источник, в том числе регион, производства наркотика? какие методы применялись для его
производства? какие реактивы и прекурсоры при этом использовались?
Для решения этих вопросов эксперт на основе исследования предоставленных образцов
наркотика должен:
• уегдновизъ специфические связи между образцами наркотика и сравни!ь их с резулыззами
исследований носiy павших ранее образцов;
• классифицировать результаты на связанные между собой группы, принимая во внимание
всю совокупность обра цов. имеющихся в его распоряжении.
Основной обьеы незаконного оборота наркотиков составляют наркотики растительного
происхождения, получаемые из мака снотворного, конопли, эфедры и кокаинового куста На-
ряду с характерными особенностями, присущими рас тигельному сырью, наркотические средс-
тва. произведенные в географической близости друг от друга, будут иметь близкий состав.
Любой наркотик растительного происхождения, изымаемый из незаконного оборота, яв-
ляется смесью вешеств. и крайне редко встречаются образны высокоочищенных наркотиков.
При этом качественный и количественный состав получаемых продуктов непостоянен и. более
того, изменяется ио мере продвижения его от производителя к потребителю. Все вещества,
входящие в состав наркотика, делятся на четыре основные группы:
• природные компоненты, присутствующие в растительном сырье, например в опии или лис-
тьях коки, используемом для получения героина или кокаина и перешедшие из него в ко-
нечный продукт:
• полупродукты, образующиеся на различных этапах производства и характеризующие это
производство:
• компоненты, добавленные с различными целями в наркотик на пути от производителя к
потребителю;
• компоненты, попавшие в наркотак случайно или образовавшиеся в нем при транспоргпров-
ке. хранении и друз их операциях.
Образны одного и того же наркотика, полученного по одной if той же технологии, имеют
один и тот же качественный химический состав, за исключением веществ, добавляемых на раз-
личных этапах цепи распространения. Их количественный состав (соотношения компонентов)
часто различается, что обусловлено специфическими особенностями исходного сырья, мето-
дами получения или производства, условиями распространения и хранения. Схожие проблемы
появляются при исследовании еинлслических наркотиков.
Методология химико-токсикологического анализа 249
Эксперт должен решать многие задачи, от установления связей между наркоторговцем и
конкретным потребителем наркотика до выявления цепи распространи гелей и определения
географического региона, в кагором наркотик был произведен.
Состав наркотиков в значительной степени зависит от метода производства и способа даль-
нейшей их транспортировки к месту продажи. На каждом из этапов наркотрафика в наркшик
добавляются различные компоненты. Это создает ситуацию, когда партия, полученная в одной
подпольной лаборатории, может распрос раниться через разные сети и, следовательно, может
иметь различный химический состав. С другой стороны, конкретный распространитель (как
правило) добавляет в наркотики, полученные от разных производителей, одни и те же компо-
ненты (см. электронное приложение).
При хранении наркотиков растительного происхождения изменяется их качественный и
количественный состав, что необходимо учитывать при проведении сравнительных исследо-
ваний. Например, при хранении марихуаны и гашиша происходит взаимопревращение канна-
биноидов. в обрицах героина — окисление аскорбиновой кислоты, которой его часто разбав-
ляют. при повышенной влажности и температуре частично разлагаются наркотики, имеющие
сложноэфирныс группировки, например героин и кокаин.
Таким образом, цель углубленного и расширенного исследования наркотиков — выявить
криминалистически значимые признаки в конкретных образцах наркотика, исходя из всей
совокупности возможного изменения их ка»ественного и количественного состава. Много-
образие таких признаков требует проведения значительно большего объема исследований по
сравнению с другими криминалистическими экспертизами.
Отличительной особенностью методов, применяемых при углубленных исследованиях нар-
котиков. является необходимость выявления и идентификации близких по своим химическим
свойствам компонентов, содержащихся в исследуемом продукте, на уровне ниже 0.1—0,001%.
но сравнению с действующим началом. Например, в опии на указанном уровне концентраций
содержится несколько десятков алкалоидов, которые MOiyr в зависимости от условий выделе-
ния частично или полноомо и неизменном ниле или частично измененными переходить в ге-
роин Аналогичная сипания характерна для других наркотиков растительного происхождения.
Для определения подобных природных компонентов, переходящих в конечный продукт (нар-
котик), требуется использование комплекса физических, физико-химических и биологических
методов (см. табл. 5-13). Следует установить:
• внешний вид наркотика: цвет, запах, консистенция, способ сто упаковки;
• химический состав основных действующих компонентов наркотического средства, а также
промежуточных и побочных компонентов их биосинтез;!, зависящий от климатических ус-
ловий созревания растите ibnoto сырья: влажности, температуры, продолжительности сол-
нечного дня. характера почвы, высоты нал поверхностью моря, фазы вегетации в период
сбора сырья и других факторов:
• химический состав специфических компонентов наркотического средства, образующихся в
процессе характерного для каждого региона способа производства обусловленного услови-
ями экстракции, интенсивностью обработки кислотами и щелочами, воздействием темпе-
ратуры, степенью и способом очистки конечного продукта и прочими факторами
• состав компонентов, обавленных к наркотику или привнесенных в него извне перед прода-
жей или употреблением: различные сахара, лекарственные вещества, другие наркотики или
пестициды;
• наличие в конечном продукте специфической микрофлоры, насекомых, пыльцы растений
или посторонних, нс свойственных данному наркотику примесей.
Классификация дна. игичсских методов базируется на принципах обязательного получения
полной информации о структуре анализируемого вещества с помощью комплекса методов и
рекомендована ведущими экспертными подразделения США. Великобритании, Японии, Гер-
мании и ряда других стран, а также группой экспертов ООН.
250 Глава 5
5.7. ОСОБЕННОСТИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Достоверное количественное определение токсикантов в крови, печени, содержимом же-
лудка или других биообъектах является надежной основой для интерпретации полученных
результатов. Токсичные и летальные дозы известны для многих соединений и отражены в раз-
личных справочных материалах (см. электронное приложение).
По объективным причинам в каждом конкретном случае невозможно и нет необходимости
определять (reelкровать) все токсичные вещества. Существует много факторов, которые необ-
ходимо принять во внимание, прежде чем определить вид ХТА (СХА, КТА напраатенный или
ненаправленный и т.л.), способы пробоподготовки или методы количественного определения.
При этом значимость медико-правовой классификации смерти (ущерба здоровью) и правильно-
го отбора образцов всегда остается приоритетной. В отношении других факторов — наркографи-
ка употребленных наркотических средств. результатов лабораторного исследования образцов
небиологического происхождения и т.п. —должно быть установлено их влияние на факт смер-
ти (ущерба .здоровью). Следует иметь в виду, что определение па соответствие употребления
терапевтических доз лекарственных препаратов, предписанных врачом и обнаруженных при
исследовании биологических образцов, должно быть проведено обязательно, лаже если вскры-
ше установило совсем другую причину смерти Так. в случае апоплексического улара патоло-
гоанатом (танатолог) может потребовать провести скринищ на присутствие прогнвоэпнлепти-
ческнх средств, чтобы определить, было ли использовано такое медикаментозное лечение. То
же самое справедливо в отношении теофиллина при смерз и бального бронхиальной астмой.
Некоторым липам, пытавшимся покончить жизнь самоубийством, могли быть прописаны для
снятия депрессии или лечения других заболеваний терапевтические дозы соответствующих
лекарств. Количественное определение этих препаратов в биообъектах будет показывать связь
«состояние пациента — использованная доза вещества». В судебной токсикологии отрицатель-
ный лабораторный результат имеет нс меньшую значимость, чем положительный.
Часто природа подозреваемых токсикантов неизвестна («общее неизвестное»). В этом слу-
чае для правильного заключения требуется анализ наибольшего количества биообъектов всеми
доступными физико-химическими методами. Первым шагом является анализ на летучие ток-
сиканты. а затем лекарственный скрининг, который позволит отсеять многие лекарственные
средства в качестве подозреваемых. Когда большинство потенциальных подозреваемых средств
удалены из сферы интересов аналитика, проводится лабораторное тестирование на другие (эк-
зотические) лекарственные средства и яды. При интерпретации данных ХТА необходимо учи-
тывать многие факторы, имеющие значение для корректной оценки результатов. 'Тто касается
прежде всего судебно-химического (особенно при работе с трудным материалом) и клиннко-
гоксикологического анализа. козла необходимо учитывать принятую дозу, способ и частоту
введения, толерантность к действию токсичных веществ, время, прошедшее с момента отрав-
ления. особенности тканевого распределения токсичных веществ, что важно для правильного
определения места отбора пробы.
Аналитик-токсиколог должен различить случаи хронического использования высоких доз
токсичного вещества (лекарственного средства) и острое отравление при передозировке. Ре-
шение о причине смерти не может быть сделано только на основании данных о концентрации
токсичного вещества в крови. Равные конисгпраини токсичных веществ в печени и крови
(при анализе образна печени) будут свилетс 1ьствовлть о хроническом использовании высоких
доз. В случае острого отравления концентрация яла в печени будет значительно превышать
концентрацию в крови. Случаи хронического и острого отравления можно различить, если
сопоставить концентрации токсичного соединения и его метаболитов в крови. Как правило,
более высокая концентрация метаболита в крови свидетельствует о хроническом применении,
а значительное превышение концентрации токсиканта нал концентрацией метаболита — об
остром отравлении.
Знание формы токсичного соединения и способа его введения в организм также имеет зна-
чение, во-первых, для определения максимальной концентрации токсиканта и времени, за ко-
торое ла концентрация достишута. а во-вторых, для правильной интерпретации результатов,
полученных при анализе образцов различных органов.
Методология химико-токсикологического анализа 251
Внутривенное введение и ингаляция первоначально дают более высокую концентрацию ток-
сичного соединения в крови, в го время как оральное, внутримышечное и подкожное введение
вследствие медленного всасывания — более низкую концентрацию. Встречаются случаи, когда
способ введения нс объясняет зависимость концентрации от способа поступления токсиканта
в организм. Так. при внутривенном введении или ингаляции (что приводит к более высокой
концентрации токсикант в крови, легких, мозге и лаже ночках) в печени обнаруживается бо-
лее низкая концентрация токсичного соединения, чем при op н.ном введении.
Высокая копией грация токсичных соединений в желудке будет указывать на ора. ьный
путь введения, хотя необходимо предусматривать н другие пути попадания его в желудок. Для
оценки быстровсасываюшихся токсичных соединений необходимо знать их концентра 1ин в
крови и печени. Следует учитывать что кровь продолжает циркулировать обычно в течение
нескольких минут после остановки дыхания, поэтому концентрация токсичных веществ при
внутривенном ввспснии будет меньше, чем при оральном введении такой же дозы. При ораль-
ном приеме большой лозы почти всегда концентрация токсиканта в печени более чем в 3 раза
превышает таковую в крови, в то время как концентрации его после внутривенного введения
почти равны. При ингаляции концентрация токсичного вещества в тканях такая же. как после
внутривенного введения, возможно, более высокая она в легких. Другие типы введения изуче-
ны недостаточно, чтобы их сравнивать.
Высокая концентрация токсичных вешеств в крови на раннем этапе после внутривенного и
орального введения будет соответствовать более высокой кон центра ин и в легких и печени, в го
время как в период выведения концентрации в желчи и моче будут более высокими по срав-
нению с концентрацией в крови. В то же время концентрация метаболитов может быть выше
концентрации исходного соединения почти во всех тканях, что особенно важно в отношении
метаболитов, обладающих фармакологическом активностью.
Если известно или предполагается. что смерть наступила в результате отравления лекарс-
твенным веществом после одноразового приема, то можно оценить интервал между введе-
нием и смертью на основе определения концентрации токсиканта в тканях. Например, в 245
исследованных случаях смерти, вызванной барбитурат, мп. концентрация в печени обычно в
4 раза превышала таковую в крови, если время между приемом и смертью составляло более
5 ч. Определено, что концентрация морфина в кропи в случае введения смертельной дозы ге-
роина обратно пропорциональна времени в случаях, если жертва отравления живет более 24 ч.
Токсичные вещества основного характера дают относительно низкие концентрации в крови и
соотношение концентрации в печени и крови часто превышает 10. Соединения кислотного ха-
рактера дают умеренно высокие концентрации в крови, и отношение коннентра ши токсикан-
та в печени к концентрации в крови составляет 2—5. Для нейтральных соединений характерны
очень высокая концентрация в крови и почти одинаковое распределение в других тканях.
Если моча недоступна для тестирования, го она может быть заменена экстрактом или филь-
тратом содержимого желудка. Лекарственный скрининг со ержимого желудка недостаточен,
чтобы определить все потенциальные токсиканты. Например, лекарственные (наркотические)
средства, обычно применяемые внутривенно. при курении или ншаляиионно. нс могут про-
никнуть в желудок в детектируемых количествах, поэтому их обнаружение проводят ИХМ в
крови или плазме.
Токсичные вещества, принятые за несколько часов до смерти, нс всегда сохраняются в
желудке. Некоторые вещества основного характера после всасывания в кровь будут диффунди-
ровать обратно в желудок и находится там в ионизированном состоянии из-за кислой реак-
ции среды. Результирующая концентрация токсиканта в содержимом желудка будет частично
определяться значением рКа и конценграцией этого вещества в крови. Результаты скрининга
содержимого желудка должны быть сопоставлены с данными ИХМ, полученными при иссле-
довании плазмы крови и стекловидного тела, или скрининга веществ основного характера в
крови методом ГЖХ с азотио-фосфорным детектором.
Вместо скрининга мочи проводят но определенной схеме исследование содержимого желуд-
ка, крови иди гомот енотов тканей в тех случаях, когда кровь недоступна для анализа.
ИХМ можно применять для анализа негемолизированной и гемолизированной плазмы, по-
смертной цельной крови или стекловидного тела. Если результат ИХМ неудовлетворительный,
то образен разбавляют равным объемом необходимого бхфера. что бывает достаточно. чтобы
252 Глава 5
сделать образен аналитически доступным. При необходимости скрипит крови может быть
осуществлен с помощью спектрофотометрии. причем гемоглобин и другие белки необходимо
сначала осалить ацетоном, .метанолом или ацетонитрилом. После такой обработки палосадоч-
ная жидкость может быть исследована с помоигыо соответствующих калибраторов.
Применительно к образцам крови, плазмы. стекловидною тела ИХМ должны быть калиб-
рованы но низкой пороговой чувствительности, которые используются хзя скрининг» мочи
Cut-olT порядка 50 нт/мл (500 tn/мл для барбитуратов) дает некоторое количество ложнополо-
ж ггельных результатов, которые вследствие перекрестного реагирования интересующих ана-
лизируемых веществ минимизируют получение ложноотрицагельпых результатов (см. начало
главы). Все положительные результаты, полученные с помощью ИХМ. должны бьть подтверж-
дены и О1тажсны в конечном отчете. Если обстоятельства дета включают детальный исход,
необходимо провести иммунохимические исследования на присутствие фенацетина и салици-
латов.
ГЖХ-скринт1г вешеез в основною характера крови более чувствителен. чем таковой содер-
жимого желудка, ио также и более трудоемок. ГЖХ-скрпнинг может быть включен в общий
скрининг, особенно когда моча недоступна как объект или когда известно. что имела место
интоксикация, но скрининг содержимого желудка дает отрицательный результат
В тех случаях, ко та первоначальный хромато! рафическин скрининг дает неидентнфнциро-
вапные пятна при ТСХ или нендентнфинированные пики на хроматограмме (ГЖХ) в oicyic-
гиие нужных стандартных веществ сравнения, образец в дальнейшем может быть подвергнут
скринингу методом ГХ-МС
.11 я интерпретации результатов X ГЛ обязательно сонос являются обстоятльет ва дела, ре-
зультаты вскрытия, медицинские показатели и результаты исследования (если возможно), а
также информация о специфических физиологических реакциях, обусловленных действием
тою или иного токсиканта. Нарушение сердечного ритма, частота дыхания, ра мер <ра 1ка и
отсутствие узнавания, несохраненные рефлексы, конвульсии и некоторые другие предсмерт-
ные симптомы Moiyr свидетельствовать о механизме токсичности подозреваемого агента и
м згь на некоторые токсиканты среди большого числа возможных (см. гл. 7-11).
Результаты вскрытия помогают химико-токсикологическому исследованию. Состояние сли-
зистой оболочки желудка пли пншевода может подпзер нгп> или исключить действие едких
обжигающих ядов. Отек легких может указать на предсмертное угнетение дыхания, некроз
печени — в первую очередь на отравление фенацетином или бледной шпанкой средн лрхгих
токсичных агентов, обладающих гепатотоксичностью. Следы инъекций позволяют предполо-
жить передозировку при внутривенном введении.
Следующие правила должны соблюдаться при анализе на «общее неизвестное».
• Если отбор образца невозможен или количество подозреваемого агента опре слить не у за-
стоя. необходимо использовать самый обширный скрининг всеми доступными мстоллми.
• Анализ содержания алкоголя в крови и глазной жидкости должен бьнъ сделан раньше (или
олповрех(епно) анализа на другие соединения (см гл. 8.1).
• Анализ алкоголя в крови предпочтительнее провести с помощью ГЖХ с использованием
внутреннего стандарт; зго не исключает возможное подтверждения другими методами (см.
гл. 8.1).
• Если есть подозрение па отравление оксидом умсрода (II). то исследование на этот токси-
кзт необходимо провеет перед общим скринингом (см. гл. 8.3).
• В тех случаях, когда отбор образца и его количество лимитированы, необходимо особенно
тщательно составить схему исследования и на ранней стадии анализа использовать ИХМ.
если доступно достаточное количество образна.
• Найденные положительные результаты додж 1ы быть в большинстве случаев подтверждены
другими независимыми методами. Когда ра мер образца лимитирован, дальнейшие этапы
общего скрининга могут быть объединены в один этап, а нс проводиться параллельно.
Специалист в области ХТА должен проанализирован. результаты фармакологических и ток-
сикологических исследовании, возможность лекарственного отравления при передозировке,
установить посмертные изменения токсичных агентов и анализируемых биообъектов. В итоге
своей работы эксперт надеется получи гь огне гы на следующие вопросы.
• Какой химический аюнт был использован, когда и как?
Методология химико-токсикологического анализа 253
• Была ли доза использованного химического агента или комбинации агентов достаточной,
чтобы вызвать летальный исход или повреждение здоровья?
• Какие системы, органы или ткани являются поврежденными?
• Существуют ли факты, сиилетсльсзвуюшис о том. что доза вещества была употреблена в
терапевтических целях, с целью суицида или убийства?
• Бы । ли умсрший(ая) иптокси11ирован(а) во время инцидента, приведшего к легальному ис-
ходу?
• Как интоксикация может быть объяснена присутствием конкретного токсичного агента?
• Существует ли альтернативное объяснение полученных результатов?
• Какие другие дополнительные исследования могли бы уточнить обстоятельства гибели или
нанесения ущерба здоровью9
Когда химико-токсикологическое исследование завершено, полученные результаты сумми-
руются в виде отчета — акта судебно-химической экспертизы, который представляется пато-
логоанатому (танатотогу. судебно-медицинскому эксперту). В акте указывают имя умершего,
если известно, или номер, ему присвоенный: анализируемые биообъекты и химические аген-
ты. обнаруженные в каждом образце: найденные концентрации этих веществ, занесенные в
таблицы утвержденной формы. В акте также указывают вешества. в отношении которых были
сделаны попытки их обнаружения, но которые обнаружены не были (особенно если в направ-
лении содержалась просьба их обнаружить). Если были обнаружены какие-либо токсиканты,
но их наличие не было подтверждено другими методами, то этот факт обязательно отражается
в отчете (акте). Кроме тою. сообщается любая информация о биообъекте, например дата и
время отбора предсмертной крови (известны сложности при интерпретации результатов, свя-
занные с посмертным перераспределением многих токсикантов), или какие-либо необычные
факты, характеризующие биообъект. В отчете должно быть указано, по чьей инициативе (су-
дебного химика или патологоанатома) был проведен отбор проб.
5.8. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА И НАДЛЕЖАЩАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ПРАКТИКА
(ПРИНЦИПЫ GLP В СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРИИ).
ВНЕДРЕНИЕ СИСТЕМЫ ВАЛИДАЦИИ И КВАЛИФИКАЦИИ
В ЛАБОРАТОРИИ
То. что не документировано — не выполнялось!
US PDA. General Principles of Validation
Значение многих работ в области ХТА снижается из-за отсутствия согласовать И системы
представления полученных результатов. Как правило, эксперт довольно редко имеет возмож-
ность осуществить детальное межлабораторное статистическое исследование, ограничиваясь
лишь рядом повторных определений в своей лаборатории. Выполняя количественное опреде-
ление, аналитик должен ответить на вопрос: когда и в какой части процесса обеспечивается
самая высокая точность? Любой результат содержит систематические ошибки измерения, слу-
чайные ошибки и отличается or истинного содержания искомого вещества. Поэтому важно
определить порядок возможной ошибки на каждой стадии аналитического процесса.
Одно из основных требований систематического ХТА состоит в правильной стратегии его
выполнения. Анализ начинается с изучения поставленной задачи, при этом выясняются и
уточняются обстоятельства, приведшие к необходимости выполнения конкретного исследова-
ния, и прежде всего правовой аспект Гак определяют вид и характер анализа. На этом этапе
выбирают методы проведения экспертизы, обеспечивающие надежность полученных резуль-
татов. и разрабатывают конкретный план анализа. Следую ций этап представляет собой отбор
аналитических методик и определение систематической ошибки измерений с использованием
эталонных растворов веществ сравнения и/или другими независимыми методами, т.е. прове-
ряют правильность избранного метола. Определение случайной ошибки является дальнейшим
254 Глава 5
этапом исследования, на котором оценивается воспроизводимость результатов аналитического
исследования (см. гл. 6-1).
Для получения надежных* результатов анализа необходимо иметь стандартные вещества
сравнения и его эталонные растворы.
• Стандартное вещество сравнения (первичный стандарт) — паспортизованный образен он
рсделяемого вещества высокой чистоты служит для приготовления эталонных растворов ве-
щества сравнения. Чистота вещества должна был» доказана одним нз арбитражных методов
(например, ГХ-МС). Хранят в таких условиях, которые обеспечивают ею стабильность и
сохранность (обычно в плотно закрытой емкости в холодильнике).
• Эталонный раствор вещества сравнения (вторичный стандарт) — раствор определенной кон-
центрации стандартного вещества сравнения в дистиллированной (деионизированной) воде
или органическом растворителе. Используют для аналитического контроля и/или калиб-
ровки аналитических приборов. Концен трацию (застворов периодически проверяют. Хранят
в таких условиях, которые обеспечивают их стабильность и сохранность (обычно хранят в
плотно закрытой емкости в холодильнике).
• Рабочий раствор вещества сравнения — раствор, приготовленный разбавлением растворов
эталонных веществ сравнения водой или органическим растворителем. Используют для
проведения контрольного опыта. Проводят анализ контрольною и холостого образцов.
• Контрольный образец — биологический образец, содержащий анализируемое соединение в
известной концентрации, гак называемая модельная смесь.
• Холостой образен — биологический образец. идентичный по составу контрольному по типу
биоматрицы, но нс содержащий анализируемою вс шеста зпи каких-либо других химичес-
ких веществ. Холостой образец анализируется для определения систематической ошибки,
часто называемой фоном.
• Фон — искусственная интерференция каких-либо материалов в контрольном или аналти-
ческом образце, которая может вызвать положительную или отрицательную ошибку.
В кол и честен ном анализе часто используют внутренний стандарт — соединение, близкое
по строению анализируемому, которое добавляют к бнообразцу в точно известных количествах
перед пробоподготовкой. Иногда используют несколько внутренних стандартов. Результаты
определений обрабатывают по одному нз известных методов расчета содержания определяе-
мого вещества:
• методу абсолютной градуировки;
• метолу внутреннего стандарта:
• метолу стандарт ной добавки
В гл. 6.1 приведены общепринятые правила представления результатов количественного
анализа, согласующиеся с номенклатурными правтыамн и рекомендациями Международною
союза торетической и прикладной химии (ИЮПАК). Систематические ошибки в ХТА могут
быть вызваны разными обстоятельствами. Если истинное значение неизвестно, трудно рас-
познать систематическую ошибку. Между систематической и случайной ошибкой невозможно
сделать ясное и полное различие в каждом частном случае ХТА. Например, небольшое систе-
матическое отклонение может быть скрыто широкой дисперсией случайных ошибок. Случай-
ные ошибки могут быть распознаны и описаны методами статистики. В табл 5-15 приведены
примеры некоторых систематических ошибок в ХТА.
Вариабельное!ьрезультатов «изодня вдень», визуально наблюдаемая как изменение накло-
на калибровочных кривых, в лабораториях можез быть сведена к минимуму.
В качестве хорошей практики рекомендуют строить калибровочную кривую для каждо-
го случая неизвестного образна. Для рутинной калибровки обычно достаточно использовать
3 раствора различной (точно известной) концентрации стандарта и холостой образен.
Алгоритм проведения количественного определения токсиканта.
I. Определение цели (правовые вопросы) и выбор методов анализа.
2. Разработка плана проведения исследования.
3. Выбор методик аналитического метола, обеспечивающих надежность полученных ре-
зультатов.
4. Определение систематических ошибок измерения:
Методология химико токсикологического анализа 255
Таб.тнпа 5-15. Примеры систематических ошибок в ХТА
Причины систематических ошибок Происхождение систематических ошибок Примечание
Неоднородность материа- ла образца Многоэтапносзь auxin за Выбор биообъекта, учет процента связывания с белком, правильность пробоподготовки. учет процента ме- таболическ го превращения и т.л. ЖЖЭ и соблюдение условий ее вы- полнения: контроль pH среды, тем- пература- выбор экстрагента, условия упаривания экстракта (в токе азота или на воздухе), учет процента мета- болического превращения, необходи- мость предварительного гидролиза и т.д. Ошибки, связанные с неоднороднос- тью, имеют место во всех видах и на всех уровнях аналитических методов В каждой серии анализов необходи- мо указывать выход. Вариабельность в результатах выходов очень часто димишрует повторяемость и вос- производимость метола. В анализе следовых количеств выход должен быть тте менее 70%. Процент выхо- да уменьшается с уменьшением кон- центрации анализируемого вещества, что связано с потерей вещества (про- цедура анализа, поглощение и хими- ческие изменения)
Некорректная характерис- тика калибровочных ве- шеств сравнения Отсутствие в ряде химико-токсико- логических лабораторий паспортизо- ванных образцов сравнения Использование паспортизованных образцов сравнения приводит к по- лу тению корректных результатов. Загря ненце образна сравнения дает завышенный (выход более 100%) тын заниженный результат*
Измерение плошали пика в хроматографических ме- тодах Нестабильная базовая линия хрома- тографа При нестабильной базовой линии лучше измерять высоту, а не пло- щадь пика
• Опасность загрязнения существует на любом этапе анализа. Загрязнения пробы можно избежать за счет четкого
планирования, организации и контроля стадии анализа.
• с веществом сравнения;
• независимым методом.
5. Оценка случайных ошибок.
• определение внутрилабораторной воспроизводимости результатов;
• определение межлаборатор той воспроизводимости результатов.
6. Адаптация условий проведения анализа в связи с полученными данными в этанах 4 и 5.
7. Повторение, если требуется, этапов 4 и 5.
8. Выполнение и представление результатов анализов.
Обязате. 1ьные условия получения надежных результатов измерения
• Для построения градуировочного графика необходимо иметь набор искусственных смесей,
содержащих определяемое соединение в концентрациях, охватывающих весь возможный
интервал варьирования концентраций в анализируемом объекте.
• Искусственные смеси готовят по стандартной процедуре (методике) из вешеств с аттесто-
ванной степенью чистоты.
• Должна быть известна погрешность определения концентрации искомого соединения в ис-
кусственных смесях используемым методом анализа, т.е. методика приготовления искусст-
венных смесей должна быть метрологически аттестована
256 Глава 5
Обеспечение качества и надлежащая лабораторная практика (принципы GLP в современной
лаборатории)
•Работа в лаборатории выполнялась в соответствии с требованиями GLP (нс имеет значе-
ния. с помощью компьютера или без), если инспектор, который возможно поест hi лаборато-
рию с проверкой даже спустя 4 или 5 лет после выполнения ргботы. имеет возможность легко
восстановить по записям в связи с чем. кик и кто выполнял ту работу, кто был руководителем
работы, какое оборудование использовалось, какие результаты были получены, е какими про-
блемами пришлось столкнуться и как они были преодолены».
D.L.M. Weller. С IP and quality Assurance
Надлежащая лабораторная практика — система мероприятий по обеспечению качества ре-
зультатов анализов в лаборатории (организационный процесс и условия, в которых планиру-
ются. осуществляются, кон гредируются, pel истрируются лабораюрные исследования и пред-
ставляются их результаты).
По существующим опенкам затраты на систему обеспечения качества должны составлять
10—20*т. эксплуатационных расходов лаборатории. В эту сумму включаются затраты па:
• проведение лабораторных исследований в соответствии с надлежащей лабораторной прак-
тикой:
• контроль за функционированием лаборатории:
• оценку качества работы лабораторного обору ювания и применяемых методик:
• проведение обучения персонала;
• проведение мероприятий по сертификации лаборатории;
• модернизацию используемых или разработку новых методик исследования с учетом изме-
нившихся требовании или появлением новых веществ или объектов исследования;
• соблюдение положений действующих нормативных документов и облегчение проведения
мероприятий для адаптации к новым:
• создание условий для аккредитации лаборатории и ее поддержания на должном уровне;
• повышение авторитета лаборатории и доверия к ней со стороны общественности;
• улучшение морального состояния сотрудников;
• сокращение числа случаев повторного анализа образцов, внесения поправок в данные ана-
лизе и получения ненадежных данных:
• повышение качества проведения лабораторных работ, обслуживания клиентов; наличие
способов компенсации претензий (поставка запасных частей к оборудованию, ремонт и
т.п.).
Контроль качества — это:
• неотъемлемая часть НЛП, котор i обеспечивает контроль за качеством н надежностью ре-
зультатов. получаемых в данной лаборатории:
• система контроля качества служит поддержанием компетенции лаборатории на необходи-
мом уровне;
• система контроля качества предусматривает проведение мероприятий как внутри, так и за
пределам и .забора 1 ори и:
• весь комплекс мероприятий НЛП должен присукчвовагь в лаборатории в печатном виде;
• двумя самыми важными и взаимолопгыняюшими друг друга в данной системе документами
являются:
— руководство по качеству, озражающее все аспекты системы контроля качества;
— стандартные рабочие инструкции — подробные пошаговые инструкции по выполнению
отдельных видов деятельности лаборатории.
Руководство по качеству
• Руководство но качеству — это внутрилаборвторный документ, регламентирующий адми-
нистративную, хозяйственную и научную стороны сс деятельности.
• Руководство по качеству обеспечивает условия проведения лабораторных работ под надле-
жащим контролем и достижения поставленной цели при соблюдении всех требуемых нор-
мативов и стандартов, с тем чтобы результаты работ могли быть приняты в качестве доказа-
тельства в .ходе судебного процесса самого высокого уровня.
Руководство по качеству содержи! следующие рахтелы.
Методология химико-токсикологического анализа 257
• Политика в области персонала лаборатории (штатные обязанности, и организация работы
лаборатории.
• Правила приема, учета, внуфилаборагорного движения, хранения, возврат и уничтожения
образцов.
• Контрольные эталоны.
• Материалы и реактивы
• Оборудование.
• Оснащение лаборатории и условия работы.
• Методы и процедуры.
• Отчетность.
• Жалобы и отклонения от нормы.
• Методы проверки качества работы.
• Меры ио обеспечению безопасности лаборатории.
• Лттесгания и межлабораторные сравнительные испытания.
• Аккредитация и сертификация.
Руководство по качеству пре,[усматривавг полное описание должностных обязанностей
каждого сотрудника лаборатории, начиная с руководителя и его заместителей. В лаборатории
в зависимости от объема проводимых работ должна быть предусмотрена по крайней мер одна
должность сотру аника, ответственного за оценку качества результатов работы, который по
своей профессиональной подготовке и опыту работы может и способен:
• на основе знания теоретических основ методик, используемых в лаборатории, оценить ка-
чество выполняемых работ и разработать адекватную методику его проверки;
• проводить анализ, интерпретацию и представление получаемых результатов:
• разработать и поддерживать на необходимом уровне порядок хранения результатов;
• в случае выявления ошибок или неточностей предпринимать адекватные действия для их
устранения.
Важнейшее значение с точки зрения качества исследований имеет постоянное повышение
квалификации персонала.
Порядок работы с образцами
Порядок работы с изъятыми материалами
• Лаборатория, проводящая исследования, должна иметь подробные инструкции о порядке
приема, способах маркировки, регистрации и обработки материалов, поступающих на ис-
следование. а также о порядке нх последующего возвращения или унн гтожения. В некото-
рых случаях предусматривается необходимость наличия инструкций по отбору самих проб и
их упаковке.
• Все представляемые на исследование образцы должны быть тщательно упакованы, иметь
четкую и ясную маркировку, обеспечивающую их индивидуальность.
• Все образцы должны иметь сопроводительную документацию, выполненную по соответс-
твующей форме
• Принимают образцы только специально выделенные для этого сотрудники, обладающие
полномочиями частично или полностью отказывать в приеме плохо упакованных или не-
маркированных образцов без сопроводительной документации.
• Каждый принятый образен индивидуально заносится в систему регистрации работы лабора-
тории. что подтверждается документально.
• Вся сопроводительная документация по каждому из образков в виде представленных вместе
с ним материалов, писем, факсов, телеграмм, протоколов заседаний, отчетов о проведен-
ных исследованиях и распечатки данных с разных приборов, а также первичные данные о
внешнем виде, весе и других характеристиках образна, включая его фотографии, хранятся в
соответствующем месте лаборатории.
• В эти материалы также необходимо включать полный перечень перемещений образца по
лаборатории за время проведения исследований, списком сотрудников, работавших с ним с
указанием продолжительности их контакта с образцами.
Отбор проб и образцов
• Главная задача процедуры отбора проб — обеспечить осуществление правильного и досто-
верного химического анализа.
258 Глава 5
• Отобранные образны должны быть представительными для всей совокупное! и исследуемых
объектов.
• В зависимости от поставленной задачи процедура отбора образцов может претерпевать зна-
чительные изменения.
— Например, отбор лекарственных препаратов для установления их качественного и ко-
личественного состава проводится в соответствии со статьей «Обшие методы анализа.
Отбор проб (выборок) лекарственных средств». Государственная фармакопея. ||-е изд.
Вып. I, М: Мединина, 1990. с. 7. В соответствии с ней на исследование в конечном счете
отбирается не менее 3 и не более 30 единиц образцов. В обшем случае это количество
равно 0.4 х корень квадратный из обшего числа объектов.
— При исследовании упаковок наркотиков соблюдаются следующие правила: если количес-
тво упаковок меньше 10. го отбираются вес упаковки: от 10 до 100 — 10 упаковок, свыше
100 — число упаковок равно квадратному корню их количества. Методические указания
ПККН «Отбор проб при исследовании наркотических средств» № 26 от 16.11.93.
— Более сложную, но статистически выверенную систему отбора образцов приводит груп-
па по анализу наркотиков европейских институтов судебной пауки «GUIDELINES ON
REPRESENTATIVE DRUG SAMPLING- ENFS1. DRUGS WORKING GROUP. 2002.
Особенности отбора биообразпов
• Обеспечить соответствие изымаемого образна проверяемому субъекту.
• Избежать подмены или фад|>сифик1Н1ин образцов на всех стадиях проведения проверки.
• Обеспечить сохранность образцов от частичной или полной потери, порчи и неправильных
условий хранения и транспортировки.
Контрольные эталоны, материалы и реактивы
• В лаборатории должна вестись документация, касающаяся контрольных эталонов, конт-
рольных проб или образцов и ступеней калибровок оборудования, которые необходимы в
различных аналитических процедурах и метопах, используемых для обеспечения надежнос-
ти результатов исследований.
• Стат парты, используемые в лаборатории, обязательно должны быть получены из соответс-
твующих национальных и международных стандартов.
• Контрольный эталон. который (обычно) закупается — ло сертифицированный эталонный
материал. одна или несколько характеристик его сертифицируется и сопровождается сер-
тификатом тити другим документом, выданным органом по сертификации либо его связь с
этими документами можно проследить.
• Контрольные эталоны должны соответствовать характеру исследований, проводимых в ла-
боратории. где должна быть документация, называющая на источник и лату их приобре-
тения. Они должны храниться в таких условиях, которые обеспечивают их стабильность и
сохранность. Если контрольные эталоны изготовляются в лаборатории, источники хими-
ческих реактивов, методы изготовления и результаты проверки готового образна должны
регистрироваться и храниться в досье.
• К закупаемым контрольным эталонам обычно прилагаются документы, подтверждающие их
химический состав, качество и концентрацию в них различных веществ. Однако рекомен-
дуется. чтобы лаборатория, прежде чем начинать пользоваться ими, самостоятельно прове-
рила их химический состав и чистоту (шли концентрацию). Это делается методом сравнения
количественных покпзнтелей нового контрольного эталона с аналогичными показателями
ранее использовавшегося эталона.
• Калибраторы, изготовленные из эталонного материала или приобретенные, используются
.ыя калибровки анализа. Там. где эго возможно, калибраторы, используемые при анализе
биологических проб, должны иметь матрицу, подобную матрице проб. Сначала следует про-
вести испытания достаточного количества калибраторов, чтобы определить параметры ка-
либровочной кривой: рекомендуется провести испытания с пустой пробой по крайней мере
трем калибровочным точкам. Стабильность калибровочной кривой должна быть проверена
в лабораторных условиях путем добавления контрольных проб или образное, как пазожи-
тельных. так и отрицательных.
• Контрольные пробы или образцы готовятся из эталонных материалов (отдельно от калибра-
торов. которые взвешиваются или измеряются отдельно), либо приобретаются, либо полу-
Методология химико-токсикологического анализа 259
чаются из фонда ранее исследованных проб или образцов. Они используются для проверки
правильности калибровки, т.е. наличия линейности и стабильности во времени результатов
количественных измерений. Там. где это возможно, контрольные пробы должны быть со-
гласованы по матрице с пробами и калибраторами.
• Ответственность за приобретение и содержание контрольных эталонов должна быть воз-
ложена на специально назначенного сотрудника, который должен вести основной решстр
всех этих материалов. Решстр должен содержать сведения обо всех официальных эталонных
веществах и препаратах, а также данные о неутвержденпых официально контрольных этало-
нах. полученных из различных внешних источников. Сюда же заносятся сведения обо всех
вторичных эталонах, изготовленных в лаборатории (рабочие сган.д рты).
• Качество реактивов должно отвечать требованиям лабораторных исследований, сети нс ого-
варивается иное. Реактивы и материалы должны соответствовать стандартам качества, тре-
буемым используемыми в лаборатории методами исследовании, действующими правилами
или надлежащей лабораторной практикой. При поступлении в лабораторию все реактивы
должны быть снабжены надлежащими этикетками, содержащими следующую информацию:
лата получения, срок годности (если таковой установлен) и дата начала использования.
На этикетке должны быть также указаны инициалы липа, проводящею анализы. Раствор
реактива, который го овигся и лаборатории, должен быть снабжен этикеткой с указанием
даты изготовления концентрации активных ингредиентов, даты истечения срока годности
и инициалов изготовившего его сотрудника лаборатории.
• Необходимо всеми средствами препятствовать практике выливания обратно в бутыли с ре-
активами неиспользованных порций растворов Аналогичным образом следует запрещать
вставлять пипетки в бутыли, в которых хранится весь раствор или другой реактив, посколь-
ку это может вызвать загрязнение. Рекомендуется, чтобы для использования в лаборатории
растворы разливались в 50<1-мидлилитровые или максимум в литровые бутылки. Растворы
для полоскания (например, микролитровых шприцев, используемых в газовой хроматогра-
фии) необходимо часто менять.
• В каждой лаборатории должна вестись тетрадь записей о приготовлении растворов реакти-
вов. которая должна храниться в установленном месте. При приготоняении раствора лицо,
ответственное за данную операцию, должно занести в тетрадь дату, вес и объем ингредиен-
тов, использованных для этой цели, и поставить свою подпись. Эта информация необходи-
ма для отслеживания возможных источников ошибок в лабораторных анализах.
Оборудован к
• К. ючевой фактор качества проведения исследований — надежность и качество используе-
мого при этом оборудования.
• Для контроля оборудования необходимы наличие в лаборатории инвентарной описи обору-
дования и ведение соответствующей документации, касающейся расположения, даты при-
обретения. данных об уходе за оборудованием, его техническом обслуживании и ремонте.
• Инструкции по эксплуатации должны быть легкодоступны персоналу и находиться побли-
зости от соответствующего оборудования. Ответственность за различные виды оборудования
должна быть распределена между сотрудниками лаборатории, которые должны осущест-
влять его регулярные проверки, составлять об этом необходимую документацию, проводить
калибровку и заполнять бланки, чтобы обеспечить соблюдение технических условий Влжно
вести учет всех проведенных калибровок. Сотрудники, отвечающие за определенные вилы
оборудования, также должны нести ответственность за техническое обслуживание и теку-
щий ремонт оборудования в соответствии с заранее установленными 'рафиками либо пер-
соналом лаборатории, либо специалистами из внешней ортанизаини. Данные о техническом
обслуживании и ремонте также регистрируются в соотве сгвуюших документах.
• В случае обнаружения неисправности оборудования о ней должно быть немедленно сооб-
щено сотруднику, ответственному за это оборудование и его техническое обслуживание и
ремонт. Оборудование должно бтль выведено из эксплуатации до устранения возникшей
проблемы Методы, время и дата устранения неисправности должны быть зафиксированы в
соответствующем регистрационном журнале для данного вида оборудования.
260 Глава 5
Конкретные требования к некоюрым видам оборудования. Весы
• Необходимость регулярной калибровки весов — один из наиболее доступных для понима-
ния примеров требований НЛП и контроля качества. Ошибки при взвешивании сказыва-
ются на всех эталонах и реактивах и влияют на достоверность аналитических результатов,
полученных с их использованием.
• В России в настоящее время существует требование для целей аккредитации лабораторий,
в котором указано, что калибровка весов должна проводиться ежегодно органом по серги
фикании на основе прослеживаемого первичного эталона, т.е. с использованием эталонных
гирь, имеющих сертификат, в основе которого лежит действующий международный стан-
дарт.
• Повседневная калибровка может выполняться в лаборатории с использованием набора эта-
лонных гирь, которые в свою очередь должны иметь сертификат о калибровке. Такие эта-
лонные гири (например, используемые в аптечных микровесах для взвешивания эталонов
наркотических веществ) можно легко повредить в результате неаккуратного обращения с
ними, лаже используя пинпет нс юго типа (например, пинцет с зубчатыми кончиками),
поэтому все сотрудники лаборатории должны пройти специальную подготовку по приобре-
тению навыков пользования ими
• Обычно рекомендуется использование весов, обеспечивающих распечатку результатов взве-
шивания. что особенно необходимо в некоторых обстоятельствах, когда, например, лабо-
ратория должна отвечать требованиям пречьявляемым к ней при аккредитации. Наконец,
результаты всех взвешиваний должны регистрироваться в лабораторном журнале в твердом
переплете, а не на отдельных листках бумаги.
Конкретные требования к некоторым вилам оборудования. Стеклянная посуда
• В руководстве по качеству и в политике лаборатории должны учитываться 3 важных обсто-
ятельства:
— качество используемой стеклянной посуды, т.е. свойства стекла, из которого она изготов-
лена (натриевое стекло, боросиликатное стекло);
— технические характеристики мерной стеклянной посуды (класс А или В): мерная посуда
класса А более точная, чем посула класса В, но и значительно более поротая;
— процедуры мойки посулы и обращения с ней; использование горячей воды для мойки
мерной стеклянной посуды приводит к безвозвратной утрате точности се измерений.
Конкретные требования к некоторым видам оборудования. Автоматические пипетки
Регулярно должна проводиться калибровка пипеток либо в лаборатории, либо во внешней
организации, а результаты калибровки должны регистрироваться в специальном журнале.
Конкретные требования к некоторым видам оборудования. Хроматографы
• Эксплуатационные пар метры этих приборов (показатели температуры, давления, скорости
потоков и тл.) должны проходить калибровку, особенно если лаборатория должна соблю-
дать установленные протоколы.
• Например, справочно-аналити геский метод с испо гьзоваиисм газовой хроматографии поз-
воляет определить температуру в форсунке и топке печи; сотрудник лаборатории должен
сверить температуры и установить, что полученные значения действительно соответствуют
значениям, которые показывают контрольные устройства.
• В некоторых случаях может возникнуть необходимость проводить калибровку параметров
приборов независимо друг от друга. Однако для большинства хроматографов правильность
их функционирования устанавливается использованием комбинации проверочных тестов.
Конкретные требования к некоторым видам оборудования. Спектрометры
• Калибровка этих приборов обычно проводится методом регистрации спектра эталонов.
• Для некоторых спектрометров предусмотрена процедура внутренней калибровки с исполь-
зованием этатонного фильтра.
Конкретные требования к некоторым видам оборудования. Масс-спектрометры
• Правильная эксплуатация масс-спектрометров и комбинации газовых хроматографов и
.масс-спектрометров требует их повседневной настройки с целью сохранения их чувстви-
тельности и поддержания оптимальных эксплуатационных характеристик.
• Обычными методами проверки эксплуатационных качеств масс-спектрометра являются
контроль за распределением отдельных ионов в спектре массы калибровочного вешества.
Методология химико-токсикологического анализа 261
например перфлюороксросина или гептафторгрибутидамипа. когда проводится калибровка
но массе, и измерение интенсивное!и ионов и соотношения интенсивности ионов в масс-
спектре. когда проверяется нормальный ход реакций ионизации и фрагментации.
Оснащение лаборатории, условия работы и техника безопасности
Оснащение лаборатории
В рамках требований системы качества должны учитываться следующие факторы.
Нель. От того, какие виды проб или образцов — изъятые материалы, биодо!ическис про
бы или и те и другие — будут исследоваться в лаборатории, завися! 1рсбования к площади,
правилам хранения и мерам безопасности. Цель определяет число сотрудников лаборатории
и потребност в рабочих местах, раздевалках, служебных помещениях и гл. В соответствии
с проектной нагрузкой лаборатория обеспечивается оборудованием и персоналом: перегрузка
работой и недостаточное количество персонала пагубно сказываются на качестве исследований
или приводят к увеличению продолжительности времени обработки проб или образцов.
Прохождение проб или образцов через лабораторию. При планировании оснащения лабора-
тории оборудованием следует обратить внимание на прохождение проб или образцов через ла-
бораторию. При размещении оборудования по помещениям лаборатории следует, по возмож-
ности учесть последовательность приемки, хранения, предварительной обработки, анализа,
удаления проб или образцов и подготовки отчетной документации. Важно также изолировать
друг от друга рахтичные вилы деятельности, чтобы свести к минимуму возможность загрязне-
ния. например лабораторную стеклянную посуду, применяемую при анализе пзыпых материа-
лов с высокими концентрациями наркогиков, следует держать отдельно or стеклянной посуды,
используемой при анализе следов в биодот ических пробах. Биологически опасные пробы не
должны переноситься в открытой посуде через не имеющие специальной зашиты зоны, так
же как и грязная стеклянная посула. Оборудование, чувствительное к окружающим условиям,
должно размещаться в местах с ограниченным доступом. Микровесы, например, должны за-
щищаться от вибрации и химической коррозии.
Обслуживание лабораторий. Лаборатория должна иметь соответствующее электро- и водо-
снабжение. специальные поставки газов (особенно для газовой хроматографии), противогазы,
шкафы биологической защиты, холодильники и морозильники; к ней должна быть подведена
телефонная линия.
Техника безопасности
• Обычные санитарно-гигиенические требования в лаборатории. Типичными требованиями
являются запрещение принятия пиши и напитков в помещениях лаборатории, обязательное
ношение лабораторных перчаток, халатов и средств защиты глаз.
• Пожарная безопасность — одно из основных требований при работе в химической лаборато-
рии. включающее правила хранения воспламеняющихся растворов и химических реактивов,
обеспечение соответствующим противопожарным оборудованием (а также его регулярный
осмотр и подготовку персонала к его исн< «ьзованию), назначение сотрудников лаборгно-
рип, ответственных за противопожарную безопасность. а также составление графиков заня-
тии по противопожарной безопасности.
• Биологическая опасность. Поскольку пробы крови и патологоанатомические пробы пред-
ставляют большую опасность заражения, чем пробы мочи, для обработки первых двух видов
проб следует пользоваться шкафами биологической защиты.
• Радиационная опасность. Источником опасности могут служить ралиоиммунолог ическис
исследования (изотоп ,г1„ или 1ритий). а также элеюронозахватпые детекторы в газовой
хроматографии (обычно *’'№) Необходимо соблюдать правила по использованию радиоак-
тивных материалов и захоронению радиоактивных отходов. Персона.! лаборатории, который
подвергается воздействию радиации, должен носить счетчики контроля дозы радиоактивно-
го облучения.
Отчетность
Система качества проведения работ должна предусматривать следующие требования к веде-
нию о!чет пости в лаборатории:
• содержание аналитического отчета;
• терминология;
• процедура отчетности:
262 Глава 5
• конфиденциальность документов:
• система хранения и поиска документов.
АккреЛ/та <ия и сертификация
Аккредитация — процедура. посрединюм которой орган но аккредитации, например на-
циональная или междунаро 1ая организация или профессиональный орган, официально
признает правомочность лаборатории run липа выполнять конкретные работы.
• Сертификация — процедура. посредством которой орган но сертификации официально
признает, что лицо или продукция соответствуют опре етенным техническим условиям.
Аккредитация и сертификация внешними ортапихшиями являются целью разработки про-
граммы обеспечения качества Хотя такие программы могут потребовать вложения значи-
тельных средств, они обеспечат самый высокий уровень доверия к работе лаборатории.
Основные составляющие системы GIJP, согласно международным правилам
• Персональная ответственность за результаты анализов {.заведующий лабораторией).
• Независимое (от лаборатории) подразделение по контролю качества текущей работы лабо-
ратории (Quality Assurance Unit).
• Валидация оборудования, программного обеспечения. мето гик выполнения измерений и
результатов анализа
• Внутренний аудит качества работы лаборатории
Впеиглиш аудит качества работы лаборатории.
Что такое валидация? В литературе существует ряд определении этого понятия.
• Валшипня — организация такой документальной проверки, которая предоставляет высокую
степень уверенности в том, что выбранный процесс проверки воспроизводимо обеспечивает
получение достоверных сведений о соответствии продукции заранее определенной специ-
фикации на эту продукцию (US FDA. General Principles of Validation).
• Валидация — доказательство того, что любая процедура, процесс, оборудование материал,
система, вид деятельности действительно соответствуют ожидаемым результатам. согласно
принципам надлежащей производственной практики — GMP (GMP guides of I С. WHO,
Pharmaceutical Inspection Convention).
• Валилания — проверь г данных на достоверность иди соответствие установленным стан-
дартам. правилам или дцговоренностям В милиция включает проверку работоспособное г и
оборудования, правильности получаемых результатов (CITAC’s International Guide to Quality
in Analytical Chemistry. EURACHEM/WF.LAC).
• Валидация компьютеризированной системы — демонстрация того, что компьютеризирован-
ная система соответствует своему назначению (OECD The application of the principles of GLP
to computerized systems).
• Валилапия аналитических методик — установленный процесс проверки метрологических
характеристик аналитического метода на соответствие своему предназначению, проводи-
мый в лабораторных условиях (USP — validation of analytical methods).
Гермин «Валидация» трактует процесс проверки достоверности каких-либо утверждений,
спецификации, правил и пр. в самом широком смысле. Термин «квалификация» — процесс
проверки и предоставления доказательств того, что оборудование работает правильно и его
работа приводит к ожидаемым результатам. — включает 4 характеристики IQ. OQ. PQ, DQ
(см. ниже).
Квалификация является честью процесса валидации и всегда относится к определенному
продукту. товару, персоналу, услуге и пр. Часто термин «квалификация» трактуется в том же
смысле, что и «валидешия» Поэтому, несмотря па то что квалификация чего-либо является
частью процесса валидации. зти термины часто используют как синонимы.
Прибор не может выдавать достоверные результаты. если не проведены или не проводятся
надлежащим образом следующие этапы его квалификации:
• DQ (Design Qualification) — проверка соответствия оборудования стоящей аналитической
задаче. Определение требуемой спецификации на оборудование.
• IQ (Installation Qualification) — проверка правильности установки оборудования, проведен-
ной в надлежащих условиях.
Методология химико-токсикологического анализа 263
• OQ (Operation Qualification) — проверка того. чго прибор функционирует в соотвшствии с
требуемой спецификацией (аналог его метро югической аттестации или поверке).
• PQ (Performance Qualification) — проверка юго, чго прибор функционирует в соответствии
с требуемой спецификацией в процессе эксплуатации для конкретной метотики.
В лабораториях в процессе работы возникают обстоятельства, в которых требуется прово-
дить квалификацию оборудования по одной или нескольким позициям, приведенным выше.
Основные объекты валидации и квалификации в лаборатории:
• квалификация аналитического оборудования;
• валидация программного обеспечения и компьютерных систем;
• валидация результатов анализа;
• валидация аналитических chcicm как единого целого (оборудование + меюдики);
• валидация меюдик выполнения I змерений;
• квалификация стандартных образцов и стандартных материалов;
• квалификация персонала лаборатории.
Валидация не гарантирует от ошибок, но обеспечивает высокую степень уверенности в до-
стоверности результатов.
Заключение
Этапы работы химико-токсико.югическои юборатории.
• прием образцов, документирование;
• пробоподготовка;
• скрининг.
• подтверждение результатов;
• интерпретация результатов;
• составление акта о проведении экспертизы.
Требования к методам анализа
Скрининг:
• Экспрессность
• Чувствительность
• Селекшвносгь (отсутствие ложноотрицательных результатов)
• Воспроизводимость
Подтвер ждающие методы:
• Чувствительность
• Селективность
• Воспроизводи мош ь
Глава 6
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ТОКСИКАНТОВ В БИОСРЕДАХ
Непрапильное знание хуже, чем незнание.
А. Дистервег
6.1. РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ
И ПРИКЛАДНОЙ ХИМИИ (ИЮПАК)
Сложность биологических объектов затрудняет установление на основе аналитических дан-
ных соответствующих причинно-следственных связен Интерпретация результатов, получае-
мых в химико-токсикологическом анализе (ХТА) с помощью методов аналитической химии,
требуют определенного уровня знаний исследуемых специфических процессов Для того чтобы
интерпретировать результаты анализа биологических объектов в соответствии с поставленной
задачей. чтобы быть уверенным в их точности. корректности и правильности. необходимо
знать все этапы XIА и общие правила выполнения экспертизы (см. гл. 5).
Количественный анализ выполняют с использованием подходящего метода, возможности
которого соответствуют решаемой задаче.. Методы количественного анализа принято класси-
фицировать на химические, физико-химические, физические, биологические. Характер вы-
полняемых аналитических операций и техника проведения работ определяются массой пробы
или имеющимся объемом жидкой пробы (табл. 6-D.
Таблица 6-1. Масштабы хичико-аиалишчсскою эксперимента (рскомсн тапни ИЮПАК)
Вид анализа и техника выполнения Масса пробы, г Объем раствора, мл
Макриа НЛ.1ИЗ Более 0.1 10-10'
Полумикроанализ 0.01-0.1 0.1-10
Микроанализ Менее 0.01 0.01 — 1
Субмнкроанализ 10 >-10 4 Менее 10 -
Ультрамикроапализ Менее 10 1 Менее 10 '
Содержание определяемых вешеств в исследуемых объектах может быть самым различным.
С точки зрения практической работы в лаборатории техника выполнения качественных ре-
акций и проб включает выполнение реакций в пробирках (чаше всею), на предметном стекле —
микрокристаллоскопичеекие реакции — с пос едуюшим изучением формы кристаллов под
микроскопом при увеличении в 50—150 раз. на полосках фильтровальной бумаги (капельные
реакции).
Метод и методика. Несмотря на близкое лингвистическое родство указанных терминов,
смысл их в аналитической химии четко различают. Метод анализа — это теоретически обос-
нованный способ определения химического состава, принцип определения этого состава на
основании исследования и/или измерения сигнала в широком смысле слова Методика анали-
за — это подробное описание выполнения анализа конкретного объекта избранным методом
применительно к дапномх объекту Методика отражает все необходимые ступени выполнения
анализа — отбор средней пробы, пробополготовку. выполнение аналитических реакций или
Методы определения токсикантов в биосредах 265
UMcpoiiHii с помощью выбранного метола анализа. вычисление результатов, обеспечение и
контроль их качества. Методика стандартизованного метода анализа существует в виде офици-
ально оформленного документа и соответствует требованиям действующих нормативных доку-
ментов ведомств, курирующих данную лабораторию. Документальное признание этого факта
оформляют в виде методики — письменного документа, аттестованного Ортонами Госстандарта
Российской Федерации. Результаты анализа, выполненного по аттестованной методике в ак-
кредитованной лаборатории, могут быть признаны имеющими юридическую силу (см. гл. 5.8).
Необходимо правильно использовать и такие термины, как измерение, анализ, определение.
Различия очень четкие: свойство — измеряют, концентрацию или содержание компонента —
определяют, объект (его пробу) — анализируют.
В качественном анализе лля идентификации вс цеств в растворах используют качественные
ана.' итические реакции, проведение которых может быть осуществлено практически в любой
лаборатории. Результатом этой реакции, о котором визуально сулят по изменению свойств
веществ, вступающих в реакцию, являются возникновение, изменение или. реже, исчезнове-
ние окраски, образование осадка малорастворимого в воде соединения, образование кристал-
лов характерной формы, рассматриваемых в микроскоп, выделение газа со специфическими
свойствами. Это химические методы обнаружения. Качественный анализ но воляет очень грубо
оценить градацию содержания искомою вещества в пробе. Можно сказать. сильный или сла-
бый аналитический сигнал наблюдает экспериментатор. Качественные аналитические реакции
используют лля получения быстрой информации о химической природе объекта исследования,
присутствии или отсутствии определенных отдельных катионов или анионов.
Для обнаружения существенно меныпих коти*еств вешеств используют физико-химичес-
кие методы. Любое изменение свойств веществ, вступающих в аналитическую реакцию, или
иное peiистрирусмос (или измеряемое) проявление свойств определяемого вещества, напри-
мер наблюдение спектральной линии в атомно- эмиссионном спектре элемента, называют ана-
литическим сигналом. В качественном анализе аналитический сигнал принято называть ана-
литическим эффектом. Носителями аналитического эффекта являются вещества — продукты
аналитических реакции, облал ющие характерными свойствами, окраской, растворимостью в
воде н/или органических растворителях, кислотах, щелочах, комнлсксообртзоватс.тях. формой
ооразуемых кристаллов. Принято эти свойства веществ связывать с их конкретным носителем
и называть продукт аналитической реакции аналитической формой Таким образом, анализи-
ческая форма есть конкретное материальное воплощение аналитического эффекта.
С химической точки зрения аналитические реакции представлены реакциями различных
типов: комплексообразования, осаждения, кислотно-основными, окислительно-восстано-
вительными. Вещество, непосредственно вступающее в аналитическую реакцию с искомым
ионом, принято называть реагентом. Реагенты могут быть неорганическими зши органичес-
кими соединениями. Последняя группа приобрела в ХТЛ исключительно большое значение,
поскольку большинство реакций с органическими аналитическими реагентами по своим па-
раметрам превосходят реакции с неорганическими реагентами. Раствор реагента, содержащий,
помимо действующего вещества, другие компоненты, часто называют реактивами. Например,
днметилглиоксим как реагент на никель часто называют реагентом Л.А. Чугаева в память из-
вестною русского анализ ика. открывшего згу реакцию Но смесь реагентов, применяемая для
обнаружения и определения нитритов, называют реактивом Грисса-Илосвая.
Важнейшие характеристики аналитических реакции и методов. Желая дать характеристику
любой аналитической реакции или методу определения элемента, вещества и г.д.. необходимо
учесть, какое минимальное количество вещества можно обнаружить вообще и какова надеж-
ность этого действия в присутствии других сопутствующих веществ. Характеристиками этих
особенностей являются предел обнаружения и избирательность реакции или метола. Предел
обнаружения — наименьшее количество вещества (масса или его минимальная концентрация),
которые могут быть обнаружены данным методом при данной технике эксперимента с опреде-
ленной доверительной вероятностью. Диапазон определяемых содержаний — область значений
определяемых содержаний, предусмотренная данной методикой и ограниченная их нижней и
верхней границами. Верхняя граница (ти. ср) — наибольшее значение количества или концент-
рации компонента, определяемое по данной методике. Естественно, наименьшему количеству
вещества соответствует и наименьший сигнал, которы г еще может быть зарегистрирован. Здесь
266 Глава 6
особенно важно не ошибиться, недопустимо как нелооткрытис. так и переоткрытие определя-
емого ком попей га. В количественном анализе, связанном с измерением сигнала с помощью
приборов, эта процедура достаточно строго описывается с помощью аппарата математической
статистики. Гак. первая ситуация — недооткрытие — есть ошибка 1-го рода: чрезвычайно
слабый сигнал пробы ошибочно принят за сигнал фона — за шумы, сопровождающие любое
измерение, в то время как вторая — псреот рыгис — ошибка 2-го рода: достаточно высокий
уровень шумов фона ошибочно принят за сигнал определяемого компонента. Чтобы нс допус
тить птких ошибок, необходимо, чтобы наименьший регистрируемый сигнал был по крайне
мере в 3 раза больше погрешности измерения сигнала фона. Соответствующие формулы будут
приведены далее.
В количественном анализе зависимость сигнала от коннентрапии определяемого вешества
называют градуировочной. Очень часто она описывается уравнением прямой линии: тотда
угловой коэффициент этой зависимости называют чувствительностью. Предел обнаружения и
чувствительность связаны между собой соответствующей зависимостью: ч и ниже предел обна-
ружения, тем более чувствителен метод Таким образом, это понятия разные, хотя на практике
их часто путают и ошибочно смешивают (см. курс аналитической химии).
Избирательностью называют возможность непосредственного определения одною вешест-
ва. элемента, иона и т.л. в присутствии других, сопутствующих ему. Как правило, химические
аналитические реакции недостаточно избирательны, чтобы применять их непосредственно.
Только строгий и надлежащий контроль над оптимальными условиями их выполнения может
обеспечить необходимую для получения правильных результатов избирательность. По этой
причине при проведении аналитических реакций строго соблюдают все необходимые условия.
В количественном анализе ситуация точно такая же. необходимо чтобы все присутствующие в
пробе компоненты ие давали при выбр иных условиях аналитических сигналов и. таким обра-
зом. нс мешали бы измерению сигнала определяемого компонента — элемента, вешества, иона
и т.д Принято классифицировать качественные реакции по их избирательности. Их можно
разделить на нсизбирагельные — общие и групповые — и относительно избирательные — част-
ные и характерные реакции. Гранина между общими и групповыми реакциями нечеткая Все
зависит от выбираемой системы классификации. Тем не менее в рамках как ра этих класси-
фикаций групповые и общие реакции используют для разделения смесей веществ или ионов,
для того чтобы далее исследовать каждую выделенную группу отдельно, используя частные и
характерные реакции.
Таким образом, избирательность аналитических реакций — категория мобильная, качест-
венная. но управляемая и. следовательно, исключительно полезная и широко используемая
в аналитической практике. Поэтому совершенно необходимо, характеризуя избирательность
и даже предел обнаружения какой-либо реакции, непременно указывать, при каких условиях
выполнена эта реакция, с использованием какой техники эксперимента это может быть до-
спи нуто
Условия выполнения аналитических реакций или количественного определения искомого
вешества должны быть оптимальными для достижения наименьшего предела обнаружения и
наилучшей избирательности. Поэтому всегда необходимо принимать во внимание такие важ-
нейшие факторы, как природа вешества. pH раствора, наличие комплсксообразователей и т.д.
(см. ниже).
При определении веществ в patiворах предел обнаружения относят к определенному объ-
ему. При проведении качественною анализа для пробирочных реакций предел обнаружения
указан для объема раствора в 1 мл. а для капельных (на полосках фильтровальной бумаги) и
микрокристалоскопичсских — для объема 0,05 мл. поскольку объем одной капли водного рас-
твора. отбираемой с помощью стеклянной пипетки, примерно равен 0.05 мл.
количественным анализом называют совокупность химических, физических и физико-хими-
ческих методов исследования, позволяющих с гарантированной требуемой точностью опреде-
лять в образце анализируемого вещества количественное содержание отдельных составных час-
тей или их концентрацию, а также устанавливать содержание примесей в исследуемом объекте,
определять содержание микроэлементов в разнообразных объектах.
Прежде чем выполнять любые количественные химические измерения. нужно провести ряд
обязательных процедур Основные стадии химического анализа (см. гл. 5 и ниже гл. 6):
Методы определения токсикантов в биосредах 267
• выбор метода и способа анализа в зависимости от решаемой npo6j «мы. имеющегося обору-
дования, времени, уровня определяемого содержания гоксикавга и требований к качеству
результата определения с учетом количества имеющегося образна пробы и ее характера;
• подготовка средств измерения и их градуировка;
• выполнение измерения величины, функционально связанной с количеством определяемого
компонента, — измерение аналитического сигнала; это измерение должно быть селектив-
ным. т.е. относигься только к определяемому компоненту;
• расчет результатов определения и опенка его качества, прежде всего точности, когда слу-
чайные погрешности минимальны, а систематические устранены: каждая стадия анализа
вносит свои погрешности в конечный результат, их необходимо строго контролировать.
Количественный анализ всегда связан с процедурой измерения какого-либо свойства оп-
ределяемого вешества или элемента. Это может бызъ. например, испускание или поглоще-
ние кванюв электромагнитного излучения атомами или молекулами исследуемых соединений
(спектрометрия), измерение потенциала электрода, величины диффузионного тока, отвечаю-
щего электрохимическому процессу, количества электричества. потребовавшегося для выде-
ления элемег ia на электроде, и т.п. (эмктроаналитические методы). Можно измерять время
н хождения различных веществ в хроматографической системе и. разделяя их. находить время
и ооъем удерживания {хроматографические методы), измерять естественную или наведенную
радиоактивность атома определяемого элемента, возмож) ости чего представляют радиоанази-
тические методы, а также измерять другие параметры н свойства. Для выполнения этих иссле-
дований необходимы соответствующие ушройства и приборы.
Прежде всего для взятия навески пробы и переведения ее в форму, удобную для проведения
анализа. — как правило, в раствор — необходимы аналитические весы (механические ры-
чажные или современные электронные) и мерная посуда (мерные колбы, бюретки, пипетки).
В ХТА для определения малых количеств используют чувствительные и избирате гьные физико-
химические {инструментальные) меюды анализа. Каждый из соответствующих приборов пред-
назначен для измерения какого-либо свойства, определяющего аналитический сигнал связан-
ного с природой определяемого вешества. а также его количеством. В современных приборах
процесс измерения автоматизирован, программируется и контролируется компьютером.
Измерение аналитического сигнала. Регистрация аналитического сигоала. свидетельствующая
о наличии искомого компонента в пробе, дает качественную информацию. Измерение интен-
сивности сигнала — пе.зь количественного определения. Функциональную зависимость интен-
сивности аналитического сигнала от содержания определяемого компонента у ~f(c) называют
градуировочной зависимостью. Аналитический сигнал — инкнеивноезь излучения. поглоще-
ния. потенциал ток. плошадь пика и т.д. Обычно сначала по образцам сравнения — эталонам,
выполнив измерения сигналов, строят 1тидуировочную зависимость (в графическом, реже таб-
личном виде). Рассчитывают эту зависимость, как правило, с помощью метола наименьших
квадратов. Всегда стремятся к тому, чтобы се линейная область, описываемая уравнением
прямой линии, была как можно более протяженной. После измерения сигнала компонента
в пробе по этой зависимости находят результат определения. Размерность результата опре-
деления (содержание) может быть iipe.'ici явлена как абсолютное количество в единицах массы
(г. мт, мкг, нг, пт), моль (моль, ммоль, мкмоль) или через массовые концентрации и содержа
ния (i/л. мг/л. мк1/л. мкг/мл. пг/мл. г/кг. мг/кг, мкг/г. мяс.%, об.%, мол.% и т.д.). В зарубеж-
ной практике иногда фирмы, производящие высокочувствительное оборудование, используют
нс рекомендуемые ИЮПАК внесистемные единицы: ppm (часть на миллион), ppb (часть на
миллиард), ppt (часть на триллион);
I ppm = Ю = 1 мг/кг (или мг/л. мкг/г. мкг/мл):
I ppb = 10-7% — 10 ’ ppm = 1 mki/kt (или мкг/л, нг/г. пг/мл);
I ppt = lO-10^ = 10-5ppb = IO’*1 ppm = 1 нг/кг (или нг/л. нг/г, пг/мл).
Результат аналитического определения должен быть достоверным и точным. Поэтому он
всегда есть среднее арифметическое из некоего множества отдельных измерений. Часто гово-
рят о среднем из п параллельных измерений. Естественно, каждый результат любого измере-
ния отличается oi своею истинного значения, т.е. характеризуется погрешностями, которые
образуют некий доверительный интерва., в рамках которого находи гея искомый результат. Все
погрешности можно разделйть на случайные и систематические. Для характеристики качества
268 Глава 6
результата анализа применяют приемы математической статистики. если имеющиеся данные
позволяют это. Чаше всею практическая сипания складывается именно так. Таким образом, с
точки зрения науки об измерениях — метрологии — возникает проблема характеристики качес-
тва результата определения как результата измерения. Су>ь вопроса состоит в том. насколько
точен результат определения. насколько он близок к истинному содержанию компонента, како-
ва iioipeuiHOCTb определения и насколько надежна сама величина этой погрешности. Ответить
на ли вопросы можно после обоснования понятия «точность». Точность - это собира)ельная
характеристика метола шн методики, включающая их правильность и воспроизводимость. Вы-
ражение «высокая точность» означает, что результаты правильные и разброс данных анализа
незначителен. Точность хараысри >уют относительной iioipcimiocibio определения в цроненгах.
Представление результатов количественного химического анализа. В пособии использованы
термины, согласующиеся с номенклатурнь ми правилами и рекомендациями ИЮ11АК при
представлении результатов количественного химического анализа и являющиеся общепри-
нятыми. Эти правила были учтены при разработке введенных в действие международных и
российских стандартов — нормативных документов. Далее приводятся важнейшие термины,
сопровождающие прететаатение результатов количестве итого анализа в редакции стандарта
Российской Федерации ГОСТ Р 11 СО-5725( 1-6)-2002 и некоторых других важнейших норма-
тивных документах. действующих с 2002 г. В частности, разъясняется новый ранее в отечест-
венной терминологии не использовавшийся термин «прецизионность». Для облегчения работы
с информацией для заинтересованного читателя в скобках приведены и соответствующие тер-
мины на английском языке. Упомянутый стандарт исходит из определенной модели погреш-
ностей. Гак. для результата измерений у:
у = пт + В + е.
где m — общее среднее значение (математическое ожидание): В — лабораторная составляю-
щая систематической погрешности в условиях повторяемости; с — случайная составляющая
потрешности каждого результата измерений в условиях повторяемости
Основные термины, рекомендованные для практического использования.
Измеренное точение: найденное в результате выполнения работы значение измеряемого
свойства — массы, объема и др.
Результат: окончательное значение измеренного или рассчитанного как результат аналити-
ческого определения параметра посте выполнения всех процедур измерения и опенок.
Истинное значение (г): идеальное значение результата определения (анализа), которое без-
упречно характеризует исследуемый объект при предполагаемом отсутствии погрешностей, от-
носящееся ко всей генератьной совокупности измерений.
Числа измерений (п): общее число результатов измерений в серии, размер выборки.
Число степеней свободы число независимых переменных и в выборке минус чисто связей
между ними: v = n — I (и in f).
Доверительная вероятность: вероятность попадания оцениваемой величины в заданный ин-
тервал: Р = I — IX.
Среднее арифметическое значение: для серии результатов из п параллельных определений
х,. х„...х...х1): уд
x = -Li-
п
Среднее арифметическое у является ouchkoii истинного значения ц (при п -»« у —»JJ). где
ц — среднее значение 1еператыюй совокупности.
Отклонение разность между результатом измерения и средним арифметическим
<1, = х, - у.
Размах варьирования: разнос) ь между наибольшим и наименьшим значением в выборке
R,= x™“ V
Дисперсия (V или о2): квадрат ста шарпюго отклонения генератьной совокупное) к резуль-
татов измерении Хараюсризус рассеяние (тезультатов относительно среднего, то есть воспро-
изводимость анализа.
Стандартное отклонение (или среднее квадратичное отклонение): характеристика рассеяния
результатов относительно среднего. Характеризует, как и дисперсия V. воспроизводи мое )ь ре-
Методы определения токсикантов в биосредах 269
зультатов анализа. Рассчитывают как корень квадратный из дисперсии V (то есть из отношения
суммы квадратов отклонений к числу степеней свободы) со знаком плюс
или
где s — станларшое отклонение выборки, в отличие от стандартною отклонения всей гене-
ральной совокупности, обозначаемого о.
Относительное стандартное отклонение: отношение сгандарпюю отклонения к среднему:
г
.г = —
г х
СИносилельние стандартное отклонение, выраженное в процентах от найденного значения х'
sr(%) = sr100.
Погрешность результата: разность между результатом определения х и истинным значением т:
е = х. - х.
Относительная погрешность: отношение погрешности результата е к истинному значению х:
е, = е / т.
Систематическая погрешность: статистически значимая разность между средним значением
генеральной совокупности ц и истинным или принимаемым за него (опорным) т:
Д = |д — х
П \ная (суммарная) систематическая погрешность: смешение
Доверительный интервал: симметричный интервал значений (±С или ±8) в который с дове-
рительной вероятностью Р = 1 — а попадает среднее значение результата:
±c-t{P’v)s.
•Jn
где t(P.v) — критн lecKoe значение распределения Стыодснта для доверительной вероятности Р
и числа степеней свободы v. s — стандартное отклонение: п — число параллельных результатов
В качестве примера в табл. 6-2 приведена малая серия значений критерия Стьюдента
Таблица 6-2. Пределы интсгирования для (-распределения (выборка)
у — п— 1 1 2 3 4 5 6 „__
t(P=0 95;v) 12 71 4.30 3.18 2.78 2.57 2 45
При соблюдении всех правил метрологии истинное значение, оцениваемое как математи-
ческое ожидание ц, рассчитывается по формуле:
у/п
Нормативные термины, сопровождающие представление результатов количественного анали-
за, согласно стандарту Российской Федерации ГОСТ Р ИСО-5725(1-6)-2002 и некоторых других
важнейших нормативных документов.
Статистическую оценку характеристики погрешности результата анализа опредатяют путем
математической обработки массива результатов анализа одной и той же пробы. Статистичес-
кая оценка характеристики погрешности результата анализа вычисляется только при наличии
необходимого массива данных. Ес вычисление проводится для установления приписанной пог-
решности результата анализа или при проведении анализа в исследовательских целях.
Наблюдаемое значение (observed value): значение характеристики, полученное в результате
единичного наблюдения.
Результат измерений (test result): значение характеристики, полученной выполнением регла-
ментированного (т.е. предусмотренного официальной методикой. Государственным стандар-
том и т.д.) метода измерений.
270 Глава 6
Выброс (outlier)-, элемент совокупности значении, который несовместим с остальными эле-
ментами данной совокупности. что может быть установлено соответствующими тестами. Вы-
брос исключают из обрабатываемых значений результатов измерений.
Точность (accuracy)', степень близости результата измерений к принятому опорному (эта-
тонному. действительному) значению. Опорным значением называют величину, используемую
в качестве согласованной для сравнения с ней полученных результатов. На практике за опор-
ное значение, как правило, принимают математическое ожидание результата определения, т.е.
среднее значение заданной совокупности результатов измерений. Однако зн опорное значение
можно принять и теоретическую величину, найденную i резул1тате научно-исследовательской
работы, или значение, аттестованное национальными или международными организациями.
Правильность (triteness): степень близости среднего значения, полученного па основании
большой серии результатов измерений, к принятому опорному значению Показателем пра-
вил ы ости является значение систематической погрешности Естественно, чем она меньше,
тем выше правильность.
Систематическая погрешность (bias): разность между математическим ожиданием результата
измерения и истинным или (в его отсутствие) принятым опорным значением. В качестве со-
ставляющих систематической погрешности вы еляют неисключенную систематическую погреш-
ность. обусловленную несовершенством реал тзешии принятого принципа измерений, noipciu-
ностъю градуировки применяемою средства измерений и лр. Если математическое ожидание
систематической погрешности известно, то в результат измерений вносят соотвстствмошую
поправку. Например, если систематическая погрешность пропорциональна значению изме-
ряемой величины, го с целью исключения ее влияния используют поправочный множитель
(числовой коэффициент — correction factor).
Систематическая погрешность taoopamopttit (laboratory bias): разность между математическим
ожиданием результатов измерений в отдельной лаборатории н истинным (в отсутствие — при-
нятым опорным) значением измеряемой характеристики.
Систематическая погрешность метода измерений (bias of the measurement method)- разность
между математическим ожиданием результатов измерений, полученных во всех лабораториях,
применяющих данный метод, и истинным (принятым опорным) значением измеряемой харак
тернстики.
1аооракюрная составляющая систематической погрешности (laboratory component о] bias), раз
ность между систематической погрешностью лаборатории при реализации конкретного метода
или методики измерений, и систематической погрешностью метода измерений
Прецизионность (precision): степень близости друт к другу независимых результатов измере-
ний, полученных в конкретных регламентированных условиях. Этот термин является новым
для отечествен! ых химиков-аналитиков. Прецизионность зависит только от случайных погреш-
ностей и не имеет отношения к истинному или установленному значению. Меру прецизион-
ности выражают в терминах неточности и вычисляют как стандартное отклонение s.
Независимые резу и>таты измерении хтя оценки прецизионности получают способом, на кото-
рые не оказывает никакого влияния никакой предшествующий результат. Кра (ними случаями
совокупностей таких условий являются ус овия повторяемости и условия воспроизводимости.
Повторяемость (repeatability): прецизионность в условиях повторяемости. иногда на практи-
ке называемая сходимостью.
Условия повторяемости (сходимости) (repeatability conditions): условия, при которых незави-
симые результаты измерений получают одним и тем же способом и тем же методом на иден-
тичных объектах исследований, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с
использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени.
Стандартное (среднеквадратическое) отклонение повторяемости (сходимости) (repeatability
standard deviation): стандартное (среднеквадрагическое) отклонение результатов измерений, по-
лученных в условиях повторяемости и являющееся мерой рассеяния результатов измерений в
этих условиях. Дополнительно для этой же цели вводят понятия: «дисперсия повторяемости*
(s,-). «коэффициент вариации», «относите1ьное стандартное отклонение» в качестве характе-
ристик рассеяния результатов измерений в условиях повторяемости.
Воспроизводимость (reproducibility): прецизионность в условиях воспроизводимости. Воспро-
изводимость результатов определений и анализа зависит не только от процедуры выполнения
Методы определения токсикантов в биосредах 271
анализа. но н от однородности и устойчивости характерисшк анализируемой пробы разброса
характеристик анализируемых проб, отобранных для проведения анализа.
Условия воспроизводимости (reproducibility conditions): условия, при которых результаты из-
мерений получают одним и гем же методом, на идентичных объемах, в разных набора ориях.
разными операторами, с использованием различного оборудования
Стандартное (среднеквадратическое) отклонение воспроизводимости (reproducibility standard
deviation)' стандартное отклонение результатов измерений, полученных в условиях воспроизво-
димости Таким образом, этот параметр есть мера рассеяния результатов измерений в условиях
воспроизводимости. Действуя аналогичным образом, можно рассчитать дисперсию воспро-
изводимости (sR-) и коэффициент вариации в качестве характеристик рассеяния результатов
измерении, находимых для условий воспроизводимости.
Предел воспроизводимости (reproducibility limit): значение, которое с доверительной вероят-
ностью Р = 95% не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух
и рении, полученными в условиях воспроизводимости
Стандартное отклонение погрешности результата анализа ши определения (standarddeviation):
положительный квадратный корень из значения дисперсии потрешности результата анализа.
Относительное стандартное отклонение погрешности результата анализа (relative standard
лепапоп ’ отношение стандартного отклонения погрешности результата анализа к абсолкттно-
« значению результата анализа.
Аттестация методики анализа (validation): процедура установления (подтверждения) соот-
ветствия методики анализа содержащимся в ней мегролошческим характеристикам. Выполня-
ется органами Госстандарта Российской Федерации (см. гл. 5.8).
Показатели качества результатов анализа ши определения: точность, правильность, препи-
в* тиоегь в условиях повторяемое nt (сходимости) н воспроизводимое ги.
Протокол аналша (protocol of analysis): документ, содержащий результат анализа, а 1акже
Х>ту»о необходимую для его правильного и однозначною понимания информацию. Протокол
-длила может быть выполнен на любом носителе (бумажном, электронном). Требования к
: ».знию протокола установлены в ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2000.
Сертификат химического состава: документ, удостоверяющий состав объекта аналитическо-
го асследования или определения отдельного компонента в нем, в отдельных случаях также его
структуру и или свойства объекта как результат выполненной работы.
ка ество результата химического анализа: результат количественного химического анализа
связывают с качеством пробы, которая по составу должна быть как можно более близкой ис-
следуемому объекту, и с метрологическими характеристиками метола анализа и методики кон-
«ретного аналитического определения. Погрешность пробоотбора вносит свой вклад в общую
-• ре иность результата, что выражается формулой:
2 2
s2 - 5н + -
т т nj
гжг — дисперсия среднего результата, погрешность пробоотбора. .гА— погрешность ана-
лоя. м — количество проб. лу— количество параллельных определений.
Важнейшей характеристикой метода количественного анализа является пре юл обнлружс-
в* то есть наименьшая концентрация определяемого вещества, при которой регистрируют
ежнад. надежно отличимый от сигнала фона. Это отличие устанавливают с заданной всро-
сэостыо Р Теория обосновывает величину Р = 99.87%. В этом случае предел обнаружения,
жь мер компонента А — с(А)и1)Н, можно найти по формуле Кайзера:
А
ое у,— сигнал фона; о„ — погрешность измерения сигнала фона: А — коэффициент чувс-
•в^глмости — гангснс угла наклона градуировочной кривой. Таким образом, чем более
чувствителен метод, тем больше коэффициент чувствительности и тем меньше предел обна-
> «г-ия Чем протяженнее линейная область градуировочной кривой, тем лучше, поскольку
i зффициент чувствительности будет сохранять свое значение постоянным во всем рабочем
сжата зоне.
272 Глава 6
Разумеется, измерение аналитического сигнала должно быть селективным и специфичным,
т.с. прибор должен откликаться только на определяемый компонент пробы и не испытывать
влияния всех прочих составляющих, в том числе и матрицы. Селективность метола сильно за-
висит от его природы и правильного выбора условии определений. Эта сторона аналитического
процесса должна всегда строго контролироваться.
Для тою чтобы результаты определений были точными, правильными, воспроизводимы-
ми и прецизионными, необходимо их сравнивать с результатами анализа, полученными с га-
рантировано установленными пшрешностя.ми. особенно важно минимизировать или учесть
систематические потрешности. Это приводит к необходимости использовать стандартные об-
разцы состава, т.е. образны реальных пешееiи и материалов, химический анализ которых был
выполнен с особой тщательностью, различными прецизионными методами, с хорошо гомо-
генизированными пробами. Стандартные обр зиы предназначены для градуировки. проверки,
калибровки аналитических приборов, а также осуществления контроля качества вешеств и
материалов. С практической точки зрения стандартные образцы состава можно разделить на
адекватные и неадекватные по опюшепию к пробе. Адекватные стандартные образцы наиболее
приближены по химическому составу к анализируемой пробе. Они необходимы при исполь-
зовании аналитических методов, чувствительных к посторонним компонентам пробы. Так об-
стоит дело, например, с рентгеиофлюоресцентным метолом. В отличие от него аналитические
методы, имеющие дело с предварительным переведением пробы в раствор. например атомно-
эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой, обычно не требуют применения
адекватных стандартных образцов (см. гл. 6.4.3.). Это позволяет существенно сократить число
используемых стандартных образцов.
Результаты анализа образца стандартного состава часто используют в качестве принятого
опорного точения. Оно служит в качестве согласованною для сравнения с получаемыми ре-
зультатами при анализе неизвестных проб Если стандартные образны недоступны, в качестве
принятого опорного значения используют математическое ожидание измеряемой характерис-
тики. т.е. среднее арифметическое значение заданной совокупности результатов анализа (как
и было показано выше):
Разность между математическим ожиданием результата измерений и истинным (или в его
отсутствие принятым опорным) значением характеризуют смете магической погрешностью.
Поэтому удобно определить точность как степень близости результата измерений к принятому
опорному значению. С другой стороны, если говорят о степени близости к принятому опор-
ному значению среднего значения, полученного на основании большой серин результатов из-
мерений. то псп ьзуют параметр правильность. Показателем правильности является значение
систематической погрешности.
Качество работы аналитика передает степень близости друг к другу независимых результа-
тов измерений, полученных в конкретных оюворенных на практике условиях, которую, как
указывалось, называют прецизионностью. Прецизионность зависит только от случайных по-
|рсшностей. Поэтому меру прецизионности выражают в терминах неточности и вычисляют
как стандартное отклонение. Стандартное отклонение единичного определения вычисляют по
формуле (к < и было показано выше):
Ец -*)2
где п — число пархиельных определений. Стандартное отклонение среднею арифметического
находят, используя выражение (как и было показано выше):
д. -х?
s- ----------------•
j «(n-1)
Методы определения токсикантов в биосредах 273
Если независимые результаты измерении получают одним и тем же способом и тем же ме-
тодом на идентичных объектах исследований, в одной и той же лаборатории, одним н тем же
оператором, с использованием о ного и того же оборудования. в пределах kojkhkoto проме-
жутка времени (т.е. соблюдают условия повторяемости), то прецизионность, найденную при
лих условиях, называют повторяемостью. Ес характеризуют (как и было показано выше) стан-
дартным (ерелнеквалран1ческим) отклонением повторяемости (или сходимости) (sr):
5Г жз/х.
Прецизионность можно понимай, несколько шире, когда резу штаты измерении получа-
ют о ним и тем же методом, на идентичных объектах, но в разных лабораториях, разными
операторами, с использованием различного оборудования. Перечень этих параметров называ-
ют условиями воспроизводимое нт. Следовательно, воепрм видимость — эго прецизионность,
охарактеризованная в условиях воспроизводимости. Для характеристики меры рассеяния ре-
зультатов измерении в условиях воспроизводимости используют стандартное (среднеквадрати-
ческое) отклонение воспроизводимости (х ). т.е. стандартное отклонение результатов измерений,
полученных в условиях воспроизводимости:
д — л / х.
При нахождении параметров воспроизво himocth важно использовать такую совокупность
it лученных результатов, которая нс содержит выбросов — резко выделяющихся значений,
несовместимых с осныьными данными. Выбросы устанавливают с помощью соответствую-
щих статистических тестов (Манделя и Кохрена). При соблюдении всех условий метрологии
вычисляют доверительный интервал А для среднего значения, в пределах к горою с заданной
вероятностью (здесь обычно Р = 0.95) находится истинное значение (как и было показано
выше) при учтенной систематической погрешности, оцениваемое как математическое ожи-
дание р:
6 = /(P.v)х, = " следовательно. р
у'/Т \П
зе 1 Р v) — критерий Стьюдента, описывающий распределение результатов относительно
среднего, найденного по небольшой выборке этих результатов: находится по таблицам для
доверительной вероятности Р = 0.95 и числа степеней евобо ы v = п — I.
Физико-химические методы анализа (ФХМА). Результат измерения характеристических
свойств в ФХМА — сигнал — несет в себе качественную и количественную информацию
об определяемом веществе, его элементном, изотопном, молекулярном и фазовом составе.
Отклик прибора, измеряемый аналитиком, называют сигналом Аналитический сигнал мо-
жет измеряться непосредственно при прямом изучении объекта, что. однако, возможно очень
редко, пли (стандартная ситуация) пос : проведения нробоподготовки. связанной, например,
с переведением пробы в гомогенный расi вор. и. если нужно, проведением соответствующей
аналитической реакции. Достоинства ФХМА состоят в низких пределах обнаружения, высокой
чувствительности, избирательности (селективности), быстроте определения, возможности ав-
томатизации. осуществления дистанционного анализа, неразрушаюшего анализа и т.д.
Градуировочная зависимость. Для получения количественной информации в ФХМА необ-
ходимо установить градуировочную зависимость, отражающую функциональную зависимость
интенсивности сигнала от концентрации определяемого компонента при поддерживаемых
постоянными оптимальных условиях выполнения определения избранным методом. Сначала
приготавливают пли используют специально приготовленные и аттестованные стандартные
образны состава, содержа цие определяемые элементы в разных количествах, отвечающих ожи-
даемым в пробе. Далее измеряют сигналы всех этих образцов S. Из результатов измерений
находят градуировочную зависимость в виде уравнения прямой липин (представлено в соот-
ветствии с рекомендациями ИЮПАК).
у - Г(х) + еу1
F(x) = В + S = В + Ах,
у = В + Ах + еч.
274 Глава 6
где у — измеренный сигнал. рассматриваемы» в качестве зависимой переменной: F(xJ — градуи-
ровочная зависимость. выраженная в математической форме как уравнение прямой липин; х —
концентрация каждого определяемого компонента, расемтнриваемая в качестве независимой
переменной; А. В — параметры уравнения прямой линии, представ.июшис соответственно
коэффициент чувствительности и сигнал нулевой линии; с. — погрешность измерения сигнала.
Погреш! ость е} оценивается как случайная вез ичпна для среднего арифметического, равно-
го пулю, npi отсутствии смешения и характеризуется стандартным отклонением s. Параметры
уравнения прямой оцениваются с помощью стандартных способов математической статистики
(см. выше).
Коэффициент чувствитс.чы ости А. строго говоря. — первая производная функция от сиг-
нала у по концентрации х: А = г)у/йх. Этот тезис оказывается полезным, если зависимость
сигнала от концентрации будет нелинейной.
Предел обнаружения и предел определения Естественно, на ФХМА в полной мере распростра-
няются рассмотренные ранее общие положения количественного анализа, касающиеся предела
обнаружения, измерения аналитического сигнала, качества результатов химического анали-
зе Можно сделать одно дополнение. И з уравнения, связывающего сигнал с концентрацией,
видно, что проб ема возникнет тогда, когда концентрация будет очень низкой и придется
решать вопрос об использовании мето lob математической статистики. Предел обнаружения —
величина вероятностная Возникает разумный вопрос о погрешности, с которой эта величина
может быть установлена. Как было показано выше, пределу обнаружения
, А. Ур + Зо0 .
е(А)МИ11—
где о„ — погрешность измерения сигнала фона, отвечает наименьший измеряемый сигнал,
равный у0 + Зоп Допустим для простоты, что средний сигнал фона статистически незначимо
отличается от 0. т.е.. что = 0. Этой ситуации отвечает соответственный сигнал нулевой линии
В = 0. Тогда относительная погрешность sr. с которой этот сигнал, следовательно. и с(А)и1<11
могут быть установлены, составит:
зг *• 100° о = 33%„„
Зст()
Это зеоретическая rioipeniHocii. только измерения наименьшею сигнала и эквивалентной
ему концентрации, но без погрешности отбора пробы и выполнения процедур пробоподго-
товки. Так что реально погрешность будет даже больше. Конечно, такая погрешность не мала
Когда можно поити на это? В том случае, когда лучше выпол) ить определение с погрешностью
в десятки процентов, чем не выполнять его вовсе. Для того чтобы огойти от таких больших
погрешностей в ФХМА используют понятие о предел определения, когда погрет ноет измере-
ния сигнала составляют единицы процента (иногда и доли его в зависимости от метола). Это
пожелание можно записать в виде формулы, подобной полученной при определении предела
обнаружения, отличающейся тем. что за предел определения можно принять енгна.. превыша-
ющий погрешность измерения фона на порялок. Поэтому предел определения:
Чл7|1рОПРЕЛ
Таким образом, концентрация, отвечающая пределу определения, — это область, с кото-
рой начинается стандартный количественный химический анализ, выдающий результаты с
погрешностями, отвечающими как паспортным данным прибора, гак и соответствующим нор-
мативам качества методик анализа.
Подтверждение аналитического метода Цель подтверждения метода — это доказагельство
соответствия данного метола своему назначению и пригодности для решения конкретной ана-
литической задачи. Необходимо установить рабочие характеристики и ограничения метода,
способность правильного обнаружения при наличии мешающих веществ в матрице пробы и
точность, достижимую при использовании данного аналитического метода Подтверждение
проводится для качественною и количественною определения анализируемых токсикантов
при разработке новых методов и методик для решения конкретной задачи, пересмотре исполь-
Методы определения токсикантов в биосредах 275
зуемых мсголов н методик с целью их удлинения шн в связи с изменением аналитической за-
дачи. использовании другого измерительного обору юна пня или методик, а также обнаружении
изменений рабочих характеристик метода.
Для качественного определения используются такие параметры, как идентичность обнару-
жения и сслективность/спенифичность метола, предел детектирования, устойчивость метола
по отношению к изменениям аналитических условии.
При проведении количественного анализа, помимо указанных выше, используют и другие
характеристики: предел количественного обнаружения, рабочий и линейный диапазон измеря-
емых концентраций, правильность измерений, прецизионность измерений, неопределенность
«неточность) измерений, связанная с установлением допуска па результаты измерения; а также
степень изздемёпия. характеризующая полноту извлечения анализируемого вещества из матри-
цы пробы. Приведем некоторые примеры. Подтверждение идентичности — это доказательство
того, что полученный при измерении сигнал обусловлен именно анализируемым веществом
(но не подобным) и не носит случайного характера. Так. при идентификации анализируемого
вещества методом масс-спектрометрии (МС) получают однозначный результат, не требующий
дополнительных способов подтверждения идентичности. Другая ситуация возникает при ис-
пользовании методов газожидкостной хроматографии (ГЖХ) пли высокоэффективной жидкост-
ной хроматофафии (ВЭЖХ). Идентификация элюируемого пика должна быть проведена на
cooiuciciBue анализируемому веществу Для этого существует стандартная процедура, коюрая
предусматривает сопоставление результатов хроматофафического и масс-спсктрального ана-
лизов набора из 5 проб биообразна (например, мочи), каждая нз которых содержит но одному
нз выбранных для эксперимента веществ.
Надежность измерений в присутствии мешающих вешеств в матрице пробы оценивают по
таким параметрам, как селективность и специфичность (или 100% селективность), с использо-
ванием стандартной процедуры анализа бланковых (пссодержаших определяемые вещества) и
содержащих определяемые вещества проб (не менее 5 в каждой фуппс) Ес. и на какой-либо
из 5 хроматограмм бланковых проб на определенных ее участках заметны пики при соотно-
шении сигнал/шум > 3:1, то метод нуждается в доработке; в противном случае селективность
считается приемлемой.
При опенке устойчивости метода оценивается вклад как пробоподготовки, так и измере-
ния аналитического сигнала с помощью соолветствующсго оборудования, рассматриваются
параметры метода и выбираются ге. которые могут значительно повлиять на качество анализа.
Если анализ проводят на современном оборудовании (методы ГХ-МС. ВЭЖХ. ИК-Фурье-
спектромегрпя. ЯМР-снектрометрия и др.), где парамефы мегоди находятся ш д жестким ком-
пьютерным контролем, исключающим влияние человеческого фактора, то любые отклонения
легко выявить на этапе контроля качества анализа. Поэтому подобные методы следует считать
устойчивыми и нс принимать в расчет устойчивость метола при оценке неопределенности ре-
зультатов измерений (см. ниже).
Предел количественной оценки (минимальной конценфаипи вещее (ва, которую можно из-
мерить с приемлемым уровнем повторяемости и правильности) используют при определении
рабочего диапазона измеряемых концентраций. Предел количественной оценки (LQ) для хро-
матографических методов определяется по следующей формуле:
I Q = J-+IOv.
LD
где LD — предел детектирования, Лт — средняя площадь пика анализируемого вещества по 10
пробам, s — стандартное отклонение. Полученный предел количественной оценки используют
как начальную точку рабочего участка диапазона измеряемых концентраций.
В к личес!венном анализе любой метод должен иметь рабочий диапазон концентраций
анализируемого вещества, в котором справедливы проведенные измерения. Нижний предел
рабочего диапазона — это предел количественной оценки, верхний предел диапазона зависит от
возможностей аналитического оборудования, на котором проводятся измерения. В пределах
рабочего диапазона может существовать линейный диапазон измеряемых концентрации. На-
личие линейного диапазона существенно упрощает калибровку, так как позволяет проводить
276 Глава 6
ее по одной точке с расчетом коэффициента наклона линейною участка. В специальной мето-
дической литературе приводятся стандартные процедуры определения этих характеристик для
различных методов. Гранины рабочего и линейного диапазона коннснтрвннй. коэффициент
наклона линейного у метка характеризуют возможности и ограничения метода
Точность гестирузЛся определенными процедурами (см. выше). Гочносгь измерений вы-
раж ется также одной величиной. учшываюшезз вклад значимых процедур анализа в общий
результат измерения и называемой исонредезенностью измерения. Неопределенность измере-
ния описывает диапазон значений возможного ре зульташ измерения в виде одного парамезра
(обычно ерс шсква.тратнческого отклонения или ловерителз.ного интервала) При расчете не-
определенности измерения должны учитываться все сушесз венные воздействия операционных
процедур на конечный результат измерения. Основными составляющими неопределенности
измерения являются:
• преззилзонноезъ резулыазов измерении.
• постоянное смешение и его ззеонреле.зеиноезь. учитывавший как смешение результата из-
мерения, так и неопределенность значения концентрации используемого стандарта,
• неопределенность. связанная с пробопадготовкоп зз приготовлением стан, аргзззнрованпых
образцов:
• любые существенные операционные эффекты. устанс ленные при тсстирова ши устойчи-
вости метода.
Повторяемость, являющаяся лабораторной оценкой нрсннзионноспз метола, зависит от
величины измеряемого сигнала, следовательно. неопрелеленносп. ре зультата измерения так-
же зависит от измеряемой конззентрапнзз Для объективной оценки неонределешзости метол
повторяемость проверяют путем анали за стандартизированного обра на с 3 уровнями концен-
траций. соответствузошимзз началу, середине зз концу линейного участка диапазона измерения.
Неонрз. зелен ноет ь измерения, связанная с прецизионностью результатов измерения, оззензз-
вастся по результатам тестирования пренизнонпости. Расширенную опенку прецизионности
е учетом пробоио.и отовки зз приготовления стандартизированных образцов проводят следую-
щим образом.
I. На линейном участке измеряемых концентраций выбирают 3 точки в начале, середине
и копне участка и из 3 ооразнов бланковой пробы готовят стандартизированные образны с
добавкой интересующего вешества в 3 выбранных концентрациях (9 стандарт зированных об-
разцов).
2. Полученный набор из 9 проб анализирую!- 5 раз на соопзстсзвуюшем измерительном
оборудовании.
3. Для каждого уровня концентрации по 15 рсз\ зьтатам измерений (для 3 стандартизирован-
ных образцов) onpe елмют среднюю кониензрацню зз среднеквадра!ичсское отклонение
14
DG срг
зле С — копнезгграпззя. полученная при одиночном измерении: С — средняя концентрация
анализируемого ззсшссгвн по 15 пробам.
Неопределенность и .морения. связанная с постоянным смешением, оценивается по резуль-
татам теспзрования правильноеm метода Для каждого уровня концентрации вычисляются
средняя концентрация и срсднекнаизразичсское отклонение st:
I _______________________________________________
где Ct — концентрация, патученная прзт одиночном измерении; С — ссртифизизрованное зна-
чение концентрации стандартизованного образна.
Методы определения токсикантов в биосредах 277
В сертификате стандарта указывается степень его чистоты, что предполагает прямоугольное
распределение вероятности. В этом случае неопреде 1енность связэнная со степенью чистоты
стандарта, определяется как:
I Р
тле Р — степень чистоты используемого стандарта.
Современные методы анализа являются устойчивыми (см. выше) по отношению к опера-
ционным факторам, поэтому оттенка неопределенности, связанная с устойчивостью метола, не
требуется.
Обитая неопределенность измерении оценивается как:
_ II ^_Р_
С V С
Сс
тын
1/(Сл) = Сях\\С
+ «Л
где u(CR ) — неопределенность результата измерений; CR — результат измерения.
Протокол оформляется в виде таблицы с указанием диапазона измеряемых концентраций
и соответствующих неопределенностей измерения. Для вывода о количестве определяемого
вещества н пробе также необходима опенка степени извлечения. Стандартным способом оттен-
ки эффективности экстракции являются введение в исходный б. анковый образец добавки с
известной концентрацией, проведение полною никла пробоподготовки и измерение концент-
рации вешества. вне ленного в виде добавки в анализируемую пробу. Недостаток этою способа
состоит в том. что введенное вещество не удерживается в матрице так же сильно, как и анали-
зируемое при естественном присутствии в биосубстр; с. Эго приводит к завышенной опенке
степени извлечения. Однако этот способ является единственным, который применяется н
практике. Опенка степени извлечения производится по стандартной методике
Степень извлечения определяется для каждого уровня концентраций (на линейном участке
измеряем ых концентрации выбираются 3 точки в начале, середине и конце) участка из следу-
ющего соотношения:
/?(%)= С| ,С;хЮ0
где С! — измеренная концентрация вещества в пробе с добавком: С, — измеренная концентра-
ция вешества в бланковой пробе: С, — концентрация добавки на данном уровне.
Алгоритм процедуры подтверждения метода. Многие операции опенки метода являются
Функционально идентичными, и результаты операций по оценке одного из параметров метода
могут быть использованы для опенки другого параметра.
Алгоритм процедуры подтверждения метода следующий.
J. Готовят 5 стандартизированных образцов с добавками по одному веществу анализируемо-
го класса с максимально возможным различием в химической структуре (качественный анализ)
или один стандарта тированный образен (количественный анализ) со средней концентрацией
добавок и производят опенку идентичности обнаружения и селективности метола.
2. Определяю! предел детектирования (качеа венные и количественные метолы анализа).
3. Определяют предел количественного обнаружения.
4 Определяют рабочий и линейный диапазоны измеряемой концентрации.
5. Проводят JO-кратаый анализ проб с kohuchiрациями, шхмветствуюшими началу, середи-
не и концу линейного участки диапазона, но результатам которою определяют правильность и
препи зионность метода.
278 Глава 6
6. Проводят анализ бланковой пробы, которая была использована лля приготовления стан-
дартизированных образцов и по результатам лого анализа и анализа по и. 5 проводят опенку
степени извлечения вещества нз матрицы пробы.
7. Из двух образцов рахтнчной бланковой пробы (не использованной в и. 5 и 6) готовят
пробы с концентрациями, соответствующими началу, середине и концу линейного участка
диапазона (6 проб), и проводится их 5-кротный анализ.
S. Случайным образом выбираю! 5 из 10 результатов анализа на каждом уровне концент-
рации по п. 5 (15 результатов), которые вместе с результатами анализа но п. 6 использую! для
оценки расширенной повторяемости и расчета неопределенное!и измерения.
В современной практике нередко проводя! совместный оценочный эксперимент — меж-
лаборагорный эксперимент, в котором ноказгиели работы каждой лаборатории оценивают в
условиях применения одного и того же сгандар!ного метола измерений на идентичном мате-
риале. Здесь можно упомянуть и о таких параметрах химического анатпза, как затр.иы на его
проведение и. таким образом, стоимость получаемой информации.
Автоматизация методов анализа. Авюматнзированные системы широко применяют при вы-
полнении биохимических исследований. в экологической химии, экоюксикологин (см гл. 10)
п других областях, не гребхегся высокая производительность анализа. Атома тзиронанные
системы включают пробоотбор. пробоподгоювку. измерение сигнала. его обработку и сопос-
тавление с имеющейся базой данных. Поскольку приходится обрабатывать много данных, очень
удобно использовать соответствующую микропроцессорную технику в сощземенных приборах
компьютер составляет часть прибора. Развитие .пломатческих меюдов анализа стимулируется
повышением надежности и экономичное!и анализа при уменьшении ею стоимости, операшв-
ноегыо получения большого объема точной аналитической информации.
Существую! два подходя к авюмап!зации аналитических определений в растворах. Реализуя
первый, стремятся создать авюма!нческин анализатор, который бы полнощью или частично
выполнял обычные аналти icckhc работы. Э о сложно и дорого. Более удачным оказался вто-
рой. принципиально иной подход, основанный па идее непрерывною анализа Здесь анализи-
руемый раствор непрерывно перемешается с помощью нерпе талы ическото насоса по жидкос-
тным коммуникациям прибора, чаще всего это просто система узких цдаептковых трубок. При
этом к нему лобавлякмея необходимые реактивы и аналитическая реакция протекает в потоке.
Определение конценграции продукта аналитической реакции — аналитический сигнал — осу
шесгвляется непрерывно с помощью детектора, когда участок потока с продуктом реакции
преходит сю. Сигнал ретстрирхется прибором. В этом случае наиболее просто достигаются
условия, обеспечивающие воспроизводимость проведения аналитических реакций и измере-
ний. Способ окажется очень удобным, простым и эффективным. Разумеется, он сочетается
с автоматическим пробоотборником — устройснюм. позволяющим ашоматичехкн отбора ib
жидкие пробы, осуществлять их смену и направление в анализатор. Ешс более удачным ока-
зался метод непрерывного анализа, предложенный в 1974 г. Ружичкой и Хансеном и названный
ими нрогочно-инжекниоиным анализом (НИХ) (Пои injection analysis), схема осуществления
которою приведена па рис. 6-1. ГI pool, инжектированная в поток решен га. вступает с ним в
реакцию и образует, например, окрашенный про ту кт реакции, регистрируемый талес детекто-
ром в виде аналитическою сигнала. В ПИА чаше всею используют спектро<1ютометричсские
легок оры (производительность до 200—300 проб в I ч). Особенности ПИА. отличающие сю
от других аналитических методов:
• быстрота выполнения (экспресс!гость) и. следов пельно. экономия рабочего времени, так
как отпадает исоохолимость в выполнении вручную длительных рутинных аналитических
операций. связанных с разбавлением растворов, добавлением реагентов, с работой на ана-
литических приборах;
• высокая воспроизводимость измерении и. следовательно. надежность результатов анализа:
• осуществление химико-аналитических реакции в закрытой в техническом смысле слова
проточной системе в отсутствие контакта с другими веществами и атмосферой;
• возможность использования неустойчивых реагентов; генерирования их непосредственно в
потоке:
Методы определения токсикантов в биосредах 279
а
Рис. б-t Схемз ПИЛ и пример регистрируе-
мых пиков.
1 — раствор реагента; 2 - перистальтический
насос; 3 — смесительная спираль: 4 — проточ-
ная кювета спектрофотометрического детекто-
ра: 5 — регистратор: б — слив. Внизу — вид
регистрируемых пиков, а - ввод стандартов;
б — пробы.
• экономия дорогостоящих аналитических реагентов, на анализ каждой пробы расходуется
100—300 мкл раствора реагента;
• большая гибкость в создании новых схем автоматического анализа: возможность использо-
вания различных параметров пика — высоты, площади, ширины — для определения кон-
центрации.
Способ используют при мониторинге за здоровьем населения в экотого-токснкологических
или санитарно-гигиенических исследованиях, например при химических катастрофах.
Информационная эффективность методов анализа и их общая оценка. Качество результата
определения должно быть оценено с точки зрения его погрешностей и должны быть охарак-
теризованы надежность, качество этой погрешности. Поэтому, согласно разработкам в этом
области, из которых принципиальные присутствуют в соответствующих современных норма-
тивных документах, необходимо учитывать следующие параметры качества анализа;
• качество пробы и пробоподготовки;
• предел обнаружения и предел определения:
• чувствительность.
• селективность (специфичность):
• линейную область градуировочной зависимости;
• точность:
• прецизионность в условиях воспроизводимости и сходимости;
• правильность (мера правильности);
• [юбастость — устойчивость результатов к небольшим колебанияУ! внешних условий:
• затраты и стоимость одного анализа;
• информацию.
В зависимости от конкретной ситуации опенка и значение этих параметров могут приобрес-
ти характер своеобразных лингвистических переменных, которые в принципе также могут быть
280 Глава 6
зхаракзерзг зованы математически. Все многообразие харак|еристик можно снести к одному ин-
тегрирующему показателю и численной мере. Общий интерес представляют такие параметры,
как время, необходимое для выполнения анализа, точность получаемых результатов и разре-
шающая способность метола. Аппарат хемометрики — пограничной области науки, в которую
входя! статистика аналитическая химия и методы вычислительной матсматки— позволяет
подойти к решению проблемы с точки зрения теории информации, исходя и з уравнения Шен-
нона. Гак. н качественном анализе возможны только лна вывода: компонент присутствует иди
отсутствует. Поэтому в качественном анализе максимальное получаемое количество ип<|юрма-
нии •= 1og,2 “ I составит I биг тот binary digit — двоичная единица измерения количества
информации но Шеннону). В количественном анализе учитывают конкретные особенности
метода анализа, например время выполнения определения, разрешающую способность мето-
да. рабочий диапазон измеряемых концентрации и другие. Поэтому объем информации I в
битах, предоставляемой методом анализа. может быть оценен по следу тощей более сложной
формуле:
где i — имеющееся в распоряжении аналитика время; г, — время, необходимое .тля выполнения
анализа данным метолом (при лА параллельных): гя|м — диапазон измеряемых свойств:
— полуширина сигнала; з^., хШ11 — интервал измеряемых концентраций. зж — случайная
погрешность; log, — двоичный лотарифм.
Таким образом, если качественный анализ способен предоставить только I бит информации,
то химические методы, например травимстрия и гнтримстрия — один-два биг информации,
атомный эмиссионный анализ и рентгеновская спектрометрия — уже согни бит. а масс-спектро-
метрия — тысячи бит. Эю обьясняется тем. что в современных приборах вс тик диапазон изме-
ряемых сит налов и диапазон измеряемых содержаний — до 5—6. а точность очень высокая.
При всесторонней опенке метода анализа немалую роль играет и стоимость, к зторая скла-
дывается из всех действительных затрат (амортизация аппаратуры, стоимость материалов,
энергии, заработная плата и т.д.). Поэтому отношение количества полученной информации к
затратам может характеризовать рентабельность метола анализа. С точки зрения рассмотрен-
ного информационного подхода большему диапазону определяемого соде] жания при прочих
равных условиях отвечает и большая информационная эф<|)сктивностъ метода. Физико-хими-
ческие методы анализа имеют принципиально более низкие пределы обнаружения и несрав-
ненно более эффективны, чем кялсснчеекие химические метопы (травимстрия и гитримет-
рия). Информационная мощь таких гибридных методов, как ГХ-МС или ВЭЖХ-МС-ЯМР (см
гл. 6.3.3. 6.4.2.). имеет значительные преимущества при единовременном выполнении сравни-
тельных исследовании большого числа определяемых аналнтов.
6.2. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ
Огличтнь снос от чужою — главное условие жизни.
Ф.\1. Бернет
6.2.1. Классификация и сущность иммунохимических методов
Теория селекции клонов австралийского исследователя, лауреата Нобелевской премии
Ф.М (юриста (!Я99—1985). дала оттзет на вопрос, почему, попадая в организм, антиген вызы-
вает синте з именно тех антител, которые специфично реагируют только с ним.
Бернет утверждал. чго одна клетка синтезирует лишь один тип антител. которые локали-
зуются на ее поверхности. Пос гедхюшие эксперименты полностью подтвердили положение о
том, что антитела формируются до н независимо от встречи с антигеном.
Методы определения токсикантов в биосредах 281
Предназначение антигена заключается в том. чтобы отыскать нужную клетку, несущую на
своеп мембране антитело. реагирующее именно с ним. а затем активировать эту клетку. Ак-
тивированный лимфоцит вступает в деление и дифференцировку, что приводит к возникно-
вению из одной клетки 500—1000 генетически идентичных клеток (клонов), синтезирующих
одни и тот же тип антител, способных специфически распознавать анттнен и соединяться с
ним
Иммунохимическис методы (ИХМ) анализа на протяжении нескольких десятилетий уснет
по применяются тля обнаружения вирусов, токсинов, гормонов лекарственных препаратов,
наркотиков, экотоксикантов в биосредах человека и животных. ИХМ используются в различ-
ных областях медицины, микробиологической и пищевой промышленности, сельском хозяйс-
тве. В 1977 г. доктор Ялов получил Нобелевскую премию в области медицины за развитие и
совершенствование аналитического метода, основанного на принципе ралиоиммунологичес-
кого анализа (РИА).
ИХМ основаны на связывании определяемого со динепия со специфическими антителами,
полученными специально на данный аналтгт, и дальнейшей тстекцин образовавшихся комп-
лексов с помощью различных меток и методов определения
В основе ИХМ анализа лежит обратимое псковаленгпос связывание антигена со специфи-
ческими антителами. Эта реакция подчиняется закону действующих масс:
h
Аг + Ат > Аг:Ат.
(свободные компоненты) к (связанная фракция)
где Ai — специфические антитела. Аг — антиген; Аг:Аз — комплекс антиген—антитело: к] —
конемппт скорости образования комплекса, к, — константа скорости диссоциации комплекса.
Реакпия обычно протекает ю установления в системе равновесия, когда конненграний ан-
тигена. присутствующего в свободном и связанной фракциях, остаются постоянными. Реакция
антигена с антителом используется для определения концентрации одною из этих реагентов.
Лнтиген — вещество, способное вызывать биосинтез специфических антител (высокомоле-
кулярные вешества — белки, полисахариды и т.д.). Иммуногенность — способность вызывать
иммунный отпет. Антигенность — способность обра овывать комплексы с антителами Анти-
генная детерминанта — функциональные труппы на поверхности антигена. Антитела — спе-
цифические тнтигста крови (иммуноглобулины).
/1о.шк.юна.и>ные антитела — гетерогенные но структуре активного центра и физико-хими-
ческим свойствам. Моноклональные — гомогенные по специфичности и физико-химическим
свойствам. Гаптены — низкомолекулярные вещества, нс способные вызывать образование ап
титс.т. но приобретающие иммуногенные свойства после коньюгировання с высокомолекуляр-
ными носителями.
Антитела являются ключевым компонентом всех ИХМ. так как именно они в значительней
степени определяют чувствительность и специфичность анализа. Ан гите да характеризуются
наличием в своей структуре специфических антитенсвязывающнх центров, которые способны
с высокой специфичностью распознавать молекулы антитена п взаимодействовать с ними.
Антитела — иммуноглобулины, продуцируемые лимфоцитами утлекопттгаюших в ответ на ино-
родные вещества, введенные в организхт. Этот биологический феномен был использован идя
введения определяемых веществ птперчувствитсльным животным с последующим сбором сы-
воротки крови, содержащей специфичные к этим соединениям антитела. Белки сыворотки
крови животных, которые специфически связываются с антигеном, подразделяются на 5 клас-
сов: IgG. IgM. IgA. IgE и IgD. Около 90% иммуноглобулинов составляет IgG (рис. 6-2) — моно-
мерная форма с двумя легкими пептидными цепями и с двумя тяжелыми пептидными цепями
связанными дисульфидными мостиками (молекулярная масса 150 000 Д). Часть молекулы,
называемая Fab-об. астью. содержит петтныную последовательность, представляющую соботт
область распознавания (связывания) антигена. Антитела специфически связывают антигены,
основываясь на молекулярной структуре штигена и пространственной ориентации молекул.
Основным приншшоут структурной организации аигигснсвязывающп.х пентррв является
политнтровая модель. Во взаимодействии с антигенами принимает участие большое число
аминокислотных остатков антитела. Для различных систем иммунных комплексов участок спя-
282 Глава 6
Рис. 6-2. IgG — мономерная форма с лву
мя легкими пептидными цепями (СИНИЙ
и зеленый цвета) и с двумя тяжелыми
псптилнымн цепями (голубой и песоч-
ный цвета), связанными дисульфидны-
ми мостиками. Fab-облаеть отмечена
красным цветом Пояснение в тексте.
зывания может иметь форму негдхбокой выемки, клино- или конусообразной по юсти. Качест-
во антитела существенно влияет на чувствительность и специфичность анализа. Антитела будут
игнорировать многие вещества, которые не похожи на антигены, но также бу тут связывать
многие вещества, которые структурно ротственны. Связывание структурно родственных ве-
ществ называется перекрестной реактивностью. Малые молекулы (молекулярная масса менее
2000 Л) не являются антигенными, поэтому необходимо «обмануть» иммунную систему' для
стимулирования продукции специфических антител. Для этого перед введением в организм
животною связывают малую молекулу с бо тишей — антигенным компонентом. После получе-
ния иммуногена проводят иммунизацию животного. Животное будет продуцировать антитела,
специфичные к малой молекуле. В зависимости от типа антител используют разных животных
н разные методы иммунизации. Использование антител как природною инструмента распоз-
навания и выделения анализируемого вещества имеет ряд преимуществ. Антитела легкодоступ-
ны. могут быть произведены в любом количестве и при небольших затратах. Для проведения
ИХМ требуется настолько малое количество антител, что иммунной сыворотки, например от
одного кролика достаточно для определения анолита в более чем 5 млн проб.
Детекцию образовавшегося комплекса антиген — антитело осуществляют, вводя метку в
одни из исходных компонентов системы. В иммуноаиализе могут применяться различные мет-
ки. обеспечи дюшис относительно простио и быструю детекцию, а также необ одимую для
анализа чувствительность. Наиболее удобными для пммуноанализа оказались изотопные, фер-
ментные. флюоресцентные, парамагнитные метки
ИХМ анализа классифицируют, используя различные сущность метода, стандартные пре-
параты. характеристики антител, типы применяемой метки, системы детектирования и лр.
(1абл. 6-3).
'Таблица 6-3. Классификации ИХМ
Сущность метола Конкурентное связывание: одна антшеннля детерминанта на
определяемом веществе анализ выполняется в условиях ограни
ченного количества реатеша
Неконкурентное связывание: на определяемом веществе должны
быть две нсиерскрывиюшисся антшенныс детерминанты; анализ
выполняется в условиях избытка реагента
Неравновесный режим: используется одна антигенная детерми-
нанта: строю контролируемый избыток реагента
Применение стандартных преиа- В качестве антигенов па твердой фазе; для получения антител:
ратои лля определения выделенных гаптенов
Методы определения токсикантов в биосредах 283
Окончание ma&i. 6-3
Характеристики используемых аипггел Mono- или поликлональные антитела Антитела различного типа (JgG или JgM) и подтипа (JgG (или JgG 2а) Моно- или поливалентные антитела Моно- или биспецифические антитеза Анштелп нативные или полученные химическим (генно-инженерным) путем Антиаллотипичсскис или антинлиотиинческне антитела Антитела, меченные или связанные с твердым носителем
Тип применяемой метки Частины (эритроциты, латекс) Соли металлов (коллоидное золото) Радионуклиды ('-Ч) Ферменты, кофакторы (перокситаза хрена, оксидазы) Потенциальные люминофоры (эфиры акридина, флюореснеин) Электрохимически активные вещества (димститаминометилфср- роцеп)
Способ детектирования Радиоактивность (РИА) Ферментативная активность (ИФА) Интенсивность флюоресценции (ПФИА) Интенсивность люминесценции (ЛИА) Тхрбодиамстрия и им.мунолиффупия (иммуноанализ с использо- ванием «частиц») Электрический сшнал (иммуносснсорпые методы)
По технике выполнения Жидкофазные и твердофазные Ручные, полуавтоматические, автоматические С жезрикнней или без нее ИХМ, используемые во внелабораторных условиях (тест-полоски)
Примечание. ИФА — иммунофсрментнын анализ: ПФИА — поляризационный флюоресцентный им-
муноанализ: ЛИА — люминесцентный иммуноаналпз.
Широкое распространение среди ИХМ получили ИФА и флюоресцентный иммуноанализ
(ФИА), в частности поляризационный флюоресцентный пммуноанализ (ПФИА).
В РИ?\ образны (или стандарты) инкубируются с небольшим постоянным количеством
определяемого вещества меченного радиоактивным изотопом (в качестве метки применяют
тритии. ,4С. ,г1р и постоянным количеством антисыворотки. После установления в системе
равновесия свободную и связанную фракцию разделяют с помощью какого-либо физическою,
химического или иммунологического метода, а затем измеряют радиоактивность в одной (или
обеих) фракциях. К достоинствам РИА следует отнести высокую точность и специфичность,
зкспрессность (результаты могут быть получены уже через I ч после поступления образцов),
малый объем образца, необходимый для анализа. Однако РИА обладает рядом недостатков, к
ним прежде всего относится необходимость работы с радиоактивными изотопами, которые яв-
ляются потении; тьно опасными для здоровья; помимо этого. меченые реагенты имеют относи-
тельно короткий период распада (u’l,). что значительно осложнясг их производство и хранение
и связано с дополнительными расходами при транспортировке. Использование дорогостоящих
счетчиков для измерения радиоактивное! и гакже препятствует широкому распространению
этих методов для мониторинга токсикантов. Кроме того, при проведении РИА необходимо
осуществлять разделение свободной и связанной с антителами фракций антигена.
Иммуноферментные методы анализа
К настоящему времени разработаны многие технологии (варианты) ИФА, которые объеди-
няет использование ферментов в качестве метки и возможность их детектирования в растворе
е помощью соогиегсгвуюших субстратных систем на уровне до 10 15 М
Сущность ИФА связана с двумя научными положениями. Первое — заключается в спо-
собности энзимов и антител, ковалентно или нсковалситно связанных с твердой основой,
сохранять свою функциональную активность, т.е. расщеплять субстрат и связывать антигены/
антитеза; второе— базируется на возможности создания комплекса ангигело—фермент в виде
284 Глава 6
конъюгата. сохраняющего спою биологическую активность в растворе, при эюм конъюгаты
характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью.
Первой сталией в любом варианте ИФА является узнавание авали тируемого соединения
специфичным к нему антителом. Вторая сталия — формирование связи меченного фермешом
соединения ио специфическим комплексом или свободными центрами связывания. Последним
обязательным этаном ИФА является трансформация ферментной метки в соответствующий
сигнал. измеряемый различными физико-химическими методами. Эта стадия осуществляется
реакцией фермента с cvoctpaKivm.
Классификацию ИФА проводят по ряду параметров: реагенту, который иммобилизован
на твердой фазе: реагенту. в который вводят ферментную метку; компоненту системы, кото-
рый используют для определения; типу анализа (конкурентный или неконкурентный) н лр.
На рис. 6-3 представлена классификация методов ИФА. предложенная Г>.1>. Дзннтиевым и
Л.П. Осиповым (19X7).
Комментируя прицеленную классификацию, необходимо отметить следующее.
1 Для количественной опенки образовавшихся иммунных комплексов сушестнус1 два под-
хо.'та:
• прямое измерение концентрации иммунных комплексов.
• определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступивших в реакцию, антител.
2. Классификацию меюдов ИФА можно осуществить также но тину реагентов, используе-
мых па первой стадии анализа. Если присутствуют только анализируемое соединение и соот-
ветствующие ему ветры связывания (антиген и антитела), то метол является неконкурентным.
Если на первой сталии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое вещество
Рнс. 6-3. Классификация методов ИФА.
Методы определения токсикантов в биосредах 285
и его аналог (меченое <|>ерментом или сорбированое на твердой <|>аie соединение), конкуриру-
ющие за имеющиеся центры специфического связывания, то метол называется конкурентным
(рис. 6-4). Принцип этого метола состоит в конк рентном взаимодействии меченого антигена
и определяемого вещества за ограниченное число центров связывания специфических анти-
тел.
Необходимым ус ювием конкурентного метода является недостаток специфических цент-
ров связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его
аналога, так как в противном случае каждый процесс образования специфического комплекса
может проходить независимо друг от друга, а следовательно, опреде шемая концентрация мет-
ки не будет зависеть от концентрации анализируемого соединения.
3. Другим принципом классификации методов ИФА является их ра меление но типу реак
иий, проводимых на каждой из иммхнохнмичсскнх стадий В соответствии с этим все методы
можно разделить па пне ipyniibi: гомогенные и гетерогенные (рис. 6-5). Если в ходе анализа
все стадии, включая ферментативную, проходят в растворе, то метол является гомогенным.
В нем отсутствует сталия разделения иммунохимических комплексон и свободных компонен-
тов. Определение концентрации анализируемого соединения основано па эффекте изменения
каталитической активности фермент а-метки. возникающем при комплексообразовании с ис-
следуемым лигандом или центрами специфического связывания.
В прямом способе, так называемый direct ELISA, проведения ИФА (рис. 6-6. б) антитела
иммобилизованы на твердой фа е. а (|зермс1пная метка вводится в антиген По этой схеме
определяемое вещество п меченый антиген добавляют к пммобилизоваиым анилолам и пос-
ле инкубации и отмывки носителя от песвязавшихся компонентов регистрируют образование
иммунною комплекса по ферментативной активное!!! (на твердой фазе), которая обратно про-
порциональна концентрации определяемого антигена. Преимуществом данной схемы является
небольшое число стадий. что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы
относятся сложность и нехннверсальность методов синтеза ферментных конъкматон. а также
возможное влияние компонентов образца на активность фермента. Непрямая схема (так на-
зываемый indirect ELISA) с использованием меченых вторичных антител (рис. 6-6. а) является
одной из наиболее распространенных В непрямом способе ИФА используют меченые вторич-
ные антитез । — антивидовые антитела. полученные к иммуноглобулинам соответствующего
типа, и иммобилизованный на твердой фазе антиген.
Гак как в ряде случаев прямая адсорбция низкомолекулярного антигена на поверхности
полистирольных планшегов невозможна или нежелательна, иммобилизацию проводят через
макромолекулярный белок-носитель, который впоследствии прочно связывается с твердой фа-
зой. Для этого предварительно получают коньки ат белка-носителя, ковалентно связанного с
гаптеном. При синтезе конъюгата белок — опре еляемос вещество следует избегать модифи-
кации групп, образующих антигенную детерминанту. Кроме того, лля снижения неспеиифи-
ческих взаимодействии необходимо использовать белок и сшивающий aieiiT. отличные от тех.
которые применяли при синтезе иммуногена
Рис. 6-4. Принцип одностадийного конкурентного ИФА
I — иммобилизованные антитела; 2 — анализируемый образ :ц; 3 — конъюгат антигена е ферментом
пероксидазой (Е); 4 — иммобилизованные иммунные комплексы с меченым антигеном; 5 — субстратная
рсакш1Я.
286 Глава 6
1. Сорбция конъюгата
бвло«-лестиццд
* од0"
2. Введение антител
и свободного
антигена, инкубация,
промывка
3. Введение
антивидоеых
антител, инкубация;
промывка
- конъюгат белок-
пестицид
О - антиген
> (пестицид)
- специфические
антитела
- конъюгат
антивидоеых
антител с
пероксидазой
4. Опредление
фе ментетивной
активности
S - субстрат
Р - продукт
Рис. 6-5. Технология твердофазного ИФА (например, определение пестицида).
Достоинством такой схемы является возможность устранения влияния различных вешеств.
содержащихся в образце, на каталитические свс (ства ферментной метки, поскольку анализи-
руемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях Однако такая схема
анализа усложняет определение анализа по сравнению с прямым метолом ИФА нз-за введе-
ния дополнительных стадий. В качестве ферментной метки обычно используют пероксидазу,
реже — щелочную фосфатазу, иногда — другие ферменты, например Р-галактозидазу или
глюкозооксилазу. В ИФА используют различные виды детектирования ферментов, наиболее
распространены спектрофотометрический, хемолюминесцентный и флюоресцентный.
Для проведения ИФА один из компонентов иммунной реакции обычно иммобилизуют на
твердой фазе для рахчеления связанной и свободной фракций антигена (гетерогенный метоп
анализа). Основным носителем являются 96-луночные полистнрольные планшеты, а также
полистирольные е<|сры. магнитные частицы, модифицированные стеклянные трубки, за счет
которых увеличиваются поверхность и сорбционная емкость твердой фазы и тем самым не-
сколько повышается чувствительность ИФА. Гетерогенный ИФА дает возможность эффектив-
но разделять компоненты аналитической системы перед стадией определения концен грации
ферментной метки.
Существует несколько технологий ИФА ELISA (enzyme linked immunoadsorben! assay)
метоц определения e помощью иммуносорбеигов, связанных с ферментами; EIA (enzyme immu-
Методы определения токсикантов в биосредах 287
- конъюгат пестицид-бело
А - пестицид: О - конъгат фермент- пестицид
- специфические антитела.
конъюгат специфических антител с ферментом;
конъюгат фермент вторичное антитело- S - субстрат; Р - продукт
Рис. 6-6. Непрямой (а) и прямой (б) методы твердофазного ИФА. Пояснение в тексте.
noassay) — метод на основе иммуноферментного определения; EMIT (enzyme multiplied immu-
noassay technique) — способ основанный па связи с ферментами, и др. (см. ниже 6.2.3). Пер-
вые две модификации (EL1S?\ и Е1А) — это методы гетерогенного или гвердофазного ИФА. а
третья (EMIT) является гомогенным ИФА.
288 Глава 6
Выбор технологии ИФА зависит от конкретной прикладной задачи. на решение которой бу-
С1 направлен этот анатиз. В экологическом мониторите часто необходимо ускпЛовить лишь
факт наличия пли отсутствия загрязняющих веществ в образцах, причем за довольно короткое
время. В других случаях важно определить концентрацию вешеезв в оброках с высокой точ-
ностью. тогда как продолжительность определения не всегда существенна. После выбора тех-
нологии ИФА онредс 1СНИЯ токсиканта проводят тестнрование полученных и.ммунорсагенгов
(антител и гаптенов) как в неконкурентных (в отсутствие определяемою соединения), гак и в
конкурентных условиях, выбирают комбинации иммунорсатентов. которые отвечают постав-
ленным перед нммуноанализом за пчам. Затем проводят оптимизацию методики, принимая во
внимание следующие параметры формат анализа; систему детекции аналитического сигнала;
определяемые коииетпрпнии антител и гаптена; время инкубации и/или пре. инкубации; пос-
ледовательное щи одновременное внесение рсатенгов; влияние блокирующих агентов; вли-
яние pH и нот той силы буферов; температурный режим проведения определения. В даль-
нейшем изучают специфичность методики н определяют сс метрологические характеристики
чувствительность, точность, воспроизводимость, правильность. На следующем этапе исследу-
ют влияние компонентов матрицы тех реальных объектов, в которых планируется проводить
определение аналита. Для этого сравнивают градуировочные трафики, полученные в буфере тт
образце, нс содержащем определяемое вещество. Все эти параметры должны быть подобраны
таким образом, чтобы обеспечивать максимальную чувствительность определения при сохра
нении хорошей точности и воспроизводимости результатов.
Специфичность и чувствительность любого иммупоанализа в большей степени определяют-
ся качеством специфических антител. Тем не менее структура меченого соединения (трейссра)
во многих случаях с казываст заметное влияние на аналитические характеристики ИФА. Tpeii-
сер может быть условно р оделен иа три структурных элемента: гаптен, ферментная метка и
спонсорный мостик между гаптеном и меткой. Показано, что чем больше размеры метки и чем
ближе она расположена к антигенной детерминанте гаптена, тем бочьше изменение иммунных
свойств трейссра. Химическая природа снейесрпот о мостика нередко определяет устойчивость
трейссра. что косвенно может сказываться на чувствительности ИФ?Х. Изменение полярнос-
ти мостика приводит, по-видимому, к уменьшению нссненифического взаимодействия и тем
самым увеличению чувствительности иммуноаналта. Наиболее летальный подход к данной
проблеме — использование методов молекулярного моделирования. Молекулярное моделиро-
вание. нап| пленное на выяснение молекулярных м хаиизмов связывания апгитен—антитело,
исследует их трехмерную структуру, электронные свойства, образование водородных связей,
ван-дер-ваальсовы, гидрофобные и электростатические взаимодействия. На основании учета
всех этих факторов с использованием компьютерных программ устанавливаются свя ш струк-
тура—активность и рассчитываются м дели связывания. Методы ИХМ. в частности ИФА.
являются нетрудоемкими, не требующими высокой подготовки персонала. Кроме того, про-
цесс может быть легко автоматизирован, за счет чего резко повышается производительность
определений, что крайне важно для обследования больших труни людей и экологического
мониторинга.
Твердофазный ИФА используется для определения широкого спектра всшеств: наркотиков,
гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов в крови больного (мониторинг лекарс-
твенных препаратов), пестицидов, бактерий, вирусов и антител к ним. Методами ИФА воз-
можны определение иммуноглобулинов (виювая принадлежность, субклассы, специфичность)
и идентификация лимфоцитов (субнонуляций). В настоящее время практическому здравоох-
ранению стал доступен твердофазный ИФА. Благодаря невысокой стоимости и экологической
безопасности метода, лабораторные исследования перешли в разряд стандартных, рутинных
анализов.
Однако технологии ИФА имеют и некоторые отрицательные стороны, к которым отно-
сятся возможность неспепифического связывания компонентов с носителем, значительное
время анализа из-за длительности реакции антиген—антитело, многостадийность (ряд ста-
дий пипетирования и промывок), а также существенное влияние неоднородности сорбци-
онных сво! ств полимерных носителей на результаты анализа. Поэтому в настоящее время
разрабатываются новые безразделительные (гомогенные) методы иммуноанализа, которые
позволяют существенно повысить производительность анализа и реализовать нысокопро-
Методы определения токсикантов в биосредах 289
пускноЛ скрининг — High-throughput screening (HTS). Для определения низкомолекуляр-
ных физиологически активных веществ наиболее перспективными, по-виднмому. являются
иммунохимические безразделительные (гомогенные) методы анализа, к которым относится
и ПФИА.
6.2.2. Принципы поляризационного флюороиммуноанализа
Метод ПФИА считают простым. относительно ючным и экспрессным из-за минимального
числа этанов пикетирования, большой скорости реакции связывания (иммунные комплексы
образуются в однофазной системе) и отсутствия вариаций аналитического сигнала. наблюдае-
мых из-за неоднородности твердой фазы в методиках ИФА.
Хотя стне не найден оптимальный иммунохимнчсскнй метод определения низкомолекуляр-
ных соединений, но проводится вес больше исследований по созданию и модификации флюо-
ресцентных методой иммуноанализа. основанных на детекции резонансного переноса энергии
флюоресценции (fluorescence resonance energy transfer — FRET) или поляризации флюоресцен-
ции (fluorescence polarization — FPIA. ПФИА) ФИА. основанный па детекции резонансного
переноса энергии флюоресценции, может быть в значительной степени миниатюризирован и
проведен в проточной системе (см. гл 6.1) или на наноплапшетах.
О широком использовании ПФИА свидетельствуют многочисленные исследования, про-
водимые во всем мире. Начиная с 1989 г. описанию и применению ПФИА посвяшено очень
много работ. В 2003 г. вышел специальный номер научного международною журнала Combina-
torial Chemistry & High Throughput Screening (CCHTS. June 2003. vol. 6. № 4), в котором были
приведены следующие обзоры.
• Поляризация флюоресценции: прошлое, настоящее и будущее.
• Разработка и применение ПФИА для открытия лекарств.
• Применение поляризации флюоресценции лля определения ферментов и олпонуклеотидно-
го полиморфизма генотипирования: некоторые последние достижения.
• Быстрая гибридизация при высоких концентрациях соли и определение бак1сриалыюй ДНК
с использованием поляризации флюоресценции
• Использование ПФИА для диагностики инфекционных болезней.
• ПФИА лля определения ионов металлов.
• ПФИА для определения токсинов зерна.
• ПФИА для определения пестицидов.
История развития метода ПФИА
Принцип поляризации флюоресценции основан на совместном протекании процессов об-
лучения молекулы плоскополярнзованным светом и флюоресценции. Явление поляризации
флюоресценции было впервые описано Перреном в 1926 г и затем по 1робно и учено Вебером
в 1952-1953 гг. В дальне (пнем Данлликер п соавт. предложили использовать поляризацию флю-
оресценции в иммунохимичсских исследованиях. Термин ПФИА лля определения различных
антигенов в буферных ра дворах впервые был введен Дандликером в 1973 г. Широкого приме-
нения этот метол вначале ие нашел, так как трейсср неспспифически связывался с белками,
поэтому проведение определения антигенов в реальных образцах сыворотки крови человека
было невозможно. Кроме того, нс было специальных инструментов лля измерения поляриза-
ции флюоресценции. Через несколько лет группой исследователей пол руководством Д. Данло-
па (Англия) было показано, что некоторые трейссры лля лекарственных вешеств (фенитоина,
гентамицина) имеют незначительное связывание с белками сыворотки крови человека, что
дало возможность этим ученым первыми (в 1976 г.) разработать ПФИА как аналитический ме-
тод определения лекарств Тем не менее до 1980 г. метод ПФИА ис был распространен, т «к как
не б то доступных инструментов для измерения поляризации флюоресценции. Только после
создания полностью автоматизированного анализатора TDx фирмы Abbott (США) и его широ-
кого коммерческого применения, метод ПФИА стал применяться для мониторинга лекарств.
В настоящее время фирмой Abbott (и другими фирмами) выпускаются наборы реагентов для
290 Глава 6
определения порядка 100 лекарственных препаратов методом ПФИА. Методик» ПФИА для
определения ряда наркотиков и пестицидов. детергентов и други* загрязнителей окружающей
среды впервые были разработаны в МГУ им. М.В. Ломоносова.
Физические основы поляризации флюоресценции
Поляризация флюоресценции обусловлена определенной взаимосвязью между ориентацией
молекул и поглощением и испусканием ими света. В процессе возбуждения <|и юоресцсниии
специфические центры модекул. связанные с поглощением и нспуск ннем квантов светя, ста-
новятся осциллирующими электрическими диполями, их называют осцилляторами поглоще-
ния и эмиссии, сооттзе гетвен но. В рас пюре неупорядоченно ориентированных молекул флуо-
ресцеина поляризованный свет будут предпочтительно поглощать те молекулы, осшталяторы,
поглощения которых параллельны плоскости по. яризапии. В возбужде и той молекуле осцил-
ляторы эмиссии определяют поляри зацию ф, юорссненции. и если молекула в момент эмиссии
относительно устойчива и не меняет свою ориентацию в пространстве, то эмиссия флюорес-
ценции также будет частично поляризована. Степень поляризации зависит от многих факторов
и описывается уравнением Перрена:
УР= УР^УР-№*Т иг/ф
где Р — наблюдаемая поляризация, Ро — максимальная поляризация; К — тазовая постоянная;
Т — аосолютная температура, и — ня зкость растворителя: т — среднее время жизни молекулы
в возбужденном состоянии; V — молярный объем флюореснеирующего вещества
Вращательное время релаксации (<р) связано с вязкостью среды (ф. абсолютной темпера гу-
рон (Т). молекулярным объемом (V) и газовой постоянной (R) еле тхюшей формулой:
Следовательно, если вязкость и температура постоянны, поляризация флюоресценции пря-
мо пропорциональна молекулярному объему, т.е. молекулярному размеру. Изменение моле-
кулярного объема может происходить вс. едствис связывания или диссоциации двух молекул,
разложения или конформационных изменении молекулы. Если возбуждение флюорссц ниии
происходит г диапазоне манной полосы поглощения и энергия не теряется в результате меж-
молекуляриых взаимодействий, то степень поляризации флюоресценции зависит от броунов-
скою движения. Маленькие молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между пог-
лощением и эмиссией равновероятно прнним ют любую ориентацию, что приводит к подпои
деполяризации сигнала эмиссии. Так. в водном растворе ф. юоресиенння флюореснсина прак-
тически не поляризована, однако при повышении вязкости раствора степень ее поляризации
резко возрастает. Среднее время жизни молекулы флюореснсина в возбужденном состоянии
(т) составляет порядка 4 нс (4-I04 с) и является оптимальным для измерения поляризации
флюоресценции в растворе. Поэтому для метола ПФИА в качестве флюорофора чаше всего
применяют флюорсснеип. При облучении молекулы флюореснсина плосконолярнзованным
светом испускаемый свет является частично или полностью деполяризованным.
Большие молекулы и при эмиссии частично сохраняют ту же молекулярную ориентацию,
которую они имели при поглощении света, поэтому их флюоресценция в большой степени
поляризована. Если такие молекулы ассоциированы в молекулярный комплекс, то степень
поляризации флюоресценции возрастает. Поляризация флюоресценции характеризуется вели-
чиной Р:
тле I, — вертикальная составляющая (параллельная лучу возбуждения): I, — горизонтальная
составляющая (перпендикулярная лучу возбуждения) флюоресценции Поскольку степень по-
ляризации Р изменяется в пределах от 0 до 0.5, в расчетах обычно используют величину милли-
поляризаттии флюоресценции — птР (птР = 1000-Р). Суммарная интенсивность флюоресценции
при этом составляет: 1 = 21 + lti.
Методы определения токсикантов в биосредах 291
Рис. 6-7. Принцип измерения поляризации флюоресценции
Флюоресцирующим раствор возбуждают светом, поляризованным в вертикальной плоскос-
ти. а эмиссию флюоресценции измеряют в перпендикулярном по отношению к лучу возбужде-
ния направлении с помощью второго поляризатора, у которого плоскость поляризации может
быть расположена или вертикально, млн горизонтально (рис. 6-7).
Следует отметить, что, кроме поляризации флюоресценции, для описания этою явления
может использоваться и анизотропия флюоресценции (А), которая определяется уравнением:
Соотношение между Р и А выражается простыми уравнениями: А = 2Р/(3-Р) или Р =
ЗА/(2+А). В некоторых случаях теоретические уравнения лля описания этого явления выглядят
проще для анизотропии. Так, уравнение Перрена, описывающее свягь между Р или А от их
максимальных значений для жестко ориентированых молекул, временем жизни флюоресцен-
ции (т) для флюорофора и его временем релаксации (<р), описывается уравнениями
(I/Р - l/3) = (l/P<>— 1/3II +т/ф|;
А = Ао/Ц +т/Ф|.
Очевидно, что второе выражение намного пропге и удобнее для расчетов. Гем нс менее лля
детекции аналитического сигнала в метоле ПФИА используется поляризация флюоресценции
(Р). значения которой немного выше, чем значение анизотропии (А).
Для поляризации флюоресценции важную роль играют молекулярный объем частицы и
степень асимметрии молекул, поэтому их используют лля детекции широкого спектра меж-
молекулярных взаимодействий. сопровождающихся ассоциацией или диссоциацией лигандов
и комплексов (белков. ДНК, РНК. антител и антигенов). Применительно к иммуноанализу
метод поляризации флюоресценции основан на конкурентном связывании анализируемого
антигена и антигена, меченного <|ъ юореснентной меткой (грсйссра). со специфическими анти-
телами. Поляризация флюоресценции свободного трейсера в растворе имеет низкое значение.
292 Глава 6
Рис. 6 8 Принцип но.1яр| займи флюоресценции.
а — быстрое вращение, низкая поляризация флюоресценции: б — медленное вращение. высокая поля-
ризация флюоресценции
F — флюоресцентная метка; Ag — антиген; ЛЬ — антитело: f Ag - зреисер — меченное флюоресцентной
меткой производное определяемою вещества
и возрастает при связывании трейсера в иммунный комплекс с антителами (рис. 6-8). Таким
образом. величина пзР реакционной смеси отражает отношение связанной и свободной фрак-
ций трейсера и обратно пропорциональна концентрации анализируемого антигена.
Степень изменения поляризации флюоресценции зависит от метки, среднего времени жиз-
ни молекулы в возбужденном состоянии, молекулярной массы антигена (верхний предел моле-
кулярной массы составляет 10 000—40 000 Д) и нрпроты комплекса. Считается. что в среднем
молекулярная масса комплекса нс должна превышать 20 000 Д. Среднее время жизни молекулы
в возбужденном состоянии примерно равно среднему времени релаксации антигена, которое
составляет несколько наносекунд. Однако при измерении подвижности мембранных белков
метка должна существовать в возбужденном состоянии намного дольше, так кек время враща-
тельной релаксации таких белков лежит в диапазоне миллисекунд. Время жизни триплетного
состояния сравнимо со временем врашательноИ релаксации мембранных белков, поэтому пос-
ледние рекомендовано изучать с помощью деполяризации фосфоресценции. При разработке
методик ФИА выбор флюоресцентной метки имеет ключевое значение. Метка должна обла-
дать следующими качествами: иметь высокую интенсивность флюоресценции, т.е. высокий
квантовый выход и большой коэффициент экстинкции, быть химически и фо гоу стой чиной в
условиях анализа. легко связываться с антигеном и нс мешать протеканию реакции антите-
ло— антиген.
Чтобы присутствующие в пробе эндотенпыс флюоресцентные гасители не мешали опреде-
лению, их длины волн возбуждения и эмиссии должны отличаться от длин волн флюоресцен-
тной метки. Кроме тою. для снижения влияния рассеяния света метка должна иметь большой
стоксов сдвиг. Хотя стоксов сдвиг флуоресцеина невелик (23 нм), флюореснеиновая метка
весьма чувствительна к рассеянию снега и интенсивности фона, но характеризуется большим
изменением поляризации излучаемого света, делая флуоресцеин пригодным для ПФИА. Не-
обходимо отметить химическую стабильность, незначительную фотолабильность при нормаль-
ных условиях, низкий температурный ко ффиниент флюоресценции (исключается необходи-
мость температурного контроля) и высокии выход флюоресценции (в связанном состоянии
30-60%).
При облучении голубым светом (длина волны 492 им) молекула флюоресцеина нот.тощает
квант света и переходит в возбужденное состояние. Время жизни в возбужденном состоянии
.тля молекулы флюоресцеина составляет примерно 410й с. Из возбужденного состояния моле-
кула возвращается в исходное состояние пли путем безызлучательного процесса с вы едени-
ем тепла, или путем и пучения свега — флюоресценцией. Молекула флюоресцеина излучает
зеленый свет с максимхтыюй длиной водны 517 нм. Если молекулу флюоресцеина обдучть
плоскополярпзованным светом, то она будет излучать также поляризованпный свет. Степень
поляризации флюоресценции будет зависеть от того, на какой угол повернется модскула флю-
Методы определения токсикантов в биосредах 293
оресцеина за время между возбуждением и излучением. Время поворота молекулы на угол
примерно 68.5° определено как время вращательной релаксации, которое для маленькой моле-
кулы флуоресцеина равно 1-10’ с, алля больших молекул тина иммуноглобулина — 10010’ е.
Так как молекулы в растворе хаопгчно ориентированы. то резу гьтируюшая поляризация (флю-
оресценции такой молекулы, как фноореснсин. б; гст приблизительно равна нулю, а для им-
мунного комплекса антитело—антиген, меченного флюорссцеином. будет большой.
На степень поляризации флюоресценции влияют различные факторы, основными из кото-
рых являются размер (или масса) флюоресцирующей молекулы. температура и вязкость рас-
твор: При постоянстве температуры и вязкости раствора поляризация флюоресценции будет
зависеть только oi размера флюоресцирующей молекулы. На этом принципе построено изуче-
ние реакции взаимодействия ан г иг ен—антитело
Меченный флюорссцеином гаптен, называемый трейсером. при возбуждении линейпо-по-
ляризинионным светом будсг флюоресцировать деполяризованным светом, так как молекулы
трейсера в растворе ориентированы хаотично. При связывании трейсера со специфическими
антителами к гаптену вращение такою иммунного комплекса значительно замедляется, и при
этом возрастает степень поляризации
Измерения поляризации флюоресценции проводятся на специальных высокоавтоматизи-
рованных флюоресцентных ридерах TDx фирмы Abbott. PFI-20 и LS-20 фирмы Perkin-Elmer
и лр.. в которых используются поляризаторы на жидких кристаллах и специальные датчики
для контроля температуры раствора. Точность измерения поляризации составляет 0.005 отн.ед.
(гпР).
Чувствительность флюориметра по отношению к вертикальной и юрпзонталыюй поляризо-
ванной флюоресценции может быть различной; это различие компенсируется эксперименталь-
но определяемым поправочным коэффициентом G:
.,_(/-(7/й)/
/(/,. + 07/»)
ПФИА основан на конкуренции определяемого антигена и трейсера за ограниченное коли
честно центров связывания антител и измерении степени поляризации реакционной смеси.
Agl -—<- AgFAb,
х.
где AgF — меченый антиген. Agl :Ab — иммунный комплекс, существует равновесие между
AgF (константа скорости связывания с Ab — к() и комплексом AgF.Ab. диссоциирующим с
константой скорости к,
Константа а(|к]жнности определяется следующим образом:
Чем выше концентрация определяемою антигена в пробе, тем в большей степени меченый
антиген в реакционной смеси будет в свободном состоянии и ниже значение поляризации
флюоресценции. Метод ПФИА является гомогенным, осуществляется в однофазной системе
и не требует механического разделения образовавшихся соединений Метод ПФИА позволяет
определять концентрацию антигена в течение нескольких минут.
Преимущества, недостатки и пути развития ПФИА
Метол ПФИА имеет много преимуществ, присущих ИХМ: универсальность применения
для определения низкомолекулярных веществ (для многих из которых уже и г 'Чены специ-
фические антитела); возможность определять как одно соединение, гак и группу соединений в
зависимости oi специфичности используемых антител; высокую чувствительность и правиль-
ность определения и др.
более того, у ПФИА есть уникальные особенности, которые присуши только этому методу,
основанному на использовании в качестве метки флюорофора (чаще всего, флюорссцсина) и
измерении поляризации флюоресценции в качестве аналитическою сигнала (пгбл. 6-4)
294 Глава 6
Таблица 6-4. Преимущества и недостатки ПФИА
Преимущества ПФИА Примечание Недостатки ПФИА Примечание
Гомогенный метол Нет необходимости в ста- диях: разделения связан- но»! и свободной фракций антител: промывки илр Ч у ветви 1СЛЫ1OCT ь ПФИА ниже, чем других ИХМ На 2 -3 порядка чувс- твительность ниже, чем ИФА
Экспрессный мегол Время анализа лимншру- сгся временем пипстиро- вания, так как кинетичес- кая константа связывания (К малых молекул airriireiioB с антителами в растворе составляет от 10’ до IOk М '/с ' Сильное влияние матричною эффеюа образна (омогеипый. безраз- дс.тнтсльный метод, поэтому наблюдается матричный эффект образца
Хорошая воспроизво- димость результатов измерений. Коэффи- циент вариации опре- делений не превыша- ет 3—5% Значение поляризации флюоресценции — отно- си гс.тьнын и безразмерный параметр, который сгла- живает колебания в ошиб- ках измерения прибора Определяют только низкомолекулярные вещества (с исполь- зованием флюорсс НСН1НЫХ MCIOK) В качестве метки в ПФИА чисто использу- ется молекула флуорес псина
Флюоресцентные метки (tpciieepu) ста- бильны при хранении в течение многих лет Трейсеры довольно легко Moiyi быть синтезированы Необходим специ- альный прибор
Метод может быть автомат»! тирован Фирма Abbott создала анализатор TDx (полно- стью автоматизирован- ный). В настоящее время по- добного типа авали за горы широко используются в диагностических лабо- раториях Д.1Я рутинных анализов
Указанные недостатки успешно устраняются, и развиваются новые направления ПФИА
(однореагентный ПФИА. ПФИА в системе остановленной струи. ПФИА в органических рас-
творителях). создаются новые приборы, используются новые метки.
Кроме флюоресиенновых. в методе ПФИА (или других методах ФИЛ), используют и другие
метки, большинство из коюрых имеют аналогичные с флюоресцеином длины ваш возбуж-
дения и эмиссии: BODiPY-Fl Alexa-FL, Oregon Green и другие. Метод ПФИА разработан нс
только для низкомолекулярных, но и лля высокомолекулярных соединений. таких, как белки
овальбумин. альбумин, ферритин, иммуноглобулин Для ПФИА на высокомолекулярные со-
единения в качестве метки используют комплексы соединений переходных металлов (рений,
рутений), которые имеют & ibincc время жизни, чем флюорсснсин.
Флюоресцентные трейсеры и антитела нашли применение в нммунометодс капиллярного
электрофореза с лазерной индукцией флюоресценции, причем этот метод позволяет опрсдс
лять «налиты с лучшей чувствительностью, чем ПФИА. но на более дорогом оборудовании и с
худшей воспроизводимостью
Недавно были описаны новые метки для измерения флюоресценции новым методом —двух-
фотонной облучагельнон флюоресценцией (Two-photon excitation of fluorescence — ТРЕ). Этот
принцип измерения флюоресценции использован для разработки нового ультрачувствитсль-
пого бсзраздслитсльного метода ArcDia(tm) ТРХ, лля которого требуется микрообъем пробы и
реагентов. Вполне вероятно, что этот новый мотов иммуноанализа может найти применение по
мере решения вопроса о приборной базе, как это было в случае с ПФИА.
Принцип ПФИА. но без использования антител и качестве распознающего объекта, был
применен при разработке методики анализа с белками в качестве связывающего агента и де-
Методы определения токсикантов в биосредах 295
лекцией поляризации флюоресценции. Этим методом были оптимизированы методики опре-
еления SH, домена тирозинкиназы и биотина.
Интересное применение принципа ПФИА предложено для определения не только иизко-
мо. екулярных антител, но тт специфических антисывороток к белкам вирусов Mycobacterium
bovt's и Brucella abortus Метод основан на связывании меченных флюоресцеином пептидов
белков вирусов с аутоантителами сыворотки животных, которые образуются при инфекцион-
ных заболеваниях. Он является быстрым и простым тсст-методом .maniocтки инфекционных
болезней, например бруцеллеза у животных. Детекция поляризации флюоресценции находит
все более широкое применение для определения специфической протеазной активности фер-
ментов и ингибиторов этой активности
Средн новейших разработок — определение токсинов в пищевых продук их: зераленопа ме-
тодом ПФИА и паклнтаксила методом, аналогичным ПФИА. но с использованием в катсствс
связывающего агента не антител, а белка тубулина (см. гл. II).
Надо отметить, что тетекпия поляризации флюоресценции находит вес большее приме-
нение тте только как аналитический метод ПФИА. но и как инструмент для изучения любых
вза тмолействий. при которых меняется молекулярная масса соединений, например, в биохи-
мических исследованиях взаимодействия олигосахаридов с литандами методом дстекнии поля-
ризации флюоресценции
Техника эксперимента метода ПФИА
Синтез меченных флюоресцеином антигенов (треиссров) Чаше всего для ПФИА используют
в качестве метки флюорсснеин. поэтому мнотне серийно выпускаемые приборы для измере-
ния поляризации флюоресценции оснащаются фиксированными светофильтрами, специально
предназначенными для работы с флюоресцеином. и имеют длину волны возбуждения и эмис-
сии. близкую к флюорссиеину (492 и 520 нм соответственно).
К трбоксильная труппа в молекуле флюоресцеина нереакцнонноспособна (рис. 6-9) и не мо-
жет быть использована для получения конъюгатов флюоресцеина с антигенами В настоящее
время доступен ряд производных флюорсснснна. пре назначенных специально для введения
метки в состав других молекул. Наиболее широко используются флюореснсинизотиоцианат.
карбоксифлтооресиеии и аминофяуоресцеин. ДТАФ и мнотне другие коммерчески доступные
соединения (рис. 6-10).
Чистота трсйсеров подтверждается ПМР. масс-спектрометрией и другими методами в зави
симости от возможностей и доступности соответствующих приборов. Трейссры и метанольных
растворах обычно очень стабильны и нс разлагаются голами при хранении, лучше сохраняются в
защищенном от прямого солнечного света месте при низких температурах (в холодильнике).
Кот нензрацию трсйсеров рассчитывают но оптической плотности раствора трейсера в 50
мМ карбонатном буфере pH 9.0 при длине волны 492 нм. допуская, что коэффициент экстин-
кции тля трсйсеров такой же, как для флюорсснснна н равен 8.78-104 М '/см Рабочий раствор
трейссра готовят в боратном буфере, интенсивность которого соответствует 20—100-кратному
значению интенсивности флюоресценции фонового раствора (боратного буфера)
Ряс 6-9. Структурная формула флюорсснснна.
296 Глава 6
5-(|4.6- Л.ихлоргриазин-2-ил)
лмино)41люор<х;исл11 (DEAF.
ДТАФ)
Этнленлткшил-«|)люорссцентггио-
карбама (EDF. ЭДФ)
Глнпниамнлофлооресиснн
(САГ ГАФ)
Рис. 6-10. Структура флюорсснснповых соединении, используемых для синтеза грс коров.
Некоторые активные производные флюореспсина. например широко используемый ЭДФ.
легко получается из «РИТЦ и этиленлиамишшигиарох.лорила:
FITC + NH,-CH,CH.-NH, = Fluor-NH-CS-NH-CH.CHj-NHj (ЭДФ)
Трейсеры обычно получают по типу пептидного синтеза из соединений с амино- н карбок-
сильной группами. Гели антиген имеет активную карбоксильную труппу, зо се активируют,
например, с помощью гилроксисукпинимида и кар<н тинмида. н «пришивают* к соединениям
флюрссисина с аминогруппой (АФ, ЭДФ. ГАФ и др.). В резу п.ттгс получают трсйсср с пептид-
ной связью, как представлено на схеме:
Ag-COOH =:> Ag-CO-Z (Z = пзлроксисукпииамид)
Ag-CO-Z + \Н -Fluor = /\g-CO-NH-Fluor
Методы определения токсикангов в биосредах 297
Если антиген имеет активную аминогруппу, то для получения трейсера. н-оборот исполь-
зуют соединения флюореенсина с карбоксильной группой (ФК и др.). На первом этапе прово-
дят активацию карбоксильной группы, а татем — пептидный синтез с аминогруппой антигена
NH.-Ag:
Пиог-СООН > Fluor-CO-Z
Fluor-CO-Z + NH,-Ag = Ag-NH-CO-Fluor
Особенно часто в качестве меток используют ФИТЦ, который уже имеет активированную
гиокарбоксилъную группу для конъюгирования с амино! руиной антигена.
Ag-NH, + FITC = Ag-NH-CS-NH-FIuor
В одну стадию получают и трсйссры с ДТАФ. в котором ак!явный атом хлоре замещается
на остаток амино- или оксинроизволного антигена:
Ag-NH, + d-DTAF = Ag-NH-DTAF
Ag-OH + CI-DTAF = Ag-O-DTAF
Если в молекуле аппнена пег аминных групп для конъюгирования. го ашиген предвари-
тельно модифицируют, вводят или карбоксильную или аминогруппу и получают трсйссры по
схемам, приведенным выше. Грейсеры обычно очищают oi ненрореагировавших пешеепт и
побочных продуктов синтеза метолом тонкослойной хроматографии (ТСХ ) в системе хлоро
форм- метанол (4:1). На одной пластинке ТСХ типа Силуфол (20x20 см) можно провести очис-
тку трейсера в количестве нескольких микрограммов, достаточном для проведения нескольких
тысяч анализов ПФИА.
Измерение поляризации флюоресценции
Измерение поляризации флюоресценции проводят на поляризационных флкхтриметрах;
ILS-20 фирмы Perkin-Elmer (Англия). Beacon 2000 фирмы PanVcra (США), анализаторе TDx
фирмы Abbott (США). АФП-2 производства ВПИИБП (Россия) и др. Все приборы обычно
имеют термостат и специальные программы для измерений, расчета потяризацни флюорес-
ценции и других параметров. В качестве kiobci для измерений используются специальные
боросиликатные стеклянные пробирки или кварцевые кюветы.
Для получения кривых титрования ашигел прево 1ят серийное ра ведение растворов тести-
руемых аннггсл, к которым добавляют фиксированное количество трейсера. и измеряют по-
ляризацию флюоресценции (рис 6-11. а). В качестве контроля нсспеипфичсского связывания
тестируют антисыворотку неиммунизированного животного. По результатам измерении строят
рафик зависимости разведения aimiTc.i (логарифмическая шкала) oi величины поляризации
флюоресценции (птР) и по этому графику определяют разведение антител, вызывающее 50%
связывание трейсера (титр).
Для получения градуировочных графиков н измерительную пробирку вносят образен, рас-
твор трейсера и pier нор ант шел «оптимальном разведении (или концентрации). Проводя! из-
мерение поляризации флюоресценции в соответствии с программами приборов. На основании
параллельных результатов измерения растворов со стандартными концентрациями вешества
строят i-радуировочный (рафик зависимости величины поляризации флюоресценции (тР) от
концентрации стандартных растворов вещества (логарифмическая шкала) (рис. 6-11. б)
Поляризацию флюоресценции измеряют на приборах в ручном и автоматическом режимах.
В (Зинеймости от прибора, время измерения анали ичсского сигнала одного образна состав-
ляет 5—7 с При измерении на приборе TDx в полуавтоматическом режиме предусмотрены
ручное дозирование иммунореагентов в пробирки и автоматическое измерение по программе
Photo Check. Общее время измерения 10 образцов около 7 мин.
Измерение на полностью автоматическом анализаторе TDx проводят следующим образом
Не менее 70 мкл стандартных растворов или образцов переносили в специальные картрид-
жи прибора, которые вместе с пробирками помещали в карусель. В предусмотренный пакет
реагентов помещают три флакона, содержащие раствор антител определенного разведения,
раствор трейсера определенной кон иен грации и раствор фосфатного буфера для разбавления.
В отвезенные места прибора устанавливают пакет реагентов, карусель и бутыль с буфером ия
разбавления. Нажатием одной кнопки запускают прибор, который в ходе анализа автоматичес-
298 Г лава б
Рис. 6-11. а. График титрования антител метолом ПФИ/Ч.
б. Градуировочный график опретелення иетествз методом ПФИА.
Методы определения токсикантов в биосредах 299
ки выполняет следующие операции: I) отбор 10 мкл образца мочи или калибратора (стандарт
кого образца) и его разбавление буфером в лунке картриджа; 2) отбор 250 мкл буфера и слив в
пробирку для измерении. 3) отбор первой патовины разбавленного обр азца из лунки картрид-
жа и перенос его в пробирку вместе с 750 мкл буфера: 4) измерение фоновой интенсивности
флюоресценции; 5) отбор 25 мкл раствора трейсера из флакона и перенос его вместе с 250 мкл
буфера в пробирку; 6) отбор 25 мкл раствора антител из флакона и слив сю вместе со второй
in юнипой разбавленного образца и 750 мкл буфера в пробирку; 7) измерение конечной ин-
тенсивности флюоресценции; 8) расчет и распечатку значений! поляризации флюоресценции
и найденной концентрации вешества (по градуировочному графику, хранившемуся в памяти
прибора) Обшсе время и мерепия 20 образцов 20—25 мни (в зависимости от используемой
программы).
Для построения градуировочной кривой используют 6 калибраторов (стандартных растворов
анализируемого вешсстши с различными концентрациями определяемого вешества. приготов-
ленных на буфере (и. и на воде). Для каждого протокола проведения анализа на приборе TDx
в автоматического режиме подб! рают условия, когорые удовлетворяют критериям качества
градуировочного графика, заложенного в память прибора. При выборе условий ПФИ?\ па
приборе TDx в автоматическом режиме необходимо выполнить следующие требования к ана-
лизу I) наличие определенного перепада поляризации флюоресценции между калибраторами:
между нулевым и первым калибратором, между соседними калибратором, между наибольшим
и наименьшим калибратором: 2) значение поляризации флюоресценции нулевого калибратора
должно находиться в опре стенных пределах — от 150 до 220 ед. поляризации флюоресценции,
значение наибольшего калибра гора — от 40 до 55 ед.: 3) градуировочная кривая должна иметь
плавный вид и удовлетворять параметрам прибора по липеризации градуировочного графика:
4) оптимальные концентрации растворов трейссра и антител, которые должны обеспечивать
выполнение требований контроля качества определений на приборе. Эти требования обосно-
ваны, исходя из принятых за образец метод» к ПФИА для наборов-реагентов фирмы Abbott,
используемых при мониторинге токсикантов.
Расчет аналитических характеристик метода ПФИА
При представлении градуировочных зависимостей поляризации флюоресценции от концен-
трации аналита используют десятичные логарифмы концентраций аналита: шР = f(lgC). Для
сопоставления iрадуировочных графиков, приводят нормированные iрафики в координатах
П1Р/п1Ро < В/Во) от логарифма концентрации а [алита.
Типичная градуировочная кривая определения всшеств методом ПФИА имеет сигмооб-
р.нный вид (рис. 6-12), как и все 1радуировочныс график»! для иммунохимических методов
анализа низкомолекулярных веществ. Развитие программного обеспечения персональных ком-
пьютеров значительно упростило обработку нелинейных графикои. Наибольшее распростране-
ние для процедуры обрабенки экспериментальных данных и расчета градуировочного [рафика
получили программы Origin и Sigma-Plot
В качестве основных аналитических характеристик ПФИА были взяты коэффициент чувс-
твительности (тангенс утла наклона градуировочной кр той), параметр 1СМ. предел обнаруже-
ния, диапазон определяемых концентраций, воспроизводимость определен и и (коэффициент
вариации), правильность определений, специфичность, пороговая концентрация (для опреде-
ления наркотиков) (см. гл. 6.1).
Для ПФИА и других иммунохимических методов под термином «чувствительность» (см.
гл.6.1) понимают несколько параметров, два из которых рассчитываются из уравнения градуи-
ровочной кривой. Это коэффициент чувствительности (тангенс угла наклона градуировочного
графика, параметр «Ь»на рис. 6-12) и параметр С — 1СМ — концентрация аналита. при которой
связывание с трсйссром составляет 50%. т.е. середина градуировочной кривой. Обычно гово-
рят. что ра!работа ! более чувствительный метол ПФИА. если удастся уменьшить параметр 1Сад
или предел обнаружения.
Преде.1 обнаружения — минимально детектируемая концентрация определяемого вешества
(см. гл. 6.1). В некоторых случаях пределом обнаружения считают концентрацию исследуемо-
300 Глава 6
1С*> С«> ICaa
C
Рис. 6-12. Расчет основных аналитических параметров по градуировочном) графику определения веществ
метолом ПФИА
F — флюоресцентная метка, Ag - антиген: ЛЬ — антитело; F-Ag — трейс-ер — меченное флюоресиснтт ОИ
меткой производное определяемого вещества
го вещества соответствующую 90% В/Вп. Обычно используют предложенный И1ОПАК кри-
терий 3S, учитывающий дисперсию колебаний холостого сигнала около среднего значения
Для определения предела обнаружения проводят несколько измерений нулевого стандарта
(стандартного раствора, не содержащего анализа), рассчитывают стандартное отклонение и
определяют предел обнаружения. Следует отметить, что минимально обнаруживаемый ана-
литический сигнал, а следовательно, и предел обнаружения определяется не средним уров-
нем фонового сигнала, а размахом колебаний этого сигнала относительно среднего значения.
<s*J-
В медицинских исследованиях часто определение предела обнаружения проводят не по ме-
толу 3S. а по подобному методу Родбарда Параметр предел обнаружения определяют как
нижнюю измеряемую конценграцию вещества, которая с 95% вероятностью отличается от
нулевого стандартного образна.
Диапаюп определяемых концентраций должен соо' встствовать прямолинейному участку гра-
дуировочного трафика. Обычно его определяют в диапазоне изменения сигнала от Х0 до 20%
ингибирования связывания грсйссра. Диана отт определяемых концентраций является важным
параметром градуировочного графика. который дает первую информацию о чувствительности
метода, так как в этом диапазоне наименьшие ошибки определения Иногда рассчитывают
Методы определения токсикантов в биосредах 301
предел количественного определения — значение концентрации, выше которой можно прово
лить количественное определение с установленной относительной правильностью или опреде-
ленным доверительным интервалом в реальных образцах (см. гл. 6.1).
Нелинейная форма градуировочной кривой ПФИА способствует увеличению эксперимен-
тальной ошибки на границах диапазона определяемых концентраций. Поэтому большинство
публикуемых сейчас работ по разработке ИХМ характеризуют параметром ICVj, определяя его
как основной показатель чувствительности анализа.
Racnpouмюдимоеть метода (см.гл 6.1) количественно определяют как относительное стан-
дартное отклонение, которое в ИХМ принято обозначать как коэффициент вариации (КВ) ре-
зу штатов КВ. % = (стандартное отклонение / среднее значение концентрации аналита)хЮ0%.
Обычно проводят определение концентрации нескольких образцов и рассчитывают коэффи-
циент вариации в одном анализе и между анализами. когда тс же образны тестируются в разное
время, разными операторами и т.д. На ве нчину коэффициента вариации ячияют случайные
ошибки анализа, качество измерительной аппаратуры и квалификация персонала. Обычно го-
ворят о хорошей воспроизводимости результатов, koi да коэффициент вариации менее 10% в
одном анализе и 15% между анализами.
Правильность метода (см. гл. 6.1) проверяется методом «ввсдсно-найдено» (тест на сткры-
тне); независимым методом (корреляция результатов с другими методами); анализом стандар-
тного пора ша (тссг на линейность).
Тссг па открытие проводят по методу добавок определяемого вещества к образцам.
По результатам определения концентрации вешеств по градуировочному графику рассчитыва-
ют процент открытия, используя отношение найденной концентрации к рассчитанной. Ана-
логично проводя! расчет процента открытия в тесте на линейность, в котором образны, со-
держащие определяемое вещество, лине (но разбзвляют бух^сром и определяют конпешрацию
вешсств в разбавленных образцах по тралу ировочному графику'. Д. я корреляции результатов
определения веществ метолом ПФИА с результатами других методов (хроматографический,
ммуноферментный и др.) проводят анализ большою числа образцов и рассчитывают коэф-
фициент корреляции для графика зависимости концентраций, определенных по методу ПФИА
и независимому метолу. Обычно считается, что наблюдается хорошая корреляция результатов,
ест коэффициент корреляции более 0.9.
Точность метола (см. гл. 6.1) — собирательный показатель воспроизводимости результатов
и правильности определения. Результаты метола мстут иметь хорошую воспроизводимость, но
нс быть правильными. И наоборот, правильные результаты могут быть получены методом с не-
высокой воспроизводимостью. Обычно методики ПФИА, как и других ИХМ. имеют хорошую
воспроизводимость и правильность определений.
Специфичность метода (см. гл. 6.1) характеризует взаимодействие антител с экзогенными и/
или эндогенными структурно-близкими аналогами определяемого вешества. содержащимися
в реальных образцах (рис. 6-13). Количественно специфичность выражается в процентах пе-
рекрестного реагирования (% ПР), которую определяют при 50% ингибировании связывания
трейсера (параметр 1Сад ) по формуле:
%ПР = (С,:С2)хЮ0%.
где С — концентрация определяемого вешества; С2 — концентрация перскрестнореагирующс-
го вешества.
Специфичность мето.ча считается высокой, если ПР (CR) составляет менее 10% для пе-
рекрестнореагнруюшсго вешества Если ПР составляет 1%, то считается что эго вещество не
влияет на определение анализируемою вещества. Некоторые вешества могут определяться с
большей чувствительностью, чем определяемое вешество. Поэтому ПР может быть и выше
100%. Так. например, для производных анализов. на которые еннтезир ют иммуногены и по-
учают антитела, процент перекрестного реагирования может составлять 1000 Это значит, что
это вещество определяется с чувствительностью в 10 раз лучше, чем анализ.
Определение аффинности антител методом ПФИА
Аффинность антител (равновесную константу образования иммунною комплекса антшен—
антитело) определяют по методу Дандлнкера. Дтя этого после построения градуировочного
302 Глава б
Специфичность ПФИА
Рис. 6-13. График определения перекрестного реагирования методом ПФИА.
CR (ПР) —перекрестное реагирование (кросс-реакция); mP/mPu пропорционально В/Волля нормирован-
ных графиков: Ag — ашкген.
графика зависимости гпР от концентрации (в моль) строят график в координатах: у = |B/F],
х " fB|, где Ви Г - соответственно связанная и свободная формы антигена (рис. 6-14).
При определении отношения связанной и свободной форм антигена [B/F] используют фор-
мулу:
B/F=<inPi — mP^J/fmP^ — mPi),
где mPi — измеренная величина поляризации; mPrin — величина поляризации при макси-
мальном связывании трсйссра и антител; тР ]п — величина поляризации при минимальном
связывании трсйссра и антитела.
При определении концентрации связанной формы антигена [BJ. используют расчет и сле-
дующую формулу:
B+F=T; F=T-B: B/F=X;
В/(Т-В)=Х. отсюда: В= Т • X /(Х+1):
В = Т • (B/F)/|(B/F) + 1],
где Т — суммарная концентрация меченого и немеченого антигенов,
X — соотношение связанной и свободной форм антигена B/F.
Константу аффинности рассчитывают как тангенс угла наклона |B/F| к |В|. Расчет конс-
тант аффинности антител проводят на основе нескольких допущении: о равенстве константы
Методы определения токсикантов в биосредах 303
а б
Рис 6-14. График для расчета констан г аффинности моноклональных антитез (а) и нолик. опальной
антисыворотки (б).
для знали га и для трейссра. о моновалентном связывании антител с антигеном и др. Набцю-
даемая константа аффинности при этом определении является средневзвешенной для всех
фракций поликлональных антител. Данный расчет начнется приблизительным и используется
в большинстве исследований для качественного сравнения антител. Более точное определение
констант аффинности требует строгих расчетов с учетом тушения флюоресценции и других
параметров и здесь обсуждаться не будет.
Итак, принцип ПФИА заключается в конкуренции определяемого вешества и вешества. ме-
ченного флюоресцентной меткой, за связывание с ограниченным количеством антител. Метод
основан на возрастании поляризации флюоресценции меченного (флюоресцеином антигена
при его специфическом связывании с антителами. Метод ИФИА очень прост в исполнении
и заключается в добавлении к аликвоте образна (10—100 мкл) растворов меченного флюорсс-
цеином гашена и антител, и последующем измерении поляризации флючоресненнии. Общее
время анализи не превышает нескольких минут.
6.2.3. Иммунохимические методы определения наркотиков и лекарств
Для определения наркотиков и лекарств (см. гл. 7) в качестве предварительных методов ис-
пользую! РИА. ИФА. ПФИА, иммунохроматографичсский анализ (ИХА) с гарантированными
пределами обнаружения в диапазоне or 0.1 до 500 нг/мл (с.м. электронное приложение).
РИА
Эти методы очень чувствительны благодаря использованию радиоактивных меток, поэтому
можно определять очень низкие концентрации аналита. Метод до сих пор имеет преимущес-
тва перед другими технологиями при определении токсикантов в крови и тканях благодаря
независимости получаемых результатов от матричных эффектов. Большинство других ИХМ
не могут быть применены при исследовании крови в случае летального исхода. Скрининг
посмертной крови проводят после предварительной оорабозки ацетонитрилом или подобны-
ми растворителями для удаления белков. Желчь без предварительной обработки может быть
протестирована на амфетамины, барбитураты, опиаты и фенциклидина (РСР), а после прове-
дения пробоподготовки в жезчн можно определять каннабиноиды и бензодиазепины. Сочета-
ние высокой чувствительности и низкого матричного эффекта позволяет успешно обнаружить
диэтиламид лизергиновой кислоты (ЛСД) в моче, рицин в тканях, каннабиноиды в волосах.
Рахтичные примеси, добавленные донорами, пытающимися скрыть факт употребления нарко-
тиков, к образцу мочи, обычно не дают ложноотрицательный результат. Недостаткам!! мето-
да являются трудности, возникающие при уничтожении радиоактивных отходов, небольшим
сроком юдности тестов (обычно 60 дней) из-за радиоактивного распада. Этот гетерогенный
тест трудно адаптировать к недорогим автоматическим анализаторам. Многие производители
304 Глава 6
иммунологических РИА-тестов их больше нс изготавливают лля рутинных исследований из-за
перечисленных недостатков, которые снижают потребительский спрос.
ИФА Технология EMIT (ферментно-мультиплицируемый иммунный тест)
Это гомогенный тест, сущность которого и схема проведения исследования представлены
на рис. 6-15. Меткой, присоединенной к наркотику в этом исследовании, является фермент
глюкозо-6 фосфатдсгилрогспаза (G-6-P-DH). который окисляет субстрат глюкозо-6-(|юсфг i
до глюкуронолактон-6-фосфата и также восстанавливай кофактор никотинамидадонннли-
нуклсотил (NAD) до NADH. Активность фермента подтверждается спектрофотометрическим
измерением продукции NADH (при А 340 нм). Ферментативная активность G-6-P-DH снижа-
ется, когда прикрепленный наркошк связан с антителом, т.е. добавление наркотика вызыва-
ет высвоСх жденис меченого наркотика из антитела, при этом возрастает степень продукции
NADH. Изменение поглощения при к 340 нм прямо связано с концентрацией наркотика в
биосубстрате.
Преимуществ.
• Коли юство связанного меченого наркотика может быть измерено без отделения свободно-
го. Этот гомогенный тест прост для автоматизации, поскольку реагенты можно смешивать,
инкубировать и легко проводить измерение в реакционной емкости. Производительность
auajui iatopa до 500 образцов в I ч с помощью одной мониторинговой системы. Автоматиза-
ция снижает внутритестовую вариабельность и повышает достоверность результатов.
• Срок хранения наборов длительный (обычно более 1 года).
• Тесты ригшчаются большим диапазоном концентраций.
• Используемые технологии широко внедрены в практику, методически близки, что облетает
подбор оборудования и снижает стоимость исследования.
• Изменение поглощения раствора измеряется как функция от времени. Поглощение от из-
лучающих веществ обычно не изменяется со временем, и сю влияние минимизировано.
• Разработаны нскоюрые специфичные тесты, например на ЛСД.
Недостатки:
Высоким уровень
превращения NAD* в
NADH
Субстанция
NAD’
Продукт
NADH
Наркотик в растворе
Высокая концентрация наркотика
Антитело
Низкая концен рация наркотика
Низкий уровень
превращения NAD* в
NADH
Субстрат
NAD*
Рис. 6-15. Сущность технологии EMIT н схема ироведе! ия исследования по М. L. Smith. Пояснение в
тексте
Методы определения токсикантов в биосредах 305
• В 1НЯНИС па результаты не только кросс-рсактивиых соединений, но и матричного эффекта,
что ведет к нарушению фермента тинных реакции. Например, салициловая кислота, метабо-
лит аспирина в моче, может привести к ложноотрииательным результатам.
• Интерференция вешеств обычно привозит к южноотрицате льным результатам.
• Определение ЛСД (см. выше) имеет линейные характеристики только при низких концен-
трациях (пг/мл). в другом случае дает €т льшой процент ложноположительных результатов,
возможно, из-за кросс-реактивности веществ.
ИФА. Технология CEDIA (клонированный ферменто-донорный иммуноанализ)
Сущность метода и схема проведения исследования представлены на рис. 6-16.
CEDIA — запатентованная технология ИХМ. использующая тенно-инженерныс фра мен-
ты р-галакювилазы Е соП и качестве ферментной метки. Активность фермента проявляется
при сочетании двух фрагментов, называемых ферментно-акпетпорным (ЕА) и ферментно-ло-
норпым (ED). При ферментном гидролизе хлорофенолред-р-галакгозид (CPRG) расщепляется
на хлорофенолред (CPR) и талактозу CPRG не потлошаст значимую энергию при л 570 нм.
Для CPR максимальное поглощение наблюдается при к 570 и 660 нм. что легко может быть
измерено ED-фрагмент связан с наркотиком и не будет реассоциировать ссзи находится в
комплексе с антителом. Добавление наркотика вытесняет ED-мсченный наркотик из антитела,
в результате наблюдается реассоциация и возрастает абсорбция Концентрация наркотика в
биологической жидкости прямо пропорциональна изменению поглощения.
Преимущества.
• Этот нммупотест гомогененпыи.
• Срок хранения реагентов длительный (обычно бс ее I года).
• Ферментативная активность часто полностью останавливается. когда связывание антитела
блокирует реассопианию фермента. Этот феномен делает высвобождение меченого нар-
котика. последующую реассоциацию (фермента и получение окрашенного продукта прямо
Антитела
Фермент
с меткой
Наркоти в образце отсутствует
Ферментно-
акцепторный
фрагмент
Ком леке
антитело-меченый
фермент
Ферментно-
акцепторный
фрагмен
Парко ик в образце присутствует
Антитело
Фермент
с меткой
Ферментно-
кцегтгорыый
фра мент
Комплекс
антитело-
наркотик
Активный
ферме т
Рис. 6-(6. Сущность технологии CEDIA и схема проведения исследования по М. L. Smith. Пояснение в
тексте.
306 Глава 6
пропорциональными концентрации HHiepecyioiiicro наркотика. Стандартны! график лине-
ен в широком диапазоне значений концентраций.
• Мониторинг второй длины волны. 660 им. обеспечивает некоторую меру танины or влияния
мешаюшнх веществ, которые могут поглощать УФ-свет при первой длине волны, равной
570 нм. И гмененис поглощения раствори измеряется как функция от времени. Поглощение
мешающих веществ обычно нс изменяется со временем, и их вклад минимизирован.
• CEDIA имеег трехкомпопешпый набор для исследования, который может быть использо
ван дня измерения ЛСД. Метод имеег большой линейный диапазон, что снижает всрояг-
пость фальсификации.
Недостатки.
• Технология относительно новая, разработанных методик недостаточно, но работы в этом
на 11 ра н ген и 11 11 ролоджакп ся
Достаточно велик процент ложпоотрипятельпых результатов из-за влияния примесей в моче
и матричного эффекта.
ИФА. Технология ELISA (Enzyme linked immuno-sorbent assay; гетерогенный твердофазный)
Сущность метода и схема проведения исследования представлены на рис. 6-17.
Если в растворе нет наркотика, то меченый фермент (пероксидаза хрзна) превращает суб-
страт телраметилбеизцднп (ТМВ) в окрашенный про вкт (Х1П 450 нм). Если часть наркотика в
комплексе фермент-наркотик связывается с антителом, прикрепленным к поверхности микро-
титрованной плтетинкп. то активность фермента снижается. Меченый наркотик выевобожд 1-
стся из связывающего центра антитела, и активность фермента восстанавливается пропорцио-
нально концентрации наркогика в добавленном образце (см. электронное приложение).
Преимущества.
• ELISA высокочувствип ен.
• Менсе выражены магричные эффекты (гетерогенный Тест). Технология двойной промывки
позволяет анализировать образцы посмертной крови.
Нет абсорбции Абсорбция,
Рис. 6-17. Сущность технологии ELISA и схема проведения исследования по М. L. Smilh. Пояснение в
тексте.
Методы определения токсикантов в биосредах 307
• Автоматизация возможна и проще. чем в РИЛ
• Срок годности ферментной метки больше. чем радиоактивной в РИА.
Недостатки.
• Адаптация к обычным высокоскоростным анализаторам затруднена, гак как это гетероген-
ныт метол. Используются специальные анализаторы (только лля этой технологии).
• Стоимость анализа 1 образца выше, чем таковая гомогенного метода из-за необходимое пт
ис юльзовагь специальный авализатор.
• Консервант мочи — натрия азид (бензоат), добавляемый ,ыя сохранности обр; итотз. бло-
кирует активность пероксидазы крени, в этом случае метод не может быть использован для
анализа подобных образцов.
Кинетическое взаимодействие микрочастиц в растворе. Технология KIMS
Меченые соединения — микрочастицы, связанные е молекулами наркотиков. В отсутствие
определяемого наркотика, конъюгат микрочастицы и молекулы наркотика связывает несколь-
ко молекул апттпел. образуя большие агрегаты. которые рассеивают направленный свет. Пока
продолжатся реакция агрегации, возрастает абсорбция. Добавленный наркотик конкурирует
за сия ть с микрочастицами, и таким образом ингибирует образование агрегатов, что уменьшает
уровень поглощения света пропорционально котптетнратити наркотика.
Преимущества.
• Дешевый гомогенный тест
• Срок годности наборов длительный (обычно более I года).
• Конъюгаты микрочастица—наркотик более стабильны, чем конъюгаты фермент—нарко-
тик.
• Вещества. которые мешают процессу агглютинации в KIMS, обычно ведут к ложнопо-
тожитс тытым результатам. Эго является преимуществом, потому что иммунотссты — ск-
рининговые тесты для идентификации образцов, которые мотут содержать наркотики.
Образцы, содержащие и наркотики, и мешающие субстанции, будут распознаны как по-
ложительные на KIMS и погребу и полтверж тюнтих тес эв. то на как другие технологии,
такие как EMIT, дадут ложноотрннательные результаты и нс будут плен гифи титроваться
по тгверждаюшимтт тестами. Изменение пог тошения раствора измеряется как функция от
времени. Поглощение от мешающих вешеств обычно не изменяется во времени, п.х вклад
минимизирован.
Недостатки
• Микрочастицы раствора, используемого в KlMS-тсстах. покрывают аналитические трубки и
требуют специального обслуживания.
ПФИА
Су т ниость метола и схема проведения исследования в общем nine описаны выше (см. гл. 6.2.2).
представлены на рис. 6-18 (а также ем. электронное приложение).
Преимуществе
• Иммуитютссг гомогенный.
• Наркотик, меченный флюореспенном. более стабилен, чем конъюгат наркотик—фермент.
• Флюоресценция пробы обеспечивает низкий предел обнаружения.
• Матричный эффект имеет меньшее влияние на изменение поляризации (tMiioopeciieiiiiHH.
чем на изменение прямой интенсивности свепа, что делает технологии ПФИА при опре-
делении наркогиков в крови или образцах мочи. хранившихся в течение нескольких дней
более точными, чем технологии ИФА.
• Срок хранения реагентов длительный (обычно более I года).
Недостатки.
• Тесты более дорогие, чем ИФА тесты.
• Флюоресценция солей в желчи инотда лает ложноположитстытые результаты.
• В настоящее время немногие технологии ПФИА адаптированы к обычным высокоскорост
ным анализаторам. Техно опт Abott (см. выше) должны быть выполнены только на анали-
заторах компании.
308 Глава б
Высокая концентрация антигена - Низкая поляризация фпюоресце ции
Низкая концентрация антигена - Высокая поляризация флюоресценции
1*нс. о-18. Принцип ПФИА Пояснение ем. гл. 6.2.2.
F — флюоресцентная метка; Ag — антиген; А — шпнтсло; F-Ag — трсисср — меченное флюоресцентной
меткой производное определяемого вешества.
Иммунохроматография на тест-полосках
Этот метод основан на протекании иммунной реакции антиген—антитело при движении
тестируемого образца жидкости по полоске та счет капиллярных си тт визуальной детекции
образования окрашенных зон в различных участках полосок с иммобилизованными иммуно-
реагентами.
Поскольку антитела специфичны к соединению определенной структуры, то наборы выпус-
каются отдельно на каждую группу наркотических средств и i \ метаболитов (опиаты, кокаин,
каннабиноиды, барбитураты и т.д.). Таким образом, при обнаружении неизвестного наркоти-
ческого средства исследуемый биообъект необходимо последовательно проанализировать на
все группы наркотических средств.
По своему исполнению тест-системы и лиагностикумы предусматривают гомогенный или
гетерогенный варианты анализа. Для детекции низкомолекулярных веществ, таких, как нар-
котики. используется конкурентный формат иммунохромаилрафии. Принцип ттммуттохромато-
графического анализа (ИХА) состоит в следующем (рис. 6-19).
На верхний участок тест-полоскн мембранного носителя иммобилизуют конъюгат антиге-
на с бе Iком-носителем (тест-зона), а в другом месте (обычно выше по полоске на 0.5—J см)
иммобилизуют антпвидовые антитела (контрольная зона), которые используют для контро-
лирования пригодности иммунорсагепгов. На нижний участок тест-полос ктт. который будет
погружаться в детектируемую жидкость, сорбируют конъюгат специфических антител на оп-
ределяемый антиген с меткой (обычно коллоидное золото) При погружении тест-полоскн в
пробу образна жидкость начинает подниматься пол действием капиллярных сил по мембране
и проходит нижний участок полоски с сорбированным конъюгатом, который также начинает
Методы определения токсикантов в биосредах 309
Движение фронта жидкости
Наличие антигена
Отсутствие антигена
Требуется
повторный анализ
Рис 6-19. Принцип ИХА нм тест полосках
подниматься с потоком жидкости. Если определяемого апппсна в пробе ист. то окрашен
ные меченные антитела доходят до верхнего участка полоски с иммобилизованным антигеном
(тсст-зона). Происходит иммунная реакция, и образуется окрашенная зона. Если в тестируе-
мой пробе антиген есть (в концентрации не ниже установленного порогового уровня), ю он
будет взаимодействовать с антителами с образованием иммунного комплекса. Это приведет
к блокировке активных центров связывания антител, и такой иммунный комплекс нс будет
связываться с иммобн шзованным антигеном в гсст-зонс, а будет нродвн аться выше но тсст-
полоскс В результате эта тест-зона будет не окрашена. Далее иммунный комплекс антигена с
антителом. меченным коллоидным золотом, будет пре пинаться до участка полоски с иммоби-
лизованными а нтн видовы м и антителами. На этом участке будет формироваться аптивиловой
иммунный комплекс, который приведет к образованию окрашенной контрольной юны. Об-
разование окраски в контрольной зоне должно быть всегда н служит кошролем сохранности
тест-полос к и для использования. Если окраски в контрольной зоне пет, го иммунорсагснты
на тест-полоске неактивны и результаты определения нельзя оценить. Необходимо повторить
тестирование с помощью новой тсст-полоскн
Таким образом формирование на тест-полоске одной окрашенной (контрольной) зоны
свидете/1ютвует о положительном результате анализа (выявление антигена н копнен грации
не ниже контролируемой), формирование двух окрашенных зон означает отсутствие антигена
в исследуемой пробе. Отсутствие окрашенных зон означает, что тсст-нолоски не могут быть
использованы тля проведения ИХА
Портовые уровни (см. ниже) определения наркотических и психотропных веществ с помо-
щью тест-полосок ИХА приведены в табл. 6-7.
310 Глава 6
Пало заметить. что положительный результат исследования, по пленный на тсст-нолосках.
далеко нс всегда свидетельствует об употреблении наркотических и психотропных вешеств и
обязательно под!вержлается другими специфическими методами. Ввиду высокой чувствитель-
ности ИХМ следует осторожно подходить к оценке и интерпретации полученных результа-
тов при анализе образцов с крайне малым содержанием наркотических вешсств (см. гл. 5.6).
Например, прием терапевтических доз лекарственных препаратов — барбитуратов, бензодиазе-
пинов может тать положительный результат анализа с помошью тест-системы, но эго не сви-
детельствует о нсмедининском использовании указанных вешсств для одурманивания. Тест-
полоска на каннабиноиды может дать ложноположнтелытый результат, если в образце мочи в
относительно большом количестве содержится папаверин с дибазолом, например лекарствен-
ный препарат паттазол Поэтому положительный результат без дополнительного исследования
другими методами имеет предварительное значение и интерпретировать ею может только спе-
циалист, особенно для дифференцирования употребления определяемых вешеств с лечебной
пслыо или для наркотического и одурманивающего эффекта.
Оборудование, вспомогательные материалы и посуда.
• Герметично закрытый влагонепроницаемый пакет, содержащий тест-полоску
• Пластиковый или стеклянный контейнер для мочи на 100—200 мл.
Сбор и подготовка обращав мочи Свежие пробы мочи собирают и чистые пластиковые или
стеклянные контейнеры, не использованные ранее для сбора мочи и нс содержащие консер-
вантов. Пробы можно исследовать немедленно или хранить в холодильнике (2—8 ’С) до 48 ч.
Лля более длительного хранения пробы мочи замораживают при —20 ’С или более низкой
температуре.
Ход анали за, Вес компоненты теста и образна мочи перед проведением анализа натревают зо
комнатной температуры. Мочу собирают в чистую сухую пластиковую или стеклянную посуду.
Вскрывают упаковку гест-нолоскн. разрывая сс вдоль прорези. стараясь нс касаться рабочей
поверхности мембраны. Извлекают полоску и погружают сс вертикально в мочу до уровня
отраничнтелытой линии па 30—60 с. Тест-полоску из мочи вынимают и кладут на торизотгталь-
ную поверхность, через 5 мин учитывают результат реакции.
Для иммунохроматотрафттчсских тест-тюлосок в качестве меток используют или ферменты,
или окрашенные мелкодисперсные вещества. такие, как коллоидное золото. Частины колло-
идного золота диаметром or 5 до 50 нм имеют ярко-красную окраску, которая легко детекти-
руется. На эти частицы иммобилизуют антигета. чаше всего используют аффинноочишеппыс
поликлональные тын моноклональные антитела. Для детекции ферментной метки нсобхонтмо
дополнительно добавлять раствор субстрата, при этом определение метки коллоидного золота
происходит визуально без допо.тннтельноз'т обработки. В настоящее время практически для всех
нммуиохромзтографнческих тест-полосок используются окрашенные ме ткодиспсрспые метки и
образова тис иммунного комплекса детектируется непосредственно в ходе движения жидкости.
В отличие от других ИХМ. проведение ИХА на тест-полосках нс требует никаких допол-
нительны* решенгов — все необходимые иммунореагенты находятся на тест-полоскс. Весь
анализ сводится к простому погружению тест-полоскн в тестируемую жидкость (например,
мочу), перемещение тест-полоскн на горизонтальную поверхность (для облертення продвиже-
ния жидкости по мембране за счет капиллярных си. ) и визуальной ретттстраиии окрашивания
зон на тест-тю тоске. Обычно время проведения анализа составлял 5—10 мин (в зависимости
от типа используемой мембраны для изготовления тест-полосок)
Преимущества.
• Простота метола (нет необходимости в дополнительных реагентах и приборах, нет стадии
пилотирования и промывки — все необходимые иммунорсагенты для анализа нанесены
заранее на мембрану).
• Определение может быть проведено неподготовленным персоналом в нслабораторных усло-
виях.
• Быстрота метопа — получение ре ультдта в течение нескольких минут.
• Внзуапызая детекция результатов для качественно или полуколнчественного анатиза.
Из-за этих преимуществ иммупо.хроматографическис тест-полоскн широко используются
для быстрого выявления различных биологически активных соединений и диагностики многих
забо. (енаний.
Методы определения токсикантов в биосредах 311
Применение обшелост ных тест-систем, получивших в последнее время широкое распро-
странение для диагностики употребления наркотических и психотропных средств, расширяет
возможности скрининговых исследований в лабораторной практике.
Тест-системы, основанные на методе ИХА. позволяют в течение нескольких минут вы-
явить наличие наркотических или психотропных средств и их метаболитов в моче человека.
Па предварительном этапе быстрая и простая диагностика, нс требующая дополнительного
оборудования, реактивов и специальных навыков, может быть очень полезна в качестве вспо-
могательного скринингового метода. В настоящее время выпускаются готовые коммерческие
тест-системы и наборы реагентов — диаптоетикумы для определения опиатов (морфин, те-
рпин) и канабнпоилов (марихуана), а также амфетамина, метамфетамина, бензодиазепинов,
барбитуратов. метадона и др. (см. электронное приложение).
МЗиСР Российской Федерации разрешены к применению их мунохроматографичсские
экснресс-тесты (тест-полоски) российского и зарубежного производства для выявления со-
держания ряда наркотических и психотропных средств и/нлп их метаболитов в моче чело-
века: амфетамина, метамфетамина, каннабиноидов (при употреблении марихуаны иди ее
продуктов), морфина (опиатов), кокаина, бензодиазепинов, барбитуратов, метадона, фен-
циклидина. экстази, трициклических антидепрессантов. Используются также тест-системы
для одновременного выявления в моче от 2 до 6 видов наркотиков. Наиболее качественные
тесты нре гептилены на российском рынке фирмами-и по гонителями ООО «Инновацион-
ные биотехнологии». ООО «Фактор-Мел». SureScreen Corp. (Канада), DRG Intern. (США).
Phamaicch (США). Human (Германия), имеющими регистрацию в МЗиСР РФ Данный вил
изделий медицинскою назначения не требует обязательного сертифицирования продук-
ции.
В последнее время был разработан новый метод выявленття скрытых форм наркомании,
в основе которою лежит ИФА. определения в сыворотке крови антител к наркотическим
веществам. Антитела к наркотическим веществам определяются, даже если испытуемый
воздерживался от употреб тения наркотиков более I нсд. поскольку антитела к наркотичес-
ким веществам циркулируют в крови после последнего употребления в течение 2—3 мес.
Разработаны наборы для определения антител в крови к опиатам, каннабиноидам, амфе-
таминам.
Особенности и трудности определения наркотиков
Моча — эго аналитически верный выбор обрата для скрининговых иммунотсстов, так как
обычно в ней меньше мешающих определению протеинов и продуктов распада эндогенных
веществ, но образцами мот быть груше жидкости пли ткани. Например, потерпевший, ко-
торые погиб от передозировки героина, имеет высокие конненграний морфина в крови, но нс
в моче (см. гл 5) Скрининговые иммупотссты мочи на опиаты будут давать отрицательный
результат. Получение результатов скрининговых исследований крови и их интерпретация —
более сложная задача, гак как сильнее нроявлются матричный эффект, кросс-реактивность
и влияние сопутствующих веществ Белки обычно осаждают до анализа ацетонитрилом или
подобным растворителем, отбирая пинеткой верхнюю фракцию для исследования ИХМ При
этом следует иметь в виду некоторые особенности проведения исследования.
• Кровь умершего со временем рахтагается, про унируя биогенные амины, которые пере-
крестно реагируют с антителами в иммунологических исследованиях на амфетамины и дают
ложт ют тол ож и тельные результаты, например в биоло нческих жидкостях может накапли-
ваться тирамин, перекрестно реайтруюший в иммунологических исследованиях.
• Соли желчи, часть из которых флюоресцируют, могут давать ложноположительные резуль-
таты при проведении ПФИА.
• Некоторые тесты РИА и ELISA будут давать ложпоположительныс результаты на канна-
биноиды в хранившихся некоторое время образцах крови. Механизм этого явления пока
неясен.
• Высокие концентрации лифе тт гм трам и па дают ложноположительные результаты в некото-
рых им му но тестах мочи на фенциклидин (РСР).
• Дигилроколенн и кодеин дают ложноположителытые результаты в большинстве исследова-
ний на морфин.
312 Глава 6
• Тесты ИФА метут давать ложноотринагсльныс рс тультаты. если в образце присутствует кон-
сервант (XaF или NaN,).
• Высокая концентрация наркотика и крови потгверждаст недавнее употреГ теине наркотика,
что может бьпь важно для расследования обстоятельств дела.
Во многих наборах пммунозсстов. помимо антисыворотки и меченого антигена, имеются
кялйбраторы н котрольпые растворы. К ыибратор — это раствор. содержащий диализируемое
вещество в известных концентрациях и используемый для установления измеренной концен-
трации в анализе. Калибра горы используют в соответствии с аналитическими требованиями.
Контрольные растворы готовят в свободной от наркотиков бпожндкости. Если иммуноапа-
лнз применяется как скрининговый тест, то достаточно одного калибратора. Для количест-
венных тестов в каждом исследовании должно быть использовано несколько калибраторов с
различными в низких и высоких областях концентрациями анализа в линейном диапазоне.
Лаборатория должна обосновать и подтвердить ограничение детекции и линейный диапазон
лля псиолыусмой мегодики. Результат теста варьирует к зависимости or партии используемых
иммунореагентов, поэтому периодически необходимо подтверждать параметры эффективности
технологии.
Особая. весьма важная и специфическая проблема определения наркотиков ИХМ — пере-
крестная реактивность, или кросс-реакция (связывание структурно родственных вешеств). Пе-
рекрестная реактивность для определяемых вешеств обязательно должна быть подтверждена.
Большинство производи!слей исследуют потенциальные мешающие вещества. и их перечень
вкладывается в упаковку тестов. Результаты исследований дают возможность публиковать бо-
лее полные списки веществ, имеющих перекрестную реактивность (табл. 6-5). Однако мета-
болиты этих вешеств обычно труднодоступны .тля определения, часто их концентрация в моче
весьма высокая, что влияет на результаты иммунологических исследований мочи. Например.
<|>снфлурамии и фентермин — вещества, используемые лля лечения ожирения, имеют низкую
нрекрестную реактивность при определении ам«|>ет imhhob метолом ПФИА, но норфенфлурд-
мнн — метаболит фенфлурамина в моче — имеет более высокую перекрестную реактивность и
ласг ложпоположительные результаты.
Таблица 6-5. Кросс-реактивность в иммунохимнческом диализе
Ичмутготесты Вещества. тякипне кросс-реакцию
Амфез ам и н/мез ам<|н-та\>и н МДА. МДМА. хлорохин, эфедрин. псевдоэфедрин. фсиилнро- пвншаыии. тирании. фентермин. фенметразин, фенф.тюрамнн. рпннтнлин
Бензодиазепины Хлорпромпзии
Бснзо1ыэк1онш1 (кокаин) Экгонин. метиловый эфир экгонина, кокаин
Каннабиноиды (ТГК-метаболиты) Кетопрофен. тплмстии. напроксен, ибупрофен, япетиясалнннло- вая кислота
лсд Эрготамин, трициклические антнлепрессвнты, вераиамты. ссрта- лин. <|к*нти>»тл
Морфи» Кодеин, диги роко :нн. тебаин, гидрокодон, оксикодон, окси- морфон. меперидин, норкодсин
Фенниклилтш (РСР) Декстромсторф.1н. TCP
Примечание. МДА — мс>и.1сн.1ноксиимфетамин, МДМЛ — мс1илендиоксиметамфетлм1Ш. ТГК — тст-
рагндрокмннабннол. TCP - теноциклидин (см. гл. 7).
Интерпретация подученных результатов при использоткшии ряда тестов требует особой тща-
тельности и учета возможных кросс-реакштй. Например. Е-эфслрнн нс ласт кросс-реакпню в
амфетаминовом тесте (табл. 6-6). Однако нужно помнить, что концентрация эфедрина в образ-
це мочи обычно нах ноги выше, чем концепт виня амфетаминов. 1 опта образен с эфедрином
будет показывать очевидный амфетаминовый результат, например 1100 нг/мл. что превосходит
cul-oir. равную 1(КМ) нг/мл. т.е. установленную наказуемую норму (по законам ЕС н С 111 А.
см. ниже). Биопробы людей, принимающих эфедрин, могут быть опеиепы пихт способом кзк
положительные на амфетамин. Поэтому требуется, чтобы вес образны, положительные в нм-
мунохимическпх тестах. подтверждались другими методами (например. ГХ-МС).
Методы определения токсикантов в биосредах 313
Таблица 6-6. Кросс-реактивность теста амфетамин/ме" амфетамин
Встгество Кросс-реактнвность %
Р-Амфстамтш 100
D- Метамфе т амин 100
L-Мепгмфетамнтт 50
Фентермин 50
[.-Амфетамин 16.7
L-Эфелрнн 0.5
Тирамин 0.5
Фенишроианоламии 0.3
Псевдоэфедрин (ИХ) мкт/мл) 0.15
Псевдо? тел яш 1 мг м.Г) 0.08
В табл. 6-6 показана более низкая кросс-реактивность для L-амфетамина. стереоизомера
D-амфетамииа. чем для фентермина, структурного изомера магамфетампна. Феигсрмнн от-
личается от амфетамина наличием метильной группы у асимметрического углерода метам-
фетамина и свободной аминогруппой, т.е. потерей хиральности. Это значимое изменение в
структуре и большая кросс-рсакзинпость кажутся парадоксом, ио в иммунной реакции важна
совместимость с принципиально распознающей структурой антител. Синтез иммуногена, ис-
пользованного для продукции антител у мышей в этом исследовании, показан на рис. 6-20.
Анти геля. «построенные» иммунной системой мыши, нс могут полностью отличить фентермин
от метамфетамина или амфетамина. Эго следует иметь в пилу при опенке недостатков иммуно-
тестов и интерпретации полученных результатов (см электронное приложение).
С течением времени иммунотссты приобрели большую специфичность к таким нарко-
тикам. как амфетамины, бензоилэкгонин. каннабиноиды, морфин, колени и РСР. Тем не
менее остаются нерешенные вопросы. Например, тесты па каннабиноиды, направленные на
определение метаболита марнхауны 11-нор-9-карбокси- Д-9-тетрагилроканнабинолглюкуро-
нида. идентифицировали большее число употребляющих лиц, чем при применении других
технологий. исттользуютних ант и тс та. более спепифичные лтя другого метаболита (см. гл. 7) —
неконъюгированной кислоты. Другой пример. Идентификацию бензодиазепинов проводят (по
разным методикам) как но нсконьюгированному наркотику, так и но конъюгированному ме-
таболиту. хотя конъюгированная форма находится в моче в большей концентрации (см. гл. 7).
Решение вопроса было найдено и предложено добавлять в образен мочи р-глюкуронндазу (для
пиролиза конъюгатов) перед тестированием. Рял производителей изготавливают спектр до
сгупных антител, позволяющих потребителям выбирать подходящий набор для применения.
М-(4-бромобутил)фталимид
Н.С СН
Метамфетамин
Н,С СН,
(,-CH-N—(CHJ.NH
гаптен
белок
Н,С СИ,
1 j-CH-N-(CHi).NH-BGT
Иммуноген
Рис. 6-20. Синтез иммунотена. Пояснение в тексте
314 Глава 6
Cui-ofT — термин, используемый для скрининговых методов исследования. так как они
распознают образны либо как положительные, либо как отрицательные без сообщения коли-
чественных результатов. Пороговая концентрация (ciil-ofT) — концентрация вещества, выше
которой образец заведомо содержит определяемое вещество или. как говорят, является поло-
жительным образном. Этот термин принят для определения наркотиков (см. гл. 5.6)
Cui-olT — эго концентрация наркотика, ниже которой образны рассматриваются как отри-
цательные. Пороговая концентрация не рассчитывается. а принимается такой, при которой не
может быть ошибки в качественном определении, т.е. ложноноложп1сльиого результата (табл.
6-7 и выше табл. 5-I4). Чем чувствительнее метол, тем пороговая концентрация ниже. Напри-
мер, для ПФИА пороговая концентрация наркотика метамфетамина принята равной I мкг/мл.
тогда как для ТСХ опа в несколько раз больше.
Пороговую концентрацию при скрининговом анализе определяют как концентрацию, по
крайней мере в 3 раза бблыпую, чем предел обнаружения метода. Для этого обычно провозя i
определение фонового значения наркотика путем измерения не менее 30 образцов нормальной
мочи or здоровых людей. Пороговая концентрация устанавливается итнищдуально для каждо-
го наркотика с учетом ировсдепных испытаний. Некоторое огрубление пороговой концентра
пин практически сводит к минимуму вероятносп» получения ложноподожительных результатов
при скрининге образцов мочи.
Табит» 6-7. Пороювые уровни оп(кл£ синя (cul-oll) (в ш/мл) наркотических и психоцхмшых вешсств ИХМ
Вещества ИХА (тест-полоски) ПФИА ИФА
Морфин (опиаты, в том числе кодеин и героин) 300 2(М) IU
Каннабиноиды 50 25 5
Амфетамин НИМ) — —
Мегамфе|амнн 1000 (500) - —
/Амфе гампи/ ме шм<|х_т ими 11 — 300 10
Зкстази 31)0 —
Метадон 300 250
Кокаин и сю метаболит 300 300 10
Барби гураты 300 200 10
Бензодиазепины 300 200 10
Фенциклидин 25 25 5
ЛСД. 0.5
Примечание. Приведены данные по источникам литературы стран ЕС и США. Прочерк — не опре-
деляли.
В различных странах мира понятие административного cut-off представляет особую пробле-
му лия котирования на наркотики. Cul-ofl'устанавливают таким образом, что каждый человек
вне зависимости от того, в какой лаборатории тестируется образец, должен получить одинако-
вые результаты, соответствующие содержанию искомых анализов. Это означает, чго порог об-
наружения наркотических и сильнодействующих вешеств (cui-ofT) должен быть легкодостижим
и одинаков лтя любой тборатории. За рубежом си(-о(Т в моче установлены, но они отлича-
ются между собой в разных странах (см. гл. 5) В го же время в РФ отсутствуют официальные
или рекомендованные пороги обнаружения наркотических и психотропных веществ в моче.
В настоящее время правомерность вынесения заключения о состоянии опьянения, вызванного
неустановленным веществом, регламентируется приказом МЗиСР РФ от 10.QI.06 № I. по сто
трактовка яатяется сворной при медицинском освидетельствовании (см. гл. 1.5).
В ходе следствия иногда возникает необходимость быстро выделить курящих среди большой
труппы людей. ПФИА в автоматическом режиме позволяет провесги скрининг большого числа
образной мочп в кратчайшие сроки. В пробе мочи объемом I0 мкл за I мин можно определить
котинин. являющийся основным метаболитом никотина. Результтны ПФИА уже отобранных
обратив следует, как указывалось выше, но.пвердигь другими методами.
Методы определения токсикантов в биосредах 315
Определение антибиотиков и сульфаниламидов
Некоторые антибиотики (например, стрептомицин, х. орамфеннкол) находят широкое примене-
на в ветеринарной практике и животноводстве в качестве лечебных и профилактических средств,
•по приводит к загрязнению продуктов пггганмя животного происхождения остаточными количес-
твами антибиотиков. Для тщательного ко!проля пищевых продуктов на наличие в них остатков
ангибиошков. например амнногликозилных. исподьзуюг хроматографические методы с разными
видами детекции — масс-спсктрометричсской. электрохимической. флуоресцентной. ультрафиоле-
тогюн. характеризующиеся высокой чувствительностью и точностью (см гл 6). ио трудоемкостью н
длительностью пробополготовки. Предельно допустимая концентрация антибиотиков. например в
молоке. — 500 нг/мл Аналитические .характеристики ПФИА антибиотиков позволяют эффективно
вести мониторинг за содержанием ашибиигикоп в продуктах питания (табл. 6-8)
Таблица 6-8. Аналитические характеристики ПФИА антибиотиков
Антибиотик Предел обнаружения. нг/мл Линейный диапазон концентраций, пг/мл
Гентамипгш ПО 150-45(Ю
Канамнинп НО 100-5000
Стрептомицин 15 20- 10000
ПФИА стрептомицина используют для экспертизы образцов молока. Хотя в этом случае
н блюластся значительное влияние матрицы и образны необходимо разбавлять дистиллиро-
игниой водой это нс снижает экспрессное™ анализа и в то же время возноляет определять
остаточно низкие концентрации антибиотика. На примере определения гентамицина было
показано, что. используя тс же самые иммунореагенты, как для ПФИА. возможно проводить
флюоресцентный иммуноанализ по тушению флюоресценции лля определения антибиогика,
используя обычный флюоримстр. который может быть простым и миниатюрным.
Метод ПФИА позволяет специфически определять один сульфаниламид из большого числа
соединений со сходной структурой NH -CbH,-SO,-N’ll R. Ведутся исследования, и получены
предварительные результаты по созданию мульти-ПФИА, т.е. одновременного определения
нескольких соединений, близких по структуре. В настоящее время метод ПФИА оптимален
.ыя тестирования антител, определения аффинности гг стратег зги по выбору иммунореагенгон
хтя определения многих лекарств
6.2.4. Иммуно-химические методы определения
пестицидов, гормонов, токсинов
Начиная со второй половины 8()-х годов XX века, интенсивно ведется разработка техноло-
гии ИХМ определения пестицидов (см. гл 8.4). Традиционно применяющиеся для детекции
пестицидов методы ГЖХ. ВЭЖХ. ГХ-МС (см. гл. 6 3 гг 8.4) требуют пробополготовки образцов,
гтличия дорогостоящей аппаратуры и высококвалифицированного персонала.
ИХМ oripi гелеггггя пестицидов основаны на реакпии связывания их молекул специфически-
ми анти голами — поликлональными сыворотками или моноклональными антителами. В пос-
леднее десятилетие развиваются технологии полученизг рекомбинантных и химерных антггтел.
Большинство пестицидов являются моновалентными антигенами, поэтому они детектиру-
ются в основном посредством конкурентных схем ИФА (см выше). Принцип метода сосгонт в
конкурентном взаимодействии меченого антигена и определяемого вешесгва за ограниченное
число центров связывания специфических антител.
В прямом способе (direct ELISA) проведения ИФА анипсла иммобили зованы на твердой
фазе, а ферментная метка вводится в антиген (см. выше гл 6.2.1). Несмотря па сложность и
нсуниверсальность методов синтеза ферментных коггьюгагов. возможное влияние комгктсн-
тов образна на активность фермента, большинство коммерческих наборов .гля определения
пестицидов основано па этой схеме анализа. В последнее время появились сообщения о ген-
но-инженерном методе получения ферментных конг.югатов и их применении для определения,
например 2.4-дихлорофеноксиуксусной кислоты (2.4-Д)
316 Глава 6
Опн тко при разработке новых мет тик ИФА чаше всего применяют более простые методы
и иммупореагепты. Непрямая схем. (indirect ELISA) с использованием меченых вторичных
антител является одной из наиболее распространенных схем (см. выше гл. 6.2.1). Однако такая
схема анализа усложняет его но сравнению с прямым методом ИФА из-за введения дополни-
тельных стадий.
Методики ИФА адаптированы для создания тест-систем (наборы для ИФА). с помощью
которых можно определять пестициды в объектах окружающей среды и продуктах питания.
Коммерческие диагностические наборы преимущественно основаны на принципах твердофаз-
ного ИФА В большинстве производимых наборов используются поликлональные антитела,
поскольку их получение сопряжено с меньшими затратами средств Реализованы наборы чаще
всего на микропланшетах или в пробирках
Некоторые пестициды нестойки в окружающей среде, поэтому в некоторых случаях эф-
фективно проводить определение нс самого псстинт та. а продуктов его разложения. Другие
пестициды быстро подвергаются биотрансформаиии в организме до устойчивых метаболитов,
которые более токсичны, чем исходные пестициды (см тл. 8.4). Разработа ты методики ИФА
для определения в моче основных метаболитов териицидов алахлора (2-х.торо-2',6'-диэтилаие-
таннлид и диэтилацетанилнд) и метолахлора (меркаптурат метолахлора).
ИФА пестицидов позволяет проводить скрининг более 100 проб в день одним оператором
без значительного повышения стоимости анализа при увеличении нагрузки. Время ра эты
оператора при этом составляет около 2 ч. значительная часть времени тратится на проведение
этапов инкубирования. В настоящее время в практику входят автоматизированные лаборато-
рии. использующие вместо классических 96-луночных планшетов 384- и 1536-луночные. что
увеличивает производительность метала до десятков тысяч проб в день.
Реагенты для анализа 1 пробы примерно в 20- 100 раз дешевле реактивов на 1 пробу в мето-
дах ГЖХ и ВЭЖХ. стоимость оборудования в 5—6 раз ниже. Во многих странах ИФА признан
наиболее экономичным для экологическою скрининга.
Доля гетерогенного твердофазною ИФА среди всех ИХМ определения пестицидов состав-
ляет около 90%. ИФА (технология Elisa ) нетто, ьзуется не только для определения часто упот-
ребляемых пестицидов и их метаболитов, но и для других поллютантов (см гл. 10). например
полнаро.матических углеводородов, хлорированных дифенилов и диоксинов (табл. 6-9). По-
следние являются особенно сложными иммуногенами, что требует применения нестандарт-
ных схем при получении антител или изменения формата анализа. ПДК этих загрязнителей
настолько низки (для диоксинов — на уровне пикограммов), что классические схемы ИФА
становятся неприменимыми. Разрабатываются новые варианты ИХМ например гомогенный
фосфоресцентный иммуноаттали з диоксинов.
Таблииа 6-9. Основные параметры определения некоторых пестицидов и других агрязияющих веществ в
различных объектах окружающей среды и питиевых продуктах метолом ИФА
Вещества Предел обнаружения, мкт/л Диапазон определяемых содержаний, мкг/л
Алахлор •„ 0,7-27.9
Атразин 0.7 1-10
Аттстохлор 0.2 0,2-65
Аттстрат 2 5-140
Ацстил-глнфосинат 17 20 10000
Азадирактин 0.5 0,5-1000
Ьепзсульфурон-мегил U.002 0,01-0.60
Бромофос этил 0,3 I-1000
Глифосат 0.6 1-25
ГХЦ1 20
Гидрокси триашпы 0.01 0,006—2
Деалкилированные т пл жеи ттазины 0.32 0.8-37,S
Лиатипоп 0.05 —
2.4-Д (Тербмпил) 0.05 0.5-5000
Методы определения токсикантов в биосредах 317
Окончание та fa. 6- 9
2.6-Дихл оробензам i ia 0.05 —
ДДТ 0.4 —
ДДТ 0.2 —
Дслтамсгрнн 1.1 —
Диоксин 0.004 —
Инабенфнл 5 мкг/кг —
Имидаклоприд 0.1 —
Карбарил клрбоф ран. мегиокарб 10 мкг/кг —
Метолахлор од 0.1 4.2
Мсркашураг мею. ахлора 0,2 0,2-20
Mo.iiniai 1 82
Мешт-наратнон 0.05 —
Н итрофено. । 0.61 —
ПХФ 0.1 0.3 30.5
ПХФ 0.5 мг/кг 0,5—50 мг/кг
П< шхлорнрованные дифенилы 0.1 0.1-1000
Пропаты 1 мкг/кг
Пропан ид 0.2 20-130
Тиабендазол 1 ~ ~ ]
Трилзины 0.01
Атразин 0.1 —
Трнклоппр 0.037 0,1—5.2
3.4.6-Tp>ix.iopoiHip>i.'iiiii 0.052 0.13-6
2 4.5-1 0.02 0.023—5000
2.4.6 ТХФ 0.2 0.48-4.14
2.4.6 ГХФ 0.2
2.4.6-Tpii.viopoaiiii3u,i 0,01 —
Феноксикарб 1 МК1/КГ -
Фснитротон
Феннтрооксон 0.32 0.71-27
Фейт ион I 10-10000
Фснбендазол — 1-20
Флу штринат — 10-2000
Ф.зутолаинл 0,3 мг/ki 0,3-10
Хлорпнрнфос 1 — 1- 100 нМ
Хлорсульфурон I I —100
Ниперметрнн 1.3 1-100
Пиазин 0.01 —
Примечание. • Прочерк — не определяли. ГХИГ — гексахлороциклогексан: 2.4-Д — 2.4-лнхлорофе
иоксиуксусная кислота; ДДТ — 1.1.1-тр11хяоро-2.2-бис-(4-хлорфсинл)этан; ПХФ — пснгахдорофснол,
2.4.5-Т — 1рн.хлорофсноксиуксусная кислота.
Основными направлениями в совершенствовании методов иммуноанали ja являются: со
крашение времени проведения анализа: возможность проведения анализа в полевых условиях,
удешевление метола; миниатюризация анализа; автоматизация определения, возможность од-
новременного определения нескольких анализов (мультианализ).
Примером сокращения времени определения может служить применение гомогенных мето-
дов. не содержащих стадий разделения реагентов, например методов, в которых используются
импринтииг-полимеры вместо антител, а также ПФИА.
318 Глава 6
ПФИА — метол гомогенный (позволяет и {бежать стал ий разделения обра юнавшихся иммун-
ных комплексов). экспрессный (время анализа К) образной около 7 мни), достаточно дешевый
лля постоянного контроля за содержанием пестицидов в режиме реального времени, однако он
уступает твердофазному ИФА но чувствительности. Чувствительность ELISA (в среднем) со-
ставляет поряд ;« 0.2 нг/мл а чувегвнте тыюсть ПФИА для оире слепня пестицидов в рабочем
диапазоне концентраций — от К) нг/мл и выше. ПФИА является оптимальным методом для
мониторинга рабочих концентраций пестицидов в объектах окружающей среды.
Для онера явного экологического мониторинга в нолевых условиях разрабатываются экс-
пресс-тесты . Один из примеров таких lecion — определение ПХФ в воде и почве с визуальной
детекцией основан на агыютннании латексных микром летиц с пришитым ПХФ при связы-
вании с антителами. Время определения 5 мин. На том же принципе основан иммуноанализ
атразина и других зрпазипов. позволяющий определять атразин в почве и воде. Описаны им
муноанадитические тсст-полоски для онрелспия гербицида 2.4-Д и днфлюбеизурона в про-
дуктах питания Интенсивность развивающейся окраски определяют с помощью переносного
фоюмстра. общее время теста вместе с пробоподготовкой составляет 15 мин.
Примером миниатюризации ИФА с хемолюминесцентной детекцией служит использова-
ние одноразовых стеклянных капилляров, покрытых карбокснметилдекстрапом, к которому
пришиты моноклональные антитела. Определение 2.4.6 1ХФ и микрокапле (58 мкм) осущест-
вляется с помощью гомогенного иммуноанализа. основанного на тушении флюоресценции
Предел обнаружения метола 0.04 мкг/л. в моче 1.6 мкг/л. При осушсегвлснин данного метола
в микропланшете предел обнаружения составляет 0,36 мкг/л. Популярными в последние года
стали миниатюрные ашинническпе устройства — микрочипы, например определение атразина
в проточной системе на микрочипе.
Мульгианализ основан либо па применении группоспецифических антител, позволяющих
определять нееннищы одной группы, либо на совместном использовании антител к рах ичным
аналитам.
Высокой производительности определения позволяют достичь автоматизированные мик-
ронланшептые ИХМ. основанные на иммуноферментных. флюоресцентных и дручнх разно-
видностях иммуноанализа Эти технолотии являююя наиболее экономически выгодными для
массового скрининга (см. электронное приложение).
Попытки улучшить характеристики анализа и уменьшить сто стоимость привели к примене-
нию новь х видов антител; рекомбинан тных, антнидиотипических. синтетических и к исполь-
зованию только отдельных фрагментов антител. Fab-фрагментов, одноненочечных антител
Капиллярный электрофоретический ИФА с электрохимической детекцией позволяет до-
стигнуть пределов обнаружения на уровне нг/л В последние годы интенсивно разрабатывают-
ся биосенсоры и иммуносенсоры — миниатюрные приборы, основанные на специфическом
иммунном распознавании и электрохимической детекпии.
Многие иммуносенсоры основаны на флюоресцентной дегекнин. Например, оптоволо-
конный иммуносепсор .тля определения гербицида 2.4-Д использует флюорофор и состоит
нз компактного твердофазного лазерного источника и фотодетектора Предел обнаружения
2.4-Д 60 нмоль. Дручими примерами являются: электрохемолюминесцентный иммуносепсор
для определения 2.4-Д с пределом обнаружения 0.2 мкг/л; биосенсор на 2,4-Д с примене-
нием импринтинг-полимсров с рабочим диапазоном концентраций — 0.22-88.4 мкг/л: био-
сенсор на 2.4.6-трихлорани.зол с использованием трафаретных электродов (так называемых
screen-primed electrodes). Для определения 2.4-Д и атразина были разработаны пьезоэлектри-
ческие иммуносенсоры па основе золотого электрода. При определении 2.4-Д иенользукмея
иммуносепсор. основанный на конкурентном нммуноапализс с применением поверхностного
плазмонного резонанса (рабочий диапазон 3—100 мкг/л), а также системы, основанные на фо-
тоиндуиироваином переносе электронов (золь-гелевый люминесцентный сенсор с использова-
нием импринтинг-полимероп. специфичных к 2.4-Д) пли электрохимическом определении с
амперометрическими трапсдыосерами. Новые технологии имеют широкий линейный диапазон
определения, низкий предел обнаружения, позволяют нснользовн1ъ переносное оборудование
для измерений в полевых условиях.
Современные аналитические подходы позволяют проводить наблюдение за связыванием е
разрешением во времени. причем как с помощью меченых реагентов, так и без использова-
Методы определения токсикантов в биосредах 319
ния метки (например, интерференционная спектрометрия). Такие подходы применяются для
мздьти шали за. гак как считывание сигнала с различных cniiTOii на одном волноводе позволяет
тетею ировать несколько сигналов из одного образна та короткое в|»емя. особенно koi да опт
чсский транслыосср присоединен к CCD-камере.
Перечисленные методики ИФА определения пестицидов апробированы и включены в офи-
циальный список агентства по охране окружающей среды США (www.epa gov/ogwdw/methods
methods.html. link io EPA's Office ol Groundwater and Office of Research and Development drinking
water methods)..
ИФА является хорошей альтернативой физико-химическим методам анализа различных
объектов на остаточное содержание пестицидов. Однако влияние содержащихся в образце при-
месей может сказываться на результатах анализе. 11оэтому часто определению пестицида пред-
шествует предварите ьная подготовка образна. В некоторых случаях нивелировать влияние
матрицы удается способом ЖЖЭ. Чаше для выделения определяемого вешества применяют
другие виды экстракции: твердофазную ультразвуковую, микроволновую, суперкритическую
жидкостную и другие (ем гл. 5). в том числе нммуноаффипную.
Иммупотксгракпня используется при определении пестицидов, наркотиков, токсинов, ле-
карственных препаратов и совместима с различными аналитическими системами, например
жидкостной хрома гографии.
Для селективной экстракции пестицидов при пробоподютовке образцов применяется спо-
соб нммуноаффинной эксгракпии. основанный на специфическом связывании антигена и ан-
гитег । — исследуемого вешеова и стационарной фазы (рис. 6-21). Такой способ пробоподго-
товки позвотяет одновременно проводить жстракнню. концентрирование и очистку образна
от компонентов матрицы.
К преимуществам иммуносорбентов опюсягся возможное п> их регенерации и длительною
многократного использования по сравнению с сорбентами, применяемыми в ТФЭ. По срав-
нению с Mcio®iMit ЖЖЭ значительно сокращается расход органических растворителей, пос-
кольку десорбцию веществ проводят малым объемом (1—4 мл) органического растворителя.
Для экстракции максимального числа веществ одной группы применяют смсшшпые имму-
носорбенты. состоящие из антител к разным соединениям .данной группы и способствующие
полноте извлечения.
Иммунос'орбсшы обеспечивают высокую чувствительность и селективность при исследо-
вании самых разных объектов, характеризующихся сложным составом матрицы и наличием
А Определяемое вещество
• Примеси
—< Антитело
Аналитическое
разделение
▼
Детекция
г
Количественный
анализ
Рис. о-21. С хсмя пробоподготовки образна метолом иммуноэкстракннп
. — сорбция определяемою нешссгва на нммзпосорбете: б — промывка на пммуносорбепгс: и — лесорб-
л определяемого вещества.
320 Глава 6
примесей: биологических жидкостей, поверхностных и сточных вол. промышленных стоков,
продуктов питания.
Определение гормонов
Женские половые гормоны и соединения, близкие к ним по структуре. достаточно давно
используются в животноводстве. и их содержите жестко контролируется в продуктах низа-
ния. До недавних пор считалось. что эстрогены не содержатся в иодных источниках или их
содержание пренебрежимо мало. Однако исследования последних лет показали. что количес-
тво эстрогенов в воде рек и озер неуклонно растет Для мониторинга окружающей среды е
целью определения эстрогенов испозьзуют хроматографические методы с различными спо-
собами легекнии. твердофазный нммуноапализ п ралиоимму1юаиалг1з. Среднее содержание
эстрогенов в природных водных источниках составляет порядка 1 нмоль/л. Эстрогены даже
в столь низких концентрациях способны оказывать влияние на эндокринную систему живых
организмов Гетерогенные иммунохимические методы (El ISA РИА) применяют для количест-
венного определения эстрогенов, а также для обшего качественного обнаружения — «наличия-
отсутствия» — эстрогенов в воде ПФИА уступает перечисленным методам в чувствительности,
ио существенно превосходит их по экспресс!гости чго имеет богыное значение при работе
с большим числом образцов. Однако чувствительность ПФИА позволяет определять прогес-
терон и 17-оксипрогестерон в сыворотке крови человека. Для тироксина, гриио.тгиронина.
кортизола, тестостерона, эстрадиола метод ПФИА пока нс применим из-за низкой чувстви-
тельности и влияния матрицы образна. Дальнейшее совершенствование иммупорсагснтов и
приборной базы позволит повысгпь чувствительность ня экспрессною и прямою определе-
ния гормонов методом ПФИА В отличие от конкурентного формата ПФИА. однореагентный
способ распросгранен не гак широко. Его основное огличие от конкурентного заю ючаегся в
предварительном смешении растворов антисыворотки и трейсера с образованием раствора гиг-
мунокомплскса. называемого «single-reagent» (SR). При последующем добавлении к рлстворх
•singlc-геrgent» анализируемого обра на происходит вытеснение меченой» антигена немеченым
гг изменение аналитическою сигнала (рис. 6-22) Про гесс устаноатсния в системе равновесия
требует б< гыиего нремени но сравнению с конкурентным метолом, однако ом не превышает
20 мнгг, что позволяет использовать однореагентнын метод анализа без ущерба экспрсссносги
его проведения.
Одним из преимуществ олнореагенгного ПФИ А является большая стабильность рмгенгов.
Так раствор «single-reagent» может храниться без потери чхветвительностн гг специфичности
гораздо более долгое время, чем растворы антисыворотки и трейсера но отдельности
Определение токсинов
Микотоксины, например .гфлазоксин. охратоксин. зераленон и другие (см гл II) часто
обнаружишют в про гукт х питания при их неправильном хранении. особенно в южных регио-
нах с высокой влажностью воздуха. Синтезированы трсйссры и иммуногены на ряд токсинов,
получены моноклональные антитела и разработчик! методики, позволяющие определять гок-
еггны с высокой ч ветвитетьностьго гг специфичностью, например в зерне, орехах, пряностях
M—F Ад—F
Ло- F
а9 F
.Ал
Ад.—F
'Аду—f
Aq-f fAg_F
। Ад Ад)
1’ие. 0-22 Схема o.inopcuieHinoio ПФИ А.
F — флюоресцентная метка; Ag — антиген: значок Y — антитело: F-Ag — грепсер — меченое флюорес
iieiinioii меткой производное определяемо л» вещества.
Методы определения токсикантов в биосредах 321
Охратоксин Л определяют в метанольных экстрактах зерна без пробоподготовки. Так. предел
обг тружсния охратоксина А составляет 3 нг/мт, а параметр ICW ртвсн 30 нг/хтл. Кросс-реак-
тивность охратоксина А с токсинами зераленон. афлатоксин, натулин. токсин Т-2 ниже 0.1%.
В настоящее время наметилась тенденция к тому, что в контроле объектов окрхжаюшей сре-
ды на содержание иирязттителей хроматотрафические методы в ряде случаен будут заметены
иммуиохимичсскимп как наиболее простыми, быстрыми и дешевыми.
6.2.5. Иммуно-химические методы анализа
металлов и металлосодержащих веществ
Для определения ионон металлов в биологических ооразиа.х и объектах окружающей среды
применяются разнообразные методы (см. гл. 6.4 и 8.5). многие из которых довольно дорогос-
тоящие. требуют специального оборудования и пробоподготовки. ИХМ с использованием спе-
цифических антител служат дополнительными методами определения ионов металлов.
Антитела получают нс к попам металлов, а к комплексу ионов металлов с хелатором. Такие
антитела обладают способностью бтюмолекулярного распознавания хелатного комплекса оп-
ределенного металла, но они не связываются с соотт етствутошн.хт комплексоном (хелатором),
з также с комплексом этою комплексона с ионами других металлов. Хелатирующий агент нс
является специфичным для определяемого металла, ио имеет высокую константу связывания
с ним. Специфичноеи> определения ионон металлов обеспечивается специфичностью исполь-
зуемых антител к комплексу ионов металла с комплексоном. Па рис. 6-23 приведена схема
образования комплекса ионов металла (определяемого и неопределяемого) с комплексоном
и связывания специфическими антителами комплекса, образованною ионами определяемою
металла, но эти антитела не связывают комплекс, образованный с ионами другого (неопреде-
ляемого) х стаяла (см. электронное приложение).
В настоящее время получены поликлональные тт моноклональные антитела к комплексам
хелатов с нонами нескольких металлов и на основе этих анттттел разработаны методики ИХМ
Для определения ионов металлов чаше всего проводится конкурентный непрямой метол ИФА
(ELISA), включающий несколько стадий инкубации и промывки (рис. 6-24). На первой стадии
<з) к образцу с ионами металлов (кружочки различного размера) добавляют избыток хелатора
Ион определяемого
металла
Хелат определяемого
металла
(<1 кД)
Иммунный комплекс
(< 160 кД)
Лк 6-23. Схема образования специфических антител. Пояснение в тексте.
322 Глава 6
„Э С О о
Г'С '> * О °
CUU । О °
4
О Э г'
П Q z'J
О) w
+ Субстрат__Окрашенный
продукт
Рис. 6-24. Стадии проведения ИФА
лля определения ионов металлов. По-
яснение в тексте.
(закрашенные полусферы) для образования хе i иного комплекса. Па второй стадии (б) этот
хелатный комплекс добавляют в лунки планшета, на степк ix которого уже иммобилизован
хелатный комплекс, а затем вводят раствор антител (значок Y). Такт м образом, иницииру-
ют конкурентную реакцию между хелатным комплексом в растворе и хелатным комплексом,
иммобилизованным на твердом носителе, за связывание со специфическими антителами.
На рстьен сталии (в), после промывки и удаления всех компонентов иммунной реакции, кото-
рые остались в растворе, образовавшийся иммунным комплекс иммобилизованного хелатного
комплекса с антителами детектируют путем добавления конъюгата анти видовых антител с фер-
ментом (значок Y со звездочкой). После проведения промывки для удаления несвязавшихся
компонентов реакции добавляют раствор субстрата и проводят детекцию фермент спектрофо-
тометрическим шли каким-либо другим способом. В результате (г) получают градуировочный
график измеренного аналитического сигнала от концентрации иона металла в образце.
Дл I проведения ИФА необходимо 50 100 мкл образна. В зависимости от специфичности
и аффинности используемых антител и методики анализа можно определять ионы металлов в
широком диапазоне (табл. 6-10).
Таблица 6-10. Предел обнаружения ионов металлов методом ИФА (те.хнолошя LL1SA)
Хелатный комплекс металла I Ipeae.i обнаружения, (нг/мл)
Cddb-FDTA 7
Hgllh-EPTA 2
Pb(II)-CHXDTPA 1
Pb(Ih DTPA 2000
\idl) DTPX 50
UO.- 0.2
Hg(ll)—глютагион 1
In-ED1A 5
Примечание. EDTA CHXDTI’A. D ГРА—комплексоны различного строения.
Методы определения токсикантов в биосредах 323
Метод ПФИА отличается от ИФА простотой постановки методики. Вместо нескольких ста-
дии определение .методом ПФИА проходит в одну сталию (рис 6-25 и 6-26).
Для определения ионов металлов методом ПФИА к аликвоте образна, содержащего опре-
деляемые и неопределяемые ионы металлов, добавляют: избыток хелатора. который переводит
все ионы металлов в образце (определяемые и неопределяемые) в их хелатные комплексы:
фиксированную копненipamno трейсера (комплекса определяемого нона металла с хелатом,
меченного флюоресцентной меткой): фиксированную концентрацию специфических антител
Реагенты перемешивают и измеряют поляризацию флюоресценции реакционной смеси
В зависимости от концентрации ионов металла в образно и результ; е проведения ПФИ?\
могут полечиться следующие результаты (рис. 6-27). Если в образце нот или очень мало опре-
Образец. содержащий
ионы определяемого
металла
Иммунореагенты
Рис. 6-25. Принцип ПФПАдля определения попов металлов.
Хелат
сфлюоресц нтнои
меткой
Проба
Рис. 6-26. Схема конкурент него взаимоасГтстния комплек-
са ионов металла с хелатором и комплекса ионов металла
с хелатором, меченным флюоресцентной меткой (тренсе-
ром) со специфическими антителами
324 Глава б
Рис. 6-27. Схема ПФИА и пример градуировочного (рафика для определения ионов металлов. Пояснение
в тексте.
деляемых ионов металла, то только трсйсер будет взаимодеи :твовать со специфическими анти-
генами с образованием иммунного комплекса, который имеег бопаную молекулярную массу.
Поэтому поляризация флюоресценции реакционной смеси будет высокой (порядка 200—
250 единиц пт!’) Если в образце концентрация определяемых ионов металла будет высокая,
ю н кон ценз рани я комплекса этих ионов с с хелатором будет высокой, значит, этот комп-
лекс будет в (аимолейетвовать со специфическими антителами, а трейсср останется в свобод-
ном (несвязанном состоянии). Tpertcep имеет относительно невысокую молекулярную массу,
поэтому поляризация флюоресценции реакционной смеси также будет невысокой (порядка
50—100 единиц тР).
Для онрсдс (сния концентрации ионов металла в неизвестных образцах сначала получа-
ют градуировочный график Измеряют поляризацию флюоресценции реакционной смеси со
стандартными образцами ионов металла с известий концентрацией и сгрояз (радуировочный
график зависимости поляризации флюоресценции от концентрации иона металла в образце.
Для неизвестных образцов проводят таким же образом ПФИА. измеряют поляризацию флю-
оресценции реакционной смеси и по градуировочному графику рассчитывают концентрацию
ионов металла в обралте.
В настоящее время получены иммунорсагснты и разработаны методики ПФИА для оирсдс-
(сния ионов свинца (предел обнаружения 50 нг/мл) и кадмия (нре гсл обнаружения 1,0 нмоль
и диапазон 0—100 нмоль).
ИФ?\ и ПФИА являются новыми технологиями для определения ионов металлов. Они поз-
воляют окре ге । (га ноны Металлон н режиме реального времени и могут быть использованы для
быстрого полу количественною и количественного определения. Используя специфические ан-
титела можно онрсдс (ять ионы конкретною металла, а используя несколько антител, опреде-
лять несколько ионов металлов при совместном присутствии. Применяя антитела с широкой
специфичностью. можно определять суммарное содержание несколько б изких по свойствам
ионов металлов. Для определения ионов металлов в нанограммах ((а 1 мл необходимо 100 мкл
образна. Время определения иона металла в 96 образцах методом ИФА составляет около 2—
3 ч, а определение конов метатлов методом ПФИА (от 1 до 96 образцов) возможно за несколь-
ко минут.
Методы определения токсикантов в биосредах 325
6.3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ
Как много тел считалось невозможными.
пока они не были осуществлены
Питии Старший
6.3.1. Классификация, термины и определения
Работа русскою ученого М.С. Инета *О новг И категории абсорбционных явлений и о при-
менении их к биохимическому анализу* — первое исследование в области хроматографии —
был опубликована в I903 I.
К копну XX иска этот метол превратился в мощнейший инструмент. без которого невозмож-
но проведение химических биохимических, медицинских, космических п других исследова-
ний. экологического мониторинга, криминалистической и ги искусствоведческой экспертизы
Хроматография — физико-химический метол разделения вешеств или частиц. основан-
ный на различии в скорости их перемещения в системе несмешиваюшихся и движущихся
относительно друг лру а фаз. В ботес широком смысле хроматографией называют науку о
межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешива-
юшихся гг движущихся относительно друг друга фаз Эти два определения даны Научным
советом по хроматографии и адсорбции РАН. По определению этого понятия, данному
Фармакопеей США. Великобритании и других стран под хроматогр гфией понимают метод
разделения вешсств при помощи различных миграционных процессов в системе, состоящей
из двух или более фаз. одна из которых двигается в определенном направлении, при этом
ин дивидуальные вещества обладают отличной ipyi от друга подвижностью, обусловленной
различиями в адсорбции, распределении, раствори мое г и. давлении паров, размерах моле-
кул или плотности заряда. Полученные в результате разделения индивидуальные вещества
могуч быть обнаружены и количЖ'ГВсгшого оиредетспы при помощи подходящего аналн
тическою метода
Из вышесказанного следует. что хроматография как физико-химический процесс основан
на различных скоростях твижеиия и размывания концентрационных зон компонентов, ко
торые движутся в потоке подвижной фазы вдоль слоя неподвижной фазы. При этом необхо-
димо иметь в виду, что исследуемые вещества находятся в обеих фазах в равновесии между
ними.
Классификация и особенности применения Основываясь на рекомендациях И ЮНАК (JU РАК).
Научный совет по хромато!рафии и адсорбции РАН прелдагцет следующие классификации
хроматографических методов (табл. 6-II).
Таблица 6-11. Классификации хроматографических методов
Метод Описание
По aiperaniOMv состоянию фаз хромагшрафичсскон системы
Газовая хромато!рафия Хроматографический метол, в котором подвижно!
Gas chromatography______________________| фа зон является газ или пар
Гвзогц сорбционная Хроматографический метод. в котором подвижной
хроматография (г азо пзерлг«фазная) фазой с.ту* п газ или вар, л неподвижной — твердый
Gas-solid chromalogjaphy________________(адсорбент__________________________________
Газожидкостная хроматография Хроматографический метод, в котором подвижной
Gas- iqnid chromatography фазой служит газ или пар. а неподвижной жид-
кость. нанесет! иг на г вер ын ностель или па сгонки
колонки
Газомс гофазная хромагография Хроматографический меюд. в котором подвижной
Gas-mesophase chromatography фазой служит таз или пар а неподвижной — вещество
в жидкокристаллическом состоянии (меюфаш)
Жидкостная хроматография Хроматографический метод в котором подвижной
Liquid chromatography фазой является жидкость
326 Глава 6
Продолжение mailt. 6-11
Жпл костг io-xicop6i।ионная хрома roi рафия (ж илкос гно-твер.чофазная) Liquid-solid chromatography Хроматографический метод. и котором подвижной фазой служи! жидкость. а неподвижной — нзер. ый адсорбент
Жидкостно-жидкостная хроматт рафия Liquid-liquid chromatography Хромптозрафичсский метод, в котором подвижной и неподвижной фазами служат нссмешивакминеся jtpyt с другом жидкости. причем неподвижная фаза нанесена на твердый носитель или ни стенкн колонки
Il ро i ШЮ1ОЧ1 шя жилкост пая хромзжн рафия Сошнег-сигтен! liquid chmmaiogniphy Жидкое!но-жидкости» хромаю рафия, основанная на распределении вешеств междх двумя движущимися опккнге.п.но друг друга несмешипаюшимися жидкос- тями. Примечание, разновидное 1ЬЮ противоточной хрома- тографии является ценная хроматография. в которой и противоположных направлениях перемешаются рас- твор поверхностно-активною вещества и пена, образу- емая нм и потоком газа
Мнцеллярная хроматография Micellar chromatography Жидкостная хроматография, в которой в качестве под- вижной фазы служит paciBop поверхностно-активного нещеова с концентрацией выше крншческой концен- трации мииеллообра ювання
Сверхкритическая флюидная хромаю! рафия Supercritical fluid chronMtography Хроматографический метод. в котором подвижной фазой является вещество. находящееся в свсрхкрнгп- чсском (или субкрптическом) состоянии (флюид)
11олифалная хроманя рафия Polyphase chromatography Хромат ^графически и метод, и котором в качестве подвижной и/или неподвижной фазы iiciio.Hi укнея ivTcfXirciiiiije системы. Примечание: разновидностями hojiii<]kiзной хромато- । рафии являются полифазная жидкостная хромато- 1 рафия, в которой в качестве подвижной <[за.зы служит эмульсия il'ih суспензия, и полифазная газовая хро- матография. в которой в качестве неподвижной фазы используется сух пен зия
По спосооу 1 перемещения сорбата
Вытеснительная хроматография Displacement chromatography Хроматографический метод, в котором смесь вешссгв периодически вводи жя в ноток подвижной фазы и вытесняется затем из колонки с помощью вещества (вытеснителя), десорбирующего все слабее удерживае- мые компоненты смеси, причем в итоге смесь разделя- ется на примыкающие друг к другу зоны ипливилуа. ь- ных компонентов, выходящих в порядке увеличения их сорбируемости
Фрошальная хроматография f rontal chromatography Хроматографический метод, в котором смесь вешеств непрерывно шзолшея с подвижной фазой и ризлезя- егся в колонке пи примыкающие друг к .труту зоны с последовательно увеличивающимся числом компонен- тов, выходящих в порядке увеличения их сорбируе- мости
Элюситная (элютивная. проявительная) хромато! рафия Elution chromatography Хроматографический метол, в котором смесь веществ периодически вводи 1ся в ноток подвижной фазы и разделяется в колонке на зоны компонентов, выходя шнх отдельно друг от друга в порядке увеличении их сорбируемости
И зократическая хроматография Isocratic chromatography Эдюентная хроматография, при которой состав под- вижной фазы сохраняется постоянным на протяжении всего процесса разделения компонентов
Гралиентная хро**нтогрвфия Gradient chromatography Элюентная хроматография, при которой сосгав смешанной подвижной <|>а ш в процессе разделения компонентов изменяют по заданным параметрам
Методы определения токсикантов в биосредах 327
Про^ликенне maoi. t>-ll
Хроматография с программированием тем- пературы Programmed-lcmperaturc chromatography Элюенгная хромаю!рафия при которой темперлуру колонки в процессе разделения компонентов изменя- ют ио заданным параметрам
Хроматография с программированием дмв- лення Programmed- pressure chomarography Элюенгная хроматография, ггри которой давление но.I тижной фазы в процессе разделения компопегггов изменяют но заданным параметрам
Хроматография с программированием рас- хода подвижной фазы Program med-flow chromatography Элюснпыя хроматография, при которой расхот под- вижной физы в процессе разделения компонентов изменяют ио заданным параметрам
Хромаднстилля пня Chromadist illation Хроматографический метод, в котором смесь паров всшссгв перемешается с потоком газа-иосигеля моль катоики в условиях отрицательного продольного грл- диептл температуры, причем в нюге смесь разделяется па примыкающие друг к другу* зоны индивидуальных компонентов. выходящих в порядке повышения их температуры кипения
По конфигурации разделяющей системы
Планарная хрома гиг-рафия Planar chromatography Способ хроматографии, в котором процессы разде- ления смеси всшссгв осуществляются в плоском слое сорбента
Тонкослойная хромаю!рафия Thin layer chromatography Способ хроматографии в к< тором процессы разде- ления смеси всшссгн осушеш ваяются в гонких слоях сорбента (нанесенного на инертную твердую падлож ку) или в пленках пористого полимерного материала
Бхмтжная хроматограф! я Paper chromatography Планарная хроматoiрафия, в которой в качестве сор- бента используют специальную бумагу
Колоночная хроматография Column chromatography Способ хроматографии, в котором протесы разделе- ния смеси исшсств осуществляются в колонке Примечание: микроколоночная хроматография — жидкостная хроматография, в коюрой используются
колонки с внутренним диаметром менее 2 мм. Капил-
лярная хроматография — колоночная хроматографии.
и которой используются капилляры с внутренним диаметром и менее 0.5 мм для жидкостной хроматог- рафии и менее 1 мм для газовой хроматографии
Циркуляционная хроматография Circulation chromatography С юсоб хроматографии, при котором разделяемая смесь вешест и циркулирует с шпиком подвижной фазы через одну и ту же хрома г шрафи вескую колонку ILU! систему колонок
Многокопот точная хроматографии Multicohinin chromatography Способ хроматографии, при котором разделяемая смесь вспгсстп пропускается через две (или более) последо- вательно (или гмраллельно) соединенные колонки с неподвижными фазами различной химической природы
Му льтихромаюг рафия Multichnimalography Неоднократно повторяемая хро.матогр |фия в системе из двух колонок с неподвижными фазами одинаковой или р спичной химической природы, при которой селективность системы варьируют путем изменения но заданным параметрам физических условии разделения (давление подвижной фазы, температура) в одной или двух козонках
Многомерная хроматография Multidimensional chromatography Способ хрома юг рафии, при котором смесь веществ разделяется вначале в одних условиях, а затем отде- льные фракции злюата подвергаются дальнейшему разделению в других условиях и ш в иных хроматогра- фических системах
Перколяционная (перфузионная 1 хроматография Percolation (perfusion) chromatography Хроматография. при которой поток подвижной фазы осу|цестн.1ясгся через поры вердого сорбента, а нс между частицами сорбент
328 Глава 6
Предо гжение nuifij. f>-ii
По о гноен е.тьной полярности подвижной и неподвижной фаз
Нормально-фазовая хромаюгрифия Normal phase chromatography Жидкостная хромато!рафия, при которой неподвиж- ная фаза более полярпа. чем по шпжная
Обрашенно-фазоиия хромато! рафия Rcvcmcd-phasc chromatography Жцлкосшая хроматография, при ко юрой неподвиж- ная фаза менее полярин, чем полпнжная
По механизму разделения вещества
Адсорбционная хромато) рафия Adsorption chromatography Хроматтрафия, в которой неподвижной фазой служит ।Bcpjtuii адсорбент и разделение смеси происходи i в результате различия в константах адсорбции bciuccib
Распределительная хроматография Partition chromatography Хромацирафия. и которой непо.тш1жной фазой служит жидкий или твердый сорбент н разделение смеси ве- ществ происходит в ре '.плате различия и константах распределения вешсств между подвижной и неподвиж- ной фазой
Эксклюзионная (ситовая) хроматография Si/e-exclusion chromatography Жидкостная хромаготрафня. в когорт й неподвижной фазой служит пористое тело тын тел. и разделение смеси веществ нроиежтднт в результате различия в размерах молекул веществ и/нли их форме и способ- ности проникать в поры неподвижной фазы Примечание: .метол, в котором неподвижной фазой служит ген., называется гелытроннкпютней хроматог- рафией
Аффинная (бпоспепифичсская) хромагография Affinity (biospecific) chromatography Жидкостная хромагография. в которой разделение смеси биологически активных веществ происходит за счет различия в их биоспсщ1<|мтчсском взаимодействии с комплементарными сорбционными центрами непод- вижной <|>азы
Лигаплообмениая хроматография L gaud exchange chromatography Хроматография, в которой неподвижная п/или под- вижная фазы содержа! комплексообразующий ион металла и разделение смеси веществ происходит за счет различия в констан tax образования комплекса и/ или коэффициентах распределения комплексов между подвижной и неподвижной фазой
Ионообменная хрома rot рафия Ion-exchange chromatography Жидкостная хроматография, в которой неподвижной фазой служит катионит или анионит и разделение смеси иоинтированных пешеегв происходит и резуль- тате различия н их константах ионного обмена
Ионная хромапирафия Ion chromatography L j Ионообменная хроматография, в которой на первой сталии проводят разделение смеси компонентой и разбавленном рае шоре кислоты (основания), а затем удаляют избыток кислоты (основания) и элюате с целью повышения чувствн1елы1осп1 определения разделенных ионов кондуктометрическим детекто- ром
Ион-парная хроматография Ion-pair chromatography Жидкое! пая хромгпо!рафия, в которой подвижная фаза содержит сорбируемое ноиогенное вещество (ион-парпый реагент) и разделение смеси веществ происходит ta счег различия в способности bciuccib к образованию ионных нар и/нли коэффициентах распределения ионных пар между подвижной и непод- вижно । фазой.
Гилродинамичсская хроматография Hydrodinamic chromatography Жидкостная хроматография, в которой роль пспо.ч- нвжной <|м!Ы и । раю г стенки колонки (канат) и разде- ление смеси макромолекул или частиц происходит' вследствие различия скоростей протекания подвижной фазы вдоль осп каидза и у его стенок, а также за счег распределения разасляемых частиц по сечению Btuxia в cootвегс।вин с их размерами
Методы определения токсикантов в биосредах 329
Прсхкмжение тааг. 6-U
Фракционирование в поперечном ноле сил 1 ield- Пом fractional ion Жидкостная хромай»рафия, в которой роль непод- вижной фалы играют стенкн колонки и разделение смеси макромолекул или *wicihu пронсх ииг вследс- твие различия скоростей протекания подвижной фазы в ноль оси капала и у его стенок, а также та сче> распределения разделяемых час ши но сечению каняла в соответствии с их размерами и поведением в прило- женном в поперечном направлении поле Оравитацн- онпом. магнитном н тр.)
Гидрофобная хроматография 1 lydrophobic-inteniciion chromatography Жидкостная хроматография на неполярных сорбентах, в которой в качесгве подвижной фазы используются водные или водно-оргапнческис буферные растворы и разлеление смеси веществ происходит в результа- те различия в их взаимолеЛсТ-вии с гидрофобными группами сорбента в условиях убывающего градиента солен в элюенте
Гидрофильная хроматография Hydrophilic-interaction chromatography Жидкостная хрома roi рафия на полярных сорбентах, в которой в качестве подвижной фазы используются восню-оргаинческне раснюры и разделение смеси про- исходит в результате различия в их взаимодействии с полярными ipyniidMit сорбента в условиях убывающего градиента органическою модификатора в хпоенге
Энапзиоселсктинпая (хиралыыя) хромипирафпя Enantioselective (chiral > chromatography Хромапирафия, в которой разделение энантиомеров происходит за счет нпнтносеяективносш н.х взаимо- действия с хиральными компонентами (хиральными селскгорами) нсноднижиоП и/или подвижной <|нзы
Критическая хроматоррафия (хроматогра- фия II КРШИЧССКИХ условиях) Critical chromatography Жидкостная хроматография олигомеров или полиме- ров в таких условиях (состав смешанного элюента, температура, природа в пористая структура сорбента), когда адсорбционные взаимодействия с сорбентом компенсированы эксклюзионными эффектами. так что удерживание макромолекул опреде шегся не их pas- мером. а наличием специфических (концепых) функ- циональных групп или тополо1псй молекулы (циклы, разветвления
Пи цели
Анали । ическая хроматография An а 1 ityeal с h romaiography Хроматография, используемая лля качественного анализа смеси ii/ilhi количественного определения отдельных «1МПО11СИТО11 смеси
11ренаративная хроматография Prepa rat i vc chro ma togi a ph v Хромтпм рафия, используемая для выделения чноых компонентов или фракций из смеси
Обращенная газовая хроматография Inversed gas chromatograph) Газовая хромато1рафия. используемая для исследова- ния структуры и свойств неподвижной ф.ны
Обращенная ситовая хроматография Inversed stee exclusion cl romniograph Эксклюзионная хроматография, используемая лля исследования пористой структуры сорбента
По химическому превращению сорбата
Реакционная хроматография Reactive chromatography Хромате! рафическии метод, при котором разделяе- мые соединения подвергаются в хром тографичсской системе химическим превращениям, включая перевод в производные до пли после хроматографической кол шки
Пиролитическая хроматография Pirolisys-gn; chromatography Реакционная га топая хроматография, при Koropoii исследуемый образец подвергается пиролизу перед хромато1рафпческой колонкой
Осадочная хрома i ография Precipitation chromatography Реакционная планарная хромагоррафпя. при которой разделяемые соединения образуют с компонентами элюента труднорастворимые осадки, располагающие- ся на поверхности сорбента в порядке увеличения их произведений растворимоеш
330 Глава б
Окончание табл. 6- ! I
По способу детектирования
t ал иохроматографня Radio chromatography хроматографический метол, сочетающим разделение компонентов смеси с детектированием всшссгв по их радиоактивное гн
Хромато-масс-спектрометрия Chromatography-mass spect rometry Хроматографический метод, сочетающий разделение компонентов смеси с масе-сиектромстричсскнм детек- тированием разделенных тм.шести
Хроматография с непрямым детектированием Chromatography wliith indirect detection Хроматографический методе использованием элюен- та. дающею постоянный откдик детектора. который ослабевает при прохождении через детектор разделен- ных веществ. не даюпшх такого отклика
Классификация 'хтектромигранионных методов разделения приведена в главе 6.3.5. где об-
суждаются эти методы и их применение в X ГА.
Вее приведенные методы в той или иной степени используются для исследования юксикап-
юв различного происхождения, бполотнческих объектов и объектов окружающей среды.
Для удсяктва изложения далее будут ханы краткие комментарии о сути некоторых мето-
дов.
Адсорбционная хроматографии. Первооткрывателем данного направления, как и хроматог-
рафии в целом, считают М.С. Цвета, который впервые осуществил разделение хлорофилла
на компоненты с использованием колоночной хроматографии. В этом виде хроматографии
стационарная фаза представляет собой твердое тело, на которое адсорбируются компоненты
пробы, а подвижная <|жза может быть жидкостью, как в жидкоегно-адсорбнионной (жидкос-
тно-твердофазной) хроматографии, или газом. как в газоалсорбниоттной (газотвердофазной)
хроматографии. Компоненты в этом виде хроматографии распределяются между фазами за
счет комбинации процессов сорбции и десорбции, а разделение веществ осуществляется за
счет выборочной (селективной) адсорбции веществ на неподвижной фазе. Такая селективная
адсорбция обусловлена сродством того ют иного соединения к твердому адсорбенту, а оно, в
свою очередь, определяется взаимодействием молекул адсорбата и адсорбента. Поэтому часто
хроматографию такого типа используют при анализе соединений, свойства которых определя-
ется числом и типом полярных Групп.
Классическими примерами являются колоночная хроматография, при которой твердая ста-
ционарная <|кгза помещается в трубчатую колонку, а подвижная фаза проходи! через нес пол
действием силы тяжести или давления, и тонкослойная хроматография, при которой адсорбент
наносится на плоскую инертную под. ожку. На рис. 6-28 приведена схема, разъясняющая не-
которые положения н понят ия адсорбционной хрома ют рафии.
По свойствам сорбентов адсорбционную хроматографию можно дополнительно разделить
следующие виды.
• Хроматография на полярном сорбенте, например силикагеле (SiO,) или окиси алюминия
(А1,О,) с неполярным элюентом, например гексаном или гептаном с добавлением 1—2%
спирта. В этих условиях хорошо разделяются неполярные соединения, такие, как насыщен-
ные и ароматические углеводороды. Применяемый элюент должен быть обезвожен, чтобы
вода не закрывала активные центры сорбента, особенно силикагеля. Указанный метод раз-
Адсорбтив (Элюент)
Адсорбция Абсорбция
«прилипание» «растворение
Рве. 6-28. Некоторые понятия адсорбционной хроматотрафии.
Методы определения токсикантов в биосредах 331
деления называется нормально-фазовым. Хромагография па нормально-фазовым сорбентах
характеризуется твердой поверхностью адсорбента, покрытой молекулами растворителя, до-
вольно слабо взаимодействующими с сорбентом. Адсорбция исследуемых веществ требует
десорбции части молекул растворителя, чтобы проба моги достичь поверхности сорбента.
Таким образом, процесс адсорбции носит конкурентный характер.
• Хроматография на неполярном сорбенте с использованием полярных элюентов, таких как
спирты, «истопигрил. ацетон. Этот метод называется обрашенно-фазовои хроматографией.
Обычно в этом метоле участвует в качестве неподвижно!» фазы силикагель, поверхность
коюрого модифицирована различными способами, в частости путем прививки на ею по-
верхность у । лево дородных соединений е длиной углеводородной цепи, зле С=2. X. 16 и IX.
На таком неполярном сорбенте хорошо разделяются полярные вешества: спирты, витами-
ны. наркотики, антидепрессанты и др. В настоящее время основная масса разделений (ло
80 г) в жидкостной хроматографии проводится с использованием этого метола. Прививая
на поверхность сорбента -NH,. -CN, -С,II, группы, можно изменить селективность разде-
ления по сравнению с силикагелем С-IX si тем самым улучшить разделение определяемых
соединений. В табл. 6-I2. приведены обращенные фазы на основе силикагеля, используе-
мые для них обозначения, структура замести гелей и области применения.
Таблица 6-12. Свойства. обознпения и облзети применения обрашенно-фаэовых сорбентов на основе
силикагеля
Фаза и ее обозначение R Назначение
сн3 Si-R сн3 С-18 RP-I8 Октаденнл ODS ~снлснТ-сн СКАЯ Универсальная фаза высокой емкоеiи Разделение I идрофильных вешеств мето дом ион-триоit хромато! рафии
С-8 RP-8 Окли -СН,-(С11,)0-С11 -с,И Универсальная фаза со средней емкостью Разделение липофильных вешеств
С-4 RP-4 Бу пи -СН,-(СНД,-СН Разделение белков и пентилов
Фенил Фаза со средней емкости ю
Этил нитрил CN -СИ -CH.-CH.-CN Фаза с низкой емкостью
В Российской Федерации некоторыми фирмами выпускаются носители с силикагелем. мо-
дифицированным С-16. С-2, нитро и другими заместителями.
Распре<кмите.1ышя хроматография Первая работа поданному направлению была опублико-
вана в 1941 г. А. Мартином (A Martin) и Р. Сиджем (К. Synge), которые впоследствии получили
за цикл работ по теории хроматографии (теория теоретических тарелок), жилкость-жилкостпой
рзспрелелительной и бумажной хроматографии Нобелевскую премию по химии. Этот вид хро-
магозрафии оз.зичаезся оз рассмотренного выше тем. что стационарной ф< зой в нем является
ж» зкость. нанесенная на твердую поверхность. В то же время мобильной фазой может быть
газ. как. например, в газожидкостной хромат оз рафии, или жидкость, как. например, в жидкос-
тно-жидкостной х[Н>маюз рафии. Бумажная хроматография представляй собой разновидность
рас |релслнтелыюн хроматографии, в которой в качестве стационарной фазы участвует вола,
адсорбированная поверхностью бума!и.
Механизм распределения используется в капиллярной газовой хроматог|эафии. те различ-
ные по свойствам жидкости нанесены на bi утреннюю поверхность длинных капиллярных тру-
бок Гакой подход позволяет решазь широкий круг аналитических плач.
Ионообменная хроматография была разработана при выполнении Манхстгенского проекта
создания атомной бомбы в США (1943- 1947 гг.) как способ обогащения урана. Ионообменная
хромагозрафпя получила признание после работ Спеллинга и Томпкинса, опубликованных в
1949—1950 гг., но широкое распространение метода стало возможно только в начале 80-х годов
332 Глава 6
прошлою века. когда оыли разраоотаны специаль-
ные сорбенты, отличавшиеся повышенной стойкое-
1ыо и воспроииюдимы.ми характеристиками.
Метол заключается в использовании поннооб-
мепных смол, представляющих собой полимер, по-
верхность которого обработана специальным обра-
зом для получения определенного числа химически
связанных с ней полярных функциональных групп,
таких как карбоксильные или четвертичные аммо-
ниевые. Механизм разделения веществ основывает-
ся на различной скорости установления равновесия
между ионами, находящимися в подвижной фазе, и
ионами на поверхности неподвижной фазы. Взаи-
модействие между ионами и сорбентом происходит
за счет формирования электростатических связей
(рис. 6-29).
Мобильная фаза в этом виде хромаю!рафии —
всегда жидкость. Метод наиболее подходит для ис-
следования неорганических ионов и небольших по-
пов органической природы.
Ге 1ьпроникаю1цая хроматография хотя и была и j-
вестиа с середины 20-х голов XX века, но в прак-
тику анализа она была введена в 1959 г. работами
Пората и Флодппа. В данном случае стационарная
фаза представлена полимером, содержащим поры
соизмеримого с анализируемы ми молекулами диа-
метра. Разделение происходит за счет способности
о
Рис. 6-29. Час nt па ионообменной смолы:
Темные кружки — заряженные функцио-
нальные группы, ковалентно связанные с
частинси нонообыснннка: свсзлыс кружки —
свободно перемещающееся проппюпотожпо
заряженные противоионы. элскзросгятнчсс-
ки связанные с частицей смолы, способные
оСменивазься с другими ионами
или неспособности вешества проникать в глубь сорбента. При лом для иешесгв. фактичес-
кие размеры молекулы которых превышаю! шамегр пор сорбента, удерживания не проис-
ходит и вещество остается в подвижной фазе. Данный метол наиболее подходит для разде-
ления смесей, в которых присутствуют как высоко-, так и низкомолекулярные вещества.
Например, до недавнего времени при исследовании на присутствие барбитуратов жстрактов
из секционного материала широко использовались сорбенты типа сефадекса. С другой сторо-
ны. такой подход полезен для очистки высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных
примесей.
Аффинная хроматография — это специализированный тин адсорбционной хрома го! рафии,
используемой для выделения и очистки биолщичсски активных макромолекул, и ишкомо-
лекулярных веществ. Данное направление зародилось в копне 50 х — начале 60-х голов XX
века за рубежом и в пашен стране. Официально принято считать, что начало ему шкиожилп
первые успешные работы по выделению и очистке энзимов, опубликованные Р Cuatrecasas.
М. Wilchek и С. Anfinscn в 1968 г. Вопросам получения новых сорбентов аффинного типа, их
использования для исследования физиологически активных веществ посвящена монография
П.В. Кузнецова (2002). Отличительной особенностью этого метода является возможность за
один хроматографический цикл выделить из сложной многокомпонентной матрицы нелепое
вещество, такое, как. энзим, рецептор и <и антитело. с коэффициентом обогащения от 100 до
10000 раз При этом оно не потеряет своей биологической активности.
Высочайшая селективное!ь аффинной хроматшрафии основывается на бпоспеиифических
взаимодействиях лиганда, иммобилизованною на твердом носителе, и исследуемого вешества.
чаще всего белковой природы.
Бноспенифичсскис лиганды, химически связанные с носителем помещаются в иссле-
дуемый образец. На практике обычно используется колоночный вариант этого метола. Ве-
щество, комплементарное используемому лиганду, взаимодействует с ним с образованием
комплекса. Далее сорбент отмывается от ненужных примесей. После этого целевое вещест-
во смывается с сорбента, а сорбент после регенерации готов для повторного использования
(рис. 6-30).
Методы определения токсикантов в биосредах 333
Рис. 6-30. Схема процессов, происходящих при
:к|>ф||11ноИ хроматографии.
В зависимости or способа употребления подвижной фа ы хроматографические методы под-
разде |яются на фронтальный. вытеснительный и элюентный (см. табл. 6-И).
Фронтальный метод. Подвижную фазу пропускают с постоянной скоростью через колон-
ку. заполненную сорбентом. В данном случае образен рассматривается как подвижная фаза.
Спустя некоторое время па выходе из колонки появляется первый компонент смеси А. об-
ладающий наименьшим сродством к использован ному сорбенту. Гак будет происходить до
тех пор. пока не исчерпается стрбниопная емкость колонки по отношению к компоненту В.
С этого момента на выходе из колонки уже будет смесь двух наименее удерживаемых ве-
ществ. йог процесс будет продолжаться до момента, когда компонентный состав смеси, по-
даваемый на вход колонки, не будет идентичен составу смеси, выходящей из колонки. После
этого процесс деления остановится На рис. 6-31 приведена схема проведения фронтального
разле зення
В результате только одно вещество получается в чистом пиле (компонент А). Это ограни-
чивает использование такою подхода на практике. Хотя он иногда оказывается полезным при
необходимости разделения сложных :месей. особенно в тех случаях, когда другие методы ока-
зались безрезультатными.
Вытеснительный метод. Исследуемая смесь растворяется в небольшом количестве рас-
творителя и наносится в виде узкой зоны на колонку. Мобильная фаза — растворитель, в
который добавлено специальное вещество — вытеснитель или замещаюшцй агент. Это ве-
щество подбираезся таким образом, чтобы оно имело наибольшее сродство к используемому
сорбенту по отношению к веществам, входящим в состав разделяемой смеси. Заметающий
агент, взаимодействуя со стационарно! фазой, будет вытеснять с сс поверхности все аз излиты
в подвижную фазу. Постоянное присутствие в подвижной фазе модифицирующего вещест-
ва приводит к аналогичному эффекту ранее рассмотренного метода - вещества, имеющие
меньшее сродство к сорбенту будут вымываться в первую очередь, а самым последним поки-
нет колонку замешаюший агент. Схема процесса вытеснительной хроматографии приведена
на рис 6-32.
Вид заместительной хроматограммы, представление!! на этом рисунке, аналогичен получае-
мой хроматограмме при фронтальном анализе. Однако существенным отличием хроматограмм
является ю. что ниспадающие фронгы хроматографических зон всех веществ смеси в вытесни-
тельном методе имеют ограничения по объему подвижной фазы.
Метод имеет два основных преимущества: используя его можно по крайней мере час-
тично выделить каждый из компонентов смеси: в отличие от общепринятых и широко
334 Глава 6
Рис. 0.31. Схема проведения фронталыю-
ю разделения смеси вешеств. Раствор, содер-
жащий смесь из трех вешеств — А, В и С —
пропускается через хроматографическую колон-
ку. Вещество Л адсорбируется < пбес остальных и
оказывается первым элюированным из колонки
веществом За ним следует смесь веществ А и В
и. наконец, смесь веществ А+В+С. Из диаграм-
мы видно, •гто концентрация вешеств я элюента
постоянно увеличивается.
Рис. 6-32. Схема вытеснительною метода, ис-
пользуемого для определения чиста, природы и
концентрации компонентов смеси. Ирода содер-
жащая веществ;! А. В и С. помешается в начало
адсорбционном колонки. Хроматограмма прояв-
ляется при помощи подвижной фазы, в которую
добавлен заметающий .цент (D). который адсор
бируется колонкой гораздо сильнее, чем вещества
смеси
Рис. 6-33. 1ШП1ЧНЫИ результат элюентиою ани-
дны с.меси. содержащей вешесгпя А. В и С. на-
несенные в начало адсорбционной колонки, че-
рез которх । пропускается чистин растворитель
(S). Компоненты разделяются, доходя то выхода
из колонки. н могут бы!ь собраны отдельно друг
or ,'ipyia.
Объем растворителя
используемых подходов. компоненты смеси в процессе разделения концентрируются, а не
разбавляются.
Э.моеитный метод выполняется путем введения анализируемой смеси по возможности в
наиболее компактном виде в начало колонки. После этого через колонку пропускается мо-
бильная фаза. В результате вещества, имеющие больший коэффициент распределения, будут
выводиться из колонки последними. Типичная хроматограмма показана на рис. 6-33.
Методы определения токсикантов в биосредах 335
Преимуществом данного подхода является то. «п каждый компонент исследуемой смеси
может быть выделен из нее в относительно чистом виде в смеси с подвижной фазой. Этот
метод используют для количественного определения содержания компонентов в смеси. Если
в течение проявления хромают раммы состав мобильной фазы остается неизменным, то такой
метод называется изонратическим От ниппельной особенностью этой модификации являются
обычно длительное время элюирования адсорбированных компонентов и относительно плохое
разделение компонентов смеси
Другой модификацией элюентпого анализа. позволяющей преодолеть указанные выше не-
достатки. является раднентный анализ. В этом случае в ычсствс подвижной фазы использует я
смесь как минимум двух растворителей. один из которых обладает пониженным сродством к
твердой фазе, а лрутот — повышенным Процесс хроматогра Жирования начинается с действия
мобильной фазы, содержащей практически только первый компонент. Постепенно состав мо-
бильной фазы изменяется в сторону увеличения содержания второго компонента. В результате
вешества. плохо удерживаемые в данных условиях, первыми выходят из колонки. Адсорбиро
ванные колонкой вещества. в обычных условиях очень медленно иди вообще нсэлюпруемые
при использовании растворителя с низким сродством к используемому сорбету, будут вымы-
ваться из колонки за счет уве тичеттия его элюирующей способности.
Основные термины и определения
Элюент (подвижная фаза) — растворитель или смесь растворителей, предназначенная для
продвижения анализируемой смеси через хроматографическую колонку.
Адсорбент (нетто твижная фаза) — твер ое вещество, способное удерживать растворенные
вещества и используемое для заполнения хроматографических колонок
Нагрузка комики — количество вешества в пробе. При введении в хроматограф большого
объема пробы или концентрированной пробы может возникнуть перегрузка колонки, которая
выражается в уширении и искажении формы пика. Па практике желательно работать при не-
больших нагрузках колонки.
Элюат — раствор, выходящий из хроматотрафичсекой колонки.
Хроматограмма — Графический результат .хроматографического процесса Хромают рам ма —
кривая, описывающая зависимость концентрации анализируемых веществ в элюате от време-
ни. Хроматограммой (с точки зрения аппаратурною оформления) можно назвать тавттсимость
отклика детектора хромают рафа от времени при прохождении элюата через ячет ку детектора.
Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответс-
твует од тому компоненту анализируемой пробы. Площадь пика при небольшой нагрузке ко-
лонки прямо пропорциональна концентрации компонента в элюате.
Хроматографический пик — кривая, которая описывает зависямосп величины сигнала де-
тектора от концентрации вешества на выходе из колонки. При неполном разделении выход
двух или более компонентов проявляется в виде одною неразрешенного пика. Идеальным пик
представляет собой кривую гауссова распределения. На ртте. 6-34 приведены хроматографичес-
кий пик тт некоторые его характеристики.
Время удерживания вещества (tR) — время пребывания адсорбата в хроматографической
колонке На практике время удерживания определяют от момента ввода пробы вешества в
хроматограф до момента регистрации максимальной амплитуды хроматографическою ника
адсорбата Кажэос вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет опреде-
ленное время удерживания. Это положение является основой идентификации компонентой
разделяемой смеси по времени удерживания при жестком соб тюленин постоянства условий
эксперимента: один и тот же состав элюента, расход элюента (объемная скорость подачи элю-
ента). использование одной тт той же колонки, минимальные колебания температуры окру
жаюш'и среды, сравнимые количества вещества в хроматографическом пике анализируемой
смеси и стандарта.
Время удерживания несорбируемого вещества (t^) — время пребывания ттссорбирусмого вс-
шссгна в хроматографе. Определение 1г является важной зада тей. так как от точности он-
релс. ения 1 зависит точность определения величины t'R. которая в свою очередь является
исходной для расчета ряда хроматографических характеристик. Величина ini является характе-
ристикой конкретной хроматографической системы при постоянном расходе элюента. Так как
на практике не всетда удается подобрать полностью нссорбнрусмый компонент, да и критерии
336 Глава 6
Гис. 6-34. Хромтхлрафичсскпй пик и нскоюрые его характеристики
\R объем удерживания: iR - время удерживания: h высота пика: V, ширина пика у основания;
w — ширина пика на полувысоте: о — дисперсия пика.
подбора такого компонента весьма расплывчаты, на практике используют время удерживания
наименее сорбируемого компонента, которое также обозначается 1т(рис. 6-35).
Исправленное (приведенное) время удерживания (t'R) определяется как разность времени удер-
живания вещества и времени удерживания несорбируемого вешества (рпс 6-35).
Объем удерживания вещества (VR) — объем элюента, прошедший через колонку ia время
удерживания вешества. определяется как произведение времени удерживания на объемную
скорость подачи элюента (рис. 6-35).
Объем удерживания несорбируемого вещества (VM) — объем элюента, вытекающий за время
пребывания несорбируемого компонента в хроматографе. Vm включает свободный объем ко-
тонки. объем устройства ввода пробы и детектора, а также объем коммуникаций между ними
(рис. 6-35).
Свободный объем колонки (Vh) — часть объема колонки, нс занятая сорбентом.
Исправленный (приведенный) объем удерживания (VR) — определяется как разность объема
удерживания вешества и объема удерживания несорбируемого вешества. Представляет собой
объем элюента, необходимый для десорбции анализируемого вешества только с поверхности
адсорбента (рис. 6-35).
Коэффициент емкости (к') — отношение количества вешества в неподвижной фазе к коли-
честву вешества в подвижной фазе. т.е. коэффициент емкости определяет степень распределе-
ния образца при перемещении его через колонку.
Связь времени удерживания вещества, коэффициента емкости (к'). длины колонки (L) и
линейной скоросзи подвижной фазы (V) можно выразить зависимое! ыо:
Отсюда видно, что ко да к' = 0. удерживаемый объем равен мерному объему (времени или
объему несорбируемого вешества). т.е. вещество не удерживается в данных условиях, а если
значение к' близко к ИЮ. то вещество нс выходит из колонки. Для характеристики сорбента —
к' — это коэффициент емкости, для ноне ксипя характеристики вешества — к' — это коэффи-
циент удерживания. Значение к' для оптима. ьного разделения вешеств находится в интервале
от 1 до 10.
Методы определения токсикантов в биосредах 337
5
О.
Мёртвый
(Ут)
Me теая
точка
Максимум
пика
Пик
несорбирующелзся
вещества
Ширина ►
пика
8
Ширина пика
у основания
Ширина лика
на олувысото
_______ Исправленный объём
удерживания (Vj)
— Объём удерживания (V,)
Направление движения
мобильной фазы ------------
Мертвое
4 время -*-я
(tm)
Исправленное время
удерживания (Ц)
5
Е
2
Время удерживания (С)
Время
Рис 6-35. Параметры хроматограммы.
Теория теоретических тарелок позволяет сравнивать эффективность различных хроматогра-
фических систем с помощью удобного критерия. За разработку згой теории Мартин и Сидж в
1952 г. были награждены Нобелевской премией в области химии.
Согласно теории теоретических тарелок, разделительная колонка состоит из набора изображае-
мых теоретических таре ток (ТТ). ТТ — условный участок хроматографической колонки, в пределах
которого устанавливается равновесие между веществом, распределенном между подвижной и не-
подвижной <Ьазой. Схематическое пре [ставленис теоретической тарелки дано на рис. 6-36
При хроматографировании каждая тарелка отвечает однократному распределению вещества
между подвижной и неподвижной фазой на определенном участке колонки. Следовательно,
чем больше теоретических тарелок в системе, тем лучше хроматографическое разделение
Чисм теоретических тарелок (Ь) вычисляется во формуле:
Л' = 16(^-)’=4ф.
"о,5 2t>
где W , — ширина пика на половине его высоты; wM — ширина инка на 0.607 его высоты.
При делении длины колонки (L) на число теоретических тарелок получается другой важней-
ший параметр — высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ).
ВЭТТ = L / N.
Хроматографическая система тем эффективнее, чем больше N и чем меньше ВЭТТ. Эти
параметры позволяют объективно сравнивать эффективность хроматографического разделения
в разных видах хроматографии и на различных колонках, чго часто используется на практике
338 Глава 6
Направление движения
Рис. 6-36. Схематическое иретставлстите теоретическом тарелки
Иногда величину N представляют в количестве теоретических тар< ок (ТТ) на I м длины ко-
лонки. например капиллярной газохроматографической.
Пример: число теоретических тарелок для ректификационных колонн, используемых для
перегонки жидкостей обычно составляет от нескольких единиц ло десятка ТТ. эффективность
жидмспюй хроматографии среднего давления — 10—20 ТТ. набивнои газо.хроматографнчес-
кой колонки — сотни Г1 наиболее распространенных в настоящее время капиллярных коло-
нок для исследования наркотиков, лекарственных веществ, пестицидов и их метаболитов — от
3000 — 5(100 до сотен тысяч ТТ.
Селективность (а) — отношение времени удерживания двух компонентов смеси, характеризу-
ет способность сромалирафпческой системы разделять эти два вешества н является мерой тер-
модинамического ра ыичия в их распределении. Селективность связана с различиями во взаимо-
действии этих компонентов с подвижной и неподвижной фазами. Селективность определяют из
хромапираммы по отношению времени и нт объема удерживания двух компонентов.
Разрешение пиков (RJ определяется расстоянием между их максим; мами, выраже тным в
сдиппшх ширины их пиков, и рассчитывается по формуле:
2(У^-У„) = 2 • лУ, * XV
* W, + W2 4с, + 4пг 4а
Чем больше разрешение, тем лумше разделение хромагшрафических полос. Более длинные
колонки дают лучшее разделение. Разрешение двух хромаю, рафическнх пиков зависит or селек-
тивности хроматграфической системы, удерживания сорбатов и эффективности хроматографи-
ческой колонки (N). Взаимосвязь между этими параметрами представляет следующая формула:
4 а I + к
где а — селективность хроматографической системы: к' — коэффициент емкости наиболее
удерживаемого вешества; N — число теоретических тарелок.
Увеличение эффективное)и хромато1рафической системы за счет увеличения N на прак-
тике означает замену имеющейся колонки более эффективной При этом следует помнить,
что разрешение пропорционально квадратному корню из эффективности, т.е. для улучшения
разделения в 2 раза гребуется колонка, в 4 раза более эффективная. чем данная. Как правило,
чем больше удерживание пйры пиков (больше значение к' пика, выходяшего последним), тем
лучше разделение. В жидкостной хромают рафии, например, практически увеличения удер-
живания добиваются путем уменьшения копнен грации полярной добавки тип модификатора
в элюенте. Два упомянутых выше способа являются скорее экстенсивными и способны лишь
отчасти улучшить разрешение. На практике они могут применяться, например, при воспро-
изведении и адаптации стандартных методик на местах. Значительное увеличение разрешения
Методы определения токсикантов в биосредах 339
Низкая эффективность
Низкая селективность
Высокая эффективность
Низкая селективность
Низкая эффективность
Высокая селективность
1’ис. 6-37. Втимосвязь эф<|>екги ввести и селективности.
Высокая эффективность
Высокая селективность
лостшастся на практике лишь путем изменения селективности, которого добиваются заменой
неподвижной фазы или изменением состава элюента.
Влияние эффективности и селективности па результат! хромаюграфпчсского разделения
пре ставлены на рис. 6-37.
Из рисунка видно, что выбор условий проведения разделения ависитот поставленной зада-
чи. гак как достижение высокой эффективности и селективности, часто требующих серьезных
материальных затрат, не всегда оправдано. Приведенный пример свидетельствует, что даже
при низкой эффективности и селективности хромаюграфпческой системы возможно отделе-
ние компонентов 1 и 2 смеси от компонента 3
6.3.2. Хроматография в тонком слое сорбента*
Hei ничею опасней для новой истины, как
старое заблуждение.
И. Гете
Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из основных мегодов определения ток-
сикантов различных ipynn. Мелодическая и приборная бала згою метола позволяют автомати-
зировать и стандартизовать условия проведения исследований для получения воспроизводимых
результатов. Использование реактивов, селективных для определенных классов химических
соединений, в первую очередь наркотических, психотропных и сильнодействующих вешеств.
резко повышает надежность их идентификации. Хроматографические зоны исследуемых ве-
ществ легко извлекаются с пдавтин. что позволяет дополнять уже имеющуюся информацию об
этих веществах результатами исс юдовапня другими методами, ншример спектральными.
На практике получили широкое распространение инструментальные методы анализа разде-
ленных зон непосредственно на хроматографических пластинах Получение спектров отраже-
ния исследуемого токсиканта в видимой. УФ-. ИК-областях света наряду с данными поведения
вещества в различных хроматографических системах в ряде случаев имеет положительное су-
дебно-химическое значение. Основы ТСХ и ее применение для исследовани! ра длинных групп
токсикантов обсуждены во многих mohoi рафиях и обзорах (см. рекомендуемую литературу).
В ХТА применяют ТСХ в двух случаях: при проведении частных иссле овании на конкрет-
ное вещество, подтверждающих или отрицающих его присутствие в исследуемом образце, и
при проведении скрининговых исследовании образна неизвестной природы (см. 1Л. 5). Мето-
дические подходы лля решения каждой нз эп х проблем несколько отличаются друз от друга.
Методика проведения эксперимента. В ТСХ обычно используют закрепленные слон на ме-
таллической. стеклянной или пластиковой подложке. Для закрепления слоя применяют гипс,
крахмал или другие cbi зуюшие компоненты, а в качестве адсорбентов — силикагели рихтнчно-
* Печатается с исправлениями и вменениями по Симонова ГА и др «Наркотики* иссл довапне придатков кожи»,
2<И)2 I. (см. электронное приложение).
340 Глава 6
го зернения, обработанные или не обработанные реактивами для осуществления как прямою,
так и обращенно-фазового ггариАнгов хроматографии. а также целлюлозу. оксид алюминия,
полиамиды и некоторые другие материалы. Часто к адсорбентам добавляют флюоресцентный
индикатор. В криминалистической практике обычно используют птастины размером 5x5, 10x10
или 20x20 см. Хромаютрафировапие всшссгв нровс гяг в герметически закрытых камерах. При
этом наиболее часто из всех возможных вариантов используется восхоляшее и горизонтальное
элюирование хроматографической системы растворителей В ряде случаев хюрошие результаты
даст многомерная и круговая хроматография.
Перед началом разделения пластину размечают соответствующим образом: отмечают линии
старга и фронта растворителя. зоны хроматографирования исследуемых нсгпеств и станлар-
тов-мстчиков. Особо отмечают условия эксперимента и лату его проведения, а также другую
необходимую информацию. Все отметки на пластине нс должны нарушать равномерность слоя
адсорбента.
Анализируемые растворы осторожно, чтобы не повредить поверхность слоя адсорбента, на-
носят на пластину, используя мерные капилляры или микрошприны. в несколько приемов,
обращая внимание на размеры получаемого пята. Одновременно на пластинку наносят эта-
лонные растворы исследуемых веществ или растворы метчиков в соответствии с утвержденны-
ми методиками.
Системы раствори г елей смешивают в требуемых соотношениях непосредственно перед ис-
пользованием при помощи интенсивного перемешивания. Иногда при смешивании раствори
толей возможно образование мутного раствора. В таких случаях полученную смесь заливают в
хроматографическую камеру, стенки и дно которой проложены фильтровальной бумагой. Если
в конкретной методггке нет специального разъяснения, то камеры герметически закрывают
крышкой и оставляют на 0.5—1 ч для насыщения нарами раствори геля (установления равно-
весия). Для каждой новой пластины готовят новхго порцию системы. Допускается временное
хранение готовой системы в посуде с притертой пробкой.
Количество растворителя .тля эксперимента рассчитывают таким образом, чтобы при восхо-
дящем варианте проведения хроматографии уровень его соогвстствова погружению пластины
нс более чем на 5 мм. Расход системы на стандартную камеру ыя пластин размером 10x10 см
с гглоским дном составляет 4—4.2 мл.
Хорошей практикой считается использование отдельной хроматографической камеры для
каждой конкретной разделительной системы. При необходимости быстрой смены используе-
мой системы растворителей к; меру просушивают, промывают 10 мл этанола, сушат и затем
промываюг растворителем, использование которого планируется.
После помещения пластинки в хроматографическую камеру растворитель движется по плас-
тине под действием капиллярных сил, пока не достигнет линии финиша, после чего пластинку
вынимают и сушат.
Качественный анааиг методом ТСХ. Наиболее часто проявление хромагографическнх зон
осуществляется по свечению в Уф-свете или гашению флюоресценции индикатора. добанлен-
ного к сорбенту. После просмотра пластинок в УФ-свете их обрабатывают реактивом или пос-
ледовательно несколькими реактивами в соответствии с утвержденными метод! ками. После
обработки реактивами отмечают положение н окраску хроматографических зон.
Основной качественной характеристикой вещества в ТСХ являечея значение Rr расчет ко-
торого проводят по формуле:
ггс Ц — длина нробета центра хроматографической зоны исследуемого соединения; L, — дли-
на пробега фронта растворителя.
Иногда данную величину представляют в процентах. для этого полученный результат умно-
жают на 100.
Ятя снижения влияния на получаемые результаты факторов, обусловленных условиями
проведения исследования, часто используют отг оегггелг.ную величину RR (Rs), которая пред-
ставляет собой отношение значения R( исследуемого вещества к гначению Rrсганмарта-мст-
чика. специально подобранного для этой цели и анализированного одновременно с образном.
Методы определения токсикантов в биосредах 341
В существующих в настоящее время системах для идентификации различных классов веществ
методом ТСХ, основу коюрых составляют данные о хроматографическом поведении большо-
го количества (до нескольких тысяч веществ) используется не одни аналитический образен
сравнения, а несколько, обычно до 4. причем значения R их равномерно распределяются но
пластине.
Величины R, н RR1 тля конкретт ого вещества в конкретных условиях хроматографирования
являются его физико-химическими константами. такими же как точки кипения или плавле-
ния. константа ионизации и др.
Заключение о присутствии или отсутствии исследуемого вешества дается на основе значе-
ний R,. при сравнении характеристик поглощения или испускания УФ-света при различных
длинах волн, а также при сравнении окрасок хроматографических зон исследуемого вешосгва
и использованного аналитического образна сравнения после обработки их специфическим ре-
активом.
Факторы, влияющие на воспротводимость Rr На точность определения значения R, воздейс-
твуют многие факторы. Воспроизводимость результатов исследования методом ТСХ достигает
ся при выполнении ряда уез овин.
• Условия проведения эксперимента включают конструкцию используемой хроматографичес-
кой камеры, способ ее герметизации; условия насыщения камеры парами растворителя,
температуру и влажность окружающей среды в момент проведения исследовании и т.д.
• Свойства хроматографической системы включают тип и способ химической обработки ис-
пользованного сорбента; величину сто зернения; толщину его слоя, а также тип подложки,
на которую он нанесен; вил и количество внесенных в адсорбент вспомогательных веществ
таких, как связующие компоненты и флюоресцирующие вещества; метод активации сор-
бента. например выдерживание при повышенной температуре: способ обработки пластинки
импрегиируюшими буферами, щелочами или кислотами, а также веществами, модифици-
рующими ее свойства.
• Методические подходы к нанесению пробы и проведению хроматографирования предусмат-
ривают способ нанесения образна на пластинку и использованное при мои устройство; раз-
меры начальной зоны хроматографирования; полярность растворителя. применяемого для
нанесения образца и его количество продолжительность исследования и величину пробега
растворителя: его состав н чистоту, а также другие параметры.
Представление риушпатов исследований. В экспертном заключении полученные рассмат-
риваемым методом результаты должны содержать подробное описание условий проведения
эксперимента: хроматографические пластины (адсорбент, наличие или отсутствие индикатора
в его составе, использованное связующее вешество. тин подложки для адсорбента, фирма-из-
готовитель, специальная обработка пластин перед исследованием, например высушивание при
повышенной температуре или импрсгнированне щелочью или буфером). Во многих случаях
|»1р.мы-и.зтогов1пели шифруют некоторую информацию о своей продукции под фирменными
названиями, например Silufol и Сорофнл или Сорбшотт В этом случае достаточно привести
янное название полностью. Далее идет описание использованных систем раство| h i елей с
указанием их качественною и количественного состава. способа хроматографирования (верти-
к. 1ьныи — обычно опускается, горизонтальный, круговой или многомерный), а также особых
приемов, например проводилось ли хрома готрафироваттне без насыщения камеры или при
повышенной температуре Схема обработки хромают рафических пластин должна содержать
описание использованных реактивов с их полным качественным и количественным составом,
последовательности проведения этапов обработки, их интенсивности и ироде тжигельности.
Особо отмечаются интенсивность и окраска хроматографических тон исследуемых вешсств
посте обработки каждым реактивом, а также величина их Rfmin RR При проведении под-
тверждающих (частных) исследований на конкретное вешество допускается указание на то. что
в данных конкретных условиях величина R и окраска хроматографической зоны исследуемого
вешества использованными реактивами совпадают с величиной Rji окраской аналитического
образна сравнения. В заключении также прттволятся данные о пределе обнаружения метола.
Метод ТСХ. позволяющий полизать информацию о качественном и полуколичсственном
содержании компот тентов, присутствующих в исследуемых объектах. находит наибо тылее при-
менение при проведении экспертизы на содержание наркотических средств, психотропных
342 Глава 6
пешее in и пестицидов. Следует учитывать. что во многих случаях у оперативных и следствен-
ных полразАелений возникап необходимость определения прнроты вещества и отнесение его
к наркотический до возбуждения уголовного дела. Поэтому применяемые методы должны в
короткие сроки надежно идентифицировать представленное на исследование вещество и к на
лифиниронан. совершенное преступление Одним из таких методов является ТСХ Ниже при
нелепы способы исследования наркотиков (см. гл. 7) методом ТСХ. коп рые рекомендованы и
угнер» 1сны Постоянным комитетом по контролю нарктгикоп (ПККН) России в ка тестве эк-
спертных При проведении такого ро та исследований используется комплекс методой с целью
получения достаточной информации об ооъектс исследования для обоснованного отнесения
сю к нарк янк тм. Метол ICX в этохт комплексе обычно имеет отрицательное су тебно-хими-
ческое (криминалистическое) значение, г. с при получении отрицательных рс хльтатов даль-
нейшие исследования другими методами ие прово ытся. а в отношении исследуемою образцу
делается заключение о том, что он контролируемых вешеств ие содержит (см. гл. 5). В мето-
диках. утвержденных ПККН. ло настоящего времени существует именно таком подход. В них
ТСХ применяется в комплексе с методом капельного химическою анали за. I ЖХ и ВЭЖХ
Окончательный вывод при этом лс заелся на основе исследований образна методами ИК-спск
тромегрии тын .хромато-масс-спекгромстрнн (см. гл. 5 и далее гл. 6) При таком подходе ис-
пользуется ограниченное число (нс более 1—2) хрома гот рафичсских систем р тс твори гелей и
специфических проявляющих реактивов. Выбор указанных условий эксперимента обусловлен
специфическими, присущими исключительно данному конкретному объекту исследования
свойствами и признаками, например присутствием специфических примесей и сопузствуюишх
компонентов. Вывод но исследуемому объекту делается на основании всего комплекса данных
о нем. Недостатком такого подхода является большое разнообразие хроматограшичсских сис-
тем и проявляющих реактивов, а также методов их непосредственною применения и нетто, ть-
ювапия (табл. 6-13).
Таблица 6-13. Хроматографические системы для исследования некоторых штркоггтческих срсЛста и пен
хотропных веществ по утвержденным ПККН тити реноменлопатитым Меж народным к пшютом ио кон-
тролю наркотиков (МККН) метсынкам
Вешсспю Хроми 1 шрафиче- ская система Азсорбенг Дидченмн Rf Ш11ЫН1НрусМ4НО вешесги и Bcuiet’- riui ерлвмеимм Прошмнюшми peaki но Окрашива- ние рсактимм
Кокаин (ексан— Хлорофорь — ТрНЭПСММИН (14:9:4) SILL. I-O1. 0.76 0 76 — UIM 1JM Ч УФ-свет (X 254 им) Реактив Коричневое
Метанон — 25% Аммиак (100:1,5) SILL f OL 0.71 0.71 — димедрол Драгендорфа
бупренор- фин Бен за1!—Эти— Триэтизитмин Merck 60 1'254 0.6S 0 59 — IVpOHH УФ свет ( X 254 нм)
(9 11) Сорбфил 0.75 0.69 — героин Реактив Марки Фиале опое
З-Мегил- фситанил 1 екс нн — Толуол — Тризтндпмии (15:10:2) Сорбфил O.oO 0.53 мер 1)4 0.42 I) 40 — цис изомер — тр«шс-н ю- «(кчпанн.т — димедрол — Пр Ml дол УФ-свет (X 254 нм) Реактив Мунье Светло-корич некое зля обо нх изомеров <|>енк1|1и.1л
Пи Г м алоз Бен юз — ) канат —Прнлиламии ( 911) Сорбфил 0.74 0.74 — наплнерин УФ-свет (X 254 нм. Реактив Марки '1 Буро «сдеиыи
Метанол —25% Ам- миак (100:1.5) Сорбф> г 0.55 0.55 — тебаин
ФеТШИКЛИ- лни Метанол —25% Ам- миак (100:1) Сорбфил 0.67 0.67 — папаверин УФ-свет (X 254 нм)
Этанол —25% Амми- ак (100:1) Сорбфил 0.SI 0.KI — — папаверин Реактив Драген торфа Реактив Эрлиха Коричневое Красное
Методы определения токсикантов в биосредах 343
Окончание таб.г 6-1.1
Эфедрин, эфедрон Бен тол— Этанол — Грнлилвмип (9:1:1) Merck 60 Г254 0.69 — эфе трои эфедрин Раствор нин- гидрина в анезоне Фио icioBo-KO ричпевос. фио теговое
Псилоци- бин. псилоцин Бутанол— Уксусная кислота— Нода (20:10:10) Merck 60 F254 0.34 пеилопн- бии 0.59 — псилоцин У’Ф-свст (X 254 нм) Реактив Эрлиха Реактив Марки Реактив Эрли ха: псилоинн — о1 серо-фи- олетового ло фиолетового: нсилопин—го- лубое. Реам ив Мар- ки: псило- цин— серо- голубой: псилоцибин - желто-зеленое
Метанол— 25% Ам- миак (100’ 1.5) 0.05 — псилоци- бин 0.39- псилоцин
Голуол — Этанол Tpi этилам и и (9:1:1) 0.07 — псилоци- бин 0.41 — псилоцин
В качестве неподвижной фазы можно использовать пластины собственного изготовления
с применением пемалифицпровапного силикагеля КСК иди готовые пластины разных про-
изводителей. например Сорбфил, Silufol или Merck 60 F254. Однако в зависимости от типа
использованной неподвижной фазы значения Rr а также окраска некоторыми реактивами
могут видоизменяться в определенных пределах. В связи с этим, как уже указывалось выше,
при выполнении экспертных работ необходимо указывать вил использованных пласт ин. их
производителя, а также параметры удерживания и окраску стандартных растворов исследуемых
веществ и веществ сравнения. Окраску хроматографических зон после обработки различными
реактивами см. в материалах электронного приложения.
На рис. 6-38 представлена хроматограмма образна героина, полученная в системе толуол—
ацетон—этанол—концентрированный аммиак (45:45:7:3) па пластине HPTLC Merck 60 Г254
после обработки реактивом Драгендорфа.
В табл. 6-14—6-17 приведены значения R, в различных хроматографических системах для
некоторых наркотических средств.
Рис. 6-38. Хроматограмма смеси содержащей
героин, после разделения в системе толуол
ацеюн—этанол—аммиак (45:45:7:3) и обработ-
ки реактивом Драгендорфа
I — морфии: 2 — носкаиин; 3 — папаверин.
4 — героин: 5 — хинтамип: 6 — зероин: 7 —
б-моноацезилморфин.
344 Глава б
Таблица 6-14. Значения R. компонентен опия и ацетилированного опия в различных хроматографических
системах
Вешество Вен тол—этанол—т рн э пстамнн (9:1:1) Хлороформ -гексан—три > иламин (9:1:1)
Silufol Merck 60 F254 Сорбфич Silufol Merck 60 F254 Сорбфил
Морфин 0.17 0.22 0.24 0.02 0.04 0.03
Колени 0.34 0.46 0.46 0.16 0.21 0.17
6-VlonoaiicTiL мор- фин 0.42 0.60 0.59 0.24 0.35 0.31
Д11ЭНС1И.1МОрфИН 0.58 0.71 0,72 0.43 0.56 0.44
Ацетил кодеин 0.64 0.72 0.74 0.52 0.64 0.53
(ебаии 0.67 0.72 0,75 0.61 0,71 0.60
Папаверин 0.70 0,77 0.81 0.65 0.76 0.64
Наркотин 0.76 <1.84 0.89 0.79 0.88 0.79
Дионин 0 40 0.50 0.50 0.18 0.24 0.18
Аиегиллноннн 0.64 0.72 0 76 0.56 0.66 0.55
Таблица 6-15. Значения К амфетаминов в системе ) юроформ аистом—этанол—25% водный раствор
аммиака (20:20.3:1) и их окрашивание реактивом ниныстрииа
Вешество Merck 60 F254 С<Х!^фН.Т Окрашивание ргакгивом нингидрина
тачсиие R значение R значение «х значение К
МДА 0.44 1,76 0.66 1.73 Желтое
МДМ А 0.12 0.48 0.23 0.60 Фиолетово-коричневое
магл 0.27 1.08 0.46 1.20 Сливается с фоном
ДОМ/STP 0.30 1.20 0.46 1.21 Жсл гое
ПМА 0.43 1.72 0.64 1.68 Желтое
дмл 0.38 1.52 0.54 1.42 Желтое
ТМА 0.30 1,20 0 43 1.13 Желтое
ДОЬ 0.34 1.36 0.41 1 08 Оранжевое
ДОХ 0.44 1.76 0.60 1.58 Желтое
МЫБ 0.26 1.04 0.41 1.08 Фиолетово- корич иевое
БДБ 0.60 2 40 0.74 1.95 Желтое
ДОЭ1 0.36 1 44 0,52 1.37 Жсл тын
MecKit ни 0.36 1.44 0.50 1.32 Фиолетовый
Метамфетамин _ ’>-.25 _ 1.00 и.зл I.OTJ Фиолетовый
Примечание. Злеет, и в табт. 6-16: см. гл. 7. тпСит. 7-3.
1аб.нша 6-16. Значения (^амфетаминов в системе юлуол—этанол—триэтиламнн (9:1:1) и окрашивание
реактивом Марки
Вешество Merck 60 1’254 Сорбфн. Окрашивание реактивом Марки
значение R, значение К ' значение R. значение R
МДА 0,31 0.86 0 46 loo Сине-зеленое -» зелено-черное
М МА 0.36 1.00 0.46 1.00 Сине-зеленое -» зелено-черное
МДЕА 0.56 1.56 0.64 1 40 Сине-зе. снос —> зелено-че ное
ДОМ STP 0.32 0.89 0.43 0.93 Желтое
ПМА 0.21 0.58 0.36 0.63 Сливается с <|нникм
ДМЛ 0.33 0 92 0.42 П.91 Желтое
ТМА 0.19 0.53 0.30 0. 65 Оранжевое
Методы определения токсикантов в биосредах 345
Окончание maci 6-16
ЛОБ 0.30 0.83 0.40 0.87 ... Желтое-ти зу мру лио-зелеттое
ДОХ 0.31 0.86 0.43 0.93 Желто- зеленое
МВД Б 0.54 1.50 0.62 1.35 Си нс-к юное —г зелено-черное
БДБ 0.48 1.30 0.59 1.28 Сине-зеленое —> зелено-черное
ДОТГ 0.36 1.0 0.40 0.87 Желтое
Mei калин 0.10 0.28 0.12 0.26 Оранжевое
Метамфета- мин 0.36 1.00 ._ 0.46 1.00 Коричневое
Примечание. См. гл 7 таб 1.7-3.
lao.wiui 6-17. Значения R и окраска основных компоиенiuii конопли на и ты инках
СИЗ^ФО! и окрашивание реактивом прочною синею Б
Значение R, в системах
Канвяиинонды Петро- лейный дфир— зфнр (4:1) 1 ексан— зфир (4: 1) Гексяп— ацетон (3: 1) Гексан— диоксап (9: 1) Бензол— гексан - лиэтила мин 25:10:1) Окрашива- ние проч- ным синим Б
Тстрапыроканна- бинол 0.29 0.48 0.36 0.35 0.20 Красное
Каннабинол 0.25 0.43 0.31 0,27 0.11 Фиолетовое
Каннабидиол 0 33 054 0.29 0.31 0.24 Оранжевое
Обрабатывать хроматотрафические пластины можно последовательно несколькими из при-
ВСДС1И1Ы.Х реактивов (табл. 6-18). Например, при исследовании веществ основного характер
оложитсльныс результаты ласт следующая схема: I) реактив Дратспдорфи; 2) раствор перман-
ганата калия подкисленный: 3) ре iktiib йод платината. При исследовании опиатов по данной
схеме возможна дополнительная обработка пластин 1% раствором нитрата серебра.
BemeciBa нейтрального и кислого характера можно обнаружить по следующим схемам: I)
реактив Ван-Урка; 2) раствор хлорида железа (111) или I) раствор нитрата ртути (1); 2) под-
кисленный раствор перманганата калия или 1) реактив фурфураля: 2) подкисленный раствор
йотплагината.
Таблица 6-18. Состав реактивов и окрашивание, получаемое с их помощью для визуализации хромено-
графических зон
Реактив Методика приготовления реактива Особенности применения Окрашивание
Fl N — реактив 250 mi хлорида железа (111) растворяют- в 15 мт 60% раство- ра хлорной кислоты. 35 мл 70% раствора азотной кислоты и 100 мл воды Красное или коричнева- то-красное окрашивание характерно для феноти- изинов. то (убое — для дибеизазспииоп
Распюр йода п нодндс калия 5% раствор иода смешивают с 10% раствором Полила калия, водой и 2 и. распюром уксусной кислоты Реактив тля обнаружения алкалоидов
Раствор коричного альдегида 5 мл коричного алыгшида рас во- ряют в 100 мл смеси □танол-кон- пешрированная соляная кислота (95:5) Темно-синее окраши- вание характерно для шик 1Ы1ЫХ препаратов
РаСГПОр нингидрина 0.5 । нингидрина растворяют п 10 мл концентрированной соля- ной кислоты и 100 мл анетона. Реактив готовя! непосредственно нсрет обработкой пластин После опрыскива- ния пластины на- гревают при 100 r С в течение 5 мин Фиолетовое розовое или пурпурное окрашивание характерно первичных аминов, желтое — для вторичных аминов
346 Глава б
flptMin 4М-СНШ1 nt till I. (>- IЯ
Раствор нигра- ra серебра 1 г нитрата серебра растворяю! в 100 чл ВОДЫ. Реактив го говн г непосредственно перед обработкой пластинок Используется в комплек- се с другими реактивами хпя обнаружения восста- н о вязелей
Раствор пнгрм- га ртути (1) 1 г нитрата ртути растворяют в 100 чл кониен!р11ронанной азот- ной кислоты Бе тые пятна на сером фоне характерны я»я барбитуратов
Рас f вор перманганат камня подкисленный 1 1 iicpuaiiiuiiaia калия раство- ряют в 100 мл 0.25 М раствора серной кислоты После спрыски нання пластины HBipCIklKTI при 100 сС в течение 5 мин Желто-коричневые пятна на фнолегоном <[юне характерны для ненасы- щенных алициклических углеводородов
Рас шор прочного синего ББ или Б 5 mi прочного сн нет о Г>1 рас творяго! в насыщенном растворе карбоната калия (40%) Реактив гоювяг непосредственно перед обработкой пластин Красное, фиолетово- красное окрашивание характерно для каннаби- ноидов
Раствор хлорида железа (III) 5 г хлорида железа (III) растворя- ют в 100 мл воды Пурпурное окрашивание характерно для соедине- ний. содержащих фе- нольные группы
Реактив Бича Готовят 5% рас 1 вор i ид роке и да калия в абсолютном этаноле Обработанную пластину нагрева- ют в течение 5 мин при 105 "С Сннс-фио.тсювос окра- шивание характерно для каннабтыиола
Реактив Ван-Урка 1 г п-днметиламино&еиK-Liuuei ила растворяют в 90 мл этанола и 10 мл концентрированной соля- ной кислоты. Реактив готовится непосредственно перед обработ кои пластин После опрыски- вания пластины нагревают при 100 'С в течение 5 Mill! Желтое иди близкое к нему окрашивание ха- рактерно для сульфани- .имидов, розовое — для многих друптх вещества ПрО для ЛСД — 0.05 мт
Реактив Драгендорфа Раствор 1. 2 г висмута нитрата основного растворяют в 25 мл ледяной у к еусной кислоты и 100 мл волы Раствор 2. 40 г иодила калия в 100 мл волы Реактив юговяг путем смеши- вания растворов 1 и 2 (по 10 мл каждого) с 20 мл ледяной ук- сусной кислоты и 100 мл воды Реактив готовят 1 раз в 2 дня После опрыски- вания пластины нагревают при 100 "С в течение 5 мин. Желтый фон реактива удаляют опрыскивани- ем пластин 10% раствором серной КИСЛОТЫ С 1ЮСЛС- дуюнитм нагрева- нием Желтое, оранжевое, крас- но-оранжевое. кирпич- но-красное. коричисво- ортнжсвое окрашивание характерно для соедине- ний. содержащих третич- ный язог
Реактив йодплагината подкисленным 5 мл 5%. раствора хлорида плати- ны (IV) смешиваю! с раствором 5 г калия йодида в 100 мл воды и добавляют 5 мл концентрирован- ной соляной кислоты После опрыски пиния пластины патрснают при 80 ’С в течение 5 мин Пурпурное или с различ- ными опенками пурпур- ное окрашивание харак- терно для четвертичных аминов. Алкалоиды первичные и вторич- ные амины дают разную окраску
Реактив Манделина 1.62 г ванадата аммония раство- ряю! в 125 мл конпентрирован- пой серной кислоты. охлаждают и приливают раствор к 125 мл ледяной воды. Пере.! уногрсблс пнем реактив разбавляют в 10 раз водой После онрыски вания пластины нагревают при 110 ‘С в течение 3 мин ПрО 0.25 2.5 мм для алкалоидов и фенолов
Методы определения токсикантов в биосредах 347
Окончание таб.1. б- Iff
Реакпш Марки Смешиваю! 2 мл 36% pact вора формальдегида в 100 мл концен- трированной серной кислоты. Реактив готовят непосредственно перед обработкой пластин Наносится капель- но или способом макания пластин в реактив Черное или пурпурно- черное окрашивание может быть характерно для опиатов
Реактив Мекке 1 г селеновой кислоты растворя- ют в 100 мл концентрированной СС| нои кислоты Реактив для обнаружения алкалоидов
Реактив Мупье Смешивают 2 мл реактива Др генлорфа. 0.1 г аскорбиновой кислоты. 0.1 г уксусной кислоты и Я мл волы Светло-оранжевое окра- iiiiittiiiHC характерно для алкалоидов и третичных аминов. Окрашиваются липиды, стероиды, пик- .lOlCKClLTilMHIlb! и другие вещества. ПрО 0.25—1.0 мкг
Реактив Про.хазки Смепшвают 35% раствор фор- малите! ила с 25% раситором соляной к слоты и этанолом в соотношении 1:1:2. Реактив готовят неиосретсiпенно перед обработкой пластин При лисином свете зоны окрашены в разные цвета. В УФ-свете они флюоресцируют. Окраска уенлива стся после обра- ботки царской водкой (смесь коп центрированных азотной и соляной кислот в соотно- шении 1:3) Индольные соединения. ПрО 10 пт
Реактив Фреде Насыщенный раствор молиб.шта натрия или калия в концентриро- ванной серной кислоте. Реам ив готовят непосредственно перед обработкой пластин Реактив лля обнаружения алкалоидов
Р "актив фурфураля Раствор 1. 2 мл фурфур.пя смешивают с 98 мл ацетона. Раствор 2. 4 мл концентрированной сер- ноп кислоты смешивают с 96 мл ацетона Пласшну обра- батывают рас- вором 1. а затем раса вором 2 От пурпурного до сине- черного окрашивания ха- рактерно ллн некоюрых веществ нейтрального характера
Реактив Эрлиха мо |ифнциро- вапный 1 г п-лимет1ыами1ктбел}аль'1е1пда растворяю! в К) XL! мешпола и 10 мл концентрированной орто- фосфорной кислоты (и ютность 1.75 г/мл). Реактив готовят непосредственно перед обработкой плаепш Темно-синее окраши- вание характерно для индолов. красное — для фенциклидина
Реактив про- чного черного К 5 мг прочного черного К рас- творяют в нашлите ином рас шоре карбоната калия (40%). Реактив готовят непосредственно перед обработкой пластин Коричневое окрашивание ни белом или свстло-ко- рнчневам фоне характер- но для а.м<|югаминов и <Ье||нлалк1!ламинов
Примечание: Г 1рО — предел обнаружения метода
Исследование образцов «неизвестного* происхождения. Эксперт! ая практика последних лет
показала. что правоохранительные органы и обслуживающие их криминалистические подраз-
деления все чаще сталкиваются в своей работе с новыми, ранее неизвестными для них объ-
348 Глава 6
скгами >i bciuccibimh. Нередки случаи, когда впоследствии гакие средства понадают в разряд
контролируемых психотропных вешиств или наркотических средств. Например, вешества из
1 руины амфетамина и его производных: МБДБ. БД Б. катинон. ДОС. N.N-димсгиламфсгамип
и др. (см. синеок сокращений в ы. 7 шбл. 7-3).
Mcioji ТСХ. как и любой другой метод определения физико-химических коншанг. поз-
воляй получать гораздо больше информации об исследуемом вешссгве при использовании
другого подхода, отличающегося от приведенного выше. Суть такого подхода заключается в
применении ограниченного количества стандартизированных хроматографических систем и
проявляющих реактивов. Хроматографпческпе системы подбираются таким образом, чтобы
получаемые с их помощью результаты были максимально эффективны, воспроизводимы от
опыта к опыту и от лабораюрин к лаборатории. Существует достаточное количество хромато!
рафичсских систем для разделения наркотических и психотропных веществ как общего, так
и частною, группового назначения, а также критериев выбора наиболее оптимальных из них.
Основными критериями выбора оптимальных условий являются следующие.
Предел обнаружения метода. Xpouaioiрафичсские системы и проявляющие реактивы долж-
ны подбираться с учетом получения сравнимых результатов при использовании каждой нт
выбранных систем. Поскольку чувствительность обнаружения веществ методом ТСХ зависит
от природы самих веществ и применяемых реактивов, пределы обнаружения в каждой из ис-
пользуемых стандартных систем должны быть близки.
Время проведения исследований. которое зависз т в основном от конкретной вязкости системы
растворителей, должно быть примерно одинаковым для всех из них
Стандартизированные системы растворителей должны давать равномерное распределение
значений R, исследуемых веществ по хромат графической пластине.
Стандартизированные системы должны иметь высокую воспроизводимость значений R.
Обычно хроматографические системы подбираются таким образом, чтобы утроенная ошиб-
ка измерения R, не превышала 10%. У выбранных хроматографических систем коэффици-
ент корреляции должен быть минимальным, что обеспечинист большую производительность
работы
Кроме того, различными авторами предложено несколько други способов математической
оценки хроматографической системы по указанным выше параметрам. Наиболее часто исполь-
зуются дна следующих
Дискриминирующая ста (DP) определяется как вероятность того, что два вешества. взяшх
случайным образом из общего числа анализируемых вешестн. Moiyr быть отделены друг ог
друга в данной конкретной системе ТСХ с учетом утроенной ошибки определения R, Расчет
DP производи гея по формуле:
где М — количество пар веществ, которые в данной системе разделены быть нс могут с учетом
утроенной ошибки определения R,; N — общее количество псстстусмых всшсств в данной
системе.
Идентификационная сила (IP) представляет собой вероятность идентификации вещества
по значениям R. для конкретной хроматографической системы или комбинации систем.
Она обратно пропорнионатьна средней шише списка кандидатов на идентификацию в вы-
бранных условиях (MLL). которая чем ближе к I. тем большее число веществ может раз-
делить данная система. При MLL. равной I. каждое анализируемое вещество в рассматри-
ваемых условиях проведения эксперимента обладает уникальными, только ему присущими
свойствами.
Ниже приведены некоторые наиболее распространенные хромаю!рафические системы для
анализа наркотикой (табл. 6-19) и значения Rf некоторых иаркотков, их аналогов в этих сис-
тем lx (табл. 6-20).
Методы определения токсикангов в биосредах 349
Таблица 6-19. Хроматографические снег мы. стандартные ошибки определения R,и вероятность разделе-
ния двух случайно выбранных веществ в них (DP)
№ системы Подвижная фаза Неподвижная фаза Стан- дартная ошибка Rr DP
1. Метанол—аммиак (100:1,5) Силикжсш*. обработан- ный 0.1 М раствором КОП 7 0,673
> Циклогексан— толуол—дпэтнламин (75:15:10) 7 0.757
3. Хлороформ—.метанол (9:1) II 0.760
4. I олтол—лис топ - гтанол—аммиак (45 45:7:3) Силикагель 7 0.810
5 Метанол—води—концентрированная садя пая кислота ($0:50:1) Силикагель RP-lS 9 0.770
Таблица 6-20. Значения Rr некоторых психотропных веществ, наркотиков и их аналогов
Вешество Значения R.B сганшртиых системах (см. табл. 6-19)
М 1 №2 №3 №4 №5
Амитриптилин 51 55 32 52 9
Амфетамин 43 l-s 9 44 56
Бензопдэкгоннп 21 0 1 0 41
Бупренорфин 76 9 68 76 19
Героин 47 15 38 38 43
Диазепам 75 23 73 73 32
Димедрол 55 45 33 49 19
Кетамин 63 37 63 72 46
К. cmJkmiih 62 8 31 63 59
Колени 33 6 IS 17 61
Кокаин 65 47 4? 7.3 34
дед 60 3 39 47 26
МДА 39 17 12 45 51
Мескалин 20 4 10 23 61
Ale адон 48 61 20 55 10
Метаквалон 70 37 SO 72 27
Метамфетамин 31 28 13 15 52
Мстил(]>ен11д:1Т 57 34 34 57 38
Морфин 37 о 0 11 77
Налоксон 65 9 66 54 70
Налорфин 59 1 23 33 71
Никотин 54 39 35 47 93
Норпсендоэфедри 11 42 25 5 62 65
Носкэпин 64 22 74 76 34
Папаверин 61 8 65 61 28
Псевдо лфедоин 33 54 4 72 63
Фентанил 70 45 74 77 19
Ф хазспам 62 30 48 65 24
Эрготамин 63 1 34 40 12
Этилморфин 40 7 22 18 5.3
Эфедрин 30 5 5 08 63 j
350 Глава 6
Результаты расчета DP для приведенных в табл. 6-20 тначений R( показывают, что при уве-
личении числа используемых хромлтот рифических систем >гот коэффициент увеличивается.
Например, для систем I и 3 он составляет <).$60: систем № I и 2 — 0.917. систем № I. 2 и 3 —
0.967 а систем I. 2. 3. 4 — 0.980. При использовании всех 5 систем только два вещества: колени
и эт тит.морфин — нс мо1ут быть отделены друз оз лр та на основании значении R в пределах
ошибки их измерения. В этом случае DP составляет 0.997. Обработка пластин для хроматотра-
фни проявляющими селективными реактивами резко повышает вероятность идентификации
веществ
Наиболее эффективным считается комплексный подход, использующий несколько хрома-
ют рафичсскттх тонкослойных, жидкостных и газовых систем, а также .химические и спект-
ральные методы В настоящее время описаны такие идентификационные системы, которые
включают указанные парах стры для большого количества наркотиков, лекарств и прочих со-
единений. общее количество которых может составлять от нескольких десятков до нескольких
сотен наименовании. В справочнике Е.А. Симонов н соавт. «Наркотические средства и психо-
тропные вещества, контролируемые на территории Российской Федерации» (2003), приведены
параметры удерживания большого количества наркотических средств, психотропных и сильно-
действующих веществ в 10 хроматографических системах (см. электронное приложение).
Использование стандартизированных методов позволяет подбирать системы растворителей,
пластины и проявляющие реагенты таким образом, чтобы анализировать различные сложные
объекты, в том числе биологические. иа присутствие большого количества — до нескольких
сотен — различных токсикантов и их метаболитов. К настоящему времени известно несколько
наборов реактивов и оборудования, позволяющих проводить работы так эго рода Наиболее
широко используемые из них это наборы, выпускаемые фирмой Камаг (Германия), и система
ТОКСИ-ЛАБ — фирмой Вариаи (США). В первой системе применяется два вида высокоэф-
фективных пластин: с силикагелем и обращенно-фазовым силикагелем с дальнейшим испо. ь-
зованисм спец талытого сканера для получения спектральных характеристик отражения света
от разделенных зон в видимой и УФ-областях света. Идентификация веществ в данной системе
осу дствлястся на основании компьютерного поиска полученных значений R,.и максимумов
отражения но базе данных, содержащей информацию о более чем 600 веществах и их метабо-
литах. Использование такой системы требует от персонала высокой квалификации, навыков
работы в области ТСХ и спектроскопии.
Система ТОКСИ-ЛАБ более проста в использовании. предоставляет аналитикам больше
информации о присутствующих в биообъектах веществах хорошо стандтртизоваиа. В состав
комплекта входят специальные емкости для проведения экстракции веществ основного или
кислого и нейтрального характера, вспомогательное оборудование и реактивы. п.тастшты для
ТСХ. набор стандартов и база данных на 700 веществ и их метаболитов (рис. 6 39).
В системе ТОКСИ-ЛАБ вещества выделяют из мочи с применением специальных патен-
тованных устройств для ЖЖЭ. экстракты переносят на диски из специального материала,
которые помещают на хрома гот рафт i чес кие пластины из этою же материала. Гуда же перено-
сят диски с нанесенными иа них стандартными образцами сравнения. Пластины хроматогра-
фируют в одной подвижной системе и последовательно подвергают следующим операциям:
обрабатывают парами формальдегида от 5 до 30 мин; затем — концентрированной серной
кислотой: промывают водой: просматривают в УФ-области света: обрабатывают реактивом
Драгендорфа
На рис 6-40 представлены этапы проявления хроматографических зон веществ, выделен-
ных из мочи, содержащей амфетамин и кодеин. На пластине по 2 хроматографические зоны
с краев пластины отведены лчя хромаютрафировапия аналитических стандартов сравнения
исследуемых веществ, относительно которых проверяется работоспособность системы как в
отношении качества проявляющих реатентов. гак и в отношении разделяющей способности
хромаю рафичсской системы В центре пластины располагается хроматографическая зона ис-
следуемого экстракта. Идентификация веществ осхшссгвлястся на основе совпадения значе-
ний R. H окраски хроматографических зон стандартов и исследуемых экстрактов.
Система ТОКСИ-ЛАБ позволяет идентифицировать вещества не только кислого и ней-
трального. но и основного характера. С ее помощью можно проводить опрсдстснис (с приме-
нением гидролиза или без пего) опиатов, каннабиноидов, бензодиазепинов и др.
Методы определения токсикантов в биосредах 351
Рис. 6-39. BiieiUHiin ши набора ТОКСН-ЛАЬ фирмы Вариан (США)
Рис. 6-40. Окрашивание плас-
тины ТОКСИ-ЛАБ в процессе
обработки проявляющими реяк-
тивами (ем. текст). Ах и Кх —
хрома ^графические юны выде-
ленных их мочи амфетамина и
кодеина соответственно. А (I)
и К (2) — хроматографические
зоны аналитических стандартов
сравнения амфетамина и котси-
I) соответственно.
352 Глава б
Денситометрическое определение наркотических средств и других токсикантов Современное
развитие хроматографической техники (см. далее гл. 6). приведшее к появлению хрома го-масе-
спектрального оборудования, диодных матриц и иро|раммируемых УФ-детскторов с изменяе-
мой пиной волны для ВЭЖХ, устройств лля сканирования тонкослойных хрома готрафических
пластин в видимой, УФ- и ПК-областях света, позволило облепить, ускорить и значительно
повысить надежность идентификации наркотических средств и психотропных препаратов. На-
личие такого широкого ассортимент оборудования дает возможность достаточно гибко подби-
рать оптимальный вариант оснащения лабораторий в соответствии с конкретной потребностью
в такою рола исследованиях. Например, если негвозхюжностп приобрести хромато-масс-спек-
тральное оборудование, можно успению использовать (в подавляющем большинстве случаев)
жидкостную хроматографию или аппаратурную ТСХ Последний вариант предпочтительнее,
так как при равной эффективности и информативности с ВЭЖХ аппаратурная ГСХ обладает
большей производительностью. меньшей стоимостью оборудования и вспомогательных мате-
риалов. что подтверждают приведенные ниже методики.
Количественное определение основных компонентов опия и героина. Метод ТСХ давно и ши-
роко используется для анализа опия. До сих пор этот метод применялся главным обратом пя
идентификации компонентов наркотика и в лучшем случае для пшуколнчествапного опреде-
ления. Денситометрия в УФ-области света хроматографических зон. полученных на пластин." х
для высоко эффективной ТСХ, а также некоторые методические подходы к нанесению пробы
позволяют значительно снизить ошибку метода. После соответствующей нробоноготовки об-
разца (см. гл. 5 и 7) проводят хроматографирование в системах (см табл. 6-19) с пробегом
растворителя нс менее 8 см:
№ I. толуол—ацетон—этанол—аммиак (45:45:7:3):
N] 2. хлороформ—ацетон—этанол—аммиак (20:20:3:1);
N 3. толуол—диэгияамии—эгаиол (9 1 1).
После удаления остатков растворителя пластину денситометрирхют при 280 нм па приборе
ILC-SCANXER III фирмы Камаг (Германия). В табл. 6-21 предс1авлены максимумы отра-
жения и значения R, основных компонентов опия. Следует отметиль. чго в зависимости от
использованной системы максимумы отражения вешеств могут незначительно изменяться в
пределах ошибки в 4 нм.
Таблица 6-21. Максимумы отражения и ишчсиия R, компонентов опия
Вешеспю Максимумы отражения в им Значения R, в системах
№ 1 М’ 2 № 3 №4 .V- 5 М 1 №2 № 3
Героин 207 280 312 — — 0.38 — —
I'll IpOKOJOH 208 218 293 — — 0.14 0.34 0.47
Гилрокогарнии 217 22$ 320 — — 0.58 — —
Ди1ядроколе1ш 212 222 245 293 — 0.09 0.26 0.43
Копеки 216 226 295 — — 0,19 0,27 0.45
Крит on ин 208 218 295 245 — 0.51 0 76 0.63
Меконин 217 225 320 — — 0.73 — — 1
Морфии 219 229 297 — — 0.09 0.15 0.20
Наркотин 217 225 322 — 0.70 0.78 0.67
Оксикодон 209 218 292 — — 0.53 0.74 0.63
Папаверин 239 249 291 211 335 0.58 0.72 0.60
Тебаин 286 296 216 236 — 0.30 U.47 0.64
Этилмо тонн 217 226 295 — 0.19 0.38 0.46
На рис 6-41 представлен спектр отражения кодеина, выд< зонного с помощью системы № 2
из образца героина.
Приведенная выше методика можете успехом применяться для количественного определе-
ния действующего начала в героине. На рис. 6-42 приведена денситограмма метанольного рас-
Методы определения токсикантов в биосредах 353
Рис. 6-41. Спектр отражения кодеина, вы теле иного
с помошью системы N1 2 из образна героина.
Рис 6-42. Денситограмма героина при X 280 нм.
твора героина (5 мг/мл). полученная при сканировании пластины при 280 нм после разделения
в системе № 2 образца героина.
В результате проведенною исследования в данном обрагце установлено присутствие
46,6±1,6% дианетилморфина (героина), 29,8±2,0% наркотина и 2,6±0,4% папаверина. Резугь-
таты денситомстричсского определения этих вешсств совпали в пределах 5% ошибки с ре-
зультатами газохроматографического исследования, проведенного по утвержденной ПККН
методике.
Обнаружение сверхмалых количеств наркотиков в био югических ооъектах. Многие нар-
котики можно анализировать методом ТСХ на уровне долей нанограмма, после обработ
ки их реактивами для получения флюоресцирующих продуктов. Методика обнаружения
и количественного определения морфина, амфетамина и первитина на поверхности раз-
личных предметов, а также в объектах биологического происхождения методом высокоэф-
фективной IСХ дансильных производных приведена ниже. Количественное определение
проводится на основании сравнения интенсивности флюоресценции хроматографических
зон исследуемых объектов и стандартных растворов визуально или с применением денси-
тометра. На рис. 6-43 приведена структурная формула продукта взаимодействия морфина
и данейтхлорида
Основные способы проведения дансилирования исследуемых веществ. Наиболее обшей яв-
ляется методика прямого лансилирования для получения дансильных производных многих
354 Глава 6
Рис 6-43. Продукт реакции образования ддисилморфина.
исследуемых bciuccib. Другая методика — экстракгцшюс дапсилиронанис — ддег большой
вышрыш во времени и имеет больший процент извлечения. Прямое лансилирование мор-
фина: к 5 мл водного раствора образна или калибровочного раствора добавляют 200 мг
карбоната натрия и 0.2 мл 0.1% раствора дансилхлорила в анезоне. Полученную смесь вы-
держивают 1.5 — 2 ч при комнатной температуре в темном месте. После лого се экстраги-
руют 2 раза 5 мл хлороформа. Хлороформные экстракты объединяют, сушат нал безводным
сульфатом натрия и упаривают досуха на роторном испарителе или в токе азота при темпе-
ратуре 40 “С
Экстрактивное лансилирование морфина: к 5 мл полного рас нора образна или калибровоч-
ного раствора добавляют 0,1 мл 0.2 М раствора тетрабутиламмония гидроксила в I М растворе
NaOH и 0.2 мл pact вора да нс и л хлорида в хлороформе (I мг/мл). Смесь встряхивают в течение
10 мии. Слой органического растворителя удхпяют (сушат) нал безводным сульфатом натрия и
упаривают досуха на роторном испарителе или в токе азота при температуре 40 С.
Лансилирование сухих остатков после экстракции из биообраша: сухие остатки растворя-
ют в 5 мл подкисленной воды. Далее поступают как в описании прямого или экстрактивного
дапсилировання.
Представленные варианты методик применимы только к морфину.
Для получения воспроизводимых результатов перед нанесением исследуемых растворов
хроматографические пластины дважды хромато! рафнруют в мега ноле и сушат при комнатной
температуре до полного удаления следов растворителя.
При исследовании сильно загрязненных образцов, например экстрактов из волос или
ногтей, перед хроматографированием в основной системе пластину хроматографируют не-
сколько раз в толуоле или аиетонс. После каждого цикла хроматографирования ее сушат
на воздухе. Окончательное хроматографирование проводят в системах, указанных в табл.
6-22.
1аблина 6-22. Хрома ю|рафичсские системы и значения R, дансильных производных исследуемых ве-
шеств
Хроматографическая система Значения R, дансильных производных
морфн за амфетамина первитина
Метанол — 25% аммиак (100:1,5) 0.60 — —
Аистом—хлороформ—этанол: 25% аммиак (20:20:3:1) 0,81 — —
Циклогексан—толуол—диэтиламин (7,5:1.5:1.0) 0.56 0.78
Эффективность приведенных методик даисилирования морфина была показана при искус-
ственном добавлении морфина 1идрохлорида в мочу (табл. 6-23.).
Методы определения токсикантов в биосредах 355
Таблица 6-23. Процент извлечения морфина (при его искусственном добавлении) из мочи различными
методами (п = 6)
Метод Концентрация морфина, мкг/мл Стандартная ошибка Извлечение, %
добавлено определено
Дансилированне после экстра- 1.0 0.78 0.12 78.0
КЦМП 2.5 2.01 0.09 80.2
Прямое дансилирование 1.0 0.82 0.21 82.0
2.5 2.03 0.15 81.2
Эксгрнктииное лапсилирова- 1.0 0.68 0.11 68.0
ние с гексаном 2.5 1.81 0.13 72.4
Экстрактивное дансилирова- 1.0 0,85 0.17 85,0
ине с хлороформом
Как видно из табл. 6-23, наилучшие результаты показал метод экстрактивного лансилн-
роваиия с использованием .хлороформа в качестве экстрагента. Предел обнаружения дансил-
морфина составил 0,5 нг в пятне, дансильных производных амфетамина и первитина — 2,5—
5.0 нг в пятне.
6.3.3. Газовая хроматография
Говорят, что между двумя противоположными
мнениями находится истина. Ни в косм случае!
Между ними лежиг проблема.
И. Гете
Первое предположение о возможности использования газа в качестве подвижной фазы в
распределительной хроматографии было высказано А. Мартином (A. Martin) и Р. Сиджем
(R. Synge) в их работах, посвященных теории теоретических тарелок, жилкость-жилкостной и
бумажной хроматографии в 1941—1944 гт. Однако только спустя 10 лет в 1951 г. Мартином в
соавт. было проведено первое успешное разделение смеси веществ этим методом на практике.
Вскоре методы газоалсорбнионной и газожидкостной хроматографии стали гак быстро разви-
ваться и гак широко использоваться в научных исследованиях, как ни один другой аналитичес-
кий метод до этого. Уже в 1955 г. сразу 3 американские фирмы начали промышленный выпуск
газовых хроматографов для научных и исследовательских целей: Burrell Corp., Perkin-Inter и
Podbielniak. В следующем году к ним прибавилось сше 5 фирм.
За последнее десятилетие был отмечен повсеместный интенсивный рост научно-исследова-
тельских работ в области газовой хроматографии и ее прикладных направлений, опубликованы
монографии и статьи, защищены диссертации. По оценкам ведущих пр |боростроите.тьных
фирм в настоящее время по всему миру эксплуатируется более 200 000 газовых хроматографов.
Мировой рынок этих приборов оценивается в I млрд долларов США или 30 000 новых прибо-
ров ежегодно при средней стоимости комплекта ог 15 000 до 30 000 долларов.
Газохроматографическпй метод подразделяется на два основных вида в зависимости от приро-
ды неподвижной фазы, так как подвижная фаза в этом случае всегда представляет собой газ. Это
газоадсорбционная хроматография (ГХ). в которой неподвижную фазу представляет адсорбент и
молекулы веществ выделяются из подвижной фазы главным образом за счет электростатических
сил. Второй вид — это газожидкостная хроматография (ГЖХ) в которой неподвижную фазу
представляет слой жидкости, покрывающий и химически связанный с поверхностью инертного
носителя или стенки колонки. В этом методе вешества частично растворяются в неподвижной
фазе и разделение смеси происходит за счет разности в их растворимости.
Преимущества метода: быстрый анатаз сложных смесей — от считанных минут до 1—2 ч;
эффективный метод, обеспечивающий высокую разрешающую способность; высокочувстви-
тельный метод, позволяющий детектировать 10* до 10в г: нсразрушаюший метод, легко объ-
единяемый с другими физико-химическими методами анализа, например масс-спектромет-
356 Глава 6
рией или ИК-Фурье-спектроскопией: метод количественного определения, ошибка которого
составляет обычно 1—5%; лля проведения исследования требуется малое количество пробы,
обычно несколько микролитров; надежный, относительно простой и относительно недорогой
метол.
Недостатки метода: применение метола ограничивается летучестью образцов; метод не под-
ходит для термолабильных вешеств; затруднено проведение препаративных работ; необходимо
использовать дополнительное оборудование для подтверждения полученных результатов.
В середине 50-х голов XX века труппой датских инженеров была начата работа по изучению
процессов, приводящих к размыванию хроматографических пиков Им ужалось вывести урав-
нение, известное в настоящее время под названием уравнения Ваи-Дсемтера, связывающее
ВЭТТ с такими экспериментальными характеристиками, как диаметр частиц стационарной
фазы, коэффициенты диффузии вешеств в неподвижною и подвижную фазы, скорость дви-
жения подвижной фазы и др. Для описательных целей уравнение представлено в упрошенном
виде:
ВЭТТ^А + ^ + Сц,
где р — линейная скорость потока подвижной фазы: А — коэффициент вихревой лиффувии,
определяющий влияние на размывание хроматографической зоны плотности и равномерности
упаковки колонки неподвижной фазой, размера и формы зерен носителя (неправильная или
сферическая) и других факторов. Прзз использовании современных носителей и колонок, изго-
товленных промышленным способом, влияние этих факторов на эффективность разделения не-
значительна. Для капиллярных i азохроматографических колонок коэффициент А равен 0. В —
коэффициент продольной диффузии, учитывающий размывание хроматографической зоны за
счет градиента концентрации вешеств* в центре и но се краям. Влияние этого коэффициента
значительно при малых скоростях потока и более выражено для газовой хроматографии, чем
для жидкостной. Уменьшить его влияние можно правильной установкой скорости расхода и
увеличением вязкости подвижной фазы; С — коэффициент массопсреноса вещества между
двумя фазами. Подвижная фаза обогащается определяемым веществом главг ым образом во
фронтальной части его хромагографнческой зоны, что связано с с движением подвижной фазы
и конечной скоростью установления равновесия между фазами. Влияние этого фактора на
эффективность разделения и размывание хроматографических зон прямо пропорционально
линейной скорости потока подвижной фазы. Эффект становится значимым для капиллярных
газохроматографических колонок, имеющих очень тонкий слой неподвижной фазы.
Современные газохроматографические колонки имеют эффективность в сотни, а капилляр-
ные — свыше 10 000 ТТ. ВЭТТ на I м колонки с 10 000 ТТ составляет 0,01 см на 1 тарелку
Обычная эффективность для современных ВЭЖХ-колопок находится на уровне до 400 ТГ на
1 см колонки, что соответствует их длине от 10 до 50 см.
Па рис. 6-44 представлено графическое гзображение зависимости ВЭТТ и Н от линейной
скорости движения подвижной фазы.
Оборудование для газовой хроматографии. Блок-схема газового хроматографа приведена на
рис. 6-45. Газ-носитель, который представляет собой инертный газ, чаще всего азот или гелий,
подастся обычно из специальных стальных баллонов под большим давлением — до 150 а гм.
Для понижения давления до уровня, пригодного для работы прибора (около 5 атм), исполь-
зуются специальные устройства — редукторы которые имеют два мембранных манометра.
В последние годы пату чает все более широкое распространение использование в качестве
rasa-носителя водорода, поставляемою либо в баллонах как газ-носитель, либо получаемо-
го по мере надобности с применением специальных гидролизеров из воды. На рис. 6-45 это
оборудование обозначено как блок газоснабжения, от которого по металлическим трубкам
газ-носитель через систему фильтров и осушителей поступает в хроматограф, где при помоши
специальных устройств формируются требуемые для проведения анализа давление и расход
газа. Сформированный таким образом поток газа-носителя через инжектор поступает в газох-
роматогра {шчсскую колонку, установленную в термостате. Термостат (печь) газового хрома-
тографа способен поддерживать рабогую температуру до 400 ’С , а при наличии специальных
охладителей — отрицательную.
Методы определения токсикантов в биосредах 357
Рис. 6-44. Графическое изображение уравнения Ван-Дссмтсра.
Рис. 6-45. Блок-схема газового хроматограф.
Инжектор (испаритель) — устройство, в котором происходят испарение пробы и введение
ее в колонку. Температура инжектора обычно выше температуры колонки на несколько де-
сятков градусов. Пройдя через колонку, вешества попадают в детектирующее устройство, где
формируется сигнал, который затем обрабатывается компьютером.
Газ-носитель. Выбор газа-носителя является критическим с точки зрения успешного хро-
матографического анализа. Теоретически тазом-носителем может быть любой таз. однако на
практике используют инертные, легко получаемые в чистом виде, доступные и недорогие газы,
такие, как гелий, азот, реже водород. Основным критерием в данном случае является чистота
газа. Примеси, содержащиеся в нем. обычно приводят к флюктуациям нулевой линии, ухудше-
358 Глава 6
Рис. 6-46. В: иянис вида газа-носителя на эффективность колонки и время анализа.
Н — эффетивносгъ колонки
нию пределов детектирования. разрушению лабильных вешсств. К таким последствиям, напри-
мер. приводят следовые количества воды, попадая в хромакирафическую систему. Следовые
количества углеводородов в газе-носителе резко повышают хроматографический <|юн и предо i
определения вешеств для большинства ионизационных детекторов. Многие дстектируюшис
системы в газовой хроматографии удовлетворительно работают только при использовании вы
сокоочищенных газов. К ним относятся, например, элсктронозахвагный и маес-сслсктивпый
детекторы.
Большое влияние на эффективность хроматографической системы оказывает выбор газа-
носителя. На рис. 6-46 приведены графики зависимости эффективности разделения веществ
на одной и той же колонке от линейной скорост азота, гелия и водорода, используемых в ка-
честве газа-носителя. Окрашенными областями под кривыми отмечены диапазоны линейной
скорости потока, соответствующие максимальной эффективности.
Как видно на рисунке, наибольшей эффективности можно достичь, применения азот
Однако диапазон оптимальных скоростей потока у него уже по сравнению с гелием и во-
дородом. Различия i эффективности разделения не столь шмоны, как отличия линейных
скоростей потока. На пракзике это означает, что применение гелия или водорода вместо
азоза при незначительном ухудшении эффективности разделения позволит проводить ис-
следования на больших скоростях потока, другими словами, резко, в несколько раз сокра-
тит время анализа. Переход с азота на водород при прочих равных условиях примерно в
4 раза сокращает время анализа. При этом увеличивающийся диапазон скоростей потока,
при которых эффективность практически не изменяется, упрощает требования к контролю
за параметрами анализа.
Колонку, в которой происходит разделение анализируемой смеси, часто называют сердцем
хроматографа. Она является основной частью оборудования для газовой хроматографии. Ко-
Методы определения токсикантов в биосредах 359
.тонки, используемые на практике, делятся на две основные группы: набивные и капиллярные.
Отличаются они яруг от друга длиной, внутренним диаметром, способом заполнения, емкос-
тью. способами введения в них образцов и эффективностью разделения. Эти и некоторые
другие характеристики обсуждаются ниже.
Набивные котики — полые трубки, заполненные адсорбентом или инергным носителем,
на который нанесена жидкая фаза. Используемые в ХТА колонки различаются по материалу,
из которого они изготош сны. длиной и внутренним диаметром, природой и размерами час-
тиц инертного наполнителя, количеством и природой неподвижной фазы Все перечисленные
хар ктсристики колонки определяют ее эффсктивт ость, а последняя контролирует селектив-
ность. Для набивных колонок минимальная В ЭТТ зависит главным образом от размеров час-
тиц носителя и всегда больше удвоенного диаметра его частиц. Для набивной колонки длиной
1 м. заполненной частицами 100—120 меш (150 125 мкм). максимальная эффективность нс
превышает 3000 ТТ. Из-за сопротг вления потоку газа-носителя, резко возрастающему при
увеличении длины колонки, длина набивных колонок редко превышает 3 м. Теоретически эф-
фективность такой колонки может достигать 10 000 ТТ, но на практике для рутинного анализа
используются колонки, имеющие от 3000 до 5000 ТГ. Эффективность колонок не зависит от
внутреннего диаметра.
Колонки обычно изготовляются из мели, нержавеющей стали. никеля, сгекла и потитет-
рафгорэгилепа. Последние два материала предпочтительны для исследования полярных и тер-
молабильных веществ
В качестве инертного носителя для ГЖХ используются диатомитовые земли, синтетичес-
кие силикагели и стеклянные шарики. Перед нанесением па них жидкой фазы эти материалы
проходят сложную многоэтапную физическую и химическую обработку, призванную сократить
количество активных центров на их поверхности, на которых возможна необратимая сорбция
аналн зируемых веществ млн их термическая деградация. Неподвижная фаза наносится на по-
сиге. ь в растворе подходящего раствори гегя. который затем удаляется под вакуумом. Количес-
тво ее обычно составляет I. 3, 5 и 10% веса носителя.
Размеры колонок и частиц неподвижной фазы в ГХ аналогичны таковым в ГЖХ В качес-
тве адсорбентов здесь используют силикагель, оксид алюминия, цеолиты, пористые полимер-
ные материалы соответствующих размеров. Эффективность этого вида хроматографии обычно
ниже, чем ГЖХ. Но для решения некоторых специфических задач такие колонки могут с ус-
пехом применяться.
Набивные колонки уже практически повсеместно вытеснены из практз ки ХТА капилляр-
ными колонками. В настоящее время они используются при проведении количественного оп-
ределения этаноза в биологических жидкостях человека этилнитритным методом и при иссле-
довании некоторых инертных газов и низкомолекулярных органических веществ
Капииярныс колонки. Основной прогресс в газовой хроматографии практически по всем
прикладным направлениям связан с разработкой в 1957 г капиллярных ко.гонок. Однако ши-
рокое распространение они получили после внедрения в практику в 1979 г. кварцевых коло-
нок. названных FSOT (fused silica open tabular column). По сравнению с металлическнми или
изготовленными из стекла FSOT-колонки обладают значительной прочностью, гибкостью и
инертностью.
Определяющими свойствами для капиллярных колонок являются их длина и внутренний
диаметр, а также толщина неподвижной фазы, нанесенной на внутреннюю поверхность ко-
лонки. из-за чего онзг также обозначаются WCOT (wall coated open tabular column) Последняя
характеристика колонки определяет величину удерживания веществ конкретной колонкой и
величину образна, который можно анализировать на данной колонке.
Капиллярная ГХ проводится на колонках, внутри которых помешается адсорбент с зернами
определенного диаметра, закрепленными па внутренней поверхности капгглляра. Такие колон-
ки получили название PLOT (particle loaded open tabular column). По сравнению с набивными
колонками они обеспечивают высокую скорость проведения анализа.
Большинство исследований с помощью капиллярной хроматографии проводится на WCOT-
колопках. По внутреннему диаметру они подразделяются на 3 группы.
• Капиллярные колонки с внутренним дигметром 0.18—0.32 мм и длиной 10—60 м. С их
применением решают практически все задачи высокоэффективной газовой хроматографии.
360 Глава 6
причем чем сложнее анализируемая смесь, тем длиннее колонка и больше время анализа.
Иногда используюг очень короткие колонки, длиной до 5 м Время анализа при этом со-
ставляет около 3 мин. Для проб неизвестного состава применяют колонки длиной 25—30 м.
Такие колонки оптимальны также для сочетания ГХ с другими физико-химическими ме-
тодами. например МС. В таких колонках приемлема скорость потока газа-носителя около
1 мл/мин оптимальна для работы вакуумной системы масс-спектрометра.
• Колонки с внутренним диаметром от 0.53 до 0.75—1.00 мм. Они рассматриваются как аль-
тернатива набивных колонок (из-за высокой емкости) при использовании больших концен-
траций аналигов с высокой эффективностью разделения.
• Тонкие капиллярные колонки с внутренним диаметром от 0,1 ло 0,05 мм. Такие колонки
обеспечивают либо экстремальную эффективность до 1 000 000 ТТ при длине колонок 100
м и внутреннем диаметре 0,1 м. либо ультракороткое время анализа в несколько секунд при
длине колонки 10 м. Для этих колонок требуется малое количество сильно разбавленного
образна.
Неподвижная жидкая фала. С начала р звигия ГХ в качестве неподвижной жидкой фазы
использовались всевозможные жидкости различного происхождения. Количество их было
oipoMHO. Со временем оно сократилось до нескольких десятков специально производимых
для ГХ жидкое।ей. К ним относятся различные замешенные и незамещенные мстилсилико-
ны, такие, как метил-5%-фенил-. метил-5()%-фенил-. метил-50%-трифторпронионил-. циа-
нонронилмстилфенилсиликоны. замешенные диэтилен- и полиэтилен гл и кол и, 1.2.3-трис(2-
цианоэтокси)нропан и др. Наибольшее значение из вышеперечисленных фаз имеют различные
силиконы с высоким коэффициентом диффузии и поэтому низким сопротивлением массопе-
рсносу. а также высокой, до 350 ‘С, термической стабильностью. Кроме тою. они при низкой
температуре представляют собой жидкости или смолоподобные вещества, обладают простой
структурой и могут без труда быть получены в очень чистом виде. На практике эти фазы
можно применять в широком температурном диапазоне при незначительном фоне колонки.
Полярные эфиры полиэтиленгликоля обладают уникальной селективностью по отношению к
некоторым веществам, имеют рабочий диапазон температур ог 60 до 240—250 ’С.
В капиллярной хроматографии используются в основном те же самые фазы.
Выбор условий анализа. В условиях изотермического анализа при постоянной скорости рас-
хода газа-носителя в рамках одного гомологического ряда например п-углено. юродов, наблю-
дается экспоненциальная корреляция между исправленным временем удерживания гомоло-
гов и их давлением насыщенного пара, точкой кипения или количеством атомов углерода в
молекуле. Для смеси углеводородов этого ряда, у которых различия в температурах кипения
не превышает 100 °C. можно подобрать оптимальную температуру разделения. Однако при
расширении температурных диапазонов это сделать уже не удастся из-за проблем с эффектив-
ностью разделения вешеств в начале и конце хроматограммы. Типичный пример этого яапения
приведен на рис. 6-47.
Решегить данную проблему можно, применяя профаммирование температуры колонки,
программирование скорости или давления газа-носителя в ходе анализа.
Протраммировагь температуру колонки во время анализа очень просто. При этом начальная
температура подбирается таким ооразом. чтобы низкокипяшис вещества смеси разделялись в
оптимальных условиях (значение к > 3). Скорость нагрева и конечная температура подбирают-
ся в зависимости от состава пробы и с учетом приемлемого времени нровсдс тия исследования.
При программировании температуры но мерс приближения к концу анализа обычно значи-
тельно поднимается фон колонки, из-за чего иногда могут возникнуть трудности особенно при
количественном определении.
Для программирования расхода газа-носителя или поддержания постоянного давления Tpe6v
ется специальное устройство — электронный расходомер. Расходомер лет дополнительные пре-
имушесгва и в настояшес время ненов >зуется нс голько при анализе сложных смесей, но и при
использовании сложных многоколоночных усгройств с переключением потоков от одной колон-
ки к другой, сочетании газовой хроматографии с другими физико-химическими методами.
Способы введения пробы в колонку. Если козонка — эго сердце хроматографа, го устройства
для введения пробы в колонку можно назвать его ахиллесовой пятой, особенно когда речь идет
о капиллярной хроматографии
Методы определения токсикантов в биосредах 361
Время
Рис. 6-47. Хроматограмма раз-
деления смеси пешестп одного
и того же гомологического ряда
в t югсрмическнх условиях, к —
коэф | и тент емкости.
Любая система введения пробы (инжектор, испаритель, дозатор) в газовой хроматографии
должна удовлетворять 3 требованиям: I) вноси га минимальный вклад в размывание хроматог-
рафических пиков: 2) обеспечивать максимальную точность и воспроизводимость дозируемого
в разделительную колонку количества образца; 3) сохранять неизменность количественною и
качественного состава смеси до и после дозирования.
Дозаторы различают в зависимости от агрегатного состояния вводимой пробы (газообраз-
ное. жидкое, твердое) и се количестве (аналитические насалошые или капиллярные колонки.
препаративные колонны).
Рис. 6-48. Конструкция инжектора для
набивных колонок. Пояснение в тексте.
Для введеия азообразных проб используют газоп-
лотный ширин или дозирующий крап. Дозирующий
шприц, состоящий из калиброванного цилиндра, пор-
шня и иглы, объемом от 0,001 до 10 мл обеспечивает
воспроизводимость дозирования от 1 ло 5% Шприц —
более гибкий и простой инструмент, чем дозируюшии
кран. Омпцко последний обеспечивает бблыиую вос-
производимость дозирования — до 0,5% объема ка. иб-
рованпой петяи. пригоден для автоматического огбора
проб из постоянных потоков, для работы с ним не тре-
буется высокая квалификация оператора.
Введение жидких проб микрошприцем через самоуп-
лотняю! (уюся резиновую мембрану в непрерывно дви-
жущийся поток газа-носитстя получило самое широкое
распрострзненис.
На рис. 6-48 показана конструкция инжектора для
набивных колонок. Технически микрошприпем проба
через самоуплотняющуюся мембрану (а) вводится либо
в испаритель хроматографа в данном случае стекловату
(б), либо непосредственно на колонку, в неподвижную
фазу (в). Крепится колонка муфтой (г) и гайкой (д).
Характеристики микрошприца и правильная его
эксплуатация во многом определяют точность и вое
производимость работы всей системы ввода. Конструк-
ция микрошпрнцев зависит от того, где происходит
дозирование жидкости: во внутреннем объеме шпри-
ца (ширины объемом 5—1000 мкл) или в игле (объем
0,5—1,0 мкт). Основными проб юмами при дозирова-
нии жидкостей микрошприпами являются изменение
количественного и качественного состава пробы из-за
362 Глава 6
разложения термолабильных соединений при контакте с нагретым металлом иглы и стенками
испарителя, каталитические превращения или селективная сорбция на поверхности металла,
а также па обуглившихся нелетучих остатках предыдущих проб или кусочках прока, ываемой
иглой микрошприца самоуплотняющейся мембраны. К настоящему времени на практике при-
меняется несколько способов введения образцов в инжектор.
Способ заполненной иглы заключается во введении в инжектор пробы, объем которой ра-
вен внутреннему объему иглы микрошприца. Бблыная часть пробы при этом испаряется из
иглы, однако какое-то ее количество остается в мембране инжектора. При таком способе
введения необходимо убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в игле шприца и при руч-
ном введении помнить о давлении газа и пара в инжекторе, которое может выбить плунжер
из шприца.
Способ холодной иглы заключается в быстром введении пробы сразу после прокалывания
мембраны инжектора. При этом учитывается. что проба в жидком состоянии проходит через
нс успевшую нагреться иглу и испаряется уже в инжекторе. Однако оставшаяся в игле проба
будет испаряться по мере ее нагревания.
Способ горячей иглы аналогичен вышерассмотренному, за исключением тою что после прока-
лывания мембраны иглу выдерживают в испарителе 3—4 с перед быстрым введением образца.
Способ «бутерброда». Перед набором образца в микрошприц набирают сначала около 1 мкл
воздуха, а затем I мкл чистого растворителя. который предотвращает преждевременное смеши-
вание жидкостей. Сама инжекция проводится с применением способов холодной или горячей
иглы. После пробы иногда набирают сшс дозу растворителя с прослойкой воздуха. При этом
способе необходимо помнить о том. что при повышенных температурах воздух окисляет пробу
и материалы, из которых сделаны колонка и инжектор.
Высокоэффективный инжектор газового хроматографа отвечает следующим требованиям:
1) равномерный обогрев инжекционною блока в интервале температур 50—500 *С с диск-
ретностью установки температуры 5—10 °C и точностью регулирования ±1—5 ‘С; 2) развитая
внутренняя поверхность, обеспечивающая подвод достаточного для мгновенного испарения
пробы количества тепла, 3) минимальный объем зоны испарения, отсутстви : непродуваемых
газом-носителем зон: 4) поток газа-носителя должен быть сформирован таким образом, ттобы
обратная диффузия образна в холодную зону возле мембраны и в подводящие линии была
сведена к минимуму. 5) газ-носитель должен приходить в зону испарения образца в нагретом
до температуры испарителя состоянии; 6) внутренняя поверхность испарителя должна быть
легкодоступна для периоднческо т чистки; 7) эффект «памяти» мембраны должен быть мини-
мизирован. сама мембрана должна иметь более низкую температуру, чем корпус испарителя,
либо должна использоваться безмембранная система ввода.
Для исследования твердых образцов их (как правило) растворяют в подходящем растворите-
ле. который вводят в колонку, используя технику ввода жидких проб. Существенным недостат-
ком такого способа дозирования является дозирование в колонку больших объемов раствори-
теля, что привозит к смыву с начального участка колонки неподвижной фазы и появлению на
хроматограмме растянутого «хвоста» пика растворителя. Кроме того, при вводе итлы шприца с
раствором в горячую зону испарителя еще до момента начала движения поршня растворитель
начинает интенсивно испаряться из иглы. Остающаяся в игле шприца жидкость обогащается
тяжелыми компонентами, причем, чем менее летуч компонент, гем больше по отношению к
менее летучим компонентам его остается в игле. В результате при количественном определении
обнаруживается дискриминация по тяжелым компонентам. т.е. экспериментально определяе-
мая концентрация тяжелых компот тентов в пробе оказывается заниженной, а более легких —
завышенной по сравнению с их истинной концентрацией.
Альтернативным способом дозирования твердых образцов является использование микро
капсул из стекла, мягкого или легкоплавкого металла. Такие капсулы с веществом переносят
в испаритель хромаю!рафа. где она в потоке газа-носителя тем нли иным способом вскры-
вается; проба испаряется и в виде паров поступает в колонку. Недостатком этого способа
дозирования является сложность конструкции шлюзового ввода, обусловленная наличием
большого числа подвижных трущихся элементов. Существуют и другие способы введения
твердых образцов.
Методы определения токсикантов в биосредах 363
Рассмотренные выше способы дотирования хорошо сочетаются с набивными колонками.
Основной проблемой является мембрана, которая по .мере эксплуатации теряет герметичность,
может выделять вешества. проявляющиеся на хроматограмме отдельными пиками, извращаю-
щими результаты исследований. Кроме того, мембрана, особенно при вводе больших объемов
растворов полярных вешеств. может их адсорбировать и затем медленно выделять в газ-носи-
тель.
Ввод пробы в капиллярные колонки. Для подавляющего большинстве исследований в ХТА,
обычно выполняемых на колонках WCOT диаметром 0.3 мм. типичная скорость расхода газа-
носигсля меньше 2 см/мин. В этих условиях при температуре испарителя 250 С объем пара
образующегося после инжекции 1 мкл пробы, составляет около 0.5 мл. что требует более 30 с
для полного очищения инжектора объемом 1 мл. Это время значительно превышает время, до-
сг<почное для получения пика птичной ширины в капиыярной хроматографии (5 с), поэтому
требуются особые подходы для введения образцов.
В зависимости от рабочих характеристик капиллярных колонок и уровня концентрации
анализируемых компоненлов пробу вводят в колонку одним из 3 способов: с делением потока,
без деления потока, непосредственно в колонку.
Системы ввода с делением потока (split injection). Проба в количестве 0.1—1.0 мкл г одастся
в сислси полностью испаряется, и гомогенная смесь паров пробы с газом-носителем раз-
деляется на два неравных потока: меньший поступает в колонку, а больший сбрасывается в
окружающую среду (рис.6-49). Если в испари геле юмогенишипя обрлша полная, то полок
газа-носителя будет делиться в отношении, определяемом скоростями двух указанных потоков.
Отношение потока называют отношением деления. На практике используют коэффициенты
деления от 1:10 до 1:1000. Конструкция делителя должна обеспечивать в процессе ввода строгое
постоянство выбранного отношения потоков. На него оказывают влияние изменение давления
при испарении пробы, зависимость вязкости парогазовой смеси от ее состава, конденсация
раствори геля на входе в капиллярную колонку.
При описываемом способе ввода большая часть пробы теряется. Считается, что этот способ
неприменим лчя авали in разбавленных образцов или следовых компонентов смеси, концен-
трация которых не превышает 0,01%. Его лучше всего использовать для разделения смесей
относительно низкокипяших вешеств. например бензинов и газолинов, содержание основных
компонентов которых составляет 0.01 — 10%.
Гайка
Гаэ-
•оситель
Мембрана
Продувка мембраны
Регуля ор потока
Вкладыш
Рагупятоп потока
Колонка
Рис. 6-49. Схема инжектора для ввода об-
разцов в капиллярную колонку (split/spliiless
injection).
364 Глава 6
Преимущества. обеспечивающие широкое распространение этого способа в ХТА: простата конс-
трукции и удобство работы с инжектором, простота выполнения многокомпонентного анализа
и небольшая относительная ошибка количественного определения.
Недостатки способа: неравномерное смешивание паров пробы и газа-носителя в испарите-
ле. вызванное разными скоростями парообразования и неполным переходом анализируемых
вешеств в пар из иглы шприца и из капли пробы, введенной в испаритель, что приводит к
серьезной потере эффективности из-за чрезмерною уширения стартовой зоны образца; метод
мало подходит для исследования термолабильных и малолегучих вещеов. а также вещее 1 в.
присутствующих в пробе в следовых количествах.
Системы ввода без деления потока (splitless injection). Способ введения пробы, при котором
весь образец целиком попадает в капил ярную колонку, был предложен в 1969 г. К. Гробом и
Г. Гробом. Системы такого тина нашли применение в ХТА сильно ра бавленных жидких об
разнов при исследовании загрязнения органическими веществами окружающей среды, опреде-
лении состава природных продуктов. Сущность способа состоит в том. что относительно боль-
шое количество (1—5 мкл) разбавленного образца вводится в испаритель, который в момент
инжекции перестает продуваться газом-носителем, испарившаяся проба за счет увеличения
объема пара продавливается в колонку. Для исключения перорузки колонки количество рас-
творенных анализируемых компонентов в пробе не должно превышать 50 иг. В данном вари-
анте обеспечивается минимальное смешивание паров пробы с газом-носителем и их подл та в
колонку' в виде не разбавленной газом полосы. Большой избыток паров растворителя дает рас-
тянутый «хвост>. который мешает определению ближайших к пику растворителя компонентов,
поэтому инжектор через 30—60 с после ввода образца подключается к системе форсированной
продувки. Анализируемые компоненты к этому моменту практически уже на 100% переводятся
в колонку, а остатки паров растворителя от нес отсекаются.
Главным моментом в технике введения без деления потока является создание условий для
реконцентрирования размг шнных но достаточно большому объему паров растворителя аназ и-
зируемых компонентов в виде узкой полосы на входе в капиллярную колонку. Без этой стадии
работа системы теряет смысл.
В настоящее время получили распространение два способа рекониенгрирования: низкотем-
пературное улавливание и введение пробы с применением эффекте растворителя. Первый из
них состоит в конденсации и задержке анализируемых соединений на начальном участке колон-
ки за счет того, что начальна» температура колонки устанавливается приблизительно на 150 "С
ниже температуры кипения анализируемых компонентов. Растворитель при этом свободно
проходит через колонку. Пекле выхода зоны растворителя включается нагрев колонки и начи-
нается процесс разделения и анализа.
Механизм эффекта растворителя более сложен и основывается на концентрировании ком-
понентов смеси в правильно сформированной зоне сконденсированного растворителя, кото-
рая образуется в начале колонки при температуре колонки, установленной ниже температур;
кипения использованною растворителя. Условия формирования определяются 4 независимо
действующим и факторами: температурой колонки, летучестью и количеством растворителя,
временем дозирования При этом температура колонки устанавливается на 20 °C и более ниже
температуры кипения рас ворителя. время задержки продувки испарителя газом-носителем
обычно составляет 20—60 с
Преимущества систем введения пробы без веления потока: разбавленные экстракты анализи-
руемых образцов дозируются без дополнительной обработки; анализироваться может широкий
спектр вешеств; простое аппаратурное оформление.
Недостатки системы: плохая воспроизводимость времени удерживания компонентов, выхо-
дящих сразу за пиком растворителя; отсутствие эффекта рсконцеитрирования лля компонен-
тов. элюируемых перед растворителем; количественная дискриминация очень тяжелых компо-
нентов. разложение термолабильных соединений из-за длительного нахождения паров образна
в горячей зоне инжектора.
Система прямого ввода (оп-со/итп). При прямом вводе образец попадает в начало колонки
в исходном агрегатом состоянии еще до начала выпаривания его в игле шприца. Эга техника
напоминает эффект растворителя. Поэтому температура колонки устанавливается на 10—20 °C
ниже температуры кипения растворителя. Ввод пробы осуществляется специальным шприцем
Методы определения токсикантов в биосредах 365
с длинной иглой, диаметр которой меньше внутреннего диаметра колонки на 0.005 мм. Обыч
но таким способом вводят в колонку 0.1 —1.0 мкл пробы. После введения образца колонка
продувается газом-носителем до полного удаления следов растворителя. Далее происходит раз-
деление компонентов смеси.
Преимущества способа: высокая воспроизводимость результатов количественного определе-
ния компонентов смеси: способ пригоден для термолабильных и малояетучих веществ, кото
рыс при других способах введения вообще не достигают колонки.
Недостатки: введение в колонку иглы может вызвать турбулентность в движении потока
газа-носителя: введение больших количеств растворителя может разрушить колонку, в связи
с чем требуются химически связанные неподвижные фазы: в результате использования такой
техники введения колонка быстро загрязняется нелетучими компонентами пробы
Система с программированием температуры испарения (PTV) Первоначально такой способ
был предложен для работы с твердыми образцами, но. как оказалось, используя его, можно
преодолеть ряд трудностей, связанных с вводом образна в капиллярную колонку. На практике
проба вводится в холодный инжектор, который продувается газом-носителем, после удаления
растворителя инжектор очень бышро разогревается по баллистического закону до 300 *С за
20—30 с Вовнутрь инжектора вставляется очень узкий, 0.5—1,5 мм, с внутренним объемом
до 150 мкл вкладыш, заполненный инертным носителем или стекловатой. Способ позволяет
вводить в колонку большие объемы пробы, от 10—50 мкл ло I мл. особенно если на первом
этапе излишки паров раствор ггеля сбрасываются в атмосферу до начала нагрева испарителя.
Большие обт мы пробы позволяют исследовать сильноразбавленные растворы исследуемых
вешеств. что сокращает время на пробоподготовку и концентрирование веществ.
Существуют и другие способы введения вешеств в капиллярную колонку, например систе-
мы с испарением в холодной игле (cooled-needle vaporizing injector) и др. О тако они еше не
получили широкого распространения в ХТА.
Детекторы в газовой хроматографии
Детекторы в газовой хроматографии предназначены для обнаружения и измерения коли-
честв компонентов в потоке подвижной фазы на выходе из хроматографической колонки. При
попадании в газ-носитель компонентов анализируемой смеси образовавшаяся бинарная смесь
компонент — газ-носитель отличается по физико-химическим свойствам от чистого газа-но-
сителя Эти изменения регистрируются во времени и представляются в форме, удобной для
дальнейшей обработки.
Основные требования, предъявляемые к хроматографическим детекторам: детектор должен
обладать высокой чувствительностью; величина сигнала детектора должна изменяться про-
порционально изменению концентрации определяемого компонента в подвижной фазе; де-
тектор должен иметь достаточное быстродействие; рабочий объем детектора должен быть по
возможности наименьшим, чтобы исключить дополнительное размывание пиков в детекторе;
желательно, чтобы показания детектора отражали изменения физико-химических свойств под-
вижной фазы в зависимости только от ее состава.
В ХТА используются дифференциальные детекторы, реагирующие (даюшис отклик) на по-
вышение концентрации каждого из разделяемых компонентов в зависимости от времени (т.е.
дС, At от О. В этом случае хромаюграфический пик является дифференциальной кривой коли-
чества компонента, выходящего из колонки по времени. Сигнал такого детектора может быть
пропорционален или кон (ентрации определяемого компонента в газе-носутеле, или потоку этого
компонента, т.е. количссгву компонента, попадающему в камеру детектора в единицу1 времени
Для концентрационного детектора плошадь регистрируемого пика обратно пропорциональ-
на скорости потока газа-носителя и прямо пропорциональна \ ассе компонента. Поэтому при
увеличении скорости потока газа-носителя площадь пика уменьшается, а высота пика остается
постоянной.
В потоковом детекторе сигнал определяется количеством вещества, попадающим в детектор
в единицу времени, т.е. потоком вешества. Для потокового детектора с увеличением скорости
потока газа-носителя плошадь регистрируемого на хроматограмме пика не меняется, а высота
пика увеличивается, поскольку при этом увеличивается поток анализируемого компонента.
Плошадь пика определяемою компонента в этом случае прямо пропорциональна количеству
вешества и скорости потока газа-носителя.
366 Глава 6
Основные рабочие характеристики детектора: предел детектирования. линейность градуиро-
вочного графика, специфичность. Остальные требования к детектору как составляющей части
метода проверяются во время валидации метода в целом (см. гл. 5).
Предел детектирования — это наименьшая аналитическая концентрация, приводящая к по-
лучению измеряемого сигнала, отличимого от шума. Этот предел, как правило, соогвсгствус!
отношению сиптал/шум. равному 3:1. Предел лс1скгирования. помимо параметров, заданных
в методе, зависит от текущею состояния оборудования (шумы анализирующего прибора, со-
стояние колонки) и пробоподготовки.
Для любою количественною метода необходимо определить рабочий диапазон концентра-
ций анализируемого вещества, в котором справедливы измерения с помощью данного метода
Нижним пределом рабочего диапазона является предел количественной оценки (ПКО). а вер-
хний предел диапазона зависит от возможностей аналитического оборудования, на котором
проводятся измерения. В пределах рабочего диапазона может существовать линейный диапазон
измеряемых концентрации. Наличие линейною диапазона существенно упрощает калибровку
Селективность и специфичность являются параметрами, оценивающими надежность изме
рений в присутствии мешающих веществ в матрице пробы. Принято, что специфичность яв-
ляется 100% селективностью.
Детекторы по теплопроводности (ДТП) различных конструкций широко используются в
аналитической. препаративной и промышленной газовой хроматографии Это объясняется
следующими преимуществами ДТП; простотой и низкой стоимостью как самою детектора, так
и электронных блоков к нему; универсальностью (возможность анализа практически любых
веществ); достаточной чувствительностью для многих хроматографических анализов: высокой
линейностью в области сравнительно больших концентраций, хорошей воспроизводимостью и
стабильностью работы и показаний.
На территории Российской Федерации ДТП используются для установления факта упо-
требления алкоголя при медицинском освидетельствовании живых лиц. проведении судеб-
но-химическою исследования органон трупа для устанокпения причины смерти (алкогольное
опьянение), а также при исследовании некоторых газов; оксида углерода (II). криптона, оксида
азота( 1) и др.
Принцип работы ДТП основан на выявлении различий в тепловодности газа-носителя —
гелия при попадании в него анализируемою вещества. Дтя этого два одинаковых по своим
электрическим характсристит м чувствительных элемента, представляющие собой нить нака-
ливания. через которую пропускается ток. объединяются в одном блоке, включаются в общую
электрическую схему и являются плечами компенсационного моста Уинстона (рис. 6-50).
При пропускании чистого газа-носителя через обе камеры детектора мост оказывается сба-
лансированным, тепловые потери в обеих камерах одинаковы, величины силы тока в обоих
плечах моста также одинаковы и как следствие этого регистрируется нулевая линия. Когда
выходящая из колонки проба попадает в рабочую ячейку детектора, изменяются теплопровод-
ность и теплоемкость газовой среды в ячейке, что приводит к изменению условий отвода тепла
и вызывает изменение температуры чувствительною элемента в рабочей камере. Изменение
температуры в свою очередь вызывает изменение величины сопротивления чувствительного
элемента, следствием чего являются разба-
лансировка моста и возникновение сигнала
ДТП.
Основные характеристики ДТП. опреде-
ленные по отношению к пропану. принятому
в качестве стандартного вещества сравнения:
• коэффициент чувствительности 2-10s;
• минимальная определяемая масса 7-10* г;
• минимальная определяемая концентрация
1.5 об.%;
• линейный диапазон детектирования 10’.
Пламенно-ионизационный детектор (ПИД.
или ДИ 11) является одним из наиболее рас-
Управление током
моста детектора
Управление
К регистратору
Измерительная ячейка
Рис. 6-50. Электрическая схема мостя Уинстона.
Ячейка сравнения
Балансировка моста
Методы определения токсикантов в биосредах 367
Коллектор
+300 V
Поляризующее
напряжение
Воздух —
+ Водород
Колонха
Рис. 6-51. Схема пламенно-ионизационного ле-
Гектора.
пространенных и популярных детекторов не только в ХТА. ио и в тазовой хроматографии.
Он появился в 1958 г. и с тех пор по некоторым своим характеристикам не был превзойден
ПИД- типичный прелставитель классического потокового четекгора
Принцип работы детектора заключается в измерении тока, проходящего через водородное
пламя горелки, размешенной на выходе из колонки. В пламени чистого водорода число ионов
очень мало, сопротивление межэлектродного пространства очень велико (1014 — I01’ Ом), ток
детектора весьма мал (10 й — 10" А). Ток является постоянным фоновым током детектора и
возникает за счет ионизации примесей. содерж<щихся в газе-носителе, водороде и воздухе.
При попадании в пламя органических веществ в нем образуются заряженные частицы, при-
сутствие которых обусловливает увеличение тока, что в итоге производит аналитический сиг-
нал детектора (рис. 6-51).
Для получения оптимальной температуры пламени в ПИД поддерживают правильное со-
отношение между водородом и вохлухом. Недостаток воздуха приводит к неполному сгорз
нию водорода и уменьшению чувствительности, а избыток его увеличивает шум детектора, что
связано с появлением турб; тентности потока. Типичное соотношение раехт та газа лля лого
детектора составляет 1:1:12 ( газ-носитель, водород и воздух, соответственно).
ПИД является одним из наиболее линейных детекторов в газовой хромагографин. По раз-
личным оценкам, его линейный диапазон детектирования составляет IO5—10’ при скорости
изменения концентрации в 0.010 нг/с для углеводородов. Он чувствителен не столько к массе
определяемого органического соединения, сколько к структуре и количественному соотноше-
нию структурных групп, которые совместно и определяют сигнал на выходе. соответствующий
данной массе вещества. Поэтому при количественных определениях следует учитывать значе-
ния величин поправочных коэффициентов для полученния исправленной величины площади
пика.
Поправочные ко Ф4 ипиенты могут быть либо определены экспериментально, либо рассчи-
таны теоретически на основании относительной малярной чувствительности (ОМ1!)
При экспериментальном определении поправочных коэффициентов исходят из того, что
для соединений с более чем 6—7 атомами углерода в молекуле, свя занными с атомами подо
рода, поправочный коэффициент близок к 1 и. следовательно, соотношение анализируемых
компонентов, найденное на основе измерения плошали пиков (в процентах), равно их про-
центному отношению но массе. Тогда, зная соотношение моль стандарта (Mvi) и исследуемого
соединения (MJ и приняв величину К. — 1, рассчитывают поправочный коэффициент для
вещества X (Кж).
368 Глава 6
Л/,
ПИЛ пс ласт показаний для следующего ряда соединений: COS, CS„ H,S, NO, NO,, NH
CO. CO,, H,O. SiClr SiHCl(, SiFr При присутствии в анализируемой пробе этих соединений
чувствительность детектора к другим соединениям не изменяется.
ПИД используется для определения токсикантов и их метаболитов в биологических объек-
тах. объектах окружающей среды, в криминалистическом анализе и других.
Преимущества: чувствительность 10 * об.%; линейный диапазон детектирования I07; высокое
быстродействие; небольшой объем рабочей камеры; диапазон рабочих температур до 400 "С;
сравнительно низкая стоимость детектора.
Недостатки: нечувствительное!ь к ряду соединений; деструктивность (разрушас! пробу);
взрывоопасность (водород); необходимость в электрометрическом усилителе; нелетучие про-
дукты ci орания (SiO,) могут откладываться на электродах, нарушая стабильность работы.
Термоионный детектор (ТИД или ДТИ). Введение паров соли щелочного металла в водород-
ное пламя горелки дает термоионпый эффект в виде си. ьного увеличения чувствительности
детектора к определенной группе органических соединений, например фосфор- и азогсодср
жашим органическим соединениям.
Фосфорсодержащие соединения удается анализировать в экстрактах из овощей и фруктов
на уровне 5 1(У6%. Установлено, что чувствительность ДТП к соединениям, содержащим
6 атомов хлора, в 1000 раз меньше, чем чувствительность к соединениям, содержащим один
атом фосфора. Подбирая расход газов и увеличивая расход водорода, можно повысить чувстви-
тельность ДТП к азотсодержащим соединениям. Так, отношение чувствительности детектора
к соединениям, содержащим Cl. As, N и Р, без учета влияния количества гетсроагомов в мо-
лекуле и органической части молекулы, нс содержащей этих атомов, примерно таково ClAs:
N:P = 1:20:100:1000.
Минимально детектируемое количество при анализе фосфорсодержащих соединений со-
ставляет 5 • 1014 г/с, а при анализе азотсодержащих — 5 • 101-1 r/с. Уровень шума при этом
сосывляег около 1.5 * I0'1 А. Линейный диапазон дегскгирова ши 10’.
ДТИ применяется для детектирования азотсодержащих соединений, причем правильный
подбор экспериментальных параметров позволяет увеличить чувствительность детектора к
этим соединениям на 2—3 порядка по сравнению с чувствительностью ПИД. При определен-
ных условиях ДТИ становится чувствительным и к галогенсодержащим соединениям. причем
чувствительность детектора к ним примерно в 100- 600 раз ниже, чем к соединениям, содер-
жащим фосфор, однако она на порядок выше чувствительности ПИД.
Пламенно-фотометрический детектор (ПФД) Работа этого детектора основана на измерении
хемолюминесценции серо- и фосфорсодержащих веществ, возникающую при их сгорании в
пламени водородной горелки. Измерение проводится при 394 нм для серосодержащих веществ
и при 526 нм для фосфорсодержащих. Интенсивность отклика детектора пропорциональна
количеству атомов серы и фосфора в молекуле. ПФД широко используется для исследования
объектов окружающей среды, биологических объектов, особенно в комбинации с другими де-
текторами.
Детектор злектронного захвата (ДЭЗ, или ЭЗД). ДЭЗ— потоковый детектор. В основе фун-
кционирования ДЭЗ лежит то положение, что молекулы многих веществ способны принимать
свободные электроны и образовывать стабильные отрицательные молекулярные ионы (рис.
6-52).
Радиоактивный источник (2) испускает р-частипы, которые при столкновении с молекула-
ми газа-носителя (как правило, азота) образуют свободные электроны и положительно заря-
женные молекулярные ионы. Под лейезвием приложенного между электродами постоянного
напряжения образовавшиеся в зоне ионизации свободные электроны движутся к аноду с очень
высокой скоростью (порядка 10' см/с), несмотря на встречное движение потока газа-носите-
ля. При этом в системе возникает электрический ток, который усиливается и регистрируется
измерителем малых токов. Если в камеру детектора попадают соединения, способные захва-
зывать электроны, го изменяются концентрация заряженных частиц в камере детектора и ве-
Методы определения токсикантов в биосредах 369
Рис. 6-52. Схема тетекгора электронного эахмта.
1 — каюл; 2 — радиоактивный источник: 3 — молекулы газа-носителя: 4 — положи тельные молекуляр-
ные ионы газа-носителя: 5 — отрицательные молекулярные ионы определяемых соединений: 6 — опреде-
тяемые маюку ты: 7 — свободные электроны: Я — анод; 9 — подача газа-носителя: 10 — зона ионизации
молекул газа-носителя.
личина тока в цепи Если создать такие условия работы детектора, при которых образуются
только отрицательно заряженные молекулярные попы анализируемого соединения, го величн
на уменьшения ионизационного тока будет зависеть только от концентрации анализируемого
соединения в камере детектора. Уменьшение величины ионизационного тока обусловлено тем.
что скорость движения отрицательно заряженных молекулярных ионов в камере детектора го-
раздо меньше скоросги движения свободных электронов и составляет 1 — 10 см/с. Встречный
поток газа-носит едя дополнительно уменьшает скорость, а на катоде в этом случ те собираются
только свободные электроны, концентрация которых зависит от концентрации молоку т аналн-
яруемого соединения в камере детектора.
Углерод тт водород почти не имеют сродства к электронам, поэтому углеводороды нс захва-
тывают свобо тные электроны. Исключение составляют полициклические конденсированные
аром ттичсские углеводороды (аптрапстт). которые сильно захватывают электроны Кислород
и галогены легко захва т ывают электроны. В ряду галогенов степень поглощения электронов
возрастает в ряду: I > Br > Cl > F.
В габ . 6-24 приведены относительные коэффициенты захвата электронов (К ) некоторыми
классами соединений.
Таблица 6-24. Относительные коэффициенты захвата электронов (К ) некоторыми классами соединений
Класс соединения К - Примеры вешеств
ЧлкаиЫз алкеггы. .игсПы. гикины^ алифатические эфиры, арочким- ческис углеводороды, ароматические спирты 0.01 Гексан, бензол, бензтиовын спирт
Палитшкличеекие конденсированные ароматические углетзозороды 0,1 Нафталин
Али< тическис спирты, кетоны, альдетн ты. амины, талотенопро- иизо.шые (монофтор-, моиобром-монохлор-) 1.0 Амиловый спирт ч<етилэтмдкетон
Ароматические кетоны, альдегиды. амины, енолы, галогетзпро- итводные (ликтор-. трихлор-. гексафтор-) ангидриды кислот, алкилевннец 10.0 Ане офепоп
300 Бен шьлептл, тетраэтилсвинец
Полигалотенированные ииклалканы 1000 ГХЦГ (лннлан)
Нитрососдинсния . 1.2-.ШКСТОНЫ п орт эпические соединения ртути 10000 Ъш ттр< бензол
Примечание. ГХЦГ - гекеахлорннклогексан.
370 Глава 6
При практическом испольювшшн ДЭЗ необходимо учитывать следующие сю особеннос-
ти: температура детектора должна быть несколько выше температуры термостата колонок для
устранения конденсации пробы и неподвижной фазы в детекторе: для сильно захватывающих
электроны веществ следует использовать небольшие количества проб. т.к. большое колпчест
во пробы насыщает детектор в течение нескольких часов: многие органические растворители
(кетоны, спирты, хлорсолсржанше соединения) способны захватывать электроны и введение
большого количества таких растворителей приводит к быстрому насыщению детектора.
Линейный диапа он детектирования детектора электронного захвата — 10 — 10s. предел об-
наружения по линдану — 10 14 г/с.
ДЭЗ применяют для опреде. синя токсичных соединений в воздухе: остаточных количеств
пестицидов( гербицидов, инсектицидов) и некоторых других соединении, вредных для человеки
в крови. пищевых продуктах, спиртных напитках: в клинических исследованиях для определе-
ния биогенных аминов, гормонов, канцерогенных веществ и их меттбанттов: летучих галотснсо-
лержатпих. металлоорганических и неорганических соединений в биологических образцах.
Недостатки ДЭЗ: чувствительность к изменению температуры; сравнительно невысокий
верхний температурный предел использования; малая линейная область детектирования; воз-
можность протекания побочных процессов (возникновения прошраиствснпого заряда и кон-
тактных потенциалов); изменение энергии электронов в процессе детектирования, приводя-
щих к искажению результатов анализа.
К настоящему времени разработано большое число модификаций ДЭЗ. из которых следует
отмстить ионизационно-резонансный детектор, который является результатом совершенство-
вания ДЭЗ.
В табл. 6-25 представлена сравнительная характеристика детекторов, используемых в тазо-
вой хроматографии.
Таи.нпы 6-25. Сравнительная характеристика зстекгоров используемых в газовой хром, Тографии
Детекторы Гни Селективность Предел Линейность ютектироваиия
Газохромагографические
Пламенно-иониза- ционный Универсальный Все органические вещества, способные ионизироваться в пламени 10 пт С/с 10
Катарометр Универсальный Все вещества, отличающиеся но теплопроводности от газа-носи- теля 1 нг/мл мобильной фа ты 10*
Электроно- laxmi г- ный Селективный Вещества, содержащие галогены, мсгал.торганические соединения, иаттшенасышеиные углеводороды 0.2 пт С1/с 10*
Азо гно-фосфор! I ы я Селективный Вещества, содержащие азот и фосфор 1 ш N/c ().5пг Р/с кг
1Ътамснно-<]юто- метричсский Селективный Bcuiccina. содержащие фосфор и сера 50 ш S/c 2 пт Р/с К)' I04
Комбинированные
ИК-Фурье- спек- трометрический (FUR Универсальный с возможностя- ми селективного Молекулярные вибрации 1 нт (сильно поглощающее вешесгво .0.
Масс- спектромет- рический (MS) унт всрсальный с возможностя- ми селективного L Характеристические ноны 1 нг полное сканирование 1 нт масе-фрагмен- тографт я 10’
Атомно-эмиссион- ный (AED) Универсальный Любой элемент с вотможноегя- ми селективного 0,2—50 нг/с в зависимости от элемента 10*
Методы определения токсикантов в биосредах 371
Илетнифнкаиня вешеств на основе данных тазовой хроматографии
Идентификация веществ в газовой хромают рафии основывается на возможное!и метола
разделять сложную смесь на индивидуальные компоненты, последовательно выходящие пз
колонки в смеси с газом-носзпелсм. На основе ш i\ тонных данных и в зависимости от постав-
ленной задачи возможно решение следующих вопросов.
Соотнесение хроматографических инков рптлеляемых вешсств с компонентами смеси, со-
став которой ориентировочно известен, например при исследовании мноюкомпонентного
лекарственного прспара та.
• Проведение трупнового знали т.
• Частичная идентификация компонентов смеси.
В зависимости от с ложности поставленной задачи для се решения ттс пользуются как различ-
ные хроматографические приемы, так и приемы с привлечением данных других химических,
физико-химических биологических и прочих методов.
Поскольку для каждой конкретной хроматографической системы время удерживания явля-
ется физико-химической константой вешества такой же. как температура кипения или плавле-
ния вейте < тва. го совпадение в пределах ошибки измерения экспериментально установленных
значений параметров удерживания разделяемых соединений с приведенными в литературе зна-
чениями этих параметров для известных вешеств может являться основанием для проведения
его идентификации. По крайней мере, отсутствие такого совпадения говорит о том. что данно-
го вещества в исследуемой смеси нет. Этот подход особенно хорошо срабатывает при исполь-
зовании данных, полученных с применением нескольких различающихся по своим свойствам,
давным обр; ом по полярности. .хроматографических неподвижных фаз.
Для гомолотзтческих рядов органических соединении достаточно просто рассчитываются
корреляционные зависимости параметров удерживания. На основании этого можно проводить
проверку соответствия экспериментально подученною пика времени удерживания конкрет-
ного члена такого ряда. Современное программное обеспечение для компьютеров на основе
термодинамических данных и структурной формулы вешества позволяет достаточно точно рас-
считать индекс удерживания .ыя бо тытшнствл веществ. Например, протрамма Национального
института стандартов США (\IST-05) имеет указанную функцию и большую базу данных но
индексам улержитжтшя ра зличных вешес тв. в том числе лекарш венных веществ, наркотиков,
пестицидов, других токсикантов и их метаболитов. В эту базу включены данные литературы
о параметрам удерживания на набивных и капиллярных колонках. Так. для амфетамина с
помошью этой иротраммы был рассчитан индекс удерживания равным 1171. а ио данным
39 источников литературы для этого вешества индекс удерживания ранен 1117± 17 с разбросом
W 1090 до 1190.
Простейшим способом установления наличия в смеси какого-либо вешества является ис-
пользование эталонных образцов сравнения. Анализируют стандарты либо отдельно от смеси,
либо добавляя в ею в смесь В обоих случаях наличие хроматографическою пика или увеличе-
ние его высоты и плошали говорит о возможном присутствии в смеси ттою вешества.
Большой выбор селективных газохрома тот рафических детекторов или использование слож-
ных многоколопочиых систем позволяет по соотношению их откликов и набору времен удер-
живания на разных колонках провотить идентификацию веществ. Такой подход наиболее часто
используется в анализе объектов окружающей среды и биологических объектов на присутствие
зестмиилов различною происхождения.
Получение данных удерживания анализируемого вещества до и после обработки ето различ-
ными дериват нзпруюшими реактивами позволяет ио совпадению времен удерживания неизме-
ненного ветцестаа п его производного оценивать присутствие данного вещества в пробе.
Как уже говорилось выше, более детальную информа ню о пробе получают, используя
рнемы. предусматривающие последовательный препаративный сбор фракций, выходящих из
гаэохроматографической колонки, с tlx tick елующнм исследованием с испо тьзованисм подхо-
дящих методов анализа.
Исследование биологических объектов предоставляет еще одну возможность идептнфика-
пни вешеств по присутствию в пробе не только самого вещества, но его метаболитов. Напрн-
ыер. обнаружение в моче наркотическою средства метамфетамин но международным правилам
требует подтверждения наличия в данной пробе и его основного метаболита — амфетамина.
372 Глава 6
Гакам же ситуация наб подастся и с другими наркотиками, например героином и 6-моноаце-
гил морфином. кокаином и бензоилэк опином.
Сравнение наперимента.н>ных и приведенных в литературе параметров удерживания. В этом
случае качественными харамернептками разделяемых вещее из являются определенные в За-
данных условиях параметры удерживания. Для идентификации при сопоставлении с опубли-
кованными данными исполыу ют относительные параметры удерживания — индексы удержи-
вания Ковача.
Относительные параметры удерживания разделяемых компонентов рассчитываются из эк
енернментальных данных как отношение испраатенного удерживаемого объема (или исправ-
ленною примени удерживания) этих компонет гов к исправленному удерживаемому объему
(или времени удерживания) вещества. входящего в состав разделяемой смеси (или специаль-
но введенного) и выбранного в качестве стандарта. Установленные относительные параметры
удерживания сопоставляются с табличными и по результатам соност явления делается вывод о
качественном составе анализируемой пробы
В основе метола идентификации но индексам удерживания Ковача лежит использование
линейной зависимости между логарифмом исправленного удерживаемого объема и числом
атомов углерода в молекуле нормальных углеволородоп.
Ковач предложил присвоить членам гомологического ряда нормальных углеводородов пос-
тоянные индексы удерживания. которые не зависят от условий процесса хроматографическою
разделения, всегда остаются постоянными и рассчитываются как произведение числа атомов
углеро т в молекуле на НЮ. Тогда индекс удерживания Ковача лля метана оказывается равным
100. для этапа — 200. для пропана — 300 и т.д.
Для идентификации вещее ига в строго зафиксированных условиях процесса разделения на
данной неподвижной жидкой фазе сначала определяют, например, логарифм испрнзленных
объемов удерживания, таких членов гомологического ряда нормальных yr тсводоро гов, кото-
рые элюируются из колонки до н посте анализируемого соединения. Затем в этих же условиях
определяют R исследуемого соединения и соответствующий индекс удерживания этою соеди-
нения.
R =1002 4-100
где R — индекс Копача: 7 — число атомов углерода в алкане: tri. tiz. Tz4| — исправленные вре-
мена удерживания вещества и алканов.
Чтобы сопоставление было корректным, измерения выполняю! в условиях, идентичных
гем. при которых получены опубликованные данные, особенно по следующим показателям
типу насадки (марка, фирма-изготовигель, количество неподвижной жидкой фазы и харак-
теристики твердого носиге.тя условия предварительном активации или обработки насадки,
условия кондиционирования колонки): тем пераlypnoMy режиму колонки и системы ввода про-
бы: параметрам (длина. диаметр, материал) и условиям предварительной подготовки колонки;
объему вводимой пробы: расходу, входному и выходному лавлепию газа-носителя; способу
измерения мертвою времени.
Для насадочных колонок с содержанием неполярной нспол1шжной жидкой фазы на твердом
носителе 15—20% межлабораториая воспроизводимость индексов удерживания Ковача состав-
ляет 1—3 ед., па полярных неподвижных фазах — до 5 ел. индекса, для капиллярных колонок
до 1—2 ед. индекса. При поиске параметров удерживания в .niiepaiype окно для разброса па-
раметров принимаемся равным 40—50 ед. ни текса
Ана.ттичеекая реакционная газовая хроматография
Аналитическая реакционная газовая хроматография — самое юж ел ьнос направление га-
зовой хроматографии, которое характеризуется специфическими методами, особой областью
применения, особенностями аппаратуры.
В отличие от других вариантов тазовой хроматот рафии в аналитической реакционной газо-
вой хроматографии в результате химической трансформации анализируемой смеси образуются
новые соединения, что приводит к изменению коэффициентов разделения и чувствительности
детектирования.
Методы определения токсикантов 8 биосредах 373
Дериватишциа. Для целен разделения, концентрирования и последующего анализа раз-
шчпых токсикантов в ХТА часто требуется целенаправленно изменить свойства аналита для
улучшения сю анализ нческих показателей. I зкой подход принято называть дернваз и задней,
т.е. получением производных Дериватазания улучшает хроматографическое разделение, осо-
бенно ннзколстучнх. полярных или водорастворимых веществ: увеличивает чувствительность
анализа: улучшает предел детектирования. Без проведения дериват! зации некоторые вешсспза
вообще нельзя было бы исследовать методом газовой хромато! рафии или при этом получали
бы неудовлетворительные результаты. Часто дсриватизапия провод шея с нелыо получения до-
полнительной информации о содержании токсикантов, например наркотиков в биологических
жидкостях Производные анализов не только эффективнее разделеляются. ио и имеют более
информативные и удобные для работы масс-спектры, например аннльныс производные сти-
муляторов амфетаминового ряда. Химические способы дернватизапии постоянно модернизи-
руются. предоставляя новые возможности для аналитиков. Ниже приведены только основные
способы дериватизаипн.
Этерификация. Апатиты со свободными карбоксильными группами обычно плохо разделяются
методом газовой хромаю1рафип из-за своей полярносш и icMiieparypnoii неш юнлыюыи. Выбор
способа дернватизанин зависит от свойств пинита, присутствия в ею молекуле других немирных
групп и вида детектирующей системы, которая будет использована для определения. Существует
несколько способов для получения менее полярных производных карбоновых кислот.
Этерификация спиртами. Разработано большое число методик получения сложных эфиров
карбоновых кислот со спиртами (от метанола до и зоами.ювого спирта) в присутствии высоко-
летучих кпгрян-заторов, таких, как хлористый водорот нюнилхлорил или ацегилхлорид, кото-
рые легко могуч быть удалены вместе с избытком растворителя. Жирные кис эты. кроме того,
легко метилируются в присутствии фторида бора (BF,) в метано ie. Нормальный бутанол и его
изомеры часто используются для этерификации аминокислот в присутствии хлорида водорода
при повышенной температуре (до 100 ’С).
Пиролитическое метилирование. Четвертичные аммониевые основания, например 1еграме-
тнламмоний или триметилфениламмонпй гидроксид, растворенные в метаноле вместе с про
бой. при введении в нагретый испаритель газового хроматографа образуют с органическими
кислотами соединения, которые сразу же ниролитичееки разрушаются с образованием мет-
ровых эфиров этих кислот. Способ широко используется в биохимии для установления жир-
нокислотиого состава липидов, в микробиологии по липидному (жирнокислотному) составу
бактериальных мембран проводится экспресс-диагностика, в том числе особо опасных мик-
роорганизмов. Этот метод широко использовался еше в середине XX !зека для метилирования
барбитуратов (см. гл. 7). В настоящее время для лериваги'занни данным способом успешно
используют фториды, цианиды или ацетаты четвертичных аммониевых катионов. Например.
3.5 -бнс( фифтормет ил)-бензил-димстил-фсниламмония фторид, лиметилансталь иди лимстил-
формамил применяются для деривагизапии экстрактов плазмы крови людей, принимавших
клонилин или его аналоги Считается, что эти вешества более эффективны, зак как не создают
щелочную среду, что может привести к необратимому гидролизу сложных эфиров.
Этерификация лиа зометаном. Диазометан в обычных условиях представляет собой заз жел-
того инета, хорошо растворимый в неполярных растворителях. Его раствор в эфире в присутс-
твии метанола был одним из первых дериватизируюншх реактивов в газовой хроматографии.
Ооычно реактив готовят непосредственно перед исследованием, так как он крайне нестабилен
и к тому же является сильнейшим канцерогеном. В настоящее время от него повсеместно
оказались в пользу феииллиазомепша или тримеТ1ЫС11ли.и1ичзомс1ап<1. гексановые растворы
которых можно приобрести у ведущих химических компаний
Этерификация галогепалканамп. Аткнл одилы. алкнззбромилы. реже алкплхлорп.ты приме-
няют .для обработки солей карбоновых кислот в срсае ацетонитрила. ацетона иди метанола.
Соответствующие сложные эфиры образуются за несколько минут с хорошим выходом и без
нагревания. Производные некоторых юкенканто» получают, например, по реакции с перфтор-
бензилбромилом. Образогзашнеся дериваты определяют па очень низком уровне с применением
1Э1 пли масс-спектрального детектора Широко используется мсгнлйодпд для метилирования
основного метаболита Tcipai идроканнабинола в моче и ею дальнейшею определения методом
а зоной хро.матографи 11
374 Глава 6
Ciuuiiipoeaiiue К настоящему моменту разработаны и широко применяются на практике
многочисленные силилнруюшие реактивы. с помощью которых можно получить несколько пи-
лон производных — от тримет итсплильпых ло грет-бути.т1имс1и.1сидильиых и др В зависимос-
ти от природы вещества и реагента силилирование идет с разной скорзстью и выходом Так.
возможен перевод анализируемого вещества в его полный эфир непосредственно в испарителе
хроматографа, в других случаях необходима длительная обработка силитируюшим реагентом
с последующим удалением избытка реактива и растворителя. Для определения пестицидов
в объектах окружающей среды и н биообъектах ино та используют силильные реактивы, у
которых один или лва атома водорода в хгетильных группах заменены бромом. Получаемые
с помошью такою вида реактивов производные исследуются е применением ДЭЗ или ПФД
Такое сочетание позволяег достичь высоком чувствительное!и и селективности определения
iHiL'iii зирусмых вешсств. В табл. 6-26 представлены данные об основных силилпруюшнх реак-
тивах и краткая их харак ерпегикл.
Таблица 6-26. Силилируюшие реактивы, их химическое строение и кра г кап характеристика по Encyclopedia
of X paraiion Science
Химическое название н при пятое сокращение Структура Примечание
Тримстилхпорсгиан (T.MCS) «А \ ^сн3 Si Первый егыгыггрутонигй реактив, получил распространение с 1944 г. В аналитической практике исполь- зовал я сн чада один, а затем в смеси с HMDS и пиридином
Гексаметнлднсгыазан (HMDS) сн» НзС^ / Si НзС^ NH /СН’ SI Н3С СН4 Начало использования е 1957 г. Очень хорошо растворяет многие вепшегва. Слабый, но селективный донор силильных групп
\ .О-оистри мегилсил ил - аистам ид (BSA) сн3 1 Н3С - Si СН3 1 О н,с \ _^Снз <4. Si N '''' \н3 Ьолсс активный донор силильных групп. Появился в 1963 г. Обычно используется в смеси с I MCS в количестве от 1 до 20‘1
Трнметплсилил имидазол (TMS1M) сна НА / н3с Используется с 1965 г. Считается, что эго самый лучший реактив для силнлироваиня гидроксильных групп
Методы определения токсикантов в биосредах 375
Продолжение тайл 6-26
\ О-бистрнмешлсилил- |рифторме1млане1ам1ы IBSTFA) т F F — F Г ° х" Xя 1 5 о 1 / хи х" я о О 1 \ / \ от 2 / °\ // Начал использоваться в I96X г. Широко применяемый реактив, способный реэшронагь нракгнчес- ки со всеми рассматриваемыми в данном pi стел с ф\нкниона.ты1ыми руинами. В процессе реакции об- разуются легучпе. легко удаляемые продукты
\ XCT1LT N -трИМСП1ЛС11- ти.1-три||лораиетамил (V1STTA) F F / F s' н,с \ /Снз Si ХСН3 сн3 Появился в 1969 г. С тех нор стал одним из самых широко примени емых реакинюв Аналог BSTFA. но образующиеся н процессе реакции продукты более летучи
\ MCTH.I-N-l-6yiHJ-KH-
метилсил1С1-трн<|тторацс-
T.1MIU
MTBSTEA)
Появился в 1975—19X11 гг Альтер-
нативный рсамин. обладающий
большей устойчивостью к гидро-
лизу
\ _,СН3
Н3С СНЭ
11е1пзфгорфснишнмет(и1-
амниоси лаповые произ-
водные
<rLOPHEV1LSYL>
Первые сообщения в 1975 г. Ре-
активы .01 и обнаружения следов
стероидов с применением ДЭЗ
376 Глава 6
Окончание табл. 6-26
^-метокс11-К.О-бнстрнмсТ111С1
ст карбама! (BSMOC)
Ратработш в 19X6 г. ,Ъ1я одновре-
менного силилироваппя т идро-
кеидьиых групп и деринатизации
оксогру пи
.Ацилирование. Этот способ дернватизации широко используется в ХТА для определения
веществ, имеющих свободную гидроксильную (фенольную или спиртовую) группы. а также
ароматическую или алифатическую аминогруппу. Определение наркотиков (амфетамины. опи-
аты). стероидов многих других веществ осуществляется с применением ангидридов или пср-
фторангидридов уксусной, пропионовой нли масляных кислот. Производные фюрированпых
кислот имеют большое сродство к электронам и поэтому определяются ДЭЗ с высокой чувс-
тва! ел ьностыо. Преимуществами рассматриваемых реактивов являются простота выполнения
реакции, значительное улучшение хроманнрафпческих свойств аналогов и дешевизна реакти-
вов. Однако обработка этими реактивами веществ, в химической структуре которых имеется
несколько реакционноспособных заместителей, может привести к частичной дегидратации и
(или) циклизации нескольких молекул а кечи га, что скажется на резулг атах количественного
определения. Иногда ангидриды кислот заменяют хлорангидридами или другими веществами,
способными выделять ацильный фршмеш
Присутствие в анализируемой пробе веществ, способных к переэтерификации других ком-
понентов смеси. приводит к неправильной интерпретации полученных результатов. Например,
ацетилсалициловая кислота, которая легко, особенно при нацхшанин. ацетилирует гидроксиль-
ные и миногруппы Так. в незаконном обороте наркотиков часто встречаются смеси героина
и аист илсалиниловай кислоты, пробы которых при газо.хроматографическом и хромато-масс-
снектра. ытом исследованиях дают отрицательный результат на содержание морфина, кодеина
и монозамещенпых морфина. В то же время ври исследовании этих же образцов методами
ТСХ и ВЭЖХ метаболиты указанных наркотиков однозначно определялись. Поэтому экспер-
ты. нс имеющие достаточного опыта, часто допускают грубейшую ошибку при интерпретации
результатов исследования смеси ацетичсалиииловой кислоты с наркотиками, особенно часто
при определении имфетямина или его аналогов, де i >я не соответствующее действительности
заключение об отсутствии в пробе контролируемых веществ.
Ацетилсалициловая кислота легко взаимодействует со спиртами, при этом получаются
не ацетильные производные, а салицилаты анализов. Эта реакция легла в основу мсгодики
разделения метилового и этилового спиртов. При добавлении в их смесь раствора ацетил-
салициловой кислоты в разогретом инжекторе образуются метил- и этилсалпнилаты. кото
рые на капиллярных колонках в условиях, подобранных для анализа наркотиков, надежно
разделяются. Этот подход часто используется в тех лабораториях, которые нс занимаются
анализом низкомолекулярных веществ, и поэтому iicpciiaeiройка приборов на их исследо-
вание неоправданна экономически, требует отвлечения от основной работы специалистов и
оборудования.
10- 15 ле1 назад в практику газохромато!рафического исследования вошди лериваги тирую-
щие реактивы на основе метил- или этилхлорформната (MCF или ECF соответственно), ко-
торые быстро и одновременно териватизнруют как амино- и гитрокси-. гак и карбоксильные
।руппы аналита.
Кроме рассмотренных выше, известно большое число способов химической модификации
анализов, которые используются иХГА при газохромаroi рафичсском исследовании. Например,
при определении веществ из группы бензодиазепинов широко применяется кислотный гидро-
лиз. в результате которого образуются обладающие хорошими хроматографическими свойства-
Методы определения токсикантов в биосредах 377
ми бензофеноны: при исследовании в биологических обтсктах оксимаслянттон кислоты часто
прибегают к переводу ее в у-бутпродактов, который татем количественно определяют.
Деривата заштя позво. яет применять газовую хроматографию для определения в биологи-
ческих объектах ряда металлов в виде их дитизона гов. При этом эксперте имеют информацию,
которую трудно или дорого получить другими методами (см. гл. 8.5).
Заключение к разделу дериватизании. После широкою введения в практику аналитической
химии в 60-х голах XX века силилирующих реактивов для газовой хроматографии, они повсе-
местно стали рассматрт ваться как основные реактивы лля модификации полифункпиональ-
ных вешеств, Всех привлекало то. что модифицирование осуществляется в одни — два этапа.
В 9()-х толах XX века хяорформиаты (сложные эфиры хлормуравьиной кислоты) стали впервые
использовать как дериватизируюише реактивы Этот новый класс мопптых дериватизируюшик
реактивов имеет ряд преимуществ: проведение реакции в водной среде, совмещение несколь-
ких стадий пробополготовки в одну, что значительно снижает время проведения исследований.
В современном приборостроении отчетливо наСмюлается тенденция к полной автоматизации
всех этанов исследования. так что следует ожидать появления новых реактивов и оборудования
лля дериватизании.
Количественный газохроматографнческнн анализ
Хроматограмма представляет собой графическое изобр жение зависимости концентрации
компонентов смеси в газе-носителе на выходе из колонки от времени. Хроматографический
пик. соответствующий индивидуальному компоненту пробы, отражает изменение во времени
концен।ранни этого компонента в газе-носитстс на выходе из колонки и может быть оха-
рактеризован рядом параметров: высотой пика (h); произведением высоты пика h на время
у герживапня Г или пропорциональное ему расстояние на хроматограмме от момента ввода
пробы до регистрации максимума пика; плошадыо пика (А) или величинами, приближенно
x.ip ктеризуютцими ее значение.
Установлено, что для хроматограммы, полученной в идеальных условиях, применение лю-
бого из указанных параметров для ко тичсствспных определении должно давать одинаковые ре-
зультаты. Поскольку реальные хроматограммы получаются в условиях, далеких от идеальных,
го в зависимости от конкретных условий анализа и применяемого оборудования ценность того
или иного параметра пика может оказаться различной.
Критерии выбора параметра пика, на основании которого проводится количественное оп-
ределение.
• Простота и точность измерения параметра. Так. полная площадь пика в большинстве слу-
чаев является приемлемым параметром. Однако измерение площади на реальных хроматог-
раммах обычно сопряжено с большими затратами труда и времени либо требует применения
специального оборудования, стоимость которого соизмерима со стоимостью хром птярафа
Поэтому такой параметр стараются заменить другим.
• Линейность связи значения параметра с количеством соответствующего ему вещества (ли-
нейность параметра). Связь значения параметра с количеством компонента в пробе должна
быть максимально близка к линейной, по крайней мерс, в пределах изменения концентра-
ции определяемого вещества в смесях, лля которых методика предназначена.
• Устойчивость параметра к изменению условий определения. Численное значение параметра
ника определяется не только количеством вещества, которому этот ник соответствует, ио
и условиями определения, в которых он получен. Чем меньше влияют условия па пара
метры пика, тем надежнее результаты. При этом особенно важны те условия определения,
которые влияют одновременно и па работу хромазогр. фической колонки, и на работу
де тек гора.
Высота хроматографического пика (h). На возможность использования высоты хроматогра-
фического ника для проведения количественного определения вещества влияют следующие
факторы:
• флюктуации температуры колонки изменяют распределение концентрации вещества в газе-
носителе, в результате чего может изменяться как абсолютное, так и относительное значе-
ние высоты пика при работе с любым детектором:
• флюктуации скорости потока газа носителя, очевидно. не скажутся на абсолютт ых и от-
носительных знамени х высоты пика при работе с концентрационным детектором; при ис-
378 Глава 6
по зьзозшиизз потокового детектора будут меняться как абсолютные, гак и озноситсльпыс
значения этого параметра:
• высота пика весьма чувствительна к перегрузке колонки: линейная связь между количеспюм
введенной пробы и высотой никл нарушается, если вводимое количество пробы существен-
но больше допустимого для конкретной хроматозрафическозз системы, при ззеззользовании
для колнчесгвснпого определения абсолютного значения высейы ника необходимо строго
стабилизировать условия авали за
Высота пика является наиболее легкоизмеряемым параметром, особенно при испо 1ьзова-
ззин приборов без устройств ьзя обработки данных. Случайные ошибки, связанные с измере-
нием на хроматограмме, как правило, минимальны. Высоту пика рекомендуется применять в
следующих случаях.
• при работе с хроматографом, обеспечивающим хорошую стабильность условий определения
и высокую точность заданных температуры и скорости потока газа-носителя:
• нрн онределсзипз сходных но составу проб и рабозе на непрерывно включенных приборах,
например автомат ззчеекззх хроматографах, установленных в потоке или производственных
лабораториях при круглосуточном режиме; в атом случае линейность параметра достаточно
велика, поскольку пределы изменения содержания компонентов незначительны
• при выполнении экспрессных определений, коз да имеется возможность повторить измере-
ния. вызывающие сомнения;
• если есть возможность точно дозировать пробу.
• если легко выполнить и проверить калибровку прибора:
• при расчете хроматозрамм, содержащих плохо разделенные пики;
• для приближенной опенки результатов.
Высоту пика ззе рекомендуется применять в следующих случаях
• если калибровка прибора затруднена:
• при нсполз>зованни потокового детектора, если скорость потока газа-ноеззтеля задается и
пз ддержнвастся недостаточно точно.
Произведение высоты ника на время удерживания ши расстояние. ему нропорционшьное (/11).
Флюктуации температуры и скорости потока газа-носителя воздействуют на этот параметр
аналогично воздействию на высозу ника.
При использовании произведения hl. как и при любых количественных измерениях, требу
ется калибровка детектора по индивидуал >ным соелиззеззиям. Следует отметить, что по различ-
ным причинам эти калибровочные коэффициенты отличаются от коэффициентов, полученных
при использовании плошалей пиков.
Измерения, необходимые для вычисления произведения высоты ника на время удержива-
ния. легковыполпимы и хорошо воспроизводятся.
Проводить количественное определение на основе этого параметра рекомендуется в следу-
ющих случаях;
• для расчсза хроматограмм, в козорых высота ника нс искажена соседними никами, в том
числе хроматограмм с нс полностью разделенными пиками;
• при использовании детекторе по теплопроводности зьти другого коззцезгграциоззззозо детектора;
ыя расчсза никои с малой нысозой (более точного, чем но высоте пика);
• тя расчета узких пиков, например в капиллярной хроматографии:
• для повзоряюззпзхся анализов. выззолззя чых ззерезулярно.
Данный параметр не рекомендуется использовать в следующих случаях:
если есть оеззоваззия предполагать нелинейность изменения высоты пика вследствие пере-
грузки колонки или детектора в сочетании с потоковыми дезекзорами;
• прзз апатите с программированззем температуры;
• ззрзз оиредел ‘нзззз вешеств с очень малым зьти очень большим временем удержиззаззия;
• при анализе смесей, лаюших зза хромагозрамме ники, сильно различающиеся по высоте.
Расчеты без применения калибровочных коэффициентов при использовании этого нчрамез-
ра могут занизь очень гк зыззие ошибки Применение к з зибровочззых ко ффициезгзов, взятых
из литературы для количественных расчетов. также приводит к ошибкам.
П.ющадъ хроматографического пика. Влияние изменения условий хрохзатозрафичсского раз-
деления на плошал з> пика своди гея к следующему:
Методы определений токсикантов в биосредах 379
• флюктуации температуры нс искажают площадь инка при работе с детекторами обоих ти-
пов;
• флюкт ашн! скорости потока газа-носителя при использовании концентрационных детек-
торов могул искажать как абсолютные. зак и относительные значении luomaait пика,
• перегрузка колонки, если она не ухудшает разделения до недопустимых пределов. практи-
чески не влияет на площадь ника.
Площадь пика для детекторов, используемых в количественной хромают рафии, является
универсальным параметром. применимым во всех случаях, когда отсутствуют необратимые
процессы в колонке тт когда детектор работает в области нормальных рабочих условии Приме-
нение потоковых детекторов при иснользованнп площади пика предпочтительнее.
Изменение высоты ника составляет 0.3—0.9% при нзменопнн температуры колонки на I С.
Точность 2% при использовании метола абсолютной калибровки по высоте ников может быть
остигнута только при стабилизации температуры с точностью до 0.1 ‘С и скорости газа-носи-
le.TH до I мт/мпн. Трудно получить результаты с относительной потрешностыо менее 2.S—3.2%
при концентрации компонента в пробе 1—2%. если в качестве параметра пика используется
его высота.
Методы количеезвенного анализа. В основу количественных методов газово i хроматографии
положены два допущения: введенная в хроматограф проба имеег юг же состав, что и анализи-
руемый раствор: количество з-го компонента в пробе пропорционально высоте или плошали
этою компонента тта хроматограмме.
Из этих двух допущении следует уравнение, связывающее концентрацию вещества i в ана-
шзнрусмом растворе С,с параметром его пика на хроматограмме Х; и размер пробы q :
Ч„ '
Величина к, называется абсолютным калибровочным коэффициентом. Физически эта вели-
чина означает количество компонента i. соответствующее единице параметра пика Х_. Обычно
к — вс тичниа непостоянная, зависящая от условий хромают рафироваиия и детектирования,
а также абсолютного количества вещества i. поступающею в детектор. Если детектор работает
линейно, к нс зависит от qfi и при соблюдении постоянных условий хроматографирования и
летскгиротитния может считаться постоянной величиной для данного вещества
Абсолютный калибровочные) коэффициент обратно пропорционален чувствительности де-
тектора. но. в отличие от нес. учитывает также конкретные особенности методики. Он имеет
размерность, которая определяется используемыми единицами измерения параметра вика н
количества вещества.
Задачей количественного анализа является определение концентрации анализируемого ве-
шества в пробе Непосредственно хроматографирование анхчизттруемого раствора позволяет
определить лишь зь ячейке параметра пика X. Величину к, определяют путем хроматографиро-
вания растворов смеси с извеезззмм количеством вещества i.
Методы количественного анализа различаются приемами, используемыми для нахождения
количества вещества. Наибольшее применение иа практике нашли метод абсолютной калиб-
ровки. метол стандартной добавки, метод внутреннего стандарта и метот нормировки.
Метод абсолютной ка.тбровки. При работе по метолу абсолютной калибровки н хроматог-
рафическую колонку вводят известные количества вещества и рассчтывакн площадь получае-
мых хроматографических пиков. По полученным данным строят график зависимости площади
пика от количества вешества.
Недостатками метода являются трудоемкость. обязательное наличие чистых исследуемых
соединений; отсутствие учета в шяния д зутнх компонентов, присутствующих в проие, на пара-
метры ника исследуемою соединения.
Метод стандартной добавки, позволяющий учесть влияние матрицы, заключается в том. что
к анализируемой смеси добавляют различные известные количества того компонента (в чис-
том виде), содержание которого следует определить. По полученным данным строится график
зависимости плошали пика от количества добавки. Содержание ю мпонента в исходной анали-
зируемой смеси соответствует площади, определяемой экстраполяцией на нулевую добавку
380 Глава 6
Второй вариант этого мсгола — расчетный. Для получения рсзу штата измерения этим ме-
тодом необходимо записать хроматограх мы двух проб: исходной и исходной с добавлением
известного количества определяемого компонента.
Обязательным условием лля использования метола побавки является линейное изменение
показаний детектора при изменении концентрации компонента в пробе за счет внесения до-
бавки.
Метод внутреннего стандарта основан на том. что к анализируемой смеси добавляют опре-
деленное количество вещества, которое не входиi в состав анализируемой смеси Определяется
отношение площадей пиков компонента и введенного стандарта и, используя предварительно
полученную зависимость отношения площадей пиков от отношения весовых количеств этих
компонента в модельной смеси, определяется содержание анализируемого компонента.
Поправочный коэ<|и|>иниснт, который определяется отношением площадей измеряемого
вещества и стандарта, должен оставаться неизменным лаже при изменении условий хроматог-
рафирования и детектирования, если, конечно, эти изменения нс вызвали нарушения линей-
ности работы детектора и в качестве параметра пика было использовано истинное значение
площади.
Метод нормировки. В этом метле сумма площадей всех хромагозрафичсских инков анали-
зируемой смеси приравнивается к 100% и по величинам плоныитей отдельных компонентой оп-
ределяют их процентное содержание в анализируемой смеси. Таким образом, этот метод поз-
воляет установить лишь огноси тельное содержание компонентов в разделяемой смеси. Кроме
того, все компоненты смеси должны давать хроматографические инки. Наличие нсхромато-
графирусмых веществ приводит к серьезным ошибкам количественного определения.
Современное состояние и перспективы развития газовой хроматографии в ХТА
Метод газовой хроматографии постоянно развивается, появляются все новые направления
его применения, растут селективность и чувствительность определения, появляются новые
материалы, колонки и реактивы. В этом разделе рассматриваются только некоторые из пере-
пек ивных направлений.
Быстрая капиллярная хроматография высокого разрешения. С появлением капиллярной хро-
матографии создалась ситуация. ко1да эффективность колонки в большинстве случаев настоль-
ко превосходи! необходимый для решения конкретной аналитической задачи предел, что это
приводит к неоправданному увеличению времени проведения исследований. Сократить его без
потери эффективности проще всего двумя путями уменьшением длины колонки и увеличени-
ем линейной скорости газа-носителя.
Ускорить анализ позволяют разработки последнего времени — пол и капиллярные или мно-
гоканальные колонки, а га к же флеш-хромагография. при помощи которой на стандартых
колонках удается осуществлять разделение веществ в 6—10 раз быстрее Для эгого применяется
сззерхбыстрая скорость нагрева колонки до 1200 °C в I мни.
Еще одним способом уменьшения времени анализа является использование сверхтонких
колонок. Разрешающая способность колонки длиной 10 м и внутренним диаметром 0.1 мм
равна разрешающей способности колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Оп-
тимальные условия ршеления на короткой колонке но нолики проводить исследования слож-
ных смесей в несколько раз быстрее. Такне колонки имеют преимущества в чувствительности
при работе с потоковыми детекторами. Для достижения всех возможностей, предоставляемых
ими. требуется современное оборудование с повышенной частотой сбора данных, эффектив-
ной печью, обеспечивающей скорость нагрева колонки до 100 “С в I мин. стабильным и вос-
ироизво гимым электронным расходомером газов, а также современным устройством для ввода
образцов, позволяющих дозировать образны при делениях потока 1/500 или 1/1000. Такими
характеристиками обладают современные хроматографы ведущих отечественных и зарубежных
приборостроительных фирм.
Системы фиксированного времени сдерживания. Разработка таких систем стала возможна
только после введения в практику капиллярной хроматографии оборудования с электронным
пневматическим управлением расходом газа-носителя, улучшенным контролем нал температу-
рой колонки и колонок со стабильными свойствами, воспроизводимыми от партии к партии.
Основываясь на этих достижениях, в настоящее время активно создаются системы, в которых
удается так устанавливать и поддерживать рабочие характеристики оборудования, что ошибкой
Методы определения токсикантов в биосредах 381
измерения времени удерживания как на каждом конкретном приборе, так и на разных, можно
пренебречь. Друвимвв словами, с закимвз сисземамвз .можно исподьзовать абсолютное время
удерживания мя вздсизификапивз вешеств вместо относительного времени сдерживания. При
этом и абсолютное. и относительно время будет одинаково на всех приборах с такими систе
мамп. как бы далеко они друз oi друза шз paciio.iai a.Hic3>.
В основе рассматриваемых систехз леж зт определение и нивелирование ипливтуальных
зрлзоктуаний своззств конкретной хроматозрафическозз сззстсмы. позлено вузоших на время
удерживания. Каждая фззрхза-ироизводззгель современного хроматозразрического оборудова-
ния. используя сво1з подходы, предоставляет хроматографисту определенные возможности.
Наприхзер. фирма «.\.лж1злсззт Тек.* (США) предлазаез сисиззазызую ирозрамму зля нолключе-
низз уже разработанной конкретной мезолззкзз определения к системе фиксированного времени
сдерживания (Retention Time Locking — RTL). Для этого в хроматовраф взюдзздея смесь иссле-
дуемых вешестзз и провозится ее анализ зз идезнззиззых условиях, за исключением яаззленззэз на
входе в колонку, которое уегайавяззваетезз равным уже выбранному оптимальному давлению,
а также озгничаюнзимся ог него зза 10 и 20<? зз ту ззлзз иную стороны. Гакззсз образом, после
5 определений усзаиаззливается взлезли не даззления на время выхода одного ззз пиков смеси,
чвзззе ззеего в ХТА используют для этого внутренний стандарт (ззолробнее см. гл. 8.1. и 8.2).
Более обшин зз простой в исполнении способ предлазает фирма «Термо Э зектроее Корп.»
IC11LA). Прзз установке колопкзз проводззтезз тестирование ее параметров ззо разработанной
фирмой программе, которазз жестко вписана в ззамягз, хроматографа. В результате в базу дан-
ных хроматозрафа занося вся все необходимые сведения о колонке и ее свойствах.
Использование системы фиксированного времензз удерживания в том взлез ином везде чрез-
вычайно упрощает рабог\ анхз згика. ОТкалззброзшззззое оборудование способно выяззлязь па
ранних стадиях псобразимые загрязнения колонкзз зз потерю ее работоспособности. В большей
степени этот метод важен прзз ззепользоваззизз комбинированных методов капиллярной хро-
магографизз со еззектралызыхззз методами, ззаирззмер ГХ-МС. ГХ-ИК-Фурьс-сззектромсзризз зз
(вели) ГХ-УФ-снекзрометрии многокозоночных приборов.
6.3.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография
Великие нозможпоспз прззхо.дят ко всем.
но многие даже не знают, что встретилззеь с нззмзз.
У. Ччннинг
Жидкое з ззая хромаз оз рафия нр тсзаззлясз собой хромазографическиГз Мезил, в котором под-
вижной фазой является жидкость. В ХТА ззепользуются следующие виды жидкостное! хро-
матографии: непарная (тонкослойная), бумажная зз колоночная. Последняя дополнительно
подраэде зясзсзз ззо своззм коззетрукгззвны.м особенностям на отрыгыс системы зз замкнутые
системы.
Под отрыты,мзз системами чаще всею полразумеваюзея стеклянные трубки зз.пз колонкзз.
заводненные сорбентом с диаметром частззц более 30 мкм. через который самотеком ззлзз под
действием пониженного дазиезнзя после колонкзз пропускается жидкая фаза.
Закрытая система. Значительного увеличения эффекгивностзз добзззэаются уменьшением
лззаметра зерен нсподвззжнозз ф< за до 10 мкм зз менее. При этом возрастает сопротивление
колонкзз. что зребует подключения к оборудованию спезнзальных насосов для формирова-
ния ззогока подвижной фазы. Описанная закрытая система дала название метолу: жидкост-
ная хроматов рафия высокозо давления ззлзз высоко эффективная жидкостная хрома гозра<|>ззя
(ВЭЖХ).
В отлззчззе от газовой хроматографзззз в ВЭЖХ селективность метода определяется взаи-
модействием вешеечва не только с ззеззолвззжнозз фазой, ззо зз в значззтельззой стспсзззз с под-
вижной фазой. Кроме того, нрзз сравненнзз этих методов необходимо учитывать, что газовая
хроматов рафия используется .зля ра зделения зз онредслензвя ззешссгв. которые можно без зна-
чительных зз воспроизводимых потерь нсревестве в парообразное состояние при температуре
ло 400 ‘С. Аналитические возхзожносгн ВЭЖХ овраничиваются растворимостью вешеезва зз
382 Глава 6
подвижной фазе В связи с этим но опенке некоторых ученых, только около 20% всех пред-
ставляющих инicpec проб можно анализировать метолом газовой хрома гог рафии Однако в
большинстве случаев эффективность капиллярной хроматографии много выше зффекгнвносги
ВЭЖХ. Таким образом, газовая хроматография и ВЭЖХ пополняют трут друга и расширяют
возможное иг ХТА
Краткая история развития метода. Начало методу жидкостной хроматографии. как и само-
му метолу, положил М.С. Hirer в начале XX века, опубликовав работы по разделения пигмен-
тов растительного происхождения. Спустя более 20 лег важность открытого им подхода была
оценена после успешного проведения препаративною выделения а- и Р-каротинов нз мор-
кови. осуществленного Кучном (Kuhn), ставшим в 1938 г. лауреатом Нобелевской премии, и
Ледсрером (Lederer) в 1931 г В 1941 г Мартин (Marlin) и Сидж (S nge) (лауреаты Н обе те вс кой
премии 1952 г.) описали технику распределтгтсльноп жиакость-жплкостной хроматографии.
В 1949 г. Сшщлинг (Speddmg) и Томпкинс (Tompkins) опубликовали первую статью но ионо-
обменной хроматографии (ИОХ). В 1959 г Порат (Porath) и Флолин (Flodin) положили нача-
ло гслытроникаютцей хрома гот рафии. Первые статыт по ВЭЖХ были опубликованы в 1966 г.
Принципиальные разработки в области создания новых неподвижных фаз. детекторов, насо-
сов, дозаторов и прочего' оборудования приходится на 70—80-е годы XX века С этого .момента
бурно растет спрос на результаты, получаемые с применением ВЭЖХ. приведший к тому, что
она в иасгояшее время стала самым широко распространенным методом выделения, очистки,
эффективного разделения и определения вешеств.
По результатам исследований с пснользогишием ВЭЖХ. за последние 35 лет издано более
800 книг; с 80-х годов XX века ежегодно проводи гея более 20 крупных международных сим-
позиумов; с 2005 г. ежемесячно издается 12 специализированных международных журналов.
Нескольким группам ученых в разное время за разработки в этой области была присуждена
Нобелевская премия. В котте XX века парк жидкостных хроматографов только в СШ А пре-
вышал 100 000 единиц. Оборот приборостроительных фирм во всем мире ежегодно составляет
несколько миллиардов долларов США.
Эффективность разве чтя в жидкостной хроматографии, так же как в газовой, оценивается
уравнением Ван-Деемтера. Однако коэффициент С этого уравнения, который значительно
увеличивается при возрастании скорости потока газа-постптеля в газовой хроматографии. в
ВЭЖХ имеет важное значение из-за того, что коэффициенты диффузии вешеств в жидко!
фазе значительно ниже, чем в газовой. Отсюда чем меньше коэффициент массопереноса (С),
тем лучшими разделительными свойствами обладает козонка для ВЭЖХ. Низкие коэффици-
енты диффузии, кроме того, снижают но сравнению с газовой хроматографией значих ость для
эффективности разделения коэффициента В того же уравнения, который уменьшается с увели-
чением линейной скорости потока подвижной фазы. Коэффициент Л уравнения Ван-Деемтера
зависит не от скорости подвижной фазы, а от размеров частитт неподвижной фазы, который
в жидкостной хроматографии и особенно в ВЭЖХ имеет важное значение. Чем меньше эти
размеры тем меньше ВЭТТ или больше число ТТ используемой колонки. Как раз затруднения
в изготовлении малых частиц неподвижных фаз. обмгалаюгшгх воспроизводимыми свойствами
сдерживало развитие ВЭЖХ до середины 70-х годов XX века. Наименьшим из доступных в
настоящее время зернением для сорбентов в ВЭЖХ являются носители с диаметром зерен
1.5 мкм. а общепринятыми считаются сорбенты с зернами диаметром 3. 5. 7 и 10 мкм. Колонки
с зернами менее 3 мкм об таллгот высоким сопротивлением потоку подвижной фазы и рядом
других недостатков, однако все больше становятся популярными короткие колонки длиной
до 2 см с зернами неподвижной фазы диаметром 1.5 мкм. Они обладают высокой эффек-
тивностью. милым временем анализа и очень малым расходом рас твори гелей, составляющих
подвижную фа у. На рис. 6-53 показано влияние величины зерен неподвижной фазы на эф-
фективность колонки для ВЭЖХ.
Внутренний диаметр колонки, связанный с не.шчиной зерен сорбента, лежит в основе часто
употребляемой в научной и методической литературе классификации типов колонок, которая
приведена в табл. 6-27.
Оборудование для ВЭЖХ, сто конструкция и материалы, из которых выполнены отдельные
части оборудования, оказывают значительное влияние на получаемые результаты. На рис. 6-54
приведена схема современного жидкостного хроматографа.
Методы определения токсикантов в биосредах 383
мм/с------►
Скорость потока
Рис. 6-53. Влияние величины крен неиол
кианой фа и.। ин я|м]х.К1ивность разделения.
Таблица 6-27. Типы колонок хля ВЭЖХ
Типы колонок для ВЭЖХ Внутренний 1наметр КО ЮНКИ, мм Типичная ск >роиь Примечание подвижной фазы, мл/мии
Препаративные До ИЮ Болес 5 Зернение носителя 10- 50 мкм; длина может доходить до 600 мм
Обычные 3.9- 5.0 1.5-5.0 Диаметр 4.6 мм наиболее оптима- лен с точки 1рения скорости и эф фективности разделения. емкости колонки
У ясне 2.1-3.9 0.5-1.5
Мпкроколонки (micro LC) 1.0-2,1 0.1-0.5 Низкий расход растворителей, вы- сокая чувствительность, особенно ври .тимптироваипо.м количестве образца
Капиллярные 0.05-1,0 0.2- ЮО f Обычно изтоговляюгся из нержавеющей спин с внутренним покрытием из стекла или плавле- ною силикагеля
Вес части хроматографа для ВЭЖХ соединяются трубками, чаше всего изготовленными
из политетрафторэтилена (РТЕЕ) и внутренним диаметром 2—4 мм. за исключением трубок,
соединяющих устройство для ввода образцов, колонку и детектор. Они соединяются толстен-
ными капиллярами из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,25 мм или капиллярами
из полиэфирного кетона (РЕЕК). Основными требованиями ко всем соединительным устройс-
твам хроматографа являются их инертность и минимизация внутреннего объема по избежание
потерн эффективное!и.
ребования к емкостям для растворителей, составляющим мобильную фазу, достаточно про-
сты. Для разных но своим свойствам растворителей нужны отдельные емкости, чаше всего из
томного стекла Они не должны содержать посторонние включения, в том чш ie гшы. способные
при стоянии собираться в пузырьки. В современных приборах имеются специальные системы
дегазации (дегазатор) мобильной фаты или се компонентов. Стандартные хроматографы предус-
матривают возможность одновременною нетто ьзовапия до 4 разных компонентов мобильной
фазы Насос представляет собой одну из основных частей хро.матотрафа для ВЭЖХ. С ею помо-
щью формируется и поддерживается скорость движения подвижной фазы через колонку.
Хорошим насосом для ВЭЖХ считается такой, который может обеспечивать поток жидкости
от 0.5 до 10 мл/мин при максимальном давлении 400—500 атм с точностью установки расхода
384 Глава 6
Дегазатор
Элюенты
А, В. С. D
Насос
Реагент X
•И Предколоночный
реактор
Q Датчик давления
Кран
Смеситель
нжектор
Элюент *Е
Коллектор
фракций
или пиков
Де ектор
Слив
Сберегатель
элюента "Е"
Форколонка Автодозатор
Термостат
Колонка
Реагент Y
Постколоночный
реактор
1’нс. б 54. Схема жидкостною хроматотрафа (Г.М Барам. 2005).
превышающей 0.5%. п флюктуациями потока менее 0.1%. Современные насосы должны иметь
системы предупреждения слишком низкого или слишком высокою давления. их несправнск.-
ти. а также колонки или системы контроля сжимаемости подвижной фала. Насосы должны
легко разбираться и собираться, быть химически инертны. во время работы не должны на ре-
ва гься их части, соприкасающиеся с подвижной фазой, во избежание образования пузырьков
газа или пара, а также но возможности бесшумны.
Вес насосы для ВЭЖХ подразделяются на два типа: насосы постоянного давления и насосы
постоянной скорости, большинство современных приборов оснашено насосами, обеспечиваю-
щими постоянную скорость движения подвижной фазы независимо от сопротивления колон-
ки. Такими свойствами оС задают шприневые и плунжерные конструкции
Шприцевые насосы но сути представляют собой большой шприц, который цозируег фазу в
колонку В таких насосах во время набора шприцем фазы движение ее через колонку приос-
танавливается. требуется длительное время для смены подвижной фазы для обычной хрома-
тографии требуются .твитатели большой мощности. для гою чтобы с очень большим усилием
обеспечить движение поршня, а также большие габариты В настоящее время они практически
не применяются в ВЭЖХ. за исключением отдельных случаев. Например, такими насосами
оборудуются отечественные хрома гот рафы «Мнллихром Л-02» ЗАО «ЭкоНона» (Новосибирск),
работающие в микроколоночиом режиме
Подавляющее большинство современных хроматографе) оснашено плунжерными насоса
ми. в которых поток фазы обеспечивается возвратно-поступательными движениями плунжера
внутри рабочей толовки насоса. Для обеспечения стабильности расхода обычно применяют
насосы с 2. 3 головками ттли 4-головочные системы. Насосы этою тина обеспечивают посто-
янную объемную подачу нем вижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление
300—500 атм. расход 0.01 — 10 мл/мин. Воспроизводимость обьемной подачи 0.5% Основной
недостаток — растворитель пт аетея в систему в виде серии последовательных импульсов,
поэтому существуют пульсации давления и потока. Для уменьшения этого используются спе-
циальное устройство — демпфер.
В современной ВЭЖХ поток подвижной фазы <|юрмир\’ется на основе двух подходов: имк-
ратического. ври котором состав и давление подвижной фазы во время анализа остаются пос-
тоянными, и градиентного, при котором во время анализа состав, а следовательно элюирующая
сила изменяется по заданным параметрам.
Методы определения токсикантов в биосредах 385
Дозирование раствора
образца а петлю
Дозирование раствора
Рис. 6-55. Схема дозирования образна с применением дозирующей петли (Г.М. Барам. 2005).
Устройства для введения пробы для ВЭЖХ оцениваются по тем ас параметрам, что ана-
логичные у тройства для других видов хроматографии. Самое основное из них то. что со-
став нво 1мой пробы по жен полностью соси воствовать исходному образцу. а зона вводимой
пробы .должна быть как можно уже. чтооы не уменьшить -и|и|>ективность системы В ВЭЖХ
используются два вила устройств введения пробы: шприцы н дозирующие петли. Особеннос-
тью дозирующих систем в ВЭЖХ является высокое давление в системе, которое необходимо
преодолеть н процессе дозирования.
Техника введения образцов шприцем в ВЭЖХ аналогична таковой в газовой хро.матогра
фин. Из-за большой вероятное! и закупоривания иглы ширина кусками эластичной мембраны
и невысокой воспроизводимости дозирования по сравнению с другими способами использова-
ние шприцев в ВЭЖХ широкого распространения не получило.
Дозирующие петли в жидкостной хроматографии являются основным способом введения
пробы При этом способе используются приспособ 1СНИЯ представленные на рис 6-55
Как ви 1но на рисунке, дозирование осуществляется с помощью 6-xo.ioboio крана и позиру-
ющем петли строго определенного объем! На первом этапе дозирования при иомоши ширина
пробой заполняется дозирующая петля. После этого происходи! переключение потока под-
вижном фазы, которая переносит образен в колонку. Одновременно петля промывается чистой
подвижной фазой. После обратного переключения крана устройство готово к новому дозиро-
ванию Особенностями такого ycipoiiciBO являются высокая точность и иоенроивволпмоегь
дозирования образца, легкая атома гизания процесса. Сейчас коммерчески доступны петли с
внутренним объемом от 0.2 мкл до 5 мл и ботсс.
Котики для ВЭЖХ обычно iimoiokihioi из нерж шеюшеи стали. Внешний вид колонок
показан на рис. 6 56. Внутренняя поверхность колонок обычно полируется для уменьшения
взаимодействия ее с компонентами смеси и подвижной фазы.
Наиболее инертная поверхность имеется у стеклянных колонок Однако закис колонки не
выдерживают шипения, которое обычно используется в ВЭЖХ. Для повышения рабочего дав-
-.ния колонок их убирают в стальную оболочку. При исследовании лабильных биологических
объектов широко иенользуютез) колонки, изготовленные из РЕЕК материала.
В ВЭЖХ часто осуществи яется термостатирование колонок для получения стабильных и
воспроизволимы.х результатов.
Детектирование выходящих из колонки веществ в ВЭЖХ по сравнению с газовой хрома-
тографией затруднительно. Различия между подвижной фазой и анализируемым веществом
в газовой хроматографии чаше всею настолько кардинальны, что позволяют использовать в
386 Глава 6
XIA универсальные детектирующие
ciicicmi,i. например детектор ионизации
ги амени или катарометр, обладающие в
данных условиях высокой чувствитель-
ИОС1ЫО. В жидкостной хроматографии,
особенно в ВЭЖХ, физические свойс-
тва подвижной фазы и ашыита близки
настолько, чго универсальные детекто-
ры практически полностью теряют свои
преимутпеепш. Современные детекторы
для ВЭЖХ облхтают высокой чувстви-
тельностью и достаточной селективнос-
тью для решения широкого ряда задач
ХТА. В табл. 6-28 представлены харак-
теристики детекторов для ВЭЖХ.
Рис. 6-56. Внешний вид колонок для ВЭЖХ.
Таблица 6-28. Хар. юерншнкн .icicKiopt в хтн ВЭЖХ
Детектор 1 Тип Максимальный линейный .шана юн Предел об- наружения, г/мл Чувствителен к изменениям
УФ-ClICKipOMCip Селективный !0’—И)5 )11ч—К) 111 Давления. тем перат у ты
Диодная Mfiipinia (DAl)i Сслек in ними 10’—10* Менсе 2 1»' По । ока. аав. еиия. тем пера ix ры
Флюоресцентный Селективный кг ю* Менее 10* Потока, темпера- туры
Ьыс1р<.1ск;ишру»ошн11 УФ- ас гсктор । FS1 > I Селективный К)' Менсе 10' 11оюка. температуры
Амперох»е1рическип 1 i Селективный НУ 10‘- Потока. тсмпсрапры (1.5%/*С)
И К-Фурьс-Детектор Селективный KF КН 1 luTOKa
Масс-еелекшвныи Универе альпый КУ-104 Менее КГ Потока
Дчя сравнения детекторов разных производи гелей пользуются параметрами. характеризу
юишми эксплуатационные характеристики оборудования: линейность, шум. чувствительносп
и отклик. Современнее детекторы для ВЭЖХ характеризуются высокой чувствительностью и
низким пределом детектирования. хорошей селективностью; высоким быстродействием, ши-
роким диапазоном линейности и надежностью. достоверностью и удобством в работе. Опреде-
ление этих параметров аналогично таковому в газовой xpoxiaioiрафии Детекторы для ВЭЖХ
как и для газаовои хромотаграфии. делятся на концентрационные и потоковые. Но в жид-
костной хроматографии тин детектора устанавливается проще, чем в газовой хроматографии
Для этого достаточно остановить поток фазы в момент выхода хроматографического ника
У концентрационных детекторов интенсивность сигнала не изменится.
УФ-детектор с фиксированной длиной ваты чаше все о применяется в ХТА. Его преимущест-
вами являются простота в работе, высокая чувствительносп. и селективность. Этот детектор пеяе-
структнвсн. является концентрационным и хорошо подходит лля препаративной хроматографии
В основе работы такого детектора лежи! поглощение света веществом, которое содержится
в элюате, выходящем из колонки Поглощение пропорционально концентрации анализа в под-
вижной фазе (СЭ и длине оптического пути в измерительной ячейке детектора (L).
log///=££G
тле / — iiiiieiiciiBiiocii. света, прошедшего через ячейку без аналига. 1/1п — пропускание.
Е — мольный коэффициент поглощения.
Методы определения токсикантов в биосредах 387
Рис. 6-57. Схема работы олнолучсвого <|юто.мегра (Барам I М 2005).
На рис. 6-57 покачана схема простейшею <|ютометра. Элюат из колонки попадает в изме-
рительную ячейку детектора, через которую пропускается спет опр деленной длины волны.
В варианте А поглощение свеча обусловлено поглощением подвижной фазы. В варианте В па-
блик чается уменьшение интенсивности света в момент выхода из ки донки вещества.
При работе с этим детектором следусч иметь в виду, что ею отктик подчиняется закону
Бучера—Ламберта- Беера не вссч га. а только при проведении Н1мерений на максимуме хрома-
тографического вика и при условии моиохре матичности источника света. Такие требования
трудновыполнимы в реальных условиях, особенно при работе с концентрированными раство-
рами или сильнозачрязненными экстрактами из биологических объектов. Данное положение
настолько серьезно влияет на получаемые результаты, что в некоторых случаях норматив-
ной документацией вводятся предельные значения интенсивности поч’лошения. выше которых
проводить количественное определение нс рекомендуется Это значение в большой степени
зависит от использованного оборудования. Обычно оно устанавливается равным I или 2 AUFS
(единицы абсорбции полной шкалы). Еше один фактор, который следует учитывать, касается
поглощения света компонентами подвижной фазы, которое в отдельных случаях может быть
значите ьным
Непременным условием для успешного определения аналога с помощью данного детекто-
ра является Наличие в нем хромофоров. В какой-то степени расширить возможности метола
можно, применяя лериваги шнию. Но сути этот подход такой же. как в Чазовой хроматоч рафии
или ТСХ. т.е. анализируемая молекула химическим путем модернизируется таким образом,
что в итоге подучаемое вс десгво начин чет поглотать свет определенной длины волны. При
этом изменением хроматографических свойств аналита обычно пренебрегают. В ХТА широко
используется дериватизания .лля получения силычопоглошаюших в УФ-свете и флюоресциру-
ющих производных токсикантов и их метаболитов с целью увеличения чувствительности и се-
лективности определения метолом ВЭЖХ. Используемые ; ля этих ччелей реактивы достаточно
универсальны и применяются для обнаружения многих вешссгв.
Для увеличения иоч дошеиия ччсшеством УФ-света применяют Х-сукччпнимилчич-п-пнчрофс-
нилапетат (SNPA). фенил! и.чразин и 3.5-дии1г1робе|1зои.1.хлорид (DNBC). Требования к про-
изводным в ВЭЖХ апалопччны таковыхч в газовой xpoxtaroipa Ьии: стабильность. низкий фон
и чр Кроме указанных реакчивов. используются вепчес ва для получения флюоресцентных
производных (см. ниже).
В жидкостной хроматографии пронодччтся дериватизания до разделения на колонке либо
после разделения. но ло того, кок элюат поступает в детектор. Каждый из этих способочг
имеет преимущества и недостатки. Прчч ирс.'чколоччоЧ1ЧоП дериватпзанип анализируется пору-
ченный дериват, а время проведения реакции чч ее условия не важны, При постколоночной
дсриватизации разделенные вещества обрабатываются непосредственно на выходе из колон-
ки. и реакция должна пройти за то время, за которое поток фазы проходит расстояние от
колонки ло детектора. Прчч этом не должно произойти резкого уменьшения эффективности
разделения.
На современных приборах можно проводить исследования прзч слипах во.лчч в диапазоне от
190 до 600 нм, наиболее часто используемыми ягсляются 210 чч 254 им. Допо.лнччтельно в них
предусматривается возможность осгаповкчч потока фазы и снятия спектра вещества во всем
диапазоне или его части
388 Глава 6
Рис. 6-58 Схема многоволновото детектора
хроматогра<|ю «Мпллттхром А-02» JAO « )ко-
IIива" (Новосибирск) (Барам Г.М.. 2005).
Многовомовое детектирование позволяет одновременно проводить анализ элюата по не-
скольких! длинам волн на лнулучевых приборах. На рис. 6-58 представлена схема anyлучевого
cncKTpoxieiрического детектора.
Mhoiоно.нювос детектированне позволяет более точно протк тин» идентификацию и ко-
личественное определение всшссгв. На рис. 6-59 показан идеальный случай хроматографи-
ческого разделения вешества. Для идентификации п количественного определения вешества
выбраны две длины волны, cooiвегетвуюшис максимуму и минимуму поглощения УФ-свста
этим веществом. При выборе ipyiiix длин волн, например как показано на хрома ют рафнчес-
ком пике. УФ-спектры имеют близкую форму, зависящую от концентрации этого вешества
в элюате.
Используя многоволповое детектирование, у тастся создавать экспертные системы тля экс-
пресс выявления и количественного определения токсикантов. Примером такого подхода
является бита данных «ВЭЖХ УФ». реализованная па отечественном микрокоде) точном хро-
матографе «Милчпхром А-02» ЗАО «ЭкоПова» (Новосибирск). На основе этот) базы с ис-
пользованием обьема (времени) удерживания и 8-волнового детектирования удается проводин.
1иептиф|1каппю и количественное определение нескольких сотен лекарственных препаратов,
наркотиков, пестицидов п их метаболитов. На рис. 6-60 показаны хроматограммы анализн-
Рис. 6-59. УФ-сисктр вещества. сто .хромато1рафичсскш1 пик и спектры. соответствующие аналитичес-
ким длинам ваш.
Методы определения токсикантов в биосредах 389
Вещество Уж, мкл е.о.п мк. мг/мл Спектральные от ношения (SyS1|#)
220 230 240 250 260 280 300
Me wtoii 618 123.53 0.86 0.23 0.02 0.04 0,12 0.24 0.00
Диоксилин 620 147,01 1,05 1.71 2.51 2.20 3.19 0.26 0.27
Теобромин 643 423.50 0.43 0.24 0.14 0.16 0.33 0.44 0,01
Cy.lb(|xiUH.I- патрнй 662 193.88 0.64 0.15 0.21 0.52 1.00 1.10 0,27
1’ г «нем- (•69 213.50 0.58 6.92 1 1.25 1.24 0.79 0.23 О.05
Геофнллш1 713 411.80 0,36 0.23 0,14 0.18 0,37 0,42 0,01
Сульфачнн 715 293.17 0,81 0.54 0.52 0.60 0.80 0.66 0.23
Серотонин 731 402.84 0,98 0.64 0.15 0.10 0.16 0,25 0.20
Фолиевая кислота 762 206.87 0.88 0.63 0.48 0,41 0.47 0.88 0.84
Рис < 60. Хромапирамм» аиачитвчсхкоц) раствора сравнения парацетамола н полученные при лом ха-
рактеристики. занесенные и базу данных «ВЭЖХ-УФ»: е.о.п. — единицы ошической пл тптостн.
чес кого раствора сравнения парацетамола ври различных длинах поли и соответствующая ему
запись в базе данных (выделена красным цветом).
На рис. 6-61 представлены хромагшрамма экстракта многокомпонентного зекарственного
препарата сслал-М. полученная с применением рассматриваемой базы данных, и результаты
количественного определения.
Использование в рассматриваемой базе данных комбинации .хроматографического разделе-
ния в । рхшенпюй микроколоночной системе с применением многоволновою детектирования
позволяет быстро и достаточно надежно обнаруживать и количественно определять большое
число гоксикантов. что необходимо при решении широкою крута задач, решаемых в рамках
ХТА Однако следует отмстить, что для проведения окончательной идентификации разделен-
ных вешеств предоставляемой информации недостаточно. Для згою необходимо привлечение
арбитр|жных методов — ВЭЖХ-МС или ГХ-МС.
Лиодная матрица представляет собой устройство, позволяющее одновременно и с
большой скоростью определять boijiouiciihc* света в широком диапазоне длин волн без оста-
новки потока подвижной фазы. Па рис. 6-62 показана схема такого детектора.
390 Глава б
Рис. 6-61. Хроматограмма экстракта многокомпонентного лекарственного препарата есдал-М. получен
пая с применением базы данных «1Г1ЖХ-УФ и результаты количественного определения
Пик Вещество VRf мкл Концентрация, мг/мл (±10%)
1 Паране, амол 669 0,334
2 Кофеин 846 0,059
3 Анальгин 986 0,180
4 Кодеин 1013 0.014
Рис. 6-62. Схема детектора на диодной матрице и получаемая с его помошью информация (I М Карам
2005). I — лампа; 2 — линза: 3 — заслонка, перекрынпюшая снетотзои поток для измерения темнового тока:
4 — проточная измерительная ячейка; 5 — дифракционная решетка 6 — матрица фотолнодов (линейка).
Работа .толпой матрицы основана на прохождении луча света через измерительную ячей-
ку, его рахтожении на дифракционной решетке и измерении полученною спектра с помошью
единичных умножителей. собранных в решетку При этом каждый отдельный диол измеряет
Hiire.iiciiBiiocib очень узкого. 0.5—1.0 нм. диапазона длин волн. От нчительио т особенностью
детектора является отсу спзис в нем движущихся частей.
Современные матрицы, которыми оснащаются хрома штрафы. содержат до 512 диодов, пе-
рекрывающих диапазон длин волн 600 i м. обычно от 190 то S00 нм. При этом точность изме-
рения длины волны обычно ненамного выше I им. За счет уменьшения разрешаюшезт способ-
ности иногда уве 1ичивают диапазон и змсрения ло КИЮ—1200 нм Чувствительность у диодных
матриц обычно ниже, а стоимость юрахто выше, чем у обычных спектрофотометров.
Быстросканирукпцие УФ-детекторы (/'SD) являются относительно недорогой альтернати-
вой диодной матрице. В силу своих конструктивных особенностей такие приборы позволяют
Методы определения токсикантов в биосредах 391
сканировал! большой диапазон длин both — от I90 до 800 нм н более — примерно ia I с: у
тис пюи матрицы ио происходи! за миллисекунды. При нормальной ширине хроматограф)!
ческого пика в ВЭЖХ, сос'пиыяюшсй около 20 с. такое быстродействие позволяет проводить,
помимо получения хроматтлрамм. и груше действия, например проверку чистты хроматогра
фического пика.
Летектор флюоресценции в сочетании с разделением методом В ЭЖХ обеспечивает высокую
чувс1ви1сл!>11ОС!ь и селективность опреде гения. Метол широко используется дня определения
таких наркотиков, как ЛСД и его аналогов. триптаминов, а при химической модификации,
гапример окислении морфина !сксацнапо<])срра-1ом (III) калия. ряда других токсикян'гов. Л1ля
дериват и га ни и веществ, содержащих в своем составе фенольные, спиртовые, амино- и кар-
боксильные группы, с нелыо получения соединений, об гадающих флюоресценцией. широко
применяются лансил.хлорид (DX.S-CI). 4-бромметил-7 метоксикумарин и флюорескамин.
Начиная с 90-х голов XX века в анализе биологически активных веществ получила рас-
пространение модификация флюоресцентного детектора — лазериндгиируемая фшюресцепиия
(LID.
ИК-Фурье-детектирование в ВЭЖХ иа современном лапе развишя обеспечивается либо
путем сбора и исследования фракции, выходящих из колонки. либо с применением проточных
кювет. В последнем случае успех определения зависит от большого числа факторов. Обычно
достигаемая чувствительность при этом невысока. Количественное определение затруднено.
Электрохимическое детектирование является альтернативой оптическим методам в жидкое
гной хроматографии. Виды элск1рохимического анализа рассмотрены в главе 6.5.
Применение масс-спсктрального детектора в жидкостной хромаюграфии рассмотрено от-
дельно в разделе 6.3.6.
Подвижная фаза
К раствори)елям, составляющим подвижную фазу. прсльявляются жесткие требования, без
выполнения которых невозможно проведение па должном уровне ВЭЖХ Этим требованиям
не всегда удовлетворяют коммерческие растворители для ВЭЖХ. Часто бывает необходимо
провести их перегонку, фильтрование или осушку. Кислород воздуха способен создавать се-
рьезные проблемы при работе с УФ-детектором, гак как он увеличивает иеспспифичсекос
ши лощение при 230 нм. Кроме того растворен ни и газ в подвижном носителе может создавать
трудности в работе наноса и колонок. Во избежание этого подвижную фазу продувают инерт-
ным юзом или обрабатывают ультразвуком
В жидкостной хроматографии чем сильнее растворитель адсорбируется неподвижной фа-
зой тем выше его элюирующая способность. Элюотропиый ряд растворителей приведен в
таб 6-29. Он соетав.тсн для нормальной хроматографии. и самыми сильными элюирующими
во(можностями в этом ряду обладает вола. Для обраигенно-фазовы.х сорбентов этот порядок
изменяется на противоположный.
Таблица 6-29. Элюотроиный ряд растворителей
Растворитель Полярность Растворяю- щая сила Дихтсктрн- ческая константа УФ... В нм Показатель преломления Вязкооъ при 25 С. и На/ с
Гепган 0.2 0.01 1.92 195 1.385 0.40
Гексан 0,1 0.01 1.88 140 1.372 0.30
Пеипш 0,0 0.00 1.84 195 1.355 0.22
Циклогексан 0.2 0.04 2.02 200 1.423 0.90
Толуол 2.4 0.29 2.40 285 1.494 0,55
Эфир 2.8 0.38 4.30 218 1.350 0.24
Бенз 1 2.7 0.52 2.30 280 1.498 0.60
Метилен-клррид 3.1 0,42 8.90 233 1.421 0.41
1.2-Дихлорэтан 3,5 0 44 10.40 228 1.442 0.78
Бчтанол 3.9 0.70 17.50 210 1.397 2.6
Пропанол 4 0 0.82 20.30 240 1.385 1.9
392 Глава 6
Окончание mad i. 6-29
Тетрат тирен] ран 4.0 0.57 7.60 212 1.405 0.46
Эти тавстат 4.4 0.58 6.00 256 1.370 0.43
11 зонронанол 3.9 0.82 20.30 205 1.384 1.9
Хлороформ 4.1 0,40 4.80 245 1.443 0.53
Диоксан 4.8 0,56 2.20 215 1.420 1.20
Анезон 5,1 0.56 330 1.356 0.30
Ут анол 4.3 0.88 24.60 210 1.359 1,08
Уксусная 6.0 6.20 1.370 1.10
KllCJOId
Ацетонитрил 5,8 0.65 37.50 190 1 341 0.34
Метанол 5.1 0.95 .32.70 205 1,326 0.54
Нитрометан 6.0 0.64 380 1.380 0.61
Во а 10 2 80.00 1,333 0.89
Основное правило при составлении подвижной фазы— она должна быть настолько проста,
насколько эго возможно Для решения специфических проблем в подвижную фазу может до-
бавляться некое вещество, которое необходимо дтя улучшения се хроматотрафических свойств
или лля детектирования веществ. При составлении прописи подвижной фазы должны учиты-
ваться следующие факторы:
• растворимость образна в элюенте:
• полярность, свегоиропускапис, коэффициент преломления. вязкость, температура кипения
элюента;
• чистота и стабильность элюента;
• требования правил безопасности при рабою с элюентом.
• pH С|к*ды
Неподвижная фаза в ВЭЖХ обычно представляет собой инертным материал. поверхность
которою химически модифицирована, полимер с заранее известными сорбционными свойс-
твами либо внутренняя поверхность колонки, обработан пая специальным образом.
Неподвижные фазы по своим механическим свойствам делятся на мягкие, выдерживающие
давление не более 0.2 мПа, используемые для жидкостной хроматографии низкого давления
и изготовленные тит основе целлюлозы, доктрина. по шакриламидз, полистрола и других ма-
териалов: тмужесткие. выдерживающие давление до 10 мПа. используемые для колоночной
ВЭЖХ и и iroroiL.ieinn.ic па основе поливинилового спирта, полистирола; жесткие, работа-
ющие при давлении до 50 мПа и изютотиепные из оксида кремния, алюминия, циркония.
стекла.
Носители на осноне силикагеля — наиболее широко распространенная труппа сорбентов .для
ВЭЖХ Силикагель представляет собой полимер (SiO 11,0). имеющий трехмерную пористую
структуру. состоящую из группировок (Si—О—Si) и определенного, контролируемою процес-
сом получения числа силанольных групп (Si—ОН) Коммерческие силикагели имеют площадь
поверхности 100—800 м:/г и средний размер пор 4—33 нм.
На качество разделения оказывает влияние форма зерен неподвижной фазы. В настоящее
время для аналитической ВЭЖХ используются только сорбенты со сферическими зернами.
Другие виды сорбентов применяются только в
препаративной хроматотрафии.
Расположенные на поверхности сорбента си- CJ —сферическая
дипольные труппы имеют полярный сдабокис- ХиЛ'
тый характер Это их свойство используется для
разделения веществ основною харпктера па нс- —неправильная
модифицированных силикагелях с применением
водных элюентов.
Обработка поверхности силикагеля специаль-
ными реактивами приводит к кардинальному из-
— неправильная (скругленная)
Методы определения токсикантов в биосредах 393
мснеинто его свойств и получению обращештофазовых сорбентов. Такая обработка позволяет
ю тучать сорбенты с заданными свойствами в широких пределах (см. начало гл. 6.3).
Дтя разделения смесей оптически активных вешсств к силикагелю химическим образом
пришивают пиклодсксгрипы. амидазу, авидин и ряд других модификаторов. Иногда такие ко-
лонки называют хиральными.
Аналогичным образом из силикагеля готовятся иопообмепникн. Для этого к нему добавля-
ют четвертичные аммониеные или сульфотруппировки.
Рабочий диапазон pH среды для силикагелей составляет от 2.0 до 8.0. Вне этих пределов он
начинает разрушаться.
Оксид циркония как сорбент для ВЭЖХ химически и термически более устойчивый, чем
силикагели. имеет больший рабочий диапазон pH. Поверхность оксида цирк лтия может быть
химически модифицирована.
Полимерные сорбенты, а пакже подикаииллярные колонки и другие разработки в эгой об-
лети редко используются в ХТА.
Выбор роматографичсскнх систем. К настоящему времени разработано большое количество
различных хроматотрафических материалов. элюентов, методов и оборудования для проведе-
ния анализа токсикантов, так что выбор конкретных условий достаточно прост. Обшие прави-
а выбора системы:
• Обратен пофазовые системы обычно треб ки контроля pH среды, органических раство-
ригелей. ионной силы раствора. ион-парных рсактивовов и др. Удерживание иеитсстп на
силикагелях менее предсказуемо. Они больше подходят для разделения разных ио своим
химическим свойствам веществ, в отличие от обраптеннофазовых сорбентов, которые бо ее
эф<|>скгив11Ы при разделении близких по свойствам веществ, например барбитуратов, опиа-
тов или амфетаминов.
• Основной проблемой при исполт топании нормальных фаз для анализа токсикангов в экс-
трактах биологических объектов является скапливание слабоиоляриыч веществ биологичес-
кого происхождения в начале колонки или медленное их вымывание из колонки, сильно
увеличивающее фон и снижающее эффективность системы.
• Для обрйшепнофазовой хроматографии соэкстракт пвныс вешества обычно элюируются либо
раньше, либо вместе с а нал и тируемым веществом, понижая чувствительность или вообще
маскируя пик аналита. В этом случае хорошие результаты может дать ион-парная хромато-
графия. Среди обрашеннофазовых колонок наибольшее распространение в ХТА получили
С-18‘-о«сорбеиты или их апалопт С-Х.
6.3.5. Капиллярный электрофорез
Ты никогда не будешь знать достаточно.
если нс будешь звать больше, чем иосгаточно.
3 л-т ик
Метод капиллярного электрофореза (КЭ) является наиболее бысгрора тви вакини мся анали-
тическим направлением. Он с успехом применяется в медицине, биохимии. судебной химии,
криминалистике, экологии, входном и технолог ическом произведет венном контроле для ана-
лиза катионов металлов, неорганических и органических анионов, наркотиков, лекарственных
препаратов, аминокислот, белков, пептидов, витаминов, пигментов и красителей, пестицидов,
нищевых продуктов, а также в генетике и токсикотенетикс.
Области применения газовой хроматографии и ВЭЖХ ограничиваются требованиями, предъ-
являемыми к пробам в каждом из этих аналитических методов. ВЭЖХ в настоящее время яв-
ляется наиболее широко распространенным метолом разделения с хорошими перспективами на
дальнейшее расширение области его применения. Проблемы при применении ВЭЖХ во шикают
то да. когда необходимо быстро и с большой эффективностью проанализировать полярные и по-
метенные пробы, особенно пробы, обладающие высокой основностью, а также биополимеры.
Заряженные частицы перемещаются в растворе нол влиянием электрического ноля с раз-
личной скоростью. Поэтому для ионотенных соединений предлагается элскрофорст ическая
394 Глава 6
техника разделения. В случае классического электрофореза применяются ге и или полоски бу-
маги. пропитанные элекф лигами. лля того чтобы уменьшшь помехи, вызванные конвекци-
ей. Использование полиакриламидного гель-электрофоре ia (ПАА1 лекгрофореза) позволяет
проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков.
В последние годы все большее распространение в анализе биологических объектов нахо-
дит капиллярный зонный электрофорез (К 13). быстрое развитие метода было обусловлено
двумя решающими ycoBcpnieiiciкованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутрен-
ний диаметр разделительного капилляра; во-вторых, детектирование по иектропроволностц.
пришедшее первоначально из изотахофореза, было заменено прямым УФ-лстсктированисм в
потоке жидкости. Дальнейшее развитие метода стало возможным при использовании кварце-
вого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-облаои и равномерным внутренним
диаметром от 25 до 100 мкм. При этом улучшилось как разделение, гак и детектирование.
Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-дс-
тектор для определения разделяемых не шест непосредственно в капилляре. Преимуществами
метода являются высокая эффективность разделения, экснресспостъ. простая нробонолюговка
и малое количество образца, необходимого для проведения исследований Разделение смесей
происходит на капиллярных колонках длиной от 40 см до I м. В пустотелом капилляре. к стен-
кам которою приложен отрицательный потении тл. а к концам — разность потенциалов, пол
действием электрического поля начинается движение молекул электролита от анола к катоду,
вызывающее общее icmchhc жидкости. При введении в такую систему анализируемого образна
(с анодного конца) положительно заряженные частицы анализируемых соединений движутся
к катоду быстрее потока жидкости в капилляре. незаряженные молекулы текут с потоком, а
отрицательно заряженные частицы, удерживаясь положи тельным зарядом, текут медленней
всего, но гем не менее текуч к катоду. Происходит весьма эффективное разделение смеси. В сов-
ременных приборах идентификация часто осуществляется масс-снектральным детектором.
КЭ основан па использовании для разделения и определения компонентов элсктрокинетн-
ческих явлений, т.е. электромиграции ионов и других заряженных частиц и электроосмосе, ко-
торые возникают при помещении исследуемой смеси в электрическое поле пре имущественно
высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например в кварцевом, то
лектрнчсское поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц
и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на инянвидталы1ые компо-
ненты. гак как параме1ры злекромифаиии специфичны для каждого вила заряженных частиц.
В то же время мешающие факторы, такие, как диффузионные, сорбционные, конвекционные.
раннгапиоппыс и т.н., в капилляре существенно ослаблены. Благодаря этому достигло)ся рекор-
дная эффективность разделения. Предел обнаружения лтя большинства веществ составляет 0.5—
1.3 мкМ. КЭ - метод, при котором пол воздействием электрическою поля высокою напряже
ния компоненты разделяю вся на основе отношения заряда к массе. Главной движущей силой в
КЭ служит осмотический поток (при высок lx значениях pH), возникающий в основном из-за
в'заимодейепшя ноложишльио заряженных попов в растворе с ipyiiiia.Mii силанола па капилляре
Разделение пробы достигается приложением напряжения к буферным сосудам. Возникаю-
щее в капилляре электрическое поле вызывает миграцию зоны пробы. На электрофоретичес-
кое перемещение всегда накладывается более или менее интенсивный электроосмотический
поток (ЭОП). который способствует пассивному транспорту зоны пробы, а не ее разделению.
ЭОП сильно зависит ог значений pH буфера и свойств поверхности кзпп ьтяра ЭОП может
быть настолько бо ihiiiim, что будут двигаться пс только нейтральные молекулы, по даже отри-
цательно заряженные ионы смогут перемещаться к детектору, несмотря на их электрофорети-
ческую мшрапию После того как в большинстве буферов па поверхности кварцевых капи.тля
ров из-за диссоциации силанольных ipynn образуются отрнц»гелы1ыс заряды. вблизи стенки
индуцируются положительные заряды и злектроо мотпческий поток движется к катоду. Это
обусловливает необходимость расположения детектора вблизи катодною iipocipaiicnui. ЭОП
помогает переносить зоны проб к детектору настолько, что при достаточно больших значениях
ЭОП к каюду могут переноситься даже анионы. При этих условиях все незаряженные молеку-
лы перемещаются с одинаковой скоростью, равной скорости ЭОП. и не мот быть разделены,
в го время как разделение заряженных ионов возможно благодаря их различной электрофоре-
тической подвижное! и.
Методы определения токсикантов в биосредах 395
Итак, сущность КЭ состоит в разделении смссст! анализируемых вешеств (ионных смесей)
в определенной среде находящейся под влиянием направленного движения электрического
поля. Нейтральные частицы не движутся пол действием электрическою ноля, хотя они мот
диффундировать из-за градиента давления или переноситься ЭОН. Скорость движение любого
иона или смеси, несущей на себе общий тарял, в электрическом ноле при заданном значе-
нии pH рассматривается как вектор суммы электрического потенциала и силы сопротивления.
Увеличивающееся напряжение и возрастающая при этом напряженность поля приводят к пос-
тоянному повышению скорости перемещения (скорости электрофореза) п вследствие этого к
более высокой скорости разделения, которое зависит от разницы в подвижности частиц смеси.
Hi электрофореграмме подвижность (р) частиц разделяемой смеси рассчитывается, исходя из
времени движения частиц (I). длины аналитического сегмента капилляра ()), приложенного
напряжения (V).
Скорость
< 1/Х)
М =
Градиент потенциалов (Г !.)
тле I — длина ло детекторного окна; I. — общая длина капилляра.
Очевидная подвижное гь (рлрп) — сумма подвижности частиц смеси (р) и подвижности за
счет ЭОН (нэт1).
+
При расчетах важно различать общую длину капилляра (L) и эффективную длину капилляра
от места вшита пробы до детектора (I). так кик электрическое поле уменьшаемся на протяжении
обшей длины капилляра, а молекулы мигрируют лишь в пределах эффективной длины капил-
ляра. Поэтому данные о длине капилляров характеризуются отношением I/L в сантиметрах.
Эффективность разделения в КЭ. выраженная как \ (число теоретических тарелок), зави-
сит от приложенного напряжения.
Г
N = ---
Чем выше напряжение, гем быстрее происходит разделение и гем уже ник. Высокое значе-
ние pH и соответственно высокое значение р также способствуют росту эффективности.
Методы детектирования в КЭ приведены в габл. 6-30.
Количественный ana.ua. На воспроизводимость получаемых результатов влияет ряд факто-
ров: различие в электропроводности между раздел итстытым электролитом и раствором пробы, в
коннепграиии компонентов пробы и их электрофорегичеекой подвижностью, в составе пробы.
С другой стороны, преимущества КЭ ироянляются при исследовании малых объемов пробы.
В автоматизированных приборах общий объем пробы составляет 3 мкл. При этом, однако,
не исключено. что состав пробы во время ввода изменится. Причина заключается в занесении
буфера в пробу или в селективном введении определенных компонентов.
Объем пробы при введении может изменяться за счет испарения. Этот эффект можно умень-
шить охлаждением пробы или использованием герметичного затвора в сосуде лля пробы. Если
необработанттыс данные исследования представлены в форме хроматотрамм или форсграмм.
го количественные результаты определения получают или определением высоты пиков, или
после ин парирования в виде площади пиков. При определении примесей количественное
выражение нх концентрации через высоту более надежно, чем через площадь пика. Этому есть
две причины. Первая заключается и том. что при анализе примесей высота пика пропорцио-
нальна их KOHUCHTpamiii. гак как эффекты насыщения и перегрузки можно исключить, а вто-
рая — в том. что ошибка автоматизированного определения высоты и этом случае меньше, чем
при интегрировании пиков Как только высота пиков возрастает, интегрирование становится
рациональным и необходимым
При оптимизации анализа необходимо находить компромисс между воспроизводимостью
и эффективностью. Если требуется количественно проанализировать пробу, то для получения
надежных результатов следует работать с конентраииями. превышающими предел обнаружения
по крайней мерс от 10 до 20 раз. Только при оптимальных условиях удается получить хорошую
эффективность и высокую воспроизводимость площадей пиков в пределах от 1.5 ло 3%.
396 Глава 6
Таблица 6-30. Методы ястсктировпния в КЗ)
Принцип детектирования Предел обнаружения, моль л Токсиканты Примечание
УФ-ПОГЛО)ИСШ1С 10-10-' Ароматические соединения. СТОЛКИ. ЦУКЛСНИОВЫС кислоты Стандарт ное детектирование в КЭ. имеется во вс х коммерчес- ких приборах
Непрямое УФ-детек- тирование 10"—10’’ Ионы металлов, амины, иронические и neopraiHriec- Имеется в коммерческих при- борах
кпе воны. углеводы
Флюоресценция 10 *-104 Аминокислот, ДНК. иешя- лы. белю) Для б<иь)1)ннс)ва проб необхо- димо получение ирон людных
Лазерная флюорес- ценция К) -107 Фра) мен и.) ДПК. ирон люд- ные амииокисю) Лазер онс доро). Детектор при- меним ТОЛЬКО В ВИДИМОЙ 11 УФ областях поглощения
Нс при мая фл юорсс - ЦС11Ш1Я КГ-10* Спирты, амины, анионы, катионы. \гленоц|.1 Редко используется
Амперометрия 10’-10* Ле> ко окисляемые и вос- ci лыплцвасмые вещестж>. например нейромедиаторы И пользуются капилляры с в tyr ренкнм лиамс)ром до 2 мкм
Концу*; омстрия 10 -10’ Ионы металлов, аминов, карбоновых кислот Трудности при замене капилляра
Потенциометрия 10» Ионы щелочных и щелочно- земельных мет адлов Определение та счет иопосслск- гинных микрсшскгролон
МС 10 ,0—10" Белки, пентилы мониторинг лекарств. наркотиков Отсутствуют проблемы совме шеи ня. доступны коммерческие интерфейсы
Радиоактивные изме- рения И)”-10 ” Р и 4С п биообъектах Хорошая чунсгвигсльнсхпъ он- рсдедения. с помошью системы ос i а । юнки потока
В ХТА используются различные вилы КЭ.
Капиллярный зонный злектрм/юрез. В КЗЭ разделение заряженных частиц происходи г в соот-
ветствии с их подвижностью и полярностью в водных растворах. При проведении КЗЭ буфер,
значение pH. а также напряженность поля во всем нросгрчнсгве разделения остаются постоян-
ными. Пробы, которые разделяются за счег различных подвижностей заряженных фрагментов
определяемых веществ, вводят в виде отдельной зоны на входе в капилляр и обнаруживаю) в
виде дискретных, отделенных ipyr or друга зон. Назначение буфера при jroll icxhmkc ра юле-
ния — поддерживать постоянное значение pH и обеспечивать транспортный поток Выбор pH
буфера определяет заряд ионов пробы. Концентрация буфера влияет на ЭОН. полому можно
оптимизировать разделение изменением величины pH и вида буфера. Наибольшее различие в
способности к перемещению для слабых электролитов, т с. наивысшую селективность, получа-
ют то)да, когда значение pH буфера лежи между значением рКдж компонентов пробы —
константа диссоциации). Для дальнейшей оптимизации moivi использоваться добавки к буфе
РУ-
Подтип КЗЭ — капиллярный ионный анализ (КИЛ) применяется для разделения ионных
частиц в водных растворах. Определение проиеходиг быстро и часто используется для нена-
правленного анализа.
Наряду с КЗЭ выделяют капиллярный гель-ляектрофорез (КГЭ). где капилляр заполнен гелем.
На электрофоретическую миграцию молекул окатывае) влияние магрина геля, поэтому селек-
тивное разделение фрагментов молекул связано с их размерами
В качестве самой старой капиллярно!) техники следует упомянуть изоэлектрическая фокуси-
ровка (ИЭФ) и капиллярный изотахофорез (кИГФ). который в настоящее время вновь приобрел
значение для концентрирования проб в КЭ. В ИЭФ степень конечною р; деления анолита
соответствует изоэлектрическим точкам анализируемых веитеств. Вешества перемешаются ио
Методы определения токсикантов в биосредах 397
гродиету pH. который образован в капилляре путем добавления амфолита. Этот метод, по-
казывая высокую эффективность при исследован ни бе ков. используется нс гак часто из за
высокой фоновой абсорбции амфолитов. В кИТФ разделение происходит в электролитной
системе, состоящей из тух буферов с различной подвижностью. В равновесии смежные зоны
должны перемешаться с равными скоростями, что может быть доспи пуло, только при оди-
наковой концентрации ионон. Поэтому кПТФ применяется при исследовании разбавленных
проб Доказана эффективность метола в комбинации с МС.
Катшярный просеивающий иектрофорез (КПЭ). Этот вид ллектро<|хэре за но.цтазумеваег
элекгромиграпию макромолекул через полупронинае тую мембрану (сито), следовательно, раз-
деление происходит за счет разницы и размерах молекул (частиц). Мембрана может представ-
лять собой гель, и этом случае речь идет о КГЭ, Наполнение капилляра гелем сейчас вытесни-
ло использование вязких растворов полимеров (например, гндроксиэтнлнсялюлозу).
Капииярюя электрохроматография (КЭХ). Здесь ЭОП используется как средство проведе-
ния элйоснта через канн тляр. который содержит неподвижную фазу. Она может быть химичес-
ки закреплена на стенках открытого капилляра пли находиться в капилляре в виде пористого
монолитного с оя. В КЭХ. в отличие от ВЭЖХ. нет градиента потока и давления, поэтому
возможно применение узких капилляров, заполненных субмпкрочастпиами.
Мицелшрная злектрокинетическая хроматография (М КХ) позволяет разделяй» незаряжен-
ные молекулы.В тайном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы рас-
пре |сляюгся между буфером и мицеллами в соответствии с нх гидрофобностью. Разделение
свя ано с подвижностью мпнелл. бс тьшннспю которых заряжено orpiiiMie.'ibiio. В основе раз-
деления лежш процесс распределения, поэтому можно с полным основанием говорить о хро-
м ттографическом методе.
В КЗЭ нейтральные пробы достигают детектора вместе с катионами и анноцами и нс
могут быть разделены. В методе МЭКХ. предложенном Терабе и соавт. в 1984 г., иодное
разделение аналита достигается введением добавок детергенгов. например никлодскстрииов.
к буферу. При лом обра уюгия мицеллы, которые имеют гидрофобный характер внутри и
заряжены снаружи, чем и достигается электрофоретическая подвижность в электрическом
поле В зависимости от знака заряда электрофоретическая подвижность направлена в сторо-
ну катода и m анола Нейтральные молекулы взаимодействуют с перемешлютимися мицел-
лами, образованными нз подходящих детергентов, вве генных в фоновый раствор электролита
КЭ. Для проведения МЭКХ нспользют приборы ия КЗЭ. но добавляют в буфер детергенты.
МЭКХ рассматривается как промежуточное звено между электрофорезом и хроматографией,
при этом гидрофобность разделяемых вешеств может быть доминирующих] фактором при
получении конечных результатов разделения. МЭКХ прелставлясз собой одну из форм КЭ.
которая делает возможным разделение не только катионов, нейтральных молекул растворен-
ных вешеств и инионов, но и смеси энантиомеров. Между молекулами в оптически активной
среде происходят стереоспецифические взаимодействия. Если смесь энантиомеров, которую
необходимо разделить, добавить к оптически активной среде, состоящей из чистого энанти-
омера. то в разделяющей системе повеление анализируемых веществ будет различным, что
и позно1яе1 осуществить их разделение. В оптически активной среде с оптически активным
ок) -жснисм взаимодепствуе! только один из энантиомеров. и смесь энантиомеров разяс-
лястся. Поэтому при разлсленппсмеси энантиомеров основное внимание уделяют выбору
подходящей оптически штивной среды — хиралыючу селектору. Поскольку универсальных
хпральыых селекторов не существует, то условия разделения каждый рзз необходимо оп-
тимизировать по-новому. В КЭ оптически активная среда обычно создается добавлением
оптически активных веществ к разделяющему буферу. Такой простой способ обладает боль-
шим преимуществом, поскольку в эюм случае отпадает необходимость в длительных и ipe-
буюших интенсивной работы стадиях иммобилизации хиральных селекторов на различив х
носителях. Поиск хирального селектора происходит, как и в ВЭЖХ. методом проб и ошибок.
Способность МЭКХ разделять рацемические смеси структур на О- и L-изомеры иш о.чьзусг-
ся в анализе наркотиков, если одни изомер является контролируемым, например в случае с
пропоксифеном, у которого правовращающий изомер (дсксгропроиоксифеи) контролируется
как наркотическое средство, а другой не контролируется — левовращающий изомер пропок-
сифена (левонропоксифсн).
398 Глава 6
В настоящее время циклолскс'грины и их прои анодные широко нрнмененяются в качестве
хиральных селекторов. Реакции, в результате которых получаются производные циклолекстри-
1юв. увеличиваю! число новых хиральных селекторов, способствующих лучшему разделению
стереоизомеров анализируемого вешества.
При разделении энантиомеров важную роль гмгряду с выбором подходящего игрального
селектора шрают н другие параметры электрофоретической системы Например, на процесс
оптимизации разделения энантиомеров решающее влияние оказывает величина pH. Вследс-
твие того что разделение энантиомеров методом КЭ основано на рахтични в подвижностях
между D- и L-формами. яназти тируемые вешества необходимо перевес!и в ионную форму, что
обеспечивается подходящим значением pH. При электрофоретическом движении анализиру-
емых всшсств через квазистацнонарную фазу (в данном случае ппклолскс грины) происходит
разделение пары шаптиомеров. Важнейшими оптимизирующими параметрами в данном слу-
чае валяются концентрация .игрального селектора в используемой буферной системе, сама бу-
ферная система (вид фонового электролит), а также другие буферные добавки и технические
приемы, например покрытие капилляра. Высокая производительность при разделении смеси
досгигается за более короткое время при применении покрытого полиакриламидом капилляра
(рис. 6-63). Основным недостатком в разделении энантиомеров является чисто аналитическая
направленность. Для решения препаративных задач метод малопригоден.
Микрозмулыиюнная мектрокинетическая капиллярная хроматография (МЭЭКХ) — относи-
тельно новый аналогичный метод, в котором формируются заряженные мнкроэмульсик для
образования гидрофобной псевдо.хроматографичсскои фазы.
Электрохроматография (ЭХ). при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ. а те-
чение элюента н перенос пробы происходят только за счет ЭОП, пока получила небольшое
распространение
Часто КЭ рассматривается как дополнительный метод при определении многих аналнтов с
помощью ВЭЖХ. Однако у КЭ есть много преимуществ. Данным методом могут анализиро-
Ряс. 6-63. Разделение знай ( номеров гексабарбгпала в капилляре с покрытием (4% линейный полнакрн I-
амил) — А и в капилляре без покрытия — Б.
Условия разделения: буфер 10 мМ натрия тетрабората с добавлением 1,56*¥ р-инклодекстрпна; pH 8.30;
дсгсктнрованне при 214 нм. ввод (гробы: I с. 2 кВ. 25 ’С.
Методы определения токсикангов в биосредах 399
взться очень м.ьтые пробы. Хотя К ) менее чувствителен но сравнению с ВЭЖХ. но он может
применяться для обнаружения при длинах воин ниже iex. которые обычно применяются в
жидкостной хромато)рафии (< 5 200 нм). КЭ используется для исследования широкого спек-
тра вешеств. нрн лом в одной пробе moivi быть определены анноны, катионы и нейтрально
заряженные частицы (особенно при М ЗКХ). КЭ проще и aeineiuie. чем ВЭЖХ. Сгоимос1ъ
оборудования для обеих систем приблизительно одинаковая, но КЭ значительно дешевле в
зкенлуатапип и не требует использования бо 1ьшого количества органических растворителей
/7/w ущсства КЭ но сравнению с газовой .хромато> рафией и ВЭЖХ:
• Разделяемые вешества мопт находиться в ионной и молекулярной формах, что прелстанля-
ei проблемы в тазовой хроматографии.
• По сравнению с ВЭЖХ отмечаются более высокие эффективность. разрешающая способ-
ность и скорость анализа (высокая р «решающая способность КЭ позволяет получить такое
же количество ников, как и при применении ВЭЖХ, но с меньшими атрагами и за более
короткий период).
• Для КЭ гребуегся существенно меньше расширителя по сравнению с ВЭЖХ. а капиллярная
колонка хчя КЭ значите пято лсшеате. чем капи ллярные к донки дл т ВЭЖХ или га юной
хроматографии.
• Для КЭ требуется значительно меньшее количество пробы и реагентов, чем для ВЭЖХ.
• При КЭ проще утилизировать лабораторные отходы.
Недостатки КЭ:
• Ограниченная чувствительность, при УФ аетектировянии (в 30—100 раз ниже, чем и ВЭЖХ)
• Затруднен сбор разделенных вешеств из-за механических проблем и m.lioio размера образ-
цов.
КЭ является перспективным методом иля технологии метаболомикп и метабономнки (см.
ix 3). Усовершенствование метода заключается в уменьшении размеров устройств (Lab-on-
chip). и сегодня они уже коммерчески доступны хтя ряда лабораторий, которые занимаются
анализом ДПК
Одним очень важным преимуществом КЭ но сравнению с ВЭЖХ является не только ис-
пользование малых проб, но также применение небольших количеств буферных растворов и
незначительный расход очень дорогих добавок к буферам (например, ииклолекс)ринов). При
применении градиента обращенной фазы в жилк сгнои хроматографии за неделю расходуется
большое количество (несколько литров) органических растворителей, гогла как при таком же
разделении с помошью КЭ расход составляет менее 100 мл обычного водного буфера. Такое
сбережение ресурсов сохраняет здорошл’ персон ыа. повышает безопасность проведения иссле-
дований и причиняет меньший вред окружающей среде.
Идентификация пиков в КЭ происходит гак же. как в ВЭЖХ. Отличие заключается, как
сказано выше, в том. что пробы движутся через детектор намного быстрее, а их количество и
концентрация приблизительно в 10 раз меньше. Детектирование вешеств происходит электрохи-
мически. спектрально шт. что более важно, с применением масс-спектрометра (см. табл. 6-30).
Схема устройства для проведения КЭ состоит из каптцт 1яра. детектора, источника высокого
напряжения и записывающего устройства (рис. 6-64)
Капилляры сделаны из расплавленного кварца и покрыты тонким слоем полиамида, что де-
лает капилляр гибким, препятствуя поверхностной гидратации. Наружный диаметр капилляра
375 мкм. внутренний 10 150 мкм Илина капилляра нс фиксирована, хотя допустимая длина,
обычно зависящая от расположения детектора как правн ю. указывается В КЭ применяются
стеклянные и плас тиковые капилляры, которые, однако, нс обладают достаточной Кронина»
мостью в коротковолновой УФ области. В настоящее время появились капилляры с покрыти-
ями. проницаемыми для УФ-лучеп. Температура капилляра строго контролируется.
Напряжение регулируется в области аг —30 до +30 кВ и при заданном значении долж-
но оставаться постоянным (но возможности). Максимально допустимая сила тока составляет
250 мкА. применение ббтыпнх значений на практике нецелесообразно. Кроме к»то. оказалось
выгодным, если или напряжение, или ток могли бы поддерживаться постоянными независи-
мо друг от друга. Напряжение но изолитьея к электродам через кабели высокого напряжения.
Электрод может быть представлен как простои платиновой проволокой, так и платиновой
трубкой диаметром примерно I мм.
400 Глава 6
«Вход»
капилляра
МПП =i
ш
Сосуд с пробирками
и буфером для проб
Детектор
Запись
данных
«Выход»
Сосуд
с буфером
Источник
высокого
напряжения
Рис. ь-64. Схема устройства для проведения КЭ
Очевидно, что комбинация водного раствора со тн и высокого напряжения требует соог-
ветствуюшсй системы безопасности. В современных приборах источник высокого напряжения
автоматически отключается при открывании емкости, в которой происходит анализ, гак что
несчастные случаи исключаются.
Компоненты пробы проходят через часть капилляра. в которой происходит детектирование
в режиме реатьното времени, или детектируются на копие капил «яра в режиме с разделением
времени. При этом следует отметить, что через детектор пробы движутся с различной скоро-
стью. Узкие пики, характерные для КЭ. додают необх тлимым применение быстрых детекторов.
Время ответа регулируется на большинстве детекторов и представляет собой отрезок времени,
необходимый на онрсдс теине пика. Узкие пики могут искажаться, если время ответа слишком
протяженное, а совсем узкие пики могут быть утеряны. Некоторые высокоподвижные анали-
зируемые вещества могут давать пики неправильной формы, если используется низкий темп
сбора данных, что может привести к неадекватным результатам количественного опрсдс тения
Высокий темп сбора информации дает лучшее представление о форме пика.
Стандартный детектор — это УФ-спсктрофотомстрнческнй детектор.
Ит-ш очень малой толщины слоя (средняя величина внутреннего диаметра каниллярти к
детекторам предъявляются высокие требования, касаюшисея чувствительности, шумов, вли-
яния светорассеяния и т.д. Для того чтобы птбежать потерн эффективности, детектирование
осуществляется прямо в капилляре. Типичная ширина зоны в каптылярс находится в пределах
5 мм. что соответствует объему 10 нл (капилляр диаметром 50 мкм). Крайне малый объем явля-
ется также причиной необходимости в очень высокой чувствительности по массе. Для рутин-
ного применения более важна концентрационная чувствительность. При УФ-детектнрованни
в КЭ концентрационная чувствительность в 30—100 рат ниже, чем в ВЭЖХ. Для повышения
чувствительности (за счет увеличения толщины слоя детектирования) были применены капил-
ляры прямоугольной формы, что улучшило результаты примерно в 10 раз. Используются УФ-
детск оры с постоянной или изменяемой длиной волны.
Спектральные данные могут искажаться из-за медленной записи при появлении пика с
очень крутыми краями. Детекиия с помощью диодной матрицы позволяет записывать много-
волновой спектр в режиме реального времени. При этом УФ-спсктры не искажаются за счет
медленной записи данных. В КЭ особенно важна быстрая запись спектров. Пробы, не облага-
ющие поглощением в УФ области, можно обнаружить с хорошей чувствительностью с помо-
щью непрямою УФ-дегектировання. Для этою к буферу добавляют электролит, обладающий
УФ-иоглошением. подвижность которого близка к подвижности раздстясмой пробы.
Методы определения токсикантов в биосредах 401
Помимо УФ-дстскторов. с нсд шпсю времени выпускаются также флюорссценгные детек-
торы. Оыичия or детекторов для ВЭЖХ заключаются. в основном, в длинах волн источников
света. Кроме обычно используемых дейтериевой п импульсной ксеноновой ламп, предлагаются
также более дорогие лазерные системы, возбуждение в которых происходи i в видимой области
.инн волн, поэтому применяются соответствующие производные апатита. Низкие скорости
потока (НЮ hj/mihi) делают возможным сочетание КЭ с МС, В исследовательских работах
используются и другие методы детектирования: спектроскопия комбинационного рассеяния,
измерение радиоактивности в режиме реального времени, круговой дихроизм, коэффициенты
пре юмлепия света, капиллярная вибрация.
Введение проб. Воспроизводимое введение пробы представляет в КЭ наиболее сложную про-
блему. Для того чтобы не вызвать уширения полос, зона пробы должна быть мала. Поэтому
необходимо вводить объем пробы ог 5 до 50 нл. Больший объем пробы быстро приводит к
искажению пика и ухудшению разделения. Чтобы отвечать этим требованиям, а также для
облегчения работы со столь малыми объемами, необходимы миниатюризация и автоматизация
вве сния пробы. Учтивая внутренний диаметр капилляра, необходимо устранить в пробе
механические примеси и осадки. Как и в ВЭЖХ. пробы лля анализа помешаются в вид гы
обычно вместимостью 1.5 мл. которые закрепляются в специальный штатив. Электролитные
растворы катода и анода обычно также помещаются в виге гы (1.5 мл г. В большинстве систем
для КЭ стремятся сократить испарение образовавшегося пара, чтобы нс изменить резулыаты
при анализе малых объемов.
Следует выделнтьлва способа введения проб: гидродинамический и электрокпистичсскнй. Гид-
родинамическое введение используется чаше. Введение щюбы обеспечивается созданием разницы
дадтений между сосудом для пробы и конном капилляра. при этом давление либо повышается
в сосуде для пробы, либо снижается на конце капилляра. Количество вводимой пробы зависит
только or разницы давлений и времени ввода пробы. Проблему ирн этом способе введения пробы
составляет сжимаемость газа. Во-первых, выбранное для введения давление должно быстро дости-
гаться. во । горых. админе давления после введения пробы не должно быть резким.
При элсктрпкннегическом введении сосуд с пробой, в который погружен капилляр, соеди-
няется с источником напряжения и под действием короткого импульса напряжения компонен-
ты пробы перемешаются в раздели тельный капилляр.
Выбор схемы определения токсикантов в биологических жидкостях или другом биологичес-
ком материале зависит от основных физико-химических наргметров определяемых вешеств.
Например, вещества, составляющие пробу, лучше разделяются в буфере. pH которого лежит
м жду значениями их рКа. На рис 6-65 представлена схема разделения метолом КЭ основан-
ным на параметрах анализ*.
Применение КЭ рассмотрим на примерах определения наркотиков и лекарственных ве-
шеств в биологических средах.
Общая система для анализа наркотиков и лекарственных средств. Табл. 6-31 С гзирхется на
работах разных авторов и объединяет их в общую систему (D. Реггей. 20041
Ограниченное число электролизных систем .зля КЭ нсподьзуегся в разделении разнообраз-
ных типов наркотиков и лекарственных средств. МЭКХ. особенно модифицированная добав-
лением сульфатированного р-ипклодскстрипа. часто применяется для анализа биологических
жидкостей. При этом идентификация осуществляется аналогично используемым в хроматогра-
фии подходам. В рассматриваемом виде разделения основным параметром для идентификации
является электрофоретическая подвижность, в отличие от ВЭЖХ и газовой хроматографии,
где используются другие показатели, такие, как время удерживания или объем удерживания.
Количественные расчеты в КЭ проводятся на основании величин высоты или площади никои
с применением абсолютной калибровки или с использованием различных вариантов метода
внутреннего или внешнего стандарта (см. выше). И в этом КЭ мало отличается от других видов
хром гтографии. Обычно КЭ показывает более высокое разрешение но сравнению с ВЭЖХ
При определении наркотиков или лекарственных препаратов в биологических жидкостях ме-
тодом КЭ воспроизводимость результатов количественною определения составляет 5—15% и
сравнима с воспроизводимостью ВЭЖХ.
Подготовка проб (см. гл. 5). Подготовка пробы для КЭ зависит от матрицы, анализируемых
вешеств. их концентраций, метода обнаружения, требуемой селективности и чувствительности.
402 Глава б
Направленный Ненаправленный Детектирование
анализ анализ по элактро-
проводимости
Рис. 6-65. Схема разделения методом КЭ, основанного па параметрах анизина (общие системы укатаны
в табл. 6-31).
В КЭ подготовка пробы должна достигать хотя бы одну, но желательно больше из нижепере-
численных целей.
• Увеличить селективность и концентрацию аналита.
• Стабилизировать анализ. определение которого затруднительно другими методами.
• Обеспечить контроль состава конечной пробы. pH. чрезмерного разбавления пробы.
• Удалить компоненты матрицы (например, белки), которые moivt влиять на конечные ре-
зультат.
• Разрушить комплекс анализируемого вешества с белками.
• Удалить механические примеси, которые могут забить капилляр.
• Обеспечить высокую степень извлечения анализируемого вешества из биологической мат-
рицы.
• Обеспечить работу с малыми количествами пробы, необходимы мн лля КЭ (менее 20 мл).
Методика определения наркотиков и лекарственных средств в биологических жидкостях без
экстракции. Для биологических жидкостей, которые не содержат белки (например, моча),
обычно требуется минимальная подготовка, которая зак иочается в фитьтрании пробы через
мембрану с размером пор 0.45 мкм или центрифугировании со скоростью 13000 об/мин (если
объемы слишком малы). Эти процедуры обеспечиваю! очищение пробы от крупных частиц,
которые могут закупорить просвет капилляра. Применение МЭКХ с использованием натрия
додецил сульфата (SDS) ласт возможность определять наркотики и лекарственные средства в
плазме, сыворотке н других биологических жидкостях без предварительной пробоподготовки.
Такой подход основан па применении SDS содержащих растворителей, способных разрушать
белки и при «том препятствовать их i алипаиню па стенки капилляра. При адсорбции белков
Методы определения токсикангов в биосредах 403
на внутренней поверхности капилляра она приобретают отрицательный заряд. что может при-
вести к замедлению элсктрофоретичсско! » перемещения.
Методики, основанные на жстракщш. Концентрирование пробы перед проведением ана'пвм
проводится методами лиофилизации. ЖЖЭ или ТФЭ. Экстракт из сыворотки, освобожденный
от протеинов, можно использовать лля КЗЭ и МЭКХ. Важно избежать чрезмерного разбавле-
пя и препятствовать преципитации. Конечный экстракт не должен быть более кислым или
щелочным по сравнению с буферным раствором. Значительная разнипл в pH и/или молярнос-
ти может дать бондную ошибку при анализе методом КЗЭ КЭ используется для определения
заряженных фрагментов молекул метаболитов наркотиков и лекарственных средств, таких, как
копью) азы с глюку роковой iliii серной кислотой.
Таблица 6-31. Сх мы проведения КЭ; обшие подходы (О. Peiren. 2004)
Обшне системы Состав буфера __Г pH Усни метод шя КЭ напря- жение (кВ) 1. •с Диализы
Л 25 ммоль натрия фосфата 2.8 КЗЭ 25-30 25 Водорастворимые, в ос- новном пентилы
В 20 ммоль натрия icrpaGopaia 9.2 КЗЭ 30- 25 25 Водорастворимые со- ставляющие кислотного хараюера
с 25 ммоль натрия тетраборат с 75 ммоль SDS 9,2 МЭКХ 15-25 20 Растворимые и малорас- тяоримые н ноле, заря- женные и нейтральные аналиты. эндогенные составляющие
D 10 ммп.н. натрия тетрабората с 2 ммоль ТТАВ и 5 ммоль натрия хромата 90 КИА 25-30 20 Водорастворим и ые дни оны
Е 10 MMO.1I. шорня тетрабората с 2 ммоль ГГЛВ и 5 ммоль имида- зола 9.0 КИА 25-30 Водорастворимые орга- нические и неорганичес- кие катионы
I 25 mmo.ii. натрия гетраборага с 75 ммоль SDS в 6.35 ммоль СУ 1Ьфй)-[}-и1!К.1О- декстрииа 9.2 МЭКХ. модифициро- ванная цик- лоп екс грином 18—22 25 Растворимые и малорас- i коримые в воде, заря- женные к нейтрал hi 1ые а нал иты. энлогег i ные составляющие
G Метанол с aneio- шприлом (50:50) и аммония аиеТа- фМ (1 ммоль) Неводный КЭ 20-30 Неполярные ан шгы
II Гентин (0.8%) +бутаиол-1 (6.6%) с 3.3% SDS в 25 ммоль iiaipiiH тетрабората 9.2 мээкх 20 30 Заряженные и нейтраль- ные аналиты. эндогенные составляющие
Примечание. ТТАВ — грнчетиттрплсипл аммоний бромид; SDS натрия лоасин.т сульфат.
К настоящему времени зиочилельное число различных классов токсикантов может быть
праналнзировано е помощью метода КЭ. Прежде всего, это относится к лекарственным препа-
ратам. наркотикам, пестицидам.
Исследование хиральных наркотиков и лекарственных средств в биологических жидкостях.
Для разделения энантиомеров применяются многие типы добавок к электролитам. На-
404 Глава 6
иболее простои метол — это добавление к электролиту Р-циклодекстрииа. поскольку его
конфигурация соответствует большому числу контролируемых веществ. Химически моди-
фицированный циклодекстрин. особенно сульфатное производное р-никлодекетрина. поз-
воляет разделить хиралытые смеси со спектральным разрешением между энантиомерами.
КЭ применяется для изучения метаболизма jnainномеров наркотиков и лекарственных
средств у человека.
Пример использования Mt/пода МЭКХв анаии/е наркотиков (данные предоставлены t.A. Си
моновым it В.А. Калашниковым. 2004. рис 6-66 и 6-67). Подобраны условия рахделеиня стан-
дартной смеси наркотиков, содержащей морфин, кодеин, героин, кокаин, амфетамин, ме-
амфетамин. Разделение проводили в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 50 мкм
п длиной 64.5 ем на приборе HP- I) производства фирмы «Хьюлетт Паккард» (США). Для
обнаружения и идентификации соединении применяли УФ-детектор с диодной матрицей, поз-
воляющей производить и мерснис поглощения и апнсь УФ-спектра без остановки разделения.
В качестве рабочего был использован буфер pH 9.5 следующего состава: 8,5 мМ боратного 6y<J>e-
ра: 8.5мМ фосфатного буфера; 85мМ долей ил сульфлд натрия: 15% ацетонитрила. Пробы вво-
дили в течение 10 е при давлении 50 мБ. Температура ра тел :ния составляла 50 с'С. напряжение
30 кВ. Запись элекгрофорстрамм проводили при длине волны 210 им. Перед каждым анализом
промывали капилляр 0.1 н. раствор* м NaOH. затем водо! . буфе|х>м и кондиционировали при
шп1ряжен||и 30 кВ. Пробы вводили гидродинамически. Дня проверки воспроизводимости вре-
мени миграции в течение 3 мес периодически провод пл и исследования тестовой смеси нарко-
тиков н выбранных условиях. Время миграции наркотиков воспроизводимо .тля всех исследо-
ванных наркотиков. Например, лля кодеина относительное стандартное отклонение времени
мт рации за этот период не превышало 0.5%.
Про граммнос обеспечение использованною прибора позволяет создавать собственные биб-
лиотеки спектров, но которым можно проводить сравнение получаемых в опыте результатов.
В настоящее время создана и активно пополняется библиотека УФ-спсктров наркошков и
других вешеств. которые могут быть обнаружены, например в образцах опия и героина. Коли-
чественное опре е юные наркотиков проводили на основании калибровочных кривых по стан-
дартным растворах, для построения которых использовали не менее 4—5 точек. Выбранные
ус шипя были использованы для исследования 12 образцов опия и героина, а также образцов
амфетамина, метамфетамина и кокаина, полученных из рахаичпых источников. По электро-
фореграммам можно идентифицировать основные алкалоиды опия: морфин, кодеин, тебаин.
Рис 6-66. Форсграмма опия. Условия рахтелсштя: кварцевый капилляр е внутренним диаметром 50 мкм
я длиной 64.5 ем. Для обнаружения и идентификации соединений применяли УФ-дстектор с иодной
матрицей, позволяющей производить измерение поглощения и запись УФ-спектра бе» остановки разде-
ления Пояснение в тексте.
Методы определения токсикантов в биосредах 405
Героин Кокаин
Рис. 6-67. УФ-летскцня при разделении смеси наркотиков методом МЭКХ. Пояснение в тексте.
папаверин и носкапин: при подобранных условиях они полностью разделяются и не мешают
количественному определению. Проведенные исследования ноказыпакм перспективность ис-
пользования КЭдля определения наркотиков.
Пример использования .метода КЗЭ- 4С в допинг-контроле при анализе образцов мочи на
содержание оксибугирата (данные нрелостаплсны Аиш юновой С А. Архипенко II.В 2005).
Профподготовка: аликвоту исслс усмого образна мочи разбавляли лпстилнронанной водой
в соотношении 1:4. Для нрелоткрашения лактоннипии у-окенбутировой кислоты добавляли
0.1 н раствор ширин гидроксила. pH полученного обра ща мочи ко пролировалп по индика-
торной (бумаге со шкалой (pH среды 13.0—14.0). Придет детектирования 0.5 мкг/мл. Основные
парамефы определения метолом КЗЭ-МС предс1ан.1епы в таблице 6-32.
Лайлина 6-32. Параметры ашицва метолом КЗЭ-МС*
Система KaiiiLi.iupnoio длектрофорезя
Капилляр Кварцевый капилляр Beckman. длина НМ) см. диаметр 50 мкм
Бчфср К) мМ aueiai аммония
pH 14.0
Приложенное напряжение 25 кВ
Термос г<н ироиание 25 ’С
Результирующий ЮК 40 мкА
Инжектор Пробу- вводили под давлением 0.5 psi / 5 с (1 psi = 6894.76 Па) Масс-снек триметр
Способ ионизации ) 1сктрораспылснис
406 Глава 6
Окончание math, 6-J2
Режим pel нет рани и PeniCTpuiiHH о|рпшпе.1Ы1ых ионов
Температура капил тяра 325 С
Температура распыляющего гада 250 С
Скорость ногоки распыляющего газа 3 л/мнп
Напряжение на капилляре 3500 В
Количество ноиов при заданном времени накоп- ления 3(1 (ИМ)
Максимальное время изоляции ионов 300 ме
Диапазон сканирования 50—108 m/z
Напряженке па умножителе 1930 В
* Воспрои шоднмость метода зависит от мсктропрово.шостн мочи
Таким образом, КЭ позволяет:
• достигать высокой эффективности радтелення с числом теоретических "тарелок более КГ при
хорошей массовой чувствительности до К) s—10 211 моль;
• на одном оборудов; нии рсашзовать множество режимов разде 1ення с различной селектив-
ностью;
• использовать малые обьсмы образца (несколько нанолитров)
Малый расход раствори телен и низкая стоп мость других расходных материалов, возможн теть
соединения с различными детекторами, простота оборудования свидетельствуют о tost, что в
самое ближайшее время этот метод будет широко пснолыоваться тля решения задач ХТА
В России налажен серийный выпуск системы капиллярною электрофореза «Капель» —
первого отечественного семейства приборов, предназначенных для реализации этою метала.
В состав семейства входят 4 модификации, аттестованные как средства измерения, а именно:
«Капель»""-1031’. «Капель»*-1031’Т, «Капель»*-104Т и «Капель»*-105. Проходят аттестацию но-
вейшие модели «Капель»*-КИМ и «Канель»я-105М. Выпускаются опытные модификации —
элскгроинжекнионные анализаторы «Капель»*-РЕ. Разрабатываются модели с встроенным
блоком потенциала течения «Капсль»'-ПТ. Системы КЭ «Капель» предназначены для количес-
твенного и качественного определения состава проб вешеств в водных и водно-органнческих
растворах На приборах любой из модификаций могут быть реализованы методики, относящи-
еся как к варианту КЗЭ. позволяющему анализировать только ионные компоненты пробы, гак
и к режиму МЭКХ. предназначенной лля анализа ионных и нейтральных форм веществ.
Новые технологии — мегаболомнка и метабономика — широко использую! МЭКХ для вы-
явления различий метаболизма токсикантов у индивидуумов. Большинство исследований про-
водятся относительно медленно (10—15 мин). Обычно в КЭ пробы ана. изируннся сериями,
при этом пропускная способность прибора в среднем составляет 80—100 проб вдень. Эконо-
мия времени может достигаться путем сокращения процедуры нроботю гогонки. что возмож-
но. учитывая селективность КЭ. Другое преимущество — работа в коротковолновой зоне УФ
(менее 210 нм), чго позволяет обнаружить гокенкаш бет добавления явных хромофоров.
6.3.6. Хроматографические методы
с масс-спектральным детектированием
Что такое истина? Соответствие наших сужде-
ний явлениям.
Л Лш)ро
Вдвойне лает гот. кто лае) быстро.
Сенека-старший
Метод масс-спектрометрии — наиболее быстроразвиваюшийся метод исследования моле-
кул. который позволяет решай» широкий крут аналитических задач.
Методы определения токсикантов в биосредах 407
Есть мною определении масс-спектрометрии. Лауреат Нобелевской премии но химии за
21Ю2 г. Д.Б. Фенн (J.B. Fenn) предложил такое: «Масс-спектрометрия — это искусство измере-
ния атомов и молекул с целью определения нх мс текулярпо/о веса. Такт информация о массе
или весе иногда достаточна. часто необходима, но все) а полезна лля идсн1ифнкацип вещест-
ва. da практике такое искусство заключается в размещении заряда на молекуле анализируемо-
го вещества и дальнейшем наблюдении за траекториями движения получаемых при этом попов
в вакууме под воздействием различных комбинации электрических и магнитных полей. Суть
данного метода заключается в превращении нейтральной анализируемой молекулы в ионы.
Лля небольших и простых аналитов такая ионизнния может быть осуществлена в газовой фазе
при взаимодействии их с электронами. фотонами или другими ионами. В последние годы уси-
лия исследователей были направлены на разработку новых технологий для получения ионов
настолько сложных и комплексных вешеств. что попытка их испарения и перевода в газовую
фазу обычно приводит к частичному или значительному. а иногда и к полному распаду иссле-
дуемой структуры».
Метод масс-сиектрометрип. в сочетании с хроматографическими методами за ни мае одно
из ключевых положений в ХТА как метол арбитражного анализа. позволяющий проводить
идентификацию неизвестных вешеств и их количественное определение в широком шаназоне
концентраций. Недаром эн ним закрепилось название золотого стандарта
Основные определения и понятия ( ушссгвеииос отличие масс-спекгрометрии о труптх ана-
литических спектральных, например оптических, методов состоит в том. что оптические мето-
ды детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектро-
метрии — непосредственно сами частицы вещества.
Прибор, осуществляющий измерение отношения массы фрагмента молекулы к его заряду,
называется масс-спектрометр. Попадая в нею, анализируемые молекулы, последовательно ио-
низируются. получившиеся в результате этого ионы разделяются в зависимости от присущих
нм отношений массы к заряду и детектируются Результатом этих процессов является масс-
спектр. который несет в себе ин(|юр.маии1о о молекулярной массе анализа и сю структуре.
Таким образом, масс-спектр ирелставляе! собой совокупность ннных об образующихся при
определенных условиях ионизации в результате распада конкретного вещества ионах и их ин-
тенсивности
Характеристический поп — обычно молекулярный ион или ею фрагмеш. присутствие ко-
торою в масс-спектре способствует идентификации вещества. Интенсивность ионов в масс-
спектре. хотя иногда она опускается, выражается в процентах к интенсивное!и максимальною
нона в данном спектре и называется относительной интенсивностью.
Масс спектрометры нобою вила обычно работают и двух режимах регистрации ионов: ска-
нирования (SCAN) полного или части диапазона величин отношения массы к заряду для иссле-
дуемого вещества или мониторинга характеристических ионов (селективный ионный монито-
ринг. S1M) этого и других вешеств в пределах определенного заданного времени (dwell time ).
Важно!! характеристикой метола является отношение сигнал/шум. которое представляет со-
бой отношение величины сшпала детектора к интенсивности систематических и ipyiiix помех,
вызванных разными причинами. Обычно соотношение 3:1 считается шачимым сточки зрения
регистрации сигнала анализируемого вещества.
Динамический диапазон (в масс-спектрометрии). Гели а нал и тылуют смесь, содержащую
99 99% одного соединения или какою-либо элемента и 0.01% какой-либо примеси, то долж-
ны быть уверены, что правильно определяют и го и другое Для гою чюбы быть уверенным
в определении компонентов в этом прим ре. нужно иметь диапазон линейности в 4 порядка.
Современные масс-спектрометры при определении вещества органической природы имеют
динамический диапазон в 5—6 порядков, а масс-сиектромсгры. предназначенные для хтсмент-
ного анализа — в 9 -10 порядков. Динамический диапазон в 10 порядков означает, что примесь
в пробе будет видна даже тогда, кота она составляет 10 мг на К) г.
Разрешение (разрешающая способность) масс-спектрометрии — количественная мера, ха-
рактеризующая способность анализатора разделять ноны с соседними массами или. иначе го-
воря определяю точную массу иона. Для магнитных масс-анализаторов расстояние между
пиками масс-спектра ие зависит от массы ионов и разрешение представляет < обой величину,
равную М/ДМ. Эта ветчина как правило, определяется ио 10% высоте пика. Так. например.
408 Глава 6
разрешение КЮО означает, что пики с массами 100.0 и 100.1 атомных единиц массы (а.е.м.)
отделяются друг от друта. т.е. не накладываются вплоть до 10% высоты.
Для анализаторов. у коюрых расстояние между пиками меняется в рабочем диапазоне масс
(чем бо лие масса, тем меньше расстояние), таких, как квадрупо.зьныс анализаторы. ионные
ловушки, врсмянролетныс анализаторы. строго говоря, разрешение имеет другой смысл. Разре-
шение. определяемое как М/ДМ, в данном случае характеризует конкретную массу. Эти масс
анализаторы принято оценивать по ширине пиков, величине, остающейся постоянной во всем
диапазоне масс. Она обычно измеряется на 50% их высоты Для таких приборов ширина пика,
на н< лувысоге равная I. является неплохим показателем и означает, что такой масс-аиализаюр
способен различить номинальные массы, отличающиеся па 1 практически во всем сто рабочем
диапазоне.
Номинальной массой или массовым числом называют ближайшее к точной массе иона целое
число в шкале атомных единиц массы. Например, масса иона водорода Н' равна 1,01)787 а.е.м..
а его массовое число — 1 пли I Д. Такие масс-анализаторы, которые в основном измеряют
номинальные массы, называют анализаторами низкого разрешения. Ионные jioi ушки в узком
диапазоне масс могут работать как масс-спектрометры высокою разрешения, обеспечивая
как минимум разделение пиков, отстоящих на 1/4 а.е.м. друг от друга. Масс-спектрометры с
двойной фокусировкой (магнитной и электростатической). ионно-циклотронною резонанса —
приборы среднего пли высокого разрешения. Разрешения в несколько тысяч можно добивать-
ся при использовании времяпро.тетных масс-анализаторов.
Разрешение тесно связано с другой важной характерна икон — точностью измерения массы.
Измерение масс заряженных частиц позволяет определять брутто-форму.ту исследуемого ве-
шества. Эю возможно благодаря г му, что атомные массы элементов и их изотопов нс являют-
ся целочисленными величинами, при чем yciaiioLtieiio. что в природе соотношение изотонов
одного и того же элемента обычно неизменно.
Таблица 6-31. Точные массы стаби. ьных изотопов легких элементов
Элемент Изотоп Точная масса Частота встречаемости в природе
Попорол и 1.007825 99.985
D 2.0141(1 0.015
Углерод ,;С 12,0000 9S.9
•с 13,00335 1.1
А 301 NN 14.00307 99.63
15.00011 0.37
Кислород “О 15.99491 99.76
'О 16.99913 0.04
|«О 17.99916 0,20
Основываясь на данных табл. 6-31, для иона с номинальной массой 28 Д можно пояобод-
рать следующие формулы:
СО N CH.N- C.Hj
,:С 12,0(8)0 ,4N । 28.0062 С 12.0000 -С 24.0000
15.99491 'П 2.0156 и 4.0312
27.99491 "N 14 00307 28.0312
28.01867
Молекулярные ионы будут регистрироваться масс-спектрометром порознь при разрешении
2500. а гочное значение массы даст ответ, какой из газов регистрируется. Измерение точной
массы доступно на приборах с двойной фокусировкой или на тандемном квадрупольпом масс-
спектрометре. Масс-спектрометрия помогает установить молекулярную формулу анализируе-
мого вещества с достаточно высокой степенью надежности. Более юго, при переходе к слож-
Методы определения токсикантов в биосредах 409
иым молекулам устаиоитение изотопного состава вещества позволяет решать ряд серьезных
зналитических задач, например установление региона производства различных наркотиков или
определение потребления синтетических допингов (с.м. гл. 7 и 9).
История развития масс-спектрометрии насчитывает более 100 act.
IS98 i. — Дж. Д. Томсон (JJ. Thomson) определил отношение массы к «ряду у электрона.
1901 г. — В. Кауфман (W. Kaufmann) использовал прототип масс-спектрометра для измере-
ния релятивистских масс электронов.
1905 г. — Дж. Д Гансом начал изучение положительных пучен.
1906 i — Дж. Д. Томсон удостоен Нобелевской премии по физике за вкш в нюрстическвс
и пракшчсскис исследования э юкзропроно шмостн taion.
1912 г. — Дж. Д. Томсон создал первый масс-спектрометр и получил мясс-спектры молекул
кислорода, азота, угарного гам. углекислого газа и фосгена.
1913 I. — С помощью своего масс-спектрометра Дж. Д. Томсон открыл изогоны неона —
неон-20 н неон 22
1919 -1923 if.
1931-1939 п.
194< -1942 п
1946-1948 it.
1953—1959 гг.
1966 г. -
1974-1980 it.
1941 — 1982 п
I9S3 г. -
1984 г. —
1987 г. -
1989 г. —
1999 г. —
2(Ю2 г. —
Ф. Астон (Fr. Aston) сконструировал первый масс-спектрограф с разрешающей
способностью 130. В это время ему удается измерить дефект массы. В 1922 г.
ему присуждается Нобелевская премия по химии за многочисленные открытия
нерапиоактнвных элементов, сделанные с применением масс-спектрометра, и за
разработку правила целых чисел в масс-спектрометрии.
Е.О. Лоурсни (Е.О. Lawrence) скоиетруировал циклотрон.
Первые работы по масс-снсюрометрии органических молекул.
Дж. Матгаус (J. Mattauch) и Р. Хсрзог (R. Herzog) ра работали масс-спекгрометр
двойной фокусировки.
А. Дсмистср (ArJ. Dempster) разработал искровую ионизационную камеру.
Ф. Аегон сконструировал масс-спсктромстр с разрешающей способное!ью 2000
Е.О. Лоурсни удостоен Нобелевской премии за разработку циклотрона.
Е.О. Лоурсни разработал промышленный способ получения урана-235 иа основе
метода масс-спектрометрии
Разработана концепция и создан первый врсмяпролегпый масс-зналнзатор.
3. патентованы квалрупо !ьный мисс-анализатор и конная ловушка.
Создан первый газовый хромаго-масс-спектрометр.
Открыта химическая ионизация.
Выпушен нервын жидкостной хромато-масс-спектрометр.
Промышленность освоила выпуск oiuocnrc.ibiio недорогих масс селективных
детекторов для газовой хроматографии.
Создан ношгатор с бомбардировкой быстрыми атомами (FAB) и с его помощью
получен первый масс-спектр молекулы белка (инсулина).
Изобретен гермоспрсй интерфейс.
МЛ. .Александров п Дж. Фени независимо друг от друга разработали элскт-
роенрей интерфейс.
Разработана ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI).
X. Дсхмслт (H.G. Dehmelt) и В Пауль (W. Paul) получили Нобелевскую премию
за разработку ионной ловушки.
А Макаров изобрел элекфосгагическую ионную ловушку. Эго изобретение сей-
час рассматривается как самое крупное достижение за последние 20 лет.
Нобелевская премия но химии присуждена двум группам ученых, разработавших
два вила мягких методов десорбции и ионизации для мЛсс-спсктрального нее л -
лопания биологически активных макромолекул: Дж. Фенн (J.B. Fenn) за разра-
ботку электроенро интерфейса (ESI) и К. Танака (Koichi Tanaka) за разработку
метода MALDI
Оборудование тля проветения исс гедовапий методом масс-сиек г рометрни обычно состоит из
нескольких основных блоков На рис. 6-68 приведена принципиальная блок-схема масс-спек-
трометра.
Системы ввооа образное были одним из первых этапов в разрабогке масс-спектрвдьпого
оборудования. Это обусловлено необходимостью введения образцов, находящихся в условиях
410 Глава 6
Рис ( f)8 Примкнииалымя блок-схема масе-спсктрометра.
нормального атмосферного давления (760 торр. или мм рт ст.) в прибор, анализирующие час-
ти которого функционируют в условиях вакуума около 10 '• торр. причем в момент введения
нежелательны скачки давления в ту или иную сторону. К настоящему моменту разработано
несколько подходов к решению этой проблемы, коюрыс рассмазриззизогся ниже.
Прямой wod веществ в камеру ионизации используется тогда, когда образец не может быть
проанализирован хроматографическими методами. В этом случае в зависимости от азрегат
ною состояния образца применяют просзейннгй метол введения газообразных либо жидких
образцов в исто* ник ионов через мембранный фильтр. Этот способ хорошо работает с газа-
ми, жзыкоетями и твердыми веществами с высоким давлением паров. В некоторых моделях
предусмотрено пезначтельное назревание образцов до 100—150 'С. Приборы с такой сис-
темой ввода, отличающиеся компактностью и простотой, широко используются в нефтега-
зовой и химической промышленности, а цзкже в качестве детекторов и сигналя зазоров гздя
мониторинга опасных ззезнеегв (обычно е молекулярной м iccoli до 300 Д) в окружающей
среде.
Среди таких приборов много мобильных и компактных — для исследований во вне.табора-
горных условиях.
Классическими вариантом раеем;п решаемого подхода являевея вакуумный шзок с конзро
лируемой температурой. на конззе которого располагается впала (DIP — Direct Insertion Probe)
или казод с нанесенным на него образцом (DEP — Direct Exposure Probe), которые широко
применяются для введения жидких и твердых образцов. Проб!, помещенная в короткие капил-
ляры или металлические стаканы, через вакуумный замок пролавливается в ионизационную
камеру масс-спектрометра. где происходиз ее ззозгонка иод действием вакуума и повышенно)
температуры, намного большей, чем при рассматриваемом ранее прямом введении парообрл
пых веществ. При пзком введении к чистоте образца предъявляются повышенные требования
Ниже приведены особенности каждого из эзих подходов.
Прямой ввод (DIP):
Образен находится зз мнкропнале.
Н.презмние по земнературноз! прозр.змме (ло
40(1 *С максимальная скорость нагревания то
200 ‘C/miiii).
Aiilltih твердых проб широкого профиля.
Прямое испарение (DEP):
• Обра зен нанесен непосредственно на казод на
грен.тгеяя.
• Баллистическое нагревание для ускорении нс
парения
• Анализ высококиняшнх соединений
Современное оборудование позволяет использовать прямой ввод наиболее эффективно для
решения ряда задач XIА и криминалистического исследования наркотиков, зекарезв и дру-
знх обз>екк>в. В лом случае особенно полезной оказалась ношежзкктз> йена ьзоззания масс-
сисктромстра в режиме тазздемной масс-спектрометрии. Выбор характерного дочернего иона
интересующего анализа и интегрирование профиля напуска как хромагографичсскозх) пика
Методы определения токсикантов в биосредах 411
позволяют получать не только качественные, по и количественные данные о содержании ин-
тересующею исследователя анализа
Некоторые ведущие приборостроительные фирмы выпускают собственные модификации
устройств для прямою введения образцов. Например, устройство Chromatoprobc фирмы «Ва-
рнак» (США) разработано на базе хроматографическою инжектора для газовою хроматографа
этой фирмы, оно оптимально подходит для термически стойких соединений и позволяет вво-
дить образен в масс-спсктромстр без нарушения вакуума. Образен помешается в микровиалу.
импульсно нагреваемую в зоне инжектора. После испарения проба ио короткой переходной
линии поступает в масс-спектрометр и анализируется в режиме электронного удара и. и хи-
мической ионизации. Преимуществами этой схемы як яюгся отсутствие риска возникновения
вакуумной течи при постоянном вводе и выводе штоков DIP и DEP. а также существенно
менынсе загрязнение масс-анализатора компонентами образна (типичная ситуация при ис-
парении пробы и области источника ионов). При работе с Chromaioprobe все малолетучие
компоненты матрицы остаются в микротзиалс. С использованием такого устройства некоторым
авторам удавалось исследовать ЛСД и его метаболиты и волосах наркоманов практически без
пробонолготовки и за короткий промежуток времени до 10 мин.
Прямая ионизация объекта исследования как система введения анализируемого вешества в
м тес-снектрометр в настоящее время активно ра «раба ты вас гея фирмами-производителями
оборудования. Прямая ионизания предназначена для исследования высокомолекулярных ве-
шеств с применением жготичссктп методов ионизации: бомбардировки быстрых и агентами
ионизации коронарным разрядом и т.д. В анали зе наркотиков практически нс используется.
А здкоспиая хроматография применяется для введения в источник ионон гермолабилытых
вешеств. разделение которых метолом газом и хроматографии невозможно. При этом под-
ходе ионизация исследуемых вешсств осуществляется мобильной фазой. В наст ом шее время
такие устройства (интерфейсы) между жидкостной хромат от рафией и масс-спектрометрией,
как хтекгроспрсй (ESI). .химическая ионизания при атмосферном давлении (АРС1), фотоио-
низация при атмосферном давлении (APPI). уже вошли в практику многих лабораторий мира.
Механизмы функционирования, возможности и недостатки этих н других способов будут рас-
смотрены ниже.
Газовая хроматография наиболее распространенная в настоящее время техника введения
образцов в масс-спектрометр. При такой системе введения в источник ионов попадают таз-
носитсзь. исследуемое вешество и некоторое количество загрязнителей (стационар!тая фаза,
масло). При использовании капиллярной колонки одни из се концов вводится нсносре гствен-
но и источник ионов. При использовании колонок большего диаметра применяют различные
модификации целителен и сплиттеров для уменьшения потока газа-носителя. Избыток газа-
носителя удаляется из спектрометра с помошью насосов вакуумной системы.
Методы ионизации. Ионизация — процесс, происходящий в ионизационной камере и при-
водящий к образованию ионов анализируемого вещества. Под методом ионизации понимается
мехтннзм ионизации и в тоже время источник ионизации — хстроисгво, внутри которого опа
осушествляе гея.
Все методы ионизании. применяемые в масс-спектрометрии, обычно можно разделить на
группы: протонированис. депротонированис (депротонация). катионизация. перенос заряжен-
ных частиц из жидком в тазовую фазу, захват или потеря электронов и др.
И ратинирование является методом иони танин, нрн kotojxim к анализируемой молекуле при-
соединяется протон или несколько прогонов, добавляя молекуле каждый раз +1 к сс общему
заряду. Приобретенные таким образом заряды. затем перераспределяются в сторону наиболее
стабильных в этих условиях частей молекул, например аминотрупн, с образованием стабиль-
ных катионов. Таким способом часто ионизируют пептиды. Этот вид ионизации (рис. 6-69)
характерен для ионизации лазерной десорбцией при содействии матрицы (VIALD1). элект-
роспрей-ионизании (ESI) и химической ионизации при атмосферном давлении (АРС1).
Депротонирование (депротонация) как метод ионизации заключается в отнятии у нейтраль
ных молекул протонов, приводящему к уменьшению на I суммарною заряда для каждого
изъятою протона. Этот подход полностью реализован в MALDI, ESI и APCI при исследова-
нии веществ кислотного характера, таких, как фенолы, карбоновые н сульфоновые кислоты
(рис. 6-70).
412 Глава 6
М + Н' —► МН'
H.N-RGASRR-OH + Н" —* МН'
Пептид
МН.
702.4
2'
1.
m/z
750
д
Рис. 6-69. Схема протонириваиия и получаемый спекгр.
Рис. 6-70. Схема дспротопиронанни (.1спротонаиии) и масс-спектр отрицательных ионон сна. той кис-
ЛО1Ы.
Катионизация как метод ионизации заключается и образовании заряженных частиц, нс обра-
зующих ковалентные связи положительно заряженных ионов и нейтральных молекул. Основ-
ным отличием этого механизма от нрогонироваиия является использование таких катионов,
как катионы щелочных металлов или алюминия. Этот подход оказался полезен для нестабиль-
ных при протонировапии молекул, так к »к уменьшаются делокализация заряда в молекуле и.
следовательно, ее фрагментация (рис. 6-71). Этот метод может быть реализован с применением
MALDI. ESI и APCI.
Перенос заряженных веществ в газовую фазу обычно осуществляется нулем десорбции и нт
распыления жидкости в газ. MALD1 и ESI достаточно просто реализуют па практике этот при-
ем. На рис. 6-72 показан масс-спектр положительных ионов тетрафенп лфосфина, полученный
с применением такого метода ионизации
Электронный уОар как метол ионизации осуществляется при бомбардировке нейтральных
молекул анализируемых веществ п чком электронов определенной энергии При этом молеку-
ла теряет электрон и получает заряд Г, который быстро перераспределяется, образуя радикалы
и катионы. Этот вид ионизации наиболее подходит лля относительно неполярных низкомо-
лекулярных вещест в. При этом обычно хорошо видна фрш мен гания исследуемой молекулы
(рис. 6 73).
414 Глава 6
Рис. 6-74. Схема ионизации захваюм здек трона и масс-спектр тексахлорбензола
Преимущества и недостатки методов ионизации приведены в табл. 6-32.
Габлииа 6-32. Методы ионизации, их преимущества и недостатки
Мети, ионизации Преимущества Недостатки
Протон и рован нс. обim iуютен и ал о хите льны с ионы МноРие вещества могут прини- мать протоны и пони тироваться. Проводится с помощью ESI. APCI MAI DI 1 AB. Cl (ем табл. 6-331 Многие вещества нестабильны при проюнпровлнии. напри- мер yi.денолы. или не мемут принимать протоны например уч ле водороды
К;пионизация, образуются по- ложительные ионы Многие вещества способны взаимодействовать с кантонами \а* или К' и ионизироваться. Проводится с помощью ESI. APCI. FAB. MALDI Фрагментация затруднена или вообще не осуществляется при работе н гамдемпои масе-снскт рометрии
Дсирототшроваште (денротона- ния). обра уются отрицатель- ные ионы Наиболее подходит для исс.че- доиания веществ кислотного характера. Проводится с помощью ESI APCI. FAB. MALDI Очень специфична и чувстви- тельна к структуре вещества
Перенос заряженной молекулы в газовую <|жзу, образуются по- ложнтезытые и отри нательные ИОНЫ Подходит только змтя веществ, которые в растворе уже нахо- дятся в ионизированной |юрмс. Проводится с помощью ESI APCI. FAB. MALDI 11епо!1изиро1к1нныс в расiворс вещества нс определяю гея
Электронный улар. образую! с я нодюжительныс ионы Наблюдается нрн ионизации электронами и может пр ю- статтить информацию о молеку- лярной массе и фр т мен шипи а нал и ли рус мо й .молекулы Часто нолхчасм тя фрат менташтя слишком избыточна. Имеются трудности в опреде- лении молекулярного иона, что создает проблемы в идентифи- кации и интерпретации шну- ченных результатов
Электронный захват, обра слот ся отрицательные ноны Наблюдается при ионизации злектронамн и может предо- ставить информацию о молеку- лярной массе и фрат ментаиии а нал и тируемой молекулы 1 Часто получаемая фрагментация слишком избыточна. Имеются тру шести в опреде- лении молску тярного иона, что соиает т роблемы в илентнфн канин и интерпретации полу- ченных рстультатов
Источники ионов. Только четвер ь пека назад исследователи в области фармакологии, био-
химии и судебной медицины начали использовать в своей работе масс-спектральпос оборудо-
вание. Ею возможности были ограничены исследованием относительно ннзкомолекучярных
Методы определения токсикантов в биосредах 415
веществ и газонов фате, ионизация которых происходила при помощи электронного удара.
Однако иейчк ситуация значительно изменилась, недаром мировое научное сообщество при-
судило гак мною самых престиж ых премий ра работникам добившимся успехов и сознании
новых подходов к масс-спсктральным нсслстованиям. В табл 6-33 приведены отдельные раз-
работки в этом направлении, которые уже используются в ХТА или существуют прогнозы об
их возмож юм и успешном применении в будущем
Габаниа 6-33. Источники ноннзаиин. условные сокращения и принципиальные схемы функционирова-
ния
Источник ионизации Ус. овное сокращение Схема функционирования
-Эле к i рос пре и 1 SI Выпаривание заряженных капель
Напохзекгроспрсй nano ESI Выпаривание заряженных капель
Химическая ионизация при а мосфсрпо.м давлении Al’C 1 Коронарный разряд и перенос протонов
Ионизация лазерной десорб- цией при coieiiciHHH млтрнны MALDI Абсорбция фотонов и перенос протопоп
Фотоионизация при атмос- ферном .именин APPI Абсорбция фотонов н перенос протопоп
Бомбардировка быстрыми атомами FAB Десорбция ионов и перенос притопов
Электронный удар M Электронный пучок и перенос злекгронов
Химическая ион и зл ция CI Перенос протонов
В настоящее время за рубежом наиболее широко pacnpociраненными источниками ионов
являются MALDI и ESI, а также в некоторой степени APCI (рис. 6-75) В нашей стране в
основном применяют приборы с электронным уларом и иногда как опцию химическую по-
им ынию. Однако за последнее время гакос положение стало выравниваться, хотя не очень
быстрыми темпами
Эмктроспрсй (эмектрораеншение) Электроспрсй своим появлением в конце XX века про-
извет революцию в масс-спектрометрии. Хотя сама идея .электрораспыления не была нова —
почти за по.твека до этого Чапмен проводил эксперименты этим методом ионизации, в 60-х
100 1000 10 000 100 000 1 000 000
Диапазон масс в дальтонах
Рис. 6-75. Современные источники ионов. типичные диапазоны измеряемых масс и чувствительность
исследований.
416 Глава 6
Скиммер
Калт фазы
Капилляр I I
//кмасс
“^И-лактрометру
азотом I I
X Вакуум
Рис. 6-76. Принципиальная схема работы э.1ектроспрся.
годах XX века Дойл вновь ввел его в практику исследований. Он же открыл явление много-
зарядпости молекул. Однако (ж Ь. Фенн и соавт. впервые применил электрораспыление для
введения жидких проб (рис. 6-76) в масс-спектрометр, за что в 2002 год получил Нобелевскую
премию ио химии.
Принцип действия электрораспылення заключается в следующем. Подвижная фаза из ВЭЖХ
полается в капилляр, заканчивающийся иглой с диаметром oi верст ия 0.I мм. иа которую по-
лается высокое напряжение порядка 6 кВ. На выходе из иглы в источнике ионов образуется
аэрозоль из заряженных капель с высоким поверхностным зарядом. Эти капли движутся к про-
зивоэлсктроду. В том же направлении уменьшается давление, хотя оно будет оставаться почти
атмосферным до самою нрсигивоэлсктрола. По мере про вижения капли теряют растворитель
и становятся все меньше. Этому способствует имеющийся на них заряд. Провесе идет до об-
разования мнкрокапсль. содержащих одну заряженную чаепшу. которая переходит в тазовую
фазу после удаления остат ков раствори геля (рис. 6-77).
Схематически показанный тта рис. 6-77 процесс ионизапни на самом деле гораздо сложнее.
Заряд, подаваемый тта капилляр, прпводтгг к образованию так называемого конуса Тейлора ко-
торый оказывает существенное влияние на весь провесе в целом. Большое значение для успеха
ионизации имеет скорость потачтт подвижной фазы. Обычно оптимальным потоком считается
I—50 мкл/мин При продувке азотом источника ионизации от п роти во электрода к капилляру
улучшаются условия выпаривания жидкости, тт скорость подачи подвижной фазы увеличив!
стся до 200 мкл/мин. На современных приборах предусмотрена установка дополнительных
устройств, позволяющих работать со скоростями подвижной фазы до 2 мл/мин.
Игла Конус
Многократно
мряжаням*
Анализ
раствориты
Достигнут гюадвп Рапвя
при котором силы кулоновского
опатмвамия рвэдомкп кеглю
Многократно
з»р«миные
кропи
Протавоэлектрод
Рис. 6-77. Схема образования микрокапель и перехода веществ из жидкой в газовую фазу
Методы определения токсикантов в биосредах 417
Эдектрораспыленис широко используется как рутинный метод при исследовании пептидов,
белков, углеводов, небольших ио длине олигонуклеотидов. синтетических полимеров и липи-
дов в медицине, биохимии и других областях. Метол хорошо зарекомендовал себя при прове-
дении ХТА. Он идеально подходит лля сочетания с ВЭЖХ и КЭ.
При использовании потоков до 20 мкл/мин качественный масс-спектр можно получить при
введении в прибор не более I амоль (IO” М) вешества. и в тоже время максимальная мо.теку-
ia. которую удалось анализировать этим методом. — молекула ДНК бактериофага Т4. масса
которой составила I К) ООО 000 Д.
Одним из преимуществ ESI является возможность измерять массы высокомолекулярных ве-
шеств. При этом используется одна из особенностей масс-спектрометрии, которая заключается
в измерении не самой массы попа, а отношения его массы к заряду. В связи с этим большие
молекулы, имеющие молекулярную массу 50 000 Д и заряд I00*. будут измеряться так же. как
ионы с молску ирной массой 500 Д и одиночным положительным зарядом.
Важным фактором, атияющим на качество получаемых результатов при использовании ESI,
являс1ся выбор растворителя для подвижной фазы. Растворитель подбирается на основе рас-
творимости в нем анализируемого вещества, летучести этого растворителя и способности его
отдавать протон. Типичные растворители для рассматриваемого метода: метанол, метанол —
иола (50:50) иди смеси ацетоншрила с водой. В некоторых случаях для улучшения растворимости
апатитов применяют апротонные растворители, такие, как смеси лиметзысульфоксида (ДМСО)
с водой (до 10% ДМСО) или изопропиловый спирт. Чистая иола тоже может использоваться лля
разделения веществ с последующим определением I х при помощи ESI, однако при этом нужно
помнить, что вода имеет ни зкую летучее! ь и давление насыщенных паров что приводит к сниже-
нию селективности и чувствительности определения. Таким образом, добавление в жидкую фазу
легколетучн.х компонентов приводит к повышению чувствительности определения веществ.
.Ты надежного определения некоторых веществ к подвижной фазе требуется добщдять хло-
роформ и 0.1% раствор муравьиной кислоты. Этот подход широко применяется при исследо-
ваниях нерастворимых в воле вешсств. Также для повышения чувствительности часто испоть-
зуют калий- или нагрийсодержашпс буферы. Однако нелетучие остатки после их испарения
могут повредить спектрометр. Лучшим выбором в этом случае являются летучие буферы на
основе ацетата пли формиата аммония.
Особенно много внимания сейчас уделяется разработке методов профилирования физиоло-
гически активных вешеств с целью выявления на ранних стадиях различных заболеваний или
уширебления активных веществ. В Ahi тюнинговом центре Москвы проводятся исследования
в данном направлении, в гом числе с помошью элемроспрея. Ниже приведены резульины
получения профилей глюкокортикостероидов и стероидных гормонов (2006). Исследования
проведены ид оборудовании 1100 HPLC with LC/MSD Trap SL фирмы Agilent в режиме эдек
трораспыления с регистрацией отрицательных попон. На рис. 6-78 приведены профили этих
веществ у здорового и больного сахарным диабетом.
Модифицированный метод ESI называется наноэлектроспреем (nano-F.SI). в котором за счет
резкого уменьшения скорости потока подвижной фазы до нескольких десятков или сотен на-
нолитров в I мин удалось на 2 3 порядка улучшить эффективность образования ионов анали-
зируемого вешества. Конечные заряженные частицы в этом методе имеют размер в нсскс. ько
раз меньше, чем в классическом варианте. Еще одним преимуществом метода является сниже-
ние количества необходимого хтя исследования вещества и времени анализа, иногда и первое,
и второе довольно значительное.
Недостатками метода считают большую зависимость результатов от чистоты пробы и ис-
поль vcmhx реактивов.
Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI) широко используется для соедине-
ния жидкостного хроматографа и масс-спектрометра уже с 7()-х годов XX века. Этим методом
генерируют ионы непосредственно в растворе и анализируют как полярные, так и неполярные
низкомолекулярные вещества, например гормоны, стероиды, пссгинндь!. лекарственные пре-
параты. молекулярной массой до 1200 Д. Этот метод довольно близок к электроспрею Прин-
ципиальная схема проведения АРС1 представлена на рис. 6-79.
Механизм АРСЕ поток подвижной фазы из колонки направляется в распылитель, где ук-
рашается в мелкодисперсный аэрозоль под действием нагретого до 350—500 °C газа, чаще
Профиль глюкокортикоидов и стероидных гормонов здорового человека
Рис. 6-78. Хромаю! рифичсские профили инококортнкостероилоп и стероидных гормонов у хлоровых и больною сахарным шаботом II гнпа, по-
лученные с применением оборудования с ESI
418 Глава 6
Методы определения токсикантов в биосредах 419
Скиммер
Ппдеикне-
фаза
Ионы
Распыляющая головка Келпи фазы /
♦ анализ /
Г жэ-осуци'жл»
Продувка
.азотом
™ф“тг*Лк Конус
Коронарный рюряд
Атмосферное
давление
Капилляр
/ К масс .
V •жтромеру
Вакуум
Рис. 6-79. 1 IpiuiuHriiiajbiKui схема источника ионов в АР< I
всего азота. Полученная смесь попадает в область ионизации, которая осуществляется под
действием коронарного разряда, так как в это/ области источника ионов поддерживается ат-
мосферное давление. Иногда вместо коронарного разряда используют слабые эмиттеры элек-
тронов. например фольгу из wbJi. В этих условиях происходит химическая ионизация анализа.
В качестве реактанта выступает подвижная фаза.
Рассматриваемый метод ионизации наиболее подходит для исследования низкомолекуляр-
ных вешеств. Ниже в качестве примера приведены результаты проверки фармакокинетических
параметров нового лекарственного средства моксонндина. который является аналогом гипо-
тензивного средства клофелнна. Действующая доза его ниже, чем клофелнна. Количественное
определение моксонндина провод! ти в плазме крови добровольцев. подучивших разовую дозу
моксонндина 40 мкг через рот. Исследуемые вещества выделяли из плазмы крови при помощи
ТФЭ Условия хроматографирования: колонка 150 мм ZORBAX Eclipse XDB-CI8 с разме-
ром зерен 3 мм. Изократичсский режим. Подвижная фаза 10% ацетонитрила в буфере 5 мМ
формиата аммония в дистиллированной воде с добавлением муравьиной кислоты. Скорость
0.7 мл/мин Интерфейс — APCI. Режим исследования. продукты распада молекулярного иона
моксонндина (242 пл//) и клонилина(230т/7.). Предел обнаружения метола составляет 0.01 нг/мл
моксонндина в плазме крови. Степень извлечения моксонндина из плазмы крови составила
'2 ± 2%. Цикл анализа 6 мин (рис. 6-80).
Данный метод ионизации применим, гак же как и ESI. в режиме положительных ионов,
когда происходи! нротопированис исследуемых молекул, или в режиме отрицательных ионов.
Фрагментация в этом методе но сравнению с ESI ниже, также не образуются ити образуются
в меньшей степени mi югозарядные ионы.
Фотоиони шция при атмосферном давлении (APPI) — метод XXI века — только в последние
годы завоевывает внимание исследователей, в том числе и экспертов в области ХТА. В этом
методе относительно неполярные вещества ионизируются прямо в растворе. Так же. как в ме-
толе APCI. ноток из колонки попадает в ионизационную камеру. Однако затем он облучается
УФ-светом, обычно от криптоновой лампы мощностью 10—10.6 эВ*, что приводит к иониза-
ции молекул аналита. Часто APPI бывает более чувствительна, чем ESI и APCI при меньшем
значении параметра сигнал/шум и меньшем фоновом шуме Эго происходит из-за высокого
потенциала ионизации метанола и воды (10.85 и 12.62 соответственно), которые крииюновои
лампой не ионизируются.
Недостатком ESI и APCI является образование фоновых побочных ионов с используемым
растворителем. Кроме того, при использовании ESI наблюлас ich подавление образования ио-
нов. а применение APCI требует для испарения высокой температуры — до 350—500 °C. кото-
рая может при вес hi к гермора южению анализов.
* Электронвольт. внесис-гсмнля единица энергии. применяется лля измерения энергии и массы микрочастиц; обозна-
чение эВ. I зВ“1.601x10 |чДж= 1.602x10 ,:эрг. Кратные единицы: I кэВ=10’эВ. I МэВ=10*эВ, I ГэВз=10’эВ. 1 атомная
елпишы м.ксы соотвстстнуст 031.5 МэВ.
420 Глава 6
хЮ4;
+MS2(242,0), 1.2-3.1 min
1.25;
1,00-
206,0
S 0.75-
€0
X
Л
5 :
| 0,50-
X
° 0,25-
0-L-=
100
120
149.0 1"'°
13?° h - 17?-° , 1 I.
140 160 180 200 220
Рис. 6-80. Масс-спектр моксонилпна в условия* A PCI n MC-MC и
его структурная формула.
, J
240 m/z
В APPI ионизация проходит по двум возможным механизмам.
Первый — это прямое фоторазложение, при котором аналнг теряет электрон и генерируется
радикальный положительно заряженный ион. Мощность облучения подобрана таким образом,
чтобы она превышала потенциал ионизации исследуемых веществ, нс влияя на растворители
и воздух. Поскольку на ионизацию затрачивается минимум энергии, фрагментация молекул
минимальна.
Второй, очень похожий на АРС1. механизм — это индуктированная фотонами химическая
ионизация при атмосферном давлении, которая может продуцировать в результате протониро-
вания ионы МН и и в результате потери прогона ионы (М-Н)’. Для инициации химической
ионизации поя воздействием света в элюент должен быть добавлен специальный инициатор
(dopant), причем для положительно!! и отрицательной ионизации должны использоваться раз-
ные вещества. Обычно эту роль выполняет анстон или толуол в работе с положительными
ионами Хотя иногда ацетон используют и дтя отрицательного режима регистрации ионов.
Ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI) — метол ионизации высо-
комолекулярных нелетучих и термолабильных веществ. Это направление активно развивается,
однако применение этою метода при работе с веществами, имеющими молекулярную массу
менее 700 Д. возникают определенные сложности. Полому этот способ ионизации практичес-
ки нс применяется в ХТА. Аналогичная картина наб. ютается и с другим методом ионизации —
бомбардировкой быстрыми атомами (FAB).
Ионизация электронным ударим (Г1). В нашей стране при проведении ХТА EI является са-
мым широко применяемым методом. Это обусловлено тем. EI позволяет проводить рутинные
измерения небольших гидрофобных, термически стабильных молекул и получать чрезвычайно
полезную информацию о фрагментации анализируемой молекулы для идентификации токси-
канта. Широкое распространение метода, большое количество высококачественных прибо-
Методы определения токсикантов в биосредах 421
ров. с одной стороны, стабильность получаемой картины фрагментаиии. востпропзводих ость,
хорошая предсказуемость и обьясннмость получаемых результатов — с другой, позволит к
настоящему времени собрать обширные библиотеки масс-спектров различных токсикантов н
их метаболитов. Число вешсств в таких базах данных составляет несколько сотен тысяч, а чис-
ло спектров .тля одного вешества может доходить до нескольких десятков. Во многих случаях
идентификация веществ осуществляется путем поиска масс-спектров по таким библиотекам.
Например, при обнаружении нескольких масс-спектров, близких с искомым и соответству-
ющих одному веществу, но снятых в немного различающихся условиях, можно утверждать с
очень высокой долей вероятности о том. чго идентификация неизвестного вешества проведена.
При использовании современных средств вычислительной техники и специализированного
математического обеспечения такая информация может быть получена в течение нескольких
десятков секунд прямо во время проведения хроматографическою анализа.
Особенностью оборудования является необходимость нахождения анализируемой пробы в
газовой фазе и при достаточно высоком вакууме. Для этого твердые и жидкие образцы ана-
лизируют путем использования устройств для прямого введения (ввода) образной (см.выше).
Другой путь — это использование капиллярной газовот хроматографии для введения образцов.
Современное оборудование позволяет ртботать с капиллярными колонками с внутренним диа-
метром 0.25—0.32 мм. непосредственно введенными в источник ионов.
Обычно ионизацию электронных ударом используют для исследования веществ с моле-
кулярной массой 400 -500 Д. Багсе тяжелые вещества труднее переводятся в газовую фа у,
подвергаются термнческ му разложению или при фрагментации дают грудноицтерпретируе-
мые спектры. Расширению диапазона поиска исследуемых вешесгн служит дернватнзаиня. при
которой получаются по сравнению с исходными веществами более летучие и стабильные при
нагревании, имеющие другие пути фрагментан ш. Таким способом удастся максимально под-
нять верхний предел молекулярной массы исследуемых вешсств ло 700—800, реже I000 Д.
Механизм формирования положительных ионов при электронном уларе заключается в сле-
дующем. В источнике ионов за счет нагревания нити накаливания и электрических полей
формируется пучок электронов мощностью 70 эВ, и анализируемая молекула в газовой фазе
проходит через него. При этом электроны перелают часть своей кинетической энергии прохо-
дящей молекуле, происходи г потеря электрона — ионизация молекулы. Большая часть из 70
эВ теряется, но остаточной эенргии (около 6 эВ) хватает для начала процесса фрагментации.
Заряженная молекула превращается в молекулярный ион с последующим образованием ионон
фрагментации и нейтральных фрагментов. Процесс за: вага электронов практически всегда
менее эффективен, и только вещества, имеющие большое сродство к электрону, ионизируются
путем присоединения электрона (рис. 6-81).
Химическая ионизация (CI) часто используется я.то исследования образцов, ранее анализи-
ровавшихся с применением метода EI. В таком варианте получаемая информация значительно
дополняет друг друга. Если EI предоставляет информацию о фрагментации анализируемой
молекулы, то С1 за счет резкого снижения фрагментаиии и увеличения молекулярного иона
наиболее подходит для опрсдезетшя массы вещества.
При С! вещества попадают в источник ионов, так же как и при EI Процесс ионизации ини-
циируется специальным газом реактанто.м. подаваемым в камеру ионизации и который под
воздействием электронов ионизируется сначала сам Обычно в качестве такого газа выступают
метан, изобутан или аммиак. Высокое давление газа-реактанта в источнике ионов приводит к
взаимодействию его с полученными ионами и анализируемыми молекулами:
Реагент (R) + с -» R' + 2 с
R + RH -» RH + R
RH* + аналит (А) -> AH’ +• R
В отличие от EI. в этих условиях образуется молекулярный ион аналита и практически по-
давляется его фрагментация. С другой стороны, требования к термостабильности и способнос-
ти вешества переходит в паровую фазу без разложения в С1 те же. чго при EI
При химической ионизации используются в качестве аналитического сигнала как поло-
жительные. так и отрицательные ионы. Для масс-спектрометрии отрицательных ионов при
химической ионизации (NCI) необходимым условием является присутствие в структуре ана-
422 Глава б
Рис. 6-81. Схеми функционирования псточ
ника ионов при электронном ударе
лизируемого вешества заместителей с высоким сродством к электронам, например галогенов,
пигрофенильных групп и др. Присутствие их может повысть чувствительность определения
вещества с использованием NCI на 2—3 порядка по сравнению с Е1. По мнению многих авто-
ров. использование NC1 в хромато-масс-спектрометрии позволяет достичь наибольшей чувс-
твительности для низкомолекулярных веществ. Возможности \< I еще больше расширяются
при введении в анализируемое вещество элсктронозахвагных групп при его дериватизании.
В табл. 6-34 приведены сравнительные характеристики методов (источников) ионизации.
Таблица 6-34. Сравните ьные характерце гики методов источников ионизации
Методы Молект' яркая масса. .1 Влияние матрицы Деградация аиалитов Смесь вешеств Совместимость с ВЭЖХ-МС 4} ют вн гельность, f
ESI 70 000 Нет Пет Анализ иногда гатруд- неп Очень хорошая 10,з._|0-о
Приме- чание Очень хорошо приспособлен для работы с ВЭЖХ-МС. сильное влияние на резулыа! ока- зывают соли. возможна работа с многозарядными ионами, смеси могут оказывать сильное влияние на ионизацию, мягкая ионизация, т.е. набаю icicb низкая фрагментация
Nano- F.SI 70 000 ! Нет Нс г । Анализ иногда затруднен, но но сравне- нию с ESI ВЛИЯНИС меньше Хорошая, но низкие скорости потока могут вы- вать проблемы ЮП_|0 >»
Приме- чание Относительное слабое влияние солей на процесс ионизации, возможна работа с многоза- рялиымн ионами, но при исследовании смесей возможно сильное н давление ионизации, мягкая ионизация, т.е. незначительная фрагментация.
APCI 1200 Нет Тср.мораз- рушенне Анализ и могла затруд- нен Очень хорошая Выше 10,J
Приме- чание Очень хорошо приспособлен лля работы с ВЭЖХ-МС. довольно сильное влияние на ре- зулыаг оказываю! соли, хорошо подходит лля исследования гидрофобных веществ
APPI 1200 Нет Фотодиссо- циация Анализ возможен Очень хорошая Выше 10”
Приме- Очень хорошо приспособлен для работы с ВЭЖХ-МС. довольно сильное влияние на ре-
чагше _зультат оказывают соли, хорошо подходит для исследования гидрофобных нешсстн
Методы определения токсикантов в биосредах 423
Окончаний modi 6-34
MALDI 300 ООО Да _1 Фо толпе- Хорошие сониапия резуль- и нзаимо- таты для действие с смесей матрицей пробы Хорошая 10
Приме- чание Ишмла соли могут подавлять ионизацию, очень хорошая чувствительность. при исследо- вании низкомолекулярных ионов iinoiaa возникаю! проблемы с фоном матрицы, мшкая ионизация, возможна фотодиссоциация вешеств. метод подходит для комплексных смесей, ешь ограничения при работе с многозарядными ионами, что снижает возможности приме- нения при МС-МС
EI 500—800 J Пет Термоде- 01 ран и- гралапия ченное приме- нение в ГХ-МС Очень ограничена 10 '
Приме- чание Хорошая чутзствитсльность. получение уникальных данных фрагментации, коммерчески доступны обширные базы данных по фрагментации, содержащие до нескольких сотен ты- сяч спектров, основная проблема при аиалигс ohojioi ических объектов— гормодссгрукция веществ, ограниченный диапазон анализируемых масс
С! 500-800 Hei Термоде- Огрвни- градаиия ченное приме- нение в ГХ-МС Очень ограничена 10*
Приме- чание Более мягкая ионизация по сравнению EI. проблемы с тер.модсградаиией
Примечание. Использованы материалы The Scripps Center for Mass Spectrometry 10550 North Toney
Pines Road La Jolla, California. I ISA.
Масс анализаторы. После проведения ионизации образна оншм из описанных выше ме-
тод в сумма образовавшихся ионов попадает в масс-анализатор. За время развития масс-
спекгромегрии разработано несколько видов таких анализаторов. Каждый из них имеет свои
преимущества и недостатки, а самое главное, свою стоимость, порой немалую. При выборе
прибора необходимо четко представлять круг задач, которые планируется решать с его помо-
щью. и насколько точны и адекватны поставленным задачам будут получаемые с их помощью
результаты.
В основе качественных характеристик любого масс-анализатора лежат быстродействие, точ-
ность определения массы и его разрешающая способность. В ХТА чаше всего используются
магнитные секторные анализаторы, киадрунольиыс фильтры и квадрувольные фильтры — нон
мая ловушка. В этом разделе представлены некоторые новые анализаторы, появившиеся в
последнее время.
Какой бы конструкции ни был мжсс-аиалнзатор. какой бы механизм ионизации ни приме-
нялся. всегда нужно помнить о том. что масс-спектрометры измеряют не массу, а величину
отношения массы нона к его заряду.
Этот факт часто приводит к серьезным затруднениям в интерпретации полученных резуль-
татов. Например, ион (С e,Ot4);< имеет молекулярную массу 976.5 Д а отношение массы
к заряду 488.3.
Получение многозарядных ионов характерно лля ВЭЖХ или КЭ и ионизационных методов,
разработанных для них. например ESI. Для газовой хроматографии больше характерно обра-
зование однозарядных ионов.
Как отмечалось выше, основными характеристиками работы масс-анализаторов являются:
точность, разрешающая способность, диапазон измеряемых масс, скорость сканирования и
возможность проведения многократного сканирования масс (МС-МС).
Точностьмасс-анализатора определяется стабильностью и разрешающей способностью при-
бора. Например, при заявленной точности 0,01% прибор надежно определяет молекулярную
424 Глава 6
массу пептида 1000 Д с ошибкой ± ОД Д или лля леи шла с молекулярной массой 10 000 Д с
ошибкой ±1.0 Д
Диапазон мисс масс-анализатора — один из основных Нарццетров прибора. Например, лля
квалрупольиого фильтра типичный диапазон составляет 3000 m/z. для магнитного секторного
прибора — до 10 000 m/z. а у время проле того лианазон практически нс лимитируется.
Возможность мс-мс-анамза представляет собой возможность масс-анализатора проводить
многокрапюе циклическое исследование выбранных ионов. Например, проводится исслс.т >-
ванне вешества. выбирается его характеристический ион. фрагментация которого исследуется,
снова выбирается характеристический пои и исследуется его фра|мснтация с целью выбора
характеристического нона и так далее. Под этим процессом подразумевайся тандемная масс-
спектрометрия или МС". Указанной способное imo облазают лишь некоторые масс-анализато-
ры. Их характеристики будут рассмотрены ниже.
Скорость сканирования — важнейшая характеристика масс-анализатора. Многие из них обла-
дают низкой скоростью, для сканирования полного диапазона требуется несколько секунд. Здесь
необходимо отмстить. что типичная ширина хроматографического пика в капиллярной .хрома-
тографии составляет 2 с. С другой стороны. времяпро етпый анализатор способе i провести пол-
ную развертку по всему диапазону измеряемых масс за несколько миллисекунд и даже меньше.
Магнитный секторный масс-спектрометр. Данный масс-аналнзатор исторически был пер-
вым. Первые приборы с таким анализатором появились в 50-х юлах XX века. Фактически
они представляют собой комбинацию из большого электромагнита и некоторого вида элек-
тростатического фокусирующего устройства. На рис. 6-82 показана схема такого анализатора
двойной фокусировки.
Принцип работы заключается в том. что ионы из источника ионов при помоши ускоряю-
щего поля и системы электродов попадают в магнитный сектор анализатора. Сканирование
напряженности магнитного поля приводит к фокусировке ионов в определенном месте анали-
затора мониторной шели. Здесь ионы собираются в соответствии со своими массами. Для по-
лучения спектра высокого разрешения ионы фильтруются через электростатические, фильтры
в соответствии со своими кинетическими энергиями. После этого ноны фокусируются в точке,
ведущей к детектору.
Начиная с момента появления, секторные приборы практически одни обеспечивали пот-
ребности науки в масс-спектрометрах. особенно в приборах высокого разрешения: секторные
приборы характеризуются диапазоном масс до 10000 Д. чрезвычайно высокой точностью их
измерения (< 5 • 10^%) и динамическим диапазоном 10 . Давление в анализаторе не должно
превышать 10* мм рг. ст. Например, новый хромаго-масс-спек1рометр с двойной фокусиров-
кой высокого разрешения модели DES фирмы Thermo Electron (США) имеет стандартный
паспортный параметр чувствительности прибора, характеризушейся отношением сигнал/шум
800:1 для введенных в колонку 100 фг 2,3.7.8-тетрахлордибепзо-р-диоксина при измерениях иа
высоком разрешении в режиме MID.
Рис. 6-82. Схема магнитною анализатора двойной фокусировки
Методы определения токсикантов в биосредах 425
Рис. 6 83. Схема квалруиольного авали штора.
К настоящему времени появились приборы высокою разрешения, альтернативные сектор-
ным магнитным, например масс-спектромстры с Фурье-преобразованием. Анализаторы такой
конструкции используются п сочетании с газовой хромазо1рафисй и ионизацией электронным
ударом или химической ионизацией отрицательных и положительных ионов. Магнитные при-
боры широко используются в изотопной масс-спскгромстрни.
Квадрупольные ана изаторы были разработаны одновременно с квадрупольпымп фильтра-
ми — ионная ловушка. Фильтр состоит из четырех параллельных стержней 1иисрболичсско-
го сечения. Противоположные стержни электрически соединены друг с другом и находятся
под напряжением, состоящим из постоянного тока п радиочастотной компоненты. Два других
имеют равную ио величине, но противоположную ио знаку компоненту постоянною токи и
сдвинутую па 180’ радиочастотную компоненту'. Через квадруполь пролегают только те ионы,
которые находятся в резонансе с его частотой. Сканируя частоты, можно добиться пропуска-
ния через ф пыр только выбранных ионов (рис. 6-83).
Квадруполь лс1ко управляется компьютером, имеет хороший динамический диапазон НУ.
стыкуется со всеми системами ввода, способен без модификации анализировать положитель-
ные и оipiiнательные ионы, обл naei высокой скоростью сканирования. небольшими разме-
рами и ценой. У квалруиольного анализатора не слишком высокие требования к давлению,
он нормально работает уже при 5 10' мм рт. ст. Диапазон масс современных квадруполей
составляет 3000—4000 Д. Разрешающая способность — обычно нс более 500. т.е. это приборы
низкого разрешения.
В настоящее время простейшие приборы, фактически детекторы для газовой хроматогра-
фии, представляющие собой один квадрупольный анализатор ионов элюатов из капиллярной
колонки, образовавшихся в результате электронного улара, в нашей стране составляют основу
приборного нарка лабораторий, проводящих ХТА. Эти приборы пртхчы. относительно дешевы
и помогают решать большое число аналитических задач.
В последнее время получило распространение использование в газовой хроматографии или
ВЭЖХ масс-спектрометров с 3. 5 и более квадруполями, которые позволяют проводить иссле-
дования дочерних ионов методом МС-МС
К нсдостажам квадрупольных анализаторов можно отнести не широкий диапазон масс и
низкую ра решающую способность.
Квадрупольный анализатор ионная ловушка был разработан одновременно с кщлрупольным
фильтром, однако первые коммерческие приборы появились в 1983 г. К настоящему времени
этот вид анализатор за счет новейших разработок становится одним из самых популярных, в
том числе при проведении ХТА. Этому способствуют его характеристики, например диапазон
регистрируемых масс составляет до нескольких десятков тысяч дальтон, разрешающая способ-
иость — ло 25 000, возможность работы в режиме МС" где п можез доходц-И до 10. Считает-
426 Глава 6
Рис. 6-84. Схема квалрупольнсмо анализатора ионная ловушка.
ся, что ионные ловушки оптимизированы для работы с низкими концентрациями аналнтов.
На рис. 6-84 представлена схема квадруюльного анализатора ионная ловушка.
Основой прибора являются 3 электрода: два концевых гиперболическом формы, обычно
заземленных, и один кольцевой электрод между ними, на который подастся радиочастотное
напряжение мегагерцевого диапазона. Эта система электродов создает некое подобие ячейки,
в которой ионы могут удерживаться значительное время. Для ионизации образна чаше исполь-
зую! электронный удар или химическую ионизацию. Работа анализатора осуществляется в
импульсном режиме, например подача электронов в ловушку (0.1 — 10 мс) вызывает ионизацию
некоего количества молекул образца. Образовавшиеся ноны какое-то время удерживаются н
ловушке. В классическом варианте импульсное изменение амплитуды радиочастотного напря-
жения. приложенною к кольцевому электроду, заставляет ионы с определенным отношением
массы к заряду переходи>ь на нестабильные траектории и покидать ловушку, попадая на элек-
тронный умножитель. В результате генерируется масс-спектр.
К преим ществам этого анализатора можно отнести и его дешевизну, это самый дешевый
масс-анализатор.
Получаемые с помощью ловушек масс-спектры несколько отличаются от классических м.н-
ншных или квадрупольных, что резко снижает возможности использования библиотек масс-
спектров для идентификации веществ.
Вре.ютролетный анализатор (TOF) основан на простейшем принципе: скорость разогнан-
ных ионов обратно пропорциональна их массам.
eV = mv1/! или т = 2eV/v\
где V — ускоряющее напряженно.
Если ионы двигаются в полой трубе, то места регистрации они дости ают в порядке увели-
чения своей массы. Анализатор такого типа крайне прост и дешев, а его диапазон масс прак-
тически не лимитирован. Еше одним преимуществом является то, что все ионы, попавшие в
анализатор, доходяг ло детектирующей системы. Это обусловливает увеличение чувствитель-
ности почти в 100 раз по сравнению со сканирующими приборами.
К преимуществам времяиролетного анализатора относятся более высокая чувствительность
по сравнению со сканирующими приборами; очень высока скорость записи спектров, до не-
скольких сотен за I с: практически неограниченный диапазон масс, разрешающая способность
более К) ООО. самые разнообразные источники ионов, идеальный второй анализатор при работе
в режиме МС-МС; небольшие размеры.
На рис. 6-85 показан пшичный масс-спектр протонированного эпитестостерона в моче
человека, полученный при APCI элюатов из обрашеннофазовой ВЭЖХ-колонки с использова-
нием прибора, оснащенного времянролетным анализатором (TOF).
Электростатическая ионная ловушка (LTQ Orbit др) — это первь и масс-аиали затор за по-
следние 20 лег, базирующийся на фундаменгально новом принципе действия (рис. 6-86).
Методы определения токсикантов в биосредах 427
289,2159
1 10+5
100+5
8.00+4
е
5 8.00+4
I 7 00+4
2
| 6 00+4
?
§ 5.00+4
В
° 4 00+4
О
3.00+4
200+4
1 00+4
Эпитестостерон
Мв288
М+Н 289,2162
Наблюдаемый Мв
289,2159
Разрешение 6890
271.2051
287,1997
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
1*нс. 6-85. Типичный спектр протонированного эпитестостсроиа в моче человека при APCI ГОГ-MS LC.
По сообщению концерна Thermo Electron (США), впервые в 2005 г освоившего выпуск обору-
ования. работающего на этим принципе, только за текущий гол, несмотря на достаточно вы-
сокую стоимость, уже собрано и продано более сотни таких приборов, что говорит о больших
ожиданиях к отношении эффективности этого оборудования.
Ионизация образна происходит в ионном источнике в режиме ESI, APCI, АРР1 и.ш MALDI
Ионы через систему ионной оптики попадают в швейную квадрупольиую ловушку, которая мо-
жет работать как отдельный прибор, детектируя ионы двумя вторично-электронными умножите-
лями. расположенными ортогонально к оси квадрупольнои ловушки. Этот прибор обладает рядом
преимуществ, может эффективно работать в режиме МСП. выполнять множественные функции
зависимых отданных сканирования и автоматически регулировать число ионов вдовушке.
Истом* ионое
Лнзейзая иомая ловуига
С-ТРАП
Рис. 6-86. Принципиальная схема электростатической ионной ловушки
428 Глава 6
Все MJM огобранные иолы выбрасываются из линейной ловушки в аксиальном направлении
и квадрулольной ионной линзой направляются в ловушку, называемую С-Trap. Эга ловушка
заполняется сухим газом (азот) при давлении менее 10* торр. На электроды С-ловушки пода-
стся потенциал таким образом, чго ионы сжимаются в плотный пакет и этот пакет ускоряется
ионно-оптическими электродами и выталкивается в орбитальную лоз ушку. Пакет ионов влета-
ет в ионную ловушку в точке, отсюяшсй от ее центра, ионы закручиваются электрическим по-
лем вокруг центрального электрода и начинают когерентно осциллировать вдоль оси ловушки
без какого-либо дополнительного возбуждения. Все ионы в орбитальной ловушке будут оснил-
лирошиь с одинаковыми амплитудами, по частота осцилляций будет зависеть аг отношения
массы к заряду в соответствии со следующим уравнением.
где со, — частота осцилляций вдоль продольной оси орбитальной ловушки, m/z — отношение
массы к заряду, к — константа кривизны поля.
Детектирование этих аксиальных осцилляций выполняется по наведенному изображению
тока на внешнем электро ic орбитальной ловушки. Для этого внешний электрод разделен изо-
лятором ровно в середине гочки симметрии ловушки. Ток каждой половинки внешнего элек-
трода усиливается и преобразуется в цифровой сигнал. Ионы с определенным отношением
массы к заряду характеризуются и определенной аксиатьной частотой. Разделение частот раз-
личных ионов происходит с применением преобразования Фурье (см. гл. 6-4).
Размеры орбитальной ловушки ионов невелики: диаметр внутреннего электрода в централь-
ной его части 8 мм, наибольший диаметр внутренней поверхности 1>пешцего элекгрода 20 мм.
Ионы внутри электростатической орбитальной ловушки двигаются в виде плотного шнура. Для
того чтобы не происходило его рассеивания, необходим значительный вакуум, который поддер-
живается внутри орбитальной ловушки на уровне 10 |в торр (мм рт. ст.) с помошью 3 турбомоле-
куляриых насосов. Даже при столь низком вакууме происходит столкновение ионов с частицами
фона, что приводит к потере фазовой когерен i ности и выпаданию ионов из ловушки.
Другое требование, которое необходимо выполнять. — максимально стабильное электро-
питание. Флюктуации питания и рассеивание ионов ограничивают время пребывания ионов в
ловушке 2 с, за это время разрешение по массам достигается порядка 150 000.
Стандаршый режим работы LTQ Orbitrap™ предусматривает время сканирования 1 с. из
которых 750 ме ионы находятся в орбитальной ловушке и детектируются но изображению
тока, навсдснного па внешнем электроде ловушки. Другие стадии анализа происходят гораздо
6bicipee: приблизительно 15 мс занимает ирсскан системы AGC. от I до 100 мс ионы проводят
в линейной квадрупольной ловушке, 20 мс — в С-Тгар и менее 10 мс занимает перенос ионов
в орбитальную ловушку.
В табл. 6-35 приведены основные характеристики масс-анализаторов.
Таблица 6-35. Основные характеристики масс-анализаторов
Характеристи- ка масс-анали- заторов Квадруполь Ионная ловушка Время-пролет- ный Магнитный Электростати- ческая ловушка
Точность. % 0.01 0.01 0.02 Менее 0.0005 Менее 0.005
Разрешающая способность 4000 4000 8000 30 000 150 000
Д <ап:пон масс. Д 4000 41)00 Ьолее 300 000 10 000 Ьолее 300 000
Скорость сканирования Секунды Секунды Миллисекунды Секунды 3d 1 с до 4 полных сканов
мс-мс МС2. три квад- руно.тьные модели МС" МС МС3 До МО"
Методы определения токсикантов в био< редах 429
Окончание matu. 6-35
Примечание к Хорошая МС МС точность, разрешающая способность, низкая энергия соударения Хорошая точность, разрешающая способ! ос ть, низкая энергия соударения В петом с режимом МС- МС не сочета- ется Ограниченная разрешающая способность, высокая энер- гия соударе- ния Прекрасная совместимость и разрешаю- щая способ- ность
Обшсс Низкая стон- зпключение мость леткое переключение отри нательно- го и положи- тельного ро- жи МОП работы Низкая стои- мость, тегкое переключение отрицатель- ного и поло- жи 1СЛЫЮ1 о режимов ра- боты. хорошо подходи г для МС" Низкая стоимость Требует ис- пользования массивного оборудова- ния, высокая разрешающая способность С помещает лучшие ка- чества ана- лизаторов по разрешающей способности, диапазону масс, чувстви- тельное? к
Методы детектирования ионов
Без современных методов детектирования ионов получить результаты невозможно. Детек-
тирование ионов является еще одним ключевым моментом успеха масс-с11ек1роме1ричсского
исследования. Конечно, выбор соответствующею устройства для детектирования зависит от
ряда условий и главным образом от пошавлепной аналитической задачи.
Любой масс-спектральный детектор генерирует сигнал при взаимодействии с ионами не-
посретственно или вторичными электронами или фотонами, которые образуются в нем после
втаимодей тния с измеряемыми ионами. Обычно токи, которые генерируются пучками ионов
с одним значением m/z. крайне малы и составляют 10' — 10 гА. Для их измерения требуются
специальные подходы.
Первыми детекторами, использованными в масс-спектрометрии, были фотопластинки, ко-
торые плавно перемешались вдоль выходного копна масс-анализатора и на которые подавали
пучки ионов. Места, в которые попадали пучки, были светлыми, а темные места соответство-
вали отсутствию ионов. Основные типы масс-детекторов.
Чашка Фарадея, или цилиндрический электрод, — очень простое устройство. Основным прин-
ципом ею действия является излучение электрона при ударе иона о поверхнос1Ь вторичною
электрода с последующим усилением и измерением полученного тока. Обычно динод* изго-
товляется из оксида бериллия, сплавов цезия и других редкоземельных металлов. Хотя чашка
Фарадея — малочувствительный детектор, но она чрезвычайно полезна в некоторых областях
масс-спектрометрии, например в изотопном ана. изе.
Электронный умножитель представляет собо усовершенствованную модель чашки Фарадея, в
которой происходит многократт ое усиление сигнала ионов — до 10- раз. Существуют две основ-
ные модификации электронною умножителя (рис 6-87). Модификация б. называемая рожками
(•horn») в последнее время используется чаше. Эффективность обоих модификаций примерно
одинакова. н. что очень важно на практике, срок их службы 1—2 юла. Эю связано с загрязнени-
ем поверхности из-за взаимодействия с поступающими ионами и неглубокого вакуума. Иногда
перед первым динодом устанавливается ускоряющее ыектростатическое ноле, за счет чего уве-
личивается скорость движения ионов и как следствие повышается чувствительность.
Принцип работы фотоумножите я. или сцинтилляционного счетчика, следующий. Первона-
чально ноны ударяют в дикол в результате чего высвобождается электроны Затем эти элект-
роны ударяют в особый фосфореснентный экран, который в свою очередь выбрасывает поток
фотонов, попадающих потом в ум ножи i с ь, где под действием тех же процессов, что описаны
выше, умножаются и измеряются (рис. 6-88). Преимуществами |х>тоумножителя являются кар-
динальное увеличение срока эксплуатации устройства и сто меньшая подверженность внешним
• Динод |ог греческого dyntamis) — сида и (электрюд!. электрод в фотоэлектронном умножителе. обла-
дающий высоким коэффициентом вторичной электронной эмиссии
430 Глава 6
Рис. 6 87. Схема работы электронного умножителя.
Рис. 6-88. Схема работы фотоумножителя
загрязнениям. В настоящее время это, по-видимому, основной тип детектора, используемого
в масс-спеыромсгрии.
Вакуумные системы в масс-спектрометрии необходимы для штатном работы масс-детекто-
ров. В случае недостаточно глубокого вакуума образовавшиеся в источнике и разделенные с
помошью масс-аналнзатора ионы будут взаимодействовать с молекулами воздуха, не дохо-
дя до детектирующей системы, чго приведет к катастрофическому снижению эффективности
и чувствительности. Более того, высокое давление может послужить причиной разрушения
электронных частей прибора и управляющего им компьютера из-за высоковольтного разряда,
способного образоваться в этих условиях. Серьезные неполадки в вакуумной системе также
опасны для масс-спектрометра.
Вакуумная система масс-спектрометра является одним из ключевых участков этого прибо-
ра. от штатного функционирования которого зависит качество получаемых спектров.
Обычно вакуумные системы масс-спектрометров работаю в 2—3 этана. На первом дости-
гается разряжение КН торр (мм рт. ст ). Для этого используются форвакуумные механические
насосы. Только после того как будет достигнут этот показатель, включаются ботее эффектив-
ные системы: диффузионные туроомолекулярные иди криогенные, которые способны дости-
гать и поддерживать длительное время давление на уровне 10’—10 " торр (мм рг. ст.).
Проведение анализа
Калибровка прибора по измеряемым массам является одним из важнейших этапов прове-
дения исслеловвнпЛ методом масс-спсктромстрии или методами, комбинированными с ней.
Такая калибровка осуществляется при помоши вещества сравнения, образующего ионы извес-
тного состава в пределах области измерения масс.
Для калибровки наиболее часто применяемого в ХТА прибора ГХ-МС с ионизацией элек
тронным ударом или химической ионизацией, работающей как с отрицательными, гак и с
Методы определения токсикантов в биосредах 431
Типе Report
Instrument: ULTRALIGHT
Source: El
Rod DC: В
Mon Dec 16 14:27:43 2002
Operate brody
Theory Actual Apex Intensity % Base Pk Isotope Rat
69.0 68.9 68.9 8134299 100.0 1.2
131.0 130.9 130.9 4939338 60.7 3.2
219.0 218.9 218.9 6645213 81.7 4.1
414.0 413.9 413.9 399822 4.9 8.5
502.0 501.9 501.9 351291 4.3 9.0
614.0 614.0 614.0 37673 0.5 13.2
Automatic Tune
Calibration Result Parameters Last Calibrated
RF Frequence Not Run 1104.9 kHz Dec 05, 2002 04:25 PM
Detector Passed 1.0e+005@ 1143 v Dec 16. 2002 02:20 PM
Nass Passed 42.99. -15.98 -0.35. 0.36 Dec 16. 2002 02:22 PM
Resolution (+) Passed -0.0523, -0.0543 0.3504. 0.3542 4.9730. 0 4583 Dec 16. 2002 02:22 PM
Leak Check Passed 4.3% of reference
lune F'.le, autotune.dsqtune
Lens 1
Lens 2
Lens 3
Elec Lens
Electron Energy
Prefilter Offset
Emission Current
= -25.00 v
= -9.30 v
= -25.00 v
= 15.00v
= -70.00 v
=-5.10v
= 100.00 uA
Ion Source Temp = 200 C
Fore Pressure = 36 m Torr
Ion Gauge Pressure = 1.1e-005Torr
No Scaling Factors
Nass-Resoluilon Tuning Factors.
Nass = 1.0 Ion Offset = 4.0 Res. Factor =17
Nass = 1050 ) Ion Offset = 4.5 Res. Factor = 2.1
Рис. 6-89. Результат калибровки масс-спскгрометра DSQ фирмы Thermo Electron (США) с применением
ПФТБА в качестве калибратора.
432 Глава б
положительными ионами, используют иерфюрксросин |ПФК. CF (CF,)n-CF | и гсктакозаф
тортрибутиламнн |ГФТБА. или ПФТБА (перфторированный). (C,F,1)1N|.
Ведущие производители оборудования для ГХ-МС исследований включают в состав про-
граммною обеспечения своею оборудования специальные программы, которые осуществляют
одновременную настройку шкалы масс-прибора, а также его многочисленных ключевых по-
казателей. таких, как напряжение ниги накаливания. репеллера. калибровку напряжения на
квадруполе и других участкт х. В результате получают отчеты, в которых такие данные объе ш-
псны На рис. 6-89 приведен отчет компьютера ио результатам настройки масс-спектрометра
модели DSQ фирмы ihermo Electron (США) с применением ПФ1 ЬА в качестве калибратора
При проведении особо важных анализов к отчету' о полученных результатах обязательно
прилагается и подобный отчет о настройке прибора, проведенной в тот же лень, что и осталь-
ные исследования.
Калибровка другого оборудования проводится с применением иных калибра оров. напри-
мер иодила цезия для приборов с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами, при термо-
распылении — ацетат аммония и полиироииленгликоль. при электрорасиылении — растворы
миоглобина и низших пептидов в ироинлентликоле. Основное требование к калибратору — он
должен давать пос. едовательность интенсивных ников во всем тиаиазоне отношений массы к
заряду при рабочих условиях ионизации. Наиболее важна калибровка масс при работе масс-
спектрометров высокою ра решения. Если для приборов с низким и средним ра решением
можно использовать внешний стандарт лля калибровки, то для обеспечения высокого разре-
шения калибратор вводят в ионный источник вместе с анолитом
Определение молекулярной массы. Возможно, наиболее ценная часть информации о веществе,
которую можно получить методом масс-спектрометри т. это молекулярная масса (М). Обычно
исходном точкой анализа является спектр электронною улара. Изотопные кластеры в облас-
ти максимальных m/z в масс-спектре, вероятнее всего, соответ твуют молекулярным сигналам
Такое отнесение сит налов проверяется по ближайшим осколочным ионам. Наличие ников при
М-1. М-2. М-15 и М-18 обычно подтверждает это предположение, в то время как потерн мо-
лекулярных масс oi 3 до 14 или от 21 ло 25 свидетельствуют либо о наличии примесей, либо
о неверном предположении о нахождении молекулярных пиков. Можно провести другие экс-
перименты — получить спектр электронного улара при более низких энергиях электронов или
использовать мят кую химическую ионизацию
Многие неполярные соединения, которые не могут лет ко присоединять протоны, например
гюлиароматичсские соединения, практически нечувствительны к методам мягкой ионизации
Когда мягкая ионизация происходит успешно наличие других пиков, кроме протонированных,
например при m/z= М + 17. М +22 и/или М +38. образующихся при присоединении молекул
аммиака, ионов натрия или калия, полезно использовать для правильною определения мо-
лекулярной массы анализируемого иона. Кроме того, работа в режимах положительных ионов
при образовании ионов |М+Н| или отрицательных ионов |М — Н| также помогает установить
молекулярную массу. В некоторых случаях используют специальные добавки к тазу реагентх
при химической ионизации, например дейтерированные сое инения.
Установление молекулярной массы является непростой задачей. Информация о природе
вешества и его физико-химических свойствах в большинстве случаев способствует ее решению
Немалое значение при этом имеет опыт специалиста, проводящего такие исследования.
Определение цементного состава и структуры вещества Для определения элементного со
става неизвестного соединения из масс-спектральных методов применяются обычно два: точ-
ное измерение масс и/или расчеты интенсивностей инков в изотопных кластерах
С помощью масс-сиектромсгра высокою разрешения можно измерить молекулярные массы
с точностью до 10’ Д и ниже. Однако даже с этой точностью редко получают четкое совпа-
дение с одним элементным составом. Число возможных составов возрастает с увеличением
числа элементов, которые, как предполагается, присутствуют в молекуле, и с увеличением
молекулярной массы. Накопленная к настоящему1 времени информация о закономерностях
фрагментации различных химических классов низкомолекулярных вешеств позволила вырабо-
тать правила, на основании которых можно с большой уверенностью говорить о присутствии
в молекуле какой тибо химической труппы или ее отсутствии, устанавливать молекулярную
массу, а также присутствие некоторых атомов, например хлора или брома.
Методы определения токсикантов в биосредах 433
Коммерчески доступные программы позволяют проводить такой анализ по масс-спскгру в
автоматическом режиме На рис 6-90 приведены масс-спектр дихлормстана и его структурная
формула. Отчет включает перечень (в порядке убывания вероятности) различных химических
групп, находящихся в анализируемой мс зеку те. Второй список отчета показывает в порядке
убывания вероятность отсутствия в молекуле определяемого вещества той или иной группы,
далее дана опенка молекулярной массы молекулы и указание на присутствие атомов хлора и
отсутствие атомов брома в молекуле.
Следующий этап качественного анализа после определения молекулярной массы и состава —
интерпретация пиков в масс-спектре для опенки струк уры соединения. Интерпретация пиков
требует большого практического опыта, который нельзя передал» коротким текстом главы в
учебнике. Мы опишем только основные аспекты интерпретации; для более глубокого ознаком-
ления рекомендуется специальная литература.
Фрагментация молекулярного иона представляет собой сложную сеть конкурирующих и
последовательных реакций, выход которых определяется устойчивостью как исходных, так и
образующихся ионов. Масс-спектр отражает результаты этих процессов.
Библиотеки масс-спектров являются мощным средством, позволяющим выяснить структуры
масс-спектров электронного удара. В большинстве из них поиск возможен в режиме on-line.
Из информации об измеренном спектре выбирают только небольшой обьем данных о наибо-
лее важных пиках и эти данные сравнивают с библиотечными спектрами. Согласие между
измеренным спектром и библиотечным образном выражается некоторым числом, обычно ле-
жащим в диапазоне 0—1000, где значение 1000 соответствует идеальному совпадению. Десять на-
млучших библиотечных спектров выводятся на экран для последующей визуальной обработки
пользователем
Компьютерный поиск в библиотеках спектров оказывается весьма полезным, так как он лает
направления поиска в случае анализа совершенно неизвестных образцов или предоставляет на-
дежные данные для подтверждения того, что исследуемое вещество действительно присутствует
образце Однако следует отметить, что наиболее часто используемые библиотеки содержат от
2000 ло 500 000 масс-спектров, а количество известных соединений в настоящее время более
12 000 000. Таким образом, результаты поиска в компьютерных базах данных нельзя воспри-
нимать как истину в последней инстанции. В табл. 6-16 приведены основные характеристики
'аблиотек масс-спектров общего назначения, используемых в настоящее время.
Рис. 6-90. Масс-спектр лихлор-
мстана, сто структурная форму
за. отчет о результатах анализа
масс-спектра Пояснение в тек-
сте.
434 Глава 6
«Substructure Report Page 1»
Search Pattern’ Dichloromethane P22O Scan #1543
Structures present
Number Probability Short Name And Description
1 98 CIIBr. chlorine and/or bromine
2 99 halogen, conta s a halogen atom (F.Cl.Br.l)
3 99 Cl. chlorine
4 99 CH&Hal. contains only carbon, hydrogen and halogen
5 98 CH&C1. contains only carbon, hydrogen and chlo ne
6 93 RCI. alky) chloride
7 89 RDBO. rings + double bonds count = 0
8 88 nocycle, no rings
9 88 sat. satuiated compound (no unsaturated bonds)
10 88 nobr. no branches
11 88 11 -fin, two functional groups attached to same carbon (chain)
12 84 -CH2- methylene group (chain)
13 84 CH2. methylene group
14 83 CH2f3 primary or secondary saturated carbon
15 82 -CH2/3-1. exactly one methySene or methyl group (cha n)
16 81 -CH2/3-, methyiene or methyl group (chain)
17 77 -CCI2. dichloromethyl group
18 76 NoAf. no aromatic rings
Structures absent:
Number Probability Short Name And Description
1 99 -O-. contains oxygen atom in chain (non-ring)
2 99 Ar-CHx. aromatic-saturated C bond with 1 or more hydrogen atoms
3 99 Ai-CO. aromatic-carbonyl bond in chain (non-ring)
4 99 Ph-2+sub. phenyt with 2 or more substituents
5 99 ArO. aromatic carbon oxygen bond
6 99 CCH3, methyl bended to carbon
7 99 AR. aromatic ring
8 99 Ar-O-R, aikyi-aryl ether (chain)
9 99 ArC. aromatic :arbon attached to carbon
10 99 4+brid, 4 bridg ig atoms in ring cluster
Molecular Weight Information:
Number MW Probability
1 84 95
2 S2 0
Clorine and/or Bromine Information:
CI-2. Br=O Probability=53%
Additional CSBr dusters were not found to confirm solution
Рис. 6-90. Окончание
Методы определения токсикантов в биосредах 435
1аб. низ 6-36. Библиотеки масс-спектров общего назначения н их основные харак ерисгнки
Харяктери тика Palisade Complete 600К Wiley 7 / MST0 5 MST 2002
Общее количество спектров 606 ООП 390 000 175 000
Тип спектров 70 •jB j.icKipomibiii y.iap
Количество веществ 495 000 317 000 147 (Ю0
В том числе с «припиши! ш мп* к спек- трам химическими струкпрами 437 01)0 147 01.Ю 147 000
Занимаемое место па лиске 350 MB 206 MB 100 MB
Форма выщ’ска CD-ROM/DVD-ROM CD-ROM CD-ROM
Среднее время поиска Mei ice 1 c
При использовании компьютерного поиска слс зуег твердо придерживаться правила, ком-
пьютер быстро сравнивает измеренный масс-спектр с библиотечным, но окончательное решение
об । аентификании исследуемого соединения принимает пользователь после изучения имюших-
ся анных и результатов компьютерной обработки.
В о время как поиск в компьютерных базах данных при масс-сиектромезрии с ионизацией
электронным уларом является достаточно мощным средством бл носаря i к временной («день
ото дня»), так и межлабораторнои («от прибора к прибору») воспроизводимости спектров элек-
тронного удара, ситуация при мягкой ионизации и десорбционной химической ионизации со-
вершенно противоположная. В этих случаях результаты масс-спсктро.мстрпи настолько сильно
зависят от экспериментальных условии, что накопление универсальных библиотек становится
невозможным. Отнако иногда использование библиотек внутри фирмы или лаборатории может
быть оправданным.
Критерии идентификации. При масс-снектрс мстрни в комбинации с разделительными ме-
тодами в каждой лаборатории должны быть утверждены в установленном порядке критерии
идентификации, на основании которых аналитики интерпретируют полученные результаты и
вытают свои заключения. Разумеется, для разделнтслыюго метода и масс-спектрометрии такие
критерии должны быть свои, учитывающие особенности использованных методов. Ниже при-
ведены типовые критерии для оценки наркотиков, стимуляторов, лекаре)венных вешеспз и их
метаболитов в моче живых лиц.
Критерии для хроматографических методов. Для капиллярной газовой хроматографии время
удерживания аналита не должно омичаться от времени удерживания стандарта. добавленного
в мочу в бтизкой к обнаруженной конненграний. более чем на 1% или ±0.2 мин. Причем ана-
лизируемые пробы н пробы сравнения должны быть проанализированы в одно и то же время.
В случаях, если разница во времени удерживания может быть объяснена, например, перегруз-
кой колонки го либо переделываюг пробу после разбавления, либо этот критерии ослабляется.
В ВЭЖХ требования ко времени удерживания составляют 2% или ±0.4 мин. ыютветецзенно.
Далее действия препринимтются аналогичные таковым в газовой хромаroiрафии.
Критерии для масс-спектрального анализа. При работе в режиме сканирования масс-спект-
ров условия подбираются п кз м образом, чтобы снятие спектров начиналось с величины m/z,
превышающей вес аналогичные показа! ели искомых апатитов или их продуктов лсривати-
зацин. если для другою нет специальных указаний. После получения спектров в выбранном
диапазоне проводят сравнение спектра анализируемого вешества со спектром аналитического
вешества сравнения, добавленною в мочу. При этом все ники с относительной интенсив-
ностью более 10% от интенсивности максимального пика аналитического образца сравнения
должны присутствовать в исследуемом спектре. Дополнительно три характеристических нона
в сравниваемых спектрах не должны отличаться по своей интенсивности больше, чем зто ука-
зано в табл. 6-37. Относительная интенсивность грех характеристических ионов может быть
получена нулем ан&тиза одиночного или усредненного спектра пли ио площадям пиков масс-
фра! ментограмм этих ионов.
Вычитание хромат ^графического фона должно проводиться одновременно и адекватно по
всем образцам
436 Глава 6
Поиск ио базам данных масс-спектров должен проводиться квалифицированным специа-
листом. В лаборатории должны быть установлены критерии идентификации с применением
баз данных, например максимальный индекс сходимости результатов.
Если не удается достичь совпадения относительных интенсивностей трех характеристичес-
ких ионов в пределах 5%. используют лернватизанпю или друзой метол ионизации. К резуль-
татам этик исследований применяются те же критерии.
При работе в режиме сканирования характеристических ионов используют критерий от-
носительной интенсивности трех .характеристических ионов, как описано выше. При лом
наименьший ил выбранных пиков должен удонретварязь критерию сингал—шум 3:1.
Таблица 6-37. Максимальные окна флюктуации показателей масс-спектрометра
Oniocimrre.ibiiM итснсшшосп., % к максимальной EI ГХ-МС CI ГХ-МС 1 х-мс* вэжх-мс. вэжх-мс
Ьолсс 51) ±10% (абсолютно) ±15% (абсолютно)
25-50 ±20% (относительно) ±25% (относительно)
1 Более 25% _ ±5% (абсолютно] _ ±10% (абсолютно)
Лучшим примером применения МС-МС лля метаболических нее словами!) является ск-
ринннт наследственных изменении метаболизма новорожденных в США и странах Евросою-
за. Несколько капель крови нонорож генною помешают на карточки филт тровальной бумаги
(карточки Гутерина). Образны используют лля определения специфических метаболитов при
наследствен и их забо витаниях (фенилкетонурия, гомонистенурия). которые сопровождаются
нарушением метабо нтзма аминов и аминокислот Раньше требовалось проведение нескольких
иссзедований лая диагностики этих заболеваний. Используемые методы джвали бол .шои про-
цент тож1юиоложите.1Ы1ых результатов, приводя к ненужным и сложным режимам лечения
Сейчас проводится точная диагностика укпмнных заболеваний с помощью одного метола тан-
демной МС-МС без использования хроматографии
6.4. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ
Все идеи в науке родились в драматическом конфликте
между реальностью и нашими попытками ее понизь.
А. Эйнштейн
6.4.1 Классификация, термины и определения
Спектрометрические методы анализа основаны на регистрации испускания или поглоще-
ния квантов электромзгиитного нхтученпя атомами или молекулами исследуемого вещества.
Экерт ия испускаемого или поглощаемого излучения, о которой можно судить по глине волны
или частоте ихтучсния, ласт информацию о природе вешсства. п интенсивность сигнала
о сто количественном содержании. В этик мск tax используют различные области спектра
электромагнитного ихтученпя. очень сильно различающиеся по энергии квантов: у-излучентте.
рентгеновское ихтучение. вакуумная ультрафиолетовая (УФ), видимая, инфракрасная (ПК) и
микрокод новая области вплоть ло радиоволновой. Столь широкому диапазону оттерт ий отвеча-
ют неодинаковые механизмы план молей твия ихтученпя с веществом — возникновение сит на-
лов имеет разную природу. Так. энергия у-квантов столь велика. чло здесь возможно осушест-
азение ялерных превращений, энергия квантов рентгеновской области отвечает электронным
переходам во внутренних электронных оболочках атомов, испускание и поглощение квантов
в Уф- и видимой областях связаны с переходами внешних патентных электронов, в то время
как поглощение И К- и микроволновых квантов обязано переходам между ко лебательными
и вращательными уровнями молекул. Энергия квантов разиоволнового лиана юна настолько
мала, что оказывается связанной только с изменением ориентации спинов электронов н ядер
атомов.
Методы определения токсикантов в биосредах 437
Теоретически и методологически обоснованным принципом классификации спектро-
метрических методов является их деление на методы атомной и молекулярной спектромет-
рии. когда ответственным та возникновение сигналов является испускание или поглоще-
ние квантов энергии соответствующего диапазона атомами или молекулами исследуемого
вешества.
В каждом конкретном методе атомной спектрометрии осуществляются только разрешенные
правилами квантовой механики электронные переходы между определенными уровнями, что
зависит от строения электронной оботочки атома и величины энергии возбуждения. Поэтому
каждый вид атомов характеризуется своим собственным набором энергетических уровней, а
слетовательно. и разрешенных переходов и уникальным набором спектральных линий. чго
и позволяет идентифицировать эти атомы по их спектрам — атомно-эмиссионным, атомно-
абсорбционным. Поэтому в каждом из соответствующих приборов, которые обычно называют
спектрометрами. устанавливают различные источники и приемники (детекторы) рабочею из-
ту*1ения. устройства для выделения узкой области рабочего излучения. называемые монохро-
маторами. Отсюда следует разнообразие принципиальных и практических схем приборов и
устройств.
Молекулярная спектрометрия. С практической точки зрения наиболее удобна работа в УФ-
видпмой и ИК-областях спектра. Иногда, желая подчеркнуть работу в видимой области, ис-
пользуют также н 1срмин «спектроскопия».
Молекулярная спектрометрия (спектроскопия) в УФ- и в видимой областях спектра, ос-
нованная па поглощении излучения оптического диапазона (200—800 нм), святана с осу-
шестязсннем электронных переходов валентных электронов. Это основа спектрофотометри-
ческого анализа. Его применяют для определения как неорганических, так и органических
соединений. Для идентификации последних может быть использовано их собственное пог-
лощение в УФ-областп. обусловленное наличием специфических групп атомов, часто назы-
ваемых хромофорами.
Спектрофотометрический анализ основан на превращении определяемого вещества в окра-
шенное соединение, определении поглощения этою соединения и нахождении концентрации
его в пробе. Явление поглощения электромагнитного излучения обусловлено осуществлени-
ем электронных переходов внешних валентных электронов. Область длин волн 200—360 нм
отвечает невидимой УФ-обзасти. а 360—760 нм — видимой. Энергия поглощаемого кван-
та соответствует разнице в энергиях между основным и возбужденным уровнем. Поглошая
квант, электроны переходят в возбужденное состояние, которое неустойчиво. Поэтому далее
следует обратный переход, а энергия возбуждения переходит в тепловую (рис. 6-91). Энсртя
электронного перехода больше, чем колебательного, поэтому каждый такой переход являет-
ся в сущности электронно-колебательным. Это приводит к появлению полос поглощения.
В конденсированной среде молекулы вещеезва взаимодействуют с солыза1 ным окружением,
что привозит к слиянию отдельных полос электронно-колебательных переходов в широкие об-
ласти поглощения, имеющие максимумы. Зависимость поглощения от длины волны называют
спектром поглощения.
а
£
а
о
<5
Рис. 6-91. Схема электронных переходов, поясняющая
явления поглощения элскгрома!ннтного излучения в
спектрофотометрии к испускания квантов ftv^ в флюо-
риметрии
I — переход внешних электронов нз основного в воз-
бужденное состояние; 2 — возвращение возбужденных
электронов в основное состояние; энергия возбуждения
деградирует в тепло — явление поглощения: 3 — безызлу-
чаюльные переходы между колебательными подуровня-
ми возбужденного состояния; 4 — электронный переход,
приводящий к испусканию кванта — яазение ф. юо-
рссцснции; 5. 5* — колебательные подуровни основного
н возбужденного состоянии.
438 Глава 6
Кд клос поглощающее вещество в зависимости от молекулярного строения характеризует-
ся собственным спектром поглощения. Поэтому спек1рофо1омстрнчсскис измерения, схема
осуществления которых показана па рис. 6-92. выполняют при оптимальном длине волны,
отвечающей наибольшей разности в поглощениях продукта реакции и всех исходных веществ.
Опрсдс 1ЯКЯИСС тначснис имеет проведение актинической реакции, вызывающей образование
интенсивно окрашенных продуктов. Для ионов металлов это обычно реакции комплексообра-
зования с различными, прежде всего органическими, реагент тми. Это могут быть реакции ком-
плексообразования. процессы окисления—восстановления, синтетические реакции, особенно
характерные при определении органических соединений. и др. Однако необходимо, чтобы
реакция протекала быстро, количественно, а образующееся соединение обладало интенсивной
тт устойчивой окраской
Основой количественною спек рофотометрнческою анализа является объединеннь и закон
свстопоглошсння Ламберта—Бугера—Беера В спектрофотометрическом анализе нот лощение
измеряют при определенной оптимальной длине волны, в этом случае высоки требования к
монохроматору (см рис. 6-92): в современных приборах используют дифракционную решетку,
кварцевую (УФ-область) пли стеклянную (работа только в вндимси области спектра) призму.
Наименьшее поглощение, которое эти приборы позво 1яют измерить, составляет т).0()2—0.1М)5.
Коэффициент молярного погашения няиботсс интенсивно окрашенных вешсств составляет
- 5-I04. но не более георетичсского предела 10\ Следовательно. при I = I см минимальная кон-
центрация. доступная количественному определению, составит Сми11 = 0.005/5104 = 10т мо т >/л.
что в среднем согласуется с достигаемыми в этом методе пределами обнаружения. Комбинируя
цветную реакцию с экстракционным извлечением окрашенною продукта в небольшой объем
несмсшиваюшегося с водой органическою растворителя, можно поппзтпъ и эту величину.
Классический пример такого рода — реагент дитизон, нс растворимый в воде, ио растворимый
в четыреххлористом углероде (зеленая окраска), в то время как его комплексы с металлами
имеют окраску oi оранжевой до красной.
Многие органические соединения т ти их комплексы с нонами мстштлов способны к <]к>-
юлюхптпесценппи. вызванной испусканием квантов в видимои области при возбуждении мо-
лекул УФ-излучеписм тт видимым светом. Такой вариант люминесцентного анализа называют
флюорнметрическим. Флюорометрия даст более низкий предел обнаружения (-106 %) по срав-
нению со спсктрофогомстрисй ('105 %) Сочетание рассматриваемых способов с экстракци-
онным концентрированием приводит к тибрилным мето, тхт анализа — экстракционно-спект-
рофотометрическому и экстракиионно-флюоримегрическому с еще более низкими пределами
обнаружения. Их часто применяют при определении микроэлементов в веществах особой чис-
тоты или металлов — юксикашов в объем ix окружающей среды.
Фтоориметрический анама. При определенном строении молекулы структура ее энергети-
ческих уровней такова, что пос г их возбуждения УФ-и злу чей нем электронные переходы с
возбужденною уровня на основной уровень сопровождаются испусканием квантов в видимой
области спектра, как это показано на рис. 6-91.
Небо ыпон избыток энергии возбуждения при ж м герястся на переходы между колебатель-
ными иолу ровнями, поэтому энергия испускаемого кванта (видимая область) меньше энергии
поглощаемого кванта (УФ-обласгь) Важнейшей характерце икон фотолюминесценции янля-
Рис. 6-92. Схема спектрофотометрических
измерении.
1 — источник непрерывного излучения: во-
ородпая, дейтериевая лампа — УФ-область.
лампа пакй.1иш111ия — видимая область:
2 — монохроматор (призма, дифракционная
решетка); 3 — проба; 4 — фотоэлектронный
умножитель; 5 - отсчетное устройство.
Методы определения токсикантов в биосредах 439
3
5
Рис С-93. Принципиальная схема флюори-
метричсскггх измерений.
I — источник УФ-ихгучсггггя (ртутная лам-
па); 2 — первичный снегофплыр (прснра-
чсн только лля УФ-излучения); 3 — проба;
4 — монохроматор (вторичный светофильтр)
5 — фотоэлектронный умножите ь.
ется сс квантовый выход Ф — отношение числа п:глучсг1ных квантов люминесценции (флюорес-
ценции) к числу квантов поглощенного возбуждающего излучения. Кгшитоный выход Ф загшегн
от длины волны возбуждающего света, природы определяемого вешества и растворителя, кон-
центрации раствора, наличия примесей в растворе. температуры. Чем ближе эта величина к I,
тем выше к.и.д. процесса. В аналитических целях используют снсгемы с высоким квантовым
выходом Математическим обоснованием количественною люминесцентного анализа служит
уравнение: I - кс. Интенсивность излучения прямо пропорциональна концентрации опре-
деляемого соединения (1 = кс) при условии, если Ф постоянен, т.е. если выполняется закон
Впшлова (см курс физики и аналитической химии).
Принципиальная схема измерения интенсивности фотолюминесценции — флюоресценции
приведена па рис. 6-93 Так как излучение флюоресценции изотропно, то монохроматор удоб-
но расположить. как показано на рисунке. Это важно: излучение источника не попадает на
детектор. Флюориметрия более чувствительна, чем фотометрия, так как при измерении погло-
щения необходимо сравнить две интенсивности лучистого потока, а во флюоримстрип изме-
ряется сам аналитический сигнал. Более того, при низких концентрациях флюоресцирующего
вешества исчезает помеха за счет тушения люминесценции этим веществом
В аналитической Ирак ткс раскрои ранены способы, основанные па образовании флюорес-
цирующих комплексов с ионами металлов. Собственная флюоресценция имеет значение для
определения редкоземельных элементов, органических соединений, витаминов, полицикли-
ческих ароматических углеводородов с конденсированными ядрами и др. Избирательность оп-
ределений обеспечивается тщательным подбором условия проведения аналитических реакций.
Среди многообразия флюоресцентных реагентов можно упомянуть 8-оксихинолпн. полиокси-
флавоны. кверцетин, оксиазо- и оксиазометнновые соединения и др
В м годе фотоакустической спектрометрии пробу облучают светом, модулированным звуко-
вой частотой, и регистрируют колебательную энергию безызлучательного перехода в основное
состояние в виде соответствующей звуковой волны. -Этот способ относительно нов и весьма
удобен при биохимических исследованиях больших молекул.
Основное назначение ИК-слектрометрии — идентификация химических соединений но их
колебательным и. реже, вращательным спектр гм. возникающих вследствие поглошенггя ими
излучения в области частот 13 000—10 см '. По ИК-спектрахг находят характеристические час-
тоты. отвечающие колебаниям отдельных групп атомов и фрагментов в молекулах. Однако не
все колебания молекул активны в ИК-сисктрах. Метод комбинационного рассеяния света (за
рубежом Раман-эффект) позволяет наблюдать неактивные в ИК-области колебания и. таким
образом, пополняет результаты ИК-снекГгромегрического исследования.
Масс-спектрометрия — мощное средство идентификации органических соединении. хи-
мических элементов и их чувствительного определения (см гл 6.3.6). Формально отнесен-
ная к спектрометрическим методам анализа масс-спектрометрия основана па воздействии на
образец высокоэнергегического пучка электронов как квантов электронного излучения и па
последующем pt делении образующихся молекулярных и осколочных ионов в эдектростаги-
ческом гг магнигном полях. Масс-сисктромстрпя рассматривается в связи с использованием
440 Глава 6
масс-селскншных детекторов в методах ГХ-МС, ВЭЖ'\-МС, ЯМР-МС, КЭ -МС. ИСП-МС и
обсуждается в соответству юш тх разделах'
В группе ра&юспектрометрических (ядерных/ метилов анализа. связанных с использованием
радиоактивности. аналитические синицы возникают за счет превращения атомов исследуемых
элементов в радионуклиды. которые далее определяют по их радиоактивности. Регнстрирую-
интй прибор часто называют спектрометре м. В методах спектрометрии магнитного резонанса
(ем. гл. 6.4.4) регистрируют сигналы, возникающие вследствие переходов магнитных диполей
между энергетическим уровнями, расщепляющимися в результате взаимодействия магнитных
моментов ядер или неспаренпых электронов е внешним магнитным полем. Эю методы ядерпо-
го магнитного и мектроиного парамагнитного резонанса (ЯМР и ЭПР соответственно). Изхтеряя
химические сдвиги сигналов ядер *14. С. Р ‘'Г. 4\ и тр по отношению к тан чарту. можно
исследовать структуру индивидуальных соединений тт их состояние в растворах (ЯМР) ЭПР
применяют при определении радикалов и частиц, имеющих неси, репный электрон.
6.4.2. Молекулярная спектрометрия
6.4.2.1. Спектроскопия в видимой и УФ-области спектра
Знание без опыта — зрячий на неизвестной ему дороге;
опыт без знания — слепец на знакомом ему пути.
//. Будет
Первые сообщения об использовании метода спектрофотометрии лля определения нарко-
тиков и ялов появились в середине XIX века. В 80-х годах XIX века В Гартли (W. N Hartley),
профессор химии Королевского кт. ьчеджа Дувре. вначале предложил. а затем использовал этот
метол для доказательства присутствия наркотиков в бттообразиах при судебных разбиратель-
ствах В I884 г. в докладе на заседании Королевского химическою общества в Лондоне он
привет 32 спектра аз калоидов, среди которых были морфин, наркотин, кодеин, папаверин,
аиоморфпн и другие. В дальнейшем число работ увеличивалось. расширялись возможно™
применения этого метода.
В настоящее время спектрофон четрт я в УФ- и видимой области спектра (УВИ-спект-
роскоппя) заняла достойное место среди друтих методой исследования вешеств. Получены
и собраны значительные базы УВИ-снектров лекарственных веществ, наркотиков и друтих
биологически активных соединений УФ-спектроскопия получи та широкое распространение в
фармацевтических, токсикологических, кримипзлисгическ тх и трут их исследованиях.
УФ-сиектроскопия — раздел оптическом спектроскопии, включающий получение. иссле-
дование и применение спектров испускания, нот лишения и отражения в УФ-области УФ-
спектроскопия при длине волны менее I85 нм называется вакуумной. так как в гой области
УФ-излучение настолько сильно поглощается воздухом, главным образом кислородом, что
необходимо применять вакуумные или наполненные нспоглошаюшпм газом спектральные
приборы. Спектроскопия в видимой области света связана с исследованием взаимодействия
вешеств с электромагнитных излучением, имеющим длину во, иы 400—700 нм. Поглощение в
УФ- и видимой области является результатом переходов энергии, в которые вовлечены глав-
ным образом валентные электроны.
Спектром поглощения вещества называется кривая зависимости его способности к свето-
поглощенпю (функция поглощения) or длины водны пли волнового числа. Это специфическая
характеристика вещества.
Измерения чаше всего проводят для растворов, хеня их можно проводить и для веществ,
находящихся в парообразном и твердом состоянии, аналогично получению ИК-епектров с
применением газовых кювет или путем прессования таблеток с бромидом калия (см. далее).
Спектры жидких образной представляют собой широкие, относительно невыразитель-
ные полосы, которые являются результатом наложения большого количества б. изко распо-
ложенных полос, соответствующих вибрационным и врашате тьныхт переходам электронов
В идеальном случае форхта этих полос приближается к форме кривых распределения Гаусса.
442 Глава 6
Рис. 6-95. Схема пропускания и абсорбции мо-
нохроматическою светового потока
I, — интенсивность монохроматического ихчу-
чеиия (светового потока), падающего на данную
свстопоглошаюшую среду. I — интенсивность
излучения (светового потока), прошедшего ме-
ре ) му среду (I < )„). Г ( I = 1 1„) — пропускание
или %Т процент пропускания |%Т= 100- (I 1„)|.
А - ошическая плотность, нам зкешнкння (Е)
поташсннс; I — тол ши на свеюнотлощаюшего
слоя.
Основной закон свстогюглошсния справедлив только для поглощения монохроматическою
светового потока с постоянной длиной волны.
Способность поглотать свет определенной длины волны является фундах опальным свойс
тиом молекул вешества В iaf i. 6-3Ji приведены способы представления кох|и|>иипен1ов пога-
шения.
Гай. ина 6-38. Способы представления к лффициентов поглощения
Коэффициент Используемые e'lHHHiuj изме- рения Обозначение и елинипа измере- ния 11релетавленнс
Молярный коэф- фициент (показа- тель) погашения* мать/л е. л/(мольсм) или лмоль'см' Численно равен оптической ilioihocih данного раствора при концентрации рас г верен нот о свет отют лошаюшею вешества 1 моль/л п толщине ноглощи ЮЩС1 о слоя 1 см
Удельный коэф- фициент (показа- тель) поыниения (нередко называют не вполне точно «удельным кпзф- фпипеп том погло- щении*) 1 г/100 мл рас- твора ЕЛ 1сы Е (1%. 1 см) Численно равен оптической плотности тайного раовора с массовой концент- рацией I г paciBopcHHoro светопоглоша- юшего вещества в 100 мл раствора при тотшине поглощающего слоя 1 см
Поглотительная способное 1Ь 1 г/я а. л/(гсм) Численно равна оптической плотнос- III данного раствора с концентрацией I г растворенною светопог.юшаюшего вешества в 1 л раствора при толщине поглощающего слоя I см
Примечание “Иногда эта величина может выражаться через десятичный логарифм, обычно принимая
значения от I до 5
Методы определения токсикантов в биосредах 443
Молярный и удельный колыши центы погашения связаны соотношением
г- Л/
с = Е-------------------------------------------
10
М — молярная масса растворенного вещества.
(. lejyei имен, ввиду, что коэффициент (пок. з Тель) поглощения к н коэффициент (по-
казатель) погашения (экстинции) е различаются в 2.3 раза. В аналитических исследованиях
практически всегда пспо тьзуют е. хотя его часто называют коэффициентом поглощения. Это
следует iimcil в виду, чтобы и бежать ошибочных результатов расчеюв.
А 'рреляция спектров абсорбции с молекулярной структурой вещества
При абсорбции электромагнитного излучения .помы, ионы или молекулы вешества пе-
реходят в ipyroe (более высоколежашее) энергетическое состояние на строго определенную
челнчпну Каждому разрешенному электронному (вернее электро!то-ко ебагелыюму) пере-
ходу соответствует определенная полоса в электронном спектре поглощения, т.е. длина волны
•частота, волновое число) максимума полосы поглощения. Интенсивность полосы поглощения
зависит от вероятности перехода в другое эиер|егическое состояние и от концентрации све-
топоглошаюших частиц. Чем выше величина е вешества (а это означает большую вероятность
перехода), тем выше интенсивность полосы поглощения в спектре. Энсрпгя разрешенных пра-
вилами отбора электронных переходов системы возрастает в ряду: и—> л* < л—» к* < п—» с* < о
-• в‘ В такой же последовательности возрастает частота п уменьшается длина волны полосы
-ooTBCTcuxioiiicro перехода в спемре поглощения.
Химические группы, содержащие в своем составе электроны, способные осуществлять оп-
ределенные энергетические переходы, называются хромофорами (гибл. 6-39). Хромог|юры обус-
ловливают появление полос поглощения в электронных спектрах, ауксохромы способны из-
менить степень или характер поглощения света другими хромофорами вследствие эффектов
.спряжения в молекуле (ауксохромы сдвигают положение максимума поглощения — X.mrt —
ромофора). Ауксохромные группы (н молекулах органических соединений) могут быть элскт-
ронодонорнымн и электроноакпепторными.
Таблица 6-39. Некоторые хромофоры и соответствующие нм полосы поглощения
Хромофор Спектра гыше характеристики хр< офоро
НМ нм е«. >•«,. "М
C=N п—- 250 10 J
с »с 175-ISO 6000
к 11 Г и н ISO 10 (ИИ)
- с = о п— я* 195 1000 270 -2К5 IS-30
-\О. п—* ж* 2S0 10
х = о 6(>0 10
—О—NO. 270 12
- (С = Ch- ж —> к" 210—230 21 0(H)
- (С = С), - 260 35 000
- (С = С), - 300 52 (ИИ)
- (С С) - ЗЗО 11S ООО
с.н- 1X4 46 700 202 6900 255 170
Дифсни г 246 2(Г 000
Нафгалии 220 112 000 275 5600 312 175
Хитреце! I 252 199 000 375 7900
444 Глава 6
Окончен ie таб. b-39
Пирн тин 174 80 000 195 6000 251 1700
Хинолин 227 37 000 270 36(8) 314 2750
Изохттнатнп 218 80 000 266 4000 317 3500
CI ион 181 10 000
I ион 226 12 600
ОН ион 194 12 600 187 5000
Сг О. ’ион 440 3000
МпО4: ион 528 2400 310 1500 225 Болес 1)00
Чем больше хромофорных групп содержит молекула, тем более интенсивно она потощает
электромагнитное излучение. Например, увеличение количества сопряженных двойных связей
в молекуле с 2 ло 5 приводит к увеличению епьи в 5,6 раза и Xma с 210—230 до 330 нм.
Если вешсство при изменении pH раствора ионизируется без деградации структуры (обра-
тимо). то изображенные вместе спектры поглощения, напученные для растворов одинаково
концентрации этого вещества, но при разных значениях pH, будут иметь одну или несколько
изобссгнчсскнх точек. Выражение «изобсстическая точка» (от треч. слов изос — равны ! и сбсс
тос — гасящий, тушашин) означает «точка равного погашения», т.е. общая точка пересечения
серии спектральных кривых (isosbestic poin). Например, если в растворе находятся две формы
вещества (АтОН <—>АгО ), то семейство кривых поглощения, соответствующих различным
значениям pH раствор;», будет иметь одну точку, при которой поглотительная способность
вешесгва остается постоянной, не зависящей от отношения концентраций АгОН/АгО-. Такая
изобестическая точка зависит лишь от общего числа эквивалентных хромофоров для двух ви-
дов частиц, находящихся в равновесии. На рис. 6-96 показана серия УФ-спектров органичес-
кою красителя, полученных при разных значениях pH среды.
Как видно на рис. 6-96. все линии пересекаются в одной точке, бл вкой к 250 нм. В этой
точке поглощение вещества нс зависит от pH среды Наличие изобестических точек помогает
при идентификации вещества. Кроме того, это свойство некоторых вешеств используется при
проверке надежности аппаратуры.
В зависимости от условий среды у ряда вешссгв изменяется способное»ь к поглощению в
УФ- н видимом свете, что является важной характеристикой вещества. Например, при изме-
нении pH среды — при переходе из кислой области в щелочную — у вешеств, содержащих
фенольные группы, происходит смещение максимумов поглощения в сторону больших дппн
волн — батохромныи (или красный) сдвиг (смешение). Батохромный сдвиг (до 10 нм) харак-
терен для наркотиков морфиновой группы со свободным фенольным гидроксилом (морфии),
фенотиазинов, барбитуратов, бензодиазепинов, пиридинов и нигрососдинсний. На рис. 6-97
приведены структуры фенобарбитала (при различных значениях pH среды) и соответствующие
им УФ-спектры.
Как видно на рис. 6-97. фснобарбшал имеет нехарактерное поглощение в облает свыше
230 нм при нейтральных и кислых зна-
чениях pH среды При pH 9.2 в УФ
спектре фенобарбитала появляется ха-
рактерная полоса поглощения при 240
нм. Более высокие значения pH среды,
например 13.0. приводят к дальнейше-
му смешению максимума поглощения к
255 им однако в этих условиях вещест-
во быстро разрушается.
Гипеохромное(\\л\\ синее) смещение —
сдвиг полосы поглощения в коротко-
волновую область — характерно, напри-
мер, для арсмагических аминов в кис- Рис. 6-96. УФ-сисктры и изобестическая точка,
лой среде
Методы определения токсикантов в биосредах 445
Рис. В-97 УФ- пектры фенобарбитала при pavnviiii.ix ншчс'ниях pH среды и соответствующие им мояс-
«..лярные структуры.
i — нсионизированцая форма фенобарбитала п 0.1 М растворе HCI, б — моиоапион фенобарбитала в
05 М растворе 6op.it но г о 6м|к.-р,1 (pH 9.2): в — диаппоп |KHo6.ip6iira.ia в 0.5 М растворе гидроксила
ширин (pH 13.0).
Увеличение пли уменьшение интенсивности полосы поглощения из-за влияния различных
факторов, в том числе влияния ауксохромов называют гиперхромным и гипохромный эффектом
. ^ответственно.
Принцип аддитивности
Прикипи аддитивности оптических плотностей: оптическая плотность смеси из m пешеств,
додчиняюшпхея закону Бутера—Ламберта—Беера и не вступающих и химическое взаимодейс-
твие друг с другом, равна сумме парциальных оптических плотностей компонентов при постоян-
ных длине волны светового потока и толщине светопоглощаюшсго слоя. По имени автора лото
принципа К Фирордта математическое выражение inioiaa называют jравнением Фирордта.
D = e,c l+s,cJ+ .. + е„с I = /У е с.
1 I X mm 1 *
де I) (или А) — оптическая плотность. ег е ..е молярные коэффициенты погашения компо-
нентов раствора. cr cr..cm — их концентрация: / — длина кюветы
На этом принципе основаны методы ко (ячествснного определения веществ в смесях, в том
числе выделенных из биологического материхза.
На практике линейная концентрационная зависимость оптичсско) плотности раствора для
многих веществ наблюдается тотько в относите п>по небольшом интервале изменения кописп-
заиии Зл пре тс тми этого интервхы могут наблюдаться кажущиеся онсюнения от основного
закона светопоглошения (и положительные, и отрицательные). Отклонения называют кажу-
щимися. гак как основной закон cbctoiioi тошения не нарушается, а изменяется число евсто-
ог зошаюших частиц н/илн прибор неточно регистрирует истинную интенсивность светового
потока, прошедшего через раствор.
Эагторы, влияющие на линейность закона Бугера Ламберта Беера
Основной закон светопоглошения справедлив лля проходящею через гомогенную изотроп-
ную среду плоекопархтлелыюго пучка монохроматического света. Причины отклонений от
446 Глава 6
этого закона связаны с физико-химическими свойствп.ми анализируемого вещества или всего
раствора в челом; особенностями используемого оборудования: анизотропией изучаемого объ-
екта.
Физико-химические свойства исследуемых растворов. Основная физико-химическая причина
отклонения от закона Бугера—Ламберта—Беера обусловлена реакциями диссоциации, ассоци-
ации. химического взаимодействия растворенного вещества с раствори гелем или реакциями
комплексообразования, фотодеградации и другими, особенно приводящими к образованию
вешеств с отличающимся от исходною вешссгва ко'л|и|)иииеи1ом поглощения. На результаты
исследований оказывают влияние природа используемого растворителя, однородность раство-
ра. а шкже процессы, способные привести к изменению его поглотительной способности,
например флюоресценция.
Выбор растворителя при проведении спектроскопических исследований имеет большое зна-
чение (табл 6-40). Миозие лекарственные вешссгва и или наркотики при снятии спектров
в неполярных растворителях имеют несколько интенсивных узких полос поглощения. а при
использовании полярттых растворителей у этих вешеств наблюдается сокращение полос погло-
щения при одновременном их уширении.
Таблица 6-40. Основные растворители используемые в УФ-сиек’цхккопни
Растворитель Допустимый предел использования: прозрачен до LIHHU ВО 1НЫ нм
Воза или разбавленная неорганически! кислота 191)
Ацетонитрил (чистый для ВЭЖХ) 200
Ацетонитрил 210
Бутиловый спирт 210
Циклогексан 210
Этанол 95% 210
Гептан 210
Гексан 210
Изопропанол 210
Метанол 210
Эфир 220
0.2 М раствор натрии гидроксила 225
Ди хлороэтан 230
Метиле! гхлорид 235
Хлоро<|юрм 245
Че I ы реххлорнсты 1 yi лерод 265
Бензол 2X0
Пирплии 305
Ацетон 330
В электронной спектроскопии можно использовать любые растворители. прозрачные в не-
обходимом диапазоне длин волн. В анализе лекарственных препаратов и наркотиков, в том
числе в биологических объектах, чаше всего используют 95% водный этанол, растворы мине-
ральных кислот или щелочей. В то же время абсолютный этанол может привести к искажению
результатов из-за находящихся в нем остаточных количеств бензола (см. гл. 8.1).
Флюоресценция исследуемою раствора приводит к увеличению стзезопотока. починающе-
го на фотодетектор и соответственно к занижению получаемых количественных результатов.
Наблюдаемый эффект сильно зависит от длины светового пути (длины кюветы) При прочих
равных условиях отклонения от закона Бутера—Ламберта—Беера из-за флюоресценции будут
возрастать при увеличении оптической плотности раствора и уменьшаться с повышением кон-
центрации растворенною вещества.
Фотометрические измерения не рекомендуется проводить при очень малых иди больших
величинах оптической плотности растворов. Оптимальный раоочий интервал измерения опти-
Методы определения токсикантов в биосредах 447
ческой плотности — 0.2—0.6 единиц (диапазон 0,2—0.Х); наименьшую ошибку получают при
X = 0.434.
Инструментальные причины. Наиболее частой инструментальной причиной отклонений от
рассматриваемого закона является псмонохроматичность падающего на образен светового по-
тока. Обычно непрерывный интервал длин волн S определяется шириной выходной шели h и
дисперсией монохроматора —:
Увеличение ширины щели, как правило, приводит к палению кажущегося коэффициента
погашения в области максимума поглощения и одновременно к его увеличению в области
минимума поглощения. Эти нарушения малозаметны на спектрах вешеств с широкими поло-
сами абсорбции, но могут быть очень резкими для узких зон поглощения. Практически, чтобы
избежать искажения спектров, особенно при количественных определениях, ширину шели ус-
танавливают много меньшей, чем полуширина исследуемой полосы (ширина, измеренная на
полз высоте полосы поглошення}.
При проведении измерений вблизи пограничных значении пределов измерения прибора,
особенно ниже 220 нм и в зоне перехода УФ-света в видимый, в которой происходит пере-
ключение соответствующего источника света у современных спектрофотометров, возможно
яолучение некорректных результатов. Это диапазон длин воли от 320 до 400 нм. Особенно сле-
дует обращать внимание па указанные факторы при проведении измерений с использованием
сильнонотлошаюшего УФ-свет растворителя или при дифференциальном анализе сильноаб-
сорбируюшнх вешеств.
Присутствие рассеянного света также искажает результаты исследования методом спектрос-
копии Пол рассеянным светом в данном случае понимается полихроматическое излучение,
попадающее в измерительную камеру прибора в результате различных отражений и рассеяний
влис11ср<нруюшсй системе. К такому явлению приводят дефекты в призмах, зеркалах, дифрак-
ционных решетках или кюветах, налеты ра зичных вешеств из атмосферы или пыль, отпечатки
пальцев па поверхностях указанных деталей и лр. (с.м. далее).
Анизотропия исследуемых объектов. Пропорциональность между оптнчсскот плотностью и
концентрацией вешества нарушается из за неравномерности распределения поглощающего
вещества в пучке света. Особенно такая ошибка заметна при проведении исследований мпк-
роспектрофотометричеекпм методом.
Чре вычайпая интенсивность спета, например от лазера, может приводить к тому, что по-
давляющая часть молекул анализируемого вешества окажется в возбужденном состоянии и в
конечном счете будет наблюдаться отклонение ог закона Бугера—Ламберта—Беера.
Оборудование для исследований методом УФ-спектроскопии
Оборудование лля проведения исследований состоит из источника света, устройства лля
исследования проб, детектора и устронства для обработки данных.
Источники излучения:
• вольфразчовые лампы накаливания (lungsten lamp) используются в видимой облает для полу-
чения излучения в диапазоне от 350 до 800 нм. Обычно представляют собой кварцевые или
стеклянные сосуды, в которых имеется вольфрамовая нить накаливания;
• водородные или дейтериевые лампы (:Н lamp) используются для получения ультрафиолетово-
го света в диапазоне от 160 до 350 нм. по конструкции напоминают вольфрамовые лампы,
но заполнены водородом и имеют в составе два электрода;
• ксеноновые лампы (Хе lamp) используются пя получения интенсивного потока излучения
в диапазоне от 200 до 1000 нм. используются редко из-за дороговизны и короткого срока
жизни;
• лазерные источники излучения применяются для детектирования веществ занлемпымн ме-
тодами. например для дез ckiпровалил элюирующихся из хроматографической колонки ве-
шсств.
Устройства для исследования проб. При определении наркотических средств к лекарственных
всиесзв методом УВИ-спектрометрии чаше всего используют жидкие образцы или растворы.
448 Глава 6
Рис. 6-98. Форма кювет различных разме-
ров.
2.5 мм 5 мм 10 мм 20 мм
100 мм
Дня исследования образцы помешают в специальные кюветы, изготовленные из кварца или
стекла. реже из полимерных материалов. Стеклянные кюветы применяю! в видимой спектрос-
копии. так как они прозрачны в диапазоне от 350 до 2000 нм и относительно дешевы. Кюветы
из кварца прозрачны при длинах волн ниже 350 им. однако они достаточно дороги (около
3000 руб. за ппуку). Обычно используют кюветы с длиной светового пути от 0,1 до 10 см. Фор-
ма кювет для образцов приведена на рис. 6-98.
Пластиковые (одноразовые) кюветы применяют при проведении исследований в видимой
области света, так как они пропускают свет в диапазоне от 350 до 900 нм. Следует обратить
внимание на то. чтобы используемы!) растворитель не растворял стенки или не вымывая
из них посторонние вещества, которые могут влиять на качество получаемых результатов.
С этой же целью необходимо тщательно следить за поверхностью кювет, тщательно их про-
мыва) ь после работы, оберегать от механических повреждений. Последнее касается всех ви-
дов кювет.
Отдельные кюветы в ряде случаев конструктивно объединяются в систему кювет или ячеек,
образуя специальные блоки кювет для многоканальных фотометрических приборов. Они назы-
ваются в зависимости от конструктивного исполнения планшетами, стрипами и т.п.
Разновидностью конструктивного исполнения контейнеров для образца является проточная
кювета. В них образец подается в измерительную проточную ячейку по тефлоновым трубкам,
прикрепленным ко входному и выходному отверстиям ячейки Для подачи образна в измери-
тельную ячейку обычно исиользуося перистатьгический насос. Проточные кюветы обеспечи-
вают постоянную величину пут лля светового потока и быстроту замера оптической плотнос-
ти образна. Между замерами ячейка автоматически промывается.
Для обеспечения кинетических исследований в фотометрических приборах предусматрива-
ется термостат!)рованне кюветы с поддержанием заданной температуры раствора (реакционной
смеси).
Детекторы изучения, Во всех приборах для спектроскопических исследовании для преоб-
разования светового потока в электрический сигнал испатьзуются специальные устройства —
фотоэлектронные умножители, фотоэлементы. фо синоды и <]ютодиолная матрица, называе-
мые детекторами.
Фотоэлектронный умножитель преобразует световую Hicpmio в ыектричсские импульсы,
которые усиливаются и поступают на считывающее устройство. Принцип действия современ-
ных трубчатых фотоумножителей основан на использовании специальной трубки из фоточувс-
гвительного металла, который поглощает световую энергию. испуская электроны в количестве,
пропорциональном падающей тучистой энергии.
Фотоэлемент (фототрубка) состоит из светочувствительного катода, изогнутого трубкой и
покрытого цезием, и узкого цилиндрического анода. Испускаемые катодом электроны собира-
ются па аноде, образуя во внешней цепи ток. поступающий на датчик для измерения.
Фотодиод (или светочувствительный диод — 1 DD) обычно изготавливается из кремниевою
материала, а в более современных разработках применяются кремниевые микросхемы, кото-
рые преобразуют энергию светового потока в измеряемый затем электрический сигнал
Методы определения токсикантов в биосоедах 449
Фотодиодная матрица представляет собой набор (линейку) фотодиодов, работающих в ком-
плексе друг с другом.
некоторые типы приборов для исследований методом спектроскопии в УВИ области
Приборы лля исследований метолом спектроскопии в УФ- и вн шмом свете различаются по
своей конструкции и решаемым задачам.
Фотокоюриметры предназначены лля определения концентрации окрашенного вещества
путем измерения величии поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного
спектра. От источника видимого свела световой поток проходит через светофильтр. Благодаря
его избирательное! и из всего излучаемого спектра вырезается область, близкая к длине волны,
соответсп хюшей максимальной величине пог эшення исследуемого вещества. В результате на
юразец падает световой поток, приближающийся к монохроматическому Это является необ-
ходимым ус товпем. Посте прохождения через кювету е исследуемым обратном ситовой поток,
часть энергии которого была поглощена раствором. поступает па детектор При этом величина
энертии светового потока, падающего па приемное устройство детектора, оценивается путем
ее преобразования в электрический сигнал. Устройство, которое пропускает световые волны
определенной длины волны и поглощает другие, называется светот)тьтром. Для этих целей в
фотоколориметрах используются стеклянные фильтры. Стеклянный фильтр представляет со-
бой одттн или несколько слоев цветного стекла, пропускающих только те волны света, которые
не послов яютея тайным цветовым фильтром. В абсорбционном фильтре Раттена (Written)
между двумя чистыми стеклами расположен слой окрашенного желатина, который позволяет
волнам только определенной длины про пи сквозь фильтр и. следовательно, через кювету' с
обра зцом.
Основными преимуществами стеклянных фильтров являются ттх низкая стоимость и про-
стота Главный недостаток заключается в относительно широком диапазоне длин тю ти свето-
вого потока на выходе светофильтра — до 60 им. что отдаляет характеристики этого потока от
монохроматического. Диапазон длин волн, пропускаемых фильтром. называют полосой про-
текания.
Фотометры. Чтобы получить излучение с более узкой, чем у стеклянных фильтров, полосой
пропускания, применяют интерференционные фильтры. Обычно ит терференииопные свето-
фильтры имеют ширину полосы пропускания в пределах 6—20 нм. Фотометры гак же. как и
колориметры, работают только па фиксированных длинах волн, при которых спектральные
характеристики используемых фильтров имеют максимальные значения.
Спектрофотометры. Основное отличие спектрофотометра от фотоколорпметра состоит в
возможности пропустить через исследуемый образец световой поток любой длины волны, про-
водить фотометрические измерения. сканируя весь диапазон длин воли не только видимого,
но и ближнего УФ-света.
Р( жим сканирования позволяет получать спектральную кривую поглощения (абсорбции),
определять максимумы (пики) поглощения, а также исследовать процессы интерференции и
находить ложные пики, приводящие к ошибочным результатам при спектрофотометрических
исследованиях
Принцип работы спектрофотометра заключается в том что полихроматический свет от ис-
точника проходит через монохроматор, который разлагает белый свет на цветовые компонен-
ты. с интервалом в несколько нанометров проходит через ту часть прибора, гле располагается
исследуемый образен, а затем — через детектор
Спектрофотометр IJV/VIS (УФ- + видимый свет) обычно имеет два источника света: для
видимого и УФ-участка спектра. Современные спектрофотометры работают в диапазоне от
НЮ—190 до 900-1200 нм.
Монохроматоры — устройства. позволяющие разделить полихроматический свет на моно-
хроматический спектр излучения. Действие спектральных приборов — спектрофотометров —
основано па том. что в некоторых физических системах условия прохождения свела оказыва
ются различными (диспергирующие системы). Обычно в качестве таких систем использую!
призму или дифракционную решетку
Основным преимуществом призмы является се низкая стоимость. Преимущество дифрак-
ционных решеток состоит в обеспечении линейной дисперсии света во всем диапазоне види-
450 Глава б
мо/о и УФ-сиск трон. Недостатком дифракционных решеток является их высокая стоимость ло
сравнению с призмами и светофильтрами
Одной из самых важных характеристик монохрома лоров является полоса пропускания, вы-
ражаемая в единицах длин ноли — нанометрах. Интерференционные фильтры лают ширину
пропускания в диапазоне 6—20 нм. а призмы и дифракционные решетки — более узкую no-
юсу. менее I нхт При анализе наркотиков и лекарственных веществ, в том числе в биологи-
ческих объектах, чате всего используются спектрофотометры с разрешающей способностью
1—2 им и менее. Уменьшение полосы пропускания влечет за собой повышение разрешающей
способности спектрофотометра. Современные спектрофотометры ведущих приборостроитель-
ных фирм имеют разрешающую способность до 0.001 им.
По своим констрхглинным особенностям спек трофотометры делятся ня оянагучевые и лв\ -
лучевые, отличающиеся по стоимости и возможностям. Однолучевые спектрофотометры нс
пользуются для раздельного (неодновременного) измерения поглощения света раствором срав-
нения и раствором исследуемого вещества. Кроме того, смена длин волн и перемещение кювет
с раствором сравнения и раствором исследуемого вешества в таких приборах осуществляется
вручную. Снятие спектров поглощения в широком диапазоне длин ноли с применением дан-
ного вила спектрофотометров затруднительно Однако в современных приборах. управляемых
компьютером, можно автоматизировать процесс. На рис 6-99 показана схема однолучсвого
сиск т рофотометра
Дву.лчевые спектрофотометры отличаются от однолучевых гем. чго излучение, выходящее
из монохрома гора, делится на два идентичных потока при помощи вращающегося зеркала
При этом один поток пропускается через кювету сравнения, а второй — через аналитическую
кювету Прошедший через кюветы свет фокусируется на фотодетектор с частотой И)—20 раз в
секунду, что позволяет полностью компенсировать неспецифическую абсорбцию материалом
кювет и используемым растворителем. Пошаговый двигатель обеспечивает вращение моно-
хроматора лля осуществления сканирования обрашов в широком диапазоне длин воли. Ско-
рость сканирования обычно составляет несколько нанометров в секунду. Однако современные
высокоскоростные приборы способны осуществлять эту операцию со скоростью от 20—50 ло
нескольких сотен нанометров в секунду. что приближает их к спектрофотометрам с диодной
.матрицей.
Спектрофотометры с фотодиодной решеткой являются особым типом приборов, у которых
свет от источника направляется непосредственно на образец и уже после этого па дифракци-
онную решетку, которая проецирует разложенный по поддиашгзонам свет на фотодиодную
решетку или матрицу со строго определенным количеством датчиков, преобразующих свето-
вую энергию в электрические импульсы. Любой диапазон длин волн при подобной конструк-
ции спектрофотометра дает свой отклик практически мгновенно (в пределах 10—30 мс). а нс
последовательно, как это имеет место в традиционной спектрофотометрии. Электрические
импульсы с <|ютодиодов обычно обрабатываются микрокомпьютером с выводом результатов
на дисплей. Количество фотодиодов определяет разрешающую способность спектрофотомет-
рического прибора.
Использование гакой схемы обеспечивает высокое быстродействие при работе спектрофо-
тометра в режиме сканирования — менее 1 с на диапазон сканирования, что хорошо согласу-
ется с возможностями хроматографических методов разделения.
Заслонка Ячейки для
Рис. 6 99. Блок-схема одно.тучсвото спектрофотометра
Методы определения токсикантов в биосредах 451
Метрологические вопросы спектрофотометрии
Правильность спектрофотамстрическ ix данных. В соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002
•Точность (Правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть I. Ос-
новные положении и определения», правильность (irucness) — степень близости среднею зна-
чения. полученного на основании большой серин результатов измерений (или результатов
испытании), к принятому опорному значению (см гл 6.1). Правильность данных си ктрофо-
то.метрин оценивается по результатам исследования аналитических образцов сравнения (этало-
нов. стандартов), свойства которых считаются известными.
Спектрофотометрические исследования лают результаты, выраженные в единицах пины
волны (частота) и единицах оптической плотности (пропускание). Соответственно методика
поверки должна предусматривать определение этих двух показателей работоспособности обо-
рудования.
Поверка шкалы длин вот. Поверка шкалы пин волн обычно проводится по спектру излуче-
ния ртмной лампы В этом спектре имеется ряд узких пиков, положение которых известно с
точностью до 0,001 им Текущий контроль шкалы проводится по растворам солен редкоземель-
ных элементов, облачающим узкими полосами поглощения.
В ГФ СССР XI издания регламентируется положение: «При измерении на разных спектро-
фотометрах значения характеристических длин волн могут отличаться на ±2 нм. Если отличие
превышает указанный предел, то необходимо провести калибровку шкалы ими воли».
Европейская и Британская фармакопеи устанавливают более строгие границы длин волн.
С згой целью испо илукмея как полосы поглощения ртутной и дейтериевой ламп, так и полосы
поглощения 4% раствора (вес/объем) оксида гольмия в 1.4 М перхлорной кислоте. Допустимые
расхождения для УФ-диапазона составляют ±1 им. для видимой области света +3 нм. В габл.
6-42 приведены полосы поглощения, ио которым проводится поверка.
Таблица 6-42. Псыосы поглощения, по которым проводится проверка шкалы длин ноли
Источник света Раствор гольмия оксида в перхлорной кислоте Ртутная лампа Дейтериевая лампа Водородная лампа Полосы поглощения, нм 241.15; 253.7; 287.15:361.5: 536.3 302,25: 313.16; 334.15. 365 48; 404.66; 435.83; 546.07: 576.96: 579.07 486.0 486.1
В настоящее время некоторые фирмы выпускают специальные поверочные фильтры. На
рис. 6-100 представлен спектр поглощения фи зыра с гольмия оксидом.
Поверка шкалы абсорбции. Для проверки шкалы пропускания ГФ СССР XI издания рег-
ламентирует использование стандартного образца — раствора дихромата калия, содержаще-
го 60.06 mi в 1000 мл в 0,005 моль/л серной кислоты при толщине слоя 10 мм Оптическую
плотность этого раствора измеряют несколько раз при длинах волн 235. 257, 313 н 350 им.
соответствующих максимумам и минимумам поглощения. Рекомендуемые средние значения
птичсской плотности: 0.7483 для 235 нм. 0.8645 для 257 нм. 0.2916 для 313 им и 0,6403 для
350 им Стандартные отклонения этих величин ис должны превышать 0.004 для 235 нм и 0.002
для прочих длин волн.
Для поверки работы прибора прзз более коротких длинах волн можно использовать раствор
никотиновой кислоты (0,016399 г/кг в 0.1 М НС1). оптическая плотность которого при 210 им
равна 0.7593
Поверка влияния рассеянного света. Поверка обычно осуществляется при опрело ichhoi'I дли-
не волны с использованием конкретного раствора или светофильтра. Например, абсорбция
1 2% раствора натрия хлорила в воде должна быть не менее 2 ед. при длине светового пути
I см и использовании волы в качестве образца сравнения.
Поверка разрешающей способности. Обычно в спектроскопии для поверки разрешающей спо-
собности оборудования используют стандартные смеси веществ с известными спектральными
характеристиками. Например, Британская фармакопея 2001 г. тля этих целей, если в конк-
452 Глава 6
Рис. 6-10U. Спектр поглощения фильтра с гольмия окисидом
ротной статье прописано проведение такой проверки, pei гаменгирусч использование 0.02^
раствора (обьем/ объем) толуола и гексане при использовании в качестве вещества сравнения
толуола. При этом отношение поглощения при максимуме 269 нм к поглощению при мини-
муме полосы пропускания при 266 нм должно соответствовать данной конкретной фармако-
пейной статье
Если проводят исследование в режиме про-
изводной спектрофотометрии (см. ниже), для
проверки разделяющей способности обору-
дования используют следующий подход. Для
0.020% раствора толуола в метаноле записыва-
ют спектральную кривую второй пропзвт диой
и диапазоне 25д—27д нм относительно мета-
нола. На спектре между полосами поглоще-
ния 261 и 26S нм должны быть две ючкн экс-
тремума. 11а рис. 6-101 показан спектр такого
раствора и oi мечены точки, необходимые для
измерения. Соотношение A/В должно быть ие
ниже 0.2. если другого не прописано в конк-
ретной фармакопейной статье
Пскпроизводимоеть спектрофотометричес-
ких данных. Основные факторы, влияющие на
BpcnjTpiWBOfl.ilмость резулыаюв спектрофото-
метрического измерения:
• Химические и фотохимические: случайные
погрешности в приготовлении анализиру-
смого раствора: влияние мутности раствора
и флюоресценции анализируемого вещест-
ва или содержащихся в растворе примесей.
• Вюветная погрешность: нескомпеиспро-
ванное из-за разной толтпииы кювет пог-
лощение растворителя, разное светопогло-
тпение кювет, многократные внутренние
отражения света в кюветах. Последняя
Рис. 6-101. УФ-спскгральная кривая второй произ-
водной расторг толуола в меганоЛе
Методы определения токсикантов в биосредах 453
причина вызывает при ооычных условиях погрешность и.05—0,2% пропускания. Наиболее
существенным компонентом кюветной погрешности является невосироизводимость поло-
жения кювег относительно оптическою пучка.
• Погрешность хо. истого опыта, складывающаяся из погрсшиосп и в приготовлении раство-
ров и влияния их летучести или способности к фчюорссцспппн. Возможно несколько спо-
собов учета оптической плотное) и холостого раствора, из которых наиболее точным являет-
ся непосредственное измерение оптической плотности испытуемого раствора относительно
ХО 1ОС1ОГО.
• Погрешность установки аналитической длины волны, складывающаяся из погрешносп! отсче-
та по шкале длин воли и несоответствия ио южепия диспергирующего ыемепта (призма,
решетка) и указателя на шкале длин волн (т.е. проявление гистерезиса*).
Спектрофотометрия как метод установления структуры вещества
Широко применяются способы химического модифицирования аналита. которые позво-
ляют в сложной смеси исследовать само вещество, его метаболит или примесь (например,
продукт иолусипгеза) путем смешения максимумов поглощения в УФ спектре полученного
деривата в длинноволновую область.
Провести полную идентификацию вещества на основе только результатов УФ спектроско-
пии без привлечения дополнительных данных об анализе практически невозможно. С другой
стороны, наличие максимумов поглощения у исследуемою вещества может пригодиться лля
нредва |пслыю11 идентификации. В XIА УФ-спектроскопия расценивается как метод, имею-
щий отрицательное судебно-химическое значение (см. гл. 5, 7. 8).
При подозрении, что в исследуемом образце присутствует вещество, ст особпос hiiiciichbiio
поглощать в УФ- или видимой области света, обычно проводя) регистрацию спектров в кислой
и щелочной водных средах, а также в органическом растворителе, например в метаноле или
junto.ie. Полученные значения максимумов поглощения сравниваются с библиотечными зна-
чениями. К настоящему времени обобщены УФ-спектрапьиые характеристики многих coich
токсикологически важных вешеств и их метаболитов, что позволяет использовать полученные
данные в ХТА. Обычно попек по базам данных осуществляется с точностью до ± 2 нм.
Количественный анализ. Количественный спектрофотометрический анализ поглощающего
свет вещее та сводится к определению его концентрации в растворе ио установленной опти-
ческой плотности испытуемого раствора и раствора стандарта с известной концентрацией при
определенной длине волны, обычно соответствующей максимуму поглощения этою вещест-
ва. Обгасги переключения источников излучения являются неблагоприятными для исследова-
ния.
Для уменьшения ошибки измерения при исследовании образцов, в состав которых входит
только одно вешество с удовлетворительной способностью к поглощению спета, выбирают
длину волны, соответствующую максимуму поглощения лого вешества Такой подход чаше
всего используют при исследовании декарс) венных препара юв. например инъекционных рас-
воров кетамина (см электронное приложение). Другой пример При количественном опре-
делении моноксида углерода в крови пострадавших (см. гл. 8.3. рис. 8-16) ВОЗ рекомендует
ясно 1ьзоваи> изобесгическую точку (А, 579 нм)
Во многих случаях точное измерение поглощения света вешеспзом при определенной пине
волны бывает затруднено из-за нсспспифического поглощения материалом кюветы, раство-
рителем или компонентами образца. Для уменьшения воздействия этого фактора разработки
несколько подходов, среди которых геометрический метол Мортона Стубба, ни |и|юрснциаль-
пая спектрофотометрия, математические методы или методы химической модификации иссле-
дуемого вешества с целью изменения положения максимума его поглощения. Некоторые из
них описаны ниже.
• Гистерезис (от ipe i hy aeresis — отставание) — запаздывание изменения физической величины, харак-
теризующей состояние вешества. от изменения другой физической величины, определяющей внешние
условия Гистерезис наблюдается в тех случаях. когда состояние тела определяется внешними условиями
не только в данный момент пречепп. по и в предшествующие моменты. Наиболее важны: магнитный
гистерезис, сегнегоелектрический иктерезие и упругий гистерезис
454 Глава 6
Дифференциальная спектрофотометрия
Кроме метола непосредственной спектрометрии, описанного выше, большое распростране-
ние получил метол дифференциальной спектрофотометрии. При измерении светопоглошения
анализируемого раствора опюептелыю среды сравнения оптическая плотность которой зна-
чительно больше 0. используют метол спектрофотометрии, называемый дифференциальной.
Дифференциальные метод анализа использую г для повышения ючиосги спектрофотометричес-
ких и фотоколоримегрических измерений при определении высоких концентраций веществ
(от 10 до 100%). Сущность метода заключается в измерении свегопоглощсния анализируемого
раствор;! онюешельпо раствор;! сравнения, содержащего определенное количество испытуе-
мого вешества; это приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению отно-
сительной ошибки анализа до 0.5—1%.
Концентрация вещества в образце сравнения Св обычно меньше его концентрации в ана-
лизируемом образце С\. хотя это и нс обязательно. Пропускание анализируемого раствора ио
отношению к раствору сравнения будет равно
-е(с„ -сп).
Т =10
OfWW
Далее рассчитывают С
I ели ввести фактор пересчета F = 1/fl. то Ск = С,+1 А . то расчеты значительно упрощают-
ся. Фактор пересчета F находят по результатам измерений оптических плотностей эталонных
растворов относительно эталонного раствора с концентрацией С,.
Для дифференциальной спектрофотометрии характерны, кроме погрешностей, общих ня
нспосрсдствс nioii спектрофотометрии, свойственные только этому метолу погрешности, на-
пример с ростом А., значительно увеличивается ширина щели сиекгр!м|ю1ометра, что привадит
к нарушению монохроматичности света, уменьшению коэффициентов поглощения веществ
и угля идклона калибровочного графика. Также увеличивается влияние рассеянного света на
результаты измеренн»! При уровне рассеянного снега 1% использование А,. > 1,5 не имеет
смысла, так как калибровочный график становится параллельным оси абсписс
Дифференциальная спектрофотометрия повышает требования к используемому оборудо-
ванию, качеству кювет и квалификации сотрудников, проводящих измерения. Используют
различные варианты дифференциальной спектрофотометрии.
Двулучевая и миоговатовая спектрофотометрия. При измерении этим методом устанав. и-
вастся разность поглощения исследуемого раствора при двух или более длинах волн. Такая
модификация метода спектро(|ютометрии широко используется при анализе биологических
объектов; для количественного определения примесей в реактивах и контроля над ходом син-
теза. например текарствсппых препаратов; в комбинированных методах исследования, напри-
мер ВЭЖХ со спектральным детектированием. Рассматриваемый вил спектроскопии имеет
ряд преимуществ по сравнению с олнолучевым вариантом. Они связаны меньшим влиянием
мутности раствора, иогюшением растворителя, нсноспроизволимостыо приготовления раство-
ра сравнения и непарностью кювет.
Двулучевая сиск1рофотометрия предпочтительна при наличии в растворах поглощающих
или рассеивающих свет примесей, малых значениях оптической плотности и £** /е‘ >0
Производная спектрофотометрия. Производную спектрофотометрию относят к одному из
вариантов дифференциальной спектрофотометрии. Улучшение разрешения отдельных полос
поглощения и повышение селективности спектрофотометрического определения достигаются
при переходе к спектральным кривым второй, а иногда и четвертой производной. В произ-
водной спектрофотометрии измеряют разность свстоног тошения при двух длинах волн X, и к,,
разделенных малым интервалом АХ = к, — к. Предел отношений разности оптических плот-
ное гей при двух длинах волн ДА к Дк равен математической первой производной и является
функцией от длины волны* dA/dk=f(k). Дифференцирование позволяет уменьшить ширину
полосы основного ника и увеличить разрешение перекрывающихся в исходном спектре полос,
при эюм малокарактсрпос поглощение подавляется. а характерные полосы, даже при малой
интенсивности усиливаются. На рис. 6-102 приведены исходный спектр вешества и спектраль-
ные кривые первой, второй и четвертой производных
456 Глава 6
Рис. 6-104. И К-спектры в областях 700-
9<Х) и 1650—2000 см 1 некоторых замешен-
ных бензола е метильными труппами.
замешенных бензола видно, что различие в строении
молекул отражается в нх колебательных спектрах. Этот
факт — основа идентификации соединений.
Средняя область ИК-спекгра (часто упоминаемая
просто как И К спектр) широко используется и «и;пи-
зс лекарственных веществ. наркотиков н пестицидов.
Дальний ИК-спсктр необходим для анализа талогс-
нированных соединений и неорганических вешеств.
поэтому некоторые приборы работают в диапазоне
приблизите пято от 5000 ло 200 см 1 С помощью ИК-
спсктрометрии изучаются главных! образом молоку
лирные спектры, так как в ПК-области расположено
бо ТЫНИНС1ВО колебательных и вращательных спектров
молекул. Поглощение ИК-излучения носит селектив-
ный характер и происходит на тех частотах, которые
совпадают с некоторыми собственными частотами ко-
лебании атомов в молекулах вещества и е частотами
вращения молекул как целого, а в случае кристалли-
ческого вещества — с частотами колебаний кристал-
тической решетки. В результате интенсивность ИК-
излучения на этих частотах резко падает — образуются
полосы поглощения. Каждое соединение имеет спе-
цифический ИК-спекзр поглощения, отличающийся
от ИК-спектра поглощения другого соединения. При
полном совпадении ИК-спектров поглощения двух пли нескольких веществ можно утверж-
дать, что данные объекты идентичны. Соединение в разных фазовых состояниях имеют близ-
кие. ио неодинаковые ИК-спектры поглощения. Гожлествснпые ИК-снектрт.1 принадлежал
оптическим изомерам одного и того же соединения.
При ИК-облучсннп поглощение происходит только при изменении дипольного момента
молекулы. Двухатомные молекулы, у которых нет дипольного момента, например водород,
азот или кислород, нс поглощают в ПК-области Полная симметрия в структуре молекулы
нс даст возможности нроявипюи некоторым вид!м поглощения, например симметричная мо-
лекула этана ие дает углерод-углеродных полос поглощения. Как известно из курсов анали-
тической химии и обшей физики, молекулы и ионы обладают несколькими видами энергии.
Это поступательная, электро!пинт, колебательная, вращательная энергия. каждая из которых
характеризует определенное движение молекул, атомов или ядер атомов. Если а.мтынту з ко-
лебаний ядер одной из связей значительно превосходит амплитуды колебаний всех остальных
ядер молекулы, тогда частоту данного нормального колебания условно относят к колебанию
именно этой связи Если частота, соответствующая колебанию определенной связи, мало ме-
няется при переходе от одной молекулы, содержаще i эту связь, к другой, то такую частоту
называют характеристической. Наличие в колебательном спектре характеристических частот
(полос) однозначно указывает на присутствие в молекуле вещества соответствующих им свя-
зей. Концепция характеристических частот широко используется лля проведения структур-
но-группового анализа веществ по их к< зебательным спектрам. Для подобного рола анализа
неорганических и органических вешеств существуют специальные корреляционные таблицы.
На схеме 6-1 прелеташтсн лиана юн характеристических частот определенных связей в органи-
ческих СОСДИНСНИЯХ.
В настоящее В|>емя ИК-сиектралытый диапазон 400—4(Л)() см * называют обл 1сп>ю «отпечат-
ков пальца». Совокупность полос в згой области характеризует молекулу в целом (см. элект-
ронное приложение).
Количественная связь между интенсивиоегью I прошедшего через вещество излучения. ин-
тенсивностью падающего излучения 1(| и величинами, характеризующими иоглошаютнее ве-
щество. определяется законом Бузера -Ламберта- Беера (см. гл 6.4.2.1).
Если при колебаниях молекул не происходи! изменения дипольных моментов, зарегистри-
ровать их ИК-спектр нельзя. В этом случае необходимую колебательную информацию о мо-
Методы определения токсикантов в биосредах 457
«00 3000 2000 1500 1000 800 600
1 . Т" 'Г 1... 1 I 1 “Г ПС-Н Л 1
vno (C-N-O или 0-N=0)
Т— ----1
V..WJ v.Mk, (C-NO2,-ONO2)
I------1 I------1
v₽-o
I----------1
J___________________I
«00 3000 2000 1500 1000 800 600
— i
V. CM
Схема 6-1. Диапазон тряктерис i нчсских частот определенных связей в органических соединениях
<Ю Л Болотов. 2002). v . v — симметричные и антисимметричные валентные колебания; 8. я —
деформационные колебания (см. курс ана. итическои .химии).
лекуле можно получить метолом комбинаишЛитого рассеяния света (КРС. рамановская спек-
трометрия). С помошью специальной техники удастся зарегистрировать результат модуляции
видимого света колебаниями молекул
Таким образом, колебательные спектры решетрируют в форме ИК-снсктров или спектров
комбинационного рассеяния (спектров КР, рамановских спектров). ИК-спектр представляет
собой спектр поглощения в инфракрасной области, спектр КР возникает при облучении ве-
шества монохроматическим светом УВИ диапазона. При пропускании монохроматическою
светового потока (с частотой v) молекулы вешества поляризуются и рассеивают свет с частотой
х- (релеевское рассеяние) и частотами v±v(li (комбинационное рассеяние), где vhi — частота нор-
мальных колебаний молекулы. Колебательные частоты няблюдакмея в виде комбинационных
смещений частоты возбуждающего света в УВИ области спектра (рис. 6-105—6-107), Частоты
458 Глава 6
Преобладает упругое релеевское i рассеяние
До... 0
—* !
Возбуж-
дающее
излучение..
Молекула
После...
Рассеянный
г; 0861
Молекула
Рис. 6-105. Вилы рассеяния света —
релеевское рассеяние.
• Частота возбужденного и
рассеянного света совпадают
Интенсивность
рассеянного
света
во Суждения
• Неупругое (рамановское) рассеяние испытывает
1/10’часть падающего снега
До Q * Возбуж дающее U излучение вл Молекула После. /Г'х * Рассеянный * свет Молекула колеблет я
Интенсивность
рассеянного
света
• Энергия света частично переходит
в энергию колебания молекул
возб 'возб колеб
Рис. 6-I06. Виды рассеяния света — ра-
мановское рассеяние.
Рамановская
компонента
Релеевская
компонента
возбуждающее излучение
(лазерное излучение
рассеивающее
вещество (образец)
зеленый
Рамановская
компонента
наблюдатель
Рис. 6-I07. Схема jKcnepitMCirra по Наблюдению рамановского рассеяния (А). При облучения вещества
Лазером усиливаются колебания атомов молекул (Ь). происходит потеря энергия падающего света (В).
v — vni называют стоксовыми, а частоты v + v1(i — антистоксовыми В резуть нруютем спектре
комбинационного рассеяния света наряду с линией индуцирующего света появятся дополни-
тельные слабые частоты в более длинноволновой области — стоксовы линии и в более корог-
коволновой — антистоксовы линии
Потери энергии падающего света после об учения обратна зависят от
• масс колеблющихся атомов, которые вхо, яг в состав молекулы;
• природы химических связей,
• состояния вещества
Методы определения токсикантов в биосредах 459
Рамановский сдвиг см
Р«. 6-108. Рамановский спектр героина в УФ-дна
вазоне (воэбужасние видимым снегом диет сильную
флюоресцентно).
Интенсивность рассеянного света зави-
сит от количества анализируемого вещес-
тва .
Сиск ip КР строят в координатах: интен-
сивность рассеяния света — рамановское
смешение Энергия фотонов возбуждаю-
щего света hv должна быть меньше энер-
гии электронного возбуждения молекулы
В противном случае може! возникнуть
флюоресценция перекрывающая спектр
КР (рис. 6-108.). Помимо полос с часто-
тами v±voi . называемых полооами первого
порядка в спектрах КР могут появляться
полосы второго (v±2v i). третьего (v±3voi)
и более высоких порядков
Не вес колебательные переходы будут
наблюдаться в ИК-снсктре или КР-сисктрс
(табл 6-43).
Тяб.шш 6-43. Основные различия ПК и КР-снектрометрнн
НК-спектрометрия (ИКС) КР спектрометрия (КРС)
Интенсивность полосы тем больше. чем сильнее меняется лииозьнын момен! молекулы при дан ном нормальном колебании Интенсивные полосы присуши неполярным мо- лекулам е ковалентными связями (например. Н,. О . CI ) Обязательное условие — поляризуемость молоку ты
МакСн мм ьная интенсивность полос hoi лощения у молекул с ионными связями Иктенсивношь ашнстоксоных полос заменю ниже чем стоксовых (при обычной температуре)
С повышением интенсивности возбуждающе и монохроматическою света интенсивность полос КР возрастает*
Дополняет возможности КРС Полный набор колебательных частот молекулы может быть получен лишь па основе совместного анализа ИК-спекгров и спектров КР Доиолняе! возможности ИКС Полный набор колебательных частот молекулы может быть получен лишь на основе совместного анализа ИК-спекгров и спектров КР
Прзпи. о альтернативного запрета: для молекул, имеющих центр симметрии, колебания, асиммет- ричные центру симметрии, активны в ИК-епект- рс и неактивны в спектре КР Правн о альтернативного запрета'для молекул имеющих центр симметрии, колебания, симмет- ричные центру симметрии. активны в КР-сиект ре и неактивны (нс паблюлакися) в спектре ПК
Интенсивность некоторых полос возрастает в 1ЫСЯЧН (десятки тысяч) риз. если частота воз- буждающего света v приближается к частоте разрешенного эдектронного перехода молекулы (резонансное КР свсм — РКР)
Нельзя (нс имеет смысла!) использовать для изу- чения водных растворов, поскольку вода интен сивно поглотает ПК-излучение Следует применять для изучения полных раство- ров. поскольку комбинационное рассеяние воды весьма слабое
*Дл того чтобы увеличить интенсивность линии рассеяния света, в качестве источника исходного моно- хроматического излучения используют зазеры.
КРС применяют для исследования молекулярной структуры орпяпичсских и иеорпничсс-
ких соединений, изучения нодпых растворов неорганических соединении определения конфи-
гурационных изомеров и в других случаях.
В табл. 6-44 приведены пределы обнаружения методов колебательной спектрометрии
460 Глава 6
Таблица h-44. Пределы обнаружения методов колем гсльиоз* спектрометрии
Метол Предел обнаружения. % мясе. Агрегатное состояние оорашов
ИКС 10'-10 Газы, жидкости. твердые пешее пи
1’КС 10'-10 Газы, жидкое! и. твердые ве шеста
Резонансная рамановская спектро- метрия (РКР-спсктрометрия) КС-КН Газы, жидкости
В ПК- и КР-спсктрах наряду с колебательными полосами по обе стороны от них присутс-
твуют и полосы, отвечающие колебательно-вращательным переходам. По мере усложнения
молекул веществ разрешение спектров уменьшается и отмечаются широкие колебательно-вра-
щательные полосы. У кристаллических веществ вращательная структура не наблюдается. Силь-
ное уширение полос в спектрах твердых и жидких нет icctb. а также их концентрированных
растворов может быть связано с образованием водородных связей между полярными группами
соседних молекул.
Рамановская спектрометрия нашла широкое применение в криминалистической эксперт и те.
Отличительные особенности рамановской спектрометрии.
• Неразрушаюший бесконтактный анализ.
• Высокая химическая селек явност ь.
• Высокая чувствительность
• Высокое пространственное разрешение.
• Объемный и микроскопический анализ.
• Различные объекты исследования: наркотики, взрывчатка, краска, волокна, чернила и др
• Возможность анализа ветиеспза в запечатанной упаковке
• Автоматизированные измерения.
• Стационарные и переносные нризюры
• Ннзкая мощность л т зера.
• Быстрота измерений.
• Наличие тематических библиотек рамановских спектров.
На рис. 6-109 представлены спектры КР близких химических структур — морфина и героина
Для обнаружения и идентификация наркотиков применяют рамановскую микроскопию.
Используемые приборы имеют специальный микрозонд хтя абораюриых исследований и
Рамановский сдвиг, см
Рис. 6-109. Селективность рамановской спектроскопии.
Методы определения токсикантов в биосредах 461
оптоволоконный датчик. Переносная рамановская система используется непосредственно на
место преступления При этом можно быстро идентифицировать смеси наркотиков и их исход-
ные компоненты по библиотеке спектров наркотических веществ (рис. 6-ПО).
Зя К) с методом КРС можно установить следы взрвывчатых веществ в образце или не-
посредственно на руках ембьекит. подозреваемого в их приготовлении и/или использовании
(рис. б-ill. 6-I12). ’
Рис. 6-110. Обнаружение наркотиков с иомотиыо ртманопскои низу лизании.
Смесь кокаина с сахаром. I — изображение в видимом свете: 2 — рамановская визуализация кокаина.
3 — рамановская титзуялизминя кокаина (после вычитания фона).
0000000000
Гис. 6-111. Отпечатки пальцев со следами взрывчатки. Отпечаток 2-го поколения: отпечаток чистого
пальца, который коснулся 40-го отпечатка 1-ю поколения лает положительный результат.
Рис. 6-112. Рамановская визуализация
взрывчатых вешеств. Крупинки тексо-
гетта.
1 — вещество в видимом свете; 2 —
рамановская визуализация гсксотсна.
462 Глава б
500 1000 1500
Рамановский сдвиг, см*1
Рис. 6-113. Спектры КР бума! и и чернил. нанесенных на бумагу.
Длина волны лазера 782 нм, диаметр лазерного пятна — 2 мкм. мощность лазера — 30 мВт. увеличение
объектива х50, время регистрации 2 мин. Коррекция фона.
С помощью конфокальной рамановской микроскопии можно идентифицировать разнооб-
разные черные и цветные чернила (рис. 6-113—6-115). отличать одноцветные чернила друг от
друга (черные чернила представляют особую сложность).
Помпмосгащвр того использования ИК-спекгрометриидля идентификации и количественно-
го определения вещества (см. электронное приложение) метод позволяет определять среднюю мо-
лекулярную массу некоторых полимеров
по к одичал ну концевых групп, степень
стсрсорегулярности. наличие конформа-
ций. водородных связей, взаимодействие
растворенное всшест во—pact ворнтсль.
природу гидратации и др. Для решения
таких сложных задач используют более
мощную аппаратуру, отличающуюся oi
(радшшонпой. когда ИК-снектр регис-
трируют. например записывая на бланке
диаграммы в координатах пропускание
Т — волновое число г, в режиме про-
пускание — время сканирования. Это
так называемый дисперсионный метод
(см. ниже). Существенным недостатком
таких систем становится их инерцион-
ность, обусловленная последовательной
записью спектра по мере сканирования
всего заданного участка ИК-области и
инерционностью таких детекторов, как
болометры и термопары. Устранить этот
недостаток можно с номошыо сочета-
ния математического алгоритма Фурье-
преобразования с ПК-спектрометрией.
И К -Фурье-спс к громе грия позволяет
чрезвычайно быстро — за секунды —
записать весь ИК-епсктр (в в других
областях спектра вплоть до радиочас-
тотной!). Математический аппарат Фу-
рье-преобразования дас| возможность
Рис. 6-114. Спектры КР разноцветных чернил, а — зеле-
ные Bic’: б — синие Parker В 11 Реп. в — красные ВегоГ
Методы определения токсикантов в биосредах 463
Рис. 6-115. Спектры КР чернил черного цвета а — Bic’ Fine; б — Pilot" BP-GP; в — Schneider Длина
водны лазера — 514 нм. диаметр лазерною пятна — 2 мкм мощность лазера — 30 мВт. увеличение объ-
ектива — х50. время penicipaiiiiii — 2 мин с коррекцией <|юна.
выделять исходные периодические компоненты из сложной также периодической функции,
например записи ИК-спектра. разумеется, путем соответствующей компьютерной обработки.
Ре ультатом Фурье-преобразования является частотный спектр. В этом методе вместо традици-
онного монохроматора с выходной ш< лью использую! классический интерферометр Майксль-
сона и пироэлектрические детекторы, что позволяет резко увеличить скорость съемки всего
спектра ло практически одномоментной. Интерферометр работает как своеобразный высокос-
коростной прерыватель и пучения, даюший соответствующую разность хода лучен Благодаря
этому дна монохроматических потока с различающимися частотами, прошедшими через пробу,
попадают в интерферометр одновременно и Лают в зависимости от ргзличня в пропускании
соответствующую интерференционную картину, записываемую после выполнения Фурье-пре-
образования на компьютере как искомый ИК-спсктр.
ИК Фурье-спектрометрия обладает существенно большим спектральным разрешением и
отличается более низкими пределами обнаружения, так как вся энергия от ИК-излучателя
проходит через образец I отсутствие оптических щелей и приборе) и попадает на детектор.
И гак. И К Фурьс-спеклрометрия представляет собой один из вариантов метола ИК-спектро-
метрии и по существу не является отдельным спектральным методом. Спектры вешеств. получен-
ные па ИК-Фурьс-спектромстрах. не отличаются or спектров, полученных на диспергирующих
ИК-спектрометрах. Термин *ИК-Фурье-спсктромстрия'» возник с появлением нового поколения
приборов, в основе оптической схемы коюрых используются интерферометры различною типа.
ИК-спекгрометры разделяют на диспергирующие и недиспергируюшне. К приборам перво-
го типа относятся сканирующие спектрометры, к приборам второго типа — Фурье-спектромет-
ры. Сканирующие спектрометры построены на базе монохроматора, в Фурье-спектрометрах
вместо монохроматоров применяют интерферометры (рис 6-116).
ИК-спектромегры (источник излучения — электрический Прово опции элемент) бывают
одно- и двулучевыми или в однохг приборе могут сочетаться два устройства. В двулучсвом при-
боре, излучение проходит в через образен, и через стандарт. Стандарт позволяет уменьшить не-
желательное поглощение, например растворителей. Прибор, снабженный компьютером, может
запомнигь и записать спектр растворителя и затем вычесть его из следующего спектра. Различ-
ные конструкции приборов позволяют излучению проходить через образец и стандарт одно-
временно иди через каждое вещество поочередно (раскалывание перед образном). Клиновид-
ное или гребенчатое гасяшее устройство, связанное с регистрирующим пишущим устройством,
регулируют таким образом, чтобы поглощение обоих лучей было равным. Эти инструменты
недостаточно чувствительны в случае сильного поглощения обр зца В современных приборах
автоматически измеряется степень интенсивности поглощения образца и стандарта.
464 Глава 6
Рис. 6-116. А. Схема Фхрье-спсктрометра Digihih FTS 700(1.
Б Принципиальная схема Ф>рье-спсктрометра. I — источник света. 2 — светоделитель. 3 — подвижное
зеркало. 4 — неподвижное зеркало. 5 — исследуемый обрг ей.
Ошибки приборов (ИК-спектрометров) обусловлены различными причинами Как правило,
ошибки измерений при больших длинах волн значительнее, чем при низких. Для современных
диспергирующих приборов допустима ошибка ±5 см'1 или менее при 5000 см а в ряде слу-
чаев — ниже 2000 см Чтобы калибровать масштаб длин волн, надо сначала записать спектр
образца, а затем поместить полнепфольную пленку в образен и записать некоторые нз глав-
ных полос с известными частотами, которые нс сони; ают с главными полосами в спектре
образца. Далее для каждой области спектра вычисляют разницу между зарегистрированной и
Методы определения токсикантов в биосредах 465
нрлвн 1ЫЮЙ частотой полос полистрол;! и используют полученные данные и табличной или
।рафичеекон <|юрмс для исправления наблюдаемых полос обра икь
В диспергирующих рамановских приборах происхо шт фокусирование рамановского сигна-
ia на решетку. которая пространственно разделяет собранный рамановский рассеянный свет
на индивидуальные длины волн. Этот пространственно-диспергированный свет наира тешется
на детектор — CCD. В современных рамановских спектрометрах применяю! исключительно
высокоппгснснвпыс монохроматические источники — лазеры гелий-неоновый (А = 632.8 км),
дргоновын (А = 488.0 нм), криптоновый (А = 530.8 нм и 647.1 нм). Одним из достоннегв
использования лазеров с короткой длиной волны является усиление рамановского сигнала.
Эффективность рамановского рассеяния значительно увеличивается, когда длина волна воз-
буждающего лазера становится меньше Однако непредсказуемая флюоресцентны (очень эф-
фекишная эмиссия с величиной на несколько порядков большей, чем рамановский сигнал) за-
трудняет применение рамановских спектрометров как рутинных приборов. Так. флюоресценция
даже средней величины может перекрыть желаемое рамановское измерение (см. рис. 6-108).
Это явление швиси! от длины волны, например образец, который флюоресцирует при одной
длине волны, может быть неактивным при другой. Полому в современных приборах длина
волны лазера оптимизирована, и существует алгоритм быстрого и простого се выбора. Лиф-
p. книоннан решетка оказывает сильное влияние на спектральное paijKiiicrine и производи-
тельность прибора. Решетки имеют много липин пли бороздок, «выжженных» па поверхности,
которые диспергируют приходящий луч. Чем больше число бороздок на решетке, тем шире
угол дигцгерсии выходящих лучей.
Чем больше дисперсия исходящих лучей, тем больше площадь, на которой будут располо-
жены различные длины волн. Koina они лостш нут детектора. Размера детектора не хватает для
всех рамановских длин волн, падающих на детектор. В случае высокой дисперсии (высокого
разрешения) двигают шбо решетку, либо детектор для после лови те. 11,11010 сбора областей спек-
тра Отклик решетки зависит от длины волны, а дисперсия вдоль оси дшн волн нелинейная,
поэтому спектральное разрешение усташисшвают для конкретной лтины во шы. которое будет
изменятся вдоль всего спектра.
Для повышения производительности работы в относите, ьно узком диапазоне длин волн
решегку выбирают с учетом желаемого разрешения и мощности лазера. В идеальном с |учас
решетки должны быть специально подобраны к лазеру и условиям проведения эксперимента.
Для диспергирующих рамановских спектрометров в основном используют CCD с очень вы-
сокой чу вс пзт ел ы гостью на основе кремния. Летектзгрующая поверхность CCD представляет
собой двухмерную матрицу светочувствительных элементов, называемых пикселями (обычно
каждый пиксель имеет размер менее 30 мкм) Каждый пиксель работает как отдельный детек-
тор каждая диспергированная длина волны детектируется отдельным пикселем (иди близко
расположенной группой пикселей). Обычно CCD имеют отклик в значительном диапазоне
длин волн — лля лабораторных систем оз 400 нм ло приблизите гыго 1000 нм. Специализиро-
ванные детекторы имеют отклик оз приблизительно 1100 нм до УФ-диапазона. Длзг гиспер-
гируюигих рамановских спектрометров с лазерохг 785 нм отклик при 3000 ехг1 (соответствует
облает спектра валентных колебаний связи С—Н) отвечает излучению 1027 нм. Многие CCD
имеют очень слабый сигнал тля откликов па излучение лазера при 785 н.м. по использование
и пучения лазеров с более высокими длинами воли крайне нежелательно, так как приводиз к
поломке детектора прибора.
Интерференционные спектрофон аметры (или Фурье-преобразователи). В отличие от дис-
пергирующих приборов, огги имеют устройство, разделяющее луч. гг два перпендикулярных
друг другу зеркал, одно из которых неподвижное, а второе — может двигаться пол углом к
плоскости (см рис. 6-116) Примерно половина излучения от источника отражается на непод-
вижное зеркало, а затем — назад к разделяющему устройству, которое передает приблизитель-
но половину (т.е. ’/4 исходного) на детектор. Вторая пг ювина исходного излучения проходит
через разделяющее устройство к подвижному зеркалу, где отражается обратно па разделяющее
устройство и примерно половина (т.е. опять */4 исходного) перелается зга детектор. Когда два
зеркала равноудалены от разделяющего устройства. лучи интерферируют. Если подвижное зер-
кало nepexreinaeiCH в любом направлении на /4 длины полны (Х/4). два луча гасят друг друга. В
случае монохромаз ическото света детектор регистрирует луч. интенсивность которого ио мере
466 Глава 6
Спектры Интерферограммы
1 tom
Рис. 6-117. Получение спектров с по-
мощью Фурье-спскгромегров в два
эгаиа. Пояснение в тексте.
движения зеркала изменяется синусоидально. Однако и случае полихроматического света де-
тектор записывает сумму всех волн: копа оба зеркала равноудалены от разделяющего устройс-
тва. все волны нахе ятся в одной фазе и. интерферируя. усиливаю 1ся и на интерферограмме
виден интенсивный центральный пик (рис. 6-117) Таким образом, с помощью Фурье-спекгро-
мстров спектры получают в два этапа. Сначала pci истрируется интерферо!рамма. т.е. выходной
световой поток в зависимости от разности хода разделенной на Koicpcniiibic пучки входной
полны от источника. Затех с псио н зованием большого объема вычислении математического
преобразования Фурье рассчитывается ИК-спсктр Метод получил широкое распространение
только с появлением современных компыоюрных систем
Применение Фурье-Раман-спектрометрии приводит к снижению вероятности флюоресцен-
ции образна. В Фурье-Раман -спектрометре обычно используют возбуждающий лазер с длиной
волны I мкм. ицгерферохгегр и высокочувствительный детектор ближнего ИК-диапазона. Де-
текторы лля Фурье-Раман-спсктрометрии. не требующие охлаждения или охлаждаемые жид-
ким азотом, выполнены соответственно на основе арсенида индия и hl глия или на основе
германия. Эти детекторы имеют высокую чувствительность. но все же меньшую, чем CCD на
основе кремния лля видимого излучения.
Фурье- Раман-спектрометрия обеспечивает
• высокую пропускающую способность;
• одновременное измерение всех длин волн:
• увеличение соотношения сигнал-шум в результате усреднения сигнала:
• высокую точность определения волновых чисел благодаря внутренней калибровке ии1срфе-
ромстра.
На результирующей интерферограмме каждая точка (функция положения подвижного зер-
кала) имеет иифор\1аиию о каждой частоте рамановского рассеяния, собранною из образца.
Индивидуальные частоты декодируются компьютером с использованием математического ме-
тода — Фурье-нреобразования и могут быть представлены как спектральная информация.
Современные приборы, использующие Фурьс-нрсобр зованис при получении и обработ-
ке данных, песет значительные преимущества Упрощается контроль над работой прибора, а
воспроизводимость и точность результатов возрастают. При этом возможен выбор наиболее
удачною представления спектра Цифровая форма записи спектров позволяет оперировать
с ними. Спектры растворителя и примесей можно вычесть из спектра исследуемого образна,
который в этом случае будет выровнен, сглажен и преобразован в нужных координатах, мас-
штаб поглощения можно значительно расширить. Спектр слабоиоглошающего образца можно
многократно снять, что усреднит сигнал, заменю уменьшит влияние шума и увеличит чувс-
Методы определения токсикантов в биосредах 467
твительност ь. Благодаря цифровой обработке спектр образца легко сравнить с библиотекой
спектров и список наиболее близких веществ вывеои на экран монитора или рас печатать либо
mpei нстрировйть наличие функциональных групп.
Для исследования вещества методом ПК- 'пектрометрии очень валено иметь чистые образцы.
ПК Фурье-спектрометры позволяют проводить судебно химические, криминалистические и
другие исследования биопроб. Maiepiution. вешсств и изделий на новом качественном уров-
не. Эффективно использовать оборудование для И К Фурье-спектрометрии можно только при
соответствующей подготовке пробы, предназначенной ыя анализа. При рабою на ПК Фурье-
спектрометрах можно применять как традиционные способы пробополготовкп вешества для
ИК-спектросконии. так и некоторые новые приемы (с помощью дополнительных приставок),
позво 1ЯЮШИС использовать меньшие пробы. Главная с ожность заключается в очистке и об-
работке нескольких микрограммов пробы без потерь, хотя в настоящее время эта проблема
относительно легко решается при работе системы: газовый илы жидкостной хромаю!раф и
И К Фх рьс-спектрометр.
При исследовании биологических жилк эстей и тканей проба прелстадляет собой остаток
посте выпаривания извлечения из мочи, крови, ткани пли другого материала Для очистки
биопробы используют любой вид хроматографии в зависимости от поставленных задач и усло-
вии работы лаборатории.
Наиболее трудоемкий способ — это бумажная или тонкослойная хромато!рафия. Существу-
ют значительные ограничения и меры предосторожности при этих способах очистки. Прсдь-
являюгся особые требования к адсорбенту (чистота). элюенгу (количество менее чем I мл.
чистота), количеству образца, детектирующим агентам (не разрушающие структуру определяе-
мого вешества). условиям выполнения процедур (избегать контакта образцов с пластмассами,
особое мытье посуды и лр.) Для каждого вещества оптимальную хроматографическую систему
и алюирукипи! растворитель можно подобрать только опытным путем. Использование водных
растворов кислот пли щелочей для элюирования веществ с пластинок или бумажных хроматог-
рамм и последующее извлечение из водного раствора более эффекшвны. чем прямое извлече-
ние с алсороента. Каждый способ очистки образцов с помощью бумажной или toiikoi дойной
хроматографии имеет свои нрепмушсс1ва и !1сдоста1ки. поэтому эксперт принимает решение,
исходя из конкретной ситуации.
Очистка образцов с помошью газовой хроматографии способствует получению чистых об-
разцов для НК-спектрометрии. Решстрирхют спектр пара, выходящего из хромато рафа. или
выделяют вешество и записывают его спектр. Методика позволяет получить надежные резуль-
таты для летучих соединений. Используют различные способы перевода вешеечва из газового
хрематографа в форме, наиболее пригодной для получения ИК-спсктра. Например, барбиту-
раты и (|зенотиазины удастся регенерировать на 50$ю в стеклянных или металлических капил-
лярных трубках, выдерживаемых при комнатной температуре, более летучие вещества (амфе
гамины) предварительно охлаж ают жидким азотом. Мпкрокюветы вместимостью 2—0.2 мл и
толщиной стенки 0.1— 0.01 мм. нзроговленные из хлорида серебра и называемые внешними
кюветами, особым образом соединяют с выхотных! отверстием газового хроматографа Кюветы
можно использовать при комнатной температуре, охладить в замораживающих смесях или в
жидком азоте Их можно использовать многократно при хранении в темном месте.
Хорошие результаты получают при работе с мембранными фильтрами на основе эфиров
целлюлозы.
Для 1вср.чых при комнатной температуре вешеств пригодна следующая методика Прямую
трубку, набитую порошком галогеноводородной соли щелочного металла, соединяют с выход-
ным отверстием хроматографа. Поток выхолит из хроматографа и конденсируется на порошке,
который посте этого сжимают в диск. Главная трудность, обшая для всех способов сбора фрак-
ций. заключается в определении оптимальной iCMiieparypiJ выходной трубки хроматографа и
температуры собирающего устройства
ВЭЖХ является наиболее удобным методом очистки, особенно в тс.х случаях, котла пе-
приемлема газовая хроматография пли требуется лернватн заиия пробы. В отличие от газовых,
жидкостные хроматографы обычно работают при температуре, близкой к комнатной, а боль-
шинство используемых детекторов псразрушаюшис Можно собрать соответствующую фрак-
цию зяюага. держа тест-трубку перед выходным отвсрсгнех! Во многих случаях количество
468 Глава 6
образна слишком маю. чтобы 11сн(\яьзовать стандартные кюветы, полому применяют микро-
кювегы типа внешних. Вешесгво регенерируют. выпаривая растворитель. Однако выпаривание
приводит к концентрированию всех нелетучих примесей и растворителе. полому очень важно
применять особо чистый раствори!ель.
Довольно часто используют простую технику микросублимашш. Вещество сублимируют из
выпаренною раствор) мото экстракта в трхбке на охлажденном штифте прибора, далее ехблн-
мат осторожно распирают с порошком бромида калия и снимают спектр.
ИК-спектры можно снять в паровой, жилкой и твердой фазах, но большинство вешсств.
iniiepecxtoiunx токсикологов. твердые при комнатной температуре
Ниже привс сны способы подготовки проб, нс требующих предварительного разделения на
компоненты. Такне способы часто используются в различных областях экспортной практики
(криминалистической. экологической. гоксиколо1ическои и др.).
Прессование таблепюк с галогенидами щелочных металлов — основной и наиболее уннвер-
сальный способ нробоиодюговки. Он заключает) в тшагелыюх) перемешивании в агатовой
(яшмовой) стхпке или вибромедьнине гонкоизмельченною обра на с порошком КВт и пос-
ледующем прессовании смеси в пресс-форме, в резу.тытпе чего подучается прозрачная или
полупрозрачная к ИК-излучению тпблстка (рис. 6-1 IN). Порошок КВт используется для абра-
зивного истирания поверхности, при этом удаляется слой образна толщиной 50—100 А. При
необходимости можно проводить повторную обработку и послойное исследование, например
многослойных пленочных материалов.
Для получения качественных спектров после диспергирования частипы вещества должны
быть ра гмерох 2—7 мкм (соносшвпмо с длиной волны ИК-излучения] Иногда для об 1сгчспия
растирания юбавляют несколько капель перегнанного растворителя (четыреххлорпстого угле-
рода или гексона). который испаряется при последующем растирании. Наилучшие результаты
получаются при вакуумировании пресс формы, что позволяет избавиться от включении воз-
духа в табчетки. Для таблеток можно использовать КВт для спектроскопии или к вл.) тфикании
нс ниже химически чистою. по предварительно высушенный от воды. Сушку бромида калия
следует проводить при 600 СС в течение не менее 6 ч и хранить сто в эксикаторе с осушителем.
Проводить такую тщательную подготовку необходимо, так как в противном случае получае-
мый спектр будет иметь широкие полосы абсорбированной воды в областях 3450 и 1630 ехг1
С таблеток диаметром 3. 5. 7 мм и более можно регистрировать спектр без дополнительных
устройств. Таблетки диаметром I и 2 мм необходимо нссгелонать с использованием микрофо-
кусировочною устройства (входит в комплект оборудования дтя спектрометрии). Если пресс-
форма не позволяет подучать таблетки диаметром I—3 мм. можно использовать специально
из оювленный. например из к; ргона крупы й вкладыш с вырезанным в нет ре отверстием со-
Рис. 6-118. Пресс-форма лля илиюктсния гаС.кчок из КВг диаметром 13 мм и лержигсль шблеюк диа-
метром 13 мм. Рагмср оправы 50x75 мм.
Методы определения токсикантов в биосредах 469
ответствуюшего диаметра. 1 )блетки диаметром 1—3 мм используют при исследовании микро-
количеств вещества. Способ прессования таблеток имеет следующие преимущества: отсутствие
мешающих полос матрицы (КВг). удобство хранения образцов (вещество при необходимости
можно регенерировать), возможность исследования жидких, вязких, мазеподобных и твердых
етучих и нелетучих веществ. Метол прессования с КВт имеет ряд существенных недостатков.
Спектры твердых вешеств. обладающих полиморфизмом, будут различаться в зависимости от
степени размола и величины дявлепия (см. ниже). В некоторых случаях, при определении не-
органических солен, солей (гидрохлоридов) аминов и других оснований, может происходить
частичный или полный ионный обмен, который приводит к значительным изменениям в спек-
ipax. что де гасг спектральные исследования ошибочными. Мегод прессования гацаегок с KBi
целесообразно рекомендовать для образцов, которые нерастворимы в обычных растворителях,
аморфны или имеют устойчивую кристаллическую структуру и нс содержат ионов, способных
к обмену.
Суспентонный метод представляет собой растирание образца до мелкодисперсного состоя-
ния (размер частиц 2—7 мкм) и приготовление суспензии в нмхфрсиоииой жидкости с близ-
ким к образцу показателем преломления. При этом в качестве матрицы обычно используют
вазелиновое масло иди фторированные, хлорированные углеводороды («масла»). Полученная
паста наносится с помошью шпателя на окно из оптического материала в виде тонкой равно-
мерной пленки. Выбор оптического материала можно сделать па основе данных, приведенных
в табл. 6 45.
Таблица 6-45. Оптические материалы лля ИК-еисктрОскопии
Оптическим материал ОГыясгь пропускания, см' Примечание
КВт 40 000-340 К Bi более ithpockoihpicii, чем KCI (очень сложно уладить следы воды). Вола может стать причиной воз- никновения артефактов в спектре, например регис- трация в нем OI i-полосы волы. Вместо КВт иногда используют AgCl. Если образен — поiспинальный окислитель. следует воспользоваться другими способами нробоиолютовки для получения надежных резин таток
Nad 40 000-590 _ _ ..... !
Cai 50 00(1—1 МО
BaF 50 ООО—«40
ZnSc 20 000 -454
KRS-5 20 000- 250 Оптические композиты с ианочастииами полупровод- ников и металлов: прозрачные поликрнсталлическне оптические материалы с высокими показателями пре- ломления. пяпрпмер KRS-5 (КВт + 111). KRS-6 (КВг +TICI), KRS-13 (AgBr759r" н AgCl 25%). имеют ли- нейные оптические свойства в среднем ИК-дпапазоне н находят применение в качестве быс1ролсйствуюших нереключепслсй импульсов лазерною излучения
Поти inucn 625-30
Наиболее часто в экспертной практике в качестве иммерсионной жидкости используется
вазелиновое масло. Однако спектр вазелиновою масла имеет полосы поглощения в областях
2.900, 1460, 1380 и 725 см1. Эти полосы накладываются на полосы поглощения образна, ком-
пенсировать их можно либо с помошью кюветы сравнения, либо путем вычитания спектра
вазелиновою масла из суммарного спектра. На практике нерфгоруглс*волороц1ЮС «масло» ис-
пользуют при исследовании веществ в области 4000—1500 см-' (нс поглощает фторированное
•масло»), а вазелиновое масло — в области 1500—400 см ' (мало поглощает вазелиновое мас-
ю). Недостатки суспензионного метола: необходимость значительною количества вещества
(10—20 мг); наличие в спектре полос поглощения иммерсионной жидкости, если нагревание
или давление в холе механического размалывания влияет на кристаллическую структуру образ-
на (что бывает часто, см. ниже), го вил спектра зависит от времени истирания. На практике
470 Глава 6
спектры одного н того же вещества, полученные методом таблетки с КВг п суспензионным
метолом, могут различаться (разреженность полос в таблетке с КВг. как правило, значительно
выше, чем в суспензии). Поэтому спектры, представленные в библиотеках ИК-спектров. в
основном получены с таблеток (КВг). что важно учитывать при проведении идентификации
неизвестного вещества по библиотекам ИК-спектров (способ пробополготовки сравниваемых
веществ должен быть одинаковым). Если принять во внимание указанные выше недостатки
суспензионного метода, то можно считать вполне оправданным преимущественное использо-
вание в экспертной практике метода получения таблеток с КВг.
П( гучение пленок. При таком способе пробополготовки необходимо на окошке из оптичес-
кого материала' (см. табл. 6-45) сформировать топкую (около 5 мкм) прозрачную пленку диа-
метром 3—5 мм. Желательно, чтобы в пределах светового луча спектрометра толщина образна
была одинаковой. Спектры, получаемые таким путем, не всегда воспрои тво шмы, поэтому
инотда приходится проводить повторные несло ювання Получение топких пленок на окошке
нз оптического материала можно проводить путем отлива из расплава (для полимерных мате-
риалов) и отлива из раствора с последующим высушиванием растворителя в термостате или
с помощью И К-лампы. При этом необходимо подбирать летучие растворители (эфир, четы-
реххлорнстый углерод, хлороформ, этп.тапстат. спирты), которые испаряются при невысоких
температурах, не вызывая термического разложения образца. Получение пленок можно ис-
пользовать для исследования термопластичных полимеров, растворимых и орт аттических рас-
творителях клеев. сильнодействующих и наркотических соединений, представляющих собой
вязкие, м тзеполобпые вещества. При исследовании органических соединений метод может
быть успешно использован в том случае, если после испарения растворителя па поверхности
окошка не образуются кристаллы вещества. При образовании кристаллов получаемый спектр
практически невосттрон звоним и его невозможно интерпрстирош ть с использованием биб-
лиотек ИК-спектров. Способ отлива пленки з раствора можно применять для последую-
щей регистрации ИК-спсктров амфетаминов, кокаина основания и других веществ, основания
которых представляют собой маслянистые жидкости и образуют па окошке из оптического
матерн&та гонкую равномерную пленку (см. ниже примеры ИК-спектров). Исследование про-
зрачных пленок полимеров можно проводить в нативном виде после закрепления образца в
соответствующем держателе, который входит в комплект ИК-Фурьс-спектромстров. При этом
важно добиться соответствующей толщины пленки, так как для толстых пленок будет полу-
чаться «зашкаленный» спектр. Уменьшить толщину пленки можно разными способами: для
термопластичных полимеров — распрсссовываппс небольшого фрагмепст пленки (1—3 мм') в
нагретой пресс-форме; для пленок на основе сложных эфиров (иодил илентерефталат. ноли-
имилы) — гидролиз в растворе щелочи с нагреванием до 50—60 С, при котором происходят
растворение поверхности пленки и соответствующее уменьшение ее толщины. Регистрируя
спектр пробы в виде тонкой пленки, необходимо помнить об указанных ограничениях метода
и использовать сто в зависимое и от природы образна и решаемых задач.
Исследование веществ в жидком и гаюнбраишм состоянии. Анализ веществ проводится соот -
ветственно в жидкостных п газовых кюветах, имеющих два окошка из оптического материала,
которые помешаются на пути луча спектрометра и между которыми находится исследуемое
вещество. Жидкостные разборные кюветы с переменной толщиной поглощающего слоя входят
в комтитект И К-Фурье-спектрометра. В таких кюветах можно исследовать летучие и нелетучие
жидкости, а также растворы веществ (рис. 6-119)
Такой способ пробопотготовки отличается высокой воспроизводимостью спектров. При
исследовании растворов твердых вешеств устраняются явления полиморфизма, которые мо-
гут оказывать серьезное влияние на спектр (см ниже) При использовании кюветы с извест-
ной толщиной поглощающего слоя можно выполнять полуколичественныи и количественный
анализ. При проведении количественных исследований необходимо стандартизовать условия
анализа и выбрать закую полосу потлошепия в спектре пробы. лля которой выполнялась бы
питейная зависимость оптической плотности от концентрации вещества. Для исследования
расгво|юв веществ П|>еж.'1е всего нужно выбрать подходящий растворитель, который должен
быть химически инертен но отношению к пробе и не поглощать в исследуемой области спек-
тра. а также нс содержать влагу (особенно если используются растворимые в воде оптические
материалы — КВг или NaCl). Число подходящих растворителей отраннчсно. Наиболее широко
Методы определения токсикантов в биосредах 471
Рис. 0-119. Виды жидкошных разборных монет с комплектом прокладок. окна КВг и CaF2. Размер оп-
равы 50x75 мм.
используемые растворители — четыреххлористый уз терол и дисульфид углерода, потому что они
незначительно поглотают в ИК.-области. Также применяют хлороформ. 1.2-днхлорэтилен. мс
тнлепхлорид. циклогексан и гептан. Коннетт i рання веществ обычно составляет 5—10%. иногда
20%. Однако при высокой концентрации вешества с гидроксильными и/или аминогруппами
возможно образование внутримолекулярных во. эродных связей. Растворитель часто способен
взаимодействовать с растворенным веществом. Тепло ИК-излучення способствует испарению
летучих растворителей, изменяя концентрацию раствора Все зтп факторы могут привести к
весьма значительным изменениям частоты определенных полос в различных растворителях.
При проведении плентификапии веществ поглощение растворителя можно компенсировать с
помощью либо кюветы сравнения, либо вычитания из спектра раствора спектра растворителя,
что позволяет выполнить программное обеспечение любого ИК-Фурье-спектромстра.
Когда вещество является газом при комнатной температуре, можно использовать диспер-
гирующие спектрометры и специальные воздухонепроницаемые газовые кюветы. Определение
газон зффективнее проводить, используя ИК-Фурьс-енектромсгры. соединенные с газовыми
хромагоз рафам н.
Прн анализе вещества в парообр. зном состоянии в газовой кювете получаемый ИК-спектр
будет резко отличаться от спектра этого же вещества в конденсированном состоянии Такое
отличие обусловлено прежде всего гем. что в газообразном состоянии у молекулы возрастает
число степеней свободы и уровней колебательной энергии, поэтому спектры веществ в газооб-
разном или парообразном состоянии отличаются поличном большого количества очень узких
полос поглощения. Илсшификапию веществ в нарообра ном состоянии проводят по соответс-
твующим библиотекам ИК-спектров.
Исследование веществ в газовых кюветах (рис. 6-120) используют в экологии при анализе
кнрязпепий атмосферы. С этой целью промышленность выпускает специальные оптические
кюветы. В экспертной практике газовые кюветы длиной 5—10 см применяют прн анализе лег-
ксстстучих органических раствори гелей (см гл. 8.2) и смлы1одсис1вующих веществ (хлорацето-
фенон. капсаицин в др., см. гл. 7).
Методы нарушенного ионного внутреннего отражения (НПВО) и многократно нарушенного
полного внутреннего отражения (МНПВО) широко применяются для исследования и опреде-
ления многослойных ентьпопогдош. юших и сильно рассеивающих объектов, тонких пленок,
поверхностных слоев, в том числе мономолекулярпых слоев, полных растворов, лекарственны
препаратов, при изучении состояния веществ вблизи границы раздела фаз (электрод—рас вор)
и лр. В таких случаях получение ИК-спектров традиционными способами затруднительно пли
невозможно. Методами НПВО и МНПВО можно работать и в УВИ-обл юти спектра. Они яв-
ляются неразрушающими методами исследования.
В основе этих методов лежат закономерности отражения электромагнитных излучений от
различных сред Спектры сражения получают, как правило, в огиической (ИК. УФ и види-
мой) области с помощью спектрофотометров, снабженных специальными устройствами Раз-
472 Глава 6
Рис. 6-120 I — кювета ивовая 10 см. Окна диаметром 40 мм КВг и CaF Материал: никелевое покрытие,
нержавеющая сталь.
2 — кювета иловая мнот с хо товая 0.8 4.8 м Окна диаметром 22 мм КВг и СлГ , Материал: анодно- алю-
миниевый сплав, нержавеющая сталь, стекло. золотое покрытие.
дичают спекгры внешнего и внутреннего отражения. Первые в спою очередь делятся па снек
три зеркального отражения, когда падающим и отраженным лучи лежат в одной плоское™ с
нормалью к отражаюшей поверхности, а угол отражения равен углу падения. и спектры диф-
фузного отражения. когда отраженные лучи рассеиваются по равным направлениям. Характер
внешнего отражения излучения определяется соотношением между длиной волны X падающе-
го их учения и размерами неровностей отражаюшей поверхности. При неровностях, ра меры
которых меньше X. наблюдается зеркл, штос отражение, в остальных случаях — лш|>фуз11ое
отражение (рассеянное излучение). Практически отраженное излучение имеет смешанный ха-
рактер: при специально выбранных условиях преобладает вклад тою или иного вила Сраже-
ния. Зеркальное отражение получают с помощью гладкой плоской поверхности, в частности
при исследовании молекулярных структур слоев, нанесенных па различные подложки. Зная
оптические постоянные вешеств, в спектрах отражения можно выделить смешение и иска-
жение форм спектральных полос и изменение их интенсивности, вы тайные не оптическими
тффекктмн. а изменениями стр ктуры отражаюшей поверхности или химическ тми реакциями.
Обычно при внешнем отражении палаюший луч проникает н образен па глубину 16—26 мкм
С нетто.тьзованисм ПК-Фурье-ст ектрохтетров могут быть исследованы слои толшино т от 5 до
5(Ю мкм при плошали исследуемого образца ло 1 мм та время от 2 до 30 мин.
Спектры, подученные при зеркальном отражении, представляют собой суперпозицию спек-
тров отражения и пропускания. Обычно наидучшне результаты получают при угле падения
излучения около 45* и толщине покрытий 0.01 мм Количество отраженной знертии при сколь-
зящем падении луча может быть значительно больше, причем проникновение излучения будет
более глубоким, т.е. будет исследоваться большая тодшнпа образна.
Спектры диффузного отражения обычно маломнтснеивны. так как у таегся собра □ и напра-
вить в спектральный прибор только очень небольшую часть рассеянного (отр тженного) паду-
Методы определения токсикантов в биосредах 473
чепия. Поэтому и этом случпе необходимо применять ПК Фурье-спскгроме1ры. обладающие
высокими светосилой и соотношением спгиад/шум. Получаемые при диффузном отражении
спектры часто подобны спектрам пропускания. Исследуемыми образцами могут быть массив-
ные твердые Тела, порошки (иногда содержащие наполнители — КВг. KCI. Csl. прозрачные
в исследуемой области спектра), волокнистые (ткани, войлок) и ячеистые материалы. пены,
суспензии и аэрозоли. Спектры отражения при диффузном рассеянии могут наблюдаться от
лостаючно малых количеств вещества, например от пятен па хроматографической пластине.
Спектры полного внутреннего отражения наблюдают, если при отражении светового луча
ею интенсивность й спектральный состав не изменяются Если излучение проходит сначала
через призму и ее границу с образном поя углом, превышающим критический, а затем прони-
кает в образен (на глубину 1—2 мкм). глс теряет часть своей энергии и отражается, го спект-
ральный состав отраженного света будет о шчагься от спектральною состава падающего све-
тового луча, а его интенсивность уменьшится 'Это явление называется нарушенным полным
внутренним отражением. Рсгисфируя на спекгрофо ометре интенсивность отраженного излу-
чения и определен пом спектральном диапазоне (н И К- или УВИ-обласш спектра) можно по-
лучить спектр 11О1ло1цення тонкого приповерхностного слоя оптически менее плотной среды —
спектр ННВО. В качестве материала лля призм используют прозрачные в различных областях
спектра кварц, оксиды цинка и магния, сапфир, кремний. фторид кальция. сулы|>ил мышьяка,
германий, селениды мышьяка и пипка, хлориды натрия, кипя и серебра, бромиды калия и
серебра, тсъзурпл кадмия. алмаз. При интерпретации спектров НПВО следует иметь в виду,
что интенсивность полос повышается по мере увеличения длины волны, что обусловлено бо-
лее гьбоким проникновением в образец длинноволнового излучения. Кроме того, искажения
формы полос и их смешения может быть обусловлены дисперсией показателя преломления.
Часто используют методику получения спектров многократно нарушенного полного внут-
реннего отражения (МНПВО). причем число огр< женин можетбьпь 25 и более. При МНПВО
интенсивность полос поглощения в получаемом спектре мноюкразпо увеличивается по ерав
нению с ППВО; сами спектры получаются бо. ее четкими.
Длина призмы, находящейся в контакте с исследуемым образном, может нревыш а. 50 мм
рн толщине до 2 мм (рис. 6-121). Угол падения излучения па кристалл можно вар1ирова)ь.
при этом изменяются число отражений и соответственно интенсивность спектра МНПВО. Чем
выше нок газель преломления материала нритмы. гем меньше глубина проникновения излу-
чения в образен. Метол МНПВО особенно полезен для качественного анализа и успешно при-
меняется для исследования поверхностей твердых тел и жидких образцов — водных растворов
юбьемом ло 25 мкл), вязких и клейких вешеств. паст. поверх1Кстпых покрытий, поверхжилей
полимерных соединений, волокнистых и вспененных материалов и т.л Качество получаемых
спектров МНПВО сильно записи I ог контакта между кристалл ичической призмой и образцом.
Вследствие мягкости или хрупкости материалов призм, используемых в этох методе, исследуе-
мые твердые образцы должны иметь гладкую плоскую поверхность и не должен быть чрезмер-
но жесткими или шероховатыми.
При исспедовапии терка, ьного отражения применяют обычно систему зеркал, которая от-
клоняет пучок излучения, направляет его па изучаемый обз>ект и возвращает отраженное из-
учение вновь в спектральный прибор. Для наблюдения спектров ППВО используют такие
же приставки, но с зон разницей, что в этом слу гас излучение направляется на призму, нахо-
дящуюся в контакте с нее юдуемым образном. Для изучения спектров диффузного отражения
обычно используют так называемую полую (фотометрическую сферу, внутренняя поверхность
ко орон покрыта отражающим материалом. нс поглощающим в исследуемой области спектра;
для пхо ы и выхода излучения и размещения образна в сфере 11редус.матрнЬяются соогвсгствую-
тис окна. При исследовании методом ИК-Фурье-спектросконпн можно пс «учагь ИК-спектры
диффузного и зеркального отражения с использованием соответствующих приставок, которые
разработаны и продаются фирмами — производителями спектрального оборудования, однако
эти дополнительные устройства используются только в отдельных случаях. Возможности таких
приставок подробно описаны в специальной литера гуре.
И К-Фурье-спектрометры в сочетании с приставкой НПВО (МНПВО) представляют собой
эффективный аналитический инструмент исследования химического состава жидких сред, в
том числе ватных растворов, а также мелкодисперсных порошков и полимерных пленок. Тол-
474 Глава 6
I 2
1*ис. 6-121. I — приставка \lIII 1130 горизонтального типа. Призма ZnSe 36x16x4 мм. угол паления 45
2 - - приставка зеркального отражения, угол паления 10*.
щина поглогг аюшего слоя в зависимости ог материала и параметрон призмы может быть вы-
брана в пределах 1—50 мкм. Спектрометрия МНПВО. являясь аналогом абсорбционной спек
тромсгрни. позволяет существенно упростить подготовку образцов и может использоваться лля
реализации экспресс-методик образцов В приставках НПВО и МНПВО в качестве оптически
более плотных сред применяют различные прозрачные материалы с высокими показателями
преломления KRS -3. K.RS—5. KRS—6, жидкостные оптические элементы, например, йодис-
тый метилен (C11.I), и др На ipainme раздела фаз образна и оптического материала (KRS-5.
KRS-6— монокристалла галогенидов талиня или селенида пипка) возннкае! затухающая волна
ИК-излучення. которая проникает на некоторую глубину в оптически менее плотную среду
(обр; зеи). прн этом регистрируется спектр пропускания ультратонких верхних слоев образна
Меняя угол паления ИК-н злучеиия можно последовательно получать спектры более глубоко-
лежаших слоев прзз исследовании многослойных пленочных материалов, порошков, жидкое
гей. прозрачных и непрозрачных пленок (размер пленки не менее 0.5 см3) с использованием
приставки МНПВО. которая iipiuiaiaeicn к ИК.-Фурье-спсктрометру и устанавливается в кю-
ветное отделение прибора. Спектр пробы, полученный методом МНПВО, совпадает со спект-
ром пропускания вешества. полученным при обычных способах пробополютовки (например, в
габлегке с КВг). по наличию, форме и относительной интенсивное!и полос поглощения. По-
этому по М НП ВО-спектрам идентификацию вещества можно проводить обычным способом
с помощью библиотек ИК-спсктров вешсств в конденсированном состоянии Преимущества
метода МНПВО.
• Простота и эобоподготовкн. Исследуемый об| гзеп (жидкость, мелкодисперсный порошок)
достаточно помссгить в ванночку. дно которой образовано призмой МНПВО Полимерные
образцы механически прижимают к поверхности призмы.
• Высокая воспроизводимость. Эффективная толщина поглощающего слоя воспроизводится с
высокой точностью, в отличие от толщины оптических кювет, так как определяется только
материалом и параметрами призмы МНПВО и коэффициентом преломления исследуемого
вещест ва.
• Простота обслуживания. Приспособления МНПВО в процессе подготовки и измерений нс
требуют сборки-разборки, не содержат труднодоступных полостей, которые могли бы за-
труднять промывку
• Высокая производительность. Время получения спектра, включая помещение образна, при
стандартных требованиях к разрешению п фотометрической точности не превышает I—
2 мин.
Методы определения токсикантов в биосредах 475
Рис. 6-122. ИК микроскоп МИК-15
позволяе । проводи>ь исследования
микр<х>бразпоп и микроспаде гей в не-
однородных образцах.
Спектры отражения — единственный метод получения
количественных оптических характеристик веществ, для
которых по тем или иным причинам (очень сильное по-
глощение, невозможность получить тонкие слои и т.п.) не
могут быть получены спектры пропускания.
ЙК-Фурье-микроскопы являются приставкой к Фурье
спектрометрах» и предназначены для получения ИК-снек-
тров пропускания и отражения для области исследования
размером 300 мкм и менее. Могут оснащаться двумя де-
тектора* в (точечными, матричными до 12S.X128 пикселей,
для средней пли ближней ИК-обтасти и др.), видеока-
мерой. моторизованными апертурой, фокусом и столи-
ком: НИВО-объскгивамн и другими приспособлениями и
приставками. Оборудование позволяет проводить иссле-
дования микрообразнов и микрообластей в нсолпороп-
ных образцах. И К-микроскоп устанавливают в кюветном
отделении Фурье-спектрометра или в квазипараллельном
пучке ИК-излучсния. выводимого за пределы ИК-Фурье-
спекгромезра.
Преимущества ИК-мнкроскопов при получении и ана-
лизе инфракрасного изображения
• Возможность работы с микро- и макрообрпзцами.
• Наличие объектива со скользящим ут лом.
• Автоматическое <|юкуснровапнс в видимой и ИК-облас-
гях.
• Возможность исследования крупных объектов.
• Возможность видеть одновременно как всю плоишь об
раз»та. так и исследуемый фрагмент.
• Возможность наблюдать объекты как через бинокуляры,
так и па экране компьютера через видеокамеру.
• Возможность устанавливать одновременно либо два точечных детектора, либо точечный и
матричный детекторы.
• Возможность с помощью масштабирования в видимой н ИФ-областях получать при необ-
ходимости более высокое увеличение без смены объективов.
• Возможность запуска регистрации спектров с панели управления микроскопа.
• Одновременная реализация автофокуса для ИК- и видимой областей, что обеспечивает
полное соответствие между видимым изображением объекта и получаемыми ИК-епектрз-
ми.
• Возможность с помощью автоматического многоточечного анализа независимо анализиро-
вать одновременно множество образцов, помешенных па столик микроскопа, или множес-
тво точек на одном образце.
Преимущества ИК-Фурье-спектрометров и метода Раман-спектрометрии представлены в
табл. 6-46.
1аб.|иии 6-46. 11реимущес|из использования ИК-Ф-рьс спектрометров и метола Рамап-сисырометрии
II К-Фурье-снсктромстры Метод Раман-снсмромстрнн**
Высокая чувезв1нелЫ1ОС1Ь рекордное во сравнению с обычными И К спектрометрами о» ношение сишал/шум нозволяе» в несколько раз повышнь чувствительность Можно анализировазь образны любой природы, в том числе полиморфы, в нанограммовых количес- твах: одиночные кристаллы. жидкие глины, кремы, в иные и органические рас-(воры, масла, образны гадовой фазы, процедурные потоки и др.
Высокая производительность: время получения спектра при средних требованиях к разреше- нию и фотометр1Р1ССК<мТ точности нс прсвы- шаш 15—20 с По своей природе ислсструктивный метод
476 Глава 6
Окончание табл. 6-46
ДосговЖтктт, анализа: анализ и идентифика-
ция осуществляются автоматически е нспо.чь
юванисм библиотеки стандартных спектров,
ттключснтюй в базу спектрометра Практически
исключается возможность субъективной ошиб-
ки оператора
Автоматизаиия измерений: процесс получения
спектра и его обработка полностью автома-
тизированы; результаты измерении автома-
тически протоколируются и заносятся и базу
данных; спектрометр может комплектовапхя
автоматической мнотоиозиционной кассетой
для образцов, управление которой осу тттсст титя-
стся ог компьютера н может программировать-
ся оператором
Простота мето ттткп iiH<Lii т
• твердые образны не прессу то г в диски КВг. а по-
мешают в облицованные золотом иди стеклом
держатели и облучают лазером
• жидкие образцы анализируют в кварцевых или
стеклянных кюветах, которые могут иметь зер-
кальную залитою поверхность для увеличения ин-
тенсивности сигнала
• мнотне образны (жидкие и твердые) могут быть
нроан ипзирошны в стетс явной посуле. хотя
опасность возникновения флюоресценции доста-
точна высокая
• образны аморфной природы и из материала тем-
ного цвета, поглощающие много тепла при дейс-
твии лазера н деградирующие. анализируют с по-
мощью специальных устройств и фильтров
Вода является лучшим растворителем для изучения
КР-спекгра. поскольку Раман-спектр волы имеет
одну широкую полосу при 3500 см * слабой ннтен-
сн нт ости
'Рамановская приставка (например. Synergy IM) к Фурье спектрометрам (ближний ИК-лазер) позволяет
гк тучзпъ рамановские спектры без влияния флюоресценции
•*Нсрсностюн рамановский спектрометр, имеющий диодный лазер и элекгроохлажтаемый матричный
CCD-лстсктор. ра зрешение 15 см 1 и спектра пятый диапазон 2700—200 см '. позволяет работать в нолевых
условиях.
Особенности способов идентификации спектра. Выбор способа идентификации вешества по
ИК-спсктру будет и значительной степени зависеть от того, какая уже имеется информация
о веществе, например значение Rp результаты цветных реакций и лр. Когда предполагают,
чю ИК-снскгр определяемого вешества идентичен найденному библиотечному спектру, то
следует сравнить полученный спектр со спектром стандартного образца. Эта процедура под-
твердит или опровергнет предварительную идентификацию. Если эти два спектра были за-
регистрированы и одинаковых условиях и на приборах одного типа, они будут очень схожи
Если спектры были зарет истрированы на разных приборах, они будут отличаться друг от дру-
га В этом случае следует очень тщательно сравнить относительную интенсивность и частоту
полос (см. электронное приложение).
Если ИК-спектр не соответствует ни одному из имеющихся в банке данных, а тип вещества
известен. спектр можно найти в соответствующих собраниях (атласах) спектров. ПК спектр
определенного вещества можно найти в коллекции спектров по 6 основным полосам поглоще-
ния Это составляет основу системы идентификации. Во многих случаях ИК-спскгр в атласе
представлен в сокращенном виде. Отобранные пики наиболее интенсивны (за исключением
пикон в области 1490—1320 см ’) и собраны в порядке уменьшения их амплитуды. Однако из-за
различия у словит! записи и используемых приборов при воспроизведении (при последующих
определениях) можно нс получить пики такой же интенсивности.
В ИК-спектрах инотда регистрирую) так называемые фальсифицированные полосы пог-
лощения. возникающие но разным причинам, например биоматериал был подвергнут не-
скольким разным способам очистки. Следы пластификаторов. сурфактантов и масел на
стеклянной посуде могут также стать причиной возникновения фальсифицированных полос
(табл. 6-47).
Методы определения токсикантов в биосредах 477
Таблица 6-47. Частоты фальсифицированных полос поглощения
Частота см’1 Источник Причина возникновения полос
ЗХПО- 2500 НО Свободная или связанная ы а в молекуле может увеличить четкость и ширину инка. При работе с лисками КВг пик свя- занной ноты может появиться при 3350 см 1
3300- 3000 \н. Оптическое положение
IS 10-1600 с-о Примеси веществ, молекулы которых содержат клрйоии.(Ы1\ю rpvuiiy. например <]>ocicn в хлороформе, пластификаторы
1750-1500 но Свободная или связанная 1я»да в молекуле может увелпчть четкость и ширину пика
1610-1515 соо- о с о Ацетаты щелочных метал юн (у которых также есть слабая полоса нот лощения ври 1425 см )
1400 хн. Ошнческое наложение
1265 St сн Смазка запорною устройства или силиконовое масло
1110-1050 Si-O-Si Стеклянные посула или i ядро шзмемые крехшеныс соединения
730-720 Полиэтилен Полиэтиленовая лабораторная посуда
700 П од ист и рол Полпстирольная лабораторная тюссда |
Заключительной сталией процесса идентификации в идеале должна быть стадия сравнения
спектра неизвестно! о вещества со спектром чистого вещества, полученною, насколько по воз-
можно. при тех же или идентичных условиях и на том же приборе. Это особенно важно, если
соответствие cneKipa определяется автоматически. Компьютер может выделить из библиотеки
только ie спектры, которые заложены в его память. Если спектра найденного вешества в бпь-
лиотске нет. то компьютер подберет спектры наиболее близких по структуре вешеств. Особого
внимания требует идентификация спектров твердых вешсств. обладающих полиморфизмом.
Полиморфизм (способность молекулы кристалл!iдопиться в различные трехмерные струк-
туры) характерен для многих веществ. Полиморфизм приобретает особое значение при опре-
делении качества лекарственных препаратов, контроле их производства, изучении механизма
токсичности веществ Раман-спектрометрия часто используется лля количественно i и качест-
венной характеристики полиморфных соединении в фармации, экспертизе наркотиков и дру-
И1Х lOKCHKaiuoB. Термин «полиморф» включает в себя полиморфы, псведополпморфы. гид-
раты и сольваты. и его обычно используют для характеристики соединения как совокупности
разных кристаллических структур, которые сосуществуют как единое целое.
КР-снектрометрпя может быть использована для изучения природы полиморфа (рис. 6-123)
и особенно полезна в случаях, когда невозможна его полная кристаллографическая характе-
ристика. Дополнительное преимущество Раман-спсктромс1рни в подобных исследованиях
простота метода и возможность измерения низкочастотных колебаний (500—50 см ). Часто
спектры двух твердых вешеств различаются в низкочастотной области рамановского спектра.
Метод Фур|>е-Ра !ап-спск1рометрия позволящ без разрушения и разделения образца идентп-
фипировать лекарственные формы, содержащие смесь полиморфов, опрсдс ять в них примеси
и наполнители.
Полиморфные вешества moivt давать различные нс только КР-. но и ИК-снектры. Напри-
мер. полиморфизм характерен лля барбитуратов. Спектральные различия между полиморфами
связаны с образованием различных внутримолекулярных и межмолскулярных водоротных свя-
зей. Кристаллическую структуру барбитуратов можно изменить в процессе проооподготовки.
поэтому, если результаты воспроизводимы. ИК-спектры барбитуратов можно использовать для
их идентификации.
Подход к интерпретации ИК-спсктра неизвестного вешества внутри группы родственных со-
единений можно показать на примере барбшура ок (см. гл. 7.3.7). Ьарби)урагы — производные
малонил моче вой (барбитуровой) кислоты, имеющие 2 заместителя в положении 5. Кроме того, у
некоторых из них есть замести (ели в положении Lay шобарбитуратов атом кислорода в поло-
жении 2 замешен атомом серы. Барон (ураты по химическому с (роению можно разделить на (ри
группы: 5.5-аи.замешенные производные барбитуровой кислоты. 1.5.5-трнзамешеппые барбиту-
478 Глава 6
Волновое число, см’1
Рис. 6-123. Фурьс-Рамап-спсктры iiiyx полиморфов карбамазепина (A Textbook of Modem Toxicology by
Ernest Hodgson. 2004; Clark’s Analysis of Drugs and Poisons. Loudon, 2004).
ровой кислоты. 5.5-дизамсшспные зиобарби провой кислоты. Эти группы можно веною очередь
также рахлелнть. пехедя из природы заместителя в положении 5. на алкил-, алкенил -, арил- или
циклоолкепилпроизводпые. В большинстве случаев у барбитуратов одним из заместителей в по-
ложении 5 является этильная или аллильная группа. .пшенная или циклическая i руппа с 5 и
менее атомами углерода Некоторые барбитураты выпускают в виде натриевых солей. Поэтому
ИК-снсктр барбитурата будет зависеть нс только от принадлежности вещества к определенной
группе, но и от прнро ы заместителей и формы барбитурата (например, солевой).
За исключением фенобарбитала и барбитуровой кислоты, свободные барбитураты не погло-
щают при значениях выше 3300 с.м 1 (рис. 6-124). Для всех барбитуратов характерны две полосы
при 3200 и 3100 см4 (М-Н-колебапия). В 5.5-дпзамещепных относительная интенсивность этих
двух полос сопоставима, хотя полоса поглощения при 3100 см обычно менее интенсивна, 5
некоторых из них интенсивность полосы при 3100 ем может быть очень небольшой и часто
идентифицируется как плечо при 3200 см4. Метщ|фснобарбитал является исключением. в его
ИК-спемре полоса поглощения при 3100 см 1 самая интенсивная. Схожее явление наблюдают
в спектрах натриевых солей, когда замещен ато\1 водорода в положении I или 3. Четыре по-
лосы поглощения средней интенсивности наблюдаются в области от 3000 до 2800 см4 (за счет
С-П-колебапий алкильных заместителей в положении 1 и 5). По интенсивности полос можно
приблизительно судил, о количестве С П-связей и. следовательно, числе углеродных атомов в
цепи. Это не относится к натриевым солям, в которых полоса, возникающая при 3000—2950 см
становится более интенсивной по сравнению с этой же полосой поглощения свобо того бар-
бтурага и является самой значимой (см. рис. 6-124). Три полосы поглощения в облает 1765—
670 см '. возникающие за счет С—О-колебании. имени разное происхождение Зная это. можно
понизь причину различий в спектрах барбитуратов. В симметричных молекулах интенсивность
этих трех пол ю одинакова. В асимметричных молекулах более высокочастотная полоса менее
интенсивна, чем две другие, что особенно заметно. когда есть заместитель в положении I.
У натриевых солей барбитуратов наблюдаю! ю. ько две полосы в этой области поглощения
(молекула несимметрична), которые видны при более низкой частоте — между 1700 и 1650 см4.
Широкая интенсивная полоса поглощения между 1600 и 1550 см 1 характерна только для солей.
Методы определения токсикантов в биосредах 479
свободные барбитураты не показывают фактически никакого поглощения в этой области. Для
натриевых солей тпобарбитуратов характерна самая низкая из трех вибраций С—О в области
Г >0—16X0 см1. Однако у них есть широкая интенсивная полоса поглощения между 1650 и
1600 см '. Итак, по числу, положению и интенсивности полос поглощения в области между
1X00 и 1 500 см можно сказать. является ли барбитурат солью и принадлежит ти к rpviuie ти-
опроизводных
Для большинства барбитуратов характерны сильные полосы поглощения между 1460 и
1250 см1 (С-Н-деформационные и C-N-лннейные колебания). Натриевые соли гнобарбнту
ратов имеют широкую интенсивную полосу поглощения между 1500 и 1480 см . которая, как
излагают, обусловлена C-N-линейпыми колебаниями углеродною атома, связанного с серой.
Эта полоса не присутствует в спектрах обычных барбитуратов п поэтому может служить от-
личительным признаком соединений, содержащих серу В ИК-спектрах многих барбитуратов
есть полосы поглощения с интенсивностью от слабой до средней в области 1150—900 см1.
В синозамсщснпых барбитуратах заметно большое число полос средней интенсивности У ве-
ществ с аллильной группой наблюдаются полосы поглощения при 1000-960 см 1, возникаю-
щие за счет деформационных С-Н-колебаний. Натриевые соли тпобарбитуратов имеют полосу
поглощения средней интенсивности между 1020 и 1000 см .
В области между 900 и 800 см 1 в ИК-спектрах барбитуратов, за исключением тиобарбиту-
ратов. имеется широкая полоса различной интенсивности.
Ниже приведены примеры пдентификашш наркотиков с использованием ИК-Фурье-епек-
троматрин (данные авторов1).
Риг 6-124. ИК-спектры (а) барбшгала и (6) барбипы-иятрня (Clark's Annhsis of Drugs and Poisons. London.
Ifcb.СЛОВ.ШПЯ ii|x>iK>.i>i.iitcb в '-)KLTlcpiiio-KpiiMiiHJ.ilieiii'iecKOM центре МВД на ИК-ЧНрьс-сисюромпрах I6PC,
hnjm ИЮоРС. J76OX i фирме Perkin Elmer. США) и Impact 400. MAGNA 550 (фирма Nicolci. США) экспертами
В И (. орокнным. Е А. Симоновым и лр. в J W—2005 гт.
480 Глава 6
Пример /. В начале 1998 г. в Москве и Московской области появилось новое, ранее не
встречавшееся в незаконном обороте и России. наркотическое средство — этонитазен. Со-
гласно данным литературы. этонитазен по аиалгетирующему действию превосходит морфин в
1000—1500 раз. наркотическое средство галюпипогениою действия, одно из самых распростри
ненных синтетических наркотических средств (см. гл. 7}.
Изъятые образны ирс стактя.тн собой порошкообразные вещества белого и светло-желтого
циста. В состав порошков в ка icctbc. наполнителей входили тальк и сахароза Основная задача
подготовки пробы к исследованию методом ИК-епектрометрии состояла в выделении актив-
ною компонента.
Методика. Навеску объекта массой около 10 mi помешают в склянку, добавляют 1 мл дис-
тиллированной воды, каплю 25е®. водного раствора аммиака. I мл хлороформа (пли четырех-
хлористого углерода), осторожно иоряхинают. а затем пентрнфушрую! (особенно при нали-
чия талька). Органический экстракт (нижний слой) аккуратно переносят в агатовую ступку и
выпариваю! в сушильном шкафу при 50—60 С до сухого остатка, который исследуют методом
ИК-спектрометрин. ИК-спектр образна этонитазена сравнивали с библиотечным ИК-спек-
тром этонитазена (рис. 6-125) Этонитазен 11-(2-Д!1ЭТ1ыаминоэт1С1)-2-п-этоксибензил-5-нит-
робеизимидазол| — брупо-формула С,.Н N4O.. молекулярная масса 396.5 а.с.. температура
плавления хлороводородной сотн 162—164 С.
Пример 2. Фенциклидин встречается в виде таблеток. капсул, порошка ti водных растворов,
а также может быть нанесен па растительные объекты: петрушку, табак, мяту и марихуану.
Существует несколько вариантов синтеза фенциклидина. однако во всех известных нам вари-
антах в качестве прекурсоров используют циклогексанон и мипершми!. Длительность синтеза
примерно 10—12 ч. В связи с решением ряда криминалистических задач провели ИК-сиектро-
мегрию образной.
Методика При поступлении на исследование порошок пре шарите п>но распзорякн в во с.
К 1 мл водного раствора фенциклидина добавляют 1 мл хлороформа и каплю аммиака. Смесь
энергично встряхивают , дают о!стояться. а затем пипеткой отбирают часть нижнего слоя (0,6—
0.8 мл) так. чтобы нс захватить верхний водный слой. Отобранную пробу переносят в агатовую
ступку и испаряют растворитель, пос. с чего дополнительно подсушивают в сушильном шкафу
при 60 “С в течение 15 мин. Образовавшийся на стенках ступки белый шест перетирают с
бромидом калия и прессуют в таблетку. Полученную табле ikx снсктрометрируют на ИК-спек-
грометрс в диапазоне волн 4000—400 см-1 с разрешением 4 смА Полученный спектр имеет с ic-
дхюшпе основные полосы поглощения 701. 757. 963. 1075. 1112. 1156. 1445. 1495. 2796. 2853.
2928. 3056. 3087 см .
Для выявления фенциклидина использовали методы капельного химического анали за, тон-
кослойной и газовой хроматографии, хромато-масс-спектрометрии. Результаты исследований
указанными методами, а также данные ИК-спектрометрии показали наличие в образцах фен-
ии клилииа.
Пример 3. В конце 90-х ютов XX века компьютерные базы данных ИК-спсктров и атласы
ИК-спекгров наркотических средств, находящихся в незаконном обороте в России, содержа ш
лишь часть спектров производных амфетамина. В связи с этим было проведено исследова-
ние большой группы производных амфетамина (в виде солей и основании), встречающихся
в незаконном обороте наркотиков в нашей стране и за рубежом, ио ИК-сиектры которых от-
сутствовали в базах данных. Вее приведенные ИК-спекгры чистых вешеств получены иа ИК-
Фурье-снектрометре Paragon 1000РС (фирма Perkin Elmer. США) в диапазоне 4000—400 см
с разрешением 4 см- . Пробы готовили методох! таблетирования с КВг. Созданная база дан-
ных ИК-спекгров производных амфетамина позволяет сегодня быстро и достоверно проводить
идентификацию наркотических cpe.iciB амфетаминовой группы, а также помогает обнаружи-
вать (ио характерным примесям полупродуктов синтеза) но тиольные криминальные лаборато-
рии. синтезирующие эти вешества. Как показывает экспертная практика, таблетки, изымаемые
из незаконного оборота, наряду с амфетаминами, содержат шшопшгели — сахара. крахмал,
соду и лр. ИК-сиектры исходных объектов нс всегда лают правильное проставление о содер-
жании наркотического средства, но могут иметь большое значение для получения информации
о наполни гелях, которые, как правило, достаточно четко различимы в ИК спектре исходного
объекта и являются важной информацией для следственно-розыскных мероприятий (см. гл. 7).
Рис. 6-125. а — UK-сиоктр тгоннтазсна основания на библитскн Crime (фирма Р rkin Rimer, США).
Рис. 6-125. Окончание. 6 — ИК-спектр экстракта образна этонитазена, содержащего сахарозу и тальк в качестве наполнителя
482 Глава б
Методы определения токсикантов в биосредах 483
Методика выделения амфетаминов с целью их последующей идентификации методом И К
спектроскопии включается в следуюшием При исследовании порошков и таблеток неболь-
шую часть вещества (примерно 20—30 мг) после измельчения и гомсисци зпрования встря-
хиванием растворяют в I мл дистиллированной воды. Затем к раствор •. после тщательного
перемешивания добавляют несколько капель 0.1 н. раствора гидроксила калия или натрия и
мл хлороформа. После перемешивания и отстаивания смеси осторожно отбирают 0.6—(1.8 мл
жидкости из нижнего хлороформного с юя и переносят в агатовую ступку. После упаривания
распюритсля в сушильном шкафу при температуре 50 С влечение 5 мин к полученному в виде
белых кристаллов или .маслянистом пленки веществу добавляют КВг. перетирают полученную
смесь и прессуют в таблетку.
Некоторые активные амфетамины (ДОБ. ДОХ к др.: ем i.i. 7) пользователи наносят на бу-
магу. В этом случае образец бумаги с нанесенным на нее веществом разрезают на ме 1кне част
и заливают 1 мл 0.1 н. раствора соляной кислоты. Экстракцию проводят в течение 10 мин при
постоянном перемешивании. Раса вор центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Вол-
ную фазу отделяют, а образец снова заливают кислотой и всю операцию повторяют ешс раз.
Объединенные кислотные вытяжки по каплям подщелачивают 0.1 и. раствором гидрокси да
натрия (или калия) до получения pH 9.0—10.0 по универсальной индикаторной бумаге и экс-
трагируют 5 .мл эфира 3 раза. Обьелинсииый клирный экстракт переносят в агатовую ступку
и сушат в сушильном шкафу при 50 °C в течение 5—10 мин. Сухой остаток перетирают с КВг
и прессуют в таблетку.
Далее регистрируют спектр на любом диспергирующем или ИК-Фурье-спектрометрс с раз-
решением 4 с.м и сопоставляют его с базом данных ИК-спсктров наркотических средств, срав-
нивая спектры по наличию, форме и относительной интенсивности полос поглощения. Дзя
амфетаминов, основания которых представляют собой маслянистые жидкости, регистрацию
ИК-сиекгра можно проводигь в виде гонкой плеики на кристалле из подходящего оптичес-
кого материаза (КВг. KRS-5 и др.), однако в этом случае сходимость спектра с библиотечным
снижается.
При наличии в исходном объекте двух и более различных амфетаминов в хлороформный
слой б\дут экстрагироваться все амфетамины и нх идентификация метолом ИК-спектросконии
будет затруднена. Поэтому и таких случаях необходимо использовать более сложные способы
пробоиодгоюнки — твердофазную экстракцию или препаративную ТСХ лля выделения инди-
видуальных компонентов и проведения их последующего определения метолом ИК-спентро-
мстрпи (рис. 6-126).
Для получения однозначного вывода о наличия в исследуемом объекте МДА. МД МА. МДЕА
или МБДБ использовали капельный химический анализ. тонкослойихю. газовую и жидкост-
ную хроматографию и хрома го-масс-спектрометрию.
Пример 4. ИК-сиектрометричсское исследование образцов кокаина. Часто ввиду наличия
различных примесей в кокаине, например лидокаина. новокаина. эфиров эк опина и т.д. (см.
гл. 7). экстракция диэтиловым эфиром (или пентаном) как способ пробополготовки не позво-
ляет получить пригодный для идентификации ИК-спектр кокаина. В этом случае пробоподго-
товку необходимо осуществлять с применением звердофазной экстракции.
Методика Перед началом исследования патрон «Диапак» лля твердофазной экстракции,
загю. пенный силикагелем с привитой фазой С|6. медленно. но каплям промывают последова-
тельно 3 мл метанола. 3 мл этилаиетата. снова 3 мл метанола и 2 мл дистиллированной возы.
20 mi кокаина растворяют в дистиллированной воле, при необходимости волу по: кпеляют
После охлаждения полученный раствор пропускают через патрон, промывают 10 мл воды, а
затем 2 мл метанона. Первый миллилитр метанола отбрасывают, а следующие 0.5 мл собирают.
Полученный метанольный смыв перенося! в «патовую ступку и выпариваю! в сушильном шка-
фу при 50—60 °C яосуха. Сухой остаток перетирают с КВг. прессуют в таблетку и регистрируют
спектр.
ИК-сисктр кокаина-оснонания. зарегистрированный на приборе Impact 400 (фирма Nicolct.
США), и ИК-спсктр кокаина гидрохлорида ле!ко отличимы (рис. 6-127).
Пример 5. В 1991 г. в России появилось нс встречавшееся ранее на ее территории наркоти-
ческое средство бупренорфин (см. гл. 7). Бупренорфин производится в нескольких странах, в
частности в Индии и США. Это наркотическое средство было официально закуплено пашей
484 Глава 6
б
103
с=1039
d=1442
J ' е=2960
f=3360
19.......................................I , . ,
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Волновое число, см''
Рис 6-126. ИК-спектры проитволных амфетамина (см. гл. ?). а — основание 3.4-метт ich диокси метам-
фетамина (пленка неразбавленного вещества на таблетках из КВг): 6 — основание З-мстоксн-4.5-меги
лсндиокснамфетамина (пленка неразбавленного вешества на таблетках из КВг): в — основание 3.4 ме-
тилендноксиамфетамина (пленка неразбавленного вешества на таблетках из КВт).
Методы определения токсикантов в биосредах 485
СМ-1
Лк 6-12' А — ИК-спектр кокаина-осиования; Б — ИК-спектр кокаина < илрохлорида.
траион в Индии лля исиольювания к качестве лекарственного препарат. Большие партии
бупренорфина (имеются случаи изъятия у одного перевозчика до 600 ампул) провозятся не-
легально через границу. В Индии лекарственное средство, содержащее бупренорфин. называ-
ется Norphin и нроизво 1ится фирмой I NICIIEM laboratories ltd. Norphin. представляет собой
водный раствор бупренорфина гидрохлорида (концентрация 0.3 мг/мл раствора) с добшкой
мальтозы либо таблетки. содержащие 0.2 мг бупренорфина. В США бупренорфин в ампулах
для ннт>ем1ий выпускается фирмой Norwich Eaton пол названием Виргепех Это лекарственное
-релство содержит бупренорфина гидрохлорид (0.3 мг/мл бупренорфина в псрес ictc на осно-
вание) и 50 мг декстрозы.
Исследования методом ИК-спектромстрии содержимого ампул с маркировкой «Norphin»
ЬКтодика К I мл препарата добавляют I мл гексана или пентана и каплю аммиака. Смесь
мзергично встряхивают. дают отстояться, а затем пипеткой otonpator часть верхнего слоя 0.6—
.8 мл) так. чтобы не захватить нижний водный слой. Отобранную пробу переносят в агатовую
ступку и испаряют раствори гель, после чего дополнительно подсушивают в сутиилытрм шкафу
рн 60 С в течение 15 мин Образовавшийся на стенках ступки белый налет перетирают с КВг
я прессуют в таблетку. Полученную таблетку Яиализир ют па ИК-сиекгромегре в диапазоне
жми 4000 400 см 1 прн разрешении 4 им Подученный спектр имеег следующие полосы пог-
•ошения: 3402. 3079. 2977. 2956. 2852. 2810. 1832. 1737. 1631. 1608. 1509. 1460. 1429. 1410. 1388.
1371. 1331. 1311. 1281. 1239. 1218. 1197. 1161. 1132. 1081. 1024.997.964.947.904.886.852. 824.
’89. 46. 724. 700. 561. 522 и 432 см’.
Результаты исследований, проведенные метопами капельною химического вналмлк ГСХ.
>Ф спектроскопии и хромато-масс-сиектромстрни а также данные ИК-спсктрометрии пока-
зали наличие в образцах бупренорфина (см. электронное приложение).
486 Глава 6
6.4.3. Атомная спектрометрия и ядерные методы
в элементном анализе токсикантов.
Применение комбинированных систем — ВЭЖХ-ИСП-МС,
ГЖХ-ИСП-МС, КЭ-ИСП-МС и гамма-резонансной спектрометрии
в биомедицинских нанотехнологиях
Наука никогда нс решает проблемы,
нс поставив леей т it новых’.
Ь Шоу
Краткий обзор методов элементного анализа
Обобщенная схема возникновения аналитических сигналов в методах атомной спектромет-
рии, обусловленных осуществлением соответствующих строго определенных энергетических
переходов, приведена на рис. 6-РХ Сначала воздействием высоких температур вешество пре-
вращают в атомный пар. т.е. превращают в свободные атомы соответствующих химических
элементов. Этот процесс называют атомизацией
Далее при столкновении с частицами плазмы* (атомы, ноны, радикалы, электроны, находя-
щиеся во всех энергетических состояниях) атомы переходят в возбужденное состояние. Одни
из электронов, находящийся на основном уровне, переходит в возбужденное состояние — на
другой уровень, которому соответствует бблыпая энергия.
Эю состояние неустойчиво, поэтому через очень малое время (-10 4 с) атом возвращается в
исходное состояние электрон вновь переходит на основной уровень, испуская квант энергии,
отвечающий разности энергий на двух уровнях. Это можно записать в виде формулы Планка
1-.п= f “ e hvi-5 = h 1-« линия:
АЕ,^,= Е; — Е0 = liv = h с/Х? л 2-я линия и т.п.,
где h — постоянная Планка: v и X— частота и длина волны спектральной липин, отвечающей
данному электронному переходу в еоо ветствуюшей спектральной области. Линии, лля ко-
торых переход заканчивается на основном уровне,
обычно наиболее интенсивные и чувствительные.
Их часто называют резонансными. Так возбуждаются
эмиссионные спектры атомов в атомно-эмиссион-
ном метоле и фотометрии пламени.
В атомнп-абсарбцчпнном анализе вещество также
подвергают атомизации, но таким образом, что воз-
буждения атомов не происходит. В этом состоянии,
которое называют атомным паром, атомы способ
иы поглощать кванты проходящего через него ре-
зонансною излучения. В результате интенсивность
излучения уменьшается и ее можно измерить. По-
мешав свой «родной» квант, атом переходит в воз-
бужденное состояние и далее в основное, однако
здесь соответствующая энергия деградирует в коле-
бательную форму — в тепло.
Индивидуальность линейчатых атомных спект-
ров всецело определяется строением внешней элек-
тронной оболочки атомов и ее заполнением элект-
ронами. В теории принято характеризовать оперт ню
электрона на каждом уровне с помошью аппарата
квантовых чисел и соответствующей символики.
Эго позволяет описывать электронные переходы
Рис. 6-128. Электрон тыс переходы между
основным (Т1) и возбужденными (I, 2) уров-
нями — причина происхождения атомных
спектров
* OiipcacicHtu термина tuaiMn среда. состоящая нт рапного Kounriccrua наюжитедько заряженных номов и отртш
Tejii.no заряженных элскгр< нов. проявляющая некоторые свонспш нгэз, однако отличающаяся от него способностью
хорошо проводи>ь Х1сктрпчссм1>т ток и вмнмоаейепшввть с манпнпым тшем I Словарь Вебстера).
Методы определения токсикантов в биосредах 487
приводящие к возникновению спектров. В методах атомной спектрометрии могут осущест-
вляться только элекфонные переходы с изменением орбитального квантового числа Соот-
ветствующий переход и ног та обозначают термином «оптический элекфон».
Атомно-абсорбционный и атомно-эмиссионный методы характеризуются низкими предела-
ми обнаружения, особенно при использовании индуктивно связанной плазмы (ИСП) и элект-
ротермической атомизации (см. ниже табл. 6-54 и 6-55).
Атомно-эмиссионный <inaiui позволяет определять до 70 элементов, в основном металлы.
Для этого анализируемую пробу вводят в источник возбуждения (плазма электрическою луго-
ного разряда. высоковольтная искра, газовое пламя. ИСП), где она испаряется и переходит в
атомарное состояние. Атомы возбуждаются и. возвращаясь в основное состояние, испускают'
кванты. Суммарное и лучение разлагается в линейчатый спектр Регистрируют наличие, поло-
жение и интенсивность спскфальных линий, отвечающих разрешенным правилами квантовой
механики переходам внешних валентных электронов гою или иного элемента. Функцией при-
роды атомов является длина волны спектральной линии в оптической области 200—800 нм.
функцией количества — интенсивность этих линий. Схема техники измерения приведена на
рис. 6-129.
Важнейший параметр источника возбуждения — температура- Температура электрической
дуги постоянною или переменного тока достигает 4000 -7000 °К, конденсированной электри-
ческой искры — 7000 - 10 000 К, в канале разряда — ло З Ю4 К. Эти источники нс отличаются
высокой стабильностью. ИСП — напротив, современный высокостабильный источник воз-
буждения, устойчиво поддерживающий температуру 6000—10 000 К. Если работают с электри-
ческой дугой, то используют элекфоды из спектрально чистого фзфита. а порошкообразные
пробы вводя’ в каналы электрода ИСП-снекфомефия — «растворный» метод: раствор про
бы распыляют аргоном в горящую плазму. Существенным может быть эффект матрицы —
кшяпие прочих элементов пробы на интенсивность излучения исследуемого элемента. Для
возбуждения каждого элемента существует оптимальная температура, при которой атомизация
достаточна. но ионизации элемента в плазме нс происходи г — спектр иона существенно отлн-
ч. елся от спектра атома.
Монохроматор необходим для разложения суммарт ого излучения пробы в спектр и выле-
тення нужных спскфальных линий. Эмиссионные спекфы атомов особенно богаты большим
числом линий Так. например, в интервале 200—800 нм в спектре атома водорода 54 липни,
калия — 99. меди — 530. железа — 3257. Безусловно, существуют проблемы с распознаванием
спектральных линий искомого элемента из-за их совпадения и наложения. Поэтому т]эебова-
ния к монохроматору высокие. В современных приборах это дифракционная решетка с особым
профилем полос. нанесенных на дифракционный элемент При качественном обнаружении
Рис. 6-129. Блок-схема измерений я ягодно-эмиссионном метоле
I — источник позб ждения: электрическая луга, искра: инлуктивво-связаштая плазма инертного газа:
2 монохроматор: призма (оптическое стекло, кварц (для УФ)|; дифракционная решетка; 3 — выходная
шель: 4 — приемник излучения: <|ююхзскгронный умножитель, диодная матрица; 5 — уенлигель-преоб
разовате.ль: 6 — отсчетное устройство.
В лтомно-эмиссионной фотом тр г и пламени:
I — газовое пламя: 2 — интерференционный светофильтр (другие монохроматоры)
488 Глава б
элемента в ею спектре нужно отыскать не менее 3 характерных линий, обычно это наибо-
лее чувствительные резонансные линии. Фотоэлектрическая регистрация спектральных линий
ныне общепринят как наиболее удачная, при этом соответствующий электрический сиг на.
легко обрабатывается и регистрируется. Прежние виды регистрации — визуальная (отсюда
и термин спектроскопия) и фотографическая (работа на спектрографах) ныне утратили свое
значение.
Основная область применения атомно-эмиссионного анализа — определение металлов в
различных объектах. При определении неметаллов наилучшие лнннн — резонансные — нахо-
дятся в труднодоступной вакуумной УФ-области. Влияние матрицы учитывают тщательным
выбором спектральных линий и соответствующей химической обработкой пробы. Поэтому в
конкретных условиях не всегда можно выбрать наиболее чувствительные резонансные линии
определяемого элемента. Приходится работать по другим, существенно менее чувс г шг тельным
линиям.
Атомно-эмиссионный ананас ПСП. Метод применяют для определения элементов в раство-
рах. Основное преимущество — возможность определять из одной пробы большое количест-
во элементов параллельно или последовательно в зависимости ог конструкции прибора. Для
возбуждения спектров хтесь используют аргоновую ИСП. получаемую в особом устройстве,
называемом горелкой (рис. 6-130).
Индукционная катушка горелки I подключается к мощному, до 2 кВт, высокочастотно-
му генератору Тесла, обеспечивающему накачку энергии в поток аргона, который вследствие
этого ионизуется. Это вызывает появление индукционного тока, циркулирующего в плазме,
происходит сильный индукционный разогрев потока аргона. Температура достигает 8000
10 000 К и поддерживается с высокой точностью, вследствие чего условия возбуждения атом
пых спектров очень хорошо воспроизводятся, чю существенно улучшает точность определе-
ний. Высокая температура плазмы устраняет многие х гмичеекне помехи, связанные, напри-
мер. с неполной минерализацией матрицы при исследовании биологических проб - при таких
температурах атомизация всегда нрогекаст практически полностью
Дчя выполнения практических определений особенно удобен последовательный сканиру-
ющий спектрометр с дифракционной решеткой, работающий под управлением компьютера
по заданной оператором программе. Программа управляет автоматической подачей проб в
горелку, автоматическим сканированием спектра пробы в зхтанпом диапазоне длин воли. что
осуществляется программируемым вращением дифракционной решетки и соответствующей
регистрацией спектральных линий искомых элементов. Диспергирующие возможности мо-
нохроматора позвотяют гибко выбирать оптимальные длины волн, обеспечивающие отсутс-
твие спектральных совпадений при анализе таких сложных объектов, как биологические. Ин-
тенсивность спектральных линий измеряется современным фотоэлектрическим способом с
применением диодных матриц. Ввиду очень большого диапазона линейности градуировочной
зависимости, охватывающего до 5—6 порядков, метод одинаково пригоден для определения
Рис. 6-130. Схема хегронепш горелки с нидуктнпио-сия:«п1-
иой пллгмои
I — индукционная катушка, охлаждаемая протекающей во
дон: 2 — зона излучения: 3 — высокочастотное электро-
магнитное иоле: 4 — внутренний поток аргона, подающий
пробы в горелку через распылитель; 5 — промежуточный
поток аргона, в котором поджигается плазма; 6 — внешний
поток аргона, сжимающий плазму ио периферии.
4
Методы определения токсикантов в биосредах 489
и малых, и больших концентраций элементов нт одной пробы. Достигаемые пределы обнару-
жения — низки и обычно составляют десятые и лаже сотые доли микрограммов иа 1 мл Эго
Олин мт лучших современных методов, применяемых для анали а биологических проб, чго
подтверждает также и наличие официальных методик и нормативных док тентов.
Атомно-эмиссионную фотометрию п. вмени (источник возбуждения — газовое пламя) в ос
новном используют для определения щелочных и щелочно-земельных металлов (ЩЗМ). по-
скольку для атомизации этих элементов и возбуждения спектров атомов достаточно темпера
гмры пламени газовой горелки. Температура газового пламени, а следовательно, и перечень
эзбхждасмых элементов зависят ог горючею газа и применяемого окислителя: срапннгельные
данные приведены в табл. 6-48
Таблица 6-48 Газовые пламена испо.чыусмыс в атомпо-эмиссионной фотометрии пламени
Горючий газ — окислитель Температура, к Возбуждаемые элементы
Светильный газ — во тух 1X00 Щелочные металлы
С Н - воздух 2200 Щелочные металлы + ЩЗМ
Н -О 2800 Щелочные металлы + ЩЗМ
С Н, - NO 3200 Другие мсгалды (Ag. Си. Мп)
В ыамснах свободные а омы детектируются в случае лсгковозбуждасмых элементов, обычно
это щелочные металлы и частично ЩЗМ. Так как температура плазмы газового пламени ниже,
чем в дуге или в Г1СП. спектры атомов характеризуются меньшим числом линий. Это упроща-
ет требования к монохроматору, его можно заменить ипгерферепионным светофильтром. что
значительно упрощает прибор. В фотометрии пламени работают с растворами проб, которые
потоком окисли геля распыляют в илами. Метод особенно подходит для определения щелочных
металлов в чюбых растворах, в том числе и в биологических жи гкоегях. Достигаемые для них
пределы обнаружения низки. Так. для Na он равен 0.0001 мкг/мл. лля К —0.001 мкг/мл. для Li —
0.00003 мкг/мл (!). для Са - 0.005 мкг/мл Из недостатков метода можно отмстить анионный
эффект. Так эмиссию кальция подавляют сульфаты, фосфаты. эмиссия алюминия уменьшается
за счет обртвования в пламенах трулнодисеоциируюших малолетучих соединений. Устранить
этот недостаток можно предварительной хт мической обработкой пробы.
В методе атачно-абсорбционнои спектрофотометрии пробу, содержащую определяемые метал-
лы переводят в атомарное состояние в газовом пламени или графитовой кювете. нагреваемой
электрическим током (пламенная или электротермическая атомизация соответственно), но воз-
буждения атомов не происходит. Через • гой атомного пара пропускают монохроматическое из-
лучение (источник — лампа с полым катодом), непременно содержащее линии определяемого
элемента, и измеряют резонансное поглощение элемента в атомарном паре в области 200—800 нм
фотоэлектрическим способом. Схема а гомно-абсорбционных измерений приведена на рис. 6-131.
Лампа с полым катодом 1 имеет катод, изготовленный в виде трубки из того металла,
который определяют; в нем вакуум и немного паров ртути. При подаче высокого напряже-
Рис. 6-131. Принципиальная схема измерении в
атомно-абсорбционном методе
I — лампа е петым катодом: 2 — атомизатор: 3 —
горючий гл; 4 — воздух. подающий раствор пробы
в распылитель, 5 — монохроматор; 6 — (|ютонрн-
емпик: 7 — регистрирующее устройство. Внизу:
графитовая кювета с отверстием сверху для ввода
пробы.
490 Глава б
ния возникает тлеющий разряд, в резулыаге которого возбуждается резонансное излучение
того металла. который определяют. Через кварц вое окошко излучение попадает в атомизатор.
Это может быть газовое пламя (чаше всего смесь ацетилен — воздух. дающая температуру
- 2250 'К), горя шее в щелевой горелке. В пламя распыляется аэрозоль исследуемого раствора
и происходит разрушение исследуемого вещества до атомарного уровня. Освобождающиеся
невозбужденные атомы поглощают «родное» для них резонансное излучение, в результате чего
мощность прошедшего через пламя лучистого потока уменьшается. Отсчетная схема прибо-
ра регистрирует это как поглощение, величину которого измеряют. Помещение Л связано с
концентрацией элемента прямо пропорциональной зависимостью А = kcl (к — коэффициент
чувствительности), исходя из которой определяют концентрению искомого элемента. Таким
образом, возможность определения рахинчныч элементов связана с имеющимся в распоряже-
нии аналитика ассортиментом ламп с по ым катсмом.
В методах рентгеновской спектрометрии регистрируют сигналы, отвечающие электронным
переходам между внутренними энергетическими уровнями атомов. Энергия квантов здесь су-
щественно больше. а длина волны меньше и составляет 0.001 — 10 нм. В рентгеновской обтаем
традиционно используют и внесистемные единицы и змерения ыин во н — ангстремы (0.01 нм -
100 Л"). В отличие от оптической спектрометрии, в рентгеновской осуществляются электрон-
ные переходы с изменением главною квантового числа, которым соответствует существенно
большая энергия квантов рентгеновского нхчучення — 4—11 эВ.
Рентгеновский эмиссионный и флюоресцентный анализ позволяет идентифицировать и коли
чсственно определять элементы с порядковым номером больше 13, возможен локальный ана-
лиз с разрешением до 10 мкм. что удобно при исследовании тонких пленок, некоторых твердых
биологических проб. Для определения кристаллическом структуры вещества — идентификации
кристаллов — изучают дифракцию рентгеновских лучей. Флюоресцентный метод можно ис-
пользовать для количественного определения.
В рснтгепофлюоресцснтном методе флюоресценцию рентгеновское излучение инициируют,
вызывая первичное, при котором осуществляются электронные переходы во внутренних элек-
тронных оболочках с изменением главного квантового числа. Положение счетчика квантов
можно изменять и таким образом регистрировать отдельные спектральные линии, отвечающие
идентифицируемых элементам. Количество зарегистрированных импульсов пропорционально
количеству атомов определяемого элемента, что и является основой количественного анализа.
Радиометрические методы основаны на использовании в аналитических целях явления радио-
активности. Эю методы сгали развиваться на основе достижений ялернси физики, радиохимии
и ядерной техники и технологии, теперь они применяются и в других областях. Методы включа-
ют определение элементов по естественной радиоактивности. например *’К. ”Rb и др. Наибо; ее
распространенные из них ралиоактивашюиный анализ, методы изотопного разбавления и нр.
Радиоактивационныи анализ. В методах ядерной спектрометрии химические элементы оп-
ределяю! по интенсивности радиоактивного и имения (у-спектр). возникающего вследствие
взаимодействия атомных ядер с корпускулярным излу гением и вызывающего извращение
атомов определяемых элементов в радионуклиды. Этот способ называют активационным ана-
лизом и применяют для определения элементного состава твердых образцов. Низкие преде-
лы обнаружения многих элементов и. следовательно, высокую чувствшельность определений
обеспечивает нейтронно-активационный анализ. для применения которого требуется источник
нейтронов — ядернын ре; кгор. циклотрон, генератор нейтронов, изотопные нейтронные ис-
точники. нелинейные ускорители. Преимущество метода — независимость чувствительности
от формы нахождения элемента, недостатки —длительность выполнения, необходимость ра-
боты в специальной радиохимической лаборатории.
При проведении нейтронно-активационного анализа образец помещают в ядернын реактор
и облучают его потоком нейтронов. в результате чего все способные к возбуждению -элементы
пробы становятся радиоактивными (рис. 6-132. а).
Зависимость наведенной радиации от взмени называется кривой растает. Она отражает
активность всех образовавшихся радиоактивных и эзопов. Индивидуальные элемешы можно
идентифицировать и определить их содержание, исследуя эту интегральную кривую и разлагая
ее па составляющие. Такую математическую задачу решают с помощью компьютеров, посколь-
ку законы. описывающие явление радиоактивного распада, математически сформулированы.
Методы определения токсикантов в биосредах 491
Так. например, при анализе пробы волос непосредственно после облучения измеряли интен-
сивность у-квантов ”С1, ,2’1 через 1 ч после облучения — мХа. мСи. 'Мп. через неделю — *гВг.
As Мо. 1 Cd. через 1 мес — *‘Сг. ’‘‘Не. wCo. ’5Se и лр Желаемые результаты можно получить
снимая не всю кривую распада, а регистрируя у-спсктр пробы в определенные моменты после
облучения Обычно используют Li-Ge-летскзор и многоканальный анализатор, работающий
пол управлением компьютера.
В радиометрическом методе анализа измеряют ослабление интенсивности радиоактивного
излучения при взаимодействии с атомами элементов. входящих в компоненты образца. В ра-
диохимическом анализе к пробе примешнвнют небольшое количество радиоактивного инди-
катора (меченые атомы) и подверыют се химической обработке аналитическими реактивами,
приводящей к изотопному обмену. Определение активности продукта реакции даст информа-
цию о ходячее вс определяемою вешества (метод изотопного разбавления). Блок-схема метола
приведен иа рис. 6-132. б.
Принцип радиометрического метода состоит в измерении ослабления интенсивности ра-
диоактивного излучение вследствие его взаимодействия с определяемыми элементами в об-
разце (рис. 6 132, в). Измеряют поглощение излучения, связанное с концентрацией искомого
хтсмснта в пробе, известной зависимостью, используя счетчики радиоактивного излучения.
Ядерный гамма-резонанс. или эффект Мессбауэра, лежит в основе метода гамма-резонансной
спектрометрии (ГРС). 1 Р-спсктры вызваны переходами между ялерпыми (!) энергетическими
уровнями. В 1958 г. Р Мессбауэр открыл эффект, который состоит в том. что испускание или
поглощение у-квантон атомными ядрами в твердом теле может происходить без возбуждения
колебательных степеней свободы твердого тела, т.е. возможны переходы без отдачи ядра, ког-
да импульс фотона принимает не отдельное ядро, а кристалл в полом При радиоактивном
распиле достаточно тяжелых элементов бблыиая часть образующихся атомов находится вна-
чале в возбужденном ядерном состоянии. Через несколько микросекунд возбужденное ядро
Рис. 6-132. Схемы радиометрических мето-
дов.
а — активационный анализ: 1 — образец;
2 — радиоактивное излучение; 3 — радио-
активный образен: А - детектор (спектро-
метр). М - определяемый элемент, * — па-
шчис радиоактив! ости
б — радиохимический анализ (изотопное
разбавление): 1 — оора :ц, 2 — добавление
радиоактивного индикатора*. 3 — хими-
ческая реакция (DY-peaiem). 4 — детек-
тор. Пунктиром отмечен бток химических
превращений, приводящий к изотопному
обмену СХ — определяемое соединение;
С катион: X — анион; * — наличие радио-
лы явное hi.
в — радиометрия; 1 — источник радиоактив-
ного излучения. 2 — образец. 3 — детектор.
VI — определяемый элеменз. поглощающий
радиоактивное ихзученнс.
492 Глава 6
возвращается в исходное (основное) состояние, испуская излучение очень высокой частоты
(1()1Х— 10- Гн), лежащей в ofkiacm у-спсктра Благодаря эффекту Мессбауэра смяли возможны-
ми измерение спектров резонансною испускания или поглощения у-к антов с разрешением
ДЕ/Е » 10 исследование физических и химических свойств конденсированных сред, взаи-
модействия электрических и магнитных моментов ядер с внутренними электрическими и маг-
нитными нолями, вызывающими растепление ядерных уровнен и ряд лрутх экспериментов,
требующих рекордно высокого энергического разрешения. Метод ГРС основан на установ-
лении зависимости числа у-кваптов, прошедших через образен (т.е. интенсивности поглощен-
ного у-изаучения). от частоты излучения у-квантов радиоактивным изотопом Относительная
энергия основного и возбужденного состоянии ядра атома зависит от электронной плотности
около него. Этот метоп является прямым методом определения электронного состояния желе-
за. кобальта, олова и ряда других элементов, лает возможность определять изменение состо-
яния элемента в структуре комплекса в зависимости от ближайшего лигандного окружения.
pH среды, степени гидратации. а также устанавливать степень окис »ения элемента н тин свя из
металл — органический лиганд. Полому метол используется при изучении строения электрон-
ных оболочек атомов в различных химических соединениях и позволяет получать необходимые
сведения о IOHKOM сфоспии молекул сложит! структуры, например комплексов определенных
металлов с пептидами, углеводами, нуклеотидами и другими биомолекулами. Метод позволяе)
получить исчерпывающую характеристику центрального атома и сведения о ко1к]юрманиои-
пом состоянии биолиганда. Современные приборы дают возможность изучать динамические
свойства пентилов. Существует более 30 элементов, лля которых 11*С может давать пс только
количественную информацию об их содержании, но и информацию о валентном состоянии,
кристаллической структуре вещества. в состав которых они входят, и тд. Наибольшее количес-
тво исследований выполнено с изотопами J’Fe. 61 Ni. 1 Sn.
Эффект Мессбауэра нашел применение во многих областях знаний, в том чиояе и в био-
медицинских исследованиях. Метол ГРС становится все более попу тярныхз в молекулярной
биологии, биохимии, биофизики и друз их смежных областях (см. электронное приложение).
Диапазон определяемых концентраций элементов при использовании важнейших методов
элементного анализа представлен на рис 6-133
100 10 1 10" 10' 10э 10* 10“ 10* 10’7 10" 10* 10”%
I-----1-----1----1-----1-----1-----1-----1-----1-----1-----1-----1-----1
1г 1мг 1ppm 1ppb 1ppi
Активационный
Масс-спектрометрия ИСП
Атомно-эмиссионный
томно-эмиссионный ИСП
Атомно-абсорбционныи электротермический
ДАтомно-абсорбционный пламенный
!псжт^ эфетометрия
Для многих элементов
Для отдельных элементов
Рис. 6-133. Диапазон определяемых концентрации элементов при использовании различных методов
анализа.
Методы определения токсикантов в биосредах 493
С точки 1реиия рассмотренного в начале главы информационного подхода большему диапа-
зону опре еляемых концентраций при прочих равных условиях отвечает и большая информа-
ционная эффективность метода (см. гл. 6.1). Физико-химические методы элементного анализа
имеют принципиально более низкие пределы обнаружения и несравненно более эффективны,
чем классические химические методы анализа. Избыточная с точки зрения химнка-анапш ка
ин1|к)рманионная мошь таких методов, как атомно-эмиссионный анализ с ИСП и масс-спек-
rpoueipiw с ИС П. в медицинской злсментологии имеет огромное преимущество при одно-
временном выпе тении сравнительных исследований большого числа элементов (ем. ниже и
гл. 8.5).
Спектральные и ядерные методы определения элементов в биообъектах
В клинико-токсикологических. клинических, судебно-химических, криминалистических,
экоюго-гоксикологических и других лабораториях часто возникает необходимость определе-
ния элементного состава от :льных бт ообразнов и/или элементного статуса пациента.
Ниже приведены хорошо известные и новые, но уже широко применяемые за рубежом ме-
тоды определения элементов в биообъектах. Например, иммунохимнческие методы, такие как
ИФА и ПФИА являются новыми технологиями лля определения ионов металлов (см гл. 6.2).
Основные методы опрсде сепия элементов в биологических объектах
• Аюмно-абсорбпиошмя спектрофотометрия (пламенная ААС).
• А1омно-лбсорбиионпая спектрометрия с электротермической атомизацией (ЭТАЛС)
• Оптическая эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-ОЭС).
или плазменная атомно-эмиссионная спектрометрия (ИСП- АЭС).
• Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС).
• Пламенная фотометрия.
• Рентгепофлюореснептная спектрометрия.
• Н йтроноактивапионный анализ.
• Снектро<|>отомегрическиН метод.
• Электрохимические методы (инверсионная вольтамперометрия, иопометрия, полярография
п др., см гл. 6.5).
• Хрома юз рафические методы (см. гл. 6.3 и 8.5.4).
• Иммунохимнческие методы (см. 6.2.) и другие методы.
Метод ААС. Традиционным стандартным метолом определения цементов в биологических
объектах является ААС. Достшаемые пределы обнаружения, особенно в методах с электротер-
мической атомизацией (например, зрафитокзя кювета), ок зываются вполне удовлетворитель-
ными. Характеристический источник света (линейчатого спектра определяемого злементя) —
дампа полого каюда или газоразрядная безэлектролная лампа Спектрометр-монохроматор
служит лля выделения в спектре определенных длин волн и проведения измерений. Детекто-
ром служит фотоэлектронный умножитель или полупроводниковый чин. который преобразует
светов ю энергию определенной длины волны в пропорциональный электрический сигнал
Жидкий образец при помощи распылителя превращается в мельчайшие капли аэрозоля. Затем
этот аэрозоль ввоппся в высокотемпературное пламя горелки. Атомы или ионы интересую-
щего элемента потощают световую шергню лампы на определенной резонансной длине вол-
ны Уменьшение интенсивности резонансного излучения подчиняется экспоненциальному
закону убывания интенсивности в зависимости от длины слоя и конпешрапии вещества,
аналогичному закону Бхтера—Ламберта—Беера. Концентрационная зависимость выражается
уравнением:
lgl,/I A-kcl.
гзе к — коэффициент поглощения: I — толщина слоя (пламени (: с — концентрация.
При количественном определении метопом ААС обычно применяют способ градуировочно-
го графика или способ добавок. Способ гралуировочно о (рафика предусматривает измерение
оптической плотности нескольких стандартных растворов и построения графика в координатах
оптическая плотность—конпентра шя. Затем определяют оптическую плотность анатизирус-
чонго раствора и по графику находят его концентрацию.
494 Глава 6
При использовании способа добавок сначала измеряют оптическую плотность ана. пзи-
руемого раствора, затем вводя! в него определенный объем стандартного раствора и сно-
ва определяю) оптическую плотность. Концентрацию анализируемою вещееibu находят по
формуле:
С, = Си.Аж
Пламенная ААС получила широкое распространение вследствие многих преимуществ.
Важным условием является малое число линий в спектре, поэтому наложения аналитичес-
ких линии практически не происходит. Погрешность определения обычно составляет 5%
и может изменяться в пределах 3— 10%. Однако этим методом нс определяются элементы,
резонансные линии которых лежат в далекой УФ-области спектра (С. 1\ галогены и др.).
К недостаткам метода относился О1раннчсн1юя производительность, определяемая наличи-
ем источников резонансного излучения: перечень определяемых элементов; нсвозможнос)ь
одновременною определения нескольких элементов, необходимость полной деструкции мат-
рицы. При этом чуне)витальность определения легколстучих элементов, например ртути, рс-
л. изустся только с помощью соответствующих гидридных приставок (метод холодного пара).
Тем нс менее преимущества метода и доступность соотве с вуюшей техники позволяют от-
нести его к стандартным (табл. 6-49). Умеренные пределы обнаружения метода пламенной
ААС ограничивают сто применение и делают пригодным для определения элементов, нахо-
дящихся в биообраз iax на уровне, составляющем миллионные доли единицы (I ppm = 10 %
= I мг/л): Na. Са, Mg. Си. Zn.
Таблица 6-49. Преимущества и недостатки пламенной ААС
Преимущества Не юстаткн
Преле I обнаружения 1 мкг/л Погрешность в зависимости от условии определения 3—10% Высокая элементная селективнооь Простота выполнения Невозможность многоэлсментного анализа Не определяются С. Р. гатоюны и др Корогкии линейный диапазон калибровки (не более 3 горняков) Помехи при анализе: химические (влияние 1’0/ на Са); нежелательная ионизация (Na. К. Ba. А1) Для каждого элемента требуется соответствующая лампа На измерение 1 хземента гре( ется 3—5 мл раствора образца Пределы обнаружения метола н юстаточны для опреде- ления многих хтсмептов на нормальном биологическом уровне в клинических образцах
Большинство анализов методом АСС выполняется в атомизаторах пламени. Образец в жид-
ком виде вводится в пламя, где в ходе химических реакции разрушается любое органическое
вещество образца, а неорганическое разлагается на свободные атомы. В настоящее время на-
шли широкое применение приборы, имеющие атомизаторы с графитовым стержнем.
Метод ЭТААС. При использовании этого метода образец объемом в несколько микролитров
наносится па подложку рафитовой кюветы.
Для разложения образца используют электрическое нагревание, которое происходит в три
стадии: сушки, озоления, атомизации. На стадии сушки растворитель выпаривается при низкой
температуре, затем при более сильном нагревании из образна удаляются летучие компоненты и
остаток из нелетучих неорганических соединений атомизирустся при ешс более интенсивном
нагревании. Ихтучение. поглощенное атомами на стадии атомизации, измеряется. Концентра-
ция определяется по высоте пика поглощения Атомизатор даст возможность измерять очень
малые концентрации веществ и вязкие образцы.
Пределы обнаружения многих элементов на уровне первых долей на ми.1лиард (I ppb = !() '%
= I мкг/л), малые объемы образца (микролитры) и способность напрямую анализировать твер-
дые образцы делают метод ЭТААС пригодным для различных целей исследования (табл. 6-50).
Например, метод ЭТААС часто используется для определения свинца в крови (см. гл. 8.5).
Методы определения токсикантов в биосредах 495
Таолнпа о-50. Прсиму песта и hcjoctjikh 9Г4ЛС
Преимущества Н достатки
Чувствительность ло разным элементам на 2—3 порялка нышс Коро кин швейный кллибровоч-
чеч в пламенной -ЧАС ный дитизон
Помехи
фоновая абсорбция
_1_1я анализа достаточны микро.шгровыс объемы образна эффект памяти
нечй ходимость применения хими-
ческих модификаторов матрицы
Умеренная стоимость анализа Весьма медленный анализ, до
3 мни на одну реплику хтя одного
элемента
Аид,из тертых образцов бет растворения
Возмож гость использования различных биообъектов (волосы.
ногти и др.)
Пределы обнаружения достаточны для определения большинс-
тва из обычно вытыкающих интерес элементов в биообр, нах
при нормальном уровне содержания
Высокоэффекг ивным методом определения микроэлементов в биолог ических объектах яв-
ляется ИСП-ОЭС. или плазменная атомно-эмиссионная спектрометрия (ИСП-АЭС).
В ИСП-ОЭС-приборс тонко диспергированный аэрозоль образна в токе аргона вводится в
факел высокотемпературной аргоновой плазмы (6(ХМ>—10 (XX) °К). Все элементы при такой тем-
пературе излучают атомные и ионные спектры, которые могут быть параллельно или последо-
вательно зарегистрированы. Высокая температура аргоновой плазмы, поддерживаемая за счет ее
индуктивного разогрева, позволяет провести высокочувствительный многоэлеменгный анализ.
Пределы обнаружения большинства металлов оказываются достаточно низкими, однако прояв-
ление спектральных наложений нс всегда заставляет исследователя выбирать для работы самые
чувствительные липни, иногда приходится работать и по ионным линиям. Высокая температура
плазмы позволяет избежать длительной процедуры полной минера, изаиин матрицы.
Конструктивно спектрометры для ИСП-АЭС могут быть представлены в параллельном и
последовательном вариантах. В первом случае суммарное ихзучение рахтагается в спектр, после
чего соответствующие спектральные линии определяемых элеменюв единовременно регистри-
руются многоэлементным детектором, например диодной матрицей. Таким образом, перечень
определяемых элементов жестко предопределен конструкцией прибора. В последовательном,
сканирующем, спектрометре определяется интенсивность спектральных линии всех интересую-
щих исследователя элементов, информация о чем заранее вводится в рабочую программу при-
бора. Производительность современных сканирующих приборов с высоким оптическим р; зре-
шением хороню сочетается с их аналитической возможностью одномоментно определять до 70
элементов в пробе. Несмотря на высокую стоимость ИСП-спектромегрон. наиболее надежные
данные о содержании химических элементов (металлов) в живых организмах в последнее вре-
мя были получены именно с помошью ИСП-АЭС. Поскольку резонансные линии неметаллов
часто лежат в экспериментально труднодоступной вакуумной УФ-области, пределы обнару-
жения. например мышьяка, сечена и других элементов в этом методе оказываются не всегда
хдовлетворительными для целей биомедицинских исследований. В параллельных спектрометрах
остановлена жесткая, конструктивно выполненная система регистрации только определенных
цементов. Такой ирг бор несколько дешевле, но не обладает необходимой иьтя исследователя
гибкостью. Как и пламенная ААС, ИСП-ОЭС наиболее подходи г для определения элементов,
находящихся на уровне частей на миллион в биообразнах. В отличие от пламенной ААС. опре-
деление методом ИСП-ОЭС занимает меньше времени и требует меньшего количества образца
• табл 6-51). Пределы обнаружения метода ИСП ОЭС недостаточны для определения в клини-
ческих образцах элементов, которые в норме присутствуют на уровне частей на миллиард (Аь.
Se Сг. РЬ. и др ).
496 Глава 6
Таблица 6-5! Нреттмхшестт т и педостаткн ПСП-АЭС
11 ^имущества Недостатки
Высокая скорость анализа Пределы общтружеиня недостаточны для определения некоторых элементов вбткюб- рлттшх (As. Se. Сг, Pb)
Значительно более редкие и менее серьезные пробле- мы с химическими, ионизационными и спектральны- ми но.ме.хамн но сравнению с ААС Стоимость шталпза от умеренной до высо- кой. однако она снижается с увеличением числя образцов
Тля анализа необходим умеренный объем растворе образца — 1—2 мл Помехи: спектральные наложения влияние матрицы самоабсорбння
Широкий дииеииын диапазон калибровки - свыше 6 порядков
Масс-спектрометрия с индуктивно-tвячанной платой (метод плазменной масс-спектромет-
рии)— ИСП-МС. Серьезным прорывом » ррЬобластьпри анализе биологических объектов стала
ИСП-МС (табл 6-52). При работе в области столь низких концентраций приходится серьезное
внимание уделять чистоте используемых реактивов и условиям работы в лаборатории. В анали
зе применяются особым образом очищенные реактивы и деионизованная воля. Исио >зование
горелки ИСП для ионизации пробы биологических субстратов в масс-спектрометрии позволи-
ло преодолеть существенные (именно ввиду специфики объектов) недостатки способов иони-
зации пробы электронным уларом химической ионизацией. ионизации искрои. Однако в том
случае начинают проявляться существенные изобарные наложения, чдо негативно сказытзается
па селективности метода. Например, определению мышьяка по иону 'As' мешает изооарный
ион *°Аг'5С1‘. определению кальция по иону мешает углерод органической матрицы
ион 1 С“О"-О". Решение задачи было найдено в приборах с квадруполычым масс-аиаяишто-
рам н дискретно-диодным детектором. Здесь инлукгпвпо-связанная плазма, пащержишпмая
в специальной горелке, способна эффективно генерировать однозарядные ионы из атомов
пробы. Далее ионы фокусируются ионно оптической системой, отделяются от потиатомных и
изобарных ионов и направляются в квалручюльный анализатор масс-спектрометра, где разде-
ляются но отношению массы к заряду (m/z) и поступают в детектор. Через масс-спектрометр
в каждый момент времени пропускаются ионы со строго определенным соотношением m/z.
Масс-анализатор в сочетании с динамической реакционной (ячейкой) системой (ЛРС) позволяет
избирательно разрушать молекулярные мешающие ионы, пропуская к детектору лишь ноны
определяемых элементов. и осуществлять химическое разрешение ионных пиков. Влияние ио-
лнатомных ионов устраняется путем их избирательного разрушения специальными приемами.
Достигаемые в квадруполытой ИСП-МС пределы обнаружения находятся на уровне десятых
(Вс Na. V. Сг. Fe. Ni, As...) и сотых (Li. Mg, Мп. Со. Rh. In. Sb. Pb. U...) долей нанограммов
в 1 л Малый расход растворов пробы и достигаемая в квадрунольном масс анализаторе абсо-
лютная чувствительность позволяют решить многие задачи элементного (а также изотопного,
например содержание -ми и B'U в ювенальных жидкостях) анализа биологических объектов.
Производительность метода ИСП МС достаточно высокая: в течение 2—3 мни в подготовлен-
ных пробах биолитнческих объектов можно количественно определить до 40—50 элементов
одновременно. Метод ИСП-МС отличается от ИСП-ОЭС принципом действия: в первом ре-
I петри руются отдельные ноны различных изотонов, л нс оптические эмиссионные спектры,
однако в обоих методах используется одна и та же система ввода образна.
Пределы обнаружения. достигающие по некоторым элементам сотых долей единиц на
трзыл тон (п 0.01 нг/л) (I ppt = !()'“% = I нг/л). широкий линейный диапазон калибровки
(до 9 порядков) и умеренный расход образца (1—2 мл раствора) делают метод ИСП-МС уни-
версальным среди сравниваемых методов.
Метолом ИСП-МС при использовании в качестве системы ввода электротермического
атомизатора или специальных мнкрораспылитслей можно определять образцы объемом в не-
скс тько микролитров. Определение ит тивилуалытых изотонов элементов методом ИСП-МС
позволяет проводить исследования метаболизма токсикантов с применением стабильных пзо-
TOinio-нзмененных смесей (см. электронное приложение).
Методы определения токсикантов в биосредах 497
Таблица 6-52. Прсимуи ества и недостатки ИСП-МС
Преимуи ества Недостатки
Весьма низкие пределы обнаружения (до сотых долей наног- 1 ммов па 1 л) бозсс 70 элементов в одной пробе Ограничение по содержанию сухого минерального остатка в анализируемом растворе (не более 0.1-0.25%)
Определение инпнп11луалы1ых изотопов, возможно измерение изотопных отношений, применение изотопного разбавления Помехи: и юбарные наложения (устранены в новейших моделях приборов с газовыми реакционными и колли знойными ячейками). матричные влияния
Умеренный расход образна — 1—2 мл Дорогостоящий вид анализа. При высокой загрузке оборудования стоимость существенно снижается
Возможность использования дополнительных систем виола (атомизаторы, ультразвуковые и мг крораспылитези. лазерная эбляпия). что приводит к увеличению чувствительности, умень- шению объема образна, зонному анализу твердых объектов, уменьшению помех Нельзя определить Bi
Одной из последних разработок в области масс-спектрометрии является ее сочетание с
азерной техникой, что позволяет осуществлял» испарение и ионизацию пробы воздействием
. азерного облучения, а также использовать вердые пробы биологических объектов, спрессо-
ванные в таб 1 :тки.
Современные методы исследования большого массива проб биологических объектов (тка-
ней. биологических жидкостей) методами ИСП-АЭС и ИСП-МС позволяют достоверно ус-
танавливать дефицит или избыток элемента в органише человека, что представляет большой
практический интерес для медико-биологических исследований XXI века.
На рис. 6-134 приведен фрагмент лаборатории НЕМ по определению микроэлементов в
биологических объектах методами ИСП АЭС и ИСП-МС
В методах АЭС и ИСП-МС каждый элемент должен подчиняться линейной зависимости
(от 0 до 25 или 250 нг/мл или нг/мг. что связано с природой металла и типом биообъекта) с
коэффициентом корреляции не менее 0.99. Внутри- и межлабораторныс ошибки должны быть
не более 5 и 10% соответственно.
Рис. 6-134. Современный комплекс для оп-
ределения микроэлементов в биологичес-
ких и других объектах лаборатории ЦВМ
1 — ИСП масс спектре метр; 2 — локальная
нытяжная вентиляция: 3 — автоматический
пробое бор гик с подготовленными г роба
ми в одноразовых пластиковых пробирках,
4 — ИСП атомно-эмиссионный спектро-
метр; 5 — управляющий компьютер: 6 — се-
тевой выключатель.
498 Глава 6
В современных, хорошо оборудованных лабораториях приборы, в том числе и злеюройные
аналитические весы, через соответствующие платы интерфейсов подсоединяют к общей шине,
объединяя тем самым один или несколько приборов в единую систему — компьютерную сеть.
Это позволяет контролировать доступ лиц, например администрации, к результатам анализа
и делает невозможным оказание какого-либо влияния на них, что очень важно при приня-
тии ответственных решений, например в области ХТА, медицинских и дру1их исследованиях.
За рубежом такие системы называют L1MS (laboratory information and management systems).
Сравнительные характеристики методов ААС, ЭТААС, ИСП-ОЭС и ИСП-МС приведены
в табл. 6-53—6-54.
Таблица 6-53. Сравнительные характеристики методов ААС, ЭТААС. ИСП-ОЭС и ИСП-МС
Метод Минимальным объем образца Линеиный рабочий диапазон калибровки
ААС 5 мл на элемент 3 порядка
ААС с проточно-инжек- ционным вводом 100 мкл на элемент 3 порядка
ЭТААС 10—50 мкл на зясмсн! 2 порядка
ИСП-ОЭС 1—2 мл 6 порядков
ИСП-МС 1—2 мл 9 порядков
ИСП-МС с электротер- мическим атомизато м 10—50 мкл 9 порядков
Таблила 6-54. Пределы обнаружения* некоторых элементов метопами ААС. ЭТААС, ИСП-ОЭС и ИСП-
МС в мкг/л
Элемент AAC ЭТААС ИСП-ОЭС ИСП-МС
AI 45 0.1 1 0 005a
As 150 0.03 2 0.0006b
Cd 0.8 0,002 0.1 0.00009c
Cr 3 0.004 0.2 0.0002c
Cu 1.5 0.014 0,4 0.0002c
К 3 0.005 1 0.0002c
Мп 1.5 0.005 0,1 0,00007
Ni 6 0.07 0.5 0.0004c
Pb 15 0.05 1 0.00004c
Sb 45 0.05 2 0.0009
Se 100 0,05 4 0.0007b
TI IS 0.1 2 0.0002
•По материалам зарубежной печати, 2004.
Примечание: а, Ь, с, — режим работы прибора см. табл. 6-55.
В табл 6-55 приведены экспериментальные данные, полученные в лаборатории Центра
биотической медицины (ЦВМ) РФ, аккредитованной при Федеральном центре Госсанэпид-
надзора М3 РФ в соответствии с международным стандартом (аттестат аккредитации ГСЭН.
RU.UOAJll, регистрационный номер в Государственном реестре РОСС RU.OOO1.5I3118 от
29.05.2003). Статистическая обработка полученных данных проведена при помощи программ
Microsoft Excel 2003 и Statistica 6.0 (см. электронное приложение)
Пределы обнаружения приведены в микрограммах на I л с использованием элементных стандар-
тов в разбавленных водных растворах а получены для 98% уровня значимости (3 стандартных от-
клонения фона). Действительно достигаемые пределы обнаружения в биосубстратах человека будут
на 1—3 порядка выше в зависимост от фактора разбавления (который обычно варьирует от п-10 до
п-100) и некоторых специфических проблем, связанных с присутствием органической матрицы
Преле ты обнаружения для метода ААС установлены с использованием параметров, оптими-
зированных для каждого элемента.
Методы определения токсикантов в биосредах 499
Пределы обнаружения для метода ИСП-АЭС установлены в одновременных миогоэлемен-
тных измерениях с аксиальным обзором плазмы, циклонной распылительной камерой и кон-
центрическим распылителем.
Пределы обнаружения для ртути по методу холодного пара определены с использованием
проточно-инжскнионной системы и прнставкои-амальгаматором. Предел обнаружения без при-
менения приставки-амальгаматора составляет 0.2 мкг/л с лампой палого катода. 0.05 мкг/л с бе-
зэлектродной разрядной лампой. Предел обнаружения со специальной проточно-инжекционной
ртутной система составляет менее О.(Х)5мкг/л, с приставкой-амалыаматором менее 0.0002 мкг/л.
IIредель об! аружения ААС с графитовой кюветой получены на образце объемом 50 мкл.
Пределы обнаружения в методе ИСП-МС. не отмеченные сносками, получены с исполь-
зованием распылительной камеры Скотта, поперечно-потокового распыл Стеля и никелевых
конусов. Пределы обнаружения по |учены с использованием трехсекунлных периодов интегра-
ции. не менее чем по 8 репликам.
Таблица 6-55. Пределы обнаружения элементов в мкг/л по данным ЦВМ
Элемент Пламенная ААС ААС с генерацией гидрилов ААС с графито- вой кюветой ИСП-АЭС ИСП-МС
AI +5 0.1 1 0.005а
As 150 0.03 0 05 2 0.0006b
В 1000 20 1 0.003с
Ва 15 0.35 0.03 0.00002с
Be 1.5 0.008 0.09 0.003
Са 1.5 0,01 0.05 0.0002с
Cd 0.8 0,002 0.1 0.00009с
Со 9 0.15 0,2 0.0009
Сг 3 0.004 0.2 0.0002с
Си 1.5 0.014 0.4 0.0002с
Fc 5 0.06 0.1 0?0003с
Hg 300 0 009 0.6 1 0.016 с
I 0.002
К 3 0.005 1 0.0002с
Li 0.8 0.06 0,3 0.001с
Mg 0,15 0.004 0.04 0.0003с
Мп 1.5 0.005 0.1 0.00007
Mo 45 0.03 0.5 0.001
Na 0.3 0.005 0,5 0.0003с
Ni 6 0.07 05 0.0004с
P 75 000 130 4 0.1а
Pb 15 0.05 1 0.00004с
S 10 28е
Sb 45 0.15 0.05 2 0.0009
Se 100 0 03 0 05 4 0.0007b
Si 90 1 10 0.03а
Sn 150 0.1 2 0.0005а
Sr 3 0.025 0.05 0.00002с
Ti 75 0,35 0.4 0.0031
T1 15 0,1 2 0.0002
V 60 0.1 0.5 0.0005
Zn 15 0,02 0.2 0.0003с I
Примечание, а — определено на приборе с ДРС в стандартном режиме с Платоновыми конусами и квар-
жвоА системой ввода; b — определено на приборе с ДРС в режиме ДРС с платиновыми конусами и кварцевой
октемой ввода; с — онредсле> о на приборе с ДРС в стандартном режиме с платановыми конусами н кварцевой
гжтгмои ввода в чистой комнате класса 100; <1 — используя изотоп “Hg; е — используя изотоп US;
500 Глава 6
Широко распространенным классическим методом определения элементов является <|ю-
тометрическое определение, с предварительным экстрагированием металла в виде окрашенно-
ю комплекса с органическим реактивом из изучаемого объекта. В основе оптических методов
определения лежит закон Бугера—Ламберта—Беера (см. гл. 6.4.1.1).
Экстракционно-фотометрическое определение нс занимает ведущее место в анализе био-
объектов. но этим методом продолжают пользоваться из-за простоты аппаратурного оформле-
ния. Например в рутинных токсикологических и биохимических исследованиях этим метолом
определяют содержание мели в крови При взаимодействии ионов меди с катионным фиоле-
товым в присутствии роданил-ионов и аскорбиновой кислоты, образуются интенсивно окра-
шенное соединение типа ионного ассоциата, которое количественно извлекается бензолом,
толуолом или другим растворите! м. В оптимальных условиях при однократной экстракции
толуолом извлекается до 97% ионною ассоциага меди. Окраска полученного соединения ус-
тойчива 5—6 ч, Х.ти=587 нм. Определение молибдена в почках и печени, основанное на взаи-
модействии металла с тиобензгидразидом. проводят после предварительного озоления биоло-
гической пробы при 450 °C и последующей реакции с водно-спирговым раствором реактива.
Образуется окрашенное в зеленый цвет соединение, хорошо экстрагируемое хлороформом.
Определение проводят при л= 630 нм относительно хлороформа. Недостатками этого метода
являются трудоемкость, невозможность многоэлсмешною анализа, рутинность и длительность
анализа. К преимуществам относятся доступное аппаратурное оформление и хорошая воспро
изводимость результатов.
Перспективным методом определения элементов является рентгено-флюоресцентный анализ
(РФА) химического состава образца, который проводится по характеристическим рентгенов-
ским спектрам. По сравнению с оптическими спектрами рентгеновские спектры состоят из
небольшого числа линий в диапазоне длин волн от 0.1 до 100 А*.
Возникновение рентгеновских спектров происходит следующим образом. При бомбарди-
ровке вещества пучком ускоренных заряженных частиц высокой энергии с одной из внутрен-
них электронных оболочек атома вырывается электрон и удаляется из атома. Образовавшаяся
вакансия заполняется путем перехода электрона с одной из внешних оболочек, что сопро-
вождается характеристическим рентгеновским излучением. Такое излучение наблюдается нс
только при бомбардировке электронами, но и при облучении поверхности электромагнитным
излучением большой энергии, достаточной для выбивания внутренних электронов из атомов.
Характеристический спектр называется флюоресцентным или вторичным
Английский физик Модти в 1913 г. установил, что корень квадршный из частоты п спект-
ральной линии характеристического излучения элемента есть линейная функция его порядко-
вого номера Z:
У R п
где R — постоянная Ридберга. Sn — постоянная экранирования, п — главное квантовое число,
v — частота излучения.
Как и в эмиссионной спектроскопии, качественный анализ проводят путем определения
длины волны интересующих линий и их последующей идентификации. Длину волны в спек-
тре обычно определяют с помошью известных опорных линий, являющихся своеобразными
стандартами. В качестве стандарта может быть использовано известное вешество. специально
вводимое в анализируемую пробу Расшифровка спектров существенно облегчается благода-
ря наличию подробных таблиц. Осложнения при идентификации вызывают спектры разных
порядков из-за наложения линий. Для надежности результатов находят нужную длину волны
и оценивают интенсивность не одной, а нескольких спектральных линий. Среди них должна
находиться наиболее интенсивная линия определяемого элемента. Предел обнаружения метода
составляет в среднем 1 мг/л, а лля некоторых элементов он снижается до 0.01 мг/л. Предва-
рительная обработка образца химическими реагентами в ряде случаев позволяет значительно
снизить предел обнаружения. Методом РФА можно исследовать как твердые, так и жидкие
образцы (табл. 6-56).
Количественное определение основано ни пропорциональности между интенсивностью
линий характеристического излучения и концентрацией элемента в пробе. На абсолютную
интенсив! ость линий влияют условия возбуждения и другие факторы, а также химический
Методы определения токсикантов в биосредах 501
состав пробы. Существуют различные способы количественного определения элемента мето-
лом РФА. В способе внутреннего стандарта сравнивается интенсивность линий определенного
элемента с линией стандарта — специально введенной» в пробу элемента в точно известном
коли тествс. Сравниваемые линии должны иметь близкие потенциалы возбуждения и не слит-
ком отличаться по интенсивности. Удобным стандартом является соседт ий элемент периоди-
ческой системы. Отношение интенсивности линий определяемого элемента и элемента стан-
дарта предполагается пропорциональным их концентрации: 1л/1 л = kC/С^. Коэффициент к
определяется эмпирически по интенсивности линий стандартных образцов. Преимуществом
способа внутреннего стандарта является его независимость от наличия стандартных образцов.
К недостаткам относится трудоемкость введения элемента сравнения в каждый анализируемый
образец.
Прн определении способом внешнего стандарта интенсивность линии искомого элемента
сравнивается с интенсивностью этой линии в спекграх стандартных образцов с известным со-
держанием Отношение интенсивности линий принимается равным отношению концентраций
элементов. Точные результаты получаются при условии, когда состав анализируемой пробы и
стандартных образцов по основным компонентам достаточно близок, так как интенсивность
линий зависит от общего состава пробы.
Применяется также способ добавок и разбавления. В способе добавок к пробе прибавляется
небольшое количество определяемого элемента. При способе разбавления в пробу вводится
наполнитель, не содержащий определяемое вещество. Недостатком этого способа является
большая погрешность в определении концентрации при малой величине добавки, гак как раз-
ность между интенсивностями первоначальной пробы и пробы с добавкой мала.
РФА испозьзуется в особых случаях в криминалистике с целью идентификации личности
по минеральному составу костной ткани (посмертно).
Таблица 6-56. Преимущества и недостатки РФА
П ренму щества
Метод неразрушаюши
Возможность анализировать твердые и жидкие
образцы
Метол многоэлемептиый
Эксирессность (анализ одной пробы занимает
1 — 5 мин)
Возможность использовать водные растворы
Анализ широкого крута объектов
Недостатки
Сложное оборудование
Ограничено количественное определение ряд
элементов из-за одновременного усиления и ос-
лабления излучения
Относительно низкая точность
Относительно низкая чувствительность
Нейтроноактивационный анализ (НАА) основан на возбуждении (активации) стабильных
ядер определяемых элементов при облучении анализируемых образцов потоками ядерных час-
тиц или квантов с достаточной энергией и регистрации наведенной радиоактивности.
При сближении нуклона с ядром до расстояния, на котором действуют ядерные силы, про-
исходит ядерная реакция. Она протекает в две сталии: на первой из взаимодействующих частиц
образуется составное ядро, которое существует около 10” с, на второй сталии ядро распадается
на продукты реакции.
Продукт реакции представляет собой изотоп исходных или сое дних элементов и характе-
ризуется новым сочетанием Z (заряд) и А (массовое число).
Неустойчивые ядра, образовавшиеся в процессе ядерных взаимодействий, претерпевают са-
мопроизвольный распад — радиоактивный распад. Периоды полураспада изотопов, использу-
емых в НАА. составляют от нескольких секунд до нескольких лет. Более 90% радиоактивных
ядер испытывают Р-распад. при котором испускается электрон (или происходит захват элек-
трона) с одной из орбит атома. Заряд исходного ядра при этом изменяется на ±1. массовое
число А сохраняется. Ядерные характеристики, такие как период полураспада, энергия p-час-
ти ц и у-лучен, индивидуальны для каждого ядра. Поэтому измерение этих характеристик обес-
печивает однозначную идентификацию элемента и. с;едователыю, высокую специфичность
анализа.
Основной метод получения количественных результатов в НАА состоит в измерении ин-
тенсивности излучения радиоизотопов, образующихся в процессе облучения пробы. Между
502 Глава 6
интенсивностью излучения и количеством определяемого элемента существует прямо пропор-
циональная зависимость.
На практике вместе с исследуемой пробой облучается эталон с известным содержанием
определяемого элемента. Содержание искомого элемента тх расе титывают из соотношения
содержание/ интенсивность: тх / т.п = 1х / !„-
Обычно идентификацию и количественное определение проводят путем измерения актив-
ности радиоизотопа, обеспечивающего наибольшие избирательность, чувствительность и точ-
ность анализа.
Чувствительность определения максимальна при облучении, равном нескольким временам
полураспада. Чувствительность будет максимальна при большей распространенности изотопа
и потока активирующих частиц.
Специфичность схемы распада радиоактивною изотопа создаст условия лля однозначной
идентификации и точного определения аналитического изотопа. Диапазон определяемых кон-
центрацией составляет от 10,5% до 100%. Можно получить данные о содержании большого
числа элементов в одной пробе
По энергии пей троны условно делятся на несколько групп, из них в методе НАА используются:
• тепловые (0,005 эв < Е S 0.4 эВ);
• резонансные (0,4 эв < Е < 103 эВ);
• промежуточные (1 кэв £ Е < 500 кэВ);
• быстрые (0,5 мэв < Е < 5 мэв).
Ведущим является метод НАА с использованием тепловых нейтронов, гИю обусловлено его
универсальностью и избирательностью, так как при облучении тепловыми нейтронами боль-
шинства цементов протекает только одна реакция — образование радиоизотопа исходного
элемента, причем различие параметров схем распада существеннее, чем при других способах
активации. Основным источником тепловых нейтронов является ядернын реактор.
Методом НАА возможно определение элементов in vitro и in vivo (при соблюдении специ-
альных мер защиты). Так, применение метода НАА позволило провести прямую количествен-
ную оценку степени минерализации скелета человека и отдельных фрагментов костной ткани.
При определении использовали радиационный захват тепловых нейтронов "Са. Образующий-
ся в результате радионуклид кальция удобен для спектрометрии (Т,„ = 8.8 года, выход 89%;
Е = 3,08 мэВ). При постоянных условиях облучения интенсивность излучения строго пропор-
циональна количеству элемента, например кальция.
При определении элементов in vitro Moiyr быть использованы различные методики. При-
менение методики на основе рад гохимического разделения элементов вызвано особенностями
состава биообъектов. Основные компоненты в них — Н. С, N. О. Na. Mg. Р, 1. Cl, К. Са. боль-
шинство из которых слабо активируются при облучении нейтронами.
Пробу упаковывают в контейнеры из радиационно устойчивого мзтериала. Производят сов-
месюос облучение образцов и эталона в потоке нейтронов ядерного реактора. Затем пробы
выдерживают в горячей камере для снижения наведенной активности до безопасного уровня
и проводят определение.
Например, методом НАА было проведено определение Ag, Au, Br, Cd, Co, Cr, Cs, Fe, Hg.
Mn. Mo, Rb. Ru и Та в волосах и ногтях жителей промышленных районов Онтарио. Пробы
волос и ногтей гомогенезировали. о гм и ван и. высушивали и помешали в алюминиевую фо 1ых
Затем подвергали облучению (Е = 2 кэВ) и после снижения наведенной активности определя-
ли уровень металлов. В результате было установлено, что ногти сильнее накапливают металлы
по сравнению с волосами.
При определ нии Си. Се, Fe. Р, Zn. Мо, Со в нормальных тканях мозга и при опухолях
использовали НАА на тепловых нейтронах. Для этого пробы лиофилизировали. высушивали,
облучали. При определении использовали стандартные изотопы. В холе исследования было
показано, что в опухолевых тканях накапливается мель, а содержание в них же сза фосфора,
пинка и кобальта снижено.
С помощью метода НАА изучали изменение микроэлементного состава органов больных
ишемической болезнью сердца, у которых содержание Са. Со. Na увеличено в мышцах; сердца.
Na — в печени. Fe и Со — в почках. Содержание К в мышцах сердца. Мп в печени. Сг и Se в
почках снижено.
Методы определения токсикантов в биосредах 503
НАЛ имеет абсолютно низкий порог обнаружения по сравнению с другими аналитическими
методами (ло К)’15 г). Однако дополнительные осложнения при работе этим методом, обуслов-
ленные опасностью радиоактивного излучения. удорожают анализ и требуют строгого соблю-
дения техники безопасности. НАА относится к арбитражным методом с длительным периодом
получения результатов (табл. 6-57).
Та&яшя 6-57. Преимущества и недостатки метода НАЛ с использованием тепловых нейтронов
Преимущества
Арбитражный метол
Высокая селективность и чувствительность
Диапазон определяемых
концентраций от 10”% до 100%
Преле г обнаружения 0.001 нг/г
Чалая трудоемкость
Возможность определения без разрушения
образна
Автоматизация
Недостатки
Опасность радиоактивного облучения и заражения
Дорогостоящее оборудование
Специальные условия работы лаборатории
Большая продолжительность анализа
Одноэлементный анализ
Применение комбинированных систем — ВЭЖХ-ИСП-МС, ГЖХ-ИСП-МС, КЭ-ИСП-МС
а ядерной гамма-резонансной спектрометрии в биомедицинских исследованиях.
В последние годы были разработаны принципиально новые технологии биомедицинских
сследований, которые изменили подход к определению метаболизма токсикантов in vivo
зы. гл. 3) Это выдвигает на первый план потребность в новых аналитических технологиях.
i - рые обеспечивают увеличеныие производительности анализа и получение мультипарамет-
веских данных, отражающих динамику происходящего процесса.
Несмотря на блестящие аналитические возможности современных приборов для опреде-
ления элементов в биосистемах, трудность интер! регалии результатов элементного анализа
дпраняется (см. гл. 8.5). Основная проблема заключайся в выборе алгоритмов правильной ин-
•^рпретаиии результатов. Важно учитывать и абсолютные количества элементов, и их соотно-
жнм. а также содержание клинически важных метаболитов — индикаторов дисбаланса эле-
«еытов (биомаркеров), но самая большая трудность заключается в установлении химической
Z» -мы нахождения элемента. В организме элементы содержатся в ионной и ковалентной фор-
ме «например, как центральные атомы биокомплсксов или мсталлорганичсскис соединения), в
мж клагратов и т.д. Обсуждаемые выше методы нс позволяют установить форму нахождения
а к «ента в организме. Часто при токсикологических, метабонических или метаболомических
исследованиях решение этой i роблсмы является определяющим для получения адекватных
результатов экспертизы или диагностических данных.
Возможность одномоментного (в одной и той же пробе) определения органической и мине-
эиыюи составляющей появилась при использовании комбинированных методов.
Практически любой хроматографический метод может быть объединен с методом ИСП-
ИС В современных приборах для ИСП-МС имеются опции, позволяющие получать интег-
--?• ванные системы ВЭЖХ-ИСП-МС, ГХ-ИСП-МС, КЭ-ИСП-МС или ионной хроматогра-
:-в ИСП-МС. Пакет программного обеспечения Plasnia-Crom предназначен для обработки
—--ъ.\ полученных методами ВЭЖХ-ИСП МС и ГХ-ИСП-МС. Специальные соединитель-
• трубки между газовым или жидкостным хроматогра<|юм обеспечивают работу системы.
Г -л.тью изолированная нагреваемая линия осуществляет перенос разделенного на фрвк-
ляи образца от газового хроматографа непосредственно в плазму, где вещество атомизируется.
« ионизиру-клся и детектируются в масс-спектрометре. В США методом ГХ-ИСП-МС
ас специальным стандартизованным методикам анализируются различные группы пестиии-
хж продукты питания и другие объекты. Наиболее удобной в биомедицинских исследованиях
с» жына система ВЭЖХ-ИСП-МС. Специальные устройства вводят кислород для разложения
< i«инеекого растворителя. С помощью ВЭЖХ происходи' разделение веществ, и с контро-
•фуемым делением они направляются в приборный блок для исследования методом ИСП-
А» Происходит одновременное определение органической части металлосодержаших сосди-
и непосредственно металла, входящего в згу структуру. Результатом анализа являются
“зеделение концентраций и получение информации о структуре органической составляющей
504 Глава 6
биокомняекса или клазрата металла. Такие исследования обеспечивают получение достовер-
ного результата.
Как известно, многие страны, в том числе Россия и США. разрешают использование любой
новой 1СХНОЛОГИИ в области судебной токсикологии только после се утверждения соответс-
твующими регулирующими органами. В Великобритании Судебное научное общество (FSS)
разрешает использовать вес удовлетворяющие определенным критериям новые методы и тех-
нологии после их утверждения главным специалистом этого общества. В США TDA (The Food
and Drags Administration) поощряет применение самой современном необходимой аппаратуры
С другой стороны, использование редких или экзотических технологических систем вызывает
значительные трудности в работе лаборатории н задерживает процесс валидации (см. гл. 5.8)
Учитывая вышесказанное, следует отметить, что интегрированные системы ВЭЖХ-ИСП-МС.
ГХ ИСП-МС. КЭ-ИСП-МС успешно валидировапы н применяются в странах Евросоюза. Be
ликобритании. США. Японии не только лля научных исследовании, но и для клинико-ток-
сикологической диагностики и судебно-химических экспертиз. Например, в Германии был
выигран судебный процесс и снято с гражданина обвинение в покушении на убийство только
бтагодаря экспертизе, проведенной в судебно-химической лаборатории методом ВЭЖХ-ИСП-
МС Известно, что многие органические соединения мышьяка нс обладают токсичностью (ок-
сид триметиларсипа, арсснобетаин, метиларсониевая кислота и др.), в отличие от неоргани-
ческих форм мышьяка. По результатам анализа, проведенного метолом ИСП-МС. в биопробах
потерпевшего концентрация мышьяка классифицировалась как токсическая. Однако данные,
полученные с помощью системы лля ВЭЖХ-ИСП-МС. показали на присутствие мызвьякз в
основном в виде нетоксичного арсенобетаина. Присутствие этого соединения в биообъектах
было связано с неадекватными пищевыми пристрааиямн обследуемого к морепродуктам
В Великобритании изучение метаболизма мышьяка в живых системах на примере потребле-
ния несколькими поколениями овец морских водорослей, общее содержание мышьяка в кото-
рых также отнесено к токсическому, показало, что мышьяк в биосубсгратах овец содержится в
малотоксичной форме димегиларсенига.
В Калифорнийском университете США с помощью комбинированных систем КЭ-ИСП-МС
и ВЭЖХ-ЯМР-МС применили мсгабономическне технологии для случая хронической инток-
сикации мышьяком, что привело к обнаружению новых биомаркеров — хиральиых изомеров
соединений рибозы с мышьяком.
Специальная компьютерная программа SALSA и система ВЭЖХ-ИСП-МС-МС были при-
менены в фармакогенетических исследованиях с диагностической целью для персонализиро-
ванного выбора лекарственного средства. Пример. В моче пациента, в течение дчительного
времени подвергавшегося действию повышенных доз кадмия, ртути и свинца, были обнаруже-
ны фумарнлацстон. высокое содержание металлотионеин-кадмия и биомаркеры токсического
действия ртути. Фумарнлацстон появляется в моче при значительной инактивации глутати-
онтрансферазы Z (GSTZ1—1), которая катализирует цис-транс-изомеризаиию малеилаието-
на до фумарилаиетона соответственно. С-конечны 4 цистеиновый остаток и активный центр
полиморфного варианта глутатионтранс<1>еразы Z (hGSTZI) ковалентно связаны с фумарила-
цетоном и маленланетоном. соответственно. Фумарилацетон и малеиланетон являются суб-
стратами и инактиваторами продуктов hGSTZI и ковалентно видоизменяют активный центр и
цистеиновый остаток hGSTZI при уменьшении содержания глутатиона. Высокое содержание
токсичных металлов в организме снижает активность глутатионтрансферазы. роль коюрой в
детоксикации ксенобиотиков хорошо известна (см. гл. 3). Таким образом, выбор лекарствен-
ных препаратов для этого пациента весьма ограничен и строго индивидуален.
В связи с экологическими загрязнениями в одном из районов Японии возникла необходи-
мость в обследовании кормящих матерей. Использование КЭ-ИСП-МС позволило определить
в образцах женского грудного молока 19 металлов (в том числе Со, Си. Fe. Zn, Ni и др.) в вше
нетоксичных биокомплексов с органическими лигандами и наличие сильнейшего токсиканта —
метилртути что дало возможность предотвратить отраатенис грудных детей.
Методом КЭ-ИСП-МС были разделены металлотиопеип и ферритин, а также определены в
них уровни содержания кадмия, меди, цинка и железа в крови (Н.И Калстина и соавт., 2006.
рис. 6-135).
Методы определения токсикантов в биосредах 505
Рис 6-135. Эаскгрофоре1рамма разделения мсталлотнопсина и ферритина в образце крови (пояснение
в тексте). Буфер: 8,5 мМ тетрабората нагрия; 5 мМ фосфатного буфера; 15 мМ додецнлеу.тьфата
натрия - 15 мМ. pH 6,8. Напряжение - 15кВ. Электрокннетический ввод пробы Разлеление проводили
в кюриевом капилляре внутренним диаметром 50 мкм и длиной 100 см на оборудовании фирмы Гетто
electron corporation.
Электрофореграмма показывает разделение металлотионеина и ферритина в крови после
проведения 5 сеансов интенсивной дистанционной лучевой терапии опухоли мочевого пузыря.
При этом содержание в металлотионенне цинка и меди значительно меньшее, чем кадмия. в
ферритине — высокий уровень железа. Предел обнаружения —1010 —Ю* моль/л. В контроль-
вой группе достоверного различия в содержании кадмия, цинка и меди в металлотионенне не
наблюдали. уровень железа в ферритине соответствовал естественному содержанию. Время
миграции воспроизводимо для всех исследованных образцов. Относительное стандартное от-
клонение времени миграции за этот период не превышало 0.5%.
Приведенные примеры свидетельствуют о переходе на качественно иной уровень аналити-
ческих диагностических тестов и экспертных опенок в биомедицинских исследованиях.
Гамма-резонансная (Мессбауэровская) спектрометрия как инструмент нанотехнологий. Ме-
тод ГРС нашел широкое применение в исследовании биомолскул главным образом благодаря
счастливому совпадению двух очень важных заложенных природой обстоятельств. Первое —
это роль ai омов железа в биолшических процессах как активных центров белков и биополиме-
ров. Второе — строение ядра’Те и его роль в развитии метода ГРС. обладающего уникальной
чувствительностью и богатыми возможностями в исследовании структурных и динамических
свойств твердых тел. По сравнению с другими широко известными методами, например ЭПР
ГРС дает возможность исследовать гораздо больший набор электронных и спиновых состоя-
ний (для ЭПР это в основном состояния с нечетным спином), в том числе и диамагнитные
соединения. В отличие от рентгеноструктурного анализа, метол ГРС нс требует применения
монокристаллов и позволяет проводить исследования белка в различных состояниях — от рас-
творов ло лиофилизованных белков. При определении электронного и спинового состояний
метол ГРС позволяет разграничить несколько состояний атома Fe, в отличие от данных намаг-
ниченности. дающих усредненный результат. Таким обраюм. оказалось возможным охаракте-
ризовать электронное и спиновое состояния атомов железа и его лигандов во многих белках
при различных условиях. Электронная структура активного центра белка, ее превращения под
действием окружающих лигандов, условий среды, субстрата и т.д. играют огромную роль в
функционировании белка Метод ГРС открыл новые возможности исследования взаимосвязи
структуры и функции биомолекул на основе данных об электронной структуре комплексов
железа, входящих в белок, и нх изменениях в процессе функционирования, например желе-
506 Глава 6
зосолержаших белков с активными центрами в виде гема, железосерных кластеров и других
комплексов.
Важным преимуществом метода ГРС по сравнению с другими методами является возмож-
ность одновременной характеристики Электрою ой структуры и атомной подвижности. Под-
вижность различных фрагментов белка, вызываемая конформационными переходами в белке. —
фактор, определяющий сю функциональную активность ГРС позволяет количественно исследовать
эти движения, причем с энергетическим разрешением, шачительно превосходящим разрешение,
получаемое рентгенодинамическим анализом и другими методами исследования подвижности.
Электронные свойства атома железа в активных центрах белков необычайно разнообразны
и. что не менее важно, у травляемы. Методом ГРС установлены особенности электронного
строения гемоглобина, миоглобина, цитохрома Р450. некоторых ферредоксинов, ферритинов,
гемэритрина, белков с рядом тонких внутримолекулярных взаимодействий — нитритрсдукта-
зы. сульфитредуктазы, некоторых цитохромов типа с, ферредоксинов с кластерным активным
центром, различных бактсриофсрритинов и др.
Методом ГРС определены конформационные перестройки гемо- и миоглобинов при изме-
нении электронного состояния Ге1* в геме после присоединения 6-го аксиального лиганда —
молекулы О, (см. гл. 8.3).
Можно ли наблюдать конформационные изменения в глобуле белка при неизменном ли-
гандном составе и электронном состоянии атома железа и как влияет конформационная пере-
стройка глобулы на электронную структуру активного центра? Ответы па эти вопросы очень
важны для обсуждения механизмов токсичности, взаимосвязи структура токсиканта—репептор
и объяснения нарушений мспиьтолитандного гомеостаза при патологии (см. гл. 2.3.3 и 8.5).
Низкочастотные конформационные изменения глобулы с частотами, менее К)7 с 1 прослежива-
ются по изменению электронной структуры и спинового состояния железа в активном центре
белка. Перестройки глобулы могут быть вызваны изменением влажности, вязкости. pH среды
влиянием внешних для молекул белка анионов, взаимодействием с субстратом и т.д. При этом
если в активном центре белка находится один атом железа, как. например, в геме, то при неиз-
менном зарядовом состоянии изменяются симметрия и граднетп электрического поля на ялре
или спиновое состояние. Если же в активном центре содержится два и более атомов железа, как
в жслезосерных кластерах, то эти взаимодействия приводят к возникновению неэквивалентных
положений этих атомов. Более высокочастотные конформационные изменения с частотами
более 10’ с'1 сопровождаются изменением вероятности эффекта Мессбауэра. Эти движения,
согласно танным гамма-рсзонансных спектров, характеризуются определенной иерархией.
Так. частоты 10 с* — 10" ст* соответствуют движениям фрагментов белка типа ограниченной
диффузии с масштабом -1 А*, частоты 10s с1— 10*. с — движениям фрагментов с масштабом
-0,3 А°, частоты 10’ с’ — 10; с 1 и более — атомным конформационным движениям Кроме
атомного и фрагментарного внутримолекулярных движений, большой интерес представляют
различного ро та эффекты спиновой релаксации и электронного обмена между железосодер-
жащими центрами. Эти эффекты дают уникальную информацию о взаимодействии различных
комплексов железа (межкластерные взаимодействия) внутри молекулы белка или электрон-
ном обмене между атомами железа, входящими в один и тот же комплекс (внутрикластерное
взаимодействие), например в железосерных кластерах. Для Ni-Fe-гидрогеназы расшифрована
структура железосодержащих не ттров в виде определенных кластеров и никелевого центра
Обнаружено обменное взаимодействие между Fe1* и Си-’* в цитохроме а}. Изучены состояние
(в разные периоды гола) ядра ферритина печени людей и животных, страдающих избытком
железа, структура активного центра корринового белка Clostridium thermoceiicum. включающего
кобаламин (порфирин с Со), метаболизм Fe-копрогспа в грибе Neurospora crassa. Таким обра
зом. электронное состояние атомов железа в активном центре белка, во многом определяющее
его функциональные свойства, может быть изменено за счег не только изменения лигандного
состава или зарядового состояния, что очевидно, но и незначительных конформационных пе-
рестроек глобулы. Эго даст иные подходы к изучению механизма действия белковых молекул,
ферментативной активности и тл.. открывает новые пути управления функционированием
бел ков.
Динамика биосистсм эффективно исследуется методом ГРС. что позволило получить ко-
личественные данные об амплитудах и частотах (временах корреляции) движений атомов, ус-
Методы определения токсикантов в биосредах 507
редненных но всей молекуле белка, которая при этом может и не содержать атомы железа или
какие-либо другие мессбауэровские атомы (т.е. атомы, содержащие мессбауэровские ядра).
К настоящему времени с помощью ГРС получено большое количество данных о биомолекулах,
главным образом о белках. Изучены ряд гемовых белков, белки нсгсмовой природы, входящие,
например, в фотосинтетические центры, железосерные, желсзотранспортные и железонакопн-
тельные белки. Для гемовых и серосодержащих белков удалось исследовать многие тонкости
хтсктронного и спинового превращений железа в двух- и трехвалентном состоянии
Метод молекулярной динамики (например, изучение динамических свойств пептидов) на-
ряду с компьютерной молекулярной графикой оказался чрезвычайно полезным при поиске
новых лекарственных препаратов и физиологически активных соединений. Это направление
получило название «молекулярным дизайн». Даже предваригельная информация о возможных
способах посадки молекулы предполагаемого лекарственного вещества на соответствующий
рецепторный участок позволяет резко сократить расходы на создание новых препаратов. Мо-
лекулярная динамикл биополимеров находится на стыке двух наиболее быстро развивающихся
в настоящее время областей науки — физико-химической биологии и информатики (более
точным является термин «computer science»). Метол ГРС является одним из инструментов
физико-химической биологии и медицины. Параметры метола (изомерный сдвиг, квалруполь-
ное расщепление, интенсивность) с высокой чувствительностью отражают конформационные
изменения в молекулах сложных биолошческих структур, свя тайных с металлами координа-
ционными связями. Так. биокомлексы железа, кобальта, никеля, меди, цинка с N-гликозилн-
рованными производными адамантана, метронидазола, нитрофурана. сульфаниламидов (за-
патентованы в РФ. Н.И. Калсгина с соавг., 1998) в зависимости от стсричсских особенностей
комплекса и состояния центрального атома изменяют свою токсичность и влияние на апоптоз
клетки (см. гл. 3 и 8 5). Изменения электронного состояния атомов железа и кобдтьта зависят
от ближайшего окружения (строения лигандов) в условиях in vivo и vitro. Параметры гамма-
резонансных спектров синтезированных комплексов железа характерны для октаэдрических
высокосниновых комплексов Fe (11) и Fe (111) Большая величина квалрупольного расщепле-
ния октаэдрического высокоспинового комплекса Fe(lll) указывает на резко асимметричную
структуру центрального узла. Комплекс Fe (111) образует искаженную (вытянутую) структуру
октаэдра. При изучении токсичности полученных комплексов было установлено, что наименее
искаженная структура октаэдрического высокоспинового комплекса Fe (11) имеет значительно
меньшую острую токсичность и обладает бакзериостическим эффектом. Плоский комплекс Fe
(III) оказывает бактерицидное действие. Комплекс Fc (III) с производным адамантана. в отли-
чие от адамантанового комплекса Fe (II) и свободного лиганда, вызывал деградацию ДНК ядер
гепатоцитов: образование крупных (фрагментов ДНК. содержащих 700. 200—250. 50—70 тыс.
пар оснований, конденсацию хроматина и выпячивание ялерной мембраны, характерные для
апоптоза, что было подтверждено гистологически и методом электрофореза ДНК. апоптоти >ес
ких клеток. При понижении температуры измерений было обнаружено, что гамма-резонансные
спектры некоторых образцов имеют магнитную сверхтонкую структуру Наличие внутренних
магнитных полей на ядрах, проявляющееся в магиипюй сверхтонкой структуре гамма-резо-
нансных спектров, связано с особенностями электронной структуры комплексных соедине-
ний. Внутренние поля на ядрах возникают в случае парамагнитных комплексов (в комплексах
параматннгным центром обычно является металл) за счет матитпото момент электронной
оболочки. Продукты взаимодействия Со (II) и Fe (III) с некоторыми биолигандами ядтяются
клатратами, т.е. неорганическими полимерными структурами, в которые включены биолигап-
ды. удерживаемые силами межмолскулярного взаимодействия. Гамма-резонансные спектры
изученных образцов представляли собой дублеты с двхмя системами магнитной сверхтонкой
структуры в рахтичном соотношении по интенсивности. Токсичность клатратов, в отличие от
комг лексов тех же металлов, не изменялась по сравнению с таковой исходных лигандов, что
подтвердили данные электронной микроскопии гистологических образцов.
Использование информации, полученной методом ГРС и компьютерных программ проек-
тирования и конструирования молекулярных устройств с заданными функциями, способствует
внедрению нанотехнологий 1акнс устройства могут быть как биоло! ической природы напри-
мер молекулярные «моторы», обеспечивающие важнейшие клеточные функции, так и моле-
кулярные устройства небиологической, синтетической, природы, используемые при изучении
508 Глава 6
протеома. Любом белковый продукт одного только гена может существовать в многообразных
формах. Динамичная модификация белков — это контрольный механизм биот этических сис-
тем. Различные эндогенные видоизменения и экзогенные факторы регулируют многие белко-
вые функции, их взаимодействия и превращения. Лекарства и токсиканты метаболизируются в
активные электрофилы, которые являются причинами модификаций ДНК (см.гя.З и 4). Про-
тсомные исследования показали значительную разницу между концентрацией редко встреча-
ющихся и постоянно присутствующих в клетке белков. Более того, измененные формы белка
и/или посттранслятанионно модифицированные структуры белков, часто представлены сте-
хиомс1ричсски в меньшем количестве но сравнению с неизмененными формами Эти факторы
ограничили степень информативности двухмерного гелевого электрофореза и привели иссле-
дователей к применению shoigun-анализ (метод случайности) протсомных стратегий для опре-
деления белковых модификаций в низких концентрациях В shotgun-анализе белковые смеси
гидролизуют протеолитическими ферментами (обычно без предшествующего фракциониро-
вания). затем полученные пептидные смеси подвер! аются хроматографическому разделению
и измерению методом ВЭЖХ-МС-МС. Использование многомерной технологии идентифи-
кации белков с помощью МС-МС и специальных алгоритмов и компьютерных программ де-
лает возможным быстро идетпнфицировать белок из всего спектра анализируемых протеинов.
Однако такие исследования не отвечают па вопрос о механизмах возникновения модификаций
белков с учетом генетических особенностей конкретного человека. В ряде случаев применение
метода ГРС позволило ответить на подобные вопросы и провести картирование определенных
модификаций, которые могут быть легко предсказаны и иметь значение для специфических
аналитических целей токсикологии. Например, гемоглобиновые аддукты, образованные пол
действием эпоксидов стирена этилена и бутадиена. часто являются следствием неблагопри-
ятных экологических условий жизни, а также курения. Для определения алифатических эпок-
сидных аддуктов гемоглобина (НЬ) человека использовали методы ВЭЖХ-МС-МС и ГРС. НЬ
инкубировали со стиреноксидом. этиленоксидом и буталиендиоксидом (в различных концен-
трациях) до образования аддуктов, расщепляющихся трипсином, и анализируемых с помощью
ВЭЖХ-МС/МС на приборе Thermol nnigan LCQ с ионной ловушкой Были получены спектры
подлинных и модифицированных пептидов НЬ. Исследования гамма-рсзонапсных спектров
подлинного и модифицированною НЬ как структуры макроцикла, содержащею железо, поз-
волило установить конформационные и дручие структурные особенности модифицированного
НЬ. Воздействию токсикантов подверглись N-коннсвые ватины обеих испей а-НЬ и 0-НЬ. а
также Glu7. Cys93. His77. 97. 143 0-цспи и His45 а-исни. На рис. 6-136 представлена селектив-
ная последовательность изменения НЬ сптрсноксидом. Слева показаны гистидин, цистеин и
N-коииевой валин в НЬ. в центре и справа — состояние НЬ под действием стиреноксида при
меньшей и большей концентрациях соответственно. По-видимому, алкилирование прояатяет
значительную селективность даже среди нуклеофилов, которые должны были бы все иметь
стерическую доступность для электрофилов.
Рис. 6-136 Селективная последовательность изменения НЬ под действием стиреноксида. Пояснение в
тексте.
Методы определения токсикантов в биосредах 509
Такой же прием был использован для он ре 1еления механизмов опосредованного д йствия
шпидных оксидантов на миоглобин мыши, что является важным этапом трансформации ок-
си миоглобина в метмиоглобин.
Результаты исследований динамических свойств белков методом ГРС были использованы
при разработке пептидпысх аптамеров (peptide aptamers). Пептидные аптамеры — вид белков,
способных связываться с тонкопленочными транзисторами и определять наличие в крови па-
циента других белков, учитывая их стсрсоэлектронпое окружение
Метол ГРС был использован для установления пространственной структуры гликопротеи-
нов и многочисленных конформаций углеводов. N-гликозидов и нуклеотидов как важнейших
продуктов жизнедеятельности клеток.
Ешс один аспект использования возможностей метода ГРС — начежный и экспрессный кон-
троль качества железосодержащих лекарственных средств, учитывая что при хранении Ге (11)
способно относительно легко окисляться в Fe (III) и оказывать токсическое действие in vivo.
Мессбауэровские спектры растворов железосодержащих лекарственных препаратов выявля-
ют наличие ионов Fe (II) с параметрами: изомерный сдвиг Д = 1.49 ± 0.03 мм/с. квадрупольное
растепление Д Е = 3.10 ± 0.10 мм/с. а также загрязняющих ионов Fe(III): средние значения
Д = 0.66 мм/с. Д Е = 0 60 мм/с. Сравнение площадей спектров Fe (II) и Fe (111) является ос-
новой количественного определения. Для широкою практического применения этого неразру-
шаюшего экспрессного и надежного метода в фармации целесообразно использовать отечест-
венные гамма-резонансные спектрометры (см. электронное приложение)
Экологическая обстановка обусловливает необходимость изучения элементного состава
природных объектов в системе человек — окружающая среда в различных биогеохимичес-
ких провинциях. Например, лекарственные растения — важнейшие объекты экологического
мониторинга железа. Среди ботее 100 исследованных видов лекарственных растений желе-
зо содержится в большинстве из них и является элементом, способным к активному комп-
лексообразованию. Железо может присутствовать в лекарственном сырье в виде различных
комплексов с углево ами, алкалоидами, полифенолами и другими биоструктурами. Однако
значительная часть железа может находиться и в виде неорганических солей, проявляющих
негативное действие на жиной организм (см. гл. 8.5). Большое распространение и биогеохи-
мическая активность железа позволяют рассматривать сто в качестве гигиенического критерия
состояния окружающей среды. При распределении в биос<|>срс максимальное количество же-
леза попадает в почву, где происходит трансформация исходных форм. Железо, поглощенное
растениями, передается по трофическим цепям. Степень его утилизации определяется кон-
центрацией и структурой железосодержащих соединений, что может служить биоиндикатором
при проведении мониторинга за состоянием окружающей среды. Достоверным является факт
преимущественного поступления железа в растения (при корневом питании с возможностью
сильного захвата элемента листьями) в виде ионной формы или транспорта через мембраны в
кле комплексов с вешествами-переносчиками — сидерофорами. Методом ГРС были получе-
ны надежные сведения о структуре и трансформации железоорганических комплексов в почве
«комплексов железа с гуминовыми и фульвокислотами).
6.4.4. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса.
Применение комбинированных систем ВЭЖХ-ЯМР
и ВЭЖХ-ЯМР-МС в метаболомике и метабономике
ком ьютсры бесполезны.
Все. что они могут нам дать,
это ответы на наши вопросы».
П Пикассо
Информационная эффективность метода ЯМР составляет тысячи бит. Определение любо-
го токсиканта — систематический процесс, включающий последовательное продвижение от
ыенее специфичных к более специфичным методам. Не существует такого метода, который
служил бы тестом для всех образцов везде и всегда. Выбор конкретного метода анализа опре-
510 Глава 6
делястся многими факторами (см. гл. 5). Спектрометрия ЯМР относится к наиболее специ-
фичным методам. Однако всегда возможны ложноположизс ьные и ложноотрицательные ре-
зультаты. С лрутой стороны, чем больше проводится тестов, тем меньше вероятность ошибки
«Может ли спектральный анализ быть „правдивым14? Физические процессы, сопровождающие
возбуждение спекзра и его регистрацию, происходят в мире, зле нет такою понятия... Толь-
ко математическая статистика — гарант ..правдивости", знак качества результата анализа». —
написал К. Дсрффель в своей знаменитой книге «Статистика в аналитической химии».
Спектрометрия ЯМР (NMR) дает возможность получить детальную информацию на атом-
ном уровне в сочетании с пониманием свойств целых молекул. Метод ЯМР-спектрометрии
является одним из самых мощных инструментальных методов, доступных химико-токсиколо-
гической лаборатории. Метод служит для молекулярной идентификации, оценки деталей мо-
лекулярной структуры, установления конформаций и исследования молекулярной динамики.
Большинство ЯМР спектрометрических исследований было выполнено для идентификации
аруктуры онюситсльно небольших химических молекул, например углеводов. ЯМР высокого
разрешения позволяет охарактеризовать индивидуальные компоненты в химических смесях и
биосредах. Этим методом можно определять трехмерные структуры белков, исследовать слож-
ные биологические ма!рицы (например, биолшические жидкосги), идентифицировать поли-
морфные соединения (твердофазная методика). Принципы и технология ЯМР лежат в основе
широко доступного теперь метода клинической диагностики.
Способность ядер некоторых атомов, имеющих магнитный момент, поглощать электромаг-
нитное излучение, когда они находятся во внешнем магнитном поле, лежит в основе ЯМР
Этот инструментальный метод позвозясг онрсдс.ягь парамагнитные атомы (примером могут
служить Н. UC, l4N. г0.3,Р, “В, WF). Теория ЯМР спектрометрии подробно описана во многих
учебниках, монографиях и обзорах.
Информативная ценность спектрометрии ЯМР 'Н базируется на том. «гго протон в зависи-
мости от электронного окружения поглощает излучение различных частот, так как в разной
степени экранируется магнитными волями электронов в ядер. Смещение резонансной частоты
поглощения под влиянием электронного окружения называется химическим сдвигом, который
измеряют в безразмерных миллионных долях (м. д ) относительно выбра того сташтарта
тетраметилсилана [(CH.)4SiJ (ТМС). Химический сдвиг ядер 'Н принят равным нулю. Ядра ато-
мов. представляющие интерес в токсикологических исследованиях, представлены в табл. 6-58.
Обычные изотопы углерода и кислорода. >2С и КО. не имеют магнитных момешов (магнитны-
ми свойствами обладают ядра, в которых сумма протонов и нейтронов равна нечетному числу)
и не дают ЯМР-спектры. Ядро 'Н. или протон, имеет самую высокую относительную чувстви-
тельность (после радиоактивного изотона трития 3Н). Изотоп |3С полезен для характеристики
углеродного скелета органических молекул. Естественное содержание ,JC составляет прибли-
зительно 1,1%. поэтому шанс обнаружения двух ядер |}С в одной молекуле равен приблизи-
тельно 0,01%, что значительно упрощает интерпретацию спектров. Поэтому в большинстве
случаев ЯМР фокусируется на 'Н и °C. Ядро **F почти столь же чувствительно, как ядро Н
(приблизительно 83%). ЯМР ‘Т спектрометрия используется в изучении метаболизма фтор-
солержащих соединений. Ядра rN и ”Р важны для определения структуры белка после его
обогащения изотопами и как средство при исследовании различных фосфорилированных мо-
лекул, включая изучение метаболических процессов in vivo. ЯМР Н, как и ЯМР 'Н (ПМР).
используется в метаболомнчсских и мстабономичсских исследованиях, анализе жидких крис-
таллов. ЯМР ISN — в химии гетероциклов и ЯМР nNa — при изучении процессов, связанных
с внутри- и внеклеточными ионами натрия. Другие ядра, такие как ’’Si, "*Sn. ’’’Хе, ”'Pt и
l9,Hg, также находят применение в области судебной химии, криминалистики, биоэлсмснто-
логии и экологии.
Таблица 6-58. Характеристика ядер атомов, представляющих интерес лля ХТА
Ядра Спиновое число Естественное содержанке. % ЯМР частота, МГн Сравнительная чувствительность
'-С 0 98/99 — —
“О 0 >99 — —
н 1/2 99.98 600.00 1.00
Методы определения токсикантов в био:редах 511
Окончание табл. 6-58
н I/2 0.06 39.98 1.21
"С 1/2 I.II 150.86 1.59-10-2
rN 1/2 0.37 60 80 1,04-10 ’
’I 1/2 100,0 564.46 8.30-10-'
«Si 1/2 4.7 119,19 7,84 10-’
лр 1/2 100,0 242.88 6.63-io-2
2Н 1 0.015 92.10 9,65-10 •
i«N 1 99.6 343.34 1.01 io-1
2 Na -V2 100.0 158.71 9.25-IO"2
’Cl 3/2 75.5 1 11 358,79 4,70-10-’
r’o 5/2 0.037 81.34 2.911012.
Каждый сигнал в спектре ЯМР 'Н (ПМР) характеризуется тремя параметрами: величиной
химического сдвига, интенсивностью и величиной константы спин-спинового взаимодейс-
твия. Резонансные линии каждого ядра могут быть расщеплены из-за спин-спинового взаимо-
действия. которое обозначается символом J. измеряется в герцах и не зависит от наблюдаемой
частоты. Константа спин-спинового взаимодействия J характеризует расстояние между рас-
щепленными линиями и является важнейшим параметром ЯМР-спектра. Существуют специ-
альные таблицы данных со значениями химических сдвигов и различных спин-спиновых рас-
щеплений, которые используют при интерпретации спектров. Мультиплетность — это число
сигналов, обусловленных спин-спиновым взаимодействием, которая зависит от числа прото-
нов п у соседних атомов и определяется по формуле М = п + I
В ЯМР *Н (ПМР) магнитное поле заставляет атомы водорода в молекуле ориентироваться
в определенном направлении. Для получения спектра с высокой разрешающей способностью
создаваемое магнитом поле должно быть гомогенным по всей поверхности образна в датчике.
При этом резонансные частоты для всех протонов в молекуле будут разными, так как зависят
от молекулярного окружения ядра. Взаимосвязь между резонансными частотами и молеку-
лярным окружением дает возможность судить о структуре анализируемого вешества. Спектр
ЯМР прослеживается на двухмерной координатной оси х/у. Оценивая прогонный спектр ЯМР.
можно определить площадь под каждым пиком, которая» указывает число ядер, совершающих
переход, и число имеющихся протонов, т.е. возможен количественный анализ
ЯМР РС дает возможность определить число атомов углерода и их относительное располо-
жение в молекуле ”С является изотопом более распространенного 1гС. Для судебно-химичес-
кого анализа и мстабонических исследований (см. гл. 3 и ниже) используются дополнительные
модификации ЯМР. Для детального анализа соединений в биологических жидкостях приме-
няется двухмерная (2D) ЯМР-спектрометрия. которая предоставляет корреляционную инфор-
мацию. показывающую взаимосвязи резонансов ядер различных атомов в молекуле. Анализ
данных 2D отвечает на вопросы: соответствуют ли резонансные пики протонам отдельной или
разных молекул; расположены ли протоны близко друг к другу в молекулах; расположены ли
протоны близко друг к другу в пространстве; можно ли соотнести конкретный резонанс или
мультиплет резонансов к конкретному протону в соединении.
Существует много разных вариантов 2D ЯМР-анализа. и полученные результаты зависят от
того, каким из них был проведен анализ. Одним из наиболее распространенных 2D ЯМР-ме-
тодов является корреляционная спектроскопия (Correlated SpcctroscopY — COSY), с помощью
которой получаются перекрестные пики для двух ядер. Например, кросс-пики показывают, что
два протона находятся в одной и той же молекуле. Эта информация дополняет данные, полу-
чаемые в варианте ID ЯМР-спсктрометрии.
Другим распространенным видом 2D ЯМР-методов является ялерный эффект Оверхаузс-
ра (Nuclear Ovcrhauser Effect Spectroscopy — NOESY). В этом случае интенсивности кросс-
пиков больше зависят от расстояния между парой взаимодействующих ядер в пространстве,
чем от структуры молекул. Поэтому метод NOESY применяется в основном для определения
отдельных протонов или метильных групп. Метод NOESY дает информацию о конформации
512 Глава 6
молекулы и является ключевым элементом ври определении структуры молекулы, например
структуры белков в растворах.
Третий тип 2D ЯМР-методов связан с разными видами ядер, например, резонанс ,!С с ре-
зонансом 'Н Чаше применяется вариант этого метода — HSQC (Heteronuclear Single-Quantum
Coherence), который коррелирует спектр 'Н со спектром ”С.
Итак, корреляционная спектрометрия (COSY) измеряет взаимодействие протон-протон
(41—'Н). а спектрометрия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) — взаимодействие прото-
нов. которые находятся близко друг к другу, но не обязательно на соседних атомах Получен-
ные ci ектры COSY. NOESY и HSQC более труднь для интерпретации и требуки специальных
знаний, однако значительно информативнее метода 1D ЯМР.
Метод ЯМР, обеспечивающий возможность определять трехмерную ориентацию некоторых
индивидуальных атомов молекулы, позволяет непосредственно установить структурные изоме-
ры. Однако степень такого рода информации обычно требуется в тех случаях, когда никакую
другую информацию нельзя получить с использованием других инструментальных методов или
когда нет основного аналитического стандарта для подтверждения присутствия определяемою
вещества. Например, два энантиомера дают идентичные ЯМР-спсктры в нехиральном раство-
рителе С помощью хирального парамагнитного реактива или хирального растворителя можно
идентифицировать энантиомеры.
В судебно-химическом и криминалистическом анализе наркотиков ЯМР — один из арбит
ражных методов, с помощью которого можно получить уникальную информацию о структуре
неизвестного всшествп или ею идентифицировать, установить различия между основной и
солевой формой анализа.
Я М Р-спектрометрия применяется главным образом для идентификации молекулярной
структуры очищенных веществ Для химических образцов органической природы обычно ис-
пользуется разбавленный раствор в полностью дейтерированном растворителе: хлороформ d.
димстилсульфоксид-d. днмстилформамид-d, никлогсксан-d или анетон-d.
Наиболее значимое отличие между исследованиями биологических жидкостей и исследо-
ваниями смесей органических соединении в химических реакциях является присутствие воды,
содержащей протоны. Кроме того, в биологических жидкостях даже основные метаболиты
обычно находятся в миллимолярных концентрациях, поэтому при анализе таких объектов важ-
но подавить резонанс воды и использовать чувствитстьныи спектрометр. Существует много
способов для подавления резонанса воды или других растворителей, содержа них протоны.
Один из них заключается в следующем. Биологические образны, которые в значительной сте-
пени включают Н О, лиофилизируют с последующим добавлением D О. однако такой подх д
может привести ^значительным потерям аналита. Поэтому вначале к образцу добавляют не-
большое количество D О и затем подавляют резонанс воды. Несмотря на то что лиофили-
зироваиис и растворение образ юв в D.O занимают много времени, они могут существенно
улучшить предел обнаружения и представить более полные данные о метаболитах, имеющих
близкие к воде резонансные пики.
Некоторые физические характеристики биологических жидкостей (вязкость образцов, со-
держание белков, солей, жиров) влияют на вил ЯМР-спектров. Высокая вязкость растворов,
присутствие белков и жиров, химические взаимодействия с образованием макромолекул могут
привести к расширению резонансных линий, затрудняющих количественный анализ. Адек-
ватная пробоподготовка исследуемых образцов перед снятием ЯМР спектров кардинальным
образом влияет на их качество и в конечном счете на информативность метода При исследо-
вании биолошческих жидкостей хорошие результаты получают, если используют ТФЭ или не-
посредственное присоединение Я М Р-спсктромстра к системе ВЭЖХ. Современные мето тики
позволяют нивелировать подобные трудности для мно1их образцов.
Сравнительные анализы биологических жидкостей, которые обычно являются задачей ме
табономикн (см. гл. 3 и ниже), требуют постоянства значений pH среды Особенно это важно
для образцов мочи, так как ее pH может широко варьировать, но и для других типов образцов
колебания pH могут значительно влиять на резонансные пики. При интоксикации отмечают
значительные изменения pH биосред, особенно мочи, из-за нарушений механизмов регуляции
pH. Для подавления изменений pH в образце добавляют высококонцентрированные буферы,
нс содержащие протонов, такие как нагрия фосфаз. Биологические образцы обычно содержат
Методы определения токсикантов в биосредах 513
высокие концентрации солей, что снижает чувствительность метода ЯМР. поэтому, как пра-
вило, для стандартизации уровня pH добавляют 300—400 ммоль фосфатною буфера. Однако
образцы, содержащие высокие концентрации фосфатов и органических соединений. представ-
ляют собой идеальные условия лля роста бактерий, в связи с этим добавляют еше и антибакте-
риальные средства. Обычно используют апротонные вещества. например натрия азид
Почти все современные спектрометры, применяемые для установления химических струк-
тур. основаны на суперпроводимости магнита с операпионнс и частотой (для 'Н наблюдений) в
диапазоне от 200 то 900 МГц. Разрешение и обнаружение улучшаются с увеличением силы маг-
нитного поля. Наиболее распространены частоты 200. 250. 270 и 300 МГн. Начиная с 2003 г.,
все больше лаборатории используют ЯМР-спекгромстрию с частотой 400 —600 МГц. Более
высокие частоты наблюдения (700, 750. 800 и 900 МГн) применяются в специализированных
исследованиях, главным образом при определении структуры белка и других биополимеров.
Сочетание математического алгоритма Фурье-преобразования с ЯМР-снектромстрией (см.
6.4.2.) дало возможность использовать двухмерную и даже трехмерную ЯМР-спектрометрию.
что улучшило чувствительность метода, сократило время анализа, позволило коррелировать
химические сдвиги '-’CJ’N пли Р и 'Н.
ЯМР-сиектромстры, очень дорогостоящие приборы, генерируют сильное магнитное поле,
которое способно, например, разрушить зашифроцтиныс данные кредитной карточки. Для
интерпретации получаемых данных требуются специалисты высокой квыификании.
Главным компонентом ЯМР-спектрометра является сверхпроводнмый магнит сильного
поля Образен растворяется в дейтерированном ртстворе и затем поступает в длинную цилип
дричсскую стеклянную трубку, обычно имеющую диаметр 5 мм. Трубка помешается в датчик
ЯМР. находящийся вблизи от центра магнитного поля.
Обнаружение и иленизфикания малых количеств аналита в очень сложной биологической
матрице со многими потенциальными взаимосвязанными переменными являются трудной за-
дачей Н ЯМР-спекгромегрия высоко! з разрешения позволяет решить подобную задачу.
Начиная с 2002 г., активно развивается метабономика — новая технология количественного
измерения динамического мулыипараметрическою метаболического ответа живых систем при
патофизиоло!нческих или генетических изменениях (см. гл. 3). Изучение динамического и
зависимого от времени профиля метаболитов in vivo уже сегодня приносит полезную инфор-
мацию. Токсические эффекты. генетчсские и соматические заболевания могут проявляться
нарушением синтеза некоторых белков, однако в конечном счете происходит изменение уп-
равления биохимическими процессами, что отражается на соотношении концентраций многих
эндогенных вешсств в потоках биологических жидкостей. Нарушение динамического равнове-
сия в биологических жидкостях организма, вызванное заболеванием или интоксикацией, из-
меняет их качественный и/или количественный состав. Для установления факш происходящих
изменений необходимо в ила ме крови, моче или желчи определить одновременно множество
метаболитов в широком диапазоне концентраций. При этом используют образны как посте
типовой пробоподготовки. так и без предварительного выделения.
Каждая биологическая жидкость, анализируемая метолом 41 ЯМР-снектромсгрин с час-
тотой 800 МГн. имеет свой характерный спектр (отпечаток пальца), что делает возможным
идентифицировать нарушение метаболических профилей не только в крови или моче, но и и
извлечениях из ткани и клеточных суспензиях. С этой целью используют специальные ком-
пьютерные программы для пре ведения анализа основных компонентов (АОК) и классифици-
руют образцы согласно их ЯМР спектральным профилям. В настоящее время эффективный
способ извлекать значащую мет тбономическую информацию состоит в комбинировании ЯМР-
спсктромстрии высокого разрешения определяемой биоло! нческой жидкости с мультивариан-
тными методами статистики. Основные компоненты (ОК) — новые переменные, созданные
от линейных комбинаций стартовых спектральных данных так, что каждый последующий ОК
имеет определенное отличие от предыдущего, причем, первый ОК в сравнении с другими
имеет разницу в наборе данных в наибо; ыип степени. У 1асток первых двух или трех ОК
дает лучшее представление о разновидности набора данных в двух или ipex измерениях Та-
ким образом, создаются карты ОК . которые могут визуально отразить повеление образцов
под влиянием любого ксенобиотика. «Рисунок» ЯМР-снектра биологической жидкости или
обраща ткани определен ею метаболическим профилем. Это достаточно простой подход для
514 Глава 6
научных исследований. Однако в условиях прочеканил биохимических процессов in vivo вес
значительно сложнее, поскольку эффекты. вызванные геншичсской молиф! камней, болезнью,
пищей, образом жизни, действием введенного препарата, развиваются в режиме реального
времени Для решения подобных многофакторных задач разработаны (и активно разрабатыва-
ются) автоматические методы классификации метабоно.мичсских данных, на основе которо!
строится математическая модель, предсказывающая правильный выбор класса для каждого
образца. Расчетные данные сравнивают с экспериментально полученным ЯМР-метаболичсс-
ким профилем. Методика позволяет количественно описать статистические границы, которые
характеризуют каждый класс образца в терминах их метаболических профилей, и отличить
образцы, которые нс принадлежат пи к одному из классов. Образен может принадлежать как
единственному классу, так и многим классам. Построив исчерпывающий ряд моделей, мож-
но пре усмотреть классификацию для широкого диапазона биообъектов. В настоящее время
благодаря возможностям такого подхода установлены биомаркеры токсических повреждении,
вызванных рядом ксенобиотиков. генс1ических повреждений, нежелательных побочных эф-
фектов лекарственных препаратов и пестицидов, а также фенотипов (\етабот инов), сформи-
рованных в результате взаимодействия генотипов с внешней средой.
Как уже о|мсча.тось. метаболическое профилирование непосредственно не связано с изуче-
нием метаболизма ксенобиотиков (см гл. 3). Однако метаболические исследования применя-
лись и для объяснения влияния первичных и вторичных продуктов метаболизма ксенобиоти-
ков на человека. Например, при ЯМР-исслсдовании мочи и плазмы крови были обнаружены
метаболиты, образование которых связано с токсическим действием хлорида ргути, 1идразина
и рада антибиотиков (см. ниже).
С помощью ЯМР-анолиза были расшифрованы и уточнены многие метаболические про-
цессы — от биосинтезе коферментов в микробах и регуляции метаболизма глюкозы у млеко-
питающих до реакций переноса метильной группы в структуре метаболита при токсических
поражениях печени (рис. 6-137).
Следует отметить, что ни одним из инструментальных методов исследования нельзя полно-
стью показать всю сложность структуры метаболома у прокариот или эукариот. Это зависит от
генетической изменчивости, тканевого и клеточного разнообразия, качества питания и огром-
ного числа разнообразных молекул, которые включает в себя метаболом. Аналитики всегда за-
нимались специфическими исследованиями индивидуальных видов (например, гистамин или
АТФ) или классов молекул (например, аминокислоты или нуклеотиды), однако цель метабоно-
мики состоит в становлении полного набора малых молекул, присутствующих в биологической
жидкости. В конце 2002 г. в базе данных КЕГГ (KEGG. см.гл.1. www.genome.ad.jp/kegg/) на-
считывалось более 10 000 соединений ХООО из которых имели молекулярную массу 30—1500 Д
Многие соединения молекулярной массой 1000—1500 Д являются пептидами и конъюгат-
ми кофермента А. Среди соединений молекулярной массой менее 1500 1 большинство нахо-
дятся в интервале 100—600 Д. К тому же многие макромолекулярные структуры (например,
мембраны) состоят из плотно, но динамично связанных небольших молекул. Поэтому задача
аналитика состоит в том. чтобы доступными методами определить качественные изменения
метаболи юв. различающихся молекулярной массой, поляризацией, зарядом, устойчивостью.
Еще одна сложность состоит в неравномерном распределении метаболитов различных вешеств
(например, глюкозы иди стероидных гормонов) в биологических жидкостях и тканях. Поэтому
р стет популярность комбинированного метода ВЭЖХ-ЯМР при идентификации компонентов
биожидкосте з. Миниатюризация аппаратуры и возможности измерения пикомолярных коли-
честв образца привлекают в настоящее время большое внимание. Уже с шествуют экспери-
ментальные системы ВЭЖХ-ЯМР, соединенные с Фурье-преобразователем. И К- и масс-спек-
тромстрометрами. В будущем такие системы дадут возможное™ анализировать смеси лобавок
полимера или идентифицировать in vivo неизвестные компоненты, не изолируя нх в индиви-
дуальном виде.
Определение компонентов в сложных биоматрицах проводят в объединенных аналитичес-
ких системах ВЭЖХ-ЯМР-МС, что дает возможность быстрой полной и надежной молекуляр-
ной идентификации. Схема ВЭЖХ-ЯМР-МС приведена на рис. 6-138.
Длина и направление капиллярных трубок к этим спектрометрам могут быть отрегули-
рованы так. чтобы и и ЯМР-спектрометр. или масс-спектрометр сначала обнаружил элюат
Методы определения токсикантов в биосредах 515
Г...I...I...-г............т
Рис. 6-137. 800 МГц 'Н ЯМР-спсктры типичного образна мочи человека. Последовательные горизон-
тальные и вертикальные расширения спектра иллюстрируют сложность биохимического профиля. Вер-
тикальная стрелка указывает на незначительный пик от аксиальной метильной группы желчной кислоты.
Методом 'Н ЯМР-спсктромстрии можно обнаружить очень тонкие изменения в минорных метаболитах
।Clark's Analysis of Drugs and Poisons. London. 2004).
Например, масс-спектрометр может помешать первоначальной идентификации ”F ЯМР-cih
нала, идущего от определяемого образна. Поэтому Я МР-спектрометр размешают перед масс-
спектрометром.
В настоящее время существует несколько методик, позволяющих использовать системы
ВЭЖХ-ЯМР. Самая простая из них — обнаружение вешеств но Я МР-спектрам в режиме ре-
ального времени как непрерывного потока хроматографических пиков элюата. Однако практи-
чески для обнаружения используются только 'Н или ”F ЯМР-спсктромстры.
Другой распространенный подход — сохранение частей элюата в капиллярных петлях лля
более позднего автономного изучения ЯМР-спсктра (выбор пика). Кроме того, поток может
быть приостановлен в коротких интервалах времени при пропускании его через ячейку ЯМР
(«разрезание» времени) аналогично использованию диодного множества УФ-латчпка (см.
гл 6 4.2.1). Такая методика позволяет получить спектры от различных частей пика. «Разре-
зание» времени наиболее полезно, если разделение происходит недостаточно и трудно опре-
делить времена удерживания В современных приборах возможен полностью автоматизиро-
516 Глава 6
Рис 6-138. Схема обору онанпя ,ыя ВЭЖХ-ЯМР МС-иселсдования.
Толстые линии — движение потока; тонкие пинии — злек ровный контроль и сигналы данных
ванный анализ при контроле программного обеспечения. Автоматизированный анализ может
быть приостановлен в любое время с возвращением к «ручному» контролю.
С помошью системы ВЭЖХ-ЯМР-МС можно получи1ь ценные маес-спектрометрическис-
данные. которые в дальнейшем будут использованы для оптг малыгого выбора инков и их
ЯМР-анализа. Так. например, можно остановить фрагменты гидроксилированного метабонпа
или глюкуронида токсиканта. ЯМР-спектры биологических образцов (биологических жидкос-
тей) чрезвычайно сложны и содержат много тысяч резонансных поглощений. Получить макси-
мальную информацию от сложных спектров можно при использовании машинных методов на
основе данных специальных математических приемов — мультивариаитной статистики.
Предел обнаружения и количественный анализ вешества зависят как от природы определя-
емых молекул, так и от класса технической сложности оборудования (например, разрешения
соответствующего ЯМР-спектрометра). Интеграл резонанса в ЯМР прямо пропорционален
количеству соединений в ЯМР-образпс. Пределы обнаружения современных ЯМР-спектро-
метров ограничивают определение метаболитами с концентрацией >0.1 мМ *. Предел обна-
ружения в методе ВЭЖХ-МС зависит от концентрации, степени ионизации компонента и
технологического приема исследования иона (см. гл. 6.3.5). С помощью современных систем
можно обнаружить субпикомолярные количества вещества в 1 мкл образца Фактором, огра-
Методы определения токсикантов в биосредах 517
Рис. 6-139. Обшая схема проведения метаболических
исслелошиий
ничиваюншм оонаружсннс ионов, являет-
ся ионизания молекул в водном растворе
Степень ионизации для определенной мо-
лекулы различается в разных образцах. На
исследуемый ион нлиякп солевые и буфер-
ные растворы, например ион натрия быс-
тро образует аддукт с кислородом, вызы-
вая сдвиг в молекулярном ионе от М + Н
(М + 1) до М + Na (М + 23). Ионизация
молекул может быть подавлена другими
нонами при одновременном присутствии.
Вес эго должно быть проконтролировано
и учтено при анализе.
Сложная структурная организация кле-
ток и тканей представляет большие труд-
ности при исследованиях метаболитов.
Схема проведения метаболических иссле-
довании представлена на рис. 6-139. Мно-
гие типы образцов требуют разрушения
клеток и тканей, ие прифуч ирования, экс-
тракции и концентрирования.
Например, лля исследования образцов
крови новорожденных вначале проводят
экстракцию крови с фильтровальной бу-
маги; экстракт можно либо сразу иссле-
довать и масс-спектрометре. либо сначала
хроматографировать, а затем проводить
МС-анализ. Некоторые стадии могут быть
укорочены в зависимое! и от типа образца и
метода анализа. Прн исследовании биоло-
гических жидкостей приготовление образ-
на может включать добавление дейтериро-
ванного буфера и внутренних стандартов
для ЯМР. Фильтрованные жидкости также могут прямо исследоваться в масс-спектрометре.
В любом случае полное качественное и количественное определение метаболитов в каком бы
го ни было образно будет требовать одновременного проведения ра личных методов. Поэто
чу применение той или мной аппаратуры для метаболических исследований зависит от цести
исс те ювания. в частности ог тою. является ли задачей исследования полная характеристика
метаболической структуры данного образца или сравнительный метабономичсский анализ В
первом случае оптимальным является использование наиболее чувствительных спектрометров
сильного магнитного поля и особых методик. В риле случаев для определения мезаболигов
с низким содержанием в пробе может потребоваться комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР
Сравнительные мегабономичсекие исследования различных образцов, в которых концентра-
ции солей, белков, величина pH и другие параметры варьируют в ограниченной степени, могут
прово 1ит1»ся с помощью спектрометра низкого поля, однако при этом увеличивается обшес
время исследования. Например, при 300 МГц общее время исследования для достижения нуж-
ного уровня чувствительности увеличивается в 4.6 раза по сравнению с исследован нем. прове-
денным при 500 Ml ц.
Кроме исследований мочи и плазмы крови, метаболические анализы также включают ис-
слс тованне содержимого клегки Используются различные протоколы, зависящие главным об-
разом оттого направлен ли анализ на гидрофильные компоненты клетки или липофильные
Надежные результаты получают после твердофа ной экстракции авали гои При этом повыша-
ется чувствительность при определении нуклеозидов, нуклеиновых оснований и моно<|юс<]к1гов
нуклсози юв но количественные характеристики триглицеридов занижены (ниже контрой ьных
значений)
518 Глава 6
Метол ЯМР позволяет добиваться почти идоялытого спектрального разделения комнонен
тон. поэтому анализ смеси, как правило, нс требует дополнительного хроматографирования.
Однако если число компонентов очень большое или резонансные инки соответствуют бо. ьше
метаболитам, чем основным компонентам, то используют комбинированный метод ВЭЖХ
ЯМР или ВЭЖХ-ЯМР-МС. Из всех хроматографических детекторов в настоящее время масс-
спектрометры имеют наибольшее значение лля полного метаболического анализа. Эго проис-
ходит благодаря быстрому развитию масс-спектральных технолог ни в последнее десятилетие.
Появление электроенрейной ионизации расширило возможности МС при биолитических ис-
следованиях: масс-спектры крупных и высокополярных молекул теперь можно обнаруживать
либо прямо из биологических образцов, либо после разделения, например, с помощью ВЭЖХ.
К тому же инструментальные методы становятся менее объемными, а исследования с приме-
нением компьютерных программ открывают новые возможности. Эффективность масс-спек-
трального детектирования при метаболических исследованиях связана нс только с высокой
чувствительностью метода, но и с возможностью р зделения метаболитов с помощью масс-
спектрометра в соответствии с молекулярной массой при минимальном разрешении I а.е.м.
Таким образом, в зависимости от разрешения конкретного масс-анализагора, количество по-
лос (пиков) масс-спектра может варьировать в очеь широких пределах. Наложение пиков в
масс-спсктрах происходит, если анализируемые соединения имеют одинаковую молекулярную
массу и одинаковую молекулярную формулу (например, различные тексолы). Такие соедине-
ния должны быть либо разделены хроматографическн перед МС-анализом. либо подвергнуты
тандемной МС-МС. Сегодня существует много типов масс-снскгромегров. применяемых для
метаболических исследований.
Различные типы масс-спектрометров обсуждены в главе 6.3.5. из них важно выделить те.
которые применяются при метаболических исследованиях. Методы ионизации API и ESI ис
пользуются для перевода полярных метаболитов в масс-спектрометре из водных растворов в
ионы газовой фазы. Как правило, многие гетсроатомы и функциональные группы (например,
СООН тт Nil.), которые содержит молекула, склонны к ионизации с помощью API. Однако
API не позволяет произвести полную ионизацию всех типов биомолекул. Ионизацию можно
увеличить при добавлении некоторых летучих буферов к растворителю (например. уксусная,
муравьиная кислоты, трифторуксусная кислота и ацетат аммония). ES1-VIC — самый рас-
пространенный метод исследования биомолскул, который можно использовать с различными
масс-анализаторами. такими, как квадруполь. ТоГ (времяпролетный) или резонанс Фурье-
преобразователь — FT (см. гл. 6.3.5) Важно, что ТоГ обеспечивает быстрое обнаружение снек-
гров. высокую точность и разрешение. Однако метод ToF-MC имеет некоторые ограничения
предела обнаружения, которые зависят от природы соединений.
Квддруполытыс инструментальные методы из-за способности мониторировать ионы, ис-
пользуя тандемную МС (МС-МС или МС2). на сегодняшний день являются золотым стандар-
том чувствительности и предела обнаружения.
Метод Г'Г-МС имеет высокую разрептаюшюю способность и даст четкие пики. Однако он
сложен и применяется редко: понадобится время, для того чтобы FT-МС стал методом выбора
при метаболических исследованиях.
Для определения метаболитов, обладающих окислитслыто-восстановитслытыми свойства-
ми. в биологических образцах, таких, как нейромедиаторы, флавоноиды в плазме, эндогенные
антиоксиданты в плазме и метаболомы митохондрий, используются способы высокочувстви-
тельного электрохимического детектирования в ВЭЖХ. В зависимости от структуры и природы
конкретного метаболита чувствительность метода находится в пределах 5—10 пикограммов.
Эффективность работы систем ВЭЖХ-ЯМР-МС можно подтвердить примером. В несколь-
ких крупных медицинских центрах США был проведен анализ 62 метаболитов мочи, вклю-
чающих органические кислоты и аминокислоты, у пациентов, отобранных в группы по оп-
ределенным показателям. Метод дал количественные данные (с отклонениями < 15%) дня
большинства метаболитов и достоверно идентифицировал 105 из 108 больных с наследствен-
ными метаболическими заболеваниями
Метаболические маркеры. С помощью метаболических маркеров можно провести сравни-
тельные количественные анализы изменений специфических метаболитов плазмы и мочи при
действии токсикантов. Получены сведения о некоторых метаболических маркерах, иденгифи-
Методы определения токсикантов в биосредах 519
Рнс. 6-140. 400 Mm 'Н ЯМР-сиектр мочи нрн остром отравлении HgCl, (Nicholls A.W. ет al.. 2001).
a — контроль; б — через 24 ч посте введения HgCl, в дозе 1 мг/кг; в — через 24 ч посте введения HgClj
в дозе 2 мт/кг.
нированных при исследовании мочи и других биологических жидкостей с помощью ЯМР. На-
пример. при изучении в эксперименте токсичности HgCl, наблюдают значительное повышение
содержания янтарной, молочной и уксусной кислот (рис. 6-140).
Кроме того, в образцах мочи обнаружс м повышенная концентрация этанола. Полагают,
что такая концентрация этанола является следствием снижения активации ал ко гольде гидро-
геназы. Дифференцирующими метаболитами лля определения степени токсического эффекта
ртути являются валин, таурин, глюкоза и оксид трнмети.тамипа (ТМАО). Последний является
общим биомаркером почечной Токсичности и идентифицируется при действии других нефро-
токс и кантов (рис. 6-141).
Важно отметить влияние кишечной микрофлоры на метаболические процессы. Микробный
метаболизм очень изменчив Кишечные бактерии обладают изменчивой восприимчивостью
к лекарствам и токсикантам. У тает не кишечной микрофлоры в синтезе метаболитов мочи
зависит от их природы. Как указано выше. ТМАО является общим биомаркером почечной
токсичности. Кишечные бактерии играют большую роль в метаболизме метиламина Образо-
вание триметиламина (ТМА) из холина главным обратом происходит с помощью кишечных
бактерий, тогда как последующее окисление в ТМАО преимущественно происходит в печени.
Образование ТМЛО является примером сложных метаболических взаимодействий. которые
должны рассматриваться с целью адекватной опенки результатов метаболомических анализов.
У пациентов с хронической почечной недостаточностью часто происходит чрезмерно быстрый
рост кишечных бактерий. Тто способствует пониженному нишевому статусу больных, особен-
но нуждающихся в постоянном диализе. Поданным исследователей, в организме повышают-
ся уровни димет штам и на (ДМА) и сто KaimepoicHiioio метаболита — питрозодимстиламина
(ПДМА) Следовательно, повышенный уровень ДМА и НДМА в моче может служить мар-
520 Глава 6
керо.м действия почечною токсиканта. Однако различные почечные токсиканты но-разнохп
влияют на рост кишечных бактерий, полому важно знать, как изучаемое соединение реагирует
с кишечной флорой. Пока затруднительно ответить на вопрос, каким образом сопоставить
уровень ДМА как маркера метаболической активное!и кишечных бактерий и уровень ДМА,
зависящий от поступления холина из пищи и других источников, которые могут служить пред-
шественниками синтеза метиламина.
При депрессии н других психических заболеваниях в моче обнаруживают фенилацетат
продукт катаболизма фенилаланина и фснилэтилампиа. Уровень фениланетата и конъюкггов
фениланетата может изменя ться под действием оральных антибиоз иков. что подчеркивает роль
кишечных бактерий в метаболизме ксенобиотиков
Несмотря на многие вопросы, 1ребуюшпе ответа исследователей, и несовершенен во анали-
тических технологий, метабономический анализ произвел революционный прорыв в медици-
не, и в частности в токсикологии и фармакологии.
Еше одним примером служит идентификация пироглутамата (5-оксопролипа) как маркера
токсического действия высоких лоз парацетамола (N-аиетил-п-аминофенола). Накопление nii-
Рнс. 6-141. 4(Х) Мгп 'Н ЯМР-спектр мочи крысы посте введения rio.iniiponniennMHna в дозе 20 мм/кг
Нижний спекгр — преддозовый (суточный) контроль, другие спектры — через 8—48 ч соответственно
после введения 11ал1Шропилсни.мина (Gartland К. ct aL. 2000).
Методы определения токсикантов в биосредах 521
роглутамата несомненно связано с метаболизмом серосодержащих аминокислот, так как про-
цесс может быть остановлен введением мсгионипа. который опосредованно используется орга-
низмом как сульфатный и цистеиновый конъюгат парацетамола (см. гл. 4). В ЧЧ ЯМР-снсктре
мочи были обнаружены резонансные хар< ктернстнки обоих конъюгатов, а также парацетамола
люкуроннда. Таким образом, было показано, что 5-оксопролинурия является следствием не-
достаточного количества серосодержащих аминокислот. Наблюдения показывают, что 5-ок-
сонролинурия также может быть биомаркером других химических агентов, которые снижают
содержание серосодержащих аминокислот.
Недавние исследования с помощью системы ВЭЖХ-ЯМР обра нов мочи людей, подвергав-
шихся хроническому производственному отравлению гептилом (ракетное горючее) в течение
нескольких месяцев, показа.!и повышение уровня 2-ампноадипата. [З-аланина. нитруялпна.
Х-З-апстилнитруллина и аргиннисукимната. что можно считать обнаружением бномаркеров
токсического эффекта несимметричного диметилгилразина (рис 6-142) (см. гл. 11).
Малотоксичныс вещества могут вызывать временные нарушения метаболизма без нанесе-
ния большою вреда тканям и органам, но прибор зафиксирует метаболический профиль, от-
личающийся от принятой нормы. Поэтому интерпретировать результаты анализа необходимо
с учетом наиболее полной информации о паниепге или потерпевшем.
В ближайшее время благодаря новым технологияя чисто уникальных бномаркеров будет
значительно увеличено.
Определение концентраций основных метаб™ и гоп является целью метаболических апачи-
юв. однако не менее важным и вполне информативным может быть изучение того или иною
метаоо шта в условиях конкретного организма in vivo. Такие анализы включают использование
прекурсоров, меченных изшопами. и исследование образков определенных метаболитов. ме-
ченных изотопами.
Лк. 6-142. Использование системы ВЭЖХ — 500 Мгц 'Н ЯМР ьтя идентификации метаболитов мочи.
Обрахн исследовали через 56 ч после последней интоксикации гептилом, ши димспсп илразином
Vicholls A.W. cl а!.. 2001). Пояснение в тексте.
522 Глава 6
Соединения, похожие по структуре, но имеющие разный состав изотопов, называются
нзотопомерами. Использование стабильного изотопа РС, принимая ио внимание его распро-
страненность в природе (всего 1,1%), обеспечивает надежность результатов анализа. Мето, ом
ЯМР-спектромстрии можно определить расположение изотона в изучаемом соединении, так
как каждый изотопомср показывает определенный ЯМР-спсктр.
Определение состава нзотопомера возможно с помощью как прямой одномерной, так и
двумерной С ЯМР-спскзромсгрии. HSQC-спсктрометрия шиясгся более чувст чизельным и
доступным лля интерпретации результатов методом.
Для изучения метаболизма дейтерированных субстра ов применяют -'Н ЯМР. Положитель-
ная сторона этого подхода заключается в относительной легкоыи проведения исследовании и
низкого распространения ле1ггерия в природе по сравнению, например, с ,3С. Метол JH ЯМР
может использоваться для анализа печеночного метабо «изма.
При исследовании метаболизма L- и О-|метиЯ—’Н,]метионина (|м«хил-О,]метионина) с
помощью Н ЯМР (D ЯМР) in vivo можно проследить биотрапсформапию того или иного
изомера, используя специальную поверхностную спираль, помешенную на печень анестезиро-
ванных крыс. При исследовании L-метнонина была обнаружена реакиия трансметилирования,
приводящая к образованию (мстил-ОЛсаркозина (рис. 6-143). что позволяет определить актив-
ность метиониналспозилтрансферазы и глииин-Ь4-метилтрансферазы.
В течение времени некоторые другие метаболиты также становятся дейтерированными из-за
действия <|>ерментов, вовлеченных в процессы метаболизма. Олни из дейтерированных сар-
козинов окисляются в митохондриях с помощью саркозиндегилрогеназы, в конечном счете
превращаясь в дейтерированную воду, однако некоторое количество может экскретироваться
И« тересио. что аналогичные исследования, в которых использован прекурсор дейюриронлн-
ного D-мстионина, дали по существу такие же результаты, показывающие быстрое превра-
щение D- в L-изомер. Сравнение метаболизма L- и D-|mciha-DЗмстиоиина показало, что
результаты могут меняться пол возле «сгнием
бензоата натрия, ингибитора D-аминоокси-
дазы. Преобразование D-метионина в L-ме
тионин, в котором участвует этот фермент,
сопровождается обратим аминированием,
которое катализируется ферментом глутами-
назой 11. Применяя такую технологию, можно
исследовать эффекты специфических хими-
ческих вешеств в метаболических путях. Было
отмечено уменьшение количества L-метиони-
на при введении бензоатов, что. возможно
связано со снижением уровня глинина. так
как последний используется в этом случае для
образования гиппурата из бензоата. Снижение
уровня глипина уменьшает его активность в
реакции образования глицин-N-мет ил транс-
феразы, что опосредованно ведет к уменьше-
нию количества L-метионипа
Обнаруженные in vivo с использованием
метода поверхностной спирали дейтерирован-
ные метаболиты печени были обнаружены и в
моче с помощью 41 ЯМР.
Клмснчсский аналитический подход к из-
мерению метаболического уровня в биологи-
ческих системах с использованием внутрен-
них стандартов и построением калибровочных
графиков практически неприменим для пол-
ных исследований сложных мстаболомов. Для
автоматического анализа данных при опре-
делении метаболических характеристик были
ppm
Рнс. 6-143. 500 Mm -Н ЯМР-спсктры биоптатов пече-
ни крыс (R.L. London ei al.. I98K). Н130 — дейтериро-
ванная вода; CHD — дезггсрировшшая группа СП,.
Методы определения токсикантов в биосредах 523
разработаны специальные опознавательные компьютерные программы, коррелирующие ре-
зу штаты исследований многоаспектного набора данных (например, значения хроматографи-
ческих времен удерживания, интенсивности масс- и ЯМР-спектров). Масштабы сокращения
времени получения массива данных огромны. С помощью метола ВЭЖХ-ЯМР-МС- ToF в
геченис 20 мин (со скоростью 5 спектров в секунду) можно создать 6000 х ракгерных МС- и
ЯМР-спектров, каждый из которых включает более 50 000 точек, 3; дача состоит в том. чтобы
выделить все реальные масс-спект ральныс и ЯМР- характеристики для более 1000 потенциаль-
ных метаболитов в каждой хроматограмме. Одним из способов визуализации и анализа дан-
ных является создание контурных графиков, на осях которых указаны аналитические сигналы
методов. Различия в контурах от образца к образцу отражают изменения в метаболических
путях. При этом необходимо иметь информацию о том. какому (острому или хроническому)
воздействию токсиканта подвергся обследуемым. В некоторых случаях краткосрочные измене-
ния метаболизма при остром отравлении могут быть противоположны этим же изменениям,
наблюдаемым у пациента прн длительном воздействии токсиканта.
В клинической диагностике метаболических изменений применение комплекса ВЭЖХ-
ЯМР-МС позволило определить липопротеины плазмы крови. Методом ЯМР-спектромстрии
получили индивидуальную характеристику каждого определенного липопротеина согласно их
ратделспию па липопротеины высокой плотное!и, липопротеины низкой плотности (ЯННИ)
и липопротеины очень низкой пл ос кости имеющих очень небольшое различие между собой,
которое заключается в разном диаметре фосфолипид ноги слоя в оболочках липопротеинов
Исследования показали, что люди с повышенным содержанием триглицеридов имеют высо-
кое содержание липопротеинов. Богатые триглицеридами липопротеины индуцируют реакции
про укипи ЛПНП ненормальных размеров и увеличивают содержание хо естерина. Традици-
онными методами исследования холестерина невозможно точно определить количество ненор-
мальных ЛПНП и сопутствующий риск коронарных забачеваний. С помощью ЯМР-спектро-
скопии можно точно определить класс липопротеинов, что даст возможность диагностировать
и успешно лечить сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на то что эти исследования
проводились с клинической целью, с их помощью можно определить повреждающее действие
токсик нтов. оказывающих влияние на метаболизм липопротеинов. или мобил извиню глико-
гена. стадии глюкогенеза и другие процессы, происходящие в организме в режиме реального
времени.
6.5. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ
Жилые организмы построены из материн
и приводятся в движение энер! ней...
С какой бы стороны мы пи подошли к биолопш -
со стороны ли МД! ери и или со стороны энергии —
мы так или иначе крилем к электронам.
Альберт Сент-Дьерди
Среди методов и средств, которыми располагает современная аналитическая химия, элект-
рохимические методы занимают одно из первых мест по частоте применения для решения про-
блем охраны окружающей среды и широко используются при анализе вод. почв, атмосферы,
пищевых продуктов, а также биосубстратов человека.
Электрохимические методы анализа — методы исследования растворов, основанные на
изучении электрохимических свойств веществ, помещенных в электрохимическую ячейку.
Классификация электрохимических методов анализа представлена на схеме 6-2. Как видно
из схемы, к ним можно отнести и небольшое число методов. в которых электродная реакция
отсутствует. Измерение омического активного сопротивления раствора электролита перемен-
ному току (чаще говорят об обратной величине — электропроводности), обусловленного опре-
деленной подвижностью ионов в растворе, составляет сущность кондуктометрии И мепение
лтектропроводностп в процессе аналитической реакции, например кислот! о-основною взаи-
модействия, осаждения и др., испотьзуют в кондуктометрическом титровании для индикации
достижения конечной точки титрования. Если измерять п зное сопротивление току высокой
524 Гласа 6
Кондуктометрия
Кондуктометрическое
титрование
Высокочастотная
кондуктометрия
(осциллометрия)
Капиллярный
электрофорез
В отсутствие токе
Потенциометрия и
потенциометрическое
титрование
Ионометрия
ЭЛЕКТРОХИМИЯ СКИЕ МЕТОДЫ
ЭЛЕКТРОДНАЯ РЕАКЦИЯ ПРОИСХОДИТ
Под действием тока
Вольтамперометрия
Полярография
Амперометрическое титрование
Инверсионная
вольтамперометрия
Переменно-токовая
полярография
Кулонометрическое титрование
Электрогравиметрия
Схема 6-2. Классификация электрохимических мегодов.
частоты, то можно обойтись и без погружаемых в раствор электродов. Так поступают в методе
высокочастотной кондуктометрии (и титровании). Эго особенно удобно при работе с токсич-
ными вен ествами. В настоя нее время подвижность ионов в электрическом поле используют
для разделения смесей ионов, например ооразусмых аминокислотами метолом капиллярного
электрофореза (см. гл. 6.3.4.)
В потенциометрических методах измеряют величину электродного потенциала индикатор-
ного электрода и отсутствие тока, которая зависит от активности (конценграции) потеициал-
определяюших ионов. Эта зависимость описывается уравнением Нернста. Метод широко при-
меняют для определения pH растворов и биологических жидкостей, концентр, ши некоторых
катионов и анионов (ионометрия). величины окислительно-восстановительных потенциалов,
а также конечной точки титрования, отвечающей моменту окончания реакции — моменту эк-
вивалентности (потенциометрическое титрование)
Методы вольтамперометрии основаны на использовании явления поляризации рабочих
электродов, когда концентрации ионов в растворе и у поверхности электро ла вследствие элек-
трохимической реакции различаются и измеряемый iioichiiikli электрода отклоняется от рав-
новесного значения, предписываемого уравнением Нсрнста. Возникающий при этом ток —
аналитический сигнал — называют диффузионным.
В полярографии анализируемое вешесгво. содержащее ионы металлов или некоторые орга-
нические соеди тения. обладающие полярографической активностью, подвергают электролизу
па ртутном капающем электроде. Типичный вил рсптстрируемой при этом поляризационной
кривой называется полярограммой (см. далее). Потенциал полунопны является характеристи-
кой вещества, а высота волны — функцией концентрации. Связь величины диффузионного
тока с концентрацией описывает уравнение Ильковича. Измерение предельного диффузион-
ного тока используют также для нахождения конечной точки титрования в амперометрическом
титровании.
Чувствительность классической полярографии (ГО-*—10 '%) можно повысить, используя
способ инверсионной вольтамперометрии. Д. я этого следы определяемого вещества (металла)
сначала концентрируют в покоящейся капле ртути, а далее при анодном растворении этого
металла регистрируют пик тока и определяют концентрацию ионов металла. Более низких
пределов обнаружения можно достичь, видоизменив способы развертки потенциала, прилага-
Методы определения токсикантов в биосредах 525
смого к электрохимической ячейке, или peiTicipaiiHii возникающею электрического сигнала.
Эги способы используют в методах переменно-токовой полярографии.
Кулонометрия основана на определении количества электричества, потребовавшегося для
полного превращения электрохимически активного вещества. Этот метод относится к наибо-
лее точным, поскольку измерения количества электричества и необходимые расчеты по урав-
нению Фарадея могут быть выполнены корректно и с высокой точностью.
Для автоматического поддержания необходимого режима электролиза используют сле-
пи; льные хчектронные устройства — потенпиоегггы Электролиз в кулонометрии можно
проводить в двух режимах — при поддерживаемом постоянном токе или нрн постоянном по-
тенциале рабочего электрода, чго удобнее. Еще более широко применяют кулонометрическое
титрование, в котором электролиз используют для электрогснсранни титрантов, в том числе
и неустойчивых при обычных условиях. Это делает кулонометрическое титрование пригод-
ным для определения широкого крута неорганических и органических соединений В особых
случаях, например, при определении меди, удастся осуществить полное электроосажденис
металла в виде осадка на электроде и определить его массу взвешиванием (электрогравимет-
рия).
Далеко не все указанные на схеме 6-2 методы имеют равное значение при анализе токси-
кантов в биологических средах или при исследовании смещений электролитических равнове-
сий в биологических жидкостях под влиянием токсического процесса.
Далее приводится информация о наиболее важных с точки зрения ХТА методах
Низкочастотная кондуктометрия. Схема измерения электропроводности растворов приве-
дена на рис. 6-144. Раствор электролита — но проводник 2-го рода. т.е. раствор, в котором час-
тицы. переносящие ток. яачяются ионами. При этом принципиально важно, чтобы электроды,
помешенные в раствор электролита, осуществляли только электрический контакт. Для этого
платиновые электроды платинируют — покрывают тончайшим слоем дисперсной платины, что
увеличивает поверхность электрода, обеспе швает отсутствие поляризационных яалений и элек-
трохимических превращений на нем. Работу проводят при переменном токе частотой 1000 Гц.
Сопротиачение ячейки измеряют с помощью мостовой схемы, подключая ячейку I к плечу
моста 2 и уравновешивая мост сопротначснием соседнего плеча Благодаря этому в момент
Рис. 6-144. Схема эксперимента в кондукто-
метрии и npi меры кривых кондуктометри-
ческого титрования.
I — ячейка с платинированными электрода-
ми; 2 — мост переменною тока; 3 — иачь-
индикатор: 4 — источник переменного тока;
5 — бюретка (при осушестачении кондукто-
метрическою титрования); кривая пирова-
ния HCI (6) и смеси НО + СН СООН (7)
раствором N ОН.
526 Глава 6
равновесия моста через его измерительную диагональ ток не протекает и измеряется истинное
омическое сопротивление.
Электропроводность — величина аддитивная и определяется подвижное! ыи всех ионов,
присутствующих в растворе, поэтому невозможно отличить один ион от другого, т.е. анали-
тическая избирательность отсугствус . Однако кондуктометрию можно эффектвно использо-
вать, наблюдая за ходом изменения электропроводности в процессе титрования. Изменение
электропроводности раствора в процессе титрования отображает кривая титрования (6). излом
на которой отвечает конечной точке титрования — vrr Расчет результата выполняют далее по
стандартным формулам гитриметрии. Титрование можно проводить в мутных и окрашенных
растворах анализируемых токсикантов, можно использовать и другие реакции, например, осаж
дсния |Na,SO4 + (СНдСОО),Ва -э BaSOj. + 2CH,COONa]. Особенность метода — возможность
анализа смесей некоторых электро, итов (см. гл. 8.6). например, сильной и слабой кисло* (7)
В этом примере г( отвечает конечной точке титрования НО. а разность v2 — v, — CII,COOH.
Высокочастотная кондуктометрия основана на измерении полной проводимости на часто-
тах порятка десятков мегагерц. При таких частотах становится отчет твой роль молекулярной,
или деформационной, и ориентационной поляризации. В первом случае под действием высо-
кочастотного поля происходит некоторое разобщение электронного облака и ядер молекулы,
появляется наведенный диполь. Полярные молекулы в таком поле стремятся ориентировать
свои липе 1ьные моменты вдоль поля. Поляризация молекул в высокочастотном поле приводит
к существенному изхтенснию диэлектрической и магнитной проницаемости всего раствора.
Изменение этих параметров можно зафиксировать, если включить ячейку в колебательный
контур и рс вирировать изменение тока в нем. как это показано па рис. 6-145. Можно помес-
тить ячейку с раствором между обкладками конденсатора (ячейка С-типа) или между витками
катушки индуктивности (ячейка Л-т ина). В любом случае это будет вариант бесконтактной
высокочастотной кондуктометрии. что является достоинством метода. Можно осуществлять
и высокочастотное титрование, получая линейные кривые титрования. подобные рассмот-
ренным выше. Следует отметить, чго в высокочастотной кондуктометрии измеряется полная
провотимоегь раствора, складывающаяся из активной омической компоненты и реактивной
составляющей зависящей от емкости и индуктивности. Понятие «реактивная составляющая
отражает изменение фазы переменною тока, при сю прохождении через реактивный элемент
емкость пли индуктивность. Итак, изменение свойств раствора приводи! к изменению оми-
ческою сопротивления и его реактивной компоненты. Регистрируемая прибором их векторная
сумма называется импедансом.
В методе высокочастотного титрования без непосредственного контакта с раствором мож-
но испол! товагь очень многие аналитические реакции — кислотно-основное взаимодействие.
Рис. 6-145. Схема и морения высокочастот-
ной проводимости растворов.
I — бесконтактная ячейка (С-типа); 2 — вы-
сокочастотный генератор: 3 — измсрите.ть-
ная схема; 4 — микроамперметр; 5 — бю-
ретка (для высокочастотно!о титрования).
Методы определения токсикантов в биосредах 527
Рис. 6-146. Схема потенциометрических
измерении и iioieiiuHOMeipH'iecKom тит-
рования.
1 — ячейки; 2 — индика горный электрод
3 — электрод сравнения; 4 — милливольт-
метр (рН-метр): 5 — цифровой милливольт-
метр; 6 — бюретка (для титрования)
эсажлснис. комплексообразование. Окраска, мутность агрессивность, токсичность раствора
'«следуемого соединения не имеют негативного практическою шячения.
Потс щиометрия и потенциометрическое титрование. Метод основан на измерении элект-
родвижущей силы гальваническою элемента, сост гвленного из помешенных в раствор инди-
каторного и вспомогательного (сравнения) электродов. Электродвижущую силу в этом случае
принято называть электродным потенциалом. Он возникает как следствие электронно-ионно-
го или ионообменного равновесия на поверхности разде за фаз электрод—раствор. Электродная
реакция происходит в отсутствие тока, не поддается непосредственному наблюдению, но про-
являет себя в электродном потенциале. Схема потенциометрического эксперимента приведена
на рис. 6-146
В потенциометрии применяют металлические и ионоселективные индикаторные электроды
г ИСЭ). Металлические электроды (иначе называемые электродами 1-го рода) могут быть ак-
тивные и инертные. Потенциал активного металлического электрода является функцией актив-
ности его собственных ионов в растворе. Например, серебряный электрод работает на основе
электронно-ионного равновесия Ag’ + ё <-> Ag. Для него справедливо уравнение Нернста:
+ 0.0591g « .
где Е^. — стандартный потенциал системы при активностях, равных I.
В растворе, содержащем ионы СГ. потенциал начинает зависеть от их концентрации Это
уже элск род 2-ю рода, для коюрого:
где + 0.059lgA.\>AeC|. a К — прои ведение растворимости AgCL Если кон-
центрацию ионов О поддерживать постоянной, величина потенциала также будет оставаться
постоянной. Соблюдая это условие, хлоридсеребряный электрод используют и качестве элек-
трода сравнения.
Инертные металлические электроды являются вишь переносчиками электронов от восста-
новителя к окислителю и изготавливаются из благородных металлов (Pt. Au). Поэтому их по-
тенциал зависит от соотношения активностей окисленной и восстановленной форм Область
их применения — потенциометрическое окислительно-восстановительное титрование
Ионометрия. Большее прикладное значение приобрела прямая потенциометрия с ионосе-
лекзивными мембранными элек родами (ионометрия с ИСЭ) для определения концентрации
ионов в растворе. Метол состоит в измерении потенциала ИСЭ и нахождении концентрации
по градуировочной зависимости. При концентрациях -КГ* М электрод утрачивает свою элек-
528 Глава 6
тродную функцию. В ИСЭ непременно имеется мембрана — полупроницаемая перегородка,
пленка, подобная внутриклеточным мембранам. Она отделяет внутреннюю часть ИСЭ от ана-
лизируемого р; створа С помошью алсктродов сравнения, помешенных во внешний анализи-
руемый и во внутренний раствор, можно измерить разность лих потенциалов, которую назы-
вают мембранным потенциалом. Потенциал мембраны возникает вследствие существования
равновесия ионного обмена на се поверхности, проникновения ионов в фазу мембраны и пе-
ремещения в ней. Сумму этих процессов, приводящих к возникновению потенциала мембраны
Ем, например, при определении концентрации иона А* в присутствии мешающего нона В*,
описывает уравнение Никольскою:
0 059
Ем = const + —— к?(стЛ + k'™^
“Л
где <А. св — заряды ионов, к^ — коэффициент потенциометрической селективности (видно,
что чем меньше этот коэффициент. тем выше селективность ИСЭ к определяемому иону).
Мембраны могут быть:
• некристаллическими с жесткой матрицей (стеклянный электрод, используемый для опреде-
ления pH);
• кристаллическими (дантанфтор тдный электрод на нон F' с мсмбра> ой из LaF сульфидсс-
ребряный электрод на ион S- с мембраной из Ag.S, йодидселектпвный элскрод с мембрд
ной из Ag,S + Agl):
• жидкостными (раствор ионообменника или нейтрального переносчика ионов в несме-
шиваюшемся с водой ор1аническом растворителе, удерживаемом в пленке пористо-
го полимера, например, кальиийселсктивный электрод с мембраной из поливинилхло-
рида, пропитанною раствором лолепизтфосфата кальция в дпоктил<|>сци.1фосфатс, или
калий селективный валиномштиновый электрод с
мембраной на основе ист трального переносчика ионов —
валиномипина. Жидкостные мембранные электроды при-
обрели особое значение в биологических исследованиях.
На рис. 6-147 приведена схема устройства стеклянного
электрода лля измерения pH. Стеклянный электрод селекти-
вен по отношению к ионам водорода. Потенциал возникает
вследствие обмена ионов водорода с ионами щелочных ме-
таллов. обычно натрия, закрепленными в силикатной мат-
рице. Конструктивно стеклянный электрод представляет со-
бой тонкостенную сферу I. изготовленную из специального
стекла, обладающего очень низкой ионной проводимостью.
Если стеклянный электрод погру ить в испытуемый раствор,
то между внешней и внутренней поверхностью стеклянной
мембраны возникнет разность потенциалов, измерение ко-
торой и позволяет рассчитать pH. Конструкция стеклянного
электрода разнообра зна. Часто его объединяют в одно целое
с электротом сравнения и применяют специальную конс-
трукцию для уменьшения и стабилизации диффузионного
потенциала. Обычно для этою используют солевой мостик —
узкую трубку, заполненную раствором КО. поскольку ионы
К' и О имеют приблизительно равные ионные подвиж-
ности. Это обеспечивает минимизацию и пос оянство диф-
фузионного потенциала. Стеклянный электрод позволяет
измерять pH в ин тершие 1.0—10.0. В сильнокислой о тас-
ттт появляются погрешности из-за уменьшения активности
воды, в силыюшслочной — вследствие проявления стеклян-
ным электродом катионной функции но отношению к при-
сутствующим в растворе ионам щелочного металла. Извест-
ны конструкции стеклянных электродов для измерений pH в
одной капле жидкости, в ее тонких пленках. В практической
5
Рис. ft-147. Схема устройства стек-
лянного электрода.
1 — pH-чувствительная мембрана
из электродного стекла: 2 — внут-
ренним раствор: 0.1 М НО. пл
сышенпый AgCl; 3 — внутренний
электрод сравнения: 4 — стеклян-
ная трубка 5 — гокоотвод.
Методы определения токсикантов в биосредах 529
работе более удобны изготовляемые из специального электропроводного стекла твердотельные
стеклянные электроды, отличающиеся отсутствием внутреннего стандартного раствора. ИСЭ с
иными мембранами имеют сходное устройство.
В современные приборы встраивают микропро! ессор (соответствующую функцию называ-
ют smart). Это позволяет проводить настройку pl 1-метра по нескольким стандартным буфер-
ным растворам (табл. 6-59). pH которых запоминается.
Таблица 6-59. Сгандарп ыс буферные растворы, применяемые для нас ройки рН-метрп
Дигарграт калия (насыщенный) прн 25 *С Днфталат калия (0.05 го) КН.РО, (0.025 ш) + Na.HPO, (0,025 m) KJI.PO. (0.008695 m) + Na.HPO. (0.03043 m) Na,BO, (0,01 m)
25 3.557 4,008 6.865 7,413 9.180
30 3.552 4.015 6.863 7.400 9.139
35 3.549 4.024 1 6.844 ] 7389 ] 9.102
Примечание m — моляльность — число моль рктворенното вещества, трихааяшееся на 100 г растворителя.
Далее по этим значениям метолом наименьших квадратов рассчитывается уравнение граду-
ировочной функции в координатах потенциал Е — pH. Для обеспечения точности измерений
необходимо копгролнроватысмпсратуру исследуемого раствор*. Так целесообразно поступать,
например, при определении pH физиологических сред, изменяющихся в достаточно широком
интервале (табл. 6-60).
Габ. ива 6-60 pH некоторых физиологических жидкостей
Физиологическая жидкость рн
Желудочный сок 6.9-2.O
Артериальная кровь 7.35-7.45
Кровь (плазма) 7.25-7,44
Моча 5.0—6,5
Пог 4.2—7.8
Слезная жидкость 7.6—7.8
Слюна 5,6—7,9
Сок поджелудочной железы 8.6—9.0
Сок тонкой кишки ( 5.07-7,07 |
Результаты эпидемиологических исследований показали, что среди про<Ьсссиональных ин-
токсикаций первое место занимает свинцовая (см. гл. 8.5). Одним из надежных диагностичес-
ких показателей свинцовой интоксикации является содержание свинца в крови, а концентра-
ция свинца в моче менее информативна, так как подвержена влиянию различных факторов.
Накопление свинца в зубах, волосах и костной ткани происходит при его длительном воздейс-
твии. поэтому содержание свинца в волосах человека можно использовать для оценки эколого-
эпидемической ситуации (см. гл. 6.4.3. 8.5. 10).
Для экспрессного определения РЬ2* в волосах человека и шерсти сельскохозяйственных
животных применяют РЬ селективные электроды с пластифицированными мембранами. На-
иболее высокую селективность (табл. 6-61) к ионам свинца (II) проявляют электроды РЬ-НФ-
100-ТБФ (теграфенилборат)
Таблица 6-61. Коэффициенты селективности Pb-селективных электродов
Электрод Мешающий катион
Ва-’" Са7* Mg2* Cd2* Zn- Na* К*
РЬ-НФ-12 ТБФ 1 6-10- 2-Ю-1 3-102 210-1 1,6-102 2-10-'
РЬ-НФ-25 -ТБФ 110-' 310’ 1.5 10 1 8 1(У2 2-10’2 1 IOJ 2 I0-2
РЬ-НФ-60-ТБФ НО1 1 102 1-Ю-’ 1 10 • ЗЮ2 1 10’ 1 1(У2
РЬ-НФ-100-ТБФ 5-КР I-I02 6-107 3 10' 3 Ш2 1 Ю’ 1 10»
Содержание свинца в волосах после мокрого сожжения анализируемых биообразцов в кон-
центрированной азотной кислоте составляет 15—100 мкг/г (относительное стандартное откло-
нение нс превышает 10%).
530 Глава 6
Большое практическое значение имеют электроды для определения фторид-ионов (см.
гл. 8.7). Изготовлены ИСЭ для определения хлоридов, бромидов, йодидов, цианидов, нитра
тов. сульфатов, ионов калия, кальция, магния, мели и др. (см. гл. 8 5—8.7). ИСЭ нашли при-
менение при определении токсикантов и установлении соотношения между концентрацией
электролитов и кислотно-шслочиы.м равновесием в биологических жидкостях с диагностичес-
кой целью. В результате смешения кислотно-щелочного равновесия концентрация различных
ионов в биологических жидкостях (внеклеточной жидкости, плазме, внутриклеточной жид-
кости, с.м. гл. 4) изменяется в той или иной степени. Возможна также обратная ситуация,
когда смешение равновесия в электролитической системе, вызванное действие токсиканта или
другими причинами, приводит к изменению кислотно-шслочиою равновесия в организме.
Исследование соотношения между кислотно-щелочным и электролитическим равновесием
имеет особое значение для обеспечения правильной диагностики и выбора метода лечения,
при проведении ХТА и юксико-киистических исследований. В плазме крови метабо. ичсс-
кий анидоз характеризуется снижением концентрации ионов гидрокарбоната и pH. вследствие
чего концентрация белковых анионов также уменьшается. В соответствии с принципом элек-
тронейтрал ьности жидкой фазы концентрация других анионов (хлоридов, лактатов и суль-
фатов) должна в соответствующей степени увеличиться или должна спили ься копией грация
катионов, например натрия. Mcra6oj ичсский ацидоз, обусловленный потерей электролита,
наблюдается, например, в том случае, если потеря хлорид-ионов превышает потерн ионов
натрия (потери хлоридов вызваны рвотой, выделением нота и т.п.). Снижение концентрации
хлорид-ионов возможно не только при метаболическом ацидозе поэтому ее нельзя рассмат-
ривать как характерный показатель данного расстройства. Тем не менее, зная величину этого
показателя, легче обнаружить причины нарушений кислотно-шслочного равновесия. Следуя
отметить, что изменение кониентрании некоторых ионов не всегда вызвано изменением их
количества, а часто свягано с протеканием осмотических процессов. Так, например, изменение
концентрации ионов на>рия во mhoihx случаях обусловлено избыточным или недостаточным
количеством воды. Установлено, что при метаболическом ацидозе концентрация ионов калия
в плазме значительно во растает, фосфа г-ионов несколько снижается, ионов кальпря и магния
незначительно увеличивается.
При метаболическом алкалозе pH и концентрация гидрокарбоната, а также концс1прания
белковых анионов повышается, в результате чего концентрация хлорид-ионов. например, сни-
жается, а концентрация ионов-калия возрастав Метаболический алкалоз — это результаг
потери электролита, если уменьшение концентрации ионов натрия превышает таковое для
хлорид ионов, что часто наблюдается, например, при интоксикации бактериальными токси-
нами (см гл. II). При метаболическом алкалозе концентрация калия и фосфатов в плазме
снижается, а лактат-ионов увеличивается по мере повышения pH.
Определенные изменения концентраций ионов наблюдаются и при респираторном ацидозе
и алкалозе. При респираюрном алкалозе концентрации ионов калия и фосфат-ионов умень-
шаются с увеличением pH, а концентрация лактат-ионов заметно возрастает.
Среди других жидких сред органи 1ма интерстициальная (тканевая) жидкость играет одну из
ключевых ролей, особенно при измерении кислотно-шелочного равновесия in vivo в тканях и
на их поверхности. В этом случае индикаторный электрод должен непосредственно ко 1тактн-
роватъ с интерстициальной жидкостью. Состав интерстициальной жидкости аналогичен соста-
ву плазмы, но содержание белка в первой чрезвычайно мало. По аналогии с интерстициальной
жидкостью спинномозговую жидкость можно рассматривать как раствор хлорида и гидрокар-
боната натрия (содержание белка в пей также сравнительно невелико — 500 мг/дм5).
Широко используется ионометрия и для определения различных биологически активных
соединений и лекарственных препаратов. В настоящее время уже можно говорить, что сущес-
твуют носители, селективные практически к любому типу органических соединений, а это
означает, что возможно создание неограниченного числа соответствующих ИСЭ. Перспек-
тивным направлением является использование ферментных эл ктродов, в мембраг у которых
вклю гены иммобилизованные ферменты. Эти электроды обладают высокой специфичностью,
свойственной ферментативным реакциям. С их помощью удается определять ингибирующие
холинэстеразу инсектициды (фосфорорганические соединения, карбаматы, см. гл. 8.4) при
концентрациях -1 нг/мл. Будущее метода связано с созданием компактных специфичных сен-
Методы определения токсикантов в биосредах 531
соров, представляющих собой современные электронные устройства в сочетании с ионосе-
лектнвиымн мембранами, которые позволят обходиться без разделения компонентов проб и
заметно ускорят проведение анализов в полевых условиях.
Потенциометрические измерения проводят in vitro и in vivo. В последнем случае электроды
(или датчики) помешают непосредственно в сосуд (ткань, орган) или на поверхность орга-
на ( ткани). Измерением in situ называют исследование какого-либо образца непосредствен-
но в месте его естественного расположения. Средн объектов измерения часто встречаются
трехфазные дисперсные системы, например, кровь. В зависимости от поставленной задачи
на результат определения влияют порядок отбора пробы, сам процесс измерения, присутс-
твие или. наоборот, отсутствие воздуха (анаэробные условия). Измерение кислот!ю-шелочного
равновесия можно проводить только в закрытых епшемах. а определение электролитов — в
открытых системах (на воздухе). Пробы, предназначенные для измерений in vitro, обычно тре-
буют предварительной подготовки (см.гл. 5). В пробы крови, например, необходимо вводить в
качестве антикоагулянта гепарин, при анализе фторидов в пробы плазмы добавляют буферные
растворы. Измерения проводят в биологических жидкостях даже в тех случаях, когда, казалось
бы, исследованию подлежит другой образец. Так. исследование цельной крови включает опрс
деление активности ионов, растворенных в плазме, поскольку именно плазма непосредственно
контактирует с индикаторным электродом. Эритроциты только влияют на состав плазмы, но
не участвуют в установлении равновесия на границе электрод—плазма. что определяет изме-
ряемый сигнал. Аналогичная ситуация наблюдается при проведении анализа на поверхности
органов или тканей, где электроды контактируют с интерстициальной жидкостью. При опенке
результатов измерений особое внимание следует обратить на условия, в которых они проводят-
ся. а также на истинное равновесие электрод—раствор. В наибольшей степени это относится
к измерениям, осуществляемым in vivo. Во внутриклеточной жидкости приходится учитывать
не гомогенность цитоплазмы и защитные реакции организма Многие результаты измерений
нт vivo параметров внутриклеточного пространства, известные из литературы, следует сегод-
ня подвергнуть критическому пересмотру из-за новых сведений, полученных при изучении
реакций организма при отторжении чужеродного тела. ИСЭ чувствительны только к нонам
раствора, который находится в непосредственной близости к электроду. Поэтому электрод
не реагирует па ионы, связанные клеточными мембранами, белками пли другими лигандами,
входящими в состав малорастворимых или комплексных соединений.
В экологической токсикологии одним из основных показателей при характеристике состоя-
ния водоемов, почв и ряда других объектов является pH, определение которого обычно прово-
дят с помощью стеклянных электродов Стеклянные электроды, покрытые полу! рои и наем ой
мембраной с пленкой соответствующего электролита, используют при анализе вол и атмос-
феры для контроля загрязнений NH3, SO,, NO. NO,, CO,, H.S (см. гл. 8.3 и 10). ИСЭ обычно
применяют при контроле содержания анионов (см. гл. 8.6), для которых методов определения
традиционно значительно меньше, чем для катионов. К настоящему времени разработаны и
повсеместно применяются ИСЭ для определения F, CI. Вг. I-, CN. S2 ионов в интервале
концентраций от I01’ до КУ' моль/л. Одной из важных областей применения ионометрии яв-
ляются гидрохимические исследования и определение концентрации анионов и катионов в
разных типах вод (поверхностные, морские, дождевые). Другая область применения ИСЭ —
анализ нишевых продуктов. Создан миниатюрный ИСЭ в форме иглы для определения ионов
непосредственно в мякоти плодов и овощей
Потенциометрическое титрование основано на осуществлении титрования с потенциомет-
рическим контролем за ходом реакции. Выбор конкретного иидшаггорного хлектрода зависит
от используемой для титриметрического определения реакции:
Кислото-основное взаимодействие — стеклянный электрод (Н+ + ОН = Н.О).
Реакции окисления-восстановления — Pl-электрод (Fe2' + Сг,О72" + 14Н* = Fe” + 2Сг’* +
’Н.О).
Реакции осаждения — электроды 1-го рода. ИСЭ (Cl + Ag* = AgCl-l).
Реакции комплексообразования — ИСЭ (Си1* + Н,У,"(ЭДТА) = Си\ + 2!!*).
Потенциал индикаторного электрода измеряют после добавления каждой небольшой пор-
ции титранта. По результатам титрования строят кривую титрования, которая имеет било-
гарнфмическую форму (рис. 6-148). Конечную точку титрования на ней находят по скачку
532 Глава 6
Рис. 6-148. Способы нахождения конечной точки (а) и кривая титрования смеси НО + СН,СООН рас-
твором NaOH (б). Конечной точке титрования отвечает пересечение пунктирной линии с осью «расход
титра «та».
Титрования. Если скачок выражен слабо, то построение кривой титрования в координатах
первая (вторая) производная — v поможет решить проблему (рис. 6-148). Метод имеет ряд
преимуществ перед прямой потенциометрией и титриметрией с визуальными индикаторами.
В отличие от прямой потенциометрии и ионометрии. здесь отсутствуют погрешности за счет
диффузионного потенциала и, кроме того, меньше случайных по1решностей. Преимушес ва
по сравнению с визуальной титриметрией состоят в исключении субъективных погрешностет
при установлении конечной точки, возможности анализа некоторых смесей веществ, когда на
кривой титрования имеется несколько скачков, чаше всего двух (см. рис. 6-148, б).
Вольтамперометрия — методы анализа. основанные на расшифровке поляризационных кри-
вых — вольтамперограмм, которые снимают в электролитической ячейке с поляризующимся ин-
дикаторным электродом и неполяризуюшимся электродом сравнения. Это позволяет одновремен-
но получать качественную и количественную информацию о природе и концентрации вешеств.
восстанавливающихся или окисляющихся на электроде-деполяризаторе. Вольтамперометрия при-
меняется для опрсдс 1сния следовых количеств токсикшпюв в самых разнообраз «ых биологических
жидкостях (сыворотка и плазма крови, моча, слюна, желчь, желудочный сок. спинномозтовая
жидкость) и тканях. При различных заболеваниях (злокачественные опухоли, лучевая болезнь и
др.) полярограммы сыворотки крови и ее безбелкового фил трата заметно изменяются.
Полярография на ртутном капающем электроде. Схема полярографического эксперимента тт
характер получающейся при этом типичной вольтамперограммы (полярографическая кривая,
вольт-амперная кривая, ноляротрамма) приведены на рис. 6-149. Применение именно ртут-
ного капающего электрода обеспечивает хорошую воспроизводимость поверхности капли и
ее постоянное обновление, что в свою очередь гарантирует воспроизводимость полярограмм.
Кроме того, метод позволяет работать в широкой области потенциалов — от +0,25 до —1,8 В
в кислых и до —2,3 В в щелочных растворах. Это открывает широкие практические возмож-
ности для классической ноляро1рафии при определении электрохимически активных ионон
металлов, способных к элсктровосстановлению в этих условиях. Получающуюся вольт-ампер-
ную кривую можно прокомментировать следующим образом. На пологом участке А—В через
ячейку протекает остаточный ток, на поверхности капли образуется двойной электрический
слой — электрод поляризуется. Компонентой остаточного тока является емкостной ток, рас-
ходующийся на поляризацию электрода. При потенциалах, отвечающих точке Б. начинается
про iecc элсктровосстановления ионов металла, атомы которого затем растворяются в ртути с
образованием амалыам М"’ + пс + Hg<-> MHg амальгама, при этом ток начинает резко увели-
чивали (учасюк Б—В).
Величина тока контролируется диффузией Мп' из раствора к поверхности ртутной капли,
поэтому его называют диффузионным. Точке В отвечает предельный диффузионный ток. Но-
вое намечающееся увеличение тока в области после точки Г обусловлено новой электрохими-
ческой реакцией, начинающейся при более отрицательных потенциалах электрода. Описанная
Методы определения токсикантов в биосредах 533
Рис. 6-149. Схема полярографических из-
мерений на ртутном капаюшем катотс (а)
и вид полярограммы (6).
I — электрох» мическая ячейка, содержа
шая ноны восстанавливающегося метадла
М"’ и фоновый мектролит. 2 — капил-
ляр ртутного капающею электрола (РКЭ);
3 — ртутный капающий электрод; 4 — элек-
трод сравнения; 5 — вольтметр: 6 — микро
амперметр: 7 — потенциометр; X — источ-
ник постоя того тока.
Фоновый электролит. обычно КС1 Раство-
ренный кислород удален продувкой азо-
том
картина наблюдается на каждой новой капле ртути. поэтому полярограмма, называемая также
полярографической возной. всегда имеет вил осциллируюшси кривой. Ток. расходующийся на
целевую электрохимическую реакцию, называют фарадеевским.
Полученная кривая содержи! информацию о природе и концентрации М°‘. Первой при
оговоренных условиях эксперимента отвечает потенциал полуволны Eri. Если и растворе име-
ется несколько ионов мстатла и их Е)/2различаются более чем на 150 мВ. на поляро1раммс ре-
гистрируется соответствующее число полярографических волн, что определяет аналитическую
избирательность метода. Функцией концентрации является величина предельного диффузион-
ного тока 1л, описываемая уравнением Ильковича:
1д = хС°.
где х — константа уравнения Ильковича. х= 605zD' -m 'е,/л. D — коэффициент диффузии.
г — число электронов, принимающих участие в электродной реакции, пт — скорость вытека-
ния ртути из капилляра. £ — время жизни ртутной капли.
534 Глава 6
Таким образом, сопас о уравнению Ильковича. можно по градуировочной зависимости
найти концентрацию искомого металла. Стандартными объектами определения являются ионы
металлов. восстанавливающиеся на ртутном катоде: Pb'+. Cd;", Zn2\ Си'" и т.п. Возможности
классической поляротрафии отраничены концентрациями - 10 5 М. препятствием для их пони-
жения является остаточный ток. Существуют много различных вариантов усовершенствования
полярографии. Д иес рассмотрены некоторые наиболее важные из них. обеспечивающие уве-
личение соотношения фарадеевский ток емкостной ток.
Переменно-токовая полярография. Схему эксперимента в переменно-токовой полярографии
иллюстрирует рис. 6-150. В методе синусоидальной перемет ню-токовой полярографии поля-
ризующее напряжение, прилагаемое к ячейке (развертка потенциала), является суммой по-
стоянною (прямая линия на рис. 6-150, а. I) и синусоидального (волнистая линия там же).
Рис. 6-150. Принцип синусоидальной переменно-токовой полярографии (а) и осциллополярографии с
треугольной разверткой потенциала (6).
1 — схема развертки потенциала; 2 — регистрируемая полярограмма; 3 — катодный днффузипонный ток;
4 — анодный диффузионный ток; 5 — анодный пик в случае обратимого i ронесса.
Методы определении токсикантов 8 биосредах 535
При этом через ячейку протекает и постоянны!!. и переменный ток. С помощью устрогства.
назы смого фазовым детектором, измеряется только переменный ток. Его возникновение
объясняется периодическими изменениями концентрации восстановленной и окисленной
форм иона-деполяризатора за счет наложенного переменного напряжения. Поэтому зависи-
мость тока от прилагаемого напряжения приобретает вид кривой с максимумом при потенци-
але. отвечающем потенциалу полуволны в классической полярографии (см. рис. 6-150. а. 2).
Высота пика пропорциональны концентрации Наилучшие результаты получают с помощью
обратимых систем. В этом случае можно определить до 510-7 М металла, обладающего поля-
рографической активностью.
Осциллографическая поляра рафия. В этом методе используют высокоскоростную линейную
развертку потенциала (0,1 — 1 В/с). изменяющегося по линейному закону (см. рис. 6-150, б, 1).
Это позволяет зарегистрировать всю полярограмму за время жизни одной капли ртути в виде
кривой с максимумом калодноютока 3 (рис. 6-150, б, 2). Причина появления максимума в быс-
троте развертки потенциала, когда диффузия за ним не успевает. Высота пика прн этом будет
больше, чем предельный ток в классической полярографии, а чувствительное!ь выше (~10 * М).
Зависимость тока пика от скорое!и развертки потенциала перелает уравнение Рэнгтса—
Шевчика. При треугольной развертке потенциала во время его спада и возвращения к исход-
ной величине можно зарегистрировать циклическую полярограмму, т.е. еще и анодный пик 4.
Развертку по!снциала осуществляют настолько быстро, что за изменением ее и высоты пика
следят с помощью электронного осциллографа. отсюда и название метода — остыл эполяро!
рафия Метод позволяет судить об обратимости электрохимического процесса па электроде.
Так, если пики катодного и анодного токов существенно сдвинуты один относительно другого
(ситуация 4), то процесс необратим Если же расстояние между ординатами пиков мало (ситуа-
ция 5). то имеет место обратимая электрохимическая реакция. Быстрота снятия полярограммы
доведена до малых долей секунды. Безынерционные электронно-лучевые и другие электронные
индикаторы обеспечивают наиболее быструю информацию о составе раствора. Число вешсств,
определяемых полярографическим методом, увеличивается в результате использования новых
электродных процессов, в частности каталитических и адсорбционных.
Инверсионная полярография (вояьатмперометрия). С помощью инверсионной вольтамперо-
метрии чаше всего определяют следы тяжелых металлов в волах и биологических материалах.
Например, вольтамперометрические методики одновременного определения Си. Cd и РЬ. а
также Zn и РЬ или Т1 в питьевой воде включены в стандарт Германии. Важным достоинством
вольтамперометрии является возможность идентифицировать формы нахождения ионов метал-
лов в водах. Это позволяет оценивать качество воды, так как разные химические формы сущес-
твования металлов обладают разной степенью токсичности (см. гл. 8.5). В методе используют
предварительное коштентрирова те определяемого вещества на поверхности индикаторного
электрода, например капле ртути. Электролиз проводят при потенциале предельного тока при
перемешивании раствора в течение непродолжительного времени. Далее перемешивание пре-
вращают. включают анодную развертку потенциала и регистрируют пик анодного растворения
сконпснгрированною в амальгаме металла. Особенность метода — возможность определения
до 10“’—10“10 М РЬ. Си. Cd. Zn н др. Современная инверсионная вольтамперометрия позволя-
ет проводить анализ содержания свинца в цельной крови, исключая стадию предварительной
подготовки пробы. Разработка новых толстопленочных и других модификаий (screen-printed)
электродов позволила создать портативные сенсоры, уменьшив тем самым необходимый для
анализа объем пробы до 1 мл, а к некоторых случаях до 50 мкл. Миниагюрный сенсор для
определения свинца в цельной крови имеет рабочий и вспомогательный электроды (углёрод-
солержащие дорожки, нанесенные на пластиковую основу методом трафаретной печати), а
электродом сравнения служит серебросолержащая дорожка.
Для исключения металлической ртути и ее солей из определения поверхность рабочего
электрода модифицируется малорастворимой солью диэтилдитиокарбамнната ртути (II) Из-
мерительная ячейка имеет объем 0.2 — 0.4 мл. Анализ проводится в три стадии: формирование
рабочей поверхности, накопление, ретисграиия.
Результаты вольтамперометрического анализа цельной крови без предвари!елыюй под-
готовки пробы и с кислотным разложением па специальной установке представлены в
табл 6-62.
536 Глава 6
Таблица 6-62. Результаты 1юлыампсроме|рнческо1о анализа цедык и крови. Фон — 0,5 М HCI
________________Найдено
Образен крови 5ез предварительной проболев»"*' После кислотною разложения,
готовки, мкг/л мкг/л
Образец 1 33.5 ± 2,0 35,0 ± 1,0
Г Образен 2 _______24,0 ± 2,0 '' 22,0 ± 1.5
Наряду с классическим ртутным электродом широко используют твердые электроды — пла-
тиновые. графитовые и др. Они незаменимы при определении веществ, которые нельзя поля-
рографировать на ртутном электроде. Современные методы позволяют с высокой точностью
измерять малые токи за короткий промежуток времени. Поэтому для проведения электрохими-
ческих реакций можно использовать короткоживущие поверхности электродов, изготовленных
из металлов и полупроводниковых материалов. Есть возможность покрывать металлы плен-
ками оксидов или других соединений. Такие электродные поверхности могут быть периоди-
ческого или однократного действия. Использование полярографических методов в прошлом,
очевидно, сдерживалось опасностью работы аналитиков с ртутью. В настоящее время широкое
применение твердых электродов в н вестной мере снимает это ограничение.
Из органических веществ можно определять соединения, обладающие группами, способны-
ми к восстановлению или окислению. Возможности определения органических вешеств мето-
дом инверсионной вольтамперометрии существенно расширяются при использовании хими-
чески модифицированных электродов. Модификацией поверхности электроат полимерными и
неорганическими пленками, включающими реагенты со специфическими функциональными
руинами, в том числе и молекулами биополимеров, можно создать для опре еляемого компо-
нента такие условия, когда аналитический сигнал будет практически специфичным. Исполь-
зование модифицированных электродов обеспечивает избирательное определение соединений
с близкими окислительно-восстановительными свойствами (например, пестицидов и их мета-
болитов) или электрохимически неактивных на обычных электродах. Вольтамперометрию при-
меняют для анализа растворов, но она может быть использована и для анализа газов Сконс-
труировано множество простых вольтамперометрических анализаторов лля работы в нолевых
условиях Полярографические методы введены в официальные фармакопеи ряда стран.
Близкий к полярографии метод амперометрического титрования также с давних пор при
влекает внимание аналитиков. Применяются тавным образом твердые электроды (80%). ртуть
используется все реже. Предложен своеобразный минерально-пестовый шсктрод.
Амперометрическое титрование. Метод основан на измерении величины предельного диф-
фузионного тока в процессе титрования. Диффузионный ток по уравнению Ильковича связан
е концентрацией электрохимически активного компонента, поэтому можно зарегистрировать
линейные кривые различного типа, а конечную точку на них находить интерполяцией линей-
ных участков кривых до пересечения. Метод отличается экспериментальной простотой (не
нужно рсгистриронат ь всю вольтампсро!рамму) и определенными аналитическими во можнос-
тямн при определении различных веществ, в том числе и не обладающих электрохимической
активностью. Кривые титрования приведены на рис. 6-151. Перед итрованисм индикаторный
электрод поляризуют напряжением, отвечающим предельному диффузионному току.
Ку юнометрия и кулонометрическое титрование. Кулонометрические методы анализа ос-
нованы на измерении количества электричества. потребовавшегося для 100% превращения
электрохимически активного вещества. Здесь электрохимическая реакция приводит к полному
исчерпанию вещества за счет его электролиза. В основе кулонометрических методов лежат
законы Фарадея, согласно которым количество элеюронреврашенного вещества прямо про-
порционально количеству израсходованного электричества и для выделения I моль любого
вещества необходимо затратить одно и то же количество элсмрнчсства. « ывасмос числом
Фарадея:
QM
г =----.
Ш’П
где Q — количество электричества, необходимое лля выделения на электроде m граммов ве-
щества с молярной массой эквивалента, равной М/п (М — молярная масса определяемого
Методы определения токсикантов 8 биосредах 537
Расход тртрана мл---------
* СгОд =
ВаСЮ. I
4
РЬ2+ + СгО^~-
pbCro.i
4
Рис. 6-151 Кривые амперомегри iccKOro титрования в различных системах
Электроактивносп.ю обладают:
I — определяемое вещество. 2 — титрант; 3 — определяемое вешество и гигрант.
вешества, и — число электронов, участвующих в электродной реакции). Количество элсктри-
чешва равно произведению тока I на время t: Q = I t.
Количественны^ электролиз можно проводить при поддерживаемом постоянном напряже-
нии или токе. Соответственно различают потенниостатическую и циьвапосгатическую куло-
нометрию (рис 6-152).
Потенщиктатическая кулонометрия Принципиальное значение имеет правильный выбор
рабочего потенциала электрода, поскольку необходимо исключить протекание конкурирующих
реакций и обеспечить 100% выход по току. Это делают, используя поляризационные кривые
всех необходимых систем. В процессе электролиза при постоянном потенциале ток уменьша-
ется. Электролиз проводят до достижения величины остаточного тока. Если ориентируются на
погрешность ~!%, то электролиз проводят до уменьшения начального тока в 100 раз. Для по-
грешности 0,1% за остаточный ток принимают ток, в 1000 раз меньший начального. Количество
затраченного электричества определяют kjk плошадь под кривой изменения тока от времени:
Q- J let с помошью соответствующих приемов.
ц
Кулонометрические титрование основано на генерации титранта, вступающего в аналити-
ческую реакцию с определяемым веществом, с помошью электролиза. Генерацию его элек-
тролизом ведут при условиях, гарантирующих 100% выход по току, когда весь затраченный
ток расходуется только на эту одну реакцию. Условия работы — гальваностатический режим
электролиза и большой избыток вспомогательного вешества. из которого генерируют тит-
рант. Способ установления конечной то гки может быть любым — от индикаторного до под-
ходящего физико-химического, например потенциометрического, спектрофотометрического,
амперометрического и т.н. Примеры элсктрогенсрацни титрантов и область их применения
приведены в табл. 6-63. Метод позволяет определять вещества, обладающие и не обладающие
злектроакгивпыми свойствами. В методе нет проблем с приготовлением и стандартизани
ей титранта, здесь первичные стандарты просто не нужны. Результат титрования находят,
умножая величину тока при электролизе на его время до достижения конечной точки. Со-
временная техника позволяет измерять ток и время с высокой точностью, поэтому кулоно-
метрическое титрование является одним из наиболее точных методов анализа: погрешности
составляют ло 0.1 отн.%.
538 Глава 6
6
Рис. 6-152. Схема эксперимента в потснциосгатнчсской (а) и 1альваностагнчсской (б) кулонометрии.
1 — потснниосгаг; 2 — кулономегр; 3. 6 — миллиамперметр. 4. 7 — вольтметр: 5. 8 — кулонометрическая
ячейка
Таблица. 6-63 Примеры кулонометрического титрования
Титрант Вспомогательный реатп Реакция на генераторном электроде Опреде шемые вещества
Кислотно-основное титрование
ОН Н.О 2Н,О + 2ё <-> ЗОН + 11 Кислоты
н- Н.О Н.О w2H + '/.О, + 2ё Основания
Титрование методом осаждения
Ля* Ag-анол Ag <-> Ag1 + с СГ. Вг . 1
Окислительно-восстановительное титрование
Мп‘ MnSO, Мпь «-» MnJ’ + е l-e(ll). Н С,О4
Вг, Вг Вг. + 2 ё «-> 2Вг As(lll). 1 . <]юнолы
12 1 21- ч-» I, + 2 ё S.O,3 . As(HI)
Методы определения токсикантов в биосредах 539
В настоящее время интенсивно разрабатываются и методы кулонометрии при постоянном
токе, и методы, основанные на регулировании потенциала. Последний прием привлекает вни-
мание избирательностью и возможностью обеспечивать весьма точное определение малых ко-
личеств вешества. Кулонометрнчески можно определять многие неорганические (практически
все металлы. в том числе тяжелые, галогены. S) и органические (ароматические амины, нитро-
и нитрозосоел мнения. фенолы, азокрасители) вешества. Автоматические кулонометрические
анализаторы для определения очень низкого содержания (до 1(У4%) газообразных загрт тнсиий
(SO,. О,. H.S. NO. NO.) в атмосфере успешно зарекомендовали себя в полевых условиях.
Существует еще один электрохимический метод — кондуктометрия, в основе которого ле-
жит измерение электропроводности. В определенных условиях элекгропроводность раствора
или расплава четко зависит от концентрации определяемого компонента. Для измерения элек-
тропроводности используют кондуктометры. Разработан один из вариантов кондуктометрии —
высокочасто i ное титрование. Преимущества метола — его бссконтактность ('лтсктроды при-
кладываются к внешним сторонам сосуда, грубки и т.п.), возможность анализировать мутные
среды, суспензии, эмульсии
Методы вольтамперометрии широко применяются в биохимических и экологических иссле-
дованиях. фармакологии и медицине, например при экспертном определении следов металлов
в нишевых продуктах. животных и растительных гканях для контроля качества средств меди-
цинского применения.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных,. 541
Сегодня в мире самими рас ростраиснпыми наркотическими средствами являются канна-
бис и его препараты (мерихуана. гашиш и гашишное масло), которые относят к категории так
называемых легких наркотиков. Однако авторы этой книги не считают возможным деление
наркотиков на легкие и тяжелые (см. далее). Препаратами каннабиса адоупотребляют 3,9%
взрослого населения. Количество потребителей каннабиса с каждым годом увеличивается.
В Европе этими наркотическими средствами злоупотребляют около 13% населения, в Америке —
23%. в Африке — более 60%. в Азии эта цифра ниже — менее 8%. Производство каннабиса в
2003 г. (в 163 странах) достигло 42 000 т. при этом 30% каннабиса было произведено в Север-
ной Америке. 28% — в Африке. 9% — в Южной Азии и 5% — Центральной Азии (Казахстан
и Киргизия). В УНП ООН в настоящее время зарегистрированы 85 стран — производителей
значительного количества каннабиса. Начиная с 2001 г.. Марокко. Афганистан и Пакистан
отмечены как основные страны-производители смолы каннабиса (гашиша), более 60% которого
попадает в Европу из Марокко, а остальная часть импортируется из Афганистана и Пакистана.
Как следует из материалов УНП ООН. сегояня для мирового сообщества, врагом номер
один среди нелегально используемых наркотиков являются стимуляторы амфетаминового ряда
(САР). Ими злоупотреб: яют более 40 млн человек, что превосходит количество героиновых
и кокаиновых наркоманов вместе взятых. Наиболее высокий уровень употребления САР на
блюдается в Восточной и Юго-Восточной Азии, далее следует Европа. Австралия и США.
Производство САР сконцентрировано в Южной и Юго-Восточной Азии (Китай, Мьянма. Фи-
липпины). Северной Америке (США. Канала. Мексика) и Западной Европе (Нидерланды,
Бельгия). В 2003 г., по подсчетам экспертов УНП ООН, мировой объем производства этих
наркотиков достиг в среднем 422 т (по другим данным, около 500 т) в год. В отличие от ко-
каина и героина, производство которых ограничивается географическими и климатическими
факторами, синтетические наркотики могут производиться повсеместно. Результаты изъятий
оборудования подпольных лабораторий, прекурсоров и ютовых наркотиков, а также отчеты
правоохранительных органов о статистике злоупотреблений свидетельствуют о стабильном
расширении рынка САР по всем параметрам. Практически из всех стран в ООН поступают
сообщения, что основной возрастной группой потребителей САР является молодежь. Число
потребителей САР среди молодых людей, регулярно посещающих ночные клубы и дискотеки,
значительно превышает таковое среди других групп населения. К факторам риска применения
САР относится не только разрушительное воздействие синтетических наркотиков, но и расши-
ряющийся ассортимент этих веществ, продающихся в различных комбинациях. Большинство
исследователей подтверждают тенденцию к снижению интеллектуального уровня, ухудшению
памяти или возникновению ряда психических заболеваний (например, болезнь Альцгеймера)
у потребителей 3.4-мет илендиокснмсгамфегалниа (МДМА) (наркотика, составляющего основу
препаратов, поступающих в оборот пол названием «экстази»).
Кокаин стоит на первом месте среди препаратов злоупотребления среди жителей Американ-
ского континента. В некоторых странах Западной Европы кокаин пока находится на втором
или даже третьем месте среди применяемых нелегальных наркотических средств, однако его
потребление постоянно возрастает. В настоящее время в Европе кокаин употребляют 3.7 млн
человек, из которых более 90% приходятся на Западную Европу. На Американском континен-
те из 9 млн потребителей кокаина почти 45% живут в Северной Америке. Наименьшее число
злоупотреб.юний кокаином приходится на Азию. Производство кокаина в силу природных
условий традиционно сосредоточено в Латинской Америке: Колумбии — 65%, Перу — 23%
и Боливии — 12%. В 2004 г. объем произведенного кокаина составил около 687 т. На черном
рынке наркотиков в Европе розничные цены на кокаин остаются наиболее высокими (в сред-
нем 88 долл, за 1 г. 2004 г.).
По данным УНП ООН. в 2005 г. опиаты, особенно героин, применяли около 16 млн че-
ловек (из них 11 млн — героин) или 0.5% всего населения в возрасте от 15 лет и старше
В 2003 г. незаконный оборот опиатов достиг 476.5 т в морфиновом эквиваленте, из которых
365 т было произведено в Афганистане. Для медицинских и научных целей во всем мире в
этом же году потребовалось 27.3 т морфина. В 2004 г. Афганистан произвел 87% мировой
опийной продукции. Поток наркотической контрабанды из Афганистана оказывает заметное
влияние на паление розничных пен на героин на черном рынке Европы (25 долл, за 1 г) и
США (75 дозы, за 1 г), тем самым способствуя расширению круча погребителей этого наркоти-
542 Глава 7
ка. Несмотря на проводимую с 2001 г. в Афганистане антитсррористи 1ескую операцию стран
НА ГО, производство опия, к сожалению, не уменьшилось. Так. в 2004 г. объемы афганского
героина составили 420 т (или 4200 т в опийном эквиваленте), а доходы от их производства и
контрабанды — около 2.8 млрд долл. США или 60% внутреннего вялово о продукта. В 2005 г.
по подсчетам экспертов УНП ООН. урожай опия составил 4100 т (или 410 т в героиновом
эквиваленте). Большинство злоупотребляющих опиатами (около 8.5 млн человек или около
половины всех потребителей опиатов в мире) приходится на Азию, особенно на страны, рас-
положенные вокруг Афганистана и Мьянмы. Обшее количество потребителей наркотиков этой
группы в Европе составляет в 4.5 млн человек или 30% всех злоупотребляющих препаратами
в регионе, из которых 2/3 потребителей опиатов приходится на Восточную Европу. Наиболее
высокий уровень хюупотребления опиатами в Европейском регионе, согласно данным УНП
ООН. приходится па Восточную Европу, включая Россию.
Поданным Министерства здравоохранения РФ, с 1995 по 2000 г. в России наблюдали четы-
рехкратный прирост числа опийных наркоманов и увеличение их в среднем на 27% ежегодно
в период с 1991 по 2000 г В 1988 г. в СССР на учете состояли 50 тыс. больных наркоманией
в 1995—1997 гг количество лип. применяющих наркотики с немелиггинской целью, составля-
ло уже 1.5 млн человек. Обшее число наркоманов в 2005 году, по разным оценкам, составило
в стране от 3 до 8 млн человек, причем из них юлько около 500 тыс. являлись пациентами
наркологических диспансеров. В первой половине 90-х г. XX века в России рейтинг предпо-
читаемых наркотиков ггредсгавлен следующим обра ом препараты из конопли — около 50%,
кустарные препараты из мака — около 30%. промедол, морфин и омнопон — 19%. друтс —
1% Если в начале 90-х годов наркоманы в Москве использовали героин в 0,6% случаев, го к
2000 г. доля опиатов и героина резко возросла. Среди оольных наркоманиями, поступавших
в этот период на стационарное лечение. 75% составляли погрсбители героина. В 2003 г. в не-
которых per ионах России, в том числе в Москве и Московской области героин в незаконном
обороте наркотиков составил 90%. Практически весь героин, поступающий в Россию, имеет
афганское происхождение.
Согласно мнению разных исследователей (медиков, психологов, социологов и др.), мотивы
возникновения наркомании и токсикомании могут быть различными. К наиболее известным
можно от гести:
• любопытство относительно действия наркотического вещества:
• желание быть принятым определенное группой;
• выражение независимости, а иногда враждебного настроения по отношению к окружаю-
щим:
• познание нового опыта, приносящею удово. ьствие. волнующего или таяшего опасность'
• достижение «ясности мышления» или « вор геского вдохновения»:
• достижение чувства полного расслабления;
• уход от гнетущих проблем и грудное геи.
Девиации (отклонения) — естественный, закономерный, необходимый способ изменения
физических, биологических, социальных систем. Девиации (флюктуации) в неживой природе,
мутации в живой природе служат механизмом изменчивости, следовательно, существования и
развития каждой системы. Социальные девиации и девиантное поведение могут иметь двоякое
значение. Одни из них — позитивные — выполняют негэнтроиийную функцию, служат средс-
твом (механизмом) развития системы, повышения уровня ее организованности, устраняя, пре-
одолевая устаревшие стандарты поведения. Это социальное творчество во всех его проявлениях
(техническое, научное, художественное и т.п.). Другие же — негативные — дисфункциональны,
дезорганизуют систему, повышают ее энтропию (преступность, терроризм, коррупция, пьянс-
тво и лр.). Социальная норма выражает исторически сложившийся в конкретном обществе
предел, меру, интервал допустимого (дозволенного или обязательного) поведения, деятельнос-
ти индивидуумов социальных групп, организаций.
В отличие от с тественных норм г ротскания физических и биологических процессов, со-
циальные нормы складываются как результат отражения (адекватного или искаженного) в
сознании и поступках людей закономерностей функционирования общества. Границы меж-
ду позгггивным и негативным девиантным поведением подвижны во времени и пространстве
социумов. В одном и том же обществе сосуществуют различные нормативные субкультуры.
weiauojiMJM и определение наркотических средств, тчмхитропньи... 'ЬиЪ
Организация и дезорганизация, норма и аномалия. энтропия и негэнтропия дополнительны
(в понимании Н. Бора), их сосуществование неизбежно, они неразрывно связаны между собой
н только совместное их изучение способно объяснить исследуемые процессы. Нс существует
каких-либо форм деятельности (повеления), которые бы были девиантны по своей природе, по
своему содержанию, perse, aui generis. Все социальные девиации онюентельиы. носят конвен-
циональным характер в зависимости от ценностей и норм, господствующих в конкретном об-
ществе. Конструируя различные формы девиантности (преступность, наркотизм, прос итуния
и др.), общество, государство определяют также формы и методы воздействия на девиантов,
попишку в отношении них. страте! ию и тактику социального контроля над девиантностью
(девиантным повелением и его носителями).
Вместе с тем необходимо различать причины отдельных девиаций как единичных явлений
и причины девиантности как массового явления.
Объясняя детерминацию девиантного поступка конкретного человека, следует учитывать вли-
яние грех составляющих: внутреннюю объективную причин)' (например, психофизиологическое
расстройств), внутреннюю субъективную причину (решение самого человека как акт ею сво-
бодной воли) и внешнюю причину (воздействие окружающей среды в настоящем или прошлом
опыте человека). В отличие ог форм индивидуальных отклонений, в детерминации форм мас-
совых отклонений доминирующее значение приобретают внешние причины. Установлена связь
между уровнем образования и некоторыми видами !рсступностн. Так. преступления, связанные
с наркотическими средствами, психотропными и сильнодействующими веществами, чаще всею
совершают лица без постоянного источника дохода и с низким уровнем образования. Обнару-
жилось новое явление, получившее название «расширение охвата». Оно связано с возрастанием
чиста лип, попавших в поле зрения специальных социальных служб. Казалось бы, это должно
радовать общественность. Попав в поле зрения системы. они становятся предметом ее труда,
петь которого — во что бы го ни стало исправить правонарушителя. Установление контроля де-
лает поступок известным широкому окружению (родственникам, друзьям, соседям школе), спо-
собствует закреплению алгоритма повеления, обусловливает дальнейшее развитие девиантной
карьеры, что приводит к автоматическому исключению такого человека из многих социально
одобряемых процессов. Отчуждение проявляется в разного рода девиантных поступках людей —
от ухода в потребление алкоголя или наркотиков до совершения тяжких преступлении
Среди факторов, порождающих наркоманию (девиантное отклонение), условно можно вы-
делить три основные группы, каждая из которых многочисленна. Это макросониальпые. мик-
росоциальные и психопатологические факторы. К макросопиальным факторам можно отнести
отсутствие целостной информационной страте! ин. ориентирующей молодое поколение на со-
хранение собственного здоровья и работоспособности как основного и обязательного фактора
жизненного благополучия или неосторожное и зачастую легкомысленное обращение с материа-
лами о наркотиках в отдельных средствах массовой информации, приводящее к формированию
нездорового интереса к потреблению и потребителям, позитивного к ним отношения. Приме-
ром микросониального фактора может служить влияние ближайшего окружения индивидуума
(близких родственников с определенными социально-психологическими характеристиками).
Группа (психопатологических) <] акторов обусловлена генетически. Так. тревожно-мнительные
черты характера, являющиеся основой психастении. при значительной выраженности могут
быть и основой систематической наркотизации (алкоголизации). Наркотики приобретают
коммуникативную и транквилизирующую (вернее, заменяющую ее. эйфоризируюшую) функ-
ции. Чем более выражены тревожно-мнительные черты, тем менее уверенно чувствует себя
ребенок (подросток, взрослый человек) в жизни, тем более он нуждается в психологической
помощи, чтобы нс прибегну! ь к «поддержке» наркотиков. Гармонично развивающийся под-
росток, теплые отношения в семье и благоприятные со сверстниками не являются гарант! ей
отказа от наркотиков. Среди людей с высокими интеллектуальными возможностями тоже есть
наркоманы В этих случаях причиной начала наркотизации нередко служит информационная
недостаточность. Психологические механизмы начала наркотизации заключаются в том, что
окружающие микросониальные условия не предоставляют хорошо развитому индивиду доста-
точных оснований для эмоционального и интеллектуального насыщения. Жизнь в этих случаях
субъективно воспринимается человеком как скучная. Поиски насыщения моционалыюй сфе-
ры и повышения интеллектуа. ьной нагрузки провоцируют потрешение «интеллектуальных»
544 Глава 7
наркотиков (кокаин) или синтетических опиоидов. В подобной ситуации психиатр-нарколог
встречается с «идейными* наркоманами, интеллектуально воспринимающими наркотики как
высшее благо. Однако сразу встает вопрос о генах предрасположенности или болезнях, кото-
рые нас выбирают (см. гл. 3.3). Ни одна группа факторов ни в одной возраезной и социальной
группе людей не является определяющей в приобретении наркозависимости конкретным че-
ловеком в любом возрасте. Только духовное овершенствование личности человека может стать
самым надежным барьером или спасением. «Человека полнощью нс одолеют ни ангелы, ни сама
смерть, кроме как через слабость его собственной ничтожной воли» (Д. Гланвиль, 1636—1680.
английский философ). Бысгро меняющаяся ситуация в области нелегального оборота нарко-
тиков привела к резкому увеличению числа исследований по определению наркотических и
одурманивающих веществ в организме человека, выполняемых в последние годы химико- гок
сикологически.ми лабораториями.
Наркотические средства, наркомания, токсикомания
Наркоманией называется группа заболеваний, которые проявляются влечением к постоянно-
му приему в возрастающих коли ествах наркотических средств вследствие стойкой психичес-
кой и физической зависимости от них с развитием абстиненции. В нашей стране к наркомании
относят патологическое пристрастие к веществам, которые указаны в Перечне наркотт чсских
средств и психотропных веществ, утвержденным Правительств» м Российской Федерации (см.
гл. 1.5). Употребление одним липом сразу нескольких веществ из перечня называют полинарко-
манией. Злоупотребления другими веществами считают токсикоманиями.
Термин «наркотическое средство и психотроп юе вещество» включает 3 критерия: медицине
кий. социальный и юридический. Они взаимозависимы и в правовом аспекте обязывают при-
знавать средство наркотическим только при наличии всех 3 критериев.
Медицинский критерий состоит в том. что средство или вещество должно оказывать только
специфическое действие на центральною нервную систему (ЦНС) (стимулирующее, седатив-
ное, галлюциногенное), которое было бы причиной его немедицинского применения.
Социальный критерий подразумевает, что немедицинское применение препарата приобрета-
ет такие масштабы, что становится социально значимым.
Юридический критерий исходит из общих вышеуказанных предпосылок и требует, чтобы
соответствующая инстанция признала данное средство наркотическим.
Термин «психотропные вещества» з~акжс употребляется как с медицинской, так и с юриди-
ческой позиции. Международная конвенция о психотропных веществах 1971 г. определила, что
в список психотропных вешеств могут включаться только тс. которые вызывают патологичес-
кое привыкание, оказывают стимулирующее или депрессанпзое воздействие на ЦНС, вызыва-
ют галлюцинации или нарушение .моторной функции, либо мышления, либо поведения, либо
восприятия, либо настроения и если такое воздействие может нрсдставизь собой проблему для
здоровья населения или социальную проблему.
Термин «психоактивные вещества» целесообразно применять к тем веществам, которые не
отнесены к наркотическим и психотропным веществам.
Лекарственная зависимость — форма зависимости, развивающаяся, как правило, в отноше-
нии психотропных ripen аратов. В соответствии с положением, разработанным ВОЗ в 1964 г.,
лекарственная зависимость определяется как состояние психической ши физической зависи-
мости от некоего вещества, действующего на ЦНС и принимаемого либо непрерывно, либо
время от времени. Это определение охватывает по сути все биологически активные вещества
и, следовательно, такие, как алкоголь, табак, наркотики и лр.
Синдромы, общие для всех форм наркоманий:
• синдром измененной реактивности организма к действию данною наркотика (защитные
реакции, толерантность, форма потребления, форма опьянения):
• синдром психической зависимости (психический комфорт в интоксикации):
• синдром физической зависимости (компульсивное влечение, потеря контроля над лозой,
абстинентный синдром, физический комфорт в интоксикации).
Эти 3 синдрома, составляющие большой наркоманический синдром, отличают наркомана от
здорового человека. Структура наркомании растянута во времени. В ра витии болезни синдро-
мы возникают не одновременно. Сначала возникают синдром измененной реактивности и сип-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 545
дром психической зависимости. Употребление сильных эйфоригепных средств сопровождается
проявлением первого болезненного при знака — мечения (синдром психической зависимости).
Употребление слабых ^йфорпзнруюших веществ даст время для проявления симптомов, входя-
щих в синдром измененной реактивности, затем становится наглядным влечение к повторному
опьянению Синдром физической завис imoctii формируется позже на фоне возникших и про-
должающих свое развитие синдромов измененной реактивности и психической зависимости.
Нередко говорят о пристрастии, рассматривая этот термин как синоним зависимости. Тем не
менее между понятиями существуют существенные различия По определению ВОЗ (1957).
пристрастие — это состояние, связанное с периодической или постоянной интоксикацией,
произвольно вызываемой ио греб тстигехг натуральных пли синтетических веществ и характери-
зующееся 4 признаками:
• непреодолимым стремлением к потребтснию ве пества;
• тенденцией к постепенному увеличению вводимой дозы;
• психической или физической зависимостью от токсиканта:
• опасностью как для отдельного л ина. так и для общества.
Зависимость является лишь одним из неотъемлемых атрибутов пристрастия. В настоящее
время принято выделять 6 основных типов химического пристрастия:
• морфиновый тип: сильная психическая и физическая зависимость с постепенным развити-
ем толерантности;
• бзрбитурат-аткогольнын тип: выраженная психическая и физическая зависимость е разви-
тием толерантности;
• кокаииовь й тип: сильная психическая зависимость, при отсутствии физической зависимос-
ти: толерантность развивается юлько в условиях эксперимента;
• каннабиноловый тип: выраженная психическая зависимость при отсутствии или слабо вы-
раженной физической зависимости: отсутствие толерантности;
• галюниногенный тин: выраженная до сильной психическая зависимость при отсутствии
физической зависимости; значимая толерантность:
• амфетаминовый тип; значимая, но индивидуально по-разному проявляющаяся психическая
зависимость при огсутствии физической зависимости: сильная толерантность.
Под психической зависимостью понимается состояние, при котором химическое вешество
вызывает чувство удовлетворения. психическою подъема и которое требует периодически во-
зобновляемого или постоянного введения средства для тою. чтобы испытать удовольствие или
избежать дискомфорта.
Физической завис! мостыо обозначается состояние, которое проявляется интенсивными рас-
стройствами многих функции организма вплоть ло легального исхода, когда прекращается
вне еиие соответствующего лекарственного средства. Характерными признаками физической
зависимости являются;
• повторное введение вещества в течение нескольких педель;
• обязательное сочетание с развитием толерантности (толерантность — привыкание, сниже-
ние эффективности действия вещества (или пониженная реакция организма) при повтор-
ном введении |:
• проявление фпзическ и зависимости, как правило, сопровождается выраженной психичес-
кой зависимостью;
• проявления токсического действия вешества противоположны симптомам абстинентного
синдрома:
• отсутствие обязательной связи между перекрестной толерантностью гг перекрестной физи-
ческой зависимостью к препаратам разных групп:
• максимальная интенсивность проявлений абстинстного синдрома в первые 4 сут после от-
мены с прекращением симптоматики через I—2 нед.
При Абстиненции резко проявляются вегетативные расстройства: сердцебиение, потливость,
тахикардия. В костях и мышцах появляются мучительно-болезненные, тяпушис боли («ломка»).
Больным овладевает сильное беспокойство, сопровождающееся криками, стонами, появляются
судороги (парестезия) конечностей. отмечаются потеря аппетита, тошнота, рвота, понос, боли
в животе, бессонница. Обман, подкуп, ложь, воровство — все пускается наркоманом в ход с
целью раздобыть наркотик или что-либо его заменяющее.
546 Глава 7
Эйфорией обозначают состояние психики в наркотическом опьянении. Э тфория слагается
hi эмоциональных проявлений, психических и сомитнческих (телесных) чувствований. Каждо-
му наркотику свойственна особая структура эйфории.
Для характеристики пе.мел1гштиского применения психоактивных субстанции часто исполь-
зуют термин •моупотреГмение*. который подчеркивает несовместимость приема данного ве-
щества с существующими социальными нормами. Вместе с тем именно общество в конкретных
исторических условиях определяет перечень вешсств. запрещенных для легального употребле-
ния. Например, и некоторых мусульманских странах запрещен прием алкоголя, но при этом
употребление опия или гашиша не считается грубым поведенческим отклонением Изменение
политических и социальных условии пере тко приводит к пересмотру официального отношения
к психоактивным веществам. Не так давно правительство Ирана нс только запретило наряду
с алкоголем наркотики, но и ввело смертную казнь за их употребление и распространение.
В друг тх мусульманских странах (со светской формой правления) алкоголь фактически легали-
зован. В Европе и США несмотря на наличие длительных традиций употребления спиртных
напит ков, в разное время делались попы тки запрети ъ иди резко ограничить употребление
алкоголя («сухие законы» в дореволюционной России. США. Финляндии. СССР). В неко-
торых европейских странах традиционно негативное отношение к употреблению наркотиков
постепенно трансформируется в свободный, контролируемый государством доступ к ним (так
называемый британский полход).
Парадокс наркомании как и подогни заключается в том. что в наркотической интоксикации
больной чувствует себя значительно комфортнее, чем в обычных условиях Это явление объяс
няется главным отличительным свои твом наркотиков — вызывать эмоционально-позитивные
и иеифализотзап» эмоционально-негативные реакции. Потому собственно состояние нарко-
тической интоксикант и субъективно не может восприниматься отрицательно, чго иодтверж
дается резулт агами анализа жалоб больных Последние, как правило, напрааттены на труд-
ности в приобретении наркотика, абстинентные яатенизт при внезапной отмене препаратов,
снижение интереса к жизни, астенические явления, навязчивое или компульсивное влечение
к наркотику, плохое самочувствие вне наркотизации. Нередко обращение за помощью проис-
ходит в результате дааления со стороны близких Зависимость от наркотиков в большинстве
случаев больными осознается, но в контексте жалоб прямо не звучит. В холе лечения иди вы-
нужденною прекращения наркотизации нерезко удается достичь состояния, обеспечивающего
нормальную адаптацию даже в тяжелых, непривычных условиях (например, в учреждениях с
регламентированным режимом). Тем не менее в абсолютном большинстве елхчаев заболевание
рецидивирует Наркоманы предпочитают взаимодействовать с окружающей средой в патоло-
гическом состоянии наркотической интоксикации. Как уже отмечаюсь выше, адаптационная
способность больною на фоне регулярной наркот изации может быть лучше, чем в преморби-
дс наркомании. Отмена наркотика ведет к обнажению наркоманического дефекта личности
или прсморбидных личностных аномалий, претерпевших декомпенсацию. В таком человеке
«ложно не его наружное, а его внутреннее: он не хочет казаться пустой поверхностью, какую
он представляет из себя тта самом деле» (Ф. Нитште). В этих случаях говорить о стабилизации
состояния, соответствующего преморбидному уровню, вообще нс приходится. Гаким образом,
соотношение понятий обшей патологии •ддоровтл—болезнь» как «адаптация—дезалаттгапия» в
клинике наркоманий выгляди г иначе: «здоровье—боле знь» как «адаптация—вторичная адапта-
ция» (искусственная и патологическая по своей сути).
Суммируя изложенное выше, можно сделать следующие выводы.
• Наркомании отличаются от остальных соматических и психических заболеваний комплек-
сом факторов, приводящих к невозможное пт использования влечении данной формы па-
тологии гралшшонных концепций «здоровье—болезнь» и общепринятых методологических
подходов к стратегии и тактике лечебного процесса.
• Специфика наркоманий ведет к бе зуслонному доминированию частного над общим, а имен-
но к необходимости рассмотрения каждого конкретного случая в контексте взаимодействия
препарат—пациент—среда и невозможности создания унифицированных методов лечения
данной формы патологии.
• Наркомании являются патологией, имеющей не только медицинский, но и социальный
аспект. Поэтому ффекгивность работы по борьбе с данной патологией определяется в
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 547
большой степени согласованностью медицинских н немелипинских (сопиачьиых. право-
вых. законодательных и тл.) воздействи 1. Более того, преувеличение роли одной из сторон
приводит к резкому снижению эффективности борьбы с наркоманиями (пример — провал
антиалкогольной кампании 1985—1986 гг. в СССР).
7.2. НЕЙРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ НАРКОТИЧЕСКОЙ
И ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЗАВИСИМОСТИ
Нейрохимические механизмы развития зависимости
Механизм действия наркотиков к к причины возникновения лекарственной зависимости
до конца не изучен. Однако в последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в
исследовании нейрохимических и нейроанатомических систем, которые имеют отношение к
химической зависимости. Оказалось, что и процесс формирования пристрастия к алкоголю,
опиатам и кокаину вовлечены общие биохимические механизмы, несмотря на ю что каждое
вещество, к которому ра вивастся привыкание, по-видимому, действует на различные анато-
мические центры этой системы.
LiKWft/b активирует норадреналиновые рецепторы мезолнмбнческой системы через каскад
синаптических передач, включающих серотонин, эндогенные опиоиды и дофамин.
Опиаты, по-видимому, взаимодействуют с системой удовол1ствий через опосредованную
опиатными рецепторами активацию мезолимбической дофаминовой системы. Кроме того, вза-
имодействуя непосредственно с опиатными рецепторами ИНС. опиаты и опиоиды вызывают
соответствующую реакцию организма в виде аналгетичсского. эйфорического. седативного и
других эффектов.
Кокаин является непрямым агонистом катехоламиновых рецепторов и. по-видимому, вызы-
вает удовольствие в терминальных отделах мезолимбической дофаминовой системы
Амфетамин и его аналоги обладают способностью высвобождать из гранул пресинаптичес-
ких нервных окончаний норадреналин и дофамин и стимулировать, таким образом, централь-
ные норадреналиновые и в большей степени дофаминовые рецепторы Группа амфетаминов
оказывает также небо тыпос иш пбируюшее влияние на активность моноаминооксидазы (МАО)
и тормозит обратный нейрональный захват дофамина и норадрепапина.
Каннабис реализует свои эффекты через дофаминовые и серотониновые рецепторы.
Эффекты диэтиламида лизергиновой кислоты (ЛСД) проявляются путем воздействия надо
фаминовую и серотониновую системы; в частности галлюциногенный эффекг обеспечивается
влиянием на серотониновые рецепторы мозга.
В качестве нейробиологических механизмов развития зависимости рассматриваются следую-
щие.
• Вещество — агонист рецептора (фенамин, наркотический аналгетнк и др ) угнетает высво-
бождение нейромедиатора с одновременным уменьшением числа возбуждаемых рецепторов
или изменением их функциональных свойств. Эти изменения более продолжительны. чем
время действия агониста, поэтому в случае невведенпя вещества тонус нейромедиатор!юн
системы понижается, что сопровождается развитием абстинетного синдрома.
• Токсикант повышает выброс нейромедиатора нз прссинаптических структур (например,
усиление выде гения дофамина при действии амфетамина) или блокирует его обратный за-
хват (кокаин). В итоге запасы нейромедиатора при длительном введении истощаются. Отме-
на препарата приводит к выраженному дефициту трансмиттера, гипофункции медиаторной
системы, что и сопровождается развитием абстиненции
• Препарат сенсибилизирует рецептор к действию нейромедитора. Развивающиеся при этом
адаптивные процессы более продолжительны, чем действие вещества. В итоге прекращение
введения вещества сопровождается гипофункцией нейромедиаторной системы с развитием
синдрома отмены (бензодиазепины).
• Вещества вызывают стойкие адаптивные изменения физико-химических свойств биологи-
ческих мембран и вследствие этого нарушение их возбудимости. Отмена препаратов приво-
дит к развил ию абстиненции (спирты, органические растворители — алкоголизм, токсико-
мании).
548 Глава 7
Рис. 7-1. Медиаторные структуры иона человека, участвующие в образовании химической зависимости.
Пояснение в тексте.
Не так давно бы ш предложена модель (рис. 7-1). описывающая комплекс нейроанатоми-
чески х структур и нейрохимических реакций, участвующих в формировании механизма удо-
вольствия мозга, названная нейромо.тулпруюшим каскадом удовольствий («the neuromoclulator
reward cascade»)- Нейрохимический дефицит мелиаюров. являющийся результатом хтоупот-
ребления психоактивными препаратами, по-видимому. приводит к неконтролируемому пове-
дению (страстному желанию) как у люде i. так и у животных
Серотониновые нейроны, на ковер ностн коюрых находятся рецепторы (5-СН). в гипотала-
мусе проеиирхюгся на метэнкефалпновые нейроны (МЭпк), ингибирующие мсзсннсфалическую
проекцию ГАМК-нейронов (рспспюров). Эш нейроны в свою очсрс.ть ингибируют дофамино-
вые (ДА)-нейро гы. которые П|зоеиируются как на ростральные ядра шва, так и на гатеральные
дофаминовые нейроны миндалины. ДА нейроны миндалины связаны нервными волокнами с
КА -o6.ukп>ю гиппокампа. Норадреналиновые (НА) нейроны синего пятна (locus cocruleus) про-
ецируют на область гиппокампа (КА^ соответствует несколько различных областей), которая со-
держи! поргшреналип. ГАМК-нейроны, проецирующие внутри гиппокампа, направляются к раз-
личным НА-co. кржащим К.\-областям Иейропсптиды регулируют опиоидные нейроны, которые
действуют па активированный ДА в ялрах шва (nucleus accumbent). Предо, laraior. чго МЭнк инги-
бирует неизвестный интернейрон, который в свою очередь вызывает взаимодействие ДА и ЛДК
(лофтлекарбоксилазы). Представленный механизм хотя и является экспериментально доказанным,
тем не менее значительно упрощает проблему. Ни в коем случае неиробиоло! и lecKiie основы за-
висимости нельзя рассматривать в отрыве от сложных психофизиологических и психосоциальных
факторов, особенностей структуры личности больного наркоманией (см. выше)
У всех вешеств. способных вызвать синдром зависимости, имеется общее звено фармаколо-
гического лейст вия — характерное влияние на катехолам и нову ю нейромелиапию в лимбических
структурах мозга, в час гное in в системе подкрепления. Эта система учашвусг в обеспечении
регуляции эмоционального состояния, настроения, моппзационной сферы, психофизического
тонуса, повеления человека в целом, его адаптации к окружающей среде.
Вветсние в организм любого наркотического или психо тропного средства запускает в ход
цепочку биохимических реакций, которая приводит к адекватному ответу клетки или органа
либо целого организма в виде специфической реакции, которая может быть оценена визуально
или с помощью различных приборов.
Опиатная эйфория слагается из ощущения соматического наслаждения и эмоционального
фона покоя, блаженства, рассл блеииости. отрешенности от реального мира (нирвана). Внеш-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных.., 549
нис при знаки наркотическою опьянения: сужение зрачков, бледность кожных покровов, су-
хость слизистых оболочек и кожи, гипотония, угнетение дыхания, пониженная активность
кишечника, запор. Характерное» особенностью морфиновой и героиновой наркомании явля-
ется развитие абстиненции. Наркоманы, у которых абстиненция ярко выражена, принимают
наркотики уже не лля ощущения эйфории, а для того чтобы подавить абстиненцию и быть
работоспособными.
После приема стимуляюров (кокаин, 11|юизволиые амфетамина) зйфория ощущается как
активация интеллектха ьной деятельности, душевный подъем. интеллектуальное просветление.
Наркотическое опьянение сопровождайся повышенным настроением, болтливостью, возбуди-
мостью, ощущением прилива физических сил. При приеме стимуляторов выражена психи-
ческая зависимость, физическая зависимость незначительна. Однако при отмене препарата
часто проявляется выраженная депрессия с состоянием сильнейшей тревоги. Внешние призна-
ки наркотическою опьянения, расширение зрачков, повышение температуры тела, бледность
кожных покровов, физическое истощение при снижении или отсутствии аппетита.
Эйфория после приема галлюциногенов (ЛСД. гашиш) сопровождается расе тройством вос-
приятия в сочетании с особым состоянием сознания мистического, фантастического содержа-
ния. Ли зергиповос опьянение характеризуется яркими, цветными фантастическими картинами,
галлюцинаторными переживаниями. лезорпешироикэй во времени и пространстве, (еряется
ощущение реальности, мир представляется захватывающе интересным. Нередки неадекватные
поступки. приводящие к лета ытому исходу и тяжелым правонарушениям. Внешние признаки
наркотического опьянения ЛСД то расширение. то сужение зрачков в такт паханию. ощуще-
ние жара, повышение температуры, слюнотечение Чувство готода одновременно с тошнотой.
Внешние при знаки гашишизма: расширенные зрачки, покраснение липа, дрожь в руках, по-
вышение либидо и потенции, усиление аппетит».
Все вышеописанные симшомы являются диагностическими признаками лля определения
характера наркотического опьянения Однако лля установления факта употребления наркоти-
ков необходимо идентифицировать наркотическое средство в биопробах, взятых у подозрева-
емого (см ниже).
Боль и опиатные рецепторы
Проблема боли и обе болнвапия с давних в|кмеи привлекала внимание людей. Воль — яв-
тение. затрагивающее различные аспекты деятельности человека и общества в целом. Опа
служит симптомом большинства острых п хронических заболеваний человека, создает в совре-
менном обществе рты проблем медицинского, социального и экономического характера.
Тысячелетний опыт изучения феномена боли показал, что. несмотря на кажущуюся про
CTOiy тгого имения, оно выражается и разнообразных физиологических, биохимических и
психоло!нческих реакциях организма, которые тесно связаны со всеми сферами деятельности
человеческого общества
Сущеспзую|иие взгляды па рецепцию боли отражают теоретические воззрения, появивши-
еся в XIX веке и до последнего времени практически не вызывавшие сомнений. Онредеаяю-
шнми считались два взгляда па рецепцию боли, наличие специфических болевых рецепторов и
восприятие боли любыми рецепторами, когда раздражающий стимул достигает определенной
величины.
,1дя изучения механизмов формирования боли большое значение имело открытие опиат
тых рецепторов и медиаторов, взаимодействующих с репей горами в различных отделах мозга.
Впервые существование рецепторных зон па поверхностных мембранах нейронов, высокоаф-
финпых к молекулам морфина, бы ю продемонстрировано в 1973 i
Опиоидная система включает опиатные рецепторы, опиоидные пентилы, а также ферменты,
ост шее пеняющие синтез и расщепление ониои тпых пептидов (рис. 7-2).
Опиатный рецептор — клеточный рецептор, способный избира1слыю взаимодействовать с
морфином или некоторыми нейропептндами (энкефалинами. эндорфинами, динорфпнами).
Конформационное состояние опиатного рецептора. способного к взаимодействию, определя-
ется в первую очередь концентрацией ионов натрия в среде, окружающей клетку. В настоящее
время идентифицировано несколько типов опиатных рецепторов: мю (р), дельта (А) и канна
<кт Было установлено. чго А-рсцепгоры подразделяются на А и А. Сродство опиатов и опио-
550 Глава 7
Рис. 7-2. Действие эндогенных и экзогенных опиатов нз опиатные рецепторы (по Ijjllmann 11. ci al
2000).
илов к определенному типу рецепторов объясняет различия в нх фармакологическом действии
(рис. 7-3).
А-Ренеи горы имеют высокое сродство к энкефалинам Различают и несколько субтинов
к-репепторов. ц-Рецепторы реализуют следующие эффекты наркотиков: супраспиналы1ую ана-
лгезию. эйфорию, угнетение дыхания, физическую зависимость. Лигандами лля к-репепторов
являются другие бензоморфановые препараты. Через к-рсцснтороры реализуется спинальная
аналгезия, миоз, седативные эффекты, гипотензия.
Недавно р-, Д- и к-ренепторы были клонированы, что позволило объединить нх в группу
G-белоксонряжсиных рецепторов (см. гл. 3). Опиатные рецепторы обнаружены в различных
центрах гипоталамуса. ствола мозга, в миокар с, широко представлены на периферии.
Механизм аналгетичсского действия морфина заключается в нарушении суммирования бо-
левого импульсн В таламусе. который является коллектором боли, происходит суммирование
болевых импульсов. Если ввести морфин и нанести одиночный болевой раздражитель (одиноч-
ный укол), то организм отреагирует на такую боль. Морфин действует только для устранения
множественного потока болевых импузихов. например с раневой iiOBcpxnocni. Морфин ока-
зывает влияние на лимбический отдел мозга, где происходит эмоциональное восприятие, на-
рушает эмоциональную и психическую опенку боли, устраняет страх, ужас. В путях передачи и
интеграции оценки боли медиагорами являются специфические пептиды — эндорфины и энке-
фалины, которые обеспечивают эффект обезболивания, связываясь с опиатными рецепторами
Энкефалины — два близких по своей структуре пептида, состоящих из пяти аминокислотных
остатков. Один из них, получивший название метионин-энкефалина. содержит последователь-
но расположенные остатки тирозина, глицина. фенилаланина и метионина, в го время как в
другом, названном лейцин-энксфалином. пятый аминокислотный остаток представлен лейци-
ном. Иммунохимические методы (ИХМ) позволили установить распределение энкефалинов
в тканях мозга, которое повгоряет распределение опиатных рецепторов. Кроме зканей мозга.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 551
Рис. 7-3. Сродство ониа юн и опиои-
дов к определенном* тину рецепторов
объясняющее различия в их фармдко-
ло1ичсском действии (но Lullmann Н.
et al. 2000).
высокая копнен Гранин энкефалинов была обнаружена и элите I ш желудочно-кишечного трак-
та позвоночных, что. очевидно, объясняется филогенетической близостью пищеварительной
и нервной систем. Увеличение содержания медиаторов (агонистический эффект) приводи) к
торможению, уменьшению боли. Морфин является агонистом опиатных рецепторов, повторяя
эффект эндорфинов и энкефалинов. способствует выбросу эндорфинов из пресинаптпческой
мембраны (рис. 7-4) Но морфии оказывает и непрямое действие. Эндорфины и энкефалины
разрушаются ферментом эн кефали налом. Непрямой эффект морфина связан с угнетением ак-
тивности этого фермента.
Распространенность опиатных рецепторов и их чувствительность весьма различаю гея у кон-
кретных индивидуумов. причем мужчины в основном хуже переносят боль, чем женщины.
Серотонин и депрессии
Серотонин (5-окснтриптамип. производное аминокислоты триптофана, serotonin) — нейро-
трансмиттер ЦНС. Серотонин является одним из физио, ют ически люивных биогенных аминов
в организме животных и человека. промежуточным продуктом метаболизма триптофана, проис-
ходящего в основном в хром )ффин пых клетках тонкой кишки, серотонинергических нейронах
мозга. громбощггах крови. Серотонин оказывает сильное влияние нд тонус сосудов, принимает
участие в |уморальнои регуляции функции центральной нервной, пищеварительной, выдели-
тельной, эндокринной систем. Нарушения в обмене серотонина, его недостаток в организме
приводят к депрессии, шизофрении, бессоннице, инфаркту миокарда, язвенной болезни и дру
гих форм патологии, снижаю) настроение, подавляют сексуальные желания, влияют па память.
Несмотря на жизненно важную роль серотонина, содержание его в организме весьма мало. На-
пример. почти весь серотонин циркулирующей крови сконцентр) рован в тромбоцитах (0.02—0.6
552 Глава 7
Рнс. 7-4. Прссниаптичсская мембрана, меженная т плеская щель н опиатный рецептор (по данным NID?\).
мг/л серотонина). Изменение обмена и функций серотонина в ЦНС иод действием га.тгюнипо-
г ст гов (ЛСД, мескалин и лр.) и паркотоков амфетаминового ря. г сопровождаемся изменением
концентрации серотонина в крови. По мнению специалистов. основным механизмом действия
экстази является усиленный выброс серотонина в мозг, что и обусловливает все приятные эффек-
ты. Когда запасы серотонина истош потея, человек становится усталым и ра гаражи тельным. По-
видимому. происходит гибель продуцирующих серотонин клеток. Например, данные судебно-
химической экспертизы свидетельствуют о значительном снижении (более чем на 80% средней
нормы) содержания серотонина в мозге человека, погибшего от передозировки экстази. Однако
ло тех пор. пока подобные результаты не бмут коррелировать с данными генетической экс-
пертизы (см гл. 3.3). можно сделан» и обр. ный вывод. Человек с генетически обусловленным
низким уровнем серотонина с большей вероятностью б’ чет нсиодьзовать наркоток во все воз-
растающих дозах. Тем не менее определение уровней сывороточного серотонина имеет большое
►сиг г г ичсское значение лля лит носчики, в том числе при длительном употреблении наркотиков.
В результате специального наблюдения нал большой группой испытуемых с близкими пехот-
ными уровнями серотог ина было установлено меньшее количество серотонина в определенных
зонах мозга людей, принимавших МДМА. по сравнению с контрольной группой (теистические
исследования не проводились). причем женщины оказались чувствительнее к потере серотони-
на. чем мужчины. Поскольку серотонин относится к медиаторам ЦНС. то различные изменения
окружающей обстановки могут вл и пь на сто коннентрапию в организме даже здорового челове-
ка. Поэтому при выборе метода определения биогенных аминов необходимо определить цели и
задачи, которые ставит перед собой исследователь. В настоящее время лля определения биоген-
ных аминов в биологических жидкостях человека используются иммунохимические и радиохи-
мические методы, газовая хроматография (ГХ). высокоэффективная жидкостная хроматография
(ВЭЖХ). капиллярный электрофорез (КЭ). I X с масс-селекгивным дртект грованисм (ГХ МС).
ВЭЖХ-МС. КЭ-МС (см. гл 6 и ниже). Отнако найду гшие результаты можно получить при
мстабоготческих исследованиях in vivo метолом ВЭЖХ — ядерпый магнитный резонанс — масс-
спектрометрия (ВЭЖХ-ЯМР-МС) (см. гл. 6.4).
Никотиновая зависимость и злоупотребление никотином
В течение 10 с после вдоха табачного дыма никотин достигает мозга и начинает гейство-
вагь на определенные группы нейронов, на поверхности которых находятся рецепторы. Как
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 553
известно, нейромедиаторы посредством рецепторов заставляют мозг вырабатывать те или иные
вещества. участвующие в рефляции работы всею организма. Никонш. не являясь нейроме-
диатором. способен связываться с рецепторами, предназначенными для тругого вещества —
ацетилхолина. Никотин запускает в работу ацетилхолиновые рецепторы в отсутствие ацетилхо-
шна Более того, он лелиет зли рецепторы неспособными рс«нировать на воздействие ацетил-
холина, снижая их чувствительность к нему. Снижение чувствительности рецепторов па фоне
хронического потребления никотина приводил к образованию дополнительного количества
аде ид.холипоных рецепторов в головном мозге. В результате моз! курильщика имеет огром-
ное число ацетилхолиновых рецепторов, отличающихся повышенным сродством к никотину.
Воздействие никотина на ацетилхолиновые репей юры приводи! к усилению продукции ряда
других всшссгв. К ним относятся: норадреналин. серотонин. дофамин, ацетилхолин, гамма-
аминомас.тяиая кислота (ГАМК), глутамат, эндорфины.
Норадреналин действует как стимулятор. Он определяет уровень бодрствования головного
моз а. обеспечивает концентрацию внимания, энергию, побуждения. Это вещество влияет на
весь организм: повышает артериальное давление, увеличивает частоту сердечных сокращений и
дыхания, чго в целом способ* вуст рабочей мобилизации организма. Именно поэтому куриль-
щики считают. чю сигареты позволяют им лучше сосредоточиться. стать бешее работоспособ
ными. Не остаток норадреналина проявляется отсутствием амбиций, побуждении, а также де-
прессией. Вероятно, дефицитом норадреналина обусловлено то. что у курильщиков снижаются
концентрация внимания и работоспособность прн перерыве в курении.
Серотонин (см. выше) — нейромедиатор эмоциональной стабильности. При его дефиците
у человека появляются раздражительность, недостаток положительных эмоций, бессонница.
Считается, что неожиданные необъяснимые слезы, а также суицидальные мысли и действия
МО1Х Г быть связаны с недостатком серотонина.
Дофамин называют ешс нейромедиатором удовольствия (рис. 7-5). Он вырабапявается в
головном мозге, когда человек испытывает удовлетворение от происходящего. Для выработки
.юфамина необходимы аминокислота фенилаланин и витамин В( которые участвуют в его
синтое. Поскольку количество этих веществ в ранионе может быть ограничено, а у курильщи-
ков происходит повышенный расход витамина Въ. некоторые люди испытывают хронический
дефицит положительных эмоиий Под действием же никотина происходит обман организма.
Рис. 7-5. Иресннаптическая мембрана, мсжсиншпичсская шеть и тси|мм||повыв рецептор (поданным NIDA).
554 Глава 7
На самом деле повода лля полож (тельных эмоций нет. но клетки. выделяющие дофамин,
получают химический сигнал о необходимости его выделения. Курильщик действительно ис-
пытывает состояние, которое принято называть удовольствием. Но в результате такого никоти-
нового подстегивания дофаминергических структур их способность выделять дофамин в oibci
на обычные сигналы истощается.
ГАМК — один из наиболее раскрое (раненных нейромедиаторов головного мозга, ко орый
присутствует в большинстве структур и отвечает за их торможение. Поэтому психологической
характеристикой, которая соответствует действию ГАМК., является спокойствие. При недо-
статке ГАМК человек испытывает тревогу, приступы паники. Для сишеза ГАМК необходимы
глутамин и витамин Bft.
К процессам поддержания никотиновой зависимости также могут быть причастны глута-
мат. который отвечает за активизацию клеток головного мозга эндогенные опиоипы (или
эндорфины) и эндогенные каннабиноиды. Участие этих веществ в реакции головного мозга
на воздействие никотина может, с одной стороны, объяснять то. что многие курильщики по-
разному описывают действие курения на нх состояние, а с другой — объяснять повышенную
распроираненкость потребдепия нелегальных наркотиков средн курильщиков.
Психическое и физическое состояние курильщика, а также ситуация, в которой происходит
курение. могут влиять на то. каким образом отдельная сигарета будет воздействовать па пси-
хологическое восприятие и физиологическую реакцию, например она может вызвать и ощу-
щение расслабленности. и ощущение бодрости. В стрессовых ситуациях сигарета может дейс-
твовать как успокаивающее средство, а в ситуации расслабленности — как стимулятор. Такая
неоднозначная реакция головного мозга на возд< иствис одного и того же вещества имеет под
собой вполне определенную нсйробиологичсскую основу. Никотинчувствитсльные ацетилхо-
линовые репей горы в головном мозге многочисленны, расположены в различных структурах
мозга, имеют множество различных типов и в зависимости от структуры и места расположения
могут выполнять как сгимулирующу о. так н тормозящую функцию. В целом же ни ко ги) (чувс-
твительные рецепторы выполняют самые рахтичныс психические функции: внимание, намять,
обучение. Клинические данные свидетельствуют о том. что никотипчувсттзительные рецепторы
залей твованы в патогенезе таких заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона, син-
дром Туретта, шизофрения, депрессия и иг.
Нико(ин стимулирует мо г. в результате чего выделяются дополнительные порции серотони-
на и дофам низ, которые мотуг создавать сосюяиия эмоциональной сгабильноси1 и удовлепю-
рения. и у курильщиков быстро развивается привычка регулярного курения. В конечном счете
курильщики нуждаются в увеличивающемся уровне никотина, чгобы чувствовать себя «нормаль-
но». и как только содержание никотина в крови снижается ниже некоторою уровня, они испы-
тывают желание закурить. Это острое желание заставляет курильщика испытывав стресс ло тех
пор. пока желание не удовлетворено. Чувство облегчения. когда это желание наконец-то удов-
летворено. курильщики обычно воспринимают как «расслабление». Таким образом, потребление
табака нс облсгчасг неизбежные стрессы, а фактически вызывает дополнительные сгрсс ы.
Согласно Международной классификации болезней 10-го iiepecMoipa (МКБ-10) и диагнос-
тическому руковотству Американской психиатрической ассоциации (DSM-IV), никотиновая
зависимость признана психическим расстройством 11икогнпош(я зависимое! ь является, воз-
можно, наиболее распространенным психическим расстройством. По данным американских
исследований, поди с никотиновой зависимостью составляют 24% населения, что соотнегс
твует примерно половине тех. кто когда-либо курил ежедневно в течение I мес иди более.
При этом распространенность никотиновой зависимости в стране может не соответствовать
распространенности курения, поскольку успешные меры по контролю над (абаком приводят
к избирательному прекращению кчрения менее зависимыми курильщиками и накоплению в
копуляции курильщиков людей с выраженной никот иновой зависимостью.
Как показывают исследования, те курильщики, которые отличаются выраженной зависимос-
тью от никотина, являются принципиально иной группой по состоянию здоровья. У них более
низкий уровень качества жизни, они чате болеют, и у половины из них обнаружены признаки
по меньшей мере еще одного психического расстройства.
Скорость формирования никотиновой зависимости может быть различной и зависит, со-
гласно результатам исследований. от генетических факторов и возрасча начала курения. К го-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 555
нетичсскпм факторам. влияющим на скорость и вероятность формирования зависимости, от-
носятся как особенности функционирования ферментных систем, отвечающих за метаболизм
никотина, так и биохимические < собсппости. предрасполагающие к развитию тех или иных
психических расстройств. В пользу генетической обусловлен пости самой никотиновой Зави-
симости свидетельствует, в частности, неравномерное распределение людей с никотиновой
зависимостью в разных семьях Считается, что если курение начинается в мотетом возрасте,
когда отдельные структуры головного мозга продолжают формировался. развитие никотино-
вой зависимости становится более вероятным. Проведенное во Франции исследование позво-
лило предположить, что степень выраженности никотиновой зависимости у курильщиков под-
росткового возраста обратно пропорциональна возрасту начала курения. Результаты опросов
показывают. что 80% взрослых курильщиков начали курить в подростковом возрасте. Данные
литературы указывают на то, что у курильщиков с большей вероятностью развивается депрес-
сия. а тс. у кого имеются признаки депрессии, с большей вероятностью курят. Связь между
курением и депрессией подчеркивается также тем фактом, что депрессия является одним из
важнейших компонентов синдрома отмены никотина у курильщиков. пытающихся отказаться
от курения.
Общеизвестна связь между курением и расстройствами. святайными со злоупотреблени-
ем химическими веществами. У молодых людей в возрасте 12—17 лет. которые курят, риск
употребления в будущем наркотиков повышается более чем в 10 раз но сравнению со своими
ровесниками, которые не курят. Люди, которые начинают курить в детском возрасте, почти в
4 раза чаше становятся регулярными потребителями наркотиков, чем тс. кто не стал куриль-
щиком в детском возрасте.
Если для начала потреб тения наркотиков наибольшее значение имеют сонивльно-психоло-
। ические факторы, то продолжение потребления обычно поддерживается сформировавшейся
зависимостью. Здесь более важными становятся биохимические процессы формирования за-
висимости. и на этом пути разные химические вещества могут усугублять действие друг друга.
Известно, что среди потребителей наркотиков курящих в среднем в 3 раза больше, чем среди
населения в целом. При этом у потребителей нескольких наркогиков, так называемых поли-
наркоманов. вероятность курения оказалась в 2.35 раза выше, чем у тех. кто потреблял один
нелегальный наркотик Успешность прекращения курения у потреби гелей наркотиков также
была в 2 с лишним раза ниже, чем средн населения в целом. Курильщики, особенно те. кто
курит много, с большей вероятностью употребляют алкоголь и приобретают алкогольные нро-
б. ;мы. чем некурящие. Статистические данные позволяют сделать некоторые обобщения.
• У курю ьшиков вероятность употребления алкоголя на 30% нышс. а вероятность развития
алкоголизма в 10 раз выше, чем у некурящих.
• От 80 до 95% всех алкоголиков являются курильщиками, а 70% всех алкоголиков выкурива-
ют более одной пачки сигарет в день.
• Начало регулярного курения обычно происходит за много лет до развития алкоголизма.
Взаимное усиление алкогольной и никотиновой зависимости может был. обусловлено раз-
личными механизмами. В частности известно синергическое действие, никотина и ацетальде-
гида. который является продуктом обмена этанола в организме
7.3. ОСНОВНЫЕ ГРУППЫ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ,
ПСИХОТРОПНЫХ И СИЛЬНОДЕЙСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ
Существует несколько классификаций психоактивных веществ, которые люди принимают
без медицинских показаний и к которым развивается зависимость. Поданным Межлупаролно-
го комитета по контролю наркотиков (МККН). вес существующие наркотики делят по харак-
теру их воздействия на ЦНС на 3 больших класса седативные, стимуляторы и галлюциногены.
Внутри каждого класса выделяют отдельные группы (см электронное приложение).
I Седативные.
• Собственно наркотики (опиаты и опиоиды): героин, морфин, опиум, препараты опия, син-
тетические и полуенг гетические вещества с морфнноиодобттым типом действия.
• Седативно-снотворные препараты: барбитураты, бензодиазепины, алкоголь. метаквалон.
556 Глава 7
li Стимуляторы
• Кокаин.
• CAP.
Hi. ГаЛЛЮЦИНОГСНЫ.
• ЛСД-5, мескалин. псилонин. МДМА и др
• Препараты конопли
Наибольшую опасность представляют наркогики, относящиеся к опийной ipyniie.
7.3.1. Опиаты и опиоиды
Что ныне снадобьем слывет. то тантра станет ядом. И чю ж?
I ;карспюм этот яд опять сочтут больные.
Рудаки. 941 г.
По международной классификации, термин «опиаты» определяет вешества, близкие по сво-
ей химической структуре к морфину, а термин «опиоиды» — вешества. оказывающие морфи-
ноподобпое де! сгвие па человека, но имеющие структуру, отличающуюся от морфина
К опиатам относятся морфии, героин, кодеин, лионин. б-О-моноанетплморфин (6-МАМт
и лр.. к опиоидам — фенциклидин. метадон, фентанил, кетамин, бупренорфин и др. (см. элек-
тронное приложение)
Уже 6000 лет назад мак был знаком древних шумерам Шхмеры называли его «растением
радости». Мак был известен и в Глипте Возможно, что его использовали жрепы в мистических
кучыовых действиях. Раскопки в Гранаде и Швейцарии показывают. что мак известен в Европе
минимум 4000 лет. Историки считают, что в то время мак культивировали прежде всего из-за
его семян с целью получения масла, а нс из-из его наркотического действия Древние греки
назвали млечный ст . опием Опии упоминается I омсром в «Илиаде» и •Одиссее». I иннократ
исполт зовал опии в качестве лекарственного средства. Теофраст из Ересоеа сообщает о приме-
нении мака в медицине (370—287 г. до н.э.). После завоевания Греции Римом наркотик начал
распространяться дальше на Запал. Римляне широко использовали опий в медицинских целях а
также в качестве яда. В VI—VII веках н э. арабы в ходе своих завоевательных походов завезли мак
в Персию, Индию и Китай. В Китае, тле опий приобрел очень большое значение, сто поначалу
не курили, а ели. Опий 1 асто употребляли потому, что он подавляет аппетит, а в Китие были
большие проблемы с продовольствием. В 1820 г. китайское правительство запретило ввошть
опий в страну, что повлекло за собой две так называемые «опиумные войны» с англичанами, для
которых Китай был самым выгодным рынком сбыта. Англичане побелили и через 38 лет ввоз
опия в Китай был вновь ра решен. В XIX веке опий широко иснол зовался в медицинских целях
в США и Западной Европе. Немедипинское потребление опия было закже распространено.
Морфин в чистом виде получили в 1803 г., но в качестве наркотика он стал использоваться
намного позже Толчком послужила франко-прусская война 1871 г., когда морфий повсемест-
но применяли как болеутоляющее средство и раненые стали быстро привыкать к нему. Всплес-
ки морфинизма всегда бывают во время и после войн.
По данным ООН в 2004 . около 4500 т опия (450 т в морфиновом эквиваленте) составили
предмет подпольной юрюадп
В начале 90-х годов XX века Мьянма, а вместе с ней и регион «Золотого треугольника» —
обширный речной Ю> о-Восточной Азин, в который входят части территории Бирмы (Мьян-
мы). Таиланда и Лаоса, являлись ведущими мировыми прои люди гелям и опиума и экспортера-
ми героина, на их доли приходилось около 60% нелегального производства наркотиков в мире.
В середине 90-х голов мировая ситуация в области незаконного оборота опиатов стала ме-
няться в пользу преобладания опия и героина афганского происхождения К 2000 г. основных!
поставщиком наркотиков опийной ipyniiu (опий, морфин, героин) па мировые нарк рынки
стал регион гак называемого «Золотого полумесяца», территория которого напоминает дугу и
находится в районе Юю-Запалной Азии, нрострастся через Пакистан. Иран п Афганистан.
Иа территории Афмнистана сосредоточено до 75% мирового производства опиума
Препараты группы опия используют в медицине в качестве апалгетпков для купирования
болевых ощущений. подавления кашля и лечения тиареи
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 557
Опий как наркотик, вызывающий приятные ощущения. издавна употребляют в пишу и
куря г. В Индии опий используется преимущественно для жевания, в Китае традиционным
является курение. В России чаше всего растворяют опин в подкисленной воде и вводят внут-
ривенно.
Опий (Opium, laudanum. Meconium) — ло высохший на воздухе млечный сок. выделя-
ющийся nt надрезов на незрелых коробочках различных видов снотворного мака (Papaver
wmniferum). в которых и период 1ехиической (опийной) зрелости накапливается то 2.5%
алкалоидов. либо упаренный экстракт маковой соломы (экстракционный опий). Из опия вы-
делено свыше 20 алкалоидов. относящихся к подгруппам фенантреновых и изохинодпновых
алкалоидов.
Сбор опия происходит путем надрезов головок мака на корню, при этом пользуются спе-
циальными ножами, позволяющими наносить одновременно 2—3 параллельные насечки. Го-
ловки надрезают во второй половине дня. До угра выступивший сок успевает подсохнуть,
делается непрозрачным и постепенно изменяет цвет от молочно-белого ло бурого. Операцию
надрезания коробочек и сбор зшустсвшего опия-сырца повторяют несколько раз ло полного
истощения коробочек. Опий-сырец содержит до 45% воды. 3—30% (в среднем 11%) морфина
и 1% кодеина и может ери ту идти ни переработку.
От прорастания семян до созревания опия проходи г около 6 мес. Было подсчитано, что если
на одном растении 3—5 коробочек и в I коробочке находится 10—100 мгоиия. то с I акра (0.4 та)
можно собрать до 7 кг опия (17.5 кг с I га). Содержание морфина в опии составляет 3—30%.
в среднем 11% (из 10 Ki опия получают около I м морфина). Таким образом, с I га посадок
мака за год (2 урожая) можно получить 3.5 кг морфина.
Химический состав опия: морфин (3—30%). кодеин (1—5%). тебаин (1—4%). папаверин
11—6%). носкапин (4—15%). другие алкалоиды (0.5—2%), меконовая кислота (5—10%). смолы
(5—10%). жнры (1—4%), камель и другие водорастворимые вещества (40—60%), зола (4—8%).
вола (8—30%).
Из брикетированного опия получают опий в порошке (Opium pulveratum). настойку опия
простую (Tincture Opii simplex). настойку опнйно-бензойную (Tincture Opii benzoica) и экстракт
опия сухой (Fxtractum Opii siccum). Широкое применение имеет препарат омнопон (синонимы:
пантопон. Sompon). который представляет смесь гидрохлоридов алкалоидов опия. Содержит
4-S- 50 с морфина и 32—35% друт их алкалоидов. Цвет порошка от кремового до желто-корич-
невого. хорошо растворяется в воле, водные растворы при взбалтывании сильно пенятся.
Действие в основном зависит от морфина, но опий содержит и другие вещества, расслабля-
ющие гладкую мускула гуру. Омнопон иногда гучше переносится, чем морфин, реже вызывает
спазмы гладкой мускулатуры. Используется в медицине внутрь или подкожно. В лечебной
практике высшая разовая доза составляет 30 мг. высшая суточная доза — 100 мг.
Наркоманы используют опий, обработанный уксусным ангидридом. — гак называемы i аце-
тилированный опий (жаргонное название «султыга»), Содержит морфин, кодеин, тебаин, апс-
пыкодеин, героин, моноанстилморфин. Прсдс1авляет собой коричневую, гемно-коричневую
либо желтую жидкость, имеющую характерный залах.
Маковая солома — Poppy Straw (синоним: кокнар, жаргонное название — «кукнар») — все
части (за исключением семян) любого copra мака, собранные любым способом, содержащие
наркотически активные алкалоиды опия. Наркоманы часто обрабатывают маковую солому ук-
сусным ангидридом и различными растворителями, полученный препарат вводят внутривенно,
комбинируют с димедролом Обработанный препарат наркоманы называют «химией». Кокна-
ризм (разновидность опийной наркомании) распространен в Казахстане. Узбекистане. Таджи-
кистане и других странах, исповедующих исламскую религию. В Азербайджане наркоманы для
внутривенно!о вве )ення в 89.6% случаях применяют кокнар. Коробочки мака (после отделения
семян) наряду с опием служат сырьем для производства морфина и других а жалоидов мака в
химико фармацевтической ирг мышленноепг Зрелые коробочки мака содержат (в пересчете
на возлушио-сухой вес) 0.3—0.6% морфина. 0.07% кодеина, до 0.05% папаверина, ло 0.08%
наркоз ина.
Морфин. В 1803 г. немецкий аптекарь Сетюрнер разделил опий на составляющие и выле-
тит из него порошок, очень малые количества которого вызывали крепкий сон. Обнаружен-
ное вещество аптекарь назван морфином и честь |реческого бога сна Морфея Однако синтез
558 Глава 7
морфина был осуществлен только в 1952 г., когда
была установлена его химическая структура. Синтез
оказался дорогостоящим, и морфин продолжаю! по-
прежнему получать из оиня-сырна.
Морфин (рис 7-6) — белый крисии лический
порошок, желтеющий при «ранении. Морфин ока-
зывав! тормозящее влияние на условные рс<|хиексы.
понижает возбудимооь дыхательного и кашлево-
го центров. Применяют морфина гидрохлорид как
болеутоляющее средство при травмах и различных
заболеваниях, сопровождающихся сильными боле-
выми ощущениями (хтокачсственные новообразо-
вания. инфаркт .миокарда и др.), при подготовке
больных к операции и в послеоперационном верно- Рис 7.6 с морфты.
де. при оессоннинс. связанной с сильными нолями.
Применяется в порошках и таблетках для орального
применения и н ампу lax для иньекний. Высшая разовая доза внутрь и подкожно 20 .мг. высшая
суточная доза 50 мг. Смертельной для человека считают дозу морфина подкожно выше 100 mi.
перорально — от 300 до 1400 мг
К морфину быстро развивается привыкание, поэтому наркоманам приходится постоянно
повышать дозу, иногда в 100 раз и более превышающую начальную.
Токсикокинетика и биотрансформаиия. Ьиолоступность морфина составляет около 20—3(Х<
при пероральном применении, так как происходит его интенсивная биотрансформация в пе-
чени и в меньш( и сюпенн — в стенке кишечника При внутривенном введении морфина мак-
симальный фармакологический .эффект развивае1ся через несколько минут, при подкожном
и внутримышечном введении — через 15 мин. Затем концентрация препарата в крови резко
палас) (см. ниже рис. 7-10). Т1Пдля морфина составляет 2—3 ч. с белками плазмы связывается
20—30% препарата. Терапевтическая концентрация морфина в плазме 0.01—0,07 мкг/мл.
Основные пути бпогрансформапни морфина — конъюгирован не с глюкуроновой и серной
кислотами с образованием морфин-3- и морфин-6-i люкуронидов. а также 6- и 3-су 1ы|>атпых
конъюгатов. В процессе реакции N-деметилирования образукнея норморфин. З-О-метилиро-
вания — кодеин. N-окислеиия — N-оксид (см. ниже рис. 7-9 а. б).
Распределен не в организме: накапливается главным образом н почках, печени, легких и
селезенке. Быстро покидает кровеносное русло, перераспределяясь в паренхиматозные орга-
ны — печень, почки, легкие, селезенка, мозг (в 2—5 раз выше концентрация, чем в крови), а
также в скелетные мышиы и миокард. При хроническом применении морфин накапливается
в волосах и ногтях.
Экскреция метаболитов морфина, а также неизмененных молекул происходит в основном с
мочой После парентерального введения до 90% морфина вы-
водится с мочой за 24 ч. причем 10% в виде свобс ного мор-
фина. 65—70% в конъюгированной форме. До 10% морфина
выделяется с желчью.
Коде 1н — один из наркотически активных алкалоидов опия,
впервые полученный в 1832 г.. является З-О-метил.морфином
(рис. 7-7). Получаю! экстракцией из расти гельного сырья: ма-
ковой соломы и опия.
По характеру действия кодеин близок к морфину, но боле-
утоляющие свойств выражены слабее; сн. ьно выражена спо-
собность подавлять возбудимость кашлевого центра. В меныпей
степени, чем морфин, угнетет дыхание. Применяют главным
образом для успокоения кашля. В сочетании с ненаркотичес-
кими аналгетиками (анальгин, амидопирин), кофеином, фе
нобарбиталом применяется при юловных батях, невралгиях.
При повторном применении кодеина может развиться при-
страстие.
Рис. 7-7. С|руктуриая формула
кодеина.
560 Глава 7
Основные метаболиты 1сроина: 6-МАМ. морфнп и морфпн-3-i тюкуропид. 6-МАМ — ме-
таболит. обеспечивающий анхнетичсское и наркотическое действие грроина и характерным
только лля героина, служит маркером его употребления, в отличие от морфина и кодеина
Распределение в организме: накапливается главным образом в почках, мо е. легких
Выведение: до 80*?. дозы выделяется с мочой в первые 24 ч. главным обратом в ви е мор-
фин-З-тлюкуроннла. от 5 до 7% — в виде свободного морфина. 1% - 6-МАМ. 0.1% — неиз-
мененного вешества.
Эффективность действия (биодоступность) опиатов обусловлена способом введения.
Хронические наркоманы предпочитюг высоконаркогенную смесь героина с кокаином или
с крэком (см талес), которую называют speed ball или crank, смесь героина с ЛСД — Frisco
speed ball.
Основной способ введения героина в странах Юго-Восточной Азии и Пилер тайлах — вды-
хание паров, курение наркотика; в России и США более типичным является внутривенное
введение. Ингаляционный способ применения героина является популярным у подростков и
молодежи и оценивается специалистами как начальный этап развития пристрастия к героину
Уже через месяц систематического употребления исчезает эйфорическая стадия интоксикации,
что побуждает человека увеличивать дозу. Суточная доза у наркоманов может достигать 2 т
сухого вещества.
При внутривенном введении героина максимальная концентрация в плазме кроны дости-
гается мгновенно (рис. 7-10). При передозировке наркоманы иногда погибают, не закончив
вветение препарата (с иг той в вене). При внутривенном введении морфина максимальная кон-
центрация в пли «мс крови достигается за 2—15 мни. пртт внутримышечном — за 7.5—20 мин,
при приеме внутрь — за 30—120 мин.
Симптомы острого отравления опиатами:
• нианоз;
• суженные в точку зрачки:
• гипотония;
• спазм желудочно-кишечного тракта;
• снижение т мпсратуры тела, влажная липкая кожа'
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 561
б
Рис. 7-9. Схема биотрансформании героина (а). 1сроина морфина и кодеина (б).
562 Глава 7
Рис. 7-10. Динамика концентраций героина и его метаболитов в крови при внутри венном введении.
• угнетение дыхания:
• нитевидный пульс;
• потеря сознания:
• кома:
• смерть от паралича дыхания через 2—4 ч при подкожном или пероральном введении сверх-
дозы и мгновенно — при внутривенном.
Методы определения опиатов
В качестве предварительных экспресс-тестов па опиаты исполь уют хромогенные реакции с
обшеалкалоидными реактивами, имеющими чувствительность реакций 0.25—0.5 мкг (табл. 7-1).
Таблица 7-1. Окрашивание опийных алкалоидов обшеалкалоидными реактивами
Вещество Реактив Ма ки Реактив Мекке Реактив Ф|еде
Героин Пурпурно- фиолетовый 1смио-зеленый Пурпурный -> ссрый/нурпурныи
Морфии Пурпурно- фиолетовый Темпо-зеленый Пурпурный -> ссрый/пурнурный
Колени Пурпурно- фиолетовыт Зслсный/синий Сипий/зеленый
6-МАМ Пурпурно- фиолетовый Темно-зеленый Желтый/зеленый
Аиетилкодеин Пурпурно- фиолетовый 1 емно-зеленыи Пурпурный -> падевый
Папаверин Нет окраш пиния Темно-синий Светло зеленый
Нос капни Ярко-желты и Зслсныи/синий Вншнсво-кр сный
ИХМ и ТСХ определения опиатов обсуждались в гл. 6.2 и 6.3 соответственно.
Для подтверждающего исследования опиатов широко используют газовую хромате»рафию.
КЭ, ВЭЖХ. ГХ-МС. спектральные методы (примеры см. гл. 6).
В табл. 7-2 приведены частоты ИК-спектров опиатов.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 565
ине нескольких часов после приема наркотика. Его
эффективная доза составляет 0.1 мт для человека
массой 70 кг. Отличается коротким действием,
продолжительность эффекта не более 30 мин. Ми-
нимальная летальная лоза фентанила 2 мг.
Потучены cine более сильные обезболивающие
вешества — аналоги фентанила. Известны случаи
использования наркоманами З-метил-фентанила
(другие названия «Persian white». «Syntetic hemin»,
«стекло»), который в 30 раз активнее фентанила.
Для обездвиживания (иммобилизации) крупных
животных применяют карфентанил (в 100 раз ак-
тивнее фентанила) и синтетический аналог морфи-
на эторфин, активность которого по крайней мере
в 2000 раз выше, чем у морфина (рис. 7-16).
Азфентанил (рис. 7-17) отличается коротким
действием (всего 10 мин). Суфентанил является бо-
лее безопасным препаратом, лофеитанил характерп-
зутся длительным действием (до 48 ч). Прогнозиру-
ют получение соединений — аналогов фентанила с
еше большей активностью, порядка I mki для чело-
века массой в 70—80 кг
Для коррекции и в то же время усиления нар-
котического действия наркоманы часто принимают
опиаты вместе с бензодиазепинами и барбитурата-
ми (см. далее). В развивающейся картине интокси-
кации преобладают ощущения бодрости, прилива
сил, повышения работоспособности, появляется
потребность двигаться, разговаривать.
Кетамин (калипсол) — синтетическое психо-
тропное вещество (рис 7-18). Оказывает снотворное
действие. Время действия примерно 2 ч. В фарма-
цевтической промышленности выпускается в виде
порошка и рас 1 воров в ампулах и флаконах. Прием большой дозы кетамина сопровождается
галлюцинациями аналогично фенциклидину. Употребляется, как правило, внутривенно.
Применение препаратов опийной группы сопровождается быстрым развитием психической
и особенно физической зависимости. Эти наркотики обладают высокой толерантностью. т.е.
ътя получения наркотического эффекта равной силы при последующих приемах требуется
увеличение дозы наркотика (иногла в 100 раз и более превышающую смертельную дозу для
ОБРАЗЕЦ МОЧИ
5 нпи 1-J ыл
ГИДРОЛИЗ
кислотным ипи энзимный
ЭКСТРАКЦИЯ
МЛЛДКОСТЪ-ЖИДКОСТНАЯ /ЛИ ТВЕРДОФАЗНАЯ
ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ИССЛЕДОВАНИЕ
МЕТОДАМИ КАТЕГОРИИ С ИЛИ Б
ПОДТВЕРЖДАЮЩЕЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
МЕТОДАМИ КА? вГОРИМ А ИЛИ <В*В1
__ I I
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ПОП УЧЕННЫХ
РЕЗУЛЬТАТОВ
Гис. 7-13. Схема анализа образна мочи на со-
зержапие опиатов.
Примечание. Эффективность экстракции
варьирует от 30—50 то 953= к орфипа п 6-МАМ
из плазмы и мочи. Опиаты экстрагируют из
мочи смесью хлорофюрм — нэопропанол (9:1)
при pH 9.0- 10.0. Часто нсшыьзукл прием де-
ри ватнзанин
а 6
Рис. 7-14. Структурные формулы гндроь орфсн а (а) я оксикодона (б).
566 Глава 7
Рис. 7-17. Структурная формула алфентаним!.
нснаркомана). В период прекращения действия опиатов у наркозавиенмых лип наблюдается
абстинентный синдром или «ломка» Она выражается в суставной и головной боли, обшем
ухудшении самочувствия, расстройстве желудка, тошноте, рвоте 'Это состояние наблюдает-
ся через 16—24 ч после приема наркотика. Особенно тяжелой является абстиненция у лип.
принимающих героин. Для купирования этих симптомов необходимо принимать морфино-
подобные препара 1Ы Ьез этого морфинисты, лишенные наркотика мот погибнуть. При
длительном приеме морфинонодобных пренараюв личность больного постепенно деградирует.
крут интересов сужается. Из-за нарушения аппетита развивается истощение Часто на теле
образуются инфильтраты, абсцессы и рубцы на месте инъекций. Для заместительной терапии
у наркоманов используют синтетический препарат метадон (фе-
надон; jipyi ие названия: «лошадка». «Dollies»), который по силе
аналгетичсского эффекта, но некоторым данным, превосходит
морфин в 5 раз. но менее токсичен (рис. 7-19)
Метадон впервые был синтезирован как заменитель морфина
в Германии во время Второй мировой войны и стат клинически
доступен в США в 1947 г. Он представляет собой кристалличес-
кий порошок без запаха. Для устранения болей высшая разо-
вая доза составляет 10 мг. суточная — 30 мг. Эффект метадона
более продолжительный, чем у морфина и может длиться 24 ч.
Это позволяет использовать его I раз в сутки. Метадон одинако-
во эффективен при парентеральном приеме и в виде инъекций.
К препара ту развивается привыкание (толерантность), и он вызы-
вает физическую зависимость. Начальная доза метадона 15—20 mi
Рис. 7-18. Сфуюурная фор-
мула кетамина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 567
Рис. 7-19. Структурная формула ме
талона.
часго оказывается достаточной, чтобы устранить симпто-
мы абстиненции. Мегадоновая но^щерживаюшая терапия
продолжается десятилетия. Практически это означает сме-
ну наркотика. В тяжелых случаях героиновой наркомании
дозе метадона возрастает до 40— 80 мг в сутки. В нашей
стране метадон запретен для испод ыования у людей
Токсикокинетика и биотрансформация. Пероральная био-
достуиность метадона и среднем 79^. Он метаболизируется
в основном посредством моно- и ли-1Ч-дсметп.тирования
со спонтанной циклизацией в результате нестабильности
метаболитов в <|юрмы 2-этилиден-1,5-димегил-3.3-дифе-
ннлпирролилнн (ЭДДП) и 2-этил-5-метил-3.3-дифени.т-
нирролидин (ЭМДП) Основными продуктами экскреции
(в моче) являются метадон, ЭДДП и ЭМДП (рис 7-20).
Методы определения. Скрининговые методы исследования
мочи базируются на иммуиоферментном (ИФА) или радиоиммунном анализе (РИЛ). Обнаружено.
что дифенилпшрпмин и яоксидамнн могут дать положительные результаты ИФА на метадон.
Газовая хроматография с ПИД — наиболее распространенный метод лля определения мета-
дона в биологических жидкостях; ЭДДП и ЭМДП moi yr быть определены в большинстве схем
без дерпвагизацпи. ЭЗД используют после окисления наркотика до бснзо(|>енона Широко
применяют ВЭЖХ. ГХ-МС используют как для определения вещественных доказательств, так
и для иссле юваний биообъектов.
Синтетический препарат . евоацетилметадо.г (LAAM. ORLAAM) имеет более длительный
период действия (от 48 до 72 ч), в США его стали использовать для лечения наркотической
абстиненции с 1994 г.
Бупренорфин (другие названия: норфин, торгесик. анфин, Buprenex, Temgesic) — синтети-
ческое наркотическое средство, получаемое из тебаина (рис. 7-21). Применяется в онкологии в
качестве обезболивающего средства. Бупренорфин пытаются использовать в США для лечения
наркотической абстиненции. В России бупренорфин применяют в медицине для купирования
сильных бо 1СИ.
п- Гцорокснлироваше и конъюгация с глюкуроновой кислотой
Ряс. 7-20. Схема бнитрансформацнн метадона. Пояснение в текста
568 Глава 7
Время действия бупренорфина 6—8 ч. Разовая доза 0,2—U.6 Mi Обезболивающее действие
бупренорфина сильнее, чем у морфина. примерно в 30 раз. Побочное действие при употребле-
нии бупренорфина: сонливость. тошнота, рвота, головокружение, иногда угнетение дыхания.
Бупренорфин входит в состав таблеток, а также выпускаете*! в виде раствора в ампулах. Рас
творы в ампулах, как правило, в качестве добавки содержат сахара. В Россию лекаре таенный
препарат, содержащий бупренофин. поступает в основном из Индии.
Токсимжинетика и биотранс Iюр нация. Т бупренорфина 2—4 ч. биотранехформания реализуется
нулем \-дсалкилироиания с образованием норбупренорфина. который фармаколо! ичсск-и активен,
и конъю-гации бупренорфина и норбуп|х:норфина. При введении однократной внутримышечной
дозы 95% меченого рядиоктивпо наркотика выводится с фекалиями (68%) и мочой (27%) в течение
144 ч Концентрация свободных бупренорфина и норбупренорфина в моче может быть менее 1 mi 'л
после приема терапевтической дозы, но повышается до 20 мг/л при злоупотреблении.
Методы определения. Бупренорфин в биологических жидкостях определяют с помощью
ИХМ. методами газовой хроматографии с ЭЗД или МС-летектором. ВЭЖХ. При пробонол-
готовке образна мочи используют энзиматический гидролиз, который более эффективен, чем
кислотный или щелочной пиролиз в данном случае
Пентазоцин (другие названия: (фортрал, тальвин) — обезболивающее средство (рис. 7-22), ко-
торое по активности и длительности действия уступает морфину. Разовая доза составляет 50—100
мг. В незаконном обороте появится в 1967 г.: распространенной добавкой к пентазоцину является
трипеле> амин (антигистаминное средство). Пентазоцин применяют перорально или в виде инъек-
ций. возможен прием путем курения и вдыхания. Длительность действия пентазоцина 3—4 ч.
При приеме пентазоцина наблюдаются эйфория, чувство расслабленности и помутнение
сознания, часто — острый психоз, характеризующийся кошмарами и зрительными галлюци-
нациями. Употребление пентазоцина иногда сопровождается сонливостью, тошнотой, рвотой,
головокружениями. При высоких лотах возможно угнетение дыхания. В незаконном обороте в
России встречается в виде (фармацевтическото препарата пол названием *Фортр;ы».
Промедол (тримеперидин) синтетическое наркотическое средство обезболивающего дейс-
твия (рис. 7-23). В фармацевтической промышленности выпускается в виде порошкообразною
вещества и растворов в ампулах и шн риц-тюбиках По действию знало) имен морфину
Эти морфин (другое название: дионин) — синтетическое производное морфина (рис. 7-24)
обезболивающего и протнвокашлевого леи лгвия. близок кодеину. Порошок белого цвета. В фар-
мацевтической промышленности выпускается в виде порошка, таблеток, растворов н мазей.
Этонитазен — синтетическое наркотическое средство обезболивающего действия (рис. 7-25
и см. рис. 6-125). По своему действию превосходит морфин в 1500 раз. В незаконном обороте в
России впервые появился в 1998 г. Встречается в виде порошкообразного вещества белого или
желтого цвета, уз отрсблястся путем курения.
Трамадол — синтетический опиоид со свойствами агониста-антагониста (рис. 7-26), аналгетик
центрально!о действия средней силы, подобно кодеину, пентазашшу или пропоксифену широко
и эффективно применяется для обезболивания в терапии и хирургии.
Рис. 7-21. Структурная формул бупренорфина.
Рис. 7-22. Стрхктурная формула пентазоцина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 569
Рис. 7-23. Структурная формула промедола
Рис. 7-24. Структурная формула этнлморфина.
Рис. 7-25. Структурная формула этонитазена
На ранних стадиях изучения трамадола его относили к наркотическим аналгегикам. Даль
ней шее исследование и опыт применения в клинической практике показали, что трамадол
не продуцирует морфиноподобный эффем, имеет низкую наркотическую активность и не
может служить заменой морфина при опийной наркомании для лип с низкой или умеренной
опиатной зависимостью. По принятой в настоящее время классификации трамадол отнесен к
сильноцействующи м средствам.
При немелицинском использовании трамадола липами с опиатной (героиновой) зависи-
мостью в дозах, значительно превышающих терапевтические, наблюдается мною побочных
эффектов, в том числе пристрастие к препарату. В судебно-медицинской практике трамадол
представляет интерес гем. что ycnjnmaci эффекты |ранквилизагорев, седативных препаратов и
средств лля наркоза и алкоголя.
Токсикокинетика и биотрансформация. Трамадол (рКа 9.4) быстро метаболизирует с лоте-
реи могильных группировок при атомах кисчорода и/или азот. О-дсметилтрамадол фарма-
кологически активен (анальгетическая активность его примерно в 2 раза выше, чем у самого
трамадола). 1, 4.3 — 6,7 ч, объем распределения 2.6~2,9 л/кг процент связывания с белками
плазмы крови 15- 20%-Около 90% принятой внутрь дозы выводится с мочой в течение 3 шей.
остальное с феюьтиями. Через 72 ч в моче обнаружено около 28% разовой пероральной лозы
в неизмененного трамадола, 20% в виде свободного и связанною О- гемегилтрамадша, 17% —
нортрамадола, около 20% свободного и конъюгированного \,О-деметилнортрамалола и дру-
гих метаболитов (рис. 7-27) Трамадол и сто метаболиты проходят через плацентарный барьер,
попадают в iрудное молоко.
Методы определения. Капельный химический анализ: реактив Марки (грязно-коричневое
окрашивание, со временем переходящее в грязно-зеленое). ГСХ в системах то iyoi-этанол-
триэ птамнн (9:1:1), R1 0,74 и метанол—25% раствор аммиака (100:1), Rf 0,55 После хрома-
570 Глава 7
тографирования зоны выявляют по гашению флюоресценции в лучах УФ-лампы (254 нм),
реактивом Марки (буро-зеленый цвет), реактивом Драгендорфа (кирпично-красная окраска).
Газовая хроматография: капиллярная колонка HP-5MS, температура колон и от 80 до 300 “С.
детектор ПИД или ГИЛ. ВЭЖХ: обратеннофазовая неподвижная фаза С18. детектирование-
УФ-детектор, флуориметр. Арбитражные методы: ГХ-МС и ВЭЖХ-МС.
Заключение
» Обнаружение опиатов в растительном сырье, таблетках, порошке и лр. проводят с помощью
реакций окрашивания реактивом Марки, хлорила железа (111) и концентрированной азот-
ной кислоты, причем хлоридом железа (111) окрашивается только морфин и растительное
сырье. Кодеин и героин этой реакции не дают. Тест с концентрированной азотной кислотот
позволяет предположительно отличить героин от морфина и кодеина.
• Обнаружение опиатов н биолотичсских образцах. Учитывая, что в неизмененном виде опиаты
выделяются с мочой в малых количествах, перед проведением исследования мочу подвергают
кипячению с соляной кислотой для разрушения конъюгатов, тем самым повышая концент-
рацию нативных соединений (однако тсроин при этом гидролизуется!). Для определения ме-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 571
таболитов героина 6-МАМ и 3-МАМ используют пробы мочи, нс нолнергавшиеся гидролизу.
Опиаты экстратруют из мочи смесью хлороформ изопропанол (9:1). pH 9.0—10,0.
Методами определения опиатов являются капельный химический анализ. ИХМ. ТСХ (или
высокоэффск1ивная ТСХ — ВЭТСХ ). ВЭЖХ. КЭ. газовая хроматсн рафия. ГХ МС. УФ , ПК
спектрометрия, Фуръе-ИК-спскзрометрия (см. гл. 6).
Морфин:
УФ-спсктромстрня: 2X5 нм (pH < 7): 29Х нм (pH > 7,0).
ИК-спектрометрня: 805. 1243, 11IX. 945. 10X6, КЗЗ см-1 (диск с КВг).
Масс-спектрометрия: 2X5. 162. 42. 215. 2X6. 124. 44. 2X4 m/z.
Кодеин:
УФ-спсктромегрия: 2X5 нм (pH < 7.0).
ИК-снектромегрия: 1052. 1500. 1111, 793. 934 (диск с КВг).
Масс-спектрометрия: 299. 42. 162. 124. 59. 300. 69 rn/z.
Героин.
УФ-снекipoMcrpH»:: 279 нм (pH < 7): 299 нм (pH > 7)
ИК-спектромстрия:: 1245. 1764. 117Х. 1215. 911, 1736.
Масс-спектрометрия: 327. 43. 369. 268. 310. 42. 215. 204 m/z.
7.3.2. Каннабиноиды
Ничто нс обходится человеку гак юрою. как сю ложное
представление о добре и зле..
Ф. Ницше
В згу группу наркотических сретств тходяг препараты, приготовленные из различных час-
тей конопли. Марихуана — верхушечные части растения конопля с цветками или плодами,
из которых не была извлечена смола. Гашиш — неочищенная или очищенная смола растения
конопля. Гашишное масло — концентрированный экстракт конопли inn смолы каннабиса.
Растение каннабис используется людьми не менее 6060 лет Первоначально это было связа-
но с употреблением волокон стеблей растения, которые шли на изготовление одежды веревок,
канатов, пи гей и друшх предметов. 4000 ст назад в Китае стали использовать каннабис для
медицинских целей при лечении малярии, ревматизма, судорог и отсутствии аппетита, а также
для получения бумаги. Гашиш упоминается в Старом завете и в «Одиссее» Гомера
Популярность гашиша на Востоке была не меньше, чем алкоголя в Европе. Около 500 г.
н.э. конопля появляется в Центральной Европе В средние века в Европе коноплю активно
выращивали для производства морских канатов и версвок из-за их повышенной устойчивости
в морской воде. В Америку коноплю завехти испанцы в XVI веке.
В настоящее время каннабис — наиболее распростри ценный наркотик во всем мире. Канна-
биноиды — вещества. накапливаемые в растении конопли (Cannabis sativa /..). которое произ
растает в ликом виде от тропических широт до регионов с умеренным климатом. Это растение,
относящееся к роду Cannabinaccae. представляет соб >й однолетний древовидный куст и может
достигать 4-мстровом высоты. Конопля имеет характерное нечетное количество (5. 7. 9) от-
ветвлений с характерными листьями. При цветении на черешках верхних листьев выделяется
смолистое вещество, которое защищает растение ог солнца (так называемая смолка)
Содержание действующего вешества в растениях, полученных из разных регионов, значитель-
но колсблсгся. В американских сортах конопли юля тетрагмлроканнабинола (ТГК) составляет
менее 0.5%, в конопле, произрастающей в Колумбии. Ямайке, Мексике. — от 0.5 до 7%. В ко-
нопле из Юго-Восточной Азии содержание ГГК доходит до 20%. Однако наибольшее количество
ТГК (до 30%) содержится в неопыленных женских растениях конопли, которые называют «син-
ссмилла*. Этим же термином обозначается технология выращивания только женских растений
конопли без опыления его мужскими. При отделении женского растения от мужского оно даст
больше сока, содержащего ТГК. Среднее содержание ТГК в синссмнлтс колеблется от 8 до 14%.
максимальное составляет 30%. Активное начало содержится во всех частях конопли, но больше
всего ТГК в цветущих верхушках и листьях. Препараты конопли, продаваемые на рынках, зна-
чительно различаются между собой по содержанию действующих веществ. Она доза кустарно
приготовленного препарата содержит обычно 10-30 г расти тельного сырья.
572 Глава 7
Различают следующие препараты из конопли марихуана, гашиш и гашишное масло (см.
электронное приложение).
Марихуана (каннабис, ipaiKi конопли, «травка». «дурь», «план», «клевер». «божья травка»,
«сено». «Мерн Джейн», «нот», «грае», «хсй». «впил») — приготовленная смесь высушенных
или непысун1енных верхушек с листьями и остатками мелких стеблей нобых соргов конопли
(без центра. >ного стебля). При изготовлении марихуаны обрывают плодоносящие и цветущие
верхушки, поскольку ПК содержится главным образом к этих частях растения. Централь-
ной ствол и ветки растения при изготовлении наркотика не используются. Употребляется
как галлюциноген. Вызывает умеренную психическую зависимость. Наркотически активным
компонентом марихуаны является 11 К Со держание ТГК в марихуане составляет 0.5—5%, хотя
целенаправленно выращенные сорта конопли содержат ло 40% ТГК. Цвет марихуаны в зависи-
мости от степени высушивания и времени сбора меняется от светло-зеленого до коричневою.
Марихуана имеет характерный пряный запах. Лоза марихуаны равна примерно 0.5 г. Марихуа-
ну чаще всего курят. При употреблении марихуаны возможен так называемый flashback, когда
через несколько дней после употребления марихуаны человек неожиданно снова впадает в
состояние наркотическою опьянения, не употребляя при этом наркотик.
Гашиш (смола каннабиса, «анаша», «опилки», «гы нт». «дурь», «чернушка») — специально
приготовленная смесь отделенной смолы и пыльны растения каннабис или смесь, изготовлен-
ная путем обработки (измельчение, прессование и т.д.) верхушек растения каннабис с различ-
ными наполнителями. Форма смеси может быть различной — таблетки, пилюли, спрессован-
ные шипки, нас гы и др. Цвет гашиша от светло-зеленою ло коричневого. Имеет характерный
пряный занах. Доза гашиша равна примерно 0.15 г. Содержание ТГК в гашише равно 2—10%.
Действие гашиша аналогично действию марихуаны. Как и марихуана, вызывает умеренную
психическую зависимость.
Гашишное масло («химка», масло каннабиса, «медовое масло», жидкий каннабис) — нар-
котическое средство, получаемое из частей растений любых видов и соргов конопли путем
извлечения (экстракции) различными растворителями тын жирами (может встречаться в виде
раствора или вязкой массы); экстракты и настойки каннабиса. Представляет собой ж тдкоегь
или вязкую массу. Цвет гашишного масла от зеленого .то коричневого. Встречается также в
виде смеси с молоком и растительными маслами. Содержание ТГК в гашишном масле равно
10—30%, иногда до 60%. Гашишное масло наносят на табак или сигареты и курят Продукты
экстракции молоком иди жирами употребляют через рот. Действие гашишного масла аналогич-
но действию марихуаны. Как и марихуана, вызывает умеренную психическую зависимость
На основании Списка I «Перечня наркотических средств, психотропных веществ и их пре-
курсоров. подлежащих контролю в Российской Федерации» марихуана, гашиш и гашишное
масло отнесены к наркотическим средствам, оборот которых запрещен на герриюрии Россий-
ском Федерации (см. гл. 1.5).
В мире существует множество названий наркотических препаратов, приготовленных из ко-
нопли. На Среднем Востоке, в Европе и России нренараг называют гашишем, в Мидии —
charas, ganga. bhang, bang, в Северной Африке — kif. в Южной Африке — dagga, в Бразилии —
maconha. В странах Америки этот наркотик чаше всего называют марихуаной. В США сущес-
твует несколько слэнговы.х названий препаратов конопли: weed (сорняк), staff (лекарство).
Indian hay (сено), grass (трава), рот (напиток).
Наркотики из конопли нс являются ни стимуляторами, ни транквилизаторами, ни гал-
люциногенами. ни опиоидами в полном смысле слова. Каннабиноиды могут вызывать
длительный сон. как транквилизаторы, и в то же время повышать тонус, как амфетамин.
В больших дозах наркотики из конопли действуют как галлюциногены, но в то же время они
не обладают перекрестной толерантностью, как ЛСД, псилоцин и мескалин. Основные дейс-
твующие вешества каннабиса — изомеры и производные ТГК (рис. 7-28 и 7-29). Характерной
особенностью ТГК является способность к кумуляции. Метаболиты ТГК можно обнаружить
в организме в течение нескольких недель после приема. Смола конопли содержит около 60
производных 2-(2-изопроннл—5-мстилфснил)—5-пснгилрезорпинола. известных как канна-
биноиды. Среди каннабиноидов, содержащихся в растении, есть каннабинол, каннабидиол,
каннабиноловая кислота, каннабигерол, каннабихромсн. изомеры ТГК: (—)-транс-Дч-ТГК
(Д’-ТГК). (—)-транс-Дн-ТГК (Д*-Т1 К), а также Дч-тстрагидрокапнабиноловая кислота (Д'-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 573
Рис. 7-28. Структурные формулы каннабидиола (и) и каннабиола (б).
Рис. 7-29. Структурные формулы А'-ТГК (а). ДЧ-ТГК (б).
ТГК-кислота). Д’-ТГК-кислота отвечает за наиболее характерный психогомиметический эф-
фект каннабиса (рис. 7-30).
А9-ТГК — вещество, обладающее психоактивным действием, каннабинол (КБН) в десять
раз менее активен, чем ТГК. каннабидиол (КБД) не обладает психоактивностью. Минорные
компоненты: каннабидиварин. каниабиварин. каинабихромин. каннабиииклол и бутиловые
аналоги ТГК в зависимости от вида сырья содержатся в растении в разных соотношениях.
Наркотическим эффект марихуаны может широко варьировать из-за различий между вида-
ми конопли. В резу ыатс целенаправленной селекции некоторые употребляемые в настоящее
время сорта растения могут содержать в 10—20 раз больше ТГК. чем конопля, которая росла
50 лет назад. Конопля содержит более 400 других химических вешеств, многие свойства кото-
рых до сих пор нс изучены. Известно, что в состав каннабиса входят азотсодержащие вещест-
ва (аминокислоты, белки, гликопротеины), ферменты, углеводы, спирты, альдегиды, кетоны,
лирные кисло 1Ы, эфиры, лактоны, терпены, стероиды, нсканнабииоидныс фенолы, флавоно-
идные гликозиды и другие классы веществ.
При малой дозе ТГК наступает ощущение благополучия, расслабления и некоторой де-
зориентации но времени. Лица, употребляющие средние дозы вещества, испытывают тс же
эффекты, только в более интенсивной форме: притупление внимания, спутанность сознания,
ослабление памяти, изменение эмоционального состояния. Большие лозы наркотика наруша-
ют некоторые функции организма, усиливая восприятие звуков и зрительных образов, вызывая
галлюцинации. Изменение сознания может продолжаться до 2 нед, такие ощущения исчезают
только после полного выведения ТГК из организма. Длительное злоупотребление препаратами
конопли приводит к снижению интеллекта и памяти
Минимальная доза ТГК 5 мг. эффективная оральная доза 50—2(H) мг эффективная доза при
курении 25—50 мкг/кг. Обычно «наркотические сигареты» содержат 300—750 мг марихуаны с
содержанием ТГК до 15% (в последнее время и до 40%). Средняя суточная доза — 2 «сигаре-
гы». Эффект после курения обычно длится 4—6 ч. но можег пролей жаться и после 24 ч.
574 Глава 7
Признаки хронической интоксикации марихуаной:
• красные глаза,
• чувство усталости и разбитости,
• повышенный аппетит
• повышенный интерес к лекаре м;
• хронический кашель:
• сонливость;
• частые простудные заболевания;
• нарушения менструального цикла;
• нарушения памяти.
• трудность подбора слов при объяснении;
• проблемы отношений с другими людьми;
• изменение настроения от пассивности до агрессивности;
• парено (я.
Идентифицировано два типа каннабиноидных рецепторов — CBI и СВ2. Их физиологичес-
кими лигандами являются производные арахидоновой кислоты и простаазандины («эндоген
ныс каннабиноиды»).
CBl-ренепторы расподагаются в центральной и периферической нервной системе, наиболее
высокая нх плотность наб юпастся в ганглиях головного мозга. Главный эффект возбуждения
СВ1 -рецепторов связан с уменьшением выпеления медиаторов — дофамина, норэпинефрина и
серотонина, чго объясняет нротиворвотное действие каннабиноидов и их влияние на эмоцио-
нальное состояние, двигательную аюивность. регулирование аппетита и боли.
СВ2-реиенторы ответственны за иммуномолулируюшие эффекты каннабиноидов и распо-
ложены в тканях, выполняющих в организме человека иммунологические функции (лейкоци-
ты крови, костный мозг, селезенка, вилочковая железа, миндалины, макрофаги и мает опиты)
Предполагают, чю нротиворвогный зффект каннабиноидов может быть связан с взаимодейс-
твием с рецепторами серотонина.
Физико-химические свойства каннабиноидов. Д’-ТГК и Д’-ТГК-кислота имеют температуру
кипения соответственно 200 и 210—213 ’С Хорошо растворяются в этаноле, ацетоне Рас-
творимость Д’-ТГК в воле 3 мг/л. Д’-ТГК-кислота ограниченно растворяется в хлороформе и
диэтиловом эфире и практически нерастворима в воде, бензоле, пстролейном эфире. Д’-1 ГК
относится к слабым кислотам и имеет рКл. равный 10.6.
Спиртовые растворы Д’-ТГК и Д’-ТГК-кислоты имеют характерные спектры поглощения в
УФ-области с максимумами соответственно 283. 276 и 283. 278 нм
Токсикокинетика и биотрансформация
Каннабиноиды активно абсорбируются из желудочно-кишечного тракта (90—959?). но из-за
эффекта первого прохождения через печень (см. гл. 4) бнодоступность при оральном приеме
составляет только 5—20% и немного выше при ингаляционном способе введения. Весьма зна-
чительно проявляются индивидуальные особенное)и жмрсбитсля наркотика, что приводит к
изменению биодоступности. Д’-ТГК имеет большой объем распределения (4—14 л/кг) и 97%
его метаболитов в плазме интенсивно связываются с липопротеинами и значительно меньше —
с альбуминами В связи с большим объемом распределения метаболиты Д’-ТГК могут нахо-
диться в моче на низком уровне в течение длительного времени. Как липофильные вешссгва.
каннабиноиды быстро перераспределяется из плазмы крови в хорошо снабжаемые кровью
ткани и пересекают гематоэнцефалический барьер (см. гл. 4). Перераспределение наркотика
приводи г к его накоплению в жировых тканях. Т — 20—57 ч лля умеренно потребляющих и
Т,,— 3-14 ч для часто потребляющих и сильно зависит от индивидуальных особенностей ор-
ганизма. Бнотрансформания каннабиноидов осуществляется системой цитохрома Р450 печени
(рис. 7-30). Д’-ТГК подвергается интенсивной биотрансформании в микросомах печени (обна-
ружено около 50 метаболитов), образуя гидроксилированные производные. Основным актив-
ным метаболитом в плазме крови является продукт окисления по C|t — 11-»илрокси-Д’-ТГК.
а в моче — продукт окисления 11-пыроксн-Д’-ТГК — ТГК-СООН Активным метаболитом
является и 8р-П1дрокси-Д‘-ТГК.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 575
11-Нор-ДЭ-ТПС-кислота
Рис. 7-30. Схема бпотрансформацни Д ТГК.
Максимальные концентрации Д -ТГК в плазме крови наблюл отся в пределах одной двух
минут после внутривенного или ингаляционною приема и между 2—4 ч после приема внутрь.
Фармакологические аффекты каннабиноидов не коррелируют с их максимальном кониент
рацией в плазме крови и наступают обычно с задержкой 15—60 мин после достижения этой
концентрации
Выведение каннабиноидов происходит в виде метаболитов в желчь и мочу в течение не-
скольких дней. Д'* ГГК и его основные метаболиты выводятся из организма главным образом
с фекалиями и мочой Для V-ТГК примерно 80—90% дозы выводится за 5 дней после приема,
причем около 20% экскретируется с мочот и 65% — с калом. С мочой каннабиноиды выво-
дятся н виде метаболитов, основным из которых является Д° ТГК-кислонт, на 80% связанная
е глюкуроновой и серной кислотами. С фекалиями в большей степени выводятся Д'-ТГК и
Л -ТГК-кислота, конъюгированные с желчными и жирными кислотами. Степень выведения Дч-
TI К зависит oi дозы и путей введения. Выведение метаболитов происходит не только с мочой
и калом, но и с секретом слюнных и молочных желез.
После употребления разовой юзы низкие копнен грации метаболитов Д*-1 ГК могут быть
обнаружены в моче в течение 5 нед. При курении или внутривенном введении в крови боль-
шая часть А'-ТГК-кислоты находится в свободном состоянии Метаболит 8 11-ди-ОН-ТГК
выводится с мочой в виде глюкуронида и может быть обнаружен после гидролиза I го уровень
более 15 нг/мл в моче указывает на вероятное потребление марихуаны не более чем за 6 ч до
отбора образца. При хроническом потреб iciiiih Д’-Т! К депонируемая в жировой ткани.
Методы определения
ИХМ определяют Д’-ТГК-кислогу и дручие хетабошгы.
С помошью ИФА можно обнаружить в моче постоянных потребителей 20 нг/мл каннаби-
ноидов (в среднем) в течение 1 мсс. а в моче непостоянных потребителей — в течение 15 дней
(от 3 до 28 дней) после последнего употребления (см. гл. 6.2).
Вследствие высокой липорастворимости каннабиноидов и их низкой концентрации в моче
и крови содержание каннабиноидов часто устанавливают в смывах рук и роговой полости по-
дозреваемых. Обнаружение каннабиноидов только в смывах не является подтверждением того,
что данное лицо употребляло марихуану.
При исследовании плазмы крови надежные результаты по обнаружению ТГК получаются
после добавления к плазме ацетонитрила (или метанола) и последующей экстракции толуолом
Д.1я очистки от сопутствующих кислот и жиров используют ре кстракпию или твердофазную
576 Глава 7
экстракцию на понообменниках и патронах. В последнем случае лаже при исследовании жи-
ровых тканей возможно выде юнис до 80% 1 ГК. Кислые метаболи 1Ы ТГК находятся в моче
в виде глюкуронидов. которые легко гидролизуются в щелочной среде (в течение 15 мин при
комнатной температуре или в течение 5 мин при 50 С), При ТФЭ кондиционирование колон-
ки (фаза С18) проводят медленно порциями метанола по 3 мл и водой Через колонку пропус-
кают гидролизированный образец 2 мл/мин и промывают 10 мл 0.1 М НС1 и 25 мл фосфорной
кислоты в 10% ацетонитриле Элюируют каннабиноиды 1 мл ацетона и упаривают пол током
азота. Сухой остаток растворяют в 100 метанола.
В криминалистическом анализе исследуют растительные препараты и сырье под микроско-
пом Для выявления характерных морфологических признаков готовя! препараты из расти-
тельного сырья (марихуана, гашиш) в водно-глицериновой смеси по стандартной методике и
при увеличении в 400 раз исследуют их с помощью свстооптичсского микроскопа. Морфологи -
ческие особенное!и растения рода конопли: простые одноклеточные волоски ретортообразной
формы с цистолитами и без них; сидячие одноклеточные волоски; железки с числом выдели-
тельных клеток 8—12; сфероидальные пыльцевые зерна с 3 порами. Для обнаружения цисто-
литов в растительном сырье на препарат, помешенный на предметное стекло, наносят каплю
воды и каплю соляной кислоты. При этом выделяются пурырьки углекислого газа, которые
хорошо видны. Хна (возможная примесь каннабиса) такую реакцию не лас I
Реакции окрашивания. Обработка раствором Дюкенуа—Левина (0.4 г ванилина в 20 мл 95%
этанола с последующим добавлением 0.5 мл ацетальдегида: концентрированная соляная кисло-
та н хлороформ). К небольшому количеству образна добавляют около 2 мл реактива и встряхи-
вают в течение 1 мин. Затем добавляют 2 мл концен трированно!! НС1. встряхивают несколько
секунд и оставляют на 5 мин. Если окраска начинает развиваться через 1—2 мин, добавляют
2 мл хлороформа и осторожно встряхивают смесь. При наличии каннабиноидов наблюдают
сине-фиолетового окрашивания нижнего хлороформного слоя.
Метод ТСХ обычно используется при анализе смывов с пальцев рук, лалоней. губ полос-
ти рга. т.е. в местах, где конденсируются продукты курения. Смывы производя г с помощью
ватного или марлевого тампона, смоченного этиловым спиртом. Из материала тампона канна-
биноиды экстрагируют органическим растворителем — этилацетатом. гексаном, петролейным
эфиром или смесью хлороформ—метанол (2:1). центрифугируют и наносят полученные экетра-
кты на пластину с силикагелем. Хроматографическое разделение проводят двукратно в толуо-
ле либо в системе петротейный эфир—ди этиловый эфир (4:1). После завершения разделения
пластину высушивают и обрабатывают 0.1 или 0.5% раствором реактива прочного синего Б
или ББ в 10% растворе гидрокарбона га натрия. При этом на пластине, разделение на кото-
рой было выполнено в толуоле, появляются соответственно окрашенные хроматографические
зоны каннабиноидов: каннабидиола (зона поглощения оранжевого цвета — R(0,76). тетрагид-
роканнабинола (зона поглощения красного цвета — R. 0,66), каннабинола (зона поглощения
красно-фиолетового цвета — R 0.55). капнабихромсна (зона поглощения красно-оранжевого
цвета — Rf 0.51).
Каннабиноиды можно обнаружить с помощью УФ- и ИК-спектрометрни, спектры Д'’-ТГК
представлены на рис. 7-31.
При исследовании плазмы крови на присутствие ТГК-СООН часто применяют метод ГХ-
МС. который позволяет при пробе объемом от 4 до 10 мл обнаруживать 1 — 10 нг/мд 1 ГК-
СООН. Такие пределы обнаружения адекватны большинству судебных случаев. Однако пос-
ле приема разовой дозы ТГК его концентрация в крови в течение уже первых часов ниже
1 в г/мл.
После приема 5—20 mi ТГК его концентрация в слюне достигает 1000 нг/мл и хорошо кор-
релирует с динамикой физиологических эффектов, а через 3 ч концентрация в слюне снижает-
ся до 50 нг/мл. что сегодня можно детектировать метолом ГХ-МС.
Для применения методов ГЖХ. КЭ, ВЭЖХ и ГХ-МС при определении каннабиноидов надо
иметь внутренние стандарты, например оксифснбутазон, кетопрофен. дейтериевые аналоги
Д4-карбокси-ТГК (для ГХ-МС). п-окгнл-н-гидроксибензоат (для ВЭЖХ) и проводить дерива-
тизацию. например сидилирование BSTFA или MTBSTFA (см. гл. 5 и гл. 6).
В табл. 7-3 приведены условия определения каннабиноидов различными методами.
В волосах методом ГХ-МС ТГК обнаруживают в кончен грации 0.1—0,29 нг/мг (рис. 7.32).
578 Глава 7
1аблица 7-3. Условия определения каннабиноидов методами 1ЖХ. ВЭЖХ.ГХ-МС
ГЖХ
Детектор: ПИД
Колонка: кварцевая колонка 10 м
х 0,52 мм 1.D с 2,6 мкм
Упаковка: 3%-й лимстилсили-
кон (OV-I)
Газовая смесь: Гелий (2 мл/мин)
Техника ввода: Split/splitlcss
Температура:
Инжектор 290 ’С
Колонка 240“С
Детектор 290 *С
ВЭЖХ
Колонка: Стационарная фаза
Octylsilica (Zorbax С8, или экви-
валент), 5 мкм. 25 см х 4.6 мм
Подвижная фаза: Аиетонит-
рил—50 мМ фосфорной кисло-
ты (65:35, по объему)
Скорость потока: 1,5мл/мнн
Обнаружение: УФ X 2II нм
(диодноматричный детектор
200—350 нм режим сканирова-
ния)
Объем ввода: 5—10 мкл
Внутренний стандарт: Канна-
бинол
ГХ-МС
Детектор: МСД
Колонка, кварцевая колонка
10-30 м х 0,18-0.25 м.м I.D с
0,25 мкм
Упаковка: фенил.мет ил или
диме! илсилоксан
Газовая смесь: Гелий (2 мл/м ни)
Техника ввода: splitless
Температура:
Инжектор 250—260 “С
Колонка от 150—220 до 270
290 "С но 5-25 ’С/мин
Внутренний стандарт: Мск-
лофенамовая кислота или
дейтерированное производное
ТГК-СООН
Заключение
При определении каннабиноидов в качестве подтверждаю цих методов использую! газовую
хроматографию, ВЭЖХ, ГХ-МС.
Масс-спектры основных компонентов каннабиса:
Каннабидиол:
Каннабинол:
Д’-ТГК
231, 246, 314, 232, 121. 193.74.174 m/z;
295, 296. 238, 310. 119. 43. 251, 239 m/z;
299, 231, 314, 43, 41, 295, 55, 271 m/z
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 579
7.3.3. Фенилалкиламины
Что снаружи и что внутри — это еще вопрос.
Р. Магритт
Существует несколько классификаций фенилалкиламинов: по химическому строению, фар-
макологическому действию, источникам получения и происхождению (см. электронное при-
ложение).
Фенилалкиламины природного происхождения содержатся в растениях: кате съедобном.
*1>едре. пейоте. Первые упоминания о кале относятся к XV столетию н.э. Молодые побеги и
листья вечнозеленого кустарника Catha edulis, произрастающего на юле Аравийского полуос-
трова и в Востолной Африке, используются населением этих регионов в качестве возбужда-
ющего. стимулирующего и эйфоризируюшего средств») Высушенные листья этого растения
известны как абиссинский или арабский чаи.
Рис. 7-33. Структурные формулы катина (а> и катинона (6)
Основным действующим началом ката съедобного является катин и катинон (рис. 7-33).
Кроме них, кат съедобный содержит жирные кислоты, эфирные масла, алкалоиды В срезан-
ном растении под воздействием ферментов в течение нескольких часов катин и катинон быс-
тро разрушаются.
Ephedrae herba — общее обозначение для всех видов Ephedra. которые содержат действующее
вещество эфедрин (рис. 7-34. а). Эфедра растет небольшим кустиком, внешне напоминающим
хвощ, и достигает в высоту 30—40 (50) см. Прутьевидные членистые ветки расположены в му-
товках с кожистыми влагалищами возле узлов и лишены зеленых листьев. Цветки этого дву-
домного растения неприметны. Дикорастущее растение эфедра используют в Китае уже более
5000 лет. употребляя ее при лихорадке, кашле, а также лля повышения работоспособности.
Галлюциногенный алкачоид мескачин (рис. 7-34. б) впервые выделен в 1S96 г. из кактуса
пейот (Lophophora williamsii) произраставшего в Северной Мексике Южноамериканские ин-
дейцы использовали мескачинсолержащие кактусы при проведении религиозных обрядов за
несколько веков до открытия Америки Колумбом. Галлюциногенные дозы мескалина оцени-
ваются в 200—500 мг гидрохлорида или сульфата. Эф([>скты от разовой лозы наблюдаются в
течение 12 ч.
Употребление разовой дозы мескачина вызывает галлюцинации. повышает сексуатьнуто ак-
тивность и обостряет чувствительность. Токсическими эффектами являются агрессивность,
тревога и чувство беспокойства, неадекватное ощущение пространства и цвета, психотические
Рис. 7-34. Структурные формулы эфедрина (а) и мескачина (б).
580 Глава 7
реакции. Наибольшее содержание мескалина в цветках, которые имеют коричневою окраску и
диаметр 2.5—5 см. Они редко ветре гаются в незаконном обороте, так как имеют очень горький
вкус.
Синтетические фенилалкиламины составляют значительную часть наркотиков в незакон-
ном обороте на территории Западной Европы. В России количество изымаемых фенилал-
киламминов, в частности амфетаминов, в последние годы растет стремительными темпами.
Синтетические фенилалкиламг ны подразделяют на:
• амфетамин:
• метамфетамин;
• метоксизамешенные по бензольному кольцу;
• мстилендиоксипроизволныс.
В силу особенностей фармакологического действия средства, содержащие амфетамины,
наиболее широкое распространение получим среди молодежи на дискотеках и вечеринках,
вызывая сильную психическую зависимость и привыкание. Производимые нелегально аналоги
амфетамина резко подвергаются тестированию по фармакологической активности. Поэтому
при их приеме постоянно существует у роза передозировки или серьезных побочных я|х|х -
тов. Производители наркотических средств не проверяют свою продукцию на присутствие
посторонних загрязняющих веществ и полупродуктов синтеза. При приеме таких препаратов
существует реальная вероя1нос1ь интоксикации побочными продуктами. Ряд аналогов амфета-
мина и метамфетамина, в том числе замещенных по бензольному кольцу, оказываю) сильное
токсическое воздействие иа организм человека.
В незаконном обороте наркотиков получили распространение около 20 производных ам-
фетамина и метафетамииа. Из них наиботсе часто встречаются МДА' (другое название: «Love
Drugs»); МДМА (другие названия — «Ecstasv». «ХТС». «Adam», «ESSENCE», «Cardillac»); МДЕА
(«Ех >, «МДЕ»); ДОМ («STP»); ПМА; ДМА; ТМА; ДОБ; ДОХ; МБДБ; БДБ; ДОЭТ; мескалин.
2-СВ. Хотя в России до настоящего момента в незаконном обороте зафиксированы случаи
употребления только некоторых из них (МДА, МДМА, МДЕА, МБДБ, ДОБ. 2-СВ и мсска-
)ин), все упомянутые амфетамины внесены в Перечень наркотических средств и психотроп-
нтве и <-in. Криtкис сисдсния о них и некоторых других амфетаминах даны ниже.
Фармакология и токсикология. Амфетамины являются психомоторными стимуляторами. ВЫ-
ЗЫВАЮТ психическое состояние, характеризующееся обострением чувств и повышенной эмони-
ондльной свободой. Некоторые амфетамины в определенных дозах могут оказывать галлюцино-
генное и психотропное действие. Препараты, содержащие амфетамины, вызывают учащенное
сердцебиение, стимулируют дыхание, активизируют моторную деятельность, снижают аппетит
и потребность в сне, снимают усталость, поднимают настроение. Физиологические симпто-
мы у человека после принятия амфетаминов проявляются: расширением зрачков, учащенным
пульсом, повышением артериальною давления, иногда дрожью. Длительное употребление пре-
паратов, содержащих амфетамины, приводит к нарушению сердечной деятельности, кровооб-
ращения, повышению агрессивности вплоть до психозов, а также поражению печени, почек
и нервной системы. Употребление амфетаминов, находящихся в незаконном обороте, часто
приводит к возникновению неврологических заболеваний, существует большой риск интокси-
кации имеющимися примесями, передозировки и смертельного исхода. Кроме того, у потре-
бителей амфетаминов высока склонность к суициду
В настоящее время амфетамины в России в .медицинской практике не применяются.
Амфетамин (рис. 7-35. а) впервые синтезирован в 1887 г. как аналог эфедрина и получил ши-
рокое распространение в медицине в качестве бронхорасширяюшего средства. В 20—30-е годы
XX века стал использоваться как стимулятор ЦНС, для подавления аппетита, лечения гипоки-
незии и нарколепсии. Основными и тяжелейшими последствиями приема являются увеличение
вероятности инсульта, гипертония, аритмии, параноидальные психозы. Входит в состав антидот
для фосфорор анических веществ из армейской индивидуальной аптечки «А—1» — афин.
Оральная или внутривенная дневная доза для наркоманов может доходить до 2 г.
Метамфетамин (рис 7-35. б) впервые синтезирован в 1919 г. Незаконно синтезируемый
из фенилацетона и N-мстилформамида метамфетамин представляет собой рацемат, а синте-
Псишостъю название всшсств см. табл. 7-4
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 581
Рис. 7-35. Структурные формулы амфе!амина (а) и метамфетамина (б).
зирусмый из эфедрина с применением красного (|юсфора и йодистоводоролной кислоты —
D-изомер. С нсмсдицинскими целями используется путем внутривенного или внутримышечного
введения, перорально, а также вдыхания паров после смешивания с марихуаной, табаком или
петрушкой. Наиболее опасной формой является «лсд» — кристаллическая форма метамфетамина
гидрохлорида. Часто используется в смесях с кокаином, героином или другими наркотиками.
МД4впервыебылсинтсзнрованв1910гиявляетсяолнимизпсрвыхсинтети 1ескихамфетаминов
(рис. 7-36). Широкое распространение в незаконном обороте наркотиков МДА получил в Аме-
рике в конце 60-х — начале 70-х годов и был известен как «Mellow Drug* (таблетки Меллоу)
или «Love Drug* (таблетки любви).
Популярность МДА снизилась после 1973 г. из-за
многочисленных смертельных случаев в США и Ка-
наде, которые связывали с употреблением этого ве-
шества. Однако этот наркотик все сше имеет широкое
распространение в ряде европейских стран. Действие
МДА сильно зависит от лозы. При принятии малых
лоз МДА (менее 80 мг) достигается стимулирующий
эффект. Большие лозы (более 150 мг) приводят к гал-
люциногенным эффектам с искажением визуальных.
акустических и тактильных ошушений. В средних до-
зах (80—150 mi) МДА вызывает психотропные эрфекш. проявляющиеся чувством расслаб-
ленности. прояснением сознания, улучшением настроения, возникновением стремления к
общению с людьми, облегчением отношения к себе и прошлому. Доза выше 500 мг является
смертельной. Кроме того, МДА снижает аппетит. Практически все препараты, в состав кото-
рых входит МДА. встречаются в виде та( теток, содержащих 200—230 мг вешества. и употреб-
ляются перорально. Действие препарата начинается через 30—60 мин после приема и длится
8—12 ч. МДА вызывает психическое привыкание средней силы при отсутствии физической
зависимости.
МДМА впервые был синтезирован в 1914 г. (рис. 7-37, а). Употребление МДМА расширяет
Гранины восприятия окружающего мира. Потребители МДМА описывают его действие как
-отделение души от тела». Средняя разовая доза при приеме перорально составляет около
100 мг. Действие начинается через 30—60 мин и продолжается 4—6 ч. МДМА вызывает высо-
кую психическую зависимость. В незаконном обороте этот наркотик под названием «экстази»
появился в конце 70-х годов XX века в виде таблеток, капсул и порошков, содержащих 50—
100 мг действующею вещества
МДЕА впервые синтезировали в 1980 г. (рис 7-37, б) Действие МДЕА начинается через
полчаса после приема, длится 3—5 ч. а затем медленно ослабевает. Принимаемая юза состав-
ляет около 120 мг. смертельная лоза — более 500 mi. МДЕА вызывает состояние эйфории, по-
вышение коммуникабельности, в определенных условиях происходит резкая смена настроения
от эйфории к депрессии. Вызывает психическую зависимость средней силы.
ДОБ (получен в 1967 г.) оказывает галлюциногенное действие подобное МДА. но интенсив-
ности превосходящие таковое МДА примерно в 100 раз (табл. 7-4). Принимаемая лоза составляв!
около 2 мг. Действие наступает через 1—2 ч. длится. по разным источникам. 18—30 ч. Нарко-
тик вызывает сильный стимулирующий эффект, изменение цветового восприятия окружающего
мира и облегченное восприятие собственных проблем: происходит потеря ощущения окружа-
ющей действительности, иногда — потеря сознания. Смертельная доза равна 30—35 мг. ДОБ
является одним из самых сильных наркотических средств и по эффекту приближается к ЛСД
582 Глава 7
МБДБ (иногда на!ываю! МДМБА) и БДБ (см. габл. 7-4) впервые появились в незакон-
ном обороте в начале 90-х голов XX века По действию напоминают МДМ А и МДА МБДБ
обладает расслабляющим свойством; усиливас! слуховые, зрительные и вкусовые ощущения.
В настоящее время евойс(ва МБДБ и ЬДЬ мало научены. МБДБ. ЬДБ. МДА. МДМА и МДЕА
отнесены к классу энтактогепов. Согласно определению, энтактогены — эго «вещества, про-
изводящие чувства внутри нас». Они пробуждают возможность и способность погружаться и
самих себя и выявлять собственные проблемы и позитивно их разрешать. О нозременно они
повышают коммуникабельность человека.
IIOM/STP (см. табл. 7-4) был перт м из производных амфегамнна. появившихся в неза-
конном обороте наркотиков в 1967 г в США в виде таблеток массой 10 мг под названиями,
характеризующими его действие: STP — Serenity (безмятежность). Tranquility (спокойствие).
Peace (мир). ДОМ/STP действует как таллюцинокн и обладает актив! остью, в 80—100 раз
более высокой, чем мескалин, но в 50—60 раз ниже, чем ЛСД.
Высокой активностью обладает ДОЛ'(см. габл. 7-4). Эют наркотик появился впервые в не-
законном обороте в США в 1972 г., а н Канаде. Аве радии и Европе в конце 70-х — начале 80-х
годов Препараты содержащие ДОХ. встречаются в виде таблеток, порошков и пропитки на
бумажных носителях. О&тчдаст активное!ью. близкой к ДОБ Описываемые ощущения срав-
нивают с состоянием комфорта и появлением видений (галлюцинаций).
Наиболее активные амфетамины (ДОБ. ДОХ и ДОМ) встречаются в виде пропитанных
веществом бумажек, аналогичных бумажкам с ЛСД. Остальные наркотики этой группы встре-
чаются в виде порошков, капсул, но прежде всего в виде таблеток. На таблетках. содержа-
щих МДА, МДМА. МДЕА. МБДБ. как прави. о, выдавлены различные изображения корона,
птичка, автомобили, голова индейца, гнома, символическое изображение доллара ($). могут
встречаться ра личные надписи (ADAM, EVE. LOVE) и т.д. Принимают препараты обычно
перорально, реже используют внутривенное введение.
Кроме самих амфетаминов, в состав таблеток могут входить такие вешества. как героин,
фентермин и флунитразепам. Часто в таблетках встречаются кофеин, аспирин, парацетамол,
а-метилбензиламин, эфедрин, хинин, i зосафро! (прекурсор для получения некоторых амфе-
таминов). лидокаин, тестостерон (гормон), хлорамфеникол (антибиотик).
В качестве наполните, ей для таб ictok и порошков. как правило, используют крахмал, лак-
тозу. г !юкозу, фруктозу, карбонат кальция, маннит, сорбит и другие вешетва. а в качестве свя-
зующего при табле!ированип — поливиниловый спирт. Эффектвиыс дозы и время действия
приведены в табл. 7-4.
На основании Списка I «Перечня наркотических средств, психотропных вешеств и их пре-
курсоров. подлежащих контролю в Российской Федерации» производные амфетамина отнесены
к наркотическим средствам, оборот которых запрещен на территории Российской Федерации.
Таблица 7-4. Дозы и время действия синтетических фснилалкиламкнов
Вещество Химическое название Эффективная доза, мг Время действия, ч
МДА 3,4-Мети.1еилноксиамфетачии 200-230 8-12
МДМА 3,4- Mei и.юшшоксимстамфс гамин 80-150
МДЕА 3,4- Мегнлендиокс и - N-э г иламфе зам ян 100-200 3-5
ДОМ/STP 2.5-Диметокси-4-мети.1-амфетамии 3-10 14-20
ПМА 4- Метоксиамфетамин 50—80 короткое
ДМА 2.5-Днметоксиамфстамин 80-160 6-8
Метеболизм и о ределение наркотических средств, психотропных. 583
Окончание matit. 7-4
ТМА 3.4,5-Tpi метоксиамфетамии 100-250 6-8
ДОБ 2.5-Диметокси-4 бромамфетамин 1-3 18-30
ДОХ 2.5-Ди.мстокси-4-хлорамфе1а.мин 1.5-3 12-24
МБЛБ Н-Мстил-1-(3.4-метмл«,1лиоксн фснил)-2-бу~ танамин 180—210 4 -6
БДБ 1-(3,4-мсги.кндиоксифенил)-2-бутаиамни 150-230 4-8
ДОЭТ 2.5-Днметокси- 4-этиламфсгамин 2-6 14-20
Мескалин* 3.4,5-Триметоксифснэти laxiini 300—500 10-12
лсд* Днэтиламнд лизергиновой кислоты 0.03-0 05 8-12
* Дозы и время действия приведены для сравнения
Фенилалкиламины являются стимуляторами ЦНС. симпаюмиметнками. некоторые из них
широко используются в медицине (например, эфедрин — а-, р-адрсностимулятор, вызывает
сужение сосудов, повышает артериальное давление). Считается, что они увеличивают уровень
катехоламинов в синаптическом пространстве, блокируя обратный захват норэпинефрина (нор-
адреналина) и допамина пресинаптическими нейронами и высвобождая указанные нейромеди-
аторы. Амфетамин и метамфетамин ингмбирют различные моноаминоокси даты. Установлено,
что амфетамины не обладают сродством к допаминовым рецепторам и адренорецепторам, но
увеличивают высвобождение серотонина, что (по существующей теории) объясняет эффекты
лих наркотиков, связанные с поведенческой реакцией. Правовращающие энантиомеры амфе-
таминов в пять раз более активны как стимуляторы, чем их левовращающие аналоги.
Амфетамины не лают выраженной физической зависимости, но при резком прекращении
присма возникает абстиненция: стойкая бессонница, депрессия с идеями самообвинения, иног-
да с суицидальными тенденциями, психоз, помрачнепне сознания, двигательное возбуждение,
в некоторых случаях преобладают бредовые идеи преследования, галлюцинации.
Хроническая интоксикация характеризуется выраженной, иногда очень интенсивной, психи-
ческой зависимостью. Она приводит к общему истощению, зяметвому снижения массы тела, веге-
то-сосудистым нарушениям, бессоннице, тахикардии, аритмии, гипертонии раздражительности,
возб) тимости. патологическому развитию личности. Длительное применение стимуляторов приво-
дит к снижению интеллекта. зацикливанию на несушестве шых деталях. сужению крута шггсресов.
В последнее время стало увеличиваться количество случаев приема эфедринсодержащих смесей.
Фишка-. имические свойства. Вещества основного характера. В форме оснований фснилал-
киламииы (кроме эфедрина) — маслянистые труднолстучис жидкости, в форме солей (гидро-
х. ориды, сульфаты) — белые или слегка кремовые порошки или кристаллы, лсгкорастворимыс
в полярных растворителях и практически нерастворимые в хлороформе и эфире. Фенилялкн
ламины обладают оптической активностью.
Токсикокинетика и биотрансформаиия. После орального введения фенилалкиламины быстро
всасываются в желудочно-кишечном тракте и распределяются по органам, хорошо снабжае-
мым кровью.
Около 70% дозы метамфетамина выводится с мочой за 24 ч. До 45% от дозы выводится как
неизмененное вещество, до 15% как 4-гидроксих етамфетамин и около 5% как амфешмин —
основной активный метаболит. Выделение ней мененного вешества зависит от pH мочи, уве-
личиваясь при кислом значении pH мочи и резко уменьшаясь (до 2%) при щелочных значени-
ях. Метамфетамин является метаболитом бензфетамина и селегилина.
Амфе1амин также быстро абсорбируется после приема внутрь или ректального введения
Его главный метаболический путь — окис итсльнос деаминирование с образованием фенила-
цетона и бензойной кислоты, которая после конъюгации с глицином даст гиппу'ровую кислоту
(рис 7-38). Меньшее значение в метаболизме наркотика имеют реакции ароматического гид-
роксилирования е формированием активного метаболита 4-гидроксиамфетамина, р-гидрокси-
лирование. которое является стереоселективным для (+) - изомера ам<ретамипа, формирование
норэфелрина (фенилпропаноламвна) и N-окисление. Продукты ароматического гидроксили-
рования и N-окислсния выводятся с мочой конъюгированными с серной inn глюкуроновой
кислотами. Выделение амфетамина, как и метамфетамина зависит от значения pH мочи зна-
чительно увеличиваясь при кислых значениях pH мочи.
584 Глава 7
Рис. 7-38. Схема био|рансформаиии мстамфс тмина
После приема больших лоз. амфетамин обнаруживается в моче в течение нескольких лней.
Приблизительно 30% дозы амфетамина выводится в неизмененном виде с мочой за 24 ч. а
90% лозы— в течение 3—4 дней. Количество амфетамина. выделившегося за 24 часа, может
достигать 74 % лозы в кислой среде и уменьшиться до 1—4% в щелочной, при этом ворастает
процент гипнуровой и бензойных кислот (50% дозы) Обычный состав вылечившихся мстабо
ли гов: । ин паровая кислота —16—28 %, бензоилглюкуронид—4 %, 4-гидроксиамфетамина—2~
4 %, норэфедрии. конъюгированный 4-гидррксиамфетамнн и фени.таиетон—2% (табл. 7-6).
Таким образом, при кислом значении pH максимален выход вещества в неизмененном виде
с увеличением периода полувыведепия. а при щелочном значении pH увеличивается процент
метаболитов и снижается период полувыведения.
Максимальная концентрация фепилалкиламинов в крови достигается ( в среднем) в течение
2—3 ч (табл. 7-5).
Зяблина 7-5. Конце, праиия фснилалкиламинов в плазме крови
Вещество Кониеитриция в плазме, мкг/м □
терапевтическая токсическая летальная
Амфетишш 0.1 0,2—3,0 До 41.0
Мсти|>ст<1м>1н 0.01—0.05 0.1-2.0 До 43.0
Эфе арин 0.035-0.08 0.15-10.0
Норэфелрин 0,05-0.12 До 50.0
Эфедрон - 0.2-30.0 ! 1
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 585
Фармакокинетические параметры некоторых фенилалкиламинов приведены в табл. 7-6.
Таблнпа 7-6. фармакокинетические параметры фешетаткиламинов
Вещество рк, 1 И- 4 Основные метаболиты, % Выделение в неизмененном вше. %
Амфетамин 9.9 8- 12 Гнппуроная кислота —16—28%. бензоил- люкуринид — 4% 4-Гилрокснамфстамни —2—4%. норэфелрин —2%. 30-70
Метамфетамин 10.1 9 Амфетамин — 5% 4-Ги дроксимстнламфстамнн — 15% 45
Эфелрш! 9.6 3-11 Норэфейрин — 8—20% Бензойная и пшнуровая кислоты, фснил- нропанлнол — 4—13%. 55-75
Норэфслрни 9.4 4 Амфетамин. эфедрин. диэтилирониоиат — менее 5% 90
Эфедрой 9.0 3-8 Эфедрин— 50—60 Норэфелрин — менее 2% 15-20
Концентрация метамфетамина в суточной моче после разового приема 10 mi составляет
0.5—4.0 mi/л. 30 mi —до 7 мг/л. В моче наркоманов концентрации мстамфсЖмина составляет
24—333 мг/л, а амфетамина — 1—90 мг/л.
МДМА выделяется с мочой в неизмененном виде до 65% принятой лозы за 72 ч и 7% как
МДЛ Например, концентрация МДМА в моче после приема 105 мг составила 17 мг/л.« МДА
менее 3 мг/л. На рис. 7-39 представлена схема бнотрансформапии МДМА (экстази). МДМА
метаболизируется путем N деметилирования в МДА.
Методы определения
Используют капельный химический анализ, ИХМ, ТСХ. ВЭЖХ, КЭ, газовую хроматогра-
фию. ГХ-МС ИК-спектрометрию. Фурье-И К-спектрометрию (примеры см. гл. 6).
Капельный химический анализ проводится при исследовании таблеток. При этом часть
таблетки массой 5—10 мг растирают в ступке, растертый порошок помешают в фарфоровую
чашку и добавляют 2—3 капли реактива Марки, наблюдая при ном появившуюся окраску.
Рис. 7-39. Схема овотран формации МДМА (экстази)
586 Глава 7
Через 10—15 мин фиксируют изменение окраски, если оно наблюдается. В качестве систем
растворителей для ТСХ используют чаще всего хлороформ—ацетон—этанол — 25% раствор
аммиака в соотношении (20:20:3:1) или толуол—этанол—триэтиламнн (9:1:1).
Определение амфетаминов в биообъектах проводят после экстракции. ЖЖЭ проводят в силь-
нощелочной среде эфиром, хлороформом или толуолом, ТФЭ — на патронах С18. ХДЦ-2 и с
последующей стадией — реэкстракцией. После этого возможен предварительный анализ иммуно-
химичсскими методами и/или ТСХ с дальнейшим подтверждением полученных результатов ме-
тодами ГХ-МС и ВЭЖХ. При определении метолом газовой хроматографии используют прием
дериватизании. значительно улучиюший аналитические сигналы и результаты анализа (рис. 7-40).
Получение ТФА-лериватов — щюдуктов взаимодействия трифторуксусного ангидрида ам-
фетаминов — проводят по следующей методике. Сухой остаток после экстракции растворяют
в 0.5—1 мл толуола, добавляют 50—100 мкл деривагнзирующего реактива (например, грифто-
руксусного ангидрида), закрывают и нагревают ло 600 °C в течение 30 мин. Далее охлаждают
до комнатной температуры, добавляют 1 мл 5% раствора идрокарбоната натрия и тщательно
перемешивают Верхнюю фазу анализируют методом газовой хроматографии или ГХ-МС. При
необходимости пробу разбавляют.
На рис 7-41 и 7-42 приведены ИК- и масс-спектры МДМА (другие примеры см. гл. 6.4.2 2)
7.3.4. Кокаин
«...если у вас есть это внутреннее качество — душевное рав-
новесие. то даже при отсутствии различных внешних усло-
вий. которые большинство считает необходимыми для счас
тья. вы сможете вести жизнь, полную счастья и радости ,.»
Ло-iait Лама
Кокаин и лист коки — самые мощные стимуляторы растительного происхождения, извест-
ные людям. Южноамериканские индейцы используют наркотики кокаинового куста бо. ее
5000 лет для вхождения в транс при религиозных обрядах, для улучшения самочувствия, снятия
усталости и уменьшения чувства голода, а также чтобы определить меру времени и расстоя-
ния. В некоторых исторических документах майя расстояния приводятся в количестве ртов
заполненных листьями коки, употребленных за время поездки. Такая единица измерения на-
зывалась «сосаба». Кокаин выделен нз листьев коки в 1859 г. А. Ниеманом (A Niemann) в Гог-
гингемском университе. его структура расшифрована в 1898 г., а синтез осуществлен в 1902 г.
(см. электронное приложение)
350000
300000
4.00 5,-00 6.00 7 00 8 00 9.00 10,00
1. Амфетамин
2 Метамфетамин
3. Эфедрин
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных . 587
Рис. 7-40. Газовая \ромато|рафня: хроматограмма смеси фенилалкиламинов до дернватизаиии (а) и после
дернватизаиии (б) пробы
Частота, см'1
Рис. 7-41. ИК-спектр МДМА.
В XVI11—XIX веках кокаин широко распространялся как свободно доступный и «безвред-
ный» стимулятор. Он использовался лля местного обезболивания вхо. ил в состав большого
тела дскарств, прохладительных напитков, тоников, вин и лакомств. Наиболее известными
из них являлись смеси вин с кокаином, например «Vin Mai апн. Popular French tonic wine» и
«Pemberton’s French wine coca», потребление которых считалось привилегией высшего обще-
ства и интеллектуальной элиты общества. В 1885 г. одна из фармацевтических компаний США
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 589
Рис. 7-43. Структурная формула кокаина.
чтобы оправдать расходы на их культивирование.
Куст коки требует богатые ivmvcom почвы, влаж-
ный климат (80—90% влажности) и обычно растет
па высоте 500—2000 м. нал уровнем моря в местах.
Lie температура постоянно держится между 15 и
20 °C. В этих условиях можно собирать до 4 урожа-
ев в гол Кусты коки лают первый урожай листьев
через 18 мес после высадки и могут плодоносить
в течение 40—50 лет. Листья собирают 3—4 раза в
год. рушат и упаковывают. Листья коки содержат в
среднем около 1% кокаина, каждый акр занимают
7000 растении с массой листьев около 800 кг. Для
получения I кг пасты кокаина необходимо около
100—200 кг листьев. Около 2.5 кг пасты кокаина
требуется для получения 1 кг основания кокаина, а I кг основания превращается в 1 кг порош-
ка кокаина, главным образом в виде кокаина гидрохлорида с чистотой 80—90%.
Кокаина гидрохлорид — белый кристаллический порошок. Та 98 °C (основание). Тп1157—
202 ’С Нидрохлорид), обладает слабыми основными свойствамщрК^ 8.6). Кокаина гидрохло-
рил хорошо растворяется в воле. Так. I г кокаина гидрохлорила растворяется в 0.5 мл воды,
в 3.5—4.5 г этанола. Этими свойствами часто пользуются контрабандисты для нелегальной
перевозки наркотика в виде растворов, маскируя кокаин под ликероводочные или парфюмер-
но-косметические изделия. (Литровая бутыль можег содержать раствор, в котором содержится
до 70% кокаина гидрохлорида). К кокаину часто подмешивают другие ингредиенты: лактозу,
инозитол, мантпол ты и местные анестетики — лидокаин. бензокаин, прокаин.
Наркотические средства коки
Листья коки. Потребл нис листьев коки первоначально было рерогативой элиты древних
индейцев. Ссгод тя их потребляют большинство аборигенов Южной Америки. Листья кокн в на-
стоящее время широко используются при производстве чая «Соса mate». Паста кокаина — суль-
фат кокаина, basuco, basa. pitillo. «тесто». Это пизкосорт <ый наркотик, который применяется в
городских трущобах Южной Америки. Паста представляет собой промежуточный продукт пере-
работки. Кокаина гидрохлорид — белый кристаллический порошок (chow) или большие, иног-
да бесцветные кристаллы (rock), обычно без запаха. Используется для внутривенного введения
или получения кокаина основания. Для уличной торговли кокаина гидрохлорид разбаатяется
до 12—50% добавлением пирацетама, кофеина, лидокаина, прокаина, бензокаина, сахарами и
крахмалом. Кокаина основание (крэк, freebase, crack) получается из кокаина сульфата. Основа-
ние (крэк) нерастворимо в воде, обычно употребляется в виде паров после возгонки порошка с
фра! мента фольги при нагревании или его смешивают с табаком или гашишем. Действие крэка
в 5—10 раз сильнее при курении, чем у соли кокаина. Когда крэк курят отдельно или вместе с
табаком либо вдыхают через специальные трубочки, то при горении высвобождается кокаина
основание, которое быстро проникает в мозг, обеспечивая выраженную эйфорию. Трубочки лля
использования крэка и кокаина состоят из двух отделений. В одно отделение помешают препа-
рат, а в другое - охлаждающую жидкость. Стеклянные трчбочки часто трескаются в процессе
нагревания, отсюда и название препарата. По другой версии название «крэк» связано с потрес-
киваниями при горении наркотика.
Для маскировки наркотика под растворимый кофе или чай со и кокаина смешивают с
хлоридами кобальта или железа до получения состава, содержащего примерно 40% кокаина, и
транспортируют под названием «коричневый» кокаин. После доставки наркотика на место его
потребления кокаин выделяют экстракцией органическими растворителями. «Черный» кокаин
получают смешиванием сотей кокаина с полимерным материалом, из которого затем из!отов-
ляют статуэтки, портфели-дипломаты, подставки и прочие предметы В последующем кокаин
выделяют экстракцией органическими растворителями. Наркоманы со стажем часто соединя-
ют кокаин с героином. Такую смесь —кокаина и героина в равных пропорциях— называют
«Speed-ball mixture». При этом действующая доза кокаина снижается до 4—10 мт. «Спидбол»
(«Speed-ball») в ответе за многие смерти (смерть известного актера-комика Д. Белушн)
590 Глава 7
Фармакология и токсикология кокаина. Кокаин оказывает влияние на дофаминергическую
систему. До сих пор кокаина 1—5% раствор применяется в качестве местно-анестезирующего
препарата в хирургии (лаза. носа, уха и глотки. Кокаин вызывает сужение кровеносных сосу-
дов. уменьшает кровотечение (периферические эффекты), а также расширяет зрачок. Высшая
разовая доза 0.03 г, высшая сутошая доза 0.03 г. 3. Фрейд был первым, кто исследовал воз-
дейс1внс кокаина на организм.
При всасывании кокаин воздействует на ЦНС. вызывая эмоциональный подъем, ощущение
прилива энергии, «усиление» умственной активности, долгий период бодрствования, сниже-
ние потребности во сне. подавляя аппетит, увеличивая физическую выносливость, Основные
признаки потребления кокаина:
• потеря массы тела;
• неопрятный внешний вид;
• покраснение кожи от постоянного почесывания (« укусы кокаиновых клопов»);
• хронический насморк и частые респираторные заболевания;
• расстройство сна, бессонница.
расширенные зрачки;
• неразборчивая речь;
• раздражительность, агрессивность, моба;
• тремор, конвульсии, судороги, припадки;
• депрессия;
• паранойя;
• бред, ложные и иррациональные идеи,
• галлюцинации обонятельные, слуховые и тактильные;
• нарушения дыхания вплоть ло отека легких и остановки дыхания;
• сердечно-сосудистые нарушения: аритмия, фибрилляция, инфаркт, остановка сердца;
• церебральный инфаркт, инсульт;
• склонность к самоубийству.
В габл. 7-7 приведены характерные внешние проявления длительного приема кокаина.
Таблица 7-7. Внешние признаки приема кокаина
Признак Комментарии
П ерфорирова 111 шя носовая перегородка Впервые описана в 1900-х голах. когда вдыхание кокаина стало популяр- ным Закапывание в нос капель, содержащих сосудосуживающие вешества, можс! привести к схожим результатам
Кокаиновые «следы» В месте последней инъекции появляются оранжево-розовые кровоподтеки, иногда с обозначенной центральной зоной вокруг укола. Со временем эти повреждения становятся желтыми и голубыми, иногда заживают бе рубиа. Медленно заживающие кожные язвы имеют красное или серое дно и блед- ные края
•Крэковый кератит» Курение крэка анестезирует рот овину у курильщиков. Сниженная чувстви- тельность может привести к очень сильному давлению на глаза при расти ранни, что в свою очередь вызывает повреждение роговицы или кератит с язвами и инфекцией
«Крэковый палец» Мозоль может возникнуть из-за мноюкратното контакта большою пальца с колесиком зажигалки
«Крэковая рука* Почерневшие гиперкератозныс и ожоговые повреждения на внутренней сто- роне ладоней образуются из-за постоянного обращения с горячими крэко- выми трубками
Эрозии зубов П моральное или интраназальное применение кокаина приводит к воздейс- твию на зубы кислоты, которая повреждает зубную эмаль. Язвы на деснах также появляются в местах аппликации вещества
При интраназальном введении кокаин попадает в мозг через 3—5 мин, достигает пика ак-
тивности через 15—20 мин. эффект длится 1—1*/2 ч. При внутривенном способе введения кока-
ина эффект наступает через 15—30 с. достигает пика активности через 3—5 мин и длится очень
недолго. При курении вещества (чаше всего крэка) кокаин попадает в мозг практически сразу
(через 6—7 с), эффект длится 10—15 мин. Из-за пиролиза препарата в желудочно-кишечном
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных . 591
тракте пероральный способ введения наиболее токсичен. Смертельная доза кокаина для чело-
века. ранее нс употреблявшего наркотик, составляет 200 мг. Разовая «уличная» доза 15—60 мг.
Для интраназального введения («дорожка» длиной 3—5 см) доза or 10—20 до 50—100 мг. Ток-
сическая оральная доза 500 мг. При индивидуальных вариациях летальная доза колеблется
от 20 мг до 8—10 г. составляя в среднем 1.2 г для наркомана. При передозировке возникают
психомоторное возбуждение, бред. гипертермия, судороги. Возбуждающее, веселящее действие
кокаина (сумеречное состояние) сближает кокаинизм с алкоголизмом. Смерть может насту-
пить от нарушения дыхания и паралича сердца, концентрация кокаина в крови при этом обыч-
но превышает 6,2 мг/л. При длительном употреблении кокаин вызывает тяжелые побочные
ффекты. Кокаин часто принимают вместе с бензодиазепинами. метаквалоном. опиатами и
метадоном, реже комбинируют с барбитуратами, алкоголем, пропоксифеном (синтетический
морфиноподобный аналгезик) и хинином
При кокаинизме развивается толерантность. В течение нескольких месяцев наркоманы пот-
ребляют до 5—10 г кокаина, в то время как у людей, не принимающих кокаин, 100 мг препа-
рата является максимальной допустимой дозой при местной анестезии.
В результате злоупотребления кокаином нарушается кровоснабжение сердца, возникает
аритмия, повышавши артериальное давление, что нередко приводит к апоплексическому удару
лаже в молодом возрасте. Часгы случаи остановки сердца у людей, не имевших ранее нару-
шения кровообращения коронарной артерии и пороков сердца. Употребление кокаина может
сиро зонировать инфаркт и инсульт. Некоторые осложнения, связанные с длительным употреб-
лением кокаина, приведены в табл. 7-8.
Токсикокинетика и биотрансформация. Основными метаболитами кокаина являются бензоил-
экгонин, экгонин и метиловый эфир экгонина (неактивные метаболиты), норкоканн (актив-
ный метаболит) и ряд других — этилэкгонин, 1идроксикокаин. мстилэктопиднн (рис. 7-44).
Т ; кокаина 38—67 мин, бензоилэкгонина 4—6 ч, метилэкгонина 2—7 ч.
Таблица 7-8. Действие кокаина на различные системы организма
Острое действие Хроническое действие
ЦНС Эйфория, редко — дисфория Ощущение прилива энер1ин Усиление умственной активности Повышение чувственного восприятия Пониженный аппетит Повышенное беспокойство Снижение потребности в сне Повышенная самоуверенность Вред Головные боли Судороги Церебральные кровоизлияния Мозговые инсульты Церебральная атрофия Церебральный васкулит Депрессия Паранойя Психоз Самоубийство Галлюцинаторные расстройства
Респираторная система Пневмоторакс 11 невмомед иасгенизм П нсвмопсрикардит Отек легких Легочное кровшечение «Крэковое легкое» Облитерирующий бронхио.тн г Обострение астмы
Желудочно-ки- шечный гракт Гастродуоденальная перфорация Колит
Голова и шея Язвенный гингивит Кератит Перфорированная носовая перегородка Изменение обоняния Окклюзия ретинальной артерии Носовое кровотечение Эрозия зубной эмали Эпителиальные дефекты роговины Хронический ригпп Злокачественная гранулема Зрительная нейропатия Остеолитический синусит
Почки Рабдомиолиз Острый тубулярный некроз
Экзокринная система Гиперпролактинемия
594 Глава 7
Основание кокаина нерастворимо в воде и растворимо в органических растворителях. Соли
кокаина растворимы в воле и нсрастноримы в органических растворителях (гептане).
Метод ТСХ позволяет иленифипировать кокаин в присутствии родственных соединении
(табл. 7-10).
Таблица 7-10. Хромаю1рафическая подвижное!ь кокаина*
Вещество Значения R/100
№ 1 №2 № 3
Кокаин 81 59 56
Экгонин 0 84 0
Метилэкгошш 61 65 44
Бенэоилэкгонин 0 25 0
инниамоидкокаин 83 59 51
Бензокаин 77 80 И
Метадон 75 41 74
Прокаин 61 55 10
* Система растворителей. № 1: хлороформ—диоксан—этилацетат — 25% аммиак № 2: метанол концентрированный аммиак (100 1,5); № 3: циклогексан—толуол— диэтиламип (75 15:10). (60:10:5);
Водные растворы кокаина имеют характерный максимальный пик поглощения в УФ-облас-
ти при 233 и 275 нм (рис. 7-45).
Эфирный экстракт образца кокаина переносят в агатовую ступку на порошок бромида ка-
лия, выпаривают в сушильном шкафу при 50—60 °C досуха и снимают ИК-спектр (см. выше
рис. 6-127). ИК-спектр кокаина основания — 1275. 1700. 1106. 1728. 710. 1040, 1280 см и
ИК-спектр кокаина гидрохлорида — 1712, 1730. 1276. 1230. 732, 1106, 1075, 1025 см легко
различимы.
Исследование биологических объектов проводится согласно обшей схеме определения нарко
тиков (см. выше) с использованием методов ТСХ и/или ИХМ и ВЭЖХ (или газовой хроматог-
рафии или ГХ-МС). Масс-спектр кокаина и основные фрагменты (ионы) кокаина, определяе-
мые методом масс-спектрометрии, представлены на рис. 7-46 и 7-47.
Исследование волос и ногтей. Для решения ряда экспертных задач возникает необходимость
анализа таких биообъектов, как волосы и ногти (см гл. 5). Содержание кокаина в волосах не
зависит от способа введения. Длительность определения в волосах разовой лозы от 2 до 6 мсс.
Содержание кокаина, определяемое в волосах, лежит в пределах 0,1—16 нг/мг (если полученное
содержание выше 20 нг/мг. то результаты следует рассматривать как ошибочные). Содержание
бензоилэкгонина в волосах менее 1 нг/мг. Содержание метилэкгонина — на уровне предела
Рис. 7-45. УФ-спектр кокаина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 595
Рис. 7-46. Масс-спектр кокаина
Рис. 7-47. Фрагментация кокаина при масс-спскгро.метрик электронным ударом при 70 эВ
обнаружения метола или ниже. Максимальное содержание кокаина а волосах определяется в
течение на 1—2 мсс после приема разовой дозы (рис 7-48).
В габл. 7-11 приведено соотношение содержания основных метаболитов кокаина в различ-
ных биообъектах.
596 Глава 7
Рис. 7-48. Определение кокаина в ногтях методом ГХ-МС.
Таблица 7-11. Соотношение содержания основных метаболитов кокаина в различных биообъектах
Моча Пот
Бензоилэкгонин метиловый Кокаин > метиловый эфир экгонина
эфир экгонина > кокаин > бсиэоилэкгонии
Воаосы
Кокаин > бенюилэкгонин > метило-
вый эфир экгонина
Различный качественный и количественный состав метаболитов наркотиков (в частности,
кока! на) в моче, поте и волосах свидетельствует о различных механизмах выделения наркоти
ков в биологические жидкости и волосы. Риск ложноположительных результатов значительно
снижается при исследовании волос (ногтей), что связано с наличием стадии отмывки поверх-
ности этих объектов от внешних загрязнений.
7.3.5. Галлюциногены: ЛСД, псилоцин (псилоцибин), фенциклидин (РСР)
Я отстраняю мягко видимый мир.
Слышу вдали и вблизи неясный рев.
Странный далекий голое в моих ушах.
Может быть, мой? Ну, что же, мои слона, падают странно
сквозь лень, словно во сне. Тусклый солнечный свет мне снит-
ся. Зато ясным взглядом любви я вижу людей, быстро илуших
куда-н> своим путем. Мир очень красив. Минуты и дни связа-
ны танцем чистого забытья. Я примирен и с Ботом, и с людь-
ми. Сыпься же. тихий песок в стеклянных часах. Я безмятежен
и не слежу за гем. как равнодушно ш УБИВАЕШЬ меня».
А. Саймонс. ^Пьющий абсент»
ЛСД был впервые получен в 1938 г. в швейцарской лаборатории «Саилоз» доктором
А. Хофманом (Hoffman). который в то время проводил эксперименты с производными алка-
лоидов спорыньи. Особый интерес к ЛСД был проявлен после того, как Хофман случайно
проглотил очень малое количество препарата. У него появились красочные зрительные гал-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 597
Рис. 7-49. Структурная |юр.мула ЛСД.
люнинаиии. которые продолжались около 2 ч. Затем на-
чали измени 1ься формы предметов и липа окружающих,
появились яркие фантастические видения, отсутствовала
способность сконцентрировать внимание, двигательное
беспокоим во сменилось состоянием неподвижности.
Через 6 ч после приема ЛСД самочувствие доктора зна-
чительно улучшилось, а на следующий день он чувство-
вал себя здоровым. Пережитые ощущения необычайного
волнения и беспокойства были им подробно описаны.
Так впервые было обнаружено, что ЛСД способно вызы
вать у человека временное изменение психики.
ЛСД (рис. 7-49) является одним из многочисленных
полусиитетичееких производных алкалоидов спорыньи
(Secale comutum, Claviceps) — гриба, паразитирующего на
колосьях ржи.
С получением ЛСД началась эра выделения психотоми-
метиков из природных соединений Изменяя их структуру,
было получено большое количество различных полусинте-
тических и синтетических препаратов, обладающих галлюциногенной активностью. Многие
психотомиметики, особенно ЛСД. стали доступны широкому кругу людей. Это объясняется
тем. что своеобразное действие ЛСД на человека широко освещалось не только в научной, но
и в популярной литературе, демонстрировалось в кино и по телевидению. Одним из тех. кто
иопулязировал свойства ЛСД. был американский писатель К. Кизи. автор знаменитою романа
«Пролегая над гнездом кукушки». В начале 1960-х годов ряд психофармакологов, изучавших
действие ЛСД. выступили с пропагандой его приема как способа самопознания, саморазвития,
своего рода «биохимического ключа» к получению мистических и грансцедентальных пережи-
ваний. Некогорое время ЛСД не входил в число запрещенных препаратов, в результате чего
препарат стал «модным безумством». Росту злоупотреблений ЛСД в этот период способствовала
высокая популярность его у хиппи, средн которых число принимавших его составляло десятки
тысяч. ЛСД стал причиной нескольких воли наркоманий в США. Франции и Германии.
Некоторые жаргонные названия ЛСД: А. «кислота», «цилиндры», «барабаны», «черная звез-
да», «промокашка», «синий восход», «синяя звезда», «золотой дракон», «кофе», «виноград»,
«оранжевый туман», «небо в алмгзах», «розовая паи гора», «фиолетовый туман» и тдг.
Способы применения. Чаще всего ЛСД получают в виде порошка или раствора. В нсзакон
ныи оборот он обычно поступает в виде таблеток, капсул по 100 мкг. растворов для инъекций,
тонких квадратов желатина (window panes), «марок» — перфорированной бумаги (blotter acid),
пропитанной раствором ЛСД. Доза ЛСД сильно варьирует, но чаше всего составляет от 30 ло
50 мкг. Большинство исследователей с‘итаег 10—30 мкг ЛСД минимальной действующей до-
зой для человека. Дозы ЛСД. применяемые дтя создания «искусственного» психоза, лежат в
пределах 70—150 мкг или 1—2 мкг/кг массы тела. Случаи, окончившиеся смертью от приема
ЛСД. не tapei истрированы, однако известно о самоубийствах после его применения из-за неа-
декватной опенки реальной обстановки. Например, человек, находящийся под действием пре-
парата. пытается рукой остановить авгомобиль или летать как птица, прыгнув с 10-го лажа.
При внутривенном введении эффект проявляется через 1—5 мин. при внутримышечном —
через 15—20 мин. при приеме внутрь — через 30—60 мин. ЛСД хорошо всасывается при перо-
ральном присмс, поэтому чаще всего используют этот способ введения
Фармако югия и токсикология. Механизм действия ЛСД на организм человека до конца не
изучен. Биохимические исследования обнаружили антагонизм между ЛСД и серотонином
Наркотик, изменяя содержание серотонина в мозге, может активизировать специфические
психотоксичеекие черты зичности. D Изомер ЛСД является одним из самых активных психо-
тропных вешеств, известных человеку ло настоящего времени как среди синтетических, так и
среди природных веществ. При приеме препарата внутрь через 20 мин появляются вегетатив-
ные симптомы, через 30 60 мин — психические нарушения, которые достигают максч маЛь-
пой выраженности через 1,5—2 ч. Продолжительность психоза составляет 4—15 ч. при приеме
больших лоз действие пролонгируется до 10—12 ч. Эффективность препарата при одном и том
598 Глава 7
же способе введения зависит от дозы. В минимальных дозах (50—70 мкг ЛСД) он вызывает
состояние, напоминающее алкогольное опьянение. При увеличении дозы до 75—100 мкг по-
является эйфория или апатия. ЛСД в больших дозах (200 мкг и более) вызывает характерное
психотомиметическое состояние с бредовыми идеями и потерей критического отношения к
своим переживаниям. Полная потеря контакта с реальностью вплоть до появления чувства
«растворения» личности отмечена при введении ЛСД в дозах 600 мкг и выше. Ежедневный
прием ЛСД вызывает быстрое привыкание к препарату. При дли тельном применении ЛСД
развивается психическая и эмоциональная зависимость, при этом наблюдается деградация
личности, возможны развитие сибоумия. резкое нарушение памяти, суицидальные мысли и
поступки. Лица, злоупотребляющие ЛСД, оканчивают свои дни в психиатрических клиниках
или умирают от болезней, вызванных токсическим действием препарата
Токсикокинетика и биотрансформация. ЛСД быстро всасывается и, легко преодолевая гема-
тоэнцсфалинеский барьер, достигает мозга. Т, равен 3.6 (2.9 — 5,14) ч. Длительность действия:
8—12 ч. Уровни ЛСД в плазме и моче в течение нескольких часов после приема разовой дозы
составляют менее нанограмма. Максимальная концентрация в плазме после орального приема
1 мкг/кг ЛСД достигается через 1 ч и в интервале до 3 ч составляет 1,7—1,85 нг/мл. Затем кон-
центрация препарата резко снижается до 1.1 нг/мл через 6 ч и до 0.2 нг/мл через 24 ч. Макси-
мальная концентрация вещества в плазме наблюдается в пределах 1 ч и составляет 4—6 нг/мл
после употребления 2 мкг/кг ЛСД.
ЛСД быстро метаболизирует и выводится из организма с мочой Менее 1% дозы обнару
живастся в моче в виде неизмененного соединения. Основными метаболитами ЛСД являются
2-окси-ЛСД, 2-окси-З-гидрокси-ЛСД, N-демстид-ЛСД (нор-ЛСД): лиламид лизервпювой
кислоты (ЛАЭ); I2-, 13- и 14-гидрокси-ЛСД и другие метаболиты, которые образуют конъ-
югаты с глюкуроновой кислотой (рис. 7-50) Концентрация неизмененного наркотика в моче
после принятия лозы 200—400 мкг в течение первых суток составляет 0,001—0.005 мкг/мл.
Носте однократного приема 2 мкг/кг (140 мкг/70 кг) ЛСД максимум концентрации его в плаз-
ме крови (0.005 мкг/мл) наблюдается спуст : 1 ч после приема, через 8 ч эта концентрация
снижается до 0,001 мкг/мл.
Гидрокси ЛСД
Рис. 7-50. Cj сма биотрансформаиии ЛСД
Конъюгация
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных.. 599
Пробоподготовка и методы исследования ЛСД
Идентификация ЛСД. особенно в биолог ичсских жидкостях, представляет серьезную ана-
литическую проблему. ЛСД чувеншгелен к УФ-облучению, действию кислорода воздуха и
повышенной температуры, нестабилен в растворах при pH ниже 4,0. Если предпринять со-
ответствующие меры предосторожности при хранении и обработке образцов и стандартов, то
такие особенности не повлияют па результаты анализа. Большую проблему прсдставляе» собой
необратимая адсорбция ЛСД и его производных при исследовании методом газовой хромато-
Iрафии. Это явление часто препятствует обнаружению ЛСД на уровне пикограммов на I мл в
био.то! ической жидкости — концентрации, соответствующей действующей дозе этого наркоти-
ка. Часто в образцах присутствует изо-ЛСД — неактивный оптический изомер алкалоида. При
длительном хранении или повышенном значении pH образца возможен взаимный переход
одного изомера в другой. В связи с этим при обнаружении ЛСД должны применяться методы
анализа, позволяющие дифференцировать оба изомера.
Методы исследования веща твенных доказательств. ЛСД обладает интенсивной флюоресцен-
цией. что позволяет его обнаружить с высокой степенью достоверности — на уровне 10-* г.
Дэя обнаружения объектов. содержащих ЛСД. используют реакции окрашивания. В основ-
ном это реакции с солями переходных металлов в присутствии сильных минеральных кислот,
а также реакции, характерные для тиольного кольца, которое входит в состав молекул ли-
зергидов. При действии на ЛСД реактива Марки вначале наблюдается коричнево-оранжевое
окрашивание, которое с течением времени переходит в фиолетовое. Аналогичные цвета по-
являются при действии на это вещество концентрированной серной кислоты, реактива Фреде
и реактива Мекке. Продукты взаимодействия лизергидов с нингидрином обладают высокой
специфичностью окраски, характерной для вешсств. имеющих в своей структуре индольную
группировку. Однако проведение этой реакции требует нагревания, что снижает се значение
лля работы во внелабораторных условиях. Широко используется на практике метод индикации
производных лизергиновой кислоты с помощью многочисленных модификаций реактива Ван-
Урка и реактива Эрлиха, в основе коюрых лежит обработка объекта н-диметиламннобс) заль-
дегидом в присутствии концентрированных минеральных кислот и иногда хлорида железа (III).
что приводит к обр< юнанию продуктов красно-фио 1CTOBOIо или фиолетового цвета.
ТСХ Для разделения близких к ЛСД алкалоидов предложено несколько хроматографичес-
ких систем растворителей. Например, в системе хлороформ — метанол (9:1) эти вещества име-
ют слсдушис значения R^ лизергиновая кислота — 0.00, изо-ЛСД — 0,33, эрготамин — 0,39,
ЛСД — 0,48, зргокриптин — 0.62. В табл. 7-12 приведены значения Rf ЛСД в наиболее рас-
пространенных хроматографических системах на пластинах для ВЭТСХ проз зводства фирмы
Merck (Германия).
Таблица 7-12. Значения R, ЛСД в различных системах растворителей
Система растворителей R,
Хлороформ — ацетон — этанол — аммиак (20:20:3:1) 0,57
Бензол — этанол — триэтиламип (9:1-1) 0.53
Анезон 0.32
Метанол — аммиак (100:1.5) 0.73
Толуол — аде юн — этанол — аммиак (45:45:7:3) 0.47
Метано.) — вода — соляная кислота (50:50:1), пластина КР-18 F254s (Merck) 0.26
ЛСД может быть обнаружен на хроматографических пластинах по яркой флюоресценции
при 254 и 365 нм. Кроме того, высокой специфичностью и чувствительностью обладают реак-
тив Эрлиха (раствор п-диметиламинобсн'зальдсгила в концентрированной о-фоефориой кис-
лоте с добавлением метанола) и реактив Прохазки (смесь раствора формалите in да, кож ентри
рованнон соляной кислоты и этанола). Общеалкалоидные реактивы — реактив Драгендорфа,
подкисленный реактив йоднлатината и другие реактивы — окрашивают зоны ЛСД в соо встс-
твуюшис цвета. Однако при этом все они имеют недостаточный предел обнаружения. Возмож-
но дснситометрическос определение ЛСД (см. гл. 6.3.1). На хроматографические пластины
600 Глава 7
Рис. 7-51. Дснситомстрнчсское определение ЛСД (прибор CAMAG-SCANNER 111. Германия).
а б
Рис. 7-52. УФ-спектры ЛСД. абсорбт рованною на ТСХ-пластинах
а — система растворителей метанол — вода — соляная кислота (50:50:1). штастнна RP-18 F254:. макси-
мумы отражения 249, 317 и 200 нм; б — система растворителей толуол — ацет мт — этанол — аммиак
(45:45:7:3); пластина F254s. максимумы отражения 243 и 315 нм.
Метаболизм и определение нарке ических средств, психотропных.. 601
2000 1500 1200 1000 900 800 700
Частота, см'1
Рис. 7-53. ИК-снектр ЛСД.
одновременно наносили анализируемые образцы и растворы стандарта ЛСД лш построения
калибровочной кривой: после проведения хромаюграфирования сушили при комнатной тем-
пер iType и сканировали при длине волны 313 нм (рис. 7-51)
УФ-снектры ЛСД, полученные при цепейгометрическом опредс гении в разных хроматогра-
фически,х системах, представлены на рис. 7-52.
Спектральные методы. Водные растворы ЛСД имеют характерный максимальный пик пог-
тощения в УФ-области спектра при 315 нм (pH < 7.0) и 310 нм (pH > 7.0).
В ИК-области cneKipa ЛСД (таблегки с КВг) имеет характерные полосы поглощения при
длинах волн 1626, 1307, 1136, 1066, 1212, 749 см-1 (рис. 7-53).
Определение ЛСД и его метаболитов в биологических жидкостях и волосах проводят вы-
сокочувствительными и селективными методами: ГХ-МС. ВЭЖХ. КЭ с флюоресцентной или
МС-детекцией (рис. 7-54).
В последнее время при изучении метаболизма ЛСД в микросомах печени методами ВЭЖХ-
МС-МС и КЭ-МС-МС удалось обнаружить два новых метаболита ЛСД.
Отнесение ЛСД к запрещенным наркотикам, спад движения хиппи, распространение ин-
формации об опасных последствиях приема ЛСД (непредсказуемые психические нарушения,
попытки самоубийства и в особенности повреждения структуры хромосом и т.д.) привели к
снижению злоупотреблений ЛСД
Водорастворимый препарат ЛСД-- артрат днэти.1амина d-лнзерги новой кислоты — под на-
званием «ЛСД-25», «Delysde» и «Lysergide» иногда применяется в к. ипической и фармако-
тогической практике за рубежом при психоан низе для облегчения выявления и устранения
пережитых в детстве психических травм.
Псилоцин (псилоцибин)
Диметил грин гамин (ДМТ) и его производные широко распространены в животном и рас-
тительном мире, но могут быть получены и синтетическим путем. ДМТ — психоделик относи-
тельно краткосрочного действия, потребление которой» засвидетельствовано во многих куль-
турах древнего и современного мира. Большое число веществ, обладающих галлюциногенной
активностью, имеют сходную с ДМТ структуру и свои :тва.
Диэтилтриптамин (ДЭТ), например, аналогичен ДМТ и вызывает тс же фармакологичес-
кие эффекты, но обладает более низкой активностью (рис. 7-55). Псилонин и псилоцибин
имеют в своей основе структуру ДМТ (рис. 7-56) Семейства грибов, содержащих галлюцино-
генные вещества, весьма многочисленны. Этот список возглавляют представители семейства
Sirophariaceae (строфариевые) — Psylocybe, Stropharia. Далее идут Coprinaceae (навозники) —
Copelandia, PanaeoHna. Panaeolus и Psathyrella'. Cortinariaceae (паутинннкн) — Gyntnopilus
{PhoHota) и Inocybe'. Pluteaceae (плютневые, также называемые вольварисвыми) — Pluteus?,
602 Глава 7
а б
Рис. 7-55. Структурные формулы ДМТ (а) и ДЭТ (б).
Rolbitiaceae (болбитусы. в просторечии «бурые поганки») — Agrocybe, Conoeybe; f'ncholomataceae
(рядовки) — Geronema и Mycena', Hygrophoraceae (гигрофоры, или мокрухи) — Hygrocybe. Все
грибы содержат различные производные 4-гилрокси-ДМТ. но ДМТ в их состав не входит.
К этому списку следует отнести еше два 1рибных семейства, но уже ио другим причинам (см.
гл. II). Одно из них — Amaniiaeeae (мухоморы). Главный рол — Amanita, во всех них обнару-
жен 5-гидрокси-ДМТ. или буфотенин. Некоторые (A. muscaria — мухомор) также содержа!
мусцимол или иботеновую кислоту и мускарин. Другие (Л. phalloides — бледная поганка) име-
ют в своем составе смертельно опасные полипептиды: гепатотоксин, фаллоидин и аманитин.
Представители рода Amanita относятся к ядовитым грибам. Другое семейство !рибов — это
Нуростеасеае (эрготовые). Здесь основным родом является Claviceps (спорынья) — сырье, из
которого были получены ЛСД и его известные модификации (см. выше).
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 603
Рис. 7-56 Структурные формулы: псилоцина (4-ишрокси-ДМТ, а) и псилоцибина (сложный эфир 4-гид-
рокси-ДМТ и фосфорной кислоты, б).
Среди высших двудольных растений ест ь обширное семейство вьюнков (Convolvulaceae), ко-
торое можно назвать сокровищницей эргиновых алкалоидов. Многие разновидное!и Ipumecea.
Rivea и Argyreia являются источником эргиновых алкалоидов, которые либо преобразуются в
лизергиновую кислоту, либо психоактивны, как любые лизергинамиды.
С давних пор (еше до открытия Америки) индейцы в Мексике и Гватемале использовали
во время религиозных церемоний для достижения особого состояния опьянения «священные»
грибы, которые называли «teon«nacatl». God's Flesh — «божественный огонь». Оказалось, что
высушенные грибы содержат от 0.2 до 0.4% псилоцибина (4-фосфорилокси-К,1Ч.-диметил-
триптамина) и следовые количества псилоцина (4-тидрокси-Ь1.Н.-димети.тгриптами11а). Оба
алкалоида в кристаллической форме были выделены в 1958 г. в лаборатории Sandoz из грибов
рола Psilocyhe. выращенных в условиях теплины.
Действие псилоцина и псилоцибина напоминает действие ЛСД и характеризуется наруше-
нием восприятия, расстройством мышления, изменениями в эмоциональной сфере и повеле-
нии человека, способностью стимулировать аффективную (чувственную) память». Через 30
мин после приема развивается выраженная картина интоксикации со зриюльными галлюци-
нациями. которая сохраняется в течение 6 ч и заканчивается сном Установлено, что в одном
грибе содержится около 1 мг псилоцина и 16 мг псилоцибина. Галлюциногенной является доза
обоих веществ 4—8 мг или около 2 г грибов. Дозы препаратов от 8 до 20 мг приводят к более
выраженным психическим изменениям. В после шие голы экспертами отмечен рост потребле-
ния псилонннсолержаших грибов мексиканского и гавайскою происхождения в Швейцарии.
Установлено, что это наркотическое средство не является смертельным и не вызывает зависи-
мости. Однако психические эффекты от ею потребления характеризуются как галлюцинация-
ми, потерей ориентации во времени и пространстве, беспричинным страхом и депрессией, так
и чувством успокоенности, причем рецидивы возможны даже спустя длительное время после
употребления данного наркотика.
Простейшим способом приема галлюциногенов данного вида является употребление в пишу
свсж> х или высушенных грибов рода Ps locybe. Содержание в них псилоцибина — основного
действующего начала этого наркотика, обычно составляет от 0,2 до 2%. максимум 3%. Для
проявления психотропных и галлюциногенных эффектов обычно используется при приеме
внутрь лоза псилоцибина равная 12—25 мг. что эквивалент но 0.6-12,5 г высушенных грибов.
Галлюциногенные эффекты и побочные соматические эффекты, связанные с приемом пси-
лоцибина и его содержащих грибов обусловленные действием основного метаболита этого
алкалоида — псилоцина, который в организме человека взаимодействует с юротопинергичес-
кими (5-11Т1А, 5-НТ2с и т.д.) и норадренергическими рецепторами.
Большинство образцов, которые продаются на «черном» рынке под названием «псилоцин»,
состоят из различных компонентов. К продаваемым на улице грибам может быть добавлен
ЛСД или фенциклидин.
В России наркоманы используют высушенные чернильные грибы Сорппи\ weaves, содержа-
нте псилопин (но 5—6 грибов на прием), а также Psilocybe semilanceala (Fr.) Kummer. Произрас-
тают нсилоиибинсодержашис грибы на пастбищах, лугах. вблиз< сельскохозяйственных угодий.
604 Глава 7
Токсикокинетика и биотрансформация
Биотрансформаиии псилоцибина начинается в ЖКТ под действием щелочной фосфатазы и
неспецифических зстераз слизисюй обо ючки кишечника. В молекуле псилоцибина расщеп-
ляется сложноэфирная связь с фосфорной кислотой. Далее псилоцин подвергается деметили-
рованию. последовательному дсаминировапию и окислению до 4-1Идроксишиол-3-уксусно
кисло 1Ы пол влиянием моноаминооксидаз и анецьтьлегилдептрогеназы печени (рис. 7-57).
Другие метаболиты псилоцибина: 4-гидроксииндолацетальдегнд, 4-гидрокситриптамин, 4-гил-
рокситриптафол. Выводится псилоцин, главным образом, в виде О-глюкуронида.
Методы определения
УФ-спектрофотометрия. Водные растворы псилоцина имеют характерные максимальные
пики поглощения в УФ-области при 266. 283. 292 нм (pH < 7.0) и 270. 293 нм (pH > 7,0), вод-
ные растворы псилоцибина поглощают при длинах воли 268 (рН< 7,0) и 269, 282, 292 нм (pH
> 7,0) (рис. 7-58).
И К-спектрометрия. Характерные полосы поглощения псилоцина (таблетки с КВг) в ИК-об-
ласти наблюдают при длинах волн 836. I26I, I236. 1042. 1061, 733 см , псилоцибина (таблетки
с КВг) — 1105. 1045. 1062. 1183. 1160. 932 см '.
Хромапю-.масс-спектрометрин Характерные ионы псилоцина — при соотношении m/z 58.
204, 59, 42. 30. 146, 77, 44, псилоцибина — 58, 42, 30, 51, 204. 146, 77, 44.
4-Гидрокси-
индопацеталадегнд
Рис. 7-57. Схема биотрансформаиии псилоцибина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 605
Рис. 7-58. УФ-спектры псилоцина (п) и псилоцибина (б).
Фенциклидин (РСР, сернил)
Поиск новых анесгетирующих cpe,4ciв привел к получению серин производных ииююгекси
ламина. Первым веществом этой группы был фенциклидин (сернил). Благодаря способности
вызывать анестезию при внутривенном введении он был предложен в 1957 г. Greifenstein и
соавт. в качестве анестезирующего средства пол названием «сернил». Однако вскоре исполь-
зование серн и за в медицинской практике было ограничено, а затем совсем запрещено из за
наступавших у пациентов осложнений в виде проходящих психических нарушений. После того
как было хстановлено, что сернил вызывает серьезные, а иногда и тяжелые психические рас-
троистна. им заинтересовались психиатры. Пик злоупотреблений фенциклидином относится к
1967 г. Олнако популярность препарата быстро упала из-за непредсказуемого и часто нежела-
тельного начального действия. Фенциклидин легко синтезируется подпольными химическими
Мораториями. Контроль за его сырьем невозможен, так как в качестве исходных применяют-
ся широко рас ространенные химические вещества.
Фенциклидин (рис. 7-59) представляет собой порошок белого цвета, легкорастворимый в
воде. Бблыная часть образцов. произведенных нелегально, загрязнены продуктами синтеза.
606 Глава 7
Поэтому цвет образцов варьирует от рыжеватого до корич-
невого. а консистенция — от порошка до смолы. РСР про-
дастся в виде таблеток, капсул, порошка и жидкости. Часто
смешивается с пахучими веществами (петрушкой, мятой,
кориандром или марихуаной) и используется для курения.
Среди наркотических вешестн фенциклидин единственный,
вызывающий психоз, неотличимый от шизофрении (см.
электронное приложение).
Жаргонные названия: имеется белее 50 наименований
этого препарата («Angel Dust», «Hog». «Crystall». «Superglats»,
«Killer Weed». «Rocket Fuel», «Embalming Fluid», «Peace
Pill»).
Фенциклидин вызывает улучшение настроения (эйфо-
рия), дезориентацию, чувство удаленности от окружающего.
Рис. 7-59. Структурная формуле
фенциклидина.
сонливость с причудливыми сновидениями, галлюцинации.
бред с элементами насилия или агрессии Действие сопровождается резким снижением боле-
вой чувствительности, часто возникают попытки членовредительства. траимы. У некоторых
людей появляется каталепсия (застывание в неудобной позе). Такой эффект развивается после
однократного приема препарата в дозе 5—10 мг и продолжается 4—8 ч. Для сернила характер-
но наличие амнезии (потеря способности запоминать информацию) в течение всего периода
действия препарата. Эффект сопровождается головокружением, нарушением речи. При увели-
чении дозы до 50 мг и более развивается потеря сознания (кома) продолжительностью до 4 сут
Смертельной дозой считают 100 мг и более. Это состояние сопровождается потерей равнове-
сия, птозом век, потливостью, тахикардией
Продолжи! ел ьное использование РСР приводит к толерантности У людей, принимающих
фенциклидин даже короткое время, в перерывах между его приемами наблюдаются ухудшение
памяти. усталость, раздражительность и депрессия. Для наркоманов, принимающих фенцик-
лидин. характерны попытки к самоубийству и выраженное агрессивное, преступное поведение.
Несмотря на то что РСР классифицируется как галлюципотен, он обладает свойствами всех
остальных групп наркотиков: стимуляторов, депрессантов, аналгетиков.
Токсикокинетика и биотрансформация. Концентрация РСР в крови обычно составляет 7—
240 мкг/л. РСР подвергается окислительному метаболизму (рис. 7 60) с образованием по край
ней мере 2 неактивных метаболитов: 4-фенил—4-пиперилиноциклогексапола и 1-(1-фенилцик-
логексил)-4-гидроксипипериднна, которые затем взаимодействуют с глюкуроновой кислотой
Трешй метаболит — 5-(1-фе11и.чииклогексиламино)-валсриановая кислота. Около 30—50% мс
ченой внутривенной дозы выводится с мочой за 72 ч в виде неизмененного препарата (4—19%)
и конъюгированных метаболитов (25—30%) Только 2% дозы выводится с фекалиями. В сред-
нем 77% внутривенной дозы можно обнаружить в моче п фекалиях через 10 дней после приема
наркотика.
В табл. 7-13 приведена концентрация РСР в органах трепа (летальный исход после приема
РСР).
Таблица 7-13. Концентрация фенциклидина в органах трупа
ГТ* гг -р " Кровь, мг/л Мозг, мкг/кг Печень, мкг/кг Моча, мг/л Желудок, мкг/кг
0 1-32 0.9-170 0.4-120 0-840
(4 8) (7.3) (23) (35) (155)
Примечание. В скобках среднее значение.
В экспериментальных условиях препарат вводили, как правило, внутривенно, однако са-
мыми распространенными способами применения являются ингаляции порошка или курение
сигарет, чисто принимают фенциклидин перорально.
Три аналога РСР продаются на нелегальном рынке США пол названием РСР: Ь-этил-1-фе-
нилцнклогексиламин (РСЕ), 1-( 1-фенилциклогексилппрролидин (РНР) и 1-|1-(2-тиенил-цик-
логексил)]-пиперилин (ТРСР, TCP). Они вызывают у человека эффект, похожий на таковой
фенциклидина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 607
он
Рис. 7-60. Схема биотрвнсформаиин фенциклидина.
Методы определения
С реактивом Марки дает слабо-розовую окраску или обесцвечивание, с реактивом Манде-
лина — оранжевую, с реактивом Эрлиха — красную.
Используется несколько систем растворителей для обнаружения фенциклидина и его про-
изводных метолом ТСХ (см. табл. 7-14).
Таблица 7-!4. Системы растворителе i для обнаружения фенциклидина к его производных метолом ТСХ
Система распну«гелем Вещества R,’ 100
Этилацетат — метанол — аммиак (концентрированны) Этициклидин 79
(85.10:5) Теноциклидин 86
Фенциклидин 84
Роииклилин 79
Циклогексан — толуол — диэтилам ни (75:15:10) Этициклидин 65
Теноциклидин 73
Феиниклилии 73
Роииклилин 66
Хлороформ — метанол (90:10) Этициклидин 27
Теноциклидин 54
Фенциклидин 35
Роииклилин 25
В ка icctbc подтверждающих методов используют хроматографические и спектральные. Час-
то проводят газохроматографическос определение с применением кварцевых капиллярных ко-
лонок и ПИД. Индексы удерживания фенциклидина и его производных: этициклидин — 1587,
теноциклидин — 1881. фенциклидин 1900. РСС — 1535. роииклилин —1795.
Спектральные характеристики фенциклидина приведены на рис. 7-61
608 Глава 7
Частота, см'1
Рис. 7-61. УФ- (а). ИК- (б) и масс-спектры (в) фенпиклнлипа.
610 Глава 7
Таблица 7-15. Разовые пероральные лозы у-оксибутирага и его вохтеистиие на человека
Лоза, г Воздействие па человека Фармакологические проявления
0.5-1.5 Слабое Эффекты подобны действию этанола Возникает чувство слабой, мягкой релаксации, возрастает коммуникабельность. уменьшает- ся двигательная активность, появляются легкое к товокружение и другие проявления легкой алкогольной интоксикации. Прит плястся внимпнис. Управление автомобилем кит другой сложной т’хникои опасно ыя окружающих и хтя принявшего препарат человека
1.0=2. Г” Среднее Увеличивается седативное действие, усиливается дезориентация в окружающей обстановке. Обостряется восприятие музыки и движе- ния тайца, поднимается настроение. Усиливается половое влечение Тошнота, рвота
2.0-3.5 Сильное Практически полная дезориентация в окружающей обстановке. Состояние человека описывается как «совершенно больной нездо- ровый*
1.0-5.0 Г «.бокий сон
Более 5.0 «Беспробудный» сон в течение нескольких часов, кома. ко1шул1>сии. рвота
10.0-14.0 Летальный исход
Рис. 7-63. Превращение оксибутнрла в П1мма-ою.>1бутиролак1он.
Рис. 7-64. Схема биотр<1нс<|х>рмапии оксибутирага.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 613
Рис. 7-66 Необратимое связывание каваина с 1л>гатноном.
Рис. 7-67. ВЭЖХ МС исследование извлечения нз кава-кава.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 615
Первый лекарственный барбитурат — диэтилбарбитуцюная кислота — был синтезирован
в 1883 г., а в 1903 г. пол торговым названием «Веронал» он стат использоваться в медицине.
В 1912 г. в медицинскую практику вошел фенобарбитал под названием «люминал» как успо-
коительное и снотворное средство 50—60-е годы XX века характеризуются пиком злоупотреб-
ления барбитуратами, особенно среди деятелей культуры. артистов и политиков. Считается,
что от наркотиков зтого типа погибло много, в том числе известных всему миру, людей. За
последние десятилетия терапевтическое значение барбитуратов постепенно снижается за счет
появления новых более эффективных. безопасных, обладающих меньшей то.черант iюс тыо ле-
карств, например бензодиазепинов. Снижению частоты использования барбитуратов способс-
твует большое количество побочных зффектов при нх совместном приеме с другими вещества-
ми, воздействующими па ИНС. наркотиками и алкоголем.
В соответствии с Конвенцией ООН о психотропных веществах 1971 г. международному
контролю подперт астся 12 барбитуратов: амобарбитал. амобарбитал. барбитал, бутабарбитал,
буталбитал, циклобарбитал, метнлфенобарбитал. пентобарбитал, фенобарбитал, секбутабарби-
тал. секобарбитал и винилбитал. Краткие сведения о них прицелены в табл 7-16.
Таблица 7-16. Строение баттбшуратов. находящихся под международным контролем
Вещество Структурная формула Список Конвенции 1471 г. Молеку тяриая формула Молекуляр- ная масса
Хллобарбитал О X Z /=о а [| 45 ’ ’ см и т от X IV 1 1 Ch.H.N.O, 201 214
Амобарбитал нс н н3с '—7\xz'nh Н3С— II о III “МбГгтГ”
Барбитал н СХ .N.^-0 н3с у Y н3с—' II О IV QI N.O, 184. 193
Буталбитал н3С Н Н2С III 224.156-
616 Глава 7
Про&мженис incidi. 7-lb
212, 245
224. 25ft
246. 262
226. 272
212. 245
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 617
Окончание табл. 7-/6
На территории нашей страны в соответствии с постановлением Правительства Росст ickoh
Федерации or 30.06.96 Ns 68I и в соответствии с международными обязательствами, взятыми
на себя Россией, контро шруются следующие барбитураты и их композиции:
• в качестве наркотического средства, оборот которого в Российской Федерации ограничен и
в отношении которого устанавливаются меры контроля в соответствии с законодательством
Российской Федерации и международными договорами Российской Федерации: таблетки
алнагон. содержащие кодеина фосфата 20 мг. кофеина 80 мг, фенобарбитала 20 .мг. кислоты
ацеп лсалнинловои 20 мг,
• в качес вс психотропных веществ, оборот которых в Российской Федерации oipaimsen и в
отношении которых устанавливаются меры контроля в соответствии с законодательством
Российской Федерации и международными договорами Российской Федерации: амобарби-
тал (барбамил), этаминал натрия, а также таблетки, содержащие барбамила 0.15 г и броми-
ювала 0.15 г;
• в качестве психотропного вещества, в отношении которого допускается исключение неко-
торых мер контроля в соответствии с законодательством Российской Федерации и между-
народными договорами Российской Федерации пентобарбитал.
Как сильнодействующие вещества в соответствии со Списком ПККП кош ротируются ал-
тобарбишт. барбитал. барбитал натрия. бенз >барбитал, буталбитал, бутабарбитал, винилбитал,
метилфепобарбитал. секбутабарбитал, секобарбишл. гсксобарбитал. тиопентад натрия, фено-
б рбитял. никлобарбигал. а также комбинированные препараты спазмовсралгнп. в том числе
спазмовералгин-нео. в состав которых входят пропифеназон 150 мг. фенобарбитал 20 мг. па-
паверина гидрохлорид 30 мг. эфедрина гидрохлорид 5 мг. кодеина дшидрофосфаг 15 мг. атро-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 619
для получения информации. Часто барбитураты применяются с незаконной целью для уве-
личения массы наркотического средства или коррекции его действия, например кокаина или
героина.
Как снотворные средства, все барбитуровые кислоты оказывают почти идентичное фар
макатинамнческое действие на организм человека. Однако у них наблюдается значительные
различия в фармакокинетике и путях бнотраисформаини. которые связаны с липофильнос-
тью и скоростью метаболизма конкретного вещества. Липофильные барбитураты например
наркотически активные тнобарбитураты или N-мопоалкилбарбитураты типа гексобарбитала,
в результате перераспределения в липофильных компартментах тела, имеют очень короткую
продолжительность действия. Кроме того, продолжительность действия этих веществ в значи-
тельной степени зависит от скорости их энзиматического разрушения в печени, в свою очередь
зависящую от их структуры. По длительности снотворного действия барбитураты делятся на
барбитураты длительного действия (веронал, фенобарбитал), барбитураты средней продолжи-
тельности действия (амобарбитал, циклобарбитал). короткого действия (гексобарбитал). бар-
битураты. эффекты которых начинаются сп егя 15—20 мин (секобарбитал).
Пентобарбитал, сскобарбигал и фенобарбитал в лозах ниже снотворных оказывают седа-
тивный действие. Однако из-за очень узкого терапевтического индекса и быстрого развития
то 1ерантности в качестве сс агивных средств они испо ьзуются ре ко.
Эффективными анестезирующими средствами являются 5.5'-дналк>и1барбпгураты. метили-
рованные по азоту в положении I, при этом один из замес)ителеи в положении 5 (олжен быть
ненасыщенным На продолжительность анестезии оказывает большее воздействие нс мстабо-
итзм вещества, а быстрое его перераспределение из хорошо орошаемых кровью тканей мозга
в мышцы и жировые ткани. Равновесие между концентра шеи вещества в плазме крови и
жировой гканыо достигается обычно спустя .длительное время, например для тиобарбигуратов
только после 1,2—2 ч. Повторная инъекция рискованна из-за возможности накопления вещес-
тва. ведущей к передозировке. Обычно барбитураты используются в смеси с ингаляционны-
ми анестезирующими средствами. В настоящее время барбитураты применяются при вводном
н тркозе и местных операциях.
Длительное употребление барбитуратов или употребление их вместе с .другими веществами,
действующими иа ЦНС. например наркотиками или алкоголем, приводит к индукции фермен-
тов, отвечающих за их метаболизм (см. гл. 4). Этим обусловлено развитие толерашпости. Она
развивается обычно в период от нескольких недель до месяцев при постоянном приеме. Важно
отметить, что толерантность не приводит к повышению концентрации вешества в крови, од-
нако она может вызвать токсические эффекты.
Прием барбитуратов в больших дозах оказывает наркотическое опьяняющее действие, по-
добное алкогольному. Признаки его включают эйфорию с эмоциональной нсушойчивостыо.
вспыльчивостью, расторможен нос г ью и агрессивностью Другие признаки: гиперемия кожных
покровов и склер. I миотония, брадикардия, снижение температуры тела, гонкий коричневатый,
спаянный с эпителием налет на языке, ншосалшшшя. угнетение безусловных воетагивных
рефлексов, мидриаз, расстройства координации, мышечная слабость, атактические paccrpoi с-
тва — неуверенность походки, пошатывание при ходьбе, падение. неточные, порывистые, раз-
машистые движения, множество лишних движений. Завершается опьянение общей слабост ью
и сном.
Следует подчеркнуть тяжесть абстиненции при злоупотреблении барбитуратами, препятс-
твующую одномоментному отрыву от наркотиков. Барбитуровая абстиненция характеризуется
р. 1ВИ1ИСМ тяжелых, опасных лля жизни расстройств. Абстинентный синдром развивается в те-
чение первых суток с момента последнего приема снотворного. Длительность абстиненции то
4—5 нел. Наибольшая интенсивность ее проявлений и (физического влечения ог 3 до 14 сут.
Соматические признаки абстиненции озноб, повышение температуры гела и артериального
давления. тахикардия, недосгаточносп. сердечно-сосулисгоп системы, что может привести к ле-
тальному исходу, боли в желудке, сгул частый, жидкий, с тенезмами тошнота, возможна мно-
гократная рвота: отличительный признак, не встречающийся при лрутих видах наркоманий и
токсикомании. — боли в крупных суставах (коленных, локтевых, нлечев! х). бази в мышцах.
Вегетативно-неараюгические признаки абспиненции: сон и аппетит нарушены, гипергидроз,
сальность кожных покровов, мидриаз с вялой фотореакцией. исдостатомное 1ь конвергенции.
620 Глава 7
головокружение, латеральный нистагм, общий тремор пальцев рук. тремор закрытых век. вы-
сунутого языка, головы, умеренные нарушения координации, непроизвольное подергивание
мышц, напряженность и крадовременное судорожное сведение икроножных мыши. фибрил-
лярные подергивания лицевой и скелетной мускулатуры, снижение сухожильных рефлексов.
Психическая сфера: усиление толерантности в 8—10 раз преоб задание злобно-тоскливого
настроения, акатизия (мышечное беспокойство, невозможность усидеть на месте), тревога;
больные угрюмы, подавлены, раздражительны, взрывчвты, при отказе в назначении зребуемых
средств могут проявить агрессию в отношении медперсонала, беспокойны, нс находят себе
места, постоянно меняют позу, возможно развитие типичной тяжелой депрессии с суицидаль-
ными ГСНДСИЦИЯМИ.
В тяжелых случаях могут отмечаться зенсрализойанные тонико-клонические припадки
вплоть до эпилептических и продолжительные психозы ззо типу делирия, что ззе свойственно
другим винам наркоманий и токсикомании Барбзггуратовые психозы, которые внешне могут
напоминать алкогольны»! делирий. отличаются более глубоким помрачением сознания, ззере-
ходят в сопор и кому вследствие отека и набухания мозга со смертельным исходом.
Хроническая интоксикация, по существующему мнению, развивается при ежедневном при-
еме до 0.5 г барбизуразов. что приводит к развитию зависимости через 3—4 мес. а 0.8 г — через
1 — 1.5 мес.
Соматические признаки хронической интоксикации', физическое истощение вследствие поте-
ри азшезига, больные выглядя! постоянно утомленными, сонливыми, пастозность, склонность
к отекам, лицо одутловатое, маскообразное, бледное, кожные покровы землистого оттенка, с
сальным налетом на коже, особенно на лбу. спинке носа, многочисленные знойничковыс вы-
сыпания. дерма । и гы. преждевременное старенззе. различные трофические нарушения, шрамы
после травм, самоповреждений. трофических язв, все повреждения заживают медленно, стой-
кая гипотония, миокарлиодистрофия. дистрофические изменения ззечепи н других паренхима-
тозных органов, импотенция. Как правило, неряшливы, нс соблюдают элементарной гигиены
тела и одежды.
Вегетативно-неврологические признаки хронической интоксикации', движения некоординиро-
ванные. нарушение статики, походка атактическая, тремор конечностей, снижение сухожззль-
ных рефлексов, заторможенная моторика, инозда расстройства глотания, узкие, вяло реагиру-
ющие на свет зрачки, нистагм, диззлопия. смазанная монотонная речь. измененззе почерка.
Психическая сфера: симптоматика органического поражения головного мозга, значите зьззое
изменение ззсихичсской деятельности, аназичзюе. «потерянное» выражение дина, бессмыслен-
ный. неподвижный взгляд, замедленность. вязкость мышления, снижение памяти, внимания,
интеллект;альных функций, крут интересов резко сужен, ограничивается единственно!) целью —
приобрести наркотик, эмоциональная неуравновешенность, взрывчатость, частые депрессив-
но-дисфорические состояния со злобой и тревозо з. краиняя лживость. замкнутость. склон-
ность к аморальным или криминальным поступкам. утрата способности к профессиональной
деятельности, безразличие к окружающим. паразитический образ жизни, резкое сниженззе
критики, весьма выраженная нравст венная деградация, превосходящая таковую прзз друз их
формах наркоманзЩ зз токсикомании.
Осззовныс симптомы барбитуромании:
• отсутствие снотворного де зствия терапевтических доз. потребность в увеличении снотвор-
зюй дозы; нарушения сна (укороченный поверхностный сон) вне приема препарата:
• психический дискомфорт вне приема барбитуратов (пеудовлегворезпзоегь. пониженное на-
строение, навязчивые мысли, страхи, астения с непереносимостью звуков, шумов, света):
• потребность в регулярном приеме; утренний, дневной прием барбитуратов;
• зззакомстзю с тонизирующим или эйфорическим действием барбитуратов!, происходящее
при увеличении разово»! дозы до з),4—0,6 г.
Острая токсичность от приема барбитуратов приводит к нарушению UHC, включая сужен-
ные зрачки, замешательство, гипотензию, слабую координацию, угнетение ды зния. летаргию
и кому. Обычно диазиоз о серьезной передозировке ставится на основании клинических про-
яззлений. так как определение концентрации барбитурата или его хзетаболигов в крови мало
показательно из-за длительного установления равновесия конззентранизг вещества в крови и
тканях. Основные лечебные мероприятия включают промывание желудка, многократный при-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 621
см активированною угля и друте подходы для дезактивации гастроинтестинальной системы,
внутривенное введение жидкости, форсированный диурез и «лкалипизания. Алкалннизапня
мочи создается внутривенным капельным введением раствора П1дрок; рбоната на!рня до I.5—
2 л в сутки под контролем определения щелочной реакции мочи и резервной щелочности кро-
ви В тяжелых случаях используют гемодиализ.
С развитием толерантности снижается уровень безопасности между эффективной и смер-
тельной лозой, что часто служит причиной смерти. Случаи смертельного Отравления барби
турата.ми довольно обычны и характеризуются бессознательным состоянием (после стадии
возбуждения наступает угнетение дыхания, обусловленное дефицитом кислорода), комой с
тотальным исходом спустя от 12 ч ло 4 дней после отравления. Прогноз при отравлениях бар-
битуратами благоприятный, если лечение было начато немедленно. Ранняя смерть от передо-
зировки — обычно результат удара или остановки дыхания. Более поздняя смерть — результат
легочных осложнений типа аспирационной пневмонии или отека легких.
Токсикокинетика и биотрансформация. Практически все барбитураты биотрансформируют-
ся до неактивных метаболитов, которые затем выводятся с мочой. Известно 4 основные пути
метаболизма этих вешеств:
• окисление заместителей при С, атоме углерода с образованием спиртов. <|зснолов. кетонов и
карбоновых кислоте последующим частичным преобразованием их в глюкурониды:
• деалкилирование N-алкильных групп;
• десульфулироваиис 5,-1руипы тиобарбитураюв;
• раскрытие барбитурового кольца между N - и С(-атомами.
На рис. 7-69 приведена схема бишрансформании барбитурата.
Биотрансформания барбитуратов может поставить перед аналитиками дополнительные за-
дачи. требующие решения. Например, при обнаружении в моче пентобарбитала следует ус-
тановить возможное присутствие тиопентала, когорый может продуцировать в ходе реакции
лесу визирования это вещее ню (рис. 7-70).
В табл. 7-16 и 7-17 представлены фармакокинетические характеристики барбитуратов и их
основные метаболиты.
Рис. 7-69. Схема бишрансформаиии барби 1ураюв.
622 Глава 7
Рис. 7-70. Реакция десульфирования тиопентала
Пентобарбитал
Таблица 7-16. Фармакокнпспнескмс характеристики барбитуратов
Вешество Тип действия Средняя доза.г 11ро.то.1- житель- ность действия. ч Начало действия, мин Связы- вание с белками плазмы. % Степень биотранс- формаини, % ₽к.
Барбитал [. 0.25-0.5 10-24 30-60 2 < 5 7.88
Фенобарб нтал 1- 0.1-0.2 4-12 зо-бо 80 7.29
Бутобарбитал L 0.05-0.1 6-12 30-60 95 8.12
AMo6sip6iimi M-L. 0.1-0.3 2-8 15-30 >95
Никлобарби । ал М 0.1-0.2 2-8 15-30 > 99 7,80
Апробарбитал м 0.065-0.13 2-8 15-30 80 8.15
Аллобарбитал м 0.1-0.3 2-8 15-30 70 7.92
Винилбитал м 0.15 6-7 15-30 35 за 4 дня
Гептлбарбитал S-M 0.1-0.4 2-4 30 98 7.78
Секбутабарбитал S-M 0.1 7—Д 30 8.00
Пешабарбитхд S-M 0.1-0.2 2-4 30 40 99 7.88
Пиклобарби itu S 0.12 0.25 2-4 30 1 8.10
Сскобзрбитал VS-S 0.1-0.2 1-3 15 45 90 7.80
Гексобарбмтал VS-S [ 0.25-0.4 1 4 15 1 95 8.30
Примечание L — продолжительное де тетвне. М — ере шее; S — короткое VS — очень короткое.
Таблица 7-17. Т, барбитуратов и п.\ основные мстабо.ппы
Веществе Выведение неизмененного вешества с мочой Метаболиты (моча) Т, из плаз- мы крови, ч
Аллобарбнтал 10-35% медленно в течение 1 нед Неизвестны 40-48
Амобарбитал 1-3% З'-Гидроксиамобарбитал (30—50%) N-Г.искуроиозиламобарбитал (до 30%) 5-(3’- Карбокси ламил)-5-зтилбарбиту роняя кислота (5%) 8-40. в среднем 24
Барбитал Почт ПОМПОСТЬЮ на 95% (2% за 9 ч; 16% за 32 ч) Является метаболитом ыетарбигхта Около 48
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 623
Окончание niatii. 7-17
Буталбитал 5% 5-(2.3-Днгндрокс1Шропил)-мегабат1п (20— 60%) 5-(3 Гилрокси-2-ыетил-)-пропил)- метаболит (10%) 30-88
Бутобарбитал 5-9% З’-Гилрокспбутобарбитал (22—287) З'-Оксобутабарбитал (14—18%) Карбоксипропил-мстаболит (4—8% Окаю 40
Цикл обе рбитал Менее 10% 5-(3-оксониклогскс-1 -ешиО-5- этил барбитуро- вая кислота 8- 17. в среднем 12 1
Mei илфен обар- битал Менее чем 2% Фенобарбитал (до 10%) п-Гилроксимегилфснобарби i ал (30—35%. кик свободны)! и коньки ироваинын) п- Г11 лроксифенобарбитал (следы) 5-Эгил-5-(4-П1дрокси-3-метоксифенил)- барбитуро! я кислота (следы) 5-Этил-5-(4-гнлрокс11-3-мегоксифеннл)- мешлбарбшуровая кислота (следы) 50
Пентобарбитал Менсе 1% З'-Гидрокспнснтобарбитал (яо 30% 3' Оксопентобарбитал (7- 14%) З'-Карбоксимстаболнт (10—15%) Ч-ыюкуронид (13%) До 48. в среднем 27
Фенобарбитал 25-67% «|-ГилроксН1|ж11обарбитал (до 17%. половина из которых конъюгирована) Ч-гиокопиранозил-мезаболит (до 30%) Два дшидроднольных мегабат ита 50—150. в среднем 100
Секбутабарбитал 5-9% 5-(2-карбоксн—1-метнлэтил)—5 этил-барбиту- ровая кислота (30%) 2' Гидроксисскбутабарбитал (3%) 2 -Оксосекбугабарбитал (1% ) 34-42
Секобарингал Менсе 5% З’-гилроксисекобарбигал (два диастереомера) 5 Аллнл-5-(3-карбокси-1 -метилнро1шл)-бар- бзпуроная кислота (4 ) 5-(2.3-Дигндроксипроии. зсекоблрбитал (4%) З’-ОксосекобарбигА! (3%) 19-34. в среднем 25
Винилбитал 5% 3- Г и троксиме габол ит
При передозировке количество неизмененною вешества в моче может быть больше приве-
денного в табл. 7-17.
Интерпретация результатов определения концентрации барбитуратов в плазме крови обыч-
но проводится с осторожностью, так как их токсические эффекты зависят or большою числа
факторов, включающих индивидуальные особенности организма (генетические, см. гл. 3 и 4).
например, степень толерантности или наличие в организме других психоактивных веществ,
таких как этанол наркотики или бензодиазепины, заболевания кардиоваскулярной или дыха-
тельных систем. Эти факторы обычно повышают концентрацию барбитурата до токсической.
Так. при лечении эпилепсии фенобарбиталом из-за быстро развивающейся толерантности те-
рапевтические концентрации вешества в плазме крови близки шли превышают токсические.
При этом исследование мочи мало показательно с точки трения установления дозы и фарма-
кологического эффекта барбитурата. Путь введения препарата также влияет на концентрацию
вещества в плазме крови. В табл. 7-18 приведены ориентировочные концентрации барбитура-
тов в плазме крови.
624 Глава 7
Таблица 7-18. Терапевтические и токсические копией трении барбитуратов в крови
Вешесгво Максимальная терапевтическая KOiiiicin рання. мг/.т Минимальная токсическая концентрация. мг/л
Аллобарбктал 40 50
Амобарбитал 12 10
Барбитал 30 20
Буталби । ал 10 10
Бутабарбитал 15 14
Циююбарбита.! 10 8
Метнлфенобарбптал 15 40
Пентобарбитал 10 5
Фенобарбитал 40 3
Сскбут абарбнтал 14 20
Секобарбшал 10 10
Винилбитал 10 5
Время детектирования барбитуратов в биолитичсских жидкостях, главным образом в моче,
изменяется в значительных пределах. Это связано зависит от ряда причин: принятой дозы
и продолжительности употребления (хронической или острой интоксикации), совместного
употребления вешеств. стимулирующих или подавляющих метаболические превращения (осо-
бенностей токсикокинетики), используемого метода обнаружения конкретного определяемого
вещества, pH мочи. Производные барбитуровой кислоты коротко! о действия, например пенто-
барбитал и сскооарбитал. могут быть обнаружены н моче в течение 24 ч, вещества длительного
действия, такие как фенобарбитал. — в течение 14 дней и ботес. В друтих объектах период
детектирования может быть более продолжительным, например в полосах барбитураты обна-
руживаются после разовой терапевтической дозы спустя 6 мес и более.
Пробоподготовка и методы определения
Способы пробоподготовки фармацевтических субстанций, порошков, таблеток и прочих объ-
ектов неизвестного происхождения обычно достаточно просты и зависят or ue ieii и задач апа-
л тза. используемого метода детектирования, наличия и количества сопутствующих вешеств.
Выделение барбитуратов иг биологических жидкостей шких, как доча и кровь, обычно про-
водятся в несколько этапов: разрушение конъюгатов анализируемых веществ если это необхо-
димо: выделение авали га и его метаболитов из образна, проведение дериватизании. если это
необходимо.
При определении барб пуратов обычно нет необходимости в проведении гидролиза конъ-
югатов (или конъюгатов их метаболитов) Этим барбитураты отличаются от многих других ток-
сикантов. Однако при проведении X ГЛ на неизвестный ял может возникнуть необходимость в
кислотном гидролизе.
При исследовании цельной крови или плазмы крови необходимым этаном является осаж-
дение из них белков, которое, как правило, проводится либо растворителем, например аце-
тоном или ацетонитрилом, либо каким-либо электролитом. Последнее предпочтительнее в
связи с возможным эффектом высаливания. увеличивающим степень экстракции вещества при
ЖЖЭ.
Выделение барбитуратов из полученных водных растворов обычно осуществляется с помо
шью ЖЖЭ или ТФЭ Описаны другие способы экстракции (см.гл.5), например экстракция
сверхкритическими жидкостями или аффинная хроматография (экстракция с применением
иммунных сорбентов), но они широкого распространения (на практике) при определении бар-
битуратов пока не получили.
ЖЖЭ барбитуратов из мочи и плазмы крови проводится с применением различных opia-
ннческих растворителей при слабокислом значении pH — дихлорметана. лиэтилового эфи-
ра. толуола, бутилхлолрида эытлаиетата. гексана и других растворителей, а также их смеси
В последнее время наблюдается тенденция отказа от применения токсичного х.юро<1юрма.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 625
Получаемые при этом экстракты достаточно чисты и не требуют дополнительной очистки. Хо-
рошо себя зарекомендовали специальные патроны TOXITUBE которые позволяют выделять
из водных растворов вешества кислого характера с применением иои-парного реактива.
ТФЭ. Перед нанесением исс юдуемых жидкостей па патроны для твердофазной экстракции
необходимо убедиться в том. что они освобождены от микрочастиц и белков, которые могут
послужить причиной частичною или полного загрязнения микроканалов патрона и не пропус-
кания жидкости через него.
При использовании твердофазных сорбентов (независимо от производителя) необходимо
помнить, что их свойства могут значительно меняться от партии к партии и привести к значм
тельному разбросу получаемых результатов.
Для определения барбитуратов чаше всего используют колонки с обрашеннофазовыми си-
ликагелями СН (или С18) или полимерными сорбентами В последнее время были разработаны
и другие устройства лля твердофазной экстракции. например, сорбционные диски с полупро-
ницаемыми мембранами.
Выделение барбитуратов из биологического материала Методы выделения барбитуратов из
секционного материала были разработаны и внедрены в практику уже много десятилетии па-
за* С некоторыми модификациями они с успехом применяются до сих пор. Надо отмстить,
что современные аналитические приборы имеют высокую чувствительность и селективность,
что позволяет значительно снизить количество необходимого для исследования материала
Изолирование барбитуратов водой, подкисленной щавелевой кислотой Оптимальные условия
изолирования барбитуратов из биологического материала водой, подкисленной щавелевой
кислотой, и способ очистки полученных вытяжек разработала М.Д Швайкова и соавг.
Согласно этому способу, в коническую колбу или стакан вносят 100 г тщательно измель-
ченных органов трупов, прибавляют 200 мл воды, подкисляют насыщенным водным раствором
щавелевой кислоты до pH 2.0 (по универсальному индикатору) и оставляют на 2 ч при частом
перемешивании. Затем содержимое колбы переносят в стакан для иентрифутирования вмес-
тимостью 500 мл и центрифугируют в течение 30 мин (3000 об мин). Цснтрифугат слипают с
осадка и процеживают через ватный тампон. Процеженную жидкость собирают в делительную
воронку и проверяют pH этой жидкости В случае необходимости pH жидкости доводят до 2.0
Содержимое делительной воронки взбалтывают с 3 порциями хлороформа (по 20 15 и 15 мл)
• течение 5 мин. Если образуется эмульсия, то ее разрушают центрифугированием
Хлороформные вытяжки соединяют, доводят хлороформом до 50 мл и перенося г в делитель-
ную воронку, в которую прибавляют 25 мл 0,1 и. гид роке ила натрия, и взбалтывают. Волную
фазу отделяют от хлороформной вытяжки, г>ту вытяжку взбалтывают с 2 порциями воды по
13 мл. Первую и вторую порции воды (по 1.5 мл), которыми промывали хлороформные вы-
тяжки. присоединяют к щелочной водной фазе Потом водную фазу подкисляют соляной кис-
лотой до pH 2.0, вносят в делительную воронку и взбалтывают с 2 новыми порциями хлоро-
форма (ио 20 мл) в течение 5 мин. Хлороформные вытяжки соединяют и доводят хлороформом
во 50 мл. В них определяют наличие и количественное содержание барбитуратов.
Изолирование барбитуратов водой, подкисленной серной кислотой (В. И. Попова). Согласно
эгтомх способу, биологический материал настаивают с водой подкисленной серной кислотой
РН 2.0—3.0. Полученные вытяжки освобождают от примесей .методом гель-хроматографии.
Для этой цели используется гель сефадекса G-25.
В стакан вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 80 мл 0,02 н
серной кислоты, перемешивают и проверяют pH среды При необходимости смесь доводят до
pH 2.0—3.0 (по универсальному индикатору) 30% раствором серной кислоты. Смесь биологи
ческого материала и подкисленной воды настаивают в течение 2 ч при частом переметиванип
Затем вытяжку сливают, а биологический материал сиге 2 раза настаивают с новыми порциями
0.02 н. серной кислоты (по 80 мл) в течение 1 ч. Кислые водные вытяжки соединяют, проце-
живают через сложенную в 3 слоя марлю и центрифугируют в течение 25—30 мин.
Налосадочпую жидкость (цснтрифугат) сливают с осадка и очищают от примесей метолом
гель-хроматографии. который обеспечивает хорошую очистку барбитуратов, выделенных из
биологического материала.
После очистки вытяжек из биологического материала с помошью гель-хроматографии по-
лучают большие объемы элюатов с низким содержанием барбитуратов Поэтому элюаты под-
626 Глава 7
вергают экстракционному концентрированию. С этой целью объединенные кислые элюаты 3
раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (ио 50 мл) в течение 7 мин. Хлороформные
вытяжки, полученные после каждой экстракции, соединяют и на водяной бане при 70 *С отго-
няют из них 120—130 мл хлороформа. Оставшийся в вытяжке хлороформ удаляют при комнат-
ной температуре под тягой. Сухие остатки используют для идентификации и количественною
определения барбитуратов при помощи соответствующих реакций и методов.
Изолирование барбитуратов подщелоченной водой Подшслачснную воду для изолирования
барбитуратов из биологическою материала впервые применил П. Валов. Для осаждения при-
месей. переходящих из био. огического материала в вытяжки, он использовал вольфрамат на-
трия. В настоящее время известно несколько модификаций метода Валова. Приводим одну из
них. предложенную МД. Швайковой и соавт
В стакан или коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала,
прибавляют 180 мл воды и 20 мл 10% раствора тдроксида натрия. Содержимое стакана (или
колбы) оставляют на 30 мин при частом перемешивании, а затем центрифугируют в течение 30
мни (3000 об/мин). От осадка отделяют падосадочную жидкость (центрифуга 1), к которой при-
бавляют 120 мл 10% раствора вольфрамата г атрия и 1 н. серной кислоты (pH 2.0). Жидкость
нагревают на кипяшеи водяной бане в течение 20 мин. а затем подвергают цензрифуг ирова-
иию в течение 30 мин. Цснтрпфугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон,
смоченный водой. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку. Тампон промы-
вают водой (10 мл). Промывную волу тоже выливают в делительную воронку. К процеженной
жидкости прибавляют равный объем диэтилового эфира и взбалтывают в течение 15 мин.
Эфирный слой отделяют и взбалтывают с 50 мл 10% раствора гидроксида натрия. Щелочной
водный слой отде. яюг. подкисляют 25% раствором серной кислоты до pH 2.0 и взбалтывают с
равным объемом диэтилового эфира Полученную при этом эфирную вытяжку используют для
обнаружения и количественного определения барбитуратов
Выделение барбитуратов из слюны, пота и волос. Слюна, пот и нотисы являются альтернатив-
ными объектами исследования по сравнению с традиционными объектами — мочой и кровью.
Исследование таких объектов стало возможным после внедрения в практику современных вы-
сокочувствительных методов.
Эти объекты по сравнению с кровью и мочой отличаются значительно меньшим количес-
твом биома сериала, который можно отобрать у конкретного человека. Концентрация опре-
деляемых веществ в них гораздо ниже по сравнению с мочой, а интервал времени, в течетие
которого можно детектировать барбитураты в слюне и ноте, узок.
Исследование слюны применяется при изучении токсикокинетики барбитуратов. Пот
как объект исследования имеет ряд преимуществ при расследовании причин отравления, а
также тестировании лиц на прием наркотиков Волосы — это единственный объект, позво-
ляющий проводить исследование динамики потребления вещества в течение длительного
времени
Слюна может отбираться несколькими способами: на какой-либо носитель — вату, марлю,
парафин, тефлон, жевательную резинку или с помощью специального устройства лля отбора
слюны Для дополнительного стимулирования выделения слюны часто используют лимонную
кислоту. Исследование слюны после экстракции с использованного носителя или специально-
го устройства проводится аналогично исследованию плазмы крови.
Образны пота отбираются на марлевый или ватный тампон, смоченный спиртом, или с по-
мощью специальных устро тств. Далее эти объекты исследуются аналогично слюне.
Особенностью исследования волос на барбитураты, как и на другие вешссгва. является
необходимость перед выделением из них анализов промывки внешней поверхности. Она не-
обходима для удаления потожировых выделении, а также остатков веществ, выделившихся с
потом. Такую промывку осуществляют в несколько этапов с применением воды и органичес-
ких растворителей, например ацетона, эфира, дихлор-метапа. толуола. Чаше всего промытые
волосы гомогенизируют различными способами и проводят либо энзиматический с примене-
нием глюкуронидазы/арилфосфатазы, либо кислотный гидролиз. После это аналитьг выделяют
с применением ЖЖЭ или ТФЭ.
Исследование рассматриваемых объектов обычно осуществляется иммунными методами,
методами ГХ-МС или ВЭЖХ-МС.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 627
Для определения барбитуратов применяются различные химические, физико-химические
и биологические методы. Выбор конкретного способа пробоподготовки и метода опреде-
ления зависит от целей и задач исследования (СХА. КТА и др.), образца, представленного
на исследование, например неизвестный порошок или моча и волосы человека, наличия
оборудования и подготовленных сотрудников, способных проводить исследование и интер-
претировать полученные результаты. Как минимум для установления факта присутствия бар-
битуратов в различных объектах требуется получение результатов 2—3 независимыми мето-
дами В число наиболее широко применяемых методов для определения барбитуратов входят
химические (хромогенные реакции), иммунохимические тесты, УФ-ВИД-спектрофотомерия,
ИК-Фурье-снсктромстрия, ТСХ. ГХ и В'ЭЖХ, а также гибридные методы: ГХ-МС и ГХ- ИК-
Фурье-спектрометрия, ВЭЖХ-МС (см. гл. 6). До недавнего времени для анализа барбитура-
тов широко использовались методы микрокристаллоскопии, однако в настоящее время они
практически не применяются.
Хромогенные (цветные) реакции
Цветные реакции известны давно и широко применяются при исследовании барбитуратов.
С их помошыо в анализируемом объекте обнаруживают вешества с определенной химической
группой в структуре.
Преимуществами цветных реакций являются дешевизна, отсутствие необходимости исполь-
зовать дорогостоящее оборудование, быстрота получения результата, проведение многих тес-
тов в течение нескольких минут и возможность проведения одновременно большого числа
тестов.
Недостатками цветных реакций при анализе барбитуратов, как и других групп веществ,
являются их недостаточная селективность, относительно низкая чувствительность и необхо-
димость применять крайне ядовитые и высокоактивные реактивы, такие как соли ртути или
серная кислота.
Приведенные ниже тесты используются как для скрининга медицинских препаратов или
неизвестных порошков, так и лля тестирования экстрактов из биологического материала. По-
ложительный результат обеспечивается присутствием, хотя и не обязательным, в тестируемом
образце вешества, имеющего в своей структуре группировку, способную взаимодействовать
с использованными реагентами. Результаты тестирования сильно зависят от индивидуальной
способности различать близкие оттенки цвета и профессиональной подготовленности специ-
алиста.
Тест Дилзе—Копани. Приготовление реактива: реактив I: растворяют 0.1 г ацетата кобальта
(II) безводного в КЮ мл метанола, добавляют 0.2 мл ледяной уксусной кислоты и тщательно
перемешивают; реактив 2: к 95 мл метанола добавляют 5 мл изопропиламина.
Проведение реакции: к нескольким крупинкам вешества или сухому остатку экстракта из
би.юбьекта добавляют но 1—2 капли реактива I и реактива 2.
При наличии барбитуратов развивается фиолетовое окрашивание с различными оттенками
Аналогичную реакцию дают сульфаниламиды, пиперидины и другие азотсодержащие вешест-
ва. Предел обнаружения метода до 25 мкг в пробе. В данной реакции метанол можно заменить
этанолом.
Тест Либермана Приготовление реактива: к 10 мл серной кислоты добавляют I г нитрата
калия или натрия при охлаждении смеси и постоянном перемешивании, избегая выделения
паров коричневого цвета.
Проведение реакции: 2—3 капли реактива добавляют к образцу, расположенному на ча-
совом стекле или белой плитке. Внимание! Большое количество веществ окрашивается под
воздействием серной кислоты. Для получения правильных результатов этого теста необходимо
провести параллельное испытание проверяемого объекта серной кислотой. Фенобарбитал дает
красно-оранжевое окрашивание, однако схожее окрашивание дают (желтые или коричневые
интенсивные цвета) вещества, имеющие фенольные групп в молекуле.
Тест нитрата ртути. Приготовление реактива: К насыщенному раствору ншрата ртути (I)
добавляют бикарбонат натрия до окончания выделения газа и образования желтого осадка.
Через некоторое время осадок меняет цвет на светло-коричневый. Используется только свеже-
приготовленный реактив (нс более 1 ч). I (сред употреблением реактив взбалтывают
628 Глава 7
Проведение реакции: пробу растворяют в минимальном количестве этанола и добавляют
каплю реактива. После перемешивания проверяют окраску в течение 2 мин. Одновременно
проводят реакцию с чистым этанолом в качестве контроля.
Темно-зеленое или черное окрашивание указывает на возможное присутствие вещества с
имидной группировкой в кольце. Скорость проявления окрашивания сильно зависит от свойств
вещества. Кроме барбитуратов, положительную реакцию этот тест дает с сульфаниламидами,
некоторыми антибиотаками, фенитоином и другими веществами. Предел обнаружения барби-
туратов от I до 5 мкг.
Иммунохимические тесты
При исследовании барбитуратов ИХМ используются для проведения скрининга большо-
го числа образцов, главным образом биологического происхождения. Получаемые при этом
результаты позволяют сделать предположение о возможном наличии в тестируемом объекте
вещества из группы барбитуратов без проведения внутригрупповой диф<|>еренцировки. Про-
должительность исследования обычно составляет oi нескольких минут до нескольких часов.
К настоящему времени отечественными и зарубежными производителями налажен выпуск
наборов и реактивов для ИФА. метода поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА),
метода ингибирования латексной агглютинации, радиоиммунных методов (РИА), а также им-
мунохроматографические наборы (см. гл. 6.2). На результаты тестирования оказывает влияние
тип используемого растворителя. pH среды, интенсивность излучения и температура прове-
дения анализа. Важнейшее значение имеет реакционная способность иммунных реактивов,
которые достаточно быстро, особенно при несоблюдении правил их хранения, теряют свою
активность. В связи с этим при проведении тестирования конкретного биообъекта, напри
мер мочи, важно придерживаться подробной инструкции от фирмы-производителя, в кото-
рой даны четкие рекомендации по степени разбавления реактивов и образна, соотношению
их объемов, условиях хранения реактивов и дру>ая информация. Любое изменение методики
исследования, выходящее за пределы инструкции, особенно изменение тестируемого объекта,
должно обязательно проверяться с использованием аналитических стандартов анализируемых
вешеств Схема проведения исследований иммунными методами должна обязательно включать
проведение испытаний работоспособности реактивов на заранее приготовленных пробах с ана-
лизируемым веществом.
В настоящее время большинство тестов ориентировано на проведение исследований мочи,
известны тесты по определению барбитуратов в крови, слюне, поте Наиболее надежные тесты
проверялись на возможность определения барбитуратов в вытяжках из секционного материала,
волосах и ногтях. Все указанные объекты являются объектами биологического происхождения
и представляют собой системы с достаточно ограниченным химическим составом и опреде-
ленными свойствами В них не встретишь агрессивных компонентов, таких как концентриро-
ванные кислоты или щелочи, окислители тын восстановители; диапазон концентраций опре-
деляемых вешеств. pH среды и ионной силы раствора достаточно узок. Так. для барбитуратов
предел обнаружения при тестировании обычно устанавливается фирмой-производителем для
определения токсических концентраций в моче и составляет от 100 до 500 нг/мл.
Ложные результаты могут быть получены после чрезмерного разбавления образна, добав-
ления в него кислот или щелочей, различных поверхностно-активных веществ, окислителей
(перманганата калия или гипохлорита натрия), подсластителей (сахарин) или других веществ.
Иммунохимические тесты широко применяются при исследовании биологических объектов
на присутствие в них барбитуратов, однако полученные положительные результаты всегда тре-
буют обязательного подтверждения другими методами.
Тонкослойная хроматография
ТСХ широко используется для исследования барбитуратов и большого числа веществ друтих
групп — наркотиков, лекарств, пестицидов, метаболитов этих вешеств. ТСХ применяется для
проведения скрининга (см. гл 6.3.1). Этот вид хроматографии полезен в качестве препаратив-
ного метода.
Хроматографирование барбитуратов обычно осуществляют на пластинах с закрещенными
слоями силикагеля с добавлением флюорсс юн того индикатора или без него на стеклянных.
Метаболизм и определение наркотических < редств, психотропных 629
полимерных или металлических носителях. Ниже приведены условия разделения барбитура-
тов.
Пластины. Активированный силикагель G на стеклянной подложке с толщиной слоя 0,25 мкм
и добавлением флюоресцентного индикатора (длина волны возбуждения 254 нм).
Нанесение образцов. На заранее размеченную пластину наносят метанольные растворы ис-
следуемых веществ или экстракты из биологических образцов. Одновременно на эти же плас-
тины наносят растворы аналитических стандартов сравнения. Лучшие результата получаются
при использовании растворов в концентрации около 5 мг/мл.
Системы растворителей
• Система А: этилацетат-метанол — 25% раствор аммиака (85:10:5).
• Система В: хлороформ — ацетон (80:20).
• Система С: изонропанол: хлоро<|юрм: 25% раствор аммиака (90:90:20).
Визуализация. После проведения разделения пластины тщательно просушивают для удале-
ния следов хрома гог'раг|гической системы, особенно следов аммиака. Для этого их нагревают
при 120 °C в течение 5 мин в термостате или обдувают горячим воздухом с помошью лабора-
торных фенов. Качество операции определяется по наличию гаггаха аммиака.
После удаления хроматографической системы пластины просматривают в УФ-свете при 254
и 366 нм и отмечают наличие хроматографических зон. Далее пластины обрабатывают реакти-
вом хлорида ртути с дифенилкарбазоном.
Состав реактива хлорила ртути с дифенилкарбазоном: реактив I: растворяют 0,1 г дифе-
ннлкарбазоиа в 100 мл этанола: реактив 2: растворят 1 г хлорила ртути в 50 мл этанола. Пред
употреблением растворы 1 и 2 смешивают и обрабатывают пластины.
Барбитураты проявляются в данных условиях в виде сине-фиолетовых пятен на розовом
фоне. Предел обнаружения составляет от 1 до 5 мкг барбитурата в пятне.
Внимание! Реактив хлорила ртути с дифенилкарбазоном обладает самой высокой чувстви
тельностью к барбитуратам среди многих других, однако он высокотоксичен и должен быть
использован с соответствующей предосторожностью.
Другими проявляющими реагентами могут быть" 1)1% раствор ацетата серебра с последую-
щей обработкой раствором лифепилкарбазона: 2) выдерживания пластин ватхосфере газооб-
разного хлора после обработки их 2.7-днхлорфлюореснином; 3) реактив Драгендорфа.
В табл. 7-19 приведены значения R*100 для барбитуратов в указанных выше хромато-
графических системах.
Таблица 7-19. Хроматографнчекая подвижность барбитуратов
Вешество Система растворителей R/100
А В С
Ат обарбитал 31 50 53
Амобарбитал 36 52 74
Барбитал 31 41 51
Буталбитал 38 54 67
Бутобарбитал 38 50 68
Циклобарбитал 35 50 59
Мстил фенобарбитал 43 70 72
Пентобарбитал 45 55 76
Фенобарбитал 28 47 38
Сек табарбитал 41 50 69
Секобарбитал 44 55 78
Винилбитал 40 38 -
Хорошо себя зарекомендовала при определении барбигуртов экспертная ТСХ-сисгема
ТОКСИ-ЛАБ. которая представляет собой полный набор инструментов, приспособлений и
реактивов для проведения пробоподготовки биологических объектов с последующим опреде-
гением более 700 веществ методом ТСХ(см. гл. 6.3.1).
630 Глава 7
УФ-cmктрофотометрия используется лля проведения идентификации и количественного
определения барбитуратов, в том числе выделенных из биологических объектов. В растворах
барбитураты в зависимости от pH среды изменяют характер поглощения УФ-света. В кислой
среде и органических растворителях поглощение барбитуратов незначительно. Однако при из-
менении pH в их спектрах появляются интенсивные полосы поглощения вследствие лактим-
лактамной таутомерии перехода лактамной формы барбитурата в лактимную при pH 9.0 (по
N( — С,) и при pH 13,0 (по N, — С,и но N,— С4).
Все 5.5-лиацилзамсшеиные барбитураты в указанных условиях имеют максимум поглоще-
ния при pH 9,0 близкий 240 нм, при изменении pH до 13.0 интенсивность их поглощения сни-
жается. При этом происходит сдвиг в более длинноволновую область к 255 нм. На рис. 7-71 а.
а показаны спектры поглощения фенобарби(ала в зависимости от pH среды. У N-замещенных
барбитуратов, например метилфснобарбитала (см. табл 7-16), может быть только одна лактим-
ная форма и на УФ-снекгре (рис. 7-71. б) проявляется только один максимум пот лощения при
243—244 нм при pH 9.0 Повышение pH до 13,0 к изменению спектра пс приводит. Тиобар-
битураты обладают высокой способностью к поглощению УФ-света (рис. 7-71, в). Максимум
поглощения в сильнощелочной среде у них составляет 303—304 нм.
УФ-спектрофотометрию используют для количественного определения барбитуратов в моче
и крови при отравлениях.
Окисленные в алифатической части метаболиты барбитуратов имеют очень близкие спект-
ры к исходным барбитуратам, поэтому результат определения — это суммарная концентрация
исходного вещества и его основных метаболитов.
Продукты реакции барбитуратов с дифен ил карбазоном и солями ртути поглотают УФ-свет
при 550 нм. Это поглощение при концентрациях барби гуратои в плазме крови в диапазоне от
терапевтических до токсических соответствует закону Бугера—Ламберта—Беера, что позволяет
использовать реакцию для определения этих веществ фотоколориметрическим способом.
ИК-Фурье-спектрометрия применяют для идентификации индивидуальных барбитуратов
(примеры см. гл. 6.4.2.2). Метод недеструктивен и достаточно просто комбинируется с другими
методами. например с ТСХ. обладает достаточно высокой чувствительностью: современные
Длина волны, нм
Рис. 7-71. УФ-спектры фенооярбитдла (а), метилфенобарбитала (б) и тиопентала (в) в зависимости от pH
среды. Пояснение в тексте.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 631
Длина волны, нм
Рис. 7-71. Окончание.
ИК-Фурье-спектрометры способны снимать спектры образцов вешества массой до 10 мкг, а
при использовании специальных приспособлений — и гораздо ниже.
Основные характеристические частоты ИК-спектров барбитуратов (см '):
—NH— (деформационные колебания) — 1680—1693:
—С=О (валентные котебания) — 1712—1725:
—CONH— (валентные колебания) — 1744—1770:
=С—N— (валентные колебания) — 1300—1320;
С=О (деформационные колебания) — 1210—1245;
-С—Н (деформационные колебания) — 830—875.
632 Глава 7
Дополни । елыю inorpynna может быть идеишфинирована но 2 полосам поглощения — 1170 и
1540 см4. фенильные заместители в положении 5 имеют полосы 1490 см и между 690 и 715 см4,
алли п.ньк. радикалы — по полосам 1000 н 1540 см '. N-мегильные радикалы — по 2 полосам около
1190 см *. В области «отпечатков пальцев» псе барбитураты мот быть идентифицированы.
Газовая хроматография и хромато масс-спектрометрия
.Метол газовой хроматографии широко используется при исследовании барбитуратов, в том
числе выделенных из биологических объектов. Современные капиллярные кварцевые газох-
роматографические колонки с нанесенными на сгепки пени лирными силиконовыми фазами
достаточно инертны и позволяют проводить исследования следовых количеств барбитуратов
без дериватизании. Однако в некоторых случаях например при проведении подтверждающего
исследования метолом хромато-масс-спсктромсгрии или при исследовании метаболитов бар-
битуратов деривагизаиия может быть полезна. С этой целью используют метилирующие реак-
тивы, такие, как диазомегаи. гидроксиды тетрлметиламмоиия или трнмстилфсниламмония. В
результате их действия атомы водорода у азот в молекуле барбитурата меняются на метильную
группу. При исследовании метаболитов барбитуратов применяют различные ацилирующие ре-
активы. например ангидриды уксусной или трпфторуксусной кислоты, либо многочисленные
силилируюшие реактивы
Детектирование обычно осуществляется е применением ПИД. азотно-фосфорпого детектора
(АФД) или МС-детектора в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ или ИК-Фурьс-
детектора. Последний вил оборудования хотя и достаточно редок, но по своим возможностям
может значительно дополнить результаты масс-спектрометрического анализа или полночью
заменить его.
В неизмененном виде барбитураты имеют масс-спектры, достаточно сложно поддающиеся
идентификации. В связи с этим до недавнего времени е этой целью использовали метильные
или димегилпые производные барбитуратов. На рис. 7-72 приведена одна из возможных общих
схем основных путей фрагментации метильных производных барбитуратов
Основные пути фршменгации ^Л-димепщпронзводных барбитуровой кислоты.
• за исключением тиольных аналогов, молекулярные ионы отсутствуют или имеют незначи-
тельную интенсивность:
• барбитуратоное кольцо стабильно. сто раскрытия нс набтютается. если R, или R нсарома-
тические радикалы:
обычно из барби!уратового кольца в первую очередь теряется более длинный насыщенный
алкильный радикал из положения 5;
• если R этильный радикал, a R, не имеет а-водорода. то путь А предпочтителен, что по во-
ляег различать амобарбитал и пентобарбитал или бугегагал и бутабарбитал.
Масс-спектры некоторых барбитуратов приведены в табл. 7-20.
Таблица 7-20. Масс-спектры некоторых барбитуратов
Вещество Молекулярная масса ионов (Д) н относительная интенсивность
Аллобарбитал 167 (100). 124 (97). 80 (68). 193 (23). 208 (2)
Амобарбитал 156 (100). 141 (73). 197 (9), 198 (6). 211 (2)
Барбитал 156 (100) 141 (97). 98 (22). 112 (20). 83 (12)
Бу галбитал 168 (100). 167 (88). 181 (30). 141 (24). 209 (3)
Бутобарбитал 141 (100). 156 (96). 98 (19). 184(10), 197(2)
Вник збитал 157 (100). 83 (29). 71 (15). 209 (1). 195 1
Мсгил<|к’побарбита. 218 (100). 117 (39). 146 (23). 246 ПО)
Пентобарбитал 156 (100). 141 (84). 69(12). 98 (10). 1У7 (4)
Секбутабитал 141 (100), 156 (87), 57 ( 27). 98 (13). 157 (12)
Сскобарбитад 168 (100). 167 (80). I9S (25), 141 (11). 209 (4)
Фенобарбитал 204 (100), 117 (29). 232 (23). 161 (20)
Ц и кл обарб in ал 207 (100), 141 (33). 236 (31. 81
Примечание. В скобках — относительная интенсивность. %.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 633
Рис. 7-72. * хема фрагментация Mei илытых производных барбитуратов. Пояснение в тексте.
Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для исследования барбитура-
тов как в лекарственных формах, так и выделенных из биологических объектов. Для этого чаще
всего применяют обращен пофазовые колонки с сорбентами С8 или С18. В качестве подвижной
фазы, используемой в изокрагичсском или градиентном режиме, служат смеси ацетонитрила
либо смеси метанола с водным буфером или смеси растворителей, например ацетонитрила,
изопропанола в гексана, с фосфа!ним или ацетатным буфере
Лучшим выбором лля детектирования барбитуратов можно с титан. УФ-детсктор или ди-
одную матрицу. В последнее время широкое распространение получили комбинированные
методы жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.
634 Глава 7
7.3.8. Производные 1,4-бензодиазепина
Ты можешь исцелить болящий разум.
Из памяти с корнями вырвать скорбь.
Стереть в мозгу’ начертанную смуту
И сладостным каким-нибудь .турманом
Очистить труть от гшубного груза.
Давящего на серлпе’
В. Шекспир
Вопрос Макбета врачу могут задать и наши современники, желая избавиться от напряжения
повседневной жизни.
Трудно дать исчерпывающее определение беспокойству. 1ем не менее беспокойное состоя-
ние часто описывают несколькими или всеми четырьмя приведенными симптомами: моторика
(например, судороги, сокращения мышц, напряженность), неконтролируемая повышенная ак-
тивность (потливость, тяжелое сердцебиение, тяжесть в желудке, внезапные приливы крови):
тревожные предчувствия (беспокойство, страх, задумчивость); настороженность (беспокойс-
тво. повышенное внимание, бессонница). Успокоительные средства, известные как транкви-
лизаторы или анксиолитики, предназначаются для лечения психологических и физиологичес-
ких симптомов беспокойного состояния. Транквилизаторы (от лат. trancjuillium — спокойствие)
представляют собой одну из важнейших групп психотропных средств. В последнее время их все
чаше называют анксиолитиками (от лат. anxius — тревожный и греч. lysis — растворение). Есть
и другие менее распространенные названия: атарактики (от греч. ataraxia — невозмутимость),
психоседативные, антиневротичсские средства (см. электронное приложение).
Значительное количество лекарственных препаратов разных групп способно проявлять
протавотрсвожпые (собственно транквилизирующие) свойства. В частности, такие свойства
присуши некоторым антидепрессантам — препаратам, оказывающим в целом стимулирующее
влияние на психические процессы (см. гл. 7.3.9). В то же время такси классический транквили-
затор. как пиназепам. обладает аптидспрессивным эффектом. Эги перекрывающиеся спектры
фармакологической активности, казалось бы. совершенно ра ных лекарственных препаратов
свидетельствуют о полнмодальносги психотропных эф<|>ектов. исключительной сложности ме-
ханизмов различных нарушений психики, происходящих с участием mhoihx нейромедиаторов.
и общности некоторых нейрохимических и нейрофизиологических звеньев этих нарушений.
Транквилизаторы известны более 50 лет. Разработка первых препаратов этой группы отно-
сится к середине XX столетия — периоду зарождения научной психофармакологии. История
применения анксиолитиков началась с внедрения в клиническую практику карбаминового эфи-
ра нропандиола — мепробамата (менротана). В начале 50-х годов ученые из лабораторий Роше
синтезировали новую группу соединений, названную бензодиазепинами в 1955 г. С момента
появления на фармацевтическом рынке хлордиазепоксида (элениум) в 1959 г. группа производ-
ных бензодиазепина, представленная разнообразными по структуре обладающими широким
спектром фармакологической активности и высокой эффективностью соединениями, вои ла в
медицинскую практику всего мира. В настоящее время группа транквилизаторов насчитыва-
ет более 100 препаратов. Продолжаются их активный поиск и
наиболее популярном ряду производных 1.4-бензодиазсиика
синтезировано свыше 3 тыс. соединений, из которых более
40 используется в клинической практике.
На 8-й специальной сессии в феврале 1984 г. Комиссия по
наркотическим средствам ООН решила поставить под между-
народный контроль 33 производных бензодиазепина.
Диазепам (1963) и хлордиазспоксид быстро заняли лидиру-
ющее место на рынке лекарств от беспокойства и бессонни-
цы. Например, более 100 млн рецептов было выписано только
на одни бензодиазепины в 1975 году.
Диазепам (валиум) является базовым препаратом — транк-
вилизатором (рис. 7-73).
совершенствование. Только в
Рис. 7-73. Структурная формула
диазепама.
В табл. 7-21 представлены наиболее раснрос раненные ле-
карственные препараты той гру 1пы.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных.. 635
Таблица 7-21. Структурные формулы некоторых производных бензодиазепина
Вещество
Хторлидзспоксид (либриум)
Структурная формула
Темазепам (З-i идроксндиазспам)
Диазепам (вал пум)
Оксазепам (алумбран, нраксиюн. сераке.
ссренал-Д)
Нитразепам (могалан. могалон)
Медазепам (побриум)
636 Глава 7
НроАмжение табл. 7-21
Лоразепам (танор. азнван. теместа)
Празепам (лометрин. верстран)
Клоназепам (ривотрил)
Флуразепам (далмалорм. лалмане)
Бромазснам (лсксотаннл. лскеотан)
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 637
Продолжение таб.1. 7-21
Флунитразепам (рогипноль)
Клобазам (фрпалум)
Камазепам (альбего)
Кета золам
Триазолам
Клотиазепам
638 Глава 7
Лорметазепам
Тетразепам
Алпразолам
Феназспам
Структура производных бензодиазепина
В основе структуры производных бензодиазепина
(рис. 7-74) лежит 5-арил-1,4-бензодиазепин. в кото-
ром бензольное кольцо соединено в положении 6, 7
с 1,4-диазепнном. В положении 5 обычно имеется ра-
дикал фенил (лля оксазепама или медазепама) или 2-
галоилный фенил- (2-хлорофенил для лоразепама или
2-фторофенил для флуразепама)
Другая группа производных бензодиазепина (ими-
дазобензодиазепнны) включает имидазольное (1.3-диа-
золыюе) кольцо, присоединенное в положении I, 2 к
1,4-диазспнну (мидазолам).
Структура триазолобензодиазепинов вместо имида-
зола содержит 1.2,4-гриазоловос кольцо (алпразолам,
эстазолам и триазолам). К друшм структурным изме-
нениям относятся наличие гетероциклических колец в
Окончание mafii. 7-21
Рис. 7-74. Обшая формула производных
1,4-беизолиазспина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 639
положении 4. 5 (галоксазолам, кетазолам и оксазолам) или замещение бензольного кольца
гриенильпым кольцом (клотиазепам).
Физико-химические свойства бензодиазепинов. Производные 1.4-бензодиазепинов бесцветные
кристаллические вещества, практически нерастворимые в воде. Их соли (по амино- тип кар-
боксильной группе) растворимы в воже. Растворимость в органических растворителях зависит
от химической природы вешества Лучше всего они растворяются — в апротонных раствори-
телях. Липофильность (1g Кр) производных бензодиазепинов находится в диапазоне 2.16—2,98.
Структура веществ этой группы определяет характер поглощения в УФ-области. В УФ-спскт-
рах имеются 3 полосы поглощения с aiibv в областях 200—215. 220—240 и 290—330 нм.
Абсорбция производных 1.4-бензодиазепинов в УФ-области изменяется в зависимости от
pH их растворов:
• в кислой среде — за счет протонирования атома азота положении в 1 или 4;
• в щелочной среде возможно изменение хромофорной системы (увеличение сопряжения за
счет лактим-лактамной таутомерии азомсгиновой связи в положении 1. 2).
Эю свойство положено в основу иденшфикаиии соединений данной группы но электрон-
ным спектрам поглощения.
Производные 1.4-бензодиазепинов являются слабыми основаниями. 1.2-Дигидропроизвод-
ные 1,4-бензолиазепина — эго амфолиты за счет наличия в молекуле амидной труппы. Произ-
водные 1.4-бензолиазспина склонны к гидролизу в кислой и щелочной средах.
Кислотный гидролиз, например, 1,2-дигидропроизводных бензодиазепина протекает, как
показано на рис. 7-75:
Продуктами гидролиза являются амниобсизофеноны (111) и аминохинолоны (IV). образую-
щиеся из промежуточного соединения (11).
В результате щелочного гидролиза 1.2-дигидропроизводных бензодиазепина образуются
соли аминокислот. которые при взаимодействии с кислотами образуют бензофенон и произ-
водные глицина (рис. 7-76):
Фармакология и токсикология По фармакологическому действию производные бензодиа-
зепина относятся к транквилизаторам, снотворным, противосудорожным препаратам и цен-
трально действующим мышечным релаксантам. Транквилизаторы применяют для устранения
беспокойства, чувства тревоги и страха, уменьшения внутреннего напряжения, раздражитель-
ности. лечения бессонницы и других проявлений невротических, неврозоподобных, психопа-
тических и нсихоиагонодобных состояний, во ста f явных дисфункций. Поэтому главной ми-
шенью применения транквилизаторов являются различные тревожно-фобичсскис синдромы
Рис. 7-75. Схема кислотного гидролиза 1,2-дип<лропроизво111ых 1.4-бензолназепина.
640 Глава 7
Рис. 7-76. Схема щелочною шлролиза 1.2-днгидропроизводных 1.4-бенэодиазепина.
непсихотического уровня, как острые, так и хронические, развивающиеся в рамках так назы-
ваемых пограничных состояний.
Одна из классификаций производных бензодиазепина основана на продолжительности дейс-
твия. Согласно этой классификации, выделяют препараты длительного действия (например,
диазепам, фецазепам. пиназепам, нитразепам, флунитразепам), средней длительности действия
(хлорлтазепоксид, лоразепам, нозепам, алпразолам и др.) и короткого действия (мидазолам, три-
азолам).
Традиционно выделяют так называемые дневные транквилизаторы, у которых преобладает
собственно анксиоли|ическое действие и минимально выражены седативный, снотворный,
миорелаксантный эффекты, — мезапам (рулотель), тофизопам (грандаксин), галазепам, кло-
разепат (транксен).
Подобный подход к классификации, однако, не учитывает механизм действия транквилизато-
ров, который особенно важен для понимания токсикодинамики и сущности побочного действия.
Нарушения передачи информации между клетками во многих случаях обеспечивают раз-
витие патоло! ических процессов. Межкле!очная коммуникация включает перенос сигнала с
помощью химических соединений, для которых на клетках-реципиентах существуют специ-
альные воспринимающие элементы — рецепторы (см. гл. 2 и 3). В настоящее время около 2/3
всех выписываемых врачами препаратов имеет «рецепторный» механизм действия, а в психо-
фармакологии этот показатель приближается к 100%.
Различные но химической структуре депрессанты — алкоголь, барбитураты. нсбарбитуратные
успокоительные средства и бензодиазепины — оказывают схожее действие при эквивалентных
дозах. Кроме того, между ними существует перекрестная толерантность. Они moivi усиливать
действие друг друга. Существует также перекрестная зависимость, гак как соответствующая доза
любого депрессанта может использоваться для уменьшения абстинентного синдрома, вызванно-
го другим депрессантом. Действительно, бензодиазепины часто используют для смягчения пос-
ледствии при отказе от алкоголя. Были получены достоверные доказательства об общности ме-
ханизма воздействия депрессантов В 1977 г. ученые сообщили об открытии бензодиазепиновых
рецепторов. Производные бензодиазепина взаимодействуют с бензодиазепиновыми рецепторами
(рис 7-77), которые расположены только в одной из нейротрансмиттерных систем — ГАМК-ср-
гической (как с пре-, так и с постсинаптическими ГАМК-ергичсскими нейронами).
ГАМК представляет собой основной ингибитор нейротрансмиссии в ЦНС. Эта аминокислота
действует, связываясь с ГАМКА-ршепторами — лигандзависимыми каналами, в которых участок
связывания нейромедиатора и ионный канал составляют один макромолекулярный комплекс.
Поскольку ионный канал, входящий в состав ГАМКА-рецептора. селективно пропускает внутрь
нейрона анионы хлора, активация ГАМКл-ренептора приводит к гиперполяризации нейрона и.
таким образом, гормозиг запуск потенциала нейропередачи. Механизм действия бензодиазепи-
нов основан на связывании со специфическим участком ГАМКЛ-рецептора.
Фармакология ГАМКЛ-рсцсптора достаточно сложна. ГЛМКА-рсцснгор служит основным
местом действия не только бензодиазепинов, но и барбитуратов, а также обусловливает неко-
торые токсические эффекты этанола. Бензодиазепины и барбитураты связываются с различны-
ми участками рецептора и усиливают тормозящее действие ГАМК. Они действуют посредством
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 641
Возбуждение в норме
ГАМК-ергическое
ГАМК-ергическое
ингибирование
ингибирование
Рис. 7-77. Механизм действия бензодиазепинов, основанный на связывании со специфическим участком
ГАМКЛ-репептора (по Hillmanii II. 2000). Пояснение в тексте.
л-'-юстерической1 ре/улянии, изменяя конфигурацию рецептора так. что его сродсчю к ГАМК
увеличивается Кроме того, эти препараты взаимно усиливают действие друг друга. Этиловый
спирт также действует аллосгсричсски. повышая сродство рецептора к ГАМК и друтим препа-
ратам. Он не связывается с самим рецептором, а изменяет мембранное окружение рецептора.
В высоких дозах барбитураты и этиловый спирт, по пс бензодиазепины могут открывать ка-
налы лля ионов хлора независимо от ГАМК. Тот факт, что бензодиазепины, барбитураты
и этиловый спирт действуют на один и тот же рецептор, объясняет их фармакологический
синертзм (а значит, опасность перст зировки при комбинированном применении) и пере-
крестную кзлерантноегь. Например, бензодиазепины оказывают влияние на познавательную
и психомоторную деятельность и ухудшают внимание водителей, что усиливается алкоголем.
Аллостерические модуляторы — вешества. связывающиеся с участком рецептора, отличным от активного центра, и
изменяющие выраженность эф<|>ектв агонистов или антагонистов. Аллостерические модуляторы могут быть позитив-
ными или негативными. усиливаюннтми или ослабляющими действие лигандов соответственно.
642 Глава 7
Перекрестная толсранчность используется при детоксикации больных алкоголизмом бензоди-
азепиновыми препаратами.
ГАМ Кх-рецепторы состоят из нескольких субъединиц. Активный Г/\М КА-рецептор вклю-
чает 2 n-субъс динипы. 2 ^-субъединицы чч g- или Д-еубьс шнииу. С бензодиазепинами вза-
имодейсп viot только те рецепторы, у которых имеется g-субьединина. Выячсчеччо несколько
разновидностей а-. 0- и g-субъединин. Разнообразие ГЛМ К ^-рецепторов обеспечивается раз-
личными сочетаниями субъединиц. поэтому следует надеяться на разработку в будущем новых
более селективных бензодилзепипонодобных препаратов, обладающих менее выраженным се-
кстинным свойством или реже вызывающих зависимость.
Основное действие бензодиазепинов связано с аллостерической регуляцией I AMKv-peuen-
торов. однако, принимая во внимание широкое рзснрос ранение в ИНС ГАМ К ч-репев торое
пока неясно, как достигается специфическое анксиолитическое действие бензодиазепинов,
применяемых в терапевтических дозах. Какие именно ГАМК-ергичсские синапсы из множест-
ва присутствующих в ИНС опоерс гу от анксиолитическое действие бензодиазепинов? Каковы
их нормальные физиологические функции?
Безусловно, рецепторы бензодиазепинов существуют в головном мозче с какой-то целью, и
вряд ли они просто ждали в мозге ожрьпия бензодиазепинов. Более вероятно, что бензодиазе-
пины имитируют естественное нейромедиаторное регулирование страха или беспокойстчча. по
лог факт пока не установлен.
Предполагается, что анксиолитические свойства бензодиазепинов связаны с инчибироваиисм
нейронов лимбической системы, а также ссротоиипсрчтчческнх (5-СН. или 5-НТ) и иоралренер-
нческих нейронов ствола мозга. Проч и носу дорожное действие бензодиазепины оказывают на
нейроны коры. Соответственно терапевтический эффект производных бензодиазепина ре
зулыат одновременного воздействия препарата на множество структур головного мозча. чем.
по-нчинчмому. тт определяется широкий стчектр их фармакологической активности. Производные
бензодпазсчти1та воздействуют преимущественно на области чоловиочо мозга, стимулирующие
физиологические механизмы подавления активности большинства нейронов. Этим объясняется
купированчче тревогчч чч других расстройств, связанных с гиперактивностью ччейронов (например,
пароксизмальная эпилептическая активность). Терапевтический эффект бензолиазенчпчов, реа-
лизующийся в редукции вегетативных и тчекоторых эндокринных нарушений, объясняется учас-
тием ГАМК-ергических сиччапсочч в центральных механизмах рстулячши функций эндокринной
чч вегетативной систем (рчче. 7-78). По лому, кроме собственно анксиолитического, к основным
Рис. 7-78. Ра «личное фармакологическое действие бечтюлиакчшнов. усилижпончнс тормозящее чЬчнязиче
ГАМК-нейронов на другие нейромедиаторные системы.
Лей — холинергические. DA — дофаминергические. NA-норллренерпччсскис. 5-НТ — серотонинергичес-
кие рецепторы. Поясненччя в тексте.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 643
клз1нико-фармакодотческим зффск ам транквилизаторов относятся седативный, миорелаксц-
руюшззй. протз восудорожный. снотворный. всзсгостабилнзнрующий и амнестический
Учитывая, чю понятие « зраиквил и за зоры» объединят многие вещества различно!1! химз
ческой природы, а вещества, близкие по структуре, тем не менее оказывают другое фармако-
лоз пческое действие, используют классификацию транквилизаторов по механизму действия
(табл. 7-22).
Таблица 7-22. Классификация важнеВших транквилизаторов (во Т А Ворониной и С.Б. С ipc ichbhv)
——. — — - — --— - у — — —. ,м .. .............. —I
Механизм зенстпня __Представители
Традиционные инкеволптикв
Прямые агонисты ГАМК^-бензолиазсвиновото Прении шые бепзолвазевива.
рецепторного комплекса с прсобллтапзцм собственно
анксиёлитического действия
(хлорлиазенокевл. диазепам. <|кна зевам
океазевпм. лоразепам и др.)
с преобладанием снотворного действия
(нтпразенам. фзунззтразепам)
с преобталанием вротпиосу юрожного
действия (кюназепзм)
Dpcnapaibi разного механизма действия Преваразы разного строения — мебнкар.
мепробам т. беззаконии. < ксн излив зз др.
Новые аззкево.пзтззкзз
Частичные агонисты бензодиазепинового Абскарнил. пмп.зазопирттдзшы (алпидем.
рецептора, пешества с ра иичпой гропностыо к золи зем)
субъединицам ГАМ КА-ревеп гора имзиазобензодиазепнны (имзизазенил.
________I____бретазеззил). 131 на.зон. иста генам______
Эидотенныс резуляторы (модуляторы) ГАМК,- Фризхзензы знлозепзшои (зз частности DB1 — I
бенза.зз1азеззз13зового рецепторною комзыекеа Diazepam binding inhibitor. г.е. иззз ибнтора
связывания диазепама)
производные b-карболизза (амбокарб.
карбаз зетам)
[____ззззкотззззамид зз его anicioiii
Хзозптсгы ГАМКц-репспторного комплекса Фенибут. I AM К. (ампиалон). бзккзфен
Мембранные модулязоры ГАМК,- Мексидои. афобатол, ладасзеп. гофззюпа.м
бензодиазепинового рецепторного комплекса ]
Глуиматерз пческне анкснолзгпзкзз Aiiiiiioibictxi NMDA-peHCirropoe* (кетамин.
фенинзспздин. цпкллзощпз)
Лшаюиисты AMP.A-peue нора *♦
(ззфезз пронзит)
Лиганды ин।ппювого учасзка
Примечание * NMDA комплекс канал/рецегиор имеет сайты связывания глутамата. глиппна. ионов
мазния зз пинка РСР пазиаминон и сайт фосфорилирования. •‘АМРА-реиензоры являются ионотроп-
ными 31 наряду с рецен юр. ш других подтипов приззимаюг участие в оиосредусмозз глутаматом нср заче
возбуждающих сшззалов.
В габлзн|у не вошли .многочисленные препараты, транквилизирующее лене г вне которых ihlimcicu .jhuii.
о пой и з граней фармакзмогическоп активности, например |}-адрепоблокаторы. янтагопнетзи холепнето-
кззнззн В-реззепзоров. нейронеизилы. агонисты гистаминовых Н -рецензоров. .зн1ззденрсссан1Ы — три-
циклические в |П1гнб||горы Х1АО-А. ингибиторы ДОФА-декарбоксилазы и ,<р.
Как видно нз таблицы, в связи с апиянием на рахтичные нейромедиаторные системы, вов-
леченные в патогенез тревожных состояний, транквилизирующее действие присуще не только
•классическим» аикеззолпзнкам. но и ерс гствам. относящимся к разным зсиншко-фармаколо
гичсским группам
Факторы, влияющие на действие транквилизаторов. В результате развития молекулярной
генетики, приведшего к зцентификаинн генов зз нх вариаций, которые кодируют озделызые
рецепторные белки, количество во можных физиологических модификаций рецепторов увели-
чилось ло нескольких лссятков тысяч. Например, матемазичсские расчеты указывают на воз-
можность сущеегвованззя около 50 000 комбинаций субъединиц ГАМКл-рспспторов. наиболее
644 Глава 7
распространенных в ЦНС. Сегодня невозможно сделать определенные заключения о физио-
логической значимости столь выраженной гетерогенности рецензирующих макромолекул, гем
более что в этом направлении наука находится в сталии накопления фактического материала.
Тем не менее наряду с особенностями механизма действия, дозой и длительностью применения
на аффект транквилизаторов существенно влияет фармакогснстический фактор — теистически
обусловленный тип ответа ортанизма на эмопионально-с грессовое воздействие. Показано, что
при активном типе реакции бензодиазепиновых транквилизаторов преобладаю! юзозависи-
мое седативное действие, угнетение поведенческих реакций, а при противоположном типе
(гак называемой frcezing-реакпии — застывание), напротив, отмщается активация поведения.
В клинических исследованиях установлено, что на астеничных нацией гоп с неврозами бензо-
диазепины оказывают транквилоактивирующее. а на стеннчных — гранквнлоседатнвнос деис-
твне. У здоровых добровольцев с высокой результативностью операторской деятельности в
эмоционально-стрессовой обстановке бензодиазепины вы (ывают седапию. а при дезорганизу-
ющем влиянии стресса — повышение показателей деятельности.
На действие транквилизаторов может влиять и минеральный сослав рациона, в частнос-
ти. уровень потребления хлорида натрия. Снижение эффект явности анксиолитика наблюдает-
ся при повышенном потреблении хлорила натрия, что. по-вилимому. связано с ослаблением
ГАМК-ергическнх тормозных процессов.
Основные побочные эффекты, встречающиеся при использовании транквилизаторов, отно-
сятся к типу А (см. гл. 1):
• гипсрседания — дозозависимая шевпая сонливость, снижение времени бодрствования, на-
рушение координации внимания, забывчивость и др .
• миорелаксация — расслабление скелетной мускулатуры, проявляющееся обшей слабостью,
слабостью в отдельных группах мышц;
• поведенческая токсичность — легкое нарушение когнитивных функций и психомоторных
навыков, проявляющееся даже при приеме малых доз и выявляемое при нейропсихологи-
ческом тестировании:
• парадоксальные реакции — усиление агрессивности и ажитации (возбужденное состояние),
нарушения сна. обычно проходящие самопроизвольно или после снижения дозы:
• психическая и физическая зависимость, возникающая при пительном (6—12 мес непре-
рывно) применении, проявления которой напоминают невротическую тревогу.
Частым побочным эффектом производных бензодиазепина являются поведенческая ток-
сичность (сонливость в дневные часы, миорелаксация, нарушения внимания и координации
движений), атаксия (преимущественно у больных пожилою возраста). Углубление сна и мио-
релаксация при приеме транквилизаторов может вызвать синдром ночного апноэ (т.е. пипные
ых.цельные паузы во сне у храпящих), что обусловливает противопоказание к применению
препаратов При этом имеет место гипоксия, возможно развитие ишемии миокарда. Остальные
побочные эффекты бензодиазепинов встречаются значительно реже (табл. 7-23).
Таблица 7-23. Основные побочные эф<|х:К1ы бензодиазепиновых анксиатишков
Система Побочные эффекты
Сердечно-сосудистая Снижение сократимости миокарда и как следствие сердечного выброса: невыраженная артериальная гипотензия ври передозировке: сосудорасши- ряющее действие
Бронхолегочная Умеренное угнетающее действие на дыхательный центр преимущественно у папистов с хроническими обструкливными заболеваниями легких
П ищевар л тельная Замедление пассажа пищи по кишечнику (клоназепам, лоразепам)
Побочные эффекты производных бензодиазепина обычно требуют лишь снижения или пере-
распределения суточной дозы препарата Необходимость отмены прои зводных бензодиазепина
возникает при упомяну!ых выше достаточно редко вс i решающихся нарушениях дыхательной и
сердечно-сосудистой систем, а также при развитии аллергических реакций и гематологических
осложнений.
Безопасность использования бензодиазепиновых анксиолитиков связана с бочыним разры-
вом между терапевтическими и летальными дозами, отсутствием неблагоприятного влияния па
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 645
ряд функциональных систем органи; ма. а также минимальными нежелательными взаимодейс-
твиями с соматотропными препаратами. Бензодиазепины не оказывают клинически значимого
воздействия на функции печени, эндокринную и мочевую системы. Следует, однако, иметь в
виду, что бензодиазепиновые анксиолитики могут взаимодействовать с некоторыми соматот-
ропными препаратами (табл 7-24). В ряде случаев такие взаимодействия могут рассматривать-
ся как неблагоприжные или очень опасные (например, с миорелаксантами — производными
тубокурарина).
Таблица 7-24. В заимолействис произвотных бензодиазепина с препаратах™ рапнчных фармакологичес-
ких групп
Группа препаратов Характер взаимодействия
Центральные а-одрсномимстики (клоиилин. метиллофа. гуанфа- иин) Усиление пшогензивното эффекта нс оральных а-адрепомимсти- ков. Взаимное потенцирование угнетающего действия на ЦНС
Периферические а-адрснобло- клоры (фентоламин, тропафен. и i порами н) Усиление шнотепзивпого эффекта периферических а тдренобзо- каторов и седативного эффекта бензодиазепинов
Блокаторы калышевых каналов Ослабление эффектов .тилтиазема при сочетании е диазепамом. Усиление эффектов мидазолама при сочетании с дилтиаземом и верапамилом
Ингибиторы анпютензин-пре- врашаюшего фермента Усиление гипотензивного эффекта
а-Алреномиметнки (адреналин, норадреналин, мезатон) У'меныпснис гипотензии, выканной передозировкой диазепама, при введении торадрсналнна
Антиарнтмическне средства Потенцирование терапевтических эффектов антиаригмических препаратов классов IB (лидокаин) и IV (дилтиазем)
Сердечные гликозилы Потенцирование карлнотропны.х эффектов сердечных гликозилов
Мети л ксантин ы (теофилд ин. аминофиллнн) Возможно нсбо.и шое повышение артериального давления. Ос- лабление эфф ктов теофиллина. Восстановление функций ЦНС после приема больших лоз диазепама при внутривенном пвелении эуфиллина
Блокаторы H,-i кетаминовых рецепторов (циметидин) По1енцирование э<|х|>сктов диазепама, хлордназспоксида. мезапа- ма. алпразолама
Мочегонные препараты Усиление артериальной гипотензии
Антикоагулянты непрямою действия (варфарнн) Ослабление шггикоагудянтного эффекта
Прогивомикробные средства Усиление эффектов алнразол тма и мидазолама при комбинации с макролидами (эритромицин). Усиление эффектов диазепама при комбинации с изониазидом. Ослабление эффектов диазепама при комбинации е рифамиинином
Оральные сахароснижаюшие npcuapaiu Потенцирование эффекта пероральных сахироснпжаюшнх препа- ратов
Оральные контрацептивы Снижение эффективности контрацепции. Усиление эффектов произвол! тых бен зодназепина
Миорелаксанты Потенцирование эффекта ассллблсния скелетных мышц
Значительно более серьезные проблемы связаны с возможностью формирования при при-
еме производных бензодиазепина зависимости' и синдрома отмены. Риск возникновения за-
висимости определяется длительностью терапии, суточной лозой, скоростью снижения дозы
перед полной отменой и длительностью периода полувыведения препаратов
1 Лекарственная зав) с н мость ст транкюытаторов трактуется специалистами неоднозначно. Однзко она является кли-
нической реальностью. ее риск прямо пропорционален длительности течения транквилизаторами В современной
1пср<тгуре встречаются указания ив то, что возникновение зависимости, зарегистрированное лишь при длительном
приеме этих препаратов, больше свойственно пациентам с определенными психофизиото ическнми чертами, живуши
ми в плохих социальных условиях, а также при особой клиничссой картине заболевания.
646 Глава 7
Upon водные беизодназсптита часто вызывают привыкание и пристрастие. Наблюдается как
психологическая, так и физическая зависимость. В современной медицине выявляются опре-
деленные противоречия: несмотря па жесткие рекомендации (ВОЗ. современные руководства
по клинической психиатрии и психофармакотераипи психических расстройств), отмечается ус-
тойчивый рост применения бензо, иазеииповых анксиолитиков, назначаемых все чаше в виде
длительных курсов
Назначение производных бен одиазепттна больным с признаками хтоупотребления психо-
активными веществами и алкоголем или зависимостью от них в анамнезе часто приводит к се-
рьезному сочетанному отравлению. Чаше всего смерть <и персдозировки психотропных препа-
ратов происходит при употреблении алкоголя совместно с депрессантами. Такая комбинация
убила Э. Пресли, так случается с тысячами людей ежегодно Совместный прием небольших
доз депрессанта и алкоголя привод» т к трагическим послелстиям опосредованно. Например,
совместный прием депрессанта в терапевтической дозе с небольшой порцией алкоголя за-
меню снижает скорость поведенческой реакции, что может стать причиной серьезною ло-
рожпо транспортного происшествия. При этом в крови определяют относительно невысокие
концентрации ирспаратоп и алкоголя, что следует принимать во внимание при интерпретации
результатов ХТА. Длительное лечение бензодиазепиновыми анксиолитиками назначают строго
по показаниям.
Несмотря па установленную взаимосвязь между концентрацией производных бензодиазе-
пина в плазме и рядом нейрофизиологических показателей (количественные показатели ЭЭ1,
степень седации, точность реакций и мышечная релаксация), большинство исследователей
указывают иа большие индивидуальные различия терапевтического действия производных
бензодиазепина. Значительный терапевтический индекс, разброс индивидуальных величии
>ффективной дозы, быстрое изменение состояния пациента па фойе приема препарата опре-
деляют целесообразность инлнвндуального подбора терапевтической дозы бензодиазепинов с
учетом различной токсичности лаже близких по свойствам препаратов мои тручиты.
Передозировка производными бензодиазепина приводит к атаксии (расстройство координа-
ции движения), амнезии, мышечной слабости и коме. В табл. 7-25 представлено сопоставление
доз. эквивалентных по токсическому з*|м|юкту К) мт диазепама, других производных бензоди-
азепина.
Таблица 7-25. Сопоставление тз. эквивалентных ио токсическому эффекту приему 10 мт диазепама,
других производных бен толтшзепина
Пронзвс ныс беиюлиазенииа Доза производных бензодиазепина, эквивалентная шт токсическому эффекту 10 мг диазепама. мг
Оксазепам 40
Хлордиазепоксид 20
Нитразепам 5
ФлЮрлЗСИ *м 30
1 три зевам 2
Брома мтам 3
Клобаэкм 20
Клоназепам 2
Флунитразепам 2
Клотиазепам 10
Клора зонам 20
1орме га золам 1
Празепам 20
Триазолам 1
Меда зонам 20
Для лечения передозировки производными бензодиазепина принимают внутрь тын вводят
внутривенно специфический антагонист’ — флумазепил (рис 7-79).
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 647
Бику купим ГАМК
(антагонмс!) (агонист)
Рис. 7-79. Конкуренте спя гикание флума гегиьта и бен кхпгазспнпа с ГАМКЛ-рсиентором.
Флумазенил применяется только при отсутствии в организме наркотиков, алкоголя, ан-
гмлспрсссап гов. а также судорожных состояний у паниенia в анамнезе (г|1лумазепи.ч может
вызывать судороги).
На рис. 7-79 нок< апы схема ГАМКЛ-ренсгпора 3 основных участка связывания и хло-
рпд-иопный канал, который открываемся в момент. когда 2 молекулы ГАМК связываются
с соответствующим участком на рецепторе Проконвульсант бикукуллин блокирует участок
связывания ГАМК Участки связывания бензодиазепинов и барбитуратов физически отделены
друг от друга и от ГАМК-связываюгггего участка. Соединения (например. флумазенил). кон-
курирующие с бензодиазепинами (например, диазепамом) за участок связывания, считаются
антагонистами бен юлиазеиинов.
Токсикокинетика и биотрансформация
Производные бензодиазепина хорошо всасываются после приема внутрь путем диффузии.
При внутривенном введении этот провесе происходит значительно быстрее и сопровождается
иными клиническими эффектами. чем при приеме внутрь. В частности, почти сразу после
поступления диазепама в венозную кровь наблюдается выраженная седация. Эти х|к]>екты
нехарактерны лля сопоставимых доз препарата при приеме внутрь.
Производные бензодиазепина в среднем на 80—95% связываются с белками плазмы, по-
этому скорость абсорбции достаточно высокая, имеют большое сродство к тканям, богатым
липидами, накапливаются в них. Максимальный уровень в крови при введении терапевти-
ческих лоз per os достигается в среднем через 1—3 ч и сохраняется около 2 ч. затем медленно
снижается. Скорость абсорбции и элиминирования производных бензодиазепина определяется
основными закономерностями токсикокинетики (см гл. 4). Скорость, с которой препараты
достигают структур головного мозга, зависит от степени нх липофильности. Препараты этой
группы легко проникают через плаценту. Так. концентрация диазепама в крови пуповины
превышает таковую в материнской крови. Уровень диазепама и оксазепама в крови плода воз-
растает медленно из-за высокой степени связи бснзлиацсиииов с белками кропи беременной,
но виосле гсгвии их концентрация в сыворотке крови идола значительно выше. Элиминация
этих препаратов и их метаболитов происходит в несколько раз медленнее. чем у взрослых
Дети в раннем носгнатальном периоде имеют повышенную чувствительность к препаратам
648 Глава 7
угнетающим деятельность ИНС. Иногда даже используется термин «бензодиазепиновые лети».
Препараты легко проникают в tрудное молоко.
Накопление производных бензодиазепина крон ходит и первую очередь в паренхиматозных
органах. Наибольшее их содержание в тканях печени и почек.
Существуют значительные различия в продолжительности действия производных бензо шазе-
пинов (табл. 7-26). которые учитываются как при назначении пациентам, гак и при проведении
ХТА. Бензодиазепины длительного действия (диазепам) рассматриваются как самые эффектив-
ные для поддержания постоянной дозы препарата иа длительным период. когда пациент страдает
повышенным беспокойством. Бензодиазепины короткого и среднего действия более подходят
при лечении бессонницы, когда желательно исчезновение эффектов препарата к утру.
Таблица 7-26. Тип деветвим, период подувс.чсния и название некоюрых производных бензодиазепина
Тип действия Период иолуведслия*
JLmme.tuioe: флунитразепам 40-250
диазепам 30—200. 21-37. 20 96. 20-70, 20-42.
< ренате пам 26-133
нитразепам 23-29. 21-28. 17-48.
клоназепам 1 39. 10^40. 19—60. J
СреОнее:
алпразолам ( 6—20. 6- 26.
лоразепам 10—20.8—25.9—16
____дойра юлам _ _ 6—23 ____
оксазепам]5—15.4—11,6—10. 10—14 ___________________________
Короткое:
триазазам I 1.5—5.2—3.1.8—3 9
мила ютам 2—5. I—4
’ По разным источникам: при ввеленип per os.
Т, зависит от ряда причин (см. гл. 4). в том числе от принятой лозы. Бензодиазепины в
зависимости от продолжительности действия делятся на 3 группы: короткого действия (Т
менее 10 ч). средней продолжительности действия (Т, 10—24 ч) и длительного действия (Т
более 24 ч). Продолжительность действия ряда бензодиазепинов зависит не только от Т1Л ис-
ходного препарата, но и от Т активных метаболитов. Так, Т, .медазепама составляет 1—2 ч.
Однако медазепам относят к длительно действующим препаратам из-за образования значи-
тельного количества активного метаболита нордазепама (см. ниже).
Выводятся производные 1.4-бензодиазспина в основном почками в виде основных сое ише-
мий и их метаболию». Наличие в органах активных метаболитов производных бензодиазепина
снижает скорость элиминации.
Примеры реакций биотрансформации производных бензодиазепина представлены иа рис.
7-80. в гибл. 7-27.
На рис. 7 -81—7-82 представлены схемы биотрансформаиии некоторых представителей этой
। руппы депрессантов.
Медазепам мсгаботизируется при окислении в положении 2 до диазепама, который затем
подвергается биотрансформаиии обычным путем, в первую очередь до пордиазеиама и окса-
зепама (ем. рис. 7-81). Медазепам также N деметилируется до нормслазспама. Это соедине-
ние может быть впоследствии окислено до нордиазепама. Основным активным метаболитом в
крови является нордиазепам. который определяет эффективность медазепама. Г, медазепама
составляет 1—2 ч. но его относят к препаратам длительного действия препаратам в связи с
образованием значительного количества активного метаболита нордазепама. Около 55% ме-
дазепама выделяется в мочу за 8 дней, главным образом в качестве оксазепама глюкуронида.
В моче обнаружено небольшое количество нордиазепама и темазепама, при этом медазепам,
нормслазепам и диазепам в и меримых количествах не найдены.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 649
Рис. 7-80. Реакции биотрансфюрмацни производных бензодиазепина. Деалкилирование диазепама приво-
дит к получению активных метаболитов (по Lfillnwnn Н. et al. 2000).
Таблица 7-27. Реакции биотрансформаиии производных бензодиазепина
Вешество Основной метаболит Тип реакции Примечание
Диазепам ДсзмеI иддпазсп ам N -де.мети.т нрование Фармакологически активные метаболиты
4- Г и 1 роке и диазепам Гидроксилирование
Хлордиазепок- Де з.мстилхлордназс поксил N-леметилированис Фармакологически активные метаболиты
сид Норлиэепам Окисление
Флюр: зонам N- 1-Деза.чкилфлюразеиам Деззги.тированне Фармако. Ю1 ически активный метаболит
Триазолам 4-Ги.трокситриаюлам и 1 -гил роки метнл-4-гилроксит- рн олам Г илроксилированне Фармакологически активные метаболиты
Мидазолам 1 - Гн зроксн м и «азолам Г илроксилнрование Фармакологически акшвный метаболит
Hitipa ii.iM 2-Ам ино-5-ни । робензофенО! 1 (АНБ) 1идролнз Разрыв аденинового кольца в положении 1. 2 и 4. 5
7-Амннони |разенаы BucciaiiowicHiic шири- группы у С7 Фармаколо! ически активный метаболит
Оксазепам Глюкуронид ок азепама Коиыо! нрование С глюкуроновой кис- лотой по ОН-i руине; фармакологически неактивный метаболит; образование глицина как вюрого продукта реакции
650 Глава 7
Окончание ma&i 7-21
Алпра золам а-I илроксиалиразолам. 4-гил- роке 1< иразолам. а 4-дшид- роксиалпра золам I нлроксплирование Фармакологически аминный метабол и |
З-гидрокси-З-метилтриаэо- лилхлоробензофеноп (ГМТ- БФ) Гидролиз Расщепление азомсти- новон связи и образо- вание аналога хлорбеп- зофенона
Лоразепам 1 1юкуроиид лоразспах а Коньки прование С глюкуроновой кис- лотой ио ОН группе фармакологически неактивный метаболиз
Триазолам 1 Гц рокенметил триазолам (а-псчрокситрие зашм) Гидроксилирование Фармаколоз вчеекзз активный мстаболш
При постоянном применении 10—50 мг препарата ежедневно концентрация метаболитов
медазепама в плазме крови составляет 0,21 — 1.68 mi /л в среднем 0,7) мг/л.
При приеме внутрь биодоступность триазолама составляет 44% После применения препарат
быстро всасывается и интенсивно метаболизируется (реакции гидроксилирования и конъюга-
ции). Основной метаболит триазолама — )-тдроксимстплтриазолам (а-гитрокситриазолам)
обусловливает 50—100% ([ктрмакологичсской активности исходною соединения. Другими ме-
таболитами являкяся 4-1 идрокситриазолам и 1-гидроксимегил-4-1 п.1рокси|рназо.1ам (см. рис.
7-84). В моче обнаружены следовые количества триазолама в неизмененном виде, а болыииис-
1во гидроксилированных метаболитов присутствуют как глюкурониды. Около 80% дозы выво-
дится с мочой в течение 48 ч и приблизительно 7% — с фекалиями за 72 ч
У ряда пациентов, принимающих триазолам (хадьиион). выявляются побочные эффекты
возбуждение, дезориентация. сомнамбулизм, раздражительность. паника Передозировка мо-
жет произойти при завышении максимальной рекомендуемой лозы в 4 раза. Проявлениями пе-
редозировки являются сопливость, спутанность сознания нарушение координации, невнятная
речь и кома, сердечно-легочный коллапс и смерть. Приведем примеры.
Нормедаэепам Нордиазепам Оксазепам
Рис. 7-81. Бнотрансформания медазепама Пояснение в тексте
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 651
Известен случай, когда один человек утонул в ванной после приема II таблеток триазо-
лама. После cMcpiii конентрания триазолама в крови и печени у нею сошАвпла 6.7 мкг/л
и 38 мкг/л соответственно. У 12 пациентов, в крови которых также присутствовал и этило-
вый спирт, посмертная концентрация препарата в среднем равнялась 62 мкг/л (диапазон Ю—
220 мкг/л). Обобщенные результаты определения концентрации триазолама при легальном
исходе приведены в табл. 7-28.
Таб.1иш 7-28 Копнен граним |риачолл.ма в крови и органах при летальном исходе
KoHueinjMiuiiH Кровь hi сердца, мкг/л Кровь из бедра, мкг/л Моз1. мкг/кг Печень. мкг/ki Почка, мкг/кг Моча, мкг/л
Средняя 119 77 161 394 197 270
Диапазон (84-153) (62—91) (106-216) (92-583) (71 293) (24 741)
Триазолам (хальпиоп) быстро действующий бензодиазепин. который появился иа амери-
канском рынке благодаря компании Upjohn в I983 г., в основном как снотворное. К начту
$()-х годов он обесиечпва.1 сои миллионам американцев и стал самым популярным в мире
ено шорным. Однако сиали появляться сообщения о пациентах, которые пострадали от разви-
тия де пресс ш и паранойи, возникших из-за приема препарата. Первый раз внимание мирово i
общественности и лои связи привлекло дело женщины из Лос-Анджелеса. которая, убив свою
мать, не получила наказания, предусмо!репное за убийство, так как находилась под длитель-
ным воздействием больших доз триазолама — осуждение с нес было снято. В настоящее время
препарат запрещен в Великобритании и Нидер знлах.
Является ли хальцион действительно вредным для здоровья.’ Психические побочные эф-
фекты. приписываемые этому препарату, в действительности очень редко присуши дру им
бензодиазепинам, и то при хроническом употреблении больших доз. Хроническое примене-
ние бензодиазепинов — достаточно сомнительная медицинская практика. Koiaa используются
Триазолам
1-Гцдроксиметип-4-гидрокситриазолам
Рис. 7-82. Биотрапсформаиия триазолам т. Пояснение в ickcic.
652 Глава 7
Ацетамидолопразолам
Рис. 7-83. Биогрансформания лопразолама. Пояснение в тексте.
Гидроксилопразолам
большие дозы. Так или иначе нельзя не помнить о том, что препарат используется миллионами
людей по всему миру без каких-либо последствий. Хотя все бензодиазепины, включая хальци-
он, более безопасны, чем их предшественники, злоупотребление ими может привести к таким
же нежелательным эффектам, как и от приема других депрессантов.
Однократная лоза лопразолама выводится с мочой (39%) и фекалиями (53%) в течение
2 нед. Препарат подвергается активной биотрансформации (см. рис. 7-83). С мочой выводит-
ся менее 1% лопразолама в неизмененном виде, 17% — в виде лопразолам-N-оксида, 4% — в
виде аистамидолонразолама. 3% — в виде гидроксилопразолама и 25% — в виде неизвестных
полярных метаболитов. Считается, что .топразолам-N-оксид обладает фармакологической ак-
тивностью.
Часть производных бензодиазепинов может перераспределяться в тканях после смерти, при
этом соотношение концентраций в крови из сердца/бедра составляет 1,5—4 разе в зависимости
от природы соединения, например алпразолам — в пределах 1,0—2.8; мидазолам — в пределах
3,0—5,0: триазолам — в среднем в 2.8 раза. Лоразепам, вероятно, не перераспределяется в орга-
низме после смерти, соотношение концентраций в крови из сердца/бедра составляет в среднем
1,0 (в пределах 0,8—1.1).
Основные метаболиты производных 1.4-бензодиазепина, как правило, фармакологически
активны. Разрыв при гидролизе аденинового кольца бензодиазепинов, а также образование
глюкуронидов приводят к снижению и потере активности.
Продукты метаболизма, как и исходные соединения, обнаруживаются во многих тканях ор-
ганизма. Выводятся производные бензодиазепина в основном почками в виде основных соеди-
нений и метаболитов. Наличие в органах активных метаболитов производных бензодиазепина
снижает скорость элиминации.
В табл. 7-29 приведены фармакокинетические параметры ряда производных бензодиазе-
пина.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных.. 653
Таблица 7-29. Фармакокинетические параметры производных бензодиазепина (по Randall С. Baselt. 2004)
Препарат Время достиже ння С_ в крови. ч Vd. л/кг Связывание с белками 4 рк.
Алпразолам 1-2 0.9-1.3 0.65-0.75 6-26 2.4
Хлорлиазепоксил 0,5-4 0.3-0.5 0.94 6-27 4.8
Клоназепам 1-3.5 1.5-4.4 0,8 19—60 1 5. 10.5
Диазепам 0.5-1.5 0.7—2,6 0.96 21-37 3.4
Флюраэепам 3-5 3,4 -5,5 0.97 1-3* 1.9. 8.2
Лоразепам 2-5 0,9-1.3 0.8 9-16 1,3, 11,5
Мидазолам 0,2—0,8 1-4 0.96 1-4 6.2
Ни ipa зекам 0.5—4 2-5 0.87 17—48 3.2. 10.8
Оксазепам 1-4 0,7-1.6 0,87-0,94 4-11 1.7. 11.6
Празепам 6 12-14 0 8-0,97 1,3 2.7
Темазепам 2-3 0,8-1 0,97 3-13 1.3
Триазолам 0,75—3 — 1.1-2.7 0.78 1.8-3.9 1.2. 1.5. _2 2, 6.5
* 47—100 ч для N-1-дсзалкилф поразспама.
В свя и с необходимостью индивидуального подбора дозы производных бензодиазепина
токсикокинетические показатели бензодиазепиновых транквилизаторов имеют ограниченное
значение, однако в некоторых ситуациях они могут оказаться необходимыми Например, если
в противоположность клиническому прогнозу терапевтического эффекта вообще нс наблю-
дайся. следует определигь концентрацию бензодиазепина в крови. При этом могут обнару-
живаться как серьезные нарушения в режиме приема препарата, так н выраженные аномалии
процессов метаболизма (см. гл 4).
Способы пробоподготовки и методы определения
Бензодиазепины, используемые в лечебных целях, относятся к наиболее часто прописыва-
емым лекарственным препаратам, и практически все они встречаются на незаконном рынке
вследствие утечки из лшальных источников. Данных об их подпольном изготовлении не име-
ется. 33 производных бензодиазепина, недавно поставленных под международный контро ь.
появляются на незаконном рынке преимущественно в виде таблеток и капсул. Лоразепам в
некоторых странах всгречается во флаконах и в виде заряженного шприца с иглой для инъек-
ций. а также в виде таблеток. Клоназепам продается в виде габлегок и сухого порошка, раство-
ряемого в соответствующем сосуде для инъекций. В Великобритании темазепам встречается в
капсулах из мягкого желатина и в в» тс раствора в полиэтиленгликоле для инъекций.
Хлордиазепоксид продается в виде свободного основания и гидрохлорида в капсулах и таб
тетках, а в некоторых случаях в ампулах с сухим препаратом. Гидрохлориды медазепама и
фтюразепама представляют собой законно изготовляемые лекарственные формы. Наиболее
распространенной формой является дикалиевая соль клоразепата, хотя встречается монокали-
евый клоразепат.
Диазепам — широко распространенный бензодиазепин — можно обнаружить в виде капсул,
таблеток, водных или полиэтилснглпколсвых растворов для инъекций, сиропов и суппозитори-
ев. В некоторых странах диазепам в виде сыпучего порошка используется в фураже для скота
с целью обездвиживания животных при перевозке, и имеется возможность утечки этой формы
наркотического средства в незаконный оборот.
Кроме того, изредка на незаконном рынке появляются комбинированные продукты такие,
к к хлорлиазепоксид-амигриптилин и хлордиазспоксил-клплиния бромид.
Выбор биообъектов для исследования и предварительную пробоподготовку образцов прово-
дят согласно цели исследования, обстоятельств дела и методологии ХТА (см. гл. 5).
Определение производных 1.4-бензодиазепина в биологических объектах желательно про-
водить незамедлительно после их изъятия. Объекты должны быть направлены на исследование
654 Глава 7
в замороженном состоянии. Использование этанола в качестве консерванта не рекомендуется
В габл. 7-30 приведены способы экстракции. используемые длц выделения производных бен-
зодиазепинов из различных объектов.
Таблица 7-30. Способы экстракции. используемые ня выделения произвол тых бен юдиззепинов
Объекты исследования Определяемые вешссгва Способы пробы 10ДГОТ0ВМ1 Выход бензодиазепинов
Лекарственные препараты Определяемое соединенно Как правило, метаноль- ные растворы конненг- pauneii 1—20 мг/мл
Кровь Нативное соедине- ние у живых дни н трупа ТФЭ*. боратный 6yi]>cp pH 9,0. элюент—мета- но.» 75 94% лля диазепама, оксазе- пама. порлиазспама. мидазолама, флушпразепама. тетразепама, триазолама и лр.
Моча Нативное соеди- нение и основные метаболиты у жи- вых -лнн н ipyiia Ферментативный гид- ролиз. ТФЭ*. фосфат- ный буфер. pll 6.0. элюент— этила- цетат 85—94%. для оксазепама, диазе- пама. норлиазепама. юрязепама. нитразепама, клоназепама. гх-гнл- роксиалпразолама, а-ii прокоп- риа золами
1ФЭ*. боратным бу- фер. pH 9.3. элюент— лихлорме ши—изонро- панол—аммиак 35—50 для оксазепама, лоразе- пама. клоназепама. триазолама. 75—90% для большинства друз нх
ЖЖЭ**. буфер. pH 9.0, jKcipaieHi—н- бутнл хлорид 50—98%. дня оксазепама, темазе- пама. лоразепама, клоназепама, триазолама, нитразепама, флу нитразепама, нх 7-амниометабо- .111 iob и др.
Печень Нативное сосчи- ten не и основные мс)аболн1Ы у трупа Вшможны при целен- ные выше способы 50 100% при ЖЖЭ в зависимос- ти от экецмгеита. 85—95% при ГФЭ
Почки Нативное соеди- нение н основные метаболии у трупа Возможны приведен- ные выше способы 1 ' - , ( - 50—|Гш% при ЖЖЭ н зависимое ли от экстрагента, % выхода 85—95% при ТФЭ
Фрагменты желу- дочно-кишечною трак га Нативное сое 1н- нение и основные метаболиты у трупа 1 1 Во можны приведен- ные выше способы 50—100<|> lypaicniiM при ЖЖЭ н зависимости от экшрагенш. 85 95% при ТФЭ
* Типы сорбентов дли колонок, элюенты, метсыики выполнения ТФЭ приведены в ы. 5. * • Экстрагенты, условия проведения и особенности ЖЖЭ приведены в гл. 5.
Скрининговые методы определения производных бензодиазепина
Иммунохимические тесты. Различные ИХМ (ралиоиммуноанализ. ПФИА. ИФА. имму-
нохроматографические и др., см. гл. 6.2) используются при скрининге биообразнов. Пазо-
житсльные результаты позволяют сделать предположение о наличии в тестируемом объекте
вещества из (руины бенздпазенпнов. но без внутри! рушюной дифферешшровки. Данные, по-
лученные ИХМ, обязательно подшерждают друз ими чувовилс (ьными н специфичными ме-
тодами. интерпретируют, сопоставляя с клиническими и лабораторными данными. Наличие
в моче анализа и/или его метаболитов свидетельствует только о предшествующем приеме ве-
щества. при этом его концентрация (и/или метаболитов) не коррелирует с концентрацией в
периферической кропи или тяжестью состояния.
При тестировании любого биообъект, например мочи, важно следоынь подробной инс-
трукции фирмы-производителя, в которой даны строгие рекомендации по степени разбавле-
ния реактивов и обрс зца. соотношению их объемов, условиям хранения реактивов и др.
Наибольшее применение находят различные ге.хнолоти (например, системы TDx' (Abbott)
или AxSYM| метода ПФИА. несмотря па ограничения (см. гл. 6.2). Схема проведения иссле-
дований обязательно включает испытания работоспособности реактивов на заранее прнгогов-
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 655
ленных пробах с анализируемым веществом. Обычно применяют калибраторы. с держащие
ноцаназепам в моче и концентрациях 0. 200. 400 800. 1200. 2400 нг/мл. Анализирую! получен-
ные путем разбавления контрольные образны мочи с известными концентрациями искомо-
го вещества. Результаты исследования контрольных образцов должны лежать в определенных
пределах, coo нс тс ни юпшх аналитическим харамерисшкам методика. Международной ассо-
циацией судебных токсикологов (T1AFT) рекомендовано использовать поротную концент-
рацию (cut-ofT). равнхю 200 нг/мл. По данным отечественных исследователей. cut-ofT можно
понизить до 100 нг/мл. по при условии согласован ноет полученных данных с результатами
по ггверждаюшего метода (например, ГХ-МС). Для анализа используют 100—150 мкл образца,
возможны и меньшие объемы. Необходимо cot подать общие правила проведения ИХМ. Так,
если фоновая интенсивность в образцах превышает допустимое значение, то разводить и пов-
торно анализировать их нельзя, следует примени ib другую методику.
При исследовании крови методом ПФИА иа присутствие группы производных бензодиазе-
пина пеобх димо проведение экстракции ана нта органическими растворителями (например,
н-бутц хлоридом). чго увеличивает чувствительность определения н иск ючаст эффект матри-
цы. Чуветвитетыюсть системы AxSYM1 при определении производных бензодиазепина в моче
составляет 40 нг мл.
Как известно, основной недостаток ИХМ высокая перекрестная реактивность веществ со
сходной химической структурой (до 80%). по тем не менее в случаях хюупотреблспий или
ос з роз о травления препаратами этой труппы Г1ФМА является достаточно падежным и быс-
трым методом, используемым в химико токепколо! нческих лабораториях при установлении
принадлежности аналита пе только к группе бензодиазепинов. но и к различных! подгруппам
(например, триазо.ю- и имнлазолопроизводныс).
ГСХ-скрининг позволяет проводить предварительную идентификацию большого числа вс-
iuccib в достаточно короткие сроки и сравнительные исследования различных образцов (гл.
6.3.1). Бензодиазепины образуют группу разнообртзных химических веществ, однако использо-
вание в сочетании 3 указанных ниже систем ТСХ обсспсчиввст хорошее разделение. Сорбент —
активированный силикагель G на высушенных стеклянных плат инах, покрытие (толщина
0.25 мм) содержит флюоресцентную добавку, которая флюоресцирует при длине волны 254 нм.
Используют следующие системы. Система А: хлороформ— ацетон (40 20): сисчсма В: хлоро-
форм- метанол (90: 10). система С: циклогексан—толуол—диэтиламин (75:15:10). Детекпия при
последователь!кто выполнении: УФ-и мучение при 254 нм; 2 н. серной кислоты, нагревание ло
80 С. УФ-и мучение при 366 нм; реагент подкисленный йолн «типаг калия (пятна пурпурной
окраски). Значения R производных бензодиазепина в проявляющих системах А. В. С приве-
дены в табл. 7-31.
Таблица 7-31. Хромат сирафнчсская подвижность (R*100) производных бензодиазепина (рукови.кл но
для националы нах лабораторий экспертизы наркотиков. ООН. 2000 г.)
Вещество “ " 1 Проявляющая система
А В С
А|Ы1роэо.*ам 8 62 1
Бромазепам 13 55 3
Галазепам 76 88 21
Г юксазола.м 8 85 13
Делоразепам 46 69
Диазепам 70 87 30
Камазепам 73 89 II
Ke lawxiaM* 66. 70 86 12. 30
Клобазам 68 83 II
Кликса зс зам 48 81 13
Клоназепам 47 60 0
Клотиазепам 75 88 34
Доира золам 3 49 2
Лоразепам 31 48 1
Лорметазепам 63 81 9
Мс ызепам 72 89 45
Ни мен зепам 45 1 87 12
656 Глава 7
Окончание табл. 7-31
Нитразепам Нордазепам*" 42 44 64 63 1 5
Оксазепам 29 48 1
Оксазолам 69 63 4. 15. 19 ’**
Пиназепам 81 90 27
Празепам 79 90 35
Темазепам 63 82 10
Тетразепам 74 88 32
Триазолам 9 52 1
Флудиазепам 67 84 29
Флунитразепам 67 86 16
Флюразспам 5 48 38
Хлор диазепоксид 15 58 2
Хлоразспиновая кислота” 44 65 4
Эстазолам 11 50 1
Этиллофлазепат 63 70 1
* Кетазолам разлагается с образованием диазепама.
** Хлоразспиновая кислота превращается в нордазепам
*** Несколько зон поглощения
Систему ТОКСИ-ЛАБ (Toxi-Lab. см. гл 6.3.1) используют для систематического обнару-
жения и идентификации производных бензодиазепина. Детектирующие реактивы позволяют
обнаружить 100 нг или менее в пятне образца из большою разнообразия групп химических
вешеств. Эта система может применяться к извлечениям мочи, извлечениям сыворотки/кро-
ви, твердым дозированным формам (таблетки, пилюли) и порошкам. Преимущество системы
заключается нс только в определении «рупп вешеств (производные бензодиазепина, барбиту-
раты), но и функциональных групп (первичных, вторичных и третичных аминов), особеннос-
тей структуры (ароматическая, дненовая структура) с помошью соответствующих реактивов, а
также УФ-абсорбпии. Недостатки системы Toxi-Lab изложены в главе 6.3.1
ТСХ весьма полезна для скрининга производных бензодиазепина, их метаболитов и продук-
тов гидролиза. В табл. 7-32 представлены алгоритмы проведения ТСХ-скриниига производных
бензодиазепина.
Таблица 7-32. Алгоритмы провеления ТСХ-скрипинга производных бензодиазепина.
Нель определения Схема определения (етектк рчвяиие Примечание
Скрининг первич- ных аминобензофе- нопов* Кислотный гидролиз HCI до соответствующих аминобензофенонов Экс факи ия этанолом Разделение на пластинах с активным силикаге- лем** толуолом Диазотирование по реакции Браттон г— Маршалла (рис. 7-84) Предел обнаружения составляет 1—5 мкг аминобензофенона в пятне Рекомендовано для мочи, так как кислотный гидро- лиз непригоден для крови и сыворотки. Нельзя ис- пользовать для триазоловых производных (алпразо, ама. эстазолама, триазолама), так как при биотрансформапии они не образую) первичных амниобензофеионов. детек- тируемых реакцией Брат- тона-Маршалла. Не имеет смысла использовать для нитробензодиазепннов (см. ниже)
Скринпш штгро- бензодиазепинов (основных метабсыи- тов — 7-амино- интробепюдназепи нов) ЖЖЭ пробы без пиро- лиза п-бути.тхлоридом. Разделение на пластинах с активных силикаге- лем** в системе раство- ри гелей этилацетат— метанол—25% аммиак (85:10:5) Диа ки нрование по реакции Браттона— Маршалла Предел обнаружения 1 —5 мкг аминобензо- фенопа в пятне Как первичные амины дают реакцию Браттона—Мар- шалла. поэтому пиролиз не проио 1ЯТ
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 657
Окончание табл. 7-32
Скрининг нативных
бен щиазепинов и
их метаболитов
ЖЖЭ- или ТФЭ пробы
Разделение на пласти-
нах с активным сили-
кагелем*** в системах
растворителей хлоро-
форм—ацетон (90:10)
бензол—изопропаиол—
аммиак (85:15:1)
В УФ-свете (фчюоре
иенция или поглоще-
ние):
с реактивом Драген-
дорфа или йолппатн-
натом
* Стандарты — метанольные растворы аминобензофенонов.
* * Без флюоресцентного индикатора.
* ** С флюоресцентным индикатором или бел него.
Рис. 7-84. Реакция Браттона—Маршалла
В табл. 7-33 приведены значения R и окраска пятен аминобензофенонов при проведении
ТСХ в системах укианных в табл. 7-31.
Таблица 7-33. Хроматографическая подвижность и цвет зон поглощения аминобензофенонов*
Вещество Образующийся бензофенон Цвет зоны К/100
Алпразолам Нс образует бензофенона
Бромазепам (2-Амино-5-бромобспзоил)-пиридии АББ АББП) Красно-фиолетовый 2
Бротизолам Нс образует бензофенона
Камазепам 2-Мсти.1амино-5-хлоробеизофенои (МАХБ) Г Желтоватый 52
Хлордиазепокс ид 2-А.мино-5-хлоробснзофенон (АХБ) Фиолетовый 27
Клобазам 1-Амино-2-(фсниламино)-4-хлоро бензен Фиолетовый
Клоназепам 2-А.МИНО-5-НИ гро-2"-хлоробензофс- нон (АНХБ) Красно-фиолстовыи 16
658 Глава 7
Окончание табл 7-33
7-Лмипокло1ипспам 2.5-Диамино-2’- хлоробензофенон (ДАХБ) Сине-фиолетовый 0
Хлора зепам 2-Амино-5-хлоробензофеиои (АХБ) Фиолетовый 27
Клокса юлам 2-Амино-5,2 -дихлоробензофснон (АЛБ) Фиолетовый 33
Делоразепам 2-Ам и но-5.2 ‘-дихл оробе н зофе> юн АДЬ) Фиолетовый 33
Диазепам 2-Мегилами i ю-5-хлоробс 1зофснон (МАХБ) Желтоватый 52
Эстазолам Не образует бензофенона
Флудиазепам И зомеры 2- метилам и и о- 5-хлоро-2’- ф оробензофенона (МХФБ | Ц). ХФМБ |2|) |1| Нет окрашива- ния |2] Фиолетовый |Ц55 12131
Ф л юн итразе пам 2-Метиламино-5-китро-2'-флуоро- бензофенон (МНФБ) Желтоватый 29
Фтюра зепам 2-Амино-5-хюро-2‘-ф.'1уоробензофе- нон (АХФБ) Фиолетовый 31
Галазепам 2-(2.2,2-Трифзуороэтют)-ами-ио-5- хлоробензофснон (ТХБ) Желтоватый 74
Галоксазолам 2-Амипо-5-бромо 2’-флуоробензофе- нон (АБФЬ) Фиолетовый 32
Кетазолам 2-Метмламино-5-хлоробенэофенон (МАХБ) Желтоватый 52
Лопразолам Не образует бензофенона
Лоразепам 2-Амино-5.2 -дихлоробензофенон (АДБ Фиолетовый Желтоватый 33
Лорметазепам 2 Метиламино-2’.5-дихлоробензофе- поп (МДБ) 57
Медазепам 2 Мегиламипо-5-хлоробепзофснон (МАХБ) Желтоватый 52
Мидазолам 2-Амино-5-хлоро-2’ -фтуоробензофе- нон (АХФБ) Фиолетовый 31
Ниметазепам 2' Метиламино-5-нитробензофенон (МНБ) Желтоватый 29
Нитразепам 2 А.мино-5-интробензофенон (АНБ) Красно-фиолетовы и 15
7-Аминопитразепам 2,5- Диаминобензофепон (ДАБ) Фио зетовый 0
Нордазепам 2-Амино-5-хлоробсизофенон (АХЬ) Фиолетовый 27
Оксазепам 2-Амиио-5-хлоробепзофенои (АХБ) Фиолетовый 27
Оксазолам 2-Амино-5-хторобензофенон (АХБ) Фиолетовый 27
Пиназепам 2-(2-Пропнниламино)-5-хлоробснзо- фсион (ХПБ. ПХБ Желтоватый 57
Празепам 2 (Циклопропилметил)-ам>1но-5-хло- робензофенон (ЦХБ. 11МХБ) Желтоватый 68
Темазепам 2-Мстнламино-5-хлоробе1 зофснон (МАХБ) Же. поватый 52
Тетразепам Her данных
Триазолам Нс образует бензофенона
* Условия хроматографирования см табл. 7-29.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 659
।
' сследованив по продуктам гидролиза
1 4-бенэсдиазвпиков — вминобенэофенонам
f
11
Исследование по неизмененному
(нативному) соединению
и метаболитам
Ткани органов
Ткани орнганов
Изолирование
полярным
растворителем
Сорбция
Экстракция а
органический
растворитель
Гидролиз до
2-аминобенэо-
фвнонов
Деструкция
тканей органов
и разрушение
1.4—бензодиазепи-
нов до 2-амино-
бензофеноное
V
Изолирование полярными
растворителями
Элюат
Гидролиз
до 2-амино-
бензо-
феноноа
ТСХ
ВЭЖХ
Рис. 7 85. Схема определения производных 1 4-бензолиазепина.
♦
Концентрирование
Сорбция на
полимерных
сорбентах
Экстракция в
органический
растворитель
---------v---------
ТСХ
i i I
ГХ ВЭЖХ УФ
Условно выделяют два пути определения производных 1.4-бензодиазепина: первый путь —
по продуктам гидролиза бенздназепинов — 2-аминобензофенонам. второй путь — по содержа-
нию в объектах исследования неизмененных (нативных) соединений совместно с метаболита-
ми (рис. 7-85).
Способ определения производных 1.4-бензодиазепина по продуктам гидролиза — 2-а.ми-
нобензофенонам позволяет суммарно определить нативные соединения и рял метаболитов.
Результатам придается отрицательное судебно-химическое значение. При положительном ре-
зультате продолжают исследование по нативному соединению и метаболитам, что позволяет в
ряде случаев с большей уверенностью сузить круг предполагаемых токсикантов.
К наиболее широко применяемым для определения производных 1.4-бснзодиазспина мето-
дам анализа, помимо ТСХ и ИХМ, относятся УФ-ВИД-спектрофотомерия. И К-Фурье-спек г-
ромстрия. ГХ и ВЭЖХ. а также гибридные методы: ГХ-МС или газовая хроматография — ИК-
Фурье-спектрометрия. ВЭЖХ-МС (см. гл. 6).
Газовая хроматография и хроматомасс-спектрометрия. Газовую хроматографию можно ре-
комендовать в качестве хстола пригодного для анализа большинства бензодиазепинов, од-
нако некоторые из них. в частности 3-гндроксизамешенные бензодиазепины, претерпеваю!
термическую деструкцию и перегруппировку. Хлордиазепоксид. клоксазолам, лорметазепам,
галоксазолам, оксазолам, эпылофлазепат и темазепам дают множественные пики. Кетазолам
дает единичный пик соответствующий диазепаму. В табл. 7-34 приведены рабочие условия
определения производных бензодиазепина методом газовой хроматографии.
660 Глава 7
Т 6 . ниа 7-34. Определение производных бензодиазепина методом газо >i хроматографии
1 Рабочие ус.т вия Примечание
Насадочные ко- лонки Стационарные фазы Стеклянные, длиной 1.8—2 м. с внутренним диаметром 2—4 мм Любые умеренно неполярные фазы: OV-1, OV-30. 10% OV-I на хромосорбе G-HP, 3% SE—30, хромасорб W-HP и др. Диапазон температур: колонка 230-280 ’С. инжектор 230— 280 °C, детектор 280—300 “С О1раниченная чувствительность Используют только для определения высо- ких концентраций в пробах гидролизоваи- ной мочи Кондиционирование колонки за 15 ч до анализа при температуре на 30 'С выше той, при которой выполняется анализ, но в пределах верхнего допустимого предела температуры колонки, рекомендованного 11роизводи1 елем
Капиллярные колонки Неполярные: НР-1 (100% диме- тилполисилоксан). HP-5. HP-5 ms. BP-1. DB-I и др. Толщина пленки 0,25 мкм. длина 25 м. внутренний диаметр 0.25 мм Диапазон температур: колонки 250- 280 °C, инжектора — 250— 280 °C. детектора — 280—300 *С Проба мочи после пиро шза Используют: для дсривазизированных и нсдеривазизиро- ванных эк трактов При определении низких концентрации аналита В методе ГХ-МС коэффициент разделения 20:1 Программирование температуры
Детекторы эзд АФД Масс-спектрометры Ионные ловушки ПИД ПИД недостаточно чувствителен для оп- ределения производных бензодиазепина в биосредах Масс-детекторы в комбинации с капилляр- ной газовой хроматографией
П робот юдготовка Пробы мочи должны быть (идролизованы перед экстракцией Дериватизании полярных соединений (см гл. 5)
Газ-иоситель Аргон—метан (95:5) при 50— 30 мл/мин, азог
В табл. 7-35 приведены коэффициенты (индексы) удерживания производных бензодиазепи-
на на капиллярной и насадочной колонках при использовании ПИД.
Таблица 7-35. Коэффициенты (индексы) удерживания производных бензодиазепина (руководство лля
напиона! ьных лабораторий экспертизы наркотиков, ООН. 2000)
Вещество Фаза SE-ЗО/ OV-1 колонка насадочная Фаза ВР-1 колонка капиллярная
Алпрозолам 3050 2936
Бромазепам 2633 2626
Галазепам 2335 2314
Галоксазолам* 2620 2634 (2518, 2272)
Делоразе 1ам 2650 2537
Диазепам 2425 2477
Камазепам 2954 2954
Ксгазолам* 2425 2475
Клобазам 2694 2582
Кл ксаэолам* 2405 2344 (2604)
Клоназепам 2885 2833
Клотиазепам 2420 2485
Лопразолам* Нс элюируется Не элюируется
Лоразепам 2402' 2448
Лорметазепам* 2674 2703 (2946)
Медазепам 2226 2287
Ниметазепам 2730 2693
Н итразепам 2750 2755
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 661
Окончание табл. 7-35
Нордазепам 2456 2522
Оксазепам 2336 2374
Оксазолам 2590 2514 (2534. 2212)
Пиназепам 2580 2551
Празепам 2641 2676
Темазепам 2633 2613 (2828)
Тетразепам 2460 2463
Триазолам 3130 3025
Флу диазепам 2460 2403
Флунитразепам 2645 2633
Флюра зепам 2785 2795
Хлордиазепокснл* 2799 (2453, 2530) 2815 (2531. 2646)
Хлоразепиновая кислоза* 2457 2521 (2783)
Эстазолам 2955 2893
Этил лофлазепат 2195 2925 (2878)
Применение Звездочка — термически нестабильные соединения. В скобках — значения для второ-
степенных пиков.
Важнейший измеряемый иарамсф в шзовой хроматотрафии - индексы удерживания ве-
шеств — время, в течение которого соединение удерживается в разделительной системе, зави-
сит от многих факторов: состава стационарной фазы, состава газа-носителя, длины колонки, ее
температуры, удерживаемого объема (см. гл. 6.3.2). Перед началом работы систему необходимо
проверив нулем хроматографирования нескольких эталонных стандартов с известными коэф-
фициентами удерживания. Метрологическое обеспечение метода обсуждается в главе 6.
Сишема ГХ-МС наряту с ВЭЖХ-МС дает наиболее надежные результаты определения про-
изводных бензодиазепина, продуктов их гидролиза и метаболитов для целей ХТА (см. гл 6.3.5).
В табл. 7-36 приведены масс-спектромстрические характеристики производных бензодиазепи-
на. продуктов их гидролиза и дериватов.
Таблица 7-36 Масс-спектрометрические характеристики производных бензодиазепина, продуктов их
гидролиза и дериватов (по результатам зарубежных и отечественных исследований).
Вешество Биообъект Молекулярные ионы (Д)* относи- тельных интенсивностях
Алпразолам Желудочный сок. плазма, моча после и без кислотного гидролиза н последующего ацетилирования 308 279. 273. 239. 204
Бромазепам Плазма. желудочное содержи мое. моча, моча после гидролиза глюку- ронидов 315, 236, 208, 179
АБП [2-амино—5-бромофенил)- (пнрилнн—2-ил)| Моча иск л с кислотного гид- ролиза 276,247. 198. 168
Кама зепам Желудочное содержимое 371.299,271, 255, 72
МАХЕ |5-хлоро—2-метн.1амино- бензофенон] Гидролизованная моча 245, 228, 193, 105. 77
Хлорди азепоксид Плазма, желудочное содержи- мое 299 282 241, 124,77
АХ Б (2-амипо-5-хлоробензофенон) Моча после кисло! hoi о 1ид- ролнза 231. 230 154, 105, 77
Клоназепам Плазма, желудочное содержи- мое. моча 315, 314 286. 280, 234
АНХБ (2-амино-2'-хлоро-5-пит робензофенон) Моча после ферментативного или кислотного гидролиза 276.241 195.139.111
Клоназепам TMS 387, 372. 352. 306. 73
662 Глава 7
Окончание таб.-t. 7-36
Диазепам Плазма, желудочное содержи мое, моча 284. 283. 256. 221, 77
МАХБ |5-хлоро-2-метилтмнно- бензофенон| Моча после ферментативного или кислотного гидролиза 245, 228, 193. 105. 77
Фена зепам Моча после ферментативною или кислотою гидролиза 350. 348. 321. 313. 177
АБХБ (2чймино-2’-бромо-5- хлоробет зофенои) Моча после ферментативного гидролиза 311. 309. 276. 274. 195
Феначспам TMS * 422. 420 405. 385, 73
Флунитразепам Желудочное сод ржи мое, плазма 313. 312. 285, 266 238
МАФНБ (2-метиламино-2’- фторо- 5-н итробе н зофе нон) Моча после ферментативного или кислотною гидролиза 274. 257, 211
Медазепам Желудочное содержимое, плазма, моча, моча после кис- лотного пиролиза 270. 242. 207, 165
Нитразепам Желудочное содержимое, плазма, моча, моча после кис- лотного гидролиза 281. 253. 234. 222, 206
Питра челам TMS 353. 352. 338. 306. 73
АН Б (2-амино-5-ннтробс11к>фе- иоп) Моча после гидролиза/кислот- ного гидролиза 242. 241, 195, 105,77
Нордазепам Плазма, желудочное содержи- мое, моча 270, 269, 242. 241, 77
АХБ (2-амино-5-хлоробснзофс- нон) Моча после пиролиза 231, 230. 154, 105. 77
Нордазепам TMS 1. 342. 341, 327. 269. 73
Оксазепам Плазма, желудочное содер- жимое. моча после гидролиза глюкуронидазой 268, 239. 233. 205. 77
АХБ (2-амино-5-хлоробеиэофе- нон) Моча после гидролиза 231. 230. 154, 105, 77
Оксазепам 2TMS 430, 429. 340. 313. 73
Оксазепам TMS 356, 341.312. 239. 135
Темазепам Плазма, моча после гидролиза гл юкурон и вазой 300. 271. 256. 228. 77
Темазепам TMS 372.343,283, 257, 73
Примечание: *— выделены характеристические ионы: TMS — триметилеилированное производное
ВЭЖХ. Вследствие разнообразия химических структур бензодиазепинов методики разделе-
ния и определения этих соединений метолом ВЭЖХ подбирают эмпирическим путем. Тем не
менее приведенные ниже условия рекомендуются (руководство для национальных лабораторий
экспертизы наркотиков, ООН, 2000 г.) для проведения при стандартных исследованиях качест-
венного и количественного определения всех производных бензодиазепина (в виде субстанций
и лекарственных форм), находящихся под международным контролем (табл. 7-37).
Для определения производных бензодиазепина в биосредах используют обрашениофазовые
колонки с сорбентами С8 или CI8. Подвижная фаза — смеси фосфатного буфера и ацетонит-
рила и/или метанола, применяемые в изократическом или градиентном режиме. При этом
важно сохранение постоянного значения pH подвижной фазы. Для детектирования чате всего
применяют УФ-детектор или диодную матрицу (см. гл. 6.3.3). Большинство производных бен-
зодиазепина определяют при X 230 нм. нитропроизводпые — при X 240 нм.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 663
Таблица 7-37. Условия определения производных бензодиазепина методом ВЭЖХ
Рабочие условия
------—---------- -------------------------------------------------------
Нормальная фаза Обращенная фаза
Колонка 250 мм при внутреннем диаметре 5 мм 250 мм при внутреннем диаметре 5 мм
Млериал насадки Диоксид кремния шя ВЭЖХ. диаметр частиц 5 мкм (Сферисорб S5W или эквивалентным) Окталепиллноксил кремния лля ВЭЖХ. диаметр частиц 5 мкм (ODS-гиперсил или эквивалентный)
Подвижная фаза А: метанол (1000 мл), содержащий хлорную кислоту (100 МКЛ). В: смесь метанол — вода — трифторук- сусная кислота (997 — 2 — 1 в отношении но объему) С: смесь метанол — вода — фосфатный буферный раствор (0.1 М) (55:25:20. в отношении по объему), pH 7.25. D смесь метанол — вола — фосфатный буферный раствор (0.1 М) (70:10:20. в отношении по объему) pH 7.67
Скорость потока 2.0 мл/мнн 1.5 мл/мин
Дстскп рованис УФ при 240 нм УФ при 240 нм
Растворы пробы Экстракция активных компонентов из лекарственных форм и субстанций Растворение в метаноле (концентрация анализа приблизительно ! мг/мл) Экстракция активных компонентов из лекарственных форм и субстании» Растворение в 50% водном растворе метанола (концентрация аналита при- близительно 1 мг/мл)
Pact вор ст андарта Растворить в метаноле количество стандарта наркотика, достаточное для получения раствора концентрации 1 мг/мл Растворить в 50% водном р: створе метанола количество стандарта нар- котика. достаточное для получения раствора концентрации 1 мг/мл
Ооъсм ннжскнин Коли leciBCiiiioe определение 20 мкл с помощью петлевою инжек- тора По пиковым областям методом вне- шнего стандарта. 20 мкл с помощью петлевою инжек- тора По пиковым областям методом вне- шнего стандарта.
Примечание. Фосфатный буферный раствор (0.1 М) готовят путем растворения ди пирата дшидро
фосфата натрия (14.35 г, 0.092 моль) и пирофосфата натрия (1,14 г. 0.00S моль) в 1000 мл воды
Система ТФЭ-ВЭЖХ ДМД (диодно-матричный детектор) позволяет проводить экспресс-ис-
спстовання, идентифицировать глюкурониды метаболитов производных бензодиазепина в моче.
При этом повышается надежность результатов скрининга мочи, которая предварительно под-
вергается <|к*рмснтатнвному гидролизу и процессу деривагизаиии полярных метаболитов. Метод
применим лля определения бензодиазепинов в сыворотке крови, моче, гомогенатах тканей.
В последнее время широкое распространение получил комбинированный метод ВЭЖХ-МС
(см. гл. 6.3.5).
И К-спектрометрия и И К-Фурье спектрометрия. Метод обладает достаточно высокой чувс-
твительное 1ью (см гл. 6.4.2.2) и позволяет иденгнфинировагь индивидуальные вешссгва из
группы бензодиазепинов.
На рис. 7-86 и 7-87 представлены ИК-спектры бензодиазепинов.
Особенности интерпретации результатов определения производных бензодиазепина
в крови и моче (табл. 7-38)
Таблица 7-38. Особенности интерпретации результатов определения производных бензодиазепина в кро-
ви и моче
Биообъекты
Моча
Нет прямой зависимости найден-
ной концентрации от введенной
дозы
Метаболиты в основном содер-
жатся в виде ыюкуроннлов
Низкий процент экстракции аиа-
нт* органическим раствори гелем
Бензодиазепины короткого действия обнаружива-
ются в течение 24—48 ч после приема, препараты
среднего и длительного действия — 7—10 дней
Нитро- и триазолопронзводные имеют специ-
фические метаболиты. В большинстве случаев
основной метаболит — оксазепам
664 Глава 7
сч-f-----------1----------1----------1-----------1
4000 3500 3000 2500 2000
2000 1850 1700 1550 1400 1250 1100 850 800 650 500
Bonwaoe число, см*1
Рис. 7-86. ИК-спектр триазолама (таблетки с КВг).
Клоназепам
2000 1850 1700 1550 1400 1250 1100 850 800 650 600
Волновое число, см*1
Рис. 7-87. ИК-опектр клоназепама (таблетки с КВг).
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 665
Окончание тайг. 7-38
Кровь
(сыворотка
или плазма)
Индикаторы опенки уровни инток-
сикации
Низкие концентрации апалита
в крови, поэтому для скрининга
чаше использую i мочу
Следует принимать но внимание наличие в крови
алкогоня. наркотиков. других лекарственных средой.
Следует учитывать, что концентрации аналита будет
выше ожидаемых (при приеме терапевтических
доз) у лиц с хроническими заболеваниями и людей
пожилого возраста. При повышенной чувствитель-
ности к препаратам интоксикация может наступит!,
при низких концентрациях апатита. Толерантность
к бензодиазепинам обусловливает прием препаратов
в значительно бблыпнх. чем терапевтические дозах,
что по/пвери ценен результатами ХТА
7.3.9. Нейролептические средства
Когда бы люди захотели, вместо того, чтобы спасать мир.
спасать себя, место юге. чтобы освобождать человечество,
себя освобождать. — как много бы они сделали для спасе-
ния мира и для освобождения человечества.
А. И. Герцен
Нейролептические средства (нейролептики) состанляют одну из главных групп современ-
ных психотропных препаратов. Хлорпромазин является родоначальником группы фенотнази-
нов (1950 г.). Нейролептики принадлежат к нескольким группам химических веществ (табл.
7-39). Кроме того, существуют препараты смешанного типа, такие как сульпнрид и клозапин.
Таблнна.7-39. Нейролептики различных химических групп
Группа вешеств
Химическая структура
Фенспназииы
амипопропплопого ряда
Хлорпромазин (аминазин)
Фенотиазины
пиперидинового ряда
Тиорилазин (сонапакс)
666 Глава 7
Фспотиазипы пиперазинового ряда Тиоксантены I fZZZZ — । । —- । L Бузирофеноны F £ Ч Дифенилбутн пиперидины Продолжение табл 7-39 Трифтазин Jx CF3 NZ \ Н2С— СН,— СН,—N N СН3 Зуклопентиксол СН СН, СН, N\ \| СН2 СН,^—ОН —Cl Галоперидол _\ к / \Х }н~с| Л С—СН2 —СН2—СН,—N Y X J _// \ / ^он Дропсрилол о =\ । лл А С — СНг— снг— СН2— N } N NH Пимозид о /=\ н чд_ А С--СН,—СН,—сн2— N\ у F
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 667
Атипичные
Нейролептики группы фенотиазина (рис. 7-88) подразделяются на 3 класса в зависимости
от вила заместителя в положении 10: аминопропнлыюго. пиперидинового или пиперазпно-
вого. но для всех них характерно наличие в молекуле фрагмента -C-C-C-N- — структуры,
определяющей нейролептическое действие. Основными представителями этой группы явля-
ются аминазин, пропазин, лепомспромазин. алимемазин. метеразин. этаперазин. френолон.
трифтазин. фгорфеназин. тиопропсразин. периниазин, тиоридазин. Соединения, имеющие в
молекуле только 2 атома углерода в заместителе, не являются нейролептиками, но обладают
антигистаминным (i ромсгазин) или ангимускариновым (этопропазин) эффектами.
Фишко-химические свойства. Основной характер производных фенотиазина обусловлен на-
личием в структуре молекулы гетероциклического атома азота (рКа 4) и третичного атома азота
в алифатическом радикале (рКа 9,1—9,8).
При взаимодействии с кислотами фснотиазины образуют соли, легкорастворимые в воде,
спирте, хлороформе, но практически нсртстворимыс в эфире и бензоле (рис 7-89).
Основания фенатиазинов — липофиль-
Рис. 7-88. Структурная формула нейролептиков группы
фенотиазииа.
ные вещества, п растворимые в воде, по
растворимые в спирте, эфире. хлорофор
ме. иилаистате. Абсорбция производных
фенотиазпна в УФ-области спектра ха-
рактеризуется наличием 2 максимумов
при: 250-260 им (с 35 000) и 300-
315 нм (г 4500).
Сравнение УФ-спектров солей про-
изводных фенотиазииа со спектрами их
оснований показывает, что они практи-
чески идентичны. Следовательно, их УФ-
спектры отражают только электронную
структуру фенотиазиновой части молеку-
лы (хлорпромазин. прометазин).
668 Глава 7
Неионизированная форма
Рис. 7-89. Схема реакции солеобраэовапття фснатиазииов (аминазина).
Ионизирований форма
Исключение представляют те производные, которые в положении 2 содержат радикалы со
свободными n-элсктронами (тиоридазин, левомспромазии).
Сульфоксиды фенотиазинов имеют в отличие от нативных (основных) соединений. 4 мак-
симума в Уф-области: при лпыи 230. 265. 285 и 400 нм.
Производные пиперазина (трифтвзин, фторфсназип) являются наиболее активными психо-
тропными препаратами данной группы. Они обладают небольшой антихолинсргичсскот актив-
ностью. однако при их применении высока всрояп ость проявления симптомов лекарственно-
го паркинсонизма.
Препараты тиоксантснового ряда, которые, как и препараты фепотиазинового ряда, имеют
заместители в положениях 2 и 10. сходны с ними по фармакологическим эффектам. но они
менее выражены.
Тиоксантены имеют в своей структуре двойную связь и могут существовать в форме иис-
трансизомсров. Цис-изомеры примерно в 20 раз более активны гранс-форм или рацематов (с%
гл. 2.2), а некоторые препараты этой группы эффективны только в том случае, если преиму-
щественно находятся в виде цис-изомера (например зуклонешиксол)
Бутирофснопы и дифенилбутнлпиперидипы (галоперидол, зрифлупсридол, меторттн, лропери-
дол. флустшрилен. пимозид, пенфлюридол) сходны по химическому строению. Некоторые бупь
ро<|>еноны рассматриваются как замешенные пиперидины, а азонсрон и флуапизон — как произ-
водные пиперазина. Галоперидол обладает наименее выраженной седативной и антимускариново*
активностью, однако экстрапирамидные симптомы при его применении проявляются чаше
Сульпирид и клозапин выделили в отдельную группу атипичных нейролептиков, так как
при их применении симптомы лекарственного паркинсонизма проявляются крайне редко
Фармакология и токсикология нейролептиков. Ашипсихотичсский эффект нейролептик -
обусловлен блокированием центральных дофаминовых рецепторов. Нскспорые нейролепт» •
блокируют также адренергические и серотониновые рецепторы. По современным пред давле-
ниям. развитие психозов связано с нарушением обмена некоторых медиаторов нервной си.
темы и в первую очередь дофамина. норадреналина. серотонина (см. гл. 7.3.10). Большине ж
существующих антипсихотических лекарств либо блокируют рецепторы эти* медиаторов. лм&
тормозят их высвобождение и обратный захват (рис. 7-90). Нейролептики оказывают различ-
ное действие на центральную и вегетативную нервную систему (блокируют рецепторы многих
медиаторов). Антипсихотический э<|»фект, обусловленный в основном торможением зофач»
новой передачи, дополняется успокаивающим, связанным с блокадой рецепторов норадрен.-
.тина и серотонин т, На этом фоне усиливается тт увеличивается продолжительность действ»
принимаемых совместно с нейролептиками лекарств, угнетающих ЦНС, — препаратов г
наркоза, снотворных тт др. Торможентте дофаминовой передачи является причиной тт основно-
го побочного эффекта нейролептиков — паркинсонического синдрома, проявляющегося сни-
жением обшей двигательной активности, замедленностью движений, дрожанием, повышением
мышечного тонуса. Паркинсонизм и болезнь Паркинсона возникают при снижении посреди» -
ческой роли дофамина в головном мозге Многие нежелательные свойства нейролептиков си-
заны с угнетающим влиянием на рецепторы вегетативной нервной системы. Это и расширение
сосудов, и снижение артериального давления, тт подавление секреции желез, и понижение
температуры тела (см электронное приложение)
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 669
Fee 7-90. Схема взаимодействия психотропных препаратов с репепторами.
Большинство препаратов этой группы необходимо принимать длительно, и тогда к выше-
упомянутым осложнениям могут присоединиться депрессия, поражения печени и крови, эндок-
ринные нарушения (увеличение массы тела, снижение потенции, расстройства менструального
мкла и т д.), кожная сыпь и дерматит, повышенная чувствительность к солнечным лучам.
Исследования показали, что дофаминовые рецепторы неоднородны. Лишь некоторые из них
участвуют в формировании психотической симптоматики и соответственно в антипсихотичес-
ком действии нейролептиков Воздействие же нейролептиков на другие группы дофаминовых
□сиепторов приводит к появлению экстрапнрамидных нарушений и других побочных эффек-
тов, а их роль в формировании собственно терапевтического ответа крайне незначительна.
В развитии психопатологической симптоматики большое значение имеет и серотонинср-
пгкская система. Одновременное блокирование дофаминовых и серотониновых рецепторов
приводит не только к более быстрой и полной редукции позитивных психопатоло!нческих
670 Глава 7
расстройств по и к уменьшению признаков негативных изменений Нейролептики второго по-
коления (атипичные нейролептики), например клозапин (лепонекс) при клинически полном
нейролептическом спектре активности оказывают по сравнению с классическими нейролеп-
тиками избирательное нейрохимическое действие. Они селективно блокируют только дофа-
миновые D;- и D-- рецепторы определенных областей мозга (в частности, меюлимбической)
и имеют некоторое сродство к серотониновым рецепторам чем объясняются особенности их
клинического действия, в частности малая выраженность побочных экстрапнрамидных эффек-
тов Новейшие нейролептики (рисперидон, оланзапин) обладают практически равным сродс-
твом к дофаминовым и серотониновым рецепторам. По эффективности они сравнимы или
даже превосходят классические нейролептики при значительно более высокой переносимости.
Ведущий принцип применения нейролептических средств основывается на зависимости между
особенностями психоiройного действия (избирательное или общее) и основными характерис-
тиками психопатолог ического синдрома.
Одна из основных фармакологических особенностей нейролептиков — своеобразное ус-
покаивающее действие, сопровождающееся уменьшением реакции на внешние стимуляторы,
ослаблением психомоторного возбуждения и рффективной напряженности, подавлением чувс-
тва страха, ослаблением агрессивности. Они в основном используются для лечения рахгичного
рола психических заболеваний, главным образом, шизофрении или паранойи, а также: мании,
делирия, ажитировапной депрессии, тревожных состояний. Кроме того, они эффективны при
сильных беспокойствах, а некоторые из них обладают антидеггрессивным действием. В качестве
противорвотных средств их используют для контроля тошноты и рвоты, возникающих, напри-
мер. при химиотерапии рака, и могут назначаться в комбинации с наркотическими аналити-
ками. действие которых они потенцируют. Помимо действия на дофаминовые рецепторы, они
вызывают антимускариновые, антигистаминные и антисеротониновые эффекты. Некоторые
психотропные препараты этой группы блокируют «-рецепторы, что способствует развитию ор-
тостатической гипотензии Применение клозапина часто сопровождается развитием у больных
атрану.юнитом поэтому при сто использовании необходим постоянный контроль показателей
крови и при первых проявлениях лейкопении следует прекратить прием препарата. Почти все
препараты, применяемые как нейролептические средства, относятся к списку Б — сильнодейс-
твующие вещества. При их терапевтическом применении у некоторых больных отмечаются
побочные нежелательные эффекты, а в случае передозировки или умышленного принятия их в
повышенном количестве возможны серьезные отравления и летальный исход.
Токсикокинетика и биотрансформация
Большинство нейролептиков характеризуется хорошим всасыванием в кровь из мест пос-
тупления при разных путях введения (перорально, внутримышечно). Они проникают через
гематоэнцефалический барьер, однако накапливаются в мозге в значисльно меньшем коли-
честве, чем во внутренних органах (печень, легкие). При пероральном приеме биодоступность
хлорпромазина составляет приблизительно 30%.
Нейролептики подвергаются биотрансформаиии в печени и вы гсляются в значительных
коли гествах с мочой и частично с калом.
Прн поступлении в кровь нейролептики связываются с белками плазмы крови преимущес-
твенно с альбуминами. Кажущийся объем распределения Vd для большинства нейролептиков
составляет более 20 л/кг, однако имеются и некоторые исключения. Так, Vd для сульпирида
составляет всего 2л/кг. Т|? большинства нейролептиков равен 10—30 ч. Лекарственные препа-
раты с наиболее сильно выраженными липофильными свойствами, такие как пнмозид и пен-
флюридол, имеют 1 100—200 ч. в то время как сравнительно более гидрофильный сульпнрил
практически полностью выводится с мочой в неизмененном виде с Tt, около 10 ч.
Т1Г фторфеназина после инъекции в виде энантата составляет 3.5 дня. а при введении в
виде деканоата его Т достигает 7—10 дней. Для сравнения, при пероральном или внутримы-
шечном введении этих препаратов в неэтерефинированном виде составляет 15—20 ч.
Всасываются феногиазины как вешества основного характера преимущественно из кишеч-
ника. Гидрофобный характер оснований фснотиазинов способствует взаимодействию их с бел-
ми. V приближается к 100%, поэтому фенотиазины локализуются в тканях органов (мозг,
печень, почки). Выводятся ночками, в моче обнаруживается в основном в виде метаболитов.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных.. 671
Биотрансформация фенотиазинов протекает 3 путями:
• 1-й путь — трансформация в радикалах R, и R • N-O-S-дсметш пропание. которое приводит
к увеличению полярности соединений, окисление ^„-боковой цепи;
• 2-й путь — окисление гетероциклического атома серы в сульфоксид или сульфон. Сульфо-
окислепис — образование сульфоксидов со степенью окисления серы +4 и +6.
• 3-й путь — ароматическое гидроксилирование в положении 3 и 6 с последующим конъюги-
роваписм с глюкуроновой кислотой.
В результате изучения биотрансформанни хлорпромазина было установлено, что при объ-
единении всех известных путей метаболизма образуется более 150 возможных метаболитов
препарата (рис. 7-91).
В плазме крови образуется хлорпромазина сульфоксид. В результате деметилирования обра-
зуются .моно- (нор!)- и дидесметил (нор)- метаболиты хлорпромазина, при окислении — хлор-
промазип-N-OKciu. Происходит ароматическое тидроксилировлние в положении 7 и в мень-
шей степени в положении 3. Большая часть фенольных метаболитов присутствует в форме
конъюгатов, которые можно гидролизовать с помощью D-глюкурониларил-сульфатазы. При-
сутствие небольшого количества 3-гидроксппромазина свидетельствует о процессе дегалоге-
нирования. Дезаминирование даст 2-хлорфснотиазин-10-пропионовую кислоту, а при полной
потере боковой цепи — 2-хлорфенотиазин.
Другие фенотиазины имеют сходные пути бтотрансформации, однако препараты с более
сложными заместителями образуют и большее количество метаболитов. Например. 2-тноме-
тильная группа в тиоридазине окисляется в сульфоксид (мезоридазин) и сульфон (сульфорила-
знн). которые также обладают нейролептической активностью (рис. 7-92).
Галоперидол в организме подвергается биотрансформании примерно на 40% (рис 7-93).
Галопсридот всасывается в основном в тонком кишечнике, в неионизированной форме,
путем пассивной диффузии. Максимальная конце»гграиия в плазме крови достигается через
2 6 ч. Биодоступносгь препарата составляет 60-70%. Около 90% галоперидола связывается
с белками плазмы крови. 10% представляют собой свободную фракцию. Отношение концен-
трации в эритроцитах к концентрации в плазме крови составляет 1:12. Кониш траиия гало-
СНгСН2СНгМ(СН3)2
Промазин
Сулъфоокисление
CH2CH2CH2N(CHs)2
Хлорпромазин
N-Деметилирование
CHjCHjCHjNfCHjJj
V
о
CHjCHjCHjNHCHj
CHjCHjCHaNKj
Р»»с 7-91. Схема биотрансформаиии хлор тромазина.
672 Глава 7
Сульфон тиоридазина
Рис. 7-92. Схема биотрансформации тиоридазина.
N-Дезмвтмлтморидазин
Рис. 7 93. Схема биотр«нс<|юрмации галоперидола.
4-Фторобенэоиппролионовая
кислота
4-Фторобенэоилуксусная
кислота
неридо, а в тканях выше, чем в крови; отмечена тенденция препарата к кумуляции в тканях.
Метаболизируется в печени. Окислительное дезалкилирование дает 1-(4-фторобензоил)-про-
пионовую кислоту и ее конъюгат с глицином, а также 4-фторофенилуксусную кислоту, ее ко-
нъюгат с глицином и 4 фторофенилацсгуровую кислоту, которые являются фармакологически
неактивными соединениями. Вероятно, газ оперился может быть конъюгирован с глюкуроно-
вой кислотой и/или сульфит-ионами без предварительных метаболических изменений. При
восстановлении галоперидола образуется вторичный спирт, часто называемый восстановлен
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 673
ным галоперидолом (RHAL). Это соединение обладает фармакологической активностью (око-
ло 25% активности исходного вещества) и может окисляться снова в галоперидол Гллоперидо
экскретируется с мочой (40%) и капом (60%). Т,, после пероральногх) применения составляв!
12-37 ч Проникает через гематоэнцефалический барьер и плаценту Другие бутирофепоны
имеют сходные пути метаболизма, например бромпсридол.
Бнотрансформания психотропных препаратов с боковой пипера гиповой цепью имеет еще
более сложный характер. В ппперазиповой пени происходит раскрытие кольца с получением
этилен глиампновых производных и полной потерей кольцевых атомов углерода. При этом по-
лучаются первичные ампносоединения. идентичные с теми, которые обра: х ются при повтор-
н м деметилировании (дилеметилироваиин) ди мсти.та ми но- замешенных исходных вешеств.
При окислении судьи и рига в положении 2 пирролидинового кольца образхется пирроди-
динон.
Пимозид может вступать в некоторые реакции окислительного N-дезалкилировйния с об-
разованием бензимилазолин-2-она. 1 -(4-пиперидил)-бензимилазозин-2-она. 4-бис(4-фтор-
фснил)бутировой кислоты, окисление которой в положении 8 дает 2-бис(4-фгирфени.г(уксус-
ную кислоту.
Метаболитами клозапина являются фармакологически активны ! N-дсзметилклозапин и
N-оксид клозапина.
В результате биогранс<1юрмашги могул образовываться стереоизомерные соединения, на-
пример восстановление карбонильной группы пропиомазина и галоперидола приводит к об-
разованию асимметрического атома углерога. Конфгпурация гинхганонленного галопсри тола
может оказывать влияние на его фармакологическую активность. Энантиомеры обычно при-
сутствуют в нрнбли зительно равных количествах выделение и количественное определение
одного из них могул привести к недооценке реального количества токсичного вещества.
Пробоподготока и методы определения
Лля выделения нейролептиков ггз биологических материалов используют ЖЖЭ. ТФЭ и
ферментативный гидролиз.
Жидко-жидкостная экстракция. Многие психотропные препараты легко экстрагируются из
плазмы в относительно неполярные растворители щелочной сре ге. Наиболее часто лля этого ис-
пользуются н-гетан. н-гексап и н-пентан. обычно с добавлением небольшого кс гичсслва изоа-
милового или изопропилового спирта для уменьшения адсорбционных потерь. Более полярные
соединения экстрагируют и более полярными растворителями (хлороформ). При количествен-
ном определении метаболитов используют лнзтиловый эфир, лихлорметан и эти.тапетаг.
Если пробу исследуют газохроматог рафичсски. в частности с ЭЗД. необходимо добавить
кислоту в следовых количествах, а после установления необходимого pH провести последую-
щую реэкстракнию в органический растворитель. В тех случаях, когда параметры разделения
позволяют, используют экстрагирование в небольшой объем органической фазы, для того что-
бы впоследствии нс было необходимости н ее упаривании. Пробы, ана. тируемые методом ГХ
с АФД run метолом ВЭЖХ. как правило, не подкисляют.
Твердофазная экстракция. ТФЭ нейролептиков лает хорошие результаты при последующем
определении методами ВЭЖХ и ГХ-МС. Например. ТФЭ хлорпромазине и его 13 метаболитов
бы. а проведен з иа колонке С8 (100 мг. I мл), которую подготовили последовательным промы-
ванием избыточным объемом 0.2 М фосфорной кислоты. 0,25% натрия карбоната, метанола и
воды. Плазма (1 мл) была подкислена Н..РО4 (3 М. 0.05 мл) и нанесена на колонку, которая за-
тем была последовательно промыта нотой. метанолом (0.5 мл) и Na,СО, (25%). Определяемые
вещества (анализы) элюировали метанолом. Для ТФЭ нейролептиков нспо ьзуют различные
типы патронов (см. гл. 5).
Ферментативный гидролиз. I идролиз глюкх роковых и сульфатных конъюгатов с помощью
р-глюкуронидазы/арилсульфатазы предпочтительны, чем кислотный гидролиз, потому что фе-
нольные метаболиты легче окисляются в кислой срезе. Например, для определения хлорпро-
мазина и его метаболитов, а также тиорилазпна в тканях, взятых после вскрытия трупа, ис-
пользование протеолитических ферментов ласт хорошие результаты.
Цветные реакции. Многие нейролептики при окислении образуют характерные окрашенные
674 Глава 7
Цветные реакции проводят для обнаружения различных заместителей в основной структуре
нейролептика. Коэ<|м|>ициент светопоглошения и цвет окрашенного соединения в 50% растворе
серной кислоты представлены в табл. 7-40. Как правило. электроноакиепгорные группы изменяют
окрашивание раствора or зелено-синего <650—600 нм) до красного (530 нм) и оранжево-розового
(500 нм) Метиловые эфиры, например 7-метоксихлорпромазин, и фенолы образуют юединения,
окраска которых идентична. Соединения с 2 электроноакиепюрнымн группами более устойчивы
к фогоокислешно, чем соединения без элскгроноакцеиюрной или с электронодонорными группа-
ми. Фенспьные метаболиты менее стабильны по сравнению с исходными соединениями.
Таблица 7-40. Окрашивание нейролептиков в 50% растворе H,SO4
Вещество Заместители в положении 2 Окрашивание к, нм
Промазин Н 514
2-М етил и ромази и СН, 528
Акпромазнн сосн, 514
Прон помаши COC.1I 520
Мстиоримепразин осн, 568
Тиорилазин SCH, Бирюзовый 640
С> зьфорндазип SOCI1 Розово оранжевый 510
Мезоридазин SO.CH. Розовый 525
Хлорпромазин CI Розовый 532
7-ОН Хлор! ромазин CI Б.1СЛ1 го- л пловы и 562
3-ОН Хлорпромазин CI Гемно-синии 580
6-ОН Хлор) ромазин CI Красно-розовый 522
8-ОН Хлорпромазин CI Синий 587
9-ОН Хлорпромазин CI Розовый 529
3.7-Дш нлрокеи-хлор- промазин CI Цвет морской волны 620
фгорфсиа ши CF3 Розоио-оранжсвый 501
Т рифторпрома чин CI 3 501
[_7-_ОН фторфсиазнн | CF3 Розовый 559
Для количественного определения нейролептиков применяют ТСХ. ГЖХ. ВЭЖХ. ГХ-МС.
Тонкослойная хроматография
Обычно ТСХ используется для качественного или промежуточного иолуколичссгвенного
скришииа. но иногда ее применяют для количественного определения, например хлорпрома-
зина и его 11 метаболитов, трифториеразина, реразина и др.
Пример. Соединения были определены количественно in sim с использованием денсиметрн-
ческого сканирования. Плазму крови (4 мл) с добавленным внутренним стандартом трифлуофс-
назииа экстра! провали гептаном После реэкстракции устанавливали pH раствора карбонатом
натрия и вновь экстра!провали аналиг пентаном. Двухмерную хроматографию проводили на
пластинах ИР для ТСХ размером 10x10 см Первое проявление в среде толуол — ацето i (60;40)
прои тили для очистки от мешаюших соединений. Флуфспазип (Rr 0.2) и внутренний стандарт
(R 0.5) разделяли в срезе толуол—ацетон—аммиак (60:40:2). После рассмотрения пластинок в
УФ-свете, определяли содержание вешеств по их флюоресценции. Чувствительность определе-
ния флуфепазнна составляет 0.1 мкг/л. коэффициеш вариации при обнаружении вешества в
концентрации 0.5 мкг/л — 8%.
Аналогичный способ применяют для определения хлорпромазина и тиорилазина. Пластины
HP подвергают воздействию паров азотной кислоты и проводят количественное определение
вешества в пятне, измеряя оптическую плотность при 365 нм (хлорпромазин) и 375 нм (тиори-
дазип). Чуветви1слыюсять метода составляет 10 мкг/л.
Количественное определение тиотриксена проводят на пластине HP для ТСХ после окисле-
ния озоном, граница определения составляет 0.1 мкг/л.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 675
Пластины, обработанные флюоресцирующим реагентом, используют для количественного
определения азаперона, азаперола. пропиомазина и каразолола в тканях Детектируют вешес-
тва при 254 нм или 366 нм. Например, в печени пропиомазин определили в концентрации
25 ш/г ткани, при этом использовали образен массой 20 г.
Количество сульпирида и других бензамидов определяют петом измерения оптической плот-
ности при 293 нм.
Газовая хроматография
Использование ПИД. Нейролептики являются липофильными соединениями. При низких
лозах поступления (стандартная терапия) концентрации препаратов в плазме крови невысоки.
Поэтому ПИД используют ня определения ограниченною числа препаратов н плазме, мша-
болитов в моче или при значительной передозировке.
Например, ПИД применяют лля определения хлорпромазина и некоторых его метаболитов
в моче (колонка — 5% SE-30). Деметилированные метаболиты выделяют в форме ацетамидов.
Хлорпромазина нитрат и хлорпромазина нитрат-еульфоксид селективно экстрагируют и иссле-
дуют в УФ-свете (сульфоксиды восста 1авливают до соответствующих сульфидов перед началом
определения). Для определении в моче фенольных и нефенольных метаболитов хлорпромазина
используют ко юнкн OV-3 и OV-17. Дериватизанию проводят тримет илсилилимидазолом.
Для количественого определения тиоридазина использовать газовую хроматографию нс ре-
комендуется. кроме тех случаев, котла деметилированные метаболиты отделены или деривати-
зированы перед хроматографированием.
Использование ЭЗД. ММ-ЭЭД и усовершенствованные силиконовые стационарные фазы,
например OV—17. позволяют проводить мониторинг концентраций нейролептиков в плазме
крови лаже при их применении в терапевтических целях. Так определяют хлорпромазин и его
деметилированные и сульфоксидные метаболиты в нтазме крови. Соединения экстра!ир\ют из
подшелаченной плазмы в гептан, проводят реэкстракиию в кислой срезе и после установления
необходимою pH экстрагируют в небольшой обьем толуола. Например, при определении хлор-
промазина в плазме крови была установлена концентрация 210 иг/л. коэффициент вариации
составил 6% (внутренний стандарт нс использовали). Предел определения — 10 мкг/л.
Совершенствование мегодик определения позволило снизить ipaHimy определения до
1 мкг/л. Наличие 2-хлор-заместителя в молекуле перфеназина дас! возможность использование
ГЖХ-ЭЗД тын количественного опрсдс ения в крови и плазме. Перед определением проводят
дериват изацию соединения уксусным ангидридом. В образце объмом 5 мл предел обнаружения
составил 0.2 мкг/л.
Для определения галоперидола. его восстановленного метаболита RHAL и трифлуперцдола
используют ЭЗД с применением капиллярных колонок (DB—17. 15 м х 0.53 мм) или колонки
с 3% OV-17. Внутренний стандарт — флюразепам. При определении в насадочных колонках
соединения дериватпзируют — ацетилируют трифторуксусным ангидридом. Чувствительность
метода 10 мкг/л. стандартное отклонение— 9,4%.
Использование АФД. Применение га юной хроматографии с использованием селективного
АФД. который отличается от предыдущих детекторов лучшим линейным диапазоном и ста-
бильностью. расширило круг анализируемых нейролептиков Фторфеназин, 7-гидрокифторфе-
назин и фторфеназина сульфоксид детектируют в моче с использованием АФД. Соединения
хроматографируют в (|юрме триметндсили зьных эфиров, которые имеют преимущество перед
анетатными эфирами, поскотьку апетилпроизволные фенольных и сульфоксидных соединений
не могут быть успешно разделены. Чувствительность детектора — 2 мкг/л.
При определении клозапина в 1 мл плазмы на капиллярной колонке DB-5 чувствительность
метода составила 1—2 мкг/л. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетилированный
мапротилин.
Масс-спектрометрическое определение
Использование режима седеющпюго мониторинга ионов позволяет детектировать низкие
уровни метаболитов и проводить точное определение в присутствии других вешеств.
Например, ГХ-МС применили лзя определения хлорпромазина, пор-хлорпромазина и 7-гид-
роксихлорпро.мазнна в плазме и спинномозговой жидкости. При работе Н-мечсиымп материи-
676 Глава 7
ламп в качестве внутренних стандартов определили. что концентрация хлорпромазина в спинно-
мозговой жидкости составляла 3% копнен (ранни в плазме. Чувсюпгслыюсгь метода — 1 мкг/л.
Используя капиллярные колонки, опре.че пнот галоперидол (0.2 нг) в обрате плазмы объ-
емом 2 мл. Для достижения такого уровня чувствительности проводят дсрнватизаниго трифто-
руксуспой кислотой, а затем масс-спскгромсзрию в режиме химической ионизации с аммиа-
ком в качестве таза-реагента.
Клозапин и его деметилированный метаболит определяю! в плазме крови с использованием
капиллярных колонок, заполненных плавленым кварцем. и масс-спектрометрии в режиме се-
лективного мониторинга ионов. п-Пропильный гомолог используют как внутренний стандарт.
Чувствительность — 1 и 5 мкг/л для основного препарата и метаболита соответственно.
Жидкостная хроматография
ВЭЖХ — самый распространенный способ определения нейролептиков в настоящее время.
Разработано много методик для широкого крута препаратов. Для хроматснрафирования чаше
всего используют модифицированный кварц (см. гл. 6.3) и щелочные элюенты. Работа иа квар-
цевых колонках обеспечивает хорошую форму пиков и их полное ра деление при правильном
выборе мобильной фазы. Амалиия связываются с 1И1юфи.н>ными основаниями (примесями),
поэтому относительное удерживание может варьировать при изменении pH. Замсиа ацетонит-
рила метанолом улучшает форму лика и разрешение метода. Вначале элюируются липофиль-
ные примеси, а затем бо iee полярные метаболиты.
Разделение пюридазииа и его мелаболитов методом ВЭЖХ показано на рис. 7-94
Детектирование в методе ВЭЖХ. Фенотазины имеют максимум поглощения в УФ-облас-
ти при коэффициенте экстинции около 30 (ХЮ М * 1 см-1 в области 245—260 им. поэтому можно
проводить УФ-дстсктнроваиие. При оптимальном вьборе режима хроматографирования нижняя
граница определения соетанляс! несколько нанограммов на 1 л. Гак. галоперидол имеет ври
245 нм. г.» 13 000 М с.м’1. a RHAL — Xmn2UO им с неоольшим поглощением при 250 нм. поэтому
определяя оба соединения, нвдо проводи! ь детектирование прн более низких тел инах волн или
при одной более высокой длине волны в случае определения одного галоперидо ia.
30
45
60
15
75
о
Рис. 7-94. ВЭЖХ разделе! не тиорпдазина и некоторых его метаболитов иа кварцевой колонке (по Walkins и др.).
I— тнор|!ла>1111-2-сульфо!|; 2. 2а — тиормдазин-2-су.1ьфон-5-су ьфоксид; 3 — мезорцдазнн; 4, 4а — ню-
ридазви-5-су (ьфоксид: 5 — нюридазин-З-суль^юксвц; 6, 6а — зиорв.1азпп-2.5-лнсуль<|>окс11л: 7 — демс-
шлгиорндазнн: 8. 8а — леметнлтиорилазнн-5-еульфокснд 9 — аезметилп!орилазин-2-су.1ьфоксвд. УФ-
легекз пропан не при 254 нм.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 677
Фенотиазнны при окислении образуют флюоресцирующие соединения (см. ГСХ выше), и
это особенно часто используется в отношении тпоридазина. который окисляется пос ic про-
хождения через колонку с КМпОг Избыток перманганат удаляют реакцией с Н.О.. прозукты
торой peiKumi измеряют флюоримстрически. Собственная флюоресценция некоторых со-
единений позволяет проводить количественное определение без дериватизании и химической
модификации, что характерно для сульпнрида и пимозида.
Многие препараты группы нейролептиков способны к электрохимическому детектирова-
нию с серебряным электродом сравнения (см. гл. 6.5). Окисление гетероциклической серы в
фенотиазинах и гиоксантипах. возможно, траст ключевую розь в их эдсктроактивиости. Это
объясняет тог факт, что N-деметилированные метаболиты и N-оксиды тнорндашна имеют
аналогичные основному соединению электрохимические параметры, в го время как 5-суль-
фоксиды имеют низкие показатели или вовсе их не имеют. Сульфоксиды могут быть определе-
ны с использованием двух электродной системы. Они восстанавливаются па первом электроде
и детектируются вместе с остальными соединениями па втором электроде.
Радиоиммунный и радиорецепторный анализ
Разработаны методики определения р поиммупным методом (с.м.гл.6.2.) соединении фено-
гиазинов и нх метаболитов. среди которых галопиргцюл. хлорпромазин фюрфе iiftun, перфс
назин. трнфторпсразнн, прохлорпсразип. тиоридазин. Предел определения при использовании
1 мл плазмы составляет 20 нг/л. Для определения галоперидола в присутствии метаболитов была
получена высокоспецифичная антисыворотка, но при се использовании наблюдали кросс реак-
цию с другими бутнрофенонамп. такими, как бромпсридол моперон. трифлуперилол и спипе-
ридон. В настоящее время из крови морских свинок получена антисыворотка с использованием
гаптена, связанною в положении. занимаемом атомом фтора, которая дает кросс-реакцию менее
чем с 1% известных метаболитов Разработан способ иммунного анализа для сульпнрида. Метод
ралнорецепторного определения не фолентиков был разработан Creese и .Snyder. Ч тствитель-
ность метода (в микрограммах на 1 л) зависела от природы соединения: лля фторфспадина — 1.8.
трифторперазина — 2.2. галоперидо ла — 2.5. хлорпромаз1)на — 8.6. тпоридазина — 30.
Концентрация нейролептиков в плазме крови во время терапии и при передозировке
Эффективность лечения хлорпромазином может быть достигнута при концентрации препа-
рата в плазме более 30 мкг/.ч. Токсические эффекты могул быть вызваны хлорпромазином при
концентрации более 500 мкг/л. а легальной считается концентрация более 2000 мкг/л.
Многие фенотиазнны эффективны при концентрации значительно ниже, чем для хлор
промазина. Так. фгорфеназин (деканопповый эфир) оказывет терапевтическое действие при
концентрации его в плазме крови от 0.2 мкт/л. В 2 смертельных случаях концентрация фгор-
феназина в печени составила 5 и 23 мг/кг соответственно. Лля перфеназнна терапевтическая
концентрация несколько выше — 1.2—2.4 мкг/л. лля. трифторпиразина — 4.2 — 5,3 мкг/л
через 6 ч после приема. Определение терапевтической концентрации гиоридазпна осложнено
высокой концентрацией активных метаболитов: при стабильных условиях концентрация мею-
рндазнна сравнима с копиейгранией основного соединения. Для обеспечения 1грапевн1ческой
эффективности предположительно требуется концентрация более 100 мкг/л. В 8 смертель-
ных случаях отравления концентрация тпоридазина в крови погибших варьировала от 300 ю
8500 мкг/л: диалогичная концен|раппя была отмечена для мезоридазина.
После приема терапевтической лозы кон иен грация тиотикссна в плазме крови —10—
22.2 мкг/л. Пример. Максимальная концентрация 520 мкг/л была определена у погибшего
нациста, который принял 800 мг препарата. При смертельном отравлении. обусловленном
приемом хлопротикеена. концентрация в плазме крови основного препарата и сульфоксидного
метаболита была равна 100 и 600 мкг/л соответственно.
Особенности исследования, которые могут влиять на результаты определения нейролептиков
При проведении определения незначительных количеств нейролептиков могут наблюдаться
адсорбция вещества на стспк < стеклянной посулы, реверсия метаболитов, влияние раствори-
телей и пластификаторов.
Нейролептики, являющиеся ппюфильными веществами. могут быть потеряны в результате
их адсорбции на стекле или пластике. Силилирование стеклянной пос гы снижает адсорбцию.
678 Глава 7
но в го же время способствует образованию эмульсий (с плазмой). что затрудняет определение.
Однако эти потери не представляют батиной проблемы вследствие дезактивации стекла эндо-
генными веществами из плазмы. Следует иметь в виду, чго адсорбированные стеклом фсноти
азины могут сохраняться на стекле посте обычного мыи>я лабораторной посуды и загрязнять
последующие образны, давая ложноположительные результаты.
Реверсия метаболитов. Точность повторных определений хлорнрома ина в биообразцах
хуже. чем в стандартных растворах Определение фенотиазинов в хранящихся исходных образ-
цах дает большие концентрации вещества, чем изначальные исследования, что объясняется ре-
версией метаболитов к нагивнь м соединениям. Возможна реверсия сульфоксидов и N-оксидов
(см. рис. 7-91: 7-92). Хлорпромазин, хлорпромазина сульфоксида и хлорпромазщм-Ь'-оксида
стабильны в плазме человека до 7 дней при 40 ’С и ло 9 нел при 18 'С Восстановление N-ok-
сида до хлорпромазина на 2-й неделе, обьясняется его неустойчивостью н щелочных расiво-
рах Метаболиты moi уч быт ь нестабильны при хромато) рафнровании или дериват иватизаиии.
X-оксиды восстанавливаются ло нативных соединений на ГЖХ-колонке. Прометазина суль-
фоксид восстанавливается на ГХ-колонкс Фепотиазнна сулы|»оксид может восстанавливаться
лериватизируюпгнм агентом, наир) мер трифтораиетил-ашидридом.
Влияние растворителей. Вешества и их метаболиты могут реагировать с растворителями или
примесями в растворителях. Растворители иногда содержат различные добавки в качестве ста-
билизаторов. Например. хлороформ часто содержит этанол, а дихлоромстаи может содержать
этанол пли пентен. Ди лиловый эфир — антиоксиданты для предотвращения превращения в
пероксид (rmpoi аллод. пирохинон, бутилгцароксиголуол). которые мешают элеюрохимичес-
кому тетектированию. Накапливающиеся в эфире пероксиды moi уг окислять ашь иг, поэтом
необходимо очистить эфир перед применением.
Влияние пластификаторов. Часто ложный пик или набор ложных пиков, возникающих на
хроматограмме, можно приписать влиянию пластификаторов, попадающих в пробу на тех эта-
пах. когда она контактирует е каким-либо пластиковым материалом. Напрмер. при определе-
нии хлорпромазина методом ГХ-ЭЗД наблюдали пики пчастификаторов. входивших в состав
материала крышек экстракционных пробирок.
7.3.10. Тимолептики и тимеретики (антидепрессанты)
Тот. кто спасет хотя бы одну жизнь, спасае весь мир.
Гагчух)
Первый трициклическим антидепрессант имппрамин (тофранил) был получен в 1957 г. Geigy
Вскоре бьыи синтезированы новые эффективные антидепрессанты. самый известный из кото-
рых амитриптилин. Применение эюй группы лекарственных препаратов стремительно возросло в
60—70-х годах XX века, и они стали препаратами выбора для ле £ения депрессий. Однако в меди-
цинской литературе появились данные об их токсичности. । особенности при передозировке Хотя
эти препараты назначаются часто, их использование остается одной из самых распространенных
причин острого отравления во всем мире, нередко с летальным исходом при передозировке.
В дальнейшем были получены гетероциклические антидепрессанты второго поколения: тра-
зодон. миансерип мапротилин и амоксапин Несмотря на отличия их структуры от трицикли-
ческих антидепрессантов, некоторые гетероциклические антидепрессанты имеют близкое фар-
макологическое действие и параметры токсичности с трициклическими антидепрессантами.
Трсчье поколение антидепрессантов — избирательные ингибиторы обратного нейронального
ыхвата серотонина (ИОНЗС) наиболее эффек!явные препараты, обладающие значительно
меньшей токсичностью при передозировке, например флуоксетин (прозак).
Химическая структура трициклических и некоторых более новых антидепрессантов
Трициклические гетероциклические и бозее новые антидепрессанты — ИОНЗС — образу-
ют химически очень неоднородную группу вешеств. Наиболее значимые группы антидепрес-
сантов — это антидепрессанты трициклической структуры дибензодиазепина имипрамина,
избирательный ингибитор МАО — моклобемид, гетероциклические соединения второго по-
коления и группа избирательных ИОНЗС представлены в табл. 7-4I
Таблица 7-41. Структурные формулы и токсико-кинетические характеристики некоторых антидепрессантов
Эффек Виотряттсформяиня и выведение
ТИ11|11ТЯ и
летальная
доза, мг
15П mi* Метаболизируется до порт
более 300 ринттснтна и диноргрннгилина
мг/сут (дезметилнортрингилина) 35%
наеденной дозы выделяется с
мочой за 24 ч в виде метабо-
литов за II дней выводится
почт 80% дозы и только в
0,2% препарата находится в
неизмененном виде
20 -50
В реакциях окисления, ме
цитирования и контюгтнии
образует множество негатив-
ных метаболитов. После одно-
кратного перорального приема
около 6-1% выводится с мочой
и .36% — с калом. менее 2%
обнаружено в моче в иеигме
ценном виде
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 679
Сертралин*
NHCHj
22—36
0.99 6-1
ci
0.90 2
Продо. жжение maiil 7-41
)
20—50 8,5 50- 200 ।
0.9- 1.5 6.1 400 М! от 1 !
После реакции К-демегили-
ровання сертралин превраща-
йся в норссртралнн. который
обладает лишь 20—308?. фар-
ыаколо!пческоП активное!и
сертралина. Сертралин. как и
норсср тралин. подвергаюгея
дезаминированию. !илроксили
рованню и KOHbioiHHiiii. Около
40—4596 доты экскроп нруется
с мочой в течение 9 дней, в
неизмененном вше выводится
около 0,2% введенной доты.
Ни сертралин. пн норссртра-
дин не были обнаружены в
моче пациентов, постоянно
принимавших препарат
680 Глава 7
Основной метаболит р-(3-окео-
s-трн i ю(4 •За)пири11ин-2-тс!)-
пронноновпя кислота (О ГПК),
,м-ч.юр<|мя1>1Л<]>ен1Ь1Г11111ер ниц
(м-ХФП) — фармакологически
акиншый мс । аболнт, а также
их глюкурониды. Окою 1%
дозы зкскрсгируегся н неизме-
ненном пиле с мочой та 24 ч;
около 7S% дозы экскрет ируст-
ся и виде метаболитов с мочой
и 159г с калом в течение 72 ч
Импцрачин
36- 105
0,88
6-20
24-72
0.80-
0.95
0.94
Продолжение табл. 7-4!
4
-X
1*1—22 10.5
20—40 9.5
20-42
9.5
75-300
75-300
20 — SU
Выводи гея в течение 21 дня
е мочой (57%) и фекалия-
ми (30%). в основном в виде
метаболитов. около 6% выво-
дится с мочой в неизмененном
вше. Метаболитами являются
продукты N-деметилирования,
дезам и 11 и роки 111 я. i иярокс ил 11 -
ровапня и конъюгации
Первичный <|к1рмаколо1ическ||
активный метаболит — дети
нрамин. Имипрамнн подвер-
гается N-деме нитрован ню.
N-окпслеиню, 2- и 10-гидрок-
силированию и конъюгации
гилроксиметаболшон.
Известно 20 метаболитов.
В ере нем 70% дозы выделя-
ется с мочой и око ю 22% — с
фекалиями та 3 дня, преиму-
щественно в свободном виде
или в виде конъюгированных
г идрикс ими габол ито в
Флуоксетин бнотра!(сформиру-
ется в активный метаболит —
норфяуоксстин. оба компонен-
та могут подвергаться О-дезал-
килнрованию с образованием
н-трнфлюоромс11ыфснат<1.
Менее 10% перпоначадпиою
лекарственного средства экс-
крстируегся с мочой в неизме-
ненном пиле
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 68
Продолжение табл. 7-41
{) 6-
1.6
6.2
КМ) 450
10-29
7.1
20-06
Е>иолтрансформпния включает
С- и N-окисление и растеп-
ление морфа ) и нового кольца,
окисное pacmeiLieHnc морфо-
линового кольца н ароматичес-
кое пшроксилирование.
Основные метаболиты: иокло-
бемид-М-окснд и оксомокло-
бемнд.
В среднем при приеме разовой
доты внутрь 83% выводится за
24 ч с мочой в виде продуктов
бпотрансформации
Препарат интенсивно мета-
болизируется путем N-леме-
гнлировзния. N-окиелсния н
8-гидрокснлирования. 64—74%
дозы выводится с мочой в
первые неско >ько дней, в
основном в виде метаболитов,
только 5% выводится в неизме-
ненном виде
682 Глава 7
686 Глава 7
Рис. 7-96. Взаимодействие антидепрессантов с различными типами рецепторов (no Lilllmann Н. ct al.
2000).
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных 687
Рис. 7-97. Взаимодействие имипраминас рецепторами (no Lullmann II cl al. 2000).
паратов сочетается с проти во тревожным и успокаивающим. Поскольку избыточное накопление
нейромедиаторов может привести к токсическим эффектам, трициклические антидепрессанты
нс назначают одновременно с ингибиторами МАО. Интервал между приемом этих препараюв
должен быть не менее I1/,—2 нед. Общим для всех антидепрессантов является тимолсптичсское
действие — влияние на аффективную сферу с улучшением настроения и общего психическою
состояния.
Таблица 7*42. Токсичность антидепрессантов и их концентрации п биосубстртттах
Вещество Токсичность
Амитриптилин Нарушается способность выполнять квалифици- рованную работу, аффект усиливается при приеме алкоголя. Возможны кома, судорожные припадки п поражение сердечно-сосудистой системы
Пароксетин Сонливость возбуждение, тремор бессонница, тошнота и мышечная слабость. СовмсснтыН прием с ингибиторами МАО может привести к повышен- ному нервному возбуждению. мышечной ригид- ности гипертермии, гипертензии, делирию н коме (серотониновый синдром), Гепатотоксичсн
Ссртрадин Сухость 1ю рту, головная боль, головокружение, тремор, диспепсические расстройства, слабость, бессонница тын сонливость: серотониновый син- дром; в отдельных случаях спутанность сознания, ажитаиия
Тразодон Галлюцинации, смяхтннисгь речи, задержка ды- хания и смерть Гепатотоксичсн Возникновение серотонинового синдрома возможно при совмест- ном применении с другими серотонинергическими препатарами
Манротилин Сонливость, тремор, мышечные подергивания, атаксия, головокружение, снутмнпосгь сознания, галлюцинации, конвульсии, потеря сознания
Имипрамин Ортостатическая типотензия, парестезия, сухость но рту, нечеткость зрения, потеря координации, бес- покойство. бессонница, агранулоцитоз. атония ки- шечника. некроз гепатоцитов, угнетение дыхания, гипертензия. аритмия. типерпирексия. тахикардия, лдержктт мочеиспускания, кома, коллапс н смерть
Флуоксетин Тошнота, бессонница, беспокойство, головная боль, суицидальные идеи и маниакальное повеле- ние серотониновый синдром. характеризующийся повышенным возбуждением потоотделением, диа- реей, лихорадкой, гиперрефлексией, нарушением координации и тремором
Kumwirrpaiimi вешества в плазме крови у взрослых при лечении Концем рапин вещества при смертельном исходе в крови* и печени
Амитриптилин 0,095 (0,038— 0,162) мг/л. iiopipninujiHiia 0.106 (0.022—0,242) мг/л В кропи концентрация амитриптилина 2 мз/л В печени суммарная концен- трация амитриптилина и нор- триптилина более 50 мг/кг
31 мкг/л В крови более 0.4 мг/л В печени 56 mi/ki (в интер- вате 15—113)
32-206 мкг/л В крови концентрация серт- ралина 3,0 мг/л, норсертра лина 1.2 мг/л В печени сертралй'на 17 мг/ кг норсертралтш 0.4 мг/кг
0,9 -1,1 мг/л В крови — 18 мг/л В печени — 69 мг/кг
0.091 мг/л В крови —5,4 мг/л В печени— 223 мг/кг
Имипраынн 0,052 (0.008— 0.105) мг/л, лсзинрамин 0,132 (0.016-0.567) мг/л В крови —5.3 мг/л В печени —167 мг/кг
Лля флуоксетина и норф- луоксетина 13 и 17 мг/л со- oincrcrBeiuio в присутствии интенсивно мешболизиру- ютих нешестп, 27 и 8 мг/л соответственно в присутс- твии малоактивных мезабо- ли знруюшнх веществ В крови концентрация ф iy- окссзнна 3.8 (1.3—6.8) mi /л. норсКтуоксегина 2.1 (0,9—5,0) мг/л В печени концентрация флу- оксетина 70 (29—128) мг/кз иор<| lyoKccTiina 17 мг/кг
688 Глава 7
Мокяобемид
Мианесрии
Головная боль, головокружение, бессонница. тош-
нота, резкая прессорная ответная реакция (серото-
ниновый синдром), спутанность сознания, гипер-
термия, миоклонус
Сонливость (в первые дни приема), гипоманиакаль-
иыс состояния, судороги,
артериальная гипотензия, изменение клеточного
состава крови (обратимая лейкопения и аграну
лоиигоз). Возможны нарушение функции печени,
желтуха, отеки, гинекомастия, артрит, артралгия.
Несовместим с ингибиторами МАО (после их при-
ема необходим двухнедельный интервал), усиливает
лепримируюшее влияние алкоголя и эффекты гипо-
тензнвнь х средств, ослабляет — антиконвульсантов
Флувоксамип Тошнота, сонливость, беспокойство, головная боль, острый психоз, серотониновый синдром
Дезимипрамин Аритмии, возбуждение, атаксия, нечеткость зрения, бессонница, юлонокружение, тошнота, головная боль
Кломипрамин Депрессия, возбуждение, судороги, гипотензия, гипсрперексня и аритмия, серотониновый синдром
Амоксапин Кома, острый метаболический ацидоз и тахикардия По сообщениям, отдельные пациенты принимали до 2.7 г амоксапина без каких-либо неблагоприят- ных последствий
Окончание табл. 7-42
0.28(0,13-0.64 мг/л В крови — 23 (3,2— 90) мг/я В печени — 30 (25—39) мг/кг
0,026 (0,023—0,030) мг/л В крови — 2,3 мг/л В печени — 8,1 мг/ki
17 (8,4-28) мг/л н 36 (21—60) мг/л при приеме 50 н 100 мг соответственно В кропи - 2,8 мг/л В печени — 113 мг/кг
0,008-0,015 (0,012) мг/л В крови — 10 мг/л В печени — 125 mi/кг
При приеме 25 мг препарат -0,017 мг/л; 50 мг - 0,033 мг/л; 100 мг — 0,076—0,140 мг/л; 150 мг — 0,126 мг/л В крови 0.54—3,3 мг/л В печени 56—320 мг/ki
При приеме 50 мг препа- рата — 0,030 мг/л: 300 mi - 0.017-0.093 мг/л В крови— 6,9 (0,9—20) мг/л В печени — 97 (17—348) мг/л
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных . 689
690 Глава 7
Токсикокинетика и биотрансформация
Токсикокинстика и биотраг сформапия трициклических антидепрессантов активно изуча-
лись многие оты. в особенности амитриптилина и имипрамина и их метаболитов нортрип-
тилина и дезипрамина соответственно. Эти соединения, как правило. хорошо всасываются из
желудочно-кишечного тракта, и в силу высокой растворимости в липидах концентрация их в
крови и плазме значительно ниже, чем в тканях. Объемы распределения веществ соответствен-
но высокие и составляют 20—40 л/кг. После приема внутрь эти вещее та активно метаболизм
руюгся в печени, в основном путем N-дсмсгилирования и гидроксилирования и последующей
конъюгацией с глюкуроновой кислотой, и выделяются с мочой. Основные пути метаболизма
иминримина и образование его 2 основных метаболитов показаны на рис. 7-99.
На рис. 7-100 и 7-101 показаны схемы биотрансформации пароксетина и мапротилина со-
ответственно.
Т, большинства трициклических антидепрессантов составляет от 0.5 до 2.0 диен, хотя у
некоторых пациентов, в особенности пожилого возраста, наблюдается период полуэлимина-
нии. превышающий 2 дня. При повторном назначении лекарственных веществ концентра-
ции в плазме достигают стадии плато, так называемой стационарной концентрации. Время
достижения стационарной концентрации зависит ог величины Г|2; 90% стационарной кои-
иен грации достигается за 3,5 периода полуэлимпнапии и для большинства людей составляет
5—7 дней. У пациентов с медленным пли нарушенным гидроксилированием стационарные
концентрации лекарственною вещества или его активных метаболитов могут не достигаться
и за несколько недель, поэтому возникает высокая вероятность замедленных токсических
эффектов.
Исследования нортриптилина и дезипрамина показали, что их стационарные концентра-
ции у пациентов, получающих одинаковые суточные дозы, раъшчаются в 20-30 раз. Опубли-
кованы многочисленные работы о фармакокинетических и фармакогснетических механизмах
значительных индивидуальных различий стационарных концентраций нортриптилина и дезп-
прамина. Последние исследования показали, что генетически детерминирован полиморфизм
ферментов цитохромов Р450 различной активности, ответственных за гидроксилирование этих
Конъюгат
с глюкуроновой
кислотой
Рнс. 7-99. Схема биотрансформаинн имипрмнна.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 691
Метаболит II
Рис. 7-100. Схемы биот ансформаиии пароксетина
CHjCHjCH/IHCHj
Малротилин
Окисление
▼
Рнс. 7-101. Схема биотрансформании маиротлмна.
вешеств. Те. у кою метаболизм этих вешеств нелос1аючсн. — гомозиюш по гену CYP2D6.
отвечающему за этот дефект.
Пробоподготовка и методы исследования
Основные направления использования методов определения антидепрессантов следующие:
• токсикология неотложных состояний;
• контроль при лечении;
• исследование побочных эффектов:
• судебно-химическая экспертиза
• клинические испытания действия ашидспрессантон;
• фармакокинетические исследования.
Часто возникают судебно-химические и клинические ситуаннн. ко!да один из методов име-
ет преимущество или есть необходимость использоваю несколько методов. Например, иногда
сложно различить смеси некоторых антидепрессантов и нх метаболитов с помощью ВЭЖХ,
692 Глава 7
особенно в тех случаях, когда был принят более чем один ан гиде пресса нт. Нзоборо с по-
мощью газовой хроматографии. в особенности капиллярной ГХ, намного лучше разделяются
сложные смеси антидепрессантов. Иммупохимические методы анализа дополняют хроматог-
рафические.
Лекарственные вещества обычно представлены стабильными солями (например, тдрохло-
рилами), которые хорошо растворимы в воде. Подкисленные водные растворы стабильны в
течение многих месяцев при хранении в холодильнике. Калибровочные стандарты смесей ан-
тидепрессантов готовят в бычьей и, и лошадиной сыворотке и хранят замороженными (—20 С)
до непосредственного использования. Такие стандарты обычно устойчивы много месяцев. Вы-
бор соответствующего внутреннего стандарта может представлять сложность, в особенности
когда природа антидепрессанта (и его метаболитов) точно неизвестна. Часто используют дру-
гой антидепрессант, который .может быть легко определен с помощью аналитической системы
(газовая или жидкостная хромают рафия). Во многих случаях можно выбрать редко назначае-
мый антидепрессант, и. следовательно, его обнаружение в образцах пациента хталовероятно.
Сбор образцов — важная стадия о трсдслеттия веществ (см. гл. 5). Как известно. важны все
факторы, влияющие на получение результата, адекватного поставленной задаче. Моча часто ис-
пользуется для скрининг-анализа. но следует заметить, что при определении антидепрессантов
результаты количественного анализа мало различаются при приеме терапевтических до ; и пере-
дозировке. При остром отравлении и смертельном исходе, если моча была собрана практически
сразу после приема вещества или сх ерть наступила очень быстро, то в моче может быть найдено
только малое количество вещества. Поэтому всегда следует провести ориентировочные исслсдо
ваттия крови па присутствие принятого вещества. Время сбора образцов крови — важны t вопрос
при контроле над лечением. Наиболее оптимальное время — 12—16 ч после приема одной дозы
на ночь или строго перед приемом следующей дозы, кот да используется режим дробт ото еже-
дневного приема.
Обязательно следует учитывать стабильность вещества и его метаболитов при транспорти-
ровке и хранении образной до проведения исследования. Трициклические антидепрессанты
стабильны несколько дней лаже при комнатной температуре Однако для некоторых более
новых антидепрессантов характерно превращение неустойчивого метабо ита — N-глюкуронида
в исхо ное вещество.
Для полноты извлечения веществ используют различные методики. В большинстве спо-
собов ЖЖЭ биообразеп помещают в щелочную среду, потом экстрагируют в относительно
неполярный органический растворитель, например н-гексап, после этого вещество еше раз
экстрагируют в небольшой обьем кислоты и определяют его напрямую методом ВЭЖХ или
рсэкстрагнруют в небольшой объем органического растворителя для анализа с помощью ГХ
В последнее время ТФЭ заменила ЖЖЭ.
Тонкослойная хроматография
ТСХ после ТФЭ или ЖЖЭ из мочи или содержимого желудка — до сих пор широко приме-
няемый метод ориентировочной оценки, который может быть использован для обнаружения
трициклических и других антидепрессантов. Применяются различные системы растворителей.
Детекция антидепрессантов может быть выполнена при использовании таких реактивов, как
реактив Драгендорфа (платиновая кислота, калия йодид, хлороводородная кислота) и реактив
Манделина (ванадат аммония, концентрированная серная кислота). Реактив Манделина яв-
ляется относительно более специфичным и чувствительных! для определения трициклических
антидепрессантов, близких к нмипрамину или амитриптилину Некоторые вещества, например
амитриптилин и нортриптилин, дают характерные цвета при просмотре в УФ-свеге. Разра-
ботан вариант ориентировочного опреиеленпя этих всшеств в моче и содержимом желудка с
помощью системы ТОКСИ-ЛЛБ. Описано несколько методик количественного определения
трициклических антидепрессантов с помощью ТСХ и денситометра. Однако эти методы, вы-
тесненные жидкостной чромапирафией. редко используются в настоящее время.
Иммунохимические методы
Применение метонов EMIT и FPIA (см. гл. 6.2) для определения тр щиклических антидепрес-
сантов имеют серьезные ограничения, в особепносп! д. я ан111дспрессаитон II и III поколения.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 693
Различные методики EMIT были разработаны для диагностики передозировки трицикли-
ческих анти депрессантов и контроля над лечением. Однако они не позволяю! дифференциро-
вать определяемые вещества, ее из перед анализом не была проведена процедура твердофазного
разделения. Из-за перекрестной реактивности эти методики не могут быть надежными при из-
мерении концентраций трициклических антидепрессантов при передозировке. в особенности
п тех случаях. когда точно неизвестна структура антидепрессанта.
Экспрессное определение трициклических антидепрессантов. основанное на I Р1Л. успешно
применяется для установления факта передозировки. FPIA. как и метод EMIT, имеет ограни-
чения из-за кросс-реактивности с другими антидепрессантами. В последнее время были опи-
си из новые реагенты FP1A для специфического онрсдансыня амитриптилина и нор|риптплина
в присутствии друч друга.
Мето ы ГЖХ-МС. ВЭЖХ-МС. КЭФ-МС применяют для качественного и количественного
определения анiидспрсссантов.
Газовая хроматография
Газовая хроматография ло сих пор гхтается достаточно распространенным методом коли-
чественного определения трициклических и друтих антидепрессантов, в особенности с исполь-
зованием капиллярных колонок и ЭЗД или АФ1. Олин из недое1агков метода в том. что он не
может бын> использован без предварительной деривагизапин полярных гидроксилированных
метаболитов. Появление капиллярных колонок заметно улучшило эффективность разделения,
которая очень важна при качественном определении антидепрессантов в скрннинт-аналнзах.
ЭЗД используется для прямого определения позученных с помошью трифторуксусного ангид-
рида дериватов антидепрессантов с зруицировкой вюричщло ямина в боковой цепи. Газовая
хромато! рафия была предпочтительным метолом количественного определения трицикличес-
ких антидеперссантов 70-х — в начале 80-х годов XX века в настояшее время основным мето-
дом является ВЭЖХ
Высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭЖХ вытеснила газовую хроматографию как метод выбора количественного определения
трициклических и друтих антидепрессантов, а также их полярных метаболитов. Распростра-
ненный подход — использование С8 или С18 измененных силиконовых колонок с подвижной
фазой, содержащей иоп-окрашиваюшие реакпгвы. например, перхлорат или основания. напри-
мер метиламин или этилам ин для уменьшения дпнны волны пиков и улучшения разделения
родственных вешеств. Часто используют УФ-летектиронппис как при относительно больших
длинах волн (254 нм), так и при более коротких (210—215 нм), флюоресцентное и электрохи-
мическое обнаружение. Bio-Rad Laboratories были разр Фотаны автоматизированные системы
ВЭЖХ для качественного и количественного определения токсикантов, включая шптшепрес-
санты Например, с помощью аналитической системы Bio-Rad Laboratories можно достатчно
быстро оределпгь состав смеси трициклических антидепрессантов, выделенных из сыворотки
крови ТФЭ, на колонке LC PCN в токе мобильной фазы анетонитрпл/метанол и УФ-дстск-
тировании (215 нм). В этих условиях разделяют смесь, содержащую тримипрамин. локеепин,
амигрн1Г1илин. имипрамип. тесмстилдоксепнп. нортриптилин, дезнпрамип, протринпиин.
Мицеллярный элсктрокинсгический каш тлярпый электрофорез (см. гл. 6.3.5) нашел широ-
кое применение для определения трициклических антидепрессантов.
Клинико-токсикологический анализ антидепрессантов
Соотношение между концентрацией трициклических антидепрессантов в плазме крови и их
терапевтическим эффектом лосих пор не установлено. Однако взаимосвязь концентрации этих
веществ в плазме крови и количества побочных реакций не подвергается сомнению. Показано,
что как у взрослых, так и у детей высокие концентрации вешеств в плазме крови связаны с
проявлениями нсйротоксичносзи. В многочисленных исследованиях определили возможность
токсического эффекта в 22—33% случаев для пациентов, у коюрых концентрация трицикли-
ческих антидепрессантов в плазме крови была выше 0.3 мг/л по сравнению с 0—8% пациентов,
у кого концентрации в плазме крови бы и ниже 0,3 mi/'I. Ранние стадии токсических эффек-
тов. индуцированных трициклическими ат и депрессантами, могут быть похожи на усугубле-
694 Глава 7
нне депрессивных симптомов. Эго значительно повышает риск отравления при увеличении
последующей дозы препарата. Накопление в плазме крови трициклических антидепрессантов
связано с нарушением метаболизма, которое обусловлено теистически. Фармакотенетическпс
исследования показали, что у пациентов с необычно высокими концентрациями этих веществ
в плазме крови отмечается недостаточная скорость гидроксилирования.
Измерение концентраций трициклических и других антидепрессантов в крови пациентов
проводят для диагностики возможной передозировки. Пациенты, концентрации веществ в
плазме крови которых более 1 мг/л. имеют выраженные симптомы отравления. Предсказать
риск сердечных приступов или вентрикулярных аритмий по результатам определения концен-
трации вещества в плазме крови не представляется возможным. При лечении отравлений у
пациентов с точно поставленным диагнозом повторные измерения концентрации трицикли-
ческих и других антидепрессантов в плазме крови неинформативны. Лабораторные измерения
обычно важны при исследовании острых отравлений. когда диагноз неясен, когда пациенты
без сознания. Соотношение концентраций исходного вещества и его активного метаболита
имеет диагностическое значение при дифференцировке острого и хронического отравления.
С этой целью используются хрома плрафическис методы. В целях экспресс-диагностнкп
ИХМ можно быстро провести полуколичественное определение концентраций трицикли-
ческих антидепрессантов и их метаболитов. ИХМ нс позволяют определить присутствие ге-
тероциклических и более новых антидепрессантов — ингибиторов обратного нейронального
захва га.
Судебно-химическое определение антидепрессантов
Большинство методов, применяемых для определения антидепрессантов в сыворотке или
плазме крови живых лиц, moist использоваться и для анализа крови, взятой после смерит Ин-
терпретация данных, однако, может представлять сложности, если место взятия образна крови
неизвестно. Достоверно установлено. что для бол ыв и нова веществ, включая антидепрессанты,
имеющих большие объемы распределения, существуют значимые различия в концентрациях
собственно вещества и ею метаболитов в крови, взятой из разных участков кровеносной систе-
мы. Особенно высокие значения можно найти в крови сосудов сердца. Стабильные результаты
получают из образцов крови, взятой с периферии, например из бедренной вены. Обычная
ситуация — увеличение концентр шин антидепрессантов в крови после смерти в силу фено-
мена перераспределения. Особая тщательность и значительный опыт эксперта требуются при
интерпретации результатов. Концентрация вещества, найденная в крови, взятой после смерти,
неэквивалентна концентрации плазмы или сыворотки крови на момент смерти.
В заключение рассмотрим особенности гоксикокинетики и определения антидепрессантов
на примере амитриптилина
Амитриптилин (эливел. эндеп) — это трициклический антидепрессант, который разрешен
Л1я клинического использования с 1961 гола.
• При приеме амитриптилина нарушается способность человека выполнять квалифицирован-
ную работу. Этот побочный эффект усиливается при приеме алкоголя
• Передозировка лекарства очень опасна, так как симптомы отртвлення тяжелые и их трудно
контрол ировать.
« Амитриптилин активно метаболизируется до более полярных соединений, включающих
нортриптилин и литтортрнптилин (дезметнлнортриптилин)
• В плазме в основном находится нортриптилин, который в значительной степени обусловли-
вает влияния ами1ршнилина как антидепрессанта.
• Динортриптилин присутствует в плазме и также может проявлять активность.
• В плазме содержатся 2 гидроксилированных метаболита (Ю-гилроксиамптрцнтилин и 10-
гидроксииоргриптилин), ио они скорее всего не шрают значительной роли в системном
влиянии препарата на организм.
• Указанные метаболиты наряду с амигринтилин-М-оксидом и 10-гилроксиноргриптилином
были обнаружены в моче.
• У пациентов, принявших 2000 мг амитриптилина и перенесших в результате кому, судо-
рожные припадки и поражение сердечно-сосудистой системы, концентрации препарата в
плазме едва достигали 2 мг/л.
Метаболизм и определение наркотических средств, психотропных... 695
• Для лечения отравлений амитриптилином и другими трициклическими антидепрессантами
успешно используется холинергический препарат физостигмин.
• Прием взрослым человеком ошоситсльно небольшой дозы препарата (600 мг) часто стано-
вится причиной смерти.
• У нескольких человек, умерших в результате приема 3—5 г препарата, концентрации не-
измененного амитриптилина в крови и печени составили в среднем 9 (3—15) мг/л и 250
(92—420) мг/кг соответственно.
• На основании исследования причин смерти, связанных с приемом амитрипти. ина. уста-
новлено. что суммарная концентрация амитриптилина и нортриптилина в печени, превы-
шающая 50 мг/кг. является признаком острой интоксикации, в то время как более низкие
концентрации — следствие терапевтических доз.
• У 32 человек, умерших от передозировки, концентрации амитриптилина и нортриптилина
в миокарде составляли 11,3 и 6.4 мг/кг соответственно. Это примерно в 5 раз превышает
средние концентрации в крови.
• В результате хромцтотрпфичсского анализа (ВЭЖХ) бнообразнов от умерших людей была
получена следующая картина распределения амитриптилина и его основного метаболита в
организме (табл. 7 43).
Таблица 7-43. Коппсшраини амитришилина в биологических жидкостях (в мг/л) и тканях (мг/кг) при
летальном исходе
Вещество Кровь Мозг Печень Почка Моча Желудок
Амтриптилив: среднее значение 3.7 II 130 22 3.4 60
(2,7—4.7) (2.6-1S) (13—317) (12-31) (0.4-7.9) (23-92)
Нортриптилин: среднее значение 1.1 3.9 1 25 13 0.3 0,1
(0,5 1.7) (0—7.7) (7,5-64) (1-25) (0-0.6) (0—0.4)
Примечание Из-за выхода препарата из депо (ткани легкою и печени) или диффузии из пищевари-
тельного тракта происходит перераспределение препарата в организме после смерти. В скобках — интер-
вал концентраций.
• В 30 случаях соотношение концентрации кровь из сердна/перифернческая кровь в среднем
составило 3,1 (0.6—15) для амитриптилина и 2,3 (0.5—8.4) для нортриптилина.
• Через 2—4 ч после однократного приема внутрь 50 мг амитриптилина максимальные кон-
центрации препарата в сыворотке достигали 0.016—0,035 мг/л. концентрации нортриптили-
на были ниже — 0.014 мг/л.
• У пациентов, систематически принимавших 150 мг препарата в сутки, равновесные концен-
трации амитриптилина в плазме составляли 0.095 (0,038—0.162) мг/л, а нортриптилина —
0.106 (0.022-0,242) мг/л.
• У 27 пациентов, принимавших 1.2—4,2 мг/кг препарата в сутки, равновесные концентра-
ции амитриптилина и плазме составили в среднем 0,113 мг/л. нортриптилина — 0,102 мг/л,
неконъюгировл иного транс- Ю-гилроксиамитриппыина — 0,015 мг/л и конъюгированного
транс-10-гидроксниорфиптилина— 0,124 мг/л.
• Установлено, что у больных Т 3 амитриптилина из сыворотки равен 9—25 ч. в среднем 15 ч,
в го время как у здоровых люден он составляет 8—15 ч.
• Оптимальный ответ организма достигается. по-внлимому. когда суммарные концентрации
амитриптилина и нортриптилина в плазме находятся в интервале 0,080—0.200 мг/л.
• Если параллельно проводить терапию флуоксетином, то равновесное содержание амитрип-
тилина в плазме увеличивается н 2 раза, а нортриптилина — в 9 раз.
• Соотношение концентраций и и ма/кровь составляет в среднем 1.0—1.1 для амитриптили-
на и 1,5—1.7 для нортриптилина.
• Только 35% введенной дозы амитриптилина выделяется с мочой за 24 ч в виде метабо-
литов. За II дней выводится почти 80% дозы и только 0,2% препарата находится в неиз-
мененном виде. Если реакция моча кислая, то в неизмененном виде выводится около 2%
дозы.
696 Глава 7
• Определение амитриптилина и нортрипгилина без дериватизании либо нор1ринтилина пос-
ле дериватизапии (его N-апетопроизводного) можно проводить метолом газовой хромато-
графии с помошью ПИД или АФД.
• Определение недериватнзированного амитриптилина и дери на визированною Hopi ришты Ti-
na (трифторанетопроизводного) можно проводить методом ГХ-МС.
• Распространенным методом для клинического определения трициклических антидепрес-
сантов является ВЭЖХ.
Глава 8
МЕТАБОЛИЗМ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ТОКСИКАНТОВ РАЗЛИЧНЫХ
ХИМИЧЕСКИХ ГРУПП
В БИОСУБСТРАТАХ ЧЕЛОВЕКА
8.1. ЭКСПЕРТИЗА АЛКОГОЛЬНОГО ОПЬЯНЕНИЯ
Другие пороки притупляют разум,
пьянство же разрушает его.
V Монтень
Алкого^ьсолержашие продукты тивссзны человеку более 4000 лет. Первое упоминание об
алкоголе (от араб, аль коголь — очурманиваюший) встречается в IV веке н.э. в писаниях китай-
ского алхимика Гэ Хуна. На Запале открытие этанола приписываюсь то алхимику I*. Луллию,
то его современнику А. же Вилланова Луллий изготовил aqua vini — первый бренди и был так
поражен чудесами aqua vini. что счел это открытие предвестником конца света.
Этанол служит сырьем для получения многих химических вешсств: ацетальдегида, диэтило-
вого эфира, тетраэтилсвинца. уксусной кислоты, хлороформа. этилат тетата. этилена и др.
Он широко применяется в медицине, нишевой, лакокрасочной, парфюмерной и фармацев-
тической промышленности, в производстве товаров бытовой химии, является консервантом,
компонентом антифриза и т.д.
Этанол постоянно поступает в организм человека в небольших количествах (до 4—5 г в сут-
ки) с некоторыми пищевыми продуктами. Например, йогурт содержит этанола 0,003—0,005%
по объему, кумыс — 1.00—4.5%. квас — 0.6—2.2%. хлеб пшеничный — 0.40—0.45%.
Этанол как топливо нс является источником парниковых газов. Этанол обладает нулевым
балансом диоксида углерода, поскольку при его получении путем брожения глюкозы и после-
дующем сгорании выделяется столько же СО,, сколько растения потребили из атмосферы для
фотосинтеза эквивалентного количества углеводов.
Смесь этанола с бензином обозначается буквой Е. Цифрой у буквы Е обозначается процент-
ное содержание этанола. Е85 — означает смесь и т 85% этанола и 15% бензина. Смеси, содержа-
щие до 20% этанола, могут применяться на любом автомобиле Автопроизводители выпускаю)
автомобили, ст особныс ргботчть и на бензине, и на Е85. Такие автомобили называю гя Пех-
Fuci. В Бразилии нх еще называют гибридными Себестоимость бра ильского этанола (около
0.19 долларов США за 1 л) дел тот сто использование экономически выгодным.
В 2004 г. в США эксплуатировались 146 195 автомобилей Flex-Fuel. В 2005 г. в США уже
более 5 млн автомобилей имеш двигатели Flex-Fuel, более тысячи заправочных станции про-
давали Е85.
Получение этанола. Существует несколько основных способов получения этанола:
• микробиологический (гидролиз и брожение) из пищевого (свекла. крахмал, картофель) и
непищевого (гидролизные субстраты древесины, стебли кукурузы, рисовая солома, отходы
лесной промышленности и целлюлозно-бумажного производства) сырья;
• синтетический (прямой пли с использованием серной кислоты)
Спиртовое брожение глюкозы пот действи м фермента зимазы — известный с давних вре-
мен способ получения этанола — протекает но схеме:
С Н ,О ч 2С,Н ОН + 2СО
Г •• П — Л Д
698 Глава 8
В результате брожении получается раствор, содержащий не более 10—15% этанола, который
затем очишают и концентрируют, обычно путем дистилляции
Гидролиз предусмаф тваег растепление целлюлозы. содержащейся в растительном сырье
(стебли кукурузы, рисовая содома, отходы лесной промышленности, зерно), до глюкозы с
последующим ферментативным сбраживанием Этим способом получают так называемый био-
этанол. или гидролизный спирт. Синтетический спирт, синтезируемый из этилена при повы-
шенных температуре. давлении и в присутствии серной кислоты (реакция внутримолекулярной
дегидратации), оказался токсичным для человека. С 1952 г. для пс «учения спирта в промыш-
ленном масштабе этилен обрабатывают концентрирован ной серной кислотой, и результате
чего образуются моно- и диэтнЛсульфагы. которые гидролизуют водой и отделяют серную кис-
лоту. В конце XX века получил распространение метол прямой гидратации этилена, который
заключается в непосредственном присоединении волы к этилену в присутствии катализатора
(ортофосфорная кислота на силикагеле) в результате обратимого экзотермического процесса
В ходе описанных процессов нро!екают многочисленные побочные реакции, приводящие
к образованию большого числа компонентов. Дистилляция не позволяет полностью очистить
получаемые продукты от примесей
Для медицинского применения по решению Фармакологического комитета России разре-
шены спирты, получаемые только из пищевого сырья. Синтетический этиловый спирт внесен
в Список ядовитых вешеств Постоянного комитета по контролю наркотиков (ПККН». В на-
шей стране синтетический спирт запрещен и лля наружного применения у лютс г
На основе происхождения сырья этиловые спирты делят на синтетические, полученные
прямой нтдратацией этилена или его гидратацией с применением серной кислоты, и фер-
ментативные. полученные путем сбраживания растительного сырья (пишевого и непищевого)
ферментами дрожжевых 1рибов рода Sacharvmyceties. В табл. 8-1 приведены марки и номера
технической документации этиловых спиртов, производимых в России.
Таблица 8-1. Марки и номера технической документации этиловых спиртов, производимых в России
Синтетические Ферментативные (п чу иные из растительного сырья)
пищевое сырье iiennnienoe сырье
ГОСТ 11547-80 Спирт этиловый синтети юс кий технический (высший и 1-й сорт) ГОСТ 131-67 Спирт эти.човый-сырец ГОСТ 17299-78 Спирт этиловый технический-сы- рец (марки А и Б)
ТУ 38402-62 117-90 Спирт этиловый синтетичес- кий технический (высший и 1 -й сорт) ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификован- ный (марки Люкс. Экстра, вы- сшей очистки и 1-й сорт) ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый рекптфнкован- ный технический (марки Экстра высший и 1 -й сорт)
ТУ 9I82-O1D-23O69 И 1-93 Cimpi этиловый синтетичес- кий ректификованный (марки Л н Б) ГОСТ 5963-67 Ciutpi втиловыи питьевом 95% ТУ 84 1203-89 Спирт Э1 иловый абсолютирован- ный технический (марки А и Б)
Полученные тем или иным способом спирты, как правило, содержат характерные примеси
(рис. 8-1).
Схема экспертного исследования спиртов с целью определения вида используемого при их
изготовлении сырья состоит из нескольких этанон:
• изучение внешних признаков представленных на исследование объектов (прозрачность
ЖИДКОС1И. цвет, запах, наличие посторонних примесей, особенность укупорки и др.);
• проведение газохроматопэафического исследования жидкости.
• проведение изотопного анализа жидкости.
Газохроматхлрафичсскос исследование спиртов проводят в настоящее время на капилляр-
ной колонке длиной 50 м и более, на внутреннюю поверхность которой нанесена полярная не-
подвижная фаза, например модифицированный полиэтилеигликоль (FFAP или HP-lnnowax).
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 699
1 2 и
5000
§
I
а 5500
5000
4500
4000
I I I I
0 5 10 15 20 25
Время удерживания, мин
Рис. 8-1. Хроматограммы синтетического синрта-сыриа (а) и пищевого ферментативного спирта-сырпа (б)
а. 1 — диз головы i! зфир, 2 —- анетальдшид, 4 — оксид энмена, 8 — третичным бутанол, 9 — метилэгилкс-
юн. 10 — димегокенмеган. 11 — вторичный бутанол, 12 — кротоновый альдегид, 14 — бензол, 15 — изо-
гексанол, 16 — мстилизобутилкетон. 17 — н-нентанол (стандарт) 3, 5—7, 13 — не идентифицированы,
б. 1 — ацетальдегид 2 — метнлацетат, 3 — этнлацетат. 4 — метанол, 5 — н. пропанол. 6 — нзобутанол, 7
— изоамиловые спирты. 8 — н пентанол (стандарт).
700 Глава 8
В качестве детектора применяют тимтменно-нонизацнонныП (ПИД) или масс-сслективиыП (МС)
детекторы. Дифференцировка лилового спирта но исходному сырью, использованному для
его изготовления, методом изотопного анализа основана на определении удельной активности
|4С* и Н в исследуемых объектах.
В 2005 г. во всем мире было синтезировано почти 46 000 млн литров этанола, из них более
30 000 млн литров приходи гея на США и Бразилию
Во всех странах мира для предупреждения об опасности использования синтетический спирт
денатурируют, добавляют в него различные вещества: фуксин, эфиры фталевой кислоты, фор-
мальдегид. высшие спирты и др.
Денатурируют также безводный абсолютный спирт. Смесь 95.57% этанола и 4.43% воды
является азеотропной Для удаления волы использую! различные химические и физико-хими-
ческие методы, например перегонку спирта с бензолом.
Фармакология и токсикология
Рецепторов, специфичных к этанолу в организме человека, не существует. Однако он взаи
модействует со многими вне- и внутриклеточными рецепторами клеток различных тканей, а
также со вторичными посредниками рецепторов и ферментными системами клеток. По свое-
му действию этиловый спирт является дспримирующим (успокаивающим) средством. однако
прием небольших доз спирта способен аминировать центральную нервную систему (ЦНС) за
счет стимуляции возбуждающих медиаторных систем головного мозга.
При выраженной интоксикации возбуждаются тормозные системы ЦНС. особенно ГАМК-
и опиатзависимые. что проявляется угнетением сознания, нарушениями дыхания п гемодина-
мики. возникающими при тяжелых отравлениях этанолом.
Этанол растворяется в фосфолипидном слое биологических мембран, кардинально изменя-
ет их свойства, снижая чувствительность рецепторов к лекарственным препаратам, тем самым
усиливая их токсичность. Между этанолом и лекарственными веществами часто возникает
конкуренция за ферментные системы, осуществляющие бнотрапсформацию ксенобиотиков
что проявляется большим количеством неблагоприятных реакций, возникающих в результате
сочетанного приема этих веществ.
Действие этанола на различные рецепторы и клинические проявления приведены в табл. 8-2.
Таблица 8-2. Рецепторы, на которые воздействует -этанол, и клинические проявления
Рецепторы Клинические т роявления
Ачренергпчсскис Возбуждение. типокалиемня. метаболические нарушения, аритмии
Дофам ннерт нчсскнс «Неправильное» поведение, неврологическая симптоматика, изменения ичностн. формирование привыкания
Глутамат ные Судороги, цитотоксическое действие, i инсргликсмия. паркинсонизм
Ход и нергцческне Брадикардия. типертилроз. когнитивные состояния
Ссротониисрт нческне Дспримирующее действие. понос, нарушения терморегуляции, кот нит нн- ныс нарушения, формирование мотивации
ГАМ Керт нчсскнс Оглушение, судороги, гипокалиемия
Опиатные Эйфория. аналгезия, обнубидтшия. кома, привыкание
Лейкотриенер! ические Эпдотоксемия
Вазопресс и । тергичеекне Повышение гидрофильности ткани мозга, тегких
В крови любого трезвого человека присутствуют следы этанола, образующегося в результате
биохимических процессов, — так называемый эндогенный этанол Источником его является
• -С (98.892%) и О1.108%)- два стабильных изотопа (см. гл. 6 4.4) Из радиоактивных изотопов наиболее важен ”С
с периоюм иатурпсицда (Г q= 5.6103 лет). Небольшие количества “С (около 21()IIJ% по массе) постоянно образуются
и верхних слоях атмосферы при действии нейтронов космического имучення на изотон азота “N. По удельной актив
носгн изотопа *С в остатках биогенного происхождения определяют их возраст. *С широко используется в качестве
изотопного индикатора.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 701
ацетальдегид, который образуется в результате декарбоксилирования пнровиногр. той кис-
логы (пирувата) при участии пируватлспщрогеназного комплекса. Количество эндогенного
этаноча зависит от многих факторов и особенностей метаболизма разных людей, поэтому ко-
леблется в довольно широких пределах. Допускается также возможность образования этанола
микрофлорой кишечника и дыхательных путей. Концентрация эндогенного ацетальдегида в
организме примерно в 100—1000 раз меньше, чем шлогснного этанола Эндогенный ацеталь-
дегид превращается в этанол в результате обратимой реакции, катализируемой алкогольлегид-
рогеназой. Считается, что предельная концентрация эндогенного этанола у здоровых людей не
превышает 0.008—0.4 г/л. При этом следует сделал ь оговорку. касающуюся метола определения
концентрации: нсспецифические фотоколориметрические методы могут давать завышенные
значения па уровне 0.3—0.4 г/л. в то время как газовая хроматография — не более 0.02—
0.07 г/л эндогенного этанола.
Концентрации эндогенного этанола и его метаболитов находятся в динамическом равно-
весии друг с другом. При приеме спиртного (более 60 г/сут) равновесие может нарушаться и
изменять биохимические циклы жизнеобеспечения организма. В нейронах и клетках парен-
химатозных- органов этанол начинает угнетать гексокииазную ферментную систему, обеспе-
чивающую транспорт глюкозы через клеточные мембраны и образование глюкозо-6-фосфата.
Продукты биотрансформании этанола, такие как ацетальдегид, уксусная кислота, также взаи-
модействуют с ферментными системами нейронов, гепагоиитов, миокардионигов и влияют на
обмен веществ в них.
Следствием действия этанола и его метаболитов является увеличение концентрации НАДН
в клетках многих органов и снижение в них кон цен грации НАД4. Нарушение равновесия в
системе окислительно-восстановительных коферментов дегидрогеназ приводит к блокаде глю-
конеогенеза. особенно в печени и почках, сбою нитратного никла и биосинтеза нейтральных
жиров в них. Проявлениями острого действия этанола являются нарушение образования энер-
гии, изменение работы ЦНС, гипогликемия, отложение жира в паренхиматозных органах и
нарушение их функции в целом.
Патохимические изменения, возникающие в клетках при приеме этилового спирта, лежат в
основе нарушений деятельности синаптических, гормональных, цитокиновых и других систем
организма.
Фармакокинетика и биотрансформация
Особенности фармакокинетики этанола необходимо знать, для того чтобы правильно оце-
нивать соотношения между принятой дозой спиртных напитков, концентрацией этилового
алкоголя в пгазмс крови и возникающими при этом клиническими при паками отравления,
а также прогнозировать возможные осложнения и провести своевременное и адекватное ле-
чение (см. электронное приложение).
Принятые внутрь спиртные напитки всасываются преимущественно в тонкой кишке, лишь
20% дозы всасывается в желудке. На полноту' абсорбции этанола и его концентрацию в плазме
крови оказывают влияние принятые ранее или совместно с алкоголем другие биоактивные
вещества или лекарственные препараты (табл. 8-3).
Таблица 8-3. В ияние различных вешеств на полноту абсорбции маната и его копнен грацию в плазме
крови
Фармакологическое ействн вешества Вешесгва Влияние на фармакокинетику алкоголя Изменение концентра- ции этанола
Замедление открытия пилорического жома Реглан, мотилиум. цезап- ри.’1. иммолиум и лр. Замедляется скорость абсор- бции этанола из-за задержки его эвакуации из желудка Концентрация нарас- тает медленно
Ослабление тонуса привратника Атропин.эуфиллип. нит- роглицерин. эстрогены, прогестерон и др. Ускоряется абсорбция эта- ноле из-за ускорения его эвакуации из желудка в топ- кую кишку, чго обеспечивает быстрое поступление его в 1 кровоток Концентрация нарас- тает быстро
702 Глава 8
Окончание табл. 8-3
Стимулирование мо- торики кишечника Реглан, мотилиум, слабительные средства, алреноблокаторы и др. Снижается полнота абсо бини этанола в кишечнике за счет сокращения времени контакта со всасынающсй поверхностью кишечника Концентрация нарастает медленно
Блокирование мото- рики кишечника Спазмолитики, барбиту- раты. натрия оксибугират и др. Расширяется площадь контакта со всасывающей поверхностью тонкой кишки и увеличивается время этого контакта Концентрация нарастает быстро
Многие лекарственные вещества используются для длительного лечения хронических со-
матических заболеваний, поэтому прием спиртного на их фоне может сопровождаться ускоре-
нием или замедлением опьянения, приводить к несоответствию между клинической картиной
интоксикации и концентрацией этанола в плазме крови бо льного, а также усиливать интокси-
кацию (табл. 8-4)
У здоровых людей на «голодный желудок» абсорбция этилового спирта завершается в те-
чение 1 ч после однократного приема спиртных налитков. Пиша существенно задерживает их
абсорбцию. 20% растворы этанола всасываются быстрее, особенно в сочетании с гидрокарбо-
натными водами, концентрированные растворы (нодки «Сибирская», «Смирнофф», разведен-
ный или «чистый» спирт) всасываются медленнее за счет вызываемого ими пилороспазма и
задержке выпитого в желудке. Назначение активированного угля не влияет на скорость абсорб-
ции водки или спирта, однако уголь адсорбирует другие вещества, находящиеся в алкогольном
напитке (ацетальдегид, этилацетат, сивушные масла, фурфурол и др.).
В желудке происходит пресистемный метаболизм этанола, т.е. его разрушение с помошью
фермента алкогольдегидроге юзы. вь раоатываемого преимущественно микробной флорой же-
лудка. С этим процессом связаны нарушения, возникающие у пациентов с отягощенным анам-
незом при алкогольной интоксикации
• У лиц, часто употребляющих спиртные напитки, отмечаются ультраструктурные измене-
ния слизистой оболочки тощей и гонкой кишки, обусловленные раздражающим действи-
ем этилового спирта. За счет этого нарушается всасывание тиамина, фолиевой кислоты,
цианокобаламина, метионина, микроэлементов и других биологически активных веществ,
которые участвуют в гликогенолизе, гликолизе и глюконеогенезе. В результате дефицита пе-
речисленных соединений нарушается промежуточный обмен вешеств и при интоксикации
этанолом чаше возникают гипогликемия и алкогольный кетоацидоз.
• У лип, страдающих гастритом и язвенной болезнью, наблюдается высокая активность алко-
гольлегидрогеназы слизистой оболочки желудка, колорая вырабатывается Н. pylori, поэтому
прием спиртного у них может сопровождаться усилением образования ацетальдегида и вы-
зывать токсические эффекты, им обусловленные: лактацидемию, ацстатемию. выраженные
вегетативные реакции, возможно и более быстрое развитие привыкания.
• При болезни Мэллори — Вейса, синдроме Ослера — Рандю, состояниях, возникающих пос-
ле резекции желудка, происходит снижение активности алкогольдегидро еназы в рсзульталс
чего снижается интенсивность пресистемного метаболизма этанола. Это приводит к бо :с
быстрой абсорбции этанола и увеличению его концентрации в плазме крови. Дспримн-
руюшее действие токсиканта развивается быстрее. Это обстоятельство является причиной
несоответствия между количеством выпитого, концентрацией этанола в плазме крови и
фактическим состоянием пострадавшего.
• Аспирин, парацетамол, Н,-гистаминоблокаторы и другие препараты, угнетающие актив-
ность алкогольдегидрогеназы желудка, способны замедлять биотрансформанию этанола и
снижать токсическое действие, обусловленное ацетальдегидом.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 703
Лабтнца 8-4. Взаимодействие этанола с некоторыми (скарствснными препаратами
Прет |>ат Результат взаимодействия
Седативные, транквилизаторы. нейролептики, антигистаминные, анал1ен1ки. жаропонижа- ющие, нестсроидиыс противовоспалительные средства — ПИ ВС Потенцирование угнетающего действия на НИС
Снотворные и транквилизаторы бензодиазепи- нового ряда Антидепрессанты — ингмбнюры мопоамнноокендазы (МАО) Потенцирование угнетающего действия на ИНС Стимулируют развитие привыкания и пристрастия к этанолу Развитие гипертоническою криза
Дифснин Блокада биотранс<|юр.маиии дифенила, повышение
его токсичности.
Гипотензивные^ детва Вазодилата горы Развитие ортостатического коллапса Потенцирование вазодилатирующего эфф-.кта кол- лаптоилнос состояние
Ниipoi.птерин, коронаролитики. спазмолитики Острая сосудистая недостаточность. коллапс
Диурез нки Проявления гипокалиемии (рвота, диарея, снижение артериального давления — АД)
Непрямые антнкоа, такты Крове течение, кровоизлияния во внутренние органы (и том числе в мозг)
Пероральные конграценгивы Снижение эффективности контрацептивов
Парацетамол Значительное повышение токсичности парацетамо- ла. проявление его тенатотокспчсского действия
Аспирин Резкое повышение aimiaiperai (ионной способности аспирина, усиление крово(ечения Изъязвление слизистой оболочки желудка
Витамин В3. триптофан, препараты нннка Потенцирование токсическою влияния этанола на печень
Тиамин аскорбиновая кислота, антиоксиданты Снижение токсического влияния этанола на печень
Метронидазол. фуразолидон, цефалоспорины, гипогликемические средства, производные су.лъ- фоннлмочевины. препараты мышьяка, ртути и тиоловые ялы Значительное усиление токсического действия эта- нола (за счет блокады длкогольлегидрогеназы)
Упитиоа. аиешлцнетеин. mciнонин Уменьшение токсического действии этанола (за счет повышения активности аЛкогпльлспырогеиазы)
Индукторы микросомальных ферментов печени (барбтггураты. дифснн11. глюкокортикостероиды и лр.) 1 Развитие перекрестной толерантности
• При заболеваниях печени, сопровождающихся снижением се антитоксической функции,
голоде, неправильном питании, авитаминозах (особенно (руины В), а также улиц, находя-
щихся на диете с целью снижения массы тела, возникает редукния гапасов гликогеновых
депо. В этих условиях острая интоксикация этанолом любой степени тяжести может со
провожлатьея гипогликемическими состояниями, кетоацидозом и другими осложнениями,
связанными с нарушением глюконеогенеза.
• Активность алкоголыгстдрогеназы у женщин в среднем вдвое ниже, чем у мужчин, поэтому
при потреблении одинакового количества спиртного в плазме крови женшнн концентрация
этанола нарастает быстрее (иными словами, женщины пьянеют быстрее мужчин).
Объем распределения этанола в организме человека (Vu) составляет 0,53 л/кг, скорость рас-
пределения в жидких средах прямо пропорциональна скорости кровотока в них.
704 Глава 8
Биотраис(|юрм;шия этанола представляет собой типичную реакцию токсификапии (см. гл. 4).
при которой образую ся более токсичные по сравнению с исходным продуктом метаболиты.
10% принятого внутрь спирта выводится почками и легкими в неизмененном виде, остальное
количество окисляется в печени. Биохимические процессы, которые происходят в ней при
биодеградации этилового алкоголя, очень важны лля понимания природы осложнении, возни-
кающих при интоксикации им.
Основной путь биотрансформании этилового спирта — его окисление цитозольной алко-
гольде гидрогеназой до ацетальдегида, который далее окисляется в митохондриях гепатоцитов
альдст иддсгидрот сшгзой до уксусной кислоты. Последняя утилизируется в цикле Кребса, если
для этого есть условия: нормальное давление кислорода в крови, активное протекание глико-
лиза в гепатоцитах, достаточное количество гликогена в них, наличие запасов окислительно-
восс га новител ьных коферментов (ниридиннуклеотидов, флавиновых коферментов, липоевон
кислоты, тиамина и др.), что обычно бывает у здоровых непьющих людей. Обе дегидрогеназы
расщепляют этанол с постоянной скоростью, которая составляет 7—10 гэтанота в I ч, потреб-
ляют НАД*, который восстанавливается до НАДИ Чем больше этанола принято человеком,
тем меньшими становятся запасы НАД" в клетках.
Таким образом, этанол, вызывая истощение запасов НАД*, нарушает и ход важнейших био-
химических реакции, в которых участвует НАД Одной из таких реакций является глюконео-
генез (рееинтез глюкозы de novo из аминокислот, жиров н лактата). Глюконеогенез является
главным источником питания для нейронов головного мозга и поддерживает энергообразова-
нис в клетках печени и ночек.
Если концентрация НАД* недостаточна, то глюконеогенез резко замедляется, возникают
гипогликемия, голодание мозга, снижаются оборот нитратного цикла и продукция тепла. Су-
ществует запасной вариант синтеза глюкозы из гликогена (гликогенолиз), однако даже в здо-
ровой печени запасы гликогена невелики и их хватает в среднем па несколько часов, максимум
на сутки. На какое-то время 1ликогснолиз покрывает расход глюкозы нейронами мозга (и
другими тканями), а затем истощение запасов гликогена усугубляет гипогликемию и вызы-
вает связанные с ней осложнения. У голодных людей, лиц, находящихся на листе, больных
диабетом, пациентов, принимающих тииогликсмическпс (за исключением толбутамида) или
гепатотоксичные (парацетамол, изониазид, альдомет. фенотиазины, некоторые антибиотики и
др.) средства, а также у алкоголиков зш. тсы гликогена в печени снижены и прием небольшого
количества спиртного может приводить к неблагоприятным последствиям. В табл. 8-5 приве-
дены осложнения, которые возникают после приема этилового спирта у лиц со сниженным
запасом гликогена в печени.
Таблица 8-5. Осложнения, возникающие после приема этилового спирта у дни со сниженным запасом
гликогена в печени
Осложнение
Гипогликемия
Аткогольный кетоанидоз
Жировая дистрофия печени
Алкогольный гепатит
Цирроз
Нарушение тканевого дыха-
ния, гипоксия, анемия,
нейропатия, кардиомиопа-
тия, снижение иммунитета
опухолевый рост, себоррсй-
ный дерматит и т.д.
Механизм развитии -к.» жиеинн
Снижение уровня глюкозы в клетках и угнетение глюконеогенеза в них
частично компенсируется липолизом, однако жиры при дефиците НАД"
окисляются нс полностью, и । ромежуточныс продукты их обмена вызы-
вают кетотшидоз
Повышение концентрации триглипсритов вызывает инфильтрацию
клеток печени, причем жировые вакуоли образуются в печени даже при
кратковременном действии этанола. В дополнение к этому при регу.зяр-
1 ном приеме спиртного нарушается продукция липопротеинов, что вызы-
вает повреждение митохондрий, образование супероксидных радикалов
и антител к гепатоцитам
НАД* отчуждается от друтих. недублируемых биохимических реакций, и
они останавливаются (например, реакции глггарил-КоА депитрогеназы,
эритроцитарной г.тутатионредуктазы в электронно-транспортной цепи
флавопротеинов), что вызывает дефицит обра тования энергии и создаст
основу для изменения морфолот ичсской структуры друтих тканей
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 705
Представленные в табл. 8-5 осложнения могут наблюдаться при воздействии больших ко-
личеств этанола и его концентрации в плазме крови от 1.5 до 3 г/л и более, особенно если
пациент, принявший его, был голодным.
Вторым по значимости путем биотрансформаиии этанола является его окисление в эндо-
плазматическом ретикулуме микросом (микросомальная этанолокисляющая система — МЭОС)
с участием цитохрома Р450 (тип CYP2D6 — дебризохингидроксилаза). Этот путь биотрансфор-
мации включается при уровне этанола в плазме крови в сретнем 1 г/л. При сформированной
зависимости от этанола система МЭОС работает наравне с биотрансформациеи дегидрогеназа-
ми, чю при сохраненной функции печени проявляется повышенной толерантностью пациента
к действию спиртного (выражение: «пьет, как лошадь*). Окисление алкоголя в системе МЭОС
также приводит к образованию аиста; ьдегидл, а в результате реакции блокируется окислитель-
ное фосфорилирование. Таким образом, при гликолизе образуется только тепло: субъективно
становится жарко, объективно снижается толерантность к холоду. Это обстоятельство является
причиной замерзания пьяных людей, так как они не чувствуют холода. Также отмечена прямая
пропорциональная зависимость между глубиной интоксикации, гипотермией, гипогликемией
и нарушениями ритма сердца при острой интоксикации этанолом.
Помимо биотрансформации этанола, цитохромы участвуют и в метаболизме многих ле-
карственных веществ, причем некоторые лекарства способны изменять их ферментативную
активность, гем самым опосредованно воздействовать на метаболизм этанола. Прием этанола
не фоне индукторов активности цитохромов (днфснина, карбамазепина, рифампицина и др
см. гл. 4) приводит к ускорению его ферментативного катализа и быстрому образованию аце-
тальдегида. На фоне блокаторов цитохромов (серталина. циметидина, низаприда и др, с.м
гл. 4) уровень этанола в плазме крови будет высоким, что приводит к несоответствию количес-
тва выпитых спиртных напитков и реального состояния больного при осмотре. При этом как
индукторы, так и блокаторы способны вызывать побочные эффекты.
Окисление в пероксидкяталазной системе микросом клеток печени является треть» м путем бно-
трансформании этанола, в результате которого образуется, помимо ацетальдегида, эндопероксида
и НАДФН. Эго приводт к дефициту НАДФХ и торможению окислительного фосфорилирования.
Последствия перечисленных реакций ферментативного катализа этанола представлены в табл. 8-6.
Таблица 8-6. Клинико-биохимические последствия ферментативного катализа этанола
Ферменты реакции Продукт реакции Последствия реакции
Алкогольле! идроге- паза Ацетальдегид. НАДН Лактапилсмия, гипогликемия, анстальтегндемия. снижение pH крови
Ал ьдспидегид роге- наза Уксусная кислота Декомпенсация метаболического ацидоза. Нарушения функции печени, миокарда, кишечника (за счет пшер- ианяри заци>1 мембран их клеток, вследствие накопления восстановленного НАДН). Развитие кегсмишдозз. блокада глюконсо! енста Нарушение обмена жиров Образование эндоперскисе»
Ферменты МЭОС Ацетальдегид А» етальдегидемня н дальнейшее снижение pH крови, угрожающая гипогликемия, гипотермия, нарушения ритма сердца, замерзание. большой риск побочного действия вводимых на фоне интоксикации лекарств
П сроке ид каталазная система Ацепшьдепи». НАДФН Дсфишп энергии, гипогликемия
При интоксикации легкой и средней степени выведение этанола из организма подчиняется
кинетике нулевого порядка. Это означает, что в единицу времени окисляется фиксированное
количество спирта несмотря на его концентрацию в плазме крови. При тяжелой степени
отравления в силу сочетанной работы всех ферментных систем биотрансформации этанола
скорость его выведения из организма возрастает и подчиняется кинетике 1-го порядка: чем
больше введено, тем больше выводится.
Средняя скорость метаболической элиминации у взрослого человека составляет 7- 10 г этанола
в I ч. что сопровождается снижением его концентрации в плазме крови на 0.15—0,20 г/л в I ч. У ал-
706 Глава 8
коголиков в силу сочетанной работы двух метаболических систем расщепление этанола происходит с
большей скоростью, которая осп тает 0,30 — 0.40 г/л в I ч. У детей она составляет 0,28 г/л в 1 ч
Основным критерием. отражающим степень клинических расстройттв при острой интоксика-
ции этанолом, является его концентрация в ллй'зме крови (табл 8-7).
Легочный путь экскреции этанола незначителен и составляет 0.05% его уровня в плазме крови.
Однако он имеет значение с точки зрения диагностики алкогольного опьянения. Считается что
порог ощущения запаха алкоголя в выдыхаемом воздухе определяется при содержании этанола в
крови не ниже 0.3 r/л. при увеличении этой концентрации до 1.2 г/л запах ошушасгся у всех людей.
При высокой температуре окружающей среды обоня1ельный iiopoi понижается, а при низкой —
повышается. Сохранение запаха зависит от количества выпитого и может косвенно указывать на
давность приема спиртного. В табл. 8-8 приведены данные сохранения запаха спиртного в выдыхае-
мом воздухе в зависимости от количества выпитого.
При использовании этого признака в качестве диагностического при алкогольном опьяне-
нии необходимо помнить о том. что запах выдыхаемого воздуха может быть обусловлен рядом
причин и влиять на восприятие запаха алкоголя, например отравление цианидами сопровож-
дается запахом горького миндаля, прием тетурама или отравление сероуглеродом «шахом
тухлых яиц. мышьяка или таллия — запахом чеснока. Некоторые заболевания, а также голода-
ние влияют на запах выдыхаемого воздуха, например при диабете появляется фруктовый запах,
при уремии — аммиачный.
Этанол накапливается в грудном молоке и активно выводится молочными железами. Обычно
его концентрация в грудном молоке превышает на 10% концентрацию в плазме крови.
При попадании в организм человека алкоголь через некоторое время начинает перераспре-
деляться между тканями Среднее значение его концентрации при этом оценивается по срав-
нению с концентрацией в крови. В таб. 1 8-9 приведено распределение этанола в некоторых тканях,
органах и биологических жидкостях по отношению к распределению в крови.
Таблица 8-7. Концентрация этанола в плазме крови и соответствующие ей клинические ироян. ення
Концентрация этанола в плазме кровя и степень ин- токсикации Клинические проявления
0.5 г/л Без вид их ых отклонений в поведении и самочувствии. изменения регис- трируются только с помощью специальных тестов
1.0— 1,5 r/л эйфория Увеличение контактнгхди гонораниость, повышенная самооценка, сни- жение внимания. нарушение выполнения заданий при тестовой оценке
1,5—2.5 г/л — возбуждение Эмоииоиал .пая лабильность. снижение скорости тормозных реакций, потеря критики, нарушение памяти, способности сосредоточиться, вос- приятия, мышечная лискоординацня
2.5—3,0 г/л — оглушение Дезориентация, вязкая речь и спутанность сознания, головокружение, гиперэмоциональностъ (страх, злоба, грусть и тл_), сенсорные нарушения (диплопия, нарушение ориентации в пространстве, восприятия запахов, цвета. <|х>рмы обт>скгов и тд.), повышение порога болевой чувствитель- ности
3.5 4.0 г/л — сопор* Нарушение сознания до глубины сопора, выраженное снижение отпета на стимулы, полная мышечная итскоординация. неспособность стоять, сидеть; рвота, непроизвольные мочеиспускание и дефекация, |ннотер- мия. гипогликемия, судорожный синдром
4.0—5.0 г/т — кома Анестезия, аналгешя, снижение рефлексов. гипотермия, нарушение ды- хания и гемодинамики возможна смерть
7.0 ।/л и выше Смерть от остановки дыхания
•Сопор — состояние, характеризующееся утратой сознания при сохранении некоторых рефлекторных форм деятель-
ности Человек, находящийся в сопоре, может реагировать на слонссныс обращения, воспринимать внешние воз-
буждения (свет болевые воздействия). но по их окончании снова впадает в прежнее состояние. При выходе из нею
воспоминания о прошедшем периоде отсутствуют или носят отрывочный хараюер Состояние сопора обычно является
следствием тяжелого поражения газов него мозга и может предшествовать коме
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 707
яблина 8-Я. Сохранение запаха алкоголя в вы ыхиемом воздухе в зависимости от количества и состава
спиртною
Спиртное Количество спиртного. г Сохранение запаха в выдыхаемом востухе. ч
Водка 50 1.5
100 3,5
200 7.0
250 9.0
500 18.0
Коньяк 1 Ю 4.0
150 5.0
Шампанское 100 1.0
150 5.0
Портвейн 200 3.5
300 4.0
400 5.0
Пиво _• 500 | _0/> _
Таблица 8-9. Отношение распределения эганола в тканях, органах и биологических жидкостях к распре-
делению в крови
Мозг Сгусток крови Жировая клетчатка Печень т Сиона Стекловидное тело
0,65 0,94 0.77 0.02 0.91 1.12 0.99-1.33
Расчет концентрации этанола в плазме крови в зависимости от количества выпитых спиртных
напитков обычно проводится на ранних стадиях алкогольного опьянения, еше ло проведения
ХИМИКО-ГОКСИКОЛО1НЧССКИХ исследовании. Такой расчет производится по следующей формуле:
С - D/V,
где С — концентрация этанола в плазме кропи, г/л; D — доза принятого спиртного, г; V — объ-
ем распределения этанола в организме человека, л.
Пример Работник вневедомственной охраны 55 лет массой тела 1<Ю кг найден на посту в циыыбморочном состоя-
нии. Со слов сослхживнев. за обедом он выпил ЛЮ г волки «Родничок». Требуется рассчитать концентрацию эттнола
в его крови.
Расчет ироииюлигся по следующей схеме
I. Вычисление объема распределения этанола (а л) у мужчины массой 100 ю раген: \ 100 (масса, кг). При Vd
0.53 д/кг, объем распределения этанола составит 53 л.
2. Обшее количество выпитого этанола (в г) в ИЮ мл возки «Родничок* составляет 40 100 мл 0,789 г /100 мл “
31,56 г. где 0.789 — шотпосп этанола, i/мл.
3. Концентрация этанола в плате крови хоста нет 31.56 г / 53 л — 0,59 г/л.
4. При сравнении полученного результат с лапиымн табл. 8-7 следует сделать вывод о несоответствии действи-
тельности показаниям сослуживцев.
За рубежом существуют и другие способы расчета концентрации этанола в плазме крови,
которые основываются на различных принципах, например на так называемой учетно-стан-
дартизированной дозе, равной 13.6 г этанола.
Клиническая картина интоксикации
Признаки интоксикации этанолом, по мнению экспертов ВОЗ. возникают при его кон
нентрации в плазме крови 1.0 г/л и с прекращением в связи этим процесса глюконеогене-
за. Токсические эффекты алкоголя различаются и зависят от многих факторов. Большинство
смертельных исходов, связанных с приемом алкоголя. происходит при концентрации этанола в
плазме крови около 3.5—4,0 г/л с колебанием от 2.6 г/л по 15,0 г/л. Выраженные клинические
признаки интоксикации наблюдаются при концентрации от 1,5 г/л и более.
708 Глава 8
Степень интоксикации этанолом определяется тяжестью поражения организма (см. табл. 8-7).
При легксг степени интоксикации, соответствующей концентрации этанола в плазме кро-
ви от 1 до 1.5 г/л. доминирует стимулирующее действие этанола, возникает эйфория, однако
снижается критическая оценка окружающей обстановки, возникает переоценка своих сил и
возможностей. Эта степень отравления лечения не требует
При средней степени интоксикации, соответствующей концентрации этанола в плазме крови
1,5—2,5 г/л. первоначально могут возникать изменения эмоционально-волевой активности, свя-
занные с депримируюшим действием этанола. Усиливаются импульсивность и половое влече-
ние. однако у части мужчин снижаются возможности для его реализации. Изменения личности
зависят от многих причин, в том числе от интеллекта. воспитания, социального положения.
Некоторые лица становятся чрезмерно эмоциональными, контактными, аффективными, кон-
фликтными, агрессивными, другие замыкаются и становятся безучастными или грсвожными.
По мерс биотрансформации выпитого этанола и накопления ацетальдегида краснеет кожа, усу-
губляются вегетативные реакции, возни кают одышка, тахикардия, снижается АД. В диапазоне
концентраций, условно соответствующих второй степени отравления этанолом, часто выявляет-
ся толерантность к нем хотя у некоторых субъектов уровень 1,5-2,0 г/л вызывает тяжелый сон.
а другим требуется проведение лечебных мероприятий и госпитализация в стационар.
При тяжелой интоксикации, соответствующей концентрации 2,5—3,0 г/л выражено депри-
мирующее действие этанола, развивается тяжелый сон, снижается АД. у некоторых чин от-
мечается брадикардия. По мере декомпенсации гемодинамики формируются тахикардия, ап-
ноэ. Снижаются рефлекторные реакции (тактильные, болевые), сознание угнетается вплоть до
комы.
Алкогольная кома наблюдается при концентрации этанола 5.0 г/л (иногда — при концент-
рации более 3.5 г/л). Первичная кома обусловлена депримируюшим и наркотическим действи-
ем этанола на ЦНС. Она возникает в ближайшие часы после его приема в большом количестве.
Во многих случаях налоксон и глюкоза оказывают пробуждающее действие. При первичной
коме имеют место гипотензия, тахикардия, может отмечаться транзиторная неврологическая
симптоматика (снижение порога болевой чувствительности, повышение или снижение тонуса
мышц, сухожильных рефлексов, «игра зрачков» и т.д.). За тяжелой интоксикацией и алкоголь-
ной комой следуют осложнения: декомпенсация дыхания. 1емодинамики, а впоследствии и
когнитивных функций что требует интенсивною лечения.
Смерть при отравлении этанолом развивается вследствие остановки дыхания и/или острой
сердечно-сосудистой недостаточности. Ее причинами могут быть нарушения:
• ЦНС (отек мозга. субарахноидальное кровоизлияние, энцефалопатия),
• респираторной системы (западение языка и обструкция дыхательных путей, вследствие ас-
пирации рвотных масс и/или асфиксии),
• сердечно-сосудистой системы (ранние коллапсы вследствие депримируюшего действия эта-
нола, поздние коллапсы, обусловленные миокардиодистрофисй. кардиомиопатией, наруше-
ниями ритма сердца):
• печени (токсическая гспатопатия);
• обмена веществ (гипогликемия, алкогольный кетоацидоз);
• переохлаждение (центральная гипотермия)
Перечисленные осложнения могут быть взаимосвязаны или могут сочетаться друг с другом.
Диагностика отравления
Действующе законодательство в области медицинского освидетельствования алкогольного
опьянения. Российское законодательство предусматривает ряд наказуемых деяний, связанных с
употреблением спиртных напитков (см. электронное приложение).
• Управление транспортным средством водителем, находящимся в состоянии опьянения, иди
передача управления транспортным средством липу, находящемуся в состоянии опьянения
(статья 12.8 Кодекса РФ «Об административных правонарушениях»).
• Распитие алкогольной и спиртсодержащей продукции в общественных местах (статья 20.20
Кодекса РФ «Об административных правонарушениях»).
• Появление в общественных местах в состоянии опьянения (статья 20.21. Кодекса РФ
«Об административных правонарушениях»).
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 709
• Вовлечение несовершеннолетнего в употребление спиртных напитков (статья 6.10. Кодекса
РФ «Об административных правонарушениях»).
• Появление на работе в состоянии алкогольного опьянения (статья 81 Трудовою кодекса РФ).
На практике наибольшее внимание уделяется правонарушениям, связанным с управлением
транспортным средством водителем, находящимся в состоянии опьянения.
Водитель, находящийся в состоянии опьянения, отстраняется от управления транспортным
средством и подлежит направлению на медицинское освидетельствование (статья 27.12 Кодек-
са РФ «Об административных правонарушениях»).
Медицинское освидетельствование входит в перечень мер обеспечения производства но делу
об административном правонарушении (статья 27.1 Кодекса РФ «Об административных правона-
рушениях») и рассматривается как комплекс мер. направленных на обнаружение на теле человека
особых примет, следов преступления, телесных повреждений, выяадение состояния опьянения
или иных свойств и признаков, имеющих значение для уголовного дела, если для этого не требу-
ется производство судебной экспертизы (статья 179 Уголовно-процессуального кодекса РФ).
Порядок осуществления медицинского освидетельствования на состояние опьянения регла-
ментируют следующие нормативно-правовые акты:
• Постановление Правительства РФ от 26.12.02 № 930 «Об утверждении правил медицинского
освидетельствования на состояние опьянения лица. которое управляет транспортным средс-
твом. и оформления его результатов».
• Федеральный закон от 10.12.95 № 196-ФЗ «О безопасности дорожного движения».
• Приказ Министерства здравоохранения РФ от 14 07.03 № 308 «О медицинском освидетель-
ствовании на состояние опьянения».
• Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 10.01.06 № 1
«О внесении изменений в приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от
14 июля 2003 г. № 308».
• Методические указания Министерства здравоохранения СССР от 02.09.88 № 06-14/33-14
«Медицинское освидетельствование для установления факта употребления алкоголя и со-
стояния опьянения».
• Приказ Министерства здравоохранения РФ от 05,10.98 № 289 «Об аналитической диагнос-
тике наркотических средств, психотропных и других токсических веществ в организме че-
ловека».
• Приказ Министерства внутренних дел РФ от 23.03.93 № 130 «О мерах по реализации Закона
Российской Федерации „О внесении изменений и дополнений в Кодекс РСФСР об ад-
министративных правонарушениях, Уголовный кодекс РСФСР, Уголовно-процессуальный
кодекс РСФСР'».
В соответствии с вышеназванными нормативными документами медицинское обеспечение
безопасности дорожного движения заключается в обязательном медицинском освидетельство-
вании и переосвидетельствовании кандидатов в водители и водителей транспортных средств,
проведении предрсйсовых. посперейсовых и текущих медицинских осмотров водителей транс-
портных средств (статья 23 Федерального закона «О безопасности дорожного движения»).
В случае, когда в отношении водителя транспортного средства имеются достаточные основа-
ния пс загать, чю он находится в состоянии опьянения, в установленном порядке проводится его
освидетельствование на состояние опьянения с применением индикаторной трубки «Контроль
трезвости» или других предназначенных для этих целей технических средств. Если водитель не
согласен проходить освидетельствование на состояние опьянения с применением индикаторной
трубки «Контроль трезвости» либо друпзх технических средств, а также в случае несогласия с
результатами про зеленного с применением указанных средств освидетельствования, он направ-
ляется на медицинское освидетельствование (статья 2 Приказа МВД РФ № 130).
Критериями, при наличии которых имеются достаточные осш влния полагать, что водитель
транспортного средства находится в состоянии опьянения и подлежит направлению на меди-
цинское освидетельствование, являются (приложение № 6 к Приказу М3 РФ «О медицинском
освидетельствовании на состояние опьянения»):
• запах алкоголя изо рта;
• неустойчивость позы;
• нарушение речи;
710 Глава 8
• выраженное дрожание пальцев рук
• резкое изменение окраски кожных покровов ли л
• поведение, не соответствующее обстановке
Медицинское освидетельствование на состояние опьянения лица, которое управляет транс-
портным средством, проводится в организациях змрпвоохрапения, имеющих лицензию на осу-
ществление медицинской деятельности с указанием соответствующих работ и услуг, а также и
в специально оборудованных для этой цели передвижных пунктах (автомобилях), соответству-
ющих установленным Министерством здравоохранения РФ требованиям. Освидетельствова-
ние проводится на основании протокола о направлении на освидетельствование, подписанного
должностным лицом, которому предоставлено право государственною надзора и контроля за
безопасностью движения и эксплуатации транспортного средства.
Средство (вешество), вызвавшее опьянение, определяется по результатам химико-токси-
кологического исследования. проводимого в порядке, ус га на вл и мемом Министерством Ира
воохра тения РФ. При освидетельствовании используются технические средства индикации
и измерения, зарст нитрированные и разрешенные Министерством здравоохранения РФ для
использования в медицинских целях и рекомендованные для проведения медицинского осви-
детельствования на состояние опьянения.
Для количественного определения алкоголя в выдыхаемом воздухе. количественного оп-
ределения алкоголя, наркотических средств, психотропных и других вызывающих опьянение
веществ в биолотнчсских средах человека используются технические средства, проверенные в
установленном Государственным комитетом РФ по стандартизации и метрологии порядке, тип
которых внесен в Государственный реестр средств измерения и проверка которых в процессе
эксплуатации осуществляется с нерподичносп ю. установленной Государственным комитетом
РФ по стандартизации и метрологии при утверждении данного типа средств измерений.
Основой заключения о состоянии освилетсльст дуемого служат данные комплексного меди-
цинского освидетельствования с учетом результатов лабораторных исследований.
При наличии клинических признаков опьянения и невозможности лабораторным исследо-
ванием установить вызвавшее опьянение вещество заключение о наличии состояния опьяне-
ния выносится на основании установленных клинических признаков опьянения.
При оказании неотложной медицинской помощи в медицинских ортанизаниях лицам, по-
страдавшим в дорожно- ранспоргных происшествиях и нахо яшимся в тяжелом состоянии,
вне зависимости от наличия ши отсутствия протокола о направлении на освидетельствование,
подписанного должностным лицом, которому предоставлено прево государственного надзора
и контроля за безопасностью движения и эксплуатации транспортного средства, заключение о
наличии опьянения выносится по результатам химнко-токсиколот ического исследования био-
логического объекта (кровь или моча), проводимого в установленном порядке, при наличии
абсолютного этилового спирта в крови в концентрации 0.5 г/л и более (приложение № 3 к
Приказу М3 РФ № 1 «О внесении изменений в приказ Министерства здравоохранения Рос
сииской Федерации от 14 июля 2003 г. N. 308»).
Многие государства законодательно утвердили допустимый уровень алкоголя (i ределыю
допустимые концентрации — ПДК) в крови водителей транспортных средств (табл. 8-10) в
промилле.
Таблица 8-10. ПДК этанола в крови (в <г<). установленные законодательством некоторых государств
Страна ПДК Страна ПДК Страна IUIK
Австрия 0.8 Дания 0.8 Финляндия 0.5
Белы ня 0.5 Италия 0.8 Франция 0,5
Великобритания 0,8 Люксембург 0.8 Швеция 0.2
Германия 0.8 Нилсрлланды 0.5 Япония 0.5
I рения 0.5 США 1.0
В соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития (МЗиСР)
РФ Ьё I «О внесении изменении в приказ Министерства здравоохранения Российской Феде-
рации от 14 июля 2003 г. № 308» внесены изменения в «Инструкцию по проведению медицин-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 711
ского освидетельствования пл состояние опьянения лица, которое yi равняет транспортным
средством», утвержденную ранее приказом № 308:
• средство (вещество), вы нывшее опьянение, за исключением алкоголя, определяется по результа-
там химико-токсикологического иссле овання биологического объекта (п. 9 приложения № 3):
• при оевг летельствованни во всех случаях осуществляется исследование выдыха мою возду
ха на алкоголь (п. 11 приложения 3);
• заключение о состоянии опьянения в резу ьтате употребления алкоголя выносится при нали-
чии клинических признаков опьянения и положительных результатах определения алкоголя в
выдыхаемом воздухе при помощи одного из технических средств измерения, проведенною с ин-
тервалом 20 мин. или при применении не менее двух разных технических средств индикации на
наличие алкоголя в выдыхаемом воздухе с использованием их обоих при каждом исследовании,
проведенном с интервалом 20 мин. В пункте 16 акта отмечается что забор биологического объ-
екта для химико-токсикологического исследования нс осуществлялся (п. 16 приложения № 3).
Для обнаружения алкоголя у живых лип используются кровь, мочь слюна и выдыхаемый воздух.
В соответствии с «Положением о правилах отбора проб на обнаружение алкоголя, нар-
котических средств, психотропных и других токсических вешеств». утвержденных! прика-
зом Министерства здравоохранения «Об аналитической диагностике наркотических средств,
психотропных и других токсических вешеств в организме человека» (далее Положение) при
поступлении в лабораторию все доставленные образны должны быть тщательно осмотрены
и зарегистрированы, при необходимости в журнале приема должны быть сделаны замечания,
касающиеся любых тарушений упаковки образца. Информация на пробирках должна точно
соответствовать сопроводи тельной документации. Присвоение специального или штрихового
кода образцу позволяет контролировать его прохождение через лабораторию (см. гл. 5).
Опреде-кше алкоголя в крови является наиболее объективным способом установления (|мкла сю
употребления. В связи е тем что отбор проб крови может осуи естнляться только медицинским
персоналом в лечебных учреждениях, на практике чаше исследуют мочу и слюну. Кровь отбирают
только при наличии couibctcthvioiuiix показаний (Методические указания М3 СССР «Медицинское
освилеге, ьегвование для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения»)
Правила забора образцов крови. В соответствии с Положением кровь забирается из поверх-
ностной йены самотеком в сухой флакон из-под пенициллина, содержащий растор гепарина
(3—5 капель на каждые Ю мл крови). Для химико-токсикологического исследования на нали-
чие алкоголя достаточно 2—3 мл крови. Исследование на алкоголь проводится в течение I ч
после получения биологических проб. Допускается хранение пробы (при условии ассптичсско-
го отбора) в холодильнике при температуре 0 ‘С не более I сут. При заборе крови для дезин-
<|>екции участка кожи недопустимо использовать средства, содержащие этанол
При заборе пробы крови обследуемый должен быть проинформирован о необходимости за-
бора данного объекта на анализ. после чего должно быть получено его письменное согласие.
Следует иметь в виду, что при определении алкоголя возможны сто потери, а также могут
быть получены завышенные результаты.
Потерн этанола возможны за счет:
• испарения при хранении образцов в негерметично закрытых емкостях, вне холодильника,
емкостях, объем которых значительно превышает объем образца
• окисления кислор лом крови и воздуха, контактирующего с кровью; потери могут составит!,
0.02 мг/дл вдень при 4 ’С. 6 мг/дл в день при 37 *С и 43 мг/дл в день при 62 ’С (присутствие
консерванта влияние не оказывает):
• микробной обсемененностн (хранение образцов в условиях пониженой температуры и в
присутствии консерванта натрия фторида).
Завышенные результаты определения (увеличение концентрации этанола) могут быть полу-
чены из-за использования средств для дезин<|эскиии. содержащих алкоголь.
При интерпретации результатов исследования крови учитывают соотношение концентра-
ций этанола в цельной крови, плазме и эритроцитарной массе; соотношение концентраций
этанола в артериальной, венозной и капиллярной крови; степень корреляции концентрации
ал koi оля в крови с клиническими проявлениями опьянения (см. 1эбл. 8-7).
Определение алкоголя в моче. Концентрация этанола в пробе мочи, взятой из мочеточников,
соответствует концентрации эганоп в артериальной крови, поступающей в почку (см гл. 2.4).
712 Глава 8
На практике отбирают пробу мочи, содержащейся в мочевом пузыре, где концентрация этано-
ла постоянно меняется из-за вновь поступающих порций мочи.
В соответствии с Положением для исследования на ал ко гать достаточно 2—5 мл мочи;
пробу помешают во флакон из-под пенициллина, который закрывают стандартной резиновой
пробкой с последующей фиксацией алюминиевым колпачком. Загрязнение образца мочи эта-
нолом извне должно быть исключено (см. электронное приложение).
Определение алкоголя в слюне. Отбор слюны i рост в исполнении и сводит к минимуму риск
заражения персонала вирусом гепатита или СПИДом.
Слюна (saliva) — щелочная жидкость, секретируемая большими слюнными и другими же-
лезами слизистой оболочки полости рта Основными составляющими слюны являются вода
(до 99.5%). слизь, ферменты (глюкозидаза и амилаза), мукополисахариды, гликопротеины,
иммуноглобулины, соли, электролиты. Слюна очищает полость рта и обладает бактерицидным
свойством. В течение суток образуется около I л слюны.
В стрессовой ситуации слюноотделение снижается, поэтому для ешмулянии отделения
слюны применяют жевательную резинку, жевательный воск, кусочки резины, тефлона или
лимонные капли и раствор лимонной кислоты. Надежнее испа ьзовать различные приспособ-
ления и устройства для отбора слюны, например устройство Salivctlc* * тын систему для отбора
ультрафильтрата слюны, функционирующую по принципу осмотического насоса.
Определение алкоголя в выдыхаемом волд) хе. Это наибатсс простой и доступный способ установ-
ления факта опьянения, однако напученные результаты измерений часто вызывают сомнения.
При интерпретации результатов определения этанола следует учитывать закономерности
токе и коки нети ки этанола (табл. 8-11).
Таблица 8-11. Результаты эксперта ы. требующие интерпретации
Показа ге. и
Соотношение концент-
раций этанола в цель-
ной крови, плазме и
эритроцитарной массе
Соотношение концент-
раций этанола в арте-
риальной и венозной
крови
Степень корреляции
концентрации алкоголя
в крови с клиничсс
кнмн проявлениями
опьянения
Концентрация этанола
в пробе мочи, взятой из
мочевого пузыря
Концентрация эта юла
в слюне
Примечание
Наибольшее количество этанола содержится в плазме, наименьшее — и эрит-
роцитарной массе:
• сыворотка плазма 1.00 + 0.01. возможный диапазон 0.98—1,04:
• сыворотка (гшазма) / цельная кровь: 1.12 ± 0.02 или 1.10. возможный лиа-
| па зон 1,03—1,24_______________________________________
। Концентрации этанола в моете, легких, почках в наибольшей степени соот-
в гствуют концентрации этанола в артериальной крови*
Концентрация этанола в мышечной ткани соответствует концентрации эта-
нола в венозной крови
Соотношение между концентрацией этанола в артериальной, венозной и
капиллярной крови зависит от фазы алкогольной интоксикации:
• в фазу аб орбцин концентрация этанола в артериальной крови выше, чем в
венозной;
• в фазу элиминации концентрация этанола в артериальной крови ниже, чем
в венозной
Определение наличия алкоголя нс позволяет окончательно судить о степе-
ни опьянения человека. Это связано с неодинаковой реак шеи различных
индивидов и непостоянной реакцией одного человека на одни и те же дозы
алкоголя, а также фазой алкогольной интоксикации
Выявление в биологи icckhx средах организма содержания алкоголя, пре-
вышающего эндогенный уровень, сви стельствует о факте употребления
спиртных напитков
В фазе абсорбции концентрация этанола в моче из мочевого пузыря всегда
ниже чем в крови, в фазе ыимннации — выше, чем в крови, поэтому алкоголь
(может быть определен в моче, когда экзогенный этанол в крови уже отсутствует
। Соотношение межлу концентрацией этаном в слюне и капиллярной крови
в среднем состаачяст -= !,! (диапазон 0.88—1.36). В зависимости от времени,
прошедшего после после него приема алкоголя, разность концентраций в
венозной крови и аноне может принимать как положительные, так и отрица-
тельные значения
Этанол может адсорбироваться на слизистом оболочке ротовой полости и
ротоглотки после употребления спнргсодержатих лекарственных препаратов
и ряда нншевых продуктов, что повысит концентрацию алкото я в слюне (в
течение 10—20 мин), поэтому при положительном результате следует повто-
рить определение через 20 мин
Анализ слюны проводят при невозможности отбора пробы крови из-за раз-
личных причин
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 713
Окончание табг. 8-11
Концентрация этанола Соотношение копией граций этанола в крови и выдыхаемом воздухе постоян-
в выдыхаемом воздухе по и с учетом отношения плотности вози vxa и крови в среднем равно 1:2200
(диапазон ): 1300— 1.3000). з.с. 2200 см5 аз ьвеолярною воздуха содержит такое
же количество алкоголя, что и ) см’ крови
Содержание паров алкоголя в выдыхаемом воздухе выражается в миллшрнм-
мах на I м' и с учетом отношения нлопюетй крови и воздуха 0,1 г/л алкого-
ля в крови соо 1 встствмет примерно 45 мг/м* алкоголя в выдыхаемом воздухе
При этом 45 мг/м' в выдыхаемом воздухе соо1вегствует 0,1 промилле**
алкоголя в крови или содержание алкоголя 450 мг/мА в выдыхаемом воздухе
соответствует в иерее iere I прими зле алкоголя в крови
На резульпны определения влияют употребление спиртсолсржап|нх лекарств
и/или продуктов (влечение 10—20 мин), курение из-за восстанови гелзлюй
способности соединения углерода (в течение 5 мин), наличие в окружающей
среде (или в ротовой полости) следовых количеств летучих веществ (ацетона).
* Забор проб артериальной крови сложен и нс используется в экспертной практике.
• • Промилле — одн, тысячная доля какого-либо числа обозначаемая знаком (одна десятая процента).
Методы исследования этанола
Первый количественный метод определения алкоюля в кропи был разработан в начале
XX века Кл трком. .модифицирован Бисмарком и известен как метол Видмарка Этанол онре
деляли окислением дихромата калия в серной кислоте с последующим титрованием избытка
окислителя. Метод Видмарка неселсктивен по о i ношению к этанолу крови, так как и другие
соединения (например, метанол) окисляются в этих условиях, давая ложноположительныи
результат.
В настоящее время для определения этанола используются методы, (юпованиые на раз
личных физико-химических принципах (табл. 8-12). обеспечивающие его надежную иденти-
фикацию и количественную или полуколичеечтзенную оценку. Оборудование, используемое
при определении этанола, должно быть включено в Перечень разрешенных к применению
медицинских изделии (изделия медицинского назначения и медицинской техники) для скри-
нинговых исследований наличия алкоголя в организме человека или в Перечень приборов,
разрешенных к применению в медицинской практике.
Таблица 8-12. Методы определения этанола у живых лип*
Методы
Способы реализации
и оборудование
Результат
Примечание
Определение этанола в выдыхаемом похлухе
Химические
Проба Л.М. Рапопорта', в две
чистые сухие пробирки налива-
ют по 2 мл дистиллированной
иолы. В одну из них опусклюг
пипетку с узким вытянутым
концом, и испытуемый выдыха-
ет через псе 1.9—2,1 л воздуха в
течение 20-30 с. В обе пробир-
ки приливают но 20 капель х.ч.
H,SO4 концентрированной и за
тем но 1 кпняе 0.535 свсжспрн-
I отопленного раствора КМнО4
Индикаторные трубки Мохо-
ва-Шинкаренко «Контроль
трезвости»:
peaivHi инликаюрных трубок:
силикагель, импринированный
раствором хромовою ши ьзрнда
в концентрированной Н SO4
Если спустя 2 мнн
окраска раствора не
изменилась в сравнении
с окраской ко1гтрольного
раствора, экзо1снный
алкоголь в организме
отсутствует
Под воздействием паров
этанола реагент восста-
навливается — Ст (VI)
переходи> в Сг(Ш) и
оранжевый (желтый)
цвет реагента изменяется
на зеленый
Испытуемый на момент
исслстова шя пол воз-
действием аз коголя нс
иахолится.
Нс исключены ложно-
положизсльиыс резуль-
таты из-за присутствия
в пробе других восст а-
навливающих реагент
вешсств.
Чупсшитсльность оире
деления 0.2%с
При вохтсйствии паров
бензина, скипидара
уксусной кислоты, кам
форы. фенола, лихлоро-
этана реаген! приобре-
тает темно-коричневую
окраску
714 Глава 8
Протяжение табл. 8-12
Электрохимичес- кие Портативные устройства используют электрохимичес- кую ячейку. в которой этанол пропорционально окисляется до анетальдс! ила. Alert J4X (фирма Alcohol Countermeasure Systems. Кана- да) и Lion Alcolmetcr SD -400 (фирма Lion Laboratories Ltd.. Великобритания) — приборы для экспрессного измерения копиейtpauMM этанола в выды- хаемом воздухе, оснащенные электрохимическим детектором Показания прибора — концентрация этанола в граммах па 1 л в пере счете на кровь Метанол, нзопропа- 11Ш и другие летучие вещества, оксляюшисся в этих условиях, лают ложноот ринатезьные результаты. Изоиропанол образу ется эндогенно при восстановлении ацето- на. уровень которого в крови во расист при голодании или диабе- тическом кетоацидозе, что надо учитывать при интерпретации резуль- татов
ИК-спстромст- рия Современные ИК-анализаторы используют несколько длин волн. Анализатор Lion lntoxilyzcr-5000 - три длины волны: 3.80. 3.48 и 3.39 мкм. Анализатор Lion lntoxilyzer-8000 — две длины волны- 3.40 мкм и 9.36 мкм; анализатор АКПЭ- 01 (ЗАО НПФ «Мета». Россия) — одну длину волны: 3.40 мкм Результат количест- венного определения этанола фиксируется на бланке и в электронной памяти прибора. Показания АКПЭ 01 — концентрация этанола в микрограммах на 1 л выдыхаемого воздуха Можно достоверно от- личить lanoji от других перекрестно реагирую- щих летучих соедине- ний. Можно выявить при- сутствие этанола в ро- говой полости (по углу наклона градуировоч- ного графика, который резко идет вверх из-за нарастания концентра- ции ланола в первых порциях выдыхаемого воздуха)
Определение зтанола в биологических жидкостях
Биохимические (энзиматичес- кие) Тест на аякогояъ в < ионе: высо- коснспифичная ферментативная реакция окисления первичных спиртов до альдегида и пе- роксида водорода, который, разлагаясь в присутствии перок- сидазы хрена, вызывает окис- ление хромогена и образование окрашенного продукта. Индикаторная шкала содержит 5 ШИПОВЫХ ЗОН. СООТВС|С1ВуЮ- ших концентрациям алкоголя 0. 0.2. 0,5, 1 и 2 г/л этанола в крови. Подоски индикаторные АЛКО-СКРИП (!) АЛКОСЕНСОР (2) Концентрацию алкоголя в анализируемом образце определяют с помощью цветовой шкалы но ин- тенсивности окраски. Минимальная определяе- мая концентрация этано- ла — 0.02% алкоголя, что соответствует 0.2 г/л алкоголя в пере- счете на кровь. Чувствительность опре деления: 0,2%о (для АЛКО- СКРИН) и 0.15%о (для АЛКОСЕН- СОР) Можно определить 0.02. 0.05, 0,1 и 0.2% алкого- ля в слюне. Сенсорный элемент чувств1ггслсн к метано- лу. этанолу, пропанолу и нечувствителен к дру- гим спиртам и ацетону
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 715
Окончание табл. 8-12
Иммупофсрмсит ные (поляризаци- онный флюо- ресцентный иммуноапализ — ПФЙА) TDx/TDx-FLx ()). AxSYM (2) — нммуноф’поорсс- цезпные анализаторы фирмы АЬЬог.США Чувствительность опре- деления: 0.25%о для проб мочи (1) и для проб цельной кро- ви и мочи (2) Полностью автомати- зированный процесс проведения анализа; реагенты находатся в картриджах и гото- вы к использованию; длительное хранение реагентов; нет необхо- димости в ежедневной калибровке прибора; возможность исследова- ния единичных образ- цов з работ в разных режимах
Хроматографи- ческие и в соче- тании с *аасс- сисктральным детектированием Газовая хроматография (ГХ) на набивных или капиллярных колонках. Высокоэ<)х1>ск1 нвзмя жидкост- ная хроматография (ВЭЖХ). Масс-сискгрометрия (МС) в со- четании с хроматографическими и другими методами разделения См. ниже См. ниже
* См. алскзронное приложение
На рис. 8-2 показана прип цитаз ьпая схема работы И К анализатора выдыхаемого воздуха.
Из приведенного рисунка видно, «по анализируемый газ поступает в и мерительную ячейку
прибора (2). через которую пропускается свет от источника ИК-ихзучения (1). который далее
попадает через с]»окусирую11дую линзу (3) и колесо с узкополосными ИК-свстофилътрами (4) на
высокочувствительный фотоэлемент (5), сигнал которого обрабатывается микропроцессором (6).
Рис. 8-2. Схема устройства ИК-анализатора этанола в выдыхаемом воздухе.
Хроматографические методы определения этанола в биологических жидкостях
Подавляющее количество определений этанола в биологических жидкостях выполняется с
применением 1"Х с вводом образцов методом равновесной паровой фазы. Различают статичес-
кий и динамический варианты (см. гл. 8.2 и электронное приложение).
В простейшем статическом варианте образен биологической жидкости, объемом V помеща-
ют в впаду (флакон) — герметично закрытый сосуд (рис. 8-3). общим объемом V. выдержива-
ют при определенной температуре до установления равновесия между фазами, затем газовую
пробу, взятую и з объема V , вводят в хроматограф.
716 Глава 8
Рис. 8-3. Сосуд, в котором получа-
ют пробу летучего ко.мтюнонта из
от ретелясмого образна.
Исходную концентрацию летучего компонента Сп в ис-
следуемом образце определяют по его концентрации С в
равновесной газовой фазе на основе коэффициент рас-
пределения К = С/Св. где С, — равновесная концентрация
компонента в образце и соотношение объемов газовой (V )
и жилкой (V) фаз. обозначаемое как 0. Эта зависимость вы-
ражается уравнением:
Л - Со / (Л'+0),
где А — отклик детектора в виде высоты или плошали хро-
матографического пика.
Конисгпраиия авали га в газовой и жидкой < лзахдля закры-
той системы подчиняется законам Дальтона, Рауля и Генри.
Закон Далыпона — давление смеси химически не взаи-
модействующих идеальных тазов равно сумме парциальных
давлений этих газов.
Закон Рауля — парциальное давление пара данного ком-
понента нал раствором равно давлению насыщенного пара
над чистым конденсатом приданной температуре умножен-
ному на мо гьную долю этого компонента в жидкой фазе.
Таким образом, относительное понижение парциального
давления пара растворителя равно мольной доле растворен-
ного вещества, т.е.
I /р\ ‘“J’
где р,° — давление насыщенного пара чистого растворителя
при данной температуре; р( — давление насыщенного пара
растворителя над раствором: х2 — мольная доля растворенного вешества. В такой форме закон
применим лишь к растворам, насыщенный пар которых ведет себя как идеальный таз. Раство-
ры, для которых соотношение выполняется при всех концентрациях и при всех температурах
в области существования раствора, называются идеальными. Поэтому в реальных условиях
испотьзуют нс давление и концентрации, а летучесть или активность (коэффициент актив-
ности) онреде тяемого вешества. Летучесть — свойство жидких и твердых вешеств переходить
в газообразное состояние. мерой которой является концентрация насыщенного пара данного
вешества при рассматриваемой температуре. Выражается летучесть в миллиграммах на I м’ или
миллиграммах па I л.
Закон Генри при постоянной температуре растворимость газа в данной жидкости (выражен-
ная сто весовой концентрацией) прямо пропорциональна давлению этого газа над раствором.
Этот закон хорошо соблюдается только дтя идеальных растворов и применим лишь в области
невысоких давлений.
В бесконечно разбавленном растворе парциальное давление (летучесть) растворителя вы-
числяется но закону Рауля, а парциальное давление (летучесть) растворенного вещества — по
закону Генри. Обшее между этими законами заключается в том, что они устанавливают про-
порциональность между парциальными давлениями раствора и его концентрацией. Однако
существует и значительное различие между ними. В законе Рауля константой пропорциональ-
ности является парциальное давление растворителя в чистой фазе, а в законе Генри константа
пропорциональности нс имеет физического смысла парииа ььного давления чистого раст ворен-
ного вешества. поскольку закон Генри применим лля бесконечно разбавленного раствора и сто
экстраполяция на конечные копнен грации недопустима.
Чувствительность и точность парофазного метола лимитируются прежде всего процессом
газовой экстракции, который наряду с общими закономерностями традиционной жидкостной
экстракции имеет ряд существенных особенностей. В табл. 8-13 приведены некоторые из них.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп. 717
Габлина 8-13. Особенности метода равновесной паровой фазы (нарофшиого анализа)
Особенности парофазного анализа
Примечание
Коэффициент распределения вещества между
жидком и газовой фазой зависит от температуры
Парциальное давление газа зависит от температу-
ры и общего давления в системе
Отсутствие требования полноты извлечения опре-
деляемого вещества из исследуемого объекта
Постоянная температура — фактор обеспечения
допустимой погрешности анализа
Постоянная температура — с]тактор повышения
чувствительности метода
Содержание определяемого вещества в исследуе-
мом объекте лимитирует линейность концентра-
ционной зависимости коэффициента распределе-
ния
При количественных измерениях необходимо стро-
го соблюдать температурный режим
При количественных измерениях необходимо стро-
го соблютать температурный режим
Высокая чувствительность газохромаготрафи-
ческого летсктиров. мня позволяет определять с
помощью газовой экстракции лаже микроприме-
си летучих веществ, содержащихся в жидких иди
твердых объектах, при очень незначительной доле
извлеченного вещества
Достигается при высокой точности тсрмостатиро-
вания в анализируемой системе
Для большинства органических веществ измене-
ние температуры на 10 *С приводит к изменению
коэффициента распределения на 3—8%. поэтому
для получения точных результатов в процессе уста-
новления фазового равновесия необходимо поддер-
живать температуру стабильной на уровне десятых
дачей градуса
Область предельных разбавлении в различных сис-
темах ограничивается диапазоном концентраций
0,01-1 г/л
Соотношение объемов жилкой и газовой фаз Для систем, в которых К > 103. при использовании
оказывает сильное влияние на чувствительность существующих устройств для парофазного анализа
и точность определения в случае малых значений соотношение объемов не оказывает аз нянин на
коэффициента распределения чувствительность и предел обнаружения
Отклонение от равновесных условий проведения
парофазного анализа может приводить к трудно
выявляемым систематическим погрешностям
Время наступления равновесия зависит от темпе- Часто используются различные механические и
ратуры и скорости перемешивания фаз другие приспособления для перемешивания образ-
ца. Обычно время наступления равновесия состав-
ляет от нескольких минут ло I ч
Адсорбция вещества поверхностью жидкой фазы Например, углеводороды в воте
может оказывать существенное влияние па точ-
ность определения компонентов раствора, резко
отличающихся по полярности от растворителя _______
При определении веществ, диссоциирующих в
растворах, их ионизацией в газовой фазе практи-
чески можно пренебречь
Результаты анализа зависят от состава образце, в Добавле ие электролитов, таких как хлорид или
том числе от наличия посторонних ионов в пробе сульфат натрия, фосфаты или карбонаты, приводит
к увеличению отклика детектора (высаливающий
эффект)
На рис. 8-4 приведены графики зависимости отклика детектора (концентрации анализа в
паровой фазе) от температуры как функции коэффициента распределения вешеств в водном
растворе.
718 Глава 8
12000 J
10000
8000
Тем ература. С
Рис. 8-4. Графики оптика детектора при опреде-
лении различных вешеств метолом равновесной
паровой фазы в зависимости от температуры: I —
этанол: 2 — этилметилкетон; 3 — толуол; 4 — гек-
сан; 5 — тетрахлороэтилен.
Используемые устройства очень просты и
состоят из сосуда с образцом, помешенным в
водяную баню. Флакон (рис 8-5). внутрь кото-
рого введено точное количество исследуемой
жидкости и внутреннего стандарта, находит-
ся в бане ло установления равновесия между
фазами. При исследовании этанола в биоло-
гических жидкостях это время сосгавляы от
нескольких минуг до нескольких десятков
минут. Далее шприцем, часто тоже нагретым
до температуры образна, парофазную пробу
отбирают для анализа. На рис. 8-5 приведены
схема устройства для парофазного анализа и
типичная хроматограмма исследования кро-
ви на алкоголь с помощью рассматриваемого
метода с применением капиллярной колонки
с модифицированным полиэтиленгликолем
длиной 30 м. внутренним диаметром 0.32 мм
и толщиной фазы 0.25 мкм. В качестве де-
тектора использовали II ИД. Объект образца
1 мл. Хроматографический пик 1 соответству-
ет этанолу, пик 2 — н-пропанолу (внутренне-
му стандарту). Концентрация этанола 0.3 г/л.
Ьолее совершенное, но и более дорогое
оборудование используется лля динамическо-
го способа ввода газовой фазы в хроматограф.
Можно проводить исследования нескольких
образцов в автоматическом режиме. Схема
такого парофазного анализатора приведена
на рис. 8-6. Обращает на себя внимание значительная длина соединительных трубок (линий)
от образца к газовому хроматографу. Эго основной источник потерь аналита за счет его необ-
ратимой адсорбции на внутренней поверхности и/или частичной (возможно, и полной) термо-
дсструкшти. Для уменьшения влияния этих факторов приборостроители стараются сократить
длину технологических линий, предусматривают их термостатирование и продувку газом-носи-
телем, при изготовлении используют специальные дорогостоящие инертные материалы.
Для решения частных задач, например при проведении исследований термолабильных ве-
ществ. которые могут разрушиться до времени наступления равновесия, или при проведении
скрининговых исследований большого количества образцов с целью выявления лиц. употреб-
лявших алкоголь, применяют варианты метода равновесной паровой фазы, при которых не
дожидаются установления равновесия. Примером такого подхода является метод ларофазного
анализа без термостатирования. При этом решается вопрос только о присутствии или отсутс-
твии в образце контролируемого вещества, например этанола Результаты количественного
определения в этом случае нося г ориентировочный характер из- а резкого возрастания неоп-
ределенности метола. При необходимости принятия решений, касающихся уголовных дел или
вопросов, связанных с санкциями за вождение |втотранснорта в нетрезвом состоянии, требу-
ется применение более точных и методически выверенных методов.
До сих во всем мире при исследовании этанола широко применяется модификация паро-
фазною анализа, в которой используется деривагизания авалигов для получения алкилнит-
ритов при реакции спиртов в кислой среде с нитриг-ионом. Реакция проходит за несколько
секунд при комнатной температуре, образующиеся вещее ва обладают высоким парциальным
д атенисм и хорошими хроматографическими свойствами. Определение в этом случае прово-
дится с использованием коротких набивных колонок при относительно низких температурах и
детектора-катарометра (см. гл. 6.3). Метод надежен при определении этане ла только в свсжсм
секционном материале. Продукты распада тканей даже в незначительных концентрациях ис-
кажают результаты.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 719
Рис. 8-5. Схема устройства тын статического парофазною авали ш
(слева) и типичная хроматограмма равновесной паровой фазы при
исследовании крови на алкоюль (справа). Пояснение в тексте.
2
Время удерживания »**
Рис. 8-6. Схема устройства динамического парофазного анализатора.
720 Глава 8
Типовые условия проведения исследовании ал кил нитритным методом: газовый хромато-
граф с детектором — катарометр; хроматографическая колонка длиной 200 см и диаметром
0,3 см; неподвижная фаза: 12% ПЭГ-1500 на цветохроме, модифицированном серебром, зер-
нением 0.250—0,315 мм; температура колонки и испарителя 75 °C; расход газа-носителя гелия
40 мл/мин; ток детектора 130 мА (см. электронное приложение).
Калибровка прибора: в пенициллиновый флакон наливают 0.5 мл 50% трихлоруксусной
кислоты, несколько капель смеси спиртов С,—С5, флакон закрывают резиновой пробкой, фик-
сируют колпачком. С помощью шприца через пробку вводят 0,3 мл 30% раствора нитрита
натрия, реакционную смесь встряхивают, через 1 мин отбирают 0,3 мл парогазовой фазы и
вводят в испаритель хроматографа. На хроматограмме регистрируют 8 пиков—от метилнитри-
та до амилнитрита. Далее в пенициллиновый флакон наливают 0.5 мл 50% трихлоруксусной
кислоты, 0.5 мл стандартного раствора этилового спирта концентрации 1. 2. 4 или 6 г/л. 0,5 мл
внутреннего стандарта н-пропанола (концентрации 4 г/л), флакон закрывают резиновой про-
бкой. фиксируют колпачком. С помошью шприца через пробку вводят 0.3 мл 30% раствора
нитрита натрия, реакционную смесь встряхивают, через I мин отбирают 0,3 мл парогазовой
фазы и вводят в испаритель хроматографа. По результатам определения строят график зависи-
мости отклика детектора от концентрации этанола в крови или другом объекте исследования.
Угол наклона калибровочной кривой не должен превышать заранее заданных значений в соот-
ветствии с требованиями надлежащей лабораторной практики.
В качестве альтернативных методов определения этанола и других низших спиртов часто при-
меняют их дериваты с реактивами, обладающими свойством флюоресценции. Полученные де-
рива)ы анализируют методом ВЭЖХ. При исследовании биологических образцов, взятых у лиц.
принимавших этанол совместно с лекарственными препаратами, возможно образование в пробе
вешеств. которые могут искажать результаты определения этанола. Например, при взаимодейс-
твии in vivo этанола с салициловой или ацетилсалициловой кислотой образуется этилсалинилат.
определяемый па хроматограмме биологического образца (мочи) вместе с другими веществами.
Биомаркеры потребления этанола и методы их определения
Перед экспертами нередко встает вопрос, когда был введен этанол в организм потерпев-
шего — при жизни или после смерти. Ответ на него можно получить. используя биомаркеры
потребления этанола
Определение в моче метаболитов серотонина — биомдрксров предшествующего приема
даже небольших количеств этилового спирта — проводят методом ВЭЖХ. К ним относятся
5-гидрокситриптофол (5 ОНГ) и 5-гидроксинндолуксусная кислота (5-ОН НУ К). Концентра-
ция более 15 ммоль/л 5-ОНТ и 100 нмоль/л 5-ОНИУК является специфичным тестом даже по
прошествии 6—15 ч после полного выведения экзогенного этанола
Определение метанола, уровень которого в моче при приеме этанола остается повышенным
спустя 2—6 ч после полного выведения последнего, проводят методом ГХ-МС. Максимальная
концентрация метанола обнаруживается на следующие сутки после приема этанола.
Сальсолинол — продукт конденсации дофамина с пируватом и ацетальдегидом — определя-
ют в плазме крови методом ВЭЖХ. Тест менее чувствительный по сравнению с представлен-
ными выше. Концентрация сальсолинола в плазме крови и моче более 0,148 нг/мл указывает
на предшествующий прием этанола или хронический алкоголизм в анамнезе.
Этилглюкуронат образуется в организме человека и млекопитающих при определенной кон-
центрации этанола в плазме крови и может быть обнаружен в моче или волосах спустя дли-
тельное время после окончания приема этанола методами ВЭЖХ-МС или ГХ-МС.
Этанол, являясь гепатотоксикантом (см. гл. 2.4 и рис. 8-7), влияет на активность ряда фер-
ментов, что используют для диагностики хронического отравления этиловым алкоголем.
Измерение активности у-глутамилтрансферазы в сыворотке крови давно используется для
оценки изменения метаболизма при злоупотреблении этанолом. Как правило, в сыворотке
крови здоровых людей активность фермента низкая. Хроническое употребление алкоголя при
водит к повышению активности этого фермента. После прекращения употребления этанола,
активность фермента постепенно снижается и возвращается к норме в течение 4—5 нед. Этот
тест нельзя считать специфичным, так как курс лечения барбитуратами, противоэпилетичес-
кнми и другими психотропными среде игами вызывает аналогичный употреблению этанола эф-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 721
Рис. 8-7. Схема основных биохимических изменений, вызываемых этанолом в гепатоцитах (Ботинеи-
ко F..1O. и др., 2004). Звездочка — изменение соотношения НЛДН/НАЛ за счет восстановленной фор-
мы. ПОЛ — перекисное окисление липидов: Ас-СоА — ацегилкофермент A: HS-CoA — кофермент А.
в состав которого входят 2-аминоэтанол, пантотеновая кислота и фосфорилированный по положению 3
рибозы аленозинд> фосфат; АзьдДГ — алнлепшдеппрогеназа.
фскт. Кроме того, на активность фермента влияют пищевой статус, возраст, пол обследуемого.
Главное преимущество теста — указание на возможное злоупотребление алкоголем.
Повышение активности аспартат- и аланинаминотрансаминаз (ACT и АЛТ) косвенно ука
зывают на злоупотребление алкоголем.
Повышенное количество эритроцитов может наблюдаться у лиц, злоупотребляющих алко-
голем. Как предполагают, это обусловлено дефицитом фолиевой кислоты, вызванным ток
сическим действием этанола. Чувствительность этого теста достаточно низкая, поэтому его
применяют в комбинации с друзими стандартными биохимическими тестами для констатации
хронического употребления алкоголя.
Проба на глюкопротеиновый трансферрин является по-видимому, наиболее надежным до-
казательством чрезмерного употребления алкоголя в течение предыдущих 2 нед.
Ложноположительные результаты могут наблюдаться у лиц (не употребляющих алкоголь) с
первичным циррозом печени, особенно у женщин, хроническим активным гепатитом, наруше-
нием экспрессии генов (см. гл. 3 и 4).
Особенности посмертного перераспределения этилового спирта
При смертельных отравлениях этиловым алкоголем обязательно проводится судебно-меди-
цинское исследование трупа, при котором органы и ткани потерпевшего подвергают химико-
токсикологическому исследованию. В постмортальном периоде этаиот способен перераспреде-
ляться. Важным показателем является его содержание в ликворе, так как накопление этанола
в нем отстает по времени от накопления его в плазме крови на 60—120 мин. Оз ношение кон-
центрации этанола в плазме к его концентрации в цельной крови колеблется от 1,10 до 1,35.
составляя в среднем 1,18.
722 Глава 8
При постмортальном перераспределении в периферических венах обнаруживают меньшие
концентрации этанола по сравнению с центральными венами, при этом диапазон концент-
раций, выявленных в одном и том же трупе, может быть очень большим — от 1.8 до 4.28 г/л
(Basclt. 2004). Е. Briglia и соавт. (1992) при анализе результатов судебно-химических экспертиз
60 аутопсий обнаружил, что в 40 из них ра&пичия концентраций этанола в крови (бедренная
вена/правое предсердие/ восходящая аорта) составили 25%. в 16 случаях — от 25 до 50%, в
4 случаях — более 50%.
В табл. 8-14 приведен диапазон кониенграций этанопа в органах и биологических жидкос-
тях при летальном исходе вследствие приема больших доз алкоголя.
Таблица 8-14. Концентрации этанола в органах н биологических жидкостях при летальном исходе вслелс-
1вие приема больших лоз этанола
Кровь, г/л Головной мои. г/на 100 г органа СМЖ, г/л Печень, г/на 100 г органа Почки, г/на 100 г органа Моча г/л
0.74 0,44 0.58 0.45 0.48 0.62
(0,42-1,77) (0.31-0,91) (0.40-0,82) (0,25-1,16) (0.29-1.04) (0,49-0.94)
Примечание СМЖ — спинномозговая жидкость. В скобках — диапазон концентраций.
Этанол может образовываться не только при гнилостном рахюжепии тканей трупа, что
приводит к увеличению его концентрации до 2,4 г/л, но и при хранении исследуемых проб,
особенно проб мочи. Концентрация этанола в ней может возрастать от 2 до 4.5 r/л за счет его
образования из глюкозы, а также под воздействием ферментов некоторых микроорганизмов,
например Candida albicans, при комнатной температуре. Для устранения этанол продуцирующе-
го действия микроорганизмов пробы мочи рекомендуют стабилизировать 1% раствором NaF
или хранить при температуре не выше 4 °C. Посмертное определение этанола, как и других
летучих ядов, проводят । азохроматографическими методами (см. гл. 8.2).
8.2. СПИРТЫ. АЛЬДЕГИДЫ. КЕТОНЫ. УГЛЕВОДОРОДЫ.
ГАЛОГЕНОПРОИЗВОДНЫЕ УГЛЕВОДОРОДОВ
Кто неуклюжей рукой хватает розу
Пусть не жалу гея что шины се ранят
Г. Гейпе
Классификация. Физико-химические и токсикологические характеристики
Летучие органические соединения находят широкое применение в качестве растворителей,
антифризов, горючих материалов, сырья для получения самых разнообразных продуктов, кото-
рые широко используются в производстве, лабораториях и быту Количество людей, постоянно
контактирующих е различными техническими жидкостями, неуклонно растет во всем мире.
Многие из них высокотоксичны и при определенных условиях Способны вызвать как острые,
так и хронические отравления, которые могут носить профессиональный характер и возникать
вследствие нарушений правил техники безопасности. Возможны и бытовые отравления — при-
ем технических жидкостей внутрь по ошибке или преднамеренно, нередко с целью опьянения
Наиболее часто встречаются и тяжело протекают острые отравления этиленгликолем и его
производными, хлорированными углеводородами (дихлороэтан, четыреххлористый углерод,
трихлорэтилен), метиловым спиртом, средними и высшими спиртами. Отравление может быть
вызвано пероральным приемом суррогатов этилового алкоголя.
К летучим токсичным веществам (летучим ядам) относятся соединения различных химичес-
ких классов. В обязательный минимум химико-токсикологического исследования включены
следующие группы веществ (приказ М3 РФ № 9 от 08.01.02):
• этиловый, метиловый и другие алг фатическис спирты.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 7 23
• хлорированные углеводороды (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлороэтнлен.
дихлороэтан, перхлороэтилен);
• ароматические углеводороды (бензол, толуол), диэтиловый эфир, анетон. этилацегат.
В первый раздел «Перечня токсикологически важных вешеств. подлежащих судебно-хими-
ческому исследованию в лабораториях бюро судебно-медицинской экспертизы» (далее Пере-
чень) включены:
• синильная кислота и ее соединения;
• метиловый, этиловый пропиловый, бутиловый и амиловый спирты;
• формальдегид:
• хлороформ, хлоралгидрат, четыреххлористый углерод, дихлороэтан;
• фенол, крезолы.
На эти соединения проводят исследования при общем судебно-химическом анализе.
Во второй раздел Перечня включены вещества, необходимость поиска которых возникает в
зависимости от клинической и секционной картины, результатов гистологического, гистохи-
мического исследования, особенностей течения химических реакций при химико-токсиколо-
гическом анализе и т.д.:
• тетраэти свиней:
• этиленгликоль;
• анетон;
• нитро- и динитробензолы, анилин;
• бензол, толуол, ксилол, бензин, керосин.
Летучие яды входят в состав так называемых суррогатов этилового алкоголя. В клиничес-
кой токсикологии суррогаты алкоголя подразделяют на две группы: расзворы и препараты,
приготовленные на основе этилового спирта, содержащие различные примеси: нс содержащие
этиловый спирт технические жидкости, растворы и препараты, в состав которых входят али-
фатические одноатомные и многоатомные спирты, хлорорганическис углеводороды (ложные
суррогаты алкоголя).
К первой группе относятся:
• синтетические, полученные прямой гидратацией этилена или его гидратацией с приме-
нением серной кислоты, и ферментативные, полученные путем сбраживания непищевого
растительного сырья (см. гл. 8.1);
• денатурат — этанол, содержащий ме иловь й спирт, альдегиды и другие примеси;
• одеколоны, лосьоны, другие подобные средства с содержанием этанола до 60%. в рецептуру
включены также эфирные масла и прочие примеси:
• синтетические клеи, содержащие рахтичные смолы растворенные в этаноле, ацетоне, толу-
оле, зтилацстате и тл.:
• поли гура — технический спирт с содержанием ацетона, бутилового и амилового спиртов;
• нигрозин — морилка для дерева, содержащая этиловый спирт и красящие вещества, вызы-
вающие интенсивное и длительное окрашивание кожных покровов и слизистых оболочек в
синий цвет.
К техническим жидкостям, содержащим суррогаты второй группы. относятся тормозные
жидкости БСК и АСК (красного цвета), содержащие соответственно бутиловый и амиловый
спирты (а также касторовое масло). Отравления «средними» спиртами напоминают картину ос-
трой алкогольной интоксикации. Токсичность этих спиртов неодинакова. Наименее токсичны
пропиловые, наиболее — амиловые спирты, а бутиловые занимают промежуточное положение.
Отравления происходят преимущественно при приеме внутрь. Пропанол и его изомеры быстро
метаболизируются в организме, амиловые спирты— медленно В результате метаболизма пер-
вичных спиртов образуются соответствующие альдегиды и кислоты. Летучие токсиканты и их
метаболиты удаляются с выдыхаемым воздухом и мочой.
По терминологии, предложенной Международной ассоциацией судебных токсикологов
(TIAFT). эта группа веществ называется volatile substance abuse — VSA. В бюллетене TIAFT
приведены сведения о более 1000 этих соединений.
Летучие вещества могут легко проникать в организм человека ингаляционпо. Частично они
проникают через кожу и достигают с потоком крови органы и ткани. При оральном приеме
724 Глава 8
летучие вешества, всасываясь из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). проникают в ткани даже
после смерги
В случаях острого отравления симптомы появляются на ранних этапах воздействия. Лету-
чие яды быстро проникают в мозг, ткани которого богаты липидами. Начальные симптомы
возникают от наркотического воздействия на ЦНС, в дальнейшем токсические эффекты про-
являются головокружением, дезориентацией, параличом вкусовых сосочков языка, галлюци-
нациями, потерей сознания и судорогами. Смерть наступает внезапно, часто от остановки
сердца. Неоправданная потеря времени, недостаточность медицинских мероприятий, непра-
вильная или несвоевременная эвакуация из очага поражения могут нанести непоправимый
вред организму, способствовать летальному исходу или развитию необратимых последствий.
Категорически запрещается оставлять для лечения в домашних условиях пострадавших даже
с легкими формами отравлений техническими жидкостями или с подозрением на вероятную
интоксикацию. При остром отравлении парами летучих ядов пострадавшему необходимо обес-
печить доступ к свежему воздуху, сделать искусственное дыхание. При псрора. ьном приеме
токсикантов необходимо срочно провести промывание желудка. В любом случае пострадавший
должен быть доставлен в специализированное медицинское учреждение как можно быстрее.
При проведении судебно-химического исследования на летучие яды необходимо учитывать,
какие предпринимались меры детоксикации (см. гл. 2.5).
Определение концентрации летучих ядов в крови важно лля установления тяжести ограв-
ления. При разработке методик обнаружения и количественного определения летучих ялов
учитывают данные о токсичности конкретного вешесгва. Пределы обнаружения методов ис-
следования должны быть ниже токсических концентраций, только в этом случае химическая
реакция или другой результат определения будет иметь отрицательное химико токсикологи-
ческое значение.
Чтобы сделать оптимальный выбор объектов, подлежащих химико-токсикологическому ис-
следованию, наряду с токсикологической характеристикой необходимо знать возможные пути
поступления и метаболизма летучих ядов в организм.
В табл. 8-15 приведены краткие характеристики только некоторых представителей этой
группы токсикантов.
Таблица 8-15. Токсиканты группы летучих ядов
Класс соединений Представители
Алифатические углеводороды Бензин, керосин
Галогенопроизводные алифатических углеводоро- Хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлоро-
лов этан, трихлороэтилен и др.
Алифатические спирты Метанол, этанол (см. гл. 8.1). пропанол и др.
Двухатомные спирты и их эфиры Этилсныиколь и его эфиры
Простые и сложные эфиры Диэтиловый эфир, этианетат и др.
Альдегиды и кетоны Формальдегид, ацетон и др.
Карбоновые кислоты Муравьиная, уксусная
Ароматические углеводороды и их производные Бензол, ксилол, нитробензол и др.
Фенолы и их производные Фенол, крезол
Неорганические кислоты и их производные Синильная кислота и ацетонитрил
Другие Тстраэтмлсвинсп
Бензин и керосин
Отравление топливными жидкостями (бензин и керосин) возникает как произв i твенная
химическая травма, а также у токсикоманов, злоупотребляющих толуолом или техническими
жидкостями. Эритемы или бу.шы видны на коже после прямого воздействия плотного пара
токсиканта или непосредственного контакта с ним. В случае вдыхания паров бензина (керо-
сина) симптомы схожи с таковыми при отравлении толуолом (см. ниже). Обычно появляются
раздражение и воспаление слизистой оболочки верхних дыхательных путей (при вдыхании
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 72S
паров), а в тяжелых случаях наблюдают психические расстройсiна. кому, судороги и г.д. При-
чиной смерти становится аритмия или остановка сердца. Нечаянное проглатывание бензина
детьми вызывает эрозию слизистых оболочек, а впоследствии пневмонию, которая может при-
вести к смерзи ребенка. Вдыхание 10 000 ppm паров или прием внутрь 100—200 мл бензина
(керосина) часто бывает смертельным.
При пероральном введении токсиканта в качестве сорбента применяют активированный
уголь и производят трахеостомию.
Галогенопроизводные алифатических углеводородов (хлоросодержащие углеводороды)
Острые отравления хлорированными углеводородами в обшей статистике острых отравле-
ний не являются ведущими. Однако крайняя тяжесть вызываемых ими поражений, высокая ле-
тальность тают основание считать интоксикацию этими токсикантами чрезвычайно опасной.
Прежде всего опасность представляют дихлороэтан, четыреххлористый углерод, трихлороэти-
лен. в меньшей степени хлороформ и тетрахлороэтилен.
Несмотря на различия в химической структуре, перечисленные хлорированные углеводоро-
ды обладают сходными физико-химическими свойствами. Это жидкости, относительно легко-
кипяшие. с характерным сладковатым запахом, тяжетее воды, пары их — тяжелее воздуха. При
соприкосновении с открытым пламенем, нагретым металлом они разлагаются с образованием
фосгена. Особенно опасны в этом отношении трихлорэтилен и страхлорэтилен. выделяющие
фосген даже при воздействии на них солнечного света.
Хлороформ
Хлороформ — бесцветная прозрачная жидкость с резким характерным запахом, сладкова-
тым. жгучим вкусом
Используется в химической промышленности для производства пластмасс и искусствен-
ного шелка, в фармацевтической промышленности при получении антибиотиков, гормонов,
витаминов. При хлорировании воды образуется за счет взаимодействия хлора с органическими
соединениями природного и антропогенного происхождения. На долю хлороформа приходит-
ся до 80% галогенопроизводных углеводородов, образующихся в воде при ее хлорировании. В
настоящее время хлороформ в качестве анестетика в клинической практике практически пс
используется.
При воздействии паров хлороформа у пострадавших проявляются симптомы наркотическо-
го опьянения (при концентрации в 16 000 ppm). Максимально допустимая концентрация в воз-
духе составляет около 100 ppm. При приеме внутрь летальная доза колебле ся от 10 до 200 мл.
При смертельных отравлениях уровень концентрации в крови варьирует от 30 до 95 мг/мл.
Под денствием солнечного света и повышенной температуры хлороформ превращается фос-
ген При вдыхании пары хлороформа раздражают органы дыхания и воздействуют на ЦНС,
вызывая учашение пульса, аритмию, фибрилляцию желудочков, что зачастую закапчивается
внезапным сердечным приступом При попадании хлороформа на кожу в месте контакта на-
блюдаются покраснение и механическое разрушение кожных покровов. Воздействие низких
концентраций хлороформа ведет к нарушению функции печени.
Четыреххлористый углерод
Четыреххлористый углерод (тетрахлорид углерода) — бесцветная тяжелая жидкость, напо-
минающая по запаху хлороформ. Применяйся как растворитель лаков, смол, для экстракции
жиров, чистки спецодежды, заправки огнетушителей и тл.
Тяжелые отравления наступают при пероральном пути поступления в организм—от 2—4 до
15-20 мл СС14. По действию на организм СС14 является наркогиком, по более слабым, чем
хлороформ и дихлороэтан. В многочисленных случаях острых и хронических отравлений чс-
тыречхлористый углерод угнетает ЦНС, проявляет пефро- и гепатотоксичность (см. гл. 2.4)
Пролонгированное воздействие паров в концентрации 25 мкг/л и более может стать причиной
тяжелого поражения почек и печени. Острое нарушение работы почек, приводящее к смерти,
отмечается при воздействии 1000-2000 мкг/л СС14 в течение 30—60 мин. Чрезмср юе употреб-
ление алкоголя может усиливать токсические эффекты тетрахлорида углерода. Предполагают
наличие канцерогенных эффектов у этого вещества.
726 Глава 8
Примеры. У взрослого человека, принявшего 30 мл токсиканта, при поступлении в больниц}'
в сыворотке крови было обнаружено 20 мг/л. в суточной моче — 8 мг/л СС14.
У 19 пациентов, доставленных в госпиталь с симптомами тяжелого отравления, конпенгра-
ция СО, в крови составляла 0.1—32 мг/л. Олин из них погиб, остальные выздоровели.
Принявшая 300 мл СС14 29-летняя женщина была успешно вы. ечена благодаря промыва-
нию желудка и гемодиализу.
У взрослого человека, совершившего самоубийство путем вдыхания паров токсиканта, пос-
ле смерти в крови концентрация вешссгва была 260 мг/л. В биологических жидкостях и орга-
нах взрослого человека, который умер через 2 дня после того, как выпил неизвестное коли-
чество тетр, хлорида углерода, определены следующие концентрации: в крови 143 мг/л, в моче
329 мг/л. в мозге 243 мг/л. в легком 127 мг/л. в печени 59 мг/л. в почке 151 мг/л.
Концентрация геграхлорида углерода в выдыхаемом воздухе человека, подвср негося воз-
действию паров в концентрации 10 мкг/л в течение 3 ч составила 2—3 мкг/л, через 1 ч после
воздействия — 0.7 мкг/л. через 5ч — менее 0.3 мкг/л. При летальных исходах концентрация
СС14 в крови колеблется от 100 ло 200 мг/мл.
В процессе метаболизма четыреххлористого углерода (тетрахлорида углерода) образуется
свободный радикал трихлорметана (трихлорметил-раликал). который повреждает клеточные
мембраны и стимулирует в них реакции ПОЛ (рис 8-8).
Мембранный дефект приводит к резкому нарушению проницаемости в субклеточных обра-
зованиях — микросомах, митохондриях, лизосомах с накоплением в них ионов кальция. При
повреждении лизосом в цитоплазму поступают протеолитические ферменты, усугубляющие
повреждения. Происходят тяжелые нарушения метаболизма углеводов, белков, жиров. Накоп
лснис нейтральных липидов в цитоплазме клеток вызывает их жировую дистрофию.
Экспериментальные исследования на животных показали, что ло 51% абсорбированной
дозы выводится с выдыхаемым воздухом в течение 29 дней — в виде четыреххлористого угле-
рода 40% и диоксида углерода 11%. Значительные количества выводятся : мочой и фекалиями
в виде продуктов метаболизма.
В диагностике и опенке степени тяжести отравлений важными являются биохимичес-
кие показатели, в первую очередь активность индикаторных ферментов печени: аланин- и
аспартатаминотрансфераз (АЛТ и ACT), лактагдегидрогеназы (ЛДГ) и ее изоферментов, а
также билирубина. Повышение активности этих ферментов начинается при тяжелых от-
равлениях через 6—12 ч. досыпает максимума на 2 -5-е сутки и продолжается до 1-3 нед.
На высоте интоксикации показатели ферментативной активности превышают норму в сы-
воротке крови в десятки и даже сотни раз. Повышение содержания билирубина в крови
начинается в те же сроки, причем вначале наряду с типичным увеличением уровня конъ-
югированного пигмента возможно доминирование свободного (пеконъюгированного или
непрямого) билирубина. При значительной печеночной недостаточности возможно быст-
рое снижение ранее высокой ферментативной активности на фоне ухудшения общего со-
стояния. стабильного или нарастающего содержания билирубина в крови. Это грозный
предвестник печеночной комы.
Дихлороэтан
Дихлороэтан — бесцветная маслянистая жидкость. 83.5 аС, нерастворимая в воде, хоро-
шо растворимая в спирте, органических растворителях.
В качестве растворителя дихлороэтан используется в текстильной и лакокрасочной про-
мышленности, применяется для экстракции жиров, масел, смол, восков, для извлечения алка
зондов из растительного сырья, входит в состав клесв для пластмассовых изделий.
Отравление лихлороэтаном (одно из наиболее тяжелых) может наступить при его попадании
в организм как перорально, так и ингаляиионно или через кожу.
Острые пероральные отравления лихлороэтаном встреч ются чаще интоксикаций другими
хлорированными углеводородами и отличаются тяжестью поражений и высокой леталыгостгю
В клинической картине отравлений выделяют токсическую энцефалопатию, острую дыхатель-
ную и сердечно-сосудистую недостаточность, токсический гастроэнтерит, токсическую гепато-
патию и нефропатию (см. гл. 2.4). Острые ингаляционные отравления лихлороэтаном протека-
ют легче, чем пероральные. Поражения печени и ЖКТ при них выражены обычно слабее, но
начальные нарушения функций ЦНС весьма значительны.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 727
Тетрахлорид углерода
CI
- с —с«
I
Cl
Хлороформ
CI
I
-----CI
I
CI
Тетрахлорид
углерода
с------CI
I
CI
Тиофосген
Оксид
углерода (IV)
CI
I
------CI
I
CI
Тетрахгюрид
углерода
радикал
Трихлорометил-
радикал
Оксид
углерода (IV)
а
I
о—с—а
I
а
Тетрахлорид
углерода
CI
I
ОН—С—CI
I
н
С=О
Оксид
углерода (II)
а
Рис. 8-8. Схема биотрансформаыин четыреххлористого углерода.
Смертельная доза перорально 30—40 мл. Вдыхание паров дихлороэтана концентрации в
воздухе 1.25—2.75 мг/л уже опасна для жизни. Летальная копнен грация в крови 5 мг%.
При пероральном поступлении в желудке начинается быстрая резорбция, причем скорость
всасывания повышается при совместном приеме с алкоголем и жирами.
Максимальная резорбция происходит в ЖКТ в течение 3—4 ч с момента принятия токси-
канта. После поступления в кровь дихлороэтан распределяется путем свободной диффузии и
накапливается в тканях, богатых липидами. — ЦНС. печени надпочечниках, сальнике. Через
6 ч около 70^ лихлороэтчна попадает в эндоплазматический ретикулум печени (см. гл. 4).
728 Глава 8
Дихлороэтан является потенциально алкилирующим ялом, способным разрушать внутрикле-
точные структуры.
Отмечается незначительный метаболизм дихлороэтапа с образованием высокотоксичных
веществ — 2-хлороэтанола и хлороуксусной кислоты. Естественным путем детоксикации в ор-
ганизме является конъюгация хгихлороэтана с восстановленным глутатионом печени, в резуль-
тате которой образуются малотоксичныс меркатпуровыс кислоты. Однако в основном дихло-
роэган и его метабо ины выводятся через легкие и почки. С выдыхаемым воздухом выделяется
10—42%. с мочой 51—73%. незначительная час<ъ выводится через кишечник. Смерть наступает
обычно от сердечно-сосудистой недостаточности.
Токсификация (расщепление экзогенных веществ в организме до более токсичных, чем
исходные) играет ведущую роль в генезе отравлений ди хлороз ганом. что связано с деятель-
ностью микросомальных ферментов. При биотрансформапии образуются свободные радикалы
и высокотоксичные вещества: активные формы кислорода (АФК), хлороацетальдепш, монох-
лороуксусная кислота и монохлороэтанол. Эти продукты обладают выраженным сродством к
сульфгидрильным группам (SII) и активно соединяются с ними.
Нарушения функций ЦНС в сочетании с тяжелыми повреждениями тканей внутренних ор-
ганов приводят к токсическому шоку с присущими ему нарушениями циркуляции крови На-
рушения водного и электролитного баланса усиливаются в связи с потерей жидкости и солей
с рвотными массами и поносом. Развивается метаболический ацидоз.
Отравления дихлороэтаном следует дифференцировать от острой алкогольной интоксика-
ции. отравления этиленгликолем, бледной поганкой, а также эпидемического гепатита (бо-
лезнь Боткина) и других заболеваний печени Летальность при отравлении дихлороэтаном
даже в условиях стационара составляет около 50%.
Основные натоморфологические изменения проявляются в виде множественных мелкото-
чечных и пят истых кровоизлияний под плевру, эпикард, эндокард, слизистую оболочку ЖКТ.
При вскрытии от органов умерших ощущается характерный запах лихлороэтана. напоминаю-
щий запах сушеных грибов. Для судебно-химического исследования направляются желудок с
содержимым, сальник, печень, почка, головной мозг, кровь. Необходимо располагать также
сведениями о примененных методах детоксикации и лечения.
Комплексное лечение отравлений дихлороэтаном. а также другими хлорорганическими уг-
леводородами (хлоро<|юрм, чегыреххлористый углерод) включает ряд мероприятий. Методы
ускоренной детоксикации — экстренное промывание желудка 2—3 раза с интервалом 1—2 ч
(15—20 л воды с последующим введением 150 мп вазелинового пли касторового масла). При
выраженных клинических проявлениях интоксикации п определении токсических концент-
раций в крови показан гемодиализ (не менее 6—10 ч). Перитонеальный диализ проводится
стандартными растворами электролитов pH 7.6—8.4 в течение первых суток после отравления,
так как метаболиты днхлороэтана обладают кислотными свойствами. Возможно проведение
липидного диализа с добавлением интерлипида — подсолнечного или соевого масла. Проце-
дура детоксикационной гемосорбции может быть применена в первые 3 ч после отравления.
Проводится 2—3 сеанса под контролем токсикологического исследования крови.
При выраженной клинической картине отравления и высокой концентрации дихлороэтана
в крови наряду с сочетанным применением гемосорбции, гемодиализа и перитонеального диа-
лиза проводится также специфическая фармакотерапия (внутривенно ацетил тистеин с глюко-
зой) и антиоксидантная терапия (внутримышечно витамин Е). Проводят также мероприятия
с целью профилактики и лечения экзотоксичсского шока (инфузия растворов нолиглюкина.
рсонолиглюкина. гемодеза, глюкозы с инсулином), токсической коагулопатии (гепарин под-
кожно), применяют гепатопротекторы (витамины группы В. глюкоза, липокаин, кокарбокси-
лаза. липосвая и глутаминовая кислоты).
При лабораторной диагностике дихлороэтан определяют в биологических средах: крови,
моче, перитонеальной жидкости.
Метиловый спирт
Метиловый спирт широко применяется в качестве сырья при производстве фармацевти-
ческих препаратов, получении денатурированного этилового спирта, формальдегида и других
веществ. Метанол является одним из компонентов моторного и ракетного топлива. В послед-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 729
ние годы нередко используемся в составе жидкостей ТГФ-М и ИМ. являющихся равными по
объему смесями метанола с тетра гид рофурфуриловым спиртом и этил целлозольвом соответс-
твенно (см. ниже).
Случаи бытовых отравлений метанолом, как правило, возникают при нарушении правил его
хранения и использования. Из-за сходства органолептических свойств метилового и этилового
спиртов метанол ошибочно принимают внутрь вместо этанола.
Токсические свойства метанола выявлены лишь в начале XX века. Длительное время счита-
лось, что токсический эффект вызывают различные примеси, которые образуются в результате
перегонки древесины при получении метилового спирта. В свя и с этим предпринимались
попытки получения химически чистого метанола и изготовления на его основе алкогольных
напитков, что приводило к отравлениям
Метанол является сильным нервно-сосудистым ядом, обладающим выраженными кумуля-
тивными свойствами.
Токсическое действие связано с угнетением ЦНС, развитом тяжелого метаболического
ацидоза, поражением сетчатки глаза и дистрофией (ригельного нерва. Отравления возника-
ют, в основном, при приеме внутрь. Возможны также случаи ингаляционных отравлений и
отравлений! при длительном действии на большую поверхность кожного покрова. Токсические
и смертельные дозы метилового спирта варьируют в самых широких пределах. Тяжелые отрав-
ления с наступлением слепоты могут быть вызваны приемом 7—10 мл метанона. Смертельная
доза, как считают большинство авторов, составляет ИХ) мл. Вместе с тем известны случаи
наступления смерти при приеме 5 мл и выздоровления после употребления 250—500 мл. Ток-
сическая концентрация метанола в крови 20 мг%. летальная более 90 мг%.
Особую токсичность метанола связывают с замедленным процессом его окисления в ор-
ганизме и токсичностью продуктов метаболизма — формальдегида и муравьиной кислоты.
Муравьиная кислота длительное время циркулирует в организме, что приводит к тяжелейшему
ацидозу. Метанол воздействует на железо гемоглобина и клеточные ферменты, в результате
чего блокируются окислительные процессы и наступает тканевая гипоксия.
Различают три сталии острого отравления метанолом наркотическую, ацидоти.ческую и
поражение ЦНС, прежде всего снижение или потеря зрения.
В отличие от этанола, метиловый спирт вызывает слабо выраженное чувство опьянения.
Наркотическое действие метилового спирта нестойко и быстро исчезает после приема большого
количества жидкости. Состояние тяжелого похмелья с головной болью, вялостью, нарушением
координации движения сменяется тяжелым сном. Далее наступает скрыл ый период, который
может продолжаться от 12 ч до 1,5 сут. Характерно волнообразное течение отравления. Перио-
ды улучшения сменяются значительным и длительным ухудшением состояния больного.
При обследовании пострадавшего отмечают резкую синюшность кожных покровов. Кожа и
слизистые оболочки гиперемированы. Появляются тахикардия, нарушение сердечного ритма.
АД сначала повышено, затем снижено. Прогрессирует острая сердечная недостаточность в
сочетании с нарушением дыхания. О гределяегся ацидоз. Реакция мочи енльнокиелая. возни-
кав альбуминурия. В крови повышается количество гемоглобина, изменяется формула кропи.
Пострадавшие жалуются на мелькание «мушек» перед глазами, резкое снижение зрения, пере-
ходящее в слепоту.
Продолжительность жизни лиц. не получивших своевременную квалифицированную по-
мощь, не превышает 3 сут. Смерть наступает, как правило, в состоянии глубокой комы вследс-
твие паралича дыхания.
Пагалогоанатомическая картина при отравлении метиловым спиртом нехарактерна. При на-
ружном осмотре трупа отмечаются выражс тные трупные пятна с цианозом кожи лица, ушных
раковин и слизистой оболочки губ. Наблюдаются обильное кровенаполнение внутренних органов
множественные мелкие кровоизлияния, темная жидкая кровь. В случаях смерти через несколько
часов после отравления ощущается типичный запах алкоголя от органов и гю.г остей трупа.
При поступлении в ЖКТ метанол быстро всасывается и через 1 ч начинает циркулировать
в крови, где может быть обнаружен в течение 3- 4 дней. Возможны отравления при поступле-
нии метанола через кожу и при вдыхании его паров. Метиловый спирт обнаруживается также
в спинномозговой жидкости. Распределение метилового спирта в гканях зависит в основном
от содержания в них воды.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 731
Пропиловые спирты получают синтетическим путем и при перегонке сивушного масла. При
меняются в качестве растворителей.
Пропиловые спирты обладают низкой летучестью, поэтому тяжелые ингаляционные отрав-
ления практически не встречаются. Гем не менее пары пропилового спирта оказывают раздра-
жающее действие на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей.
Пероральные отравления встречаются редко, чаше всего при приеме вх есте с этиловым
спиртом.
Пропиловые спирты обладают наркотическими свойствами Характер токсического дейс-
твия сходен с этиловым спиртом. Случаи смертельных отравлений встречаются при приеме не
менее 300 мл жидкости и более. В клинической картине отравлений пропиловыми спиртами
при пероральном приеме отмечают состояние опьянения, которое в течение 2—3 час сменяет-
ся угнетением, заторможенностью, безучастностью к окружающему. При содержании в крови
15 г/л пропилового спирта через 2—4 ч могуз наступить коматозное состояние и смерть. Про-
пиловый спирт окисляется в организме с образованием пропионовой и молочной кислот. Вы-
водится из организма с выдыхаемым воздухом, мочой, калом.
Полное всасывание изопропилового спирта происходит через 2 ч. В крови он может быть
обнаружен через 30 мин после приема. 30—50% принятой лозы подвертается окислению.
В результате биотрансформании изопропилового спирта образуется ацетон, который сохраня-
ется в организме довольно долго.
После введения в желудок собакам 90 мл изопропилового спирта через 4 ч в крови обнару-
живается 0,39 г/л неизмененного спирта и 0.34 г/л ацетона. В мозге содержание изопропило-
вого спирта и ацетона составляет соответственно 0,93 и 0.49 г/л. в сердце—0.73 и 0,35 г/л.
Патологоанатомическая картина при отравлении пропиловыми спиртами нехарактерна. От-
мечаются лишь выраженные гемодинамические расстройства внутренних органов.
Для судебно-химического исследования берут 100 г крови. 300 г головного мозга, сердце,
200—300 г скелетных мыши, желудок с содержимым, одну почку и мочу.
При проведении судебно-химическою исследования на содержание пропилового спирта
следует иметь в виду, что из-за быстрою его окисления отрицательный результат не всегда сви-
детельствует об отсутствии отравления. В случае отравления изопропиловым спиртом анетон
определяется в моче до 4 сут. Учитывая, что и при некоторых заболеваниях в моче обнаружи-
вается анетон, необходимо проволигь его количественное определение
Нормальный бутиловый спирт (н-бутиловый спирт, бутанол-1) получают биохимическим пу-
тем при воздействии ферментов некоторых бактерий на кр ;мал, а также синтетическим пу-
тем при восстановлении кротонового альдегида. 4 изомера бутанола-1 объединяют под общим
названием «бутиловые спирты», хотя они различаются по свойствам и способам применения.
Бутанол-2 получают синтетическим путем.
Изобулиловый спирт (2-мегилнропанол-1) получают при перегонке сивушных масел или
синтетически из бутена. Применяется в виде эфиров уксусной, масляной и других кислогдля
получения фруктовой эссенции, в фармацевтической промышленности, парфюмерии.
Трстичный бутиловый спирт (2-метнлпропанол-2) получают синтетическим путем при гид-
ратации изобутилена, применяют в производстве синтетического каучука.
Пары бутиловых спиртов оказывают раздражающее действие иа слизистые оболочки глаз и
верхних дыхательных путей. ПДК паров 10 мг/м3.
При возд:йствик на кожу мшуг возникать экзема, дерматит, что обусловлено содержанием
в бутиловом спирте непредельных соединений (кротонового альдегида), которые образуются в
процессе его промышленного производства.
Смертельная доза бутиловых спиртов при приеме внутрь составляет 200—300 мл. Однако
наблюдаются значительные индивидуальные колебания.
Бутиловые спирты вызывают наркотический эффект с поражением ЦНС. особенно под-
корковых образований головного мозга. Клиническая картина отравления выражается в не-
продолжительном и неглубоком опьянении с последующей адинамией, расстройством зрения,
быстрым развитием комы.
Патологоанатомическая картина нс характерна. На судебно-химическое исследование на-
правляют желудок с содержимым. 100 г крови, 200 г головного мозга, 100—150 г печени, почку.
100 г легких.
732 Глава 8
Амиловый спирт имеет несколько изомеров. Основное токсикологическое значение имест
изоамиловый спирт, который является иавной составляющей частью сивушного масла, обра-
зующегося при спиртовом брожении. Используются амиловые спирты в качестве растворите-
лей лаков, смол. камеди, в парфюмерии, фармацевтической и пищевой промышленности.
При окислении изоамилового спирта образуется изовалсриановая кислота, которая в виде
метилового эфира применяется при получении валидола. Изоамилацсгат. известный под на-
званием грушевой эссенции, используется при изготовлении тортов, конфет, фруктовых вод и
т.д. Имеет приятный грушевый запах.
Отравления чистым изоамиловым спиртом из-за неприятного запаха и ограниченного до-
ступа встречаются редко. В основном это отравления спиртосодержащими жидкостями, в со-
став которых входят сивушные масла.
Амиловые спирты во много раз токсичнее этилового спирта. Наиболее токсичным является
изоамиловый снирг. Смертельная доза изоамилового спирта 10—20 мл. Для сивушных масел
выраженное состояние отравления наблюдается при приеме всего 0.5 г. Смертельная лоза ами-
лового спирта при пероральном приеме около 20—30 мл. При приеме этилового спирта, кото-
рый содержит даже небольшую примесь амилового спирта, алкогольное отравление характе-
ризуется тяжелым течением. Из-за чрезвычайно медленного окисления в организме сивушные
масла вызывают длительное состояние тяжелого похмелья.
Пары амиловых спиртов оказывают сильное раздражающее действие, что приводит к воз-
никновению ларингитов, трахеобронхитов, конъюнктивитов. В тяжелых случаях развивается
каргина острою иигв тяционною отравления с поражением ЦНС.
Амиловые спирты вызываю! наркотический эффект с резко выраженной токсичностью.
При этом поражается ЦНС, возникае! паралич жизненно важных центров продол!оватого
мозга. что приводит к смертельному исходу.
Биогрансформання первичных амиловых спиртов, к которым относится амиловый спирт,
а также его изомеры — изоамиловый спирт и вторбутилкарбипол происходит очень быстро с
образованием промежуточных продуктов реакции — альдегидов и кетонов. У крыс н валериа-
новый альдегид обнаруживается через 15 мнн после введения в кров
Патологоанатомическая картина отравлений амиловым спиртом нехарактерна. При наружном
и внутреннем обследовании трупа отмечают выраженные признаки быстро наступившей смерти
В то же время при обследовании трупа отмечается неприятный специфический сивушный
запах, особенно ог содержимого желудка, а также проявление раздражающего действия амило-
вых спиртов на слизистые оболочки пищеварительного тракта
На судебно-химическое исследование направляют ИИ) г крови, всю мочу, одну почку, желу-
док с содержимым, 200 г головного мозга, 150 г печени и 200 г легких.
При судебно-химическом исследовании достаточно провести качественный анализ на наличие
амиловых спиртов. Количественное определение, как правило, в биоматериале не проводится.
Этиленгликоль
Этиленгликоль — бесцветная сиропообразная сладковатая жидкость без запаха. Температура
кипения — 197,4 °C. Хорошо растворяется в спирте, воде, ацетоне, плохо — в эфире и жирах.
Водные растворы лиленгликоля замерзают при температуре —65 °C.
Этиленгликоль и его производные (целлозольфы. карбиголы) используются в качестве анти-
фризов, тормозных и технических жидкостей. Наибольшее распространение имеют мономстило-
ВЫЙ И МОНОЭТИЛОВЫЙ эфиры (МСТИЛ- И ЭТИЛЦСЛЛОЗОЛЬВЫ) ЭТИЛСН1ЛИКОЛЯ. Применяются в чистом
виде или в виде водных растворов. Используются как растворители, антикристаллизационные
добавки к моторному топливу, например в виде жидкости, содержащей равные объемы смеси
этилцеллозольна и метанола. В отличие от этиленгликоля, они обладают достаточно высокой
летучестью и способны вызывать не только пероральные, но и ингаляционные отравления. Цел-
лозольвы. особенно метоловым обл тают большей токсичностью, чс.м этиленгликоль.
Этиленгликоль применяется также в химической, фармацевтической и парфюмерной про-
мышленности.
Отравление эм иленгзиколем, как правило, происходит при пероральном приеме, постра-
давшие принимают техническую жидкость вместо этилового спирта, даже не предполагая, на-
сколько она токсична.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 733
Ингаляционные отравления этиленгликолем из-за малой летучести не встречаются Воз-
можно также всасывание через кожу, но этот путь поступления вещества нс имеет судебно-
медицинского значения.
Относительно смертельной дозы этиленгликоля в литературе нет единого мнения. Значи-
тельное влияние на выраженность токсического эффекта оказывают общее состояние организ-
ма и индивидуальные особенности. Большинство смертельных отравлений вызывается при-
емом 100—150 мл жидкости. Вместе с тем известны случаи наступления смерти при приеме
25—30 мл и выздоровления при приеме 250—500 мл этиленгликоля.
Токсическое действие этиленгликоля и его эфиров во многом определяется процессами его
биотрансформании и токсичностью метаболитов (рис. 8-10 и 8-11).
Этиленгликоль быстро всасывается из желудка и кишечника. Лишь частично (20—30%)
выводится почками в неизмененном виде. Большая часть этиленгликоля (до 60%) окисляется
в печени под действием алкогольдсгилрогеназы до гликолевого альдегида. гликолевой, щаве-
левой и других кислот (с.м. рис. 8-10) Особенно токсичны гликолевый альдегид, вызывающий
тяжелые поражения сосудов мозга и почек, а также глиоксиловая кислота, рч юбщающая про-
* Основной путь биотрансформации
► Вспомогательный путь биотрансформации
Рис. 8-10. Схема биотрансформании этиленгликоля (Рапу М., Wallach R., 1974). АДГ — алкогольде гид-
рогеназа.
734 Глава 8
-> Основ»- и путь биотрансформации
► Вспомогательный путь биотрансформации
Рис. 8-11. Схема биотрансформации эф< ров этиленгликоля (Ghanayem В.. Burka J.. 1987). АльДГ — аль-
депгдцег илрогеназа.
цессы окисления и фосфорилирования. В то же время ряд авторов считают, что главную роль
в токсичности этиленгликоля играет гликолевая кислота — хотя она и менее ядовита, чем дру
гис метаболиты этиленгликоля, но ее концентрация в биосредах на порядок выше, чем других
метаболитов. Определенную роль в генезе интоксикации играет щавелевая кислота. Последняя
взаимодействует с ионами кальция, образуя плохо растворимь й оксалат кальция. До 50% эти-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 735
ленгликоля и продуктов его распада уделяется через почки. Оксалаты осаждаются в стейках
капилляров, лоханках и канальцах почек действуют нс посредствен но и рефлекторным путем,
нарушают почечный кровоток и вызывают тяжелую токсическую нефропатию (вплоть до ост-
рой почечной недостаточности). Выраженные изменения происходят также в печени, поджелу-
дочной железе, ЦНС. сердечной мышпе. Гипокальциемия способствует этим нарушениям.
Целлозольвы быстро всасываются, распределяются в организме относительно равномерно,
в неизмененном вице удаляются преимущественно с мочой и с выдыхаемым воздухом. Подвер-
гаются интенсивной биотрансформаиии. преимущественно в печени. Среди двух возможных
путей биотрансформации — окисления спиртовой группы и разрыва эфирной связи — у чело-
века явно преобладает первый с образованием продуктов (метокси- к этоксиуксусных кислот),
более токсичных, чем исходные вещества (см. рис. 8-11). Основным ферментом гоксификэции
целлозольвов является, по-видимому, алкогольдегидрогеназа. Развитие интоксикации сопро-
вождается нарушениями обмена пирувата и лактата, а также кетоацидозом, свидетельствующи-
ми о серьезных сдвигах межуточного обмена.
В клинической картине отравления выделяют два этапа. В начале наблюдается наркоти-
ческий эффект и преобладают симптомы поражения ЦНС по типу алкогольного опьянения.
В крови в этот период циркулирует неизмененный этиленгликоль. Далее прогрессируют сим-
птомы поражения ЦНС, присоединяются нарушение дыхания и поражение сердечно-сосудис-
той системы.
На 2—5-е сутки в клинической картине отравления преобладают симптомы поражения по-
чек. где происходят необратимые изменения, полому элиленгликоль характеризуется как не-
фротоксикант (см. гл. 2-4). Тяжелые деструктивные изменения наблюдаются также в печени,
головном мозге и других органах.
В механизме токсического действия этиленгликоля большую роль играют его гидрофиль-
ные свойства. Этиленгликоль и продукты его метаболизма являются осмоти гески активными
веществами и вызывают гидропические изменения клеток. Проникая в клетку, молекула эти-
ленгликоля увлекает за собой жидкость, наручная клеточную структуру вплоть до ее гибели.
Возникает резкая гидропическая дистрофия с образованием так называемых клеток-пузырей,
что приводит к гибели клеток. Этот процесс наблюдается в эпителии проксимальных отделов
почечных канальцев, где происходит реабсорбция жидкости. что и является одной из причин
развития острой почечной недостаточности
Диагностика отравления этиленгликолем затруднительна, так как на первом этапе клиника
отравления сходна с алкогольным опьянением, пострадавшие часто скрывают факт употреб-
ления жидкости, поэтому диагноз отравления ставится с большим опозданием или только на
вскрытии.
В случае смерти в течение 2—3 дней с момента отравления при патологоанатом нчсском
исследовании обнаруживают морфологи геские изменения — поражение сосудистой сети, в
первую очередь эндотелия сосудов и кристаллы оксалата кальция в препаратах почек.
В случаях смерти в период выраженной почечной пато; огни наблюдается гидропическая
дистрофия эпителия проксимальных отделов извитых канальцев ночек, которая переходит в
некротический некроз с появлением очаговых кровоизлияний в корковом слое. В почках по-
являются кристаллы оксалатов. Наблюдаются также центролобулярная гидропическая дистро-
фия и некроз печени, выраженные кровоизлияния в головном мозге, легких и других органах
вследствие поражения стенок сосудов.
Для судебно-химического исследования отбирают 150—200 г печени и мозга, одну почку’,
всю мочу, желудок с содержимым.
При опенке результатов судебно-химического исследования следует иметь в виду, что эти-
ленгликоль обнаруживается в моче лишь в течение 48 ч после отравления. Далее сю концент-
рация в биологических жидкостях и внутренних органах резко снижается.
При исследовании крови, мочи, внутренних органов трупа максимальная концентрация
этиленгликоля отмечается в моче через 1—2 ч после поступления в организм, которая в 4—
5 раз выше таковой в печени и почках и в 8—10 раз в тканях, головном мозге, легких, скелет-
ных мышцах.
Важным диагностическим признаком отравления этиленгликолем является обнаружение в
моче кристаллов оксалата кальция.
736 Глава8
Большое значение при постановке диагноза отравления имев! исследование остатков жид-
кости. взятой на месте происшествия, а также рвотных масс и промывных вод желудка.
Методы детоксикации при отравлении гликолями: промывание желудка через зонд, фор-
сированный диурез: в 1—2-е сутки проведение гемодиализа, перитонеального диализа, гемо-
сорбиия при раннем эндотоксикозе. Специфическая терапия: в I—2-е сутки назначение 30%
раствора этилового спирта внутрь по 50 мл через 3 ч или 5% раствор внутривенно (1-2 г 96
этилового спирта на 1 кг массы тела в сутки). Внутривенно по 10—20 мл 10% хлористого каль-
ция или глюконата кальция (для связывания образующейся шавелевой кислоты). Метилпира-
зол 20 мг/кг внутрь 2 раза в сутки в течение 3—5 дней (лля снижения активности алкоголь-
дсгилрогеназы). Симптоматическая терапия — как при тяжелой алкогольной интоксикации.
При возбуждении назначают 10 мл 25% раствора сульфата магния внутримышечно. проводят
спинномозговую нункнию. Лечение ацидоза: внутривенно 4% раствор гилрокарбоната натрия
до 1000—1500 мл в сутки. При поступлении в стационар больных через 3—5 сут после отрав-
ления с явлениями острой печеночно-почечной недостаточности применяют гемодиализ, при
его безуспешности необходима пересадка донорской почки.
Диэтиловый эфир
Днэтиловый эфир (эфир, этиловый эфир) — летучая огнеопасная жидкость, которую ис-
пользуют прежде всего как растворитель при изготовлении синтетических красителей и пласт-
масс. Это был первый успешный препарат для наркоза, сейчас его редко применяют из-за
воспламеняемости и раздражающего действия.
Обезболивание наступает при концентрации эфира в крови 100—500 мг/л. наркоз — при
1200 мг/л. Воздействие более высоких концентраций вызывает депрессию ЦНС, при этом
возникает тошнота, дыхание становится нерегулярным, понижается температура тела, урежа-
ется пульс. Концентрация 100 000 ppm приводит к быстрому смертельному исходу. Признаки
токсичности при хроническом употреблении эфира проявляются потерей аппетита, головной
болью, истощением и психическим расстройством.
Более 90% лозы эфира выводится с выдыхаемым воздухом и небольшое количество экскре-
тируезся с мочой в неизмененном виде, при метаболизме образуются незначительное количес-
тво ацетальдегида. углекислый газ и вода.
Формальдегид
Формальдегид — газ при комнатной температуре. Формальдегид характеризуется резким
раздражаюшим запахом и денатурирующим действием на белки. Формальдегид широко ис-
пользуют в промышленности при производстве пластмасс, синтезе лекарственных и других
соединений, как компонент изоляционных материалов изданиях, а также в внле формалина —
40—35% (обьсм/объсм) водного раствора ( консервант при хранении биологических матери-
алов или фиксатор гистологических препаратов). Вдыхание паров формальдегида в высокой
концентрации вызывает тяжелое воспаление слизистой оболочки носоглотки, отек гортани,
дыхательных путей и воспаление легких. Признаками перорального приема формальдегида
при несчастном случае или с целью самоубийства являются повреждение пищеварительного
тракта, включающее эрозию, язву или 1 рободенис, анидоз. а также почечная недостаточность,
проявляющаяся олигурией шли анурией.
Формальдегид окисляется в муравьиную кислоту в эритроцитах и печени, затем расщепля-
ется до углекислого газа и воды. Муравьиная кислота является основным токсичным продук-
том метаболизма формальдегида; она нарушает окислительное фосфорилирование в сетчатке
глаза, в которой возникает недостаток аленози1при(|юсфорной кислоты (А ГФ). Пострадавшие
почти всегда жалуются на резкое снижение зрения, которое при тяжелом течении заканчива-
ется слепотой.
Максимально допустимая концентрация в воздухе паров формальдегида 1 ррпл. а прием от
30 до 60 г формалина внутрь приводит к смерти.
При р< заражении желудка используют 0.2% раствор аммиака. 1—2% раствор гилрокарбона-
та аммония, молоко или теплую воду. Пациентам с тяжелым отравлением проводят гемодиализ
в сочетании с кислородными ингаляциями.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 737
Ацетон (диметилкетон, пропанон)
Листон является хорошим растворителем многих веществ. Используется в лакокрасочной
промышленности, при производстве бездымного пороха, ацетатного искусственного волокна,
каучука, некоторых лекарственных вешестн.
Отравления, как правило, носят случайный характер, нередко встречаются у лиц в состо-
янии алкогольного опьянения Острые отравления ацетоном возможны при вдыхании паров
в высокой концентрации и всасывании через кожу. При попадании внутрь и вдыхании паров
ацетона наблюдаются опьянение, головокружег нс слабость, шаткая походка, тошнота, боли в
животе, коллапс, коматозное состояние. Однако коматозное состояние нс достигает большой
глубины Слизистая оболочка полости рта и глотки отечна, воспалена. Изо рта чувствуется
запах ацетона. Возможны серьезные поражения печени (токсический гепатит) и почек (сниже-
ние диуреза, появление белка и эритроцитов в моче). При выходе из коматозного состояния
часто развиваются бронхит и пневмония.
Токсическое действие ацетона мпо ообразно. Помимо поражения мисиих отделов ЦНС.
ацетон yiистает активность окислительных ферментов, которые участвуют в его метаболизме,
например цитохром 2Е1 (CYP2E1). Первая помошь вывести пострадавшего на свежий воздух,
при обмороке давать вдыхать нашатырный спирт, покой, горячий чай. кофе
При оценке клинической картины учитывается. насколько быстро нарастают симптомы
отравления в зависимости от принятой дозы При употреблении менее 50—70 мл ацетона от-
равление протекает со скрытым периодом до 1 сут и более, при приеме 80—100 мл симптомы
тяжелой интоксикации с потерей сознания и развитием комы нарастают быстро Ацетон воз-
действует на дыхательный центр, вызывая его паралич. Повторяющаяся остановка дыхания
возможна через 45—60 мин после перортльного приема ацетона.. При принятии больших доз
ацетона смерть наступает через 6—12 ч после приема. Тяжелое ингаляционное отравление воз-
можно при содержании анезона в воздухе 2.3- 3 мг/л. максимальная допустимая концентрация
500 ррт, воздействие 1200 ррт или прием внутрь 60—75 мл ацетона опасно и может привести
к смерти Токсическая концентрация ацетона в крови 20—40 мг%. детальная 55 мг%.
При вдыхании паров ацетона его содержание в крови постепенно нарастает ло наступления
динамического равновесия с концентрацией в воздухе Установлено, что после распределения
в организме концентрация ацетона во внутренних органах уменьшается в следующей последо-
вательности’ головной мозг, селезенка, печень, поджелудочная железа, ночки, легкие, мышцы,
сердце. При концентрации ацетона в крови 330 мг/л коэфт] иннент распределения моча/кровь
составляет 1,34.
В организме ацетон окисляется в ацетат и формпат со скоростью 1 и 3 мг/(к1 ч) соответс-
твенно. В результате биотрпнеформании происходит незначительное образование изопропано-
а. Уровень изопропанола у больных диабетическим кетоацидозом может достигать 300 мг/л.
Выделение ацетона из организма с выдыхаемым воздухом происходит в виде как неизме-
ненного ацетона, так и диоксида углерода — одного из продуктов его прсвра пения Неизме-
ненный ацетон интенсивно экскретируется почками в течение первых 2—3 ч. затем процесс
з» мсдляется, но продолжается в течение суток. При высокой концентрации в крови наиболь-
шее количество ацетона экскретируется через легкие, с мочой выводится менее 3%. Возможно
также выделение ацетона через кожу
Ацетон является продуктом обмена веществ, в норме его содержание в крови составляет
0,5—2.0 мг . в суточном объеме мочи — 20—30 мг. Уровень кетоновых тел. включающих аце-
тон. ацетоуксусную кислоту и 0-1 илроксибугират, возрастает в организма при голодании, когда
не происходит окисления углеводов, а также при нарушениях обмена вешеств. что приводит к
повышению содержания ацетона в моче
При судебно-медицинском исследовании трупа специфические признаки отравления аце-
тоном не обнаруживаются.
Для судебно-химического исследования берут 100 г крови, всю мочу, желудок с содержи
мым. НИ) г головного мозга, 100 г печени. 200 г ткани легкого и селезенку Наиболее часто для
исследования используют кровь и мочу.
При судебно-химическом исследовании на наличие ацетона необходимо проводить диффе-
ренциальную лиа ностику с изопропиловым спиртом, который подвергается метаболическим
превращениям до ацетона (при отравлении изопропанолом в крови уровень ацетона достигает
738 Глава 8
токсического). Необходимо также учитывать, что при диабетической коме уровень ацетона в
крови может достигать 30—55 мг%, т.е. токсического и летального.
Бензол
Бензол — прозрачная бесцветная или светло-желтая жидкость со сладковатым аромати-
ческим запахом. Легко воспламеняется, нерастворим в воде, легко растворим в большинстве
орган ичес ки х раствори теле й.
Бензол используется в качестве исходного сырья для синтеза стирола, фенола, циклогекса-
на. при производстве красок, растворителей, резины, пластмасс и фармацсвгических препара-
тов В следовых количествах бензол обнаружен в сигаретном дыме, питьевой воде.
Бензол тяжелее воздуха. В закрытых, плохо вентилируемых помещениях вдыхание паров
бензола может вызвать асфиксию. При остром отравлении симптомы схожи с симптомами от-
равления другими ароматическими углеводородами. Вдыхание паров бензола вызывает раздрг
жснис кожи, роговицы глаз (с помутнением зрения), респираторного тракта, депрессию ЦНС
и аритмию. Хроническое воздействие может спровоцировать анемию, изменения иммунной
системы, лейкемию вследствие поражения хромосом (см. гл. 2.4).
Трансдермальная абсорбция происходит медленно, всасывается около 0.2% бензола от нахо-
дящегося в воздухе помещения. При ингаляционном пути поступления всасывается около 50%
бензола. Концентрация бензола в крови у некурящих жителей европейских городов составляет
в среднем 0,2 мг/л. у курильщиков — 0,4—0 6 мг/л. При ингаляционном воздействии 25 ppm
бензола в течение 2 ч максимальная концентрация бензола в крови достигает 200 мг/л.
Попадание бензола в глаза вызывает резкую боль с отслоением роговины. При продолжи-
тельном или хроническом контакте бензол раздражает кожу, так как он ее обезжиривает, вы-
зывая локальную эритему, жжение, в более тяжелых случаях экзему и волдыри.
Эффекты острого ингаляционного отравления бензолом (неврологические, дермшгыгые.
респираторные, гастроинтестинальные) возникают немедленно. Неврологические эффекты
преимущественно обусловлены прямым воздействием бензола на ЦНС. Так, они уже заметны
после ингаляций высоких доз бензола (3000 ppm в течение 5 мин). Эффекты средней тяжести
включают головную боль, головокружение, потемнение в глазах, помутнение сознания, рвоту,
пошатывающуюся походку. Более тяжелыми эффектами являются тремор, подавление дыха-
тельной функции, потеря сознания, кома и смерть. Потеря сознания может быть весьма про-
должительной, хотя у большинства людей сознание возвращается вскоре после прекращения
воздействия бензола на организм.
Воздействие высоких концентраций паров бензола (более 1000 ppm) сг ижает восприимчи-
вость сердечной мышцы к адреналину, вызывая опасные аритмии, например фибрилляцию
желудочков. Эти эффекты обычно обратимы при прекращении воздействия бензола на орга-
низм.
Повторяющееся воздействие вьсокой концентрации бензола может вызвать необратимые
изменения ЦНС и заболевания крови (тромбоцитопению, апластическую анемию, панцитопе-
нию, острую миелоидную лейкемию). Вод растворимые метаболиты бензола, образующиеся в
печени, вызывают угнетение гемопоэза.
Бензол — признанный канцероген человека. Гематологические новообразования, такие, как
миелоидная лейкемия, возникают при хроническом воздействии or 10 ppm бензола.
Восстановление от воздействия бензола занимает 1—4 нед. В течение 2 нед после отравле-
ния наблюдаются нарушение походки, нервозность, раздражительность одышка. Нарушение
сердечной деятельности и пожелтение кожи могут сохраняться в течение месяца.
При приеме внутрь всасывается около 90% бензола. После перорального приема бензола
наблюдаются острые токсические эффекты: жжение слизистой оболочки рта. пищевода и же-
лудка, головокружение, рвота, боль в абдоминальной области. В организме бензол накаплива-
ется преимущественно в жировой ткани, что связано с его липофильностью. Наиболее высокие
концентрации бензола наблюдаю гея в мозге.
1 стальная доза бензола составляет 50—70 мл, но зарегистрированы смертельные случаи при
приеме 15 мл. При смертельном отравлении от перорального приема бензола были зафикси-
рованы следующие конц играниг в крови 38 мг/л, в моче 20 мг/л, в мозге 253 мг/кг, в почках
21 мг/кг, в печени 105 мг/кг. Смерть при отравлении бензолом наступает от г сстезиругощсго
Метаболизм и определение токсикантов различнь х химических групп... 739
действия (утетенис дыхательного центра) или сснсибилизиронйния миокарда (возникновение
фатальных аритмий).
Токсичность бензола в большой степени обусловлена образованием ряда свободных радика-
лов. что связано с активацией цитохрома Р450.
Образование метаболитов бензола, преимущественно » печени сопровождается их транс-
портом в костный мозг и другие органы. Существует несколько механи ьмов воздействия ме-
таболитов бензола на костный мозг. Так. ковалентное связывание гидрохинона с про теином
объясняет ингибирование клстоитого деления. Повреждение ДНК вызывает подавление де-
ятельности костного мозга, ‘по приводит к развитию апластической анемии, дисплазии кост-
ного мозга и миелоидной лейкемии. Существует множество свидетельств того, что метаболиты
бензола играют ключевую роль в проявлении его токсичности.
На рис. 8-12 показан один из механизмов (А) первой стадии биотрансформании бензола.
Цитохром Р450 генерирует пероксид водорода, окисляющий NADPH с образованием свобод-
ного радикале ОН", который в свою очередь гидроксилирует бензол.
Цит Р450 + NADPH + Н~ + О2 -» Циг Р450 + NADP* + НООН
НООН -» 2 ОН
Бензол + ОН’ -* Фенол
Рис. 8-12. Механизм А первой стадии биотрансформацни бензола.
глюкуронидов
Возможен другой путь биотрансформании бензола (рис. 8-13). Первым продуктом биотранс-
формаиии является оксид бензола, который неэнзиматическим путем превращается в фенол.
Оксид бензола может также гидра тироваться эноксидшдролазой в 1.2-гидроксибензол, кото-
рый потом окисляется в катехол. Реакцию оксида бензола с глутатионом катализирует глута-
nion-S-грансфераза. что приводит к образованию премеркаптуровой кислоты. Фенол в свою
очередь может быть далее гидроксилирован до гидрохинона или катехола.
Бензол метаболизируется в печени и выводится почками. От 16 до 41% бензола выводится
в неизмененном виде легкими за 5—7 ч. 0.1% бензола экскретируется с мочой в неизмененном
виде. При изучении кинетики элиминирования бензола из организма человека установлены
два периода полувыведения — 1—3 ч и 9—24 ч. Через 48 ч 51—87% бензола экскре пзруется с
мочой в виде фенола. 6% в виде катехола и 2% в виде гидрохинона. Фенольные метаболиты вы-
деляются в форме конъюгатов — сульфатов и глюкуронидов Другие обнаруженные метаболиты
бензола включают 1.2.4-трипщроксибензол, муконовую кислоту, фенилмеркаптуровую кислоту
и углекислый газ. Кроме 1-фенилмеркяптуровой кислоты, выводятся такие меркантопроииюл-
ные. как 6 ^ацсзилцистеинил-Б-З.З-ииклогексадпснол и 2,5-дигилрокспфенитмеркаптуровая
740 Глава 8
П-Бензохянон 1.2.4-Тригцдроксибенэоп
Рнс. 8-13. Вариант Б первой стадии биогрансформации бензола.
кислота. В моче также обнаружены 2 ациклических метаболита бензола — гране транс-муконо-
вая кислота и 6-гидрокси грапс-транс-2,4-гексадисновая кислота (рис. 8-14).
Толуол
Толуол — ароматический углеводород, применяется в промышленности в качестве раство-
рителя и исходного вещества для органических синтезов. Толуол — основной компонент (or 60
до 70%) в различных растворителях и разбавителях такокрасочных материалов, вхшнт в состав
клеев и других средств, часто использующих в быту.
Эффект толуола подобен бензолу, хотя его хроническое токсическое действие менее опасно,
но острое отравление толуолом выражено зна шгельнее, чем отравление бензолом.
У токсикоманов с зависимостью от толуола (при копие гтрации токсиканта в крови менее
1.0 мг/л) в выдыхаемом воздухе чувствуется запах толуола. При концентрациях толуола в крови
1,0—2,5 мг/л проявляются признаки интоксикациями, при 2.5—10 мг/л наблюдается выражен-
ная интоксикация с галлюцинациями, что в половине случаев требует срочной госпитализации.
При уровне толуола в крови выше 10 мг/л наступает потеря сознания, в тяжелых случаях —
смерть.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 741
1. Конъюгаты в виде ульфатов и глюкуронидов
O(S.G)
2. Меркаптуроеые кислоты
6-Г1-ацетилцистеинил-
S-1 иклогексадиен
н н
I I
НООС— С = С — С = С — CHjOH
н н
3. Ациклические метаболиты
Н Н
6-гидрокси-трэнс-транс-2.4-
гексадиеновая кислоте
НООС — С - С — С = С —СООН
I I
н н
Транс- транс-муконовая кислота
Ы7-фенил гуанин
Рис. 8-14. Конъюгаты бензола.
Зависимость от толуола (токсикомания) приводит к гспато-. нефропатии и острому метабо-
лическому анидозу с гиперкалиемией и гиперхлоремией.
Случайные отравления часто происходят на лакокрасочных предприятиях при контакте
кожи с толуолом или вдыхании его паров.
Воздействие паров толуола в концентрации 200—500 ppm влечение нескольких недель вызыва-
ет головную боль, тошноту, слабость, нарушение координации движения и потерю памяти. Кон-
u нтрапия 500—1500 ppm вызывает похожие, но более выраженные эф<|>екгы. 10 000—30 000 ppm
толуола в воздухе может привести к спутанности сознания, состоянию опьянения и коме.
Тг_, толуола из крови в среднем составляет 4,5 ч и может варьировать в пределах 3—6 ч.
Последующее выведение оставшегося количества толуола продолжается в среднем 36 ч. эго
связано с элиминацией из жировой ткани. Установлено, что опюшение концентрации в крови
и плазме равно 1.7. Средине концентрации толуола при остром отравлении его парами со-
ставляют: в крови 22 (10—79) мг/л. в моче 3 (1—5) мг/л, в ледком 12 (3—35) мг/кг. в моете 47
(10—182) мг/кг, в почках 21 (11—39) мг/кг. в печени 43 (13—73) мг/кг. Около 80% принятой
дозы толу ла окисляется до бензойной кислоты. которая затем конъюгирует с глюкуроновой
кислотой или глицином и выводится с мочой. 20% дозы выводится в неизмененном виде с
742 Глава 8
выдыхаемым воздухом и менее 0.1*» — с мочой. В суточной моче окаю 68% дозы приходится
на глициновый конъюгат (гиги уровую кислоту). Т, .которого 2—3 ч.
Считается, что толуол в незначительной степени окисляется в о-, м- и п-крезолы. которые,
вероятно, выделяются с мочой в виде конъюгатов. п-Крезол — обычный компонент мочи чело-
века. присутствующим в концентрации 20—200 мг/л; воздействие 200 ррт толуола увеличивает
этот уровень только на 10 мг/л. В норме о-крезол и м-крезол не содержатся в моче, их при-
сутствие (в концентрации 1—3 мг/л) показывает взаимосвязь с интенсивностью воздействия
толуола
Ксилол
Три изомера ксилола являются компонентами углеводородов нефпг. Промышленный кси-
лол состоит из 75—85% м-изомера и только 5% п-изомсра. Ксилол (как растворитель) входит
в состав красок, лаков, очищающих средств, пестицидов, содержится в бензине и керосине, в
лабораторных условиях используется в подготовке гистологических образцов. Ксилол хорошо
всасывается при вдыхании и контакте с кожей, его токсичность сходна с толуолом.
Концентрации ксилола в воздухе 200 ррм и более вызывают раздражение слизистых оболо-
чек. тонгногу, рвоту, головокружение и нарушения координации. При концентрации ксилола в
крови свыше 3 мг/л. возможной при экспозиции 300-400 ррм. симптомы интоксикации более
значительные — происходит повреждение вестибулярной системы. При концентрации кси. ста
в воздухе около 10 (XX) ррм наблюдают потерю сознания, угнетение LLIIC. возможна внезапная
смерть. Хронической интоксикации ксилолом среди людей отмечено нс было. Смертельная лоза
ксилола при пероральном употреблении менее 15 мл. У лиц. намеренно употребивших большое
количество ксилоле. в крови (после вскрытия) концентрация составгша 100 мг/л и более.
Изомеры ксилола быстро метаболизируются главным образом в результате окисления ме-
пыьной группы соответств нно в о-, м- или гг-толуоловую кислоту; 72% принятой дозы вы-
водится в виде этих метаболитов с мочой через 18 ч в виде глициновых конъюгатов, а также в
виде о-. м- и п-метилгиппуровой кислот. Происходит также гидроксилирование кольца кси-
лола и около 2% лозы выводится с мочой соответственно как ксиленол (2.6-диметилфснол).
вероятно, в конъюгированной форме. Только около 5% дозы выводится в неизмененном виде
при дыхании и менее 0,01% неизмененного ксилола — с мочой.
У хлоровою человека гилпуровыс кислоты, в том числе метилппгпуровыс кислоты, не явля-
ются продуктами метаболизма, выделяющимися с мочой. Концентрации в моче м-мстнлгип-
ггуровых кислот у лии. подвергшихся воздействию ксилола в концентрациях 100 и 200 ррм в
течение 8 ч. составили 1.9 и 4,6 мг/л соответственно. Выведение м-метилгиппуровых кислот в
составе мочи увеличивается в течение 8-часовой экспозиции, но стремительно снижается по
окончании экспозиции; Т1/3 ксилола оценивается по выведению метаболитов в составе мочи
примерно в 1.5 ч.
Нитробензол
Нитробензол — жидкость при комнатной температуре с характерным запахом горького
миндаля, хорошо абсорбируется при вдыхании паров, всасывании или контакте жщ кости с
кожей.
ПДК в волнухе производственного помещения I ррт (5 мг/м’). Установлено, что у рабо-
чих, ежедневно по 8 ч контактирующих с нитробензолом со средней концентрацией в воздухе
19 мг/м . средние уровни метгемоглобина в крови достигают 4.3% (см. гл. 2.4).
Нитробензол метаболизируется в организме путем окисления до п-нитрофенолэ или вос-
становления до анилина, который в дальнейшем окисляется до п-амннофснола (рис. 8-15).
Нитрозобеггзол и фснилгилроксиламин. представляющие собой высокотоксичные соединения,
образуются в качестве промежуточных продуктов при восстановлении нитробензола в анилин
(см гл. 2.4). Около 13—16% первоначальной дозы выделяется с мочой в виде п-питрофегюла и
менее 10% — в виде п-аминофенола. Оба вещества выводятся в форме конъюгатов с серной
или глюкуроновой кислотой. Т нитробензола составляет около 60 ч. Т,, п-нитрофенола и
п-амнно<|>енола — 84 ч. а последующее постепенное выведение проюлжается в течение 22 дней.
Воздействие 3—6 рргп нитробензола в течение нескольких часов вызывает головную боль и
повышение концентрации метгемоглобина в крови. Например. У человека после внутривенно-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 743
го введения 4 мл цветной гущи наблюдались
слабость, цианоз, уровень метгемоглобина до-
стиг 40%, концентрация нитробензола в кро-
ви составляла 1.1 мг/л. У пожилого мужчины,
который принял внутрь 250 мл нитробензола,
развилась кома, почечная недостаточность,
уровень метгемоглобина достиг 70%; проба
крови, взятая через 2 дня после приема, по-
казала наличие 3.2 мг/л нитробензола смерт ь
наступила иа 3-й сутки.
При длительном воздействии возникает'
сильная головная боль, нианоз. анемия, го-
ловокружение. тошнота, потеря аппетита и
чувствительности в конечностях, резкая сла-
бость. Многочисленные случаи острою неле-
гального и летального отравления вследствие
всасывания или контакта с кожей нитробен-
зола происходили в начале XX века, когда это
вещество было обычным компонентом мыл,
краски для обуви, чернил и других средств
бытовой химии
Рис. 8-15. Схема биотрансформании нитробензола.
Фенолы и их производные
Фенолы и их производные широко применяются в нефтяной, химической и фармацевтичес-
кой промышленности. при производстве красителей, взрывчатых вешеств, резины, пластмасс
и в сельском хозяйстве. Использусгся в качестве дезинфицирующего средства для т влетов,
загонов для скота, вьнребных ям, площадок и канализационных труб, а также как экстракци-
онный растворигель лля очистки нефти. Три наиболее важных сферы применения фенолов
производство фенольных смол, бифенола А и капролактама.
Фенол легко абсорбируется через кожу и в ЖК1 а пары фенола легко абсорбируются
в легких. Он быстро всасывается в кровь. Степень резорбтивного действия при попадании
иа кожу зависит от плошали поражения и характера жидкости, в которой растворен фенол.
В организме часть фенола окисляется, а часть связывается с белками, вызывая их свертывание.
Промежуточными продуктами биотрансформании являются двухатомные фенолы — гидрохи-
нон и пирокатехин. Около 80% всосавшегося в кровь фенола выводится с мочой в виде эфиров
серной и глюкуроновой кислот. Некоторое количество фенола выводится в неизмененном
виде. Наибольшее количество фенола и сю метаболитов выводится в течение первых 2—3 ч.
выделение прекращается через 24 ч.
Токсическое действие фенола связано с концентрацией свободного фенола в крови. Острое
отравление фенолом проявляется в вазодилатации, сердечной недостаточности, гипотермии,
коме и остановке дыхания. При приеме внутрь фенол вызывает сильную абдоминальную боль
и жжение во рту. Фенол оказывает воздействие на моторные центры в спинном мозге, что
приводит к появлению дрожи и сильных судорог. Пострадавшие ощущают боль по ходу пи
шевода и в желудке. Уже через I—2 мин появляются резкая слабость, головокружение, шум в
ушах, слюнотечение и т.д. Очень быстро, обычно через 5—10 мин. наступает потеря сознания
и развивается коллаптоидное состояние с учащением пульса до 120—170 в минуту. Возникают
судороги, и при явлениях паралича дыхания и сердечной деятельности наступает смерть.
При попадании на кожу местное действие сочетается с общетоксическим, резорбтивным.
Вначале пострадавший ошушает покалывание в области пораженного участка. а затем — оне-
мение. Анестезия способствует более активной резорбции. Кожа приобретает белесоватую
окраску, сморщивается. Если жидкость немедленно не удалена, развивается так называемая
фено ьная гангрена вследствие глубокого проникновения фенола в ткани и повреждения сосу-
дов. Прием внутрь человеком 1 г фенола приводит к смертельному исходу. Почти каждый 2-й
зафиксированный случай ociporo отравления фенолом закапчивается смертью.
Хроническое отравление фенолом встречается относительно редко
744 Глава 8
Патолоюапатомическая картина острого отравления фенолом обусловлена концентрацией
принятою внутрь раствора и временем, прошедшим после отравления. При приеме концент-
рированного раствора (карболовой кислоты) при наружном осмотре трупа отмечаются ожоги
кожи липа вокруг рга. слили стой оболочки губ и языка. Основные изменения наблюдаются в
пищеварительном тракте, на слизистые оболочки которого фенол оказывает прижигающее и
обе поживающее действие, вызывая некроз. Резкий характерный запах помогает распознать
отравление фенолом
На судебно-химическое исследование направляют желудок с содержимым, всю мочу. 100 .мл
крови. 100 200 I головного мозга, одну почку. 200 г печени и сердце. В случаях быстрой
смерти после отравления фенолом химико-токсикологическое исследование имеет решающие
значение при установлении причин смерти, так как фенол быстро окисляется и выводится из
организма.
Крезолы
Чистый крезол представляет собой смесь орто- (о), мета- (м) и пара- (п) изомеров, в то время
как технический крезол (иногда так называют смесь крезолов) представляет собой смесь крезо-
лов. ксиленолов и фенола, в которой 50% вешества имеет температуру кипения выше 204 С.
Лизол — раствор крезолов (60% крезолов и 40% мыльного раствора) — темно-бурая жидкость
с сильным характерным удушливым запахом, маслянистой консистенции, выраженными де-
зинфицирующими свойствами. Он применяется в качестве дезинфицирующего средства, в су-
дебно-медицинской практике известны случаи острого отравления лизолом при ошибочном
употреблении внутрь вместо алкогольного напитка.
По токсическому воздействию крезол подобен фенолу. Он может абсорбироваться через
кожу, дыхательную систему и ЖКТ. Степень проникновения через кожу в большей степени
зависит от площади поверхности, чем or копнен грации.
Крезолы после поступления в организм, точно так же. как и фенол, бь стро переходят из
крови в ткани организма и довольно быстро выделяются почками. Часть крезола окисляется
до гидрохинона и пирокатехина, а оставшаяся ббльшая 1асть выводится неизмененной либо в
соединении с глюкуроновой или серной кислотой. Через 12—14 ч примерно равное количес-
тво крезолов содержится в печени, почках, легких, несколько меньшее — в головном мозге и
скелстн' и мускулатуре. Крезолы являются промежуточными продуктами белкового обмена и в
норме содержатся в моче живых лип в количестве около 0.018 г/л или около 87 mi в суточном
количестве.
Как и фенол, крезол является общим протоплазматическим ядом и токсичен для всех кле-
ток. Локальное воздействие концентрированных растворов разрушает кожу и слизистые обо-
лочки. а разбавленные растворы вызывают покраснение кожи, появление волдырей и язв
Контакт с кожей приводит к периферийному лицевому невриту, ухудшению функции почек и
даже некрозу печени и почек. У чувствительных людей растворы с концентрацией менее 0,1%
могут вызвать сенсибилизапноннып дерматит (см. гл. 2.4). Крезол является сильным депрес-
сантом сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, в частности костною и спинного
мозга. При приеме внутрь появляется ощущение жжения во рту и пищеводе, может появиться
рвота. Системная абсорбция приводит к сосудистому коллапсу, шоку, понижению гемперату
ры тела, потере сознания, ухудшению дыхания и смерти. Предполагают, что летальная доза лля
человека составляет около 10 г.
У трупов лиц, умерших в результате резорбции лизола через кожу, кожные покровы (в мес-
те действия токсиканта) имеют окраску от коричневато-розовои до светло бурой, скользкие на
ощупь. эпидермис частично или полностью отсутствует, дерма обнажена. От кожи ощущается спе-
цифический запах лизола. На судебно-химическое исследование направляют желудок с содержи-
мым. 100 мл крови, всю мочу. 100—200 г головного мозга, одну почку. 200 г печени и селезенку
Синильная кислота и ацетонитрил (метилцианид)
Синильная кислота и ее соли (см. гл. 8.3)
Ацетонитрил — прозрачная жидкость. Используется в лабораториях и промышленности как
растворитель. Пороговое значение в атмосфере промышленной зоны 40 мкг/л.
Метаболи; м и определение токсикантов различных химических групп.. 745
В крови и плазме ацетонитрил обнаруживается только при отравлении. Однако метаболиты аце-
тонитрила - цианид и тиоииоиат - обнаруживаются в крови человека (см. гл. 8.3). В норме у людей
концентрация цианида в крови не превышает 0.04 мг/л. а тиоиионата в плазме менее 12 мг/л.
Пары ацетонитрила при концентрации 0.5 мг/л раздражают слизистую оболочку, а при более
высокой концентрации появляются слабость, тошнота, судорот и и может наступить смерть.
Например. У 6 лиц. которые погибли вследствие случайного орального приема 0,5—2.4 г/ki
ацетонитрила, его концентрации в крови составляли 160—800 мг/л (в среднем 573 мг/л). а кон-
центраты цианида в крови —2,4—15 мг/л (6.2 мг/л).
Тетраэтилсвинец
Теграэти.1свипеи(ТЭС)|(С,Н5)4РЬ|—бссцвег1 тая. маслянистая жидкость, плот ность 1.65 г/см’,
при температуре кипения 195 °C разлагается. ТЭС применяется в составе этиловой жидкости.
Этиловая жидкость — маслянистая жидкость с характерным фруктовым запахом; плотность
1.5—1.7 г/см' — смесь 50—62% по массе ютраэтилениппа (тстрамегилсвипиа) с лилбромидом,
либромэтаном и другими галогенопроизводными углеводородами, способствующими удале-
нию свинца из двигателя. Применяется как катализатор полимеризации олефинов, винилхло-
рида и акрилонитрила, алкилирования углеводородов, сульфохлорирования и хлорирования,
присоединения тиолов по кратным связям, синтеза индола из анилина и ацетилена; добавка
к серосодержащим смазочным маслам; наполнитель в счетчике Гейгера; как антидетонатор
моторного топлива в карбюраюрных двигателях внутреннего сгорания. ТЭС сильно ядовш
Этилированный бензин часто окрашен в оранжевый, красный или синий цвет.
ТЭС проникает в организм через дыхательные пути, неповрежденную кожу. ЖКТ. Выделя-
ется из организма с мочой и калом. Депонируется в паренхиматозных органах (печень, почки)
и головном мозге. При остром отравлении скрытый период составляет от нескольких часов
до нескольких суток. Первые признаки отравления: резкая головная боль, сопровождающаяся
дрожанием конечностей и некоторых групп мышц, резкое снижение температуры тела, сла-
бость. помрачение сознания, нарушение ориентировки в пространстве, появление устрашаю-
щих галлюцинаций. Характерны вегетативные нарушения: понижение давления, замедление
пульса, усиленное слюноотделение.
В заключение этого раздела приведены основные метаболиты токсикантов, относящихся к
группе летучих ялов (табл. 8-16).
Таблица 8-16. Основные метаболиты летучих ядов
Вещество Основные метаболиты. % абсорбированной дозы Примечание
1,1.1-Три хлоро- этап 2.2.2-Трихлорозтанол до 2%: трнхло- розксусная кислота до 0.5% —
2-Пронанол Ацетон до 80—90% Т|Г, 2-пропан<п<1 около 2 ч. ацетона — до 22 ч
Анетон Выводится, в основном, в неизменен- ном виде н как 2-пронанол (неболь- шое количество) Образуйся в большом количестве в орга- низме больных диабетом и кетоацидозом; является основным метаболитом 2-пропа- нола.
Ацетонитрил До 12^ присутствует как шшнид-нон, переходящий затем п тиоцианид-иоп При длите. ыюм поглощении паров аце- тонитрила цианид- и тионианид-ионы накапливаются
Бен юл Фенол — 51 -87% , катехол — ло 6%; гидрохинон н транс-муконовая кисло- та — до 2% В моче обнаруживается в виде конъюгатов фенола с серной или глюкуроновой кислой. Присутствие в моче фенола может служить
индикатором отравления бензолом, одна-
ко при этом наблюдаются значительные
флюктуации. связанные с индивидуальны-
ми особенностями ортанизма
746 Глава 8
Продолжение табл 8-16
Ьромомстан Бромиды Незначительные концезгграцик бромид-иона в плазме крови используются для моннто ринга состояния отравления. Эти концен- трации значительно ниже, чем при приеме бромисговодородиых солей перорально
Бутан 2-Бутаиол и 2-буч® нон. каждого не более 1% При легальном исходе исследуется жировая гкань. Определение карбоксигемоглобина используется для индикации хроническою отравления природным газом
Бугат юн ( МС ГИЛЭТНДKCTOI1) З-Ги троксибчганон в моче нс более 0.1% Большая часть вещества выводится и неиз- мененном виде с выдыхаемым воздухом
Галотан Фторотаи Хлорогр тфторозтан. хлородифюро- этнлсн. трифтороуксусная кислота, бромидион и др. Образование свободных радикалов может служить причиной гепатотоксичности э1их средства для таркозе
Гексан 2-Гексанол: 2-гсксанон; 2.5-дшскса- динон 2-Гексанол выводится с мочой в виде ыю- куроццда. Считается, что 2,5-днгсксацжион определяет гепатоксичность гексана, а 2-гексанон — его нейротоксичность. В дальнейшем последний метабол и тирует в 2,5-дтпександион
Дпметилсульфок- СИЛ Днметнлеульфид до 3%: днмегилсульфон до 18—22% Лет ко проникает через кож тыс покровы. После пероральною тын перкутанною проникновения выделяется с выдыхаемым воздухом как лнмегилсу.тьфнд н как лиме- тнлеутьфоп с мочой
Диоксан Р-Гидроксизгоксиуксусттая кис. ога (ГЭУК) ГЭУК выводится с мочой
Дихлорометан Монооксид углерода до 50% При атмосферном давлении в выдыхаемом воздухе Tfjl моноксида учлерода около 13 ч. Определение карбоксигемоглобина исполь- зуется ддя индикации хронического отрав- ления
Изобутан Незначительное коли icctbo 2-метил- 2-iipoiiaiio.ia см. Бутан
Изобутнлншрнт 2-Мет ил-1-пропанол до 99% и Н111ри1-ноп Эю вещество не детектируется в плазме крови. Концентрация метгемоглобина явля- ется индикатором отравления
И.ЗОНС1П ILIIIirrpMT З-Meiivi Ьбуганол до 99% и нитрит-ион Это вещество не детектируется в плазме крови. Концентрация метгемоглобина явля- ется нндикато >м о явления
Ксилсны Толуоловые кислоты — до 95%, кси- ленолы — до 2% Конъюгаты толуоловых кислоте глицином и выведение метилгиппуроиой кислоты — индикатор выведения токсиканта
Метанол Формальдегид — по 60%, муравьиная кислота Отравление метанолом отслеживается но концентрации муравьиной кисло™ в моче
Пропан 2-Пропанол, ацетон, каждого менее 1% см. Бутан
Стирсн Амшлилиновая кислота до 85%. фе- нил глиоксиловая кислота — до 10% Выведение токенкшпа контролируется но содержанию амитдвлнновой кислоты в моче. Этапа! ингибирует ес выведение
Тетрахлорэти дсн Трнхлоруксусивя кислота менее 3% Выделение 1рих.поруке\сной кислоты явля- ется и пл и катером отравления
Толуол Бензойная кислота до 80% и изомеры крезола до 1% В моче бензойная кислота нрнсутствует п виде конъюгата с гл и пином
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 747
Окончание ma&t. 8-16
Трихлоротгнзен 2.2.2- Трихлороэтанол до 45%. трихло- роуксусная кислота 32% Т, глюкуронида грихюрозтанола и трихто- роуксусной кислоты 12 и 100 ч. соответс- твенно
Хлороформ Диоксид уцперола 50%, днглута тиснил лит иокарбонат Высокая гепатотоксичность спя:зана с об- разованием грпхюромс! ильных свободных радикалов, фосгена и тт офосгсна
Циклогексанон Как циклогексана! до 50% Циклогексана! в моче присутствует в виде конъюгата с глюкуроновой кислотой
Четырсххлорцс- тый углерод Хлорофо м. диоксид углерода, гекса- хлороэтан II др Чрезвычайно высокая гепатотоксичность связана с образованием трихлорме!ильных свободных pa.il калов, фосгена и тиофосгена
Энфлхран Д ифторомстоксндифтороу ксус пая кислота до 2.5 >. фторид-ион —
Этилацетат 1 Этанол. уксусная кислота Метаболизм проходит быстро за счет лейс- 1ВНЯ эстераз плазмы крови
Этилбен юл Мсти.1фс11илкпрби11ал ло 5%; амигпа- j и новая кислота ло 64%: фенил глиок- силовая кислота до 25% Из перечисленных кислот в моче только мегилфснилкарбниол присутствует виде конъюгата, остальные — в виде свободных
кислот. Мониторинг тяжссш отравления
определяется но копнентрапин амнглалнно-
в< и кислоты
В табл. 8-17 приведены токсические и летальные концентрации летучих ялов в крови по
данным Международной ассоциации судебных токсикологов (19%).
Таблыis 8-17. Токсические и легальные концентрации летучих ядов в кронн
Вешество Токсическая концентрация. мг% Летальная концентрация. мт%
Анилин — U.63
Ацетон 20-30 55
Ацетонитрил (метаболит — цианид) — 0,077
Бензол - 0.094
Д 1хюроэтан следы 0.5
Изопроиаиол >150 100-150
Крезол — 12
Ксилол — 0.3 4.0
Метанол 20 >89
Mei иленхлорнд — 28
Трихлороэтян — 10-100
Tpi । хлороэтнл с н — 0,3-11.0
Толуол — 1
Фторошп 20
Фенол - 9
Хлорал) штрат (метаболит — трихюрэтанол) 10 25
Хлороформ 7- 25 39
Цпанил — 0.24—0.5
Четыреххторнстый углерод 2-5 10-20
Этанол 100 > 350
Ji H.ICHI. школь 150 200-400
748 Глава 8
Особенности пробополготовки биологических образцов и методы определения
Объекты исследования при подозрении на отравление летучими токсикантами изымаются в
соответствии с учетом особенностей токсикокинетики анализируемых вешеств и соответствии
с нормативными документами.
Объектами исследования при ХТА на летучие яды яд яются кровь, моча и промывные воды,
внутренние органы, i также технические жидкости.
Кровь отбирают пункцией кубитальной вены в сухой стерильный флакон емкостью 10—
15 мл под пробку с 1—2 каплями раствора гепарина. Флакон тотчас герметично закрывают
силиконовой пробкой и содержимое перемешивают. При проведении операций гсмосорбции
(гемодиализа) кровь отбирают в сухие стерильные флаконы до и после пропускания через ко-
лонки
Мочу отбирают в сухие стерильные флаконы и тотчас закрывают пробкой. Обязательно
одномоментное взятие крови и мочи, интервал не должен превышать 5—10 мин. Кровь и мочу
отбирают в экстренном порядке так как большинство летучих ядов очень быстро выводятся
легкими.
Псриюпсальную жидкость отбирают после се полной эвакуации из полости и измерения
объема в сухой флакон под пробку и герметично закрывают
Сальник и жировую клетчатку отбирают в особых случаях при проведении перитонеального
диализа. В предварительно взвешенный флакон помешают 1—3 г иссеченном ткани, флакон
взвешивают и укупоривают.
Раздельно отбирают первую и последнюю порции промывных вол отдельно.
Технические жидкости и другие вещественные доказательства доставляют на исследование
в оригинальной упаковке или отбирают во флаконы и тщательно укупоривают.
На все флаконы цаклешзают стандартные этикетки с указанием фамилии, имени и отчества
больного, номера истории болезни, времени взятия пробы
Вее объект ло начала исследования хранятся в холодильнике, замораживание не допуска-
ется. Флаконы откупориваются непосредственно перед исследованием
При проведении судебно-химического анализа в соответствии с приказом М3 РФ № 161 от
24.04.03 отбирают следующие пробы при подозрении на отравление:
• этанолом — кровь, моча 10—20 мл (в посулу, заполненную под пробку). Кровь беру i пи-
петкой пли шприцем из крупных вен конечностей или синусов твердой мозговой оболочки.
При невозможности направить кровь и мочу, берут мышечную ткань (около 10—20 г) и
ночку:
• летучими хлороргапическими веществами — часть сальника 200 г, головной мозг, печень но
100 г. почка, кровь, моча — 10—20 мл:
• метиловым спирюм — головной мозг, печень по 100 г. почка, кровь моча 10—20 мл.
Банки герметично закрывают, наклеивают этикетки с необходимыми записями и помещ; ют
в опечатанный полиэтиленовый пакет, который немедленно пересылают для исследования.
Экспериментальные исследования на животных показали, что применение формалина для
консервирования внутренних органов трупа не влияет па сохранность диэтилового эфира хло-
роформе. этанола, толуола и нс мешает их определению, но консервант обычно не добаатяют
Для исключения загрязнения вещественные доказательства — технические жидкости, рас-
творители. ишаляциопные анестетики, вызвавшие отравление, а также образец консерванта в
случае его применения — должны упаковываться транспортироваться и храниться отдельно от
биологических образцов.
Основным методом опреде тения летучих токсикантов в настоящее время является газовая
хроматография (см. гл. 6.3). Большинство методик газохроматографического определения лету-
чих вешеств основано на анал) зе равновесной паровой фазы, которые отличаются по способу
введения анализируемой пробы в хроматограф (см электронное приложение).
Анализ равновесной паровой фазы имеет ряд преимуществ: исключены трудоемкие операции
пробополготовки (экстракция, перетопка, перегонка с водяным паром и т.п.), перегрузка или за-
грязнение хроматографической колонки водой, высококипяшими или нелету1 ими веществами,
что неизбежно при непосредственном вводе в колонку анализируемой пробы в жидком виде
Мслкоизмельченпие навески внутренних opianon. биологические жидкости (кровь, моча,
ликвор и др.) помешают в герметичную емкость, через определенное время устанавливается
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 749
термодинамическое равновесие летучих компонентов в паровой фазе С помощью дозирующе-
го устройства часть паровой фазы отбирают и вводят в анализатор (см. гл. 8.1). Равновесную
паровую фазу отбирают с помощью газоплотного шприца Используют ручной способ или
автоматический с помощью автосамплера. При ручном способе флакон с пробой подогревают
в термобапе.
Статический парофазный пробоот юрник. С помошью системы электронного конгроля дав-
ления газа-носителя оптимизируется процесс переноса пробы из статического парофазного
пробоотборника в газовый хроматограф и условия проведения анализа — давление во флаконе
с анализируемым образном, деление потоков газа.
Динамический парофазный пробоотборник (Purge and Trap) Сорбционное концентрирование
образцов из газовой фазы с помощью динамического пробоотборника Purge and Trap дает воз-
можность анализировать ультра низкие концентрации летучих органических вешеств. При про-
бополготовкс достигаются высокая степень очистки и эффективность извлечения летучих ве-
ществ из биологических жидкостей. Инертный газ пропускают через образец, а пары летучего
соединения концентрируются вдовушке с адсорбентом «кливнрованный уголь, силикагель, по-
лимерные юрбенты — полисорб. Тепах). Для последующего определения сконцентрированные
вешества десорбируются с носителя путем быстрого и превания ловушки с адсорбентом до высо-
кой температуры и потоком гелия через капилляр вводятся в испаритель газового хроматографа.
Эффективность выделения летучих вешеств при использовании этою метода достигает 97% (на
концентраторе Purge and Trap Tckmar LSC 2000). а в сочетании с газохроматографическим разде-
лением на капиллярной колонке и масс-селективным детектированием идентифицируют любые
летучие вешества на уровне фоновых концентраций в биологических жидкостях, питьевой воде,
атмосферном иохтухе, воздухе производственных помещений и рабочей зоны.
Метод прямого ввода пробы в хроматограф. При использовании метода прямого ввода на
стадии пробо юлготовкн объектов биологическою происхождения применяются различные
способы, позволяющие предотвратить загрязнение хроматографической колонки. При прямом
введении в испаритель хроматографа непосредственно цельной крови происходит ее спека-
ние в микрошприне в результате термокоагуляиин. После лепротенпизирования вольфраматом
натрия и серной кислотой возможен прямой ввод биологических жидкостей в испаритель с
высокой температурой. Хорошие резульшты получают при использовании технических воз-
можностей современных хроматографов — испарителя, оборудованного системой охлаждения
и программирования температуры, системы переключения потока газа-носителя на сброс че-
рез несколько минут после ввода пробы с одновременным резким повышением температуры
испарителя. При этом используются легко сменяемые предколонки — специальные вставки
в испаритель (лайнеры), заполненные различными сорбентами, которые работают в качестве
защитных фильтров от малолетучих компонентов биологических жидкостей. Это дает возмож-
ность повысить предел обнаружения за счет уменьшения фона хроматограммы.
Метод прямого ввода в основном применяется при анализе малолс учих токсичных ве-
ществ, в частности гликолей и их высококипяших эфиров. Так, при направленном анализе на
этиленгликоль и диэтилсигликоль мочу предварительно центрифугируют, а затем пропускают
через патрон для твердофазной экстракнпи Evidex SPE С18 для дополнительной очистки от
компонентов органической и неорганической природы.
Значительное количество летучих токсикантов легко перегоняются с водяным паром, за
исключением вешеств, имеющих высокую температуру кипения и не образующих с водой
азеотропных смесей: этиленгликоль — TKmi 197.4 ’С; уксуспяя кислота — Тып1 118.5 °C. тетра
Э1ИЛСВННСЦ — Ткл 195 °C и другие. Для изолирования летучих токсичных веществ традиционно
применяют различные типы дистилляции (перегонки).
• Метод перегонки с водяным паром.
• Микроотгонка — еще один способ подготовки пробы для проведении газохроматографнчсс-
кого определения Количество объекта 5 г Собирается 2 мл дистиллята
• Перегонка с водяным паром с одновременной продувкой азотом — частный метод, который
используется для изолирования из биообразпов синильной кислоты и ее солей (см. гл. 8.3),
которые согласно принятой в токсикологической химии классификации относят к группе ле-
тучих ялов. Проводится в приборе для перегонки с водяным паром. В пробке, которая закры-
вает перегонную колбу, делают дополнительное отверстие для подачи тока азота. Дистиллят
750 Глава 8
собирают в приемник, содержащий 5 мл 0,1 и. гидроксида нагрия Укатанным способом изо-
лируются до 62,90—88,05% синильной кислоты при содержании 50—1000 мкг в 100 г органа.
Изолирование можно проводить как из свежего, так и из зашившего трупного материала.
• Дистилляция (простая нсрионка) используется для веществ с низкой температурой кипе-
ния: ацетона, этанола, метанола и др. Недостатком метода является неполная оггопка ана-
лизируемых веществ.
• Азеотропная перегонка. При азеотропной перегонке температура кипения азеотропной сме-
си ниже, чем температура кипения самого низкокипяшего компонента
• Экстракционный метод применяется при изолировании некоторых высококппяших летучих
ялов. Так, при исследовании свежего трупного материала используется экстракция этилен-
гликоля бензолом из печени и желудка с содержимым.
• Метод .микродиффузии. Модифицированные камеры Конвея используют для изолирования
синильной кислоты (см. гл. 8.3). Дистиллят собирают в 2 мл 0,1 н. едкого натра, который
помещают в центральное углубление модифицированной камеры Конвея (внутренняя ка-
мера). Диаметр внутренней камеры 3 см. диаметр внешней камеры 6 см. Во внешнюю
камеру избавляют 4 мл крови или мочи. 2 мл 10% раствора серной или винной кислоты и
тщательно перемешивают Камеру закрывают завинчивающейся крышкой, помещают на
1 ч в термостат (50 С). После охлаждения из центрального углубления камеры отбирают
1 мл жидкости для количественного определения синильной кислоты. Оставшуюся жид-
кость исследуют химическим методом. При содержании 50—1000 мкг синильной кислоты в
100 мл крови определяется 86.00—98,10%. в моче — 92.80—99.10%.
Схема скрининга на гетучие токсичные вещества, подлежащие судебно-химическому иссле-
дованию в лабораториях БСМЭ регламентируется Перечнем (см. выше). При проведении ХГА
используют и твзохроматотрафнчсский и химический методы, однако последний малоспеци-
фичен и в настоящее время применяется редко.
Скрининг метолом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) проводится на двух колонках е
неподвижными жидкими фазами рахтичнои полярности по относительному времени удержи-
вания или индексам удерживания Ковача. Подтверждающие исследования проводят методом
ГХ-МС или используют качественные химические реакции, иногда — дополнительные I—
2 хроматографические колонки.
Один из первых примеров применения в Х1А тазовой хроматографии в России — иденти-
фикация и количественное определение спиртов 0,-0, (после дермватизации в алкилнитри-
ты), дихлороэтана и ацетона на отечественных тазовых хроматографах (ХЛ. 1ХМ) с детектором
по теплопроводности (см. гл. 8.1).
Скрининг летучих токсикантов проводят газохроматографическим метолом по унифици-
рованной методике. которая основана на применении фазовых равновесий летучих веществ
вне хроматографическом колонки — анализа равновесной паровой фазы. При исследовании
биообразца на содержание многокомпонентных смесей органических растворителей, бензин,
керосин проводят идентификацию по их основным компонентам путем наложения (сравне-
ния) хроматограмм исследуемых объектов и стандартов.
Условия газохроматографического разделения
Как один из вариантов исследование выполняют на газовом хроматографе с ПИД. Скорость
потока газа-носителя гелия 24 мл/мип. водорода 27 мл/мин, воза ха 270 мл/мин. Колонки метал-
лические. 100x0.3 см. Температура термостата колонок 82 °C. испарителя 100 °C. Колонка заполне-
на сорбентом — целитом С-22 (60—80 мент), модифицированным слоем металлического серебра.
Неподвижные жидкие фазы. 10% 1.2.3-три-(р-ииан-этокси)-пропан и 10% тритон Х-100.
Методика исследования. В 2 стеклянных флакона (15 мл). содержащих по I мл раствора фос-
форновольфрамовой кислоты, помешают ио 1 мл внутреннего стандарта (2-хлорбутана) и но
1 мл исследуемой пробы. После перемешивания во флаконы вносят по 2,5 г безводного суль-
фата натрия, флаконы закрывают резиновыми пробками и фиксируют алюминиевыми кол-
пачками. Флакон помешают на кипящую водяную баню на 5 мин Затем прокалывают пробку
шпрппем и отбирают 0.5 мл парогазовой фазы и вводят в хроматограф Измеряют время удер-
живания наблюдаемых на хроматограммах ников в 2 параллельных исследованиях, рассчи-
тывают параметры удерживания — относительное время (объем) удерживания или индексы
удерживания Ковача (см. гл. 6.3).
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 751
Мешающее влияние и границы обнаружения. Обнаружению н определению хлороформа
четыреххлористого углерода, дихлороэгана. хлоралгидрата. ацетона, алифатических спиртов,
бензола, толуола, о-, м-ксилолов не мешает их совместное присутствие, а также присутствие
таких вешеств, как мстилэтилкстон, формальдегид. ацетальдегид, лнэтиловый эфир. метил-,
этил-, бутил- и амиляцетагы. циклогексанон, метиденхлорид. перхлороэтилен. хлоробензол,
гексан, гептан, циклогексан. касторовое и минеральное масло.
Вещества, образующиеся при гниении биоматериала, могут мешать определению. Так, в
пгилостно-и вмененной крови н-проггиловыи спирт образуется как один из продуктов мик-
робиологической деструкции органических вешеств. В этом случае в качестве внутреннего
стандарта целесообразно использовать другое вещество. например метиловым спирт, нс обра
зугошийся в значимых количествах п процессе гниения внутренних органов и крови
Гранины обнаружения хлорорганнчсских и ароматических углеводородов в биоматериале
приведены в табл 8-18.
Таблица 8-18. Гранины обнаружения хлорорпшических и ароматических углеводородов в биоматернжпе
Вещество Гранина -азохроматографического Чувствительность химической
обнаружения реакции, мг 100 г органа или
в мг на 2 мл крови в мг на 5 г печени мг/,0° *=> биадоптесгигв жид-
кости
Хлороформ 0.01 0.025 0.01- (0.2)
Четыре хсзористый углерод 0.05 0,15 2.3- (6.8)
Дихлороэтан 0.025 0.05 - (2.5)
Хлорит ruipai — 0.025 0.01- (0,15)
Трихлороэтилен 0.025 0.05 - (-)
Бензол — 0.001 0.08” (-)
Го.чуол — 0.002 0.1” (-)
ч-Ксилол — 0.01 0.6” (-)
• Чувствительность реакции образования изоюггргпа (в скобках — чувствительность реакции замещения хлорила).
•* Чунстинтелыюсть реакции шгпхикшия ароматических соединений (определена при жспсрим игольном нсслсдо
валки).
При газохроматографическом исследовании с ПИД идентификацию веществ проводят по
параметрам удерживания. В большинстве современных методик при этом используется про-
грамма фиксации времени удерживания (RTL — Retention Time Locking), разработанная фир-
мой Agilent Technologies для газовых хроматографов с электронным контролем потоков, что
позволяет унифицировать методику анализа в различных лабораториях.
Методика RTL дает возможность произволггть настройку хроматографической системы та-
ким образом, чго время удерживания анализируемых соединений остается неизмененным при
замене хроматографической колонки, а также при использовании методики на аналогичном
оборудовании в других лабораториях.
При проведении исследования методом ГХ-МС (см. гл 6.3) идентификацию обнаруженных
тетучих вешеств проводят по параметрам удерживания и их масс-спсктрам (используются биб-
лиотеки масс-спсктров Pfcgcr, NISI'. WrLev) Масс-снектрометрнческое детектирование вы-
полняется в режиме полного сканирования (SCAN), регистрируемые масс-спектры идентифи-
цируют но библиотеке масс спектров. При совл< ген ни масс-спектра и времени удерживания
анализируемого вещества и вещества сравнения идентификацию считают достоверной.
Режим селективной регистрации по выбрщным иогмгм (SIM — селективный ионный монито-
ринг) проводят для повышения чувствительности определения. При этом идентификация вещес-
тва проводится по времени удерживания и отношению интенсивностей регистрируемых ионов.
752 Глава 8
Количество летучего вешества в паровой фазе при газохроматографическом определении
измеряется площадью его пика F и рассчитывается по формуле (закон Рауля):
F = y- c-pn-x = k-x.
где у — коэффициент активности р отворенною компонента: с — константа, зависящая от
характеристик применяемого детектора: ро— давление пара чистого компонента, х — мольная
доля летучего компонента, растворенного в анализируемой пробе.
Коэ(|и|>иниенг активности у зависит нс юлько or природы летучего компонента и других
компонентов смеси, мольной доли всех компонентов, но и от температуры и давления (если
давление в замкнутом объеме превышает 2 агм).
При количественном газохроматографическом анализе равновесной паровой <|кпы необхо-
димо найти коэффициент к прямыми измерениями (нрн калибровке хромаю) рафа с помощью
стандартных образцов). При этих же условиях проводится исследование экспертных биообъ-
ектов и/или других вещественных доказательств, доставленных с места происшествия. Резуль-
таты количественного определения токсикантов методами ГХ-ПИД и ГХ-МС получают путем
авгома!ического расчета по площади пика (базового нона — ГХ-.МС) с учетом коэффициента
относительной чувствительности по отношению к внутреннему стандарту. Оперативный конт-
роль погрешности определения и контроль качества измерений (Quality Control — QC) прово-
дят. используя стандартные смеси. Погрешность определения для метода ГХ-МС нс превыша-
ет 5 и 2% на уровне определяемых концентраций 0.005—0,5 и 0.5—1000 мг/мл соответственно.
Для метода ГХ-ПИД погрешность определения не превышает 5 и 2% на уровне определяемых
концентраций 0.5—5 и 5—1000 мг/мл соо- ветственпо. Контроль фора, в результате которого
MoiyT быть выявлены ложпоположительпые результаты, выполняют, анализируя биологичес-
кие жидкости, нс содержащие определяемых веществ. Оперативный контроль сходимости и
отсутствия ложноиоложигельных результатов проводится ежедневно перед исследованием экс-
пертных образцов (см. гл. 5).
По согласованию с судебно-медицинскими экспертами исследования на (]юрмальдегид, си-
нильную кислоту и ее соединения, фенолы, крезолы, а также токсиканты из второю раздела
Перечня — этиленгликоль. нитро- и динитробензо ты. анилин, тетраэтилсвинец проводятся
при специальном задании с номошью других методик (см. электронное приложение).
Определение этиленгликоля и диэтиленгликоля в моче
Малоаегучнс соединения этиленгликоль, диэтилеигликоль и близкие им по летучести ве-
щества анализируют прямым вводом биожидкости в хромато!раф
Мочу предварительно центрифугируют, отбирают надосадочный слой пробы.
Для скрининга используют аликво!у мочи 800 мкл. К ней добавляют 3 мкл водио-этано. ь-
ного раствора циклогексанола (ВС) и 200 мкл этанола. Концентрация ВС в пробе составляет
2,8 мкг/мл. В испаритель хроматографа вводят I мкл а|Л|ИЗирусмой пробы. При прямом вводе
мочи в хромато«раф этанол количественно нс определяю!.
При направленном анализе только на этиленгликоль и днэтиленгликоль 3 мл мочи пос-
ле центрифугирова шя дополнительно очищают методом твердофазной экстракции. Пацюп
Evidex SPE CI8 предварительно активируют, пропуская 3 мл метанола и 10 мл дистиллиро-
ванной воды. Этиленгликоль и днэтиленгликоль в патроне нс сорбируются. Отбирают 800 мкл
мочи, пропущенной через патрон, добавляют ВС, 200 мкл этанола, I мкл анализируемого рас-
твора вводят в испаритель хроматографа.
Условия хроматографического анализа. Газовый хроматограф Agilent 6890N с масс-сслсктив-
ным детектором Agilent 5973N и нро!раммой RTL для контроля и фиксации времени удержи-
вания. Капиллярная кварцевая колонка HP-FFAP (длина 50 м. внутренний диаметр 0.2 мм.
толщина пленки НЖФ 0,3 мкм). Скорость потока газа-носителя гелия I мл/мин Температур!
термостата колонок 60 °C (5 мин), повышение температуры со скоростью 10 °С/мин до 190 °C
(25 мин). Температура испарителя 280 "С. интерфейса 180 "С, источника ионов 230 'С, квад-
рупольного фильтра 150 °C. Анализ проводится в режиме сканирования по полному ионному
току (SCAN). Диапазон масс m/z 29—300 а.е.м. Напряжение па фотоумножителе устанавлива-
ется при авюматический настройке по перфторбугиламину в режиме ATUNE.
В табл. 8-19 приведены хроматографические параметры удерживания и масс-спектры неко-
торых мало, сту шх компонентов технических жидкостей.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп. 753
Таблица 8-19. Хроматографические параметры удерживания и масс-спектры некоторых малолетучих ком-
понентов технических жидкостей.
Вещество 1 Молекулярная масса. а.е.м. Время удержива- ния. мин Масс-спектр (в скобках — интенсивность, % от базового пика, базовый пик — 100)
Циклогсксанол 100.1 11.52 99 (2.6). 82 (42,7), 73 (16.2). 67 (48.8). 57 (100). 41 (46.3)
1,2-Бугилепглик<1ПЬ 90 1.3.97 91 (9,3). 73 (100). 55 (13). 45 (69)
1,2-Пропилспгликолъ 76 14,21 77 (5,5), 59 (42). 45 100)
Этиленгликоль 62 14.74 63 (58). 45 (НЮ)
Ди этил с н гл и кол ь 106 19,72 107 (3), 89 (5). 75 (6)
Фенол 94.1 20.37 94 (100). 66 (47)
Тимол 150.2 24.39 150 (25). 135 (100). 117 (10). 115 (10).
9) (15)
8.3. ЯДОВИТЫЕ ГАЗЫ
Мысль никогда не должна подчиняться ни догме,
ни направлению, ни страсти, ни интересу ни предвзятой идее.
ни чему бы то ни было, кроме фактов, поюму что
для нес подчиниться — значило бы перестать су цествоватъ.
А Пуанкаре
8.3.1. Оксид углерода (II)
Из ядовитых газообразных веществ особый токсикологический и судебно-медицинский ин-
терес представляет СО — оксид углерода (II) Долгосрочные последствия отравления угарным
газом нередко приводят к летальному исходу. Исследователи обнаружили, что угарный газ
повреждает белок миелин, входящий в состав оболочки нервных клеток В ответ на отравле-
ние О в организме начинается синтез специализированных лимфоцитов, которые выводят
поврежденный белок из организма. Проблема заключается в том. что с удалением измененных
молекул миелина одновременно повреждаются и нормальные молекулы, тем самым запускает-
ся своего рода цепная аутоиммунная реакция.
Оксид углерода (II) — бесцветный газ без запаха и вкуса. В воде почти нс растворяется, то-
рит синеватым пламенем до образования оксида углерода (IV) с выделением тепла.
Острые отравления окисью углерода занимают ведущее место среди ингаляционных отрав-
лений, летальные исходы составляют 12.5% общего количества всех смертельных отравлений.
Источники СО. Оксид углерода встречается везде, где существуют условия для неполного
сгорания веществ, содержащих углерод, входит в состав многих промышленных газов (домен-
ный. генераторный, коксовый); широко применяется в современном органическом синтезе.
Важными источниками СО являются выхлопные газы автомобилей (содержание оксида уг-
лерода I 13%). дым от пожара и неверно эксплуатируемые нагревательные системы. Пары
дихлорометана (детергентов и аэрозолей), в результате метаболизма которого неспенифическими
оксидазами образуются угарный и углекислый газы также могут приводить к отравлению СО.
Токсикокинетика и биотрансформация
Единственным путем поступления в организм СО являются дыхательные пути. Токсичес-
кий эффект для человека наблюдается при вдыхании воздуха с концентрацией СО З Ю-' г/л в
течение I ч.
Механизм токсического действия СО обусловлен образованием карбоксигемоглобина —
НЬСО (см. гл. 2.4). При острых отравлениях СО связывается преимущественно железом ге-
754 Глава 8
моглобина эритроцитов. При повзорных или хронических отравлениях в плазме крови уве-
личивается количество негсмозлобиноззого железа та счет выхода его из тканей. Это железо
также фиксирует поступающий СО. При действии даже весьма низких концентраций СО его
присутствие обнаруживают в различных тканях организма, так как СО фиксируется имею-
щимися в них железосодержащими ферментами, а в мышцах — еще и железом миоглобина.
Кроме того, присутствие СО в тканях связано с наличием в них крови, содержащей СО. По
сравнению с гемоглобином сродство миоглобина к СО и О2 приблизительно в 5 раз меньше. Нз
распределение СО между кровью и мышцами влияют концентрация СО во вдыхаемом вохтухе
и продолжительность контакта. При смертельном отравлении у людей и содержании в крови
58—85% НЬСО в скелетных мышцах было обнаружено 10—53%. в миокарде — 3—44% карбо-
ксимиоглобина (МЬСО) Концентрация МЬСО в мышцах зсезда значительно ниже концентра
ции НЬСО в крови. Сопоставление концентраций НЬСО и МЬСО может помочь в установле-
нии динамики отравления. Для установления коэффициента корреляции между количеством
НЬСО и МЬСО требуются дополнительные наблюдения и специальные исследования.
При отравлениях СО нарушается углеводный обмен. Увеличение уровня сахара в крови
начинается с первых минут интоксикации и нарастает параллельно гипоксемии Установлено,
что эти изменения обусловлены нарушением центральной регуляции углеводного обмена под
воздействием СО. что связано с усилением распада гликогена или нарушением утилизации
глюкозы. Усиленный зликогенолиз приводит к развитию гипергликемии. Повышение содер-
жания глюкозы отмечается не только в крови, но и в ткани мозга. Установлена зависимость
между тяжестью интоксикации угарным газом и содержанием глюкозы в мозге.
Оксид углерода выводится из организма в основном через дыхательные пути в течение не-
скольких часов. После прекращения вдыхания СО 60—70% яла выделяется у человека в тече-
ние 1-го часа; за 4 ч выделение составит 96% абсорбированной организмом дозы. В ничтожном
коли зсстве оксид углерода выделяется через кожу — около 0.007 мл/ч, несколько больше —
через ЖКТ и ночки. СО с мочой выводится в виде комплексного соединения с железом.
Лабораторная диагностика отравлений оксидом углерода заключается в определении НЬСО
в крови. В то же время содержание НЬСО в крови, козорос определяется при поступлении
больного в стационар, не может служить надежным критерием установления тяжести сосгоянзтя
больных. В большинстве случаев оно бываег очень низким, в то время как клиническая симп-
томатика свидетельствует о тяжелой степени отравления. Подобное несоответствие можно объ-
яснить тем, что со временем происходит диссоциация НЬСО. поэтому большее дишносзическое
значение имеет его определение в крови, взятой непосредственно на месте происшествия.
Методы определения оксида углерода (П) к ниюбъектах
Определение СО в крови
Для определения СО в крови можно использовать рахтнчные xtстолы, включая предвари-
тельные пробы, спектрофотометрию, зазовую хромазозрафию и специальные методы. Опреде-
ление СО в крови проводят либо по СО. либо выделяют из пробы крови зазобразную смесь
СО. СО,, О2. N,, измеряют количество газа и тем или иным способом устанавливают содержа-
ние в нем оксида уз лерода (11).
Предварительные методы исследования (химические). При выполнении нижеуказанных реак-
ций паршзлелызо исследуют два образца — кровь, не содержащую НЬСО. зз кровь пострадавшего
гзрзз отравлении. В образцы добавляю! одинаковые объемы реактивов зз наблюдаю за измене-
нием окраски. Изменение окраекзз происходит олько в образцах с нормальной кровью. Окраска
обра нов крови пострадавшего при отразхзепни не измезыется юзз изменяется незначительно.
Экспресс-тесты. или пробы, проводят непосредственно на месте происшествия или сразу
после поступления пострадавшего в клинику, Цель — быстро установить наличие НЬСО.
Тест /. К 15 мл ззоды добавляют 1—2 капли исследуемой крови зз отдельно донорскую кровь,
пробиркзз встряхивают. В норме проба светло-розовою цвета, при наличии НЬСО — вишне-
во-красною. Затем добавляют 5 кагзелз» 20% раствора гидроксида натрия. После энергичного
встряхивайизз при налмчизз НЬСО в течение нескольких секунд сохраняется светло-розовын
цвет (концентрация НЬСО не менее 20%) Если светло-розовый инет перейдет в соломенно-
желтый, зз крови ззег НЬСО илзз его содержится менее 20%. Проводят контрольную пробу с
донорской кровью.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 755
Гест 2. В две пробирки вносят но 10 мл дистиллированной воды, затем в первую — 5 капель
анализиру Moil пробы (кровь) и 5 капель свежспрпготоатенного раствора су ьфида аммония,
во вторую — 5 капель донорской крови и 5 капель свежеприготовленного раствора сульфида
аммония. После осторожного перемешивания добавляют в обе i робпрки по 2—3 капли 30%
раствора уксусной кислоты Анализируемая проба при наличии НЬСО окрашивается в крас-
ный цвет. контрольная проба (донорская) — в грязно-зеленый.
Тест .3. К 5 мл крови (анализируемой пробы п донорской), разбавленной в 100 раз истит-
лировапной водой, добавляют 5 капель концентрированного раствора сульфида меди. Дли-
тельно и энергично встряхивают. Кровь, содержащая НЬСО. красного цвета, не содержащая —
зеленого.
Тест 4. К 1 капле крови (анализируемой пробы и донорской) добавляют 40 капель волы и
5 капель 40% раствора феиилгндрв.зина. Кровь, содержащая НЬСО. светло-красная. нс содер-
жащая НЬСО — темно- или черно-красная.
Тест 5. К 5 мл крови (анализируемой пробы и донорской), разведенной 100 раз. добавляют
5 капель 1% раствора гексацианоферрата (III) калия. Кровь, содержащая НЬСО, вишневого
цвета, не содержащая — светло-коричневого (железо гемоглобина окисляется до Fe1*).
Другие химические пробы. Исследуемую кровь и контрольную кровь из печени животного в
количестве 2—5 мл разбавляют 100 мл воды. При этом кровь, содерж иная НЬСО. имеет ярко-
красный цвет, контрольная кровь — буроватый оттенок
Затем проводят следующие химические реакции.
• К разбавленным в соотношении 1:100 пробам испытуемой и контрольной крови прибав-
ляют равные объемы 30%. раствора гидроксила натрия. Кровь, содержащая оксид углерода,
сохраняет розовую окраску, контрольная принимает зеленовато-черную окраску
• К разбавленным в соотношении 1:4 пробам испытуемой и контрольной крови прибавляют
приблизительно по 3 объема 1% раствора танина и взбалтывают. Кровь, содержащая оксид
углерода, сохраняет розовый цвет: контрольная принимает серую окраску
• К разбавленным в соотношении 1:20 пробам испытуемой п контрольной крови прибавляют
равные объемы 20% раствора 1сксаиианофсррага (111) калия и 2 мл разведенной 1:2 уксус-
ной кислоты. Кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет розовый цвет, контрольная
приобретает бурую окраску.
• Контрольная кровь, смешанная с 5 частями расгвира основною ацетата снинпа. принимает
грязно-зеленую окраску, кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет свой цвет.
• Контрольная кровь после разбавления формалином спустя короткое время принимает гряз-
но-бурую окраску, кровь, содержащая оксид углерода, сохраняет красный цвет в течение
нескольких недель.
Реакции можно проводить, смочив разведенной кровью белую фильтровальную бумшу, на-
нося затем на пес реактивы. Описанные реакции малопригодны для обнаружения малых ко-
личеств НЬСО в крови.
Гззохроиатографический метод
Газовая хромате! рафия является достаточно простым и прямым методом определения об-
щего количества СО в крови. Высвобождение СО из НЬСО крови достигается обычно добав-
лением растворов натрия карбоната или некоторых других веществ Газовая фаза вводится в
хромато1раф, снабженный детектором по теплопроводности. Концентрация СО опреде ляется
по калибровочному графику после расчета плошали пика Результаты метола достоверны при
концентрации НЬСО 30—100%. Ошибка при использовании метода составляет 10%.
Другой вариант газохроматографического определения СО в крови основан на переведении
его в метан или СО за счет каталитического восстановления водородом иди окисления на
силикагеле с нятиокисыо йода.
В первом случае после высвобождения СО из крови в реакторе-дозаторе гелием газовую
смесь мгновенно выталкивают из реактора в хроматографическую колонку, где СО кат тити-
чески восстанавливается водородом до метана и регистрируется ПИД.
Во втором случае СО и СО разделяются на одной колонке с силикагелем, а затем в ячейке
с пятиокисью йода СО окисляется до СО и последний регистрируется детектором. Разница ве-
личин интенсивности пиков до и после окисления позволяет установить концентрацию СО.
756 Глава 8
Оптические методы
Объектами исследования на СО являются главным образом кровь пострадавшего и воздух
произволе)венных или жилых помещений, содержащий СО.
Диагности |сское значение имеет определение НЬСО в крови, взятой непосредственно па
месте происшествия, так как при оказании пострадавшему первом помощи происходит час-
тичная элиминация угарного газа и снижается содержание НЬСО в крови. Спек рофотомст-
рический метод определения СО наиболее распространен, потому что все гемоглобиновые
орукгуры имеют абсорбцию в определенной части спектра.
Метод Рооке является наиболее подходящим при определении низких концентраций НЬСО.
Он основан на сравнении спектров поглощения восстановленного гидросульфитом натрия НЬ
и НЬСО, который нс реагируете гидросульфитом натрия. Спектры снимают после разбавления
крови (0,1 мл) раствором аммиака (50 мл) Измеряют абсорбцию НЬ и НЬСО при 420 и 432 нм.
Предварительно определяют молярный коэффициент экстинкции при 420 и 432 нм. При 420 нм
абсорбция НЬСО в 2 раза превышает абсорбцию ПЬ. а при 432 им абсорбция НЬ почти в
3 раза больше абсорбции НЬСО. Разнице между абсорбцией НЬ и НЬСО при 420 и 432 нм ис-
пользуется при расчете содержания НЬСО по определенной формуле. Метод Рооке нескотько
громоздок в подготовительной части и математических рас ютах, но полученные результаты
обычно точны и воспроизводимы.
Спектроскопический метод. В основх спектроскопического (микроспсктралытого) анализа
положено свойство гемоглобина и его производных поглощать свет определенной длины вол
ны, поэтому при прохождении луча света через растворы, содержащие гемоглобин или его про-
изводные, в спектре появляются темные полосы поглощения, расположенные в определенной
части спектра для каждого производного гемот лобина.
В судебно-медицинской практике для этого пользуются микроспектроскопами — прибора-
ми, представляющими собой спектроскоп, соединенный с окуляром.
Оксигемоглобин (НЬО) имеет в видимой части спектра две полосы поглощения при X 589—
577 и X 556—536 нм. восстановленный гемогтобин (НЬ) имеет одну полосу поглощения при X
596—543 нм. НЬСО — 2 полосы при X 579—564 и X 536—523 нм.
Кровь для исследования разбавляют вод й до тех пор. пока не будут видны при спектро-
скопическом исследовании две полосы поглощения в желтой и зеленой частях спектра, между
линиями Фраунгофера D и Е, Эти линии соответствуют НЬО. При добавлении к жидкости
свежеприготовленного (NH,);S происходит восстановление НЬО в редуцированный гемогло-
бин; спустя некоторое время вместо двух полос поглощения появляется одна более широкая
полоса, лежащая между двумя ранее бывшими полосами. При спектроскопическом исследо-
вании крови, содержащей СО, также видны две полосы поглощения, принадлежащие НЬСО.
При сравнении полученного спектра НЬСО со спектром НЬО оказывается, что эти полосы по
своему расположению не совпадают Добавление сульфида аммония не вызывает восстановле-
ния ПЬСО, и две полосы поглощения НЬСО не исчезают
При отравлениях нс происходит полного насыщения крови СО. так как смерть наступает
раньше, чем оно произойдет. Поэтому в крови трупа наряду с НЬСО имеется некоторое количес-
тво ПЬО. После добавления сульфида аммонии при сохранившихся двух полосах НЬСО .между
ними пояатяется большее или меньшее затемнение — полоса восстановленного гемоглобина.
Количественное определение в крови НЬСО колориметрическим методом (модифицированный
метод Вольфа). Этот метод основан на том. что при pH 4.95. температуре 55—60 °C. за IQ-
15 мин НЬО. в отличие от НЬСО. выпадает в осадок. Для осаждения НЬСО требуется больше
времени. Таким образом, зги два вещества отделяют и НЬСО определяют колориме)рически.
Строят калибровочную кривую, используя растворы разной степени разведения из образца
крови с известным содержанием гемоглобина. Исследуемый образец крови разбавляют 50—
100 раз. измеряют световоглощенис и по калибровочной кривой находят концентрацию гемог-
лобина. Процент насыщения гемоглобина СО определяют по соответствующей формуле.
Следует отметить, что метод Вольфа можно использовать для определения СО только в самое
ближайшее время после смерти or оправления СО. гак как при длительном посмертном сроке
белковая часть молекулы меняется, чго влияет на растворимость )с.монрогеинов окси- и НЬСО.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 757
Спектрофотометрический меты) Фревурста — Майнеке основан на определении поглоще-
ния света определенной длины волны (X 575 или 578 нм) раствором гемолизованной крови до
и после восстановления 11ЬО гидросульфитом г атрия. При 100% насыщении крови СО вели-
чина поглощения света после добавления гидросульфита натрия не меняется. При неполном
насыщении или отсутствии СО она уменьш гется. По степени этого уменьшения определяют
процент НЬСО в исследуемом образце.
Клинические химические лаборатории обычно оснащены автоматизированными дифферен-
циальными спектрофотометрами (СО-оксимстрами), которые одновременно измеряют опти-
ческую плотность гемолизированной крови на 4 и более длинах волн для определения общего
гемоглобина, процентною содержания НЬО. НЬСО. метгемоглобина и сульфагемоглобина (см.
гл. 2.4).
Количественное определение в крови НЬСО спектрофотометрическим методом
При добавлении восстановителя (натрия тиосульфата) к исследуемой крови окси- и мет-
гемоглобин количественно образуют восстановленную форму гемоглобина. Последняя имеет
спектр поглощения, представленный на рис. 8-16. Б.
СО имеет бблыпее сродство к гемоглобину, чем кислород, поэтому комплекс НЬСО ле
может быть разрушен тиосульфатом натрия. Таким образом, после обработки тиосульфатом
натрия комплекс НЬСО проявляется характерным спектром с двумя максимумами поглоще-
ния (рис. 8-16. Л). Максимальная разница оптической плотности между спектрами А и Б от-
мечается при длине волны 540 им, тогда как при длине волны 579 нм оптическая плотность
практически одинакова. Процентное содержание СО в крови (см. рис. 8-16. А) может быть
вычислено по формуле, исходя из значения оптической плотности «здоровой», не содержащей
НЬСО крови (см. рис. 8-16. Б), и исследуемого образца (см. рис. 8-16, В) после добавления
тиосульфата натрия:
% = 2^LM51.]oo%
Х(А)-Х(Б)
где х — оптическая плотность.
Рве. 8-16. УФ-спектры НЬСО (Л),
восстановленного гемоглобина (Б)
и крови пациента при отравлении
угарным газом (В).
758 Глава 8
Интерпретация результатов
• Содержание СО в крови < 5%: норма; для курящих до 10%.
• Содержание СО в крови 10—20%: интоксикация легкой степени.
• Со (ержание СО в крови 20—30%: интоксикация средней степени
• Содержание СО в крови 30—40%: интоксикация средней степени, но возможен коллапс.
• Содержание СО в крови 40—50%: интоксикация средней степени, выраженные расстройс-
тва дыхания и функций сердечно-сосудистой системы, часто коллапс, возможна смерть.
• Содержание СО в крови 50—60%: интоксикация сильной степени — кома, судороги. воз-
можна смерть.
• Содержание СО в крови 60—90%. смерть (см. также гл. 2.4.3).
Судебно-медицинская оценка резу штатов количественного определения карбоксигемоглобина
и карбок имиогюбина
• Содержание НЬСО в крови зависит прежде всего от концентрации СО во вдыхаемом возду-
хе и времени его воздействия.
• Концентрация НЬСО тем выше, чем выше парциальное давление СО в альвеолярном воз-
духе по сравнению с парциальным давлением О2.
• За один и тот же промежуток времени при прочих равных условиях СО поступает в орга-
низм тем больше, чем больше минутный объем дыхания.
• Соответствие между концентрацией НЬСО и тяжестью отравления имеется не всегда. Это
особенно отчетливо проявляется при трупповых о1ранлспиях.
• Смертельная концентрация НЬСО в крови составляет в среднем около 60%. но может коле-
баттля от 40 ю 80% и более, что обусловлено влиянием внешних условий и особенностями
организма.
• Тяжесть острого травления СО усиливается при низком барометрическом давлении, повы-
шенной влажности, высоком или низкой температуре воздуха, усиленно* мышечной работе.
• При смертельном отравлении порог насыщения НЬСО у пожилых людей ниже. У женщин
отравление протекает лете. чем у мужчин. Беременные женшины более чувствительны, чем
пеберемепныс. Лица, подвергавшиеся хроническому воздействию СО. тяжелее переносят
острое отравление.
• Острое оживление проходит тяжелее у лиц. страдающих заболеваниями легких, сердца,
нарушениями кровообращения, неврастенией, ожирением, анемией, перенесших черепно-
мозговую травму, во время инфекционных заболеваний.
• Данные о влиянии алкогольной интоксикации на тяжесть о гратен ня СО противоречивы.
• При сочетанном отравлении СО и оксидами азота. СО2. нарами бензина. HCN (например,
в результате пожара или технологического процесса) к смертельному исходу может привести
относительно невысокая концентрация НЬСО.
• Необходимо учитывать очень разную чувствительность отдельных лиц к действию СО. При
групповых отравлениях у некоторых лиц, находящихся в коматозном состоянии, содержа-
ние НЬСО бывает гораздо ниже, чем у лиц, перенесших тяжелое отравление и при этом
чувствующих себя удовлетворительно.
• Изредка встречаются атипичные формы отравления, протекающие с быстрой потерей созна-
ния или тяжелыми расстройствами дыхания и сердечной деятельности (СО в крови 30%).
• Количественное содержание НЬСО в крови, по-видимому. может зависеть ог того, из како-
го участка кровеносной системы взят лля исследования кровь. При вскрытии трупа кровь
лля исследования надлежит брать из правого предсердия (при наличии в нем крови) или
бедренной вены либо из другого магистрального сосуда, а также из 1рудной или брюшной
полости (при патичии излившейся в псе крови).
• В некоторых случаях целесообразно измерять содержание НЬСО в гематомах и кровоподте-
ках, так как оно может служить одним из признаков определения времени их возникнове-
ния. Считают, что гематомы, в которых содержание НЬСО менее 10%, возникли до воздейс-
твия СО. Если содержание НЬСО в них превышает 20%. то образование тсматом связано с
отравлением СО.
• В воздухе промышленных городов постоянно содержится СО. вследствие чего в крови жи-
телей обычно находится некоторое количество НЬСО. Между концентрацией НЬСО и сте-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 759
пенью загрязнения воздушной среды СО отмечена прямая зависимость. Например, в крови
регулировшггков уличного движения содержание НЬСО .может достигать 22%.
• При освидетельствовании лиц, перенесших отравление СО. нужно иметь в виду, что при
интоксикации сроднен степени в течение первого часа выделяется около половины посту-
пившего в организм СО. Полное освобождение организма от СО наступает спустя 10—12 ч.
но может затягиваться и ло 24 ч.
• При обнаружении в крови трупа менее 60% НЬСО необходимо проанализировать пато-
логоанатомическис данные и обстоятельства отравления, чтобы обосновать заключение о
причине смерти.
• При повышении поступления СО в ор ггнизм соответственно увеличивается содержание СО
в тканях.
• Необходимость в исследовании скелетных мышц трупа или его частей возникает в очень
редких случаях (например, при гнилостных изменениях резко обескровленных частей тру-
па). потому что для определения НЬСО спектрофотометрическим методом необходим всею
1 мл крови из свежего или хранившегося до 10 дней биологического материала.
8.3.2. Сероводород, оксиды азота
Отравление сероводородом
Сероводород (H,S) - бесцветный газ с характерным резким неприятным запахом. Смеси
сероводорода с воздухом. содержащие от 4 до 45 об.% этого газа, взрывоопасны. 11ри концент-
рации H;S в воздухе 0.02—0,2 мг/л появ.1ягогся симптомы интоксикации, смертельная концен-
трация H.S в воздухе — 0,9—1.2 мг/л. ПДК сероводорода в рабочем помещении промышлен-
ного предприятия 10 мг/м' (0.01 мг/л).
Сероводород оказывает нейротоксическое действие, обусловленное развитием тканевой ги-
поксии, и местное раздражающее действие. Характерно поражение слизистой ободочки глаз —
конъюнктивит. светобоязнь. Роговина покрывается точечными поверхностными эрозиями. Опас-
ность отравления увеличивается в связи с потерей обоняния под действием H.S. что ограничи-
вает возможность своевременного выхода работающих из загрязненной атмосферы. Симптомы
ипюкепкаиии: насморк, кашель, резь в глазах бпсфароспазм, бронхит, головная боль, тошнота,
рвота, возбуждение, в тяжелых случтях кома, судороги, токсический отек легких. Смерть насту-
пает вследствие кислородного го издания. коюрос вызывается блокированием тканевого дыха-
ния в связи с угнетением клеточных окислительно-восстановительных процессов.
Детоксикация — прекращение дальнейшего контакта с газом: ингаляция амилнитрита, дли-
тельная ИНГЖ.1ЯПИЯ кислорода, гипербарическая оксигенация, симптоматическая терапия
Распространение и использование
Сероводород может встречаться как в производственных, так и в природных условиях: в
местах естественного выхода газов, серных минеральных вод. в глубоких колодцах и ямах, где
имеются гниющие органические вещества, содержащие серу. Он является главной составной
частью клоачного газа В воздухе канализационных сетей концентрация сероводорода может
достигать 2—16%. В ряде производств (химическая промышленность, текстильное, кожевенное
производство) серово юрод выделяется в воздух в качестве побочного продукта Несмотря на то
что органические и неорганические сульфидные соединения имеют промышленное значение,
общим источником сулъфид-иоиа при отравлении человека является газообразный сероводо-
род как продукт разложения органических соединений.
Токсикокинетика и бистро ccf юр нация
Сероводород частично окисляется ферментами печени до тиосульфата, в неизмененном
виде выводится через легкие. В определенных фракциях крови существует в виде сульфаге-
моглобипа (см. гл. 2.4 3). образуемого в результате взаимодействия гемоглобина с продуктами
метаболизма эндогенной серы.
У здоровых людей, нс подверженных воздействию сероводорода, соотношение концентра-
ции тиосульфата и креатинина в моче постоянно. При воздействии сероводорода соотношение
концентраций линейно увеличь вастся в течение 15 ч. а затем в течение многих часов постепен-
но снижается до нормальною значения.
760 Глава 8
Употребление пиши или воды с высоким содержанием серы может значительно увеличить
концентрацию тиосульфата в моче, что усложняет интерпретацию данных при отравлении се-
роводородом.
Содержание сульфида в образцах тканей человека, взятых посмертно (кровь мозг, легкие,
бедренная мышца) зависит от температуры хранения биообъектов: увеличивается при темпе-
ратуре выше 20 "С.
В табл. 8-20 приведены результаты определения концентрации сульфидов в тканях пострадав-
ших при легальном воздействии сероводорода на рабочих местах в замкнутом пространстве.
Таблица 8-20. Конце гграция сульфидов в ортанах и тканях при смертельном исходе
кро , мг/л Мозг, мг/г Печень. мг/г Почки, мг/г
0,92-2.4 11,06-1.45 10.38-0.56 0,34-0.47
Методы определения
В биологических объектах после пробоподготовки способом микродиффузии сульфиды мо-
гут опрелеля1ъся колориметрически или с помощью ион-селективного электрода. Использует-
ся ГХ-МС с квадрупольным анализатором ионная ловушка или магнитным секторным масс-
спектрометром (см. гл. 6.3)
Определенные трудности возникают при анализе сульфидов в связи с быстрой потерей
сульфидов из биологических материалов и образованием значительного количества сульфидов
во время хранения in vi го тканей при температуре, выше 20 ’С.
Отравления сероводородом также определяют по количеству тиосульфатов в моче или по
количеству сульфидов и тиосу iьфатов в крови с помощью колориметрии, жидкостной и газо-
вой хроматографии.
Наиболее распространенным способом определения в биологических жидкостях смеси ио-
нов, включающей бромид-. Йодид-, цианид-, роданид-, интриг- и сульфид-ионы, является
перевод их в летучие нентафторбензильные производные, которые можно детектировать с по-
мощью ПИД и ЭЗД методом ГЖХ (см. гл. 6.3). В последнем случае концентрацию сульфидов
в биологических объектах можно определить на уровне нескольких нанограммов па I мл.
Отравление оксидами азота
Токсичными компонентами выхлопных газов бензиновых и дизельных двитатслен (помимо
СО) являются оксиды азота (NO, NO?). которые образуются в результате реакции окисления
азота кислородом воздуха под воздействием высоких температур и давления в цилиндрах дви-
гателя. Кроме тою. NO является промежуточт ым продуктом при получении а отпои кислоты
окислением аммиака или азота воздуха, выделяется при сварочных работах и как продукт не-
полного сгорания топлитш. ПДК NO 5 мг/м . Диоксид азота (NO.) образуется при использова-
нии концентрированной азотной кислоты (например, при нитровании целлюлозы, глицерина,
травлении меди и медных сплавов), применяется как нитрирующий агент, гомогенный катали-
затор при получении серной кислоты камерным (башенным) способом. ПДК NO, 2 мг/м*.
Сравнительная токсичность NO и NOj зависит от их концентрации и длительности воз-
действия. NO способен реагировать с большинством биологически активных вешеств in vivo,
и его роль в организме многообразна (см. гл. 2 4. 3 и 8.5). При значительном увеличении в
организме продукции NO его пито токсичность определяется преимущественно способностью
превращаться в новые вторичные оксиданты, причем эти превращения носят циклический
характер. Взаимодействие NO со свободным кислородом приводит к образованию высоко-
токсичного диоксида азота NO?. однако эта реакция в физиолог тческих условиях протекает
медленно и при низких концентрациях NO in vivo нс играет существенной роли в токсическом
повреждении клеток. одг ако патогенные эффекты резко возрастают при его ыпернролукции.
NO, оказывает выраженное раздражающее н прижигающее действие па дыхательные пути, что
приводит к развитию токсического отека легких; уч истае т аэробное и стимулирует ана робкое
окисление в лет очной ткани. Нс исключена возможность обшего действия, в том числе за счет
всасывающихся в кровь с поверхности легких продуктов клеточного распада.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 761
Оксид азота т \,О) — невоспламеняюшпйся газ почти без запаха, был о гкры г Пристли в 1776 г.,
его свойство как анестетика были определены Дейви в 1799 г„ применять в лечебных целях
N.O начали с 1860 г. При злоупотреблении N.O вызывает эйфорию. Вдыхание воздуха, содер-
жащего N,0 в концентрации 40%. сопровождается беспокойством, спутанностью сознания и
седативным эффектом. воздух, содержащий 80% N.O. вызывает бессознательное состояние у
большинства людей. Пороговое ограничение для профессионального использования 90 мг/м*.
После воздействия N;O выводится очень быстро посредством легочной диффузии Не об-
наружено какой-либо биотрансформанни в организме. При злоупотреблении \,0 возможен
летальный исход. Этот газ угнетающе воздействует на ЦНС, может вызвать асфиксию. Распре-
деление и посмертные концентрации N,0 в тканях и органах представлены в табт 8-21.
[аблнтш 8-21. Распределение и посмертные концентрации N,0 п тканях и ортанах
Коэффициент распределения \2О
кровь/газ мозг/кровь неяснь/кровь почкн/кровь жировая ткань кровь
0.47 и 0.9 0.9 2.3
Диапазон копнен грации N.O
Кровь, мл/л Мозг, мл/кт Лет кис мл/кг
66-88 27-34 11- 16
Методы определения
Оксиды азота (NO, NO,, N2O) опрсд тятот в биологических пробах методами ИК-Фурье-
спсктрометрии (время измерения 3 мин, концентрации компонентов мотут различаться более
чем в 7(Ю раз), ГХ, масс-спектрометрии, но в большинстве случаев используют ГХ. В моче
оксид азота N2O можно определять с помощью метода ГХ-МС (см. гл. 6).
8.3.3. Цианистый водород и цианиды
«Молекулы жизни из молекул смерти» — лог афо( т зм выражает су гь одной из гипотез, под-
твержленнон многочисленными опытами, постоянным субстратом самопроизвольною синтеза
аминокислот, белков и нуклеотидов в добиолотический (бескислородный) период развития
планеты Земля был цианистый водород (HCN).
Синильная кислота (цианистый водород, цианистоводородная кислота) — бесцветная про-
зрачная жидкость со своеобразным запахом, напоминающим запах горькою миндаля однако
приблизительно 50% населения нс способны распознать этот запах.
Температура плавления НС!\/ 13.3 "С, кипения 25.7 “С, очень летуча при обычной темпера-
туре. Так. при 20 С максимальная концентрация HCN достигает 837—1100 г/м’. Синильная
кислота на воздухе быстро испаряется, в газообразном состоянии обычно бесцветна. С водой
HCN смешивается во всех отношениях, легко растворяется в спиртах, бензине и других орга-
нических рястворн гелях. Пары хорошо адсорбируются текстильными волокнами и пористыми
vwc прилукгми. кирпичом, бетоном, древесиной. (TCN диффундирует
даже ‘lejxrj яичную скор тунх. Пары HCN вы. сляются. когда ее соли смешиваются с кислотами
или попадают в кислое содержимое желудка.
HCN и сс соединения относятся к чрезвычайно ядовитым веществам нейротоксическою
действия, они блокируют кт сточную цигохромоксилазу. в результате чего возникает выражен-
ная тканевая гипоксия. Отравление может наступить при вдыхании паров HCN. поштланин
ес на кожу или в желудок. Всасывается очень быстро. Смертельная доза синильной кислоты
50—100 мг. цианида калия 200 мт. При вдыхании небольших концентраций синильной кисло-
ты наблюдаются uapairoHi-c в юрлс. горький вкус во рту. головная боль, тошнота, рвота, боли
за фудиной. При нарастании интоксикации урсжастся пульс, усиливается одышка, развива-
ются судороги, наступает потеря сознания. Кожа при этом ярко-розовая, слизистые оболочки
синюшны.
762 Глава 8
При вдыхании высоких концентраций синильной кислоты или попадании ес внутрь появ-
ляются клонико-тонические судороги, резкий цианоз и почти мгновенная потеря сознания
вследствие паралича дыхательного центра. Смерть может наступить в течение нескольких ми-
нут (молниеносная или апоплексическая форма отравления). Концентрация цианистого во-
дорода 0,1 мг/л опасна xifl жизни. Смерн. наступает в течение l-ю часа. ПДК цианистого
водорода в воздухе 0.0003 мг/л. Смертельные дозы цианидов натрия и калия 100 и 120 мг
соответственно.
Основным механизмом токсического действия цианидов и сульфидов (см. выше), попав-
ших в кровь, являются проникновение в ткани и взаимодействие с трехвалентным железом
цитохромоксидазы. которая утрачивает при этом свою физиологическую активность. С же-
лезом, находящимся в двухвалентном состоянии (гемоглобин), эти токсиканты не реагируют.
Блокада транспорта цитохромов, резкое замедление окислнтсльно-восс!зновителы!ых про-
цессов вызывают клеточную шпоксию. коюрая непосредственно затрагивает клетки мозга и
сердца.
Если пострадавшему быстро ввести необходимое количество мстгемог.чобинообразователя.
то образующийся метгемоглобин, в котором железо трехвалентно, вступит в химическое вза-
имодействие с токсикантами, связывая их и препятствуя поступлению в ткани. Болес того,
концентрация свободных токсикантов в плазме крови понизится и возникнут условия /тля раз-
рушения обратимой связи сульфид- и/или пиан-нона с нигохромокепдаюй (рис. 8-17).
Синильную кислоту используют для получения хлорпиана. акрилонитрила аминокислот,
акрилатов, необходимых при производстве пластмасс, а также в качестве фумиганта — средс-
тва борьбы с вредителями сельского хозяйства, лля обработки закрытых помещений и транс-
портных средств. Цианиды ветре таются в воздухе рабочих помещений при производстве
бензола, толуола, ксилола, извлечении золота и серебра из руд, горении целлулоида, в про-
изводстве «гремучей» ртути, гальванопластике, мегаллуршп и др. Растворимые соли калия
и натрия цианида используются в промышленности (гальванические покрытия, обработк
мезалла) и как лабораторные реактивы. Менсе растворимые соли золота, серебра, ртути циа-
нида также выделяют HCN при контакте с сильными кислотами. 11CN часто образуется при
пожарах как продукт сгорания азотсодержащих материалов: шерсти, шелка, синтетических
полимеров, полиуретанов, полиамидов и др. Источниками цианида являются ниансотержа-
шис растения или их семена, которые могут быть случайно или преднамеренно включены в
состав пиши.
Отравление НС\ в условиях производства возможно главным образом в результате вдыха-
ния 1азообразно1о цианистого водорода при проникновении его через кожу.
Среднесуточная ПДК синильной кислоты в воздухе населенных мест равна 0,01 мг/м ;
в рабочих помещениях промышленного предприятия — 0.3 мг/м’. Koiiuci грация кисло<ы ло
50 мг/м’ при многочасовом вдыхании опасна и приводи! к отравлению. При 80 мг/м' отравле-
КРОВЬ
Hb Fe2+
NaNO2
V
MetHb Fe3*
♦
MetHb Fe3* CN
Рис. 8-17. Механизм антидотного
ас ii ствия метгемоглоби i гообра зо-
вателей (например. NaNO,) при
отравлении цианидами. MeiHb —
метгемоглобин. шла- цитохром-
оксилаза а.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 763
нис возникает независимо от экспозиции. Если 15 мин находиться в атмосфере, содержащей
100 мг/м’ HCN. это приведет к тяжелым поражениям, а свыше 15 мин — к летальному исходу.
Воздействие концентрации 200 мг/м' в течение 10 мин и 300 мг/м' в течение 5 мин смертель-
но. Дегазацию синильной кислоiu на местности не проводят, так как она высоколетучая. За-
крытое же помещение для лого достаточно хорошо проветрить или онрыскагъ формалином.
Неотложная помощь при отравлении HCN’
• ингаляция амилнитрита (2—3 ампулы):
• 50 мл 30% раствора тиосульфата натрия внутривенно;
• 50 мл 1% раствора метиленового синего внутривенно:
• 10 мл 1% раствора нитрита натрия внутривенно медленно через 10 мин 2—3 раза;
• 20—4( мл 40% раствора глюкозы в» утривенно;
• кордиамин, эфедрин подкожно;
• одновременно с антидотной терапией ингаляция кислорода.
При попадании токсиканта в ЖКТ необходимо промыть желулок 0.1% раствором перман-
ганата калия или 5% раствором тиосульфата натрия. При нарушении лыхапия рекомендуется
пи । итон. лобелии, при коме — искусственная аппаратная вентиляция легких.
Токсикокинетика и 'иотрансформация
Цианистый водород и его соли всасываются через ЖКТ и легкие в течение нескольких
секунд, проникновение через кожу происходил несколько медленнее. В печени иианид-поп
биогрансформирусзся в гиоцианат-ион (SCN ). который значительно менее токсичен (см. л.
2.5) Концентрация цианида в крови быстро снижается (Т , от 1 до 2 ч). HCN выделяется из
организма частично в неизмененном виде через легкие, с мочой и калом, частично в виде ро-
данистых соединений через почки и ЖКТ.
Методы определения
В качестве объектов исследования используются: кровь (10 мл), отобранная в пробирку с
ЭД1А (цианид в крови устойчив при хранении в течение недели при 3°С, но неустойчив при
замораживании или комнатной температуре): желудок с содержимым (важно в посмертной
экспертизе), другие органы; вещественные доказательства.
Пробы крови берут из псри(|>ерийпых участков, например из бедренной вены (см гл. 5).
При приеме цианидов с пишей концентрации цианида в кров г. взятой из сердца, могут до-
стигать 50 мг/л.
На количественное содержание цианидов оказывают влияние процессы гниения из-за бак-
териальной или грибковой контаминации, в результате которого происходит разложение пи-
апидсодсржащнх веществ, находящихся в организме. Поэтому необходимо собирать кровь в
пробирки, содержащие нс только антикоагулянты, но и фторид натрия (см. гл. 5).
О грсдсленис цианидов осуществляют после нробоподготовки. проведенной с помощью дис-
тилляции (сбор пробы только в 10% водный раствор гмдрокисича натрия) или микродиффузии
(см. гл. 8.2). Новая техника пробоотбора — твердофазная микроэкстракния (ТФ.МЭ), которая
хорошо сочетается с хроматографическим анализом и автома гическим устройством для ввода
проб в хроматограф (см. гл. 5 и 6).
В настоящее время для определения цианидов применяют УФ-спскгроскопию. ГЖХ (ПИД.
термоионный детектор — ТИД или ЭЗД), ВЭЖХ-МС (см. гл. 6).
Сравнение двух методов определения HCN в 20 образцах крови — хроматографическою
и спектрофотометрического показало. что между полученными результатами нет видимых
статистических различий. Однако меньшее время анализа и лучшие метрологические ха-
рактеристики отмечены при использовании ГЖХ. Предел обнаружения равен 1,5 нмоль и
1.1 нмоль при относительном стандартном отклонении 0.05 и 0.08 соответственно, а время
анализа метолом ГЖХ составляет 8 мин, в то время как спсктрофотометрирование занимает
более 2 ч При определении методом газовой хроматографии строят градуировочный график
на основе анализа равновесного пара, образующегося при взаимодействии этилроданида с
дитпотрентолом (в буферном растворе, содержащем ЭДТА) при 60 ”С в течение 15 мин. Обра-
зующиеся летучие продукты анализируют на капиллярной колонке (25 мхО,53 мм) при 100 °C
п применении ТИЛ.
764 Глава 8
Спектрофотометрическая методика основана на взаимодействии HCN с хлорамином Т. вве-
дении окрашенного реагента (барбитуровая кислота в растворе пиридин—12 М 11С1) и измере-
нии оптической плотности продукта реакции при 580 нм.
В образцах цельной кропи НС\ можно определять в равновесной паровой фазе методом ГХ
с ТИД и с использованием криогенной печи. При низкой температуре печи (от -30° до +160 "С)
без потерь вводят в капиллярную колонку 5 мл равновесного пара, что позволяет в 10—100 раз
повысить чувствителт ность по сравнению с традиционными методиками При применении в ка-
честве внутреннего стандарта пропионитрила предел обнаружения равен 2 нг/мл (относительное
стандартное отклонение 0.029—0.118). Методику используют в судебно-химическом анализе.
Парофазное реакционно-хромато рафическое разделение (см. гл. 6.3) I1CN в крови основа-
но на ее превращении в хлорниан (CNCI) в колонке-реакторе с хлорамином и детектировани-
ем с помощью ЭЗД, предел обнаружения равен 005 мкг/мд (рис. 8-18).
Широко известны методики определения цианидов химическим методам. многие из которых
приведены в электронном учебнике по токсикологической химии (см. список рекомендуемой
литературы) Поэтому О1рапичимся кратким указанием на используемые химические способы
определения цианидов в биообъектах.
Реакция образования берлинской юзури — характерный тест обнаружения цианидов, который в
критической ситуации выполняют с желудочным соасрж тмым без предшествующей дистилляции.
Определение цианидов может быть проведено при общем анализе на лету» ис яды и целе-
направленном анализе (табл. 8-22).
При проведении обше то анализа на летучие
___!_________________I__________________1_
0 5 10
В «имя удерживания мин
Рис. 8-18. Хроматограмма кропи содержащей
1 мкг/мз HCN:
1 — воздух; 2 — хлорнипп; 3 — метиле! !хлоршт
(внутренний иандарт). Разделение проводили
на стеклянной колонке при 55 “С. с использо-
ванием УЗД.
яды положительные результаты перечисленных
выше реакций являются необходимым устови-
с.м последующего применения подтверждающей
частной методики определения HCN.
При отрицательных результатах указанных
реакции делают заключение о пеобпнружепии
HCN в биоматериале.
При целенаправленном исследовании по-
ложительные результаты реакций образования
полиметинового красителя с пиридин-бензиди-
новым реактивом, берлинской глазури на импре-
гнированной бумаге п микрокристаллов цианида
серебра служат основанием для заключения об
обнаружении цианидов. При слабоположитеть-
ных результатах реакций обнаружения HCN
лнстихтят упаривают и вновь проводят реакции
образования полиметинового красителя с пири-
дин-бензидиновым реактивом, берлинской 1 ia
зури на импрегнированной бумаге и микрокрис-
таллов цианида серебра. В случае отрицательных
результатов перечисленных реакций дают заклю-
чение о необнаружении синильной кислоты.
Предел обнаружения HCN вышеперечислен-
ными реакциями в стснкс желудка с содержи-
мым стенке кишечника с содержимым, печени,
почках, крови и моче 50 мкг в 100 г. в головном
мозге 100 мкг в 100 г органа.
Для пациентов с почечной недостаточнос-
тью. у которых могут накапливаться тиоцианаты
в высоких концентрациях и вызывать токсичес-
кое действие, необходимо определять в плазме
или мочетионионат-ионы. Присутствие тиоцио-
патов и тиосульфатов при концентрации ло
50 мг/л нс мешает определению цианид I
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 765
Таблица 8-22. Определение цианидов
Общий анализ на летучие яды (I) Целенаправленный анализ (II)
Примечание
Биообъекты
Печень, почки, головной мозг. Печень, почки, головной мозг. До проведения изолирования
кровь и моча легкое, селезенка: кровь и моча HCN исключают мешаюшис
’_____________________________ферро- или феррициаиил-иоиы
П робопояготовка
Первый лис видят. полученный
в результате перегонки с водя-
ным паром биоматернала при
обшем анализе на летучие ялы
Дистиллят объемом 5 мл соби-
рают в 5 мл 0,1н. пироксида
натрия
И олированис н з внутренних орга-
нов: перегонка с водяным тром
биоматернала при одновременном
пропускании в перегонную колбу
азота
Изолирование из крови и мочи
метолом мпкроднффузни в мо-
дифицированной камере Конвея
при термостатировании при 50 сС
в лечение 1 ч или суховоздушной
дистилляцией
Пропускание в перегонную
колбу азота позволяет изолиро-
вать до 62.90—88,05% содержа-
щейся синильной кислоты
При совместном с HCN при-
сутствии ферро- или феррипи-
аиид-ионов добавляют ацетат
цинка для их связывания
Качественное обнаружение
Рекция с пиридин-бензидиновым реактивом (чувствительность
реакции — 0.2 мкг). При наличии циан ид-иона образуется полиме-
ги новый краситель с переходом окраски от оранжевой к красно-фи-
олетовой. Максимум светопоглошения окрашенного соединения при
530 им
Используется для свежего и
гнилосгно разложившегося био
логического материала
Реакция с пиридин-барбитуровым реактивом (чувствительность реак
ции 0.2 мкг). При наличии цианил-иоиа образуется полнметнновый
краситель с переходом окраски от синей к фиолетовой. Максимум
светопоглошения окрашенного соединения при 574 нм
Используется только лля свеже-
го биологического материала
Реакция образования берлинской
лазури проводится в пробирке
(чувствительность 10 мкг) или на
импрегнированной бумаге (чувс-
твительность 0.05 мкг)
Реакции образов ния берлинс-
кой лазури па импрегнированной
бумаге
Реакция бензоиновой конденсации с п-иитробснзальдсгидом и
о-динитробензолом (чувствительность 0.05 мкг) Имеет отрицатель-
ное судебно-химическое значение при проведении (II)
Микрокриеталлоскопвческая реакция с нитратом серебра (чувстви-
тстыюсть0.1 мкг). Имеет отрицательное судебно-химическое значение
при проведении (I)
Используется только для свеже-
го биологического материала
Используется только для свеже-
го биологического материала
Количественное определение
Аргентометрическое титрование
При содержании 1,09—10.90 мг
IICN в 100 г гнилостно разло-
жившегося биоматериапа опре-
деляют 94,49—99.92% с относи-
тельной ошибкой ± 8.39—0 54%
Фотометрический метод изме-
рения оптической плотности
соединения, полученного по ре
акнпн с пиридин-бензидиновым
реактивом
Флюорпметрическин метол (пре-
дел обнаружения 0.1 мг/л)
При содержании 50—1000 мкг
HCN в 100 г органа определяют
62.90 88.05% HCN после сс
изолирования при пропускании
в перегонную колбу азота
Используют 50 мкг крови
766 Глава 8
При проведении судебно-химического исследования органов и тканей погибших при отрав-
лении HCN людей необходимо учитывать следующие обстоятельства
• Содержание цианидов в органах и тканях погибших при отравлении НСХ снижается в пос
лсдователытости: желудок с содержим ым > кровь > печень > почки> кишечник е содсрж т-
мым > ткань головного мозга > моча.
• Естсс!венные количества цианидов. содержащиеся в органах и биологических жи костях
человека. можно обнаружить современными физико-химическими методами (например, в
равновесной паровой фазе методом ГХ с ТИД и с испозыловапием криогенной печи), чувс-
твительность приведенных выше химических реакций недостаточна
• Количественное опрс с тснис цианидов в содержимом желудка следует проводить обя а
телыто. если путь приема гоксикаша является сомнительным или неизвестным.
• Следует учитывать при интерпретации результатов температуру хранения биообра шов орта
ттов и тканей для исследования цианидов, а также присутствие в моче и крови углеводов и
ацетоновых гел (табл. 8-23).
Таблица 8-23. Возможные сроки определения цианидов в органах и тканях (экспериментальные данные
in vnro)
Биообъект* Содержание цианидов. % исходно- го ко.тичсства сшшлыюй кис.юты Возможный срок определения ци- анидов при гейт i ра гу ре хранения 20 С
Кровь 44.38 Через 7 дней
Моча 4.58 Через 7 дней
Кровь + 1% раствор сереб- ра нитрата (ст-.били.затора) + этанол Моча + 1% раствор серебра нитрат (стабилизатора) + этанол 73.05 64.45 Через 7 дней Чсре) 7 дней
Кровь + глюкоза 55.20 Через 1 сут
Моча + глюкоза 34,40 Через 1 сут
Кровь + ацетон 80.00 Через 1 суп
Моча + ацетон 70.01) Через 1 сут
Кровь + ацетон + глюкоза 46.00 Через 1 сут
Моча + аиетон + глюкоза 28.00 Через I сут
'Содержание в биообъекте: ТОГО) мкг синтстьиой кислоты в 100 м.1 жидкости. I г ацетона в ТОО хы жидкости. I г глю-
козы в 100 мт жидкости
Интерпретация результатов
• Концентрация цианида в крови менее 0,05 мг/л — результат метаболических процессов.
• Концентрация цианида в крови до I мг/л вызывает незначительное токсическое действие.
• Концентрация цианида в крови 17—20 мг/л вызывает значительные повреждения и смерть.
В посмертных случаях после перорального приема цианидов с нишей концентрация циани-
да в крови редко составляет более 10 мг/л.
• Концентрация цианида до 1 мг/л в крови (как в прсдсмсрт тых. так и посмертных образцах)
наб. юдается при ингаляционном пути его введения (например, при пожарах).
Амигдалин
Амигдалин — p-D-O- глюкозид, содержащий цианогруппу. Он обнаружен в ядрах миндаля,
абрикосов, вишен, персиков, корне маниоки и других растениях. В 100 г сырых ядер абрикоса
содержится 217 мг цианидов.
Амигдалин может гидролизироваться ферментами или кислотой (щелочью) сначала до
манэелонитри т-р- D-O-тлюкозида и D-глюкозы. затем до манделонитрила и D-глюкозы и,
наконец, до бензальдегида и цианистого водорода. Эта реакция при попадании влаги ка-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп. . 767
тали шруется группой ферментов ( эмульсинов), присутствующих в ядрах плодов. которые
содержат амигдалин. Если плоды попали внутрь, то реакция продолжается в кислой среде
желудка или щелочной — кишечника, а также из-за присутствия бактериальных гидроли-
тических ферментов.
Для лечения онколологичсских больных за рубежом используют препарат Laetrile. который
ранее считали мдпделонптрнльным глюкуронидом. Однако последующие исследования этого
препарата позволяют при тать, что все известные формы Laetrile — ло фактически амш
далии. Вещество выпускают в таблетках 250 н 500 mi для орального применения и 3 г/10 мл
раствора для внутривенной или внутримышечной инъекции. Ежедневная доза для взрослых —
500 -2500 мг орально или 3000—6000 мг для инъекций. Терапсвшческий курс — 3 нед еже-
дневных инъекпий совместно с ежедневным оральным приемом соответствующих доз. При
внутривенном введении препарата Laetrile гилротш амт латина незначителен Внутримы-
шечно или внутривенно введенная лоза амиглапина может быть выведена в неизмененном
виде с мочой в течение 24 ч почти полностью. При оральном приеме голько X—32% выводит-
ся в неизмененном виде с мочой. Концентрация цианида и тиоцианата в моче увеличивается
незначительно после внутри вс и понт или орального применения амигдалина. Часто пациенты
с онкологическими заболеваниями употребляют миндаль или ядра абрикоса как дополнение
к обычной оральной тын внутривенной терапии амигдалином. У пациентов, получающих
оральные дозы амигдалина, не набдюталось токсических эффектов (концентрации цианида
в крови ниже 1 мг/л). но при добавлении в пишу миндаля, я ра которого содержат р-глюко-
зидазу, уровень цианида в крови увеличился до 2.0 мг/л. что проявилось тошнотой, рвотой,
головной болью, головокружением и слабостью. Другой пример После приема в питу семян
абрикоса возможно острое отравление с летальным исходом. Так. известен случай острого
отравления 9 детей, 2 из которых умерли, после того как каждый из них съел в среднем
10—12 семян абрикоса.
В плазме или моче амигдалин определяют после ферментативного гидролиза в присутствии
бензалытстилп методами УФ-спектр< мстрин, ГЖХ (ЛИП или ЭЗД). ВЭЖХ МС.
8.4. ПЕСТИЦИДЫ
Будем тверды в достижении цели
и мягки в средствах сс достижения.
8.4.1. Классификация пестицидов
Пестици ды — химические средства, применяемые в сельском хозяйстве для мши гы расте-
ний от различных видов вредных организмов и сорняков, а также в гигиене людей и животных.
Термин «пестицид» охватывает широкое разнообразие веществ, имеющих свойство уничтожать
нежелательные формы жизни.
Потенциальная опасность для живой природы и люден, непредотвратимость циркуляции
пестицидов в биосфере и в связи с этим конзакз большого количества людей с ними отличают
неопщилы от прочих химических вешеств. используемых человеком. Более тысячи пестици-
дов используется сегодня в мире. Большинство из них имеет общепринятые названия, со-
гласованные с Международной организацией по стандартизации (International Standardisation
Organisation — ISO). Существуют различные подходы к классификации пестицидов. Их клас-
сифицируют по назначению, способности проникать в организм вредителя, характеру и меха-
низму действия, токсичности и другим признакам (табл. 8-24).
К пестицидам также относят химические средства. стимулирующие и тормозящие poet рас-
тений (регуляторы роста растений), препараты для удаления листьев растений (дефолианты),
препараты для подсушивания растений (десиканты), препараты для отпугивания (репелленты)
и привлечения (апрактанты) насекомых.
768 Глава 8
Таблица 8-24. Классификация пестицидов по назначению, способу проникновения и характеру дейс-
твия
Группа пестицидов Назначение. способ проникновения и характер листвия
Инсскотиды
Контакт ного действия | Вызывают тбель вредных насекомых при контакте
Кишечного действия Вызывают гибель насекомых при попадании в кишечник
Системного действия Способны продвигаться по сосудистой системе растения и отравлять пос-
____________________i лающих его насекомых________
Фумиганты Действуют в газообразном состоянии через орины дыхания насекомых
Гербициды
Контактного действия Вызывают гибель сорных растений при контакте
Системного действия Способны продвигаться по сосудистой системе растений и вызывать их гибель
Почвенного действия Дей твуют на корневую систему растений или па прор стающие семена
Избирательного действия Поражают только определенные виды растений
Сплошного действия Уничтожают всю мстительность
Фунгици ы
Контактного действия Используют для борьбы с патогенными фибами
Системного действия Способны продвигаться по сосудистой системе растений и убивать пато- генные грибы
Защитного действия Способны защитить от воздействия патогенных грибов
Лечебного действия Способны давать лечебный эффект при действии патогенных грибов
Другие группы
Ларвнниды Уничтожают личинок и гусениц насекомых
Акарициды (органотипы) Уничтожают растительноядных клешей
Онинизы Уничтожают яйца вредных насекомых и клешей
Нематопиды (фораты) Уннчюжак* круглых червей
Зоонилы. или родентициды Уничтожают грызунов
Моллюстниилы (ННКЛО- зам иды) Уничтожают моллюсков
Бактерициды Уничтожают болезнетворные бактерии
Классификация пестищЮов по токсичности
Обладая выраженной биологической активностью, пестициды могут оказывать токсическое
действие на организм животных и человека, что приводит к нарушению работоспособности
человека, заболеванию и лаже к смерти
Степень токсичности пестицидов зависит от пути их поступления в организм (ингаляци-
онный. пероральный, трансдермальный и лр.). от индивидуальных особенностей организма
(возраст, пол, наследственность, заболевания и тл.) и ряда других факторов.
Классификация по степени опасности отравления предложена специалистами ВОЗ и осно-
вана на величине LDV пестицидов для крыс в зависимости от пути введения токсикантов и их
агрегатного состояния (табл. 8-25).
Опасность отравления пестицидами зависит от природы соединения, его aipcramoro со-
стояния (жидкая форма пестицида более опасна, чем твердая), продолжительности контакта,
степени летучести токсиканта, его устоичивосзи в окружающей среде персистензность), спо-
собности к кумуляции (накопление в организме).
Персистентность очень важна для оценки токсичности пестицидов. Пестициды делятся по
устойчивости в почве па очень стойкие, период рвхзожения которых составляет более 1 гола,
стойкие — от 6 мес до I года, умеренно стойкие — 1—6 мее, малостойкие — до I мес.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 769
Таблица 8-25. Классификация ио степени опасности ограилепня
Класс опасности Ы)„ для крыс, мг/ы массы re.ia
перорально транслсрчжльно
твердые жидкие твер 1ЫС жидкие
IA — крайне опасные 5 и менее 20 и менее 10 и менее 40 иди менее
IB — высоко опасные 5—50 20—200 10-100 40 -400
II — умеренно опасные 50-500 200-2000 100-1000 400-4000
111 — мало опасные около 5ти> более 2000* около 20110 более 3000* около 1000 1 около 4(КЮ
• Допускается только для некоторых пестицидов.
Кумуляция пестицидов в органилме человеки и животных характеризуется коэффициен-
том кумуляции, который определяется отношением суммарной дозы препарата, вызывающей
гибель 50% подопытных животных при многократном введении, к дозе, вызывающей гибель
50% животных при о некратном нт тении Если коэффициент кумуляции менее 1. вещество
обладает рверхкумуляниеи. при коэффициенте кумуляции 1—3 у вещества выраженная куму-
ляция. при коэффициенте 3—5 — умеренная. при коэффициенте более 5 — слабовыраженная
кумуляция.
Различные классы пестицидов обладают в большей или меньшей степени иммуногоксич-
ностыо, эмбрио токсичностью, гепатотоксичностью и другими видами токсичности
Для отнесения пестицида к тому иди иному классу опасности в первую очередь учитыва-
ется свойство, определяющее его опасность. Это значит, что даже мало токсичное вещество,
по обладающее канцерогенным или мутагенным свойством, мож пт быть отнесено к I классу
опасности Если пестицид по сытному из показателей относится к первой труппе гигиенической
классификации (см. гл. 2). он очень опасен для люден и теплокровных животных.
Для выбора методов определения пестицидов важно знать их свойства. В этом случае более
удобна классификация по химическому строению. В зависимости от химического строения
пестициды подразделяются на две группы: неорганической природы (соединения мышьяка,
таллия, меди, серы и др.) и органической природы синтетического или биологического проис-
хождения. Отдельно можно выделить металлоорганические соединения. например алкилртуг-
ные фунгициды. Большинство пестицидов — это органические соединения, которые подраз-
деляются на классы и подклассы (хлорортаттические соединения — ХОС. фос<|юрз ртаническис
соединения — ФОС. синтетические пиретроиды — СП. карбаматы и т.д.). Представители од-
ного и того же класса, имея сходное химическое стростите, могут иметь разнонаправленное
действие (входить в различные труппы по назначению), обладать иными токсическими свойс-
твами.
Инсектициды подразделяются на 8 химических групп. 5 из которых имеют важное токсико-
логические значение ФОС, ХОС. карбаматные соединения (эфиры карбаминовой кислоты),
естественные и синтетические пиретроиды, производные мочевины.
Героициды по свое т химической структуре подразделяются на 12 групп, но наиболее важны
в токсикологическом отношении то тько 7: хлорированные феноксикислоты. производные мо-
чевины. триззины. урацилы, соединения с четвертичным азотом, карбаматы и гиокарб маты,
карбоциклические кислоты и эфиры. Также гербициды по химической структуре представлены
амидами, хлорапетанилидами. органическими соединениями мышьяка и др.
А' фунгицида.» принадлежат соединения многих химических групп: бензимидазолы, дитио-
карбаматы. ацилалзнпны. ФОС и др. Наиболее важные из них — комплексы дигиокароаматов
с марганцем, никелем и цинком, органические и неорганические соединения мели и ртути.
Родентициды представлены 3 группами сосдт нений: фосфином, салями галлия, обычно
сульфатами; кумариновыми аптнкоатуляпгими.
Акари (иды. мо.икктициды и нематициды 11екоторые и т этих соединений имеют более одной
области применения и могут быть среди вышеупомянутых химических групп веществ.
770 Глава 8
Формы применения пестицидов
Эффективность применения пестицидов зависит не только от действующего псшества. но
и от выпускаемой формы препарата, условий, при которых оно кошакгирует с вредными ор-
ганизмами. Формы выпуска пестицидов смачивающиеся порошки, концентраты эмульсий,
гранулированные препараты, микрокапсулированные препараты, растворы, аэрозоли и др
Основные требования, предъявляемые к пестицидам
Пестициды должны обладать наряду с высокой биологической активностью по отношению
к различным видам вредных организмов и сорных растений комплексом свойств, обеспечива-
ющих безопасность их использования. Важнейшими грсбоваииями. прсдьявляемыми к пести-
цидам. являются:
• низкая токсичность для теплокровных животных и человека.
• обязательное отсутствие у них бластомогенного, тератогенного, мутагенного, эмбрио токси-
ческого дсйст вия и других возможных отдаленных нежелательных последствий.
• отсутствие резко выраженных кумулятивных свойств;
• способность разлагаться в природных условиях на нетоксичные компоненты в течение не
более 2 гет.
Учитывая токсичность пестицидов, а иногда их малую эффективность. например, резис-
тентность переносчиков инфекционных заболеваний к пестицидам. Комитет экспертов ВОЗ
предлагает использовать чередование пестицидов, смеси пестицидов, синергисты пестицидов,
чередование малых и больших лоз, биологические методы борьбы.
Алыерплнвои использования ядохимикатов являются биологические пестициды. При био-
логической борьбе используются агенты, являющиеся токсичными только для насекомых-пе-
реносчиков или вредителей Например, в Индии и Сомали борьбу с малярией ведут с помощью
рыб, поедающих личинок комаров — переносчиков заболевания. а также клопов-гладышей,
выпушенных на рисовые чеки В Иране с этой целью используют грибы Lugeniditim gigantum.
Бактерия Bacillus ihunngiensis продуцирует обширное и неоднородное семейство пестицидных
белков. Многие нз них токсичны для сельскохозяйственных вредитезей. особенно бабочек,
а два типа (серотип H-14J3 В. ihunngiensis и В. sphaencus) продуцируют протеины, токсичные
для личинок комаров и мошки Активность H-14J3 В. ihunngiensis и В sphaencus обусловлена
4 различными белками с относительной молекулярной массой 27 300,65 000, 128 000 и 135 000 Д.
Вполне вероятно, что периодическое применение Н I4J3 В. ihunngiensis н В. sphaencus в ка-
честве ларвицида при чередовании с традиционными инсектицидами позволит прсдогвратить
или отсрочить выработку резистентности к последним. Полезной тактикой предупреждения
резистентности к бактериальным пестицидам может стать дальнейшее совершенствование их
применения путем переноса генов В. ihunngiensis трансгенным организмам (например, сине-
зеленым водорос гям) при сохранении максимального разнообразия пестицидных белков.
8.4.2. Физико-химические свойства, метаболизм, токсичность
Строение и физико-химические свойства пестицидов (изомерия, устойчивость при нагрева-
нии. действии света, влаги и кислороде воздуха, рас воримоегь в воде и органических раство-
рителях, кислотно-основные свойства, летучесть) должны учитываться при проведении ХТА
(выбор способов пробопоягоговки и методов определения, приготовление и храпение рабо* их
растворов, растворов сравнения и т.п.).
Диапазон токсичности пестицидов для людей довольно большой. Известно, что всего 100 мг
тербуфоса. принятых внутрь, смертельны для большинства взрослых людей, в то время как
др>гой пестицид — амитрол не ядовит в лозе нескольких сотен граммов. Даже в пределах од-
ного класса пестицидов токсичность их может значительно различаться. Метаболиты многих
пестицидов являются более токсичными веществами, чем исходные соединения. Некоторые
пестициды нс проявляют высокой токсичности, но входящие в состав выпускаемых препаратов
различные наполнители и раствори гели могут быть ядовитыми и служить главной причиной
симптомов отравлений.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 771
Представители одного и тою же класса пестицидов имеют сходные свойства и часто одни
и тот же механизм действия. Источником отравлении людей и животных могут быть как сами
пестициды, ттк и различные объекты внешней среды, содержащие их. например вода, расте-
ния. пишевые продукты, что связано с накоплением пестицидов в окружающей среде и пере-
мещением их но пищевым пеням. Частая причина (правлений — несоблюдение правил безо-
пасности при работе с пестицидами в быту и на производстве (случайные. профессиональные,
бытовые отравления). Встречаются суицидальные отравления пестицидами. У лиц, занятых в
производстве пестицидов или постоянно использующих их. возможно хроническое отравле-
ние, прежде всего из-за способности пестицидов к кумуляции.
При остром отравлении в первую очередь проявляются специфические симптомы отрав-
ления, зависящие от вши и функциональной роли определенных рецепторов токсичности, с
которыми взаимодействует неепшид или ею метаболит Постепенно появляются признаки
поражения отдельных органов или систем (см. электронное приложение).
При хронической интоксикации, в отличие от острой, проявлению специфических симпто-
мов токсического поражения предшествует длительный период обшссоматических расстройств
(головная боль, головокружение, ломота в суставах, тошнота, рвота)
Антихолинэстеразные препараты
Известно большое количество химических соединений, способных подавлять активность
холинэстеразы (ХЭ). К соединениям, обладающим таким свойством, относятся пестициды из
группы ФОС и производных карбаминовой кислоты, составляющие значительную часть ассор-
тимента препарагов. широко испа ьзусмых в сельском хозяйстве, среди которых инсектициды,
акарициды, гербициды, нсмаюциды. дефолианты и другие ядохимикаты. Ведущим звеном в
механизме действия этих вешеств на организм человека и животных является нарушение ка-
талитической функции фермента ХЭ во всех органах и структурах, имеющих холинергическую
иннервацию, прежде всего в ЦИС. Поэтому фосфорорганические пестициды (ФОН) и карба-
маты относят к нервным или синаптическим ядам.
Фосфорорганические пестициды
OixpbiT не биоло) нческих свойств сложных эфиров фосфорной кислот ы произошло случай-
но в 1932 г. после выявления сильных холинергических эффектов у людей при вдыхании паров
фторднгидрида диэтилфосфата. В 1934 г. Г. Шредер предложил использовать вместо никотина
в качестве инсектицид» тетраэтнлпиро<|хх.-фвт. Он же положил начало разработкам, привел
шим к получению «нервных» газов табуна и зарина. После Второй мировой войны были син-
тезированы и апробированы в качестве инсектицидов более К) ООО вешсств класса ФОС. По-
тенциальное количество соединений, которые можно создать на основе структуры (рис. 8-19).
предложенной Г. Шредером, оценивается в 250 Ю0 наименовании.
К настоящему времени известно более 100 коммерчески доступных ФОН. которые ежегодно
производятся в количестве 1.5-2.5-105т (табл. 8-26). К ним относятся эфирные, амидные или
тиоловые производные фосфорной (дихлофос). тиофосфорноп (метафос. трихлорметафос. мср-
каптофос и др.), дитиофосфортюй (карбофос, фосфамид и др.), пнрофосфорной. фосфоновой
(хлорофос) кислот.
ФОП представляют собой твердые кристалли-
ческие вешества, бесцветные или желтовато-ко-
ричневые, часто маслянистые жидкости. Многие X
из них имеют неприятный специфический запах,
низкое давлен не пара, мллорастворимы в воде, хо-
рошо — в липидах. Большинство ФОП, за исклю-
чением дихлорфоса, имеет сравнительно низкую R_______ _______R
летучесть, в воде подвергается гидролизу, образуя ’
неядовитые соединения, опасность отравления
которыми значительно меньше по сравнению с
хлорорганнческими лесищи ламп, которые более Rj
продолжительно воздействуют на организм.
Рис. 8-19. Общая структурная формула ФОС
772 Глава 8
Габлица 8-26. Классификация ФОН
Подкласс к. Из х
Фос<|юро дитионаты О-алкил О-алкил S-алкил. S-арил S
Фосфиротиоиаты О-алкил О-алкил О-алкил. О-армл S
Фосфо отиоаты О-алкил О-алкил S-алкил. S арил о
ФоС<|)<||Ы O-UJIKH.I O-rtJlKILl О-аЛМЫ. O-jpiLl О
Фосфоиаты О-.МСТИ.1 О-метил Аллил. ариз О
Фосфонсцип иоаты алкил О-алкил S арил S
Фосфороам идотноаты О или S-алкил О-алкнл Nil,-группа О ши S
В сельском хозяйстве используют главным образом эмульсионные концентрасы или влаго-
поглощаюшие порошки для получения жидких зроюлей и гранул. Летучие соединения ис-
пользуют ограниченно.
ФОП легко всасываются через кожу, попадают в организм через дыхательную систему и
ЖКТ Независимо от способа введения концентрация многих ФОП в мозге значительно мень-
ше. чем в других тканях, что связано с их плохой проницаемостью через гематоэнцефаличес-
кий барьер.
Биотрансформация ФОП происходит путем окисления и гидролиза при действии эстераз,
что приводит к образованию продуктов различной токсичности. ФОП и их метаболиты вы-
водятся в виде глюкуронидов с мочой и калом. Степень и время эффект зависят or природы
ФОП Нейротоксическая активность ряда ФОП может изменяться в результате биотрансфор-
мации.
Так, метаболизм триортокрсзилфосфатз (ТОКФ) в организме животных протекает с образо-
ванием циклического соединения о-полнинклосалегининфосфата. нейротоксические свойства
которого выражены в 5 раз сильнее, чем у ТОКФ. В процессе превращения лсшофоса образу-
ются такие метаболиты, как лептофосоксон и десбромлептофос. которые в 2—3 раза активнее,
чем леигбсЬос. Метаболитом афоса является оксиосфонат. обладающий более сильным нейро-
паралитическим свойством. При окис л :нии паратиона образуется высокоюксичное соединение
параоксон. Некоторые фосфоротиоаты вследствие большей липофильности могут находиться в
организме в неизмененном виде в течение многих дней или недель, что провоцирует рецидив
клинических проявлений после улучшения. Другие, например дихлофос (О.О-дпметнл-О-2-2-
дихлорвинил фосфат) и омегоаг (л имел и (фосф ротиоаг) быстро гидролизуются в неактивные
соединения и не оказывают пролонгированного токсического действия. Как правило. ФОП нс
накапливаются в организме человека. Однако после острой интоксикации ФОП обнаруживают
в жировой ткани в течение нескольких недель.
ФОП нарушают каталитическую функцию ХЭ. Ацетилхолин (АХ) является медиатором ЦНС.
синтезируется в нервных клетках из холина и уксусной кислоты при участии ХЭ и анетилко-
энзима А. ХЭ локализуется нс в митохондриях нервных клеток (по последним данным), а в
цитоплазме, обладает высоким сродством к мембранным рецепторам. АХ накапливается в окон
чаниях нервных волокон, которые отделены от синаптической щели прссипаптичсской мемб-
раной. )а синаптической щелью шириной 20-50 нм расположена постсинапгаческая мембрана.
ХЭ располагается как на пресипаптичсской. так и на постсинаптическон мембране.
Нервный импульс, достигая синаптического окончания, деполяризует его. в синапсе проис-
ходит обратимое увеличение концентрации ионов калышя. что и приводит к выбросу АХ в си-
наптическую шель. АХ взаимодействует на постсннаптической мембране с холиноренептором —
мембранным комплексом белковой нрироты. имеющим анионный центр, который рсапзруст с
катионной головкой АХ. Другой участок рецептора взаимодействует со сложноэфирной груп-
пировкой молекулы АХ, что приводит к открытию иди закрытию ионных каналов. возникает
деполяризация мембраны. Антихолннэстеразные вещества нарушают цепь синаптической пере-
дачи возбуждения. Быстрый гидролиз АХ обеспечивают ферменты ХЭ. среди которых известны
аиетилхолинэстераза (АХЭ). бутирилхолн i эстераза (БуХЭ) и бснзоцдхолинэстераза (БеХЭ). АХЭ
содержится веером веществе мозга, симпатических ганглиях, нейронах спинного мозга, эритро-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 773
нитах. эндоплазматическом ретикулуме, мышцах и
других тканях. Гидроксил серина и пиридиновый
ато.м азота имидазола в гистидине — аминокислот,
входящих в ХЭ. ответственны за ее реакционную
способность по отношению к АХ. Конформаци-
онные изменения молекул су страта и фермента
обеспечивают высокую каталитическую эффек-
тивность реакции ХЭ и АХ. которая протекает за
несколько миллисекунд. АХЭ траст главную роль
в гидролизе .АХ.
ФОП вызывают необратимое ингибирование
АХЭ, фосфорилируя фермент и накапливая АХ
на чувствительных к нему рецепторах (рис. 8-20).
На первой стадии (1) происходит обратимая
конкурентная реакция (обратимое ингибирование
ферментно-субстратного комплекса Михаэлиса),
затем — фосфорилирование гидроксила серино-
вого остатка фермента и потеря группировки X
(2). далее возможна реактивация комплекса (3),
о
® II
Энжм - OH * X - Р - (Oft)2 » Энзим ОН X-P-^OR^
А
I @
♦
® I
-------4--------- Энзим-О-Р-(0Н)г
Энзим -O-P-OR
I
О
Рис. 8-20. Ингибирование ЛХЭ ФОП. Поясне-
ние в тексте.
скорость которой зависит от природы песшпи-
па. pH среды и наличия оксимов, катализирую-
щих реакцию, или вторая необратимая сталия (4) — разрыв R-OP связей, в результате чего
ингибитор (ФОП). входящий в комплекс с ферментом, отличается от своей первоначальной
cipyi гуры. В результате деалкилирования прочность связи с ХЭ резко возрастает, т.е. происхо-
дит старение комплекса ингибитор—фермент и гидролиза АХ не происходит. Итак, различие
во взаимодействии ХЭ с АХ и ФОС состоит в том. что ацетилированный фермент — очень
непрочное соединение, легко подвергающееся гидролизу, что освобождает активные пенгры
ХЭ для новых реакций с АХ, а при фосфорилировании образуется чрезвычапно устойчивое к
идролизу соединение, утратившее свою кагялшичсскую функцию и неспособное рсагировазь
с АХ, Устойчивость к гидролизу фосфорилированной ХЭ зависит от характера алкоксиГрупп.
связанных с фосфором и увеличивается в последовательности’ диметиловые, диэтнловые. ди-
изопроп иловые эфиры фосфор зых кислот. последние практически необратимо угнетают ХЭ.
Стр< е шс ХЭ и холинорецепторов имеет много общего, поэтому ФОП могут взаимодейство-
вать не только с ферментом, но н с холш оренеитором (например, паратион).
большей токсичностью и лнти.холин-эстеразной активностью характеризуются соединения,
в которых атом фосфора связан с кислородом, а не с ат мом серы. Оптические и геометричес-
кие изомеры ФОП проявляют разную ангихолинэшердзную активность.
Клиника острой интоксикации ФОП включает мускарино- и никотиноподобные наруше-
ния, изменения со стороны центральной нервной и дыхательной систем
Потребов. пням ВОЗ. препараты, оказывающие отдаленное нейротоксическое действие, —
ОНД (через 14—21 день, а иногда через 1—5 лет после перенесенного острого отравления),
приводящее к стойкой потере трудоспособности, не допускаются к внедрению в практи-
ку. К настоящему времени механизм ОПД ФОП окончательно не выяснен, нс установлена
прямая связь между нх аигихолинэстсразпым и нейропаралитическим действием. Мишенью
ОНД ФОП является специфический белок нервной ткани, так называемая нейротоксическая
(нейропатическая) эстераза (НТЭ). Фосфорилирование эстеразы сопровождается гидролизом
эфирной (Р-О-С) или амидной (P-N -P) связи ФОП. приводящим к появлению ионизиро-
ванной |рупны кислого характера. Снижение активности НТЭ регистрируют задолго до по-
явления клинических признаков нейропатии. Развитие ОНД связано не только с угнетением
НТЭ. но и с последующим се старением. Под старением понимают такое изменение структу-
ры фосфорилированной 11ТЭ. в результате которого она теряет способность к реактивации.
Ингибирование активности фермента менее чем на 70 80% не обеспечивает старение, и та-
кие ФОП не вызывают ОНД. У человека похожий на НТЭ фермент обнаружен в лейкоцитах
и тромбоцитах периферической крови. В настоящее время определение в периферической
крови этого фермента рас матривается как тест, предсказывающий у людей р гзвнгне поздних
774 Глава 8
невропатй. К ФОП. выливающим невропатии. относятся: S.S.S-грибутил-фосфорот pin по-
эт, мерное и фентионы.
Об опасности отравлений человека ФОП свидетельствуют приведенные в табл. 8-27 высшая
суточная доза (ВСД). ПДК в пределах рабочей зоны и предельная пороговая величина (ППВ)
для некоторых ФОП.
Таблнла 8-27. ВСД ПДК и ППВ лля некоторых ФОП
Соечииенне ВСД. мг/кг массы тела ПДК, мг/м1 1111 В. мг/м1
Ацефат 0,03 — —
Эт ил-азннофос нет — —
Метил-азииофос 0.005 0.2 0.2
Бромофос 0,04 — —
Этил-бромофос 0,003 - -
Карбофенотион 0.0005
Хлорфенвинфос 0.0005 — —
Метил хлорпирифос 0.01 — 0.2
Хлортион нет — —
Кум 1фос нет —
Леметон пег 0,1 0.11
Дсметон-S-Mci ил
и его производные 0.0003 — 0.5
Диазинон 0,002 1.0 0.1
Дихлорфос 0.004 1.0 0.9
Диметоат 0,01 — —
Дпсу 1ьфотон 0,0003 — 0,1
Этиоп 0.002 0.4
Фенитротион 0.005 —
ФС1ГТИОН 0.007 0.2 0.2
Малатион 0.002 15 10
Мсвншрое 0.0015 0.1 0,092
Ометоат 0.0003 —
Этил- парат ион 0.004 0,1 0,1
Метил-паратнон 0.003 — 0.2
Мстил-при м ифос 0,03 — —
Т пометой 0.003 — —
Достаточно сложно предоставить достоверные данные о летальных долах для человека. Счи-
тается. что прием внутрь или ингалянионно 10—300 мг паратиона оказывает летальное воз-
действие на взрослого человека. Определена смертельная доза диазинона для человека, которая
составляет 25 мг при присмс внутрь, средняя летальная доза малатиона равна примерно 60 г.
Однако известны случаи, когда дети погибали от воздействия 0,1 мг/кг паратиона. При адек-
ватном лечении можно пережить и воздействие намного более высоких доз на организм.
Лечение острых отравлений включает уход и специфическую герапию противоядиями для
нейтрализации то :ичсского действия ФОП. Как антидот используют атропин, который начн-
ется блокатором М-хо шпорецепторов. Однако атропин не оказывает значительною влияния
на скорость регенерации ингибированной ЛХЭ.
Оксимы яатяются антагонистами ФОС, т.е. это реактиваторы ХЭ. В результате деалкилирова-
ния некоторые ФОС вызывают настолько быстрое старение комплекса фермент—ФОС. что ок-
симы уже не могут оказать действия. При использовании некоторых оксимов возможны тяжелые
последствия. поэтому прежде чем назначать оксимы, необходимо идентифицировать ФОС
Карбаматы (эфиры карбаминовой кислоты)
Термин «карбаматы» используется для обозначения класса органических соединений, яв-
ляюшт хся производными карбаминовой кислоты и обладающих различной биологической
активностью (инсектициды, гербициды, фунгициды, мо. яюскоциды). Карбаминовая кислота
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 775
(амид угольной кислопа) н свободном состоянии неизвестна. Соли карбаминовой кислоты,
напротив. устойчивы, и именно они носят название «карбаматы». В качестве пестицидов на-
шли применение не соли, а сложные эфиры карбаминовой кислоты — урезаны В связи с этим
использование термина «карбаматы» применительно к производным карбаминовой кислоты,
являющимися пестицидами, некорректно Тем не менее этог термин принят в химии пестици-
дов и будет нами использован при дальнейшем изложении материала.
Карбаматы представляют собой синтетические аналоги токсичного алкалоида физостигми-
на, выделенного из калабарских семян растения Phvsosiigma ve/ienosum в 1864 г. Химическая
струк ура этого вешества была установлена
Стедманом и Бейкером в 1925 г., а холинерги-
ческие свойства описаны Леви в 1926 i
Известно большое количество антихолнп-
эстеразпых карбаматов. Карбаматы, исполь-
зующиеся в качестве пестицидов (КП), явля-
ются синтетическими производными сложных
эфиров карбаминовой кислоты H.N-COOH
(рис. 8-21). Гиокарбаматы и дитиокарбаматы
рассматриваются ниже, они имеют ином меха-
низм действия.
Среди КП выделяют карбоциклические,
гетероциклические и оксипроизводныс кар-
баминовой кислоты. Большинство из них ма-
лорастворимо в воде и умеренно растворимо
в бензоле, толуоле, ксилоле, хлороформе и
1.2-дихчорохтетанс Некоторые соединения
Рис. 8-21. Обшая структурная формула карбама-
тов. R — н большинстве случаев радикалы бен-
зола. нафталина или других соединений с арок i-
тнчсским кольцом; R — обычно только водород.
R — обычно метильная группа.
плохо р«зстворимы в неполярных органических растворителях, но хорошо растворимы в относи-
тельно полярных органических растворителях: метаноле, этаноле, ацетоне, диметидформамнле
Как сложные эфиры они подвержены гидролитическому рахтожению особенно в щелочной
среде. При увеличении pH па каждую единицу выше 7,0 скорость гидролиза увеличивается
приблизительно н К) раз, при повышении температуры на 10 *С — почти в 4 раза. Неустойчи
востъ этих соединений в щелочах используется для очистки и обеззараживания предметов от
присутствующих на них карбаматов.
КП в основном применяю! и сельском хозяйстве в качестве инсектицидов. фунгицидов,
гербицидов, нематонидов или для подавления роста сорняковых побегов. Кроме того, их ис-
пользуют в промышленности или других сферах деятельности, а также в домашнем хг шйстве
как биоциды
Соединения, применяемые в сельском хозяйстве, выпускают, как правило. в виде смачива-
ющихся порошков, пылеобразных вешеств. гранул и концентратов с эмульгирующей способ-
ностью. Важно отметить, что некоторые карбаматы выпускаются в комбинации с другими пес-
тицидами. Это особенно важно для шагпостикн и выбора методов лечения при отравлениях.
КП легко проникают через неповрежденную кожу, слизистые оболочки, дыхательные пути
и пищеварительный тракт. Опасность для здоровья представляет частое контактирование с
КП. связанное с профессиональными обязанностями. Воздействие на организм происходи!
ингаляционным путем и через кожу, перорально — при суицидальных попытках и случайном
приеме внутрь.
Производные мстил- и димегилкарбаминовой кислоты подвергаются окислению (нрн учас-
тии ра зличных оксидаз) либо гидролизуются и выводятся в свобгдном и конъюгированном (с
серной или глюкуроновой кислотой) виде. Реакции окисления включают N-демсгнлиронание.
гидроксилирование ароматического кольца. О-дсалкилирование. алкильное гидроксилиро-
вание. сульфоокисление, превращение N-мсти ьных групп в N-формамидныс или N-гидро-
ксиметильные группы, а также образование дигидроксипроизволных ароматического кольца.
Как правило, метаболиты менее токсичны, чем исходные карбаматы. KJI быстро выводятся с
мочой.
Известно, что пестншьт карбарил бпотрансформируется путем окисления, гидролиза и
конъюгации (с глюкуроновой или серной кислотой) Образовавшийся при гидролизе Р-нафгол
776 Глава 8
составляет более 20% принятой внутрь дозы, выводится с .мочой в свободном и ко гьюгирован-
но.м виде вместе с небольшим количеством конъюгированного 4-гидроксикарбарила.
КП. подобно ФОП. снижают активность ХЭ. но ингибирование активного центра фермента
обратимо. Клинические проявления отравлений обоими типами всгпесгв, т.е. карбаматами и
ФОП. одинаковы, но у карбаматов они менее продолжительные. Опасность отравления при
ежедневном воздействии токсикантов на организм не увеличивается, поскольку их количества
недостаточно для немедленного проявления симптомов интоксик щии. Обычно симптоматика
отравления сохраняется не более 8 ч. Me гнл карбаматы угнетают активность ХЭ в 5—10 раз
сильнее, чем димсгилкарбаматы АХЭ способна гидролизовать КП. хотя скорость гидролиза
при этом будет ниже, чем при гидролизе естественного субстрата <|>ер.мента — АХ. Симптомы
отравления проявляются, если количество пестицида в организме достигает того уровня, при
котором скорость карбамилнрования АХЭ превышает скорость пиролиза КП под действием
фермента. При этом происходит накопление АХ в нейроэффекторном и синаптическом про-
странстве. что ведет к клинических проявлениям. подобным отравлению ФОП. КП не вызы-
вают длительных невропатий.
Токсичность КП колеблется в широких пределах. Большинство ароматических карбаматных
сложных эфиров обладает низкой токсичностью при грансдсрмальпом пути введения. Однако
алдикарб проявляет сильное токсическое действие при попадании в организм как через кожу,
так и перорально. Доза большинства КП. при принятии внутрь которой возможна интокси-
кация с летальным исходом, составляет для человека 50—500 мг. Так. описан случай гибе ш
в 2005 г. 27 филиппинских студентов после употребления в пишу корней маниоки, в которых
содержались КП. часто используемые па фермах и в домашних хозяйствах па Бохоле.
Специфическое лечение заключается в применении атропина до тех пор. пока нс появят-
ся признаки атропипизатши или обратная динамика симптоматики отравления. Очень важно
поддерживать дыхательные пути свободными При попадании токсиканта через рот можно
провести промывание желудка. Использование оксимов противопоказано.
Наиболее широко применяемые КП: карбарил (севин). пиримор (пиримикарб, рапид), дра-
вин 755 (алфилип. бутокарбоксим). пропоксур (байгой) алдикарб (енмак. тсмик).
Дитиокарбаматы
Дитиокарбаматы (ДТК) — широко используемые фунгициды; их можно разделить на три
группы: тиурамы, димсгилдитиокарбаматы и этилен-бне-дитиокарбаматы.
Дисульфид углерода (CS.) и 2-гиотиазолидин-4-карбоно1мя кислота (ТТКК) являются ме-
таболитами, общими практически лля всех ДТК. Существенное повышение концентрации
этих соединений в моче наблюдается при воздействии ДТК-песгицидов. Этилентномоче-
вина (ЭТМ) — основной метаболит эгилсн-бис-дигиокарбамагов. Она также присутствует
в виде примеси при промышленном выпуске препаратов. ЭТМ считается тератотенной и
канцерогенной для крыс и других видов животных, обладает тиреотоксичностью и широ-
ко используется для оценки воздействия этилен-бис-литиокарбамага. ЭТМ — нсспсцнфич-
пое производное. Он г может образовываться из манеба, маикоцеба тип цинеба. В качестве
альтернативного метода определения воздействия ДТК может использоваться определение
металлов в моче пострадавших, так как ДТК легко образует комплексы с различными метал-
лами in vivo (см. гл. 8.5). Так. у рабочих, подвергшихся воздействию маикоцеба, повышается
выведение марганца с мочой
Хлорорганические пестициды
Хлорпроизводные алифатических, алициклических, ароматических углеводородов состав
лягот большую группу пестицидов, применяемых в сельском хозяйстве. Представители этой
группы обладаки инсектицидной. акартшилиой. фумигантной и другой активностью, но в ос-
новном — эю контактные инсектициды с длительным и широким спектром действия.
Хлорсодержащие псегипилы (ХОГГ) условно принято делить на четыре группы:
• ДДТ и его аналоги:
• гексахлорогшклогексап (ГХЦГ);
• циклодиены и их производные;
• токсафен и его производные.
Метаболизм и опредет ениетоксикантов различных химических групп.. 777
Bciucciini входящие в ли группы, значительно различаются по способу применения, ток-
сическому воздействию и соответственно способам лечения отравлений Дтя ХОП характер-
на химическая стабильность. Они плохо растворимы в во с. хорошо — в органических рас-
творителях и жирах Многие из них достаточно летучи, устойчивы к воздействию различных
факторов внешней среды (температура, влажность и т.д.). 'До обусловливает длительность
защитного действия препаратов от вредителей, но создает опасность зшрязнения окружающей
среды и сельскохозяйственной продукции. Особенно большие количества ХОП поступают в
атмосферу при использовании ссльскохозяистве! ной авиации ХОП переносятся с воздухом
на большие расстояния. Фоновые концентрации гексахлорана и ДДТ в воздухе над океаном
равны соответственно 0.4—0.6 и 0.03—J.0 нг/м*. Максимальные копиенграции ХОП отмеча-
ются в атмосфере в теплый период с пиковыми значениями весной и осенью. Концентрации
ХОП в поверхностных волах составляют в среднем 1—50 нг/см’. что связано с их более высо-
кой растворимоегью в воле ХОП хорошо адсорбируются органическим веществом почни или
донным илом и за счет этого способны перемешаться с поверхностными волами. Загрязнение
водных объектов ХОП обусловлено поверхностным стоком с тагрязненных полей, а также
осаждением из атмосферы. Попадая в водоемы. ХОП сравнительно быстро перерасиредсляют-
ся между водой и донными отложениями. Период полур. пала в почве для большинства ХОП
превышает 1.5 года, а для некоторых (ДД1. днэлдрин) составляет J5—20 лег и более. Остаточ-
ные количества ХОП в сельхозпродукции нс удаляются в процессе термической и кулинарной
обработки. Согласно данным ВОЗ. достоверно установлено 12 основных стойких органических
загрязнителей (СОЗ). К ним относятся диоксины. фураны, полихлорбифениды. ДДТ. хлордан,
гентахлор. тексахлоробснзол. токсафен, алдрин, днэлдрин. эндрин, мирекс. большая часть из
которых относятся к ХОП (см. гл. 10).
Загрязненная ХОП рыба, а также растения, листья и побеги которых хорошо поглотают
ХОП из воздуха, являются основными источниками поступления пестицидов в организм че-
ловека. Д|я человека и животных большинство соединений этой группы умеренно токсично и
лишь некоторые нысокогоксичны. Отрицательным свойством ХОП является резко выражен-
ная способность к кумуляции. При повторном попадании в организм даже малых количеств
ХОП развивается хроническое очратздение. что резко ограничивает возможность их широкого
использования. Некоторые ХОП обладают мутагенным свойством, повышают риск развития
ряка, повреждают репродуктивную функцию. Их действие во многом аналогично действию
диоксинов и днбензофуранов (см. ниже и гл. 10).
ХОП могут всасываться через кожу или поступать в организм пероральным и респиратор-
ным путем. Например. ДДТ в виде расi воров плохо проникает через кожу. Днэлдрин. напро-
тив. проникает через кожу настолько хорошо, что он в 2 раза токсичнее при транслермалъном.
чем при пероральном, пути введения
При биотранс^юрманни возможно образование более токсичных метаболитов (например,
метаболит гептахлора — эпокись тепгахлора). Выводятся ХОП в основном с фекалиями. в
меньшей степени с мочой.
ХОП обгыают нейро-, гепато-, нефро-, гематогоксичностью. также вызываю) нарушение
функций эндокринной и сердечно-сосудистой систем.
ДДТ и его аналоги
ДДТ был синтезирован в 1874 г. О. Цсйдлсром. но сто инсектицидные свойства стали из-
вестны только в 1939 г. после опубликования работ П. Мюллера Фактически с этого момен-
та началась эра синтстз ческих органических инсектицидов. Сразу после окончания Второй
мировой войны началось интенсивное их использование. Тгому способствовав комбинация
уникальных свойств Д1Т и его аналогов; широкий спектр инсектицидной активности; лж-
тсльпая сохраняемость в окружающей среде следов этих веществ; низкая острая токсичность
для млекопитающих: низкая стоимость.
Термин ДДТ. или п.н'-ДДТ | J.)-ли(4-хлорофенил)-2.2.2 -трих5|Ороэтан| широко известен
во всем мире. Структура ДДТ может иметь несколько из<и|юрм. Структурная формула ДДТ и
некоторых его аналогов приведена на рис. 8-22 и в табл. 8-28. Стрхктурные изомеры ДД1 —
кристаллические соединения белого или слегка желтоватого цвета, не имеющие вкуса и поч-
ти нс имеющие запаха, с эмпирической формулой СМП,С1, и относительной молекулярной
778 Глава 8
массой 354.5 Д Температура плавления п.п'-ДД 1
108.5—109.0 °C. ДДТ растворим в бензоле, никло
1ексане. хлороформе, практически не растворим в
воде.
ДД1 — сильнодействующий контактный инсек-
тицид. Многочисленные исследования, проведен
ныс по всему миру, показали, что слелоныс коли
чества его могут оказывать серьезное воздействие на
окружающую среду и опасны лля человека.
ДДТ накапливается в тканях млекопитающих и
является канцерогеном, мутагеном, эмбрио-, ней
ро-, нммуно-, гепаготокенкантом. влияет на работу'
гормональной системы ДДТ уменьшает воспроиз-
водство у птиц, рыб и змей. Расчет Дамена и Хейса
(1973) показал что на каждом звене пищевой цепи
происходит увс ичеиис содержания ДДТ в 10 раз. Гак. седи в морской воле концентрация ДТТ
составляет всего l-IIT’ г/л то в морской рыбе — 5-Ю5 г/кг (в 50 пас. раз больше!), а в хищ-
ных птицах, питающихся рыбой, концентрация этого токсиканта составляет уже МО г/кг (в
10 млн раз больше, чем в воде). Производство и применение ДДТ в нашей сгране (и в других
странах) запрещено ( в СС СР в 1972 г.), его ло сих пор можно найти на всех уровнях биосферы.
ДДТ продолжает оставаться одним нз наиболее распространенных и опасных токсикантов. К
сожалению, в некоторых тропических странах смесь изомеров ДДТ до сих пор используегся в
сельском хозяйстве и для уничтожения переносчиков особо опасных инфекции, таких как тиф
и малярия
1аблица 8-28. Структура П.п'-ДДТ и его аналогов
Название Химическое название R,
дат 1.1 -Ди(4 хлорофенггл)-2.2.2-трг1ХЛороэтан —C1 i-H са,
Дикофол (кезпгн) 1.1 -Ди(4-хлорофеннл)-2,2.2-трих.юроэтанол -CI он -са,
Эгилан (Перпгн) 1.1 -Ди(4-зги.1фенил)-2.2 зихлоролап с,н. —н -сна
Метоксихлор 1.1- Ди(4-мегоксифенил)-2,2.2-трг1\лоро тн J-oc.n, - II - са,
Продан 1.1-Д1Ц4 х. орофе1нс1)-2-ни1ронроиан С1 - н и-. ьог. -сн
ТДЭ’ 1,1 Ди(4 хлорофепил) -2,2-лихлороэтап -а —н -сна,
• В качестве инеем впила это соединение принято называть 1ДЭ как мстабалт ДДТ — его >ш1ыпакп ДДГ
Линдан
Линдан, 1а-, 2а-, Зр-, 4а-. 5а-. бр-гексахлоропиклогексан (ГХЦГ) или у-ГХЦГ Это вещес-
тво получило химически неправильное, но тем не менее широко используемое на пракгике
другое название — «бензолгексохлорил» (БГХ).
БГХ, или ГХЦГ впервые синтезирован Фарадеем в 1825 г. Его инсектицидные свозствл
независимо друг от друга открыты в 1941 г. в Великобритании Сзацдом и по Франции Дюпсре
и Раукуртом. Соединение (рис. 8-23) имеет 8 стереоизомеров.
Техническая смесь изомеров — беловато-коричневый порошок со сто гким запахом плесени
умеренно растворимый в ацетоне, бензоле и хлорированных углеводородах, плохо растворим в
керосине, жирах и маслах, а в воде практически не растворим. При повышенной температуре
возгоняется. Биотрансформаиня линдана происходит в печени при участии ферментов ци-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 779
тохрома Р450. Большое количество метаболитов, кото-
рые ло сих пор полностью не изучены, образуется при
реакциях дегнлриро шипя, дегидрохлорирования. дехло-
рирования, гидроксилирования. При введении внутрь
линдан из крови быстро перераспределяется в жировую
ткань. Описан клинический случай. когда через 12 ч
после приема внутрь был определен максимальный уро-
вень линдана в сыворотке крови — 1.3 мкг/мл. а через
36 ч после введения он понизится до 0.8 мкг/мл.
ГХИГ применяется в сельском хозяйстве в виде лус-
тов. смачивающихся порошков, концентратов эмуль-
сии. дымовых шашек и др. Его используют в качестве
инсектицида для борьбы с вредителям! терновых и са-
довых культур, паразитами животных и т.д.
Линдан — стойкий органический загрязнитель. ко-
Рис. 8 23. Структурная формула у- ГХЦГ
(ГХШ . БГХ).
горый накапливается в жировых тканях живых орга-
низмов. В воде линдан стабилен: для биологического
разрушения необходимо от 3 нед до 3 лет Линдан очень токсичен для пчел и других полезных
насекомых. Применение препарата в РФ строго регламентировано. В настоящее время для
зашиты ргстений разрешается использовать линдан только н смссевых протравителях. ПДК
в воздухе 0.004 мг/дм*. Линдан запрещен в большинстве стран Индия и Румыния остаются
единственными его производителями. Во многих государствах, где линдан еще применяется,
не ослабевает движение за прекрашение его использования. Рабочая группа но пестицидам
Всемирной сети по ликвидации стойких органических загрязнителей (IPEN) предлагает ис-
ключить линдан из обращения, несмотря на его высокую эффективность как инсектицида
с широких! спектром действия (см. гл. 10). С 1098 по 2003 г. только в США было выявлено
870 случаев отравления линданом при его случайном проглатывании. Большинство случаев отрав-
ления (90%) были легкой или средней тяжести и проявлялись рвотой, тошнотой, раздражением
слизистой оболочки ротовой полости рта и глотки абдоминальными спазмами и судорогами.
Циклодиены и их производные
Цнкло'шеновые производные (габл. 8-29) — алдрин. изодрип. ди 1ьдрин. эндрин и пентахлор —
легко пропихают через кожу, легкие и ЖКТ. Трапсдермаяьная абсорбция гигклодисновых произ-
водных. определенная на добровольцах, составляла 7—8% нанесенной лозы. До 50% вдыхаемого
аддрина всасывается и аккумулируется в организме. Процентное соотношение введенного внутрь
и непосредственно всосавшегося адприна не установлено. После всасывания алцрии быстро рас-
пределяется по органам и тканям, затем устанавливается подвижное равновесие между его кон-
центрацией в крови и других органах. Алдрин легко превращается в дилыгрин. главных! образом
в печени, где через 2 ч после ввсдс! ия алдргша можно обнаружить присутствие дилыгрина. Диль-
дрин и другие циклодисны накапливаются преимущественно в жировой ткани. Одни ннклодиепы
элиминируются в неизмененном виде, другие биотрансформируюгся в печени с образованием г ил
рофшгьиых метабо.1 итов, которые экскретируются с желчью и калом. Алдрин и дилыгрин при био-
грансформапнн образуют одинаковые основные метаболиты — 9-гидроксипрон*твоянос и трапс-
6.7-дигидроксипроизводное. При анализе кала было обнаружено только 9-пздроксипроизводное.
Гептахлор при попадании в организм через ЖКТ окисляется до эгЮксигеигахлора — продукта
более токсичного, чем гептахлор; оба накапливаются в тканях организма.
Дилыгрин. так же как и ДДТ, якияется инсектицидом: он более эффскпгвен и более сто-
ек. чем ДДТ В тех случаях. когда у насекомых вырабатывалась устойчивость к ДДТ, часто ис
пользовали дилыгрин. Концентрирован ie дилыгрина при движении по нишевой цепи хоро-
шо демонстрируют исследования, проведенные в Балтийском морс концентрация дилыгрина
в зоопланктоне составляла 21 нг/г жира, тогда как в конечнгм звене пищевой пени — селыти —
она была равна 121 нг/г жира. Обследуя население США и Каналы. ученые показали, что диль pm г
присутствует в гканях. крови и трудном молоке обследуемых. Дилыгрин является канцерогеном и
запрещен к применению во всех странах (см. гл. 10). хотя благодаря своей высокой устойчивости
ешс долго будет оказывать влияние на различные экосистемы гг здоровы* населения.
Тшииня 8-29. Строение и свойства ииклолиеновых производных
Пестицид
Структурная формула
Молекулярные формула
н масса.Д
С ,Н,С1.,
373.5
C..ILCI,,
365 '
Дильлрин
( „на.
410
Эндрин
CI
С гереоитомер дильдркна
С,.П,С1ЬО
381
cl2H,cifo.
381
Температура плавления. ’С Растворимость Примечание
Цис-изомер 106-107, транс-изомер 104-105 Растворим в боль- шинстве органических растворителей, практи- чески пс растворим в воле Технический црояукт — густая вязкая жидкость янтарно-желтого цвета, содержащая около 45 компонентов
Чистый продукт 95-96. технический продукт - 46-74 Растворим в аиетонс, бен толе, четыреххло- ристом углероде, цикло- гексаноне. керосине и ттаноте Чистый пролукт бе- лое кристаллическое вещество без запаха, технический продукт содержит около 72% гептахлора и 2Я% его производных
Чистый продукт 104. технический 49—60 Умеренно растворим в сложных лфирах и кетонах, ароматических соединениях, пшогс- нозамешенных угле- водородах. трудно — в спиртах Чистый продукт — бе- лое кристаллическое вещество бет запаха, технический продукт содержит нс менее 90% аддртпм
176-177 Малорастворим в али- фатических утлсводоро- лж и спиртах, умеренно растворим в ацетоне, растворим в аромати- ческих и галогеиозаме- шенных угле вол оро.тах -- . - — Чистый продукт — бе- лое кристаллическое вещество без вапаха. технически и продукт содержит не более 5% других веществ
235 Практически пс раство- рим в воде, растворим в органических растворах Чистый пролукт — бе- лое кристаллическое всшссгво без запаха
780 Глава 8
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 781
Токсафен и его производные
Токсафен — сложная смесь нескольких сотен со-
единений, которые образуются при фотохлор 1ровании
бициклического терпена камфена. Теоретически в сме-
си .может находиться 32 768 различных соединений. В
техническом токса<|>ене содержатся наиболее активные
из них — 2,2.5-энд з-6-эк зо-8.9,10-гептахлороборнлн и
2.2.5-эндо-6-экзо-8.9,9.10-октах. ороборнан (рис. 8-24),
суммарное содержание которых составляет 2—6%. Ко-
личество изомеров только этих производных (О, и С1И)
может составить 6840. В 1993 г. бы ю сообщение, что из
технического токсафена удалось выделить 670 индиви-
дуальных соединений. В окружающей среде количество
изомеров токсафена должно быть меньше из-за агрес-
сивного влияния внешних условий и в результате био-
трансформаиии.
Технический токсш|кн — воскоподобнос вещество жел-
то-яитарного цвета, липкое на ошупь. со слабым сосновым
запахом. Токсафен легкорастворим в органических раство-
Г*пс 8-24. Структурная формула одно-
го нз изомеров токсаг|>еиа.
ригелях. трудно — в воде.
Токсафен является инсектицидом широкого спектра действия, используется в сельском хо-
зяйстве. особенно при выращивании хлопчатника и сон. а также при уничтожении паразитов
крупного рогатого скота и нрутих домашних животных.
Аналогично другим летучим пестицидам токсафен способен распространяться ио воздуху,
поэтому его можно обнаружить в воздухе и почвах тех мест где он ранее не использовался.
Содержание токсафена в воздухе в некоторых местах зависит от сезона В почвах токсафен
является одним из самых распространенных ХОЛ Концентрации токсафена в организмах,
обитающих в войной среде, высоки во всем мире: в рыбах залива Святого Лаврентия (Канада)
содержание токсафена составляет 28 мг/кг жира, в рыбах Балтики — 6 мг/кг жира, в форели
Великих озер США — 25—30 мг/кг жира. в сслзсзи Северного моря — 1—4 мкг/кг сырого веса,
в китах залива Святого Лаврентия — 23 мг/кг, в дельфинах Северного моря — 19 мг/кг сырого
веса. В организм человека гоксафе г в основном попадает с рыбой. Люди, питающиеся рыбой,
могут получить в лень 2.8—5.6 иг зоксафена на 1 кг массы зела. В последнее время токсафен
обнаружен в грудном молоке женщин Швеции. Финляндии. Нидерландов (0.05—0.07 мг/кз-
жира) зз Никаразуа (до 68 мг/кг жира).
Токса<|>ен хорозио сохраняется в окружающей среде. Период сзхэ полураспада зз почве со-
ставляет от 2 мес до 10 лет Токсафен является канцерогеном для большинства теззлокровных
животных зз человека, нейро-, гспато , иефро-. зематотоксикантом. В настоящее время он за-
прещен для применения во всех странах
Пиретрины и синтетические пиретроиды
Пирстрины — смесь сложных эфиров (+)-
грансхризаптемовой и (+) транспирегриио-
вой кислот с замещенным (+)-пиретро. оном
Пиретрины — инсектициды. содержащиеся
в некоторых видах ромашки рола пиретрум.
Оптическзз активные тр знс-изомеры этих
соединений — бесцветные высококипянзие
жидкости. лезко гидролизуются щелочью, ус-
тойчивы в слабокислой среде, разлагаются на
воздухе при действии света и влаги LDW пи-
ретринозз для крыс при пероральном приеме
составляет 200—2600 мг/кз. Общая формула и
действующие вещества пиретрума приведены
на рис. 8-25 и в табл. 8-30 соответствен ззо.
Рис. 8-25. Структурная <|юрмула пнретрхма
782 Глава 8
Таблица 8 30. Действующие вещества пиретрума
Получают перитрнны экстракцией измсль-
В шсство я* ченных цветков ромашки (пиретрума) смесью полярных и неполярных раствори гелей, реже
Пирегрин I -СИ -CH-CII. одним каким-либо растворителем, например
Пнретрин II -ОС.ОСН, -СН=СН, днхлороэганом или другими хлорировании-
Цннсрин 1 -сн -сн. ми углеводородами. Сопутствующие вещества удаляют осаждением, адсорбцией на угле или вымораживанием с последующей фильтрани-
Пиперин II -ососн, -снл
Жасмолии 1 -сн -сн.-сн
ей. Технический 25% экстракт содержит 10% пиретрииа I. 9% нирстрина II. 3% пиперина 1.
Жас.молин II -ососн -сн,-сн
около 3% пиперина II и следы жасмолинов. Смесь представляет собой желтое .масло, нс-
растворимос в воде, растворимое в большинстве орфических растворителей. Соотношение
компонентов в смеси и токсичность для теплокровных животных могут изменяться в зави-
симости от сорта цветков, условии роста растения, обработки во время экс грат ирования или
отгонки растворители.
Перитрнны — контактные инсектициды с быстрым парализующим действием (нокдаун-
эффект). Применяются в форме аэрозолей, дустов. эмульсий для борьбы с бытовыми насеко-
мыми (клопы, вши, тараканы). Могут использоваться для уничтожения вредных насекомых в
сельском хозяйстве и при обработке запасов. однако их действие очень кратковременно. Из-за
нестабильности состава к ним редко возникает резистентность. Инсектицидное действие уси-
ливается при добавлении различных ветцеств-сипсргистов (пинеронилбутоксил, трониталь, се-
замскс и др ). Препараты на основе псритрипов имеют высокую стоимость, что обусловливает
их ограниченное использование.
Пиретроиды. синтетические эфиры хризантемовой кислоты, — аналоги пирсгринов. Их
получают взаимодействием хлорангидрила хризантемовой кислоты с соответствующими спир-
тами в присутствии третичных аминов или переэтерификацией этилового эфира хризантемо-
вой кислоты в присутствии натрия. Наиболее токсичные для насекомых соединения найдены
среди эфиров наклонен геполонов, замешенных бензиловых спиртов и N-оксиметилимилов.
На основе синтетических пиретроидов выпускаются препараты.
• аллетрин — 2-аллил-3-метил-2-никлопентен-4-ол-1-оннлхризантемат;
• баргрин — б-хлор-пинеропилхризаитемат;
• диметрин — 2.4-димегилбензилхризангсмат;
• неопииамин — >1-(3,4,5,6-тетрагидрофтальимидо)-метилхризантс.мат;
• фуретрнн — 2-фурфуР1и-3-мстил-2-циклопснтсн-4-ол-1-онилхризангсмат:
• циклетрин — 2-циклопентенил-3-метид-2-никлопентен-4-ол-1-онилхризантемат.
Используют и другие синтетические пиретроиды: альфамстрнн (фастак), дсльгаметрин (дс-
льтапид, биорин, децис), перметрин (амбуш. висмсгрнн), шшерметрин (цимбуш. ровикил, ни
неркил. циткор). фенвалерат (суминидин, фенаке, фенакси.т) Они применяются, в основном,
для борьбы с бытовыми насекомыми, обычно в виде аэрозолей
Триазиновые производные
В качестве почвенных гербицидов системного и контактного действия используются про-
изводные 1,3,5.-триазина: аметрин. атразин, метазин. пропазин, симазин и другие препараты,
а также их смеси. Специфика действия препаратов обусловлена их строением и физико-хи-
мическими свойствами. Сохраняемость триазинов в почве колеблется в широких пределах:
более устойчивы в почве хлорсодержащие триазины (симазин. атразин и пропазин), быстрее
разрушаются метилтиопроизводные. На рис. 8-26 приведена структурная формула одного нз
гербицидов этого класса.
При метаболизме гриазинов происходит моно- или ди-М-деалкилировзнис. исходное ве-
щество и N-деалкнлированные метаболиты подвергаются меркаптеновой конъюгации и выво-
дятся с мочой.
Прием внутрь около 100 г атразина может нривесш к коме, коллапсу. метаболическому
ацидозу, желудочному кровотечению, почечной недостаточности, некрозу гепатоцитов, нару-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 783
шеиию свертываемости крови и смертельному исходу.
В случаях острых отравлений рекомендуется проведе-
ние гемодиализа.
Производные бипиридила (паракват и дикват)
Паракват и дикват — четвертичные аммониевые
соединении, применяемые в качестве п;рбицидов кон-
тактною действия (рис. S-27). По химическим свойст-
вам дикват аналогичен параквату, но характер его ток-
сическою действии ня человека несколько иной. Эти
соединения применяются в виде солеи (паракват — в
виде хлорида и сульфата, дикват — в виде дибромтиа)
как самостоятельно. так и в смеси друг с другом тин
друтими гербицидами.
В незначительной степени зти вещества могут про
пикать через неповрежденную кожу и слизистые обо-
лочки, однако в большинстве случаев отравления обус-
ловлены приемом параквата (или диквата) внутрь.
Рис. 8-26. Структурная формула атразина.
Рис. 8-27. Структурные формулы параквата (а) и ликвдгч (б).
При приеме внутрь их абсорбция в основном осуществляется в тонкой кишке. Всасывается
примерно 10% принятой дозы, паракват накапливается в легких (дикват нс накапливается) оба
накапливаются в почках, до 90% параквата выводится из организма в первые 2 ч.
Биотраисформаиия параквата осуществляется при участии дети рогеттаз с образованием
АФК. Установлено, что паракват захватывается альвеолонитами, а затем в них начинается
цикличный процесс НАДФ’-НАЛФН-зависимого восстановления и окисления с образованием
катиона параквата и АФК, которые повреждает клеточные мембраны (см. гл. 3).
Отравление паракватом приводи) к почечной нсдосшточпости и прогрессирующему легоч-
ному фиброзу, что может вызвать смерть от остановки дыхания через 2—3 нед после отравле-
ния.
Дикки — токсикант раздражающего действия, вызывает рвоту, диарею и боль в эпигас-
тральной области. В серьезных случаях возникают печеночная и почечная недостаточность,
судороги и кома, но отравление дикватом не приводит к прогрессирующему легочному фиб-
розу.
См рть обычно наступает при концентрации параквата в плазме более 0.2 и 0.1 мг/л через
24 и 48 ч соответственно после поступления токсиканта в организм. В случаях смертельных
отравлений дикватом его концентрация в плазме составляет 0.45—4,5 мг/л.
Другие группы
Кумариновые антикоагулянты
Кумариновые родентициды ингибируют активность ферментов синтеза витамина К в пе-
чени млекопитающих, в том числе человека (рис 8-28). В результате нарушается синтез ви-
тамин-К-зависимых факторов свертывания крови [факторов II (протромбина), VII. IX и XJ.
Антикоагулянтное действие является аозозависимыхт и проявляется, когда уровень факторов
свертываемости в крови снижается примерно ло 20% нормального.
784 Глава 8
Эпоксид-редуктаз витамина К
Рис. 8-28. Цикл витамина К. К — витамин К; КО — эпоксид витамина К; КН — активная форма вша-
мина К Пояснение в тексте
Дня оценки степени воздействия кумаринов (блокирования цикла витамина К) определяют
предшественники факторов коагуляции (PIV КА) в крови.
Случайное или намеренное употребление внутрь 4-гидроксикумарипоных родентицидов мо-
жет привести к серьезному отравлению, которое проявляется внутренними кровотечениями.
Лечение заключается в назначении витамина К, а при тяжелых отравлениях показано перели
ванне крови или введение очищенных факторов свертываемости в количестве, необходимом
для восстановления времени свертывания крови до нормальных значений.
Отравление считается сильным при концен рации токсиканта » сыворотке крови 5 мг/л.
но для некоторых производных, например ацекумарола и бронифакума. токсическое действие
проявляется при значительно более низких концентрациях.
Производные мочевины. Большинство производных мочевины являются почвенными герби-
цидами. Ассортимент гербицидных препаратов этого класса достаточно широк (глин, теноран
малоран. лиронион и др.). В растениях и почве они подвергаются сложным превращениям,
при водя шим к их разрушению и инактивации Не описано ни одного случая тяжелого отрав-
ления человека пестицидами этого класса.
Нипцюфенаш и нипрокрезолы. Отравления динитрофснолом, диницхжрезолом и диносебом
приводят к разобщению процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, проявляются
сильной головной болью, тахикардией, повышением температуры, обильным потоотделением
Головная боль и недомогание отмечаются при концентрации в крови токсикантов этой
группы около 40 мг/л. значительная интоксикация наблюдается при концентрации динитро-
крезола 44—60 мг/л. При отравлении динитрофснолом со смертельных» исходом его концент-
рация в крови была 75 мг/л.
Хлорированные феноксикислоты
Пестициды на основе хлорофеноксикислот относятся к гербицидам. Наиболее широко ис-
пользуются 2.4-дихлорофеноксиуксусная (2,4-Д). 2.4.5-трихлорофеноксиуксусная (2.4,5-Т) и
2-метил-4-хлорофенокснуксусная (МХФУ) кислоты. Эти средства быстро разрушаются в ок-
ружающей среде, но практически не подвергаются биотрансформэции в организме млекопи-
тающих Более 95% 2,4-Д, 2.4,5-Т и МХФУ после абсорбции в ЖКТ выводятся из организма
человека в неизмененном виде с мочой в течение 5 дней. При мониторинге воздействия этих
гербицидов на производстве используется измерение содержания неизмененных соединений
в моче. При обследовании лиц. подвергшихся воздействию малых доз токсикантов на произ-
водстве, были определены их концентрации в моче: 0.10—8 мг/л для 2.4-Д. 0.05—4,5 мг/л для
2,4,5-Т и менее 0,1 — 15 мг/л для МХФУ.
Хлорированные феноксикислоты повреждают кожу, глаза, дыхательную систему и ЖК'1
Преднамеренный или случайный прием внутрь больших лоз токсикантов вызывает рвоту, боли
в желудке и кишечнике, диарею, метаболический ацидоз, отек легких и кому. Начальная кон-
центрация 2,4-Д в плазме крови пациента, выжившего после приема 7 » вещества, составила
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 785
4и0 mi/л. В другом. иесмертсльном случае отравления максимальная концентрация 2.4-Д в
плазме была 1031 мг/л. Однако, как правило. концентрация 2.4-Д в крови 58—826 мг/л при-
водит к смертельному исходу
Эффективная терапия заключается в ощелачивании мочи с целью увеличения выведения
2.4-Д н других соединений класса хлорофеиоксикислог.
Особую опасность представляет производство этого класса пестицидов. При промышлен-
ном получении трихлорфенола. предшественника гсксахлорофена и 2.4,5-Т в качестве побоч-
ного продукта образуется 2.3.7.8-тетрахлорадибензо-п-лиоксин (2.3.7.8-ТХДД. тетрадиоксин).
Это одно из самых токсичных синтетических вешеств. известных в настоящее время.
Диоксины — сильнолипофильные соединения, имеющие тенденцию к кумуляции в жировой
ткани организма, стабильны в окружающей среде (см. гл. 10). Высокие концентрации диокси-
нов обнаруживаимся в поджелудочной железе и печени. Основной путь экскреции — с калом
С конца 40-х голов XX века в различных странах развернулось производство химических со-
единений на основе полихлорфснолов: гербицидов 2.4.5-Т. 2 4-Д. бактериостатического средс-
тва гсксахлорофена. фунгицида пентахлорофенола и других веществ. В 1949 г. впервые были
установлены акнегенные свойства полупродуктов производства гербицидов 2,4.5-Т и 2,4-Д (см.
гл. 2.4.5). В 50-е голы появились сообщения о частых поражениях техническими 2,4.5- Г и
трихлорфенолом на химических заводах ФРГ и Франции, причем последствия взрывов вЛюл-
вшсхафснс (1953) и Гренобле (1956) обсуждались широко и летально. Многочисленные случаи
поражения рабочих трихлорфенолом в 50-е годы имели место и в США. В 1957 г. произошел
несчастный случай с американским химиком Дж. Дитрихом, который, занимаясь синтезом ди-
оксина и сю аналогов, получил сильное поражение с выраженным акнеформным дерматитом,
напоминающим поражение кожи техническим трихлорфенолом. Так было установлено, что хлор-
акногенным фактором технического трихлорфснола действительно является 2.3.7,8-ТХДД —
неизбежный побочный продукт щелочной переработки симметричного тстрихлорбенэола.
В 60-х годах была выявлена причина развития хлоракне при воздействии технического трихлор-
фенола. установлен ф ikt токсичности 2,3.7.8-ТХДД < диоксины перестали быть ней вестнь м
хлоракногенным агентом. Синдром хлоракне стал рассматриваться как маркер диоксиновой
интоксикации, а 2.3.7.8-ТХДД — как наиболее мошный акноген.
В 1976 г. на фабрике в Севезо (Италия). производящей |рихлор<|>енол, произошел взрыв, в
результате которого в воздух поп мо значительное количество трихлорфснола и его примесей, наи-
более опасной из которых являлся 2,3.7.8-ТХДД. После выпадения 2.3.7,8-ТХЛД из воздуха им
был за1рязнен обширный и густонаселенный участок местности в провинции Севезо к северу от
Милана. Сильно пострадали не менее 500 человек, воздействию диоксинов подверглись несколько
тысяч поселков, погибли тысячи домашних животных. В результате этой аварии было распылено
от 2 ло 3 кг, а по некоторым оценкам, до 5 кг 2.3.7.8-ТХДД. Спустя 30 лет после войны во Вьетна-
ме частота хлоракне у жителей. подвергшихся воздействию загрязнявшего дефолианта (гербицид
2.4.5-Т) 2.3.7.8-ТХДД была достоверно выше, чем у населения контрольной группы.
В России высокий уровень загрязнения производственной среды диоксинами отмена, ся при
производстве хлорорганических пестицидов на заводах объединения «Химпром» в Уфе. Чапа-
евске, Дзержинске. Новочебоксарске и других городах. Профессиональный характер заболева-
ния определялся возникновением в едином временном периоде однотипных изменений кожи
у большинства рабочих одного цеха и одной и той же профессии. Наиболее ранние и тяжелые
заболевания кожи отмечались у работающих на станциях, где имелся контакт с 2.4.5-трихлор-
фенолом. 2.4.5-Т и се эфиром и где эти продукты обрабатывали при высокой температуре и
высоком атмосферном давлении, что способа новало усиленному газо- и паровыделен ню.
Диоксины — наиболее токсичные представители класса хлорорганических соединений (рис.
8-29). поражающие печень, нервную, эндокринную и иммунную системы. Диоксины обладают
канцерогенным и тератогенным свойствами.
Рис. 8-29. Структурная формула 2.3.7.8-ТХДД
786 Глава 8
Диоксины относятся к группе химических вешеств, имеющих повсеместное рас и рост ране-
ние. чрезвычайно высокую токсичность, стойкость, способность перемета!вся на значитель-
ные расстояния, а также накапливаться и живых организмах и окружающей среде (см. гл. 10).
Элементоорганические соединения и неорганические соединения метанов. Пест и пилы этой
группы используются как акарициды (оргапогнн), гербициды (органические соединения мы-
шьяка). фунгициды (днтиокарбаматные комплексы марганца, никеля и пинка, металлооргани-
ческие соединения ртути и неорганические соединения меди), родентициды (фосфиды магния,
алюминия и цинка, сульфат таллия). Химическая природа и токсичность представителей этой
группы весьма разнообразны (см. гл. 8.5). Например, неорганические соединения олова отно-
сительно безвредны, оловоорганические соединения (этил-, бутил- или фенилпроизводные).
используемые главным образом как моллюстннилы, представляют серьезную опасность из-за
высокой растворимости в липидах, которая является причиной их проникновения в L1I1C Это
может привести к частичному параличу, расстройствам зрения и психики, судорогам и смерти
от остановки сердца или дыхания. Прием внутрь неорганических соединений ртути вызывав!
расстройства деятельное!и ЖКТ (рвота, диарея) и почечную недостаточность, в го время как
растворимые в липидах органические соединения ртути (ди.метилртутъ или диэтилртуть) на-
капливаются в ЦНС и приводя! к атаксии, судорогам, параличу и смерти.
Отравление солями таллия вызывает повреждение сердечно-сосудистой, иммунной, дыха-
тельной систем, а также периферической и центральной нервной системы. Характерный при-
знак отравления таллием — выпадение волос через 1—2 нед после интоксикации.
Наиболее надежная диагностическая процедура — определение таллия а сыворотке крови,
моче и обязательно в волосах (см. гл. 8.5).
Фосфин. Фосфин используется как инсектицид или родентицид и обычно получается в ре-
зультате действия воды на фосфиды металлов (алюминия, магния и цинка). При поступлении
внутрь фосфидов металлов фосфин образуется в желудке и действует на пищеварительную и
центральную нервную системы. При сильном отравлении симптомы развиваются быстро — в
течение 2 ч появляются боль в животе, рвота, судороги, кома, весьма вероятен летальный
исхол. Описан случай смертельного обращения мужчины фосфидом алюминия, при котором
концентрация фосфина в крови составила 0.5 мг/л, в печени — 3 мкг/м.
8.4.3. Методы определения
Доступны и широко используются тысячи пестицидов. Большие запасы устаревших пести-
цидов, которые перестали выпускаться в промышленном масштабе, хранятся на складах и их
продолжают применять. Для окружающей среды, человека и животных пестициды несомненно
представляют опасность.
Широкий ассортимент различающихся по своим свойствам вещеегв делает >адачу их оп-
ределения чрезвычайно сложной. С этой целью применяют иммуиохимические (см. гл. 6.2)
и хроматографические методы. Объектами исследования являются различные коммерческие
препараты, продукты домашнего пригогою синя, космстка. вала, напитки, пиша, объекты
окружающей среды, образцы биологических жидкостей и тканей.
Пробоподготовка
Разнообразие химических классов пестицидов и их свойств, характера объектов исследо-
вания (почва, вода, воздух, пншевые продукты, биологические образцы и т.д.). особенности
методов определения влияют на выбор способа пробоподготовки (см. гл. 5).
В этом разделе будет рассмотрена пробоподготовка только биологических объектов.
Гидролиз конъюгатов пестицидов и их метаболитов с глюкуроновой, серной или другими
кислотами (иными субстратами) часто является одной из стадий пробоподготовки биообраз-
пов. Предпочтительным способом гидролиза конъюгатов пестицидов и их метаболитов являет-
ся ферментативный гидролиз, который обычно осуществляется с применением р-глюкурони-
дазы и р-арилиульфатазы в течение 12 ч при 37 'С.
Экстракция из биологических жидкостей осложнена гем, что некоторые пестициды лег-
ко нарушаются кислотами или щелочами. Продукты разложения ряда пестицидов, например
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 787
производных мочевины, могут вступпь во взаимодействие с некоторыми растворителями, на-
пример этанолом или ацетоном. Пестициды изолируют из водной среды, применяя жидкостъ-
жидкосгггую (ЖЖЭ» или тггср эфазную (ТФЭ) экстракции. ЖЖЭ раснсннвасгся как более
универсальный способ для скрининга, в то время как ТФЭ предпочтительна при проведении
количественного определения ряда пестицидов в образцах крови пли при и истечении пести-
цидов определенною химического класса, таких как кумгриновыс лнгикоагулянгы пли четвер-
тичные аммониевые основания. В последние годы ТФЭ используют чаше.
Использование лля ЖЖ Э растворителей. различающихся по своей природе и полярности,
позволяет получать извлечения с наименьшим количеством соэкетрактивных веществ. Так,
при извлечении ФОП из тканей органов трупа с помощью гексана или петро генного эфира,
смесей гексана и ацетона (к соотношении ЭД: 10 и 70:30 соответственно) получают извлечения
е наименьшим числом соэкетрактивных вешеств Использование в качестве экстрагентов ане-
тонигрила. бензола. хлороформа, метанола. этанола значительно увеличивает массу и число
экстрактивных вешеств.
Твердые образны гомогенизирую! с равной массой воды Пишевые продукты, содержимое
желудка, особенно с неусвоенными остатками пиши, или ткани желудка, гомогенизированные
с водой, смешив мот с насыщенным раствором калышя хлорида, оставляют на ночь и фильтру-
ют. Фильтрованный образен или гомогенат в количестве 5—10 мл встряхивают 5 мин с равным
объемом смеси гексан — толуол (1:1. по объму). Органический слой отделяют центрифугиро-
ванием и сохраняют pH водной фрикции довоип до 2.0 добавлением I М серной кислоты и
затем извлекают равным объемом ди лилового эфира Водную фазу сохраняют для дальнейше-
го исследования. Толуол-гексановое и эфирное извлечения объединяют и затем разделяют на
равные части. Каждую часть выпаривают досуха при 40 "С в токе азота. Первый сухой остаток
растворяют в 50 мкл толуоле или гексана. Аликногу от 5 до 10 мкл помешают иа пластину
для тонкослойной хроматографии, аликвоту от I до 2 мкл подвергают анализу методами ГХ
или ГХ-МС Два других остатка и водную (разу сохраняют для лершзгнизаиии и/или дополни-
тельных испытаний, которые могут быть частью процедур подтверждения пли скрининга (см.
электронное приложение).
Для очистки экстр истов. содержащих пестициды, or балластных веществ применяют раз-
личные способы Одним из простых способов очистки экстрактов от липидов на первом этане
очистки япгястся вымораживание. На последующих этапах применяют жстракииоипуго очис-
тку. хроматографические методы: препаративную тонкослойную хромагогрфню. колоночную
хроматографию, гсльпроникаюшую run флеш-хроматографию. Для выделения пестицидов и
удаления мешающих примесей также применяют ультразвуковую, микроволновую. сверх кри-
тическую жидкостную (СЖЭ). сверхкритическую флюидную экстракцию и др. (см. гл. 5.4 и
6.2). СЖЭ селективна и позволяет использовать небольшие объемы растворителя. Свсрхкри-
тическис жидкости имеют плотность, близкую к плотности обычных жидкостей, но меньшую
вязкость и высокий коэффициент диффузии. Автоматизация процесса позволяет проводить
экстрактно и очистку быстро и в один згал Хорошие результаты получены лля полярных и
малополярных пестицидов.
В последние годы усиленно развивается метол микро во. новой экстракции. Он осногмш на
использовании энергии микроволнового излучения и имеет ряд преимуществ перед другими
методами экстракции. Микроволновая экстракция иозволзгет количественно извлекать орга-
нические сое тннсния из матрицы за 10—15 мин с использованием минимальных количеств
органических раствори гелей (2—10 мл растворителя на I г образца)
Решить проб, ему многостадийной пробополготовки и повысигь точность анализа можно с
помощью нммуноаффннной хроматографии (ИА.Х). основанной иа биоспсннфичсских взаи-
модействиях с использованием иммунгкорбентов (Кузнецов П.В.. 2002. см гл. 6.2).
Некоторые пестициды (например. ГХЦГ) из тканей органов можно изолировать перегонкой
с водяным пиром.
Газохроматогряфическое исследование многих пестицидов требует проведения лериватиза-
цни. которая нс только улучшает хроматографическое разделение. но и хтя многих веществ
обеспечивает во гможность использовать этот метол. Кроме того, в некоторых случаях хрома-
тографический анализ изндсчения до и после проведения дериватизании увеличивает эффек-
788 Глава 8
тивность идентификации метолом ГХ. а лля методов ГХ-МС изменения в картине фрагмента-
ции могут давать дополнительную информацию об исследуемом веществе.
Методики дериватизации пестицидов. Трифтораиетаты получают обработкой сухого остатка
извлечения 50—100 мкл трифторуксусного ангидрида и 50 мкл эгилаиетата при 60’С в течение
15 мин. После выпаривания смеси остаток растворяют в 50 мкл безводного этилапетата (1:1) и
2 мкл раствора подвергают анализу методами ГХ или ГХ-МС. Использование растворителей
содержащих остаточные количества воды, спиртов или аминов, может привести к гидролизу
полученных производных.
Ацетилирование используют вместо трифтораиетилирования 10(3 мкл пиридина и I0U мкл
уксусного ангидрида добавляют к высушенному извлечению. Образны перемешивают взбал-
тыванием. нагревают до 70 °C 20 мин, высушивают в токе азота и растворяют в 50 мкл этил-
ацстата. От 1 до 2 мкл подвергают анализу методами ГХ или ГХ-МС. Альтернативно процесс
ацетилирования может быть кроне ich с 50 мкл смеси уксусною ат идрила и пиридина (3:2 по
объему) пол действием микроволнового излучения в течение 5 мин.
Метилирование проводят после выдерживания в течение 2 ч при комнатной температуре
сухого извлечения с 200 мкл не содержащего метанол раствора диазометана в лиэтнловом эфи-
ре, зятем смесь выпаривают досуха. Остаток рас воряют в 50 мкл метанола, и от I до 2 мкл
подвергают анализу методами ГХ или ГХ-МС.
Альтернативный способ: высушенный остаток растворяют в 0.5 мл толуола и 0 5 мл ли-
метилсулъфоксида. После добавления 50 мг натрия гидрила и 0.5 мл мепыйодида образец
дериватизируют в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления 2 мл гексана
образец взбалтывают I мин. С целью удаления избытка диметилсульфоксида добавляют 2 мл
воды и образец слегка взбалтывают. затем органический слой удаляют и водную фазу вновь
экстрагируют 2 мл гексана и затем 2 мл этилапетата. Объединенные извлечения высушивают
сульфатом натрия в течение 15 мин и зачем концентрируют ло 0.1 мл.
Возможно использование других лсрипатизируюших реактивов и способов дериватизании
Предварительное исследование пестицидов проводят хроматографическими методами (ТСХ
и ГХ) или ИХМ. ТСХ применяют для скрининга и идентификации пестицидов в коммерчес-
ких препаратах, добавленных к напиткам или пищевым продуктам, биологических жидкостях
(содержимое желудка, моче) и тканях.
Исследования образцов крови, обьсяпов окружающей среды на наличие остаточных коли-
честв пестицидов требуют применения более чувствительной техники ГХ. Наличие в молекулах
пестицидов атомов фосфора. (атогенов. сурьмы или мышьяка позволяет использовать возмож-
ности селективных газохроматографических детекторов (АФД, ЭЗД. пламенно-фо ометрнчес-
кий — ПФД). а также газохроматографических систем, способных одновременно потучать
сигналы оч нескольких из указанных детекторов или оборудованных современными устройс-
твами для переключения потоков между хроматографическими колонками разной полярности
(многомерная хроматография).
Арбитражным методом при определении пестицидов считают ГХ-МС.
Однако с развитием аналитической техники все большее значение приобретает ВЭЖХ с
масс-селективиым детектированием (ВЭЖХ-МС). особенно при определении термолабильных
водорастворимых вешеств (см. электронное приложение).
В последние юды разрабатывается скрининговый анализ пестицидов с использованием
ИХМ. Лидирующее положение среш ИХМ определения пестицидов занимает гетсрсяснпый
твердофазный нммуноферментный анализ (ИФА). технехтогия ELISA. Метод поляризацион-
ного флюоресцентного иммуноанализа (ПФИА) также успешно применяется лля определения
пестицидов. ИФА пестицидов обсуждается в гдаве 6.2.4.
Тонкослойная хроматография
Одним из наиболее простых и распространенных методов определения пестицидов являет-
ся ТСХ. При исследовании пестицидов испо >зуют пластины с силикагелем, реже с оксидом
алюминия. Подвижной фазой мот быть олиокомнонентные системы растворителей (гексан,
бензол, хлороформ, ацетон и др.), но для разделения смесей пестицидов и идентификации их
по величинам Rrнаиболее результативны двух- и трехкомнонентные системы растворителей на
основе гексана и толуола с добавлением полярных растворителей (апстон, хлороформ, бензол.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 789
диэтиловый эфир. этилаиетат). Целесообразно применение многокомпонентных систем, на-
пример для разделения смесей ешпстнческнх пиретроидов.
При проведении ХТА для скрининга пестицидов регламентировано применение хромато-
графических систем: силикагель 60 F ч. система растворителей гексан — аиетон (80:20) или
толуол — анезон (95:5). проявляющие реагенты.
Универсальными, но неселективпымн реагентами являются иод. раствор перманганата ка-
лия. раствор дихромата калия. исследование в УФ-свете (пластины с флюоресцирующим ин-
дикатором). Обнаружение ХОП: после опрыскивания хроматограмм раствором аммиаката се-
ребра в апетоне и последующего облучения в УФ-свете такие пестициды проявляются в виде
темных пятен (исиользмот и другие реакции). Алкилтиопроизволные симметричного триазина
при действии этого реагента (в результате образования хелата серебра) обнаруживают в виде
белых пятен на сером фоне хроматопзаммы.
Соединения. содержащие донорные атомы серы, кислорода, азота (синтетические пиретро-
иды. ФОП. симметричные трназины. тиокарбаматы и др.) детектируют реакцией с бромфено-
ловым синим (реакция неизбнратсльна).
Для обнаружения синтетических пиретроидов, содержащих нианогрунпу (<|»енналераг. пи-
перметрин. дельтамстрип) и способных освобождать пианид-ион при щелочном гидролизе,
проводят реакцию с ацетатом меди и о-толуидином (синее окрашивание)
Обнаружение некоторых карбаматов возможно по реакции азосочстания после их превра-
щения в производные ароматических аминов. Прч введении пинка (необходимого для вос-
становления) н состав адсорбционного слоя, а кислоты — в проявляющий решен i. реакция
образования красителя происходит непосредственно в топком слое сорбента.
В литературе приводятся величины Rf для многих веществ в различных системах раство-
рителей. Но эти данные могут служить только для ориентировки, так как нельзя в точности
повторить условия хроматографирования и получить полное совпадение результатов. поэтому
всегда нужно пользоваться pact ворами свидетелей (см. гл. 6.3.2).
Подробное описание методик определения пестицидов с помощью ТСХ с указанием хрома-
тографических систем, способов приготовления проявляющих реагентов и их использования
можно найти в с<х>тие1ствую1цей литературе.
Один из вариантов проведения ТСХ-скрининга пестицидов приводится в табл. 8-31.
Таблица 8-31. Условия хроматографирования (скиыаргныс методики США в стран Евросоюза)
№ н/п Подвижная система для пластин с нлнкагслсч Проявляющие реактивы '
1 Xjh реформ — аиетон (9:1) Ag. RHB. DBQ и Pd
2 Хлороформ Последовательная обработка реактивом Драгендорфа. раство- ром хлорида железа (111) н раствором ода в йодиде калия
3 Гексан — анстои (4:1) DPA. \ВР и DBQ
4 Толуол — ацетон (95 5) Ag и Pd
5 Д|1Х.'ЮрМСН1Н DPA
6 Эгилапетат — изооктан (15:85)
• Пояснения в тексте.
Используют четыре системы ТСХ, состоящие из подвижной фазы и ряда рахзичных реак-
тивов-детекторов. широко применяемых для обнаружения пестицидов. Общие системы № 1 и
2 использую) для обнаружения любого нести низа в исследуемом образце и позволяют предпо-
ложительно определить, к какой химической группе следует отнести пестицид. Системы № 3
и 4 ис11(мьзуют для идентификации тина нести пила.
Для дополнительной информации применяют две другие системы раст «зрителей (№ 5 и 6).
790 Глава 8
Используют пластины с силикагелем с толщиной слоя 0.25 мм без флюоресцентного инди-
катора и 4 ношнжные фазы: процесс проходит в насыщенных их парами камерах восходящим
способом. Применяют 7 детектирующих реактивов, которые облетают дифференцирование
за счет образования пятен различных цветов. Большое количество пестицидов реагирует бо ее
чем с одним реактивом. Реактивы в выбранной последовательности распыляют на пластину.
Предел обнаружения лля большинства пестицидов — К) мкг после распыления набора детек-
торов и 2—5 мкг при применении единственного реактива-детектора.
После высыхания все хроматограммы рассма1ривают сначала при УФ-свеге (366 и 254 нм)
и затем последовательно обрабатывают реактивами соответственно каждой системе. Пластину
после обработки первым реактивом высушивают и отмечают любое изменение цвета (если
указано в методике, то повторно просматриваю! пластину в УФ-свете, ем. ниже). Далее па
пластину распыляют другой реактив и снова отмечают любые изменения.
Проявляющие реактивы
Серебра нитрат (А&). Пластины обрабатывают 0,1 М водным раствором нитрата серебра.
После распыления реактива высушенные пластины подвергают УФ-облучснию (254 им) в те-
чение 10 мин. Многие пестициды образуют белые. серые и коричневые пятна па ярко-корич-
невом фоне.
Родамин В и натрия гидроксид (RHB). 0.02% расп ор родамина В в этаноле, а затем насыщен-
ный раствор гидроксида натрия в этаноле последовательно наносят на пластину. После распы-
ления рас ворон исследуемые соединения видны как темно-голубые пятна при УФ-свегс.
Дифениламин и цинка хюрид (DPA). Раствор для напыления содержит 0.7% дифениламина и
0.7% пинка хлорила в ацетоне После его распыления пластины подвергают УФ-облучснию в
течение 10 мин и затем нагревают до 100 'С. пока не прекратится дальнейшее изменение цвета.
На белом фоне видны светло-синие, синие, зеленые п розовые пятна.
2.6-Дибромквинон-4-хюримид и натрия гидроксид (DBQ). 0.2% раствор 2.0-дибромквинон-4-
хлоримида в ацетоне, а затем насыщенный раствор гидроокиси натрия в этаноле используют
для обработки пластин. После этою пластины нагревают до 100 °C К) мин. Видны темпо-си-
ние. розовые и фиолетовые пятна па светло-синем фоне.
Палладия хюрид (Р<!). Для приготовления раствора 0.5 г хлорида палладия (II) растворяют
в 2.5 мл 35% HCI и осторожно доводят водой до 100 мл. После распыления видны желтые и
коричневые пят на.
4-(4-Питрг>беншл)пиридин и тетра зтиленкентамин (НВР). Дтя приготовления реактива рас-
творяют 5 г 4-(4-ннтробснзил)пир1!лн1!а в 100 мл ацетона и разбавляют смесью тезраэтцден-
пентамин (Т)-ансгон (1:5 по объему). Затем пластину сушат при 110 ’С в течение 10 мин. После
охлаждения пластину обрабатывают разбавленным раствором Т и на белом фоне наблюдают
пятна от синего до фиолетового цвета. Цвета неустойчивы. Стабильность цветов может быть
увеличена распылением на пластину 20% (по обьему) раствора уксусной кислоты, высушива-
нием при комнатной температуре и при ПО 'С перед применением Т. Реактивы должны быть
свежеприготовленными.
Последовательная обработка пластин реактивом Драгендорфа. 5% раствором хлорида железа
(III), смесью 1 г йода и 4 i йодида калия, растворенных в 100 мл этанола, и 25% раствором
концентрированной хлористоводородной кислоты в этаноле. Реактивы распыляют последова-
тельно. отмечают появление пятен и любых цветовых изменений
Газовая хроматография
Метол обладает высокой чу ветви гельностью. поэтому широко и успешно применяется для
обнаружения и количественного определения микроколичеств пестицидов в пищевых про-
дуктах растительного и животного происхождения, различных объектах окружающей среды,
технических препара ах. биообразпах. Применение метода можо ограничиваться низкой лету-
честью и термической нестабильностью некоторых пестицидов. Эффективность газовой хро
магографии определяется типом и режимом работы детектора, характером разделительной ко-
лонки. свойствами хроматографируемых соединений, используемой аппаратурой.
Исследование проводят на капиллярных колонках с различающимися но полярности не-
подвижными жидкими фазами. Выбор неподвижной жилкой фазы для решения каждой кон-
кретной задачи требует индивидуальною подхода. Для определения пестицидов часто исполь-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 791
зхют ЭЗД, ТИД. АФД. ПФД, ПИД и др. Выбор детектора зависит от ue.ui анализа и условии
его выло тения. Для определения ХОП применяют преимущественно ЭЗЯ. чувствительный
и селективны i к галозеисолержашим соединениям, сульфидам, соединениям с сопряженны-
ми двойными связями и некоторым другим веществам со ержащнм атомы с высокой элект-
роотрицательное гыо (по шкале Полита). При определении фосфорсодержащих соединений
используют высокосстсктивныс и чувствительные к фосфор- и азотсодержащим органическим
соединениям ТИД, АФД. ПФД и ПИД (см злектрониое приложение).
Газовая хроматография с масс-селективным детектором
Системы ГХ-МС сопровождаются библиотеками, которые содержат спектры мпотих пес-
гплилов, их метаболитов и продуктов разложения. В настоящее время разработано несколь-
ко комплексных систем обнаружения и количественного определения различных пестицидов
метолом ГХ-МС Многие из них используют самые современные методы математической об-
работки получаемой информации, включающей методы декоивалкшии хроматографических
пиков, реализованные в программе AM1J1S Национального американского института стандар-
тов (NISI) с последующей обработкой хемометрическими методами распознавания образов.
Данная система позволяет проводить нсслсдовлнис более 5(М) пестицидов разных химических
классов в различных объектах (см электронное приложение).
На рис. 8-30 приведены хроматограммы смеси стандартов нести низов и экстракта из био-
логического объекта на кварцевой капиллярной колонке длиной 30 м. На рис. S-3I показаны
масс-спектр фосфорорганического пестицида. обнаруженного в анализируемом экстракте в
количестве 6.1 нг/г и его библиотечный масс-спектр.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Для определения пестицидов ВЭЖХ менее м|к|к'ктнвна. чем цгзовая хроматография. гак как
имеет меньшую чувствительность для большинства нешесгв и их времена удерживания менее
воспроизводимы. Однако ВЭЖХ применяется д. я количественного определения пости шпон, а
также для проведения нод|всрждаюшнх исследований. особенно при наличии МС-детскгора.
Современные способы по [готовки образцов (ТФЭ и ЖЖЭ при еверхкритичсскнх условиях)
лают возможность повысить чувствительность определения до уровней паногриммов на I кт
или I л. Преимущество этого метола заключается в том, что нелетучие и водорастворимые
пестициды можно определять на современных жидкостных хроматографах без лериватнзапин.
Поскотьку разделение и регистрация пикон производятся при комнатой (или слегка повы-
шенной) температуре, этот метод идеально подходит для работы с веществами, малоустойчн
вымн при нагревании.
На рис. 8-32 приведена хроматограмма смеси ХОП па колонке Fxil Cyano 5 мк длиной 250 мм
н вг утренним диаметром 4.6 мм. Подвижная фаза — изооктан, скорость потока 0.75 мл/мин.
Детектор УФ при 254 пм.
При проведении ВЭЖХ используют главным образом силикагели немолифниирова тые,
или молппирогмнпые CI8. или другое, например ни шмолифипированные сорбенты. В ка-
честве подвижных фаз применяются смеси ацетонитрила с новой и другие, аналогичные им
смеси. Выбор неподвижной и подвижной фаз сильно зависит от свойств исследуемых веществ
и используемого оборудования (см. гл. 6.3.4).
В последние годы для определения пестицидов в различных объектах применяю! капи.-ыяр-
ный электрофорез с МС-летектором — КЭ-МС (см. i t. 6.3.5)
Для количественной оценки содержания пестицидов в объектах исследования применяются
ТСХ, ГХ, ГХ-МС. ВЭЖХ, КЭ-МС (см. гл. 6.3 и электронное приложение).
Концентрация пестицидов в биообъектах, взяпях от пациентов с острыми отравлениями,
определяет адекватный выбор методов детоксикации и гечсния, особенно когда рассматрива-
ется необходимость применения форсированного диуреза или гемодиализа. При смертельных
отравлениях (в случаях убийств или самоубийств) концентрация пестицидов в не,следуемых
объектах (биообразцы, напитки, пиша, оцежда. почва и др.) может быть достаточно высокой,
что облегчает идентификацию конкретного пбйипилл. Количественное опре юление j того ве-
щества в тканях ipyna позволяет доказан,, что oipaivieiinc вызвано именно этим пестицидом
792 Глава 8
Интенсивность
18479
26.203
23.078
39.774
600000
5.573
28.3'
0
500000
13.713
400000
3.867
33.336
37.290
41.80
300000
8.350
6.425
90S
5.649
5
200000
100000
23.
>04
о
5.00
10.00
114/
17.264
13200
12 3
26 420
15.00
25.00
20.00
30.00 35.00 40.00
Время удерживания мин
Интенсивность
Рис 8-30. Хрома гО1раммы смеси стандартов различных псстнцнлоп (внизу) и экстракта из биологического
объекта, содержащего смесь этих же пестицидов (вверху). не кварцевой капиллярной колонке
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 793
Интенсивность
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
о
Время у ерживания мин
Рис. 8-31. Масс-спектр ФО I (итюрху) и его библиотечный масс-спектр (пишу).
794 Глава 8
I--------1---------1-------
О 8 16
Рис. 8-32. Размещение смеси
ХОП метолом ВЭЖХ. (Поясне-
ние в тексте.)
I — ллдрии; 2 — гептафтор; 3 —
ДДТ; 4 — эндрин; 5 — дгыь-
дрин.
Количественное определение используют л, я мониторинга
концентрации пестицидов в почве, источниках волы, реках,
озерах и пищевых продуктах; в некоторых а ранах введен за-
конодательный контроль за допустимым уровнем пестицидов в
окружающей среде.
Методы определения отдельных классов пестицидов
Фосфорорганические пестициды
При острых клинических отравлениях диагностическое зна-
чение имеет пониженная активноегь холинэстеразы. Обнару-
жение. идентификация и опрс течение количества специфичес-
кою агента, ответственного за отравление. не имеют большого
значения в выборе безотлагательного метода лечения, хотя
некоторые из диэтилфосфотиола гов. обладающих липофиль-
ными свойствами, могут накапливаться в тканях в течение не-
скольких дней. и у пациентов, которые уже выздоравливают,
может произойти повторное поятенис симптомов отравления.
Идентификация агента может подготовить клиницистов к та-
кой ситуации.
Определение активности холинэстеразы в плазме, сыворотке
и цельной крови. В орпнизмс существует два типа холинэстераз
(с.м. выше). АХЭ, которая известна как истинная холинэсте-
раза. содержится в эритроцитах. нервных окончаниях, легких
и тканях мозга. Ее главная функция — гидролиз АХ в хг пн-
пергичсскнх нервг ых окончаниях. Холинэстераза второю тина
известна как иееняохолинэсгераза (ПХЭ), содержится в плззме
и различных тканях организма. Точная физиологическая функ-
ция 11ХЭ неизвестна, но она обладает способностью к гидроли-
зу различных сложных эфиров, в отличие от АХЭ. Понижение
активности ПХЭ может быть вызвано химическими соедине-
ниями, не являющимися пестицидами, патологией печени и
другими факторами (физиологическими, фармакологическими
или генетическими). Поэтому определение активности АХЭ в
эритроцитах является более специфичным показателем инги-
бирования холинэстеразы, вызванного пестицидами из групп
кгрбамагов или ФОН. Кроме того, снижение активности АХЭ
в эригроннгах может обнаруживаться спустя 2—6 нед после
воздействия токсиканта. активность ПХЭ плазмы возвращает-
ся к норме гораздо быстрее. Однако па практике активность
ПХЭ плазмы — также важный показатель воздействия на ор-
ганизм пестицидов вышеупомянутых групп: нормальная активность ПХЭ исключает острое
отравление этими веществами. Некоторые карбаматные гербициды и фунгициды класса лигио-
карбаматов нс оказывают существенного влияния на хо гинэстеразу и относительно неядовиты
для людей.
Исследуемые пробы, взятые посмертно для испытания активности АХЭ, должны хранить-
ся при пониженной температуре и быть проанализированы как можно скорее, чтобы мини
мизировать возможность спонтанной реактивации фермента. Следует заметить, что диапазон
нормальных значений активности АХЭ зависит от выбора метола исследования и имеет инди-
виду гьные различия. К настоящему времени разработано и широко применяется на практике
несколько специальных наборов для определения активности АХЭ в биологических объектах.
В большинстве из них определяют уксусную кислоту, образующуюся при гидролизе АХ. также
применяются наборы, использующие ИХМ
Определение ФОП в моче. Большинство соединений этого химического класса быстро гидро-
лизуются различными ферментными системами организма с образованием множества метабо-
литов. их конъюгаты выделяются с мочой и неустойчивы при хранении. Для получения лосто-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 795
верных данных о степени отравления и концентрации ФОП важно пронести анализ образцов
как можно скорее после инцидента. Образцы мочи должны быть проанализированы в пределах
н течи после забора пробы и храниться при пониженной температуре до анализа.
Многие ФОП могут быть проанализированы без предварительной дериватизаиин. Скрининг
этих соединений проводится методом газовой хроматографии с многодетекторной системой.
При этом наибсмес часто применяются комбинации детекторов: ПИД—АФД, ПИД—АФД —
ДЭЗ , иногда к ним добавляются ПФД или МС-детекгор. Применение АФД десятикратно уве-
личивает чувствии ibiiocib обнаружения ФОП по сравнению с использованием ПИД. Это очень
важно, потому что многие ФОП высокотоксичны и их концентрации в биообъектах низки.
Фрагментация этих соединений при использовании масс-спек громе трин характеристических
ионов (интенсивность которых очень варьирует от вещества к веществу) позволяет определить
химический класс соединений. Молекулярные ионы ФОП обнаруживаются при использова-
нии ВЭЖХ с ионизацией алектронным ударом (см. гл. 6.3.6). Протонированные и содержащие
положительно заряженный четвертичный атом азота молекулы мотуг быть детектированы в
режиме обнаружения положительно заряженных ионов без фрагментации. Фосфаты и фосфо-
дитионагы дают лучший результат. чем другие химические классы. Фо фодитионаты с такими
заместителями в кольце, как хлор, бром или нитрогрунна. образуют особенно интенсивные
пики. Масс-спектры, полученные нрн работе в режиме обнаружения отрицательно заряженных
попов, позволяют определить большее количество сопутствующих соединений.
Карбаматы
Эти соединения разделяются на подклассы. характеризующиеся различной тсрмостабиль-
ноегью. Продукты разложения N-метил карбаматов при нагревании представлены главным
образом замешенными фенолами. Их молекулярные ионы имеют большую интенсивность в
масс-спектрах. Соединения из других подклассов более устойчивы к нагреванию. Их молеку-
лярные ионы имеют низкую интенсивность, но вместе с друтими диагностическими фрагмен-
тами масс-спектра позволяют провести идентификацию Определение карбаматов методами
ВЭЖХ-МС нс вызывает трудностей.
X рированные углеводороды
ХОП могут быть определены (без лсриватизатгии) хроматографически с использованием
двойной системы детектирования ПИЛ—АФД. но при применении ЭЗД достигается большая
чувствительность. Методы, используемые в клинических и судебных случаях, нс должны быть
высокочувствительными. потому чго большинство соединений, которые принадлежат к эгому
классу, не обладают высокой токсичностью и серьезные признаки отравления наблюдаются
только при присме внутрь больших количеств (несколько граммов) этих веществ. Кроме того,
симптомы часто обусловлены токснчносты^ растворителей, которые используются в коммер-
ческих средствах, содержащих ХОП.
Пиретрины и пиретроиды
Пиретроиды не содержат атомов азота, поэтому дня их определения подходит методы
ГХ-ПИД и ГХ-МС. Эти сое мнения могуч быть проанализированы хроматографически без
дериватизапии или после метилирования.
Хюрированные феноксикислоты
Замещенные феноксикислоты выпускаются как коммерческие ирод кты в виде солеи или
эфиров. Превращение солей после экстракции и дернватизации в соответствующие метиловые
эфиры улучшает результаты хроматографического анализа. Присутствие озооктиловых (2.2.4-
гриметилпенгиловых) эфиров гербицидов класса хлорированных феттоксикислот может быть
доказано при использовании ГХ-МС по ионам (m/z) 41, 55. 57. 64. 71 н Х5. имеющим значи-
те л ы ту ю и 11 т е т тс и вность.
Диоксины как техническая примесь часто содержатся в смеси с пестицидами этой группы.
Уровень диоксина в биологических пробах очень мал. поэтому для его определения требуются
весьма чувствительные и специфические методы. Единственным успешно используемым мето-
дом в настоящее время является ГХ-МС.
Применяются методики определения диоксинов в нишевых продуктах и биологических тка-
нях после ускоренной экстракция растворителями и экстракции, стимулированной микровол-
новым полем, с последующим анализом экс рактов методами ВЭЖХ, многомерной газовой
хроматотрафии или ГХ-МС. Новейшие методики определения диоксинов основаны на экстрак-
796 Глава 8
иконном выделении (СФЭ. см. гл. 5) и применении комбинированных систем типа СФЭ-ГХ—
ВЭЖХ-МС Нередко в бионробах совместно с диоксинами определяют и полих. орировапвые
дибепзофураиы (см. гл. 10).
На рис. 8-33 показаны хроматограммы изомеров хлорбе изофуранов. выделенных из экстра
кта печени трупа и идентифицированных по молекулярным ионам (метод ГХ-МС).
Триазины
Триазины содержат несколько атомов люта и их можно обнаружить методом IX-ПИД и
ГХ-АФД. Большинство триатипов легко определить методом ГХ МС. получают характерные
Рис.8-33. Хроматограммы изомеров хлорбензофу-
рзнов, молекулярные ионы которых идентифици-
рованы.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 797
масс-спектры неизмененных соединений и их метаболитов — гидрокси- и дезалкилтриа шпон.
Используя ВЭЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI) и иониза-
цией электронным ударом, протонированные молекулы гриазипов могут быть детектированы
без фрагментации (см. гл. 6.3.6). если подобраны оптимальные параметры разделения.
Соед тения с четвертичным азотом
Паракват и дикват как полностью растворимые в воде всшества не подвергаются ЖЖЭ.
Производные, полученные восстановлением параквата и диквата натрия борт идрилом, мо-
гут быть извлечены диэтиловым эфиром из щелочного раствора для проведения дальнейшего
хроматографического анализа. Масс-спектры этих соединений предоставляют ограниченные
возможности для идентификации. Наиболее широко используемый метод — колориметричес-
кое определение параквата и диквата после реакции с натрия дитионигом в щелочной среде.
Оба продукта реакции имеют максимумы поглощения при 396 и 379 нм. Используя технику
ионно-парной экстракции, можно достичь предел обнаружения 50 мкг/л. Однако метод имеет
серьезные ограничения, так как невозможно включить в процедуру определения внутренний
стандарт.
Радиоиммунные и иммуно<|х юоресиснтпыс мете ты определения параквата в сыворотке
очень чувствительны и требуют небольших объемов проб, но они не являются общедоступны-
ми. Паракват определяют в сыворогке кропи методом ВЭЖХ-УФ после ТФЭ. Дикват в био-
объектах определяют бо;1Ы1пшствох< методов, описанных для параквата
Кумариновые антиква улянты
Антикоагулянтные родентициды варфарип. бродифакум. бромадиолон. куматетралил и пи-
фенакум определяют после дериватизании или без нее методами ГХ пли ГХ-МС. являющи-
мися наиболее чувствительными и селективными ня этого класса вешеств. Метилирование
(пери ваги зация) с использованием тетрагексилам мония гидросульфата. мстлйодида п ТФЭ
применяют для определения этих пестицидов в плазме крови и моче. Наличие в масс-спектрах
ионов (m/z) 291. 294. 295. 309. 313. 322. 324. 336. 343 и 354 х ожст указывать иа присутствие
4-1 идроксикумтриповых антикоагулянтов 11114 гидроксиметаболитов кумахлора. куматетралила
и варфарина. Пять из 4-гияроксику мариновых антикоагулянтов (бродифакум. бромадиолон.
куматетралил, лнфенпкум и варфарин) могут быть обнаружены и количественно определены в
сыворотке крови метолом ВЭЖХ с флюориметрическим детектором.
Пиримидиновые гербициды (урацилы)
Пиримидиновые гербициды могут быть определены как исходные вещества или после лери-
ватизапип метолом ВЭЖХ с УФ-детектором при 254 или 270—280 нм. Для идентификации ура-
цилов используют ВЭЖХ и масс-спектр мстрию с элсктроспрей-ионизацией (ESI) или APCI
(см. гл. 6.3.6) в режимах определения положительных и отрицательных ионов.
•Пестициды отчасти при неправильном использовании и хранении, а отчасти из-за от-
сутствия достоверных научных данных об их влиянии на человека и окружающую среду пре-
вращаются в химические бумеранги, которые запускаются химиками для позитивного реше-
ния конкретных проблем, но на второй половине петли возвращаются по трофическим цепям
в живые организмы, биоаккумулируются в них и вызывают серьезные химические стрессы»
(В.С. Петросян, химический факультет МГУ)
8.5. ТОКСИЧНЫЕ И ЭССЕНЦИАЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ
«...но-настояшему на вреди гь себе
способны только мы сами*.
С Джонсон
8.5.1. Главные факторы токсичности металлов,
их биологические мишени. Металлолигадный гомеостаз
Железо и пинк. хюлиблен и вянаяий. медь и кобальт, а также десятки других химических
элементов присутствуют в организме человека в очень малых количествах — Юл—10 '“%. Од-
нако их избыток или недостаток в организме приводил к патологии. Металлы — элеменгы зем-
798 Глава 8
ной коры. т.с. их воздействие из естественных источников неизбежно. Большинство организ-
мов. включая человека, имеют различные биологические механизмы для противодействия их
потептгиалыто вредному уровню (избыточному или недостаточному). Поддержание гомеостаза
связано с и змспспиячи протеома (см. гл. 3). по направление и скорость процессов синтеза или
растепления белков часто определяют попы металлов. Стабильный уровень внутриклеточных
металлов является важнейшим трактором клеточного гомеостаза.
Почему один и тот же элемент, но в разных формах может играть как созидательную. так
и разрушительную роль? Еще в начале XX века проф. Московского университета В.И. Вер-
надский на еьезде русских врачей и естествоиспытателей сделал основополагающий доклад о
связи химического строения земной коры, свойств рассеянных элементов (микроэлементов)
и состояния здоровья человека. В настоящее время доказана роль макро- и микроэлементов
в процессах роста, дифференцировки, репарации и регенерации, апоптоза, некроза, выживае-
мости клеток а также патогенезе хронических воспалительных, дегенеративных и ряда других
заболеваний.
Ио словам известного патолога и физиолога акал ,\.П Автгына. микроэлементы — «скорее
всего не случайные интрсдисшы тканей и жидкостей организмов, а компоненты закономерно
существующей очень древней и сложной физиологической системы, участвующей в регулиро-
вании жизненных функций на всех стадиях ратит ня».
Организм — динамическая нолилигандная и полиметаллическая система, для функциони-
рования которой необходимо поддержание металлов нитяного гомеостаза (МЛГ). Несмотря lift
зависимость от различных факторов и опосредованный характер большинства протекающих в
организме при участии металлов биопроцессов, они подчиняются глобальному закону химии —
закону действующих масс и описываются константами комнлсксообразотшпия и нестойкости.
Обмен, циркуляция, депонирование ионов менвыои во многом ооъясняюзся их участием в
процессах комплексообразования с природными эндогенными лигандами (нуклеиновые кис-
лоты, углеводы. аминокислотами, пептиды, бе ки. витамины, гормоны) и экзогенными лиган-
дами (лекарственные препараты, пищевые продукты и др.).
Бывают обстоятельства, при которых частота, интенсивность или продолжительность воз-
действия соединений металлов превосходят емкость адаптационных механизмов. Тогда встает
вопрос об экспертной оценке степени токсичности металлов Каждый элемент имеет диапазон
бсзопясной зкепозипии (рис. 8-34).
Например, марганец — эссенциальный элемент, который активирует многие эн зимы и вхо-
дит в состав ряда ферментон-металлопрогеииов. Результатом хронического вохтействия высо-
ких лоз марганна. его накопления в тканях головного мозга объясняют необратимое нсвроло-
тичсское состояние, характеризующееся странным поведением и маскообразным выражением
лица, близкое по симптомам к болезни Паркинсона, которое часто встречается у подростков-
наркоманов. использующих получаемый в домашних условиях эфедрон (см. гл. 7), и при про-
фессиональной патологии работников горнодобывающих комбинатов, электросварщиков.
Обсуждая роль н значение макро- и мик-
роэлементов в регулировании жизненных
функций организма, следует говорить как о
металлах, так и неметаллах Селен — один из
самых токсичных 'элементов Периодической
системы элементов Менделеева. Это мнение
просуществовало с момента открытия селена
(1836) до середины 70-х годов XX века, коми
в живых организмах и растениях ученые об-
наружили аминокислоты — селсиоииетеин и
селсномсгионин (см. гл. К.5.3). Среди природ-
ных аминокислот селеноиистенн — 21 ами-
нокислота. образование которой теистически
кодируется. Токсичность микроэлемента не
исключает сто эссенииальность. Это связано в
итачнгельной степени с формой нахождения
элемента в организме: копялентшгЛ или или-
1 — Недостаточность МЭ
2.4— Погремим*» хжы
3— Оптитма/ъный зффагт
5— Токсическое дойстама
Рис. 8-34. Зависимость лоза-эффект: каждый эс-
сенциальный элемент имеет диапазон оптималь-
ных концентраций, обеспечивающий нормальную
жизнедеятельность организма (3 — область М.ТГт.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 799
нои. Утверждение «селен токсичен* относится к ионном форме селена неорганических соеди-
нении (см. гл. 8.5.3) и его нельзя признать ошибо шым. Существует организмы (в том числе
водоросли). которые быстро метилируют ртуть в ионном виде до существенно более токсичных
органических соединений — мстнлртути и лнметилртути. таким образом, сомавая опасную и
лег коабсорбируемую форму Эл илем ические отравления мети тртутью от потребления рыбы и
моллюсков наблюдались в некоторых частях Японии в 50—60-х голах XX века (болезнь Ми
намята), а самая крупная вспышка отравления метилртутью случилась в Ираке в начале 70-х
голов как результат потребления х. бй загрязненного фунгицидом. содержащим ртуть.
При определении токсичности металлов и других элементов (например селена, мышьяка)
нужно учитывать уникальные и разнообразные физические и химические свойства этой группы
токсикантов. Металлы не подвержены дегражшии естественным путем, чго нриводиг к более
выраженному их воздействию, чем у лрутнх. менее устойчивых токсичных вешеств органичес-
кой природы. Способность соединений мет з.чов к ионизации в растворах влияет на абсорб-
цию. распределение н выведение токсикантов. Существование элементов в окружающей среде,
растительных и животных организмах в различных химических формах (элементная, ионная,
ковалентная. в частности координационная) влияет на их химические и токсические свойства.
Приведем несколько примеров, иллюстр» руюших разнообразие форм нахождения металлов в
организме. Электронное строение атома железа в активных центрах важнейших железосодер-
жащих белков (1с.монротсины. гемоглобин, миоглобин, цитохромы, ниюхро.моксидаза. игро-
ки лаза. миелопероксидаза, каталаза, цитохром, с-редуктаза. сукцинатдегидрогеназа, пратипок
сидаза, НАДФ-дегидрогепаза. ашы-КоА-дегилрогеназа. ксантинооксдаза) рахтичается и. что
не менее важно, может быть изменено за счет нс только очевидных причин (изменение лиган-
дного состава или зарядового состояния атома), ио и за счет незначительных кон<]юрмаиион-
ных перестроек глобулы белка (см. гл. 6.4.3). В организме человека насчитывается более 21Ю
иинксолержаших металлопротеннов. yi пкалыюсп многих из них обусловлена особенностями
и возможными изменениями электронного строения центрам, «ого атома Нинк — компонент
активных центров РНК-полимераз. карбо знгилр ны. алкогольаегилрогеназы. факторов транс-
крипции. ферментов — оксидоредуктаз, трансфераз, лиаз, гидролаз, изомераз, цитозольной
формы супероксиддисмутазы Нинк входит в структуру гормона вилочковой железы тимулина.
участвует в упаковке инсулина, гонадотронинов и других гормонов. Цинк карбоангидразы С.
выступая в качестве элсюрофила. участвует в образовании Н и ОН ионов нз молекулы воды
и катализирует реакцию о раюванпя угольной кислоты (рис. 8-35).
Рис. 8-35. Схема реакции образования угольной кислоты при каталитическом участив иона цинка карбо-
ангидразы С. Е— активный центр энзима карбоашилразы С.
Ионы меди II) — кофермент дофамин-0-гидроксилазы. участвующей в синтезе нейромеди-
аторов (см. гл. 7). Ионы меди (I) являются катализаторами реакпи> образования АФК (см. гл. 3).
В коре надпочечников содержится мельзавиенмый фермент А5 — 3-кстостероид изомераза в
виде хелата мели. Кобальт — ключевой элемент кофермента витамина Вр, молибден — компо-
нент активного центра ксантиноксидэзы. важный участник пуринового метаболи зма. никель —
компонент оксидоредуктаз, в частности уреаз бактерий, пиролитических ферментов человека —
и многие другие элементы, выполняющие биологические функции, находятся в вше комплек-
сов с различными эндогенными лигандами.
800 Глава 8
Неэссенциальные металлы (и неметаллы) — это те металлы (и неметаллы), полезная роль
которых в какой-либо биологической функции неизвестна. К ним относят* (па сегодняшний
день) бериллий, кадмии, ртуть, свинец, таллий, уран и некоторые другие.
Химическое состояние и степень окисления металла в соединениях значительно влияют па
их токсичность. I ак. соединения хрома в степени окисления +3 и +6 оказывают различное
действие на организм (см. ниже). С другой стороны, условия внешней среды (pH. температура,
наличие лигандов и т.д.) обусловливают форму нахождения металла в био- и экосистемах. На-
пример. медь имеет высокое сродстио к ор1аническнм лигандам, связывается с органическими
веществами почвы и накапливается в ее верхних слоях (если поступила с поверхности), что
можег повысить вероятность воздействия меди через контакт с почвой. Соли металлов (ион-
ная форма металлов) имеют токсические свойства, которые отличаются от таковых у металла,
связанного в комплекс. Комплексы металлов в зависимости от геометрии молекул, природы
лигандов, усго пивости и других факторов могут вести себя по-разному, что влияет на их аб-
сорбцию и распределение в организме
Молекулярные механизмы большинства мсталлозависимых химических процессов, происхо-
дящих в клетке, изучены недостаточно. Количественные изменения компонентов металюма —
продуктов взаимодействия ионных и атомных форм металлов с нуклеотидами и нуклеозидами,
белками и аминокислотами, углеводами и высшими жирными кислотами, гормонами и про-
стагландинами. во многом, остаются неизвестными. Металл в живой клетке может находи >ься
в виде кластера или комплекса, а также в ионной или молекулярной форме. Определение фор-
мы нахождения металлов, биологически активных амфотерных элементов (например, селена)
в клетке и среди субклеточных структур, а также их бномаркеров (метаболитов органической
природы) становится реальностью в связи с внедрением новых технологии — метаболомики
и метабономики и тандемных или комплексных аналитических систем ВЭЖХ-ИСП-МС. КЭ-
ИСП МС-ЯМР или ВЭЖХ-ИСП-МС-ЯМР (см. гл. 3.3. 6.4.4 и электронное приложение).
Переход металла из одной формы в другую в условиях окружающей среды обусловлен био-
геохимическими циклами. Внутри биологических циклов металлы раснределякися и лепо-
нируюгся. включаются в пищевые цени. Например, иногда загрязненные металлами почвы
засаживаются растениями или грибами, которые их абсорбируют из почвы и связывают в
стабильной форх с со структурными элементами своих клеток. Удаление растении или грибов
приводит к эффективному избавлению от избытка металлов на этом участке почвы. Другой
пример. Некоторые п ieccnii можно культур!гровать при условиях, когда они будут восстанав-
ливать ргуть из ионной формы в элементную, которая обычно менее биодоступна, хотя пары
элементной ртути могут быстро дш|>фундировать через многие клеточные мембраны. Неорга-
нические соединения свинца могут подвергнуться биотраисформации нскоюрыми бак *риями
ло тетраэтилсвинца — органического вещества, которое значительно легче транспортируется
через биологические мембраны, чем ионная форма (см. гл. Х.2). Таким образом, в организме
(животном иди растительном) возможно изменение формы элемента.
В природе распространены координированные влияния элементов. Существуют пары п
триады элементов, которые оказывают синергическое или аптагонисгичсское влияние па раз-
личные биохимические процессы и физиологические показатели (рис. К-36), например, пары
Fe/Ми. Fe/Zn. Zn/Cu. Cd/Cu. Cu/Mo и др., триады (I . Са. РО ’). (Mo. Си, SO/ ). Повышен-
ный уровень Си и Мп — антагонистов Мо — способствует развитию выраженной формы его
дефицита, а дефицит Мо рассматривают как один из ({гакторов предрасположенности к раку.
Низкий уровень Se в сыворотке крови указывает на снижение антиоксидантной зашиты орга-
низма. Антагонистами Se являются Pb. Hg. Cd. As Общеизвестен механизм повреждающего
действия этих элементов как тиоловых ялов. Токсичность Pb, Hg. Cd. As может проявляться и
опосредованно через снижение уровня Se, чго объясняется различием констант образования их
комплексов с серосодержащими аминокислотами по сравнению с производными селена. Низ-
кий уровень Se в сыворотке крови и его повышенная концентрация в волосах служат одним
из тестов ранней дна) носилки токсического действия антагонистов селена. Подтверждающий
результат такого предположения возможен только по совокупное и данных многоэлементного
' В литературе встречается и не стгыь категоричное утверждение, например что кадмий и свиней, имеющие давнюю
репутацию токсичных. при определенны* условиях обладают свойствами jeceiiinuui.iiijx.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 801
Антагонизм
Индукция ФНО-о
Pb, Cd и Нд
I_____________
Антагонизм
Рис. 8-36. Синергическое и аита-
юнпстцческое влияние элемен-
тов на различные биохимические
процессы и физиологические по-
казатели.
анализа металлов и количественного определения клинически важных индикаторов дисбалан-
са микроэлементов (см. гл. 6.4.2). При этом весьма важно получи!ь информацию о количест-
венном содержании как можно большего числа микроэлементов в одной пробе одновременно
и в различных типах биообъектов (например, в крови и волосах).
Сочетанное действие элементов может быть опосредовано через процессы фосфорилирова-
ния в стенке кишечника или влияние на активноегь iiiniieiKipif ic.ibiibix ферментов. Возможно
также и непрямое взаимодействие, например путем стимуляции размножения и активности
микрофлоры в желудке и кишечнике.
Сиисршческис механизмы функционируют на уровне тканевого и клеточного метаболизма.
Можно выделить взаимодействие элементов в формировании костног ткани (Са и Р). синтезе ге-
моглобина (Fe и Си), стабилизации конформации молекул РНК (Мп и Zn). Элементы-синергисты
могут участвовать в формировании активного центра ферментов (Fe и Мо в составе ксантин- и
альдепшоксидаз. Си и Fe в составе цитохромоксидазк В отличие от синергизма. которым чаше
бывает взаимным, антагонизм можез быть как обоюдным, так и односторонним. Mg и Р. Zn и Си
взаимно тормозят абсорбцию друг друга в кишечнике, а Са ингибирует абсорбцию Zn и Mg (но
не наоборот). Эффект ингибироивиня абсорбции одних элементов другими в пищеварительном
канале может быть обусловлен конкуренцией за мембранный переносчик ионов (Со2'. Fc2').
802 Глава 8
На рис. 8-37 представлена схема взаимодействия ряда элементов.
Кальций выполняет функцию главного неорганического мессенджера. Ьто участие в про-
цессах метаболизма описано в главе 3.2. Цинк регулирует направление и скорость многих
реакции биотрансформации, поэтому его называют «главным неорганическим гормоном».
Значительное изменение уровня какого-либо элемента почти неизбежно сопровождается из-
менением со. ержания другого элемента или лаже нескольких. Например, введение ионной
формы цинка (соли цинка органических или неорганических кислот) не давляег усвоение мели
(сходство элсюронных оболочек) и железа (близкие ионные радиусы), что на организменном
уровне может инициировать системные болезни с аутоиммунными нарушениями тина васку-
литов. Это связано со снижением активности опрел* тенных ферментов из-за neaociaiKa меди,
вытеснения ее из лизилоксидазы — медьсодержащего фермента (протеинлизин-6-оксидазы),
участвующего в процессах сшивки коллагеновых волокон, что в свою очередь увс тчивает
рыхлость стенок сосу юн и клеток соединительной ткани. В процессах синтеза коллагена учас-
твуют 2 железосодержащих фермента (проколлагснпролин-Д-диоксигсназз и цроколлагенли
зин-5-диоксигсназа). Искусственно вызванный из за антагонизма элементов дефицит железа
после введения ионной формы цинка усилит эффект индуцированных васкулитов, а также
может способствовать развитию остеопороза и нарушению энергетического обмена в клетках
блат одаря подавлению активности дыхательной цепи. Нарушение батанса мели и железа при-
водит к нарушению синтеза протеогликанов, основного вещества межклеточного матрикса,
чго сопровождается болезненными артритами коленных, тазобедренных, локтевых и плечевых
суставов с возможным развитием артрозов. Введение препаратов пинка в виде комплексов с
органическими лигандами, т.е. в координационно-связанной (хелатной) форме, не приводит к
таким последствиям.
Медицинская статистика последних лет показала, что в РФ длительное бесконтрольное
добавление препаратов кальция с витамином Г), в рацион беременных женщин приводило к
изменению у них ряда важных показателей минерального обмена и снижению содержания
витаминов труппы В. т.е. к большой вероятности развития остеопороза. Длительное введение
ионном формы клльмпя нарушат метаболизм железа. йсыа. селена, пинка.
В организме человека обнаружено более 80 химических элементов, причем аналитически
установлено, что их относительное содержание сопоставимо с элементным составом океани-
ческой воды. Обилие фактического материала (нередко довольно противоречивого) о влиянии
содержания металлов в организме на состояние здоровья человека создаст впечатление хаоса
фактов, эффекта калейдоскопа. В действительности такое впечатление ошибочно. Экспери-
ментальные наблюдения группируются вокруг 3 больших проблем патологии: элементной не-
достаточности. элементной интоксикации, элементного дисбаланса
Рис 8-37. Пример взан моден твия
элементов в орган» тме.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 803
В качестве шкалы содержания элементов (металлов и неметаллов) в организме принято
придерживаться следующих дефиниции:
• макроэлементы: Н О. С. N. Р. S. С1. Са. К. Na. Mg. Fe.
• микроэлементы: Zn. F. Sr, Mo. Cu. Br. Si. Cs, I. Mn, Al. Pb. Cd. B. Rb, Se. Hg, \ As. b. Ba. Ti. Sn;
• улырамикро । юменгы: Co. Cr. Ni. Ag. Be Ga. Ge. Sc. Zr. Bi. Sb. U. Th. Rh.
Микроэлементы п ультрамикроэлемснгы — группа химических элементов, которые содер-
жатся в животных и растительных организмах в количестве I01—10 •%. Они распределены в
органах и жн (костях человека неравномерно.
Нарушение МЛ Г вызывает прела лировшгис или дефицит ионов металлов (например, изменение
геохимической среды обитания, эдоолеванис). увеличение или снижение концентрации лигандов
(длигел .нос применение ряда лекарственных средств, определенная диета, заболевание). У1ЛГ —
это «фундаментальный механизм жизнедеяте гьиости биологических систем, коюрьи опирается
ни принцип рекомбинационных преобразований. или единства в многообразии. К трансферы г
пин свойств системы иривоыт не только количественные изменения се злементов. но и их пе-
регруппировка на всех уровнях — от молекулярного до организменного» (акад. Д.С. Саркисов).
Например, хпггетьное употребление статинов, которые используются для предотвращения атерос-
клероза и коронарной болезни сердца, может вызвать миопатию и идиопатическую 1юыипейропа-
тию. Статины ингибируют окси мсти i тутарил-КоА (НМО-СоА)-редуктазу — начальный фермент
мевалонатного нуги синтеза холестерина, в результате не образуется необходимый для синтеза
холестерина восстаноктснный июпентснилнирофоефат (1РР) и подпаляется синтс холестерина.
Однако IPP необходим для синтеза селенопротеинов, когорые участвуют в регенерации миоцитов,
антиоксидантной защите в виде tj татионперокендазы и гиорслок инредуктазы, а также в сост те
дейодиназы контролирую через тироксин и йодсодержащий кальцитонин гомеостаз кальция (рис.
8-38). Таким образом, положительный эффект лекарства сопровождается п побочным действием —
нарушением .МЛГ в виде слабо выраженных элементоюв Sc, I, Са.
Гис. 8-38. Схема мсысюнвгного пут сигпеза холестерина (Moosmann В.. Bchl С., 2004). Д -IPP и Л:-1РР —
окисленная и воссгаиоЕиешшя формы IPP.
804 Глава 8
Белый и ис । во лекарственных вешеств содерж* элекцюполонориыс труппы п являются ак-
тивными лигандами, вступая in vivo в реакции конкурирующего комплексообразования с ме-
тал.1осодержашимн хелатами нормальных процессов метаболизма.
Как известно, устойчивость комплекса характеризуются константой устойчивости или об-
ратной величиной — константой нестойкости, что позволяет прогнозировать направление
лит андообменных процессов. Конкурирующий процесс комплексообразования пойдет в на-
правлении получения наибо тее прочного комплекса, т.е. с наименьшей константой нестой-
кости. Объектом конкуренции может быть как металл, так и лиганд. Поэтому при приеме
многих лекарственных препаратов может наблюдаться изменение содержания эссенциальных
металлов. Рассмотрим это подробнее. Выступая в качестве центрального атома, большинство
микроэлементов способно образовывать биокомплексы in vivo. Устойчивость комплексов иг-
рает фундаментальную роль во внутри- и внеклеточной динамике, антагонизме, синергизме
и фармакодинамическом действии микроэлементов. В составе лиганда может быть один или
несколько донорных атомов. Лиганды делятся на moi юле i паз и ыс и волилентатпые. Бблыная
часть мета.глов в организме находится в виде хелатов с биологически активными веществами.
Полиялериые ком иле кеч те соединения имеют несколько центральных атомов с координиро-
ванными полидентатными лигандами. Макро гиклические комплексные соединения образо-
ваны поли дентатным и циклическими лигандами, внутри которых размешается центральный
атом. Принцип макроциклического связывания — «лиганд-хозяин, центральный атом-гость» —
широко распространен в природе: гемоглобин, хлорофилл. пиаиокобаламнн и др. В организме
постоянно пропекают .нпанднообменныс процессы. Металлы имеют разное сродство к оп-
ределенным донорным группам: Zn — к гегероаюму азота имидазольных циклов (например,
гистидина) или к атому серы цистеина, Мо — к атому кислорода и атому серы. Си — к атому
азота и др. Конкурирующий процесс комплексообразования идет в направлении получения на-
иболее прочного комплекса, т.е. с наименьшей константой нестойкости (согласно глобально-
му закону химии — закону действующих масс). Совмещенное лигандное равновесие возмож-
но при наличии в среде нескольких литанлов или ионон металлов одновременно. Например,
свинец может заменить цинк в некоторых цинксодержапгих ферментах, то есть нарушить их
функцию. Если принять во внимание, что цинк является фактором иммуногенеза. сперматоге-
неза, репродукции, ранозаживления. ю понятно, чем грозит детскому организму загрязнение
окружающей среды свинцом, который часто называют токсикантом be 1. Отравление соедине-
ниями свинна может привести к серьезным трудностям в обучаемости, нарушению повеления
(агрессивность), перевозбуждению, энцефалопатии. Свинец влияет на кроветворную систему
путем изменения активности cooibcictbviouihx ферментов, вовлеченных в биосинтез гема (см.
гл. 8.53 и 8.5.4).
С увеличением прочности комплекса возрастает специфичность функции металла. Прочные
комплексы постоянно находятся в организме (например, гемоглобин, витамин В12, цитохро-
мы). Замена .металла в них невозможна, так как означает разрушение макроцикла и полную
потерю биологической функции.
Непрочные комплексы образуются только для выполнения определенных функций и затем
разрушаются Ионы металлов в таких случаях могут служить активаторами ферментов на пери-
од их каталитического действия. Константа устойчивости этих комплексов низкая. Комплекс
каждый раз разрушается после структурной перестройки в .молеку ic субстрата и вновь обра-
зуется после присоединения очередной молекулы субората. Например, в мсталлопол и нук-
леотидных комплексах, стабилизирующих двойную спираль ДНК. ионы Ми. Со. Fe. Ni могут
заменять друг друга, не вызывая негативных последствий.
В так называемых диссоциирующих металлоферментах (ДМФ) металлы выполняют функции
кофактора. Константа нестойкости их больше, чем макроциклов, но меньше, чем у функцио-
нальных комплексов. Замена в активном центре фермента одного металла (даже на близкий по
сно стам и строению атома) другой металл ведет к резк му снижению активности фермента.
К таким комплексам относятся: алкопыглегилрогеназа. карбокеипептндаза А и др.
Стабиль гость биокомплексов определяется многими факторами, наиболее важными из ко-
торых являются: комилсмеитарпосгь. стсреоселсктивность. природа микроэлементов и лиган-
дов. меж- и внутримолекулярные стабилизирующие и неетабилизируюшис взаимодействия,
кипе гика комплексообразования и др. Например, ионы Cu: , NP*. Со1' и Zn1* эффективно
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 805
конкурируют q протонами за атом азота в азотсодержащих лигандах. Стернческис особенности
образуемых комплексов способствую! увеличению их проницаемости через клеточные мемб-
раны и модулируют доступность подобных комплексов для разнообразных клеточных рецеп-
торов. Бнокомплсксы металлов представляют уникальную группу соединений. участвующих
в поддержании целостности клетки вследствие взаимодействий различной природы и про-
странствен ион организации клеточных ком нонен гов Комплексы одного и того же биолиганла
с различными нонами металлов (и наоборот) имеют различную токсичность. Эго объясняет
множественность биологических эффектов эндогенных комплексов Разная степень сродства
ионов к тем или иным бнолнгандам может быть причиной их антагонизм*). Белок металло-
тионеии способен связывать 7—10 атомов металлов (Zn. Cu. Cd. Ilg. Au. Ag) и предохраняет
организм от интоксикации ионами металлов. В виде комплекса с метжлло'пюпеи!Ю.м проис-
ходит внутриклеточный транспорт антагонистов — мели и цинка, депонируется цинк Ионы
пинка и мети стимулируют выработк меТаялотионсина. причем активность пинка выражена
в большей степени, однако более прочным является образующееся комплексное соединение с
ионами меди. Повышение в организме концентрации ионов пипка вызывает выработку попол-
нительного количества металлонюпеина. который связывает ионы мели, уменьшая гем самым
их копие! гранию в плазме. Другой пример Некоторые вещества, содержащиеся в нище, могут
итруднять всасывание металлов. Ионы железа образуют прочные комплексы с полш])епо.ть-
нымн соединениями Чай. кофе, соевый белок, содержащие гакис структуры, значительно
тормозят всасывание железа.
Взаимодействие между клетками в организме происходит коммуникационно (см гл. 3).
Нарушение баланса внутриклеточных микроэлементов в организме, например, введением ио-
нов металлов из внешней среды (рекламируемые биолобавки. загрязненные солями металлов
пиша. вода, воздух и т.л.). может серьезно повлиять на работу системы сигнальной трансдукции
(ССТ). которая способна опосредовать внеклеточные ст налы различной химической природы.
И звеетно о феномене ннзколозовой гнперчувствительности ж шых организмов при сочетанных
воздействиях металлов под влиянием естественно встречающихся изменений колебаний сверх-
слабых геомагнитных полей. Поэтому весьма важны дополнительные локазательсиш скрытой
роли металлов-экотоксикантов в деструкции здоровья человека, т.е. действия вешеств в малых
и сверхмалых копнен грациях. В последнем случае речь идет о концентрациях |0 |6% и лаже
В токсикологии известен феномен возвращения действия ядов при уменьшен!!!! их
лозы (И В. Санопкий). Дтя многих ксенобиошков при таких условиях отмечены биолоптчсс-
кие эффекты, зпчастую сопоставимые по величине с эффектами от обычных (общепринятых)
концентраций (10 —10 i%). Существуют различные гипотезы о механизме этого явления. Одна
из них предполагает передачу регуляторного сигнала в живых системах посредством изменения
оруктуры ноты и адгезивных белков. В частности, речь идет о возможной роли структуриро-
ванной водной фазы, без которой не обходится никакое взаимодействие в биологической сис-
теме. Вода принимает участие в формировании пространственной структуры биокомплсксов
металлов. что непосредственно реализует их возможность связываться с рецепторами мембран
клеток. Друт ис гипотезы объясняю! лот феномен взаимодействием энергетических микропо-
лей молекул или голографическим принципом организации вешсств. При введении «сверхма-
лых лоз» вешества время действия растягивается на несколько суток и более.
Химические тенты, и в частности соединения металлов. способны нпрушать регуляциюанопто-
К1 клеток. Апоптоз (см. гл. 3.2) является приротным механизмом защиты Апотггоз — автономный
процесс клеточной смерти, который требует активного участия эндогенных клеточных ферментов
□ля демонтажа клетки. Микроэлементы способны модулировать про|рамму апоптоза посредством
как уже известных механизмов, гак и пока сше окочатслыю не устанопченных. Апоптоз реализу-
ется разными путями, во всех из них участвую! каспазы — цистеиновые протеазы.
Канонический апонтогнческий путь смерти клетки реализуется. когиа лиганд снизывается с
рецепторами семейства ФНО-а. имеющими «домен смерти» в цитозоле. При этом происходит
активация каскада протеаз, которые и являются эффекторами гибели клеток. Сутью механиз-
ма. 1ежлшего в основе апоптоза, спровоцированного избытком или дефицитом микроэлемен-
тов. являются процессы митохондриального повреждения и активация каскада каспаз. Мик-
' !*• IS г - фемтогрлмч (фг). И! IX г аттограмм (иг).
806 Глава 8
роэлементы вовлечены в самосборку и синтез митохондриальных ферментов, следовательно,
в работу комплексов дыхательной цепи. Соли токсичных микроэлементов (свинец, никель,
кадмий, ртуть) и некоторые другие экопатогены способны блокировать протеазы митохондрии
что ведет к развитию приобретенной митохондриальной недостаточности.
В патогенезе митохондриальней недостаточности существенную роль траст генотоксичес-
кое действие ряда металлов, вызывающих дефекты и мутации как в ялерной, так и в митохонд-
риальной ДНК. Образование аномальных и модифицированных митохондриальных белков ин-
дуцирует образование ан i имитохондриальных антител. В физиологических условиях продукция
ангимитохондриштьных антигсл способствует замене поврежденных или стареющих органелл.
Например, ионы таких металлов, как Cd. Pb. Ni. могут блокировать активность Zn-зависимой
пептидазы, находящейся в межмембранном пространстве митохондрий и участвующей в про-
цессе транспорта белков в митохондрии. Накопление аномальных белков угнетает митохон-
дриальные функции. Несмотря па эво. оиионпо предусмотренные особенности митохондри-
ального генома, обеспечивающие его значительные адаптационные возможности (множество
транскрипгонов. протяженные интронные и концевые некодирующиеся последовательности
ДНК), суммирование врожденных и приобретенных дефектов приво ит к возникновению ми-
тохондриальной недостаточности. Соединения металлов различной природы, обладающие как
прямым, так и непрямым генотоксичным свойством, могут быть использованы при скрытой
форме биогеррорисгнчсских актов (экологические диверсии) с ошаленными результатами,
приводящими к сокращению времени жизни человека и животных, значительному ухудшению
ее качества. Попадая в организм через волу, продукты питания, лекарства, такие структуры
могут вмешиваться в процессы регуляции апоптоза и быть использованы для блокировки жиз-
ненно важного гена, при этом синтез белков в ортанизмс будет непоправимо нарушен. Речь
идет о био терроризме на генном уровне, когда результат может проявиться в следующих по-
колениях. Усугубляющее влияние на проявление генотоксического эффекта металлов, прежде
всего в ионогенной форме, оказывает как дефицит, так и избыток или дисбаланс ряда эссен-
циальных микроэлементов. Блокирование или индукция генов - ретуляторов апоптоза может
быть вызвано ратличными внутренними и внешними сшналами Белки семейства Bel 2 и лру
гис способны проникать в липиднын бислой мембран и формировать pH-чувствительные ион-
ные каналы, которые переносят катионы металлов в виде комплексов согласно кинетическим
закономерностям. В генной регуляции апоптоза шрают важную роль ит ибнтор апоптоза —
белок Вс!2, обладающий ан1иоксидан1ными свойствами, действующий подобно свободно-
радикальной ловушке, и другой регулятор генной стабильности — р53. Например, апоптоз,
индуцированный агентами, вызывающими разрывы ДНК (металлы, радиация), зависит от
транскрипции р53. Ионы ряда Металлов: Ni2’. Pb *. Cd2* и др — могут вызывать мутации или
повреждение Rb-гена. что приводит к клонированию мутировавшей клетки. И jbcctho, что Сг,
Pb. Hg, Cd проявляют синергизм в реализации генотоксического эффекта. Другие ipyniibi:
Sc — Mo, Ni. As. Hg. Cr;
As — Zn, Se.
Zn — Ni. Pb. Fe, Cu, Cd. Hg. As;
Pb — Mn. Co. Fe. Cu. Zn;
Co - Pb. Cd;
Fc — Mn. Cd, Cu, Hg. Zn. Ni. Pb;
Cu - Pb. Fe. Cd. Zn;
Cd - Mn. Co, Fe. Cu. Zn, Sc проявляют антагонизм в реализации геноповреждаютего дейс-
твия. Учитывая специфическое влияние различных микроэлементов на регуляцию апоптоза, их
Шебалине опосредованно можег стать пусковым механизмом апоптоза.
Н ipyuiciuie процессов регуляции апоптоза приводит к возникновению заболеваний. Повы-
шенная активация апоптоза, связанная с функцией Са2’-. Mg24-зависимых эндонуклеаз, яв-
ляется звеном в патогенезе СПИДа, псйроде1еперагивных и ишемических заболеваний; ин-
гибирование апоптоза может быть вызвано избытком ионов Zn и способствовать развитию
опухолей различной природы, вирусных заболеваний.
Сегодня утке можно констатировать ряд экспериментально доказанных фактов участия мак-
ро- и микроэлементов в процессах апоптоза:
• нинк ингибируй ак1ивны) венгр каспаз-3. 6 и 9. запускающих начальные этапы апонто-
тического процесса; белки Вс! содержат рял гомологичных ВН-областсй (BHI, ВН2. ВИЗ и
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 807
белок ВН4). из которых беток ВИЗ ответственен за проапоптотическую деятельность. Цинк
способен стабилизировать эти регионы связывания, блокируя и предотвращая апоптоз;
• ииюхром с при высвобождении через митохондриальные норы запускает активацию каспаз
(железо—компонент гема в составе цитохрома с), отсутствие гема в составе цитохрома или
связывание иных металлов с гемовой группировкой препятствует процессам активации;
• кальций. магний, марганец янлякися кофакторами эндонуклеаз. участвующих в деградации
ДНК. но цинк и кадмий способны конкурировать за центры связывания, что тормозит этот
процесс;
• дефицит меди снижает активность цито.хром-с-оксидазы, что может обьяснить влияние де-
фицита меди на процесс апоптоза;
• селен зависимые ферменты митохондрий — тноредокснпрг тукгаза или фоефолипидисрок
сндаза — способствуют защите тиольных грхпп от свободно-радикального повреждения и
препятствуют активации. открытию пор и высвобождению цитохрома с (многие металлы,
как известно, — тиоловые ялы);
• комплексы ванадия активируют процессы диссоциации Bel-Bad или Bel-Bax. «по ведет к
апоптозу.
Например, предполагают наличие связи между активностью обмена меди и стабильностью
митохондриальною генома в этнологии болезни Ви ьсоиа— Коновалова — наследственного
заболевания, характеризующегося разнообразными миюхо|ыриалы1ими дефектами и накоп-
лением мели в печени. И збыточное накопление или усиленное высвобождение связанных эс-
сенциальных элементов (железо, кобальт, мель, селен) и в особенности накопление токсичных
микроэлементов (кадмий. ртуть свинец) провоцируют генерацию АФК. что увеличивает по-
генциальный риск повреждения генов опу холь-су прессирующих белков. Установлена корреля-
ция между повышенным содержанием железа в организме и ранним развитием атеросклероза,
ишемической болезни, опухолей.
Гемохроматоз и болезнь Вильсона—Коновалова увеличивают риск рака печени из-за накоп-
ления мутанта р53. В нашей стране в последнее время рост заболеваемости вторичным гемохро-
матозом связан с употреблением наркотиков, алкоголизмом, увеличением числа гсмотрансфузий
н повсеместным употреблением напитков н продуктов питания в металлической упаковке.
Гемохроматоз — генетическое нарушение, характеризующееся аномально высоким содер-
жанием железа в клетках слизистой оболочки кишечника, накоплением его в тканях печени,
сердна. поджелудочной железы и приводящее к их повреждениям. К генерализованным фор-
мам сидерозов относятся наследственные и вторичные гемохроматозы, вызывающие гепато-
мы. рак поджелудочной железы, лимфомы. Идентифицированы 4 типа гемохроматозов. Типы
I— III представляют собой аутосомио-репеесивные нарушения, IV тип наследуется домиггап-
тно. Гемохроматоз IV типа — это аутосомно-доминантная форма повышенного содержания
железа из-за мутаций в гене SLC40AI. колирующем белок для экспорта железа — ферроиортнн
(FPN1). Го ютрансферрин связывается с трансферриновым рецептором (TfR) на пове хности
клетки. Комплекс располагается на выстланных клатрином углублениях, которые HiieariiiHipy-
ются внутрь клетки, инннннруя эндонитоз. После формирования специализированной эндосо-
мы при помощи протонной помпы происходит анидификация ее содержимого, что приводит к
изменению конформации белков и обусловливает освобождение железа из трансферрина. Эти
же процессы активизирует переносчик двухвалентных металлов (DMTI). при помощи которого
железо покидает эндосому и выходит в цитоплазму. Апочрансферрин вместе с трансферрино-
вым рецептором возвращается на поверхность клетки, пне в нейтральной среде происходит их
диссоциация. Далее цикл повторяется. В большинстве клеток железо запасается в виде ферри-
тина и гемосидерина (рис. 8-39).
К настоящему времени идентифицированы желсзоотвечаюнше элеменгы (IRE — iron response
element), регулирующие мс аболизм железа как в норме, так и при патологии. Эти структуры
находятся в .мРНК и регулируют трансляцию мРНК трансферринового рецептора на пост-
транскрнпционпом уровне. Когда внутриклеточная концентрация железа достаточно высокая,
образуются комплексы Fe (II) — IBP (железосвязываюший белок), которые нс соединяются с
IRF. что дестабилизирует мРНК трансферринового рецептора. Снижение экспрессии рецепто-
ров к трансферрину на клеточной поверхности о|раннчнваст поступление железа. О нако эта
модель действует только в диапазоне адаптационных возможностей организма (рис. 8-40)
808 Глава 8
Голо трансферрин
Рис. 8-40. Схема взаимодействия жслезочуветвнтелиного элемента и жслсзосвязышпощего белка. Регуля-
ция трансляции мРНК ферршина. переносчика двухвалентного железа DMT1. рецептора трансферрина
и фсрроиор1ина в условиях низкой и высокой концентрации железа внутри клетки Пояснение в ickcic
(pucviioK М. Литвиновой. 2005).
Метаболизм и определение токсикангов различных химических групп... 809
В условиях низкой концентрации железа внутри клетки железосвязывающий протеин URE-
ВР) взаимодействует е железочувствителытым элементом (IRE) мРНК на 5' (5'UTR)- или 3'
(3’UTR )-нетранслируемом участке. При этом IRE ферритина и ферропортина находятся на
5 UTR, a IRE трансферринового рецептора и двухвалентного переносчика металлов ДМТ1 —
на 3'UTR. Связывание IRE-BP с IRE на 5'UTR ведет к блоку трансляции мРНК. связывание
на 3'UTR — к ее стабилизации В условиях высокой концентрации железа взаимодействие Fe
с IRE-BP препятствует контактированию последнего с IRE. что соответственно дает противо-
положный эффект.
Железо — эссенциальный элемент С другой стороны, ионы Fe2* как индукторы ПОЛ про-
воцируют разрывы ДНК, участвуют в мутагенезе и канцерогенезе. Железо in vivo находится
в виде комплексов в составе трансферрина, лактоферрина и ферритина, которые обрывают
иепь дальнейших реакций повреждения генома. Согласно литературным и собственным эк-
спериментальным данным органические комплексы железа стабилизируют геном, однако в
ионизированном состоянии этот элемент может вызывать повреждение ДПК и провоцировать
..мертв клетки. Как известно (см. гл. 3.2) существует два пути токсического действия сунерок-
енл-анион-раликала О’: через нерацикальныс продукты (ONOO и Н О,) и радикалы ( NO,
СО- и НО ). Во втором случае О; бурно реагирует с ‘NO, который синтезируется NO-спнтазой
iNOS). образуя перокенпитрнт (ONOO ) ’NO — важнейший нейромедиатор н межклеточный
посретиик — «двуликий Янус», влияющий на биологические процессы как цитопаюгенный.
так и шпопротективный агент. Главными источниками ’NO к организме служат эндотелий,
нервная и лимфоидная ткани. В обмене микроэлементов (железо, цинк, селен) также прини-
мает участие эндотелий. ‘NO имеет короткий период полураспада и быстро инактивируется
при контакте с гемовым железом (цитохромы гемоглобин и т.д.). Цинк, никель, свинец и
ртуть служат потенциальными модуляторами синтеза NO посредством фермента NO-синтазы.
NO участвует в деструкции н метаболизме Ге-, Со-. Мп-. Zn-содержаших ферментов. Имен-
но б.таютаря способности ‘NO инактивировать Ге-содержашие фер.менты происходят гибель
молекул цитохромов, каталазы, гемоглобина, а также индукция апоптоза в клетках, где повы-
шается уровень свободного, нехелагированного железа.
Таким образом. в стареющих клетках с дестабилизированным пулом эндогенных металлов —
железа, меди, пинка — происходит усиление процессов ПОЛ и синтеза ‘NO. что приводит к
апоптозу клетки. NO-зависимый апоптоз происходит наиболее активно при дефиците Cii.Zn-
завиеимой суперокеиддиемутаз т (СОД). Практические врачи не раз отмечали, что назначе-
ние* витамина В, (Со-содсржаший витамин) при сепсисе позволяет значительно уменьшить
деструктивные изменения в шоковых органах. Эго можно обьясшггь конкурирующим лигаи-
дообменным процессом между ионами Со2*. Ге и NO Витамин В , связы тая избыточное
количество продуцируемого макрофитами тт моноцитами "NO. образует пптрозокобаламин.
который не имеет побочных эффектов селективных ингибиторов NO-синтазы. Даже умерен-
ный дефицит или избыток микроэлементов может повлиять на процессы репонулятши клеток
и апоптоза. Самоубийство клетки также вызывает лемопгаж внутриклеточных камер, или ком
ттартмеитов, где находились микроэлементы. поэтому соседние клетки сталкиваются с про-
блемой использования и накопления этих элементов. Таким образом, апоптоз можег вносить
вклад во внутриклеточное накопление или потерю микроэлементов.
Восстанонленис баланса МЭ — очень трудная задача. решить которую можно далеко не
всегда с помощью восполнения дефицита или выведения избытка микроэлементов.
В габл. 8-32 и 8-33 представлены потребность, биологическая функция и нарушения обмена
микроэлементов в организме человека (подробнее см гл. 8.5 3)
Миллиарды людей страдают заболевай ням и. связанными с дефицитом макро- и микроэле-
ментов (ем. гл. 8.5.3). Можно ли корректировать элементный статуе человека? В настоящее
время большое внимание уделяется борьбе с дефицитом в организме отдельных микроэлемеп-
ов. в первую очередь Йола, селена, пинка и железа. Усвоение Fe контролируется одновремен-
но несколькими элементами Са. Г-, I,. 7п. Cu. Со, Sc. Если нет генетически обусловленных
нарушений синтеза железосодержащих белков, вызвать дефицит железа сложно (рис. 8-41).
810 Глава 8
Таблица 8-32. Потребность в микроэлементах и их биологическая функция (по данным отечественных и
зарубежных исследователей )*
Элемент Потреб- ность, мг/сут Содерлоши' в оргатв- ме. г Некоторые бисиотнчсс- кис функции Ме>а.ииир<>гси||ы
Kji icc фермента или {мп белка 11рнмеры
Железо 6.11—40.0 3.9-5 Транспорт кислорода Гсмсолсржашие бе ikh. оксидоредуктазы Цитохромоксидаза
Цинк 12-15 1.3-2.3 Синтез н расти нуклеиновых кисло г и белков, мешболизм ЭЬ1НО.Ш Трансферазы гидрола- зы. лиазы, изомеразы, линии, оксидоредук- тазы. факторы транс крнпнни РНК-полимеразы ат- Morcwwiei илрогеиази. ре । ш 11 горы i л кжокор- ти кондов
Мель 2.0-3.5 0.08-0.15 Синге i гсмог юбнна, обменные процессы в соединительной ткани, рост и р.нвитие кост- ной ткани Оксилорс ту кт а ня Супсрокс>ы>1ис му- тям. церулоплазмин (ферроксплаза). ами HOOKCIUUT13
Кобальт 0.02-0.05 0.0015 Метаболизм ме1 но- нина Трансферазы Метионнпенитаза
Марганец 2-5 0.012-0.02 Окислительное фосфо рилированис: мстабо .ним жирных кислот, гликозаминогликанов и холестерина Оксидоредуктазы. гкдролачы. лигазы Плацентарная амнно- окенлнза. иирунаткар- боксилаи
Молибден 0.075-0.25 0.070 Метаболизм ксантинов Оксидо|хщ>кгазы Ксантиноксндаза
Селен 0.02-0.07 0.010-0.015 Антиоксидант Оке нлорслуктазы. транс<Ьеразы Глутатион - перокси - лаза
Никель 0.4-0.2 0.012 Стабнл । ипия структу- ры РНК Оке шюрелу ктаз ы. 1Илрол:г$ы Уреаза
Хром 0.15 0.006 Связывание инсулина клетками, метаболизм глюкозы
• Потребность зависит от возраста и физиологического состояния организма (например изменяется при беременности)
Таблица 8-33 Нарушения обмена некоторых микроэлементов
Микро- элемент Дефицит И тбыток*
Железо Анемия и ее miioiсчисленные проявления Гемохроматоз, печеночная пслостаточносгь. сахарный диабет. атрофия яичек, apipiii, рестриктивная кардиомиопатия, нейропа- тия, 11111ерп1И.мензаш1Я
Цинк Задержка психомоторною развития у детей, шюпспня. дерматит. поражение иммунной системы, атрофия половых желез, нарушения сперматотонеза. раздражительность. депрес- сия. пороки развития плода и др. Тошнота, рвота, язва желудка, панкреатит, сопливость, анемия, лихорадка, дыхатель- ные расстройства, пневмосклероз
Медь Анемия, сдержка психомоторного разви- ты у детей, дефект кератина и нарушение пигментации волос, гипотермия расслаиваю- щая аневризма аорты вследствие нарушения синтеза элнетина, психические расстройства, поражение костной ткани. наследственные заболевания (болезнь Вильсона—Коновалова, синдром Менкеса и лр.) Гепатит, цирроз печени, тремор, психичес- кие расстройства. кольце Кайзера—Флей- шера. гемолитическая анемия, нарушение функции почек (синдром Фанкони}
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 811
Окончание Я 3.3
Марганец Диабет, нечувствительный к инсулину, пшо- ХОЛССТСрННС-МИЯ. Паркинсонизм, энцефалопатия. психозы, пневмокониоз
Кобальт Дефицит витамина 13 Дилатационная кардиомиопатия. зоб. «бо- лезнь любителей пина»
Молиб- ден Рак пишевода. ксаитниурия Гнисруриксмия, артрозы, анемия
Хром Нарушение толерантноеш к глюкозе Почечная недостаточность, алдерз ичсский контактный дерматит (при контакте с це- ментным раствором, содержащим хроматы), рак легкого
Селен Поражение миокар. ia сердечная недостаточ- ность. мпогц ия. ферчентопатин Алопеция, поражение попей, эмоциональная лабильность, вялость. запах чеснока изо рта
Никель 9 Аллергический контакты» дерматит, ост- рая эозинофильная пневмония, гепатит, рак .легкого, рак придаточных пазух и полости носа
Кремний Нарушение развития опорно-дю и отельного аппарата Силикоз
Фгор Нарушение структуры костной ткани и зубов Флюороз: слабость. потеря массы тела, ане- мия. обызвествление связок и сухожилий, хрупкость костей, пятнистое поражение эмали
• Скмшомы записи! от пути ппслскня и распределения в биожнлкостях и тканях.
Рис. 8.41. Схема взаимодействии основных компонентов системы регуляции обмена железа. Пояснения
в шкете (рисунок М. Литнипоной, 2005).
812 Глава 8
Активность ферропортина регулируется влиянием гормоноподобного бел ка гепсидина, вы-
зывающего сю интернализацию н лизосомную деградацию. При нормальном функциониро-
вании системы регуляции угнетение ферропортина npi во ит к повышению концентрации же-
леза внутри клетки. Находясь в избытке в недифференцированной клетке крипты кишечника,
железо связывается с IRP. что ведет к блоку трансляции DMT1 энтсроцита ворсинки. Послед-
нее уменьшает абсорбцию Fe пиши в тонкой кишке. При генетическом нарушении метабо-
лизма железа происходит его усиленное всасывание из пиши, накопление в паренхиматозных
органах, что приводит к повреждению последних и развитию наследственного гемохроматоза.
Поэтому чтобы восстанавливать пониженное содержание железа, надо знать причину его де-
фицита. Длительный прием препаратов може г только ухудшить ситуацию. «Борьба». например,
с дефицитом йода при недостатке селена в окружающей среде и лише человека бессмысленна
из-за нсуазояемоети в этом случае йода. Кроме того, возникает опасность взаимодействия из-
бытка йода с другими микроэлементами: подавляется усвоение селена, железа, цинка и каль-
ция. нарушается их метаболизм, что неминуемо приведет к полимикроэлеменгозу. Учитывая
большую токсичность ионной формы селена и его антагонизм (подавление усвоения) с йодом,
фтором, цинком, кальцием и железом, бесконтрольный прием препаратов селена может нанес-
ти значительный ушерб здоровью.
Закономерности токсикокинетики рассмотрены в главе 4 и будут обсуждены ниже (см.
гл. 8.5.3) при изложении хпмпко-токсикологичсскнх характеристик отдельных элементов.
Механизмы токсичности
Как микроэлементы воздействуют на клетку? В организме реализуются многие пути, напри-
мер действие на специфические рецепторы и мембраны клеток, влияние на ак1ннность ^тер-
ментов, гормонов, белков-переносчиков, продукцию иммуноглобулинов. иа процессы апоптоза,
хемотаксиса, адгезии, фагоцитоза, участие в формировании иммунологической памяти и др.
Транспорт металлов в организме происходит в основном в виде их комплексов с белка-
ми: трансферрина, транскупреина. трансманганина, никелеплазмина. металле тионеина и др.
После присоединения к белку металл (например, ющмий-металлотпонеип) поступает в клетку
путем эндоцнгоза. Другие металлы (например, свиней) могут абсорбироваться пассивной диф-
фузией
Молекулярными мишенями всзлсйствия ионных или атомных форм металлов служат:
• земсопержашис белки и ферменты:
• системы пероксидного и свободнорадикального окисления липидов и белков;
• системы антиоксидантной зашиты:
• фермешы транспорта электронов и синтеза АТФ
• белки клеточных мембран и ионные каналы мембран.
факторы, влияющие на токсичность металлов:
• способность токсиканта конкурентно взаимоде(1сгвовать с эссенциальными элементами:
• способность к образованию мсталл-белковых комплексов с различными кинетическими и
термодинамическими харакгсристиками;
• возможность длительного воздействия на структуру-мишень;
• наличие различных химических форм металла:
• состояние иммунною сп туса организма.
Токсические эффекты металлов обусловлены несколькими механизмами действия.
I. Ионы многих металлов образуют прочные комплексы с аминокислотами и другими био-
молекулам и, содержащими mo-(HS-) или алкилтиогруппнровки (RS-). Ряд металлов имеет
значительную аффинность к сульфгидрильным группам (SH) белков, большинство ферментов
ингибируется металлами, относящимися к группе реагентов на SH-группы, или тиоловых ядов.
SH-ipyinibi как сильные нуклеофилы отличаются высокой реакционной способностью. чю
обусловлено значительной поляризуемостью атома серы. I иоэфнрные зз лнеу.'ифндные группы
вступают в не столь разнообразные реакции, как SH-группа. Устойчивость -S-S-связей при
физиологических значениях pH соответствует их основной функции — участию в стабилиза-
ции макромолекулярной структуры белков. Дисульфидные ipynnu в активных центрах окисли-
те зьных ферментов подвергаются обратзгмому превращению в SH-группы при взаимодействии
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 813
с субс!ратами и участвуют в каталигических реакциях Белки часто являются мишенями лля
металлов. Формированием ковалентных связей с этими группами металлы могут ингибировать
активность ферментов или нарушить целостность клеточных мембран. Последнее подтверж-
дается признаками дестабилизации липопротеиновых комплексов, происходящей за счет кон-
формационной перестройки апопротеиновой части комплексов из-за блокирования SH-rpyiin.
Например, эффект мимикрии: комплекс. образуемый ртутью и цистеином, имитирует амино-
кислоту метионин, необходимую для биосинтеза адреналина и холина.
2. Конкуренция и замещение эссенциальных катионов. Замена металлов в металлсодержа-
щих биокомплексах вызывает изменение их био Ю1нчсскон активности.
Например, свиней, амеигая нинк в ни независимом ферменте дегидратазе 5-аминолсвулс-
повой кислоты (ALA-D). ингибирует синтез гема — важного компонента гемоглобина и гемсо-
держаших ферментов, таких, как цитохромы.
Иногда связывание металла с ферментом ведет к активации последнего (например, актива-
ция кадмием уреазы). Уреаза катализирует гидролитическое расщепление мочевины на аммиак
и углекислый газ, Каждая молекула уреазы связана с 2 атомами никеля Не исключено, что
никель в уреазе траст ту же роль, что и цинк в карбоксипентила : При интоксикации кад-
мием наблюдается его синергизм с никелем. Кадмий, образуя координационное соединение
с аммиаком, сдвигает равновесие реакции вправо, что приводит к активации уреазы Кроме
гою. кадмий. замещая и высвобождая ионы никеля, способствует работе других ферментов,
катализирующих гидролиз глутамина с образованием аммиака, который может проявлять ней-
ротоксическое действие.
3. Нарушение синтеза цитохрома Р450, ответственного за биотрансформапию токсикантов
и эндогенных биологически активных вешеств: гормонов, витаминов, холестерина и др. Это
приводит к накоплению органических токсикантов в тканях или нарушению синтеза или ак-
тивности эндогенных метаболитов природных вешеств (см. гл. 4).
Известны и селективные механизмы токсического действия элементов в определенных хи-
мических формах.
Арсенат-ион AsO4’_ подобен фосфат-иону по размеру и структуре. Арсенат может замещать
фосфат во всех фос<|юро.титических реакциях, например в реакции расщепления гликогена,
катализируемой гликогсифосфорилазой. Однако эфиры мышьяковой кислоты менее устойчи-
вы. Промежуточный продукт глюкозо-1-арсенат быстро гидролизуется с образованием глюко-
зы (арсенолит) и вместо фосфата появляется арсенат, т.е. процесс нс прекращается, но АТФ не
образуется (арсенат разобщает процессы окисления и фосфорилирования).
Токсичные металлы могут нарушать структуру и функции ряда органелл. Например, могут
ингибировать ферменты, связанные с эндоплазматическим рстикуломом. ферменты дыхатель-
ной цепи в митохондриях, аккумулироваться в лизосомах, а в ядрах могут образовывать вклю-
чения. У наркоманов, испол уюпшх эфедрон. обнаружено (методом компьютерной томогра-
фии) отложение VIпО в некоторых структурах головного мозга. Это приводит к необратимым
последствиям.
Поскольку мужские и женские репродуктивные органы находятся поя сложным нейроэн-
докринным и гормональным контролем. то любой токсикант, влияющий на эти процессы,
способен повлиять также и на репродуктивную функцию. Однако металлы могут и селективно
во 1лсйствовать на репродуктивные органы. Известно, что кадмий поражает яички в результате
острого отравления, а аккумулирование свинца в яичках связывают с дегенерацией последних,
ингибированием сперматогенеза и атрофии клеток Лейдига.
В организме человека при травлении мета глами продуцируются метаболиты белковой при-
роды, которые связывают, инактивируют и экскретируют токсиканты. Липопротеины внутри
почечных лизосом, по-вилимому. функционируют именно таким образом, т.е. обеспечивают
защиту почек, которые особенно подвержены повреждению металлами. Неспецмфическое свя-
зывание с белками, например с сывороточным альбумином и гемот гобином. траст важную
роль в процессах транспорта металлов в кровеносном русле и распределения металлов между
эритроцитами и плазмон. Белки со специфическими мстал.чсвязываюшими свойствами участ-
вуют в транспорте металлов в клетку. Метатлотионенны — класс серосодержащих метатлсвязы-
ваюших белков, продхкиия которых значите тыю усиливается в ответ на поступление кадмия,
ртути, пинка, меди и некоторых других метал тон (см. 6.4.3, рис. 6-135). Металлотионеии —
814 Глава 8
низкомолекулярный мегаллсвязываюший белок (молекулярная масса приблизительно 7000 Д).
состоящий из 61 аминокислотного остатка
Токсичность металлов. прежде всего кадмия, свинца и ртути, зависит от их внутриклеточ-
ной бпо тоступнос!и и частично регулируется специфическим связыванием е лигандами —
некоторыми цитозольными белками, которые содержат многочисленные SH-центры. Белки,
обладающие такими Петрами. конкурирую! с другими внутриклеточными белками и обес-
печивают таким образом внутриклеточную биодоступность металла. Внутриклеточные соеди-
нения способны удалять токсичные металлы из чувствительных органелл ло тех нор, пока их
спя .тающую способность не превысит лоза токсиканта. При этом в печени происходит ин-
дуцируемым рядом факторов синтез металлотионеинов. К таким факторам относятся экю- и
эндотоксины. обра: х ющиеся при инфекционных процессах, повышение конценграции ионов
опрелезенных металлов, голодание, стресс, физическая нагрузка, лапаротомия и др. Например,
в экспериментах in vivo экспозиция кадмием приводит к синтезу металлотионеинов в печени
и образованию кадмий-металлотионеинового комплекса, который можно обнаружи ть в крово-
токе доступными методами (см. электронное приложение).
В биотрансформаими мегал.юрганичсских соединений не менее важна детоксицирующая
функция других белков и гликопротеинов. Существующий в восстановленной и окисленной
формах трнпетид глутатион ответствен за перенос аминокислот черст клеточные мембраны
(см. гл. 4). Весьма разнообразные функции глутатиона выполняются при участии SH-группы.
Глутатион защищает SH-группы внутриклеточных ферментов or окисления, блокирования ме-
таллами и другими токсикантами, участвует в устранении АФК п продуктов ПОЛ. В частности,
восстановление Н,Ог и перекисей липидов (в основном) катализируется селенсодержащей глу-
татионпероксидазои Трансферрин — гликопротеин, связывающий большую часть плазменно-
го железа. Трансмембранный транспорт железа осуществляется iрансферрином по принципу
эндошггоза Этот же белок может транспортировать алюминий и марганец. Ферритин — бе-
лок. осуществляющий храпение железа в ретикулоэндотелиальных клетках печени, селезенки и
костной ткани — может функционировать как детоксикант, гак как связывает многие токсич-
ные металлы, включая кадмий. цинк, бериллий, алюминий (см. рис. 6-13S). Церулоплазмин -
медьсодержащая гликопротеиноксидаза, окисляющая железо (II) в железо (111). которое затем
связывается с трансферрином. — усиливает поглощение и накопление железа.
Однако металлы мшут проникать внутрь клеток не только в виде комплексов с эндогенны-
ми лигандами, но и по ионным каналам (например, кальцин) Родерик Мак Киннон удостоен
Нобсдевскс н премии в 2003 г. за открытие ионных каналом. В 1998 г. ученый смог определить
пространственную структуру калиевого канала. Существует 5 основных типов ионных каналов,
проводящих ионы кальция. натрия, хлора калия и нсспеиифичсские Наиболее важны два
типа ионных каналов — с по1енниалзависимыми воротами, необходимые для распространения
потенциала действия, и с лигандзавнеимыми воротам т, которые превращают внеклеточные
химические сшналы в электрические и необходимы для функционирования синапсов (см
гл. 2.2). На открытие и закрыто ионных канатов, изменяющих рас и ределение зарядов и из-
меняющих мембранный потенциал, влияют эндогенные и экзогенные (лекарства или другие
токсиканты) биологически активные вещества и их мстаболи гы (рис. 8-42).
Наиболее распространены фосфатные и су!ьфзтпые транспортеры ионов металлов. Сущее
твуют еще ванадатные и арсенатные транспортеры, структурно схожие с фосфашыми. а так-
же хроматные, молиблатные и селеновые, сходные с сульфатными. Некоторые переносчики
транспортируют ионы металлов в виде соединен! й с аминокислотами, пептидами и углево-
дами. Например, определенные клетки способны поглотать медь только в виде комплексов с
ГИС1ИДИНОМ. Ешс одним видом транспортеров двухвалентных металлов являются так называ-
емые АГФ-зависимые помпы.
Токсическое действие тиоловых ялов, связанное со специфическими особенностями по-
ражаемых ими белковых систем, проявляется по-разному Например, кадмий угнетает синтез
гликогена в печени, вызывая гипергликемию, нарушает фосфорно-кальниевый обмен, вме-
шивается в обмен ряда микроэлементов: Zn. Cu, Fe. Mn. Se. Па токсичность Cd влияет со-
держание в пищевом рационе белка, витаминов С и D. Острую токсичность Ni-’* связывают
с образованием продуктов ПОЛ. Известно влияние хрома на углеводный обмен. Действие
металлов, вызывающих окислительный стресс, сопровождается нарушениями глутатионзави-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 815
симою баланса |иолы/днсульф|11ы и усилени-
ем ПОЛ мембран. Однако это ведет к наруше-
нию гомеостаза Са- за счет локализованного
в клеточных мембранах пула этого иона (см
гл. 3). Ионы Hg1*. Си- , Cd2*, Pb2 . Zn2', об-
итающие высоким сродством к SH-групнем
и способные действовать на функции SH-co-
держаших белков, при окислительном стрессе
стимулируют выход Са- через ионные каналы
в различных биосистемах, дезор1анизуют сто
гомеостаз и через этот механизм ннтибируют
Са-. Mg-содсржашис ферменты, нарушая тем
самым митохондриальные функции клеток
различных организмов (рис. 8-43).
Острая токсичность вызывается относи-
тельно высокими дозами металла за короткий
период времени. Продолжительность после
первичного воздействия ло проявления кли-
нических симптомов обычно небольшая, по-
рядка от нескольких часов до нескольких дней.
В силу (в основном) разрушающего действия
иа клеточные мембраны металлы могут дать
различные локализованные эффекты в месте
первичною кондак га. Обычные симптомы ос-
трого отравления металлом после перорально-
го пути воздействия включают тошноту, рвоту,
повреждения слизистой оболочки кишечника
и всего ЖКТ. Ингаляционное воздействие со-
единений металлов часто приводит к раздра-
жению в верхних дыхательных путях, кашлю
или одышке, а также повреждению легких п
эпителия рсспираюрното трякга. Воздействие'
на кожу может привести к локальной сыпи п
ралтражению кожи или изменению ее цвета
(см гл. 8.5.3).
I (екоторые металлы оказывают направлен-
ное токсическое воздействие. Высокий уро-
вень свинна приводит к серьезным неврологическим нарушением, включая конвульсии или
кому, а также нарушения гематопоэтической системы, в особенности продукции гема (см
гл. 8 5.4). Интоксикация свинцом может привести к трудностям в обучаемости, нарушениям
поведения, псревозбужденности или летаргии
Рис. 8-42. Схема действия Na’ ионного канала на
примере введении местных ui естсгнков.
и атаксии
Рис. 8-43. Замена иона магния
ионом Hg-". Си2’. Cd2'. Pb2’. Zn2’
приводит к прекрашению процес-
са свя «ывания АДФ
АДФ
816 Глава 8
Токсические ффскты острого отравления ртутью варьируют в зависимости от формы ме-
талла. присутствующей в организме. Воздействие больших колнчес!в паров элементной ртути
или метилртути скорее всего окажет большее воздействие на ЦНС. чем неорганические соли
ртути, в силу различий прохождения через гематоэнцефалический барьер. Мегилргуть из-за
липофильной природы легко преодолевает его. в отличие от неорганической ртути. Пары эле-
ментной ртути способны проникать через мембраны клеток. Хроническое воздействие ртути
вызывает перевозбуждение и лаже психоз. Он был определен как «синдром спятившего шляп-
ника». так как в XIX веке наблюдался у изготовителей шляп, которые подвергались воздейс-
твию нитрата piyrn в процессе производства Даже есть английская поговорка «безумен как
шляпник».
Ряд металлов депонируется н тканях на длительный период. Например, свинец может за-
мешать кальций в растущей кости ребенка, что провоцирует долгосрочное отложение свинца
и последующее медленное его высвобождение этого металла. Долгое время у пострадавшего
будут наблюдаться серьезные токсические симптомы, несмотря на прекращения воздействия
токсиканта.
Повреждение и снижение функции печени и почек — типичны!! результат хронического
воздействия многих металлов. по-видимому, в силу роли этих органов в интегрировании,
детоксикации и экскреции токсикантов. Дегенерация слизистой обоючки и ингибирование
почечных и печеночных г|>срменгон — обычный результат хронического избыточного воздейс-
твия металлов. Хронические отравления свинцом, ртутью и кадмием всегда связаны с повреж-
дением почки, а хроническое воздействие меди вызывает повреждение печени.
Наиболее восприимчивы к дейС1вию металлов дети и пожпше люди. Дети потребляют
больше калорий на единицу массы, поэтому важный путь поступления металлов — именно
с пищей. Кроме того. ЖКТ .четей легко пропинаем для большинства металлов, особенно для
свинца. Из-за процессов активного клеточного деления организм ребенка более чувствителен к
генотоксическим эффектам металлов. Вредные привычки усиливают проявление токсичности
ряда металлов. Так. сигаретный дым содержит кадмий и стронции. Оба элемента благодаря
своим физико-химическим свойствам могут занять место кальция в кристаллической решетке
основного минерала кости — апатите. Поскольку размер иона кадмия меньше, а С1ронция
больше, чем кальция, кость разрыхляется и наблюдаются известные признаки остеопороза.
Прием алкоголя значительно уменьшает биодоступность или усиливает экскрецию эссенци-
альных металлов.
Современное увлечение разнообразными морепродуктами и тезис «чем меньше они тер-
мически обработаны, гем лучше» подлежат сомнению. По данным FDA (США), в свежем и
мороженом тунце должно содержатся менее 0.383%г. ртути. Тунен ян. яется одним из наиболее
распрос раненных компонентов суши, причем предпочтение отлается более старым и крупным
экземплярам. Между тем рыбы, которые живут дольше, с возрастом накапливают больше рту-
ти и поэтому7 представляют наибольшую опасность. Напротив креветки и лососевые, которые
живут относительно недолго, практически не накапливают ртуть. По данным специалистов,
средней уровень ртути в суши составляет 0.721%с. чго почти в 2 разз выше допустимого.
Наибольшую опасность ртуть представляет для беременных женшин и детей. Мстилртуть, со-
держащаяся в рыбе, нарушает развитие нервной системы плода и нарушает развитие мозга у
детей. Последствиями его употребления у детей могут быть снижение интеллекта, двигатель-
ные расстройства, снижение остроты зрения и слуха. У взрослых .тюлей воздействие низких доз
мети, ртути приводит к усилению невро iohimcckiix нарушений, увеличению риска сердечно-
сосудистых и онкологических заболеваний. В настоящее время подобные предупреждения в
США действуют в oi ношении королевской макрели, меч-рыбы, акулы и кафелытка (амаяай),
нередко содержащих повышенный уровень ртути. В России участились случаи хронического
отравления ртутью и мышьяком, связанные с пишевым рационом
Иммунный статус организма особенно важен при воздействии металлов, вызывающих ре-
акции гиперчувствигсльности. Иммунные реакции провоцирует избыточное введение ртути,
золота, плтгины. бериллия, хрома и никеля. В иммунный ответ может включаться любой тип
реакции гиперчувствительности.
Канцерогенность. Бериллии. кадмий, хром (в степени окисления +6), мышьяк и некото-
рые соединения никеля оказывают канцерогенное действие на людей и экспериментальных
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 817
животных при ингаляционном пути введения. Свинец является канцерогеном для животных
но не для людей. Другие металлы — медь, цинк и ртуть — не обнаруживают канцерогенный
эффект.
Способ введения металла весьма важен для проявления канцерогенного эффекта. Кадмий
и хром (в степени окисления +6) канцерогенны только при ингаляционном пути, а мышьяк и
бериллий оказывают канцерогенное воздействие — при ингаляционном, пероральном и. может
быть, дермальном путях поступления.
Каждый металл, обладающий канцерогенными свойствами. по-видимому. имеет уникаль-
ный механизм действия при определенных путях поступления. Хром (в степени окисления +6)
восстанавливается в клетках до Ст’* и образует прочные аддукты с ДНК и белками. Биологи-
чески активные канцерогены — скорее всего это промежуточные вещества, образующиеся при
восстановлении хрома. Данные по токсикогенетике подтверждают гипотезу о том. что хром
(в степени окисления +6) негенотоксичсн per se. но что его генотоксичность опосредована
внутриклеточным восстановлением хрома. Парадоксально. но Сг3* нс индуцирует повреждение
ДНК, даже несмотря на то что связывается с ДНК in vitro и in vivo. Ионы никеля накаплива-
ются в клетках, образуют АФК. которые, по мнению ряда исследователей, являются причиной
генотоксического повреждения, связанногос канцерогенностью никеля. Мышьяк скорее всего
играет роль негенотоксичного непрямого канцерогена, ингибирующего стадию починки ДНК
(см. гл. 3.3). Ионы Со3* индуцируют ПОЛ. подавляют репарацию ДНК и обладают комутаген-
ными с ионами NiI+, Pb2*, Cd2t свойствами, запускают синтез противовоспалительного цито-
кина TNF-a, вызывающего апоптоз и некроз клеток-мишеней (см. гл. 3.2).
Природные и антропогенные источники воздействия металлов Металлы в различных концен-
трациях находятся в почве, осадочных породах, не поверхности, в подземных водах и воздухе
Важнейшее неотъемлемое свойство металлов — их устойчивость Они осаждаются на поверх-
ности земли из воздуха, уходят из почвы и воды в растения, передаются по пищевой цепочке
при употреблении в пишу и биоаккумулируются, вновь выводятся в окружающую среду пос-
редством экскреции и разложения мертвых организмов В мобилизации, трансформации и
транспорте соединений металлов в окружающей среде, кроме естественных биогеохимических
циклов, большую роль играют люди. Человеческая деятельность может увеличивать скорость
перемещения металлов, создавать новые соединения, сильно изменять распределение металлов
по земле, воде и атмосфере. Горное дело, земляные работы, строительство и производство —
все они удаляют металлы из мест их естсс венного пребывания и могут усилить воздействие
на человека. Люди часто подвергаются воздействию опасных уровней соединений металлов в
условиях окружающей среды посредством изменения естественных биогеохимических циклов.
Например, прекращение использования тетраэтилсвинца как добавки к бензину существенно
снизило влияние ингаляционного пути его воздействия, а также содержание свинца в почве. Но
применение красок на основе свинца и припайки свинцом труб в водопроводе для транспорта
питьевой волы поддерживает уровень воздействия свинца выше, чем фоновый. Соединение
марганца (метилииклопентадиенил марганца трикарбонил) использовалось в США как анти-
детонируюшая добавка вместо тетраэтилсвинца к бензину, но оно также вызывало серьезный
токсический эффект. Люди, живущие около зон с отходами, шахт или плавилен, подвергаются
большим, чем фоновые, уровням воздействия металлов в воздухе, питьевой воде и почве
К сожалению, вновь приходится вспоминать о научной автаркии. Информация о роли и
значении микроэлементов для организма человека, получаемая исследователями: химиками,
биологами, медиками — пока еше малодоступна практикующим врачам. Так. высокий уро-
вень антропогенной нагрузки на систему мать—плод приводит к дисбалансу микроэлементов
в биосредах фетопланентарного комплекса. На основании определения содержания микроэле-
ментов в почве и питьевой воле на территории районов с различной степенью антропогенного
загрязнения и уровня накопления микроэлементов в плаценте и крови илола были выявлены
приоритетные территориальные экотоксиканты для биосрел фетопланентарного комплекса.
Например, в России почвы Ярославской. Ивановской и сопредельных с ними северных об-
ластей крайне бедны йодом, селеном, железом, а почвы Курской, западной части Московской
области весьма насыщены железом. Способные к активному комплексообразованию металлы
могут присутствовать в растительном лекарственном сырье в виде рагтичных соединений с
углеводами, алкалоидами, полифенолами и другими веществами. Однако по-прежнему как
818 Глава 8
самые безопасные лекарственные средства, будущим мамам рекомендуют растительные сборы,
полный элементный состав которых, согласно действующим нормативным документам РФ, не
контрол ирустся.
Среди обшей популяции воздействие высоких уровней металлов обычно очень важно для
работников тех отраслей индустрии, где металлы обычно используются. Воздействие в усло-
виях производства некоторых металлов может быть связано со специфической отраслью про-
мышленности (см. гл. 8.5.4).
Восстановление баланса микроэлементов in vivo может оказаться тем самым «маленьким
ключом, которым можно открыть большой сундук», где хранятся рецепты новых фармакоте-
рапевтических способов лечения различных заболеваний, улучшения качества и увеличения
продолжительности жизни при сохранном интетлекте.
Получить достоверные и надежные результаты при массовых исследованиях можно в лабора-
ториях. использующих совокупность чувствительных методов анализа, таких как масс-спектрос-
копия с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС). гамма-резонансная спектрометрия (ГРС),
газовая хроматография с масс-спектрометрией (ГХ-МС) и др. (см. гл. 6). Значительное загряз-
нение окружающей среды соединениями металлов оборачивается ростом генети юских мутаций
раковых, сердечно-сосудистых и профессиональных заболеваний, отравлений, дерматозов, сни-
жением иммунитета и связанных с этим болезней. К сожалению, в РФ нет четких указаний на
обязательность элементного анализа при мслико-диагностических исследованиях. Элементная
диагностика в медицине является важным инструментом в понимании первичных и вторичных
взаимосвязей между изменениями содержания макро- и микроэлементов с целью поиска и вы-
бора рациональной стратегии лечения mhoihx заболеваний. Интенсивность и особенности реа-
гирования организма на дисбаланс микроэлементов индивидуальны и связаны с генетическими
механизмами МЛ Г. Основная проблема в настоящее время заключается в выборе алгоритмов
правильной интерпретации результатов количественного определения макро- и микроэлементов
с учетом их соотношений, содержания клинически важных бномаркеров, или молекулярных
индикаторов элементного статуса, определения ионогенной или координированной формы на-
хождения микроэл ментов в организме человека (см. электронное приложение).
Элементный состав биожидкостсй и тканей отражает суммарное содержание макро- и мик-
роэлементов, включая их поступление из среды обитания, что позволяет использовать коли-
чественные значения их уровней в клинико-токсикологической диагностике и судебно-хими-
ческом анализе, практике судебно-медицинской экспертизы техногенных катастроф.
Развитие учения о микроэлементах всегда шло вслед за успехами в области аналитичес-
кой химии Мультилисцинлинарный подход к изучению взаимодействия микроэлементов с
биоструктурами организма и современная аналитическая база позволяют систематизировать
мноючислснныс экспериментальные данные, объединить их в понятие «микроэлементозы»
(определение введено акал. А.П. Авныным) и считать разделом патологии, предметом которого
является новый класс болезней человека с уже установленной этиологией, но с еще неясным
патогенезом.
В качестве объектов исследования для оценки содержания элементов в биосредах организма
человека в настоящее время используют определение их концентрации в крови (сыворотке,
плазме, цельной крови, эригронитной массе), моче, волосах. Иногда определяют токсикант в
выдыхаемом воздухе. Перечисленные объекты используются при проведении судебно-хими-
ческих экспертиз, экологических и клинических исследований, в профпатологии. Кроме этого,
при проведении судебно-химических экспертиз для анализа используют печень, почки, желу-
док с содержимым, вещественные доказательства и др. При выборе объекта исследования (по
возможности) ориентируются па данные об информати пости объекта: в каком из них содер-
жание токсиканта наиболее соответствует наблюдаемым эффектам воздействия. Обязательно
учитывают токсикокинетические параметры: в каком нз биосубстратов концентрация предпо-
лагаемого токсиканта может быть выше. Так. при изучении действия свинна установлено, что
в крови больше всего он концентрируется в эритроцитах и лишь 1—2% находится в плазме.
Концентрация микроэлементов в плазме крови далеко не всегда отражает их содержание в
тканях. Определение уровня микроэлементов в тканях, например биопсия печени, относится к
инвазивным методам. Определение концентрации микроэлементов в клетках методом быстрых
отпечатков, например в гранулоцитах, нельзя выполнить на рутинной аппаратуре и требует
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп. 819
больших затрат. Связь между эффектом и концентрацией металла-токсиканта в моче менее
выражена или еще не установлена. Для того чтобы оценить содержание металла в организме
в целом или отдельных органах, иногда используют математическое моделирование (см. гл.
4). Имеющиеся данные по оценке преимуществ и недостатков элементного анализа волос по-
казывают. что содержание микроэлементов в волосах отражает элементный статус организма.
Пробы волос являются интегральным показателем минерального обмена, а также архивным
материалом в историческом биомониторинге, что при постоянном совершенствовании ана-
литической базы открывает новые возможности для этого вида контроля уровня элементов в
человеческом организме. Например, концентрация Zn в волосах снижается в течение первых
3 лет жизни ребенка, концентрация Сг и Si в некоторых тканях — на протяжении всей жизни.
Волосы являются представительным объектом, по крайней мере при определении Zn. Си, Ст.
Pb. Hg. Мп. Sc. TI. As и некоторых друшх элементов (см. гл. 8.5.2 и 8.5.3).
Изменение содержания элементов — кратковременное по экспозиции и значительное по
степени отклонения — отражается в их концентрации в жидких средах оршнизма. Биожид-
кости являются информативными объектами в первую очередь для клинической диагностики.
Оценка элементного статуса человека производится либо путем прямого определения со-
держания химических элементов в его органах и тканях, либо косвенно путем определения ме-
таболитов различных биохимических реакций и процессов, в которые вовлечены эти элементы.
Главной задачей всегда является выбор наиболее подходящих для исследования биомаркеров
и методов анализа. Чтобы адекватно интерпретировать аналитические результаты определения
микроэлементов необходимо выбрать характерную ткань, т.е. такую, которая отражала бы не-
достаточное или избыточное воздействие окружающей среды (рис. 8-44). Для этого необходи-
мы знания о то кси коки нети ке и механизме действия конкретного токсиканта (см. гл. 8.5.3).
Основные методы определения элементов в биологических объектах рассмотрены в соот-
ветствующих разделах главы 6.
• Атомно-абсорбционная спектрофотометрия (пламенная ААС). см. гл. 6.4.2.
• Атомно-абсорбционная спектрометрия с электротермической атомизацией (ЭТААС), см.
гл. 6.4.2.
• Оптическая эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-ОЭС).
или плазменная атомно-эмиссионная спектрометрия (ИСП-АЭС), см. гл. 6.4.2.
Ряс. 8-44. Поступление, распределение и выведение соединении металлов (а).
Содержание свинца и селена в волосах детей Москвы поданным М.Г. Скальной и АВ. Скального (2004) (б).
Метод определения элементов — ИСП-МС.
820 Глава 8
• Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС). см. 1Л. 6.4.2.
• Пламенная фотометрия.
• Рентгенофлюресисшиая спектрометрия, см. гл. 6.4.2.
• Нейтроноактивационный анализ, см. гл. 6.4.2
• Гамма-резонансная спектрометрия, см. гл. 6.4.2.
• Спектрофотометрический метод, см. гл. 6.4.2.
• Электрохимические методы (инверсионная во гьтамперометрия. ионометрия. полярография
и др.), см. гл. 6.5.
• Хроматографические методы (ВЭЖХ. система ВЭЖХ-МС и др.).
• Иммунохимические (см. гл. 6.2.) и другие методы.
Иммунохимичсскис методы ( ИФА и ПФИА) — новые технологии экспрессного элементно-
го анализа. Многие из перечисленных методов определения элементов в биологических объек-
тах уже нашли применение в криминалистических, клинико-токсикологических, клинических,
судебно-химических, эколого-токсикологических лабораториях, практически полностью заме-
нив химические методы определения металлов.
Оценка влияния токсичных веществ на здоровье населения, диагностика заболеваний че-
ловека на ранних стадиях так или иначе связаны с нарушением баланса макро- и микроэле-
ментов. Становится очевидным, что для установления диагноза и назначения эффективного
лечения современный практикующий врач должен иметь возможность оценил ь элементный
статус пациента. К сожалению, методы анализа, способные дать информацию о содержании
микроэлементов в организме человека либо недостаточно чувствительны (спектрофотомет-
рия), либо требуют специального дорогостоящего оборудования, которым осиашспы только
отдельные медицинские центры (ИСП-МС). Используя возможности инверсионной вольтам-
перометрии. хроноампсрометрии. циклической вольтамперометрии, хронопотенииометрии,
российские ученые разработали портативный прибор для определения микроэлсментного со-
став;! биологических жидкостей, электрохимические сенсоры, методики и алгоритмы для оцен-
ки микроэлементного и иммунного статуса организма в режиме реального времени. Опытные
образны прибора проходят испытания в лабораторных и полевых условиях.
8.5.2. Выбор биообъектов для элементного анализа
В каждой естественной на кс заключено столько истины,
сколько в ней математики.
И Кант
Определение малых концентраций химических элементов в различных объектах живой и
неживой природы возможно высокочувствительными инструментальными методами с исполь-
зованием стандартных образцов сравнения для адекватной опенки полученных результатов.
Основные требования, предъявляемые к методам, — сочетание низких пределов обнаружения,
высокой чувствительное!и и селективности. Для определения элементов в биологических об-
разцах все большее распространение в России получают методы ИСП-АЭС и ИСП-.МС. кото-
рые позволяют одновременно определить в одной пробе 60 и более макро-, микро- и ультра-
микроэлементов. что очень важно для оценки взаимодействия элементов в организме человека
(см. гл. 6.4.3). Высокая стоимость приборов пока тормозит широкое внедрение ИСП-АЭС и
ИСП-МС в практическую деятельность лабораторий в нашей стране. Однако во всем мире
методы ИСП-АЭС и ИСП-МС используются для высокопроизводительного многоэлементпого
анализа различных образцов. Надежность современного оборудования, простота и точность ка-
либровки по общедоступным стандартным образцам, относительная свобода от взаимных фи-
зических и химических влияний при анализе — несомненные достоинства метода ИСП-МС.
Следует сше раз подчеркнуть, что содержание макро- и микроэлементов как результат ана-
лиза пс может интерпретироваться вне концепции МЛ Г (см. гл. 8.5.1).
Для опенки элементного статуса человека используют определение элементного состава
биосубстратов, а также активность ферментов или содержание метаболитов, косвенно отража-
ющих уровень химических элементов в органах и тк. нях. В табл. 8-34 приведены биомаркеры,
наиболее часто используемые при опенке элементного статуса человека.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 821
Таблица 8-54. Биомаркеры. используемые при опойке элсмсггтното статуса человеки (по Bertram Н.Р..
1992, с дополнением Скальною Л.В. 2000)
Элемент Биообъекты общепринятые возможные Ьиочаркеры
А) Плазма крови Моча, волосы Р. Са-шелочная фосфатаза
Sb Моче, волосы Цельная кровь Специфические изменения в клинической кар- ги не крови
As Моча, волосы, ногти Кровь Амииа’1свулинот1Я кислота, фетальный эритро- протеин 6. данные аудио1раммы
Pb Цельная кровь, моча Волосы, зубы Амшюлсвулиновая кислота п моче, нервно-мы- шечная проводимоегь. ииик-лротоиорфирнн, копропорфирнн
Cd Моча и цельная кровь Волосы Р.-микрогиобглин в моче
Сг Эритроциты Волосы Гиалуронидаза плазмы крови, насыщенность трансферрина хромом тест на толерантность к и ю ко эе
Fe Плазма крови Волосы Ферритин плазмы, свободный эри1ропорфирин. насыщенность железом трансферрина
F Моча Волосы Данные рентгеишрамм костей
Au Волосы, ногти Моча. iviaxMa крови Специфические изменения клинической карги- иы крови
1 Моча, плазма крови Волосы
Cu П пзма крови, волосы Моча, hoith Церулоплазмин, лнзилоксилаза. пофамин-p-nui- poKcitiajd
Li Плазма крови Моча, волосы
Mn Волосы. моча Результаты электроэнцефалографии (ЭЭГ). элек тромиографии (ЭМГ), агглютинация эрнгроцн тов. 17-кегостсроилы в моче
Mo Моча, плазма крови Волосы, ногти Церулоплазмин. соешнения мели п моче, моче- вая кислота в плазме и моче, активность ксантин- оксилазы в эритроцитах
Pt Моча и плазма кропи Волосы
He Моча Кроиь, полосы, слюна Лизосомальные ферметы в плазме крови, белок в моче
Se Моча, волосы, плазма крови Ногти Глутитионпсроксилиза в эритроцитах
Ag Моча Волосы, плазма крови
П Моча, волосы Кровь, кал Микроскопия корней волос
Bi Суточная моча Волосы
Zn Моча, плаша крови. ПОЛОСЫ Слюна, ногти Рстннолсвязыгаютий белок, активность карбо- ангидразы. изменение вкуси и обоняния
Типы биообьектов и обшие операции пробополготовки образцов для элементного анализа
изложены в главе 5.4 Ниже приведен ряд особенностей преланалигической подготовки проб
для элементного анализа
У живых лин диагностическими биосубстратлми для определения концентрации элементов
чаше всего являются цельная кровь, плазма (сыворотка), моча и волосы. Согласно современ-
ным представлениям. элементный состав этих биосубсграчов отражает копнен грацию хими-
ческих элементов во внутренней среде организма.
Концентрации в моче и крови указывают на недавнее воздействие токсиканта и/или нару-
шения баланса микроэлементов, вызванное разными причинами. В ряде случаев обнаружение
822 Глава 8
токсиканта в моче (например, кадмия) может быть следствием накопления в почечной ткани
его соединений при хронической интоксикации. При этом диагностическим тестом служит
концентрация металла в конкретной форме. Так. содержание мсталлотионсин-кадмня в плазме
или моче имеет гораздо большее токсикологическое значение, чем общее содержание кадмия.
Относительно малый период полувыведения характерен для большинства металлов (за ис-
ключением свинца, кадмия. стронция и некоторых других, см. гл. 8.5.3). Отбор проб крови и
мочи обычно проводят в течение 2—3 дней после последнего воздействия.
Практически все металлы концентрируются в волосах и ногтях, которые считают индика-
торами долгосрочного воздействия. Однако необходима осторожность, чтобы обеспечить до-
казательства об имеющихся уровнях металла в составе матрицы ткани, а не поверхностного
загрязнения.
Кровь. Для опенки элементного статуса в клинической лабораторной диагностике часто ис-
пользуют анализ сыворотки и плазмы крови. В сыворотке и плазме крови элементы находятся
в составе продуктов метаболических и катаболических процессов. Информация, полученная
с помощью анализа сыворотки и плазмы крови, косвенно отражает взаимосвязь обменных
процессов, происходящих в различных органах или метаболически активных компартией тах
организма.
В сыворотке и плазме крови определяют общую концентрацию элемента на момент непос-
редственною забора пробы. Недостатком определения обшей концентрации элемента является
то, чго его дефицит в сыворотке и плазме крови проявляется как отражение усиленного выве-
дения и специфические изменения концентрации отдельных металлопротеинов не могут быть
распознаны своевременно.
Элементный состав внутренней среды организма находится под контролем гомеостатичес-
ких механизмов, что загруднясг возможности интерпретации полученных результатов при до-
нозологических и начальных стадиях развитие заболевания. Для того чтобы повысить аналити-
ческую информативность полученных результатов, необходимо знать, в каком вид , связанном
или свободном, и в каких соотношениях с другими элементами находится определяемый эле-
мент в сыворотке крови. Ответить на эти вопросы с помощью методов только элементного
анализа невозможно. Однако использование гибридных методов — ВЭЖХ-ИСП-МС. ВЭЖХ-
ИСП-МС-ЯМР и/или ГРС (см. гл. 6.4.3) позволяет получить надежную информацию.
Д|я применения высокочувствительных методов элементного ана. иза и корректной интер-
претации полученных результатов необходимо иметь специально подготовленный высокопро-
фессиональный персонал лабораторий и валидировать лабораторную технику (см. гл. 5).
Трудность проведения элементарного анализа заключается в возможном затрязнении образ-
ца микроэлементами в процессе .забора хранения, транспортировки и пробоподготовки. На-
пример, незначительный гемолиз крови может привести к повышению концентрации Fe. Си.
Zn. Pb. Rb. Мп и Mg в сыворотке крови от нескольких десятков до солен процентов, при этом
повторно полученные результаты могут значительно различаться. При контакте с медицинс-
ким инструментарием возможно наружное загрязнение пробы AI. Сг, Мп. Ni. Zn. что требует
специальных методов забора и храпения. По некоторым данным, заоор пробы крови с помо-
шью обычного медицинского шприца может повышать конценлрацию AI в сыворотке крови
полти в 10 раз (от 1,4+0,9 до 13,0+1.9 мкг/л). Поэтому предпочтителен забор крови венными
канюлями из пластического материала, а нс шприцем.
Когда образцы крови, поступившие в лабораторию, не могут быть немедленно проанализи-
рованы в силу обстоятельств, плазму или сыворотку отделяют от эритроцитов перед глубоким
замораживанием. Ряд токсикантов способны быстро поглощаться эритронитами (например,
свинец, кадмий, ртуть), поэтому необходимо законсервировать образцы цельной песвернув-
шейся крови. Однако использование антикоагу япвов и консервантов (оксалал, нитрат, ЭДТА.
гепарин) может способствовать загрязнению образцов ионами металлов. Ана. из сыворотки
крови в ряде случаев предпочтительнее анализа плазмы.
Во всех случаях при подозрении на отравление металлами следует отбирать венозную кровь
(10 мл) и использовать контейнер с К-ЭДТА. В настоящее время имеется широкий ассор-
тимент пробирок для сбора крови Для исключения возможных загрязнений рекомендуется
применять сертифицированную продукцию для микроэлементного анализа, особенно когда
речь идет о субклиническом поступлении таких агентов, как свинец и кадмий. Лаборатория.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп .. 823
закупив относительно большую партию стандартных пробирок для сбора крови (все пробирки
должны иметь один номер упаковки), должна протестировать их из каждой упаковки, чтобы
гарантировать отсутствие загрязнения исследуемыми металлами (например, свинцом, кадмием
или алюминием). Если образны крови поступают в лабораторию в необычном контейнере,
следует запросить аналогичный чистый контейнер для его проверки на содержание возможных
примесей
В равной степени важно убедиться, что для забора крови при аутопсии используются нужные
контейнеры. В этом случае пробирки могут быть переданы натоло1у заранее перед аутопсией
в составе стандартных наборов. При аутопсии рекомендуется кровь забирать из определенного
места (желательно из бедренной вены), поскольку может произойти значительная диффузия
или перераспределение токсикантов в результате смерти (см. гл. 5). Ни koi да не следует за-
бирать кровь из полостей тела после смерти, потому что кровь, отобранная после смерти из
разных частей тела, например из бедренной вены и аорты, имеет неодинаковый элементный
состав.
В диагностических целях использование цельной крови связано с теми же трудностями,
что и в случае с сывороткой и плазмой. Однако из-за того, что концентрация химических
элементов в цельной крови намного выше, чем в сыворотке, для ее анализа иногда можно ог-
раничиться забором капиллярной крови, что уменьшает инвазивность пробоотбора и особенно
ценно при скрининговых исследованиях, например для определения РЬ у детей.
При пробоподготовке образцов крови (цельной, плазмы, сыворотки) возрастает риск потерь
элементов при применении таких методов минера, извини, как озоление в му<|>ельной печи и
мокрое озоление с помощью кислот в открытых сосудах (см. гл. 5.4). При перечисленных спо-
собах пробоподготовки повышается риск как потерь элементов, так и контаминации проб. По-
этому для получения валидных данных при элементном анализе любых биосубстратов следует
применять современные методы минерализации в закрытых емкостях под давлением с исполь-
зованием ультрачистых реагентов, отвечающих требованиям МУК 4.1.1482—03. 4 1.1483—03.
2003 (см. гл 5.4 и электронное приложение).
Цельная кровь и ее составные части отражают обеспеченность химическими элементами на
момент исследования. Из-за индивидуальных особенностей метаболизма и гомеостатической
регуляции содержание микроэлементов в крови может не изменяться даже при обеднении депо
в органах и тканях.
Моча. При анализе мочи на содержание химических элементов у живых лиц оглают пред-
почтение суточной моче. Единичная порция может быть информативна только при значи-
тельно выраженной нагрузке организма токсичными металлами. В настоящее время наиболее
достоверным показателем считаю! содержание токсикан!а в моче в мкг н* I г креатинина.
Если пациенту проводят хелатирующую терапию, то также следует собрать образцы суточной
мочи в пластиковые контейнеры, промытые кислотой. Перед отбором аликвот на анализ ре-
гистрируют общий объем мочи, чтобы установить уровень экскреции хелатируемых элементов
в эффективность лечения.
Для исследования обменных процессов рекомендуется собирать мочу в течение 48—72 ч.
Во всех случаях необходимо собирать мочу в предварительно очищенные иди одноразовые по-
лиэтиленовые резервуары. При сборе мочи с помощью катетера возможно загрязнение кровью
или материалом, из которого изготовлен катетер. Это важно иметь в виду при отборе мочи
посмертно, если далее планируется провес!и элементный анализ. Следует отобрать мочу как
можно скорее (30 мл в простой контейнер типа Sterilin без добавки стабилизаторов) и таким
образом, чтобы максимально избежать загрязнения в процессе отбора пробы.
Как в случае сыворотки и плазмы крови, использование мочи в качест ве диагностического
биосубстрата при латентных стадиях заболеваний и донозологических состояниях ограничено.
Так. возможные за1рязнения в ходе нарушений требований к сбору, хранению и подготовке
пробы могут повлиять на результаты анализа более существенно, чем обнаруженные мстаба и-
чсскис эффекты, при определении ультрамикроэлементов. Интерпретация данных о понижен-
ном содержании элементов в моче всегда бо ice проблематична но сравнению с повышенным.
В первую очередь это касается условно-токсичных и токсичных элементов, для которых ре-
нальный путь выведения является основным. Исследование экскреции химических элементов
с мочой даст представление об их текущем потреблении. Исследование суточной мочи осно-
824 Глава 8
вано на физиологическом механизме: снижение экскреции с мочой огражает недостаточность
поступления и истощение запасов, а усиление экскреции — избыточное поступление веществ.
На процесс выведения влияют функциональная способность почек и состояние организма
(физическая активность, стресс, инфекции и т.д.).
Волосы. В сравнении с анализом крови или мочи атементнын анализ волос имеет преиму-
щества: относительно высокая концентр< ция элементов, неинвазивность отбора проб, удобство
при хранении и транспортировке, что предопределяет преимущества использования элемент-
ного анализа волос в донозологической диагностике патологических изменений и латентных
процессов, происходящих в организме. Как указано выше, содержание элементов в волосах
отражает длительный период обеспеченности организма химическими элементами и мало за-
висит от гомеостатического контроля.
Информативность анализа волос как показателя, отражающею элементный статус организ-
ма. продолжает дискутироваться в научной литературе. Некоторые исследователи считают. чго
элементный анализ волос пригоден только для популяционных исследований элементного ста-
туса. За последние годы анализ волос нашел широкое применение в тит иене, эколотии. токси-
кологии, судебной медицине, например при выявлении случаев отравления As, Hg, Cd, F, Ni.
Мп. Pb. Были найдены значительные различия
Таблица 8-35. Опенка инфорыашшюсзи при
определении химических элементов в различных
биосубстратах
Элемент Кровь Mma Волосы
As + + +
Л1 +
Ва +
Bi +
В +
Cd + + +
Са + + +
Сг + +
Со +
Си + + +
Fe +
Pb + +
Mg +
Hg + -1-
P +
Se +
Ag +
Sr +
TI +
Zn 4 +
в изменении концентрации элементов в волосах
при популяционных исследованиях в разпич-
ных географических регионах. Так, например,
при эпидемиологическом исследовании в Ки-
тае была выявлена зависимость между низкой
концентрацией Se в волосах и эндемическим
гипоселенозом (1995). В нашей стране и за
рубежом проведены многочисленные иссле-
дования. в которых продемонстрирована взаи-
мосвязь между уровнем обеспеченности насе-
ления Zn. Se. Си и другими микроэлементами
и их содержанием в волосах, показана прямая
зависимость концентрации Pb. Hg. As, Cd, Ni,
Сг в волосах от уровня нагрузки популяции и
индивидуума этими .цементами. По мнению
большинства авторов, анализ волос может ис-
пользоваться и качестве оценки элементною
статуса не только на популяционном, но и на
индивидуальном уровне, отражая как эндоген-
ное содержание элемента, так и уровень выве-
дения элементов из организма.
Согласно рекомендациям МАГАТЭ, воло-
сы для анализа следует отбирать в 4—5 местах
с затылочной части головы, используя нож-
ницы из нитрила титана или керамики. Па
концентрацию элемента в волосах могут вли-
ять их окраска, цвет (содержание меланина,
см. гл. 5.4). длительное применение некото-
рых шампуней, мазей и других косметических
и лечебных наружных средств. Поэтому все
перечисленные факторы должны учитываться
при опенке содержания химических элемен-
тов в волосах. В табл. 8-35 представлены наи-
более информативные биообъекты для опре-
деления химических элементов.
Зависимость диагностической ценнос-
ти анализа волос и жидких бносубстратон от
стадии патологического процесса и дефицита
макро- и микроэлементов представлены на
рис. 8-45.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 825
Рис. 8-45. Информативность определения химических элементов в биосубстрагах в за йен мости от ста-
дии развития патологического процесса (М ncrahioflc und Spurendcmcntc. 1992).
Для живых лиц определение обеспеченности организма химическими элементами и/или
урозня накопления токсикантов может быть получен путем одновременного определения эле-
ментного состава как минимум двух биосубстратов, отражающих ретроспективную и текущую
картину (например, волосы и сыворотка крови), в сопоставлении с данными биохимических и
клинических исследовании, а также оценкой фактического питания.
Другие образцы (содержимое желудка, ткани органов, кости, мышцы и др.), полученные
при аутопсии
Содержимое желудка. Регистрируют общий объем содержимого желудка. Образец мясе го-
могенизируют в блендере, чтобы получить 2 или 3 репрезентативных образна малого объема
для количественного определения. Гомогенизированные образны можно профильтровать не-
посредственно через неплотную фильтровальную бумагу или разбавин» диаиллированной во-
дой. Чистый супернатант или репрезентативный образец гомогенизированного содержимого
желудка используют в анализе. Количественный анализ содсржД мото желудка важен в леталь-
ных случаях, когда концентрация присутствующего токсиканта в желудке может обеспечить
доказательство судебного заключения.
В судебно-химическом анализе часто используют предварительный простои тест (проба
Рейнша) содержимого желудка и/или вещественных доказательств на месте происшествия для
обнаружения мышьяка, олова, висмута и ртути. Необходимыми реагентами и материалами
826 Глава 8
являются концентрированная и разбавленная соляная кислота, разбавленная азотная кисло-
та, медная фольга (5x10 мм) или проволока (длиной 2—3 см). Очищенную и промытую медь
(фольга или проволока) помешают на фильтровальную бумагу. Цвет фольги или проволоки
свидетельствует о наличии:
• олова—пурпурно-черный цвет;
• мышьяка — матовый черный цвет;
• висмута — блестящий черный цвет;
• ртути — серебристый цвет.
Тест не является специфичным, поскольку селен и теллур гакже образую! черное окрашива-
ние. Высокие концентрации серы могут придать меди крапчатый вил. Несмотря на указанные
недостатки, тест является простым и быстрым способом предварительного обнаружения важ
нейших металлов-токсиканюв.
Отбор образцов и пробоподготовка других биообъектов изложены в главе 5.4. Основная за-
дача пробоподготовки (см. выше) — избежать загрязнения образцов металлами извне.
Понятие нормы в оценке результатов элементного анализа биосубстратов
В последние десяти, ст ня отмечаются попытки в установлении норма.! ,ных физиологичес-
ких границ содержания химических элементов. Однако использование цеитильной шкалы*
может быть расценено только как статистическая характеристика исследованной группы, но
не как отражение состояния здоровья. «Понятие нормального значения содержания того или
иного элемента лишь предполагается, однако в настоящее время не существует точного опре-
деления нормальности и здоровья населения» (Е. Wormer. 2000).
Центром по контролю за заболеваниями США (CDC. 2004) принято, что лабораторные
анализы 95% населения соответствуют норме и только 5% находятся вне области нормальных
значений. Это приводит к хорошо известным и попятным затруднениям в диагностике заболе-
ваний и особенно выявлении состояний прелболезни и латентно протекающих процессов.
Для формирования групп риска по интоксикации металлами в нашей стране предложено
использовать какие показатели, как биологически допустимый уровень (БДУ) и критический уро-
вень (КУ) химических элементов в биосредах.
БДУ — содержание элемента в организме или критическом органе, которое при постоян-
ном его присутствии не вызывает изменений состояния здоровья человека, обнаруживаемых
современными методами исследований. При значительном превышении БДУ но одному из
элементов у многих обследованных целесообразно использовав. ругой показатель — КУ.
КУ— содержание элемента в организме или критическом органе, при котором наблюдаются
биохимические изменения, связанные с токсическим воздействием какого-либо элемента или
дефицитом эссенциального.
Во всем мире наблюдается повышенный интерес ученых и врачей-практиков к роли микро-
и микроэлементов в диагностике и лечении заболеваний Однако отсутствие установленных
границ БДУ и КУ содержания элементов в биосубстратах. с одной стороны, и относительно
низкий уровень лабораторной службы — с другой, привели к многочисленным публикаци-
ям и использованию в медицинской практике так называемых региональных нормативов по
отдельным элементам, отличающихся от общепринятых на порядки, а также к накоплению
несопоставимых друг с другом аналитических данных (даже при использовании высокочувс-
твительных методов анализа). В связи с этим возникла необходимость обоснован, нижние и
верхние фанины БДУ (или границы физиологическом нормы) химических элементов в диа-
* При анализе регультатон измерения непрерывной переменной иногда по. езно объединить результаты в несколько
ранных групп. Например, чтобы отучить 4 ранные tpynnu. необходимо имст ь значс <ия делящие исходные данные
по 25% в каждой группе. Существуют 3 таких значения (точки деления), которые называются квартилями (quartile),
ври этом средняя из них также называется медианой. Аналогично, можно использовать 2 терпин (lertile). чтобы
разбить данные на 3 группы. 4 квшгп тя (quintile), чтобы разб1гп> их на 5 групп, и так далее. Общий термин для таких
точек раздела — «квантили» Другие термины — «дешын» (decile), которые летят данные на 10 частей, и «иенгили»
(ccniile). которые делят данные на 100 "tactvn (их также называют процентилями) Значения !нпи кшрнией мот быть
выражены через ueirriun например, самый левый кгаргиль равен 25-му вентилю, а медиана — 50-му пентилю. I (пиболее
общее заблуждение — это использование терминов «тертили». «квартили», «квишили» и тл. пс для обозначения точек
отсечки, а для групп данных, полученных таким образом.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 827
гностических биосубстратах. Предлагается (Скальный А.В.. 2000) ввести понятие условного
биояогическн допустимого уровня (УБДУ).
УЬДУ — содержание элемента в волосах — эмпирически установленный показатель, полу-
ченный в аккредитованной и лицензированной (см. гл. 5.8) на определение элементов в био-
объектах по международному гган врту лаборатории,— которое при условии многолетних (не
менее 10 лет) клинических наблюдений, не приводит к специфическим изменениям состояния
здоровья.
Приведем результаты выполненного в период с 1987 по 2001 г. обследования элементного
состава волос жителей Москвы. Распределение обследованных жителей г. Москвы по полу и
возрасту представлено в табл. 8-36.
Таблипа 8-36. Половозрастной состав обследованных жителей Москвы
Половозрастная группа Количество обследованных
Дети до 1 года 321
Дети от 1 года до 3 лет 1194
Дети от 3 ло 6 лет 1305
Мальчики от 6 до 11 лет 1021
Левочки от б до II лет 1116
Мальчики от И до 17 лег 777
Девочки от 11 до 17 лет 1944
Мужчины от 17 до 34 лет 1761
Женщины от 17 до 34 лез 1810
Мужчины от 34 до 49 лет 1223
Женщины от 34 до 49 дет 2857
Мужчины старше 49 лег 2858
Женщины старше 49 лет 2864
Всего 21 051
В полученных образ ах волос определяли концентрации Al. Са. Cu. Fe. К. Mg. Na. Р. Si
и Zn. Все образцы волос собирали и подвергали пробоподготовкс согласно требованиям МА-
ГАТЭ и методическим рекомендациям М3 СССР и ФЦ ГСЭН РФ (см гл. 5). В резупьтазе
проведенных исследований были установлены границы стандартных пентильных интервалов,
принятых при массовых обследованиях населения: 3, 5. 10. 25. 50. 75, 90. 95 и 97 центили. В
качестве нормы приняг интервал 25-й — 75-й центиль. как соответствующий средней кон-
центрации данного химического эземента в популяции; значения, лежащие в интер алс 10-й
— 25-й и 75-й — 90-й центиль. рассматривались как соответствующие состоянию предболезнн,
а в интервале 0 — 10-й и 90-й — 100-й центиль — состоянию болезни. Для удобства использо-
вания результатов анализа волос в скрининг-днагностичсских исследованиях ввели 4-балльную
шкалу, соответствующую степени отклонения содержания в волосах того или иного хи ми чес
кого элемента от предложенного нормального содержания. За отклонение 1 степени принят
значение ниже 25 и выше 75 центиля. II степени — ниже 10 и выше 90. 111 степени — ниже 5
и выше 95 и IV степени — ниже 3 и выше 97 центиля.
По результатам многолетнего исследования А.В. Скального и соавт. все элементы разделены
на 2 группы. Для элементов 1-й группы (Са, К. Mg, Na и Zn) характерны выраженная воз-
растная динамика, а также существенные отличия содержания этих элементов в волосах у лип
разного пола. Концентрация в волосах элемешов 2-й группы (AJ. Cu. Fe. Р, Si) с возрастом не
претерпевает знач1гтельных изменений различия между полами также слабо выражены.
Гранины нормы лля элементов, отнесенных ко 2-й группе, установлены едиными незави-
симо от пола и возраста. Для элементов 1-й группы целесообра но использовать нормативные
значения, связанные как с возрастом, так и с полом (табл. 8-37 и 8-38).
828 Глава 8
Таблица 8-37. Гранины нормальною (физиологического) содержания (мкг/г) химических элементов
1-Й группы в волосах жителей Москвы разною возраста, установленные при помощи анализа неншльных
интервалов
Э.шменг Транши Дегк в возрасте до 1 гада Дети в возрасте от 1 года до 3 лет Дети в возрасте от 3 до 6 ЛСТ Мальчики в возрасте от 6 до 11 лез Девочки в возрасте от 6 до II лет Мальчики в возрасте от 11 до 17 лет Девочки в возрасте от 11 до 17 «ст Мужчины в возрасте от 17 до 34 лет Жеяпишы в возрасте от 17 до 34 лет Мужчины в возрасте от 34 до 49 лет Женщины в возрасте от 34 ло 49 .зет Мужчины старше 49 лет- ЖеннПзнЫ ст ршс 49 лет
Са Н 300 250 250 250 350 350 500 400 500 400 550 400 500
В 700 500 500 500 700 700 1200 850 1400 800 1700 700 1500
К н 300 200 150 130 60 60 30 50 зо 65 40 90 60
в 1700 1600 1500 900 450 320 100 240 340 180 460 350
мй 11 20 15 15 15 20 20 35 30 35 25 35 25 30
в 40 30 30 40 55 50 90 65 ПО 65 130 50 120
Na н 200 200 200 150 100 120 70 120 65 150 90 200 150
в KIX) 1000 1(ХЮ 900 500 550 260 470 220 600 380 8(К* 8<Ю
Zn н 75 50 70 115 130 150 170 150 170 140 160 130 140
в 200 150 150 1X0 200 200 230 210 230 200 220 190 200
Примечание. II — нижняя границу 25-4 иенгнль; В — верхняя ран н до 75-й ueimi.ib.
Таблица 8-38. Гранины нормального (фиjho.ioi плоского) содержания (в мкг/r) химических элементов
2-й группы в волосах жителей Москвы, установленные при помощи пентильных ишервалов
Элемент Нижняя граница Верхняя граница
А1 15 30
Си Г 1 8 15
Fc 10 30
Р 130 190
Si 5 30
Воздействие металлов можем быть подтверждено и часто количественно определено с ис-
пользованием специфических биомаркеров воздействия. Биомаркср воздействия — любой из-
меряемый биологический параметр, который показывает воздействие токсичного вещества.
Эго может быть индуцированный белок, фермент, метаболит или даже само токсичное вещес-
тво. Биомаркеры широко используются в диагностике профессиональных и профессионально
обусловленных заболеваний (см. гл. 8.5.4).
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 829
8.5.3. Химико-токсикологические характеристики элементов
Благо везде и всюду зависит от соблюдения двух условий:
правильного установления конечной пели всякого рода деятельности
н отыскания соответствующих средств, ведущих к конечной цели
Аристотель
Развитие зна шй о химическом составе человеческого тела и значении химических элемен-
тов для жизни и здоровья человека тесно связано с именами наших выдающихся соотечествен-
ников; В.И Вернадского. А. П. Виноградова А.И Вснчикова, В.В. Ковальского. Г.А. Бабенко.
А.П. Авныиа и рядом друтих видных ученых — биогеохимиков, биологов и медиков. Как ска
за но выше, в организме человека обнаружено бо :е 80 химических элементов (рис. 8-46).
Особенностью функционирования химических элементов в организме является их взаимо-
действие jipyi с другом, которое проявляется
синергическими или антагонистическими эф
фактами (см. гл. 8.5.1). Изученные к настоя-
щему времени двух-, трех и многосторонние
взаимосвязи между химическими элементами
в организме исчисляются сотнями. На рис.
8-47 представлены пути обмена химических
элементов в организме.
Химико-токсикологические характеристи-
ки элементов приведены ниже и в электрон-
ном приложении.
Элементы 1 -й группы периодической систе-
мы элементов (литий, медь, серебро, золото)
Литий (Li)
Соединения зития широко используются в
атомной промышленности, металлургии, ор-
ганическом синтезе, производстве стекол, гла-
зурей и эмалей
В медицине применение соединений лития
oi раничено. Соли лития (лития карбонат ли-
тонит и др.) используются при лечении мани-
акально-депрессивных психозов (рис. 8-48).
В последние годы появились сведения об
эффективности препаратов лития при лече-
нии новообразовании, сахарного диабета и
алкоголизма. У таких больных паб юдается
пониженное содержание лития в организме
Ежедневно с нишей и жидкостью в орга-
низм поступает 2 мг лилия. Ионы лития (LT)
быстро н практически полностью абсорбиру
ются из ЖКТ. по видимому, из топкой киш-
ки. а также из мест парентерального введения
Ионы лития легко прон гкают через биоло-
гические мембраны. Литий распределяется в
организме сравнительно равномерно В крови
литий находится в основном в плазме
Выведение лития осуществляется преиму-
щественно через почки и в меньшей степени с
калом и потом. Концентрация лития в мо1 е в
25 раз выше, чем в сыворотке крови.
Кальции
(1.7)
Натрий
(0.2)
Фосфор
(1.25)
Хлор
(0,2)
Магний
(0.05)
Калий
(0.25)
Сера
(0.3
Фтор
(0.02)
Железо
(0,006)
Цинк
(0 0033)
Другие элементы
Медь
Йод
Марганец
Кобальт
Молибден
Селен
Итого (0,0005)
Рис. 8-46. Содержание химических элементов (в %)
в организме человека (по Rilling S I993).
830 Глава 8
Внешнее
Кал
Менструальная
кровопотеря.
Моча
Рис. 8-47. Пути обмена химических элементов в организме
вагинальные
выделения
Имеются данные о влиянии лития на нейроэндокринные процессы, жировой и углеводный
обмен. В обменных процессах литий активно взаимодействует с ионами К+ и Na+. Назначе-
ние препаратов лития на фоне дефицита натрия опасно для здоровья, так как может вызывать
поражение почек. Кроме того, к побочным эффектам терапии препаратами лития можно от-
нести угнетение функции щитовидной железы путем блокирования литием высвобождения
тиреотропного гормона (ТТГ), ризлинг-гормона (ТТГ-РГ) и тироксина. Под влиянием лития
возрастают поглощение глюкозы, синтез гликогена и уровень инсулина в сыворотке крови
больных диабетом, применяющих препараты лития, снижается уровень глюкозы и кетоновых
тел в моче. Литий обладает инсулиноподобным свойством.
Опенку содержания лития в организме проводят по результатам исследования органов, тка-
ней. сыворотки крови и волос. Риск интоксикации литием определяют по его концентрации
в слюне и моче.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 831
Токсические эффекты солей лития начинают прояв-
ляться при концентрации лития в плазме крови свыше
I0 мкт/л. При концентрации лития II —13 мкг/л появля-
ются слабые симптомы интоксикации. Они становятся вы-
раженными при возрастании концентрации лития ю М—
I7 мкг/л. и при уровне 21 мкг/л и выше развивается кли-
нически выраженная полиорганиая патология. К ранним
симптомам отравления относятся тремор кистей, полиурия
и умеренная жажда При средней интоксикации появляют-
ся диарея, рвота, мышечная слабость, вялость и потеря ко-
ординации. При тяжелом отравлении литием развиваются
неврологические расстройства: атаксия, ухудшение зрения,
потеря памяти, головокружение, потеря ориентации, судо-
роги, ступор и кома.
При остром отравлении литием мишенями вредного
воздействия являются:
• кожа и слизистые оболочки желудочно-кишечного трак-
та (токсический дерматит, тошнота, рвота, диарея);
• дыхательные пути (трахеит, бронхит, пневмония):
• ЦНС (гиперрефлексия, тремор, атаксия, спутанность
сознания и в особо тяжелых случаях кома).
При хронической интоксикации литием отмечаются
поражения почек: прямое токсическое повреждение гло-
мерулярного аппарата и тубулярных клеток угнетение
активности антидиуретического гормона, протеинурия и
полиурия. Страдают также сердечно-сосудистая система
(аритмия, снижение артериального давления) и шитовид-
ная железа (угнетение выработки тиреоидных гормонов)
Причины избытка лития:
• избыточное поступление;
• нарушение регуляции обмена лития.
При избытке лития следует использовать симптомати-
ческие средства, вводить в организм дополнительное коли-
чество NaCI и электролитные смеси.
Основные проявления избытка лигия:
А Острая интоксикация:
• гиперкалиемия;
• дефицит натрия;
• токсический дерматит;
• гиперрефлексия;
• тремор, атаксия;
• спутанность сознания;
• кома.
Б. Хроническая интоксикация:
• повреждения гломерулярного аппарата ночек и тубуляр
пых клеток
• угнетение активности антидиуретического гормона;
• протеинурия;
• полиурия.
• снижение артериального давления:
• аритмия;
• угнетение выработки гормонов шитовидной железы.
Синергисты и антагонисты лития
Основным антагонистами лития является натрий, в
меньшей степени — калий и магний. Синергист лития —
кдлышй.
Н
LI+ Литий Be
Na Mg
К Ca
Rb Sr
Cs Ba
Мания
Рис. 8-48. Схема действия солей ли-
тия при лечении маниакально-де-
прессивных психозов (по Lollmann
ei al.. 2000).
832 Глава 8
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание Li в плазме/сывороткс крови, слюне. Соотношение Li в слюне/
сыворотке крови (> 2,()—2,5).
Дополнительные: содержание Li в моче.
Токсикокинетические характеристики лития приведены в табл. 8-39
Таблица 8-39. Токсикокинетические характеристики лития
Суточное поступление с продуктами питания 2 мг
Резорбция из ЖКТ в к вь > 90%
Суточное выведение
моча 0.85 мг
кал 1,2 мг
пот Следы
прочие (волосы и др.) —
Период полувыведсния (Ти,) 17-58 ч
Объем распределения (Vd) 0,4—1,4 л/кг
Связывание с белками плазмы (Fb) 0
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кг 9.1 мт
кости 0,19 мг/кг сухого веса
мышцы 0.023 мг/кг
КрО13Ь 0.004 мг/л:
плазма 0,0001-0.001 мг/л
моча 0,400-0.425 мг/л
волосы 0,01—0,25 мг/кг
зубы (дентин) 1,13 мг/кг
сыворотка 0.009-0,027 мг/л
печень Около 0.001 мг/кг
слюна 0.02 мг/л
Токсическая доза лития для человека 92—200 мг. Содержание лития в биожидкостях и тка-
нях организма человека при легальном исходе приведено в табл. 8-40.
Таблица 8-40. Содержание лития в биожидкостях (в мг/л) и тканях (в мг/кг) при летальном исходе
Биосубстраты Кровь Мозг 11ечень Почки Моча
Среднее значение ' 1,9 (0.3—4,6) 2,0 (0,9—4,2) 2.8 (0,2—6.7) 3.6 (0,6—9,6) 6.7 (6.7)
Примечание. Здесь н в других таблицах в скобках — диапазон
Медь (Си)
Соединения меди используются при изготовлении проводов для электросети, монет, тру-
бопроводов. теплообменников, широко известны сплавы меди с другими металлами (бронза и
др).
В медицине применяют сульфат меди в качестве противомикробного и прижигающего
средства. Препараты различных солей мели используют наружно для промываний и сприн-
цеваний. в виде мазей при воспалительных пропессах слизистых оболочек, в физиотерапии
Медь и железосодержащие препараты применяют при лечении детей с гипохромной анемией.
Медьсодержащие препараты и биологически активные добавки (БАД) используют также при
лечении и профилактике заболеваний опорно-двигательного аппарата, гипотиреоза. Широкое
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 833
распространение получило использование медной внутри маточной спирали в качестве средс-
тва котраненции.
В ЖКТ абсорбируется до 50% поступившей в организм мели (причем в желудке максималь-
ное количество), затем идут двенадцатиперстная, тощая п подвздошная кишки. Лучше орга-
низмом усваивается Cu (II). В крови мель связывается с сывороточным альбумином (12—17%).
аминокислотами — цитидином, треонином, глутамином (10—15%). транспортным белком
транскупрсином (12—14%) и церулоплазмином (до 60 65%)
Мель способна проникать во все клетки, ткани и орзаны. Максимальная концентрация
мели отмечена в печени, почках мозге, кропи, однако ес можно обнару жить и в лрутих органах
и тканях. Схема обмена мели в организме представлена на рис. 8-49.
Ведущую роль в метаболизме мели играет печень, поскольку здесь синтезируется белок
церулоплазмин, обладающий форменки и иной активностью и участвующий в регуляции го-
меостаза мети
Медь является жизненно важным ззементом. который входит в состав многих витаминов,
гормонов, (|>ерментов, дыхательных пигментов (например, гемоцианин), участвует в процес-
сах обмена веществ, тканевом дыхании и т.л. Мель имеет большое значение для поддержания
нормальной структуры костей, хрящей, сухожилий (коллаген), эластичности стенок кровенос-
ных сосудов, id очных альвеол, кожи (эластин). Мель входит в состав миелиновых оболочек
нервов. Действие меди на углеводный обмен проявляется посредством ускорения процессов
окисления глюкозы, торможения распаял гликогена в печени. Медь содержится во многих
важнейших ферментах: шггохромоксидазс, тирозиназе, аскорбиназс и др. Медь присутггнусг в
системе антиоксидантной зашиты организма, являясь кофактором фермента СОД, участвую-
щей в нейтрализации свободных радикалов кислоро з Мель повышает устойчивость организ-
ма к некоторым инфекциям, связывает бактериальные токсины и усиливает действие аитибио
тт ков Мель обладает выраженным противовоспалительным свойством, смяпает проявления
аутоиммунных заболеваний (ревматоидного артрита), способствует усвоению железа.
Поступление меди с пищей
Выведение с калом Выведение с мочой потом,
выдыхаемым воздухом,
выделениями (месячные)
Сывороточный
альбумин
(плазма)
Церулоплазмин
Рис. 8-49. Обмен меди и организме челоиеки.
834 Глава 8
Опенку содержания меди в организме проводят по результатам исследования крови, мочи и
волос. Об обмене меди можно судить по уровню церулоплазмина в сыворотке крови и актив-
ности других медьсодержащих ферментов.
Дефицит, как и повышенное содержание соединений меди в орншнзме. представляет опас-
ность для человека (см. гл. 8.5.1).
Причины дефицита меди:
• недостаточное поступление.
• длительным прием кортикостероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов
ант ибиотиков;
• нарушение регуляции обмена меди.
Основные проявления дефицита меди:
• торможение всасывания железа, нарушение гемоглобинообразования. угнетение кроветво-
рения. развитие микроцитарной гипохромной анемии:
• ухудшение деятельности сердечно-сосудистой системы, увеличение риска ишемической бо-
лезни сердца, образование аневризм стенок кровеносных сосудов, кардиопатии;
• ухудшение состояния костной и соединительной ткани, нарушение минерали ании костей,
остеопороз, переломы костей;
• усиление предрасположенности к бронхиальной астме, аллергодерматозам;
• дегенерация миелиновых оболочек нервных клеток, увеличение риска развития рас сяшюю
склероза:
• нарушение пигментации волос, витилиго:
• увеличение шитовидной железы (гипотиреоз, дефицит тироксина);
• задержка полового развития у девочек, нарушение менструальной функции, снижение по-
лового течения у женщин, бесплодие;
• развитие дистресс-синдрома у новорожденных,
• нарушение липидною обмена (атеросклероз, ожирение, диабет);
• угнетение функций иммунной системы;
• ускорение старения организма.
Причины избытка меди:
• избыточное поступление в организм (вдыхание паров и пыли соединений меди в условиях
производства, быювые интоксикации растворам ! соединений меди, использование медной
посуды);
• нарушение регуляции обмена меди.
Основные прояв. ения избытка меди:
* функциональные рвсстронства ЦНС (ухудшение памяти, депрессия, бессонница);
• медная лихорадка — озноб, высокая температура, проливной пот. судороги н икроножных
мышцах (при вдыхании паров);
• слезотечение, раздражение конъюнктивы и слизистых оболочек, чиханье, жжение в зеве,
головная боль, слабоси>, боли н мышцах, желудочно-кишечные расстройства (при воздейс-
твии медной пыли и оксида мели);
• нарушения функций печени и почек.
• поражение печени с развитием цирроза и вторичным поражением головного мозга, связан-
ным с наследственным нарушением обмена меди и белков (болезнь Ви. ьсона—Коновалова);
• аллергодерматозы,
• увеличение риска развития атеросклероза.
• гемолиз эритроцитов, появление гемоглобина в моче, анемия.
Синергисты и антагонисты меди
Усиленный прием молибдена и цинка могут привести к дефициту меди Кадмий, марганец,
железо. антациды, таннины. аскорбиновая кислота способны снижать усвоение меди. Нинк,
железо, кобальт (в умеренных, физиологических дозах) повышают усвоение меди организ-
мом. В свою очередь медь может тормозить усвоение организмом железа, кобальта, цинка,
молибдена, витамина А. Оральные контрацептивы, гормональные средства, прспаршы кор-
тизона способствуют усиленному выведению меди их организма.
Индикаторы зкепо иции/интоксикации
Приоритетные: содержание меди в илазме/сынороже крови.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 835
Допо тигельные: содержание меди в волосах (проксимальным участок волос 2.5 см), реже—
в моче, печени (биотит, яугонсийиый материал). церулоплазмина — в сыворотке крови.
Токсикокинетические характеристики меди приведены в табл. 8-41.
Таблица 8-41. Токсикокинетические характеристики мели
Суточное поступление с продуктами питания 3,5 мг
Суточное поступление с воздухом 0.02 мг
Резорбция из ЖКТ в кровь 50%
Суточное выведение:
моча 0.05 мг
кал 3.37 mi
нот 0,04-0.4 мг
прочие (волосы и др.) 0.003 mi
Период полувывсдсния (Т1/3) 12—61 ч: 26 еут
Объем распределения (Vd) 2 л/кг
Связывание с белками плазмы (Fb) 95%
Среднее содержание:
ор1аннзм человека массой 70 ki 80—150 мг
кости 1—26 мг/кг сухого веса
кровь 0,8—1.3 мг/л
нлазма/сыиоротка 0,85—1,55 мг/л (женщины) 0,7—1,4 мг/л (мужчины)
слюна 0,12 мг/л
печень* 2.5—35 мг/кг 3.2—9.9 мг/кг
почки 1,07-4.19 мг/г
МЫШЦЫ 10 мг/кг
грудное молоко 0.197-0.751 мг/л 0.003—0.035 м)/сут
моча 0.025 мг/л
ВОЛОСЫ* 7.5—80 мг/кг 6.8—39 мг/кг
ногти 6.2 mi/кг
зубы (з.маль) 0.005—2 мг/кг
з бы (дентин) 0.005—3.2 мг/кг
* По разным источникам.
Токсическая поза меди для человека более 250 мг.
Содержание меди в биожидкостях и тканях организма человека при летальном исходе при-
ведено в табл. 8-42.
Таблица 8-42. Содержание мели в бножидкостях (в мг/л) и тканях (в mi/кг) при летальном исходе
Биосубстраты Кровь Моз! Печень Почки
Среднее начсние 33 (2.5—66) 6.2(1.1—11) 258(8.3—1410) 36(8.9—61)
При интоксикации концентрация мели в моче > 0.2 мг/сут.
836 Глава 8
Серебро (Ag)
Серебро широко применяется в фоюграфии. ювелирном деле, при изготовлении монет и
зеркал, в электронной и других отрас. ях промышленности.
IJ медицине используется бактерицидное, антацидное, вяжущее действие серебра. В XV111 —
XIX веке препараты серебра применялись для лечения нервных (невралгия и эпилепсия) и же-
лудочно-кишечных заболеваний. В настоящее время лекарства на основе серебра (протаргол,
колларгол и др.) используют при эрозиях, язвах, избыточных грануляциях, трещинах, остром
конъюнктивите, трахоме, хроническом гиперпластическом ларингите, а также для промывания
мочеиспускательного канала и мочевого пузыря. Некоторые изотопы радиоактивного серебра
применяются в лучевой терапии.
Вопрос о физиологической роли серебра изучен недостаточно. Серебро относят к потенци-
ально юксичным и к потенциально канцерогенным элементам.
Известно, что в организме серебро образует соединения с белками, может блокировать тио-
ловые группь ферментных систем, ут встать тканевое дыхание. В плазме крови серебро связы-
вается с глобулинами, альбуминами и фибриногеном. При длительном контакте с серебром на
производстве оно может накапливаться в печени, почках, коже и слизистых оболочках. Уста-
новлено. что лейкоциты могут фагоцитировать серебро и доставлять сю к очагам воспаления.
Основное количество серебра содержится в печени. Серебро обнаружено в мозге, в легких,
эритроцитах, пш меткой оболочке глаза, гипофизе.
Оценку содержания серебра в организме проводят по результатам исследования крови, мочи
и волос.
Причины и основные проявления дефици1а серебра в организме изучены недостаточно.
Причины избытка серебра:
• поступление серебра в организм в токсических дозах (в резутьтаге несчастных случаев);
• поступление в организм металлического серебра (при длительном кон акте);
• вдыхание ныли бромистого и сернистого серебра на производстве;
• длительное лечение препаратами азотнокислого серебра.
С целью выведения из организма избытка серебра назначают средства, оказывающие дре-
нажное действие на органы, коюрыс накапливают серебро (печень, почки), а также препараты
меди (для повышения активности медьзавиецмых ферментов). Показаны симптоматические
средства и хелатирующая терапия.
Основные проявления избытка серебра:
• признаки поражения ЦНС.
• расстройства зрения в результате отложения серебра н сетчатке глаза:
• першение в горле, кашель, насморк с кровянистыми выделениями, слезотечение (при вды-
хании пыли с солями серебра):
• снижение кровяного давления:
• бурый или сероватый оттенок кожи и слизистых оболочек (аргироз);
• боли в правом подреберье, увеличение печени:
• катаральные гастриты;
• тошнота, рвота, диарея;
• аргирия — образование отложений серебра в коже (при хроническом воздействии).
Синергисты и антагонисты серебра
Серебро — антагонист меди (угнетение Cu-зависимых ферментов).
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание серебра в моче.
Дополнительные: содержание серебра в плазме/сыворотке крови, волосах.
Токсикокинетичсские характеристики серебра приведены в табл. 8-43.
Токсическая доза серебра для человека 60 мг. летальная доза — 1,3—6,2 г.
Содержание серебра в биожидкостях и тканях организма человека при интоксикации и ле-
тальном исходе приведено в табл. 8-45.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 837
Т > тица 8-43 Токсикикинетичсскис характеристики серебра
Суточное поступление с продуктами питания 0.07 м»
Рс горбция и т ЖКТ в кровь 5Й
Суточное выведение:
моча 0.008 mi
кал 0.06 mi
ПО] 0.01104 mi
прочие (волосы и лр.) 0,00065 mi
Период полуиыведепия (Т, .)• 48—52; 80—160 сут
О6»»ем распределения (Vdi 9
Связывание с белками илпшы (Fb) 9
Среднее содержание:
ор»анизм человека массой 70 к» 1.1 Ml/кг
кости O.OU 1-0.44 mi/кг
мышиы 0.009—0.28 мг/кг
кровь 0.003 — 2.7 мкг (я
сыворотка кропи 0.002 мг/л
печень 0.005-0.02 мг/кг
моча ОДНИ мг/л
псы осы 0.005-0.2 мг/кг
зубы (эмаль) 0,004—2.2 мг/кг
Зубы (ДСНН1П) 0.005—0.56 mi /Ki
НОГТИ 0.003— 1.4 mi /кг
• По разным источникам
Таблица 8-44. Содержание серебра в бнож ил костях и гканях при интоксикации и легальном исходе
Бносубстр»гг Копна гтрапия п<1М интоксикации Концентрапня при летальном исходе
Сыноротка/плззма кропи 0.0083—0.01; > 0.3 мг/л
Мочи* 0.089; > 0.550 мг/сут
Печень 6.3 мг/кг
Мозг ( 0,6 мг/кг
Примечание. *Пп разным псточинкям
Золото (Ли)
Сплавы золота с другими тлагородиыми металлами широко применяются в пр» боростро -
нии. космической, электронно» и медицинской промышленное» и. при изготовлении ювелир-
ных изделий. медалей и монет.
В Средние иска юлою использовали при лечении туберкулеза, проказы, сифилиса, эпилеп-
сии. Iлатных, болезней, злокачественных опухолей. В настоящее время ripeiiapaib» на основе
различных солен золоти» (аураиофип. кризанол и др.) используются в терапии ревматоидного
и псориатического артрита. синдрома Фелти, красной волчанки. Препараты залога вводят как
внутр»», гак и парентерально в виде коллоидных рклтюров (так называемая хризотерапия)
Как правило, препараты золота имеют много побочных эффектов и противопоказаний. Ра-
диоактивное золото (|иАи) применяется при лечении некоторых опухолей и в первую очередь
рака легких. Золото оказывает антисептическое действие на бактерии и вирусы. Коэффициент
резорбции золота из ЖКТ в кровь в среднем составляет 10% Коллоидное золото всасывается
значительно меньше.
838 Глава 8
В организме взрослого человека содержится около 10 мг золота, примерно половина этою
количества находится в костях. Распределение золота в организме зависит от растворимости
сзо соединений Коллоидные соединения в большей степени накапливаются в печени, раство-
римые — в почках Сведения о скорости выведения золота из организма разноречивы (от 3 до
240 сут).
Механизм действия соединений золота до конца неясен, однако в настоящее время из-
вестно. что золото может входить в состав метал юнротеинов. взаимодействовать с медью и с
протеазами, гидролизующими коллаген, так же как и с эластазами и другими активными ком-
понентами соединительной ткани Золото может вовлекаться в процессы связывания гормонов
в тканях
Опенку содержания золога в организме проводят по результатам исследования крови, волос
и биопгатов. При отравлении золотом в моче повышается содержание копропорфирппв. дс-
льга-аммнолевуленовой кис.юты (ДАЛ К) подобно отравлению свинцом.
Золото относят к потенциально токсичным (иммунотоксичным) элементам Металлическое
золото почти не всасывается, данные о его токсичности отсутствуют. В то же время некоторые
соли золота обладают токсическим свойством сходным с таковым у ртути.
Несмотря на то что золото является инертным металлом, у части людей при ношении золо-
тых ювелирных украшений развивается контактный дерматит Иногда золото может вызывать
сенсиби нзацию организма при использовании в стоматологической практике, применении
золотых нитей для армирования лица и тела и в ряде других случаев.
Выражс iiioc раздражающее действие па кожу оказывают золота хлорид, трихлорид, цианид,
калия дицнаноаурат (который используется в электронной и химической промышленности, а
также при производстве фаянса).
Отравление золотом наблюдается очень редко. Механизм токсичности золота основан на
большом сродстве этого элемента к сульфгидрильным группам SH-содержащих белков, в ре-
зультате чего юл ото ингибирует SH-фермиггы. Этот механизм реализуется, например, при
лечении больных ревматоидным артритом, когда длительное введение препаратов золота при-
водит к снижению активности сульфгидрильных систем и энзимных комплексов лейкоцитов
и в конечном счете к уменьшению концентрации ревматоидного фактора. Однако негативное
действие избыточного количества золота легко снимается введением 2,3-димеркаигопронрв-
нола. SH-ipynna которою отрывает золою от SH-содсржатих белков, восстанавливая их нор-
мальные свойства.
Данные о нониженнном содержании золота и организме отсутствуют.
Причины избытка пота
• избыточное поступление
• передозировка при лечении препаратами золота.
При интоксикации золотом используются комплексообразоватсли димеркаптол бритаискип аи-
тилюизнт (2.3-димсркапто-1 про ынол (БАЛ) и D пеницилламин (дспсн. купренил, кунримин).
В качестве вспомогательных средств применяю! андрогены, кортикостероиды, антитимо-
цитарный глобулин В некоторых случаях показана пересадка костного мозга, применение
стимуляторов гемопоэза.
Основные проявления избытка золота
Острое отравление:
• состояние возбуждения:
• слюнотечение, металлический вкус во рту;
• рвота, спазмы, коликообразные боли в кишечнике, понос:
• выделение белка с мочой:
• кожные сыпи.
Хроническое отравление.
• симптомы угнетения ЦНС;
• боли ио ходу нервов;
• появление болезненных пятен на коже;
• усиленное потоотделение;
• боли в костях, суставах мышцах
• отеки ног;
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 839
• конъюнктивит:
• апластическая rinioiu зия костного мозга;
• панцитопения (лейкопения, тромбоцитопения):
• уменьшение массы тела.
Побочные явления и отдаленные последствия хрн ютераиии;
• повышение температуры тела, недомогание;
• зуд. воспаление кожи, генерализованная экзема;
• боли в костях и суставах;
• воспаление слизистых оболочек языка и полости рта;
• боли в глотке, рвота, понос:
• апластическая анемия:
• гломеру юпефрит: нефротический синдром.
Синергисты и антагонисты золота
Химические элементы, которые мотут быть синергистами и антагонистами золота. не уста-
новлены.
Индикаторы мсшнииии/интоксикиции
Приоритетные: в ногтях (нот и рук), волосах (корреляция с общим содержанием Au в ор-
гапи тме).
Дополнительные: содержание золота в моче (при высокой экспозиции), гдазме/сыворотке
крови.
Содержание киота в биожилкостях и тканях организма человека при легальном исходе
приведено и табл. 8-45
Таблица 8-45. Содержание золота в бножидкостях (в мт/л) и тканях (в мг/кг) при летальном исходе
Биосубстрагы Кровь Селезенка Печень Почки (корковое Почки (мозговое
вситеетпо) вещество)
Среднее значение 0.4 10.7 2.6 15.7 111.0
Элементы И группы Периодической системы элементов (бериллий, стронций, барий,
цинк, кадмий, ртуть)
Бериллий (Не)
Бериллий используется в сплавах с медью и никелем для увеличения их тепло- и злектро-
проводпости. применяется в атомной, авиационной и космической промышленности, прибо-
ростроении. производстве люминесцентных ламп. Бериллий является одним из компонентов
ракетного топлива. В медицине бериллии применяется в рентгеновских установках.
Бериллий относится к высокотоксичным химическим элементам. В организм человека бе-
риллий может поступать как с пишем. так и через легкие. При поступлении в растворимой
форме в ЖКТ бериллий взаимодсйсгаусг с фосфатами и образует плохо растворимый BeJPOJ,
или снизывается белками эпителиальных клеток в прочные протеинаты. Поэтому всасывае-
мость бериллия в ЖКТ невелика и зависит от кислотности желудочного сока.
Бериллий постоянно присутствует в крови, костной, мышечной ткани (0,001—0,(103 мкг/г)
и других органах. Установлено, чго бериллий может .депонироваться в легких, печени. .ihm(|ki-
гических узлах, костях, миокарде. Бериллий, поступивший в кровь, выводится нз организма
преимущественно с мочой.
Физиологическая роль бериллия изучена недостаточно, однако известно, ч-го бериллий мо-
жет принимать участие в регулянии фосфорно-кальннсвого обмена, поддержании иммунного
статуса оргапнзм.1. Установлено. ч ю активность соединений бериллия опстливо проявляется в
различных биохимических превращениях, связанных с участием неорганических фосфатов.
Оценку содержания бериллия в организме проводят по результатам нсслежшинпя мочи, волос,
плазмы (сыворотки) крови. Допиши подно определяют копненграцию магния в волосах и плазме
(сыворотке) крови, изучается содержание сывороточных белков и аминокислот в моче. При ин-
токсикации бериллием уровень IgG и IgA повышен. IgM и аминокислот и моче понижен
840 Глава 8
Для полгверждення диагноза хронического бергг.ыиоза исггользуют следующие гее гы:
• определение содержания бериллия u биот аге костной ткани;
• определение содержания бериллия в биопгагс легочной ткали;
• определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови;
• опенка функции легких;
• определение клиренса мочевой кислоты (снижение показателя свидетельствует о бсриллиозс).
Повышенное содержание бериллия в нише сиособсгнуст образованию фосфата бериллия и
разрушению костной ткани. Известно, что введение бериллия животным вызывает бериллие-
вый рахит и даже небольшое количество бериллия и составе костей приводит к их размягчению
(бериллии г). В местах парентерального введения бериллия происходит разрушение окружаю-
щих тканей. Депонируется бериллии в костях и печени.
Бериллий — токсичный, канцерогенный и мутагенный элемент. Патогенное действие бе-
риллия наблюдается при его ингаляции в концентрациях. которые превышают ПДК в 2 раза
и более. Соли бериллия и концентрации 1 мкмоль/л специфически ингибируют активное гь
щелочной фосфатазы, уг нетаюше действуют на другие ферменты. Достаточно хорошо изучены
иммунотежснческне свонспы бериллия. Рахгичают острые и хронические отравления берил-
лием Известно, например, чю хгиминашгя соединений бериллия из организма (особенно
из органов лимфатической системы, где они аккумулируются) происходит чрезвычайно мед-
ленно. в течение более 10 лет. Повышенный уровень бериллия встречается в семьях рабочих,
контактирующих с ним на произволе г вс.
Данные о пониженном содержании бериллия в организме отсутствуют.
Причина избытка бери тин:
• избыточное поступление.
Для предупреждения развития патологии, вызываемой контактом с соединениями бериллия
на производстве. необходимо строю соблюдать правила техники безопасности (использование
респиратора, сменной одежды и г.л.). устранять действие на организм возможных раздражите-
лей (иикогни. холодный сухой воздух, спреи).
При хронической иигсксикацигг необходимо сменить место работы.
Для лечения бериллпоза применяются специальные препараты, способные обеспечить свя-
зывание и выведение из организма попои бериллия. препараты магния, а также стероиды,
броиходилататоры. кардиотрогпгые препараты. иммуностимуляторы.
Основные проявления избытка бериллия:
• поражение легочной ткани (фиброз, саркоидоз);
• поражения кожи — экземы, эритемы, дерматоз (при контактах соединений бериллия с ко-
жей);
• бериллиоз;
• литейная лихорадка (ра сражение слизистых обо. очек глаз и дыхательных путей).
• эро ши ели зиетых оболочек ЖК Г;
• нарушения функции миокарда, печени,
• развитие аутоиммунных процессов. опухолей.
Синергисты и антагонисты бсрииин
Антагонистом бериллия является магнии. Магний в организме преимущественно находится
штугри клеток, где образует соединения с белками и нуклеиновыми кислотами. содержащие
связи Mg-N и Mg-О. Сходство физико-химических характеристик ионов Вс’* и Mg2’ обуслов-
ливает их способность к взаимному замещению в таких соединениях. Это объясняет, в част-
ности. ингибирование магннисодержащнх ферментов при попадании в организм бериллия.
Индикаторы зкспозиции/интоксикаиии
Приоритетные: содержание бериллия в моче, биоптатах костной ткани и легочной ткани.
Дополнтгтельныс: содержание бериллия в плаэмс/сывароткс крони. Mg в плазмс/сыворотке
крови. бел юг в сыворотке крови (уровень IgG и IgA — повышен. IgM — снижен), содержание
аминокислот в моче — снижено; тестирование функций легких; клиренс мочевой кислоты
снижен.
Токсикокинсг ическис характеристики бериллия приведены в табл. 8-46.
Содержание бертсыия в моче при интоксикации и летальном исходе приведено в табл. 8-47.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 841
Таблица 8-46. Токсикокинсгические характеристики бериллия
Суточное поступление с пролу игами питания 0,0! 2 мг
Суточное поступление с воътухом О.О00ОО9 mi
Резорбция, из ЖКТ в кровь 1-10%
Суточное выведение:
моча 0,00! мг
кал 0,01 мг
ПОТ —
прочие (волосы и др.) —
Период нолунывеления ('I /}) 1040 сут
Объем распределения (Vd) 9
Связывание с белками плазмы (ГЪ) 0.7
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кг 0.036 мг
КОС ГМ 0.0003 мг/кг
мышиы 0.00075-0.032 мг/кг
кровь < 0.001 мг/л
моча 0 (Ю05 мг/л
полосы 0,005—0,01 мг/кг
Таблице 8-47. Содержание бсри.иия в моче при интоксикации и летальном исходе
Бносубстрят Концентрация при интоксикации Концентрация при летальном исходе
Моча > 0,02 мг/л 1,7—1,9 мг/.ч
Стронций (Sr)
Стронций применяется при производстве кинескопов телевизионной аппаратуры. Строн-
ций используется в мспилургип, производстве аккумуляторов и пиротехнических средств.
В медицине радиоактивные изотопы VJSr и **"Sr применяют в лучевой терапии костных опу-
холей. Изотопы стронция могут образовываться при ядерпых взрывах и авариях на объектах
ато.мной энергетики и приводить к поражению костного мозга и развитию лейкемии и рака
костей. Особо опасен лля организма радиоактивный стронций-90, который при попадании в
костную ткань способен воздействовать на костный мозг и нарушать процессы кроветворения.
Ингаляция соединений стронция индуцирует фибротические изменения в легких.
При избыточном поступлении стронция возникает так называемый стронциевый рахит или
уровская болезнь. Это эндемическое заболевание, впервые обнаруженное у населения, про-
живающею вблизи реки Уров в Восточной Сибири. Уровская болезнь возникает вследствие
вытеснения ионов кальция ионами стронция из костной ткани или попышепного поступления
в организм стронция на фоне дефицита кальция. Накопление в организме стронция приводит
к поражению всего организма, однако наиболее типичным для этого тбозевапня является раз-
витие дистрофических изменений костно-суставной системы в период роста и развития орга-
низма (формируется симметричный деформирующий остеопороз из-за торможения роста кос-
тей со стороны метаэпнфпзарных хрящей). Болезнь у человека впервые описана российскими
врачами Н.М. Кашиным и Е.В. Беком в I895—1900 гг. (второе название уровской болезни —
болезнь Кашина—Бека). Как правило, это заболевание сопровождается выраженным наруше-
нием фосфорно-калышевого соотношения в крови, дисбактериозом кишечника.
Причины избытка стронция
• избыточное поступление;
• нарушение регуляции обмена стронция.
Для выведения избытка стронция из организма используют препараты мапшя. кальция, расти-
тельные нишевые волокна, сульфат натрия. При интоксикации стронцием показан \а,Са-ЭДТЛ
842 Глава 8
Основные проявления избытка стронция;
• рахитоподобные заболевания;
• уровская болезнь;
• фиброз ЛСТ ких.
Синергисты и антагонисты стронция
Калышй. входящий в состав костной ткани, по своим свойствам близок к стронцию, поэ-
тому ионы стронция могут замешать калыгпй в костях. При этом наблюдается как синергизм,
так и антагонизм стронция. Витамин D. лактоза, аминокислоты, лизин и аргинин улучша-
ют абсорбцию стронция. Богатая нишевыми волокнами растительная пиша, сульфат натрия
уменьшают усвоение стронция.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание стронция в волосах, моче.
До1юлни1слы1ые: содержание стронция в рубцах. бпоптагах костной ткани.
Токсикокинетичсские харвктсрисгнки стронция приведены в табл. 8-48.
Таблица 8-48. Токсикокипстическис характеристики стронция
Суточное поступление с продуктами питания 1.9 мг
Резорбция из ЖКТ в кровь 10-60%
Суточное выведение:
моча 0.34 мг
кал 1.5 мг
пог 0.02 mi
прочие (полосы и др.) ___________________0,00Q2 яг_______________
Период полувыведения (Т|/5) До 900 суг
Объем распределения Vd о
Снизывание с белками плазмы (ГЪ) 9
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кг 320 мг
KOCHI 36—100 мг/ki
МЫШЦЫ 0.12-0,35 мг/кг
кровь 0,031 мг/л
сыворотка крови 0.01—0.100 мг/л
моча 0,17 мг/л
волосы 0.25—15 мг/кг
зубы (эмаль) 70—100 мг/кг
зубы (дентин) 81 110 мг/кг
ногти 0.017-0.65 мг/кг
печень 0.05—0.15 мг/кг
Барий (Ва)
Барий применяется преимущественно в виде соли BaSO4 в нефтяной и газодобывающей про-
мышленности. при производстве стекол, красок, эмалей, в вакуумной и пиротехнике. В медици-
не его используют как контрастное вещество при рентгенологических исследованиях ЖКТ.
Барий относится к токсичным микроэлементам. Содержание бария в организме взрослого
человека составляет около 20 мг, среднесуточное поступление — 0,3—I мг. Вс(сывасмость
растворимых солей бария в желудочно-кишечном тракте составляет около 10%. иногда до
30%. В дыхательных путях резорбция достшаст 60—80%. Содержание бария в нлазме крови
изменяется параллельно изменениям концентрации кальция. В незначительных количествах
барий находится во всех орга tax и тканях. Около 90% всего содержащегося в организме бария
находится в костях и зубах.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 843
Установлено. что при ишемическом болезни сердца, хронической коронарной псдосгагоч-
ггосги. заболеваниях органон пищеварения содержание бария в тканях снижается. Даже в нич-
тожных концентрациях барий оказывает выраженное влияние на гладкие мышцы.
Оценку содержания бария в организме прогкъгят по результатам исследований крови. мочи и
волос. Среднее содержание бария в организме человека 22 мг (из них в костях— 20 мг). концент-
рация плазме крови составляет 50-90 мкг/л. в моче — 1.5-5.0 мкг/л. в волосах — 0,2- 1.0 мкг/г.
Барий оказывает нейротоксическое, кардиотоксическое и гематотоксическос действие. Дан-
ные о пониженном содержании бария в организме отсутствую!
Причина избытка бария:
• избыточное поступление, в том числе за счет производственных и бытовых отравлений
При отравлении солями бария и качестве ант илотов применяют растворимые серпокислые
соли иазрия и магния, способствующие образованию трулнорастворимых сульфатов бария,
которые затем удаляются из организма.
Основные проявления избытка бария
Острое отравление:
• жжение во рту и пищеводе, обильное слюноотделение, тошнота, рвота колики, диарея.
• головокружение, шум в ушах |мсс родства координации движений и мозговой деятельности.
• бледность кожных покровов, обильный хо.го ныи пот:
• слабость пульса, брадикардия, экстрасистолия
Хроническое отравление:
• пневмокониоз (бари юз). развивающийся при хроническом вдыхании пыли сульфата бария
и отличающийся относительно доброкачественным течением
Синергисты и антагонисты бария
Кальций, в основном выходящий в состав костной ткани. по своим свойствам близок к
барию, поэтому ионы бария могут замешать кальций в костях. При пом наблюдается как си-
нергизм. так и антагонизм.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: со «.ржание бария в волосах, ногтях.
Дополнительные: содержание бария в моче.
Содержание бария в биожилкоегях и тканях организма человека при зет и.ном исходе при-
ведено в табл. 8-49.
Таблица 8-49. Содержание бария в биожи костях (мг/кг) и тканях (мг/л) при летал ном исходе
Биосубстрагы Кровь Мозг Печень Желчь Почки Селезенка
Среднее значение 1.9 0,4 1 6 6.1 7.5 5.9
При интоксикации концентрация бария в цельной крови составляет 0,26 мг/л, в моче —
0.2Х мг/л.
Линк (Zn)
Нинк используется при гальвани зации железа, в сплавах (латунь); в аккумуляторных бата
реях и как стабилизатор полимеров. Природным источником цинка являются минералы (сфа-
лерит).
В мелипиие цинк применяют в радиоизотоп ной диагностике, в том числе как метку для
нинксодержаших ферментов. Сульфат цинка используют при определениях свертываемости
крови. В последние годы соединения Zn (глюконат, аспарагинат, пиколинат и др.) стали ши-
роко применяться в дерматологии, эндокринологии, при лечении иммунодефицитных состо-
яний.
Цинк можно обнаружить во всех органах и тканях, но наибольшее его количество содер-
жится в гипофизе, предстательной, поджелудочной железе, сперме, коже, волосах, мышечной
ткани. клоках крови На рис. 8-50 представлена схема обмена цинка в организме человека
844 Глава 8
(депо в печени)
Рис. 8-50. Обмен цинка н организме человека.
Цинк являе1ся кофактором большой группы ферментов, участвующих в белковом и других
видах обмена, поэтому он необходим для нормального протекания многих биохимических
процессов (см. гл. 8. 5.1). Этот элемент требуется лля синтеза белков, в том числе коллагена, и
формирования костей. Цинк принимает участие в делении и дифференцировке клеток, спер-
матогенезе. формировании Т-клеточного иммунитета, выработке инсулина поджелудочной же-
лезой. регенерации кожи, росте волос и попей, секреции сальных желез, биотрансформации
алкоголя (см. гл. 8.1), кроветворении, ранозаживлении. способствует всасыванию витаминов А
и Е. поддержанию их нормальной концентрации в крови.
Опенку содержания цинка в организме проводя ио резу штатам исследования волос, сыво-
ротки и цельной крови. Определяют активность ферментов карбоат гидразы. сорби(дегидроге-
назы. лактатдегидрогеиазы и щелочной фосфатазы.
Пониженное содержа те цинка в органшме
Нередко снижение содержания цинка в организме может быгъ следствием избыточного
поступления в организм меди, кадмия, свинца, являющихся функциональными антагонистами
пинка, особенно на фоне неполноценного питания (дефицит белка), а Также хронического
злоупотребления алкоголем. Роль Zn при алкогольной интоксикации обусловлена его участи-
ем в метаболизме алкоголя (молекула тыкоголмсгидрогеиазы содержит 4 атома Zn). На фоне
дефицита Zn могут происходить задержка полового развития у мальчиков и потеря сперматозо-
идами способности оплодотворения яйцеклетки у мужчин. Дефицит пинка способствует уси-
ленному накоплению кадмия, свинца, железа и меди. Избыточное поступление цинка может
понизить общее содержание и поступление в орышидм такого важною элемента, как мель.
Причины дефицита цинка'
• состояния после операции, ожоги, парентеральное питание:
• избыточное поступление в организм эстрогенов, кортикостероидов, диуретиков и некото-
рых других лекарств:
• избыточное поступление в организм меди, кадмия, свинца, ртути.
• злоупотребление алкоголем;
• усиленное расходование цинка (например, при беременности, кормлении грудью, в период
заживления ран и выздоровления посте боле ши):
• нарушение всасывания цинка в кишечнике (дисбактериоз, ферментопатии и пр.);
• кишечные паразиты.
• псориаз, себорея, повышенная потливость.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 845
Основные прояа ei ия дефицита цинка:
• раздражительность, утомляемость, потеря памяти, нарушение сна,
• гиперактивность:
• депрессивные состояния:
• предрасположенность к алкоголизму:
• снижение остроты зрения:
• потеря вкусовых ошушений, язвы во рту;
• расстройства обоняния*
• снижение аппетита;
• диарея:
• уменьшение массы тела, исхудание;
• ' накопление в организме железа, меди, кадмия, свинца;
• чешуйчатые высыпания на коже, угри, фурункулез, экзема, дерматит. псориаз, трофиясские
язвы, плохое зажиатепие ран:
• расслаивание ногтей, пояатенис на них белых пятен;
• тусклый цвет волос, перхоть, замедление роста, выпадение волос:
• снижение уровня инсулина, риск развития сахарного диабета:
• задержка роста, позднее половое созревание у детей (особенно у мальчиков);
• снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов;
• снижение сексуальной активности, импотенция у мужчин:
• увеличение риска развития аденомы простаты
• преждевременные роды, рождение ослабленных детей, стерильность у женщин
• снижение Т-клеточиого иммунитета, снижение сопротивляемости инфекциям:
• частые и длительные простудные заболевания.
• аллергические заболевания;
• анемия:
• увеличение риска развития опу отевых процессов:
• ускоренное старение.
Повышенная концентрация пинка в волосах обычно свидетельствует о нарушении обмена
er шести, которое может привести к дефициту и перераспределению цинка в организме, а нс об
избыточном поступлении цинка в организм, хотя это тоже возможно.
Причины избытка цинка:
• избыточное поступление (при контакте с соединениями цинка на производстве);
• неконтролируемое использование препаратов цинка, в том числе мазей;
• нарушение регуляции обмена цинка.
Основные проявления избытка цинка:
• нарушения иммунной системы, аутоиммунные реакции
• нарушения состояния кожи, волос, ногтей
• болезненная чувствительность желудка, тошнота;
• снижение содержания в организме железа, меди, кадмия;
• ослабление функций предстательной железы.
• ослабление функций поджелудочной железы:
• ослабление функций печени.
Синергисты и антагонисты цинка
Функциональными антагонистами пинка являются медь кадмий, свинец, особенно на фоне
дефишгга белка. Повышенное поступление (фитатов, фосфатов, избыток кальция, прием корти-
коидов. оральных контрацептивов, анаболиков, аптиметаболитов, диуретиков, алкоголя, имму-
носупрессоров могут привести к дефициту пипка в организме. Витамин А — синергист цинка
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание цинка в моче, плазме и цельной крови, волосах.
Дополнительные: содержа! ие цинка в слюне, определение ретинолсвязывающего белка,
активность карбоангидразы; нарушения обоняния и вкуса
Токсикокипстическис характеристики цинка приведены в табл. 8-50.
846 Глава 8
Таблица 8-50 1оксикокинст ическис характеристики цинки
Суточное поступление с продуктами питания 13 мг 16 мг — мужчины, 12 мг — жеишины
Суточное поступление с воздухом 0.01 мг
Резорбция из ЖКТ в кровь 20-30%
Суточное выведение:
моча 0,5 мг
кал 11 мг
ПОТ 0.8 мг (2—3 мг в жарком климате)
прочие (волосы и др.) 0.03 мг
Период иолувыведения (Т|/2) 245 сут
Объем распределения (Vd) 7
Связывание с белками плазмы (Fb) 0.99
Среднее содержание:
оршнизм человека массой 70 кг 1.3-2.3 г
кости 75—170 мг/кг
кровь 4—8.6 мг/л
плазма/сыворотка 0.55—1.3 мг/л
печень 15—150 мг/кг
МЬЦДИЫ 240 мг/кг
моча 0.25 мг/л
ВОЛОСЫ* 50—400 мг/кг 124-320 мг/кг
НОГ! И 73—304 мг/кг
зубы (эмаль) 173-250 мг/кг
зубы (дентин) 200—365 мг/кг
। рудное молоко 0.75—4 mi /л
* По разным источникам
Токсическая доза цинка для человека (при хроническом поступлении) — 150—600 mi, ле
тальная доза —6 г
Содержание цинка в биожидкостях организма человека при интоксикации и ле1алыюм
исходе приведено в табл 8-51
Таблица 8-51. Содержание цинка в биожидкостях при интоксикации и летальном исходе
Бносубстрат концентрация при интоксикации, концентрация при «стальном исходе,
мг/л мг/л
Цельная к вь 29-50
Сыворотка/плазма крови •14.6-50 [> 50
Моча Более 1 мг л 1
Кадмий (Cd)
Кадмий относится к высокотоксичным металлам.
Кадмии применяется в ядерной энергетике, электронной и радиотехнической промышлен-
ности, при производстве аккумуляторов, различных сплавов и красок, в качестве стабилизи-
рующей добавки при получении пластмасс. Кадмий попадает в окружающую среду с отходами
цветной металлургии и при производстве минеральных удобрений.
В медицинских целях сульфат кадмия используют при определении свертываемости крови.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп. 847
Физиологическая роль кадмия изучена недостаточно. Кадмий обладает гонадотропным, му-
пнснным. канцерогенным, эмбриотроппым свойствами. способствует возникновению почеч-
ной дисфункции. Описано массовое отравление кадмием жителей Японии, вызвавшее остео-
маляцию, нефропатию, болезненность и многочисленные переломы костей (болезнь itni-iiai).
При хроническом к шмиозе в первую очередь поражаются мочевыватяшая и половая системы.
Наблюл по к я протеинурия, злюкозурия. аминоацидоурия. р -микрсилобулинурия (см. гл. 2.4).
проскпопвгия с риском возникновения новообразовании и некроза яичек, в моче обнару-
живается ретинолсвязывающпй белок. Поражение бронхолегочной системы сопровождается
фиброзными изменениями и повышением риска возникновения эмфиземы. Развивается ане-
мия, связанная со снижением всасывания железа в кишечнике и лизисом эритроцитов. По-
вышается артериальное давление. Отмечаются остеопластические и остеопорозные изменения
костной ткани. что связано с нарушением абсорбции кальция в кишечнике и эндокринными
расстройствами.
Установлено, что кадмий тормозит превращение 25-пзлроксик пызифероча в 1,25-дигид-
рохолскалышфсро i и ингибирует активность лнзилоксидазы в костях. Кадмий связывается с
меркаптогруппами. фосфолипидами. нуклеиновыми кислотами и влияет на процессы фосфо
рилирования.
Кадмий, поступающий в организм с вдыхаемым воздухом, усваивается значительно лучше,
чем поступающий с нишей и водой. Выкуривание всего одной сигареты увеличивает поступ-
ление кадмия в организм на 0.1 мкг, т.е. существенно повышает риск интоксикации кадмием.
Доказана роль кадмия в развитии рака легких п рака почек у куря ших. а также патологии
предстательной железы
Кадмий в организме человека транспортируется белком металлотионеином (см. гл. 8.5 1).
аккумулируется в основном в почках, печени и двенадцатиперстной кишке. С возрастом со-
держание кадмия в организме увеличивается, особенно у мужчин
Эстрогены у илввают выведение кадмия, чзи может быть связано с активизацией обмена мети.
Проявление дефицита кадмия — замедление роста — установлено в эксперименте па лабо-
раторных животных.
Причины избытка кадмия:
• избыточное поступление;
• дефицит ииика. с< сна. меди, кальция. желе а.
Для профилнктики кал миоза необходимо избегать контактов с кадмием. строго выполнять
правила техники безопасности на производстве, не курить и не вдыхать табачный дым Токси-
ческое действие кадмия мозут ослабить ниша, богатая белком, витаминно-минеральные комп-
лексы. содержащие Zn. Cu. Fe. Se, Са, фосфаты, витамины D. С. В6, метионин
При остром и хроническом отравлении кадмием назначают комнлексообразователи. Хе-
латирующая терапия включает 2,3-лимеркаптосупцн11овую кислоту (ДМСК). Na.Ca-ЭДТЛ в
комбинации с гемодиализом зз введением глютатиона. а также симптоматические средства —
диуретики, стероиды и пр.
Основные проявления избытка кадмия:
• простатопатия:
• карднопатия, гипертония;
• эмфизема легких;
• остеопороз, дефор ания скелета;
• нефропатия:
• анемия;
• дефицит цинка, селена, меди, железа, калышя.
Синергисты и антагонисты кадмия
S. Sc, Zn, Си. Са и растительные нишевые волокна замедляют усвоение кадмия.
Индикаторы зкепозиции/интоксикаиии
Приоритетные: содержание кадмия в моче, цельной крови, волосах, содержание р,-мнк-
роглобулина в моче.
Дополнительные: содержание ретииолсвязываюшсго белка, иммуноглобулинов в моче, по-
вышенное ицдслснис Са. Zn. Си. Р с мочой.
Токсикокинетические характерззетикн кадмия приведены в табл. 8-52.
848 Глава 8
Таблица 8-52. Токсикокинстичсскис характеристики кадмия
Суточное поступле те с продуктами питания__ 0 1^мг
Суточное поступление о воздухом OjWl мг
Резорбция из ЖКТ и легких в кровь 5% (Ж К , 10—50% (легкие}
Суто шое выведение
моча 0,005 мг
кал 0,05 мг
пот —
прочие (волосы и лр.) —
Период полувыведения (Т1П) 13-47 лет
Объем распределения (Vd) 9
Связывание с белками плазмы (Fb) 9
Среднее содержание:
организм человека массой 70 ki 50 мг
кости 1.8 мг/кг
мышиы 0.14—3,2 мг/кг
кровь 0,003-0,009 мг/л. до 0.009 мг/л — некурящие; до 0.015 мг/л — курящие
сыворотка/ плазма крови 0,0001—0.0015 мг/л
моча 0.002 мг/л
волосы 0,35—2,43 мг/кг
зубы (эмапь) 0.1—0.12 мг/ki"
зубы (дентин) < 0.0001—0,51 mi /кг
ногти 0.08—3,4 мг/кг
печень 0.3—4.1 мг/кг
грудное молоко 0,00007-0,0046 мг/л
Токсическая доза кадмия для человека 3—330 mi. летальная доза — 1.5—9 г. Кадмий явля-
ется одним из основных поллютантов окружающей среды.
Содержание кадмия в биожилкоегях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в габл. 8-53.
Таблица 8-53. Содержание кадмия в биожилкоегях (в мг/л) и тканях (в мг/кг) при летальном исходе
Биосубстраты Кровь Мозг Печень Почки корковое вещество Почки (мозговое вешество
Среднее значение ... 80.0 80.0 8.9
Ртуть (Hg)
Ргуть является высокотоксичным металлом.
Ртуть исполь устся в промышленном производстве мора и NaOH. в электроаппаратуре,
люминесцентных лампах, фунгицидах и т.д. Применение ртутных соединений в качестве ле-
чебных средств началось в глубокой древности при лечении кожных заболеваний и сифилиса.
В современной медицине используется противовоспалительное. внтисептичсское н дезинфи
пирующее действие ртути. Ргуть используют в термометрах, манометрах, ртутно-кварцевых
лампах и других приборах медицинского назначения.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 849
Токсичность ртути зависит от химической формы, в которой она попадает в организм (см.
гл 8.5 I и 8.5.4) Элементная ртуть очень хорошо резорбируется в респираторном тракте. Ор-
ганические соединения ртути (алкилртутпые и арилртутные соединения) всасываются в ЖКГ
практически полностью, выводятся из организма в основном с калом (80^) и мочой. Макси
мальная концентрация ртути отмечается в почках.
При хроническом отравлении ртутью развивается синдром меркуриализма с наруше-
ниями деятельности ЦНС и пишеваритетьного тракта, возникновением дерматозов (мер-
куриализм кожи). В Японии описано массовое отравление ртутью населения, получившее
название «болезнь Минамлта». Данные о пониженном содерж пин ртуги в организме ог-
сутствуют.
Причины избытка ртути:
• избыточное поступление в организм при бытовых и профессиональных отравлениях:
• потребление загрязненных пищевых продуктов;
• долговременный прием ртутьсояержаишх препаратов.
При умеренном накоплении ртути в организме назначают мочегонные средства. npeiiapaibi
и БАД, содержащие селен, серу, цинк и витамин С.
Для лечения отравлений ртутью и ее соединениями использую! БАЛ. ДМСК. натриевую
соль 2,3-димеркаптопропапсулы1юновоз) кислоты (ДМПС), сукпимср.
Основные лронтения избытка ртучпи:
• психические нарушения головная боль, утомляемость, тревожность, раздражительноегь;
• ртутная энцефалопатия, сопровождающаяся нарушениями психики и интеллекта:
• астеновегетатнвный синдром, мозжечковая атаксия, нарушения зрения и слуха, тремор кис-
тей рук, век. губ и всего тела;
• ртутная токсикодермия. диффузная сливная сыпь, иногда геморрагического характера, эк-
зема. выпадение волос, ломкость ногтей.
• лабильный пульс, тахикардия, высокая лихорадка;
• ртутный стоматит, гингивит, отек, эрозии и язвы слизистой оболочки по ос!и рта. омерт-
вление челюстных отростков, выпадение зубов;
• ртутный язвенно-некротический гастроэнтерит, гастралгия. колики, понос. изъязвление и
некроз стенки толстой кишки;
• язвенно-некротический нефрозонефрит. протеинурия, боли, нарушение выделительных
функций вплоть до анурии:
• расстройства менструального никла, выкидыши, внутриутробная гибель г зола;
• изменение состава крови, гемолиз эритроцитов, нарушения кроветворения, анемия с тяже-
лым течением.
Для острого отравления парами ртути характерны повышение температуры (церебрального
генеза), одышка, эмфизема легких, цианоз, для хронического отравления — тремор, раздражи-
тельность. поражения зубов и десен, акроднния (у детей).
При остром отравлении неорганическими соединениями ртути наб.иолакнея эрозии сли-
зистых оболочек глотки и гортани, тошнота, рвота, а при хроническом отравлении к этим
симптомам присоединяется протеинурия Острое отравление органическими соединениями
ртути проявляется сужением полей зрения, расстройством речи и движений, парестезией.
Хроническое отравление сопровождается поражением ЦНС. расстройством слуха и зре-
ния.
Синергисты и антагонисты ртути
Антагонистами ртути являются пепсин, аминокислоты. Se. Zn. S и витамин С.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание ртути в цельной крови, проксимальных (2.5 см) утайках волос,
суточной моче.
Дополнительные: активность лизосомальных ферментов в сыворотке крови, содержание
белка в моче (см. гл. 8.5.4).
Токсикокинетические характеристики ртути представлены в табл. 8 54.
850 Глава 8
Таблица 8-54. Токсцкокинстнчсские характеристики рту in
Суточное поступление с продуктами питания 0.004—0.02 мт 0,015 mi (в среднем)
Суточное поступление с воздухом 0.1)04—0.02 mi
Резорбция из ЖКТ и легких в кровь. % -1% из ЖКТ (элементная) 80% (пары) из легких 8 15% (неорганические соединения) 90—100% (органические соединения
Суточное выведение:
моча 0.004 мг
кал 0.01 мг
ПСИ следы
прочие (ВОЛОСЫ и лр.) 0.001 мг
Период полувыведения (Т, ) 30 сут — неорганические соединения 60 сут — органические соединения
Объем распределения Vd 9
Связывание с белками плазмы (1Т>) 9
Среднее содержание
организм человека массой 70 кт 0.4—1.04 мг/кг
кости 0.45 мг/кг
мышиы 0.02—0.7 мг/кг
кровь 0.003-0.011 мг/л
сыворотка/ плазма крови 0.02-0.058 мг/л
моча 0,002 мг/л
полосы 0.5 1.5 мг/кг
зубы (дентин) 0.11-3.2 мг/кг
ногти 0.07-7.3 mi /кг
печень 0.14 -1,3 мг/кг
грудное молоко 0.0002-0.013 .мг л
Т оксическая лаза ртути для человека 0.4 мг, летальная доза 150—300 мг.
Содержание ргути и биожидкостях и тканях организма человека при легальном исходе
вследствие воздействия органических соединений ртути представлено в табл. 8-55.
Таблица 8-55. Содержание ртути в биожндкостях (в мг/д) и тканях (в мг/кп при детальном исходе
Бпосубстраты Кровь Мозг Печень Почки Моча
Среднее значение |2.6 (0.6—6.0) 27 (18-35) 30 (4,2-78) 22(2.4-41) 0.8 (0.8)
При интоксикации концентрация ртути в цельно* крови составляет 0.18—0.62 мг/мл. в
плазме крови — 0.8 мг/л. в моче - 0.09—0.25 мг/л: > 0.15 мг/сут. в печени 2.4—76 мг/кг. в
волосах 60—200 мг/кг и более.
Элементы III группы Периодической системы элементов
(бор, алюминий, галлий, таллий)
Бор (В)
Соединения бора применяются для повышения твердости и жаропрочности стальных из-
делий: при строительстве атомных реакторов, ракет: в стекольной и химической промышлен-
ности. В медицине издавна применяют соединения бора: борную кислоту, буру. Известно, что
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 851
соединения бора обладают противовоспалительным. гнполипидсмическим и противоопухоле-
вым свойствами. Препараты бора оказывают лечебное действие при остеопорозе, артритах и
костном флюорозе. Буру назначают при начальных стадиях развития эпилепсии.
Содержащийся в нише бор быстро и поч1и полностью всасывается. В ортанизмс содержится
около 20 мг бора, и з них 40% в мышцах и 37% в скелете. Бор обнаруживается во всех тканях и
органах человека, однако в зубах и ногтях его концентрация в несколько раз выше. Бор выво-
дится из организма в основном с мочой (77%).
В некоторых регионах мира из-за повышенного содержания бора в окружающей среде в
организм человека полапает ежедневно 17—27 мг бора, и тогда его концентрация в крови зна-
чительно возрастает. Описано такое эндемическое заболевание, как борный энтерит, которое
встречается на Южном Уряде и на севере Казахстана.
Бор шрает существенную роль в обмене углеводов и жиров, ряд» витаминов и гормонов,
влияет на активность некоторых ферментов. Показано, что введение бората натрия в дозе 5—
10 мг/кг вызывает повышение уровня сахара в крови. Под влиянием боратов инактивируются
витамины В и В,,. угнетается окисление адреналина.
Имеются данные, свидетельствующие о том, что бор играет регуляторную роль по отноше-
нию к л раттормону и поэтому может косвенно влиять на метаболизм кальция, магния. с|хэс-
фора и витамина D. Соединения бора используются в лечении и профилактике остеопороза.
Оценка содержания бора в организме возможна по результатах! исследования мочи, плазмы
или сыворотки крови, реже волосам (см. гл. 8.6).
Бор относят к условно-эссенциальным, иммунотоксичным элементам. Считается, что сред-
несуточной безопасной дозой бора для человека является I3 мг.
Спринцевания раствором борной кислоты могут вызвать симптомы интоксикации. Об-
работка сосков кормящих матерей раствором борной кислоты может вызвать отравление
у грудных детей. При острей) интоксикации соединениями бора (бурой, борной кислотой)
наблюдаются рвота и друз не диспепсические расстройства, а также шок. При вдыхании га-
зообразных соединений бора могут развиться судороги, мышечные боли, психические пару
шения, диплопия.
Причины дефицита бора:
• недостаточное поступление бора:
• нарушение регуляции бора
Основные проявления дефицита бора:
• задержка роста;
• нарушение минерального обмена.
Причина избытка бора:
• избыточное поступление.
Основные проявления избытка бора
Острая интоксикация:
• тошнота рвота диарея;
• рибофлавинурия;
• дерматит;
• летаргия.
Хроническая интоксикация:
• потеря аппетита, тошнота, рвота водянистый стул, обезвоживание организма;
• сыпь и шелушение кожи:
• снижение половой активности, ухудшение показателей снсрмограммы
Синергисты и антагонисты бора
Бор тормози г всасывание аскорбиновой кислоты, флавоноидов, серосодержащих амино-
кислот. В то же время бор является синергистом хлора, усиливает действие концентриро-
ванного алкоголя и некоторых антибиотиков. Обнаружена положительная корреляция между
метаболизмом бора и цинка.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание бора в моче, плазмс/сыворогке крови.
Токсикокипстическис характеристики бора представлены в табл. 8-56.
852 Глава 8
Таблица 8-56. I оксикок1шетические характеристики бора
Суточное поступление с продуктами питания 1.3 mi (1,1 mi — с ни- шей. 0,23 мг — с водой)
Резорбция из ЖКТ -100%
Суточное выведение.
моча 1.0 Ml
кал 0.22 мг
пот —
прочие (волосы и яр) 0.001 mi
Период полувыведения (Т, , 12-27 ч
Объем распределения (Vd) 0,17—0.50 л/кг
Связывание с белками плазмы (ГЬ) менее 10%
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кг 20 мг
кости 1,1—3.3 мг/кг
мышцы 0,33—1 мг/кг
кровь 0.013—2 мг/л
грудное молоко 0.27 мг/л
моча 0.5 мг/л
волосы 0,1—3.5 (7,5) мг/кг
зубы (дентин) 5 mi/ki
ногти 33 мг/кг
почки 0.6 мг/кг
печень -0.2 mi/ki
При интоксикации бором концентрация его в крови составляем более 20 мг/л.
Токсическая доза бора для человека 4 г.
Алюминий (А1
Соединения алюминия широко используют в авиационной промышленности, металлургии,
электротехнике, нишевой промышленности и ряде других областей.
И медицине применяют лекарственно препараты, содержащие соединния алюминия. Гид-
роксил алюминия принимают внутрь как антацидное средство при язвенной болезни желудка и
двенадцатиперстной кишки, острых и хронических гипераиидных гастритах и нишевых отравле-
ниях. Гидроксид алюминия вместе с оксидом магния входит в состав препарата альмагель и ряда
других подобных лекарств, применяемых в качестве обволакивающего, антацидного средства.
Фосфат алюминия обладает противоязвенным, адсорбирующим, обволакивающим свойствами,
снижает кислотность желудочного сока. Белую глину (каолин) и жженые квасны применяют
наружно, как правило, в виде присыпок, мазей и паст при лечении кожных заболеваний.
В организм человека ежесуточно поступает от 5 до 50 мг алюминия в зависимости от реги-
она проживания. Растительные продукты содержат в 50—100 раз больше алюминия, чем про-
дукты животною происхождения.
Алюминий, который находится в почве, обычно плохо усваивается растениями. Однако при
повышении кислотности почвы усвоение алюминия растениями значительно увеличивается.
Источниками поступления алюминия в организм являются питьевая вода, где сто содержание
составляет 2—4 мг/л, и воздух.
Окружающая среда может быть загрязнена соединениями алюминия в результате их вы-
бросов в атмосферу или сточные воды в районах расположения алюминиевых, горнорудных,
лакокрасочных, бумажных, текстильных и других промышленных предприятий. Источниками
повышенного поступления алюминия в организм человека могут быть запыленный воздух, за-
грязненная питьевая вода и пиша (особенно консервированная). К источникам, которые могут
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 853
содержать избыток алюминия, следует отнести чай. морковь, некоторые травы и плавленые
сыры, лекарственные вещества антациды, дезодоранты, бумажные полотенца, а также про-
дукты кон [актирующие с алюминиевой фольгой. Известно, что использование алюминиевой
посулы загрязняет пищу этим металлом
У рабо тих, контактирующих с пылью, содержащей металлический алюминии тын оксид алюми-
ния (например, при работе с корундом), могут возникать бронхолегочное воспаление, развиваться
необратимые фиброзные изменения в легких. Алюминии траст в организме важную физиологи-
ческую роль: участвует в образовании фосфатных и белковых комплексов, в процессах регенера-
ции костной, соединительной и эпителиальной ткани, оказывает в зависимости ог концентрации
тормозящее или активирующее действие на ишцевартггечьные ферменты, влияет на функцию око-
ЛО1ШГГ0ВИЛПЫХ желез. Алюминий в небольших количествах необходим для организма, особенно
для костной ткани, избыток его может представлять серьезную опасность лля здоровья. В целом
алюминий относят к токсичным (иммунотоксичным. нефротоксичным) элементам.
Опенку содержания алюминия в организме проводят по результатам исследований крови,
мочи и волос Депонируется алюминий в костях, печени, легких и сером веществе головного
мозга. С возрастом содержание этого элемента в легких и головном мозге увеличивается.
Повышенное содержание алюминия в волосах у мужчин встречается чаше, чем у женщин,
а у детей оно выше, чем у взрослых.
Пониженное содержание алюминия в волосах может свидетельствовать о нарушении об-
менных процессов в костной ткани, передозировке комплексонов. алкалозе организма.
При подозрении на интоксикацию алюминием определяют его содержание в сыворотке или
плазме крови, моче, волосах, биоптатах костей, спинномозговой жидкости, а также проводят
энцефалографию, денситометрию, исследуют функции почек и легких.
Токсичность алюминия во многом связана с его антагонизмом ио отношению к кальцию, маг-
нию, фосфору, цинку и меди, а также способностью влиять на функции околощитовидных желез,
легко обр< овывать соединения с белками, накапливаться в почках, костной и нервной ткани.
Порог токсичности алюминия 2 мг/сут. Органами-мишенями при шбьпочных концентра-
циях алюминия в организме являются почки. ЦНС. кости, легкие, костный мозг, яичники,
магка и молочные железы.
Данные о пониженном содержании алюминия в организме человека отсутствуют.
Причины избытка алюминия:
• острые отравления солями алюминия на производстве;
• избыточное поступление оксида и солен алюминия с пищей, питьевой водой, вохчухом;
• поступление с лекарственными препаратами, дезодорантами
• хроническая почечная недостаточность.
При острой и хронической интоксикации алюминием обычно используют комплексообра-
зователи и антагонисты алюминия. а также симптоматические средства.
При восстановительном лечении и в качестве профи тактики избыточного поступления алю-
миния в организм в качестве антагонистов, замедляющих всасывание алюминия и воспол-
няющих дефицит жизненно важных вешеств. используют лекарственные препараты и БАД,
содержащие кальций. мантий. фосфор. пник. марганец, железо и медь.
Симптоматическая терапия может включать мочегонные и желчегонные средства антиок-
сиданты. инотропные препараты. церебролизнн и ряд других, в зависимости от клинической
картины в каждом отдельном случае.
Основные проявления избытка алюминия:
• энцефалопатии. нарушения функции ЦНС (ухудшение памяти, трудности в обучении, не-
рвозность. склонность к депрессии, прогрессирующее старческое слабоумие):
• нейро-дегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона), эн нефа
лопатип;
• нарушения фосфорно-калышсвого обмена, гиисрнаратиреоидпзм. склонность к развитию
остеопороза, к остеохондрозу, рахиту, остеопатиям и другим заболеваниям опорно-двига-
тельного аппарата:
• фиброзные уплотнения в мягких тканях:
• алюминоз (алюминиевые легкие) с характерными патологическими изменениями в легоч-
ной ткани сухим или влажным кашлем, рвущими болями во всем теле, потерей аппетита.
854 Глава 8
исхуданием, ниоиха расстройством пищеварения, болями в желудке, изменениями состава
крови (лимфоцитоз. эозинопсния),
• снижение активности отдельных ферментов;
• запор;
• нарушение функции почек (нефропатии, увеличение риска мочекаменной болезни).
• снижение абсорбции железа;
• снижение количества эритроцитов и уровня гемоглобина в кропи;
• микроцитарная анемия (которая может развиться у больных после гемодиализа);
• угнетение функций Т- и В-клеток. макрофагов;
• обострение аутоиммунных заболеваний;
• нарушение обмена фосфора магния, цинка, мели;
• имеются данные о мутагенной активности алюминия.
Данные о проявлениях дефицита алюминия отсутствуют.
Синергисты и антагонисты алюминия
Алюминии тормозит усвоение многих элементов, витаминов (кальций, магнии, железо, ви-
тамин ВА. аскорбиновая кислота) и серосодержащих аминокислот.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание алюминия в плазме/сы воротке крови, моче, волосах.
ДополниlObiibic: содержание алюминия в бноптатс костной ткани, спинномозговой жид-
кости, соотношение содержания фосфата и кальция. активность щелочной фосфатазы.
Токснкокинстические характеристики алюминия представлены в табл. 8-57.
Таблица 8-57. Токсикокипстическис характеристики алюминия
Суточное поступление с продуктами питания 45 мг
Суточное поступление с воздухом 0.01 мг
Резорбция из ЖКТ и легких в кровь 2% — ЖКТ до 10% — легкие
Суточное выведение:
моча 0.01 мг
кал 43 мг
пот 0.1 мг
прочие (волосы и лр.) 0.0006 mi
Период нолувыведенпя (1,,) 200 сут
Объем распределения (Vd) •)
Связывание с белками плазмы (Fb) 60-80%
Среднее содержание:
организм человека массой 70 ю 100 мт
КОСТИ 7—10 мг/кг
мышцы 0.7—28 мг/кг
кровь 0.20 мг/л
сыворотка/ плазма крови 0.002—0,03 мг/л
моча 0.005 мг/л
ПОЛОСЫ 1—20 мг/кг
зубы эмаль) 62—13б мг/кг
зубы (дентин) 12.5—86 мг/к!
НОГТИ 132-927 мг/ki
печень 1—10 мг/кг
грудное молоко 0.12- 0.33 мг/л
почки 0.4 мг/г
мозг 2 мкг/кг
легкие 50 мг/кг
Токсическая доза алюминия для человека 5 г
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 855
Содержание алюминия в тканях организма человека при летальном исходе представлено в
табл. 8-58.
Таблица 8-58. Содержание алюминия в тканях (и мг/кг) при летальном исходе
Виосубстраты Легкие Мо гг Печень Кос пт
Среднее значение |430 5 *М) 30
При интоксикации концентрация алюминия в плазме крови составляет 0.4 мг/л. в моче —
0.1-0.2 мг/л.
Галлий (Ga)
Галлий используется при производстве свете диодов, полупроводников, легировании метал-
лов. Одним из наиболее распространенных полупроводниковых материалов является арсенид
галлия. Широкое использование арсенида галлия с начала 80-х голов XX века привело к уве-
личению риска интоксикации этим элементом нс только работников электронной промыш-
ленности. но и населения, гак как методы утилизации и рециркуляции отходов, содержащих
арсенид галлия, не были разработаны. Основной мишенью для арсенида галлия в организме
является иммунная система. Сплавы галлия с золотом применяются в ювелирном деле и при
протезировании зубов.
В медицине нитрат галлия используется при лечении гиперкальциемии у онкологических
больных, у которых эффект воздействия достигается за счет угнетения активности остеоклас-
тов. Радиоизотоп галлия применяют в диагностике и лечении опухолевых заболеваний.
Соединения галлия плохо всасываются из ЖКТ. Коэфнциснт резорбции менее 0,1% Наи-
более высокие концентрации гад тия обнаруживаются в скелете. почках, печени и селезенке,
наиболее низкие — в мышнах. Из организма галлин выводится преимущественно с мочой
Данные о пониженном содержании галлия в организме человека отсутствуют
Причина избытка галлия:
• избыточное поступление.
Основные проявления избытка галлия:
• значительные колебания содержания калия и натрия в сыворотке крови;
• повреждения слизистых оболочек ЖК‘1
• усиление экскреции аминолевуленовой кислоты и порфиринов.
Синергисты и антагонисты гания
Синергисты и антагонисты галлия в настоящее время нс установлены.
Индикаторы экс нозиции/интоксикацни
Приоритетные: содержание галлия в печени, ночках, моче.
Дополнительные: содержание галлия в волосах.
Таллий (11)
Таллий — мягкий металл серебристо-белого цвета с серошпым оттенком, образует сплавы с
большим коли те’твом других металлов. Соединения таллия с мышьяком и фосфором испоть-
зуются в качестве полупроводников.
Источниками о рзвления таллием могут служить бытовые средства — химикаты, предна-
значенные для борьбы с грь зунами. — родентициды (сульфат таллия). Риску отравления гал-
лием подвергаются рабочие, запятые на таких производствах, как обжиг пирита, плавление
руд (сульфидные руды, богатые калием минералы), получение полупроводников. цемента,
специального стекла с добавлением галлия Поступать в организм галлий может также через
загрязненные пищевые продукты или с пылью. Известны случаи использования солей таллия
с целью убийства или самоубийства.
Таллий обладает выраженной токсичностью, которая обусловлена нарушением ионного ба-
ланса Na* и К\ Ион ТГ образует прочные соединения с серосодержащими лигандами и таким
образом подйнз яст активность многих ферментов. Ионные радиусы К' и ТГ близки, они имеют
сходные свойства тт способны заметать друг друга в ферментах. Кат поп ТГ обладает большей
856 Глава 8
по сравнению с К способностью проникать через клеточную мембрану внузрь клетки. При
этом скорость проникновения Т1 в 1(Ю раз выше, чем щелочных металлов. Это вызывает рез-
кое смешение равновесия Na'/K.' и приводит к значительным функциональным нарушениям
ЦНС. Токсичность соединений таллия для человека существенно выше, чем свинца и piyni.
При остром отравлении галлием поражаются периферическая и центральная нервная сис-
тема, сердце, гладкая мускулатура, печень, ночки, кожа и волосы.
Причина избытка таиия:
• избыточное поступление.
Антидотами при отравлении таллием являются серосодержащие вещества: пистин, мети-
онин и др., которые связывают Л' и способствуют его выведению из организма. Показаны
также препараты К. Mg, Se, Zn. витамины (биогин) и симптоматические средства.
Основные проявления избытка таляия
Острое отравление:
• сильные боли по типу невралгий, гиперестезии в конечностях (приблизительно с 4-го дня
после перорального поступления таллия):
• бессонница;
• истерия:
• расстройство зрения;
• спутанность сознания:
• тахикардия (резистентная к терапии обычными средствами):
поражение потовых и сальных желез кожи:
• выпадение волос из-за нарушения синтеза кератина (на 10—13-й тень после отравления или
несколько позже).
Синергисты и антагонисты таллия
Антагонистами таллия являются серосодержащие вещества. Таллий угнетает усвоение желе-
за и способен вытеснять калий из организма.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные, содержание галлия в моче, фекалиях, волосах, цельной крови; тест для ран-
ней (от 4—5 сут) диагностики интоксикации — морфологические изменения волосяных фол-
ликулов. обнаружение в них темных пигментных отложений (утолщение Винди).
Токсикокипстическис харакгеристики таллия представлены в табл. 8-59.
Таблица 8-59. Токсикокипстическис характеристики таллия
Суточное поступление с продуктами питания 0.0015 mi
Суточное поступление с воздухом 0. 00005 mi
Резорбция из ЖКТ в кровь 45%
Суточное выведение моча кал пот прочие (волосы и др.) 0,()005 mi 0.001 mi 0.000001 мг
Период нолувыведенпя (Т1О) 2-10 сут
Объем распределения (Vd) 1—5 л/кг
Связывание с белками плазмы (РЪ) •>
Среднее содержание: организм человека массой 70 кг кости МЫШЦЫ кровь плазма /сыворотка крови моча 6—9 мкг 0.002 мг/кг 0.07 мг/кг 0.0OU05—О,('005м|/л 0.0002-0.001 мг/л 0.00025 мг/л
Метаболизм и определение токсикангов различных химических групп... 857
Окончание тайн <У-59
ВОЛОСЫ ло 0.02 мг/кт
зубы (эмаль) 0.005 мг/кг
ногти 0.002-1.6 мг/кг
печень 0,0005-0,002 мг/кг
Летальная доза таллия для человека 6СМ) мг (8 мг7кг). Данные о токсической дозе таллия
отсутствуют.
Содержание таллия в биожидкостях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в табл. 8-60.
Таблица 8-би. Содержание галлия в биожндкостях (в мг/л) н тканях (п mi/кг) при летальном исходе
Биосубстраты Кровь Мозг Печень Почки Мочв
Средг ее значение 4.0 7.8 15 11 5.2
(0.5-11) (3—15) (5-29) (6-20) (1.7-11)
При интоксикации концентрация пыли я в цельной крови составляет 0.008—0.8 мг/л. в моче —
> 0,2 мг/л; > 0.5 мг/сут.
Элементы IV группы (германий, олово, свинец)
Германий (Ge)
Германий получают как побочный продукт при очистке пипка и меди. Отходы угледо-
бывающей и коксовой промышленности служат источником загрязнения окружающей среды
германием. В золе лигнита содержится ло 120 мкг/г германия. Германий используется в про-
изводстве полупроводников (транзисторы, диолы и лр.). оптических линз, детекторов ионизи-
рующего излучения.
В медицине германий применяю! при лечении анемий и иммунодефицитных состояний.
В организм человека германий поступает с нишей Значительное количество германия со-
держится в чесноке, рыбе, отрубях, овощах, семенах, грибах корне женьшеня (0.01—1 мкг/г).
Неорганические соли германия более токсичны, чем органические. Имеются данные о смер-
тельных случаях отравления БАД гг препаратами. содержащими органические соли германия и
одновременно ^грязненные неорганическими солями германия.
Содержание германия определяют в моче, а также в других биосубстратах.
Проявление дефицита германия установлено на экспериментальных животных развитие
остеопороза, риск заболевания раком.
Причины избытка германия:
• избыточное поступление;
• нарушение регуляции обмена германия.
Основные проянленин избытка германия:
• раздражение кожи (при контакте с GeCl,);
• поражение печени и почек (при очень высоких дозах)
Синергисты и антагонисты германия
Синергисты и антагонисты германия ггс известны.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание германия в моче.
Дополни гельные: раздражение кожи после контакта с соединениям!! германия, содержание
германия в печени гг почках.
Содержание германия в биожидкостях гг тканях организма человека при летальном исходе
представлено в габл. 8-61.
858 Главе 8
Таблица 8-61 Содержание германия в бножи.ткостях (в mi/ki) и тканях (н mi/д) прн летальном исходе
Бносубстраты П пазма Печень Почки Мочи
Среднее значение 4.4 17 I 15
Олово (Sn)
Основным источником олова для промышленности являются минералы касситерит и ста-
нин. Олово используется в смазкпх и сплавах, а также в качестве добавки к полимерам, при
изготовлении тары для пиши, припоев.
Олово поступает в организм человека преимущественно с нишей. В молоке и свежих ово-
щах содержание олова невелико и обычно составляет 1 мкг/г и ниже. Значительно выше содер-
жание олова в жирах и жирном рыбе (до 130 мкг/г). Олово может присутствовать в консервах
и упаковочной фольге.
Полагают, что оптимальное поступление олова в организм составляет 2—10 мг/сут. Дефицит
олова может развиться при недостаточном поступлении (1 мг/сут и менее), a nopoi токсичнос-
ти равен 20 мг/сут.
Олово входит в состав желудочного фермента гастрина, оказывает влияние на активноегь
флавиновых ферментов, способно усиливав процессы роста.
Повышенное содержание олова в волосах может быть следствием контакта с этим элемен-
том на производстве и в быту (в первую очередь консервы и фторсолержашис зубные пас ы)
При избыточном поступлении в организм человека олово накапливается в печени, ночках,
скелете и мышцах. Органические соединения олова проявляют выраженный кумулятивный
эффект с последующим развитием хромосомных аберраций в клетках костною мола
Данные о пониженном содержании олова в организме человека отсутствулот.
Причина избытка олова.
• избыточное поступление.
Основные проявления избытка олова:
• головокружение,
• постоянная головная боль.
• расстройство зрения.
• раздражение кожи
• станиоз (изменения в легких);
• снижение аппетита;
• металлический привкус во рту;
• тошнота, боли в животе, понос;
• увеличение печени.
• повышение активности трансаминаз в крови.
• гиперьдикемия;
• снижение содержания в организме цинка и меди
Данные о проявлениях дефицита олова у человека отсутствуют
Синергисты и антагонисты олова
Антагонистами олова являются цинк и медь.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание олова в моче
Дополнительные: содержание олова в волосах.
Токсикокинетические характеристики олова представлены в табл. 8-62.
Таблица 8-62 Токсикокинетические характеристики олова
Суточ нос 1 кктучиенис с продуюамн питания 4 мт
Суточное поступление е воздухом 0,0000034 мг
Резорбция из ЖКТ в кровь 3% Sn1*'; < 1% Sn‘*
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 859
Окончание таш 8-62
Суточное выведение:
моче 0.02 мт
кал 3.5 мг
ПО! 0.5 мг
прочие (ветки и др.) —
Период тюзуяывеления (Т ) 90—100 сут
Объем распределения (Vd) 2
Связывание с белками плазмы < Fb) о
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кт данные проти «речивы
КОСТИ 1.4 мг/кг
МЫШЦЫ 0.33—2.4 мг/кг
кровь До 0.002 мг/л
моча 0,01 мг/л
волосы 0,05—1.5 мг/кт
зубы (эмаль) 93 мг/кг
зубы (дентин) 0.21 — 120 мг/кг
НОГТИ 12 мг/кг
печень 0.1 —1,0 мг/кг
Токсическая доча олова для человека 2 г
Свинец (РЬ)
Свиней широко используется при производстве аккумуляторов, силовых кабелей, красок,
стекла. керамики, различных смазок, згилированного бензина, средств защиты от радиации и
т.л. Свинец входит в состав припоев, шлифовальных паст для обработки кузовов автомобилей.
В медицине применяют свинцовую примочку, ацетат свинца — в космстоло1ии для окраски
сенях волос.
Свинец — jto остсотроппый элемент, за мешающий кальций в кристаллах гидроксиаппатита
Са1м(РО4)ь(ОН),. При поступлении с птицей и водой свинсн распределяется в организме живот-
ных и человека по скелетному тину. Наиболее высокая концентрация свинца в зубах.
При контакте со свинцом на производстве с воздухом в организм человекi может нон: тать
значительное количество металла. При больших концентрациях тетраэтилсвинца возникает
риск сто проникновения через кожу. Повышенное поступление с нишей кальция, фосфора,
магния, пинка снижает абсорбцию свинна. тогда как на фоне дефицита железа и пере тислен-
ны.х элементов поглощение свинца возрастает.
Токсическое действие свинца во многом обусловлено его способностью образовывать ком
плсксы с лигандами. содержащими сульфгидрильные и карбоксильные группы, производные
имидазола. (|юсфвг-ионы (см. гл. Я 5 1) Свинец снижает активность ферментов (например
АТФазы). нарушает синтез гема, порфириновый обмен, индуцирует дефекты мембран эритро-
цитов (см. гл. 2.4.2 и 8.5.4)
БДУ свинца в волосах. рассчитанный для рабо тих. контактирующих со свинцом на произ-
водстве. 80—100 мкт/г. Для дегей БДУ нс должен превышать 9 мкт/г Гак называемый чровень
•обеспокоенности» для детей составляет 5 мкт/т. Принятые в РФ фоновые уровни свинца в
волосах взрослых 2—4 мкг/г.
Для всех регионов России свинец является основным антропогенным токсичным элементом
из труппы тяжелых металлов. Эго связано с высоким индустриальным загрязнением и выбро-
сами выхлопных газов автомобильного транспорта, работавшего на этилированном бензине.
Or 5 до 30% населения в различных городах России страдают от избытка свинца
Эссенпиалытость свинца доказана в лабораторных условиях в эксперименте на жизотных
860 Глава 8
Причины избытка свинца:
• избыточное поступление.
• лсфтшт в организме кальция. магния, цинка и железа.
При умеренном избытке свинца и для профилактики сатурнизма используют сульфатные
минеральные воды, пектин, альгинаты, жел 1егонные средства, поливитамины, нишевые кис-
лоты, препараты кальция, магния, фосфора, пипка, железа При интоксикации свинцом кроме
профилактических средств применяют хелатирующую терапию (препараты ЭДТА, ДИСК. D-
пенинилламин) и восстановленный глутатион.
Основные проявления избытка свинца:
• повышенная возбудимость, слабость, утомляемость, снижение памяти;
• головная боль;
• поражение периферической нервной системы (боли в конечностях);
• появление свинцовой каймы на деснах:
• кариес зубов, артропатия, заболевания костной системы;
• повышение артериального давления, атеросклероз;
• боли в животе (свинцовые колики), спастический запор,
• истощение, исхудание, снижение массы тела;
• нарушения порфиринового обмена;
• нефропатия, прогрессирующая почечная недостаточность;
• ухудшение подвижности сперматозоидов и способности к оп лодотворению;
• снижение потенции;
• рсгикулоцитоз, анемия;
• снижение устойчивости к инфекциям (особенно у детей);
• синдром сатурнизма;
• снижение содержания в организме кальция, цинка, селена, магния.
Нарушения развития у детей отмечаются при концентрации свинца в цельной крови 10—
20 мкг/100 мл, снижение 1Q у детей — 20—40 мкг/100 мл. периферическая нейропатия
(у взрослых и xieieii) — 40—60 мкг/100 мл, хроническая нефропатия у взрослых — 60—
80 мкг/100 мл, анемия и острая нефропатия удетей — 80—100 мкг/100 мл. энцефалопатия — 100—
120 мкг/НЮ мл
Данные о проявлениях дефицита свинца у человека отсутствуют.
Синергисты и антагонисты свинца
Серосодержащие аминокислоты, витамины /X. С. Е. В-комнлекс. фолиевая кислота, нико-
тинамид. Са, Mg. Zn. Fe, Сг. Р, Se способствуют снижению уровня свинца в организме.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные; содержание свинца в цельной крови, моче.
Дополнительные; содержание свинца в волосах (2,5 см. проксимальная часть), свободный
протонорфирин зригрт питов (FEP). ДАЛ К в моче, дстцдратаза ДАЛ К в крови, цинк-протонор-
фирин в крови (см. гл. 8.5.4).
Токсикокипс ! ические характеристики свинца представлены в табл. 8-63.
Т инца 8-63. Токспкокннетическис характеристики сшита
Суточное поступление с продуктами питания Суточное поступление с воздухом 0.4—0,5 мг. с водой до 0,1 мг 0.01 мг
Резорбция из ЖКТ в кровь 8-20%
Суточное выведение; моча 0,05 мт
кал 0,3 мг
пот 0,065 мг
про IHC (волосы и др.) 0.003 mi
Период полувыпедення (Т1О) 1000-12 000 сут
Объем распределения (Vd) 7
Связывание е белками плазмы (Fb) 7
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 861
Окончание табл. 8-63
Среднее содержание
организм человека массой 70 кг
мкл II
МЫШЦЫ
кровь
моча
полосы
зубы (эмаль)
зубы (демши)
norm
печень
1 рудное молоко
120 mi
3,6-250 мг/ki
0.23—3.3 мг/кт
0,008-0.269 mi /л
0.025 мг/л
0.05—52 мг/кг
7.3—23 мг/кг
3.6—36 мг/кг
14—40 mi/ki
0,05—2.5 мг/кг
0.0036-0.03 мг/л
Токсическая лоза свинна для человека I мг. летальная доза 10 i.
Содержание свинца в биожидкостях и жанях организма человека при летальном исходе
представлено в табл. 8-М.
Таблица 8-64. Содержание свинца в бножндкостях (в мг/л) и тканях (в мг/кг) при летальном исходе
Ьносубстразы Кровь Мозг Печень Почки Плоские кости Трубчатые косги
Среднее значение 0.95 —5.3 5.8 40 8.8 268 132
При интоксикации концентрация свинна в цельной крови составляет 0.1 — 2.28 мг/л. в моче —
0.05 —0.08 мг/л. в волосах — более 25 mi/кг (см. главу 8.5.4).
Элементы V группы Периодической системы элементов
(ванадий, мышьяк, сурьма, висмут)
Ванадий (V)
Физиолотчсская роль ванадия недостаточно изучена. Полагают, что ванадий участвует в
регуляции углеводного обмена и сердечно-сосудистой деятельности, метаболизме тканей кос-
тей и зубов, является катал и за юром ряда окислительно-восстановительных процессов, являет
ся регулятором соотношения Na'/K'. ингибитором АТФазы. рибонуклеазы и некоторых дру-
гих ферментов.
Ванадий входит в состав мышечной и костной ткани, накапливается в сердечной мышце,
селезенке, щитовидной железе, легких, почках, жировой ткани
Оценку содержания ванадия в организме проводят но результатам исследований крови,
мочи и полос В качестве показателя интоксикации организма ванадием используют результаты
определения цистина в крови, моче, волосах и ногтях
Установлено, что он может тормозить синтез жирных кислот, подавлять образование холес-
терина. Ванадий ингибирует фосфорилирование и синтез АТФ. снижает уровень коэнзимов А
и Q. стимулирует активность МАО. Известно также, что при шизофрении содержание ванадия
в крови значительно повышено.
Избыточное поступление ванадия в оршнизм обычно связано с экологическими и произ-
водственными факторами. При остром воздействии токсических доз ванадия у рабочих отмеча-
ются местные воспалительные реакции кожи и слизистых оболочек глаз, верхних дыхательных
путей, скопление слизи в бронхах и альвеолах. Возникают системные аллергические реакции
тина астмы н экземы, а также лейкопения и анемия. Повышенное содержание белков и хром-
содержащих продуктов в рационе снижает токсическое действие ванадия.
862 Глава 8
Причина дефицита ванадия:
• недостаточное поступление.
Основные проявления дефицита ванадия:
• увеличение риска развития атеросклероза и сахарного диабета.
Причина избытка ванадия:
• т 1быточное поступление.
Для выведения из организма избыточных количеств ванадия и детоксикации применяются
комплексообразоватсли (ЭДТА) и препараты хрома.
Основные проявления избытка ванадия
Острая интоксикация:
• воспалительные реакции кожи и слизистых оболочек глаз, глотки, верхних дыхательных
путей;
• аллергические реакции ('экзема, астмоподобные состояния);
• лейкопения, анемия.
Хроническая интоксикация:
снижение содержания в орСниизме аскорбиновой кислоты;
• снижение содержания цистина в волосах;
• повышение частоты заболеваний бронхолегочной системы;
• увеличение риска развития новообразований.
Синергисты и антагонисты ванадия
В настоящее время синергисты ванадия не выявлены. Антаюнистами ванадия являются
хром и содержащиеся в пище белки.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание ванадия в цельной крови, моче, волосах.
Токсикокинетические характеристики ванадия представлены в габл. 8-65.
Таблица 8-65. Токсикокинс!нческне характеристики ванадия
Суточное поступление с продуктами питания 2 mi
Суточное поступление с воздухом 0.0002 мг
Резорбция из ЖКТ 0.1-2%
Суточное выведе те
моча 0.03 мг
кал 1,94 мг
Период полувынедсния (Т1,) 20—40 ч
Объем распределения Vd i 0.6 л/к!
Связывание с белками плазмы (1Ъ) 77%
Среднее содержание:
ортанпзм человека массой 70 кг 100 мк1
кости 0.0035 мг/ki
МЫШЦЫ 0.02 mi/кг
кровь < 0.0002 мг/л
сыворотка крови 0.00015 мг/л
моча 0,015 мг/л
волосы 0.005—2.0 мг/кг
зубы (дентин) 0,017 мг/кг
Мышьяк (As)
Мышьяк применяется для произве детва различных сшивов, полупроводников, красителей,
аккумуляторов, пестицидов, составов для пропитки древесины, а также в кожевенной, текс-
тильной и стекольной промышленности. Соединения мышьяка используются в медицинских
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 863
целях уже более 2000 лет. В настоящее время неорганические соединения мышьяка в пезнпчгг
тельных количествах входят в состав общеукрепляющих и тонизирующих средств, содержатся
в лечебных минеральных водах и грязях. а органические соединения мышьяка используются
как прогивомикробпые и нротнвонротозоиныс препараты.
В организм человека соепинения мышьяка поступают с питьевой и -минеральной водой,
виногралиыми винами и соками, морепродуктами, медицинскими препаратами. пестицидами
Депонируется мышьяк преимущественно в ретикулоэндотелиальной системе.
Мышьяк может поступать в организм в повышенных количествах с атмосфернь м воздухом.
Так. в юродах при сжигании угля концентрация мышьяка в воздухе составляет порядка I —
20 нг/м}; около медеплавильных предприятий, котельных и ТЭЦ. работающих на угле, она
может достигать 70—500 нг/м’. а в эколог ически чистых районах концентрация мышьяка нс пре-
вышает 1 ггг/м1. В почвах около медеплавильных комбинатов, обжиговых заводов, где налажено
прои водство сплавов мышьяка, его концентрация достигает 100—ЗОгЮ мкг/г и более, тогда как
норма не должна превышать 40 мкг/г. Риск арсеноза также повышен у курильщиков табака.
Значительные количества мышьяка содержатся в рыбьем жире и морской рыбе (до 10 мг/кг).
винах (ло I мг/л и более) В питьевой воле содержание мышьяка составляет менее 10 мкг/л.
однако в некоторых регионах мира (Индия. Бангладеш. Тайвань. Мексика) содержание этого
элемента достигает более 1 мг/л. что является при твой массовых хронических отравлений
мышьяком и вызывает гак называемую болезнь «черной стопы*.
Мышьяк, поступающий с пишей. легко всасывается в кровь и быстро выводится в равньх
количествах с мочой и калом. Мышьяк накапливается в печени, почках, селезенке, легких,
стенке пищеварительного тракта. Основное депо мышьяка — эритроциты и селезенка Мышь-
як дотго сохраняется в костях и волосах.
Мышьяк относят к условно-эесснниальным. иммунотоксичным элементам. Известно, что
мышьяк (тиоловый ял) взаимодействуют с тиоловыми группами белков, цистеином, глутати-
оном. .гипоевой кислотой, нарушения обмена серы, селена гг фосфор* Токсичность мышьяка
зависит от его химических свойств и снижается в следующем порядке ряда: арсин > неоргани-
ческий As-'* > органический AsJ* > неорганический Ах5, > соединения арсония > элементарный
мышьяк.
Органами-мишенями при избыточном содержании мышьяка в организме являются костный
мозг. ЖКТ. кожа, легкие и ночки. Предполагают, что неорганические соединения мышьяка —
канцерогены. Высокий уровень смертности от рака легких зарегистрирован средн рабочих,
занятых на производстве мышьяксоларжашпх пссгицидов. в добыче золота и выплавке спла-
вов мышьяка с другими металлами, а также цветных металлов и особенно меди. В результате
длительного употребления загрязненной мышьякох воды или лекарственных препаратов не-
редко наблюдается развитие низколифференпированного рака кожи (рак Боуэна) Вероятно,
гемангиоэндотелиома печени также валяется арсеноэявисимой опухолью.
Данные о проявлениях дефицита мышьяка отсутствуют
Причины избытка мышьяка:
• избыточное поступление (постоянный контакт е мышьяком, з. грязнение окружающей сре-
ды. табакокурение, глоупотребление виноградным вином, длительное введение препаратов
сальварсана):
• нарушение регуляции обмена мышьяка:
• усиленное накопление при недостатке в организме селена.
При остром отравлении мышьяком производят промывание желудка, а в случае поражения
почек — гемодиализ. При остром и хроническом отравлении мышьяком применяют унитиол.
ДМ ПС в качестве антидотов. Также следует использовать антагонистические свойства селена,
серы, фосфора, цинка. дополните гьио вводить препараты витаминов А. С. Е и аминокислот.
Основные проявления избытка мышьяка:
• раздражи гельность. головная боль.
• нарушение функций печени, развитие жирового гепатоза
• кожные аллергические реакции, экзема, дерматит, зуд, язвы, депигментация кожи, ладон-
но-подошвенный гмггсрксратоз. конъюнктивит:
• поражение системы тыхания (фиброз, аллергозы, прободение носовой перегородки, опухоли);
• поражение сосудов (в первую очередь нижних конечностей — эпдоангипг);
864 Глава 8
• нефропатия;
• повышение риска развития новообразован и 1 кожи, печени, легких;
• при острой интоксикации внутрисосудистый гемолиз, острая почечная, печеночная недо-
статочность. кардиогенный шок;
• отдаленные последствия — снижение остроты слуха у детей, поражение ЦНС (энцефалопа-
тии. нарушения речи, координации движений, судороги, психозы, полиневриты с болевым
синдромом), нарушение трофики мышц, иммунодефицит.
Синергисты и антагонисты мышьяка
Мышьяк может усиленно накапливаться в организме при недостатке селена и тем самым
способствовать дефициту селена. Антагонистами мышьяка являются сера, фосфор, селен, ви-
тамины С и Е, аминокислоты Мышьяк тормозит усвоение организмом цинка, селена, аскор-
биновой кислоты, витаминов А и Е, аминокислот.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание мышьяка в моче, волосах, ногтях.
Дополнительные: Se в моче, волосах, ногтях (Se — антагонист As).
Токсикокинетические характеристики мышьяка представлены в табл. 8-66.
Таблица 8-66. Токсикокинетические характеристики мышьяка
Суточное поступление с продуктами питания 1 мг
Суточное поступление с возцухом 0.001 мг
Резорбция из ЖКТ. легких, кожи 80% - ЖКТ. 10% - легкие. 1% — кожа
Суто 1иос выведение: моча кал 0.05 мг 0.08 мг
ПОТ —
прочие (волосы и др.) 0,0005 мг
Период полувывслспия (Т1Л) 1-10 сут
Объем распределения (Vd) 0.2 л/кг
Связывание с белками плазмы (Fb) 7
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кт 18 мг
косги 0.08—1.6 мг/кг
МЫШИЫ 0.009—0.65 мг/кг
кровь 0,0017—0,023 мг/л
плазма крови 0.0017-0.0154 мг/л
моча 0,01—0.03 мг/л
волосы 0.005—0.5 mi/ki
зубы (эмаль) 0.022—0.1 мг/кг
3v6u (дентин) <0.02—0,07 мг/ki
ногти 0.2—3.3 мг/кг
печень 0,001—0,053 мг/кг
грудное молоко 0,00025—0.024 мг/л
Токсическая доза мышьяка для человека 5—50 мг. летальная доза As,О, — 50 —340 mi
Содержание мышьяка в биожидкос!ях и тканях организма человека'при летальном исходе
представлено в табл. 8-67.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 865
Таблица 8-67 Содержание мышьяка в биожилкосгях (н мг/л) и гканяч (в мг/кг) при легальном исходе
Биосубстраты Кровь Мол Печень Селезенка Почки
Среднее значение 3.3 1.7 29 8.8 15
0.6—9,3 0.2 4.0 2.0 120 0.5 62 0.2 -70
При интоксикации концентрация мышьяка в цельной крови составляет 0.1 —1.6 мг/л. в
плазме — более 0.1 мг/л. в моче — более 0.1 mi/л, в волосах — 1—47 мг/кг.
Сурьма (Sb)
Сурьма используется в химической и полиграфической промышленности, при изготовле-
нии аккумуляторных батарей, полупроводников. подшипников, кабелей и т.д. Органические
сое шнения сурьмы применяются в сельском хозяйстве в качестве фунгицидов.
Длительное время соединения сурьмы (винно-сурьмяно-н ггриевая соль, винно-сурьмяно-
калиевая соль — рвотный камень) и использовались как отхаркивающие и рвотные средства.
В современной медицине препараты сурьмы (солюсурьмин и др.) применяются при лечении
висцерального и кож тою лейшманиоза, а также при определении свертываемости крови.
Сурьма поступает в организм человека в основном с пищей С мочой в сутки выводится 10
мкг сурьмы, с калом — примерно 9 мкг. с волосами — 1 mki Коэффициент резорбции сурьмы
из ЖКТ в кровь равен 10%. У человека основное количество сур мы обнаруживается в ске-
лете (2 мг). печени (0,36 мг), почках (0,09 мг) и селезенке (0.06 мг) В крови Sb’ находится
преимущественно в эритроцитах. Sb5 содержится преимущественно в почках. Период полу-
выведения Т сурьмы и организма человека около 730 сут. Естественное содержание сурьмы
в моче 0.001—0.01 мг/л. в плазме крови 0.00014-0.001 мг/л, в цельной крови 0.0002 мг/л. Из
организма сурьма выводится достаточно медленно, преимущественно с мочой (до 80%).
Физиологическая роль сурьмы изучена недостаточно. Сурьма реагируете SH-группаыи фер-
ментов. что обусловливает се высокую токсичность.
Данные о пониженном содержании сурьмы в организме человека отсутствуют.
Причина избытка сурьмы
• избыточное поступ юние (с пищей и лекарствами).
Основные проявления избытка сурьмы
Острая интоксикация:
быстро развивающееся обезвоживание в результате сильною слюнотечения. длительной
рвоты, поноса
• нитевидный пульс, расширение кожных капилляров;
• головные бати, расстройства координации движений;
• усиленное мочеотделение (при тяжелом отравлении — анурия), воспаление почек
• снижение температуры тела.
Хроническая интоксикация
• потеря аппетита, воспаление слизистых оболочек зева и гортани:
• сухость в горле, тошнота, рвота бати в кишечнике
• увеличение и болезненность печени, иктеричность склер;
• воспаление слизистых оболочек верхних лмхательных путей
• длительный кашель.
Синергисты и антагонисты сурьмы
Взаимодействие сурьмы с другими химическими элементами изучено недостаточно.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание сурьмы в моче, волосах.
Дополнительные: содержание сурьмы в цельной крови, формула крови
Содержание сурьмы в биожидкостях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в табл. 8-68.
864 Глава 8
• нефропатия:
• повышение риска развития новообразований кожи, печени, легких
• при острой интоксикации внутрисосудистый гемолиз, острая почечная, печеночная недо-
статочность, кардиогенный шок.
• отдаленные последствия — снижение остроты слуха у детей, поражение ЦНС (эннефалона
гии, нарушения речи, координации движений, судороги, психозы полиневриты с болевым
синдромом), нарушение трофики мыши, иммунодефицит
Синергисты и антагонисты мышьяка
Мышьяк может усиленно накапливаться в организме при недостатке селена и тем самым
способствовать дефициту селена Антагонистами мышьяка являются сера, фосфор, селен, ви-
тамины С и Е. аминокислоты. Мышьяк тормозит усвоение организмом цинка, селена, аскор-
биновой кислоты, витаминов А и Е. аминокислот
Индик аторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание мышьяка в моче, волосах, ногтях.
Дополнительные: Se в моче, волосах, ноггях (Se — антагонист As).
Токсикокинетические характеристики мышьяка представлены в табл. 8-66
Таблица 8-66. Токсикокинетические характеристики мышьяк?
Суточное поступление с продуктами питания 1 мг
Суточное поступление с воздухом 0.001 мг
РсЗОрбЦИЯ ИЗ ЖКТ, ЛС1КИХ, кожи 80% - ЖКТ. 10% -
легкие, 1 % — кожа
Суточное выведение'
моча 0.05 мг
кал 0,08 мг
нот —
прочие (волосы и др.) 0,0005 мг
Период полувыведения (Т ) 1-10 суг
Объем распреле? ения (Vd) 0,2 л/кг
Связывание с белками плазмы (Fb) 9
Среднее содержание-
ортанизм человека массой 70 кг 18 мг
кости 0 08—1 6 мг/кг
мышны О.ООУ—U.65 мг/кг
кровь 0.0017-0.023 мг/л
плазма крови 0.0017-0.0154 мг/л
моча 0.01—0.03 мг л
ВОЛОСЫ 0.005—0.5 мг/кг
зубы (эмаль) 0,022 0.1 мг/кг
}убы (дентин) <0.02 0.07 мг/кг
НОГТИ 0,2—3,3 мг/кг
печень 0,001-0.053 мг/кг
грудное молоко 0.00025-0.024 мг л
Токсическая доза мышьяка для человека 5—50 mi , летальная доза As,O, — 50—340 mi
Содержание мышьяка в биожидкостях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в табл. 8-67.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 865
Таблица 8-67. Содержание мышьяка в биожидкостях (в мг/л) и тканях (в мг/кг) при яетальном исходе
Биосубстраты Кровь Моз1 Печень Селезенка Почки
Среднее значение 3.3 и 1 29 8.8 15
0.6—9.3 0,2—4.0 2,0-120 0.5-62 0,2-70
При интоксикации концентрация мышьяка в цельной крови составляет 0.1 —1.6 мг/л, в
плазме — более 0.1 мг/л. в моче — более 0.1 mi/л. в волосах — 1—47 мг/ki.
Сурьма (Sb)
Сурьма используется в химической и полиграфической промышленности, при изготовле-
нии аккумуляторных батарей, полупроводников, подшипников, кабелей и т.д. Органические
соединения сурьмы применяются в сельском хозяйстве в качестве фунгицидов.
Длительное время соединения сурьмы (винно-сурьмяно-натрисвая соль, винпо-сурьмяно-
калисвая соль — рвотный камень) и использовались как отхаркивающие и рвотные средства.
В современной медицине препараты сурьмы (солюсурьмин и лр.) применяются при лечении
висцерального и кожного лейшманиоза, а также при определении свертываемости крови.
Сурьма поступает в организм человека в основном с пищей. С мочой в сутки выводится 10
мкг сурьмы, с калом — примерно 9 мкг, с волосами — 1 мкг. Коэффициент резорбции сурьмы
из ЖКТ в кровь равен 10%. У человека основное количество сурьмы обнаруживается в ске-
лете (2 .мг), печени (0.36 мг). почках (0.09 мг) и селезенке (0.06 мг). В крови Sb'* находится
преимущественно в эритроцитах. Sb5, содержится преимущественно в ночках. Период полу-
выведения Т сурьмы из организма человека около 730 сут. Е тествснное содержание сурьмы
в моче 0.001—0,01 мг/л, в плазме крови 0.00014—0.001 мг/л, в цельной крови 0.0002 мг/л. Из
организма сурьма выводи гея достаточно медленно, преимущественно с мочой (ло 80%)
Физиологическая роль сурьмы изучена недостаточно. Сурьма реагирует с SH-группамн фер-
ментов, что обусловливает ее высокую токсичность.
Данные о пониженном содержании сурьмы в организме человека отсутствуют.
Причина избытка сурьмы:
• избыточное поступление (с нитей и лекарствами).
Основные проявления избытка сурьмы
Острая интоксикация:
• быстро развивающееся обезвоживание в результате сильного слюнотечения, длительной
рвоты, поноса;
• нитевидный пульс, расширение кожных капилляров;
• головные боли, расстройства координации движений;
• усиленное мочеотделение (при тяжелом отравлении — анурия), воспаление почек;
• снижение температуры тела.
Хроническая интоксикация:
• потеря аппетита, воспаление слизистых оболочек зева и гортани;
• сухость в горле, тошнота, рвота, боли в кишечнике;
• увеличение и болезненность печени, иктеричность склер;
• воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей;
• длительный кашель.
Синергисты и антагонисты сурьмы
Взаимодействие сурьмы с другими химическими элементами изучено недостаточно.
Индикаторы жспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание сурьмы в моче, во юсах.
Дополнительные: содержание сурьмы в цельной крови, формула крови.
Содержание сурьмы в биожилкоегях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в табл. 8-68.
866 Глава 8
Таблица 8-68. Содержанке сурьмы в биожидкостях (в мг/л) к тканях (в мг/кг) при детальном исходе
Биосубстраты Кровь Мозг Легкие Печень Желчь Почки Подкож! ю жировая клетчатка
Среднее значение 4,6 6 6 45 404 32 5
При интоксикации концентрация сурьмы в моче > 5 мг/л.
Нисмут (Bi)
Соединения висмута широко используются в электронике, при производстве различных
сплавов, керамики, стекла. красителей. Соединения висмута нашли применение и в медицине.
Основной галлат висмута при нанесении на кожу и слизистые оболочки вызывает уплотнение
коллоидов внеклеточной жидкости, слизи, экссудата и образует защитную пленку, предохраня-
ющую окончания чувствительных нервов от раз/ ражения. которая снижает болевые ощущения
и препятствует развитию отека. Основной нитрат висмута в виде мазей и присыпок использу-
ется как зашишое и противовоспалительное средство при дерматите, экземе, эрозиях и язвах
кожи. При назначении внутрь в виде суспензий, гелей или таблеток соли висмута образуют на
поверхности слизистых оболочек ЖКТ защитную пленку — хелатные соединения с белковым
субстратом, которая способствует уменьшению местного воспалительного процесса, заживле-
нию пептических язв и снижению числа рецидивов. Препараты висмута обладают нтибакте-
риальным свойством.
Висмут относится к токсичным микроэлементам. В организм человека висмут поступает в
основном с пишей, воздухом и водой. Всасывание висмута, поступившего в ЖКТ. незначитель-
но — около 5%. В организме металл распределяется относительно равномерно. В небольшом
количестве висмут накапливается в печени, почках (до 1 мкг/г), селезенке, костях, головном
мозге. Содержание Bi в мягких тканях нс превышав! 230 мкг. Висмут, прошедший через ЖКТ.
выделяется в виде сульфида висмута, окрашивая кал в темный цвет.
О физиологической роли висмута известно немного. Висмут индуцирует синтез низкомо-
лекулярных белков, принимает участие в процессах оссификации. образует внузриюеточные
включения в эпителии почечных канальцев. Возможно, этот элемент обладает генотоксичны-
ми и мутагенными свойствами.
Оценку содержания висмута в ор!анизме проводят по результатам исследований мочи, кро-
ви, волос и биоптатов. При хронической и!ггоксикации висмутом определяют его концентра-
цию в суточной моче.
Интоксикация обычно наблюдается лишь при длительном возде! ствии на организм сотей
висмута в больших дозах. Тем не менее встречаются случаи ятрогенных, профессиональных и
бытовых отравлений. Установлено, что при отравлении солями висмута поражаются почки,
ЦНС, печень, кожа и слизистые оболочки. Длительный прием препаратов висмута в больших
дозах может вызвать симптомы висмутовой энцефалопатии (особенно у больных с нарушением
функции почек). Опасным считается хроническое поступление 1—1,5 г висмута в сутки.
Данные о проявлениях дефицита висмута отсутствуют.
Причина избытка висмута:
• избыточное поступление
На ранних стадиях отравления для удаления нсабсорбированной части висмута промывают
желудок и назначают слабительные средства, проводят хелатирующую терапию. БАЛ способс-
твует снижению уровня висмута в головном мозге, а ДМ ПС — в других тканях opi аиизма. БАЛ
эффск!ивен также при лечении везикулярной ритродермы. Отмечен положительный эффект
при введении димеркаптола (800—1200 мкг/сут). При поражениях почек показан гемодиализ.
Основные проявления избытка висмута:
• снижение памяти, бессонница;
• поражение ЦНС (нарушения чувствительности, ригидность затылка);
• слабость сердечно» деятельности, аритмии;
• темная кайма вокруг десен, пигментация слизистой оболочки десен и полости рта;
• стоматит, фарингит, затруднение глотания;
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 867
• слюнотечение, тошнота, рвота, боли в животе, метеоризм, понос:
• токсический гепатит с жировой дегенерацией и ш ррозом;
• альбуминурия, цилиндры в моче;
• висмутовые дерматиты:
• потеря аппетита, упадок сил. похудание
Синергисты и антагонисты висмута
Синергисты и антагонисты висмута неизвестны
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание висмута в суточной моче.
Токсикокинетические характеристики висмута представлены вкбл 8-69.
Таблица 8-69 Гоксикокинетическис характеристики висмута
Суточное поступление с продуктами питания 0.02 mi
Суточное поступление с воздухом 0.0001 мг
Резорбция нз ЖКТ в кровь 5%
Суточное выведение:
моча 0.002 мг
кал 0.02 mi
пот неизвестно
прочие (ВОЛОСЫ и др.) неизвестно
Период полувы ведения (Т „) 0.6—5 сут
Обьсь распределения (Vd) 9
Связывание с белками плазмы (Fb) 9
Срсдн<-е содержание:
организм человека массой 70 кг неизвестно
кости 0.2 мг/кг
МЫШЦЫ 0.032 мг/кг
кровь 0.001-0.05 мг/л
MO4J 0.001 мг/л
волосы 2 мг/кг
печень 0.005 мг/кг
почки 0.3—0.5 мг/г
Данные о токсической и легальной лозах висмута для человека отсутствуют.
Содержание висмута в биожндкостях и тканях организма человека при интоксикации пред-
ставлено в табл. 8-70.
Таблица 8-70. Сод ржание висмута в биожидкостях (в мг/л) и тканях (в мг/кг) при интоксикации
Биосубстраты Кровь Мозг Легкие Печень Желчь Почки Моча
Среднее значение 0.5 0.6 0.9 6.8 3.9 33 1.2
Элементы VI группы Периодической системы элементов (хром, селен)
Хром (Сг)
Соединения хрома широко используются в сталелитейной промышленности, при произ-
водстве стекла. резины, керамики, кожаных изделий, при крашении тканей и т.д.
В медицине изогоны хрома использчют в лучевой диагностике. Пиколинат и аспарагинат
хрома применяют в качестве БАД к пище, а также как компонент витаминно-минеральных
комплексов.
868 Глава 8
Один из биологи lecKHX эффектов хрома связан с его влиянием на фактор толерантности к
глюкозе, активность которого снижается при дефиците хрома и восстанавливается после его
добавления. Синдром нарушения толерантности к глюкозе сопутствует сахарному диабету и
проявляется гипергликемией и глюкозурией на фоне дефицита хрома. Имеются данные, сви-
детельствующие о том. что хром iioicnunpyCT действие инсулина в периферических тканях.
Хром влияет па обмен аминокислот глицина, серина, метионина и ГАМК, гомеостаз сыво-
роточною холестерина и предупреждает его повышение с возрастом (см. гл. 8.5.1).
В организм соединения хром* поступают с пищей, водой и воздухом. На скорость всасы-
вания оказывает влияние степень окисления хрома: Сг*+ всасывается интенсивнее, чем Сг”.
В сыворотке крови хром прочно связывается с трансферрином. В тканях органов содержание
хрома в десятки раз выше, чем в крови. Наибольшее количество хрома присутствует в печени и
почках, кишечнике, щитовидной железе, хрящевой и костной ткани, легких (при поступлении
соединений хрома с воздухом). Хром выводится из организма главным образом через почки в
в меньшем количестве через легкие, кожу и кишечник (рис. 8-51).
Биоусвояемость хрома из неорганических соединений в ЖКТ невысока — 0.5—1%, однако
она возрастает ло 20—25% при поступлении хрома в виде солей органических кислот (пиколи-
наты, аспарагинаты).
Хром — жизненно важный микроэлемент, который является постоянной составной частью
клеток всех органов и тканей. Основные функции хрома в организме:
• хром участвует в регуляции синтеза жиров и обмена углеводов, способствует превращению
избыточного количества углеводов в жиры;
• входит в состав низкомолекулярного органического комплекса — фактора толерантности к
глюкозе, обеспечивающего поддержание нормального уровня глюкозы в крови:
• вместе с инсулином действует как регулятор уровня сахара в крови, обеспечивает нормаль-
ную активность инсулина;
• способствует структурной целостности молекул нуклеиновых кислот;
• участвует в регуляции работы сердечной мышцы и функционировании кровеносных сосу-
дов;
• способствует выведению из организма токсинов, солей гяжелых металлов. радионуклидов.
Оценку содержания хрома в организме проводят по результатам исследований крови, мочи
и волос. О риске интоксикации хромом свидетельствует сю повышенная концентрация в моче
(до 25—50 мкг/л) и волосах (более 5—15 мкг/г).
По сравнению со взрослыми у детей чаще наблюдается повышенное содержание хрома в
волосах. У взрослых, как мужчин, так и женщин, отмечается следующая тенденция: чем выше
содержание кальция в волосах, тем выше содержание хрома. У детей эта зависимость носит
еще более выраженный характер.
Пониженное содержание хрома в волосах обычно наблюдается при ожирении, атероскле-
розе, диабете, инфекционных забо: еваниях. белковом голодании, стрессовых воздействиях и
интенсивных физических нагрузках.
Выведение
с калом
Печень
сыворотка
крови
__________ФК-
мышцы
Выведение с
мочой
Рис, 8-51. Обмен хрома в организме че-
ловека ФТГ — фактор толерантности к
глюкозе
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 869
Причины дефицита хроча:
• нечостагочнос поступление извне;
• нарушение регуляции обмена;
• повышенное расходование (например, беременности);
• усиленное выведение хрома из организма в условиях повышенною содержания в нише уг-
леводов (избыточное потребление белого хлеба, сладостей, макаронных изделий);
• увеличение выведения хрома с мочой в результате повышенных физических нагрузок.
Основные проявления дефицита хрома:
• утомляемость, беспокойство, бессонница, головные боли:
• невралгии и сниженные чувств пхиьносги конечностей;
• нарушение мышечной координации, дрожь в конечностях:
• повышение уровня холестерина, трш in нор идо в в крови:
• повышение риска развития атеросклероза;
• изменения массы тела (исхудание, ожирение);
• снижение тотерангпости к глюкозе, особенно у лиц среднего и пожилого возраста:
• изменения уровня глюкозы в крови (гипергликемия, гипогликемия);
• повышение риска р« звития сахарною диабета
• повышение риска развития ишем шеской болезни сердца;
• нарушения репродуктивной функции у мужчин.
Хотя хром является жизненно в<гжным элементом. при избыточном поступлении в организм
он может стать опасным токсикантом. Соединения хрома токсичны лля человека. Шестива-
лентный хром является канцерогеном 1 класса опасности. Опухоли легких образуются после
длитсчыюго (15—20 лет) контакта с повышенными концентрациями хроматов и дихроматов.
Причины избытка хрома (интоксикации):
• избыточное поступление извне (повышенная концентрация в воздухе избыточный прием
хромсодержащих БАД. усиленное всасывание при недостатке цинка и железа);
• нару пение регуляции обмена хрома
При интоксикации хромом проводят хелатирующую терапию ДМПС с аскорбиновой кис-
лотой. При контакте с солями хрома рекомендуется мытье, в душе с распюром Na^Ca-ЭДТЛ.
Основные проявления избытка хрома (интоксикации):
• воспалительные заболевания с тенденцией к изъязвлению слизистых оболочек (перфорация
носовой перегородки);
• аллерги зйруюшес лейст вис;
• дерматиты и экземы;
• астматический бронхит, бронхиальная астма
• астено-нсвротическис расстройства;
• повышение риска онкологических заболеваний.
Как избыток, так и дефицит хрома в организме способен привести к существенному нару-
шению здоровья человека.
Синергисты и антагонисты хрома
Цинк — синсрп1ст хрома.
Индикаторы экспозиции/интокеикации
Приоритетные содержание Сг (VI)—в эритроцитах. Сг (III) — плазме/сыворотке крови
Дополнительные: содержание хрома в волосах, активность сывороточной гиалуронидазы,
тест io icpairmocin в глюкозе, насыщенность хромом трансферрина крови.
Токсикокинс!ическис характеристики хрома представлены в табл. 8-71.
Таблица 8-71. Токсикокинетические характеристики хрома
Суточное поступление с продуктами витания <(,15 мг
Суточное поступление с воздухом 0.0001 мг
Резорбция из ЖКТ и легких а кровь 0.5—2% — Ж.КТ. 70% —
легкие
870 Глава 8
Окончание табл. 8- 7/
Суточное выведение моча кал пот прочие (волосы и яр.) 0,07 мг 0.147 мг 0.001 mi 0,0006 мг
Период нолувыведенпя (Т17)* 80 суг; 3—4 г
Объем распределения (Vd) 7
Связывание е белками плазмы (Fb) 2
Среднее содержание:
органн м человека массой 70 кг 6 Ml
кости 0.1—33 мг/ki
кровь 0.0007-0,0028 мг/л
эритроин ы 0,020—0.045 мг/л
плазма/сыворотка 0,0001-0,0002 мг/л
МЫШЦЫ 0.024—0.84 мг/кг
моча 0,0005 мг/л
волосы 0,15—1.5 мг/кг
ногти 0.3—1.2 мг/кг
зубы (эмаль) 0.005—2 мг/кг
зубы (дентин) 0.005-3,2 мг/кг
ПОЧКИ 0,06 мг/кг
печень 0,001—0.002 мг/кг
* По разным источникам.
Токсическая доза хрома для )еловска 200 мг, летальная лоза > 3 г
При длительной (профессионально обусловленной) хронической интоксикации соединени-
ями Сг (VI) при летальном исходе от рака легких концентрация хрома в мозге 0.05—0,06 мг/кг,
в легких 0.6—7,1 мг/кг. печени 0,07 мг/кг. в почках 0.13 мг/кг (по Randall С. Basclt, 2004).
Смей (Se)
Соединения селена используют в электронной. литейной, медеплавильной, стекольной, ла-
кокрасочной. нефтеперерабатывающей, химической и фармацевтической промышленности. а
также в медицине (селенит, ссленат натрия, селенописгсин. селснометионин. селенопиран,
радиоактивные изотопы).
Источником селена в обычном питании человека являются различные продукты животною
и растительною происхождения (зерновые, особенно пшеница, чеснок, репа, свиное сало,
мясо, белые грибы, оливковое масло, морские водоросли, бобовые, маслины, фисташки, ке-
шью и др.), причем в животных продуктах преобладает селсноцистенн (Sc-Cys). а в расти-
тельных — селснометионин (Se-Met) Основная форма Se в зерне — Se-Mct* По некоторым
данным, большая часть этой аминокислоты сосредоточена в зародыше зерна, поэтому гонкий
помол муки снижает уровень погреб; синя Se. Биодоступность органического селена из пше-
ницы и животного продукта (мяса), по-видимому, одинакова.
• Главным фактором, определяющим накопление Se в зерне, является уровень зтого гемента в почвах, который мо-
жет колебаться п очень широких пределах В Российской Федерации крайне низкие уровни Sc в почвах огмечаюгся
в Бурятии н Чк|инской области Получены донные н о возможности большого дефицита Se среди чает населения
Иркутской области. Для значительного числа дру ix регионов России (Ленинградская. Псковская, Новгородск я. Ка-
лужская. Брянекая. Ярое, авская области. Алтайский край) характерен уровень Sc в крови 60—80% фи шолоп1чеекою
оптимума (г.с. 70—40 мкг/л) В целом но России, согласно данным эпидемиологических исследований. проведенных
н последнее время, более чем у 80% населения обеспеченность селеном ниже оптимальной.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 871
Обеспечение организма селеном может осуществляться также путем потребления неорга-
нических солей — селе и та или селснета натрия, однако их токсичность достаточно высокая
(см ниже). Органические и неорганические соединения селена легко всасываются в ЖКТ, но
биотрансформируются по-разному (рис. 8-52). Сслсиат- и селениг-анионы быстро восстанав-
ливаются ферме гаi явным путем до селеноводорода, присутствующего при физиологических
значениях pH в основном в виде гидроселен нд-ап поил (HSe). Необходимым кофактором про-
цесса является восстановленный глупнион (GSH), причем промежуточным продуктом являет-
ся селенодиглутатион (GS-Se-SG). Некоторое количество образующегося селеноводорода быс-
тро связывается с транспорт ними белками за счет слабых ковалентных или ван-дер-ваальсовых
связей, образуя лабильный (обмениваемый с селенитом) пул селена, причем емкость этого
пула ограничена. Избыточные количества селеноводорода медленно подвергаются фермента-
тивному метилированию с образованием последовательно метилпшроселенидв (Se-содсржа-
ший аналог метанола), димстилссленила и катиона триметилселенония. Эти соединения Se
экскретируются с мочей, а диметилселснид — также и с потом. Процесс метилирования произ-
водных селеноводорода обратим. Строю определенное количество селена, входящего в состав
пула селеноводорода, через сталию селенофосфата включается в высокоспецифичный процесс
синтеза селенопротеинов. таких, как глутатион!юроксидазы 1. II, III. и IV, селенопротеин Р,
5'-йодогиронинлейодиназа. селенопротеин W, тиорелоксинредуктаза и некоторых других (см.
гл. 8.5.1). В состав этих белков у человека Se входит исключительно в виде остатка селенонис-
теина. Перечисленные возможности количественной утилизации селеноводорода в организме
oi различены и при поступлении в организм избыточных количеств неорганического селена он
может накапливаться в тканях в форме гидросслепид аниона. Эта форма Se чрезвычайна ток-
сична.
Органические формы селена (Se-Met и Se-Cys) утилизируются по иному пути. Ввиду боль-
шого сходства физико-химических свойств метионина и селеномстиоиина последний способен
замещать метионин в белках, включаясь в них по специфическому для метионина механиз-
му (соответствующая тРНКте! «ошибается», принимая за метионин его селеновый аналог).
Включение селеномстиоиина в белки обладает двумя важными особенностями. Во-первых,
селен тем больше включается в белки, чем большее количество остатков Met и Cys имеется в
их первичной последовательности. Во-вторых. количество включаемого Se-Met в значительной
степени зависит от количества не только поступающего с пищей Se-Met. но и метионина. На
основании этих данных сделан вывод, что Se-Met является источником селена для синтеза
специфических селенопротеинов только тогда, когда организм нормально обеспечен серой в
форме метионине. Процесс включения Se-Mei в тканевые белки и высвобождение из них нрн
протеолизе протекают медленно. Количество Sc-Mct. которое может включаться в животные
белки без изменения их функции, сравнительно велико. При нормальной обеспеченное!и селе-
ном человека общее количество селена в организме составляет 10—14 мг. а количество селена в
лабильном метаболическом пуле (специфические селенопротеины + селенит 4- селеноводород
и его производные) — 3,5—6.5 мг. Остальной селен в виде селеномстиоиина и селенопистеина
находится в составе тканевых белков. Можно предположить, что при потреблении избытка
Sc-Mct величина пуле (консервативное депо селена в организме) может быть еше большей. С
этим обстоятельством связана, по всей видимости, гораздо меньшая токсичность Se-Mct по
сравнению с селенитом при пероральном поступлении. Часть высвобожда мого Se-Met траи-
са.мпнпрусгся с образованием аланина и метилгндросслепила. который далее либо метилиру-
ется и экскретируется, либо деметилируется ло селеноводорода, включаемого в лабильный пул
селена в организме.
Другой путь метаболизма — транссульфтрания с образованием селенопистеина. Послед-
ний может далее песпеиифически включаться в тканевые белки вместо цистеина. Включение
Se-Cys в тканевые белки зависит от обеспеченное!и организма серой так же. как и включение
Se-Met. Часть селенопистеина деселен и ртется с образованием либо селенита, либо селено-
водорода под действием зависимой от витамина В„ сслсноцистеинлиазы и с промежуточным
образованием при этом свободного Se. Хотя в состав глутатион пероксидазы, селенопротеина Р
и других Se-специфических селенопротеинов Sc входи г именно в составе селенопистеина, пос-
ледний в сколько-нибудь заметных количествах непосредственно в эти белки нс включается.
Таким образом, взжно подчеркнуть два обстоятельства: во-первых, соединения нсорганичес-
872 Глава 8
кого Se обладают низким порогом токсичности ввиду ограниченных возможностей утилизации
их главного токсичного метаболита — селеноводорода (аниона гидросе спида) и, во-вторых,
неор аничсский селен в организме человека и животных может вклюгаться в селеноцнстеин.
но никогда нс включается в селенометионин (см. рис. 8-52).
Селен является элементом, выполняющим антиоксидантую защитную функцию в организ-
ме (ем. гл. 8.5.1).
Оценку содержания селена в организме проводят по результатам исследования крови, мочи
и волос. Активность глутатиопероксидазы в эритроцитах является индикатором селенового
статуса организма.
Избыточное поступление селена и его соединений, как правило, профессионально обуслов-
лено. Описаны случаи сслснотоксикоза (щелочной болезни) у человека и животных. связанно-
го с поступлением селена из растений, произрастающий на почвах с избыточным его содержа-
нием. В России избыток селена в окружающей среде встречается в Якуши и на Урале.
Дефицит и особенно избыток селена и его соединений опасен для человека.
Причины дефицита селена:
• пониженное содержание селена в пище, питьевой воде;
• нарушение обмена селена в организме;
• усиленный расход на нейтрализацию вредных веществ;
• недостаточное поступление при парентеральном штанин;
• алкоголизм.
Ос ювные проявления дефицита селена'
• дерматит, экзема;
• слабый рост, выпадение волос;
• дистрофические изменения ногтей;
• снижение иммунной зашиты организма;
• нарушения функции печени;
• недостаточное и. репродукшвиои системы (в основном мужское бесплодие);
• замедление роста у детей
Причины избытка селена:
• избыточное поступление;
• нарушение регуляции обмена селена.
Выведение с
калом
Бронх легочный
тракт
(СНз>з& (снлаз
Рис. 8-52. Схема биогран формации соединений селена в организме человека.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 873
При интоксикации селеном необходимо использовать хелатирующую терапию, а также сим
птоматические средства.
Основные проявлю ин избытка се. ена:
• нестабильное эмоциональное сос оянис.
• чесночный запах изо рта и от кожи (образование длметилселенида):
• тошнота, рвота.
• нарушения функций печени.
• эритема кожи;
• насморк, бронхопневмония, отек легких (при вдыхании паров селена):
• выпадение волос;
• ломкость ногтей.
Синергисты и антагонисты catena
При дефиците селена в организме происходит усиленное накопление мышьяка, кадмия и
ртути. Селен являемся апгаюпистом ртути, мышьяка, кадмия. свинца, таллия и серебра Вита
мин Е способствует усвоению селена. Избыточные поступления Hg. Cu. As. сульфатов, пара-
цетамола. фенацетина, противомалярийных препаратов может привести к дефициту' селена в
ор1анизме.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные содержание селена в плазме кропи.
Дополнительные: содержание селена сыворотке крови и моче, проксимальных участках по-
лос (2.5 см), активность глутатиопсроксидазы.
Токсикокипстическис характерноптки селена представлены в табл. 8-72.
Таблица 8-72. Токсикокинетические характеристики селена
Суто । юе поступление е продуктами питания 0.02—0.07 mi
Резорбция ит ЖКТ 50-70%
Суточное вы веление моча кал ЦО1 прочие (волосы и др.) 0.008 мг 0.0) мг 0,0015 мг 0.0005 мг
Период полу выведения (Т ,) 50—70 сут
Объем распределения (Vd) •J
Связывание с белками плазмы (Fb) 99%
Среднее содержа ние:
орган» гм человека массой 70 кг 10—15 мг
кости 1 -9 мг/кг
кровь 0.058-0.234 мг/л
иллзма/сыворог ка 0.046 — 0.160 мг/л
мышпы 0,42—1,9 мг/к<
। рудное молоко 0.01-0.062 mi/л
моча 0.004 мг/л
волосы 0.2-1.8 мг/кг
ногти 0.3- 1.8 мг/кг
зубы (эмаль) 12.8 мг/кг
зубы (лектин) 0.27 0.87 mi/кг
Токсическая доза селена для человека 5 мг
Содержание селена в биожидкостях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в табл 8-73.
874 Глава 8
Таблица 8-73. Содержание селена в биож кд костях (в мг/л) и гканях (в мг/кг) при легальном исходе
Биосубстраты Кровь Мозг Печень Почки Моча
Среднее значение 5.1 1.1 2.7 6.3 2,1
(0.5-28) (0,5-1.5) (0.8—5.4) (1.5-14) 2,1
При интоксикации концентрация селена в крови более 0.10 мг/л, в моче более 0,40 мг/сут.
Молибден (Мо)
Природным источником молибдена является минерал молибденит, а получают молибден
обычно как побочный продукт при производстве мели. Соединения молибдена применяются в
производстве различных сплавов, электродов, минеральных удобрений, используются в качес-
тве катализаторов при биологической фиксации азота.
В медицине в диагностических целях применяют радиоизотопы молибдена (сканирование
печени, исследование циркуляции крови в мышцах). В настоящее время изучают эффектив-
ность тстрамолибдата аммония в терапии новообразований головного мозга и при мужском
бесплодии.
Соединения молибдена попадаю! в организм с пищей. Растворимые соединения легко всасыва-
ются из ЖКТ, абсорбируются из легких, поступают в кровь из мест парентерального введения.
За сутки в организм взрослого человека поступает вместе с пищей 75—250 мкг молибдена.
Болес половины поступившего в ЖКТ молибдена всасывается в кровь. Около 80% поступив-
шего в кровь молибдена связывается с белками (в первую очередь с альбуминами). Молибден
накапливается в печени, а в кропи распределяется равномерно между форменными элемента-
ми и плазмой. Растворимые соединения молибдена выводятся из организма с мочой и калом
(рис. 8-53).
Физиологическое значение молибдена лля организма животных и человека было впервые
показано в 1953 г. в связи с открытием апияния этого элемента на активность фермента ксан-
тиноксидазы Молибден входит в состав альдегидоксидазы, сульфигоксндазы, ксанз иноксида-
зы, выполняющих важные физиологические функции, в частности регуляцию обмена мочевой
кислоты. Недостаток молибдена в организме сопровождается уменьшением содержания в тка-
Поступление с пищей
Рис. 8-53. Обмен молибдена в организме человека
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 875
нях ксангиноксгшазы. Тиомолибдат аммония (растворимая соль молибдена» является анта-
гонистом мели и нарушает ее утилизацию в организме. Есть сведения, что молибден шраег
важную роль в процессе включения фтора в зубную эмаль. а также в стимуляции гемопоэза.
Оценку содержания молибдена в организме проводят по результатам исследования крови и
волос. Среднее содержание молибдена в плазме крови составляет 0.3—1.2 мкг/л. в волосах —
0.02—2.0 мкг/г.
Пониженное содержание машбдена в организме
При недостатке в организме модибдена (или избытка вольфрама) нарушается процесс окис-
ления ксантина до мочевой кислоты, тормозится катаболизм метионина, уменьшается экскре-
ция мочевой кислоты и неорганических сульфатов, происходит избыточное накопление меди
вплоть до медной интоксикации. Все эти явления могут быть устранены при добавлении в
рацион молибдена.
В некоторых районах мира наблюдаются эндемические заболевания, связанные со степенью
обеспеченности населения молибденом (например, отмечен рост заболеваемости раком пище-
вода в провинциях Хэнань. КНР: Транскей, ЮАР).
Причины дефицита машбдена:
• вегетарианская листа;
• парентеральное питание:
• избыток гюльфр: ма в организме.
Основные проявления дефицита молибдена:
• снижение активности молибдснсодержаших ферментов;
• повышенная возбудимость. раздражительность:
• нарушение зрительной (темновой) адаптации, «куриная слепота».
• нарушение ритма сердечных сокращений (тахикардия);
• повышение риска развития рака нитевода.
Повышенное содержание молибдена в организме
Избыток молибдена в организме может быть следствием превышения безопасного уровня
ею поступления е нитей (0.5 мг/сут). Ко да сжссутогнос потребление молибдена составляет
0,5—10 мг. отмечаются лишь умеренно выраженные биохимические изменения, существенно
не влияющие на здоровье человека. При потреб гении 10—15 мг молибдена в сутки проявля-
ются клинические симптомы интоксикации. При дозах молибдена, превышающих 15 мг/сут.
повышается активность ксангнноксидазы. накапливается мочевая кислота, увеличивается риск
возникновения подагры (улиц, контактирующих с молибденом в производственных условиях).
При хронической молибденовой интоксикации развиваются неспснифические симптомы, про-
являющиеся ра гдраженнем слизистых оболочек. пневмокониозом, уменьшением массы тела.
При избыточном содержании молибдена в почве наблюдается эндемическое заболевание —
молибденовая подагра. впервые наблюдаемая в Ан каванском районе Армении проф В.В. Ко-
вальским.
Причины избытка молибдена:
• избыточное поступление в организм соединений молибдена с пищей, воюй, молибденсо-
лержашими препаратами:
• интоксикация молибденом в условиях производства.
• дефицит мели в рационе.
Основные проявления избытка молибдена:
• повышение активности ксантин оксидазы;
• повышение уровня мочевой кислоты в моче.
• подагра (также возможна уратурия. мочекаменная болезнь):
• раздражение слизистых оболочек:
• пневмокониоз;
• угнетение кроветворения (анемия, лейкопения);
• снижение массы тела.
Синергисты и антагонисты машбдена
Полагают что вольфрам, свинец и натрий действуют как антагонисты молибдена и вы-
зывают его дефицит в организме. Сульфат меди усиливает выделенке молибдена с желчью.
Тиомоли блат аммония (растворимая соль молибдена) является антагонистом меди и нарушает
876 Глава 8
ее утилизацию в организме. Дефицит мели и железа способствует увеличению содержании мо-
либдена в организме.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание молибдена в плазме крови, волосах. моче.
Дополнительные; содержание меди в моче, церулоплазмина в сыворотке крови, повышение
активности ксантиноксидазы эритроцитов и концентрации мочевой кислоты в сыворотке кро-
ви и моче.
Токсическая доза молибдена для человека 5 мг. летальная доза 50 мг.
Элементы VII группы Периодической системы элементов (марганец, йод)»
Мар анец (Мп)
В виде сплавов с железом (ферромарганец) и кремнием (силикомарганец) марганец ис-
пользуется в сталелитейной и химической промышленности, при производстве кормов для
животных и удобрений, в медицине в качестве анiиссптического средства широко применяют
перманганат калия и органические соединения марганца в минерально-витаминных комплек-
сах и БАД, радиоактивные изотопы марганца для диагностики
Mapiанец активирует многие ферментативные процессы, необходим для синтеза гликоза-
миногликанов хрящевой ткани, для эритропоэза, образования гемоглобина, оказывает липо-
тронное действие (см. гл. 8.5.1).
Резорбция марганца из ЖКТ в кровь невысока. Всасывание марганца происходит в орга-
низме на всем протяжении тонкой кишки. Марганец быстро покидает кровяное русло и в тка-
нях содержится главным образом в митохондриях клеток, накапливается в печени, трубчатых
костях, поджелудочной железе, почках. Выводится марганец преимущественно с калом и в
незначительном количестве — с потом и мочой (рис. 8-54).
Марганец относится к важнейшим микроэлементам и выполняет вортанизме многочислен-
ные функции.
• участвует в синтезе и обмене нейромедиаторов в ИНС:
• препятствует свободнорадикальному окислению, обеспечивает стабильность структуры кле-
точных мембран;
• обеспечивает нормальное функционирование мышечной ткани:
• участвует в обмене гормонов шитовидной железы (тироксин):
• обеспечивает развитие соединительной ткани, хрящей и костей:
• усиливает гипогликемический эффект инсулина;
• повышает гликолитическую активность;
• повышает интенсивность утилизации жиров:
• снижает уровень липидов в организме;
• противодействует жировой дегенерации печени;
• участвует в регуляции обмена витаминов С. Е, группы В, холина, меди.
• участвует в обеспечении потноценной репродуктивной функции:
• необходим для нормального роста и развития организма.
Дефицит марганца — одно из распространенных нарушений биоэлементного обмена совре-
менного человека. Это факт связан с повышенной психоэмоциональной нагрузкой на человека
за счет усиленного расхода марганца для обес игчеиия основных нейрохимических процессов в
L1IIC. Дефицит марганца отрицательно сказывается на стабильности мембран нервных клеток
и ЦНС в целом, отражается на функциях мозга и других органов и систем.
Причины дефицита марганца:
• недостаточное поступление марганца извне (неправильное питание, снижение потребления
богатых марганцем продуктов, в частности растительной пиши),
• избыточное поступление в организм фосфатов (пимонады, консервы);
• усиленное выведение марганца под влиянием избыточного содержания в организме каль-
ция. меди и железа:
• усиленное расходование марганца в результате психоэмоциональных перегрузок, у женшин
в предклимактерическом периоде и при климаксе:
Фтор. хлор, бром ем. гл. 8.6. н 8.7.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 877
калом мочой
Рис. 8-54. Обмен марганца в организме человека
• загрязнение организма различными токсинами (цезий, ванадий);
• нарушение рефляции обмена марганца в организме.
Основные проявления дефицита марганца:
• утомляемость, слабость, головокружение, плохое настроение:
• ухудшение процессов мышления, способности к принятию быстрых решений, снижение
памяти;
• нарушения сократительной функции мышц, склонность к спазмам и су; рогам, боли в
мышцах, двигательные расстройства;
• дегенеративные изменения суставов, склонность к растяжениям и вывихам, остеопороз в
климактерическом периоде;
• нарушения пигментации кожи, появление мелкой чешуйчатой сыпи, витилиго;
• задержка роста нопей и волос;
• снижение уровня «полезного» холестерина в крови, нарушение толерантности к глюкозе,
прибавка массы тела, ожирение:
• бесплодие;
• дисфункция яичников, ранний климакс, преждевременное старение:
• расстройства иммунитета, ajuepi ические реакции, риск онкологических заболеваний.
• задержка разви гия у детей
Факты отравления человека марганцем, содержащимся в пищевых продуктах, не зафиксированы.
В то же время описаны случаи острого отравления марганцевой пылью на производстве с последую-
шим быстрым развитием «марганцевого психоза». Для развития клинической картины хронической
интоксикации марганцем обычно требуется несколько лег. Следует отметить достаточно медленный
процесс изменений в организме, вызываемый повышенным содержанием марганца в окружающей
среде (например, распространение эндемического зоба, не связанною с дефицитом йода).
Причины избытка марганца
• избыточное поступление в организм (вдыхание марганцевой пыли на производстве:
• нарушение регуляции обмена марганца в организме.
Основные проявления избытка марганца:
• вялость, утомляемость, сонливость, заторможенность, ухудшение памяти, депрессия;
• нарушения мышечного тонуса, парестезии, замедленность и скованность движений, рас-
стройства походки, снижение мышечного тонуса, атрофия мышц;
878 Глава 8
• развитие паркинсонизма, энцефалопатии;
• диффузное узелковое поражение легких, развитие манганокониоза (при вдыхании пыли).
Синергисты и антагонисты марганца
Всасыванию марганца в ЖКТ способствуют витамины В,. Е, фосфор и кальции (в умерен-
ном количестве), а препятствует избыточное поступление фосфора и кальция.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание марганца в цельной крови, плазме.
Дополнительные: содержание марганца в волосах, печени, почках, костях, поджелудочной
железе. ЭЭГ/ЭМГ. эритроцитарною глутатиона. 17-кслостероидов в моче.
Токсикокинетические характеристики марганца представлены в табл. 8-74
Таблица 8-74. Токсикокинетические характеристики мар|аниа
Суточное поступление с продуктами питания 3.7 мг
Сую 1ное поступление с воздухом 0,002 mi
Резорбция из ЖКТ в кровь 1-5%
Суточное выведение.
моча 0.03 мг
кал 3.6 мг
пот 0.04 мг
прочие (волосы и др.) 0,002 mi
Период полувывеления П /2) 4—40 сут
Объем распределения (Vd)
Связывание с белками плазмы (Fb) •?
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кг 12 mi
кости 0,2—1 мг/кг
кровь 0,0016-0.075 мг/л
плазма/сывороткд 0.0003-0,001 mi/л
печень 0,5—5,0 мг/ki
мышны 0.5—2,1 мг/ki
грудное молоко 0.01 мг/л
моча 0,015 мг/л
МОЗГ 0,25 мг/кг
почки 0,56 мг/кг
легкие 0.22 мг/кг
ВОЛОСЫ 0,2—4.4 мг/кг
HOJTH 0.05-2.0 мг/ki
зубы (эМДЛЬ) 0.19—10.5 мг/кг
зубы (дентин) 0,04 —10,5 мг/кг
Токсическая доза марганца для человека 40 мг.
Содержание маршнна в биожидкостях организма человека при интоксикации представлено
в табл. 8-75.
Таблица 8-75. Содержание марганца в биожнчкоетях при интоксикации*
Биосубстра Концентрация при интоксикации, мг/л
Це ьная кровь •>
Сыворотка ilt зма крови > 0.1 мг/л
Моча >0.02 мг/л
•См гл. 8.5.4.
880 Глава 8
Йог обладает высокой физиологической активностью и является обязательным структур-
ным компонентом тиреотропного гормона и тиреоидных гормонов щитовидной железы. Ос-
новные функции йода в организме:
• участие в регуляции скорости биохимических реакций;
• учасше в регуляции обмена энергии. температуры тела;
• участие в регуляции белкового, жирового, водно-электролитного обмена;
• участие в регуляции обмена некоторых витаминов;
• участие в регуляции дифференцировки тканей, процессов роста и развития организма;
• индукция повышения потребления кислорода тканями.
Причины дефицита йода:
• недостаточное поступление;
• наличие в пище струмогенных факторов, препятствующих усвоению и утилизации иода;
• прием лекарств, оказывающих струмогенное дей :твие:
• нарушение регуляции обмена;
• повышение радиационного фона:
• загрязнение окружающей среды;
• аллергизация организма.
Основные проявления дефицита йода:
• увеличение выработки и выделения гормонов щитовидной железы:
• формирование зоба;
• развитие йододефицитных состояний и заболеваний.
Причины избытка йода:
• избыточное поступление;
• нарушение регуляции обмена йода.
Основные проявления избытка йода:
• формирование зоба;
• развитие гипертиреоза, тиреотоксикоза;
• головные боли, усталость, слабость, депрессия;
• онемение и пощипывание кожи, сыпь, угри;
• токсикодсрмия (йододерма), обусловленная избытком или непереносимостью препаратов
йода;
• асептическое воспаление (йодизм) слизистых оболочек в местах выделения йота (дыхатель-
ные пути, слюнные железы, околоносовые пазухи).
Синергисты и антагонисты йода
Не следует одновременно принимать добавки, содержащие йод и карбонат лития. Литии сни-
жает активность щитовидной железы, а йод усиливает проявления побочных эффектов лития.
Антагонистами йода являются избыточные количества Со. Мп, Pb, Са, Вг, Cl. F. Усиление стру-
могенного эффекта наблюдается при дефи тите у человека Se, Zn, Си. Во всех перечисленных
случаях может развиваться нарушение обмена йода и его утилизации щитовидной железой.
Индикаторы зкспозиции/интоксикации
Для оценки обеспечения населения йодом определяют содержание йода в моче, для инди-
видуальной оценки — концентрацию йода в волосах, показатели состояния щитовидной желе-
зы — с помощью УЗИ и гормонального профиля.
Токсическая доза йода для человека 2 мг, летальная более 35 г.
Элементы VIII группы Периодической системы элементов (железо, кобальт, никель)
Железо (Fe)
Железо входи г в состав сотен минералов, встречается и в виде самородного железа. В про-
мышленности железо широко применяется в виде множества различных сталей и сплавов.
В медицине препараты на основе различных солей двух и трехвалентного железа, а также
железосодержащие БАД, применяются для восполнения относительного или абсолютного де-
фицита железа (см. гл. 8.5.1).
В организме взрослого человека содержится около 3—5 г железа; почти 2/ лого количества
входит в состав гемоглобина. Роль и функции соединений железа в организме человека обсуж-
дались в гл. 8.5.1.
Схема обмена железа в организме человека представлена на рис. 8-56.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 881
Поступление Fe с лишен
(Fe^/Fe2*). 10-16 мг/сут
Рис. 8-56. Обмен железа в организме человека.
Содержание железа в волосах у мужчин выше, чем у женщин. У лип. страдающих заболе-
ваниями печени, селезенки, хроническим алкоголизмом, содержание железа в волосах повы-
шено.
Причины дефицита же tew:
• недостаточное поступление (неправильное питание, ве етарианская листа, недоедание):
• снижение всасывания железа в кишечнике.
• нарушение peiy.iniiHH обмена витамина С:
• избыточное поступление в организм фосфатов, оксалатов. кальция. пинка, витамина Е;
• поступление в организм железосия зываюших веществ (комплексонов);
• отравление свинцом антацидами;
• усиленное расходование железа (в периоды интенсивного роста и беременности);
• потери железа, свя апные с травмами, обильными менструациями, донорством, занятиями
спортом, кровопотери при операциях:
• гормональные нарушения (дисфункция щитовидной железы):
• гастриты с пониженной кислотообразующей функцией, дисбактериоз:
• различные системные и опухолевые заболевания;
• глистная инвазия.
Основные проявления дефиците] железо:
• развшие железодефицишых анемий;
• головные боли и головокружения, слабость, утомляемость, непереносим :хзь холода. сниже-
ние памяп) и концентрации внимания;
• замедление умственного и фишчиского развития у дечей. неадекватное поведение;
• учащенное сердцебиение при незначительном физической нагрузке;
• растрескивание слизистых оболочек в узлах рта. покраснение и сглаженность поверхности
языка, атрофия вкусовых сосочков;
• ломкость, уюнчсние. деформация ногтей:
• извращение вкуса (тяга к поечанию непищевых веществ), особенно у детей младшего воз-
раста. затрудненное глотание, запор:
882 Глава 8
• угнетение клеточного и гуморального иммунитета;
• простудные и инфекционные болезни у детей, гнойничковые поражения кожи, энтеропа-
тии;
• повышение риска развития опухолевых заболеваний.
Для диагностики дефицита железа в организме обычно используют комбинацию тестов,
включающих определение сывороточного железа, сывороточного ферритина, обшей желе-
зосвязываюшеЛ способности сыворотки (ОЖСС). свободного порфирина эрнгроцитов.
При некоторых наследственных и хронических заболеваниях, избыточном поступлении
извне железо может накапливаться в организме. Люди с избыточным содержанием железа
страдают от физической слабости, теряют в массе тела, чаше болеют, при этом избавиться от
избытка железгг часто намного труднее, чем устранить его дефицит (см. гл. 8.5.1).
При гяжслом отравлении железом повреждается слизистая оболочка кишечника, развива-
ется печеночная недостаточность, появляются тошнота и рвота. Для детей младшего возраста
отравление железом является одним из самых распространенных видов с.тучш ною отравления.
У ребенка прием Зги более сульфата железа вызывает летальный исход.
Причины избытка железа
• избыточное поступление извне (например, при повышенном содержании в питьевой воде);
• заболевания печени, селезенки, поджелудочной железы (в том числе, в результате хроничес-
кою алкоголизма);
• нарушение регуляции обмена железа.
При хроническом избытке желез*, его отложении в тканях и органах (сидероз) применяют
кровопускания, попользуют гепатопротскторы. комплексообразовагслн (дсфероксамин 0,5—
1 г/день. внутривенно, внутримышечно, подкожг о. 5 мг/кг внутривенно в течении 1 ч. мед-
ленно). препараты цинка и др.
При остром отравлении железом промываюг желудок 6—8 л полиэтиленгдиколя в течение
2—4 часов. В некоторых случаях проводят гастротомию, чтобы изъять поступившее железо
и предотвратигь тяжелое поражение печени. Назначают дсфероксамин (лесферал) до 15 мг/
(кгч). по 0,5 г каждые 4—12 ч. максимум 6 г вдень, продолжительность введения не более 24 ч.
поскольку более длительная терапия повышает риск развития днстресс-снндрома.
Основные проявления избытка железа:
• отложение железа в тканях и органах, сидероз;
• головные боли, головокружения, повышенная утомляемость. слабость,
• пигментация кожи;
• изжога, тошнота, рвота. боли в желудке, запор или диарея, изъязвление слизистой оболочки
кишечника;
• печеночная недостаточность, фиброз;
• повышенная насыщенность железом трансферрина;
• снижение уровня сывороточного железе (в 1.5—3 раза);
• повышение риска развития атеросклероза, болезней печени и сердца, артритов, диабета и
т.д.;
• угнетение клеточного н гуморального иммунитета:
• повышение риска развития инфекционных и опухолевых заболеваний.
• потеря аппетита, уменьшение массы тела.
Избыток железа уменьшает способность организма усваивать медь и цинк.
Синергисты и антагонисты железа
Железо проявляет синергизм с кальцием, медью, витаминами Вр. А, пектином Антагонис-
тами железа являются фосфаты, антациды, фитаты, витамин Е. цинк, алмагсль, клофибрат.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание железа Fe в сыворотке/илазмс крови, волосах (проксимальный
участок волос).
Дополнительные: уровень сывороточного ферритина. ОЖСС. свободною порфирина в
эритроцитах (зри троим гарный порфирин).
Токсикокинетичсские характеристики железа представлены в табл. 8-76.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 883
Таблица 8-76. Гокснкоквнстнческие характеристики железа
Суточное поступление с продуктами питании Суточное поступление с воздухом 6—40 mi 16 мг (мужчины), 12 мг (женщины) 0.03 мг
Резорбция из ЖКТ в кровь 10-20%
Суточное выведение:
моча 0.25 мг (мужчины). 0.20 мг (женщины)
кал 15 мг (мужчины). II мг (женин ны)
йот 0.5 мг (мужчины). 0.6 mi (женщины)
прочие (во. осы и др.) 0.01 mi
Периол нолувыведения (Т|Л) 3-8 ч
Объем распределения (Vd) 0.07 -0.13 л/м
Связывание с бедками плазмы (ГЬ) 99%
Среднее содержание:
ор типам человека массой 70 ki 3.9-5 ।
КОСТИ 3-380 мг/кг
кровь 309-521 мг/л
i ыазма/с ы ворот ка 0.5—1.7 мг/л (женщины) 0.65—1,75 мг/л (мужчины)
слюна 0.4 мг/л
печень 50—24( мг/кг
сслеченкл 57- 590 мг/кг
почки 7—160 мг/кг
мозг 8—96 мг/кг
легкие 112-280 мг/кг
мыишы 180 мг/кг
|рулное молоко 0.202-1.71 м /л
моча 0,10—0.12 мг/л
волосы 5—177 мг/кг
жили 27—79 мг/кг
зубы (эмаль) 32—110 мг/кг
зубы (дентин) 4.4—338 мг/кг
Токсическая лоза железа лля человека 200 мг, летальная доза 7—35 г.
Содержание железа в биожидкостях и тканях организма человека при ин1оксикании и ле-
гальном исходе представлено в табл. 8-77.
Таблица 8-77 Содержание железа в биожилкостях (в мг/л) я тканях (в мг/кг) при интоксикации и ле-
тальном исходе
Биосубстраты Концентрация при интоксикации Концентрация при летальном исходе
Сыворотка/Пжзма крови 2.8—25.5 19—50
Печень 1504
11ОЧКИ 982
Кобальт (Со)
Соединения кобальта используются лля получения кобальтовых сплавов, при изготовлении
керамики, в химической промышленности.
884 Глава 8
Содержащий кобальт витамин Вр (цианокобаламин), при лечении постгеморрагических,
жслезодефицитных и апластических анемий, а также заболеваний ЦНС и кожных болезней.
Хлорид кобальт (II) в виде 20% раствора используют при лечении гипертонической болезни.
Радиоактивный изотоп кобальта применяют в радиоизотопной диагностике и при лучевой те-
рапии (ы)Со).
Кобальт является жизненно необходимым элементом для человека и животных. Он оказывает
влияние на гемопоэз, бе. ковый. углеводный, жировой обмен, размножение и рост организмов,
участвует в ферментативных процессах и образовании гормонов щитовидной железы, угнетает
обмен йода, способствует выделению волы почками. Кобальт повышает усвоение железа и син-
тез гемоглобина, является мошным стимулятором эритропоэза. Витамин В|2. помимо участия в
процессах кроветворения, синтеза белков способствует детоксикации организма (см. гл. 8.5.1).
В организм человека кобальт поступает с пишей. Особенно много кобальта в говяжей пече-
ни, молоке. красной свекле, редисе, зеленом луке, капусте, петрушке, салате и чесноке.
Причины дефицита кобальта:
• недостаточное поступление;
• нарушение регуляции обмена.
• атрофия слизистых оболочек ЖКТ;
• пониженная кислотность желудочного сока;
• снижение функции полж дудочной железы:
• глистная инвазия:
• дефицит витамина В,
Основные проявления дефицита кобальта:
• обшая слабость, утомляемость
• снижение памяти:
• вегетососудистые нарушения, аритмии;
• анемии.
• замедленное развитие в детском возрасте;
• медленное выздоровление после заболеваний.
Дефицит кобальта наблюдается при недостаточном поступлении этого элемента в организм —
10 мкг/cvt и менее.
Избыточное поступление кобальта в организм встречается довольно редко и сопровождает-
ся различными нарушениями здоровья. Повышенное содержание кобальта наблюдает у лиц.
работающих в металлургической, стекольной и цементной промышленности. Пыль, солер-
жащая соединения кобальта, при поступлении в легкие способна вызывать отек и легочные
кровотечения. Повышенное количество кобальта в организме наблюдается при избыточном
приеме (ипамипа В 3. Соли кобальта используются при про вводстве некоторых сортов пива,
что в ряде случаев приводит к развитию у сто потребителей кобальтовой кардиопатни.
Причина избытка кобальта:
• избыточное поступление.
Основные проявления избытка кобальта:
• пневмосклероз, кобальтовая пневмония:
• поражение сердечной мышцы (кобальтовая кардиомиопатия);
• аллергодерматиты (контактный дерматит):
• гиперплазия щитовидной железы;
• поражение слухового нерва;
• повышение артериального давления и уровня липидов в крови;
• повышение количества эритроцитов в крови.
Синергисты и антагонисты кобалыт а
Повышенное содержание белка и железа в нише замедляет усвоение кобальта в ЖКТ. медь
и цинк, напротив, усиливаю! этот процесс. Избыток кобальта может приводить к нарушению
метаболизма иола в шитовидной железе.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание кобальта в моче, волосах.
Дополнительные: содержание кобальта в сыворотке крови (риск контаминации).
Токсикоктготические характеристики кобальта представлены в табл. 8-78.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 885
Таблица 8-78. I экснкокинегическис характеристики кобальта
Суточное постугьчсггие с продуктами пи гания 0.02—0.05 мг
С уточное поступление с во пухом 0.00012 mi
Резорбция из ЖКТ и кровь 20-30%
Суточное выведение.
моча 0.005 мг
KJL1 0,01 мг
пот 0.0025 мг
прочие (полосы и др.) 0.0005 мг
Период |1олувывелсния (Г > 30—40 дет
Объем распределения (Vd) •>
Связывание с бедками плазмы (1Т>) ?
Среднее содержание:
организм человека массой 70 кг 1,5 мг
иоггм 0.01-0.04 мг/кг
кровь 0.0002-0.04 мг/л
п ла зма/сыворо! ка < 0.0005 мг/л
дритропигы 0.016—0.0-16 мг/л
МЫШЦЫ 0.028-0.65 мг/кг
грудное молоко 0.3 мг/л
моча 0.002 мг/л
ВОЛОСЫ 0.0004 - 0.5 мг/кг
ногти 0.01-1.0 мг/кг
зубы (змаль) 0.006 1.1 мг кг
зубы (дентин! 0.004 -0,13 мг/кг
ночки 0.1—0.5 мг/кг
печень 0.006—0,11 mi/ki
Токсическая лоза кобальта лля человека 500 мг.
Содержание кобальта н биожидкоегях и тканях организма человека при летальном исходе
представлено в табл 8-79.
Таблица 8-79. Содержание кобальта в биожидкоегях (и мг/.lj П тканях (в мг/кз) при легальном исходе
Биосубстраты Когшсгпрниия при летальном исходе
Сыворогка/пдазма крови 1.360
Моча 26.40
Сердце 0.37
Легкие 0.17
11сченг. 0.34
Почки 0,29
1/ике.1ь (\7)
Соединения никеля используются для изготовления монет, в металлических покрытиях и
катализаторах различных силанах В медицине никель применяется при изготовлении имп-
лантатов.
Никель и его соединения поступают в организм различными путями: пероральным, трапс-
<|юрма.тьным. ингаляционным. комбинированным. В организме никель накапливается в пе-
чени. надпочечниках, костном мозге, гюжслудочной и щитовидной железах, легких, где его
содержание е возрастом увеличивается.
886 Глава 8
В п шзме крови никель находится в основном в связанном состоянии с Годками: никедь-
гишзмином (а,-макроглобулин) и «,-гликопротеином
Никель участвует в ферментативные процессах, окислении аскорбиновой кислоты, угнетает
действие адреналина. Повышенная концентрация никеля в моче (свыше 50 мкг/л) свидетельс-
твует об интоксикации никелем организма. При повышенном содержании никеля в органи: ме
вдвое возрастает выведение корт икос героидов с мочой. Избыточное поступление в организм
никеля может вызывать депигментацию кожи (вшилиго). контактный дерматит, системную
тнерчувствителыюсть к никелю. Карбонил никеля является канцерогеном. При длительном
в течение 10—40 лет, профессиональном контакте с сульфидом или оксидом никеля могут
образоваться карциномы легких и носоглотки. На производствах с использованием никеля у
10—13% рабочих отмечаются аллергические реакции (папулезная, папуловезикулезная сыны
У женщин аллергические реакции на никель наблюдаются в 3—5 раз чаше, чем у мужчин. Опи-
сана даже так называемая «аллергия кухарок», которая развивается у поваров и домохозяек,
контактирующих с никелированной посудой.
Данные о пониженном содержании никеля в организме человека отсутствуют, однако в эк-
сперименте на ЖИВО1ИЫХ показано, что значительный дефицит никеля вызывает их гибель.
Причины избытка никеля:
• избыточное поступление никеля в организм в быту и папроизволстве
При интоксикации никелем проводят симптоматическое лечение и хелатирующую терапию
(триэтилентетрамина литидрохлорилом — TR1EN). Циклима! кальция усиливает выведение
никеля с мочой.
Основные проявления и бытки никеля:
• повышение возбудимости центральной и вегетативной нервной системы;
• отеки легких и мозга,
• аллергические реакции кожи и слизистых оболочек верхних дыхательных путей (дерматит,
ринит и др.).
• тахикардия:
• анемии;
• снижение иммунной зашиты, повышение риска развития новообразований в легких, поч-
ках. на коже.
Синергисты и антагонисты никеля
К числу антагонистов никеля относятся серосодержащие аминокислоты, кальций, сера, же-
лезо. цинк, селен, витамин С.
Индикаторы экспозиции/интоксикации
Приоритетные: содержание никеля в моче, волосах.
Дополнительные: содержание никеля в цельной крови
Токсикокинетическис характеристики никеля представлены в табл. 8-80.
Таблица 8-80. Гоксикокипезические характеристики никеля
Суточное поступление с продуктами питания 0.4 мг
Суточное поступление с воздухом 0.0006 мг
Резорбция из ЖКТ 1-10%
Суточное выведение-
моча 0.01 мг
кал 0.37 мг
нот 0.02 мг
прочие (волосы и др.) 0.001 мг
11сриод полувыведення (Т ) II ч
Объем распределения (Vd) 7
Связывание с белками плазмы 1 Fb 0.59
Среднее содержание.
организм человека массой 70 кг 12 мг
кости < 0.7 мг/кг
мышиы 1—2 мг/кг
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 887
Окончание matu.
КрОВЬ 0.001—0.05 мг/л
сыворог ка/пэазма 0.00005 —0.028 мг/л
рудное молоко 0.0015 -0.039 мг/л
моча 0.0002-0.010 мг/л
волосы 0.0—1.0 Mi/Ki
зубы (jM.L'lb) 1.35 мг/кг
ногти 0.0—3.0 мг/ki
печень 0.000—0.078 мг/кг
110'1 КМ 0.(8)7—0.018 мг/кг
легкие 0.085—0.200 мг/кг
Токсическая доза никеля для человека 50 мг. При концентрации Ni в моче 0.1 мг/л — лег кос
отравление. 0.1—0,5 мг/л — отравление средней тяжести, > 0,5 мг/л необходима госпитализа-
ция и терапия хелаторами
Концентрация никеля в биожцдкостях и тканях организма человека при интоксикации и
летальном исходе представлена в табл. К-81.
Таблица 8-81. Концентрация никеля и бножилкостях (в mi/.tj и тканях (в мг/кг) при интоксикации и
лезальпом исходе
Биосубстриты Концентрация при интоксикация Концентрация при летальном исхолс
Цельная кровь 7.5
Сыворогка/иллзма крови 0.005: 3
Моча* 0.025-1.0 47
1 (счень 27-53
Легкие | Ц73
* Хроническим Н1покснк<шия.
На рис. 8-57 показаны основные биологические свойства химических элементов
Не
Не
Аг
Кг
Хе
Rn
Рис. 8-57. Основные биологические свойства микролгементоп (ио Brarin R с( al., 1999).
888 Глава 8
8.5.4. Аналитическая диагностика профессиональных
и экологически зависимых заболеваний, вызванных действием металлов
и металлосодержащих соединений
Нс клиническая симптоматика, а ранние изменения на молекулярном
и клеточном уровнях должны быть главным ориентиром
в диагностике начальных стадий развития болезни.
Я- Саркисов
Загрязнение окружающей среды способствует возникновению профессиональных. профес-
сионально обусловленных и экологически зависимых заболеваний. Актуальность определения
токсичных химических вешеств в биологических средах возрастает но мерс ухудшения эколо-
гической ситуации. Интенсивное развитие промышленности привело к серьезному загрязне-
нию производственной и окружающей человека среды токсичными веществами, которые могут
поступать в организм человеки с продуктами питания, вдыхаемым воздухом и водой. Внедрение
в промышленность новых токсичных веществ па фоне ухудшения экологической обстановки,
особенно в условиях аварийных ситуаций (см. гл. 10). требует использования экспрессных и
надежных методов определения токсикантов в биостбетратах человека. Несмотря на то чго
профессиональные заболевания встречаются реже, чем другие болезни, социальное значение
их велико, так как они поражают значительное число лиц трудоспособного возраста нередко
протекают тяжело и являются причиной потери трудоспособности. В нашей стране уровень
профзаболеваний остается высоким, однако преобладают стертые формы течения болезни.
Раннее выявление признаков воздействия на организм человека пеблагоприят зых факторов
окружающей среды связано с повышением чувствительности и селективности валидных мето-
дов оценки уровня токсикантов в корректных диагностических биосубстратах. Такие методы
широко применяются в различных странах мира и являююя частью системы наблюдений за
показателями состояния здоровья населения, выбранными в качестве индикаторов для опен-
ки воздействия неб агоприятпых факторов окружающей среды. Достоверность лабораторных
результатов обеспечивается выполнением комплекса организационных мероприятий и соблю-
дением принципов GLP. надлежащей лабораторной практики (НАП) (см. гл. 5.8). Обязатель-
ной составной частью определения являются межлабораторный контроль и интеркаллиброн
ка (ннтеркаллибрацня) результатов лабораторных исследований, использование стандартных
образцов, соблюдение единого протокола по отбору, транспортировке, подготовке и анализу
образцов диагностических биосубстратов (см. электронное приложение).
Разработка критериев, позволяющих объективно диагностировать профессиональную пато-
лоз ию в нреморбидпый период, оценивать течение профессиональных и экологически завнеп
мых заболеваний, эффективность лечебных мероприятий, в первую очередь связана с приро-
дой токсиканта и особенностями (механизмами) его токсического дез'зствия.
В табл. 8-82 приведены некоторые токсиканты, под воздействием которых могут возникнуть
профзаболевания.
Определение токсикантов в биосубстртпх используют в качестве биомаркеров экспозиции
(воздействия). Пробоподготовка и методы определения в биосредах органических и неоргани-
ческих соединений металлов изложены в гл. 5.6. 8.5.1 и 8.5.2. При диатостике профессиональ-
ных заболеваний невозможно ограничиться определением только биомарксров экспозиции.
На практике наблюдают случаи, когда при повышенном содержании токсиканта в биосредах
человек практически здоров (или симптомы болезни не диагносцируюгся имеющимися у врача
методами?!) и наоборот, например нс учитывается синдром повышенной химической чувстви-
тельности. обусловленный генетическими особенностями конкретного человека (см. гл. 10).
Во всех развитых странах в профпагологии особое внимание уделяется донозологической
диагностике (см. гл 8.5.2) и генетической экспертизе для выявления синдрома повышенной
химической чувствительности.
Кроме количественных показателей биомтркеров экспозиции необоходимо иметь объектив-
ную информацию о степени выраженности эффекта. Для этого проводят определение тех ха-
рактерных изменений па молекулярном и клеточном уровнях, которые вызваны поступлением
токсиканта в организм.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 889
Таблица 8-82. Токсиканты, вызывающие профзаболевания
1 окенкшпы Синдромы профзаболевания
Бензол, .хлорбензол, гсксахлороциклогексан, гекскметиленлнамнн Угнетение гемопоэза Поражение гспатобнлна ной системы
Фтор Флюороз
Ароматические амино- и нитросослинеиия (аии лип. нитробензол, нитротолуол, ди- и тринитрото- луол). бертс лова соль Метгемоглобинемия Поражение почек и мочевыводящих путей
Окснл углерода (II) Карбоксигемоглобинемия
Мы1Н1лкопистый водород. феннлгилразип Гсмо; 1 итическая анемимя
Свинец Нарушение синтеза порфиринов и гема Поражение почек и мочевыводяших пуген Поражения центральной и периферической пе- риной системы
Сероуглерод, пары ртути. МАршнсщ тетраэтилсви- нец Поражения пснтра||ыюй и периферической не- рвной системы Поражение почек и мочевыводяших путей Поражение гепатобилиарной системы
Хлорированные уг.1сводорилы, хлорироизво зные нафталина, стирол, спирта, гликоли, некоторые эфиры, керосин. хлорсодержзнте пестициды, со- единения ргупи. соединения мышьяка, фосфор Поражение гепатобилиарной системы Поражение ночек и мочевыводяших путей
Кадмий, лшнй висмут, золото, хром. цинк. ко- Поражение почек и мечет воля ши х путей
бальт и другие металлы, ядохимиката I_______________________ ___________
Интерпретация резулыагов обследования пациента — как диагноз профессионально обус-
ловленного или экологически зависимого заболевания — возможна (согласно действующему
законодательству РФ) лишь в том случае, если установлена связь произошедших изменений в
организме с копнен грацией токсиканта, определенной в биосубстратах больного.
Выбор того или иного диагностического биосубстрата в оте icctbchhux пниепических ис-
следованиях часто обусловливается аналитическими возможностями лаборатории и простотой
взятия пробы биологического образна. При этом далеко не всегда учитываются существующие
международные правила и мировой опыт ио выбору адекватно: о дна: нош ического биосубстра-
та (табл. 8-83).
Для оценки клинической ценности лабораторных тестов приняты следующие критерии:
диа! поэтическая информативность. диагностическая чувствтсльность. патопюмнчность и
диагностическая специфичность метода определения.
Информацию о диагностической ценности лабораторного теста получают в результате изу-
чения зависимостей доза—тф(|>ект, доза—ответ, выраженность воздействия — э<|>фект и выра-
женность воздействия - огвс! в эксперименте на животных. Результаты, полученные при об-
следовании рабочих, контактирующих с токсикантом в производственных условиях, являются
наиболее ценными В качестве дозы используют концентрацию токсиканта в биологическом
материале, для оценки эффект и ш огнега применяю! наб юдаемыс спениалисшми измене-
ния. происходящие в организме при контакте человека с фактором токсичное! и. Для уста-
новления ранних изменений используют лабораторные иммунологические, биохимические,
гематологические и другие показатели.
В качестве примера установления зависимости лоза—эффект между концентрацией свинца
в крови рабочих и уровнем ряда лабораторных показателен в габл. 8-84 приведены материалы,
полученные при обследовании людей, контактирующих со свинцом в процессе производствен
ной деятельности
890 Плавав
Таб. ина В-83. Рекомендуемые диагностические биосубстраты (по Casarctt and Doulls Toxicology- the Bosk
Science of poisons. Fifth Edition. 1998. Рсвич Б.А.. 2004)
Биосубстраты Токсиканты
ноны элементов идиотические и ароматические углеводороды галогснсодержаши углеводороды и гетероциклы другие соединения
Кровь* Al. Ag, Ba Cd. Со. Си. F, РЬ. Мп (?). Ni. Hg. Se. Zn. 11. U, V. Сг (в эритро- иитаз) Хлоромстап, бромо- Meiaii. дихлорометан, винилхлорид. трнхло- роэтилен, диоксины, полихлорированные бифенилы (ПХБ), гск- сахлорониклогексан. ДДТ и др. Нитробензол. СО ацетон
Моча* Sb, As, Al, Ba. Вс, Cd. Gc. Co. Cu. Cr (?), F. Pb. Mn (?). Ni. Hg. Sc. Tl. 1 J. Zn. V Гексан, циклогек- сан. бензол, ксилол, стирол, этилбензол, триметилбеизол. толуол и а . Ншробензат анилин, ацетон, фенол, пеитахло- рофснол
Волосы As. Pb. Hg. F. Sb. Fe. Cd. Cu. Se, Zn, реткоземельных
Грудное молоко Диоксины, ПХБ. гек- сахл opoi in KjIoickcui i, ДДТ и др
Mhckvlcmoiihumii мшнются вопросы lit формата внести содержания в моче хрома и Mitptaiuai. а также моргания в
крови (см гл. 8.5.3)
Таблица 8-84. Изменение уровня некоторых бномаркеров в биосубстратах рабочих при разных конценг
рациях свивив в крови*
Ьномарксры ____________ Концентрация свинца в крови, мкг/мл
*о 10 10-20 21—30 31-40 41—50 более 51
АЛ К-Дэр - ч ++ ++ ++++
3P5N - + _++ ++ +++ 4" "И”
ППЭ - + ++ ++ ++ч- ++++
ZnPP-)p - - - + +++ +++
АЛКм — - +++
РТ - - + ++4 1
БЗЭ - - - L ++
Примечание АЛК-Д эр— ритроцигзр >ая дегидратаза деььта (драминолсвулниовот кмооты; -ЭР5М — эритроцитар-
ная пнрнмндин-5-нуклсотидаза; 11113 — нротопорфирииы эр1гтроиитов; ZnPP^ — цникопротоворфирин эршре чипов;
АЛ Км —Б-амиполсвутшовап кислота мочи- РТ — ретикулоциты крови. БЗЭ — биюфатыкгкрнистыс jpirrpouHiu
Обозначение — — содержание или активность бноыарксра нс изменяется- + — содержание или активность изменяет
ся нс более чем у 25% обследуемых; ++ — содержание или лкчивность изменяется не более чем у 50% обследуемых.
+++ — содержание или активность изменяется не более чем у 75% обследуемых; ++++ содержание или активность
изменяется у 100% обследуемых.
Из абл. 8 84 следует, чю но мерс повышения концентрации свинца в крови увеличивает-
ся число показателей, содержание или активность которых в организме человека изменяется,
одновременно увеличивается число рабочих с измененными тестами. Наиболее рало начинают
изменяться активность АЛК-Дзр. 3P5N и содержание ППЭ в крови, что свидетельствует о на-
рушении порфиринового об.мепа и повреждающем действии свинца на нуклеиновые кислоты
(рис. 8 58).
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 891
Рис. 8-58. Схема повреждающего леиствия свинти на порфириновый обмен
ALA-S — синтетаза Б-аминолевулсновон кислоты. ALA — Б-змиполевуленовая кислота; ALA D — де-
гидратаза Б-амиполенутеновой кислоты; I’BG — порфобилиноген; Uropor — уронорфирнноген; Сорго —
коиронорфнринотен; Сорго-О — копропорфиринотеиоксилаза. Ferro-C - г|кррохслагаза; Cyloch-c — ци-
тохром с.
У ряда рабочих эти показатели в крови изменяются уже при концентрации свинца зна-
чиrcjn.no меньшей, чем верхняя граница его естественного содержания у жителей развитых
стран (среднее значение естественного содержания свинца в крови у жителей европейских
стран около 20 мкг/дл. а верхняя граница доспи лет 40 мкг/дл). Между концентрацией свин на
в крови и г ток; кнелями, приведенными в габл. 8-84. выявлена корреляционная снизь. Таким
образом, при одновременном определении токсичного вешества и биохимических показателей
у рабочих, контактирующих со свинцом, можно выразить математически зависимость доза —
эффект, установить последовательность нарастания изменений, происходящих в организме, и
определить наиболее ранние из них. Показатели которые изменяются при наиболее низких
концентрациях токсиканта, могут быть использованы для ранней доклинической диагностики
и. возможно, при проведении экологи тсских исследований Высокие коэффициенты корреля-
ции между концентрацией свинпа в крови и табораторными гостами говорят о па готом ич-
посги этих биомаркеров.
Зависимость доза — ответ характеризует диагностическую чувствительность и информатив-
ность теста. Для этой пели рассчитывают частоту встречаемости обследуемых лиц. у которых
активность или концентрация биомаркера выходит за пределы нормальных значений.
Частота встречаемости биомарксра. содержание или активность которого выходит та вреде
чы нормальных значений, выраженная в процентах, характеризует его диагностическую чувс-
твительность (Дч). О
Дч = ^х|(Ю.
где Q — число рабочих, у которых уровень биомаркер;! изменен; N — общее число обследо-
ванных рабочих в группе.
Пример зависимости лоза—ответ, полученной при обследовании рабочих, контактирующих
со свинцом, приведен в табл. 8-85
892 Глава 8
Таблица 8-85. Частота встречаемое ги рабочих в % с измененными уровнями биомаркеров в биосрсдах при
разных концентрациях свинца в (зонухе проз зводствсцных помещении
Ьиомаркеры Концентрация свинца в возлухе. мг м’
0.005 0.15 i.o
А'1К-Дэр 42 100 100
АЯКм В 60 90
КПм 12 16 50
Свинец в моче 15 69 87
Свинец в крови 33 71 85
Примечание. КПм — koi ропорфнрнн в моче
И з табл. 8-85 следует, что по мере повышения концентрации свинца в воздухе увеличивается
частота встречаемости лиц с измененным содержанием или активностью биомарксра Паиболь-
niec значение Дч получено при определении активности АЛК-Дэр в эритроцитах, которая со-
ставляет 42% уже при концентрации свинца в воздухе, в 10 раз меньшей чем рекомендуемая в
настоящее время ПДК (0,05 мг/м’). На втором месте находится определение свинца в крови —
Дч = 33%. Содержание свинца в моче, АЛ Км и КПм (копропорфирин в моче) повышается
лишь у 12- 15% при низкой концентрации свинца в воздухе рабочих помещений. При повы-
шенных концентрациях свинца в воздухе рабочих помещений Дч для приведенных в табл. 8-85
тестов достаточно высока кроме содержания КПм.
При изучении зависимости доза — ответ при низких концентрациях свинца в воздухе на-
иболее информативным является определение содержания свинца в крови и активности АЛК-
Д в эритроцитах. При более высоких концентрациях свинца в воздухе наряду с определением
содержания свинца в крови и активности А1К-Д в эритроцитах достаточно высокой диагнос-
тической чувствительностью обладают определение АЛК в моче и свинца в моче. Поскольку
определение КПм характеризуется низкой Дч даже при высоких концентрациях свинца в воз-
духе промышленных предприятий его применение для диагностики едва ли целесообразно
Зависимость выраженность—эффект даст тополншельную информацию для обоснованного
выбора критериев при диагностике профзаболеваний, обусловленных воздействием токсикан-
тов. Пример изменения уровней биомаркеров в биосрслах рабочих при разной степени выра-
женности воздействия свинца приведен в табл. 8-86.
Таблица 8-86. Уровни свинца и показателей лабораторных тестов в биосредая рабочих в зависимости от
выраженности ею воздействия
Тесты I руина обследованных рабочих
контроль 1-я 2-я 3-я 4-я
РЬм, мкт/л 21 67 109 175 500
РЬкр. мкг% 24 39 60 74 102
АЛ Км 1.7 3.2 11.9 18.3 39.7
БЗЭ До 15 6 5 30 294
МДА. нмоль/мл 15 26 31 32 —
а-ТК 4.1 3.2 3,0 2.7 —
ХЛ, у.е. 240 490 618 — —
Примечание МДА — малоновый днальаепм; а-1 К — и токоферол. ХЛ — хемилюминесценция, 1-я — практичес-
ки щоровые рабочие. контактирующие со свинцом; 2-я - шбора горная сталии хронической свинцовой шноксикзиии
(ХСИ): 3-я — больные лсткой сталией ХСИ. 4-я — Схмьныс выраженной сталией ХсИ Выраженность вошействия
определяется ciieuikLiiieroM-iipo<]Hiaix>.ioioM.
Из табл. 8-86 следует, что концентрация свинца в моче и крови, АЛК и моче, а также ряд
показателей окислительного метаболизма (МДА, а-ТК) хотя отличаются от условного нор-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 893
мальиого уровня. тем не менее клинических при знаков интоксикации в этот период еще не
наблюдается. Содержание БЗЭ начинает изменяться значительно позже и является одним из
бномаркеров ХСИ. а не предпатологии
Определение конценГранин токсиканта в бносредах человека выгодно отличается от других
тестов, так как этот маркер характеризуется абсолютной диагностической специфичностью. В
гигиенических исследованиях и профпатологин проводят определение и токсиканта, и других
маркеров интоксикации. Однако уровни биохимических. иммунологических и других лабора-
торных показателен, как правило, изменяются не только при действии определенного токси-
канта. ио и при воздействии дру их токсикантов и/или наличии сопутствующих заболеваний.
Например, снижение активности раннего и очень чувствительного биомаркера воздействия
свинна — АЛК-Д в эритроцитах, а также содержания АЛК в моче, БЗЭ происходит при воз-
действии как свинна. так и ряда органических растворителей. Сильно снижается активность
АЛК-Д при принятии алкоголя. Для повышения специфичности диагностики профинтокси-
капий используют ряд приемов. Так. определение активности АТК-Д при ратных pH инку-
бационной среды или температурная обработка пробы крови перед проведением анализа зна-
чительно повышают информативность теста. Иногда диагностическая специфичность может
быть повышена при соблюдении пациентом перед отбором крови или мочи определенной
диеты. Например, активность АЛК-Д сильно снижается после приема алкоголя, однако, в от-
личие от воздействия свинца, через 10 ч возвращается к нормальным значениям Поэтому при
проведении лабораторной диагностики на наличие ранних стадий свинцовой интоксикации
обязательным требованием является запрещение принятия алкогольных напитков за 2 сут до
взятия крови.
Для повышения специфичности лабораторной диагностики целесообразно применять нс
один биомаркер, а их комплекс, характерный для воздействия конкретного токсиканта, что
значительно повышает специфичность и надежность диагностики. В рекомендациях по ис-
пазьзованию комплекса биомаркеров отмечают, при каких заболеваниях возможно изменение
каждого показателя. Если такие заболевания исключены при медицинском обследовании. то
точность диагностики с помощью методик, включенных в диагностический комплекс, сущес-
твенно повышается.
Поскольку ранние изменения при воздействии токсикантов, как правило, неспецифичны для
оценки общего состояния организма, целесообразно использовать методики, которые с высокой
вероятностью отражают ранние неспенифичсские эффекты. Например, данные об изменении
уровня окислительного метаболизма при действии свинца свидетельствуют о повреждении кле-
точных мембран нарушении процессов окислительного фосфорилирования, что лежит в основе
многих патологических процессов и происходит практически при любом воздействии (стресс,
ряд заболеваний, действие рахтичных токсичных вешесгв). Ik тому наряду с более специфич-
ными показателями, характеризующими нарушения порфиринового обмена, при диагностике
свинцовых интоксикации используют и малоснецифичные маркеры, характеризующие измене-
ния окислительного метаболизма и отражающие общее состояние организма.
Установление зависимостей доза—эффект, доза—ответ. выраженность воздействия — ответ
позволяет выявить патогном ич ность лабораторного теста, его диагностическую информатив-
ность и чувствительность, влияние концентрации токсиканта в определенном биосубстрате,
оценить их значение в общем комплексе лабораторных методов для диагностики, выбрать
наиболее эффективный комплекс методов, м также методы, отражающие наиболее ранние из-
менения. происходящие в орзанизмс при хроническом поступлении токсиканта.
Анал пичсские результаты при определении токсичных веществ в биологических материа-
лах должны быть получены с помощью аттестованных методик в акцептованных лаборатори-
ях. оснащенных современным оборудованием (см. гл. 5 и 6.1) и корректно интерпретированы.
Соблюдение нормативов химического анализа. заложенных в 1 ОС Г Р ИСО 5725-02 «Точность
(правильность и прецизионность) методов и результатов измерений» является обязательным
(см. гл. 6.1).
У штывая задачи, встающие перед нрофнатологней. значение наименьшей опредетяемой
концентрации (Сн) для методов, используемых в клинико-гигиенических исследованиях. не
должно быть выше, чем верхняя граница естественного содержания токсиканта в биосредах.
Если значение Сн. определяемое методикой, выше, чем естественное содержание токсичного
894 Глава 8
вешества. то невозможно корректно оценить концентрацию токсиканта в биосредах и нельзя
провести диагностику ранних стадий заболевания. Так, лля свинца Сн по одной из методик его
определения в моче составляет не более 40 мкг/л (0,04 мкг/мл), для крови — не более 40 мкг/дл
(0.4 мкг/мл). Если токсичное вешество в нормальных условиях в организме не содержится,
то Сн определяется самой низкой его концентрацией, имеющей токсикологическое значение.
При проведении эколо!ических исследований использую) более чувствительные методики.
При разработке методик определения неорганических веществ метод стандартных добавок
целесообразно применять, если биоло)ичсский материал подвернется полной минерализации,
так как при использовании этого способа без полной минерализации возможны ошибки оп-
ределения. Это обусловлено тем, что токсичное вешество, введенное непосредственно в про-
бу, не связано с белками, в отличие от выделяемою токсиканта. Поэтому определение ртути
в моче атомно-абсорбционным методом без частичной минерализации мочи сопровождается
существенными погрешностями. Если способ внесения добавок неприемлем, то используют
способ сравнения ноной методики с надежным способом, разработанным ранее. Если вещест-
во не улетучивается и не разлагается при минерализации, то возможно сравнение результатов,
полученных после минерализации биоматернала и без нее. Тем нс менее стандартной между-
народной методикой является способ внесения добавок (см. гл. 6.1).
Наиболее н [ежный способ проверить методику — использовать сташгартые образны срав-
нения. Применяют государственные стандартные образны (ГСО), отраслевые стандартные об-
разны (ОСО), стандартные образны предприятий (СОП). Значение воспроизводимости в ра-
бочем диапазоне определяемых концентраций для методов, применяемых в профпатологин, не
должно быть выше 0,1, что вполне достижимо в практических условиях
Свинец
Биомаркеры раннего воздействия свинца на организм
• повышенные концентрации свинца в моче и крови,
• снижение активности АЛК-Д. 3P5N, катализы (КАТ);
повышенное содержание ППЭ, малонового диальдепща;
• снижение количества РТ;
• усиление хсмилюминисненции крови.
Ьиомаркеры аккумуляции свинца в организме и выраженной ХСИ (включая и биомаркеры
раннего воздействия):
• серые «линии свинца» на деснах, козорыс о)ражают повышенную секрецию свинца (и рту-
ти) в слюне;
• повышенное содержание АЛК в моче;
• повышенное содержание ZnPP в крови,
• увеличение количества БЗЭ в крови,
• нарушение функционального состояния почек (см. гл. 2.4 4);
• изменение картины крови (см гл. 2.4.3).
Если выраженность свинцовой интоксикации высокая, а концентрация свинца в моче и
крови низкая, то токсическое действие свинца на организм пациента обусловлено постоянным
поступлением металла из депо (см. гл. 4). Например, человек давно прекратил работу, связан-
ную с поступлением в организм повышенной дозы свинца, однако за прошедшие годы свинец,
содержащийся в крови, депонировался в скелет, частично печень и почки. Для подтверждения
причины профзаболевания в таком случае используют способность ряда комплексообразовате-
лей ускорять выведение токсичного вещества. В организм вводят хелатор (например, тетании),
который ускоряет выведение свинца из депо, и определяют концентрацию мсг&гла в моче до
введения и после введения хелатора. Отношение концентраций свинца до введения и после
введения тетаиина указывает на наличие депо в организме человека.
В разных странах мира (США. Канада, Германия. Япония, Нидерланды. Скандинавские
страны) осуществляются национальные программы по определению свинца в биосредах, но
другим токсичным веществам действует программы МАГАТЭ и ВОЗ (см. гл. 10).
Ртуть
Для раннего выявления действия ртути используют комплекс биомаркеров:
• KOHueirrpauiin ртути в моче и крови — биомаркеры экспозиции;
• активность СОД — биомаркер эффекта-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 895
• акт и вноси. КА Г — бномаркср эффекта
• активность глутатионрелуктазы (ГР) — бномаркср эффекта:
• активность холинэстеразы (ХЭ) — биомаркер эф<]>екта;
• со ержание малонового диалыкт ида в крови — бномаркср эффект;
• содержание катионных белков в нейтрофилах — биомаркер э<|м|>екта:
• активность ^ацстил-р-О-г.покозаминидазы (NAG) в моче — бномаркср начальной стадии
поражения ночек (см. гл. 2.4.4).
Определение ртути в биосредах человека — важнейший критерий в диагностике ртутных ин-
токсикаций. Для интерпретации полученных результатов используют данные об естественном
содержании ртути в биосрсдах и максимально допустимых се концентрациях (см. «л. 8.5.3).
Повышение активности антиоксидантных ферментов СОД, каталазы и ГР рассматривается
как компснсаторно-приспособшельная реакция организма, направленная на замедление про-
цессов свободнорадикального окисления, вызванных действием токсиканта. При концентра-
циях ртути в моче (50 мкг/л) активность этих ферментов и ХЭ, а также концентрация магния
и нинка в крови начинают снижаться. Одновременно отмечается активация ПОЛ, повышается
концентрация малонового диальдегида в крови, [к-микроглобулина и белка в моче, активность
NAG в моче, отмечается начальная сталия повреждения функциональной активности почек.
Происходит срыв адаптации. Использование комплекса биомаркеров токсического действия
ргути по виляет выявить ранние спиши токсического действия металла на организм и оценить
выраженность этого воздействия.
Симптомы ргугной интоксикации у лип. имеющих контакт со ртутью на производстве,
появляются при содержании ртути в моче более 50—70 мкг/л. Согласно рекомендациям Аме-
риканской ассоциации 1игиенистов труда, содержание ртути в моче не должно превышать
50 мкг/л в течение рабочего дня и 15 мкг/л крови в конце рабочей недели, в РФ — эти цифры
равны 30 мкг/л и 15 мкг/л соответственно.
Повышенное поступление ртути в организм изменяет содержание других элементов (см.
гл. 8.5.1). В габл. 8-87 приведено среднее содержание химических элементов в волосах р тбочих,
контактирующих с ртутью на производстве и у жителей Москвы.
Таблица 8-87. Среднее содержание химических элементов в паюсах рабочих, кон (актирующих с ртутью
па ирон тполствс и у жигелей Москвы (мкг'г)
Элемент Рабочие Жители Москвы
n«*60 16915
Са 1166,01106.0 1153,0110,0
Си 17,2011.19 16.410.1
Fe 38,6917.57 20.410.3
11g [11.5511,741____________0,9610.02
I 11.4210.20 " Г 9.41 ±2.42
К 468.0193.01 183,013.0
Mg 170,0115.0 120.011.0
Р 216,0112,0 173,012,0
Sc 0,3410.02 0.9810.06
Zn 178.016.0 206.011.0
Примечание. Достоверность различил (р < 0.00 И
Метол ИСП-МС (см. гл. 6.4.3 и 8.5.2) позволяет быстро получить достоверные жшные о
содержании ртути в волосах и использовать результаты для оценки избыточного накопления
Hg в организме (рис. 8-59) и выделения групп риска при обследовании больших групп людей,
имеющих контакт с ртутью па производстве
896 Глава 8
90-г----------------------------------------------------------------------
80----
□ Москвичи Москвичи (мужчины)
Москвичи (женщины) Москвичи (контакт с ртутью)
Промышленные рабочие
Рис. 8-59. Частота избыточного накопления Hg в волос х в различных группах обследованных
(Скальная М.Г.. Скальный А.В., 2004).
Кабмий
Содержание кадмия в металлотионенне плазмы крови и m мочи — самый надежный крите-
рии выявления хронического воздействия токсиканта и имеет гораздо большее токсикологи-
ческое значение, чем общее содержание кадмия Однако его определение требует применения
дорогостоящих методов исследования (см. гл 6.4.3 и 8.5.1). В профпатологии (Россия) инди-
катором хронического воздействия кадмия считают концентрацию кадмия в моче при низких
уровнях его поступления и отсутствии заболеваний почек. Определение концентрации ка. мия
в крови используют преимущественно как показатель текущею поступления его в организм.
При д, тельном воздействии повышенных доз токсиканта содержание кадмия в волосах отра-
жает уровень его накопления в организме.
Комплекс биомаркеров вредного воздействия кадмия на органи м человека:
• концентрация кадмия в моче и крови.
• активность NAG в моче;
• содержание р,-микроглобулина (р,-МГ) в моче;
• содержанке ретинол-связывающего белка (RBP) в моче;
• содержание трансферрина (ТР) в моче.
Повышение экскреции р -МГ с мочой — один из ранних признаков повреждения почечных
канальцев, который наблюдается при концентрации кадмия в моче около 3,3 мкг/моль кре-
атинина. Чувствительным маркером ранней стадии развития хронической дисфункции почек
при поступлении кадмия считают определение в моче лизосомального энзима, находящегося в
почечных канальцах: активность NAG повышается до 3,3 ел на 1 г креатинина при концентра-
ции кадмия в моче 0,9—1,7 мкг/г на 1 г креатинина. Одновременно повышается концентрация
трансферрина. RBP альбумина в моче.
Впервые допустимый уровень кадмия в моче 9 мкг/л был установлен в Японии в 1970 г.
Впоследствии в США был предложен более низкий уровень — 5 мкг кадмия на 1 г креатинине
(7 мкг/л мочи) и 5 мкг кадмия на I л крови (см. гл. 8.5.3).
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 897
Никель
Повышенное содержание никеля в организме является основной причиной развития про-
фессиональных дерматозов
Для диагностики токсического действия никеля предложен комплекс бномарксров:
• определение никеля в моче:
• цитохимические показатели (активность кислой фосфатазы нейтрофилов — КФн, щелоч-
ной фосфатазы нейтрофилов — ШФн. миелопероксидазы нейтрофилов — МПн . КАТ, ХЭ.
нитохромоксида зы):
• тест-НС I и тест-РГМЛ*;
• показатели окислительного метаболизма (активность КАТэр. содержание малонового ди-
альдегила и церулоплазмина в сыворотке крови);
• нарушение углеводного обмена
Наиболее высокая диагносiическая чувствительность характерна для цитохимических тес-
тов. При низких уровнях воздействия и стаже работы с соединениями никеля до К) лет Дч для
КФн составляет 94,5%, для МПн — 89%, для ШФн — 81,4%. Дч определения никеля в моче
около 100%. Дч для тсста-НСТ и теста-ИМЯ повышается с увеличением стажа работы до
80-91%.
При концентрации никеля в моче 100 мкг/л отмечают слабую степень интоксикации, при
100—500 мкг/л — интоксикацию средней тяжести и свыше 500 мкг/л — тяжелую интоксика-
цию.
В России принята стандартная (официальная) методика определения ряда тяжелых метал-
лов. папр «мер железа, никеля, пинка и др. в же. чи. Она заключается в прямом определении
целевых компонентов методом ААС (Fe при 248,3 нм. Zn при 213.9 нм и Ni при 232.0 им).
Отбор проб желчи производят в стерильную химически чистую посулу при дуоденальном
зондировании. Для консервирования пробы в пробирку вносят 0. 05 мл хлороформа Пробы
можно хранить в холодильнике в течение 3 сут. Для приготовления стандартных растворов
исследуемых металлов лля калибровки ААС используют бидистиллнрованную волу. Основно з
стандартный раствор готовят из стандартного образца с концентрацией металла 1.05—0.95 г/мт
путем разведения 0.1 и. азотной кислотой в мерной колбе на 100 мл. Диапазон определяемого
содержания: 0,1 —1,5 мкг/мл (железо). 1—5 мкг/мл (цинк), 0.5—2,5 мкг/мл (никель). Погреш-
ность измерения нс более 25% (Р = 0.95) Время одного определения 7—10 мин.
Марганец
У рабочих, занятых добычей марганцевых руд. существенно повышена смертность. На пер
вом месте среди причин смерти стоят злокачественные новообразования (36%). далее идут
сердечно-сосудистые заболевания (25.4%), болезни органов дыхания (22%). цирроз печени
(12.4%).Токсичсское действие марганца на производстве обусловлено преимущественно вды-
ханием дыма и. реже, пероральным поступлением с водой или продуктами питания.
ПДК марганца в воздухе рабочих помещений равна 0,05 мг/м’ по диоксиду марганца и 0,03
мг/м’ по металлу. Признаки и симптомы влияния марганца на ЦНС проявляются при кон-
центрации сю в воздухе 2—5 мг/м'. Полагают, чго максимально допустимый уровень (МДУ)
марганца в воздухе должен быть менее 1 мг/м’.
Для оценки экспози тонного риска токсического действия марганца используют определе-
ние его концентрации в волосах. Отмечают прямую зависимость между концентрацией мар-
ганца во вдыхаемом воздухе и в волосах, например электросварщиков. Содержание марганца в
волосах отражает провесе длительного поступления токсиканта и накопления его в организме.
Установлена также прямая зависимость между выраженностью воздействия марганца от кон-
* Реякния торможения миграции лейкоцитов (РТМД) позвачяет охарактеризовать функцию T-лимфоггптов и ныяпигь
антиген (например, специфический печеночный антиген и лр.). к которому сснснбгинзирогыны Т гимфоггнты. РТМЛ
применяется хгя выявления органоспецифической гнперчувствите гьноепг замедленного типа Если в качестве ан-
тигенов использовать специфические клеточные структуры тех нт иных внутренних органов (например, мембраны
кардном ионитов, печеночных липопротеидов. амилоидных фибрилл и т.п.). РТМЛ может оказаться полезной для
подтверждения местной (органной) гнперчувствительиостн замедленного типа (например, при кеспсннфическом мн-
окрадите, хроническом активном гепатите амилоидозе почки и т.п.). В качестве антигена используют митогены рас-
тительного происхождения — фитогемагтлютинин (ФГА) или конканавалшг А (КОН А), а также оргаггоспецифнчкые
антигены (например, специфический печеночный или почечный антиген).
898 Глава 8
iieiirpaunn сю в boj осах. Полагают, что ориентировочная лимитирующая концентрация мар-
ганца в волосах не должна превышать 3 мг%.
Корреляция между уровнем марганца в сыворотке, цельной крови, моче и клиническими
проявлениями сю воздействия не вывалена. Поэтому диагностическая значимость опреде-
ления марганца в крови до сих нор однозначно не установлена (см. гл. 8.5.3). Не выявлено
достоверной связи между концентрацией марганца в крови и продолжительностью его воз-
действия. Концентрация марганца в крови нс связана и со стадией хронической марганцевой
интоксикации (ХМИ). Полагают. что определение содержания марганца в крови имеет лишь
npoi ностическос значение: чем выше уровень металла в крови, тем более вероятно прогресси-
рование заболевания.
Кроме определения металла в волосах и крови, для диагностики интоксикации марганцем
рекомендуют биохимические теегы. которые характеризуются высокой иг формативностью:
определение содержания 11-оксикортикостероидов в крови (11-ОК кр). 17-ОКС в моче, ад-
реналина и 3.4-диоксифенилаланина (ДОФА) в моче, i тстзмина в крови, серотонина крови.
МАО в сыворотке крови. 5-оксниндолуксусной кислоты (5-ОИУК) в моче.
При эколого-токсикологических исследованиях работами отечественных ученых доказано,
что волосы являются хорошим индикатором воздействия на населения мышьяка, брома, фто
ра. группы редкоземельных элементов и актиноидов (вблизи прои волств по их переработке),
ртути. что согласуется с данными зарубежных специалистов.
8.6. КИСЛОТЫ. ОСНОВАНИЯ, АНИОНЫ СОЛЕЙ
Все бедствия людей происходят не столько от того,
что они не сделали то, что нужно сделать,
сколько от того, что они делают то. чего не нужно делать
.1.11. Толстой
К группе вешеств. изолируемых экстракцией водой в сочетании с диализом, относятся ми-
неральные кислоты — серная, соляная, азотная, щелочи. водный раствор аммиака и ряд солей,
из которых токсикологическое значение имеют главным образом г итрит натрия (реже нитрит
калия), нитраты натрия и аммония (реже нитрат калия), хлорат калия.
Исследование биологических матери; ов на наличие этих веществ проводится тогда, ког-
да предварительные испытания дают для этого основания или материалы дела указывают на
возможность отравления указанными веществами. При переходе щелочей в карбонаты, а сво-
бодных минеральных кислот в соли их обнаружение невозможно, так как они являются состав-
ными частями животных организмов.
Анноны неорганических и некоторых карбоновых кислот в биологических жидкостях и
тканях в настоящее время определяют методами ГХ-ЭЗД. ГХ-ПИД, ГХ-ТИД. ВЭЖХ. ион-
ной хроматографии. КЭ. ИСП МС. флюорометрии, электрохимическими, биохимическими и
другими методами (см. гл. 6). Наиболее рас гростраиенным способом анализа смеси анионов,
включающей бромид-, йодид-, цианид-, роданид-, нитрит- и сульфид-ионы. в биологических
жидкостях является перевод их в летучие пентафторбензндьные производные, которые можно
детектировать с помощью ГХ- ПИД и ГХ ЭЗД. В последнем случае при анализе биологических
объектов Сн не превышают нескольких нанограммов на I мл.
Химические и биохимические методы также применимы в ряде случаев.
Объектами исследования на наличие этой группы вешеств являются содержимое желудка,
рвотные массы, остатки ниши. *асти одежды к др. При исследовании на соли к перечислен-
ным объектам следует отнести также печень.
Изолирование кислот, щепчеи солей
Исследуемый объект смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды до об-
разования густой кашицы, способной фильтроваться, и смесь через 1—2 ч фильтруют. Для
отделения белковых вешеств смесь (даже до фильтрования) или фильтрат подвергают диализу.
Диализ проводят 2—3 раза по 4—6 ч. Слитые вместе диализаты выпаривают на водяной бане
до объема 5—10 мл и исследуют на наличие кислот, щелочей и совей. Перспективен для этих
целей электродиализ.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 899
Минеральные кислоты
Ориентировочные указания о возможности присутствия минеральных кислот Moiyr быть
получены при исследовании обьекла или водной вытяжки из него с помощью индикаторов
(лакмус, коню, универсальный) В кислой среде наблюдается посинение конго. Изменение
окраски индикаторов при контакте с объектом приводит к необходимости проведения иссле-
дований на отдельные кислоты
Обнаружение свободных кислот может быть осуществлено лишь в результате их перегонки.
Некоторые кислоты перегоняются при очень высокой температуре, поэтому часто применяют
их восстановление в более летучие соединения. Так. серную кислоту переводят в сернистую,
летучую в виде ангидрида SO,, азотную кислоту — в оксиды азота.
При наличии свободной серной кислоты при простой перегонке вследствие постоянного
присутствия хлоридов из объекта исследования перегоняется и хлористый водород:
NaC! + H.SO.-+ НО + NaHSO4.
Поэтому исследование на наличие кислот необходимо начинать е серной кислоты.
Серная кис юта
Качественное обнаружение
• Характерным признаком концентрированной серной кислоты является ее способность обуг-
ливать углеводы.
• Добавление к кислой жидкости раствора соли бария приводит к образованию обильного
осадка сульфата бария, что указывает на наличие сульфат-иона. но не доказывает присутс-
твия свободной серной кислоты.
• К жидкости, полученной после упаривания диализата, добавляют медные опилки, отгоня-
ют сернистую кислоту в приемник с расг вором йода в йодиде калия. После добавления к
отгону разбавленной соляном кислоты и удаления йода нагреванием вносят хлорил бария.
Выпадение осадка сульфата бария указывает на наличие серной кислоты.
Количественное определение. Аликвоту водного извлечения титруют 0.1 М раствором гид-
роксила натрия в присутствии метилового оранжевого. Затем в другой части извлечения оп-
ределяют количество сульфатов весовым способом. Найденные количества серной кислоты
сопоставляют. Результаты определения имеют только относительное значение.
Азотная кислота
Качественное обнаружение
• Азотная кислота при достаточной концентрации реагирует с белками, окрашивая их в жел-
тый цвет (ксантопротеиновая реакция). Часть исследуемой жидкости выпаривают с шерстя-
ными нитками, при этом шерсть (белковое вещество) окрашивается в желтый цвет перехо-
дящий при добавлении раствора аммиака в оранжевый (свободная азотная кислота). Кроме
азотной кислоты. шерсть окрашивает в желтый цвет и пикриновая кислота. Отличием пос-
ледней служит окрашивание самой жидкости в желтый цвет а также окрашивание шерсти
при кипячении с разведенными растворами.
• Каплю исслелуемой жидкости смешивают с 2—3 каплями раствора дифениламина в кон-
центрированной серной кислоте — появляется синее окрашивание Такое же окрашивание
дают соли азотной и азотистой кислот. а также другие окисли гели.
• К исследуемой жидкости добавляют медные опилки и выпаривают ее почти досуха. При
достаточной концентрации азотной кислоты происходит восстановление ее медью в оксид
азота (II). который при взаимодействии с кислородом воздуха образует оксид азота (IV)
(оранжевые пары). Последний, диспропорционируя в воде, даст азотную и азотистую кис-
лоты. которые и обнаруживаются химическими реакциями:
2X0/ Н О -> НХО, + HNOj.
Соляная кис юта
Качественное обнаружение
• Водное извлечение, или диализат. исследуют с помощью реакции на СГ Образование
обильного осадка хлорида серебра указывает на необходимость проведения дальнейшего
исследования на свободную соляную кислоту. Вследствие возможности образования со-
ляной кислоты из хлоридов при наличии свободной серной кислоты сначала необходимо
произвести исследование на серную кислоту, а затем — на соляную.
900 Глава 8
• Часть волною извлечения перегоняют. Вначале отгоняется вода, затем при повышении со-
держания хлористого водорода до 10% он начинает перегоняться, поэтому жидкость должна
быть выпарена по возможности вся.
• Дистиллят исследуют на наличие хлористого водорода: реакцией с раствором нитрата сереб-
ра (обнаружение С1 ): по выделению хлора при нагревании с хлоратом калия:
6НС1 + КСЮ, = ЗС1, + ЗН,О + КС1.
Количественное определение. Количсс венное определение хлористого водорода важно, что-
бы судить о том. имеется ли в данном случае (например, в рвотных массах) введенная кислота,
а не соляная кислота желудочною сока (0.1—0,2%), которая обычно в содержимом желудка
трупа уже нейтрализована.
Определенную часть водного извлечения подвергают перегонке, выпаривая содержимое
колбы, как описано выше, досуха. В дистилляте определяют количество хлористого водоро-
да титрованием по Фольгарду или весовым путем, взвешивая хлорид серебра. В случае при-
сутствия в дистилляте сероводорода образовавшийся осадок отфильтровывают, растворяют на
фильтре в 10% растворе аммиака, затем полученную жидкость подкисляют атотной кислотой, а
выделившийся при этом хлорид серебра отфильтровывают и определяют количественно.
Токсичность. Минеральные кислоты очень широко применяются в риыичных областях про-
мышленности и в быту. Они легкодоступны широким слоям населения, которое знакомо с
их свойствами, поэтому возможны как случайные, так и умышленные отравления кислотами.
Применение минеральных кислот в промышленности при недостаточном соблюдении правзы
техники безопасности приводит к поступлению кислот в том или ином виде в воздух предпри-
ятий и отравлению ими.
Известны криминальные случаи обливания серной кислотой (реже другими кислотами}, что
вызывает необходимость проведения химико-токсикологического исследования. Наблюдались
отравления, связанные с преступной небрежностью — хранением серной кислоты в стаканах,
стоявших между рамами для поглощения влаги воздуха, в бутылках из-под вина, имевших
винные этикетки.
Токсикологический интерес представляют азотная кислота и ее соли — нитраты натрия,
аммония и калия. В организме нитраты восстанавливаются в более ядовитые нитриты. Отрав-
ление нитратами и нитришми нередко происходит по ошибке, например вместо NaCl исполь-
зуют NaNO2.
Смертельная доза при приеме внутрь серной кислоты 5 г, азотной кислоты 8 г, соляной
кислоты — около 15 г.
Клиническая картина. При острых отраатениях кислотами, принятыми внутрь, наблюдаются
жжение и сильная боль во рту, глотке, пищеводе, желудке, рвота, иногда с примесью крови.
Рвотные массы имеют цвет кофе вследствие превращения гемоглобина в гематин и содержат
пленки слизистой оболочки пищевода или желудка. Возможен ожог кожи лица. Слизистая обо-
лочка рта, км, глотки обычно ярко-красная, отечная, с сероватыми или желтоватыми пленками
омертвевшей ткани, местами кровоточит. Часто развивается болевой шок. Смерть при отравле-
нии кислотами может наступить в первые дни от шока или перфорации желудка, а позднее от
рахтичных осложнений (сужение пищевода или желудка и последствия этого сужения).
Патологоанатомическая картина при отравлении минеральными кислотами сходна. Наибо-
лее глубокие изменения вызывает серная кислота. На месте действия кислоты наблюдаются
воспаление, ожог или некроз ткани. Струп окрашен в бурый (серная кислота) или желтый
(азотная кислота) цвет. Возникают рубцы, а также наблюдаются изменения в почках, печени,
поджелудочной железе.
Основания
• щелочи — NaOH. КОН и Са(ОН),;
• слабое основание-NH4OH.
Наиболее часто отравления вызываются нашатырным спиртом, в редких случаях — каус-
тической содой. Нашатырный cnnpi используется в медицине, технический раствор аммиака
применяется в рахтичных отраслях промышленности. Каустическая сода используется в про-
изводстве искусственного волокна, мыловаренном производстве, бумажной промышленности.
Щелочи понадают в организм в основном перорально при авариях на производстве, в тру-
бопроводах; возможно ингаляционное воздействие аммиака.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп.. 901
Нашатырный спирт (NH,OH) — 10Sf водный раствор аммиака (NH,): технический раствор
аммиака содержит 28—29% МП,, смешивается с водой, обладает резким запахом, pH 1% вод-
ного раствора 11,7.
Каустическая сода (гидроксил натрия. N ЮН) — твердое белое вешество. температура плав-
ления 320 “С. Т. кнн. 1390 ’С. Растворимость в воде 42% при 0 *С. pH 1% водного раствора 13,0.
Отравления гидроксидом калия отмечаются редко.
Негашеная и гашеная известь, несмотря па сс доступность, редко встречается в качестве
токсикантов.
Для обнаружения шелочей (при щелочной реакции на лакмус) к вытяжке прибавляют не-
сколько капель спиртового раствора фенолфталеина. а затем избыток хлорида бария, сохране-
ние розовой окраски наблюдается в присутствии NaOH. КОН. NH4OH и Са(ОН),. Необходимо
предварительно убедиться, чго лабораторная посуда мелочно-устойчива.
Аимяик
Качественное обнаружение. Способом обнаружения аммиака в биологическом материале яв-
ляется посинение красной лакмусовой бумажки от паров вытяжки. Извлечение помешают в
колбу с пробкой, к нижней поверхности которой прикреплены 3 бумажки: 1 — красная лакму-
совая: 2 — смоченная раствором сульфата меди; 3 — смоченная раствором ацетата свинца.
Посинение бумажек 1 и 2 указывает па наличие аммиака. Для приюговлеттия бумажки 2
берут разведенный раствор, имеюшнй лишь голубую окраску, которая от аммиака делается
шгенсивно синей.
Почернение «свинновой» бумажки указывает на наличие сероводорода и. следовательно,
на процесс гниения, что делает невозможным обнаружение введенного в организм аммиака.
Образование аммиака может происходить та же при наличии шелочей (NaOH. КОН), выделя-
ющих аммиак из его солей и белковых вешеств.
Токсичность. Водный раствор аммиака широко применяется в различных областях промыш-
ленности п в быту. Нсоднокра но имели место отравления при принятии раствора аммиака
внутрь как в результате несчастного случая, так и е целью отравления. Обстоятельства дела
в таких случаях обычно бывают настолько ясны не только для врача, но и для следственных
органов, что необходимости в проведении химического исследования не возникает. Острые
отравления аммиаком на производстве очень опасны. ПДК аммиака в воздухе 0.02 мт/л.
Отравления нашатырным спиртом составляют около 15—20' I всех отравлений прижигающи-
ми жидкостями и возникают при его употреблении с целью отрезвления. Летальность при дан-
ной патологии около 5% летальная лоза 10% водного аммиака (нашатырный спирт) 50—100 мл.
При отравлении небольшим количеством нашатырного спирта развиваются конъюнктивит,
раздражение слизистой оболочки бронхов. В больших концентрациях аммиак и нашатырный
спирт могут вызвать рефлекторную остановку дыхания, отек гортани, мучительный кашель с
отхаркиванием отошедшей слизистой оболочки или кровянистой мокроты, одышку и цианоз.
Гидроксиды натрия, калия и кальция
О содержании щелочи ласт указание титрование определенной части водной вытяжки объ
екта по осаждении карбонатов сотей щелочных металлов хлорилом бария. Для решения вопро-
са о катионе (Na*. К’, или Са1*) используют методы элементного анализа (см гл.6.4.3) или про
водят микрокрнсталлоскопнческие реакции с гексагилроксостибатом калия, виннокаменной
кислотой и оксалатом аммония (в настоящее время — очень редко). Количественное определе-
ние катионов в биологических объектах стаю возможным при использовании многоэлемент-
ных методов анализа (например. ЛЭС-ИСП и ИСП-МС). а также с помошью ионсслскгнвных
эяектролов и пламенной фотометрии
Токсичность. Отравления пт роксидом натрия (каустическая сода) вписывают наиболее тра-
гические страницы в историю отртплений: в прошлом 50% больных умирали, у половины ос-
тавшихся в живых возникали стриктуры нитевода.
Клиническая картина. Ведущим симптомом при отравлении щелочами является ожог пи
шевода, вы ываюшвй сильнейшую боль и как следствие шок При глубоких ожогах возможна
острая перфорация пищевода. Тяжелые ожоги пищевода обычно завершаются стриктурами,
преимущественно в трудном отделе и нижней трети. Рубцовая облитерация пищевода ратвнва-
ется в течение I—2 лет после ожога.
При патоморфологическом исследовании а1итзлстая оболочка nafvx пая. рыхлая. студневидная,
со стекловидным оттенком, легко рвется, резкой границы с неповрежденными тканями нет.
902 Глава 8
Соли щелочных металлов
Из соаей наибольшее токсикологическое значение имеют соли азотистой кислоты (нитри-
ты) в хлораты. Некоторое токсикологическое значение имеют соли щавелевой и борной (бура.
Na,B4O.) кислот Вотное извлечение подвергают исследованию на наличие солей обычно при
соо встствутоших указаниях в материалах дела.
Нитриты
Для экспрессного определения в моче нитритов их превращают в иитромезигилен. который
определяют на капиллярной колонке (15 мхО.55 мм) при 100—125 °C с использованием ТИЛ.
Сн составляет 0.5 мкмоль. Широко применяют мсюдом ГХ-ЭЗД для определения нигритов и
нитратов (после их превращения в нитробензол) в моче, кровт. слюне и других биосрсдах. Сн
на уровне пикограммов.
Качественное обнаружение
1. Исследование водного изменения:
а) . Проводят реакцию диазогирования и получения азокрасителя. К части извлечения при-
ба ляют растворы сульфаниловой кислоты или п-ннтроакилина. соляной кислоты и взбалты-
вают Спустя 10 мин жидкость подщелачивают и прибавляют свежеприготовленный щелочной
раствор р-нафтола — появляйся оранжево-красное окрашивание или осадок.
б) . К части жидкости прибавляют реактив Грисса — появляется темно-красное, красное
или розовое окрашивание е образованием осадка Степень окраски позволяет приблизительно
судить о количестве нитрита и в зависимости от этого подготовить к количественному опреде-
лению стандартные растворы соответствующей концентрации
2. Перегонка водного извлечения В колбу, соединенную с нисходящим холодильником, ко-
пен которого опушен в разбавленный раствор гидроксида натрия, помешают вытяжку, подкис-
ляют разведенной уксусной кислотой и пропусканием из аппарата Киппа диоксида углерода
собирают азотистую кислоту в виде натриевой соли Дистиллят исследуют приведенными выше
реакциями. Часть дистиллята подкисляют и прибавляют раствор иодила калия, подкисленного
разведенной серной кислотой и смешанного с крахмальным клейстером, — при наличии азо-
тистой кислоты тотчас наблюдается синее окрашивание.
Такой путь исследования является единственно возможным при ана. изе внутренних орга-
нов трупа, так как более чувствительный способ привел бы к обнаружению следов нитритов,
распрос раненных почти повсюду: в слюне, частях растений, земле, а следовательно, и в пыли
Следы азо1исгой кислоты (оксидов азота) всегда находятся и в воздухе лабораюрий. поэтому
необходимо соблюдать особую осторожность и наряду с основным исследованием ставить кон-
тре ЗЬНЫЙ опыт.
Исследование вещественных доказательств — солей азотистой кислоты:
1. К соли прибавляют уксусную кислоту — выделяются оксиды азота в виде оранжевых паров,
раздражающих слизистые оболочки.
2. Проводят реакции 1а или 16 (образование азокрасителя) и выделения йода.
3, Проводят реакции на ионы Na и К* или определяют их физико-химическими методами
Количественное определение. Небольшое количество азотистой кислоты удобно определять
колориметрическим методом. Для стандартных растворов используют нитрит серебра, приго-
товленного специальным способом. Прибавляют определенное количество реактива Грисса.
Окраску испытуемой жидкости сравнивают с окраской рабошх растворов
Токсичность. Использование нитри а натрия для приготовления азокрасителей (диазотиро-
вание) делает его доступным. Такие отравления происходят при использовании в пище вместо
хлорида натрия нитрита натрия.
Поступление оксидов азота в воздух некоторых производственных помещении может вы-
звать профессиональные отравления. При соприкосновении с водой (с влажными слизистыми
оболочками) МО,диснропорционирует в азотную и азогисгую кислоты.
Бораты
Pact ространение и использование. Борат-иоп является слабым термицилом в видном раство-
ре. Борная кислота часто используется как антисептик наружного применения Борат натрия
содержится в чистящих средствах, средствах для защиты древесины и фунгицидах. ПДК для
боратов равна 1—5 мг/м’ в воздухе рабочей зоны.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп . 903
Токсикокинегпика Бораты найдены в следовых количествах в здоровых тканях. Концент-
рация бора в крови в пересчете на бораты для здоровых людей в среднем составляет 0.6 мг/л
и варьирует в интервале 0.2—2.0 мг/л. Например, ежедневное полоскание горла раствором
борной кислоты увеличило концентрацию борат-иона в крови у 4 взрослых людей от средней
величины 0.4 мг/л до 0.8—1.1 мг/л спустя неделю Аналошчиые концентрации наб полаются
после употребления вина или изюма. продуктов с высоким содержанием бора, в течение 1—2 ч
после употребления.
Борная кислота хорошо абсорбируется через механически поврежденную поверхность кожи
или через кожу, пораженную грибком, но нс проникает через неповрежденную кожу.
Бораты из организма выводятся в неизмененном виде в основном почками. Т борат-иона
варьирует от 12 до 27 ч. 85—100% дозы, посту пившей в организм, может быть выведено с мо-
чой з< 5—7 дней. Лишь небольшое количество борчтов найдено в поте и фекалиях.
Токсичность. Соединения бора имеют относительно низкую токсичность. Однако описано
множество случаев острого и хронического отравления у детей и взрослых производными бора
Смертельная доза для взрослою человека 15—20 i борной кислоты. Признаки отравления про-
являются диареей, рвотой.
Газообразные галоидные соединения бора действуют как сильно раздражающие средства.
Длительное воздействие пыли. содержащей бораты, вы зывает дерматиты. кашель, прерывистое
дыхание у пострадавших.
Наблюл тлись случаи отравления боратами и со смертельным исходом (табл. 8-88)
Таблица 8-88. (. одержание боратов при летальном исходе в бножпдкостях (в мг/л) и тканях (мг/кг)
biiocyfkiaHibi К)ювь Мозг Печень Почки
Диапазон значений 381 — 1620 588—515 515—715 562—453
Объекты исследования. Объектами исстелования при отравлении борной кислотой или бурой
являются кровь, моча, желудок с содержимым. Кровь отбирают в количестве 10 мл в пробирку
с раствором ЭДТА. мочу — 20 мл в пластмассовый универсальный контейнер
Кроме этого, при отравлении мо)ут быть исследованы вещественные доказательства, кото-
рые полезны ня идентификации токсиканта.
Качествен! ое обнаружение
• При нанесении раствора образца (после предварительного окисления аналита) на куркумо-
вую бумажку происходит ее окрашивание в коричнево-красный цвет, который усиливается
при высушивании.
• При нанесении растворе! образна на смоченную в разбавленном растворе аммиака бумагу
наблюдается зе еповато-черное окрашивание (чувствительность 20 мг/л бората).
• При сжигании части образна, смешанного с серной кислотой и этанолом, зеленый цвет
вокруг пламени указывает присутствие борат
Количественное определение. Ранее бораты определяли в биологических жидкостях и тканях
ко юримсчричсским меюдом. используя карбаминовую кислоту. В настоящее время для опре-
деления бора используется метод ИСП-МС.
Бромиды
Природным источник бромидов служат соляные озера, природные рассолы, подземные
скважины и морская вода, где бром находится в виде бромидов натрия, калия и магния. Со-
единения брома используются в фотографии, при про (зво сгвс пестицидов и инсектицидов
В медицине широко применяются лекарственные средства, содержащие соединения брома,
которые оказывают выраженное ссдат imioe. снотворное и противосудорожное действие.
Бромиды участвуют в активации пепсина, липазы и амилазы ноджс дудочной железы, ре-
фляции ЦНС. усиливая процессы торможения, угнетают деятельность щитовидной железы,
являясь антагонистами йодидов, и при хроническом воздействии замедляют их усвоение.
Абсорбция бромидов происходит в желудке и проксимальных отделах гонкой кишки пас-
сивной диффузией, бромид-иоиы. как и хлорид-ионы распределены главным образом во вне-
клеточной жидкости. Основной путь выведения через ночки. Период полувыведения бромидов
904 Глава 8
9—15 сут после острою отравления или несколько недель после прекрашения избыточного
хронического потребления.
Токсичность- Острая интоксикация бромидами сопровождается ошнотой, рвотой и диареей.
Хроническая интоксикация развивается в течение 2—4 иед и трудно диагностируется. Лечение
состоит в соблюдении правильного питьевого режима и введении хлоридов и/или диуретиков
для ускорения выведения бромидов. Редко интоксикация бромидами наблюдается у пациен-
тов. постоянно принимающих гидробромидные соли в качестве лекарств — пиридостигмип
и декстрометофан. При хронической интоксикации бромидами их концентрация в крови со-
ставляет 500—4280 мг/л. Известны случаи, не приведшие к смерти у нескольких шшиенгов, у
которых 33% хлоридов плазмы были замешены бромидами, что является угрозой для жизни.
Отравление бромидами может вызвать неврологические заболевания (атаксия, автономное
возбуждение, ухудшение познавательных способностей). Клинический диагноз труден, если
использование бромидов нс подозревается.
При хронической интоксикации соединениями брома на производстве, при длительном
приеме препаратов, содержащих бромиды, иди их индивидуальной непереносимости могут
развиваться различные симптомокомплексы. известные как бромизм и бромодерма. При ос-
тром отравлении наблюдается «бромистое оглушение» с ослаблением внимания к внешним
воздействиям, расстройством походки, затруднением речи.
Причины избытка брома:
избыточное поступление:
нарушение регуляции обмена бромидов.
Основные проявления избытка брома:
кожная сыпь:
пустулы. мягкие воспалительные узлы фиолетово-красного цвета
ринит;
бронхит;
нарушения пищеварения:
расстройства сна и речи:
снижение памяти и другие неврологические нарушения.
Антагонистами бромидов являются йодиды, фториды, хлориды и алюминий.
Токсикокипстическис характеристики бромидов представлены в табл. 8-89.
Таблица 8-89 Гоксикокинетичсские характеристики бромидов
Суточное поступление с продуктами питания 7.5 мг
Суточное выведение:
моча 7 мг
кал 0.07 мг
нот 0,2 мг
прочие (волосы и др.) 0.002 мг
Период полувыведсния (Т( ) 9— 15 сут
Объем распределения (Vd) 0,35 —0,48 л/кг
Связывание с белками плазмы (1b 0
Среднее содержание.
организм человека массой 70 ki 2б0 мг
кос ГЦ 6.7 мг/кг
МЫШЦЫ 7,7 мг/кг
цельная кровь 3—5 мг/л
плпзма крови 12.5 мг/л
моча 3.5 мг/л
волосы 2—8 мг/кг
зубы (эмаль) 4.2 114 мг/кг
зубы (дентин) 1,12-34 мг/кг
НОГТИ 9-10 мг/кг
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 905
Объектами исследования служат кровь (10 мл), отобранная в пробирку' с раствором ЭДТА.
моча, помещенная в пластмассовый универсальный контейнер. При посмертной экспертизе
исследуют желудок с содержимым.
Качественное оонаружение
• При добавлении к части образна равного обтлма 5% picruopi серебра нитрата образуется
желтый осадок, который нерастворим 30% растворе азотной кислоты и малорастворим в
растворе аммиака.
• При добавлении к части образца 5 мл pact вора мора и 3 мл хлороформа слой хлороформа
окрашивается в желтый цвет, йодиды дают фиолетовый цвет, хлориды не реагируют.
Количественное определение
Существует много клинико-лабораторных методов о 1редсления хлорилов в сыворотке, ко-
торые также подходят для определения бромидов.
Предложен специфический метол колориметрического определения бромида. а также мето-
дики, основанные на применении газовой и жидкостной хроматографии, ионной хроматогра-
фии. капиллярного электрофореза (рис. 8-60»
Рис. 8-60. Э.1екгрофоре1рамма смеси анионов, содержащихся в обрате Mo'll!.
1 — бромиды; 2 — хлориды; 3 — сульфаты. 4 — фториты; 5 — фосфаты. Пояснение в тексте
Разделение анионов в моче проводили на кварцевом капилляре (56/64.5 см х 50 мкм) в бу-
ферном растворе при напряжении 30 кВ и 25 'С, УФ-детектирование при 350/60 и 245/10 нм).
Идентификацию анионов осуществляли по стандартным веществам (верхняя часть хроматог-
раммы).
Разработаны бромцд-сслектнвныс электроды, способные определять уровень бромидов в
плазме крови (см. гл. 6.5).
Хлораты
Натрия хлорат — эффективный недорогой гербицид, калия хлорат используется в изготов-
лении спичек и некоторых взрывчатых веществ. Оба вещества являются сильными окислите-
лями. Ранние признаки травления хлоратами включают тошноту', рвоту, боль. При проник-
906 Глава 8
новснни хлоратов в кровь гемоглобин превращается в метгемоглобин, что приводит к цианозу
(см. гл. 2.4.3).
Объектами исследования являются кровь (10 мл в пробирке с раствором ЭДТА). моча (20 мл),
желудок с содержимым, а также вещественные доказательства, полезные для идентификации
Качественное обнаружение
• При добавлении к части образца в разбавленной серной кислого I мл 1% раствора индиго
наблюдается темно-синее окрашивание.
• К 5 мл рвотной массы добавляют 5 мл 20% pacTBopt трихлоруксусной кислоты и фильтру
ют. Делят фильтрат на две равных части. К первой части добавляют 2 мл анилина и 1 мл
соляной кислоты на 1 мл образна — наблюдается сине-зеленое окрашивание. Ко второй
части добавляют 2 мл 1% раствора дифениламина в серной кислоте — наблюдается синее
окрашивание
При внесении хлоратов в кровь она окрашивается в коричневый цвет из-за образования
метгемоглобина. При добавлении к I мл такой крови 2 капель раствора цианида калия немед-
ленно происходит окрашивание в красный цвет, что подтверждает присутствие метгемоглоби-
на. Однако этот тест нс является специфичным для хлоратов, поскольку и другие вещества,
обладающие окислительной способностью, будут давать такой же результат. Необходимы пол
тверждаюшие исследования.
Количественное определение
В клинических случаях отравления хлоратами диагноз основан на измерении уровня метге
моглобина, которое легко выполняется как часть обычного биохимического анализа.
Метод ионной хроматографии для прямого анализа хлората в биожилкостях и тканях позво
ляст идентифицировать хлорат среди других анионов: нитрата, бромата и фосфата.
Интерпретация. Серьезное ино да с летальным исходом отравление может произойти пос-
ле присма в пингу 15 г и более натрия или калия хлората. Случай, описанный Eysseric и соавт.
(1999): 49-летний мужчина был госпитализирован с серьезными поражениями, вызванными
отравлением хлоратом. У пациента наблюдался острый гемолиз с содержанием гемоглобина в
плазме 3,9 г/л и 30% метгемоглобина. В плазме крови, желудочном содержимом и моче были
найдены высокие кошгент] ашгн хлорат-иона: 54. 1300 и 4300 мг/л соответственно Паписггг
умер через 12 ч после присма.
Оксалаты
Распространение и использование. Щавелевая кислота и ее соли применяют в промышлен-
ности и быту как чистящие и отбеливающие средства. Оксалаты присутствуют в относительно
высоких концентрациях в некоторых растениях, используемых в пище: шпинате, ревене н чае.
При приеме внутрь оксалаты оказывают местное раздражающее действие и вызывают гипо-
кальциемию, из-зо осаждения кальция. Эго свойство позднее было использовано при добааге-
нии оксалатов в пробы крови в качестве антикоагулянтов. ПДК щавелевой кислоты в воздххе
промыть лепных предприятий 1 мг/м1.
Метаболизм. До 99% введенной дозы оксалатов выделяется с мочой в течение 36 ч. В ЖКТ
всасывается только 2—5% щавелевой кислоты. Уровень щавелевой кислоты в моче составляет
обычно 8—40 мг/дснь. В организме окса агы образуются из аскорбиновой кислоты, тосту-
пагошей из пищи (35—44%), прн метаболизме глиггина (40%) и в наименьшем количестве из
других метаболических источников. В моче часто обнаруживают кристаллы оксалата кальция.
Пациенты с пгпсроксалурией из-за увеличенного желудочно-кишечного всасывания при при-
еме оксалата с нишей выделяют с мочой 95—380 мг/день оксалата. Естественное содержание
оксалата в мозге составляет 0.6 мг/кг. в печени — 2.3 мг/кг. в почках — 4.0 мг/кг. Концент-
рации оксалата в сыворотке крови человека в среднем составляют 1,4 мг/л. Верхняя граница
нормы в сыворотке равен 2,4 мг/л.
Токсичность. При наружном воздействии щавелевой кислоты вошнкасг раздражение кожи
и глаз, Оксалаты повреждают почки и снижают уровень кальция в плазме, что может привести
шок. коллапсу и судорогам При оральном приеме смертельная доза оксалата нагрия составляет
15—30 г, однако при внутривенной иньскпии она равна 1.2 г. что. например, привело к смер-
ти 16-летней девочки (случай из практики). Множество отравлений детей наблюдалось гюсле
употребления листьев ревеня (а ие стеблей), которые содержат до 1% щавелевой кислоты.
Даум мужчинам потребовался гемодиализ в связи с развитием острой почечной недостаточное-
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 907
in из-за упозреблсния сока плода Averrhoa carambola, содержащего 0.8% щавелевой кислоты.
Сообщалось об одном случае отравления из-за хронического профессионального воздействия
паров щавелевой кислоты. признаками которого были тяжелая головная боль, рвота, снижение
чувствительности. анемия и крайнее истощение. После приема в пишу гидрооксалата калия
4 женщинами концентрация оксалата в плазме через 6 ч у I оставшейся в живых была 3.7 мг/л.
в то время как у 3 умерших она составила 18—110 мг/л.
Щавелевую кислоту определяют в биологических жидкостях биохимическими методами,
комплексономстричсским титрованием, колориметрией, флюорометрией, методом газовой
хромато рафии как производные эфиров.
8.7. ФТОР И ЕГО СОЕДИНЕНИЯ
Пределы науки походят на горизонт:
чем ближе подходят к ним,
тем более они отдаляются
П. Буаст
Соединения фтора используются в металлургии и химической промышленности лля синг за
фторорганических соединений, фторопластов фторкаучуков. фреонов и красителей. Контакт с
фторсолержашими веществами возможен при переработке плавикового шпата, добыче и пере-
работке апатитов, криолита, являющегося основным сырьем для получения алюминия, в галь-
ванопластике при извлечении урана, обработке стекла. Фтороводород является основным сы-
рьем для получения неорганических фторидов и фтороуглсволорочов, реагентов лля травления
металлов и стекла. катализаторов для ряда органических реакций. Кремнефтористоводородная
кислота H,SiE6 и ее соли используются для пропитки древесины, получения фторсиликатов и
фторидов металлов.
В медицине фторсодержашис препараты применяют для течения гипофтороза. используют
как средства для наркоза, кровезаменшели и тщ. Радиоактивные и зотопы фтора применяют в
медико-биологических исследованиях.
Соединения фтора поступают в организм человека с пищей и водой. Фториды содержатся
в рисе, говядине, яйцах, молоке, луке, шпинате, яблоках и других продуктах, особенно ими
богаты чай (100 мкг/r) и морская рыба (5—10 мкг/г).
Фториды присутствую! в разных количествах в почве и естественных водных запасах, поч-
ти во всех растениях. Фториды добавляют в воду и зубную пасту для профилактики зубного
кариеса. Оптимальное содержание фторидов в воде но данным ВОЗ 1 mi в 1 л. В организме
человека фториды находятся как в связанном состоянии, обычно в виде труднорастворимых
солей калышя. магния, железа, так и в свободном (F1. Фториды входят в состав всех тканей.
99% их количества, приходится на кости и зубную эмаль. Фториды жизненно необходимы для
нормального роста и развития организма, участвуя во многих важных биохимических реакциях
они активируют аденилагциклазу. ингибируют липазы, эстеразу 1ДГ и т.д.
Тропность фторидов к фибробласту, т.е морфогенетической функции коллагена придает
фтору статус эссенциального элемента.
При пероральном поступлении хорошо растворимые соединения фтора всасываются из
ЖКТ в кровь на 93—97% в результате пассивной диффузии, усваивается организмом около
80% фторидов. Всасываемость фторидов зависит не только от растворимости их солей, но и
содержания кальция и магния в организме. Магний тормозит усвоение фторидов. В крови
фториды связываются в незначительной степени с альбуминами. Основным местом депониро-
вания фторидов в организме являются кости и зубы. Максимальную концентрацию фторидов
регистрируют в цементе зуба, несколько меньшую в твердой костной ткани, дентине и эмали
зуба. В минеральной фракции костей фториды включены в кристаллическую решетку солей ц
частично локализуются на поверхности кристаллов гидроксиапатита. Выведение фторидов из
организма осуществляется главным образом с мочой, частично с ютом, пбтом. У зд рового
человека существует прямая корреляция между содержанием фтора в потребляемой питьевой
воде и выведением ею с мочой.
908 Глава 8
Токсикокипстическис характеристики фторидов представлены в табл. 8-90.
Таблица 8-90. Токсикокипстическис характеристики фторидов
Суточное поступление с продуктами питания до 2 mi
Резорбция ЖКТ -90-97%
Суточное выведение:
моча 1 мг
кал 0, 2 мг
пот 0.65 (в жарком климате)
прочие (волосы и др.) —
Период подувыведения (Т|Д) 2-9 ч
Объем распределения (Vd) O.5-O.7 Л/К1
Связывание с белками плазмы (Fb) 0
Среднее содержание.
организм человека массой 70 кг 2-3 г
КОСТИ 112—310 мг/кг
кровь 0.01 -0.03 мг/л
ыаз.ма/сыворотка 0.007-0.022 мг/л
молоко 0.007-0.017 мг гл
моча 0.5 мг/л
волосы 53—72 мг/к1
зубы (эмаль) 140—157 мг/кг
зубы (дентин) 293-340 мг/кт
печень 0.2—0 8 мг/кг
почки 0.2—0.8 мг/кг
мозг 0 2-0.8 мг кг
легкие 0.2-0 X мг/кг
Токсическая лоза фторидов для человека 20 мг. icnun.iiasi доза 5—10 г фторида натрия.
При летал! ном исходе концентрация фторидов в крови 15 мг/л. в моче — 211 мг/л.
Индика ором содержания фторидов в организме является концентрация в моче. Часто оп-
ределяют фториды в волосах и зубах.
Токсичность
В начале второй мировой войны были синтезированы фторсодсржашис боевые отравляю-
щие вещества —дналкилф'1орфосфа|ы — зарин и зоман, оказывающие нервно-паралитическое
действие. При вдыхании воздуха с концентрацией зарина 7 мкг/л в течение 10 мин наступает
смерть. При попадании зарина на кожу смертельная доза составляет 0.12 мг/л.
Газообра ныЙ фтор (Г,) и фтористый водород — сильные раздражающие яды. При вдыха-
нии эти соединения вызывают ожог слизистых оболочек рта. гортани, бронхов, легких, сопро
вождаюшисея острой болью. Возможны приступы удушья, лихорадка, одышка, цианоз и отек
легких.
Производные фторуксусной кислоты (СН FCOOH) также являются высокотокснчиымн
всцсствами. Термин «фторацетаты» объединяет многочисленные производные фторуксусной
кислоты. Некоторые фторацетаты используют в качестве родентопидов. Действие фгораце-
татон связано с блокированием цикла трикарбоновых кислот. Смертельная доза фторацетата
натрия при поступлении в организм человека около 50 мг
Фторированные углеводороды (фреоны, фторогаи. тефлон, фторопласт) сравнительно ма-
лотокенчны.
Токсикологическое значение имеют главным образом натриевая соль фтористоводоро.ч юи
кислоты (NaF) и натриевая соль кремнефтористоводородной кислоты (Na,SiT ) Отравления
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп... 909
производными фтористоводородной кислоты в большинстве случаев вызваны ошибочным
применением их в быту вместо других солей.
При избыточном содержании фторидов возникает хроническая фтористая интоксикация —
флюороз. Хроническая фтористая интоксикация — это полиснстемное заболевание, при кото-
ром поражение костной системы развивается по типу диффузного осгеосклероза: нарушается
синтез коллагена, происходят дегенеративно-дистрофические изменения в хрящевой и кост-
ной гканях, нарушается остеогенез. В связи с этим при заболевании ф гюорозом повышается
содержание оксипролина в моче. Между содержанием оксипролина и фторидов в моче отме-
чают прямую зависимость, поэтому содержание оксипролина в моче считается биомаркером
их воздействия. При флюорозе страдают печень, почки, центральная нервная, сердечно-сосу-
дистая и нейроэндокринная системы.
Избыточное поступление фторидов нарушает белковообразующую функция печени. В сы-
воротке крови повышается содержание ^-глобулинов и альбуминов, гаптоглобина. Так, при
контакте на производстве с плавиковой кислотой и сс солями самым распространенным видом
висцеральной патологии является поражение билиарной и гастродуоденальной систем. При
избытке фторидов существенно снижается содержание инсулина в сыворотке крови. Длитель-
ное воздействие соединений фтора является одним из факторов риска ра вития артериальной
гипертонии, нарушений липидного обмена, при этом повышается содержание холестерина и
липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке крови.
При хроническом поступлении повышенного количества фторидов нарушается биосинтез и
обмен андрогенов и эстрогенов, снижается тиреотропная функция гипофиза: в крови умень-
шается концентрация 'ПТ. повышается концентрация соматотропного гормона. Сначала сни-
жается концентрация ТЗ, а концентрация Т4 остается без изменений, достоверно повышается
концентрация кальцийтонина. Диагностическая чувствительность при определении уровня ТЗ у
.тин с поражением печени довольно высока и составляет 76%, что. очеви но обусловлено дейс-
твием фторидов на ферментную систему дейодирования. Фториды угнетают метаболизм йода
в организме. Низкий уровень ТЗ является ранним диагностическим признаком хронической
фтористой интоксикации, а также причиной функциональной неполноценности Т-клеточного
звена иммунитета, чго проявляется снижением реакции бласггрансформапии лимфоцитов. На
ранней стадии флюороза происходит увеличение количества В-лих фонитов. что расценивается
как защитно-компенсаторная реакция. При продолжительной интоксикации отмечаются дис-
функция синтеза антител, снижение содержания IgG. IgM и повышение — IgA.
Угнетающее действие фторидов на активность ряда ферментов сопровождается нарушением
межуто гного обмена в тканях. При поступлении в организм повышенного количества фто-
ридов отмечаются активация рссинтсза АТФ. угнетение гликолиза, синтеза ядерных РНК и
белков. Полагают, что в основе фтористой интоксикации лежит гипоксия.
При избыточном воздействии фторидов возникают иммунологически опосредованные ре-
акции в форме латентной сенсибилизации или профессионально обусловленных дерматозов.
Фториды обладают повышенной онкопатогенгюстъю вследствие экспрессии супрессорного
звена иммунной системы.
Таким образом, на молекулярном уровне избыточное поступление фторидов проявляется в
изменении концентрации многих гормонов, повышении концентрации холестерина, триглице-
ридов и ЛПВП в сыворотке крови, повышении концентрации оксипролина в моче, повышении
концентрации гаптоглобина в сыворотке крови, снижении активности глутатионпероксидазы
и повышении активности СОД в эритроцитах, повышении концентрации малонового лиаль-
депгда в крови, изменении концентрации иммуноглобулинов и субпопуляций лимфоцитов в
крови, снижении концентрации трансферрина и ингибитора протеиназ в сыворотке крови.
Степень изменения уровня биомарксров в моче и крови зависит от концентрации фторидов
в биосредах. Биологически значимые изменения в организме человека начинаются при кон-
центрации фторидов в крови более 0.3 мг/л. Однако более надежным биомаркером воздейс-
твия считают содержание фторидов в моче, волосах и слюне.
В профпатологни. нри экологических исследованиях и ранней дгниносгнке хронической
фтористой интосикапии в ка гестве биомаркеров во действия принято использовать содержа-
ние фторидов в моче, слюне, волосах и крови, а в качестве биомаркеров эффекта содержание
окенпролина в моче, гормонов щитовидной железы (ТЗ и Т4) и ПТ. иммуноглобулинов IgG.
910 Глава 8
I’M и IgA. субпопуляций В- и Т-лимфоцитов, инсулина в сыворотке крови, МДА и активность
СОД в цельной крови.
В качестве диагностического критерия для выявления доклинической стадии и формирова-
ния групп повышенного риска предложен метод, основанный на влиянии фторидов на куль-
туру лимфоцитов.
Хроническая интоксикация обычно развивается при употреблении питьевой волы с повы-
шенным содержанием фторидов (более 4.5 мг/л). Флюороз костей развивается, как правило,
через 10—20 лег хроническою воздействия фторидов.
Причины избытка фтора
• избыточное поступление фтора в организм с питьевой водой (некоторые районы севера
России, окрестности предприятий по производству алюминия);
• хроническая интоксикация плавиковой кислотой и другими соединениями фтора в нроиз
водсгвенных условиях;
• длительная передозировка препаратов фтора;
• нарушение регуляции обмене фтора.
При хронической интоксикации фтором рекомендуется ограничить поступление его в орга-
низм и проводить симптоматическое лечение.
Основные проявления избытка фтора
• меловидные пятна на зубах, разрушение зубной эмали, хрупкость зубов, остеосклероз (флю-
ороз);
• остеомаляция, остеопороз, кальциноз сухожилий и связок, образование костных шпор:
• кровоизлияния в десны, слизистые оболочки pia и носа;
• потеря голоса, сухой удушливый кашель;
• брадикардия, снижение артериального давления;
• кожный зуд. раздражение и слущивание эпидермиса,
• нарушение жирового и углеводного обмена.
Обнаружение и количественное определение фторидов при химико-токсикологических исследо-
ваниях
Объектами исследования служат кровь, отобранная в количестве 10 мл в пробирку с раство-
ром ЭДТА. моча в количестве 20 мл. рвотные массы.
При проведении судебно-химических исследований фториды изолируют путем минерали-
зации биологического материала после его подщелачивания избытком NaOH, смачивают рас-
твором концентрированной серной кислоты шт нитрата аммония и сжигают при температуре
не выше 500 °C. Далее проводят качественное обнаружение и количественное определение
фторидов.
Качественное обнаружение
• К части образца добавляют 25% раствор хлорида кальция. Фториды дают белый желатино-
вый осадок, который нерастворим в 30% растворе уксусной кислоты, и мало растворим в
разведенной соляной кислоте.
• Часть мочи или рвотной массы сушат, растворяют и нагревают с гидроксидом кальция.
Добавляют 0.2 г очишенного песка, переносят в выпарительную чашку. Наносят мазок мяг-
ким парафином на стеклянную пластину, делают любую пометку (опознавательный знак на
парафиновом слое). Добавляют 5 мл серной кислоты в выпарительную чашку, пластиной
(парафиновый слой обращен к чашке) закрываю! чашку и нагревают в к-чение 20 мин.
Удаляют парафиновый слой с пластины. Оставленный след на пластине, соответствующий
сделанному опознавательному знаку, указывает на присутствие фторидов.
Количественные определение
Метод парофазного анализа (ПФА)-ГХ (см. гл. 8.1 и 8.2) чаше других применяют для опре-
деления фторидов в крови и моче. Методика основана на использовании комбинации ПФА-
ГХ-ПИ. -ЭЗД. Экстракция содержащихся в сыворотке крови фторидов гриметилхлорсиланом
(превращение реакционноспособного фторида в инертное летучее производное — тримстил-
фгорсилан) даст возможность определять фториды прн их содержании 10—50 нг (около 15 нг/л).
Для количественного определения фторидов в биологических жидкостях также предлага-
ются многочисленные колориметрические и спектрофотометрические методы, некоторые из
которых очень трудоемки.
Метаболизм и определение токсикантов различных химических групп 911
Значительно менее трудоемким является определение фторидов с помощью ионо-селскгив-
ного электрода (см. гл. 6.5). Однако этот метод требует тщательной калибровки электродов.
Все большее применение в элементном анализе при токсикологических исследованиях на-
ходит метод ИСП-МС как тувстви тельный и надежный (см. гл. 6.4.3).
В профпагологии наиболее часто используют от редс тонне фторидов в моче с помощью ио-
носслективного электрода. Методика основана на определении разности потенциалов между
анализируемым раствором мочи, к которой добавлен буферный раствор с высокой ионной
силой, и внутренним раствором лсктрола. Величина разности потенциалов пропорциональна
обратному логарифму активности фторидов в исследуемом растворе. Нижняя граница опреде-
ления 5 IO'7 моль/л (0.01 мг/л) фторида, систематическая погрешность 4%, воспроизводимость
± 2%. интервал определяемых концентраций — си 5-10'7 до 102 моль/л. Время определения
фтори. а в одной пробе мочи около 5—6 мин. Вещества, естественно содержащиеся в моче,
определению тте мешают Методика может быть использована и для анализа других биологи-
ческих материалов после их минерализации.
ПРИМЕРЫ СИТУАЦИОННЫХ ЗАДАЧ
Лля решения различных типов ситуационных задач сл*тует восполгзова ься материалами
электронного приложения, а также обучающими задачами, изложенными в учебном пособии
«Токсикологическая химия. Многоуровневые ситуационные задачи и упражнения» / Пол ред.
проф. Н И. Калетиной. — М.: ГЭОТАР. 2007
СИТУАЦИОННАЯ ЗАДАЧА
Для проведения ХТА доставлены: кровь и моча ребенка, флакон с остатками инсектицида
Обстоятельства дела. Семья с ребенком 12 лет учас вовала в пикнике в горах. Однако отды
омрачали многочисленные комары, несмотря на использование инсектицида. К ве iepy пошел
сильный дождь, было решено вернуться в город. Неожиданно дорогу преградил небольшой
селевой поток. Всем взрослым членам семьи пришлось расчищать дорогу. Ребенок уснул, и его
оставили в машине, включив отопление. Через 2 ч взрослые вернулись и увидели, что ребенку
плохо. Его вынесли из машины. У ребенка начались рвота, желудочно-кишечные боли. Вер-
нувшись в машину, мальчик жаловался на сильную головную боль, чрезмерное потоотделение,
затрудненное дыхание, нечеткость зрения. При въезде в город ребенок потерял сознание и
был доставлен и больницу. С момента обнаружения симптомов отравления прошло около 2 ч
К этому времени кожа лица ребенка была сине-багрового цвета, а видимые слизистые оболоч-
ки — малиново-красного оттенка.
Цель исследования: провести ХТА представленных биообъектов.
Информация. В пробах с таннином и ферроцианидом калия кровь ребенка сохраняла розо-
вый цвет (предварительная проба на токсикант № 1). Дальнейшие исследования подтверди ли
отравление ребенка токсикантом № I. По результатам ХТА в крови ребенка обнаружены следы
вешества. ингибирующего холинэстеразу (токсикант № 2). Т(/ и Vd токсиканта № 2 для людей
не установлены. Во флаконе находился инсектицид (токсикант V 2), продуктами окисления и
гидролиза которого являются: сх-нафто.т. формальдегид, аммиак, углекислый газ.
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
1. какие исследования будут проведены?
А. Направленный КТА
Б. КТА на неизвестный яд.
В. СХА па неизвестный яд.
Г. Направленный СХА.
Д. Анализ наркотических веществ (АНВ).
2. Какая формула отража т химическую структуру токсиканта № 2?
Примеры ситуационных задач 913
3. К какой группе токсикантов относится токсикант № Г.’
А. Ядовитых газон пеорншического происхождения.
Б. Пестицидов.
В. Металлических ялов
Г. Летучих ялов органической нрирс ты
Д. Афлатоксинов.
4. Токсикант № 2 — это:
A. Ь1-хтет.}1-О-(пафтил-1)-карбамат.
Б. 5.6-Диме 1ил-2-днме1илачнп-4-(М.М-лиме1н.1карбамо11.1оксн)-пиримилин.
В. О.О-лимегнл-S-l 1.2-.1н(этокснкарбонил)-этил|-литиофосфат.
Г. 3-Фснокснбензил-( I К.28)(+)-3-(2.2-лпхлор1я1нн.1)-2.2-днмегилпиклопропанкарбоксилат.
Д. 1,4.5.6,7.8.8-Ге тгахлор-4.7-энломспиен гетра) илроннлен.
5. Основные эгио.ю1нчсские факторы о1рав.тсннй токсикантом № I:
А. Отр тления при пожарах
Б. Присутствие в помещениях с неисправным отоплением.
В. Профессиональное травление в котельных бытовых и производственных зданий.
Г. Присутствие в закрытых автомобилях с неисправным отоплением.
Д. Все Перечисленное верно
6. Для группы пестицидов, к которой оi носится токсикант № 2. нехарактерно то. что они:
А. Инсектициды контактного, системного и кишечного действия.
Б. Умеренно персистентны.
В. Быстродействующие 10рбиииды не избирательного, контактного действия. дефолианты,
десиканты, регуляторы роста.
Г. Малорастворимы в воде и большинстве ортанических растворителей.
Д. Абсорбируются через кожу, всасываются при ингаляционном и пероральном попадании
в органи гм.
7. Каковы возможные пути попадания токсиканта Ле 1 в организм человека?
А. Ингаляционный. перкутанный.
Б. Перкутанный, пероральный.
В. Ингаляционный, пероральный
Г. Только перо ыьнып
Д. Только ингаляционный.
8. Токсикант № 1 (при концетраиин в крови НЬСО 30—40*) вызывает у пострадавшего:
А. Сильную головную боль, туман в глазах. гиперемию кожных покровов, рвоту, увеличение
уровня сахара в крови, гемическую гипоксию, коллапс.
Б. Головную боль, гиперемию кожных покровов.
В. Смерть меньше, чем за час вдыхания токсиканта № I.
Г. Нарушение функций дыхательной, сердсчпо-сос диетой, выделительной систем, судоро-
ги. кому.
Д. Легкое не домогание без специфических симптомов
9. Характеристика токсического действия токсиканта Ле 2:
Л. Умеренно токсичный.
Б. Значительно повреждает ЦНС. почки, печень при транслермальном пути введения в
средних дозах.
В. Повреждает кожу глаза органы дыхания и желудочно-кишечный 1ракг.
Г. Легочный токсикант, который может вызвать смерть от остановки дыхания н некоторых
случаях через 2—3 не.ч после отравления.
Д. Практически нетоксичен.
10. Продукты биотрансформании токсиканта Ле 2:
А. р-Гидроксикарбарил и его конъюгаты с глюкуроновой или серной кислотами.
а-Нафтол и сто коньюгаты с глюкуроновой и. и серной кислотой
914 Примеры ситуационных задач
Б. IS соединении и более, их коньюгаты с глюкуроновой кислотой, аминокислотами, суль-
фатами (например. 3-ФЬК, 4-ОН ФБК. 4-ОН ФБК сульфат и др.).
В. ЗГх-деалки.1ирован11Ых метаболита, меркаптновые конъюгаты.
Г. 2.4-Днхлорофсиол и фенол, их конъюгаты с глюкуроновой или серной кислотой; около
90% токсиканта № 2 выводится в неизмененном виде.
Д. Токсикант № 2 восстанавливается до неустойчивого свободного радикала. который нов
горпо окисляется с образованием супероксидного радикала.
II. Механизм действия токсиканта № 2:
А. Обратимое ишибированпе холинэстеразы
Б. Необратимое ингибирование холин эстеразы.
В. Воздействие па транспортные системы переноса через мембраны ионов натрия, калия,
кальция и хлора, ингибирование ферментов, влияние на вы вобождение медиаторов в
нервных окончаниях.
Г. Образование свободных радикалов, разрушающих липидные мембраны.
Д. Механизм действия неизвестен.
12. Может ли токсикант № I выделяться с мочой?
А. Нет.
Б. Да. эго основной путь выведения.
В. Да, в следовых количествах.
Г. Только в виде конъюгатов с серной кислотой.
Д. Только в виде метаболитов и конъюппов с !.тюкуроновои кислотой
13. Отравление ребенка согласно клинической картине (см. обстоятельства дела), могло соответствовать
диапазону концентраций токсиканта 1 в воздухе (в закрытой машине) на момент интоксикации:
А. 0.01—0.04 мг/л (соответствует уровню НЬСО в крови 0—3%).
Б. 0.08—0.11 мг/л (соответствуетуровню НЬСО в крови 4—10$ )
В. 0.23—0,46 мг/л (соответствует уровню НЬСО в крови 20 30%).
Г. 0.46—O.SX мг/л (соозветствует уровню НЬСО в крови 30—40 )
Д. 1.26—1.76 мг/л (соответствует уровню НЬСО в крови 50—60%).
14. Каковы нуги выведения 96% абсорбированной организмом дозы токсиканта Ns 1?
А. Через дыхательные пути в первые 20—30 мин после прекращения попадания в орга-
низм.
Б. С мочой через 4—5 ч после прекращения попадания в организм
В. Через дыхательные пути в течение I ч после прекращения попадания в организм.
Г. Чере з дыхательные пути в течение 2 ч после прекращения попадания в оркшизм
Д. С мочой, через кожу к через дыхательные пути через 4 5 ч после прекращения попада-
ния в организм
15. Дтя определения карбоксигемоглобина в крови проводят зкспресс-тесты, кроме:
А. Добавления 1% раствора K4|Fe(CN)J.
Б. Добаатения 20% раствора едкого натра.
В. Добавления 40% раствора фенилгидразииа.
Г. Добавления 30% раствора уксусной кислоты.
Д. Добавления раствора сульфида меди
16. Исходя из обстоятельств дела, дтя проведения предварительных испытаний на токсикант № 2
оптимально использование иммунохнмнчсскнх методов:
А. Технологии ELISA.
Б. Гехнологии EMIT.
В. РИА.
Г. ПФИА
Д. Гехполоин! K1V1S
17. При добавлении 40%. раствора фенилгилразипа к капле крови исследуемого образца:
А. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин. остается светто-красной. при его отсутствии
становится темно-зеленой.
Примеры ситуационных задач 915
Б. Кровь, содержимая карбокснгсмоыобнн. ос клея светло-красной. при сю отсутствии
оановнгся темно- или черно-красной.
В. Кровь, сотсржащая карбоксигемоглобин, остается темно- или черно-красной, при его
отсутствии становится светло-красной.
Г. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, становится темно-зеленой, при его отсутствии
становится свет ю-краенон.
Д. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, становится бледно-голубой. при его отсутствии
становится светло-красной
18. Каким методом можно подтвердить наличие токсиканта № 2 в крови ребенка?
А. Биохимическим (холииестеразная проба)
Б. ТСХ.
В. ПФИ А
I. Мет юм У Ф спектроскопии.
Д. ВЭЖХ-МС
19. Каким способом в данном случае следует провести пробоподготовку образцов крови для коли-
чественного определения токсиканта № 2?
\. Твердофазной микроэкстракцией.
Б. Экстракцией на жидкостных мембранах
В. Суперкритической жидкостной экстракцией.
Г. Иммуноаффинной хроматограф иен
Д. Любым из перечисленных способов.
20. Какие детекторы используют при определении СО в крови методом газовой хроматографии?
А. Катарометр. ПИД.
Б. Катарометр ЭЗД
В. VIС. ПИД
Г. ЭЗД. МС.
Д. АФД
21 На каком из рисунков представлены спектральные данные, которые можно использовать для
идентификации и количественного определения карбокси смоглобина?
Оптическая плотность
6-25 6.30 6:35 6:40 6:45 6:50 6:55 7:00
Время мин
ь
916 Примеры ситуационных задач
Поглощение
Г
Д
22. Учитывая обстоятельства дела, какие методы анализа в указанной последовательности шлут
надежные результаты определения токсикантов в кратчайшие сроки?
А. Химические тесты. ИФА (ELISA). УФ-спектроскопия. ВЭЖХ МС.
Б. Химические тесты. ИФА (EMIT). ИК-спектрометрия. ГХ-МС.
В. Химические тесты. УФ-спектроскопия. ГЖХ (ПИД).
Г. Химические тесты. РИА. ИК-Фурье-сиектроскоиня, ГХ-МС.
Д, Химические тесты, ПФИА. ГСХ, ИК-спектромстрия.
23. количественное определение токсиканта Хё 2 и его метаболитов в образцах крови и мочи про-
водили методом ВЭЖХ-МС. Какие данные соответствуют результатам КТА?
А. В крови, карбарила 0.0001 мг/л. а-нафтола 0. 005 мг/л; в моче: а нафтола — 0.05 мг/л.
Б. В крови: карбарила О.СМХ) 1 мг/л, а-иафтол ие обнаружен: в моче: а-нафтола — 0.05 мг/л.
В. В крови: карбарила О.(МХ)1 мг/л. а-нафтола 0. 005 мг/л: в моче: а-нафтола — 0.0005 мг/л.
Г. В крови: карбарила 0.0001 мг/л. а-нафтола 0.505 мг/л: в моче a-нафтол не обнаружен.
918 Примеры ситуационных задач
К снижению длоупогрсбиений в последнее время веществом D
привс ю распространение информации об опасных последствиях
его приема (непредсказуемые психические нарушения, попытки
самоубийства. повреждения структуры хромосом и тл.).
Наркотическое вещее) во I). Аналитические характеристик)!.
УФ-спектрофотомстрпя: водные растворы вещества D имеют
характерный максимальный ник поглощения в области 315 им
(pH < 7.0) и 310 нм (pH > 7.0).
ИК-снектрометрия: характеристические частоты 1626.
1307.1136.1066.1212.749 см 1(таблетки с КВг).
Хромато-масс-спектрометрня: принципиальные пики при
соотношении m/z 323. 221. 181. 222. 207. 72. 44. 223. 324.
323
Рис. 1. Масс-спектр наркотического вещества О
IIарктическое вещество С. Анадшичсскис характеристики
600000
5 550000-
i
5 500000
S.
450000-
400000
350000-
300000
250000-
200000-
150000-
100000-
50000-
39
94
105
152 166
а. ।
40
182
303
198
I 222
. .............J. - .Д
160 180 200 22 3 240 260 280 300
272
Phc. 2
nVz
Примеры ситуационных задач 919
Врем* ымх
920 Примеры ситуационных задач
Рис. 6.
Наркотическое вещество С оказывает влияние на дофаминергические системы мозга. Из-
вестно около 200 видов растении, содержащих наркотическое вещество С.
Наркотическое вещество С.
• Смертельная доза (д*я человека, рапсе сто не употреблявшего) 200 мг.
• Разовая «уличная* лоза 15—60 мг
• Для ии|ра>10залы1ого введения: «дорожка» длиной 3—5 см, содержащая от 10—20 mi до
50—100 mi.
• Токсическая доза ор,ь »но 500 mi
• Летальная доза 1.2 I. Доза может быть снижена до 20 мг и менее или повышенI до S- -10 i в
зависимости от индивидуальных особенностей человека.
На фошграфии — фрагмент растения, из которого по гучают всшесию С.
Лаборатория работает согласно принципам GLP и оснащена аналитическим оборудованием в
соответствии с современными рекомендациями Т1АГГ.
Цель исследований! провести СХЭ представленных биообъектов на содержание вешссгва С.
Примеры ситуационных задач 921
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
1. Какие исследования будут проведены?
Л. Направленный СХА
Б. Направленный КТА
В. Ненаправленный СХА.
Г. Ненаправленный К ГА.
Д. Криминалистический анализ.
2. Определяемый токсикант С — это производное:
Л. Тропана.
Б. Пиридина.
В. Ппрпмитиа.
Г. Хинолина.
Д. Hi иола
3. Какая формула отражает химическую структуру токсиканта?
922 Примеры ситуационных задач
4. Биодоступность кокаина при рапидных способах введения:
Л. Оральный — 20 40%.
Б. Ин гран азольный — 20—40%.
В. Курение — 6—32%.
Г. Внутривенный — 100%.
Д. Верно все.
5. Основные признаки длительного потребления кокаина:
А. Потеря массы тела.
Ь Раздражительность. агрессивность; бессонница.
В. Хронический насморк и частые респираторные заболевания.
Г. Расширенные зрачки.
Д. Верно все.
6. Если человеку массой 60 кг была введена доза кокаина 100 мг внутривенно, а через 5 мин кон-
центрация ею в плазме крови составила I мг/л. го кажущийся объем распределения равен:
А. 1.6 л/кг.
Б. I л/кт
В. 0,2 л/кг.
Г. 0.6 л/кг.
Д. 0.08 л/кг.
7. Какой метаболит, обнаруживаемый в моче, служит маркером употребления алкоголя совместно
с кокаином?
А. Анпироэкгоннднн
Б. Бензоилэкгоиин.
В. Экгонин.
Г. Норкокаин.
Д. Кокаэтилсн.
924 Примеры ситуационных задач
Г. Способность легки диффундировать в клетки ткани
Д. То. что удельный нес растворителя должен значительно превышать удельный вес волы.
16. При каким значении pl I кокаин максимально бу дез извлекаться органическим раствори гелем,
если показатель ионизации кокаина 8,6?
\. 9.0—10,0.
В. 2.0-3.0.
В. 12.0-13.0.
Г. 8.0—9.0.
Д. 10,0-12.0.
17. Выорагь наиболее правильный варианз использования физико-химических методов на рапид-
ных 'лапах проведения ХТА.
Л. ГЖХ. ВЭЖХ. ТСХ ГХ-МС (ирс । зрительный лап) -» иммунохимические методы
(ИХМ). химические методы (ХМ) (нолзнсрждающиГз лап) -♦ ВЭЖХ (колззчеезвеззпое
определение).
Б. ГЖХ (предварительный этап) -> ИХМ. ХМ (подтверждающий этап) -> ГХ-МС (коли-
чественное определение).
В. Спетрофотометрия (СФМ) в видимой и УФ-области, капиллярный электрофорез (КЭ)
(предварительный этап) -э ТСХ (подтверждающий этап) —> ГЖХ (количественное опре-
деление).
Г. ГЖХ. ТСХ, ИХМ. ХМ (предварительный этан) —> ВЭЖХ. ГЖХ. ГХ-МС, дзп|><|)ерензн1-
альнпя снсктро<|ютометрия (Дифф. СФМ) в УФ-обласзн (по.гзнерждающнй этазз и колн-
чсственное определенззе).
Д. Только ГЖХ (предварительный пап, но.цнсржгаюшпй этазз и количественное опреде-
ление).
18. При исследовании анализ* методом ТСХ на пластине проявились пятна соединений с Rr сов-
падающими с R, .метчиков (кокаина и его метаболи зов) после обработки пластины:
А. Рсактином Симона.
Б. Раствором хлорила жслеза(111).
В. Раствором пнпзидрмпа а ацетоне.
Г. Реактивом Манделина.
Д. Реактивом Драгенпор^кз.
19. Для обнаружения кокаина в виде крисга.злов — краеззо-фиолезовых прямоугольных и квадрат-
ных пластинок — может бытз> использована реакция с:
А. Раствором перманганата калия.
Б. Раствором платинохлорнстоводородной кислоты.
В. Реакт ином Бушарда.
Г. Реактивом Драгендорфа
Д. Реактивом Маркзз.
20. В УФ-сззектре раствора кокаина наблюдаются:
А. Максимум ззо цицепня в кислой среде зз отсутствие максимума поглощения в щелоч-
ной.
Б. Максимум поглощения в кистой среде зз максимум поглощения н щелочной среде.
В. Дна максимума поглощения н щелочной среде
Г. Максимум поз ношения в шелочпои срслс и отсутствие .максимумов в кислой среде.
Д. Два максимума поглощения в кислой среде.
21. При иссле юваззии волос для установления факта мзозрезмения кокаина используют:
А. ГХ МС.
Б. ГЖХ
В. ВЭЖХ.
Г. ИКС.
Д. ЯМР.
22. Выосрзп из нрсдс1эв.тснных зза рис. 2—6 анализ ических данных ИК-сззектр токсиканта, характе-
ризующий его форму после экстракции органическим раствори!едем из секционного мазериала:
А. Рис. 4.
Примеры ситуационных задач 925
Б. Рис. 3.
В. Рис. 5.
I. Рис. 2.
Д. Рис. 6.
23. Количественное определение кокаина методом УФ-СП ктроскопии проводят:
А. По предварительно построенной калибровочной кривой, представляющей собой линей-
ную зависимость оптической плотности (Л) от концентрации (С мт/мл).
Б. По времени удерживания.
В. По плошали пика.
I. По величине m/z — отношению массы фрагмента к заряду.
Д. По характеристическим частотам
24. Наркотическое вещество D — это:
Л. ЛСД 25.
Б. Псилоцибин.
В. Героин.
Г. Димегилтрнп г тмнп.
Д. Пснлоиин.
Приведите схему XT А представленных объектов.
926 Примеры ситуационных задач
Ситуационная задача
На ХТА доставлены: кровь, моча и волосы пострадавшего.
Обсгоягел1>С1ва дела Молодой человек 20 лет. стоя па лестнице. опрыскивал инсектицидом
верхушки яблонь на приусадебном участке. Средегв индивидуальной зашиты на нем не было.
Оступившись па перекладине лестницы, он упал и получил серьезную травму позвоночника.
Потерпевший был доставлен в б. нжайшую сельскую больницу, где дежурил молодой врач. В
ожидании специализированной бригады Скорой помощи врач, видя страдания пациента, на-
значил ему ииьекиию сильнодействующего обезболивающего средства. Через 3 ч после несчаст-
ного случая биожидкости пострадавшего были переданы для проведения ХТА.
Информация. По результатам ХТА установлено, что инсектицид (токсикант № 1) относится
к группе полнхлорцнклодпенов. Продуктом сю метаболизма является соединение, имеющее в
своей структуре эпокенгруппу
Обезболивающий лекарственный препарат — эго соль алкалоида. анионом коюрой являет-
ся хлорт-нон.
УФ-спсктр алказои. а-осиованмя: максимум поглощения при 285 нм в 0.1 н НО и макси-
мумы поглощения при 205 и 298 им в 0.1 п. NaOH
ИК-спекгр соли алкалоида: полосы поглощения при 1460. 1449.1444. 1409,1224. 1076, 787 см
При проведении ТСХ лекарственное вешество можно обнаружить реактивом Марки —
красно-фиолетовое окрашивание, реактивом Ф[ еде — фнолеюное окрашивание, переходящее
к бледно-розовое, реактивом Манделина — фиолетовое окрашивание, переходящее в бледио-
ро ювое.
В моче пострадавшего были обнаружены 6-мопоанетнлморфин (6-МАМ), морфин, мор-
фин-3- глюкуронид. Содержание морф| на превышало дозу введенного сильнодействующего
обезболивающего препарата Чем это можно объяснить?
Какое вещество явилось токсикантом № 2? При исследовании биообъектов в качестве под-
тверждающею мечола анализа токсиканта V 2 использовали метод, аналитическим сигналом
которого является величина m/z.
Цель исследования: провести ХГА на наличие токсикантов № 1 и № 2.
Приведите схему ХТА предел явленных биообъектов.
Лаборатория работает согласно принципам GLP и оснащена аналитическим оборудованием в
соответствии с современными рекомендациями TIAFT.
При решении задачи следует:
• обосновать выбор биообъектов лля проведения ХТА (физико-химические свойства токси-
кантов. данные по токеикокиненгке и биртрансформаиии);
• обосновать выбор способа пробополготовки
• обосновать выбор методов и е|г1ификаиии н количественною определения токсикантов,
учитывая их чувствительность и специфичность, преимущества и недостатки;
• обосновать выбор способа количественного определения, поэтапно изложить схему и про-
цедуру его проведения, привести мшемат ические формулы, если необходимо, произвести
вычисления
• представить интерпретацию полученных результатов:
• дать заключение об обнаружении юксикаитов.
Ситуационная задача
На СХЭ доставлены: внутренние органы (xej док с содержимым, сердце, печень, почки,
мозг, жировая ткань, легкое), кровь, моча, волосы трупа, обертка от конфеты. Биообъекты не
подвержены гнилостному разложению
Обстоятельства дела. Три подруги Таня. Маша и Юля — договорились встретиться после
работы и пойти в кино. Ганя и Юля работа.iи вместе и жили в одной комнате обшежшия. Да-
лее записано со слов Юли Таня почему-то сильно волновалась перед вс речей и более 10 раз
а день пила крепкий кофе. В кинотеатр девушки не пошли так как Таня была очень сильно
возбуждена и вела себя неадекватно. У метро Маша купила три шоколадные конфеты и угос-
тила подруг. Юля и Маша сразу съели свои конфеты. Таня нс хотела сладкого. Маша все-таки
уговорила подругу, развернула конфету и дала ей. Обертку от конфеты она спрятала в карман
Дома у Тани началась рвота, затем она потеряла сознание. Юля. отправляя Таню в больницу.
Примеры ситуационных задач 927
ска на врачам. чю подруга, ио-вилимому. отравилась кофе. По пороге в больницу Таня умер-
ли. Реанимационные мероприятия провести не успели.
Маша (через 2 дня после смерти Гани) призналась, что отравила подругу. заменив конфету
другой, в которую заранее вложила яд. В доказательство своих показании представила обертку
от конфеты.
Пнформацн На обертке конфеты сохранились следовые количества токсиканта № 1 Токсикант
№1 обнаружен в биообъектах в концентрации. которая не могла привести к летальному исходу.
Согласно результатам ХТА. токсикант № I относился к группе металлических ядов. Извест-
но. что отравление, вызванное этим ядом, сравнивают с заболеванием СПИДом («химический
СПИД»), Хлориднын комплекс этого токсиканта с тртк|>е11И.тмстановым красителем, извле-
ченный толуолом, сохраняет голубую окраску при промывании раствором серной кислоты.
Сульфид этого токсиканта растворим. Волосы пострадавшей содержали фоновое количество
токсиканта № 1.
Во внутренних органах трупа был обнаружен токсикант № 2 — 3.4-метилендиоксиметпм-
фетамин (МДМА) и его метаболит. Концентрация МДМА в крови соответствовала приему
вещества в дозе, несовместимой с жизнью. Зерна кофе, из которою iioicpneBiiiaB готовила на-
питок. не содержали токсикантов № 1 и 2. однако па чашке, которой пользовалась погибшая,
были обнаружены следы МДМА.
Количественное содержание кофеина в крови пострадавшей — менее 30 мкт/мл
Приведите схему ХТА представ.генных биообъектов.
.Набораюрня работает согласно принципам GLP и оснашена аналитическим оборудованием в
соответствии с современными рекомендациями TIAFT.
При решении задачи следует:
• обоснован, выбор биообъектов для проведения ХТА (физико-химические свойст а токси-
кантов. данные по токсикокипстике и биотрансформации).
• обосновать выбор способа пробоподготовки;
• обосновать выбор методов идентификации и количественного определения токсикантов,
учитывая их чувствительность и специфичность, преимуществе и недостатки:
• обоснован, выбор способа количественного определения, поэтапно ихтожить схему и про-
цедуру сто проведения, привести математические формулы, если необходимо, произвести
вычисления;
• представить интерпретацию полученных результатов;
• дать заключение об обнаружении токсикантов.
Ситуационная задача
На СХЭ доставлены: внутренние органы (желудок с содержимым, сердце, печень, почки,
мозг, жировая ткань, легкое), кровь, мочи, полосы трупа. Объекты не подвержены гнилостному
разложению.
Обстоятельства .чела. Со слов родственников, накануне собрания акционеров один из ч с-
нов совета директоров крупной авиакомпании долго не мог уснуть, даже приняв тройную дозу
хальциона. Жена посоветовала принять теплую хвойную ванну Утром этот человек бы г найден
утонувшим в ванне.
И нформация. В крови и печени трупа были определены концентрация триаза' ама 72 и
258 мкг/л соответственно. значительная концентрация хальциона. В крови также присутство-
вал этндовый спирт в концентрации, соответствующей сильному опьянению.
Со слов коллег известно, что пострадавший часто курил марихуану. Результаты СХЭ под-
твердили эту информацию.
Летальная концентрация триазолама
Кон генерация Кров из сердца Кровь го бедра Мо-гг 1 Гсчень Почка Моча.
мкг (л мкг/кг мкг/л
Средняя 119 77 [ 16'1 1 394 197 270
Диапазон (84-153) (62—91) (106-216) | (92-563) (71-293) (24-741)
928 Примеры ситуационных задач
Цель исследования: пронести химико-тиксиколоптческое исследование па наличие всех ка-
занных токсикантов.
Приведите схему ХТА представленных биообъектом.
Лаборатория работает согласно принципам GLP н оснашена аналитическим оборудованием н
соответствии с современными рекомендациями TIAFT.
При решении задачи следует:
• обосновать выбор биообъектов для проведения ХТА (физико-химические свойства токси-
кантов. данные по токсикокинстикс и биотрансформации):
• ооосновать выбор способа пробополготовки;
• обосновать выбор методов идентификации и количественною определения токсикантов,
учитывая нх чувствительность и специфичность. преимущества и недостатки.
• обосновать выбор способа количественного определения, поэтапно изд< лить схему и про-
цедуру его проведения, привести математические формулы, если необходимо, произвести
вычисления:
• представить интерпретацию полученных резульдадов:
• дать таключение об обнаружении токсикантов.
Глава 9
ДОПИНГОВЫЕ СРЕДСТВА
Только нс делай того, чего не должно
делать и ты сделаешь все то, чго должно.
JI.H. Толстой
Победы прославляют не только самих спортсменов и их тренеров, но и имеют сильнейшее
политическое, экономическое и социальное значение, повышают престиж стран, представ-
ляемых победителями. Постоянный рост спортивных рекордов, острое соперничество между
ведущими спортсменами приводят к тому, что они подвергаются высочайшим по интенсив-
ности и объемам тренировочным и соревновательным нагрузкам, которые нередко превышаю!
естественные возможности человеческого организма, угрожая жизни триумфаторов. К насто-
ящему времени в большинстве видов спорта физические и психические нагрузки спортсме-
нов практически исчерпали адаптационные (компенсаторно-приспособительные) способности
организма человека. Поэтому и спортсмены, и специалисты работающие в спорте и смежных
с ним сферах, помимо совершенствования системы отбора и под отонки молодежи для боль-
шого спорта, методик тренировок, улучшения материальной базы изыскивают всевозможные,
нередко неблаговидные способы, направленные на обеспечение победы на спортивных аренах
любой иеной.
Одним из таких путей является широкое использование в спорте различных лекарственных
средств и биодобавок в избыточных количествах, тганосяших вред здоровью спортсменов и
нарушающих принципы спортивной этики. Такие вешества и/или методы их использования
классифицируются как допинг. Применение допинговых средств в спорте запрещено В табл.
9-1 представлена история и современное состояние использования допингов.
В настоящее время проблема применения допинговых средств остается одной из самых
актуальных в спорте высших достижений, о чем свидетельствуют допинговые скандалы, пос-
тоянно сопровождающие крупные международные соревнования. Но эго только вершина ай-
сберга. Как показывает практика последних лет. молодежь, устоявшая от пагубных привычек
потребления алкоголя, табака и наркотиков и сделавшая свой выбор в пользу здоровою образа
жизни, подвергается давлению и изощренной пропаганде употребления физиологически ак-
тивных вешеств для улучшения физических данных. По действию такие вешества способству-
ют скорейшему наращиванию мышечной массы, увез ичению физических характеристик тела и
сохранению работоспособности в течение длительного времени, но наносимый ими вред мало
отличается от действия наркотиков. Особо опасно бесконтрольное потребление подрос!ками
модифицированных мужских половых гормонов. Уже однократный прием таких препаратов
грубо и на продолжительное время нарушает гормональный статус организма человека Пов-
торное же потребление усугубляет проблему. В итоге к 25—30 годам постоянно занимающийся
спортом и ведущий здоровый образ жизни, но употребляющий допинги человек имеет серьез-
ные заболевания печени, почек, суставов, гормональной системы. Как показывает практика, в
спорпншых залах и клубах широкое распространение получили контрафактно произведенные
препараты, препараты для ветеринарной практики тын неизвестного происхождения. Доля ле-
ка эственных препаратов лля медицинского применения среди них крайне мала.
930 Глава 9
Таблица 9-1. Этапы использования допингов
4000—5000 лет до н.э. Растительные стимуляторы, содержащие кофеин
2000 лет до н.э. И птенцы Южной Америки повсеместно употребляли растительные стимуляторы (кофеин и кокаин) для повышения работоспособности и уменьшения чувства голода
500 легло н.э. Слово «допинг» использовалось для обозначения напитка который южно-афри- канские племена принимали во время релш полных ритуалов
300 лет до н.э Гален. отец современной медицины. отмечал использование греческими атлета- ми стимуляторов
В первой половине XIX века Наркотические средства давали лошадям, участвующим в конных скачках, про- водившихся в Англии
1865 г. Впервые термин «допинг» применили по отношению к спортсменам, прини- мавшим стимутя оры во время соревнований по плаванию. проводившихся в Амстер.1аме
1886 г. На соревнованиях по велосипедному спорту была зафиксирована первая смерть одного из участников — англичанина Линтона, наступившая из-за применения нм лопинш во время гонки по маршруту Париж — Бордо.
1928 г. Международная федерация легкой атлетики стала активно бороться с использо- ванием допинга
30-е голы XX века Выделение тестостерона, его синтез из холестерина, синтез других мужских половых тормонов
1952 г. На зимних Олимпийских играх были отмечены случаи использования фенамина конькобежцами, которым при забеге потребовалась медицинская помощь
1956 г. На Олимпийских играх з аналоги* ную ситуацию попали велосипедисты
Конец 50-х — на- чало 60-х годов XX века 1960 г. Получили распространение синтетические мужские половые гормоны сре- ди спортсменов США. В большом числе публикаций препараты этого класса рекомендовались спортсменам специализирующимся в силовых и скоростно- сшовых вилах спорта — тяжелой атлетике, бо тибнлдннгс метаниях ядра и др. Рекламную кампанию среди спортсменов проводили фармацевтические фирмы производившие анаболические стероиды, а врачи выписывали спортсменам рецепты на эти препараты для улучшения результатов соревновании Гибель татского гонщика К. Йенсена во время соревнований по велоспорту на XVII Олимпийских играх в результате применения фенамина Международный олимпийский комитет начал борьбу с допингом
1960 г. 21 страна приняла резолюцию против использования в спорте допинговых суб- станций
Начало 60-х годов Проводятся первые тестирования спортсменов на применение стимуляторов, р-алреноб.'юка оров. наркотических вешсств
1963 г. Совет Европы создал специальный комитет по борьбе с допингом
1964 г. Первые пробы на применение спортсменами запрещенных стимуляторов были взяты в Токио на XVIII Олимпийских играх
1965 г. На Международном конгрессе спортивной медицины, проходившем в Страсбур- ге (Франция), было сформулировано; «Допинг — эго введение в организм человека любым путем вещества, чу того этому организму, или какой-либо физиологической субстанции в ненормаль- ном количестве, или введение какого-либо вещества неестественным путем, для того чтобы искусственно и нечестным путем повысить результат спортсмена во время выступления в соревнованиях»
1966 г. Федерация велосипедного спорта и Федерация футбола были первыми меж- дунлродт ыми федерациями которые официально ввели пробы на допинг при проведении чемпионатов мира
Допинговые средства 931
П/ю&ижение тай/. 9- /
I967 г.
1%7 г.
1968 г.
Копсп 60-х — нача-
ло 70-х голов
60—70-е и последу-
ющие 10ДЫ
1972 г.
Международный олимпийский комитет (МОК) учредил Медицинскую комис-
сию. принял определение допита и выпустил нерпы И перечень ' прешенных
препаратов
Во время тонки «Тур де Франс» умирает английский гонщик Т Симпсон, тю-
у потребивший допинговыми epe тствами
На X зимних Олимпийских трах в Гренобле и иа XIX Олимпийских играх в
Мехико Медицинская комиссия МОК впервые осуществила широкий ангнло-
пишовый контроль. в ходе которого проверку на применение стимуляторов и
наркотических вешеств прошли более 750 споргсменон
Анаболические стероиды стали широко использоваться в странах Восточной
Европы
Довольно сложной (с точки зрения обнаружения фактов применения) оказа-
лась проблема контроля на кровяной допинг, использование которого получи-
ло распространение в видах спорта, связанных с проявлением выносливости
к длительной работе. Экспериментально было установлено. что применение
кровяного опинга (гемотранефузия, аутоп могранефт ня) намного повышает
уровень гсмоглобн та в крони, способству пч самым существенному увеличе-
нию возможностей кис оро.ттранспорт ной системы и повышению выносливости
спортсмена в условиях протолжительиой работы
На Олимпийских играх в Мюнхене тестирование спортсменов с целью выятме-
70—80-е готы
ния применения ими запрошенных препаратов приобрело характер широкомас-
штабной акции. Пробы были взяты более чем у 2 т-ыс. участников игр; 7 проб
дали положительный результат. Все спортсмены, в том числе 4 медалиста. были
дисквалифицированы
Особхю популярность анаболические стероиды приобрели, кагэд было aov*ia-
но, что эти препараты явяякпея 'эффективным средством стимуляции вотмож-
MSRX’eb. хжбкмаю'кхмкк
внедрению анаболических стероидов в практику ползотовкн велосипедистов.
пловцов. гребцов, конькобежцев и др. Распространение препаратов этою класса
стимулировалось тем. что именно в этот период в подавляющем большинстве
видов спорта появилась тенденция к ре коп шгтснснфикаиин тренировочного
процесса, и очень Miioine победы на Олимпийских играх и чемпионатах мира
как и немало установленных феноменальных мировых рекордов, имели «анабо-
лическое» происхождение
Середина 70-х годов
Р работайы методы, позволяющие выявлять использование спортсменами ана-
болических стероидов
1975 I .
1976 г
Конец 7<)-х — 80-х
юдов
МОК вводит анаболические стероиды в Список запрещенных препаратов
Обследования. проведенные на Олимпийских нтрах. обтружилп наличие запре-
щенных средств в пробах 11 участников соревнований. В 8 случаях спортсмены
применяли анаболические стероиды
Разразилась серия скандальных ракэблччений. связанных с применением ана-
болических стероидов. Наиболее громким скандалом бы а лискисынфз капля
канадского спрингера Б. Джонсона, вынгравшеп золотую медаль в спринтер-
ском беге на Ю0 м на Олимпийских играх 1988 г. в Сеуле и лишенного этой
мс ши за применение стапозолола После истечения срока лис квалификации
Джонсон вернулся в спорт, однако в 1993 г. быт дисквалифицирован пожизнен-
но за применение того же анаболика На зт.х играх было лисква. ифшгировдно
несколько бо.царских тяжелоатлетов. после чею вся болгарская команда была
снята с соревнований и с позором выслана из Сеула. Широкий резонанс приоб-
рела история с 2 советскими тяжслоат. стами, пойманными в Канале с партией
анаболиков и задержанными правоохранительными органами за их распростра-
нение
932 Глава 9
Окончание табл. 9- I
Начало 80-х годов Медицинская комиссия МОК столкнулась с проблемой использования спорт- сменами таких препаратов, как р-алреэ облокаторы (вещества. активно воздейс- твующие на периферическую нервную систему и гемодинамику) и диуретики (средства, способствующие снижению массы тела и выведению из организма следов применения тех или иных допинговых средств). В результате после XXIII Олимпийских игр 1984 г., проходивших в Лос-Анлжслосе, вещества, относящие- ся к упомянутым группам, были включены в Список запрещенных препаратов
1986 г. После введения МОК запрета па использование кровяного допинга в спорте проблема еше более обострилась. Во-первых, из-за отсутсттня падежной сис- темы контроля, а во-вторых. в свя и с внедрением в снорт препаратов группы эритропоэтина, которые явились синтетическими аналогами кровяного допинга
1990 г. Запрет применения эритропоэтина проблемы нс снял, гак как >ш этот момент не было надежных методов его определения. Эритропоэтин стал широко при меняться в вилах спорта, требующих проявления выносливости и значительного потребления кислорода
Середина 90-х голов Дисквалификация нескольких китайских шпвпов. уличенных в применении анаболических стероидов
90-е юды Судебные процессы в Германии по искам к организаторам и исполнителям про- траммы применения запрещенных препаратов в спорте ГДР Запрет на применение анаболических стероидов и жесткие наказания за их ис- пользование стимулировали поиск новых допингов. Получил широкое распро- странение 'оматотропиый гормон (гормон роста). По неофициальным данным, впервые был использован в ГДР
2000 г. Среди участников международных соревнований в отельных видах спорта, требующих значительного потребления кислорода (особенно в лыжных гонках), становится все больше спортсменов, предъявляющих медицинские справки о том, что они астматики и потому не могут существовать без приема антиасгма- тичсских лекарств. Прием этих препаратов (санкционированный медиками) даст спортсменам довольно существенные преимущества перед соперниками Ра работаны методы исследования эритропоэтина. В обороте появились аналоги эритропоэтина (дарбепоэтин и др.) заменители крови па основе гемоглобина
2002—2007 г. Широко внедряются препараты, трудновыявляемые в процессе допинг-контро- 1я, например ряд пептидных гормонов. Используются достижения молекуляр- ной медицины и 1СНО.МИКН
2002—2007 г, Получили широкое распространение производство пищевых добавок и их
интенсивное использование спортсменами. Эти добавки не относятся к лекарс-
твам. 'по значительно облетает процесс их производства и выхода на рынок.
Однако многие добавки содержат запрещенные вещества (анаболические стеро-
иды. стимуляторы н др.), холя информация об этом на этикетках и в инструкци-
ях но их использованию отсутствует. В этой связи у спортсменов и иредсгавитс-
лей антидопинговой системы контроля возникли серьезные проблемы.
Основные допинговые средства
Контролируемые допинга перечислены в Списке запрещенных препаршив (далее Список)
для использования в олимпийском cnopie. Он ежегодно, обычно I января, обновляется Все-
мирным антидопинговым агентством (ВАДА. WADA) и утверждается МОК. Влияние на фор-
мирование списка запрещенных препаратов оказывают международные спортивные федера-
ции. которые рекомендуют включать в список те или иные вещества, способные положительно
повлиять на результат в конкретном виде спорта.
Всемирный антидопинговый кодекс ВАДА определил 3 основных положения, касающиеся
включения субстанций и методов в Список.
1 В Список должны быть включены субстанция или метол, отмечающие любым 2 из 3 сле-
дующих критериев:
• данная субстанция или метод способны улучшать или улучшают спортивные результаты (на
основании научно обоснованных тайных ши предыдущего опыта);
Допинговые средства 933
• данная субстанция или метод представляют риск, в том числе потенциальный, для здоровья
спортсмена (на основании научно обоснованных данных или предыдущего опыта);
• использование данной субстаннин или метода противоречит духу спортивных состязаний.
2. Субстанция или метод также должны вноситься в Список, если Вг\ДА определяет, что
существуют медицинские или другие научные данные, фармакологический эф4>ект или опыт,
евпдеге.чылиующпе о том. что дзнная субстанция или метод способен маскировать использо-
вание других запрещенных субстанций и запрещенных методов.
3. Решение ВАДА о включении той или иной субстанции или метода в Список окончатель-
но и не может быть предметом обсуждения со стороны спортсмена или другой персоны на
основании того, что данная субстанция или метод якобы нс является маскирующим агентом,
нс может улучшал, результаты, не i сеет риска для здоровья иди не противоречит духу спор-
тивных состязаний.
Основные классы допинговых средств включают широкий набор веществ. Среди них особое
место занимаю! стимул» оры. наркотики, анаболические стероиды. гормональные средства и
ряд других групп. Несмотря на исключительно активную борьбу с применением допингов, ко-
торую ведет МОК уже более 40 лет. проблема использования запрещенных веществ и процедур
в спорте не решена и с каждым годом приобретает все бблыпую ocrpoiy.
Запрещенные методы допинга охватывают различные варианты кровяного допинга, а также
все физические, химические, фармакологические манипуляции, которые искажают пока пели
мши изов мочи катет ери запню. замену мочи, подделку или подавление почечных выделений
и др. В отношении ряда веществ имеются ограничения, т.е. они запрещены в определенных
условиях, в отдельных видах спорта. Это касается местных анестетиков, глюкортикостероилов.
|3-алрсноблокаторов. алкоголя.
В соревновательных условиях проводят анализы на все перечисленные выше группы ве-
ществ и методы. В тренировочных устовиях исследования проводятся в ограниченном виде и
с учетом требований международных спортивных федераций.
Обычно в этот период в организме спортсмена устанавливают наличие анаболических аген-
тов. диуретиков, пептидных гормонов, их миметиков и или аналогов, а также определяют воз-
можные (запрещенные) методы н.х применения.
В табл. 9-2 нредстанлсиы основные классы допингов.
Г блица 9-2. Основные классы допингов
Допинги Фармакологическое действие I(римечанне
Стимуляторы Оказывают стимулируюшсс воздейс- твие на центральную нерпную сис- тему (ИНС), способствуют ингсм- енпному исполыованию эндогенных энергетических ресурсов организма, повышают выносливость к работе, требующей большого потребления кислорода Э<|эфек является лозоза- нисимым После приема высоких доз возможны психические расстройства. галлюцинации. Постепенно развивается тяжелая форма психической зависимости. Побочные эффекты, аналогичные эффектам норад- реналина; сужение кровеносных сосудов, повышение артериального давления с выраженным ютоотаслстшсм. возможен тепловой удар. Стимулируют диурез. чго может привести к обезвоживанию орга- низма. Возможен летальный исход
Наркотические Увеличивают толерантность к боле- Самый тяжелый острый пооочиый
лпалгггики вым ощущениям. способствуют повы- шению спортивной работоспособнос- ти за счет продолжения выполнения физической пагру зки за пределами естестве того ограничения эффект при передозировке — паралич органон дыхания. Применение приводит к появлению наркотической зависимости
Анаболические Ускоряю! процессы синтеза бел- Вызывают заболевания ссрлсчно-сосу.шс-
средства ка. Увеличивают толерантность к болевым ощущениям. Способствуют повышению спортивной работоспо- собности гот. эндокринной, гепатоцеллюлярной, мочеполовой систем, серьезные наруше- ния психики, физическую и психическою зависимость
934 Глава 9
Окончание табл. 9-2
р3-Адреномн мети ки Стимулируют р.-адреиореиепгоры Проявляют выраженное анаболи- ческое дейС1вие (без андрогенного). Усиливают способность мыши к сокращению Побочные эффекты — тахикардия, при- ступы стенокардии, аритмии. Побочные эффекты при использовании больших дозах малоизучены
Диуретики Способствуют выведению мочи и уменьшению содержания жидкости в организме, нс повышая работос по- собности Способствую! быстрому снижению массы юла Часто применяют спортсмены, специали- зирующиеся в различных видах борьбы, художественной и спортивной гимнас- тки. В отдельных случаях используют для выведения запрещенных препаратов с целью затруднения допинг-контроля. При длительном систематическом ис- пользовании или применении больших до з усиленно выводятся эссенциальные микроэлементы (см. гл. 8.5). Способству- ют развитию остеопороза
Маскирующие вешества (диурети- ки. 'питестостерон. пробенецид и нлаз- моадменителн типа гсмодеза) Выводят запрещенные вешества. норма- .11 зуют соотношение тсстостерон/энитес- тостсрон. затрудняют установления факта применения анаболических стероидов. Побочные эффекты: раздражение слизис- той оболочки пищеварительного тракта (пробснснид). кожные аллергические реакции, образование камней в почках, потеря массы тела, обезвоживание орп- низма и лр.
Пептидные гормоны Повышают выработку тестостерона. Способствуют росту скелета, повы- шению массы тела Использую! как анаболики. Повышают работоспособность и вынос- ливость. особенно при значительной затрате кислорода. Побочные эффекты: сахарный диабет, гиперфункция щито- видной железы, тяжелая innoi ликемия. увеличение вязкости крови сердечно-со- судистые заболевания, ишемия сосудов головного мо и а
Кровяной допит (гсмотрансфузня) Способствует интенсивному исполь- зованию эндогенных энергстичес- KI х ресурсов организма, повышает выносливость к работе, требующей большого потребления кислорода Возможно инфицирование организма н/или эмболия сосудов (за счет попада- ния воздуха в кровяное русло)
Р-Адрсноблокаторы Подавляют процессы возбуждения Снижаю! тремор, частоту сердечных со- кращений. Часто используют спортсмены, занимающиеся стрельбой из пистолета, лука и другими вилами спорта
Стимуляторы
В 2006 . ВАДА запрещены к применению следующие стимуляторы, включая, где уместно,
также их оптические D- и L-изомсры:
Адрафинпл, адреналин*, амфепрамон, амифеназол. амфетамин, амфетаминил, бензфета-
мин, бромантан, карфедон, катин**, клобензорекс, кокаин, кропропамид. кротетамид. цикла-
* Как местное обезболивающее или при местном применении (например, назальном офтальмало1нческом) нс запретен.
•• Запрещен, если его концентрация в моче превышает 5 мкг в I мл.
Допинговые средства 935
зодон. димегиламфслммин. эфедрин* ••. этамиван. э иламфетамин. элилэфрии. фвмпрофазон,
фснбутразат, фенкамфамин. фенкамнн. фенетиллин. фенфлурамин, фенпропорекс. фур<}>ено-
рекс. гептамннол. изометсптси. левмегамфетамин, меклофеноксат. мефенорекс, мефентермин,
мезокарб, метамфетамин (D), метилендиоксиамфетамин. мстилезшиокснметамфетамин, р-ме-
тиламфегамин. метилэфедрин*, метилфенидат, модафинил. никетамид, норфепефрин, норфсн-
флурлмнп. окюпзмип. ортетамии. оксилофрин. парагидроксиам1ретамнн, пемолин, пентетра-
зол. фендиметразин, фенметразин, фенпромстамии. фентермин. пролинтан. пропилгекседрин,
селегилин, сибутрамин, стрихнин и другие вещества с подобной химической структурой или
подобным биологическим эффектом” (см электронное приложение).
Эти вешссгва активизируют сердечно-сосудистую и дыхательную системы, что проявляется
в увеличении сердечного выброса, расширении бронхов, повышении артериального давления.
Препараты снимают чувство усталости. неуверенности в своих силах. улучшают псе виды пси-
хической и моторной деятельности.
Ко<|зеин — алкалоид. который является основным действующим веществом листьев чая. зе-
рен кофе, орехов кола, бобов какао и продукт их переработки — шоколада (см. гл. 7). Кофеин
содержится в лекарственных препаратах, например пенгалгине. каф<|>етнне. цитрамоне, а так-
же н широко распространившихся в последнее время энергетических безалкогольных напитках
(содержание кофеина в одной банке напитка может доходить до 100 мг и более, что превышает
его суточную лозу). Медицинская комиссия МОК в определенных границах (15 мг ко(|>еина на
I л жидкости в организме) допускает применение кофеина. что соответствует терапевтической
дозе. Исследования показывают, что применение 3—6 мг кофеина на I кг массы тела за I ч до
нагрузки приводит к повышению работоспособности и не превышает допинговый порог.
Кофеин в умеренных дозах не опасен лля иоронья человека. Это вещество стимулиру-
ет образование энергии во время напряженной физической работы, сократительную способ-
ность мышечных волокон, легочную вентиляцию за счет увеличения просвета бронхов, сер-
дечный выброс и периферическое кровоснабжение, эффективность использования глюкозы,
повышение содержания в крови свободных жирных кислот и их использование в качестве
источника энергии, что особенно важно. поскольку предотвращает расход запасов гликогена
Употребление кофеина заметно повышает работоспособность человека.
Установлено, что воздержание от приема кофеина в течение 5—7 дней способствует уси-
лению реакции организма па его последующее применение, что проявляется в более сущест-
венном влиянии кофеина на повышение уровня и мобилизацию свободных жирных кислот в
крови. В то же время высокоуглеводшя диета, которая часто используется перед соревнования-
ми. может снизить эффем применения кофеина, поскольку стимулирует выделение инсулина,
угнетающего мобилизацию свободных жирных кислот.
Избыточное потребление кофеина имеет неприятные последствия, особенно при длитель-
ной работе в условиях жары Обусловлено это тем. что кофеин обладает диуретическими свойс-
твами. стимулирует теплопродукцию, что может негативно сказаться на терморегуляции.
Длительное употребление кофеина или препаратов с высоким его содержанием можег при-
вести к зависимости и тяжелым последствиям. Чифнризм — злоупотребление концентрирован-
ным настоем чая. Чифирь относи гея к стимуляторам, содержит кофеин, теофиллин. теобро-
мин. дубильные вешссгва. эфирные масла, аминокислоты, вызывает наркотическое опьянение.
Последнее характеризуется блеском глаз, покраснением лица, шаткостью походки, широкими
и размашистыми движениями, двигательным возбуждением. суетливостью, многословностью,
навязчивостью и назойливостью в обшении. Длительное употребление чнфира изменяет пси-
хику человека и может вызвать делирии (галлюцинаторное помрачение сознания с преоблада-
нием зрительных иллюзий, сопровождаемых бредом и двигательным возбуждением). В насто-
ящее время кофеин включен в Прхнрамму мониторинга спортсменов ВАДА.
Другой стимулятор раст ительного происхождения, широко применявшийся ранее в спорте, —
алкалоид кокаин, содержащийся в листьях кокаинового куста (см. гл. 7). Наркотическое вещес-
тво кокаин может стать причиной смерти от инфаркта миокарда или кровоизлияния в мозг
* laiipcuiriiu, если копцехтршня в моче прсиышяет 1(1 мю и I мл.
•• Rcuiecntu. включенные и Программу мониторинга 2006 г. {Птврошюн. кофеин, фенилэфрин фсинтпропзнг11П1мин.
пипраэо.1, iiceujK'м|>е.|рН11. сннм]|рин) не ыирешеиы
936 Глава 9
При определенной дозе Стимулирующими свойствами обладает ыкалоид чилибухи (рво! но-
те ореха, Sfrychnos nux-vomica L.) стрихнин. В медицине его препараты применяют для лечения
последствий двигательных параличей и парезов в восстановительном периоде, при явлениях
общей мышечной слабости, быстрой утомляел ости. атонии кишечника, половой слабости, не-
которых (формах энуреза, заболеваниях, характеризующихся понижением процессов обмена.
К наиболее эффективно воздействующим стимуляторам относятся производные фснил-
этиламинов (см. гл. 7) — фенамин (амфетамин), мсридил. сиднокарб и др. Их стимулирующее
действие в зна тительиой мере связано с влиянием на стволовую часть мозга. В условиях ос-
трою воздействия они быстро изменяют функциональные показатели деятельности головно-
го мозга (активизируют биоэлектрическую активность мозга, изменяют условные рефлексы и
др.), повышают выносливость к физической работе. Наиболее активными из этих препаратов
являются метамфетамин и фенамин (амфетамин). Производные фснилэтиламинов снижают
утомляемость, улучшают координацию движений, повышают силовые возможности и вынос-
ливость. Под влиянием эгих препаратов возрастают результаты во многих видах спорта.
Повышение функциональных возможностей спортсменов под влиянием стимуляторов мо-
жет привести к серьезным заболеваниям сердца, печени, почек, нарушению терморегуляции
организма и даже смерти. Увеличение дозы очень популярного допинга фенамина и ею про-
изводных часто приводит к гипертоническому кризу и кровоизлиянию в мозг, возникновению
аритмии, что может стать причиной внезапной смерти. Прием этих препаратов сопровождается
увеличением скорости метаболических процессов и значительным выделением пепла, что может
вызвать тепловой удар. Возможны также смертельные исходы вследствие сердечно-сосудистого
шока. Специалисты проанализировали причины многочисленных смертельных случаев от сер-
дечно-сосудистых заболеваний в результате применения фенамина и его производных. При-
чинами трагических исходов стали развивающаяся гипертрофическая кардиомиопатия, разрыв
аорты, пролабирование митрального клапана и др. Велико отрицательное влияние фенамина
и его производных и на психику, у 90% спортсменов, потребляющих в день 300 мг препарата,
наблюдаются слуховые галлюцинации. у 33% — психические реакции с параноидальным бре-
дом. которые часто остаются и после прекращения приема препарата.
Первоначально в качестве стимуляторов использовались стрихнин, кокаин, фен тмин и его
производные. Когда МОК ввел запрет на применение этих стимуляторов, в практику бы ти
внедрены такие мощные стимуляторы, ио уже используемые в больших дозах, как эфедрин,
псевдоэфедрин, кофеин и др.
Широко распространен в спорте эфедрин — активный ишредиент кустарника эфелры. сти-
мулирующий ЦНС (см. гл. 7) Эфедрин применяется при лечении ринита и бронхиальной аст-
мы. В спорте эфедрин как допинг используется в видах, требующих выносливости, что обуслов-
лено ею способностью увеличивать систолический объем и сердечный выброс, объем дыхания,
ускорять обменные процессы в скелетных мышцах, снижать массу тела за счет потери жира.
Эфедрин опасен для здоровья спортсмена, особенно в больших дозах: он повышает артериальное
давление, нарушает сердечный ритм, может вызвать бессонницу, толовттые боли, нервозность,
тремор, а в отдельных случаях приводит к инфаркту, инсульт)' и даже смерти. Вредные эффекты
эфедрина существенно увеличиваются если применять его в сочетании с кофеином.
К классу стимуляторов отнесен бром ангин — препарат разработанный в СССР (Ленинград-
ская военно-медининская академия им. С.М. Кирова) для потребностей армии. В 90-х годах
этот препарат получил широкое распространение в российском спорге. так как отсутствовал
в списке запрошенных к применению веществ. На Олимпийских играх 2000 г. в Сиднее пред-
принимались попытки дисквалификации российских спортсменов за применение бромантана.
которые были отвергнуты как безосновательные. Однако после этого бромалтан был запрещен
и как стимулятор, и как маскирующий агент.
Броматам является актопроГектором и сочетает свойства мягкого психостимулятора и ак-
гопротектора, замедляет развитие нервно-психического и физического утомления, ускоряет
восстти овление работоспособности, особенно при деятельности в осложненных условиях (ги-
пертермия. гипоксия). Толерантность к действию препарата пс выражена, после прекращения
его длительного курсового приема не возникает синдрома отмены. В отличие от других пси-
хостимуляторов. ис вызывает эйфорию, следовательно, говорить о том. что применение эюго
препарата способно нанести вред здоровью спортсменов, нет оснований.
Допинговые средства 937
Многие стимулирующие вешества. в первую очередь кофеин, активизируют деятельность
симпатической нервной системы, в связи с чем они получили название симпатомиметиков
От стимуляторов следует отличать лсихоэнергизаторы. Несмотря на определенную схожесть
звучания, эти термины означают разные фармакологические группы вешеств. Психоэнергиза-
торы относительно недавно вошли в клиническую практику. К ним относятся лекарственные
вешества основным эффектом которых являются восстановление и нормализация клеточного
метаболизма, нарушенного в результате патологического состояния. Следствием приема пси-
хоэнерз и заторов является повышение физической работоспособности К исихоэнсрги заторам
относятся гептаминол (метаболит, встречающимся в нервных клетках, клетках миокарда и по-
перечно-полосатых мышц): ди метилам и ноэтаноя (деанол), являющийся предшественником
ацетилхолина в ЦНС; нанклар — фосфорный эфир лимстиламиноэгаиола, являющимся одним
из промежуточных продуктов в синтезе фосфолипидов мозга; ацсфен — комплекс диметила-
миноэтанола с п-хлорофсноксиуксусной кислотой, которая родственна растительному гормону
роста: мефексамнд, относящийся, как и анефен, к группе ауксинов; эуклидлн — производное
никотиновой кислоты: актебрал и тонибрал — производные янтарной кислоты (по мнению
ряде исследователей, анефен и мефексамнд ближе примыкают к iруине ноогропны.х средств).
Ряд экспериментальных и клинических наблюдений свидетельствуют о целесообразности
использования психоэнергизаторов в качестве средств повышения физической работоспо-
собное! и. в том числе и у спортсменов высокой квалификации. Из нсихоэнерн заторов за-
прещенным веществом является гептаминол (его отнесли к стимуляторам). О запрете других
психоэнср! и заторов в спортивной практике данные отсутствуют. Поскольку большинство пси-
хоэнергизаторов являются производными метаболитов эндогенных вешсств или самими ме-
таболитами. разработка критериев их применения (или неприменения) в качестве допинга в
настоящее время достаточно проблематична. Тонибрал — наиболее используемый препарат
этон группы в процессе подготовки спортсменов.
Наркотические аналгетики
Наркотические аналгетики — лекарственные средства природного, полусннтетического и
синтетическою происхождения, которые имеют выраженный болеутоляющий эффект с про-
йму ц ествснпым влиянием на ЦНС. а также вызывают психическую и физическую зависимость
(см. гл. 7). Наркотические аналгетики применяют только в тех случаях, когда нснаркотическис
аналгетики неэффективны. Запрещенными к использованию в спорте являются вес сильные
наркотические препараты (бупренорфин, лскстроморамил. геро зн, метадон, морфин, пентазо-
пин. петидин и близкие к ним вещест за). Разрешается использовать кодеин. декс|ропропок-
сифсн. дсксгромсторфан. дифеноксилат. дшидрокодсин. фолко ши. пропоксифен и трамадол.
Они намного слабее, чем морфии, и реже вызывают привыкание, их применяют для снятия
сильных болевых ощущений у спортсменов. Если запрет на использование таких веществ, как
героин, является абсолютно оправданным, то по поводу морфина можно дискутировать. Это
связано с тем, что героин очень часто вызывает наркотическую зависимость уже после пер-
вой инъекции: морфин после разовой инъекции зависимости не вызывает, и его применение
(а также применение близких по действию к нему препаратов), вероятно, могло бы быть оп-
равданным в единичных случаях при тяжелейшей травме у спортсмена.
ВАЛА запрещены к использованию спортсменами следующие наркотические вещества (см. гл. 7):
• бупренорфин, лскстроморамил. дна морфин (ivpoiiii), (]х.*нганил и его производные, гидро-
морфон. метадон, морфин, оксикодон, оксиморфон, пентазоцин, петидин;
• каннабиноиды (гашиш, марихуана).
Анаболические стероиды
Если стимуляторы имеют давнюю историю применения в спорте. то андрогенные анаболи-
ческие стероиды (производные мужского полового гормона естостероиа — наиболее распро-
страненный в спортивной практике класс препаратов) активно используются лишь в течение
последних 3 дссягилегий.
Ниже приведены контролируемые анаболики (Список запрещенных вешеств, ВАДА, 2007 г.).
1. Экзогенные вешества. которые обычно не могут быть выработаны организмом в естес-
твенных условиях: I-андростенлиол (5а-анлрост-1-ен-Зр. 17р-диол). 1-андростендион (5а-ап-
1рост-1-сн-3.17-лион). бо 1анлиол (19-нораилростсн.1ио.1). боластерон. болдснон. боллион
938 Глава 9
(андроста-1.4-диен-3.17-лион), калустсрон. клостебол, даназол 117а-этинил-17р-гидроксиан-
дрост-4-епо( 2.3-с1)изоксазо.т], дегидрохлормети тгестостерон (4-хлоро-17^-1 идрокси-17а-мс-
тиландроста-1.4-диен-3-он). дезокси Mt гид тестостерон (17а-метил-5а-ан.чрост-2-ен-17р-ол),
лростанолоп. этил эстренол (19-нор- 17а-прегн-4-сн- 17-ол), флуоксиместерон. формебо.тон.
фуразабол 117р -гидрокси-17а-ме1'ил-5а-аилростано(2.3-e)-<|>vpa ит|, гестринон, 4-1 идрокси-
тестостерон (4.17р-дигипроксиандрост-4-ен-3-он), местанолон. местеролон метенолон, ме-
танлиснон (17р-гиярокси-17а-метилан.троста 1.4-диен-З-он). мстапдриол. метастсрон (2а.
17а-лиметил-5а-андростан-3-он-17р-ол). метилдиеполон (17р-гилрокси-17а-мстилэстра-4.9-
дисн-3-он). мс।ил-1 -тестостерон (17Р-гидрокси-17а-метпл-5а-андрост-1 -ен-3-он). метилнор-
тестостерон (17Р-гилроксн-17а-метнлэстр-4-ен-3-он). мстилчриенолон (17р-гидрокси-17а-мс-
тилэстра-4,9.11-триен-З-он), метилтестосгерон. миболерон, нанлролон, 19-норандростенлион
(эстр-4-ен-3.17-дион). норболетон. норклостсбол. норэтандролон. оксаболон. оксандролон,
оксиместерон. оксиметолон. простанозол |(3.2-с)пиразол-5а-эгиоаллохолан- 17р-тетрагилро-
ниранол|. квинболон. сгапозолол. стенболон. 1-тестостерон (17р-гидрокси-5а-апдрост-1-сн-
3-он), тстрагидрогестринон (18а-гомо-прегна 4.9,11-трпсн-17р-ол-3 он), трснболон и другие
всшества с подобной химической структурой или подобным биологическим эффсктом(ами).
2. Эндогенные вещества, которые могут вырабатываться организмом в естественных ус-
ловиях: андростендиол (андрост-5-ен-Зр.17р-диол), андростендион (андрост 4-сн-3.17-лион).
дигидротестостерон (17р-п1лрокси-5а-андростан-3-он). прастерон (дегидроэпиандростерон.
ДГЭА). тестостерон и следующие метаболиты и изомеры: 5а-анлростап-3а.17а-диол, 5а-ап-
дростан-3а.17р-диол. 5а-анлростан-3р.17а-диол, 5а-анлростан-3р. 17р-диол, андрост-4-ен-
За.17а-диол, андрост 4-ен-За,17р-диол, андрост-4-ен-Зр.17а-диол. андрост-5-ен-За. 17а-диол.
андрост-5-ен-За,17р-лиол, андрост-5-ен-Зр. 17а-лиол. 4-андростендиол (андрос1-4-ен-Зр.17р-
диол). 5-андростендиои (андрост-5-ен-3,17-дион), эпидигидротестостерон. За-гидрокси-5а-ан-
дростан- 17-оп. Зр-гидрокси-5а-апдростан- 17-он. 19-норандростерон, 19-норэтнохолаполоп.
3. Другие анаболические средства, имеющие в своем составе кленбутсрол, тиболон. зеранол.
зилпатерол.
В 1939 г. Ружичка и Бутан бы а присуждена Нобелевская премия за получение синтетичес-
кого тестостерона из холестерина. С этого времени началась эпоха андрогенов.
В современной спортивной практике для стимулирования анаболических процессов ши-
роко применяются различные синтетические прет араты, близкие по химической структуре
и эффекту к тестостерону, однако пс вырабатываемые организмом человека. — сганозатол.
мстилтсстостерон и др.
Воздействие анаболических стероидов идентично воздействию тестостерона и проявляет-
ся анаболическими (изменение структуры и объема мышечной жани) и андрогенными (рост
волос по мужскому типу, ускорению процесса полового созревания, огрублению голоса и др.)
изменениями.
л
4-Хлор
Рис. 9-1. Центры замещения в молекуле тестосте-
рона.
На рис. 9-1 приведена схема возможных
центров замещения в молекуле тестостерона,
используя которые получают анаболические
стероиды.
Андрогенные анаболические стероиды ши-
роко используются в клинической практике.
Фармацевтической промышленностью вы-
пускаются различные препараты этого класса,
предназначенные для орального или инъек-
ционного применения. Большое количество
анаболиков выпускается и для целей ветери-
нарии.
Использование анаболических стероидов
на фоне интенсивной тренировочной работы
оказывает существенное воздействие на орга-
низм спортсмена. В настоящее время нако-
пилось достаточно материалов, позволяющих
Допинговые средства 939
оценить влияние этих препаратов на изменение морфофункпиональных возможностей спорт-
сменов. нх результаты. состояние здоровья. Общепризнано, что применение анаболических
стероидов в сочетании с интенсивным бечковым рационом и напряженной работой скоро-
стно-силового характера приводит к большому увеличению массы тела за счет роста мышечной
массы при одновременном уменьшении массы жира. У женщин тестостерона вырабатывается
в 10 раз меньше, чем у мужчин. В женском организме тестостерон частично трансформируется
и женские половые гормоны — эстрогены. Поэтому женшины более восприимчивы к анаболи-
ческим стероидам и эффект от их применения отмечается при значительно меньших лозах по
сравнению с мужчинами.
Принципиальным моментом воздействия анаболических стероидов на мышечную ткань
является то. что увеличение мышечной массы при воздействии анаболических стероидов. ра-
циональной белковой диете и специальной силовой тренировке составляет в среднем 5% за
6 недель и не сопровождается увеличением массы жира. Прекращение приема анаболичес-
ких стероидов даже при интенсивном белковом питании и постоянных физических нагрузках
снижает мышечную массу п силовые возможности спортсменов. И хотя эта зависимость не
носит линейного характера, достигнутый во время тренировок успех ие удастся сохранить в
достаточной мере до момента состязаний даже за счет увеличения физической нагрузки. Часто
возникает .зависимость спортивного результата от регулярного приема анаболических стеро-
идов. У хорошо подготовленных спортсменов с развитой мускулатурой процесс реадаптации
происходит быстрее по сравнению с липами со слабой мускулатурой.
Повышение уровня кортизола, отмечаемое у спортсменов высокого класса в период наибо-
лее напряженной подготовки, снижает содержание г.чнкогсна в мышцах и усиливает расщеп-
ление белков. Применение тестостерона противодействует этому. Соотношение содержания
тестостерона и кортизола в организме определяет направление метаболических процессов в
мышнах — синтез или распад белков. Во многом этим обусловлено широкое распространение
стероидных препаратов в качестве допинга.
Принято считай», что стероиды эффективны для профи гак гики и лечения перенапряжения
функциональных систем, несущих основную нагрузку в вилах спорта, требующих высокой вы-
носливости (тяжелая и легкая атлетика, гребля, велосипедный спорт, различные виды борьбы,
нлянаннс. конькобежный спорт к пр.). В этих видах спорта улучшение результатов вследствие
интенсивного применения спортсменами анаболиков особенно заметно: без анаболических
стероидов супертяжеловесы могут показать в толчке 200—235 кг. а применение препаратов
может увеличить результат по 265—270 кг.
Широко распространено мнение, что если не нее. то подавляющее большинство сегодняш-
них мировых рекордов в тяжелой и легкой атлетике не было бы установлено без применения
анаболических стероидов. Косвенным подтверждением этому является факт, что большинство
мировых рекордов в легкой атлетике, например прыжках или метании копья, лиска, как у муж-
чин. так и у женщин было зарегистрировано 10—20 лет назад, т.е. в то время, когда система
контроля за применением анаболических стероидов отсутствовала или была несовершенна.
В настоящее время количество положительных реакций на тестостерон при допиш-контроле
находится в прямой зависимости от вила спорта: наибольшее количество случаев применения
тестостерона обнаруживается в тяжелой атлетике, метании и прыжках.
В последние годы достоверно установлено отрицательное влияние люупотребления анабо-
лическими стероидами на здоровье спортсмена. Почти все стерон ня. потребляемые орально,
приводят к нарушению функций печени. Диапазон этих нарушений весьма широк — от прак-
тически бессимптомных, о наличии которых можно судить только по повышению в плазме
крови активности специфических ферментов печени, до таких тяжелых, приводящих к смерти
заболеваний, как рак печени и печеночное кровотечение. Регулярное применение анаболичес-
ких стероидов значительно повышает вероятность ишемической болезни сердца н относитель-
но молодом возрасте, так как приводит к повышению артериального давления и снижению
содержания липопротеинов высокой плотности. Установлено, что у спортсменов, применяю-
щих анаболические стероиды, концентрация липопротеинов высокой плотности снижается в
среднем на 20% и более, в то время как снижение ее на 10% повышает вероятность коронарных
заболеваний на 25%.
940 Глава 9
Избыточное применение аг золических стероидов. характерное для современного спорта,
приводит к:
• изменениям метаболизма соединительной ткани и снижению прочности сухожилии и свя-
зок. увеличению риска их разрывов;
• структурно-функииональным изменениям костной ткани, чго чревато переломами;
• подавлению функции иммунной системы;
• развитию онкологических заболеваний, в частности рака печени и предстательной железы;
• нарушению психического состояния (агрессивность и излишняя импульсивность):
• нарушению (у молодых спортсменов) роста эпифизарных хрящей. преждеврехтенному фор-
мированию ске юта. замедлению роста тс а;
• нарушению репродуктивной функции (часто необратимого характера).
У мужчин применение анаболиков подавляет естественное производство тестостерона в ор
ганизме со всеми вытекающими отсюда последствиями: дистрофией половых желез, импо-
тенцией, изменением по женскому типу, например увеличением грудных желез. У женщин
прекращается менструальный цикл, грубеет голос, появляются полосы на коже липа и др.
Наиболее опасным является бесконтрольный прием этих препаратов в больших дозах, что рас-
пространено в спорте высших достижений. Нередко спортсмены, приобретая анаболические сте-
роиды, пользу отся услугами «черного* рынка, что может привести к трагическим последствиям.
I срапевтичсская доза при пероральном приеме (5—10 мг/сут) нередко превышается в де-
сятки и даже сотни раз — 300—2000 мг/сут. Проблема усугубляется тем. что применение ана-
болических стероидов обычно сопровождается использованием других сильнодействующих
препаратов для сокрытия следов применения или предупреждения нежелательных эффектов.
Небольшие дозы анаболических стероидов снижают естественное производство тестостерона,
нанося врет организму, и при этом не дают ожидаемого спортсменом результата. Выраженный
эффею проявляется гогько при приеме больших доз препаратов.
Р2-Адреномиметики
МОК относи г к анаболическим веществам и Р,-адрсномимс1ики (клснбутсрол, сальбуги-
мол, сальмегерол тербугамин и др.), включая их D- и L-изомсры. Все они запрещены ВАДА.
Эти препараты обладают анаболическим (без андрогенного) эффектом, в клинической прак-
тике используются для купирования приступов астмы перорально и в виде инъекций.
О механизме анаболического действия этих препаратов известно мало. Предполагают, что
в механизм их действия вовлечены гормоны щитовидной железы. Эти препараты усиливают
способность мышцы к сокращению и оказывают сильное антикатаболическое действие. Из
всех препаратов группы р.-адреномиметиков наибольшее применение в спортивной практике,
особенно в бодибилдинге, нашел кленбутерол.
Применение некоторых препаратов этой группы в виде ингаляций разрешено МОК при
предварительном уведомлении антидопинговых служб. Однако грань между разрешенным и
запрещенным очень неопределенна, методы контроля несовершенны, многие спортсмены пре-
доставляют сомнительные заключения и документы о заболеваниях астмой и необходимости
применять эти препараты. Избыточное применение р.-ллреномнмстпков может отрицательно
повлиять на здоровы? и вызвать гипертензию, головные боли, нервозность, гремор. нарушение
координации движений.
Кровяной допинг
В последние десятилетия в спорте получил широкое распространение гак называемый кро-
вяной допинг, или кровяная поддержка, кровяная загрузка, индуцируемая эритропитемия.
Установлено, что забор у спортсмена порции крови (около 400 мл) с их последующим введе-
нием в организм через 3—4 недели или более приводит к увеличению максимальною потребле-
ния кислорода на 8—10%. Кровяной допинт может быть достигнут разными метотами, одним
из которых является гомологическая трансфузия — получение от донора крови с необходимы-
ми для сс переливания характеристиками. Второй метод называется аутогемотрансфузией, при
котором спортсмену вводят его же собственную кровь (см. электронное приложение).
За месяц количество эритроцитов в организме восстанавливается до нормального. Лля со-
хранения эритроцитов отобранной крови нх осаждают центрифугированием. отделяют от плаз-
Допинговые средства 941
мы и замораживают. Впоследствии размораживают и смешивают с солевым раствором для
ускорения трансфузии. При введении крови ее общее коли тество в организме спортсмена воз-
растает, что вызывает повышение артериального давления и как следствие выведение почками
воды из плазмы, однако при этом эритроциты остаются в кровяном русле, а их количество
в крови возрастает. С увеличением концентрации эритроцитов и. соответственно, концентра-
ции кмопобинл. возрастает способ гость крови доставлять к работающим мышцам большее
количество кислорода (см. гл. 2.4.3).
Повышение уровня гемоглобина и улучшение транспорта кислорода под влиянием кровя-
ного допинга, несомненно, способствуют повышению выносливости при работе аэробного ха
рактера. Следует также отметить, что кровяной допинг снимает отрицательное влияние средне-
горья и высокогорья па максимальное ютребление кислорода и выносзивость спортсменов.
Особенно высока результативность кровяного допинга в лыжных гонках, беге на длинные
дистанции. Имеются данные, что успех велогонщиков США. которым переливали донорскую
кровь, на Олимпийских играх в Лос-Анджелесе в значительной степени был обусловлен при-
менением этого способа стимуляции выносливости.
В настоящее время достаточно хорошо отработана методика применения кровяного допинга.
Специалисты считают, что использование донорской крови связано с определенным риском, так
как. несмотря и; тщательный подбор крови по группам. некоторые лица (3—4%) отрицательно
реагируют на переливание крови в связи с разрушением трапсфузировапных эритроцитов. Не ис-
ключаются также случаи возникновения инфекционных заболеваний. Избежать этих отрицатель-
ных влияний позволяют забор, храпение и пос. едуюшее введение спортсмену собственной крови
(аутогемотрансфузия), что широко используется в спортивной практике. На протяжении ряда лет
этот метод был практи зески легальным средством повышения работоспособности спортсменов, а
многие споршвные победы и рекор 1ы были результатом применения кровяного допита.
После введения в 1987 г. МОК запрета на применение кровяного допинга эта проблема сто-
ит особенно остро, поскольку надежного способа его обнаружения не разработаз о. Попытки
выявить применение кровяного допинга по излишне высокому уровню гсмоиобина к успеху
не приводят, так как высокий уровень гемоглобина может быть обусловлен генетическими
особенностями организма спортсмена, методами тренировки, подготовкой в условиях высоко-
горья. Некоторые другие предлагаемые способы также нельзя признать достато* но э<1>фектив-
ными. Ситуация обостряется еще и тем. *гго в спорте получили распространение официально
разрешенные в медицине гормональные средства, способствующие повышению уровня гемо-
глобина и применяемые при лечении анемии. В частности, в качестве такого средства особое
распространение получил эритропоэтин (см. ниже).
Гормоны и гормоноподобные вещества i
ВАЛА запрещены следующие вещества и высвобождающие их факторы, включая вещества
с подобной химической структурой или подобным биологическим эффектом:
• эритропоэтин:
• гормон роста, инсулиноподобные факторы роста — ПФР (например. ИФР-1). механичес-
кие факторы роста (МФР);
• гонадотропины (лютеинизирующий гормон, хорионический гонадотропин человека), за-
прещенные только для мужчин;
• инсулин;
• кортикотропины.
Отнесение пептидных гормонов к допинговым препаратам преследует в первую очередь
профилактическую цель — предостеречь спортсменов от применения этих препаратов из-за
серьезных побочных эффектов.
Эритропоэтин является естественным гормоном, вырабатываемым почками, который стиму-
лирует воспроизводство эритроцитов в организме. Активизируя образопшшс красных кровяпьх
телец, он повышает способность организма доставлять кис ород через кровоток к мышпам. Ана-
лог человеческого эритропоэтина. синтетически) версия этого гормона, используется в медици-
не для лечения анемии или почечной недостаточности. Стимулирование рекомбинантом челове-
ческого эритропоэтина кислороднесушей способное) и крови позволяет иснользова ъ кровяной
допинг спортсменам, стремящимся получить преимущество в вилах спорта на выносливость.
942 Глава 9
Применение этого препарата в течение 7 недель способно повысить выносливость на 10%. чрез-
мерные дозы эритропоэтина могут привести к опасному для хюровья повышению гематокрита
и угрозе не только для здоровья, но и для жизни. У спортсменов, принимающих эритропоэтин,
могут возникать гипертензия, тромбоз сосудов, нарушение деятельности сердца.
Болес 10 лет (1980—90-е годы) эритропоэтин для многих спортсменов был эффективным
редством повышения результатов. В то время многочисленные рекорды на Олимпийских иг-
рах н чемпионатах мира были поставлены именно благодаря использованию эритропоэтина.
Признание эртропоэгина допингом и запрет на его применение в 2000 г. проблемы не
сняли — появились препараты аналогичного действия, но не запрещенные МОК. В частности,
на смену эритропоэтину пришел аналогичны!) ему то характеру дс» ствия и сшс более эф<|>ск-
тивный препарат ларбепоэтин. появившийся в 2001 г. на американском рынке и молниеносно
проникший в спорт высших достижений. Массовое применение дарбепоэтина на XIX зимних
Олимпийских трах в 2002 г. в Солг-Лейк-Сиги повлекло ряд скандалов и дисквалификаций.
Следует отметить, что эр 1тропоэтин и дарбепоэтин как синтетические препараты, стимули-
рующие повышение кислородной емкости крови, более опасны для здоровья спортсменов по
сравнению с вполне физиологичной процедурой аутогемонтрансфузии.
Опасность для человека представляет применение гормона роста — соматотропного гормона
(соматотропина) при отсутствии медицинских показаний. Интенсивное использование в спор-
тивной практике этого вешества началось в 80-х годах XX века после запрета анаболических
стероидов. Пептидный гормон соматотропин вырабатывается в передней доле тпофиза под
контролем соматостатина и соматолиберина. Основные его функции: стимуляция линейного
роста, поддержание целостности тканей и уровня глюкозы в крови, достаточного для функци-
онирования головного мозга. Соматотропин имеет широкий спектр действия:
• ускоряет синтез белка, задерживая в организме азот и фосфор и обеспечивая их положи-
тельный баланс за счег снижения уровня мочевины;
• ускоряет рост костей и мягких тканей, действуя через инсулиновые факторы роста;
• тормозит выведение натрия и калия с мочой;
• усиливает всасывание кальция в кишечнике;
• стимулирует расщепление жиров в жировой ткани и ускоряет поглощение жирных кислот
из крови мышечной тканью и печенью (где они преобразуются в глюкозу);
• препятствует поглощению глюкозы тканями оказывая влияние на уровень глюкозы крови,
противоположное действию инсулина;
• увеличивает количест но Т- лимфоцитов.
Кроме того соматотропин ускоряет синтез других стимуляторов роста, прежде всего сома-
томсдип*. Уровень сомагомедина в свою очередь влияет на секрецию соматотропного гормона
гипофизом (эффект многократно) о усиления). Выделение соматотропина повышено при физиче-
ской раооте, во время глубокого сна, при гипогликемии и бога ом белками пищевом рационе.
В спортивной практике соматотропин применяется в схемах по набору сухой мышечной
массы с учетом выраженного анаболического и жиросжигающего действия, а также для повы-
шения эффективности энергообмена при физических ншрузках В 1980-х годах в разных стра-
нах предпринимались попытки использовать гормон роста в спорте для воспитания спортив-
ных гигантов. Главным побочным действием применения этого препарата является разви ие
акромегалии. В последние десятилетия XX века ряд спортсменов стали жертвами бесконтроль-
ного применения гормона роста.
Гонадотропин хорионический человека часто используется мужчинами для стимуляции вы-
работки тестостерона, кор) икот ронин — для увеличения уровня эндогенных глюкокортикосте-
роидов в крови, в основном для достижения эйфорического эффекта.
Глюкокортикостероиды. Все глюкокоргикосткроиды запрещены для применения внутрь,
ректально. внутривенно или внутримышечно. Их использование требует «исключений на те-
рапевтические использования»
Остальные пути применения, кроме обозначенных ниже требуют сокращенного «исклю ic-
ния на терапевтические цела ьзования».
Местные средства, используемые для лечения кожных, ушных, носовых бо. :зней, глазных,
заболеваний полости рга, не запрещены и не гребуюг никаких «исключений на терапевтичес-
кие использования».
Допинговые средства 943
Агенты с антихтрогашой активностью. Запрещены следующие классы аитиэстрогенных
веществ:
• ингибиторы ароматазы, имеющие в своем составе анастрозол, астрозол. амииоглутстимил.
экземестан. форместан. тестолактон:
• избирательные модуляторы рецептора эстрогена, имеющие в своем составе разок:нг|сн.
тамоксифен, торсмифсн;
• прочие антиэстрогснные вещества, содержа цис кломифен, никлофенил. фу звес грант.
Мочегонные и другие маскирующие агенты
Ниже приведен перечень контролируемых мочегонных и других маскирующих агентов из
Списка ВАДА на 2007 г.
• Маскирующие агенты, имеющие в своем составе: мочегонные средства*, эпитестостароп.
пробенецид, ингибиторы а-редуктазы (финастерид, дутастерид) пллзмозаменители (альбу-
мин. декстран, гидрокси л нлкрахмал).
• Мочегонные средства: апетазоламил. амилорил. буметанид, канренон. хлоргалилон. эзакри-
новая кислота, фуросемид, инданамил. мстотазон. спиронолактон, тиазиды (бенлрофлуме-
тиазид. хлоротиазид, гидрохлороттгазид). гриамгерен и другие веществ;! с подобной хими-
ческой структурой или подобным биологическим эффектом (кроме дросперинона. который
нс запретен).
Диуретики — лекарственные средства разного химического строения. которые способству-
ют большему выведению мочи и уменьшению содержания жидкости в организме. Применение
диурезиков в спортивной практике имеет давнюю историю. В течение многих дет их использо-
вали хтя снижения массы тела наездники, боксеры, борцы, гимнасты. Запрет на применение
диурез иков в спорте был обусловлен тем. что их стал)! использовать для маскировки примене-
ния допинговых вешсств.
Диуретики воздействуют на процессы, происходящие в нефроне: клубо зковую фильграцию,
канальцевую реабсорбцию, секрецию (см. гл. 2.4.4) Применение лихретиков не способствует
повышению физической работоспособности и. следовательно, не может оказывать существен-
ного влияния на спортивные результаты Они используются в спортивной практике для
• срочного снижения массы тела в таких видах спорта, как тяжелая атлетика, бокс, ряхтичиые
вилы борьбы, спортивная и художественная гимнастика и ар.:
• сокрытия применения запрещенных фармакологических препаратов, так как увеличенный
объем мочи и се повышенная экскреция способствуют интенсивному выведению химичес-
ких вешсств (см. гл. 4).
Поскольку применение диуретиков приводит к значительной потере воды орзанизмом и
снижению массы зела и в то же время не сказывается отрицательно на выноса и воспз спорт-
смена и езо скоростно-силовых возможностях, то можно ожидать повышения результатов во
многих видах спорта. Эффект ешс более возрастает, если прием лихретиков сочетается со спе-
циальными листами.
Недопустимо применение диуретиков в видах спорта, связанных с проявлением выносли-
вости. в видах спорта, требующих большого расхода кислорода, т.с в работе аэробного харак-
тера. Прием диуретиков приводит к значительному снижению объема плазмы крови, систо-
лического и сердечного выброса, что снижает работоспособность. В отдельных видах спорта
этот эффект применения диуретиков может усугубляться дегидратацией организма вследствие
продолжительных интенсивных физических нагрузок, нередко усиленно!) условиями жары.
Применение диуретиков приводит к избыточному выдеясиию мнкроэтемезттов со всеми
вытекающими последствиям!! (см. гл. 8.5), нарушению терморегуляции, снижению способззос-
ти к адаптации при эндогенном повышении температуры тела в условиях тренировочной или
соревновательной деятельности при повышенной температуре воздуха
При соблюдении принципов рационального комбинированного применения диуретиков их
побочные эффекты могут быть сведены к минимуму. Например, комбинирование активных
диуретиков, действующих на уровне б з зальной мембраны (диакарб. гидрохлортиазил иикломе-
• Исключения на тсрапентические непшьэовахня нслеЛсгннтельны. если моча гаста содержит мочегонное средство
вместе с пороговым илн под пороговым уровнем цпрешениого нс шест №.
944 Глава 9
тиазид, оксотолин и др.), с триамзереном или спиронолактоном — препаратами, действующи-
ми на уровне апикальной мембраны, уменьшает вероятность возникновения гипокалиемии
Могут ли диурсгики принести пользу организму спортсмена? В некоторых случаях несом-
ненную и отнюдь не в отношении сокрытия друз их запрещенных вешеств Дело в том. что
одним из основных показаний к применению диуретз ков является интоксикация организма
как экзо-, так и эндогенного характера. Интоксикации эндогенного характера спортсмен под-
вержен в большей степени, чем не занимающийся спортом человек. Это связано с усилением
под апияписм высоких физических нагрузок обменных процессов, вследствие чего в организ-
ме спортсмена накапливаются рахтичпые токсичные продукты — кетоновые тела, аммиак,
мочевина, мочевая кислота и др., поэтому применение диуретиков могло бы способствовать
дезинтоксикации организма спортсмена. Таким образом, можно говорить о том, что запрет
па диуретики не является оправданным с точки зрения зашиты здоровья спортсмена и даже
наоборот ограничивает спортивного врача в его возможностях оказать необходимую помощь
пациенту
Что касается диуретиков растительного происхождения, то их применение в спорте не за-
прещено, очевидно, из-за отсутствия в настоящее время необходимых тест-систем I радиииоп-
но используется мочегонное свойство тишь некоторых растений. Несмотря на то что действие
растительных диуретиков слабее, чем синтетических препаратов, они имеют преимущества,
связанные с более низкой токсичностью. Достоинствами диуретиков растительного происхож-
дения являются выведение из организма токсичных метаболитов и недоокислснных продуктов
углеводного обмена, а также отсутс вис нарушений баланса электролитов, что чрезвычайно
важно для спортсменов. Это позволяет использовать растительные препараты в течение дли-
тельного времени без серьезных побочных эффектов.
р-Адреноблокаторы
Р-Адрсноблокаторы запрещены ВАЛЛ только на период соревнований лля следующих видов
спорта, если не указано отдельно: авиационного (FAI), стрельбы из лука (FITA, IPC, запре-
щены также вне соревнований), автомобильного (FIA). бильярда (WCBS), бобслея (FIBT),
боулинга (CMSB, IPC bowls), бриджа (FMB). шахмат (FIDE) керлинга (WCF), гимнастики
(FIG), мотоциклетного (FIM). современного пятиборья (UIPM) для дисциплин, включающих
стрельбу, боулиш с 9 кеглями (FIQ), парусного спорта (ISAF) в парных состязаниях только
со шлемами, стрельбы (1SSF. IPC; запрещено также вне соревновании), лыж/сноуборда (FIS)
для прыжков на лыжах, воздушного фристазспа/халфпайпа/большого воздушного фристайла,
борьбы (FILj\).
Препараты, содержащие следующие р-адреноблокаторы и контролируемые ВАДА: анебу-
толол. алпрснолол, атенолол, бетаксолол. бисопролол. бунолол. картеолол. карведилол. цели-
пролол. эсмолод. лабеталол. левобунолол. метипранолол. метопролап. налолол. окспренолап.
пиндолол. пропранолол, соталол. тимолол.
р-Адрсноблокагоры представляют собой неоднородную по своим фармакологическим свойс-
твам группу лекарственных препаратов Общепринятой классификации р-адреноблокаторов не
существует. Наряду с блокадой Р^адренорецепторов эти препараты могуг блокировать или нс
блокировать р,-адренорецспторы. В первом случае говорят о неселективных p-бтокаторах, во
втором — о селективных Р2-блокаторах. Благодаря своей уникальной способности конкурент-
но связываться с Р,- и Р2-адрснорсцепторами различных органов и тканей они блокируют
взаимодействие рецепторов с катехоламинами, предотвращая многие нежелательные эффекты
последних, в частности чрезмерную активацию симпатико-адреналовой системы и репин-азз-
гиогснзнн-альдостсроновой системы. Применение p-алреноблокаторов способствует уменьше-
нию частоты и снижению силы сердечных сокращений, уменьшению минутного объема кровн
(сердечного выброса) и как следствие снижению потребности миокарда в кислороде. Одновре-
менно снижаются возбудимость и проводимость миокарда. В покое снижение частоты сердеч-
ных сокращений и силы сердечного выброса не столь заметны, как. например, при физической
нагрузке или психоэмоциональном напряжении. Во время стрессовых ситуаций артериальное
давление на фоне приема p-адреноблокаторов возрастает значительно меньше.
В спорте р-адрсноблокаторы используются для подавления излишнего возбуждения, сниже-
ния тремора, снижения частоты сердечных сокращений, что может оказаться эффективным в
Допинговые средства 945
процессе соревновательной деятельности в так зх видах спорта, как пулевая и стендовая стрель-
ба. стрельба из лука, прыжки па лыжах с трамплина и др. Отдельные из веществ эюго клпсеа
оказывают примерно такое же действие. как производные фенамина, но менее выраженное.
Р-Алреноблокаторы угнетают функцию сердечно-сосудистой системы, понижают уровень
гемоглобина и свободных жирных кислот в крови и отрицательно влияют па результативность
в нижзх спорта, связанных с проявлением выносливости, а также в видах спорта, требующих
высокой координации и быстрой реакции
Интенсивное применение препаратов зтого класса способно привести к серьезному нару-
шению сбал зпеированпой деятельности везетативноп нервной системы, блокаде и ос пювке
сердца. Эти препараты могут также вызывать депрессию. нарушать сон. отрицательно влиять
па половую функцию.
Алкоголь (этанол)
Алкогсыь (этанол) запретен только на период соревнований. Этанол обнаруживают с по-
мощью дыхательною iccia и/нли анализа крови. Для каждой федерации опр зелен свой по-
рог допустимых значении концентрации препарата (приведен в скобках): авиационного (FAI
0.20 г/ з). стрельбы из лука (FIIA. IPC: 0,10 г/л); автомобильного (НА. 0.10 г/л); бильярда
(WCBS; 0.20 г/л): боулинга (CMSB, IPC bowls: 0.10 г/л): каратэ (WKF: 0.10 г/л): современно-
го пятиборья (ЫРМ: 0.10 г/.л) лля дисциплин. включающих стрельбу: мотоциклетный (FIM:
0.10 г/л): состязания на каюрах (DIM: 0.30 г/д).
Запрещенные методы
Улучшение транспорта кислорода
Запрещены:
• добавление в кровь примесей, включая использование аутологичных, гомологичных или
гетерологичных препаратов крови или эритроцитов. юбого происхождения;
• искусственное уветичивапие захвата. транспортировки или доставки кислорода, включая
использование перфлюореагентов. эфапроксирала (RSR13) и производных измененного ге-
моглобина (заместителей крови на основе гемоглобина. микроинкапсулированные продук-
ты гемоглобина).
Химическая и физическая манипуляция
Запрещены:
• вмешательство или попытка вмешательстзза с целью нарушить честность и правильность
забора пробы во время допинг-контроля, катетеризация. подмена или изменение мочи:
• внутривенные вливания, кроме необходимых при оправданном нсогложном медицинском
лечении
Вмешательства па генном уровне
Запрещено не терапевтическое использование клеток, генов, генетических элементов и пт
изменение экспрессии гена с целью улучшения спортивных достижений
Особенности отбора образцов и проведения исследований
Отбор проб является одним из самых строго регламентированных и ответственных участков
в системе антидопинговых мероприятий. При отборе проб во избежание осложнении и ошибок
при принятии решений и санкциях за употрсб сине допинга должно быть обеспечено одно-
значное соответствие конкретной пробы и конкретного спортсмена. исключена возможность
подмены или фальсификации той пробы кем бы то пи было, обеспечены адекватные условия
хранения и транспортировки образцов в аналитическую лабораторию.
Обязательному антидопинговому кот трат о подлежат призеры, а также спортсмены, опре-
деленные по жребию. В командных соревнованиях (и зависимости от числа участников) тести
ровапию полтежат 1—2 спортсмена от каждо 1 из команд, занявших первые 3 моста, а также от
команды, выбранной но жребию. Спортсмен может быть тестирован несколько раз в течение со-
ревнований. При этом максимально учитываются все его интересы но участию в соревнованиях.
По решению судейской коллегии допинговому тестированию может быть подвергнут спортсмен,
который вызывает подозрение своим повелением, внешним видом. неадекватными реакциями.
Спортсмену, выбранному для допингового контроля, сразу же после окончания соревнова-
ний вручается уведомление, в котором сообщается о месте и времени взятия у него бпопробы.
946 Глава 9
Спортсмен обязан поставить на уведомлении свою подпись в знак нолпгсрждепня тою. что
он взвешен. Спортсмен должен явиться на допинговый пункт с документом. удостоверяющим
его личность, не позднее чем через I ч после вручения ему уведомления. Неявка спортсмена
на допинговый пункт в указанный срок или с тказ or прохождения антилопппговою кош роля
расценивается как факт применения допинговых препаратов, и к спортсмену применяются
соо гве1 е гнуюпше санкшн i
В допинговом пункте, кроме спортсмена и сопровождающего липа, могут находиться со-
трудники допингового контроля, представитель соответствующей спортивной федерации, врач
или представитель команды. Присутствие других лип. в том числе представителей средств мас-
совой ннформашш. на допинговом пункте нс разрешается.
Спортсмен не имеет права покидан, лошпновый пункт до окончания процедуры взятия про-
бы. В случае вызова спортсмена на награждение собранная порция биопробы опечатывается в
соответствии с 1рсбовапиямн Потожения ВАДА. На пункте остается доверенное днпо спортсме-
на. а сам спортсмен в сопровождении официального представителя допинговою пункта идет на
награждение. Отбор биопробы производится в закрытом помещении Линам, сопровождающим
спортсменов, запрещается находиться в помещении, тле производится взятие биопробы.
Устанаапнвается следующий порядок взятия биопроб: по прибытии спортсмена на лонпн-
говый пункт руководитель допингового пункта знакомит спортсмена п сопровождающее его
лицо с правилами процедуры отбора бнопроб. после чего спортсмен расписывается в прото-
коле отбора бнопроб. что ознакомлен с процедурой. Затем спортсмен выбирает нз нескольких
предложенных упаковку для отбора бнопроб. в которой имеются два флакона и один мочепри-
емник. В мочеприемник под наблюдением сотрудника допингового пункта должно быть взято
нс менее 75 мл мочи. Одежда, налетая на спортсмена, не должна препятствовать наблюдению
за мочеиспусканием. Дане спортсмен должен вернуться в кабинет врача с емкостью, напол-
ненной мочой.
Спортсмен сам разливает из мочеприемника равное количество мочи в два флакона н плотно
их закрывает. В мочеприемнике по остаткам мочи измеряются температур*, плотность и pH про-
бы (pH мочи нс должен быть менее 5.0 и более 7.0. моча должна иметь удельный вес не менее
1.010 т/см’ (1010). температура пробы не должна быть ниже 32 ’С) и занос1нся в протокол. Руко
водитель допингового пункта убеждается в том. что оба флакона (пробы А и В) плотно закрыты,
герметично опрессовывает их. маркирует кодовым номером, выбранным спортсменом.
Руководитель допинговою пункта должен предоставить спортсмену и сопровождающему
его лицу возможность убедиться в том, что флаконы опечатаны и промаркированы правильно.
Далее он записывает в протокол кодовый номер и перечень медикаментов, принятых спорт-
сменом за последние 3 дня. лает возможность спортсмену и сопровождающему его лицу све-
рить кодовый номер флаконов с кодовым номером, записанным в протоколе.
Опечатанные фтакопы в контейнере для транспортировки биопроо отправляются спептрап-
снортом в лабораторию, производящую анализ. и сдаются пот расписку. Одновременно туда
же отправляются транспортные протоколы, содержащие коды флаконов н сведения о приня-
тых лекарствах (если это имело место).
Атпыиз. как правило. должен быть проведен в течение 72 ч после получения проб лабора-
торией. В отдельных случаях в связи с се загруженностью этот срок может быть увеличен до 5
рабочих дней с момента доставки проб в лабораторию.
В случае положительного результата, пробы А Лаборатория немедленно извещает спортсмена о:
• положительном результате анализа;
• праве спортсмена на немедленный запрос на проведение анализа пробы В (отс тствие за-
проса в течение 7 дней после итвещения спортсмена является юридическим основанием
считать результат положительным);
• нраве спортсмена и/или его представителя присутствовать при вскрытии и анализе пробы
В. если на этот анализ был подан запрос
• нраве спортсмена подать запрос на предоставление ему копий документации по анализам
проб А и В. предусмотренной в Международных Стандартах для лабораторных анализов.
Распространение информации о результатах анализа пробы А не допускается. Если ре-
зультат пробы В не подтверждает результат анализа пробы А. то результат ана иза считается
отрицательным.
Допинговые средства 947
При положительном результате в пробе А спортсмен отстраняется от участия в соревнова-
ниях .«о вынесения решения о санкциях. Контрольное исследование проводится не позднее
7 диен с момента получения запроса о проведении пробы В oi спортсмена. В присутствии
комиссии из 3 человек производится осмотр и вскрытие пробы В. о чем составляется соответс-
твующий акт. Отсутствие спортсмена, представителя спортивпой организации не является пре-
пятствием зля проведения контрольного исследования Результат контрольного исследования
пробы В является окончательным и пересмотру ие подлежит.
Нарушением агпилопинтовых правил являются:
• присутствие запрещенных субстанций или их метаболитов или маркеров в пробе, втятой у
спортсмена:
• использование или попытка использования запрещенной субстанции:
• отказ или непрелоставдение проб после того, как спортсмен был проинформирован о не-
обходимости их сдачи, если не будут документально подтверждены уважительные причины
непрелостаплсния пробы гои уклонения от сдачи проб;
• нарушение существующих требований относительно лост пности спортсмена для взятия у
него проб во время внесоревпователытого периода, включая нспрслостявлспис информации
о местонахождении спортсмена и пропуски очередных тестировании;
• фальсификация или попытка фальсификации в любой сфере юпинг-коптроля:
• обладание апрешенны.ми субстанциями:
• распространение побои запрещенной субстанции.
• назначение или попытка назначения спортсмену любой запрещенной субстанции или со-
действие. подстрекательство, помошь. потворство, укрывательство и любой другой вил со-
участия в нарушении антидопинговых правил или в попытке мпрушегшя.
Пробы для допинг-контроля должны анализироваться только в лабораториях, аккредито-
ванных В/ХДЛ. Выбор конкретной лаборатории, аккредитованной ВАДА, для анализа взятых
проб определяется исключительно антплопннговои организацией, ответственной за результаты
анализа. При этом указанные пробы должны анализироваться исключительно на предмет об-
наружения в них запрещенных субстанций или использования запрещенных методов, указан-
ных в Списке, а также дополнительно указанных ВАЛА субстанций.
Особые требования предъявляются ВАЛЛ к аналитическим лабораториям и качеству проводи-
мых ими исследовании. Для получения аккредитации ВАДА лаборатории должны удовлетворять
жестким требо гениям и пройти несколько ступеней тестирования и проверки па техническую
компетентность и независимость.
В первую очередь кандидаты на получение аккредитации должны в своей работе нсукос
нительпо следовать требованиям международных организаций по стандартизации и качеству
проведения исследований (ISO, OECD. EU). основываясь па положениях GLP (см. гл. 5). Для
российских условий данное положение основано на получении регистрации в Государствен-
ном реестре Федерального агентства по техническому регулированию и метролотии на соот-
ветствие требованиям Системы аккредитации аналитических лабораторий (центров), а также
требованиям ГОС'1 Н ИЗО/МЭК 17025 па техническую компетентность и независимость.
Дальнейшие шаги для получения аккредитации ВАДА основываются на подготовке пакета
документов, в которых раскрывается работа лабораторки: наличие оборудования, стандартов
исследуемых веществ и методического обеспечения проведения исследований. квалификация
персонала. а также вопросы финапсировзния. объемы планируемых работ и ряд других. Эти
документы рассматриваются ВАДА, после чего наступает лап преаккрелиташш. В течение
этого этапа лаборатория получает 3 серии проб мочи в течение 6—12 мес. которые она должна
протестировать на присутствие запрещенных веществ или их метаболитов При успешном про-
хождении данного этапа наступает этан собственно аккредитации. В этот период лаборатории
лается задание провести исследование 10 подготовленных ВАДА проб. которые она должна
проанализировать за 3 дня. При этом за ходом анализа наблюдает комиссия экспертов ВАЛА.
Лишь получив правильные ответы по всем 10 пробам, а также положительное заключение ко-
миссии. лаборатория может рассчитывать на получение аккредитации.
Получившие аккредитацию ВАДА лаборатории имеют право проводить исследования проб,
изъятых в ходе международных соревновании самого высокого уровня. Дтя поддержания ра-
ботоспособности своих лабораторий В.ХДА осуществляет комплекс мер. н который входит ре-
948 Глава 9
аккредитация, заключающаяся в предоставлении лабораториям раз в квартал 5 контрольных
проб, которые они должны проанализировать в холе обычных рутинных пропел р и iют ию-
ни г ь расширенный отчет по каждой из них. Данный отчет рассматривается компетентен ко-
миссией и в случае нснрашцьиой идентификации или ошибки в количественном определении
хотя бы одною из пешее тв принимается решение о лишении данной лаборатории аккредита-
ции (обычно) или снижении се статуса.
Для проверки квалификации отдельных сотрудников, кроме проб но рсаккрсдитанни. время
от времени лаборатория получает образны так называемого профессионального теста, кото-
рый заключается в исследовании образцов на присутствие отдельных групп контролируемых
вешсств или даже отдельных веществ и их метаболитов. Высокий уровень квалификации ео-
трудников лабораторий под ерживлетея на ежегодных встречах, на которых обсуждаются воп-
росы развития аналитических методов определения допшнов. последние научные разработки
и достижения в этой области. Всею в настоящее время ВАЛА аккредитованы 32 лаборатории
и еше несколько проходят аккредитацию.
Анализ функционирования в 2003—2005 и. сети аккрели оваиных при ВАЛА лаборатории
показывает: при оошем количестве указанных лабораторий (32) ежегодно выполняется тести-
рование более 150 000 человек, что составляет примерно 10% общего количества принимаю-
щих участие в соревнованиях высшего уровня. На рис. 9-2 приведены данные НАЛА по коли-
честву протестированных человек за 2003-2005 гг.. которые показывают тенденцию к росту как
общего количества тестов, так и количества положительных
Рис. 9-2. Катичесгво проведенных ин i тюнинговых тестов аккрелиюваннымн нрн ВАДА лтбораюриями
за 2003—2005 и. (по данным ВАДА).
Как видно из рисунка, нрн достаточно большом количестве протестированных enopicMCiioB
количество выявленных потребителей допингов не превышает 2%.
Антидопинговые лаборатории различаются количеством проведенных исс юдонаний и чис-
лом положительных результатов. полученных при ном. В самых крупных лабораториях мира
были получены следующие показатели. В Лос-Анджелесе (США) на 37 047 проведенных в 2004 г.
iccroB 364 (0.98%) были положительными, в Кельне (Германия) за лот же период — 10 297 и
176 (1,71%). в Риме (Италия) — 8368 и 95 (1,14%) cooibctctbciiiio. В то же время лаборатории,
выполняющие меньшее количество исследований, чаше обнаруживают допинги в образцах.
Например, лаборатория Лиссабона (Португалия) в 2004 г. выполнила 2965 icctob, из них 120
(4.05%) были положительными, Бангкока (Таиланд) — 1555 и 41 (2.64%) соотетствснпо. В
среднем каждая и з лабораторий выполняет 1500 — 5000 (в среднем 3000) тестов соответственно
в гол.
Методы исследования и интерпретация полученных результатов
При проведении юнши-кошрош аккредитованными ВАЛА лабораториями используется
комплекс химических, биологических и физико-химических методов. Проводится многоэтап-
ное исследование. предусматривающее скрппинювос предвариiельнос исследование с целью
950 Глава 9
рациям их в моче после приема допинговых средств. — так называемая qc-проба. Цифры па А
1 — генгаминол; 2 — амфетамин; 3 — мезамфет мин, 4 — диметиламфетамин: 5 — никотин
6 - зфедрин; 7 - фенметразин; 8 — никетамид; 9 — пснтстразол; 10 — фенкамфамин; 11 —
внутренний стандарт; 12 — кофеин. Па хроматотрамме (Б) показан результат исследования
контрольной пробы мочи человека, не употреблявшего допинги. — так называсх ая негативная
проба На ней видны хроматографические пики внутреннею сзандлрга (11} и кофеина (12). На
хроматограмме (В) показан результат исследона шя проверяемой пробы. На ней кроме пиков
кофеина (12) и внутреннего стат дарта (11). четко виден пик. совпадающий по времени удер-
живания с пиком амфетамина. Такой результат требует проведения подтверждающих исследо-
ваний методом ГХ-МС.
Приведенные чроматотраммы получены с использованием капиллярной хроматографичес-
кой колонки с метилсилпконовон фазой НР-1 длиной 17 м. внутренним диаметром 0,2 мм и
1.00 2.00 3.00 4.00 5,00 6.00 7,00 8.00 9.00 Время, мин
Ин енсивность
1,00 2,00 3,00 4,00 5.00 6.00 7.00 8,00 9,00 Время, мин
1,00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9,00 Время, мин
Рис. 9-4. Хроматограммы предвари тельного исследования проб мочи (пояснение в тексте)
952 Глава 9
История долин г-контроля имеет многочисленные подтверждения того факта, что только
использование современных разработок и последних достижений аналитической химии при-
водит к успешному результату.
Для примера на рис. 9-6 приведена схема биогрансформацин. а также перечислены этапы
выделения и исследования метандиснона в моче спортсмена.
Решение вопроса об употреблении спортсменом этого допинга основывается на нахож-
дении в его моче характерных метаболитов в виде их силильных производных. На рис. 9-7
приведен масс-спектр одного из этих веществ, полученный с применением масс-спектрометра
низкого разрешения.
он
Рис. 9-6. Схема биотрансформашти метандиснона (вы: депо красным цветом) и основные сю метаболи-
ты. по которым проводится и лектнфикаиия метннднеиона в моче (выделено синим вветом) (а). Этапы
выделения и анализа этих веществ в моче методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС (б).
954 Глава 9
Подтверодение по трем характерным ионам
(S/N > 3). концентрация З'-ОН-Станоэолола
0,1 нг/мл мочи
Хроматограмма 3+-ОН-Станозолола и
МС-МС спектр (345->)
Ai- । k
1*ис. 9-9. Схема биотранс^юрманин становолоцв и результаты определения в моче атлета З’-пглрокснста-
нозолоиа метолом ВЭЖХ МС-МС.
Допинговые средства 955
jiin 1 сотоеIсрони (Е). его природного изомера. Введение тестостерона резко изменяло соот-
ношение Т/Е За норму соотношения Т/Ь была взята 1 Хотя разброс значений Т/Е был гоже
велик — от 0.1 до 3.5 и выше, гем не менее при Т/Е более 6 можно утверждать, что это проба
положительная Результаты такого исследования приведены на рис. 9-10.
Рис. 9-10. Масс-спектр тримегилсилилЫ1О1 о производного тестостерона (вверху) и фршмешотраммы
экстрактов мочи по иону с молекулярной массой 432 Д.
а — отринатс ьнзя проба: б — положительная проба
956 Глава 9
В начале XXI века лаборатории начали осваивать новым метод определения тестостерона,
так называемый изотопный, основанный па том. что соотношение изотопов атомов углерода в
молекуле синтетического тестостерона от шчается от такового соотношения у природной моле-
кулы. Это сложный метод, требующий больших затрат и на приобретение оборудования, и иа
проведение анализа. Он применяется в том случае, если соотношение Т/Е превышает 4.
На рис. 9-11. покатана схема биотрансформании холестерина и тестостерона, а также соот-
ношение изотопов |1С/12С углерода без приема и после приема тестостерона.
Рис. 9-11. Схема биограиьформации холестерина и тестостерона и вовможиоети использования соотно-
шения изотопов углерода для установления факта приема тестостерона
Естественное
содержание
Положительная
проба
Опыт последних лег показал, что только одна или две пробы ти 100 демонстрируют изотоп-
ное соотношение. свидетельствующее о внешнем, эк опытном, происхождении тестостерона,
т.е. если у спортсмена соотношение Т/Е было достаточно большое, вплоть до 10. го ник тес-
тостерона представляет собой смесь свое о. природного, и экзотенното тестостерона и метод
изотопного соотношения оказывается бсспо езен
958 Глава 10
Рис. 10-1 Графическое и юоражспне закона лимитирующих факторов.
дов давало несомненный экономический эффект, прсвосх шшии. как казалось, ущерб, нано-
симы! i токсикантами природе.
Согласно данным международного регистра, до 6 миллионов токсичных веществ исполь-
зуются в промышленности, сельском хозяйстве и для бытовых целей. Окою 60 тысяч из них
производятся в больших количествах, в том числе более 500 относящихся к группе сильно
действующих ядовитых вешеств (СДЯВ). СНЯВ — высокотоксичпые химические вешества.
применяемые в промышленности и сельском хозяйстве, и способные вызвать массовые пора-
жения людей, животных и загрязнять окружающую среду при сбросе на поверхность земли или
выбросе в атмосферу.
Производство, транспортировка, испо 1ьзование и хранение СДЯВ строго регламентируется
специальными инструкциями и правилами контроля и техники безопасности при их примене-
нии. Однако при крупных промышленных авариях, пожарах, стихийных бедствиях и катастро-
фах могут произойти разрушения производственных здании, оборудования и технологических
линий, складов, емкостей, трубопроводов и т.п., в результате чего большие количества СДЯВ
могут попасть в окружающую среду, распространиться по территории не только производс-
твенных площадей, но и за ее границы.
Обьеюы. нрн яварин на коюрых. или при их разрушении происходит массовое поражение
люден, животньх и растительного мира СДЯВ называют химически опасными объектами.
К химически опасным объектам относят:
• предприятия химической. Шрмаисвгической. нефтедобывающей, нефтеперегонной про-
мышленности. заводы по производству СДЯВ и химических удобрений;
• предприятия и отрясли промышленности, использующие СДЯВ' целлюлозно-бумажная,
текстильная, металлургическая, пищевая, мясомолочная: водопроводные станнин и очист-
ные сооружения:
• железнодорожные сганнии с имеющимся лля отстоз! подвижными составами со СДЯВ;
• склады и базы с запасами химических удобрений и ядохимикатов для сельского хозяйства,
а также с запасами лзя дезинфекции, дезинсекции и дератизации;
• склады длительного хранения боевых отравляющих вешеств;
• оборонную промышленность.
По физико-химическим свойствам СДЯВ подразделяют на:
• стойкие быстродействующие, не имеющие скрытого периода и приводящие к летальному
исхо у в течение нескольких минут (фосфорорзанические соединения - ФОС, анилин,
фурфурол);
• нестойкие быстродействующие, имеющие латентный период (синильная кислота, аммиак,
оксид углерода (II) акрилонитрил, метили зонианат);
• стойкие замедленного действия (серная кислота, тетраэтилсвинец):
• нестойкие замедленного действия (фосген. азо тая кислота, хлорпикрин).
Токсическое действие СДЯВ на организм зависит от их:
• физических и химических свойств (агрегатное состояние, растворимость в воде, жирах, теп-
лота испарения. летучесть. плотность паров, коррозийная активность, температура возгора-
ния. пожаро- и взрывоопасность, способность к п ролизу. окислению и т.д.);
Экотоксиканты 959
• путей поступления в организм, от которых, в свою очередь, зависят быстрота развития симп-
томов поражении и тяжесть состояния пострадавших:
• вила действия (рефлекторное, местное, резорбтивное):
• koi шеи грани и в окружающей среде (вохдух. вола, почва) и продуктах питания.
В табл. 10-1 приведена классификация СДЯВ по клиническим признакам отравлений, вы-
званных их действием
Более 80% СДЯВ наряду с местным об задают и резорбтивным действием Нейротоксиканты
и метаболические я гы являются причиной быстрого нарушения сознания у пораженных, раз-
вития коллапса, судорожною синдрома, острой гипоксии, комы.
В России в настоящее время насчшываеи'я несколько тысяч химически опасных объектов,
которые мот представлять угрозу не только для персонала этих объектов, но н для прожива-
ющего вблизи населения.
Тлблнил 10-1. Классификация СДЯВ ио клиническим признакам отравлений. вызнанных их jicHcibhcsi
Классификация едя В Примечание
Вещества преимуществен но удушающею действия Хлор, хлорпикрин. фосген треххлориетый фосфор, хлорилы сери Поражение iiiiiu.ihuiioiiiioc. Воздействуя на слизистые обточки вызывают их растра жсиие и носиалнтсльио-пскрощчсские из- менения Патологический процесс может развива!ься быстро и бурно при контакте с определенными веществами, но может иметь и скрытый период (мнимого благополучия) при воздействии других СДЯВ этой же груп- пы. Пострадавшие чувствуют себя вполне мювлснзорите.|ьно. а через несколько часов или суток внезапно развивается острый ток- сический отек легких Скрытый период значи- тельно сокращается при физической нагрузке или переохлаждении
Вешес 1ва прен.мушестиеино обшеяловитою действия Мышьяковистый водород, сернистый ангидрид, оксид углерода. оксиды азота, си- нильная кислота и ее соли, дннитрофснол. этиленхлор- гидрпи. ссрово юрод, акри- лонитрил * Эти СНЯВ телятся на гематотоксикапты (мы- шьяковистый волорол. СО. оксиды азота, сернистый ашидрил) и на тканевые яды (ци- аниды. сероводород, акрилонитрил, линитро- <|к'нол) Для обеих групп веществ характерно бурное течение iiiitowciik3iiiiii. Нередко ог первых симптомов поражения до летальною исх та проходи 1 всего несколько минут из- за нарушения функции центральной нервной системы (ЦНС). регуляции дыхательной и сер- дечно-сосудистой систем. Потеря сознания, развитие вегетативных реакций, судорожный синдром, кома
Вещества удушающего и обшеядовитого .действия Аютиая кислоте, мышья- ковистый волорол. сернис- ты п ангидрид,сероводород, оксиды азота Вызывают отек легких, л при резорбции ока- зывают общеяловнтос действие. М hoi не пред- ставители эгоп группы обладают сильнейшим прижигающим действием
Bciuecitki нейро грешного действия ФОС. сероуглерод Почти вес ФОС жидкости. хорошо раство римы в органических растворителях и срав- нительно недолго сохраняются во внешней среде. Угнетают активность хо ши эстеразы, нарушаю! генерацию и передачу нервною им- пульса. Характерно бурное течение интокси- кации. нарушение функций жизненно важных органов, сознан :я. Развивается судорожный синдром и кома
960 Глава 10
Онончаиие mufii III-1
Вещества удушающею в нейротропного деиепшн Аммиак Воздействие тппалятшоппое. В течение 60 мин возникает токсический отек легких, ты <|юпе которою формируется тяже юс поражение не- рвной системы В перньк типуты проявляется раздражающее действие Вызывается рс(|цек торный ларнит оспа зм. угнетение дыхательно- го и сосулоатштателитого иетггров. Ока п итает выраженное действие на L1I1C — возбуждение, судороги
Метаболические яды Диоксин, бро.мэгзн. хлор- МС1Ш1 Нарушают обмен веществ в органотме. Дли- тельный скрытый пернет Даже при смер- тельных отравлениях от первых проявлении до летального исхода могут протии недели, а иногда и месяцы. Везущим поражением яв- ляется нарушение сердечно-сосудистой де- ятельности. ЦНС. работы паренхима тоннах органов
Часть населения России постоянно живет н условиях тагрятпсния окружающей среды При-
оритстпымтт загрязнителями являются взвешенные частицы различных твердых вешеств. окси-
ды азота и углерода, диоксид серы, полихроматические углеводороды. фенол, формальдегид,
тяжелые металлы (рис. 10-2).
Наиболее многочисленная труппа населения России — 15 млн человек — подвергается воз-
действию взвешенных частиц. Второе место по масштабу воздействия занимает бензапирен
Для источников питьевого водоснабжения приоритетными загрязнителями являются ток-
сичные вещества, перечень которых во мттотом определяется региональными особенностями
развития производства (составом сточных нод предприятии).
Значительную опасность лля здоровья населения представляет загрязнение почвы металла-
ми. что является характерным для болыттинствл территорий (см. гл 8.5)
Рис. 10-2. Раенрострнненность тиисрзйемснтозов у детей некоторых торолон России (Скальная М.Г..
Скальный А.В 2005)
Экотоксиканты 961
Загрязнение среды обитания может являться причиной ухудшения хюровья населения, под-
вергающегося воздействию токсикангов. При длительном воздействии даже небольшою их i о-
лпчества происходит увеличение риска возникновения экологически обусловленных заболела
ним. поэтому химический фактор является основным в соииально-гигиеническом мониторинге.
Во .многих крупных городах отмечается рост заболеваемости сердсчно-сосулнсгои тт нейроэндок-
ринной систем, нарушений репродуктивных функции у женщин. врожденных пороков развития
у детей. Наиболее подвержен воздействию химических вешсств детский организм что особенно
проявляется в возникновении аллер ических состояний и росте заболеваемости бронхиальной
астмой (Онищенко Г.Г.. 2002).
В последнее десятилетие опубликовано мною р-тбот о чувствительности человека и живот-
ных к сисрхмттлым — пико- (х1()12 Мт и фемто- (х|0 11 Мт — концентрациям токсикангов (см.
и. 8.5.1) Механизм действия еверхмалых концентраций ксенобиотиков пока не установлен,
в научной литературе обсуждается несколько гипотез. Например, дейсише низких кот щеп гра-
ниц токсиканта интерпретируется как «голографический принцип- организации вешеств или
объясняется взаимодействием не молекул как таковых, а их энергетических микрополей (при
регистрации эффекта от применения ничтожных концентрации вешеств. менее I молекулы на
клетку). Существует гипотеза о передачи регулярною ситала в живых системах посредством
изменения структуры волы и адгезивных белков в копнен грации 10*—10 14 М пот воздействием
токсикзнга. Волу рассматривают как структурно-динамический сенсор при изучении механиз-
ма действия свсрхмалых концентраций ксенобиотиков.
При использовании токсикокинетнческих моделей было показано, что действие токсиканта
в сверхмалой юзе приводи! к продлению времени ею влияния на ортаннзм. Так. при воздейс-
твии ГОКСИК1НК1 к «обычной» лозе я|и|ккт .может развиться в течение нескольких минут, а при
введении «свсрхмалых доз» время действия растягивается на несколько суток.
Согласно современным предо гашениям. вес биологически активные всшсспза. в том числе
н экогоксикангы. ввозимые в организм в малых дозах, повторяют свопегвеннос им деиенше н
дозах больших Подученные новые данные, по-видимому, приведут к пересмотру безопасных
и предельно допустимых уровнен воздействия токсикангов на живой opiaiiniM.
В настоящее время часто уиотрсбтяется термин синдром химической чувствительности
(СХЧ. чаше — ХЧ). иод коюрым понимают последствия для человека экспозиции химичес-
ких вешеств из окружающей среды Генетические особе! пости индивидуума лежат в основе
развития ХЧ у разных людей. Индивидуальная ХЧ пишется од той из причин повышенной
интоксикации. заболеваемости раком, болезней дыхательных путей, возникновения некото-
рых неврологических н психических расстр< иств, а также синдрома хронической усталости не
только у работников химических производств.
ХЧ проявляется как р (новилность скрытой («крипто») токсичности и развивается в две
ci.-i.iH3i. Вначале происходит снижение юлерянтпости после осгроз и ш хронической экспози-
ции загрязнителями окружающей среды, например иестииилмми. раствори гелями, моющими
средствами. кои га мн пантами воздуха различных помещений п т. л. На второй сталии развития
ХЧ симптомы заболевания проявляются при экспозиции чрезвычайно низкими концентраци-
ями химических веществ.
Синдром ХЧ во мноюм обусловлен генетически детерминированной ипднвидуа 1Ыюн фер-
ментной активностью каждого человека, то есть наследственным полиморфизмом генов (см.
гл. 3 и 4). В определенных условиях среды так называемые «молчащие» гены начинают про-
являть свое действие. По1снииалыю токсические факторы окружающей среды новреждаюше
воздействуют только на генетически предрасположенную к специфическим мутациям часть
населения, у которой и нроявлястея высокая ХЧ. В настоящее время па генетических картах
хромосом человека обозначены локусы генов, мутации которых лежат в основе изменения от-
вета организма па действие химического фактора.
Роль <|шкторов внешней среды в мутагенезе рахтична:
• некоторые из них являясь мутагенами, вытыкают дискретные генетические изменения:
• другие — вызывают дисбаланс физиологических и биохимических процессов в организме и
тем самым повышают эндогенный мутагенный фон;
• третьи — и меняю! функциональное состояние клеюк. их восприимчивость к действию
мутагенов различной природы.
962 Глава 10
Однако в организме активно действуют механизмы репарации ДНК. восстанавливающие их
первичные повреждения. Только при нарушении работы системы репарации ДНК первичное
изменение ее структуры реализуется в мутацию (см. гл. 3).
Современные аналитические технологии позволяют установить генные нарушения:
• определение конкретной мутаиин (генной, хромосомной, геномной) посредством цитогене-
тических и молекулярно-генетических анализов (см. гл. 3);
• регистрация продуктов гена с помощью методов аналитической химии (см. гл. 6);
• определение специфических компонентов (эндогенных и экзогенных соединений, а также
их метаболитов), во никаюших в результате генетической детерминации реакций био1ранс-
формаини (технологии мегаболомики и мстабономикн, см. гл. 3, 4 и 6).
Полимеразная цепная реакция (ПНР) позволяет выявить и воспроизвести миллионы копии
исследуемого участка ДНК. я применение капиллярного электрофореза с флуоресцентным и
диодно-матричным вариантом детектирования (например, лазерно-индупнрованной флуорес-
ценцией). а также твердофазного иммуноферментного анализа (например. EL1SA) позволяют
надежно регистрировать продукты ПНР.
Для проведения мотекулярно-генетичсского анализа достаточно использовать малые коли-
чества биологического материала, например 20—40 мг хориона или от I мкл до 1 мл крови или
1—10 mi культуры клеток. В настоящее время для выполнения таких процедур применяют ми-
ниатюрные устройства — ДНК-чипы многократного использования, обеспечивающие полную
ашома1 изанию анялигических определений.
Практическим следствием признания действия сверхмалых доз п возникновения синдрома
ХЧ является снижение минимальных уровне i риска интоксикации. По оценке Всемирной
организации здравоохранения (ВОЗ), например каждь и избыточный микршрам.м бензола в
воздушной среде свёрх 6 мкг/м’ эквивалентен риску возникновению шести случаев заболева-
ния лейкемией иа миллион жителей Эта величина в десятки раз меньше значении предельно
допустимых концентраций (ПДК) разных стран, в том числе РФ Для оценки последствий
воздействия канцерогенных веществ введена «Единица избыточного риска» (Unit Risk Exccv )
позволяющая оценивать риск поражения организма при определенном уровне воздействия на
него токсичных соединений.
Известные сегодня высокочувствительные и избирательные анализическис методы (см. гл. 6)
мониторинга токсикантов в био кнических жидкостях и объектах окружающей среды позво-
ляют успешно определять в них концентрации ксенобиотиков. Однако для адекватной ннгер-
прегщии полученных аналитическими методами результатов, прогноза экологически обуслов-
ленных заболеваний человека, создания и верификации микроэкологических моделей важно
выявить системы биомаркеров воздействия (см гл. 2. 3. 6. 8) супсрэкотоксикантов в биологи-
ческих жидкостях человека.
Работа специалистов, занимающихся проблемами экотоксико.то1ии. направлена на изуче-
ние действия химических веществ на окружающую сред.' и выявление потенциально опасных
ффектов. Большое количество данных может быть получено при ретроспективном анализе
химических катастроф. Анализ таких случаев помогает выявить потенциальную опасность воз-
действия химических веществ на окружающую среду, а в дальнейшем регулировать или огра-
ничить нх использование в промышленности и сельском хозяйстве.
Изучение свойств химических вешеств заставляет разрабатывать лля иужл общества н< выс
соединения, не обладающие ранее выявленными токсическими свойствами. Например, выяв-
ленная способность хлорорганнческих пестицидов к накоплению в живых ор|аиизмах привела
к разработке новых классов пестицидов (карбаматы и пиретроиды). которые также обладают
токсическим действием, но сниженная способность к биоаккумуляции делает их более прием-
лемыми к использованию (см. гл. 4).
Прежде чем какое-либо вещество будет применяться в промышленности или сельском хо-
зяйстве. обычно устанавливают
• ист ли к нему уникальной чувствительности ключевых видов живот пых биогеоценоза из
разных классов;
• взаимодействуют ли живые организмы (от микроорганизмов до че ювекл) с неживыми (аби-
отическими) компонентами окружающей среды, подвергнутыми обработке, что иногда мо-
жет привести к усилению токсических эффектов;
Экотоксиканты 963
• будет ли наблюди гься пслснитгнроваиис токсического возденет тшя смеси химических ве-
ществ:
• воздействует ли токсичное вещество только па индивидуальные организмы млн выживание
экосистемы в целом.
Экотоксичность и мотоксиканты
Объектами изучения экотоксико эгии являются вещества. обладающие биодоступностью,
что обусловливает возможное нарушение обмена веществ, а также фи тико-химической струк-
туры клеток и тканей, в результате чего могут возникнуть патологические изменения. Как
правою, эти соединения находятся в газообразном и жидком состоянии или адсорбированы
на частшктх почвы тт различных поверхностях, а также и виде ме:тк дисперсной ныли твердых
веществ (размер частиц менее 50 мкм). Значительной биолост ути тост ыо обладают многие т-ок-
енканты. поступающие в организм с пищей.
Химические вещества, накапливающиеся в окружающей среде в несвойственных ей ко-
личествах, выступают в качестве экополлютантов (загрязнителей), одновременно возможно
избыточное накопление как одного, так и многих экополлютантов (табл. 10-2).
Таблица ПТ-2. Основные зкоползютатпы
lurpniHHte.TH воттуха
Газы:
оксиды серы
оксиды азота
оксиды углерода
озон
хлор
углеводороды
фреоны
Пылевые частицы:
асбест
угольная пыль
оксид кремния
металлы
Загрязнители воты н почвы
Металлы (снинеп. кадмий, ртуть и лр.). мышьяк
Х.1орор|«1шческие несгиниды (4.4-лихлоро тифс1шд-трихлоро-
лаи (ДДТ), аллрин. лнзлзрии. хлордан)
I Iптряты
Фосфиты
II фть и нефтепродукты
Органические растворители (тодуат. бензол, тетракяороэтизеи и
лр.)
Пнткомо.текулярные такиснированныс утлетюаоролы i.viopo-
<|нтрм. бромодихлоромст-ан. бромоформ, тетрахлоромектн. лихло-
роэтан и лр.)
Полициклические ароматические у тле водороды
Полихлорированные бифенилы (ПХЬ)
Диоксины
Дибеизофураны
Сильные минеральные кислоты ________
Экотоксикант — экоткхтлютант, накопившийся в среде в количестве, достаточном для инн
ниашти токсического процесса в биогеоценозе (на любом уровне организации живой материи).
Одна из практических задач экогоксиколотин — определение количества жоноллютаига
ттри которохт сто уже считают экотоксикантом. Примерами перехода экополлютантов в разряд
экотоксикантов могут служить превращения веществ, а также значительное увеличение их
концентрации при пожаре. Выброс в окружающую среду токсичных веществ, образующихся в
результате тсрмолеструкпни различных синтетических материалов. вызывает накопление диок-
синов. цианидов. фос<|юроргаиичсских вешсств. оксида углерод (II) и других соединений на
ттрилетающих к очагам поражения территориях. Экологическая опасность многих групп ток-
сикантов усиливается вследените высокой устойчивости их к воздействию физико-химических
факторов окружающей срезы и ме.тленттой биодеструктши (тибл. 10-3).
Во время пожаров нередко гибнут люди, но в последнее время в индустриально развитых
странах наблюдается тенденция к росту числа погибших. Это объясняется тем. что причина-
ми гибели людей на пожарах являются нс только ожоги, воздет ст вне высокой температуры и
психопатический фактор, тто и отравления токсичными продуктами сгорания синтетических
материалов, широко используемых в строительстве и быту.
Основным показателем токсичности продуктов термоокислителыюй дсструктши служит кон-
центрация СО в воздухе и карбоксигемоглобина в крови иостралтшших (см. гл. 2.4.3 тт 8.3). Смерть
Таблица 10-3. Газообразные вещества-загрязнители, образующиеся при пожарах
Вещества Источники поступления токсикантов Свойснза вешеств Распределение в организме Сохранение в трупном материале
HllipiLIM КИСЛОТ Образую кя при трении азотсодержащих природных и синтетических материалов (капрон, найлон, нитрон). Ацетонитрил используется в промышленном произволе - тве полимеров в качестве раствори геля Хорошо растворимы в воде Практически равномерное рнсирсне- дение в орнппимс - стенке желудка, юнкой кишке, печени, почках; в ле) ких и мозге концентрация ирснышпст средний уровень в 2-3 раза (см. гл. X) Не изменяются при х шепни при 20J 3 °C в течение 14 дней (в же- лудке копнет рання уменьшается на 10-15% вследствие гидролиза в кислой среде)
Метан Основной компонент при- родного газа, нснолыуется в быту в качестве углеводород- ного топлива. Большие количеств» образу- ются при гниении органи- ческих вешеств в условиях ограниченного доступа воз- духа Не сорбирует обыч- ными сорбентами, пло- хо растворяется в поле и органических раство- рителях В оргаин 1мс человека нс накапливает- ся. но образуется в орг.шпзме в составе кишечных юзов. Естественное содер- жание метана: в 1 мл крови 0.12210.0074 мк1, в 1 । легкою — 0.2±()04мк1 В подгнившем биоматериале со- держание метана может значи- тельно увеличиться. шитому при проведении зкенертзы необхо- димо сравнивать результаты ис- следования jKciiepiiiM.x объектов с контрольными, взятыми от дру- IUX трупов людей хранившихся в тех же условиях. что п экспертные объекты
Ацетилен Широко используется в про- мышленное! и для авто)си- ний ииешленовой сварки металлов. получения синте- тических продуктов, а также в xnpypi нческой практике (иаприлсп) Малоряетпорим в поме, хорошо растворим в анегоне В организм поступает через дыханшь- ные нуги, в больших концен грвннях оказывает наркотическое воздействие и вызывает кислородное голодание Смертельных отравлений ацет- леном практически нс встреча- ется, гак как в кончен i рациях, встречающихся на производстве, не токсичен. Трудно обнаружить в ПОЛ1 пившем биомаicpniuie
Оксиды азота Образуются в больших коли- чествах при горении азоко- лержяших полимеров N О. NO, NO,, КД — газы, миорастиорп- мы в воде N,O4 жидкость ври охлаждении При котпакте оксидов азот с шшжной поверхностью легких образуются азот- ная и азотисшя кисло) ы, поражающие легочную ткань, вызывая отек легких. В крови образуются нитриты и нитраты, расширяющие «худы и снижающие артериальное давление. Нитриты реа- гируют с оксшсмоглобином, вызывая метгемоглобинемию (см. гл. 2 и 8) Онреде яки В крови по содержа- нию метгемоглобина н свободных нитритов
Оксид yuiepoid (II) Пожары Не реагирует с водой, кислотами. пюючами Взаимодействует с гемоглобином с об- разованием карбоксшсмо! лопина (см. гл. 2 и 8) 1 тшостпое изменение не влияет на результат анализа
964 Глава 10
Экотоксиканты 965
при пожарах обусловлена высоким содержанием н воздухе нс только СО При дсЛстнии на
организм нескольких зетучих токсичных вешсств отмечается потенцирование токсическою
эффекта. Например, токсичность СО и цианистых соединений (акрилонитриле. ацетонитрила,
см. гл. 8.3) при совместном воздействии на организм значительно выше, чем при изолированном,
что и происходит при пожарах. По лому при провслснни судебно-химической экспертизы трупного
материала на летучие продукты, образующиеся в результате юре шя иемета.ь*шческих материалов
важз о испатьзовпть метод, позволяющий определять в одной пробе различные соединения с тем-
пер, турой кипения до 175 С без предварительного изолирования летучих веществ (дернватизання
необходима лля <|юрмалкчегпда. кислот алифатического ряда и некоторых амннопроизволны.х).
Например, в Бюро судебно-медицинской экспертизы г. Москвы искать уют унифициро-
ванную методику газохроматографического определения (при совместном присудстии) токси-
канзов. >uicto образующихся при пожарах (Яблочкин В.Д.. 20(B).
Методика основана на применении набора из 3 хроматографических колонок с фазами
различной полярности (№ I — слабополярная, № 2 — средней по яркости. № 3 — полярная
фазы» в стандартных условиях, а в случае необходимости изменению подл жиз только темпе-
ратура колонки. Для идензификацни веществ проводят абсолютую калибровку с использова-
нием стандартных вешеспз и расчет относительного времени удерживания токсикантов.
Условия 1азохроматографического разделения веществ:
• газовый хроматограф ЛХМ-80 модель 6 с пламенно-ионизационным детектором (ПИД);
• колонка № I — 5% карбовакс i (ЗООхО.З см), температура 90 'С.
• колонка №2 - 15% диэтитенгликольссбаиината (ДЭГС) (200x0.3 см), температура 110 'С:
• колонка № 3 — 15Ц» 1.2.3-тр11с-(р-11из11глоксн)пропана (НЭП) (300x0.3 см), температура 70 °C:
• температура детекторов, испарителей 140 "С
• расход газа-ноеи едя азота, водорода хтя детектора 30 мл/мин, воздуха 300 мд/мин:
• шкала 5-10 10 А:
• внутренний стандарт н-пропанол
Вешество считается обнаруженным в объекте, если его параметры совпадают на 3 колонках
Элементом экотоксиколо! ической эксперт ты поллютантов является илсшификация их ис-
точников Решить эту задачу далеко не просто, так как порой вешество поступает в среду в
ничтожных количествах, иног: а в виде примесей к нетоксичным субстанциям. Образование
зкоиоллютэзгта в окружающей среде возможно в результате абиотических или биотических
трансформаций других веществ.
Многочисленные абиотические (происходящие без хчастня живых организмов) и биотичес-
кие (происходящие с участием живых организмов) процессы в окружающей среде направлены
на элиминацию экопо лютантов. Ря. ксенобиотиков, попав в воздух, почву, волу, приносят
минимальный вред экосистемам. поскольку время их воздеПспшя ничтожно мало. Вещества,
оказывающиеся резистентными к промессам разрушения и вследствие этого хзительно находя-
щиеся н окружающей среде, как правило, являются потенциально опасными экотоксикангами
(габл. 10-4).
Таблиц» Ю-4. Период полураспада некоторых поллютантов в окружающей среде
Поилютшп Перши полураспада Среда
ДДТ 12 лез Почил
2.3.7.8-ТХДД’ 9 лет Почва
Атразин 25 мес Вода (pH 7.0)
Бевзопернлен 14 мес Почва
Фена! прей 138 дней Почва
Карбофуран 45 дней Вола (pH 7.0)
Фосфорил! походи ны 21 день Почва (15 С)
Иприт 7 дней Почва (15 С)
Зорин 4 ч Почва (15 *С)
2..1.7.x (X.JL'l — 2..1.7.8 тетрах. оролгВснэо-р-лилксии
966 Глава 10
К числу пешее i n. длительно сохраняющихся в окружающей среде, относятся соединения
таких металлов, как свиней, медь, цинк, никель, кадмий, кобальт, сурьма, ртуть, хром, а также
мышьяк, полициклические полшалогеипрованныс углеводороды (полихлорированные дибен-
зодиоксины и дибсизофураны. полихлорированные бифенилы и т.д.). некоторые хлороррдни-
чсские пестициды (ДДТ. гексахлоран, алдрин. линдан п т.д.) и др.
Установлено, что по мере движения химических соединений по нишевой цени oi проду-
центов (от лат. producens — производящий, создающий: организмов, способных к фото- или
хемосинтезу и являющихся в нишевой цепи первым звеном, или источников образования
органических веществ из неорганических) до коисуменюв (от лат. consume — потребляю; ор-
ганизмов. являющихся в нишевой цепи потребителями органического вещества) количество
экоюксиканта вследствие медленной биотрансформашш и неполной экскреции во внешнюю
среду накапливается в возрастающих концентрациях.
Процесс увеличения концентрации токсиканта в ра тичных организмах при переходе ог
низших трофических уровней данной экосистемы к высшим называют экологической магни-
фикянией. Например, в планктоне содержание димстилртути составляет примерно 0.01 мкг/г.
в мышечной псами хищных рыб достигает 1.5. а у п тин-рыболовов — 3—14 мкт/г. При иссле-
довании одной из экосистем озера Мичиган было обнаружено следующее накопление ДДТ в
нишевых пенях: в донном иле озера — 0.014 мг/кг. в ракообразных, питающихся на дне — 0.41
мг/кг. в различных рыбах — 3—6 мг/кг. в жировой ткани чаек, питающихся этой рыбой — свы-
ше 200 мг/кг
Исследования показали. что ДДТ оказывает влияние практически на все живые организ-
мы (см. гл. 8.4). Обработка ДДТ салон и лесов десятки лет тому назад привела к тому, что его
содержание в почвах в этих местах очень высоко. Сейчас во многих местах вместо плодовых
деревьев выращивают другие сельскохозяйственные культуры, которые могут аккумулировать
ДДТ из почвы, в результате чего он попадает в пишу животных и людей. Так. в 1975 г. ДДТ
содержался в 8% образное мяса. 5—10% образцов корнеплодов и картофеля. В 1988 г. в 30%
образцов сухого молока для детского П1ггания содержание ДДТ в 5 раз превышало допустимую
норму. То же можно сказать и о 52% образцов сливочною масла в 1989 г. (Fedorov !,. Experi-
ence of usage DDT in Soviet Union alter ns «ban» // Organolialogcns Comp. V. 32. p. 41. 1997). В
большинстве с гран с начала 70 го»ов XX века введен запрет на применение ДДТ. Однако и в
настоящее время ДДТ продолжает оставаться одним из наиболее распространенных и опасных
экотоксикантов. «Разве должно быть иначе: мы платим за все. не нужно и сдачи» (Бродский И.).
Исследования грудного молока (РФ. 1998 г.) показали. что в отличие от стран Западной
Европы, оно загрязнено токсичными ПХБ сильнее, чем диоксинами. Если удастся снизить
уровень загрязнения грудного молока ПХБ. то 1рудные дети будут значительно меньше под-
вергагься риску от воздействия гоксикангов.
Особенно экологически опасно загрязнение водоемов, потому что микроорганизмы (псегыо-
моноподобныс бактерии), обитающие в донных отложениях, интенсивно осуществляют процес-
сы биометилнрования. например ртути и дрмих металлов. Дипофи (ьныс металлоорганические
соединения накапливаются в жировых тканях и передаются по пищевым цепям (см. гл. 8.5).
Экотоксичность — способность экотоксиканта вызывать неблагоприятный эф<|ккты в соот-
ветствующей экосистеме, проявляющиеся (по Куценко С.А.. 2002):
• на уровне организма (аутэкогоксические) снижением ре нстеитюсти к другим тсйсшую-
шим факторам ерс ,ы. ростом заболеваемости, в том числе раком, нарушениями репродук-
тивных функций и даже гибелью организма:
• на уровне популяции (демэкотокснчсские) гибелью популяции, ростом заболеваемости,
смертности, уменьшением рождаемости. увеличением числа врожденных дефектов разви-
тия. нарушением демографических характеристик (соотношение возраста, пола и т.д.). из-
менением средней продолжительности жизни;
• на уровне биогеоценоза (синэкотоксические) изменением популяционного спектра ценоза
вплоть го исчезновения отдельных видов и появления новых, нс свойственных данному
биоценозу, нарушением межвидовых взаимоотношений.
При оценке котоксичности лишь одного вещества в отношении представителен только
одного вида живых существ в пашой мере moivt быть использованы качественные и ко i-
чественныс характеристики, принятые в классической токсикологии — дозы и концентрации
Экотоксиклнты 967
токсикант. проявляющие острую, подострую, хроническую токсичное! ь. мутагенный. каитте-
роюнный и иные э<|х|>ек1Ы (табл. 10-5).
Таблица 10-5. Предельно допустимые KOimeiiTp.iiuni. или уровни некоторых токсичных веществ в р; з-
.тичиых объектах
Вещество Вода. mi/л Воздух, мг/м’ Почва. мг/кг
подвижная форм валовая форма
Диоксины (ДЭ)’ 5-10* 5 10 1 ПО"
Бензапирен 5 10» 1 -10» 11.02
Три 'стороби(| е н ил ы 0.1Ю1 — - 0.03
Пентахлоробифеиилы 0.0Л1 — 0.1
ДДТ 0.1 5 10* - 0.1
Гсксахлороиикло! ексан 0.02 0.03 - 0.1
N -иитрозолимстилдмин 1 — 5-105 — 1 —
ц-Нлфти (амин — 0.003 1 —
Ртуть 5 104 3 10 4 - 2.1
Кадмий 0.001 3-10* 3.0 -
Свинец 0.03 3-10 4 6.1) 32
Примечание: Д-> — яиоксинопый экнипхтент
В 6aiee сложных системах экотокснчность количественно не измеряется, а оценивается
через понятия -экологическая опасность» или •экологический риск» (см. гл. I)
В зцвисимости от продолжите ьности действия экотоксикантов на экосистему можно гово-
рить об острой иди хронической экотокепчноетт
Острое экогоксическое действие вешества па биоценоз может быть следствием аварии или
катастрофы, сопровождающейся выходом в окружающую среду бс много количества относи-
тельно нестойкого токсиканта, а также неправильного использования химикатов.
Острое экогоксическое действие не всегда приводит к гибели или острым заболеванием
людей или представителей других биологических видов, подвергшихся воз. ‘йстнйю. Так. сре-
ди отравляющих вешеств. применявшихся в Первую мировую войну, был сернистый иприт.
Эю пешееIво. являясь канцерогеном, в дальнейшем стало причиной смерти нор<жеиных от
новообразован и и.
С хронической токсичностью веществ, кг к правило, ассоциируются сублегальные э<|>фекты
Часто при этом подразумевают нархшенпе репродуктивных функций, иммунные сдвиги, эн-
докринную патологию, пороки развития, аллергизаппю и т.д. Однако хроническое воздействие
токсиканта может приводить и к летальному исходу особей некоторых видов. В большинстве
с. хчаев экотоксиколог сталкивается с хронической экотоксичностью
Специфическое и неспецифическое (обшетоксическое) действие ксенобиотиков зависит не
только от их токсикологических характеристик, но и от генетически обусловленной актив-
ности компенсаторно-приспособительных (адаптационных) реакций организма, прежде всею
активности иммунной системы и системы биогрансформатшн чужеродных химических соеди-
нений. Экологические системы обла iaioi выработанными в процессе эволюции мощными ме-
ханизмами зашиты от экстремальных химических воздействий как на популяционном уровне,
так и на уровне отдельных особей. Вместе с тем в настоящее время скорость антропсненных
изменений в биосфере начинает превышать возможное»! приспособляемости ортапнзма к но-
вым условиям среды
Наиболее опасные лкотоксикаиты и особенности их определения в биосистемах
В последние 30 лет уделяется серьезное внимание изучению труппы стойких ортанических
загрязнителей (СОЗ), которые воздействуют на среду обитания на чрезвычайно низком уровне
968 Глава 10
(нижний предел обнаружения 10"—НЕ14 ). Многие из них известны давно и широко исполь-
зовались в промышленности и сельском хозяйстве большинства стран. СОЗ оз нося Ля к классу
хлорорганических соединений и имеют следующие специфические признаки:
• способносгь к биоконцентрированию (или биоаккумуляции) за счет высокой липофильности:
• глобальная распространенность за счет способности переноситься на большие расстояния:
• чрезвычайная стойкость к физическим, химическим и биологическим факторах :
• способность окатывать токсическое воздействие па организмы в крайне малых лотах.
В Программе ООН по защите окружающей среды (United Nations Environmental Project —
UNEP) особо выделена группа из 12 соединений. па которые следует обращать первоочередное
внимание при эколо!ичсских исследованиях. Эта так называемая «грязная дюжина» включает
с. слуюшие вещества: полихлорированные либензо-р-диоксины (ПХДД). ПХБ. полихлориро-
ванные либензофураны (ПХДФ). алдрин, лиэлдрип. дихлоролифенилтрихлороэтан (ДДТ). эн-
дрин. хлоролаи. 1сксахлоробензол (ГХБ). мирекс, токсафен и гептахлор (см. гл. 8.4). Список
был составлен и |>езу.плате мноючис.тепных международны* исследований. консультаций и
форумов, главным итогом работы которых стало принятие и подписание 23.05.2002 в СТок-
1ол1.мс Глобальной международной конвенции о запрещении СОЗ. к которой присоединилась
и Россия.
Стокгольмская конвенция выдвинула ряд предложений по изучению воздействия СОЗ на
здоровье человека, животных, растения, изучению путей распространения этих веществ, атак
же по запрещению их производства и использования. Частью этой программы является эко-
лого-аналитический контроль, в который входят выявление и опенка источников загрязнения.
опрсде1ение уровней Зсмрязнеиия природных и пищевых объектов СОЗами в результате апг-
ponoicHHoro воздействия (прямого, косвенного или катастрофического) на окружающую среду
и человека.
Одним нз наиболее надежных методов, характеризующих воздействие токсичных веществ
на здоровье населения, является оценка уровня их содержания в диагностических биообъектах
Различные методы опенки возлзиензня токсикантов широко примснякмся во многих странах
мир< Они являются частью системы мониторинга за определенными показателями состояния
здоровья населения, выбранными в качестве индикаторов степени воздействия неблагоприят-
ных факторов окружающей среды. Например. Агентством по охране окружающей среды США
осуществляется программа по опенке содержания диоксинов в грудном молоке женщин из раз-
личных регионов страны. Центром но контре тю за заболеваниями США (CDC) — националь-
ная программа по определению свинца в крови и т.д. Подобные программы осуществляются
в Канаде. Германии. Японии. Нидерландах, скандинавских странах. Специальные пршрэммы
по определению диоксинов и ПХБ в грудном молоке и крови выполняет ВОЗ. по другим ток-
сичным веществам — Международное агентство по атомной энергии (МАГАТЭ).
Для выявления неблагоприятного воздействия загрязнителей окружающей среды на opia-
низм человека проводят определение их содержания как в природных объектах, так и в орга-
низме человека При выборе методов определения токсикантов необходимо учитывать, что во
многих случаях загрязнение происходит не одним конкретным веществом, а их смесью. Как
правило, выявить весь комплекс действующих веществ удается редко. Поэтому и экотоксико-
логичсскнх исследованиях принято использовать методы, позволяющие определить в одной
пробе группу токсикантов. В связи с достаточно низкими концентрациями (исключая ситуа-
ции химических кащетроф) эк юксикангов в биосредах для анализа необходимо использовать
методики, характеризующиеся высокой чувствительностью. Нижняя граница определения ток-
сиканта в биосредах должна быть на уровне нижней |ранины естественного содержания. Если
определяемое вещество в организме ие содержится, то при выборе методики целесообразно
ориентироваться на биологически допустимый уровень (БДУ) (см. гл. 8.5.2). При этом ниж-
няя гранима опре еления не должна бьнь выше БДУ. Например, в рсзутьтатс Чернобыльской
катастрофы произошло всем известное загрязнение объектов окружающей среды не только ра-
диоактивными веществами, по н соединениями токсичных металлов. таких, как свинец, хром,
вольфрам и других. В этом случае использование дорогостоящего чувствительного многоэле-
ментного мещда анализа — масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС)
для мониторинга объектов окружающей среды и эпидемиологического обследования населения
было оправдано и весьма полезно (см. i.i. 6.4 и 8.5). Выбор того или иного дна! hoci ическото
Экотоксиканты 969
биосубстрвта часто обусловливается аналитическими возможностями лаборатории и простотой
ВЯ1ИЯ того или иною био. ini ичсскою обратна. При этом нс всегда учитывается существующий
мировой опыт по определению наиболее адекватного диагностического биообъекта, обобщен-
ный в токсикологических профилях. обзорах ВОЗ по токсичным веществам и ряде моногра-
фий. В главе 8.5.4 при обсуждении аналитической диагностики профессиональных и эколо-
гически зависимых заболеваний прелепялены рекомендуемые диагностические биоехбетраты
(но Casarett and Doulb Toxicology (he Basic Science of poisons. Fifth Edition. 1998. Рееич Б.А.
2004) и вещества, наиболее значимые как згнря ihhic.ih окру ж пошей среды населенных пунк-
тов России
Для решения вопросов загрязнения окру ж о шеи среды в первую очередь необходимо вы-
являть загрязненные регионы и источники заражения. Экологический контроль неблагопри-
ятных регионов осуществляется во всех развитых трапах. однако известно, что этой проблеме
все еше уделяется недостаточное внимание. Причинами того, что эко огнчсский мониторит
развивается столь медленно являются техническая сложность, высокая стоимость, л также от-
носи(слы1о низкая производительность определения токсикантов при необходимости прове-
дения обследования большого числа объектов. Эю касается и массового контроля пищевых
продуктов. т.е. методики юлжны быть ошостс шно простые, экспрессные и недорогие.
Для получения статистически достоверных результатов следует проводить сотни и тысячи
онрелеЛенин экотоксикантов в объектах органической и неорганической природы Поэтому к
современным тест-системам предъявляются следующие основные требования: высокая чувс-
твительность. простота выполнения. нспро.толжн1слыюе время проведения, высокая произ-
водительное «ъ. низкая стоимость авали м. Опенка крон 1воднтслы1оети. стоимости и точности
наиболее распространенных в настоящее время методов определения токсикантов показала,
что тля скрининга биоло! ических образно» на содержание экотокейкантов. например нести
инлов. с экономической точки зрения более удобны экспрессные иммунохимичеекие методы
(см. гл. 6.2).
Особое место среди жотоксикшпов занимает группа диоксинов. ПХБ и хлорированных
бен золов.
Диоксины
В настоящее время насчитывается несколько десятков семейств этих токсикантов, а обшее
число соединении превышает тысячу. 2.3.7.8-ТХЛЛ (диоксин) — самый токсичный представи-
тель этой |рупны (см. гл 8.4).
Распространение и применение. Диоксин является одним из продуктов при производстве
трихлорофешыа. промышленного ирелшесгвснипка «ексахлорофека и 2.4.5-трихлоро1|>енокси-
уксусиой кислоты (2.4,5-Т). Образование диоксина увеличивается, когда температура в реак-
ционной среде превышает 160 С. Расчворы 2.4.5-1 (оранжевый агент. Agent Orange), широко
применявшиеся но Вьетнаме в качестве дефолианта, содержали до 30 ррт лнокенпа. сейчас
такие смеси содержат менее 0,1 ррт. Было обнаружено, что диоксин сверхстабилсн и устойчив в
окружающей среде: среднее дневное поступление в организм че «опека состанляш около 0.05 нг.
98% которого пощупает с нишей.
Концентрации в крови. Диоксин в сыворотке крови определяется в концентрации в сред-
нем до 5 нг/л. 1 п диоксина составляет в среднем 7.1 года.
Диоксин — гидрофобное соединение, имеющее тс иеннию к кумуляции к жировой ткани,
обнаружен и в поджелудочной железе, и в печени. Неизвестно, метаболизируется ли эго ве-
щество в организме человека. Основной путь экскреции — с катом Жировая ткань человека
содержит в среднем 7.4 mki/ki диоксина по сравнению е 80 мкг/м у ш (ей. подвергнувшихся
его воздействию.
Токсичность. В табл. 10-6 представлены копиенгрании диоксина у человека, подвергавше-
юся его воздействию.
Таб.11П1й 10-6. Концентрации диоксина (в мкг кг) у человека, подвергавшегося его воздействию
Кровь Мозг Легкие Печень Поджелуточная Почка Жировая
железа ткань
0.006 0.06 0.06 0.15 1.04 0.04 I.S4
970 Глава 10
Предполагается, что во время войны в Южном Вьетнаме с 1962 по 1971 г.. США было
выброшено в атмосферу порядка 170 кг диоксина в качестве примеси к используемому там
дефолианту Agent Orange (по другим подсчетам, почти 500 кг). Выброс ядовитого вешества
связали с ростом заболеваемости раком печени, онемением, появлением хлорных утрой (хло-
ракнз, см. гл. 2.4.4). изменениями в поведении у ветеранов войны во Вьетнаме и дефектами
при рождении их детей. До проведения дефолиации в Южном Вьетнаме рак печени был на 8-м
месте среди всех заболеваний раком в стране, что составило примерно 2,9% общего количества
хюкачествснпых заболеваний. В 1979 г. рак печени был уже на 2-м месте — примерно 10%
общего количества заболеваний раком. Заболеваемость раком печени в Ханое. Северном Вьет-
наме (который не был подвержен прямому распылению) нс изменилась. Рак печени является
следствием хронического воздействия малых доз диоксина у животных.
Методы определения. Уровень диоксина в биологических пробах очень мал и лля его об-
наружения требуются высокочувствительные и специфичные методы определения — газовая
хроматография с масс-спекгромегрическнм детектированием (ГХ-МС) или высокоэффектив-
ная жидкостная хроматот рафия (ВЭЖХ) (рис. 10-3. 10-4).
На рисунке 10-5 показаны модели молекул 2.3,7,8-ТХДФ и 2.3.7.8-ТХДД.
В Российской Федерации установлен единый регламент на содержание 11ХДД и ПХДФ в
почве — 0.133 пг/г.
Ежесуточное предельно допустимое поступление диоксина в организм человека в разных
странах определено по-разному — оз 1 до 200 пг/кг массы.
Полихлорированные бифенилы
Среди СОЗ ПХБ наиболее распространены. Они массово производились и использовались
начит ая с 1929 г. С тех пор и до прекращения их промышленного выпуска в 1986 г. в мире
было произведено около 2 млн тонн ПХБ.
ПХБ относятся к классу ароматических соединений, состоящих и з 2 бензольных колец, со
единенных связью С-С и замешенных 1-10 атомами хлора в орто-, мета- или пара- положениях
(рис. 10-6). Существует 209 индивидуальных химических структ; р ПХБ. отличающихся числом
и положением атомов .хлора в молекуле имеющих общую формулу: СрН, Cl. где х — I —10.
По своим физико-химическим свойствам ПХБ близки к диоксинам. Размер молекулы в
длину 9—10.5 А. в ширину около ЗА. ПХБ обладают рядом уникальных физических и химичес-
ких свойств: исключительной термостойкостью и электроизоляционными характеристиками,
инертностью по от ношению к кислотам и щ ночам, от нестойкостью. хорошей растворимостью
Время удерживания мин
Рис. 10-3. Масс-хроматограмма 2.3.7.8-ТХДД полученная па приборе МАТ 95 ХР, Птегто Finnigan
Экотоксиканты 971
<D
Стандарт
Full-scan MS
"С- 2.3.7.8-TCDF
2.3.7.8-TCDD
Стандарт
MS/MS
100-1
20
| 80
га
*60
02
^40
100-1
80-
£
О.
ф
§
60т
40
о
17.5
2,3,7 8-TCDD
Ч>2.3,7.8-ТСОР
20-
18.0 18.5 19,0 19.5 20.0
Время удерживания, мин
Экстракт
молока
MS,'MS
100—1
ф
о 80
3?6ОТ
0
17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20,0
Время удерживания, мин
100 -1
60-
60т
3
40
20-
20-
2.3.7.8-TCDD
о
17,5 18.0 18.5 19,0 19,5 20.0
Время удерживания, мин
'C-2.3.7.8-TCDF
|Т;‘!тН /?!
17.5 18,0 18.5 19.0 19.5 20.0
Время удерживания мин
8
5
ё
Ф
3
О
8
г
о
ё
§
5
Рис. 10-4. Хроматограммы ci.ntaapioii — 2.3,7,&-тстра.мород||беп.>офурлна (2,3.7.8-ТХ.1Ф. 2.3.7.8-TCDF)
и 2,3,7,8-ТХДД (2.3.7.8-TCDD) (вверху) и реальною обра па (внизу) по полному масс-спектру (МС)
(слева) и гандем масс-спектру (МС-МС) (справа)
Рис. 10-5. Mo.ie hi молекул 2.3.7.8-ТХДФ (а) и 2.3.7.8-ТХ21Д (б). Оботпачсппс: атомы углерода — голубо-
го. атомы нагорелы — ссропт. атомы хлора - (слепого. .помы кисиорода — красною цвета
Рис. 10-6. Структурная формула ПХБ
Экотоксикангы 973
• тстрахлоробифсиилов (ТХБ) — 0.06 мг/кг;
• ПсХБ — 0.1 мг/кг
0.11 in ко возможность применения этих норма! иной не обоснована ни имеющейся прибор-
но-методической базой. ин гем. что ПХБ нс встречаются отдельно. а to.4i.ko в виде смесей.
Существуют ба ьшие различия в токсичности, способности к биоаккумуляции и биотранс-
формашш для различных ПХБ. Производные. не содержащие атомы хлора в орто-положении
модем лы (орго-пеэлмешенные ПХБ), могут принимать планарную конфигурацию, которая
энергетически наиболее вьподна (рис. 10-7). Молекулы «р/ло-иезамещенных ПХЬ, являются
наиболее токсичными и оказывают действие, ана. огичпое действию ПХДД и ПХДФ
Механизм действия орго-незамешенных и моно-орто-замешенных ПХБ аналогичен меха-
низму действия 2.3.7.Х-ГХДД.
Современные методы и подходы, используемые при анализе объектов окружающей среды
на содержание ПХБ. позволяю) определять все производные. несмотря на ло что ни одна хро-
матографическая колонка не может в настоящее время ра целить все 209 компонентой ПХЬ
Доминирующими методами являются:
• iaюжидкосшая хроматография (ГЖХ) с иснользовиннем селективного к хлоросо держащим
соединениям д.тектроиоза.хватного детектора (ЭЗД);
• сочетание ГХ с МС низкою разрешения; для определения планарных ПХЬ (N. 77. XI, 126.
169) сочетание 1 X с МС высокого разрешения.
Эти методы позволяют ртзрешать любые проблемы, связанные с детектированием ПХБ не-
зависимо от характера природной матрицы.
Выбор метода определения зависит от конечной цели анализа. Если необходимо знать сум-
марное или групповое содержание ПХБ. то используют обычно ГЖХ. Если же ставится залпча
обнаружения определенного вещества из (руины ПХБ (например № 77 пли № 169). то приме-
няю! более сложные и дорогостоящие селективные методы.
CI
• - Hi 1С8. 3.3" 4.4'. 5 5Г ГкХБ
Рис. 10-7. Структурные формулы наньовее токсичных производных «рото-нсзамттснных ПХБ; 3.3'.4.4‘-
тетрахлоробифенил (а). 3.3’.4.4',5-11еитахлоробифенил (б), 3.3',4,4’,5.5'-гексахлоробифснил (в).
974 Глава 10
Определения суммарного содержания ПХБ в объектах окружающей среды. В данном случае
количествен нос определение ПХБ осуществляется сравнением хроматографического профиля
анализируемого обрата с профилем стандартных технических смесей. Такой анализ проводит-
ся. как правило, методами ГХ -ЭЗД и ГХ-МС.
На хроматографической колонке ПХБ не рахпеляются на индивидуальные изомеры, они
элюируются в виде кластеров, редко достигая базовой липни. Для градуировки используют
различные коммерческие смеси, обычно смеси Арохлор. идентификация осуществляется ис-
ключительно по времени удерживания.
В случаях. когда проба содержит только одн техническую смесь, эта методика лает удов-
летворительные результаты, но если проба загрязнена двумя техническими смесями и более
в неизвестном соотношении, то пн одна из технических смесей Арохлор пс может бьнь взята
в качестве стандарта, что приводит к ошибкам определения. Кроме того, вместе с ПХБ могут
элюироваться и другие загрязнители. такие, как бутилмоиоклородифсниловыс эфиры, изоп-
ропнлхлоробпфеиилы. хлоробепзолы. хлороуглсволороды (некоторые пестициды), которые не
идентифицируются. ио включаются в общую сумму ПХБ. Несмотря на неточность метод прост
и удобен.
Для такого рода анализа можно также использовать масс-спектрометрически и детектор, ко-
торый заметно увеличивает селективность. Он обладает не менее высокой чуисгвигельноечью.
чем ЭЗД, и позволяет осуществлять идентификацию на основании структурной информации
по молекулярным и осколочным ионам в масс-спектре. Высокая чувствительность в ГХ-МС
достигается при использовании селективного детектирования выбранных ионов. Характерная
картина изотопного распределения хлоросодержаших ионов дает дополнительные возможнос-
ти для идентификации.
Концепция определения суммы ПХБ имеет ряд недостатков с точки зрения как их содер-
жания в окружающей среде и технических смесях, так и токсического действия. Определение
суммы ПХБ без идентификации их состава используют только для предварительной оценки
затря тнения.
В воздухе, рыбе, дойных отложениях, почве, растительных матсриатах обычно обнаружи-
вается до 100 индивидуальных производных бифенилов. Поскольку физико-химические и
токсикологические свойства изомеров ПХБ сильно различаются, то исобх димо проводить
селективное определение. Например, изменение профиля изомеров может дать информацию
о связи между структурой ПХБ и их распространением в природе или биогрвнеформацией в
организме. Однако нельзя определять ограниченное число производных, это может привести к
недооценке обшей суммы ПХБ.
Включение в расчет диоксиновой натрузки и риска наряду с 11ХДД и 11ХДФ днокенно-
полобных ПХБ привело к модификации метчики определения ПХБ. К лиоксипоподобным
относятся планарные производные ПХБ, не содержащие атомов хлора в орто-положенни и
некоторые моно-, орто замешенные производные. Их концентрации обычно малы. Если тре-
буются надежная идентификация и точное определение содержания изомеров, то обычно ис-
пользуется ГХ-МС (низкого иди высокого разрешения), так же как и для определения ПХЛД
и ПХДФ
Хлорированные Гн толы
Хлорированные бензолы — группа химических соединений, используемых в качестве органи-
ческих растворителей, пестицидов, фунгицидов, компонентов химического синтеза. Они пред-
ставляют собой молекулу бензола, в которо т атомы водорода замещены 1—6 атомами хлора.
Как правило. люди подвергаются воздействию этих вешсств на производстве. однако в пос-
леднее время достаточно высокие концентрации хлорированных бензолов стали обнаруживать
в воздухе, почве, продовольствии. везде. Чем выше степень Фторирования мо скулы, тем ниже
растворимость в воде и летучесть веществ.
Исследования на животных свидетельствуют о способности таких соединений (гсксахло-
робстгзола. дихлоробепзола) вызывать карциному печени, почек и аденому паращитовидной
желе ты. Исследования хлорированных бензолов на генотоксичность дают отрицательный ре-
зультат. Нет достоверных данных о канцерогенности хлорированных бензо ов для человека.
Экотоксиканты 975
Коэффициенты токсичности для ПХДД и ПХДФ относительно 2.3,7,8-ТХДД приведены в
табл. 10-7.
Таблица 10-7. Коэффициенты токсичности ПХДД и ПХДФ относительно 2.3,7,8-ТХДД
Группа изомеров Изомеры Международные. 1989 г. ВОЗ, 1998 г., для:
млекопитающих рыб птиц
1ХДД 23.7.8 1 1 1 1
Остальные 0 0 0 0
ПсХДЦ I.2.3.7.8 0.5 1 1 1
Остальные 0 0 и 0
Г ХДД 1.23,4.7.8 0.1 0.1 0,5 0.05
1.23.6,7,8 0.1 0.1 0.01 0.01
1,23.7.8.9 0.1 0.1 0.01 0.1
Остальные 0 0 0 0
ГпХДД 1.23.4.6.7,8 0.01 0.01 0.001 < 0.001
Другой 0 0 0 0
ОХАЛ 0,001 0,0001 ,<00001 0.0001
ТХДФ 23.7,8 0.1 0.1 0.05 1
Остальные 0 0 0 0
ПсХДФ 1.23.7.8 0.05 0.05 0.05 0.1
23.4.7.8 0.5 0,5 0.5 1
Остальные 0 0 0 0
ГкХДФ 1.23-4.7.8 0.1 0.1 0.1 0.1
1.23.6.7.8 0.1 0.1 0.1 0.1
23.4.6.7,8 0.1 0.1 0.1 0.1
1.23.7,8.9 0.1 0.1 0.1 0.1
Оста, ьные 0 0 0 0
ГиХДФ 1.23.4,6,7.8 0.01 0.01 0.01 0,01
1.23.4.7.8.9 0.01 0.01 0,01 0,01
Оста, ные 0 0 0 0
ОХДФ 0.001 U.O00I рС 0.0001 0,0001
Примечание. Г ХДД — гексахлоролибснзо-р-диокстш. ГкХДФ — гсксахлородибензофуран. ГвХДД
гста.хюродибеню-р-диоксин. ГиХДФ — гейтах лоролнбевзофуран. ОХ Л Л — октахлородттбен эо-р-диок-
син. ОХДФ — октахлорс ибензофуран. ПсХЛД — пентахлоролнбснзо-р-дноксин, ПсХДФ — исигахло-
рояибензофурвн. 1ХДФ — тетра торо.тнбет офуран
Достижения аналитической химии и приборостроения позволили перевести изомероселек-
тивное определение ПХДД и ПХДФ из разряда уникальных анализов в категорию выполняе-
мых серийно, но по-прежнему такие работы являются весьма трудоемкими. Наиболее надеж-
ным методом опреде. ния со ержанпя ПХДД и ПХДФ в различных матрицах является метод
изотопного разбавления с детектированием с помошью ГХ-МС высокого разрешения, что
обеспечивает высокую чувствитезьность и селективность, необходимые при таком анализе.
Хромато-масс-спектрометр высокого разрешения Finnigan MAT 95ХР является одним из
приборов, сертифицированных для данного тина определений. Он удовлетворяет требованиям
976 Глава 10
методик LS-EPA 1613. 8290 и 1668. являющихся основой методов улы раследового определе-
ния диоксинов и ПХБ в мире.
В настоящее время в России имеется 10 стандартизованных методик. позволяющих качес-
твенно выделять и анализировать ПХДД и Г1ХДФ. Они внесены в реестр Госстандарта РФ
Методики включают отбор проб, внесение изотопно-меченых сгаидаргов (метол изотопного
разбавления), экстракцию. очистку на многостопной (кислотно-щелочной) колонке с активи-
рованным углем, колонке с оксидом алюминия и собственно хромато масс-сиемрометричес-
кое определение
Для большинства образцов может быть использована следующая схема определения этих
экотоксикантов (рис. 10-8).
Рис. 10-8. Схема обнаружения полихлорированных прои видных бифенг тон бензолов и диоксинов в
биообъектах и объектах окружающей среды
Соединения свинца и ртути *
В России достоверные данные о содержании свинца в крови гетей получены в последние голы
после унификации методов его определения с лабораторией (Blood Lead Laboratory Reference System)
Центра по контролю за заболеваниями США (CDC). Результаты этих работ впоше сопоставимы
с ранее опубликованными данными по загрязненным территориях! других стран, но в городах РФ
с металлургическим произволспюм содержание свиниа в крови детей существенно выше, чем ре-
гистрируемый в настоящее время средний уровень свиниа в крови детей США. Германии и других
сгр; н. гае был запретен л илпрованный бензин и снижен выброс мсталлур!ических производств (по
данным БА Рсвича). В США лля работающею персонала допустимое содержание свинца в крови
30 мкг/100 мл крови. При содержании свинца и крови беременных женишп более 15 мкг/дл возрас-
тает риск спонтанных абортов, поэтому этот уровень рекомендован как пределыю допустимый для
беременных. За последние 30 ют в США и многих tpyin.x «ранах выполнены крупные исследова-
ния по опенке связи между содержа нием свинца в крови ребенка и выраженностью тех или иных
отклонений в состоя ши здоровья. Биологической ПДК свинца или. как ее еще называют «уровнем
озабочег ости или настороженности», принята величина 10 мкг/дт крови, превышение котороз со-
провожу шея снижением коэффициента интеллекта IQ и способности к обучению, поведенческими
нарушениями. Олнако при содержании свинца ниже этой величины у детей наблюдаются опреде-
ленные изменения нервно-психического характера. Кроме того, в настоящее время рассматривается
роль свищи как фактора риска развития остеопороза в постклимакгерическом периоде
Для прижизненного определения содержания свинца в организме используют математичес-
кое моделирование (см. гл. 4). Математическое моделирование. основанное на установлении
взаимосвязей между содержанием свиниа в крови детей и окружающей среде — воздухе. воде,
почве, пыли — позволило установить, что почти у 2 млн детей в городах России moivt возни-
кать отклонения в повелении и обучении, обусловленные возден лвием свинца, почти 4U0 тыс.
Подробно о соединениях свиниа, ртути, кадмия и других металлов-jkotokcm кангов. а также мышьяка — см. гл. К.5.
Экотоксиканты 977
нужд потея в медицинском обследовании и повторном oiipi юлении свинна и крови. 10 тыс. —
в специальной тералин. Очень важно, что негативные последствия могут обнаружиться и
10 лет спустя посте вомсйствия токсиканта в раннем детстве.
Во многих исследованиях в ратных странах мира используется определение свинца в во-
лосах у детей и взрослых для опенки эколого-эпилсмичсскои ситуации. Так. например. хтя
работающих на производстве содержание свинца не толжно превышать 70 мкг/r. что соответс-
твует уровню свинна в крови рабочих 40 мкг/дл крови. Для детей рекомендуется в качестве
допустимого уровня свинна в волосах 3 мкг/т н до 6 mki /i для взрослых.
В экологических исследованиях часто применяю! хроматографические методы. Например,
извлечение целевых компонентов нз крови или мочи осуществляют из паровой фазы мето-
лом твердофазной мнкроэкстракпин — ТФМ Э (см. гл. 5.4). Микроконнентраиин свинна в
цельной кропи и моче определяют методом ГХ-ПИ.1 после превращения РЬ (по реакции с
тстралилборатом натрия) в летучее производное — тетраэтилсвинец (С.Н5),РЬ и улавливания
конечного продукта из паровой фазы (4 мл) шприпем с по. 1идимеп1леи.токсановым волокном
(100 мкм). Шприц с концентратом аналита вводят в испаритель хром.пограз|>а. После термоде-
сорбции целевые компоненты разделяются на кварцевой капиллярной колонке (30 мхО.25 мм)
с силиконом SPB-5 при программировании температуры (40—120 С) со скоростью 20 С/мип
(газ-носитель Не).
Современная инверсионная нольтпмпсромстрич позволяет определять содержите свинца в
цельной крови, исключая стадию предварительно/! подготовки пробы. Разраооткл новых тол-
скныеиочиых и «creen-prinied ыектролов позволила создать портативные сенсоры, уменьшив
тем самым необходимый для анализа объем пробы до I мд. а с помощью модифицированных
сенсоров лот объем можно уменьши и. до 50 мкл. Для исключения металлической ртути и ее
солей и г определения поверхность рабочего электрода модифицируется малорастворимоп солью
лиэтиллптиокарбамината ртути (II). Измерительная ячейка имеет обьем 0.2—0.4 мл. Определе-
ние проводится в три стадии: г|х>рмнронание рабочей поверхности. накопление. регистрация.
Общий выброс ртути в атмосферный воздух- тз тько от промышленных источников достша-
ег. по экспертным оценкам. 20 т в год. Кроме того, продолжается использование ргутьсолержз-
ших пестицидов (гранозана), а на складских помещениях находится до КИК) т этих вешеств.
Содержание pi ути в крови у людей, потребляющих большое количество морепродуктов,
увеличивается до 12.7 мкг/дл крови Установлена корреляция между уровнем потребтения
морепродуктов и коинентрацисп ртути в крови люден. Пороговым уровнем piyrn в крови
женщин считают 2 мкг/дл, уровень выше К! мкг/дл указывают на повышенны!! риск для здо-
ровы! ( Канада); США орисн|ирую!ся на еше более низкий уровень ртути в пупочной крови —
0.58 мкт/дл. В России в крови жительниц Санкт-Петербурга среднее содержание ртути в крови
составило 0,12±О.ЗЗ мкт/дл.
В эколого-эпидемиологических исследованиях наиболее широко применяется определение
накопления pt ути в волосах. У людей мдю и/или не употребляющих в пишу рыбу, содержание
мстилртути в полосах, как правило, не превышает I—4 мкг/г тюлек У тюлей, в рационе ко-
торых доля морепродуктов достаточно велика, почти вея ргуть в волосах содержится н форме
метл ртути.
Прз! определении органических и неорганических форм ртути в биообъектах используют
различные методы. например хорошие результаты лает применение гибридных методов (см.
гл. 6).
После экстракции из крови образен тсриватзирутот и получают бутилпроизволные ртути,
которые анализируют метолом ГХ-ИСП-АЭС или ГХ-ААС Возможно пспользотзапие для этих
целей (после этилирования) криогенной газовой хроматографии с атомно-флюоресцентным
детектированием холодного пара или исигро1>но-ак1ивапио1п1ого анализа в сочетании с экс-
тракцией соединении ртути из образцов крови. Относительное сгаплариюе отклонение резуль-
татов измерении составляет 0.06—0.09. При криогенном концентрировании чувствительность
увеличивается в 20 раз Предел определения 0.2—0.6 мкг т.
978 Глава 10
Заключение
Человек загрязняет атмосферу в течение тысячелетий, и только за последние полвека при-
шло осознание того, что деятельность человека может оказывать негативное влияние на окру-
жающую среду, а ухудшение се состояния опасно для всех живых существ, в том числе и для
него самого. Практически все города России е населением более миллиона человек (включая
Санкт-Петербург и Москву) должны быть отнесены к I или II категориям экологического не-
благополучия («наиболее высокое» и «очень высокое»). Медики и эколот установили прямую
связь между ростом числа людей, страдающих аллертей. бронхиальной астмой, раком и дру-
гими заболеваниями, и ухудшением экологической обстановки в данном регионе.
Задачи экотоксиксмоыш заключаются в установлении возможных путей аккумуляции био-
трансформации. множественных связей экотоксикаитов с геми или иными видами биот и
предсказании экогоксикологических последствий. Особенно важны количественные характе-
ристики устойчивости токсикантов и продуктов их превращений в природных условиях, кото-
рые получают пибо в ходе мониторинга — отслеживания изменения концентраций отдельных
химических соединений путем систематического анализа представительных проб воздуха, воды
и почвы, либо в резулыте лабораторного моделирования.
Традиционно для определения содержания жотоксикатов применяют разнообразные, но
обязательно высокочувствительные хроматографические методы, капиллярный электрофорез
ИСП-МС и другие. Однако эти методы требуют дорогостоящей аппаратуры и высокой квали-
фикации nepcona.IT и малопригодны для оперативного контро. т в полевых условиях Кроме
того, определению каждого биообразна чаше всего предшествует пробополтогонка. Экологи-
ческий мониторинг основан на регулярном провстении определений большого числа образцов
или единичных образцов, но содержащих несколько токсикантов. Технология высокопропуск-
ного екршипна (HTS) зпачигелыто повышает upon тпо.нпельиость лабораторий при соблюдс
нии правил надлежащей лабораторной практики (НЛП. GLP)
Взаимоотношения человека с окружающей средой — одна из сложнейших проблем совре-
менного естествознания. Главная задача охраны природы — обеспечить установление равнове-
сия между использованием и восстановлением ее ресурсов.
Во многих странах имеются национальные нро!раммы природоохраны, учитывающие мест-
ную специфику. Как показывает практика, природоохранная деятельность быстро превраща-
ется из региональной в национальную а затем и глобальную, успехи которой зависят ог всего
мирового сообщества.
В 1992 г. Организацией объединенных наций принят глобальный план по охране природы
на XXI век. направленный па поддержание и усиление экологической безопасности. Так. в ре-
зультате принятых мер в Норвегии и Швеции удалось в определенной степени стабилизировать
состояние окружающей среды и реализовать основные направления национальных программ
но охране и оздоровлению природы.
Россия находится в начале пути, по которому уже достаточно успешно прошли многие сэра
вы. «Надо только освобождаться от обывательства, <... > беречь огонь сердца, укреп тть свое чувс-
тво ответственности и превышать требования. предья&1яеиые к самому eerie* (Ильин И.А.).
Глава 11
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОПАСНОСТЬ
И БИОЛОГИЧЕСКИЙ ТЕРРОРИЗМ
А царь гем яд 1М паи и тал
Свон послушливые стрелы
И с ними гибель разослал
К соседям в чуждые пределы.
.1.С. Пушкин
Возможно, вирусы с их способностью ВКЛЮЧИТЬСЯ в меточный
генем и помыть его были активными учасгниками процесса
оптимизации генетического материала всех живых существ
в ходе эволюции. Просто мы этого не заметили (1969).
С. .Ърия
мурллт Нобемчлюш премии
11.1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ
В копие 80-х толов XX иска появилось понятие «амер ркенгныс вирусные болезни». ставшие
в 90-х годах одной из главных проблем здравоохранения. В течение последних 100 зет ученые не
раз меняли свое прсдставлсгшс о природе вирусов. В 1998 г. некоторые специалисты при исследо-
вании причин заболеваемости крупного рогатого скота коровьим бешенством пришли к выводу,
что инициатором заболевания может быть минеральная матршы. Иначе нельзя объяснить тот
факт, что экспериментальные животные заболевали при введении инфицированного материала,
прокаленного при 600 ’С, i.e. полностью минерализованного. Сегодня предполагают, что виру ы
су зествуют между живым и неживым мирами и яиляются основными участниками эволюции.
Люди разрушают природу, а это влечет за собой нарушение биологических связей и исчерпание
условий су шествования. Со временем волна природных инфекштй будет только нарастать и в этой
лавине можно четко спрятать специально созданные возбудители — мошное оружие «без обратно-
го адреса». Если страны разделятся на тех. кто владеет генными и молекулярными технологиями,
и на тех. кто безнадежно отстает, то люди поделятся на эксперимента оров и подопытных.
В 1975 г. вступил в силу основополагающий правовой документ в с<|к'ре нераспространения
биологического оружия — «Конвенция о запрещении биологического и токсинного оружия»
(КБТО). В отличие от других видов оружия массового уничтожения — ядерпого и химического,
которыми в настоящее время располагает ряд государств мира, участники КБТО обязались не
разрабатывать, не производи гь. не накапливать, не приобретать и не передавал ь биологическое
оружие. Два основополагающих правовых документа — КБ 10 и Конвенция о биологическом
разнообразии (1992)*. принятые мировым сообществом, должны были бы снизить угрозу гло-
бальной биобезопасности. Однако этого не случилось, и человечество сегодня вплотную по-
допью к той грани, за ко орой возможны случаи биологического террора. В перечне наименее
* В 1995 |. Российская Федерация рипн|>ипнров<па Конвенцию о биологическом разнообразии и подписала «Прото-
кол о биологической безопасности-, регулирующий обработку и межгр:ипгчни1| перенос «любых живых ншепеннш
оргянизмои. являющихся резу тьппом исподьюнания биогемкмо! ических методов и способных оказать неблагоприят-
ное Ko.ueBcimie на сохранение и устойчивое использование биологически!» риякюбразня органигмоп».
980 Глава 11
контролируемых и наиболее опасных угроз человечеству подавляющее большинство ; кспертов
называют биоагрессию, биотерроризм и экологические войны. Это заключение основывается
как на уже свершившихся фактах террористических акций в США, Японии. Индии. Кише и
ряде друпгх стран, так и на достижениях в развитии биотехнологии, молекулярной биологии
и медицины. Особую опасность представляет группа эмерджеипгых инфекций вирусной при-
роды. против которых отсутствуют эффективные терапевтические средства. Эмерлжеитг гость
(возникновение, появление нового) следует понимать как наличие у какой-либо системы осо-
бых свойств, не присущих ее подсистемам и блокам. Подобие части и целого не означает их
идентичности. Еще в античные времена была сформулирована аксиома: целое больше сум-
мы его частей. Сейчас она читается как аксиома эмсрдженпгосги: целое всегда имеет особые
свойства, отсутствующие у частей — лолсисгем. и нс равно сумме элементов, не объединенных
сисгемообразуюшими связями. Например, свойства биологического вила или биологической
популяции не представляют собой свойства отдельных особен. Эмерджентностъ невозможно
разложить на составляющие, ее хож ю лишь принять как данность и необходимо изучать не-
посредственно. Это есть нечто изначально целостное. неделимое, присущее только всей систе-
ме в целом и никакому элементу системы в отдельности.
К настоящему времени созданы предпосылки для разработки усовершенствованных био-
логических средств массового поражения. По прогнозам аналитиков, 1990—2010 гг. — период
разработки агентов, мишенью действия которых будут генные структуры клеток. Практически
любые научные достижения могут быть использованы двояко — как орудие пора и зла.
В феврале 2007 г. США заявили о своем отказе поддержать проект протокола к Между-
народной конвенции о запрещении биологического и токсинною оружия, ссылаясь на то.
что проект иротокота подвергнет риску национальную безопасность гг конфиденциальную
коммерческую информацию. Специфика биотехнологий состоит в том. что все они имеют
двойное применение. Работы ио созданию биологическою оружия легко замаскировать иол
ирон золство мирной продукции. У цехов и лабораторий отсутствуют характерные признаки, а
сами готовые средства насту нагельной биологической воины чрезвычайно компактны. Произ-
водить биологическое ор жие можно и на пивоварен г тохг заводе, и на предприятии по выпуску
iorypia. Обнаружить такое производство и установить его истинное назначение чрезвычайно
сложно, а на основе добровольности, как предлагает протокол. — с точки зрения США — во-
обще невозможно. По этим причинам эффективный международный режим проверок является
почти неразрешимой задачей. Правительство США начиная с 1995 г. неизменно признает не-
способность любого из пред, агаемых протоколов улучшить возможность проведения проверки
соблюдения Конвенции о биологическом оружии.
В настоящее время ограничения использования террористами и криминальными структу-
рами биологических средств для устранения отдельных личностей или проведения массовых
террористических акций обусловлены психологическим и интеллектуальным факторами, но не
техническими возможностями.
Ареалы обитания огромного числа возбудителей опасных инфекционных болезней хорошо
известны. Рассматривать возбуди гелей ии<|>екц1юниых болезней, встречающихся в природе, в
качестве исходного материала для ра гработки биологического оружия правомерно, но вероят-
ность их гтснагьзования без применения специальных технологий и оборудования как биоло-
гического оружия массового уничтожения невелика.
Однако существуют многочисленные природные токсины и биорегуляторы, которые, как
показывают реальные примеры их использования (рицин, сакситоксин, тетродотокспн. батра-
хотоксип. аматоксин и лр.), следует серьезно учитывать при системном подходе к биологичес-
кой безопасности
Биологическая опасность* — отрицательное воздействие биологических патогенов любого
уровня и происхождения (от прионов до многоклеточных организмов), создающих опасность в
мсдико-сошталыгой. технолог ической. сельскохозяйственной и коммунальной сферах
Биологическая безопасность — состояние защищенности людей, сельскохозяйственных жи-
вотных и растений, окружающей природной среды от опасностей. вызванных или вызываемых
источником биолог о-соишъ ьной чрезвычайной ситуации
Термины и определения лавы сопато Спракочннку по поражающему действию биологического оружия. 1995 г.
Биологическая опасность и биоло! ическии терроризм 981
Ьимогический тсррариди — использование опасных ополотических агентов тля нанесения ущер-
ба жизни и хюропыо .потен ради достижения целей политическою и материшьною характера
Биорегуляторы — вещества биологическою происхождения, существенно влияющие па про-
текающие в организме процессы.
Генетически модифицированные (сконструированные) организмы — микро- и макроорганизмы
с искусственно измененным геномом, определяющим гаркании свойств ррганиша.
Источники биологической опасности — совокупность природных и техногенных биологических
<|mKiopoii. способных причинить существенный прел тлороттью тилей и животных вплоть до их гибе-
ли. а Также ущерб обществу и экономике путем распространения опасных оиаюптческих .центов.
Обеспечение биилоеической безопасности — соблюдение правовых норм, выполнение сани-
тарно-гигиенических и сани гарно-зпн.темиолот ических правил. технологических и организа-
ционно-технических |ребоваипй. а также проведение соответ ситующего комплекса правовых,
санитарно-гигиенических, сани гарно-jiiii.icmiio.hoi ических. организационных и технических
мероприятии, направленных на предотвращение. ослабление и ликвидацию заражения людей,
сельскохозяйственных животных и растении инфекционными болезнями.
Лопатогены — совокупность факторов природного и техногенного происхождения, нано-
сящих ущерб объектам окружающей среды.
Опасные биологические агенты — патогенные микроорганизмы, токсины и паразитические
организмы. вызываюшие заболевания человека, животных, растений, разрушение материалов,
резкое ухудшение качества окружающей среды
Бактерио югичеекое (биологическое) оружие — специальные боеприпасы и боевые приборы
со сре ггиамн доставки, снаряженные биологическими средствами, предка шаченными титя
поражения живой силы противника, сельскохозяйственных животных, посевов сельскохозяйст-
венных культур, а также порчи некоторых видов снаряжения и материалов.
Токсинное оружие — р. зновттдпость биологическою оружия, поражающее действие которою
основано на болезнетворных свойствах токсинов различного происхождения.
Токсины — высокотоксичные продукты микроорганизмов, природные ялы животною или
растительного происхождения либо их пталопт. полученные метлами химического синтеза,
белки. обладающие высокой биологической активностью и чрезвыча тио токсичные лля вы-
сших животных (рицин, лифгерпйпын токсин, ботулинический токсин и т.д.).
Генетическое оружие — разновидность биологического оружия, поражающее действие ко-
торого основано ил использовании свойств генетически модифицированных микроорганизмов
или специально скопстру трованных молекул нуклеиновом кислоты.
\\ ХУситре коихро.чм УктлсзнеЛ США. опаздше Бмологическмс агент» wvv-л ш
3 категории опасности: А. В. С.
Категория А — это высокоприоритетные агенты, представляющие риск для национальной
безопасности (например. Bacillus antliracis. Clostridium botulinum. Yersinia peats. Variola major).
К категории А отнесены возбудители. способные передаваться от человека к человеку, вызы-
вать высокую заболеваемость тт смертность провоцировать панику среди населения. Для ипа-
кгинпнии биоагентов категории А требуются специальные средства зашиты.
Категория В — это высокоприоритетные агенты (например рицин. е-зоксни. энтеротокси-
ны). Возбудители категории В вызывают заболевания с низким уровнем смертности тт умерен-
ной выраженностью остальных признаков.
Категория С — тто наиболее приоритетные агенты — эмердженгпые патогены, которые
могут быть сконструированы тт лнсссминированы (например, хантавирусы, вирусы клещевого
энцефалита). В категорию С отнесены возбудители. которые могут быть применены в качестве
оружия массовою поражения после различных. в том числе и генно-инженерных, манипуля-
ций в силу их высокой трпнсмнссивпости и способности к воспроизводству и вызывающие
высокую смертность.
Совершенствование подготовки специалистов, осуитесгпляюших лабораторную диагности-
ку природных токсинов и опасных биатотических агентов, является необходимым этапом в
обеспечении биологической безопасности страны.
Изхченнем природных ялов — токсинов — занимается самостоятельная наука токеннаю-
гия. Однако, исходя из целей настоящего издания, далее будет дана краткая информация о
метаболизме и методах аналитической диагностики природных токсинов.
982 Глава 11
Ядовитость — универсальное явление в живой природе. Среди животных и растительных
организмов ядовитые формы встречаются практически во всех таксонах. Хорошо известна вы-
сокая токсичность бактериальных ядов.
11.2. ПРИРОДНЫЕ ТОКСИНЫ: ИСТОЧНИКИ, КЛАССИФИКАЦИЯ,
ТОКСИЧЕСКИЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ,
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
По своей химической структуре токсины весьма разнородны: это алифатические. аромати-
ческие и гетероциклические соединения, относящиеся к алкалоидам. стероидам, полипепти-
дам и другим группам биологически активных вешеств.
Источниками токсинов могуг быть и простые микроорганизмы, и сложно организованные
позвоночные. Действие токсинов может вызывать острое или хроническое отравления, пора-
жая при этом едва ли нс все системы организма. Огромное количество соединений. которые
подходят под определение природных токсинов, нспользусгся в лечебных целях. Классически-
ми примерами являются эрготамин, салициловая кислота, сердечные гликозилы (дигоксин),
антибиотики (пенициллин. циклоспорин), токсин ботулизма, который применяется при ле-
чении блефароспазмов Природные соединения, употребляемые в качестве наркотических ве-
ществ. такие как каннабис, кокаин и морфин, представлены в главе 7.
Разнообразная клиничеекяя картина отравлений токсинами, с одной стороны, и часто очень
сложная, лабильная нх структура, с другой стороны, ограничивают возможности токсикологи-
ческих и аналитических исследований при идентификации токсинов.
Многочисленные химических классы соединений, встречающиеся среди токсинов, позво-
ляют рационально их систематизировать только на основе биологической классификации.
К организмам, продуцирующим токсины, относятся:
• бактерии:
• грибы:
• высшие растения:
• беспозвоночные.
• позвоночные
Рассмотрим лишь некоторые из них.
Токсины бактериального происхождения
Средн множества токсинов, продуцируемых патогенными бактериями, внимание токсико-
ло|ив-аиали1иков привлечено к 3 наиболее сильным бактериальным токсинам: тетанус-ток-
син. токсин ботулизма и веротоксин.
Токсин ботулизма и тстанус-токсин выделяются облигатными анаэробными бактериями
вида Clostriduni и относятся к нейропаралитическим ядам. Токсин ботулизма состоит из 4
пептидов с молекулярной массой 150—900 кД. Тетанус-гоксин состоит из 2 пептидов, объеди-
ненных дисульфидной связью (50—КЮ кДа). Клострадиальные нейротоксины являются силь-
нейшими из известных ялов.
Токсин ботулизма относится к «живым ялам, в организм попадает с пищей, зараженной
токсином С. botulinum. Клиническая картина: диплопия, птоз с последующим ощущением сла-
бости верхних, затем нижних конечностей, в тяжелых случаях развивается паралич дыхатель-
ных систем. Специальных методов лечения ботулизма нет. Возможно применение антитоксина.
Аналитическое определение токсш и ботулизма требует его идентификации в крови или кале па-
циента. Для диагностических целей применяют чувствительны^ иммупоферментнь и анализ —
ИФА (технология ELISA, см. гл 6.2) Как способ летскпии обнаружения бактериальных спор
и токсинов используется биосенсор, основанный на электрохемилюминесценции. Этот анали-
затор обладает чувствительностью, позволяющей обнаруживать фемтограммы токсинов.
Тетанус- токсин образуется в некротизированной ране при заражении спорами С. terani.
Особенно опасен неонатальный тстанус-токсин (летальность при заболевании составляет 24%).
Вероятность летальною исхода снижается при использовании антитоксина и внутривенном
введении пенициллина. В настоящее время пет сведений о широко применяемых аналитичес-
ких методах идентификации и количественного определения тетанус-токсина.
Биологическая опасность и биологический терроризм 983
Один из штаммов широко распространенной кишечной наточки Е. coli. встречающийся
обычно в кишечнике крупного рогатого скота и других животных, продуцирует сильный цито-
токсин — всротоксин (verotoxin). или вероцитотоксин (verocyioioxin). Химическая природа вс-
рогоксипа до сих пор не установлена. Веротоксинпролунируюшне штаммы Е. coli определяют
при помоши полимеразной цепной реакции (ПНР). Д НК-гнбридизации и анализа цитоток-
сичности веротокенна. Прочие штаммы Е. coli. а также и другие вилы бактерии продуцируют
дизентерийные токсины, которые способны вызывать отравление при употреблении заражен-
ного мяса, нс прошедшего лоста очную тепловую обработку. Для детекции обнаружения ди-
зентерийного токсина в образцах кала больного и в зараженном мясе применяется НФА
Микотоксины
Микотоксины представляют собой группу потенциально токсичных веществ. выделяемых
рнпичными видами грибов. Только немногие виды грибов продуцируют токсины, вызываю-
щие смерть при попадании внутрь Значительно большее количество грибов, паразитирующих
на пиш вых продуктах, выделяют токсины, которые могут быть причиной нежелательных эф-
фектов при хроническом попадании в организм в малых количествах. Важную роль в диагнос-
тике отравлений играют аналитические токсикологические исследования
Афлатоксины
Афлатоксикоз — отравление, вызванное употреблением пиши, загрязненной грибками рода
Aspergillus. Афлатоксины Bl. В2, G1 и G2 — группа микотоксинов, продуцируемых плесневы-
ми грибами A.Jlavus и A parasiticus. которые встречаются в нише человека н кормах животных
(например, в кукурузе, арахисе, фисташках). Механизм действия их заключается в том. ч то они
после метаболической активации способны соединяться с пуриновыми основаниями, наручная
связи комплементарных пар оснотяший в днухпеночечной молекуле ДНК. и в результате угне-
тать репликацию и транскрипцию ДНК. а также индуцировать мутации (см. гл. 3). Афлатокси-
ны — потенциальные канцерогены.
Афлатоксин В! является наиболее токсичным. Его главный метаболит — аф токсин М
(рис 11-1) — обычно экскретируется из организма с мочен тын грудным молоком при упот-
реблении загрязненной грибками пиши. Другой продукт метаболизма а флатоксина В,. нревра
шаись в эпоксид, реагирует с ДНК и может провоцировать гепатоцеллюлярную карциному
Афлатоксин В.
АфгатокжО.
Афлатоксин М
Охраток ин А
Рис. 11-1. Структурные формулы афтагокеннои и охратоксина А
984 Глава 11
Существует несколько аналитических методов определения в грудном молоке, .моче и об-
разцах крови афлаюкситтов Gr G,. В, и В,. Методом ТСХ афлатоксины раздсляк>1 на индиви-
дуальные компоненты Bl, В2. GI и G2. При детектировании в УФ свете первые 2 флюорес-
цируют синим. вторые 2 — зеленым цветом. Описаны процедуры их определения при иомоши
нысокоэффек явной тонкослойной хромаю) рафии (ВЭТСХ). ИФА. однако прел почтительным
методом является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флюоресцентной
детекцией.
Охратоксин А — широко распространенный микотоксин, выделяемый грибами A. uchraceus
и Penicillinum verruculosum. его можно обнаружить в зернах кофе, паков, крупяных продуктах,
специях и ).д. Кроме того, возможно заражение человека по пищевым цепям, например через
потребление свинины. Охратоксин А (рис. 11-1) очень устойчив вследствие связывания с ком-
понентами плазмы крови, Г, составляет около 35 дней, является каицеротеном, тераго|еном
и иммунотокеичным агентом Механизм токсичное™ заключается в увеличении уровня пе-
рекисного окисления типнлов. ингибировании реакций алкилирования аминов и. возможно,
превращении в метаболиты, способные образовывать аддукты ДНК (см гл. 3). Идентифика-
цию и количественное определение охратоксина А проводят с помощью ТСХ. ИФА. ВЭЖХ с
флюоресцентной детекцией при длине волны 330 нм. ВЭЖХ с масс-селективным детек!иро-
ванием (ВЭЖХ-МС).
Деоксиниваленол. I -2 токсин, зераленин
Средн других MiiKoioKciiiioB, прсдсчавляюших опасное!ь для человека, необходимо отме-
тить микотоксины /usarium. b gram теснит (Gibberella zeae). F. cuimorum, F. sporotrichcndes. про-
дуцируемые плесневыми грибами, паразитирующими на зерна! злаковых растений (кукуруза,
пшеница) Тошнота, рвота, боль в животе, диарея, головокружение и головная боль возника-
ющие через 5—30 мин после употребления в пишу покрытой плесенью пшеницы и кукурузы,
являются основными симптомами отравления ими.
Деоксиниаалеиал (ДОН) представляет собой микотоксин, принадлежащий к типу трихоте-
цена (trichothecenc) и является модулятором иммунной системы (рис. 11-2). Ежедневная доза
токсина, к которой человек татераитен. составляет 0.5 мкг/кг.
1 -2-пюксин (рис. 11-2) также представляет собой микотоксин, принадлежащий к типу три-
хогепена (irichothecene) и является потенциальным биологическим оружием, поскольку вызы-
вает отравление под названием «элементарная токсическая алейкня* с уровнем смертности бо-
лее 50% (гиперемия слизистых оболочек, слабость. л ихор, ка тошнота, рвота, гастроэнтериты,
прогрессирующий лимфоцпюз. анемия)
Зераленон — производное бснзоксаннклотеградеиина. относится к числу наиболее распро-
страненных микотоксинов (рис. 11-2). Из грибков Gibberella zeae, ранее называемых Fusarium
graminearum. выделяют несколько изомеров этого токсина: штс-. транс-. О- и L-изомеры. Все
они обладают эс ротеттной и анаболической активностью Этот гоксин в нослсденее время ак-
тивно используется в качестве допингового средства в спорте высших достижений.
Обычно через зараженное зерно человек подвергается воздействию сразу нескольких ток-
синов Fusarium, поэтому большинство аналитических методов, используемых для определе-
ния микотоксинов, проводится в одной процедуре. Для опсрашвиою скрининга используется
Рис. 11-2. Структу зные формулы псоксннип.ыенсыа, зераденона и Т-2-токсина.
Биологическая опасность и биологический терроризм 985
ТСХ. Большинство методик количественною определения основано на uuouoit хрома парафин
с электроне-захватных! детектором (ГХ'-ЭЗД) и ВЭЖХ. В ГХ-МС пределы обнаружения для
X различных микотоксинов, включая ДОН. 1-2 токсин, зсралсион. лежат в интервале 0.1 —
0.5 мкг/кг. вероятность обнаружения составляет около
Эргтика ои<)ы спорыньи
Плесневые грибы Clavicepx purpurea паразитируют на зернах злаков, «инне всею на ржи. во
время дождливых сезонов и выделяют токсины, называемые эргоалкалоидами (рис 11-3), ко-
торые в свою очередь называют заболевание зрптпгзм (диарея, рвота, гангрена, конвульсии,
угнетение центральной нервной системы - ЦНС или маниакальное возбуж Зеппе). В зкчюне
химического строения эргоалкалоилон лежит лизергиновая кислота (рис. 11 3). Известно 12
основных xiKa.ioiijioB этой группы. Рекомендуемыми методами определения jpioaiK.i.зоилов в
сыворотке крови является ВЭЖХ е флюоресцентной или млсс-селективной детекцией после
твердо-жидкЗетой экстр; киш При исследовании мочи методами выбора является ТСХ и
I Х-МС
Токсины галлюиииокиных ерибон
Некоторые iipc4icT3iiHic.il и базидиомипстов содержа! галлюциногены к наиболее известных!
представителям относятся Amanita muscaria и некоторые пилы Pxilncyhe. Мухомор распростра-
нен в северном полушарии. а также в Южной Африке. Южной Америке. Австралии и Ноной
Зе мидии. Несмотря на широко распространенное мнение о ядовитости лих |рибов. смертель-
ных случаев среди люден зарегистрировано не было Важнейшим токсином мухомора является
нс мускарин (хотя он и присутствует в следовых количествах), а иботеиовая кислота и ее ie-
карбокси шроваиное upon людное мусцимол. Отравление мухомором в резул1ла1с умышлен-
Рнс. 11-3. CipyKrypiiue формулы jiiiK'piiiHOBoit кне.киы (а) и тргошмпиа (б).
986 Глава 11
Рис. 11-4. Структурная формула мус-
цимола.
пою употребления проянляезся через 20—1«() мин в виде
психоактивного зффскта Мусцимол (рис. 11-4) является
агонистом ГАМК-рецепторов. Это вызывает угнетение
ЦНС. (роявляюшееся в сонливости н з оловокружен и и
с последующим улучшением настроения, возрасипощеи
моторной активностью (тремор, возбуждение, галлюци-
нации) Специфических антижнов нс существует. Исчез-
новение симптомов происходит в процессе мааболизма
токсинов в организме. Не существует падежных методов
анализа иботсновой кислоты и мусцимола в крови и моче.
Для их определения в |рнбах используется ион-парная
ВЭЖХ с УФ-детсктором после экстракции метанолом.
Грибы, накапливающие псилоцин и псилоцибин:
• Strophariaceae (строфарпевые) — Psylocybe, Strvpharia:
• Coprinaceae (навозники)— Copelandia. Panaer. na, Panaeolus, Psathyrella',
• Cortinariaceae (паутинники) — Gyfrinopilus (Phuliota), Inocybe;
• Pluteaceae (плютневые. также называемые вольвариевымн) — Pluteus;
• Bolbiliaceae (болбитуеы. в просторечии «бурые нотаночкн») — Agrocybe, СопосуЬе,
Trichnlomataceae (рядовки) — Geronema. Mycena:
• Hygrophoraceae (гитрофоры. или мокрух О — /fygrvcybe.
На территории России обнаружены 3 вида псплоцибинсодсржашнх грибов (рис. 1-5): Psilo-
cybe scmlianceata (ареал распространения Ленинградская область. Дальний Восток). Inocybeсогу-
daliua (Центральная и Южная Россия) и Panaeolus subbalteaius (Цеигральная Россия. Средняя
Сибирь) Отмечены случаи изъятия из незаконного оборота грибов рола Coprinus. Парне. 11-5
приведены фого1рафни нсмлоцинсадержаших грибов.
Псилоцибический синдром, на ннкаюшни при употреблении многих видов iiobccmcciiio
распространенных исилопибов. обусловлен содержанием псилоцибина (рис. 11-6) и дефосфо-
рил ированного псилоцина. который в 1.5 раза активнее псилоцибина (см гл. 7) Интоксикации
нсилопибинсодержащимн грибами всегда преднамеренны. Основные вещества, обладающие
галлюциногенной активностью, и их предшественники: псилоцин |4-гидрокси-лиметилтрипга-
мнн (ДМТ)|, псилоцибин (эфир 4-1 идрокси-ДМТ в фосфорной кислоты), басопистин |(эфир
4 пирокси-ГЧ-метилтриптампна (NMT) и фосфорной кислоты)! и норбасоцисгин (зфир 4-гил-
poKCH-rpiiiiTiiMHiiii н фосфорной кислоты) обнаружены в псилонибах. В зависимости от вила
и условий пронзрас!ания в одиночном грибе в пересчете на сухой вес содержится от 0.004 5г
и менее до 0.1—0.2% псилоцина и от менее 0.08 до 3,3% псилоцибина. Кроме того, в грт бах
обнаружены серотонин, три гтофан, триптамин и мочевина. Для определения псилоцибина и
родственных индольных алкалоидов в образцах грибов или био югичсском материале исполь-
зуется ГСХ (система метанол—25% раствор аммиака Псилоцибин и псилоцин проявляют
при длине волны 254 нм н УФ-свсте, затем опрыскивают реагентом Ван-Урка для индольных
Рис. 11-5. Внешний вид ipn6on Pxilocybe.
988 Глава 11
• Lepiota spp:
• Conocybe Jilaris.
Токсическое действие npoxivisnor циклические полипептиды (рис. 11-8): фаллотоксины
(бициклические гептапептиды), виротоксины (монопнклическис гептапептилы) и аматоксины
(бициклические октапептнлы). Фаллотоксины разрушают органеллы клетки за счет лизиса ми
гохонлрии и высвобождения ферменшв. стимулируют полимеризацию G-актинов. усиливают
потерю клетками ионов Са2 и К', в плазме крови необратимо взаимодействуют с белками, по-
ражают печень. Аматоксины необрлимо ингибируют РНК-полимвразу II. Отравление бледной
ногайкой можно условно разделить на 3 фазы. Первая начинается спустя 6 ч после употребле-
ния грибов и характеризуется лихорадкой и хотерополобпой диареей Опа объясняется дейс-
твием фаллогщипов и успешно лечится восстановлением электролитного баланса крови. Вторая
фаза наступает спустя 2—3 дня в виде кратковременной ремиссии, которая является ложной,
затем она сменяется еше более опасной третье i фазой, характер» ующейся гепаторенальных и
симптомами, вызванными действием аматоксинов на РНК-полимсразу. Повреждение печени
происходит за счет увеличения активности аминотрансферазы в плазме. Отравления аматокси-
нами смертельны, а- и 0-Лманитины — целевые вещества при исследовании биообъектов при
отравлении блетной ногайкой. а-Аманигин выделен изб. едкой поганки Летсрьером в 1826 г.,
а в 1893 г французский врач Сиберт впервые описал фаллои.гиновый синдром как связанный
с вохгейсIпнем р-аманитииа. Бледная поганка содержи) в каждом <рамме сырых )рибов 0,08 mi
<х-амани)ина и 0.05 мг р-амант нна. всего 0.13 мг. Смертельная лоза а-аманитипа для человека
составляет 5—8 мг (нерорш ьно). Аманигины содержатся но всех видах )рибов. в том числе и в
съедобных. Ни один из предложенных антидотов не мт положительных результатов, посколь-
ку гепаторенальные симптомы проявляются только после необратимого связывания токсинов
соответствующим ферментом. Трансплантация печени является одним из вариантов лечения.
Сложная химическая структура и низкая концентрация в плазме затрудняют идентификацию
токсинов в крови. Предел обнаружения р-аманитина методом ИФА равен примерно 80 пг/мл.
метолом ВЭЖХ с электрохимическим детектором — 2 мкг/л. ВЭЖХ-МС — для а- и р-амани-
тина — И) мкг/л.
Гираметрин, содержащийся в ложных сморчках
К ложным сморчкам относятся (рис. 11-9):
• Gyromilru Ьгиппеа.
• G. Caroiiniana;
Рис. 11-8. Структурная форму га а-амавгиина
Биологическая опасность и биологический терроризм 989
• G. Esculenta
• G. fastigala, G rifula, G. gigas:
• Helvetia elasfica, //. Lacunosa;
• Рампа spp.
• Sarcosphaera erassa
Пирометрии — компонент трибов. который в
процессе их житнедеятельпоспт гидролизуется в
моттомстилтзотразин — хорошо известное высо-
котоксичное ракетное топливо.
Отравления с летальным и ходом после упо-
требления этих грибов составляют от 2 до 4%
общего количества отравлений грибами в Евро-
пе. Мономстилгиаразин — прозрачная жидкость
с харакчерным запахом органических аминов,
смешивается с водой. гидразином, спиртами. Рис. 11-9. Внешний юю фибов ОупмяЛл»
растворим в углеводородах слабое основание,
мошный восстановитель, возгорается при кон-
такте с окислителями. Симптомы отравления ложными сморчками напоминают отрвняение
бледной поганкой Amanita. Латентный период 6 -10 ч после употребления, затем возникают
резкие бо. и в животе, ей тытая головная боль, тошнота, иногда диарея, боль во всем челе, судо-
роги. Токсином поражается в первую очередь печень, и. меняется состав крови, наблюдаются
симптомы перевозбуждения ЦНС: нарушение координации. кома, конвульсии. Исслелшпчис
биообъектов прочюдяг метолом парафазового анализа 11ФА-ГХ с пламенно-ионизационным
детектором ( ПИД)
Каприн
Копрг чч содержится в «чернильных» грибах Сорпп is (рис. 11-10). к которым относятся
• Coprinus atramentarius — гриб инков;
• ( ткасеш
• С ritscescens
• С insignit
• С spp. (некоторые африканские виды)
• Clitocyhe clavipes.
Конрнн — аминокисло а. бди чкая глутаминовой Неядовита до момента приема алкоголя.
I рчтоы вида Coprinus atrinientarius считаются совершенно съедобными, если употребляются
без алкогольных напитков. Химически копричч сходен с антабусом. Симптомы появляются
обычно спустя 5—30 мин после еды. если до этого в течение последних 72 ч человек упот-
реблял алкоголь. Симптомы отравления: покраснение липа, обильное потоотделепчче. частое
с затруднением дыхание, брадикардия, сильная тозонная боль, тошнота и рвота. Действие за-
канчивается через 2—4 ч.
фитотоксины
Рицин
Рицин — высокоприоритетный токсичный агент категории В (см выше). Phiiihi — расти-
тельный лектин, содержащийся в Ricinus communis (плодах клещевины), а также в некоторых
Рис 11-10. Внсшппй вид грибов
Coprinus.
990 (лава 11
видах Jatropha. Эю белок, состоящий из 2 иолипептидных пеней с молекулярной массой
34 кДа ажлая. соединенных дисульфидным мостиком. Цепь А интмбнрует синтсз белка. Цепь В
представляет собой галактозамин- или N-аистилгалактозамин-лектин. ответственный за свя-
зывание рицина с рецепторами клеточной поверхности. Цепь В способствует проникновению
токсина в клоки. Человек может подвертаться действию рицина при попадании в пишу ядо-
витых семян. В медицинском касторовом масле рицина нет из-за его гидрофильности. Редко
рицин применяется в терапевтических целях как иммунотоксин.
При отравлении рицином ортаном-мишенью является печень, наблюдаются внутрисосудис-
тая агрегация эритроцитов, острая адренокортикальная и почечная недостаточности. Иденти-
фикацию и количественное определение рицина в тканях проводят с помощью ИФА (предел
обнаружения 0.2 мкг/л). Иммунохимические методы (ИХМ) с хемолюминиснснтной детекци-
ей имеют нредет обнаружения 0.1— 1.0 мкг/л.
Фитс гт ксииы, содержащиеся в растениях семейств зонтичные и сложноцветные
К наиболее известным токсичным видам семейства Umbelliferae относятся Cicuta virosa (вех
ядовитый, цикута) и Conium maculatum (болеголов крапчатый или пяшиггый) Первый содер-
жит полиин иикутокеин в качестве активного компонента, второй — пиперидиновый алкало-
ид кониин (конин) (рис. 11-11). Цикутоксип поражает в первую очередь ЦНС. в то время как
кониин действует на нервно-мышечные синапсы и может привести к респираторной недоста-
точности. Оба токсина относятся к сильным ядам с высоких! уровнем смертности сразу после
попадания внутрь. В обоих случаях лечение симптоматично.
Корневище и корпи веха ядовитого содержат цикутоксип (до 2%) и иикутол. а также неядо-
витое эфирное масло желтого цвета, в состав которого входят пнимол. куминовый альдегид, в
траве обнаружены флавоноиды кверцетин и изор. мнетин Вех — одно из самых ядовитых рас-
тений. Оно ядовито полностью как в свежем, так и в сухом виде, особенно корневище и корни.
ИЮ—200 I корневищ и/или корней достаточно, чтобы убить корову, а 50—100 г убивакм овну,
а вот жаворонки и перепелки спокойно, без вреда для своего организма, склевывают семена
веха ядовитого. В зависимости от времени года и климатических условий токсичность расте-
ния изменяется. Весной более ядовито корневище. Симптомы отравления ноявлякися через
несколько минут после попадания в организм, гак как цикутоксин очень быстро всасывается в
желудочно-кишечном тракте. Горечь во рту. боль в животе, слюнотечение, рвота, расстройства
дыхания и кровообращения, бред, судороги — признаки отравления вехом. Смерть наступает
от паралича дыхания. 50% отравлений смертельны.
Рис. 11-11. Структурные формулы конина (а) и пнкутоксииа (6). цветки цикуты (и).
Биологическая опасность и биологический терроризм 991
К другому классу токсинов, источником которых являются растения семейства Apiaceai
(сложноцветные). относятся фурокумарины и псоралены. Наиболее известным псораленом
борщевика является 8-метоксипсорллен (8-МОП). он используется в терапии псориа а в ком-
бинации е УФ-облучснием. В биологическом материале псоралены могут быть обнаружены
метолом ВЭЖХ. Как токсическое, так и терапевтическое действие основано на связывании
активных продуктов реакции, образованных из 8-МОП иод действием УФ-света. с ДНК в
батальных клетках эпилермися. Фототоксичность псоралена иепользуется тля инзыикании
патогенов в донорской крови при предварительной оорзботке перед трансфузией препаратов
крови. Для этой ноли используется фурокумарип — амотосален.
Р- \'-окса.ш /амино / танин
Чипа посевная (Lal) yrussaiivus} встречается повсеместно и содержит аминокислоту p-N-ок-
салпламипо-1 -аланин (БОАА). которая вызывает нейролевенервгпвные поражения, лигирпзм.
Механизм действия L-БОАА связан со стимуляцией глутамат-рецепторов. Это действие сторер
специфично а-Изомср D-БОХА облапает более слабым нейротоксичным действием.
Пиками
Нейротоксин инказин — метилазоксиметаиол-р-О-глюкозил — содержится в семенах са-
говника завитого (Cycas arcinalis.). который произрастает на о. Гуам (один нз Марианских
остров Тихого оксана) и на японском полуострове Кии, Семена саговника содержит два класса
вешеств с потенция тьнон нейротоксической активностью — аминокислоты и лзоксигликози-
лы. Гоксичпые аминокислоты имеют близкую с БОАА химическую структуру, но являются
двухосновными кислотами Под действием р-глюкозилазы пи казни метаболизирует в метила-
зоксиметанол. который является прямым алкилирующим агентом ДНК с гепатотоксичсским.
мхтагенным, канцерогенным и тератогенным свойствами
Дигоксин и дигитоксин
terhera odollam растет и Индии и Юто-Восточной Азии. Его нашали «дереном самоубийц»
(рис. 11-12). За 1989—1999 гг. только в одном индийском штате Керала было зарегистрировано
более 500 случаев отравления Cerhera Симизимы огратстения дигоксином хорошо t звесгны
Метод Hcc'ie.iOB.iniiH биообъектов — ВЭЖХ-МС-МС.
Наперстянка круииопветковая (Dyfytalis grandiflora Milf) содержит большое количество сер-
дечных гликозидов карленолилной природы в том числе пурнуреагликозил А (дезанетилланго-
зид А), пурнуреагликозил В (лезанетнхдантозил В), которые в процессе хранении и высуши
вания ферментативно расщепляются соответственно на дигитоксин или гитоксин и глюкозу
Ядовита надземная часть, особенно листья. Гоксическое действие дигитоксина связано с угне-
тением работы натрий-калнекого насоса миокарда, ‘по приводит к значительной потере внут-
риклеточного К+ и развитию экстрасистолии. Сер точные гликозилы наперстянки обладают
способностью к кумуляции в организме животных и человека.
Для судебно-химического доказательства отравлении карленолидами независимо от способа
их введения и химической структуры исртюсгснсииое значение имеет исследование печени и
невскрытого желчною пузыря, верхнего отдела тонкой кишки и ткани сердца Изатирова-
Рис. 11-12. Цветок Cerbin odollam (а) и структурная форму та дигоксина то).
а
992 Глава 11
иис сердечных гликозилов дигиталиса проводят 70сс раствором канола без подкисления .1ля
очистки извлеченных карленолияов используют осаждение белков этанолом, экстракцию бал-
ластных веществ четыреххлорнстым углеродом, промывание извлечений раствором шс ючи
Возможно применение ТСХ в системе растворителей хлороформ-меганол (К.5:1,5). Проявле-
ние проводят щелочным раствором 3.5-линнтробензойной кислоты в метаноле. В зависимости
от количества токсиканта окраска пятен меняется от розовою и сиреневою цвета до малиново-
го. При детектировании пятен 0,075% спиртовым раствором 2.4-динитроди-фенилсульфоном в
щелочной среде пятна приобретают голубую или стопою окраску.
R-
лититоксинл 0,60—0,68 (0,62).
движения 0.48—0.55 (0,50);
ланатозида С 0,20—0.29 (0.24);
дезанстилланатозида 0.14—0.22 (0.17).
Абсорбционная спектроскопия (при длинах волн от 300 до 550 им) растворов в концен-
трированной серной кислоте позволяет дифференцировать дититоксин (\ж 470 — 475 нм)
и дигоксин (Xu K 320, 385 и 475 нм). Терапевтические лозы строфантина К лаже в период
насыщения организма гликозидом нельзя обнаружить этим методом. Поэтому качественное
обнаружение строф нтина К в моче может служить доказательством введения пострадавшему
завышенных лоз гликозил;-! Терапевтические дозы дигоксина. как правило, обиируживаю'1 в
моче больных в период насыщения организма карленолилами. Наряду с нативным карлено-
лнлом (или вместо него) обнаруживают метаболит с сохранившимся бутсполилным никлом.
R которого превышает R дигоксина на 0.1—0.2. Другим методом исследования биообтлктов
является ВЭЖХ-МС-МС.
Зоотоксины
Многие зоотоксины обладают высокой токсичностью и представляют реальную опасность
для человека и животных (табл. 11-1).
Таблица 11-1. Сравнительная токсичность некоторых широко известных токсинов
Токсин И СП! источник IJ>„ (мыши), мг/кг
Мускарин (алкалоид мухоморов) 1
Зоман (боевое справляющее вещество) 0.1
Нейротоксин кобры 0.075
Нейротоксин скорпиона 0.009
Сакситоксин (из динофлагеиыат) 0.008
Тетродотокснп (из рыбы фугу) 0,008
Ьатрахотокеии (кожный ял амфибий) 0,002
Примечание. Для сравнения - LDW inijjiti.u калия сосипляет 10 мг/ш
В этом разделе обсуждаются только некоторые из них. имеющие клпнико-токсикологичсс-
кос и криминалистическое значение. Токсиноло!нческая классификация ядовитых животных
представлена на схеме 11-1. Первично-ядовитые животные вырабатывают ядовитый секрет в
специальных железах, различаются по способам выработки и применения яда. Вгорично-ядо-
ВИ1ЫС животные используют яды друшх оршнизмов (например, насекомые, обитающие на
ядовитых растениях).
Активно-ядовитые животные имеют специальный аппарат, который у вооруженных живот-
ных снабжен ранящим устройством (зубы у змей, жало у насекомых, колючки у рыб). Невоору-
женные животные лишены ранящего приспособления (кожные железы амфибий) и оказывают
токсическое действие при трансдермальном контакте.
Пассивно-ядовитые животные накапливают ядовитые продукты метаболизма в раыичных
органах и тканях и представляют опасность только при попадании и пищеварительный гр кт
другого организма.
Действие зоотоксинов может быть местным (в месте его первичного воздействия) или ре-
зорбтивным. В зависимости от химической природы ядов местное действие бывает очень енль-
Биологическая опасность и биологический терроризм 993
Схема П-1. Гокс миологическая
классификация ядовитых живот-
ных
Пассивно ядовитые
АкГИВНО-ЯЛОВИТЫО
Вооруженные
Невооруженные
ньзм. в тяжелых случаях приводящее к некрозу пораженной ткани (яды кишечнополостных,
гадюк. жалоносных перепончатокрылых), но возможно и преобладание общих симптомов от-
равления после всасывания яла из первично о депо (яд каракурта
1 оксины характеризуются высокой специфичностью действия Так. нейротоксины змей на-
рушаю! передачу возбуждения в нервно-мышечных синапсах, токсины амфибий (батрахоток
син), рыб (тетродотоксин). простейших (сакситоксин) блокируют распространение нервного
импузьс. , ферменты ялов гадюк воздействуют ня свергиваюшсю систему крови
Фикотоксины
Токсины водорос левого происхождения называются фнкотоксинами Отравление моллюс-
ками. вызванное фикотоксинами, обычно проявляется у человека
• паралитической интоксикацией (сакситоксины);
• рнарейнон интоксикацией (например, окадапновая кислота);
• нейротоксическим дсйсишсм (бреветоксин);
• амнестической интоксикацией (домоевая кислота)
/ 1аралитическая интокхикания вызывается сакситоксином, продуцируемым морскими ли-
иоф.1 лгеллазами (зак называемые красные прззлпвы) зз прссноззо гзымзз сине-зелены ми водо-
рослями. например Mexandnum хрр., Gymnodi/iiitm cutmatu зз Pyrodinium bahamense. В конце
50-х годов XX века из моллюсков выделили токсин наптнный сакситоксином. Впоследствии
сакситоксин был ззолучен из динофлагеллят и крзбов. обитающих на коралловых рззз|их Ме-
тол 1мзз рентгенострх’ктурного анализа и ЯМР-спе-ктроскопнн была установлена химическая
природа сакситоксина (рис 11-13). Тго волорпстворимый зерзззизт пурина. образующий соли
с минеральными кислотами Фармакологическое дез(ствие сак итокеззна связано с его ззеи
ротронной активностью Олзззз зз з наиболее опасных симптомов отравления токсином — пара-
лич дыхазел|.иой хзуску.затуры. Смерзедьная доза сакситоксина хзя взрос того человека (массой
70 кг) 0.3—1 mi (по ланныхз из разных источников).
Рис. 11-13. Структурные формулы сакситокспнп и его co.ni.
994 Глава 11
Смерть может наступить в течение 2—12 ч после отравления. Механизм юксичносзи сакситок-
сина связан с прямым действием на возбудимые мембраны. Его сильное деполяризующее действие
опосредовано селск।нвным увеличением проницаемости для мафия в мембранах нервных клеток
и клеток поперечно-полосатой мускулатуры. В основе лежит высокая аффинность токсина по
отношению к специфическому сайту (связывающему полиэфирные цепи) рецептора ионного ка-
нала. который отвечает за активацию натриевых и кальциевых каналов (см. рис. 8-42).
Надежный метод определения сакситоксина — ВЭЖХ с флюоресцентной детекцией. Мно-
гие из фикотоксинов, включая сакситоксин, могут быть детектированы и количественно оп-
ределены меюдом флюориметрической детекции при длине волны 330 нм (возбуждение) и
440 нм (эмиссия).
Лиарейная интоксикация шшюсками. Главным токсичным агентом является окала и новая
кислота (рис. 11-14). которая продуцируется главным образом линофлагеллаыми. приналлеж I-
шими к виду Dinophysisand Proroce игит. Эту токсины липофильны и накапливаются в пищева-
рительных железах мидий. Окадаиновая кислота является сильным ингибитором протеиновых
фосфатаз 1А и 2А. У человека, съевшею зараженного моллюска, проявляются в основном
желудочно-кишечные симптомы: диарея, тошнота, рвота и боль в животе, которые возникают
спустя некоторое время после приема нищи (от 30 мин до нескольких часов), для отравления
достаточно 40 мкг токсина. При отравлении необходимо поддерживающее лечение, полное
выздоровление происходит через несколько дней. В настоящее время нет простых и доступных
аналитических методов определения окадаиновой кислоты в биообъектах
Нейротоксическое действие вызывается токсином, продуцируемым другим видом динофла-
геллятов — Gymnodin ит breve, который распространен па западном побереж|л Флориды. в
Мексиканском заливе, Японии и Новой Зе анлим. Причиной токсичности является липо-
фильный полиэфир бреветоксин В и С (рис. 11-15). молекулярная масса которых составляет
примерно 900 Д; бреветоксин относится к наиболее сильных! из известных токсинов. Принцип
но
Рис. 11-15. С>рук1урная формула бреветоксина В и С.
Биологическая опасность и биологический терроризм 995
токсического действия бреветоксина схож с гакопым нигуатоксина (ем. ниже). Бреветоксин
относи гея к деполяризующим агентам в холинергической системе, он открывает мембранные
натриевые канаты (см рис. 8-42). Результатом является увеличение поступления ионов на-
|рня в клетку. которое может быть заблокировано гстродотоксином (см. ниже). Результатом
<нр вления человека моллюсками, зараженными бреветоксином. может быть гастроэнтерит и
неврологические симптомы. В течение 3 ч появляются тошнота, рвота, парестезии, изменение
ощущения тепла и холода, ощущение сжатия горла и атаксия. В течение 2 лисп происходит
полное исчезновение этих симптомов без специального лечения. Бреветоксин может быть де-
тектирован методами ИФА и ВЭЖХ-МС-МС
Амнестическая интоксикация малиосками была названа морской интоксикационной болез-
нью в 1987 г. Токсичность обусловлена трикарбоновой ломоевой кислотой, которая синте-
зируется некоторыми вшами диатомовых водорослей pom PscuiionitSachia. Домосвая кислота
(рис. 11-16) является нейротоксичным агентом, она конкурентно связывае! клиновую Kucaoiy
и « <1мнно-3-ги.трокси-5-метил-4-изоксазотепро11иоиовую кислоту — подтип 1.тутам-ал1ых ре-
цепторов в ЦНС, что привозит к повышению уровня спобопюго внутриклеточного кальция
п разрушению клетки (см. гл. 3). При концентрации ломоевой кислоты 20(. мкг в 1 г тела
моллюска могут проявип>ся симптомы О1рандсния v человека. Симптомы острого отравления:
рвота и диарея, а в некоторых случаях — потеря памяти, дезориентация. кома и смсргь. Ос-
таточные неврологические проявления, особенно конгитивная дисфункция, характерны для
большинства пациентов. у которых поражение ЦНС длилось в течение 48 ч. Домосвую кислоту
можно определить различными аналитическими методами, что связно с ее сравнительно прос-
той химической структурой. При ТСХ использовали систему растворителей бутанол — уксус-
ная кислота — вода (3:1:1). Rf ломоевой кислоты — 0.45. Предел детектирования ломоевой кис-
лоты в биообразиах методом ВЭЖХ с флюоресцентным детектором очень низкий — 0.001 нт.
ИФА с использованием моноклональных антител к ломоевой кислоте позволяе! определять ее
концентрации на уровне 0.11 — 1.81 нг/г.
Для опрсдс «синя домоенои кис юты часто нсноть устся метод капиллярного электрофореза
(КЭ) с УФ-детекцией. Он имеет преимущества перед ВЭЖХ. полому чю с сю помощью могут
быть рахтелены некоторые изомеры ломоевой кислоты. Однако предел обнаружения эз им ме-
тодом составляет 150 нг/г в тканях, что значгпельно выше, чем получаемый методами ВЭЖХ
и ИФА.
Конопюксин улиток
Известны укусы нскоюрых видов улиток рола Conus, вызывающие смерть человека. Есть
мнение, что. возможно, существует 50000 конотоксинов. содержащихся в различных видах рода
Conus. Ял Со. geographtis содержит несколько пептидов. а-Конотоксин представляет собо пеп-
тид из 13 аминокислоте 2 дисульфидными мостиками, который обладает сильной антаюнис-
гнческоп активностью по отношению к никотиновым
рецепторам: р-конотоксии начнется б окпором на-
триевых каналов (как тетролокенн). ш-Конотоксин —
пептид, вызывающий характерный тремор, в насто-
ящее время используется в неврологии. Пептидные
коногокенны определяют метолом ВЭЖХ
Токсины книЛцшй
Книдарии мо1\т быть прикрепленными, например
ci ценные (жгу шс) коралты {Millepora alcicomi\). или
свободно плавающими, например медуза «португаль-
ский военный кораблик» (PIisalia phisalis) формами. У
них есть стрекательные клетки или нематоцисты (кап-
сула диаметром 40 мкм. которая содержит вязкую жид-
кость с множеством различных токсинов) и лишние,
похожие на волоски спиральные трубочки (нема).
Паштоксин. Зоонарии — своеобразная группа ко-
раллов. напоминающих своим внешним видом мелких
актинии, из которых выделено высокотоксичное соеди-
нение палитоксин (рис. 11-17).
Рис. 11-16. Структурная формула т>мо-
евои кислоты.
996 Глава 11
Рис. 11-17. Зоопарки, обитающие в регионе острова Таши и Гаванских островов <а) и структурная <|юр-
мула палитоксиня (б).
Палитоксин — один из самых сильных еполяризуюших агентов. Он вызывает сокращение
гладкой мускулатуры в концентрации 10"1 г/мл. При отравлении этим токсином используют
защитное действие кортикостероидов и калы!ийзнвисимый эффект палитоксина.
Токсины медуз весьма сложны по свое i природе и разпоиапраитены по действию. В их состав
входят тетрамин, вызывающий паралич нервных окончаний. таласснн. поражающий кровсиос
ную систему, конгестин, обладающий анафилактическим действием, повышающий чувствитель-
ность организма к остальным компонентам яда и влияющий на дыхательный центр, и гипноток-
син. вызывающий оцепенение и сонливость. Яд медуз обладает большой стойкостью, поэтому
книларни нельзя брагь в руки, тже е ти они мертвы. О трая системная реакция организма при
отравлении может включать гипотензию, шок. припадки. атаксию, гемолиз, острую почечную
недостаточность и смерть.
К другому смертельно опасному виду медуз относится Stomofphus nomurai. который рас-
пространен в возах Китая. Самая ядовитая медуза в мире — австралийская морская оса (рис.
11-18). После прикосновения к ее щупальцам человек умирает через 1—3 мин. если не будет
оказана медицинская помощь. Диаметр ес купола всего 12 см. но щупальца имеют длину 7—8
м. Токсин морской осы по своему действию аналогичен ялу кобры, парализует сердечную
мышцу, действует избирательно, вызывая спазм сосудов, нарушения сердечного ритма, пе-
риферическую нейропатию, афонию, нарушение зрения и дизавюномию парасимпатической
системы. Родственные вилы, например Cartikia bamesia. произве ят токсин, который по эф-
фекту схож с интенсивным высвобождением катехоламинов, этот токсин повреждает миокард
Для выделения, очистки и идентификации ялов книдарий используют КЭ и ИФА.
Токсин физаши. Характерным представителем сифонофор (класс гидроидные медузы и по-
липы) является физалия (рис. 11-19). Плавательный пузырь фтгзалии ярко окрашен и дрейф
физалий напоминает маневры парусной флоттыии. что и послужило основанием называть их
•’португальский военный кораблик1». Стрекательные к. етки расположены на длинных щупальцах
под гы звательным пузырем, В составе токсина обнаружены АТФаза. нсснспнфичсская амино-
пептидаза. РНКаза. ДНКаза. АМФаза и фибринолизин. Токсин физалии обладает выраженны-
ми мембраиотроипымн свойствами, проявляет фосфолипазную активность. В тяжелых случаях
наблюдаются расстрот ства дыхания, сердечной деятельности, судороги, летальный исход. Лече-
ние симптоматическое.
Биологическая опасность и биологический терроризм 997
Рис. 11-1Я. Хжлра. hi некая морская оса (СЫпнк*
fleckeri)
Ряс. 11-19. Фнкиня Phixalia eretioa
Иашлсптидные токсины актиний рлхлклпкп на нсйроюксины. характеризующиеся высокой
специфичностью в'зяпмолейегвия с ионными каналами. и нитотоксины — мембрпноактшшые.
Токсины головоногих и брюхоногих ио l носков
( ре in мол носков можно ветреешь типичные формы активно-ядовиты к (конусы, головоно-
гие) и пассивно-ядовитых (некоторые брюхоноше и большинство двустворчатых).
Гипобрлпли.тмшые железы моллюска иурекс содержат токсин мурексином и ею аналоги.
По своему физиологическому действию мурексии и его аналоги (например, акрилхолии) по-
добны аценыхатину (рис. 11 -20).
Впоследствии мурексии был сишезиронвп и назван уроканндхолином
Уктг осьминогов (головоногих моллюсков) вызывает очень сильную боль и нередки может ока-
зшься для человека смертельным из-за токсичного белка цефалотоксина и небелкового токсина
маку.тотоксина. близкого по действию и свойствам тстролотоксину (см. рыбы фугу). Симпюмы
отравления: быстро развивающийся паралич. приводящий к нарушению функции дыхания.
Самый опасный осьминог среди нссх iоловоногих — голубокольчятый (длина не более
20 см. масса до 100 г) в возбужденном состоянии покрывается ярко-голубыми пятнами, отсюда
ею другое название — •голубая смерть* (рис. 11-21). Ею токсин включает 2 компонента, кото-
рые действую! одновременно на нервную и мышечную системы.
Такс ины арахнид и гименонтср (членистоногих)
Клеши, пауки, скорпионы (арахниды) и пчелы, осы. муравьи (гименопгеры) обычно вво-
дят свои токсины при помощи жала. По химическому строению и механизмам токсическою
действия ялы членистоногих относятся к разным группам. Роль аналитических исследований
сн,
/
СИ = СН СООСН2— СН2 CHj— n\-ch
;< сн3
сн3
Н,С=СН— COJCH2),--------Nt____
•. СН
б
3
Рис. 11-20. Струк1урныс формулы мурсксина (л), акрплхолини (б>.
998 Глава 11
Рис. 11-21. Осьмниоз го.тубокольчатын [Hapalochla-
епа maculosa).
Рис. 11-22. Скорпион {Scorpiones).
при укусе жалом ограничена, и поэтому в этот раздел включены лишь немногие из наиболее
важных ядов членистоногих.
Скорпионы предо 1авлиюг собой серьезную опасность для здоровья людей, живущих в стра-
нах с жарким климатом. 30 видов скорпионов, распространенные по всему миру, продуциру-
ют потенциально смертельный токсин. Основными компонентами, определяющими свойства
токсина скорпиона (рис. 11-22), являются видоспеппфнческие нейротоксины полипептидной
природы, взаимодействующие с ионными каналами, что приводит к повышению активности
пресинаптнческих нервно-мышечных соединений. При этом поражаются парасимпатическая,
адренергическая системы и мозговая оболочка надпочечников, что объясняет широкий спектр
клинических проявлений у пестра авших
Яд скорпиона содержит по меныпей мерс 85 различных пептидных нейротоксинов.
Таксины титулов-тенетников (рис. 11-23), которых в отечественной литературе называют «ка-
ракурт*. а в аш оязычной — «черная вдова» (black widow), вызывают судороги, слюно- и
слезотечение, коматозное состояние, отек легких, паралич и смерть. Основным действующим
начатом токсина является кислый белок а-латротоксип. в состав которого входит около 1000
остатков аминокислот, они необратимо связываются с пресинапгической клеточтк и мембра
ной. генерируя ионные каналы и мешая эндонитозу везикул мембран При лечении назнача
ются специфические антидоты и мышечные релаксанты.
Укус австралийского сиднейского лей
копаутинного паука (Л/гох robustus) способен
вызвать смерть в течение 15 мин. Рооусто-
пюксин действует, открывая натриевые ка-
н ты в аксонах жертвы. Родственные виды
Hadrvnynche versutus продуцируют версуток-
син. дающий аналогичный эффект. Другую
симптоматику вызывает коричневый (бурый)
паук-отшельннк Loxosceles spp.. 5 видов ко-
торого распространены на юге США. Их яд
содержит набор ферментов, которые вызыва-
ют некротический арахнидизм в месте укуса
и широкий спектр системных симптомов —
от лихорадки и артралгии до диффузной внут-
рисосудистой коату.тянии и почечной нело-
ста очпости.
Токсин тарантулов — полипептид, состо-
ящий из 104 аминокислотных остат ков и со-
держащий 5 дисульфидных связей. вызывае>
сокращение гладкой мускулатуры анало-
гично брадикинину. Ядовитость тарантулов
Рис. 11-23. Каракурт (Ixnrodeaus macians), или
«черная вдова» (black widow).
Биологическая опасность и биологический терроризм 999
Рис. Н-24. Тарантул [Lycota laremuhn
(рис. 11-24) имеет сезонные колебания. макси-
мум токсичности их яда прич иится на период с
мая по август.
Кичци больше известны как переносчики
ряда инфекции и инвазий. Однако они выде-
ляют опасный гоксин. обладающий свойствами
ингибитора протеаз.
Токсины насекомых (Insecta)
Токсины ос и пчел — сильные аллергены. со-
держашие MCDP (mast cclldcgrannlaling peptide)—
пептиды. зстраиулируюшие тучцые клетки и
высвобождающие из них гистамин. Общие про-
явления отравления при жалениях осами кож-
ные (сыпь тина крапивницы). циркуляторные
(апафи.тактический шок), отечные (отек Квинке), астматические (удушье и зкепираторндя
одышка). Яд ос — сложная химически гетерогенная система, в которой идентифицированы
ферменты, полипептиды, физиологически активные биогенные амины (гистамин. дофамин,
норадреналин) и ацетилхолин. Сочетание гистамина и ацетилхолина вызывает очень сильный
тюлевой эффект Осиный яд содержит ферменты, схожие с таковыми пчелиною яда. но с до-
бавлением холннестера । и фосф« ангины Л1 вместо фосфолипазы Л2.
Из яг крупного шершня К mandarine. обиттюшего в К)ю Вюточнон Аши. выделен ней-
ротоксин мандаротоксин. Опасность смертельною ужаления этого шершня связана с большим
к< шчеством яла (до 20 мг). содержащегося в его ядовитом аппарате. Токсин лишен гемолити-
ческой и ферментативной активности и является типичным нейротоксином.
Основная фракция тетиного яда содержит пептиды (пеггпи-401. апамин. мелиттин) и фер-
менты (фосфолипаза А2 и гиалуронидаза) Мелитгии. который способен гидролизовать мембраны
клеток, яктяется основной причиной боли при укусе пчелы. Адлер!пческие реакции, вызываемые
главным обра юм антигенными свойствами фосфолипазы А2. опосредованы IgE. Повторный укус
с интервалом менее 2 мес является риском развития гимсиоптсровой адлерши.
Биологически активные вещества, входящие в состав пчелиного яда. принято ралдслятъ на
несколько групп: белки с ферментативными свойствами (фост]юлипаза А2. гиалуронидаза и кис-
лая фосфатаза). токсичные полипептиды (мелиттин, апамин. MCDP, icprirnnmi. секапии. гис-
тамннсодержащие пента- и тетранептиды), биогенные амины (пк-тжмин и в незначительном
количестве дофамин и норадреналин). Оспенной компонент пчелиною яда — мелиттин — по-
линенгпд сильного цитолитического действия, состоящий из 26 аминокислотных оста!кмз
NH. — Глн- Иле—Гли—Ала—Вал—Лей—Лиз—Вал—Лей—Тре—Тре—Глн—Лей—Про-
Ала—Лей— 11ле—Сер—Три—Иле—Л н з—Apr—Лиз— Apr— Глн—Глн — CONH
Мслиттпн обладает ан nt коагулирующим свойством, активирует систему фибринолиза, уг-
нетает окислительные процессы в о лученном организме, унеднчпвдет сопротивляемость к
стрсссорным воздействиям. Болеутоляющее и противовоспалительное действие пчелиною яла
во многохз связано с эффектами MCDP и активацией гипофизарно-надпочечниковой системы.
Основной антиген пчелиною яда — белок PLA2. главная причина гемолиза эритроцитов и
разрушения клеточных стенок, действует в синергизме с мелиттином.
Резкие запахи (духи, одеколон, спиртное и т.л.) действуют на пчел как аггракг.ппы.
Среди токсинов жа.гоносиых м\равьев. жуков нарывников. плавунцов. бомбардиров, божьих ко-
р вок идентифицированы вещества гегероинклическоп (рис 11-25) и полипептидной природы,
оказывающие нейро- и дсрматотоксическое гейсгвие, а также вызывающие нарушение водно-
солевою обмена. Яд красных муравьев Solepnoxb inrivta содержит фосфолипазу А) и другие
аллергены, родственные кеспид (vespd) ялам.
Наибольшую опасность представляет попадание кантаридина (либо целых шпанских му-
шек) в пищеварительный тракт. Смертельная юза для человека при приеме внутрь кантариди-
на составляет 20—30 mi. Интенсивное всасывание яда через слизистую оболочку жслудочио-
кишечного тракта приводит к быстро развивающемуся отравлению появляются слюнотечение.
1000 Глава 11
Рис. Н-2з. С рукгурныс форму лы солснопсина А (траис-З-мезпл-Ь-п-уц euinпиперидин) (а), лен рола-
зииа (б), нрндомпрмепина (в), кантаридина (г).
жжение. волдыри. образуются струпья в полости рта. возникают сильная жажда, тошнота,
рвота с кровью, геморрагия, боли в почках, маточные кровотечения. патологическая зрекния
(приапизм). Приостановка мочеотделения приводит к тяжелым поражениям почек и смерти.
Па вскрытии отмечаются резкая гиперемия слизистых оболочек, язвы и геморрагические очаги.
Диффузные очаги поражения наблюдаются в печени и почках. Гломерулонефрит и цистит —
•пличные последствия отравления кангариднззом Он раздражает нежную ткань внутренних
стенок мочеиспускательного канала, что приводит к болевым ощущениям и усилению местно-
го кровоснабжения. Именно это состояние вызывает зрекшпо. Выброс спермы ослаб яет раз-
дражение. Эрекция повторяется, когда снова возникает раздражение. Кантаридин был обна-
ружен в некоторых биодобавках, рекламируемых как средства, восстанавливающие потенцию.
Использование преларазов шпанской мушки (рис. 11-26) приводит к печальным последствиям:
болезням мочеполовой и нервной систем, а иногда к летальному исходу. В силу выраженного
стимулирующего действия кантаридин может спровоцировать гипертонический криз.
Токсины .многоножек
Укус пиантской цейлонской сколопендры может привести к мышечным контрактурам, па-
резам и параличам, а также нарушениям Сердечной деятельности, что связано с действием
ацетилхолина, гистамина, есротоз ина. ироте-
олизичеекнх ферментов, содержащихся в ес
выделениях. Другие вилы выделяют бензохи-
ноны. п-крезол. камфарополобные вещества,
синильную кислоту и бензальдегид. Напри-
мер. многоножка Aplteloria corrugate выделяет
секрет. содержащий маиделоззззгрнл при фер-
ментативном гидролизе которого ex tempore
образуются синильная кислота и бензальде-
гид (рис. 11-27). Общее количество синиль-
ной кислены может достичь 545 мкг.
Токсины иг юкожих (Echinodermata)
Из морских звезд (рис. 1I-2X. а) были вы-
делены токсичные сапонины. При кислотном
гидролизе они дают стероидные агликоны —
Рис. 11-26. Мушка шпанская Цуиа veskatona
Биологическая опасность и биологический терроризм 1001
н
Рис. 11-27. Структурная формула м.ние.юпитрн i.i.
он
.icTepoi спины. серную кислоту и сахара. Ас-
теросаиоиины Л и В необратимо блокируют
нервно-мышечную передачу
Токсины морского ежа Гпрпеимеь gmiilla
(урхитоксины) — соединения белковой при-
роды. обладающие кинниоподобнои актив-
ностью. служат причиной сильной боли,
оказывают паралитическое. спазмогенное и
кар.тиотоксичсское действие. Ядовитые ежи
распространены и основном в тропических и
субтропических районах Индийского. Тихо-
го и Атлантического оксанов (рис. 11-28. б).
Между настоящими ш тами морского ежа
располагаются видоизмененные иглы — пе-
дипеллярии. У берегов Японии встреч тется морской еж токеопнеустес. тело которого птшено
игл. но покрыто множеством педннеллярии. Стоит только задеть их. как яд впрыскивается
в тело жертвы. Местные рыбаки называют этою ежа убийцей, потому что уколы его бывают
смертельны Пловец, пораженный этим ялом. рискует утонуть.
Голотурии (рис.11-29) больше известные как пшневси продукт трепанг, содержат тритерпе-
новые гликозилы нейротоксического и i смоли гичсского действия. Трепанг — это выверенные и
высушенные голотурии, у которых предварительно тщательно удаляются внутренности В случае
неправильного прйтютонленпя (в том числе с криминальной целью) мотуг наблюдаться серьез-
Рие. 11-28. Морские ibclim (Анспш/еа) (л), морской
еж (Rexulanu) (6).
ные отравления bi топ» лр гемолиза и пораже-
ния Периферической нервной системы.
Токсины рыб (Pisces)
Отравления ядовитыми рыбами (ихтно-
саркотокепкоз) характерны для мест с теп-
лым климатом. но случаются и в умеренной
климатической полосе при несоблюдении
пниепически.х норм. Тетродотоксичсскне
и ннгу атаксические отравления связаны с
употреблением в пишу рыб. которые ассими-
лируют ГОКС1111НрОДуТН1ру|О111!1С организмы,
такие, как бактерии или простейшие водо-
росли. Скомброюксин являет собой пример
токсина, продуцируемою при неправильном
хранении рыбы.
Некоторые рыбы обладают ядовитыми
шипами.
Ведущее моего в мире по отравлениям иг-
лобрюхами (особенно футу) занимает Япо-
ния (уровень смертельное in 60е?). где эту
рыбу, несмотря па ядовитость. считают де-
ликатесом Терапия отравлений включает
поддерживающие меры — искусственную
вентиляцию легких н борьбу с гипотензией.
Нанбо се ядовитыми у фугу являются яич-
ники. печень, в меньшей степени — кожа н
кишечник Токсичность яичников и печени
некоторых видов фугу такова. что достаточно
2 г ткани, чтобы вызвать смертельное отрав-
ление. Токсичность фугу имеет сезонные ко-
лебания и повышается во время нереста, что
указывает на связь токсина с репролукiявны-
ми органами. Смертельную дозу яла можно
получить, лаже прикоснувшись голой рукой
1002 Глава 11
Рис. 11-29. Голотурии ядовитые (Actinopjga agassizi).
к внутренностям рыбы. Некоторые японские
повара умеют обезвреживать печень, длитель-
но вымывая из нее большую чисть токсина,
однако полностью удалить яд из печени прак-
тически невозможно, а даже малая его доза
действует как наркотик: человек чувствует
своеобразное опьянение, нарушаются связи
с реальностью. Летальная доза токсина при
попадании через желудочно-кишечный тракт
для человека составляет 5—30 мг/кг. Симпто-
мы отравления проявляются в течение 5—30
мин пос е попыапия токсина в организм.
Активное начало фугу — meinptx атак-
сии. который предстать яст собой соединение
аминопертнлрохиназолина с гуанидиновом
группой (рис. 11-30) — высокоспепифнчный
блокатор натриевых каналов. В основе токси-
ческого действия тетродотоксина лежит его способность блокировать проведение нервною им-
пульса в нервных и мышечных ткенях. Ведущими симптомам! отрав, синя тетродотоксинаявля-
ются быстро наступающая гипотензия, угнетение дыхания, паралич скететной .мускулатуры.
Основным способом выделения тетродотоксина является жидкостная экстракция из из-
мельченных тканей в кислой среде. Для идентификации тетродотоксина применяют ГХ-МС,
ИК- и ЯМР-спектрометрию. В качестве предварительного метода используют ГСХ в сисгемс
раствори гелей этанол-уксусная кислота (96:4) при детектировании раствором кристаллическо-
го йода в хлороформе с нагреванием до 200 ’С в сухожаровом шкафу в течение 5 мин (R, тет-
родотоксина 0.3). Метод тазовой хроматографии позволяет количествен но определить токсин
в содержимом желудка. Предел обнаружения при использовании ВЭЖХ с флюорсснентонои
детекцией составляет порядка 2 мкг/г. что является достаточным для определения тетро юток-
сина и его аналогов в биосредах.
Тетродотоксин также содержится в коже и икре калифорнийскою тритона Taricha torosa.
центрально-американских (Панама. Коста Рика) сухопутных .титушек Aidopus (см. ниже), у
юлубокольчаюю ос минога Hapalochlaena maculosa (см. выше).
По особым показаниям тетродотоксин начинают применять как высокт .эффективное (но
небезопасное) обезболивающее средство в кардио юти. онкологии, стоматологии, при нейро-
генной форме проказы.
Термином «сигуатсра» ранее обозначали пищевые отравления брюхоногими моллюсками,
позднее так стали называть отравления рыбами, сопровождающиеся желудочно-кишечными,
сердечно-сосудистыми, неврологическими и другими расстройствами. Выздороть сине длите ь-
ное. иногда несколько месяцев. Как правило, желудочно-кишечная форма вызывается траво-
ядными рыбами (рыба-хирург и др.), а сердечно-сосудистая — хищными (мурена, барракуда).
Возможно, что сигуатсра вызывается более чем одним токсином, па что укатывает сложность
симптоматики. К настоящему времени выделили и идентифицировали 2 группы токсинов,
основная из них содержит жирорастворимые сигуатоксин (рис. 11-31) с молекулярной массой
1500 Д и гамбиерал, продуцируемые эпифит-
ными дштофлагеллатами Gambierdiscus loxicus.
Другая группа включает водорастворимый
маитотоксин. Наибольшее количество си-
гуатоксина содержится в печени, мышцах и
внутренних органах рыб. Синдромы сигуате-
ры {Ciguatera Pish Poisoning) являются прямым
следствием стимуляции адренергической и
холииертичсской систем через открытие ион-
ных натриевых каналов в мембранах нервных
клеток. Употребление зараженной рыбы вы-
зывает расстройства пищеварения (тошнота.
Рис 11-30. Структурная форм) ла гетролотоксина
Биологическая опасность и биологический терроризм 1003
но
Рис. 11-31. Структурная формула сигуатоксина
рвота. Iпарен) н течение нескольких часов, после которых следуют невролог нческне симптомы
С’игуагера — наиболее частый (от 10 ООО до 50 000 тыс человек в год) случай отравления морс
кими токсинами, однако летальность составляет менее 1%. ВЭЖХ-МС и ИФА используют для
опреле тения токсина в биосрелах.
Некоторые сельдевые могут вызывать смертельные (до 42*?) отравления (клуиеогоксизм).
Первые признаки отравления — резкий металлический привкус ио рту. Токсичными могут
быть мясо и икре гунна. Мясо тунна содержит путресцин, кадаверин. спермидин и очень бо
гато аминокислотой гистидином, которая путем декарбоксилирования (возможно, бактсриаль
нои декарбоксилазой) превращается в физиологически активный амин ihct.imhh, вызывающий
аллергические реакции. Кроме того, в крупных особях тунцов могут содержаться в значитель-
ном количестве ртуть и мышьяк (см. гл. 8.5).
Гоксины хрящевых рыб (акул, скатов и химер) могут быть причиной отравления при употреб-
лении в нишу мяса (печени) акул и скатов Токсин ската — весьма лабильный белок, разделен-
ный па 10 <|>ракнин. нз которых 5 токсичны.
Чрезвычайно опасны для человека костные рыбы боролапчатки, или камень-рыбы
(Synanceja). а также европейская скорчена н разнообразные рыбы коралловых рифов Их иглы
очень прочны и могут пробить толстую резиновую подошву Чаще всего борохшчдтки обзттпют
среди рифов. где маскируются среди корхыоп Смерть может наступить в течение 5 ч после
укола. Некоторые вилы кефали и султанок (в нюне—августе) вызывают отравления, сопровож-
дающиеся галлюцинациями Полагают. что токсин токалн зуется в голове рыбы Отравление
вызывается как сырой, так и вареной рыбой
1004 Глава 11
Токсины амфибий (Amphibia)
Активное начало кожного секрета сала-
мандр (земноводные) — вещество алкалоид-
ной природы самандарин. Для человека са-
мтндарин не представляет опасности, кроме
специальных (криминальных) случаев (рис.
11-32).
Токсин обладает нейротоксическим дейс-
твием, влияет на cepacMHo-cocvjitciyio сис-
тему. Наличие в структуре алкалоида азепн-
повою гетероцикла позволяет предположить,
что токсин имеет сродство к бензодиазепи-
новым рецепторам ИНС Спектр активности
ядовитых секретов кожных желез амфибии
достаточно широк — от высокотоксичных со-
единений типа батрахогоксина до обезболива-
ющих пептидов — дерморфинов. Кроме того,
в секретах кожных желез амфибий содержат-
ся биогенные амины, тахи- и брадикинины,
кардиотонические стероиды, гемолитические
белки, причем на первый план выступают
токсичные алкалоиды и стероиды, не разру-
шающиеся в организме человека пищевари-
тельными (|крме>нами при парентеральном
введении. Наиболее типичными для амфибий
биогенными аминами являются серотонин и
его N-метнльные дериваты, например гал-
люциноген буфотенин (1\.Гх-диметил-5-ок-
ситриптамин). содержащийся в большом ко-
личестве в яле жаб Bufo alvarius (рис. 11-33).
В коже различных лягушек найдена боль-
шая группа фармакологически активных пеп-
тидов. в том числе брадикинин. Некоторые
из них. в отличие от брадикинина. вызыва-
ют быстрое сокращение инссосудистой мус-
кулатуры и получили название тахикининов.
Из кожи бесхвостой амфибии филлимедуза
выделен новый класс сильных опиоидных
пептидов — дерморфины. Атеистическая ак-
тивность дерморфнна в 11 раз больше, чем у
морфина (рис. 11-34).
При изучении лягушек-децлрйбатил (рис.
11-35). обитающих на юге Центральной Аме-
рики п северо-западе Южной Америки (дре-
волазы янстолазы. ателопы). был выделен
нейротоксичный алкалоид батрахотоксин.
Батрахотоксии (рис. 11-36) обладает силь-
ным кардиотоксичсским действием, вызывая
зкстрасистолин. желудочковую фибрилляцию
и смерть. Содержание его в коже различных
лягушек значительно колеблется, достигая
1.9 мг па лягушку (взрослая особь PhyUohates
terribilis длиной менее 50 мм). Эффективные
антидоты при отравлении батрахотоксином
не известны, за исключением тетродотокси-
Рис. 11-32. Структурная формула самаидаршг
Рис. 11-33. Структурная формула й^фотетшна.
Тир—Асп-Ала—Фон—Гпи—Тир—Про—Сер—NH
Рис. 11-34. Опиоидный пептид — дерморфнн.
Рис. 11-35. Лнстолаз (Phyllohates inntuuis).
1006 Глава 11
Буфотенин (см. рис. I1-38) является продуктом распада 5-1Идроксигриптампна (серотони-
на), и его присутствие в .моче является диагностическим признаком психических рисстройсп
Буфок'нип и другие потенциально галлюциногенные N-ди метилирование нндоламины в моче
человека определяют методом ВЭЖХ-.МС с предварите шной твердофазной экстракцией. Для
увеличения чувствительности определения используют электроспрейную методику ионизации
(см. гл. 6.3.5).
Другая труппа — караиотонические стероиды, которые пре гшавлепы свободными и связан-
ными агликонами (буфотенинами). 1енины яда жаб — производные пиклопентанпергилрофе-
паптреиа. имеющие в качестве Стоковой цени шестичленное nciiaebiiiicinioc лактонное кольцо
(буфодиенолид). Кроме бу фодиснол илов. являющихся Сч-стероидами. имеются карде ноя иды —
С.,-стероиды. Они отличаются наличием пятичленного насыщенного лактонного кольца. Кар-
пенолилы близки по своему строению с агликонами сердечных гликозидов наперстянки.
Токс ины рептилий
Высокая лффектявность действия ядов змей обусловлена сложным комплексом биологичес-
ки активных соединений: ферментов, токсичных полипептидов, ряда белков со специфичес-
кими свойствами, а также неорганических компонентов. Токсичные полипептиды змей можно
разделить на 3 группы:
• токсины, специфически блокирующие Н-холипоренепторы субсииаптичсской мембраны
скелетной мускулатуры и некоторых отделов центральной и негативной нервной системы
(постсинаптнческис нейротоксины);
• токсины с высокой степенью избирательности, воздействующие на прссинатическис
нервные окончания и нарушающие процесс высвобождения медиатора (прееннаптическис
нейротоксины):
• мембраноактивные полипептиды (карлиотоксины и ннютоксины). активно воздействую-
щие на мембраны клеток, в том числе и возбудимые, вызывая их деполяризацию.
Ядовитые змеи принадлежат 3 основным семействам — FJapidae (кобры). Vipcridae (гадюки)
и Crotalidae (ямкоголовыс). Э аниды объединяют около половины всего мирового разнообра-
зия видов ядовитых змей, к ним относятся кобры и мамбы. Ролы, принадлежащие семейству'
злати, обнаружены в Азии. Северной. Ueiiipxibiioit и Южной Америке и Африке. Гадюки
Viperidae, наиболее известным представителем которых является обычная гадюка, обитают в
Европе. Азии и Африке Я.мкоголовые гадюки Crotalidae встречаются большей частью в Се-
верной. Центральной и Южной Америке, к ним относятся гремучие змеи родов Crotalidae и
Sistrurus.
По действию змеиные ялы разделены на 2 основные группы: нейротоксические и коагуло-
токсические. Нейротоксины кобр и гадюк действуют на ностсинаигическом уровне (гх-неп-
ротоксины). препятствуя связыванию ацетилхолина репепюрами, или иа пресниаитическом
уровне путем воздействия иа высвобождение нейромедиатора Существуют также блокаторы
калиевых каналов или p-нейротоксины, которые х растеризуются активностью фосфолипазы
А2. Дендротоксипы — малого размера белки яда мамбы, обладающие специфичностью к кали-
евым каналам. Токсины мамбы проявляю! высокий аффинитет в отношении мускариновых и
ацетилхолиновых рецепторов.
В основе гепатотоксичности лежит действие яда на компоненты свертывания системы кро-
ви. Токсины представляют собой ферменты, вызывающие коагуляцию фибриногена. или фер-
менты, разрушающие фибрин или фибриноген, а также активаторы факторов V и X свертыва-
ния крови или индукторы и ингибиторы агрегации тромбоцитов. Геморрагическими агентами
являются цинксодержашие металлог ротеиназы. которые разрушают бедки мембраны эндоте-
лиальных клеток капилляров.
Симптоматика змеиных укусов у человека варьирует в очень широких пределах в зави-
симости от вида змей, ио общими являются локальная боль. отек, жжение и некроз ткани
Основными причинами смерти становятся кровоизлияния в мозг или интенсивные забрюшин-
ные кровотечения Часто гематотоксичные и нейротоксичные яды змей вызывают почечную
недостаточность.
Наиболее эффективным средством лечения змеиных укусов является серотерапия. Отна-
ко скорость связывания токсинов с клетками-мишенями организма выше, чем нейтрализация
этих токсинов антителами сыворотки. Поэтому введение сыворотки в отдаленные сроки может
ьиолоп*еоая опэс-осъ * омапсги^.о^ дугою» WB7
Рис. 11-39. Утконос
окатиться малогм|»фсктивньтм. Проблема возникает при
идентификации вша укуси ншеЛ человека змеи. гак как
чаше всею ни сам пострадавший, ни врач нс могут пра-
вильно определить ши змеи. Тактики лечения обяза-
тельно должна учитывать особенности патофизиологи-
ческих механизмов действия различных змеиных ядов,
обусловленные своеобразием их химического состава.
Вопросам ТОКСИПО.ТОПП1 змей посвяшеиа мпогочне-
енпая специальная литература, в книге приводятся
только общие сведения.
Ядовитость не свонсл ценна представителям класса
лиакопитаюииа {Mammalia} и ветретается лишь в не-
которых наиболее примитивных отрядах. Например,
при пор. женин человека шпорой утконоса (рис. 11-39»
отмечаются отеки, сопровождающиеся сердечно-сосу-
дистыми нарушениями Токсин утконосов изучен не-
достаточно. У люден смертельные случаи не зарегис-
трированы. однако есть сведения, что собаки иногда
гибнут во время охоты на утконосов
1008 лава 11
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Микробы — вот кто правит миром.
Т. Г<нд,
известный астрофт зик
Нельзя не принимать во внимание возможное использование в террористических целях ряда
патогенов из существующего в природе разт оооразия микроорганизмов — вирусов, бактерий
и грибов, вызывающих заболевания человека, растений и животных. К настоящему времени
изучено не более долей процента сущее»вутошпх вирусов. 11рп|юда создаст новые опасности —
так называемые эмерджентные вирусы, и этот потенциал неисчерпаем.
Задача создания глобгь ыюи системы надзора за использованием биологического и токсин-
ного оружия несопоставимо сложнее, чем надзора за использованием химических aicHiou. что
заставляет мировое сообщество прилагать экстраординарные усилия в этом направлении.
Одним из таких направлений является осушсствл тис программы глобального мониторинга,
исследования и обучения с целью контроля нал инфекционными заболеваниями (GMRTCID).
выполняемой под пилой ВОЗ совместно с интернациональным центром генной инженерш!
и биотехнологии (1CGEB) и ря том iieiipaBHicjiiiCiвепны орынизаний В настоящее время со-
здается сеть ретинальных центров и лаборатории (с высоким уровнем биологической зашиты)
для детектирования агентов, которые могут служить иди уже пос гужилп причиной биотерро-
ристических актов, и для выработки ответных мер.
Выявление рецепторных мишеней токсикантов, токсинов или биоактивных компонентов
вир сов в белках хозяина и. исходя из структуры лих рецеп оров (во многих случаях уже из-
вестных). поиск путей оптимальной защиты организма являются важнейшими задачами совре-
менной токсикологии — науки меж- и iio.T»LiiicuiiiLiiiiiapiioii по своей сути
Технологическая революция не тотько создает блага для человечества, но и значительно
увеличивает потенциальные угрозы, например использование научных достижений террорис-
тическими организациями дитя противозаконной деятельности.
Профессиональные эксперты в области развития науки прогнозируют, что в токсикологии
в самое ближайшее время будут широко использованы достижения нанотехнологии, геномики,
информационных технологий и др. Диагностические микрочипы обеспечат быстрый и одно-
временный анализ многих тысяч параметров, что крайне важно для определения токсикантов,
экоюксиканюв или токсинов в организме человека, жнвотых и окружающей среде в режиме
on-line.
Дополнительные источники информации:
www.who.inl/disease-ouibrcak-news/:
hltp://www.who.int/csr/resources/publications/csrpublicanons/cn/inde.x2.html;
hnp://www.who.inl/gb/EBWHA/PDF, WHA54/ea54rI 4.pdf:
http://www.niaid.nih.gov/biodefense.