Автор: Джаксон М.Б.
Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология общая биология физика биология биофизика
ISBN: 978-5-9963-0011-2
Год: 2009
Текст
УДК 576.32/.36
ББК 28.05
Д40
Переводчики: Е. В. Жуковская, С. В. Лущекина, М. М. Медведникова,
Л. В. Сиголаева, К. Б. Терешкина, Н. С. Богатырева, О. Ю. Сенцова
Джаксон М. Б.
Д40 Молекулярная и клеточная биофизика / М. Б. Джаксон ; пер.
с англ. — М. : Мир ; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. —
551 с.: ил.
ISBN 978-5-9963-0011-2 (БИНОМ. ЛЗ)
ISBN 978-5-03-003857-5 (Мир)
ISBN 978-0-521-62470-1 (англ.)
Учебное пособие по теоретической биофизике, посвященное анализу струк-
туры и функций макромолекул. На основе фундаментальных физических
принципов рассмотрены конформационные изменения и принципы укладки
белковых молекул, образование молекулярных комплексов, а также алло-
стерические взаимодействия как механизм, объединяющий конформационные
переходы и реакции связывания. Отдельные главы посвящены анализу ионных
взаимодействий, кинетики множественных состояний и флуктуаций структуры
и активности макромолекул. В рамках термодинамики и кинетической теории
изложены принципы ферментативного катализа и действия ионных каналов
в биомембранах. Обсуждаются вопросы электрической возбудимости мембран
и проведения нервных импульсов. Книгу отличает ясность и четкость изложения
материала.
Для студентов, преподавателей, аспирантов и научных сотрудников, изу-
чающих вопросы структуры и функций белков, мембранологии, энзимологии,
физической химии и химической физики макромолекул, молекулярной биологии,
молекулярной и клеточной биофизики, биоорганической химии и нейробиологии.
УДК 576.32/.36
ББК 28.05
По вопросам приобретения обращаться:
«БИНОМ. Лаборатория знаний»
Телефон: (499)157-5272
e-mail: binom@Lbz.ru, http://www.Lbz.ru
ISBN 978-5-9963-0011-2 (БИНОМ. Л3)
ISBN 978-5-03-003857-5 (Мир)
ISBN 978-0-521-62470-1 (англ.)
© Cambridge University Press
2006
© перевод на русский язык,
оформление, «Мир», 2009
Оглавление
Предисловие...........................................................11
Глава I. Конформационные переходы в белках..........................13
1.1. Определение термина макросостояние.........................14
1.2. Равновесие между двумя макросостояниями....................17
1.3. Термоиндуцированные конформационные макропереходы..........18
1.4. Развертывание молекулы лизоцима............................20
1.5. Крутизна кривой и энтальпия................................22
1.6. Эффект кооперативности и температурные переходы............23
1.7. Переходы, индуцируемые другими факторами...................25
1.8. Конформационные переходы, индуцируемые изменением разности
потенциалов......................................................27
1.9. Сенсоры потенциала в потенциал-зависимых каналах...........30
1.10. Воротный ток..............................................32
1.11. Кооперативность и потенциал-зависимые переходы............33
1.12. Пластичность макросостояния...............................35
Задачи......................................................38
Глава 2. Молекулярные силы в биологических структурах ................40
2.1. Электростатические взаимодействия..........................40
2.2. Собственная электростатическая энергия.....................42
2.3. Сила отображения...........................................44
2.4. Взаимодействия заряд—диполь................................46
2.5. Индуцированные диполи......................................48
2.6. Взаимодействие катион—л-электроны..........................49
2.7. Дисперсионная сила.........................................51
2.8. Гидрофобные взаимодействия.................................52
2.9. Сила гидратации............................................55
2.10. Водородные связи..........................................56
2.11. Стерическое отталкивание..................................60
2.12. Изгибание связей и гармонические потенциалы...............61
2.13. Стабилизирующие силы в белках.............................63
2.14. Внутрибелковые силовые поля...............................67
2.15. Стабилизирующие силы в нуклеиновых кислотах...............69
2.16. Липидный бислой и мембранные белки........................70
Задачи......................................................72
Глава 3. Конформации макромолекул.....................................74
3.1. н- Бутан...................................................74
3.2. Функции распределения конфигураций и полимерные цепи.......76
3.3. Статистика случайных клубков...............................78
3.4. Эффективная длина сегментов................................80
3.5. Неидеальные полимерные цепи и тета-растворители............82
3.6. Распределение вероятности..................................83
3.7. Образование петель.........................................85
6
Оглавление
3.8. Упругость случайного клубка.................................86
3.9. Когда возможна конформация случайного клубка?...............87
3.10. Вращение полипептидного остова: вторичная структура белков.87
3.11. Энтропия денатурации белка.................................90
3.12. Переход спираль—клубок.....................................92
3.13. Математический анализ перехода спираль—клубок..............94
3.14. Характеристики перехода спираль—клубок.....................98
3.15. Способность к образованию а-спирали.......................100
3.16. Укладка белковых молекул..................................102
3.17. Кооперативность укладки белковых молекул..................106
Задачи......................................................108
Глава 4. Образование молекулярных комплексов..........................109
4.1. Равновесные реакции связывания в растворе..................109
4.2. Кооперативность связывания.................................111
4.2.1. Согласованное связывание.............................111
4.2.2. Последовательное связывание..........................113
4.2.3. Взаимодействие соседних участков.....................114
4.3. Термодинамика образования комплексов.......................115
4.4. Образование связей.........................................116
4.5. Статистическая механика образования молекулярных комплексов . . . 117
4.6. Свободная энергия поступательного движения.................119
4.7. Свободная энергия вращательного движения...................122
4.8. Свободная энергия колебательного движения..................123
4.9. Эффекты сольватации........................................126
4.10. Свободная энергия конфигурации............................128
4.11. Связывание белков в мембране — уменьшение числа измерений .... 129
4.12. Связывание с мембраной....................................130
Задачи......................................................131
Глава 5. Аллостерические взаимодействия...............................133
5.1. Аллостерический переход....................................133
5.2. Простейший случай: один связывающий участок и один
аллостерический переход.........................................134
5.3. Связывание лиганда и ответный конформационный сдвиг........137
5.4. Энергетический баланс конформационного перехода для белка
с одним лиганд-связывающим участком.............................138
5.5. Рецепторы, сопряженные с G-белками.........................140
5.6. Взаимодействия связывающих участков........................143
5.7. Модель Моно—Уаймена—Шанже..................................145
5.8. Гемоглобин.................................................148
5.9. Энергетика конформационного перехода по модели
Моно—Уаймена—Шанже..............................................150
5.10. Аддитивность на макро- и микроуровнях.....................151
5.11. Фосфофруктокиназа.........................................153
5.12. Лиганд-зависимые каналы...................................156
5.13. Взаимодействия между субъединицами:
модель Кошланда—Немети—Филмера..................................157
5.14. Модель Сзабо—Капласа......................................161
Задачи......................................................165
Оглавление
7
Глава 6. Диффузия и броуновское движение...........................166
6.1. Макроскопическая диффузия; законы Фика....................166
6.2. Решение уравнения диффузии................................167
6.2.1. Одномерная диффузия из точки........................168
6.2.2. Трехмерная диффузия из точки........................170
6.2.3. Диффузия через границу раздела......................170
6.2.4. Анализ диффузии с учетом граничных условий..........172
6.3. Диффузия при стационарном состоянии.......................174
6.3.1. Длинная трубка......................................175
6.3.2. Малое отверстие.....................................176
6.3.3. Пористые мембраны...................................177
6.4. Диффузия на микроуровне: случайные перемещения............178
6.5. Броуновское движение: нормальное распределение смещения...181
6.6. Уравнение диффузии на микроуровне.........................184
6.7. Трение....................................................185
6.8. Закон Стокса..............................................187
6.9. Коэффициент диффузии макромолекул.........................188
6.10. Латеральная диффузия в мембране..........................189
Задачи.....................................................190
Глава 7. Основные кинетические процессы............................192
7.1. Релаксация по экспоненте..................................192
7.2. Энергия активации.........................................194
7.3. Координата реакции и детальное равновесие.................196
7.4. Линейное соотношение величин свободной энергии............198
7.5. Константы скорости потенциал-зависимых макропереходов.....201
7.6. Соотношение Маркуса для свободной энергии.................203
7.7. Теория Эйринга............................................204
7.8. Диффузия через барьер: теория Крамерса....................206
7.9. Кинетика одиночных каналов................................209
7.10. Координата реакции в случае макроперехода................212
Задачи.....................................................219
Глава 8. Кинетика образования комплексов...........................221
8.1. Образование бимолекулярного комплекса.....................221
8.2. Небольшие возмущения......................................222
8.3. Диффузионно-зависимое образование комплексов..............224
8.4. Диффузионно-зависимая диссоциация комплексов..............228
8.5. Связывающие участки.......................................229
8.6. Реальные скорости связывания лигандов белками.............231
8.6.1. Эволюция скорости...................................232
8.6.2. Ацетил холинэстераза................................233
8.6.3. Пероксидаза хрена...................................234
8.7. Перенос протонов..........................................235
8.8. Связывание с мембранными рецепторами......................236
8.9. Уменьшение числа измерений................................240
8.10. Связывание белков с ДНК..................................242
Задачи.....................................................243
Глава 9. Кинетика множественных состояний..........................245
9.1. Модель системы с тремя состояниями........................245
8
Оглавление
9.2. Начальные условия..........................................248
9.3. Разделение временных шкал..................................249
9.4. Общее решение кинетических уравнений для систем с множественными
состояниями.....................................................251
9.5. Модель трех состояний в матричном выражении................254
9.6. Стационарность, консервативность и детальное равновесие....256
9.7. Кинетика одиночных каналов: модель трех состояний..........258
9.8. Разделение временных шкал: анализ пачек открываний одиночных
каналов.........................................................262
9.9. Общий анализ кинетики одиночных каналов: подсчет числа состояний 265
9.10. Сходство между кинетикой одиночных каналов и кинетикой
макроскопических систем.........................................266
9.11. Утрата стационарности, консервативности и детального равновесия . . 267
9.12. Корреляции состояний одиночных каналов: подсчет числа путей
переходов.......................................................270
9.13. Кинетика мультисубъединичных белков.......................272
9.14. Броуновское движение и «растянутая» кинетика..............275
Задачи......................................................277
Глава 10. Ферментативный катализ......................................278
10.1. Основные механизмы действия ферментов на примере сериновых
протеаз..........................................................278
10.2. Кинетика Михаэлиса—Ментен..................................282
10.3. Аппроксимация к стационарному состоянию....................284
10.4. Кинетика предстационарного состояния.......................286
10.5. Аллостерические ферменты...................................287
10.6. Использование энергии связывания...........................288
10.7. Теория Крамерса для скорости реакции и катализ.............290
10.8. Эффект сближения и энтропия поступательного движения.......291
10.9. Энтропия вращательного движения............................294
10.10. Снижение £*: комплементарность переходного состояния субстрата
активному центру фермента........................................295
10.11. Трение фермент-субстратного комплекса.....................299
10.12. Кислотно-основный катализ и графики Бренстеда.............300
10.13. Кислотно-основный катализ в р-галактозидазной реакции.....303
10.14. Механизм действия сериновых протеаз и сильные водородные связи . 304
10.15. Теория Маркуса и перенос протона карбоангидразой..........306
Задачи......................................................308
Глава I I. Ионы и противоионы.........................................309
11.1. Уравнение Пуассона—Больцмана и дебаевский радиус...........310
11.2. Ионный коэффициент активности..............................312
11.3. Ионизация белков...........................................317
11.4. Теория Туи—Чапмена и поверхностный заряд мембраны..........319
11.5. Поправки Штерна к теории Туи—Чапмена.......................322
11.6. Поверхностный заряд мембраны и проводимость каналов........325
11.7. Поверхностный заряд и регуляция канала потенциалом.........328
11.8. Электрофоретическая подвижность............................329
11.9. Растворы полиэлектролитов I. Экранирование по теории
Дебая—Хюккеля....................................................333
ОГЛАВЛЕНИЕ
9
11.10. Растворы полиэлектролитов И. Конденсация противоионов....336
11.11. Плавление ДНК............................................338
Задачи.....................................................341
Глава 12. Флуктуации.................................................343
12.1. Отклонения от среднего....................................343
12.2. Флуктуации числа молекул и распределение Пуассона.........344
12.3. Статистика восприятия света глазом . . ...................347
12.4. Равномерное распределение энергии.........................349
12.5. Флуктуации энергии макромолекул...........................351
12.6. Флуктуации в ионизации белка..............................353
12.7. Флуктуации в системе с двумя состояниями..................354
12.8. Ток через одиночный канал.................................356
12.9. Корреляционная функция для систем с двумя состояниями.....357
12.10. Теорема Винера—Хинчина...................................359
12.11. Шум ионных каналов.......................................362
12.12. Шум электрического контура...............................364
12.13. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия..............367
12.14. Трение и флуктуационно-диссипативная теорема.............371
Задачи.....................................................373
Глава 13. Ионная проницаемость мембран и мембранный потенциал. 374
13.1. Потенциал Нернста.........................................374
13.2. Доннановский потенциал....................................377
13.3. Клеточный мембранный потенциал............................379
13.3.1. Нейроны............................................380
13.3.2. Скелетные мышцы позвоночных........................381
13.4. Проницаемость мембран для Na+и К+.........................382
13.5. Вновь о мембранном потенциале нейронов....................385
13.6. Соотношение потоков по Уссингу и активный транспорт.......386
13.7. Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для мембранного потенциала 387
13.8. Мембранные помпы и потенциал..............................390
13.9. Переносчики и потенциал...................................391
13.10. Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока......394
13.11. Двухвалентные ионы.......................................396
13.12. Поверхностный заряд и мембранный потенциал...............397
13.13. Теория скоростей реакций и мембранный потенциал..........398
Задачи.....................................................401
Г лава 14. Ионная проницаемость и структура каналов..................403
14.1. Ионная проницаемость мембраны в отсутствие каналов........403
14.2. Омическая модель канала...................................406
14.3. Энергетические барьеры и свойства каналов.................407
14.4. Эйзенмановские ряды селективности.........................410
14.5. Взаимодействия внутри ионного канала......................413
14.6. Грамицидин А..............................................415
14.7. Теория скоростей реакций в применении к мультибарьерным каналам 416
14.8. Одноместные каналы........................................421
14.9. Однорядные каналы.........................................427
14.10. Канал KcsA...............................................431
Задачи.....................................................436
10
Оглавление
Глава 15. Кабельная теория.........................................438
15.1. Ток через мембрану и цитоплазму.........................438
15.2. Кабельное уравнение.....................................441
15.3. Стационарное состояние в случае кабеля конечной длины...444
15.4. Ступенчатые сдвиги напряжения в кабеле конечной длины...446
15.5. Ступенчатые сдвиги тока в кабеле конечной длины.........449
15.6. Ответвления и модели эквивалентных цилиндров............450
15.6.1. Стационарное состояние...........................452
15.6.2. Постоянные времени...............................453
15.7. Кабельный анализ нейрона................................455
15.8. Интегративные свойства дендритов: аналитические модели..460
15.8.1. Ответ на стимул..................................461
15.8.2. Реальные синаптические входы.....................463
15.9. Компартмент-модели и кабельная теория...................465
15.10. Интегративные свойства дендритов: анализ на основе
компартмент-модели.............................................467
Задачи...................................................470
Глава 16. Потенциал действия.......................................471
16.1. Потенциал действия......................................471
16.2. Фиксация напряжения и свойства натриевых и калиевых каналов . . . 476
16.3. Уравнения Ходжкина—Хаксли...............................478
16.4. Кривые ток—потенциал и пороги...........................483
16.5. Распространение.........................................486
16.6. Миелин..................................................489
16.7. Морфология аксонов и проводимость.......................492
16.8. Разнообразие каналов....................................494
16.9. Ритмическая импульсация и А-ток.........................494
16.10. Колебания..............................................498
16.11. Интеграция сигналов в дендритах........................502
Задачи...................................................504
Приложение I. Разложения и ряды....................................506
П1.1. Ряды Тейлора............................................506
П1.2. Биномиальное разложение.................................507
П1.3. Геометрическая прогрессия...............................507
Приложение 2. Матричная алгебра....................................509
П2.1. Линейные преобразования.................................509
П2.2. Определители............................................510
П2.3. Собственные значения, собственные векторы и диагонализация .... 512
Приложение 3. Анализ Фурье.......................................515
Приложение 4. Гауссовы интегралы.................................519
Приложение 5. Гиперболические функции............................521
Приложение 6. Полярные и сферические координаты..................522
Литература.........................................................524
Предметный указатель...............................................540
Предисловие
В этой книге сделана попытка раскрыть предмет биофизики на теоретическом
уровне. Это необходимо особо отметить, поскольку слишком часто биофизику по-
нимают как набор физических методов, которые можно использовать в молеку-
лярной и клеточной биологии. При таком техническом акценте неизбежна узость
подхода, и в худших случаях он приводит к сугубой ограниченности, когда резуль-
таты сложных измерений интерпретируют без основательного рассмотрения фи-
зических принципов, от которых зависят особо сложные стороны макромолеку-
лярных биологических механизмов.
Соответственно своему теоретическому характеру книга содержит солидную
дозу теорий. Теоретический анализ важен при концептуальном подходе, но я дол-
жен признаться, что акцент на теорию отражает также мое восхищение тем, на-
сколько глубоко физическая теория позволяет проникнуть в природу биологиче-
ских механизмов. Привлекая физические и химические теории, я старался делать
это в рамках практических соображений и математическое описание приводить,
где возможно, в более общей форме. Большей частью оно не выходит за уровень
вводного курса математического анализа. При необходимости использовать более
сложный математический аппарат я пытался сочетать рассмотрение основного
предмета с обучением математике. Для помощи читателю в книгу включены шесть
математических приложений. Они могут служить полезным руководством, но,
безусловно, не претендуют на полностью строгое и исчерпывающее изложение ма-
териала.
Читатель, желающий получить более обширные сведения по используемым
математическим методам, должен будет обратиться к учебникам, где описывают-
ся, например, матричный анализ и дифференциальные уравнения в частных про-
изводных. Соответствующие главы в том или ином пособии по математическим
методам анализа для физиков или химиков, вероятно, восполнят возникающие
пробелы.
Для понимания излагаемого в книге материала важна не столько математиче-
ская подготовка, сколько подготовка по физической химии. Книга написана исхо-
дя из предположения, что читатель владеет знаниями по основам термодинамики,
кинетической теории и статистической механики. Некоторые важные теоретиче-
ские положения разъясняются, но мои краткие обзоры теорий не могут заменить
достаточно глубокие знания по их соответствующим разделам.1 Предполагается
также, что читатель знаком с биохимией.
1 Для освоения излагаемого в книге материала в большинстве случаев достаточно дополни-
тельно пользоваться сведениями из пятитомных изданий «Химическая энциклопедия» и «Физи-
ческая энциклопедия», выпущенных издательством «Советская энциклопедия» (первые тома)/
«Большая Российская энциклопедия» (последние тома) в 1988—1998 гг. — Прим. вед. ред.
12
Предисловие
Развиваемые в книге гипотезы часто носят довольно общий характер, и боль-
шое значение для их объяснения имеют конкретные примеры. Подходящие при-
меры найти было весьма трудно. Я постарался не слишком широко использовать
примеры из областей, близких к темам моих исследований, таких как функции
мембран и ионные каналы, но, возможно, это не вполне удалось. Гипотеза поясня-
ет пример так же часто, как пример поясняет гипотезу. Чтобы эта книга стала по-
лезной и для тех, кто работает в других областях исследований, я попытался, по-
бродив, так сказать, далеко с широким бреднем, найти примеры из разнообразных
направлений работ биофизиков.
Многое в этой книге относится к фундаментальным предметам, которые, од-
нако, до сих пор не были раскрыты в учебниках. Чтобы представить такую работу
в приемлемой форме, пришлось принимать трудные решения относительно выбо-
ра тем и их взаиморасположения. Мне остается только надеяться, что это удалось
сделать не худшим образом. К огромному сожалению, многие интересные и важ-
ные аспекты биофизики не отражены в книге, поскольку для курса продолжитель-
ностью один семестр она содержит и так более чем достаточно материала. Наде-
юсь, эта книга сделает доступными для студентов многие темы, ранее не нашед-
шие места в учебниках биофизики.
Представленный в книге материал неоднороден по сложности. Более трудные
и не первостепенно важные для дальнейшего изложения разделы помечены звез-
дочкой (*).
Благодарности
Приношу особую благодарность двум студентам, работавшим в моей лаборатории
в то время, когда настал завершающий этап работы над книгой. Вначале я попро-
сил Пейна Чанга и Хьюэ Хана прочесть некоторые главы, но в итоге они прочли
каждую страницу, проделав большую работу по выявлению ошибок и внесению
необходимых уточнений. Оба они следовали китайской пословице «Я уважаю мое-
го профессора, но истину я уважаю больше», что в огромной мере послужило на
пользу книге.
Приношу также благодарность друзьям и коллегам за критические замечания
по одной или нескольким главам: Эду Чапмену, Клаудио Гроссману, Энфу Хьюи,
Мэтту Джонсу, Питеру Джордану, Стюарту Лайту, Эндрю Локуте, Кэти Моррис,
Бобу Пирсу, Стиву Редману, Кимберли Тейлору, Джеффу Уолкеру и Джиму Уэйс-
хаару. В заключение выражаю благодарность Адаму Ван Уинсберге за помощь
в создании рисунка для обложки.
Глава I
Конформационные переходы
в белках
Центральный вопрос в молекулярной биологии — это связь между структурой и
функцией молекул. Однако структуру можно представлять на разных уровнях, осо-
бенно когда речь идет о сложных биологических молекулах. Например, можно
знать их химическое строение, то, как атомы соединены ковалентными связями,
но при этом ничего не знать о конформации молекул, т. е. о том, как атомы распо-
ложены в пространстве. Между тем конформационное состояние молекулы имеет
важное значение для осуществления ее функции, и в молекулярной биофизике
подробно изучаются как сами конформации, так и то, как они обеспечивают био-
логические функции.
Конформационное состояние молекул в свою очередь можно исследовать на
различных уровнях. Одна работа может быть нацелена главным образом на выяв-
ление общей формы молекулы, другая — на выяснение детальной картины с опре-
делением позиции каждого атома. Анализ детальной структуры — это более труд-
ная задача, но он позволяет получить гораздо больше важных сведений. Некото-
рые подходы к выяснению детальной структуры макромолекул описаны в
последующих главах. В этой, первой главе мы рассмотрим наиболее простой под-
ход к изучению конформаций белковых молекул, который не зависит от знания
каких-либо деталей их структуры.
Данный подход основан на идее о том, что белки имеют так называемые мак-
росостояния. Критерием для выделения макросостояний служит способность мо-
лекулы осуществлять свою функцию. Мы будем исходить из предположения, что
белок имеет небольшое число макросостояний, возможно всего два. Между макро-
состояниями существуют взаимопереходы; мы будем называть их макроперехода-
ми или конформационными переходами. Относительно структуры молекулы мак-
росостояние рассматривается как черный ящик. Такое упрощающее представле-
ние о макросостояниях и макропереходах, не связанное непосредственно с
деталями молекулярной структуры, служит хорошей основой для качественного
анализа функциональных переходов в белках.
Этот подход применим практически в любой области молекулярной биоло-
гии. Конформационные состояния белков включаются как основные строитель-
ные блоки в модели различных биологических процессов; взаимопереходы меж-
ду макросостояниями лежат в основе механизмов передачи клеточных сигналов.
К процессам, в которых действуют такие механизмы, относятся активация мем-
бранных рецепторов, регуляция экспрессии генов, контроль клеточного деления,
14
Глава I. Конформационные переходы в белках
регуляция ионных каналов и генерация механической силы. В данной главе мы
рассмотрим два хорошо изученных типа макропереходов — переходы, индуци-
руемые изменением температуры, и переходы, индуцируемые изменением разно-
сти потенциалов. Способы экспериментального изучения переходов этих двух
типов существенно различаются, и поэтому лишь в редких случаях оба они ис-
следованы для одного и того же белка. Однако с теоретической точки зрения
можно видеть поразительные параллели между данными переходами, и их совме-
стный анализ позволяет лучше понять общую природу функциональных перехо-
дов в белках.
1.1. Определение термина макросостояние
Введенный подход указывает общую стратегию, состоящую в том, чтобы пре-
уменьшить значение структурных деталей, но еще требуется принять строгое опре-
деление понятия макросостояние. Оно позволит нам уйти от вопроса, как макро-
состояние может соотноситься, по крайней мере в принципе, со структурой белка.
Понятие макросостояние (или макроскопическое состояние) заключает в себе гру-
бую характеристику молекулы, но она связана с тонкими характеристиками, отно-
сящимися к тому, что называют микросостояниями. Под микросостоянием пони-
мают конформацию, которую можно описать весьма детально — с указанием по-
зиций всех атомов или двугранных углов всех связей, вокруг которых возможно
вращение (см. гл. 3). Макросостояние включает большое число микросостояний.
Между этими микросостояниями происходят быстрые взаимопереходы, и макро-
состояние отражает усредненную результирующую микросостояний. Такой способ
анализа макромолекул основан на принципах статистической механики. Набор
микросостояний составляет ансамбль, т. е. некое единое множество, и статистиче-
ская механика дает концептуальную базу для понимания макросостояния как про-
изводного микросостояний.
Свободная энергия макросостояния определяется внутренней потенциальной
энергией микросостояний, как и изменение энтропии, обусловленное конформа-
ционной неупорядоченностью при взаимопереходах между микросостояниями.
Свободную энергию системы, содержащей N независимых молекул, можно опи-
сать следующим выражением
G = -kT\n(QN), (1.1)
где Q — функция распределения молекулы и кТ — произведение постоянной
Больцмана и температуры. Данная функция распределения есть сумма вероятно-
стей ряда микросостояний, определяющих макросостояние
0 = £е-£'/лг (1.2)
/
Здесь Ei — это энергия z-ro микросостояния и e~Ei/kT — его статистический вес по
Больцману. Если рассматривать одно макросостояние, эта сумма ограничивается
определенным рядом микросостояний, или субансамблем микросостоянием, что
указывает индекс GS. Таким образом, zzGS — это общее число микросостояний, оп-
I. I. Определение термина макросостояние
15
ределяющих данное макросостояние. Теперь мы можем получить выражения для
различных макросостояний путем суммирования вероятностей неперекрываю-
щихся субансамблей микросостояний.
Для определения вероятности одного микросостояния, у, характеризующегося
энергией Ер среди всех возможных микросостояний при данном макросостоянии
можно использовать распределение Больцмана
Сумма в знаменателе этого выражения представляет собой функцию рас-
пределения, описываемую уравнением (1.2). Здесь она нормирует функцию веро-
ятности, т. е. сводит все вероятности к одной. В этом отношении, как сумма веро-
ятностей, функция распределения позволяет оценить термодинамическую ста-
бильность макросостояния. То макросостояние, которое характеризуется более
высоким значением функции распределения, имеет более высокую вероятность и,
следовательно, меньшую свободную энергию.
Определение понятия микросостояние весьма гибкое, т. е. оно может быть рас-
ширено для включения многих важных характеристик. Например, каждое микро-
состояние характеризуется энтропией, определяемой разупорядочивающим влия-
нием колебаний связей. Чтобы учесть этот параметр, в сумму в уравнении (1.2)
можно включить колебательные энергетические уровни. Микросостояния белко-
вой молекулы могут различаться также по позициям и ориентации окружающих
молекул воды и ионов, присутствующих в растворе. Если вклады этих факторов
включить в сумму в уравнении (1.2), величина свободной энергии в уравнении
(1.1) будет определена с большей точностью. Подобные теоретические соображе-
ния помогают представить в широком смысле, как различные детали способны
влиять на общую картину. Свободная энергия макросостояния в действительности
зависит от всего комплекса факторов. Ниже мы определим данные зависимости,
но здесь непосредственно касаться их не будем.
Другой способ анализа функции распределения макросостояния состоит
в том, чтобы представить дискретные состояния в уравнении (1.2) как континуум.
При таком подходе сумма превращается в интеграл по определенному диапазону
всех внутренних координат молекулы
<2= |e’£(r)/*7’dr (1.4)
GS
Здесь г означает вектор, определяющий позиции всех атомов, и Е(г) — по-
тенциальную энергию молекулы как функцию этих позиций. Уравнение (1.4) на-
зывают классическим конфигурационным интегралом (McQuarrie, 1976). Диапа-
зон интегрирования, обозначаемый как GS, характеризует макросостояние путем
ограничения пространства координат. Это аналогично ограничению общего числа
микросостояний субансамблями «GS в уравнении (1.2). Ограничение диапазона
интегрирования в уравнении (1.4) и ограничение диапазона суммирования в урав-
нении (1.2) — это эквивалентные способы подразделения пространства состояний
белковой молекулы на отдельные области, соответствующие различным макросо-
стояниям.
16
Глава I. Конформационные переходы в белках
Необходимо отметить, что в уравнениях (1.2) и (1.4) не учтен вклад кинетиче-
ской энергии. Эта энергия не входит здесь в предмет рассмотрения, поскольку
в классической физике (т. е. без учета квантово-механических эффектов) каждый
атом имеет среднюю кинетическую энергию, равную 3/2кТ. В рамках классиче-
ской физики это распространяется на все микросостояния. В случае сильных, ко-
валентных связей квантовые эффекты имеют большое значение и кинетическая
энергия колебаний атома может быть ниже указанной величины. Однако при кон-
формационных переходах данный вклад, по-видимому, существенно не изменяет-
ся, поскольку разрыва ковалентных связей при них не происходит. Это позволяет
считать уравнения (1.2) и (1.4) особенно подходящими для биофизического анали-
за поведения макромолекул.
Не задаваясь здесь целью рассчитать функцию распределения белковой моле-
кулы, просто примем к сведению, что существует свободная энергия макросостоя-
ния, которую можно определить этим способом. Величина свободной энергии
макросостояния включает все энергетические характеристики, от которых зависит
большая стабильность одного состояния по сравнению с другим в определенных
условиях. Не уточняя эти характеристики, мы все же можем разрабатывать полез-
ные гипотезы для выяснения факторов, влияющих на конформационные измене-
ния белковых молекул.
Модели, основанные на понятии о макросостояниях, весьма широко исполь-
зуются в молекулярной биологии, но часто без уточнения теоретической базы
и обоснования исходных допущений. В действительности мы не имеем достаточ-
ных оснований полагать априори, что белок имеет лишь небольшое число макро-
состояний или что поведение белка может быть корректно описано в данных рам-
ках. Логично считать, что конформационные изменения, влияющие на функции
белков, включают сдвиги в распределении микросостояний. Каждое функцио-
нальное состояние может описываться одним и тем же набором микросостояний,
но вероятности некоторых из них различны для различных функциональных со-
стояний. Таким образом, существует два полюса в представлениях о природе кон-
формационных изменений в молекулах белков. Один из них — это объяснение
конформационного перехода как перехода между отдельными неперекрывающи-
мися популяциями микросостояний, другой — как сдвига в распределении внутри
их одной жестко связанной популяции. О том, какое из этих представлений более
соответствует реальности, можно судить на основании результатов эксперимен-
тальных исследований; некоторые из них будут приведены ниже при рассмотре-
нии соответствующих теоретических гипотез.
Переменная £, в приведенных выше уравнениях означает энергию отдельной
молекулы. Однако часто удобнее оперировать величиной энергии в расчете на
1 моль вещества. Для этого постоянную Больцмана, к, следует заменить газовой
постоянной, R. На практике нередко требуется переходить от молекулярной еди-
ницы энергии к молярной, и обычно это легко сделать, если учесть, какая необхо-
дима постоянная, к или R. Чтобы пояснить масштаб различий между энергией мо-
лекулы и энергией 1 моль вещества, сравним величины кТи RT(при физиологиче-
ской температуре 300 К): кТ = 4,11 • 10"21 Дж; RT = 2,47 • 103 Дж. (Величина RTравна
также 590 кал, и эту размерность чаще используют в случае применения молярной
величины энергии.) При вычислении вероятности состояния на основе распреде-
ления Больцмана значения энергии делятся на эти числа. Таким образом, кТи RT
1.2. Равновесие между двумя макросостояниями
17
представляют собой основные величины, относительно которых рассчитывается
энергия. Вычисленная относительно этих величин энергия состояния показывает,
насколько вероятно данное состояние.
1.2. Равновесие между двумя макросостояниями
Рассмотрим равновесие между двумя макросостояниями, А и В, описываемое вы-
ражением
А<=±В (1А)
Этот взаимопереход подобен реакции изомеризации. Макросостояние А характе-
ризуется молярной свободной энергией Ga, макросостояние В — свободной энер-
гией Gb. Молярные величины свободной энергии растворов с определенными кон-
центрациями А и В составляют
Ga = Ga°+/?Tln[A] (1.5а)
Gb = Gb +7?Т1п[В], (1.56)
гдеОа° nGb — это стандартные молярные величины свободной энергии (т. е. отно-
сящиеся к концентрации 1 М). Изменение свободной энергии при переходе
А —► В можно рассчитать следующим образом
AG=Gb-Ga=Gg-Ga°+ATln^ (1.6)
[А]
При равновесии AG = 0. Обозначив равновесные концентрации как [А]равн и [В]равн,
запишем уравнение изменения свободной энергии
AG°= -ЯЛп-5?^- = -ЯТ1п/Сравн, (1.7)
[А]Равн
где Д G° = Gb -Ga° и Хравн — константа равновесия перехода между А и В. Преобра-
зуя это уравнение в экспоненциальную функцию, получаем
Q-bGQ/RT_ 1равн
(1 8)
" [А]раВн
Индекс «равн» далее можно опустить, поскольку до конца главы все рассматривае-
мые концентрации будут относиться к равновесным.
Уравнение (1.8) весьма сходно с распределением Больцмана, которое позволя-
ет вычислить соотношение относительных вероятностей двух микросостояний как
экспоненциальную функцию разницы их энергий. Такое соотношение для относи-
тельных вероятностей двух микросостояний можно вывести из уравнения (1.3).
Аналогичным образом, уравнение (1.8) может быть выведено непосредственно из
уравнения (1.3) путем суммирования энергий микросостояний для каждого из двух
макросостояний и последующего вычисления соотношения между этими двумя
18
Глава I. Конформационные переходы в белках
суммарными величинами. Данная связь указывает на то, что равновесие, описы-
ваемое уравнением (1.8), отражает относительную стабильность двух различных
сочетаний (субансамблей) микросостояний. Уравнение (1.8) дает полезное началь-
ное понятие об энергиях, рассматриваемых в моделях конформационных перехо-
дов. Общая идея таких моделей состоит в том, чтобы сделать предположение отно-
сительно А 6° и использовать уравнение (1.8) для анализа следствий.
1.3. Термоиндуцированные конформационные
макропереходы
Показательным примером конформационных изменений может служить теп-
ловая денатурация белков. Низкая температура благоприятствуют свернутому
состоянию белковых молекул. Оно включает относительно небольшое число
микросостояний, и во всех этих микросостояниях молекула имеет сходную
структуру, соответствующую компактной конфигурации (рис. 1.1). Эта конфигу-
рация поддерживается за счет специфических связей между многочисленными
аминокислотными остатками (см. разд. 2.13). При высокой температуре белковая
молекула развертывается, т. е. теряет свою нативную укладку (рис. 1.1). Такое де-
натурированное состояние характеризуется очень большим числом микросо-
стояний, соответствующим всему набору различных конфигураций случайным
образом извитой цепи (см. гл. 3). Данный переход может быть обратимым, т. е.
охлаждение может приводить к восстановлению специфической укладки белко-
вой молекулы.
Отметим, что чувствительность перехода к температуре обусловлена разницей
в количестве микросостояний при двух указанных макросостояниях. Примем это
положение как данное, не рассматривая структурные детали в соответствии с об-
щей установкой данной главы. Анализ процесса тепловой денатурации в рамках
статистической механики приведен в гл. 3.
Для того чтобы объяснить, каким образом температура влияет на денатурацию,
разделим свободную энергию на ее составляющие — энтальпию и энтропию
А(7°= АЯ°-7А5° (1.9)
Энтальпия в общем относится к связям, стабилизирующим нативную, сверну-
тую конформацию молекулы белка. Энтропия отражает вклад, обусловленный
Рис. 1.1. При тепловой дена-
турации молекула белка
подвергается конформаци-
онному (макро-) переходу из
компактно свернутой, натив-
ной формы в случайным об-
разом извитую форму.
1.3. Термоиндуцированные конформационные макропереходы
19
большей неупорядоченностью развернутого состояния. Это упрощенное представ-
ление; на самом деле энергии стабилизирующих связей не являются чисто энталь-
пийными (об этом подробнее будет идти речь в гл. 2), однако такое разделение ме-
жду энтальпией и энтропией служит полезным способом анализа процесса денату-
рации. Важно отметить также, что некие связи могут стабилизировать развернутое
состояние. В развернутом состоянии белок не имеет собственной структуры, кото-
рую необходимо стабилизировать, но более сильные связи между открывшимися
при денатурации аминокислотными остатками и молекулами воды либо другого
растворителя влияют на АЯ°. В этом состоит механизм действия денатурирующих
веществ (см. разд. 1.7).
Предполагая, что параметры АЯ°и А5° сами по себе не зависят от темпера-
туры, можно считать, что движущим фактором термоиндуцированного сдвига
равновесия между А и В служит величина 7А5°. Существует температура пере-
хода, Г*, при которой концентрация молекул в свернутой конформации равна
концентрации молекул в развернутом состоянии. В этой точке AG° = 0, т. е.,
согласно уравнению (1.9), АЯ°=Г*А5°. При значениях температуры ниже АТ7*
величина АЯ°>7А5° и А(7° составляет положительную величину, в соответст-
вии с чем более стабильно состояние А. При значениях температуры выше Т* ве-
личина АЯ°<7А5° и А(7° составляет отрицательную величину, вследствие чего
более стабильно состояние В. Это легко видеть при объединении уравнений (1.8)
и (1.9).
[В] _ е(-Д//°+ГД5°)/ЯГ
[А]
(1.10)
Для прикладных целей часто определяют переменную х как фракцию вещества
в состоянии В, или степень превращения из А в В
[В]
[В] + [А]
С помощью уравнения (1.10) эту переменную можно выразить как функцию А(7 °.
Деление величин в числителе и знаменателе на [В] позволяет получить уравнение
(1.Н)
1
1 + ([А]/[В])
(1.12)
Подставляя в это уравнение выражение (1.10), получаем
1 + еЛГ
дя°
(1.13)
В области низкой температуры положительный энтальпийный член в показателе
степени преобладает, значение экспоненциальной функции высокое и величина х
близка к нулю. При высоких значениях температуры доминирует отрицательный
энтропийный член, значение экспоненциальной функции низкое и величина х
близка к единице. Таким образом, уравнение (1.13) описывает процесс взаимопре-
вращений от х ~ 0, когда [А]» [В], до х ~ 1, когда [В]» [А].
20
Глава I. Конформационные переходы в белках
1.4. Развертывание молекулы лизоцима
В большом числе работ тепловая денатурация белков изучалась с той целью, чтобы
определить вклады различных внутримолекулярных сил в стабилизацию нативной,
свернутой конформации. Эти силы будут более подробно рассмотрены в гл. 2, но
здесь мы приведем результаты таких экспериментов, поскольку они хорошо пока-
зывают, как структурные изменения молекулы влияют на макропереходы.
Путем скрининга были выделены термочувствительные мутантные варианты
фермента лизоцима из бактериофага Т4. Молекула этого белка развертывается при
повышении температуры и в развернутом состоянии не обладает ферментативной
активностью. Мутантные температурочувствительные варианты лизоцима подвер-
гаются денатурации при более низкой температуре, чем белок дикого типа. Изучение
структуры мутантных белков, характеризующихся более низкими значениями тем-
пературы плавления, позволило выявить аминокислотные остатки, от которых за-
висит термостабильность, в частности остаток треонина в позиции 157. С помощью
метода сайт-направленного мутагенеза были получены варианты лизоцима, в которых
этот остаток был замещен остатками 13 других аминокислот (Alber et al., 1987).
Термочувствительные варианты лизоцима отличаются от белка дикого типа по
разности величин свободной энергии свернутого и развернутого состояний. Это
может быть результатом изменения силы взаимодействия боковой цепи данного
аминокислотного остатка с соседними остатками, поскольку такое изменение
приводит к изменению энтальпии. В других случаях боковая цепь нового амино-
кислотного остатка может обладать большей или меньшей свободой конформации
и это вызовет изменение энтропии. Изучение выделенных мутантных вариантов
лизоцима показало, что замена треонина-157 одним из 13 других аминокислотных
остатков приводит к снижению Г*. С применением калориметрического метода
было установлено, что эта дестабилизация отражает как уменьшение АЯ°, так
и увеличение А5°.
На рис. 1.2 показаны расчетные кривые плавления для белка дикого типа и не-
скольких мутантных белков. При повышении температуры белок поглощает тепло-
ту. Количество поглощенной теплоты, означающее энтальпию, можно измерить
с помощью калориметра. Представленные графики соответствуют уравнению (1.13),
в которое подставлены величины АЯ° и А5°, определенные на основе экспери-
ментальных данных. Рассчитанные по уравнению (1.13) значения переменной
х умножали на АЯ° для вычисления увеличения энтальпии, и по этим результатам
строили график. После вычитания фонового поглощения теплоты растворителем
и белком в макросостояниях, не связанных с денатурацией, получали величину те-
плоты, соответствующую конформационному переходу. Таким способом легко рас-
считывается теплота, поглощаемая в результате развертывания молекулы.
Кривая плавления лизоцима дикого типа (рис. 1.2, А) показывает, что общее
поглощение теплоты равно величине АЯ° белка. Значение температуры в точке,
соответствующей х = 1/2 и А//°/2, — это температура плавления, Г*. Величину
А5° определяют как \Н^/Т*.
Кривые плавления мутантных белков представлены на рис. 1.2, Б вместе с кри-
выми плавления белка дикого типа. На рис. 1.2, В показан участок структуры бел-
ковой молекулы вокруг сайта мутации (треонина-157). Мутация с заменой этого
остатка на остаток аланина приводит к снижению Г* на 4 °C и снижению уровня
1.4. Развертывание молекулы лизоцима
21
плато. Оба эти изменения — следствия снижения ДЯ° в результате мутации.
В случае мутации, которая не влияет на величину Д5°, снижение Г* происходит
в соответствии с тем, что Г*Д5° = ДЯ°. Снижение ДЯ° при такой мутации отража-
ет потерю двух водородных связей, образуемых гидроксильной группой остатка
треонина-157 (рис. 1.2, В). Замещение этого остатка остатком валина снижает Т*
в еще большей степени; уровень плато в этом случае ближе к уровню плато кривой
плавления белка дикого типа, т. е. такая дестабилизация вызвана главным образом
увеличением Д5° перехода, а не уменьшением ДЯ°. Это может указывать на огра-
ничение движения соседних боковых цепей, вызванное тем, что размеры боковой
цепи валина больше, чем размеры боковой цепи треонина. Наконец, в случае за-
мены остатка треонина остатком изолейцина величина ДЯ° выше по сравнению
с белком дикого типа. Если величина Д5° остается без изменений, то Г* должна
возрасти, но такая мутация приводит к наибольшему снижению Г*, из чего мож-
но сделать вывод, что увеличение Д5° значительно больше, чем увеличение ДЯ°.
Температура, °C
Рис. 1.2. А. На графике зависимости энталь-
пии от температуры для лизоцима дикого ти-
па (ДТ) показаны основные характеристики
кривой плавления. Общее изменение эн-
тальпии составляет ДН° перехода; Г — точ-
ка 1/2 максимального изменения. Б. Мутант-
ные формы лизоцима фага Т4 плавятся при
более низких значениях температуры. В ре-
зультате мутаций подвергался замене оста-
ток треонина в позиции 157: на остаток изо-
лейцина (I), остаток валина (V) или остаток
аланина (А). Энтальпию рассчитывали как
хДН° с помощью уравнения (1.13). Данные
измерений ДН° и д$° взяты из работы
Connely et al., 1991. В. Схематическое изо-
бражение связи атома водорода в составе
гидроксильной группы боковой цепи треони-
на-157 с гидроксильной группой треонина-
155 и амидной группой остова в аспарта-
те-159 (см. Alber et al., 1987).
20 40 60
Температура, °C
В
22
Глава I. Конформационные переходы в белках
Боковая цепь изолейцина образует связи с другими участками белка, стабилизируя
структуру, но размеры этого остатка слишком велики для того кармана в конфигу-
рации молекулы, который занимает остаток треонина, и движение этих боковых
цепей гораздо более ограничено. Таким образом, замена на остаток изолейцина
обусловливает большую неупорядоченность в развернутом состоянии в результате
гибкости крупной боковой цепи этого остатка и А5° увеличивается в результате
изменений с обеих сторон перехода.
1.5. Крутизна кривой и энтальпия
Тепловая денатурация отражает конкуренцию между энтальпией и энтропий, в со-
ответствии с чем изменение той или другой из этих характеристик сдвигает темпе-
ратуру перехода вверх или вниз. Зададимся вопросом, что происходит, если АЯ° и
А5° изменяются параллельно? Значение Г* в этом случае остается неизмененным,
но вид графиков меняется, и это указывает на еще один интересный аспект темпе-
ратурнозависимых конформационных изменений белковых молекул. График, со-
ответствующий уравнению (1.13), для таких переходов, которые происходят при
одной и той же температуре Г* = 300 К, представлен на рис. 1.3. При расчете ис-
пользованы различные значения АЯ°; величину А5° вычисляли как Как
видно из графиков, если и АЯ° и А5° увеличиваются совместно, угол наклона
кривой возрастает.
Увеличение угла наклона кривой с возрастанием АЯ° позволяет применить
следующий способ для анализа термоперехода. Величина АЯ° (равно как и А5°)
обусловливает чувствительность перехода к температуре. При возрастании АЯ° и
А5° величина АС0 изменяется быстрее, когда температура проходит через значе-
ние Г*.
Это соотношение между температурной зависимостью равновесия и его вели-
чинами А5°и АЯ° диктуется правилами классической термодинамики. Рассмот-
рим вначале следующее основное уравнение
— = -5° (1.14)
о юо 200 зоо 400 500 600 Рис. 1.3. Графики уравнения (1.13) для
Г, к т*=300 К и трех значений ДН° (AS0=&Н°/Т*).
1.6. Эффект кооперативности и температурные переходы
23
(1.15)
(1.16)
(1-17)
(1.18)
(1.19)
Оно применимо и для случая изменения рассматриваемых величин
дт
Данное соотношение показывает, что Д50 определяет температурную зависимость
равновесия; замена Д5° выражением \Н®/Т* позволяет утверждать то же в отно-
шении энтальпии.
Используем уравнение (1.15) для подстановки вместо Д5°в уравнение (1.9)
Лб(1=Л//°+7’—
дТ
Производя дальнейшие преобразования и деление на Т2, получим выражение
1 ад<?° д<?° = дя°
Т дТ Т2 ~ Т2 ’
из которого выводится уравнение, называемое уравнением Гиббса—Гельмгольца
а(Дб!°/Г)_ ДЯ°
дТ ~ Т2
Это можно проверить, определяя производную в левой части уравнения. Исполь-
зуя уравнение (1.7), продвинемся на шаг дальше
а in([B]/[A]) _ дя°
дТ RT2
Уравнение (1.19), называемое уравнением Вант-Гоффа, дает важный способ
интерпретации температурной зависимости равновесия между двумя макросо-
стояниями. По углу наклона кривой, отражающей зависимость 1п([В]/[А]) от тем-
пературы, можно определить ДЯ°. Вычисляемую этим способом энтальпию часто
называют энтальпией Вант-Гоффа, обозначая ее ДЯУ°.
Отметим, что характеристики Д5° и ДЯ° нельзя рассматривать отдельно одну
от другой, когда речь идет о температурных эффектах. Для полноты параллельный
анализ можно провести с использованием Д5°. Объединяя уравнения (1.7) и (1.15),
получим следующее уравнение
а/?Г1п([В]/[А]) 0
------------ — £Д О
дт
Если анализировать термопереход с помощью этого уравнения, по углу наклона
кривой можно рассчитать величину Д5°. Поскольку ДЯ° = Г*Д5°, величины Г*,
ДЯ° и Д5° не изменяются независимо; определение двух из них позволяет устано-
вить третью.
(1.20)
1.6. Эффект кооперативности и температурные переходы
Как правило, крутизна кривой температурной зависимости термоперехода связана
с эффектом кооперативности. Этот эффект заключается в том, что различные час-
ти системы неким образом связаны, т. е. сила, воздействующая на одну ее часть
и вызывающая изменение конформации, зависит от того, подвергаются ли другие
24
Глава I. Конформационные переходы в белках
части этому изменению. Энтальпия и кооперативность, по-видимому, существен-
но не связаны, но оба эти фактора влияют на крутизну кривой термозависимости
перехода.
Рассмотрим белок, состоящий из п идентичных субъединиц. Если все п субъе-
диниц подвергаются конформационному изменению одновременно, переход мож-
но назвать полностью кооперативным и описать его уравнением равновесия
А„^В„ (1.1В)
В данном случае предполагается, что в системе не могут присутствовать в смеси
молекулы в состоянии А и молекулы в состоянии В, т. е. исключена ситуация АД
(где / + j = п) и конформационный переход возможен только между Ал и Вл. По-
скольку в случае кооперативности переходу подвергаются одновременно все субъ-
единицы, изменение энтальпии в расчете на 1 моль л-мерной молекулы вычисля-
ется умножением ДЯ° для одной субъединицы на п. Полученное большее значе-
ние энтальпии представляет собой ДЯУ°Ь. От данной величины зависит угол
наклона графика температурной зависимости конформационного перехода, и она
должна использоваться в уравнениях (1.13) и (1.19), описывающих температурную
зависимость равновесия. Таким образом, в случае мультисубъединичного белка
кооперативность повышает эффективную энтальпию перехода, увеличивая тем са-
мым его крутизну.
При полной кооперативности справедливо, таким образом, равенство
ДЯУ°Ь = п\Н\ Однако в случае, когда кооперативность неполная, крутизна кривой
перехода меньше и величина ДЯУ°Ь ниже. Если субъединицы подвергаются переходу
полностью независимо одна от другой, крутизна этой кривой зависит от ДЯ° од-
ной субъединицы. Таким образом, мерой степени кооперативности можно считать
отношение ДЯУ°Ь к ДЯ°, где ДЯ° для одной субъединицы измеряется независимо
с помощью калориметра. Соотношение ДЯУ°И / ДЯ° называют единицей коопера-
тивности; оно может варьировать от 1 до п. Эта величина показывает, в какой сте-
пени субъединицы взаимодействуют при температурозависимом переходе.
Используем эти допущения, чтобы проверить, является ли тепловая денатура-
ция переходом между двумя макросостояниями. Рассмотрим белок, содержащий
т мелких доменов. Каждый домен подвергается переходу между двумя макросо-
стояниями с изменением энтальпии Д/г °. Отметим, что Д//У°ь должна равняться
ДА °, если домены независимы, и если они взаимозависимы в высокой сте-
пени и переход полностью кооперативный. Таким образом, гипотезу о переходе
между двумя макросостояниями можно проверить путем сравнения ДЯ°, изме-
ренной с помощью калориметра, и ДЯУ°Ь, определенной по углу наклона кривой
плавления.
Такое сравнение проведено для ряда белков. В случае глобулярных белков не-
большой молекулярной массы (менее 15 000 кДа) значения ДЯУ°Ь и Д//° почти пол-
ностью совпадают (Privalov, 1979). Этот важный результат означает, что молекула
белка не развертывается понемногу с повышением температуры. При значениях
температуры, близких к температуре плавления, сосуществуют два состояния, но
нет в значительном количестве интермедиатов, т. е. термопереход затрагивает од-
новременно всю молекулу белка, а не происходит как постепенное ослабление ста-
бильности структуры или как множество отдельных переходов в различных струк-
турных доменах. В случае более крупных белков наблюдается плавление с несколь-
1.7. Переходы, индуцируемые другими факторами
25
кими отдельными состояниями, возникающими по мере плавления отдельных
доменов, и модель двух состояний применима к этим доменам (Privalov, 1982).
Кооперативность термозависимого развертывания молекул глобулярных бел-
ков нельзя считать общим правилом. Нет гарантии, что любая аминокислотная по-
следовательность будет свертываться с образованием определенной компактной
конформации, и для многих синтетических пептидов этого не наблюдается. Идея,
что компактно свернутые аминокислотные цепи, могут представлять ограничен-
ный набор среди всех возможных, рассматривается в разд. 3.16. Некоторые данные
об условиях кооперативности свертывания получены при изучении денатурации
лизоцима калориметрическим методом. Описаны мутантные формы этого белка
с пониженной кооперативностью тепловой денатурации (Carra et al., 1996). В слу-
чае этих белков ДЯУ°Ь составляет 80—90% величины ДЯ°, измеренной калоримет-
рически. Как показывает рентгеноструктурный анализ, N- и С-концевые домены
в молекуле лизоцима существенно разделены и их соединяет один отрезок а-спи-
рали. Мутации, приводящие к изменениям в а-спиральной последовательности
N-концевого домена (остатки аланин-42, серин-44 и лизин-48, далекие от трео-
нина-157), нарушают сопряжение между двумя доменами, в результате чего плав-
ление этих доменов происходит независимо, как два отдельных процесса, каждый
из которых обнаруживает собственное кооперативное поведение с наличием двух
состояний.
1.7. Переходы, индуцируемые другими факторами
Приведенный выше анализ температурозависимых переходов показывает, каким
образом предположения, касающиеся энергетики белка, могут быть использованы
для прогнозирования и интерпретации его поведения в эксперименте. С помощью
такого подхода можно исследовать и влияние других экспериментально контроли-
руемых переменных на макропереход. Например, если говорить о давлении, следу-
ет рассматривать изменение объема, связанное с конформационным переходом.
Изменение свободной энергии при макропереходе, вызванном изменением давле-
ния, будет включать величину работы, определяемую как PW.
Рассмотрим макропереход с изменением молярного объема, ДИ°. Если моле-
кула в каждом из двух макросостояний несжимаема или одинаково сжимаема, дав-
ление может влиять на относительную стабильность двух макросостояний только
через указанную работу. Это позволяет разделить молярную свободную энергию
перехода на две составляющие
Дб° = Дбн°д + РДИ°, (1.21)
где ДСнд — независимое от давления изменение свободной энергии. Теперь это
выражение следует включить в уравнение, отражающее соотношение концентра-
ций белка в двух макросостояниях, чтобы вывести соответствующую экспоненци-
альную зависимость от давления. В результате мы получим уравнение, аналогич-
ное уравнению (1.13), но с Дб„д +РДИ0 вместо ДЯ° -7Д5°. Крутизна кривой связа-
на в этом случае с Д К0, так же как с ДЯ° в случае температурозависимого перехода.
Продолжая эту аналогию, можно предполагать, что в случае мультимерного белка
26
Глава I. Конформационные переходы в белках
величина Д И0 будет возрастать вследствие кооперативности, степень которой от-
ражает, в какой мере связаны переходы в отдельных субъединицах. Если переход
кооперативный, величина эффективной ДУ° возрастает, как и угол наклона гра-
фика зависимости перехода от давления.
Другой важный пример макропереходов — это изменение конформации бел-
ков под действием денатурирующих веществ (Tanford, 1986; Fersht, 1998). При вне-
сении в раствор таких соединений, как мочевина, гуанидин или спирт, белки пере-
ходят в состояние, качественно сходное с развернутым состоянием, вызванным
нагреванием (рис. 1.1). В количественном отношении эти два фактора действуют
различным образом: при нагревании белок сохраняет некоторую остаточную
конформацию, тогда как в результате воздействия денатурирующего вещества ее
почти не остается. В этом последнем случае развертывание белковой молекулы
вызвано главным образом тем, что денатурирующее вещество энергетически вы-
годным образом взаимодействует с компонентами внутренней области белка. Так,
мочевина образует водородные связи с амидными и карбонильными группами
пептидного остова. Эти взаимодействия рассматриваются в гл. 2; здесь требуется
лишь указать, что взаимодействие аминокислотных остатков, скрытых внутри
свернутой молекулы, с водой энергетически невыгодно. Открывание этих остатков
в результате развертывания белковой молекулы делает ДО0 положительной вели-
чиной. При увеличении концентрации денатурирующего вещества энергетически
невыгодное взаимодействие с водой компенсируется энергетически выгодным
взаимодействием с денатурирующим веществом. Этот вклад в изменение свобод-
ной энергии пропорционален концентрации денатурирующего вещества и числу
скрытых остатков. Обозначив денатурирующее вещество как D, запишем следую-
щее уравнение
Дб7° = AGb°+wd[D] (1.22)
Здесь mD — это эмпирический параметр, отражающий число скрытых остатков,
умноженное на среднюю энергию их энергетически выгодного взаимодействия
с денатурирующим веществом в расчете на один скрытый остаток.
Используя это выражение для вычисления ДО0, мы вновь получим уравне-
ние, аналогичное уравнению (1.13). Теперь можно определить фракцию разверну-
того белка как функцию концентрации денатурирующего вещества, [D], и постро-
ить ее график, чтобы путем подгонки найти ДО° и mD. Анализ этих графиков на
основе модели двух состояний существенно помогает изучению укладки белковых
молекул.
Можно рассмотреть и много других примеров. В каждом случае имеется экспе-
риментально контролируемая переменная (внешний фактор) и соответствующая
характеристика системы, чувствительная к этой переменной. Например, такой
внешний фактор, как линейное растяжение, G, вызывает растяжение эластичных
молекул и при этом чувствительной характеристикой системы служит длина моле-
кулы, L. Если под действием линейного растяжения происходит макропереход ме-
жду двумя состояниями с различной длиной молекулы, то совершается работа, ве-
личина которой составляет $Д£°, где ДА0 — изменение длины. При обозначении
поверхностного натяжения как П и площади поверхности, занятой мембранным
белком, как А, эта работа выражается величиной ПДЯ°, где А4° — изменение пло-
1.8. Конформационные переходы, индуцируемые изменением разности потенциалов
27
щади. Конформационный переход может быть индуцирован также сдвигом pH;
в этом случае он обусловлен разницей в числе протонированных групп между
двумя макросостояниями. Такой переход можно описать как процесс связывания
лигандов, используя в качестве экспериментально контролируемой переменной
концентрацию лиганда и в качестве характеристики системы число занятых
лигандсвязывающих участков. Еще одним фактором, способным индуцировать
макропереход, служит разность потенциалов; анализу его влияния посвящен сле-
дующий раздел.
1.8. Конформационные переходы,
индуцируемые изменением разности потенциалов
Когда белок локализован в мембране, на его заряды воздействует трансмембран-
ный потенциал. Если этот белок подвергается макропереходу, разность потенциа-
лов может благоприятствовать тому или иному из его состояний в зависимости от
распределения зарядов в молекуле при двух макросостояниях. Это имеет особо
важное значение для функций возбудимых мембран, и рассмотренные здесь идеи
будут использованы в последующих главах, в частности в гл. 16. Следует отметить,
что теория конформационных переходов в молекулах белков наиболее разработана
для ионных каналов. При регистрации одиночных каналов наблюдается ступенча-
тое изменение мембранного тока, и это непосредственно свидетельствует о макро-
переходах на уровне индивидуальных молекул.
Чтобы объяснить зависимость макроперехода от потенциала, предположим,
что два макросостояния, А и В, различаются по распределению зарядов в молеку-
ле. В качестве примера рассмотрим одиночный дискретный заряд q, перемещаю-
щийся между двумя позициями при изменении конформации (рис. 1.4, А). Для
упрощения предположим, что потенциал падает на мембране линейно (от одной
стороны мембраны к другой; рис. 1.4, Б; см. также разд. 13.10). Электростатиче-
ская потенциальная энергия заряда в мембране составляет qxV, где х — расстояние
от той стороны мембраны, на которой потенциал принимается равным нулю,
и V— разность потенциалов на мембране. Переменная х нормирована на толщину
мембраны и варьирует от 0 до 1; таким образом, энергия варьирует от 0 до ^соот-
ветственно перемещению заряда в направлении от одной стороны мембраны
к другой.
В результате конформационного перехода изменяются локализация этого за-
ряда и соответственно его электростатическая потенциальная энергия. Если ис-
пользовать для описания перемещения заряда выражение 5 = хь -ха, изменение
электростатической энергии можно вычислить как qV§ (рис. 1.4, Б). Эта величина
составляет потенциал-зависимую часть изменения свободной энергии при макро-
переходе. Зная вклад одного заряда, можно вычислить сумму таких вкладов всех
зарядов белковой молекулы и получить следующее выражение для общего измене-
ния электростатической свободной энергии при макропереходе
А(7“=£<7,8,И (1.23)
/=1
28
Глава I. Конформационные переходы в белках
Рис. 1.4. А. Белок, погруженный в липидный бислой. Указан единственный положительный заряд,
присутствующий в молекуле. Во время макроперехода заряд перемещается из положения ха
в положение хь. Б. Заряд имеет потенциальную энергию изменяющуюся линейно с его переме-
щением как qVx При смещении заряда от ха до хь электростатическая энергия изменяется соот-
ветственно Ql/(Xb - Ха) = qVd (при 5 = Хь - ха).
Б
Здесь т — число зарядов и i — нумерующий индекс. Если ослабить допущение
о равномерном падении потенциала на мембране, отраженное на рис. 1.4, Б, мож-
но переписать уравнение (1.23), используя величину8, как фракцию мембранного
потенциала. В этом случае она уже не будет означать физическое расстояние, на
которое перемещается заряд.
Теперь мы можем разложить общее изменение свободной энергии при макро-
переходе, представив его как сумму потенциал-зависимой и потенциал-незави-
симой составляющих
т
Д6° = Д(7Н°П = Д6„°П + aV (1.24)
I 1
Величина AG°n — это независимая от потенциала составляющая; величина а в за-
висимой от потенциала составляющей равна Отметим, что член а И ил-
люстрирует описанный в предыдущем разделе подход с использованием внешней
переменной (в данном случае это Р) и определенной характеристики системы, чув-
ствительной к этой переменной (в данном случае это а).
Чтобы пояснить, как может быть использовано уравнение (1.24), рассмотрим
в качестве конформационного макроперехода процессы открывания и закрывания
ионного канала. Каналообразующий белок имеет два состояния — открытое (О, от
англ, opened) и закрытое (С, от англ, closed), т. е. две конформации, связь между
которыми описывает следующая схема
С<=±0 (1.1С)
1.8. Конформационные переходы, индуцируемые изменением разности потенциалов
29
Используя уравнения (1.8) и (1.24), запишем соотношение концентраций белка
в двух этих состояниях
121 = е-(ДС2п+аИ)/ЯТ
[С]
(1.25)
Вероятность открытого состояния, как и в случае уравнения (1.11), составляет
Р -- [0]
° [О] + [С]
(1.26)
Используя для подстановки в это выражение уравнение (1.25) и производя преоб-
разования, мы получаем выражение, сходное с уравнением (1.13)
° 1 + е(Д(7°п+аИ)/ЯГ
В более удобной для применения форме это выражение может быть получено
путем замены RT/a. новым параметром, и замены Д(7°п величиной — Ио/И5
= 1 + е(^-^о)/и5 (1-28)
Эти новые параметры весьма полезны для анализа, так как представляют собой хо-
рошо изученные характеристики потенциал-индуцированных конформационных
изменений: Ио — это величина потенциала в средней точке перехода (при V = V0
и Ро= 1/2); У5 — это диапазон величин потенциала, в котором происходит конфор-
мационное изменение. Чем меньше этот диапазон, тем резче переход.
Графики, соответствующие уравнению (1.28), показывают, что в зависимости
от значения Ио кривая сдвигается влево или вправо (рис. 1.5, А) и изменение
У5 приводит к изменению угла наклона кривой (рис. 1.5, Б). Здесь параметр Уо яв-
ляется аналогом Т* — характеристики температуроиндуцированного перехода.
Разность потенциалов, мВ Разность потенциалов, мВ
Рис. 1.5. Графики уравнения (1.28) для различных значений Из И) и l/s (Ь). Обратите внимание,
что Vs = 25 мВ соответствует а = 1.
30
Глава I. Конформационные переходы в белках
Действительно, Ио можно назвать потенциалом перехода, поскольку, когда V> Ио,
преобладает одно состояние и, когда И< Ио, — другое. Аналогичным образом пара-
метр Vs сравним с ДЯ°. Поскольку этот параметр определяет крутизну кривой пе-
рехода, его часто называют фактором крутизны. Количественной характеристикой
энергии перемещения заряда служит параметр а, и перемещение одиночного за-
ряда через всю область разности потенциалов соответствует значению фактора
крутизны 25 мВ (относительно единиц измерения см. разд. 13.1). Эта величина оп-
ределяется тем, что для единичного заряда при физиологических значениях темпе-
ратуры RT/q ~ 25 мВ. Перемещение 1 моль одновалентных ионов через электриче-
ское поле с разностью потенциалов 25 мВ требует затраты энергии, равной RT.
В случае потенциал-зависимых переходов можно выявить соотношение, ана-
логичное соотношению между крутизной кривой перехода и кооперативностью
при температуроиндуцированных изменениях конформации. Под кооперативно-
стью потенциал-зависимого перехода понимают то, что все заряды в белковой мо-
лекуле перемещаются при конформационном изменении одновременно. При
этом, чем больше число зарядов, тем выше значение параметра а. Таким образом,
увеличение числа зарядов, перемещающихся при изменении конформации кана-
лообразующего белка, сопоставимо с увеличением единицы кооперативности при
температуроиндуцированном переходе.
В биофизике мембран уравнение (1.28) называют уравнением Больцмана
(Hille, 1991). Оно тесно связано с распределением Больцмана и содержит приве-
денную выше экспоненциальную энергетическую характеристику. Это уравнение
часто используют при анализе потенциал-зависимых каналов, включая каналы,
ответственные за проведение электрического импульса в нейронах (см. гл. 16).
Ниже будет показано на примере, каким образом уравнение Больцмана помогает
интерпретировать данные о регуляции канала и определить участки белковой мо-
лекулы, затрагиваемые потенциал-зависимым конформационным изменением.
1.9. Сенсоры потенциала в потенциал-зависимых каналах
Мембранные белки, образующие потенциал-зависимые каналы, составляют об-
ширное суперсемейство, включающее в том числе каналы для К+, Na+ и Са2+. Ка-
налы этого суперсемейства закрыты при отрицательных значениях мембранного
потенциала и открыты при его положительных значениях. Все каналообразующие
белки, конформация которых регулируется потенциалом, имеют общие структур-
ные особенности. Одна из них — это наличие сегмента (примерно из 25 аминокис-
лотных остатков), обозначаемого как S4 (четвертый из шести пронизывающих
мембрану сегментов). Каждый третий остаток в этом сегменте представлен несу-
щим положительный заряд остатком аргинина или лизина; остальные остатки
в нем гидрофобные. Когда в молекулах каналообразующих белков был обнаружен
этот специфический 84-мотив, он привлек внимание как возможный сенсор по-
тенциала. Подтверждение такой роли 84-мотива было получено в биофизических
исследованиях каналов с использованием их мутантных форм.
Исследования проводили на белках, экспрессируемых в ооцитах Xenopus. В эти
крупные клетки инъецировали мРНК каналообразующих белков, и в результате
ооциты осуществляли их синтез. Синтезированный каналообразующий белок бла-
1.9. Сенсоры потенциала в потенциал-зависимых каналах
31
годаря внутриклеточной сортировке транспортировался к клеточной мембране
и встраивался в нее. С помощью микроэлектродов клетку подвергали воздействию
напряжения, изменение которого влияло на функцию каналов, индуцируя ток раз-
личной силы. Этот ток был пропорционален доле открытых каналов, и получен-
ные данные позволили построить графики зависимости Ро от И, которые можно
интерпретировать с помощью уравнения (1.28).
Такие графики, полученные при изучении первого из клонированных канало-
образующих белков, К+-канала (белок Shaker из Drosophila), представлены на
рис. 1.6. При некоторых мутациях, приводящих к замене остатков, несущих поло-
жительный заряд, на нейтральные остатки в 84-сегменте, наблюдалось уменьше-
ние крутизны кривой потенциал-зависимого перехода и возрастание величины Ks.
Это демонстрирует мутация R368Q с заменой несущего положительный заряд ос-
татка аргинина глутаминовым остатком. Она приводит к уменьшению числа заря-
дов, перемещающихся при данном переходе, и соответственно к снижению вели-
чины а и расширению диапазона Ks. Аналогичные исследования были проведены
на белках №+-каналов из клеток позвоночных (Stuehmer et al., 1989).
Мутации могут сдвигать потенциал-зависимость в направлении области поло-
жительных или отрицательных значений. Эти сдвиги происходят в результате
структурных изменений, приводящих к изменению относительной стабильности
открытого и закрытого состояний канала. Примером такого эффекта может слу-
жить влияние мутации R371K, в результате которой один аминокислотный оста-
ток, несущий положительный заряд, замещается другим остатком, также несущим
положительный заряд. Поскольку при этой мутации заряд 84-сегмента остается
прежним, крутизна кривой перехода не изменяется. Обе мутации, эффекты кото-
рых показаны на рис. 1.6, сдвигают кривую потенциал-зависимости влево, т. е. по-
вышают стабильность открытого состояния канала.
Описанные нарушения функции каналов охватывают не все эффекты мута-
ций, но в целом результаты исследований с использованием мутантных форм ка-
налов указывают на то, что переход канала из одного состояния в другое обуслов-
лен перемещением остатков, несущих положительный заряд, в 84-сегменте (Sig-
worth, 1994; Bezanilla, 2000). Это подтвердили результаты ряда других интересных
Рис. 1.6. Графики уравнения (1.28) для
различных значений Vq и l/s показывают
зависимость вероятности открытого со-
стояния канала от разности потенциа-
лов. Мутантный белок R368Q характери-
зуется заменой положительно заряжен-
ного остатка аргинина нейтральным
остатком глутамина. В мутантном белке
R371K остаток аргинина замещен остат-
ком лизина (в результате замены не про-
изошло изменения заряда). (Значения 1/о
и l/s взяты из работы Papazian et al.,
1991.)
32
Глава I. Конформационные переходы в белках
экспериментов. Так, установлено, что при отрицательных значениях мембранного
потенциала участки 84-сегмента можно химически модифицировать только со
стороны внутренней поверхности мембраны, тогда как при его положительных
значениях эти участки доступны для модификации только с ее наружной стороны
(Ahern, Horn, 2004). Экспериментально полученные значения а согласуются
с предположением о перемещении этого положительно заряженного сегмента по-
перек мембраны.
1.10. Воротный ток
В результате перемещения зарядов в молекуле мембранного белка при потенци-
ал-индуцированных изменениях его конформации временно генерируется ток,
обусловленный данным переходом. Этот весьма слабый, но тем не менее измери-
мый ток назван воротным током. Когда изучение каналов только начиналось, об-
наружение воротного тока послужило важным свидетельством в пользу основного
предположения, о том что потенциал-зависимый переход связан с перемещением
зарядов в молекуле мембранного белка. Воротный ток наблюдается только в про-
цессе изменения конформации белка; после открывания канала через него течет
стационарный ионный ток, но воротный ток после завершения конформационно-
го изменения канала прекращается. Экспериментальная запись воротного тока
схематически показана на рис. 1.7. Воротный ток можно зарегистрировать практи-
чески для любого типа потенциал-зависимых каналов, если их плотность в мем-
бране достаточна высока и ионный ток в эксперименте может быть блокирован.
В воротный ток вносит вклад каждый заряд, перемещающийся при конформа-
ционном переходе. Поскольку сила тока равна d^/dz, величину воротного тока
можно проинтегрировать, чтобы получить значение q. Оно служит эксперимен-
тально измеримым показателем заряда, перемещающегося при изменении состоя-
ния канала [аналогично параметру а, определяемому по уравнению (1.24)]. Если
имеется N каналов, каждый из них вносит вклад а в общее движение зарядов, что
описывается следующим уравнением
J/B(Od/ = tfa, (1.29)
где временной интеграл тока, /B(Z), взят по времени процесса перехода. Если из-
вестно число каналов, можно определить а по данным измерения воротного тока.
Разность
потенциалов
Вероятность
открытого
состояния
Воротный ток
Рис. 1.7. Ступенчатое повышение напряжения приводит к
открыванию потенциал-зависимых каналов. Открывание
характеризуется определенной кинетикой. Если поток ио-
нов через канал блокирован, при открывании канала мож-
но наблюдать положительный воротный ток. При падении
напряжения происходит закрывание канала и наблюдает-
ся отрицательный воротный ток. Воротные токи при от-
крывании и закрывании канала характеризуются различ-
ными максимумами и различными кинетиками. Площади
под пиками равны, поскольку общее количество заряда
при прямом и обратном переходах одно и то же.
1.11. Кооперативность и потенциал-зависимые переходы
33
Получаемая величина сопоставима с величиной а, рассчитанной по фактору кру-
тизны, который можно определить из уравнения (1.28).
Этим иллюстрируется еще одна параллель с температуроиндуцированными пе-
реходами. Для конформационных изменений обоих этих типов параметры, харак-
теризующие крутизну перехода, могут быть определены непосредственно на осно-
ве экспериментальных измерений — ДЯ° с помощью калориметрического метода
и а путем измерения тока. Для обоих типов перехрдов сопоставление измеренных
значений этих параметров со значениями, рассчитанными по крутизне кривой пе-
рехода, дает некоторые указания на общий масштаб изменения конформации. Эта
связь подробно проанализирована в ряде работ (Sigworth, 1994; Bezanilla, 2000;
Schoppa et al., 1992).
I. I I. Кооперативность и потенциал-зависимые переходы
Рассмотрим потенциал-зависимое конформационное изменение молекулы белка,
состоящей из п субъединиц. Как и в случае температурозависимого перехода, пол-
ная кооперативность обусловливает увеличение крутизны кривой перехода в п раз,
поскольку а в уравнении (1.27) заменяется величиной паи Ks в уравнении (1.28) де-
лится на п, т. е. переход происходит в более узком диапазоне разности потенциа-
лов.
Эффект кооперативности можно относить и к мономерным белкам, согласно
модели двух состояний; как предполагает эта модель, при изменении конформа-
ции мономерных белков происходит совместное перемещение всех зарядов. Ана-
лиз кооперативности можно попытаться использовать для проверки гипотезы
о переходе между двумя состояниями в случае потенциал-зависимых переходов
в молекулах мономерных мембранных белков, как это было сделано для термоза-
висимого перехода. В отношении потенциал-зависимых каналов такая проверка
сопряжена с определенными трудностями, поскольку ионные каналы, на которых
можно производить необходимые экспериментальные измерения, имеют крупные
размеры. Многие из них представлены олигомерными белками и даже такими,
в молекулах которых нет функционально раздельных доменов.
Полная кооперативность между субъединицами, входящими в состав белковой
молекулы, при конформационном изменении малореальна. Анализ потенциал-
зависимых переходов позволяет предполагать более правдоподобную промежуточ-
ную кооперативность. Рассмотрим молекулу каналообразующего белка, включаю-
щую две идентичные субъединицы, и примем, что каждая из субъединиц подверга-
ется конформационному изменению, описываемому параметрами уравнения
(1.24), Д(7нП и а. Если обе субъединицы подвергаются переходу совместно, коопе-
ративным образом, фактор крутизны будет составлять 2а. В том случае, если воз-
можны взаимонезависимые переходы, следует рассматривать три состояния диме-
ра, а именно АА, ВВ и АВ (АВ и ВА считаются идентичными по симметрии).
Переход в любой субъединице включает изменение свободной энергии
AG°n +аК, в соответствии с чем можно записать уравнение
[АВ1 = [ВВ] = е-(д(?0п+аП/ЯГ q эд'
[АА] [АВ]
34
Глава I. Конформационные переходы в белках
Если ДА, АВ и ВА обозначают закрытое состояние канала и ВВ — это единствен-
ное состояние, в котором канал открыт, вероятность открытого состояния соста-
вит
[АА]-ь [АВ]-ь [ВА]-ь [ВВ]
Разложением [ВВ] и подстановкой уравнения (1.30) получаем
Р _i/pAA] ( [АВ] t [ВА] ( Л ___________________1_______________
° / t[BB] [ВВ] [ВВ] J 1-ь2е(д<72п+аК)/лг + е2(д<72п+аК)/лг
Отметим, что равенство [ВВ]/[АА] = [АВ]/[АА] определяет [ВВ]/[АВ] из уравнения
(1.30). Знаменатель из уравнения (1.32) представляет собой полный квадрат, следо-
вательно
(1 + 2е(дС"п+аК)/я7’)2 (1 + е^о)/^)2
(1.33)
Замена величин Д(7„п и а на Ио и Vs означает то же преобразование, что и пере-
ход от уравнения (1.27) к уравнению (1.28). Для иллюстрации того, каким образом
форма кривой перехода зависит от взаимодействия между двумя субъединицами,
на рис. 1.8 представлен график уравнения (1.33) вместе с графиком уравнения
(1.28). [Чтобы облегчить сравнение, уравнение (1.33) использовано в форме, когда
Ро =1/2 при И=0; см. задачу 10.]
Как видно из рис. 1.8, график уравнения (1.33) является промежуточным по
крутизне относительно графиков простых переходов между двумя состояниями
при а = 1 и а = 2, что обусловлено промежуточной степенью кооперативности, ко-
торую отражает уравнение (1.33). Хотя субъединицы в составе данного белка под-
вергаются переходу независимо, между ними все же должно существовать некое
взаимодействие в соответствии с условием, что канал открыт, когда обе субъедини-
цы находятся в состоянии В. Если субъединицы абсолютно независимы, каждая из
них в состоянии В должна обладать проводимостью независимо от состояния дру-
гой субъединицы. Тогда зависимость проводимости мембраны от разности потен-
1.12. Пластичность макросостояния
35
циалов будет аналогична этой зависимости для мономерного каналообразующего
белка и димерная структура белка не будет проявляться.
Этот пример двухсубъединичного каналообразующего белка можно использо-
вать для дальнейшего анализа кооперативности. Введем величину свободной энер-
гии взаимодействия между двумя суъединицами в различных состояниях, Дб£аИМ.
Данная величина отражает неблагоприятную для кооперативности энергию кон-
такта между субъединицами, когда они находятся в разных состояниях, т. е. когда
белок имеет структуру АВ или ВА. Включив эту величину в уравнение (1.30) и про-
изведя то же преобразование, что и в случае уравнения (1.33), получаем следующее
уравнение
(1.34)
Присутствие члена ДС£иИМ не позволяет произвести здесь простую факторизацию,
которую мы применили при выведении уравнения (1.33) из уравнения (1.32). Этот
пример можно использовать для оценки экстремального случая полной коопера-
тивности. Он соответствует очень большой энергии взаимодействия, вследствие
которой значение среднего экспоненциального члена в знаменателе должно
упасть до нуля. Уравнение (1.34) превращается при этом в простое уравнение
Больцмана, с величиной воротного заряда, равной 2а. Таким образом, высокое
значение Дб^им обусловливает более высокую степень кооперативности перехода,
поскольку делает энергетически невыгодным смешанные состояния, т. е. присут-
ствие в одной молекуле субъединиц в разных состояниях.
*1.12. Пластичность макросостояния
На основе предположения о том, что зависимость конформационного перехода от
потенциала полностью связана с перемещением воротных зарядов, разработана
относительно простая теория. Можно, однако, сомневаться, что данное условие
физически реально. Например, существует вероятность того, что заряды способны
перемещаться при одном и том же макросостоянии белка, и тогда их движение
в электрическом поле может происходить без конформационного изменения мо-
лекулы. В этом случае величина электростатической энергии просто в форме qV8
будет неполной, поскольку 8 становится переменной величиной, зависящей от
разности потенциалов; при каждом макросостоянии изменение потенциала будет
вызывать соответствующее ему смещение зарядов. Реальные физические взаимо-
действия не могут абсолютно жестко стабилизировать структуру белковой молеку-
лы. Рассмотрим случай, когда заряд в молекуле белка удерживается на месте благо-
даря эффекту эластичности. Движение такого заряда против силы эластичности
отражает влияние на него электрического поля.
С учетом одновременного воздействия удерживающей силы эластичности по-
тенциальная энергия заряда как функция его позиции описывается следующим
уравнением
U(х) = qVx + ±<р(х - х0)2 (1.35)
36
Глава I. Конформационные переходы в белках
Рис. 1.9. На заряд в молекуле белка действу-
ют падение потенциала на мембране (предпо-
лагаемое линейным) и гармонический потен-
циал с силовыми постоянными фа и фь в каж-
дом из двух макросостояний.
Первый член уравнения — это знакомое нам линейное выражение, суммиро-
ванное в уравнении (1.23). Второй член — это потенциальная энергия гармониче-
ского осциллятора с силовой постоянной ф. Когда заряд перемещается от позиции
х0, соответствующей энергетическому минимуму в отсутствие электрического
поля, он подвергается воздействию удерживающей силы, равной ф(х-х0). Теперь
выражение, обозначающее эту дополнительную энергию, необходимо ввести в вы-
ражение для потенциал-зависимого конформационного перехода, производное от
уравнения Больцмана. Рассматриваемые при этом макросостояния различаются
как позицией заряда, так и величиной силы эластичности, удерживающей заряд на
месте (рис. 1.9).
Вначале мы должны выяснить, как на энергию и позицию данного заряда при
каждом макросостоянии влияет электрическое поле. Заменим (х-х0) в уравнении
(1.35) параметром х', так чтобы х' = 0 соответствовал центру одной из гармониче-
ских потенциальных ям, показанных на рис. 1.9. Преобразуя квадратный член, по-
лучаем выражение
t/(x) = qVx^ + J<p(x'+ <?И/ф)2 -1($И)2/ф
(1.36)
Это уравнение показывает, что под действием разности потенциалов позиция
энергетического минимума сдвигается от нуля до -qV/q. Последний член в уравне-
нии (1.36) показывает, что энергия в этом минимуме на 1/2(<?И)2/ф ниже, чем она
была бы в том случае, если макросостояние не характеризовалось бы пластично-
стью и заряд оставался на месте. При воротном заряде, соответствующем энерге-
тическому минимуму, энергия этого заряда равна qVxQ -1/2(4 И) 2/ф. Разницу между
двумя величинами энергии в этой форме следует включить в выражение, описы-
вающее изменение энергии при макропереходе
Д G* = Д GH°n + qVb - Uq И)2 f-J- -1
<<Pb 9а
(1.37)
Это уравнение содержит уравнение (1.24), в которое добавлен новый квадратный член.
Таким образом, вместо уравнения (1.28) мы получаем более сложное уравнение
Больцмана
(1.38)
1.12. Пластичность макросостояния
37
Это уравнение включает дополнительную экспоненциальную зависимость от
квадрата разности потенциалов. Чтобы описать движение множества зарядов, тре-
буется произвести суммирование, как в уравнении (1.23), но основные моменты
можно выяснить при анализе уравнения (1.38) для случая одиночного воротного
заряда.
Ключевой вопрос состоит в том, соответствует ли члену И2 в экспоненте вели-
чина, достаточно большая для того, чтобы имел место доступный для наблюдения
эффект. В этом случае потенциал-зависимость Ро будет качественно отличаться от
предсказываемой уравнением (1.28). Если силовая постоянная при обоих состоя-
ниях одна и та же, тогда (ра = <Рь и этот член равен нулю Чтобы наблюдался эффект
влияния пластичности макросостояния на потенциал-зависимость конформации
мембранного белка, заряд должен быть при одной конформации более слабо фик-
сирован, чем при другой. Рассмотрим крайний случай, наиболее благоприятный
для проявления эффекта пластичности макросостояния. Зададим очень высокое
значение одной из силовых постоянных, в результате чего величина 1/фа будет
близка к нулю. Если другой силовой постоянной, <рь, придать низкое значение,
множитель при И2 будет большой величиной.
Чтобы определить реальную величину <рь, следует учесть, насколько может уда-
ляться заряд от его равновесной позиции. При очень слабой фиксации на месте за-
ряд может двигаться в диапазоне 5 А, что соответствует расстоянию, примерно
равному 10% толщины мембраны (толщина типичного липидного бислоя — при-
мерно 50 А). Такое перемещение довольно значительно по сравнению с перемеще-
ниями, допускаемыми обычным растяжением ковалентных связей (см. разд. 2.12),
а также по сравнению с масштабом внутримолекулярного движения в белках, и
поэтому указанная величина может считаться в общем смысле максимальной.
Чтобы вычислить соответствующую этому перемещению силовую постоян-
ную, примем во внимание, что любая степень свободы характеризуется средней
энергией RT/2 в расчете на моль (по принципу равномерного распределения; см.
разд. 12.4). Средняя потенциальная энергия тогда равна
^/l=RT/2 (1.39)
При среднеквадратичном смещении, равном 10% толщины мембраны, величина
х'2 равна 0,01. Тогда, решая уравнение относительно силовой постоянной, мы по-
лучаем
(рь=100АТ (1.40)
Подставляя это значение в экспоненту уравнения (1.38), мы можем преобразо-
вать показатель степени и сравнить линейный и квадратный члены.
2<рь 200 ЯТ
(1-41)
Это уравнение можно упростить далее, поскольку для одиночного заряда при ком-
натной температуре RT/q ~ 25 мВ
qVb-
<7 qv2
RT 200
5 вольт
(1.42)
38
Глава I. Конформационные переходы в белках
Вынося за скобки qVf получаем выражение
qVfi- И/(5 вольт)) (1.43)
Если безразмерная величина V/(5 В) сравнима с величиной 8, (также безраз-
мерной, поскольку она нормирована на толщину мембраны), член И2 будет зна-
чимой величиной. Если величина 8 мала, например равна 0,1, данный квадрат-
ный член станет явно значимым при возрастании разности потенциалов пример-
но до 0,5 В. Это очень высокий потенциал для мембраны. Биологические
мембраны, как правило, разрушаются при значении напряжения, вдвое меньшем
этой величины. В действительности, если бы 8 была равна нулю, все внимание
можно было бы сосредоточить на члене К/(5 В). Эта величина изменяется на-
столько незначительно в диапазоне значений экспериментально измеряемого
мембранного потенциала (±0,2 В), что белок не мог бы проявлять потенциал-
зависимость. Таким образом, пластичность положения заряда в мембранном бел-
ке, по-видимому, не влияет существенно на потенциал-индуцируемые конфор-
мационные переходы. Этот вывод подтвержает правомерность использования
уравнения Больцмана (1.28) для описания зависимости конформации мембран-
ных белков от трансмембранного потенциала. Какое свойство белка зависит от
экспериментально контролируемой переменной соответственно этой квадра-
тично-экспоненциальной функции, в общем сказать трудно. Итак, проведенный
анализ фактора пластичности макросостояния свидетельствует в пользу того, что
перемещение зарядов способно вызывать конформационные изменения мем-
бранных белков.
Задачи
1. Используйте отношение Вант-Гоффа [уравнение (1.19)] для описания параметрах,
заданного уравнением (1.11), как функции Т.
2. Белок подвергается денатурации при температуре 65 °C; переход характеризуется
АЯ°= 80 ккал/моль. Чему равна <7° при 25 °C? Повторите расчет, используя данные
о том, что в денатурированном состоянии белок имеет теплоемкость, на 9 кал/°C
более высокую, чем в свернутом состоянии.
3. Как изменится потенциал-зависимость конформационного перехода (уравнение
(1.28)) при изменении температуры? Как можно объяснить изменение Ио? Почему
существенное изменение Ks менее вероятно?
4. Используя уравнение Больцмана, получите уравнение для вероятности существо-
вания в мембране свободно вращающегося диполя, имеющего ориентацию0 отно-
сительно оси, перпендикулярной плоскости мембраны. Вначале рассмотрите слу-
чай, когда диполь фиксирован в плоскости, перпендикулярной мембране. Затем
произведите расчет для случая, когда диполь может свободно вращаться. В обоих
случаях следует диполь считать расположенным полностью внутри мембраны
и изменение разности потенциалов линейным.
5. Как будет изменяться параметр mD в уравнении (1.22) в зависимости от изменения
мол. массы белка, если белок денатурирует под действием денатурирующего веще-
ства (в случае глобулярных белков)?
Задачи
39
6. Рассчитайте Д(7° потенциал-зависимого перехода при К= -70 мВ и V= +30 мВ для
молекулы белка, характеризующегося двумя макросостояниями, при Ио= -20 мВ и
Ks =10 мВ.
7. Вычислите потенциал-зависимость открывания канала согласно модели, приве-
денной в разд. 1.11, но для случая тримера, в котором В3 представляет только от-
крытое состояние.
8. Определите вероятность открытого состояния'канала щелевого контакта между
двумя клетками как функцию разности потенциалов между содержимым двух кле-
ток. Щелевой контакт образует пара расположенных в ряд каналов, каждый из ко-
торых регулируется независимо от другого. Оба эти канала характеризуются одни-
ми и теми же величинами Ио и Ks. Исходите из предположения, что на каждый ка-
нал действует половинная величина разности потенциалов.
9. Выведите выражение, соответствующее уравнению (1.34), для температурнозави-
симого конформационного изменения димерного белка.
10. Вычислите из уравнения (1.33) значение Ко, при котором график проходит через
0 мВ при Ро=0,5 (как на рис. 1.8). Чему будет равно значение этого параметра
в случае тримера, рассмотренного в задаче 7?
11. Используя классический интеграл конфигурации (уравнение (1.4)), рассчитайте
функцию распределения гармонического осциллятора (функция потенциальной
энергии U(x) = 1/2<р(х - х0)2). Запишите выражения для свободной энергии, эн-
тальпии и энтропии (см. приложение 4).
Г лава 2
Молекулярные силы
в биологических структурах
В гл. 1 мы условно приняли конформацию белковых молекул за черный ящик, ос-
тавив тем самым в стороне все, что происходит внутри них. Такой подход полезен
для объяснения многих экспериментальных данных, но когда необходимо исполь-
зовать сведения о деталях молекулярной структуры, требуется открыть черный
ящик и заглянуть внутрь. При этом важно иметь представление о молекулярных
силах, действующих внутри макромолекул и при их взаимодействии с другими мо-
лекулами или ионами. От действия этих сил зависят укладка белковых молекул
и их конформация. Аналогичные силы определяют структуру нуклеиновых кислот
и липидных бислоев, а также образование комплексов при связывании макромо-
лекул с их лигандами.
Силы, определяющие конформацию макромолекул и организацию молекуляр-
ных структур, делятся на несколько категорий. В целом они настолько хорошо
изучены, что с хорошим приближением описываются математически. Многое из-
вестно о их относительной силе при различных условиях. Однако важно учиты-
вать, что структура и динамика молекул биополимеров зависят от соотношения
и взаимовлияния многих молекулярных сил. Эти сложные связи затрудняют изу-
чение молекулярных сил непосредственно на биомолекулах, и часто приходится
обращаться к модельным системам, которые, несмотря на всю их небиологич-
ность, весьма полезны. На основе анализа модельных систем мы можем разделить
сложные эффекты сил, действующих внутри макромолекул, на более простые со-
ставляющие.
2.1. Электростатические взаимодействия
Один из фундаментальных законов электростатики, называемый законом Кулона,
состоит в том, что энергия взаимодействия двух точечных зарядов обратно про-
порциональна разделяющему их расстоянию, г, и прямо пропорциональна произ-
ведению этих зарядов, q} и q2
(2.1)
ег
Для выражения этих величин мы будем использовать единицы систем СГС (санти-
метр, грамм, секунда) и СГСЭ (система СГС электростатическая), где заряд выра-
2.1. Электростатические взаимодействия
41
жается в единицах СГСЭ (заряд электрона равен 4,8 1О"10 ед. СГСЭ), расстояние
в сантиметрах и энергия в эргах; символом е обозначена диэлектрическая прони-
цаемость среды, в которой находятся заряды. Эта последняя величина отражает
реакцию среды на электрическое поле.
Зависимость энергии взаимодействия зарядов от q и г проста и понятна, тогда
как влияние диэлектрической проницаемости среды не так очевидно. Оно зависит
оттого, насколько легко поляризуются молекулы, из которых состоит данная сре-
да. Среда с сильной реакцией на поле, состоящая из высокополярных молекул или
молекул, способных к поляризации, характеризуется высоким значением е. Поля-
ризация молекул среды влияет на электрическое поле, снижая энергию электро-
статического взаимодействия (кулоновского потенциала). Величина е различных
сред варьирует от -2 (неполярные углеводороды) до ~80 (вода).
Высокая диэлектрическая проницаемость воды обусловлена тем, что ее моле-
кулы обладают большим дипольным моментом и легко вращаются в электриче-
ском поле. Эти свойства воды вызывают ее противодействие эффекту электриче-
ского поля, делая данный эффект незначительным. Так, энергия взаимодействия
ионов Na+ и СГ в воде при их предельном сближении (3 А) составляет, согласно
уравнению (2.1), лишь ~ 1,3 ккал • моль-1, т. е. ненамного превышает величину
2RT. В соответствии с этой низкой величиной энергии NaCl диссоциирует и рас-
творяется в воде. (Для описания распределения ионов в растворах таких сильных
электролитов, как NaCl, характеризующихся слабым взаимодействием между ато-
мами, применим аппарат статистической механики; см. гл. 11). Углеводороды, ди-
электрическая проницаемость которых равна 2, в отличие от воды делают электро-
статические взаимодействия внутри гидрофобной внутренней области белковых
молекул и внутри мембраны чрезвычайно сильными. Ниже мы рассмотрим другой
электростатический эффект — исключение зарядов из этих областей.
В случае гомогенной диэлектрической среды легко рассчитать энергию элек-
тростатического взаимодействия как сумму уравнения (2.1) по всем парам зарядов.
Однако многие биологические системы не относятся к гомогенным, и существую-
щие в них пространственные изменения е в большинстве случаев не позволяют ис-
пользовать для расчета электростатических взаимодействий закон Кулона. Элек-
тростатический потенциал в системе с различными по диэлектрической прони-
цаемости областями можно вычислить с помощью уравнения Пуассона или
близкого уравнения Лапласа при граничных условиях, определяемых геометриче-
ской формой рассматриваемых областей системы. Эти дифференциальные урав-
нения здесь нет смысла приводить, поскольку не стоит углубляться в детали их ре-
шения в таком изложении. Для описания простых систем с линейными, сфериче-
скими или цилиндрическими границами областей используется ряд стандартных
математических методов. Некоторые примеры их применения содержатся в сле-
дующих разделах. В случае сложных и неправильных форм различающихся облас-
тей биологических структур требуется, как правило, использовать компьютер для
получения численного решения.
За простотой закона Кулона скрывается один интересный аспект, часто остаю-
щийся незамеченным. Он связан с термодинамикой электростатических взаимо-
действий. Когда измеряют энтальпию, ее величину во многих случаях ошибочно
рассматривают как энергию электростатических взаимодействий (и водородных
связей; см. разд. 2.10). Подобно этому большую энтропию часто ошибочно припи-
42
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
сывают гидрофобным взаимодействиям (см. разд. 2.8). Энергия электростатиче-
ских взаимодействий эквивалентна работе, необходимой для перемещения заря-
дов в соответствующие позиции при постоянных значениях температуры и давле-
ния. Отсюда следует, что это свободная энергия, а не просто потенциальная
энергия, равная энтальпии. При более точном анализе кулоновского потенциала
оказывается, что в воде он обусловлен энтропией.
Чтобы разложить электростатический потенциал на Я и TS, запишем формулу
для энтропии S --dG/dT, где G — потенциальная энергия из уравнения (2.1).
Дифференцируя это выражение, получаем
_Lf Ml} = = G~ —
дТ\ гг J е2г дТ е дТ
(2.2)
Если диэлектрическая проницаемость не изменяется с изменением температуры,
энтропия должна быть равна нулю и кулоновский потенциал действительно дол-
жен быть эквивалентен энтальпии. Однако диэлектрическая проницаемость воды
сильно зависит от температуры; ее снижение составляет 0,46% в расчете на градус
Кельвина при комнатной температуре. Это означает, что (1/е)(5е/57) = -0,0046 и
S = -0,0046(7. При Т = 300 К величина TS = -1,38(7. Таким образом, вклад энтропии
в потенциальную энергию электростатического взаимодействия выше, чем собст-
венно величина свободной энергии.
Приведенный расчет показывает, что энтальпия противодействует электроста-
тическому притяжению между противоположно заряженными ионами в воде
и сила притяжения определяется энтропией. На молекулярном уровне объяснение
этого неожиданного вывода состоит в том, что растворенные ионы ограничивают
вращение и другие виды движения окружающих молекул воды. Работа, совершае-
мая при этом над молекулами воды, больше той работы, которую производят ионы
в отношении друг друга, и кулоновский потенциал отражает баланс между взаимо-
действиями ион-ион и ион—вода. Действительные взаимодействия невероятно
сложны в деталях, но все эти детали поглощаются одной величиной, е. Такое упро-
щенное объяснение обосновано тем, что поляризация растворителя изменяется
линейно в зависимости от наложенного электрического поля и эта линейность
«кристаллизуется» в единственной величине — е.
2.2. Собственная электростатическая энергия
Итак, в водной среде ион совершает значительную работу над окружающими мо-
лекулами воды, ориентируя их диполи посредством вращения. Это происходит не-
зависимо от того, присутствуют ли поблизости другие ионы, и такое взаимодейст-
вие между ионом и растворителем существенно влияет на распределение ионов.
Энергию внедрения иона в диэлектрическую среду можно рассчитать из кулонов-
ского потенциала следующим образом. Рассмотрим работу, которую необходимо
совершить, чтобы произошло небольшое приращение заряда, 8?', на поверхности
сферы радиусом г, несущей заряд q'
= (2.3)
er
2.2. Собственная электростатическая энергия
43
Это просто уравнение (2.1), где qx = q' и q2 = §q'. Чтобы рассчитать общую работу,
процесс приращения заряда следует проинтегрировать, начиная с заряда, равного
нулю, и заканчивая величиной q
(7 = 1L'59' = ^- (2.4)
er • 2er
Эту энергию называют собственной энергией заряда или энергией Борна по имени
физика Макса Борна, предложившего ее формулу в 1920 г.
Из уравнения (2.4) можно рассчитать свободную энергию внедрения иона
в растворитель данной диэлектрической проницаемости. В случае воды это энер-
гия гидратации. Величина энтальпии гидратации позволяет судить о гидрата-
ции как процессе поляризации окружающей воды. Чтобы вычислить энтальпию
из уравнения (2.4), необходимо продифференцировать его по температуре, полу-
чив в результате величину -5, как в предыдущем разделе, и рассчитать Н как
G + TS. Вычисленная таким образом энтальпия обратно пропорциональна рас-
стоянию, г, и это подтверждают экспериментальные данные (рис. 2.1). Однако
здесь важно учитывать, что принимается за г. Теоретически данная величина
представляет собой радиус полости в растворителе вокруг иона, и эксперимен-
тально полученные данные подтверждают существование такой полости радиусом
от центра иона до наружной электронной оболочки противоиона (Rashin, Honig,
1985).
Можно только поражаться, что уравнение (2.4) позволяет столь точно вычис-
лить энергию взаимодействия ионов с растворителем. На уровне размеров атомов
должны иметь значение детали структуры растворителя. Можно было бы ожидать,
что энергия этого взаимодействия зависит от характера взаимодействия молекул.
Кроме того, огромная напряженность электрического поля на поверхности иона
должна в максимальной степени поляризовать растворитель, обусловливая то, что
называют диэлектрическим насыщением. В то же время данные, представленные
на рис. 2.1, относятся к ионам с валентностью от 1 до 4. Если бы происходило на-
сыщение диэлектрика, результаты по четырехвалентным ионам не должны были
бы ложиться на ту же кривую, что и данные по одновалентным ионам. Совершен-
Рис. 2.1. Зависимость энтальпии гидрата-
ции от расстояния. Представлена величи-
на энтальпии для различных ионов, делен-
ная на q2. Эта обратная зависимость от
расстояния описывается уравнением
(2.4). Сплошная кривая соответствует про-
порциональности —1/г. (По Rashin, Honig,
1985.)
44
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
но превосходным образом такое простое уравнение количественно точно описы-
вает процесс. ।
На основе различия между величинами собственной энергии иона при двух
различных значениях е можно определить свободную энергию переноса иона меж-
ду двумя средами. Перенос иона Na+ радиусом г = 0,95 А из воды (е = 80) в углеводо-
род (е = 2) сопровождается изменением потенциальной энергии на 0,15 • 10-12 эрг,
что эквивалентно очень большой энергии, 85 ккал • моль-1. Этим обусловлено
то, что неорганические соли, как правило, нерастворимы в органических раство-
рителях. По причине диэлектрической поляризации ионы не внедряются в не-
полярную среду. Коэффициент распределения иона Na+ между маслом и водой
зависит от свободной энергии переноса как е"лс7/лг, что дает значение 10-63, если
за G принята собственная энергия. Это объясняет, почему для иона невероятно
трудно внедриться во внутреннюю область белковой молекулы или в липидный
бислой.
2.3. Сила отображения
Сильная зависимость собственной энергии от диэлектрической проницаемости
среды означает, что вблизи границы раздела двух сред, различных по диэлектриче^
ской проницаемости, заряд будет притягиваться к области более высокой диэлек-
трической проницаемости. Этот ион будет оказывать более сильное поляризующее
действие на данную область, и образовавшиеся в ней диполи будут притягивать
ион к границе раздела фаз. Подобно этому, ион в высокодиэлектрической среде
будет отталкиваться от соседней среды с низким значением г.
Рассмотрим точечный заряд у линейной границы раздела двух полубесконеч-
ных областей с величинами диэлектрической проницаемости и е2 (рис. 2.2).
Этот пример имитирует случай, когда ион находится вблизи липидной мембраны.
Решение левой части уравнения Лапласа (к которой относится ej) представля-
ет собой сумму двух членов, эквивалентных уравнению (2.1). Один из них — это
кулоновский потенциал заряда q, другой — кулоновский потенциал несуществую-
щего заряда, называемого отображаемым зарядом (q' на рис. 2.2). Отображаемый
заряд локализован на том же расстоянии с противоположной стороны границы,
как зеркальное отражение. Сила взаимодействия, которой обладает заряд на гра-
Е1 - Е2
г - г
• +Q - 0 -Q'
-
Рис. 2.2. Заряд +q на расстоянии г слева от границы между
средами с диэлектрической проницаемостью и е2 поля-
ризует окружающие среды. Поляризация правой среды,
показанная штрихами на границе, может быть представле-
на как отображаемый заряд, -q' на расстоянии г с другой
стороны границы.
2.3. Сила отображения
45
Рис. 2.3. А. Заряд радиусом а расположен
в центре пластины толщиной Ь. Внутри пласти-
ны среда имеет диэлектрическую проницае-
мость еу (~2 для углеводорода), снаружи — ев
(~80 для воды). Собственная энергия этого за-
ряда вычисляется по уравнению (2.6). Б. Заряд
радиусом а расположен в центре углеводород-
ной сферы радиусом Ь. Собственная энергия
этого заряда вычисляется по уравнению (2.7).
нице раздела фаз, различающихся по диэлектрической проницаемости, названа
соответственно силой отображения.
При е2 > £] заряд в точке отображения имеет величину q' = — £j )/(£2 + £|)
(см. Jackson, 1975). Согласно уравнению (2.1), потенциальная энергия взаимодей-
ствия зарядов q и q\ разделенных расстоянием 2г, равна
е2~е|^ Q2
£2 + £j J2E/
(2.5)
Таким образом, сила действия диэлектрической среды на заряд имеет ту же форму,
что сила действия другого заряда.1 Знак минус в этом уравнении означает, что сила
направлена в сторону области с более высоким значением £. При £2 > £j сила, дей-
ствующая на ион, направлена вправо.
Чтобы выяснить, как сила отображения влияет на энергетику некоторых био-
логических процессов, рассмотрим два важных случая. В одном из них заряд рас-
положен в середине пластины конечной толщины с низкой диэлектрической про-
ницаемостью, окруженной на бесконечном расстоянии с обеих сторон средой
с высокой диэлектрической проницаемостью (рис. 2.3, А). В другом случае заряд
расположен в центре сферы с низкой диэлектрической проницаемостью, окру-
женной средой с высокой диэлектрической проницаемостью (рис. 2.3, Б).
В случае диэлектрической пластины свободная энергия внедрения заряда q в ее
центр описывается выражением (Parsegian, 1969)
G = -^—- — \n
'IZyO £yb ^£в + £у
(2.6)
где £в — диэлектрическая проницаемость воды и £у — диэлектрическая проницае-
мость углеводорода. Первое слагаемое представляет собой величину собственной
энергии заряда в бесконечной среде (уравнение (2.4)). Второе слагаемое показыва-
ет, насколько уменьшается эта энергия в случае конечной толщины слоя среды.
При толщине типичного липидного бислоя 50 А второе слагаемое составляет пре-
Обратите внимание, что это выражение справедливо только для иона, размеры которого
малы относительно расстояния г. Сингулярность при г = 0 нереальна, и если принять во вни-
мание размеры иона, потенциальная энергия будет изменяться монотонно при пересечении гра-
ницы.
46
Г лава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
небрежимо малую величину. Это означает, что в середину липидного бислоя иону
внедриться почти столь же трудно, как в углеводородную среду, занимающую
большой объем. Энергия внедрения иона в липидный бислой — это важный во-
прос в изучении проницаемости мембран для ионов (см. гл. 14).
Второй случай на рис. 2.3, заряд в центре диэлектрической сферы, может слу-
жить моделью для расчета энергии, обеспечивающей скрытое положение несуще-
го заряд аминокислотного остатка во внутренней области глобулярного белка. Эта
энергия рассчитывается тем же способом, который был использован при выведе-
нии уравнения (2.4). Движение каждого элемента заряда Sq' к поверхности при
г = а можно разделить на два этапа — движение через воду к поверхности при г = Ь,
когда работа равна^'б^'/е^, и движение через углеводород к поверхности при г = а,
когда работа равна ^г8^г(1/еу)[(1/л)-(1/6) ]. Интегрирование по q' от нуля до q по-
зволяет получить выражение
G = + (2.7)
2еДа Ь) 2г,Ь
Это выражение для энергии внедрения заряда в центр масляной сферы
(рис. 2.3, Б), Обратите внимание, что при больших значениях Ь, радиуса углеводо-
родной сферы, это выражение отражает разность между двумя величинами собст-
венной энергии, описываемой уравнением (2.4). Поскольку ев значительно выше
Бу, последним слагаемым в этом выражении обычно можно пренебречь. При ра-
диусе, равном радиусу молекулы типичного глобулярного белка, например 20 А,
эта энергия не превышает 5% собственной энергии заряда в большом объеме сре-
ды с диэлектрической проницаемостью Бу (радиус иона предполагается равным
1 А). Эти расчеты показывают, что внедрение заряда в середину липидной мембра-
ны или во внутреннюю область глобулярного белка почти так же затруднено, как
внедрение его в большой объем среды с подобной низкой диэлектрической прони-
цаемостью.
В то же время небольшой водный карман может стабилизировать ион в непо-
ляризуемой области. Структура ионного канала в мембране представляет собой
наполненную водой полость радиусом 5 А. Стабилизируя заряды глубоко внутри
мембраны, такие полости выполняют важную роль в ионной проницаемости мем-
бран (см. разд. 14.10).
2.4. Взаимодействия заряд-диполь
Обычно заряд распределен в молекулах неравномерно, и это позволяет нейтраль-
ным молекулам взаимодействовать с внешними зарядами. Один из способов рас-
чета таких взаимодействий основан на идее анализа электрического диполя, опре-
деляемого как два эквивалентных заряда противоположных знаков, разделенных
фиксированным расстоянием. Рассмотрим нейтральную молекулу, схематически
изображенную на рис. 2.4, в которой положительные и отрицательные заряды кон-
центрируются в двух отдельных участках, разделенных отрезком а. Дипольный мо-
мент этой молекулы рассчитывается из выражения для взаимодействия между за-
рядом q и каждым из несущих заряд участков молекулы.
2.4. Взаимодействия заряд-диполь
47
Рис. 2.4. Молекула, обладающая дипольным моментом,
взаимодействует с точечным зарядом. Диполь образуют
два заряда противоположных знаков, разделенные рас-
стоянием а.
Энергия рассматриваемого взаимодействия будет равна сумме двух кулонов-
ских потенциалов, один из которых отражает взаимодействие между q и -q' и дру-
гой — между q и +q\ при расстояниях, обозначенных на рис. 2.4
и = + = -gfracose (2
£Г £/; e(r-J-acos0) e(r + J-acos6) e(r2-(a2/4)cos26)
На первом этапе преобразований г_ и г+ выражаются как проекции на г следующим
образом г+ =r + J-acos0 и r_ =r -|acos9. Такое приближение обосновано в случае,
когда а мало и линии, соединяющие заряды, почти параллельны. Эти составляю-
щие затем просто складываются, и в итоге выражение для энергии рассматривае-
мого взаимодействия имеет вид формулы (2.8). Когда г» а, членом a2cos29/4
в знаменателе можно пренебречь, получив в результате выражение
1/-^*, <2-9>
ег
где d = aq' означает дипольный момент.
Потенциальная энергия взаимодействия заряд—диполь обратно пропорцио-
нальна квадрату расстояния (1/г2), в отличие от энергии электростатического взаи-
модействия (пропорциональной 1/г). Таким образом, первое взаимодействие осу-
ществляется на более коротком расстоянии, поскольку обратная квадратичная
функция убывает быстрее. Это отражает общую тенденцию, состоящую в том, что
чем выше порядок электростатического взаимодействия, тем выше показатель сте-
пени при обратной величине расстояния и меньше диапазон действия. Таким об-
разом, взаимодействие между двумя диполями будет уменьшаться обратно про-
порционально г3 (и будет зависеть от ориентации обоих диполей относительно ли-
нии между их центрами; см. задачу 3).
Нельзя забывать, что условием выведения данной зависимости было г » а.
Уравнение (2.9) неприменимо для расстояний, сравнимых или меньших, чем рас-
стояние между зарядами в диполе. Если диполь на рис. 2.4. поместить непосредст-
венно рядом с зарядом q, величина 9 будет равна нулю и выражение для энергии
взаимодействия приобретет вид
(2.10)
По мере сближения заряда и диполя г становится меньше а, в результате чего зна-
чимым остается только первое слагаемое. В этом случае взаимодействие прибли-
жается к кулоновскому взаимодействию с ближайшим зарядом диполя.
48
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
Рассматриваемые взаимодействия относятся к диполям с фиксированной ори-
ентацией зарядов, возможной внутри свернутой молекулы белка с относительно
ригидной структурой. Например, карбонильные группы в полипептидах характе-
ризуются значительными дипольными моментами и их электростатические взаи-
модействия вносят важный энергетический вклад в стабильность а-спирали (см.
разд. 2.13). Однако в растворе взаимодействующие молекулы могут вращаться,
и тогда сила взаимодействия изменяется с изменением ориентации молекул.
В этом случае становится необходимым усреднение по всем ориентациям. Вероят-
ность данной ориентации задается тогда величиной статистического веса по
Больцману е~ЩкТ. Вращение не только ослабляет взаимодействие, способствуя как
энергетически выгодным, так и энергетически невыгодным взаимодействиям, но
и укорачивает диапазон взаимодействия. Если использовать среднюю вероятность
ориентации, рассчитанную с помощью распределения Больцмана, для вычисле-
ния средней энергии взаимодействия между двумя свободно вращающимися ди-
полями с дипольными моментами dx nd2i можно вывести следующее выражение
(Setlow, Pollard, 1962)
u=-4*l
3&2гькТ
Необходимо отметить, что это выражение получено на основе допущения, что
энергия изменяющихся ориентаций мала по сравнению с кТ. В действительности,
как показывают расчеты, это допущение обоснованно, и диполь-дипольные взаи-
модействия не ограничивают существенно вращение. Одно важное исключение
составляет вода, поскольку ее молекулы обладают особенно значительным ди-
польным моментом. В случае других молекул в растворе диполь-дипольное взаи-
модействие довольно слабое. Как будет продемонстрировано ниже, тесно связан-
ная с этим взаимодействием дисперсионная сила намного больше по величине
и более важна для стабилизации биологических структур.
(2.11)
2.5. Индуцированные диполи
Электрические силы способны влиять даже на молекулы, не несущие заряда и не
обладающие постоянным дипольным моментом. Такие молекулы поляризуются
в электрическом поле, приобретая индуцированный, или наведенный, дипольный
момент. В результате этой индукции исходно нейтральные молекулы притягивают-
ся положительно заряженными, отрицательно заряженными или полярными мо-
лекулами. Индуцированный дипольный момент выражается как произведение на-
пряженности поля, £, и величины поляризуемости, а, отражающей свойство дан-
ной молекулы
d = aE (2.12)
Подставляя это выражение в уравнение (2.8) и полагая Е = q/sr2, получаем выра-
жение для энергии как функции расстояния между зарядом и поляризуемой моле-
кулой
U = ~4r> (2.13)
2.6. Взаимодействие катион-л-электроны
49
где cosO = 1, поскольку индуцированный диполь считается ориентированным в на-
правлении поля.1 *
В случае взаимодействия между постоянным и индуцированным диполями за
Е в уравнении (2.12) принимается поле диполя
и = -^~ (2-14)
ег
Здесь вновь видна тенденция к увеличению показателя степени при величине г
с повышением порядка электростатического взаимодействия.
2.6. Взаимодействие катион-л-электроны
Между катионом и ароматическим кольцом при их сближении (рис. 2.5, Л) возни-
кает сильное притяжение (Ma, Dougherty, 1997). Бензол в газовой фазе довольно
прочно связывает катионы. Энергия связывания составляет 38 ккал • моль-1 в слу-
чае Li2+, 28 ккал • моль"1 в случае Na+ и 19 ккал • моль"1 в случае К+. Тот факт, что
меньшие по размерам ионы связываются более прочно, указывает на простое
электростатическое взаимодействие, при котором связывание имеет большую
прочность при меньших размерах иона, поскольку в этом случае возможно боль-
шее сближение.
Частично это взаимодействие обусловлено поляризацией ароматического коль-
ца под влиянием катиона, а также индукцией диполя, описанной в предыдущем
разделе. Однако даже в отсутствие поляризации ароматическое кольцо характери-
зуется неравномерным распределением заряда. л-Электроны двойных связей обра-
зуют электроотрицательную область, компенсированную положительными зарядами
в плоскости расположения ядер атомов углерода (рис. 2.5, Б). Такое распределение
зарядов, называемое квадруполем, может быть представлено в виде двух диполей
(рис. 2.5, В). Энергия взаимодействия при этом типе распределения зарядов обратно
пропорциональна г3, что можно установить, применяя математические операции,
-q
+q
+q
-q
Рис. 2.5. А. Комплекс молекулы бензола с катионом. Б. л-Электроны бензольного кольца обра-
зуют два электроотрицательных слоя, между которыми лежит электроположительный слой
в плоскости расположения ядер атомов углерода. В. Это распределение зарядов отражает мо-
дель квадруполя, образованного двумя диполями
1 Молекулы способны обладать анизотропной поляризуемостью, означающей, что поле той
же напряженности будет поляризовать молекулу в одном направлении больше, чем в другом То-
гда поляризация не обязательно будет соответствовать направлению поля.
50
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
использованные в разд. 2.4 (задача 4). Эти взаимодействия заряд—индуцирован-
ный диполь и заряд—квадруполь, сочетаясь в различной степени в различных аро-
матических структурах, и обусловливают притяжение катионов (Cubero et al., 1998).
Характер возникающих взаимодействий довольно сложен, и эту силу называют си-
лой взаимодействия катион—л-электроны, не используя специальный термин из
электростатики, такой как квадруполь или индуцированный диполь.
В белках взаимодействия катион—л-электроны возможны в случае аминокис-
лотных остатков, содержащих ароматическое кольцо (остатки фенилаланина, ти-
розина и триптофана). Эти аминокислотные остатки, по-видимому, во многих слу-
чаях взаимодействуют с положительно заряженными боковыми цепями других
аминокислотных остатков и присутствуют в связывающих участках для лигандов и
субстратов, несущих положительный заряд. Теоретический расчет энергии взаи-
модействия катион—л-электроны между метиламмонием и бензолом дает для не-
полярного растворителя величину —12,5 ккал • моль"1. В воде эта энергия снижа-
ется до —5,5 ккал • моль"1 (Gallivan, Dougherty, 2000). Электростатическое взаимо-
действие между метиламмонием и ацетатом уменьшается в тех же условиях от
—53 ккал • моль-1 до —2,2 ккал • моль"1. Таким образом, в воде взаимодействие ка-
тион—л-электроны сильнее, чем электростатическое взаимодействие между одно-
валентными ионами.
Нейромедиатор ацетилхолин содержит положительно заряженный четвертич-
ный амин; связывающие ацетилхолин белки, ацетилхолинэстераза (рис. 8.4) и аце-
тилхолиновый рецептор, содержат в связывающих участках остатки ароматиче-
ских аминокислот. Роль взаимодействия катион—л-электроны в этом связывании
была изучена на ацетилхолиновом рецепторе (Zhong et al., 1998). Когда один из
двух остатков триптофана в связывающем участке, триптофан-149, замещали раз-
личными фтор-производными этой аминокислоты, кривая зависимости связыва-
ния от концентрации лиганда сдвигалась. Атомы фтора оттягивали электроны от
системы индольного кольца триптофана, ослабляя электроотрицательный слой,
показанный на рис. 2.5, Б. Это приводило к ослаблению взаимодействия катион—
л-электроны. График зависимости кажущейся энергии связывания от расчетной
силы взаимодействия катион—л-электроны показывает хорошую корреляцию, что
указывает на значительный энергетический вклад этого взаимодействия в связы-
вание ацетилхолина (рис. 2.6). Следует отметить, что тангенс угла наклона этой
Энергия взаимодействия катион-л-электроны
Рис. 2.6. График зависимости кажущейся
энергии связывания для ацетилхолинового
рецептора, рассчитанной по ЕС50. от рас-
четной энергии взаимодействия катион-л-
электроны. Для каждой точки указан ами-
нокислотный остаток в позиции 149 (в свя-
зывающем участке). (По Zhong et al., 1998.)
2.7. Дисперсионная сила
51
кривой меньше единицы, поскольку расчет произведен для газовой фазы и неорга-
нического иона, а экспериментальные данные получены для связывания ацетил-
холина в воде.
2.7. Дисперсионная сила
Распределение заряда молекулы подвержено быстрым флуктуациям, и каждое
мгновенное распределение электрического заряда создает мгновенный дипольный
момент. Если две молекулы расположены близко одна к другой, флуктуации ди-
польного момента могут приводить к тому, что притяжение между молекулами бу-
дет сменяться отталкиванием и наоборот. В этом отношении электрическое взаи-
модействие между молекулами подобно взаимодействию между свободно вращаю-
щимися постоянными диполями, ориентированными в конфигурациях либо
притяжения, либо отталкивания. Поскольку конфигурации притяжения характе-
ризуются более низкой потенциальной энергией, чем конфигурации отталкива-
ния, они имеют больший средний статистический вес по Больцману, и результи-
рующим эффектом всегда является притяжение. Для расчета энергии этого взаи-
модействия применяется много способов, все довольно сложные. В общем
расчеты показывают, что эта энергия пропорциональна 1/г6, как и в случае взаимо-
действия между вращающимися диполями. Важные физические факторы, опреде-
ляющие силу дисперсионного взаимодействия, отражает следующее выражение,
сравнимое с уравнением (2.11), (Setlow, Pollard, 1962)
у АЛ (2.15)
г6 Зп4 А + Л
где а, и а2— поляризуемость двух взаимодействующих молекул, Ц и /2 —- энергия
ионизации и п — показатель преломления среды.
Хотя согласно обоим уравнениям, (2.11) и (2.15), энергия изменяется пропор-
ционально 1/г6, дисперсионное взаимодействие отличается от взаимодействия ме-
жду двумя свободно вращающимися постоянными диполями по нескольким важ-
ным пунктам. В частности, в уравнении (2.15) отсутствует диэлектрическая прони-
цаемость. Сила дисперсионного взаимодействия зависит от среды, но флуктуации
электронной структуры, определяющие мгновенные дипольные моменты, проис-
ходят намного быстрее, чем вращение молекул в жидкости. В связи с этим диэлек-
трическая проницаемость не влияет на дисперсионное взаимодействие. В то же
время в выражении для данного взаимодействия присутствует показатель прелом-
ления среды, поскольку он характеризует ответ среды на быстрые изменения элек-
трических полей (с частотами, близкими к световому диапазону). В воде показа-
тель преломления немного выше единицы, т. е. он намного ниже величины ди-
электрической проницаемости. Как важное следствие этого, дисперсионное
взаимодействие значительно превышает взаимодействие между свободно вращаю-
щимися постоянными диполями.
Более точное выражение для дисперсионного взаимодействия должно вклю-
чать поляризуемости как функции частоты флуктуаций электрических полей, оп-
ределяемые на основе спектроскопических данных. О величинах, варьирующих
в зависимости от частоты изменения полей, говорят, что они проявляют диспер-
52
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
сию, и именно поэтому рассматриваемое взаимодействие называют дисперсион-
ным. Кроме того, его называют взаимодействием Лондона, по имени Фрица Лон-
дона, предложившего для него в 1930 г. первую приближенную формулу. Важное
следствие дисперсии состоит в том, что между двумя молекулами может не быть
сильного притяжения, если диапазоны указанных частот, в которых их величины
поляризуемости высокие, не перекрываются. В случае взаимодействия между
сходными молекулами эти диапазоны частот близки и дисперсионное взаимодей-
ствие сильнее. Отсюда происходит известное правило растворимости — подобное
растворяется в подобном.
Зависимость от 1/г6в уравнении (2.15) часто используют для определения дис-
персионного взаимодействия. Константу пропорциональности обычно получают
эмпирически, а не вычисляют с помощью компьютера на основе молекулярной
структуры. При этом необходимо иметь в виду, что зависимость от1/г6 справедли-
ва для таких расстояний между взаимодействующими молекулами, которые боль-
ше размеров этих молекул. При коротких расстояниях зависимость от расстояния
ближе к \/r (Parsegian, 1973).
Дисперсионное взаимодействие носит довольно общий характер. Как состав-
ляющая межмолекулярного взаимодействия оно проявляется, в частности, между
молекулами сложной формы; кроме того, оно возникает и между макроскопиче-
скими телами при их сближении как результат флуктуаций электромагнитных по-
лей этих тел. Теоретический анализ дисперсионного взаимодействия весьма сло-
жен и мало различается для разных случаев. Опубликовано лишь небольшое число
уравнений, описывающих это взаимодействие. Один важный случай — это взаимо-
действие между параллельными палочковидными молекулами, для которых дис-
персионное взаимодействие пропорционально 1/г5. Эту зависимость можно уста-
новить путем суммирования по взаимодействиям между линейно расположенными
центрами, взаимодействие между которыми пропорционально 1/г6. Притяжение
между параллельно расположенными палочковидными молекулами обусловливает
силу сцепления между углеводородными цепями в липидном бислое (см. разд. 2.16)
и играет роль в стабильности структур, образуемых фибриллярными белками. Слои
липидов, разделенные средой с иной диэлектрической проницаемостью, притяги-
ваются, и основная составляющая этого взаимодействия пропорциональна
1/г2 (Parsegian, 1973). Этому притяжению, соединяющему два липидных слоя в бис-
лое, противодействует отталкивающая сила гидратации (см. разд. 2.9).
2.8. Гидрофобные взаимодействия
Один из наиболее важных типов молекулярных сил, действующих в биополиме-
рах, — это гидрофобные взаимодействия. Всем известно, что маслянистые вещест-
ва образуют фазу, отдельную от воды. Подобно этому, макромолекулы образуют
структуры с минимальным контактом между их полярными и неполярными доме-
нами. Притяжение между масляными, углеводородными частями молекул означа-
ет при этом отвращение — фобию — к воде, с чем и связан термин «гидрофобный».
Данный термин очень точно отражает характер взаимодействия, поскольку оно
обусловлено главным образом высокой энергетической платой за создание кон-
такта углеводород—вода.
2.8. Гидрофобные взаимодействия
53
При попытке объяснить гидрофобный эффект его первым естественным фак-
тором представляется дисперсионное взаимодействие. Однако, будучи обусловлен
дисперсионным взаимодействием, гидрофобный эффект должен был бы сопрово-
ждаться положительным изменением энтальпии, вызванным образованием кон-
такта между гидрофобными молекулами и водой. Для их смешивания должны
были бы разрушаться сильные взаимодействия вода—вода и углеводород—углево-
дород и возникать слабые взаимодействия вод^Г—углеводород, что сопровожда-
лось бы поглощением теплоты. Вода и углеводороды слабо смешиваются, и кало-
риметрические измерения показывают, что при этом происходит лишь очень
незначительное изменение энтальпии, причем часто не с тем знаком. Соответст-
венно для объяснения гидрофобного эффекта следует искать иные физические
факторы.
В случае малых положительных изменений энтальпии должны существовать
источники энтропии, обусловливающие разделение углеводородов и воды. Основ-
ным источником энтропии при гидрофобных взаимодействиях служит упорядоче-
ние расположения молекул воды на гидрофобной поверхности. Компьютерное
моделирование соседства воды и неполярной поверхности показывает, что в этом
случае происходит уменьшение энтропии в результате структуризации воды напо-
добие льда. Такое упорядочение воды в соседстве с неполярной поверхностью объ-
ясняется тем, что вода не способна формировать сильные водородные связи (см.
разд. 2.10) с углеводородом. Чтобы поддерживать энергетически выгодные водо-
родные связи, молекулы воды должны как бы оседлать гидрофобную поверхность
(рис. 2.7). Это ограничивает ориентацию молекул воды и снижает энтропию
(Stillinger, 1980).
Другой подход к объяснению снижения энтропии воды у неполярной поверх-
ности состоит в том, чтобы определить число возможных путей образования моле-
кулой воды водородных связей с соседними молекулами. Если изобразить тетра-
эдр, образуемый водородными связями четырех молекул воды с центральной мо-
лекулой воды, можно видеть, что центральная молекула воды донирует свои атомы
водорода в любую комбинацию двух из четырех соседних молекул. Таким образом,
имеется шесть путей образования полного числа водородных связей. Замена в этой
пирамиде одной молекулы воды гидрофобной молекулой, не образующей водо-
родных связей, приведет к уменьшению числа путей полного связывания пример-
но в два раза.
Ограничение ориентации соседних с гидрофобной поверхностью молекул
воды зависит от температуры. С повышением температуры упорядочение молекул
воды все более и более затрудняется. В результате контакты углеводород—вода ха-
Рис. 2.7. Ориентация молекул воды, соседних с гидрофоб-
ной молекулой, ограничена при образовании ими водород-
ных связей с другими молекулами воды.
54
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
растеризуются очень высокой теплоемкостью. При повышении температуры по-
добная льду вода у гидрофобной поверхности постепенно плавится. Интересно и,
можно сказать, парадоксально то, что при повышении температуры и возрастании
энтропии гидрофобный эффект не только не ослабляется, но даже несколько воз-
растает (Dill, 1990). Это объясняется усилением дисперсионного взаимодействия,
компенсирующим при повышении температуры потерю энтропии как движущей
силы структуризации воды. Таким образом, гидрофобное взаимодействие следует
рассматривать как обусловленное снижением энтропии при низкой температуре
(близкой к комнатной) и как обусловленное увеличением энтальпии при более вы-
сокой температуре (близкой к точке кипения воды). Экстраполяция термодинами-
ческих параметров к температурам выше точки кипения воды позволяет предпола-
гать, что сила гидрофобного взаимодействия достигает максимума и при этой тем-
пературе изменение энтропии будет равно нулю. Следовательно, общий штамп
«зависит от энтропии» справедлив только для ограниченного диапазона темпера-
туры.
Ввиду сложного характера физического процесса, которым обусловлено гид-
рофобное взаимодействие, трудно разработать его подробную количественную
теорию, но идея о том, что углеводородная поверхность упорядочивает соседние
молекулы воды, позволяет в очень простой форме приближенно выразить энергию
этого взаимодействия через площадь поверхности контакта с водой. Проведено
большое число измерений свободной энергии переноса углеводородных молекул
различных форм и размеров из липидной фазы в воду. В общем, эта свободная
энергия пропорциональна площади углеводородной поверхности. Соответствую-
щий график для пяти аминокислот приведен на рис. 2.8. Вычисляемый из этого
графика коэффициент пропорциональности 18 кал • А-2 позволяет определить
Рис. 2.8. Зависимость свободной энергии пе-
реноса из воды в органический растворитель
от площади поверхности боковой цепи ами-
нокислоты. (По Rose et al., 1985.)
2.9. Сила гидратации
55
энергетическую плату за контакт гидрофобной поверхности с водой. Необходимо
отметить, что этот график содержит данные для аминокислот с неполярными бо-
ковыми цепями. Если включить в него данные для аминокислот с полярными
боковыми цепями, соответствующие им точки будут находиться ниже приведен-
ной здесь кривой. Эта зависимость свободной энергии от площади поверхности
контакта, определенная эмпирическим путем, весьма полезна для анализа энерге-
тики гидрофобных взаимодействий.
Гидрофобный эффект усиливается в присутствии ионов (Baldwin, 1996). Как
правило, внесение соли снижает растворимость неполярных соединений в воде
и приводит к увеличению угла наклона графика зависимости свободной энергии
от площади поверхности контакта, аналогичного тому, который приведен на
рис. 2.8. Ионы притягивают молекулы воды, поскольку она обладает высокой ди-
электрической проницаемостью, и отталкивают неполярные молекулы, обладаю-
щие намного более низкой поляризуемостью. Этот эффект можно объяснить на
качественном уровне с привлечением понятия о силе отображения (разд. 2.3). На
основе многочисленных экспериментальных данных установлены ряды ионов
(лиотропные ряды, или ряды Гофмейстера), где ионы расположены в порядке уси-
ления или ослабления их влияния на свойства растворителя, в том числе в отноше-
нии высаливающего действия.
2.9. Сила гидратации
Взаимодействие с водой гидрофильных поверхностей, образуемых несущими за-
ряд или полярными молекулами, в отличие от гидрофобных поверхностей, энерге-
тически выгодно. Воду трудно удалить от гидрофильных поверхностей. Удаление
воды, необходимое для контакта гидрофильных поверхностей, означает эффек-
тивное отталкивание воды. Силу, эквивалентную этому отталкиванию, называют
силой гидратации. Лучше всего сила гидратации изучена на липидных бислоях, но
предположительно она имеет довольно общий характер.
Как было отмечено выше, области двух липидных слоев, обращенные внутрь
мембраны, притягиваются друг к другу за счет дисперсионного взаимодействия.
Этому притяжению противодействует сила гидратации, в результате чего липид-
ные слои сближены в мембране не более чем на 20—40 А. Для измерения силы гид-
ратации применяют не непосредственное сжатие двух слоев, а осмотическое уда-
ление воды. При этом определяют, как изменяется расстояние между липидными
слоями в зависимости от химического потенциала воды и рассчитывают силу гид-
ратации как функцию расстояния между липидными слоями в бислое. Такие экс-
перименты показали, что сила отталкивания между липидными слоями с умень-
шением расстояния возрастает экспоненциально. Расстояние, на котором эта сила
изменяется в ераз, довольно невелико, примерно 1—3 А. Таким образом, сила гид-
ратации возрастает очень резко, и расстояние, на котором она становится значи-
тельной, зависит от химической природы полярной головной группы фосфолипи-
да. При некоторых условиях происходит агрегация липидных слоев в бислое и раз-
деляющее их расстояние отражает баланс между притяжением в результате
дисперсионного взаимодействия и отталкиванием за счет силы гидратации (Rand,
1981).
56
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
Гидрофильные поверхности часто несут заряд, и можно было бы ожидать, что
больший вклад в гидратацию вносит электростатическое взаимодействие. В случае
липидных бислоев электростатическое взаимодействие доминирует только в том
случае, когда разделяющее слои расстояние превышает примерно 25 А. На более
близком расстоянии ионный эффект не играет определяющей роли, что указыва-
ет на силу гидратации как основную. Если говорить о клеточных процессах, при
которых соединяются два липидных бислоя, например о слиянии мембран, важно
иметь в виду, что сила гидратации служит для этого громадным препятствием.
Его преодолению способствует присутствие двухвалентных катионов, соединяю-
щих некоторые полярные головные группы в составе фосфолипидов. Кроме
того, быстрое и специфичное слияние мембран способны катализировать белки,
ассоциированные с предназначенной для слияния везикулой и мембраной-
мишенью.
2.10. Водородные связи
Атомы водорода обладают уникальным химическим свойством образовывать мос-
тики между двумя атомами, несущими отрицательный заряд (обычно атомами ки-
слорода или азота). Согласно общей теории химических связей, атом водорода мо-
жет образовывать только одну ковалентную связь, но в случае водородной связи
электрон атома водорода распределяется между обоими связываемыми атомами.
Отрицательно заряженный атом, выступающий в роли акцептора водорода, также
нарушает общие правила числа связей. Например, атом кислорода карбонильной
группы, уже образовавший две ковалентные связи, образует третью связь, когда
участвует в водородной связи. Чтобы объяснить, каким образом соблюдается пра-
вильное число связей, водородную связь предлагалось считать обусловленной
электростатическим взаимодействием диполей, а не ковалентным взаимодействи-
ем. В пользу этого предположения говорит то, что водородные связи намного сла-
бее типичных ковалентных связей. Однако расчеты с помощью методов квантовой
механики показывают, что водородная связь носит выраженно ковалентный ха-
рактер и предположение о ее электростатической природе является чрезмерным
упрощением (Weinhold, 1997).
Длина водородной связи лежит, как правило, в диапазоне 2,5—3 А (в случае
расстояний между двумя электроотрицательными атомами). Когда в образовании
связи участвуют три атома, они ориентированы преимущественно вдоль одной ли-
нии. Если акцептором водорода служит атом кислорода или азота с одинарными,
а не двойными связями, водородная связь включается в тетраэдрическую симмет-
рию р-орбиталей этого атома. Однако данные эффекты ориентации незначитель-
ны, и энергетическая цена изгибания водородной связи низка по сравнению с це-
ной аналогичных искажений углов ковалентных связей.
Водородные связи несколько варьируют по силе. К наиболее слабым относятся
связи с участием алифатических углеводородов, характеризующиеся энергией
менее 1 ккал • моль-1. Энергия очень сильных водородных связей превышает
20 ккал • моль-1. К этому особому типу очень сильных водородных связей относят-
ся связи, на образовании которых основан механизм катализа у некоторых фер-
ментов (см. разд. 10.14).
2.10. Водородные связи
57
Таблица 2.1. Энергия образования водородной связи
Связь АН, ккал • моль-1
Н2О---НОН
Газ —5,4
Жидкость —3,4
Лед от -3,0 до —7,7
с-он---о = с Уксусная кислота (газ) 3,7
С-ОН---ОН Этанол (газ) от —3,4 до —4,0
NH---O = C Формамид (расчетные данные) -7,9
По Jeffrey, Saenger, 1991, р. 27.
Сила водородных связей имеет большую величину в том случае, когда в их об-
разовании участвуют атомы, несущие большой отрицательный заряд. Напри-
мер, связи с атомами кислорода обычно более сильные, чем связи с атомами азота.
Некоторые величины энергии водородных связей приведены в табл. 2.1. На осно-
вании этих данных можно предполагать, что водородные связи выполняют важ-
ную роль в образовании структуры биомакромолекул. Однако, в отличие от более
сильных ковалентных связей, водородные связи легко разрываются, вследствие
чего определяемые ими структуры должны характеризоваться определенной гиб-
костью.
Важное значение водородных связей состоит в том, что они обеспечивают
необычные свойства воды, такие как уменьшение объема при плавлении, высо-
кая диэлектрическая проницаемость, высокая точка плавления, высокая точка
замерзания и высокая теплоемкость (Stillinger, 19890). Способностью воды об-
разовывать водородные связи частично объясняется гидрофобный эффект (см.
разд. 2.8).
Вода легко образует водородные связи с растворенными веществами, и это рас-
сматривается как важный фактор при оценке способности химических групп обра-
зовывать между собой водородные связи. Внутримолекулярная водородная связь
между двумя группами в белке образуется вместо двух водородных связей с моле-
кулами воды. Подобно этому, образование межмолекулярной водородной связи
между белком и лигандом происходит за счет разрыва водородных связей с водой.
В результате уменьшается вклад энергии водородных связей в стабилизацию
структуры.
Чтобы объяснить роль воды, необходимо рассматривать образование водород-
ной связи как обменную реакцию, а не просто как образование связи. Полное
представление о процессе образования водородной связи между донором АН и ак-
цептором В дает схема (2А)
АН---ОН2 + В — НОН<=±АН--В + НОН--ОН2 (2А)
58
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
В обеих частях схемы показаны две водородные связи. В левой части и АН и В свя-
заны водородной связью с молекулой воды. В правой части донор водорода АН
связан водородной связью с В и две молекулы воды связаны водородной связью
между собой. Поскольку общее число водородных связей в этой системе постоян-
но, можно было бы предположить, что рассматриваемые процессы не должны со-
провождаться изменением энтальпии. Однако, как показывают данные, приведен-
ные в табл. 2.1, энергия образования водородной связи зависит от типов вещества
и среды. Кроме того, величина АЯдля водородной связи между молекулами воды
в жидком состоянии относится к изолированной паре молекул и это следует учи-
тывать, хотя данное изменение энтальпии и не слишком значительно. При боль-
шом количестве молекул сила водородных связей выше за счет эффекта коопера-
тивности, рассматриваемого ниже. Наконец, вода, не связанная с белком, имеет
более высокую энтропию, чем связанная вода. Под влиянием всех этих факторов
равновесие приведенной выше реакции должно сдвигаться вправо, однако точный
вклад свободной энергии водородной связи рассчитать трудно.
Свободную энергию обмена водородных связей определяют различными спо-
собами; некоторые из полученных результатов приведены в табл. 2.2. Для водород-
ной связи NH — ОС в полипептидном остове свободная энергия определена
в ряде измерений на модельных соединениях.
Свободную энергию водородных связей в фермент-субстратном комплексе
рассчитывают с использованием данных для мутантных белков. Такие белки с за-
меной образующего водородную связь аминокислотного остатка другим остатком,
не образующим этой связи, получают с помощью метода сайт-направленного му-
тагенеза. Пример реакций образования фермент-субстратного комплекса белком
дикого типа и мутантным белком приведен на рис. 2.9 для тирозил-тРНК-синтазы.
Субстрат тирозин образует с этим ферментом несколько связей, в том числе водо-
родные связи с остатком аспартата в позиции 176 через водород гидроксильной
группы тирозина и с остатком тирозина в позиции 34 через кислород той же гидро-
ксильной группы (рис. 2.9, Б). В отсутствие субстрата тот же участок занимает
молекула воды, образующая водородные связи с теми же аминокислотными остат-
ками (рис. 2.9, А). В случае мутантного фермента, содержащего вместо тирози-
на-34 фенилаланин-34, водородная связь ни с водой, ни с субстратом не обра-
зуется (рис. 2.9, В и Г) и энергия связывания фермента с субстратом ниже на
0,5 ккал • моль-1. Эта величина соответствует энергии реакции обмена, приведен-
Таблица 2.2. Энергия обмена водородной связи с водой
Связь Свободная энергия, ккал • моль-1
NH---O = C -1,4
Пептид1 Фермент-субстратный комплекс2 молекула-партнер не несет заряда от -0,8 до -1,5
молекула-партнер, несущий заряд от -3 до -6
1 По Jeffrey, Saenger, 1991.
2 По Fersht, 1987.
2.10. Водородные связи
59
А
Н
I
о ч
н' \
/ н
' I
с°2 Q
I
Asp 176 Туг 34
Туг
Н2О
Туг
Н2О
Asp 176 Phe34
Рис. 2.9. Водородные связи, образуемые тирозил-тРНК-синтазой с водой (А и В) и субстратом
тирозином (Б и Д). В случае фермента дикого типа образуется водородная связь с тирози-
ном-34 (А и Б). В случае мутантного фермента, содержащего в этой позиции остаток фенилала-
нина, данная водородная связь не может образоваться (8 и Г). (По Fersht et al., 1985.)
ной на схеме (2А). В таких экспериментах получены величины энергии связыва-
ния ферментов с субстратами, приведенные в табл. 2.2.
Значение среды для водородных связей, отмеченное в предыдущем разделе,
обусловлено в первую очередь ее полярностью. Амидные и карбонильные группы
являются высокополярными, но при образовании водородной связи их поляр-
ность снижается. В результате перенос донорно-акцепторной пары в неполярную
среду происходит легче, если между донором и акцептором имеется водородная
связь. Это должно также обеспечивать относительно более высокую движущую
силу образования водородных связей в неполярной среде. Таким образом, сила во-
дородных связей, как правило, выше в неполярных внутренних областях белковых
молекул и липидных бислоев (Roseman, 1988).
Если атом участвует в образовании не менее чем двух водородных связей, оно
происходит кооперативным образом. Кооперативность обусловлена тем, что рас-
пределение заряда атома, который служит донором водорода, изменяется в сторо-
ну повышения электроотрицательности и он легче образует вторую водородную
связь. Такой эффект приводит к формированию цепочек, колец и сеток водород-
ных связей, в которых стабилизирующая энергия значительно выше величины,
рассчитанной путем прибавления пар (Stillinger, Weinhold, 1997). За счет коопера-
60
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
тивности водородные связи в жидкой воде могут иметь большую силу. Когда сетка
водородных связей образуется в молекуле белка, стабильность этой сетки превы-
шает сумму энергий отдельных водородных связей.
2.1 I. Стерическое отталкивание
Два объекта не могут занимать одно и то же пространство в одно и то же время, и в
результате происходит их стерическое отталкивание. Эта сила связана с принци-
пом исключения Паули, согласно которому два электрона с одним и тем же спи-
ном не могут находиться на одной орбите. Такое правило означает очень крутое
возрастание энергии отталкивания в случае, когда электронная оболочка одного
атома становится проницаемой для электронной оболочки другого атома. Сила от-
талкивания описывается крутой экспоненциальной функцией или как пропор-
циональная обратной величине расстояния в высокой степени. Обычно силу сте-
рического отталкивания рассчитывают как пропорциональную 1/г12, поскольку,
когда эту величину прибавляют к величине силы притяжения, обусловленного
дисперсионным взаимодействием и пропорционального 1/г6(см., например, урав-
нение (2.15)), расчет упрощается. Тогда потенциальная энергия отталкивания как
функция расстояния описывается формулой
U(r) = 4е
х 12
ГО ]
(2.16)
Эта функция имеет минимум в области значений немного выше г = г0, характе-
ризующийся глубиной е. Энергия, рассчитываемая по уравнению (2.16), названа
потенциалом Леннард-Джонса. Данный потенциал объединяет многие силы меж-
молекулярного взаимодействия. За счет силы притяжения молекулы сближаются;
на близком расстоянии резкое отталкивание препятствует их соударению
(рис. 2.10). Формула (2.16) широко используется в теории жидкостей и применима
во всех случаях, когда притяжение вследствие дисперсионного взаимодействия
должно компенсироваться стерическим отталкиванием.
1.0 -
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
0,0 -
-0,2 -
0,5
। Рис. 2.10. График потенциала Лен-
1,0 1,5 2,о 2,5 з.о нард-Джонса, соответствующий
г уравнению (2.16) при е=0,25 и г0 = 1.
2.12. Изгибание связей и гармонические потенциалы
61
На практике точное математическое выражение для этой силы отталкивания
применять почти никогда не требуется. Поскольку сила отталкивания круто воз-
растает при сближении атомов, каждый атом окружен практически непроницае-
мым пространством, которое можно считать объемом, исключенным для других
атомов. Стабильные поверхности, определяемые силами стерического отталкива-
ния, жизненно важны как основа для стереоспецифических взаимодействий по
принципу ключ—замок, на которых основана специфичность взаимодействия мо-
лекул в живых организмах.
2.12. Изгибание связей и гармонические потенциалы
Возможно, кто-то подумает, что за счет действия сил отталкивания биологические
макромолекулы в своем поведении должны быть подобны твердым керамическим
объектам. Стереоспецифичность следовало бы тогда понимать как абсолютную ха-
рактеристику, исключающую возможность сжатия или растяжения связывающего
участка для распознавания тех молекул, которые ему не полностью комплементарны.
Однако атомы в макромолекулах не фиксированы на одном месте. Они могут сме-
щаться в результате растяжения и изгибания соединяющих их связей. Каждое из
этих движений подобно растяжению пружины. Смещению атомов противодейству-
ет сила, пропорциональная этому смещению, х. Таким образом, сила смещения рав-
на F(x) = -ф(х - х0), где <р — это силовая постоянная и хь — равновесное положение,
в котором данная сила равна нулю. Потенциальная энергия в этом случае равна
£/(х) = 1<р(х-х0)2 (2.17)
При подстановке данного выражения в уравнение Ньютона для движения это
уравнение превращается в выражение для классического гармонического осцил-
лятора. Решение получаемого таким способом уравнения представляет собой пе-
риодическую синусоидальную или косинусоидальную функцию с частотой ^/(ф/w).
Это частота колебаний связи, и для определения силовых постоянных ф использу-
ются данные, получаемые с помощью колебательной спектроскопии (Wilson et al.,
1955). Для более точного определения силовых постоянных в расчет включают по-
мимо частот колебаний и другие данные, например характеризующие равновесные
конформации и энтальпию слияния (Lifson, Warshel, 1968).
В случае С—С-связи силовая постоянная растяжения равна 5 • 105 дин • см-1,
или 660 ккал • А-2 • моль-1. Эта величина означает, что энергия смещения связи все-
го на 0,1 А превысит тепловую энергию при комнатной температуре. Силовые по-
стоянные растяжения многих ковалентных связей совпадают по порядку величин
с этой постоянной для С—С-связи, и соответственно растяжение связей не может
быть существенным фактором пластичности молекул. Силовые постоянные изги-
бания связей, как правило, примерно в 10 раз ниже, и тепловая энергия может обу-
словливать деформацию примерно на 0,2 А. Наконец, типичная силовая постоян-
ная для растяжения водородной связи составляет примерно 30 ккал • А-2 • моль-1.
Хотя каждая из этих степеней свободы в отдельности не существенна для пластич-
ности молекул, эффекты многих таких движений в крупной макромолекуле могут
складываться, обеспечивая ее значительную гибкость.
62
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
Гармонический потенциал выявляется при выражении потенциальной энер-
гии макромолекулы как общей функции всех позиций атомов. Внутренние ко-
ординаты обозначаются как вектор х = (х,, х2, х3... xN), где х отражает координаты
х, у и z всех атомов. Определим систему координат как центрированную в точ-
ке минимума потенциальной энергии, UQi и благодаря этому избавимся от учета
х^ в уравнении (2.17). Вблизи данного минимума потенциальная энергия состав-
ляет
и(х) = и0+^х^ (2.18)
и
График этого уравнения представляет собой многомерную параболу, и при любом
ненулевом значении х} энергия будет выше UQ. Величины atJ можно связать в итоге
с силовыми постоянными растяжения и изгибания связей.
Перепишем уравнение (2.18) в матрично-векторной форме (см. приложение 2)
t/(x) = UQ + хАх‘ (2.19)
Вектор х — это вектор-строка в левой части выражения; х1, транспозиция х, — это
вектор-столбец в правой части. Матрица А характеризуется как положительно по-
луопределенная, в соответствии с чем при всех смещениях от х = 0 величина Uне из-
меняется или возрастает. В этой форме выражение для потенциальной энергии
можно преобразовать с помощью методов матричной алгебры (см. приложение 2).
Положительно полуопределенная матрица может быть диагонализована с помо-
щью преобразования подобия ТАТ’1 = Г, где Г — матрица, в которой только диаго-
нальные элементы не равны нулю. Эти диагональные элементы, у/7, называют соб-
ственными значениями матрицы А. Способ нахождения матрицы Т — это особая
задача, которую здесь нет необходимости решать. Достаточно знать, что она суще-
ствует, чтобы переписать уравнение (2.19) следующим образом
Щх) = UQ + хТ^ТАТ’Тх' = С/°фГф‘, (2.20)
где ф = хТ-1 и ф‘ = Тх‘. Таким образом, каждый элементф представляет собой ли-
нейную комбинацию X/.
Отбрасывая матрично-векторную форму, получаем следующее выражение для
уравнения (2.20)
Щ<р) = ^о+Еу-(Р/ <2-21>
/
Теперь потенциальная энергия выражается как сумма слагаемых, сходных с выра-
жением (2.17). Это важная общая характеристика любой произвольной функции
потенциальной энергии, состоящая в том, что вблизи минимума функция может
быть представлена в форме суммы слагаемых, идентичных выражению для гармо-
нического осциллятора. Если это выражение для потенциальной энергии подста-
вить в уравнение для движения атомов, с помощью аналогичного математического
анализа можно определить моды колебательного движения сложной молекулы. Их
называют нормальными модами или нормальными колебаниями молекулы (Wilson
et al., 1955). Фактически в многоатомной молекуле это действительно моды, изме-
ряемые с помощью колебательной спектроскопии, а не частоты колебаний инди-
2.13. Стабилизирующие силы в белках
63
видуальных связей. Функция потенциальной энергии также имеет нормальные
моды, и это часто помогает выразить гибкость молекулы через сумму деформаций,
как в уравнении (2.21).
Поскольку х в уравнении (2.19) включает значения координат х, у и гдля каж-
дого атома, молекула, состоящая из W атомов, описывается вектором с числом
измерений 3N. Тогда матрица А должна иметь 3Nсобственных значений (см. при-
ложение 2, разд. 3). Однако не все эти собственные значения будут отражать де-
формацию молекулы. Движению всей молекулы вдоль осей х, у и z соответству-
ют три моды, и другие три моды соответствуют вращению вокруг осей х, у и г
Данные смещения не связаны с изменениями потенциальной энергии, что отра-
жают соответствующие этим типам движения собственные значения, принимая
нулевые значения. Таким образом, остается 3N— 6 ненулевых собственных значе-
ний А, и это составляет число нормальных мод деформации молекулы. Диапазон
этих ненулевых собственных значений может быть значительным. Наименьшие
собственные значения соответствуют «мягким» модам движения, т. е. движению,
легко приводящему к деформации. Во многих случаях эти моды представляют
наибольший интерес, поскольку отражают общие изменения структуры (Levitt
et al., 1985).
Анализ гармонического потенциала в рамках статистической механики очень
прост. Классический конфигурационный интеграл (уравнение (1.4)) при подста-
новке в него уравнения (2.17) принимает вид
Q = J e-^-^l^dr = (2.22)
и свободная энергия тогда составляет
G = -kT\nQ = - кТ Inf -— | (2.23)
2 {2кТп)
Таким образом, при возрастании силовой постоянной повышается свободная
энергия. Это отражает уменьшение энтропии в результате ограничения х меньшей
областью значений. В общем, высокая силовая постоянная, возможная в прочных
комплексах, образованных двумя молекулами, характеризует эту скрытую величи-
ну свободной энергии, которую следует учитывать при расчете полного изменения
свободной энергии (см. разд. 4.8). Распространение этого анализа на многомер-
ный гармонический потенциал приводит к замечательно простому выражению
(задача 11).
2.13. Стабилизирующие силы в белках
Чтобы осуществлять свою функцию, белок должен иметь нативную укладку. На-
тивное состояние — это макросостояние, включающее небольшой определенный
набор конформаций из их общего набора (см. разд. 1.1 и 3.11). Компактную натив-
ную укладку белковой молекулы должны обеспечивать молекулярные силы, дейст-
вующие между боковыми цепями различных аминокислотных остатков и группа-
ми в составе поли пептидного остова. Выяснению энергетических вкладов различ-
64
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
ных молекулярных сил в стабильность нативного состояния белковых молекул
посвящены огромные исследовательские усилия. В таких работах изучают относи-
тельные вклады водородных связей, солевых мостиков (связей между боковыми
цепями, несущими противоположные по знаку заряды) и гидрофобных взаимо-
действий. Вместе с тем необходимо получить также ответ на вопрос, существуют
ли общие руководящие принципы укладки белковых молекул или каждый белок
характеризуется собственным комплексом сил, стабилизирующих нативную
структуру.
В некоторых ранних работах, посвященных этой проблеме, была сделана по-
пытка оценить вклад электростатических взаимодействий. В основу была положе-
на идея о том, что между боковыми цепями, несущими положительный заряд,
и боковыми цепями, несущими отрицательный заряд, образуются солевые мости-
ки. Поскольку, однако, скрытые заряды обладают большой собственной энергией,
даже как ионные пары, подобные взаимодействия могут осуществляться только на
поверхности белковых молекул, контактирующей с водой. По данным рентгено-
структурного анализа, в белках очень мало скрытых ионных пар. Большее число
их обнаружено на поверхности белковых молекул, но высокая диэлектрическая
проницаемость воды уменьшает энергетический вклад ионной пары до величин
1—2 RT(как отмечено в разд. 2.1). В связи с этим образование ионных пар на по-
верхности белковых молекул не играет существенной роли в стабилизации их
структуры. Как правило, ионные пары в белках не относятся к высококонсерва-
тивным участкам аминокислотной последовательности, и замена несущих заряд
аминокислотных остатков не оказывает большого влияния на стабильность натив-
ного состояния. В экспериментах электростатические взаимодействия в белках
исследуют путем изменения pH или концентрации раствора. Результаты этих ис-
следований не позволяют сделать четких выводов, но, по-видимому, можно пред-
полагать, что ионные пары имеют вторичное значение в стабилизации нативной
белковой структуры (Dill, 1990).
Все больше данных указывает на то, что стабильность белковых молекул зави-
сит от взаимодействия катион—л-электроны (см. разд. 2.6) (Gallivan, Dougherty,
1999). Энергия взаимодействий этого типа выше энергии солевых мостиков, и аро-
матические боковые цепи аминокислотных остатков в белках могут располагаться
немного ниже поверхности белковой молекулы, в пределах досягаемости для по-
ложительно заряженных боковых цепей, расположенных на самой поверхности
молекулы. Особенно часто в этой ориентации расположены остатки триптофана
вблизи остатков аргинина и лизина. Энергетический вклад этих взаимодействий
в стабильность белковой структуры пока не изучен экспериментальными способа-
ми, но анализ моделей показывает, что правильно ориентированные пары остат-
ков триптофана и аргинина в соответствующем пространстве могут стабилизиро-
вать а-спирали, преимущественно благодаря взаимодействиям катион—л-элект-
роны (Shi et al., 2002b). Вместе с тем величина этого эффекта ниже расчетной силы
взаимодействия катион—л-электроны.
Наибольшую роль в укладке белковых цепей, судя по результатам многочис-
ленных исследований, выполняют гидрофобные взаимодействия (Dill, 1990).
Согласно данным структурных исследований, гидрофобные группы скрыты во
внутренней области белковых молекул (рис. 2.11). Анализ белковой структуры
и ее объяснение с помощью данных о переносе молекул растворителя (рис. 2.8
2.13. Стабилизирующие силы в белках
65
Рис. 2.11. При укладке белковой молекулы аминокислот-
ные остатки с гидрофобными боковыми цепями (показа-
ны серым) располагаются внутри молекулы, тогда как
полярные группы (показаны черным) локализованы на ее
поверхности. Группы, несущие заряд, способны образо-
вывать солевые мостики на поверхности белка.
и разд. 2.8) позволяют количественно определить вклад гидрофобных взаимодей-
ствий в стабилизацию белковой структуры (Spolar et al., 1992). При увеличении
гидрофобности растворителя нативная структура белков нарушается и происхо-
дит их денатурация. Например, спирты более гидрофобны относительно воды
и они действуют как сильные денатурирующие вещества. При этом пропанол бо-
лее эффективен, чем этанол, соответственно своей более высокой гидрофобно-
сти. Денатурирующее действие спиртов и других гидрофобных растворителей от-
ражает их способность конкурировать с гидрофобными участками, между кото-
рыми существует взаимодействие внутри молекулы белка. Дополнительным
свидетельством в пользу важности гидрофобных взаимодействий в укладке белко-
вых молекул служат результаты изучения мутантных форм белков в отношении
стабильности структуры молекул (см. разд. 1.4). Как установлено, каждая скрытая
СН2-группа вносит в свободную энергию нативного состояния вклад, равный
примерно —2 RT (Расе, 1992).
Гидрофобные взаимодействия зависят от температуры (см. разд. 2.8). Пони-
жение температуры приводит к ослаблению их силы до такой величины, при ко-
торой они уже не способны стабилизировать нативное состояние белка. При
очень низких значениях температуры (обычно ниже О °C) вода достаточно струк-
турирована во всем объеме и присутствие гидрофобной поверхности не оказыва-
ет существенного влияния. Таким образом, это ослабление гидрофобных взаимо-
действий приводит к денатурации белков. Итак, и низкая температура, и высокая
температура вызывают денатурацию белков, хотя для холодовой денатурации не-
обходимо очень сильное охлаждение или внесение мочевины, сдвигающей холо-
довую денатурацию в диапазон более высоких значений температуры (Grico,
Privalov, 1992).
Примерно 90% всех групп, способных образовывать водородные связи, образу-
ет их в молекулах белков, но общее количество водородных связей в белках недос-
таточно велико, чтобы можно было говорить об их энергетической значимости для
укладки белковых молекул. Если рассматривать образование водородных связей
как реакции обмена (см. схему (2А) и разд. 2.10), нет гарантии, что оно благопри-
ятствует свернутому состоянию. Каким образом водородные связи могут стабили-
зировать это состояние, если они так же легко образуются с молекулами воды?
66
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
Согласно одному из объяснений содержания водородных связей в белках, они об-
разуются после того, как в результате гидрофобных взаимодействий соответствую-
щие участки белковой цепи соединяются с образованием компактной структуры
(см. разд. 3.16). Когда группы, способные образовывать водородные связи, оказы-
ваются отделенными от контакта с водой, между ними образуются водородные свя-
зи и это в свою очередь обеспечивает образование а-спиралей и 0-складок. Соглас-
но этому предположению, гидрофобный эффект косвенно способствует формирова-
нию вторичной структуры белков.
Как отмечено выше, эксперименты с использованием растворителей, напри-
мер спиртов, показывают, что водородные связи имеют меньшее значение для ста-
билизации белковой молекулы, чем гидрофобные взаимодействия. Однако экспе-
риментальное изучение стабильности мутантных форм белков позволяет предпо-
лагать, что водородные связи выполняют более существенную роль и не являются
просто следствием гидрофобных взаимодействий (Myers, Расе, 1996). Мутации, за-
трагивающие те остатки, которые образуют водородные связи, приводят к деста-
билизации белковой молекулы. Хотя любая мутация имеет множественные энер-
гетические последствия, точный расчет различных вкладов в энергию молекулы
показывает, что при потере одной водородной связи дестабилизация нативного со-
стояния характеризуется величиной 4RT.
Интересный подход к определению роли водородных связей разработан на ос-
нове определения обмена водород—дейтерий (Shi et al., 2002а). Дейтерий распре-
деляется избирательно в более слабые водородные связи. Более сильные водород-
ные связи преимущественно включают протоны. Соотношение дейтерий/водород
(измеренное с помощью метода ядерного магнитного резонанса, ЯМР) может
быть использовано, таким образом, для определения энергии индивидуальных
водородных связей в белках. Кроме того, ослабление водородных связей в резуль-
тате изотопного обмена сдвигает равновесие между нативным и денатурирован-
ным состояниями. Эти эксперименты позволили определить вклад водородной
связи в а-спирали в стабильность свернутого состояния как 0,7 ккал • моль (при-
мерно 1 RТ). В различных белках этот стабилизирующий эффект неодинаков;
в белках с меньшим количеством а-спиральных участков и большим количеством
0-складок он вообще не обнаруживается. Таким образом, различия в силе водо-
родных связей между различными атомами в различных по форме молекулах
и при различном окружении могут служить значительным источником энергии
для укладки молекул некоторых, но не всех белков. Водородные связи между
молекулами воды, по-видимому, сильнее, чем водородные связи между молеку-
лами воды и белком и чем внутримолекулярные водородные связи в белках.
Этим обусловлен сдвиг равновесия реакции обмена (схема (2А)) вправо, обеспе-
чивающий возможность вклада водородных связей в стабильность белковой
структуры.
В а-спирали амидные диполи и карбонильные диполи фиксированы по
ориентации и положению структурой спирали (рис. 2.12). Энергия этого диполь-
дипольного взаимодействия изменяется пропорционально 1/г3 и сложным об-
разом зависит от ориентации диполей (см. разд. 2.4). Соседние связи распо-
ложены почти бок-о-бок, и их взаимодействие носит характер отталкивания
(рис. 2.12, Б). Однако более далеко отстоящие друг от друга связи ориентированы
примерно конец-в-конец и их взаимодействие проявляется как притяжение. Не-
2.14. ВНУТРИБЕЛКОВЫЕ СИЛОВЫЕ ПОЛЯ
67
Рис. 2.12. А. Пептидная связь обладает дипольным моментом.
Б. Дипольные моменты пептидных связей в молекуле белка
ориентированы вдоль оси а-спирали и складываются.
смотря на короткий диапазон расстояния, при суммировании всех этих взаимо-
действий преобладает притяжение и результирующий эффект для энергии стаби-
лизации составляет примерно 1—2 ккал • моль-1 в расчете на аминокислотный ос-
таток. Этот стабилизирующий эффект более выражен в случае более длинных
спиралей.
Важным следствием линейного расположения дипольных моментов является
существенный результирующий дипольный момент всей а-спирали, какой мог бы
существовать, если бы в ней присутствовало по половине элементарного заряда на
каждом конце. Этот диполь создает поле, способное влиять на связывание лиган-
дов и ферментативный катализ (Hol et al., 1978). Дипольные моменты а-спиралей
обеспечивают вход катионов в водную полость ионного канала, селективного для
К+ (см. разд. 14.10). Дипольные моменты трансмембранных спиральных сегментов
белковых молекул определяют влияние мембранного потенциала на ориентацию
этих сегментов, что может служить движущей силой потенциал-зависимых изме-
нений конформации мембранных белков (см. разд. 1.8).
2.14. Внутрибелковые силовые поля
На основе количественных выражений для различных сил, приведенных выше,
можно в принципе рассчитать общую потенциальную энергию белковой молекулы
при ее определенной конфигурации. Разработке математических моделей, адек-
ватно описывающих потенциальную энергию белковых молекул как функцию по-
зиций всех атомов, посвящено большое число работ. Уравнения внутрибелковых
силовых полей обычно составляют в виде суммы многих членов (Brooks et al., 1983;
Weiner et al., 1986; Levitt et al., 1995)
68
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
и = £йа(Х' - *,о)2 +
СВЯЗИ
+ й(0/-9,о)2 +
углы связей
+ 2X0 -cos («/ (в/ - 0< о)))2 +
диэдральные углы
+ у _^+
заряды
+ 4^5
нейтральные атомы
(f А12
^0
(2.24)
Первая сумма выражает энергию растяжения всех ковалентных связей в белке.
Символ аа означает силовую постоянную для этих связей (см. разд. 2.12), индекс а
указывает тип связи; символ х/0 означает длину связи с минимальной энергией
растяжения. Вторая сумма выражает энергию изгибания всех связей, где и 0/о
аналогичны соответствующим параметрам в первой сумме. Третья сумма означает
энергию вращения диэдральных углов между связями; указанные параметры ана-
логичны тем, которые присутствуют в первых членах. Четвертая сумма отражает
электростатические взаимодействия между зарядами при диэлектрической прони-
цаемости, зависящей от позиции внутри белковой молекулы. Пятая сумма отно-
сится к взаимодействиям, не обусловленным связями и описываемым как потен-
циал Леннард-Джонса (уравнение (2.16)). С помощью компьютера на основе урав-
нения (2.24) можно рассчитать энергию белковой молекулы с учетом координат
всех атомов в белке (обычно используя «рбЬ»-файл).
Расчет силовых полей осуществляют с различными целями, чаще всего для мо-
делирования динамических флуктуаций в структуре. При этом в основу кладут за-
кон Ньютона для движения F = zwa и по уравнению (2.24) рассчитывают F как гра-
диент U, Таким образом, сила выражается как вектор с тремя составляющими для
каждого атома в белке. Ускорение а — это также вектор с тремя составляющими
для каждого атома. За исходное принимают состояние с рандомизированными по
температуре скоростями, включают случайный элемент для учета эффектов темпе-
ратурных скачков и с помощью компьютера получают численное решение. Такой
способ компьютерного моделирования широко используется для изучения быст-
рых процессов, протекающих в пределах наносекунд (Karplus, 2002)
Предпринимаются попытки использовать расчет белковых силовых полей для
прогнозирования структуры белков. При этом исходят из предположения, что на-
тивной должна быть структура с минимальной потенциальной энергией, рассчиты-
ваемой по уравнению (2.24). Разница между величинами энергии в двух различных
локальных минимумах должна показывать относительную стабильность двух макро-
состояний. Однако при таких расчетах возникают значительные трудности. Преж-
де всего с увеличением размеров молекул необходимая для нахождения достовер-
ного минимума мощность компьютера возрастает экспоненциально. Даже для ана-
лиза низкомолекулярных белков эта проблема в настоящее время неразрешима.
Другая проблема состоит в том, что точность каждого члена в уравнении по-
тенциальной энергии не абсолютна. Например, очень трудно точно вычислить силу
электростатических взаимодействий, поскольку диэлектрическая проницаемость
2.15. Стабилизирующие силы в нуклеиновых кислотах
69
окружения зависит от позиции в молекуле белка и редко она известна более точно,
чем ~2. Зависимость других взаимодействий от окружения вообще мало изучена.
Помимо этих неопределенностей, следует иметь в виду, что общую энергию со-
ставляют тысячи слагаемых. Статистический подход в этом случае показывает, что
ошибка суммирования будет примерно равна средней ошибке в расчете на член,
умноженной на корень квадратный числа членов (см. гл. 12). Таким образом,
ошибка при суммировании будет больше, чем различия величин энергии в локаль-
ных минимумах функции потенциальной энергии.
Чтобы проиллюстрировать возникающие при расчете энергии белков проблемы,
рассмотрим среднюю энергию молекулы в расчете на член, равную 10± 1 ккал • моль’1.
При А-числе членов общая энергия молекулы будет равна 107V ±17^7, и при
N = 10 000 средняя энергия молекулы составит 100 000 ±100 ккал-моль"1. Ошибка,
равная 100 ккал моль’1, представляет собой относительно небольшую долю общей
энергии (0,1%), но очень большую величину относительно изменений свободной
энергии при типичных конформационных переходах (например, при тепловой де-
натурации; см. гл. 1). Эту проблему не удастся преодолеть путем повышения мощ-
ности компьютера. Ее решение зависит от повышения точности расчетов внутри-
молекулярных сил, а также от такой точности расчета функции потенциальной
энергии, которая, вероятно, недостижима.
Для преодоления этих трудностей предпринимаются огромные усилия, и бла-
годаря постепенному совершенствованию методы расчета силовых полей начина-
ют уже давать плодотворные результаты в прогнозировании структуры белковых
молекул. Дважды в год проводится представительный конкурс на определение
структуры белка по аминокислотной последовательности, называемый CASP
(critical assessment of protein structure prediction). Кроме расчета силовых полей, для
предсказания белковой структуры разрабатываются и многие другие подходы,
и CASP-конкурсы выполняют важную роль в оценке результатов проводимых ис-
следований (Lesk et al., 2001).
2.15. Стабилизирующие силы в нуклеиновых кислотах
Молекулярные силы определяют конформацию и свойства олигонуклеотидов,
одноцепочечных полинуклеотидов (например, РНК) и двухцепочечных полинук-
леотидов (например, ДНК) (Bloomfield et al., 1974; Record et al., 1981). К наиболее
важным взаимодействиям в молекулах нуклеиновых кислот относятся 1) межпло-
скостные взаимодействия между ароматическими кольцами соседних оснований,
2) электростатические взаимодействия между несущими заряд фосфатными груп-
пами полинуклеотидного остова и 3) водородные связи между азотистыми основа-
ниями в их комплементарных парах, открытых Уотсоном и Криком.
Межплоскостные взаимодействия между парами оснований характеризуются
значительной силой и приводят к тому, что ароматические кольца оснований скла-
дываются в стопки наподобие тарелок. В результате этого взаимодействия проис-
ходит слабое связывание мономерных нуклеотидов в растворе и, что более важно,
стабилизируется двойная спираль ДНК. Данная сила характеризуется относительно
незначительным энтропийным вкладом и поэтому не тождественна гидрофобному
взаимодействию. Межплоскостные взаимодействия оснований в нуклеиновых
70
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
кислотах зависят от дисперсионных сил, особенно сильных вследствие большого
сходства электронной структуры различных оснований. Частотные зависимости
поляризуемости оснований обнаруживают значительное сходство, что, как отме-
чено выше (разд. 2.7), служит основным фактором сильного дисперсионного взаи-
модействия.
Водородные связи образуются между пуриновым основанием одной цепи ДНК
и пиримидиновым основанием другой цепи, т. е. два такие основания составляют
комплементарную пару оснований. Энергия одной водородной связи в двойной
спирали ДНК варьирует в диапазоне 0,8—1,6 ккал • моль-1 (Fersht, 1987).
Пара гуанин—цитозин стабилизирована тремя водородными связями, пара
аденин—тимин — двумя, и поэтому можно предполагать, что двойная спираль, бо-
гатая ГЦ-парами, обладает более высокой стабильностью, чем двойная спираль,
богатая АТ-парами. Эту гипотезу трудно проверить, поскольку плавление двойной
спирали представляет собой термодинамически сложный процесс. Однако, хотя
вклады отдельных энергий определить при этом трудно, анализ плавления ДНК
выявляет замечательный факт: ДЯ и Д5 плавления — это простые линейные функ-
ции величины фракции ГЦ-пар в ДНК. Данная линейная зависимость позволяет
сделать важный вывод, состоящий в том, что для стабильности ДНК гораздо важ-
нее количественное соотношение оснований, а не сама по себе нуклеотидная по-
следовательность.
В результате сочетания водородных связей и межплоскостных взаимодействий
(между ароматическими кольцами соседних оснований) образование двойной
спирали происходит как высококооперативный процесс. Когда между двумя цепя-
ми спариваются первые два основания, их удерживают вместе только водородные
связи и комплекс не слишком стабилен. Но как только образуется эта первая пара
оснований, соседние основания немедленно выстраиваются в конфигурацию спа-
ривания за счет межплоскостных взаимодействий. В результате затравочное спа-
ривание первых двух оснований обеспечивает высокую скорость образования
двойной спирали. Это взаимодействие ближайших соседних структур может слу-
жить прекрасным примером того типа кооперативности, который рассматривается
в теории перехода спираль—клубок (см. разд. 3.12).
Нуклеиновые кислоты содержат сильнокислые фосфатные группы, большая
часть которых при нейтральном pH ионизирована. Сила отталкивания между эти-
ми зарядами действует в направлении выпрямления спирали, удлиняя одноцепо-
чечные полимеры и увеличивая персистентную длину (см. разд. 3.4). Отталкивание
между фосфатными группами двух цепей ДНК также противодействует ассоциа-
ции цепей и образованию двойной спирали. Между температурой плавления и ло-
гарифмом концентрации соли существует удивительно простая линейная зависи-
мость. Это хорошо объясняет теория, основанная на связывании противоионов
(см. разд. 11.11).
2.16. Липидный бислой и мембранные белки
Головоломная загадка — как расположить амфипатические молекулы таким спо-
собом, чтобы контакт между углеводородом и водой был минимальным, — имеет
совершенное решение в структуре клеточных мембран, представляющих собой
2.16. ЛИПИДНЫЙ ВИСЛОЙ И МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ
71
липидный бислой. Оптимальная организация достигается в мембране благодаря
почти параллельной плотной упаковке фосфолипидных молекул, при которой их
полярные головные группы образуют плоскую поверхность, обращенную в водную
фазу, а углеводородные цепи («хвосты») направлены внутрь бислоя и обращены
друг к другу. Интегральные мембранные белки встроены в мембрану посредством
своих гидрофобных сегментов, пронизывающих бислой (рис. 2.13; ср. рис. 2.11).
Таким образом, внутренняя область мембраны остается гидрофобной и в участках
расположения белков. Сегменты мембранных белков с полярными боковыми це-
пями погружены в водную фазу и контактируют с полярными головками фосфо-
липидов мембраны.
Принцип совмещения гидрофобных поверхностей с наибольшей пользой
реализуется в мембранных белках. Трансмембранные сегменты белковой молеку-
лы лишь незначительно варьируют по содержанию гидрофобных аминокислот-
ных остатков. Трансмембранные сегменты, контактирующие с липидом, более
гидрофобны, чем сегменты, скрытые во внутренней области белковой молекулы
(Ress et al., 1989). Показатель гидрофобности рассчитан для а-спиральных транс-
мембранных сегментов фотосинтетических реакционных центров, состоящих из
нескольких мембранных белков. Средняя гидрофобность остатков, скрытых во
внутренней области этих мембранных белков, сходна с аналогичным показателем
остатков, скрытых внутри глобулярных белков. Таким образом, интернализация
(погружение в мембрану или вглубь белковой молекулы) боковых цепей амино-
кислотных остатков мембранных белков и глобулярных белков определяется, ве-
роятно, одними и теми же факторами Периферические домены мембранных бел-
ков, контактирующие с углеводородными хвостами мембранных фосфолипидов,
намного более гидрофобны, чем скрытые домены, и это обнаруживается по сов-
падению показателей гидрофобности белка и углеводородных хвостов фосфо-
липидов.
В липидных бислоях параллельно расположенные углеводородные цепи при-
тягиваются друг к другу под действием силы дисперсионного взаимодействия, про-
порциональной 1/г5 (см. разд. 2.7). Лишенные полярных групп молекулы твердого
Рис. 2.13. Липидный бислой, включающий
интегральный мембранный белок. Гидро-
фобные элементы (показаны серым) скры-
ты внутри бислоя. Полярные элементы (по-
казаны черным) расположены на поверх-
ностях, обращенных в водную фазу
72
Глава 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУРАХ
парафина характеризуются средней площадью в расчете на углеводородную цепь
примерно 18—19 А2, и это отражает минимум потенциальной энергии, обеспечи-
ваемый сочетанием дисперсионных сил притяжения и сил стерического отталки-
вания. В гелевой фазе внутри липидного бислоя углеводородные цепи, вытянутые
и параллельные друг другу, имеют среднюю площадь примерно 21 А2. Эта площадь
больше, чем в случае парафина, за счет присутствия в фосфолипидах полярных
групп, занимающих большую площадь при упаковке, чем две сложенные углеводо-
родные цепи. Полярные группы отталкиваются одна от другой, и это разводит уг-
леводородные цепи.
При повышении температуры происходит плавление — переход мембраны
в жидкое состояние. Углеводородные цепи теряют упорядоченное расположение,
приобретают изогнутую и ломаную конформацию и расходятся, так что занимае-
мая липидной молекулой площадь достигает 301 А2. Плотность упаковки молекул
липида становится сходной с плотностью упаковки молекул жидкого парафина,
и такое повышение неупорядоченности углеводородных цепей приводит к умень-
шению толщины мембраны (Weiner, White, 1992). При физиологической темпе-
ратуре липиды в биологических мембранах имеют тенденцию к жидкому состо-
янию, что обеспечивает большую гибкость и свободу диффузии мембранных
белков.
Задачи
1. Составьте выражение для энтальпии гидратации на основе уравнения (2.4).
Сплошная кривая на рис. 2.1 соответствует пропорциональности С/г. Рассчитайте
численную величину С с помощью полученного выражения, используя темпера-
турную зависимость бв, указанную ниже (уравнение (2.2)) (Rashin, Honig, 1985).
2. Энергия расположения зарядов выражается интегралом по всему диапазону вели-
чины е£2/(8л), где Е — напряженность поля (Jackson, 1975). С использованием
этого интеграла выведите уравнения (2.4) и (2.7).
3. Составьте выражение для потенциальной энергии взаимодействия между двумя
диполями, лежащими в одной плоскости, как функцию расстояния и ориентации.
4. Составьте выражение для потенциальной энергии взаимодействия между квадру-
полем (рис. 2.5, В) и катионом, находящимся на оси квадруполя.
5. Рассчитайте разницу в энергии Борна для внедрения тетрафенилфосфония из
масла в воду. Рассматривайте молекулу тетрафенилфосфония как сферу и опреде-
лите ее размеры по химической структуре.
6. Аминокислота лизин содержит первичную аминогруппу на конце боковой цепи.
Принимая радиус этой аминогруппы равным 1,7 А, рассчитайте энергию ее пере-
носа из воды в масло. Примите р£ первичной аминогруппы равным 10 и рассчи-
тайте свободную энергию депротонирования кислоты в форме (RNH3) при pH 7,3.
Сравнивая эти значения энергии, сделайте вывод о том, в какой форме лизин мо-
жет встраиваться в мембрану, в протонированной или в депротонированной.
7. Рассчитайте свободную энергию переноса тетрафенилфосфония из масла в воду.
Как и в задаче 5, рассчитайте площадь молекулы по химической структуре. Срав-
ните полученную величину с величиной, рассчитанной в задаче 5.
Задачи
73
8. Определите разницу между величинами свободной энергии переноса тирозина
и фенилаланина из масла в воду.
9. Определите позицию минимума свободной энергии для потенциала Леннард-
Джонса (уравнение (2.16)) и глубину этого минимума.
10. Рассчитайте силовую постоянную при минимальном значении потенциала Леннард-
Джонса через величины е и г0. Чему равна эта постоянная при е = 10 ккал • моль-1
и /*о = 2,8 А? Сравните данную величину с силовой постоянной для связи С—С,
приведенной в разд. 2.12.
11. Определите функцию распределения и свободную энергию многомерного гармо-
нического потенциала в уравнении (2.19), используя классический конфигураци-
онный интеграл (уравнение (1.4)). Выразите результат с помощью матрицы А.
Глава 3
Конформации макромолекул
Конформационные изменения макромолекул выше рассмотрены в гл. 1 на основе
представлений о макросостояниях, без привлечения сведений о деталях молеку-
лярной структуры. Теперь обратимся именно к анализу деталей, т. е. к изменениям
микросостояний, что позволит прояснить и характер некоторых типов макросо-
стояний. Для подробного анализа факторов, определяющих конформации макро-
молекул, мы будем использовать сведения о внутримолекулярных взаимодействи-
ях, приведенные в гл. 2. Вначале рассмотрим структуру простых полимеров в каче-
стве моделей для последующего анализа сложных биополимеров.
3.1. Н-Бутан
Прежде чем исследовать конформации сложных по структуре полимерных моле-
кул, рассмотрим в этом отношении низкомолекулярное газообразное вещество
//-бутан (нормальный бутан), насыщенный алифатический углеводород. Молекула
бутана имеет три наиболее стабильные конформации, зависящие от вращения во-
круг центральной С—С-связи с образованием различных диэдральных (двугран-
ных) углов. Эти конформации имеют обозначения транс-, гош-левая и гош-правая
(рис. 3.1). Электронная структура С—С-связи ограничивает вращение вокруг цен-
тральной связи, в результате чего молекула большей частью находится в трех ука-
занных конфигурациях.1
Рис. 3.1. Три вращательных изомера н-бутана. При транс-конформации все атомы С располо-
жены в одной плоскости и диэдральный угол, образуемый тремя С—С-связями, равен нулю.
При повороте связи на 120° и 240° образуются гош-правая- и гош-левая-конформации соответ-
ственно.
1 Обычно ограничение вращения в молекуле н-бутана и молекулах других прямоцепочечных
алифатических соединений объясняют стерическим отталкиванием. Однако детальный анализ
показывает, что сила отталкивания ничтожно мала и предпочтительность определенных вариан-
тов вращения обусловлена взаимодействиями между орбиталями связей (Reed, Weinhold, 1991).
3.1. /-/-Бутан
75
Разность энергий /яря//с-конформации и гои/-конформаций составляет
1/2 ккал • моль-1 (Rosenthal et al., 1982). Эта величина может быть использована для
расчета относительной вероятности транс- и гои/-конформаций //-бутана с помо-
щью распределения Больцмана. Обозначив энергию /яря//с-конформации £т и
энергию гои/-конформации £г, запишем соответствующее распределению Больц-
мана выражение для относительного содержания молекул в этих конформациях,
определяемого разностью энергий
^Г-П _ Л-л _ ^-ЬЕ/КТ (3 1)
Л Л
Здесь транс-, гош-левая и гои/-ярявая-конформации обозначены индексами т, г-л
и г-п соответственно. Размерность энергии принята в единицах на моль, и поэтому
использована газовая постоянная R (см. разд. 1.1).
Далее необходимо привлечь к анализу величину статистического веса по
Больцману (см. разд 1.1), которая для состояния i составляет
= e~Ei/RT (3.2)
В случае //-бутана индекс / может означать т, г-л или г-п. При Ет = О, £г.л = £т.п = 0,5
и ЯТ~0,6 ккал • моль-1 (при комнатной температуре) величины статистического
веса по Больцману составляют
и>т =е"0/0,6=1 (3.3а)
wr - е"°’5/0’6 =0,43, (3.16)
где обозначение wr использовано и для гош-левой и для гои/-лрявои-конформаций.
Вероятность транс- и гои/-конформаций //-бутана выражается через величины ста-
тистического веса
1
т wT+2wr 1 + 2-0,43
р = р
* г * г-п ' * г-л
2и>г
wT + 2и>г
2 0,43
1 + 2 0,43
= 0,46
(3.46)
Отметим, что Рт +РГ = 1, поскольку сумма вероятностей должна быть равна еди-
нице.
Коэффициент 2, на который умножается величина wr в уравнениях (3.4а)
и (3.46), означает, что различие между левой и правой конформациями не прини-
мается во внимание и два данных состояния объединены. Этот коэффициент 2
служит показателем вырожденности энергетического уровня, т. е. означает число
энергетически эквивалентных вариантов данного состояния. Назовем статистиче-
ский вес, умноженный на коэффициент вырожденности, элементарным стати-
стическим весом (для гои/-конформации он составляет 2е"д£/лг). Использование
такой величины часто облегчает вычисление вероятности.
Уравнения (3.4а) и (3.46) выражают зависимость фракций молекул в той и дру-
гой конформации от величины энергии и фактора вырожденности. С возрастани-
76
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
ем Ег величина wr уменьшается, вероятность Рг падает до нуля и Рт достигает еди-
ницы. Когда величина RTмала по сравнению с разностью энергий, молекула нахо-
дится большей частью в состоянии с наименьшей энергией. При повышении
температуры влияние разности в энергиях снижается, поскольку обе величины
статистического веса по Больцману становятся равны единице. При этом вероят-
ность данных состояний пропорциональна их коэффициентам вырожденности.
На основе приведенных статистических расчетов можно определить, напри-
мер, расстояние между концами молекулы «-бутана. Рассмотренные выше кон-
формации характеризуются длинами молекул /ти /г. Если бы все молекулы имели
/«ря«с-конформацию, средняя длина молекулы была бы равна /т, в аналогичном
случае при го«/-конформации — /г. Однако та и другая конформации присутствуют
одновременно в пропорции, определяемой величинами Рг и Рт, (уравнения (3.4а)
и (3.46)), поэтому за среднюю длину молекулы следует принять среднее между дли-
нами /ти /г, взвешенное по относительному количеству молекул в той и другой
конформациях
/=/тРт+/гРг (3.5)
Обычно расстояние между концами молекулы обозначают как вектор, но тогда
среднее по всем ориентациям значение равно нулю. В связи с этим за основной ко-
личественный показатель размеров молекул часто принимают среднеквадратич-
ную величину расстояния между концами молекул
# = >//т2рт +/2л (3.6)
Среднеквадратичное расстояние между концами молекул служит важной ха-
рактеристикой гибких макромолекул, и ниже в этой главе оно вычисляется для мо-
лекул большой длины с применением того же метода усреднения по всем конфор-
мациям.
3.2. Функции распределения конфигураций
и полимерные цепи
Знаменатель в уравнениях (3.4а) и (3.46) представляет собой сумму величин стати-
стического веса по Больцману всех конфигураций молекул «-бутана. Напомним,
что таким образом вычисляется функция распределения в статистической механи-
ке (разд. 1.1). В общем виде функция распределения вещества с «-числом состоя-
ний записывается следующим образом
С = ^е-£,/«г (3.7)
/=|
Функцию распределения можно также выразить через энергию как суммарный
показатель, взяв сумму всех величин элементарного статистического веса
Q = ^EeE/RT (3.8)
Е
3.2. Функции распределения конфигураций и полимерные цепи
77
Такой способ более удобен во многих случаях. Переменная со£ — это параметр вы-
рожденности состояний с энергией Е. Если несколько состояний, обозначенных
индексом z, характеризуется одной и той же величиной энергии, данный энергети-
ческий уровень представлен как вырожденный и в соответствии с этим его стати-
стический вес умножается на со£ в уравнении (3.8).
Чтобы проиллюстрировать использование функции распределения, рассмот-
рим среднюю энергию молекулы
J^e-£'//?r
--------- (3.9)
^е-£'/лг
/=1
Дифференцируя уравнение (3.7) по температуре, получаем
Производя деление на выражение (3.7) и используя уравнение (3.9) для £, получа-
ем следующее выражение для средней энергии
£=ЛГ2£1п2 (з.П)
дТ
Как правило, найдя удобную форму выражения функции распределения, можно
вычислить много важных характеристик полимера.
В качестве примера продемонстрируем, каким образом использование функ-
ции распределения позволяет выявить важное соотношение между свойствами по-
лимера и составляющих его мономеров. Рассмотрим цепь из N мономеров. Моно-
меры могут различаться по энергии, поэтому обозначим энергию л-го мономера
как Еп, имея в виду, что величина п варьирует от 1 до п и каждый член Еп может
принимать значения, определяемые сочетанием поворотных конфигураций. Если
ориентации мономеров независимы, элементарный статистический вес данной
конфигурации полимера равен произведению величин элементарного статистиче-
ского веса мономеров: р[со£ле"£лДГ. Функция распределения при этом равна сум-
Еп
ме всех этих произведений
qn= Z
Ех,Е2.Еn л=1
(3.12)
Можно обратить порядок вычисления сумм и произведений и записать произведе-
ние явным образом
(3.13)
Каждая сумма в этом произведении представляет собой функцию распределения
мономера, обозначаемую Q{. Соответственно полученное выражение можно запи-
сать как
78
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
Qn=Q" (3.14)
Таким образом, если мономеры независимы в своей ориентации, функция распре-
деления полимера — это функция распределения мономера в степени N.
Рассмотрим в качестве примера полиэтилен, представляющий собой цепь из
СН2-групп. Если считать повороты вокруг каждой С—С-связи подобными поворо-
там в молекуле «-бутана (рис. 3.1), тогда 0, — это функция распределения «-бутана
и функция распределения полиэтилена равна Qx в степени N. (В этом рассуждении
не учтен тот факт, что концы молекулы отличаются по структуре. В случае N ато-
мов углерода следует на самом деле использовать величину 0/"3, поскольку общее
число связей, подобных связям в «-бутане, равно N -3.)
Приведенный расчет показывает, как легко определять характеристики, если
считать ориентацию мономеров независимой. Если же попытаться принять во
внимание взаимодействие между соседними связями, анализ существенно услож-
няется. Это станет ясно при рассмотрении в последующих разделах конфигурации
случайного клубка и перехода спираль—клубок, при котором играют роль условия
взаимодействия между соседними звеньями цепи.
3.3. Статистика случайных клубков
Гибкие полимерные цепи, такие как молекулы полиэтилена, имеют свойство изги-
баться и скручиваться случайным образом, образуя структуру в виде клубка. Это
общее свойство полимеров, включая биополимеры, и статистические модели слу-
чайного поведения полимерных цепей служат важным инструментом анализа фи-
зических характеристик макромолекул. Существует много вариантов моделей слу-
чайного, или стохастического, клубка, различных по сложности в отношении ус-
ловий взаимосвязи между сегментами. Простейшая модель — это цепь из свободно
сочлененных сегментов (свободно сочлененная цепь), где каждый сегмент имеет
полную свободу вращения и все возможные углы между связями равновероятны.
В отличие от этого в модели цепи со свободным внутренним вращением углы меж-
ду связями фиксированы, но диэдральные углы могут принимать любое значение.
Наконец, еще более сложная модель поворотных изомеров предполагает аналогию
с молекулой «-бутана, где диэдральные углы имеют несколько наиболее вероятных
значений.
Рассмотрим вначале модель свободно сочлененной цепи и рассчитаем для нее
среднеквадратичное расстояние между концами молекул. Структура такой цепи
показана на рис. 3.2. Все связи изображены на рисунке для простоты в одной плос-
кости, но при расчете мы будем иметь в виду трехмерную молекулу, состоящую из
jV-сегментов.
Рис. 3.2. Свободно сочлененная цепь содержит N сегментов,
соединенных связями длиной / каждая. Вектор R/v, соединяю-
щий концы молекулы, представляет собой сумму векторов для
N сегментов.
3.3. Статистика случайных клубков
79
Математический анализ модели свободно сочлененной цепи существенно схо-
ден с приведенным в гл. 6 математическим анализом модели диффузии, связанной
со случайными перемещениями. Здесь мы проведем анализ свободно сочлененной
цепи таким способом, который поможет объяснить физические свойства полиме-
ров. Определим для цепи из N сегментов вектор Кд, протяженностью от начала
первого сегмента до конца jV-го сегмента (рис. 3.2). Этот вектор расстояния между
концами молекулы равен сумме векторов N сегментов.
R#=Er" О-15)
Л = 1
Среднее значение вектора по всем конфигурациям цепи составляет Ryy =0, по-
скольку для каждого Ryy существует аннулирующий его вектор, обозначающий точ-
но противоположное направление (как отмечено выше для //-бутана). Поэтому
вместо величины Ryv усредним ее квадрат
--- ( N у N N
r2№ =iczr"'r'” (злб>
\л=1 J л=1 т = \
Полученное выражение содержит произведение векторов. Двойную сумму можно
разложить на члены в соответствии с условиями п = т или п^т
--- N — N N ________
R* = + (3-17)
Л = 1 Л#Л1
В случае свободно сочлененной цепи все члены при п*т равны нулю, по-
скольку при полностью свободном сочленении ориентация любых двух различных
сегментов полностью независима. Соответственно в выражении остаются только
члены в форме г2 и все они равны /2. Имея в сумме 2V таких членов, мы получаем
следующее выражение для среднеквадратичного расстояния между концами моле-
кулы
R2„ = 7W2 (3.18)
Таким образом, среднеквадратичная величина расстояния между концами мо-
лекулы возрастает как a/JV. Это основополагающее физическое свойство молекул
со случайной конформацией цепи. Данная пропорциональность обнаруживается
не только для полимерных молекул, извитых случайным образом, но и для многих
других статистических систем. Ключевым условием получения такого результата
служит условие независимой ориентации сегментов.
Если соседние сегменты взаимодействуют, указанная пропорциональность ме-
жду R» и N сохраняется, при условии что взаимодействие не распространяется не-
определенно далеко вверх и вниз по цепи полимера. Примером может служить
цепь со свободным вращением, где угол между двумя соседними связями имеет
фиксированное значение 0. В этом случае существует корреляция между поворота-
ми данных сегментов. Члены в уравнении (3.17), имеющие форму г„ гл+1, составля-
ют при этом I2 cos0, и таким образом мы получаем простой тригонометрический
результат. Поскольку данный угол между соседними сегментами всегда равен 0,
80
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУ/1
в усреднении по 0 нет необходимости. Чтобы оценить величину гл-гл+2, разложим
гл+2 на составляющие, параллельную и перпендикулярную гл +гл+1. Вклад перпенди-
кулярной составляющей в среднюю величину равен нулю, вклад параллельной со-
ставляет /2 cos20. В этом проявляется определенная тенденция: для любой пары
сегментов при п*т имеет место равенство гл -г,, = /2 cosl""'”! 0. Для низких значений
п-т каждая сумма в уравнении (3.17) берется примерно 22Ураз. Все члены в этом
уравнении при п^т образуют геометрический ряд вида 22Vcos0. Суммирование
всех этих членов с помощью метода суммирования геометрического ряда (см. при-
ложение 1) позволяет получить следующее выражение для среднеквадратичного
расстояния между концами цепи
R^ = 1 + COs9 pN
1-COS0
Как можно видеть, за исключением дроби, отражающей влияние угла между свя-
зями, данное выражение совпадает с уравнением (3.18), полученным для свободно
сочлененной цепи. Уравнение (3.18) теряет смысл, если значение 0 приближается
к 0° или 180°, поскольку суммы уже не сходятся; однако данные углы не соответст-
вуют природе гибкой полимерной молекулы.
В модели поворотных изомеров вращение вокруг связей ограничено, и по этой
причине математический анализ становится более сложным. Выражение для сред-
неквадратичного расстояния между концами молекулы приобретает вид
ЗГГ _ fl + COS0
U - COS0
И вновь мы получаем результат!^ ос /2N. Угол ср — это диэдральный угол, образуе-
мый тремя последовательными связями. Более детальный анализ этих кратко рас-
смотренных здесь моделей можно найти в специальных работах (Flory, 1969;
Cantor, Schimmel, 1980).
Модель поворотных изомеров наглядно иллюстрируется расположением мо-
номеров в узлах решетки. Если связи ограничены углом 90° и диэдральные углы
кратны 90°, это кубическая решетка. Такой молекулы не существует, но в случае
полиэтилена углы близки к 120° и для него неплохим приближением может слу-
жить гексагональная решетка. Подход с расположением полимерной цепи на ре-
шетке полезен для визуального представления о случайных конфигурациях макро-
молекул, и мы еще не раз обратимся к нему в этой главе.
3.4. Эффективная длина сегментов
Решения уравнений в моделях случайной конфигурации полимерных цепей по-
степенно усложняются по мере введения новых условий, но усложнение всегда ог-
раничено множителем при члене /W, т. е. пропорциональность числу Nсохраня-
ется. Это позволяет обобщить результаты, если учесть все разнообразные условия
в таком параметре, как эффективная длина сегмента, /эфф. В этом случае можно
объединить уравнения (3.19) и (3.20) следующим образом
= (3.21)
1 + COS? ,2м
(3.20)
1-
3.4. Эффективная длина сегментов
81
Таблица 3.1. Параметры гибкости полимерных молекул
/,А / А 'эфф' *' Z С
Полиэтилен1 1,54 12,4 0,83 6,7
Поли-Ь-аланин2 3,8 36 0,95 9,0
Двухцепочечная ДНК (в 0,2 М растворе соли)2 3,5 ' 300 1 86
1 Cantor, Schimmel, 1980.
2 Record et al., 1981.
В такой форме любая модель будет аналогична модели цепи со свободно сочленен-
ными звеньями, но сегменты при этом будут не действительными, а эффективны-
ми сегментами, имеющими эффективную длину /эфф. Этот параметр служит показа-
телем степени жесткости полимерной цепи. Значения /эфф, лишь незначительно
превышающие /, означают, что молекула очень гибкая; если /эфф (/, молекула имеет
жесткую структуру.
Другим показателем, широко используемым для описания конформационной
гибкости, служит характеристическое отношение
С —
l2N I ’
где z — это геометрический коэффициент, используемый для отражения того фак-
та, что полностью вытянутая цепь может иметь длину, меньшую чем величина NI
(например, в полностью вытянутой молекуле полиэтилена углы связей равны 112°
и длину NI необходимо умножить на геометрический коэффициент). Характери-
стическое отношение показывает, насколько среднеквадратичное расстояние ме-
жду концами молекулы больше, чем оно должно быть в случае цепи со свободно
сочлененными звеньями. Значения /, /эфф, z и С для полиэтилена, полиаланина
и ДНК приведены в табл. 3.1. В случае ДНК величины /эфф и С намного выше, по-
скольку это молекула с жесткой структурой, тогда как полиэтилен и полиаланин
отличаются гибкостью молекул. Важно подчеркнуть, что даже молекула очень
жесткой структуры, такая как двухцепочечная ДНК, будет иметь случайным обра-
зом извитую конфигурацию при достаточно большой длине. В этом случае до-
статочно большой считается длина, в несколько раз превышающая /эфф. Данные,
приведенные в таблице, позволяют рассчитать, что в случае ДНК извитая кон-
формация возможна при длине молекулы 3000 А, т. е. примерном числе пар нук-
леотидов 1000.
Для полноты следует указать еще один широко используемый показатель жест-
кости молекулы, называемый персистентной длиной. Эта величина, обозначаемая
/п, определяется как сумма проекций всех сегментов на одну связь
/n = Limv-& <3-23>
Среднее значение берется здесь по всем конформациям. Если цепь жесткая, меж-
ду ориентацией сегментов, разделенных значительным расстоянием, все же име-
82
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
ется корреляция и они вносят вклад в общую сумму. Таким образом, более жест-
кая цепь будет иметь большую персистентную длину. Персистентная длина может
быть использована для замены многих членов в двойной сумме в уравнении
(3.17), определяющем среднеквадратичное расстояние между концами молекулы.
Произведя необходимые преобразования, можно выявить следующую связь меж-
ду персистентной длиной и характеристическим отношением (Cantor, Schimmel,
1980)
/п=|(С + 1)/ (3.24)
В случае жесткой цепи, при z = l, это выражение можно объединить с выраже-
нием (3.22), что позволяет получить простое аппроксимирующее соотношение
41 ~ ^эфф/2*
3.5. Неидеальные полимерные цепи и тета-растворители
В приведенном выше анализе цепей, образующих случайные клубки, как единст-
венный вид взаимодействия между сегментами рассматривалось ограничение уг-
лов между связями. Кроме этого фактора, на конформацию молекул оказывают
сильное влияние еще два типа взаимодействий, но их математический анализ го-
раздо более сложен. Первый из этих типов — притяжение, например приводящее
к образованию водородных связей и гидрофобным взаимодействиям (см. гл. 2)
и тем самым к сближению отдаленных друг от друга сегментов и переходу молеку-
лы в состояние с более компактной структурой. Второй тип указанных взаимодей-
ствий — это стерическое отталкивание (также рассмотренное в гл. 2), препятст-
вующее двум сегментам занимать одно и то же пространство в одно и то же время.
Взаимодействие в форме отталкивания, называемое эффектом исключенного объ-
ема, оказывает влияние, противоположное притяжению, и приводит к уменьше-
нию компактности молекулы. Точных математических решений в моделях с этими
взаимодействиями не найдено, и поэтому модель случайного клубка особенно
важна как базисная. В соответствии с этим модели случайных клубков называют
моделями идеальных цепей, тогда как более реалистичные, но аппроксимирующие
модели, в которых учтены эффекты притяжения и отталкивания, — моделями не-
идеальных цепей.
Ряд аппроксимирующих решений для моделей с учетом эффекта исключенно-
го объема показывает, что среднеквадратичное расстояние между концами молеку-
лы пропорционально числу сегментов в степени v, представляющей собой показа-
тель масштабной инвариантности (скейлинговый показатель)
(3.25)
Для идеальной цепи v = l/2 (разд. 3.3). Модели с учетом эффекта исключенного
объема дают несколько более высокие значения v, чаще всего 3/5. Согласно модели,
представленной в одной из работ (De Gennes, 1972), значение v равно 0,5975. Эти
результаты, полученные с помощью моделей, позволяют сделать заключение, что
если полимерная молекула не может «выпадать сама на себя» (самоперекрываться),
то она имеет более вытянутую конформацию, концы ее разделены большим рас-
3.6. Распределение вероятности
83
стоянием. Таким образом, эффект исключенного объема приводит к увеличению
эффективных размеров молекул относительно ожидаемых для идеальной цепи.
Набор конфигураций, которые может принимать цепь при наличии эффекта
исключенного объема, представляет собой часть набора конфигураций, возмож-
ных для соответствующей идеальной цепи. Эффект исключенного объема приво-
дит к уменьшению общего числа конфигураций, и это означает, что модель слу-
чайного клубка дает завышенное значение энтропии конфигурации полимера.
Если рассматривать идеальную цепь как случайным образом располагающуюся на
кубической решетке (см. заключительный комментарий относительно вращатель-
ных изомеров в разд. 3.3), число возможных конфигураций составит поскольку
каждый участок в такой решетке имеет шесть соседних участков и каждый новый
сегмент может быть добавлен шестью способами.
Число неперекрывающихся конфигураций полимерной цепи на кубической
решетке определено с помощью компьютерного моделирования, и по его результа-
там для этого числа эмпирически получено выражение A^l/64,68/v (Chan, Dill, 1991;
Camacho, Thirumalai, 1993). Деление величины б77 на данное выражение показыва-
ет, что по модели распределения идеальной цепи на кубической решетке число
конфигураций в 1,28 n/N 1/6 раз больше, чем действительное число конфигураций.
Модель случайного клубка можно легко усовершенствовать, если принять условие,
что из шести возможных способов добавления нового сегмента один путь занят.
Исключение одного участка дает существенное улучшение результата расчетов —
число конфигураций становится равным 5N и превышение действительного числа
конфигураций соответствует тогда коэффициенту 1,07n/N4\
Взаимодействия между сегментами, обусловленные притяжением, оказывают
противоположный эффект, сближая сегменты и делая молекулу более компактной.
Это влияние сильно зависит от вида растворителя. В случае растворителя, в кото-
ром сегменты полимера слабо растворимы, они сближаются, снижая энергетиче-
ски невыгодный контакт с растворителем. В отличие от этого хороший раствори-
тель делает цепь более вытянутой.
Можно подобрать такой растворитель, в котором притяжение между сегментами
компенсируется эффектом исключенного объема. При правильном балансе сред-
неквадратичное расстояние между концами молекулы будет соответствовать рассчи-
танному для модели идеальной цепи. В этом случае растворитель называют тета-
растворителем. Использование такого растворителя дает исключительную возмож-
ность оценить основные свойства полимерных молекул. Однако следует иметь
в виду, что хотя среднеквадратичное расстояние соответствует при этом jVi/2, в ос-
тальных отношениях поведение молекул отклоняется от действительного случайного
клубка. Эффект исключенного объема приводит к исключению большего числа
компактных конфигураций, и это компенсируется силами притяжения, которые
делают более вытянутые конформации менее вероятными. В результате распреде-
ление вероятности расстояния между концами молекулы в диедия-растворителе имеет
более острый максимум, чем рассчитанное для идеальной цепи (Sanchez, 1979).
3.6. Распределение вероятности
Среднеквадратичное расстояние между концами молекулы — это лишь одна из
многих исследуемых характеристик гибких полимерных молекул. При более слож-
84
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
ном описании их поведения учитывается распределение вероятности расстояния
между концами молекулы, P(R). В случае идеальной цепи, где ориентация эффек-
тивных сегментов независима, можно использовать такой мощный инструмент
анализа, как центральная предельная теорема (одна из предельных теорем теории
вероятностей). Согласно этой теореме, любая сумма независимых случайных ве-
личин с одним и тем же средним значением имеет нормальное распределение.
С учетом данного фундаментального положения легко определить распределение
вероятности расстояния между концами молекулы. Напомним, что выше при рас-
чете среднеквадратичного расстояния между концами молекулы ключом для полу-
чения простого решения служило условие независимости вращения сегментов.
Чтобы продемонстрировать, каким образом вывод о нормальном распределе-
нии величины расстояния между концами цепи может быть получен для полимер-
ных молекул, рассмотрим упрощенную модель — случайную конформацию цепи
в одном измерении. Каждый сегмент при этих условиях может принимать только
два положения, правое или левое. Если конец цепи из Nсегментов находится в по-
зиции х, то конец цепи из N-1 сегментов, достигающей области этой позиции,
должен находиться в позиции х+/ или х-l. Соответственно можно составить сле-
дующее отношение между двумя вероятностями, PN_{ (х-l) и PN_X (х+/)
PN(x) = ±(PN.t (x-l) + PN_t (х+ /)), (3.26)
где коэффициент 1/2 введен в связи с тем, что для любого из двух возможных по-
ложений сегмента 7V-1 следующий шаг может быть либо в сторону позиции х,
либо в сторону от позиции х. Разложение каждого из членов в правой части урав-
нения в ряд Тейлора вокруг х дает следующее выражение
PN(x) = 1 [ PN_t (x)-l^ + il2^4 + (х) + +1/2 = (3.27)
2^ дх 2 дх дх 2 дх )
1 г)2 Р
= Р^,(х) + 1/2^4 (3.28)
2 дх
Если перенести член /\_,(х) в левую часть уравнения, разность PN(x)-PN[(x) может
быть записана как ДР(х). Поскольку AW= 1, можно аппроксимировать это выраже-
ние как производную, получив в результате дифференциальное уравнение вероят-
ности
Это уравнение диффузии (рассмотренное в гл. 6), и решением его является гауссо-
ва функция1
1
PN(x)dx = , е 2w2dx, (3.30)
л/2лМ2
что можно проверить подстановкой в уравнение (3.29).
1 Это решение удовлетворяет также соответствующим граничным условиям Р -> 0 при х -> ±оо
и Р(х) ->S(x)при 7V -> 0.
3.7. Образование петель
85
Этот результат получен для нереальной одномерной цепи. Решение для трех-
мерной цепи можно получить перемножением трех гауссовых функций в форме урав-
нения (3.30), которое позволяет получить выражение для вероятности нахождения
конца цепи в позиции (х, у, г)
x2+y2+z2
PN(xiyiz)dxdydz = ---7Гз77е 2/v/2 dxdydz - (3.31)
(2лМ2)3/2
Чтобы получить на основе этого выражения функцию расстояния между конца-
ми цепи, перейдем от прямоугольных координат к сферическим, где х2 + у2 + z2=R2
и dxdydz = 47cT?2d/?
R 2
Pn{R)AR = (3.32)
(2лМ2)3'2
Это уравнение описывает поведение реальной, случайным образом извитой
цепи, представляемое как расположение на кубической решетке (см. замечание
в конце разд. 3.3). Уравнение (3.32) можно считать применимым и к другим фор-
мам и моделям случайным образом извитых полимерных молекул, но с заменой
величины / величиной 1^.
3.7. Образование петель
Насколько легко могут сойтись вместе два конца случайного клубка? Для расчета
вероятности образования петли можно использовать уравнение (3.31). Молекула
образует петлю, если данный конец находится вблизи позиции х = у = z = 0
P„(0)dxdydz= (2nNl2)'3/2dxdydz (3.33)
Действительная вероятность нахождения двух концов в определенном интервале
зависит от размеров произвольного элемента объема, бхбубг. Однако для данного
значения этого элемента объема вероятность будет варьировать как (2 лЛ72)"3/2. Та-
ким образом, вероятность образования петель в случае идеальной цепи уменьша-
ется с увеличением числа сегментов или увеличением длины сегмента. Уравнение
(3.33) позволяет оценить скорость образования кольцевой ДНК из линейной фор-
мы (Record et al., 1981; Crothers et al., 1992). В качестве примера рассмотрим ката-
лизируемое ферментом ДНК-лигазой соединение концов линейной молекулы
ДНК, в том случае если они «липкие», т. е. представляют собой короткие одноце-
почечные участки, комплементарные один другому. Скорость этой реакции цик-
лизации служит показателем вероятности образования петель. В случае очень ко-
ротких отрезков молекулы ДНК уравнение (3.33) неприменимо, так как жесткость
структуры этой молекулы не позволяет концам соединиться подобно концам
цепи, образующей случайный клубок. Для коротких цепей, характеризующихся
жесткостью структуры, более пригодна модель металлическая проволока (см.
разд. 19-7 в кн. Cantor, Schimmel, 1980).1
1 Об этой модели см. ст. «Макромолекула» в кн. «Химическая энциклопедия» т. 2. М. 1990. —
Прим. вед. ред.
86
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
3.8. Упругость случайного клубка
Примем условие, что концы случайного клубка фиксированы в определенных по-
ложениях. При этом число возможных конфигураций молекулы, согласно уравне-
нию (3.31), будет больше в том случае, если ее концы сближены, по сравнению
с тем случаем, когда они расположены далеко один от другого. Следовательно, для
полимерной цепи характерна тенденция к сближению концов цепи. В основе это-
го лежит в качестве движущей силы энтропия, обусловленная тепловым движени-
ем. Величину силы стягивания концов можно рассчитать, определив, как число
конфигураций изменяется в зависимости от вытягивания цепи. Для данного зна-
чения х число конфигураций, которые способна принять полимерная молекула,
составляет
QP(x)dx = . ° e~2widx,
VKm7
(3.34)
где Q обозначает общее число конфигураций цепи. Энтропия цепи как функция ее
длины определяется, согласно уравнению Больцмана для энтропии, выражением
A;In (число состояний)
S(x) = к ln(QP(x)dx) = к In
JlnNl2
е 2/v/2dx =АЛп
Qdx
JlnNl2
+ kln e 2N/2
(3.35)
Левый член в этом уравнении не зависит от х и может быть исключен. В случае
идеальной цепи другие физические взаимодействия отсутствуют (внутренняя
энергия равна нулю) и свободная энергия определяется только энтропией
G(x) = -TS = -кТ\п е 2N'2
кТх2
2N12
(3.36)
Сила стягивания концов равна производной этого выражения по х
= W (3-37)
Данное выражение идентично закону Гука для упругости, соответственно ко-
торому сила возрастает линейно с увеличением деформации. Это означает, что слу-
чайный клубок ведет себя как простая пружина. Более длинный клубок (с боль-
шим числом сегментов) будет более рыхлым и более способным к растяжению.
Коэффициент 1/W уменьшает силу растяжения с увеличением числа сегментов.
Важно отметить, что сила упругости возрастает с увеличением температуры,
и этим подтверждается, что данная сила обусловлена тепловым эффектом возрас-
тания неупорядоченности.
Уравнение (3.37) описывает давно установленную закономерность, известную
ранее всего из теории эластичности резины. Пружиноподобная эластичность со-
ставляет основное свойство полимерных материалов, показательным примером
которых служит резина. Недавно проведенные эксперименты с применением
3.10. Вращение полипептидного остова: вторичная структура белков
87
молекулярных зондов, мишенями которых служили концы полимерных молекул,
позволили измерить силу растяжения одиночных молекул. Для коротких молекул
наблюдалась линейная зависимость силы растяжения от длины цепи, но для более
длинных молекул и особенно для молекул с жесткой структурой, таких как ДНК,
модель случайного клубка не была адекватной. Как и при анализе образования пе-
тель (см. выше), для молекул с жесткой структурой здесь более пригодна модель
металлическая проволока, поскольку она лучше отражает свойство жесткости
(Kellermayer et al., 1997).
3.9. Когда возможна конформация случайного клубка?
Имея точные результаты расчетов, приведенные выше для моделей случайных
клубков, важно представлять, в каких случаях такое поведение молекул проявляет-
ся. Конформацию случайного клубка часто имеют полипептидные цепи и длин-
ные линейные молекулы ДНК. Наиболее естественной конфигурация случайного
клубка, казалось бы, должна быть для денатурированных белков, однако на самом
деле денатурированные белки могут иметь довольно компактную структуру, хотя
и существенно неупорядоченную.
В нативном состоянии белок характеризуется строго определенной структу-
рой, никоим образом не случайной. Однако даже в белковых молекулах с правиль-
ной укладкой имеются некоторые области, не имеющие типичной вторичной
структуры в виде а-спирали или p-слоя (см. разд. 3.10). В некоторых из этих случа-
ев кристаллическая структура белка местами выглядит нечеткой, что указывает на
некую степень неупорядоченности. Такие области могут иметь конформацию слу-
чайного клубка, т. е. даже нативные белки содержат небольшие участки случайной
структуры, к которым, возможно, применима в той или иной форме модель сто-
хастического клубка.
На основе модели поворотных изомеров строго определенное нативное со-
стояние белковой молекулы можно рассматривать как один специфический пово-
ротный изомер среди большого числа возможных. Каким образом реализуется
единственная специфическая конформация, это весьма интересный вопрос, обсу-
ждаемый в конце главы (см. разд. 3.16).
3.10. Вращение полипептидного остова:
вторичная структура белков
Структура полипептидного остова белковых молекул включает химические связи
трех видов: связь между а-атомом углерода и атомом углерода карбоксильной
группы (Са—С-связь), связь между атомом азота амидной группы и а-атомом угле-
рода (N—Са-связь) и связь между атомом углерода карбоксильной группы и ато-
мом азота амидной группы (С—N-связь — пептидная связь) (рис. 3.3). Вокруг свя-
зей Са—С' и N—Са возможно вращение фрагментов молекулы, тогда как в случае
пептидной связи как частично двойной карбонильная группа и соседние атомы N
и Са удерживаются в одной плоскости. При этом условии фиксированного угла,
88
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
О
Рис. 3.3. Вращение вокруг связей в пептидном остове белковой молекулы. Частично двойной
характер пептидной связи препятствует вращению вокруг связи между атомом углерода карбо-
нильной группы и соседним атомом азота. Конформацию пептидного остова белка определяют
угол вращения вокруг связи N—Са, ср, и угол вращения вокруг связи Са—С', у.
образуемого данной связью, вопрос определения конформации сужается до опре-
деления диэдральных углов между Са—С' -и N—Са-связями. Обозначим диэдраль-
ный угол при С а—С-связи как ф и диэдральный угол при N—С “-связи какф. Набор
углов ф и ф в значительной мере определяет конформацию, и для ее описания оста-
ется выяснить только положение боковых цепей.
Как и в случае н-бутана, энергия конформаций, возникающих при изменении
углов ф и ф, характеризуется тремя минимумами. Однако позиции этих минимумов
нечетко локализованы и соответствующие значения энергии неизвестны. Измене-
ние углов между связями в полипептидной цепи может быть существенно ограни-
чено стерическим отталкиванием. При данном значении ф имеется диапазон зна-
чений ф, в котором соседние атомы в составе остова и боковых цепей перекрыва-
ются. Такие значения относятся к энергетически запрещенным. Этот эффект
удобно оценивать с помощью графика энергетических контуров как двумерной
функции ф и ф, на котором можно выявить области, не исключенные стерическим
отталкиванием. Пример таких графиков, называемых графиками Рамачандрана по
имени предложившего их исследователя (Ramachandran, Sasisekharan, 1968), пока-
зан для полиаланина на рис. 3.4. Представленные контуры включают области раз-
решенных значений ф и ф, т. е. не исключенных стерическим отталкиванием.
В случае глицил-глицина примерно 50% площади на ф—ф-графике составляет
область энергетически исключенных значений. Добавление боковой цепи еще бо-
лее ограничивает доступную площадь. В случае полиаланина, мономер которого
имеет метильную боковую цепь, область доступных значений углов составляет
лишь 25% общей площади (области внутри штриховых контуров на рис. 3.4).1 Для
полимера а-аминоизомасляной кислоты, получаемой присоединением второй
метильной группы к а-С-атому аланина, вращение еще более ограничено и об-
ласть энергетически возможных углов составляет лишь несколько процентов об-
щей площади ф—ф-графика.
Особенно полезны ф-ф-графики в связи с тем, что основным типам вторич-
ной структуры белковых молекул соответствуют определенные значения углов.
Точные формы контуров и их площадь зависят от выбора функций потенциальной энергии
для вращения связей и стерического отталкивания.
3.10. Вращение полипептидного остова: вторичная структура белков
89
Рис. 3.4. Контурный график зависимо-
сти потенциальной энергии от углов <р и
\|/ для дипептида, состоящего из остат-
ков аланина (график Рамачандрана).
Штриховой контур относится к нулевому
уровню, каждый сплошной контур соот-
ветствует уменьшению потенциальной
энергии на 1 ккал • моль-1. Указаны точ-
ки, соответствующие а-спирали, р-слою
и конформации полипролин II. (По
Ramachandran et al., 1966.)
<р
Для а-спирали это значения ср = -57° и у = -47°. Данная точка указана на рис. 3.4,
как и точки другой важной формы вторичной структуры, параллельных и анти-
параллельных р-складок. Интересно, что хотя большая часть площади графика
занята областью, запрещенной вследствие эффекта исключенного объема, точка
а-спирали и точки р-складок в эту область, как правило, не попадают. Это помога-
ет объяснить высокую частоту структур в виде а-спирали и р-складок в белковых
молекулах. Даже в таком полипептиде, который состоит из строго ограниченных
в отношении вращения остатков а-аминоизобутирата, область вокруг значений уг-
лов —57° и —47° все же энергетически доступна. Включение этой аминокислоты
в полипептид фактически вызывает образование а-спирали.
Все больше экспериментальных и теоретических данных указывает на то, что
конформация с минимальной потенциальной энергией для простых гидратиро-
ванных полипептидов представляет собой вытянутую левозакрученную спираль,
в которой ср = -75° и \|/ = 145° (Han et al., 1998; Shi et al., 2002 с). Эта точка, также
указанная на рис. 3.4, находится в разрешенной области ср—у-пространства. Такая
конформация названа полипролин II, как одна из двух конформаций, которые
имеет полипептид, состоящий из остатков пролина. Конформации полипролин I и
полипролин II определяются конфигурацией относительно N—Са-связи — цис-
и транс- соответственно. Пятичленное пирролидиновое кольцо пролина ограни-
чивает вращение вокруг N—С “-связи (ср), делая полипролин намного менее гибкой
молекулой по сравнению с пептидами, состоящими из других аминокислотных ос-
татков, и препятствуя образованию а-спиралей.
На рис. 3.5 представлены ср—у-графики, построенные для четырех хорошо изу-
ченных белков. Каждому аминокислотному остатку соответствует точка на графи-
ке. Как правило, в областях а-спирали и р-складок наблюдается кластеризация
точек. В случае гемоглобина большая часть точек лежит в зоне а-спирали, что от-
ражает высокоспиральную структуру этого белка. Молекула зеленого флуоресци-
рующего белка (GFP) имеет структуру в виде бочонка, сформированную р-склад-
ками, и в соответствии с этим на графике наблюдается большое скопление точек
90
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
150
100
50
V 0
-50
-100
-150
-150-100 -50 0 50 100 150
150
100
50
V 0
-50
-100
-150
-150-100 -50 0 50 100 150
Рис. 3.5. (р-у-Графики для четырех белков Расчет по PDB-массивам I LFY (гемоглобин), 2 ЕМО
(зеленый флуоресцирующий белок), I LJH (лизоцим) и I BL8 (KcsA).
в области р-складок. Молекула лизоцима включает структуры обоих этих типов.
В молекуле микробного К+-канала (KcsA) вторичная структура представлена глав-
ным образом двумя пронизывающими мембрану а-спиралями. На всех четырех
графиках имеются точки, рассеянные по их площади, и это показывает, что все че-
тыре белка содержат аминокислотные остатки, не участвующие в формировании
наиболее типичных форм вторичной структуры.
3J I. Энтропия денатурации белка
Нативное состояние белковой молекулы зависит от большого числа внутренних
связей между входящими в ее состав аминокислотными остатками.1 Эти связи де-
лятся на два основных типа: локальные связи, например между соседними амино-
кислотными остатками в а-спирали, и дальние связи — между остатками, разде-
1 Речь идет о связях, имеющих нековалентную природу. — Прим. ред. пер.
З.Н. Энтропия денатурации белка
91
ленными десятками или сотнями аминокислотных остатков в первичной структу-
ре. Связи обоих этих типов влияют на общую стабильность нативного состояния.
При таком сплетении взаимодействий разрыв одной или нескольких связей неиз-
бежно приводит к разрыву многих других. Соответственно формирование натив-
ной структуры должно происходить как высококооперативный процесс. Белковая
молекула не может находиться в состоянии неполной укладки, по крайней мере
в течение продолжительного периода времени; она должна быть либо полностью
свернутой должным образом, либо в высокой степени неупорядоченной. Экспери-
ментальные данные указывают на то, что тепловая денатурация — развертывание
белковой молекулы — происходит как переход из специфического нативного со-
стояния в денатурированное состояние, включающее обширный набор конфигу-
раций (см. разд. 1.6).
Кооперативное свертывание белковых молекул рассматривается ниже,
в разд. 3.16, здесь же мы примем кооперативность этого перехода как факт и по-
пытаемся с помощью модели случайного клубка определить энтропию разверты-
вания белков. Нативное состояние считается единственной поворотной конфи-
гурацией с энтропией fclnl = 0. Денатурированное состояние рассматривается как
конфигурация случайного клубка, где каждая связь имеет три энергетических ми-
нимума, связанных с вращением образующих ее групп. Если на каждый аминокис-
лотный остаток приходится две связи, вокруг которых происходит вращение (углы
ср и у, рассмотренные выше), все аминокислотные остатки в полипептидной
цепи, образующей случайный клубок, имеют по 23 = 8 состояния вращения. Боко-
вые цепи также обладают некоторой конформационной гибкостью. Число допол-
нительных связей, вокруг которых возможно вращение, незначительно варьирует
в зависимости от вида остатка, но в среднем равно 3. Соответственно в расчет тре-
буется ввести дополнительный коэффициент, З3 = 27. Число конфигураций для
цепи из Nостатков рассчитывается в итоге как (8 • 27)/v = 216/v [сходство с уравне-
нием (3.14) не следует считать совпадением]. Отсюда энтропия конфигурации рав-
на A; In 216 в расчете на остаток в молекуле, или R In 216 = 10,6 кал • К-1 в расчете на
остаток на 1 моль белка.
Такой расчет может показаться слишком упрощенным, и с учетом этого его
можно усовершенствовать двумя путями. Допустим, что в нативном состоянии
10% общей длины полипептидного остова занимают неупорядоченные участки.
Это оказывает незначительный эффект, повышающий энтропию нативного со-
стояния всего на 0,1 • R In 8 = 0,4 кал • К-1. Более важным источником энтропии
при нативном состоянии белка служат боковые цепи аминокислотных остатков,
особенно те, которые расположены на поверхности белковой молекулы. Если
считать, что половина из них вращается, вызванное этим возрастание энтропии
составит R 1п(31,5) = 3,3 кал • К-1. При учете двух указанных факторов рассчитан-
ная выше величина энтропии денатурации должна снизиться до 6,9 кал • К-1.
Напомним, что модель случайного клубка дает завышенную оценку энтропии,
поскольку не учитывает эффект исключенного объема. Вводя коэффициент
1,28У/У1/6 для неидеальных цепей, использованный выше (разд. 3.5), полу-
чаем, что в случае цепи из 100 аминокислотных остатков требуется ввести
фактор коррекции 2,4 -1010. С учетом этого величина энтропии снижается лишь
на 0,47 кал • К-1 и составляет 6,4 кал • К-1 в расчете на аминокислотный ос-
таток.
92
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
Подробное экспериментальное изучение тепловой денатурации белков позво-
лило установить величину энтропии 4,2 кал • К-1 в расчете на остаток и на 1 моль
белка (Privalov, 1979). Эта величина относится к температуре НО °C, при которой
гидрофобные взаимодействия обусловлены в основном энтальпией, а не энтропи-
ей (см. разд. 2.8). Наша грубая оценка энтропии конфигурации полипептидного
остова и боковых цепей примерно на 50% выше экспериментально полученной ве-
личины. Весьма вероятно, что это расхождение объясняется меньшим числом сте-
пеней свободы у денатурированного белка по сравнению со случайным клубком.
Конформация полипролин II (см. разд. 3.10) — это, по видимому, конформация
с наименьшей энергией для развернутой полипептидной цепи, и многие связи об-
разуют углы, указанные для этой конформации на рис. 3.4, а не вращаются свобод-
но. Таким образом, восемь состояний вращения в расчете на аминокислотный ос-
таток в проведенных выше вычислениях следует, вероятно, считать завышенной
оценкой; компьютерный анализ моделей развернутых полипептидных цепей по-
зволил установить величины от 1,5 до 3 (Dinner, Karplus, 2001).
Таким образом, при свертывании белковой молекулы с образованием натив-
ной конформации происходит значительное снижение энтропии, и в связи с этим
представляет интерес оценить, чему равно ожидаемое время укладки полипеп-
тидной цепи. При энтропии 420 кал • К-1 • моль-1 в случае цепи из 100 аминокис-
лотных остатков по расчетам возможны е212 = 1092 развернутых конфигураций.
Согласно оценке Левинталя (Levinthal, 1968), если бы развернутая белковая моле-
кула «пробовала» конфигурации со скоростью 1/нс (обоснованная величина, ус-
тановленная исходя из скорости вращения вокруг индивидуальных связей), такой
процесс опробования мог бы длиться 10 75 лет до попадания в правильное натив-
ное состояние. Эту загадку с фантастически длинным сроком укладки белковой
молекулы называют парадоксом Левинталя. На самом деле процесс укладки белка
занимает, как известно, период от нескольких секунд до минут, а не 10 75 лет, и от-
сюда следует, что выбор конфигурации не может иметь характер случайного про-
цесса. Без некой руководящей идеи белок никогда не свернется должным обра-
зом. Соответственно этому почти все модели, учитывающие энергетическую на-
правленность к состоянию правильной укладки, дают реалистичные оценки
длительности этого процесса. Предложены модели, в которых некоторые части
белковой молекулы формируют вторичную структуру, которая служит затравкой
для распространения этой структуры по всей молекуле. В других моделях введено
условие некоторой направленности к нативному состоянию для каждого амино-
кислотного остатка. Выбор адекватных моделей станет возможным, когда будут
получены экспериментальные данные, позволяющие установить, какой путь че-
рез пространство конфигураций реализуется при укладке белковых молекул (см.
разд. 7.10).
3.12. Переход спираль—клубок
Конформация полипептидной цепи в виде а-спирали — это одна особая поворот-
ная конфигурация с характеристиками <р = -57° и у = -47° (рис. 3.4). Такая конфи-
гурация стабилизирована водородными связями между атомами кислорода карбо-
нильных групп и атомами азота амидных групп, расположенных через три и четы-
3.12. Переход спираль—клубок
93
ре промежуточных остатка в полипептидном остове. В то же время ограничение
вращения вокруг связей остова снижает энтропию. В результате имеются две силы,
направленные противоположно одна другой, и в зависимости от таких факторов,
как температура, тип растворителя и варианты боковых цепей аминокислотных
остатков, превалирует либо организующее влияние водородных связей, либо разу-
порядочивающий эффект энтропии цепи.
Относительная стабильность а-спирали по сравнению со случайным клубком
составляет предмет теории перехода спираль—клубок. Эта теория лежит в основе
поиска способов предсказания конформационного состояния полипептидов и ил-
люстрирует некоторые важные идеи относительно кооперативных переходов
в макромолекулах (Zimm, Bragg, 1959; Poland, Scheraga, 1970; Cantor, Schimmel,
1980).
Наличие перехода спираль—клубок свидетельствует о том, что тенденция того
или иного аминокислотного остатка принимать спиральную конформацию весь-
ма чувствительна к состоянию соседних остатков. Как было отмечено выше, раз-
рыв нескольких связей в нативной структуре белка не может не вызвать разрыва
многих других связей. Относительно а-спирали вводится менее строгое ограниче-
ние для взаимозависимости различных связей. Оно состоит в том, что собствен-
ные водородные связи данного аминокислотного остатка, стабилизирующие его
спиральную конформацию, разрываются труднее, если соседний остаток также
спиральный, и что данный остаток легче образует спираль, если соседний остаток
уже имеет эту структуру. Таким образом, спиральная конфигурация одного остат-
ка накладывает ограничения на ф- и \|/-углы соседних остатков, в результате чего
эти соседние остатки не теряют энтропию вращения, когда образуют водородные
связи с соседними остатками. Некоторые из этих утверждений иллюстрирует
рис. 3.6, из которого видно, что перекрывающиеся водородные связи взаимно
стабилизируются.
Другой важный момент, отраженный на рис. 3.6, состоит в том, что часть бел-
ковой молекулы образует спираль, тогда как другие ее части имеют конформацию
случайного клубка. Таким образом, переход спираль—клубок не относится к мак-
ропереходам. Однако взаимодействия между соседними остатками способствуют
объединению спиральных участков в более протяженные спиральные области.
Хотя на рис. 3.6 изображен только один спиральный участок, присутствие в моле-
куле белка множественных спиральных участков вполне возможно и это учитыва-
ется при определении среднего числа спиральных остатков по всем конформаци-
ям (см. след. разд.).
Рис. 3.6. Полипептид может
содержать спиральные и
клубковые фрагменты. Спи-
ральные отрезки стабили-
зированы Н-связями (пунк-
тирные линии) вдоль пеп-
тидной цепи. Фрагменты в
конформации случайного
клубка имеют бблыиую сво-
боду вращения.
94
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
*3.13. Математический анализ перехода спираль—клубок
Основой модели перехода спираль—клубок служит функция распределения поли-
пептидной цепи. Напомним, что функция распределения «-бутана — это просто
сумма величин статистического веса по Больцману транс- и го«/-конформеров.
В случае полиэтилена функция распределения рассчитывается как функция рас-
пределения «-бутана, возведенная в степень N(уравнение (3.14)). Можно было бы
думать, что этот способ приложим и к полипептидам, т. е. что можно вычислить
функцию распределения поворотных положений каждого аминокислотного остат-
ка в полипептидном остове и вычислить затем функцию распределения молекулы
как их произведение. (Это служит основной идеей в разд. 3.2 и 3.11.) Однако при
таком подходе не принимаются в расчет взаимодействия между остатками, в то
время как именно этими взаимодействиями и обусловлен главным образом пере-
ход спираль—клубок. Они должны вносить вклад в статистический вес по Больц-
ману, и нам поэтому следует определить энергию данных взаимодействий для каж-
дой конформации.
В а-спирали каждый аминокислотный остаток взаимодействует с остатками,
отстоящими от него на три и четыре промежуточных остатка. Чтобы сделать расчет
менее сложным, используем более простую модель — взаимодействия между со-
седними остатками. Такое упрощение не влияет на результат определения основ-
ных характеристик перехода спираль—клубок, как показывает детальный анализ
более близкой к реальности модели (Lifson, Roig, 1963). Как отмечено выше,
в длинной полипептидной цепи могут присутствовать как спиральные участки, так
и участки в конфигурации случайного клубка (рис. 3.6). Чтобы наглядно предста-
вить такую структуру полипептидных цепей, обозначим аминокислотные остатки
в спиральных сегментах буквой h и остатки в клубковых сегментах буквой с. Рас-
смотрим цепь со следующим расположением спиральных и клубковых сегментов
cccccchhhhhccchccccccchhhhhhhhhhcccccccc
Это одна из 240 возможных конфигураций для данной цепи, содержащей 40
аминокислотных остатков. Приведенная конфигурация включает три спиральных
участка, состоящих из 5, 1 и 10 остатков.
Для того чтобы рассчитать элементарный статистический вес такой конформа-
ции, мы должны оперировать тремя величинами элементарного статистического
веса состояний, в которых могут находиться индивидуальные остатки (эти величи-
ны определяются как произведения фактора вырожденности и статистического
веса по Больцману, сое"£ДГ, согласно уравнению (3.8)). Три указанные величины —
это значения элементарного статистического веса для состояний h и с, необходи-
мость введения которых очевидна, и дополнительный элементарный статистиче-
ский вес — для пограничного остатка в спиральном участке. Включение этой
третьей величины позволяет учесть взаимодействие между соседними аминокис-
лотными остатками. Вычисляя произведение трех данных величин элементарного
статистического веса (уравнение (3.12)), мы можем рассчитать элементарный ста-
тистический вес для любой конформации данной полипептидной цепи. Его значе-
ние можно вычислить и непосредственно, располагая соответствующими величи-
нами вырожденности и энергии. Чаще всего их определяют путем подгонки к экс-
периментально полученным характеристикам перехода спираль—клубок.
3.13. Математический анализ перехода спираль—клубок
95
Примем спираль за исходное состояние с нулевой энергией. Если нормировать
все значения вырожденности к вырожденности клубка, его элементарный стати-
стический вес составит 1. Обозначим элементарный статистический вес амино-
кислотного остатка в спиральном участке как s и примем, что он отражает только
энергетически выгодный вклад образования водородных связей. Эта величина
связана с продолжением уже начатого спирального участка, и член s часто называ-
ют параметром продолжения спирали. Элементарный статистический вес погра-
ничного остатка в спиральном участке должен вычисляться с учетом неблагопри-
ятной энтропии о, обусловленной ограничением вращения связей полипептидно-
го остова. Элементарный статистический вес пограничного участка равен
соответственно as. Член о часто называют параметром инициации спирали. Хотя
в спиральном участке, расположенном между неупорядоченными участками, име-
ется два пограничных аминокислотных остатка, каждый спиральный участок дол-
жен иметь только один коэффициент инициации спирали, и мы будем вводить ко-
эффициент только для границ с—h, но не для границ h—с.
Рассчитаем теперь элементарный статистический вес одной конфигурации как
произведение трех указанных выше значений — 1, s и os. В конфигурации цепи из
40 аминокислотных остатков, приведенной выше, содержится спиральный сег-
мент из 5 остатков, вклад которого равен s5o, спиральный участок, содержащий
один остаток — вклад os, и спиральный участок из 10 остатков — вклад s10о.Таким
образом, искомый элементарный статистический вес составляет s5osos10o = s16o3.
Соответствующая функция распределения представляет собой сумму таких произ-
ведений по всем возможным сочетаниям с и h
e = £co/Js,oy, (3.38)
у
где со, у — это фактор вырожденности для числа путей образования в данной цепи
j спиральных участков из i спиральных аминокислотных остатков.
Напомним, что с помощью функции распределения рассчитывается средняя
энергия молекулы (уравнение (3.11)). Подобным образом можно рассчитать
и среднее число спиральных остатков в полипептидной цепи, величину /
/=#-------— (3.39)
Дифференцируя уравнение (3.38), производя деление и используя затем соотноше-
ние (3.39) (т. е. применяя тот же способ, каким было получено уравнение (3.11)),
мы получаем полезную формулу для определения среднего числа спиральных ос-
татков
i = (3.40)
Q ds ds
Среднее число спиральных остатков служит весьма ценным показателем масштаба
перехода, и его можно вычислить, зная функцию распределения полипептидной
цепи.
96
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
Теперь определим функцию распределения цепи из Nаминокислотных остат-
ков. Во-первых, разложим ее на две части — функцию распределения молекулы,
в которой крайний правый остаток клубковый (QNc), и функцию распределения
молекулы, в которой данный остаток спиральный (QNh), т. е. составим равенство
QN = QNc+QNh. Если добавить еще один остаток к цепи и попытаться рассчитать
QN+[, станет ясно, что в случае цепи с крайним клубковым остатком добавление
еще одного клубкового остатка требует умножения величины QNc на 1 (элементар-
ный статистический вес для остатка в конфигурации клубка), тогда как при добав-
лении спирального остатка величину QNh следует умножить на os (элементарный
статистический вес граничного спирального остатка). Аналогичным образом, если
цепь содержит на конце спиральный остаток, при добавлении клубкового остатка
величину QNh необходимо умножить на 1, при добавлении спирального остатка —
на s. Таким образом, справедливо уравнение
Qn+\ ~ 0 +CT5)0yvc + 0 + s)Qn\\ (3.41)
Выделяя две части этой функции соответственно крайнему правому остатку, полу-
чаем два уравнения
O(/v+Dc= Qnc + Qn\\ (3.42а)
<?(/v+Dh = °sQnc + sQNh (3.426)
Эти два выражения можно представить в матрично-векторной форме (см.
приложение 2). Обозначим две части данной функции распределения как компо-
ненты вектора (QNc> QNh) и перепишем в соответствии с этим уравнения (3.42а)
и (3.426)
(3 43)
^0(^+1 )h J V75 ) \(?Wh J
В случае, когда первый остаток клубковый, вектор его состояния записывается
как (1, 0). Добавление N остатков означает умножение на матрицу 2x2 из урав-
нения (3.43) (обозначаемую как М) в степени N. В результате получаем выраже-
ние
= M7Vf1>| (3.44)
Умножение в левом направлении на вектор-строку (1, 1) позволяет сложить две
части функции, чтобы получить функцию распределения для полипептида из
А аминокислотных остатков
^=(l,l)Mw^ (3.45)
Переведя эту функцию распределения в матричную форму, мы получаем воз-
можность использовать эффективный математический метод диагонализации
матриц. Можно найти матрицу Т и обратную матрицу Т-1, которые диагонализуют
матрицу М следующим образом
3.13. Математический анализ перехода спираль—клубок
97
Т-'МТ = Л = П 0 ], lo Х2/ (3.46)
где Xj и Х2 — это собственные значения М. Поскольку использование ТТ 1 дает
идентичную матрицу, уравнение (3.45) можно переписать в следующей форме
Qn =(1,1)TT-|MTT-|MT...T-'MTT’iP ] = (l,l)TAJVT’lj J (3.47)
Это несколько упрощает расчет, благодаря тому что при возведении диагональной
матрицы в степень N мы получаем диагональную матрицу с элементами и X2.
Собственные значения М составляют1
_ l + s + 7(l-s)2+4os Ai — 1 2 (3.48а)
l + s-7(l-s)2+4ш X2_ 2 Выражения для T и T-1 записываются следующим образом (3.486)
% -5 Х2
Т = 05 <5S <1 1 , (3.49а)
т-| _ 1 ( ™ A«i — Х21—05 J (3.496)
Эти выражения можно проверить для Xj и Х2 и Т и Т-1 подстановкой их в уравне-
ние (3.46). Подставляя выражения для Т и Т-1 в уравнение (3.47) и вводя произве-
дения матриц и векторов, получаем следующее выражение для функции распреде-
ления
_Х^|(1-Х2)-^|(1-Х,) Qn X, - х2 (3.50)
Если Xj > Х2, то при большом числе N в числителе доминирует первый член,
в результате чего справедливо приближение qn~^ (3.51)
С учетом этого можно использовать уравнение (3.40) и получить следующее выра-
жение для среднего числа спиральных остатков
( . 5-1+2о ) 1 + . / _ s ding _ s -7(1-5)2 + 4о5 N N ds 1+ 5 + 7(1-5)2+4о5 \ 7 (3.52)
1 Эти уравнения представляют собой результат первого разложения определителя матрицы,
полученной с использованием матрицы М в уравнении (П2.17). Получаемое квадратное уравне-
ние имеет эти два решения.
98
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
Таким образом, мы получили выражение для масштаба перехода как функции ос-
новных параметров - а и 5.
3.14. Характеристики перехода спираль—клубок
Уравнение (3.52) показывает, какая часть полипептида будет иметь спиральную
структуру соответственно величине 5. Напомним, что 5 = сое"£/*г, где Е — это энер-
гия образования водородной связи внутри спирального сегмента. Таким образом,
если изменение условий, например вида растворителя или температуры, благопри-
ятствует спиральной конфигурации, величина 5 возрастает. При низких значениях
5 величина Т/N близка к нулю, при высоких — достигает 1; в средней точке перехо-
да, где 1/N = 1/2, s = 1 (см. задачу 11).
Для того чтобы определить, как фракция спиральных участков варьирует при
изменении условий, влияющих на стабильность спиральной структуры, построим
график зависимости 1/N от 5 для различных значений параметра кооперативности
о (рис. 3.7). С увеличением s спиральная фракция, как и ожидалось, возрастает,
причем форма кривой перехода сильно зависит от изменения о. Параметр коопе-
ративности отражает то, насколько легко формируется граница между спиральным
сегментом и клубковым сегментом. При низких значениях а образование этой гра-
ницы затруднено и большие фрагменты полипептидной цепи подвергаются пере-
ходу совместно, т. е. переход в большей степени кооперативный. Напротив, когда
о = 1, состояние одного остатка полностью независимо от состояния соседнего ос-
татка. Можно продемонстрировать, что уравнение (3.52) упрощается при этом до
выражения 5/(1+ 5) (см. задачу 10), отражающего поведение набора независимых
остатков. Можно считать, что снижение о повышает масштаб единицы коопера-
тивности перехода, и в этом видна интересная параллель с идеей о кооперативно-
сти, высказанной в гл. 1.
В случае более коротких цепей кооперативность имеет менее существенное
значение, что не очевидно из уравнения (3.52), поскольку оно характеризует предел,
связанный с большими N. Чтобы выявить влияние длины цепи, следует вернуться
к уравнению (3.50) и продифференцировать 1п0 по 5. Получаемое выражение, бо-
лее сложное, здесь не имеет смысла приводить. Графики для нескольких значений
N представлены на рис. 3.8. С уменьшением длины цепи проявляется характерный
Рис. 3.7. Графики уравнения (3.52) показы-
вают зависимость фракции спиральных
фрагментов от параметра продолжения
спирали, s. При снижении значения пара-
метра инициации спирали, с, крутизна кри-
вой перехода возрастает.
3.14. Характеристики перехода спираль—клубок
99
Рис. 3.8. Графики фракции спиральных
фрагментов для цепей различной длины
при с = 0,0001.
концевой эффект, т. е. сдвиг кривой перехода и расширение его области. Сдвиг точ-
ки перехода в сторону более высоких значений s отражает тот факт, что концевые
остатки не могут быть фланкированы спиральными остатками. В случае длинной
цепи это не приводит к значительным различиям, но в случае короткой цепи кон-
цевые остатки вносят существенный вклад в общую свободную энергию цепи.
Наконец, следует отметить, что вблизи точки перехода, при 5 = 1, цепь содер-
жит наибольшее количество и спиральных участков и клубковых участков. Чтобы
убедиться в этом, продифференцируем функцию распределения, уравнение (3.38),
пост, а не по 5. Это позволяет получить среднее число границ,;, эквивалентное чис-
лу спиральных отрезков.
Q до до
График данной функции показан на рис. 3.9.
Как видно из рис. 3.9, в средней точке перехода цепь из 1000 аминокислотных
остатков содержит примерно 16 отдельных спиральных участков. Средняя длина
этих участков составляет 500 : 16 = 31,25 остатков. Эту величину можно рассмат-
ривать как единицу кооперативности данного перехода, по аналогии с гипотезой
единицы кооперативности (см. разд. 1.4). Крутизна кривой макроперехода увели-
чивается по мере возрастания единицы кооперативности. Однако в случае перехо-
да спираль—клубок величина единицы кооперативности не фиксирована и пере-
ход определенно не соответствует модели системы с двумя состояниями.
Рис. 3.9. График зависимости числа спи-
ральных фрагментов от s, построенный в со-
ответствии с уравнениями (3.50) и (3.53).
100
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
3.15. Способность к образованию а-спирали
Уравнение, позволяющее определить в рамках теории перехода спираль—клубок
спиральную фракцию пептидной цепи, 1/N, часто и, как правило, успешно ис-
пользуется для подгонки к экспериментальным данным. Величины параметров,
вычисляемые при такой подгонке, варьируют в зависимости от аминокислотного
состава пептидных цепей. Это отражает различия между аминокислотами по спо-
собности образовывать а-спиральную структуру. Некоторые аминокислотные ос-
татки с гораздо большей частотой, чем другие, присутствуют в спиральных участ-
ках белковых молекул. В связи с этим параметры 5 и о можно считать полезными
для предсказания вторичной структуры белка и рассматривать их как показатели
способности к формированию спирали. Измерению и интерпретации этих пара-
метров посвящено большое число исследований.
Гомополимеры многих аминокислот невозможно исследовать эксперимен-
тально, из-за того что они труднорастворимы. Взамен этого подхода для определе-
ния способности аминокислот формировать спираль успешно разрабатывается
подход с изучением последовательностей «хозяин—гость». В таких исследованиях
получают серию пептидов, представляющих собой последовательности белка-«хо-
зяина», в которых определенную позицию занимает тот или иной остаток-«гость».
В зависимости от способности остатка-гостя к образованию спирали изменяется
температура перехода спираль—клубок. При анализе такого рода данных установ-
лена низкая величина параметра инициации о, примерно 10~4, близкая к расчет-
ной. Параметр удлинения 5 изменяется в процессе перехода, но может быть опре-
делен для стандартного набора условий и использован в качестве показателя для
сравнения способности различных аминокислот к формированию спирали.
В табл. 3.2 представлен ряд значений АА(7а, измеренных путем определения сдви-
гов равновесия реакции димеризации, в которой пептиды в виде димеров имеют
спиральную конфигурацию, а мономеры конфигурацию клубка. Эти значения от-
ражают преимущественное присутствие каждой аминокислоты в спиральной кон-
формации и примерно согласуются с другими показателями способности к обра-
зованию спирали (O’Neil, DeGrado, 1990).
Таблица 3.2. Энергия образования спиралей
Аминокислота Аминокислота дд<за
ala -0,77 cys -0,23
arg -0,68 ile -0,23
lys -0,65 tyr -0,17
leu -0,62 asp -0,15
met -0,50 val -0,14
trp -0,45 asn -0,11
phe -0,41 thr -0,07
ser -0,35 his -0,06
gin -0,33 gly 0
glu -0,27 pro 3
По O’Neil, DeGrado, 1990.
3.15. Способность к образованию q-спирали
101
Значения ДД(7а помогают объяснить, почему аминокислоты различаются по
способности образовывать а-спираль. Один из наиболее важных факторов, влияю-
щих на эту способность (см. разд. 3.10), — это стерические препятствия, связанные
с наличием боковой цепи. Между тем группа, связанная с а-атомом С, лишь не-
значительно ограничивает диапазон у—ф-углов; содержащие ее аминокислоты ха-
рактеризуются, как правило, значениями ДД(7а, которые свидетельствуют о высо-
кой способности к образованию а-спирали. Так, в случае аланина вращение огра-
ничивает метильная группа, связанная с а-атомом С, но данная аминокислота
характеризуется как одна из наиболее способных к образованию а-спирали. В то
же время глицин представляет собой одну из наиболее неспособных к образова-
нию спирали аминокислот, хотя его молекула не содержит боковой цепи, способ-
ной ограничивать вращение. Другой фактор, влияющий на образование спира-
ли, — это конформационная энтропия боковой цепи. Боковые цепи в а-спирали
плотно упакованы, т. е. крупные гибкие боковые цепи не имеют в ней свободы
вращения. Этим объясняется, почему, например, аланин в большей степени спо-
собен к образованию спирали по сравнению с валином (Aurora et al., 1997). Боко-
вая цепь аланина не имеет конформационной свободы, которую пришлось бы те-
рять, тогда как боковая цепь валина такой свободой обладает.
На стабильность а-спирали влияют и многие другие факторы. Например,
большое значение имеют концевые эффекты, о чем свидетельствуют низкие зна-
чения о. Серин и треонин имеют боковые цепи, способные образовывать водород-
ные связи с полипептидным остовом, и это облегчает образование границы между
спиральными и клубковыми отрезками цепи. Такой эффект, называемый кэппин-
гом, в результате стратегической локализации кэппинговых аминокислотных ос-
татков существенно облегчает формирование спирали. Напротив, взаимодействие
боковой цепи аспарагина с полипептидным остовом дестабилизирует а-спираль.
Пролин не способен образовывать а-спираль, поскольку его кольцевая структура
ограничивает вращение связей с остовом; у—ср-углы не могут принимать необхо-
димые для а-спирали значения, и по этой причине пролин характеризуется наи-
меньшим значением s среди всех аминокислот (и наибольшим значением ДД(7а;
см. табл. 3.2).
Несмотря на значительный объем сведений относительно стабильности
a-спиралей, пока трудно предсказать, где могут находиться спиральные участки
в аминокислотной последовательности. Как правило, предсказания, основанные
на данных о способности различных аминокислот формировать спиральную
структуру, верны в 60—70% случаев. Помимо прочего, неясно, почему при том, что
энергия образования границ благоприятствует образованию длинных спиральных
отрезков, многие спиральные участки в белках короткие (Dill, 1990). Эффектом
кэппинга наблюдаемое в белках большое число коротких спиральных участков
объяснить не удается.
Одна из трудностей, возникающих при попытке предсказать, какие участки
аминокислотной последовательности будут иметь спиральную структуру, связана с
чувствительностью этой структуры к внешним условиям. На энергетику водород-
ных связей влияет, например, полярность среды (см. разд. 2.10). В водной среде об-
разование этих связей протекает как обменный процесс, в котором связи с водой
замещаются внутримолекулярными связями. Изменение свободной энергии при об-
мене водородных связей составляет незначительную величину. Когда же водородная
102
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
связь образуется между двумя группами, находящимися во внутренней области
белковой молекулы, участие воды исключено и процесс происходит не как обмен-
ный. В этом случае полная энергия образования связи может служить движущей
силой образования вторичной структуры.
По сравнению с ролью указанных факторов влияние боковых цепей амино-
кислотных остатков меньше. Если в результате нелокальных взаимодействий ами-
нокислотный остаток оказывается во внутренней области белковой молекулы, он
скорее всего включится во вторичную структуру, обусловленную водородными
связями, независимо от наличия в нем боковой цепи. В связи с этим для прогно-
зирования требуется установить, какие остатки при укладке белковой молекулы
оказываются в ее внутренней области и какие остаются на поверхности. Это, без-
условно, трудная задача, но если хотя бы немного приблизиться к ее решению, по-
пытки предсказания вторичной структуры белка будут, вероятно, более успеш-
ными.
3.16. Укладка белковых молекул
Рассмотренные выше модели разработаны в основном применительно к гомопо-
лимерам, таким как поли-Ь-аланин, и хорошо объясняют их поведение. Гомопо-
лимеры образуют случайные клубки и подвергаются переходу спираль—клубок.
Однако некоторыми основными и специфическими свойствами белков гомополи-
меры аминокислот не обладают. Они не способны свертываться с образованием
высокоупорядоченной нативной конформации и подвергаться макропереходам.
Наиболее приближенная к нативному состоянию конформация, которую могут
принимать молекулы гомополимеров аминокислот, — это так называемая расплав-
ленная глобула, компактная, но тем не менее в высокой степени случайная и как бы
текучая структура. Поведение расплавленной глобулы весьма сходно с поведением
неидеального случайного клубка и характеризуется сильными взаимодействиями
в виде притяжения между мономерами.
Образование расплавленной глобулы из случайного клубка сопровождается
резким уменьшением числа возможных конформаций. Гомополимер из 100 ами-
нокислотных остатков может располагаться на кубической решетке примерно 1067
способами без перекрывания остатков (Camacho, Thirumalai, 1993). Свертывание
этой цепи с образованием максимально плотной структуры снижает число конфи-
гураций, по грубой оценке, до 1017. Вопрос состоит в том, что заставляет эту цепь
принимать лишь одну из возможных 1017 конформаций.
Представление о нативном состоянии как об одной-единственной конформа-
ции следует, конечно, считать сугубо упрощенным. Ближе к реальности описание
нативного состояния как совокупности сходных конформаций, или как макросо-
стояния, включающего небольшое, но значимое число микросостояний. Тем не
менее нативное состояние характеризуется все же несравнимо меньшим числом
возможных конфигураций, чем набор всех компактных состояний, и по-прежнему
остается в силе вопрос о том, чем обусловлена нативная укладка белка.
Определяющее свойство белка, от которого зависит его укладка, — это амино-
кислотная последовательность. Внутримолекулярные взаимодействия, рассмот-
ренные в гл. 2, такие как электростатические взаимодействия, водородные связи
3.16. Укладка белковых молекул
103
и гидрофобные взаимодействия, включаются в полную функцию потенциальной
энергии белка, которая зависит от тысяч таких взаимодействий. Анализ внутри-
белковых силовых полей как один из подходов к изучению механизма укладки
белковых молекул (см. разд. 2.14) уже дает полезные результаты.
Некоторые основные принципы укладки белковых молекул выясняются с по-
мощью моделей, основанных на гораздо более простых функциях потенциальной
энергии по сравнению с полными внутрибелковыми силовыми полями. Один из
примеров таких моделей — это решеточная Н—P-модель, с помощью которой ана-
лизируют пептиды, состоящие из аминокислотных остатков двух типов, гидро-
фобного (Н) и полярного (Р). Построенная на допущении, что главным фактором
стабильности нативной конформации служат гидрофобные взаимодействия (см.
разд. 2.13), Н—P-модель включает только эти взаимодействия. Если стандартный
набор аминокислот принять за 20-буквенный алфавит, принципом Н—Р-модели
можно назвать упрощение алфавита до двухбуквенного.
Упрощение состоит в этой модели не только в исключении всех негидрофоб-
ных взаимодействий, но также в суммировании всех гидрофобных взаимодейст-
вий. Гидрофобные аминокислоты несколько различаются по степени гидрофобно-
сти (см. разд. 2.8), но Н—P-модель игнорирует эти различия, включая в рассмотре-
ние лишь лишь один энергетический параметр, 8, для всех Н—Н-связей. Типичное
значение величины 8 равно примерно -2 ккал • моль-1, но при анализе данной мо-
дели ее значения изменяют, чтобы определить, насколько влияет на предсказания
сила этого взаимодействия. Большинство Н—P-моделей основано на решеточном
способе построения, при котором конфигурация изображается как последователь-
ность соединенных узлов решетки (рис. 3.10). Благодаря такому изображению лег-
ко идентифицировать связи. Чтобы рассчитать энергию отдельной конфигурации,
подсчитывают число Н-остатков, связанных с другими Н-остатками. Произведе-
ние числа этих связей и основного энергетического параметра принимают за энер-
гию данной конфигурации.
Анализ Н—P-моделей проводят, как правило, с помощью компьютера. Это
единственно возможный путь проверки каждой последовательности и подсчета
всех возможных конфигураций. Тщательное изучение таких моделей позволило
получить интересный результат для коротких последовательностей на двухмерной
решетке. Хотя число всех возможных конфигураций огромно, число конфигура-
ций с минимальной энергией у некоторых последовательностей очень небольшое.
Это иллюстрирует правая решетка на рис. 3.10 с расположенной на ней Н—Р-
цепью из 20 аминокислотных остатков, имеющей состояние с минимальной энер-
гией в случае восьми Н—Н-связей, обладающих в сумме энергией 8 8. Таким боль-
шим числом н-н -связей обладает только данная конфигурация данной последо-
Рис. 3.10. Н—P-цепь из 20 аминокислотных остатков,
имеющая последовательность РНРРНРРННРРННРРНРРНР
(Н — черные кружки, Р — светлые кружки). Конфигура-
ция слева включает пять Н—Н-связей, конфигурация
слева — восемь таких связей. Три другие конфигурации
этой цепи включают пять Н—Н-связей, но ни одна другая
конфигурация не содержит восемь таких связей. Таким
образом, данная последовательность имеет один энерге-
тический минимум (Dill et al., 1995).
о • о—о
104
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
вательности; все остальные конфигурации содержат меньшее число Н—Н-связей.
Другая конфигурация, включающая пять Н—Н-связей, показана на рис. 3.10 сле-
ва. При подсчете всех конфигураций этой последовательности найдено четыре
конфигурации с таким числом Н—Н-связей.
Относительно немного Н—P-последовательностей подобны приведенной на
рис. 3.10, т. е. имеют только одну конфигурацию с минимальной энергией. Другие
последовательности имеют много таких конфигураций, что делает их энергетиче-
ский минимум вырожденным. При длине цепей от 11 до 18 остатков примерно
2,5% последовательностей имеют одну конфигурацию с минимальной энергией,
и эта конфигурация, как правило, в высокой степени компактная. Низкая вырож-
денность энергетического минимума некоторых последовательностей позволяет
предполагать, что, если найти правильную последовательность, Н—P-цепь может
имитировать специфическую способность белковых молекул свертываться един-
ственным образом. С этой точки зрения загадка свертывания белковых молекул
объясняется как секвестрация гидрофобных остатков в сердцевинной части моле-
кулы. Поскольку гидрофобный эффект обычно рассматривается как малоспеци-
фический, кажется удивительным, что модель, основанная только на гидрофоб-
ных взаимодействиях, дает единственную конфигурацию с минимальной энергией.
Ключом к разгадке служит специфичность аминокислотной последовательности,
благодаря которой неспецифические взаимодействия обеспечивают образование
структуры со строго определенной укладкой.
Н—P-последовательности широко варьируют в отношении того, сколько кон-
фигураций характеризуется минимальной энергией. Те из них, которые имеют не-
много таких конфигураций, можно рассматривать как «хорошо свертывающиеся»
последовательности, наиболее близко имитирующие свойство белков принимать
нативную конфигурацию. Найти такую последовательность можно скорее всего
среди цепей с соотношением Н- и Р-остатков 1:1. Более высокое содержание
Н-остатков приведет к сжатию молекулы в плотную структуру, но таких структур
с минимальной энергией будет много. При большей доле P-остатков, напротив,
молекула не свернется компактно, но будет иметь вытянутые конфигурации, бла-
гоприятствующие контакту P-остатков с водой. Оптимальное соотношение 1 : 1
близко к соотношению гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остат-
ков в глобулярных белках (Camacho, Thirumalai, 1993). Небольшое число хорошо
укладывающихся Н—P-последовательностей соответствует, вероятно, подобному
небольшому числу вариантов укладки, характерному для белков. Белковые по-
следовательности с неизвестной структурой во многих случаях могут принимать
конфигурации, известные для белков с разнообразными аминокислотными после-
довательностями. Пока невозможно оценить, насколько трудно найти свойство
хорошей укладки среди последовательностей, сконструированных случайным об-
разом из 20 входящих в состав белков аминокислот.
Если анализировать более длинные цепи на трехмерной решетке, с целью при-
ближения к реальным условиям, результат с единственным вариантом свертыва-
ния Н—P-цепей получить уже не удается. Однако и в этом случае, хотя последова-
тельностей с единственной конфигурацией, обладающей минимальной энергией,
не найдено, некоторые последовательности все же характеризуются низкой выро-
жденностью энергетического минимума. Краткий анализ Н—P-цепей, состоящих
из 88 остатков, на трехмерной решетке позволил выявить некоторое количество
3.16. Укладка белковых молекул
105
цепей, имеющих менее пяти конфигураций с минимальной свободной энергией
(Dill et al., 1995). В другом, аналогичном исследовании анализ цепей из 48 остат-
ков выявил 103—106 конфигураций с минимальной энергией для всех 10 изучен-
ных последовательностей (Yue et al., 1995). Таким образом, хотя оптимизация
Н—Н-связей значительно сужает круг поиска условий нативного состояния, учет
только этого фактора не позволяет прийти к окончательному решению.
Совершенно очевидно, что для образования специфической нативной кон-
формации необходимы другие взаимодействия и успешно предсказывать ее можно
с помощью более сложных функций потенциальной энергии (Kolinski et al., 1993).
Это требует добавления букв в используемый алфавит, т. е. в функцию потенциаль-
ной энергии желательно включать фактор упаковки боковых цепей и параметры
кооперативности образования водородных связей, например параметре, рассмот-
ренный выше в теории перехода спираль—клубок.
Для выявления факторов укладки белковых цепей разрабатывается также экс-
периментальный подход, который состоит в изучении связывания синтетических
пептидов (Raleigh, DeGrado, 1992; Betz et al, 1995; Schafmeisteret al., 1997). В прове-
денных исследованиях был синтезирован прототипный пептид, включающий ос-
татки лейцина как Н-аминокислоты и остатки глутамата как Р-аминокислоты.
Эти остатки были расположены таким образом, что когда пептид принимал
а-спиральную конформацию, он имел раздельные полярную и гидрофобную по-
верхности. Четыре таких пептида связывались с образованием тетрамера, внутрь
которого были обращены гидрофобные лейциновые области (рис. 3.11, А). Спек-
троскопический анализ показал, что эта структура полностью неупорядоченная.
Боковые цепи обнаруживали состояние наподобие текучести, указывающее на то,
что в гидрофобной сердцевине тетрамера много пространства для их движения.
GLEELLEELEELLEEG
EELLKQALQQAQQLLQQAQELAKK
Рис. 3.11. А. Спирали с Н—P-подобной последовательностью (указана внизу однобуквенными
обозначениями) образуют пучок, изображенный на рисунке в проекции вдоль оси спиралей.
Гидрофобные группы (показаны черным) формируют поверхность вдоль края каждой спирали.
Эти боковые цепи не упорядочены, и пучок спиралей не сходен с нативной структурой белка
(Raleig, DeGrado, 1992). Б Более сложная последовательность с чередованием остатков лейци-
на и аланина формирует приблизительно плоскую гидрофобную поверхность. Комплементар-
ные поверхности плотно упакованы и в результате этот пучок спиралей имеет упорядоченную
структуру и имитирует нативную структуру белка (Schafmeister et al., 1997). Сокращения: G —
глицин, L — лейцин, Е — глутаминовая кислота, А — аланин, К — лизин, Q — глутамин.
106
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
Синтетические пептиды, состоящие из остатков лейцина и других аминокислот,
также гидрофобных, но отличающихся от лейцина по размерам, формируют при свя-
зывании «скованный», высокоструктурированный пучок из четырех спиралей. При
связывании пептидных цепей, в которых остатки лейцина чередуются с остатками
аланина, в таком пучке формируются более плотно упакованные, плоские внутрен-
ние поверхности. Подвижность боковых цепей в этом случае внутри пучка спиралей
снижена, что весьма близко воспроизводит нативное состояние белка (рис. 3.11, 2>).
В этой структуре внутренняя поверхность спиралей напоминает картинку-голово-
ломку, в которой фрагменты плотно состыкованы таким образом, что свободного
пространства для движения не остается. В противоположность этому внутренняя сто-
рона спиралей в структуре, изображенной на рис. 3.11, А, более сходна с каплей масла.
Структура наподобие капли масла и поверхность наподобие картинки-голово-
ломки — это два крайних представления о внутренней области белковых молекул
(Kallenbach, 2001). Описанные выше Н—P-последовательности хорошо имитируют
внутреннюю структуру типа капли масла, но не структуру типа картинки-голо-
воломки. Пока неясно, что в действительности больше напоминает внутренняя об-
ласть белковых молекул — каплю масла или картинку-головоломку. У белков в кри-
сталлической форме, как правило, наблюдается высокая плотность внутренней об-
ласти, указывающая на плотную упаковку. Из теоретических соображений белки
с внутренней областью, подобной картинке-головоломке, должны быть структурно
гораздо менее устойчивы к мутациям по сравнению с белками, внутренняя область
которых по структуре подобна капле масла. В соответствии с этой идеей проведены
обширные молекулярно-генетические исследования, в которых получали мутации
с заменой гидрофобных аминокислотных остатков во внутренней области белковых
молекул другими гидрофобными остатками и затем проводили проверку мутантных
форм белков на сохранение структуры и каталитической активности. Две из работ
такого рода дали совершенно несходные результаты, в совокупности позволяющие
заключить, что внутренние области белков не соответствуют какому-либо одному
типу структуры. Так, бактериальная рибонуклеаза обнаруживала устойчивость
структуры и функции при замене аминокислотного остатка во многих позициях;
примерно четвертая часть мутантных вариантов этого фермента проявляла актив-
ность (Axe et al., 1996). В отличие от этого при изучении триозофосфатизомеразы
было установлено, что большинство остатков, формирующих внутреннюю область
молекулы, имеет существенное значение для активности фермента и замена любого
из них приводит к ее значительному снижению; лишь один вариант из 1О10 мутант-
ных белков с заменой во внутренней области сохранял активность (Silverman et al.,
2001). Эти два примера показывают, что белки различаются в том, насколько плот-
но упакованы боковые цепи аминокислотных остатков в молекуле при ее нативной
укладке. По-видимому, в молекулах белков могут присутствовать как структуры на-
подобие капли масла, так и структуры наподобие картинки-головоломки.
3.17. Кооперативность укладки белковых молекул
Существенный недостаток Н—P-последовательностей как теоретических моде-
лей состоит в том, что при небольших приращениях энергии их конфигурация те-
ряет упорядоченность лишь в малой степени, например они плавятся медленно,
3.17. Кооперативность укладки белковых молекул
107
не кооперативно. Это противоположно кооперативной природе укладки белковых
молекул. В разд. 1.6 развертывание молекулы белка охарактеризовано как макро-
переход. Возрастание энергии (в случае тепловой денатурации повышение тем-
пературы) вызывает кооперативный переход из состояния, характеризующегося
высокоупорядоченной компактной структурой, в состояние, определяемое слу-
чайной совокупностью многих более неупорядоченных состояний. Стабильных
промежуточных состояний при этом относительно немного. Поскольку хорошо
укладывающиеся Н—P-цепи слабо развертываются при небольшом увеличении
энергии и энтропии, следует считать, что они лишены важного свойства, присуще-
го белкам.
Одного добавления букв в используемый алфавит недостаточно для преодоле-
ния этого недостатка модели (Kolinski et al., 1996; Kaya, Chan, 2000; Pokarowski et
al., 2003). Большая трудность состоит в том, что вычисление энергии как простой
суммы энергии парных взаимодействий не позволяет получить модель молекулы,
подвергающейся развертыванию как макропереходу из одного состояния в другое,
даже при рассмотрении различных типов взаимодействий. Для того чтобы модель
имитировала кооперативное свертывание белковой молекулы, она должна вклю-
чать некий параметр групповых (не парных) взаимодействий. Наиболее простая
форма взаимодействия, удовлетворяющая этому требованию, — это кооператив-
ное взаимодействие, включенное в модель перехода спираль—клубок (разд. 3.12).
В этой модели параметр о отражает зависимость образования связей (в данном
случае водородных) от состояния соседнего аминокислотного остатка. Если
в функцию потенциальной энергии включить такой параметр кооперативности
(интуитивно весьма обоснованный в случае модели перехода спираль—клубок),
можно получить модель кооперативной укладки.
При создании моделей кооперативной укладки белковых молекул в качестве
основного положения использовался калориметрический критерий (см. разд. 1.6),
состоящий в том, что вант-гоффова энтальпия перехода равна калориметрической
энтальпии (Kaya, Chan, 2000; Pokarowski et al., 2003). Распределение конформаций
для любой температуры определяли с помощью компьтерного моделирования
большого числа конфигураций и расчета для каждой из них энергии. Эти распре-
деления существенно различались в случаях нативного и денатурированного со-
стояний, и повышение температуры сдвигало распределение от одной группы кон-
фигураций к другой. По крутизне этого сдвига рассчитывается теоретическая эн-
тальпия Вант-Гоффа. По различию между величинами средней энергии между
этими двумя группами конфигураций получают величину калориметрической эн-
тальпии. Модели, включающие в функцию потенциальной энергии параметр коо-
перативности, удовлетворяют условию двух состояний: калориметрическая эн-
тальпия равна, согласно этим моделям, энтальпии Вант-Гоффа. Таким образом,
эти модели имитируют эффект кооперативности, характерный для процесса ук-
ладки белковых молекул.
Итак, модель, основанная на учете энергии простых парных взаимодействий
между аминокислотными остатками двух типов, гидрофобными и полярными,
позволяет объяснить компактность белковых молекул в их нативном состоянии.
Однако для определения единственного специфического нативного состояния
белка необходимо включать в рассмотрение дополнительные взаимодействия,
обеспечивающие правильную укладку. Кооперативные переходы между свернутым
108
Глава 3. КОНФОРМАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
и развернутым состояниями нельзя объяснить парными взаимодействиями между
остатками. Это свойство требует включения в функцию потенциальной энергии
параметра групповых взаимодействий, отражающего зависимость энергии взаимо-
действий от состояний соседних остатков.
Задачи
1. Продемонстрируйте, что уравнения (3.4а) и (3.46) согласуются с уравнением (3.1).
2. Рассчитайте среднюю энергию молекулы бутана как функцию температуры. Вы-
числите эту величину для значений Г = 0КиГ = 298 К, а также для предела/1 ->оо.
3. Рассчитайте вероятность отсутствия в цепи н-пентана гоо/-связей и наличия в ней
только одной гоо/-связи.
4. С помощью уравнения (3.19) определите явное значение /эффдля полиэтилена, ис-
ходя из того, что это цепь со свободным вращением.
5. С помощью уравнения (3.20) определите /эфф для полиэтилена, используя значе-
ния вероятности различных диэдральных углов, известные для н-бутана.
6. Используя данные, приведенные в табл. 3.1, рассчитайте среднеквадратичное рас-
стояние между концами молекул поли-Ь-аланина и ДНК. В том и другом случаях
сделайте расчет для цепей, состоящих из 100 и 1000 аминокислотных остатков
и пар нуклеотидов соответственно.
7. Рассчитайте концентрацию одного конца молекулы на другом ее конце для поли-
Ь-аланина и ДНК при тех же размерах молекул, что в задаче 6.
8. С помощью уравнения (3.23) рассчитайте величину /р для цепи со свободным внут-
ренним вращением.
9. Белок модулин характеризуется температурой плавления 350 К и ДЯ° 50 ккал • моль"1.
При обработке химическим веществом, избирательно модифицирующем остатки
валина, свобода внутреннего вращения белка снижается. До модификации боко-
вые цепи остатков валина имеют три поворотных конфигурации, после обработ-
ки — одну. Молекула модулина содержит пять остатков валина, все во внутренней
области. Вычислите, насколько изменяются в результате модификации значения
энтропии, энтальпии и температуры тепловой денатурации.
10. Продемонстрируйте, как упрощается уравнение (3.52) при о = 1.
11. Решите уравнение (3.52) для 5 = 1. Что означает отсутствие о в ответе?
Глава 4
Образование молекулярных
комплексов
В предыдущих главах описаны свойства белковых молекул как индивидуальных
частиц. Теперь рассмотрим, как белки взаимодействуют между собой и с другими
молекулами. В живых организмах постоянно происходит связывание белков с об-
разованием комплексов и диссоциация таких комплексов. Специфическое связы-
вание лежит в основе механизмов передачи сигнала, ферментативного катализа
и регуляции белковой активности под влиянием гормонов, нейромедиаторов и ме-
таболитов, в основе действия лекарственных препаратов и т. д. Путем связывания
макромолекул происходит сборка клеточных органелл. Данная глава посвящена
описанию термодинамических и статистических принципов образования молеку-
лярных комплексов; ее материал послужит введением к описанию аллостериче-
ских взаимодействий, рассматриваемых в следующей главе.
Образование молекулярных комплексов происходит в соответствии с двумя
основными принципами: 1) связывание молекул обеспечивается нековалентными
связями (этот тип связей описан в гл. 2, где рассматривается, каким образом со-
вместные эффекты различных нековалентных взаимодействий — водородных свя-
зей, а также электростатических и гидрофобных взаимодействий — обусловливают
формирование молекулярных комплексов) и 2) связывание белков является высо-
коспецифичным и зависит от строго определенного расположения взаимодейст-
вующих химических групп. Связывающий участок в молекуле белка подобен зам-
ку, взаимодействующая с ним молекула-лиганд — ключу; другими словами, моле-
кулы с высокой точностью распознают одна другую и даже незначительные
изменения их структуры влияют на связывание.1
4.1. Равновесные реакции связывания в растворе
Рассмотрим реакцию связывания молекул А и В с образованием комплекса С. При
равновесия она описывается схемой (4А)
А + В С (4А)
1 Лиганд — это молекула (не субстрат фермента), которая связывается прочно и специфично
с макромолекулой, обычно белком, с образованием комплекса макромолекула—лиганд. — Прим,
перев.
110
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Символ А далее будет использоваться для обозначения крупной молекулы белка,
символ В — для обозначения малой молекулы, лиганда; в некоторых случаях и А
и В будут обозначать макромолекулы. Здесь это не имеет значения, поскольку опи-
сываются общие закономерности. В условиях равновесия отношение концентра-
ции продукта к концентрациям реагентов описывается уравнением (4.1)
-М- = _Ц (4.1)
[А] [В] *дис
где Ктс — это константа диссоциации, имеющая размерность концентрации. Час-
то используется также обратная этой константе величина — константа ассоциа-
ции. Чем выше значение константы ассоциации, тем большей прочностью харак-
теризуется комплекс, т. е. эта величина может служить мерой сродства к лиганду,
или силы взаимодействия. Константу диссоциации удобно использовать для опре-
деления концентраций. В общем случае связыванию благоприятствуют концен-
трации реагентов, превышающие константу диссоциации.
Для случая, когда В — это низкомолекулярный лиганд и А — белок со связы-
вающими участками для В, уравнение (4.1) можно использовать для расчета доли
занятых связывающих участков (степени насыщения) как функции концентрации
лиганда. Общая концентрация белка А постоянна и равна сумме концентраций
свободного белка А и этого белка в составе комплекса
[РобШ] = [PJ + IPJ (4.2)
Здесь Рс — свободный белок, соответствующий А в схеме (4.А), и Рк — белок, свя-
завший лиганд, т. е. входящий в состав комплекса. С использованием этих новых
обозначений перепишем уравнение (4.1) в следующем виде
----г = —, (4.3)
[Ь]([Ро6Щ]-[Рк]) Хд„С
где L обозначает лиганд, соответствуя прежнему В. Путем простого преобразова-
ния можно далее получить выражение для величины (/), означающей долю связы-
вающих участков, занятых лигандом, или степень насыщения
Рис. 4.1. График, соответствующий уравне-
нию (4.4) при /<Дис=10- Пунктирной линией
отмечено, что при [L] = /<дис f = 0,5.
4.2. Кооперативность связывания
111
f = = ——— (4.4)
[PocJ [L]+^„c
График этой зависимости имеет вид гиперболической кривой, характерной для ки-
метики реакций с насыщением, какими являются реакции связывания белков с их
лигандами.
I Доля связывающих участков, составляющая половину их общего числа, соот-
ветствует [L] = ХдИС. Кинетика, приведенная на рис. 4.1, является общей для всех
случаев, когда белок имеет связывающие участки одной специфичности и некото-
рая измеримая форма активности зависит от их насыщения. Известный пример та-
кой зависимости — кинетика ферментативной реакции, описываемая уравнением
Михаэлиса—Ментен (см. гл. 10).
4.2. Кооперативность связывания
Во многих случаях связывание лигандов с белком характеризуется кооператив-
ностью. Когда белок содержит больше одного связывающего участка, связыва-
ние одной молекулы лиганда повышает (положительная кооперативность) или
понижает (отрицательная кооперативность) аффинность связывания следую-
щих молекул лиганда. При этом зависимость процесса от концентрации лиганда
существенно отличается от изображенной на рис. 4.1. Рассмотрим несколько
примеров возможных взаимодействий, лежащих в основе кооперативного связы-
вания.
4.2.1. Согласованное связывание
При наличии в молекуле белка множественных связывающих участков некие
внутримолекулярные взаимодействия могут обусловливать такое состояние этих
участков, при котором они либо все одновременно свободны, либо все одновре-
менно заняты. Такой тип связывания называют согласованным в отличие от по-
следовательного. Представим этот процесс схемой (4Б)
Ро + nL Рп, (4Б)
где п — число связывающих участков, Ро — белок со свободными связывающими
участками и Рл - белок, у которого все эти участки заняты молекулами лиганда.
Здесь используется допущение, что каких-либо интермедиатов с промежуточной
степенью насыщения не образуется. Этот случай сходен с конформационным пе-
реходом в мультисубъединичных белках, при котором сдвиг происходит одновре-
менно во всех субъединицах (см. разд. 1.6).
Полное отсутствие промежуточных состояний предполагает полную коопера-
тивность. Для образования комплексов это допущение следует считать искусст-
венным, поскольку нет оснований утверждать, что физические силы, удерживаю-
щие лиганды в отдельных участках, настолько взаимозависимы. Для построе-
ния обоснованной модели кооперативного связывания необходимо учитывать
аллостерические эффекты (см. гл. 5), вследствие которых связывание не всегда
происходит как полностью кооперативное. Приведенный выше пример, хотя он и
I 12
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
не вполне реалистичен, полезен тем не менее для анализа процесса и часто ис-
пользуется.
В условиях равновесия реакция, описываемая схемой (4Б), характеризуется
следующим соотношением концентраций реагентов и продукта I
[Р„] 1
[LF[P0] V
(4.5)
где К„ — это константа диссоциации комплекса, отражающая согласованное свя-
зывание всех п лигандов. Как и в случае уравнения (4.2), сумма концентраций [Ро]
предполагается равной [Р„], что позволяет исключить параметр [РОбш1> и получить
следующее выражение
[PJ _ 1
[Ь]"([Ровщ]-[Р„]) Кп
(4.6)
Произведя то же преобразование, что при выводе уравнения (4.4), получаем урав-
нение
f = _SrE_ (4.7)
[Робщ] [Lf + ^
Этому уравнению, называемому уравнением Хилла, соответствует график в виде
сигмоидной кривой (рис. 4.2). Увеличение угла наклона кривой при повышении
концентрации лиганда обусловлено эффектом кооперативности, наличие которой
отражает член [L]" в числителе уравнения (4.7). Напомним, что аналогичное уве-
личение угла наклона кривой имеет место в случае повышения кооперативности
конформационного перехода (см. разд. 1.4).
Уравнение (4.7) можно преобразовать следующим образом
In Щ/- = Hn([L])-ln(*„)
(4.8)
Рис. 4.2. График, соответствующий урав-
нению (4.7) при указанных значениях п и
Кп = 10 п. (Это означает, что при [А]п = Кп
f = 0,5, как отмечено пунктирными линиями.)
Кривая для п = 1 идентична кривой, приве-
денной на рис. 4.1.
4.2. Кооперативность связывания
113
График зависимости 1п((1 - /)//)от IrifL] имеет вид прямой с угловым коэффициен-
том п. Такой график, называемый графиком Хилла, используется для определения
степени кооперативности. Величину п называют коэффициентом Хилла. График
Зависимости/от L также можно считать графиком Хилла. Величину п определяют
Обычно путем подгонки уравнения (4.7) к такому графику.
I Один из наиболее известных примеров кооперативного связывания — это свя-
зывание О2 гемоглобином. Связывание молекулы кислорода происходит в железо-
содержащем участке связывания — геме, присутствующем в каждой из четырех
субъединиц в составе молекулы гемоглобина. График зависимости насыщения
связывающих участков от парциального давления кислорода имеет вид S-образной
кривой, и значение л, вычисленное с помощью этого графика, составляет 2,7.
Причина, по которой п не равно 4 (соответственно числу субъединиц), состоит
в том, что связывание не является полностью кооперативным, но происходит в не-
которой степени последовательно, с образованием частично насыщенных интер-
медиатов. Вследствие неполной кооперативности расчетная величина коэффици-
ента Хилла оказывается меньше числа связывающих участков. Анализ коопера-
тивности связывания кислорода гемоглобином с учетом аллостерических
эффектов приведен в разд. 5.8.
Как правило, в случае мультисубъединичного белка коэффициент Хилла не ра-
вен точно числу связывающих участков, поскольку кооперативность не может
быть полной. Обычно экспериментально полученное значение п, с помощью гра-
фика Хилла или путем подгонки уравнения (4.7), является нижним пределом чис-
ла участков связывания, содержащихся в белке. Если экспериментально получено
значение 2,5, в молекуле должно быть не менее трех связывающих участков и тео-
ретически их может быть гораздо больше. Подробнее это будет рассмотрено ниже
при описании процессов последовательного связывания.
4.2.2. Последовательное связывание
Для того чтобы выяснить, почему значения коэффициента Хилла ниже действи-
тельного числа связывающих участков, рассмотрим более общий случай, когда
связывание молекул лиганда с различными участками белковой молекулы проис-
ходит не согласованно, а последовательно (Tanford, 1961; Cantor, Schimmel, 1980)
L L L L
Po^> Р1 P2Рп_1 P„ (4B)
Для каждого этапа связывания в схеме (4В) имеется следующее условие равнове-
сия
В этом случае можно составить систему уравнений, связывающих концентрации
молекул белка, различающихся по степени насыщения. Имеется л[Робш] (общее
число) связывающих участков, и фракция занятых участков составляет
у* _ [Pi] + 2[P2] + 3[P3] +... + и[Рл]
и[РОбш]
(4.10)
114
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
С помощью уравнения (4.9) можно выразить концентрацию каждого состояния
с частичной занятостью участков связывания, [PJ, через [Ро]
[Р,] =—— (4.11)
КХК2К3...К) г
Это уравнение получено путем вычисления вначале [PJ, затем [Р2] и т. д. Исполь-
зуем данное уравнение для каждого из [PJ в уравнении (4.10) и затем разложим
[Ро], чтобы получить следующее выражение
[L] ! 2[L]2 ! t <]
к, ••
Kt кхк2 кхк2...к„)
(4.12)
Кривая зависимости (4.12) не может подниматься так же круто, как [L]", поскольку
в числителе присутствуют члены с более низкими показателями степени. Таким
образом, наличие состояний с промежуточной занятостью связывающих участков
снижает степень сигмоидности кривой насыщения и тем самым величину л. кото-
рая будет определена подгонкой уравнения (4.7). При л-числе связывающих участ-
ков величина f не может возрастать в более высокой степени, чем [Цл. Поэтому,
как правило, экспериментально определенные значения коэффициента Хилла
должны быть ниже или равны числу связывающих участков.
4.2.3. Взаимодействие соседних участков
Другое предположение о механизме кооперативности состоит в том, что связыва-
ние зависит от занятости соседних связывающих участков. Это иллюстрирует
рис. 4.3, изображающий линейное расположение связывающих участков вдоль
длинной молекулы. Такая модель хорошо описывает связывание нуклеотидов при
синтезе одноцепочечной ДНК или РНК, а также помогает объяснить связывание
лигандов с белковыми молекулами нитевидной формы.
Для описания такого варианта кооперативного связывания необходимо ис-
пользовать две константы равновесия, одна из которых, KQi характеризует связы-
вание отдельного лиганда с отдельным участком и другая, К19 — связывание лиган-
да с участком, соседним по отношению к занятому участку. Здесь можно видеть
существенное сходство с переходом спираль—клубок (см. разд. 3.12), и математиче-
ский анализ такого варианта связывания в значительной степени сходен с анализом
этого перехода. Параметр непрерывности спирали соответствует КХ9 и параметр
инициации спирали — Xo. Поскольку имеется столь близкое соответствие, общий
Рис. 4.3. Длинная молекула имеет много связывающих участков, расположенных в ряд. Лиганд
способен взаимодействовать с другими лигандами, расположенными в соседних участках, и это
может стабилизировать комплекс
4.3. Термодинамика образования комплексов
115
характер изменения формы кривой перехода спираль—клубок с изменением этих
параметров (рис. 3.6—3.8) может служить иллюстрацией связывания, зависящего
Ьт занятости соседних связывающих участков. Кривая связывания будет в боль-
шей степени сигмоидной (более круто поднимающейся), если лиганд связывается
орлее прочно в присутствии лиганда, связанного с соседним участком, и менее
прочно при незанятом соседнем связывающем участке. Если молекула белка
с множественными связывающими участками короткая, крутизна кривой связы-
вания будет лимитироваться длиной белковой молекулы. При большей длине мо-
лекулы возрастает число связывающих участков и крутизна кривой связывания.
Однако этот эффект достигает предела, определяемого силой взаимодействия ме-
жду участками. Добавление большего числа участков связывания в результате уд-
линения молекулы только до определенной степени повысит крутизну кривой
связывания. Как и в случае перехода спираль—клубок, показателем кооператив-
ности может служить средняя длина отрезка молекулы со сплошной занятостью
участков связывания. Увеличение длины молекулы сверх этого значения не повы-
сит существенно кооперативность связывания.
4.3. Термодинамика образования комплексов
До сих пор мы рассматривали образование молекулярных комплексов, не прини-
мая во внимание те специфические взаимодействия, на которых оно основано.
Попытаемся теперь связать константы диссоциации с энергетическими парамет-
рами и оценить силу нековалентных взаимодействий, стабилизирующих молеку-
лярные комплексы. Запишем выражение для молярной свободной энергии рас-
творенного вещества в идеальном растворе
6=60+/гПп[А], (4.13)
где (7° — это молярная свободная энергия при стандартных условиях.
С помощью уравнения (4.13) составляются выражения для каждого из трех
участвующих в образовании комплекса соединений. Вычитание свободной энер-
гии реагентов из свободной энергии продукта позволяет определить величину ДО,
которая принимается равной нулю при условии, что реакция образования ком-
плекса протекает как равновесная. В этом случае соотношение между ДО0 и Клис
(уравнение (4.5)) записывается следующим образом
AG0 = -ЯПп-£^- = /гПп/Гдис (4.14)
[L][PC]
Это выражение характеризует изменение молярной свободной энергии при стан-
дартных условиях, которые, как правило, означают одномолярную концентрацию
реагентов и продуктов. Таким образом, ДО0 представляет собой изменение сво-
бодной энергии в случае, когда белок в одномолярной концентрации связывает
лиганд, присутствующий в той же концентрации, с образованием комплекса в той
же концентрации. Ниже мы сможем убедиться, что от выбора стандартных усло-
вий зависит определение величины одного из компонентов свободной энергии
связывания, а именно энтропии поступательного движения.
116
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Используя эти сведения как исходные, попытаемся проанализировать взаимо-
действия, лежащие в основе реакций образования молекулярных комплексов, как
факторы изменения свободной энергии.
4.4. Образование связей
Первое, что приходит в голову при попытке определить движущую силу реакций
связывания, — это образование энергетически выгодных связей между двумя мо-
лекулами. Можно считать, что образующие комплекс молекулы удерживаются в
нем посредством таких взаимодействий, как водородные связи и солевые мостики,
а также благодаря соприкосновению гидрофобных поверхностей. Если известна
структура комплекса, можно попытаться выявить обеспечивающие его образова-
ние взаимодействия и затем определить их энергии с помощью формул, приведен-
ных в гл. 2. Такой подход позволит затем суммировать влияния этих взаимодейст-
вий, чтобы оценить их общий вклад в величину AG0 (уравнение (4.14)). Если при-
нять, что z-oe взаимодействие вносит вклад в свободную энергию, равный е,, вклад
всех межмолекулярных взаимодействий в свободную энергию можно приближен-
но представить в виде суммы
Д6°В=2>, (4.15)
/
Вклад водородных связей можно определить с помощью данных, приведен-
ных в табл. 2.1 и 2.2. Если рассматриваемые взаимодействия соответствуют потен-
циалу Леннард-Джонса (уравнение 2.13)), их энергию можно вычислить как е
из этого уравнения. В случае сил притяжения, стабилизирующих комплекс, вели-
чины энергии будут отрицательными, и эта энергия будет способствовать образо-
ванию комплекса. В уравнение могут также включаться энергетические парамет-
ры, отражающие отталкивание и представляющие собой положительные величи-
ны, в тех случаях если комплементарность двух молекул не полная и некоторые
группы, между которыми нет притяжения, оказываются сближенными. Противо-
действующие связыванию взаимодействия возникают, когда в результате обра-
зования комплекса происходит сближение зарядов одного и того же знака, или
приводятся в соседство группы, между которыми существует стерическое оттал-
кивание, или гидрофобные группы оказываются в контакте с гидрофильными
группами.
Вычисленная из уравнения (4.15) величина суммарной энергии соответству-
ет условию, что взаимодействия происходят как независимые. При этом не учи-
тываются, например, возможные искажения структуры молекул, вызванные их
связыванием. В каждой молекуле возможно некоторое растягивание и перекручи-
вание связей или существенные конформационные изменения (последние рас-
смотрены ниже). Как правило, подобные искажения должны приводить к возрас-
танию свободной энергии комплекса и таким образом противодействовать связы-
ванию.
Уравнение (4.15) можно представить в более общей форме, включив в выраже-
ние для энергии силовое поле всех атомных взаимодействий между двумя молеку-
лами (см. разд. 2.14) для учета всех возможных межмолекулярных взаимодействий.
4.5. Статистическая механика образования молекулярных комплексов
117
В то же время не имеет значения, насколько точно мы попытаемся оценить энер-
гию связывания на основе молекулярных взаимодействий; вычисленная таким
Способом величина не будет соответствовать действительной свободной энергии
связывания. Это обусловлено тем, что существуют другие важные эффекты, кото-
рые требуется учитывать. При связывании двух молекул происходит существенное
снижение энтропии в результате ограничения движения двух молекул друг относи-
тельно друга. Этот вклад в энергию комплекса чрезвычайно важен, и далее мы про-
ведем его подробный анализ.
4.5. Статистическая механика образования
молекулярных комплексов
Рассмотрим функцию распределения молекулы, обозначаемую Q (см. разд. 1.1),
и разложим ее на составляющие
Q ~ Q мвЯпЯврЯкдЯкгЯС •> (4. 16)
где <?мв означает вклад межмолекулярных взаимодействий, рассмотренный выше,
qn — вклад поступательного движения, (?вр — вклад вращательного движения, q^ —
вклад колебательного движения, qKV — вклад конформационной гибкости молекул
и (?с — вклад эффектов сольватации. В общем случае рассматривается также вклад
электронных состояний, но для анализа процесса связывания он не имеет сущест-
венного значения и поэтому здесь опущен.
За исходное выражение удобно принять уравнение (4.16), поскольку эта функ-
ция распределения представляет собой просто произведение параметров, отра-
жающих вклады различных факторов. Функция распределения может быть разло-
жена таким способом на основе допущения, что каждая из различных форм энер-
гии независима и аддитивна. Поскольку величины статистического веса по
Больцману представляют собой экспоненциальные функции энергии, их можно
выразить как произведение (правая часть уравнения (4.16)) соответственно усло-
вию аддитивности энергий.
Вначале определим функцию распределения ансамбля как произведение по всем
Nмолекулам, 0^, деленное на комбинаторный, или «счетный», фактор №, позво-
ляющий учесть то, что взаимообмен идентичными молекулами не приводит к из-
менениям состояний. В этом случае свободная энергия выражается через функцию
распределения для ансамбля в виде совокупности N молекул одного вида*
G = -kT\n\^-\ (4.17)
Чтобы получить математическое выражение, описывающее связывание моле-
кул А и В с образованием комплекса С, распространим функцию распределения
1 Способ выведения функции распределения системы из А молекул, а также анализ рассмат-
риваемых ниже вкладов энтропии поступательного, вращательного и колебательного движения
можно найти в специальной литературе (см. MacQuarrie, 1976; Hill, 1960; Moore, 1972).
118
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
на смесь этих трех компонентов системы. Будем исходить из предположения, что
молекулы в растворе не взаимодействуют между собой иначе, чем с образовани-
ем данного комплекса. С учетом независимости взаимодействий функцию рас-
пределения смеси компонентов А, В и С можно выразить как произведение функ-
ций распределения каждого из трех компонентов. Величины свободной энергии
в этом случае аддитивны, и свободную энергию смеси молекул А, В и С мож-
но представить как сумму выражений в форме уравнения (4.17) следующим об-
разом
G = -кТ\п\ HTln HTln = -kT\n\ Vc
Wj I J ^Aa!AbWc!
(4.18)
Когда процесс связывания достигает равновесия, величина свободной энергии
системы минимальна. В этом случае взаимодействие бесконечно малого количест-
ва молекул А и В с образованием комплекса С не изменит эту величину свободной
энергии. Используем данное положение, чтобы рассчитать величину Сдля связы-
вания всего одной молекулы А с одной молекулой В. При этом взаимодействии
числа А\ и Nb уменьшатся на единицу, a Nc увеличится на единицу. Поскольку та-
кое малое превращение не изменяет величину свободной энергии, можно записать
равенство
( nN*nN* nNc А ( z)/Vb-A
I Aa’Ab!Ac! ) ^(Aa-1)’(Ab-1)!(Ac4-1)'.J
(4.19)
Из равенства членов в скобках легко вывести следующее условие равновесия1
QaQb _ /4 20)
Ос
Число молекул можно пересчитать на концентрацию, выражаемую как число
моль на единицу объема. С использованием концентраций получаем выражение
для константы диссоциации АдИС из уравнений (4.1) и (4.14)
Qc^_ [С] _ 1 4
ОвСа [А](В] Кюс ’
где V — это объем и А — число Авогадро, включенное в связи с тем, что [А] как
число моль в расчете на единицу объема равно NK/VA.
Теперь продолжим анализ различных составляющих свободной энергии, опре-
деляемых межмолекулярными взаимодействиями, поступательным движением,
внутренним вращением и т. д. Замещая каждый член Q соответствующим произве-
дением из уравнения (4.16), получим выражение для константы диссоциации, ко-
торое включает члены, отражающие вклад каждого из учитываемых факторов
в свободную энергию системы
1 В учебниках для этого приводится способ, состоящий в дифференцировании по TVA, 7VB
и Nc, приравнивании производных нулю и решении относительно с использованием формулы
Стирлинга для аппроксимации факториала.
4.6. Свободная энергия поступательного движения
119
1
/удис
*?Смв
Вмв
?сп ИА
QkwQВп
<?Свр
^Авр^ Ввр
*7 С кд I ЯСкг
/7акд*?Вкд ) Ч^Акг^Вкг
(4.22)
Присутствие члена ИА при параметре, отражающем вклад поступательного движе-
ния, станет понятным при рассмотрении свободной энергии поступательного дви-
жения в следующем разделе.
Взяв логарифм выражения (4.22) и умножив его йа RT, мы возвращаемся к вы-
ражению для AG0. Рассмотрим теперь AG0 как сумму вкладов, отражающих влия-
ние каждого фактора, приведенного в уравнении (4.22). В начале этого раздела было
отмечено, что аддитивность каждой формы энергии на уровне одной молекулы по-
зволяет разложить функцию распределения на составляющие, как в уравнении (4.16).
Перейдя теперь к величине молярной свободной энергии, т. е., рассчитав RT\n Клнс9
мы видим, что вернулись к этому свойству аддитивности. Уравнение (4.22) позво-
ляет разложить свободную энергию связывания на отдельные составляющие.
Для оценки вкладов энергии поступательного, вращательного и колебатель-
ного движения удобно использовать число степеней свободы. Все молекулы име-
ют три степени свободы поступательного движения, соответствующие движению
в направлениях х, у и г Кроме того, все молекулы, за исключением некоторых
симметричных молекул, имеют три степени свободы вращательного движения,
соответствующие вращению вокруг осей х, у и z. Две молекулы обладают 12 степе-
нями свободы поступательного и вращательного движения; образующийся в ре-
зультате их связывания комплекс обладает только тремя степенями свободы каж-
дого из этих типов и в сумме шестью данными степенями свободы. Другие шесть
степеней свободы, утраченные при образовании комплекса, замещаются в обра-
зовавшемся комплексе шестью новыми — степенями свободы колебательного
движения (см. разд. 4.8). Таким образом, общее число степеней свободы остается
постоянным, что является важной характеристикой реакций связывания. Чтобы
составить общее представление об изменении свободной энергии в реакциях свя-
зывания, необходимо определить вклады в нее энергии поступательного, враща-
тельного и колебательного движения молекул.
4.6. Свободная энергия поступательного движения
Вклад поступательного движения молекул в их свободную энергию обусловлен
тем, что они обладают свободой перемещения внутри данного объема V. Эту сво-
боду можно вычислить как энтропию, подсчитав число положений молекулы. Раз-
делим пространство, в котором молекула способна перемещаться, на множество
клеток, или кубиков, в каждом из которых молекула имеет одну и ту же потенци-
альную энергию (если к ней не приложено внешней силы). Функция распределе-
ния молекулы, включающая в этом случае подсчет общего числа клеток, будет
пропорциональна объему, в котором молекула может перемещаться. Объем одной
клетки или кубика, вычисляемый методами квантовой механики с использовани-
ем волновой функции частицы в ячейке, составляет (й2/(2л^Т)) (McQuarrie,
1976; Hill, 1960; Moore, 1972), где т — это масса и h — постоянная Планка. Исполь-
зуя эту величину, запишем формулу для вклада поступательного движения в функ-
цию распределения молекулы в объеме V
120
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
(2пткТ\3/2 _ £
(4.23)
Обозначение объема воображаемой клетки, используемой в квантовой меха-
нике, как А3 позволяет записать результат в простой форме, ясно показывающей,
что qn — это число таких клеток в рассматриваемом объеме. Данное уравнение
обычно относят к идеальному газу, но можно распространить его и на растворы
(Steinberg, Scheraga, 1963; Tidor, Karplus, 1994; Gilson et al., 1997). Переменная A
имеет размерность длины и называется длиной тепловой волны Де Бройля. По-
скольку величина А3 выражает объем, эти единицы в выражении для qn удаляются
и результат представляет собой безразмерную величину — число состояний, обу-
словленных поступательным движением. Применив это выражение для qn к каж-
дому компоненту системы, А, В и С, получаем следующее выражение для фактора
поступательного движения в уравнении (4.22)
Qcn^4 _ АаАвЛ 2^
<7ап<7вп А3с
Это выражение описывает вклад поступательного движения молекул в свободную
энергию реакции связывания.
Единственный параметр в данном уравнении, зависящий от конкретного ве-
щества, — это масса, и с использованием ее величины можно достоверно оценить
вклад поступательного движения в свободную энергию реакции связывания. Если
рассмотреть в качестве примера связывание белка А с небольшим лигандом В, ве-
личины Аа и Ас будут близкими и сократятся, в результате чего останется выраже-
ние ЛА3В как хорошая аппроксимация уравнения (4.24). При мол. массе 100 и тем-
пературе 300 К величина Ав равна 10"9 см. Стандартные условия для свободной
энергии поступательного движения — это просто — RTln (1 М), т. е. за них принята
одномолярная концентрация всех компонентов рассматриваемой системы. Пере-
считав А3В на литры, получаем следующее выражение для вклада поступательного
движения в АС0
AGn° = -Я71п
Ял3в
1М
= 0,5881п(6,02 -10 7) = 8,4 ккал • моль 1
(4.25)
Это чрезвычайно важное уравнение, в котором единственная специфическая
для лиганда величина представляет собой мол. массу, учтенную в параметре Ав.
Увеличение массы молекулы В в 10 раз приводит к возрастанию свободной энер-
гии, рассчитываемой по уравнению (4.25), на 2 ккал • моль-1. Таким образом, полу-
чаемая с помощью данного уравнения величина вклада в свободную энергию от-
носительно’ мало зависит от мол. массы лиганда. Кроме того, при рассмотрении
ниже вклада колебательного движения можно будет убедиться, что эта зависимая
от мол. массы часть выражения для вклада поступательного движения сокращает-
ся и выражение для свободной энергии связывания по существу не включает чле-
нов, зависимых от мол. массы (Gilson et al., 1997).
Чтобы лучше представить вклад поступательного движения в свободную энер-
гию связывания, можно рассмотреть связывание как уменьшение объема, доступ-
4.6. Свободная энергия поступательного движения
121
ного для молекулы, от величины 1 л на Л молекул в 1 М растворе (1,7 • 10-24 л • мо-
лекула-1) до величины А3 на молекулу (10-30 л • молекула-1). Вклад поступательного
движения в функцию распределения молекулы пропорционален объему в расчете
на молекулу (уравнение (4.23)), и таким образом изменение свободной энергии
поступательного движения при связывании белка с лигандом равно логарифму со-
отношения двух указанных объемов.
Важно подчеркнуть, что величина AGn° зависит от выбора стандартных усло-
вий. Приведенный выше расчет относится к одномолярной концентрации всех
компонентов системы; при изменении стандартных условий величина Д(7П0 также
изменится. Единственная составляющая свободной энергии, которая зависит от
концентрации веществ, это вклад поступательного движения. Таким образом, ус-
ловия равновесия реакции связывания следует представлять как баланс между
вкладом поступательного движения и всеми остальными составляющими свобод?
ной энергии. Возможно, этим объясняется, главным образом, изменение скорости
связывания при изменении концентраций компонентов реакции.
Для обозначения вклада поступательного движения в свободную энергию ре-
акций образования комплексов часто применяют термин кратный (Gurney, 1953).
Это полезная идея, поскольку она позволяет отличить данную составляющую сво-
бодной энергии как единственную, которая зависит от стандартных условий, а не
от свойств молекул, от других составляющих свободной энергии, определяемых
исключительно свойствами молекул и механизмом взаимодействия. В ранних ра-
ботах по определению кратного вклада использовали для вычисления энтропии
связанного состояния величину объема в расчете на молекулу воды при ее концен-
трации 55 М. К настоящему времени установлено, что такой способ дает сильно
заниженную оценку того, в какой степени при связывании ограничивается посту-
пательное движение.
Вклад поступательного движения в свободную энергию межмолекулярного
взаимодействия в основном, хотя и не полностью, обусловлен изменением энтро-
пии. Чтобы убедиться в этом, возьмем производную уравнения (4.25) по темпера-
туре. (Необходимо учесть, что_А зависит от температуры и поэтому данная произ-
водная не равна просто R In ЛА3В.)
Д5° =Я1пЛА3в-|я (4.26)
Путем вычитания 7А5П° из AGn° в уравнении (4.25) получаем выражение
ДЯ° = ^RT (4.27)
Смысл этого выражения наиболее ясен из анализа числа степеней свободы.
При связывании число степеней свободы поступательного движения уменьшается
на три степени, каждая из которых характеризуется кинетической энергией 1/2 Л Г
в расчете на моль. Значение ДЯП° при комнатной температуре равно всего лишь
0,9 ккал • моль-1, и обычно это изменение уравновешивается кинетической энер-
гией новых степеней свободы — колебательного движения внутри комплекса (см.
разд. 4.8). Единственный случай, когда этого не происходит, — образование очень
прочного комплекса, в котором за счет квантово-механических эффектов кинети-
ческая энергия гармонического осциллятора падает ниже 1/2 RT. Таким образом,
122
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
поскольку энтальпийная составляющая свободной энергии поступательного дви-
жения мала и не изменяется при связывании, можно рассматривать AGn° практиче-
ски полностью как изменение энтропии.
В качестве другого подхода к определению вклада поступательного движения
в свободную энергию реакции связывания предложен метод выражения измене-
ния энтропии поступательного движения как отношения объема, доступного для
молекулы при стандартных условиях (1 л/Л), к объему, доступному для молекулы
при ограничении ее движения в результате образования комплекса (Finkelstein,
Janin, 1989; Gilson et al., 1997). Этот ограниченный объем выражается как (8х)3, где
8х характеризует свободу колебательного движения в составе комплекса. При та-
ком подходе изменение свободной энергии поступательного движения отражает
эффективный свободный объем, доступный для лиганда в связывающем участке
белка, с которым этот лиганд образовал комплекс.
Д G® =-RT 1п((8х)31/1 М) (4.28)
Это уравнение отличается от уравнения (4.25) только тем, что вместо парамет-
ра А содержит член 8х. Такая замена необходима, поскольку в составе комплекса
свобода поступательного движения молекул ограничена не столь значительно, как
определяет очень короткий отрезок длины, А. Однако относительное движение
молекул в составе комплекса, отражаемое величиной 8х, обусловлено новыми, ко-
лебательными движениями, вклад которых в свободную энергию рассматривается
ниже. Этот вклад удобнее анализировать отдельно, поскольку он зависит от специ-
фических свойств взаимодействующих молекул, тогда как на изменение свобод-
ной энергии поступательного движения их свойства почти не влияют.
4.7. Свободная энергия вращательного движения
Молекула в растворе способна вращаться вокруг своих осей. Как правило, асим-
метричные молекулы биополимеров имеют три ортогональные оси. Число враща-
тельных состояний для каждой оси можно представить как пропорциональное
длине окружности, радиус которой равен радиусу молекулы, г; например, ос2лг.
Действительное число их рассчитывается для ригидной молекулы методами кван-
товой механики, позволяющими получить функцию распределения вращательных
состояний. Далее можно вычислить вклад вращательного движения в энергию мо-
лекулы тем же способом, который описан выше для вклада поступательного дви-
жения, и получить выражение для члена, обусловленного вращением, в уравнении
(4.16) (McQuarri, 1976; Hill, 1960; Moore, 1972)
I h1 J I h2 J I h1 ) ’ ( ’
где Ix) Iy и Iz означают основные моменты инерции вращения вокруг трех ортого-
нальных осей. Каждый из этих членов равен сумме ^(тг2) по всем атомам, где
т — масса и г — расстояние до оси вращения. (Здесь не рассматриваются учиты-
ваемые обычно при таком вычислении факторы симметрии, поскольку они не
имеют существенного значения для биохимических реакций связывания.)
4.8. Свободная энергия колебательного движения
123
Полученное выражение позволяет вычислить вращательный член <7СвР/<7авР <7ввр
в уравнении (4.22), где А — белок, В — лиганд и С — комплекс. Вращательные чле-
ны для А и С можно сократить, поскольку ~ 1Сх и т. д. Таким образом, остается
выражение 1/<7Ввр. При вероятном значении момента инерции для небольшой мо-
лекулы (2 • IO’37 г.см2) получаем из уравнения (4.29) <?Ввр = 106. Таким образом, по-
теря трех степеней свободы вращательного движения обусловливает следующий
вклад в свободную энергию реакции связывания
Д(7вр = -/?Т1п(1/<7Ввр) = 8,2 ккал • моль"1 (4.30)
Эта величина сходна с величиной вклада поступательного движения (уравнение
(4.25)).
Как и в случае вклада поступательного движения, энтропия может быть рас-
считана здесь путем дифференцирования по температуре. Величину AGB°p состав-
ляет главным образом энтропия, но, как и в случае вклада поступательного движе-
ния, значение ДЯв°р при комнатной температуре равно 3/2 RT- 0,9 ккал • моль-1,
что отражает кинетическую энергию вращения вокруг трех основных осей.
И вновь, как и в случае кинетической энергии поступательного движения, утрата
степеней свободы вращательного движения компенсируется появлением новых
степеней свободы — колебательного движения комплекса. Таким образом, вклад
вращения в ДО0, как и вклад поступательного движения, представляет собой чис-
то энтропийный параметр.
Приведенный расчет основан на предположении, что две молекулы, образую-
щие комплекс, не вращаются одна относительно другой в составе комплекса. Если
они соединены только одной связью, будет происходить внутреннее вращение, ко-
торое необходимо учитывать, и тогда величина свободной энергии вращения из-
менится. Однако в большинстве случаев комплексы, образуемые биомолекулами,
стабилизированы множественными нековалентными связями и поэтому враще-
ния компонентов в них не происходит.
4.8. Свободная энергия колебательного движения
Вклады свободной энергии поступательного движения и вращательного движе-
ния в энергию комплекса, вычисленные выше, составляют с необходимостью по-
ложительные величины. При образовании комплекса число этих степеней свобо-
ды сокращается, что противодействует связыванию. Поскольку утраченные сте-
пени свободы замещаются новыми, обусловленными внутренними колебаниями
комплекса, можно ожидать, что компенсирующий вклад колебательного движе-
ния в энергию комплекса составляет отрицательную величину. Комплекс, обра-
зуемый двумя молекулами при их связывании, обладает шестью новыми степеня-
ми свободы, которых не имеют эти молекулы по отдельности; эти новые степени
свободы обусловлены колебательным движением. Колебания зависят от растяже-
ния и искажения связей, соединяющих две молекулы в составе комплекса. Появ-
ление шести степеней свободы колебательного движения комплекса служит
принципиальной характеристикой реакции связывания двух молекул, абсолютно
не зависящей от числа стабилизирующих комплекс связей (если их число больше
124
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
единицы). Вычислим теперь вклад колебательного движения в свободную энер-
гию комплекса.
Обусловленный колебательным движением член в уравнении (4.22) представ-
ляет собой выражение 4Скд/4акд4вкд- Чтобы оценить его величину, будем исходить из
того принципа, что многочисленные колебания сложной молекулы могут быть
разложены на нормальные моды (см. разд. 2.12). Нормальная мода определяется
как совокупное колебание большого числа атомов. В математическом описании
поведение этой характеристики подобно отдельному гармоническому осциллято-
ру. Выражая энергию как сумму отдельных членов, представляющих каждую из
нормальных мод (уравнение (2.21)), можно определить вклад (функцию распреде-
ления) колебательного движения как произведение членов, относящихся к инди-
видуальным нормальным модам. Функция распределения гармонического осцил-
лятора имеет следующий вид (McQuarri, 1976; Hill, 1960; Moore, 1972)
e-hv,/2kT
= <4’31>
где vz = (1/2л)7(<Р//Ц/) — это частота колебаний, ц — приведенная масса и <р — си-
ловая постоянная. Индекс / нумерует нормальные моды. Полная функция распре-
деления колебательного движения для молекулы будет в этом случае представлять
собой произведение членов в форме уравнения (4.31) по всем нормальным модам.
В первую очередь упростим уравнение (4.31), исходя из того что нековалентные
взаимодействия, обеспечивающие образование комплекса из двух молекул, гораз-
до слабее, чем ковалентные связи. При этом условии силовые постоянные межмо-
лекулярного взаимодействия будут иметь незначительную величину по сравнению
с силовыми постоянными ковалентных связей в двух молекулах. Частота колеба-
ний этих слабых нековалентных связей будет низкой и, следовательно, справедли-
во соотношение hv«kT. Таким образом, можно разложить экспоненциальную
функцию, представив ее в виде выражения e-/,v/*r~ 1 - hv/kT. В этом случае числи-
тель в уравнении (4.31) становится равным единице, а знаменатель hv/kT, и при
использовании выражения, получаемого из уравнения (4.31) для vz, можно запи-
сать уравнение
= F = (4-32)
hVj 2 Tin у <pz
Это выражение представляет собой классический предел гармонического осцил-
лятора, в котором средняя кинетическая энергия составляет X/2RT в расчете на
моль. Таким образом, утраченная кинетическая энергия поступательного движе-
ния полностью замещается энергией колебательного движения, если взаимодейст-
вия достаточно слабые, чтобы имели место классические колебания.
При образовании комплекса С из молекул А и В все нормальные моды изменя-
ются, будучи функциями полной функции потенциальной энергии молекулы. Та-
ким образом, вклад колебательного движения в гораздо большей степени зависит
от свойств молекул по сравнению с вкладами поступательного и вращательного
движения. Подробный компьютерный анализ изменений энергии колебательного
движения при димеризации инсулина показал, что помимо добавления новых
шести мод колебательного движения при образовании комплекса происходит из-
4.8. Свободная энергия колебательного движения
125
менение многих существовавших у мономеров внутренних мод (Tidor, Karplus,
1994). В этой работе вклад энтропии колебательного движения для данной реак-
ции димеризации вычислен как 23 кал • К-1 • моль-1, в соответствии с чем величи-
на свободной энергии колебательного движения составляет -7,2 ккал • моль-1.
Для количественного анализа колебаний требуется использовать данные о
структуре молекул и подробную функцию потенциальной энергии, однако общее
представление о колебательном движении можно поручить с помощью упрощен-
ного подхода. Предположим, что внутренние колебания молекул А и В существен-
но не изменяются при образовании комплекса. Это позволяет аппроксимировать
величину <?Скд как произведение <?Акд <?Вкд д'кл, где член qfKд отражает новые шесть мод
колебательного движения, обусловленные растяжением и изгибанием нековалент-
ных связей, стабилизирующих комплекс. При подстановке этого выражения для
<7Скд в множитель, соответствующий колебательному движению в уравнении (4.22),
множитель <?Акд #Вкд сокращается и остается лишь величина ^'д. Таким образом, за-
дача состоит теперь только в определении этой величины.
Вначале определим величины ц и <р. Согласно принципу равномерного распре-
деления энергии (см. разд. 12.4), средняя потенциальная энергия гармонического
движения составляетср(5х)2/2 = RT/2 (в классическом пределе). Принимая, что па-
раметр 5х для типичных среднеквадратичных смещений, наблюдаемых в молеку-
лах белков, варьирует в пределах 0,15—0,25 А, получаем <р = ЯГ/бх2. Мол. массу ти-
пичного лиганда примем равной 100 Да и используем эту величину как значение ц.
Подстановка данных значений для ц и <р в уравнение (4.32) позволяет установить,
что величина для одной моды варьирует в диапазоне 3,7—6,3. В случае шести та-
ких мод свободная энергия колебательного движения составляет
Д(7ад = -ЯТ1п(<7ад) = от -4,6 до -6,5 ккал • моль-1 (4.33)
Используя эту оценку, можно определить общий энергетический барьер (эн-
тропию) для образования комплекса, обусловленный ограничением движения.
Суммируя вклады поступательного и вращательного движения как члены из урав-
нений (4.25) и (430) и вычитая уравнение (4.33), получаем величины в диапазоне
10,0—12,2 ккал • моль-1. Благоприятствующая образованию комплекса свободная
энергия образования связей должна превышать эту величину, чтобы произошло
связывание.
Энтропию, связанную с колебательным движением, можно оценить также для
реакции димеризации инсулина, приведенной выше в качестве примера (Tidor,
Karplus, 1994). Мол. масса инсулина равна 5700 Да. Силовую постоянную опреде-
лим, как выше для среднеквадратичного смещения, в позиции 0,15 А. Для одной
моды получаем уравнение q^ = kT/hv = 29 (уравнение (4.32)). Этому соответствует
значение энергии 2 ккал • моль-1 в расчете на моду, или 12 ккал • моль-1 в расчете
на новые шесть мод колебательного движения. Чтобы вычислить энтропию, будем
вновь исходить из того, что классический гармонический осциллятор характеризу-
ется общей внутренней энергией, равной (в расчете на моль) RT (кинетическая
энергия = 1/2 RTи потенциальная энергия = 1/2 RT). Вычитая 6RT, получаем ве-
личину вклада энтропии, равную —8,4 ккал • моль-1 и сходную, таким образом,
с результатом —7,2 ккал • моль-1, полученным в цитированной выше работе (Tidor,
Karplus, 1994).
126
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Объединение выражений, полученных для вкладов поступательного, враща-
тельного и колебательного движения, позволяет прийти к важному заключению,
состоящему в том, что константа равновесия реакции образования молекулярного
комплекса не зависит существенно от массы. При извлечении параметра массы из
выражения для вклада поступательного движения (А3В в уравнении (4.25)) получа-
ем /ив3/2. В случае вклада вращательного движения зависимость от массы содер-
жится в основных моментах инерции, и это позволяет получить из уравнения
(4.30) выражение (/Bx/B>,/BJ 1/2 • Вклад колебательного движения сводится прибли-
зительно к величине для мод растяжения и изгибания связей между молекула-
ми и должен быть пропорционален произведению квадратных корней шести при-
веденных масс для новых мод, обусловленных колебательным движением. В слу-
чае связывания крупной белковой молекулы и небольшой.молекулы-лиганда,
приведенная масса для трех мод колебательного движения будет близка к массе
лиганда, в соответствии с чем определяется член т3/2. Три другие из новых мод
обусловлены так называемой либрацией (более медленными, или малыми, колеба-
ниями), и соответствующие приведенные массы будут основными моментами
инерции лиганда, чему соответствует член (/вДвДв<)1/2- Когда выражения для
энергий поступательного, вращательного и колебательного движений перемножа-
ются, эти зависящие от массы члены полностью сокращаются. Параметры массы в
выражении для вклада поступательного движения сокращаются с параметрами
массы в выражении для вклада колебательного движения. Аналогичным образом
параметры массы в выражении для вклада вращательного движения сокращаются
с параметрами массы в членах, выражающих вклад либрации. Получаемое в итоге
уравнение показывает, что константы равновесия реакции образования комплекса
очень незначительно зависят от массы (Gilson et al., 1997).
4.9. Эффекты сольватации
Поскольку реакции связывания, представляющие интерес для биологии, протека-
ют в водных растворах, необходимо рассмотреть влияние молекул воды, которые
покрывают поверхность реагирующих молекул. При связывании двух молекул эти
молекулы воды должны смещаться (если они не остаются, способствуя стабилиза-
ции комплекса путем образования мостиков). Взаимодействие между гидрофоб-
ными поверхностями и водой энергетически невыгодным, и смещение молекул
растворителя необходимо для взаимодействия гидрофобных поверхностей за счет
сил притяжения (см. разд. 2.8). Если на поверхности молекулы лиганда или белка
имеются полярные группы, вода должна притягиваться ими. С помощью методов
дифракции рентгеновских лучей и ядерного магнитного резонанса получены дан-
ные, подтверждающие, что с белковыми молекулами слабо и неспецифично связа-
но большое количество молекул воды. В то же время большинство белков содер-
жит несколько участков, способных связывать воду довольно прочно (Bryant,
1996). Когда при образовании комплекса эти связанные молекулы воды смещают-
ся, происходит значительная потеря свободной энергии.
В случае прочно связанной молекулы воды силу связей, удерживающих ее на
месте, можно считать приближенно близкой к силе связей, образуемых этим уча-
стком белка с лигандом. Например, гидроксильная группа в молекуле лиганда
4.9. Эффекты сольватации
127
может образовывать водородную связь, которая замещает аналогичную связь с
молекулой воды. Если силы этих связей примерно равны, образование данной
связи не будет служить толчком для связывания лиганда вместо воды. В то же
время потери энтропии поступательного движения и вращательного движения
должны довольно сильно различаться в случаях связывания воды и лиганда. Если
крупная молекула лиганда при связывании смещает несколько молекул воды,
должно происходить существенное результирующее увеличение энтропии посту-
пательного и вращательного движения. Однако общее количество энтропии, обу-
словленное связыванием воды, вычислить сложно. При высокой концентрации
воды ее молярная энтропия снижается. Использованные выше уравнения стати-
стической механики не вполне подходят для анализа связывания воды, посколь-
ку ее молекулы плотно упакованы и расположены высокоорганизованно. Такая
упаковка делает величину энтропию более низкой по сравнению с предсказан-
ной выше на основе анализа свободного поступательного и вращательного дви-
жения.
Вместо того, чтобы применять упомянутые уравнения статистической механи-
ки, воспользуемся результатами измерений термодинамических параметров
(Dunitz, 1994). Энтропия жидкой воды равна 16,7 кал • моль-1 • К-1 при 298 К. Для
воды, связанной с кристаллами, измерения энтропии показывают величины, рав-
ные примерно 10 кал • моль-1 • К-1. Эта величина отражает колебания молекул
воды внутри кристалла. Разность данных величин можно рассматривать как поте-
рю энтропии при связывании воды с поверхностью белковой молекулы. Если при-
нять разность между значениями энтропии воды в свободном и связанном состоя-
ниях равной 6,7 кал • моль-1 • К-1, потеря свободной энергии в результате смеще-
ния наиболее прочно связанной молекулы воды при 298 К должна составлять
примерно 2 ккал • моль-1, и, разумеется, в случае более типичных, слабо связанных
с белком молекул воды эта величина должна быть меньше.
Потеря свободной энергии, равная 2 ккал • моль-1, в случае воды, иммобили-
зованной на поверхности белковой молекулы, намного ниже аналогичной вели-
чины, относящейся к связыванию лиганда при стандартных условиях (концен-
трации реагентов 1 М). Здесь следует учесть, что суммирование уравнений (4.25),
(4.30) и (4.33) дает величину, большую чем 10 ккал • моль-1, т. е. указывающую на
противодействие связыванию. Итак, предположим, что комплекс из двух моле-
кул образуется за счет связей, сходных по силе со связями, которые образует с
этими молекулами вода. Поскольку потеря энтропии при иммобилизации воды
намного меньше, связывание воды должно быть гораздо более предпочтитель-
ным. Таким образом, лиганд, смещающий при своем связывании с белком только
одну молекулу воды, не будет конкурировать с ней в связывании. (Этот вывод на
самом деле тривиален, так как отражает большую доступность воды в водном
растворе.) Однако, если молекула-лиганд крупная и поэтому при связывании
смещает несколько молекул воды, ситуация становится обратной. Можно пред-
полагать, что лиганд, смещающий 10 молекул воды, образует столько же связей с
молекулой белка, сколько их образовывали эти 10 молекул воды. При условии ба-
ланса энергии данных связей величина ДЯ будет равна нулю. Однако высвобож-
дение 10 молекул воды может вызвать повышение свободной энергии в форме
энтропии на величину 10 • 2 = 20 ккал • моль-1, которая примерно в два раза
выше величины потери свободной энергии в результате связывания одной круп-
128
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
ной молекулы-лиганда, и благодаря этому будет происходить прочное связыва-
ние лиганда. Таким образом, энтропия благоприятствует связыванию крупных
лигандов.
4.10. Свободная энергия конфигурации
Образование комплексов может сопровождаться значительными изменениями
конформации взаимодействующих молекул. При анализе реакции связывания
с белком мелких молекул-лигандов, структурные изменения в мелкой молекуле не
рассматриваются, поскольку мелкие молекулы не обладают существенной гибко-
стью. В то же время белки иногда подвергаются крупным конформационным из-
менениям при связывании мелких молекул-лигандов, что обусловлено аллостери-
ческими взаимодействиями (см. гл. 5).
Конформационные изменения, индуцированные связыванием, часто рассмат-
ривают как ограничение числа конфигураций. Таким образом, часть молекулы
может до связывания вести себя как случайный клубок (см. гл. 3), но в результа-
те связывания принять определенную конформацию (рис. 4.4). Для таких моле-
кул связывание и укладка происходят как сопряженные процессы. Для сравнения
рассмотрим модель тепловой денатурации белка. Согласно этой модели, натив-
ное состояние белковой молекулы представляет собой единственную специфиче-
скую конфигурацию, тогда как денатурированное состояние означает поведение
случайного клубка. Анализ этой модели позволяет вычислить изменение энтро-
пии при укладке белковой молекулы, в расчете на аминокислотный остаток (см.
разд. 3.11). Если известно, сколько остатков охватывает упорядочение в результате
связывания, можно на основе величины изменения энтропии в расчете на один
остаток оценить ожидаемое изменение энтропии конфигурации, вызванное упо-
рядочением связанного пептида.
Для проверки этой идеи были использованы термодинамические и структур-
ные данные (Spolar, Record, 1994) С целью получения уравнений, подобных урав-
нениям (4.25) и (4.30), определяли вклады поступательного и вращательного дви-
жения в свободную энергию связывания. Энтропию взаимодействия гидрофобных
поверхностей вычисляли на основе площади контактов углеводородных участков
(см. разд. 2.8). Эти величины вычитали затем из определенной экспериментально
Рис. 4.4. При связывании белком пеп-
тида, имеющего конформацию случай-
ного клубка, пептид приобретает ста-
бильную конформацию, что сопряжено
с неблагоприятствующим связыванию
уменьшением энтропии
4.11. Связывание белков в мембране — уменьшение числа измерений
129
величины Д5° реакции связывания. В случае некоторых реакций связывания она
была меньше суммы рассчитанных вкладов, и такие реакции интерпретировали
как жесткие ассоциации (примером их может служить связывание субтилизином
его ингибитора). Структурные данные подтверждали то, что в этих случаях не про-
исходит существенных конформационных изменений. В то же время при других
реакциях связывания расчет показывал значительную избыточную энтропию, свя-
занную с изменением свободы конфигурации. Эту величину избыточной энтро-
пии делили на величину энтропии, относящуюся к одному аминокислотному ос-
татку, чтобы определить число остатков, участвующих в укладке молекулы при
связывании.1 Полученные результаты сравнимы с оценками, произведенными на
основе данных рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектров.
Приведенный анализ хорошо иллюстрируют данные, полученные для фермен-
та рибонуклеазы А. Этот белок способен расщепляться на два фрагмента, один из
которых представляет собой пептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков
и названный S-пептидом. Два пептида, образующиеся при расщеплении рибонук-
леазы, способны реассоциировать, и это позволяет измерить энтропию данного
изменения белковой молекулы. Для S-пептида были вычислены вклады поступа-
тельного, вращательного и колебательного движения, а также взаимодействия гид-
рофобных поверхностей в свободную энергию связывания. Остаток после их
вычитания был принят за вклад свободы конфигурации. Деление этой величины
энтропии конфигурации на величину данной энтропии в расчете на аминокислот-
ный остаток позволило определить, что процесс упорядочения структуры при об-
разовании комплекса охватывает 14 из 20 остатков, образующих данный пептид.
Анализ структурных данных показал, что укладка молекулы при связывании двух
пептидов распространяется на 17 из 20 остатков. Таким образом, при данной реак-
ции связывания изменение энтропии близко к его значению, рассчитанному для
превращения структуры S-пептида из случайного клубка в фиксированную кон-
формацию (рис. 4.4).
4.1 I. Связывание белков в мембране —
уменьшение числа измерений
Если белок локализован в мембране, свобода его поступательного движения огра-
ничена двумя измерениями, т. е. он способен перемещаться только в плоскости
мембраны (рис. 4.5). Мембраносвязанные белки обычно не смещаются в направ-
лении поперек мембраны, т. е. внутрь и наружу из липидного бислоя. Как правило,
их ориентацию в мембране фиксируют трансмембранные сегменты молекулы
и эти белки могут только вращаться вокруг единственной оси, перпендикулярной
плоскости мембраны. Таким образом, заякоривание белков в мембране ограничи-
вает свободу их перемещения и тем самым снижает энергетический (энтропий-
ный) барьер образования комплексов.
1 В цитируемой работе (Spolar, Record, 1994) использовали величину энтропии укладки в рас-
чете на аминокислотный остаток, равную 5,6 кал -К-1, основываясь на собственном анализе теп-
ловой денатурации большого числа белков.
130
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Рис. 4.5. Поступательное движение белка
в мембране ограничено двумя измерения-
ми. Вращение белка может происходить
только вокруг оси, перпендикулярной
плоскости мембраны.
При образовании комплекса из двух мембраносвязанных белков исчезают
только две степени свободы поступательного движения вместо трех и вклад этого
движения в свободную энергию составляет не 8,4 ккал • моль"1, а 5,6 ккал • моль"1.
Одновременно исчезает одна степень свободы вращательного движения, и вклад
его составляет не 8,2 ккал моль"1, а 2,7 ккал • моль"1. Комплекс белков в мем-
бране обладает только тремя новыми модами колебательного движения, а не
шестью, и вклад этого движения в свободную энергию варьирует от —2,3 до
—3,2 ккал • моль"1 вместо тех значений, которые дает уравнение (4.33). Эти вклады
в сумме составляют величину свободной энергии 5—6,1 ккал • моль"1, которая
должна быть ниже, чем вклад энергетически благоприятных связей. Она также
значительно ниже, чем энергетические барьеры (энтропия) для связывания двух
молекул в растворе, вычисленные в предыдущих разделах. Это означает, что две
белковые молекулы легче связываются, если они локализованы в мембране. Таким
образом, связывание белков с мембраной облегчает образование ими молекуляр-
ных комплексов. Этот эффект называют уменьшением числа измерений. Он спо-
собствует реакциям связывания, делая мембраны наиболее подходящим местом
осуществления некоторых сигнальных процессов.
Уменьшение числа измерений не только способствует связыванию белков, но
также несколько ускоряет эти реакции. Благодаря разделению процесса на два эта-
па может потребоваться меньше времени для столкновения двух свободно диф-
фундирующих молекул. На первом этапе молекулы связываются с мембраной. За-
тем происходит их столкновение в результате диффузии в мембране. И процесс
связывания с мембраной, и зависимое от диффузии образование комплекса в мем-
бране могут протекать быстрее, чем зависимое от диффузии связывание при пол-
ной свободе перемещения в трех измерениях. Кинетический анализ этих процес-
сов приведен в разд. 8.8 и 8.9.
4.12. Связывание с мембраной
Ограничение поступательного и вращательного движения белка в мембране влия-
ет на распределение этой молекулы между водной фазой и мембраной. Это необхо-
димо исследовать для объяснения механизма связывания белков с мембраной.
Мембраносвязанный белок может перемещаться только в двух измерениях, а не
в трех, как белок в водной среде. Следовательно, при связывании с мембраной он
теряет одну степень свободы поступательного движения Потеря этой одной степе-
ни свободы количественно эквивалентна 1/3 величины, определяемой из уравне-
Задачи
131
Рис. 4.6. Белок в мембране имеет одну колебательную моду, перпендикулярную плоскости мем-
браны (прямая двойная стрелка), и две либрационные моды, одну в плоскости рисунка (закруг-
ленная двойная стрелка) и другую в плоскости, перпендикулярной плоскости рисунка (не пока-
зана).
ния (4.25), т. е. 2,8 ккал • моль"1. Мембраносвязанный белок может вращаться
в мембране вокруг одной оси, а не трех, как в растворе. Потеря двух степеней
свободы вращательного движения количественно характеризуется величиной,
равной 2/3 величины, вычисляемой из уравнения (4.30), т. е. 5,5 ккал • моль"1.
Таким образом, связыванию белка с мембраной противодействует энергия, равная
8,3 ккал • моль"1.
После связывания происходят определенные колебания вдоль оси молекулы,
перпендикулярной мембране, а также колебание этой оси в плоскости мембраны
(рис. 4.6). Эти вклады в энергию связывания определены в работе Бен-Шоула с со-
авт. (Ben-Shaul et al., 1996) как равные в сумме 3,7 ккал • моль"1. В случае пептида,
содержащего большое число гидрофобных остатков, энергия, высвобождаемая
при иммерсии в липидном бислое, может существенно превосходить это противо-
действие и обеспечивать прочное связывание с мембраной. Тем не менее при опре-
делении величины энергии связывания необходимо учитывать фактор иммобили-
зации.
Задачи
1. Выведите уравнение (4.11) из уравнения (4.9).
2. Вычислите предел для уравнения (4.12) при Кп » ..Кп_х.
3. Рассчитайте величину изменения свободной энергии вращательного движения
для связывания О2 с одним связывающим участком в молекуле миоглобина или
гемоглобина, с учетом того что вращение вокруг оси связи О—О не различается
для связанного и свободного О2.
4. Определите изменение свободной энергии поступательного движения в реакции
связывания, при которой лиганд размещается внутри кубической полости с дли-
ной стороны 1 А (температура 298 К).
5. При условии, что взаимодействие белка с лигандом обусловлено только водород-
ными связями, характеризующимися энергией -2,5 ккал • моль-1, рассчитайте,
сколько примерно необходимо водородных связей, чтобы константа диссоциации
была равна 1 мкМ или 1нМ, без учета смещения молекул воды (температура
298 К).
6. При условии, что связывание обеспечивается взаимодействием гидрофобных по-
верхностей, рассчитайте, какой примерно величины должна быть площадь кон-
такта, чтобы константа диссоциации была равна 1 мкМ или 1 нМ. Считайте, что
132
Глава 4. ОБРАЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
эффекты смещения воды уже учтены в параметре, связывающем свободную энер-
гию с площадью контакта гидрофобной поверхности с водой (см. разд. 2.8).
7. На примере идеальной полимерной молекулы с известной величиной /эфф, у кото-
рой концы могут связываться один с другим, рассчитайте, какой длины должна
быть цепь, чтобы свободный лиганд (присутствующий в концентрации 1 мМ и хи-
мически эквивалентный одному из концов полимера) мог сместить половину дли-
ны концевых участков полимера (см. разд. 3.7).
8. Рассмотрите идеальную цепь (с известной величиной /эфф), концы которой могут
связываться с двумя ее различными участками, разделенными отрезком г. Как
должна варьировать свободная энергия связывания в зависимости от длины цепи
(см. разд. 3.8)?
9. Рассчитайте свободную энергию колебательного движения при 298 К для атома 16 Да,
удерживаемого на месте силой потенциала Леннарда—Джонса (е = 2 ккал • моль-1
иг°= 1А) (подсказка: используйте вторую производную, вычисленную для мини-
мального значения силовой постоянной). Сравните величину свободной энергии
колебательного движения, обусловленную этой энтропией, с глубиной минимума
потенциальной энергии (е).
Глава 5
Аллостерические взаимодействия
В предыдущей главе при описании реакций связывания белков с лигандами отме-
чалась роль образуемых ими молекулярных комплексов в передаче клеточных сиг-
налов. В данной главе мы рассмотрим принцип, на основе которого реакции свя-
зывания лигандов определяют биологические функции белков.
В качестве примера проанализируем механизм внутриклеточной сигнализа-
ции, основанный на связывании белков с их лигандами, и для этого будем исхо-
дить из положений теории образования молекулярных комплексов (гл. 4) и теории
конформационных переходов между макросостояниями (гл. 1). Ключевой предпо-
сылкой при синтезе этих теорий служит то, что и реакции связывания, и конфор-
мационные переходы происходят главным образом за счет нековалентных взаимо-
действий (см. гл. 2). Соответственно данному сходству механизмов макроперехо-
дов и реакций связывания величины их энергии лежат часто в одном диапазоне
значений, и благодаря этому реакции связывания способны инициировать кон-
формационные изменения белковых молекул, определяемые аллостерическими
эффектами. Рассмотрению аллостерических взаимодействий как механизма регу-
ляции функций белков и посвящена настоящая глава.
Термин «аллостерический», применяемый в молекулярной биологии, образо-
ван соединением греческих слов allo и steric и означает влияние на другой участок.
Классический пример употребления этого термина относится к известному меха-
низму регуляции каталитической активности фермента связыванием лиганда с ре-
гуляторным центром. Регуляторный центр может быть локализован совсем не в той
области молекулы фермента, где находится его активный центр, т. е. эти участки
молекулы структурно не перекрываются, что указывает на некий неочевидный ме-
ханизм влияния. Объяснение этого механизма было предложено в основополагаю-
щей работе Моно с соавт. (Mono et al., 1965), где впервые введено понятие аллосте-
рический эффект. Соответственно этому ключевому термину предложенная ги-
потеза получила название теория аллостерического взаимодействия, и термин
аллостерический переход стали применять для обозначения того особого типа кон-
формационных изменений, с которым связаны аллостерические взаимодействия.
5.1. Аллостерический переход
Приведем вначале основные положения теории аллостерического взаимодействия
на примере белка, способного находиться в двух функционально различных мак-
росостояниях. Согласно теории Моно с соавт, одно из этих состояний характери-
134
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
зуется как напряженное (Т, от англ, tense, напряжение), а другое как релаксирован-
ное (R, от англ, relaxed, расслабленное). Молекула способна переходить из одного
состояния в другое, и существует равновесие
Т R (5А)
Если белок представляет собой фермент, он может иметь низкую каталитическую
активность в Т-состоянии и высокую в R-состоянии. Если белок — ионный канал,
в Т-состоянии канал может быть закрытым и в R-состоянии открытым. Если бе-
лок — репрессор гена, он может в Т-состоянии связываться с ДНК и блокировать
транскрипцию, а в R-состоянии диссоциировать от ДНК. Эта идея как весьма об-
щая имеет много приложений.
Аллостерический переход представляет собой особый случай макроперехода.
Оба состояния, между которыми происходит аллостерический переход, являются
функциональными, и молекула белка в обоих этих состояниях имеет свернутую
структуру. Такой макропереход, как тепловая денатурация, не относится к аллосте-
рическому типу, поскольку молекула в развернутом состоянии не обладает функ-
циональной активностью. Важно отметить (ниже это рассматривается подробно),
что в обоих макросостояниях, между которыми возможен аллостерический пере-
ход, белок способен связывать лиганд. Таким образом, аллостерическое состоя-
ние — это состояние с нативной, компактной укладкой молекулы, характеризую-
щееся одним из минимальных значений потенциальной энергии. Переход из од-
ного аллостерического состояния в другое начинается как резкое изменение
конфигурации молекулы; в процессе перехода молекула приобретает конфигура-
ции с различными значениями энергии, но затем под влиянием внутримолекуляр-
ных взаимодействий возвращается в одно из низкоэнергетических состояний
с компактной укладкой, характеризующееся специфичностью связывания и функ-
циональной активностью.
5.2. Простейший случай: один связывающий участок
и один аллостерический переход
Рассмотрим принципы аллостерического взаимодействия на простейшем приме-
ре, которым может служить белок с единственным лиганд-связывающим участ-
ком, подвергающийся аллостерическому переходу между двумя конформациями.
Каждая из этих конформаций характеризуется своим сродством к лиганду, или аф-
финностью, в соответствии с чем можно записать два отдельных уравнения для ре-
акций связывания
T0+L^±T, (5Б.1)
R0 + L<==±R1, (5Б.2)
где L обозначает лиганд. Индексы при обозначениях состояний нумеруют связан-
ные молекулы лиганда, число которых в данном случае равно нулю или единице.
Изменение аффинности к лиганду при аллостерическом переходе свидетельст-
вует, что этот переход представляет собой такой сдвиг в конформации белковой
молекулы, в результате которого либо увеличивается число связей с лигандом,
5.2. Простейший случай: один связывающий участок и один аллостерический переход 135
Рис. 5.1. Аллостерический пе-
реход между двумя аллосте-
рическими состояниями, Т и R.
Более прочное связывание в
R-состоянии показано как бо-
лее полная комплементарность
форм связывающего участка
белка и молекулы-лиганда.
либо существующие связи становятся более прочными (рис. 5.1). Важная особен-
ность данного перехода состоит в том, что он является согласованным, т. е. изме-
нение конформации затрагивает всю молекулу белка и белок не может осуществ-
лять R-подобную функцию или Т-подобное связывание. С позиций молекулярной
физики белка это следует понимать так, что минимальная величина потенциаль-
ной энергии, соответствующая каждому аллостерическому состоянию, определяет
структуру всего белка. R-состояние и Т-состояние соответствуют различным ми-
нимумам многомерной функции потенциальной энергии, и на каждом из этих ми-
нимальных энергетических уровней состояние белковой молекулы характеризует-
ся своими значениями энергии связывания и функциональной активности.
При связывании лиганда структура белка не изменяется. Структура То по су-
ществу та же, что Т„ и структура Ro та же, что RP С учетом двух равновесных реак-
ций связывания и двух аллостерических переходов — между состоянием белка,
связавшего лиганд, и состоянием белка, не связавшего лиганд, — можно составить
следующую схему превращений белка
Кт
To + L<=± Ъ
Го fl I! г, (5В)
Ro *+ L < > Ri
Kr
где Kj и — это константы равновесия реакций связывания и Уо и ¥\ — константы
равновесия аллостерического перехода белка, не связавшего лиганд, и белка, свя-
завшего лиганд, соответственно.
Чтобы вывести уравнение зависимости биологической активности белка от
концентрации лиганда, предположим, что активность пропорциональна той фрак-
ции белка, которую составляют его молекулы в R-состоянии. Обозначив биологи-
ческую активность как А, запишем следующее уравнение
А _ [Белок в R-состоянии] _ [Ro] + [R,]
[Общий белок] [R о 1 + [R1 ] + [То 1 + [Ti 1
(5.1)
Теперь составим равенства для четырех констант равновесия, характеризующих
условия равновесия реакций, отраженных в приведенной выше схеме (5В).
К = Л1_
т [T0][L]
(5.2а)
136
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
KR =-2J-
[Ro][L]
(5.26)
[Rq]
[То]
(5.2в)
y =
1 [TJ
Из этих равенств можно выразить величины RH То и ?! через Ro. Например,
[То] = [Ro]/Ко (уравнение (5.2в)). Подставляя полученные таким способом выраже-
ния в уравнение (5.1), запишем уравнение
(5.2г)
д _ ___________[Rq] + [L]^r[Rq]________
[Ro] +[L]/^ [Ro] +[Ro]/Ko +[L]/Tr[R0]/^
Деление числителя и знаменателя в этом уравнении на Ro позволяет получить
уравнение для активности как функции концентрации лиганда
(5.3)
(5.4)
А 1 + 1/KO+[L]*R(1 + W
Как следует из этого уравнения, при [L] = 0 справедливо равенство
А= Ко/(1 +Т0), что эквивалентно [RJ/fRJ + [То]. Таким образом описывается
только переход между состояниями То и Ro [уравнение (5.2в)]. При очень высоких
значениях [L] уравнение (5.4) превращается в А = Ki/(1 4- KJ, что соответствует
только переходу между Т1 и R| (уравнение (5.2г)).
Напомним, что белок обладает активностью в такой конформации, которую
его молекула приобретает в результате связывания лиганда, и в отсутствие лиганда
активность белка минимальна. Соответственно этому мы можем считать величину
Yx очень незначительной и значение А при [L] = 0 близким к нулю. При очень вы-
соком значении [L] величина Yx должна быть очень большой и значение А достига-
ет единицы. Эти точки позволяют упростить уравнение (5.4). Вначале умножим
числитель и знаменатель на Ко
(5.5)
l + Ko + M^Kod + l/KJ
Поскольку величина Ко мала по сравнению с другими членами в числителе и зна-
менателе, эту константу можно не учитывать (за исключением тех случаев, когда
она входит в выражение для продукта), как и \/Yb поскольку величина Yx большая.
На основе этого получаем простое аппроксимирующее выражение
[L]^rK0
1 + [L]*rK0
Согласно уравнению (5.6), график функции, описывающей активность, пред-
ставляет собой прямоугольную гиперболу, подобно графику скорости реакции свя-
зывания. Зависимость активности белка от концентрации лиганда не отличима от
аналогичной зависимости скорости реакции связывания без аллостерического пе-
(5.6)
5.3. Связывание лиганда и ответный конформационный сдвиг
137
рехода [рис. 4.1 и уравнение (4.4)]. Это важный результат, поскольку можно было
бы ожидать, что для двух аллостерических состояний с двумя различными величи-
нами аффинности к лиганду эти зависимости будут качественно различными. Ал-
лостерический белок отвечает на лиганд как молекула с единственным лиганд-
связывающим участком, характеризующаяся аффинностью к лиганду, промежу-
точной между аффинностями в состояниях Т и R. Когда [L] = 1/(XRKO), А= 1/2
и скорость связывания составляет 1/2 максимальной. Если судить по кинетике
связывания лиганда, аллостерический белок ведет себя как молекула с единствен-
ным связывающим участком, обладая кажущейся аффинностью = KRYQ,
5.3. Связывание лиганда
и ответный конформационный сдвиг
Мы называем величину кажущейся аффинностью, поскольку это не действи-
тельная константа равновесной реакции связывания. Напротив, переменная KR
представляет собой действительную характеристику аффинности связывания, но
она не может быть определена по графику экспериментально полученной зависи-
мости связывания от [L]. Чтобы убедиться в этом, определим фракцию занятых
лигандом участков связывания в молекуле, обозначив эту фракцию В.
в = [Занятые участки] = [RJ + tTJ
[Общий белок] [Ro] + [RJ + [То] + [TJ V '
Используем вновь уравнения равновесия [уравнения (5.2а)—(5.2г)], чтобы выра-
зить все величины через Rq.
в = [L]^r[Ro] + [L]^r[Ro]/^
[R0] + [L]/rR[R0] + [R0]/r0 +[L]/rR[R0]/r
Разделив числитель и знаменатель на Rq и умножив на YQi получаем
в [L]r0/rR(l + l/^)
i + r0 + [L]№(i + W
Вновь допуская, что величина Уо мала, а У| велика, получаем аппроксимирующее
выражение
Это уравнение идентично уравнению зависимости доза—ответ [уравнение
(5.6)]. Таким образом, измерение скорости связывания позволяет определить то
же, что график доза—ответ, т. е. кажущуюся аффинность, = KRYQi и не позво-
ляет определить действительную константу равновесия реакции связывания.1
1 Существует возможность зафиксировать этап связывания отдельно от аллостерического пе-
рехода. Это осуществимо в том случае, если переход происходит относительно медленно. Техни-
ка быстрых измерений позволяет уловить момент связывания лиганда белком в Т-состоянии до
его перехода в R-состояние.
138
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Эти результаты объясняют, почему конформационный переход не выявляет-
ся в экспериментах многих типов. Аллостерический белок ведет себя, согласно
получаемым в них данным, как простой лиганд-связывающий белок, не подвер-
гающийся конформационному переходу. Схема активации, описываемая выраже-
нием
Р + L <=± Р*, (5.Г)
где Р — это белок и Р* — белок, активированный связыванием лиганда, бу-
дет удовлетворять графику зависимости связывания от концентрации лиган-
да или графику доза—ответ, точно так же, как простейшая аллостерическая мо-
дель.
Одно из наиболее важных заключений, которые можно сделать на основе дан-
ного анализа, состоит в том, что если на белок воздействовать неким образом, вы-
зывая изменение конформационного равновесия, кажущаяся аффинность связы-
вания также изменится, поскольку константа равновесия Уо является ее состав-
ляющей. Аллостерический переход носит характер общего сдвига, и структурное
изменение в месте, далеком от связывающего участка, может изменить А^каж по-
средством изменения Уо. Этим обусловливаются аллостерические взаимодействия.
Кривая связывания при этом изменяется, хотя в самом связывающем участке
структурных изменений не происходит. Данный вывод иллюстрируют примеры,
приведенные ниже.
5.4. Энергетический баланс конформационного перехода
для белка с одним лиганд-связывающим участком
Допустим, что переход белка из Т-состояния в R-состояние требует затраты энер-
гии. Источником энергии проще всего считать реакцию связывания лиганда, но
в действительности этот источник следует определять как разницу между величи-
нами энергии связывания лиганда молекулами в двух состояниях. В этом можно
убедиться, если проанализировать изменение свободной энергии на каждом этапе
изменения состояния белковой молекулы.
Схема (5В) отображает два пути, по которым возможен переход из Т0-состоя-
ния в Rj-состояние. Один путь проходит через состояние Тр вначале связывается
лиганд и затем происходит аллостерический переход. Другой путь — через состоя-
ние Rq: вначале происходит аллостерический переход и затем связывается лиганд.
Независимо от того, какой из этих путей чаще реализуется в действительности,
сам факт, что оба они существуют, имеет важное значение для анализа энергетики
белка. Это связано с тем, что если каждый из указанных этапов обратим, резуль-
тирующее изменение свободной энергии для того и другого путей будет одним
и тем же. Соответствующее уравнение энергетического баланса имеет следующий
вид
RT\nKT+RT\nY} =RT\nYQ+RT\nKR (5.11)
5.4. Энергетический баланс перехода для белка с одним лиганд-связывающим участком 139
Выражение в левой части этого уравнения соответствует пути через Т|-состояние,
в правой — через Ro-состояние. Из данного уравнения легко получить следующее
равенство1
=ад (5.12)
Таким образом, в выражении Ккаж = KRYQ правую часть можно заменить величиной
KTY}. Этот результат может быть также получен из условия детального равновесия
(понятие из теории скоростей реакций, согласно которой скорости прямой и об-
ратной реакций должны быть равны, если система находится в равновесии, и кон-
центрации в этом случае постоянны; см. разд. 7.3).
Если преобразовать уравнение (5.12) в следующее выражение
= (5.13)
Го *т
то можно видеть, что кратность изменения Кпри связывании лиганда эквивалент-
на кратности изменения константы равновесия связывания при аллостерическом
переходе. Умножение логарифма правой части уравнения (5 13) на ЯГдает величи-
ну разности между значениями свободной энергии связывания в двух аллостериче-
ских состояниях. Таким образом, движущей силой перехода в состояние R служит
изменение величины энергии связывания в энергетически выгодном направлении, а не
действительная энергия связывания сама по себе. Если лиганд связывается одина-
ково хорошо с молекулами в обоих состояниях, движущей силы для аллостериче-
ского перехода не будет, независимо от прочности связывания.
Этот процесс можно представить более наглядно с помощью его схематическо-
го изображения (рис. 5.2). Белок в Т-состоянии характеризуется в данном случае
большим числом внутримолекулярных взаимодействий и меньшим числом связей
с лигандом по сравнению с белком в R-состоянии. Уравнение (5.13) отражает ба-
ланс между превосходством в числе связей с лигандом (соотношение Ку/К^) и раз-
Рис. 5.2. Аллостерический пе-
реход при образовании комп-
лекса белок—лиганд, аналогич-
ный показанному на рис. 5.1, но
в данном случае с изображени-
ем ключевых связей (•-•). Внут-
римолекулярные связи в Т-со-
стоянии разрываются при пере-
ходе в R-состояние и образо-
вании новых связей с лигандом.
1 Уравнение (5.12) можно также вывести без рассмотрения свободной энергии. Четыре выра-
жения, описывающие условия равновесия, (5.2а)—(5.2г), указывают два способа расчета соотно-
шения концентраций молекул в любых двух состояниях, представленных на схеме Это позволяет
исключить данное соотношение и получить уравнение (5.12) как соотношение между константа-
ми равновесия (задача 1) Оно представляет собой основной результат для модели с петлей, та-
кой, как на схеме (5В) Независимо от того, содержит ли модель петли, константы равновесия
уже не являются независимыми одна от другой.
140
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
личием в относительной стабильности двух конформаций (соотношение Уо/У|).
Таким образом, чтобы лиганд служил эффективным сигналом, сила этих дополни-
тельных связей со связывающим участком должна превосходить силу внутримоле-
кулярных взаимодействий, стабилизирующих Т-конформацию. Легче всего пред-
ставить происходящие изменения как образование и разрыв связей, но связи могут
также растягиваться и смещаться от своих положений, характеризующихся мини-
мальной потенциальной энергией. Это относится к изменению практически всех
форм энергии, с которыми связана стабильность белковых молекул.
5.5. Рецепторы, сопряженные с G-белками
Сопряженные с G-белками рецепторы составляют весьма обширное семейство
белков, опосредующих ответы на химические сигналы и свет. Все белки этого се-
мейства содержат семь гидрофобных сегментов, пронизывающих плазматическую
мембрану и тем самым заякоривающих белок на клеточной поверхности. При свя-
зывании лиганда эти рецепторы переходят в активированное состояние и посред-
ством взаимодействия с GTP-связывающими белками (G-белками) инициируют
многоэтапный процесс передачи сигнала внутрь клетки.
Большинство рецепторов, сопряженных с G-белками, представляют собой мо-
номеры и имеют единственный лиганд-связывающий участок. Кинетики связыва-
ния с лигандом и функционального ответа этих рецепторов обычно имеют вид
кривых насыщения, соответствующих уравнениям (5.6) и (5.10). Однако прямое
сравнение таких графиков часто затруднено вследствие того, что связыванием ре-
цептора с G-белком инициируется каскад событий, т. е. между связыванием ли-
ганда и клеточным ответом имеет место несколько дополнительных этапов. Выяс-
нению деталей механизмов активации рецепторов, сопряженных с G-белками, по-
священы многочисленные исследования.
Один из подходов к этой проблеме основан на использовании сайт-
направленного мутагенеза для изучения лиганд-связывающего участка. Получая
мутации генов рецепторов, исследуют далее связывание лиганда мутантными ре-
цепторами и последующий биологический ответ. Однако, как следует из уравне-
ний (5.6) и (5.10), при концентрации лиганда, соответствующей точке полунасы-
щения либо реакции связывания, либо биологического ответа, кажущаяся кон-
станта связывания равна произведению KRYQ. Это позволяет предполагать, что
существует две возможные причины изменения кинетики насыщения рецептора:
1) мутации, затрагивающие участок связывания, с изменением KR и 2) мутации, за-
трагивающие другую область белковой молекулы, со сдвигом равновесия между
двумя аллостерическими состояниями и изменением величины Ко.
Один из сопряженных с G-белками рецепторов, мускариновый ацетилхолино-
вый рецептор, изображен схематически на рис. 5.3. Этот рецептор активируется
двумя близкородственными лигандами, ацетилхолином (нейромедиатор) и карба-
моилхолином (лекарственный препарат, имитирующий ацетилхолин). Для выяс-
нения локализации связывающего участка в молекуле этого рецептора были полу-
чены мутации, затрагивающие аминокислотные остатки, показанные на рис. 5.3,
А. Все эти мутации в той или иной степени влияли на связывание как ацетилхо-
лина (рис. 5.3, Б 1), так и карбамоилхолина (рис. 5.3, Б 2). Видя из рисунка, как
5.5. Рецепторы, сопряженные с G-белками
141
ДТ S120A Y148F Т231А Т234А Т502А Y506F Y529F Y533F Т537А
Рис. 5.3. А. Схематическое изображение мускаринового ацетилхолинового рецептора, показы-
вающее семь трансмембранных сегментов. Роль отмеченных аминокислотных остатков в свя-
зывании лиганда была изучена с помощью мутационного анализа. DRY (аспартат—аргинин—ти-
розин) — консервативная триада, влияющая на величину Yq. Б. 1. Диаграмма величин ККаж для
ацетилхолина в случаях рецептора дикого типа и его мутантных форм. 2. График Ккаж для карба-
моилхолина. 3. Соотношение Ккаж для ацетилхолина и карбамоилхолина. По Wess et al., 1990.
S — серин; A — аланин; T — треонин; F — фенилаланин; Y — тирозин; ДТ — дикий тип.
142
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
распределены в молекуле белка точки замен в результате мутаций, трудно предста-
вить, каким образом мелкие молекулы ацетилхолина и карбамоилхолина могли бы
взаимодействовать со всеми этими аминокислотными остатками.
Объяснить данные, полученные при изучении мутантных рецепторов, помога-
ет уравнение (5.10). Отметим, что величина Ккаж, равная KRYQ, зависит как от Ко, так
и от KR. Следовательно, мутация по аминокислотному остатку, непосредственно
участвующему в связывании, приведет к изменению KR и тем самым Ккаж. В случае
мутации, влияющей на Уо, Ккаж также изменится. Изменение Уо влечет за собой из-
менение в одно и то же число раз кажущейся аффинности связывания разных ли-
гандов, так что соотношение величин Ккаж для двух лигандов остается постоянным.
В отличие от этого, в тех случаях, когда мутации затрагивают аминокислотные ос-
татки, образующие связь с лигандом, KR, по-видимому, изменяется в различной
степени в отношении различных лигандов.
Соотношение величин Ккаж для ацетилхолина и карбамоилхолина отражает
график, приведенный на рис. 5.3, Б 3. Как показывает этот график, независимо от
изменений Ккаж для ацетилхолина и карбамоилхолина, соотношение этих величин
примерно одинаково (~3) для белка дикого типа и большинства мутантных белков.
Это указывает, что многие аминокислотные остатки, влияющие на связывание,
локализованы не в самом связывающем участке. Скорее они оказывают влияние
посредством аллостерического перехода. Лишь в случае двух мутантных белков
с нарушениями, затрагивающими позиции 502 и 537, наблюдается значительное
изменение этого соотношения. Неэквивалентные сдвиги в связывании этими бел-
ками ацетилхолина и карбамоилхолина нельзя объяснить только изменением По-
следовательно, затронутые данными мутациями остатки, близкие по расположе-
нию, как показывает схема (рис. 5.3, А), непосредственно взаимодействуют с ли-
гандом. Это более вероятно, чем их взаимодействие с остатками, локализованны-
ми в других областях молекулы рецептора. Как правило, такой анализ соотноше-
ний Ккаж для ряда сходных лигандов позволяет найти аминокислотные остатки,
участвующие в связывании лиганда (Jackson, 1993b).
Другой интересный подход к выявлению аллостерических эффектов в молеку-
лах рецепторов, сопряженных с G-белками, состоит в том, чтобы найти мутации,
изменяющие Ко в направлении повышения фоновой активности. Мутантные ре-
цепторы с повышенным уровнем независимой от лиганда активности сохраняют
способность отвечать на лиганд возрастанием активности, но величина Ккаж =
в этом случае выше, поскольку выше значение Уо.
Мотив D-R-Y, показанный на рис. 5.3, А, является высококонсервативным,
и предположительно он выполняет важную роль в стабилизации Т-конформации
этого белка. Замена остатка аспартата (D) в этом мотиве в молекуле а1В -адренерги-
ческого рецептора (этот рецептор опосредует реакции на эпинефрин и норэпи-
нефрин) остатком любой другой аминокислоты повышает фоновый уровень ак-
тивности (рис. 5.4; в этом случае активность состоит в активации фосфолипазы
С — мишени G-белка, активируемого а1В-рецептором).
График, представленный на рис. 5.4, отражает предсказываемую зависимость:
чем выше фоновая активность, тем выше К^. Однако можно пойти в предсказа-
нии и дальше, если вспомнить, что уравнения (5.6) и (5.10) были получены из бо-
лее сложных выражений на основе допущения, что величина Уо очень мала. В слу-
чае мутантных рецепторов с необычно высоким уровнем фоновой активности это
5.6. Взаимодействия связывающих участков
143
Рис. 5.4. График зависимости Ккаж от фоновой
активности. Каждая точка отражает результаты
двух измерений для одного молекулярного ва-
рианта а1В-адренергического рецептора. Кри-
вая получена путем подгонки уравнения (5.14).
(По Scheer et al., 1997.) Рецептор, мутантный по
позиции аргинина, не представлен, поскольку
для него получены аномальные результаты, воз-
можно вследствие нарушения взаимодействия
с G-белком.
Возрастание фоновой активности, %
допущение можно считать обоснованным. Тогда мы можем вернуться к выраже-
нию (5.9) и определить Ккаж путем подстановки В = 1/2 и решения уравнения отно-
сительно 1/[L]. Новое выражение для Ккаж будет иметь вид
r0*R(i+W
1 + У0
Это уравнение хорошо соответствует данным, представленным на рис. 5.4.
Предельное значение А^каж при высоком Уо равно примерно 3 мкМ1 и, согласно
уравнению (5.14), соответствует Я^(1 + 1/У,). Если »1, данная предельная вели-
чина становится равной KRi константе связывания для белка в R-конформации.
Это очевидно, поскольку при высоком значении Уо рецептор большей частью на-
ходится в R-состоянии, независимо от того, связал он лиганд или нет. В этом слу-
чае Т-состояние не реализуется.
Среди рецепторов, сопряженных с G-белками, можно найти много примеров
соответствия описанной здесь простой модели с одним связывающим участком
и двумя состояниями, однако при изучении некоторых белков этого семейства по-
лучены экспериментальные данные, с которыми данная модель не согласуется.
Для этих белков предложены модели с тремя аллостерическими состояниями
(Tucek, 1997).
5.6. Взаимодействия связывающих участков
Один из важных вопросов в теории аллостерических взаимодействий состоит
в том, чтобы объяснить, каким образом присоединение лиганда к одному связы-
вающему участку влияет на удаленные от него участки белковой молекулы. Рас-
смотрим этот механизм на примере односубъединичного белка, который связыва-
ет два различных лиганда в отдельных участках и подвергается аллостерическому
переходу (рис. 5.5).
Модель связывания лигандов А и В таким белком строится путем объединения
двух схем, подобных приведенной выше схеме (5В), и включает восемь состояний
(То, ТА, Тв, ТАВ, R^, Ra, Rb и Rab). Это более сложная модель, но для получения не-
которого представления о возможных взаимодействиях связывающих участков
не требуется производить ее полный анализ. Для упрощения рассмотрим случай,
144
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Рис. 5.5. Аллостерический переход, сопровождающийся увенличением аффинности к лиганду
двух связывающих участков на противоположных сторонах молекулы белка.
когда связывание любого из двух лигандов в отдельности не обеспечивает перехода
белка из Т-состояния в R-состояние (т. е. константы равновесия УА и Ув «1), тогда
как связывание обоих лигандов приводит к такому переходу (УАВ »1). При избытке
лиганда В участок его связывания в молекуле белка будет практически всегда за-
нят, но в отсутствие лиганда А доминирующим останется Т-состояние. Опишем
связывание лиганда А в присутствии избытка лиганда В, преобразовав схему (5.В)
в схему (5.Д)
^ГА
Тв + А < > Тдв
Гв|| Ц Гав (5-Д)
Rb+А > Rab
Ara
При Кв «1 переход из состояния Тв в состояние RB не происходит (то же справед-
ливо для УА и перехода ТА -> ЯА). Связывание второго лиганда приведет к аллосте-
рическому переходу, поскольку значение YAB больше единицы.
Ориентируясь на схему (5 В) и используя уравнение (5.10), можно получить
выражение для кажущейся аффинности связывания белка с лигандом А в при-
сутствии избытка лиганда В, Ккйж = К^У^ Аналогичным образом в присутствии
избытка лиганда А кажущаяся аффинность связывания лиганда В будет равна
^каж = ^rb^a- Используя условие энергетического баланса [уравнение (5.12)], вели-
чину можно также выразить как КТВУАВ и KjaYab для лигандов А и В соответст-
венно.
Эти величины интересно сравнить с кажущейся аффинностью связывания
в случае отсутствия второго лиганда. Поскольку связывание первого лиганда не
приводит к аллостерическому переходу, оно характеризуется аффинностями белка
в Т-состоянии, К1А и К1В (см. задачу 2). Сравнив эти величины с величинами Хтв УАВ
и ^TAKAB, которые равны кажущейся аффинности в случае избытка второго лиган-
да, можно убедиться, что каждый лиганд повышает сродство белка к другому ли-
ганду в УАВ раз.
Рассмотрим теперь тот случай, когда связывание одного лиганда служит доста-
точным условием перехода белка в другое конформационное состояние. Для этого
случая выявляется поразительная параллель с предыдущим. Здесь применимы ап-
проксимации, позволившие вывести уравнение (5.10) для схемы (5 В), поскольку
5.7. Модель Моно—Уаймена—Шанже
145
связывание каждого лиганда способно вызывать конформационный переход. Та-
ким образом, Ккаж = XraУо и = KRB Уо для А и В соответственно в отсутствие дру-
гого лиганда. При связывании любого из лигандов белок переходит в R-состояние.
Последующее связывание второго лиганда не вызывает аллостерического перехо-
да, и характеризующие его величины аффинности равны просто и KRB. Вновь
можно видеть, что связывание каждого лиганда повышает аффинность белка
к другому лиганду в одной и той же степени — в 1/У0 раз.
В обоих рассмотренных случаях один лиганд влияет на связывание другого
в отдаленном участке белковой молекулы. Ключевой вывод состоит здесь в том,
что совместное изменение обоих связывающих участков обусловлено аллостериче-
ским переходом. Взаимодействия такого рода входят в общее понятие сцепление.
Сопряжение одного равновесного процесса с другим исследуют путем термодина-
мического анализа циклов с целью получить набор уравнений, связывающих раз-
личные параметры (Cantor, Schimmel, 1980).
Эти примеры относятся к связыванию одного лиганда при условии, что другой
лиганд отсутствует или присутствует в насыщающей концентрации. Однако, когда
второй лиганд присутствует в промежуточной концентрации, наблюдается качест-
венно иной эффект. Если А присутствует в промежуточной концентрации и кон-
центрация В варьирует, лиганд А будет связываться с частью рецепторов с кажу-
щейся аффинностью К^. Поскольку лиганд В занимает свой участок, остальные
участки для В на рецепторах, не связавших А, будут характеризоваться аффинно-
стью /СТА. Кинетика насыщения становится при этом двухфазной. Следовательно,
такой эксперимент выявляет два аллостерических состояния. Вариант этой модели
был использован при анализе рецепторов, сопряженных с G-белками, а именно
для объяснения двухфазного связывания адренергических рецепторов, а также из-
менения аффинности связывания лиганда под действием гуаниловых нуклеотидов
(De Lean et al., 1980). В этой системе, состоящей из двух белков, G-белок и сопря-
женный с ним белок-рецептор при связывании образуют комплекс, в котором
с рецептором связывается его лиганд и с G-белком связывается GTP. В результате
присоединения GTP к G-белку рецептор переходит в форму с высокой аффинно-
стью к лиганду, и аналогично этому связывание лиганда с рецептором приводит
к переходу G-белка в форму с высокой аффинностью к GTP.
5.7. Модель Моно—Уаймена—Шанже
До сих пор мы рассматривали односубъединичные белки. Однако уже в ранних ра-
ботах по изучению аллостерических взаимодействий целью было объяснить коо-
перативные процессы в мультисубъединичных белках. Идею о том, что коопера-
тивность в мультисубъединичном белке обусловлена аллостерическим переходом,
предложили Моно с соавт. (Mono et al, 1965), чтобы дать трактовку накопившимся
экспериментальным данным, полученным на различных белках. Эта идея лежит
в основе модели Моно—Уаймена—Шанже (называемой здесь далее моделью Моно
и др.).
Начальным объектом анализа в данной модели служит белковая молекула,
включающая п идентичных субъединиц, в каждой из которых присутствует один
связывающий участок. За исходное условие принимается, что эта молекула обла-
146
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
дает способностью к аллостерическому переходу с изменением аффинности свя-
зывания. Переход предполагает согласованное изменение третичной структуры
всех субъединиц и изменение четвертичной структуры белка в результате того, что
субъединицы перестраиваются относительно друг друга. Изменения третичной
и четвертичной структур, согласно условию, происходят совместно. Это предполо-
жение лежит в основе модели, и ее часто называют гипотезой согласованного пе-
рехода. Модель исключает независимые изменения третичной структуры индиви-
дуальных субъединиц. Для более мягких в этом отношении условий разработаны
другие модели (Кошланда—Немети—Фил мера и Сзабо—Капласа), рассматривае-
мые ниже в данной главе.
Чтобы описать модель Моно и др., вернемся к анализу макропереходов в муль-
тисубъединичных белках (разд. 1.6) и предположим, что единица кооперативности
эквивалентна числу субъединиц.
Рассмотрим последовательность этапов связывания для Т-состояния. Пока бе-
лок находится в этом состоянии, все реакции связывания характеризуются одной
и той же константой равновесия Кт. Аналогичным образом в R-состоянии все ре-
акции связывания определяются константой KR. Допустим, что при некоторой
степени занятости связывающих участков происходит аллостерический переход
Т —> R. Полная схема процесса записывается следующим образом
пКт У2(п-1)Кт Кт/п
To + L<=* Ъ + L Т2 T^ + L^T,,
г°1! Ну 1!у 1!у
Ro + L Ri + L Ri Rn-1 + L R*
пКн Kr/h
(5.Е)
Индекс, означающий число связанных молекул лиганда, варьирует от 0 до п.
Важно подчеркнуть, что величины и KR характеризуют связывание с индивиду-
альными участками. Использование этих констант связывания для реакций связы-
вания в данной модели требует учета множественных участков и множественных
состояний их занятости лигандом. Это означает, что Кт и KR необходимо умножить
на число участков, доступных для взаимодействия с новым лигандом при переме-
щении вправо и разделить на число тех занятых связывающих участков в состоя-
нии справа, которые могут стать свободными при движении влево. Таким образом,
умножение Кт и KR в схеме (5.Е) на л, (п — 1 )/2 и т. д. позволяет выразить константы
равновесия соответствующих реакций. С использованием этих коэффициентов
преобразуем уравнения (5.2а) и (5.26), характеризующие условия равновесия
к _ (/ + 1)[Т,Ч|]
т (л-/)ГГ,][Ц
(5.15а)
(5.156)
к _ G + l)[R,4il
R («-/)[R,][L]
Для каждого состояния занятости связывающих участков существует константа
равновесия аллостерического перехода
У. = [RJ
' [Т,]
(5.16)
5.7. Модель Моно—Уаймена—Шанже 147
1 Используя эти соотношения, можно вывести уравнение, описывающее ответ
белка на связывание, а также получить выражение для фракции занятых связы-
вающих участков. В качестве примера приведем здесь выведение последнего выра-
жения, оставив первое для самостоятельного выведения (задача 4).
Фракция занятых связывающих участков может быть выражена следующим
уравнением
в [R,]+2[R2]+...+/»[R„] + [T,]+2[T2]+...+»[T„]
л([К0] + [R, ] + [R2]+...+[R„] + [То] + [Т,] + [Т2]+...+[Т„]>
£/[R,] + £/[T,]
= - Ш------------ (5.17)
п £[r,]+£[t,i
1=0 1=0
Далее с помощью равенств (5.15а) и (5.156) можно получить выражения для [Л,]
и [7]] через [Ло] и [То]
[Т,] = и[Т0Ит[Ы (5.18а)
[Т2] = ^[Т,Ит[Ц = -^y^[T0](XT[L])2 (5.186)
Определяя тренд, получаем выражения для [7}]
(5.19а)
и для [Я,]
[R/] = 7-^[Ro1(*r[L])' (5-196)
Поскольку выражение п\/(п - /)!/! представляет собой множитель биномиального
разложения [уравнение (П1.7)], суммы в знаменателе уравнения (5.17) можно пре-
образовать следующим образом
X [Т,] = [То]£-(ВД' = [То](1+Ку [L])" (5.20а)
/=0
EIRJ = = [RoKI + ^rIL])" (5.206)
Суммы в числителе уравнения (5.17) можно оценить, взяв производные уравнений
(5.19а) и (5.196) по [L] и затем произведя умножение на tfT[L] или AfR[L]
£/[Т,] = [То]£/—(ЛГТ [LD- = «[То] АГТ[Ь](1+^[L])"-1 (5.21а)
ti Д (и-/)!/!
£/[R,] = [RoE?—[L])' = «[Ro] ATr[L](1+[L])"-1 (5.216)
to to
148
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Подставляя эти суммы в уравнение (5.17) и принимая [T0] = [R0]/}^ [уравнение
(5.16)], получаем уравнение, описывающее зависимость фракции связывающих
участков, занятых лигандом, от [L]
KR [L](1 + KR [L])+ (Кт [L]/y0)(l + Кт [L])
D = ------------------------------------- ( J.ZZ)
(l + /fR [L])” + (1/У0)(1 + ЛГТ[Ь])Л
В соответствии с уравнением (5.22) кривая связывания при п > 1 имеет сигмо-
идную форму. Это может показаться удивительным, поскольку модель не содержит
явного допущения, что связывание носит кооперативный характер. Каждое собы-
тие связывания трактуется в ней на основе условий равновесия простой реакции
взаимодействия. Кооперативность в модели Моно и др. диктуется условием согла-
сованности перехода: все субъединицы в составе белковой молекулы подвергаются
переходу совместно. Следовательно, когда белок находится в Т-состоянии и лишь
небольшое число связывающих участков занято лигандом, он легко переходит
в R-состояние. Тогда связывающие участки, оставшиеся пустыми, приобретают
большую аффинность и кривая связывания большую крутизну. Таким образом, мы
установили следующее важное положение: когда кооперативность связывания
в модели явно не предполагается, ее обусловливает условие кооперативности мак-
роперехода. Если принять фракцию белка в R-состоянии за показатель биологиче-
ской активности белка, кривая зависимости этой активности от [L] также будет
иметь сигмоидную форму (задача 4).
Величина п в уравнении (5.22) имеет гораздо большее значение, чем коэффи-
циент Хилла п в уравнении (4.7). В отсутствие допущения о согласованности свя-
зывания коэффициент Хилла не может быть приравнен действительному числу
связывающих участков. Модель Моно и др. более реалистична, поскольку допус-
кает варьирование числа занятых участков связывания. Таким образом, величина п
в этой модели отражает число субъединиц и должна иметь значение интегральной.
В случае гемоглобина, как отмечено выше, значение коэффициента Хилла равно
2,7, тогда как число субъединиц равно 4 (см. разд. 4.2.1). Теперь можно убедиться,
что уравнение (5.22) при п = 4 очень хорошо описывает кинетику связывания ки-
слорода гемоглобином. Следовательно, величина п в модели Моно и др. имеет зна-
чение не только показателя степени кооперативности.
5.8. Гемоглобин
Несмотря на то, что Моно с соавт. (Mono et al., 1965) создавали свою модель
для обладающих свойством кооперативности ферментов, они рассматривали
также и гемоглобин, называя его «почетным ферментом». В исследованиях на
гемоглобине впервые было установлено, что зависимость связывания от кон-
центрации лиганда имеет вид сигмоидной кривой, и этот белок послужил важ-
ным объектом для анализа физической основы кооперативности. Модель согла-
сованного связывания (разд. 4.2.1) может объяснить данный эффект на качест-
венном уровне при искусственном допущении, что связывание происходит
одновременно. Однако уравнение Хилла плохо согласуется с эксперименталь-
ными данными о связывании кислорода (рис. 5.6), если учесть, что число субъ-
5.8. Гемоглобин
149
Рис. 5.6. Результаты эксперимен-
тального измерения связывания ки-
слорода гемоглобином (квадраты),
соответствующие графику уравне-
ния (5.22) из модели Моно и др.
(сплошная кривая) и графику урав-
нения Хилла (уравнение (4.7)) (пунк-
тирная кривая). В обеих моделях п
было принято равным 4 (табличные
данные имеются в работе Szabo,
Karplus, 1972).
единиц в молекуле гемоглобина равно 4 и п должно иметь это значение. Напро-
тив, модель Моно и др. при п = 4 очень хорошо согласуется с экспериментальны-
ми данными.
Помимо хорошего совпадения с кинетикой связывания, подтверждением аде-
кватности модели Моно и др. служат и другие экспериментальные данные, полу-
ченные при более детальном изучении функции гемоглобина (Perutz et al., 1998).
Так, установлено, что кристаллическая форма гемоглобина в Т-состоянии связы-
вает О2 с низкой аффинностью и кривая связывания имеет форму простой равно-
бочной гиперболы, указывающей на отсутствие кооперативности (оно объясняет-
ся тем, что кристаллическое микроокружение препятствует изменению четвертич-
ной структуры). В случае кристаллической формы гемоглобина в R-состоянии
связывание происходит также некооперативным образом, но с высокой аффинно-
стью. Следовательно, в отсутствие аллостерического перехода не наблюдается коо-
перативности связывания, как и предсказывает модель Моно и др.
При Т-состоянии в молекуле действительно существует напряжение, под кото-
рым следует понимать сцепление субъединиц. Эту конформацию с высокой по-
тенциальной энергией обусловливает взаимодействие между субъединицами. Ко-
гда субъединицы диссоциируют, напряжение теряется; при этом составляющие
молекулу полипептиды связывают кислород некооперативно с высокой аффинно-
стью, характерной для R-состояния.
Функция гемоглобина регулируется, помимо прочего, рядом аллостерических
эффекторов. Один из них — это дифосфоглицерат, который связывается в единст-
венном участке на границе между субъединицами и влияет на аффинность гемо-
глобина к кислороду. Связывание кислорода зависит также от pH (эффект Бора).
В рамках модели Моно и др. эти данные можно объяснить предпочтительной ста-
билизацией одной конформации в результате связывания дифосфоглицерата или
протонов. Такие эффекторы, хотя и не взаимодействуют непосредственно с кисло-
род-связывающими участками, вызывают сдвиг кривой связывания в результате
предпочтительной стабилизации Т-состояния относительно R-состояния. Более
подробно данные эффекты рассмотрены в разд. 5.14, где описывается регуляция
активности гемоглобина.
ISO
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
5.9. Энергетика конформационного перехода по модели
Моно—Уаймена—Шанже
С помощью модели Моно и др. для мультисубъединичного белка можно проанали-
зировать, каким образом повышение прочности связывания может служить дви-
жущей силой конформационного перехода (см. разд. 5.4). Для наглядности алло-
стерический переход в молекуле тетрамерного белка с двумя занятыми участками
связывания лиганда схематически изображен на рис. 5.7. Здесь, как и на рис. 5.1
и 5.2, можно видеть, что, когда белок находится в R-состоянии, связывающий уча-
сток лучше соответствует форме молекулы-лиганда, чем при Т-состоянии.
Аллостерический переход сопровождается возрастанием энергии взаимодейст-
вия с лигандом, согласно следующему уравнению
ДД(7Ѱ = -RT \n(KR/KT) (5.23)
Это увеличение энергии связывания, отражающее повышение прочности взаимо-
действия между белком и лигандом, способно служить движущей силой аллосте-
рического перехода. При связывании двух лигандов (см. рис. 5.7) увеличение энер-
гии вдвое больше, чем показывает уравнение (5.23). Если конформационный пере-
ход в случае белка, не связавшего лиганд, характеризуется Д(7° =-/?Т1пУ0,
связывание лиганда в каждом участке будет изменять свободную энергию перехода
в соответствии с уравнением (5.23). Следовательно, изменение свободной энергии
при аллостерическом переходе как функция числа занятых связывающих участков
описывается следующим выражением
Д(7а°(/) = -/?Пп}< = -RT\nYQ-iRT\n(KR/KT) (5,24)
Это означает корректировку модели Моно и др. Чтобы получить условия рав-
новесия, при которых справедливо уравнение (5.22), следует ввести исходное до-
пущение об аддитивности. Уравнение (5.24) показывает, что имеет место одинако-
вое приращение энергии аллостерического перехода при взаимодействии лиганда
с каждым связывающим участком. Это представлено графически на рис. 5.8.
Рис. 5.7. Аллостерический переход в тетрамерном белке с двумя занятыми участками связыва-
ния из четырех. Источником энергии для перехода служит образование более прочных связей
между рецептором и лигандом.
5.10. АДДИТИВНОСТЬ НА МАКРО- И МИКРОУРОВНЯХ
151
Рис. 5.8. График зависимости свободной
энергии (в произвольных единицах) от 10-
степени занятости связывающих участ-
ков. Связывание лиганда приводит к по-
нижению свободной энергии обеих кон-
формаций рецептора. Поскольку при
R-конформации связывание более проч-
ное, график для этой конформации имеет
больший угол наклона. С увеличением
числа занятых участков графики сближа-
ются и пересекаются; при дальнейшем
возрастании числа занятых участков сво-
бодная энергия R-конформации падает
ниже свободной энергии Т-конформации.
8-
о-
Число занятых связывающих участков
Как показывает график, свободная энергия каждой конформации снижается
линейно по мере возрастания числа занятых лигандом связывающих участков. По-
скольку связывание лиганда белком в R-конформации отличается большей проч-
ностью, уменьшение свободной энергии при связывании лиганда каждым связы-
вающим участком белка в этой конформации больше, чем белком в Т-конформа-
ции. В случае, когда с рецептором не связан ни один лиганд, свободная энергия
белка в R-конформации, определяемая величиной -RT\nYQ, намного выше. По
мере заполнения связывающих участков разница между значениями свободной
энергии двух состояний белка уменьшается, пока две кривые не пересекутся и ус-
ловия не начнут благоприятствовать переходу в R-конформацию. Точка пересече-
ния кривых показывает, где приращение энергии в результате повышения прочно-
сти связывания лигандов превышает величину энергии, не благоприятствующую
аллостерическому переходу.
*5.10. Аддитивность на макро- и микроуровнях
Как показал анализ, приведенный в предыдущем разделе, модель Моно и др. зави-
сит от допущения об аддитивности величин ДД6Ѱ (изменение свободной энергии
при связывании) и Дба° (изменение свободной энергии при аллостерическом пере-
ходе). Поскольку изменения на низших уровнях структуры белка при этом не учи-
тываются, данную аддитивность можно назвать макроаддитивностью. Чтобы вы-
яснить, чем обусловлена макроаддитивность, следует обратиться к анализу изме-
нений на микроуровнях. Рассмотрим, какие следствия может иметь аддитивность
энергий отдельных связей. Проверка предположения об аддитивности на таком
уровне поможет выявить связь между различными взаимодействиями внутри бел-
ковой молекулы и ее взаимодействием с лигандом.
152
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Предполагаемая аддитивность требует доказательства, поскольку нельзя ис-
ключать того, что при взаимодействии лиганда с белком нарушаются внутримоле-
кулярные связи вблизи участка связывания. Если белок «мягкий», эти нарушения
могут распространяться и в случае перекрывания областей нарушений от различ-
ных связывающих участков энергия двух событий связывания не может быть адди-
тивной величиной.
Вначале опишем стабильность двух аллостерических состояний как зависимую
от двух различных совокупностей внутримолекулярных связей в белке. Одна сово-
купность связей, характеризующаяся энергией ет, стабилизирует Т-конформа-
цию; другая совокупность связей, характеризующаяся энергией er , стабилизирует
R-конформацию. Аллостерический переход сопровождается разрывом связей од-
ной совокупности и образованием новых. Таким образом, мы можем рассматри-
вать изменение свободной энергии при аллостерическом переходе как разность
величин энергии этих двух совокупностей связей
ДСа°=£еК-£ет (5.25)
Связывание лиганда также можно рассмотреть на уровне связей. Обозначим
общую энергию связей между белком и лигандом как el. Эта энергия составляет
лишь часть свободной энергии связывания. Как отмечено в гл. 4, последняя вклю-
чает также энергию поступательного движения, внутреннего вращения, колебаний
и конфигурации. Вклад энергии поступательного движения и вращения будет од-
ним и тем же для связывания лиганда с белком в различных аллостерических со-
стояниях, и поскольку мы пытаемся определить разность АА(7°, величины этих
вкладов не должны внести ошибки. Вклад энергии конфигурации также не будет
источником ошибки, если лиганд имеет одну и ту же конфигурацию при связыва-
нии с белком в Т-состоянии и R-состоянии. Изменение конфигурации белковой
молекулы уже учтено в связи с аллостерическим переходом, и в отсутствие такого
перехода вклад энергии конфигурации предполагается одинаковым при связыва-
нии лиганда с белком в различных конформациях. Значение колебаний зависит от
особенностей связей, стабилизирующих комплекс, и их вклад можно совместить
с вкладом, обусловленным связями между белком и лигандом. С учетом этих допу-
щений изменение энергии связывания, сопряженное с аллостерическим перехо-
дом, можно выразить как сумму изменений величин энергии связей между белком
и лигандом
ДД(7Ѱ = £5el (5.26)
Если связи, стабилизирующие комплекс белок—лиганд, не зависят от внут-
римолекулярных связей в белке, стабилизирующих два его аллостерических со-
стояния, для каждого занятого связывающего участка уравнение (5.26) можно
включить в уравнение (5.25). Это позволит определить изменение свободной
энергии аллостерического перехода как функцию числа занятых связывающих
участков
Д(7а°(/) = £ек -£ет +£5eL (5.27)
Данное уравнение, как и уравнение (5.24), показывает линейную зависимость от i.
5.11. Фосфофруктокиназа
153
Таким образом, можно сделать вывод, что макроаддитивность обусловлена
аддитивностью на микроуровнях, при условии что вклады всех соответствующих
связей аддитивные. Чтобы установить, действительно ли вклады указанных свя-
зей аддитивные, требуется рассмотреть некоторые более сложные аспекты (Jack-
son, 1997а). Многие взаимодействия, рассмотренные в гл. 2, не характеризуются
аддитивностью, однако большое расстояние между связывающими участками,
как правило, благоприятствует аддитивности. Таким образом, если связывающие
участки удалены один от другого, их вклады будут скорее всего аддитивными. Не-
которые связи, стабилизирующие аллостерическое состояние, могут находиться
вблизи участков связывания, и это может обусловливать неаддитивность между
энергиями связывания и энергиями аллостерического перехода. Однако, если
данный эффект является локальным, зависимость от i в уравнении (5.26) остается
линейной.
Таким образом, допущение о макроаддитивности, включенное в модель Моно
и др., правдоподобно при условии, что связывающие участки удалены один от
другого. Эти предположения не подвергались строгой проверке, но на данном эта-
пе мы можем считать, что аддитивность на микроуровнях обусловливает макро-
аддитивность и лежащие в основе модели Моно и др. допущения скорее всего дос-
товерны, в том случае если связывающие участки разделены большими расстоя-
ниями.
5.1 I. Фосфофруктокиназа
Модель Моно—Уаймена—Шанже создавалась ее авторами с целью объяснить
эффекты кооперативности и механизмы регуляции аллостерических ферментов.
Подобные ферменты имеют множественные субстрат-связывающие участки и, по-
мимо того, регуляторные связывающие участки, или регуляторные центры, с кото-
рыми взаимодействуют эффекторы, регулирующие активность фермента. Показа-
тельным примером таких ферментов может служить фосфофруктокиназа. График
зависимости скорости катализируемой ею реакции от концентрации субстрата
имеет сигмоидную форму, свидетельствующую о наличии кооперативности; раз-
личные эффекторы сдвигают кривую этой зависимости в соответствии с предска-
заниями модели Моно и др. (Blangy et al., 1968).
Фосфофруктокиназа катализирует фосфорилирование фруктозо-6-фосфата
с образованием фруктозо-1,6-дифосфата в реакции, протекающей с участием АТР.
Эта реакция представляет собой центральный этап гликолиза и поэтому ее регуля-
ция имеет важное значение для обеспечения клетки энергией. Можно было бы
ожидать, что ADP как продукт реакции должен выполнять роль ее ингибитора, од-
нако на самом деле происходит обратное: повышение концентрации ADP служит
сигналом того, что окисление углеводов не обеспечивает энергетические потреб-
ности клетки. В результате связывания ADP в регуляторном центре фосфофрукто-
киназы каталитическая активность фермента возрастает. Таким образом, ADP дей-
ствует как аллостерический активатор ферментативной активности. Регуляторный
центр удален от участка связывания АТР как субстрата (Schirmer, Evans, 1990).
В отличие от эффекта ADP, повышение уровней АТР, цитрата и фосфоенолпирува-
та служит сигналом того, что энергетический уровень в клетке высокий, и, когда
154
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Рис. 5.9. Схематическое изображение фосфофруктокиназы — тетрамерного белка с ката-
литическим и регуляторным центрами на каждой субъединице. Регуляторный центр при Т-кон-
формации в большей степени комплементарен аллостерическому ингибитору (показан свет-
ло-серым) и при R-конформации — аллостерическому активатору (черный овал). Два субстра-
та (показаны темно-серым) связываются более прочно активным центром при R-состоянии
белка.
любой из этих метаболитов связывается в регуляторном центре фосфофруктоки-
назы, каталитическая активность падает.
Молекула фосфофруктокиназы представляет собой тетрамер, и для иллюстра-
ции механизма ее аллостерической регуляции можно использовать рис. 5.7, доба-
вив в него регуляторный центр (рис. 5.9). Субстраты связываются в активных цен-
трах фермента, которые в результате аллостерического перехода приобретают вы-
сокую аффинность. Если переход происходит в молекуле фермента, когда не все
активные центры заняты, пустые активные центры легче связывают субстрат
и скорость фосфорилирования, катализируемого фосфофрукто киназой, возраста-
ет. Моно с соавт. (Mono et al., 1965) назвали такой тип аллостерического белка
К-системой; в этой системе изменяется аффинность связывания субстратов и ал-
лостерических эффекторов, но максимальная скорость реакции Имакс одинакова
при обеих конформациях белка (см. разд. 10.5). В случае К-системы возрастание
каталитической активности обусловлено повышением прочности связывания суб-
стратов и аллостерических эффекторов.
Теоретический анализ модели Моно и др. с включением в нее регуляторного
центра аналогичен выведению уравнения (5.22). В данном случае это основное
уравнение выражает долю занятых связывающих участков как функцию концен-
трации субстрата. Лиганд х, взаимодействующий с регуляторным центром, влияет
на каталитическую активность посредством изменения Yo. Таким образом, величи-
на Уо в уравнении (5.22) заменяется следующим выражением (Blangy et al., 1968)
l + ^RxM\
(5 28)
Индексы при константах связывания лиганда х в регуляторном центре фермента
указывают его конформацию, Т или R; лиганд х изменяет зависимость фермента-
тивной активности от концентрации субстрата только посредством изменения эф-
фективной константы равновесия аллостерического перехода. Направление и ве-
5.11. Фосфофруктокиназа
155
личина этого эффекта зависят от концентрации лиганда х и соотношения величин
Xrx и КТк.
Уравнение (5.22), содержащее член Уо, описывает зависимость скорости ре-
акции от концентрации лиганда в отсутствие аллостерического регулятора
(рис. 5.10). В случае участия активаторов и ингибиторов для получения графиков
скорости требуется использовать в уравнении (5.22) величину Ко'. В отсутст-
вие эффектора фермент демонстрирует выраженную кооперативность, тогда как
при добавлении эффектора значение KJ падает или возрастает. При этом индук-
ция перехода связыванием лиганда становится более легкой или затрудненной
и соответственно изменяется тот уровень концентрации субстрата, который не-
обходим для индукции перехода. В конечном итоге фермент достигает лимити-
рующего поведения Т- и R-конформаций. Плохое Т-поведение означает состоя-
ние белка, при котором значение величины Ко' настолько низкое, что, даже когда
все связывающие участки заняты, R-конформация недостижима. Отсутствие
аллостерического перехода приводит к разобщению связывающих участков,
вследствие чего кривая концентрационной зависимости теряет сигмоидную фор-
му. Плохое R-поведение имеет место, когда Уо' > 1 и белок всегда находится в
R-состоянии. При этом также не происходит аллостерического перехода и кри-
вая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата не имеет S-об-
разной формы. В каждом из этих предельных случаев кооперативность утрачи-
вается и аллостерический переход перестает служить фактором активности (см.
задачу 6).
Если рассматривать энергетику описанных эффектов, то приведенные дан-
ные можно интерпретировать как относительные сдвиги вверх и вниз двух ли-
[Фруктозо-6-фосфат], М
Рис. 5.10. Зависимость скорости ферментативного катализа от концентрации фруктозо-
6-фосфата, рассчитанная по уравнению (5.22) для различных значений Уо- Жирная линия —
фермент в отсутствие аллостерического регулятора: YQ = 2,5 • 10-7, Kr = 12 мкм и Кт = 25 мМ.
Сдвиг кривой вправо отражает ингибиторное действие фосфоенол пирувата (Уо = 2,5 • 1О“10 и
2,5 • 10-13). Сдвиг кривой влево отражает активирующее действие ADP (Yq = 2,5 • 10“4 и
2,5 • 10-1). Кривые для R- и Т-конформаций отражают предельные случаи в отсутствие аллосте-
рического перехода (см. Blangy et al., 1968).
156
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
нейных графиков на рис. 5.8. В случае, когда Уо' < ^о> разрыв между Ro и То воз-
растает и точка пересечения графиков сдвигается вправо. Если указанный раз-
рыв становится настолько большим, что графики не пересекаются, возникает
плохое Т-поведение. В случае, когда Уо' > Уо, имеет место обратное: точка пересе-
чения графиков сдвигается влево и в конечном счете возникает плохое R-пове-
дение.
5.12. Лиганд-зависимые каналы
Лиганд-зависимые каналы представляют собой класс мембранных рецепторов,
формирующих ионные каналы в плазматической мембране. Открывание и закры-
вание этих каналов обеспечиваются аллостерическими переходами белка, R-»T и
Т ->R соответственно. Такой белок можно представить как молекулу, изобра-
женную на рис. 5.7, если в центр между субъединицами добавить канал. В случае
никотинового ацетилхолинового рецептора аллостерические переходы регистри-
руются как в белке, связавшем лиганд, так и в белке, не связавшем лиганд (с ис-
пользованием метода регистрации одиночных каналов) (Jackson, 1994). В отсутст-
вие лиганда каналы открываются спонтанно с очень низкой частотой. В присутст-
вии лиганда каналы большей частью открыты, но периодически на короткое
время закрываются, не теряя лиганда (рис. 5.11). Графики свободной энергии от-
крытого и закрытого состояний в зависимости от числа занятых связывающих
участков имеют линейный характер, как следует ожидать в случае макроаддитив-
ности.
Рис. 5.11. Запись тока одиночного канала, непосредственно отражающая аллостерический пе-
реход в молекуле каналообразующего белка, связавшего лиганд и не связавшего лиганд. Этот
белок — рецептор ацетилхолина — состоит из пяти субъединиц и содержит два связывающих
участка.
5.13. Взаимодействия между субъединицами: модель Кошланда—Немети—Филмера
157
Мутации, затрагивающие различные области молекул лиганд-зависимых кана-
лов, приводят к сдвигам Ккаж. Аминокислотные остатки, ответственные за связыва-
ние лиганда, четко установлены для никотинового ацетилхолинового рецептора,
и в результате обнаружено, что многие мутации, изменяющие затрагивают
участки молекулы, значительно удаленные от участков связывания лиганда. В ча-
стности, величина Ккаж весьма чувствительна к заменам аминокислотных остатков,
формирующих путь прохождения ионов через канал. Причина состоит в том, что
эти остатки участвуют в образовании и разрыве связей при переходе, регулирую-
щем состояние канала, и соответственно сильно влияют на величину Уо (Jackson,
1997а). Большое количество экспериментальных данных, полученных в исследова-
ниях на никотиновом ацетилхолиновом рецепторе, подтверждает многие предска-
зания модели Моно и др. (Jackson, 1998).
Большинство лиганд-зависимых каналов в действительности имеет по мень-
шей мере три аллостерических состояния. Очевидны открытое и закрытое состоя-
ния, но требуется рассматривать и третье состояние, которое позволило бы объяс-
нить тот факт, что длительное присутствие лиганда вызывает закрывание канала,
т. е. его десенситизацию. Десенситизация служит внутренним тормозящим меха-
низмом, препятствующим тому, чтобы канал был открыт лишнее время. В некото-
рых случаях десенситизация происходит очень быстро и ограничивает постсинап-
тический ответ несколькими миллисекундами. Десенситизация требует отдельно-
го аллостерического состояния рецептора, в котором он связывает лиганд даже
с большей аффинностью, чем в открытом состоянии, но не проводит ионы. Высо-
кая аффинность в состоянии десенситизации установлена экспериментально. Вы-
сокоаффинный рецептор присутствует в небольшом количестве в начале экспери-
мента по определению связывания, показывая, что небольшое количество молекул
рецептора находится в десенситизированном состоянии в отсутствие лиганда
(Changeux, 1984).
5.13. Взаимодействия между субъединицами:
модель Кошланда—Немети—Филмера
Важное значение имеет вопрос о том, подвергаются ли все субъединицы в составе
белковой молекулы аллостерическому переходу согласованно, как предполагает
модель Моно и др. Альтернативной в этом отношении служит модель Кошланда—
Немети—Филмера (Koshland et al., 1966), в которой нет условия согласованности
перехода. Согласно модели Кошланда и др., каждая субъединица способна подвер-
гаться переходу индивидуально.
Данная модель предполагает, что каждая субъединица имеет различные кон-
формации с различными значениями аффинности связывания, но изменение сво-
бодной энергии при переходе в данной субъединице зависит от соседних субъеди-
ниц. Для формального описания такой зависимости требуется применение слож-
ного математического аппарата, но здесь с целью упрощения мы введем
допущение, что конформационный переход в каждой субъединице сопутствует
связыванию лиганда. Тримерный белок в таком случае имеет четыре состояния
(рис. 5.12). Субъединицы имеют между собой плотный контакт, если находятся
158
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Рис. 5.12. Тримерный белок, иллюстрирующий модель Кошланда и др. Энергетически неблаго-
приятные контакты между субъединицей, связавшей лиганд, и субъединицей, не связавшей ли-
ганд, «выталкивают» систему в полностью занятое или полностью свободное состояние.
в одинаковом состоянии; в другом случае контакт неплотный и энергия взаимо-
действия является положительной величиной.
В модели Кошланда и др. рассматриваются три энергетических параметра:
энергия связывания, разность значений внутренней энергии для каждой субъеди-
ницы в двух состояниях и энергия взаимодействий между субъединицами. В соот-
ветствии с условием, что связывание сопровождается конформационным перехо-
дом, можно объединить вклады этих двух факторов и принять за энергию одного
акта связывания разность значений свободной энергии (в расчете на одну субъеди-
ницу) белка, не связавшего лиганд, и белка с полностью занятыми связывающими
участками (состояния 0 и 3 соответственно на рис. 5.12). Определим эту разность
как , где — это константа связывания, включающая не только энергию,
относящуюся к взаимодействию белок—лиганд, но также энергию сопряженного
с этим взаимодействием конформационного перехода. Для характеристики взаи-
модействия между субъединицами важно учитывать, что они плотно контактиру-
ют, находясь в одинаковом состоянии (рис. 5.12). Когда связавшая лиганд субъе-
диница граничит с субъединицей, не связавшей лиганд, энергия взаимодействия
между ними равна -RT\nc Таким образом, для случая, когда занято i связываю-
щих участков и имеется j границ раздела между субъединицами с различными со-
стояниями по занятости связывающих участков, величина свободной энергии от-
носительно состояния 0 (рис. 5.12) составит AG° = -/RT\nKs - jRTlna.
В случае белка с одним занятым связывающим участком i = 1 и j = 2 (рис. 5.12).
Обозначив концентрацию лиганда [L], составим уравнение равновесия между бел-
ком с незанятыми связывающими участками и белком с одним занятым связываю-
щим участком, описав это равновесие как функцию двух основных параметров
свободной энергии
-ILL = 3e-AG°/^= 3eln£.+21n« = зк 2
[PoJ[L]
(5.29)
Множитель 3 соответствует числу путей перехода белка в состояние с одним заня-
тым связывающим участком. На этапе перехода из состояния с одним занятым
связывающим участком в состояние с двумя занятыми связывающими участками
значение у не изменяется (см. рис. 5.12) и величины [PJ и [Р2] имеют один и тот же
множитель, следовательно
[Р2] г
[PJ[L] s
(5.30)
5.13. Взаимодействия между субъединицами: модель Кошланда—Немети—Филмера
159
Наконец, на третьем этапе связывания лиганда два неплотных контакта сменяют-
ся плотными и соответственно величина j уменьшается вдвое. В этом состоянии
три участка могут терять лиганд и множитель равен 1/3
[Рз] _ Ъ
[P2][L] 3g2
(5.31)
Составим теперь выражение для фракции занятых связывающих участков
[Занятые участки] _ [Р, ] + 2 [Р2 ] + 3[Р3 ]
[Общее число участков] 3([Р0 ] + [Р, ] + [Р2 ] + [Р3 ])
(5.32)
Используя уравнения (5.29)—(5.31) для выражения [PJ, [Р2] и [Р3] через [Ро] и про-
изведя подстановки в уравнение (5.32), получаем
3[P0][L]^5ct2 + 6[P0]([L]X's)2ct2 + 3[P0]([L]/rs)3
3([Po] + 3[Pq][L]X'sct2 + 3[P0]([L]X's)2ct2 +[P0]([L]X's)3)
[LjA'sO2+2([L]A's)2ct2 + ([L]A~S)3
1 + 3[L]tfso2 +3([L]X's)2ct2 + ([LJX's)3
(5.33)
Поскольку величина о отражает взаимодействия между субъединицами, мож-
но путем варьирования значений этого параметра определить, как данные взаимо-
действия влияют на общие характеристики связывания. При значении энергии
взаимодействия, равном нулю, а = 1 и соответственно уравнение (5.33) принимает
следующий вид
в = №+2([L]/(s)2 + ([LK5)3 = [L]^S(1 + [L]^)2 = [L]/G
1 +3[L]XTS +3([L]/fs)2 + ([LJA'J3 (1 + [L]ATS)3 l + [L]tfs
Это выражение относится к случаю, когда субъединицы полностью независимы.
Напротив, если энергия взаимодействия между субъединицами очень велика, зна-
чение а падает до нуля и выражение для фракции занятых связывающих участков
приобретает вид
(№)3
i + №)3
(5.35)
Это выражение представляет собой уравнение Хилла, относящееся к согласован-
ному связыванию (см. разд. 4.2.1 и уравнение (4.7)).
Графики, соответствующие уравнению (5.33) для значений а, варьирующих от
О до 2, показывают, как с увеличением энергии взаимодействия между субъедини-
цами, связавшими лиганд, и свободными субъединицами форма кривых связыва-
ния изменяется от сигмоидной до гиперболической, отражающей кооперативный
эффект (рис. 5.13). При о < 0,02 (это значение соответствует энергии взаимодейст-
вия между субъединицами, равной 2,4 ккал • моль-1) график становится трудноот-
личимым от графика для предельного значения а = 0 (уравнение (5.35)). В то же
время значение а = 2 соответствует отрицательной (благоприятной) величине сво-
бодной энергии контакта между субъединицами с занятым и с незанятым связы-
160
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Рис. 5.13. График, соответствую-
щий уравнению (5.33) при Ks = 1
и указанных значениях ст.
вающими участками. Это указывает на отрицательную кооперативность — харак-
теристику, выходящую за пределы возможностей модели Моно и др.
Анализ модели Кошланда и др. для случая белка с четырьмя субъединицами
немного более сложен. Поскольку взаимодействие между субъединицами зависит
от специфической геометрии белковой молекулы, здесь требуется ввести большее
число допущений, и это затрудняет выявление общих тенденций. Например, субъ-
единицы тетрамерной молекулы могут располагаться в виде тетраэдра или квадра-
та, и свойства белка будут варьировать в зависимости от расположения субъеди-
ниц. По причине быстрого усложнения анализа с увеличением числа связываю-
щих участков модель Кошланда и др. имеет меньшее применение по сравнению
с моделью Моно и др., и в результате возможные эффекты взаимодействия между
субъединицами часто не рассматриваются.
Выявить конформационные изменения отдельных субъединиц в мультимер-
ном белке действительно весьма трудно, однако исключение из этого составляют
потенциал-зависимые каналы. Хотя функциональную перестройку этих белков
индуцирует изменение разности потенциалов, а не связывание лиганда, модель
Кошланда и др. применима к этому случаю. Получены многочисленные доказа-
тельства того, что индивидуальные субъединицы в этих тетрамерных (и мономер-
ных с четырьмя доменами) белках подвергаются конформационным переходам
независимо одна от другой. Переход канала из одного состояния в другое про-
исходит только после того, как все субъединицы принимают состояние, которо-
му благоприятствует положительная величина разности потенциалов. Ранние
модели регуляции каналов были основаны на допущении, что переходы в от-
дельных субъединицах происходят как независимые. Однако регистрация оди-
ночных К+-каналов позволила установить, что активация такого канала происхо-
дит через ряд приращений, которые можно объяснить переходами в отдельных
потенциал-чувствительных доменах (Chapman et al., 1997). Позже для тетрамер-
ных белков, образующих калиевые каналы, было установлено, что вследствие
мутации, затрагивающей лишь одну из субъединиц и приводящей к сдвигу потен-
циал-зависимости ее перехода, возникают также сдвиги потенциал-зависимостей
перехода соседних субъединиц (Tytgat, Hess, 1992). Это отражает энергию взаимо-
5.14. Модель Сзабо—Калласа
161
действия между соседними субъединицами, находящимися в различных кон-
формациях.
*5.14. Модель Сзабо—Калласа
С помощью рентгеноструктурного анализа установлена структура кристалличе-
ского гемоглобина в присутствии и в отсутствие кислорода (см. обзор Perutz et al.,
1998). Анализ этих данных показывает, что при аллостерическом переходе проис-
ходит разрыв связей, главным образом солевых мостиков, между субъединицами.
Благодаря разрыву связей изменяется расположение субъединиц и они претерпе-
вают структурные изменения. Такая перестройка приводит к повышению аффин-
ности связывающих участков к кислороду. Получение этих данных послужило сти-
мулом для более детальной разработки гипотезы аллостерических взаимодействий
(Szabo, Karplus, 1972). Гипотеза Сзабо—Капласа включает в термодинамическую
модель величины энергии связей на основе идеи, концептуально близкой понятию
аддитивности на микроуровнях (см. разд. 5.10). Далее в этом разделе рассматрива-
ется, каким образом простейший вариант данной модели, хотя он имеет в качестве
основы иную физическую картину, позволяет получить те же результаты, которые
дает модель Моно и др. При этом модель Сзабо—Капласа обладает преимущест-
вом, поскольку создает устойчивую конструкцию, позволяющую легко включать
в нее новые детали.
Модель Сзабо—Капласа базируется на анализе нескольких ключевых связей
между субъединицами и внутри них. Связывание О2 соответствующим участком
молекулы гемоглобина вызывает конформационный переход в данной субъеди-
нице, в результате которого происходит разрыв ее внутренних связей и связей
с другими субъединицами. Предполагается также макропереход в белке на уровне
четвертичной структуры между Т- и R-состояниями. Это аллостерический пере-
ход, и он существенно сходен с согласованным переходом, рассматриваемым
в модели Моно и др. Согласно модели Сзабо—Капласа, этот аллостерический
переход сопровождается разрывом всех ключевых внутренних связей и связей
с другими субъединицами. Таким образом, разрыв связей может быть либо ло-
кальным в результате связывания лиганда, либо общим вследствие аллостериче-
ского перехода.
Всем связям приписывается для упрощения одно значение энергии, £s, и каж-
дой субъединице придается i связей.
Энергия связывания О2 всегда включает энергию непосредственного взаимо-
действия О2 с гемом в составе связывающего участка. Кроме того, в эту энергию
связывания, —£в, вносят вклад различные типы случайного движения, рассмот-
ренные в гл. 4. Если межсубъединичные контакты и внутрисубъединичные связи,
сопряженные со связывающим участком, интактны, при связывании они подвер-
гаются разрыву, энергию которого также следует учитывать. Энергия связывания
в случае белка, находящегося в R-состоянии, составляет просто £в, поскольку от-
сутствуют связи, которые следует в нее включать (связи подверглись разрыву при
аллостерическом переходе). Энергия связывания с белком в Т-состоянии должна
включать энергии разрыва связей. Таким образом, она будет равна -(£в - /£s). Кон-
станты связывания определяются следующими выражениями
162
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
/;T=e(£B--£s)/«7’ (5.36а)
Л'к=е£“/яг (5.366)
Энергия изменения четвертичной структуры белка — аллостерического пере-
хода — включает внутреннюю компоненту, EQ, и компоненту, отражающую свя-
зи, способные подвергаться разрыву. В случае белка, не связавшего лиганд, все
4/ связи должны разрываться, в соответствии с чем энергия перехода равна
Eq 4- 4z£s. Эта величина количественно эквивалентна Уо в модели Моно и др.
Уо = e-(£<5+4Z£s)/'i7' (5.37)
По мере заполнения связывающих участков лигандом, связи, относящиеся к соот-
ветствующим субъединицам, разрываются, что способствует аллостерическому пе-
реходу. Когда все связывающие участки заняты, не остается связей, подвергаю-
щихся разрыву, и энергия становится равна просто величине q~Eq/rt, эквивалент-
ной Уо.
Основываясь на сведениях о кристаллической структуре, Сзабо и Каплас под-
считывали связи следующим образом. Четыре связи разрываются между двумя
а-субъединицами и еще одна связь — между каждой а-субъединицей и парной ей
0-субъединицей. При таком распределении связей i = 2 для обеих а- и 0-субъеди-
ниц. Внутренние связи в 0-субъединицах разрываются. Между двумя 0-субъедини-
цами связей не обнаружено. В соответствии с этим можно определить 9 состояний,
различающихся по величине фракции связывающих участков, занятых лигандом
(рис. 5.14). Значения энергии оцениваются по числу связей.
Константа равновесия для каждого состояния, представленного на рис. 5.14,
относительно базисного состояния рассчитывается добавлением числа занятых
лигандом связывающих участков и числа интактных связей. В статистический вес
состояний вносит вклад внутренняя энергия каждого занятого связывающего уча-
стка
к = tE*/R\
(5.38)
а также энергия каждой разорванной связи
5 = tE*/RT (5.39)
и энергия изменения четвертичной структуры (аллостерического перехода)
q = е-£о/*7- (5.40)
По рис. 5.14 можно определить, какой из этих энергетических вкладов имеет
место при каждом состоянии, и затем рассчитать величины констант равновесия
с учетом соответствующих величин статистического веса. Необходимо также
учесть дополнительный статистический фактор — число различных путей дости-
жения данного состояния занятости (его вырожденность). Этот коэффициент ра-
вен четырем для состояний с одним связанным лигандом, шести для состояний
с двумя связанными лигандами и четырем для состояний с тремя связанными ли-
гандами. Все эти значения используются при расчете фракции занятых связываю-
щих участков, как в случае уравнения (5.17). Выражая концентрацию каждого
5.14. МОДЕЛЬ СЗАБО—КАЛЛАСА
163
Рис. 5.14. Гемоглобин и в окси- и в дезоксиформе имеет девять различных состояний занятости
кислородом. Кружки и квадраты обозначают субъединицы, связавшие Ог и свободные соответ-
ственно. Линии между субъединицами показывают связи, которые образуются только в случае
дезоксиформы. Полукружия показывают внутримолекулярную связь в 0-субъединице. При свя-
зывании Ог связи разрываются. Значения статистического веса приведены в тексте.
164
Глава 5. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
состояния в зависимости от концентрации О2 с использованием констант равнове-
сия, получаем следующее равенство
^^4^2[О2]-н12>г22>4[О2]2-н12^3^6[О2]3+4А:4^8[О2]4-н^8^>г[О2]-н12А:2[О2]2-н12Л:3[С>2]3-н4А:4[О2]4)
“4(1+4^2[О2] + 6^254[О2]2+4^356[О2]3+^458[О2]4)+^8(1+4^[О2]+6^2[О2]2+4^3[О2]3+^4[О2]4) ’
Это выражение можно факторизовать с помощью биномиального разложения
в ряд (уравнение (П1.7)), чтобы получить уравнение, идентичное уравнению (5.22)
при п = 4
в = №2 (1 + [ОзК?2)3 + [О;К^8 (1 + [ОгЮ3 ,5 42>
(i+№2)4+9s8(i+[O2R)4
Если определить вклад различных величин энергии для некоторых связей бо-
лее детально или учесть различные количества связей, подвергающихся разрыву
при связывании лиганда с различными субъединицами, выражение будет сходным
с уравнением (5.41), но нельзя будет произвести факторизацию и упростить равен-
ство до уравнения (5.42).
Как в модели Моно и др., так и в модели Сзабо—Капласа в качестве механизма
влияния одних связывающих участков на другие предполагается изменение чет-
вертичной структуры белка. Хотя обе модели описывают один и тот же характер
связывания, модель Сзабо—Капласа дает важное физическое уточнение. В модели
Моно и др. не учитывается, что индивидуальные субъединицы могут независимо
претерпевать изменения четвертичной структуры. Согласно этой модели, связы-
вание усиливается при аллостерическом переходе непосредственно благодаря уси-
лению взаимодействия между лигандом и белком. В отличие от этого модель
Сзабо—Капласа предполагает, что связывание лиганда приводит к изменению чет-
вертичной структуры одной субъединицы, достаточному для изменения взаимо-
действия с другими субъединицами. Более прочное связывание в R-состоянии
объясняется разрывом связей, препятствующих связыванию лиганда. Изучение
структуры гемоглобина позволяет выявить различия в гем-содержащих связываю-
щих участках между Т-конформацией и R-конформацией, свидетельствующие
о прямом влиянии на связывание О2, как предполагает модель Моно и др. (Perutz
et al., 1998). Когда белок находится в R-конформации, атом железа лежит в плос-
кости гема, тогда как при Т-конформации этот атом выходит из плоскости гема
и молекула кислорода, локализованная с другой стороны, не может связываться
прочно.
Связи, учитываемые в модели Сзабо—Капласа, представляют собой солевые
мостики, образуемые ионизированными боковыми цепями аминокислотных ос-
татков. В зависимости от pH при разрыве этих связей состояние протонирования
данных боковых цепей изменяется. Гемоглобин весьма чувствителен к pH. Низкие
значения pH благоприятствуют Т-конформации и способствуют диссоциации О2
(эффект Бора; см. разд. 5.8). Модель Сзабо—Капласа предлагает адекватный учет
этого свойства белка. С ее помощью можно описать большинство данных, полу-
ченных к настоящему времени. Как установлено, а- и 0-субъединицы характеризу-
ются несколько различными аффинностями. Кроме того, как отмечено выше,
внутренний компонент аффинности связывания, отражающий непосредственное
взаимодействие между О2 и атомом железа, изменяется при аллостерическом пере-
Задачи
165
ходе. Модель Сзабо—Капласа используется для включения в анализ этих и других
свойств белка (Lee et al., 1988).
Задачи
1. Получите уравнение (5.12), используя четйре условия равновесия, указанные
уравнениями (5.2а)—(5.2г).
2. Найдите аппроксимирующую форму уравнения (5.9) для « 1. Установите, как
это объясняет использование Ку в разд. 5.6 для описания связывания первого из
двух лигандов. '
3. Используйте энергетический баланс, чтобы выразить отношение У0/^ав через ве-
личины констант связывания для полной модели с двумя лигандами (разд. 5.6).
4. Используя модель Моно и др., определите фракцию белка в R-состоянии как
функцию концентрации лиганда. Если биологическая активность связана только
с R-состоянием, это выражение будет представлять собой функцию доза—ответ
для данного белка.
5. Покажите, что выражение, полученное в задаче 4, превращается в уравнение (5.4),
когда п = 1 (используйте уравнение (5.12)).
6. Покажите, каким образом из уравнения (5.22) следует, что связывание имеет не-
кооперативный характер при Т- или R-состоянии белка в случае предельно низких
и предельно высоких значений Уо-
7. Получите выражение для константы равновесия аллостерического перехода кон-
формации мультисубъединичного белка, такого как фосфофруктокиназа, в при-
сутствии регуляторного лиганда, связывание которого характеризуется константа-
ми Kr* и Ку*. Результатом должно быть уравнение (5.28).
8. Составьте уравнение концентрационной зависимости связывания (фракции заня-
тых связывающих участков), согласно модели Моно и др., для тетрамерного белка,
в котором одна субъединица содержит лиганд, постоянно связанный с соответст-
вующим участком.
9. Постройте график связывания по модели Кошланда и др. для димерного белка.
Покажите, что при высоких значениях а две эффективные константы связывания
равны 2сК3 и К3/2с.
10. Постройте график связывания по модели Кошланда и др. для двух типов тетрамер-
ных белков, субъединицы которых образуют тетраэдр. Запишите выражения для
случаев а = 0 и а = 1.
Глава 6
Диффузия
и броуновское движение
В жидких средах внутри живых организмов многие молекулы присутствуют в сво-
бодном состоянии и перемещаются случайным образом. Характер беспорядочного
движения молекул важно учитывать для лучшего понимания динамики биохими-
ческих процессов, и описанию этого движения посвящена данная глава. Вначале
будут рассмотрены основные кинетические зависимости. В предыдущих главах,
посвященных анализу систем в состоянии равновесия и влияния различных усло-
вий на устойчивость этого состояния, практически не затронут вопрос о том,
сколько времени требуется для достижения равновесия. Переходя к описанию ди-
намики биологических систем, мы рассмотрим в данной главе общие закономер-
ности диффузии и броуновского движения, применимые для анализа многих про-
цессов. Описанию других подходов к анализу динамических процессов посвяще-
ны последующие главы.
6.1. Макроскопическая диффузия; законы Фика
(6.1)
В основе теории диффузии лежат два простых и основополагающих принципа.
Первый из них состоит в том, что вещество движется в направлении снижения гра-
диента его концентрации и поток вещества пропорционален величине градиента.
В определенных условиях, когда градиент и поток связаны линейной зависимо-
стью, диффузия описывается для одномерного случая выражением, которое носит
название первый закон Фика
J = -D—,
дх
где х — это точка измерения, С — концентрация в данной точке и D — коэффици-
ент диффузии. Переменная /означает поток и определяется как количество веще-
ства, проходящее через точку х (или через единичную площадку, перпендикуляр-
ную направлению потока) в единицу времени. Отрицательный знак свидетельству-
ет о том, что поток направлен в сторону уменьшения концентрации. В основе
данного уравнения лежит простое логическое заключение, что вещество движется
из области его большей концентрации в область меньшей концентрации.
Второе исходное положение, лежащее в основе теории диффузии, — это прин-
цип сохранения вещества. Если на малом отрезке, равном dx, поток на входе отли-
чен от потока на выходе, функция С(х) на данном элементе пространства изменя-
Решение уравнения диффузии
167
(6.3)
(6.4)
ется. Разность между двумя потоками — J(x) и J(x + Дх) — определяет накопление
вещества в области от х до x + dx за промежуток времени ДГ.
(J(x + Дх) - J(x)) Д/ = - ДСДх (6.2)
Данное уравнение указывает на сохранение вещества при диффузии, т. е. на то, что
не происходит ни потери, ни образования вещества.
Уравнение (6.2) можно свести к производным и преобразовать к следующему виду
5С = _cV
dt дх
Далее избавимся от J, объединив уравнения (6.1) и (6.3). Для этого продифферен-
цируем уравнение (6.1) по х, чтобы получить выражение для производной потока,
которое затем подставим в уравнение (6.3). Полученное в результате выражение
представляет собой уравнение диффузии, называемое вторым законом Фика
дС _Dd2C
dt дх2
Способ выведения этого уравнения показывает, что любой процесс, удовлетво-
ряющий указанным выше исходным допущениям, описывается данным уравнени-
ем диффузии. Градиент концентрации и поток должны быть связаны линейным
соотношением, и количество диффундирующего вещества должно сохраняться
неизменным. Этим условиям удовлетворяют также процесс рассеяния теплоты и
пассивное распределение напряжения в кабеле (см. гл. 15). В обоих случаях про-
цесс описывается уравнением диффузии (или неким близким уравнением).
Уравнение (6.4) описывает одномерный случай. Для трехмерного случая про-
странственную производную из уравнения (6.1) необходимо заменить градиентом
концентрации. При этом закон Фика превращается в векторное уравнение
5 =-DVC (6.5)
Одновременно следует заменить пространственную производную потока в одном
направлении (уравнение (6.3)) суммой трех пространственных производных по
трем различным осям или параметром дивергенции в векторных обозначениях
— = -V.J
dt
Тем же способом, объединяя два уравнения, исключим Лив результате получим
уравнение диффузии для трехмерного случая
— = DV2C,
dt
где V2 — оператор Лапласа (d2/dx2) + (d2/dy2) + (d2/dz2)-
(6.6)
(6.7)
6.2. Решение уравнения диффузии
Уравнение диффузии представляет собой уравнение в частных производных, опре-
деляющее изменение пространственного распределения вещества во времени. Ре-
шая это уравнение при известном начальном распределении С(х, у, z, /о), можно
168
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
получить распределение С(х, у, z, tz) для любого более позднего момента времени,
tv Решений данного уравнения может быть столько, сколько будет задано началь-
ных распределений. Исходным может быть, например, распределение с высоким
значением С при х=у=г=0и нулевым значением С при любых других условиях.
Можно также взять в качестве начального распределения произвольную функцию,
и ее изменение во времени будет описываться уравнением диффузии.
В то же время для решения уравнения диффузии недостаточно знать лишь на-
чальное распределение, поскольку на диффузию оказывают также влияние гео-
метрические условия, в которых она происходит. Такими условиями могут быть,
например, бесконечный объем, бесконечная трубка или замкнутый объем слож-
ной формы. Данные параметры представляют собой так называемые граничные
условия и определяют предельные значения Си/или его пространственных произ-
водных на границах рассматриваемого объема. Таким образом, для решения урав-
нения диффузии необходимо знать, помимо начального распределения вещества,
граничные условия. Если они известны, принципиально возможно найти
С(х, у, z, О; даже если аналитическим путем решение уравнения найти не удается,
его можно решить численными методами с помощью компьютера.
Математическому анализу уравнений диффузии посвящены многочисленные
исследования, и благодаря этому для большинства известных граничных и началь-
ных условий можно найти готовые решения в известных Учебниках (например,
Carslaw, Jaeger (1959); Crank (1975)). Здесь мы опишем несколько наиболее нагляд-
ных примеров, иллюстрирующих основные принципы теории диффузии.
6.2.1. Одномерная диффузия из точки
Рассмотрим следующие начальные условия: величина С бесконечно большая при
х = 0 и равна нулю при всех остальных значениях х. Для одномерного пространства
такую систему можно описать дельта-функцией С = Л/5(х), где М — общее коли-
чество диффундирующего вещества; при t = 0 общее количество диффундирующе-
го вещества определяется интегралом j C(x)dx = М. Бесконечно высокое значе-
ние С в бесконечно малой области, возможно, практически нереальное условие,
но для теоретического анализа это не имеет значения. Уравнение диффузии при
таких начальных условиях решается с помощью преобразований Фурье, и резуль-
татом является гауссова функция1
1 Применение преобразования Фурье к уравнению (6.4) для случая трехмерного пространства
позволяет получить уравнение (ПЗ. 15)
=-zy2cf(./;o.
dt
где/— переменная частоты, используемая в преобразованиях Фурье, и Cf — преобразование Фу-
рье для С. Решение уравнения имеет следующий вид
Cf(X/) = Cf(Z0)e-D/2',
где Cf (ft) — преобразование Фурье для начальных условий.
cf (р) = -4= f Wx^dx = М
6.2. Решение уравнения диффузии
169
С(х,Г) =
М 2-x2/(4Dt)
y/4nDt
(6.8)
Правильность решений проверяется путем их подстановки в уравнение (6.4). Интег-
рал по С(х,/) будет равен Л/при любых значениях t, что можно проверить с помощью
уравнения j е-ах dx = ^/(л/а) (уравнение П4.4); это служит доказательством сохра-
нения массы вещества. Таким образом, уравнение (6.8) согласуется с одним из пред-
положений, лежащих в основе исходного уравнения, как и ожидалось для решения
уравнения диффузии. Уравнение диффузии основано на условии сохранения вещест-
ва, и все получаемые решения следует проверять на соответствие данному условию.
Изменение распределения вещества во времени, С(х, /), иллюстрирует рис. 6.1.
Как и следовало ожидать, при диффузии распространение вещества увеличивается
во времени. Кривые распределения его концентрации симметричны относительно
х = 0 во все моменты времени, и значение С(0, t) в процессе диффузии падает. Кри-
вая при t = 0,01 показывает, как данная функция приближается к дельта-функции
при t -> 0.
Важной характеристикой процесса диффузии является то, что среднеквадра-
тичное смещение от начального положения возрастает пропорционально квадрат-
ному корню времени
Рис. 6.1. Графики решений уравнения
диффузии (уравнение (6.8)) при М = 1 и
D = 1/4 при указанных значениях времени.
X
о
и С можно вычислить из выражения для Cf с помощью обратного преобразования Фурье
C(x,t) = — [e’D/2'e'Ad/
2л Д
Наконец, уравнение (6.8) можно получить путем вычисления интеграла (см. уравнение (П4.7))
C(x,t) fe-«r W~2/(4*)d/ =
2л Zo
00 (f/Dt- * f
= _e-x /(4D/) fe 2^J d/ =
2л 1
__Л£е-х2/(4£>/) Q~x2/(4Df)
2л V Dt -UnDt
170
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
Тх2" = Vm (6.9)
Данный результат можно получить непосредственно из уравнения (6.8), если вы-
числить интеграл j x2C(x)dx. Кроме того, уравнение (6.8) показывает, что ширина
нормального распределения равна 4Dt. Можно также показать, что величинах, оп-
ределяемая из уравнения (6.9), означает позицию, где концентрация вещества по-
стоянна. На меньшем расстоянии от источника концентрация уменьшается, на
большем увеличивается (см. задачу 4 в конце главы).
Уравнение (6.9) широко используется для расчетов. Здесь оно выведено для од-
ного частного случая, но использование данного начального условия, диффузии из
точки, служит полезным общим подходом к анализу диффузии. Например, данное
выражение применимо для оценки того, сколько времени занимает диффузия ме-
таболита из клетки, если он образуется в ее определенной области. При типичном
значении коэффициента диффузии 10-6 см2 • с-1 величина Тх2” принимает значе-
ния 1 мкм для t = 5 мс, 3,2 мкм для t = 50 мс и и 10 мкм для t = 500 мс. При возраста-
нии значения t в 10 раз расстояние увеличивается в 710 =3,16 раз.
6.2.2. Трехмерная диффузия из точки
Решение уравнения для случая трехмерной диффузии весьма сходно с полученным
в предыдущем разделе. Для того, чтобы получить это решение, воспользуемся вме-
сто уравнения (6.4) уравнением (6.7). В данном случае нас интересует только рас-
стояние по радиусу от начальной точки, и поэтому оператор Лапласа должен быть
приведен к сферическим координатам (уравнение (П6.5))
дс п 1 д ( 2 дС}
dt г2 дг\ dr J
(6.Ю)
Решение сходно с решением, полученным для одномерного случая, но не идентич-
но ему
С(г,Г) =
М4пг2 г2/(4рр
(4nDt)3/2
(6.П)
На самом деле, если записать три уравнения вида (6.8) — для х, у и г, перемножить
их и затем ввести замену х2 + у2 + z2 = г2, результатом будет уравнение (6.11). (По-
скольку в уравнении (6.8) подразумевается dx, здесь необходимо также заменить
dxdydz величиной 4nr2dr; уравнение (П6.4).) Таким образом мы вновь получаем
нормальное распределение относительно центральной начальной точки. Путем
умножения уравнения (6.9) на корень квадратный числа измерений можно получить
уравнение распространения л/г2” = 7б/)Г. Для выведения этой простой зависимости
7^ от числа измерений используется пифагоров принцип сложения компонентов.
6.2.3. Диффузия через границу раздела
В случае контакта между двумя различными по концентрации растворами молеку-
лы растворенного вещества диффундируют через границу раздела. Рассмотрим
этот случай на примере трубки, заполненной с одного конца раствором и с другого
6.2. Решение уравнения диффузии
171
конца чистой водой. Примем, что трубка бесконечно длинная, т. е. исключим из
рассмотрения процессы на ее концах. Если считать, что при заполнении трубки не
произошло смешивания воды и раствора, в начальный момент времени С= Со при
х > 0 и С = 0 при х < 0 (границе раздела соответствует х = 0).
Найдем решение уравнения для одномерной диффузии, удовлетворяющего за-
данным начальным условиям. Для этого используем решение гауссовой функции,
полученное выше для случая диффузии из точки. Область, находящуюся справа от
границы раздела, будем считать бесконечным рядом бесконечно малых точечных
источников, для каждого из которых распространение вещества описывается урав-
нением (6.8). Если точечные источники расположены достаточно плотно, их сум-
му можно считать постоянной функцией (рис. 6.2).
Решением в этом случае будет наложение решений для всех точечных источни-
ков (рис. 6.1) при условии, что диффузия растворенного вещества из одной такой
точки происходит независимо от диффузии из всех остальных точек. Данное усло-
вие не является новым в теории диффузии, поскольку если бы имело место какое-
либо взаимовлияние молекул растворенного вещества, диффундирующих из раз-
личных точек, простая линейная зависимость между движущей силой и потоком
была бы невозможна и уравнение (6.1) не являлось бы верным. Линейные зависи-
мости можно суммировать, поэтому здесь для решения применяется суперпози-
ция.
На основе такого представления о диффузии через границу раздела суммируем
вклады всех точечных источников. Обозначив центр точечного источника х' и рас-
стояние между соседними источниками dx', получим выражение для С(х) в виде
интеграла в пределах малого dx'
С(х) = ,С° fe~(Jt'~J);/(40,)dx' (6.12)
^/4nDt /=0
Данный интеграл не имеет аналитического решения, но может быть преобра-
зован к виду особой функции, известной как функция дополнительной погрешно-
сти и имеющей следующий вид
erfc(x) = -r=Je у dy Рис. 6.2. Трубка (вверху) заполне- на справа от х = 0 раствором кон- центрации Со и слева раствором концентрации 0. Профиль концен- трации (внизу) диффундирующего растворенного вещества (сплош- ная кривая) представлен как бес- конечно большое число близко расположенных функций Гаусса (штриховые кривые). (6.13) С = 0 С = Со 0 х = 0 у\/ууууууууу\С(х) | '| '| '| '| '| '| '| '| '| 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
172
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
Рис. 6.3. Профили концентрации вокруг
границы раздела между раствором концен-
трации Со и чистой водой. Графики функ-
ции (6.14) построены для последовательно-
сти значений времени, начиная с t = 0.
(х^— х)
При замене переменной на z= , - уравнение (6.12) принимает вид
Tier
(6.14)
График данной функции (рис. 6.3) показывает размывание границы раздела во
времени. Градиент концентрации, резкий в начальный момент времени, постепен-
но становится все менее крутым. Это сходно с распространением вещества из то-
чечного источника. Следует отметить, что производная по х от уравнения (6.14)
имеет вид гауссовой функции, т. е. при диффузии через границу раздела градиент
концентрации вещества изменяется таким же образом, как концентрация вещества
при диффузии из точечного источника.
Данный способ решения можно применить для любого начального распреде-
ления концентраций, С0(х). С этой целью, рассматривая диффузию из каждой точ-
ки вновь как «расплывающуюся» во времени гауссову функцию, следует взять ин-
теграл по данному распределению
С(х) =
(6.15)
Сравните полученное выражение с уравнением (6.12).
6.2.4. Анализ диффузии с учетом граничных условий
До сих пор мы рассматривали диффузию в бесконечно большой области, и при
этом условии граничными условиями можно было пренебречь. Однако в том слу-
чае, когда пространство ограничено, необходимо учитывать его форму, определяя
диффузию на границах. В качестве примера рассмотрим открытую с двух сторон
трубку, заполненную раствором и помещенную в большой резервуар с водой
(рис. 6.4). Вода, таким образом, присутствует в избытке, и растворенное вещество
диффундирует из концов трубки. Когда молекула достигает того или другого конца
трубки, т. е. при х = 1 или х = -1, она фактически исчезает в результате разбавления.
6.2. Решение уравнения диффузии
173
Рис. 6.4. Трубка, заполненная раствором концен-
трации Со, помещена в большой контейнер с чис-
той водой. Растворенное вещество диффундиру-
ет из трубки в воду.
С = С0
С = о
С = о
о
X
Границу в этом случае называют поглощающей, и математически данное условие
записывается как С = 0 при х = 1 и х = -1. Отсюда следует, что решение уравнения
(6.4) должно удовлетворять данному условию при всех t > 0, и, кроме того, для него
должно выполняться начальное условие С = Со при -1 < х < 1 при t = 0.
В данном случае трудно применить гауссову функцию, полученную для случая
точечного источника, поскольку в нем не учитываются граничные условия. Здесь
следует использовать интегральное решение одномерного уравнения диффузии,
которое можно получить путем разделения переменных* 1
C(x,r) = (A cos(ax) + В sin(ox))e~a2 Dt (6.16)
Правильность данного решения проверяется подстановкой его в уравнение (6.4).
Уравнение (6.16) легко применить к случаю граничных условий, если подоб-
рать соответствующую пару констант А и В для тригонометрических функций
и ввести Со. Для решения задач по диффузии с учетом граничных условий обычно
используют преобразования Фурье.
Условие С = 0 при х = ±1 означает, что, когда a = пп/2 (где п — нечетное целое
число), граничным условиям будет удовлетворять любой косинусоидальный член
и, напротив, не будет удовлетворять любой синусоидальный член. В соответствии
с этим положим все В в уравнении (6.16) равными нулю и получим начальное рас-
пределение, состоящее из одних лишь косинусоидальных членов.
Прежде чем объединить эти косинусоидальные функции для получения пря-
моугольного начального распределения, пронаблюдаем поведение одной из таких
функций. Для начального распределения Со = Mcos(tix/2) из уравнения (6.16) по-
лучаем следующее решение уравнения диффузии
С(х,/)= Л/cos у е’("/2)2°'
(6.17)
1 Запишем С(х,/) как произведение двух функций, одна из которых зависит от х, а вторая от t
С(х,Г) = %(х)Т(Г)
Подставив данное выражение в уравнение (6.4) и произведя преобразования, получаем
1 дТ 1 д2Х
Dt dt X дх2
Переменная х не зависит от Г, соответственно вся правая часть выражения не зависит от t. В свою
очередь Тне зависит отх, т. е. вся левая часть выражения не зависит отх. Следовательно, обе час-
ти уравнения можно считать константой. Приравняв их этой константе, обозначаемой -а2, полу-
чаем решение данных двух уравнений
Т = e-a2/)z
X = A cos(ax) + Bsin(ax),
где А и В — произвольные константы. Перемножая Хи Т, получаем уравнение (6.16).
174
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
Данная функция равномерно убывает по длине трубки, сохраняя при этом косину-
соидальную форму В каждой точке концентрация убывает экспоненциально с одной
и той же скоростью. Суммируя эти функции, получаем выражение, описывающее
убывание концентрации в каждой точке, в виде суммы экспоненциальных функций.
Соотношение различных экспоненциальных функций в разных точках будет разным,
и, следовательно, динамика процесса в различных позициях будет различаться.
Вернемся к начальному условию С = Со в любой точке внутри трубки. Для дан-
ного случая с помощью преобразований Фурье можно получить следующую беско-
нечную сумму, представляющую собой прямоугольную функцию
Л'Г/ пч 4Г f ЛХ^ 1 ГЗлХ^ 1 Л57ГхЛ 1 (7тГхЛ /г юх
С(х,0) = Со — cos — --cos - +-cos -- —cos ---- ... (6.18)
л / 3 \ 2 J 5 \ 2 J 7 \ 2 J )
Чтобы решить это уравнение, преобразуем каждое из слагаемых к виду (6.17)
C(y а - с 4 Ггл/ях\-(л/2)2р' _ 1 гп/3ях V(3n/2)2/)' -
л 2 J 3 < 2 J
+lCosf—V(5"/2)2"-lcosf—J (6.19)
5 I 2 J 7 v 2 J )
Каждое слагаемое суммы, имея вид уравнения (6.16), удовлетворяет уравнению
диффузии. При t = 0 эта сумма преобразуется к виду уравнения (6.18), что соответ-
ствует начальному условию. На очень коротких промежутках времени крайние
значения весьма сходны с решениями для случая диффузии через границу раздела
(6.3). На больших промежутках времени быстро убывающие члены исчезают и в
результате остается уравнение (6.17) — равномерно убывающая косинусоидальная
функция. Следует также отметить, что члены в уравнении (6.19), соответствующие
более высоким пространственным частотам, затухают быстрее. Следовательно,
диффузия быстро разрушает большие пространственные градиенты, тогда как ма-
лые пространственные градиенты разрушаются медленно, что иллюстрирует об-
щую характеристику процесса диффузии — концентрации изменяются быстрее на
меньших расстояниях.
Рассмотренный пример относится к поглощающим граничным условиям, при
которых решение уравнения диффузии для границы должно быть нулевым. Если
концы трубки герметично закрыты, границы называют отражающими. Посколь-
ку поток (J) на такой границе равен нулю, из уравнений (6.3) и (6.5) следует, что
производные пространственной концентрации в направлении, перпендикуляр-
ном границе, также равны нулю. Для случая замкнутого пространства (рис. 6.3),
но с герметично закрытыми границами это означает, что уравнение включает си-
нусоидальные, а не косинусоидальные члены ряда Фурье (задача 5).
6.3. Диффузия при стационарном состоянии
В предыдущих разделах рассмотрены примеры изменения концентрации во време-
ни при диффузии. Однако важно проанализировать также случаи, когда концен-
трация остается постоянной во времени на большой области пространства, в ре-
6.3. Диффузия при стационарном состоянии
175
зультате того что диффундирующее вещество проникает в один участок и выходит
из другого с одинаковой скоростью. Таким образом, вещество диффундирует от ис-
точника к приемнику, и его концентрация вдоль этого пути непрерывно уменьша-
ется. В данном случае происходит постоянный поток вещества через систему, и
цри этом поток на входе в каждый элемент объема и поток на выходе из него пол-
нЬстью сбалансированы. Такое состояние системы называется стационарным и оп-
ределяется тем условием, что производная концентрации по времени в рассматри-
ваемой области равна нулю
— = 0 (6.20)
St
В таком случае уравнение диффузии (6.4) можно упростить до уравнения Лапласа
V2C=0 (6.21)
Решая данное уравнение, находят распределение концентрации при стационар-
ном состоянии системы в различных (в отношении границ, источников и прием-
ников) геометрических условиях.
6.3.1. Длинная трубка
Для описания основных свойств стационарного состояния рассмотрим трубку
длиной /, соединяющую два сосуда, один из которых заполнен раствором концен-
трации Со, а другой — чистой водой. Чтобы получить выражение для концентра-
ции вещества в трубке, вначале проинтегрируем выведенное для одномерного слу-
чая уравнение (6.21) и получим следующее выражение
— = А, (6.22)
дх
где А — это постоянная интегрирования. Второе интегрирование дает
С = Ах + В, (6.23)
где В — постоянная интегрирования. Конец трубки, помещенный в сосуд с водой,
обозначим х = 0; поскольку в данной точке С = 0, то и В = 0. На другом конце труб-
ки С = Со, и соответственно при х = 1 решение уравнения будет иметь вид А = CQ/l.
Определив таким образом А и В, подставим эти величины в уравнение (6.23), что-
бы получить выражение для концентрации вещества в трубке при стационарном
состоянии.
С(х) = (6.24)
Таким образом, имеет место линейное изменение концентрации по длине трубки
от 0 до Со.
Величину потока J в любой точке трубки можно вычислить из уравнения
(6.24), если предварительно продифференцировать уравнение (6.1). Эта величина
потока составляет-C^D/l и характеризует поток через единичную площадку. Выра-
жение для общего потока имеет вид -C^Da/l, где а обозначает площадь. Это выра-
жение сходно с уравнением электрического тока в резисторе. Напомним, что элек-
176
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
трическое сопротивление пропорционально длине и обратно пропорционально
площади, из чего следует, что ток пропорционален а/1.
6.3.2. Малое отверстие
Теперь рассмотрим диффузию сквозь малое круглое отверстие, через которое сооб-
щаются сосуд с раствором концентрации Со и сосуд с чистой водой (рис. 6.5).
Предположим, что концентрация, С, определяется только расстоянием, г,
от этого отверстия. По сторонам отверстия наблюдаются области градиента кон-
центрации, имеющие форму полусферических раковин, вокруг которых гради-
ента концентрации нет. Запишем уравнение диффузии в сферических коорди-
натах (уравнение (6.10)). Для стационарного состояния оно будет иметь следую-
щий вид
1 д ( 2 ас^ п
-Т— г — = 0
г2 dr V дг )
Путем интегрирования этого уравнения получаем выражение
2 ас А
г— = А
дг
(6.25)
(6.26)
Повторное интегрирование позволяет получить уравнение
+ Д
С =
(6.27)
где А и В — постоянные интегрирования.
При г -» оо концентрация раствора по левую сторону отверстия стремится
к нулю, и соответственно для этой области В = 0. В центре отверстия значение С
должно быть средним между 0 и Со, т. е. равным С0/2. Далее мы имеем основание
предположить, что С=С0/2 непосредственно вблизи отверстия, внутри сферы
радиусом га. Тогда из уравнения (6.27) можно выразить А как гаС0/2. В соответ-
ствии с этим выражение для концентрации раствора слева от отверстия будет
иметь вид
с = ^£о
2г
(6.28)
Рис. 6.5. Два раствора, концентраций
С = 0 и С = Со, разделены преградой
с отверстием.
6.3. Диффузия при стационарном состоянии
177
Далее, используя уравнение (6.1), получаем выражение для потока при произ-
вольных значениях г
\ J = -D— = D^- (6.29)
1 dr 2r2
Это выражение характеризует поток через единичную площадку. Чтобы опреде-
лить величину потока через всю полусферическую поверхность, данное выражение
достаточно умножить на ее площадь 2 яг2. Тогда общая скорость движения раство-
ренного вещества через полусферу (при стационарном состоянии) будет описы-
ваться выражением
Т = nraDCQ (6.30)
Поскольку поверхности, на которых концентрация постоянна, не являются
идеально сферическими, особенно для небольших г, результат следует считать
приблизительным. Для получения точных значений необходимо решать уравнение
диффузии в цилиндрических координатах, чтобы получить уравнение (6.30), но
с заменой л на 2 (Crank, 1975; Berg, 1983).
Важно отметить, что, по уравнению (6.30), скорость движения растворенного
вещества пропорциональна радиусу отверстия, а не его площади, тогда как в слу-
чае трубки скорость движения вещества пропорциональна площади отверстия на
ее конце. При диффузии через отверстие скорость потока вещества ограничена на
подходе к нему, а не при прохождении через него. В общем случае отверстия про-
извольной формы скорость прохождения через него зависит от его линейных раз-
меров, но не от площади. Аналогичная зависимость описывается в гл. 8 при анали-
зе зависимых от диффузии реакций образования молекулярных комплексов. Про-
порциональность потока линейным размерам отверстий имеет важное значение
в случае движения веществ через пористые мембраны, рассматриваемые ниже.
6.3.3. Пористые мембраны
Рассмотрим случай, когда отверстие, показанное на рис. 6.5, закрыто пронизанной
порами мембраной. Скорость движения вещества через каждую пору, рассматри-
ваемую как подобие отверстия из предыдущего примера, определяется уравнением
(6.30), включающим вместо га радиус поры гр. Скорость движения вещества через
мембрану с A-числом пор описывается уравнением
T=NnrpDCQ (6.31)
Однако данное выражение содержит определенное несоответствие. При Nrp = гл
определяемая им скорость движения вещества через пористую мембрану равна
скорости, определяемой уравнением (6.30) для случая, когда отверстие не закрыто
мембраной. Часть площади мембраны, занимаемая порами, составляет N(rp/ra)2.
Следовательно, если радиус поры значительно меньше радиуса отверстия, общая
площадь пор будет значительно меньше площади мембраны (в соответствии с тем,
что данное выражение содержит квадрат радиусов), но скорость движения вещест-
ва будет такой же, как через открытое отверстие. Например, если диаметр каждой
поры меньше диаметра отверстия в 100 раз, то при А =100 поток вещества будет
178
Глава 6. ДИФФУЗИЯ И БРОУНОВСКОЕ ДВИЖЕНИЕ
таким, как через открытое отверстие. Но, поскольку каждая пора составляет лишь
(0,01)2 = 0,0001 общей площади отверстия, 100 пор покроют всего лишь 1% площади
мембраны. Соответственно мы получаем неправдоподобный результат, состоящий
в том, что если пор больше 100, поток вещества через них превысит поток через от-
крытое отверстие.
Это несоответствие связано с перекрыванием сферических «раковин» по сто-
ронам каждой поры, когда поры разделены очень малым расстоянием. В данном
случае частично перекрываются сферические срезы, соответствующие градиентам
концентрации по сторонам отверстий. Если количество пор невелико, перекрыва-
ние не оказывает большого влияния на точность уравнения (6.31), но чем больше
количество пор, тем меньше это уравнение будет соответствовать действительно-
сти. Следовательно, для более полного анализа необходимо учесть перекрывание
в уравнении (Berg, 1983), приведя его к следующему виду
-- ~ . Г)
TQ l + ^/Wp)
где TQ — скорость потока через открытое отверстие (см. уравнение (6.30)).
Как показывает приведенный анализ, небольшое количество пор может значи-
тельно влиять на скорость транспорта вещества через клеточную мембрану. Кле-
точная мембрана содержит множество различных переносчиков, обеспечивающих
избирательный транспорт различных молекул. Поскольку переносчики каждого
типа занимают лишь небольшую часть поверхности мембраны, они не перекрыва-
ются, и через клеточную мембрану эффективно переносится большое число раз-
личных веществ.
6.4. Диффузия на микроуровне: случайные перемещения
До сих пор мы рассматривали диффузию на макроскопическом уровне, практиче-
ски не касаясь движения молекул (по крайней мере, процессов на молекулярном
уровне). Как известно, молекулы движутся случайным образом, с очень большой
частотой сталкиваясь друг с другом. Рассмотрим это случайное движение в связи
с диффузией (Chandrasekhar, 1943).
В основе анализа диффузии на молекулярном уровне лежит теория броунов-
ского движения. Согласно этой теории, случайное движение макромолекул носит
характер дискретных скачков на фиксированное расстояние 8 через фиксирован-
ный промежуток времени т. Рассмотрим вначале процесс в одном измерении, т. е.
при условии, что скачки молекул происходят только в направлении плюс или ми-
нус (вправо или влево).
Случайные перемещения в обоих этих направлениях можно рассматривать как
равновероятные, но несложно построить также модель для случая, когда переме-
щения в двух направлениях неравновероятны. Здесь мы проанализируем второй
случай как более общий. Обозначим вероятности скачков влево и вправо как р и
q и соответственно используем равенство p + q = \. При Л-числе скачков вероят-
ность того, что т скачков будут иметь направление вправо (и соответственно
(N - т) скачков — влево), задается биномиальным распределением
6.4. Диффузия на микроуровне: случайные перемещения
179
D/ 4 N\pmqN~m
i P(m) =----—-----
\ (N-m)lml
Если обозначить направление вправо как положительное и направление влево как
отрицательное, результирующее смещение в случае т скачков вправо и (N- т)
скачков влево составит х = (2т- N)8. Соответственно Р(т) — это вероятность об-
щего смещения данной величины в результате W скачков.
Среднее смещение от начальной точки можно вычислить как функцию време-
ни. Вначале определим среднее число скачков вправо, произведя усреднение по
всем возможным значениям т
(6.33)
Я. - x Z ,
±0 ~0(N-m)\ml
Для вычисления суммы используем биномиальное разложение (уравнение (П1.7))
(6.34)
. £N'.pmqN-m
(p+q) = / ——-—
(6.35)
Дифференцируя данное выражение по р и затем умножая на р, получаем
m=o (/V -m)\m\
(6.36)
Поскольку p + q = 1, левая часть данного выражения упрощается до Np. Его правая
часть — это сумма из уравнения (6.34), следовательно
т = Np
Поскольку х = (2w- _/V)8, среднее смещение соответствует выражению
(6.37)
х = (2т - 7V)8 = (2 Np - 7V)S = N(p - q)b
(6.38)
Если p = q=\/2, то x =0, что вполне ожидаемо, поскольку количества скачков
в противоположных направлениях равны.
Однако тот факт, что среднее смещение при случайных и равновероятных
в том и другом направлении перемещениях равно нулю, не позволяет прояснить
природу таких движений. Гораздо более информативна среднеквадратичная вели-
чина смещения
х2 = 62(2т- N)2
(6.39)
Возведем в квадрат выражение 2т-N и усредним каждый из членов
х2 = 62(4т2 -4mN + TV2)
Среднеквадратичное значение /и, т2, составляет
(6.40)
2
т
= ^m2P(m) = £
т=0 т=0
rnlN\pmqN-m
(N -т)\т\
(6.41)
180
Глава 6. ДИФФУЗИЯ И БРОУНОВСКОЕ ДВИЖЕНИЕ
Дифференцируя уравнение (6.36) по р и умножая его затем на р, получаем выраже-
ние для этой суммы. Далее используем полученный результат для преобразования
уравнения (6.41)
т2 = (Лр)2 + Np{\ - р) = (Np)2 + Npq (6.42)
Теперь подставим выражения (6.37) и (6.42) в уравнение (6.40)
х2 =62(4№р2+4^-4р№+№) (6.43)
Для случайных перемещений, равновероятных в обоих направлениях, при
р = q = 1/2, данное выражение сводится к простому виду
x2=52W=52£ (6.44)
где t — общее время, равное Nt.
Таким образом, среднеквадратичное смещение возрастает пропорционально
квадратному корню времени, что совпадает с результатом (уравнение (6.9)), полу-
ченным выше при решении уравнения диффузии. Кроме того, можно выразить
D через основные параметры модели броуновского движения, если сопоставить
корень квадратный уравнения (6.44) с уравнением (6.9)
Z)=52/2t (6.45)
С помощью этого выражения для D можно оценить эффективную длину
скачка и частоту перемещений диффундирующей макромолекулы в результате
столкновений с другими молекулами. Согласно теории химической кинетики,
среднеквадратичная скорость движения молекулы равна ^(ЗкТ/т). Для белка
мол. массой 14 000 Да (например, для фермента лизоцима) в растворе она состав-
ляет 1,3 • 103 см • с-1. При данной скорости молекула белка должна совершать
скачки десятки раз в секунду, и она не может диффундировать с такой высокой
скоростью, поскольку направление ее движения столь часто меняется.
Определим, насколько часто оно меняется. Коэффициент диффузии £>для ли-
зоцима составляет ~10'6 см2, с"1. Принимая среднеквадратичную скорость равной
5/ти Dравным52/2ти решая эти уравнения, получаем, чтоб = 10-9 см и т = 10"12 с.
Это означает, что направление движения данной белковой молекулы меняется ка-
ждую пикосекунду и между столкновениями она перемещается лишь на 0,1 А. Эти
масштабы частоты и длины скачков отражают основной характер движения белко-
вых молекул в водных растворах.
Выше при анализе броуновского движения в одном измерении использовалось
биномиальное распределение, и его можно преобразовать для двух- или трехмер-
ных моделей. Предположим, что движения в каждом измерении происходят как
независимые случайные перемещения. Тогда из теоремы Пифагора получаем
г2 = х2 + у2 + z2. Учитывая, что каждая из величин х2, у2 иг2 равна б2//т (уравне-
ние (6.44)), получаем л/г2” = 5Л/(ЗГ/т).
Броуновское движение характеризуется тем, что среднеквадратичная величина
смещения возрастает линейно с числом скачков. Такое соотношение между сред-
неквадратичной величиной и количеством элементов часто встречается в стати-
стической физике. Напомним, что в случае рассмотренного в гл. 3 полимера, в со-
6.5. Броуновское движение: нормальное распределение смещения
181
ставе которого мономеры вращаются независимым образом, среднеквадратичное
расстояние между концами молекулы пропорционально квадрату числа мономе-
ров. Подобные закономерности описываются важной в теории вероятностей цен-
тральной предельной теоремой.
*6.5. Броуновское движение:
нормальное распределение смещения
Среднеквадратичная величина смещения при броуновском движении, как проде-
монстрировано в предыдущем разделе, характеризуется той же зависимостью от
времени, что и аналогичная величина в случае диффузии (см. уравнения (6.44) и
(6.9)). Сходство между процессами броуновского движения и диффузии состоит
также в том, что при увеличении N распределение вероятности для случайного
смещения стремится к гауссовой функции, получаемой также при решении урав-
нения диффузии (Chandrasekhar, 1943). Эти решения можно сравнивать, посколь-
ку начальное условие диффузии С(х,0) = 5(х) тождественно условию случайного
смещения от точки х = 0.
Вначале сравним решения двух рассматриваемых уравнений с помощью гра-
фиков. Если принять значение р = 1/2, наиболее соответствующим значением
т будет 7V/2. Далее введем переменную к, чтобы выразить смещение через откло-
нение от N/2\ в таком случае т будет равно N/ 2 + к. (Смещение х, выраженное че-
рез к, составляет 2^5; при выражении через т оно равно (2?и- 7V)5.) В соответствии
с этим преобразуем уравнение (6.33)
Р(к) =
(6.46)
График, соответствующий данному уравнению, при N = 10 и х = 2к8 практически
представляет собой кривую нормального распределения (рис. 6.6).
Рис. 6.6. Точки на графике соот-
ветствуют значениям вероятно-
сти смещений при случайном
движении в 10 скачков (уравне-
ние (6.46) при N = 10). Функция
Гаусса, полученная при решении
уравнения диффузии (уравнение
(6.8)), изображена для сравнения
сплошной линией. Обратите вни-
мание, что х = 1 в случае 5 = 0,5
при к = 1.
х, к
182
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
Это сходство нормального распределения и биномиального распределения
можно продемонстрировать математическим способом, если взять предел уравне-
ния (6.46) при больших значениях ^и использовать приближение Стирлинга для
/ дгч/V
У!~ — V2^.'
V е )
(6.47)
JlnN
Поскольку квадратный корень изменяется в значительно меньшей степени, чем
экспоненциальные функции, величиной к2 в подкоренном выражении можно
пренебречь. Далее избавимся от сомножителей e/V
1 Логарифм /V! представляет собой сумму
/V
In А! = £1п/и
т=\
Аппроксимация этой суммы как интеграла позволяет получить выражение
/V
ln7V!~ Jlnxdx ~ AinN - N,
x=l
где член х = 1 сокращается как пренебрежимо малая величина. Это уравнение применимо во мно-
гих случаях и в данном случае позволяет получить ожидаемую гауссову функцию, но со значи-
тельным несоответствием. Чтобы согласовать ее количественно с решением уравнения диффу-
зии, преобразуем эту формулу, взяв (А + 1/2)1п А - А. Дополнительный множитель 1/2 станет
понятен, если рассматривать сумму как площадь многих прямоугольников и считать, что инте-
грал доходит только до средней точки последнего прямоугольника. Тогда данная сумма отличает-
ся от данного интеграла дополнительной половиной прямоугольника при верхнем пределе А.
Добавочный множитель 1/21п(2л) служит удобным способом корректировки указанного рас-
хождения между площадью непрерывной функции и прямоугольниками. Включая этот коррек-
тирующий множитель в полученное выше выражение и беря экспоненциальную функцию, по-
лучаем
/А^ /-----
А!~ — Т2лА
I е )
6.5. Броуновское движение: нормальное распределение смещения
183
(6.48)
Каждый сомножитель, содержащий член вида 1±а, можно с определенным при-
ближением представить как е*1, поскольку к « N (см. разложение первого члена
в уравнении (П1.4)).
V nN
=(6'49)
Таким образом, мы получили функцию, описывающую нормальное распреде-
ление, как предел биномиального распределения, и в ней начинает быть видна
аналогия с уравнением (6.8). Для полноты картины выразим число скачков в еди-
ницах времени и расстояния. Используя формулы к = х/28 и N = t/т, получаем
Р(Х) = ДЁе-”2/2'’2 (6.50)
V nt
Далее используем уравнение (6.45) для замены бит коэффициентом диффузии
P(x) = J^e-*2/4D' =
UDt
—L_e-*740'25
4nDt
(6.51)
Если выразить 25 как dx в соответствии с тем, что х = 2к6, полученное уравнение
будет совпадать с уравнением (6.8).
Наиболее четко этот предел выявляется, когда значение N не слишком боль-
шое, как на рис. 6.6. Область значений, где гауссова функция явно не может быть
184
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
пределом, это х > 7V8. Наибольшая возможная величина смещения относится к
тому случаю, когда направление всех N скачков одинаковое. Гауссова функция
дает крайне низкие значения для вероятности больших смещений, тогда как при
случайном движении она равна нулю. В редких случаях это создает трудности для
анализа. Тем не менее гауссова функция успешно используется в теории броунов-
ского движения.
6.6. Уравнение диффузии на микроуровне
Как отмечено выше, если случайные перемещения — скачки — молекул происхо-
дят независимым образом, среднеквадратичная величина смещения пропорцио-
нальна Vr. Предположение о независимости скачков молекул лежит в основе тео-
рии диффузии, и оно использовалось Эйнштейном при выведении уравнения
диффузии (см. Einstein, 1956; обзор работ Эйнштейна по броуновскому движе-
нию).
Обозначим вероятность попадания молекулы в точку г в момент времени t + dt
как p(r, t + dt). Величину этой вероятности можно записать в виде интеграла по
произведениям двух вероятностей — вероятности попадания в точку г +6 в момент
времени г, обозначаемой р(г +6, Г), и вероятности скачка из точки г + 5 в точку г за
время dr, обозначаемой как ц/(5). Соответствующее выражение для искомой веро-
ятности имеет вид
p(r, t + dr) = j p(r + 5, r)\|/(5)d5 (6.52)
-00
Поскольку и dr и 5 малые величины, диапазоном 8 в данном интеграле можно пре-
небречь. В таком случае, используя разложение в ряд Тейлора (см. приложение 1)
для р(г + 8, Г) и p(r,t+dt), получаем уравнения
p(r, r + dr) = p(r, r) + dr (6.53)
dt
и
р(г+8,0 = p(r, t) + 8^^- + а^(Г2’ ° (6.54)
dr 2 dr
Заменяя левую часть уравнения (6.52) уравнением (6.53) и используя уравнение
(6.54) для p(r + d, t) в правой части, получаем выражение
p(r,r) + dr ’ = р(г,Г) + 8 <------ + -82 72 V(6)d8 (6.55)
dt J dr 2 dr
—00
Первое слагаемое интеграла в правой части этого уравнения — это просто p(r, t),
поскольку интеграл по всем возможным скачкам должен быть единицей. Далее
этот член сократится с тем же членом в левой части уравнения. Второе слагаемое
равно нулю, ввиду того что скачки в положительном и отрицательном направлени-
ях равновероятны. Последнее слагаемое к простому выражению не сводится, но,
6.7. Трение
185
согласно предположению Эйнштейна, частное от деления данного интеграла на
dr — это определенная постоянная величина, представляющая собой коэффици-
ент диффузии
1 Г 1 э
j ^-52\|/(5)d5 = Z> (6.56)
Обратите внимание на сходство данного выражения с выражением D = 5 2/2т (урав-
нение (6.45)), выведенным на основе теории броуновского движения. Уравнение
(6.55) превращается, таким образом, в уравнение диффузии
Предположение о том, что частное от деления среднеквадратичной величины
смещения, присутствующей в уравнении (6.56), на dr, — это константа, эквива-
лентно предположению, что среднеквадратичное смещение возрастает пропор-
ционально корню квадратному времени. Таким образом, круг рассуждений замы-
кается, и данное предположение является одним из основных результатов теории
диффузии.
Возможно, наиболее важное предположение, используемое при выведении
данного уравнения диффузии, представляет собой уравнение (6.52), выражающее
независимость вероятностей р и ц/. Благодаря этой независимости данные величи-
ны можно перемножить, чтобы получить искомую вероятность. Независимо от
того, в какой точке пространства находится частица, вероятность совершения ею
скачка 5 описывается функцией ц/(5), не зависящей от г. Таким образом, любое слу-
чайное перемещение не зависит от предыдущих перемещений. Такое предположе-
ние относит случайное движение молекул к разряду марковских процессов, т. е.
случайных процессов без последействия. На этом важном предположении основа-
ны многие модели динамических процессов (см. гл. 7 и 9).
6.7. Трение
Диффундирующая молекула подвергается действию силы трения. Кроме того, не-
прерывное движение в любом направлении тормозят столкновения молекул,
вызывающие броуновское движение. Рассмотрим связь диффузии с трением и вы-
разим коэффициент диффузии через коэффициент трения.
Опишем движение молекулы в растворе под действием внешней силы FBH.
Примером может быть движение молекулы, несущей заряд, в электрическом поле
либо движение молекулы в гравитационном поле или в поле центробежных сил.
Когда поле придает молекуле ускорение, ее движению противодействует сила тре-
ния FTp, пропорциональная скорости движения молекулы
Лр = -л, (6.58)
где f — коэффициент трения и знак минус означает, что трение противодействует
движению. При увеличении скорости движения молекулы величина FTp возрастает
до эквивалентной FBH. Когда FTp + FBH = 0, т. е. сила трения уравновешивает внеш-
186
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
нюю силу, скорость движения молекулы постоянна. В этих условиях FBH - fv = 0, и
v= Fw/f. При такой средней скорости поток молекул описывается равенством
/ = C(x)v = C(x)FBH//.
Под действием внешней силы создается градиент концентрации вещества, вы-
зывающий в свою очередь диффузию молекул в противоположном направлении.
Если достигается равновесие двух потоков, величина С(х) постоянна, что свиде-
тельствует о балансе двух противоположно направленных сил. Для описания тако-
го баланса суммируем выражения для потока, обусловленного диффузией по гра-
диенту концентрации (уравнение (6.1)), и потока под действием внешней силы,
C(x)Fw/j\ приняв полученную сумму равной нулю
C(X)FBH _ддС(х) =0 (6.59)
f дх
Далее выведем уравнение, показывающее, что в состоянии равновесия, когда
движение под действием внешней силы уравновешивается движением по градиен-
ту концентрации (диффузией), величина С(х) подчиняется распределению Больц-
мана. В случае постоянной силы, не зависящей от координат, выражение для по-
тенциальной энергии имеет простой вид FBHx и распределение Больцмана для нее
записывается следующим образом
С(х) = С(0)е-£‘нХ/*г, (6.60)
где С(0) — концентрация в некой точке отсчета. Дифференцируя данное выраже-
ние по х и сопоставляя его с начальным, получаем
C(x)FBH _ 5С(х) = Q (6.61)
кТ дх
Наконец, сопоставляя уравнения (6.59) и (6.61), получаем уравнение
кТ
D = y~ (6.62)
Данное уравнение, определяющее соотношение между диффузией и трением,
выведено Эйнштейном и названо его именем. Трение замедляет диффузию неза-
висимо от формы молекулы или вязкости раствора. Напомним, что на основе тео-
рии броуновского движения молекул мы получили выражение для D в переменных
расстояния (смещения) и времени скачков, определяемых случайным тепловым
движением молекул. Из выражения (6.62) очевидно, что это движение, обусловли-
вающее диффузию, обусловливает также и трение. Таким образом, теория диффу-
зии связана с представлением о трении как о следствии беспорядочного движения
множества молекул, столкновения которых с объектом изменяют направление его
движения. Это рассматривается подробнее в разд. 12.14.
Для того чтобы описать общую картину диффузии в силовом поле, просумми-
руем внешнюю силу и силу трения. Будем исходить из уравнения (6.59), но примем
допущение об отсутствии равновесия между силами FTp и FBH; величина потока вы-
ражается в этом случае суммой двух членов
/ = С^^вн _ D дС(х) (6.63)
f дх
6.8. Закон Стокса
187
Используя уравнение Эйнштейна, получаем
j = D(C(x)FBH _ дС(хЙ
I кТ дх )
(6.64)
Данное уравнение лежит в основе анализа разнообразных кинетических процес-
сов, рассматриваемых в последующих главах. Уравнение (6.64) для случая, когда
внешней силой служит разность потенциалов, называется уравнением Нерн-
ста—Планка.
6.8. Закон Стокса
Чтобы прояснить связь между диффузией и трением, рассмотрим трение малой
частицы, диффундирующей в жидкости. Если можно измерить или теоретически
вычислить коэффициент трения, уравнение (6.62) позволяет вычислить также ве-
личину коэффициента диффузии. Опишем кратко способ определения коэффи-
циента трения для сферической частицы.
Для того чтобы вычислить коэффициент трения, необходимо решить уравне-
ния для потока вязкой жидкости, но это непростая задача. Молекулу сферической
формы жидкость обтекает, как показано на рис. 6.7. Поток жидкости можно пол-
ностью описать и затем рассчитать силу, с которой жидкость действует на данную
частицу (Berg, 1983). Из выражения для данной силы можно вывести коэффициент
трения и соотношение, называемое законом Стокса
f = 6лг|г, (6.65)
где г означает радиус и т| — вязкость.
Для объектов неправильной формы вычислить f значительно сложнее, и урав-
нение (6.65) применяется для грубой оценки величины/на основе предположения
о форме и размерах молекул. Например, предполагают, что белковая молекула
имеет форму сферы, радиус которой пропорционален корню кубическому мол.
массы, и оценивают f исходя из данного предположения. Как показывает матема-
тический анализ, проведенный для молекул различной формы, величина/пропор-
циональна или почти пропорциональна линейным размерам молекул. Следова-
тельно, можно предполагать, что для ряда молекул сходной формы величина
f варьирует в диапазоне корня кубического мол. массы. Анализу данного соотно-
шения посвящен следующий раздел.
Рис. 6.7. Сфера, движущаяся в вязкой жидкости, испытывает трение в результате контакта
со средой.
188
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
6.9. Коэффициент диффузии макромолекул
Оценим величину коэффициента диффузии для белков, используя закон Стокса
и уравнение Эйнштейна. Объединив уравнения (6.62) и (6.65), мы получаем выра-
жение для коэффициента диффузии как функции размеров молекул
кТ
D = (6.66)
6тГГ|Г
Данное выражение известно как соотношение Стокса—Эйнштейна. Если считать
форму молекулы глобулярного белка приблизительно сферической, масса одной
молекулы составит (4/3)(тгг3р), где р — плотность. Величины плотности глобуляр-
ных белков имеют сходные значения и равны примерно 0,7 г • мл -1. Выражение
(6.66) предполагает, что величина Л обратно пропорциональна корню кубическому
мол. массы.
Коэффициенты диффузии известны для многих белков; как правило, для их
определения создают границу раздела (см. рис. 6.2 и 6.3), измеряют концентрацию
и подставляют полученные данные в уравнение (6.14) (Tanford, 1961). Некоторые
значения этих коэффициентов представлены на рис. 6.8, показывающем их зави-
симость от мол. массы белка. Точки укладываются приблизительно по линии, ука-
зывающей на пропорциональность Л/"1/3. Однако на самом деле значения коэф-
фициентов диффузии несколько ниже тех, которые дает соотношение Сто-
кса-Эйнштейна. Это объясняется тем, что 1) белки гидратированы и за счет
гидратной оболочки размеры их молекул немного больше, чем можно рассчитать
исходя из мол. массы, и 2) форма молекул глобулярных белков, как правило, отли-
чается от правильной сферической и соответственно для них выше коэффициент
трения и ниже величина D.
Коэффициенты трения для других форм объектов, в том числе эллиптической,
получают с помощью весьма сложных расчетов, результаты которых в общем пока-
зывают, что при данном объеме наименьший коэффициент трения характерен для
сферических частиц и соответственно скорость диффузии частиц любой другой
Рис. 6.8. Коэффициенты диффузии различ-
ных глобулярных белков нанесены на гра-
фик относительно их мол. массы. На данном
графике, где шкалы по обеим осям лога-
рифмические, тангенс угла наклона близок
к -1/3, что очевидно из прямой, проведен-
ной через кружки (осМ-1^). Данные приве-
дены для следующих глобулярных белков
(в порядке возрастания мол. массы): рибо-
нуклеазы, лизоцима, химотрипсиногена,
0-лактоглобулина, овальбумина, сывороточ-
ного альбумина, гемоглобина, каталазы и
уреазы. Треугольниками показаны значения
для фибриллярных белков: тропомиозина,
фибриногена, коллагена и миозина. (Дан-
ные из табл. 21-1 в кн. Tanford, 1961.)
6.10. Латеральная диффузия в мембране
189
формы ниже. Это показывают приведенные на рис. 6.8 значения Л для глобуляр-
ных белков и белков нитевидной формы. Закон Стокса не позволяет точно вычис-
лить коэффициенты трения нитевидных белков; он дает для них значительно бо-
лее низкие значения, чем для глобулярных белков. Глобулярные белки характери-
зуются существенно более высокими коэффициентами диффузии по сравнению
с нитевидными белками сходной мол. массы.
Белковые молекулы, имеющие конформацию случайного клубка, также отли-
чаются от глобулярных белков по величине коэффициента трения. Как отмечено
в гл. 3, конформацию случайного клубка имеют многие макромолекулы, и средне-
квадратичное расстояние между концами молекулы зависит у них от числа сегмен-
тов, образовавшихся при данном случайном свертывании. При 4г2 ос Jn коэф-
фициент их трения пропорционален Mi/2, а не Л/1/3. Объединяя уравнения (6.62)
и (6.65), можно продемонстрировать, что значение D обратно пропорционально
квадратному корню мол. массы, и это подтверждено для белков в форме случайно-
го клубка экспериментальными данными (Tanford, 1961; Cantor, Schimmel, 1980).
При диффузии молекул, несущих заряд, в растворе электролита окружающие
ионы движутся в противоположном направлении и замедляют движение молекул,
несущих заряд. Данный пример подробно рассмотрен в разд. 11.8.
6.10. Латеральная диффузия в мембране
Развитие в начале 1970 гг. представлений о текучести мембран вызвало большой
интерес к двумерной диффузии молекул в биологических мембранах. В плоскости
липидной мембраны, покрывающей клетку, происходит случайное движение как
липидов, так и белков. Это было установлено с использованием флуоресцентных
меток, позволяющих следить за движением молекул на клеточной поверхности.
Если вызвать слияние флуоресцентно меченной клетки с немеченной клеткой,
флуоресценция уже через несколько минут равномерно распределяется по всей
поверхности новой клетки. Если с помощью лазера вызвать фотообесцвечивание
метки на небольшой части клеточной поверхности, флуоресценция в этой области
восстанавливается, что свидетельствует о диффузии красителя из необеспечен-
ной области в обесцвеченную. Метод с восстановлением флуоресценции после
фотообесцвечивания, известный как FRAP (от англ, fluorescence recovery after
photobleaching), служит важным количественным методом изучения латеральной
диффузии в мембранах (Jacobson et al., 1987). С этой целью широко используется
также корреляционная флуоресцентная спектроскопия (см. разд. 12.13).
Величины коэффициентов диффузии липидов и белков в плоскости мембраны
(в двух измерениях) не менее чем на два порядка ниже по сравнению с приведен-
ными в предыдущем разделе значениями коэффициентов диффузии типичных
глобулярных белков. Определить соотношение между коэффициентом диффузии
и размерами молекул для двумерного процесса сложнее, чем для трехмерного.
Данное соотношение для трех измерений, закон Стокса (уравнение (6.65)), отно-
сится к потоку жидкости вокруг сферы (рис. 6.7) при стационарном состоянии.
В случае двухмерного пространства решения соответствующих уравнений для по-
тока при стационарном состоянии найти не удается и необходимо применять зна-
чительно более сложный математический аппарат. Использование трех альтерна-
190
Глава 6. Диффузия и броуновское движение
тивных подходов позволило в итоге получить следующее выражение для коэффи-
циента латеральной диффузии цилиндра радиусом а в мембране толщиной h (Saff-
man, Delbruck, 1975)
DL= kT I In0,5772 I, (6.67)
где г| м — вязкость мембраны и г| в — вязкость окружающей водной среды. В качест-
ве исходного допущения предполагается, что первая величина больше второй.
Уравнение (6.67), известное как уравнение Саффмана—Дельбрюка, отличается
от закона Стокса в нескольких отношениях. Во-первых, описываемая им обратная
логарифмическая зависимость от радиуса значительно слабее, чем зависимость
в законе Стокса. Согласно уравнению (6.67), молекулы различных размеров харак-
теризуются весьма сходными коэффициентами латеральной диффузии. Как пока-
зала экспериментальная проверка, молекулы белков и липидов, диаметры которых
различаются в 10 раз, имеют коэффициенты диффузии, различающиеся не более
чем в 2 раза (Peters, Cherry, 1982). Из уравнения (6.67) следует также, что величина
Dl не зависит от вязкости окружающей водной среды. Экспериментально установ-
лено, что когда г|в изменяется в 12 раз, значение DL изменяется не более, чем на
50%. Напротив, увеличение вязкости мембраны, например при падении темпера-
туры ниже точки упорядочения липидной структуры, приводит к снижению значе-
ния Dl как для липидов, так и для белков более чем на порядок.
Величина DL для белков в клеточных мембранах, как правило, значительно
ниже, чем в искусственных липидных мембранах (Jacobson et al., 1987). Это может
объясняться тем, что мембранные белки часто связаны с цитоплазматическими
структурами и элементами цитоскелета. Кроме того, на диффузию влияет эффект
кластеризации молекул в мембране. Часто наблюдается, что белки занимают боль-
ше половины площади клеточной поверхности. Мембранные белки обнаруживают
тенденцию следовать одинаковым путем, что ограничивает случайные перемеще-
ния и приводит к снижению DL.
Функции рецепторов, каналов и переносчиков часто зависят от их локализа-
ции в определенной области клеточной поверхности. С помощью метода FRAP
часто выявляются фракции белков, различающиеся по подвижности, и это пока-
зывает, что одни белки заякорены в мембране, тогда как другие свободно диффун-
дируют. В одном из исследований при наблюдении за перемещением отдельных
молекул в клеточных мембранах были обнаружены новые типы движения, показы-
вающие, что в мембране может происходить высокоупорядоченное и направлен-
ное перемещение белков (Saxton, Jacobson, 1997). Благодаря свободе движения
мембранные белки могут образовывать комплексы, передавать сигналы, регулиро-
вать свои функции, а также поглощаться путем эндоцитоза для последующего
внутриклеточного оборота.
Задачи
1. Продемонстрируйте, что уравнение (6.11) удовлетворяет закону сохранения
массы.
Задачи
191
2. Методом прямой подстановки в уравнение (6.4) докажите, что уравнение (6.14)
является решением уравнения диффузии.
3. С помощью уравнения (6.11) выведите формулу среднеквадратичного радиального
смещения от точечного источника в трех измерениях; другими словами, определи-
те как функцию t.
4. Определите, в каких областях при одномерной диффузии из точечного источника
(уравнение (6.8)) величина с возрастает, в каких убывает и в каких является посто-
янной.
5. Решите задачу, рассмотренную в разд. 6.2.4, для случая трубки с закрытыми конца-
ми (отражающие граничные условия) при начальных условиях С(х,0) = 5(х).
6. Решите задачу для одномерной диффузии в полубесконечной трубке с (а) одним
закрытым концом и (б) одним открытым концом при х = -1 и начальных условиях
С(х, 0) = 5(х). (Подсказка: поместите другой график начального распределения
в позиции х = -2, что будет удовлетворять граничному условию при х = -1).
7. Запишите гауссову функцию, график которой изображен на рис. 6.6.
8. При синаптической передаче медиатор, высвобождаемый из отдельной везикулы
(50 000 молекул), движется из этой точки крайне высокой концентрации, что мож-
** но аппроксимировать дельта-функцией. Диффузия происходит в двух измерениях
через синаптическую щель (шириной 50 нм). Вычислите среднюю концентрацию
как функцию времени в диске диаметром 2 мкм, центр которого находится в точке
высвобождения медиатора (Khanin et al., 1994).
Глава 7
Основные кинетические процессы
Продолжая описание динамических процессов, начатое в гл. 6, перейдем от рас-
смотрения диффузии как процесса переходов внутри связного множества состоя-
ний к анализу противоположного крайнего случая — перехода между двумя со-
стояниями в один этап. Аналогичная модель использована для анализа макропере-
хода в гл. 1.
Кинетику перехода между двумя состояниями, при котором просто происхо-
дит скачок из одного состояния молекулы в другое, несложно описать математиче-
ски, и благодаря этому модель двух состояний служит элементом для построения
других, более сложных моделей, описывающих кинетику множественных состоя-
ний (см. гл. 9). Модели множественных состояний занимают промежуточное по-
ложение между моделями двух состояний и моделями континуума — связного
множества — состояний.
Модель двух состояний, широко применяемая в молекулярной биологии, ис-
пользована выше (см. гл. 1) при анализе того, как влияют экспериментальные ус-
ловия на термодинамическое равновесие в системе с двумя состояниями. В этой
главе мы проанализируем динамику достижения такой системой равновесия. Пер-
вые разделы содержат описание характеристик перехода между двумя состояния-
ми; в последующих разделах рассматриваются некоторые основные теории, объяс-
няющие физические основы кинетики таких переходов.
7.1. Релаксация по экспоненте
Рассматривая выше энергетику макроперехода, мы просто отмечали, что он сопро-
вождается изменением свободной энергии. Теперь, чтобы исследовать кинетику
перехода, следует ввести константы скоростей перехода в одном и другом направ-
лениях
А<=±В (7А)
Константы скоростей переходов а и 0 в схеме (7А) имеют размерность с"1. Если
система не находится в равновесии, концентрации молекул в A-состоянии и моле-
кул в В-состоянии не постоянны. Переходы А -> В приводят к уменьшению кон-
центрации молекул в A-состоянии, и обратные переходы, В->А, к повышению
концентрации молекул в A-состоянии. Скорость каждого из этих процессов равна
произведению константы скорости и концентрации молекул в соответствующем
7.1. Релаксация по экспоненте
193
состоянии. Соответственно этому скорости изменения концентраций молекул
в A-состоянии, [А], и В-состоянии, [В], в результате прямого и обратного переходов
описываются следующей парой дифференциальных уравнений
= -а[А]+р[В] (7.1а)
Си
^ = а[А]-р[В] (7.16)
dr
Чтобы найти решения этой пары связанных дифференциальных уравнений
с двумя переменными, сведем их к одному дифференциальному уравнению.
Поскольку общее количество (Т) вещества (например, белка), равное [А] + [В], по-
стоянно, введем замену [В] = Т - [А] и тем самым исключим член [В]. В результате
уравнение (7.1а) сведется к дифференциальному уравнению с одной переменной
[А]
^1 = рТ-(а+р)[А) (7.2)
dr
Далее упростим данное уравнение, для чего разделим его на Т и примем х = [А]/Т
(фракция белка в А-состоянии)
^ = р-(а + р)х (7.3)
dr
Общее решение данного уравнения представляет собой экспоненциальную функ-
цию с константой убывания, равной а + 0. Определим частное решение для началь-
ного условия г = 0, х = х0
x = fx0--Ые’<а+Р)' + ~7Г (7.4)
a + 0J а+р
Следует отметить, что на большом промежутке времени х стремится к значению
0/(а + 0), соответствующему той фракции белка, которую составляют молекулы
в A-состоянии при равновесии. Таким образом, от любого начального неравновес-
ного значения величина х релаксирует по экспоненте с константой убывания а + р
к равновесному значению. Обычно динамика процессов такого типа описывается
с использованием постоянной времени т = 1/(а + 0). Эта постоянная означает вре-
мя, за которое разность между текущим и равновесным значениями х сокращается
в е раз.
Экспоненциальные зависимости (как соответствующие функции или их сум-
мы) характерны для многих кинетических процессов. Так, при конформационном
переходе в молекуле белка, индуцированном изменением температуры или разно-
сти потенциалов, величины а и 0 зависят от температуры или напряжения и в ре-
зультате резкого изменения данного параметра изменяются значения констант
скорости перехода. При этом с определенной скоростью происходит релаксация
белка к новым условиям равновесия (рис. 7.1).
Приведенный на рис. 7.1 график показывает пути перехода данной системы
в равновесное состояние от двух начальных точек за один и тот же промежуток
194
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Рис. 7.1. Релаксация по экспоненте
в системе с двумя состояниями. Гра-
фик функции (7.4) для двух различ-
ных начальных значений х0; в обоих
случаях система переходит к состоя-
нию равновесия с одной и той же по-
стоянной времени. В указанном при-
мере т = 2 и хкон = 0,4.
времени. Если начальное значение х < 0/(а + 0), величина х возрастает; если исход-
но х > 0/(а + 0), величина х уменьшается. Другими словами, разница между вели-
чинами х и 0/(а + 0) сокращается в е раз за время т = 1/(а + 0). Следует отметить, что
скорость dx/d/ в данном случае не служит информативным показателем. Значение
тангенса начального угла наклона кривой, отражающего кинетику изменения х,
может быть положительным или отрицательным, и наклон может различаться по
крутизне в зависимости от того, насколько начальное значение х отличается от
0/(а + 0). Таким образом, величины а и 0 служат определяющими параметрами, для
установления которых необходимо знать постоянную времени.
7.2. Энергия активации
Модель двух состояний предполагает, что переход между состояниями происходит
практически мгновенно, т. е. занимает пренебрежимо малое время, и промежуточ-
ные состояния не влияют на термодинамические характеристики системы. Тем не
менее должен существовать реакционный путь. В действительности он может
иметь много траекторий, но мы предположим, что в основном переход происходит
по одной из них. Когда молекула проходит реакционный путь, ее структура не от-
носится ни к А-, ни к В-состоянию. Поскольку этот путь занимает очень малое
время, промежуточное состояние должно характеризоваться весьма высокой энер-
гией. Следовательно, существует разделяющий состояния А и В энергетический
барьер с высоким значением энергии, £*. Переходное состояние — это положение
на реакционном пути, характеризующееся наибольшей энергией. Данное основ-
ное определение связывает константы скорости перехода а и 0 со структурой
и энергетическими характеристиками молекулы, участвующей в реакции. Ско-
рость пересечения барьера определяется, таким образом, вероятностью обладания
молекулой этой наибольшей энергией; данную вероятность можно оценить с по-
мощью распределения Больцмана
а = Се~£’/яг (7.5)
Смысл данного уравнения, называемого уравнением Аррениуса, состоит
в том, что при прочих равных условиях скорость процесса тем ниже, чем выше
7.2. Энергия активации
195
энергетический барьер. Кроме того, уравнением Аррениуса описывается темпе-
ратурная зависимость реакции — возрастание константы скорости реакции с по-
вышением температуры. Значение переменной С, называемой предэкспоненци-
альным множителем, резко меняется в зависимости от характера реакции. Более
подробно предэкспоненциальные множители рассматриваются ниже. Для оп-
ределения Е* по кинетическим данным строят график зависимости логарифма
скорости процесса от 1/Г(график Аррениуса). Как правило, графики Аррениуса
линейные, и это подтверждает теорию пересечения энергетического барьера
как верную модель динамики перехода. Величину энергию на вершине барьера,
£”*, называют энергией активации. В случае конформационных изменений бел-
ков, а также ферментативных процессов ее значения обычно лежат в диапазоне
10—20 ккал • моль"1.
Предэкспоненциальный множитель С можно оценивать различными способа-
ми. Например, с учетом величины свободной энергии активации (7* он будет отра-
жать как потенциальную энергию на вершине барьера, так и плотность состояний
вблизи этой вершины. При G*= Н* -Т* мы получаем выражение
a = C'^/RT=C>e-s^e-H^T, (7.6)
где предэкспоненциальному множителю С из уравнения (7.5) соответствует
С'е"5*/Л. Отсюда следует, что переходное состояние геометрически можно пони-
мать не просто как барьер, но как перевал — наиболее низкую седловину в высо-
кой горной гряде или как наивысшую точку энергетически наиболее выгодного
пути реакции на поверхности потенциальной энергии. Можно предполагать, что
ширина перевала связана с величиной энтропии активации, 5*. Величина t~s*/R не
зависит от температуры, и поэтому ее трудно отделить от предэкспоненциального
множителя.
Зависимость скорости реакции от температуры характеризуют обычно коэф-
фициентом С10, который показывает, во сколько раз изменяется скорость реакции
при изменении температуры на 10 градусов. С помощью уравнения (7.5) параметр
Q10 можно связать с энергией активации следующим аппроксимирующим выраже-
нием
£•* _ 1П(01р) /у
10
При обычной физиологической температуре и Q10 = 2 величина Е* равна
~12 ккал • моль-1.
Энергетический барьер — это одно из наиболее важных понятий в химиче-
ской кинетике. Конфигурация барьера как характеристика переходного состоя-
ния наглядно показывает путь перехода молекулы из одного состояния в другое.
В настоящее время, однако, сведений о переходном состоянии для большинства
процессов очень мало, несмотря на то что его анализ весьма важен при изучении
кинетики. Такое положение связано с тем, что, как правило, невозможно выде-
лить переходное состояние для подробной характеристики. В большей части ис-
следований как параметр переходного процесса определяют величину энергии,
но на основе кинетических данных, что легко приводит в ловушку круговых до-
казательств.
196
Глава 7. Основные КИНЕТИЧЕСКИЕ процессы
7.3. Координата реакции и детальное равновесие
За энергию активации принимают высоту барьера на графике изменения энергии
вдоль координаты реакции (рис. 7.2). Такой график наглядно иллюстрирует важ-
ное соотношение между энергетическими уровнями, характеризующими различ-
ные состояния молекулы. Для пересечения барьера слева направо молекуле требу-
ется энергия и константа скорости процесса при этом равна
а = Се-£“>г (7.8)
В случае пересечения барьера справа налево константа скорости равна
р = Ce^/RT (7.9)
При равновесии переход А —> В полностью компенсирован обратным переходом
В->А. Для нулевого момента времени уравнения (7.1 А) и (7.1.Б) дают
а[А] = р[В] (7.10)
Таким образом, константа равновесия выражается через константы скорости реак-
ции
= - (7.11)
[А] Р
Это уравнение демонстрирует связь между положениями кинетической теории
и теории химического равновесия. Любое кинетическое описание системы должно
включать описание равновесного состояния при нулевых значениях соответствую-
щих производных по времени. На практике таким способом можно проверять ки-
нетические модели. Данным ограничением кинетической теории по фактору рав-
новесия определяется условие детального равновесия (см. разд. 5.4).
С учетом условия детального равновесия выражения для констант скорости пе-
рехода (уравнения (7.8) и (7.9)) приводятся к следующему виду
IAJ _ е(-£Р +Е“ )/ЯГ _ е-ДС/ЯТ [В] Пе9®*°о^е в (7.12) Рис. 7.2. График изменения энергии вдоль коорди- наты реакции. Минимумы в точках А и В соответству- ют двум стабильным состояниям, максимум — пере- ходному состоянию.
7.3. Координата реакции и детальное равновесие
197
Л
Рис. 7.3. Варианты графика, представленного на рис. 7.2; координаты реакции для процесса
связывания (Д) и транспорта через мембрану (Б).
где предэкспоненциальный множитель исключен из коэффициента. Уравнение
(7.12) дает константу равновесия, выраженную через разность значений свободной
энергии двух состояний. Следовательно, эти значения энергии связаны между со-
бой следующим соотношением1
(7.13)
Это основное соотношение между кинетикой и энергетикой наглядно иллюстри-
руется рис. 7.2. Если скорости прямой и обратной реакций определены достаточно
точно, чтобы вычислить значения энергии, можно приблизительно построить гра-
фик реакционного пути.
Реакционный путь — кривая изменения потенциальной энергии вдоль коор-
динаты реакции — изображен на рис. 7.2 для процесса изомеризации. Аналогич-
ный график для реакции связывания показан на рис. 7.3, А; он отражает отно-
сительное положение двух молекул. Когда энергия их столкновения достаточно
велика, чтобы мог быть преодолен энергетический барьер, они оказываются свя-
занными, т. е. переходят в состояние ограниченного движения, которому соответ-
ствует минимум потенциальной энергии в правой части графика. Другим приме-
ром, иллюстрирующим принцип пересечения барьера, может служить транспорт
молекулы через мембрану. Чтобы пересечь мембрану, молекуле необходимо пре-
одолеть энергетический барьер, но по обе стороны мембраны она способна пере-
мещаться свободно, что показывают пологие участки графика потенциальной
энергии (рис. 7.3, Б).
Если попытаться использовать уравнения (7.8) и (7.9) для случаев, представлен-
ных на рис. 7.3, возникают трудности, связанные с предэкспоненциальным мно-
жителем, С, поскольку он предполагает учет частоты пересечения барьера. Очевид-
но, что две молекулы, участвующие в реакции связывания, будут преодолевать
барьер с частотой, пропорциональной частоте межмолекулярных столкновений.
Две связанные молекулы находятся в положении энергетического минимума и со-
ответственно достигают барьера значительно чаще, поскольку комплексу свойст-
венны колебания, тогда как движение входящих в него двух молекул ограничено.
В этом случае можно составить уравнение детального равновесия, подобное урав-
нению (7.13), которое будет отражать соотношение скоростей прямой и обратной
реакций с константой равновесия. Однако соотношение между величинами энер-
гии свободного и связанного состояний должно включать и такие параметры, как
1 Присутствие в одном выражении величин энергии и свободной энергии снижает его стро-
гость, однако здесь удобно ввести соотношение между различными энергетическими параметра-
ми и условием детального равновесия.
198
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
энтропия поступательного и вращательного движения, поскольку эти факторы
вносят вклад в константу равновесия реакции связывания (см. гл. 4). В случае
транспорта через мембрану частота ее пересечения молекулами пропорциональна
концентрации данного вещества на другой стороне мембраны (рис. 7.3, Б).
7.4. Линейное соотношение величин свободной энергии
При изменении структуры молекулы обычно изменяются константы равновесия
и константы скоростей реакций, в которых она участвует. Изменения этих пара-
метров часто хорошо коррелируют, так что наблюдается линейное соотношение
величин свободной энергии. Этот принцип линейного соотношения величин сво-
бодной энергии используется при изучении механизмов реакций в органической
химии, а также в многочисленных исследованиях в биофизике.
Влияние какого-либо фактора на изменение свободной энергии реакции
и константы ее скорости можно наглядно продемонстрировать с помощью графи-
ка изменения потенциальной энергии вдоль координаты реакции. Допустим, что
изменение структуры молекулы привело к стабилизации состояния В относитель-
но состояния А. В таком случае правый энергетический минимум на рис. 7.2, соот-
ветствующий состоянию В, примет более низкое значение. Далее, если влияние
данного структурного сдвига изменяется линейно вдоль координаты реакции,
энергетический профиль в области барьера будет изменяться соответственно и но-
вый график изменения потенциальной энергии можно построить путем вычита-
ния из прежнего линейной функции. Линейное изменение функции энергии по-
казано на рис. 7.4. Если приравнять разность между двумя минимальными значе-
ниями энергии, соответствующими состояниям А и В, изменению свободной
энергии, ДО, изменения ДО и Е* будут пропорциональны.
Если положение максимума на координате реакции не изменяется, должно
иметь место линейное соотношение между энергией активации и изменением сво-
бодной энергии перехода
Е*=Е*°-ФД6 (7.14)
Это уравнение отражает предположение, что вершина барьера может находиться
в произвольной точке реакционного пути между двумя сторонами барьера. Часть
Рис. 7.4. Изменение графика энергетическо-
го барьера в результате прибавления убы-
вающей линейной функции. Поскольку вер-
шина барьера находится посередине между
энергетическими минимумами, соответствую-
щими двум различным состояниям, сдвиг Е*
равен 1/2 изменения AG.
7А. Линейное соотношение величин свободной энергии
199
Ф = 0,5
Рис. 7.5. В результате прибавления линейного профиля энергии к барьеру величина Е* изменя-
ется пропорционально изменению AG. Пропорциональность зависит от значения Ф, положения
энергетического максимума между минимумами на координате реакции.
пути — от левого минимума до вершины барьера, обозначаемая Ф, может варьиро-
вать от 0 до 1. На рис. 7.4 вершина барьера находится посередине между его грани-
цами и соответственно Ф = 1/2.
Различные положения вершины барьера иллюстрирует рис. 7.5. Если вершина
близка к точке энергетического минимума, соответствующего состоянию А, вели-
чина Ф низка и энергия перехода А —> Влишь слабо зависит от изменения свободной
энергии. Когда вершина барьера расположена ближе к минимуму, соответствующе-
му состоянию В, значение Ф высокое и энергия перехода сильнее зависит от Д(7.
Линейные соотношения величин свободной энергии применимы при исследо-
вании конформационного перехода с помощью мутантных форм белка, если во
всех случаях можно измерить константы скорости и равновесия данного процесса.
Чтобы использовать результаты таких измерений, удобно преобразовать уравнение
(7.14) с использованием уравнения (7.5) и заменой Д(7 наЯПп К. Произведя лога-
рифмирование, получаем следующее выражение
Ina = InC - E*°/RT+ Ф\п К (7.15)
Это уравнение описывает линейную зависимость логарифма константы скоро-
сти процесса от логарифма константы равновесия. Оно применимо для изучения
многих кинетических процессов. Особенно широко уравнение (7.15) используется
в теории кислотно-основного химического катализа, где известно как уравнение
Бренстеда. В теории ферментативного катализа уравнение Бренстеда применяется
для изучения того, каким образом каталитически активные боковые цепи амино-
кислотных остатков в молекулах ферментов взаимодействуют с субстратами (см.
разд. 10.12 и 10.13).
Примером использования принципа линейного соотношения величин свобод-
ной энергии может служить структурно-функциональный анализ гемоглобина
(Eaton et al., 1991). Этот аллостерический белок подвергается переходу из Т-состо-
яния, в котором молекула имеет низкое сродство к кислороду, в R-состояние, ха-
рактеризующееся высоким сродством к кислороду (см. разд. 5.8). При изучении
этого перехода варьируют число занятых связывающих участков, лиганды (О2, СО,
Nj), pH и другие факторы. Вводя такие различия, измеряют константу равновесия
и скорость перехода между двумя аллостерическими состояниями. График зависи-
мости Ina от In К показывает, что значения этих параметров близко соответствуют
200
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Рис. 7.6. Линейный график свобод-
ной энергии аллостерического пере-
хода в молекуле гемоглобина. Точки
соответствуют различным условиям,
при которых измеряли значения К и
а. (По Eaton et al., 1991.)
линейному соотношению величин свободной энергии (рис. 7.6). Подстановка из-
меренных значений констант равновесия двух состояний и скорости перехода ме-
жду ними в уравнение (7.15) позволяет вычислить Ф = 0,17. Следовательно, верши-
на энергетического барьера расположена ближе к минимуму, соответствующему
R-состоянию (подобно вершине на левом графике на рис. 7.5). Отсюда можно за-
ключить, что структура гемоглобина в переходном состоянии, вблизи вершины
энергетического барьера, ближе к его структуре в R-состоянии, чем к структуре
в Т-состоянии.
Графики, показывающие линейное соотношение величин свободной энергии,
особенно полезны при кинетическом анализе, если можно исследовать наряду
с белком дикого типа его мутантные формы. Однако здесь имеются определенные
ограничения, поскольку мало что известно о реальных реакционных путях и фор-
ме функции потенциальной энергии для конформационных переходов. Весьма со-
мнительно, что в случае макромолекулы, обладающей большим числом внутрен-
них степеней свободы, существует лишь единственный реакционный путь перехо-
да между двумя конформационными состояниями (см. разд. 7.10). Кроме того,
нельзя предполагать, что при структурных изменениях происходят линейные
сдвиги реакционного пути. На рис. 7.7 представлен вариант рис. 7.4 для случая не-
линейного изменения, который может иметь место при модификации молекулы,
Рис. 7.7. При нелинейных сдвигах реакци-
онного пути изменения Д(Э и Е* не влияют
существенно на значение Ф.
7.5. Константы скорости потенциал-зависимых макропереходов
201
приводящей к ослаблению пространственного отталкивания в состоянии В. Ввиду
того, что пространственное отталкивание действует на коротком расстоянии (см.
разд. 2.11), такое изменение не будет распространяться далеко. Значение энергии
на вершине барьера существенно не изменится. Следовательно, значение Ф будет
низким (0,2 на рис. 7.7). В таком случае возможно сделать неверное заключение,
что вершина барьера ближе к минимуму, соответствующему состоянию А. В на-
стоящее время эти вопросы остаются неясными, поскольку пока недостаточно
сведений об изменении структуры и энергетики молекул вдоль координаты пере-
хода.
7.5. Константы скорости потенциал-зависимых
макропереходов
Принцип линейного соотношения величин свободной энергии можно использо-
вать при анализе кинетики потенциал-зависимых конформационных изменений
мембранных белков (см. разд. 1.8). Напомним, что один из основных процессов
данного типа — это обратимый переход ионного канала из открытого состояния
в закрытое, описываемый схемой (7Б)
С<=±0 (7Б)
Р
Если потенциал падает на мембране линейно и соответствующая разность потен-
циалов вносит вклад в энергетический барьер, разделяющий два состояния мем-
бранного белка, влияние потенциала на соотношение величин энергии данных со-
стояний может соответствовать графику, представленному на рис. 7.8.
Обозначим падение мембранного потенциала на участке между двумя миниму-
мами как 5; тогда потенциал-зависимый вклад в разность величин энергии двух со-
стояний будет определяться как 5 И. Если барьер расположен точно посередине ме-
жду минимумами, соответствующими двум состояниям (т. е. Ф = 1/2), изменение
высоты барьера означает прибавление или вычитание половины этой разности.
Следовательно, две константы скорости определяются следующим образом
(7.16а)
р . (7.166)
Выше в этой главе отмечено, что кинетика релаксации к новому состоянию
равновесия в модели двух состояний описывается экспонентой с постоянной вре-
мени т = 1/(а + р). Произведя в соответствии с этим выражением подстановку
в уравнения (7.16) для констант скорости, мы получаем следующее выражение для
постоянной времени потенциал-зависимого перехода
е£* е£
С (е6,//2ЯГ + е6И/2ЯГ) 2С [мт)’
(7.17)
где sech(x) = l/cosh(x) (см. приложение 5).
202
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Рис. 7.8. Влияние потенциала на различие в энергии двух состояний мембраносвязанного бел-
ка. Барьеры для перехода в каждом направлении изменяются пропорционально изменению
разности величин энергии (см. рис. 1.4), и 8 характеризует долю падения потенциала, приходя-
щуюся на область между двумя минимумами.
Эта функция достигает максимального значения при V = 0 (см. рис. 7.9). В тер-
модинамическом описании данной модели (см. разд. 1.8) величина потенциала
в средней точке перехода интерпретирована как разность величин внутренней
энергии молекулы в двух состояниях. Крутизна кривой перехода отражает величину
Рис. 7.9. График функции (7.17) при 8/(2ЯТ) = 1.
[.6. Соотношение Маркуса для свободной энергии
203
воротного заряда. Если эти параметры включить в анализ кинетики, можно вы-
явить параллели в отношении величины т. Например, т достигает максимума при
величине потенциала, соответствующей средней точке перехода и вершина макси-
мума на графике функции ттем острее, чем больше угол наклона кривой перехода.
Экспериментально измеренные постоянные времени для потенциал-зависи-
мых переходов во многих случаях обнаруживают именно такую зависимость. На-
пример, описанная выше зависимость тот потенциала установлена в классических
исследованиях ионных каналов мембран нейронов (см. рис. 16.6, Б) и искусствен-
ных мембран (Ehrenstein et. al., 1974). Аналогичная зависимость наблюдается так-
же в случае переноса гидрофобных ионов через липидные мембраны (Oberhauser,
Fernandez, 1995).
7.6. Соотношение Маркуса для свободной энергии
Изменение скорости реакции при изменении ее движущей силы зависит от формы
реакционного пути. Модели, рассмотренные выше, включают линейные зависи-
мости свободной энергии, но существует также теория, в которой рассматривается
их квадратичная зависимость. Исходно разработанная для характеристики реак-
ций с переносом электронов, эта теория впоследствии была модифицирована при-
менительно к реакциям с переносом протонов (Marcus, 1964, 1968). Теория Марку-
са, о которой идет речь, успешно применяется при изучении различных процессов
с переносом зарядов, и далее в этой книге с ее помощью рассмотрен механизм дей-
ствия фермента карбоангидразы (см. разд. 10.15).
График функции потенциальной энергии имеет два параболических минимума
потенциальной энергии, при х = -1 для реагента и при х = 1 для продукта реакции
(рис. 7.10). Точка перегиба в месте пересечения двух парабол соответствует пере-
ходному состоянию. В данной точке координаты реакции функция потенциальной
энергии резко переходит из одной параболы в другую. Параболическая функция
обоснованно используется для описания области в окрестности минимума потен-
циальной энергии (см. разд. 2.12). Однако исходно в теории Маркуса эта квадра-
тичная функция применена в соответствии с тем, что электростатические взаимо-
действия пропорциональны квадрату величины заряда. Кроме того, в ней учиты-
валась собственная энергия заряда сферической частицы в диэлектрической среде
(см. разд. 2.2 и уравнение (2.4)). Здесь мы выведем квадратичное выражение для
потенциальной энергии и с этой целью рассмотрим реакционный путь как количе-
ство перенесенных зарядов, или степень поляризации растворителя, которая
должна уравновешивать электростатическую энергию заряда, совершающего ска-
чок от одного центра к другому.
Запишем квадратичную зависимость потенциальной энергии от положения
относительно минимума для каждого из двух минимумов в виде выражений
G_, = G0*(x+l)2
<7, = G0*(x -I)2 + Д(7°,
(7.18а)
(7.186)
где G означает энергию, под которой понимается свободная энергия в той же фор-
ме, какой представлена свободная энергия движущей силы реакции Д(7°. Силовые
204
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Рис. 7.10. Параболы с точками перегиба
при х = +1 и х = -1 описывают потенциаль-
ную энергию как функцию координаты ре-
акции для реагента и продукта реакции.
Точка пересечения парабол соответствует
переходному состоянию с энергией G*.
При увеличении энергии продукта реакции
изменяется движущая сила реакции, что
приводит к изменению положения и энер-
гии переходного состояния.
постоянные в уравнениях (7.18а) и (7.186) обозначены как Gq , чтобы получить
удобное выражение для описания того, что, когда два минимума потенциальной
энергии одинаковы (А (7° =0), значение энергии в точке пересечения парабол со-
ставляет величину энергии активации Gq . При значениях Д<7°, не равных нулю,
положение точки пересечения можно вычислить, если принять, что функции
(7.18а) и (7.186) эквивалентны.
Gq(x +1)2 = Gq(x -1)2 + Аб° (7.19)
Решение для х соответствует положению переходного состояния на координате ре-
акции.
х*=-^ (7.20)
4С?0*
Чтобы определить энергию переходного состояния, достаточно вычислить бщ^с*)
или б/х*)
G*=Gf 1 + ^Ц <7-21)
Таким образом, мы получили уравнение квадратичной зависимости высоты энер-
гетического барьера от движущей силы реакции.
График, представленный на рис. 7.10, не отражает такой важной для количест-
венного описания процесса с переносом заряда характеристики, как работа, затра-
ченная на приведение двух реагирующих групп в необходимые положение и ори-
ентацию. Соответствующие этой работе параметры, обозначаемые wp (для реаген-
тов) и wn (для продуктов), не зависят от движущей силы реакции. Введение
параметра wp в уравнение (7.21) позволяет получить полное выражение для сво-
бодной энергии.
7.7. Теория Эйринга
Рассмотрим более подробно динамику пересечения энергетического барьера реак-
ции. Количественное выражение для скорости этого перехода выводится в стати-
стической механике, согласно теории Эйринга для абсолютной скорости реакции.
Обычно это выражение получают для реакции между двумя сталкивающимися мо-
[.7. Теория Эйринга
205
л акулами, но здесь мы получим его для модели двух состояний молекулы. Вначале
обратимся к графику реакционного пути (рис. 7.2) и определим относительную ве-
роятность положения на вершине барьера по сравнению с положением в любой
точке левого минимума. Обозначим координату реакции как £ и выразим вероят-
ность нахождения в элементе d^ с помощью распределения Больцмана
№№ = eU(WkT<%/A, .. (7.22)
где U(g) — это потенциальная энергия, график которой представлен на рис. 7.2, и
А = л/л2/(2лаиА:7Э — длина тепловой волны Де Бройля (см. разд. 4.6). Напомним,
что длина волны Де Бройля — это длина одной границы кубического пространст-
ва, определяемого в квантовой механике. Таким образом, вид распределения
Больцмана в уравнении (7.22) нормирует элемент длины d^ к этому основному
кванту длины, что позволяет получить соотношение абсолютной вероятности на-
хождения молекулы на вершине барьера и вероятности ее нахождения в любой
точке левого минимума.
Рассмотрим область непосредственно слева от вершины барьера, настолько
близкую к вершине, чтобы приближенно считать в ней уровень потенциальной
энергии постоянным. Определим элемент длины d£ таким образом, что молекулы
в данном элементе двигаются вправо со скоростью v и пересекают среднюю точку
барьера за время dr. При этом молекулы подвергаются переходу из одного состоя-
ния в другое. В качестве параметра скорости перехода будем рассматривать ее
среднеквадратичную величину Jv* = ^(кТ/т). Тогда элемент длины, в котором
присутствуют достигшие барьера молекулы, — это расстояние, пройденное за вре-
мя dr, т. е. vdr ’
dl; = dJ^ (7.23)
V m
Подставляя данное выражение в распределение Больцмана (7.22), получаем, что за
время dr совершает переход только половина молекул (остальные движутся по дру-
гой траектории). Обозначим это число молекул как dTV
d/V = dL [ELe-e’/*r (7.24)
2A V m
Подставляя в указанное выражение приведенную выше величину Ав явной форме,
приведем его к более простому виду
dTV =d/^^^e-£’/*r (7.25)
Поскольку константа скорости — это число молекул, пересекающих барьер в еди-
ницу времени, выражение для скорости перехода можно записать следующим об-
разом
а = ^е’£’/*г (7.26)
206
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕСС!
Множитель ^/тс/2 заменен здесь коэффициентом к. С помощью данного поправоч-
ного множителя, называемого коэффициентом пропускания, учитываются неяс-
ные детали процесса. Можно вывести искомое выражение и более сложным обра-
зом, используя распределение скоростей вместо среднеквадратичной величины
скорости, но и этим способом невозможно получить точное значение к (Hill, 1060,
ch. 11).
Зависимость (7.26) представляет собой важное положение теории химической
кинетики. Для реакций, протекающих в газовой фазе, она подтверждена результа-
тами многочисленных исследований, показавших высокое соответствие уравне-
ния (7.26) измеряемым величинам (Moore, 1972, ch. 9). Однако к кинетическим
процессам, протекающим в жидкостях, данная теория применима в гораздо мень-
шей степени, поскольку направление движения вдоль координаты реакции £
может меняться вблизи вершины барьера. В случае реакций в газах обращение
движения не частый случай, но в жидкостях оно происходит часто в результате
столкновений молекул и изменений температуры. Отсюда следует, что среднеквад-
ратичная скорость перехода = yJ(kT)/m не может использоваться для расчета
того, сколько молекул пересекает барьер. Напомним, что в разд. 6.4 при анализе
случайного движения было определено, что в среднем направление движения мо-
лекулы меняется после ее смещения, равного лишь 0,1 А. Это беспорядочное дви-
жение молекул вдоль координаты реакции необходимо учитывать, и один из спо-
собов учета данного фактора состоит в создании модели, в которой координата ре-
акции сопряжена с бесконечным числом других координат, соответствующих
положениям молекул растворителя. Результаты, получаемые с помощью такого
подхода, совпадают с выводами более простой теории, в основе которой лежит по-
нятие диффузии через энергетический барьер (Hanggi et al., 1990).
Эту диффузионную теорию химических реакций мы рассмотрим в следующем
разделе. Заканчивая данный раздел, посвященный теории Эйринга, важно отме-
тить, что в случае характерных для живых клеток реакций в жидкостях предэкспо-
ненциальный множитель (ккТ)/Ь в уравнении (7.26) не имеет какого-либо значе-
ния. Это необходимо четко представлять, поскольку в литературе часто встречают-
ся примеры некорректного использования теории Эйринга.
7.8. Диффузия через барьер: теория Крамерса
Математический анализ диффузии служит важным подходом к изучению кинети-
ческих процессов, включающих скачок через энергетический барьер (Kramers,
1940; Hanggi et al., 1990). Напомним (см. гл. 6), что при диффузии под действием
внешней силы F происходит поток FC(JQ/f, где f — коэффициент трения. Здесь мы
будем рассматривать F как силу, которую можно определить по углу наклона гра-
фика, представленного на рис. 7.2, если перед производной потенциальной энер-
гии поставить отрицательный знак, -d£/(^)/d^. Градиент концентрации также вы-
зывает поток, равный -Z>(dC(^)/ d^), где D — коэффициент диффузии. В случае
диффузии через барьер градиент концентрации превращается в градиент вероят-
ности нахождения молекулы в определенной позиции на координате реакции.
Следовательно, необходимо перейти от переменной С(^) к переменной Р(^). Далее
с помощью уравнения (6.64) составим уравнение для потока вероятности
,8. Диффузия через барьер: теория Крамерса
207
f _P_dU__dP_
[ кТ
(7.27)
1Это уравнение описывает зависимость потока Р(£) как от функции потенци-
альной энергии, так и от случайных столкновений молекул с молекулами раство-
рителя и фрагментов молекул. Объединим две производные в производную произ-
ведения
(7.28)
Полученное уравнение можно проверить, если продифференцировать Psu/kt с по-
мощью теоремы умножения. Далее предположим, что через барьер проходит ста-
ционарный поток (условие стационарного состояния). Значение / при стационар-
ном состоянии постоянно вдоль всего энергетического барьера, т. е. не зависит от
кроме того, величина Рне зависит от времени, поскольку в любой точке потоки
в противоположных направления взаимокомпенсированы.
Теперь выведем выражение для / при стационарном состоянии. Вначале умно-
жим уравнение (7.28) на eu/kt и возьмем его интеграл на отрезке от одной стороны
барьера до другой. Поскольку значение / в этой области постоянно, данную вели-
чину можно вынести за знак интеграла
ь
J j = D (Р(а)еи°/кТ - P(b)eUi/kT)
а
(7.29)
При соотнесении с рис. 7.2 можно видеть, что значение £ = а — это средняя точка
минимума с центром А и значение £ = b — это средняя точка минимума с центром
В. При t = 0 ни одна из молекул еще не совершила переход, так что все молекулы
находятся слева в области минимума А. Это означает, что Р(Ь) = 0. Предположим,
что в точке = а энергия равна нулю, и сведем уравнение (7.29) к следующему вы-
ражению для потока через барьер
J = bDP(a) (7.30)
je^di;
а
Если мы имеем математическую функцию, описывающую форму барьера, ее
можно проинтегрировать и получить полное решение. Воспользуемся уравне-
нием координаты реакции в верхней точке барьера, U(£) = Е*-ср*(^-^*)2, где
Е* — высота барьера и член -ср*(^-^*)2 означает квадратичное убывание
функции по обе стороны барьера. Вынося е-£ /кТ, мы получаем интеграл гауссо-
вой функции, который можно определить, получив в результате выражение
£е'ф’)Wd£, = JnkT/<f (см. уравнение (П4.4); пределы ±оо можно не прини-
мать во внимание, поскольку значения функции вне максимума представляют со-
бой очень малые величины). Выражение для потока в стационарном состоянии бу-
дет, таким образом, иметь следующий вид
J = РР(а) еЕчкт (7.31)
y]TikT/^
208
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Наконец, определим Р(а) — вероятность нахождения молекул в центре энерге-
тического минимума слева от барьера. В начале процесса эта вероятность равна
единице, поскольку все молекулы находятся в области энергетического миниму-
ма. Предположим, что молекулы расположены в этой области в соответствии с рас-
пределением Больцмана. Это не вполне корректно, так как происходит постоян-
ный поток вправо, но вместе с тем переходы через барьер редки и поэтому в дан-
ном случае допустимо использовать распределение Больцмана. Представим
потенциальную энергию как квадратичную функцию, ветви графика которор об-
ращены вверх и точка перегиба соответствует £, = а, в виде выражения
t/(£) = ф0(£-я)2. Таким образом, в указанной области Р(£) = e-<₽fl(^"o) /кТ; при этом
Р(а) = 1 у/J 11Путем подстановки в уравнение (7.31) полу-
чаем выражение для константы скорости перехода при диффузии через барьер
а _ ^УфоФ* z~E*/kT
пкТ
(7.32)
Данное выражение полезно сопоставить с тем, которое было получено на ос-
нове теории Эйринга (уравнение (7.26)). Это сравнение показывает, что в обеих
моделях вероятность нахождения на вершине энергетического барьера подчиняет-
ся распределению Больцмана, поскольку оба выражения описывают экспоненци-
альную зависимость от высоты барьера. Однако предэкспоненциальные множите-
ли в них заметно различаются. Исходя из зависимости D от а в уравнении (7.32)
можно чисто интуитивно предположить, что данное различие определяется легко-
стью диффузии вдоль координаты реакции. Действительно, заменив D членом
кТ/(6тщг) (уравнение (6.66)), получаем, что коэффициента обратно пропорциона-
лен вязкости. Таким образом, трение, испытываемое молекулой во время движе-
ния вдоль координаты реакции, непосредственно влияет на скорость реакции.
Кроме того, представляют определенный интерес зависимости отф* и ф0. Указан-
ные параметры отражают обратное значение ширины барьера и левого энергетиче-
ского минимума соответственно. Отсюда следует, что при сужении области барье-
ра скорость процесса возрастает, как и при сужении области минимума.
Уравнение (7.32) определяет скорость пересечения барьера под влиянием теп-
лового движения. Эта теория описывает элементарные кинетические процессы
в жидкостях, где случайное движение молекул сопровождается частыми измене-
ниями направления их движения. При более общем физическом подходе к пробле-
ме данный случай рассматривается как предельный в отношении высокой вязкости
среды. Для случая, когда вязкость среды низкая, картина перехода через барьер
описывается совершенно иным образом. Молекулы совершают многократные ко-
лебания в пределах энергетического минимума, не пересекая барьер. Столкнове-
ния с другими молекулами увеличивают или уменьшают энергию колебаний, и в
результате этого случайного процесса молекула достигает энергетического уровня,
при котором возможно пересечение барьера. Следовательно, в данном случае, чем
больше столкновений, тем выше скорость реакции. При высокой вязкости среды
столкновения обусловливают возрастание коэффициента трения и снижение ко-
эффициента диффузии, что замедляет реакцию. Соотношение между скоростью
реакции и тепловыми колебаниями подробно рассматривается в оригинальной ра-
боте Крамерса (Kramers, 1940) и в работе Хангги с соавт. (Hanggi et al., 1990).
l9. Кинетика одиночных каналов
209
7.9. Кинетика одиночных каналов
При регистрации тока на фрагменте мембраны, выделенном с помощью пипетки
(метод пэтч-кламп), наблюдаются скачки тока, соответствующие открыванию
и закрыванию одиночных каналов (рис. 7.11). Эти скачки тока отражают конфор-
мационные переходы каналообразующих белков между двумя состояниями. Такие
переходы происходят беспорядочно во времени, подобно случайному движению
молекул, и кинетику переходов одиночных молекул-каналов можно описать с по-
мощью стохастического варианта кинетической теории.
Анализ в данном случае сходен с анализом модели двух состояний, приведен-
ным выше, но при этом содержит несколько интересных отличий. Иная форма
данных по регистрации одиночных каналов заставляет ставить и принципиально
иные вопросы. Результаты экспериментов по регистрации одиночных каналов не-
обходимо выражать в терминах вероятности, а не концентрации. Чтобы вычислить
вероятность того, что канал будет оставаться в открытом либо в закрытом состоя-
нии определенный промежуток времени или оставаться открытым либо закрытым
дольше определенного промежутка времени, следует ввести функцию плотности
вероятности, pit). Эта функция определяет вероятность того, что событие будет
иметь продолжительность в интервале времени [/, Z + dZ], как p(Z)dz. В отличие от
этого функция распределения вероятности, P(z), определяет вероятность того, что
продолжительность события превышает временной промежуток Z.1 Эти функции
вероятности связаны следующим соотношением
00
jp(s)d5 = P(0 (7.33)
t
Запишем вновь простую схему модели двух состояний
С<=±0 (7Б)
Символ С в схеме (7Б) обозначает закрытое состояние канала, символ О — откры-
тое. Выведем уравнение для P0(Z), для чего определим соотношение между P0(Z) и
P0(Z+dZ). Очевидно, что, если канал находится в открытом состоянии до момента
Рис. 7.11. Ток через одиночный Cl -канал, активированный уАМК, при напряжении -80 мВ. (По
Zhang, Jackson, 1995.) уАМК — у-аминомасляная кислота.
1 Использование распределения в данной форме удобно для анализа кинетики одиночных ка-
налов. В других случаях указанную величину, как правило, называют функцией надежности
и распределение записывают в виде единица минус величина из уравнении (7.33) либо как инте-
грал p(s) от 0 до t.
210
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
времени t + dr, он должен был находиться в нем и до момента времени Г. В проме-
жуток времени между t и r + dr может происходить закрывание, следовательно, ве-
роятность 7^ (r + dr) должна быть меньше вероятности Р0(Г). Запишем вероятность
закрывания в данный промежуток времени как 0dr. Единственная противополож-
ная вероятность — это вероятность того, что в данный промежуток времени канал
не закроется, и соответственно ее значение составляет 1 - pdr. Вероятность сохра-
нения открытого состояния до момента времени r + dr рассчитывают как произве-
дение вероятности его сохранения до момента времени Г и вероятности того, канал
не закроется в последующий короткий интервал
P0(r + dr) = (l-pdr)P0(r) (7.34)
На этом этапе необходимо принять несколько ключевых допущений. Во-
первых, интервал dr должен быть достаточно малым, чтобы вероятность более чем
одного перехода в нем была пренебрежимо мала. Во-вторых, рассматриваемый
процесс должен быть марковским процессом (см. разд. 6.6). Независимо от того,
насколько долго канал был открыт, вероятность его закрывания будет определять-
ся только собственной частотой р и длительностью малого интервала времени dr.
Путем простой перестановки приведем уравнение (7.34) к виду дифференци-
ального уравнения первого порядка
dP
= -РРО (7.35)
dr
Решение этого уравнения представляет собой сумму экспоненциальной функции
и константы скорости перехода, но константа будет равна нулю, если ввести на-
чальное условие Р(0) = 1. Таким образом, решение принимает следующий вид
Ро(0 = еЛ (7.36)
где значение Р0(Г) в точке Г = 0 равно 1 и на достаточно продолжительном проме-
жутке времени убывает до нуля. Следовательно, любой открытый канал должен
оставаться открытым по меньшей мере бесконечно малое время и все открытые
каналы должны когда-то закрываться. Дифференциальное уравнение (7.35) про-
ще, чем пара уравнений (7.1а) и (7.16), описывающих кинетику макроскопической
системы с двумя состояниями. Это объясняется тем, что после закрывания канал
уходит из рассмотрения, по аналогии с молекулой при диффузии в случае погло-
щающих граничных условий (см. разд. 6.2.4).
Графически вероятность времени жизни состояния одиночного канала можно
представить как число интервалов открытого состояния соответствующей дли-
тельности при разбиении по времени с одним и тем же шагом (рис. 7.12).’ Если от-
крыты N каналов, начальный ток будет иметь значение Ni, где i — ток через оди-
ночный канал. Общая величина тока будет экспоненциально убывать как
iNP(t) = (уравнение (7.36)). В действительности таким способом хорошо опи-
сывается процесс синаптической связи. Выделение нейромедиатора в синаптиче-
скую щель вызывает одновременное открывание большого числа каналов.
1 Способы анализа данных по активности одиночных каналов в подробном изложении мож-
но найти в книге «Регистрация одиночных каналов» (М. «Мир». 1987). — Прим. вед. ред.
l9. Кинетика одиночных каналов
211
Рис. 7.12. Распределение времени жиз-
ни ^открытого состояния может быть
представлено как частота интервалов
открытого состояния при разбиении по
времени с одним и тем же шагом. При
синапсе каналы открываются почти од-
новременно и закрываются беспоря-
дочна, что описывается таким распре-
делением времени жизни открытого со-
стояния. (См. «Регистрация одиночных
каналов», с. 185. — Ред.)
Несвязанный медиатор очень быстро удаляется, и повторное связывание с рецеп-
тором, приводящее к повторному открыванию канала, невозможно. Таким обра-
зом, этот синаптический ток описывается формулой вероятности открытого со-
стояния одиночного канала, экспоненциально убывающей с константой р.
Сравним уравнение (7.36) с уравнением (7.4), представляющим собой аналогич-
ное выражение для макроскопических условий. Поскольку для одиночных каналов
начальные и конечные условия проще, экспоненциальная функция в этом случае не
имеет суммарной константы. Интересное отличие уравнения (7.36) состоит также
в том, что константой убывания в нем является р, а не сумма констант а + р.
С помощью тех же логических рассуждений, которые использовались для вы-
ведения формулы распределения времени жизни открытого состояния, получим
формулу распределения времени жизни закрытого состояния
Рс(0 = е"а/ (7.37)
Таким образом, аир можно определить раздельно по формулам распределения
времени жизни закрытого и открытого состояний соответственно. Функции плот-
ности вероятности выводятся путем дифференцирования и замены знака (см.
уравнение (7.33))
Ро(0 = ре-₽' (7.38а)
(7.386)
рс(1) = аеш
212 Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
--------------------------------------------------------------------
Эта простая модель для описания временной зависимости синаптического
тока, определяемой скоростью закрывания канала, была выведена в начальный пе-
риод исследований функции каналов при нервно-мышечном синапсе (Anderson,
Stevens, 1973). Впоследствии она была модифицирована с учетом того, что канал
может многократно закрываться и открываться в то время, когда связывающие
участки заняты. Таким образом, убывание синаптического тока определяется про-
должительностью пачки открываний канала. В данной модели требуется рассмат-
ривать большее число кинетических состояний и применять иные методы анализа
(см. разд. 9.7—9.9).
Важно отметить, что регистрация одиночных каналов позволяет измерять кон-
станты частоты их открывания и закрывания, аир, без применения какого-либо
стимула для инициации кинетического процесса. Начального момента времени
t = 0 в этом случае нет. Регистрация тока в течение продолжительного времени по-
казывает скачкообразные колебания от состояния равновесия. По этим записям
вычисляют время жизни открытого и закрытого состояний, что позволяет вывести
соответствующие распределения. Если такие колебания тока слишком малы, что-
бы их можно было зарегистрировать, исследуют общие флуктуации тока большого
числа каналов — шум каналов, также позволяющий определять свойства каналов
(см. разд. 12.8 и 12.11).
7.10. Координата реакции в случае макроперехода
В рассмотренных выше кинетических теориях учитывается одна координата реак-
ции. Однако для анализа конформационного перехода в белковой молекуле это
крайне упрощенный подход. В молекуле белка при таком переходе изменяются
расстояния между тысячами атомов и соответственно существует большое число
внутренних координат реакции; поэтому возникает вопрос, в какой мере теория
процессов с одной координатой реакции может применяться для анализа белков.
При изучении макроперехода в белковых молекулах проблема состоит в том,
чтобы описать движение в пространстве с очень большим числом измерений. Ус-
ловие многомерности требует определения макросостояния как ансамбля микро-
состояний вблизи данного минимума на мультимерной поверхности потенциаль-
ной энергии (см. разд. 1.1). Через пространство между энергетическими миниму-
мами, определяющими два различных макросостояния, реализуется, вероятно,
большое число реакционных путей. При макропереходе потенциальная энергия
должна вначале значительно возрастать, чтобы молекулы могли покидать положе-
ние одного минимума, и затем вновь снижаться, чтобы они оказывались в положе-
нии другого минимума. На любом из возможных при этом реакционных путей
должен существовать энергетический максимум, и наиболее часто реализуемым
должен быть путь с наименьшей высотой максимума. Как отмечено в разд. 7.2, та-
кой путь можно сравнить с горным перевалом, и поверхность потенциальной
энергии в этой области называют седловиной (см. рис. 7.13).
Теорию перехода через энергетический барьер, описывающую реакции с одной
координатой реакции, удается распространить на системы с многомерным про-
странством координат путем введения некоторых структурных данных о характере
поверхности потенциальной энергии вблизи точки перевала и энергетических ми-
A10. Координата реакции в случае макроперехода
213
Рйр. 7.13. В случае многомерной функции потенци-
альной энергии путь реакции при макропереходе
включает точку перевала. Функция потенциальной
энергии имеет минимум в отношении всех внутрен-
них координат, кроме одной, координаты реакции.
Путь реакции показан стрелкой. Максимум на коор-
динате реакции соответствует точке перевала.
нимумов (Hanggi et al., 1990). Если принять энергию активации Е* за энергию
в центре седловины, можно использовать теорию перехода через барьер для иссле-
дования макропереходов в белках, рассматривая структуру переходного состояния
в рамках многомерного пространства.
В качестве примера рассмотрим переходное состояние при денатурации бел-
ка — макропереходе белковой молекулы из нативной, свернутой конформации
в развернутую конформацию. Такой переход может быть индуцирован повышени-
ем температуры (см. разд. 1.3) либо воздействием денатурирующих веществ (см.
разд. 1.7). Под действием денатурирующего вещества D изменяется разность вели-
чин свободной энергии нативного и развернутого состояний в соответствии
с уравнением (1.22)
ДСП = AGn°-mn[D], (7.39)
где Д6“ — свободная энергия развертывания (перехода) в отсутствие денатури-
рующего вещества и Д(7^ — свободная энергия развертывания при концентрации
денатурирующего вещества [D]. Параметр тп — коэффициент действия денатури-
рующего вещества — можно определить как энергию взаимодействия между D
и внутренней областью белковой молекулы. Рассматривая денатурацию как мак-
ропереход между двумя состояниями, мы можем выразить константу равновесия
для развернутого и свернутого состояний белка (Рр и Рс) через Д(7П. Преобразова-
ния, описанные в гл. 1, позволяют получить уравнение зависимости относитель-
ной концентрации белка в развернутой конформации от концентрации денатури-
рующего вещества и Д(?п
[Рр]
1
[РС] + [РР] l + e4c!“w"|D1
Это выражение сходно в основе с уравнениями (1.13) и (1.27). С его помощью мож-
но определить Д(7П0 и тп, измеряя [Рр] при различных значениях [D].
Скорость развертывания определяется как экспоненциальная функция сво-
бодной энергии переходного состояния
кп =Cc~^/RT (7.41)
Если предположить, что под действием денатурирующего вещества изменяется
только величина Д(7*, но не предэкспоненциальный множитель С, влияние кон-
(7.40)
214
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
центрации денатурирующего вещества на скорость развертывания можно описать
следующим выражением
Д(7* = Д<7*°-m*[D] (7.42)
Взяв логарифм уравнения (7.41) и подставив в него выражение (7.42) для AG*, по-
лучаем уравнение
1пАгп =ln£n°+/<[D], (7.43)
где к° — скорость перехода при [D] = 0. Подставляя в данное уравнение результаты
измерения скорости развертывания при различных значениях [D], можно опреде-
лить /и*. Параметры тп и т* количественно отражают скрытую внутреннюю об-
ласть молекулы; соотношение /и*/тр названо числом Танфорда 0Т. Это очень важ-
ная величина, сравнимая по значению с Ф в уравнении (7.15); она определяет часть
белковой молекулы, скрытую в ее внутренней области при переходном состоянии
в процессе развертывания (Fersht, 1998). Число Танфорда 0Т принимает значения
от 0,28 до 0,88, из чего следует, что белки незначительно различаются в отношении
той фракции молекулы, которая остается недоступной для растворителя при пере-
ходном состоянии (Tanford, 1970).
Подвергая денатурации мутантные формы белка и сравнивая характеристики
их конформационного изменения с характеристиками этого перехода в белке ди-
кого типа, можно определить этапы процесса развертывания. В случае мутации,
приводящей к включению боковой цепи одного из аминокислотных остатков в ту
внутреннюю часть молекулы белка, которая взаимодействует с денатурирующим
веществом, значение тп возрастает, т. е. развертывание белка вызывает меньшая
концентрация D. Таким образом, можно определить влияние данной мутации на
энергетический баланс между нативным и развернутым состояниями.
Чтобы определить влияние мутации на величину свободной энергии переход-
ного состояния, прологарифмируем соотношение вычисляемых по уравнению
(7.41) констант скорости денатурации белка дикого типа и его мутантных форм
^ = -RT\n(kn/kfn) (7.44)
Аналогичным способом можно установить влияние мутации на А(7„ в уравнении
(7.40) и получить выражение для АА<7°. Если исходить изданных, представленных
на рис. 7.5, можно предполагать, что изменение свободной энергии переходного
состояния, ААС*, составляет часть изменения свободной энергии развертывания,
AAGn°
ААС7* = ФААС7П° (7.45)
Таким образом, располагая значениями AAG* и АА<7°, можно определить величину Ф.
В случае многомерных кинетических процессов величина Ф имеет другой смысл.
Наиболее важно, что в результате различных мутаций она принимает различные зна-
чения. При переходном состоянии различные части белка могут различаться по сте-
пени развертывания. Например, одна часть белка может иметь полностью разверну-
тую конформацию при переходном состоянии. В случае мутации, затрагивающей
данную область, значение Ф будет равно 0, т. е. данная мутация будет изменять кон-
станту равновесия, не влияя на скорость развертывания. В то же время другая часть
7.10. Координата реакции в случае макроперехода
215
белка может оставаться полностью свернутой при переходном состоянии, и мута-
ции, затрагивающие эту область молекулы, будут определять Ф = 1, т. е. при них ско-
рость развертывания будет изменяться в той же степени, что и константа равнове-
сия. Таким образом, величина Ф при мутации в определенной степени характеризует
структуру данной области молекулы белка при переходном состоянии.
На рис. 7.14, Б представлены значения Ф для бактериальной рибонуклеазы.
График показывает, что второй и третий а-спиральные сегменты, а также первый
Рис. 7.14. А. Схематическое изображение молекулы бактериальной рибонуклеазы, показываю-
щее основные элементы вторичной структуры. Б. По значениям Ф можно определить, какая часть
молекулы имеет упорядоченную структуру при переходном состоянии. (По Serrano et al., 1992.)
216
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
и второй 0-слои характеризуются значениями Ф, близкими к единице. Следова-
тельно, указанные части белка при переходном состоянии свернуты. При укладке
развернутой молекулы данные области, будучи уже свернутыми, служат ядром для
свертывания всей молекулы. Как видно из рис. 7.14, А, области al, a3, 01 и 02 кон-
тактируют между собой. В участках контактов сосредоточены различные гидро-
фобные остатки, и соответственно образование вторичной структуры сопряжено
с образованием этого гидрофобного комплекса. Начальный участок первой а-спи-
рали также относится к данному кластеру, и значения Ф для него также близки
к единице. Таким образом, в процессе свертывания бактериальной рибонуклеазы
существует такое состояние молекулы, при котором небольшое число ключевых
элементов имеет необходимую укладку и остальная часть молекулы свертывается
вокруг этого ядра. Применение метода имитации молекулярной динамики для
анализа развертывания этого фермента позволило выявить переходное состояние,
хорошо соответствующее результатам экспериментального определения значений
Ф (Daggett, Fersht, 2003).
Однако не при всех мутациях значения Ф равны нулю или единице. Как пока-
зывает рис. 7.14, Б, при мутациях по некоторым аминокислотным остаткам Ф при-
нимает дробные значения. В случае ингибитора-2 химотрипсина значения Ф рас-
пределены в широком диапазоне дробных значений и лишь в редких случаях этот
параметр принимает значения, близкие к нулю или единице. Среднее значение Ф
немного ниже 0,5 по всей молекуле этого белка (рис. 7.15, Б). Несколько более вы-
сокие значения Ф отмечаются для спиральных областей, и один аминокислотный
остаток, аланин-16, характеризуется значением Ф, равным единице.
В отличие от значений Ф, равных нулю или единице, которыми характеризуют-
ся полностью свернутые или полностью развернутые области белка при переход-
ном состоянии молекулы, дробные значения Ф не имеют однозначного соответст-
вия конформации. Они могут означать, что соответствующая часть белка находит-
ся в некой области частичного свертывания при переходном состоянии. Кроме
того, дробная величина Ф может представлять собой среднее значение для множе-
ственных переходных состояний при различных путях свертывания. Эти пути
можно разделить, если проанализировать последствия нескольких мутаций, затра-
гивающих один сайт (Fersht et al., 1994). Рассмотрим два различных пути укладки,
на которых различные домены белка, А и В, свертываются в разной последователь-
ности. Путь, при котором вначале происходит укладка домена А и лишь затем ук-
ладка домена В, характеризуется константой скорости ка путь с укладкой вначале
В и затем А — константой скорости кь. Наблюдаемая скорость перехода при этом
будет равна сумме скоростей перехода по обоим путям, кп = ка + къ. Если мутации
сконцентрированы в области, влияющей на укладку домена А, они будут влиять
только на скорость £а. Для этой группы мутантных вариантов белка константа ско-
рости перехода будет равна
к„ = k^G"/RT+kb (7.46)
Если в случае белка дикого типа величина къ превышает ка, мутации с незначи-
тельными ААGn -эффектами не будут иметь заметных последствий в отношении
скорости перехода. Однако при увеличении ДД(7П в результате мутации путь с ка
станет доминирующим. Таким образом, кривая зависимости кп от ДД(7П вначале
7.10. КООРДИНАТА РЕАКЦИИ В СЛУЧАЕ МАКРОПЕРЕХОДА
217
должна быть пологой и затем приобретать угол наклона с тангенсом, равным еди-
нице. В то же время при единственном пути развертывания график зависимости
кп от АА(7П должен быть линейным для всего набора мутаций в данной области
белка.
Рис. 7.15. А. Схематическое изображение молекулы ингибитора-2 химотрипсина, показываю-
щее основные элементы вторичной структуры. Три остатка, формирующие «мини-ядро», изо-
бражены объемно. Б. Величина Ф, определяемая с помощью анализа мутантных вариантов
ингибитора-2 химотрипсина, имеет дробные значения почти для всей молекулы белка. (По
Itzhaki et al., 1995.)
218
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Подобный анализ, проведенный для ингибитора-2 химотрипсина и бактери-
альной рибонуклеазы, дал два различных результата (рис. 7.16, Б). В случае инги-
битора-2 химотрипсина были изучены многочисленные мутантные формы, в кото-
рых мутацией был затронут кластер из трех аминокислотных остатков, формирую-
щих мини-ядро (остатки, показанные в объемном изображении на рис. 7.16, А).
AAGn, ккал • моль'
Рис. 7.16. Мутации, нарушающие укладку белка, повышают скорость развертывания пептидной
цепи. А. Линейная зависимость lnkn от AAGn в случае ингибитора-2 химотрипсина свидетельст-
вует о том, что процесс развертывания происходит по одному пути. Данные мутации затрагива-
ли мини-ядро, показанное на рис. 7.15, А. Б. График для мутантных форм бактериальной рибо-
нуклеазы, несущих нарушения в основной а-спиральной области (а1 на рис. 7.14, А), показыва-
ет отклонение от указанной линейности, которое свидетельствует о том. что у этого фермента
имеются различные пути развертывания (Fersht et al., 1994).
Задачи
219
Возрастающая дестабилизация свернутого состояния в результате уменьшения
гидрофобных связей между этими остатками приводила к линейному увеличению
скорости развертывания (рис. 7.16, Б). Это показывает, что в случае ингибитора-2
химотрипсина развертывание молекулы происходит по единственному пути.
В случае бактериальной рибонуклеазы обнаружена совершенно иная картина
(рис. 7.16, Б). В области низких значений AAGn график^ имеет небольшой на-
клон, но при увеличении AAGn поднимается более круто. Такая зависимость ближе
к уравнению (7.46), т. е. в данном случае имеют место множественные пути развер-
тывания молекулы. Как показывает количественный анализ этого графика, полу-
ченные результаты не соответствуют простой модели с двумя путями перехода и
вместе с тем свидетельствуют, что не все мутантные формы белка развертываются
по одному и тому же пути. Вероятно, большее число путей развертывания в случае
бактериальной рибонуклеазы связано с ее большими размерами (100 аминокис-
лотных остатков) по сравнению с ингибитором-2 химотрипсина (64 аминокислот-
ных остатка). Можно предположить, что молекула бактериальной рибонуклеазы
включает отдельные модули, которые развертываются в определенной степени не-
зависимо. Каждый из этих модулей при развертывании проходит через переходное
состояние, подобное переходному состоянию ингибитора-2 химотрипсина, в ко-
тором имеется частично сформированная вторичная структура, охватывающая об-
ширную область молекулы.
Мутантные белки используются также для анализа линейных соотношений
свободной энергии с целью выяснить путь перехода при действии ворот ионных
каналов. Для нескольких мутантных форм рецептора ацетилхолина с помощью ре-
гистрации тока через одиночные каналы были исследованы константы равновесия
и скорости открывания и закрывания канала. В случае перехода, вызванного свя-
зыванием ацетилхолина, мутации по позициям вблизи связывающего участка дают
значения Ф, близкие к единице, тогда как мутации по позициям вблизи канала —
значения Ф, близкие к нулю. На основании этих данных можно предполагать, что
при таком переходе в первую очередь изменяется конфигурация связывающего
участка с повышением аффинности к лиганду, в то время когда канал еще слабо
открыт. Таким образом, открывание канала завершается после того, как конфор-
мация связывающего участка изменится для связывания ацетилхолина (Grosman
et al., 2000). Для случая перехода при спонтанном открывании канала обнаружена
резко иная картина, а именно значения Ф, близкие к единице для всех областей
молекулы белка (Grosman, 2003). Следовательно, при открывании канала, не зави-
сящем от связывания лиганда, путь перехода существенно отличается от индуци-
рованного связыванием ацетилхолина. В этом случае переходное состояние сход-
но с открытым состоянием канала. Обнаруженная в этих исследованиях разница
в путях перехода, возможно, объясняет ~10 7-кратное ускорение открывания кана-
ла при связывании ацетилхолина.
Задачи
1. Найдите решения для а ир, используя значениях и хкон, приведенные на рис. 7.1.
2. Выведите маркусовское соотношение величин свободной энергии для случая, ко-
гда вершина энергетического барьера определяется формулой Е* - <р(х - х0)2 и по-
тенциал падает на мембране линейно, как показано на рис. 7.4.
220
Глава 7. ОСНОВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
3. Составьте выражения для констант скорости потенциал-зависимого перехода
(уравнения (7.16а), (7.166) и (7.17)) для случая, когда значение средней точки пе-
рехода не равно нулю.
4. Составьте выражение для константы равновесия процесса с двумя состояниями,
используя константы скоростей прямой и обратной реакций, согласно теории
Крамерса. Преобразуйте полученное выражение с использованием функции рас-
пределения гармонического потенциала (см. разд. 2.12).
5. Рассмотрите случай, когда запись тока одиночного канала на фрагменте мембра-
ны начинается в произвольный момент при закрытом состоянии канала. Составь-
те выражение для распределения времени ожидания открывания канала. Сравните
полученный результат с выражением для распределения времени жизни закрытого
состояния канала (Jackson, 1985).
6. Составьте выражение для распределения времени пребывания канала в открытом
состоянии при условии, что открытое состояние может смениться закрытым со
скоростью р, либо утратиться со скоростью т| в результате химического воздейст-
вия.
7. Исходя из условий, приведенных в задаче 6, выведите функцию плотности вероят-
ности открытого состояния канала для случаев, когда оно сменяется закрытым со-
стоянием и когда утрачивается при химическом воздействии.
8. Среднее время жизни состояния канала можно определить из функции плотности
вероятности как / = j Докажите, что на основе этого распределения можно
определить среднее время жизни состояния канала как t = J
Глава 8
Кинетика образования комплексов
Образование молекулярных комплексов лежит в основе механизма передачи кле-
точных сигналов и других важных биологических процессов, как отмечено при из-
ложении теории образования комплексов в гл. 4, где мы рассматривали главным
образом термодинамические основы таких реакций и факторы, влияющие на
прочность связывания. В данной главе мы проанализируем кинетику реакций свя-
зывания и факторы, влияющие на их скорость. Как и в гл. 7, вначале будет описана
кинетика процесса при заданной константе скорости, после чего мы перейдем
к анализу того, как эта константа зависит от основных физических процессов. По-
скольку в реакции образования комплекса участвует два реагента, связывание ко-
торых происходит при столкновении их молекул в растворе в процессе случайного
движения, кинетика этой реакции определяется случайными перемещениями
и диффузией.
8.1. Образование бимолекулярного комплекса
Рассмотрим два соединения, А и В, молекулы которых при столкновении связыва-
ются с образованием комплекса С (схема (8А)). Для упрощения опустим вначале
обратную реакцию. В этом случае процесс характеризуется только константой ско-
рости реакции второго порядка, а (в единицах М-1 • с-1)
А+В-^С (8А)
Примем за показатель выхода реакции количество вещества А, связавшееся
с веществом В, и обозначим эту величину как х. Соответственно этому условию
х увеличивается со скоростью, равной а[А][В]. При обозначении начальных кон-
центраций как [А]о и [В]о текущая концентрация равна [А] = [А]о -х. Концентрация
вещества В уменьшается стехиометрически, т. е. [В] = [В]о -х. Скорость изменения
х описывается тогда дифференциальным уравнением
^- = а[А][В] = а([А]0-х)([В]0-х), (8.1)
а/
преобразуемым к виду
------—-------= аск (8.2)
([А]о-х)([В]0-х)
Решить это уравнение проще всего при условии [А]о = [В]о
222
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Полученное выражение легко проинтегрировать
— -----= а/ + С (8.4)
[А]о -х
Здесь С — постоянная интегрирования. При Г = 0х=0иС = 1/[А] 0. Соответствую-
щая подстановка позволяет решить уравнение относительно х
х= а(А1°Г (8.5)
1+а[А]0/
Это выражение описывает интуитивно понятную временную зависимость ре-
акции связывания. Начальное значение х равно нулю; в ходе реакции х за опреде-
ленное время достигает значения [А]о. Время полупревращения, т. е. время, за ко-
торое концентрация А снижается наполовину и х принимает значение [А]о/2, со-
ставляет t = 1/(а[А]0). Данная величина часто сравнима с временной константой
экспоненциальной кинетики реакции изомеризации (см. разд. 7.1). Однако, в от-
личие от реакции изомеризации, кинетика реакции связывания описывается, со-
гласно уравнению (8.5), не экспонентой, а гиперболой.
Если [А]о не равно [В]о, уравнение (8.2) труднее проинтегрировать, но все же ре-
шение можно получить с помощью разложения на простые дроби. Определив по-
стоянную интегрирования (способом, аналогичным описанному выше) получаем
-а([А]о-[ B]o)r _ 1
Х = 1А|о|В||,|В1е-°»'Ч‘'->'-|Л1 <8<,)
LD Joе _ иМо
В этом уравнении присутствуют экспоненты, как и в уравнении, описываю-
щем кинетику реакции изомеризации, но данное выражение явно более сложное.
Независимо от того, используется ли уравнение (8.5) или (8.6), кинетика реакции
связывания качественно отличается от экспоненциальной зависимости, характе-
ризующей кинетику изомеризации. В общем, в случае реакций высокого порядка
зависимость скорости реакции от времени не носит экспоненциальный характер.
Однако в условиях, близких к равновесным, она приближается к экспоненциаль-
ной, что будет рассмотрено ниже.
8.2. Небольшие возмущения
Кинетические процессы часто изучают методом введения небольшого возмуще-
ния, приводящего к сдвигу равновесия. Чтобы вывести систему из состояния рав-
новесия, незначительно изменяют температуру, давление, концентрацию реаги-
рующих веществ, напряжение или другой параметр. Небольшое быстрое измене-
ние одного из этих факторов приводит к изменению константы равновесия, и в
результате изменяются концентрации реагентов и продуктов. Время этой релакса-
ции к новому состоянию равновесия определяется начальной и конечной скоро-
стями реакции.
8.2. Небольшие возмущения
223
При таком анализе учитываются и прямой и обратный процессы, исходя из ус-
ловия что реакция протекает как близкая к равновесной
А+В«=±С (8В)
Концентрации [А], [В] и [С] в схеме (8В) определяются как близкие к равновесным
концентрациям [А]равн, [В]равн и [С]равн. Обозначим отклонение концентрации от рав-
новесного значения переменной х и составим равенства [А] = [А]равн + х, [В] = [В]равн + х,
[С] = [С]равн - х. Далее запишем выражение для скорости изменения [А]
^1 = -а[А][В] + р[С] (8.7)
at
Если все концентрации выразить через х, это уравнение принимает вид
d([A17 +Х) = £ = -а([А]равн + х)([В]равн + х) + р([С]равн -х) =
а/ а/
= -а[А]равн [В]равн + р[С]равн - (а([А]равн + [В]равн) + р)х - ах2 (8.8)
Поскольку величина х мала относительно всех других концентраций, член х2 мож-
но исключить. Тогда полученное дифференциальное уравнение принимает форму
уравнения (7.3). Это означает, что решением будет экспоненциальная функция
с константой убывания, равной множителю при х, а([А]равн + [В]равн) +Р- Постоян-
ную интегрирования можно вычислить с учетом того, что на большом промежутке
времени х стремится к нулю, поскольку нуль — это равновесное значение х. Обо-
значив начальное значение х как Xq, запишем решение уравнения (8.8)
X _ X А ]раВН+( B]paDH)+p)r (g 9)
Рис. 8.1. Результаты измерения кинетики связывания Са2+ с флуоресцентным красителем
фура-2 при сдвиге равновесия в результате температурного скачка. Приведена зависимость
константы убывания (1/т) от концентрации Са2+. (По Као, Tsien, 1988.)
224
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Таким образом, в условиях, близких к равновесным, кинетика реакции высокого
порядка описывается экспонентой.
Чаще всего уравнение (8.9) применяется, вероятно, для анализа данных,
получаемых в экспериментах с температурными скачками. Константы равно-
весия, как правило, зависят от температуры, и изменение температуры пример-
но на градус вызывает небольшое изменение скорости реакции, необходимое
для такого типа анализа. Обычно кинетику изучают в этих экспериментах при
разных концентрациях одного из реагентов. Если схема (8В) верна, константа
убывания в уравнении (8.9) должна линейно зависеть от концентрации. Это ил-
люстрирует график на рис. 8.1, представляющий собой кривую зависимости кон-
станты убывания от концентрации кальция при температурном сдвиге реакции
связывания Са2+ с Са2+-чувствительным флуоресцентным красителем фура-2.
По наклону прямой можно вычислить а; точка пересечения прямой с осью орди-
нат ([Са2+] = 0) указывает значение р+а[фура-2]. Таким образом с помощью
подобных графиков можно определять константы скорости и прямой и обратной
реакций.
Какое уравнение следует использовать для изучения кинетики реакций связы-
вания, (8.9), (8.5) или (8.6), зависит от начальных условий и от того, насколько ре-
акция близка к равновесной.
8.3. Диффузионно-зависимое образование комплексов
Скорость связывания двух молекул в растворе зависит от частоты их столкновений
при случайных перемещениях. Если две молекулы обладают высокой взаимной
аффинностью, они связываются при каждом столкновении. Такое условие соот-
ветствует верхнему пределу скорости реакции связывания. Если не любое столкно-
вение приводит к образованию комплекса, реакция протекает с меньшей скоро-
стью. Анализ связывания, ограниченного диффузией, весьма важен для изучении
кинетики бимолекулярных реакций.
Чтобы определить скорость реакции связывания, зависимого от диффузии,
рассчитывают частоту столкновений молекул, используя уравнения теории диф-
фузии (Hammes, 1978). Рассмотрим два вещества, М и N, молекулы которых име-
ют сферическую форму (рис. 8.2). Примем, что центр молекулы М находится в на-
чале сферической системы координат. Молекулы N в процессе диффузии сталки-
ваются с молекулой М. Определим, насколько часто происходят столкновения
молекул N с молекулами М, вызванные диффузией.
Рис. 8.2. В результате диффузии происходят столкно-
вения молекул М и N, рассматриваемых в виде сфер
радиусами а и b соответственно. Обозначенная штри-
ховой линией окружность вокруг молекулы М указы-
вает расстояние максимального сближения молекул,
г = а + Ь.
8.3. ДИФФУЗИОННО-ЗАВИСИМОЕ ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ
225
2 dCN(r)
дг
(8.10)
Непосредственно после смешивания реагентов рассматриваемая молекула
М оказывается в растворе молекул N, имеющем постоянную концентрацию CN.
В процессе реакции молекулы N, расположенные вблизи молекулы М, с большой
вероятностью могут связаться с ней, так что в среднем концентрация молекул N в
окрестности молекулы М перестает быть постоянной: она зависит от расстояния,
разделяющего молекулы N и М. Таким образом, CN будет функцией расстояния г.
Частота столкновений будет определяться функцией <*N(r).
В начале реакции CN(r) резко меняется, после чего устанавливается стационар-
ное состояние, при котором CN(r) уже не зависит от времени. Это означает, что
производную по времени в уравнении диффузии (разд. 6.3) можно принять равной
нулю. В сферических координатах (см. приложение 6) данным условиям соответ-
ствует уравнение (6.25).
j__a_
г2 дг
Фактически этот случай аналогичен диффузии через малое отверстие (см.
разд. 6.3.2), и к нему применимо полученное выше уравнение для граничных усло-
вий (6.27)
_ А
С"(г) = — + В (8.11)
г
В рассматриваемом случае граничные условия отличны от тех, которые описа-
ны в разд. 6.3.2. При столкновении молекул N с молекулой М молекулы N связы-
ваются и уходят из рассмотрения. Это означает, что у поверхности сферы радиусом
а + b концентрация N равна нулю, т. е. CN(a + />) = 0 (по принципу поглощающих
граничных условий; см. разд. 6.2.4). На большом расстоянии от молекулы М, при
г -» оо, концентрация N равна концентрации в общем объеме, CN (оо). Эти два гра-
ничных условия определяют значения постоянных интегрирования в уравнении
(8.11): А = (а + Ь)Си(ж) и В = CN(oo). Соответственно выражение для концентрации
N имеет вид
CN (Г) = -(?+ Cn (оо) (812)
Г
Частота столкновений молекул N с рассматриваемой молекулой М пропор-
циональна потоку молекул N при г = а + Ь. Величину этого потока можно вычис-
лить, взяв производную по г (уравнение (6.1))
г_ n ^CN _ т) (<2+/>)CN(oo) _ ^N^n(°°) /о
j - -17n —— - -17n-----2--------------— (б. и;
дг г£ а+Ь
Эта величина означает скорость движения молекул через единичную площадку
при г = а + Ь. Чтобы вычислить общий поток через всю поверхность сферы, следует
умножить уравнение (8.13) на площадь поверхности 4л(я + />)2- Этот общий поток
эквивалентен частоте столкновений молекул N с молекулой М
Частота столкновений = 4л(я + b)DNCN(оо) (8.14)
226
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Таким образом, частота столкновений, как и ожидалось, пропорциональна концен-
трации молекул N в общем объеме, CN (оо), и константа скорости связывания равна
a=4n(a + b)D^ (8.15)
Этот расчет относится к одной молекуле М, поэтому коэффициент диффузии Z)N
выражен здесь в см2 • с-1, расстояния аиЬ — в см и а — в см3 • молекула-1 • с-1. Ниже
размерности будут переведены в более привычные единицы, М-1 -с-1.
При выводе этого выражения для константы скорости связывания мы не при-
нимали во внимание, что диффундируют не только молекулы N, но и молекулы М.
Частота столкновений, вычисляемая с учетом диффузии молекул М, выше величи-
ны, рассчитываемой по уравнению (8.15). Для вычисления частоты столкновений
с учетом диффузии молекул М заменим коэффициент диффузии для молекул N
суммой двух коэффициентов диффузии
а=4л(л + />)(Ям +^n) (8.16)
Уравнения (8.15) и (8.16) отражают важные принципы кинетики бимолекуляр-
ных реакций. Впервые введенные Смолуховским в 1917 г., они позволяют точно
определять константы скоростей химических реакций, зависимых от частоты
столкновений молекул. Эта теория послужила основой для развития многих на-
правлений химической кинетики (Keizer, 1987).
Уравнения для частоты столкновений можно использовать и при анализе реак-
ций связывания, протекающих в живых организмах, но здесь столкновения почти
всегда тем или иным образом ограничены. Например, рассчитанная зависимость
скорости связывания от размеров молекулы для биомакромолекул неприменима,
поскольку она предполагает возможность связывания в любом участке поверхно-
сти. В действительности при многих химических и биохимических процессах свя-
зывание происходит только в определенных участках поверхности макромолекул.
Кроме того, связывание зависит при этом от взаимной ориентации молекул. Влия-
ние подобных ограничений рассматривается ниже, но уже здесь можно сделать за-
ключение, что все они снижают скорость реакции, определяемую уравнением
(8.16), и соответственно это уравнение дает достоверный верхний предел скорости
реакций связывания.
Чтобы оценить скорость образования бимолекулярного комплекса, используем
коэффициент диффузии, типичный для мелких молекул, DM = Z)N = 5 • 10-6 см2 • с-1,
и примем а = b = 2,5 • 10-8 см (2,5 А). Расчет с помощью уравнения (8.16) дает вели-
чину а, равную 6 • 10-12 см3 • молекула-1 • с-1, или 6 • 10-15 л • молекула-1 • с-1. Умно-
жив эту величину на число Авогадро, получаем а = 4 • 109 М-1 • с-1.
В более общем виде выражение для константы скорости связывания, зависи-
мой от диффузии, выводится путем исключения коэффициентов диффузии и раз-
меров молекул в уравнении (8.16) с использованием соотношения Стокса—Эйн-
штейна D = АГ/6лгг| (уравнение (6.66)) и при условии, что г = а = b
а=87?71/3т|, (8.17)
где г| — коэффициент вязкости. Вычисление с помощью этого выражения кон-
станты скорости для условий вязкости воды и комнатной температуры, дает вели-
чину, равную примерно 1О10 М-1 • с-1. Благодаря удачному исключению параметров
8.3. ДИФФУЗИОННО-ЗАВИСИМОЕ ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ
227
молекул, скорость реакции вычисляется независимо от этих величин. Экспери-
ментально измеренные константы скорости связывания, как правило, не выходят
за пределы расчетных значений, т. е. 109—1О10 М-1 • с-1 (см. разд. 8.6 и разд. 8.7
о протонировании). Этот диапазон определяет верхний предел скорости реакций
связывания.
Полученное выражение для константы скорости выведено на основе допуще-
ния, что молекулы — это твердые сферы, между которыми не действуют какие-
либо силы, кроме отталкивания на близком расстоянии. Если между молекулами
действует притяжение, оно повышает скорость связывания. Сила притяжения вво-
дится в уравнение константы скорости реакции с помощью выражения для пото-
ка, учитывающего действие этой силы (уравнение (6.64) при F = dU(r)/ дг; см. так-
же уравнение (7.27)). Частота столкновений равна произведению величины потока
(J, уравнение (6.64)) и площади поверхности сферы, 4лг2, т. е. общий поток через
поверхность сферы определяется как 4лг2 J
„ л 2П ГОДИ dU(r) dCN(r)A Q
Общий поток = -4лг Z)N ---— +—(8.18)
< кТ дг дг )
Вид функции потенциальной энергии реакций связывания, t/(r), может варьиро-
вать, и она может не включать барьер, описанный в разд. 7.8 (т. е. реакции обра-
зования комплексов могут протекать как безактивационные, не характеризуясь
значительной энергией активации и энергетическим барьером). Эта функция при-
нимает минимальные значения, определяемые притяжением, максимальные зна-
чения, определяемые отталкиванием (при уменьшении г) или форму плато (при
увеличении г).
При стационарном состоянии процесса величина общего потока постоянна.
На основании тех же предположений, которые позволили перейти от уравнения
(7.27) к уравнению (7.30), можно преобразовать выражение для общего потока
„ 4nZ>N(CN(oo)et/<”)/*r-CN(a+Z>)e(/(a+z’)/*r)
Общий поток =----------------—------------- (8.19)
f J-e'^dr
J г2
a+b
Пределы интегрирования соответствуют здесь расстоянию максимального сбли-
жения (г = а + Ь) и бесконечности (г = оо).
Как и выше, при определении постоянной интегрирования в уравнении (8.11),
примем, что в результате столкновения молекулы N уходят из рассмотрения, т. е.
CN (a + b) = 0. При г = оо используется концентрация в общем объеме, CN (оо), и при-
нимается Щоо) = 0. При этих условиях частота столкновений, согласно уравнению
(8.19), равна
Частота столкновений = ^tc^n^n(q0) (8.20)
j J-e^^dr
a-t-b
Если принять U(г) =0, мы возвращаемся к случаю твердых сфер. Тогда инте-
грал знаменателя в уравнении (8.20) равен 1/(а + Ь) и уравнение (8.20) упрощается
до уравнения (8.15).
228
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
8.4. Диффузионно-зависимая диссоциация комплексов
Выражения, полученные для скорости зависимого от диффузии образования ком-
плексов, справедливы и для скорости их диссоциации. Вернемся к уравнению
(8.11), которое относится к стационарному состоянию реакции связывания моле-
кул сферической формы. При анализе реакций образования комплексов мы при-
няли, что CN (a + b) = 0 и CN (оо) равна концентрации молекул N в общем объеме.
Для случая диссоциации комплексов решим обратную задачу, приняв CN (оо) = 0 и
CN (a + b) = (одна молекула)/(объем вокруг молекулы М). Объем сферы вокруг мо-
лекулы М равен (4/3)л(я + />)3, следовательно CN (а + Ь) = 1/((4/3)л(я + />)3 )• При этих
граничных условиях постоянные интегрирования в уравнении (8.11) равны В = 0 и
А = -3/(4л(я + />)2), и в стационарных условиях концентрация молекул N зависит от
расстояния следующим образом
3
CN(r) =------±—
4тс(а + Ь)2г
Поток при г = а+Ь определяется выражением
j = -dn = pN---------
dr 4n(a+b)2r2 4n(a+b)4
(8.21)
(8.22)
Эта величина противоположна по знаку величине, определяемой уравнением
(8.13), поскольку при диссоциации комплекса поток имеет противоположное на-
правление. Частота столкновений вычисляется умножением величины потока на
площадь поверхности
3Z)
Частота столкновений =---(8.23)
(а+Ь)2
Эта величина представляет собой константу скорости диссоциации как реакции
первого порядка, выраженную в единицах число молекул • единица времени-1. Для
учета диффузии обоих веществ, М и N, коэффициент Z)N следует заменить суммой
Z)M + On, как при выведении уравнения (8.15).
Полученное выражение для константы скорости диссоциации комплекса
справедливо при условии, что стабилизирующие комплекс взаимодействия отсут-
ствуют. Чтобы учесть эти взаимодействия, выполним операции, аналогичные ис-
пользованным в случае вычисления потока при диффузии в силовом поле (уравне-
ние (8.19)). Для стационарного состояния при наличии граничных условий выра-
жение, описывающее частоту столкновений, имеет вид
u . 4nD^a+b»kT 3D^eu(a+b)/kT
Частота столкновении =------------------------------------------- (8.24)
|я(а + b)3 ]eUM/kTdr/r2 (a+b)3 ]eu^kTdr/r2
a+b a+b
Если функция потенциальной энергии [/(г) равна нулю, интеграл легко берется
и уравнение возвращается к виду (8.23).
Уравнение (8.23) не используется широко в биофизике, поскольку зависимость
от диффузии применима для диссоциации комплексов только в случае, когда сила
8.5. Связывающие участки
229
притяжения очень мала и комплекс вообще не может образоваться. Однако прове-
денный здесь анализ полезен для полноты рассмотрения реакций образования
комплексов. Он показывает, что скорость диссоциации комплексов зависит также
от коэффициентов диффузии. Это принципиально важно, поскольку в общем слу-
чае константы равновесия не зависят от коэффициентов переноса, в том числе от
коэффициента диффузии. Константы равновесия равны отношению констант
скоростей прямой и обратной реакций, и в силу того, что обе эти константы про-
порциональны коэффициенту диффузии, последний сокращается при составле-
нии отношения (см. задачу 2).
8.5. Связывающие участки
Вывод уравнения для константы скорости диффузионно-зависимой реакции обра-
зования комплекса был основан на том допущении, что к образованию комплекса
приводит столкновение между любыми двумя участками реагирующих молекул.
Это возможно при связывании некоторых мелких молекул (например, иода и СС14;
см. Keizer, 1987) или слиянии двух капель жидкости, но связывание большинства
биомолекул происходит только посредством определенных участков их поверхно-
сти. Для внесения этого уточнения в модель, изображенную на рис. 8.2, примем,
что столкновение должно произойти между реакционноспособными участками
молекул. При таком условии скорость связывания будет ниже полученной нами
величины.
Чтобы определить скорость образования комплекса с участием связывающих
участков, рассмотрим связывание мелкой молекулы, обладающей реакционноспо-
собной поверхностью, со связывающим участком на поверхности белка (рис. 8.3,
А). Для определения частоты столкновений между этим участком и мелкой моле-
кулой (лигандом) можно было бы обратиться вначале к уравнению (8.16), произве-
сти вычисление, используя радиусы молекулы белка и лиганда, и сделать пересчет
на площадь поверхности, занимаемую одним связывающим участком. Для пере-
счета с использованием радиуса связывающего участка, 5 (рис. 8.3, А) следовало бы
взять отношение площадей, s2/a2, как коэффициент пересчета и аналогичный ко-
эффициент взять для лиганда. Однако этот интуитивно приемлемый подход оши-
бочен; на самом деле скорость реакции при заданном условии пропорциональна
линейным размерам связывающего участка, а не его площади, как и скорость свя-
зывания в уравнении (8.16), пропорциональная линейным размерам реагирующих
молекул.
Рис. 8.3. А. Связывание зависит от
столкновения определенного участ-
ка поверхности малой молекулы со
связывающим участком на поверх-
ности белка. Б. В приближении этот
случай рассматривается как столк-
новение с полусферическим выпук-
лым участком на плоской поверх-
ности.
230
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Частоту столкновений лиганда со связывающим участком можно достоверно
рассчитать с помощью модели, представленной на рис. 8.3, Б. Исключим из рас-
смотрения параметры реакционноспособного участка малой молекулы Ь, посколь-
ку гораздо большее значение имеют ограниченные размеры связывающего участка
на поверхности белка. Далее вместо круглого участка на поверхности сферы
(рис. 8.3, А) будем рассматривать полусферическую выпуклость на плоской по-
верхности (рис. 8.3, Б). При этих условиях задача решается путем незначительной
модификации уравнений, приведенных в разд. 8.3. Уравнение (8.10) относится
к стационарному потоку через сферическую поверхность. Стационарный поток
через полусферическую поверхность определяется просто как 1/2 этой величины.1
В таком случае ход рассуждений аналогичен тому, который был использован при
выведении уравнения (8.15). Если не принимать во внимание относительно низ-
кий коэффициент диффузии белка, константа частоты столкновений в случае,
представленном на рис. 8.3, Б, равна
а = 2л($ + Z>)Z)N (8.25)
Аналогичная задача решается также для круглого участка на плоскости вместо
полусферической выпуклости на плоскости. В этом случае математическое реше-
ние (несколько более сложное и поэтому здесь не излагаемое) дает результат 4sZ)N
(Shoup et al., 1981). Соответственно в уравнение (8.25) вводится множитель
л/2 = 1,57. Сходная поправка указана при рассмотрении диффузии через малое от-
верстие (разд. 6.3.2).
На практике это уравнение часто модифицируют, вводя предположение, что
лиганд при связывании «достраивает» связывающий участок, будучи ему полно-
стью комплементарен, т. е. помещаясь в него как шар в лунку. В этом случае эф-
фективный радиус связывающего участка следует уменьшить на радиус лиганда.
В модифицированной таким способом форме выражение для константы скорости
связывания имеет вид (Shoup et al., 1981)
a=4(5-^)DN (8.26)
Здесь необходимо отметить, что допущение о совпадении размеров лиганда
и связывающего участка довольно произвольно и с тем же успехом можно принять
связывающий участок и лиганд близкими по размерам и в уравнении (8.25). Тогда
константа скорости будет равна 8Z?DN (в результате замены 2 л на 4, аналогично слу-
чаю для круглого связывающего участка на плоскости; см. выше). Используя соот-
ношение Стокса—Эйнштейна, как при выведении уравнения (8.17), получаем
а = 4Я773лп (8.27)
1 Присутствие нереакционноспособной поверхности вокруг выпуклости не создает затрудне-
ний для расчета, хотя в принципе добавление границы может усложнить уравнение диффузии.
Для плоскости, окружающей участок связывания, поток равен нулю, и это налагает граничное
условие равенства нулю градиента концентрации, перпендикулярного этой плоскости (см.
разд. 6.2.4). В решении для стационарного состояния в задаче со сферой градиенты строго ради-
альны, и в полусферах, центрированных вокруг выпуклости, концентрация лиганда постоянна.
Поэтому градиенты, перпендикулярные плоскости на рис. 8.3, Бу нулевые, и в этом направлении
потока нет. Следовательно, деление уравнения (8.10) на 2 дает правильное решение этой задачи.
8.6. Реальные скорости связывания лигандов белками
231
Эта величина в 2тг раз меньше частоты столкновений между сферами одинакового
размера, определяемой уравнением (8.17). Уравнение (8.27) позволяет вычислить
важную величину — диффузионный предел реакций связывания лиганда с белком,
равный 1,6 • 109 М-1 • с-1 при вязкости воды и комнатной температуре.
Если ввести ограничение для реакционноспособной поверхности лиганда
(рис. 8.3, А), расчетная частота эффективных столкновений еще более уменьшится.
Проведенный выше анализ предполагает, что используются размеры связывающе-
го участка лиганда, а не размеры лиганда. Однако, если лиганд быстро вращается,
неэффективное в отношении связывания столкновение может стать эффективным.
Таким образом, за счет вращательной диффузии скорость реакции повышается,
и если скорость вращательной диффузии намного выше, чем скорость поступа-
тельной диффузии, она может устранить влияние небольших размеров реакцион-
носпособного участка лиганда. В этом случае мы можем вернуться к использова-
нию размеров целого лиганда в расчетах скорости связывания, зависимого от диф-
фузии. Однако обычно скорость вращения не настолько высока, и создается
промежуточный вариант, когда ограниченные размеры связывающего участка ли-
ганда и его вращение в сочетании определяют значение скорости, среднее между
максимальным и минимальным (Shoup et al., 1981).
8.6. Реальные скорости связывания лигандов белками
Уравнения для диффузионно-зависимой скорости образования комплексов следу-
ет рассматривать как приближение. Точно рассчитать реальную скорость таких ре-
акций невозможно. Приведенные выше расчетные величины скоростей служат не
более чем грубыми оценками. Многие белки связывают свои предпочтительные
лиганды с очень высокой скоростью (табл. 8.1), и часто измеренные скорости свя-
зывания близки к теоретически рассчитываемому значению скорости диффузи-
онно-зависимой реакции (разд. 8.3). Экспериментально измеренные скорости,
превышающие ~108 М-1 • с-1, позволяют предполагать, что связывание происходит
настолько быстро, насколько позволяет диффузия. Однако для точной проверки
этой гипотезы необходимо использовать дополнительные критерии.
Поскольку теоретически рассчитанные верхние пределы скоростей связыва-
ния приблизительны, экспериментальное определение скоростей связывания слу-
жит важным источником информации для описания кинетики. Казалось бы,
в экспериментах можно варьировать в качестве переменной вязкость растворите-
ля, поскольку в уравнениях (8.17) и (8.27) присутствует показатель вязкости, а ко-
эффициенты диффузии, как правило, обратно пропорциональны вязкости раство-
ра (уравнение (6.66)). Однако для выяснения того, является ли реакция
диффузионно-зависимой, такой подход, как определение зависимости скорости
реакции от вязкости среды, таит в себе подвох. Выше, в разд. 7.8, указано, что кон-
станта скорости перехода при диффузии вдоль координаты реакции входит в урав-
нение для скорости реакции, протекающей по механизму пересечения энергетиче-
ского барьера. Если на внутреннее движение молекулы белка влияет движение мо-
лекул растворителя, скорость пересечения барьера зависит от вязкости среды
(о различных формах зависимости связывания от вязкости среды см. Berg, Hippel,
1985; о влиянии вязкости среды на ферментативный катализ см. в разд. 10.11). Что-
232
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Таблица 8.1. Высокие экспериментально измеренные скорости связывания лигандов белками
Белок Лиганд Константа скорости связывания, М-1 • с1
Ацетилхол инэстераза1 N-метилакридин 1,1 • 10'°
Пероксидаза хрена2 и-Нитробензойная кислота 1,3 • ю8
Супероксиддисмутаза3 Супероксид-анион 2,4 • 109
Триозофосфатизомераза4 Фосфогл и церал ьде гид 2,4 • 10“
р-Лактамаза5 Бензилпенициллин 7,6 • 107
Химотрипсин6 л-Нитрофениловый эфир 9 • 107
Кальмодулин7 Са2+
N-концевой домен 5 108
С-концевой домен 1 • 108
Ацетилхолиновый рецептор8 Ацетилхолин
1-й связывающий участок 6 • 107
2-й связывающий участок 1 • 108
1 Nolte et al., 1980. 2 Nakatani, Dunford, 1979. 3 Fielder et al., 1974. 4 Putnam et al., 1972. 5 Hardy, Kirsch, 1984. 6 Brouwer, Kirsch, 1982. 7 Falke et al., 1994. 8 Sine et al., 1990.
бы прояснить этот вопрос, сравним зависимость связывания от вязкости среды для
двух сходных лигандов, характеризующихся различными скоростями связывания.
Если в случае более низкой скорости связывание незначительно зависит от вязко-
сти среды, энергетический барьер реакции мало зависит от движения молекул рас-
творителя. Тогда зависимость от вязкости в случае лиганда с более высокой скоро-
стью связывания нельзя объяснить пересечением того же барьера. Таким образом,
в случае этого второго лиганда можно сделать вывод, что связывание протекает как
диффузионно-зависимое.
Полезную информацию позволяет также получить определение температур-
ной зависимости связывания. Если реакция слабо зависит от температуры или на
температурную зависимость влияет вязкость раствора, связывание следует рас-
сматривать как не основанное на пересечении энергетического барьера. Таким об-
разом, слабая зависимость от температуры показывает, что связывание ограничено
скоростью диффузии.
8.6.1. Эволюция скорости
Давление отбора должно оптимизировать скорость реакций связывания лигандов.
Почти для любого фермента более высокая скорость связывания субстрата может
служить преимуществом. Обладая небольшим числом молекул быстродействую-
8.6. Реальные скорости связывания лигандов белками
233
щего фермента, организм экономит энергию, например при синтезе белка. Если
бы фермент был способен катализировать реакцию мгновенно, скорость его дей-
ствия была бы ограничена только диффузией. Таким образом, частотой столкнове-
ний в результате диффузии определяется абсолютный максимум скорости катали-
за для любого фермента. В действительности почти у всех изученных ферментов
каталитическая активность ниже по сравнению с диффузионным пределом скоро-
сти связывания субстрата примерно на два порядка величин (Miller, Wolfenden,
2002). Это, вероятно, отражает общее для большинства ферментов преимущество
в скорости катализа.
В случае фермента, эффективность действия которого близка к пределу, опре-
деляемому диффузией, дальнейшее совершенствование каталитического воздей-
ствия на связанный субстрат не имеет смысла. Эта идея высказана, например, в от-
ношении триозофосфатизомеразы — фермента, связывающего субстрат с очень
высокой скоростью (табл. 8.1). Связывание ею субстрата замедляется при увеличе-
нии вязкости раствора, что согласуется с предположением об ограничении скоро-
сти диффузией (Blacklow et al., 1988). Скорости последующих этапов катализа име-
ют тот же порядок величин, что и скорость этапа связывания субстрата, наблюдае-
мая при его физиологических концентрациях. Повышение скорости этих
последующих этапов не может существенно увеличить общую скорость реакции.
Триозофосфатизомераза названа в связи с этим совершенным ферментом, исклю-
чающим возможность эволюции (Albery, Knowles, 1976).
8.6.2. Ацетилхолинэстераза
Фермент ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз нейромедиатора ацетилхо-
лина на завершающем этапе передачи сигнала в нервномышечном синапсе. Ско-
рость связывания субстрата этим ферментом чрезвычайно высока и лимитирована
только диффузией, как показывает ее зависимость от вязкости раствора. Фактиче-
ски эта скорость, равная 1,1 • 1О10 М-1 • с-1 (табл. 8.1), даже несколько выше соот-
ветствующего диффузионного предела, равного 1,6 • 109 М-1 • с-1 (согласно уравне-
нию (8.27)).
Столь высокая скорость связывания объясняется структурой фермента, кото-
рую удалось установить с помощью рентгеноструктурного анализа (рис. 8.4). Ак-
тивный центр и связывающий участок ацетилхолинэстеразы локализованы
в длинной узкой полости. Примерно 40% поверхности этой полости занимают
ароматические боковые цепи остатков фенилаланина, тирозина и триптофана.
Эти ароматические структуры сильно притягивают катионы (см. разд. 2.6); в свою
очередь ацетилхолин содержит положительно заряженный четвертичный амин.
Притяжение со стороны ароматических остатков способствует как бы удлинению
области захвата субстрата, т. е. полость действует наподобие электростатического
пылесоса. Молекула ацетилхолина, достигающая такой увеличенной по протяжен-
ности области рукава, связывается в нем и далее притягивается каталитическими
аминокислотными остатками, входящими в активный центр. Этому притяжению
способствует также несколько отрицательно заряженных боковых цепей остатков
глутамата и аспартата, стратегически расположенных у границ полости.
Если принять, что полость в молекуле ацетилхолинэстеразы соответствует ли-
нейным размерам связывающего участка, который в этом случае примерно в пять
234
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Рис. 8.4. Структура моле-
кулы фермента ацетилхо-
линэстеразы. Ароматичес-
кие аминокислотные остат-
ки показаны темно-серым,
кислые аминокислотные ос-
татки — светло-серым. Бе-
лым кружком выделен ак-
тивный центр. (По Sussman
et al., 1991.)
раз больше длины лиганда, то значение константы скорости связывания, рассчи-
танное по уравнению (8.25), будет примерно в три раза выше ее значения, опреде-
ляемого уравнением (8.27). Однако даже при таком увеличении расчетная скорость
связывания примерно в два раза ниже его измеренной скорости, что не позволяет
объяснить скорость захвата субстрата только диффузией. Вероятно, снаружи моле-
кулы фермента проявляется сильное действие электростатического притяжения со
стороны кислых аминокислотных остатков и это способствует втягиванию суб-
страта в связывающую полость. В пользу такого предположения свидетельствует
высокая чувствительность скорости связывания к концентрации ионов (Nolte et
al., 1980), нейтрализующих и ослабляющих электростатические взаимодействия
(см. гл. 11).
Измеренная скорость связывания субстрата ферментом супероксидцисмутазой
(табл.8.1) также превышает расчетную скорость диффузионно-лимитируемой ре-
акции. В молекуле этого фермента длина связывающего участка увеличивается за
счет содержащихся в нем многочисленных положительно заряженных боковых це-
пей аминокислотных остатков, что способствует притяжению отрицательно заря-
женного субстрата Oj (Tainer et al., 1983).
8.6.3. Пероксидаза хрена
К высокоэффективным ферментам относится также пероксидаза хрена, о чем сви-
детельствует измеренная скорость связывания субстрата (табл. 8.1). Проведено срав-
нение этой скорости связывания, равной 1,3 • 108 М-1 • с-1, с величинами, получен-
ными при расчетах скорости как диффузионно-зависимой частоты столкновений.
8.7. Перенос протонов
235
Уравнение, сходное с уравнением (8.16), при расчете частоты столкновений с целой
белковой молекулой дает величину 1,7 • 1О10 М-1 • с-1. С использованием параметров
молекулы возможного субстрата, не способного подвергаться катализу из-за круп-
ных размеров, длина связывающего участка была определена как равная 4 А. Вычис-
ленное на основе этого результата значение скорости связывания, линейно зависи-
мое от длины связывающего участка (согласно уравнению (8.25)), хорошо соответ-
ствует экспериментально измеренной* величине (Nakatani, Dunford, 1979).
8.7. Перенос протонов
Биомакромолекулы обмениваются протонами с окружающими молекулами воды,
причем скорость переноса протонов при этом может быть необычайно высокой
(Eigen, Hammes, 1963; Gutman, Nachliel, 1997). Во многих случаях скорость связы-
вания протонов с различными акцепторами превышает предел, рассчитываемый
при условии ее лимитирования диффузией (табл. 8.2). Столь высокая скорость пе-
реноса обусловлена в первую очередь высокой подвижностью протонов в жидкой
воде. Измерения проводимости показывают, что подвижность протонов более чем
в пять раз превышает подвижность других одновалентных катионов (Moore, 1972).
В действительности столь быстро диффундирует не сам протон, а его заряд.
Протон скачкообразно перемещается между различными заряженными формами
воды: Н3О+, Н5Ог и Н9О4. Когда молекула воды связывает протон, она может пе-
редать один из своих других атомов Н в виде протона молекуле воды, ближайшей
к ней с другой стороны. Заряд, таким образом, получает бесплатный проезд. Он
переносится в один этап на расстояние, сравнимое с размерами молекулы воды.
Этот механизм действует как челнок, обеспечивая перенос протонов на акцепторы
с необычайно высокой скоростью.
Высокая скорость переноса протонов предположительно компенсирует низкое
содержание Н+ в воде при физиологических значениях pH. При pH 7, т. е. концен-
трации протонов 10"7 М, время жизни свободных оснований — акцепторов прото-
нов, как правило, несколько ниже 1 мс при большинстве констант скорости пере-
носа, приведенных в табл. 8.2.
Таблица 8.2. Скорости переноса протонов
Акцептор протона Константа скорости связывания, М-1 • с-1
ОН- 1 CH3CO2 ‘ Имидазол1 1,3 • 10" 4,5 • Ю10 1,5 • Ю10
Бактериородопсин2
цитоплазматический домен внеклеточный домен Кальциевый канал3 5,8 • 10'° 1 • 109 4,1 • 10"
1 Eigen, Hammes, 1963.
2 Checover et al., 1997.
3 Prod’hom et al., 1987.
236
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
Протонированию определенных участков в молекулах белков, в частности
мембранных, может способствовать сосредоточение в этих участках отрицатель-
ных зарядов, благодаря которому повышается электростатическое притяжение.
В случае мембранносвязанного белка бактериородопсина, представляющего собой
светозависимую протонную помпу, высокой скорости связывания протонов на ци-
топлазматической стороне мембраны способствует локализация в этом участке
белка трех отрицательно заряженных карбоксильных групп (Gutman, Nachliel,
1997). Связывание Н+ в данном участке происходит как первый этап активного вы-
качивания протонов из клетки за счет энергии поглощаемого бактериородопси-
ном света.
С помощью метода регистрации одиночных каналов измерена скорость прото-
нирования кальциевого канала в мембране (табл. 8.2). Это наиболее высокая ско-
рость среди известных для реакций связывания. В дальнейшем удастся, вероятно,
объяснить ее на основе детального анализа структуры белка.
8.8. Связывание с мембранными рецепторами
В разд. 8.5 получены выражения для частоты столкновений, определяющей связы-
вание лиганда со специфическим участком белковой молекулы. Многие рецепто-
ры гормонов локализованы на клеточной поверхности, и скорость связывания
ими лигандов, казалось бы, должна определяться частотой столкновений. Для
проверки этой идеи в первую очередь можно было бы использовать уравнения
(8.25)—(8.27) и умножить затем полученную величину на число рецепторов, при-
сутствующих на клеточной поверхности. Однако при таком подходе не учитывает-
ся следующий важный эффект: когда молекула сталкивается с любым участком
клеточной поверхности, клетка ограничивает ее дальнейшую диффузию таким об-
разом, что с высокой вероятностью могут происходить повторные столкновения
с клеточной поверхностью. При последующих столкновениях с различными участ-
ками клеточной поверхности высока вероятность попадания данной молекулы на
ее рецептор, молекулы которого в большом числе рассеяны по мембране. Таким
образом, в качестве эффективной мишени можно рассматривать всю клетку, не-
смотря на то что на самом деле мишенями служат молекулы рецептора, разбросан-
ные по ее поверхности.
Влияние повторных столкновений на скорость связывания лиганда с клеточ-
ным рецептором можно проанализировать с помощью модели Берга и Перселла
(Berg, Purcell, 1977). За исходное состояние в ней принято положение молекулы на
расстоянии у от центра клетки-мишени, рассматриваемой как сфера радиусом а
(рис. 8.5). Далее определены два возможных варианта событий: 1) молекула диф-
фундирует от клетки в бесконечность, никогда не сталкиваясь с поверхностью ми-
шени, и 2) происходит столкновение молекулы с мишенью. Поскольку столкнове-
ние с мишенью рассматривается в варианте 2 как конечное событие, поверхность
мишени считается поглощающей границей.
Решить эту задачу на основе теории случайного движения сложно, но, к сча-
стью, существует эквивалентная простая задача в рамках стационарной диффузии.
Если молекулы появляются на воображаемой поверхности сферы радиусом у от
центра мишени с постоянной скоростью, имеется два их потока — к центру сферы
8.8. Связывание с мембранными рецепторами
237
Рис. 8.5. Молекулы лиганда появляются с по-
стоянной скоростью на поверхности сферы
радиусом у, считая от центра сферической
мишени радиусом а. Общий поток внутрь
сферы обозначен как GBH, поток наружу —
Он.
и в направлении от сферы в бесконечность (рис. 8.5). Соотношение этих двух ста-
ционарных потоков эквивалентно соотношению вероятностей двух вариантов со-
бытий, указанных выше. Это связано с тем, что вариант стационарной диффузии
отражает средний результат всех возможных беспорядочных движений от поверх-
ности сферы радиусом у.
Выведем теперь выражение для общего потока через поверхность сферы радиу-
сом г. Два противоположных потока — обозначим их как(7вн и (7Н (рис.8.5) — рав-
ны произведению площади поверхности и потока через единичную площадку
(обозначенного выше как J). Здесь поток J равен произведению коэффициента
диффузии D и градиента концентрации дСвн /dr. Уравнения для двух потоков за-
писываются следующим образом
GBH =4nr2JBH = -4nr2D^-
dr
GH =4лг2/н = -4nr2D^-,
dr
(8.28a)
(8.286)
где (7ВН и GH означают соответствующие концентрации в области внутри и снаружи
сферы радиусом у. Отметим, что значения GH и (7ВН в этих областях постоянны, по-
скольку молекулы здесь не образуются. В этом случае уравнения легко проинтег-
рировать и получить общее решение С = G/4jtrD + А. Граничные условия представ-
ляют собой Свн = 0 при г = а и Сн = 0 при г = оо. Используя значение А, определенное
для данных условий, получаем
(7ВН GBH
4nrD 4naD
(8.29а)
сн = -% (8.296)
4nrD
Несмотря на то, что GH и (7ВН здесь не определяются, известно, что это постоян-
ные величины, противоположные по знаку, причем (7ВН — отрицательная величи-
на, чтобы Свн могла быть положительной величиной. Две рассматриваемые кон-
238
Г лава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
центрации должны быть равны при г = у. поэтому можно приравнять выражения
(8.29а) и (8.296) и получить следующее равенство
GBH (7ВН (7Н
4naD 4nyD'
(8.30)
которое после преобразования приобретает вид
^вн _ а
GBH —Gn у
(8.31)
Поскольку GBH — отрицательная величина, левая часть уравнения равна
|СВН |/(|^вн |+ |^н |)1- Это доля тех молекул, появившихся на расстоянии у от мишени,
которые движутся в направлении к мишени. Столь простое выражение означает,
таким образом, вероятность того, что молекула, начиная движение на расстоянии
у, столкнется с мишенью, а не диффундирует в бесконечность.
Теперь используем уравнение (8.31) для определения вероятности того, что мо-
лекула столкнется со своим рецептором, раньше чем диффундирует от клетки
(имеется в виду, что после первого столкновения молекулы с клеткой происходят
последующие столкновения этой молекулы с разными участками клеточной по-
верхности) (рис. 8.6). Рассмотрим беспорядочное движение молекулы вдоль кле-
точной поверхности. Расстояние ее удаления от клетки после столкновения, дос-
таточное для того, чтобы следующее столкновение произошло с новым участком
поверхности, должно быть сравнимо с размерами связывающего участка, s. Если
молекула удаляется после столкновения на расстояние 5, то в соответствии с урав-
нением (8.31) вероятность ее последующего столкновения с клеточной поверхно-
стью равна
а + 5
(8.32)
Вероятность того, что последующего столкновения не произойдет, равна
s/(a + s). Соотношение двух этих возможных исходов равно s/a (уравнение (8.31)).
Рис. 8.6. Две молекулы при случайном движении достигают поверхности клетки (слева) После
нескольких столкновений с клеточной поверхностью одна из них попадает в связывающий уча-
сток и образует комплекс с рецептором. Другая молекула после нескольких столкновений
с клеткой удаляется от нее, не достигая рецептора
8.8. Связывание с мембранными рецепторами
239
При каждом столкновении существует вероятность, что оно произойдет не
с рецептором. Эта вероятность равна единице минус доля клеточной поверхности,
занимаемая данными рецепторами, 0 = 1-(№2/4а2), где N — число молекул рецеп-
тора на поверхности клетки. Тогда вероятность столкновения, не приводящего
к связыванию с рецептором, равна 0Р5. Вероятность п таких столкновений с после-
дующим удалением молекулы от клетки в бесконечность равна Р/0Л (1 -Р5). Веро-
ятность удаления молекулы в бесконечность (Рудал) без связывания с рецептором
равна сумме
^удал = £Р,Т(1 " Р, ) = — = —1------------Г" =
a + s^Q^a + sJ a + s 1- a$/(a + 5)
a + s - ap 4a + Ns
При вычислении этой суммы применен метод суммирования геометрической про-
грессии (уравнение (П1.11)).
Уравнение (8.33) определяет долю тех молекул, которые после столкновений
с клеткой покидают ее, не связываясь рецептором. Частоту столкновений молеку-
лы с клеткой можно вычислить из уравнения (8.15) как4ла/)С (Ь опускается, по-
скольку а » Ь, т. е. клетка гораздо крупнее лиганда). Вероятность того, что молеку-
ла не удалится от клетки, равна 1 - Рудал. Выразив эту величину из уравнения (8.33)
и умножив ее на частоту столкновений с клеткой, получаем частоту связывания
лиганда с рецептором
Ns
Частота столкновений = 4naDC----- (8.34)
4а + Ns
Это важное уравнение, применяемое для расчета скорости заполнения связы-
вающих участков рецепторов лигандами (Abbott, Nelsestuen, 1988; Nelsestuen,
Martinez, 1997). Получены также уравнения для двух предельных случаев: низкой
плотности рецепторов и высокой плотности рецепторов на клеточной поверхно-
сти. Если плотность рецепторов низкая, Ns «4а, выражение (8.34) стремится
к пределу
Частота столкновений ~ nNsDC (8.35)
В этом предельном случае размеры клетки не имеют значения; в качестве мишени
рассматривается рецептор, т. е. считается, что рецепторы присутствуют как бы сво-
бодные в растворе. В случае, когда плотность рецепторов на клетке высокая,
Ns » 4а, частота связывания приближается к величине
Частота столкновений ~ 4naDC (8.36)
Это выражение соответствует диффузионному пределу частоты столкновений мо-
лекулы с клеткой, т. е. в качестве мишени рассматривается вся клетка.
Проведенный анализ показывает, как различается вероятность связывания ли-
ганда рецептором в двух крайних случаях — при высокой и при низкой плотности
рецепторов на клеточной поверхности. Такие варианты детально изучены для ще-
лочной фосфатазы, локализованной в периплазматическом пространстве (между
клеточной и наружной мембранами), у E.coli (Martinez et al., 1996). При высокой
240
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
наружной концентрации субстрата имеется мало свободных молекул фермента,
т. е. связывающих участков, для молекул субстрата, проникающих в периплазма-
тическое пространство. В этом случае активность фермента определяется уравне-
нием (8.35). При низкой концентрации субстрата свободных связывающих участ-
ков много, т. е. существует высокая вероятность того, что каждая молекула
субстрата, столкнувшаяся с клеткой и проникшая в периплазматическое про-
странство, будет связана. К этому случаю применимо уравнение (8.36).
Важно представлять, каким образом кинетика подобного процесса связывания
может отличаться от кинетики, описанной в разд. 8.1. Скорость уменьшения коли-
чества свободных рецепторов на клеточной поверхности в результате связывания
лиганда определяется уравнением (8.34) как
После интегрирования получаем выражение
4aln(W/W0) + N - Wo = -4naDCt, (8.38)
где Nq — исходное число рецепторов. Это трансцедентальное уравнение не может
быть решено для N, но оно показывает, что временная зависимость связывания ли-
ганда рецептором на поверхности клетки должна отличаться от кинетик, рассмот-
ренных в разд. 8.1 и 8.2. В данном случае кинетика не экспоненциальная и не ги-
перболическая, что не отражает сложность механизма связывания, но отражает пе-
реход из состояния с высокой плотностью рецепторов в состояние с их низкой
плотностью.
8.9. Уменьшение числа измерений
В случае, когда рецепторы локализованы на клеточной поверхности, вероятность
связывания ими лиганда, как мы убедились, выше по сравнению с тем случаем,
когда они находятся в растворе. Это обусловлено уменьшением размерности про-
странства, в котором перемещаются молекулы лиганда. При диффузии в трехмер-
ном пространстве вероятность эффективного столкновения возрастает, если пред-
варительной мишенью может служить вся поверхность клетки, т. е. когда процесс
связывания разбит на два этапа. Первый этап — это ограничение диффузии в ре-
зультате столкновения с крупной предварительной мишенью, второй этап — диф-
фузия в двумерном пространстве у поверхности клетки, когда в итоге возможно
столкновение с рецептором. Уменьшение размерности пространства, в котором
происходит диффузия, — это важный общий принцип, определяющий кинетику
диффузионно-зависимых процессов распознавания в живых организмах (Adam,
Delbriick, 1968; Berg, Purcell, 1977).
Чтобы проанализировать влияние уменьшения размерности пространства при
диффузии на кинетику связывания, удобно было бы повторить анализ, проведен-
ный в разд. 8.3 для одномерного и двумерного пространств. Этот способ позволил
бы определить, насколько быстро диффузия в плоскости приводит к столкнове-
нию с круглой мишенью и насколько быстро диффузия вдоль прямой приводит
8.9. Уменьшение числа измерений
241
к столкновению с точечной мишенью. Однако кинетические уравнения в одно-
и двумерном случаях не имеют стационарного решения. Необходимо использовать
другой подход, в качестве которого пригоден метод расчета среднего времени за-
хвата. Чтобы вычислить среднее время, необходимое для столкновения молекулы
с мишенью при случайном движении, мы решим здесь задачу для одномерного
случая, а для двух- и трехмерного случаев приведем готовые результаты решений
(Berg, 1983).
Случайное движение в одномерном пространстве описано в гл. 6. При таком
движении происходят скачки молекул на расстояние 5 вправо или влево через оди-
наковые промежутки времени, т. Обозначим среднее время захвата, т. е. среднее
время, необходимое для того, чтобы молекула от начального положения х в первый
раз достигла некоторого определенного положения, как И^(х). Каждая траектория
от точки х до мишени должна в первый момент пройти либо через точку х +5, либо
через точку х -5 (с одинаковой вероятностью). Следовательно, И^х) можно выра-
зить через РИ(х +6) и РИ(х -5) как
1Г(х) = т + 1Г(х+8) + РИ(х-8) /2 (8.39)
Таким образом, начало движения от точки х подобно началу движения спустя про-
межуток времени тотточки х +8 илих -8. Умножая уравнение (8.39) на2/8, полу-
чаем
(И"(х +8) — И"(х))/8 - (И'(х) - 1Г(х -8))/8 + 2т/8 = 0 (8.40)
Теперь запишем две производные относительно х
dlT
х+5/2
dJT 2т
---- 4---
х-5/2 $
(8.41)
Путем деления на 8 скомбинируем две производные первого порядка в производ-
ную второго порядка. Используя затем уравнение (6.45) и заменяя 2т/82 на 1/D,
получаем следующее выражение
^ + 1 = 0
dx2 D
(8.42)
Решение уравнения (8.42) относительно W — это формула среднего времени
захвата. Здесь необходимо учесть граничные условия, сходные с теми, которые
вводятся при решении уравнения диффузии (см. разд. 6.2.4). Если мишень нахо-
дится в точке х = а, границу следует считать поглощающей и JV(a) = 0. В то же вре-
мя, если при х = а путь реакции включает барьер, граница является отражающей и
dWz/dx=0.
Теперь определим среднее время захвата при связывании, лимитированном
диффузией в одномерном пространстве. Примем, что молекула находится в об-
ласти длиной b и мишень в позиции х =0. Общее решение уравнения (8.42) сле-
дующее
х2
W(x) = -— + Ах + В, (8.43)
242
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
где А и В — постоянные интегрирования. Поскольку И^О) = 0 (поглощающая гра-
ница), В = 0. Поскольку dW/dx = 0 (отражающая граница) в области b, А = b/D. Ре-
шение при этих условиях имеет вид
W(x) = ^(xb-x2/2) (8.44)
Теперь произведем усреднение по всем начальным положениям молекулы от 0 до
Ь, чтобы получить искомое выражение
1 b 1 f 2
' = - %2/2)dx = -^(b3/2 - b3/6) = (8.45)
Этот анализ легко распространить на двумерное и трехмерное пространства,
хотя при этом необходимо учитывать размеры мишени, a (Adam, Delbriick, 1968;
Berg, Purcell, 1977; Berg, von Hippel, 1985). Для случая диффузии в двумерном про-
странстве среднее время захвата определяется выражением
t=— In — , (8.46)
2D а
для случая трехмерного пространства —
t = -- (8.47)
2D а
Необходимо отметить, что в каждом из этих выражений для t значение D является
характеристикой диффузии в пространстве данной размерности.
Эти три выражения для среднего времени захвата показывают, как число изме-
рений пространства качественно влияет на процесс, зависящий от диффузии
и столкновений. Множители b/а (в случае трехмерного пространства) и 1п(д/а)
(в случае двумерного пространства) значительно снижают величину скорости свя-
зывания. В том, что связывание лигандов с рецепторами на поверхности клетки
может быть описано через частоту столкновений с клеткой, проявляется, таким
образом, эффект уменьшения размерности пространства для диффузии от трех из-
мерений до двух после первого столкновения с клеткой. Примером осуществления
этого принципа может служить также кинетика связывания белка со специфиче-
ским участком в длинной цепи ДНК.
8.10. Связывание белков с ДНК
Специфичное связывание определенных белков с определенными участками ДНК
происходит намного быстрее, чем можно ожидать для процесса диффузионно-
зависимого столкновения с узкой областью ДНК, содержащей участок связывания
(Berg, von Hippel, 1985). Это позволяет предполагать, что связывание включает два
этапа. Вначале белок, возможно, неспецифически связывается с любым участком
ДНК, после чего диффундирует в одномерном пространстве вдоль молекулы ДНК,
связываясь в итоге со специфической, распознаваемой нуклеотидной последова-
Задачи
243
тельностью. Если бы белок связывался с ДНК в результате случайных столкнове-
ний при диффузии в трехмерном пространстве, максимальная диффузионно-
зависимая константа скорости этого процесса определялась бы уравнением (8.15).
Коэффициент диффузии ДНК при расчетах можно не учитывать, поскольку он на-
много меньше коэффициента диффузии белка.
Согласно модели двухэтапного связывания, после неспецифического связыва-
ния с неким случайным участком ДНК белок должен диффундировать в одномер-
ном пространстве вдоль молекулы ДНК. При этом возможны два исхода — либо
белок успеет столкнуться со специфическим участком связывания, либо он рань-
ше этого удалится от молекулы ДНК. Среднее время нахождения белка вблизи мо-
лекулы ДНК до удаления от нее пропорционально обратной величине константы
скорости диссоциации, 1/£дис. Расстояние которое белок может пройти вдоль
цепи ДНК при случайном движении в одномерном пространстве, составляет
(уравнение (6.9))
d = ^2Djk^, (8.48)
где D\ —коэффициент одномерной диффузии. Если неспецифическое связывание
произошло в участке, расстояние от которого до распознаваемого участка меньше
d, имеется хороший шанс для стабильного связывания. В результате эффективная
длина мишени равна не реальной длине узнаваемой последовательности ДНК,
а расстоянию d. В случае высокого коэффициента Z), и низкой к^с расстояние
d может быть намного больше, чем длина связывающей последовательности, Ь.
Подобное увеличение эффективных размеров мишени делает связывание более
вероятным. Таким образом, слабое неспецифическое связывание приводит
к уменьшению размерности пространства, доступного для диффузии белка, от трех
измерений до одного и это способствует связыванию, как и в случае связывания
лиганда с рецептором на поверхности клетки.
Реализация этого механизма существенно зависит от того, может ли белок лег-
ко двигаться вдоль ДНК, несмотря на неспецифическое связывание с ней. Как
можно предполагать, высокая плотность отрицательно заряженных фосфатных
групп в остове ДНК обусловливает эффект неспецифического связывания катио-
нов, по принципу конденсации противоионов (см. разд. 10.11). Этот тип связыва-
ния характеризуется значительной силой взаимодействия, т. е. низкой величиной
kwc. Однако благодаря тому, что все нуклеотидные последовательности одинаковы
в отношении плотности распределения заряда, неспецифически связанный белок
может, вероятно, свободно двигаться вдоль ДНК в любом направлении. Эта мо-
дель двухэтапного связывания весьма плодотворно была использована для описа-
ния скорости связывания /ас-репрессора с операторным сайтом /ас-оперона
в ДНК (Berg, von Hippel, 1985).
Задачи
1. Используя рис. 8.1, определите константы скоростей образования комплекса и его
и диссоциации для Са2+ и фура-2 ([фура-2] = 5,33 мкМ).
2. Используя уравнения (8.15) и (8.23), определите константу равновесия реакции
связывания.
244
Глава 8. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ
3. Включите фактор простого электростатического притяжения или отталкивания
в выражение для зависимой от диффузии скорости связывания, взяв U(r) в уравне-
нии (8.19) в виде электростатического потенциала (Hammes, 1978).
4. Определите константу скорости диссоциации при константе равновесия диссо-
циации 10-6 М и константе скорости связывания, лимитируемого диффузией,
Ю10 м-1 • с-1 (рассчитанными из уравнения (8.17)).
5. Выведите уравнение (8.46), считая, что круглая мишень имеет радиус а и находит-
ся в центре круглой площадки радиусом Ь, причем b » а.
6. Используя уравнение (8.20), определите константу скорости связывания, если
U(r) = -UQ при г < с и U(г) = 0 при г > с (где с > а + Ь). Как изменится константа,
если Uq -> оо? Объясните этот результат.
Глава 9
Кинетика множественных
состояний
В качестве основы для анализа сложных систем можно использовать модель систе-
мы с двумя состояниями, рассмотренную в гл. 7. В системе, имеющей больше двух
состояний, возможны переходы между их различными парами, и кинетика в этом
случае отражает совокупную картину таких переходов. Кинетика модельных сис-
тем с несколькими состояниями, как мы увидим в этой главе, описывается уже не
простой экспоненциальной функцией, а уравнениями в виде суммы экспонент.
В гл. 7 проанализированы основные физические процессы, определяющие
скорость перехода между двумя состояниями. Теперь мы примем за исходный фе-
номен переход с заданной скоростью, объединим несколько переходов и получим
выражение, характеризующее динамическое поведение таких сложных систем.
Математический метод, используемый для анализа кинетики множественных со-
стояний, в высокой степени точен и эффективен. С его помощью получают коли-
чественное описание моделей общего класса для систем с различным числом со-
стояний. Этот подход применяется при изучении не только кинетических задач
в биофизике, но также широкого круга других вопросов, от случайных процессов
в физике до динамики популяций в экологии.
Анализ кинетики систем с множественными состояниями имеет важное прак-
тическое значение, поскольку большинство моделей молекулярных механизмов
включает переходы между несколькими состояниями. Определение кинетики час-
то служит наиболее прямым экспериментальным способом проверки достоверно-
сти таких моделей.
9.1. Модель системы с тремя состояниями
Этот пример позволяет проиллюстрировать многие важные особенности кинетики
систем с множественными состояниями. Взяв за основу модель с двумя состоя-
ниями, добавим в нее еще одно состояние (схема (9А))
а у
А^=±В^=±С
Р 5 (9А)
Как и при анализе модели системы с двумя состояниями, запишем дифференци-
альные уравнения для скоростей изменения концентраций вещества в трех состоя-
ниях, А, В и С. Каждая константа скорости отражает здесь процесс возрастания
246
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
концентрации вещества в одном из состояний при снижении его концентрации
в другом состоянии. Таким образом, [А] уменьшается как -а[А] и увеличивается
как р[А]. Подобным образом, [В] возрастает как а[А] + у[С] и уменьшается как
-(Р + у) [В]. Соответственно этому запишем три дифференциальных уравнения
^ = -а[А] + р[В] (9.1а)
ф = а[А1-(р+у)[В] + 5[С] (9.16)
а/
ф = у[В]-6[С] (9.1в)
а/
Решение этих дифференциальных уравнений дает выражения для [А], [В] и [С]
как функций времени. Общее решение представляет собой сумму экспонент, убы-
вающих с различными скоростями и объединенных в различных соотношениях
в зависимости от начальных условий. Математический подход к решению кинети-
ческих задач такого типа включает два этапа. Вначале определяют константы убы-
вания экспонент. Затем, исходя из начальных условий, вычисляют коэффициенты
при экспонентах.
Здесь мы лишь кратко рассмотрим способ решения таких систем уравнений,
но это позволит объяснить, в чем заключается общий подход. Суть его состоит
в том, чтобы путем замены исключить две переменные и таким образом получить
дифференциальное уравнение с одной переменной. Прежде всего, с учетом того,
что общее количество взаимопревращающегося материала остается постоянным,
запишем равенство [А] + [В] + [С] = Г, где Т — константа. На основе этого равенства
исключим [С] из уравнения (9.16)
^=а[А]-р[В]-у[В]+8(Г-[А]-[В]) (9.2)
а/
Далее, преобразовав уравнение (9.1а), запишем выражение [В] =(l/P)((d[A]/dr)+
+ а[А]), которое можно продифференцировать, чтобы получить выражение для
d[B]/dr. Подставляя эти два выражения, исключим [В] из уравнения (9.2) и в ре-
зультате получим дифференциальное уравнение, содержащее лишь одну зависи-
мую переменную, [А]
^^ + (а+р+у+8)^ + (ау + а8 + р8)[А]-р87’ = 0 (9.3)
Теперь удалим последний член, Р5Т, путем замены [А] новой переменной,
[А]' = [А] - р5 Т/(ау + аб + р8)
^1+(а + р+у+5)^+(ау + а8 + р8)[АГ = 0 (9.4)
dr dr
Этому дифференциальному уравнению удовлетворяет экспоненциальная
функция, что позволяет заменить [А]' членом еХ/. Сокращая все множители при
экспонентах, получаем квадратное уравнение относительно X
X2 +(а + р + у + 5)Х+ау + а5 + 05 = 0 (9.5)
9.1. Модель систем ы стремя состояниями
247
Если X удовлетворяет этому уравнению, тогда ех' удовлетворяет уравнению
(9.4). Уравнение (9.5) имеет два решения
= -(а + Р + у + 8) + ^/(а + Р + у + 8)2-4(ау + а8 + р8) (9
= -(а + Р + у + 8)-л/(а + р + у + 8)2-4(ау + а8 + р8)
Выражение для [А]', удовлетворяющее уравнению (9.4), имеет, таким образом,
следующий общий вид
[А]' = ^е*1' + а2еХ2', (9.7)
где ах и а2 — константы, которые будут определены в следующем разделе. Теперь
мы видим, что [А]' изменяется во времени как сумма двух экспонент. Константы их
убывания, X, и Х2, задаваемые уравнениями (9.6а) и (9.66), всегда отрицательные
и действительные величины в случае положительных величин констант скоростей,
в соответствии с чем [А]' всегда падает до нуля.
Поскольку, как мы записали выше, [А]'= [А]-р877(ау + а8 + р8), при [А]', рав-
ной 0, справедливо равенство [А] = р877(ау + а8 + р8). Фактически это равновесное
значение [А], которое можно получить из схемы (9А) путем выражения констант
равновесия через отношения констант скоростей и решения относительно [А].
Обозначив равновесное значение как [А]равн, получаем следующее решение
[A] = flleX|' + a2eX!' + [A]paBH (9.8)
Таким образом, независимо от начального значения [А] эта переменная спустя
достаточно большой промежуток времени достигает значения [А]равн.
Аналогичным образом можно исключить [А] и [С], чтобы получить дифферен-
циальное уравнение для [В], или исключить [А] и [В], чтобы получить дифферен-
циальное уравнение для [С] (задача 1). В любом случае будет получена двухэкспо-
ненциальная зависимость с одними и теми же двумя константами убывания, опре-
деляемыми уравнениями (9.6а) и (9.66). Временные зависимости для разных
веществ будут различаться множителями ах и а2.
Этот анализ показывает, что добавление третьего состояния в кинетическую
схему приводит к добавлению второго экспоненциального члена в решение. В слу-
чае схемы с четырьмя состояниями система дифференциальных уравнений будет
включать четыре уравнения. Для ее решения применим тот же метод исключения,
но полученное дифференциальное уравнение с одной переменной будет уравнени-
ем третьего порядка с третьей производной. Используя еХ/ в качестве проверочной
функции, мы получим кубический многочлен, а не квадратный, как в уравнении
(9.5). Кубический многочлен имеет три корня, и общее решение этой системы
дифференциальных уравнений представляет собой сумму трех экспонент. При до-
бавлении еще одного состояния в систему решение будет включать четыре экспо-
ненты и т. д. Таким образом, добавление одного состояния в кинетическую модель
всегда приводит к добавлению еще одной экспоненты в систему уравнений
временной зависимости. Это общее и очень важное свойство кинетических моде-
лей систем с множественными состояниями, рассматриваемое ниже.
248
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
9.2. Начальные условия
В предыдущем разделе мы получили двухэкспоненциальное выражение для описа-
ния кинетики, но для завершения решения необходимо определить еще коэффи-
циенты ах и а2 в уравнении (9.8). Уравнение (9.8) — это общее решение, которое
становится частным при вычислении. Частное решение определяется начальным
состоянием системы или начальными условиями. Необходимо знать величины
[А], [В] и [С] при t = 0. Здесь мы рассмотрим случай, когда [А]о = Т и [В]о = [С]о = 0.
Соответственно при Z = 0 уравнение (9.8) сокращается до выражения
Т = а{ + а2 +[А]равн (9.9)
Чтобы найти неизвестные а, и а2, требуется еще одно уравнение. Используя урав-
нение (9.1а), мы можем выразить [В] через [А]
р[В] = а[А] + = а(а, еХ|' + а2еХг' + [А]равн) + (а, X, еХ|' + а2Х2еХг')
а/
При начальных условиях t = 0 и [В] = 0 выражение для а{ и а2 имеет вид
0 = аа, + аа2 + а[А]равн + +а2Х2
Уравнения (9.9) и (9.11) решаются относительно этих двух неизвестных
-аТ-Х2(Т-[А]равн)
а' X, - х2
аГ + ХДТ-^равн)
аг х,-х2
Подставляя эти выражения в уравнение (9.9), получаем частное решение для дан-
ных начальных условий
[А] = -аГ-Х2(Г-[А]равн)г|, + аГ + Х,(Г-[А]равн)гг, + (9 13)
X] ~ Х2 Х| ~ Х2
Это выражение достаточно полно описывает рассматриваемую систему. С по-
мощью уравнения (9.1а) из уравнения (9.13) легко получить выражение для [В].
Выражение для [С] выводится при использовании либо уравнения (9.16), либо
уравнения (9.1в) или из равенства сохранения вещества [А] + [В] + [С] = Т.
По модели трех состояний можно определить динамику концентраций вещест-
ва в различных состояниях, задавая определенные значения констант скоростей
переходов между ними. При а = у = 4ир=5 = Т = 1 изменение концентраций раз-
личных состояний описывается выражениями
[А] = 0,667е~3' + 0,286е’7' + 0,048 (9.14а)
[В] = 0,667е"3' - 0,857 е"7' + 0,19 (9.146)
[С] = -1,ЗЗЗе‘3' + 0,571е~7' + 0,762 (9.14в)
(9.10)
(9.11)
(9.12а)
(9.126)
9.3. Разделение временных шкал
249
Рис. 9.1. Графики зависимостей
[А], [В] и [С] от времени, соответ-
ствующие уравнениям (9.14а)-
(9.14в).
Графики этих уравнений, представленные на рис. 9.1, наглядно показывают изме-
нение концентраций вещества в различных состояниях, рассчитанных как суммы
одних и тех же двух экспонент, в зависимости от времени.
Уравнения (9.14а—в) и рис. 9.1 отражают ожидаемые характеристики системы.
При начальном значении [А], равном 1, концентрация вещества в этом состоя-
нии равномерно снижается, согласно двухэкспоненциальной зависимости, до
равновесного уровня 0,048. При начальном значении [В], равном 0, происходит
возрастание концентрации вещества в этом состоянии до максимального значе-
ния и затем ее снижение до равновесного уровня. Максимум обусловлен отрица-
тельным коэффициентом при более быстро убывающей экспоненте в уравне-
нии (9.146). При начальном значении [С], равном 0, возрастание этой концентра-
ции начинается после задержки, связанной с необходимостью предварительного
возрастания [В]. Соответственно вначале производная по [С] равна нулю (см. за-
дачу 2).
Приведенные уравнения позволяют предсказать временной ход кинетического
процесса, когда известны константы скоростей переходов. В то же время экспери-
ментаторам обычно требуется сделать противоположное — определить константы
скоростей по данным, полученным в кинетическом эксперименте. Фактически
один эксперимент, в котором установлена зависимость от времени, подобная опи-
сываемой выражением (9.13), дает достаточно данных, чтобы можно было найти а,
Р, у и 8 (задача 4).
9.3. Разделение временных шкал
Можно легко объяснить, почему модель системы с тремя состояниями представля-
ет собой двухэкспоненциальное кинетическое уравнение. Например, если переход
между состояниями А и В быстрый, а между В и С медленный и исходно система
содержит вещество в состоянии А, вначале произойдет быстрый переход вещества
из состояния А в состояние В. Однако обратный процесс приведет к квазиустойчи-
вому положению. Когда далее с медленной скоростью вещество из состояния В пе-
250
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
реходит в состояние С, происходит дальнейшее медленное уменьшение [А]. Ин-
туитивно можно предположить, что первая константа убывания отражает перехо-
ды между А и В, и, таким образом, одна константа убывания будет равна примерно
-(а + Р). Соответственно вторая экспонента должна отражать скорости переходов
между состояниями В и С, и вторую константу убывания можно предполагать рав-
ной примерно -(Х + 5).
Это интуитивное предположение можно проверить, вернувшись к точным вы-
ражениям для констант убывания (уравнения (9.6а) и (9.6б)). В общем, если вели-
чина 4(а5 + р5 + Ру) относительно низка, в квадратном корне будет доминировать
член (а + р + у + 5)2. Тогда, согласно уравнению (9.6а), Xj ~0 и, согласно уравнению
(9.66), Х2 ~-(а4-р 4-у 4-6). Таким образом, временные шкалы разделяются. Если а
и р » у и 6, это позволяет определить одну из ожидаемых констант скоростей пе-
реходов.
Ь2~-(а4-р) (9.15)
Чтобы получить с учетом этих условий приблизительное выражение для Х15
вынесем (а 4- р 4- 6 4- у) из-под знака корня в уравнении (9.6а)
= a+p+y+sC L 4(ay + aS + pS)^ 16
' 2 [ (a + p + y + S)2J
Теперь используем разложение в ряд Тейлора 7(1 + *) ~1 + х/2 (уравнение (П1.6)),
чтобы сократить выражение для Xj до
Если значение р намного превышает значения всех остальных констант скоро-
стей переходов, константа убывания Xj ~ -6. Если значение а превышает значения
всех других констант скоростей, то Xj ~ -(у 4-6). В зависимости от условий прибли-
женное выражение для «медленной» константы скорости может меняться. Таким
образом, упрощающая аппроксимация модели системы с тремя состояниями мо-
делью двух отдельных процессов, включающих два состояния, не настолько досто-
верна, как ожидалось. Тем не менее разделение временных шкал характеризует,
как правило, сложные модели множественных состояний. Часто можно вывести
простые приближенные выражения для некоторых констант убывания, но их сле-
дует использовать с осторожностью и проверять путем тщательного анализа.
Необходимо отметить условия, при которых временные шкалы не разделяют-
ся. Когда квадратное выражение в квадрате под знаком корня в уравнениях (9.6а)
и (9.66) составляет небольшую величину, ((а 4- р 4- 6 4- у)2 ~ 4ау 4- 4а5 4- 4р8), тогда X j и
Х2 будут иметь близкие значения и константы убывания нельзя будет так легко ап-
проксимировать с использованием констант скоростей того или другого перехода.
Очевидно, что, когда член под знаком корня в уравнениях (9.6а) и (9.66) равен
нулю, справедливо равенство Xj = Х2. В этом случае кинетика системы с тремя со-
стояниями будет описываться одноэкспоненциальным выражением и константы
убывания будут вырожденными. Необходимо, таким образом, определить общее
правило относительно числа состояний. Фактически минимальное число состоя-
ний отражается числом экспонент в уравнении, описывающем динамику системы.
9.4. Общее решение кинетических уравнений для систем с множественными состояниями 251
9.4. Общее решение кинетических уравнений
для систем с множественными состояниями
Метод, использованный для решения систем уравнений в случае модели трех со-
стояний, можно, в принципе, распространить на модели с большим числом со-
стояний, но при этом способ исключения, использованный в разд. 9.1 для реше-
ния задачи, становится на практике слишком сложным. В то же время уравнения
для систем с множественными состояниями легко решаются с помощью матриц
и векторов (Сох, Miller, 1965). Этот подход фактически систематизирует метод ис-
ключения, использованный выше для решения в случае системы с тремя состоя-
ниями. Анализ, приведенный в данном разделе, может показаться абстрактным,
но на самом деле он весьма полезен для решения практических задач, в чем позво-
лит убедиться содержание следующего раздела.
Рассмотрим п состояний и определим концентрацию вещества в z-м состоянии
как [AJ. Тогда состояние системы может быть описано вектором-столбцом, со-
ставленным из концентраций вещества в этих состояниях
Г[А1П
[А2]
JAJ,
(9-18)
Другой вектор-столбец будет производной первого вектора-столбца (dA/dZ) с эле-
ментами d[Az]/dt
Скорости взаимопревращений вновь будут определяться как произведение
константы скорости и концентрации вещества в данном состоянии, подвергаю-
щемся превращению, например, а[А] или у[В]. Производная по времени концен-
трации вещества в каждом состоянии записывается как дифференциальное урав-
нение в виде суммы таких членов. Это показывают уравнения (9.1а) и (9.16), и в та-
кую систему уравнений мы включим дополнительные состояния и превращения.
Каждое превращение вносит вклад в производные по времени концентрации ве-
щества в двух участвующих в переходе состояниях. Переход из состояния Az- в со-
стояние Ау приводит к уменьшению концентрации вещества в состоянии Az и нако-
плению его в состоянии Ау; обратный переход приводит к противоположному ре-
зультату. Если учесть все переходы из состояния Az и в него, производная
концентрации [А,] будет суммой членов аи [А, ] + а/2 [А2] +... +а/я[А„], где все зна-
чения а получены из констант скоростей. Это позволяет определить матрицу Q и
записать полную систему из п дифференциальных уравнений как простое мат-
рично-векторное уравнение
^=QA (9.19)
d/
Элементы матрицы Q определяют с помощью следующего простого правила. Диа-
гональные элементы Qu представляют собой взятую со знаком минус сумму скоро-
стей превращений из А, во все другие состояния. Каждый элемент Qjh лежащий вне
диагонали, означает скорость перехода из состояния Ау в состояние Az.
252
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
Это компактное выражение для системы кинетических дифференциальных
уравнений в теории случайных процессов называют мастер-уравнением (Van
Kampen, 1981). Оно отражает общий эффект всех переходов, происходящих в дан-
ной системе, суммируя все приращения и уменьшения концентраций по каждому
из состояний.
Для решения уравнения (9.19) произведем то же действие, что при решении
уравнения (9.4), т. е. опробуем экспоненциальную функцию. Примем, что А = UeZz,
где U представляет собой неизвестный вектор той же размерности, что А, и подста-
вим его в уравнение (9.19)
XUez'=QUex' (9.20)
Таким образом,
XU=QU (9.21)
Далее путем преобразования получаем выражение
(Q-XI)U = 0, (9.22)
где I — идентичная матрица с единицами по диагонали и нулями во всех остальных
позициях. Один из способов решения уравнения состоит в том, чтобы приравнять
все элементы U нулю, но это тривиальное решение бессмысленно, поскольку ис-
ходный вектор А должен содержать ненулевые элементы. Чтобы вычислить векторы,
для которых U *0, следует принять во внимание то важное ограничение, которое
уравнение (9.22) накладывает на матрицу Q-XI. Ненулевой вектор U, являющийся
решением этого уравнения, дает возможность объединить столбцы Q-XI, чтобы
получить вектор с одними нулями. Столбцы в таком случае не являются линейно
независимыми, вследствие чего определитель равен нулю (см. приложение 2)
IQ - Х1| = 0 (9.23)
Это характеристическое уравнение (уравнение (П2.17)) для Q. Определитель
Q-XI записывается как многочлен по X «-го порядка (по числу состояний). Кор-
нями этого уравнения являются характеристические величины, или собственные
значения, матрицы Q. Поскольку число корней многочлена равно его порядку, су-
ществует столько значений X, сколько состояний имеется в данной кинетической
системе. При числе состояний, равном «, уравнение (9.23) определяет множество
п констант экспоненциального убывания Xj ,Х2,...,ХЯ. В таком случае решение бу-
дет включать п экспонент. Это формально доказывает утверждение, сделанное
выше: при каждом добавлении в систему нового состояния добавляется еще одна
экспонента в решение кинетической задачи.
Может показаться, что здесь существует противоречие, поскольку решение кине-
тических уравнений для системы с тремя состояниями, описанное в разд. 9.1, включа-
ет только две экспоненты. В случае трех состояний уравнение (9.23) должно пред-
ставлять собой кубический многочлен, в соответствии с чем решение должно быть
суммой трех экспонент. Объяснить это можно при условии, что одно из значений X
равно нулю. Это соответствует наличию постоянного члена, [А]равн, в уравнении (9.13).
Приведенный анализ показывает, что временная зависимость концентрации
вещества в любом из его состояний в кинетической системе с п состояниями мо-
жет быть описана обобщенным вариантом уравнения (9.8)
9.4. Общее решение кинетических уравнений для систем с множественными состояниями 253
1А,] = £айеЧ (9.24)
к=1
где индекс к нумерует собственные значения, в отличие от индекса z, нумерующего
состояния. Каждому значению [AJ соответствует собственный набор коэффици-
ентов, aik, используемых для объединения одних и тех же экспонент в различных
соотношениях. Как и в случае модели трех состояний, эти коэффициенты опреде-
ляются начальными условиями. В модели п состояний начальное условие прини-
мает форму А(0) = Ао, где Ад определяет начальные концентрации вещества во всех
состояниях.
Чтобы вычислить aik в уравнении (9.24) из матрицы Aq, вернемся к уравнению
(9.22). Для каждого собственного значения уравнение (9.22) решается относитель-
но вектора U с использованием одного из значений кк. Эти векторы называют ха-
рактеристическими векторами или собственными векторами матрицы Q. Каждому
из п собственных значений соответствует свой вектор, т. е. имеется также п собст-
венных векторов. Каждый к-й собственный вектор образует пару с к-м собствен-
ным значением, в соответствии с чем (уравнение (9.21)).
Решение уравнения (9.22) относительно U требует решения системы из п ли-
нейных уравнений с п неизвестными. Поскольку уравнение (9.22) было получено
путем подстановки пробного решения A = UeXz в уравнение (9.19), его решение
имеет вид и*ех*'. Особым случаем будет, если начальное условие примет значение
одного из собственных векторов (A0 = UJ; при этом изменение концентрации ве-
щества в каждом состоянии (каждого компонента А) будет описываться уравнени-
ем с одной экспонентой. Это особая характеристика собственных векторов. В от-
ношении отдельного множества концентраций в собственном векторе все взаимо-
переходы компенсируются, и соответственно решение содержит одну экспоненту.
На практике это почти нереально. Чрезвычайно маловероятно, чтобы концентра-
ции вещества во всех состояниях одновременно были равны значению одного
из собственных векторов. Кроме того, собственные векторы часто имеют отрица-
тельные значения, что делает их равенство концентрациям физически невозмож-
ным. Реальные решения представляют собой сумму всех п основных решений,
ех*'. Таким образом, выражение для каждого из состояний содержит п экс-
поненциальных членов.
Для вычисления aik в уравнении (9.24) собственные векторы следует объеди-
нить в правильном соотношении, чтобы получить желаемый вектор начального
состояния, Ад. Это можно осуществить, поскольку, согласно принципам линейной
алгебры, собственные векторы образуют ортогональное множество, которое может
быть объединено для представления любого «-размерного вектора. Имеется, таким
образом, множество коэффициентов Ьк, объединяющих собственные векторы сле-
дующим образом
1Ж=А0 (9.25)
к=\
Левая часть этого выражения может быть записана как произведение матрицы
и вектора
UB = Ао (9.26)
254
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
Собственные векторы используются для составления матрицы U, в которой к-м
столбцом является U* и В представляет собой вектор-столбец с элементами Ьк, Ре-
шим уравнение (9.26) для получения множества коэффициентов в векторе В
В = 1Г‘А0 (9.27)
Теперь объединим п функций илех*' для получения частного решения уравне-
ния (9.19)
A=W'‘' (9-28)
к=\
где Ьк является компонентом вектора В. Таким образом, концентрация вещества
в каждом состоянии выражается как [А,] = ИАиjkekkt и каждый коэффициент
в уравнении (9.24) равен aik = bk\Jik = (U-1 A0\U^. Следует отметить, что при t - 0 вос-
станавливается начальное условие, уравнение (9.25).
С помощью компьютера данный подход легко осуществим и вычисление соб-
ственных значений и собственных векторов для небольших матриц не занимает
много времени. Матрицу собственных векторов можно обратить для решения
уравнения (9.27) и получения коэффициентов. Следует отметить, что матрица U
может использоваться для преобразования матрицы Q в диагональную форму
UlQU = Л, (9.29)
где Л — это диагональная матрица при \кк = кк (уравнение (П2.20)).
9.5. Модель трех состояний в матричном выражении
Чтобы продемонстрировать применение матричного метода для анализа кинетики
множественных состояний, получим заново решение системы уравнений для мо-
дели трех состояний, приведенной в начале главы. Система трех уравнений для
скоростей изменения концентраций вещества в трех состояниях (уравнения
((9.1а)—(9.1 в))) записывается в матричном выражении следующим образом
гсЦаГ
ск ^-a ₽ (P
d[B] d/ = a -₽-Y 8 в (9.30)
d[C] 1° Y -sj
I d' J
Из уравнения (9.23) получим характеристическое уравнение
(9.31)
Раскрывая этот определитель, получаем кубический многочлен
X3 + (а + р + у + 8)Х2 + (ау + а8 + р8)Х = О
(9.32)
9.5. Модель трех состояний в матричном выражении
255
Здесь условие X = 0 является решением, и вынесение этой величины за скобки при-
водит к уравнению (9.5). Таким образом, уравнения (9.6а) и (9.66) имеют другие
корни.
Чтобы получить выражения для собственных векторов, перепишем уравнение
(9.21)
хи =
Р
-р-у
Y
(Р
8
-6,
(9.33)
(и А,
Подстановка пробного решения ик2
е к дает следующие три уравнения
и
О
+₽^2-
(9.34а)
aUkl-^ + y)Uk2 + dUk3=kkUk2
(9.346)
yUk2-6Uk3=kkUk3 (9.34в)
На первый взгляд может показаться правильным использовать эти три уравне-
ния для нахождения трех неизвестных, Ukl9 Uk2 и Uk3) и таким образом определить
элементы собственного вектора. Однако это нельзя сделать, поскольку строки мат-
рицы не являются линейно независимыми; уравнение (9.346) представляет собой
просто взятую со знаком минус сумму уравнений (9.34а) и (9.34в). Для определе-
ния элементов вектора U требуются дополнительные сведения. Примем, что соб-
ственный вектор имеет длину, равную единице
u2kt+u2k2+u2k3 = \
(9.35)
Объединение этого уравнения с двумя из трех уравнений (уравнения (9.34)) по-
зволяет вычислить элементы вектора U*
Р
к = -- (9.36а)
LpJ +рц
= Т-------1--------2 (9'36б)
1+(_ц +[ и
Y
U3k = ---------------= (9.36в)
Из этих трех уравнений приходится по одному на каждое собственное значение
(к = 1, к = 2 ик = '3). Они могут быть проверены как решения уравнений (9.34а)—
(9.34в) и уравнения (9.35).
256
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
*9.6. Стационарность, консервативность
и детальное равновесие
Кинетические системы часто обладают некой формой стабильности и могут дости-
гать стационарного состояния. В этом состоянии концентрации вещества в раз-
личных состояниях постоянны и их производная по времени равна нулю. Это
предполагает, что константы скоростей взаимопереходов подчиняются определен-
ным соотношениям. Система может иметь стационарное состояние, если в ней со-
храняется число молей вещества, или если она находится в термодинамическом
равновесии. Как отмечено в разд. 7.3, термодинамическое равновесие служит ус-
ловием детального равновесия. Это правило можно распространить на кинетиче-
ские системы с множественными состояниями, для которых соотношения между
константами скоростей переходов определяют важные свойства 0-матрицы.
Вначале рассмотрим свойство стационарности. Под ним понимается то, что
система имеет состояние, в котором она стабильна и неизменна. Это может быть
термодинамическое равновесие, однако не все стационарные состояния являются
равновесными (см. ниже). При стационарном состоянии все производные кон-
центраций по времени равны нулю. Используя вектор А^. для обозначения отдель-
ного множества концентраций, где выполняется это условие, получаем из уравне-
ния (9.19)
QACT =0 (9.37)
Данное уравнение решается относительно через константы скоростей перехо-
дов между состояниями.1
Теперь рассмотрим уравнение (9.21). Принимая Аст в качестве собственного
вектора, получаем
QACT = ХАСТ (9.38)
Из уравнения (9.37) очевидно, что X = 0. Таким образом, матрица Q должна иметь
одно собственное значение, равное нулю, и А^ представляет собой соответствую-
щий собственный вектор. Это важное свойство кинетических систем со стацио-
нарным состоянием. Обратное утверждение также справедливо. Если система не
имеет стационарного состояния, ни одно из собственных значений не может быть
нулевым.
Данная ситуация была отмечена выше для модели трех состояний. В том случае
имелось равновесное состояние и одно из решений уравнения (9.32) было нуле-
вым. Используем решение для модели трех состояний (уравнение (9.13)) и при-
мем, что последний член [А]представляет собой [А]равн еХз'. Это ничего не изме-
нит, поскольку при Х3 = 0 член еХз' равен единице. При нулевом собственном зна-
чении существует гарантия того, что, когда все другие кинетические процессы
завершены, система придет в равновесное состояние, соответствующее стацио-
нарному состоянию, при котором А = Аст.
1 Обращение матрицы Q получить нельзя, поскольку, как мы вскоре увидим, |Q|= 0, что дела-
ет матрицу необратимой. Для того, чтобы найти решение для А^, требуется другое условие, такое
как сохранение числа молей.
9.6. Стационарность, консервативность и детальное равновесие
257
Теперь рассмотрим сохранение общего числа молей вещества во всех его со-
стояниях, между которыми происходят переходы (свойство консервативности).
Чтобы кинетическая система обладала таким свойством, в ней не должны проте-
кать ни процессы деградации, ни процессы синтеза и не должно быть потоков ве-
щества, направленных в систему или из нее, а также образования комплексов или
их распада, поскольку во всех этих случаях изменяется число молей вещества.
Процессы образования комплексов приводят, помимо нарушения стабильности
числа молей вещества, к появлению в уравнениях кинетики нелинейных членов
вида [А][В], и тогда математические методы, используемые здесь для решения по-
добных задач, неприменимы.
Если общее число молей никогда не изменяется, производные концентраций
по времени в сумме должны быть равны нулю
£Ё!^1 = о (9.39)
Из правой части уравнения (9.19) очевидно, что произведение QA можно вычис-
лить и затем сложить элементы полученного вектора. Как следует из уравнения
(9.39), полученное выражение должно быть равно нулю
ЙОДА,] = 0 (9.40)
;=1 /=1
Теперь изменим порядок суммирования и объединим множители для каждого А,
i C./AJ + £е2ДА2] + ... + L^[A J = 0 (9-41)
у=1 ;=1 у=1
Каждый член в уравнении (9.41) содержит сумму всех элементов одного столб-
ца матрицы Q. Это уравнение справедливо для любого из членов [AJ, [А2], ... [Ал],
поэтому суммы, на которые умножаются значения [AJ, должны также быть нуле-
выми. Следовательно, сумма элементов в каждом столбце матрицы Q должна быть
равна нулю. Легко проверить, что Q в уравнении (9.30) подчиняется этому правилу.
Это общее свойство кинетических систем с множественными состояниями, в ко-
торых сохраняется число молей. Ниже, при анализе кинетики одиночных каналов,
мы увидим, что матрицы не имеют такого свойства, поскольку вероятность не со-
храняется (см. разд. 9.11).
Как в случае стационарности, так и при сохранении числа молей матрица Q
имеет определитель, равный нулю. При стационарности матрица имеет собствен-
ное значение, равное нулю, и соответственно |Q| = 0, согласно уравнению (П2.23).
При сохранении числа молей также |Q| = 0, вследствие того что сумма элементов
в каждом столбце равна нулю. Поскольку каждая строка матрицы Q может быть
выражена как сумма всех других строк, взятая со знаком минус, строки не являют-
ся линейно независимыми и определитель равен нулю. Это означает, что матрица
для кинетической системы, удовлетворяющей условию сохранения числа молей,
должна иметь по меньшей мере одно нулевое собственное значение и, таким обра-
зом, система должна иметь стационарное состояние.
Наконец, рассмотрим равновесное состояние и условие детального равнове-
сия. Когда система с двумя состояниями достигает равновесия, скорости прямого
258
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
и обратного переходов равны (см. разд. 7.3). В случае системы с множественными
состояниями то же условие будет поддерживаться для всех взаимопереходов, в со-
ответствии с равенством
а/У[А,] = ау/[Ау], (9.42)
где а,у — константа скорости перехода из состояния А, в состояние Ау и ау/ — кон-
станта скорости обратного перехода. Иными словами, это уравнение означает, что
скорость прямого перехода из А; в Ау равна скорости обратного перехода, аналогич-
но тому, что указано для модели двух состояний в разд. 7.3.
Диагональный /-й элемент матрицы Q представляет собой сумму скоростей пе-
реходов из Aj, т. е. Каждый элемент, лежащий вне диагонали столбца /, —
это константа скорости одного из обратных переходов, т. е. ау/. Таким образом, из
уравнения (9.42) можно видеть, что сумма столбцов будет в сумме равна нулю, как
и при ограничивающем условии сохранения числа молей. Кроме того, поскольку
система, удовлетворяющая условию детального равновесия, имеет стационарное
состояние, соответствующая матрица будет иметь одно собственное значение, рав-
ное нулю. Отсюда следует, что условие детального равновесия (как в уравнении
(9.42)) накладывает те же ограничения на матрицу скоростей, какие были опреде-
лены для стационарного состояния и условия сохранения числа молей.
Система с сохранением числа молей и система со стационарным состоянием
не обязательно подчиняются условию детального равновесия. Сумма столбцов
матрицы Q в этих случаях равна нулю, но такое свойство может иметь место и в
том, случае, если система не удовлетворяет уравнению (9.42). Это означает, что
система будет в циклическом режиме многократно проходить через последова-
тельность состояний. Молекула может проходить последовательность состояний
А -> В -> С —> А чаще, чем последовательность состояний А—>С->В—>А. В общем
случае для этого необходим источник энергии. Например, переход из А в В может
сопровождаться гидролизом АТР, и тогда цикл А -> В -> С -> А протекает с затра-
той энергии. Обратный процесс будет требовать синтеза АТР и тем самым будет
энергетически невыгодным. Система будет поддерживать движение по циклу
в энергетически выгодном направлении, с затратой АТР. Наконец, когда реакция
АТР—ADP достигнет равновесия, система будет удовлетворять условию детально-
го равновесия. Эти выкладки рассматриваются ниже при анализе кинетики оди-
ночных каналов (см. разд. 9.11).
9.7. Кинетика одиночных каналов: модель трех состояний
Как мы видели в разд. 7.9, уравнение кинетики одиночных каналов связывает кон-
станты скоростей конформационных изменений каналообразующих белков с ве-
роятностями состояний ионных каналов. Обратимся теперь вновь к анализу пове-
дения этих одиночных молекул, чтобы выяснить, как модель кинетики множест-
венных состояний может быть адаптирована к решению вопросов такого типа.
С этой целью мы должны перейти от макроскопического уровня, где исследуются
концентрации, к микроскопическому уровню, где переменными являются вероят-
ности. В сущности, этот переход очень прост. Если сумму концентраций вещест-
ва во всех взаимопревращающихся состояниях обозначить как Г, концентрация
9.7. Кинетика одиночных каналов.- модель трех состояний
259
вещества в состоянии А будет равна РАГ, где РА — это вероятность того, что моле-
кула находится в состоянии А. В результате кинетические уравнения, описываю-
щие изменения вероятностей, имеют ту же основную форму, что и уравнения, опи-
сывающие изменения концентраций. Математический подход для выведения
уравнений также аналогичный.
Идеи, обсуждаемые в этом разделе, применимы к анализу поведения любых
одиночных молекул, но здесь мы будем использовать термины для ионных кана-
лов и обозначать состояния как открытые и закрытые. Начнем с применения мо-
дели трех состояний, приведенной в начале главы, но определим, что оба состоя-
ния справа — это открытые состояния каналов (схема (9Б))
а у
с^=±о1^=±о2
₽ 8 (9Б)
Оба открытых состояния характеризуются одинаковой проводимостью для ионов,
и по данным регистрации тока нельзя установить, в каком из двух открытых со-
стояний находится канал.
Из модели двух состояний, описанной в разд. 7.9, очевидно, что распределение
времени жизни закрытого состояния в схеме (9Б) будет описываться одной экспо-
нентой, е"а'. Это объясняется тем, что существует только одно закрытое состояние.
Однако для описания распределения времени жизни открытых состояний (време-
ни пребывания канала в открытом состоянии), согласно схеме (9Б), одной экспо-
ненты недостаточно. Открывание начинается переходом в состояние Он но из
него канал может либо немедленно закрыться, либо перескочить в состояние О2.
Таким образом, можно предсказать ряд короткоживущих событий, ведущих непо-
средственно к закрытому состоянию (С), и ряд долгоживущих событий, имеющих
место при состоянии О2.
Уравнение распределения времени жизни открытых состояний из схемы (9Б)
выводится по аналогии с анализом кинетики на макроскопическом уровне для мо-
дели трех состояний. Вновь запишем дифференциальные уравнения для различ-
ных состояний, но теперь они будут выражать увеличение и уменьшение вероятно-
стей, а не концентраций. Здесь требуются дифференциальные уравнения только
для двух открытых состояний. Вероятность закрывания в данном случае не имеет
значения, поскольку активность после этого события не входит в предмет рассмот-
рения. Обозначим вероятность пребывания канала в состоянии Oj какРо1 и веро-
ятность пребывания в состоянии О2 как Ро2, чтобы записать уравнения
^2L = -(P + Y)P0|+5Po2 (9.43а)
а/
d Р
^- = уРо1-8Ро2 (9.436)
at
Данные уравнения не включают скорость открывания канала, а, что вновь под-
тверждает независимость от закрытого состояния.
На данном этапе может показаться правильным исключить одну из перемен-
ных при наложении условия консервативности, как мы делали это при анализе
макроскопического поведения моделей системы с двумя состояниями и системы
с тремя состояниями. Однако вероятность пребывания канала в открытом состоя-
нии уменьшается во времени. Условие консервативности при этом неприменимо
260
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
(9.44)
(9.45а)
(9.456)
(см. ниже). Преобразуя уравнения (9.43а) и (9.436) с помощью замен и исключе-
ния, как при выведении уравнения (9.3) из уравнений (9.1а)—(9.1в), мы получаем
дифференциальное уравнение второго порядка относительно одной из перемен-
ных. Далее с использованием пробного решения ev получим квадратное уравне-
ние, аналогичное по форме уравнению (9.5)
V +(р + у + 8)Х + р8 = 0,
имеющее два решения
_-(P + Y + S) + 7(P + Y + 8)2-4₽5
Х,= 2
-(P + Y + 8)-7(₽+Y + 5)2-4p8
-------------2
Таким образом, в общем виде решение уравнений (9.43а) и (9.436) представляет со-
бой сумму двух экспонент
РО1 =a^{t + a2^2t (9.46)
Здесь, как и при анализе макроскопических концентраций в модели трех со-
стояний, переход от общего решения к частному требует включения начальных ус-
ловий. Однако теперь начальные условия не могут быть произвольными. В начале
открывания канал должен находиться в состоянии О15 поскольку это единственное
состояние, доступное для перехода из закрытого состояния. Таким образом, при Z,
равном нулю, РО1 = 1 и Ро2 = 0. Соответственно этому из уравнения (9.46) мы полу-
чаем следующее выражение
+ а2 = 1
Подстановка уравнения (9.46) в уравнение (9.43а) дает выражение
8Ро2 = а^е*1' + а2Х2е^2' +(р + ч-а^2')
Поскольку при t, равном нулю, Ро2 = 0, справедливо равенство
aj(Xj + р + у) + а2(к2 +р + у) = О
Теперь решим уравнения (9.47) и (9.49) относительно и а2
а, = -Х2-р-у
X] - Х2
X, +P + Y
а2 —-------
х,-х2
Получив эти решения, мы можем записать уравнение (9.46) подробно в виде
= -Х2-р-у + X, +р + (9,51)
01 Х,-Х2 X, -Х2
Теперь используем уравнение (9.48), чтобы получить Ро2 из уравнения (9.43а)
Ро2 = ——еК|'------—еХ2' (9.52)
Х,-Х2 Х,-Х2
(9.47)
(9.48)
(9.49)
(9.50а)
(9.506)
9.7. Кинетика одиночных каналов: модель трех состояний
261
(9.53)
(Уравнение (9.52) упрощается с помощью соотношений XjX2 =₽8 и Xj +Х2 =
= -(Р + у + 8), которые легко вывести из уравнений (9.45а) и (9.456).)
На этом этапе применимы два способа, позволяющие вывести выражение для
вероятности пребывания канала в открытом состоянии. Можно предположить,
что вероятность перехода в закрытое состояние, происходящего в момент времени
t, равна константе скорости закрывания р, умноженной на вероятность пребыва-
ния в состоянии Oj. Это произведение записывается как рР01, и распределение ве-
роятности открытого состояния выводится путем интегрирования данного выра-
жения по интервалу времени от 0 до t. (Напомним, что распределение вероятности
представляет собой интеграл плотности вероятности — уравнение (7.33).)
_ -Х2 -р 1,, Xj +р i2/
°"х,-х2 х,-х2
Другой вариант выведения уравнения для распределения вероятности пребывания
канала в открытом состоянии основан на том, что это распределение записывается
как Р01 + Ро2. Соответственно вероятность того, что канал все еще будет находиться
в открытом состоянии в момент времени t, равна сумме вероятностей того, что ка-
нал находится в каком-либо одном из открытых состояний. При обоих способах
выведения мы получаем одно и то же выражение для распределения времени жиз-
ни открытых состояний (см. задачу 6).
Графики Ро1,Ро2 и их суммы позволяют наглядно представить, как эти различ-
ные функции вероятности изменяются во времени (рис. 9.2). Исходное значение
Р01 равно единице, и во времени эта вероятность быстро уменьшается, что отража-
ет доминирование быстрой компоненты распределения. Поскольку все открыва-
ния начинаются с перехода в состояние О15 величина Ро2 исходно равна нулю и за-
тем возрастает до максимума, после которого начинает уменьшаться. Величина Ро
отражает обе эти динамики.
Все приведенные на графике функции являются суммой двух экспонент с од-
ними и теми же константами убывания, но в различных соотношениях. Максимум
на графике Ро2 отражает тот факт, что один из коэффициентов в уравнении (9.52)
является отрицательным, как и в случае концентрации [В] в модели двух состоя-
ний (рис. 9.1).
Рис. 9.2. Графики уравнений (9.51)-(9.53)
при р = 4 и у = 6 = 1 (соответствующие
значения констант убывания = -0,76
и Х2 = -5,24).
262
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
9.8. Разделение временных шкал:
анализ пачек открываний одиночных каналов
При регистрации тока через одиночные каналы часто наблюдается, что открыва-
ния происходят «пачками». После длительного периода пребывания канала в за-
крытом состоянии следует множество открываний в быстрой последовательности
и затем опять длительный период закрытого состояния (рис. 9.3).
Для описания этого поведения канала можно применить модель трех состоя-
ний, из которых два закрытые, при условии что переходы между открытым и за-
крытыми состояниями быстрые, а между двумя закрытыми состояниями медлен-
ные. Распределение времени жизни закрытых состояний будет включать две ком-
поненты. Короткие отрезки времени пребывания канала в закрытом состоянии
внутри пачек открываний будут составлять быструю компоненту распределения,
а длительные отрезки времени пребывания в закрытом состоянии между пачка-
ми — медленную компоненту.
Модель канала с двумя закрытыми состояниями имеет следующий вид (схе-
ма 9В)
а у
С, <=> С2 ^=± О
Р 8
(9В)
Аналогичную задачу мы решали в предыдущем разделе. Здесь требуется только за-
менить константу р константой у и константу а константой 5. Тогда, согласно урав-
нениям (9.45а) и (9.456), распределение времени жизни закрытых состояний будет
содержать следующие константы убывания экспонент
-(а + р + у) + 7(а + Р + У)2 ~ 4ау
2
-(а + Р + У) ~ 7(а + Р + У)2 ~ 4ау
(9.54a)
(9.546)
Уравнение распределения времени жизни закрытых состояний выводится с ис-
пользованием этих выражений для X, и Х2 и путем соответствующих подстановок
в коэффициентах уравнения (9.53).
Как и в разд. 9.3, условие разделения временных шкал заключается в том, что-
бы значение второго члена под знаком квадратного корня было намного ниже зна-
11И
Время пребывания в открытом состоянии
Закрытое состояние
Рис. 9.3. Три пачки открываний оди-
ночного канала. Запись средней
Открытое состояние пачки приведена в увеличенном
масштабе.
9.8. Разделение временных шкал: анализ пачек открываний одиночных каналов
263
чения первого члена: (а + р + у)2 »4ау. Условие пачечного открывания возникает,
когда а меньше констант скоростей других переходов. Переходом в состояние Cj
начинается длительный период закрытого состояния между двумя пачками откры-
ваний. Короткие отрезки времени пребывания в закрытом состоянии наблюдают-
ся, когда канал из состояния О переходит в состояние С2 и затем возвращается
в состояние О. При условии, что р и у » а, те же соображения, на основе которых
мы выводили уравнения (9.15) и (9.17), позволяют получить следующие прибли-
женные выражения для и л2
X, ~ (9.55а)
P + Y
Х2~-(₽ + У) (9.556)
Вначале рассмотрим константу убывания Х2. Распределение времени жизни
состояния С2 выражается как e“(p+Y)z. Два пути перехода из этого состояния полно-
стью аддитивно влияют на уменьшение времени его жизни. Определим теперь ко-
личественное соотношение переходов из состояния С2 в состояния О и СР Эти пе-
реходы должны происходить в соотношении у/p. Доля переходов из С2 в О равна
у/(у + Р), а доля переходов из С2 в С| составляет р/(у + р). Это соотношение перехо-
дов можно включить в выражение для распределения времени жизни закрытых
состояний, чтобы определить фракции короткоживущих и долгоживущих закры-
ваний соответственно.
Рс ~ _2_е-<Р+>)' + _Р_ e-aY'/(P+y) (9.56)
у + р У + Р
Подход к анализу активности каналов с этой стороны позволяет раскрыть не-
сколько интересных дополнительных характеристик пачек. Можно задаться во-
просом, сколько открываний вероятнее всего включает пачка. Вначале определим
вероятность пачки, включающей только одно открывание. Если канал исходно на-
ходится в состоянии С2, то для того, чтобы пачка закончилась, он должен быстро
перейти в состояние СР Согласно соотношению переходов, вычисленному выше,
вероятность того, что это произойдет, равна Р/(у + Р). В случае пачки с двумя от-
крываниями канал должен вернуться из состояния С2 обратно в состояние О; веро-
ятность этого равна у/(у + р). После второго открывания канал опять окажется в со-
стоянии С2, и в этот момент должен произойти переход в состояние Cj с вероятно-
стью Р/(у + Р). Перемножая величины вероятности этих двух отдельных событий,
мы получаем вероятность пачки с двумя открываниями, равную Ру/(у+ Р)2. Повто-
ряя данное действие, можно вывести общее выражение для вероятности пачки
с л-числом открываний
Р(и)~-^-— (9.57)
(Р + у)
Записав среднее значение п, преобразуем с помощью уравнений (П1.11) и (П1.12)
входящие в это выражение суммы
^ПР{П} 0+у
« - *=!------ (9.58)
Р
Л = 1
264
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
При регистрации тока через одиночный канал легко подсчитать число открываний,
приходящееся на одну пачку, и определить среднее число открываний. Среднее вре-
мя жизни закрытого состояния внутри пачки равно 1/(р + у), и с помощью уравнения
(9.58) можно найти константы скоростей переходов р и у (Colquhoun, Hawkes, 1982).
Анализ пачечного открывания каналов был применен при исследовании блока-
ды каналов анестетиками местного действия (Neher, Steinbach, 1978). Эти лекарст-
венные вещества входят в открытые каналы и действуют подобно пробке, препят-
ствуя потоку ионов. Запись тока от одиночного канала ацетилхолинового рецепто-
ра в присутствии анестетиков выглядит очень похожей на ту, которая приведена на
рис. 9.3. Однако при этом закрывания внутри пачек отражают события связывания
с анестетиком, а не переходы воротного механизма ионного канала.
Для интерпретации полученных данных Неер и Стейнбах использовали сле-
дующую модель (схема (9Г))
a *CB[D]
С О <=± В
Р К (9Г)
Состояние, обозначенное как В, — это блокированное состояние канала. Анесте-
тик связывается с каналом в открытом состоянии со скоростью, равной произведе-
нию константы скорости связывания кса и концентрации анестетика [D], и диссо-
циирует со скоростью, пропорциональной кл. Константу р определяли из формулы
распределения времени жизни открытого состояния в отсутствие анестетика (но
в присутствии ацетилхолина). При добавлении анестетика наблюдалось более
быстрое экспоненциальное убывание распределения времени жизни открытого
состояния. Скорость убывания линейно возрастала с ростом концентрации ане-
стетика, и тангенс угла наклона соответствовал кса. В присутствии анестетика на-
блюдались краткие закрывания, отражающие события блокады. Распределение
времени жизни этих кратких событий носило экспоненциальный характер, и по
его кривой определяли кл.
Эти результаты согласовались со схемой (9Г), но тем не менее авторы провели
более тщательную проверку своей модели. С увеличения концентрации анестетика
пачки открываний становились более длительными. Авторы произвели разделение
шкалы времени как аргумента, чтобы получить приближенную среднюю длитель-
ность пачки. На основе предположения, что состояния О и В быстро достигают
равновесного уровня, было выведено следующее выражение для доли времени, ко-
торая приходится на состояние О внутри пачки
(9.59)
X =_________
° *Д+*СВР]
Пачка заканчивается при переходе из состояния О в состояние С, и скорость ее
окончания равна рх0. Средняя продолжительность пачки в таком случае рассчиты-
вается как величина, обратная этой скорости
— _ 1 f £CB[D]
(9.60)
Это уравнение очень хорошо соответствует экспериментально установленным ве-
личинам средней продолжительности пачек в исследованном диапазоне концен-
9.9. Общий анализ кинетики одиночных каналов: подсчет числа состояний
265
траций анестетика, что свидетельствует о достоверности представленной модели
блокады открытых каналов (схема 9Г).
9.9. Общий анализ кинетики одиночных каналов:
подсчет числа состояний
Распределение времени жизни состояний ионных каналов описывается набором
дифференциальных уравнений, например уравнениями (9.43а) и (9.436) для моде-
ли канала с двумя открытыми состояниями. Эти уравнения можно записать
в матрично-векторной форме (см. разд. 9.4). В данном случае вектор состояния
обозначается как Ро и выражает множество вероятностей открытых состояний при
произвольном числе открытых состояний
IX)
Р02
(9.61)
Данная матрица учитывает скорости переходов между различными открытыми со-
стояниями и из них. Обратные переходы из закрытого состояния в открытое счи-
таются незначимыми. Модель канала с двумя открытыми состояниями представ-
ляет следующая матрица
(—В - у 6
Qo = Р 7 J (9.62)
Индекс о означает, что данная матрица отражает вероятности открытых со-
стояний. Закрытые состояния указываются индексом с. В терминах Ро и Qo изме-
нение вектора вероятности открытого состояния во времени подчиняется диффе-
ренциальному уравнению того же вида, что уравнение (9.19)
^7 = QoPo (9.63)
а/
Это уравнение решается тем же способом, что уравнение (9.19). Константы экс-
поненциального убывания представляют собой собственные значения матрицы
Qo. Число собственных значений определяет число экспонент в уравнении распре-
деления времени жизни открытых состояний. Это число должно в свою очередь
определяться размерностью матрицы Ро, равной числу открытых состояний. Разу-
меется, тот же способ может быть использован для выведения формулы распреде-
ления времени жизни закрытых состояний, где матрицу Qo заменяет матрица Qc.
Отсюда следует важное правило кинетики одиночных каналов. Число экспонент,
предсказываемое схемой состояний и переходов, в распределении времени жизни
данного уровня проводимости равно числу состояний, характеризующихся этой про-
водимостью. Например, в случае, когда распределение времени жизни открытого
состояния хорошо описывается суммой трех экспонент, можно заключить, что в от-
крытом состоянии этот канал находится при трех своих кинетически различимых
конформациях. Пример распределения времени жизни открытых и закрытых состоя-
266
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
Рис. 9.4. Распределение времени жизни открытых (А) и закрытых (Б) состояний по данным реги-
страции СГ-канала. активированного у-аминомасляной кислотой (см. рис. 7.11). График в полуло-
гарифмических координатах показывает экспоненты как прямые линии. Путем подгонки получе-
ны выражения для распределения времени жизни открытого состояния, 97еч/0,81 + 23 е 4/12,9 (А),
и закрытого состояния, 145еч/0," + 4,9еч/45,3 (Б). (По Zhang, Jackson, 1995.)
ний для СГ-канала, активированного нейромедиатором (у-аминомасляной кисло-
той), приведен на рис. 9.4. Эти распределения были рассчитаны по записям длитель-
ной регистрации переходов канала, таким как показанные на рис. 7.11. Каждое экспе-
риментально установленное распределение хорошо описывала сумма двух экспонент,
и на основании этого канал был определен как имеющий два открытых и два закры-
тых состояния. Здесь следует иметь в виду, что могут существовать процессы, слиш-
ком быстрые или слишком медленные, чтобы можно было их измерять, а также близ-
кие, или вырожденные, собственные значения. С учетом этого число экспонент
обычно считают нижней границей числа состояний с данной проводимостью.
Коэффициенты при экспонентах определяют тем же способом, что и в макро-
скопической кинетике, т. е. находят собственные значения матрицы и объединяют
их в соответствии с начальными условиями. В случае распределения времени жизни
состояний одиночных каналов начальное условие вновь диктуется распределением
между открытыми состояниями в начале открывания. Полный матричный анализ
кинетики одиночных каналов можно найти в работе Colquhoun, Hawkes, 1995.
*9.10. Сходство между кинетикой одиночных каналов
и кинетикой макроскопических систем
Очевидно, что уравнения кинетики множественных состояний для макроскопиче-
ских систем и для одиночных молекул весьма сходны, т. е. между кинетическим по-
ведением систем этих двух типов можно выявить четкую связь. Рассмотрим кине-
тическую схему для канала с множественными открытыми и закрытыми состояния-
ми. Составим полную матрицу Q, отражающую взаимопереходы между всеми этими
состояниями (уравнение (9.19)) и затем разделим ее на подматрицы по признаку
9.1 I. УТРАТА СТАЦИОНАРНОСТИ, КОНСЕРВАТИВНОСТИ И ДЕТАЛЬНОГО РАВНОВЕСИЯ
267
проводимости канала. Выделим внутри матрицы Q подматрицу Qo, отражающую
переходы между различными открытыми состояниями, а также переходы из совокуп-
ности открытых состояний. Кроме того, выделим подматрицу Qc, соответствующую
переходам между различными закрытыми состояниями, а также переходам из сово-
купности закрытых состояний. Наконец, можно выделить подматрицы Qc_0 hQ0_c ,
соответствующие переходам между открытыми и закрытыми состояниями. С ис-
пользованием этих матриц уравнение <9.19) записывается следующим образом
fQc Qc-»YPc>| = d' (9.64)
lQo-c Qo APoJ dPp
I dt J
Таким образом, мы получили уравнение (9.19), преобразованное в матричную
форму и содержащее матрицу Q, разделенную описанным выше образом, и матри-
цу А, разделенную на матрицы Рс и Ро. Перемножая члены, составляющие левую
часть этого уравнения, получаем два матричных уравнения
dP
QcPe+Qc-oPo=VL (9-65)
d/
dP
Qo-cPc+QoPo=£7T (9-66)
at
Матричное уравнение для распределения времени жизни закрытых состояний
получают путем исключения члена QC_OPO из уравнения (9.65), матричное уравне-
ние для распределения времени жизни открытых состояний — путем исключения
члена Qc-oPc из уравнения (9.66). Два исключенных члена отражают возврат в дан-
ное состояние, т. е. процессы, которые в кинетике одиночных каналов характери-
зуются как незначимые. В этом заключается основа общего метода шагов назад
и вперед между полной кинетической схемой и подсхемами для распределений
времени жизни состояний одиночных молекул.
*9.11. Утрата стационарности, консервативности
и детального равновесия
Полная кинетическая схема конформационных переходов белка должна включать
равновесное стационарное состояние, при котором все переходы удовлетворяют
условию детального равновесия (см. разд. 9.6). Однако при анализе одиночных ка-
налов используется лишь часть полной схемы, и поэтому для них схема характери-
зуется существенными отличиями. В кинетике одиночных каналов вероятность
того, что канал остается в любом состоянии, во времени стремится к нулю; беско-
нечно долгоживущих состояний не существует. Это означает, что не существует
стационарного состояния. Вероятность пребывания в любом состоянии снижается
во времени, т. е. не может быть консервативной величиной. В рамках кинетики
одиночных каналов не поддерживается детальное равновесие, поскольку переходы
из данного состояния (например, из закрытого в открытое) не компенсируются
обратными переходами.
268
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
Все эти условия влияют на характеристики матриц Qo и Qc. Как правило, они со-
держат ненулевые определители и ненулевые собственные значения. Если бы они
включали собственное значение, равное нулю, в выражении для вероятности времени
жизни присутствовал бы постоянный, неубывающий член (последний член, перене-
сенный из уравнения (9.13)), и это давало бы неадекватный результат — ненулевой
предел при / -> оо. Равенство нулю собственного значения матрицы переходов явля-
ется условием стационарности, консервативности и детального равновесия. Важно
представлять, что при использовании описанного выше метода разделения, с помо-
щью которого из матрицы Q извлекаются соответствующие подматрицы одиночных
каналов, мы получаем матрицы, имеющие характерные и существенные отличия.
Это относится в общем к одиночным каналам, независимо от того, подчиняет-
ся ли схема условию детального равновесия или нет. Если полная кинетическая
схема удовлетворяет принципу детального равновесия, можно подробнее охарак-
теризовать форму распределения времени жизни состояний. В случае кинетиче-
ской схемы одиночных каналов с обратимыми переходами распределение времени
жизни состояний ограничивается монотонным убыванием от единицы до нуля
(см. график для Ро на рис. 9.2). Это распределение времени жизни состояний выра-
жается суммой убывающих экспонент, в которой каждый член имеет положитель-
ный коэффициент. Если условие детального равновесия не соблюдается, послед-
нее правило теряет силу. Становится возможным появление отрицательных коэф-
фициентов, и распределение времени жизни может изменяться по мере того, как
вероятность возрастает или снижается.
Для того чтобы в этом убедиться, рассмотрим следующую циклическую схему
(схема (9Д))
я
(9Е)
Эта схема включает два открытых состояния, как и схема (9Б), но здесь оба откры-
тые состояния связаны с закрытым состоянием. Это создает интересную ситуа-
цию, когда нарушение детального равновесия приводит к предпочтительному дви-
жению через три состояния по часовой стрелке или против часовой стрелки.
Прежде всего отметим, что константы скорости в данном случае не являются
независимыми. Это можно установить путем определения соотношений концен-
траций (подобно анализу циклических схем в гл. 5). Соотношение [О2]/[С], опре-
деляемое прямым взаимопереходом, равно ср/е, но при переходе из состояния О2
в состояние С через состояние О, то же соотношение равно ау/08. В условиях рав-
новесия два эти выражения должны быть равны
ауе = Р8(р (9.67)
Аналогичная идея была использована при выведении уравнения (5.13), но здесь
мы использовали константы равновесия. Если скорости не подчиняются уравне-
нию (9.67), условие детального равновесия отсутствует и система будет демонстри-
ровать предпочтительное циклическое движение в одном направлении. Это озна-
чает, что по крайней мере одна из стадий осуществляется за счет некого источника
энергии и возможность равновесия исключена.
9.11. Утрата стационарности, консервативности и детального равновесия
269
Чтобы вывести выражение для распределения времени пребывания в откры-
том состоянии по схеме (9Д), определим матрицу для открытых состояний
<-0 - у 6
Qo = Р У s , (9.68)
у -о - ej
в которой Qo имеет следующие собственные значения
-(Р + у + 6 + £) + 7(P + Y+S + £)2-4(P5 + pe + ye)
Aj -------------------------------------- (У.оуа;
= -(P + Y + 5 + £)-7(P + y + 8+e)2-4(P8 + p£ + ye) (9 69Ь)
Начальное условие определяется относительной частотой открытых состояний
О! и О2. Очевидно, что это соотношение определяется соотношением констант
скоростей переходов, а и ср. Таким образом, Р01 (0) = а/(а +ср) и Ро2 (0) = ф/(а +ср). Ко-
эффициенты при экспонентах в выражении для Ро1 при этом равны
al+a2=-^— (9.70)
а+(р
Из значения Ро1 можно вычислить Ро2 и получить второе условие
-^- = (р+у-Х,)а, + (р + у-Х2)а2 (9.71)
а + ф
Теперь решим уравнения (9.70) и (9.71) относительно ах и a2i чтобы вывести выра-
жения для Р01 и Ро2. Объединение этих выражений позволяет получить уравнение
распределения времени пребывания в открытом состоянии
Ро = -.-------— (-((а+<р)Х2 +ар + ф£)еХ|' + ((а+ф)Х| +а₽+ф£)еХ2') (9.72)
(а+ф)(Х, -Х2)
Далее проверим следствия нарушения детального равновесия, для чего возь-
мем экстремальный случай и примем, что 0 и ф стремятся к нулю. Как следует из
схемы (9Д), при этом все открывания начинаются из состояния Ои Кроме того, ка-
нал должен возвращаться из них в состояние С через состояние О2, т. е. цикличе-
ски проходить через все три состояния при каждом открывании. Уравнение (9.72)
в таком случае сокращается до вида
Ро = ~Х2 еХ|'+——е*2' (9.73)
Х,-Х2 Х,-Х2
Между уравнениями (9.72) и (9.73) имеется важное различие. Это может быть
не вполне очевидным, но коэффициенты в уравнении (9.72) всегда положитель-
ные, если выполняется уравнение (9.67), тогда как коэффициенты в уравнении
(9.73) имеют противоположный знак. Таким образом, нарушение детального рав-
новесия приводит к качественному отличию. Это иллюстрируют графики двух
данных выражений (рис. 9.5) при 0 = 1, ф = 10 (величины выбраны так, чтобы вы-
полнялось уравнение (9.67)) и при 0 = ф = О (см. Colquhoun, Hawkes, 1995).
270
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
При условии р = ср = 0 в момент времени t = 0 наклон кривой нулевой. Это озна-
чает, что вероятность закрывания канала сразу после его открывания равна нулю.
Функция плотности вероятности (производная распределения) будет, таким обра-
зом, начинаться в нуле (где кривая для условия р = ср = 0 на рис 9.5 имеет вид пла-
то), проходить через максимум и затем до нуля. Такой тип поведения каналов ино-
гда наблюдается в экспериментах. Одним из типичных примеров может служить
активность канала — регулятора трансмембранной проводимости (мутациями
в его гене обусловлено наследственное расстройство муковисцидоз). Этот
СГ-канал переходит в открытое состояние при связывании с АТР и закрывается
после гидролиза связанного АТР. Таким образом, открытый канал закрывается по-
сле некоторой задержки (Zeltwanger et aL, 1999).
Путем обобщения уравнения, приведенного выше для модели трех состояний
канала, было установлено, что для любой схемы активности одиночного канала,
в которой отдельные стадии подчиняются условию детального равновесия, коэф-
фициенты всегда положительные (Kijima, Kijima, 1987). Таким образом, функция
распределения затухает монотонно, не имея максимумов и модуляций. Это под-
тверждают получаемые при регистрации одиночных каналов экспериментальные
данные, которые, таким образом, служат доказательством того, что механизм пе-
реходов канала в различные состояния включает по меньшей мере одну энергоза-
висимую стадию, например гидролиз АТР. Однако обратное утверждение неверно:
если в наблюдаемом распределении времени жизни состояний все коэффициенты
положительные, наличие энергозависимой стадии не исключается. В этом случае
трудно обнаружить неравновесное поведение и требуется использовать более
сложные аналитические методы (Steinberg, 1987; Rothberg, Magleby, 2001).
9.12. Корреляции состояний одиночных каналов:
подсчет числа путей переходов
До сих пор мы рассматривали периоды продолжительности состояний канала по
отдельности. Однако в некоторых кинетических схемах периоды последователь-
ных состояний зависят один от другого, т. е. коррелируют между собой. Это озна-
9.12. КОРРЕЛЯЦИИ СОСТОЯНИЙ ОДИНОЧНЫХ КАНАЛОВ: ПОДСЧЕТ ЧИСЛА ПУТЕЙ ПЕРЕХОДОВ
271
т rz::: zn_jL_r
Рис. 9.6. Корреляции между открываниями канала: короткие периоды открытого состояния, свя-
занные с длительными периодами закрытого состояния (слева), и длительные периоды откры-
того состояния, связанные с короткими периодами закрытого состояния (справа).
чает, что расчетная длительность одного состояния будет зависеть от длительности
предыдущего состояния. В действительности корреляции могут распространяться
на несколько последовательных состояний. Эта взаимозависимость выражается
через двумерную плотность вероятности pc o(tc, t0). Для решения данной более
сложной задачи могут быть использованы математические методы, примененные
выше для расчета вероятностей времени жизни состояний одиночного канала, но
в существенно модифицированном варианте (Fredkin et al., 1985). Здесь мы приве-
дем некоторые наиболее интересные результаты применения такого математиче-
ского подхода, не касаясь его подробностей.
Наличие корреляций между периодами различных состояний ионных каналов
часто позволяет определить их кинетическую схему. Допустим, что запись токов от
одиночных каналов показывает соответствующие четкие корреляции (рис. 9.6).
В такой записи видны длительные периоды закрытого состояния, следующие за
короткими периодами открытого состояния, и наоборот. Допустим далее, что рас-
пределения времени жизни открытых и закрытых состояний проанализированы
и установлено, что оба они описываются двумя экспонентами (рис. 9.4). Из этого
следует, что имеется два открытых состояния и два закрытых состояния. Наличие
корреляций говорит о том, что должны существовать два разных пути перехода ме-
жду открытыми и закрытыми состояниями. Модель, включающая только один
путь перехода, не может объяснить наблюдаемые корреляции.
Чтобы описать поведение такой модели, рассмотрим следующую схему пере-
ходов между последовательными состояниями
С,^С2^О,^О2 (9Е)
Длительные периоды пребывания в открытом состоянии могут быть результатом
того, что канал переходит из состояния О! в состояние О2. Если же открывание за-
канчивается переходом из состояния О) в состояние С2, от длительности периода
открытого состояния не зависит, будет ли закрытое состояние быстро заканчивать-
ся переходом в состояние О! или продолжится длительное время в результате пере-
хода в состояние С,. Фактически, если выводят выражение для двумерной вероят-
ности времени пребывания канала в открытом состоянии и затем в закрытом со-
стоянии, то получают произведение распределений времени жизни открытых
и закрытых состояний, причем вероятности являются независимыми.
Теперь рассмотрим модель с другим механизмом
О, +=± С, С2 О2 (9Ж)
Пребывание в открытом состоянии О! будет заканчиваться переходом в состояние
Сн и, следовательно, время пребывания в закрытом состоянии будет определяться
этим начальным условием. Пребывание в открытом состоянии О2 будет заканчи-
ваться переходом в состояние С2, поэтому вероятность времени пребывания в за-
крытом состоянии будет иной. Длительность пребывания в закрытом состоянии
272
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
будет в данном случае коррелировать с длительностью предшествующего периода
пребывания в открытом состоянии.
В действительности многие каналы обнаруживают четкую корреляцию между
периодами последовательных состояний (например, ацетилхолиновый рецептор),
и анализ этой корреляции позволил исключить кинетические схемы, включающие
только один путь перехода между открытым и закрытым состояниями (Jackson et
al., 1983).
При математическом анализе корреляций времени жизни состояний одиноч-
ных каналов находят коэффициент корреляции как функцию числа промежуточ-
ных (между событиями открывания) интервалов, п. Выражение для этого коэффи-
циента представляет собой сумму экспонент, убывающих в зависимости от л, при-
чем число экспонент на единицу меньше числа путей переходов (Fredkin et aL,
1985). Таким образом, анализ данных регистрации токов одиночных каналов этим
способом сокращается до определения числа путей переходов, которыми связаны
открытые и закрытые состояния.
Больше информации о механизмах переходов между состояниями каналов
можно получить при использовании матричных методов для расчета вероятности
длительных (многоминутных) периодов активности канала, включающих тысячи
переходов в одиночном канале. Если произвести такие вычисления для различных
кинетических схем, то схему, дающую наибольшую расчетную вероятность, можно
определить как наиболее адекватное описание воротной активности канала (Нот,
Lange, 1983). Этот метод максимизации вероятности позволяет существенно про-
яснить воротные механизмы каналов, в частности потенциал-зависимого натрие-
вого канала (Hom, Vandenberg, 1984).
9.13. Кинетика мультисубъединичных белков
Мультисубъединичные белки могут характеризоваться кооперативным поведени-
ем. Характерные изменения равновесного состояния таких белков позволяет вы-
явить термодинамический анализ (см. гл. 1 и 5). Теперь рассмотрим кинетику
мультисубъединичных белков. Для случая, когда идентичные субъединицы под-
вергаются конформационным переходам независимо, простейшим примером бу-
дет двухсубъединичный белок, описываемый схемой (93)
2а а
А2 <=> АВ <=> В
Р 2Р
(93)
2
Вектор состояния для этой системы имеет вид ([А2], [АВ], [В2]). Переход каж-
дой субъединицы из конформации А в конформацию В характеризуется констан-
той скорости а; обратный переход — константой скорости р. Из состояния А2 воз-
можен переход любой субъединицы, так что константа скорости перехода белка из
состояния А2 в состояние АВ равна 2а. Скорость перехода из АВ в В2 равна а, по-
скольку при состоянии АВ только одна субъединица может подвергнуться перехо-
ду. Подобно этому константа скорости перехода из В2 в АВ равна 2р и константа
скорости перехода из АВ в А2 равна р. С использованием этих констант скоростей
для различных переходов составим следующую матрицу
9.13. Кинетика мультисубъединичных белков
273
^-2а
Q= 2а
О
р о'
-а-p 2р
а -2р,
(9.74)
Характеристическое уравнение (уравнение (9.23) в данном случае записывается
в виде
X3 -3(а + р)Х2 -2(а2+2аР+р2)Х = 0 (9.75)
Решая это уравнение путем разложения на множители, получаем следующие три
собственных значения
Х,=0 (9.76а)
Х2 = -(а + р) (9.766)
= -2(а + р) (9.76в)
Таким образом, две ненулевые константы убывания будут кратны основной кон-
станте убывания в случае перехода одной субъединицы, -(а + Р).
Для п субъединиц эта модель описывается схемой (9И)
па (п— 1)а (п— 2)а а
А^А^В Ал_2В2 <=± ...АВ.-^В, (9И)
р 2р Зр яр
Две подобных строки включает модель Моно—Уаймена—Шанже, (см. гл. 5; схема
(5Е)). Примем в качестве начального условия, что все субъединицы находятся
в конформации А, и, таким образом, А„ отражает единственную присутствующую
конформацию. Если внезапный внешний сдвиг вызовет переходы, начнется обра-
зование конформации В. Отдельные субъединицы будут релаксировать к новому
равновесному состоянию согласно уравнению (7.4)
где х — это доля, которую составляют определенные субъединицы, например
в конформации А. Отметим, что х0 = 1.
Поскольку изменения конформации субъединиц происходят независимо, ве-
роятность обнаружить отдельную комбинацию А1Вп_1 задается биномиальным рас-
пределением, содержащим х в качестве элементарной вероятности из уравнения
(9.77)
Р/(Г) = ^^х'(1-хГ1 (9.78)
В этом выражении степенями х задаются степени основной экспоненциальной
функции е-(а+₽)', т. е. е-(а+₽)', е-2(а+₽)', е-3(а+₽)' и т. д. до е’',(а+₽)'. Таким образом, не
записывая и не решая характеристическое уравнение, мы тем не менее можем оп-
ределить, что собственные значения принимают форму -/(а + р) при /, изменяю-
щемся от 0 до п (Chen, Hill, 1973).
274
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
Рис. 9.7. График уравнения (9.79) при
различных значениях п, а = 1 и р = 0.
Чтобы получить выражение для РВя, используем уравнение (9.78) при i = 0
Графики этого уравнения при различных значениях п показывают, что зависи-
мость РВя от времени имеет характерную сигмоидную форму (рис. 9.7).
Такая форма кинетической кривой была получена при изучении воротной ак-
тивности потенциал-зависимых каналов (см. гл. 16), и структурные исследования
подтвердили, что молекулы этих каналов содержат ожидаемое число независимых
или почти независимых структурных доменов.
Эта модель отличается изящной математической структурой; она включает
собственные значения в виде целых величин, кратных а + р. Однако очень простая
модификация позволяет получить модель конформационных переходов в белках
с качественно иными характеристиками (Jackson, 1993с). Если принять, что каж-
дый из переходов в схеме (9И) представляет собой изомеризацию связи внутри
белка, то можно предположить, что каждая связь стерически препятствует макро-
переходу, когда белок находится в состоянии А. Макропереход представляет собой
переход из В„ в новое состояние, В„->С, связанный с поворотом всех п связей.
Если переходы в состояние В несколько энергетически невыгодны или слиш-
ком велико число связей, поворот которых должен произойти, белок редко будет
находиться в состоянии В„. Низкая вероятность этого состояния означает, что мак-
ропереход будет происходить не часто и скорость его будет низкой по сравнению
со скоростями изомеризации отдельных связей. При значениях аир порядка
109 с-1, типичных для скоростей изомеризации связей в макромолекулах, можно
получить п собственных значений, очень близких к целым величинам, кратным
а + р = 2 Ю9 с'1. Эти собственные значения отражают кинетику изомеризации свя-
зей. Однако переход Вл -> С препятствует тому, чтобы модель имела стационарное
состояние, и нулевое собственное значение, встречающееся в схемах (93) и (9И)
(уравнение (9.76а)), исчезает. Вместо этого мы получаем собственное значение,
очень близкое к нулю. Для набора вероятных значений а, р и п наиболее «медлен-
ное» собственное значение может составлять 1 с"1. Это согласуется с обычно до-
9.14. Броуновское движение и «растянутая» кинетика
275
вольно низкими скоростями макропереходов. Кроме того, разделение на сущест-
венно различные временные шкалы означает, что в макропереходе будет домини-
ровать «медленное» собственное значение. Весь процесс, по-видимому, следует
простой одноэкспоненциальной кинетике, даже если лежащая в основе модель
включает много состояний.
9.14. Броуновское движение и «растянутая» кинетика
Кинетические модели во многих случаях включают последовательность идентич-
ных стадий (схема (9К))
а а а а
Ао < * Aj < > А2 < > ••• Ап_[ <. > Ал
₽ ₽ ₽ ₽ (9К)
Фактически это модель случайного движения, рассмотренная в гл. 6, за исключе-
нием того, что стадии в данном случае протекают непрерывно во времени, а не на-
ступают через дискретный интервал времени, т. Для модели случайного движения,
непрерывного во времени, можно получить решение, но оно весьма сложное (Van
Kampen, 1981). Здесь мы вернемся к приведенной в гл. 6 модели, в которой собы-
тия происходят через дискретные интервалы времени.
Эта модель обнаруживает интересные свойства, если принять за начальное со-
стояние Ад и задаться вопросом, как вероятность пребывания в этом состоянии
снижается во времени. Если принять а = р, тогда р = q = 1/2 и случайное движение
становится симметричным в отношении вероятнрсти скачков. Однако состояний
левее Ао не существует. В этом отношении модель асимметрична.
В соответствии с данной асимметрией первый шаг — это переход из состояния
Ао в состояние АР Можно определить вероятность пребывания в состоянии А! по-
сле N -2 шагов. Эти полупериоды вероятности дают желаемый результат, т. е. ве-
роятность пребывания в состоянии Ао после N шагов. Вероятность перехода из А|
в А| через N -2 шагов можно рассчитать методом отображаемых точек (Chandra-
sekhar, 1943). Состояние Ао является отражающим барьером, который нельзя пере-
сечь. Можно продемонстрировать, что каждый переход из А, в Ар при котором пе-
ресекается барьер, соответствует одному переходу из А, в А.,; А_, представляет со-
бой точку отображения АР Следовательно, вероятность достижения А, при
наличии барьера равна сумме вероятностей достижения А| и А_, в отсутствие барь-
ера. Сложение их позволяет получить следующее выражение
р (М п_(^-2)!(1/2)"-\ (ЛГ-2)!(1/2)"-2 _
=------------------1---1 =-------------
12 2 )
Умножая числитель и знаменатель на 7V/2, получаем уравнение
/>Л|(#-1)= 2 (9.81)
(т)!
276
Глава 9. КИНЕТИКА МНОЖЕСТВЕННЫХ СОСТОЯНИЙ
Вероятность достижения состояния Ад через шагов равна 1/2 этой величины,
т. е. в числителе показатель степени при 1/2 становится равным N. Полученное
уравнение — это уравнение (6.46) при к = 0. Теперь можно использовать в качестве
приближения гауссову функцию (уравнение (6.49))
(’ад
Поскольку шаги выбраны с одинаковыми интервалами времени, N пропор-
ционально времени. Таким образом, уравнение (9.82) предсказывает временную
зависимость убывания Ад в схеме (9К), пропорциональную /-|/2. Это специфиче-
ская форма динамического поведения, качественно отличная от экспоненциаль-
ного или мультиэкспоненциального убывания, предсказываемого для моделей
систем с небольшим числом состояний.
Данный результат иллюстрирует общую особенность динамики моделей с бро-
уновским движением. Они предсказывают вероятность выживания процесса, ко-
торая уменьшается обратно пропорционально степени времени. Поскольку при
анализе броуновского движения множитель г"|/2 возводится в степень, соответст-
вующую числу измерений (см. разд. 6.2.2), вероятность выживания обычно запи-
сывают как ocr-d/2, где d — число измерений. Отметим, что dопределяется как па-
раметр в результате подгонки к временной зависимости, и его часто называют раз-
мерностью кинетического процесса.
Интересная особенность кинетики с пропорциональностью t~d/2 состоит
в том, что в этом случае протекание процесса поддерживается в чрезвычайно ши-
роком интервале времени. Все экспоненциальные процессы убывают очень быст-
ро, когда t превышает их характеристическую постоянную времени. Данная экс-
поненциальная функция при t > Ют = 10/(а + Р) снижается до е-10 ~ 5-10-5. В то же
время в случае кинетики с пропорциональностью г"|/2 процесс будет снижаться
только в V10 =3,1 раз на каждый порядок увеличения t (рис. 9.8).
Кинетические процессы, растянутые на такой широкий промежуток времени,
встречаются не часто, но известен хорошо изученный пример — повторное связы-
вание лиганда СО с миоглобином после фотодиссоциации. Этот процесс обычно
Рис. 9.8. Графики, показы-
вающие более медленное
изменение Г1/2 относитель-
но экспонент с различными
константами убывания.
Задачи
277
моделируется не как пропорциональный r-d/2, а как exp(r-d/2), соответственно ме-
ханизму реакции. Растянутая кинетика повторного связывания скорее всего объ-
ясняется тем, что существуют близкорасположенные энергетические уровни
(Hagen, Eaton, 1996). Перескок между энергетическими уровнями — это вид слу-
чайного движения, и его характеристики аналогичны тем, которые предсказывает
схема (9К).
Задачи
1. Получите дифференциальное уравнение второго порядка относительно [С] для
модели трех состояний с помощью того метода, который был использован для вы-
ведения уравнения (9.4) относительно [А]. Затем выведите характеристическое
уравнение для нахождения собственных значений.
2. Выведите общую зависимость [С] от времени с использованием констант скоро-
стей переходов для модели трех состояний при начальных условиях, указанных
в разд. 9.2.
3. Получите решение уравнения зависимости [А] от времени для модели трех состоя-
ний при начальных условиях [В] = 1 и [А] = [С] = 0.
4. Определите, как найти а2, Х2 и [А]равн путем подгонки уравнения (9.13)
к экспериментально определенной временной зависимости. Нормируйте все кон-
центрации на Ти решите уравнение относительно а, р, у и 5 (подсказка: вычислите
Х|Х2 и Х| +Х2 и используйте эти величины).
5. Определите собственный вектор при X = 0 для модели системы с тремя состояния-
ми (схема (9А)), используя уравнения (9.36а)—(9.36в). Определите равновесные
фракции [А], [В] и [С] непосредственно и сравните два полученных результата.
6. Докажите, что в соответствии со схемой (9Б) сумма Р0| + Ро2 равна Ро в уравнении
(9.53).
7. Докажите, что в соответствии со схемой (9Б) производная Ро по времени при t = 0
равна -р. __
8. Выведите формулу распределения времени жизни открытых и закрытых состоя-
ний для следующей кинетической модели состояний канала
а у
Oj «=► С <=± 02
1 р 5 2
9. Выведите формулу распределения времени жизни открытых и закрытых состоя-
ний для следующей кинетической модели канала
а у е
О,«=±С1=*С2^О2
р 8 ф
10. С помощью уравнения (9.63) докажите, что среднее время жизни состояния г оди-
ночной молекулы может быть выражено как сумма элементов вектора Q,2A0.
11. Чему равны общее число открываний и общее число закрываний на графиках,
представленных на рис. 9.4?
Г лава IО
Ферментативный катализ
Одна из классических и наиболее сложных задач биофизики — это изучение меха-
низмов, лежащих в основе ускорения ферментами биохимических реакций. Фер-
менты с высокой специфичностью связывают молекулу субстрата, химически мо-
дифицируют ее, высвобождают продукт и затем повторяют цикл. Аналогичные хи-
мические реакции могут протекать и без участия ферментов, но скорости их при
этом несравнимо ниже. Степень ускорения реакций ферментами достигает 1О20
(Miller, Wolfenden, 2002). Наиболее типично ускорение в пределах 108—1012, но
и это можно считать необычайным эффектом. Научный интерес к механизмам
действия ферментов в первую очередь определяется тем, что от их участия полно-
стью зависит обмен веществ в живых организмах, но в то же время существует
и другой стимул для изучения ферментативной активности. Почти все ферменты
представляют собой белки (остальные относятся к рибозимам — каталитически
активным РНК), и исследование ферментативного катализа открывает возмож-
ность проникновения в механику белковых молекул, на которой основано выпол-
нение ими своих функций. Ферментативный катализ может служить ярким при-
мером того, как структура и динамика белковых молекул связаны с осуществляе-
мой ими активностью.
Химические механизмы ферментативного катализа исследованы в огромном
числе работ. С помощью рентгеноструктурного анализа раскрыто строение фер-
мент-субстратных комплексов на уровне атомов и выявлены многие важные взаи-
модействия, лежащие в основе образования этих комплексов. Так, определены
взаимодействия, специфически обусловливающие распознавание и связывание
субстратов. Для анализа этого первого этапа ферментативного катализа важное
значение имеют подходы, используемые при изучении физических основ образо-
вания молекулярных комплексов (см. гл. 4). Следующий этап катализа состоит
в осуществлении химического преобразования, и здесь приложимы методы изуче-
ния динамических процессов, описанные в гл. 7. В данной главе мы рассмотрим,
каким образом под действием фермента изменяется профиль свободной энергии
в ходе ферментативной реакции.
10.1. Основные механизмы действия ферментов
на примере сериновых протеаз
Описание механизмов ферментативного катализа удобно начать с примера, иллю-
стрирующего его основные этапы. Таким примером может служить активность
10.1. Основные механизмы действия ферментов на примере сериновых протеаз
279
ферментов, называемых сериновыми протеазами. К ним относятся, в частности,
трипсин, химотрипсин и эластаза — ферменты, расщепляющие белки на мелкие
пептиды и аминокислоты. Название сериновые протеазы эти ферменты получили
в связи с тем, что ключевую роль в их активном центре выполняет остаток серина.
Химическая реакция, катализируемая сериновыми протеазами, заключается в гид-
ролизе пептидной связи (схема (10А))
О
X—с—N—Y + Н2О—>х—с—ОН + H2N—Y
(10А)
Эта реакция в водной среде начинается спонтанно, но протекает с очень низкой
скоростью. В воде анион ОН“ атакует карбонильную группу и замещает амино-
группу, осуществляя так называемое 8Ю-смещение. Сериновые протеазы выпол-
няют то же действие посредством механизма, показанного на рис. 10.1. Вначале
Интермедиат 2
Рис. 10.1. Этапы гидролиза пептидной связи сериновой протеазой. А. Субстрат связывается
с ферментом. Б. Сериновый остаток атакует карбонильную группу в молекуле субстрата, и об-
разуется первый интермедиат, в котором связи С-атома-мишени формируют фигуру тетраэдра.
В. Продукт, представляющий собой аминоконцевой фрагмент молекулы субстрата, высвобож-
дается, оставляя комплекс ацил—фермент Г. Активированный гидроксил и протон присоединя-
ются к ацил—ферменту с образованием второго интермедиата, в котором связи С-атома-
мишени формируют фигуру тетраэдра. Д. Высвобождается продукт, содержащий на конце
карбоксильную группу Номера позиций аминокислотных остатков приведены для трипсина но
изображенный механизм действия является общим для всех сериновых протеаз.
280
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
фермент, благодаря наличию в его молекуле специального кармана, с высокой спе-
цифичностью связывает субстрат, распознавая его боковую цепь (R на рис. 10.1).
Затем гидроксильная группа каталитического серинового остатка (в молекуле хи-
мотрипсина это остаток серина в позиции 195) активируется в результате отнятия
от нее протона соседним остатком гистидина (в случае химотрипсина это остаток
гистидина в позиции 57) и превращения кислорода в реакционноспособный атом
—О". Этот атом кислорода атакует атом углерода карбонильной группы в составе
субстрата, аналогично тому как действует гидроксил-анион в воде. В результате об-
разуется интермедиат, в котором С-атом-мишень предположительно образует свя-
зи, формирующие тетраэдр. Затем происходит разрыв пептидной связи с образова-
нием вновь двойной связи С=О. Таким образом, активность атома —О" в остатке
серина приводит к удалению аминогруппы и образованию комплекса ацил—фер-
мент. .
Этим наполовину решается исходная задача: N-концевой фрагмент белка уда-
лен, но его С-концевой фрагмент остается ковалентно связанным с ферментом
через эфирную связь с атомом кислорода серинового остатка (ацилфермент на
рис. 10.1). Разрыв эфирной связи путем гидролиза осуществляется с участием того
же остатка гистидина, который активировал гидроксильную группу остатка сери-
на. В данном случае гистидиновый остаток отнимает протон от молекулы воды,
и образующийся в результате активированный гидроксил атакует карбонильную
группу, связанную с боковой цепью серинового остатка (пример общего основного
катализа; см. разд. 10.13). При этом образуется второй интермедиат, в молекуле ко-
торого связи атакуемого атома углерода формируют октаэдр. Далее интермедиат-2
распадается в результате высвобождения концевой карбоксильной группы продук-
та из связи с серином-195.
Сериновые протеазы демонстрируют ряд ключевых принципов ферментатив-
ного катализа. Прежде всего анализ их активности показывает, что фермент обла-
дает функцией распознавания субстрата, отличной от функции каталитической
активности. Сериновые протеазы весьма специфичны в отношении субстратов.
Наиболее важной для распознавания детерминантой в молекуле субстрата служит
боковая цепь аминокислотного остатка на карбокси-стороне пептидной связи,
предназначенной для расщепления. Трипсин преимущественно расщепляет пеп-
тиды, в которых указанную позицию занимает несущий положительный заряд ос-
таток аргинина или лизина, химотрипсин — пептиды с остатком ароматической
аминокислоты, эластаза — пептиды с небольшой алифатической боковой цепью
в этой позиции.
Субстратную специфичность сериновых протеаз демонстрируют данные о ско-
ростях расщепления ими различных субстратов (табл. 10.1). Скорость гидролиза
химотрипсином пептидов, содержащих остаток триптофана в участке расщепле-
ния, в 106 раз выше скорости их гидролиза под действием трипсина. Напротив,
если в этой позиции находится остаток лизина, трипсин действует в 104 раз более
эффективно. Объяснение такой специфичности следует искать в структуре фер-
ментов. Молекулы сериновых протеаз имеют полость (карман), в которую вмеща-
ется боковая цепь субстрата, как схематически показано на рис. 10.1. В случае
трипсина на дне этой полости расположен несущий отрицательный заряд остаток
аспартата, с которым взаимодействует несущий положительный заряд остаток ли-
зина или аргинина в составе субстрата. Мутации с заменой этого остатка аспартата
10.1. Основные механизмы действия ферментов на примере сериновых протеаз
281
Таблица 10.1. Скорость гидролиза (М“1 • с“1)
Субстрат с X = триптофан Субстрат с X = лизин
Химотрипсин 1,3 • 106 69
Трипсин 1,5 1,9 • 10s
Трипсин (D189S) 4,8 7,3
Субстрат: сукцинат—аланин—аланин—пролин—X—аминометилкумарин, где X — триптофан
либо лизин, как указано. Трипсин (D189S) — мутантный фермент, в котором аспартат-189 заме-
щен серином. (По Hedstrom et al., 1994.)
на остаток серина делают трипсин еще менее эффективным в расщеплении
лизин-содержащих белков, чем химотрипсин.
Это далеко не все, что известно о распознавании субстрата сериновыми про-
теазами. Внутреннюю поверхность субстратсвязывающей полости формируют не-
сколько аминокислотных остатков; соседние остатки в молекуле субстрата взаи-
модействуют с другими участками молекулы фермента (Hedstrom et al., 1994). Од-
нако те остатки в составе фермента, которые связывают субстрат, не участвуют
непосредственно в катализе. Катализ осуществляет отдельная группа аминокис-
лотных остатков, в которую входят остаток серина и остаток гистидина, показан-
ные на рис. 10.1, а также остаток аспартата (рис. 10.12). Эти остатки, обеспечиваю-
щие протекание химической реакции, представляют собой консервативные эле-
менты всех сериновых протеаз, независимо от их субстратной специфичности.
Механизм, посредством которого боковые цепи данных остатков совместно участ-
вуют в образовании и разрыве ковалентных связей, рассматривается в разд. 10.14.
Другой важный принцип ферментативного катализа, выявляемый на примере
сериновых протеаз, состоит в том, что при связывании субстрата участок его моле-
кулы, предназначенный для расщепления (атом углерода, образующий пептидную
связь), помещается рядом с атакующей каталитической группой фермента. Взаи-
морасположение этих двух реакционноспособных групп вблизи друг друга, опре-
деляемое связыванием, обеспечивает протекание реакции с гораздо большей ско-
ростью, чем в том случае, если бы эти группы приходили в контакт в результате
столкновения их как свободных в растворе. Данный эффект сближения взаимо-
действующих групп выполняет важную роль в катализе (см. разд. 10.8).
Помимо эффекта сближения групп, важную роль в катализе имеет повышение
их реакционноспособное™ благодаря специфическому окружению внутри фер-
мента (см. разд. 10.14). Гидроксильная группа боковой цепи серинового остатка
сама не является реакционноспособной, но вследствие взаимодействия с другими
группами в составе фермента превращается в высокореакционноспособный окси-
анион (—О”). В отсутствие специфического окружения, имеющегося в ферменте,
необходимы экстремальные условия, такие как высокое или низкое значение pH,
чтобы образовались химические группы сравнимой реакционноспособное™.
Описание механизма реакции, осуществляемой ферментом, еще не дает объяс-
нения того, каким образом происходит ее ускорение. Химический механизм слу-
жит лишь отправной точкой в поиске физических факторов, способных обеспе-
чить повышение скорости реакции. Чтобы определить, какие физические меха-
низмы лежат в основе столь эффективного действия ферментов, необходимо
обратиться к анализу кинетики ферментативных реакций.
282
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
10.2. Кинетика Михаэлиса—Ментен
Между ферментами имеются различия в механизмах действия, например в числе
этапов связывания субстрата, его химического превращения и высвобождения
продуктов. Однако независимо от этого общие закономерности протекания фер-
ментативных реакций на качественном уровне описывает одна и та же простая мо-
дель. Если принять, что все реакции с участием ферментов начинаются связыва-
нием субстрата, и объединить последующие этапы воедино, обозначится основной
двустадийный процесс (схема (10.Б))
E + S^ES-Ье + Р (ЮБ)
В этой упрощенной схеме связывание субстрата описывается как равновесная
реакция с константой диссоциации Ks. Превращение субстрата S в продукт Р и по-
следующий этап диссоциации фермента и продукта объединены в одну стадию
с константой скорости ккаг Первый этап (связывание) протекает предположитель-
но с большей скоростью, чем второй, и соотношение [Е], [S] и [ES] определяется
величиной Ks.
[ES] 1
[E][S] Ks
(ЮЛ)
Считая общее количество фермента постоянным, [Еоб1Ц] = [Е] + [ES], можно ис-
ключить [Е] и решить уравнение относительно [ES]
[ES] =
[Eq6uiHS]
[S]+*s
(Ю.2)
Образование продукта из комплекса фермент—субстрат представляет собой реак-
цию первого порядка, протекающую со скоростью v = ккаг [ES] (схема (ЮБ)). Заме-
на [ES] выражением (10.2) позволяет получить уравнение скорости реакции как
функции [S]
£кат[ЕобшНЗ]
[S]+*s
(10.3)
Это уравнение, называемое уравнением Михаэлиса—Ментен, показывает, что
скорость реакции с увеличением [S] вначале возрастает и затем достигает уровня
насыщения, когда значения [S] превышают значение Ks (константа Михаэлиса—
Ментен, обычно обозначаемая Км). Таким образом, при низких значениях [S] про-
цесс ферментативного катализа носит характер реакции второго порядка, проте-
кающей со скоростью, примерно равной (£кат [Eo6lu]/Xs)[S], тогда как при высоких
значениях [S] он протекает как реакция первого порядка со скоростью, примерно
равной к^ [Еобщ]. Это показывает график, соответствующий уравнению (10.3) (см.
рис. 10.2). Кинетика с насыщением характерна почти для всех ферментативных ре-
акций, и уравнение Михаэлиса—Ментен описывает зависимость скорости образо-
вания продукта от концентрации субстрата для большинства ферментов. Фермен-
тативные процессы могут быть более сложными, в частности когда используется
несколько субстратов, но насыщение реакции в них также наблюдается. В редких
10.2. Кинетика Михаэлиса—Ментен
283
Рис. 10.2. График уравнения Михаэлиса—
Ментен (уравнение (10.3)).
случаях, когда насыщение отсутствует, причиной служит, как правило, то, что
из-за недостаточной растворимости субстрата не достигаются его высокие кон-
центрации.
При анализе кинетики ферментативной реакции уравнение (10.3) обычно под-
гоняют к графику зависимости ее скорости от [S], и таким способом определяют
значения Ks и к^ Эти параметры как наиболее важные количественные характе-
ристики активности фермента служат отправной точкой для более детального изу-
чения механизма катализа.
При насыщающей концентрации субстрата фермент в свободной форме прак-
тически отсутствует, находясь на 100% в составе комплекса с субстратом. Продукт
при этом образуется со скоростью к^ [Е]. В связи с этим к^ часто называют чис-
лом оборотов фермента; эту величину можно определить через каталитическую
эффективность, т. е. как константу скорости реального катализа — превращения
связанного субстрата в продукт. Однако допущения, принятые при выведении
уравнения Михаэлиса—Ментен, могут нарушаться таким образом, что основная
форма уравнения остается без изменений, но данная интерпретация к^ становит-
ся неадекватной. Например, если этап диссоциации продукта лимитирует ско-
рость реакции, величина к^г больше относится к этому этапу, чем непосредственно
к этапу химического превращения субстрата. Этап катализа может протекать с бо-
лее высокой скоростью, но казаться более медленным в связи с тем, что необходи-
мо определенное время для диссоциации продукта. По этой причине величину к^г
рассматривают как нижнюю границу скорости превращения субстрата в составе
фермент-субстратного комплекса.
В случае, когда величина к^ близка к реальной скорости оборота фермент-
субстратного комплекса, ее можно сравнить со скоростью неферментативной ре-
акции, чтобы оценить каталитическую эффективность фермента. Скорость реак-
ции без участия фермента определяется константой скорости, kQi как £0[S]. Если
принять кКйГ за характеристику скорости реакции S -> Р внутри фермента, увеличе-
ние скорости реакции ферментом будет соответствовать отношению k^/kQ.
Отношение константы скорости реакции к константе Михаэлиса, кка1/К^ име-
ет важное значение как кажущаяся константа скорости реакции второго порядка
при низких, ненасыщающих концентрациях субстрата. Величина отношения
^кат/^s, часто называемая эффективностью катализа, варьирует для многих и разно-
284
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
образных ферментов в пределах 105—109 М • с-1 (Miller, Wolfenden, 2002). Этот диа-
пазон может показаться широким, но для его правильной интерпретации следует
учесть, что скорости некатализируемых реакций лежат в пределах 10"17—10"1 М • с-1.
Возможно, диапазон наблюдаемых значений к^/К3 показывает, что существует
физический предел эффективности ферментативного катализа.
Другое интересное обобщение предложено в отношении Ks (Fersht, 1998). Для
большинства ферментов величина Ks в 1 — 100 раз выше, чем внутриклеточные
концентрации субстратов. Это означает, что большинство ферментативных реак-
ций в клетке не достигает насыщения, поскольку нет достаточной концентрации
субстратов. В результате возможна эффективная регуляция концентрации субстра-
тов посредством ферментов: если концентрация субстрата возрастает, повышается
скорость его превращения в ферментативной реакции.
Для ферментов, по-видимому, не характерна максимальная прочность связы-
вания субстрата. Значения Ks, как правило, выше значения константы диссоциа-
ции той же молекулы из комплекса с белком, не обладающим каталитической ак-
тивностью (Fersht, 1998). Например, связывание АТР многими ферментами харак-
теризуется величинами Ks в диапазоне примерно 0,1 — 10 мМ. В то же время
константы диссоциации для связывания других белков с АТР примерно в Ю10 раз
ниже (в случае миозина Ks = 10-13 М). Это позволяет предполагать, что давление от-
бора в отношении субстратсвязывающего участка не благоприятствует максималь-
ной прочности связывания. Действительно, очень прочное связывание может про-
тиводействовать катализу вследствие либо чрезмерной стабилизации структуры
субстрата, препятствующей его превращению, либо затруднения диссоциации
продукта. Ниже можно будет видеть, что одна из причин не максимальной проч-
ности связывания субстрата состоит в использовании части потенциальной энер-
гии связывания на каталитические функции (разд. 10.6—10.10).
10.3. Аппроксимация к стационарному состоянию
Большинство ферментативных реакций подчиняется кинетическим зависимо-
стям, более сложным чем уравнение Михаэлиса—Ментен. Тем не менее сложные
зависимости можно анализировать с помощью этого уравнения на основе аппрок-
симации к стационарному состоянию, при котором концентрации интермедиатов
не изменяются во времени. Чтобы продемонстрировать такой подход на простом
примере, модифицируем схему Михаэлиса—Ментен (схема (10Б)), включив в нее
этапы связывания и диссоциации субстрата
E + S±=>E8 >Е + Р (Ц)В)
Схема (10В) названа механизмом Бриггса—Холдейна. Скорость изменения [ES]
зависит от скоростей образования комплекса, катализа и диссоциации
= ^i[E][S]-fc_l[ES]-fcKaT[ES] (10.4)
а/
Для случая, когда связывание происходит с высокой скоростью, можно предпола-
гать, что концентрация фермент-субстратного комплекса быстро достигает ста-
10.3. Аппроксимация к стационарному состоянию
285
ционарного уровня и остается постоянной на протяжении реакции. Если принять
производную за нуль, решить уравнение относительно [ES] и использовать усло-
вие [E^] = [Е] + [ES], будет получено выражение, сходное по форме с уравнени-
ем (10.3)
У _ ^кат [Ербщ] [S] (10 5)
[SJ + C^-ьЛ_1)/Л1
Отметим, что при условии к^«к_х восстанавливается уравнение (10.3) (при
Ks=k_Jk{).
В качестве более сложного примера рассмотрим механизм действия сериновой
протеазы
кг к,
Е + S ES,—> ES2 + Pj—> Е + Р2 (ЮГ)
В этом механизме ES, соответствует начальному комплексу, ES2 — комплексу
ацил—фермент (рис. 10.1). Два последовательно высвобождаемых продукта, Р|
и Р2, представляют собой N-концевой и С-концевой фрагменты молекулы исход-
ного пептида.
Кинетика образования ES, и ES2 описывается следующими уравнениями
= ^[E][S]-«, +MIES,] (10.6)
at
^^ = ^[ES,]-^[ES2] (10.7)
at
При стационарном состоянии эти производные равны нулю и соответственно
уравнения кинетики имеют следующий вид
JES.1! =—— (10.8)
[E][S1 Л.,+Л2
[ES2] _ к2
[ES,] к3
Скорость образования продуктов пропорциональна произведению к3 и ES2
V = *з[Еобш]---—----------= 7---^[Еобщ]--
o6u*J[E]+[ES1] + {ES2] ( [Е] , IES,] ! !
11ESJ [ES2]
Используя уравнения (10.8) и (10.9) и производя преобразования, получаем урав-
нение для скорости реакции как функции концентрации субстрата
у [Еобщ ] [ S] z । q 11 \
Важно подчеркнуть, что скорость здесь характеризуется той же качественной
зависимостью от [S], какую описывают уравнения Михаэлиса—Ментен и Бригг-
са-Холдейна, но значения параметров в этом новом уравнении существенно
286
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
отличаются. Это важно, поскольку концентрация субстрата, при которой скорость
реакции равна 1/2 максимальной, не равна обычной константе равновесия и мак-
симальная скорость зависит от скоростей двух этапов реакции.
Аппроксимация к стационарному состоянию позволяет получать ценные дан-
ные о кинетике ферментативных реакций (Cleland, 1970; Plowman, 1972). Даже
при большом числе интермедиатов и множественности субстратов этот метод
позволяет составить информативное выражение для скорости реакции. Кривая
концентрационной зависимости имеет, как правило, форму прямоугольной ги-
перболы (рис. 10.2), но ее параметры определяются сочетанием констант скоро-
стей. Особенно важен метод аппроксимации к стационарному состоянию для изу-
чения кинетики ферментативных реакций в связи с тем, что подход к анализу
кинетики множественных состояний (см. гл. 9) сопряжен с использованием ха-
рактеристик этапов связывания. Наличие в уравнениях скорости реакции соот-
ветствующих членов второго порядка не позволяет использовать матричные мето-
ды и намного усложняет математический анализ.
10.4. Кинетика предстационарного состояния
Важные сведения о механизмах ферментативных реакций дает также анализ про-
цесса достижения ими стационарного состояния. Составим дифференциальное
уравнение для [ES] на основе схемы (10В)
^ = ^[E][S]-(^,+^aT)[ES] (10.12)
dz
Чтобы исключить член [Е], используем выражение [Е] = [Еобш] - [ES]
^ = ^[Eo6ui][S]-(^[S] + fc_, +*KaT)[ES] (10.13)
dz
Для этого уравнения также трудно найти решение, но если пренебречь изменени-
ем [S] в процессе достижения стационарного состояния, решение получить легко.
Такое допущение можно считать обоснованным, поскольку субстрат присутствует
в гораздо большем количестве по сравнению с ферментом (кроме всего прочего,
фермент является катализатором). Таким образом, небольшое количество субстра-
та способно полностью загрузить все количество фермента. При условии постоян-
ства [S] уравнение (10.13) становится просто дифференциальным уравнением пер-
вого порядка, решением которого является экспоненциальная функция с констан-
той убывания, равной [S] + к_х + ккат. Конкретное решение зависит от начальных
условий. При Z = 0 величина [ES] также равна нулю; при высоких значениях Z дос-
тигается стационарное состояние, когда значение [ES] постоянно. Таким образом,
параметр [ES] имеет следующую временную зависимость
[ES] =---РобшР]----(10.14)
[S] + (^кат + &_| )/&|
Начальную точку в этом процессе определяет значение [ES] = 0; при возрастании
значений данного параметра достигается стационарное состояние, при котором
10.5. Аллостерические ферменты
287
[ES] = [Eo6llI]([S]/([S] + (/:KaT +к_])/к])). Скорость образования продукта равна к^т [ES]
и поэтому нарастает с задержкой. Эта задержка характеризуется той же константой
убывания, что и [ES] при достижении стационарного состояния.
Обратите внимание, что когда значения [S] превышают (&кат +к_{ )/к}, стацио-
нарный уровень [ES] эквивалентен общей концентрации фермента. Этим отража-
ется закон действующих масс, согласно которому при высоких концентрациях
субстрата равновесие реакции сдвигается в направлении образования продукта,
так что почти весь фермент находится в составе комплекса с субстратом. Данное
соображение весьма полезно иметь в виду в тех случаях, когда концентрация фер-
мента неизвестна из-за трудности учета фракции денатурированного белка и из-
менения фракции активного фермента в разных опытах. Эти факторы создают
некоторую неопределенность относительно точной концентрации активного фер-
мента, но если точно измерить [ES] в предстационарном состоянии, можно опре-
делить [Ео6ш].
Кинетика предстационарного состояния подробно изучена на примере гидро-
лиза эфиров «-нитрофенола под действием химотрипсина. Продуктом первого
этапа превращения является «-нитрофенол, высвобождаемый при ацилировании
фермента. Кинетику этого этапа особенно легко исследовать, поскольку «-нитро-
фенол, в отличие от его эфира, обладает сильным поглощением света в видимой
области спектра. Анализ, позволивший получить уравнение (10.14), можно приме-
нить к данному особому случаю для определения динамики образования комплек-
са ацил—фермент (задача 3). В этой реакции вначале наблюдается всплеск образо-
вания «-нитрофенола как продукта ее первого этапа, однако по мере образования
ацилфермента в качестве интермедиата скорость выделения первого продукта сни-
жается, достигая стационарного уровня. Временная константа достижения этого
стационарного состояния та же, что в уравнении (10.14). Таким образом, макси-
мальный уровень образования «-нитрофенола в начальный период измерения эк-
вивалентен количеству ацилированного фермента, и это позволяет определить
концентрацию активного фермента (Fersht, 1998).
Анализ кинетики предстационарного состояния часто дает возможность полу-
чить ключевые данные, позволяющие определить все константы скоростей. С по-
мощью анализа скорости реакции при стационарном состоянии можно получить
значения соотношения (£кат +к_})/к} и величины [£общ]А:кат. Определив [£общ] по
уровню всплеска образования «-нитрофенола в предстационарный период реак-
ции, далее легко найти значение к^г Чтобы вычислить значения двух остальных
констант, к{ и к_}, можно использовать постоянную времени для достижения пред-
стационарного состояния из уравнения (10.14) и концентрацию субстрата, обеспе-
чивающую скорость реакции, равную 1/2 максимальной.
10.5. Аллостерические ферменты
Как показывает аппроксимация к стационарному состоянию (разд. 10.3), в случае
сложных кинетических механизмов реакций качественная зависимость их скорости
от концентрации субстрата тем не менее описывается уравнением Михаэлиса—
Ментен. Это связано с тем, что многие ферменты содержат один субстратсвязы-
вающий участок. Ферменты с множественными субстратсвязывающими участка-
288
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
ми могут характеризоваться кооперативным поведением, и зависимость скорости
катализируемой ими реакции от [S] графически отражается тогда сигмоидной кри-
вой. В соответствии с гипотезой согласованного связывания (см. разд. 4.2.1), мож-
но составить уравнение для скорости ферментативной реакции, подобное уравне-
нию (4.7)
v = ^T[Eo6m] [я5]Л (10.15)
+AS
Примером фермента, активность которого связана с эффектом кооперативно-
сти, а также с регуляцией под действием различных эффекторов, может служить
фосфофруктокиназа (см. разд. 5.11). Такую активность хорошо описывает модель
Моно—Уаймена—Шанже, в которой активность белка выражается как функция
концентрации субстрата с учетом фракции занятых связывающих участков (урав-
нение (5.22)).
Для описания механизмов ферментативного катализа Моно с соавт. выделили
два класса аллостерических ферментов, названных ими К-системами и V-система-
ми. Для К-систем характерно то, что аффинность к субстратам и аллостерическим
эффекторам варьирует в зависимости от конформации фермента, Т или R. Эффек-
тивность катализа у этих ферментов в Т- и R-состояниях одинакова. Функция бел-
ка зависит только от эффективности связывания, и сигмоидная кривая зависимо-
сти скорости реакции от концентрации субстрата полностью соответствует сигмо-
идной кривой его связывания. В отличие от этого у ферментов, относящихся
к V-системам, от конформации фермента зависит непосредственно скорость реак-
ции. Аффинность связывания субстрата в этом случае одна и та же в Т- и R-koh-
формациях, и кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата
в этом случае не имеет сигмоидной формы, описываемой уравнением (10.15). В то
же время при R-состоянии выше значение А:кат по сравнению с Т-состоянием, и с
белком в R-конформации предпочтительнее связывается аллостерический актива-
тор. В результате этого связывания, сдвигающего конформационное равновесие
в сторону образования каталитически активного (R-) состояния, скорость реакции
возрастает, но величина Ks не изменяется. Аллостерические ингибиторы связыва-
ются преимущественно с белком в каталитически неактивном (Т-) состоянии
и сдвигают конформационное равновесие другим образом.
Моно с соавт. выявили ряд примеров К-систем и V-систем, и эта классифика-
ция весьма полезна. Однако не вполне ясно, почему нет смешанных К- и V-систем
с аллостерическими состояниями, различающимися и по аффинности, и по ката-
литической эффективности. Тем не менее данная классификация представляет
ценность хотя бы в том отношении, что определяемые с ее помощью различия
ферментов подтверждают важность разделения функций связывания и каталити-
ческой активности.
10.6. Использование энергии связывания
Сведения, представленные в предыдущих разделах, отражают описательный уро-
вень изучения ферментов. На этом уровне установлено, что ферменты ускоряют
биохимические реакции, и определены функции ферментов. Однако основной
10.6. Использование энергии связывания
289
вопрос, связанный с ферментами, состоит в том, каким именно образом они по-
вышают скорость реакции. К этому вопросу мы теперь и обратимся, перейдя на
уровень рассмотрения физической основы ферментативного катализа.
Большинство гипотез относительно ферментативного катализа содержит идею
о неком способе использования в нем энергии связывания; например, предполага-
ется повышение прочйости связывания субстрата в переходном состоянии. Под
энергией связывания понимают величину снижения статистического веса энерге-
тического барьера Е*. Однако из дальнейшего изложения станет ясно, что эту
энергию определяют также и эффекты энтропии.
Когда речь идет об использовании энергии связывания, процесс образования
фермент-субстратного комплекса нельзя рассматривать как полностью отделен-
ный от катализируемой реакции. Прочные связи между субстратом и ферментом
могут использоваться для катализа, однако существует и возможность того, что
они препятствуют движению системы вдоль координаты реакции к вершине
энергетического барьера. В этом случае прочное связывание будет замедлять ре-
акцию.
Результаты измерений, проведенных на ряде субстратов, свидетельствуют
в пользу идеи о связи между энергией связывания и эффективностью катализа,
указывая на общую тенденцию, которая состоит в том, что величины Ks и ккаг об-
ратно пропорциональны (Fersht, 1998; Hedstrom et al., 1994). Таким образом, более
прочное связывание понижает Ks и повышает ккаг Это не жесткое правило, по-
скольку существует множество путей влияния структурных изменений на связыва-
ние и катализ, и тем не менее установленная тенденция указывает на утилизацию
энергии связывания.
В качестве примера рассмотрим вновь реакцию, катализируемую химотрипси-
ном. На рис. 10.3 приведен график зависимости к2, скорости ее первого этапа, при-
водящего к образованию комплекса ацил—фермент, от энергии связывания суб-
страта (-ETlnEs). На графике виден широкий разброс точек, обусловленный
структурными различиями субстратов. Влияние структуры субстрата на прочность
связывания в сторону ее повышения сопряжено или не сопряжено с увеличением
^каг Однако слева разброс приблизительно ограничен экспоненциальной кривой
1000 .
100,
10-
1.
Рис. 10.3. График зависимости к2 от
-F?Tln/(s для реакций гидролиза химо-
трипсином разнообразных субстратов.
Пунктирная кривая соответствует урав-
нению (10.16) при \|/ = 1. (Данные из ра-
боты Berezin et al., 1971.)
0,1.
2 3 4 5 6
-firings)
о
290
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
возрастания скорости реакции с увеличением энергии связывания (пунктирная
линия). Эта огибающая линия соответствует структурным вариантам, в случае ко-
торых энергия связывания используется с наибольшей эффективностью для уско-
рения реакции.
Формула, отражающая идею об использовании энергии связывания в катали-
зе, описывает экспоненциальное возрастание скорости реакции в результате при-
ращения энергии связывания
kiaTxe^RT"'-Ks, (10.16)
где \|/ — это параметр, введенный для обозначения той части энергии связывания,
которая утилизируется в реакции. Пунктирная линия на рис. 10.3 иллюстрирует
случай, когда у ~ 1, т. е. энергия связывания используется в катализе с максималь-
ной эффективностью. Это может означать, что некоторые связи, участвующие
в связывании субстрата, очень тесно сопряжены с реакцией. Использование энер-
гии связывания частично устраняет разделение между двумя основными функция-
ми фермента, связыванием и катализом. Установив, таким образом, что энергия
связывания способствует катализу, рассмотрим теперь возможные пути ее утилиза-
ции.
10.7. Теория Крамерса для скорости реакции
и катализ
При выяснении механизмов использования энергии связывания важно принять за
основу определенную теорию, и здесь в качестве такой основы мы используем тео-
рию Крамерса, описывающую динамику перехода системы через энергетический
барьер (см. разд. 7.8). Эта теория служит идеальной отправной точкой для провер-
ки большинства ключевых гипотез ферментативного катализа.
Вначале рассмотрим уравнение (7.31)
j= DP(a') еЕ*,кТ (10.17)
jnkTfo*
Это выражение получено путем решения уравнения диффузии вдоль координаты
реакции для стационарного состояния. Координата реакции обозначена как D —
коэффициент диффузии, характеризующий движение вдоль координаты реакции.
Потенциальная энергия как функция £, имеет барьер со статистическим весом £*
и шириной l/ср*. Поток через этот барьер обозначен как J; величина потока, делен-
ная на количество молей или молекул, составляет константу скорости.
Уравнение (10.17) будет далее использовано для анализа каждого из ключевых
факторов, влияющих на скорость реакции. Безусловно, основной из них — это
энергетический барьер, £*. Следует определить также распределение молекул
в области основания барьера, поскольку некоторые из наиболее важных механиз-
мов ускорения реакции ферментами можно выявить по изменениям этого распре-
деления, как будет ясно из материала двух следующих разделов. Кроме того, необ-
10.8. Эффект сближения и энтропия поступательного движения
291
ходимо рассмотреть коэффициент диффузии D и попытаться выяснить, каким об-
разом фермент облегчает движение системы вдоль координаты реакции.
10.8. Эффект сближения
и энтропия поступательного движения
В результате связывания подвижность молекулы субстрата ограничивается. Тот его
участок, который подлежит воздействию, удерживается вблизи боковых цепей
фермента, участвующих в катализе. Каталитическая группа, например атом кисло-
рода серинового остатка в сериновой протеазе, могла бы реагировать с субстратом,
если бы эти реагенты в свободной форме находились в растворе, но такая реакция
зависит от вероятности столкновения двух молекул. Фермент способствует этому
взаимодействию, осуществляя сближение каталитической группы и субстрата. Это
фактически превращает реакцию второго порядка, зависящую от концентрации
субстрата и катализатора, в реакцию первого порядка, зависящую от концентра-
ции фермент-субстратного комплекса.
Данный эффект отражает позиция у подножия энергетического барьера на ко-
ординате реакции. Реакционный путь для внутримолекулярного процесса и про-
цесса взаимодействия молекул показан на рис. 10.4. В случае внутримолекулярно-
го процесса величина £, соответствует узкому минимуму потенциальной энергии на
стороне реагента. В случае межмолекулярного взаимодействия отрезок профиля
потенциальной энергии до подножия барьера на стороне реагентов представляет
собой протяженную горизонтальную линию; двигаясь по этой линии, система дос-
тигает подножия барьера и пересекает его.
Форма кривой реакционного пути у подножия барьера определяет значение
величины Р(а) в уравнении (10.17). Это уравнение представляло предпоследний
этап выведения уравнения Крамерса для константы скорости реакции в гл. 7. По-
следний этап включал оценку Р(а) для равновесного распределения на координате
реакции в параболическом минимуме потенциальной энергии на левой стороне
энергетического барьера. В случае, когда реагенты образуют комплекс, процесс
характеризуется как внутримолекулярный. Величина энергии в окрестности ми-
нимума при ^ = а составляет U(JQ = фа(^-л)2, и вероятность данного значения £
определяется распределением Больцмана как Р(^) = е~и^)кТ. Вычисляя интеграл
Больцмана для функции этой потенциальной энергии, получаем выражение
Рис. 10.4. Профили потенциальной энергии вдоль координаты реакции для внутримолекуляр-
ной и межмолекулярной реакций.
Межмолекулярная
реакция
292
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
Р(а) = д/фа/л^Г. Подставляя это выражение в уравнение (10.17), мы повторно вы-
водим уравнение (7.32)
*вНУгр = Данутр2^~ е~£"'1утр/*г, (10.18)
nkl
где коэффициент D снабжен индексом внугр, чтобы учесть зависимость коэффици-
ента диффузии от среды. Это рассматривается далее в разд. 10.11.
В случае межмолекулярного взаимодействия Р(а) равна просто общей концен-
трации, С, которая слева от точки = а нижней кривой на рис. 10.4 должна быть
постоянной. Тогда из уравнения (10.17) можно получить выражение для константы
скорости реакции межмолекулярного взаимодействия
к — D / р-^межмолАГ /in 1 Q\
''-межмол — межмол Л , —У
V пкТ
Чтобы сравнить скорости внутри- и межмолекулярных реакций, следует умно-
жить ^Межмол на концентрацию, С (которая здесь одномерна), и затем взять отноше-
ние уравнений (10.18) и (10.19)
I Фа межмол _^внутр)/Г
пкТ
(10.20)
внутр _ внутр
~ СП
межмол межмол
Ширина барьера 1/ф* предполагается одинаковой для обоих случаев, и поэтому
данный член можно исключить (если есть основание считать, что фермент изме-
няет этот параметр, он должен быть оставлен в уравнении (10.20)). Полученное
уравнение можно использовать для сравнения скоростей ферментативной и не-
ферментативной реакций. Мы будем использовать его не только для анализа
фактора сближения реагирующих групп, но и для оценки влияния других фак-
торов.
Чтобы рассмотреть влияние сближения реагирующих участков молекул субст-
рата и фермента, примем Лвнутр = £>меЖмол и Е*нутр = £*ежмол. Тогда отношение в урав-
нении (10.20) упрощается до формулы (1 /С)^((ра/лкТГ). Эта ключевая формула
отражает увеличение скорости реакции, достигаемое благодаря приведению в тес-
ный контакт субстрата и участвующей в катализе боковой цепи молекулы фер-
мента. Фактически это отношение двух обратных величин длины. Переменная С
равна числу молекул на единицу пути слева от барьера, и фа — это силовая постоян-
ная, выраженная в единицах энергии на квадрат расстояния. Таким образом,
в результате деления на кТ (величину, выражаемую в единицах энергии) и вычис-
ления квадратного корня остается величина, обратная длине пути. Отношение
^внугр /(С^межмол) представляет собой фактически соотношение расстояния, на кото-
рое может перемещаться молекула в свободном состоянии в растворе, и того рас-
стояния, на которое она может переместиться в связанном состоянии.
Определим теперь эти два отрезка. Величину концентрации примем рав-
ной 1 М. Объем, приходящийся на одну молекулу при одномолярной концент-
рации вещества, равен 0,166 • 10"23 л. Поскольку в данном случае концентрация
одномерная, мы используем для вычислений длину стороны куба этого объему,
1,18 • IO’7 см.
10.8. Эффект сближения и энтропия поступательного движения
293
Рассмотрим теперь <ра, силовую постоянную удерживания реагента на уровне
его потенциальной энергии вблизи £ = а (см. разд. 2.12). Силовая постоянная рас-
тяжения С—С-связи равна 660 ккал • А”2 • моль-1, растяжения типичной водород-
ной связи — 30 ккал • А-2 • моль-1. Маловероятно, что фермент связывает субстрат
с такой же прочностью, какой характеризуется С—С-связь, и силовую постоян-
ную этой последней связи можно использовать для вычисления верхнего предела
возможного смещения молекулы. В этом случае величина ^(^а/пкТ) равна 19 А"1.
Соответствующий отрезок, возможный для £ в энергетической яме, составляет
5,3 • 1О-10 см. Отношение этого отрезка и отрезка 1,18 • 10-7 при условии одномо-
лярной концентрации в случае межмолекулярного взаимодействия показывает
коэффициент увеличения скорости реакции, равный 223. Использование для та-
кого расчета силовой постоянной водородной связи дает более правдоподоб-
ную оценку возможного расстояния перемещения молекулы, поскольку такая
связь типична для нековалентных взаимодействий, стабилизирующих комплекс
белок—лиганд. В этом случае коэффициент увеличения скорости реакции состав-
ляет 47,5.
Данные коэффициенты увеличения скорости процесса относятся к одномер-
ной координате реакции, показанной на рис. 10.4. Чтобы перейти к трехмерному
случаю, следует рассмотреть трехмерную поверхность потенциальной энергии,
центрированную в точке а, и межмолекулярную реакцию в трехмерном простран-
стве с угловой точкой а. Для этого просто возведем в куб одномерный коэффици-
ент, что даст коэффициенты ускорения реакции, равные 1,1 • 107 для силовой по-
стоянной С—С-связи и 105 для силовой постоянной водородной связи.
Эти коэффициенты увеличения скорости реакции полезно рассмотреть с уче-
том эффективных концентраций. Данная скорость межмолекулярной реакции со-
ответствует концентрации субстрата 1 М, и внутримолекулярную реакцию можно
считать протекающей как межмолекулярная, но при концентрации реагента, соот-
ветствующей скорости внутримолекулярной реакции. Таким образом, коэффици-
ент возрастания скорости внутримолекулярной реакции (относительно межмоле-
кулярной), равный 105, означает, что один из реагентов присутствует в концентра-
ции 105 М. Как считается, концентрация воды находится на уровне физического
предела, к которому она может приближаться при высокой эффективной концен-
трации. Соответственно максимальный коэффициент увеличения скорости реак-
ции равен 55, но эта величина существенно ниже оценки ускоряющего влияния
сближения взаимодействующих групп. Причина данного несоответствия состоит
в том, что координата реакции может быть ограничена намного меньшим объе-
мом, чем средний объем, приходящийся на молекулу воды.
Аналогичная идея была высказана выше при расчете изменения энтропии
поступательного движения в реакциях образования молекулярных комплексов
(разд. 4.6). Действительно, вычисление Р(а) в уравнении Крамерса для скорости
реакции (приводящее к уравнению (10.18)) включает тот же расчет, что в случае из-
менения энтропии поступательного движения связанной молекулы. Чтобы вычис-
лить Р(а) для функции потенциальной энергии, мы рассчитывали конфигураци-
онный интеграл (уравнение (1.4)), по существу представляющий собой функцию
распределения. Это указывает на формальную связь между эффектом сближения
при катализе и снижением энтропии при образовании активированного комплек-
са. Такой комплекс обладает меньшей энтропией, чем две отдельные молекулы.
294
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
Внутримолекулярная
реакция
Межмолекулярная
реакция
Рис. 10.5. Внутримолекулярный и межмолекулярный механизмы образования ангидрида.
Помещение субстрата в позицию, обеспечивающую катализ, обеспечивает преодо-
ление данного энергетического препятствия в форме энтропии и ускорение реак-
ции ферментом.
Экспериментальный подход к определению эффекта сближения состоит в том,
чтобы сравнить внутримолекулярную химическую реакцию с эквивалентной реак-
цией, происходящей с участием двух молекул. Известный пример использования
такого подхода — это анализ внутримолекулярной реакции в результате нуклеофиль-
ной атаки эфирной связи атомом кислорода карбоксильной группы (рис. 10.5)
(Bruice, 1970). В молекуле эфира янтарной кислоты свободная карбоксильная
группа атакует этерифицированную карбоксильную группу, и в этом заключает-
ся внутримолекулярная реакция. Сходная межмолекулярная реакция между уксус-
ной кислотой и эфиром уксусной кислоты при концентрации каждого реагента
1 М протекает в 105 раз медленнее.
В случае внутримолекулярной реакции группа-мишень легкодоступна для кар-
боксильной группы. В аналогичной межмолекулярной реакции карбокси-группа
уксусной кислоты должна приблизиться к эфирной группе в результате диффузии,
и поэтому реакция протекает медленнее. Наблюдаемая скорость данной внутри-
молекулярной реакции указывает, что эффективная концентрация карбокси-
группы составляет 105 М. Известно также много других примеров сравнения
внутри- и межмолекулярных реакций, и в большинстве случаев увеличение скоро-
сти реакции достигает, но не превышает уровень 105—106 (Bruice, 1970). Однако
увеличение скорости может быть и более значительным, если ограничено враще-
ние вокруг связей, и это также следует принимать во внимание.
10.9. Энтропия вращательного движения
Образование фермент-субстратного комплекса приводит к ограничению не только
поступательного движения, но и внутреннего вращения молекулы субстрата (вра-
щения фрагментов молекулы). Для того чтобы могла произойти реакция, реагенты
10.10. Снижение Е*
295
должны быть, как правило, ориентированы определенным образом. В случае фер-
ментативных реакций реагирующие группы приобретают необходимую ориента-
цию и положение благодаря образованию фермент-субстратного комплекса. Огра-
ничение внутреннего вращения можно рассматривать как эффект сближения в ко-
ординатах вращения. Коэффициент ускорения реакции за счет ограничения
вращения нельзя вычислить здесь таким же прямым путем, каким был вычислен
коэффициент ускорения за счет сближения реагирующих групп в предыдущем
разделе. В данном случае следует взять за основу параллель между энтропией внут-
реннего вращения и энтропией поступательного движения. Чтобы определить,
в какой степени ограничение вращения способствует ферментативному катализу,
используем расчет, применяемый для определения вклада энтропии вращательно-
го движения в энергию связывания (см. разд. 4.7).
Обратимся к анализу факторов, влияющих на свободную энергию связывания
(см. гл. 4). Образование комплекса сопровождается потерей трех степеней свободы
поступательного движения и трех степеней свободы вращательного движения
с приобретением шести степеней свободы колебательного движения. В то время
как энтропия поступательного и вращательного движения при связывании моле-
кул снижается (уравнения (4.25) и (4.30)), энтропия колебательного движения воз-
растает (уравнение (4.33)). В этом балансе можно учитывать коэффициент ускоре-
ния реакции за счет ограничения поступательного движения, рассмотренный
в предыдущем разделе. Внутреннее вращение вносит в энтропию связывания сход-
ный вклад (уравнение (4.30), и таким образом поступательное движение и враща-
тельное движение оказывают сходное влияние на ферментативный катализ. Сле-
довательно, ограничение вращения должно примерно в той же степени способст-
вовать увеличению скорости реакции, что и сближение взаимодействующих
групп, т. е. в 105—107 раз.
Совместно эффекты сближения и ограничения вращения обеспечивают увели-
чение скорости реакции в IO10—1014 раз и имеют, таким образом, огромное значе-
ние в ускорении реакций ферментами. Данные энтропийные эффекты обычно от-
носят к наиболее важным факторам этого ускорения (Jencks, 1975).
10.10. Снижение Е*: комплементарность переходного
состояния субстрата активному центру фермента
Несмотря на важное значение энтропии, продемонстрированное выше, вполне
обоснованно также рассматривать в связи с катализом и снижение энергии пере-
ходного состояния. Эта идея, предложенная еще в 1946 г. Лайнусом Полингом
(Pauling), послужила стимулом для большого числа экспериментальных и теорети-
ческих исследований. Как правило, скорость ферментативных реакций характери-
зуется значениями 01О = 1,5—2; значения 0ios для соответствующих нефермента-
тивных реакций обычно немного выше (Miller, Wolfenden, 2002). Это свидетельст-
вует о том, что ферменты снижают величину энергетического барьера, £*.
Для проверки такого предположения были использованы результаты рентгено-
структурного анализа фермент-субстратных комплексов и комплексов фермент-
ингибитор. Изучение лизоцима, первого фермента, для которого была определена
296
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
структура молекулы, позволило обнаружить остаток аспартата в такой позиции,
где при условии ионизации он может стабилизировать положительно заряженный
интермедиат оксикарбениум (С—О+=С), образующийся при расщеплении поли-
сахаридного субстрата. Углы, образуемые связями в молекуле сахара (в цикличе-
ской форме), должны также изменяться при образовании данного интермедиата,
и возможно, что фермент вызывает растяжение молекулы субстрата, при котором
происходит изгибание этих связей.
На основе данных рентгеноструктурного анализа подтвердить идею стабилиза-
ции переходного состояния весьма трудно. Если поставить себе целью рассчитать
снижение энергии переходного состояния в результате связывания фермента,
нельзя использовать понятие силовых полей, рассмотренное в разд. 2.14. Оно не
включает фактор изменения ковалентных связей. Для анализа этого важного энер-
гетического фактора необходимо применять методы квантовой механики, которые
настолько зависят от мощности компьютера, что с их помощью можно проанали-
зировать лишь небольшую часть фермент-субстратного комплекса. В связи с этим
введено понятие гибридных силовых полей, позволяющее проводить количествен-
ный анализ небольшой части системы. Результаты первого исследования с помо-
щью такого подхода убедительно свидетельствовали в пользу того, что в снижении
£*, осуществляемом лизоцимом, существенная роль принадлежит электростати-
ческим взаимодействиям, тогда как роль растяжения связей в этом незначительна
(Warshel, Levitt, 1976). Дальнейшие исследования с помощью модели гибридных
силовых полей, возможно, позволят разделить вклады различных фермент-
субстратных взаимодействий в снижение £* (Wang et al., 2001).
Большое число экспериментальных данных указывает на большую прочность
связи фермента с субстратом в переходном состоянии. Использование соедине-
ний, представляющих собой синтетические аналоги переходного состояния суб-
стратов, показало, что они связываются с ферментом более прочно, чем субстрат.
Например, это установлено при изучении связывания подобного аналога с раце-
мазой пролина, обращающей симметрию а-атома углерода пролина с переносом
атома Н приа-атоме С и образованием плоской молекулы интермедиата (рис. 10.6).
Аналог переходного состояния субстрата
Рис. 10.6. При ферментативной рацемизации пролина образуется интермедиат плоской формы.
Аналог этого переходного состояния субстрата связывается ферментом пролинрацемазой более
прочно, чем субстрат.
10.10. Снижение
297
Аналог этого интермедиата, показанный в верхней части рисунка, имеет ту же пло-
скую форму, что пролин в переходном состоянии. Данный аналог служит силь-
ным ингибитором фермента, поскольку связывается с ферментом в 160 раз
более прочно, чем пролин (Cardinal, Abeles, 1968). Заманчиво предположить, что
это объясняется снижением ферментом величины £* в соответствующей степени
(RT\n 160 = 3 ккал • моль-1), но необходимо учитывать, что двойная связь в мо-
лекуле-аналоге обусловливает иную электронную структуру и тем самым изменя-
ет по сравнению с субстратом взаимодействие со связывающим участком. Пока
неясно, каким образом можно отделить влияние геометрии молекулы от влия-
ния электронной структуры, но тем не менее очевидно, что фермент предпоч-
тительно связывается со структурой, имитирующей переходное состояние суб-
страта.
Аналоги переходного состояния субстратов относятся к наиболее сильным ин-
гибиторам ферментов. Рентгеноструктурный анализ комплексов ферментов с этими
аналогами субстратов подтверждает комплементарность активных центров струк-
туре субстрата в переходном состоянии. Как правило, подобные аналоги связыва-
ются с ферментом в 102—104 раз более прочно, чем субстрат (Fersht, 1998). Не зная,
насколько это обусловлено различиями в электронной структуре и насколько разли-
чиями в геометрии молекул, можно предполагать, что благодаря комплементарно-
сти фермента субстрату величина £* снижается примерно на 2,8—5,6 ккал • моль-1.
Это следует считать нижней границей снижения энергетического барьера, по-
скольку аналоги лишь приближенно воспроизводят переходное состояние суб-
страта. При повышении прочности связывания молекулы субстрата происходит,
возможно, большее снижение £*.
Другой подход к экспериментальному исследованию фермент-субстратных
комплексов состоит в том, чтобы путем изменения структуры фермента с помо-
щью методов генетической инженерии определить ее ключевые для катализа уча-
стки. В этом направлении интенсивно работают Фершт (Fersht) с соавт., исследуя
фермент тирозил-тРНК-синтазу, катализирующий образование эфира с участием
карбоксильной группы аминокислоты и гидроксильной группы концевого остатка
рибозы в составе тРНК. Благодаря их работам в первичной структуре данного бел-
ка выявлены две позиции, мутации по которым снижают /скат, не влияя существен-
но на связывание субстратов — тирозина и ATP (Wells, Fersht, 1986). Таким обра-
зом установлено, что занимающие эти позиции аминокислотные остатки — трео-
нин-40 и гистидин-45 — играют роль в более прочном связывании субстрата в
переходном состоянии. Модель, построенная по данным рентгеноструктурного
анализа, показывает, что расположение данных остатков позволяет им образовы-
вать водородные связи с фосфатной у-группой АТР, благодаря чему в фосфатной
a-группе изменяются углы, образуемые связями атомов О, и атом Р приобретает
способность образовывать координационную связь с пятым атомом О. По-види-
мому, это происходит при нуклеофильной атаке атома кислорода карбоксильной
группы (рис. 10.7). Исходя из величины коэффициента ускорения реакции, можно
рассчитать, что вклад каждой водородной связи между белком и фосфатной
у-группой в стабилизацию переходного состояния составляет 3—5 ккал • моль-1,
и эта величина соответствует энергии типичной водородной связи (см. разд. 2.10).
Наиболее ярко продемонстрировать комплементарность активного центра
фермента переходному состоянию субстрата позволяет использование антител
298
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
О
II
Т ^С—О'
Тир—
?
Аденозин
Рис. 10.7. Тирозил-тРНК-синтаза катализирует нуклеофильную атаку карбоксильной группы ти-
розина в отношении фосфатной а-группы АТР. Остатки треонина и гистидина в составе фер-
мента образуют Н-связи с фосфатной у-группой АТР, и в результате изменяются углы связей
фосфатной а-группы, что способствует формированию пяти связей у атома фосфора в пере-
ходном состоянии (показано штриховой линией)
к его аналогу (Schultz, Lerner, 1995). Такие антитела, получаемые путем иммуни-
зации животных синтетическими аналогами субстратов, действуют подобно фер-
ментам. Например, антитела к эфиру фосфонату — аналогу интермедиата с тет-
раэдрическим расположением связей, образующегося в реакции гидролиза эфи-
ра (рис. 10.8), — осуществляют гидролиз эфиров. Как правило, такие катали-
заторы ускоряют реакции не слишком значительно, примерно в 102—104 раз. Это
ускорение трудно объяснить на количественной основе, исходя из механизма
реакции, но можно предполагать, что его наиболее важным фактором служит
снижение Е*. Каталитическая активность антител к аналогам интермедиатов рас-
сматривается в качестве независимой линии доказательств того, что комплемен-
тарность переходного состояния субстрата ферменту имеет важное значение для
катализа.
Наконец, необходимо указать еще один путь снижения Е*. Помимо повыше-
ния прочности связывания субстрата в переходном состоянии, снижению Е* мо-
жет способствовать такое взаимодействие фермента с субстратом в исходном со-
стоянии, которое приводит к возрастанию энергии субстрата и стиранию тем са-
мым энергетического различия между его исходным и переходным состояниями.
Это предположение было сделано на основе результатов структурного и теоретиче-
ского анализа фермента оротидин-5-фосфат-декарбоксилазы (ОДКазы) (Wu et al.,
R1
он
Рис. 10.8. Эфир фосфонат (А) сходен с переходным состоянием карбоксилатного эфира при
гидролизе (Б). Антитела к фосфонату гидролизуют карбоксилатный эфир стабилизируя пере-
ходное состояние.
10.11. Трение фермент-субстратного комплекса
299
2000). ОД Каза отщепляет отрицательно заряженную карбоксильную группу от
нуклеотида оротидинмонофосфата, в результате чего образуется уридинмонофос-
фат. При связывании субстрата ферментом отрицательно заряженный остаток ас-
партата в активном центре сближается с этой карбоксильной группой, что приво-
дит к ее электростатическому отталкиванию и отщеплению. Безусловно, сильное
электростатическое отталкивание существенно противодействует связыванию, но
это противодействие преодолевается за счет большого числа взаимодействий меж-
ду ферментом и другими участками молекулы субстрата. Подобное неблагоприят-
ное для связывания взаимодействие в исходном фермент-субстратном комплексе
называют электростатическим стрессом (Fersht, 1998), и данная гипотеза исполь-
зуется во многих работах по изучению ферментативного катализа.
10.1 I. Трение фермент-субстратного комплекса
Согласно теории Крамерса, скорость реакции должна изменяться, если под дейст-
вием факторов среды изменяется коэффициент диффузии вдоль координаты реак-
ции. Быстрые случайные движения вызывают трение (см. разд. 6.7), и соответст-
венно такие движения в молекуле белка вызывают трение на реакционном пути.
Определенный вклад в это трение вносит также раствор, поскольку в нем происхо-
дит случайное движение молекул растворителя и растворенного вещества. Рас-
смотрим трение, возникающее в результате случайного движения молекулы белка
и молекул в растворе, чтобы определить, каким образом различие между этими
движениями в отношении трения влияет на соотношение Днутр и Диежмол (см. урав-
нения (10.18)—(10.20)).
На теоретическом уровне внутреннее движение в белках изучают методом мо-
лекулярной динамики. В качестве примера получаемых таким способом данных
рассмотрим результаты анализа торсионных движений боковых цепей остатков
тирозина в низкомолекулярном белке — ингибиторе трипсина (McCammon et al.,
1979). Плоское ароматическое кольцо, которое представляет собой молекула тиро-
зина, вращается вокруг оси, образуемой С—С-связью между фенольным кольцом
и пептидной цепью. На это случайное движение существенно влияет среда, и по
динамике ее влияния можно определить коэффициент трения. Расчет с использо-
ванием формулы Эйнштейна D = А:///(уравнение (6.62)) дал значение коэффици-
ента диффузии D= 2,3 • 1011 с-1. Оно в 3 или 4 раза превышает значение коэффици-
ента диффузии, обусловленной вращением, для бензола, и, судя по этому, внутрен-
нее движение в молекуле белка экранировано ее структурой от влияния раствора.
Благодаря защите от колебаний молекул растворителя уменьшено трение при вра-
щении боковых цепей остатков тирозина в белке. Подобное влияние на реакцион-
ный путь должно тем же образом способствовать ускорению реакции, но данный
эффект незначителен по сравнению с огромным возрастанием ее скорости в ре-
зультате изменения £** и энтропии поступательного и вращательного движения.
В экспериментальных исследованиях для изучения влияния трения на внут-
реннее движение в белках варьируют вязкость раствора. При некоторых случайных
движениях в белковой молекуле ее фрагменты перемещаются через растворитель,
и вязкость среды замедляет это движение. Как установлено, скорость связывания О2
и СО гемоглобином и миоглобином снижается с увеличением вязкости раствора
300
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
в соответствии с теорией Крамерса (Веесе et al., 1980). Однако данная зависимость
слабее расчетной, и это служит еще одним указанием на то, что внутреннее движе-
ние в белковой молекуле экранировано ее структурой от колебаний молекул рас-
творителя. Следовательно, величина D для этого движения должна быть больше
расчетной.
В другой, аналогичной работе исследовали влияние вязкости растворителя на
скорость реакции, катализируемой карбоксипептидазой. Результаты этой работы
подробно проанализированы в рамках теории Крамерса (Werben, 1979). Обнару-
женная для данной реакции гидролиза белкового субстрата степень снижения /скат
при возрастании вязкости раствора указывает на то, что в этом случае молекула
фермента не экранирует реакционный путь от того влияния, которое оказывает
движение молекул растворителя. Если структура молекулы фермента хорошо экра-
нирована от движения молекул растворителя, величина &кат должна слабо зависеть
от вязкости среды. Таким образом, хотя вопрос о влиянии трения на скорость фер-
ментативных реакций пока недостаточно изучен, можно считать, что увеличение
скорости реакции за счет экранированности фермента от движения молекул рас-
творителя, обеспечивающей снижение эффекта трения на реакционном пути, не
имеет большого значения для ферментативного катализа. Тем не менее в исследо-
ваниях выявлена роль трения, связанного со случайным движением молекул рас-
творителя на внутреннее движение в белках.
Четкие представления о связи между случайным движением молекул и трени-
ем помогают выяснить, что неверно в некоторых фантастических предположениях
об ускорении ферментативных реакций вследствие колебаний в белковых молеку-
лах. Колебания при внутреннем движении в молекулах ферментов не могут ис-
пользоваться этими ферментами, поскольку направление любого подобного дви-
жения в силу его случайного характера быстро меняется в пределах перемещения
на ~0,1 А и времени 1 пс (см. разд. 6.4). Такие внутренние движения сопряжены
с трением, и увеличение этих колебаний приводит к увеличению трения, замед-
ляющего любой кинетический процесс. Теория Крамерса определяет при некото-
рых условиях константу скорости, которая возрастает с увеличением трения, одна-
ко это относится к предельно низким значениям плотности и вязкости среды, т. е.
к условиям, характерным для газов. В жидкостях при высокой плотности и вязко-
сти среды колебания молекул не могут никоим образом приводить к возрастанию
скорости реакции. Кроме того, фермент не может высвобождать сохраненную по-
тенциальную энергию, чтобы провести молекулу субстрата через переходное со-
стояние, поскольку кинетическая энергия в какой-либо одной форме очень быст-
ро рассеивается в большое число других ее форм.
10.12. Кислотно-основный катализ и графики Бренстеда
Вернемся к вопросу о том, каким образом фермент использует для катализа энер-
гию связывания субстрата, и проанализируем связь между движущей силой реак-
ции и энергией переходного состояния. Для этого следует обратиться к линей-
ным соотношениям свободной энергии кинетических процессов (разд. 7.4.). Если
за счет энергии связывания изменяется движущая сила реакции, можно ожидать,
что пропорционально изменяется энергия переходного состояния. Относительно
10.12. КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЙ КАТАЛИЗ И ГРАФИКИ БРЕНСТЕДА
301
связи кинетики и энергетики в литературе имеется огромное количество данных
для химических и биохимических реакций, катализируемых кислотами и основа-
ниями.
Боковые цепи аминокислотных остатков во многих ферментах действуют в ка-
честве катализаторов лишь в особых условиях. Так, оксианион в остатке серина ак-
тивного центра сериновой протеазы не образуется с легкостью в растворе. Это лег-
че всего пояснить на примере реакции водного гидролиза эфиров. Ион ОН" или
молекула воды могут действовать как нуклеофил и атаковать карбонильную груп-
пу, в результате чего связи при атоме С образуют фигуру тетраэдра и молекула эфи-
ра приобретает переходное состояние. Ион ОН" легко взаимодействует с эфирами,
но при нейтральном pH его концентрация очень низка. Вода также атакует эфиры,
но крайне неэффективно по сравнению с гидроксилом. Таким образом, в растворе
реакционноспособный ион ОН" присутствует в небольшом количестве, тогда как
молекула Н2О, присутствующая в избытке, не реакционноспособна. Аналогичным
образом в каталитическом остатке серина сериновой протеазы присутствует глав-
ным образом слабый в качестве нуклеофила гидроксил, тогда как сильный нуклео-
фил оксианион может образовываться в избытке только при сугубо нефизиологи-
ческих значениях pH.
Низкореакционноспособная молекула Н2О ведет себя более сходно с высоко-
реакционноспособным гидроксилом в присутствии общего основного катализато-
ра. Общий основный катализатор представляет собой буфер, отнимающий протон
от молекулы воды. Гидролиз эфиров ускоряется при увеличении концентрации та-
кого буфера, даже если значение pH остается постоянным. В"-форма такого буфера
активирует молекулы воды, повышая нуклеофильность атома кислорода (рис. 10.9).
Буферы могут также осуществлять общий кислотный катализ, активируя молекулы
воды для донирования Н+. Эти два вида катализа называют общими, чтобы отли-
чить их от специфического кислотного катализа и специфического основного ката-
лиза, связанных с непосредственным действием протонов или ОН".
Для определения эффективности общего основного или общего кислотного
катализа варьируют концентрацию буфера и вычисляют константу скорости вто-
рого порядка катализируемой реакции. Различные буферы существенно различа-
ются по эффективности действия в качестве общих кислотных или общих ос-
новных катализаторов. Сильные кислоты и основания действуют более эффективно,
чем слабые кислоты и основания. Например, сильное основание пиридин действу-
ет в качестве катализатора гидролиза эфиров намного эффективнее, чем слабое ос-
нование ацетат. Если отложить на графике логарифм константы скорости второго
Рис. 10.9. Общий основный катализ по механизму нуклеофильной атаки со стороны воды.
302
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
Рис. 10.10. График зависимости
логарифма скорости гидролиза
эфира от рКа кислоты в составе
буфера, использованного в ка-
честве общего оснбвного ката-
лизатора. Тангенс угла наклона
0,47 представляет собой пара-
метр р в уравнении (10.21). (По
Jencks, Carriuolo, 1961.)
порядка (&2) для различных катализаторов как функцию обнаруживается зави-
симость, близкая к линейной (рис. 10.10).
Это пример линейного соотношения величин свободной энергии; соответст-
вующее уравнение для кислотно-основного катализа названо уравнением Брен-
стеда. Для общего оснбвного катализа оно записывается следующим образом
logfc2 = A + pptfa,
(10.21)
для общего кислотного катализа —
logfc2 = Л-ар/Га (10.22)
Величины аир имеют собственные характерные значения для различных реакций.
Эти параметры показывают, насколько чувствительна или устойчива данная реак-
ция к одной из двух форм катализа.
Величина p/Ta представляет собой логарифм константы равновесия ионизации
и равна величине свободной энергии ионизации, деленной на RT. Уравнения
Брёнстеда указывают на то, что часть свободной энергии ионизации буфера может
использоваться для снижения энергии переходного состояния. Соответственно ве-
личины аир отражают долю энергии ионизации, которая может использоваться
таким образом.
Подобно тому, как буферы с экстремальными значениями рКслужат лучшими
катализаторами, боковые цепи аминокислотных остатков с высокими или низки-
ми значениями рК в активном центре фермента могут обеспечивать ускорение ре-
акции. Здесь, однако, имеется дополнительная проблема. При нейтральном pH
наиболее сильные кислоты — наилучшие катализаторы — в большой степени ио-
низированы и в ионизированном состоянии не эффективны для катализа. Подоб-
ным образом наиболее сильные основания при нейтральном pH в большой степе-
ни протонированы и не способны отнимать протон от молекулы воды. В связи
с этим при многих условиях трудно наблюдать общий кислотно-основный ката-
лиз. Ферменты обходят эту проблему, поскольку структура белковой молекулы
обеспечивает окружение, в котором очень сильная кислота или основание экрани-
10.13. КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЙ КАТАЛИЗ В Р-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ
303
рованы от обмена протоном с окружающей водой. Это иллюстрируется в следую-
щих разделах на примере р-галактозидазы и химотрипсина.
10.13. Кислотно-основный катализ
в р-галактозидазной реакции
Р-Галактозидаза расщепляет дисахариды, содержащие остаток галактозы. Этот
фермент атакует О-связанный атом углерода галактозы с участием в качестве нук-
леофила карбоксильной группы боковой цепи остатка глутамата. Когда образуется
связь между ферментом и остатком галактозы, происходит разрыв связи этого ос-
татка с остатком другого сахара. Комплекс фермент—галактозный остаток, в кото-
ром эти компоненты связаны ковалентной связью, нестабилен и гидролизуется
водой с высвобождением свободной галактозы. Интересный момент в этом двух-
этапном превращении состоит в том, что симметрия О-связанного атома С галак-
тозного остатка дважды обращается и в итоге не происходит изменения симметрии
молекулы сахара. Другие ферменты осуществляют то же химическое превращение
в один этап с обращением симметрии атома углерода.
На первом этапе р-галактозидазной реакции нуклеофильной атаке остатка са-
хара боковой цепью остатка глутамата способствует второй, расположенный вбли-
зи остаток глутамата, выполняющий роль общего кислотного катализатора. Когда
нуклеофильный остаток глутамата атакует атом С остатка галактозы, второй, ката-
литический остаток глутамата снабжает уходящий атом О протоном (рис. 10.11).
В результате получения протона от этого остатка глутамата атом О сахара значи-
тельно легче отнимается нуклеофильной карбокси-группой другого остатка глута-
мата (Richard, 1998).
При нейтральном pH карбоксильная группа боковой цепи остатка глутамата
в обычном случае ионизируется, и этот процесс характеризуется р/Г = ~ 4. В моле-
куле р-галактозидазы остаток глутамата, атакующий сахар, ионизирован, в отли-
чие от другого каталитического, близко расположенного остатка глутамата. В случае
Рис. 10.11. В р-галактозидазной реакции ионизированная карбоксильная группа остатка глута-
мата действует как нуклеофил, атакуя атом углерода в кольцевой молекуле галактозы Протони-
рованный остаток глутаминовой кислоты (вверху) обеспечивает ускорение процесса, выступая
в роли донора протона для атома кислорода в составе отщепляемого сахара
304
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
ионизации этого второго остатка глутамата два отрицательных заряда располага-
лись бы рядом и это требовало бы большой траты энергии на стабилизацию струк-
туры. Таким образом, р/Гдля ионизации второго остатка глутамата выше 7. В ре-
зультате второй остаток глутамата сохраняет свой протон при нейтральном pH,
представляя собой идеальный кислотный катализатор — сильную кислоту в прото-
нированной форме.
Окружение этого второго остатка глутамата изменяется при образовании ин-
термедиата в виде комплекса галактозил—фермент. Первый остаток глутамата при
образовании связи с остатком галактозы теряет заряд. В результате устраняется
препятствие для ионизации второго остатка глутамата и он теряет протон. Благо-
даря этому депротонированию, которое происходит на первом этапе реакции, су-
щественно возрастает энергия, используемая для осуществления второго этапа.
Оценить это возрастание движущей силы процесса можно с помощью соотноше-
ния Бренстеда (уравнение (10.22)) (Richard, 1998). В случае реакций с участием
сходных модельных соединений величина а составляет примерно 0,9. Изучение
мутантных ферментов, лишенных каталитического остатка глутамата, позволило
установить, что протонирование остатка глутамата обусловливает вклад в энергию
ионизации, равный 5,3 ккал • моль-1. Таким образом, согласно уравнению (10.22),
величина log к2 должна при этом возрастать в 4,8 раза (0,9 • 5,3 = 4,8) и скорость ре-
акции должна увеличиваться в 63 000 раз.
На втором этапе реакции, когда происходит гидролиз комплекса фермент—га-
лактоза, роль каталитического остатка глутамата обратная. Будучи ионизирован-
ным, он осуществляет функцию общего основного катализатора, отнимая протон
от молекулы воды и тем самым повышая ее реакционноспособность в отношении
атома С, связывающего остаток галактозы с ферментом. Благодаря этому ускоря-
ется второй этап реакции. Таким образом, один и тот же аминокислотный остаток
вначале, находясь в протонированной форме, служит кислотным катализатором
и затем в ионизированной форме выполняет роль общего основного катализатора.
10.14. Механизм действия сериновых протеаз
и сильные водородные связи
Механизм основного катализа, казалось бы, можно проиллюстрировать на приме-
ре сериновой протеазы, описанной в начале этой главы (см. рис. 10.1). Остаток
гистидин-57 в молекуле химотрипсина должен функционировать в качестве осно-
вания, чтобы отнимать протон от серина-195, активируя тем самым этот остаток
для нуклеофильной атаки карбонильной группы в белке-субстрате. Однако значе-
ния р/Гне соответствуют этому. Гистидин, как правило, характеризуется величиной
рК ~ 7 и в соответствии с этим не способен активировать гидроксильную группу
остатка серина, который характеризуется рК~ 14. Для объяснения этого высказано
предположение, что окружение боковой цепи данного остатка гистидина (гисти-
дин-57 на рис. 10.1) изменяется при связывании субстрата, в результате чего зна-
чение р/Г возрастает и гистидин-57 приобретает способность катализировать ре-
акцию.
Ключевой момент в данном предполагаемом механизме изменения р/f гисти-
дина-57 — это особый характер его Н-связи с аспартатом-102 (Cassidy et al., 1997).
10.14. Механизм действия сериновых протеаз и сильные водородные связи
305
Протон, образующий эту связь, характеризуется необычно большим химическим
сдвигом в спектре ЯМР. Кроме того, в комплексах, образуемых химотрипсином
с некоторыми аналогами переходного состояния субстрата, действующими в каче-
стве ингибиторов, расстояние между атомом N51 гистидина-57 и атомом О карбок-
сильной группы аспартата-102 необычно малое (2,52 А, тогда как в типичных Н-
связях оно равно ~2,8—2,9 А; см. разд. 2.10). Эти особенности указывают на то, что
данная Н-связь чрезвычайно сильная; ее энергия определена как 11 ккал • моль"1.
Такие сильные Н-связи образуются в том случае, если атом Н распределен более
равномерно между донором и акцептором и занимает положение примерно посе-
редине между ними; при этом не существует барьера для его переноса как на до-
нор, так и на акцептор. Подобную Н-связь называют низкобарьерной.
Образование низкобарьерной Н-связи зависит от близости значений рХ доно-
ра и акцептора. Условием служит также низкая диэлектрическая проницаемость
окружения и обеспечивающая это белковая структура. Значения рК остатков ас-
партата и гистидина становятся более близкими при условии, что оба атома N
в кольце остатка гистидина протонированы. Если атом NE1 остатка гистидина ио-
низирован, атом N51 будет иметь более высокую аффинность к его протону, чем
карбоксильная группа остатка аспартата (рис. 10.12). При несовпадении значений
рК образуется обычная водородная связь с энергией 3—4 ккал • моль-1. Как пред-
полагается, связывание субстрата приводит к конформационному изменению
структуры фермента с уменьшением расстояния между атомами N и О и благодаря
этому между ними образуется сильная водородная связь. За счет такого повыше-
ния энергии Н-связи должна возрастать энергия протонирования атома NE1. Дан-
ное увеличение энергии связи определено как равное ~7 ккал • моль-1, и установле-
но, что значение р^для атома NE1 возрастает при такой связи до ~12.
В результате столь существенного возрастания величины рК боковой це-
пи гистидина-57 этот остаток становится более эффективным катализатором
(рис. 10.12). В действительности увеличение рК варьирует в зависимости от вида
боковой цепи в молекуле субстрата, и чем выше рХ, тем больше скорость ацили-
рования. Это продемонстрировано с использованием ряда ингибиторов химот-
рипсина, индуцирующих конформационное изменение его молекулы и возраста-
ние в той или иной степени р^гистидина-57. Кривая зависимости логарифма уве-
Рис. 10.12. При связывании субстрата с химотрипсином происходит сближение двух аминокис-
лотных остатков в составе фермента — гистидина-57 и аспартата-102, что обеспечивает обра-
зование ими высокопрочной низкобарьерной Н-связи В результате увеличивается значение рК
атома Ne1 гистидина-57 и он действует как общий основный катализатор, отнимая протон гидро-
ксильной группы от остатка серин-195.
306
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
личения скорости реакции с участием субстратов, содержащих те же боковые
цепи, что ингибиторы, от р А" характеризуется тангенсом угла наклона 0,68 (Lin et
al., 1998). Таким образом, это 0-график Бренстеда, применимый для характери-
стики катализа нуклеофильной атаки пептидной связи гидроксильной группой
остатка серина в специфическом окружении активного центра химотрипсина.
Как предполагается, низкобарьерные водородные связи играют роль в каталити-
ческой активности не только химотрипсина, но и многих других ферментов
(Cleland et al., 1998).
10.15. Теория Маркуса
и перенос протона карбоангидразой
Карбоангидраза катализирует реакцию, приведенную на схеме (10Д)
НСОз «=±СО2 +ОН" (10Д)
В отличие от большинства ферментативных реакций, карбоангидразная реакция
имеет важное физиологическое значение и в прямом и в обратном направлениях.
Этот фермент способствует растворению СО2, образующегося при дыхании, дейст-
вуя в левом направлении реакции, и обеспечивает превращение растворенного
НСОз в СО2 в легких для его выделения с воздухом, действуя в правом направле-
нии реакции.
Молекула карбоангидразы содержит атом Zn, прочно связывающий молекулу
воды. От этой связанной молекулы воды протон быстро переносится на бикарбо-
нат (схема (10Е))
Е— Zn — Н2О + НСО2 Е— Zn — ОН + СО2 + Н2О (10Е)
Лимитирующим скорость этапом в общем процессе является не это превращение,
а изменение состояния протонирования связанной с атомом Zn воды через обмен
протоном с остатком гистидина в активном центре фермента (схема (ЮЖ))
Е— Zn — OH+HisH<=±E— Zn — Н2О +His' (ЮЖ)
Мутации с заменой этого остатка гистидина остатком аланина приводят к сниже-
нию ккат в 20—50 раз, и это снижение не достигает большей степени за счет того,
что буферный раствор поставляет тот протон, который исходно донируется остат-
ком гистидина.
Координата реакции для этого этапа переноса протона исследована в экспери-
ментах с использованием мутантных форм карбоангидразы, в которых произошла
замена остатков вблизи остатка гистидина — донора протонов (Silverman et al.,
1993). Изменения заряда и полярности в этих позициях приводили к изменению
значения р/Гдля остатка гистидина. Дополнительные данные были получены с по-
мощью добавления доноров протонов в раствор. В каждом случае определяли ско-
рость переноса протона и рК для донора и акцептора. Различие между донором
и акцептором в значениях рК служило оценкой движущей силы реакции. Таким
образом, эти данные могут быть использованы для анализа зависимости скорости
реакции от ее движущей силы.
10.15. Теория Маркуса и перенос протона карбоангидразой
307
Теория Маркуса предлагает соотношение между скоростью и движущей силой
реакции, применимое к широкому спектру процессов с переносом заряда (см.
разд. 7.6), включая перенос протона. Выражение, применимое к схеме (ЮЖ), мож-
но получить из уравнения (7.21), если добавить в него параметр w
( лг°¥
<7* =w+G0* 1 + ^Цг , * (10.23)
\ 4G0 )
где (7* — это свободная энергия активации для конкретной движущей силы и Д(70
и — значения энергии активации при нулевой движущей силе. Параметр w оз-
начает вклады в энергетический барьер, которые остаются постоянными при этих
изменениях движущей силы.
Кривая зависимости логарифма переноса протона от движущей силы имеет
форму, предсказываемую соотношением Маркуса для свободной энергии (рис. 10.13).
Этот график полностью соответствует уравнению (10.23), показывая, что теория
Маркуса применима для объяснения кинетики переноса протона карбоангидразой.
Такое соответствие теории экспериментальным данным позволяет утверждать,
что если донор и акцептор находятся в положении для переноса протона, естест-
венный энергетический барьер реакции довольно низок (AG* = 1,4 ккал • моль-1).
Данная величина сходна с величиной барьера при неферментативном переносе
протона между сходными группами. Однако, хотя карбоангидраза считается эф-
фективным ферментом (£кат превышает 105 с-1), реакции переноса протона в рас-
творе могут быть значительно более быстрыми (10й с-1; см. разд. 8.7). Различие
здесь состоит в большой величине w (10 ккал • моль-1), отражающей вклад в энер-
гетический барьер, который не связан с движущей силой. Он объясняется необхо-
димостью организации молекул воды в каталитической полости молекулы фер-
мента. Донор протонов — гистидин-57 — и акцептор — гидроксильная группа,
связанная с атомом цинка, — разделены расстоянием 9—12 А. Находящиеся между
ними молекулы воды служат челноком для протона. Предположительно эти моле-
кулы воды располагаются строго в ряд, чтобы мог происходить перенос протона.
Вероятность такого правильного расположения должна быть связана с параметром
w; при этом она не зависит от значений рКдонора и акцептора (Silverman, 2000).
Рис. 10.13. Зависимость скорости пе-
реноса протона от донора на связан-
ную с цинком гидроксильную группу в
активном центре карбоангидразы (схе-
ма (Е)) от ДрК донора и акцептора. При
подстановке этих данных в уравнение
(10.23) значение Gq = 1,4 ккал • моль-1
и и/ = 10 ккал • моль-1. (По Silverman et
al., 1993.)
6,0-1
308
Глава 10. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
Задачи
1. Составьте уравнение динамики потребления субстрата в ферментативной реак-
ции, протекающей в соответствии с кинетикой Михаэлиса—Ментен (необходимо
получить выражение для [S] как функции /). Постройте график этой зависимости
и сравните результаты для начальной концентрации 5 • Ks и 0,2 • Ks; величину Имакс
примите в обоих случаях равной единице.
2. Исходя из схемы (ЮГ) включите в уравнение реакции на втором этапе связывание
второго субстрата. Составьте уравнение равновесия для скорости образования
продукта как функции концентрации двух субстратов.
3. Составьте уравнение предстационарной кинетики образования «-нитрофенола
в реакции, катализируемой химотрипсином. Исходите из того, что этот продукт
образуется на первом этапе реакции, приведенной на схеме (10В), считая его необ-
ратимым.
4. Определите последствия умножения фа в уравнении (10.18) на коэффициент.
Сравните увеличение скорости реакции с изменением свободной энергии гармо-
нического осциллятора. (Используйте результат решения задачи 11 к гл. 1.)
5. Можно ожидать, что снижение Е* реакции на ДЕ* должно приводить к повыше-
нию скорости реакции соответственно е“д£ /кТ. Если полное выражение для энер-
гии активации (U(Q = Е* разд. 7.8) разделить на коэффициент, ка-
кой результат это будет иметь для величины ускорения реакции согласно теории
Крамерса?
6. Объедините все факторы увеличения скорости реакции, рассмотренные в этой
главе, чтобы получить оценку максимальной каталитической эффективности фер-
мента.
Глава 11
Ионы и противоионы
Среда внутри живых организмов представляет собой водный солевой раствор.
Присутствующие в нем ионы испытывают притяжение и отталкивание под дейст-
вием электрического поля других ионов и несущих заряд макромолекул. Молеку-
лы, несущие заряд, как правило, окружены ионами с зарядом противоположного
знака, облако которых нейтрализует электростатические взаимодействия молекул,
экранируя их заряд. Присутствие ионов существенно влияет на энергетический
пейзаж раствора в результате разнообразных эффектов. Описанию этих эффектов
и объясняющих их теорий посвящена данная глава.
Энергию взаимодействия ионов в растворе можно вычислить по формуле
электростатического (кулоновского) потенциала
U = ^- (11.1)
ег
В случае ионов Na+ и СГ расстояние между их центрами при наибольшем сближе-
нии равно примерно ЗА. Подставляя это значение и величину диэлектрической
проницаемости воды (е ~ 80) в уравнение (11.1), получаем величину потенциальной
энергии взаимодействия этих ионов при непосредственном контакте, равную
—9,3 • 10"14 эрг. В действительности энергия данного взаимодействия немного
выше, поскольку молекулы воды под действием сильного электрического поля ка-
ждого из этих ионов приобретают упорядоченную ориентацию и за счет этого ди-
электрическая проницаемость воды снижается. Энергия теплового движения при
Т = 298 К равна кТ= 4,1 • 10"14 эрг. Таким образом, энергия притяжения между Na+
и СГ примерно в два раза превышает энергию их теплового движения. Зная вели-
чину энергии, необходимой для преодоления энтропии поступательного движения
(см. гл. 4), можно заключить, что сила притяжения в данном случае слишком мала
для образования стабильной связи.
Поскольку взаимодействие между Na+ и СГ в воде столь слабое, их соль диссо-
циирует. Электростатическое взаимодействие между ионами в воде во многих слу-
чаях не очень сильное, но оно проявляется на больших расстояниях, т. е. кулонов-
ский потенциал с увеличением расстояния убывает медленно по сравнению с дру-
гими составляющими энергии межионного взаимодействия. При такой
незначительной силе взаимодействия и большом расстоянии, на которое оно рас-
пространяется, важное значение для анализа энергетики раствора электролита
имеет распределение ионов. Ионы Na+ и СГ, хотя их ассоциации и не происходит,
в среднем находятся большей частью в близком соседстве. Ионы с одноименными
зарядами, напротив, удаляются друг от друга. Пространственное распределение
310
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
ионов отражает баланс между силами электростатического взаимодействия
и энергией теплового движения. Далее мы проанализируем этот баланс с помощью
уравнения Пуассона—Больцмана, решая его разными способами и для разных ус-
ловий, чтобы описать разнообразные ионные эффекты, важные для понимания
биологических процессов.
I 1.1. Уравнение Пуассона—Больцмана
и дебаевский радиус
Уравнение Пуассона—Больцмана объединяет применяемое в электростатике урав-
нение Пуассона с распределением Больцмана. Уравнение Пуассона выражает об-
щее соотношение между распределением заряда, р(г), и электрическим потенциа-
лом, <р(г), создаваемым центральным ионом и его ионной атмосферой в точке, рас-
положенной на расстоянии г от центрального иона
V2cp(r) =-—р(г) (11.2)
£
Это уравнение представляет собой обобщение формулы кулоновского потенциала
для произвольного распределения зарядов. Оно сводится к уравнению кулонов-
ского потенциала при условии, что р(г) — это точечный заряд в однородной ди-
электрической среде. Поскольку уравнение Пуассона включает функцию р(г), оп-
ределяющую распределение ионов, уравнение Пуассона идеально подходит для
выведения уравнения распределения ионов в растворе электролита. Обозначим
как г расстояние от заряда до объекта, несущего заряд, — иона, белка или другой
макромолекулы либо мембраны. Для всех этих случаев можно использовать урав-
нение Пуассона, однако система координат и соответственно форма V2cp(r) будут
определяться геометрическими характеристиками объекта.
Плотность распределения зарядов выражается через концентрации ионов, при-
сутствующих в растворе. Обозначим концентрации катионов и анионов как с+(г) и
с_(г). В случае простой бинарной соли плотность распределения зарядов определя-
ется по формуле р(г) =еЯ10"3(с+(г)-с_(г)). Величина р выражается в ед. СГСЭ мем-3,
а концентрация в моль • л-1, поэтому уравнение содержит коэффициент еА10~3,
где е — единичный заряд электрона, А — число Авогадро и множитель означает
10"3 л • см-3. В общем виде для произвольного набора ионов с зарядовыми числами
Zi и концентрациями с, это уравнение записывается следующим образом
р(г) = еЛ10-32>,(г) (11.3)
/
Концентрация иона на расстоянии г связана с потенциальной энергией взаи-
модействия ионов, согласно распределению Больцмана, следующим образом
С/(г) = с,(оо)е-ег'ч>(г)/*7’ (11.4)
Здесь с, (оо)— концентрация в общем объеме, т. е. в бесконечно удаленной точке,
где потенциал (р принимается равным нулю. Подставляя с, (г) в уравнение (11.3),
получаем выражение
11.1. Уравнение Пуассона—Больцмана и дебаевский радиус
311
р(г) = еЯ10-:’^г,с/(оо)е-ег'ф<г)/*г (11.5)
/
Подстановка этого выражения для р(г) в уравнение (11.2) позволяет получить урав-
нение Пуассона—Больцмана
72ф(г) = -4ле^10 3уг.с.(оо)еЧ;'ф(г)/*7' (11.6)
е j
Таким образом, мы исключили р(г) и получили дифференциальное уравнение для
ср(г). Решение уравнения (11.6) представляет собой выражение для электрического
потенциала, в котором учитывается экранирование заряда окружающими его про-
тивоионами. Зная ср(г), можно вычислить плотность распределения зарядов по
уравнению (11.5). В зависимости от геометрической формы несущего заряд объек-
та для решения этого уравнения требуется использовать различные подходы и при-
ближения, что рассматривается ниже.
Хотя основной целью в данной главе является решение уравнения Пуассона-
Больцмана, весьма полезный вывод можно сделать уже на этом этапе изложения.
Поскольку взаимодействие между ионами во многих случаях довольно слабое, по-
казатель степени ez^)/kT часто представляет собой величину, намного меньшую
единицы. При этом можно аппроксимировать показательную функцию в уравне-
нии (11.6) как \-ez^)/kT и записать выражение следующим образом
_2 , ч 4леЛ10’3^ , ег,-ср(г)Л
V2cp(r) =-------2Lz‘c^\ 1 —О L7)
е j V кТ )
В бесконечно удаленной точке, где концентрации ионов принимаются равными их
концентрациям в общем объеме, раствор электронейтрален и£.ег,с,(оо) = 0. Для
этих условий уравнение (11.7) сводится к виду
V2cp(r) =--——2ct(оо)ф(г) (11.8)
гкТ j
Данное уравнение называют линеаризованным уравнением Пуассона—Больц-
мана. Ниже мы приведем его решение, но вначале необходимо обратить внимание
на множитель, стоящий перед ср(г) в правой части уравнения. Им определяется
ключевой параметр
1 _8ле2Л10-37
гкТ ( ’
Символ / обозначает ионную силу раствора, равную I = j^.z,2c,(oo). Уравне-
ние (11.8) при данном приближении упрощается до выражения
У2ф(г) = А-ф(г) (11.10)
Ad
Переменная XD, выражаемая в единицах длины, имеет название дебаевский
радиус, или радиус Дебая. Если в уравнении (11.10) перейти к переменной с раз-
312
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
мерностью единиц X D, оно не будет содержать каких-либо параметров. Это озна-
чает, что для раствора электролита величина XD служит естественной единицей
расстояния при расчете межионных взаимодействий.
В случае 1 М раствора NaCl (/ = 1) при температуре Т = 298 К дебаевский радиус
равен XD =3,05А. Обратите внимание, что XDoc/"1/2 и поэтому XD возрастает
с уменьшением 1. Например, при 10 мМ концентрации раствора NaCl XD =30,5 А.
На расстояниях, меньших XD, проявляется сильное электростатическое взаимо-
действие, тогда как на расстояниях, больших XD, электрическое поле центрально-
го заряда экранировано его ионной атмосферой. Иными словами, величина XD
фактически является радиусом экранирования заряда окружающими его противо-
ионами. Соответственно этому дебаевский радиус уменьшается с увеличением
ионной силы раствора. Следует отметить, что ионная сила раствора I зависит от
квадрата зарядового числа иона, z2, поэтому в случае многовалентных ионов ве-
личина I возрастает с увеличением их концентрации резче, чем в случае однова-
лентных ионов. Таким образом, многовалентные ионы более эффективно экра-
нируют электростатические взаимодействия по сравнению с одновалентными
ионами.
I 1.2. Ионный коэффициент активности
Растворы электролитов не являются идеальными. Например, осмолярность 100 мМ
раствора NaCl составляет 187 мОсм, а не 200 мОсм. Одна из основных причин от-
клонения от идеальности состоит в притяжении между противоположно заряжен-
ными ионами. Это описывается уравнением Пуассона—Больцмана, приведенным
в классической работе Дебая и Хюккеля, и из него можно вывести коэффициент
активности иона. Решим вначале линеаризованное уравнение Пуассона—Больц-
мана, чтобы найти функцию потенциальной энергии <р(г), и затем вычислим энер-
гию внедрения иона в раствор, содержащий другие ионы.
Рассматриваемая нами система схематически изображена на рис. 11.1. Катион
притягивает анионы, и их средняя плотность вблизи катиона больше, чем вдали от
него. Эту область преобладания зарядов противоположного знака вокруг цен-
трального иона называют ионной атмосферой.
Единственной значимой координатой в данной системе является расстояние г
rq центра центрального иона. Это означает, что для анализа следует использовать
оператор V2 в сферических координатах (см. приложение 6). Однако в сфериче-
ских координатах уравнение Пуассона—Больцмана не имеет аналитического ре-
шения, поэтому используем его линеаризованную форму (уравнение (11.10))
Рис. 11.1. Ион, несущий положительный заряд, окружен обла-
ком ионов, несущих отрицательный заряд. Это облако противо-
ионов, или ионная атмосфера, с плотностью распределения за-
рядов р, экранирует электрическое поле центрального положи-
тельного заряда, уменьшая в результате величину потенциала
ф(г). Знаки минус показывают распределение заряда, а не
отдельные ионы.
I 1.2. ИОННЫЙ КОЭФФИЦИЕНТ АКТИВНОСТИ
313
^7""= (11.11)
г dr XD
Умножая обе части уравнения на г, получаем дифференциальное уравнение для
функции гср(г), которое легко проинтегрировать
г<р(г) = /4е-гДо+БегДо (11.12)
Здесь А и В — постоянные интегрирования, определяемые граничными усло-
виями. Постоянная В равна нулю, что вытекает из условия (р -> 0 при г -> оо. Посто-
янная А определяется электрическим полем на поверхности иона, которое должно
быть непрерывной функцией расстояния г. Экранирование на поверхности иона
отсутствует, поэтому величину электрического поля можно рассчитать по формуле
кулоновского потенциала для заряда q. При ионном радиусе, равном а, поле на по-
верхности иона равно
Е=Л2
га
Используя это граничное условие, найдем постоянную интегрирования А в уравне-
нии (11.12), для чего вначале запишем выражение для потенциала <р(г)
. ч Ле’г/Х°
<р(г) =-----
(11.13)
(И.14)
Дифференцируя его по г, получаем выражение для напряженности электрического
поля Е
. Ле-гАо ( 1 1
Е{г) =------ — + -
г г
Теперь подставим г = а, приравняем правые части уравнений (11.13) и (11.15) и ре-
шим полученное уравнение относительно А
(П.15)
л _ q ( efl/XD
А. — — --------------
е ^1 + а/ Л, □
(11.16)
Подставляя это выражение для А в уравнение (11.14), получаем его решение
<р0-) = —
ег
<e-(r-G)MD
ч 1 + я/Х D
(11.17)
Это уравнение потенциальной энергии межионного взаимодействия в области
вокруг иона. Величину потенциальной энергии можно разделить на две состав-
ляющие — энергию электростатического взаимодействия и энергию экранирова-
ния заряда противоионами. Первой составляющей соответствует множитель g/er,
в соответствии с чем уравнение (11.17) можно переписать в виде следующей суммы
/х Q Q (ъ .
ф('') = — + — --77----1
er er^l+a/XD
(11.18)
Второе слагаемое в этом уравнении — вклад экранирования заряда противоионами.
314
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
Определим вклад экранирования заряда противоионами в отклонение раство-
ра электролита от идеальности. Оценить этот вклад можно на основе уравнения
(11.18) для электрического потенциала, зная который, можно рассчитать работу,
совершаемую при внедрении иона в раствор, и тем самым свободную энергию вне-
дрения иона в раствор. Работу, совершаемую при внедрении заряда q при г = О,
можно вычислить в форме энергии приращения заряда, как при определении соб-
ственной энергии иона в диэлектрической среде (см. разд. 2.2). Вычисление при-
ращения заряда в первом слагаемом (уравнение (11.18)), соответствующем элек-
тростатическому потенциалу в отсутствие экранирования заряда, приводит к зна-
комому уравнению (2.4) для собственной энергии заряда. Эта величина не зависит
от других ионов и поэтому в данном контексте не является значимой. Второе сла-
гаемое в уравнении (11.18) зависит от концентрации ионов (поскольку от нее зави-
сит XD), и интегрирование этого члена дает величину работы, совершаемой в отно-
шении других ионов в растворе при увеличении заряда центрального иона, находя-
щегося от них на расстоянии г = О
1
(11.19)
(11.21)
(11.22)
1 ( I \ Я 7
№=—I—1-—
ea^l + a/XD ) * 2e^XD+a
Эта величина вводится в выражение для свободной энергии идеального рас-
твора, чтобы учесть экранирование заряда противоионами
G=G0+A7Tnc + ir (11.20)
Коэффициент активности, у, для одиночного иона определяется выражением
fcTlny = JK, из чего следует
In у = - —- ---
J XD +а
В случае разбавленных растворов величина XD значительно больше радиуса
центрального иона и им можно пренебречь. При этом условии мы получаем урав-
нение для коэффициента активности иона в растворе, известное как предельный
закон Дебая—Хюккеля
„2
In у =-----
2e£TXD
Для соли, диссоциирующей на одновалентные ионы (например, NaCl), ионный
коэффициент активности при 298 К равен log10 у = -0,5056ус, для соли, диссоции-
рующей на одновалентный и двухвалентный ионы (например, СаС12) он равен
-1,7517с. Заметим, что значение ионного коэффициента активности стремится к
нулю при снижении концентрации соли до нуля, как и следовало ожидать, посколь-
ку при бесконечно большом разбавлении все растворы являются идеальными.
Сравнение расчетных и экспериментально полученных данных показывает,
что предельный закон справедлив только для области низких концентраций элек-
тролита (примерно до 10 мМ) (рис. 11.2). В соответствии с этим законом ионный
коэффициент активности зависит только от заряда иона и не зависит от других его
специфических свойств. Таким образом, в предельном случае все ионы с одинако-
вым зарядом ведут себя одинаково. Это вполне логично, поскольку кулоновский
потенциал зависит только от величины заряда.
I 1.2. ИОННЫЙ КОЭФФИЦИЕНТ АКТИВНОСТИ
315
Рис. 11.2. График зависимости ло-
гарифма ионного коэффициента
активности от 4с для NaCl (квадра-
ты) и СаС1г (ромбы). Сплошные ли-
нии соответствуют уравнению пре-
дельного закона (уравнение (11.22)),
пунктирные кривые — уравнению
(11.21) при а = 4,45 для NaCl и 5,24
для СаС1г. (По Maclnnes, 1961.)
При более высоких концентрациях (примерно до 100 мМ) экспериментальным
данным соответствует уравнение (11.21), представляющее собой модификацию
предельного закона. В отличие от предельного закона, в это выражение входит
специфическая для каждого иона величина его радиуса, а. Этот параметр не влияет
на электростатическое взаимодействие, но скорее отражает то, что два иона не мо-
гут занимать одно и то же место в пространстве. Данный стерический эффект (эф-
фект исключенного объема) относится и к электрически нейтральным молекулам.
Наиболее точное значение а, полученное подгонкой уравнения (11.21) к экспери-
ментальным данным (см. подпись к рис. 11.2), как правило, оказывается больше
суммы кристаллических радиусов аниона и катиона. Это обусловлено влиянием
гидратной оболочки, препятствующей тесному сближению ионов.
Теория Дебая—Хюккеля с довольно хорошим приближением описывает ион-
ную атмосферу, экранирующую электрическое поле иона. Подставляя в уравнение
(11.2) выражение для потенциала <р(г) из уравнения (11.17) (оператору2 тот же, что
в уравнении (11.11)), получаем
п <P-(r-a)AD
Р(Н = —
4rcrXD 1 +fl/AD
(11.23)
Величина заряда в сферическом слое толщиной dr на расстоянии г составляет
4nr2p(r)dr. График этой функции приведен на рис. 11.3.
Рис. 11.3. График зависимости 4лг2р (р из
уравнения (11.23)) от г при двух значениях
316
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
Как видно из графика, плотность распределения зарядов противоионов дости-
гает максимума при г = XD (см. задачу 3). Чем больше XD (т. е. чем меньше ионная
сила раствора), тем дальше распространяется ионная атмосфера от центрального
иона. Этот пример иллюстрирует важность величины XD в качестве основной еди-
ницы расстояния при определении взаимодействий между ионами в растворе.
Совпадение предсказаний теории Дебая—Хюккеля с экспериментальными
данными для разбавленных растворов свидетельствует, что она верно описывает
межионные взаимодействия в этой области концентраций соли. Однако к области
более высоких концентраций теория Дебая—Хюккеля неприменима, поскольку
в этих условиях не корректны два приближения, лежащие в ее основе. Первое из
них — это линеаризация уравнения Пуассона—Больцмана, благодаря которой по-
лучено уравнение (11.7). Линейное приближение обосновано при низких значени-
ях показателя степени, ezcp/кТ, в уравнении (11.6). Вспомним, что вычисленная
в начале данной главы энергия кулоновского взаимодействия при г = 3 А составля-
ет 9,3 • 10"14 эрг, что приблизительно эквивалентно 2кТ. Однако при г = XD (30 А в
случае / = 10 мМ) показатель степени eq/кТ ~ 1/5. Таким образом, в области с наи-
более высокой плотностью распределения зарядов (рис. 11.3) электростатический
потенциал достаточно низкий, чтобы линеаризация служила хорошим приближе-
нием. Концентрация, при которой теоретически рассчитанные величины начина-
ют не соответствовать экспериментальным данным, приведенным на рис. 11.2, со-
ответствует точке, где величинаe^kD)/kT становится значительной по сравнению
с единицей.
Второе важное приближение, лежащее в основе теории Дебая—Хюккеля, —
это использование потенциала, рассчитанного по средней плотности распределе-
ния зарядов, р(г). Для нахождения действительного среднего потенциала на опре-
деленном расстоянии от данного иона необходимо взять средние значения для по-
зиций всех остальных ионов, включая такие распределения, при которых в одной
области находится много ионов. Среднее значение плотности распределения заря-
дов не позволяет оценить вклад мультиионных распределений. В то же время муль-
тиионные эффекты становятся значимыми с повышением концентрации раство-
ра, и поэтому вычисление энергии межионного взаимодействия по среднему зна-
чению плотности распределения заряда в этих случаях перестает служить хорошим
приближением. Если проблему, связанную с линеаризацией в качестве приближе-
ния, можно обойти, найдя с помощью компьютера численное решение, то избе-
жать использования средней плотности распределения зарядов гораздо сложнее.
Для этого требуется применить более совершенные теоретические методы либо
расчеты по методу Монте-Карло, позволяющие анализировать сложное поведение
систем, состоящих из большого числа молекул.
Как показывает подробный анализ, теория Дебая—Хюккеля становится точ-
ной в предельном случае бесконечно большого разбавления. Более детально и на
доступном для неспециалистов уровне анализ взаимодействия ионов в растворах
электролитов, включая приближения теории Дебая—Хюккеля и некоторые спосо-
бы их обхода, изложен в других книгах (см. Hill, 1960, ch. 18; McQuarrie, 1976,
ch. 15).
При изучении некоторых биофизических систем возникает дополнительная
проблема, связанная с использованием уравнения Пуассона—Больцмана. Если
рассматривать распределение противоионов в воде вблизи области с низкой ди-
11.3. Ионизация белков
317
электрической проницаемостью, то необходимо учитывать отталкивание под дей-
ствием силы отображения (см. разд. 2.3) и включать этот параметр в уравнение Пу-
ассона-Больцмана, что довольно непросто. Данная проблема исследована мето-
дом компьютерного моделирования броуновского движения ионов в небольших,
заполненных водой, сферических и цилиндрических полостях внутри среды с низ-
кой диэлектрической проницаемостью (Моу et al., 2000). По мере уменьшения раз-
меров такой полости до величины дебаевского радиуса, соответствующей данной
ионной силе раствора, экранирование противоионами уменьшается. При типич-
ных физиологических условиях, когда XD ~ 10 А, внутри цилиндра диаметром, рав-
ным диаметру крупного ионного канала (~ 10 А), экранирование заряда противоио-
нами практически отсутствует. Ионы в полной мере подвергаются воздействию
силы отображения со стороны среды с низкой диэлектрической проницаемостью,
и экранирование противоионами незначительно. Только когда радиус цилиндра
превышает два дебаевских радиуса, эффект экранирования противоионами для
иона в центре цилиндра достигает величины эффекта экранирования в общем объ-
еме.
11.3. Ионизация белков
Поверхность белковых молекул усеяна аминокислотными остатками, способными
ионизироваться, такими как остатки глутамата, лизина и аргинина. Если боковая
цепь одного из этих остатков ионизируется, изменяется общий заряд белка и элек-
тростатические взаимодействия приводят к изменению энергии ионизации боко-
вых цепей других аминокислотных остатков. Ионизация одной боковой цепи за-
трудняет ионизацию остальных, поэтому кривая титрования белка охватывает бо-
лее широкий диапазон pH, чем в случае, когда те же группы присутствуют как
независимые в растворе. При добавлении соли этот эффект уменьшается, в резуль-
тате того что неорганические ионы экранируют электростатические взаимодейст-
вия между зарядами на поверхности белковых молекул. Данный эффект хорошо
объясняет теория Дебая—Хюккеля.
Исходная модель ионизации белков, предложенная Линдерстрем-Лангом (Lin-
dersti^m-Lang, 1924), построена на предположении, что в случае глобулярного бел-
ка заряд равномерно распределен по его сферической поверхности. Соответствен-
но энергия ионизации рассматривается в ней как электростатическая работа по
приращению заряда сферы. В отсутствие ионов эта энергия должна быть равна
собственной энергии (уравнение (2.4)), однако в случае раствора электролита сле-
дует использовать интеграл из уравнения (11.19), который позволяет найти энер-
гию приращения заряда сферы в присутствии ионов. Согласно Скатчарду (Scat-
chard, 1949), выражение для свободной энергии ионизации одной определенной
группы на поверхности белка при изменении зарядового числа с г на г + 1 записы-
вается следующим образом
АС0 = -ЯТ1п/Г0+и>(г + 1)2-и>г2, (11.24)
где Kq — характеристическая константа равновесия для данной группы в отсутст-
вие электростатических взаимодействий и w(z + l)2 -wz2 — изменение электроста-
тической энергии, пропорциональное квадрату заряда (характеристика, общая для
318
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
всех электростатических собственных энергий). В данном случае г2 соответствует
(? в уравнении (11.19), поэтому величина w в уравнении (11.24) равна
w = ----5— (11.25)
2eXD+a
Чтобы соотнести эти уравнения с данными, получаемыми при титровании бел-
ков, рассмотрим изменение равновесия ионизации, когда заряд увеличивается на
единицу. Разделим заряды на две группы: постоянные (или, по крайней мере, та-
кие, которые полностью ионизируются в интересующем нас интервале pH) заряды
р и ионизируемые заряды п. В соответствии с уравнением (11.24) увеличение числа
зарядов, возникающих при ионизации, от i i + 1 вызывает следующее изменение
свободной энергии
Д<7°
RT(n-i), „ / • 1x2 /
—------- In KQ +w(p + i + 1) - w(p + i) =
RT(n-i).
--------In KQ + w(2p + 2i + 1) =
(11.26)
Здесь (n-i)/i — статистический фактор, отражающий число участков на по-
верхности белка, где могут протекать прямой и обратный процессы ионизации
(этот же фактор использован при анализе модели Моно и др.; разд. 5.7). В уравне-
ние (11.24) он не входит, так как это уравнение характеризует энергию одной иони-
зируемой группы.
Член в скобках в уравнении (11.26) представляет собой выражение для кон-
станты равновесия ионизации
где символом А, обозначен белок со степенью ионизации i. Логарифмируя это вы-
ражение и подставляя значение 1g е = 0,434, получаем
log(H+] + loglM = log Ко - ^4wi (2p + 2i + 1) (11.28)
[A,] RT(n-i)
или
и i [A/+11 к. 0,434w/ 14 Z11
pH-log—— = pK + —------~(2p + 2i + \) (11.29)
[AJ RT(n-i)
Чтобы найти соотношение [A/+1 ]/[A,], понадобилось бы проводить весьма
сложные измерения на ряде белков с числом титруемых групп i и / + 1. Для упроще-
ния задачи сосредоточим внимание только на центре кривой титрования, где ио-
низирована примерно половина групп и i ~ n-i. Соответственно статистический
фактор i/(п- 0 здесь приблизительно равен единице и для любой группы можно
использовать одну и ту же константу равновесия.
11.4. Теория Гуи—Чапмена и поверхностный заряд мембраны
319
Определим степень ионизации как а = [А-]/([АН] + [А-]). Тогда можно выра-
зить i какал и [А-] / [АН] = [А/+1 ]/ [А, ]кака/(1 - а). В этом случае уравнение (11.29)
принимает вид
pH-log—= рК+0,434(2р+2аи + 1)ш/ЯГ (11.31)
1-а
Уравнение (11.31) широко используется для анализа результатов титрования
белков в таких экспериментах, где измеряют а при различных значениях pH. Гра-
фик зависимости pH-log(a/(l-a)) от а представляет собой прямую, по тангенсу
угла наклона которой можно найти значение и>. Полученные таким способом зна-
чения w довольно хорошо согласуются с рассчитанными по уравнению (11.25)
(Tanford, 1995; Breslow, Gurd, 1962; Stigter, Dill, 1990). Заметим, что в отсутствие
электростатических взаимодействий величина w равна нулю и уравнение (11.31)
сводится к уравнению Гендерсона—Хассельбаха, как и следовало ожидать для слу-
чая независимых и эквивалентных событий ионизации.
I 1.4. Теория Гуи—Чапмена
и поверхностный заряд мембраны
Поверхность биологических мембран обычно несет определенный заряд. Он
может быть обусловлен полярными головными группами в составе фосфолипи-
дов, зарядами аминокислотных остатков в мембранных белках и несущими заряд
углеводными компонентами мембранных гликопротеинов. Поверхностный за-
ряд мембраны оказывает влияние на распределение ионов в среде, и это влияние
описывается с помощью уравнения Пуассона—Больцмана в теории, разрабо-
танной Гуи и Чапменом (Gouy, Chapman). Данная теория была создана на 10 лет
раньше теории Дебая—Хюккеля, и эти две теории содержат поразительные па-
раллели (ссылки на оригинальные статьи см. в работах Overbeek, 1952; Latorre,
1992).
Чтобы применить уравнение Пуассона—Больцмана к распределению зарядов
на поверхности мембраны, в качестве единственной значимой пространственной
координаты следует использовать расстояние до поверхности, обозначаемое здесь
как х. В этом случае оператор Лапласа в уравнении (11.2) представляет собой про-
сто вторую производную. Уравнение Пуассона принимает тогда вид
^ = -^pW, (11.32)
dx 8
и уравнение Пуассона—Больцмана вид
сР<р(л) = _4лЛе10 Зу Zic^)eei”MlkT (11.33)
dx 8 V
В рассмотренной выше теории Дебая—Хюккеля на этом этапе анализа исполь-
зовано линейное приближение, поскольку переход к сферическим координатам
значительно усложняет математические расчеты. Однако в случае единственного
320
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
измерения можно найти точное решение уравнения Пуассона—Больцмана, не
прибегая к его линеаризации.
Вначале умножим уравнение (11.33) на интегрирующий множитель 2dcp(x)/dx
2d(P(x)d2<P(x) = 2 d<p(x) 4пеЯ10~3 у,, c^)c-WfQ(x>/jtr (11 34)
dx dx2 dx £ i
Теперь проинтегрируем обе части уравнения в пределах от х до оо
fdcp(x)^ ^d(p(oo)^ _ 871^7/410 у\.(оо)^е~*г,<р(*>/*г — e~gZ/<p(00>/*r) (11 35)
V dx ) V dx ) £ 1 k
Поскольку при x = оо функция ср и ее производная равны нулю, выражение преоб-
разуется к виду
= ^kTA\Q-y ^C.(oo)(e-«Z9(X)/^ (11.36)
В случае простой бинарной соли, такой как NaCl, z = ±1 и можно переписать
сумму в виде
fdcp(x)^ _ 871^7/410 С / -ey(x)/^T | ge<p(x)/^T 2) (1137)
I dx J £ 1 J
Извлекая корень квадратный из обеих частей уравнения, получаем выражение
d<p(x) _ Ял/сТАЮ 3С / -еф(х)/2АТ _ е«р(х)/2ЛТ\ _
dx V £
= 2 l8^7^10 3c.sinhfz£^'| (11.38)
V £ V 2кТ )
На первом этапе здесь использовано преобразование (e"fl/2 -ео/2)2 = е"° +е° -2.
Теперь следует проинтегрировать уравнение (11.38), чтобы получить функцию
<р(х). Однако вначале на основе полученного выражения необходимо установить
еще один важный момент. Определяя плотность распределения поверхностного
заряда о, мы должны принимать во внимание, что этот заряд уравновешивается
эквивалентной величиной заряда ионов противоположного знака, находящихся
в растворе. Заряд таких ионов равен интегралу функции р(х), и предполагаемый
баланс зарядов описывается уравнением
c = -jp(x)dx (11.39)
О
Выражая р(х) через ср из уравнения (11.32), получаем выражение
£ fd2(pdx - £ d(p(0)
47t'dx2 4т: dx
(11.40)
где вновь учитывается, что производная функции ср равна нулю при х = оо.
11.4. Теория Гуи—Чапмена и поверхностный заряд мембраны
321
Уравнение (11.40) связывает поверхностный заряд с электрическим полем
(градиентом потенциала), создаваемым поверхностным зарядом мембраны. Ис-
пользуем теперь уравнение (11.38), чтобы найти dcp(0)/dx в уравнении (11.40) и по-
лучить очень важное выражение, известное как уравнение Гуи—Чапмена
гкТЛЮ 3С ( -e^Q/2kT
1 2п (е
|2еАТЛ10"3с . .( есро
' п \2кТ )
(И.41)
где потенциал <р(0), обозначенный <р0, фигурирует как поверхностный потенциал.
Константа перед экспонентами сводится к выражению Vc/136, где о имеет размер-
ность заряд электрона на A2 (Latorre et al., 1992).
Если линеаризовать показательную функцию в уравнении (11.41) и воспользо-
ваться определением дебаевского радиуса (уравнение (11.9)), выражение сущест-
венно упрощается
о = —Фо (И.42)
4яЛ, □
Таким образом, поверхностный потенциал и поверхностный заряд прямопропор-
циональны один другому. Эта пропорциональность аналогична соотношению ме-
жду напряжением и зарядом в электрическом конденсаторе. Напомним, что ем-
кость такого конденсатора равна С -q/V. Аналогично этому в уравнении (11.42)
с/4лХ D = о/сро, т- е- e/4kXd — это эффективная емкость в расчете на единицу пло-
щади. Как и емкость конденсатора, она зависит от диэлектрической проницаемо-
сти среды, е; величину XD можно считать аналогичной расстоянию между пласти-
нами конденсатора. Такой характер распределения зарядов на поверхности, т. е.
наличие двух противоположно заряженных слоев зарядов, описывается понятием
двойной электрический слой.
Вернемся к уравнению (11.38). После его интегрирования и проведения неко-
торых преобразований получаем выражение
— = 1п
Xd
(е«р(^)/2АГ _|_ l)(e«₽o/2*r
(е«р(^)/2^Г _ l)(e«Po/2*r
(П.43)
При условии ey/2kT «1 с помощью линеаризации показательных функций мож-
но вновь упростить уравнение
(11.44)
отсюда
Ф = (рое'хА° (11.45)
Сравним полученное выражение с уравнением (11.17). Обе функции потенциала
убывают экспоненциально в зависимости от XD. Множитель 1/г в уравнении
322
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
(11.17) отражает сферическую форму ионного облака, окружающего центральный
ион.
При рассмотрении биологических систем представляет интерес случай, когда
ионная сила раствора низкая. Поскольку часть ионов должна оставаться вблизи
мембраны, чтобы сохранялась электронейтральность системы, концентрация ио-
нов непосредственно у поверхности мембраны стремится к ненулевому пределу,
в то время как концентрация их в общем объеме уменьшается. Для описания этого
процесса необходимо учесть тот отмеченный выше момент, что при высоких зна-
чениях потенциала <р0 значим только один из экспоненциальных членов в уравне-
нии (11.41). В случае отрицательно заряженной поверхности выражение для о име-
ет вид
О = -р.ГА19_3.£(е'яро/П7') (11.46)
V 2 л
При возведении этого выражения в квадрат получаем
о2 = е^Г^10 3 с^о/кт (11.47)
2л
Концентрация ионов, соответствующая распределению Больцмана, описывается
выражением
с(х) = с(оо)е’еф(х)МГ (11.48)
Таким образом, произведение се-ефоМГ в уравнении (11.47) представляет собой с0,
концентрацию ионов у поверхности мембраны. Учитывая это, можно записать
Итак, в случае разбавленного раствора с0 не зависит от концентрации в общем
объеме, с(оо). Этот вывод имеет интересные следствия для проницаемости ионных
каналов, в чем можно будет убедиться ниже.
Теория Гуи—Чапмена позволяет делать ряд важных прогнозов, которые до-
вольно легко проверить. К этому мы перейдем далее, после того как рассмотрим
ограничения этой теории и то, как они устраняются с помощью модификаций,
внесенных Штерном.
11.5. Поправки Штерна к теории Гуи—Чапмена
Теория Гуи—Чапмена неприменима к условиям высокой плотности зарядов
и сильного электрического поля. Выше, в разд. 11.2, мы рассматривали аналогич-
ные ограничения теории Дебая—Хюккеля. При величине поверхностного потен-
циала мембраны примерно 100 мВ (это довольно высокий, но вполне реальный
потенциал) экспонента в уравнении (11.48) равна е4 = 55. При с(оо) = 0,1 М концен-
трация притягиваемых поверхностью мембраны ионов непосредственно вблизи
этой поверхности составляет 5,5 М, что превышает концентрацию насыщения для
11.5. Поправки Штерна к теории Гуи—Чапмена
323
многих солей. Наименее всего данная теория соответствует случаю многовалент-
ных ионов, которые сильно взаимодействуют с заряженной поверхностью мембра-
ны и могут даже высокоспецифично связываться с ней. Эти ограничения теории
Гуи—Чапмена устраняются двумя модификациями, внесенными в нее Штерном
(см. Overbeek, 1952; Aveyard, Haydon, 1973).
Первая модификация вносит поправку на размеры ионов. Центр иона реально
не может находиться на расстояниях = 0 от поверхности мембраны. Минимальное
расстояние, на которое он может приблизиться, составляет один ионный радиус.
Следовательно, в непосредственной близости от поверхности мембраны имеется
зона, полностью свободная от ионов. Для учета этого к расстоянию х прибавляется
величина, равная радиусу иона. На первый взгляд это изменение кажется незначи-
тельным, однако энергия электростатического взаимодействия на поверхности не-
сущей заряд мембраны может быть довольно высокой и данная поправка в этом
случае играет существенную роль.
Вторая поправка позволяет учесть специфическое связывание ионов с опреде-
ленными участками на поверхности мембраны. Связывание может происходить,
если ион находится на расстоянии от поверхности, не превышающем его радиус,
т. е. на расстоянии х = а. Все ионы, взаимодействующие с поверхностью мембра-
ны, можно разделить на две группы. Первая группа — это связанные с поверхно-
стью ионы, образующие так называемый фиксированный электрический слой.
Вторая группа ионов располагается дальше от поверхности, чем первый слой, но
в пределах дебаевского радиуса. Эти ионы образуют второй слой, называемый
диффузным (рис. 11.4). Они не связаны с поверхностью мембраны, как ионы фик-
Рис. 11.4. А. Конденсация катионов, присутствую-
щих в растворе, у отрицательно заряженной по-
верхности. Часть этих катионов, связанная с по-
верхностью, образует фиксированный ионный
слой. Остальные катионы, распределенные в пре-
делах дебаевского радиуса, образуют диффузный
ионный слой. Толщина фиксированного слоя со-
ставляет х = а\ диффузный слой ограничен коор-
динатами от х = а до х ~ XD. Б. Зависимость потен-
циала от расстояния в этих областях различна.
В пределах фиксированного слоя потенциал сни-
жается линейно, тогда как в области диффузного
слоя он описывается уравнением (11.43), включаю-
щим <р(д) вместо фо-
Фикси- Диффузный
324
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
сированного слоя, но тем не менее находятся достаточно близко к ней, чтобы при-
тягиваться мембранным зарядом.
Условие баланса зарядов требует, чтобы плотности распределения зарядов
в этих двух слоях в сумме равнялись плотности распределения поверхностного за-
ряда мембраны
о=оф + од (11.50)
Индексы ф и д относятся к фиксированному и диффузному слоям соответственно.
Ионы фиксированного слоя находятся в состоянии равновесного связыва-
ния с мембраной (см. гл. 4). В случае взаимодействия катиона А с отрицатель-
но заряженным участком мембраны S" это равновесие описывается следующей
схемой
A++S’<=>AS (ИА)
Концентрации катиона и взаимодействующей с ним группы связаны при равнове-
сии соотношением
[AS] _к
c(a)[S’]
(11.51)
где с(а) — концентрация катиона А+ на расстоянии х = а от мембраны. Энергию
связывания можно разделить на две составляющие: химическую, равную ЯТЧпЛ'0,
и электростатическую, определяемую электростатическим потенциалом при рас-
стоянии х = а
RT\nK = RT\nK° + еАzcp(a)
(11.52)
Здесь KQ — константа связывания в отсутствие электростатического взаимодейст-
вия ионов с поверхностью мембраны.
Плотность распределения зарядов фиксированного слоя зависит от плотности
распределения фиксированных зарядов (связывающих участков) на поверхности
мембраны, а также от доли таких занятых участков. Зная плотность распределения
связывающих участков на поверхности мембраны (обозначаемую ps) и долю этих
занятых участков (выражаемую через концентрации [S~] и [AS]), можно составить
уравнение для плотности распределения зарядов фиксированного слоя
zeps [AS] zeps
[S-] + [AS] l + [S-]/[AS]
(11.53)
Выразим отношение [S ]/[AS] из уравнения (11.51) через концентрацию с(а) и
константу связывания, К
Q zeps __________________________zeps___________
* \ + \/(с(а)К) \ + \/(с(а)Ка&‘'Лг№{а}/кт)
(11.54)
Второе преобразование выполнено с учетом уравнения (11.52).
Чтобы найти плотность зарядов диффузного слоя, воспользуемся уравнением
(11.41), но вместо <р0 возьмем <р(а)
11.6. Поверхностный заряд мембраны и проводимость каналов
325
Ье/сТАЮ Зс . (-еср(а)Л ..
од = -J-----sinh —(11.55)
д V л I 2кТ )
Уравнения (11.54) и (11.55) выявляют соотношения между плотностями распреде-
ления зарядов в двух слоях и измененным поверхностным потенциалом <р(а).
Вернемся к аналогии с конденсатором (уравнение (11.42)). Фиксированный
и диффузный слои ионов действуют подобно двум конденсаторам, соединенным
последовательно. Их общая емкость при этом равна
с = £ф£д (11.56)
Сф + Сд
При высоких значениях ионной силы раствора большинство связывающих участ-
ков на поверхности мембраны занято и наибольшей емкостью обладает фиксиро-
ванный слой, в результате чего С обращается в Сд. При низкой ионной силе рас-
твора выше емкость диффузного слоя и С обращается в Сф.
Экспериментальный анализ распределения ионов на поверхности липида, не-
сущего заряд, подтвердил существование как фиксированного, так и диффузного
слоев (Bedzek et al., 1990), и для широкого ряда биофизических процессов теория
Гуи—Чапмена—Штерна удовлетворительно описывает ион-мембранные взаимо-
действия (McLaughlin, 1989).
С практической точки зрения наиболее существенным отличием теории
Гуи—Чапмена от теории Штерна является то, что в первой теории значение прида-
ется исключительно заряду иона. Согласно этой теории, различные ионы с одина-
ковыми зарядами должны вести себя одинаково. Другими словами, вместо иона
Na+ можно взять ион К+, NH4+ или ион тетраэтиламмония и результат от этого не
изменится. Аналогично этому, замена двухвалентных ионов, таких как Mg2+, Са2+
или Sr2*, также не должна влиять на результаты. Однако это справедливо только
для тех случаев, когда ионы не связываются с поверхностью, поскольку константа
связывания KQ специфична для каждого иона. Взаимодействие двух разных двух-
валентных ионов с поверхностью мембраны часто происходит различным образом.
Обычно это интерпретируют как доказательство связывания ионов с участками
мембраны и образования фиксированного слоя ионов.
11.6. Поверхностный заряд мембраны
и проводимость каналов
Проводимость ионных каналов зависит от концентрации соответствующих ионов.
Под влиянием поверхностного заряда мембраны ионы притягиваются к входу в ка-
нал, концентрируясь в этом участке, и в результате проводимость канала возраста-
ет, превышая значение, рассчитываемое на основе концентрации данного иона
в общем объеме. Согласно уравнению (11.48), концентрация проникающих ионов
с0 связана с поверхностным потенциалом следующим образом
Со =с(оо)е-ефоМГ
(Н.57)
326
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
Здесь cQ — это концентрация данного иона на поверхности мембраны и предполо-
жительно у входа в канал. Если поверхность мембраны несет заряд, при изменении
ионной силы раствора в результате внесения или удаления непроникающих ионов
поверхностный потенциал будет изменяться согласно уравнению (11.41) и вызван-
ное этим изменение с0 приведет к изменению проводимости канала. Таким обра-
зом, изменение поверхностного потенциала мембраны за счет непроникающих
ионов влияет на поток проникающего иона.
Этот эффект продемонстрирован для многих каналов. Например, проводи-
мость калиевого канала в клетках сердечной мышцы уменьшается при добавлении
различных иных ионов, таких как холин, Mg2+ и Са2+ (рис. 11.5). Проводимость ка-
нала падает вследствие того, что нейтрализуется отрицательный поверхностный
заряда и в результате снижается концентрация ионов К+ у входа в канал. При воз-
растании ионной силы раствора влияние поверхностного заряда мембраны ней-
трализуется и проводимость канала достигает величины, которая наблюдалась бы
в случае мембраны, лишенной заряда. В целом данный эффект хорошо описывает
теория Гуи—Чапмена. Уравнение (11.41) определяет поверхностный заряд как
функцию поверхностного потенциала. Это выражение можно обратить и записать
поверхностный потенциал как функцию ионной силы раствора и поверхностного
заряда мембраны (задача 6). Тогда, согласно уравнению (11.57), поверхностный
потенциал будет определять концентрацию ионов у входа в канал, пропорцио-
нальную проводимости канала.
Изменение концентрации проникающего иона позволяет выявить другой ин-
тересный эффект, связанный с поверхностным зарядом. Согласно уравнению
(11.49), при снижении концентрации иона в общем объеме до нуля его концентра-
ция на несущей заряд поверхности мембраны, с0, будет уменьшаться до конечного
предела. Это означает, что при уменьшении концентрации проникающего иона
проводимость канала в мембране, несущей поверхностный заряд, может снижать-
ся до ненулевого предела. Такой вывод кажется парадоксальным, поскольку при
нулевой концентрации иона нечему проводить ток.
80 -
70 -
Ъ
160-
!
о 50 - •. Двухвалентные
§ ’♦ катионы
S *.
§ 40 -
о
о.
с:
30 -
Одновалентные
катионы
20 -
Т-ПТ]----1--1 Г—ГТТТТ]----1---1 1 I I I I I |
1 10 100
[Непроникающие катионы], мМ
Рис. 11.5. Проводимость калиево-
го канала уменьшается при добав-
лении непроникающих ионов,
вследствие нейтрализации поверх-
ностного заряда мембраны. Пунк-
тирные кривые соответствуют пре-
образованному уравнению (11.41)
при ст = -0,23 заряд • нм-2. (По Kell,
DeFelice, 1988.)
11.6. Поверхностный заряд мембраны и проводимость каналов
327
В экспериментах на Са2+-активируемом калиевом канале в искусственных
мембранах наименьшая проводимость, наблюдавшаяся при низких концентраци-
ях К+, составляла примерно 30% максимальной проводимости при насыщающей
концентрации К+. Если путем изменения липидного состава мембраны нейтрали-
зовали заряд ее поверхности, величины тока, регистрируемого в каналах, были го-
раздо более низкими в результате снижения концентрации К+ (Moszydlowski et al.,
1985). Сходный результат был получен при химической модификации располо-
женных у входа в канал остатков глутамата путем удаления его отрицательно заря-
женной боковой цепи (MacKinnon et al., 1989).
Важно различать, локализован поверхностный заряд на липиде или на канало-
образующем белке. Уравнение (11.49) основано на допущении, что заряд равно-
мерно распределен по плоской поверхности. Однако в том случае, когда заряды
локализованы в молекулах каналообразующих белков, их распределение неравно-
мерное. Любой белок с большим или меньшим приближением можно считать то-
чечным зарядом на расстоянии, достаточно большом по сравнению с размерами
самого белка. Проведенный на основе этого допущения анализ позволил получить
численное решение уравнения Пуассона—Больцмана для формы канала, изобра-
женной на рис. 11.6, A (Cai, Jordan, 1990). Вычисляя проводимость канала как
функцию насыщения с0, эти авторы получили зависимость, при которой сохраня-
ются довольно высокие значения проводимости при снижении концентрации ио-
С(оо)
Липид
40-|
Рис. 11.6. А. Модель канала
с двумя несущими заряд участ-
ками в области входа. Б. Чис-
ленное решение уравнения Пу-
ассона—Больцмана (Cai, Jordan,
1990) выражает зависимость
концентрации ионов у входа
в канал, с0, от их концентрации
в общем объеме, с(оо). Это вы-
ражение количественно описы-
вает изменение проводимости
натриевого канала при измене-
нии концентрации Na+. (Экспе-
риментальные данные по Green
et al., 1987.)
10-
0 -I—I—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।
0,0 0,5 1,0 1,5 2.0 2,5 3,0 3,5 4,0
[NaCI]. M
328
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
нов в общем объеме и происходит резкое падение с0 (и, следовательно, проводи-
мости канала) после снижения концентрации в общем объеме до миллимолярного
уровня (рис. 11.6, Б). Такая зависимость четко определяется характером распреде-
ления ионов у входа в канал, и на основе этих опытов можно сделать важные выво-
ды о расположении фиксированных зарядов в каналообразующем белке.
11.7. Поверхностный заряд и регуляция канала потенциалом
Поверхностный потенциал мембраны непосредственно влияет на регуляцию ион-
ных каналов напряжением. Это объясняется тем, что напряжение, воздействую-
щее на воротные заряды канала, фактически представляет собой разность потен-
циалов на двух поверхностях мембраны (рис. 11.7). Таким образом, при изменении
поверхностного потенциала на одной или обеих сторонах мембраны должно изме-
няться электрическое поле, от которого зависит состояние канала.
Чтобы описать эту регуляцию канала поверхностным потенциалом, следует
в уравнении Больцмана для регуляции каналов напряжением (уравнение (1.28))
включить в параметр А И поверхностные потенциалы (см. рис. 11.7). Обозначив
разность фо-прав - Фо-лев как Афо> получаем выражение
= 1 . (ди-дио+Дфо)/к (11.58)
1 Т V
Если две стороны мембраны различаются по плотности распределения зарядов,
изменение концентраций ионов будет по-разному влиять на потенциал ф0 по раз-
ные стороны мембраны и, следовательно, будет изменяться разность Аф0. Если по-
верхностный заряд распределен одинаково на двух поверхностях мембраны, раз-
ность потенциалов Аф0 может изменяться при повышении или снижении концен-
трации ионов с одной из сторон мембраны.
Соответствующее влияние на состояние каналов продемонсрировано во мно-
гих работах (см. Hille, 1991, ch. 17). Изменение концентрации одновалентных ио-
88
Рис. 11.7. Напряжение от которого зависит состояние канала равно мембранному потенциалу,
д|/. минус разность поверхностных потенциалов каждой стороны мембраны На данном рисунке
знак мембранного потенциала меняется на противоположный из-за того, что поверхностный по-
тенциал на правой стороне мембраны выше, чем на левой
11.8. Электрофоретическая подвижность
329
нов вызывает, как правило, такие изменения в характере влияния потенциала на
канал, которые согласуются с теорией Гуи—Чапмена. В случае Са2+-активирован-
ного калиевого канала в мембране клеток скелетной мышцы потенциал-зависи-
мость состояния канала подчиняется уравнению Больцмана и при увеличении
концентрации К+ с одной из сторон мембраны от 1 до 150 мМ сдвигается пример-
но на 40 мВ (MacKinnon et al., 1989). Величину этого сдвига с хорошей точностью
позволяет рассчитать теория Гуи—Чапмена при о=-0,23 (элементарный заряд • нм-2).
В то же время в отношении многих каналов двухвалентные катионы вызывают раз-
личные сдвиги потенциал-зависимости их состояния, и это указывает на влияние
фиксированного ионного слоя, образующегося при специфическом связывании
ионов с определенными участками мембраны.
11.8. Электрофоретическая подвижность
Электрофорезом называют движение заряженных частиц в электрическом поле.
Сила, действующая на общий заряд Q со стороны поля, равна
F3 = EQ, (11.59)
где Е — напряженность электрического поля. Под действием электрического поля
движение частицы ускоряется, пока не будет достигнут баланс между действием
поля и сопротивлением движению со стороны трения. При достижении этого ба-
ланса частица начинает двигаться с постоянной скоростью (см. разд. 6.7). Сила
трения пропорциональна скорости движения частицы, v, и направлена противопо-
ложно ее движению (уравнение (6.58))
Лр = -Л (11.60)
где f — коэффициент трения.
Средняя скорость движения частицы отражает баланс между двумя действую-
щими на нее силами. Приравнивая силу F3 из уравнения (11.59) силе Е^ из уравне-
ния (11.60), получаем следующее выражение для скорости частицы при условии
баланса сил
(11.61)
Электрофоретическая подвижность и определяется из этого уравнения как отно-
шение скорости частицы к напряженности поля
и = — = — (11.62)
Е f
Использование выражения для коэффициента трения из закона Стокса (урав-
нение (6.65)) позволяет получить следующее выражение для электрофоретической
подвижности
« = (11.63)
6лТ|Я
330
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
где а — радиус частицы (рассматриваемой как сфера) и ц — вязкость. Однако для
раствора электролита уравнение (11.63) некорректно, поскольку противоионы, со-
ставляющие ионную атмосферу вокруг данной частицы, подвергаются электрофо-
резу в обратном направлении. Движение этих ионов приводит к возникновению
потока жидкости, который увлекает рассматриваемую частицу в направлении,
противоположном направлению ее движения под действием электрического поля
(рис. 11.8). В результате реальное значение и оказывается существенно более низ-
ким, чем рассчитанное по уравнению (11.63).
На первый взгляд может показаться, что для описания взаимодействий между
противоионами, жидкостью и поверхностным зарядом частицы требуется чрезвы-
чайно сложное выражение, однако электрокинетическая теория объясняет эти
взаимодействия весьма простым образом. Рассмотрим тонкий, как лист бумаги,
слой раствора на расстоянии х от поверхности частицы (рис. 11.8). В электриче-
ском поле этот слой смещается, поскольку содержит растворенные ионы. Дейст-
вующая на него со стороны поля сила равна Ep(x)Adx, где Adx — объем слоя. Со
стороны соседних слоев, движущихся с другими скоростями, на рассматриваемый
,dv
слои действуют силы вязкого сопротивления, равные -т]А—
.dv
^А—
dx
на расстоянии х и
dx
на расстоянии x+dx.
x+dx
При стационарном состоянии, когда рассматриваемая частица движется с по-
стоянной скоростью, жидкость течет вдоль линий электрического поля парал-
лельно поверхности частицы и чем ближе расположен слой к данной частице, тем
ближе скорости потока жидкости и движения частицы. Скорость движения каж-
дого слоя постоянна, т. е. результирующая всех сил, действующих на данный
слой, должна равняться нулю. Таким образом, сила действия электрического поля
Е
F = Ep(x)dxA
- д :
”11 dx
F-EcA
Рис. 11.8. Поверхность несущей заряд частицы в растворе электролита. Под действием нало-
женного электрического поля напряженностью Е положительно заряженная частица (показана
темно-серым) движется в одном направлении, а отрицательно заряженные противоионы —
в другом. Элемент объема раствора, Дбх (показан светло-серым) расположенный на расстоя-
нии хот поверхности несущей заряд частицы, подвергается воздействию наложенного электри-
ческого поля и сил вязкого сопротивления со стороны верхнего и нижнего слоев жидкости.
11.8. Электрофоретическая подвижность
331
равна сумме сил вязкого сопротивления со стороны верхнего и нижнего слоев
раствора
.dv
x+dx
г, z ч ., ^dv
£p(x)ndx = т|Л—
dx
Это выражение преобразуется следующим образом
d2v
£Р=Т1—у
dx
(11.64)
(11.65)
Выражая плотность распределения зарядов, р, из уравнения Пуассона (уравне-
ние (11.2)), получаем выражение
£e d2<p _ d2v
4л<1х2 ^dx2
(11.66)
Путем интегрирования найдем соотношение между первыми производными. На
расстоянии от заряженной частицы х = оо производные как ср, так и v равны нулю;
на больших расстояниях от частицы потенциал стремится к нулю и скорость тече-
ния жидкости постоянна. Таким образом, соотношение между производными ос-
тается постоянным
£е dtp _ dv
4л dx ^dx
(11.67)
Вновь применяя интегрирование с учетом, что <р(оо) = 0 и v(oo) = 0, получаем
Fp
-^<р(0) = r|v(0)
4л
(11.68)
Казалось бы, деление обеих частей этого уравнения на Е и т| должно дать выра-
жение для подвижности и = у/Е (уравнение (11.62)). Однако необходимо принять
во внимание тонкое различие между ср(О) в этом уравнении и ср0 в теории Гуи—Чап-
мена, описанной выше. Величина ср0 в теории Гуи—Чапмена означает потенциал
на таком расстоянии от заряженной частицы, где ион находится в непосредствен-
ном контакте с ее поверхностью. В отличие от этого <р(0) в уравнении (11.68) —
это потенциал на том расстоянии от заряженной частицы, где жидкость как бы
прилипает к частице и движется вместе с ней, т. е. скорость течения жидкости от-
носительно частицы обращается в нуль. Эти два «нулевых» потенциала неэквива-
лентны. Во избежание путаницы в выражении для электрофоретической подвиж-
ности вместо <р(0) используют символ £ и эту величину называют дзета-потен-
циалом. Итак, согласно уравнению (11.68), электрофоретическая подвижность
равна
у е£
и = — = ——
Е 4тгг|
(11.69)
Это выражение, впервые полученное Гельмгольцем и затем усовершенствован-
ное Смолуховским, названо уравнением Гельмгольца—Смолуховского (Overbeek,
332
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
Wiersema, 1967). В нем поражает то, что подвижность ионов не зависит от характе-
ра изменения ср и р при изменении х. Удивительным образом в уравнение (11.69) не
входят ни размеры, ни заряд частицы, хотя, по интуитивным представлениям,
электрофоретическая подвижность должна зависеть от этих параметров. Это мож-
но объяснить, если считать частицу большой сферой с равномерно распределен-
ным по поверхности зарядом, для которой из уравнения (11.17) можно найти по-
тенциал экранирования ее поля противоионами. Потенциал на расстоянии , т. е.
дзета-потенциал, равен
l + a/XD ?
(11.70)
В случае большой сферы ~ а и поэтому экспоненциальный член приблизительно
равен единице. Подставляя выражение для дзета-потенциала в уравнение (11.69),
получаем выражение (Benedek, Villars, 2000; section 3.1)
Q
(11.71)
w =
4лг|я(1+я/Х0)
Для частицы, размеры которой значительно превышают дебаевский радиус XD,
значение и, как можно видеть, гораздо ниже величины, рассчитываемой по закону
Стокса (уравнение (11.63)). В этом и кроется ответ на загадку. Заряд и размеры час-
тицы влияют на ее электрофоретическую подвижность косвенно, через величину
дзета-потенциала, что раскрывает уравнение (11.71).
В случае частиц, размеры которых сравнимы с XD, уравнение (11.71) менее
корректно, и при дальнейшем уменьшении размеров частиц электрофоретическая
подвижность приближается к значениям, характерным для мелких ионов. Более
подробное теоретическое исследование этих вопросов показывает, что определяю-
щее значение имеет отношение D. Если размеры частицы намного больше тол-
щины двойного ионного электрического слоя, уравнения (11.69) и (11.71) вполне
точно описывают скорость ее движения при электрофорезе (Overbeek, Wiersema,
1967).
Одним из объяснений удивительной простоты выражения для электрофорети-
ческой подвижности (уравнение (11.69)) может служить то, что движению частицы
препятствуют главным образом локальные взаимодействия ее поверхности с окру-
жающими ионами и жидкостью. В отличие от этого закон Стокса описывает сме-
щение жидкости как результат движения частицы (рис. 6.7), т. е. рассматривает по-
ток жидкости вокруг всей частицы.
Хотя электрофорез широко применяется в качестве аналитического метода для
определения характеристик белков и нуклеиновых кислот, а также их разделения,
исследователи лишь в редких случаях обращаются к теории, описывающей его на
количественном уровне. Между тем результат количественного расчета электро-
форетической подвижности зависит от учета многих деталей, например таких, как
форма молекулы белка и распределение заряда, поскольку заряды распределены
по поверхности белковых молекул неравномерно. В отличие от этого электрофоре-
тическая подвижность клеток и липосом хорошо описывается уравнением Гельм-
гольца—Смолуховского, т. е. изменение ионной силы раствора вызывает ожидаемые
изменения подвижности. При этом одновалентные ионы оказывают одинаковые
11.9. Растворы полиэлектролитов I. Экранирование по теории Дебая—Хюккеля
333
эффекты, в соответствии с теорией Гуи—Чапмена, тогда как эффекты многова-
лентных ионов специфичны, что объясняется их связыванием с поверхностью
^лембраны, которое учитывают поправки Штерна (McLaughlin, 1989).
11.9. Растворы полиэлектролитов I.
Экранирование по теории Дебая—Хюккеля
В случае полиэлектролитов, таких как ДНК и РНК, заряды распределены по всей
длине молекул, обычно с довольно высокой плотностью, и электростатический
потенциал вблизи поверхности молекулы существенно превышает величину кТ.
Для этих условий линеаризация экспоненты е-еф//сГ из распределения Больцмана
неприменима. Уравнение Пуассона—Больцмана имеет точное решение для случая
равномерно заряженного цилиндра, но только при том строгом ограничении, что
кроме противоионов полиэлектролита в растворе нет других ионов, т. е. отсутству-
ют другие соли (см. Oosawa, 1971). В этом разделе мы рассмотрим некоторые наи-
более широко применяемые, приблизительные и интуитивные теории (Manning,
1969; Oosawa, 1971).
Предположим, что вследствие отталкивания между зарядами полимерная мо-
лекула имеет вытянутую форму (рис. 11.9), когда каждый заряд q отделен от сосед-
них зарядов расстоянием Ь. Благодаря такому электростатическому отталкиванию
молекула ДНК, например, сохраняет свою стабильную вытянутую форму (см.
разд. 3.4). Рассчитаем потенциальную энергию на поверхности цепи ДНК. В каче-
стве исходного возьмем уравнение (11.17). В случае разбавленного раствора, когда
радиус XD превышает размеры индивидуальных несущих заряд групп в молекуле
полиэлектролита, можно считать вполне обоснованным приближение l + fl/XD~l.
Для одного заряда на молекуле полиэлектролита потенциал равен
(11.72)
-(r-a)/XD
ф(г) = ^-------
£Г
Это выражение для электростатического потенциала, в которое добавлен член
e"r/XD, отражающий эффект экранирования заряда противоионами.
Важно отметить, что величина X D вычисляется с учетом ионной силы раствора
соли. В случае присутствия полиэлектролита, зарядовое число которого (z) часто
может превышать 104, величина дебаевского радиуса должна была бы быть чрезвы-
чайно мала даже при его очень низких концентрациях. Однако полиэлектролиты
не так эффективно экранируют электростатические взаимодействия, поскольку их
заряд распределен по очень протяженной поверхности. Большая экранирующая
способность многовалентных ионов объясняется тем, что их заряд сконцентриро-
ван в одной точке.
।-------1
ь
Рис. 11.9. Схематическое изображение молекулы полиэлектролита линейной формы, в которой
заряды разделены отрезками длиной Ь.
334
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
Для упрощения анализа примем допущение, что молекулы полиэлектролита
не взаимодействуют между собой в силу их пространственной удаленности одна от
другой и взаимодействие происходит только между полиэлектролитом и окружаю-
щими его неорганическими ионами. При этом условии рассчитаем потенциал на
поверхности одной из заряженных групп, изображенных на рис. 11.9 в виде круж-
ков. Пронумеруем заряды на молекуле полиэлектролита, начиная с одного из ее
концов. Расстояние между зарядами с номерами i и j составляет \i — j]b, и потенци-
ал заряда /, экранируемый зарядом у, равен ^е(-,,’у,д/Хв)/е|/ - J\b) (величиной а в по-
казателе экспоненты можно пренебречь). Суммируя по j и включая в член для за-
ряда i сам этот заряд, получаем выражение
+ (Н.73)
га г ~ nb
Здесь первое слагаемое относится к z-му заряду и вычисляется по уравнению
(11.72) при г = а. Множитель 2 во втором слагаемом отражает факт взаимодействия
заряда с соседним зарядом с каждой стороны; бесконечность в верхнем пределе
суммирования означает, что молекула полимера очень длинная.
Далее примем эту сумму приблизительно равной интегралу по dx/b, что при
х = nb позволяет получить выражение
q 29re-x/XDdx
Ф = —+ ~т1--------- (П-74)
га гЬ * х
О
Заменяя x/XD переменной г, получаем следующее выражение
ф = ± + 2£ Г (11.75)
га гЬ z
b/kD
Этот интеграл нельзя вычислить аналитически1, но, когда b/kD мало (неравенство
b«'kD справедливо при низкой ионной силе раствора), его можно вычислить
приближенно следующим образом
(р = ^__2£1п± (11.76)
га гЬ Л,р
Это приближение обоснованно, поскольку при высоких значениях г значение по-
дынтегральной функции низкое. При Z>/XD ->0 интеграл возрастает, и это наблю-
дается в области значений показательной функции, близких к единице. Таким об-
1 Интегрирование по частям дает
। с dz _ е-г |n z + jq-z jn
Дальнейшее интегрирование по частям дает
ez lnz+ e’*(zlnz-z)+ je~z(z\nz-z)dz
Повторение этих действий приводит к появлению слагаемых вида e~zz‘ и e~zz‘ In г. При z = «> все
слагаемые обращаются в нуль вследствие того, что этот параметр присутствует в показателе степе-
ни. При z = b/kD все слагаемые малы по сравнению с первым ln(/?/XD)« -ln(/?/XD).
11.9. Растворы полиэлектролитов I. Экранирование по теории Дебая—Хюккеля
335
разом, при низких значениях b/\D данный интеграл должен быть подобен инте-
гралу 1Д, в котором преобладает отрицательная логарифмическая сингулярность.
i Теперь рассчитаем работу, совершаемую над ионами в растворе в результате
нриращения заряда всей цепи полимера. Эта задача аналогична задаче по вычисле-
нию работы в случае приращения заряда иона сферической формы (уравнение
(11.19)). Итак, проинтегрируем уравнение (11.76) в пределах от 0 до q
MZ ( 1 2 . b Vr ,. ,
W =--------In— \q&q =
\га &b
q2 q21 ь
= —----— In— =
2ед гЬ XD
2 2 2
=-^—- — \nb + — inXD (11.77)
2га гЬ гЬ
Мы разделили это уравнение, аналогично уравнению (11.18), на составляю-
щие, одна из которых зависит от концентрации соли, а две другие от нее не зави-
сят. Зависимость от концентрации соли (XD) в уравнении (11.77) полностью отра-
жается последним слагаемым. Два остальные слагаемые не зависят от наличия или
отсутствия соли. Чтобы выяснить, какое влияние оказывает соль на поведение по-
лиэлектролита, рассмотрим последнее слагаемое как работу, совершаемую над ио-
нами, в расчете на один заряд полиэлектролита, внедряемый в раствор
>T=^-lnXD (11.78)
гЬ
По Маннингу (Manning, 1969), данное уравнение выражает зависимость сво-
бодной энергии растворения несущего заряд полимера от концентрации соли.
Однако это не истинный предельный закон, подобный предельному закону Де-
бая—Хюккеля (уравнение (11.22)), поскольку данное выражение нежелательным
образом обращается в бесконечность, когда концентрация соли стремится к нулю
(lnXD ->оо). Причина неполной адекватности выражения (11.78) состоит в том,
что полимерную молекулу нельзя рассматривать как цепь бесконечной длины,
если величина XD достигает значения, сравнимого с длиной молекулы полимера.
Однако это условие относится к очень разбавленным растворам солей и уравне-
ние (11.78) справедливо для всех случаев, кроме крайне низких концентраций
соли.
С помощью уравнения (11.78) можно установить многие важные характеристи-
ки растворов полиэлектролитов. Например, если полиэлектролит оказывает влия-
ние на коэффициент активности определенного иона, это влияние можно опреде-
лить, продифференцировав уравнение (11.78) по концентрации данного иона
/<Г1 dW
кТ\пу, = —-
д
0Cj
/ 2
— lnXD
(11.79)
Используя выражение для X D из уравнения (11.9), определяем, что в случае бинар-
ной соли
336
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
dXD _____________
дс 2(q + с2 +ссУ
(11.80)
где С] и с2 — концентрации аниона и катиона, образующихся при диссоциации до-
бавленной соли, а сс — концентрация собственных противоионов полиэлектроли-
та. Дифференцирование уравнения (11.79) с использованием данного выражения
позволяет получить выражение (Manning, 1969)
AT In у =-----------
2гЬ(с} +с2+сс)
(11.81)
IIJ0. Растворы полиэлектролитов II.
Конденсация противоионов
Приведенный выше анализ экранирования заряда противоионами (теория Де-
бая—Хюккеля) применим только для полиэлектролитов с низкой плотностью рас-
пределения зарядов. Когда эта плотность высокая, полиэлектролит притягивает
ионы настолько сильно, что вызывает особый вид связывания, называемый кон-
денсацией противоионов (Oosawa, 1971). Чтобы объяснить этот феномен, использу-
ем модель, в которой распределение зарядов, изображенных на рис. 11.9, усредне-
но по всей молекуле, т. е. заряд как бы размыт по всей длине цепи.
При анализе очень тесного взаимодействия экранированием Дебая—Хюккеля
можно пренебречь. В случае иона, несущего заряд qh электростатический потен-
циал определяется взаимодействием этого иона с линией зарядов, плотность рас-
пределения которых равна qjb. Таким образом, данный потенциал можно вычис-
лить как интеграл функции 1/г, выражаемый в виде логарифмической функции
<p(r) = -^lnr, (11.82)
гЬ
где расстояние г мало по сравнению с длиной молекулы полиэлектролита.
Далее для вычисления вклада взаимодействия ион—полиэлектролит в функ-
цию распределения системы полиэлектролит—ионы используется классический
конфигурационный интеграл (уравнение (1.4))
Я = Mje’<₽('')/*r27irdr (11.83)
о
Появление множителя 2лг в этом уравнении связано с использованием системы
полярных координат; гмакс — это произвольно большое расстояние, величина кото-
рого не имеет существенного значения, в чем можно будет убедиться ниже. Под-
ставляя в уравнение (11.83) выражение для потенциала из уравнения (11.82), полу-
чаем
гмш(с гмакс । |
Q= J rMr2nrdr=2n j r MTdr (11.84)
0 0
11.10. Растворы полиэлектролитов II. Конденсация противоионов
337
Решать этот несложный интеграл здесь нет необходимости, но важно обра-
тить внимание на качественные различия его поведения в зависимости от того,
больше или меньше, чем -1, показатель степени в экспоненциальной функции г.
Если 1 + (2^ q2 )/(ebkT) < -1, интеграл расходится; если данный показатель степени
больше -1, интеграл сходится. Это позволяет определить величину q2)/(^bkT)\
Цк основной параметр плотности распределения заряда в молекуле полиэлектро-
лцта. При
£>1 (11.85)
расхождение интеграла в уравнении (11.84) означает, что система полиэлектро-
лит—ионы обладает очень высокой свободной энергией и поэтому нестабильна.
Напротив, при
£<1 (11.86)
должно иметь место обычное экранирование полиэлектролита противоионами,
адекватно описываемое теорией Дебая—Хюккеля, рассмотренной выше.
По предположению Маннинга (Manning, 1969), в случае нестабильной систе-
мы (см. выражение (11.85)) ионы, присутствующие в растворе, концентрируются
вокруг молекулы полиэлектролита, уменьшая в ней эффективную плотность рас-
пределения зарядов. Концентрирование ионов должно продолжаться до тех пор,
пока Е, не снизится до 1. При этом эффективное среднее расстояние между заряда-
ми возрастет до нового значения которое определяется уравнением
= 1
%эфф
(11.87)
Поведение полиэлектролита в этом состоянии соответствует значению b = Та-
ким образом, конденсация противоионов на полиэлектролите уменьшает плот-
ность распределения зарядов в его молекуле до такого значения, при котором кон-
фигурационный интеграл сходится. Точно определять природу этого связанного
или конденсированного состояния нет особой необходимости; конденсация про-
тивоионов не зависит от их химической природы и определяется только их заря-
дом. Независимо от вида внесенных в раствор ионов, с полиэлектролитом связы-
вается одно и то же их количество, при условии что ионы имеют одинаковый за-
ряд. Таким образом, конденсация противоионов не характеризуется химической
специфичностью, как и экранирование противоионами, описываемое теориями
Дебая—Хюккеля и Гуи—Чапмена.
Расстояние между несущими заряд группами в молекуле полимера, при кото-
ром £ = 1, составляет b = 7,1 А при температуре Т = 298 К и условии, что qx и q2 —
одиночные заряды. В молекулах многих полиэлектролитов расстояние между заря-
дами более короткое, поэтому для них весьма характерна конденсация противоио-
нов. В случае ДНК длина отрезка Л = 1,7А. Можно рассчитать, сколько зарядов
должно связаться с ДНК, чтобы это расстояние увеличилось до 7,1 А. Поскольку
величины Е, и ^эфф пропорциональны плотности распределения зарядов в молекуле
электролита до и после конденсации противоионов соответственно, относитель-
ная доля зарядов полиэлектролита, нейтрализованных противоионами, составляет
(£- £эфф)А = (^ -1) А и доля остальных зарядов — Д = 1Д. В случае ДНК ^ = 4,2
338
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
и, следовательно, доля зарядов, нейтрализованных одновалентными противоиона-/
ми, равна 0,76. Эта теоретически рассчитанная величина соответствует экспери-
ментальным данным для различных противоионов в широком диапазоне их конА
центраций (см. обзор Manning, 1978).
Для конденсации противоионов, как показывает ее анализ, характерно то, что
фракция связанных ионов остается постоянной независимо от изменения концен-
трации соли в общем объеме раствора. Для обычного процесса связывания это не
характерно (см. гл. 4). Теоретически должно происходить постепенное изменение
доли занятых связывающих участков при изменении концентрации лиганда, одна-
ко конденсация противоионов не подчиняется закону действующих масс. Это объ-
ясняется большой протяженностью области электростатического потенциала, ко-
торый распределен по всей длине линейной цепи зарядов. Выше мы установили,
что потенциальная энергия системы полиэлектролит—ионы, равная сумме куло-
новских потенциалов для всех зарядов в молекуле полимера, увеличивается по ло-
гарифмическому закону с увеличением XD (уравнение (11.78)). Разбавление рас-
твора приводит к увеличению XD и усилению притяжения противоионов. Это уве-
личение XD точно эквивалентно возрастанию энтропии как движущей силы
диссоциации — энтропия также изменяется по логарифмическому закону. Балан-
сом этих двух логарифмических составляющих энергии взаимодействия и обуслов-
лено постоянство доли нейтрализованных зарядов на молекуле электролита. Про-
тивоионы диссоциируют от полиэлектролита только при очень низкой концентра-
ции соли, т. е. когда дебаевский радиус XD становится больше длины молекулы
полиэлектролита. В случае, например, ДНК, состоящей из 1000 пар нуклеотидов и
имеющей длину 3500 А, дебаевский радиус в растворе NaCl равен длине этой моле-
кулы ДНК при концентрации соли ~1 мкМ.
В некоторой степени сходные свойства, объясняемые наличием в молекуле
большого числа зарядов, характерны и для полиэлектролитов нелинейной формы.
Противоионы аналогичным образом нейтрализуют определенную долю их заряда.
Эта доля, а также количество конденсированных противоионов хотя и не постоян-
ны, как в случае линейных макромолекул, но изменяются лишь очень незначи-
тельно при изменении концентрации соли (Oosawa, 1971).
I l.l I. Плавление ДНК
В двухцепочечной ДНК основным дестабилизирующим фактором служит оттал-
кивание между отрицательно заряженными фосфатными группами. Присутствую-
щие в растворе ионы экранируют это отталкивание, стабилизируя двойную спи-
раль и повышая температуру плавления ДНК. Как показывают эксперименталь-
ные данные, температура плавления ДНК повышается пропорционально
логарифму концентрации соли. Это можно объяснить на основе объединения двух
эффектов — экранирования противоионами по теории Дебая—Хюккеля и конден-
сации противоионов, описанной в предыдущем разделе.
Рассмотрим равновесие между одноцепочечной и двухцепочечной формами
ДНК, когда высвобождается или связывается i противоионов (схема 11 Б)
D«=>2S + ZA+, (НБ)
11.11. Плавление ДНК
339
где D и S обозначают двухцепочечную и одноцепочечную ДНК соответственно
У катион обозначен как А+. Хотя переход спираль—клубок не соответствует модели
перехода между двумя состояниями (см. разд. 3.12), примем его приближенно за
процесс, описываемый такой моделью, и будем рассматривать схему (11Б) как пе-
реход между двумя состояниями одной единицы кооперативности. Такое упроще-
ние допустимо, поскольку цдс главным образом интересует здесь температура
плавления, а не тип перехода.
Равновесие по схеме (ИБ) характеризуется константой равновесия
(11.88)
[D]
Изменение свободной энергии при этом представляет собой функцию концентра-
ции соли
Д(7 = AG' + iRTlnc, (11.89)
где ДО' включает все вклады в свободную энергию системы полиэлектролит— ио-
ны, кроме вклада, обусловленного связыванием противоионов соответственно за-
кону действующих масс. Таким образом, указанную свободную энергию, ДО', со-
ставляют энергия взаимодействия между цепями ДНК, энергия сольватации и
энергия экранирования по теории Дебая—Хюккеля.
Для описания процесса плавления вначале воспользуемся полученными выше
выражениями для конденсации противоионов, чтобы определить разницу, /, в ко-
личестве противоионов, связанных одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. Доля
заряда на полиэлектролите в отсутствие конденсации противоионов составляет
1/ £ (см. выше). В растворе в свободном состоянии присутствует соответствующее
количество противоионов. Обозначим плотность распределения зарядов в двухце-
почечной и одноцепочечной ДНК как £,дц и ^оц соответственно и запишем выра-
жение для изменения числа свободных противоионов в процессе плавления
/ = (H.90)
Sou Чдц
Теперь рассмотрим зависящий от концентрации соли электростатический
вклад в ДО'. Этот вклад, обозначаемый ДСЭЛ, определяется взаимодействием меж-
ду полиэлектролитом и его ионной атмосферой. При анализе эффекта экраниро-
вания заряда по теории Дебая—Хюккеля мы получили выражение (11.78), опреде-
ляющее работу по внедрению полиэлектролита в раствор соли в расчете на одну
несущую заряд группу. Перепишем это выражение в виде ЛТ^эфф lnXD и разделим
его на £ для учета доли зарядов, не нейтрализованных противоионами. Умножив
полученное уравнение на число Авогадро (замена множителя кТмножителем RT),
мы получаем выражение для свободной энергии в расчете на моль. Поскольку
^эфф =Ь разность электростатических вкладов в случаях двухцепочечной ДНК и
одноцепочечной ДНК составляет
1
mi
In А.0
(11.91)
340
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
Объединяя это выражение со слагаемым iRTln с из уравнения (11.89), отра-
жающим закон действующих масс, и подставляя значение i из уравнения (11.90),
получаем следующее выражение для свободной энергии системы
\G = \G,,+
- — |яЛпА.о + I ----— brine
Uou М
(11.92)
Второе и третье слагаемые в правой части этого уравнения отражают вклад экрани-
рования зарядов противоионами и вклад конденсации противоионов соответст-
венно; ДО"— это разность ДО'и ДСэд. Как и выше (в уравнениях (11.18) и (11.77)),
мы разделили свободную энергию на составляющие, зависимые и не зависимую от
концентрации соли, и теперь определим влияние концентрации соли на свобод-
ную энергию рассматриваемой системы.
Как следует из уравнения (11.9), величина XD пропорциональна 1/7с.
Соответственно мы можем перенести независимый от концентрации соли множи-
тель при XD из среднего слагаемого в правой части уравнения (11.92) в слагаемое
ДС" и получить в результате вклад в свободную энергию, независимый от концен-
трации соли, ДСнкс. Поскольку In 1Д/с = -1/2 In с, можно соединить два слагаемые
в уравнении (11.92), зависимые от концентрации соли, следующим образом
Д(7 = Д(7НКС + J-I —-------— ЯТЧпс
П КС j I ? и I
\Чоц Чдц/
(11.93)
Это весьма важное уравнение, показывающее, как влияет концентрация соли
на равновесие между одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. Чтобы найти тем-
пературу плавления, заменим ДСнкс разностью ДЯНКС - 7Д5НКС и примем Т равной
температуре плавления, Гпл, при которой значения свободной энергии одноцепо-
чечной и двухцепочечной ДНК равны. В этом случае ДО = 0
0 = ДЯнкс - ^плА^нкс +т1 ----------— |ЯГПЛ Inc
пКС ПЛ пки / I и к I нл
\Чоц Чдц)
(11.94)
Решая это уравнение относительно Гпл, получаем выражение
у ________________А/7НКС____________
(11.95)
Данное уравнение показывает, что температура плавления возрастает при уве-
личении концентрации соли. Эта зависимость будет более четко ясна, если упро-
стить выражение. С учетом того, что Д5НКС больше второго слагаемого в знаменате-
ле, дробь можно раскрыть, пользуясь правилом 1 / (1 - х)«1 + х
А И
у ~ ^-“нкс 1
1 ПЛ до j
^^нкс
1(1 1 DT >
2ASHKcUou
(11.96)
Таким образом, зависимость Тп„ от Inc носит линейный характер; тангенс угла
наклона соответствующего графика равен
Задачи
341
[Na+], М
АЯНКС Г 1_____L_ — ^^плнкс f 1__1 (1197)
2A^KcUou U) 2ДЯнДи
где величина Д5НКС выражена как ДЯНКС /Тппнкс}
Уравнение (1 L.96) описывнеч линейную зависимость Гпл от логарифма концен-
трации соли. Соответствие этой мнисимости экспериментальным данным иллю-
стрирует рис. 11.1*0» В случае ДНК £ ли ~ 4,2. Величину ДЯ° можно измерить кало-
риметрическим способом либо рассчитать по уравнению Вант-Гоффа (уравнение
(1.19)). Тогда остается одно неизвестное — ^оц в правой части уравнения (11.97).
По тангенсу угла наклона экспериментально полученных графиков, подобных
изображенному на рис 11.10, можно вычислить значение £оц -1,7 (Record, 1975).
Этот результат согласуется с тем, что одноцепочечная ДНК содержит вдвое мень-
ше фосфатных групп и имеет нес колько большую длину по сравнению с двухцепо-
чечной ДНК. Данное уревнонак хорошо соответствует многочисленным экспери-
ментальным данным по влиянию концентрации соли на температуру плавления
ДНК (Manning, 1978). Таким образом, с учетом двух эффектов — экранирования
противоионами и конденсации противоионов — установлена вполне адекватная
математическая зависимость относительной стабильности одноцепочечной и
двухцепочечной ДНК от концентрации соли.
Задачи
1. Вычислите XD при 25 мМ и 50 мМ концентрациях NaCl. Проведите аналогичный
расчет для раствора MgC^.
2. Продемонстрируйте, что интегрирование функции р(г) (уравнение (11.23)) по объ-
ему дает общий заряд противоионов, точно компенсирующий заряд иона.
1 Гплнкс— это температура плавления для фиктивного, независимого от концентрации соли
состояния, не равная Гпл, однако разность между этими двумя значениями температуры на шкале
абсолютной температуры невелика.
342
Глава I I. ИОНЫ И ПРОТИВОИОНЫ
3. Определите расстояние, на котором плотность распределения зарядов максималь-
на по теории Дебая—Хюккеля (максимум функции (11.23)).
4. Вычислите общий заряд противоионов внутри окружающей ион сферы радиусом
XD-
5. На основе предельного закона Дебая—Хюккеля составьте уравнение зависимости
простого равновесия реакции ионизации А++ В"<=> АВ от ионной силы раство-
ра, не учитывая вклады концентраций А+ и В" в /.
6. Преобразуйте уравнение (11.41), чтобы выразить потенциал ф0 через с и а (см. при-
ложение 5).
7. Продемонстрируйте, что поверхностный потенциал для сферы (уравнение (11.18))
равен потенциалу для плоскости (уравнение (11.42)), когда радиус сферы а » XD.
Это означает, что теория Гуи—Чапмена справедлива для поверхностного потен-
циала мембраны сферической клетки.
[нйэнып. тэваыэыпо (д^. 1А
MNONHBC йоте эывтэтэвто<
>= св^пэа .01.
ЖВЛ'йЛ
о охакохээн тээмы n nnyq
' лшосюх эынэнавоу эонн
Глава 12
Флуктуации
Биологические системы часто флуктуируют в большей степени, чем типичные фи-
зические и химические системы. Это отражает крупные размеры многих биологи-
ческих молекул и малые размеры клеток. Молекулярная природа вещества вызы-
вает флуктуации в любом мыслимом свойстве системы. Выявить такие флуктуации
может быть легко или трудно, и критическим фактором при этом являются разме-
ры системы. В системе, состоящей из N молекул, многие измеряемые величины
пропорциональны N, а флуктуации — А172. Тогда флуктуации относительно сред-
него уменьшаются с размером системы как А-172. Когда ^сравнимо с числом Аво-
гадро, выявить флуктуации с помощью измерений, проводимых стандартными
методами, становится довольно сложно. Безусловно, существуют весьма чувстви-
тельные методы измерений, которыми можно воспользоваться. Так, можно фик-
сировать сигналы от одиночных молекул; флуктуации этих сигналов будут отра-
жать вероятностную природу молекулярной активности. Во многих случаях, когда
сигналы от одиночных молекул настолько малы, что их не удается зафиксировать,
можно определять суммарные флуктуации. Специфические масштабы размеров,
характерные для живых объектов, обусловливают уникальные виды флуктуаций,
особо интересные для изучения.
О флуктуациях упоминалось выше в гл. Зв связи с конформациями макромо-
лекул и в гл. 6 в связи со случайным движением. Вероятность флуктуаций может
быть рассчитана, когда для определения количественных молекулярных характе-
ристик используются методы статистической механики, и во многих случаях ана-
лиз флуктуаций позволяет получить важную информацию. Изучение флуктуаций
становится при этом эффективным экспериментальным подходом, с помощью ко-
торого можно осуществлять проверку моделей и определять молекулярные пара-
метры. Кроме того, анализ флуктуаций имеет практическое значение для умень-
шения шума при инструментальных измерениях, из-за которого ограничивается
круг объектов измерения. Наконец, поскольку флуктуации представляют собой
неотъемлемую характеристику молекулярной активности, их изучение позволяет
полнее раскрыть механизмы функционирования биологических молекул.
12.1. Отклонения от среднего
Для количественной оценки флуктуаций существует ряд способов. Плотность рас-
пределения вероятностей отражает то, как часто наблюдаются те или иные значе-
ния из массива. Знакомое по предыдущим главам больцмановское распределение
показывает, как варьирует величина энергии молекул. В то же время во многих
344
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
случаях требуется определить величину флуктуаций, выраженную одним числом.
Для этого обычно используют величину отклонения от среднего значения,
Дх = х - х. Однако усреднение данной величины дает в результате нуль, и, чтобы не
сталкиваться с этим, вычисляют среднее квадратичное отклонение, или диспер-
сию, Дх2 = (х -х)2. Возведение в квадрат перед усреднением позволяет избавиться
от проблемы сокращения положительных и отрицательных отклонений. Выраже-
ние Дх2 можно привести в более удобную форму, раскрыв скобки
Дх2 = (х -х)2 = х2 -2хх +х2 = х2 -х2 (12.1)
Это наиболее распространенный способ представления флуктуаций. Данную
величину, Дх2, называют дисперсией х. Если извлечь корень, мы получим знако-
мое среднеквадратичное отклонение, преимущество которого состоит в том, что
оно имеет одну размерность с измеряемой величиной х.
Рассмотрим, что произойдет, если сложить две независимые случайные вели-
чины
Д(х + у)2 = (х + у-х + у)2 = х2 - 2хх + х2 + у2 - 2уу + у2 + 2ху-2х у (12.2)
Если хи у взаимно независимы, имеет место равенство ху = х у. При этом условии
выражение значительно упрощается
Д(х + у)2 = х2 -х2 + у2 - у2 = Дх2 + Ду2 (12.3)
Таким образом, независимые флуктуации складываются как их квадраты. Если
принять величины флуктуаций за катеты прямоугольного треугольника, их сумма
будет гипотенузой, вычисляемой по теореме Пифагора. Это свойство является
важным и общим для флуктуаций; оно позволяет непосредственно обобщить дан-
ную аддитивность для произвольного числа независимых величин.
Такой способ определения открывает путь для изучения флуктуаций, однако
имеется небольшая часть информации, которую среднеквадратичное отклонение
не может дать. Оно характеризует только ширину распределения, но ничего не го-
ворит о его форме. В то же время распределение может быть, например, асиммет-
ричным, т. е. может содержать больше положительных отклонений по сравнению
с отрицательными. Функция распределения в этом отношении более информатив-
на, но, даже имея полную функцию распределения, мы ничего не можем узнать
о скорости флуктуаций. В действительности, если система флуктуирует очень мед-
ленно, велик риск того, что измерения Дх2, произведенные на коротком отрезке
времени, не будут достоверно отражать реальные значения. Методы количествен-
ного анализа временной шкалы флуктуаций будут описаны ниже.
12.2. Флуктуации числа молекул и распределение Пуассона
В тех очень малых объемах, которые характерны для клеток и их органелл, число
молекул должно быть очень невелико, и в результате флуктуаций оно может откло-
няться от среднего весьма значительно. Чтобы описать эти флуктуации количест-
венно, необходимо получить распределение вероятности числа молекул в неболь-
12.2. Флуктуации числа молекул и распределение Пуассона
345
Рис. 12.1. Малый объем v внутри большого объема V содержит пере-
менное число молекул.
шом объеме. Выделим в достаточно большом замкнутом объеме Vочень малень-
кий элемент объема, v (рис. 12.1). Если V содержит N независимых молекул,
вероятность того, что каждая молекула попадет в элемент v, равна р = v/V. Вероят-
ность того, что в объеме v содержится т молекул, описывается биномиальным рас-
пределением
(12.4)
(N-mY.ml
Полагая, что величина р мала и возможные значения т очень малы по сравне-
нию с N, можно сделать несколько оценочных приближений. Прежде всего запишем
выражение Nl(N-m)l= Аг(Лг-1)(УУ-2)...(Лг-7л + 1) ~Nm. Из этого выражения сле-
дует, что N\pm/(N-т)\ -(NpY1. Далее, мы знаем, что выражение Np = m (уравнение
__ N_ -L(/V-т)р
(6.37)) дает нам т т. Член (1 - р) т можно записать в виде (1 - р)р .В этом виде
он сходен с выражением lim(l-x)1/x = е"1 (близким к формальному определе-
х->0
нию е как lim(l + x)l/x), следовательно, мы получаем (1-p)N~m ~ e"(yv"'n)p. Наконец,
х->0
можно использовать выражение Np = m в показателе экспоненты (N-т)р - Np
и получить e"w. Разбивая правую часть уравнения (12.4) на соответствующие мно-
жители и заменяя их соответствующими оцененными значениями, мы получаем
упрощенную форму уравнения (12.4)
(12.5)
Это выражение представляет собой распределение Пуассона. Если взять т из
концентрации, можно легко вычислить вероятность обнаружения т молекул в ма-
лом объеме.
На рис. 12.2 изображены графики распределения Пуассона для различных зна-
чений т. При т = 0,5 вероятность отсутствия молекул в малом элементе объема
(т = 0) составляет 0,61. С возрастанием т эта вероятность монотонно падает. При
т = 2 данная вероятность максимальна для т = 1 или 2. При т = 10 распределение
почти симметричное, центр его близок к/й. При значениях т в этом интервале или
более высоких становится трудно определить различия между распределением Пу-
ассона и исходным биномиальным распределением (уравнение (12.4)).
Важно учитывать, что информация о размерах системы (величина N) была ут-
рачена при переходе к пределу, когда выводилось распределение Пуассона. Вели-
чина 2Vфигурирует в исходном выражении (12.4), но исчезает в процессе преобра-
зований. Таким образом, общее число молекул более не является значимым. Если
N недостаточно велико, а р недостаточно мало, чтобы можно было делать прибли-
346
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
жения, ведущие к выражению Пуассона, рассматриваемое распределение будет за-
висеть от N, и можно было бы ожидать, что Nпредставляет собой свободный пара-
метр. Однако в пределе Пуассона это невозможно; N нельзя определить из наблю-
даемого распределения. На практике даже довольно сложно понять по
измеренному распределению, насколько реально оценить N по данным измерения
флуктуаций.
Распределение Пуассона обладает рядом математических свойств, помогаю-
щих анализировать флуктуации. Заметим, что тт/т\ является членом ряда Тейло-
ра для функции е'” (уравнение (П1.4))
= (12.6)
^о">!
Суммирование уравнения (12.5) для т от нуля до бесконечности дает выражение
е'"е"'" = 1. Это ожидаемый результат, поскольку сумма вероятностей всех возмож-
ных исходов должна быть равна единице.
Уравнение (12.6) можно использовать для проверки того, что т действительно
среднее
iTo
(12.7)
Первый член этой суммы равен нулю, поэтому суммировать можно по т от едини-
цы до бесконечности
Сравнивая это уравнение с уравнением (12.6), можно видеть, что сумма равна е'”,
и, таким образом, правая часть уравнения сокращается до т.
Чтобы определить среднеквадратичное отклонение от среднего, вначале опре-
делим т2 следующим образом
-- —-2 zn rrrzn оо «Mzrrzn—1
т2 = ^Р(т) = = гпе” (12.9)
т т т' ^(/Я-1)!
12.3. Статистика восприятия света глазом
347
Здесь также первый член равен нулю, и, следовательно, мы можем осущест-
вить ту же процедуру, что с уравнением (12.8), и в результате получить выражение
2
т
Z К
у mm _ _e_s у (т - 1)т + у т______
.Хо(^-1)! I^Xo Ои-D’ .Xo(^-l)!j
(12.10)
Сравнивая это уравнение с уравнением (12.8), можно видеть, что первая сумма со-
ставляет ет. Согласно уравнению (12.6), вторая сумма равна ew, что дает
т2 = те т (те т + е т) = т2 +т (12.11)
Используя эти результаты для преобразования уравнения (12.1), мы получаем вы-
ражение для среднеквадратичных отклонений распределения Пуассона
7Aw2 = 7/л2 -т2 = ^т2 + т -т2 = ЛЙ (12.12)
Вернувшись к рис. 12.2, отметим, что действительно распределение становится
шире с возрастанием т. Однако величина отклонения относительно среднего па-
дает как 4^т2/т = \/ЛИ. Это свойство распределения будет использовано ниже
для оценки порогового количества фотонов, необходимого для восприятия света
человеческим глазом (см. разд. 12.3).
Прежде чем идти дальше, кратко опишем использование распределения Пуас-
сона для решения задачи, поставленной в начале этого раздела, — количественного
анализа флуктуаций числа молекул в малом объеме. Рассмотрим куб объемом 1 мкл,
или 10"15 л. При нейтральном pH величина [Н+] равна 10"7 М. Умножая произведе-
ние этих величин, 10"22 моль, на число Авогадро получаем, что при pH 7 в микро-
литровом кубике содержится в среднем 60 ионов Н+. Согласно уравнению (12.12),
среднеквадратичное отклонение от этого среднего значения составляет 7б0 = 7,7.
Таким образом, число ионов Н+ в кубе воды объемом 1 мкл флуктуирует в пределах
~ 12%. Концентрации сигнальных молекул или регуляторных белков в клетках могут
быть меньше. Итак, для данных условий значение т близко к единице и тогда сред-
неквадратичные отклонения близки к величинам средних значений.
12.3. Статистика восприятия света глазом
Глаз человека способен видеть очень слабые вспышки света. Реальное число фото-
нов, необходимое для восприятия света, настолько мало, что флуктуации в этом
процессе очень велики. Они проанализированы с использованием статистики Пу-
ассона в классической работе по изучению зрительного световосприятия (Hecht et al.,
1942; см. Aidley, 1978, ch. 17 либо Benedek, Villars, 2000).
Схема проведенного в этой работе эксперимента изображена на рис. 12.3. Ис-
точник света, настолько малый, что его можно считать точечным, фокусировался
Рис. 12.3. Экспериментальная схе-
ма измерения порога восприятия
света человеческим глазом.
348
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
на сетчатке глаза глазными линзами. Все условия были оптимизированы для повы-
шения чувствительности световосприятия следующим образом. Свет фокусирова-
ли в наиболее чувствительной области сетчатки (с отклонением на несколько гра-
дусов от центральной ямки — участка, где острота зрения максимальна), для чего
испытуемый фокусировал взгляд на другом предмете. Зрение испытуемого предва-
рительно было адаптировано к темноте (он находился более 20 мин в темной ком-
нате). Длина волны света и продолжительность вспышки были выбраны опти-
мальным образом. В небольшом участке сетчатки глаза, на который падает луч све-
та, находится множество фоторецепторных клеток, содержащих очень большое
число молекул родопсина. Поглощение фотона любой из этих молекул родопсина
вносит вклад в световосприятие. Если исходить из наличия большого числа моле-
кул родопсина и предположить далее, что поглощение света всего несколькими из
них обеспечивает достижение порогового уровня и тем самым восприятие света, то
имеются условия для применения распределения Пуассона — большое значение N
и малое значение р.
Распределение Пуассона позволяет определить вероятность поглощения тако-
го числа фотонов, которое выше порогового значения, тп. Для этого суммируются
все члены распределения Пуассона при т > mQ
Р(т>т^) = (12.13)
т'.
Отметим, что среднее число поглощенных фотонов, т, изменяется с изменением
интенсивности света. Однако при любом конкретном т испытуемый может уви-
деть или не увидеть вспышку света. Уравнение (12.13) описывает эту вероятность.
Графики уравнения (12.13) при различных т приведены на рис. 12.4. Логариф-
мическая шкала помогает видеть изменение крутизны с возрастанием /и0. Эти гра-
фики показывают, что при возрастании порога световосприятия возрастает и кру-
тизна кривой. Чтобы объяснить это, представим, что число актов поглощения фо-
тона, необходимое для световосприятия, большое. Тогда порог будет очень резким;
12.4. Равномерное распределение энергии
349
испытуемый будет видеть вспышку света всякий раз или никогда, в зависимости от
того, выше или ниже порогового значения будет интенсивность вспышки. Это
связано с тем, что флуктуации для большого числа элементов малы по сравнению
со средним значением. Если число фотонов, необходимое для световосприятия,
довольно мало, флуктуации будут значительными и небольшие изменения интен-
сивности света будут оказывать менее заметный эффект на пропорцию случаев
восприятия и невосприятия света.
В описываемых экспериментах испытуемых тестировали несколько раз подряд
при слабых вспышках света, чтобы определить вероятность световосприятия как
функцию интенсивности света. Полученные кривые были близки к приведенным
на рис. 12.4, и наибольшее соответствие достигалось для mt в диапазоне 5—8. В тех
же экспериментах пороговое значение оценивали независимо путем тщательного
анализа различных факторов, от которых зависит, какое количество света реально
достигает сетчатки и какая его доля поглощается. По результатам этого анализа по-
роговое число фотонов составило 5—14, что хорошо согласуется с оценками, полу-
ченными с использованием распределения Пуассона.
Может возникнуть вопрос, поглощается ли каждый из 5—8 фотонов отдельной
фоторецепторной клеткой или некоторые фоторецепторные клетки должны по-
глощать более одного фотона, чтобы был зарегистрирован ответ. Как показали рас-
четы, область сетчатки, на которую сфокусировано световое пятно, содержит не-
сколько сотен фоторецепторных клеток. Соответственно этому вероятность, что
одна из клеток поглощает два из 5—8 фотонов, крайне мала. Таким образом, фото-
рецепторная клетка может электрически активироваться одним фотоном. Гангли-
озная клетка сетчатки, проводящая сигнал к мозгу, получает синаптические вход-
ные сигналы от многих фоторецепторных клеток. Возбуждение в результате актов
поглощения света передается к ганглиозной клетке от большого пула фоторецеп-
торов, и она суммирует эти входные импульсы. Если их сумма превышает порого-
вое значение, возникает потенциал действия (см. гл. 16).
12.4. Равномерное распределение энергии
Когда энергию можно выразить как квадрат некой величины (например, как
E = aq2), использование больцмановского распределения позволяет получить
очень простое выражение для дисперсии этого значения (см. приложение 4)
]q^lkTdq
]t°^kT<iq 20
(12.14)
Тогда среднее для энергии составляет
— ---- кТ
E=aq2=-^~ (12.15)
Если переменной является скорость движения в направлении х, vx, энергия бу-
дет кинетической при а = т/2. Выражение для среднеквадратичной скорости дви-
жения в этом направлении имеет вид
350
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
~ кТ
vx = —
m
(12.16)
Средняя кинетическая энергия движения в направлении х составляет кТ/2.
Если переменная — это позиция при движении в параболической потенциаль-
ной яме, потенциальная энергия будет равна <рх2/2 (уравнение (2.17)), где <р — си-
ловая постоянная. Уравнение (12.14) теперь определяет среднеквадратичное сме-
щение, которое дает информацию о флуктуациях позиции
х1 =— (12.17)
Ф
Это выражение полезно для оценки того, насколько сильно изменяется положение
атома или молекулы, удерживаемых на месте молекулярными взаимодействиями.
Различные выражения для потенциальной энергии, приведенные в гл. 2, часто ис-
пользуются для вычисления силовых постоянных, равных половине второй произ-
водной потенциальной функции энергии в точке ее минимума.
Приведенные уравнения показывают, каким образом тепловая энергия распре-
деляется по различным модам. Независимо от массы молекулы или действия воз-
вращающей силы энергия каждого вида колебаний будет равна кТ/2. Эту законо-
мерность называют принципом равномерного распределения, или равнораспреде-
ления, энергии, определяя ее как принцип потому, что, в отличие от законов
и теорем, она не всегда реализуется. Наиболее важные исключения из нее относят-
ся к случаям, когда необходимо принимать во внимание квантовую механику.
Квантование энергетических уровней делает неправомочным интегрирование не-
прерывных переменных в уравнении (12.14). Для колебательных энергий сильных
ковалентных связей с легкими атомами энергии квантовых состояний сильно раз-
несены, из-за чего интегрирование должно быть заменено суммированием. Одна-
ко более слабые, нековалентные взаимодействия, стабилизирующие биологиче-
ские структуры, могут рассматриваться в хорошем приближении с классических
позиций и поэтому для них применим принцип равнораспределения.
Интересно выяснить, насколько эффективен данный подход для анализа
флуктуаций в случае крупных молекул с большим числом атомов. Согласно прин-
ципу равнораспределения, каждая мода движения характеризуется энергией, рав-
ной кТ/2. Если атомы движутся по классическому типу (т. е. без квантовых эффек-
тов), три моды кинетической энергии в сумме дают величину энергии ЗкТ/2. Каж-
дый атом находится в потенциальной энергетической яме, где смещение от
положения минимума возможно в направлениях х, у и z. В результате к потенци-
альной энергии прибавляется еще ЗкТ/2.1 Таким образом, молекула с N атомами
имеет среднюю энергию (кинетическую плюс потенциальную), равную 3NkT/2.
Это значение послужит отправной точкой для изучения флуктуаций энергии круп-
ных молекул.
1 Это является сильным упрощением, но классическая гармоническая функция потенциаль-
ной энергии может быть переведена в набор координат, для которых потенциальная энергия яв-
ляется суммой членов формы yq2 (см. разд. 2.12). В итоге величина потенциальной энергии выра-
жается как кТ/2 в расчете на степень свободы.
12.5. Флуктуации энергии макромолекул
351
12.5. Флуктуации энергии макромолекул
Подход на основе принципа равнораспределения энергии применим для анализа
флуктуаций энергии крупных молекул, в которых энергия распределяется по мно-
гим внутренним уровням (модам). Вначале необходимо оценить Е2, где Е2 выра-
жается какср2#4 для любой моды. Тогда из больцмановского распределения можно
получить выражение для qA, аналогично q2 в случае уравнения (12.14) (см. прило-
жение 4).
2
— J ।kT i
q4 = —----------= 3 — (12.18)
При этом среднеквадратичная энергия составляет
F = ^ = |(£T)2 (12.19)
Вычитая Е2 = (кТ/2)2 (из равнораспределения), можно вычислить дисперсию по
уравнению (12.1)
^2 = (ЛТУ (12.20)
Уравнение (12.20) применимо к каждому энергетическому уровню макромоле-
кулы. Если молекула состоит из 7Vатомов, каждый атом вносит в энергию молеку-
лы три моды кинетической энергии и три моды потенциальной энергии. Согласно
уравнению (12.3), флуктуации складываются как их квадраты, и, таким образом,
дисперсия суммарной энергии является суммой дисперсий энергии по всем 6N мо-
дам молекулы. Умножая обе части уравнения (12.20) на 6 У, мы получаем выраже-
ние для дисперсии энергии всей молекулы
ДЕ2 =ЗУ(£Т)2 (12.21)
Теперь вернемся к средней энергии. Согласно принципу равномерного распре-
деления, средняя энергия каждой моды составляет кТ/2. Следовательно, средняя
энергия всей молекулы равна 3NkT. Тогда теплоемкость, с, производная Е по Т,
равна 3Nk. Объединяя этот результат с уравнением (12.21), получаем важное соот-
ношение для флуктуаций энергии
АЕ2
7^Т = С (12.22)
кТ2
Это уравнение показывает, что флуктуации энергии можно определить, изме-
ряя теплоемкость. Способ выведения уравнения (12.22) не строгий, так как равно-
мерное распределение выполняется не для любой внутренней моды молекулы. Тем
не менее он полезен, поскольку ясно показывает, каким образом данное уравнение
основывается на том, что флуктуации энергии и теплоемкость одновременно отра-
жают число энергетических уровней.
Уравнение (12.22) можно вывести и более строгим способом, не прибегая
к принципу равнораспределения энергии (Hill, 1960, ch. 2; Kittel, 1958, ch. 25).
352
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
Вначале запишем выражение для средней энергии системы, используя распределе-
ние Больцмана
F - J._______
^~Е‘/кТ
i
Перепишем это выражение в виде
(12.23)
Е^е-Е‘/кТ ="^Е)еЕ‘1кТ (12.24)
/ /
Каждую часть данного уравнения можно продифференцировать по'температуре
дТ, ^кТ2 ^кТ2 ( ’
Из полученного уравнения следует, что производная в левой части выражает теп-
лоемкость, с. Разделив обе части уравнения на сумму ^е"£,/ЧГ, получаем, что дру-
гие два члена — это Е2/кТ2 и Е2/кТ2. Таким образом, уравнение (12.25) можно
переписать как
_ Е2 Е2 _ ЬЕ2
С~ кТ2 кТ2 ” кТ2
(12.26)
Таким образом мы вновь пришли к уравнению (12.22).
Это принципиальное уравнение было получено Гиббсом и независимо от него,
много лет спустя, Эйнштейном. Оно связывает флуктуации энергии системы с по-
глощенной ею тепловой энергией. Это уравнение можно использовать вместе
с уравнением (12.21), чтобы продемонстрировать, как размеры системы влияют на
флуктуации ее энергии. Теплоемкость возрастает с размерами системы. Если все
колеблющиеся атомы поглощают тепловую энергию независимо, теплоемкость
пропорциональна числу атомов, N. Тогда уравнение (12.26) показывает, что дис-
персия энергии в свою очередь пропорциональна N, и, следовательно, среднеквад-
ратичное отклонение энергии пропорционально W. Энергия системы, как и теп-
лоемкость, пропорциональна N, следовательно флуктуации энергии относятся
к среднему отклонению как 1/Va . Это иллюстрирует общую тенденцию, отмечен-
ную в начале главы: чем крупнее система, тем сложнее выявить в ней флуктуации.
В случае 1 моль вещества необходимо производить измерения с чувствительно-
стью 1:10"12 (примерно корень квадратный числа Авогадро), чтобы уловить колеба-
ния тепловой энергии. Шанс заметить тепловые колебания повышается, если рас-
сматривать системы меньших размеров.
С помощью уравнения (12.26) проведен анализ флуктуаций энергии белка (Coo-
per, 1976). Теплоемкости белков лежат в интервале 0,30—0,35 кал-г"1 К"1. В случае
белка мол. массой 25 000 Да молярная теплоемкость равна 7,5—8,75 ккал • моль"1 • К"1.
Используя уравнение (12.22), получаем величину л/аЕ2 = 6,41О"20 калорий на мо-
лекулу, или 38 ккал на моль, что близко к 1/2 АЯ при тепловой денатурации белка
этих размеров (см. разд. 1.4). Таким образом, белок характеризуется флуктуациями
энергии, сравнимыми с энергией стабилизации его структуры.
12.6. Флуктуации в ионизации белка
353
Может показаться, что при таких значительных флуктуациях энергии натив-
ная структура белка неспособна быть устойчивой. Однако флуктуации не от-
носятся лишь к тем внутренним энергетическим уровням, которые дестабили-
зируют структуру молекулы, а распределены по всей молекуле. На самом деле
значения флуктуаций энергии, рассчитанные с помощью выражения (12.26),
малы по сравнению с общей тепловой энергией белка. Согласно принципу рав-
номерного распределения, средняя энергия в расчете на атом равна ЗкТ, т. е.
~10"21 кал. В случае белка мол. массой 25 кДа, содержащего примерно 5000 ато-
мов, энергия молекулы составляет ~5-1О’18 кал. Величина V Д7Г2 =6,41О-20 кал,
получаемая из уравнения (12.26), почти на два порядка ниже. Флуктуации энергии
белка отражают независимые вибрации множества атомов, входящих в состав его
молекулы. Таким образом, четко определенная молекулярная структура действи-
тельно может характеризоваться величиной флуктуаций, определяемой выраже-
нием (12.26).
12.6. Флуктуации в ионизации белка
Как правило, белковые молекулы содержат многочисленные ионизируемые груп-
пы. При изменении pH изменяется средний заряд белка, поскольку меняется заря-
довое состояние этих групп (см. разд. 11.3). Для групп, рК которых равна pH, веро-
ятность приобрести заряд составляет 50%. При постоянном pH заряд белка будет
колебаться в зависимости оттого, как меняется зарядовое состояние групп, рК ко-
торых близка к pH. Связь этих флуктуаций заряда с крутизной кривой титрования
описывается уравнением Линдерстрем-Ланга. Способ его выведения содержит ин-
тересную параллель с выведением уравнения (12.26).
Рассмотрим последовательность ионизационных равновесий в белке (схема 12А)
н+ н+ н+ н+
Р, Р2 ... Рл_1 Рл (12А)
Вначале необходимо получить выражение для зарядового состояния белка как
функции pH. Для этого требуется провести анализ моделей насыщения связываю-
щих участков, рассмотренных в гл. 4. Каждый шаг перезарядки характеризуется
своей константой равновесного связывания
К2 = ... Кп = —(12.27)
[Ро][Н+] [Р,][Н+] [РЛ_,][Н+]
ИЛИ
[Р1]=^1[Р0][Н+], [Р2]=^2[Р1][Н+] ... [РЛ]=^[РЛ_1][Н+] (12.28)
Последовательная подстановка этих уравнений приводит к выражению для кон-
центрации белка, в молекуле которого протонировано m групп
[Pm] = [Po][H+rfK (12.29)
/=|
Чтобы упростить это выражение, заменим произведение членов X, новой констан-
той J„ = рр (К,
354
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
[Р.] = [Р0][Н+Г4 (12.30)
Запишем равновесную долю протонированных групп как отношение числа этих
групп к общему числу групп
т=^------- (12.31)
£[PJ
m=Q
Подставляя для каждого Рт отношение из уравнения (12.30) и сокращая множите-
ли Ро в числителе и знаменателе, получаем
рт
т=*=*-------- . (12.32)
£.4. [НТ
/п=0
Это уравнение выражает зависимость среднего числа протонированных групп
от [Н+]. Чтобы узнать, как его значение флуктуирует относительно среднего, умно-
жим обе части уравнения на знаменатель и продифференцируем по [Н+]
-^-£/т[НТ + /й^/и[Н+Г' = £/иЧ[НТ’‘ (12.33)
1ш=0 ш=0 ш=0
Теперь обе части уравнения умножим на [Н+]. В первом члене мы можем выразить
производную
+ ^ = ай = _^_
d[H+] aiog[H+] а рн
Разделив обе части уравнения (12.33) на сумму, стоящую слева, получим в правой
части первый член, равный т2, и второй член т2. С помощью уравнения (12.1) за-
пишем выражение для флуктуаций относительно т
—= т2 -т2 = \т2 (12.35)
а рн
Таким образом, заряд белка будет в наибольшей степени флуктуировать при том
значении pH, которое определяет наиболее крутую кривую титрования. Чаще всего
это значение лежит вблизи изоэлектрической точки. Использование уравнения
(12.35) для оценки заряда молекулы гемоглобина показало, что вблизи изоэлектри-
ческой точки среднеквадратичный заряд молекулы составляет 1,85 (Cohn, Edsall,
1943). Для рибонуклеазы было получено значение 3,65 (Tanford, 1961; р. 573).
12.7. Флуктуации в системе с двумя состояниями
Модель системы с двумя состояниями, рассмотренная в предыдущих главах при
описании конформационных переходов в белках, имеет вид (схема 12Б)
12.7. Флуктуации в системе с двумя состояниями
355
Состояние равновесия описывается выражением
^=*равн (1236)
Константа равновесия может быть также выражена через константы скоростей пе-
реходов как Аравн = а/(3 (см. разд. 7.3). Если общая концентрация белка равна Т и
[А] + [В] = Г, в состоянии равновесия число молекул в каждом состоянии, т. е.
в форме В и форме А, будет долей Т. Заменив в уравнении (12.36) на а/р
и произведя преобразования, получаем
[А] = Т-&- (12.37а)
а + Р
[В] = Т—— (12.376)
а + Р
Заметим, что [А] и [В] в этих выражениях в действительности означают сред-
ние концентрации. В любой момент времени происходят флуктуации, несколько
увеличивающие содержание А или В. Эти флуктуации спадают и появляются
вследствие вероятностного характера конформационных превращений, происхо-
дящих в каждой молекуле белка независимо. Оценим вначале величину этих флук-
туаций и затем в разд. 12.9 рассмотрим их динамику.
Из уравнений (12.37а) и (12.376) можно записать равновесную вероятность на-
хождения молекулы белка в конформации А или В
а + Р
(12.38а)
а
а + Р
Ръ =
(12.386)
Поскольку каждая белковая молекула независима, можно использовать биноми-
альное распределение, чтобы выразить вероятность нахождения определенного
числа молекул в той или иной конформации. Обозначим общее число белковых
молекул как No5m. Вероятность того, что молекул находится в конформации А,
составляет
Р(У ) = --AW----- Na 0 _
(12.39)
Соответствующее выражение можно записать для P(Nb).
Теперь ситуация математически эквивалента случайному движению, описан-
ному в гл. 6, где биноминальное распределение использовалось для вычисления
вероятности определенного числа скачков молекулы вправо или влево. С помо-
щью уравнения (6.37) можно вывести выражение для среднего числа молекул А
или В. Вернувшись к уравнениям (12.37а) и (12.376), получаем для А выражение
___ Л'обш ДТ I О
v./лл v7',(1 ’ а ’ <12'40)
w+o ЛиОУобш - М,)! а + р
где для замены ра использовано уравнение (12.38а).
356
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
Для вычисления флуктуаций необходимо знать также среднеквадратичное зна-
чение. С использованием уравнения (6.42) запишем выражение
= IX л7 1/лУ°бщ! >н,^(1-А)^^‘ =(^обшА)2 + М>бщА(1-А) (12.41)
Wa = 0 “ 2*а)-
Объединяя уравнения (12.40) и (12.41), мы получаем выражение для флуктуации
числа молекул в форме А относительно среднего числа этих молекул
Д^=л7-^2 = ^6шра(1-ра)=^6ш-^ (12.42)
(а + Р)2
Вновь можно видеть, что среднеквадратичные флуктуации пропорциональны
N. Таким образом, среднеквадратичные флуктуации как доля среднего числа моле-
кул А описываются следующим выражением
^- = EZ (12.43)
Флуктуации числа молекул относительно среднего значения уменьшаются про-
порционально размерам системы, нормированным на А"1/2.
12.8. Ток через одиночный канал
Анализ флуктуаций используется для изучения ионных каналов. Поскольку ион-
ные каналы открываются и закрываются, ток через клеточную мембрану флуктуи-
рует. Анализ этих флуктуаций позволил получить некоторые из первых оценок об-
щих свойств каналов. Хотя этот метод часто заменяется прямым измерением токов
через одиночные каналы с помощью метода «пэтч-кламп», в некоторых случаях
все же необходим анализ шума каналов. С использованием уравнений, приведен-
ных в предыдущих разделах, мы выведем здесь выражение для тока через одиноч-
ные каналы через флуктуации мембранного тока.
Регуляцию ионного канала можно рассматривать как равновесие между закры-
тым и открытым состояниями (схема (12В))
а
С<=»0
Р (12В)
Ионы проходят только через открытый канал. Если из А каналов открыто NQ кана-
лов, ток выражается просто как zW0, где i — ток через одиночный канал. Среднее
число открытых каналов, Ао, равно общему числу каналов, умноженному на веро-
ятность открывания, ро- Тогда выражение для среднего тока имеет вид
7 = /дЛ>бш, (12.44)
где р0 взята из уравнения (12.386) как равная а/(а + Р).
Дисперсия тока вычисляется из дисперсии числа открытых каналов с исполь-
зованием уравнения (12.42)
д72=/2ДУ2=/2^ш-^-7 (12.45)
(а + Р)
12.9. Корреляционная функция для систем с двумя состояниями
357
Рис. 12.5. График зависимости диспер-
сии от среднего значения для мембран-
ного тока при изменении Ро от 0 до 1. Со-
гласно уравнению (12.46), предельный
угол наклона кривой соответствует току
одиночного канала, / (пунктирная линия).
Разделив дисперсию на среднее значение, сократим 7Vo6ui, чтобы получить выражение
= = (12.46)
I а + Р
где р0 изменяется от нуля до единицы. Если значение р0 близко к нулю, правая
часть уравнения (12.46) сводится к /. Отношение дисперсии к среднему значению
может служить оценкой тока через одиночный канал.
Это основа классического метода изучения ионных каналов (DeFelice, 1981;
Lecar, Sachs, 1981). При его использовании важно убедиться, что р0 на самом деле
низка. Обычно строят график зависимости дисперсии от среднего значения и бе-
рут касательную с предельным углом наклона в точке нулевого значения тока
(рис. 12.5). Обратите внимание, что кривая этой зависимости проходит через мак-
симум и опять падает до нуля с увеличением среднего значения тока. Нулевые зна-
чения тока на каждом конце кривой соответствуют вероятностям открывания,
равным нулю и единице. Очевидно, что в предельных случаях, когда открыты или
закрыты все каналы, дисперсия должна быть нулевой.
12.9. Корреляционная функция
для систем с двумя состояниями
До сих пор мы рассматривали только величины флуктуаций, не принимая во вни-
мание скорость, с которой они происходят. В то же время скорость является важ-
ной характеристикой флуктуаций. Поскольку флуктуации происходят в реальном
времени, они служат источником шума, регистрируемого при измерениях. Этот
шум обычно действует как помеха, но одновременно он содержит информацию
о кинетике процесса, который его вызывает.
Один из наиболее важных способов анализа шума в сигнале S(t) включает оп-
ределение корреляционной функции, обозначаемой как FK(t)
FK(/) = (5(0)-5)(5(/)-5) = (5(0)5(г)-5(0)5 - 5(/)5 + 52) = 5(0)5(/)-52 (12.47)
358
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
Для нахождения корреляционной функции измеряют 5 в момент времени t = 0 и в
момент времени Г, перемножают эти результаты и усредняют их по многим таким
измерениям. Если интервал времени между измерениями очень большой по срав-
нению с временем флуктуаций, корреляции между 5(0) и 5(0 наблюдаться не бу-
дут. Среднее произведения 5(0)5(0 будет равно 52 и FK(f) будет равно нулю. Если
интервал времени настолько мал, что 5не успевает измениться, 5(0)5(0 = 52 и FK(f)
становится равна Д52. Интересным представляется, насколько FK(f) отклоняется
от Д52 во времени.
Эту ситуацию можно проиллюстрировать на примере ионного канала с двумя
состояниями (схема 12В) (Lecar, Sachs, 1981), описывая FK(f) с использованием
констант скоростей открывания и закрывания, аир. Выведение этой корреляци-
онной функции можно рассматривать как еще один аспект анализа кинетики мо-
дели двух состояний, приведенного в гл. 7.
В случае флуктуаций тока, текущего через одиночный канал, S(f) представляет
собой 1(f). Когда канал закрыт, /равно нулю, поэтому произведение 7(0)/(0 не рав-
но нулю только в случае, когда канал открыт в оба момента времени. Вероятность,
что канал открыт при t = 0, равна а/(а + Р). В момент времени t канал будет открыт
только в том случае, если произошло четное число переходов состояния канала
в интервале времени от 0 до t. Таким образом,
\2
, (12.48)
a + pj
где Рч — вероятность четного числа переходов. Второй член — это квадрат средне-
го тока, 72, соответствующий 52 в уравнении (12.47).
Чтобы получить выражение для Рч (0, используем метод, подобный использо-
ванному для получения формулы распределения времени жизни открытого со-
стояния канала (разд. 7.9). Запишем выражение для P4(r + dO через Рч (f). Чтобы
число переходов было четным в момент времени t+dt, оно должно быть четным
в момент t и за время dr не должно происходить перехода либо число переходов
должно быть нечетным в момент времени t и за промежуток dr не должно быть пе-
рехода. В первом случае следует определить вероятность того, что не произойдет
перехода, когда канал открыт. Вероятность закрывания составляет pd/, и соответ-
ственно вероятность незакрывания 1-pdr. Во втором случае канал закрыт и веро-
ятность перехода на промежутке dt составляет adr. Наконец, отметим, что вероят-
ность нечетного числа переходов равна единице минус вероятность четного числа
переходов. Объединяя эти условия, получаем выражение
Рч (t + dr) = Рч (0(1 - ₽d0 + (1 - Рч (O)adr (12.49)
Преобразуем его к виду дифференциального уравнения
^- = -(а + Р)Рч +а (12.50)
Общее решение этого уравнения содержит экспоненту е~(а+₽)'. При начальных
условиях Рч (0) = 1, полное решение имеет вид
Лс(О = /2-^Л(О-'-2
а + Р
12.10. Теорема Винера—Хинчина
359
(12.51)
(12.52)
ci Ве
рч(‘)=— + -—
а+р а+р
Подставляя это выражение в уравнение (12.48), получаем корреляционную функцию
FK(0 = /2 аР e~(atp)' = ZFe"(a+₽)',
(а + Р)2
где последние упрощения были сделаны с использованием уравнения (12.45)
и предположения, что корреляционная функция для N независимых каналов
должна быть пропорциональна N. ___
Эта функция имеет ожидаемые свойства. От начального значения Д/2 она спа-
дает к нулю. Наиболее важный вывод из этого уравнения состоит в том, что корре-
ляционная функция падает с той же скоростью, что и ответ на макроскопическое
возмущение (см., например, уравнение (7.4)). Таким образом, одна и та же основ-
ная скорость а + р характеризует динамику как на макроскопическом, так и на
микроскопическом уровне. Эта параллель между флуктуациями на микроскопиче-
ском уровне и макроскопической кинетикой прослеживается во многих направле-
ниях при анализе динамических процессов. Далее мы увидим, как в случае дина-
мики шумов каналов это можно использовать для анализа их активности. Но прежде
нам необходимо применить еще один инструмент для анализа шумов.
12.10. Теорема Винера—Хинчина
Динамику процессов можно рассматривать либо в реальном времени, либо через
их характеристические частоты. Анализ в реальном времени более прямой; корре-
ляционная функция, выведенная в предыдущем разделе, при этом легко визуали-
зируется, и экспоненциальная постоянная времени связана непосредственно
с временем затухания флуктуаций. В области частот сигнал рассматривается как
случайная осцилляция, характеризующаяся диапазоном частот. Эти два подхода
связывает теорема Винера—Хинчина (McQuarrie, 1976; ch. 22; Kittel, 1958; part 2),
которая будет доказана ниже после введения понятия о преобразовании Фурье для
случайного сигнала.
Частотный подход к анализу флуктуаций основан на преобразовании Фурье,
в котором сигнал разлагается на сумму синусов или косинусов (см. приложение 3).
Сигнал, изменяющийся чаще, имеет более высокочастотные компоненты. Это ил-
люстрирует рис. 12.6, где показаны зашумленные сигналы, из которых отфильтро-
ваны различные частоты. Верхняя линия на рисунке — это сигнал с вкладом частот
< 200 Гц; шум в этом случае проявляется меньше. Нижние линии включают более
высокочастотные компоненты, при вкладе которых шум проявляется больше.
Преобразование Фурье позволяет определить вклад каждой частоты.
Случайный сигнал S(t) может выглядеть как одна из линий, показанных на
рис. 12.6. Мы можем выразить S(f) как интеграл, в котором объединены в правиль-
ном соотношении множество синусоидальных или косинусоидальных волн раз-
личной частоты. Такой интеграл Фурье имеет вид
5(0 = — L(co)eim'dco (12.53)
2 л J
360
Глава 12. Флуктуации
200 Гц
Рис. 12.6. Шум, записанный усилите-
лем при отсечении различных частот.
0,00 ' 0JD2 ' СХ04 ' СЩ6 ’ 0?08
Время, с
Мы используем комплексное выражение при е,<0/ = cos(co/) + i sin(coO и i = V—Т,
так как последующие преобразования легче производить с этой формой. Функция
Л(со) — это вклад в сигнал флуктуаций с частотой со. Например, в случае верхней ли-
нии на рис. 12.6 Л(со) очень мало при f = со/2л > 200 Гц, но велико для более низких
частот.1 Функция Л (со) определяется из 5(Г) с помощью преобразования Фурье
Л(со) = | р(/)е‘ш'с1Л (12.54)
' -т
где ±Т — интервал, в котором рассматривается сигнал.2 Можно понимать Л(со) как
среднее время 5(Z)e“'“' (умноженное на два). Этот интервал должен быть длиннее,
чем несколько периодов самых «медленных» из рассматриваемых частот. Часто ре-
альная величина Т не имеет значения. Однако ее необходимо иметь в виду при
анализе экспериментальных данных и написании программ, где используется чис-
ленное интегрирование.
Можно применить преобразование Фурье к функции 5(0, чтобы показать, как
складываются шумы с разными частотами. Рассмотрим интеграл по Л (со)2. Заме-
ним один из множителей Л(со) на его представление как преобразование Фурье для
5(/) (уравнение (12.54))
p(co)2dto = 1 р(ю) j5(Oe"‘“'d/dco (12.55)
-оо -оо -Т
Объединяя оставшийся член Л(со) с е‘“' и интегрируя по со, получаем 2 л5(0, соглас-
но уравнению (12.53). Тогда правая часть становится интегралом по 5(02
p(o)2dco = — p(r)2d/ (12.56)
-оо -Г
1 Обратите внимание, что со измеряется в радианах в секунду, а/— в оборотах в секунду, так
что со = 2 л/.
2 Обычно интервал для преобразований Фурье составляет ± л. Поскольку величина интеграла
пропорциональна длине интервала, производится деление на Т.
12.10. Теорема Винера—Хинчина
361
Теперь видно, что среднее значение времени 52 может быть записано как
-Lp(r)2d/ = F (12.57)
2/ _т
Таким образом, уравнение (12.56) приводится к виду
S2 = — p(co)2dco (12.58)
-00
Уравнение (12.58) известно как теорема Парсеваля. Она утверждает интуитив-
но понятную идею, состоящую в том, что если сложить шум по всем частотам, то
получится среднеквадратичное значение флуктуаций сигнала. Тогда Л(со)2 dco явля-
ется долей конкретной частоты в общем шуме. Важно, что частотные составляю-
щие складываются как квадраты. Это еще один пример свойства, отражаемого
уравнением (12.3), — различные частоты действуют как независимые источники
флуктуаций. График, приведенный на рис. 12.6, показывает, что добавление боль-
ших частот увеличивает общую амплитуду шума.
Величина Л(со)2/(4л) играет важную роль в анализе флуктуаций и обозначается
как Р(со). Для нее используются два названия — спектр мощности флуктуаций
и спектральная плотность.
Применим преобразование Фурье к корреляционной функции 5(0. Чтобы из-
бавиться от члена 52 в уравнении (12.47), вычтем из этого уравнения среднее зна-
чение; теперь колебания сигнала происходят вокруг нуля. В этом случае корреля-
ционная функция может быть записана как среднее по времени, если взять инте-
грал и разделить его на длину интервала
Л(5) = 5(/)5(1 + s) = -L р(1)5(1 + 5)dz (12.59)
2/ _г
Как и выше в уравнении (12.54), величина Т должна быть достаточно большой,
чтобы можно было получить хорошее усреднение.
Поскольку FK(s) имеет те же основные свойства, что 5(0, можно применить
преобразование Фурье к уравнению (12.59) так же, как к уравнению (12.54)
т т т
1= j e“'mi 5(1)5 (1 + s)dlds (12.60)
Подставляя 1 = е"|ш'е,ш' в правую часть уравнения, получаем
1 т 1 т т
у = JFK(s)e-iB,ds = j ’е'“'5(1)5(1 + ^dlds (12.61)
Теперь разделим правую часть уравнения на два преобразования Фурье, что дает
выражение
1= =
1 -т
1 т т
|5(l)e'“'dl Jе"'“(,+5 ’5(1 + j)dy,
(12.62)
362
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
где произведение 1/Т и первого интеграла равно Л(со) (уравнение (12.54)). Второй
интеграл преобразуется путем замены Г + 5 новой переменной, чтобы получить дру-
гой множитель Л(со). В результате уравнение принимает вид
1 = |+к(5)е-|ш1с1$ = -Л(со)2 = 2лР(со), (12.63)
Т _т 2
где Р(со) определена выше (см. уравнение (12.58)).
Уравнение (12.63) — это и есть теорема Винера—Хинчина. Она утверждает, что
корреляционная функция и спектральная плотность сигнала связаны преобразо-
ванием Фурье. С помощью обратного преобразования Фурье из спектральной
плотности можно получить FK (5). Это показывает двустороннюю связь между вре-
менным и частотным представлениями динамических флуктуаций. Ниже мы при-
меним теорему Винера—Хинчина для определения спектра мощности флуктуаций
в случае флуктуирующей системы с двумя состояниями.
12.11. Шум ионных каналов
В разд. 12.9 рассмотрена корреляционная функция системы с двумя состояниями,
а в разд. 12.10 продемонстрирована связь между корреляционной функцией
и спектром мощности флуктуаций. Естественным дальнейшим шагом будет объе-
динение этих результатов. Используем теорему Винера—Хинчина для определения
спектра мощности флуктуаций в системе с двумя состояниями. Подставляя в урав-
нение (12.63) FK(t) из уравнения (12.52), получаем выражение
Р(со) = — f FK(f)eiu,'dt = — f Z72e-(a+₽)'e-i“'d/' (12.64)
2лД 2л Д,
Поскольку этот интеграл содержит отрицательные значения t, преобразуем выра-
жение для FK (Г), чтобы в экспоненту входили абсолютные значения t. Замена зна-
ка Г в FK(t) не должна изменить эту величину, поскольку усреднение по I(s)I(s + t)
дает тот же результат, что и усреднение по Тогда предыдущий интеграл
становится удвоенным интегралом на интервале [0,оо]
Р(со) = - f X77e_<“+₽+i‘0)'dr = —-!--- (12.65)
л * ла + P + ico
Из этого сложного выражения необходимо выделить действительную часть. Мни-
мой частью можно пренебречь, поскольку сигнал 1(f) действительный
7» = ----!----(a + P-i<0 (12,66)
л a+ p + ico^a+ P - icoj л (a + P) +co
Отбрасывая мнимую часть с членом ico в числителе и вынося за скобки (a + Р)2
в знаменателе, получаем
Аейсп» = , ,/ -72 (12-67)
л(а + Р) 1 + (со/(а + Р))
1111. Шум ионных каналов
363
Наконец, заметим, что со выражена в радианах в секунду. В случае более при-
вычных единиц измерения в эксперименте — оборотах в секунду — множитель ра-
вен 2л. Тогда вместо со/(а + Р) мы получаем 2л//(а + Р). По причинам, которые ста-
новятся ясны, если посмотреть на график этой функции (рис. 12.7), величина
(а + Р)/2л называется угловой частотой, обозначаемой /уг;1. При использовании f
спектр мощности флуктуаций описывается выражением
----- ? 1
РДейств (/) = А/2—-----------------т
/угл1 + (///угл)2
(12.68)
Обратите внимание, что множитель 2 л был включен, поскольку плотность Р(со) со-
держит подразумеваемую величину dco, которая должна быть заменена величиной
2лб/. Заметим также, что спектр мощности относится к диапазону частот [-оо,оо].
Обычно вычисляют спектр мощности только для положительных частот и затем
результат умножают на два.
Во многих случаях используется функциональная форма уравнения (12.68), на-
зываемая лоренцианом. Лоренциан имеет важное применение, поскольку является
преобразованием Фурье часто используемой экспоненциальной функции. График
лоренциана изображен для нескольких значений fyrn на рис. 12.7, где рядом для
сравнения приведены графики Ругл(/), чтобы показать, как эти величины изменя-
ются противоположным образом: более долгие времена соответствуют более низ-
ким частотам. Значения /угл обозначены на графике и можно видеть, что они
находятся на изгибе кривой, где Р(/) начинает быстро спадать с ростом f
Кривые на рис. 12.7 можно рассматривать в связи с последовательностями ли-
ний шумовых сигналов, показанных на рис. 12.6. Верхняя линия, где обрезаны
частоты выше 200 Гц, соответствует спектру мощности с /угл = 200 Гц. Нижние ли-
нии на рис. 12.6 соответствуют более высоким угловым частотам.
Анализ спектров мощности флуктуаций, которыми характеризуется проводи-
мость ионных каналов, имеет довольно широкое применение, в основном для опре-
деления постоянных времени открывания/закрывания каналов. Наиболее важные
применения приведены в работах DeFelice, 1981; Lecar, Sachs, 1981. Анализ актив-
Рис. 12.7. Графики P(f) из уравнения (12.68) и Fym(t) из уравнения (12.52) при /угл = (а+ р)/2л.
364
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
ности одиночных каналов (см. гл. 7 и 9) обычно более информативен, чем анализ
шумов, но когда события на уровне молекул слишком незначительны, чтобы их
можно было зарегистрировать, по-прежнему используется спектр мощности шумов
каналов, чтобы оценить константы скоростей переходов между состояниями. Боль-
шинство каналов обнаруживает кинетику множественных состояний, и в этих слу-
чаях модель двух состояний неприменима. Имеются разработки по применению
теории шумов к системам с множественными состояниями (Chen, Hill, 1973).
12.12. Шум электрического контура
В электрических цепях в результате случайного теплового движения электронов
возникают флуктуации, которые служат причиной шумов, наблюдающихся при
электрических измерениях. Приводимый в этом разделе анализ таких шумов имеет
двойную пользу: он дает практическое представление о малейших сигналах, кото-
рые могут регистрировать электронные приборы, и знакомит с еще одним важным
основным методом изучения флуктуаций.
В качестве отправной точки рассмотрим контур, содержащий сопротивление
и конденсатор, подключенные параллельно (рис. 12.8). Если измерять напряжение
на контактах с помощью чувствительного вольтметра, он будет регистрировать
сигнал, флуктуирующий относительно среднего нулевого напряжения. Эти флук-
туации отражают мгновенные сдвиги полного потенциала от равновесного значе-
ния при V = 0. При отклонениях в напряжении ток течет через сопротивление, что
возвращает систему к равновесному состоянию. Флуктуация напряжения V соот-
ветствует флуктуации заряда q, и они находятся в соотношении, равном емкости
конденсатора цепи
С = ^~ (12.69)
V
Прохождение малого количества дополнительного заряда Sq через участок разно-
сти потенциалов V изменяет энергию системы на величину 8qV. Потенциальная
энергия системы с суммарным зарядовым дисбалансом q выражается интегралом,
отражающим работу электростатических сил, необходимую для приведения систе-
мы в это состояние
1
Я < с
т
Рис. 12.8. Сопротивление и конденсатор, соединенные параллельно, образу-
ют модельную цепь для вычисления шумов.
12.12. Шум электрического контура
365
Поскольку эта энергия пропорциональна И2, можно использовать принцип
равномерного распределения (см. разд. 12.4) чтобы получить среднюю энергию
этой моды, равную кТ/2. Тогда среднеквадратичное напряжение составляет
С
(12.71)
Заметим, что величина сопротивления не входит в это выражение. Сопротивление
появится в формуле потенциальной энергии при анализе флуктуаций во времени.
Чтобы рассматривать флуктуации во времени, необходимо вывести дифферен-
циальное выражение для заряда через напряжение. Можно начать со стандартного
анализа динамического ответа ЯС-цепи. Из уравнения (12.69) следует, что V - q/C.
Продифференцируем это выражение по времени. Заметим, что d^/dr = так как
положительный ток через сопротивление (рис. 12.8) уменьшает заряд на конденса-
торе
dK
dr ” С
(12.72)
Заменяя I на V/R, согласно закону Ома, получаем дифференциальное уравнение
первого порядка для V
При начальном значении К(0) решение имеет вид
И = И(0)е"'/лс (12.74)
Уравнение (12.74) само по себе не помогает анализу флуктуаций, поскольку
описывает ответ цепи на макроскопическое возмущение. Для описания флуктуа-
ций добавим в уравнение (12.73) шумовой член Ф
dK -V
— = ——+ Ф(Г) (12.75)
dr ЯС
Переменная Ф(Г) отражает электрический шум, который случайно флуктуирует во
времени, т. е. это малые непредсказуемые отклонения напряжения от нуля. Если
предположить, что отклонения в положительном и отрицательном направлениях
случаются с равной вероятностью, можно получить полезное выражение для кор-
реляционной функции V.
Чтобы решить уравнение (12.75), перенесем - V/RC в его левую часть и объеди-
ним два члена как производную произведения
Л 17 t/RC
е,/кс . = ф(/) (12.76)
Умножая обе части уравнения (12.76) на е'/яс и интегрируя в интервале от нуля до t,
получаем выражение
K(0e'/RC - К(0) = Jе'/ясФ(/)с1г
о
(12.77)
366
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
С помощью преобразований выведем функцию К(/)
И(/) = И(0)е’,/яс + е"'/лс j е'/ясФ(/)ё/ (12.78)
О
Если далее вычислять интеграл в явном виде, могут возникнуть затруднения.
Вместо вычисления интеграла возьмем математическое ожидание. Поскольку ве-
роятность положительных величин Ф равна вероятности отрицательных, матема-
тическое ожидание интеграла будет равно нулю. Умножая уравнение (12.78) на
К(0) и вычисляя математическое ожидание путем усреднения по ансамблю, мы
достигаем цели — получаем корреляционную функцию V
FK(t) = И(/)И(О) = v*e,/KC = ^.e'/RC (12.79)
На последнем этапе преобразований здесь использовано уравнение (12.71).
Этот результат весьма важен, поскольку он показывает, что по динамическим
характеристикам микроскопические флуктуации не отличаются от реакций на
макроскопические возмущения (уравнение (12.74)). В обоих случаях ответ систе-
мы затухает экспоненциально с постоянной времени, равной RC. Это было уста-
новлено также для корреляционной функции системы с двумя состояниями (урав-
нение (12.52); разд. 12.9).
Чтобы завершить описание динамики контурного шума, применим теорему
Винера—Хинчина и получим из корреляционной функции выражение для спектра
мощности шума. Используя уравнение (12.79) для FK(t) в уравнении (12.64), полу-
чаем
Р((0) = fе-'/ясеч“'с1/ (12.80)
2лС Д,
Этот интеграл можно решить тем же способом, каким было получено уравнение
(12.68) из уравнения (12.64)
Р(<0) = *Lrc-----1----- = —------1----- = 2kTR-----!----- (12.81)
Cit 1+(ЯС<о)2 л 1 + (АСсо)2 1 + (2лЯС/)2
На втором шаге преобразований переменная была заменена f = со/2л (с подразу-
меваемой заменой df = dco/2 л). Полученное выражение имеет ту же форму лорен-
циана, что и аналогичное выражение в случае системы с двумя состояниями (урав-
нение (12.68)).
Зададимся вопросом, что произойдет, если из цепи, изображенной на рис. 12.8,
удалить конденсатор, чтобы в нее входило только сопротивление. В этом случае
сопротивление сохранит небольшую паразитарную емкость, поэтому проведен-
ный выше анализ будет по-прежнему применим. Однако величина RC будет на-
столько мала, что членом (ZitfRC)2 в знаменателе можно будет пренебречь. Нако-
нец, если использовать это выражение только для положительных частот (см. ком-
ментарий после уравнения (12.68)), выражение для P(f) следует умножить на два
P(/)d/ = 4kTRdf
(12.82)
1113. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
367
Это уравнение известно как теорема Найквиста (Kittel, 1958). Согласно дан-
ной теореме, среднеквадратичная величина шума напряжения на сопротивлении
уменьшается как V/?, что хорошо подтверждают экспериментальные данные. Теп-
ловой шум в резисторе называют джонсоновским шумом. Теорема Найквиста весь-
ма полезна для определения шума в электрических приборах.
12.13. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
Концентрационные флуктуации, амплитуды которых рассмотрены в разд. 12.2,
также характеризуются динамическими свойствами. Они возрастают и спадают во
времени, что отражает некий кинетический процесс. Этот кинетический процесс
может включать либо диффузию внутрь элемента малого объема и из него, либо
химическую реакцию. Измеряя флуктуации концентрации, можно выявлять соот-
ветствующие компоненты кинетического процесса. Отличным способом изучения
этих флуктуаций служит флуоресцентная спектроскопия, поскольку лазер можно
сфокусировать так, чтобы была изолирована небольшая область внутри большого
объема (рис. 12.9). Флуоресцирующие молекулы диффундируют внутрь области
лазерного луча и из нее, вызывая флуктуации сигнала. Проанализируем динамику
этих флуктуаций, чтобы увидеть, как из шума флуоресцентного сигнала можно из-
влечь полезную информацию (Elson, Magde, 1974).
Вначале определим флуктуации в концентрации флуорофора как
8С(г,Г) = С(г,Г)-С, где С — среднее. Концентрация подчиняется уравнению диф-
фузии (уравнение (6.7)). Если заменить С величиной 8С, производные С равны
нулю и останется выражение
^^=Z)V23C (12.83)
dt
Как показано на рис. 12.9, молекулы диффундируют радиально в область лазерно-
го луча и из нее, поэтому мы рассмотрим плоскость х—у, перпендикулярную лучу.
Для исходной флуктуации величины 8С(х0, уо,О) запишем уравнение (6.8) для х и у
и перемножим полученные выражения
8C(x,y,t) = 5С(х0, Уо, 0)-^=—.е-(х-х°)2/4О'-=!—. е-о-уо)2/4л (12.84)
*j4nDt *j4nDt
Теперь необходимо связать 8С с флуоресцентным сигналом. Лазерный луч не
гомогенен; его интенсивность падает с увеличением расстояния от центра луча.
Эти изменения можно примерно описать с помощью нормального распределения,
и тогда интенсивность света будет описываться выражением
Рис. 12.9. Лазерный световой луч возбуждает
флуоресценцию молекул, попадающих в его об-
ласть.
Лазер
368
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
7(х,у) = /0е-2(х2+?)/< (12.85)
где /0 — интенсивность света в центре луча и w — параметр ширины луча (обычно
он равен примерно 1 мкм). Измеренный сигнал — это вся флуоресценция, возбуж-
даемая лучом, и она может быть выражена интегралом в плоскости х—у
S(t) = Ajjl(x,y)C(x,y)dxdy, (12.86)
О о
где А — множитель, учитывающий экспериментальные условия измерения и длину
оптического пути, а также коэффициент экстинкции и квантовый выход флуорес-
цирующих молекул.
Чтобы получить корреляционную функцию этого сигнала, усредним произве-
дение 5(0)5(/)
(S(0)S(/)) = (a2 J J J f /(x0,y0)C(x0, yo,O)I(x,y)C(x, y, /)dxodxdyod^ (12.87)
Скобки означают усреднение по исходной флуктуации 5С(х0, уо,О). При любом
значении С = С + 8С произведение С(х0,у0>0) и C(x,y,t) будет включать четыре
члена. Первый из них — это член, независимый от времени, дающий квадрат
среднего сигнала. Два вторых члена пропорциональны 8С(хо>Уо>О) и 8С(х, у, t),
и оба они усредняются к нулю. Четвертый член 8С(х0, у0,0)8С(х, у, t) — это ключе-
вой член, зависящий от времени и требующий внимания. Согласно уравнению
(12.47), корреляционная функция флуоресцентного сигнала представляет собой
интеграл
FK(t) = (a2 J J J J7(х0,у0)8С(х0> уо,О)1(х,у)8С(х, у, t)dxodxdyody^ (12.88)
Используя уравнение (12.84) для 8С(х,у,/), и уравнение (12.85) для /(хо>Уо) и
Дх, у), получаем выражение
FK(t)=A2I^^~ Г f f fe-2<?+x«,/w2e-<x-X0)2/4Z’'e-2(>,2+y»)/"’ e-(,’-,’°)2/4D'dx0dxdy0dy (12.89)
4nDt ДДДД
Усредняя по исходным флуктуациям в момент времени t = 0, получаем множитель
^8С(хо,уо>О)2)> который проще обозначается как8С02. Его можно оценить с помо-
щью распределения Пуассона (см. разд. 12.2).
Интегралы в уравнении (12.89) могут быть разложены в два одинаковых двой-
ных интеграла, один по х и х0, второй по у и у0. Рассмотрим один из них
э = J je-2(x2+x»)/B’2e<x’xo)/4Z’'dx0dx (12.90)
Чтобы оценить этот двойной интеграл, можно попытаться разделить переменные,
но это не даст результата. В то же время перегруппировка экспонент дает выраже-
ние
12.13. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
369
1
4Dt
и; 2
/— Л
W i _L + _L
V ..,2 4Г
= 4лЛ2/о2ЗСо2и>2
(12.93)
00 00 (х Xq)2( -t j
9= j |e’(x+x°)2/"’2e 1и,г “^dxodx (12.91)
Теперь заменим переменные х + х0 = и и х-х0 = v, чтобы получить выражение
00 оо - 2 (— 1 1
9=2 | |е’“!/"2е " ^!+4D'^dv, (12.92)
-00-00
где множитель 2 появляется в результате замены переменной dxodx = 2dwdv. Теперь
у нас есть два гауссовых интеграла (см. приложение 4). Первый равен wVn, вто-
рой Суммируя эти результаты в уравнении (12.89), получаем
___ / \ 2 Z X
Гк(Г)=4Л2/02^
Это выражение часто записывают в виде
О
^(0 = 7---, (12.94)
1 + (Г/т)
где В включает все параметры интенсивности и т равно
t = w2/4Z) (12.95)
Данная корреляционная функция ожидаемым образом спадает во времени
к нулю. Однако в отличие от других корреляционных функций, приведенных
в этой главе, ее падение происходит не по экспоненте. В действительности точная
математическая форма затухания данной функции зависит от формы распределе-
ния интенсивности света в лазерном луче. Мы приняли выше условие, что это нор-
мальное распределение (уравнение (12.85)), и тогда конечный результат (уравне-
ние (12.94)) имеет очень простую форму. Если предположить, что луч гомогенен по
интенсивности в цилиндрическом объеме, математическая запись результата будет
гораздо более сложной. Однако в виде графика он весьма сходен с уравнением
(12.94) (Elson, Magde, 1974). Из того, как данные интегралы были разложены при
выведении уравнения, должно быть очевидно, что каждое пространственное изме-
рение вносит множитель вида (1 + //т)"|/2 (см. задачу 2).
Особое преимущество флуктуационной корреляционной спектроскопии со-
стоит в том, что лазерный луч может быть сфокусирован на клетке для изучения
кинетических процессов in vivo. Если ввести в клетку флуоресцентно меченные
белки, можно определять их движение в различных клеточных компартментах. На
рис. 12.10 показаны сигналы от флуоресцентно меченных белков, введенных в ги-
гантский аксон кальмара (Terada et al., 2000). Один из этих белков, фермент креа-
тинкиназа, как глобулярный белок не должен взаимодействовать с другими белка-
ми. Другой белок, компонент цитоскелета тубулин, может олигомеризоваться
и взаимодействовать со многими другими белками. Получаемые от этих белков
флуоресцентные сигналы (рис. 12.10, вверху) сильно зашумлены, и временные
рамки этих флуктуаций характеризуются с помощью компьютерных оценок кор-
370
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
Рис. 12.10. Сигналы флуоресценции (вверху) от флуоресцентно меченных креатинкиназы и ту-
булина, введенных в гигантский аксон кальмара. Вычисленные корреляционные функции (внизу)
показывают значения т = 0,845 мс для тубулина и 0,075 мс для креатинкиназы. (По Terada et al.,
2000; с любезного разрешения д-ра Terada.)
реляционных функций (рис. 12.10, внизу). Такие корреляционные функции при-
ведены к виду уравнения (12.94) и преобразованы для сфокусированного луча
(с изменениями для флуктуаций, происходящих вследствие перехода молекул при
возбуждении флуоресценции в триплетное состояние). Эта подгонка позволяет
получить основной параметр, т, который в свою очередь используется для оценки
коэффициента диффузии в уравнении (12.95).
Коэффициент диффузии для креатинкиназы должен быть близок к значению,
вычисляемому из соотношения Стокса—Эйнштейна (уравнение (6.66)), но с уче-
том того, что вязкость цитоплазмы в 2-3 раза выше вязкости воды. Креатинкиназа
не агрегирует и не взаимодействует существенно с другими белками, поэтому она
служит полезным зондом для изучения жидкостных свойств цитоплазмы. В случае
тубулина величина т более чем в 10 раз выше, чем в случае креатинкиназы. Креа-
тинкиназа имеет большую мол. массу и должна иметь меньшую константу диффу-
зии. Таким образом, диффузия тубулина в аксоне кальмара гораздо менее значи-
тельна, чем предсказывает соотношение Стокса—Эйнштейна. Это можно объяс-
нить тем, что тубулин формирует крупные агрегаты или связывается с крупными,
малоподвижными комплексами. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
применима для изучения широкого спектра интересных биологических вопросов
(Rigler, Elson, 2001). С помощью этого метода можно исследовать не только диф-
фузию. При анализе химической кинетики по флуктуациям флуоресценции мож-
но определять константы скоростей реакций.
12.14. Трение и флуктуационно-диссипативная теорема
371
12.14. Трение и флуктуационно-диссипативная теорема
Молекулярные флуктуации в жидкостях вызывают трение. В этом последнем раз-
деле мы продемонстрируем, каким образом изучение флуктуаций позволяет глубже
понять природу силы трения и процессов движения в целом. Обычно под трением
понимают нечто препятствующее движению и замедляющее все процессы. Однако
в применении к событиям, происходящим на молекулярном уровне в жидкостях, та-
кое представление является слишком упрощенным. Если молекула имеет нулевую
скорость, сталкивающиеся с ней окружающие молекулы будут приводить ее в движе-
ние. В итоге молекула будет иметь среднеквадратичную скорость у/(ЗкТ/2т). Напро-
тив, если молекула движется со скоростью, большей чем ^(ЗкТ/2т), столкновения
с другими молекулами будут замедлять ее движение. Независимо от того, какой
была начальная скорость молекулы, в результате столкновений с другими молеку-
лами среднеквадратичная скорость ее движения будет одной и той же. Эти одина-
ковые флуктуации лежат в основе броуновского движения и диффузии. Связь ме-
жду коэффициентами диффузии и трения, описываемая уравнением D = kT/f,
рассмотрена в гл. 6. Вернемся к этой теме.
Может показаться, что в жидкости, имеющей высокую вязкость, молекулы ме-
нее подвижны. На самом деле, однако, среднеквадратичная скорость движения
молекул не зависит от вязкости среды. Вязкость влияет на флуктуации скорости во
временном масштабе, т. е. на то, как быстро меняется скорость. Это можно проде-
монстрировать с помощью уравнения Ланжевена как формы второго закона Нью-
тона для движения (F = та), выражающего воздействие на молекулу двух сил —
силы трения и случайно меняющейся силы, не связанной со скоростью. Посколь-
ку ускорение — это производная скорости, запишем второй закон как дифферен-
циальное уравнение первого порядка для скорости
— = -А + ф(/)э (12.96)
dr т
где член - fv/m отражает замедление движения молекул под действием силы тре-
ния. Как и в уравнении (6.62),/— коэффициент трения. Функция Ф(г) описывает
случайную, или флуктуирующую, силу, обусловленную соударениями молекулы
с окружающими молекулами; она сходна с шумовым членом в уравнении (12.75).
Для обозначения этой силы использован тот же символ, поскольку она характери-
зуется теми же основными математическими свойствами. Параллель между урав-
нениями (12.96) и (12.75) означает параллель между сопротивлением цепи и трени-
ем движущейся частицы.
Умножим обе части уравнения (12.96) на у
1 dv2 /у2
——— =+ Ф(Г)у (12.97)
2 dr т
Это уравнение при усреднении дает дифференциальное уравнение по у2
— = (12.98)
dr т
372
Глава 12. ФЛУКТУАЦИИ
Усредняя произведение Ф(/)у из уравнения (12.97), получаем нуль, так как ве-
личины Ф и у в среднем равны нулю и не связаны между собой. Если начальная
скорость молекулы равна v0, а конечная v2 = (ЗкТ/2т), решение уравнение (12.98)
будет иметь вид
v2 = + (vl _ V2Z'/m (12.99)
тп < m )
Появление величины силы трения в показателе экспоненты указывает, что данная
сила определяет масштаб времени для замедления флуктуаций скорости.
Соотношение между коэффициентом трения и флуктуирующей силой можно
получить путем решения уравнения (12.96) (McQuarrie, 1976). Запишем решение
уравнения (12.96), полученное тем же путем, каким было выведено уравнение
(12.77) как решение уравнения (12.75)
v(/) - v(0)ev'/m = ef,/m j ez'/mO(/)d/ (12.100)
о
Возведение в квадрат обеих частей этого уравнения дает выражение
v(/)2 -2 v(/)v(0)e“z'/m + у(0)2е’2/'/т = e’2Z'/mf je('+'')Z/^WWz' (12.101)
о о
Из правой части этого выражения следует, что произведение Ф(г)Ф(г) является
функцией только разности t-t'. Преобразуем этот двойной интеграл путем замены
переменных q = t-t' и s = t + t'
v(/)2 -2 v(z)v(0)e~z'/m + v(0)2e’2Z'/ra = e‘2Z'/m J elZ/^is |ф(?)Ф(0)^ =
0 0
= (1 -e-2Z'/m)-|ф(?)Ф(0)с19 (12.102)
f 0
Первый интеграл в конечном уравнении определен как (е2/'л”-1)(/и//). Полагая
/->оо, получим математическое ожидание. Выражение, оставшееся слева, — это
среднеквадратичное значение скорости, выражаемое как ЗкТ/2тп. Таким образом,
уравнение преобразуется к виду
= [ф(</)Ф(0)£1</ (12.103)
2ди 0
Данное уравнение связывает коэффициент трения с корреляционной функци-
ей флуктуирующей силы, которая введена для отражения случайных столкновений
молекулы с другими молекулами. Уравнение (12.103) служит примером примене-
ния флуктуационно-диссипативной теоремы. Эта теорема концептуально важна,
поскольку позволяет непосредственно описать связь между коэффициентом тре-
ния и случайными флуктуациями, происходящими вследствие теплового движе-
ния молекул в жидкости. Флуктуационно-диссипативная теорема имеет весьма
Задачи
373
общее значение. Во всех случаях, когда уравнения вида (12.75) или (12.96) записы-
ваются как функции, зависимые от времени, коэффициент ответа может быть вы-
ражен с помощью интеграла корреляционной функции соответствующей флук-
туирующей величины.
Задачи
1. Вычислите концентрацию растворенного флуоресцирующего вещества в объеме
10"15 л при условии, что измеренная среднеквадратичная величина флуктуаций
флуоресценции составляет 3% средней флуоресценции.
2. Запишите уравнение, соответствующее уравнению (12.94), для лазерного луча,
сфокусированного на маленьком пятне с радиальной шириной и осевой шири-
ной wa.
3. При каком значении р0 канальный шум будет наибольшим (уравнение (12.45))?
4. Вычислите среднеквадратичную величину флуктуаций напряжения на сопротив-
лении 1 МОм для диапазона частот f < 1000 Гц и Т = 298 К.
5. Вычислите спектр мощности для системы с тремя состояниями, если корреляци-
онная функция является суммой двух экспонент, Xje’//T| +х2е Z/T2-
6. Вычислите среднеквадратичную величину флуктуаций длины водородной связи,
используя силовую постоянную 30 ккал • А-2 • моль-1 (см. разд. 2.12).
Глава 13
Ионная проницаемость мембран
и мембранный потенциал
Транспорт ионов с затратой метаболической энергии позволяет клеткам накапли-
вать одни ионы и выводить другие, в результате чего концентрации ионов внутри
клеток и снаружи различаются. По этим градиентам концентраций происходит
пассивный транспорт ионов через мембрану, причем скорости его для разных ио-
нов различаются, соответственно тому что проницаемость клеточной мембраны
для одних ионов выше, чем для других. Это приводит к разделению зарядов и обра-
зованию трансмембранной разности потенциалов, или мембранного потенциала.
Практически любая клетка обладает мембранным потенциалом, который генери-
руется транспортом ионов. Движение ионов через мембрану вызывает различные
электрические эффекты и обеспечивает возможность передачи электрических сиг-
налов. Мембранный потенциал существует также на мембранах органелл и на кле-
точных слоях, например эпителии. В основе всех указанных процессов лежит из-
бирательная проницаемость мембран для различных ионов. В данной главе рас-
сматривается связь между проницаемостью мембраны, ионными потоками
и мембранным потенциалом; описанию механизма проницаемости посвящена
следующая глава.
13.1. Потенциал Нернста
Рассмотрим два раствора соли, различающиеся по концентрации и разделенные
мембраной (рис. 13.1). Если мембрана проницаема только для одного иона, этот
ион будет диффундировать через мембрану по градиенту его концентрации, тогда
как другие ионы не будут проходить сквозь мембрану. В результате образуется дис-
баланс зарядов и, следовательно, мембранный потенциал. Возникший мембран-
ный потенциал будет противодействовать проникновению через мембрану того
иона, для которого она проницаема, и в итоге установится равновесие — полный
баланс между разностью электрических потенциалов и разностью химических по-
тенциалов.
Обозначим концентрацию иона, для которого мембрана проницаема, в раство-
ре а как са и в растворе b как съ. Запишем выражение для изменения свободной
энергии в результате переноса 1 моль этого иона из раствора а в раствор Ь.
ДС = ЯПп^ (13.1)
Са
13.1. Потенциал Нернста
375
Рис. 13.1. Два раствора, а и Ь, различающиеся по
концентрации соли, разделены мембраной, прони-
цаемой только для одного иона
а Диффузия иона b
Изменение свободной энергии в расчете на моль, вызванное изменением электро-
статической, или электрической, энергии, составляет1
\U = zF(yb-V^ = zF\V (13.2)
В условиях равновесия между двумя растворами результирующее изменение энер-
гии переноса ионов через мембрану равно нулю. При условии ДG + Д U = 0 справед-
ливо уравнение для потенциала
ДИ = -—In—(13.3)
ZF са
Это уравнение названо уравнением Нернста, и определяемый им потенциал
ДИ называют потенциалом Нернста для данного иона. Вальтер Нернст вывел это
уравнение в 1888 г., и спустя более пол столетия о нем было высказано мнение как
о «лучшем из известных и наиболее часто встречающемся в биологической лите-
ратуре» (Katz, 1966). Это несколько преувеличенная оценка, но, действительно,
данное соотношение между концентрацией иона и мембранным потенциалом
имеет чрезвычайно важное значение в клеточной физиологии и биофизике мем-
бран.
Если ион, способный проникать через мембрану, представляет собой однова-
лентный катион, зарядовое число z = 1. Если са > сь, убывание катионов в растворе
а и их накопление в растворе b приведет к увеличению отрицательного заряда
в растворе а. Согласно уравнению Нернста, Иь > Иа и ДИ составляет положитель-
ную величину. Если проникающий ион представляет собой одновалентный анион,
Z = -1 и соотношение потенциалов обратное.
Величина RT/F, присутствующая в уравнении (13.3), имеет размерность
вольт и равна 25,6 мВ при комнатной температуре.2 Это очень важная величина,
присутствующая во многих уравнениях в данной главе; она определяет соотно-
шение между термодинамическими формами свободной энергии и электриче-
1 С этого момента становится очень неудобно использовать систему единиц СГС (см. гл. 2),
где заряд выражен в единицах системы СГСЕ и энергия в эргах. В электрофизиологии использу-
ется в качестве единицы заряда кулон. Единица энергии при этом равна 1 кулон-вольт = 1 джоуль =
= 0,2389 кал. В случае одновалентных ионов, чтобы перейти от кулонов к молям, необходимо
произвести умножение на число Фарадея (F = 96 485 Кл • моль-1).
2 R = 1,98 кал • моль-1 • К-1 и Т = 298 К, соответственно RT = 590 кал • моль-1.
F = 96 485 Кл • моль-1 = 96 485 Дж • В-1 • моль-1 = 23 050 кал • В-1 • моль-1 (при использовании
коэффициента 0,2389 для перехода от джоулей к калориям; см. первое примечание в этой главе).
Таким образом, RT/F= (590 кал • моль-1) / (23 050 В-1 • моль-1) = 0,0256 В.
376
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
ской энергией. Величина RТ/F представляет собой приращение мембранного
потенциала при е-кратном изменении соотношения концентраций. Используя
In 10 = 2,3, можно рассчитать, что изменение соотношения концентраций в 10 раз
приводит к изменению мембранного потенциала на 58 мВ. Эти числа полезно за-
помнить.
В большинстве типов клеток позвоночных концентрация К+ составляет
~ 130 мМ, тогда как его внеклеточная концентрация равна ~ 4 мМ. В этом случае,
согласно уравнению (13.3), ДИ равно ~ -87 мВ как потенциал Нернста для К+. Это
очень грубая оценка мембранного потенциала большинства электрически возбу-
димых клеток; обычно он варьирует в диапазоне от -60 до -90 мВ. Для количест-
венного вычисления мембранного потенциала требуется учитывать другие ионы,
что будет кратко рассмотрено ниже.
Уравнение Нернста описывает условия термодинамического равновесия, когда
сила концентрационного градиента уравновешивается разностью потенциалов.
Это условие предполагает, что ионы не перемещаются через мембрану и система
остается стабильной неопределенно долгое время. В действительности, как мы
убедимся ниже, при одновременном присутствии различных проникающих ионов
мембранный потенциал находится в стационарном, а не равновесном состоянии
(за исключением доннановского потенциала). При стационарном состоянии про-
исходит непрерывное движение ионов через мембрану, но их потоки сбалансиро-
ваны таким образом, что результирующий ток равен нулю.
Важно иметь в виду, что при транспорте ионов, вызывающем изменение разно-
сти потенциалов на мембране, концентрации ионов изменяются очень незначи-
тельно. Если сравнить начальные концентрации ионов са и сь и конечные концен-
трации после установления потенциала Нернста, можно убедиться, что они почти
одинаковы. Рассмотрим для этого сферическую клетку радиусом 100 мкм. Элек-
троемкость мембраны такой клетки равна 4л 10"10Ф (участок мембраны площадью
1 см2 обладает электроемкостью ~1 мкФ; см. разд. 15.2). Для изменения разности
потенциалов на мембране на 100 мВ требуется заряд 12,6 • 10"11 Кл. Деление на чис-
ло Фарадея позволяет рассчитать на основе этого заряда концентрацию однова-
лентного иона, равную 1,3-10"15 моль. Объем рассматриваемой клетки составляет
4,2 • 10"6 см3, или 4,2 • 10"9 л. Таким образом, концентрация иона изменится при об-
разовании потенциала Нернста лишь на 0,3 мкМ. Поскольку внутриклеточные
концентрации ионов обычно лежат в миллимолярном диапазоне, такое их измене-
ние можно считать относительно небольшим.
Отметим, что электроемкость пропорциональна площади и концентрация об-
ратно пропорциональна объему. Следовательно, в меньших по объему клетках при
том же изменении разности потенциалов изменение концентрации иона будет
больше. Для мелкой клетки радиусом 1 мкм приведенные выше величины состав-
ляют 1,3 • IO’19 моль и 4,2 • 10"15 л, т. е. в случае изменения мембранного потенциала
на 100 мВ концентрация иона должна увеличиться на 0,03 мМ. Внутриклеточная
концентрация Са2+ составляет менее 1 мкМ, и транспорт Са2+ может изменять ее
довольно сильно. Этим обеспечивается функция [Са2+] как эффективного химиче-
ского сигнала. Однако в случае ионов, представленных в клетке в большем количе-
стве, таких как Na+, К+ и СГ, обычно можно не учитывать изменения их концен-
трации при транспорте через мембрану, вызывающем изменение мембранного по-
тенциала.
13.2. ДОННАНОВСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ
377
13.2. Доннановский потенциал
Потенциал Нернста относится к случаю, когда через мембрану диффундирует
только один ион. Противоположный крайний случай, когда через мембрану спо-
собны проникать все ионы, кроме одного, характеризует величина доннановского
потенциала. Непроникающим ионом обычно считается крупный полианион, на-
пример такой, как присутствующая в клетке нуклеиновая кислота. Эти условия
иллюстрирует рис. 13.2, где символом N~w обозначена крупная молекула, несущая
суммарный заряд — w.
Мелкие анионы и катионы, В“ и А+, способны проникать через мембрану, то-
гда как крупный анион N~w может находиться только в левом растворе. В отсутст-
вие этого полианиона в системе достигалось бы равновесие, при котором концен-
трации соли АВ были бы равны по обе стороны мембраны. Однако в присутствии
N~w имеется дополнительный отрицательный заряд в растворе айв соответствии
с этим анионы В” выталкиваются вправо, а катионы А+ влево (рис. 13.2). В итоге
достигается равновесие, при котором разность потенциалов компенсирована дви-
жущей силой диффузии. В результате движения А+ в раствор а и В” в раствор b соз-
дается разность потенциалов ДК = КЬ -Ка с отрицательным знаком.
Равновесие силы диффузии и электрических сил, действующих на ионы А+ и
В", означает, что концентрации этих ионов удовлетворяют уравнению Нернста
ДИ = -—In-——— (13.4а)
F [А+]а
ДИ = — щРА, (13.46)
F Па
где z = 1 для катионов в уравнении (13.4а) и z = -1 для анионов в уравнении (13.46).
Путем приравнивания этих выражений получаем
[А+]ь[В“]а = [А+1а[В"1ь (13.5)
Это соотношение можно использовать как тест на доннановский потенциал, не
производя измерений мембранного потенциала. Если определяемые в экспери-
менте концентрации А+ и В" соответствуют уравнению (13.5), можно считать, что
имеет место доннановский потенциал.
Из уравнений (13.4а), (13.46) и (13.5) нельзя вычислить концентрации и мем-
бранный потенциал; для этого требуются дополнительные сведения. Здесь необхо-
Рис. 13.2. Присутствие с одной стороны мембра-
ны полианиона N~w, не способного проникать
сквозь мембрану, вызывает перераспределение
проникающих анионов В" и катионов А+, что при-
водит к установлению доннановского равновесия.
378
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
димо иметь в виду, что величина суммарного заряда в каждом растворе близка
к нулю. Это следует из примеров, рассмотренных в конце предыдущего раздела,
где продемонстрировано, что в случае типичных значений мембранного потен-
циала увеличение содержания иона в клетке незначительно по сравнению с его
внутриклеточной концентрацией. Соответственно можно пренебречь микромо-
лярными изменениями концентрации на фоне существующей миллимолярной
концентрации. Условия нулевого суммарного заряда означают состояние электро-
нейтральности , и для раствора а оно описывается выражением
[А+]а -[В’]а -МАТЧ = 0
(13.6)
Для раствора b условия электронейтральности означают, что [А+] ь = [В- ] ь. На осно-
вании этого равенства можно заменить концентрации данных ионов в уравнениях
для раствора b концентрацией их соли, съ.
Преобразуем уравнения (13.4а) и (13.46) указанным образом
-^ = е-мг/лг (13.7а)
[А+]а
_£ь_ = е£д|//лт (13.76)
[В )а
Решая эти уравнения относительно [А+]а и [В"]а и подставляя полученные выра-
жения в уравнение (13.6), мы получаем уравнение
c^v/RT-cbe^v/RT ~^[N~W] = ^ (13.8)
Умножение на еми/лг и деление на сь дает
е2£ди/Ят_)Юе^/лг-1 = 0 (13.9)
Съ
Это квадратное уравнение в отношении члена е£ди/лг, и решение его относительно
данного члена имеет вид
ma-п + Luv-*]Y н
qf^/rt _ сь у к сь J
2
= <2+ и
2сь Ц 2cb J
(13.10)
Из двух корней уравнения (13.9) в качестве физически значимого оценивается
только корень в виде положительной величины. Таким образом, мембранный по-
тенциал составляет
Т Z ЛУ-
ДИ =--In
F
НАЛ + ГМА'ЧУ
2cb yl 2cb J
(13.11)
13.3. Клеточный мембранный потенциал
379
Итак, величина мембранного потенциала может быть рассчитана из концен-
траций [А ] и сь. Важное различие между этими условиями и теми, в которых воз-
никает потенциал Нернста, состоит в том, что здесь имеет место значительный
поток ионов, необходимый для достижения равновесия. При диффузии иона, при-
водящей к возникновению потенциала Нернста, концентрация иона почти не из-
меняется, тогда как установление доннановского потенциала сопровождается зна-
чительными изменениями концентраций ионов. Электронейтральность при этом
сохраняется, поскольку баланс зарядов поддерживается за счет потоков различных
ионов.
13.3. Клеточный мембранный потенциал
Клеточная мембрана большинства электрически возбудимых клеток обладает так
называемым потенциалом покоя, под которым понимается стабильный мембран-
ный потенциал в отсутствие стимуляции. Как правило, потенциал покоя имеет от-
рицательную величину, т. е. внутреннее содержимое клетки является электроотри-
цательным относительно внешней среды. Рассмотренные выше теории потенциала
Нернста и доннановского потенциала объясняют потенциал покоя альтернативны-
ми способами. Если клеточная мембрана проницаема только для одного иона (ка-
тиона), клетка может концентрировать этот ион посредством активного транспор-
та, и тогда он диффундирует в обратном направлении, создавая на мембране отри-
цательный потенциал Нернста. Тот же эффект достижим в случае, если из клетки
выкачивается анион, способный проникать через мембрану; возникающая в резуль-
тате диффузия этого аниона обратно в клетку приводит к образованию отрицатель-
ного потенциала на мембране. Другая ситуация имеет место, когда в клетке синте-
зируется большое количество полианиона и через мембрану способны проникать
многие другие ионы, генерирующие при своем перераспределении доннановский
потенциал. Далее мы рассмотрим, как эти теории объясняют потенциал покоя, на
примере нейронов и мышечных волокон. В мембране нейронов генерация потен-
циала покоя связана главным образом с транспортом К+, и этот потенциал близок
по величине к потенциалу Нернста. В клетках скелетных мышц позвоночных по-
тенциал покоя обусловлен транспортом К+ и СГ. Потоки двух этих ионов проис-
ходят совместно и хорошо описываются теорией доннановского потенциала.
При изучении потенциала покоя вначале рассчитывают потенциал Нернста
для каждого иона. Такие данные для аксона кальмара и скелетной мышцы лягушки
представлены на рис. 13.3. Они показывают определенное сходство между этими
объектами в распределении ионов между клеткой и внешней средой. Каждый
ион неравномерно распределен по сторонам клеточной мембраны, например кон-
центрация К+ выше внутри клетки, тогда как концентрации Na+ и СГ выше сна-
ружи клетки. Неравномерное распределение К+ и Na+ поддерживается работой
Na+/K+-ATPa3bi в качестве ионной помпы (см. разд. 13.8). (Этот присутствующий
во всех клетках мембранный белок использует энергию осуществляемого им гид-
ролиза АТР для выведения из клетки Na+ и поглощения К+.) В то же время по про-
ницаемости для различных ионов клеточные мембраны аксона кальмара и мышеч-
ной клетки лягушки различаются, и механизмы генерации потенциала покоя у них
разные.
380
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
Потенциал Нернста
Внутри клетки Снаружи клетки
Аксон кальмара
[Na+] = 50 [Na+]» 440
[К*] = 400 [К+]« 20
[СГ] = 40-150 [СГ] х 560
[№] = 360
56 мВ
-77 мВ
от-34 до 68 мВ
Потенциал покоя = -60 мВ
Рис. 13.3. Внутриклеточ-
ные и внеклеточные кон-
центрации ионов, потен-
циалы Нернста и мемб-
ранный потенциал покоя
для клеток двух типов
(Aidley, 1978).
Мышца лягушки
[Na+] = 10,4 [Na*] = 109
[К+] = 124 [К*] = 2,25
[СГ] = 1,5 [СГ] = 77,5
[N’] - 74 [N-J-13
60 мВ
-103 мВ
-101 мВ
Потенциал покоя = -90 мВ
13.3.1. Нейроны
Потенциал покоя на клеточной мембране аксона кальмара не равен потенциалу
Нернста ни для одного иона, но близок к потенциалам Нернста для К+ и С1“, что
служит важной отправной точкой для анализа. Чтобы выяснить причину этой свя-
зи, необходимо произвести измерения мембранного потенциала при варьировании
концентраций различных ионов. Если имеет значение проницаемость для одного
из этих ионов, мембранный потенциал будет изменяться в соответствии с уравне-
нием (13.3). Данные, получаемые в таком эксперименте, приведены на рис. 13.4.
Как видно из графика, при изменении внеклеточной концентрации К+ происходит
ожидаемое изменение потенциала. При концентрации этого иона выше 30 мМ ее
Рис. 13.4. График зависимости
мембранного потенциала покоя
от внеклеточной концентрации
К+ в случае аксона кальмара (по
Curtis, Cole, 1942). Кривая соот-
ветствует уравнению Нернста
для К+.
13.3. Клеточный мембранный потенциал
381
10-кратное увеличение приводит к изменению потенциала примерно на 58 мВ
и значения потенциала покоя лежат близко к расчетной кривой изменения потен-
циала Нернста. Варьирование концентрации СГ практически не оказывает влия-
ния на потенциал покоя. Таким образом, потенциал покоя на клеточной мембране
аксона кальмара представляет собой по существу потенциал Нернста для К+ при
концентрации этого иона не ниже ~30 мМ.
При более низкой концентрации К+ мембранный потенциал не описывается
уравнением Нернста. Это в основном обусловлено вкладом в мембранный потен-
циал других ионов, для которых мембрана проницаема. Для СГ и Na+ она прони-
цаема в гораздо меньшей степени, чем для К+, но вклады этих двух ионов в потен-
циал измеримы, особенно при низкой концентрации К+. Следовательно, мемб-
ранный потенциал необходимо рассматривать с учетом многих проникающих
ионов, и далее это будет сделано в краткой форме, но вначале следует описать по-
тенциал покоя на клеточной мембране мышечного волокна.
13.3.2. Скелетные мышцы позвоночных
Как и в случае аксона кальмара, потенциал покоя на мембране мышечного волок-
на близок по величине к потенциалам Нернста для К+ и СГ (рис. 13.3). Однако
в отличие от того, что характерно для аксона кальмара, на величину потенциала
покоя мышечного волокна существенно влияет изменение наружной концентра-
ции какК+, так и СГ. В классической работе Бойля и Конвея (Boyle, Conway, 1941)
мышцу лягушки помещали в различные растворы и измеряли внутриклеточные
и внеклеточные концентрации ионов. Концентрации К+ и СГ подчинялись урав-
нению (13.5), указывая на то, что транспортом этих двух ионов генерируется дон-
нановский потенциал. Сходство потенциалов Нернста для этих ионов между собой
и с потенциалом покоя соответствует другому предсказанию доннановской теории
(уравнения (13.4а) и (13.46).
Изменение внеклеточной концентрации как К+, так и СГ приводит к измене-
нию мембранного потенциала в клетках скелетной мышцы лягушки (Hodgkin,
Horowicz, 1959). Повышение внеклеточной концентрации К+ с 2,5 до 10 мМ вызы-
вает быстрое повышение потенциала на 16 мВ и более медленное, в течение не-
скольких минут, повышение на 10 мВ. Снижение внеклеточной концентрации СГ
в 4 раза вызывает повышение потенциала примерно на 20 мВ, но через несколько
минут он возвращается к исходному уровню. Согласно уравнению Нернста, изме-
нение концентрации иона в 4 раза должно приводить к изменению потенциала на
35 мВ; следовательно это уравнение применимо не к любому иону.
Данные, полученные Ходжкином и Горовицем, позволяют выделить быстрое
и медленное изменения потенциала. Вначале потенциал покоя близок к потенциа-
лам Нернста для К+ иСГ (рис. 13.3). Повышение внеклеточной концентрации К+
или снижение внеклеточной концентрации СГ сдвигает потенциал Нернста для
данного иона в сторону положительных значений, и в результате потенциалы
Нернста для этих ионов уже не равны друг другу. Быстрое изменение потенциала
покоя состоит в том, что он возрастает до некоторой величины, промежуточной
между потенциалами Нернста для К+ и СГ (точный расчет этой величины приве-
ден в разд. 13.7). После этого быстрого изменения концентрации ионов изменяют-
ся медленно, что приводит к образованию нового доннановского потенциала. По-
382
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
вышение внеклеточной концентрации К+ вызывает вход К+ и СГ в клетку в рав-
ных количествах (с сохранением электронейтральности). Потенциал Нернста для
СГ повышается значительно больше, чем для К+, поскольку при внутриклеточной
концентрации СГ, равной всего 1,5 мМ, ее относительное изменение намного
больше. Транспорт КС1 продолжается до тех пор, пока потенциалы Нернста этих
ионов не становятся равными и не восстанавливается доннановское равновесие.
Той же логической канве соответствуют события при повышении внеклеточной
концентрации СГ: вначале повышение потенциала и затем выход КС1 из клетки
с уменьшением потенциала Нернста для СГ.
Такие закономерности характерны для клеток скелетных мышц позвоночных
(Aidley, 1978; Aickin, 1990). Мембраны этих клеток высокопроницаемы и для К+,
и для СГ, но проницаемость для СГ обычно в 2—20 раз выше, чем для К+. Измене-
ние концентрации Na+ не оказывает существенного влияния на мембранный по-
тенциал, так как клеточная мембрана в состоянии покоя малопроницаема для дан-
ного иона Низкая проницаемость для Na+ служит двум целям. Прежде всего, она
обеспечивает поддержание осмотического баланса — высокой внутриклеточной
концентрации органических анионов, для которых мембрана малопроницаема,
должна соответствовать высокая внеклеточная концентрация катиона. В то же
время в клетку должна поступать вода для разведения ионов. Высокая внеклеточ-
ная концентрация Na+ поддерживает осмолярность снаружи клетки на уровне ос-
молярности внутри клетки. Кроме того, градиент концентрации Nar служит резер-
вом для быстрого изменения мембранного потенциала, т. е. генерации потенциала
действия при передаче электрических сигналов (см. гл. 16).
13.4. Проницаемость мембран для Na* и К*
Если через мембрану может проникать не менее двух ионов, мембранный потен-
циал отражает относительную силу влияния транспорта каждого иона в направле-
нии соответствующего потенциала Нернста. Рассмотрим условия, при которых
через мембрану проникает два иона с одинаковым зарядом. Анализ этого случая
позволит привести некоторые важные идеи и лучше объяснить данные, представ-
ленные на рис. 13.4.
Рассмотрим случай, когда два раствора содержат NaCl и КС1 в различных про-
порциях, но в одинаковой суммарной концентрации (рис. 13.5). Концентрация
Na+ выше в левом растворе, и этот ион будет диффундировать в правый раствор,
в результате чего левый раствор станет электроотрицательным. В свою очередь
а Na Высокая концентрация NaCl Низкая концентрация KCI Ь К+ Высокая концентрация KCI Низкая концентрация NaCl
Рис. 13.5. Два раствора разделены мембраной
проницаемой и для К+ и для Na+
13.4. Проницаемость мембран для Na+ и К
383
диффузия ионов К+ в левый раствор должна приводить к возрастанию отрицатель-
ного заряда в правом растворе. Какая тенденция будет преобладать, зависит от
скоростей транспорта ионов через мембрану. Однако в уравнении Нернста кон-
станта диффузии отсутствует, поскольку оно относится к условиям равновесия, ко-
торое, как правило, не зависит от скорости транспорта.
При расчете мембранного потенциала для случая проникновения через мем-
брану многих ионов обычно составляют уравнения потоков всех ионов, суммиру-
ют их и приравнивают общий поток нулю, после чего находят значение потенциа-
ла. В основе такого подхода лежит идея, что, если суммарный поток равен нулю,
мембранный потенциал имеет постоянную величину.
Поток иона через мембрану рассматривается как диффузия под влиянием двух
одинаковых сил, величины которых входят в уравнение Нернста, — разности по-
тенциалов и градиента концентрации. Совместное действие этих сил рассматрива-
лось выше при описании процесса диффузии и кинетики химических реакций (см.
гл. 6 и 7). Поток, вызываемый градиентом концентрации, описывается выражени-
ем -Z)(dc/dx), где D— коэффициент диффузии иона через мембрану. Поток, гене-
рируемый разностью потенциалов, составляет величину -(zFc//)(6И/dx), где f —
коэффициент трения для иона в мембране. Учет этих двух величин в сочетании
с двумя указанными силами при использовании соотношения Эйнштейна, f = kT/D
(уравнение (6.62)), позволяет вывести уравнение для общего потока ионов, подоб-
ное уравнению (6.64)
(zFc d И de
J = -D + — (13.12)
{RT dx dx)
Переход от кТ к RTозначает, что здесь концентрация выражена в молях. Необхо-
димости в получении частных производных в данном случае нет, поскольку диф-
ференцирование производится только по х. Это выражение, как можно продемон-
стрировать, согласуется с уравнением Нернста (см. задачу 2).
Выражение для тока, обусловленного транспортом данного иона, выводится
из уравнения (13.12) путем умножения на величину заряда в расчете на моль. На-
помним, что коэффициентом для перехода от молей к кулонам служит число Фа-
радея (см. прим, в начале этой главы). Таким образом, умножая величину J, выра-
женную в моль • с-1, на zF, мы получаем величину тока, выраженную в Кл • с-1, т. е.
в амперах
( zFc d V de
I = -zFD — — + — (13.13)
[RT dx dx)
Прежде чем перейти к выведению выражения для ДИ, необходимо отметить,
что, когда градиент концентрации равен нулю, уравнение (13.13) превращается
в простое линейное соотношение между током и потенциалом
/ = _^e£dr
RT dx
Это уравнение можно проинтегрировать по толщине мембраны. Данная величи-
на /является постоянной, и левая часть уравнения при интегрировании становит-
384
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
ся равной /8, где 8 — толщина мембраны. При значении с, постоянном внутри
мембраны, интеграл производной в левой части уравнения равен ДИ
z2F2cD
16= (13.15)
RT
Теперь произведем деление на 8 и заменим величину D/6 новой величиной, Р, оз-
начающей проницаемость
72F2cP
! = W (13.16)
RT
Данное выражение по существу представляет собой закон Ома. Присутствую-
щий в нем коэффициент пропорциональности — это величина проводимости
мембраны
72F2cP
G= (13.17)
RT
Таким образом, проводимость — величина, характеризующая ток, вызванный
транспортом иона в ответ на разность потенциалов, — прямо пропорциональна
проницаемости как величине, характеризующей поток иона, вызываемый гради-
ентом концентрации. Связь между этими величинами понятна. Способность мем-
браны противодействовать потоку ионов, вызванному одной из этих двух сил,
в целом эквивалентна ее способности противодействовать влиянию другой движу-
щей силы.
Отметим, что уравнения (13.16) и (13.17) справедливы только для условий, ко-
гда концентрации ионов очень близки по обе стороны мембраны (т. е. dc/dx ~0).
Если концентрации различаются, неизвестно, что принимать за с. Ниже мы проде-
монстрируем, как эта проблема решается с помощью уравнения Гольдмана—Ход-
жкина—Катца для ионного тока (разд. 13.10).
Возвращаясь к выведению уравнения стационарного мембранного потенциала
для случая двух проникающих катионов, преобразуем уравнение (13.13), приняв
Z = 0, и запишем выражения для тока, связанного с транспортом Na+ и К+
/Na = -FD^-^ d(lNa>f|Z//ir) (13.18а)
dx
/к = -FDYe.-FV/RTd([K Iе ’ \ (13.186)
dx
где Z)Na и DK — коэффициенты диффузии для Na+ и K+ соответственно. Аналогич-
ные математические действия были использованы для выведения уравнения
(7.28). Полученный результат легко проверить, применив правило умножения
к производной в правой части уравнения.
При стационарном состоянии сумма токов, обусловленных транспортом Na+ и
К+, равна нулю
FZ>Nae’f,z/A7' d^a + FDKeFVIRT d^[K № = о (13.19)
dx dx
13.5. ВНОВЬ О МЕМБРАННОМ ПОТЕНЦИАЛЕ НЕЙРОНОВ
385
От множителя Fqfv/rt перед каждым членом можно теперь избавиться, в результа-
те чего останутся только производные, которые легко проинтегрировать от левой
стороны мембраны (а) к правой стороне (Ь)
Z)Na ([Na+]b^RT - [Na+]a ^RT) + DK ([K+]be™ - [K+]a eF^RT) =
= £Na ([Na+]b^V/RT - [Na+]a) + DK ([К+]ьч/ди/лг - [K+]a) = 0 (13.20)
Здесь на втором этапе е£Иа/лг выносится за скобки и в результате остается выраже-
ние е£(Иь"Иа)//гг = еми//?г, из которого можно определить ДИ
д у _ _ &Т j f Z)Na [Na+]b + Z\([K+] J (13 21)
F ^Na[Na+]a + Z)K([K+]a J
Это пример уравнения Гольдмана—Ходжкина—Катца для мембранного потен-
циала, которое в приложении к более общему случаю транспорта ионов с различ-
ными по знаку зарядами выводится ниже (см. разд. 13.7 и 13.11). В основе уравне-
ния (13.21) лежит только условие независимости потоков двух ионов и постоянства
Z)Na и Z)K внутри мембраны (Hille, 1991). Отметим, что, если Z)Na » DK, величина
ДИ приближается к потенциалу Нернста для Na+; в обратном случае она прибли-
жается к потенциалу Нернста для К+.
Коэффициенты D в уравнении (13.21) обычно заменяют коэффициентами
проницаемости Я (мы определили Ркак/)/8, т. е. величины Ри D пропорциональ-
ны). Очевидно, что умножение всех коэффициентов D на один и тот же коэффи-
циент не приведет к какому-либо изменению. Следует обратить внимание, что ве-
личина ДИ зависит от соотношения проницаемостей, а не от их абсолютных вели-
чин, и при использовании уравнения (13.21) не имеет значения, включает оно D
или Р. Величину Р удобно использовать для обработки с помощью уравнения
(13.21) результатов экспериментального измерения мембранного потенциала.
13.5. Вновь о мембранном потенциале нейронов
Уравнение (13.21) помогает правильно объяснить результаты измерения мембран-
ного потенциала на мембране нейронов (рис. 13.4). Для их анализа вначале необ-
ходимо переписать уравнение (13.21) с использованием соотношения проницае-
мостей /?K/Na =^к/Л4а = ^\/^Na
ЯЯ j /[Na+]b ^K/Na[K-]b
F |jNa+]a + Як/Na [к+]а ,
(13.22)
В такой форме уравнение содержит лишь один неизвестный параметр, /?K/Na. Ис-
пользуя приведенные на рис. 13.3 данные о концентрациях Na+ и К+ в растворе b и
Na+ в растворе а и считая концентрацию К+ экспериментальной переменной, мож-
но достоверно описать изменение мембранного потенциала в зависимости от вне-
клеточной концентрации К+, приняв величину /?K/Na равной 19 (см. рис. 13.6). Для
многих типов клеток уравнение (13.22) хорошо соответствует измеряемой вели-
чине мембранного потенциала при значениях /?K/Na от 10 до 100. Таким образом,
386
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
отклонения потенциала покоя от потенциала Нернста для К+ можно объяснить
низкой проницаемостью мембраны для Na+. Из этого анализа следует важный вы-
вод, состоящий в том, что данные о проницаемости мембраны для второго иона,
в данном случае натрия, существенно помогают сопоставлению эксперименталь-
ных данных и теоретических результатов. Однако действительный механизм изме-
нений потенциала покоя более сложен; он может включать некоторый вклад
транспорта СГ, а также влияние величин проницаемости, которые изменяются
в зависимости от величины мембранного потенциала (Hille, 1977).
В нейронах потенциал покоя зависит главным образом от работы калиевых ка-
налов. Существует много видов К+-каналов, различающихся по той роли, которую
они выполняют в регуляции возбудимости мембраны. Многие из этих каналов об-
наруживают сложную зависимость от потенциала (см. гл. 16), однако в нейронах
ганглиев лягушки активность тех К+-каналов, которые обеспечивают основной
механизм проникновения К+ через мембрану в состоянии покоя, очень незначи-
тельно зависит от мембранного потенциала и, по-видимому, эти каналы специфи-
чески предназначены для этой своей функции (Jones, 1989). В клетках разных ти-
пов генерацию потенциала покоя обеспечивают различные К+-каналы. В нейро-
нах мозжечковых гранул за высокую проницаемость мембраны в состоянии покоя
для К+ ответствен К+-канал с двумя поровыми доменами (Millar et al., 2000). В ней-
ронах среднего мозга эту функцию осуществляет канал однонаправленного транс-
порта К+ внутрь клетки, и закрывание этого канала под влиянием нейромедиатора
частично разрушает мембранный потенциал (Nakajima et al., 1988). Как отмечено
выше (разд. 13.3.2), потенциал покоя в клетках скелетной мышцы определяется
транспортом иК+ и СГ; связанный с этим СГ-канал имеет обозначение С1С-1
(Jentsch et al., 2002).
13.6. Соотношение потоков по Уссингу
и активный транспорт
Каким способом можно распространить уравнение (13.21) на потоки дополни-
тельных ионов? Для этого требуется более подробный математический анализ за-
13.6. Соотношение потоков по Уссингу и активный транспорт
387
висимости потоков ионов от сочетания электрических и химических факторов.
Важный элемент этой теории был введен Уссингом в его классическом исследова-
нии активного транспорта ионов (Ussing, 1949).
Вернемся к уравнению (13.18а) или (13.186) для одного иона, обозначаемого
индексом i, чтобы вновь рассмотреть поток, / (не ток, 7), и умножим его на экспо-
ненциальный коэффициент
csz'FV/RT (13.23)
dx
Считая состояние стационарным, при котором / является постоянной величиной,
проинтегрируем обе части уравнения по толщине мембраны
ь
Л |ег,ЛУ/лгсЬс = -A (fiibcMT -с-ае^ят) (13.24)
а
Интеграл в левой части этого уравнения нельзя точно вычислить без определения
функции И(х) внутри мембраны. Однако здесь это не имеет значения, поскольку
данный интеграл при дальнейших преобразованиях сократится.
С помощью уравнения (13.24) опишем однонаправленный поток иона, кото-
рый можно наблюдать, если внести в раствор с одной стороны мембраны радио-
активную метку и измерять ее накопление по другую сторону мембраны. Если
метка внесена в раствор а, концентрация метки в растворе b исходно равна нулю
и уравнение (13.24) в этом случае будет отражать поток метки из раствора а в рас-
твор b
/i(a-.b)=©iCiae^^r (13.25)
Здесь символ 0, обозначает величину Д, деленную на интеграл при члене / в ле-
вой части уравнения (13.24). Сход ное уравнение можно вывести для потока метки
в обратном направлении
(13.26)
где член 0, обозначает то же, что в уравнении (13.25). Соотношение двух этих по-
токов будет представлять собой равенство
*^i(a->b) _ £ia_^-ZiMI77?r 27)
Л(Ь->а) ^ib
Это выражение для соотношения потоков ионов, выведенное Уссингом. Оно
позволяет объяснить результаты измерения потока метки на основе механизмов
активного и пассивного транспорта. Измеренный Уссингом транспорт метки через
кожу лягушки характеризовался соотношением, которое в сотни раз отличалось от
предсказываемого уравнением (13.27), и это указывало на участие активного
транспорта. Уссинг проверил зависимость процесса от метаболической энергии
путем внесения ингибитора; в течение нескольких минут после его внесения про-
исходило изменение потоков ионов до величин, соответствующих уравнению
(13.27).
388
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
13.7. Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца
для мембранного потенциала
Теперь на основе уравнения (13.21) выведем выражение для мембранного потен-
циала как функции концентраций и соотношения потоков всех одновалентных
ионов (Patlak, 1960). Вначале запишем условие для нулевого результирующего тока
(как это было сделано для двух ионов в разд. 13.4), но будем рассматривать каждый
результирующий поток как разность между однонаправленными потоками вправо
и влево, описанными в предыдущем разделе. Потоки катионов полностью сбалан-
сированы потоками анионов, и результирующий поток составляет
^(Л(Ь->а) ” Л(а->Ь)) ” ^(Л(Ь->а) - Л(а->Ь)) = 0 (13.28)
катионы анионы
Используя полученное Уссингом уравнение для соотношения потоков (13.27),
исключим член относящийся к катионам, и член Ji(b_>a), относящийся
к анионам
( -F^V/RT\ ( -FbV/RT \
I/цЬ^а) 1-—---------- " £Л(а-.Ь) ~-----------1 =0 (13.29)
катионы \ ^ib ) анионы \ ^ia )
Поток из раствора b в раствор а должен быть пропорционален сь, и константа про-
порциональности между концентрацией и потоком равна величине проницаемо-
сти. Таким образом, ^(b->a) = ^icibi аналогичным образом /(а_,Ь) = ^cia- Производя
соответствующие замены, получаем выражения
= 0
катионы анионы
^cib-e-^ J>ib + ^=0
катионы катионы анионы анионы
Решим эти уравнения относительно е"£ди/лг и возьмем логарифм
nr +
А* катионы_______анионы
F ?Р>са +
\ катионы анионы
(13.30)
(13.31)
(13.32)
Это уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для разности потенциалов
(13.21), но в более общей форме. Оно описывает мембранный потенциал как
функцию концентраций и проницаемости мембраны для всех одновалентных ио-
нов. Исходно данное уравнение было выведено на основе предположения, что на-
пряженность электрического поля по всей толщине мембраны постоянна и про-
филь потенциала в мембране линейный. В соответствии с этим его называют урав-
нением в приближении постоянного поля. Ниже мы кратко проанализируем
предположение о постоянстве напряженности поля, но способ получения уравне-
ния (13.32) показывает, что это уравнение носит более общий характер, чем пред-
полагалось исходно. Описываемая им закономерность не ограничена условием по-
стоянства напряженности электрического поля по толщине мембраны.
13.7. Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для мембранного потенциала
389
Лежащее в основе уравнения (13.32) предположение, что поток каждого иона
не зависит от потоков других ионов, не вполне обоснованно. Легко допустить, что
через канал идут потоки ионов, влияющие один на другой, и условие независимо-
сти нарушается. Например, возможны насыщение ионами связывающих участков
в каналах и обусловленная этим блокада связывания других ионов. Обзор много-
численных данных о несоответствии характера действия ионных каналов условию
независимости транспорта ионов приведен в 14 гл. книги Хилле (Hille, 1991); в по-
следующей главе автор анализирует несколько специальных моделей. Однако не-
смотря на эти данные уравнение (13.32) широко используется для определения со-
отношений проницаемости на основе результатов измерений потенциала, при ко-
тором ток равен нулю. Следует отметить, что эти соотношения представляют
собой критические величины, а не абсолютные значения проницаемости. Подоб-
но уравнению (13.22), уравнение (13.32) можно переписать в другой форме, выра-
зив по-иному соотношения проницаемости.
Важно определить, как измеряемая величина ДИ влияет на проницаемость
мембраны для различных ионов. В большинстве клеток основные одновалентные
ионы, которые требуется в связи с этим рассматривать, — это К+, Na+ и СГ
(рис. 13.3). Уравнение (13.32) для данных ионов можно записать следующим обра-
зом
RT 1пГ PNa[Na+]b+Рк[К+]ь+РС1 [СГ]а^
F ^PNa[Na+]a+Рк[К+]а+РС1[СГ]Ь J
(13.33)
На рис. 13.7 представлены графики зависимости мембранного потенциала от [К+]ь
при различных значениях Рсь построенные на основе данных о концентрациях ио-
нов для аксона кальмара, приведенных на рис. 13.3. Величина Рк принята равной
20 • PNa, и взяты несколько значений РС1. В случае, когда Рк » РС1, график сходен
с графиком на рис. 13.4, показывающим, что при высокой концентрации К+ пре-
^ci/^k=0,1
РС|/ЯК= Ю
[К+], мМ
Рис. 13.7. Уравнение (13.33) описывает зависимость ДУ от [К+]а. В присутствии проникающего
сквозь мембрану иона хлора влияние [К+] на потенциал снижается. Пунктирная линия — график
потенциала Нернста для К+. Внутриклеточная концентрация СГ принята равной 75 мМ.
390
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
обладает потенциал Нернста для К+. С увеличением Ра влияние концентрации ка-
лия снижается. Влияние данного иона на потенциал определяется произведением
концентрации иона и его проницаемости, и возрастание PCi приводит к тому, что
мембранный потенциал приближается к потенциалу Нернста для СГ (в данном
случае равному -88 мВ). В математическом выражении этот эффект состоит в воз-
растании [СГ] в числителе и знаменателе уравнения (13.33), при котором данное
соотношение становится независимым от изменений концентраций других ионов.
Здесь необходимо принять во внимание активности ионов. Уравнение для сво-
бодной энергии (13.1) относится к идеальному раствору. В количественных иссле-
дованиях часто приходится рассматривать отклонения от идеальных условий, и для
этого концентрации заменяют величинами активностей ионов. Молярная свобод-
ная энергия равна тогда 0° +RT\na, где а — активность иона. Как было отмечено
в гл. 11, при физиологических концентрациях NaCl и КО, равных примерно 100 мМ,
имеет место существенное отклонение от идеальных условий. Обычно предполага-
ется, что величины ионной силы и соответственно коэффициенты активности оди-
наковы внутри и снаружи клетки. Это позволяет исключить данные члены из чис-
лителя и знаменателя в логарифмическом члене уравнения Гольдмана—Ходжки-
на—Катца. В таком случае неидеальность раствора не имеет значения. Если
растворы имеют различную ионную силу, наблюдается различие и в активностях
ионов, и учет этого часто позволяет значительно повысить точность результатов.
13.8. Мембранные помпы и потенциал
На первый взгляд может показаться, что уравнения для мембранного потенциала,
включающие концентрации всех одновалентных ионов и проницаемость мембра-
ны для них, позволяют вычислить потенциал покоя для любой клетки. Уравнение
(13.33) действительно объясняет многие эффекты пассивного транспорта ионов,
но существует также вклад активного транспорта. В клеточных мембранах присут-
ствуют белки, действующие как ионные насосы. Эти белки, используя химиче-
скую энергию, транспортируют ионы против их концентрационного градиента.
Такие ионные помпы создают градиенты ионов, генерирующие мембранный по-
тенциал, и в конечном итоге, опосредованно, вносят вклад в генерацию потенциа-
ла покоя. В то же время многие активные ионные помпы в мембране, в первую
очередь Na+/K+-ATPa3a, являются электрогенными, т. е. генерируют ток, перекачи-
вая в одном направлении больше ионов, чем в другом. Эти помпы непосредствен-
но участвуют в генерации мембранного потенциала.
Чтобы объяснить влияние тока, создаваемого ионными помпами, на мембран-
ный потенциал, запишем вначале сумму всех пассивных ионных потоков из урав-
нения (13.28) и прибавим к ней поток ионов, перекачиваемых помпами, /помп (это
может быть измеренная величина потока или также измеренная величина тока, де-
ленная на zF). Произведя действия, аналогичные использованным при выведении
уравнения (13.32), получаем уравнение
( V /-Cih + У РС;а + /помп
пт I ю । 1» помп
а т/ — ___ In катионы анионы / 1 Q ТД\
\ катионы анионы 7
13.9. Переносчики и потенциал
391
В большинстве клеток подавление активности Na+/K+-ATPa3bi ингибитором,
например уабаином, приводит к быстрой деполяризации мембранного потенциала
на 10—15 мВ (см. Jones, 1989). Это изменение ДИ происходит в результате сниже-
ния Упомп из уравнения (13.34) от нормального значения до нуля. Затем падение по-
тенциала продолжается более медленно в течение часов. Это медленное снижение
потенциала обусловлено постепенным исчезновением концентрационных гради-
ентов, когда активность ионных насосов подавлена.
Величина вклада электрогенной помпы в мембранный потенциал покоя может
незначительно варьировать. В нейтрофилах (один из типов клеток крови, содержа-
щих ядро) мембранный потенциал, по-видимому, полностью генерируется ионной
помпой (Bashford, Pasternak, 1986). Ионные градиенты вносят в него гораздо мень-
ший вклад, и изменение внеклеточной концентрации калия вызывает лишь незна-
чительное изменение потенциала. В этих клетках подавление активности ионной
помпы приводит к снижению потенциала до нуля. Такие клетки являются необыч-
ными, но не сам эффект; мембранный потенциал в митохондриях, имеющий
очень большую величину, в масштабе от -100 до -200 мВ, генерируется полностью
за счет активности электрогенной протонной помпы.
13.9. Переносчики и потенциал
Белки-переносчики, составляющие обширную группу мембранных белков, осу-
ществляют сопряженный транспорт не менее чем двух веществ в стехиометриче-
ском соотношении. Например, мембрана эритроцитов содержит белок, перенося-
щий путем обмена анионы, а именно СГ и НСОз в противоположных направле-
ниях. Этот транспорт может протекать в любом направлении в зависимости от
градиентов концентрации. Так, установлено, что когда повышение концентрации
СО2 в тканях и легких приводит к обращению трансмембранного градиента его
концентрации (взаимопревращения СО2 и НСО3 катализирует фермент карбоан-
гидраза; см. разд. 10.15), направление действия данного анионобменного перенос-
чика в эритроцитах становится обратным. Другой переносчик осуществляет обмен
Na+ и Са2+. Этот белок использует градиент Na+, создаваемый №+/К+-АТРазой,
для выведения Са2+, что способствует поддержанию низкой концентрации послед-
него в цитозоле. В мембранах нейронов присутствует переносчик, который ис-
пользует градиенты Na+, К+ и Н+ для транспорта в клетку нейромедиатора глутама-
та, выделяемого из клетки при синаптической передаче (Zerangue, Kavanaugh,
1996). На таком принципе основано действие огромного разнообразия мембран-
ных транспортных белков, осуществляющих перенос метаболитов путем активно-
го транспорта в косвенной форме (вторичный активный транспорт). Они не гид-
ролизуют сами АТР, но используют градиенты, создаваемые мембранными помпа-
ми. Когда в результате транспорта не происходит результирующего переноса
зарядов, мембранный потенциал не изменяется. Однако, если транспорт сопрово-
ждается результирующим потоком зарядов, мембранный потенциал влияет на
транспорт веществ и наоборот.
Рассмотрим транспортный белок, переносящий п молекул в форме аниона А"
из раствора а в раствор b в обмен на т молекул катиона В+ из раствора b в раствор а.
Этот обменный транспортный процесс может быть отражен следующей схемой
392
Глава I 3. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
лАа + тВь 7=^ лАь + /иВа (1 ЗА)
Существует три силы, способные обеспечивать данный процесс. Две из них — это
градиенты концентраций А" и В+, третья — мембранный потенциал. В этом случае
мембранный потенциал будет определяться балансом всех сил, действующих
в системе при термодинамическом равновесии.
Изменение свободной энергии при транспорте путем обмена зависит от кон-
центраций переносимых веществ в соответствии со схемой (13А)
AG = /?Tlnf[A KPT) (13.35)
I [А’]а"[В+]^ J
Схема (13А) показывает также, сколько зарядов переносится в процессе. Перенос
п анионов в одном направлении и т катионов в другом направлении эквивалентен
результирующему переносу зарядов п + т. При наличии мембранного потенциала
А И электростатическая энергия составляет
MJ = F\V(n + ni) (13.36)
Уравнения (13.35) и (13.36) подобны уравнениям (13.1) и (13.2), использованным
при выведении уравнения Нернста.
Уравнение (13.35) можно переписать следующим образом
= (13.37)
UA-]aJ I [B+L J
Поскольку эти два уравнения близки к уравнению Нернста, можно выразить АО
через потенциалы Нернста для А" и В+, обозначаемые £А и £в соответственно
&G = nFEK +mFEB (13.38)
Здесь следует учитывать, что значение z должно быть равно z = ±1 для двух ионов.
Баланс сил при равновесии означает равенство уравнений (13.36) и (13.38)
АИ(и + /л) = и£а + /л£в (13.39)
Мембранный потенциал составляет, таким образом, среднее двух потенциалов
Нернста, взвешенных соответственно стехиометрическим коэффициентам двух
ионов
ДГ = +тЕв- (13.40)
п + т
Подобно потенциалу Нернста, мембранный потенциал, зависящий от двух сопря-
женных процессов транспорта, будет изменяться как логарифм соотношения их
концентраций. Однако изменение одной из концентраций должно приводить
к меньшему изменению потенциала, чем в случае потенциала Нернста, соответст-
венно взвешенности в уравнении (13.40).
13.9. Переносчики и потенциал
393
Это соотношение применялось для интерпретации результатов эксперимен-
тов, в которых использовали бактериальный белок, гомологичный СЬ"-каналам
мембран эукариотических клеток (Accardi, Miller, 2004). При встраивании этого
белка в липидные бислои он проводил ток ионов СГ. При наложении градиента
СГ происходил сдвиг потенциала реверсии от нуля, но его величина была меньше
потенциала Нернста. Попытки выявить другой проникающий ион не дали резуль-
тата. Эти данные нельзя было объяснить на основе уравнения Гольдмана—Ход-
жкина—Катца (уравнение (13.32)), используя комбинацию СГ с каким-либо дру-
гим ионом. Объяснение удалось найти благодаря тому, что был обнаружен сдвиг
Рис 13.8. График зависимости потенциала реверсии от концентрации ионов на стороне а от
мембраны (для СГ приведена активность, т. е. у[СГ]). А. Значение pH на стороне b от мембраны
равно 3; концентрация СГ 300 мМ по обе стороны мембраны. Б. Активность СГ 213 (300 мМ) на
стороне Ь. Пустые кружки — pH 5; черные квадраты — pH 3. Сплошные линии — результат под-
гонки уравнения (13.40) при т/п = 0,43. Пунктирные линии — графики, соответствующие урав-
нению Нернста. (По Accardi, Miller, 2004.)
394
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
потенциала реверсии от нуля при наложении градиента pH, даже при равных кон-
центрациях СГ по обе стороны мембраны. Это указывало на сопряженный пере-
нос СГ и Н+, и путем дробного варьирования концентраций обоих ионов данный
эффект был доказан. Изменение потенциала реверсии при варьировании концен-
трации СГ и pH очень хорошо описывалось уравнением (13.40) при подстановке
коэффициента т/п ~0,5 (если обозначить Н+ как т и СГ как п) (рис. 13.8). Это по-
казывает, что на каждый ион СГ переносилось два иона Н+.
Чтобы точнее определить происходящие процессы, один из ионов в экспери-
менте распределяли симметрично. При этих условиях один из потенциалов Нерн-
ста был равен нулю и величина A V определялась потенциалом Нернста для другого
иона, но деленным на п/(п + т) или /л/(и + т). Напомним, что потенциал Нернста
изменяется как логарифм соотношения концентраций иона по сторонам мембра-
ны, в частности на 58 мВ при изменении концентрации в 10 раз. Если построить
такой график для сопряженного переноса ионов, осуществляемого белком, за-
висимость потенциала, АГ, от логарифма концентрации также будет линейной,
но с меньшим углом наклона по сравнению с графиком потенциала Нернста
(рис. 13.8). Полученные в этой работе данные показали, что исследованный бак-
териальный белок не является СГ-каналом, как исходно предполагалось на ос-
новании его гомологии по аминокислотной последовательности белкам СГ-кана-
лов клеточных мембран позвоночных. Дополнительные эксперименты четко про-
демонстрировали, что градиент СГ в данном случае служит движущей силой
транспорта Н+ и градиент Н+ — движущей силой транспорта СГ.
13.10. Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца
для ионного тока
До сих пор мы рассматривали условия, когда потенциал постоянный и нет ионно-
го тока. Теперь зададимся вопросом, что произойдет, если наложить на проницае-
мую для ионов мембрану напряжение. В этих условиях через мембрану будет течь
ток, величина которого должна определяться свойствами мембраны. Чтобы опи-
сать эту зависимость, вернемся к уравнению (13.18а) и перепишем его без обозна-
чения натрия
ieF V/RT = -zFD d^ce-f-^^ (13.41)
dx
Как и выше, будем рассматривать условия стационарного состояния, при которых
величина тока постоянна и не зависит от х. В этом случае мы можем произвести
интегрирование по х поперек мембраны. Интеграл правой части уравнения (13.41),
подобно интегралу, полученному при переходе от уравнения (13.19) к уравнению
(13.20), легко решается, поскольку он уже выражен как производная
-z/Dfd^cerfr/^dx = -zFD(cbzlFVb/RT-c^RT) (13.42)
a d*
Чтобы проинтегрировать выражение в левой части уравнения (13.41), необхо-
димы некоторые сведения о природе И(х) в мембране, как уже отмечалось выше
13.10. Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока
395
при анализе уравнения Уссинга (уравнение для потоков ионов). Внутренняя об-
ласть мембраны несет очень незначительный заряд, и в соответствии с этим урав-
нение Пуассона (уравнение (11.2)) для этого компартмента имеет вид Д2ср(г) = О.
В одномерном случае его решение равно просто <р(х) = Е(х) (константа интегриро-
вания исключается как не соответствующая условиям). Переменная Е означает
электрическое поле, напряженность которого в данном случае постоянна. Это по-
зволяет решить интеграл, получаемый из левой части уравнения (13.41)
fe^^dx = -^L^/ит _(13,43)
zFE
Получив два последних выражения, мы проинтегрировали уравнение (13.41)
и можем записать теперь выражение для тока как соотношение двух решенных ин-
тегралов
где член егГКа/лг сокращен и разность Иь -Иа заменена членом ДИ. Напомним, что
D/S = Р и £3 = AV (разд. 13.4), соответственно DE = РДИ, и это позволяет записать
полученное уравнение в следующем виде
Это уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока. Оно описыва-
ет зависимость тока от потенциала для отдельного иона, концентрации которого
по разные стороны мембраны различаются. Это сильно усложненная зависимость
по сравнению с законом Ома, который устанавливает простую линейную зависи-
мость I =GAV (уравнение (13.16)). Уравнение (13.45) не выражает линейную зави-
симость, если са * съ. График этой зависимости показан на рис. 13.9 для сь = 10 са.
Рассмотрим предельные случаи, когда ДИ составляет очень большую положи-
тельную или очень большую отрицательную величину. При большой положитель-
Напряжение
Рис. 13.9. График уравнения
(13.45) при сь=10са. Пунктирны-
ми линиями показаны предельные
углы наклона кривой.
396
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
ной величине ДИ значение экспоненциальной функции становится настолько вы-
соким, что выражение в скобках можно приравнять единице, и тогда уравнение
(13.45) превращается в уравнение (13.16), содержащее сь. При очень большой от-
рицательной величине A V значение экспоненциальной функции становится пре-
небрежимо малым и зависимость выражается уравнением (13.16), содержащим са.
Таким образом, уравнению (13.45) соответствуют два предельные угла наклона
кривой, отражающие экстремальные случаи, когда ионный ток течет только в од-
ном направлении (пунктирные линии на рис. 13.9). Определив с помощью уравне-
ния (13.45) этих углы наклона, можно вычислить действительную проницаемость
мембраны для иона. В отличие этого, измерение потенциалов реверсии и исполь-
зование уравнения Гольдмана—Ходжкина—Катца для мембранного потенциала
позволяют вычислить только соотношение проницаемостей.
Подобно уравнению (13.32), уравнение (13.45) часто называют уравнением
в приближении постоянного поля в соответствии с условием, для которого оно вы-
ведено. Это условие обосновано тем, что заряд внутренней области мембраны
очень незначителен. Однако внутри мембраны на ион могут действовать различ-
ные силы, и далее мы выясним, как они влияют на проницаемость (разд. 13.13).
Подробнее эта тема рассматривается в гл. 14.
13.1 I. Двухвалентные ионы
Уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для мембранного потенциала (уравне-
ние (13.32)) применимо только для случая одновалентных ионов. Оно не позволяет
рассматривать ионы, для которых z* ±1. В случае ионов с большей валентностью
определить А И значительно труднее. С этой целью чаще всего записывают уравне-
ние Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока, включая в него все ионы,
в том числе двухвалентные
^7^ДИГсыег'Мк/лг-саЛ
RT e^v/KT_x I
(13.46)
Затем с помощью компьютера вычисляют корень уравнения, АГ, для данного на-
бора соотношений проницаемостей (Adams et al., 1980).
Существуют также способы аналитического определения АГ для случая двух-
валентных ионов. Здесь мы выведем выражение для мембранного потенциала
в случае переноса произвольного количества одновалентных катионов и одного
двухвалентного катиона. Запишем сумму всех ионных токов и приравняем ее
нулю
4Г2РбсАИ
RT
' 1FLV/RT_
£bdc_2________^adc
JFbV/RT - j
г^дк
RT
( FbV/RT
bi c________i-ai
еми/лг-1
(13.47)
+E
= 0
Сумма справа содержит члены в форме членов уравнения (13.45), в которых ин-
декс i указывает каждый одновалентный катион; для каждого члена суммы z = l.
Другой член уравнения (13.47) представляет собой уравнение (13.45) при z = 2. Он
соответствует току, переносимому двухвалентным катионом (индекс de). Путем
13.12. Поверхностный заряд и мембранный потенциал
397
деления на общие коэффициенты (F2 W/RT) и умножения на е2гди/лг -1 и с уче-
том того, что е2/?ди/лг-1 = (егди/лг-1)(егди/лг + 1), получаем выражение
(емк/Ат + (сые™'кт - cai) +4Pdc (сМсе2МК/яг - cadc) = 0 (13.48)
Перепишем это выражение как квадратное уравнение относительно члена qfi^v/rt
+£/»Cai) + -cbi)] -4PdcCbdc -£/?cbi = 0 (13.49)
Теперь используем формулу квадрата и найдем положительный корень1
еми/ят = -b + ylb2-4ac (j 3 50)
2а
Из этого выражения следует
д1. RT (-b + ^b1-4ас\
&V =----In ------------
F 2a
\ 7
где л =4Pdceadc+£/?cai
Z> = ^(cai -cbi)
C = —47dc^bdc ~
(13.51)
(13.52a)
(13.526)
(13.52b)
Это выражение для мембранного потенциала (уравнение (13.51)) называют
расширенным уравнением для мембранного потенциала в приближении постоянного
поля (Piek, 1975). Оно зависит от условия постоянства напряженности электриче-
ского поля, лежащего в основе уравнения Гольдмана—Ходжкина—Катца для ион-
ного тока. Расширенное уравнение можно вывести для общего случая, включаю-
щего участие анионов и большего числа двухвалентных ионов. Чаще всего данное
уравнение используют при анализе Са2+-каналов, имеющих особое значение в свя-
зи с ролью Са2+ в передаче сигналов.
13.12. Поверхностный заряд и мембранный потенциал
Сильное влияние на мембранный потенциал могут оказывать заряды, присутст-
вующие на клеточной поверхности. Ионные потоки чувствительны к поверхност-
ному потенциалу, и если он влияет на потоки разных ионов в различной степени,
потенциал реверсии будет изменяться. Чтобы объяснить этот эффект, необходимо
использовать не только сведения, приведенные в данной главе, но и теорию по-
верхностных зарядов (см. разд. 11.4).
1 Величина ас в уравнении (13.50) отрицательная, как показывают уравнения (13.52а)
и (13.52в), и, следовательно, подкоренное выражение > Ь2.
398
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
Рассмотрим, как влияет заряд поверхности мембраны на транспорт ионов, на
примере двух проникающих ионов с зарядами противоположных знаков, К+ и СГ,
для чего используем уравнение (13.32)
/?Г1пГРк[К+]ь+РС1[СГ]а^
F v к[К+]а + PCi [СГ]Ь J
(13.53)
Теперь прибавим величину поверхностного потенциала q>0 к обеим поверхностям
мембраны. Согласно распределению Больцмана, концентрация иона на поверхно-
сти мембраны составляет
с0 =с(оо)е-", (13.54)
где произведена замена t/кТ на zF/RT с целью перехода к молярным размерно-
стям, принятым в этой главе. Потенциал реверсии рассчитывают для концентра-
ции в общем объеме, с(оо), но концентрация, равная с0, соответствует потоку иона
через мембрану и относится, таким образом, к уравнению (13.53). Производя эту
подстановку, получаем уравнение
RT Г Рк [К+] b e~F<po//?r + РС1 [СГ]а eF<po//?r
F П1^Рк[К+]а e“F<₽o//?r + РС1 [СГ]ЬеГф0/лг)
(13.55)
При наличии поверхностных зарядов проницаемости умножаются на коэффици-
ент поверхностного потенциала. Если соотношение проницаемостей в отсутствие
поверхностного потенциала составляетPK/cl = > т0 с учетом поверхностного
потенциала новое соотношение эффективных проницаемостей записывается как
D -2/чро/ЯГ
ЛК/С1>
Это соотношение кажущихся проницаемостей может лишь незначительно от-
личаться от соотношения действительных проницаемостей. Чаще всего поверх-
ностный потенциал равен ~25 мВ, и тогда коэффициент поверхностного потен-
циала в выражении для соотношения проницаемостей, T?K/CLe”2лро/лг, составляет
е-2<₽о/25 _ i/e2 _ о,135. Таким образом, при концентрировании ионов одного заряда
и истощении ионов противоположного заряда поверхностный потенциал может
изменять проницаемость мембраны. Влияние поверхностного потенциала опреде-
ляли для канала ацетилхолинового рецептора, в случае которого повышение вне-
клеточной концентрации Са2+ или Mg2+ приводит к изменению потенциала ревер-
сии в сторону положительных значений (Lewis, 1979). В целом влияние подобных
эффектов исследовано в работе Майдемы (Miedema, 2002), где установлено, что
при изменении поверхностного потенциала кажущаяся селективность ионного
канала может варьировать от селективности для катионов до селективности для
анионов.
13.13. Теория скоростей реакций и мембранный потенциал
Поток иона через мембрану в действительности зависит от того, каким образом
потенциальная энергия иона изменяется внутри мембраны. Выше при определе-
нии проницаемости мембраны и мембранного потенциала эта важная зависимость
13.13. Теория скоростей реакций и мембранный потенциал
399
оставалась в стороне. Единственным указанием на связь между потоком иона и его
потенциальной энергией в мембране служило предположение о постоянстве на-
пряженности поля внутри мембраны, необходимое при выведении уравнения
Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока (уравнение (13.45)). Идея о по-
стоянстве напряженности поля может быть проверена с помощью простого дока-
зательства на основе понятий электростатики (разд. 13.10). Количественный рас-
чет электростатических параметров для ионного канала (Levitt, 1978а) и анализ
с учетом распределения ионов (Jordan et al., 1989) показали, что это предположе-
ние можно считать хорошим приближением. Однако на потоки ионов влияет не
только трансмембранное электрическое поле. Разность потенциалов на мембране
должна суммироваться с другими силами, действующими на ион. Эти другие силы
отражают взаимодействие между ионом и мембраной, которое сильно варьирует
в зависимости от позиции иона в канале. Подробно это взаимодействие рассмат-
ривается в гл. 14 с использованием приводимого здесь метода соотнесения ионно-
го потока с потенциальной энергией иона в мембране. Однако в данной главе его
интересно привлечь к анализу для выяснения того, каким образом ионные потоки,
определяемые указанными силами, могут вносить вклад в мембранный потенциал.
Когда ион попадает в гидрофобную внутреннюю область липидного бислоя,
его потенциальная энергия очень высока, что обусловлено низкой диэлектриче-
ской проницаемостью липидов. Сила отображения выталкивает ионы из внутрен-
ней области мембраны в водную фазу (см. разд. 2.3). График соответствующей
функции потенциальной энергии изображен на рис. 13.10. Максимум на кривой
соответствует потенциалу отображения, С/макс. Падение потенциала на мембране,
А Г, определяется как разница между левым и правым предельными значениями.
Высокая потенциальная энергия иона в центре мембраны действует как кине-
тический барьер в отношении проницаемости. Кинетические теории, основанные
на идее о пересечении энергетического барьера, рассмотрены в гл. 7, и одну из этих
теорий мы применим для анализа кинетики переноса ионов через мембрану
Вернемся к уравнению Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока,
а именно к тому этапу его выведения, который предшествовал введению предпо-
ложения о постоянстве напряженности поля по толщине мембраны. Без этого
Рис. 13.10. Профиль потенциальной энергии
иона при его прохождении через липидный
бислой.
400
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
предположения интеграл в уравнении (13.43) должен вычисляться другим спосо-
бом. Здесь мы вычислим его путем выражения потенциальной энергии как экспо-
ненциальной функции с прибавлением разности потенциалов к энергетическому
барьеру. Итак, прибавим член U(x) в виде функции с максимумом (рис. 13.10) к чле-
ну zFV(x). Тогда выражение для тока, вычисляемое как соотношение двух интегра-
лов (уравнение (13.44)), будет содержать в знаменателе вместо уравнения (13.43)
интеграл экспоненциальной функции этой функции энергии
zFbV/RT
I = ~zFD^—^------------(13.56)
Je(zFk(x)+t/(x))//?TcjA.
а
Поскольку U(x) имеет максимальное значение в центре мембраны, можно
применить способ, использованный в разд. 7.8, и аппроксимировать U(x) как
^макс-и^х-хмакс)2. Профиль потенциала в мембране вновь будем считать линей-
ным, И(х) = хД И. Теперь интеграл в знаменателе уравнения (13.56) можно записать
следующим образом
b ь
|е(гГхДИ+{/макс -w(x-xMaKC)2)//?r^ _ е(t/макс - ^макс2 )/ЛГ J^(-wx2 + (lwx макс + (13.57)
а а
Как следует из рис. 13.10, при х = а и х = b эта энергия должна быть небольшой, и
соответственно пределы интеграла могут быть ±оо. Теперь с помощью уравнения
(П4.7) получим следующее выражение
_ е(t/макс-^макс2 )/ЛГе(2н'хмакс + гМИ)2/4н-/?Г kFF (13.58)
V w
Принимая хмакс = 1/2 (максимум Uв центре мембраны), можно упростить это вы-
ражение следующим образом
= е^макс/ЛГе(2гГДИ+(гГДк)2)/^)/4ЛТ \kRT (13.59)
V W
Наконец, поскольку квадратичный член (zF&V)2/^wRT составляет незначитель-
ную величину, его можно исключить. Используя уравнение (13.59) для интеграла
в знаменателе уравнения (13.56), получаем следующее выражение для ионного
тока
I = -zFD _Са) (13.60)
V tiRT
Теперь соберем вместе факторы, независимые от потенциала и концентрации,
и выведем выражение для проницаемости
Р = (13.61)
V nRT
В результате можно получить более простое выражение для ионного тока
Задачи
401
Рис. 13.11. Графики зависи-
мостей тока от мембранного
потенциала, предсказывае-
мых кинетической теорией
(уравнение (13.62)) и уравне-
нием Гольдмана-Ходжкина-
Катца для ионного тока (урав-
нение (13.45)). В обоих слу-
чаях са = 10 Сь. Обратите вни-
мание, что обе кривые пере-
секают нулевое значение по
оси тока при одном и том же
значении потенциала.
I = -ZFP(cbezF^/2RT -cae-zF^/2RT) (13.62)
Это выражение равно нулю при потенциале Нернста для иона (как и ожида-
лось). Если взять сумму токов одновалентных ионов, описываемых данным урав-
нением, и приравнять ее нулю, можно вывести уравнение (13.32) (см. задачу 12).
График уравнения (13.62) представлен на рис. 13.11 вместе с графиком уравнения
Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока (уравнение (13.45)). Крутизна
кривой на этом графике возрастает при увеличении как положительных, так и от-
рицательных значений потенциала. Это характерная особенность кинетических
процессов с пересечением энергетического барьера, и она подробно рассматрива-
ется в следующей главе. Зависимость ионного тока от потенциала действительно
довольно часто отклоняется от того, что предсказывает уравнение (13.45), и объяс-
нить такой характер кривой можно с учётом более сложных механизмов проницае-
мости, связанных с пересечением энергетического барьера.
Задачи
1. Составьте уравнение доннановского потенциала для N* при условии, что непро-
никающий ион представлен поликатионом. Продемонстрируйте, что результат эк-
вивалентен получаемому из уравнения (13.11) для полианиона, но противополо-
жен по знаку.
2. Выведите уравнение Нернста из уравнения потока (13.12) на основе предположе-
ния, что при равновесии поток равен нулю.
3. Используя уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока (уравнение
(13.45)), выведите уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для потенциала (урав-
нение (13.32)).
4. Ориентируясь на выведение уравнения (13.21), составьте более общее выражение
для любого числа одновалентных катионов. Составьте соответствующее уравнение
для анионов. Сравните эти два уравнения с уравнением (13.32).
5. Для случая, когда NaCl присутствует с одной стороны мембраны и КС1 с другой
в равных концентрациях, используйте уравнение (13.33), чтобы решить уравнение
402
Глава 13. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
соотношения проницаемостей через «двуионный потенциал», который доминиру-
ет, когда мембрана проницаема только для катионов.
6. Согласно уравнению (13.45), ток не равен нулю при ДИ = 0, если са*сь
(рис. 13.10). При каких условиях ток равен нулю, когда ДК = 0?
7. Выведите уравнение Нернста из уравнения (13.45), приняв 1=0.
8. В основе уравнения (13.16) лежит допущение, что градиент концентрации ионов
на мембране отсутствует. Иногда это уравнение применяют для случая, когда на
мембране существует градиент концентрации иона, записывая его следующим об-
разом: /, = 6\(ДК - £,), где — это потенциал Нернста для иона i. В чем состоит
основное количественное различие между этим уравнением и уравнением Гольд-
мана—Ходжкина—Катца для ионного тока (уравнение (13.45)?
9. Взяв за основу уравнение тока из задачи 8 =G{(AV - )), составьте выражение
для мембранного потенциала при нулевом значении тока, используя величины Q
и
10. Выведите уравнение (13.55) для одновалентных катионов и докажите, что поверх-
ностный потенциал в этом случае не оказывает влияния.
11. Преобразуйте уравнение (13.55) для случая, когда поверхностные потенциалы на
разных сторонах мембраны не эквивалентны.
12. Выведите уравнение (13.32) из уравнения (13.62).
13. Выведите уравнение, аналогичное уравнению (13.40), для сопряженного транс-
порта т катионов и п анионов, т. е. транспорта всех этих ионов через мембрану
в одном направлении.
14. Переносчик глутамата в мембране нейронов переносит три иона Na+, один протон
(Н+) и один глутамат-1 внутрь клетки в обмен на один ион К+, выделяемый из
клетки (Zerangue, Kavanaugh, 1996). Составьте выражение для равновесного по-
тенциала, соответствующего работе этого переносчика, как функции концентра-
ций указанных ионов. Преобразуйте затем это выражение с использованием четы-
рех потенциалов Нернста для указанных ионов.
Глава 14
Ионная проницаемость
и структура каналов
Проницаемость чистых липидных бислоев для неорганических ионов крайне низ-
ка. Добавление в такие искусственные мембраны каналообразующих белков повы-
шает проницаемость более чем в 108 раз, позволяя ионам проникать через мембра-
ны и вызывать быстрые изменения потенциала. Здесь можно видеть существенное
сходство с ферментами. И поток ионов, и химическая реакция, катализируемая
ферментом, характеризуются энергетически выгодным изменением свободной
энергии, при котором протекание процесса возможно и в отсутствие соответст-
вующего катализатора, но с очень низкой скоростью. Ионные каналы, как и фер-
менты, резко повышают скорость процесса, действуя при этом высокоспецифич-
ным образом. В случае ферментов небольшие изменения в структуре субстрата
в огромной степени снижают эффективность катализа. Ионные каналы, подобно
этому, способны с высокой точностью различать ионы и обеспечивать проникно-
вение через мембрану только одного из них.
На первый взгляд может показаться, что по сравнению с ферментом задача
ионного канала более простая. Канал просто формирует заполненную водой пору,
создавая для ионов сплошной водный путь через мембрану. Однако простая водная
пора не может быть специфичной в отношении одного определенного иона. Меж-
ду тем проницаемость каналов, например натриевых и калиевых, различается для
Na+ и К+ более чем в 1000 раз, хотя разница в размерах этих ионов невелика (диа-
метр иона К+ равен 1,33 А, иона Na+ — 0,95 А). Объяснение специфичности дейст-
вия ионных каналов — это одна из основных задач изучения ионной проницаемо-
сти каналов. Транспорт ионов обеспечивается не только благодаря заполнению
поры водой, но также и благодаря специфической молекулярной структуре белка,
формирующего канал.
14.1. Ионная проницаемость мембраны
в отсутствие каналов
Для того чтобы лучше понять, насколько важную роль выполняют каналы в про-
ницаемости мембран для ионов, рассмотрим вначале проницаемость (не только
для ионов) мембраны, лишенной каналов. Наиболее раннее исследование мем-
бранной проницаемости, осуществленное в конце 19 в. Овертоном, показало, что
проницаемость мембраны для вещества коррелирует с его способностью распреде-
404
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
литься между водой и гидрофобными растворителями. На основе этих данных
Овертон высказал предположение о липидном составе мембран: внутренняя об-
ласть мембраны гидрофобна, поэтому гидрофобные вещества способны прони-
кать в нее и легко пересекать мембрану.
Для раскрытия этой идеи введем коэффициент распределения 0, выражающий
отношение концентраций вещества в воде и в гидрофобном растворителе, когда
эти два растворителя находятся в контакте и в условиях равновесия. Обозначим
эти концентрации св и сг соответственно и запишем выражение
Р = - (14.1)
Такие коэффициенты распределения позволяют оценить свободную энергию пе-
реноса вещества между двумя средами. Выше аналогичное соотношение было ис-
пользовано для описания гидрофобных взаимодействий (см. разд. 2.8). При рас-
творении вещества в воде и последующем установлении равновесия его концен-
траций по обе стороны мембраны градиент концентрации вещества между двумя
водными растворами создает пропорциональный градиент этого вещества внутри
мембраны, между двумя ее поверхностями. Согласно уравнению (14.1), концен-
трационный градиент на мембране пропорционален разности концентраций ве-
щества в водных средах по разные стороны мембраны: Дсм = 0Дсв. Если поток ве-
щества через мембрану пропорционален этой внутренней движущей силе, Дсм, он
должен быть пропорционален и 0Дсв.
Таким образом, проницаемость мембраны для вещества непосредственно свя-
зана с коэффициентом распределения этого вещества. Для органических соедине-
ний это подтверждено с помощью экспериментальных данных. При их анализе не-
обходимо учитывать подвижность молекул, и с этой целью в уравнение включается
коэффициент диффузии, D. Как показал такой анализ для 16 исследованных орга-
нических веществ, зависимость проницаемости от 0/) в логарифмических коорди-
натах линейна в пределах шестого порядка величин и тангенс угла наклона графи-
ка близок к единице (Finkelstein, 1987).
Неорганические ионы, как правило, характеризуются крайне низкими значе-
ниями 0; они практически нерастворимы в гидрофобных растворителях. Таким
образом, низкую проницаемость липидных бислоев для неорганических ионов
можно объяснить с помощью простой теории Овертона. Разница в свободной
энергии иона в воде и внутри мембраны определяется величиной собственной
энергии и разницей в диэлектрической проницаемости двух сред (см. разд. 2.2).
Путем расчета силы отображения (см. разд. 2.3) можно вычислить работу по пере-
мещению заряда из воды, диэлектрическая проницаемость которой ев ~ 80, в сере-
дину мембраны, где диэлектрическая проницаемость ег ~2 (уравнение (2.6); см.
рис. 2.3, А)
AG = ^-f—(14.2)
2а ^er eBJ ег/ veB+erJ
где I — толщина мембраны, а — радиус иона и q — заряд.
Переменная ДО в уравнении (14.2) отражает высоту энергетического барьера,
который необходимо преодолеть иону для пересечения мембраны. Если рассмат-
ривать поток ионов через мембрану как процесс с преодолением энергетического
14.1. Ионная проницаемость мембраны в отсутствие каналов
405
барьера, его скорость будет пропорциональна экспоненциальному коэффициенту
(см. гл. 7)
Joce’^7 (14.3)
Все факторы, снижающие Д(7, должны способствовать потоку иона через мембрану.
На основе этой теории можно сделать два предположения: 1) среди ионов
с одинаковым зарядом ионы большего диаметра пересекают мембрану с большей
скоростью (в соответствии с уменьшением первого члена в уравнении (14.2)) и
2) ионы легче пересекают мембраны меньшей толщины (соответственно возраста-
нию отрицательной величины второго члена).
Оба эти предположения проверены экспериментально. Первое предположение
подтверждается тем, что крупные органические ионы, такие как тетрафенил фос-
фоний, тетрафенилбор и дипикриламин, пересекают мембрану со значительно бо-
лее высокой скоростью по сравнению с мелкими неорганическими ионами. Все
приведенные в качестве примера органические ионы одновалентные, и их эффек-
тивные радиусы в несколько раз больше эффективных радиусов одновалентных
неорганических ионов, таких как Na+ и СГ.
Второе предположение, касающееся изменения потока с толщиной мембраны,
также проверено экспериментально. Толщину искусственной бислойной мембра-
ны можно варьировать, конструируя ее из различных по длине цепи липидов. Кро-
ме того, толщина мембраны по неясным причинам зависит от того, в каких алка-
нах растворяют липиды: бислои, образованные из растворов липидов в алканах
с более длинными цепями, имеют большую толщину. Толщину мембран определя-
ли путем измерения емкостного сопротивления — величины, обратно пропорцио-
нальной толщине мембраны. При изучении транспорта через искусственные мем-
браны крупного органического катиона дипикриламина скорость пересечения
барьера определяли по релаксации тока. График зависимости этой скорости от
толщины мембраны хорошо соответствовал уравнениям (14.2) и (14.3) (рис. 14.1).
Результаты этих экспериментов указывают на электростатическую природу
энергетического барьера для ионного потока через мембрану. С уменьшением ра-
диуса ионов значение первого члена в уравнении (14.2) существенно возрастает;
Рис. 14.1. Скорость прохождения
дипикриламина через липидный би-
слой как функция толщины бислоя.
Поток, J, нормирован по значению
Jo при / =5. Сплошная линия соот-
ветствует зависимости е-3,69+17,8//,
выведенной из уравнений (14.2) и
(14.3) (данные из работы Benz, LSu-
ger, 1977).
406
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
соответственно этому для биологически наиболее важных ионов, таких как Na+,
К+, СГ и Са2+, энергетический барьер непреодолим. Одна из важных функций
ионных каналов состоит в том, чтобы уменьшить этот барьер.
14.2. Омическая модель канала
Если исключить действие в канале силы отображения, его водную полость можно
рассматривать как фрагмент раствора электролита большого объема, соответст-
вующий размерам канала. Удельное электрическое сопротивление, р, физиологи-
ческого раствора в его большом объеме обычно составляет примерно 100 Ом-см,
т. е. куб с длиной грани 1 см обладает сопротивлением 100 Ом, если имеется раз-
ность потенциалов между двумя его противоположными поверхностями. При раз-
мерах куба, соответствующих размерам ионного канала, сопротивление будет про-
порционально длине грани, /, и обратно пропорционально площади стороны по-
верхности, А. При таком масштабировании мы получаем следующее выражение
для проводимости одиночного канала
г=4> <14-4)
р/
где у — электрическая проводимость одиночного канала, выражаемая в сименсах
(См = Ом-1). Проводимость мембраны обозначают символом G. Величина G не-
сколько отличается от у, поскольку зависит от размеров клетки и площади мембра-
ны, тогда как у отражает свойство молекулы, указывающее некоторым образом на
структуру канала.
Рассмотрим цилиндрический канал, длина которого равна толщине мембраны
и площадь внутренней поверхности А = лг2 (рис. 14.2). Такой омический канал
служит наиболее простой моделью ионного канала (Hille, 1991). Эта модель не
включает силу отображения и предполагает, что структура микроскопических раз-
меров характеризуется свойствами макроскопических систем. С уменьшением
размеров канала начинает проявляться влияние взаимодействия воды и ионов
с его стенками, и тогда канал по своим свойствам уже не соответствуют фрагменту
раствора электролита большого объема. Чем меньше диаметр канала, тем сильнее
проявляются сила отображения и микроскопические взаимодействия. Таким обра-
зом, уравнение (14.4) позволяет проверить влияние обоих этих факторов.
Имея необходимые сведения о структуре канала, можно рассчитать его прово-
димость с помощью уравнения (14.4) и затем сравнить полученные значения с экс-
периментальными данными. Такие данные для двух очень крупных каналов (бак-
териальных механочувствительных каналов MscL и MscS) и двух каналов средних
Рис. 14.2. Цилиндр, представляющий объем раствора электролита, как
простейшая модель ионного канала.
14.3. Энергетические барьеры и свойства каналов
407
Таблица 14.1. Структурные особенности и проводимость различных каналов
Канал А, Аг Л А Теоретическая величина, ут, нСм (уравнение (14.4)) Эксперименталь- ная величина, уэ, нСм ([KCI], М) Уэ/Ут
MscL1 707 40 4,4 2,5 (0,2) 0,57
MscS2 95 15 1,6 0,6 (0,2) 0,37
Ацетилхолиновый рецептор3 28 6 0,59 ' 0,08 (0,1) 0,14
Грамицидин4 19 26 0,45 0,014(0,1) 0,031
Единицы проводимости 1 нСм = 10"9 См
1 По Sukharev et al., 1997, 2001.
2 По Bass et al., 2002; Sukharev et al., 1997.
3 По O’Mara et al., 2003; Imoto et al., 1988.
4 По Wallace, 1990; Andersen, 1983.
размеров (ацетилхолинового рецептора и грамицидина А) приведены в табл. 14.1.
Каналы наиболее мелких размеров не включены в таблицу, поскольку для них
омическая модель непригодна.
Сравнение теоретически рассчитанных и экспериментально измеренных вели-
чин проводимости, приведенных в табл. 14.1, показывает наличие четкой тенден-
ции. Чем крупнее канал, тем ближе его реальная проводимость соответствует рас-
считанной по уравнению (14.4). Следовательно, каналы больших размеров харак-
теризуются более выраженными свойствами макроскопических систем и величина
силы отображения в них невелика. С учетом размеров молекулы воды (примерно
2,5 А) можно заключить, что ширина крупного канала достаточна, чтобы поперек
него могло располагаться несколько молекул воды, тесно примыкающих одна
к другой. Этим легко объяснить то, что крупные каналы обнаруживают свойства
макроскопических систем. В то же время в канале средних размеров молекула
воды, вероятно, контактирует с его стенками, и ее поведение должно отличаться от
поведения молекулы воды в большом объеме раствора. Измеренная проводимость
каналов средних размеров в 10 раз ниже рассчитанной по уравнению (14.4).
Наиболее мелкие каналы составляют особый класс, не включенный в табл. 14.1.
Как показывают структурные исследования, их диаметр равен примерно 3 А. Эти
каналы обладают очень высокой селективностью, и их проводимость в большой
степени зависит от того, какие ионы присутствуют в растворе. Один из таких кана-
лов, аквапорин, пропускает только воду и непроницаем для катионов и анионов;
его измеренная проводимость на несколько порядков ниже той величины, кото-
рую дает уравнение (14.4). Каналы малых размеров иногда называют однорядными
каналами (Lattore et al., 1992); смысл такого названия объясняется ниже в этой гла-
ве. Хотя проводимость по омической модели можно рассчитать только для каналов
наиболее крупных размеров, эта модель полезна также для анализа микроскопиче-
ских свойств каналов средних и малых размеров.
14.3. Энергетические барьеры и свойства каналов
С уменьшением размеров каналов основным фактором, определяющим их прони-
цаемость, становятся энергетические барьеры, например обусловленные силой
408
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
отображения. Данные об энергетических барьерах каналов можно получить путем
измерения протекающего через них тока в зависимости от разности потенциалов
на мембране. Омический канал, естественно, подчиняется закону Ома, и проте-
кающий через него ток линейно зависит от мембранного потенциала. При нали-
чии в мембране энергетического барьера ситуация иная, и зависимость тока от по-
тенциала в этом случае становится нелинейной. Аналогичная задача для диффузии
через мембрану с пересечением барьера решалась в разд. 13.13 (уравнение (13.62))
(желательно обратиться к этому разделу). Если концентрация соли, с, по обе сто-
роны мембраны одинаковая, уравнение (13.62) упрощается до выражения
/ = ^Р(е^ди/2ЛГ-е-гМИ/2ЛГ)
П Г D • и! I
= 2zFcPsinh ---- ,
\2RT )
(14.5)
где Р — проницаемость. Знак минус можно опустить, поскольку в данном случае
ионные градиенты учитывать не требуется. Здесь положительная разность потен-
циалов обусловливает положительный ток.
График зависимости тока от разности потенциалов приведен на рис. 14.3, А.
Проводимость рассчитана с помощью преобразования уравнения (14.5), и ее вели-
чина пропорциональна cosh(zF&V/2RТ) (рис. 14.3, Б). Эта нелинейная форма за-
висимости непосредственно определяется экспоненциальной зависимостью ско-
рости пересечения барьера от его высоты. Экспериментально полученная кривая
зависимости ионного тока от мембранного потенциала сходна с расчетной кривой,
Разность
потенциалов
Рис. 14.3. А. График зависимости тока от напря-
жения, соответствующий уравнению (14.5). Раз-
мерность единицы напряжения —ZF/2RT. Б. Гра-
фик зависимости проводимости от напряжения
(преобразованное уравнение (14.5)).
14.3. Энергетические барьеры и свойства каналов
409
приведенной на рис. 14.3, А, что свидетельствует о наличии в мембране барьера
(Hall et al., 1973).
В случае, когда зависимость тока от разности потенциалов на мембране нели-
нейная, как на рис. 14.3, А, можно утверждать, что проницаемость канала связана
с пересечением энергетического барьера во внутренней области мембраны. Основ-
ную информацию о свойствах барьера содержит интеграл знаменателя в уравне-
нии (13.56), хотя иногда о них можно узнать и больше. Таким образом, высота
барьера непосредственно не влияет на форму зависимости тока от потенциала.
Можно было бы ожидать, что в случае барьера меньшей величины ее нелиней-
ность будет менее выражена. Однако приближения, использованные для получе-
ния рассматриваемого уравнения, с уменьшением высоты барьера становятся не-
корректными. Если барьер настолько мал, что им можно пренебречь, анализ при-
водит к уравнению тока Гольдмана—Ходжкина—Катца (уравнение (13.45)). При
одинаковой концентрации соли по обе стороны мембраны выражаемая им зависи-
мость линейная.
Одна их характеристик барьера, определяемая на основе экспериментальных
данных, — это его положение относительно центра мембраны. Если барьер лежит
вне центра мембраны, график зависимости тока от потенциала имеет асимметрич-
ную форму. Чтобы объяснить эту связь, возьмем за исходную позицию уравнение
(14.5). При выведении соответствующего ему уравнения в разд. 13.13 экспоненци-
альный член е-£/макс/лг исчез в результате его включения в выражение для проницае-
мости. Теперь вернем этот член, чтобы вывести следующее выражение
( - 1/макс + zFA И/2 -UuaKC-zF^/2\
I = zFcP'\e RT -e RT
(М.6)
где P' = PqUm^/rt, Из этого уравнения можно видеть, что показательная функция со
знаком плюс отражает скорость пересечения энергетического барьера в положи-
тельном направлении и барьер, который необходимо пересечь иону, имеет величи-
ну ^макс -zPhV/'l. Показательная функция со знаком минус описывает скорость
пересечения барьера в противоположном направлении, и величина соответствую-
щего барьера составляет [/макс +гМК/2. Таким образом, данное уравнение имеет
вид линейного соотношения свободных энергий (см. разд. 7.4). Уравнение (14.6)
относится к случаю, когда барьер находится точно посередине мембраны, поэтому
высота барьера для одного направления потока увеличена на 1/2 величины изме-
нения потенциала, а для противоположного направления потока уменьшена на 1/2
этой величины. Распространяя правило линейного соотношения свободных энер-
гий на этот случай, введем величину падения потенциала, 5, на участке мембраны,
соответствующем барьеру, и запишем уравнение
I = ^/cP'(e(-^MaKc+zF8AK)//?r _e(-£/MaKc-zF(l-5)An//?r'
(14.7)
где 8 варьирует от 0 до 1. При 8 = 0,5 это уравнение обращается в уравнение (14.6).
Проводя аналогию с линейным соотношением свободных энергий, вернем ве-
личину е-£/макс/лг в выражение для Р, чтобы получить уравнение в той же форме, ка-
кую имеет уравнение (14.5)
/ = zFcP($zF^v/RT _е’г£(1’5)ди/АГ)
(14.8)
410
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
Рис. 14.4. Графики уравнения (14.8) при ука-
занных значениях 8. Размерность единицы на-
пряжения — zF/RT.
Согласно этому уравнению, при 8 1/2 кривая зависимости тока от разности по-
тенциалов имеет асимметричную форму (рис. 14.4). Наблюдая такую зависимость
в эксперименте, можно приблизительно предсказать положение барьера.
Асимметрию кривых зависимости тока от напряжения, подобную показанной
на рис. 14.4, называют свойством выпрямления. В электронике выпрямитель —
это устройство, пропускающее ток только в одном направлении. Сходным образом
действуют каналы, барьеры которых смещены относительно середины мембраны.
Выпрямление — это общее свойство полупроводников, на основе которого были
созданы транзисторы, но физический механизм выпрямления в полупроводниках
принципиально иной. Биологические мембраны также обладают общим свойст-
вом выпрямления, но чаще всего оно определяется потенциал-зависимой регуля-
цией каналов (см. разд. 1.8), а не положением барьера. Асимметричность графиков
зависимости тока от разности потенциалов на мембране может быть также резуль-
татом блокады канала ионами, связывающимися на одной его стороне (см. Hille,
1991; ch. 18). Если эти альтернативные механизмы выпрямления отсутствуют, оно,
вероятно, обусловлено асимметричным расположением барьера.
14.4. Эйзенмановские ряды селективности
До сих пор мы не касались того, каким образом каналы различают ионы, т. е. в чем
состоит механизм избирательной проницаемости, или селективности, ионных ка-
налов. Существует два основных уровня селективности каналов. Низкий уровень
селективности — различение только знака заряда — характерен для каналов, про-
пускающих либо катионы, либо анионы. Например, грамицидин и ацетилхолино-
вый рецептор формируют каналы, селективные для катионов, у-аминомасляная
кислота (ГАМКа) и глициновые рецепторы — каналы, селективные для анионов.
Различные одновалентные ионы с одинаковым знаком заряда этими каналами
дифференцируются слабо. Селективность в отношении знака заряда обеспечивают
расположенные внутри канала фиксированные заряды или диполи, ориентиро-
ванные так, что проходить через канал могут только заряды определенного знака.
Второй, более высокий уровень селективности — это различение ионов с одинако-
вым знаком заряда. В основе этой формы селективности лежит иной механизм,
включающий более сложные взаимодействия. Рассмотрим одну из наиболее ран-
них теорий, предложенных для объяснения селективности ионных каналов.
14.4. ЭЙЗЕНМАНОВСКИЕ РЯДЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ
411
Селективность высокого уровня обычно классифицируют по результатам из-
мерения проницаемости для нескольких сходных ионов, располагая эти ионы
в порядке убывания проницаемости. Из пяти наиболее часто изучаемых
одновалентных катионов — Li+, Na+, К+, Rb+ и Cs+ — теоретически можно ском-
бинировать в общей сложности 5! = 120 возможных последовательностей. Од-
нако на практике наблюдаются только 11 последовательностей (Eisenman, Horn,
1983). Эйзенман дал этому простое объяснение. Несмотря на то, что лежащую
в его основе физическую модель следует считать в значительной степени упро-
щенной, объяснение Эйзенмана на качественном уровне описывает механизм
избирательного пропускания каналами различных ионов и поэтому весьма по-
лезно.
Теория Эйзенмана основана на допущении, что проницаемость контролирует-
ся селективным фильтром. Таким фильтром служит участок внутри канала, несу-
щий заряд. Знак заряда этого участка противоположен знаку заряда ионов, для ко-
торых канал проницаем. Величина потока данного иона определяется величиной
энергии взаимодействия иона с этим участком. Согласно закону Кулона (уравне-
ние (2.1)), энергия взаимодействия с фильтром, Еф, при наименьшем возможном
расстоянии между фильтром и ионом описывается выражением
(14.9)
г _ ^Ф^и
?
е(гф + ги)
где г — радиус иона, q — заряд иона и подстрочные индексы обозначают фильтр
или ион. Включим в это выражение энергию гидратации £гидр (она также зависит
от радиуса иона, см. разд. 2.2) и примем полученную сумму равной изменению
энергии при перемещении иона из водной среды к селективному фильтру
= £гидр - Еф = £гидр - /ф?и ч (14.10)
е(гф + г„)
Поскольку величина этого потока ионов будет пропорциональна е’л£/яг, ряд
ионов в порядке убывания проницаемости должен быть обратным последователь-
ности значений Д£. На рис. 14.5 показано, как изменяется Д£ для каждого иона
с изменением гф. Соответственно этим зависимостям при различных значениях гф
значения энергии для набора ионов выстраиваются в разные последовательности.
Ряд селективности определяется порядком значений энергии вдоль вертикальной
линии, т. е. при данном значении гф.
Каждый график на рис. 14.5 пересекает остальные графики только в одной точ-
ке. При каждом пересечении два иона меняются местами в ряду величин энергии.
Общее количество пересечений равно 10 (это ограничено топологией), поэтому
общее число рядов ионов равно 11. Замечательным образом эти 11 рядов были об-
наружены и экспериментальным путем, когда изменялся лишь один специфиче-
ский для канала параметр, гф. Такое соответствие теоретических предсказаний экс-
периментальным данным можно считать поразительным успехом теории Эйзен-
мана. Аналогичное соответствие обнаружено для анион-селективных каналов
(Eisenman, Horn, 1983).
Данные, приведенные на рис. 14.5, указывают на некоторые важные законо-
мерности функционирования каналов. Ряды ионов, расположенные справа, отра-
жают случай, когда взаимодействие между ионом и каналом невелико и проницае-
412
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
Li Na Na Na Na К К К Rb Rb Cs
Na Li К К К Na Rb Rb К Cs Rb
К К Li Rb Rb Rb Na Cs Cs К К
Rb Rb Rb Li Cs Cs Cs Na Na Na Na
Cs Cs Cs Cs Li Li Li Li Li Li Li
Рис. 14.5. Эйзенмановские
ряды селективности для пяти
одновалентных катионов. Ря-
ды построены по значениям
энергии различных ионов (в
точках, отмеченных вертикаль-
ными штриховыми линиями).
Ряды ионов, указанные ввер-
ху, составлены в порядке, об-
ратном порядку возрастания
энергии. Сплошные линии при-
мерно соответствуют уравне-
нию (14.10). Графики этого
уравнения группируются в кла-
стер, так что их сложно разли-
чить.
мость зависит главным образом от энергии гидратации. Значения энергии гидра-
тации убывают в ряду Li+ > Na+ > К+ > Rb+ > Cs+, т. е. чем меньше радиус иона, тем
труднее он гидратируется. Таким образом, когда ряд ионов в порядке убывания
проницаемости обратный относительно ряда ионов в порядке убывания энергии
гидратации, следует считать, что электростатические взаимодействия между кана-
лом и ионом имеют меньшее значение и проникновению препятствует в основном
дегидратация. Если же преобладают электростатические взаимодействия ионов
с каналом, проницаемость будет выше для ионов меньших размеров, поскольку им
легче приблизиться к участку селективного фильтра. Этому случаю соответствуют
ряды ионов в левой части рис. 14.5. Промежуточные последовательности отражают
взаимное влияние двух рассмотренных сил.
Физическую модель, лежащую в основе теории Эйзенмана, безусловно, следу-
ет считать чрезвычайно упрощенной. Взаимодействия между ионами и каналами
носят более сложный характер, анализу которого посвящена большая часть дан-
ной главы. В теории Эйзенмана имеется очевидный парадокс. С одной стороны,
дегидратация иона требует большой траты энергии, и, следовательно, взаимодей-
ствие иона с каналом должно быть очень сильным. Однако, с другой стороны, ряд
селективности обратен ряду ионов в порядке убывания энергии гидратации лишь
в том случае, если сила взаимодействия с селективным фильтром невелика (высо-
кие значения гф в уравнении (14.10)).
Тем не менее верные предсказания рядов ионов по проницаемости свидетель-
ствуют о том, что эта простая модель содержит важный физический смысл. Как
правило, проницаемость в отношении данного иона отражает баланс между не-
сколькими высокими значениями энергии. Когда два из этих видов энергии моно-
тонно изменяются с радиусом иона, пересечения графиков определяют 11 рядов
селективности для пяти ионов. Гидратация и электростатические взаимодействия,
рассмотренные в теории Эйзенмана, представляют лишь два вклада в совокуп-
ность видов энергии, влияющих на проницаемость каналов. Анализу вкладов этих
и других видов энергии посвящены следующие разделы.
14.5. Взаимодействия внутри ионного канала
413
14.5. Взаимодействия внутри ионного канала
Как было отмечено выше, на ион в канале действует значительная сила отображе-
ния, обусловленная низкой поляризуемостью мембраны по сравнению с водой.
Величина этой силы возрастает по мере уменьшения радиуса канала, что не учиты-
вается в омической модели канала (основной недостаток этой модели; см.
разд. 14.2). Силу отображения можно рассчитать теоретически с помощью уравне-
ний электростатики, если рассматривать водную среду и мембрану как непрерыв-
ные среды с различными диэлектрическими постоянными. Такой тип задач рас-
смотрен в разд. 2.3. Значение потенциальной энергии иона, находящегося внутри
канала, можно определить из уравнения Лапласа. В простейшем случае канал ап-
проксимируется цилиндрическим отверстием в плоском листе (рис. 14.6).
Подобная задача впервые была рассмотрена для цилиндра бесконечной длины
(Parsegian, 1969). Разница значений потенциальной энергии для иона в общем объ-
еме водной среды и иона в канале в этом случае описывается выражением
&Е = (14.11)
2err ^ев J
где г — радиус канала и F — математическая функция, вычисляемая с помощью
компьютера. При ев =80 и ег =2 уравнение (14.11) принимает вид
д£ = ккал • моль1, (14.12)
г
где величина г выражена в А. При г = 3 А изменение энергии равно 9,8 ккал • моль-1,
или 16 RT.
Такой энергетический барьер слишком высок, чтобы ионный поток мог про-
исходить со скоростью, наблюдаемой для большинства каналов. Более реалистич-
ные теоретические результаты получены для случая канала конечной длины. Они
показывают, что энергия иона существенно зависит от длины канала; в случае,
если его длина сравнима с толщиной мембраны, энергия может быть меньше при-
веденного выше значения в 2—3 раза (Levitt, 1978а). Поскольку высота энергетиче-
ского барьера столь сильно зависит от размеров канала, анализ влияния силы ото-
бражения на ионную проницаемость канала следует проводить для конкретных ка-
налов с известной структурой молекулы.
Многие ионные каналы связывают ионы. Это нельзя объяснить действием
силы отображения, поскольку она представляет собой исключительно силу оттал-
кивания. Следовательно, для продвижения ионов внутрь канала необходима до-
полнительная сила притяжения. Силу притяжения часто рассматривают как взаи-
модействие на очень близком расстоянии между ионом и выстилающими пору
Рис. 14.6. Цилиндрическая пора, заполненная водой (ев = 80) в гидро-
фобном слое (ег = 2).
414
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
аминокислотными остатками. Поскольку это сила короткого радиуса действия,
ионы могут подвергаться ему только после проникновения в канал. Сила притя-
жения относительно постоянна по всей длине канала (см. рис. 14.7). Если сум-
мировать силу притяжения и силу отображения, на каждом конце канала будет
наблюдаться минимум потенциальной энергии, означающий наличие в этой по-
зиции связывающего участка. В центре канала расположен энергетический барь-
ер, лимитирующий скорость ионного потока. Это общая характеристика профи-
лей потенциальной энергии ионов в каналах. Анализу данных по проницаемости
и проводимости каналов с учетом барьеров и связывающих участков посвящено
большое число работ. Функция потенциальной энергии с такими параметрами хо-
рошо описывает транспорт ионов по каналу, образуемому грамицидином А (см.
разд. 14.6).
Скорость движения иона в ионном канале между позициями двух энергетиче-
ских минимумов можно рассчитать, используя кинетическую теорию (Levitt,
1978b). Примем в качестве отправной точки уравнение (13.56), где U(x) — это сум-
марная энергия взаимодействия иона с каналом и мембраной (рис. 14.7) и V(x) —
мембранный потенциал
zF^V/RT _
I = -zFD-^----------(14.13)
Je(^(x)+l/(x))Ardx
а
Здесь точки а и b обозначают позиции двух энергетических минимумов на концах
канала; ра и Рь — вероятности нахождения иона в данных точках. Принимая усло-
вие, что ра = Ръ и падение потенциала на этих участках невелико, можно записать
показатель экспоненты в числителе как 1 + zFW/RT. В этом случае уравнение пре-
образуется к следующему виду
/ = _^ДИр_____________1_______
лу JetzfKtxj+t/tx)^?^
а
Проводимость канала варьирует с изменением концентрации иона. Допустим, что
проводимость максимальна при концентрация иона, соответственно которой канал
содержит один ион. Вероятность того, что этот ион находится в позиции х, выража-
Рис. 14.7. Сила отображения и сила притя-
жения короткого радиуса действия в сумме
обусловливают наличие минимума потенци-
альной энергии на каждом конце канала. Эти
минимумы соответствуют связывающим уча-
сткам (см. Levitt, 1978b).
14.6. ГРАМИЦИДИН А
415
ется больцмановским распределением, ра = е ^FV^+u^lRTi jе ^<x)+u(x))/rt^x^ при_
равняв энергию иона нулю при х = а, мы получаем числитель, равный единице.
Используя это выражение для ра в уравнении (14.14) и произведя деление на ДИ,
получаем выражение для максимальной проводимости
У = _______________1______________ * (14 15)
Г макс b ь чч.и/
Л1 J е(гГИ(х) + (/(х))//?^ | е-(сГГ(х) + (/(х))//?^
а а
Путем вычисления интегралов можно определить максимальную величину прово-
димости одиночного канала, позволяющую связать теоретический профиль энер-
гии с этой легко измеряемой величиной.
14.6. Грамицидин А
Грамицидин А — это антибиотик, формирующий в липидном бислое катион-
селективный канал. Он представляет собой пептид из 15 аминокислотных остат-
ков с необычным чередованием D- и L-остатков. Благодаря небольшим размерам
молекулы грамицидин А служит удобным объектом структурных исследований
(Wallace, 1990). При укладке этот белок свертывается с образованием необычной
спирали в форме бочонка. В бислое два таких бочонка димеризуются, формируя
канал длиной 26 А и диаметром 4—5 А. Как структурно простой белок грамицидин
представляет интерес в качестве основы для физических моделей ионной прони-
цаемости каналов.
Исследования с помощью метода ЯМР показали, что связывание катионов
происходит на концах грамицидинового канала (Tian, Cross, 1999). Концевые свя-
зывающие участки заполняются по мере возрастания концентрации иона. Прово-
димость достигает максимума, когда в канале находится в среднем один ион. По
мере заполнения обоих связывающих участков проводимость падает. Связывание
происходит за счет сил притяжения (рис. 14.7). Внутренняя поверхность поры, об-
разуемой грамицидином А, выстлана электроотрицательными атомами кислорода,
входящими в состав карбонильных групп пептидного остова и экспонированными
внутрь поры. Они притягивают катионы, и этим обусловлена большая селектив-
ность грамицидина для катионов по сравнению с анионами (Jordan, 1990; Roux et
al., 2000; Kuyucak et al., 2001).
Анализ реалистичных функций потенциальной энергии показал наличие вы-
сокого энергетического барьера в центре канала. Рассчитанные при этом значения
проводимости канала были на несколько порядков ниже наблюдаемых в экспери-
менте. В связи с этим возникли сложные вопросы относительно энергетических
характеристик ионной проницаемости данного канала (Jordan, 1990, Kuyucak et al.,
2001). Сложность главным образом состоит в том, что модуль суммы двух значи-
тельных по величине и противоположно направленных сил (силы отображения
и ион-пептидного взаимодействия) представляет собой по сравнению с ними ма-
лую величину, из-за чего возникает высокая вероятность ошибок.
Хотя количественные расчеты этих энергий весьма сложны, на качественном
уровне имеющиеся представления об ионной селективности грамицидинового ка-
416
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
нала весьма важны для исследований (Edwards et al., 2002). Энергия силы отобра-
жения пропорциональна z2 (уравнение (14.2)), где z — валентность иона. Энергия
ион-дипольного взаимодействия пропорциональна z (уравнение (2.9)). Таким об-
разом, энергетический барьер можно представить как сумму z2Umo&p + zUwn9 где
^2^отобР и zf/дип ~ это энергия силы отображения и энергия ион-дипольного взаи-
модействия соответственно. Если принять величины t/OTO6p = U и Uwn = -U, т. е.
приближенно равными по значению и противоположными по знаку заряда, для
одновалентного катиона (z = l) барьер вычисляется как z2U -zU = $. Таким обра-
зом, для одновалентных катионов энергетического барьера нет и они входят в ка-
нал легко и быстро. В то же время для одновалентных анионов (z = -1) барьер вы-
числяется путем сложения, а не вычитания данных величин энергии, что дает
высоту барьера, равную 2 U. Эта высокая энергия обусловливает низкую проницае-
мость канала, образуемого грамицидином, для анионов. Наконец, для двухвалент-
ных катионов проницаемость данного канала также низка, поскольку она зависит
от z2. В случае двухвалентного катиона z = 2 и соответственно z2U -zU = 2 С/. В этом
случае сила отображения настолько возрастает, что создается барьер, сравнимый
с барьером для анионов.
Проблемы количественного согласования теоретических результатов с экспе-
риментальными данными в случае канала, образуемого грамицидином А, подроб-
но изучены (Edwards et al., 2002). Для воспроизведения в математических расчетах
тех значений проводимости и концентрационных зависимостей, которые наблю-
даются в эксперименте, необходимо, чтобы глубина энергетических ям на концах
канала составляла 8кТ, а энергетический барьер в середине канала имел высоту
5кТ. Такой энергетический профиль невозможно получить простым сложением
силы отображения и функции потенциальной энергии взаимодействия иона с пеп-
тидом. Проблема возникает в связи с тем, что вода в грамицидиновом канале рас-
сматривается как непрерывная среда. Канал содержит примерно шесть молекул
воды, расположенных в ряд концом к концу (Finkelstein, Andersen, 1981). Поляри-
зация и ориентация этих молекул воды зависят от поля иона не просто линейно,
поэтому для количественных расчетов ионных взаимодействий в канале грамици-
дина А необходимо использовать молекулярную теорию воды. С применением
этой теории установлено, что линейное расположение молекул воды в канале гра-
мицидина А поразительно эффективным образом стабилизирует ион внутри кана-
ла (Allen et al., 2004). В указанной работе получена подробная функция потенци-
альной энергии, при использовании которой в уравнении, сходном с уравнением
(14.15), расчетная величина максимальной проводимости в среднем в 25 раз пре-
вышает экспериментально полученное значение.
14.7. Теория скоростей реакций в применении
к мультибарьерным каналам
Наличие минимумов, соответствующих связывающим участкам, и энергетических
барьеров, разделяющих минимумы, — это общая характеристика функций потен-
циальной энергии ионов в каналах (рис. 14.7). При изучении ионной проницаемо-
сти каналов эти основные характеристики были многократно выявлены. Таким об-
разом, мы можем принять, что движение иона внутри канала происходит как по-
14.7. Теория скоростей реакций в применении к мультибарьерным каналам
417
следовательные скачки через барьеры (рис. 14.8). Далее следует учесть разность по-
тенциалов на мембране, определяющую скачки в одном или другом направлении.
Здесь мы рассмотрим упрощенный случай, когда величины всех максимумов
и минимумов на профиле потенциальной энергии иона одинаковы. Для одного
барьера и двух соседних связывающих участков обозначим скорость пересечения
барьера в правом направлении кака и в левом направлении как р. Согласно теории
скоростей реакций, эти величины определяются как экспоненциальные функции
высоты барьера
а =сое 2л '' (14.16а)
Р=сое1 2л , (14.166)
где со — предэкспоненциальный множитель, рассчитываемый из функции потен-
циальной энергии вблизи минимума (см. разд. 7.8; приводить здесь его формулу
нет необходимости) и Е — высота энергетического барьера при Д V = 0. Как видно
из рис. 14.8, в выражение для каждого энергетического барьера необходимо вклю-
чить падение потенциала на участке мембраны, соответствующем барьеру. Раз-
ность потенциалов между двумя соседними связывающими участками составляет
ДИ//7, высота барьера — половину этой величины, и, таким образом, разность по-
тенциалов между связывающим участком и барьером равна ДИ/2и. Как и в
разд. 14.3, эту величину следует прибавить к величине энергии барьера, чтобы рас-
считать энергию перемещения иона вправо, и вычесть из величины энергии барье-
ра для расчета энергии перемещения иона влево.
Концентрацию иона с каждой стороны мембраны можно измерить экспери-
ментально, а вероятность связывания иона с соответствующим участком внутри
канала как неизвестная величина рассчитывается с помощью модели. Обозначив эту
вероятность запишем следующее выражение для вероятности результирующего
потока через барьер как разницы частот пересечения барьера в правом и левом на-
правлениях
/, =од-Рр,, = a>e“£/Rr(p,e“zft|//2"Rr - p,+1ezfiiK/2"Rr) (14.17)
На втором шаге преобразований здесь использованы уравнения (14.16а) и (14.166).
Рп
Рис. 14.8. Ряд максимумов и минимумов потенциальной энергии иона, проходящего через канал
(энергетические барьеры и ямы). Переменные аир — скорости пересечения барьера в прямом
и обратном направлениях. ДV — разность потенциалов на мембране, Д1//л — разность потен-
циалов в области барьера.
418
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
Примем, что система находится в стационарном состоянии, т. е. значения р,
не зависят от времени. Тогда величина потока, */,, для всех барьеров одинакова,
и поэтому далее мы будем использовать одно и то же обозначение, J, во всех выра-
жениях, отбросив нижний индекс. Для случая незначительного падения потенциа-
ла в области барьера, F&V/n<RT, мы можем раскрыть экспоненты
J = сое ' \Pi 1 - ----- - p,., 1 + ----
I I 2 nRT J ,+4 2 nRT
\ / \ zFAF
= сое )-(А.—
I 2 nRT
(14.18)
Для случая равных концентраций иона по две стороны мембраны можно полу-
чить простое выражение, поскольку р, и р.+1 будут тогда также равны. Умножив J на
zF, чтобы преобразовать поток в ток, и разделив выражение на ДИ, мы получаем
выражение для проводимости канала
.. _СО^, с-£/ЯТ
nRT
(14.19)
Как следует из этого уравнения, проводимость обратно пропорциональна числу
барьеров. Таким образом, барьеры действуют как последовательные сопротивле-
ния и общее сопротивление движению иона через мембрану равно сумме сопро-
тивлений всех барьеров.
Полученное уравнение относится к случаям такой незначительной разности
потенциалов на барьере, при которой ток зависит от напряжения линейно. При
большей разности потенциалов преобразование экспонент, позволившее получить
уравнение (14.18), неприменимо, поскольку, когда ДИ достигает значения, равного
nRT/zF, зависимость тока от напряжения становится нелинейной. Как было отме-
чено выше, в модели одиночного барьера зависимость тока от потенциала выра-
женно нелинейная (рис. 14.3). Теперь распространим эту нелинейность на мульти-
барьерную модель.
Процедуру необходимо начинать в направлении вдоль энергетического про-
филя слева направо и записывать выражения для потока через каждый барьер. Для
первого барьера используем уравнение (14.17) при / =0
J = v.vc.A-^ (14.20)
где vca — это замена р0. Вероятность нахождения у подножия первого барьера, рас-
положенного вблизи входа в канал, пропорциональна са, концентрации иона в на-
ружной водной среде. Переменная v — это константа пропорциональности, имею-
щая размерность объема. Ее можно рассматривать как элемент с малым объемом,
расположенный вблизи входа в канал. Решая уравнение (14.20) относительно
мы получаем выражение
Р\ = <Р^а
(14.21)
где (р = а/р. Согласно уравнениям (14.16а) и (14.166), (р = е zl*v/nRT,
14.7. Теория скоростей реакций в применении к мультибарьерным каналам
419
Поток через второй барьер равен
/ = ад-₽й (14.22)
Как отмечено выше, величина /одинакова для всех барьеров, поскольку задано ус-
ловие стационарности состояния. Решение уравнения относительнор2 имеет вид
Р2 = ФА --
Подставляя выражение для />, из уравнения (14.21), получаем
р2 =<p2vca -(1+ф)-
Повторим это преобразование для третьего барьера
Рз = Ф3гса-(1+<р + <р2)-
(14.23)
(14.24)
(14.25)
Теперь очевидна определенная тенденция, и можно записать выражение для веро-
ятности в общем виде
Р, = <p'vca -
(14.26)
Сумма в правой части уравнения представляет собой геометрическую прогрессию,
которую легко вычислить с помощью уравнения (П1.9)
(14.27)
А =<Р vca - -
Р(ф-1)
С правой стороны канала рп = vcb (по аналогии с р0 = vca в уравнении (14.20)).
В таком случае выражение для рп, получаемое из уравнения (14.27), можно прирав-
нять УСЬ
п W-V
VCb = (р УСЛ-1--
р(ф-1)
Это решение уравнения относительно J. Далее используем выражения <р = егМК/лЛГ
и <рл = егМИ/лг и уравнение (14.146), чтобы получить выражение для р
(14.28)
-(Е-(гЕДК/2л)) , Zfav/RT _ \(ZF\V/nRT i\
J = vcoe RT __________________~f-b-Ae________
J егЕДГ//?7’_1
При ca =cb =c это выражение упрощается до вида
I = гГиосе-£/яг(егМГ/2"яг- = zFv^ctE/RT sinhfg^,
(14.29)
(14.30)
где величина потока преобразована в величину тока путем умножения на zF.
Таким образом, мы получили гиперболическую синусоидальную функцию,
аналогичную функции, выражаемой уравнением (14.5). При п = 1 уравнение (14.30)
420
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
сводится к уравнению (14.5) для модели с одним барьером. Как показывает график
уравнения (14.5), проводимость резко возрастает с увеличением разности потен-
циалов (рис. 14.3). Когда имеется не один, а п барьеров, нелинейность выявляется
при изменении ДИ до величины InRT/zF, а не до величины 2RT/zF, как в случае
одного барьера. Таким образом, при увеличении числа барьеров кривая зависимо-
сти тока от разности потенциалов распластывается и нелинейность вытесняется
в область больших и менее реальных значений потенциала (рис. 14.9, Л, Б). Это по-
казывает непосредственную связь между профилем энергии иона в канале и нели-
нейностью графика зависимости тока от мембранного потенциала. Чем больше
в канале барьеров, тем слабее выражена указанная нелинейность. Рис. 14.9 иллю-
стрирует также вывод, сделанный выше на основании уравнения (14.9а): с увели-
чением числа барьеров уменьшается проводимость канала.
Полученное уравнение относится к условиям, когда величины барьеров в ка-
нале одинаковы. Однако, как будет ясно из следующего раздела, его можно рас-
пространить и на случай, когда барьеры имеют разную величину. Подробный ана-
лиз моделей с барьерами позволил выявить много интересных свойств ионных ка-
налов (Lauger, 1973). В указанной работе объяснены причины нелинейности
графика зависимости тока от разности потенциалов на мембране и продемонстри-
ровано, что, когда величины барьеров у входа в канал больше, чем величины барь-
еров внутри канала, нелинейность имеет противоположную форму — проводи-
мость уменьшается с увеличением мембранного потенциала.
Рис. 14.9. А. Зависимость тока от напряже-
ния (уравнение (14.3)). Размерность едини-
цы напряжения — ZF/2RT. Б. Графики, при-
веденные в А, но масштабированные так,
чтобы углы наклона при Д1/ = 0 были равны
Такое изображение подчеркивает нелиней-
ность зависимостей.
14.8. Одноместные каналы
421
С помощью мультибарьерной модели можно также определить зависимость
потока от градиента концентрации иона и тем самым получить выражение для
проницаемости канала. Возьмем за основу уравнение (14.29) и примем ДИ ->0.
Предел отношения (егМ|//лЛ7-1)/(егМ|//Л7-1) в этом уравнении после первого по-
рядка разложения экспонент равен \/п. В итоге мы получаем уравнение
vcoeӣ//?r
/ = —------(Са-сь) (14.31)
п
Проницаемость выражается как константа пропорциональности J и разности
Са - СЬ
Можно также получить выражение для проводимости из уравнения (14.30).
Примем ДИ ->0 и произведем умножение на г/7 для преобразования величины по-
тока в величину тока. Проводимость выражается как константа пропорционально-
сти между током и напряжением
усос72И2е"£/Л7'
= vcocz -----
1 nRT
Сравнивая уравнения (14.32) и (14.33), можно установить соотношение между про-
ницаемостью и проводимостью, аналогичное уравнению (13.17).
14.8. Одноместные каналы
В омической модели канала проводимость обратно пропорциональна среднему
удельному сопротивлению, р (уравнение (14.4)). С ростом концентрации иона это
сопротивление падает, а проводимость соответственно возрастает. Однако во мно-
гих случаях при увеличении ионной концентрации наблюдается максимальная
проводимость каналов. На самом деле для многих каналов существует оптималь-
ная концентрация ионов, после превышения которой проводимость начинает
снижаться. По такому принципу функционирует, например, канал, образуемый
грамицидином А (см. разд. 14.6). Это очевидным образом не согласуется с омиче-
ской моделью канала, тогда как модели, включающие энергетические барьеры,
объясняют причину такой зависимости.
Один из способов включения порога насыщения в модель канала состоит
в том, чтобы ввести предположение о присутствии в канале в каждый момент вре-
мени только одного иона. Это предположение основано на той идее, что вследст-
вие электростатического отталкивания ионы с зарядом одного знака не могут на-
ходиться в непосредственной близости друг от друга. Когда один ион находится
в канале, остальные ионы удерживаются снаружи. В случае грамицидина А это до-
пущение неверно; в образуемом этим белком канале ионы могут занимать оба кон-
ца канала. Однако для некоторых других каналов принцип нахождения в канале
только одного иона справедлив, и теоретические предсказания моделей подобных
«одноместных» каналов оказались полезными для исследований.
422
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
И/2
Рис. 14.10. Первый барьер имеет высоту Ei, первая потенциальная
яма — глубину Wb Скорость движения вправо через первый барь-
ер — он, влево — pv В целом модель включает п барьеров, каждый
из которых характеризуется собственной энергией и скоростью
пересечения его ионами.
Здесь мы рассмотрим модель одноместного канала с произвольным набором
барьеров различной высоты и минимумов различной глубины (рис. 14.10). Это бо-
лее общий анализ по сравнению с приведенным в предыдущем разделе, где вели-
чины всех барьеров и минимумов считались одинаковыми. Таким образом, мо-
дель, описываемая в данном разделе, основана на модели из предыдущего раздела,
но при этом в нее включено допущение о нахождении в канале только одного иона
и наличии в канале произвольного числа различных по величине энергетических
барьеров и минимумов.
Условие присутствия в канале только одного иона вводится путем преобразо-
вания уравнения (14.20). Поток через первый барьер — вход ионов в канал —
уменьшается в(1 - р) раз (Lauger, 1973), где р — это вероятность того, что ион запол-
няет один из связывающих участков внутри канала = Таким образом,
ион может войти в канал только при условии, что канал пуст
J = aIvca(l-p)-PjPj
(14.34)
Поток ионов, пересекающий второй барьер, описывается выражением
/ = а2р, -р2р2
(14.35)
Общее выражение для ph соответствующее уравнению (14.26), можно получить
путем последовательного решения уравнения (14.35) относительно рг и т. д.
В результате выводится более общая форма уравнения (14.26)
(14.36)
где (р, =а,/р, .
Это громоздкое выражение можно легко упростить с помощью уравнений ско-
рости реакций
az =coe”(£'"^_|)//?r
(14.37а)
р. =сое’(£'’иг')/лг (14.376)
Уровни энергии Е и ^обозначены на рис. 14.10. Уравнения (14.37а) и (14.376)
представляют собой обобщенную форму уравнений (14.16а) и (14.166). Используя
их, получаем выражение
<Р/
а,
р7
(14.38)
е-(и<-и/_1)/яг
14.8. Одноместные каналы
423
Энергетические барьеры в этих уравнениях (£ на рис. 14.10) равны Е + §zF&V,
где Е — энергия в отсутствие мембранного потенциала и 6 — разность потенциалов
на участке мембраны, соответствующей барьеру, как часть трансмембранной раз-
ности потенциалов. Величины энергии в точках минимумов зависят от величины
падения потенциала на этих участках тем же образом, т. е. равны W + §zF&V.
Если перемножить значения ср, величины W в последовательных членах сокра-
щаются. В результате мы получаем следующее общее выражение для произведений
(14.39)
k=j
Если значение энергии в левой части энергетического профиля приравнять нулю
(И^о =0), с помощью полученных выражений можно упростить уравнение (14.36)
Pi=cav(l-p)^RF-J^RT^^— =
7=1 Р;
= сау(1 - p)ew-/RT (14.40)
® %
На втором шаге преобразований использовано уравнение (14.376) для второго чле-
на в правой части.
Поток через последний барьер с правой стороны канала описывается уравне-
нием
J = ctnpn_} -p„cbv(l-p) (14.41)
Введение в уравнение множителя (1- р) отражает то, что ион не способен войти
в занятый канал с правой стороны мембраны. Уравнение (14.41) по смыслу являет-
ся зеркальным отражением уравнения (14.34). Используя уравнение (14.40) для за-
мены рп_} в уравнении (14.41) и производя деление на р„, получаем выражение
f = саУ(1 - р)фле-^-^ - ^ф„е-^-'^£е£'^-Сьу(1 - р) (14.42)
Ри СО
Это выражение можно упростить с учетом того, что (рпе~^п~,/лт= )/rtq-w„-\/rt=
= t~Wn/RT. Здесь Wn — это энергия иона после пересечения последнего барьера на
правой стороне канала, т. е. преодоления мембранного потенциала, -zF&V. Если
перенести член 7/Р л в правую часть уравнения и использовать уравнение (14.376)
для р„, мы получим выражение для и-го члена, который необходимо включить
в сумму в уравнении (14.42). В итоге эта сумма будет включать не (л -1), а п членов
0 = cav(l-p)tmT-L^RTt е£,/лг-сьу(1-р) (14.43)
® %
Решая это уравнение относительно J, получаем выражение
J_<aV(\-p)(c3-cbe-zF^/RT) (1444)
УУ"ЯТ
424
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
На этом этапе кое-что начинает проясняться, но полученное выражение еще
не является искомым, поскольку неизвестна вероятность, р. Тем не менее уравне-
ние (14.44) позволяет выявить некоторые важные характеристики потенциалов ре-
версии. Возьмем два проникающих через канал иона, А и В, потоки которых равны
JA и JB соответственно. При потенциале реверсии сумма этих двух потоков должна
обращаться в нуль. Записывая соответствующее выражение, член cov(l- р), общий
для обоих потоков, можно опустить (Lauger, 1973)
г -г r _r --zFbV/RT
сАа сАЬе_______сВа СВЬС______ _ Q (14.45)
^^ъ/RT
;=i ;=i
Это уравнение нельзя решить относительно ДИ, поскольку значения энергии
барьеров, EjA и Ejb, зависят от разности потенциалов. Даже если принять, что эта
зависимость, как показано на рис. 14.8, линейная, уравнение (14.45) нельзя ре-
шить для произвольных барьеров. Однако, не решая это уравнение относительно
потенциала, можно тем не менее сказать, что умножение концентраций обоих ио-
нов на одно и то же число не изменит значения ДИ. Коэффициент масштабирова-
ния для концентраций сокращается, и выражение остается без изменений. Следо-
вательно, при линейной зависимости от концентраций ионов потенциал реверсии
не зависит от этих концентраций, пока их отношение остается постоянным. Дан-
ное утверждение справедливо, несмотря на то что нельзя найти точное решение
для ДИ. Таким образом, на основании уравнения (14.45) можно сделать важное
предположение, доступное для экспериментальной проверки, как показано на
рис. 14.11.
Выражение для потенциала реверсии, получаемое из уравнения Гольдма-
на—Ходжкина—Катца для мембранного потенциала (уравнение (13.32)), содержит
величины концентраций и проницаемостей, но проницаемости в нем принимают-
ся постоянными, не зависящими от потенциала. На самом деле, если суммы в зна-
менателях в обеих частях уравнения (14.45) обозначить как величины, обратные
проницаемостям, и пренебречь их зависимостью от потенциала, будет получено
уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца (см. задачу 3). Таким образом, эти сум-
Рис. 14.11. Соотношение проницае-
мостей (Рк/Рыа) не зависит от кон-
центраций ионов и равно отноше-
нию проводимостей (Gk/Gn3) в пре-
деле нулевой концентрации. Кривая
Gk/Gn3 соответствует уравнению
(14.49) при К = 60 мМ. (По Coronado
et al., 1980.)
14.8. Одноместные каналы
425
мы, несмотря на их зависимость от потенциала, отражают эффективные прони-
цаемости. При асимметричном изменении концентраций потенциал реверсии бу-
дет изменяться, но одновременно изменится соотношение проницаемостей. Это
означает явное отклонение от классической теории Гольдмана—Ходжкина—Кат-
ца, описанной в гл. 13. Подобные свойства обнаруживают многие каналы, и для
интерпретации таких результатов модели каналов, включающие барьеры, оказа-
лись весьма полезными, поскольку они описывают профиль энергии иона в кана-
ле (Eisenman, Hom, 1983).
Если представить все концентрации в едином масштабе, постоянство потен-
циала реверсии и соотношения проницаемостей можно сравнить с другими, изме-
няющимися свойствами канала. В частности, проводимость канала изменяется
с изменением ионной концентрации, а соотношение проводимостей для двух раз-
ных ионов может изменяться, когда их концентрации одновременно увеличиваются
или уменьшаются. Таким образом, для проницаемости как коэффициента, связы-
вающего ионный поток с градиентом концентрации иона, характерны зависимо-
сти, принципиально отличные от зависимостей проводимости как коэффициента,
связывающего ионный поток с разностью потенциалов.
Чтобы объяснить это отличие, необходимо вернуться к уравнению (14.44)
и вывести выражение для р — вероятности того, что канал занят. Изменение р
можно описать реалистичным образом, принимая J = 0 и са = сь = с. В этом случае
уравнение (14.36) упрощается до следующего выражения
Pi = vc(l - p)]7I<Py = vc(l - р)е"(И//-и/°)//гг (14.46)
;=i
Здесь на втором шаге преобразований использовано уравнение (14.38). Суммируя
члены уравнения (14.46), получаем выражение
р = §Л = гс(1-р)§е-и''/яг, (14.47)
/=1 /=1
где cIVq/rt=\1 поскольку =0. Теперь можно получить решение для р
vc^w'/RT
Р =------------- (14.48)
l + vc^e’^
/=i
Согласно этому выражению, при увеличении концентрации иона происходит
насыщение канала. График р выходит на плато, как только значение с превышает
l/(v^"JI,e_,F'//?r). В действительности сумма ^Je’^7 представляет собой кон-
станту связывания, поэтому можно обозначить ее \/К. (Очевидно, что эта сумма
в значительной степени сходна с функцией распределения.) Необходимо иметь
в виду, что К зависит от Wh энергии иона в позициях энергетических минимумов
в канале (рис. 14.10).
Теперь можно получить выражение для тока, подставив р из уравнения (14.48)
в уравнение (14.44). Принимая вновь са = сь = с и умножая величину потока на zF,
получаем выражение
426
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
zFcovc р -е г£ди//?7'>|
(14.49)
Зависимость связывания белка с лигандом от концентрации лиганда характеризу-
ется, как правило, насыщением (см. гл. 4). При низких концентрациях отношение
с/К составляет низкую величину и в знаменателе им можно пренебречь. Тогда по-
лучаем
Z = zFavc (1 - е-гМ,//яг) (14.50)
>1
Обратите внимание, что в этом выражении константа К, зависящая от глубины
энергетических минимумов, отсутствует. Таким образом, при низких концентра-
циях ионов ток, I, не зависит от глубины энергетических ям и определяется только
высотой барьеров.
Для низких значений мембранного потенциала можно принять 1 _е-^ди//гг~
~ zFW/RT. Тогда уравнение (14.50) принимает вид
г2£2согсДИ
RT^tEj/RT
(14.51)
Проводимость выражается как константа пропорциональности тока, I, разности
потенциалов, ДИ. Соотношение проводимостей для двух разных ионов будет зави-
сеть от сумм в знаменателе. Эти суммы в свою очередь зависят только от высоты
барьеров и не зависят от глубины ям, соответствующих связывающим участкам.
Аналогичным образом от барьеров зависят и проницаемости (знаменатель в урав-
нении (14.45)). Таким образом, соотношения проводимостей и соотношения про-
ницаемостей для разных ионов при их низких концентрациях равны.
С увеличением концентрации иона ток достигает предельного значения, при
котором канал всегда занят. В этом пределе при высоких значениях с и низких ДИ
уравнение (14.49) принимает вид
1 =
z2F2a>vKAV
RT^/rt
(14.52)
В этом случае проводимость зависит от К, и, следовательно, от значений Wh энер-
гии иона в энергетических ямах. При низких концентрациях иона зависимость
проводимости, как мы видели выше, существенно иная (уравнение (14.50)). Сим-
метричное увеличение концентраций ионов не влияет на значения проницаемости
канала, определяемые потенциалом реверсии (уравнение (14.45)), но изменяет
проводимость. Это означает, что при измерении проводимости канала для ряда ио-
нов относительная проводимость может варьировать. Действительно, ряд ионов,
составленный в порядке убывания проводимости канала, изменяется при варьиро-
вании их концентраций.
14.9. Однорядные каналы
427
Эти теоретические предсказания прекрасно подтвердились на примере кати-
онселективного канала мембраны клеток саркоплазматического ретикулума
(Coronado et al., 1980). Соотношение проницаемостей в этой работе определяли из
значений потенциала реверсии для Na+ на одной стороне канала и для К+ на дру-
гой его стороне. Проводимость одиночного канала измеряли при симметричном
увеличении концентраций К+ и Na+. Соотношение проницаемостей Pk/PN3 было
равно ~2 и не изменялось в широком диапазоне концентраций этих ионов (рис.
14.11), согласно уравнению (14.45). При низких концентрациях ионов соотноше-
ние проводимостей, согласно уравнению (14.50), было близким к соотношению
проницаемостей. Однако при более высоких концентрациях ионов соотношение
проводимостей возрастало до трех. Таким образом, после насыщения канала обна-
руживается влияние энергетических ям. Вероятно, области ям в большей степени
селективны для К+, чем области барьеров, и вследствие этого при высоких концен-
трациях ионов соотношение проводимостей выше соотношения проницаемостей.
Проводимость одиночного канала достигает уровня насыщения при увеличе-
нии концентрации иона. Аналогичным образом зависит от концентрации соотно-
шение проводимостей (рис. 14.11). Такая кинетика с насыщением соответствует
исходному условию о том, что в каждый момент времени в канале может находить-
ся только один ион. Это свойство характерно для относительно небольшого числа
каналов, тогда как большинство каналов способно содержать одновременно боль-
шее число ионов. Для описания проницаемости каналов, способных одновремен-
но вмещать несколько ионов, требуются иные модели. Среди них важное значение
имеет модель однорядного канала, рассматриваемая в следующем разделе.
14.9. Однорядные каналы
Термин «однорядный канал» применяют для моделей, согласно которым ионы
формируют пронизывающую канал линейную цепочку; канал при этом считается
настолько узким, что ионы не могут обходить один другой. Поскольку ни один ион
в таком случае не может перемещаться, не приводя в движение другие ионы, все
ионы в канале движутся вместе. Если они не могут перемещаться единым блоком,
их движение происходит последовательными скачками, т. е. каждый ион переме-
щается на свободное место, образовавшееся в результате смещения соседнего
иона. Однорядные модели особенно хорошо подходят для высокоселективных ка-
налов, связывающие участки которых характеризуются высокой специфичностью
и прочностью взаимодействия с ионами.
Впервые однорядная модель была предложена в классическом исследовании
Ходжкина и Кейнеса (Hodgkin, Keynes, 1955). Современные структурные исследо-
вания замечательным образом подтвердили основные свойства однорядной моде-
ли. Ходжкин и Кейнес исследовали поглощение К+ аксоном кальмара в условиях
блокады активного транспорта. При ингибировании активности ионных насосов
поглощение К+ происходило лишь за счет его электрохимического градиента на
мембране. Измеряя потоки К+ внутрь клетки и наружу с помощью изотопной мет-
ки, авторы определяли соотношение потоков по Уссингу (см. разд. 13.6). В соот-
ветствии с этой теорией соотношение однонаправленных потоков записывается
следующим образом (см. уравнение (13.27))
428
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
4(а-*Ь) = e-z,MK//?T (14.53)
Z(b->a) Cjb
Результаты, полученные Ходжкином и Кейнесом, не подчинялись данной за-
висимости. При потенциале Нернста (когда правая часть уравнения (14.53) равна
единице) потоки внутрь клетки и наружу были равны, но остальные данные могли
удовлетворять этому уравнению только в том случае, если показатель степени в его
правой части был больше единицы. Экспериментальным данным соответствовал
показатель степени, равный 3,5. Этот результат не противоречил исходному усло-
вию пассивного транспорта, поскольку при потенциале Нернста величины проти-
воположно направленных потоков были равны. Однако соотношение потоков по
Уссингу рассчитывается при допущении, что потоки внутрь клетки и наружу неза-
висимы. В отличие от этого Ходжкин и Кейнес для объяснения результатов своих
экспериментов ввели предположение, что потоки К+ тесно взаимосвязаны, и тем
самым пришли к однорядной модели канала.
Однорядный канал, заполненный ионами, изображен на рис. 14.12. Ионы К+
присутствуют по обе стороны мембраны. С левой стороны мембраны они обозна-
чены как А, с правой — как В. Канал содержит п связывающих участков, занимае-
мых либо ионами А, либо ионами В. Ионы А и В разделяет в канале четкая грани-
ца, поскольку для образования последовательностей АВА или ВАВ необходимо,
чтобы ион вошел в канал с той стороны мембраны, где все остальные ионы имеют
другое обозначение. Этого не может произойти, так как радиоактивная метка не-
медленно разбавляется («исчезает») после того, как достигнет противоположной
стороны канала. Таким образом, все занятые состояния однорядного канала име-
ют форму АА ... АВ ... ВВ.
Далее вводится разграничение между потоками метки, зависящими от ее кон-
центрации, и результирующим ионным потоком или током, для которого концен-
трация метки не имеет значения. Событие перемещения метки происходит после
того, как в одном направлении произошло на (и + 1) согласованных скачков ионов
больше, чем в другом. В то же время событие перемещения заряда происходит при
каждом скачке. Обозначим частоту событий перемещения заряда вправо и влево
как г и s соответственно. Согласно потенциалу Нернста, эти частоты соотносятся
следующим образом
- = [А]е-гаи/яг (14.54)
5 [В]
Здесь г = s при Д V = (уравнение (13.3)).
ZF [А]
При каждом событии перемещения заряда, или скачке, весь ряд ионов в кана-
ле смещается на одно положение. Допустим, что исходно все п связывающих уча-
стков заняты ионами А (линию ионов в канале можно обозначить тогда Ал) и канал
переходит в состояние Ал1В со скоростью s. Обратный процесс характеризуется
[А] [В]
ААА......ВВВ
Рис. 14.12. Однорядный канал. Ионы К+ обозначены слева от мембраны
как А, справа — как В.
14.9. Однорядные каналы
429
скоростью г. Соответственно этому дифференциальное уравнение скорости изме-
нения [AJ имеет вид
= -5[A„]+r[A„_,B]
dr
В стационарном состоянии скорость изменения состояния равна нулю, поэтому
r_ [An]
(14.55)
(14.56)
* [АЛ_|В]
Из состояния однорядного комплекса [Ал1В] возможен переход в состояние [Ал]
или [Ал_2В2], и, наоборот, из этих двух состояний возможен переход в первое со-
стояние в результате обратного процесса. Таким образом, скорость изменения
[А В] равна
d[A;-|B] = -(*+г)[А„_,В] + г [А„_2В2 ] + s[A„ ]
dr
В случае стационарного состояния это выражение равно нулю. Производя соот-
ветствующие преобразования и используя уравнение (14.56), получаем для данно-
го случая выражение
(14.57)
(14.58)
k-V [А^Вг]
Аналогичное выражение можно вывести для [АЛ_2В2 ], [АЛ_3В3 ] и т. д. Общее выра-
жение имеет вид
(14.59)
[Ал]
Ы [Ал-;Ву]
События потока метки происходят только из состояний Ал и Вл. Перемещение
ионов А в правый раствор (см. рис. 14.12) происходит со скоростью г[А„], ионов В
в левый раствор — со скоростью s[BJ. Соотношение этих величин дает соотноше-
ние потоков метки в виде выражения
* 4(а->Ь) = Г[АЛ] = (ГЧ"+1
Z(b->a) 5[BJ k*^.
(14.60)
Здесь на втором шаге преобразований использовано уравнение (14.59) при j = п.
Объединяя это выражение с уравнением (14.54), мы получаем искомое уравнение
Г (а-*Ь) _ | [A] ^-zFbV/RT
^(b->a) • UB]
(14.61)
Как было указано выше, Ходжкин и Кейнес путем подгонки этого уравнения к
своим экспериментальным данным получили показатель степени 3,5, т. е. п = 2,5. На
основании этого они заключили, что цепочка ионов К+ в канале включает 2—3 иона.
Ключевое условие данной модели, состоящее в том, что все ионы перемещают-
ся вместе, согласованными скачками, в действительности представляется малове-
роятным. Более правдоподобная модель перемещения ионов в однорядном канале
430
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
создана путем включения нескольких барьеров и связывающих участков. Если все
участки, кроме одного, заняты, в канале имеется одно свободное место. Когда ион
совершает скачок, чтобы заполнить это место, освобождается место сзади данного
иона. Такая модель с одним свободным местом описывается набором уравнений,
весьма сходных с уравнениями одноместной модели, рассмотренной в предыду-
щем разделе. Решение одного из этих уравнений наметили Шумахер и МакКин-
нон (Schumaker, MacKinnon, 1990), указав способ получения гиперболической си-
нусоидальной функции для зависимости ток—напряжение, существенно сходной
с аналогичной функцией для мультибарьерной модели (уравнение (14.30)).
Барьерные модели однорядных каналов сложны математически, поскольку за-
нятость большим числом ионов означает и большое число состояний. Соответст-
вующие кинетические уравнения решаются с помощью компьютера или общих
методов, описанных в гл. 9. Результаты, получаемые с помощью этих моделей,
подтверждены рядом экспериментальных данных (Hille, Schwarz, 1978), в том чис-
ле подтверждена экспоненциальная зависимость соотношения потоков от соот-
ношения концентраций иона (уравнение (14.61)). Как предсказывает однорядная
модель, проводимость канала возрастает с увеличением концентрации иона до
максимума и затем снижается. Снижение проводимости происходит, когда концен-
трация иона настолько высока, что свободное место, достигшее границы канала,
быстрее заполняется ионами из внешней среды, чем ионами из соседнего связы-
вающего участка. Кроме того, однорядная модель предсказывает резкую потенци-
ал-зависимую блокаду канала некоторыми ионами, для которых он непроницаем,
и резкие потенциал-зависимые изменения проводимости. Такие свойства наблю-
даются для многих калиевых каналов, что говорит о широком распространении
однорядного механизма.
Известно много интересных примеров действия однорядного механизма мем-
бранного транспорта ионов. Так, на его основе можно объяснить, почему кальцие-
вые каналы непроницаемы для одновалентных катионов, например для Na+. Свя-
зывающие участки в кальциевом канале обладают высоким сродством к Са2+; кон-
станта диссоциации для первого связывающего участка равна ~1 мкМ, другие
связывающие участки заполняются при несколько более высоких концентрациях
Са2+. Ионы Na+ также способны связываться с этими участками, но непрочно. При
физиологической концентрации Са2+, равной ~1 мкМ, кальциевые каналы всегда
заполнены ионами Са2+, что блокирует вход одновалентных катионов. Если в ка-
нал случайно входит ион Na+, его более низкий заряд обеспечивает лишь относи-
тельно слабую силу электростатического отталкивания, которой недостаточно для
перемещения соседнего иона Са2+ в связывающий участок, расположенный далее
в глубь канала, и запуска однорядного движения. Когда в канал входит ион Са2+,
вызываемое им более сильное электростатическое отталкивание провоцирует дви-
жение других ионов Са2+ по однорядному механизму. При концентрации Са2+
ниже ~ 100 мкМ занятым остается только один участок. Для обеспечения проводи-
мости канала необходимо, чтобы большое число связывающих участков было за-
нято ионами, поэтому при низкой концентрации Са2+ ток снижается до нуля.
Дальнейшее снижение концентрации Са2+ приводит к высвобождению последнего
иона Са2+ из канала, после чего Na+ может легко входить в канал. Таким образом,
в случае полного удаления Са2+ кальциевый канал превращается в канал, селектив-
ный для Na+ (Aimers, McCleskey, 1984; Hess, Tsien, 1984).
14.10. Канал KcsA
431
Однорядные модели были использованы для анализа потока воды в канале, об-
разуемом грамицидином A (Finkelstein, Andersen, 1981). В этом канале поток воды
связан с потоком ионов. Как показали расчеты, данный канал содержит примерно
шесть молекул воды. Результаты компьютерного моделирования подтвердили од-
норядный механизм движения молекул воды и ионов, т. е. показали, что ионы
и молекулы воды никогда не обходят друг друга внутри канала (Edwards et al., 2002).
Путем измерения ионных потоков было установлено, что при концентрациях ио-
нов ниже ~100 мМ (точное значение концентрации зависит от иона) ионы движут-
ся через канал по одному, т. е. не в виде взаимосвязанного ряда. Однако при повы-
шении концентрации ионов соотношение противоположных потоков больше еди-
ницы, и это свидетельствует о том, что оба связывающих участка, показанных на
рис. 14.7, могут быть заняты ионами. В таком случае перемещение иона из одного
участка в другой сопровождается задержкой, связанной с освобождением соседнего
с ионом участка связывания. Поток метки становится при этом двуионным про-
цессом, и поэтому показатель степени в уравнении (14.61) превышает единицу.
Другим интересным примером действия однорядного транспорта может слу-
жить перенос нейромедиатора серотонина через мембрану (Adams, DeFelice, 2002).
Добавление в систему немеченого серотонина приводит к изменению потока ме-
ченого серотонина, что свидетельствует о взаимодействии молекул нейромедиато-
ра в процессе пересечения мембраны. Результаты дополнительных экспериментов
позволяют предполагать, что переносчик серотонина формирует канал, заполняе-
мый наряду с серотонином неорганическими ионами. Таким образом, ионные гра-
диенты могут служить движущей силой переноса серотонина через мембрану, т. е.
обеспечивать перемещение цепочки его молекул. Возможно, это общий механизм,
по которому электрохимические градиенты ионов действуют в качестве движущей
силы транспорта субстратов через мембраны (DeFelice, 2004).
Различные модели, приведенные в этом и двух предыдущих разделах, весьма
успешно объясняют многие аспекты проницаемости каналов для ионов. Энергети-
ческие барьеры и связывающие участки, включенные в эти модели, отражают ре-
альные характеристики каналов. Однако величины энергии, полученные в качестве
параметров при подгонке барьерных моделей к экспериментальным данным, до-
вольно условны. Как правило, их нельзя четко связать со структурой канала. Проб-
лема здесь связана не с моделями, а с недостатком достоверных данных о структуре
каналов. В последнее время благодаря успехам структурных исследований положе-
ние в этом отношении быстро улучшается и уже подтверждены многие предполо-
жения, сделанные на основе барьерных моделей каналов. В следующем разделе
описывается, каким образом результаты рентгеноструктурного анализа некоторых
каналов позволяют дать ясные ответы на старые вопросы о ионной проницаемости
каналов и перейти от барьерных моделей к подробным расчетным теориям.
14.10. Канал KcsA
Первым селективным ионным каналом, для которого удалось с высоким разреше-
нием установить структуру, стал калиевый канал KcsA (Doyle et al., 1998). Амино-
кислотная последовательность этого бактериального белка имеет много особенно-
стей, общих для калиевых каналов, и поэтому сведения, полученные при изучении
канала KcsA, имеют более широкое значение.
432
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
Рис. 14.13. Калиевый канал KcsA (структура пептидного остова). А. В проекции на плоскость
мембраны эта молекула имеет четырехскладчатую симметричную структуру с центральной по-
рой. Б. Вид в плоскости, перпендикулярной плоскости мембраны. Две основные пронизываю-
щие мембрану а-спирали двух противоположных субъединиц выстилают стенки канала. После-
довательности TVGYG образуют селективный фильтр на конце канала, расположенного с на-
ружной стороны мембраны. Полость в центре канала заполнена водой. Ворота канала
находятся вблизи внутренней стороны мембраны. В канале присутствует три иона, два в облас-
ти селективного фильтра и один между фильтром и водной полостью. (По Doyle et al., 1998.)
Наружная
поверхность
мембраны
Внутренняя
поверхность
мембраны
Каналообразующий белок KcsA состоит из четырех субъединиц, соединенных
в форме клеверного листа и образующих в центре этой структуры водную пору
(рис. 14.13, А). Стенки поры выстланы со стороны каждой субъединицы а-спира-
лью, пронизывающей мембрану, и последовательностью из пяти аминокислотных
остатков, имеющей вытянутую конфигурацию (рис. 14.13, Б). Данная последова-
тельность, треонин—валин—глицин—тирозин—глицин (TVGYG), — это характер-
ный мотив в составе белков, образующих калиевые каналы Такие сегменты четы-
рех субъединиц формируют вместе селективный фильтр, имеющий форму трубки
шириной 3 А. Между селективным фильтром и воротами канала расположена
большая полость, заполненная водой. Молекула канала, исследованная методом
рентгеноструктурного анализа, содержала в области фильтра три иона, что соот-
ветствует однорядной модели канала. Таким образом, селективный фильтр этого
канала представляет собой структуру, описываемую классической моделью одно-
рядного ионного канала.
Проницаемость непосредственно обеспечивается многими деталями структу-
ры. Карбонильные группы пептидного остова в участке селективного фильтра,
экспонированные внутрь канала, представляют собой ряды связывающих участ-
ков, специфичных к ионам К+. Большая водная полость позволяет гидратирован-
ным ионам достичь селективного фильтра с минимальной затратой энергии (см.
задачу 5). Короткая а-спираль, соединяющая каждую из пронизывающих мембра-
ну спиралей с последовательностью TVGYG, ориентирована таким образом, что ее
дипольный момент способствует входу катионов и препятствует входу анионов
(Roux, MacKinnon, 1999; см. рис. 2.12). Дополнительные полярные группы форми-
руют диполи, способствующие входу катионов. Некоторые из этих групп являются
кислыми аминокислотными остатками, способными нести отрицательный заряд,
однако состояние ионизации данных остатков установить сложно
14.10. Канал KcsA
433
Ключевой структурой для проницаемости служит селективный фильтр. Он
включает четыре связывающих участка, занимаемых двумя ионами по мере увели-
чения ионной концентрации (Morais-Cabral et al., 2001). Эти два иона распределя-
ются примерно равномерно между четырьмя связывающими участками, из чего
можно сделать вывод о наличии двух состояний занятости, К+—W—К+—W
и W—К+—W—К+ (где W — молекула воды), в равной пропорции. Ионный поток
можно представить как переходы между этими двумя конфигурациями. Энергии
различных конфигураций были рассчитаны с помощью теоретической формулы
силового поля, основанной на данных о структуре канала. Полученные величины
показали, что формы К+—W—К+—W и W—К+—W—К+ являются наиболее ста-
бильными (Aqvist, Luzhkov, 2000). Они характеризуются примерно равными значе-
ниями энергии и легко подвергаются взаимным превращениям. Анализ методом
имитации молекулярной динамики показал, что при согласованном переходе меж-
ду конфигурациями комплексы вода—К+ совершают скачок в течение всего не-
скольких наносекунд вместе с третьим ионом К+, находящимся в водной полости
(Bemiche, Roux, 2000).
Различные энергетические вклады в проницаемость KcsA-канала определены
на основе сведений о структуре канала с учетом основных электростатических
факторов (рис. 14.14, A; Chung et al., 1999). К таким факторам относятся область
с низкой диэлектрической проницаемостью, окружающая заполненную водой
пору, диполи селективного фильтра, диполи а-спиралей и диполи у входа в канал
Рис. 14.14. Энергетика проникновения ионов через канал KcsA. А. На схеме, соответствующей
данным рентгеноструктурного анализа (рис. 14.13), показаны параметры, используемые для
расчетов энергии. Б. Теоретически рассчитанная энергия иона как функция позиции по оси ка-
нала. Серым показана область селективного фильтра. Линия а — энергия силы отображения;
линия б — энергия взаимодействия иона с диполями селективного фильтра: линия в — энергия
взаимодействия иона с диполями а-спиралей; линия г— сумма этих значений энергии и энер-
гия взаимодействия иона с диполем входного отверстия. В. График энергии второго иона в при-
сутствии одного иона в селективном фильтре (показан как + в позиции 19 А) и график энергии
третьего иона в присутствии двух ионов в фильтре. (С изменениями по Chung et al., 1999.)
434
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
с двух его сторон. Форма канала определяет силу отображения, которую можно
рассчитать для данной структуры с помощью методов, описанных в разд. 14.6.
Профиль энергии одного иона, движущегося вдоль оси канала, показан на рис.
14.14, Б линией а. Эта кривая достигает максимума, уровень которого примерно
равен 20 кТ, вблизи центра селективного фильтра.
Диполи селективного фильтра (рис. 14.14, Б\ линия б) и диполи а-спиралей
(линия в) вместе с диполями входного отверстия притягивают ионы в канал. Эта
сила притяжения превышает силу отображения, вследствие чего суммарный энер-
гетический профиль имеет глубокий минимум в области селективного фильтра
(линия г). При глубине минимума более 25 кТодиночный ион связывается очень
прочно. Если бы на этом процесс останавливался, проницаемость канала была бы
очень низкой. Ион входил бы в селективный фильтр и оставался в этом участке
длительное время.
Однако в канал входит большее число ионов. На второй ион действуют те же
силы, что и на первый, плюс отталкивание, вызываемое присутствующим в канале
первым ионом. Кроме того, на второй ион влияет поляризация среды, индуциро-
ванная первым ионом и оказывающая притяжение. Результирующий энергетиче-
ский профиль для двух ионов имеет вид кривой, показанной на рис. 14.14, В. Вто-
рой ион попадает в область энергетического минимума на границе селективного
фильтра, вблизи водной полости. На рисунке изображена также кривая для случая,
когда в канале присутствуют три иона, но для третьего иона силы притяжения
уравновешены силами отталкивания от первых двух ионов. Третий ион проходит
два энергетических минимума, оба в водной полости.
Чтобы установить соотношение между этими энергетическими профилями
и проницаемостью канала, был использован метод математического описания
броуновского движения, позволивший смоделировать движение ионов в канале
(Chung et al., 1999; Kuyucek et al., 2001). В основе этого метода лежат уравнения ус-
корения ионов в трехмерном варианте силового поля, показанного на рис. 14.14.
Для отражения соударений с молекулами окружающей среды в результате теплово-
го движения в уравнения вводится случайная флуктуирующая сила. В системе
с большим числом ионов сила, действующая на /-й ион, вызывает ускорение в со-
ответствии с уравнением Ньютона для движения
/П, — = Л, -Vt/+(p(/), (14.62)
d/
где Vt/ — силовое поле, включающее упомянутые выше взаимодействия, и ср(/) —
случайная флуктуирующая сила, отражающая тепловое движение. Данное выра-
жение представляет собой уравнение Ланжевена (уравнение (12.96)), в котором уч-
тена внешняя сила.
Эти уравнения решают с помощью компьютера численным способом путем
расчета изменений в положениях частиц с шагом 10"13 с. Траектории рассчитывают
на отрезке времени в несколько микросекунд. Когда в уравнение движения вклю-
чают разность потенциалов на мембране, модифицируя функцию потенциальной
энергии (С/в уравнении (14.62)), через канал в течение расчетного времени прохо-
дит значительное число ионов, т. е. проницаемость эффективно моделируется. Это
дает возможность детально сравнивать теоретические данные с результатами экс-
периментов.
14.10. КАНАЛ KCSA
435
Такое моделирование позволило выявить основные характеристики движения
ионов по каналу (Chung et aL, 2002). Вопреки ожиданиям, лимитирующим ско-
рость этапом оказалось не прохождение ионов через селективный фильтр. Для ио-
нов К+, движущихся наружу (из клетки), наиболее медленным этапом было пере-
сечение барьера внутри полости (кривая для трех ионов на рис. 14.14, В). Как толь-
ко третий ион достигает входа в селективный фильтр, тот ион, который
расположен на противоположном конце фильтра, быстро вытесняется вправо под
действием электростатического отталкивания. Другой ион в селективном фильтре
занимает положение, прежде занятое вытесненным ионом, а ион из полости вхо-
дит в селективный фильтр. Эти этапы протекают довольно быстро по сравнению
с этапом пересечения полости. Весь процесс целиком повторяется, что соответст-
вует однорядному механизму проницаемости канала.
Результаты, полученные при моделировании, ясно указывают, что для оценки
реальной скорости движения ионов через канал необходимо сосредоточить внима-
ние на этапе пересечения ими полости, а не селективного фильтра. Высота энерге-
тического барьера в полости, как было установлено, сильно зависит от радиуса по-
лости; его изменения существенно влияют на проводимость канала. Калиевые ка-
налы, обнаруженные в мембранах клеток различных организмов, варьируют по
проводимости в пределах 1—250 пСм (10-12 См). Это можно объяснить варьирова-
нием размеров полости в более широком диапазоне, чем предполагаемые для нее
пределы 4—10 А.
Примечательно, что селективность канала и величина тока контролируются
двумя разными частями белка. Селективный фильтр формирует участки связыва-
ния, обладающие большим сродством к К+ по сравнению с Na+. Мутации, затраги-
вающие фрагмент TVGYG, нарушают селективность. В природе не может возни-
кать разнообразия первичной структуры этой области белка без нарушения селек-
тивности канала, но вместо этого по-разному формируется полость, чем
и обусловлен широкий диапазон структур канала при одинаковой селективности.
Селективный фильтр не участвует также в открывании и закрывании канала. Эти
события зависят от движения ворот, расположенных на другом конце полости,
ближе к внутренней стороне мембраны (рис. 14.13, Б).
Секрет селективности калиевых каналов связан с тем, какую структуру в физи-
ческом отношении представляют собой селективный фильтр и присутствующая в
нем последовательность TVGYG. Возможны две противоположные физические
характеристики фильтра. Фильтр чрезвычайно жесткой структуры может быть
способен различать ионы. Если положение атомов кислорода карбонильных групп
пептидного остова строго фиксировано, ионы К+ диаметром 1,33 А точно подходят
к связывающим участкам селективного фильтра (Garofoli, Jordan, 2003). При заме-
не К+ меньшим по диаметру ионом Na+ (0,95 А) происходит растяжение этих свя-
зей. В жесткой структуре на растяжение затрачивается значительная работа, по-
скольку силовые постоянные ковалентных связей высокие. Напомним, что растя-
жение такой связи всего на 0,1 А увеличивает ее энергию на величину, примерно
равную кТ(см. разд. 2.12). Аналогично этому фильтр не пропускает ион Cs+ как бо-
лее крупный (диаметр 1,69 А), поскольку этот ион деформирует связи в обратном
направлении.
Если селективный фильтр имеет «мягкую» структуру, он не может различать
ионы по этому механизму, поскольку в таком случае связи в карбонильных группах
436
Глава 14. ИОННАЯ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И СТРУКТУРА КАНАЛОВ
способны смещаться и фильтр пропускает ионы разного диаметра. Растяжения
связей в этом случае не требуется. Однозначного мнения о ригидности данной об-
ласти канала не существует, и это послужило стимулом для выдвижения иного объ-
яснения селективности (Noskov et al., 2004). Согласно новой гипотезе, диполи кар-
бонильных групп пептидного остова в области фильтра, от влияния которых зави-
сит проникновение ионов, испытывают взаимное отталкивание. Связывание иона
основано на энергетически выгодных ион-дипольных взаимодействиях и энерге-
тически невыгодных диполь-дипольных взаимодействиях. При геометрических
параметрах селективного фильтра калиевого канала в результате взаимовлияния
этих типов взаимодействий глубина энергетического минимума в случае ионов К+
больше, чем в случае Na+. Эта теория объясняет селективность специфичностью
взаимодействий между проникающим ионом и белковыми структурами внутри ка-
нала, тогда как по теории Эйзенмана она основана на простых электростатических
взаимодействиях (см. разд. 14.4).
В начале главы была проведена параллель между ионными каналами и фер-
ментами, и в заключение интересно сравнить достижения в количественном мо-
делировании процессов движения ионов по каналам и ферментативного катализа.
Одно из благоприятных условий моделирования ионных каналов связано с тем,
что ионы проходят через канал очень быстро и поэтому их активность требуется
моделировать на отрезке времени порядка микросекунд. В отличие от этого ак-
тивность большинства ферментов необходимо моделировать для периода време-
ни, примерно в 1000 раз большего, чтобы отразить этапы катализа. Прохождение
иона по каналу не связано с химическими реакциями, т. е. ковалентные связи при
этом не образуются и не разрываются, и для описания траектории движения иона
достаточно использовать стандартные функции потенциальной энергии. В отли-
чие от этого моделирование ферментативного катализа требует количественного
учета сил, участвующих в образовании химических связей и стандартные функ-
ции потенциальной энергии для этих процессов неприменимы (см. разд. 10.10).
Движение ионов, кроме того, не связано тесно с движением белковой молекулы,
поэтому оно хорошо моделируется на основе модели броуновского движения при
относительно статичном окружении. Уравнения в этом случае имеют существен-
но упрощенную форму за счет пренебрежения динамикой белка; вычисления
производятся довольно быстро и благодаря этому моделирование можно осущест-
влять на отрезках времени, достаточно продолжительных для требуемого числа
пересечений барьеров. В случае ферментов движение белковой молекулы играет
важную роль, и при моделировании это требует применения метода молекуляр-
ной динамики, в результате чего вычисления занимают значительно большее
время.
Задачи
1. Используя омическую модель канала, рассчитайте проводимость селективного
фильтра, размеры которого указаны на рис. 14.14.
2. Докажите, что когда все барьеры одноместного канала (рис. 14.10) для двух раз-
личных ионов различаются на одну и ту же величину, ДЕ, соотношение проницае-
мостей составляет е"д£/лг (Coronado et al., 1980).
Задачи
437
3. Найдите проницаемости РА и Рв для соответствующей суммы в уравнении (14.45),
не принимая во внимание их зависимость от напряжения, и выведите уравнение
Гольдмана—Ходжкина—Катца для напряжения (уравнение (13.22)).
4. Используя результаты одноместной модели канала (разд. 14.8), докажите, что от-
ношение КР/умж является постоянным и не зависит от выбора иона (Р— прони-
цаемость) (Coronado et al., 1980). Для Р используйте соответствующую сумму из
уравнения (14.45). Для вывода умакс используйте уравнение (14.52).
5. Используя уравнение (2.7), рассчитайте энергию иона К+ в центре заполненной
водой полости канала KcsA, допуская, что эта полость имеет форму сферы радиу-
сом 5 A (Roux, MacKinnon, 1999; Roux et al., 2000).
6. Рассмотрите канал с одиночным связывающим участком при 5 = 1/2 и двумя барь-
ерами с 5 = 1/2 ± 1|/, где 1|/ может изменяться от 0 до 1/2. Связывающий участок мо-
жет быть свободен или содержать один ион. Энергетические барьеры при нулевой
разности потенциалов составляют величину, равную ART, минимум потенциаль-
ной энергии равен нулю; предэкспоненциальный множитель равен единице. По-
лучите формулу зависимости тока от напряжения и концентрации иона. Для сим-
метричного изменения концентрации ионов в диапазоне их низких концентраций
постройте график вольт-амперной зависимости для А = 10 и ср = 0,1, <р = 0,25 и
(р = 0,4.
7. Рассмотрите одиночный барьер для ионного потока через мембрану. При ДГ = 0
ион обладает максимальной потенциальной энергией в центре мембраны. Вблизи
этого максимума его энергия описывается выражением Е-<р(х-х0)2. Прибавьте
к этой энергии вклад линейного падения потенциала и определите положение
и высоту барьера для произвольного значения ДИ Это покажет соотношение вели-
чин свободной энергии (см. разд. 7.6). Запишите формулу зависимости тока от на-
пряжения.
8. Если п в уравнении (14.61) равно единице, модель уже нельзя называть моделью
однорядного канала, поскольку в канале присутствует только один ион. Независи-
мы ли потоки при этом условии? Почему соотношение потоков выводится из
уравнения Уссинга (уравнение (13.27))?
Г лава 15
Кабельная теория
Нервные клетки имеют очень сложную форму, и мембранный потенциал в их раз-
ных участках резко различается по величине. Если через ограниченную область
клеточной мембраны течет ионный ток, в этом участке мембранный потенциал
быстро меняется, тогда как в отдаленных участках клетки он изменяется медлен-
нее и в меньшем диапазоне. Изменения потенциала, распространяющиеся по
клетке, влияют на функции мембраны и служат сигналами определенных клеточ-
ных процессов, например экзоцитоза и мышечного сокращения. Посредством пе-
редачи электрических сигналов от нервной системы происходит регуляция и фор-
мирование поведения организмов.
Электрические сигналы, возникающие в клетках, делятся на два основных
типа. Сигналы одного типа, не изменяющие проводимость мембраны, распростра-
няются пассивно на ограниченное расстояние; такие сигналы называют электро-
тоническими. Сигналы другого типа изменяют проводимость мембраны и благо-
даря усилению распространяются без затухания на неограниченное расстояние.
Настоящая глава посвящена анализу пассивной передачи электрических сигналов;
активное распространение рассматривается в следующей главе.
Изучение пассивного распространения сдвигов потенциала представляет инте-
рес по нескольким причинам. 1. Пассивно распространяются некоторые биологи-
чески важные сигналы; этот путь распространения наиболее характерен для неболь-
ших изменений потенциала. 2. Пассивное изменение потенциала имеет техническое
значение для проведения электрофизиологических экспериментов и интерпрета-
ции получаемых в них данных. 3. Анализ пассивного распространения изменений
потенциала служит основой для изучения их активного распространения.
Принципы пассивной передачи электрических сигналов соответствуют основ-
ным правилам электрических цепей. Под действием напряжения ток течет через
сопротивления. В результате зарядки конденсатора током изменяется напряжение.
Кабельная теория обобщает эти процессы с учетом формы элементов цепей, рас-
пределенных в клеточной мембране и цитоплазме, что позволяет вывести кабель-
ное уравнение. В случае клеток любой формы можно получить решение кабельно-
го уравнения, описывающее пассивное распространение сдвига потенциала.
15.1. Ток через мембрану и цитоплазму
Ионный ток течет через клеточную мембрану и цитоплазму. В мембране он вызы-
вает изменение потенциала; ток через цитоплазму обеспечивает распространение
15.1. ТОК ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ И ЦИТОПЛАЗМУ
439
этих изменений потенциала. Относительные величины токов через мембрану и
цитоплазму определяют, на какое расстояние распространится изменение потен-
циала. Чтобы сравнить эти два тока, необходимо знать сопротивление эквивалент-
ных участков мембраны и цитоплазмы. Сопротивление участка мембраны пло-
щадью 1 см2 составляет 104 Ом (сопротивление единичной площадки мембраны,
называемое удельным сопротивлением мембраны, рм, измеряется в Ом см2). Ку-
бический объем цитоплазмы, равный 1 см3, обладает сопротивлением примерно
100 Ом (удельное сопротивление цитоплазмы, рц, измеряется в Ом-см). Пересчет
кубического объема цитоплазмы на единичную площадку, толщина которой равна
толщине мембраны (~ 5 • 10"7 см), дает величину 5 • 10"5 Ом. Таким образом, прово-
димость цитоплазмы примерно на восемь порядков величины выше по сравнению
с проводимостью мембраны. По этой разнице можно количественно оценить мас-
штаб распространения в клетке сдвига потенциала. При разности потенциалов ме-
жду двумя точками, одна из которых находится внутри клетки, а другая снаружи,
падение напряжения происходит почти полностью на мембране.
При этих приблизительных оценках потенциал внутри всей клетки считается
одинаковым. Если клетка сферическая, сопротивление между двумя любыми точ-
ками в цитоплазме пренебрежимо мало по сравнению с сопротивлением мембра-
ны. Иным образом обстоит дело при необычной форме клеток, когда протяжен-
ность цитоплазмы очень большая. В цитоплазме таких клеток существуют значи-
тельные градиенты потенциала. Это характерно для клеток с длинными тонкими
отростками в виде волокон.
Поскольку пространственные градиенты потенциала в клетке с отростками
должны быть связаны с распространением его изменения по волокну, в качестве
основной геометрической модели можно использовать цилиндрический кабель
радиусом а (рис. 15.1). В такой модели цитоплазматический ток течет почти пол-
ностью вдоль оси цилиндра. Обозначим этот продольный ток в цитоплазме как /п и
ток, пересекающий мембрану, как zM.
Теперь определим относительное сопротивление этих двух путей в случае кабе-
ля, изображенного на рис. 15.1. Сопротивление продольному и поперечному то-
кам определяется через продольное и поперечное удельные сопротивления, гп и гм,
для единицы длины кабеля. Продольное удельное сопротивление равно частному
от деления рц на площадь поперечного сечения
Эта величина измеряется в Ом-см"1, и ее умножение на длину дает величину со-
противления току, текущему вдоль оси цилиндра, на определенном участке кабеля.
Поперечное удельное сопротивление равно рм, деленному на окружность мем-
браны
(15.2)
Мембрана
Рис. 15.1. Ток течет в продольном направ-
лении через цитоплазму и в поперечном
направлении через мембрану.
Цитоплазма
440
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Эта величина измеряется в Ом-см, и ее следует разделить на длину, чтобы вычис-
лить сопротивление сегмента кабеля току через мембрану. Каждая из этих величин
уменьшается с радиусом; гм ос \/а и гп ocl/д2. Таким образом, с увеличением а про-
дольное сопротивление падает быстрее, чем поперечное, и в результате потенциал
распространяется дальше в более толстом кабеле. Отношение гп/гм — это естест-
венная переменная для определения неоднородности потенциала. Величина дан-
ного отношения обычно мала, так что потенциал распространяется в направлении
вдоль оси на довольно большое расстояние.
Полезно также сравнить временную шкалу релаксации пространственного
градиента потенциала в цитоплазме со шкалой релаксации разности потенциалов
на мембране. Для каждого из этих процессов мы используем модель параллельного
соединения сопротивления и конденсатора, где напряжение падает экспоненци-
ально как е“'//?с (7?С — постоянная времени). Вначале рассмотрим единичный ку-
бический объем раствора. Две противоположные стороны этого куба можно счи-
тать конденсатором емкостью С = 8ВЛ//, где 8В — диэлектрическая проницаемость
воды, А — площадь и / — толщина. Если конденсатор заряжен, ток будет течь меж-
ду его плоскостями, встречая сопротивление, равное R = pJ/A. Произведение RC
представляет собой величину, независимую от параметров кубического элемента
объема, поскольку А и / сокращаются и остается произведение 8врц, называемое
максвелловской постоянной времени.1 Для типичной физиологической солености
порядок величины 8врц составляет 1 нс.
Для описания релаксации потенциала на мембране используем величину со-
противления мембраны R = рм/А и емкость С = смА, где см — специфическая
емкость мембраны. При вычислении RC= рмсм величина А вновь сокращается.
В случае типичной мембраны рмсм ~ 10 мс. Соответственно пространственные из-
менения потенциала в растворе релаксируют примерно в 107 раз быстрее, чем
падает потенциал на мембране. Эти динамические характеристики дополняют
приведенную выше оценку пространственного распространения сдвигов потен-
циала.
Приведенные количественные расчеты показывают, где следует искать про-
странственные изменения потенциала и где это не имеет смысла. Например, в слу-
чае типичной сферической клетки диаметром 25 мкм можно задаться вопросом,
1 Более строгое выведение максвелловской постоянной времени основано на преобразовании
уравнения Пуассона
d2r d2r d2r q
cbc2 dy2 dz2 £
Поскольку / =(l/p)(dr/cbc), первые производные по Иможно заменить на /хр, iyp или /гр, где /х, iy
и iz — плотности тока в направлении каждой производной потенциала. Тогда имеется диверген-
ция плотности тока, позволяющая определить общий заряд, текущий в элементе объема, минус
выходящий общий заряд. Эта величина должна быть эквивалентна скорости изменения плотно-
сти заряда в этом участке (консервация заряда), и можно заменить левую часть уравнения Пуас-
сона выражением p(d?/ dr)
dr e
Решение имеет вид? =?ое",/ре, где ?0 — начальное значение, и мы получаем, таким образом, мак-
свелловскую постоянную времени ра
15.2. Кабельное уравнение
441
что происходит, если на малом участке мембраны сконцентрирован пучок ионных
каналов. Одномоментное открывание всех этих каналов вызовет изменение потен-
циала в этом пятне, но изменение потенциала будет распространяться по сфериче-
ской клетке соответственно максвелловской постоянной времени, равной ~10 9 с.
Это намного большая скорость, чем скорости биологических процессов передачи
сигнала. В то же время в аксоне или дендрите длиной ~1 мм цитоплазма обуслов-
ливает высокое суммарное сопротивление и большая площадь мембраны — боль-
шую утечку тока. В этом случае потенциал будет изменяться лишь незначительно.
15.2. Кабельное уравнение
Чтобы перейти от качественной оценки, позволяющей определить порядок вели-
чин, к количественному анализу, требуется взять за основу более точное математи-
ческое выражение. В качестве такого выражения хорошо подходит кабельное урав-
нение. Рассмотрим кабель радиусом а, разделенный на бесконечно тонкие сечения
(рис. 15.2). Исходя из условия однородности свойств на коротких отрезках напря-
жение в одном сечении можно считать одинаковым.
Предположим, что напряжение вне кабеля везде равно нулю и что в кабеле оно
зависит только от расстояния по оси, представляя собой функцию И(х). Согласно
закону Ома, продольный ток через любое сечение равен напряжению, деленному
на сопротивление, которое вычисляется как гп (уравнение (15.1)), умноженное на
расстояние между сечениями, dx. Для двух сечений на рис. 15.2 уравнение тока
имеет вид
•/ V(x+dx)-V(x) -1 dK(x + ^-dx)
'"(x+W-——— Sx 115 3a)
(15 36,
k 2 7 rndx rn dx
Позиция для определения производной берется как половина расстояния между
двумя поверхностями, x+dx/2 и x-dx/2.
Рис. 15.2. Между двумя сечениями те-
чет продольный ток, /п(х), и поперек
клеточной мембраны течет мембран-
ный ток, /м(х). Одно сечение ограниче-
но координатами х - dx и х, соседнее
сечение — координатами х и х + dx.
442
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Поперечный ток через мембрану, покрывающую центральное сечение, также
вычисляется по закону Ома. Сопротивление в этом случае составит гм /6х (уравне-
ние (15.2)), и выражение для тока имеет вид
/м(х) = dxK(x)/rM (15.4)
Согласно закону Кирхгофа, результирующий ток через сечение с центром в точке х
должен вызывать изменение напряжения в точке х, пропорциональное емкости
мембраны. Величина результирующего тока вычисляется путем суммирования
вкладов продольного и поперечного токов на входе и на выходе из центральной
точки на рис. 15.2, согласно уравнению
/n(x-|dx)-/n(x + |dx)-/M(x) = dxcM.-^^, (15.5)
z z ст
где — это емкость той же площади мембраны, для которой сопротивление рав-
но гм (индекс м' необходим, поскольку см обозначает емкость единичной площадки
мембраны).
Теперь используем уравнения (15.3а), (15.36) и (15.4), чтобы заменить все вели-
чины токов в уравнении (15.5) и получить уравнение, в котором единственной пе-
ременной является напряжение
(15.6)
1 5K(x-ldx) ! aK(x + ±dx) йх . дУ(х)
----------±---+----------*-------У(х) = dx си—
r„ дх r„ дх rM dt
Разность производных можно преобразовать во вторую производную после деле-
ния на dx. Последующее умножение на гм позволяет получить выражение
дУ
dt
(15.7)
гм д2У
—^-y = fuc,
гп дх2
Уравнение (15.7) называют кабельным уравнением. Это дифференциальное
уравнение в частных производных, по математическим характеристикам сущест-
венно сходное с уравнением диффузии, приведенным в гл. 6. Кабельное уравнение
показывает, как начальный пространственный сдвиг напряжения изменяется во
времени. При данных начальных условиях И(х, 0) и граничных условиях на концах
кабеля решение кабельного уравнения позволяет получить значение И(х, г), т. е.
распределение напряжения в любой последующий момент времени. Кабельное
уравнение имеет долгую историю, начало которой восходит ко времени начала
применения телефонной связи на дальние расстояния с помощью электрических
кабелей. В биофизику оно было введено Ходжкином и Раштоном (Hodgkin,
Rushton, 1946) и с тех пор служит исходным уравнением при анализе широкого
круга электрических процессов в клеточной физиологии (Rail, 1977; Jack et al.,
1983).
Если заменить переменные Т = 1/(гмсм>) и X = х/^гм/гп, кабельное уравнение
преобразуется в более компактную форму
д2У J7 дУ
дХ2 дТ
(15.8)
15.2. Кабельное уравнение
443
В таком виде кабельное уравнение не содержит постоянных, поскольку они вклю-
чены в переменные.
Это преобразование указывает на важность величин гмсм, и ^гм/гп , опреде-
ляющих основные единицы времени и длины. Величина
(15.9)
представляет собой постоянную времени для мембраны, указанную в конце предыду-
щего раздела. Поскольку сопротивление и емкость пропорциональны площади
противоположным друг другу образом, размеры мембраны сокращаются и остает-
ся постоянная времени тм в единицах времени.
Величина
Х = (15.10)
имеет размерность длины и называется кабельной постоянной длины или простран-
ственной постоянной. Переменные тм и X — это основные единицы в кабельном
уравнении, и при анализе данных часто требуется брать за основу эти меры длины
и времени.
Отметим, что X — это корень квадратный того важного отношения удельных
сопротивлений, которое было введено при качественном анализе распростране-
ния сдвига напряжения в предыдущем разделе. Чтобы понять, что означает X, и по-
лучить более точное количественное представление о расстоянии, на которое рас-
пространяется сдвиг напряжения, рассмотрим уравнение (15.8) для стационарного
случая, приняв dV/dT = 0
d2V
— = V (15.11)
дХ1
Если кабель бесконечный и приняты условия V = Ко при X = 0 и V = 0 при X = оо
(граничные условия), решение уравнения в отношении X имеет вид
V = yQe~x =voe~x/x (15.12)
Таким образом, величина X несет явный физический смысл как отрезок длины, на
котором напряжение изменяется в е раз. Поэтому она и названа постоянной дли-
ны. Это естественная единица расстояния, которую удобно использовать при ана-
лизе пространственных изменений потенциала в клетках.
Уравнение (15.10) показывает, что X возрастает с увеличением гм и снижается
с уменьшением гп. Зависимости распространения потенциала от данных парамет-
ров интуитивно ясны, если исходить из уравнения (15.1), которое описывает раз-
деление тока между двумя направлениями — поперек мембраны и вдоль волокна
через цитоплазму.
Поскольку гм и гп зависят от радиуса, X также зависит от радиуса. Это становит-
ся очевидным, если с использованием уравнений (15.1) и (15.2) выразить X в урав-
нении (15.10) через более общие величины
х = S
ррц
(15.13)
444
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Таблица 15.1. Параметры кабеля
Аксон кальмара1 Аксон омара2 Нейрон гиппокампа3
см,мкФсм"2 рм, Ом • см2 рц,Ом • см 0,9 1,3 0,9 7600 2300 14 000 61 60 300
1 Hodgkin et al., 1952.
2 Hodgkin, Rushton, 1946.
3 Genter et al., 2000; Meyer et al., 1997.
Факт зависимости X от a иллюстрирует еще один момент, отмеченный в предыду-
щем разделе на качественном уровне, а именно то, что потенциал распространяет-
ся дальше в более широком кабеле.
Кабельное уравнение включает несколько ключевых электрических парамет-
ров, влияющих на распространение потенциала в клетках. Это удельные сопротив-
ления, рм и рц, а также специфическая емкость мембраны, см (для единичной пло-
щадки; см' — для единицы длины кабеля). Некоторые экспериментально установ-
ленные значения данных параметров приведены в табл. 15.1.
Величина см довольно незначительно варьирует между различными клетками и
очень близка к значению, рассчитываемому по формуле с =г/1 при диэлектриче-
ской проницаемости е ~5 и толщине мембраны / ~ 50 А. Значение р внеклеточной
жидкости равно просто удельному сопротивлению в общем объеме. При более
точном анализе изменений потенциала вне клеток учитывают эту величину, но ее
влияние обычно незначительно. Отметим, что рц трудно измерить. Примерно это
удельное сопротивление в два или три раза превышает величину р изотонического
раствора, что отражает более высокую вязкость цитоплазмы и большое количество
зарядов, присутствующих в ней на слабоподвижных макромолекулах. Величина рм
для невозбужденной мембраны различается у разных клеток. Если клетку подверг-
нуть стимуляции химическим агентом или напряжением, происходит открывание
ионных каналов, что приводит к изменению рм более чем в 100 раз. На этом осно-
вано активное распространение электрических сигналов (см. гл. 16).
15.3. Стационарное состояние
в случае кабеля конечной длины
Кабельное уравнение для стационарных условий описывает постоянные градиен-
ты потенциала в клетке. Электрические сигналы часто носят очень быстрый и ди-
намичный характер, и для их описания условия стационарного состояния не впол-
не применимы. Однако решение уравнения для стационарных условий получить
гораздо легче, и когда длительность изменений потенциала существенно больше
постоянной времени мембраны, тм, эти решения весьма полезны.
Общее решение кабельного уравнения для стационарных условий имеет сле-
дующий вид
V = Аех +Btx
(15.14)
15.3. Стационарное состояние в случае кабеля конечной длины
445
Частное решение находят путем наложения граничных условий, определяющих
постоянные интегрирования А и В. Один из примеров — это бесконечный кабель
(уравнение (15.12)). Решение уравнения для такого случая легко найти; при этом
не требуется учитывать граничные условия. Рассмотрим далее кабель длиной L.
Через электрод, расположенный на одном из концов кабеля, в точке X = 0, подает-
ся напряжение Ио. Другой конец кабеля, точка X = £, открыт, и соответственно на-
пряжение здесь равно нулю (поглощающие граничное условия; см. разд. 6.2.4).
Граничное условие для точки X = 0 выражается как И(0) = Ио. Отсюда следует
А+В = У0 (15.15)
В соответствии с другим граничным условием, И(£) = 0, получаем выражение
Ae~L+BeL=0 (15.16)
Решения уравнений (15.15) и (15.16) в отношении А и В имеют вид
-Ке2£
А = -^Г
1-е2£
и
В- у°
-Иое£
е“л - ел
(15.17а)
(15.176)
Иое^
e-i -е£
Второе выражение в каждом из них получено путем умножения на e-i/e Под-
ставляя эти выражения в уравнение (15.14), получаем частное решение
(15.18)
(15.19)
И = х + -^—ге% = z _/ (е£~% ~е'
е-е е-е е-е
При использовании гиперболических синусоидальных функций это выражение
упрощается следующим образом
у _у sinh(A-X)
° sinh(£)
Читатель может проверить, что полученное выражение является решением уравне-
ния (15.14) и удовлетворяет наложенным граничным условиям.
Если кабель в точке X = L герметически закрыт, граничное условие должно
быть другое. В этом случае продольный ток отсутствует, т. е. /п = -(1/гп )(дУ/дх) =
= -(1/кгп)(дУ/дХ) = 0 (см. уравнения (15.3а) и (15.36). Таким образом, вместо того
чтобы приравнивать нулю уравнение (15.14), как мы делали в случае открытого
конца кабеля, здесь мы приравниваем нулю его производную (отражающая грани-
ца; см. разд. 6.2.4))
-Ae~L+BeL=0 (15.20)
Объединяя это уравнение с уравнением (15.15) для нахождения А и В, получаем
cosh(Z - X)
cosh(Z)
Графики, соответствующие уравнениям (15.19) и (15.21)), представлены на
рис. 15.3 вместе с графиком уравнения для бесконечного кабеля (уравнение
у = У°
eL + е"£
L-X
(15.21)
446
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Рис. 15.3. Графики решений кабельного уравнения для стационарных условий при открытом
конце кабеля (уравнение (15.19)), закрытом конце (уравнение (15.21)) и бесконечном кабеле
(уравнение (15.12)). Графики построены для L = 1. Пунктирная линия нанесена, чтобы показать,
что график для условия открытого конца не линейный.
(15.12)). Эти уравнения показывают, как изменяется решение кабельного уравне-
ния в зависимости от граничных условий. Ниже мы рассмотрим данную зави-
симость при анализе динамического поведения кабельного уравнения в разд. 15.4
и 15.5.
Случай с закрытым концом наиболее информативен в качестве модели клеточ-
ных процессов. Как видно из рис. 15.3, если L = 1, напряжение в конце процесса
составляет примерно 65% Ио. Величину L полезно знать, поскольку она позволяет
оценить неравномерность напряжения.
15.4. Ступенчатые сдвиги напряжения
в кабеле конечной длины
Приняв за основу уравнение для стационарного состояния, рассмотрим случай,
когда напряжение изменяется во времени. При этом необходимо использовать
полное дифференциальное уравнение в частных производных (уравнение (15.8)).
С помощью метода разделения переменных (см. разд. 6.2.4, прим.) получаем общее
решение
V(X, Т) = (A sin(aX) + ficos(aX))e’(l+a2)7' (15.22)
Это решение можно проверить прямой подстановкой в уравнение (15.8). Единст-
венное различие между данным выражением и общим решением уравнения диф-
фузии (уравнение (16.6)) состоит в том, что показатель степени содержит 1 +а2
вместо а2. Обычно от этого общего решения переходят к частному решению тем же
способом, какой используется в случае уравнения диффузии (см. гл. 6), т. е. опре-
деляют граничные условия на концах кабеля и для этих условий находят а. Как
правило, это дает бесконечное число решений и их нумеруют с помощью индекса
как а,. Получаемое бесконечное число синусоидальных и косинусоидальных
15.4. Ступенчатые сдвиги напряжения в кабеле конечной длины
447
функций объединяют в виде суммы Фурье, удовлетворяющей данному начальному
условию
И(У,0) = £(4 sin(a,А^) + В, cos(a/-Ar)) (15.23)
I
(Отметим, что е"(1+а2)Г =1 при Т = 0.) Величины 4 и Вх можно определить путем
применения к начальному условию преобразования Фурье (см. приложение 3).
Зная эти величины, получаем решение
V(X, Т) = £(Д sin(a,X) + В, cos(a,X)e'(l+a?)r) (15.24)
/
Различные значения az соответствуют различным частотам пространственного
изменения начального распределения напряжения. Тот характер изменения, кото-
рый показывает а, и в пространственной, и во временной частях уравнения, озна-
чает, что пространственные характеристики с более высокими частотами (измене-
ния на более коротких расстояниях) быстрее затухают во времени. Аналогичным
свойством характеризуется диффузия.
Теперь решим уравнение зависимости от времени для кабеля длиной L с нане-
сением напряжения в точке X = 0 для поддержания И(0,Т) = 0. На другом, закрытом
конце, при X = £, производная по Xдолжна быть равна нулю. Применяя вначале
условие при X =0 и дифференцируя уравнение (15.24), получаем
£(4a, cos(az£) - Да, sin(az£))e”^1+a^r= 0 (15.25)
/
Поскольку это выражение справедливо для всех Т, оно применимо для каждого
члена
4a, cos(az£)-Да, sin(azZ) =0 (15.26)
Теперь применим граничное условие И(0,Т) = 0 в уравнении (15.24). Путем ис-
пользования sin(0) = 0 и cos(O) = 1 получаем
^д.е-(|+а?)г=0 (15.27)
/•
Это выражение также справедливо для всех Т, т. е. применимо к каждому члену.
В результате все Д равны нулю. В итоге уравнение (15.26) преобразуется в краткую
форму
4a, cos(az£) = 0 (15.28)
Это уравнение определяет набор значений а. Одно из них, равное нулю, обо-
значим а0 =0. Однако это значение ничего не вносит в решение, поскольку
sin(0) = 0 и BQ =0. Другие значения az, получаемые из данного уравнения, равны
л/2, Зл/2, 5л/2 и т. д. Общее выражение имеет вид
а,=(2/-1)^-, (15.29)
где i — положительное целое число. Соответственно экспоненты в решении имеют
ВИД е-(1+«2/-1)<к/2Д»2)7-
448
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Важно, что данные граничные условия позволяют определить величины а,.
Определенные таким образом экспоненциальные функции можно объединять
различными способами в соответствии с различными начальными условиями.
Постоянные времени ответа на ступенчатый сдвиг напряжения служат важным
источником информации о клетке независимо от начальных условий. При / = 1 и
i = 2 в уравнении (15.29) выражения для постоянных времени в случае двух наибо-
лее «медленных» экспоненциальных функций имеют вид
Т Тм Тм
1 1+а2 1 + (л/2Л)2
И
м _ _______________м______
2 " 1+а2 ’ 1+(Зл/2Л)2’
(15.30)
(15.31)
где вновь появляется тм, поскольку единицы переведены обратно в реальное вре-
мя, t= тмТ. Решим эти два уравнения в отношении L
л 19т2~^1
2 V Ti -т2
(15.32)
Таким образом, L вычисляется из постоянных времени, определенных на основе
экспериментальных данных, и затем рассчитывается тм, либо по Т|, либо по т2, из
уравнений (15.30) и (15.31).
Постоянные времени составляют важную часть данного выражения, но, чтобы
получить окончательное решение, необходимо ввести начальное условие для нахо-
ждения А,. При X =0 величина Ибыла принята равной нулю, но при условии, что
напряжение подается при Т = 0. Ранее Т = 0 подача напряжения происходила при
другом напряжении, которое мы обозначим Ио. Примем, что предыдущее напряже-
ние держалось достаточно долго, чтобы установилось стационарное состояние.
В этом случае И(Л) непосредственно перед сдвигом задается уравнением (15.21).
Комбинация синусоидальных функций, сумма которых определяет данную част-
ную функцию, можно найти с помощью преобразования Фурье
4 =-----2----f
Lcosh(L)'
4л(2/-1)
4£2+(2/-1)2л2
(15.33)
Отсюда мы можем получить начальное условие как сумму синусоидальных функций
cosh(Z-y) 4л(2/-1) . (... „тьП
=---'----- / —5—1Г sin (2z -1)-
cosh(Z) f^4L2 +(21-1)2л2 С 2L)
(15.34)
Поскольку данная сумма синусоидальных функций удовлетворяет начальному ус-
ловию, сумма экспоненциальных функций
V(X,T) = И0У—,4я(2< .sin|(2<-^---|e-('+((2;-|)"/2£)2)r
^4£2+(21-1)2л2 I 2L )
(15.35)
удовлетворяет и начальному условию, и кабельному уравнению, представляя со-
бой таким образом полное решение. Каждый член в уравнении (15.35) имеет фор-
му общего решения (уравнение (15.22)).
15.5. Ступенчатые сдвиги тока в кабеле конечной длины
449
Рис. 15.4. Графики урав-
нения (15.36) как функ-
ции Т (слева) для L = 2
и указанных величин X.
Обратите внимание, что
V возрастает с разными
скоростями до стацио-
нарных значений (спра-
ва), определяемых урав-
нением (15.21). График
справа подобен графи-
кам, приведенным на
рис. 15.3, но здесь он по-
строен для L = 2.
Из этого решения очевидно, что, если мы используем другой путь и изменим
потенциал при Г = 0 от 0 до Ио, решение будет иметь вид
И(Х,Т) = Ио cosh(£-%) _кУ—4л(2<-1) sinj<(2f-l)7tA'\_(i+((2,_|)„/2£)2)r
cosh(Z) ^4£2+(2/-1)2л2 I 2L )
При Т = 0 сумма не содержит члена cosh(£-%)/cosh(£), соответствующего ста-
ционарным условиям, когда напряжение везде равно нулю. С убыванием экспо-
ненциальных функций эти члены в данной сумме постепенно исчезают и выраже-
ние сводится к условию конечного стационарного состояния.
На рис. 15.4 представлены графики уравнения (15.36) при L-2 и Т= 0,1,
Т = 0,5 и Т- 2. Они показывают, как изменяется потенциал в различных позициях
при ступенчатом сдвиге напряжения в точке Х= 0. В позициях, ближайших к точке
нанесения сдвига напряжения, изменения потенциала наибольшие и происходят
с наибольшей скоростью. Это иллюстрирует на общем уровне, как сдвиг напряже-
ния изменяется в кабеле при пассивном распространении.
15.5. Ступенчатые сдвиги тока в кабеле конечной длины
Математическое решение кабельного уравнения весьма интересным образом свя-
зано с экспериментальным методом, применяемым для записи электрических сиг-
налов. Эта связь будет проиллюстрирована на примере измерений в режиме фик-
сации тока при их сравнении с описанными в предыдущем разделе измерениями
в режиме фиксации напряжения. В случае фиксации напряжения наносят его
сдвиг в определенной точке и измеряют ток. При фиксации тока производят сдвиг
тока, но измеряют напряжение. Эти экспериментальные условия математически
выражаются как граничные условия. Сдвиг напряжения до значения Ио в точке
Х= 0 соответствует граничному условию И(0) = Ио. Сдвиг тока до значения 70 в точ-
ке Х= 0 определяет производную напряжения в этой точке. Производя упрощение
для /0 = 0, получаем
(15.37)
450
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Производная общего решения (уравнение (15.22)) представляет собой сумму си-
нусоидальных и косинусоидальных членов. Поскольку cos(O) = 1, все значения Д., ко-
торые становятся коэффициентами косинусоидальных членов после взятия произ-
водной, должны быть равны нулю. Соответственно математическое решение этой за-
дачи должно состоять полностью из членов в форме Д cos(a/Ar)e"^1+a'^. Сравните это
выражение с уравнением для напряжения, рассмотренным в предыдущем разделе, где
коэффициенты Вбыли равны нулю и остались члены в форме Д sin(a,X)e^+ai^T.
Производная для закрытого конца при X = L равна нулю. При этом условии
выражение для оставшихся членов в форме В, имеет вид
аД sin(a/Z) = 0 (15.38)
Поскольку синусоидальная функция равна нулю при 0, л, 2 л, Зл и т. д., получаем
уравнение
а,=р (15.39)
где iравно нулю или положительному целому числу (ср. уравнение (15.29)). Экспо-
ненциальные функции в этом случае имеют форму е_(1+(/я/£)2)г, где постоянные
времени равны
Наиболее «медленная» постоянная времени — это просто тм при / =0. Напротив,
наиболее медленная постоянная времени при фиксации напряжения (уравнение
(15.30)) всегда ниже тм.
Приведенный теоретический расчет предполагает простой эксперименталь-
ный способ определения тм: принимать за нее постоянную времени наиболее мед-
ленного компонента ответа на сдвиг тока. Однако этот путь может привести
к ошибкам в случае наиболее реалистичных моделей нейронов (см. разд. 15.7).
Различия между уравнениями для случая фиксации напряжения и случая фик-
сации тока можно обобщить следующим образом. В случае фиксации И= 0 коси-
нусоидальные члены удаляются и оставшиеся синусоидальные члены определяют
а, как полуцелые кратные л/А, не включая нуль. В случае фиксации 1= 0 удаляют-
ся синусоидальные члены и оставшиеся косинусоидальные функции определяют
а, как целые кратные л/L, включая нуль.
15.6. Ответвления и модели эквивалентных цилиндров
Кабельная теория очевидным образом применима к аксонам и мышечным волок-
нам, поскольку они имеют форму кабеля, но можно ли распространить эту теорию
на клетки другой формы? Многие нейроны имеют сильно разветвленные дендри-
ты (рис. 15.5). Их строение, казалось бы, не дает никакой надежды на возможность
математического моделирования. Однако в 1959 г. У. Ролл (W. Rail) ввел характери-
стики разветвленных дендритов, при которых сложное дендритное дерево можно
15.6. Ответвления и модели эквивалентных цилиндров
451
рассматривать как единую систему цилиндров. Эти характеристики заключаются
в следующих условиях ветвления: 1) при ответвлении радиус родительского сег-
мента, ар, и радиусы дочерних ветвей, ав1 и яв2, связаны соотношением
fl3/2 3/23/2
“р ~ в! + “в2
(15.41)
(это соотношение называют правилом показателя степени 3/2); 2) все ветви закан-
чиваются при одной и той же электротонической длине, так что для двух ветвей
41 =42 (15.42)
Каждое значение L выражается в единицах его собственной постоянной длины, у в|
или ув2. Работа Ролла дала надежду, что цилиндр соответствующих размеров может
служить моделью для описания пассивного распространения сдвига потенциала
в сложноразветвленном дендрите. Идея представления дендритов в виде системы
Рис. 15.5. А. Нервная клетка-зерно из
мозговой извилины крысы (рисунок лю-
безно предоставлен д-ром Helen Scharf-
man). Б. Промежуточный нейрон из ла-
терального коленчатого ядра крысы (ри-
сунок любезно предоставлен д-ром Dan
Uhlrich).
452
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
цилиндров оказала важное влияние на развитие электрофизиологических исследо-
ваний нейронов.
15.6.1. Стационарное состояние
Используем вначале решение кабельного уравнения для стационарных условий,
чтобы продемонстрировать, каким образом при условиях ветвления, принятых
Роллом, сопротивление дендрита эквивалентно сопротивлению цилиндра. Вход-
ное сопротивление кабеля длиной L с закрытым концом равно частному от деле-
ния потенциала наложенного в точке % = 0, на общий мембранный (попереч-
ный) ток. Ток проходит через мембрану по всей длине кабеля. В каждой точке он
равен K(x)d(x)/rM, и выражение для общего тока через мембрану представляет со-
бой интеграл
1 л L
I = — J V(x)dx = — J V(X)dx
гм о Гм о
Этот интеграл вначале был выражен в членах х, поскольку гм выражается в Ом • см,
и после этого переведен в единицы L. Подставляя V(X) из уравнения (15.21), полу-
чаем
(15.43)
/ = I C?s-^ X)dX (15.44)
ru Jo cosh(Z)
Интеграл cosh(£ - X) равен -sinh(£ -X) (см. приложение 5), и соответственно со-
противление Rl равно
1^ = ^cosh(L) =---г„--- j5 45)
I Xsinh(Z) Xtanh(L)
Используя зависимость X от радиуса кабеля, а, с помощью уравнений (15.2)
и (15.13) получаем
RL =------------Д— = ----VPuPm (15.46)
27ratanh(£) Na рм >/27rtanh(Z)V
Теперь рассмотрим разветвленный цилиндр (рис. 15.6). Согласно уравнению
(15.46), сопротивление каждой ветви равно
а-3/2
ЯВ| = -7=—в| ^Рирм
v27rtanh(ZB1)
Rb2 = К чл/РцРм
>/2л tanh(ZB2)
(15.47а)
(15.476)
Эти два сопротивления параллельные, и их общее сопротивление равно
1 _ VРиРм ________________1_______________
(1/ЯВ|) + (1/Я.2> тсл/2 ^tanh(LB1)a’f + tanh(Z.B2)aB3f ?
(15.48)
15.6. Ответвления и модели эквивалентных цилиндров
453
Рис. 15.6. Разветвленный кабель с родитель-
ским сегментом радиусом ар и ветвями с радиу-
сами ав1 и ов2 и длиной /_в1 и /_В2.
Теперь, применив условия Ролла, упростим это уравнение
а-3/2
= i / г \ VРцРм
V2 к tanh(£B)
(15.49)
Данное выражение идентично уравнению (15.46).
Таким образом, данные две ветви ведут себя как продолжение родительского
сегмента. В таком случае сопротивление полной структуры, изображенной на
рис. 15.6, должно составлять (задача 4)
(15.50)
д-З/2
R =--------------JpupM /2
ntanh(£p + £B)VHuH f
Родительский сегмент с двумя ветвями имеет такое же сопротивление, как один
цилиндрический сегмент длиной £р +£в. Этот расчет показывает, что решение
уравнения для стационарных условий в случае системы с ветвлением будет таким
же, как решение для эквивалентного неразветвленного цилиндра, если сегменты
подчиняются двум условиям ветвления, принятым Роллом.
15.6.2. Постоянные времени
Временной ход распространения напряжения в кабеле с ответвлениями также
сводится к выражению для эквивалентного цилиндра при ролловских услови-
ях ветвления. Убедимся в этом путем выведения уравнений для постоянных вре-
мени.
В каждом сегменте напряжение равно сумме членов в форме
Vp(XpJ) = (/lpsin(a(Lp -%p))+jSpCos(a(Ap -Ур)))е-(|+а2)г (15.51а)
K,l(X,l,T) = (Alsin(a(£„ -%Bl)) + 5Blcos(a(LB1 -%„,))) e~<l+a2>r (15.516)
Ив2(А'в2>7’) = (Л2 sin(a(ZB2 - %в2)) +ВЛ cos(a(LB2 - (15.51 в)
Данные выражения отличаются от уравнения (15.22) заменой %на L - X. Это удов-
летворяет уравнению (15.8) и удобно для настоящего анализа.
Концы ветвей закрыты, так что граничные условия при ЛВ1 = LB| и %в2 = £в2 оп-
ределяют производную по X как равную нулю. Члены /4acos(a(£ - X)) (произвол-
454
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
ные синусоидальных членов) не могут быть нулевыми при X = £, поскольку
cos(O) = 1 и ЛВ1 и Лв2 должны равняться нулю.
Точка ветвления, где %р = £р и ХВ1 = Хв2 =0, характеризуется двумя дополни-
тельными условиями. Значения всех трех функций напряжения в этой точке долж-
ны быть равны: Ир(£р, Т) = ^(0, Т) = ^2(0, Т). Таким образом, Ир(£р) равно просто
дре"(|+а )г5 поскольку cos(O) = 1, sin(0) = 0 и ЛВ1 и Лв2 равны нулю, согласно условиям
для концов ветвей. После сокращения коэффициентов, зависимых от времени
и одинаковых во всех уравнениях, равенство значений напряжения в точке ветвле-
ния выражается следующим образом
Вр = ЯВ1 cos(a£B1) = Въ2 cos(a£B2) (15.52)
Имеется также условие для тока в точке ветвления. Ток, выходящий из роди-
тельского сегмента, равен сумме токов, входящих в ветви. Каждый ток выражается
пространственной производной, деленной на продольное удельное сопротивление
(из уравнения (15.1))
7tap2 <ЭИр _ nal дИв| , лд22 ЭГв2 (15 53)
puXp дХр рцХв| 5УВ| рцХв2 агв2
Постоянные длины присутствуют в этом выражении в связи с тем, что необходимы
единицы с размерностью см, совместимые с единицами, используемыми для рц.
Если принять, что рц и рм одни и те же для всех сегментов, множители при всех
производных сокращаются, кроме а3/2
дЗ/2 дУр 3/2 3/2 дИв2
р зхр Bl аув1 в2 аув2
(15.54)
Подставляя в это уравнение выражения для Ир, Ив, и Ии2 из уравнений (15.51а)—
(15.51в), получаем
-ар3/24 = а’(2Вв1 sin(aLBl) + д’2/25в2 sin(aLu2)
(15.55)
Последнее условие закрытого конца при Хр =0 означает, что производная
уравнения (15.51а) равна нулю
a(^pcos(a£p)-Z?psin(a£p)) =0 (15.56)
Теперь с использованием уравнений (15.52), (15.55) и (15.56) можно найти а.
Из уравнения (15.52) Вв1 и Вв2 выражаются как Z?p/cos(a£B1) и Z?p/cos(aiB2) соответ-
ственно. Из уравнения (15.56) Ар выражается как Вр sin(a£B1 )/cos(a£p). Производя
эти подстановки в уравнение (15.55), получаем равенство
3/2 sin(aZp) з/2 д sin(aZBl) 3/2 sin(a£B2)
р cos(aZp) в р cos(a£B1) р cos(a£B2)
(15.57)
которое можно упростить до выражения
ap/2 tan(a£p) + tan(a£B1) + ав2/2 tan(aZB2) = 0 (15.58)
Данное уравнение в принципе можно решить в отношении а, но для произ-
вольных величин а и L получаемые выражения весьма сложны. Это преодолимо
15.7. Кабельный анализ нейрона
455
с помощью ролловских правил ветвления. Во-первых, используя уравнение
(15.42), £В1 = Ав2 = Ав, получаем
йр/2 tan(aAp) + (a3'2 + a32/2)tan(aLB) = 0 (15.59)
Далее, если соблюдается правило показателя степени 3/2, справедливо равенство
tan(a£p) + tan(a£B) = О * (15.60)
Наконец, определение тригонометрического значения тангенса суммы
* z tan(a) + tan(P) Z1C,14
tan(a + В) =--—-----— (15.61)
1 - tan(a) tan(P)
показывает, что уравнение (15.60) должно иметь те же корни, что tg(aip +aiB),
и можно записать
tan(a(£p + £в)) = 0 (15.62)
Соответственно а определяется как целые кратные я/(£р + Ав), подобно уравнению
(15.39). Таким образом, временной ход распространения импульса в разветвлен-
ном кабеле должен характеризоваться теми же постоянными времени, что и в од-
ном цилиндре длиной £р + £в.
Проведенный анализ можно распространить на очень сложную дендритную
структуру. Следуя обратно от концов, можно заменить каждую пару ветвей эквива-
лентным сегментом и в итоге свести весь дендрит к одному эквивалентному ци-
линдру. Как продемонстрировано Роллом (Rail, 1959; 1977), все характеристики
динамического ответа полностью воспроизводятся такой моделью.
Разумеется, этот математический подход вызывает вопрос, действительно ли
дендриты соответствуют правилам ветвления, принятым Роллом. На основании
результатов подробного изучения морфологии нейронов, таких как приведенный
на рис. 15.5, можно заключить, что при огромном разнообразии строения этих
клеток общие правила ветвления выявить невозможно. Так, для двух типов релей-
ных нейронов в латеральном коленчатом ядре можно предполагать, что роллов-
ские правила имеют место (Bloomfield et al., 1987). В то же время в мотонейронах
дендриты утоньшаются по мере ветвления и сумма а3/2 меньше, чем у родитель-
ского сегмента (Barrett, Crill, 1974; Clements, Redman, 1989). Это указывает, что та-
кой дендрит следует моделировать как цилиндр, который сужается по мере удале-
ния от тела клетки.
Способы проверки адекватности модели цилиндра приведены в конце следую-
щего раздела. Если ролловские правила ветвления нарушаются или неизвестно,
применимы ли они, можно использовать данные о морфологии клетки для созда-
ния компартмент-модели и поиска решения путем компьютерного моделирования
пассивного распространения сдвига напряжения (см. разд. 15.9).
15.7. Кабельный анализ нейрона
Если дендритное дерево нейрона условно рассматривать как разветвленный ци-
линдр, для его анализа применима модель, представленная на рис. 15.7. Простая
456
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
-----Электрод
Тело клетки
Длина дендрита = L
Рис. 15.7. Модель Ролла описывает тело
нейрона с дендритом, представляемым
в виде эквивалентного цилиндра. Сопро-
тивление и емкость тела клетки (нейрона)
обозначены как Ятк и Стк. Усилитель пода-
ет напряжение Vc через локальный элек-
трод, имеющий сопротивление /?э.
структура ветвления нейрона, как на рис. 15.5, Л, вполне позволяет использовать
эту модель. Тело клетки принимается за сферу и дендрит за цилиндр. Аксон на-
столько тонкий, что его можно не принимать в рассмотрение. Такая физическая
схема нейрона известна как модель Ролла (Roll, 1969). Здесь мы используем модель
Ролла в конфигурации «регистрация от целой клетки» с локальным электродом
(Jackson, 1992). Сдвиг напряжения подается от усилителя через кончик пипетки-
электрода внутрь клетки в точке, обозначенной на рис. 15.7 как Vc.
Прежде чем анализировать эту модель полностью, необходимо кратко описать,
как она характеризуется без дендрита (Marty, Neher, 1995). Если сопротивление
тела клетки, R1K, очень велико по сравнению с сопротивлением электрода, Аэ,
единственный значимый ток течет через электрод, и, согласно закону Ома, его ве-
личина составляет (Ис - Ио )/Яэ. Этот ток заряжает емкость тела клетки, Стк, и Ио из-
меняется со скоростью, определяемой током и емкостью
Ис-И0_^ dP0
R3 тк dt
(15.63)
Член И0/7^к исключен, так как составляет очень большую величину. Согласно
этому уравнению, отклик на сдвиг напряжения будет описываться одной экспо-
нентой с постоянной времени, равной ЯЭСТК.
Теперь добавим в модель дендрит. Дендрит обеспечивает выход тока из тела
клетки через кабель, и в уравнение (15.63) следует включить член, отражающий
этот продольный ток. Величина данного тока равна производной напряжения на
входе в цилиндр, деленной на продольное удельное сопротивление, гп. Включив
этот член в левую часть уравнения (15.63), получаем
ис-и0 . 1 аИр_^
R3 гп дх тк dt
(15.64)
Чтобы использовать кабельное уравнение, необходимо перейти к единицам X и Т
следующим образом
15.7. Кабельный анализ нейрона
457
ис-и0 । i аи0 = (и 65)
R3 Vn дХ RlK dT
Величина 7^к появилась в связи с тем, что после того как t было заменено тмТ, ве-
личина Стк сокращается, если взять тм - R^C^- При X = L имеется обычное усло-
вие закрытого конца
дУ
^ = 0 (15.66)
дХ
Как и в случае отклика на ступенчатый сдвиг напряжения в кабеле конечной
длины, общее решение, уравнение (15.22)), входит в каждое из граничных условий.
Во-первых, используем уравнение (15.65), примем Vc =0, сократим экспоненци-
альный множитель, присутствующий в каждом члене, и, принимая sin(0) = 0 и
cos(O) = 1, получим выражение
-А + ^ = _Д(1+а2) (15.67)
Хгп
Это выражение можно преобразовать следующим образом
— = (15.68)
В а 1^3 ЯгК J
Во-вторых, включая уравнение (15.22) в другое граничное условие (уравнение
(15.66)), запишем выражение
,4cos(aL)-Z?sin(aZ) =0, (15.69)
которое можно преобразовать следующим образом
л
— = tan(a£) (15.70)
В
Теперь от А и В можно избавиться, приравняв уравнения (15.68) и (15.70), чтобы
получить выражение для a
tan(aZ) = —
l + a2>
у
(15.71)
Значения а, вычисляемые из этого уравнения, определяют экспоненциальные по-
стоянные времени, аналогично тому как уравнения (15.28) и (15.38) определяют a
для других условий.
Хотя уравнение (15.71) трансцедентальное и не имеет аналитического реше-
ния, его поведение можно определить с помощью преобразования
^atan(aA)-^ + l + a2 =0 (15.72)
Хгп R3
График левой части этого уравнения в зависимости от а изображен на рис. 15.8,
чтобы показать корни.
458
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Рис. 15.8. График зависимо-
сти левой части уравнения
(15.72) от а. Здесь Я/А/п = 2,
Ятк/Яэ = 200 и L=1. Пунктир-
ные вертикальные линии со-
ответствуют полуцелым крат-
ным л.
Как видно из рис. 15.8, уравнению (15.72) удовлетворяют значения а, очень
близкие к л/2, Зтс/2 и т. д. Такие корни объясняются тем, что тангенциальная
функция стремится к бесконечности при полуцелых кратных л. Поскольку отно-
шение Ятк /Яэ составляет большую величину, тангенциальная часть уравнения так-
же должна быть очень большой величиной, чтобы ее можно было сократить. При
низких значениях а корни определяются соотношением между этими двумя члена-
ми. Важно отметить, что эти корни аналогичны тем, которые определяются в слу-
чае кабеля конечной длины без тела клетки (уравнение (15.29)).Таким образом, для
расчета L и тм могут быть использованы уравнения (15.30)—(15.32).
Важное значение имеет то, что при высоких значения а может быть найдено
решение уравнения, которое не зависит от специфики тангенциальной функции.
В этой точке график уравнения пересекает ось х при а2 ~ Ятк /R3, поскольку Ятк /7?э
составляет величину порядка 100. Это означает, что одна из экспоненциальных
функций будет содержать постоянную времени, задаваемую выражением
р
х~хи-^- = С7КЯэ, (15.73)
которое идентично для постоянной времени одной экспоненциальной функции,
полученной при решении уравнения (15.63). Таким образом, это значение а карди-
нально отличается от других, отражая зарядку тела клетки. Другие экспоненциаль-
ные постоянные времени отражают зарядку дендрита. На записях, получаемых
при регистрации от нейронов методом локальной фиксации («пэтч-кламп»), за-
рядка тела клетки довольно заметна и ее легко отличить от более медленных со-
ставляющих, которые отражают зарядку дендрита. Несмотря на присутствие денд-
рита, данный компонент позволяет измерить емкость тела клетки, Стк.
Пример такой экспериментальной записи эпизода пассивной зарядки в нейро-
не при ступенчатом сдвиге напряжения приведен на рис. 15.9. Ток выражается
суммой трех экспонент, и значения т, и т2 используются для определения L и тм
с помощью уравнений (15.30)—(15.32).
По характеристикам временной зарядки можно также оценить адекватность
модели цилиндра. Например, согласно уравнению (15.32), если т, > 9т 2, величина
L становится мнимой. В цилиндре невозможен сдвиг с такой динамикой зарядки,
15.7. Кабельный анализ нейрона
459
Рис. 15.9. Пассивный временный ток,
вызываемый ступенчатым сдвигом на-
пряжения на 10 мВ в процессирую-
щей клетке (нервная клетка-зерно из
мозговой извилины крысы, показан-
ная на рис. 15.5, А). Уравнение вре-
менного тока путем подгонки получе-
но в виде суммы трех экспонент:
/(f)=3,24e’,/o,13 + 1,41e’,/o'7+1,O9e"'/4,8.
Пунктирными кривыми показаны две
«медленные» компоненты.
т. е. в данном случае модель цилиндра неприменима к дендриту. На основании это-
го можно было бы довольно легко отвергнуть модель Ролла. Однако противопо-
ложный диапазон дает иные характеристики. Сдвиг при т, <9т2 позволяет рас-
считать L и тм, хотя это и не доказывает, что для процесса зарядки дендрита адек-
ватна модель цилиндра.
Если ответ на ступенчатый сдвиг напряжения выражается уравнением с тремя
или большим числом экспонент, величины L и тм отлично определяются и можно
оценить соответствие процесса модели эквивалентного цилиндра. После расчета L
и тм из двух наиболее «медленных» постоянных времени для распространения
сдвига напряжения (уравнения (15.30)—(15.32)), проверяются амплитуды и посто-
янные времени других компонент. Разработаны также дополнительные критерии
соответствия модели цилиндра (Jackson, 1992; 1993а), и при удовлетворении не-
скольким теоретическим предсказаниям вероятность адекватности данной модели
повышается. Однако следует подчеркнуть, что анализ временной зарядки нейрона
необходимо дополнять детальной реконструкцией морфологии нейрона, а это не-
возможно из-за недостатка данных. Довольно часто модель Ролла не соответствует
экспериментальным данным, т. е. во многих случаях модель цилиндра непримени-
ма. Для их анализа необходимо использовать более сложные аналитические мето-
ды (Major et al., 1993) и компьютерное моделирование (см. разд. 15.9).
Важно тем не менее, что во многих отношениях характеристики распростране-
ния сдвига напряжения в нейроне сходны с соответствующими характеристиками
модели цилиндра (разд. 15.4). Более медленные компоненты имеют одни и те же
постоянные времени, и уравнения (15.30)—(15.32) позволяют количественно оп-
ределить L и тм. Менее благоприятна ситуация для анализа результатов измерений
в режиме фиксации тока в нейроне. В этом случае постоянные времени определя-
ются по формуле (задача 9; Roll, 1969)
aL cot(aZ) = -
^тк
Яд tanh(A)’
(15.74)
где Ад — сопротивление дендрита. Данное уравнение не имеет простых решений,
поскольку его правая часть не может быть ни очень малой, ни очень большой ве-
460
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
личиной (задача 10). В зависимости от соотношения R^JR^ значения а и соот-
ветственно постоянные времени могут варьировать между двумя экстремумами
уравнений (15.29) и (15.39). Это делает весьма сомнительным определение наибо-
лее медленной постоянной времени из экспериментальных данных как тм (см.
разд. 15.5). Необходимо использовать дополнительные теоретические уравнения
для определения соотношения сопротивлений тела клетки и дендрита и с их по-
мощью определять соответствующие корни уравнения (15.74) (Rail, 1969; Jack,
Redman, 1971).
Фиксация напряжения служит более подходящим методом для кабельного
анализа по сравнению с фиксацией тока. Уравнения (15.30)—(15.32) позволяют
точно определить L и тм из данных о распространении напряжения. Несмотря на
это, измерения в режиме фиксации напряжения редко используются для анализа
кабельных свойств нейронов. Работа Ролла 1969 г. ясно показала преимущества из-
мерений в режиме фиксации напряжения. Однако в то время этот метод был со-
пряжен с большими техническими трудностями. Тогда для фиксации напряжения
требовалось ввести в клетку два микроэлектрода, что крайне трудно. Доступные
в тот период микроэлектроды обладали высоким сопротивлением, так что даже
с одним электродом клетка и электрод были последовательными сопротивления-
ми. При этом поддерживаемое напряжение делилось таким образом, что трудно
было регистрировать напряжение от клетки. Ток удавалось регистрировать легче,
поскольку при двух последовательных сопротивлениях через них проходил один
и тот же ток. По этим причинам в экспериментах для исследования кабельных
свойств нейронов применяли фиксацию тока. Много позже, в 1990 гг. электрофи-
зиологи разработали метод применения локальных электродов для регистрации от
нейронов в тонких срезах мозга. С помощью этих электродов (< 10 МОм) можно
легко осуществлять фиксацию напряжения, но исследователи, долгое время при-
менявшие для кабельного анализа измерения в режиме фиксации тока, не могут
быстро отказаться от привычной методики.
15.8. Интегративные свойства дендритов:
аналитические модели
Нейроны сообщаются между собой через морфологически специализированные
контакты — синапсы. Формировать синапс способна практически любая часть
нейрона, но обычно он осуществляется между окончанием аксона и дендритом.
Под действием нейромедиатора, высвобождаемого пресинаптическим нервным
окончанием, открываются ионные каналы и возникает ток через небольшой уча-
сток постсинаптической мембраны дендрита. Эффект, вызванный этим током,
можно измерить в отдаленном участке нейрона с помощью электрода, введенного
в тело клетки. Математическое описание того, как изменение потенциала, возник-
шее в участке синапса, распространяется по остальной части клетки, получено
в рамках кабельной теории (Rail, 1967; Rail et al., 1967; Jack, Redman, 1971). Пол-
ный анализ этого процесса с использованием модели Ролла весьма сложен, однако
качественные характеристики проведения электрического сигнала можно опреде-
лить с использованием более простой модели в виде цилиндрического сегмента
с двумя закрытыми концами (рис. 15.10).
15.8. Интегративные свойства дендритов: аналитические модели
461
Рис. 15.10. Синапс на цилиндрическом дендрите. Ось X пока-
зывает расстояние вдоль дендритного кабеля. Регистрирую-
щий электрод находится у одного конца при X = Z. Синапс на-
кодится при X = Y. Электротоническая длина дендрита равна L.
15.8.1. Ответ на стимул
В этом разделе мы проведем анализ для условия, что синаптический потенциал
возникает как мгновенный импульс напряжения, имеющий форму дельта-
функции. Полученные результаты будут ниже распространены на более реали-
стичные характеристики синаптического входа. Отправной точкой для описания
ответа на стимул может служить анализ, приведенный в разд. 15.5. При двух за-
крытых концах а, определяется из уравнения (15.39) как полуцелые кратные л/£;
все коэффициенты при синусоидальных членах, Ah равны нулю. Чтобы определить
коэффициенты при косинусоидальных членах, Bh мы должны определить началь-
ное условие. Если синаптический вход рассматривать как мгновенный импульс,
начальное напряжение при Т = 0 можно описать дельта-функцией
И(ХО) = 50§(АГ-Г), (15.75)
где Y— это точка входа, показанная на рис. 15.10, и 50 — входящий при синаптиче-
ском стимуле заряд, деленный на емкость постсинаптической мембраны в точке Y.
Теперь необходимо использовать интеграл Фурье, чтобы найти Bj для выведе-
ния дельта-функции из косинусоидальных членов
в, = ^2|5(%-r)cosf—(15.76)
Дельта-функция представляет собой одну из функций, к которым наиболее легко
применить преобразование Фурье. Поскольку она имеет высокое значение при
X = Y и равна нулю при всех прочих условиях, интеграл позволяет определить зна-
чение косинусоидальной функции при X = Y
В.
250 Г/лП
—-cos ---
A L L )
(15.77)
Несколько иное выражение для В^ оно представляет собой уравнение (15.76), де-
ленное на 2, с учетом условия / = 0 (уравнение П3.2)
В0=^ф(%-Г)<1%=^
ь о L
(15.78)
Теперь подставим полученные выражения в уравнение (15.24) для полного решения
V(X,0) = +2^cos^^^cos^^^e'(l+<''"/i)!)r
(15.79)
Графики этого уравнения представлены на рис. 15.11 для кабеля длиной L = 2,
при X, соответствующем точке регистрации (Z = 0,01 для отведения от левого кон-
ца, как показано на рис. 15.10) и разных точках нанесения стимула (значения Y).
462
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Рис. 15.11. Графики уравне-
ния (15.79) (при суммирова-
нии по 2000 членам) для
L = 2 и синаптических входов
на указанных расстояниях от
точки регистрации (см.
рис. 15.10).
Время (тм)
Эти графики показывают, как изменяется очень кратковременный сигнал при его
распространении.
Представленные на рис. 15.11 графики демонстрируют ряд важных характери-
стик пассивного распространения сдвигов напряжения. В случае проксимального
входа (вблизи точки регистрации) регистрируемый сигнал возрастает почти мгно-
венно и затем затухает, вначале быстро и далее с меньшей скоростью. При дисталь-
ном входе (отдаленном от точки регистрации) регистрируемый сигнал возрастает
после задержки и медленно затухает с той же постоянной времени, какой характе-
ризуется медленная фаза затухания в случае проксимального входа. Фактически
при всем разнообразии распространяющихся сигналов на конечной стадии затуха-
ния они характеризуются одной и той же постоянной времени, эквивалентной тм.
Это соответствует ао = О. Данный факт отражает то, что, согласно уравнению
(15.79), все ответы описываются суммой одного и того же набора экспоненциаль-
ных функций.
Другая важная характеристика распространения сигналов, выявляемая на
представленных графиках (рис. 15.11), состоит в том, что максимумы ответов
сильно уменьшаются с увеличением расстояния между местом входа стимула
и точкой регистрации. Крайним случаем здесь является вход и регистрация в од-
ной и той же точке. Начальное напряжение при этом будет теоретически бесконеч-
но большим, но это искусственный результат, связанный с применением при ана-
лизе дельта-функции. Мы кратко это рассмотрим, но здесь важно отметить, что
максимумы снижаются от 0,86 до 0,33, до 0,18 и до 0,16 при Y = 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 со-
ответственно. Данное уменьшение гораздо больше, чем прогнозируемое для рас-
твора при соответствующих стационарных условиях (уравнение (15.21)). В случае
раствора данные величины составляют 0,62; 0,41; 0,3 и 0,27, т. е. уменьшение про-
исходит в 2,3 раза, а не в 5 раз, как при ответе на импульс. Это иллюстрирует общее
положение кабельной теории. Временные сигналы не распространяются так дале-
ко, как стационарные сигналы. Данное свойство нейронов объясняется тем, что
емкость мембраны действует в качестве низкопропускного фильтра, удаляя быст-
рые колебания напряжения.
15.8. Интегративные свойства дендритов: аналитические модели
463
15.8.2. Реальные синаптические входы
\ответ на импульс иллюстрирует некоторые важные качественные характеристики
интеграции синаптических входных сигналов дендритом нейрона, но не позволяет
непосредственно установить реальный временной ход проведения синаптического
сигнала. Рассмотрим вход с некой временной зависимостью поступления импуль-
сов. Эту временную функцию можно использовать взамен параметра 50 в уравне-
нии (15.75). Поскольку время здесь означает временной ход стимуляции, мы обо-
значим его другим символом, 5, и функцию обозначим (p(S).
Если записать уравнение (15.79) как функцию Иимп(%, Г), ответ на определен-
ную часть стимуляции в момент времени S выражается как (р(5)Иимп(Х, T-S),
Выражение для полного ответа будет тогда представлять собой интеграл этого
произведения по диапазону от 0 до Т
V(X, Т) = jИимп (%, Т - 5)<p(5)d5 (15.80)
о
Такой интеграл называют интегралом свертки; он появляется при анализе многих
задач в физике. Здесь мы выражаем синаптический ответ как свертывание ответа
на импульс и временную функцию синаптического входа.
Решим полученный интеграл (уравнение (15.80)), используя функцию
ф(5)=о25е-°5 (15.81)
В этой форме функция (р(£) возрастает, имеет максимум при S = 1/о и затем спадает
экспоненциально. Она хорошо описывает действительный временной ход прове-
дения сигнала при реальном синапсе (Finkel, Redman, 1983). Множитель о2 нор-
мирует площадь, так что временной ход может быть растянут или сжат без количе-
ственного изменения входящего заряда.
Подставляя уравнения (15.81) и (15.79) вместе в уравнение (15.80), мы получа-
ем выражение для ответа на альфа-функцию синаптического входа
2 T
И(Х,П = ^/е
L о
Перепишем это выражение следующим образом
1 ( т
И(Л',7’) = — е~г|5е
L I о
+ 2У| cos| — |cos|— \-^!L)2\T-S} |5e-a^d5
ta I L J I L J J
(15.82)
cos
>d5 +
f5e(l+(in/£)2-a)5d5
(15.83)
4 У 4 У 0 т 7
Здесь необходимо решить два интеграла, оба в форме j5ec5d5 = ^-(1 + есГ(с7’-1)),
что дает о
2/ -Т оо (-jyA Лтг1 УЛ p_(1 + (in/L)2)7’
И(Х, Г) = — г(1 + (Г(1 -о) - 1)е(| -а)Г)+2У cos — cos — х
L (Jl-o)2 V 7 £ I L ) I L J(l+(i7t/L)2-o)2
ircY
— -a
L J
e(l+(in/L)2-a)r
(15.84)
464
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
0,5 1,0 1,5
Рис. 15.12. А. Ответы на корот-
кий вход (о = 5) при Z = 0,01 в ка-
беле длиной L = 2 при входах в
указанных позициях. Суммирова-
ние в уравнении (15.84) включало
100 членов. Пунктирная кривая
показывает вход (<p(S)) в уравне-
нии (15.81)). Б. То же, что в части
А, но при о = 0,2.
2,0 2,5 3,0
Время
Графики этой функции представлены на рис. 15.12 для тех же значений К, что
и графики на рис. 15.11. На рис. 15.12, А отражен случай быстро изменяющегося
входа, соответствующего о = 5. Поскольку Твыражается в единицах тм, это означа-
ет, что максимум синаптического входа имеет место при тм/5. Другой вариант
(рис. 15.12, Б) — это медленно изменяющийся вход, соответствующий о =0,2
и имеющий максимум при 5тм.
Ответы на кратковременный вход (рис. 15.12, А) по качественной тенденции
сравнимы с ответами, изображенными на рис. 15.11. Ответ на вход, более удален-
ный отточки регистрации, меньше по амплитуде и более длительный. Данный эф-
фект не столь резко выражен, как при ответе, изображенном на рис. 15.11, по-
скольку здесь импульс короче и более чувствителен к действию кабеля как фильтра
высокочастотных колебаний. Важно, что в обоих случаях при Y > 1 (сигнал и ко-
роткий вход как функция (р(^)) ответы сходны. Это означает, что эксперименталь-
ные данные регистрации дистального синаптического потенциала содержат очень
мало информации о действительном временном ходе ответа на кратковременный
синаптический вход. Кабель отфильтровывает эту информацию. Имеет значение
15.9. КОМПАРТМЕНТ-МОДЕЛИ И КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
465
также и то, что форма ответа на рис. 15.12, А не изменяется существенно по мере
приближения Yк L. Это затрудняет определение участка входа, когда он располо-
жен близко к дистальному концу дендрита (Jack, Redman, 1971).
\ Сигнал от медленного входа, в противоположность быстрому входу, как пока-
зывает рис. 15.12, Б, не искажается настолько сильно кабелем. Амплитуды ответов
уменьшаются, и примерно они соответствуют шкале для стационарных условий
(уравнение (15.21)). Такие входы характеризуются достаточно большой длительно-
стью для того, чтобы напряжение достигало стационарного уровня.
Графики, подобные представленным на рис. 15.11 и 15.12, А, используются для
характеристики того, как форма ответа зависит от локализации синаптического
входа. Путем сравнения записей синаптических изменений напряжения с этими
теоретическими графиками можно оценить расстояние между участком синапса
и точкой регистрации (Rail et al., 1967; Jack, Redman, 1971). Когда после такого
анализа место синапса определяли анатомически, наблюдалось хорошее соответ-
ствие результатов расчетов реальным величинам (Redman, Walmsley, 1983).
Интересный экспериментальный подход к определению локализации входа со-
стоит в наложении ступенчатых сдвигов напряжения на тело клетки и активации
синаптического входа в разное время после ступенчатого сдвига напряжения. Ам-
плитуду синаптического ответа определяют в зависимости от этого интервала вре-
мени. Проксимальный вход быстро отражается на этой величине, определяемой но-
вым напряжением, тогда как влияние дистального входа проявляется не так быстро
(Hestrin et al., 1990). Этот метод позволил определить узколокальные всплески внут-
риклеточной концентрации Са24, индуцированные синаптическим входом. С его
помощью можно определить локализацию входа более точно, чем это позволяет ка-
бельный анализ. Работ, основанных на объединении кабельного анализа и результа-
тов локализации Са2+-всплескрв этим методом, пока проведено мало, хотя такой
путь весьма перспективен для изучения интегративных свойств дендритов.
15.9. Компартмент-модели и кабельная теория
Большинство аналитических результатов кабельной теории относится к модели
эквивалентного цилиндра. Для распространения кабельного анализа на геометри-
чески более сложные формы, характерные для нервных клеток, необходим общий
подход, независимый от того математического аппарата, который удобен при ана-
лизе цилиндрического аналога. Наиболее полезным общим подходом такого рода
служит компьютерный анализ, с помощью которого задачи решаются численным
способом для любых форм объектов (Segev et al., 1989).
Напомним, что в основе кабельного уравнения лежит условие деления цилин-
дра на сечения (рис. 15.2), и это отражают уравнения, описывающие изменения
тока и напряжения при распространении по кабелю. Кабельное уравнение пред-
ставляет собой предел при бесконечно большом числе бесконечно тонких сече-
ний. В этом разделе для выработки более общего подхода рассмотрим по аналогии
сечения клетки. Однако вместо того чтобы брать предел при бесконечно большом
числе бесконечно тонких сечений, попытаемся найти подходящий отрезок, на ко-
тором напряжение можно считать существенно однородным. Напомним, что
в разд. 15.1 на основании качественных оценок мы установили, что потенциал
внутри клетки изменяется только на довольно больших отрезках. Это означает, что
466
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
для получения полезной модели нет необходимости брать экстремальный предел.
Можно рассмотреть компартменты, достаточно малые для того, чтобы считать по-
тенциал в них примерно одинаковым, но не настолько малые, чтобы их было
слишком много для компьютерного анализа.
Рассмотрим нейрон как структуру, включающую тело клетки и дендрит, и раз-
делим ее на компартменты (рис. 15.13). В качестве приблизительного и пробного
подхода рассчитаем локально постоянную длины и примем длину компартмента
много меньшей, например равную менее 5% постоянной длины. Потенциал будет
варьировать внутри такого сечения примерно в е"0,05 = 0,95 раз, т. е. его изменение
будет составлять только 5%.
На рис. 15.13 обозначены сопротивления и емкости как элементы цепи для ка-
ждого компартмента. Границы нанесены произвольно, причем не имеет значения,
как они изображены, если сечения настолько малые, что потенциал в них пример-
но одинаковый. Мембрана, покрывающая каждый компартмент, имеет собствен-
ную емкость, пропорциональную площади поверхности, и собственное сопротив-
ление, обратно пропорциональное площади поверхности. Эти параметры можно
рассчитать с использованием характеризующих мембрану единиц рм и см . Между
компартментами показано сопротивление цитоплазмы. Площадь поперечного
среза на границе двух компартментов используется для расчета сопротивления
контакта из величины рц.
Потенциал в каждом компартменте должен изменяться в результате зарядки
емкости покрывающей его мембраны при прохождении тока через сопротивления
в данном компартменте. Запишем основное уравнение цепи для каждого компар-
тмента. Компартмент 1 — это тело клетки с сопротивлением мембраны Ам1. Его по-
тенциал Kj изменяется при зарядке емкости мембраны, С1? током, проходящим че-
рез мембрану, и продольным током
СЩ = %
& ^м! ^п!-2
Первый член в правой части этого уравнения отражает поперечный ток через мем-
брану тела клетки, второй член — продольный ток через цитоплазму, соединяющую
этот компартмент с компартментом 2. Контакт описывается сопротивлением 7?п1 _2.
(15.85)
Рис. 15.13. Клетка, состоящая из тела (1), начального дендрита (2—4) и точки ветвления (5) с дву-
мя конусообразными сегментами (6, 7 и 8, 9). Каждый компартмент характеризуется собственными
сопротивлением и емкостью мембраны Соседние компартменты соединены сопротивлениями.
15.10. Интегративные свойства дендритов: анализ на основе компартмент-модели
467
(15.86)
Выражение для потенциала компартмента 2 имеет вид
\ с dp2 = V2 । V'~V2 V2~V\
I 7?m2 ^nl-2 ^n2-3
где сопротивления и емкости аналогичны приведенным в уравнении (15.85). Здесь
имеется два члена для продольного тока, один для тока между компартментами 1
и 2 и другой для тока между компартментами 2 и 3. Уравнения потенциала для
компартмента 4 должно включать три таких члена, поскольку он содержит ответв-
ление. Для участка на конце ветви уравнение должно включать только один член
для продольного тока.
Каждый компартмент описывается собственной формой уравнений (15.85)
и (15.86). Полное описание клетки с N-числом компартментов содержит, следова-
тельно, N таких уравнений. Они образуют систему связных линейных уравнений
в первых производных, точно той же формы, что и система, рассмотренная при
анализе кинетики множественных состояний (гл. 9). Здесь полностью применим
матричный метод, использованный для решения подобных кинетических задач
(Perkel et al., 1981), но на практике к поиску аналитических решений прибегают
редко, пользуясь вместо этого компьютером для интегрирования системы уравне-
ний численным способом и вычисляя как функцию времени для всех компарт-
ментов.
В нейробиологии разработаны эффективные программы компьютерного моде-
лирования, основанные на компартмент-моделях. Для использования этих про-
грамм требуются подробные сведения о форме клеток. При установлении системы
компартментов используют микрофотографии клеток (рис. 15.5), в некоторых слу-
чаях тысячи таких микрофотографий. С учетом площади мембраны каждого ком-
партмента и площади его поперечного сечения рассчитывают параметры, такие
как С„ Ям/ и Rni /+1. Для каждого определенного параметра систему уравнений ин-
тегрируют и затем с высокой точностью моделируют пассивное распространение
сдвига напряжения. При анализе таких моделей обычно в точных пределах варьи-
руют схему компарментации, чтобы удостовериться, что компартменты достаточ-
но малы, чтобы потенциал в каждом можно было считать однородным. Например,
делят каждый компартмент пополам, удваивая число компартментов; компьютер-
ное время, необходимое для интегрирования, при этом, безусловно, возрастает, но
благодаря такой проверке, если выявляется то же поведение, результаты для пер-
воначальной схемы компартментации можно считать достоверными.
15.10. Интегративные свойства дендритов:
анализ на основе компартмент-модели
Чтобы проиллюстрировать метод компартмент-моделирования, рассмотрим его
применение к интеграции синаптических стимулов в дендритах (см. разд. 15.8) на
примере пирамидной клетки гиппокампа (рис. 15.14, А). Поскольку дендриты этих
клеток сильно разветвлены, модель цилиндра, вероятно, не может дать в данном
случае эквивалентного описания передачи сигналов. Кроме того, мы не знаем точ-
но, как сдвиги потенциала распространяются из одной ветви дендрита в другие
ветви. Анализ модели цилиндра не позволяет прояснить этот вопрос.
468
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Рис. 15.14. А. Изображение пирамидной клетки гиппокампа с пятью участками (а—д) в качестве
синаптических входов (нейрон п 170 из http:Wneuron.duke/edu). Б. Рассчитанные с помощью ком-
пьютера ответы в теле нейрона на синаптические входы в указанных участках (см. А).
Как видно из рис. 15.14, Б, потенциал в теле клетки зависит от влияния синап-
тических входов, локализованных в различных участках дендритов. Механизмы
этого влияния проанализированы с помощью компьютерной программы
NEURON (Hines, Carnevale, 1997) в рамках компартмент-модели для клетки, пока-
занной на рис. 15.14, А. Данная модель включает примерно 200 компартментов,
соединенных в соответствии с простыми правилами, изложенными в разд. 15.9.
Программа интегрирует соответствующие -200 уравнений для условий, когда про-
водимость одного из компартментов изменяют, моделируя синапс в различных
указанных участках (функция входа описывается уравнением (15.81) при о = 5).
Аналогично тому, что показано на рис. 15.11 и 15.12, А, здесь в случае более
дистально расположенных входов синаптические потенциалы вызывают в теле
клетки ответные изменения меньшей амплитуды и более растянутые во времени
(рис. 15.14). В области затухания ответов все кривые сходятся в одну и ту же «мед-
ленную» экспоненту. Подобно этому пассивное распространение сдвига потен-
циала описывается суммой одних и тех же экспоненциальных функций, различно
взвешенных в соответствии с условиями каждого варианта моделирования сигна-
ла. Модель эквивалентного цилиндра улавливает эти качественные эффекты, но
различия между влиянием проксимальных и дистальных синаптических входов
в этих реальных нейронах выражены в гораздо большей степени. Стимулы от дис-
тальных синаптических входов затухают до уровня, при котором они уже почти не
влияют на потенциал в теле клетки. Это означает, что многие дистальные синапти-
ческие входы должны активироваться одновременно, чтобы генерировать значи-
мый ответ. В пирамидных клетках гиппокампа улавливание стимулов от дисталь-
ных участков обеспечивается тем, что в них имеется большая плотность рецепто-
ров, благодаря которой возбуждающие синапсы в этих участках вызывают большие
токи (Magee, Cook, 2000).
Компартмент-модель можно использовать также для иллюстрации несколько
более интересных характеристик проведения синаптических сигналов. Прежде
15.10. Интегративные свойства дендритов: анализ на основе компартмент-модели 469
\ всего, хотя при распространении к телу клетки сигналы от дендритов затухают
и задерживаются, локальный ответ в участке синапса намного больше и возникает
довольно быстро (рис. 15.15, А). При синапсе происходит незначительная деполя-
ризация мембраны в соседнем сегменте дендрита. Поскольку дендрит очень тонкий,
емкость этого участка мембраны мала. Ток, входящий в клетку в участке синапса,
может, таким образом, оказывать сильный эффект на данную малую емкость. Ко-
гда этот ток распространяется по дендриту, большая площадь поверхности много-
численных ветвей действует как сито, поглощая большую часть заряда, входящего
в клетку при местных изменениях потенциала. В результате этой значительной
утечки лишь небольшая часть заряда достигает тела клетки.
Интересно также выяснить, как синаптические входы влияют на другие облас-
ти дендрита. Кривые изменения потенциала, приведенные на рис. 15.15, Б, пока-
зывают, что синаптический вход в одном участке вызывает деполяризацию другого
участка мембраны с той же амплитудой и динамикой, которые наблюдаются, когда
эквивалентный синаптический вход в этом другом участке деполяризует первый
участок. Фактически это общее правило обратимости, которое можно доказать ма-
тематически для любой пары участков в структуре произвольно разветвленных ци-
линдров (Major et al., 1993).
От локализации синаптического входа на дендритной структуре существенно
зависит функционирование нейрона в нейронной сети. В результате интеграции
Рис. 15.15. А. Синаптический вход
в точке в (рис. 15.14, А) деполяризу-
ет этот участок гораздо быстрее и в
гораздо большей степени, чем тело
нейрона. Обратите внимание, что
кривая для тела нейрона — это кри-
вая в на рис. 15.14, Б. Б. Синаптиче-
ский вход в точке г дает ответ в точ-
ке б. Синаптический вход в точке б
дает ответ в точке г. Кривые специ-
ально несколько смещены друг от-
носительно друга, чтобы показать,
что они идентичны.
470
Глава 15. КАБЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
синаптических влияний нейроны действуют как весьма интересные и универсаль-
ные электрические устройства. Разнообразные по морфологии клетки в различных
областях мозга выполняют свои специфические функции, на основе которых ней-
ронные сети обрабатывают информацию различными путями. Эффекты этих раз-
нообразных функций в огромной степени усиливаются за счет присутствия в денд-
ритах потенциал-активируемых ионных каналов (Stuart et al., 2000). Благодаря это-
му распространение всех, кроме наиболее слабых, сигналов происходит активным
путем, рассмотрение которого выходит за рамки модели пассивного распростране-
ния электрических сигналов (см. разд. 16.11).
Задачи
1. Продемонстрируйте, что преобразование V - Ue~T переводит кабельное уравнение
в безразмерную форму уравнения диффузии.
2. Определите сопротивление полубесконечного кабеля и кабеля конечной длины
9 открытым концом при X = L, а также с закрытым концом при X = L.
3. Решите кабельное уравнение для стационарных условий и конечного отрезка дли-
ны при V = Ио и X = 0. Конец при X = L заканчивается сопротивлением Якон (под-
сказка: граничное условие при X = L определяется как l/rnX(dK/d%) = (И/7?кон)).
Рассчитайте сопротивление через параметры А, /?кон, рцирми а.
4. В предыдущей задаче поместите цилиндр с закрытым концом длиной £в того же
диаметра к концу сегмента длиной LA (L из предыдущей задачи). Продемонстри-
руйте, что общее сопротивление равно сопротивлению цилиндра конечной длины
длиной £А + Ав с закрытым концом.
5. Решите кабельное уравнение для кабеля, продолжающегося в ±оо, при V(X,0)=6(X)
в качестве- начального условия.
6. Продемонстрируйте, что две ветви, удовлетворяющие ролловским условиям ветв-
ления для эквивалентного цилиндра, имеют ту же площадь поверхности (не вклю-
чая концы), что эквивалентный цилиндр.
7. Определите постоянные времени для кабеля с открытым концом при X = L в слу-
чае фиксации тока.
8. Определите постоянные времени для разветвленной структуры, изображенной на
рис. 15.6, при фиксации напряжения в точке %р = 0 и с учетом ролловских условий
ветвления. Для этого следует повторить анализ, приведенный в разд. 15.6.2, при
Ир(0) = 0 вместо условия закрытого конца.
9. Выведите уравнение (15.74).
10. Постройте график уравнения (15.74), чтобы определить корни, приравнивая пра-
вую часть 0,2; 1, и 5. Сравните два наименьших корня, показываемых этим графи-
ком в случае целых и полуцелых кратных л.
11. Вычислите L и тм из постоянных времени, указанных в подписи к рис. 15.9. Согла-
суется ли т3 с этим результатом? На что указывают эти значения в отношении дос-
товерности модели эквивалентного цилиндра для обработки данных регистрации
от этой клетки?
Глава 16
Потенциал действия
Клетки многих типов, включая нейроны, мышечные волокна и клетки эндокрин-
ных желез, обладают способностью генерировать электрические импульсы в ответ
на возбуждение. Эти импульсы, называемые потенциалами действия, представля-
ют собой биологический механизм преобразования информации и выполняют
важную роль в регуляции клеточных функций. Потенциалы действия возникают
благодаря особому сочетанию характеристик клеточной мембраны. Они зависят от
селективной проницаемости ионных каналов (см. гл. 14) и потенциал-индуциро-
ванных изменений конформации мембранных белков (см. гл. 1). В отличие от пас-
сивных затухающих процессов, описанных в гл. 15, потенциалы действия — это
волнообразные события, распространяющиеся на большие расстояния. В этой
главе, с использованием многих идей, содержащихся в предыдущих главах, рас-
сматриваются количественные характеристики потенциалов действия как основ-
ной формы биоэлектрической сигнализации.
16.1. Потенциал действия
Потенциал действия резко отличается от рассмотренного в предыдущей главе пас-
сивного процесса распространения электрических сигналов. Основной механизм
потенциала действия наиболее ясно можно изложить на примере небольшой сфе-
рической клетки без внутренних градиентов потенциала. При таком упрощении не
рассматривается процесс распространения (о нем пойдет речь в последующих раз-
делах).
Вначале рассмотрим пассивный ответ клетки, мембрана которой содержит
только каналы, генерирующие потенциал покоя Ип = ~-70 мВ (см. разд. 13.3). Эти
каналы всегда открыты, и ответ клетки на стимулирующий ток, введенный через
электрод, описывается дифференциальным уравнением
НИ
с^ = /стим+(Ип-ю/я, (16.1)
где С — емкость клетки, /стим — ток, введенный через электрод, и R — сопротивле-
ние, принимаемое здесь за постоянную величину. Член (Vn - V)/R отражает ток че-
рез каналы, устанавливающий потенциал покоя. Это линейное выражение немно-
го проще, чем уравнение Гольдмана—Ходжкина—Катца для ионного тока (уравне-
ние (13.45)) или уравнение, выведенное на основе теории скоростей реакций
(уравнение (13.62)). Такое представление вполне соответствует цели данного раз-
дела, состоящей в том, чтобы сравнить пассивный и активный ответы на стимул.
472
Глава 16. Потенциал действия
Решение уравнения (16.1) имеет вид
V = ип + /СТИМА(1 - е"'/лс) (16.2)
Заметьте, что V = Уп при t = 0 и конечное значение Уп = /стим R достигается соответ-
ственно снижению величины экспоненциального члена. График, отражающий
этот тип ответа, представлен на рис. 16.1, А. Как видно из рисунка, возрастание
стимулирующего тока приводит к сдвигу потенциала в направлении области поло-
жительных значений и вызывает тем самым деполяризацию мембраны. Конечный
стационарный потенциал возрастает линейно с увеличением тока, и постоянная
времени, RC, одна и та же для всех значений тока.
Электрически возбудимая клетка генерирует ответ, резко отличный от пассив-
но возникающего ответа, изображенного на рис. 16.1, А. Графики, отражающие ак-
тивные ответы, приведены на рис. 16.1, Б. При наименьшем стимулирующем токе
ответ примерно сходен с наименьшим пассивным ответом, приведенным на
рис. 16.1, А, но при увеличении стимулирующего тока ответ резко изменяется. Ко-
гда стимулирующий ток превышает определенную величину, называемую порогом,
потенциал круто возрастает до значения, близкого к значению потенциала Нерн-
ста для Na+ (~50 мВ), и затем снижается до более высокой отрицательной вели-
чины относительно исходной, после чего возвращается к значению потенциала
А "3°-
-40-
m -50-
§ . п -60- cs -80- —90 1 I ’ । । । 0 2 4 6 8 Время, мс Б 60- 40 - Г\ 2°- \\ \ ЧА со \ \ 1 -20- /\\ \ ь°- )] Л\\ -60- \\ \ -80- \ \ V -100-1 1 1 1 г 0 2 4 6 8 Время, мс 10 Рис. 16.1. А. Пассивные отклики мем- — бранного потенциала на ступенчатые ——сдвиги подаваемого тока возрастаю- —, j щей величины. Б. Активные отклики ю мембраны на ступенчатые сдвиги то- ка возрастающей величины.
16.1. Потенциал действия
473
покоя. Этот короткий импульс потенциала, специфически характерный для возбу-
димых клеток, получил название потенциал действия. Часто потенциалы действия
в соответствии с характерной формой их записи называют просто спайками (от
англ, spike, зубец) или зубцами.
Потенциалы действия нельзя объяснить статической проводимостью мембра-
ны, подобной той, которая обусловливает потенциал покоя. На качественном
уровне потенциал действия можно объяснить как результат регуляции состояния
ионных каналов, приводящей к изменению потенциала в одну и другую стороны
между потенциалами Нернста для К+ и Na+ (Ек и £Na). Вспомним из содержания
гл. 13, что потенциал покоя мембраны нейрона составляет отрицательную величи-
ну, немного превышающую Ек, в соответствии с тем, что проницаемость мембра-
ны для К+ намного выше ее проницаемости для всех остальных ионов. Величина
ENa равна примерно 50 мВ, и когда открыто достаточно много натриевых каналов,
чтобы проницаемость для Na могла доминировать, мембранный потенциал дости-
гает £№.
Потенциал действия инициируется открыванием потенциал-зависимых
№+-каналов. Оно происходит в ответ на сдвиг потенциала в сторону положитель-
ных значений, поскольку этот сдвиг вызывает конформационное изменение моле-
кулы каналообразующего белка (см. разд. 1.8). При потенциале покоя -70 мВ поч-
ти все Na'-каналы закрыты. Среднее значение потенциала для активации натрие-
вых каналов равно примерно -45 мВ, и, когда стимул вызывает подъем
мембранного потенциала, эти каналы открываются. В результате ионы Na+ входят
в клетку, и при достаточно большом числе открытых каналов поток ионов Na+
внутрь клетки превышает поток ионов К+ из клетки, вследствие чего мембранный
потенциал начинает сдвигаться к значению ENa. Как только эта тенденция возни-
кает, процесс приобретает регенеративный характер. Даже если стимулирующий
ток отключить, вход Na+ в клетку продолжается, потенциал возрастает в сторону
положительных значений и открывается большое число натриевых каналов. В ито-
ге потенциал достигает значения несколько ниже ENa, отражая новое состояние —
доминирование транспорта Na+ (рис. 16.2, А).
Этим транспортом Na+ через потенциал-зависимые натриевые каналы объяс-
няется фаза подъема потенциала действия. Если бы больше ничего не происходи-
ло, потенциал действия протекал бы как однонаправленный процесс. Однако при
изменении потенциала активируется еще два процесса, которые возникают вслед
за активацией натриевых каналов. Эти два процесса ограничивают длительность
поддержания потенциала на уровне ENa. Один из них — инактивация натриевых
каналов. Это отдельное потенциал-индуцируемое конформационное изменение
каналообразующего белка, приводящее к запиранию или закрыванию канала.
Другой процесс, противодействующий возрастанию потенциала, — активация до-
полнительных К+-каналов (не тех, которые генерировали потенциал покоя). Эти
два процесса вместе способствуют прекращению потенциала действия и вызывают
реполяризацию мембраны до значения потенциала, близкого к Ек. Открывание
дополнительных К+-каналов приводит к возрастанию соотношения проницаемо-
стей K+/Na+ до значения, намного более высокого, чем в состоянии покоя, когда
оно примерно равно 20 (см. разд. 13.5). Это вызывает снижение мембранного по-
тенциала до величины ниже потенциала покоя и его приближение к Ек. При воз-
вращении потенциала в область отрицательных значений потенциал-зависимые
474
Глава 16. Потенциал действия
Время, мс
Рис. 16.2. А. Потенциал действия, ана-
логичный показанному на рис. 16.1, Б,
но с указанием уровней, где он в фа-
зе подъема достигает En3 и в фазе
затухания снижается до Е&. Б. Линия
а — нормальный потенциал дейст-
вия; линия б — потенциал действия
в отсутствие потенциал-зависимых ка-
лиевых каналов; линия в — потенци-
ал действия в отсутствие инактива-
ции натриевых каналов; линия г —
потенциал действия в отсутствие ка-
лиевых каналов и инактивации на-
триевых каналов.
К+-каналы закрываются и в результате мембранный потенциал возвращается к по-
тенциалу покоя (рис. 16.2, А).
При потенциале действия происходит, таким образом, три отдельных
потенциал-зависимых изменения состояния каналообразующих белков: актива-
ция Na+-каналов, инактивация Na+-каналов и активация К+-каналов. Вклады этих
трех процессов в потенциал действия иллюстрирует рис. 16.2, Б. На нем показан
полный потенциал действия, как на рис. 16.2, А, а также расчетные изменения по-
тенциала в отсутствие инактивации №+-каналов, в отсутствие активации
К+-каналов и при активации №+-каналов как единственном изменении состояния
каналов.
Эти изменения проводимости мембраны будут подробно рассмотрены в сле-
дующем разделе, а здесь мы продолжим анализ на качественном уровне, чтобы оп-
ределить, каким образом эти мембранные механизмы могут обеспечивать распро-
странение потенциала действия по кабелю. Если ток вводится на одном конце ка-
беля, происходит деполяризация данного участка мембраны, возрастание
напряжения в нем выше порогового значения и инициация потенциала действия.
Одновременно с этим входящий через мембрану ток распространяется от места
возбуждения в продольном направлении, деполяризуя в результате соседний уча-
сток мембраны в достаточной степени, чтобы и в нем открылись №+-каналы
и возник потенциал действия. Таким образом потенциал действия может распро-
16.1. Потенциал действия
475
страняться по всему кабелю до его дальнего конца. Благодаря регенеративному ха-
рактеру процесса потенциал действия способен распространяться на неограничен-
ное расстояние.
Сравнение пассивного и активного проведения стимула в кабеле иллюстрирует
рис. 16.3. Пассивный ответ уменьшается с увеличением расстояния отточки нане-
сения стимула (подобно ответу, приведенному на рис. 15.4). При активном ответе
максимальная амплитуда наблюдается по всей длине кабеля. Форма кривой ответа
также одинаковая, однако на более далеком расстоянии от точки нанесения стиму-
ла ответ наблюдается после задержки, отражающей то время, которое необходимо
для распространения импульса от места нанесения. Как правило, потенциал дей-
ствия распространяется с постоянной скоростью.
Потенциал действия характеризуется рядом важных свойств. Основное его
свойство — это резкий порог стимула, необходимый для инициации, в соответст-
вии с которым потенциал действия подчиняется принципу «все или ничего». Поч-
ти невозможно вызвать потенциал действия половинной амплитуды. После того
как стимулирующий ток при своем возрастании превысит пороговый уровень,
максимальная амплитуда потенциала остается почти постоянной независимо от
силы стимула. Однако при снижении стимула ниже порогового уровня ответ ста-
новится низким и сходным с пассивным ответом, форма которого представлена на
рис. 16.1, Л и 16.3, А. Другое важное свойство потенциала действия — это наличие
рефрактерного периода, наступающего после прекращения потенциала действия.
В этот период надпороговый стимулирующий ток не может вызвать новый потен-
циал действия (см. разд. 16.4). Два потенциала действия, распространяющиеся на-
50 мВ
Рис. 16.3. Распространение напряжения в ка-
беле по пассивному (А) и активному (Б) меха-
низмам в ответ на стимуляцию (показана слева
на схематическом изображении волокна). Мо-
делирование проводилось для кабеля длиной
2 мм и диаметром 2 мкм (схема на А вверху) при
включении в модель потенциал-зависимых ка-
налов, от которых зависит потенциал действия,
и в их отсутствие. Потенциал показан из отме-
ченных положений, разделенных расстоянием
300 мкм. Задержки максимумов на Б отражают
время, необходимое для распространения по-
тенциала действия до этих точек.
476
Глава 16. Потенциал действия
встречу друг другу от противоположных концов аксона, будут вследствие этого
рефрактерного периода сталкиваться и аннулировать один другой.
Потенциал действия полностью объясняется потенциал-зависимыми измене-
ниями состояния Na+- и К+-каналов. В последующих разделах будет дан подроб-
ный количественный анализ связи между потоками этих ионов и потенциалом
действия.
16.2. Фиксация напряжения и свойства
натриевых и калиевых каналов
Чтобы объяснить потенциал действия, необходимо исследовать Na+- и К+-каналы
и определить, как их активность меняется с изменением потенциала и во времени.
Это трудная экспериментальная задача, поскольку при сложной форме, характер-
ной для возбудимых клеток, трудно контролировать потенциал на мембране. Токи
через разные области мембраны в этом случае будут суммироваться, создавая запу-
танную смесь. Необходимо «запереть» потенциал всей клетки, чтобы измерения
тока отражали только распространяемое напряжение. Первые эксперименты
с фиксацией напряжения осуществили в 1949 г. К. Коул (К. S. Cole) и Дж. Мар-
монт (G. Marmont). Позднее А. Ходжкин (A. Hodgkin) и А. Хаксли (A. Huxley) ис-
пользовали этот метод в своей основополагающей работе (1952 г.), открывшей ос-
новные свойства Na+- и К+-каналов мембраны нейронов. Впоследствии они про-
демонстрировали, как активность этих каналов обеспечивает генерацию
потенциалов действия.
Объектом в экспериментах служил проходящий в мантии кальмара особо
крупный аксон, называемый гигантским аксоном. У животных, использованных
для экспериментов, этот аксон имел длину примерно 20 см и ширину 0,5 мм. Такой
необычно большой диаметр позволял вводить в этот аксон длинную тонкую сереб-
ряную проволоку, как показано на рис. 16.4. Электрический импульс, подаваемый
на проволоку, проводился почти однообразно по всей длине аксона. Благодаря ис-
пользованию проволоки цилиндрическую форму аксона при анализе можно было
свести к форме круга.
Продольно введенная проволока устраняла пространственную неоднород-
ность, но даже при такой «пространственной фиксации» токи, ответственные за
потенциал действия, было трудно изучать, поскольку проводимость мембраны из-
меняется с изменением потенциала. Когда ионные каналы открываются и закры-
ваются, обусловливая изменение тока, меняется и напряжение. Чтобы решить эту
проблему, необходимо подсоединить цепь, через которую можно было бы поддер-
живать напряжение на постоянном уровне при изменении тока. С этой целью был
сконструирован усилитель, контролирующий напряжение на продольной прово-
локе и позволяющий измерять ток как изменение проводимости мембраны. Обыч-
но напряжение изменяют скачкообразно, производя ступенчатый сдвиг. Это влия-
Рис. 16.4. Аксиально введенная проволо-
ка проводит приложенное напряжение (I/)
равномерно по аксону.
16.2. Фиксация напряжения и свойства натриевых и калиевых каналов
477
ет на состояние ионных каналов и вызывает изменения тока соответственно их от-
крыванию и закрыванию.
Примеры №+-тока и К+-тока, активированных серией ступенчатых изменений
напряжения, показаны на рис. 16.5. При потенциале покоя и №+-каналы, и К?-ка-
налы большей частью закрыты, но, когда ступенчатые изменения потенциала вы-
зывают его сдвиг в сторону положительных значений, эти каналы открываются.
При К+-токе (рис. 16.5, Б) потенциал всегда выше Ек (-7*7 мВ) и ток возрастает по
мере увеличения напряжения. Значение ENa при этих расчетах равно 50 мВ, и на-
триевый ток характеризуется как отрицательный, пока мембранный потенциал
ниже 50 мВ (согласно условию, что положительные заряды, выходящие из клетки,
генерируют положительный ток). Когда изменение напряжения достаточно велико,
чтобы вызвать открывание натриевых каналов, при его дальнейшем увеличении на-
триевый ток уменьшается, когда потенциал приближается к £Na. При одном пока-
занном на рисунке импульсе, превышающем ENa, натриевый ток положительный.
Натриевый и калиевый токи показаны на рис. 16.5 по отдельности. Ток, запи-
сываемый от гигантского аксона кальмара, помещенного в обычную морскую
воду, представляет собой сумму этих двух компонентов. Чтобы разделить эти два
тока, готовили морскую воду, в которой натрий заменяли холином. Холин не про-
Рис. 16.5. Ионные токи, рассчитанные
для аксона кальмара по уравнениям Ход-
жкина—Хаксли (разд. 16.3). Время = О
означает момент ступенчатого измене-
ния напряжения от -70 мВ до указанно-
го уровня.
478
Глава 16. Потенциал действия
никает через натриевые каналы, и в его растворе регистрировался только калиевый
ток. Вычитанием калиевого тока из общего тока, наблюдаемого в обычной мор-
ской воде, вычисляли натриевый ток. В последующие годы были разработаны го-
раздо лучшие способы разделения различных ионных компонентов мембранного
тока. Помимо усовершенствованных методов замены ионов, вошло в практику
применение фармакологических агентов, которые связываются со специфически-
ми каналообразующими белками и блокируют их функцию. Например, тетродо-
токсин блокирует большинство натриевых каналов, тетраэтиламмоний — боль-
шинство калиевых каналов. В настоящее время имеется огромный арсенал высо-
коспецифичных ингибиторов каналов, используемых в подобных экспериментах.
Характеристики натриевого и калиевого токов, временной ход которых пока-
зан на рис. 16.5, полностью объясняют потенциал действия. Они включают три ос-
новных потенциал-зависимых процесса, названных в предыдущем разделе при ка-
чественном описании фаз подъема и затухания потенциала действия. Как видно из
рис. 16.5, деполяризация мембраны быстро вызывает открывание натриевых кана-
лов. Реальная скорость возрастания тока зависит от потенциала, но при импульсах
выше -20 мВ максимум достигается менее чем за одну миллисекунду. В отличие от
этого калиевые токи активируются более медленно. Этим обеспечивается неболь-
шое окно, во время которого доминирует проницаемость мембраны для натрия.
Таким образом, вначале активируются натриевые каналы, и вход в клетку натрия
приводит к сдвигу потенциала к ENa.
После достижения максимума натриевый ток затухает (рис. 16.5, А), Это обу-
словлено инактивацией натриевых каналов, упомянутой в предыдущем разделе.
Она отличается от активации и представляет собой отдельный эффект влияния по-
тенциала на натриевый канал. Инактивация натриевых каналов (рис. 16.5, А) и ак-
тивация калиевого тока (рис. 16.5, Б) происходят после активации натриевых кана-
лов. Эти два более поздних процесса вместе способствуют реполяризации потен-
циала действия и, как показывает рис. 16.2, оба они необходимы. В отсутствие
потенциал-зависимого калиевого тока в результате инактивации натриевых кана-
лов остаются только калиевые каналы в покоящемся состоянии и ток через них
слишком слабый, чтобы быстро изменить напряжение. В отсутствие инактивации
натриевых каналов реполяризующее действие потенциал-активируемого калиевого
канала встречает слишком большое противодействие со стороны открытых натрие-
вых каналов, так что потенциал остается на уровне, более близком к ENa, чем к Ек.
16.3. Уравнения Ходжкина—Хаксли
Записи тока, получаемые в экспериментах с фиксацией напряжения, дают важную
информацию для количественного описания потенциалов действия. Рассмотрим
теперь, как количественные описания кинетики регуляции каналов можно ис-
пользовать для реконструкции основной волнообразной формы потенциала дей-
ствия. В разд. 16.5 на основе этих идей объясняется распространение потенциала
действия.
Количественное описание активности натриевых и калиевых каналов, предло-
женное Ходжкином и Хаксли (1952), широко используется и в настоящее время.
Они описали отдельные компоненты натриевого и калиевого токов (рис. 16.5) путем
16.3. Уравнения Ходжкина—Хаксли
479
подбора подходящих эмпирических функций. Например, кривая убывания на-
триевого тока имеет характер простой экспоненты (рис. 16.5, А), и экспоненциаль-
ная функция очень хорошо описывает эту часть данных. Убывание по экспоненте
указывает на то, что это кинетика перехода между двумя состояниями (см. разд.
7.1). Таким образом, мы можем определить инактивацию как переход от активиро-
ванного/открытого состояния, А, в инактивированное закрытое состояние, I.1 *
А<=; I
Рл (16А)
В схеме (16А) аА ирА — это константы скоростей прямого и обратного процес-
сов. Индекс h — это переменная, означающая относительную долю каналов в со-
стоянии А (й = [А]/([А]+ [!])). Схема отражает простой процесс в системе с двумя
состояниями, и соответственно мы можем использовать уравнение (7.4) в качестве
выражения для временной зависимости й. В данном случае оно имеет вид
й=(й1-й„)е-'Лл+Л», (16.3)
где йда — это равновесное значение й, равное РА/(аА +РА), и тА — постоянная вре-
мени, равная 1/(аА + рА). После ступенчатого сдвига напряжения величина й релак-
сирует от начального значения, й>, определяемого напряжением, существовавшим
до сдвига, к новому значению, йж, определяемому новым уровнем напряжения.
Активация натриевых каналов, в отличие от инактивации, описывается не экс-
понентой, а сигмоидной кривой (рис. 16.5, А). Фазе подъема соответствует экспо-
нента е3. Это позволяет предполагать, что молекула белка натриевого канала вклю-
чает три независимые субъединицы, каждая из которых должна участвовать в от-
крывании канала. Такие потенциал-чувствительные субъединицы часто называют
воротными частицами. Чтобы описать механизм, включающий два состояния, как
на схеме (16А), используем для каждой воротной частицы переменную т, обозна-
чающую ее относительную долю в активированном состоянии, и запишем выра-
жение, соответствующее уравнению (16.3)
т = (тх -mJet/Xh + тх (16.4)
Возводя т в третью степень, мы получаем относительную долю каналов, в которых
активированы все три воротные частицы, т. е. относительную долю открытых ка-
налов.
Для расчета фракции каналов, подвергшихся активации и пока не инактивиро-
ванных, умножим т3 на й. Тогда натриевый ток будет равен произведению числа
открытых каналов и движущей силы И - ENa. Если обозначить число натриевых
1 Символ А в действительности включает и закрытое состояние, способное перейти в откры-
тое при изменении потенциала, и открытое состояние. Инактивированное состояние — это от-
дельное закрытое состояние, которое сохраняется при положительном значении потенциала. Та-
ким образом, кинетика инактивации включает переходы и из закрытого, и из открытого состоя-
ний в инактивированное состояние. Эта идея заложена в приведенном ниже выражении для
проводимости, пропорциональной rnh (уравнение (16.5)). Механистическая основа этой модели
обычно признается неадекватной для полного и подробного кинетического описания натриевого
канала, но она вполне адекватна для количественного моделирования натриевого тока с целью
объяснения потенциала действия.
480
Глава 16. Потенциал действия
каналов как 7VNa и проводимость одного канала как yNa, уравнение для натриевого
тока, /Na, будет иметь вид
Лча — — ^'Na)^NaYNa W h ~
= (И-^а)0№.макс((т, -т„)е-,л‘ + ^)3((й, -+йД (16.5)
где во втором выражении подставлены выражения для т и h из уравнений (16.3)
и (16.4). Кроме того, величины jVNa и yNa заменены 6Na.MaKC, поскольку их произве-
дение отражает максимальную возможную проводимость мембраны для Na+,
имеющую место, когда все каналы одновременно открыты. Для гигантского
аксона кальмара GNa.MaKC =120 мСмсм"2. С учетом проводимости одиночного ка-
нала, равной 4 пСм, можно рассчитать плотность каналов как 300 мкм"2 (Hille,
1991).
Выражение для калиевого тока получить легче, поскольку в этом случае необ-
ходимо учитывать только процесс активации. График активации калиевых кана-
лов, как и натриевых каналов, имеет вид сигмоидной кривой (рис. 16.5, Б). Она хо-
рошо описывается выражением для кинетики перехода между двумя состояниями,
возведенным в четвертую степень, поскольку белок калиевого канала содержит че-
тыре воротные частицы. Обозначим относительную долю этих частиц в активиро-
ванном состоянии как п и выведем выражение для калиевого тока тем же спосо-
бом, какой был использован для получения уравнения (16.5)
/к=(Г-ЕкЖукл4 =
= (И - £к)С?к.Макс((«i - «»)е"/ТА + «J4 (16.6)
В гигантском аксоне кальмара 6к.макс = 36 мСм • см"2. При значении проводимости
одиночного канала, равном 20 пСм, расчетная плотность этих каналов составляет
18 мкм"2 (Hille, 1991).
Записи тока при фиксации напряжения легко описываются путем подгонки
уравнений (16.5) и (16.6), что позволяет вычислить тх, , а также постоянные
времени тт, xh и т„. Графики зависимости этих параметров от напряжения приведе-
ны на рис. 16.6. Графики сходны с графиком уравнения Больцмана
(рис. 1.5), как и ожидается для потенциал-зависимого равновесия системы с двумя
состояниями (разд. 1.8). Подобно этому, графики тт, тл и сходны с графиками,
приведенными на рис. 7.9 (разд. 7.5).
Графики параметров уравнения Ходжкина—Хаксли, представленные на
рис. 16.6, показывают другим путем основные характеристики потенциала дейст-
вия. При значениях потенциала, близких к потенциалу покоя, величина вы-
сокая, а т,х — низкая. Произведение mt h.^ в этом случае малая величина, и соот-
ветственно натриевые каналы закрыты. Резкое изменение напряжения фикса-
ции до примерно -50 мВ приводит к возрастанию т, и соответствующее низкое
значение хт означает, что это возрастание происходит быстро. Таким образом, на-
чинается цикл открывания натриевых каналов и увеличения потенциала в сто-
рону положительных значений. Изменения h и п должны противодействовать
этому процессу, но более высокие значения тл и т„ по сравнению с хт (рис. 16.6, Б)
16.3. Уравнения Ходжкина—Хаксли
481
Рис. 16.6. Графики зависимостей параметров из уравнений Ходжкина—Хаксли от напряжения.
указывают, что открывание натриевых каналов в самый ранний период развития
потенциала действия доминирует. Когда h и п начинают возрастать параллельно
/и, инактивация натриевых каналов и активация калиевых каналов приводят к за-
туханию потенциала действия и возвращению мембранного потенциала к уровню
покоя.
С использованием измеренных величин тт и и простых выражений, приве-
денных в тексте под уравнением (16.3), можно вычислить ат и Р„;, а также h и п при
любом напряжении. Ходжкин и Хаксли (1952) нашли таким способом для аир
следующие эмпирические выражения
= рт(И) = 0,108е"^18 (16.7а)
ал(И) = 0,0027е-^ рА(И) = г—(16.76)
а»(И) = /О1-ГХ*о МП = О,О55е~и/80 (16.7в)
I g lu
Важно подчеркнуть, что эти уравнения не выведены на основе физических
принципов, а получены эмпирически для определения характера потенциал-зави-
симости воротных механизмов, т. е. переходов между состояниями. Удовлетвори-
тельная физическая интерпретация выражений для ат и ал предложена в рамках
теории Крамерса (Goychuk, Hanggi, 2002), однако в основном эти выражения не-
обходимы для описания электрических импульсов с помощью данных параметров
проводимости, а не для объяснения механизмов проводимости.
Используем теперь найденные потенциал-зависимые константы скоростей пе-
реходов для расчета точной траектории потенциала действия. Через эти константы
скоростей переходов каналообразующих белков можно выразить скорость измене-
ния переменной состояния для каждого из различных переходов воротных частиц.
Используя дифференциальное уравнение, описывающее процесс такого типа (см.
уравнение (7.2)), запишем скорость изменения каждой переменной состояния ка-
налов как сумму скоростей прямого и обратного процессов
482
Глава 16. Потенциал действия
— = am(l-w)-pmffl (16.8а)
at
^ = аА(1-й)-рлЛ (16.86)
at
^ = а„(1-п)-р„« (16.8в)
at
Наконец, нам требуется уравнение, описывающее скорость изменения V. Из-
менение потенциала зависит от тока через каналы, и для его выражения можно
объединить уравнения (16.5) и (16.6)
С^-= GNa.mMm3h(V- ENa) + Ок.максл4(И- £к) + GL(K- £L) + /стим (16.9)
at
Дополнительный ток утечки, GL(K-EL), представляет собой ток через каналы,
поддерживающий потенциал покоя. Он в основном соответствует линейному чле-
ну в уравнении (16.1). По результатам измерений, в случае гигантского аксона
кальмара 6L =0,3 мСмсм-2 и EL = -54 мВ. Здесь /стим — это ток, входящий через
электрод при экспериментальной фиксации. Если величина /стим незначительна,
потенциал остается на уровне покоя, и в этом случае величины m3h и п4 низкие.
Каналы не открываются, и ничего не происходит. При высоком и положительном
/стим потенциал изменяется до уровня, где m3h становится большой величиной.
Большая величина Cd V/&t означает, что мембранный потенциал будет изменяться.
Уравнения (16.8а)-( 16.8в) и (16.9) представляют собой систему связанных диф-
ференциальных уравнений, которые можно решить с помощью компьютера. Что-
бы представить, как компьютер решает эту задачу, возьмем начальное условие, оп-
ределяющее п, т, h и И. При очень малом приращении времени, 8, изменения 8л,
8/и, 8й и 8 И можно рассчитать из правой стороны соответствующего уравнения пу-
тем умножения на 8г. Незначительно измененные значения аир рассчитываются
для нового потенциала, V + 8 И, с помощью уравнений (16.7а)—(16.7в). Этим завер-
шаются расчеты для одного шага времени. Затем расчеты повторяются для другого
шага времени и т. д. Компьютерная программа для такого итеративного ступенча-
того продвижения во времени на самом деле очень короткая и простая. Компьютер
необходим для практического использования этих уравнений, поскольку они не
имеют аналитических решений.
Потенциалы действия, показанные на рис. 16.1 и 16.2, рассчитаны с помощью
такого процесса интегрирования уравнений (16.8а)—(16.8в) и (16.9). Близкое сход-
ство этих расчетных потенциалов действия с потенциалами, экспериментально за-
писанными на аксоне кальмара, — это впечатляющий успех теории. Важно под-
черкнуть, что уравнения Ходжкина—Хаксли были основаны на данных, получен-
ных методом фиксации напряжения, так что расчет потенциала действия
представляет собой настоящий теоретический прогноз. В разд. 16.5 описывается
еще один успех теории — расчет скорости распространения потенциала действия
на основе объединения уравнений Ходжкина—Хаксли и кабельного уравнения.
Прежде чем идти дальше, важно отметить, что решение этих уравнений позво-
ляет вычислить не только потенциал как функцию времени, но также п, т и h как
функции времени. Таким образом, мы можем реконструировать не только потен-
16.4. Кривые ток—потенциал и пороги
483
Рис. 16.7. А. Потенциал действия, вычис-
ленный путем объединения уравнений
(16.8а)—(16.8в) и уравнения (16.9). При
значениях /СТИм от 1 до 1,2 мСм инициирует-
ся потенциал действия с двумя точками пе-
региба. Б. Нормированные проводимости
для Na+ и К+ были рассчитаны с использо-
ванием т, h и п. В. Параметры активации
и инактивации натриевой проводимости, т
и h.
Время, мс
циал действия, но и временной ход натриевого и калиевого токов. На рис. 16.7, А
показан потенциал действия и на рис. 16.7, Б — временной ход нормированных
проводимостей для Na+ и К+, рассчитанный по развитию потенциала действия:
GNa/GNa.MaKC - это m3h и GK/GK.MaKC - п. Как видно из рисунка, GNa/GNa.MaKC возрас-
тает быстро и это соответствует подъему потенциала действия; GK/GK.^KC увеличи-
вается позднее, и это увеличение совпадает во времени с реполяризацией мембра-
ны и падением потенциала ниже его исходного уровня.
Графики /пий приведены на рис. 16.7, В, чтобы показать, как четко возраста-
ние т соответствует увеличению GNa/GNa.MaKC и падение h — снижению GNa/GNa_MaKC.
Таким образом, рис. 16.7 иллюстрирует, как изменяется активность калиевых и на-
триевых каналов во время потенциала действия и как воротные процессы, отра-
жаемые величинами т и й, связаны с натриевым током.
16.4. Кривые ток—потенциал и пороги
Два особых предельных случая уравнений Ходжкина—Хаксли помогают понять,
каким образом генерируются пороговые потенциалы, вызывающие потенциал
действия. Если к мембране аксона в течение длительного времени приложен по-
стоянный ток, все кинетические процессы будут в итоге сходиться к конечной точ-
ке. Чтобы описать эту ситуацию, возьмем уравнение (16.9), примем dK/dr = 0 и и, т
и h равными wx, йхи л/х. Получаемое в результате выражение представляет собой
484
Глава 16. Потенциал действия
зависимость ток—потенциал для стационарных условий. Обозначив этот потенци-
ал как Истац, получаем выражение
“ Дггим “ (^стац “ ^Na)^Na-макс^ооС^стац) Дю(^стац) +
+ (Истац-£к)Ск-максМИстац)4 + (7и(Истац -£,) (16.10)
Наряду с этим немедленно после включения /стим величина т, как имеющая
наиболее «быструю» постоянную времени, будет изменяться ранее п и й. При на-
чальном потенциале Ио значения п и h будут соответствовать начальным значениям
Лоо(И0) и ^(Ид). Максимальный ток будет близок к току, характеризующемуся зна-
чением (И) при новом значении потенциала, И, и значениями йДИд) и лДИд) при
предыдущем значении потенциала. Обозначим новое значение Икак Ибыстр и запи-
шем соответствующую зависимость
“-^стим ~ (^быстр — ^*Na X^Na- макс^оо(^быстр) +
+ (И6ЫСТр - Ek)Gk. макс л„(И0)4 + GL(K6blCTp -£,) (16.11)
Хотя уравнения (16.10) и (16.11) выглядят сходными, использование Ио для п и
h вносит большое различие. Уравнение (16.11) относится ко времени непосредст-
венно после наложения стимула. Точно этот момент неизвестен; примерно он на-
ступает ранее, чем через 1 мс, поскольку хт всегда < 1 (рис. 16.6, Б). Важно, что это
значение времени позволяет довольно хорошо аппроксимировать потенциал, ко-
торым обусловливается максимальный ток.
Эти два уравнения определяют принципиально различные зависимости ток-
потенциал. График уравнения (16.10) на рис. 16.8, А показывает, что кривая пере-
секает ось тока в нулевой точке только при потенциале покоя —65 мВ (см. врезку).
Это единственная величина потенциала, при которой ток равен нулю, и соответст-
венно не имеет значения, при каком потенциале произойдет начальный сдвиг;
в конце процесса, после отключения /стим, потенциал возвращается к потенциалу
покоя. Быстрые потенциал-зависимые переходы состояний каналов не приво-
дят к изменению потенциала покоя. Поскольку натриевые каналы инактиви-
руются, активность калиевых каналов длительно доминирует при любом потен-
циале.
Рассмотрим теперь кривую зависимости ток—потенциал для момента после
подачи тока (график уравнения (16.11) на рис. 16.8, Б). В области потенциала по-
коя (см. врезку) при небольших смещениях от этого значения положительный ток
(ток из клетки) будет сдвигать потенциал в обратном направлении. Однако при
значениях потенциала немного выше -64 мВ ток достигает максимума и уменьша-
ется. При потенциале примерно —62,5 мВ ток вновь равен нулю; при более низких
отрицательных значениях потенциала ток отрицательный. Это указывает на поро-
говое значение потенциала, вызывающее потенциал действия. Если произойдет
хотя бы незначительный сдвиг потенциала от этой точки, отрицательный ток (ток
из наружной среды в клетку) через открывшиеся натриевые каналы будет изменять
потенциал в сторону положительных значений, дальше от потенциала покоя. Это
приведет к открыванию большего числа натриевых каналов и инициации потен-
циала действия. Рис. 16.8, Б очень полезен для понимания этого процесса, так как
хорошо показывает, что происходит в области порога.
16.4. Кривые ток—потенциал и пороги
485
Точное пороговое значение потенциала не является абсолютным свойством
аксона. Кривая на рис. 16.8, Б построена на основе предположения, использован-
ного для выведения уравнения (16.11), о том что т изменяется мгновенно при из-
менении потенциала, когда п и h еще не изменяются. Если потенциал изменяется
медленно, будет время для возрастания п и h вслед за т и в результате ток изменит-
ся. На самом деле, если потенциал изменяется очень медленно, рассматриваемая
кривая будет соответствовать уравнению (16.10) и кривой на рис. 16.8, А. В этом
случае потенциал действия не возникнет. Очень медленная деполяризация, вызы-
вая инактивацию натриевых каналов, делает аксон невозбудимым. Это хорошо из-
вестное свойство возбудимых мембран называют аккомодацией. Теория порога, та-
ким образом, несколько размывается. Действительное пороговое значение потен-
циала зависит от характера стимула и от начального потенциала.
Форма кривой ток—потенциал, представленной на рис. 16.8, Б, отражает харак-
терное свойство возбудимой мембраны. Оценивая сопротивление по наклону этой
кривой, можно сказать, что отрицательный наклон означает отрицательное сопротив-
ление. Для мембран это отмечается только в случае, когда потенциалом вызывается
переход между состояниями канала. Если наклон везде положительный (рис. 16.8, А),
ток всегда сдвигает потенциал назад к потенциалу покоя. Мембрана характеризует-
ся стабильностью и после любого возмущения возвращается в состояние покоя.
Рис. 16.8. А. График уравнения (16.10) —
зависимости ток—потенциал для ста-
ционарных условий, выведенной из
уравнений Ходжкина—Хаксли. Б. Гра-
фик уравнения (16.11); «быстрая» кри-
вая ток—потенциал, для момента непо-
средственно после подачи тока. Врез-
ки показывают область вблизи потен-
циала покоя.
486
Глава 16. Потенциал действия
В противоположность этому область отрицательного наклона может указывать на
нестабильность. Когда потенциал смещается в эту область, ток сдвигает его еще
дальше от уровня покоя, а не возвращает к исходному состоянию. В соответствии
с этим пересечение в нисходящем направлении оси потенциала на графике, пред-
ставленном на врезке рис. 16.8, Б, и служит столь важной характеристикой.
Помимо порогового механизма уравнение Ходжкина—Хаксли позволяет объяс-
нить рефрактерный период. Это возрастание порогового значения потенциала по-
сле потенциала действия, которое происходит при инактивации натриевых каналов
и открывании большего числа калиевых каналов, означает, что необходим больший
стимул, чтобы вызвать потенциал действия. Затухание рефрактерного периода
обусловлено как прекращением инактивации натриевых каналов (рис. 16.7, В), так
и закрыванием калиевых каналов (рис. 16.7, Б).
После рефрактерного периода аксон находится в супернормалъном состоянии
(Swadlow et al., 1980). В это время пороговое значение потенциала ниже, чем до по-
тенциала действия. Период супернормального состояния незначительно варьирует
в зависимости от вида животного и типа аксона, но обычно его максимальная про-
должительность составляет промежуток времени между 7 и 20 мс после потенциала
действия. В качестве причины этого состояния можно предполагать либо умень-
шение инактивации натриевых каналов (увеличение Л), либо снижение проводи-
мости мембраны для калия (уменьшение п). Анализ относительных вкладов этих
компонентов показывает, что уменьшение п влияет в большей степени и может
быть основной причиной снижения порога в супернормальный период (Stock-
bridge, 1988).
16.5. Распространение
При анализе мембранных токов в разд. 16.2—16.4 не рассматривались пространст-
венные изменения потенциала. На самом же деле наиболее важное свойство по-
тенциала действия состоит в том, что он распространяется (рис. 16.3). Количест-
венные характеристики процесса распространения выясняются на основе меха-
низма генерации потенциала действия посредством потенциал-зависимой
регуляции натриевых и калиевых каналов. Отправной точкой для анализа про-
странственного изменения потенциала служит кабельное уравнение, приведенное
в предыдущей главе. Возьмем уравнение (15.7) и разделим обе его части на гм
(16.12)
дУ д2У У
dt гп dx1 гм
В этой форме уравнение показывает, что изменение потенциала во времени
в данном участке зависит от двух параметров. Первый из них относится к осевому
фактору, отражая дисбаланс продольного тока, текущего в направлении слева на-
право. Второй параметр — это трансмембранный ток. Чтобы включить в кабельное
уравнение параметр тока через каналы, заменим этот второй параметр, У/гм, сум-
мой мембранных токов из уравнения (16.9)
- (И - ^Na^Na- макс/и3А - (У ~ EK)GK. макс«4 - GL(K - £l)
dt гп dx
(16.13)
16.5. Распространение
487
Переменные т, h и п теперь изменяются в зависимости от х, позиции вдоль кабеля,
помимо того, что они зависят от потенциала и времени. Численный компьютер-
ный способ нахождения И, т, h и п как функций времени должен быть при этом
модифицирован для включения пространственной функции. С этой целью аксон
следует разделить на множество малых сегментов длиной Дх (см. рис. 15.2). Прира-
щения параметров И, т, h и п в каждом сегменте должны рассчитываться, как опи-
сано в разд. 16.3. Однако необходимо также вычислить дополнительный вклад,
происходящий от соседних сегментов, определив с помощью компьютера
(1/гп)(д2 ИДх2). Компьютерные программы позволяют легко осуществить это ин-
тегрирование путем использования методов компартмент-моделирования, опи-
санных в разд. 15.9.
Ходжкин и Хаксли располагали лишь счетной машиной, а не компьютером,
когда изучали аксон в 1950 гг; поэтому они модифицировали уравнение (16.3),
чтобы легче было производить расчеты. Их метод также важен для объяснения
скорости распространения потенциала действия, и мы рассмотрим его подробно.
Если исходить из факта, что потенциал действия сохраняет свою форму при
распространении, решение уравнения (16.13) будет иметь вид
И(х,/) = И(х-0Г), (16.14)
где 0 — скорость. Это весьма общее математическое выражение, применяемое
в волновой физике. Если И(х, 0) имеет некую сложную форму с центром в точке хь,
тогда, согласно уравнению (16.14), в некий последующий момент времени функ-
ция Ибудет иметь ту же форму, но с центром в точке х = х +0/. Уравнение (16.14)
представляет собой общее решение дифференциального уравнения в частных про-
изводных, называемое волновым уравнением
д2У _ 1 д2У
дх2 ” 02 dt2 ’
(16.15)
и это легко проверить путем подстановки.
Уравнение (16.13) в комбинации с выражениями для т, h и п (уравнения
(16.8а)—(16.8в)) дает систему дифференциальных уравнений в частных производ-
ных как пространственных и временных функциях. С помощью уравнения (16.15)
можно исключить вторую производную по х, заменив ее второй производной по
времени. Таким способом это дифференциальное уравнение сводится к уравне-
нию зависимости только от одной независимой переменной
+ - ^а^а-макс^’й +(И- £к)Ск-максЯ4 +^L(K- EL) (16.16)
dt гп0 at
При одной независимой переменной, времени, реально осуществить численное
интегрирование ручным способом. За несколько часов можно проинтегрировать
небольшими шагами (0,01 мс) период в несколько миллисекунд.
Единственная неизвестная величина в уравнении (16.16) — это 0, скорость
проведения. Ходжкин и Хаксли определили, что для большинства значений 0 чис-
ленное решение дает изменение V с течением времени до V = ±0. Если значение 0
слишком высокое или слишком низкое, V возрастает. Путем использования раз-
личных значений 0 они установили, что при одном из значений 0 функция И(Г) воз-
вращается к потенциалу покоя после генерации импульса, сходного с эксперимен-
488
Глава 16. Потенциал действия
тально записанным потенциалом действия; величина, позволившая получить этот
результат, составляет 0 = 18,8 м - с"1. Это значение весьма близко к эксперименталь-
но измеренной скорости распространения потенциала действия, равной 21,2 м с"1.
Проведенное Ходжкином и Хаксли определение скорости распространения
посредством анализа уравнения (16 16) можно считать замечательным успехом
ионной теории возбудимости мембран. Необходимо подчеркнуть, что параметры,
использованные в качестве исходных, были основаны на измерении тока в аксоне
при фиксации напряжения. Хотя использование уравнения (16.15) для выведения
уравнения (16.16) предполагало волноподобное решение, скорость волны не была
известна. Таким образом, близость теоретически рассчитанной и измеренной ве-
личин 0 служит строгим доказательством теории.
Уравнение (16.16) нельзя решить аналитически, чтобы выразить скорость рас-
пространения через параметры, представляющие собой характеристики каналов.
В то же время можно получить точное выражение для зависимости скорости про-
ведения от кабельных параметров. Соберем основные параметры уравнения
(16.16) вместе путем деления на см,. Это позволяет получить член 1/(02гп см,) в каче-
стве множителя при d^V/dt1. Коэффициенты при специфических параметрах тока
через каналы в таком случае все имеют форму GJc*,. Поскольку плотности всех
каналов фиксированы, каждое значение Gx будет определяться соответственно
площади; см, также соответствует площади, и соотношения Gx/cM, представляют
собой постоянные величины. Соответственно этому константа 1/(02гпсм,) инвари-
антна в отношении диаметра аксона. Когда величина данного фактора, который
дает стабильное решение уравнения (16.16), найдена, она пригодна для любого
диаметра аксона. Обозначив эту величину к, запишем уравнение
(16 17)
Рис. 16.9. Скорость про-
ведения потенциала дей-
ствия в зависимости от
диаметра аксона. Измере-
ния производили на разно-
образных аксонах из каль-
маров и каракатиц различ-
ных размеров. Кривая —
О.вд/диаметр. (Данные из
работы Pumphrey, Young,
1938, Table 1; температу-
ра 19,5—22,1 °C.)
16.6. Миелин
489
Вспомним из гл. 15, что гп = рц/ла2 (уравнение (15.1), где а — радиус. Отметим
также, что см, — это емкость мембраны для единицы длины аксона; см, = 2ласм.
Произведя эти подстановки, получаем
е = (16.18)
ррцсм
Это важное уравнение, поскольку оно показывает, что скорость проведения
импульса возрастает пропорционально квадратному корню радиуса аксона. На са-
мом деле это давно известный экспериментально установленный факт, как пока-
зывает график зависимости скорости проведения от диаметра аксона для аксонов
различных видов кальмаров и каракатиц (рис. 16.9).
Уравнения (16.18) и рис. 16.9 показывают, что в случае аксонов скорость прове-
дения выше при большей величине этого волокна. Поскольку повышение скоро-
сти выгодно для организма во многих отношениях, эволюционное преимущество
должны иметь крупные аксоны. Гигантский аксон кальмара представляет собой за-
мечательный пример. Этот аксон, проходящий через мантию, обеспечивает пере-
дачу сигнала для быстрой двигательной реакции. Такое движение составляет часть
рефлекса избегания хищников, и скорость проведения импульса аксоном вносит
вклад в скорость реакции.
16.6. Миелин
Преимущество скорости проведения, обеспечиваемое крупным аксоном, имеет
и свою оборотную сторону в отношении размеров структуры и энергетической
платы. Сложная нервная система, содержащая миллиарды нейронов, при большом
числе крупных аксонов была бы несоизмеримо огромной и поглощающей неверо-
ятное количество метаболической энергии. У беспозвоночных, таких как кальмар,
число нейронов, как правило, небольшое. Позвоночные обладают намного более
сложно организованной нервной системой, и повышение скорости проведения
импульса обеспечивается в ней другим способом. Этот способ основан на присут-
ствии толстой многослойной миелиновой оболочки, покрывающей аксоны. Мие-
лин увеличивает сопротивление мембраны аксона и снижает его емкость
(рис. 16.10, Л). Это способствует повышению скорости проведения сигнала. По-
Рис. 16.10. А. Миелин спиралеобразно обертывает аксон. Б. Между миелиновыми чехлами рас-
положены перехваты Ранвье, в которых мембрана открыта. Эти перехваты расположены через
регулярные интервалы. Стрелками показан вход ионов Потенциалы действия распространяют-
ся скачкообразно от перехвата к перехвату
490
Глава 16. Потенциал действия
крытое миелином нервное волокно лягушки, имеющее диаметр 10 мкм, проводит
нервный импульс со скоростью примерно 20 м с"1 (Hodgkin, 1964), приблизитель-
но в три раза быстрее, чем аксон кальмара, имеющий диаметр 100 мкм (рис. 16.9).
Миелиновый чехол не полностью покрывает поверхность аксона. Покрытые
миелином участки чередуются с так называемыми перехватами Ранвье — участка-
ми, не покрытыми миелином (рис. 16.10, Б). В этих участках ионы имеют беспре-
пятственный доступ к мембране. Записи электрических сигналов от покрытых
миелином аксонов показали, что перехваты представляют собой участки генера-
ции потенциала действия. Внеклеточные поля, записанные вблизи перехвата, по-
казали, что потенциалы действия сопровождаются активными входящими токами
(Huxley, Stampfli, 1949). Записи от других участков показали только пассивные вы-
ходящие токи. В перехватах Ранвье очень высока плотность натриевых каналов,
важных для инициации и распространения потенциала действия.
Благодаря высокому сопротивлению миелина деполяризация мембраны в од-
ном перехвате распространяется на большое расстояние без существенной потери
тока. Одно из объяснений этого состоит в том, что увеличение сопротивления
мембраны приводит к увеличению постоянной длины, X. Миелин снижает также
емкость, в результате чего заряд, входящий в перехват, может изменить потенциал
на большей площади мембраны аксона. Повышенное сопротивление и понижен-
ная емкость в сочетании обеспечивают быстрое распространение потенциала дей-
ствия от одного перехвата Ранвье до следующего. Поскольку это включает скачки
от перехвата к перехвату, такой тип проведения нервного импульса в миелинизи-
рованных аксонах назван сальтаторным.
Строение миелинизированных аксонов показывает значительную масштабную
инвариантность, т. е. внутренний диаметр, наружный диаметр и расстояние между
перехватами имеют одно и то же соотношение для нервных волокон различных
размеров. Такая масштабная инвариантность, как было установлено, оптимизиру-
ет скорость проведения (Rushton, 1951). Это можно объяснить с учетом постоян-
ной длины и постоянной времени миелинизированного аксона. Вначале рассмот-
рим постоянную длины X = д/гм /гп (уравнение (15.10)). Высокое значение X озна-
чает, что потенциал действия будет распространяться на большее расстояние.
Рассмотрим, как эта величина может быть максимизирована для данного наруж-
ного диаметра, dQ, миелиновой оболочки. С уменьшением внутреннего диаметра,
^внутр, слой миелина увеличивается, и соответственно будет возрастать гм. Величину
гм можно рассчитать как сопротивление многих концентрических цилиндрических
сопротивлений, соединенных последовательно. Сопротивление мембраны одного
из этих цилиндров диаметром s равно р м /(tis) для единицы длины аксона (уравне-
ние (15.2)). Далее возьмем гм как интеграл от внутреннего диаметра до наружного
диаметра
^нар 1
rM=bL f Ads = — ln(dHap/dBHyrp) (16.19)
Л S Л
s —“внутр
Однако при уменьшении ^внутр уменьшается и гл, поскольку уменьшается площадь
цитоплазматического содержимого по продольной оси. При гп = рм/(4л^внутр)
(уравнение (15.1)) выражение для X можно записать следующим образом, исполь-
зуя уравнение (15.10)
16.6. Миелин
491
х = Е = |(PM/^W„apMH^ = 2J Kln(JHap/JBHyTp) (16.20)
Vrn V Рц/(4л“внугр) (Рц
Величина </внутр> ПРИ которой к имеет максимальное значение, может быть вычис-
лена путем дифференцирования по ^внугр и приравнивания производной нулю. По-
лучаемое выражение имеет вид
4±™=е-,/2 = 0,607 ‘ (16.21)
^нар
Таким образом, максимальное значение X соответствует этому соотношению внут-
реннего и наружного диаметров миелиновой оболочки. Кроме того, поскольку со-
отношение ^Внугр/^нар в уравнении (16.20) постоянно, величина к пропорциональна
^внутр (или ^наР)- Таким образом, масштабная инвариантность расстояния между пе-
рехватами Ранвье, /, и величины ^внугр или г/нар означает, что / будет иметь одну и ту
же электротоническую длину при различных диаметрах аксонов.
Теперь мы можем использовать кабельное уравнение, чтобы применить прави-
ло масштабной инвариантности к анализу скорости распространения нервного
импульса. Во-первых, отметим, что постоянная времени независимо от присутст-
вия миелиновой оболочки остается той же величиной т = гмсм. Соответственно
тому, что гм ос 1п(^нар/^внугр) (уравнение (16.19)), можно на основании тех же рассуж-
дений записать см ос 1/(1п(^нар/^внугр)). Таким образом, произведение гмсм остается
одним и тем же. Вспомним из гл. 15, что кабельное уравнение, если его записать
в единицах X и тм, становится безразмерным. Таким образом, миелинизированный
сегмент между двумя перехватами Ранвье — это эквивалент при любом диаметре
аксона, поскольку тм одна и та же величина и, согласно правилу масштабной инва-
риантности, / постоянно, если выражается в единицах X. В месте перехвата Ранвье
потенциал действия генерирует напряжение, которое распространяется через
миелинизированный участок аксона. Поскольку это распространение пассивное,
для его описания применимо кабельное уравнение. Хотя временной ход измене-
ния напряжения в перехвате Ранвье сложный и не может быть выражен матема-
тически, решение безразмерного кабельного уравнения, описывающего распро-
странение импульса по миелинизированному участку аксона, будет одним и тем
же для различных по размерам аксонов эквивалентной электротонической длины.
Время, необходимое для того, чтобы в соседнем перехвате был достигнут порого-
вый потенциал, будет соответственно одним и тем же. Обозначив это время Г1? за-
пишем скорость проведения импульса как I /tx. При масштабной инвариантности
I х ^внутр и ^наР скорость проведения должна возрастать линейно с увеличением диа-
метра миелинизированного аксона. Эта линейная зависимость продемонстриро-
вана экспериментально (Waxman, Swadlow, 1977). Теоретическая основа описания
скорости проведения была заложена Хаксли и Стампфли (Huxley, Stampfli, 1949);
общие принципы масштабной инвариантности параметров аксона определены
Раштоном (Rushton, 1951).
Количественные выражения для натриевого и калиевого токов через мембрану
перехвата Ранвье в основе подобны уравнениям Ходжкина—Хаксли (уравнения
(16.7а)—(16.7в)), хотя в некоторых случаях показатели степени в выражениях для
констант скорости изменения т и п в них ниже (Hille, 1977). Расчет потенциалов
действия на основе этих уравнений дает обоснованные скорости распространения
492
Глава 16. Потенциал действия
импульса, которые линейно возрастают с увеличением диаметра аксона, при усло-
вии что / и ^внугр соотносятся, как определено Раштоном (Goldman, Albus, 1968).
По данным ультраструктурных исследований, соотношение ^ВНутрМар варьиру-
ет от 0,64 до 0,87; его среднее значение составляет 0,77 (Waxman, Swadlow, 1977).
Это значительно более высокое значение, чем оптимальная величина 0,607, полу-
ченная выше (уравнение (16.21)). Однако функциональная зависимость от ^внутр
в уравнении (16.20) имеет широкий максимум, так что отклонение от этой величи-
ны не может легко приводить к изменению X. Значение / также несколько выше,
чем оптимальное для скорости проведения; как предполагается, увеличение / мо-
жет иметь иное преимущество для запасания энергии. Каждый перехват Ранвье
представляет собой участок, где энергия рассеивается, и разбивка перехватов
большими промежутками должна обеспечивать уменьшение энергетической пла-
ты за потенциал действия (Rushton, 1951).
Интересные биологические вопросы возникают при анализе соотношения ме-
жду скоростью проведения импульса и степенью его процессинга. По расчетам
Раштона (1951), увеличение скорости проведения от 30 до 90 м с"1 могло бы уско-
рить ответ примерно на 2 или 3 мс. При сложном поведении, включающем после-
довательную активацию многих нейронов, это можно оценивать как лишь неболь-
шое преимущество, поскольку задержки синаптических сигналов в сумме могут
занять значительно больше времени, например 50 мс. В то же время уменьшение
в три раза диаметра аксона позволяет уместиться в том же пространстве в 9 раз
большему числу аксонов, обеспечивая 29 =512 возможных «оп—оА»-комбинаций.
Таким образом, миелинизация может быть выгодной в случае аксонов, несущих
такой сенсорный вход, который требует лишь минимальной расшифровки. Если
же в сигнале должны быть выявлены тонкие отличия, предпочтительнее не выиг-
рыш в скорости, а получение большей информации.
16.7. Морфология аксонов и проводимость
Основной структурной единицей аксонов служат длинные «кабели», но при этом
возможны различные варианты их формы. Аксоны могут сильно разветвляться, их
диаметр может резко или постепенно изменяться, в них могут присутствовать су-
жения и расширения. Когда потенциал действия достигает точки расширения,
продольный ток встречает большую емкость мембраны. Это должно приводить
к уменьшения изменения потенциала. Таким образом, область расширения аксона
действует как преграда для распространения потенциала действия, и здесь возмож-
ны интересные эффекты (Goldstein, Rail, 1974; Swadlow et al., 1980). Варианты рас-
пространения потенциала действия в участке вздутия аксона иллюстрирует
рис. 16.11. На нем показаны моделируемые с помощью компьютерных программ
потенциалы действия в немиелинизированном аксоне диаметром 5 мкм с одним
сферическим расширением при различных диаметрах этого расширения.
В случае расширений диаметром 10 и 20 мкм эти результаты показывают, что
потенциал действия может быть задержан этой преградой (рис. 16.11). Между мак-
симумами в участках 1 и 2 время задержки больше сравнительно с задержкой между
максимумами в участках 2 и 3. С увеличением диаметра расширения задержка воз-
растает. Зарядка мембраны расширения замедлена вследствие большей емкости этого
участка. Потенциал в расширении (участок 2 на схеме; рис. 16.11, А) ясно показывает
>6.7. Морфология аксонов и проводимость
493
Рис. 16.11. Распространение потенциала
действия вдоль аксона, содержащего сфе-
рическое расширение. Потенциал в точ-
ках, указанных на схеме (Д), представлен
на графиках (5) для различных размеров
расширения. С увеличением расширения
возрастает задержка потенциала в резуль-
тате преодоления этой преграды. При диа-
метре расширения 22 мкм оно вызывает
рефлексию потенциала действия — его
распространение и в прямом и в обратном
направлениях (обратите внимание, что кри-
вая 1 показывает два спайка, возникающих
в различное время). Расширение диамет-
ром 25 мкм вызывает прекращение потен-
циала действия.
i------1------1-----1------1------1------1------------1
О 5 10 15 20
Время, мс
замедленную передачу потенциала действия. Если эта задержка длится дольше реф-
рактерного периода, продолжающаяся деполяризация в расширении инициирует
потенциал действия и в прямом и в обратном направлениях (d = 22 мкм). Этот про-
цесс называют рефлексией. Расширение может быть настолько большим, что про-
дольный ток не вызовет в нем возрастания потенциала до порогового уровня.
В этом случае дальнейшее распространение потенциала действия невозможно. Та-
ким образом, в зависимости от диаметра расширения аксона потенциал действия
может либо задерживаться, либо рефлектировать, либо прекращаться.
Прекращение потенциала действия экспериментально установлено в участках
увеличения размеров, точках ветвления и расширениях аксонов (Swadlow et al.,
1980). В большинстве случаев сигнал в них отличается несущественно, так что не-
большие изменения возбудимости мембраны должны изменять выход. Повторные
потенциалы действия могут уменьшить возбудимость мембраны посредством та-
ких механизмов, как инактивация натриевых каналов или накопление внеклеточ-
ного К+. Это может приводить к прекращению потенциала действия в расшире-
нии. Когда расширения останавливают распространение потенциала действия, из-
менения в характеристиках мембран способны сдвинуть баланс в сторону его
распространения (Obaid, Salzberg, 1996) или прекращения (Segev, 1990; Jackson,
Zhang, 1995).
Задержки в несколько миллисекунд, наблюдаемые в участках расширений диа-
метром 10—20 мкм, могут быть важны для нервных функций, включающих точные
временные последовательности событий. На эти задержки должны влиять такие
494
Глава 16. Потенциал действия
события, как активация рецепторов на мембране расширения под действием ней-
ромедиатора. Примечательно, что расширения замедляют распространение потен-
циала действия, тогда как однородно больший диаметр способствовал бы более
быстрому проведению (см. разд. 16.5).
Рефлексии представляют собой довольно странный феномен. Можно предпо-
лагать, что они возникают в гантелеподобной структуре, где потенциал действия
отражается независимо в прямом и обратном направлениях. Рефлексия продемон-
стрирована непосредственно с помощью записи потенциала от нейронов моллю-
сков. Потенциалы действия, генерируемые в аксонах, распространяются в крупное
тело клетки и отражаются назад (Таис, 1962). При нормальных биологических
функциях рефлексия является редким эффектом, и в то же время эта форма перио-
дической электрической активности известна как один из важных факторов сер-
дечных аритмий (Antzelevitch, 2001).
16.8. Разнообразие каналов
Потенциал-зависимые натриевые и калиевые каналы, участвующие в генерации
потенциала действия, принадлежат к обширному суперсемейству родственных
белков (Ashcroft, 2000; Caterall et al., 2002). Известно по меньшей мере девять на-
триевых каналов млекопитающих, имеющих качественно сходные характеристи-
ки, но количественно различающихся по зависимости от потенциала и по кине-
тике состояний. Существует не менее 50 калиевых каналов, составляющих четыре
отдельных семейства, и не менее десяти потенциал-регулируемых кальциевых ка-
налов. Кальциевые каналы родственны натриевым каналам, и в клетках некоторых
типов они генерируют входящий ток, который вызывает импульсы, распростра-
няющиеся подобно потенциалу действия.
Порог, длительность, форма, рефрактерный период, скорость и другие харак-
теристики потенциала действия варьируют соответственно специфическим свой-
ствам ионных каналов, присутствующих в клеточной мембране. Легко видеть, что
положительный сдвиг в зависимости активации натриевых каналов от потенциала
(график на рис. 16.6, А) будет приводить к повышению порога. Более медлен-
ная кинетика закрывания калиевых каналов при отрицательном напряжении будет
способствовать продлению рефрактерного периода и задержке супернормального
периода. В случае кальциевых каналов инактивация происходит замедленно и в
некоторых случаях почти отсутствует. Вызванные кальциевым током потенциалы
действия обычно имеют большую продолжительность. Разнообразием потенциал-
зависимых ионных каналов обусловлено большое разнообразие процессов элек-
трической сигнализации в живых организмах.
Многие из ионных каналов исследованы методом регистрации в режиме фик-
сации напряжения, и в некоторых случаях количественное описание их регуляции
сделано в той же форме, которую использовали Ходжкин и Хаксли. Методы, опи-
санные в разд. 16.3—16.6, легко применимы к различным каналам. Таким образом,
имеется общий метод, открывающий большие возможности для соотнесения био-
физических свойств этих белков с их биологической функцией. В то же время био-
физические свойства каналов можно объяснить на основе молекулярной струк-
туры образующих их белков, и в предыдущих главах этой книги ионные каналы
использованы для иллюстрации многих важных положений молекулярной биофи-
116.9. Ритмическая импульсация и А-ток
495
зики. В следующих разделах мы рассмотрим, исходя из биофизических механиз-
мов проводимости мембран, некоторые виды сложной электрической активности
нейронов и мышечных волокон.
16.9. Ритмическая импульсация и А-ток
Единичный импульс тока обычно вызывает один потенциал действия, но когда
стимулирующий ток поддерживается, потенциалы действия могут с регулярно-
стью повторяться. При увеличении подаваемого постоянного тока в аксоне каль-
мара возникает вместо одного спайка более 50 спайков в секунду. При дальнейшем
увеличении тока эта частота возрастает не очень существенно (рис. 16.12). Таким
образом, аксон кальмара теряет в этой области информацию о том, насколько
сильным был стимулирующий ток. Такая утрата может не иметь значения для реф-
лекса удаления, инициируемого с участием гигантского аксона, но в случае других
функций сила тока способна, возможно, оказывать влияние через «более умные»
нейроны.
Частота генерации потенциала действия, как и его форма, зависит от функцио-
нирования ионных каналов. Инактивация натриевых каналов и закрывание ка-
лиевых каналов обусловливают рефрактерный период, который ограничивает час-
тоту ответов. В результате инактивации натриевых каналов аксон, кроме того, при-
обретает аккомодацию или теряет свою чувствительность, когда незначительный
стимулирующий ток индуцирует медленную деполяризацию. Поэтому, когда сти-
мулирующий ток равен 5 мкА, ответ ограничен лишь одним спайком (рис. 16.12).
Для других возбудимых клеток установлены сильно отличающиеся характеристи-
ки в отношении частоты ответов в соответствии с иными кинетическими свойст-
вами их потенциал-зависимых каналов. Для различных форм ритмической актив-
ности предложены объясняющие их гипотезы (Jack et al., 1983; ch. И). Здесь мы
икиш
I-1-1-1-1-'-1-1-1-1-1
О 20 40 60 80 100
Время, мс
Рис. 16.12. Результаты компьютерной имита-
ции ритмической активности в аксоне кальма-
ра. В уравнения Ходжкина—Хаксли был вклю-
чен стимулирующий ток (величина его указа-
на слева), подаваемый начиная со времени
1 мс в течение всего периода имитации.
496
Глава 16. Потенциал действия
рассмотрим лишь один важный пример для иллюстрации того, как добавление ка-
лиевого канала особого типа, исходно названного А-током, может резко изменить
электрическую активность нейрона. Активность этого канала обусловливает ли-
нейное изменение частоты ритмической импульсации в широком диапазоне.
При исследованиях с использованием в качестве объекта улитки Anisidoris из-
мерения в режиме фиксации напряжения с отведением от тела нейрона показали
наличие трех ионных токов: натриевого тока, качественно сходного по характери-
стикам с натриевым током в аксоне кальмара, и двух калиевых токов (Connor,
Stevens, 1971а, b). Один из этих калиевых токов, /к, имел некоторое сходство с ка-
лиевым током в аксоне кальмара, но другой калиевый ток, /А (А-ток), сильно отли-
чался по своим характеристикам. Выделенные при фиксации напряжения токи
показаны на рис. 16.13. Сдвиг потенциала от -80 до 40 мВ приводит к открыванию
/к-каналов с сигмоидной кинетикой активации. Отметим, что /А-каналы также по-
казывают сигмоидную кинетику активации, но этот ток инактивируется с посто-
янной времени примерно 200 мс. Инактивация становится все более выраженной
по мере изменения исходного напряжения от —80 мВ до —40 мВ. Это означает, что,
когда начальный потенциал равен —40 мВ (перед ступенчатым сдвигом до +40 мВ),
УА-каналы уже инактивированы и сдвиг до +40 мВ не может вызвать открывание
значительного числа этих калиевых каналов.
А-ток позволяет объяснить некоторые особые формы электрической активно-
сти, наблюдаемые в нейронах улитки Anisidoris. Активность, обусловленную свой-
ствами этих каналов, можно объяснить с помощью количественных выражений
---------------------------- 40мВ
-40 мВ
—80 мВ
Рис. 16.13. Сравнение кинетики активации /к,
обычного калиевого тока, и /а, временного ка-
лиевого тока, в нейроне улитки Графики по-
строены с использованием уравнений Шатте-
ра (Schutter, 1986) Потенциал поддерживали
на уровне от -80 до -40 мВ (это указано для ка-
ждого графика /А) и затем ступенчато изменя-
ли до 40 мВ. Ступенчатые изменения потенциа-
ла показаны внизу.
£.9. Ритмическая импульсация и А-ток
497
Рис. 16.14. Результаты компьютерного моде-
лирования ритмической активности в нейроне
улитки Anisidoris при возрастании стимулирую-
щего тока.
i---1----1---1----1---1----1---1----1---1----1
О 200 400 600 800 1000
Время, мс
для констант скорости (а и 0), характеризующих каждый процесс активации и
инактивации. Такие выражения в той же основной форме, что уравнения (16.7а)—
(16.7в), были выведены Шаттером (Schutter, 1986). Эти выражения можно исполь-
зовать вместо выражений Ходжкина и Хаксли для Na+- и К+-каналов. Решения
данных уравнений для случая поддерживаемого стимулирующего тока (рис. 16.14)
весьма отличаются от решений уравнений для аксона кальмара (рис. 16.12). Воз-
растание стимулирующего тока приводит к пропорциональному возрастанию час-
тоты потенциалов действия. Промежуток времени между потенциалами действия
определяется в основном кинетикой инактивации А-тока. Более сильные стимули-
рующие токи сдвигают потенциал через диапазон инактивации (от —80 до —40 мВ;
рис. 16.13) более быстро, так что А-ток инактивируется быстрее и новый потенци-
ал действия может возникнуть скорее. Соотношение между величиной стимули-
рующего тока и частотой спайков почти линейное (Connor, Stevens, 1971b; Jack et al.,
1983), хотя простого математического описания этой зависимости нет.
А-ток широко распространен и обнаружен в нейронах, обладающих рядом ин-
тересных свойств (Rogawski, 1985). При способности к ритмической активации
в широком диапазоне частот А-токи делают ответ клетки высокочувствительным
к малым изменениям потенциала относительно потенциала покоя. При этом по-
тенциале, близком к -70 или -80 мВ, инактивация каналов незначительна и кана-
лы А-тока полностью активны. В этом случае А-ток способен служить мощным
тормозом для внезапных возбуждающих импульсов. Постоянный стимул будет вы-
зывать только один потенциал действия после длительной задержки, во время ко-
торой А-ток инактивируется. Если мембранный потенциал находится на уровне
выше -50 мВ в течение более чем -200 мс, А-ток в основном инактивируется, так
что клетка проявляет намного более высокую чувствительность к стимуляции.
Кроме того, А-ток и другие калиевые каналы со сходными свойствами могут инак-
тивироваться под влиянием ритмической активности. Когда эти каналы инакти-
вированы, меньший калиевый ток реполяризует потенциал действия. Потенциалы
действия становятся тогда шире (Aldrich et al., 1979), и, если это происходит
в нервном окончании, больше ионов Са2+ входит в клетку во время спайка и в ре-
498
Глава 16. Потенциал действия
зультате инициируется высвобождение большего количества нейромедиатора
(Jackson et al., 1991).
Хотя термин А-ток еще широко используется, он стал несколько устаревшим.
Характерные для этого тока временные характеристики обнаружены у нескольких
различных калиевых каналов. К ним относится белок, кодируемый 5Ла£ег-геном
дрозофилы, и гомологичный ему белок млекопитающих Kvl.4. У млекопитающих
калиевые каналы Kv3.2, КуЗ.З и Ку4.1 показывают сходное поведение, и вспомога-
тельные субъединицы белков калиевых каналов (Р-субъединицы) могут комбини-
роваться с формирующими канал а-субъединицами для превращения его неинак-
тивирующейся формы в инактивирующуюся форму.
16.10. Колебания
Колебания мембранного потенциала служат механизмом регуляции разнообраз-
ных биологических процессов. Моделировать биологически реальные колебания
потенциала можно на минимальном комплексе из двух каналов, характеризующих-
ся различными скоростями активации. Если эти каналы проводят ионы с сильно
различающимися потенциалами Нернста, их активность будет конкурентно влиять
на потенциал, соответственно сдвигая его в противоположных направлениях. Для
иллюстрации рассмотрим модель Морриса и Лекара (Morris, Lecar, 1981), воспро-
изводящую колебания мембранного потенциала в мышечных волокнах рака.
Эта модель включает два потенциал-активируемых канала, кальциевый и ка-
лиевый. Потенциал Нернста для К+ в мышечном волокне рака составляет -70 мВ,
и открывание калиевых каналов сдвигает мембранный потенциал в направлении
отрицательных значений. Потенциал Нернста для Са2' равен 100 мВ, и открывание
кальциевых каналов сдвигает потенциал в направлении положительных значений.
Оба канала открываются, когда потенциал изменяется в сторону положительных
значений, но кальциевые каналы открываются быстрее и при немного больших
отрицательных значениях потенциала. Таким образом, при стимуле, сдвигающем
потенциал в направлении положительных значений, кальциевые каналы открыва-
ются первыми; при этом потенциал изменяется до ЕСа = 100 мВ. Калиевые каналы
открываются медленнее, но когда они обеспечивают большую проводимость ио-
нов калия, это вызывает сдвиг потенциала в обратном направлении. В результате
оба канала закрываются. Постоянный стимулирующий ток вызывает возрастание
потенциала и повторение цикла.
Исходя из наличия калиевых каналов, кальциевых каналов и пути утечки тока
запишем дифференциальное уравнение, отражающее изменение потенциала под
действием токов
с1И
с— = /стим + ССа(Г - Еса) + GK(V + Ек) + GL(y + EL) (16.22)
at
Изменение потенциала определяется суммой различных токов. Обратите внима-
ние на сходство данного уравнения с уравнением (16.9). Величина EL составляет
здесь -50 мВ.
Одно из достоинств модели Морриса—Лекара состоит в том, что она построена
на простейшей схеме потенциал-зависимых изменений состояния каналов. На-
16.10. Колебания
499
помним, что кривые для и лда (рис. 16.6, А) сходны с графиками уравнения
Больцмана, использованного для описания регуляции каналов мембранным по-
тенциалом в разд. 1.8 (рис. 1.5), и кривые для тт, тл и тл (рис. 16.6, Б) сходны с гра-
фиками для зависимых от потенциала скоростей переходов, приведенными в разд. 7.5
(рис. 7.9). В соответствии с этим возникает идея заменить чисто феноменологиче-
ские уравнения, описывающие т, h и п (уравнения (16.7а)—(16.7в)), более простыми
уравнениями, основанными на элементарных моделях боротных механизмов.
Для выражения зависимости вероятности открывания кальциевых каналов от
равновесного потенциала используем функцию Больцмана (уравнение (1.28))
= 1 + е”и/7,5 (16.23)
Калиевые каналы открываются при более высоких положительных значениях по-
тенциала, и соответственно этому в уравнении Больцмана для вероятности откры-
вания калиевых каналов, лда, величина потенциала меньше на 10 мВ
<16-24>
Как было отмечено вначале, существенное исходное условие в этой модели со-
стоит в том, что кальциевые каналы активируются гораздо быстрее, чем калиевые
каналы. На основании этого можно предположить, что зависимость вероятности
открывания кальциевых каналов от изменения потенциала не включает никакой
задержки (наподобие немедленного ответа т в уравнении (16.10)). Таким образом,
постоянная времени для т равна нулю.
Калиевые каналы отвечают на изменение потенциала медленнее, в соответст-
вии с чем можно записать
^ = (лш-л)/т„ (16.25)
а/
Это выражение подобно уравнениям (16.8а)—(16.8в), но имеет несколько иную
форму (задача 1). Изданного уравнения следует, что кинетика изменения л, пара-
метра потенциал-зависимости состояния калиевых каналов, описывается экспо-
ненциальной функцией с постоянной времени тл. Соответственно тп должна зави-
сеть от потенциала и мы можем использовать здесь модель переходов в мембранных
белках с пересечением энергетического барьера. При вероятности открывания, за-
данной уравнением (16.24), с использованием уравнения (7.17) получаем выражение
e(k-l0)/15 +e-(k-10)/15’ V • 7
где ап — это параметр, отражающий статистический вес энергетического барьера
перехода в отсутствие потенциала. Здесь выбрано значение ал = 0,05мс-1, чтобы
задать частоту колебаний в избранном диапазоне.
Уравнения (16.22)—(16.26) позволяют определить, как потенциал будет изме-
няться во времени. Этот набор уравнений подобен уравнениям Ходжкина—Хакс-
ли, но проще по форме, поскольку здесь имеется только две независимые пере-
менные. Для решения этих уравнений может быть использован тот же численный
способ: рассчитываются производные п и Кпо времени для начального условия и
затем новые значения п и Кдля малого приращения времени. Новые значения л и К
500
Глава 16. ПОТЕНЦИАЛ ДЕЙСТВИЯ
35 нА
ШлААМААА
80 нА/
Рис. 16.15. Колебания потенциала в мышеч-
ном волокне рака, имитированные на модели
Морриса—Лекара. Пороговое значение тока
лежит между 35 и 40 нА, и для этих значений
стимулирующего тока кривые потенциала на-
несены на одном графике. Ток 80 нА вызывает
постоянную ритмическую импульсацию, ток
120 нА — затухающие колебания. Во всех слу-
чаях исходным потенциалом был потенциал
покоя -50 мВ.
120 нА j
0 100 200 300 400
Время, мс
используются вновь для вычисления производных, и этот цикл повторяется столь-
ко раз, сколько необходимо для моделирования изучаемой характеристики. Ре-
зультаты показаны на рис. 16.15 для четырех различных стимулирующих токов.
Подпороговый стимулирующий ток, 35 нА, просто смещает потенциал к ново-
му значению (одна из верхних кривых на рис. 16.15; потенциал покоя равен -50 мВ
и новое стационарное значение потенциала -27 мВ). Надпороговый стимулирую-
щий ток, 40 нА, приводит систему в состояние регулярных колебаний (ритми-
ческой импульсации), и при большем стимулирующем токе, 80 нА, частота коле-
баний возрастает. Наконец, когда стимул превышает критическую величину,
примерно 115 нА, колебания возникают, но затем затухают, и потенциал устанав-
ливается на новом стабильном уровне ~7 мВ.
Для описания колебаний имеются строгие математические теории, и мы про-
анализируем полученные уравнения немного подробнее с использованием неко-
торых положений этих теорий. Возьмем нулевые производные п и V по времени,
чтобы получить два условия стабильности. Приравнивая уравнение (16.22) нулю
и решая его относительно и, получаем выражение
-/стим -67L(K-rL)-GCa.MaKC^(r)(r-rCa) _
^К-макс(И-Ик)
= -Лтим -GdV - KL) - (Сса-макс/(1 + ~ О ( j6 27)
СК.Макс(И-Ик)
где GK = бк.макслг, GCa = ССа.максАи(И) и для на втором этапе преобразований ис-
пользовано уравнение (16.23). Приравнивая уравнение (16.25) нулю, получаем
где для пж использовано уравнение (16.24).
16.10. Колебания
501
Рис. 16.16. Нуль-клины для двух за-
висимых от времени переменных
в модели колебаний потенциала
в мышечном волокне рака. Графики
построены на основе уравнений
(16.27) и (16.28).
Эти два соотношения между и и К называют изоклинами нулевого смещения,
или нулъ-клинами. Их иллюстрирует рис. 16.16. Стимулирующий ток в этом случае
варьировали, используя некоторые из значений, приведенных на рис. 16.15.
Нуль-клины для dK/dZ (уравнение (16.27) возрастают при увеличении /стим. Для
dn/dz вычерчена только одна нуль-клина, поскольку /стим на эту величину не влияет.
Возможно найти стабильную точку, удовлетворяющую обеим нуль-клинам.
Удовлетворения только одному из этих условий недостаточно, так как другая вели-
чина будет изменяться. Однако пересечение двух нуль-клин — это место, где обе
переменные имеют постоянное значение. При I = 35 нА нуль-клины пересекаются
в трех точках. Наименьшее значение потенциала составляет -27 мВ, и это стабиль-
ная конечная точка соответствующих модельных кривых на рис. 16.15. Другие точ-
ки пересечения нестабильны, даже несмотря на то, что обе производные по време-
ни равны нулю. Причина этого состоит в том, что когда при бесконечно малых
смещениях от этих точек в п— И-пространстве производные становятся ненулевы-
ми, знаки этих производных такие, что значения п и Кбудут всегда удаляться от
данных точек пересечения. Эти точки подобны состоянию балансирования стула
на одной ножке. Малейшее возмущение будет сбивать их.
Важно отметить, что пороговое значение потенциала для генерации потенциа-
ла действия характеризуется тем же свойством нестабильности. Как видно из врез-
ки на рис. 16.8, Б, в точке, где ток равен нулю вблизи позиции -62 мВ, напряжение
не изменяется, но малейшее возмущение влево возвращает мембрану к потенциалу
покоя, а малейший сдвиг влево вызывает потенциал действия.
Снижение /стим ниже 35 нА сдвигает нуль-клину dK/dZ вниз, и стабильная точ-
ка пересечения смещается влево. Однако при возрастании /стим кривая сдвигается
вправо и в итоге смещается эта точка пересечения. В случае, когда /стим = 80 нА,
имеется только одна точка пересечения и она нестабильная. Ритмическая импуль-
сация при этом стимулирующем токе отражает отсутствие стабильной точки
в п— К-пространстве. Нет пары величин w и К, которая постоянно соответствовала
бы этой величине /стим. Возрастание /стим далее сдвигает одну точку пересечения
вправо, и, когда две кривые пересекаются или проходят локальный максимум
в нуль-клине dP/dZ, становится возможной стабильность. Конечный потенциал
при стимулирующем токе 120 нА на рис. 16.15 соответствует точке пересечения
нуль-клин для этого тока на рис. 16.16.
502
Глава 16. Потенциал действия
V, мВ V, мВ
Рис. 16.17. Изменение п в зависимости от потенциала для двух кривых, представленных на
рис. 16.15, и соответствующие нуль-клины (пунктирные кривые) из рис. 16.16.
Концепция п— К-пространства служит полезным подходом для визуализации
колебаний. На рис. 16.17 представлен график зависимости п от Квместе с нуль-кли-
нами. Колебания потенциала при /стим = 80 нА определяют кривую в виде замкну-
той петли, уходящую в бесконечность в направлении против часовой стрелки. На-
правление ясно обозначается ходом петли от точки начального напряжения -50 мВ.
Обратите внимание, что точка пересечения нуль-клин попадает внутрь петли.
Затухающие колебания при /стим =120 нА обусловливают л—И-график, кото-
рый спирально закручивается внутрь, к точке пересечения нуль-клин. Это непо-
средственно соответствует затуханию колебаний на нижнем графике рис. 16.15.
Математический анализ колебаний позволяет выявить гораздо больше зависи-
мостей. Для любого набора параметров, регулирующих зависимость т, п и тп от
потенциала, можно разделить пространство параметров на области с количествен-
но различными динамическими характеристиками. Это продемонстрировано в ра-
боте Morris, Lecar, 1981; в ней приведены также ссылки на другие работы в этом на-
правлении.
16.11. Интеграция сигналов в дендритах
Синаптические входы нейрона находятся на его дендритах. Об этом шла речь
в гл. 15, где изложен механизм пассивного распространения стимула в отсутствие
активности клеточной мембраны. Хотя в отношении этого предположительного
механизма распространения стимула исследователями были высказаны существен-
ные возражения, он широко использовался при анализе проведения электрических
сигналов, поскольку его строгую проверку трудно было осуществить. В 1994 г. Стю-
арт и Сакманн (Stuart, Sakmann) с помощью метода локальной фиксации непосред-
ственно продемонстрировали, что в мембране дендритов присутствуют потенци-
ал-зависимые натриевые каналы. Это изменило подход, на основе которого нейро-
физиологи анализировали интеграцию сигналов в дендритах. В настоящее время
теория пассивного распространения стимула заменяется более реалистичными мо-
делями, включающими участие потенциал-зависимых каналов в проведении сиг-
16.11. Интеграция сигналов в дендритах
503
нала. Однако интеграцию очень слабых, подпороговых синаптических стимулов
по-прежнему трактуют на основе кабельной теории и она продолжает служить по-
лезной основой для разработки теорий активного проведения стимула.
Теперь мы модифицируем анализ, проведенный в предыдущей главе, — доба-
вим в мембрану каналы и посмотрим, что в результате изменится. Эксперименты,
подобные тем, которые осуществили Стюарт и Сакман, показали, что, хотя мем-
брана дендритов содержит потенциал-зависимые ионные каналы, их плотность
в ней довольно низка; она составляет лишь несколько процентов плотности тех же
каналов в мембране гигантского аксона кальмара. При низкой плотности каналов
трудно инициировать потенциал действия путем введения тока в дендрит. Факти-
чески, когда сильный ток вводят в дендрит, изменение потенциала распространя-
ется в тело нейрона и начальный участок аксона. Затем в аксоне возникает потен-
циал действия, который распространяется обратно в тело нейрона и дендриты.
Модельные кривые на рис. 16.8, Б иллюстрируют эти моменты на примере
клетки той же формы, которая служила объектом при анализе пассивной интегра-
ции синаптических сигналов (рис. 15.14, А), но с добавлением отрезка аксона. Эти
рис. 15.14, А. но с искусственно до-
бавленным аксоном длиной 500 мкм.
Б. Имитируемые ответы на синапти-
ческий ток в участке входа вызывают
потенциал. действия, возникающий
в аксоне и распространяющийся об-
ратно в дендриты. Плотность потен-
циал-регулируемых каналов в аксоне
в 40 раз выше, чем в дендритах и теле
нейрона. В. В отсутствие ионных ка-
налов в теле клетки и дендритах по-
тенциал действия по-прежнему воз-
никает в аксоне, но не распространя-
ется в дендриты. Имитацию динамики
осуществляли с помощью программы
NEURON (Hines, Carnevale, 1997) и с
использованием опубликованных па-
раметров каналов (Migliore et al., 1999).
504
Глава 16. Потенциал действия
кривые получены с помощью компартмент-модели (см. разд. 15.9), в которую
были включены потенциал-зависимые ионные каналы (Mainen et al., 1995; Rapp et
al., 1996). Дендриты и тело нейрона содержали дендритный натриевый канал, ак-
сон содержал натриевые каналы с более низким порогом и более медленной кине-
тикой, причем плотность их в аксоне была в 40 раз более высокой по сравнению
с плотностью в мембране дендритов. Плотность калиевых каналов составляла 30%
плотности натриевых каналов. К участку на дендритной структуре, показанному
на рис. 16.18, Л, был приложен высокоинерционный синаптический вход. Это
приводило к медленной деполяризации, распространявшейся в аксон, где порого-
вое значение потенциала было достаточно низким, чтобы мог возникнуть потен-
циал действия. Затем потенциал действия распространялся в дендрит.
На рис. 16.18, В представлены результаты моделирования на той же клетке, но
при условии, что мембрана дендрита не содержит каналов. Синаптический сигнал
по-прежнему приводил к возникновению в аксоне потенциала действия, но он не
распространялся в дендриты.
С помощью аналогичного моделирования были определены биофизические
свойства, важные для воспроизведения экспериментально наблюдаемых процес-
сов (Mainen et al., 1995; Rapp et al., 1996). Низкая плотность каналов в дендритах
и их высокая плотность в аксонах создают большую разницу в пороговых значени-
ях потенциала в этих двух областях. Если это различие превышает уменьшение по-
тенциалов, связанное с их распространением из дендритов в аксон, порог будет
достигаться в аксоне раньше, чем в дендрите (Rapp et al., 1996). Разница в порогах
возрастает дополнительно в результате различий в зависимостях от потенциала
и в кинетиках между натриевыми каналами в этих двух областях.
Хотя низкая плотность каналов в дендритах препятствует возникновению
в них потенциала действия, она достаточна для того, чтобы потенциал действия,
возникший в другом месте, мог распространяться в дендриты. Распространение
потенциала действия в дендриты имеет особо важное значение, поскольку эти из-
менения потенциала достаточны для того, чтобы открывались потенциал-
зависимые кальциевые каналы. В результате входа Са2+ инициируются каскады
сигналов, изменяющие силу синаптических импульсов. Такие изменения в синап-
тической функции, связанные с этой активностью, обеспечивают способность
мозга к научению и адаптации реакций организма на внешние воздействия.
Обратное распространение потенциала действия в дендриты может регулиро-
ваться активностью потенциал-зависимых каналов. В мембране дендритов обна-
ружен А-ток, описанный выше в связи с ритмической импульсацией. Напомним,
что степень инактивации этих каналов варьирует в зависимости от потенциала по-
коя. Кроме того, А-ток может регулироваться по механизму фосфорилирования
каналообразующего белка. Удерживая мембранный потенциал на уровне ниже по-
рогового, А-ток способен лимитировать расстояние, на которое потенциал дейст-
вия распространяется обратно в дендриты, уменьшая изменение потенциала в их
отдаленных участках. Но если А-ток инактивирован, обратное распространение
потенциала действия, как показывают результаты моделирования, возможно на
довольно значительное расстояние (Migliore et el., 1999). Поскольку от поступле-
ния потенциала действия в дендриты при электрической активности зависит вход
Са2+, этот механизм может определять, насколько синапсы нейрона будут модифи-
цироваться в зависимости от условий.
Задачи
505
Задачи
1. Продемострируйте, что уравнение (16.8а) можно эквивалентно выразить как
d/w/dr = (т^-т)/тм. (Разумеется, другие уравнения этой группы также могут быть
переведены в эту форму.)
2. Почему на графике, приведенном на врезке рис. 16.8, Б, порог будет несколько
выше, чем потенциал в точке второго пересечения осн абсцисс?
3. С использованием уравнений (16.7а)—(16.7в) и (16.9) запишите полное выраже-
ние, которое можно решить (численным способом), чтобы определить потенциал
покоя.
4. Постройте график уравнения (16.11) при начальном потенциале -75мВ вместо
-65 мВ и используйте этот график для определения порога. Как эта величина отли-
чается от показанной на рис. 16.8, Б? Вначале определите поддерживающий ток,
который следует прибавить к /стим, чтобы получить начальное напряжение -75 мВ.
Значения тока на графике должны соответствовать этому поддерживаемому току.
5. С использованием компьютерного языка или программ моделирования, таких как
MATLAB, MATHCAD или MATHEMATICA, составьте код, который интегрирует
систему уравнений Ходжкина—Хаксли со стимулирующим током, чтобы получить
потенциал действия (много подобных результатов получено с помощью програм-
мы MATHCAD). Не используйте такие программы, как NEURON или GENESIS,
поскольку они уже содержат код, который вам требуется найти.
6. Для случая, когда натриевые каналы не инактивируются (рис. 16.2, Б, кривая в),
рассчитайте с помощью уравнений Ходжкина—Хаксли конечное значение потен-
циала, которое устанавливается после потенциала действия.
7. Составьте выражение для изменения потенциала при условиях, что в аксоне каль-
мара натриевые каналы полностью блокированы и деполяризующий ток
20 мА-см"2 подается в течение 50 мс. Используя уравнения Ходжкина—Хаксли,
определите значения потенциала в ключевые моменты времени во время стимула
и по его окончании.
Приложение 11
Разложения и ряды
П1.1. Ряды Тейлора
Любая гладкая функция в окрестности каждой точки может быть аппроксимиро-
вана касательной к этой функции в данной точке. Данная аппроксимация имеет
вид
F(x+8x)« F(x) + 5x^^ (П1.1)
dx
Это иллюстрирует график на рис. П1.1. Очевидно, что с увеличением окрестности
данная аппроксимация ухудшается. Увеличение 8х ведет к все большему отклоне-
нию кривой функции от аппроксимирующей ее прямой. Аппроксимацию можно
улучшить, добавив вторую производную
г/ я \ г/ \ я dF(x) 8x2d2F(x) _
F(x + 5х) « F(x) + 5х —— +--(П1.2)
dx 2 dx
Теперь в качестве аппроксимирующей линии, проходящей через точку х, исполь-
зуем вместо прямой параболу. Такое приближение точнее, но и оно ухудшается
с увеличением 8х.
В общем виде этот способ аппроксимации лежит в основе разложения Тейло-
ра, которое позволяет аппроксимировать любую непрерывную функцию на произ-
вольном расстоянии от х с желаемой степенью точности, при условии, что опреде-
лены все производные по х
Рис. П1.1. Произвольная гладкая функция в окрестности точки х
аппроксимирована прямой, проходящей через эту точку с на-
клоном, равным производной данной функции в этой точке
(уравнение (П1.1)).
1 Редактирование перевода приложений осуществлено А. В. Финкельштейном.
П1.3. Геометрическая прогрессия
507
я \ г/ X я <*F(x) Sx2 d2F(x) 5х3 d3F(x)
F(x + 8х) = F(x) + 8х —— +----------+ —----------V2-
dx 2 dx2 6 dx3
. ^8x"d"F(x)
= F(x) + >-----—
Ь n\ dx"
(П1.3)
Разложение функции в ряд Тейлора до первой ил и-второй степени 8х широко
используется при теоретическом анализе. Чаще всего возникает необходимость
разложения функций, приведенных ниже. Здесь они представлены как вычислен-
ные до третьей степени х непосредственно из уравнения (П1.3). Как правило, эти
разложения справедливы для малых значений х.
л, X2 X3
е =1 + х + — + —...
2 6
х2 х3
1п(1+х) = Х-у + у ...
(П1.4)
(П1.5)
(П1.6)
П1.2. Биномиальное разложение
Биномиальное разложение имеет следующий вид
N N ।
(а + Р)"=У ’ а'Р
-z)!z!
/п N-i
(П1.7)
Это разложение легко проверить при малых значениях N. Для произвольных зна-
чений N комбинаторный член M/(N-l)!z! представляет собой число различных
способов размещения, /, значков а в N клетках.
П1.3. Геометрическая прогрессия
Перемножением двух сомножителей легко проверить, что
(1 -а)(1 + а + а2 + а3...ал) = 1 -ал+1 (П1.8)
Сумма геометрической прогрессии, т. е. второй слева сомножитель в уравнении
(П1.8), вычисляется следующим образом
п 1 Л+1
Za'=V— <п1-9>
1-а
Дифференцируя это уравнение по а и затем умножая на а, получаем выражение
508
Приложение I. РАЗЛОЖЕНИЯ И РЯДЫ
A.g^ad-a^-C^Da-' (Ш ,10)
£о (1-а) 1-а
При п-><х> и0<а<1из уравнений (П1.9) и (П1.10) получаем соответственно
00 1
£>'=-!- (П1.11)
to 1-а
V / а
/ /а =----7
to О-a)2
(П1.12)
Приложение 2
Матричная алгебра
П2.1. Линейные преобразования
С помощью матриц можно упростить математический анализ задач с несколькими
линейными уравнениями и неизвестными. Рассмотрим в качестве примера четыре
линейных уравнения с четырьмя неизвестными
0ц*1 +012*2 + Л13Х3 + 014*4 = У\ (П2.1а)
021*1 + 022*2 + ^23*3 +024^4 = У2 (П2.16)
031Xj +032*2 + ^33*3 +Л34*4 = Уз (П2.1в)
041Xj +042 *2 + 043 *3 + 044*4 = У4 (П2.1г)
Используя матрицы и векторы, можно записать эти уравнения в виде одного урав-
нения в матричном виде
Ах = у, (П2.2)
где х и у — векторы с координатами (*ь х2, *3, *4) и (уь у2, у3, у4) соответственно
и А — матрица вида
4i 012 а\з 014
А = 02] а22 а23 024 (П2.3)
^31 а32 ^33 034
4^41 а42 043 044 у
Векторы представимы в виде столбцов, и соответственно из уравнения (П2.2) по-
лучаем
0ц 012 013 014 V +1'
^21 а22 а23 а24 *2 — У2 (П2.4)
а3\ а32 а33 а34 *3 Уз
к041 042 043 044 > кХ4> ^4,
Здесь умножение матрицы на столбец вектора включает следующие действия: каж-
дую строку матрицы представляют в виде вектора и затем берут скалярное произ-
510
Приложение 2. МАТРИЧНАЯ АЛГЕБРА
ведение каждой строки на столбец х. При этом каждый элемент вектора у пред-
ставляет собой сумму в уравнениях (П2.1а)—(П2.1г).
Такой краткий вид запись имеет и в том случае, когда рассматривается ряд по-
следовательных преобразований. После записи Ах = у, преобразующей х в у, можно
выполнить второе преобразование, By = z. Если воспользоваться системой обозна-
чений из уравнений (П2.1а)—(П2.Id) и выразить Zi, z2, Z3 и через х1? х2, х3 и х4, ре-
зультат будет чрезвычайно сложным. В отличие от этого в матричной форме запись
последовательного преобразования имеет простой вид
ВАх = z (П2.5)
При этом каждый элемент матрицы-произведения ВА определяется как скалярное
произведение соответствующей строки матрицы В и соответствующего столбца
матрицы А. Для элемента, лежащего на пересечении /-й строки и у-го столбца мат-
рицы ВА, получаем
(ВА), = £*1А,- (П2.6)
к=\
Г12.2. Определители
Определитель квадратной матрицы А обозначают как |А|. Этот определитель сум-
мирует все возможные произведения, получаемые перемножением элементов мат-
рицы А, причем каждый индекс столбца и каждый индекс строки входит в каждое
произведение только один раз. Произведение будет иметь знак минус, если для
того, чтобы все сомножители этого произведения стали иметь индекс вида П, тре-
буется нечетное количество перестановок индексов столбцов (или строк) внутри
этого произведения; в противоположном случае произведение будет иметь знак
плюс. В случае матрицы 2x2, имеем
|А| =
«II
*21
*12
*22
- ДцД22
*12*21
(П2.7)
Для матрицы 3x3
*и
|А|= а2|
«12
*22
*13
*23 “ *11*22*33 “*11*32*23 “*21*12*33 +*21*13*32 +*31*12*23 “*31*22*13
(П2.8)
*31 *32 *33
Если какую-либо строку (или столбец) можно получить линейной комбинаци-
ей других строк (или столбцов), определитель равен нулю. Таким образом, условие
неравенства нулю определителя указывает, являются ли строки (и столбцы) ли-
нейно независимыми. В качестве примера рассмотрим матрицу А, в которой чет-
вертый столбец состоит из нулей. Преобразуем эту матрицу в матрицу А', для чего
заменим нули в четвертом столбце значениями вектора у, полученными как Ах. То-
гда определитель матрицы А' равен нулю, поскольку четвертый столбец представ-
ляет собой линейную комбинацию трех других столбцов. При этом четвертый
П2.2. Определители
511
столбец является избыточным. Действие этого столбца может быть как бы погло-
щено тремя другими столбцами, и такое преобразование дает матрицу, состоящую
всего из трех столбцов.
В случае, когда матрица вырожденная, соответствующие линейные уравнения
также вырожденные.1 Это означает, что когда мы трансформировали четыре эле-
мента вектора х в четыре элемента вектора у, один из элементов х не был необхо-
дим (в качестве отдельного элемента. — Ред.), и можно было вычислить четыре
элемента вектора у, имея лишь три элемента вектора х (точнее, х". — Ред.). Следо-
вательно, нельзя использовать у для воспроизведения всех четырех значений век-
тора х, поскольку это повлекло бы за собой нахождение четырех неизвестных с по-
мощью только трех уравнений.2
Если матрица не вырожденная, можно восстановить вектор х по вектору у. Та-
кое обратное преобразование определяет обратную матрицу
А ’у = х
(П2.9)
Это уравнение имеет ту же форму, что уравнение (П2.2), и А-1 представляет собой
квадратную матрицу той же размерности, что матрица А. Найти обратную матрицу
можно тогда и только тогда, когда |А|*0.
Умножим уравнение (П2.9) справа на А
АА ’у = Ах
(П2.10)
Произведение АА 1 = I, где I — единичная матрица (такая, что 1х = х). Диагональ-
ные элементы матрицы I равны единице, все остальные элементы — нулю.
'1 0 0 0'
! ° i 0 0
"0010
ч0 0 0 1,
Одна из важных общих теорем для матриц с ненулевым определителем состоит
в том, что определитель произведения равен произведению определителей
|АВ|=|А||В| (П2.12)
1 Если четвертый столбец имеет вид(А')/4 = Xj(А)л + Х2(А)/2 + Х3(А)/3, где Xj, Х2, Х3 — мно-
жители линейной комбинации векторов (А),|, (А)/2, (А)/3, то уравнения (П2.1а)—(П2.1г) приобре-
тают вид
(А)/1Х| + (А)/2х2 + (А)/3х3 + [X] (А),| + Х2(А)/2 + Х3 (А )/3 ]х4 =
= (А)/1[х1 + Х1х4] + (А)/2[х2 + Х2х4] + (А)/3[х3 + Х3х4] = Yit где i = 1, 2, 3,4, (*)
т.е. выражают действие матрицы, состоящей из трех векторов, (А)/1,(А)/2 и Х3(А)/3, на вектор х",
состоящий из трех элементов: х" =Xj + XjX4, х2' =х2 + Х2х4, х'3 =х3 + Х3х4. — Прим. ред. перев.
2 Речь идет о невозможности однозначно получить Х|, х2, х3, х4 из трех уравнений
xj' =Х| + Х|Х4, х2 =х2 + Х2х4, х3 =х3 + Х3х4. Автор вообще оставляет за скобками вопрос о невоз-
можности, в общем случае, получить три неизвестных величины х", х2, х'3 из четырех уравнений
(*). — Прим. ред. перев.
512
Приложение 2. МАТРИЧНАЯ АЛГЕБРА
Для матрицы 2x2
|А||В| =
«и
Д2|
а12 Pl I
а22 P2I
“ (Л| 1^22 ~ а\2а2\^\\^22 ~ ^12^21)
- 1^22^11^22 ~а\ 1^22^12^21 а\2а21^11^22 + а\2а21^12^21 (П2.13)
^ц^ц + ^12^21 а\Ф\2 +^12^22
а2\^\\ +а22^21 а2\^\2 +а22^22
= (Л||/>|| + 2^21X^21^12 + а22^22) ~ (^11^12 + а\2^21)(.а2\^\ 1 +^22^21)
= ^11^1^21^2 +а\\^\а22^22 + а\2^2\а2\^\2 + а 12^2\а22^22 ~
~а\\^\2а2\^\\ ~ а\\^\2а22^2\ ~ а\2^22а2\^\\ ~ а\2^22а22^2\
= а\\^\а22^22 + а\2^2\а2\^\2 ~ а\\^\2а22^2\ ~ а\2^22а2\^\\ (П2.14)
Результаты уравнений (П2.13) и (П2.14) тождественны. Справедливость уравнения
(П2.12) можно доказать для квадратной матрицы любой размерности.
П2.3. Собственные значения, собственные векторы
и диагонализация
Рассмотрим уравнение, в котором произведение матрицы на вектор равно произ-
ведению числа на тот же вектор
Ах = Хх (П2.15)
Величина X в этом уравнении называется собственным значением (или характери-
стическим числом) матрицы А, величина х — собственным вектором (или характе-
ристическим вектором) матрицы А. Такой тип уравнений встречается довольно
часто, поэтому мы изложим основные принципы вычисления собственных значе-
ний и рассмотрим некоторые свойства собственных векторов.
Соответственно равенству Хх = Х1х можно перегруппировать уравнение
(П2.15) следующим образом
(А-Х1)х=0 (П2.16)
Поскольку данное произведение равно нулю1, мы можем выразить один из столб-
цов матрицы А-XI как линейную комбинацию остальных столбцов.2 Определи-
тель такой матрицы равен нулю.
|А-Х1|=0 (П2.17)
1 Это возможно только тогда, когда либо матрица А -XI состоит из одних нулей, либо х,
п-мерный вектор, перпендикулярен всем п векторам-строкам п-мерной матрицы А - XI, т. е. ко-
гда все эти векторы-строки укладываются в пространство размерности п -1 и, значит, линейно
зависимы. — Прим. ред. перев.
2 Заметим, что х = 0также является решением уравнения (П2.14), но этот случай не представ-
ляет здесь интереса.
П2.3. Собственные значения, собственные векторы и диагонализация
513
Данное уравнение называют характеристическим уравнением матрицы А. Оно
является полиномиальной функцией степени п по X, где п — размерность матри-
цы А. Это очевидно из содержания предыдущего подраздела: слагаемые определи-
теля представляют собой произведения, включающие по п элементов матрицы,
взятых из различных строк и столбцов. В число данных слагаемых входит и произ-
ведение диагональных элементов (я,, -X), а это — полином /?-й степени по X.
Степень остальных слагаемых определителя будет ниже п по X. В число слагае-
мых будет входить также член, не содержащий X (он равен |А|). Таким образом,
определитель матрицы — это сумма разных степеней X, где член с высшей степе-
нью — V.
Таким образом, собственные значения матрицы можно определить как корни
уравнения (П2.17). Полином и-й степени имеет п решений, поэтому матрица раз-
мерности пхп имеет п собственных значений. Иногда некоторые собственные
значения идентичны, и в этом случае их называют вырожденными. Собственные
значения матрицы могут быть также комплексными.
Каждое собственное значение имеет собственный вектор, связанный с ним
уравнением (П2.15). Для удобства присвоим собственным значениям и собствен-
ным векторам индексы. Таким образом, имеется п уравнений, подобных уравне-
нию (П2.15)
Ах,=Х,х,- (П2.18)
Построим матрицу /7х и, столбцы которой являются собственными векторами
X = (х,, х2,... хл) (П2.19)
Транспонирование этой матрицы, определяемое как перевод строк в столбцы или,
что то же самое, столбцов в строки, можно записать в виде
X1 =
(П2.20)
где каждый вектор х- получается транспонированием в ряд вектора-столбца х,.
Без потери общности можно наложить условие, что каждый вектор х имеет
единичную длину в и-мерном пространстве, т. е. х- =1 (поскольку собственный
вектор, умноженный на число, также удовлетворяет уравнению (П2.15)). Кроме
того, можно продемонстрировать, что векторы х, формируют ортогональную сис-
тему векторов, т. е. произведение любых двух из них равно нулю: х*ху =0, если
i * j. Заметим, что умножение вектора-строки на вектор-столбец подчиняется об-
щим правилам умножения матриц и эквивалентно скалярному произведению век-
торов. Ввиду того, что произведения векторов равны нулю (если / * j) или едини-
це, матрицы X1 и X обратны друг другу: Х'Х = I.
Умножая А на X и используя уравнение (П2.18), получаем уравнение
АХ =(Х,Х, Д2Х2,...ДУХЛ)
(П2.21)
514
Приложение 2. МАТРИЧНАЯ АЛГЕБРА
Умножение левой части этого уравнения на X1 дает в правой части уравнения мат-
рицу, для которой каждый элемент имеет форму х,- Хуху. Все недиагональные эле-
менты в правой части уравнения равны нулю, поскольку х • ху = 0 при i * j, а диаго-
нальные элементы представляют собой собственные значения, так как х-=1.
Итак, мы имеем выражение
ХАХ = А, (П2.22)
гдеЛ — диагональная матрица с элементами Л„ = X,.
Операцию, с помощью которой получено уравнение (П2.22), называют диаго-
нализацией. Она состоит в том, что левую и правую части уравнения умножают на
матрицы, чтобы получить диагональную матрицу, т. е. такую, в которой на диаго-
нали стоят собственные значения исходной матрицы, а остальные места занимают
нули. Вспомним, что XlX = I. Из правила перемножения (уравнение П2.12) следует,
что диагонализация матрицы не меняет ее определителя (поскольку |Л| = |Х1||А||Х|
и |Х11 |Х| = 1. — Ред.). Определитель Л представляет собой просто произведение соб-
ственных значений, так как это единственное ненулевое произведение, которое
можно составить из элементов различных строк и столбцов Л. Поскольку опреде-
лители матриц А и Л одинаковы, можно записать выражение
|А| = |Л| = ПХ,. (П2.23)
i = \
Таким образом, как только найдены собственные значения матрицы, легко вычис-
лить ее определитель.
Приложение 3
Анализ Фурье
Анализ Фурье позволяет представить функции как суммы тригонометрических
функций двух видов — синусов и косинусов. Вначале покажем это на примере.
Возьмем периодическую функцию, меняющую свое значение с -1 на +1 и обратно
в точках, кратных л (рис. П3.1). Эту функцию можно точно представить суммой
F(x) = -fySin^2<~1)x^ (П3.1)
2/-1 )
Первые четыре члена данного ряда изображены на рис. П3.2 слева; суммы, полу-
ченные последовательным прибавлением каждого члена, изображены справа. При
добавлении членов со все более высокой частотой полученная сумма становится
все более сходной с функцией, изображенной на рис. П.3.1.
Уравнение ПЗ. 1 — это пример ряда Фурье. Вообще любую функцию (представ-
ляемую в виде графика. — Ред.)у на интервале [-я, я] можно представить как сумму
^(Х) = у +
(Я, sin(Zx) + В, cos(Zx))
i = \
(П3.2)
Чтобы иметь возможность использовать такое представление, необходимо знать
значения Л, и Вг Их можно получить путем умножения уравнения (П3.2) на sin(/x)
или cos(/x) (где j — целое положительное число) и интегрирования полученного
выражения на интервале [-я, л]. В результате этих операций правая часть уравнения
станет суммой следующих интегралов
л
| sin(yx) sin(Zx)dx = О
для Z * j
= л для Z = j
л
j cos( jx) cos(Zx)dx = 0 для Z j
(ПЗ.За)
= л для Z = j
Рис. П3.1. График знакочередующейся сту-
пенчатой функции.
(ПЗ.Зб)
17*
516
Приложение 3. АНАЛИЗ ФУРЬЕ
' = з щ/vwwvwwvwvwvwwvv
i = 4 —vwwvwwwwwwwwwvwwww
Рис. П3.2. Слева: графики первых четырех членов суммы уравнения (П3.1). Справа: графики, де-
монстрирующие результаты последовательного прибавления каждого из четырех членов суммы.
и
jsin(yx)cos(/x)dx =0 (ПЗ.Зс)
-я
Для каждого уравнения, полученного из уравнения (П3.2) таким умножением
и последующим интегрированием, только один из членов будет ненулевым. Для
уравнений, полученных умножением уравнения (П3.2) на sin(/x), единственный
ненулевой член будет
1 л
Aj = — j F(x)sin(yx)dx
(П3.4)
Для уравнений, полученных умножением на cos(/x), ненулевой член имеет вид
Bj = 1 j F(x)cos(A)dx (П3.5)
Чтобы получить Aq, следует непосредственно проинтегрировать уравнение (П3.2).
Интегралы sin(zx) и cos(zx) на этом интервале дают нуль; таким образом, остается
интеграл Aq/2 на промежутке от -л до л. Он равен лЛ0, следовательно
4=-j/’(x)dx (П3.6)
Уравнения (П3.4)—(П3.6) дают общий метод получения коэффициентов урав-
нения (П3.2) в явном виде. Фактически любую функцию можно выразить таким
Приложение 3. АНАЛИЗ ФУРЬЕ
517
образом. Коэффициенты Фурье для большого числа часто используемых функций
вычислены, и их можно найти в математических таблицах.
Отметим, что обычно легко определить, когда ряды Фурье будут состоять толь-
ко из синусов или только из косинусов. Если F(x) четная функция, т. е.
F(x) = F(-x), ряд будет состоять из косинусов, также четных. Если же F(x) нечетная
функция, т. е. F(x) = -F(-x), ряд будет состоять только из синусов, также в виде не-
четных функций.
Рассмотрим теперь преобразование Фурье. Вместо использования суммы три-
гонометрических функций мы можем перейти к пределу бесконечно малого рас-
стояния между частотами волн синуса и косинуса. В результате функция будет
представлена интегралом
F(x) = j/l(s)sin(5x)d5 +jz?(5)cos(5x)d5 (П3.7)
о о
Это уравнение — аналог суммы в уравнении (П3.2), но вместо индекса суммирова-
ния i оно содержит непрерывную переменную 5.
Для преобразования Фурье обычно удобно использовать формулу Эйлера
е1* = cos(x) + i sin(x) (П3.8)
Теперь выразим функцию F(x) как интеграл
F(x) = j<7(5)eixidi (П3.9)
-оо
Интеграл от косинуса в уравнении (П3.7) является действительной частью этого
выражения, причем теперь пределы интегрирования расширяются до ±оо. Появле-
ние предела -оо облегчает анализ, и при этом не утрачивается смысл суммирования
волноподобных тригонометрических функций.
Выражение для G(s) выводится путем умножения на е-1Х5 и интегрирования пох
jF(x)e'"ds= j j(7(5)eixIe-”d5dx = J G(j) Je“(,-y)dx dj (П3.10)
-00 -00 -00 -00 \-00 )
Второй интеграл, записанный в скобках, — это известное представление дельта-
функции, S(s-s'), умноженное на 1/2л
J F(x)e"“'dx = — J(z(j)5(s - /)ds (ПЗ. 11)
-00 -00
Интегрирование правой части уравнения по 5 дает значение функции G(s) при s = s'
j F(x)e ixs dx = |<7(У) (П3.12)
Эта операция — обратное преобразование Фурье. Отметим симметрию между этим
выражением и преобразованием Фурье (уравнение (АЗ.9)). Таким образом, можно
переходить от непрерывной переменной х к непрерывной переменной 5 и обратно.
На практике эти две переменные часто представляют собой время и частоту
518
Приложение 3. АНАЛИЗ ФУРЬЕ
Преобразования Фурье особенно полезны при решении дифференциальных
уравнений. Это объясняется простотой результатов, получаемых в случае примене-
ния преобразования Фурье к производным. Обозначим преобразование Фурье
функции G как ср((7). Тогда преобразование Фурье производной от G(s) будет
fdG i-я
= —ed5
J ds
(П3.13)
Интегрирование по частям дает
<р(^р| = G(s)e'x! - ix jG(s)eixsd5
(П3.14)
Часто известно, что при х —> ±оо значение функции (7(х) равно нулю. В этом случае
00
|(7(5)e,X5d5 = -ix(p(G)
-00
(П3.15)
Иными словами, преобразование Фурье, примененное к производной функции,
есть преобразование Фурье этой функции, умноженное на -ix. Это действие легко
распространить и на производные более высокого порядка. Новое умножение на
-ix дает
Ф —— = -х Ф((7)
\ds )
(П3.16)
Приложение 4
Гауссовы интегралы
Интеграл гауссовой функции не может быть легко вычислен для произвольных
пределов
ь
9 = Je'ax2dx (П4.1)
а
Однако его легко вычислить в пределах от -оо до оо. Это достигается перемножени-
ем двух таких интегралов
З2 = Je-cxx2(±x je’^dy = j je^e’^dxdy (П4.2)
-оо -оо -оо -oo
Перейдем к полярным координатам, где х2 +у2 = г2 и dxdy = rdrdO
92 = J je'arrdrdO (П4.3)
0=0r=0
Интеграл по 0 равен просто 2я. Интеграл по г решается методом замены перемен-
ных и - г2, и решение имеет вид 1/2сс. Таким образом, Э2 = л/а. Возьмем квадрат-
ный корень
9=Je-<“2dx = (П4.4)
Интеграл, взятый на интервале от х =0 до оо, — это половина нашего интеграла,
поскольку подынтегральная функция симметрична относительно х =0.
Другой полезный интеграл можно получить дифференцированием уравнения
(П4.4) по а. Продифференцировав один раз, получаем
(П45)
Продолжая дифференцирование, можно получить интеграл от любой четной сте-
пени х, умноженной на гауссову функцию.
Часто встречаются интегралы вида [ e-ax "Pxdx. Умножением на 1 = е"р /4аер /4а
J-00
они приводятся к виду уравнения (П4.4). В экспоненте образуется полный квад-
рат
520
Приложение 4. ГАУССОВЫ ИНТЕГРАЛЫ
je'“2'₽xdx =е₽2/4а je'a(x2+PA/a+₽!/4a!)dx =е₽2/4а Je'a(x+₽/2a)2dx (П4.6)
-00 -00 -00
Этот интеграл решается заменой переменных и = х + Р/2а
je““2‘₽W =e₽2/4a je"a“2du = e₽2/4a (П4.7)
Приложение 5
Гиперболические функции
Гиперболический косинус определяется как
cosh(x) = (П5.1)
Гиперболический синус есть
sinh(x) = - (П5.2)
Как можно видеть, эти две функции переводятся одна в другую дифференцирова-
нием. Гиперболический тангенс определяется как отношение гиперболического
синуса к гиперболическому косинусу, что аналогично определению тригонометри-
ческого тангенса как отношения синуса к косинусу
+ , z ч sinh(x) ех -е х /гг.
tanh(x) =----— =--------- (П5.3)
cosh(x) ех + е х
В отличие от тригонометрических функций, гиперболические функции можно
инвертировать. Умножим уравнение (П5.1) на ех и перегруппируем его
е2х - 2 cosh(x)ex + 1=0 (П5.4)
Это — квадратное уравнение относительно е*; его решение имеет вид
ех = cosh(x) ± 7cosh2(x)-l (П5.5)
и, следовательно,
х = ln(cosh(x) ± 7cosh2(x)-l) (П5.6)
Таким образом мы инвертировали гиперболический косинус. Заменив cosh(x) на и,
получаем
х = cosh”1 (и) = 1п(м ± л/м2 -1) (П5.7)
Аналогично этому
sinh”1 (и) = ln(w ±7w2 +1) (П5.8)
18 М. Джаксон
Приложение 6
Полярные и сферические
координаты
Во многих задачах ведется отсчет от одной центральной точки и основной пере-
менной является расстояние г до этой центральной точки. В таких случаях исполь-
зуют полярные или сферические координаты и уравнения записывают как функ-
ции г. При этом стандартные операции исчисления должны быть модифицирова-
ны. В случае одной плоскости необходимо перейти от декартовых координат х и у
к полярным координатам г и 0, в случае трехмерного пространства — от декартовых
координат х, у, z к сферическим координатам г, 0, ср (рис. П6.1).
Если функцию f\x,y) преобразуют к полярным координатам, она выражается
как /(г, 0)). Функция f(x,y, z), преобразованная к сферическим координатам, име-
ет вид /(г,0, ср). В этой книге рассматриваются изотропные случаи, когда функция
зависит только от г и не меняется с изменением угла поворота. Соответственно
этому функции зависят только от г, т. е. это функции f(r).
Чтобы проинтегрировать функцию по всему пространству, необходимо преоб-
разовать дифференциалы к новой системе координат. В полярных координатах
члены dxdy превращаются в rdrd0, и соответственно можно записать
J = J J/(r,0)rdrd0 (П6.1)
х=-оо^=-оо г=0 0=0
Когда f зависит только от г, интеграл по 0 записывается следующим образом
J J/(r,0)rdrdO = J/(r)2nrdr (П6.2)
/=0 0=0 r=0
Заметим, что множитель 2urdr — это площадь сферической оболочки радиусом г
и толщиной dr.
В сферических координатах дифференциал dxdyd^ преобразуется в дифферен-
циал г2 sin0drd0dcp, и соответственно интеграл имеет вид
f f J/(^,y,^)dxdyd^ = J j J/(r,0)sinOr2drd0d(p (П6.3)
x=-oo y=-<oz=-co г=0 0=0ф=0
В изотропном случае мы можем проинтегрировать по углам
f f J/(r, 0)sinOr2drd0d(p = J/(r)47cr2dr (П6.4)
r=0G=0<p=0 r=0
Приложение 6. ПОЛЯРНЫЕ И СФЕРИЧЕСКИЕ КООРДИНАТЫ
523
Рис. П6.1. Полярная и сферическая систе-
мы координат, показанные на фоне декар-
товых координат.
Полярные
координаты у
Отметим, что член 4лг2dr — это объем сферической оболочки радиусом г и толщи-
ной dr.
Преобразование координат влияет также на производную. Особое значение
имеет дифференциальный оператор Лапласа (лапласиан); он фигурирует во мно-
гих уравнениях в этой книге, в том числе в уравнении диффузии, уравнениях Пу-
ассона и Пуассона—Больцмана, а также в кабельном уравнении. В сферических
координатах полный лапласиан — это сложное выражение, но в изотропной систе-
ме производные по 0 и ср обращаются в нуль и выражение для лапласиана имеет вид
?2^Ж^ = 14Л^
дх2 ду2 dz2 r2dr< dr)
Альтернативный вариант выражения для лапласиана
г dr2
(П6.5)
(П6.6)
Применив теорему умножения производных, можно продемонстрировать, что эти
два выражения эквивалентны.
Литература
Abbott, A.J. and Nelsestuen, G.L. (1988). The collisional limit: an important consideration for
membrane-associated enzymes and receptors. Faseb J., 2, 2858—2866.
Accardi, A. and Miller, C. (2004). Secondary active transport mediated by a prokaryotic
homologue of С1ССГ channels. Nature, 427, 803—807.
Adam, G. and Delbriick, M. (1968). Reduction of dimensionality in biological diffusion processes.
In Structural Chemistry and Molecular Biology, ed. A. Rich and N. Davidson. San Francisco:
Freeman, pp. 198—215.
Adams, D.J., Dwyer, TM. and Hille, B. (1980). The permeability of endplate channels to
monovalent and divalent metal cations. J. Gen. Physiol, 75, 493—510.
Adams, S.A. and De Felice, L.J. (2002). Flux coupling in the human serotonin transporter. Biophys.
J., 83, 3268-3282.
Ahern, C.A. and Horn, R. (2004). Stirring up controversy with a voltage sensor paddle. TINS, 27,
303-307.
Aicken, C.C. (1990). Chloride transport across the sarcolemma of vertebrate smooth and skeletal
muscle. In Chloride Channels and Carriers in Nerve, Muscle, and dial Cells, ed. F. J. Alvarez-
Leefmans and J. M. Russell. New York: Plenum Press, pp. 209—249.
Aidley, D.J. (1978). The Physiology of Excitable Cells. Cambridge: Cambridge University Press.
Alber, T, Dao-pin, S., Wilson, K., Wozniak, J.A., Cook, S.P. and Matthews, B.W (1987). Contri-
butions of hydrogen bonds of Thr 157 to the thermodynamic stability of phage T4 lysozyme.
Nature, 330, 41-46.
Albery, WJ. and Knowles, J. R. (1976). Evolution of enzyme function and the development of cat-
alytic efficiency. Biochemistry, 15, 5631—5640.
Aldrich, R.W, Getting, P.A. and Thompson, S.H. (1979). Mechanism of frequency-dependent
broadening of molluscan neurone soma spikes. J. Physiol., 291, 531—544.
Allen, TW, Andersen, O.S. and Roux, B. (2004). Energetics of ion conduction through the
gramicidin channel. Proc. NotlAcad. Sri., 101, 117—122.
Aimers, W. and McCleskey. E.W (1984). The non-selective conductance in calcium channels of
frog muscle: calcium selectivity in a single-file pore. J. Physiol, 353, 585—608.
Andersen, O.S. (1983). Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measure-
ments at very high potentials. Biophys. J., 41, 119—133.
Anderson, C.R. and Stevens, C. F. (1973). Voltage-clamp analysis of acetylcholine produced end
plate current fluctuations at frog neuromuscular junction. J. Physiol, 235, 655—691.
Antzelevitch, C. (2001). Basic mechanisms of reentrant arrhythmias. Curr. Opin. Cardiol, 16, 1—7.
Aqvist, J. and Luzhkov, V. (2000). Ion permeation mechanism of the potassium channel. Nature,
404, 881-884.
Ashcroft, F.M. (2000). Ion Channels and Disease. San Diego: Academic Press.
Aurora, R., Creamer, T.P., Srinivasan, R. and Rose, G.D. (1997). Local interactions in protein
folding: lessons from the a-helix. J. Biol. Chem., 272, 1413—1416.
Aveyard, R. and Haydon, D. A. (1973). An Introduction to the Principles of Surface Chemistry. Cam-
bridge: Cambridge University Press, p. 231.
Axe, D.D., Foster, N.W. and Fersht, A.R. (1996). Active barnase variants with completely random
hydrophobic cores. Proc. Natl Acad. Sci., 93, 5590—5594.
Литература
525
Baldwin, R.L. (1996). How Hofmeister ion interactions affect protein stability. Biophys. J., 71,
2056-2063.
Barrett, J.N. and Crill, W.E. (1974). Specific membrane properties of cat motoneurons. / Physiol,
239, 301-324.
Bashford, C.L. and Pasternak, C.A. (1986). Plasma membrane potential of some animal cells is
generated by ion pumping, not by gradients. Trends Biochem. Sci., 11, 113—116.
Bass, R.B., Strop, P., Barclay, M. and Rees, D.C. (2002). Crystal structure of Escherichia coli
MscS, a voltage-modulated and mechanosensitive channel. Science, 298, 1582—1587.
Bedzek, M.J., Bommarito, G.M., Caffrey, M. and Penner, TL (1990). Diffuse-double layer at
a membrane-aqueous interface measured with X-ray standing waves. Science, 248, 52—56.
Beece, D., Eisenstein, L, Frauenfelder, H. et al. (1980). Solvent viscosity and protein dynamics.
Biochemistry, 19, 5147—5157.
Ben-Shaul, A., Ben-Tai, N. and Honig, B. (1996). Statistical thermodynamic analysis of peptide
and protein insertion into lipid membranes. Biophys. J., 71, 130—137.
Benedek, G.B. and Villars, F.M.H. (2000). Physics with Illustrative Examples from Medicine and Bi-
ology. New York: Springer-Verlag.
Benz, R. and Lauger, P. (1977). Transport kinetics of dipicrylamine through lipid bilayer mem-
branes. Biochem. Biophys. Acta, 468, 245—258.
Berezin, I.V, Kazanskaya, N.F. and Klyosov, A.A. (1971). Determination of the individual rate
constants of a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis with the added nucleophilic agent 1,4-buta-
nediol. FEBSLett., 15, 121-124.
Berg, H.C. (1983). Random Walks in Biology. Princeton: Princeton University Press. [Cited in
Chapters 6 and 8. This is an accessible and clear introduction to Brownian motion and diffusion
with good biological examples.]
Berg, H.C. and Purcell, E.M. (1977). Physics of chemoreception. Biophys. J., 20, 193—219. [Cited
in Chapter 8. A seminal paper that introduces many important concepts in diffusion-limited en-
counters.]
Berg, O.G. and von Hippel, P.H. (1985). Diffusion-controlled macromolecular interactions. Ann.
Rev. Biophys. Biophys. Chem., 14, 131 — 160. Berniche, S. and Roux, B.
(2000). Molecular dynamics of the KcsA K+ channel in a bilayer membrane. Biophys.J., 78,
2900-2917.
Betz, S.F., Bryson, J.W. and DeGrado, W.E (1995). Native-like and structurally characterized de-
signed n-helical bundles. Curr. Opin. Struct. Biol., 5, 457—463.
Bezanilla, F. (2000). The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol. Rev., 80,
555-592.
Blacklow, S.C., Raines, R.T, Lim, W.A., Zamore, P.D. and Knowles, J.R. (1988). Triosephosphate
isomerase catalysis is diffusion controlled. Biochemistry, 27, 1158—1167.
Blangy, D., Buc, H. and Monod, J. (1968). Kinetics of the allosteric interactions of phosphofru-
ctokinase from Escherichia coli. J. Mol. Biol., 31, 13—35. [Cited in Chapter 5. This provides an
example of how the MWC theory can synthesize a broad range of observations.]
Bloomfield, S.A., Hamos, J. E. and Sherman, S.M. (1987). Passive cable properties and morpho-
logical correlates of neurones in the lateral geniculate nucleus of the cat. j. Physiol., 383,
653-692.
Bloomfield, V.A., Crothers, D.M. and Tinoco, I. (1974). The Physical Chemistry of Nucleic Acids.
New York: Harper and Row, Publishers, Inc.
Boyle, P.J. and Conway, E.J. (1941). Potassium accumulation in muscle and associated changes.
J. Physiol., 100, 1-63.
Breslow, E. and Gurd, F.R.N. (1962). Reactivity of sperm whale metmyoglobin towards hydrogen
ions and p-nitrophenyl acetate. J. Biol. Chem., 237, 371—381.
526
Литература
Brooks, B.R., Bruccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan, S. and Karplus, M.
(1983). CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calcu-
lations. J. Cotnput. Chem., 4, 187—217.
Brouwer, A.C. and Kirsch, J.F. (1982). Investigation of diffusion-limited rates of chymotrypsin re-
actions by viscosity variation. Biochemistry, 21, 1302—1307.
Bruice, T.C. (1970). Proximity effects and enzyme catalysis. In The Enzymes II, ed. P.D. Boyer.
New York: Academic Press, pp. 217—279.
Bryant, R.G. (1996). The dynamics of water-protein interactions. Ann. Rev. Biophys. Biomol.
Struct., 25, 29-53.
Cai, M. and Jordan, P.C. (1990). How does vestibule surface charge affection conduction and toxin
binding in a sodium channel. Biophys. J., 57, 883—891.
Camacho, C.J. and Thirumalai, D. (1993). Minimum energy compact structures of random se-
quences of heteropolymers. Phys. Rev. Lett., 71, 2505—2508.
Cantor, P.R. and Schimmel, P.R. (1980). Biophysical Chemistry. San Francisco: W.H. Freeman and
Co. [Cited in Chapter 3. This thorough three-volume set has excellent chapters on conforma-
tional statistics of polymers and the helix-coil transition.]
Cardinale, G.J. and Abeles, R.H. (1968). Purification and mechanism of action of proline
racemase. Biochemistry, 7, 3970—3978.
Carra, J.H., Murphy, E.C. and Privalov, P.L. (1996). Thermodynamic effects of mutations on the
denaturation of T4 lysozyme. Biophys. /.,71, 1994—2001.
Carslaw, H.S. and Jaeger, J. C. (1959). Conduction of Heat in Solids. Oxford'. Oxford University
Press.
Cassidy, C.S., Lin, J. and Frey, P.A. (1997). A new concept for the mechanism of action of
chymotrypsin: the role of the low-barrier hydrogen bond. Biochemistry, 36, 4576—4584.
Caterall, W.A., Chandy, G.K. and Gutman, G.A. (eds.) (2002). The IUPHAR Compendium of Volt-
age-Gated Ion Channels. Leeds: IUPHAR Media.
Chan, H.S. and Dill, K. A. (1991). Polymer principles in protein structure and stability. Ann. Rev.
Biophys. Biophys. Chem., 20, 447—490. [Cited in Chapter 3. This article draws many interesting
connections between basic polymer theory and protein structure.)
Chandrasekhar, S. (1943). Stochastic problems in physics and astronomy. Rev. Mod. Phys., 15,
1—89. [Cited in Chapter 6. This is a clear account of Brownian motion, and is also included in
an excellent selection of related papers, edited by N. Wax and published by Dover.]
Changeux, J.P. (1984). Acetylcholine receptor: an allosteric protein. Science, 225, 1335—1345.
Chapman, M.L., Van Donger, H.M.A. and Van Donger, A.M.J. (1997). Activation-dependent
subconductance levels in the drk 1 К channel suggest a subunit basis for ion permeation and
gating. Biophys. J., 72, 708—719.
Checover, S., Nachliel, E., Dencher, N.A. and Gutman, M. (1997). Mechanism of proton entry
into the cytoplasmic section of the proton-conducting channel of bacteriorhodopsin. Biochem-
istry, M, 13 919-13 928.
Chen, Y.-D. and Hill, T.L. (1973). Fluctuations and noise in kinetic systems: Applications to K+
channels in the squid axon. Biophys. J., 13, 1276—1295.
Chung, S.-H., Allen, T.W., Hoyles, M. and Kuyucak, S. (1999). Permeation of ions across the po-
tassium channel: Brownian dynamics studies. Biophys. J., 77, 2517—2533. [Cited in Chapter 14.
A lucid treatment of K+ channel permeation with modern computational methods.]
Chung, S.-H., Allen, T.W and Kuyucak, S. (2002). Conducting-state properties of the KcsA po-
tassium channel from molecular and Brownian dynamics simulations. Biophys. J., 82, 628—645.
Cleland, W.W. (1970). Steady state kinetics. In The Enzymes, ed. P.D. Boyer. New York: Academic
Press, Vol. ii, pp. 1—65.
Cleland, W.W, Frey, P.A. and Gerlt, J.A. (1998). The low barrier hydrogen bond in enzymatic ca-
talysis. /. Biol. Chem., 273, 25 529-25 532.
Литература
527
Clements, J.D. and Redman, S.J. (1989). Cable properties of cat spinal motoneurons measured
by combining voltage clamp, current clamp and intracellular staining. J. Physiol, 409, 63—
87.
Cohn, E.J. and Edsall, J.T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions.
New York: Reinhold Publishing Corporation.
Colquhoun, D. and Hawkes, A.G. (1982). On the stochastic properties of bursts of single ion chan-
nel openings and of clusters of bursts. Phil. Trans. R. Soc. bond., B300, 1—59.
Colquhoun, D. and Hawkes, A.G. (1995). A Q-matrix cookbook. In Single-Channel Recording, ed.
B. Sakmann and E. Neher. New York: Plenum, pp. 589—633.
Connelly, P, Ghosaini, L, Hu, C.-Q., Kitamura, S., Tanaka, A. and Sturtevant, J.M. (1991). A dif-
ferential scanning calorimetric study of the thermal unfolding of seven mutant forms of phage
T4 lysozyme. Biochem., 30, 1887—1891.
Connor, J.A. and Stevens, C.F. (1971a). Inward and delayed outward membrane current in isolated
neural somata under voltage clamp. J. Physiol, 213, 1 — 19.
(1971b). Prediction of repetitive firing behavior from voltage clamp data on an isolated neurone
soma. J. Physiol, 213, 31—53.
Cooper, A. (1976). Thermodynamic fluctuations in protein molecules. Proc. NatlAcad. Sci., 73,
2740-2741.
Coronado, R., Rosenberg, R.L. and Miller, C. (1980). Ionic selectivity, saturation, and block in
a K+-selective channel from sarcoplasmic reticulum. J. Gen. Physiol, 76, 425—446.
Cox, D.R. and Miller, H.D. (1965). The Theory of Stochastic Processes. New York: Chapman and
Hall.
Crank, J. (1975). The Mathematics of Diffusion. Oxford: Oxford University Press.
Crothers, D.M., Drak, J., Kahn, J.D. and Levene, S.D. (1992). DNA bending, flexibility, and heli-
cal repeat by cyclization kinetics. Methods Enzymol, 212, 3—29.
Cubero, E., Luque, F.J. and Orozco, M. (1998). Is polarization important in cation-л: interactions?
Proc. NatlAcad. Sci., 95, 5976-5980.
Curtis, H.J. and Cole, K.S. (1942). Membrane resting and action potentials from the squid giant
axon. J. Cell. Comp. Physiol., 19, 135—144.
Daggett, V. and Fersht, A.R. (2003). Is there a unifying mechanism for protein folding? TIBS, 28,
18-25.
DeFelice, L.J. (1981). Introduction to Membrane Noise. New York: Plenum Press. (2004). Trans-
porter structure and mechanism. TINS, 27, 352—359.
De Gennes, PG. (1972). Exponents for the excluded volume problem as derived by the Wilson
method. Phys. Letts, 38A, 339—340.
De Lean, A., Stadel, J. M. and Lefkowitz, R.J. (1980). A ternary complex model explains the ago-
nist-specific binding properties of the adenylate cyclase-coupled b-adrenergic receptor. J. Biol.
Chem., 255, 7108-7117.
de Schutter, E. (1986). Alternative equations for the molluscan ion currents described by Connor
and Stevens. Brain Res., 382, 134—138.
Dill, K.A. (1990). Dominant forces in protein folding. Biochemistry, 29, 7133—7155. [Cited in
Chapter 2. This is an excellent review with an emphasis on the hydrophobic effect.]
Dill, D.A., Bromberg, S., Yue, K. et al. (1995). Principles of protein folding — a perspective from
simple exact models. Protein Sri., 4, 561—602.
Dinner, A.R. and Karplus, M. (2001). Comment on the communication «The key to solving the
protein-folding problem lies in an accurate description of the denatured state» by van
Gunsteren et al. Angew. Chem. Int. Ed., 40, 4615—4616.
Doyle, D.A., Cabral, J.M., Pfuetzner, R.A. et al. (1998). The structure of the potassium channel:
molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science, 280, 69—77. [Cited in Chapter 14.
The first crystal structure of a selective channel and a major advance.]
528
Литература
Dunitz, J.D. (1994). The entropic cost of bound water in crystals and biomolecules. Science, 264,
670. [Cited in Chapter 4. This is a lucid account of the thermodynamics of water association
with proteins.]
Eaton, W.A., Henry, E.R. and Hofrichter, J. (1991). Application of linear free energy relations to
protein conformational changes: the quaternary structural change of hemoglobin. Proc. Natl
Acad. Sri., 88, 4472-4475.
Edwards, S., Corry, B., Kuyucak, S. and Chung, S.-H. (2002). Continuum electrostatics fails to
describe ion permeation in the gramicidin channel. Biophys. J., 83, 1348—1360.
Ehrenstein, C, Blumenthal, R., Latorre, R. and Lecar, H. (1974). Kinetics of the opening and closing
of individual excitability-inducing material channels in a lipid bilayer. J. Gen. Physiol, 63, 707—721.
Eigen, M. and Hammes, G.G. (1963). Elementary steps in enzyme reactions. Adv. Enyzmol, 25,
1-38.
Einstein, A. (1956). Investigations on the Theory of Brownian Movement. New York: Dover. [Cited in
Chapter 6. This small book contains five papers published by Einstein from 1905 to 1908. This
work is timeless and still worthy of careful study by students of biophysics.]
Eisenman, G. and Horn, R. (1983). Ionic selectivity revisited: the role of kinetic and equilibrium
processes in ion permeation through channels. J. Membrane Biol, 76, 197—225.
Elson, E.L and Magde, D. (1974). Fluorescence correlation spectroscopy: I. Conceptual basis.
Biopolymers, 13, 1—27.
Falke, J.J., Drake, S.K., Hazard, A.L. and Peersen, O.B. (1994). Molecular tuning of ion binding
to calcium signaling proteins. Q. Rev. Biophys., 27, 219—290.
Fersht, A.R. (1987). The hydrogen bond in molecular recognition. Trends Biochem. Sri., 12,
301—304. (1998). Structure and Mechanism in Protein Science. New York: Freeman. [Cited in
Chapters 7 and 10. This is an excellent resource for kinetics and enzyme mechanisms.]
Fersht, A.R., Shi, J.-P., Knill-Jones, J. et al. (1985). Hydrogen bonding and biological specificity
analysed by protein engineering. Nature, 314, 235—238.
Fersht, A.R., Itzhaki, L.S., El Masry, N.F., Matthews, J.M. and Otzen, D.E. (1994). Single versus
parallel pathways of protein folding and fractional formation of structure in the transition state.
Proc. Natl Acad. Sri., 91, 10426—10429. [Cited in Chapter 7. This provides a very nice example
of how to use plots to address the mechanism of protein unfolding.]
Fielder, E.M., Roberts, P.B., Bray, R.C. et al. (1974). The mechanism of action of superoxide
dismutase from pulse radiolysis and electron paramagnetic resonance. Biochem. J., 139,49—60.
Finkel, A.S. and Redman, S.J. (1983). The synaptic current evoked in cat spinal motoneurons by
impulse in single group la axons. J. Physiol., 342, 615—632.
Finkelstein, A. (1987). Water Movement Through Lipid Bilayers, Pores, and Plasma Membranes.
New York: Wiley-Interscience.
Finkelstein, A. and Andersen, O.S. (1981). The gramicidin A channel: A review of its permeability
characteristics with special reference to the single-file aspect of transport. J. Membrane Biol, 59,
155-171.
Finkelstein, A.V. and Janin, J. (1989). The price of lost freedom: entropy of bimolecular complex
formation. Protein Engineering, 3, 1-3.
Flory, P.J. (1969). Statistical Mechanics of Chain Molecules. New York: Interscience Publishers.
Fredkin, D.R., Montal, M. and Rice, J.A. (1985). Identification of aggregated Markovian models:
application to the nicotinic acetylcholine receptor. In Proceedings of the Berkeley Conference in
Honor of Jerzy Neyman and Jack Kiefer, ed. L.M. Le Cam and R.A. Olshen. Wadsworth, Vol. 1,
pp. 269-289.
Gallivan, J.P. and Dougherty, D.A. (1999). Cation-л interactions in structural biology. Proc. Natl
Acad. Sri., 96, 9459-9464.
(2000). A computational study of cation-л interactions vs salt bridges in aqueous media: Impli-
cations for protein engineering. J. Amer. Chem. Soc, 122, 870—874.
Литература
529
Garofoli, S. and Jordan, P.C. (2003). Modeling permeation energetics in the KcsA potassium
channel. Biophys.J., 84, 2814—2830.
Gavish, B. and Werber, M.M. (1979). Viscosity-dependent structural fluctuations in enzyme catal-
ysis. Biochemistry, 18, 1269—1275.
Gentet, L.J., Stuart, G.J. and Clements, J.D. (2000). Direct measurement of specific membrane
capacitance in neurons. Biophys. J., 79, 314—320.
Gilson, M.K., Given, J.A., Bush, B.L andMcCammon, J.A. (1997). The statistical thermody-
namic basis for computation of binding affinities: a critical review. Biophys. J., 72, 1047—1069.
[Cited in Chapter 4. This is an excellent review of the statistical mechanics of molecular associ-
ations.]
Goldman, L. and Albus, J.S. (1968). Computation of impulse conduction in myelinated fibers;
theoretical basis of the velocity-diameter relation. Biophys. J., 8, 596—607.
Goldstein, S.S. and Rail, W. (1974). Changes of action potential shape and velocity for changing
core conductor geometry. Biophys. J., 14, 731—757.
Goychuk, I. and Hanggi, P. (2002). Ion channel gating: a first-passage time analysis of the Kramers
type. Proc. Natl Acad. Sri., 99, 3552—3556.
Green, W.N., Weiss, L.B. and Andersen, O.S. (1987). Batrachotoxin-modified sodium channels in
planar lipid bilayers J. Gen. Physiol., 89, 841—872.
Griko, Y.V. and Privalov, P.L (1992). Calorimetric study of the heat and cold denaturation of beta-
lactoglobulin. Biochemistry, 31, 8810—8815.
Grosman, C. (2003). Free-energy landscapes of ion-channel gating are malleable: changes in the
number of bound ligands are accompanied by changes in the location of the transition state of
the acetylcholine-receptor channels. Biochemistry, 42 (50), 14977—14987.
Grosman, C, Zhou, M. and Auerbach, A. (2000). Mapping the conformational wave of acetylcho-
line receptor channel gating. Nature, 403, 773—776. [Cited in Chapter 7. This is an important
advance mapping the gating transition of an ion channel and an excellent illustration of the use
of plots in biophysics.]
Gurney, R.W (1953). Ionic Processes in Solution. New York: McGraw-Hill.
Gutman, M. and Nachliel, E. (1997). Time-resolved dynamics of proton transfer in proteinous
systems. Ann. Rev. Phys. Chem., 48, 329—356.
Hagen, S.J. and Eaton, W.A. (1996). Nonexponential structural relaxations in proteins.]. Chem.
Phys., 104, 3395-3398.
Hall, J.E., Mead, C.A. and Szabo, G. (1973). A barrier model for current flow in lipid bilayer
membranes. J. Membr. Biol, 11, 75—97. [Cited in Chapter 14. This is an early example of how
barriers shape the current-voltage behavior of a membrane.]
Hammes, G.G. (1978). Principles of Chemical Kinetics. New York: Academic Press.
Han, W-G., Jalkanen, K.J., Elstner, M. and Suhai, S. (1998). Theoretical study of aqueous N-
acetyl-L-alanine N'-methylamine: structures and Raman, VCD, and ROA spectra. J. Phys.
Chem. B, 102, 2487-2602.
Ha#nggi, P., Talkner, P. and Borkovec, M. (1990). Reaction-rate theory: fifty years after Kramers.
Rev. Modern Phys., 62, 251—341. [Cited in Chapter 7. This is an excellent review of modern ap-
proaches to rate theory.]
Hardy, L.W. and Kirsch, J.F. (1984). Diffusion-limited components of reactions catalyzed by bacil-
lus cereus b-lactanase I. Biochemistry, 23, 1275—1282.
Hecht, S., Schlaer, S. and Pirenne, M. (1942). Energy, quanta, and vision. J. Gen. Physiol, 25,
819-840.
Hedstrom, L, Perona, J.J. and Rutter, WJ. (1994). Converting trypsin to chymotrypsin: Residue
172 is a substrate specificity determinant. Biochemistry, 33, 8757—8763.
Hess, P. and Tsien, R.W. (1984). Mechanism of ion permeation through calcium channels. Nature,
309, 453-456.
530
Литература
Hestrin, S., Nicoll, R.A., Perkel, D.J. and Sah, P. (1990). Analysis of excitatory synaptic action in
pyramidal cells using whole-cell recording from rat hippocampal slices. J. Physiol, 422,
203-225.
Hill, TL. (1960). An Introduction to Statistical Thermodynamics. Reading: Addison-Wesley. [This is
highly recommended as a resource for statistical mechanics.]
Hille, B. (1977). Ionic basis of resting and action potentials. In Handbook of Physiology. The Ner-
vous System. Cellular Biology of Neurons, ed. J.M. Brookhart and V.B. Mountcastle. Bethesda:
American Physiological Society, pp. 99—136.
(1991). Ion Channels of Excitable Membranes. Sunderland: Sinauer Associates.
Hille, B. and Schwarz, W. (1978). Potassium channels as multi-ion single-file pores. J. Gen.
Physiol, 72, 409—442. [Cited in Chapter 14. A full treatment of single-file models and an excel-
lent summary of their basic properties.]
Hines, M.L. and Carnevale, N.T (1997). The NEURON simulation environment. Neural Compu-
tation, 9, 1179-1209.
Hodgkin, A.L. (1964). The Conduction of Nervous Impulse. Springfield, IL: Charles Thomas.
Hodgkin, A.L. and Horowicz, P. (1959). The influence of potassium and chloride ions on the
membrane potential of single muscle fibres. J. Physiol., 148, 127—160.
Hodgkin, A.L. and Huxley, A.E (1952). A quantitative description of membrane current and its ap-
plication to conduction and excitation in nerve. J. Physiol, 117, 500—544. [Cited in Chapter 16.
This is the culminating paper in the seminal series on membrane excitability.]
Hodgkin, A.L. and Keynes, R.D. (1955). The potassium permeability of a giant nerve fiber. J.
Physiol, 128, 61—88. [Cited in Chapter 14. This is the classical development of the single-file
theory of permeation.]
Hodgkin, A.L and Rushton, W.A.H. (1946). The electrical constants of a crustacean nerve fiber.
Proc. R. Soc. bond., В133, 444-479.
Hodgkin, A.L, Huxley, A. E and Katz, B. (1952). Measurement of current voltage relations in the
membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol, 116, 424—448.
Hol, W.G.J., van Duijnen, P.T. and Berendsen, H.J.C. (1978). Thea-helix dipole and the proper-
ties of proteins. Nature, 273, 443—446.
Horn, R. and Lange, K. (1983). Estimating kinetic constants from single channel data. Biophys. J.,
43, 207-223.
Horn, R. and Vandenberg, C.A. (1984). Statistical properties of single sodium channels. J. Gen.
Physiol, 84, 505-534.
Huxley, A.F. and Sta#mpfii, R. (1949). Evidence for saltatory conduction in peripheral myelinated
nerve fibres. J. Physiol, 108, 315—339.
Imoto, K., Busch, C, Sakmann, B. et al. (1988). Rings of negatively charged amino acids deter-
mine the acetylcholine receptor channel conductance. Nature, 335, 645—648.
Itzhaki, L.S., Otzen, D.E. and Fersht, A.R. (1995). The structure of the transition state for protein
folding of chymotrypsin inhibitor 2 analysed by protein engineering methods: evidence for a nu-
cleation condensation mechanism for protein folding. J. Mol. Biol., 254, 260—288.
Jack, J.J.B. and Redman, S.J. (1971). An electrical description of the moto- neuron and its appli-
cation to the analysis of synaptic potentials. J. Physiol, 215, 321—352.
Jack, J.J.B., Noble, D. and Tsien, R.W. (1983). Electric Current Row in Excitable Cells. Oxford: Ox-
ford University Press. [Cited in Chapters 15 and 16. This is a comprehensive textbook that cov-
ers cable theory and excitability very well.]
Jackson, J.D. (1975). Classical Electrodynamics. New York: John Wiley & Sons.
Jackson, M.B. (1985). The stochastic behavior of a many channel membrane system. Biophys. J.,
47, 129-137.
(1992). Cable analysis with the whole-cell patch clamp: theory and experiment. Biophys. J., 61,
756-766.
Литература
531
(1993а). Passive current flow and morphology in the terminal arborizations of the posterior pi-
tuitary. J, Neurophysiol., 69, 692—702.
(1993b). Binding specificity of receptor chimeras revisited. Biophys. J., 63, 1443—1444.
(1993c). On the time scale and time course of protein conformational changes. J. Chem. Phys.,
99, 7253-7259.
(1994). Single channel currents in the nicotinic receptor: A direct demonstration of allosteric
transitions. TIBS, 19, 396—399.
(1997a). Adding up the energies in the acetylcholine receptor channel: relevance to allosteric
theory. In The Nicotinic Acetylcholine Receptor: Current Vipws and Future Trends, ed. F. Barran-
tes. Austin: Landes Bioscience, pp. 61—84.
(1997b). Inversion of Markov processes to determine rate constants from single channel data.
Biophys. J., 73, 1382-1394.
(1998). Allosteric mechanisms in the activation of ligand-gated channels. Biophysics Textbook of
the Biophysical Society. Rockville: Biophysical Society. [Cited in Chapter 5. A discussion of
allosteric mechanisms using ligand-gated channels to illustrate important concepts.]
Jackson, M.B. and Zhang, S.J. (1995). Action potential propagation and propagation block by
GABA in rat posterior pituitary nerve terminals. J. Physiol, 483(3), 597—611.
Jackson, M.B., Wong, B.M., Morris, C.E., Lecar, H. and Christian, C.N. (1983). Successive open-
ings of the same acetylcholine receptor channel are correlated in open time. Biophys. J., 42,
109-114.
Jackson, M.B., Konnerth, A. and Augustine, G.J. (1991). Action potential broadening and fre-
quency-dependent facilitation of calcium signals in pituitary nerve terminals. Proc. Natl Acad.
Sci.,88, 380-384.
Jacobson, K., Ishihara, A. and Inman, R. (1987). Lateral diffusion of proteins in membranes. Ann.
Rev. Physiol, 49, 163-175.
Jeffrey, G.A. and Saenger, W. (1991). Hydrogen Bonding in Biological Structures. Berlin: Springer-
Verlag.
Jencks, WP. (1975). Binding energy, specificity, and enzyme catalysis: the Circe effect. Adv. En-
zymol, 43,219-410.
Jencks, W.P. and Carriuolo, J. (1961). General base catalysis of ester hydrolysis. Journal of the
American Chemical Society, 83, 1743—1750.
Jentsch, T.J., Stein, V., Weinreich, F. and Zdebik, A.A. (2002). Molecular structure and physiolog-
ical function of chloride channels. Physiol. Rev., 82, 503—568.
Jones, S.W (1989). On the resting potential of isolated frog sympathetic neurons. Neuron, 3,
153-161.
Jordan, P.C. (1990). Ion-water and ion-polypeptide interactions in a gramicidin-like channel.
A molecular dynamics study. Biophys. J., 58, 1133—1156.
Jordan, P.C, Bacquet, R.J., McCammon, A.J. and Tran, P. (1989). How electrolyte shielding influ-
ences the electrical potential in transmembrane ion channels. Biophys. J., 55, 1041 — 1052.
Kallenbach, N. (2001). Breaking open a protein barrel. Proc. Natl Acad. Sci., 98, 2958—2960.
[Cited in Chapter 2. This presents a clear presentation of the oil-droplet versus jigsaw puzzle
pictures of a protein interior.]
Kao, J.P.Y. and Tsien, R.Y. (1988). Ca2+ binding kinetics of fura-2 and azo-1 from temperature
jump relaxation measurements. Biophys. J., 53, 635—639.
Karplus, M. (2002). Molecular dynamics simulations of biomolecules. Ace. Chem. Res., 35, 321 —
323. [Cited in Chapter 2. This is the editorial for a special issue that covers a wide range of appli-
cations.]
Katz, B. (1966). Nerve, Muscle, and Synapse. New York: McGraw-Hill.
Kaya, H. and Chan, H.S. (2000). Polymer principles of protein calorimetric two-state coopera-
tivity. Proteins: Structure, Function, and Genetics, 40, 637—661.
532
Литература
Keizer, J. (1987). Diffusion effects on rapid bimolecular chemical reactions. Chem. Rev., 87,
167-180.
Kell, M.J. and De Felice, L.J. (1988). Surface charge near the cardiac inward-rectifier channel
measured from single-channel conductance. J. Membrane Biol, 102, 1—10.
Kellermayer, M.S.Z., Smith, S.B., Granzier, H.L. and Bustamante, C. (1997). Folding-unfolding
transitions in single titin molecules characterized with laser tweezers. Science, 276, 1112—1116.
Khanin, R., Parnas, H. and Segel, L. (1994). Diffusion cannot govern the discharge of neurotrans-
mitter in fast synapses. Biophys. /.,67, 966—972.
Kijima, S. and Kijima, H. (1987). Statistical analysis of channel current from a membrane patch I.
Some stochastic properties of ion channels or molecular systems at equilibrium. J. Theor. Bid.,
128, 423-434.
Kittel, C. (1958). Elementary Statistical Physics. New York: John Wiley & Sons.
Kolinski, A., Godzik, A. and Skolnick, J. (1993). A general method for the prediction of the three
dimensional structure and folding pathway of globular proteins: Application to designed helical
proteins. J. Chem. Phys., 98, 7420—7433.
Kolinski, A., Galazka, W. and Skolnick, J. (1996). On the origin of the co-operativity of protein
folding: implications from model simulations. Proteins: Structure, Function, and Genetics, 26,
271-287.
Koshland, D. E., Nemethy, G. and Filmer, D. (1966). Comparison of experimental binding data
and theoretical models in proteins containing subunits. Biochemistry, 5, 365—384.
Kramers, H.A. (1940). Brownian motion in a field of force. Physica, 7, 284—304.
Kuyucak, S., Andersen, O.S. and Chung, S.-H. (2001). Models of permeation in ion channels. Re-
ports of Progress in Physics, 64, 1427—1472.
Latorre, R., Labarca, P. and Naranjo, D. (1992). Surface charge effects on ion conduction in ion
channels. In Ion Channels (Methods in Enzymology), ed. L. Iverson and B. Rudy, vol. 207, pp.
471—501. [Cited in Chapter H.A very clear overview of surface charge effects in ion channels.]
Lauger, P. (1973). Ion transport through pores: a rate-theory analysis. Biophysica and Biochimica
Acta, 311, 423—441. [Cited in Chapter 14. A thorough development of barrier models for per-
meation.]
Lecar, H. and Sachs, F. (1981). Membrane noise analysis. In Excitable Cells in Tissue Culture, ed.
P.G. Nelson and M. Lieberman. New York: Plenum, pp. 137—172.
Lee, A.W., Karplus, M., Poyart, C. and Bureaux, E. (1988). Analysis of proton release in oxygen
binding by hemoglobin: implications for cooperative mechanism. Biochemistry, 27, 1285—1301.
Lesk, A.M., Lo Conte, L. and Hubbard, T.J.P. (2001). Assessment of novel fold targets in CASP4:
Predictions of three-dimensional structures, secondary structures, and interresidue contacts.
Proteins: Structure, Function, and Genetics, 45(S5), 98—118.
Levinthal, C. (1968). Are there pathways for protein folding. J. Chem. Phys., 65, 44—45.
Levitt, D.G (1978a). Electrostatic calculations for an ion channel. I. Energy and potential profiles
and interactions between ions. Biophys. J., 22, 209—219.
(1978b). Electrostatic calculations for an ion channel II. Kinetic behavior of the gramicidin
A channel. Biophys. J., 22, 221—248.
Levitt, M., Sander, C. and Stern, P.S. (1985). Protein normal-mode dynamics: trypsin inhibitor,
crambin, ribonuclease and lysozyme. J. Mol. Biol., 181, 423—447.
Levitt, M., Hirehberg, M., Sharon, R. and Daggett, V. (1995). Potential energy function and pa-
rameters for simulations of the molecular dynamics of proteins and nucleic acids in solution.
Comput. Phys. Communs, 91, 215—231.
Lewis, C.A. (1979). Ion-concentration dependence of the reversal potential and the single channel
conductance of ion channels at the frog neuro-muscular junction. J. Physiol, 286, 417—445.
Lifson, S. and Roig, A. (1963). On the theory of helix-coil transition in poly- peptides. J. Chem.
Phys., 34, 1961 — 1974. [Cited in Chapter 3. This is an elegent and clear development of the
mathematical theory of helix-coil transitions.]
Литература
533
Lifson, S. and Warshel, A. (1968). Consistent force field for calculations of conformations, vibrational
spectra, and enthalpies of cycloalkane and n-alkane molecules. J. Chem. Phys., 49, 5119—5129.
Lin, J., Cassidy, C.S. and Frey, P.A. (1998). Correlations of the basicity of His 57 with transition
state analogue binding, substrate reactivity, and the strength of the low-barrier hydrogen bond in
chymotrypsin. Biochemistry, 37, 11940—11948.
Linderstro/m-Lang, K. (1924). On the ionization of proteins. Compt. rend. trav. Carlsberg, 17,
1—29. (See also Linderstrom-Lang, K. (1962) Selected Papers. New York: Academic Press.)
Ma, J.C. and Dougherty, D.A. (1997). The cation-л interaction. Chem. Rev., 97, 1303—1324.
Maclnnes, D.A. (1961). The Principles of Electrochemistry. New York: Dover.
MacKinnon, R., Latorre, R. and Miller, C. (1989). Role of surface electrostatics in the operation
of a high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Biochemistry, 28, 8092—8099.
Magee, J.C. and Cook, E.P. (2000). Somatic EPSP amplitude is independent of synapse location
in hippocampal pyramidal neurons. Nature Neurosci., 3, 895—903.
Mainen, Z.F., Joerges, J., Huguenard, J.R. and Sejnowski, T.J. (1995). A model of spike initiation
in neocortical pyramidal neurons. Neuron, 15, 1427—1439.
Major, G., Evan, J.D. and Jack, J.B. (1993). Solutions for transients in arbitrarily branching cables:
I. Voltage recording with a somatic shunt. Biophys. J., 65, 423—449. [Cited in Chapter 15. This
paper explores the cable equation in complicated dendritic arbors.]
Manning, G.S. (1969). Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions.
I. Colligative properties. J. Chem. Phys., 51, 924—933.
(1978). The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic
properties. Q. Rev. Biophys., 11, 179—246.
Marcus, R.A. (1964). Chemical and electrochemical electron-transfer theory. Ann. Rev. Phys.
Chem., 15, 155-196.
(1968). Theoretical relations among rate constants, barriers, and Bronsted slopes of chemical
reactions. J. Phys. Chem., 72, 891—899.
Martinez, M.B., Flickinger, M.C. and Nelsestuen, G.L. (1996). Accurate kinetic modeling of al-
kaline phosphatase in the Escherichia coli periplasm: implications for enzyme properties and
substrate diffusion. Biochemistry, 35, 1179—1186.
Marty, A, and Neher, E. (1995). Tight-seal whole-cell recording. In Single-Channel Recording, ed.
B. Sakmann and E. Neher. New York: Plenum, pp. 31—51.
McCammon, A.J., Wolynes, P.G. and Karplus, M. (1979). Picosecond dynamics of tyrosine side
chains in proteins. Biochemistry, 18, 927—942. [Cited in Chapter 10. This is a seminal paper on
the internal dynamics of proteins.]
McLaughlin, S. (1989). The electrostatic properties of membranes. Ann. Rev. Biophys. Biophys.
Chem., 18, 113-136.
McQuarrie, D.A., (1976). Statistical Mechanics. New York: Harper & Row. [This is highly recom-
mended as a resource for statistical mechanics.]
Meyer, E., Muller, C.O. and Fromherz, P. (1997). Cable properties of dendrites in hippocampal
neurons of the rat mapped by a voltage-sensitive dye. Eur. J. Neurosci., 9, 778—785.
Miedema, H. (2002). Surface potentials and the calculated selectivity of ion channels. Biophys. J.,
82, 156-159.
Migliore, M., Hoffman, D.A., Magee, J.C. and Johnston, D. (1999). Role of an А-type K+ con-
ductance in the back-propagation of action potentials in the dendrites of hippocampal pyrami-
dal neurons. J. Comp. Neurosci., 7, 5—15.
Millar, J.A., Barrett, L, Southan, A.P., Page, K.M., Fyffe, R.E.W. and Robertson, B. (2000).
A functional role for the two-pore domain potassium channel TASK-1 in cerebellar granule
neurons. Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 3614—3618.
Miller, B.G. and Wolfenden, R. (2002). Catalytic proficiency: The unusual case of OMP decarbox-
ylase. Ann. Rev. Biochem., 71, 847—885.
534
Литература
Moczydlowski, Е., Alvarez, О., Vergara, С. and Latorre, R. (1985). Effect of phospholipid surface
charge on the conductance and gating of a Ca2+-activated K+ channel in planar lipid bilayers.
J. Membrane Bid., 83, 273—282.
Monod, J., Wyman, J. and Changeux, J.-P. (1965). On the nature of allosteric transitions: A plau-
sible model. J. Mol. Biol., 12, 88—118. [Cited in Chapter 5. This is the seminal paper on
allosteric regulation of proteins. A remarkable conceptual advance and still well worth reading.]
Moore, WJ. (1972). Physical Chemistry. Englewood Cliffs: Prentice-Hall. [This is highly recom-
mended as a resource for statistical mechanics.]
Morais-Cabral, J.H., Zhou, Y. and MacKinnon, R. (2001). Energetic optimization of ion conduc-
tion rate by the K+ selectivity filter. Nature, 414, 37—42.
Morris, C.E. and Lecar, H. (1981). Voltage oscillations in the barnacle giant muscle fiber. Bio-
phys. J., 35, 193—213. [Cited in Chapter 16. A clear and illuminating account of membrane os-
cillations.]
Moy, G., Cony, B., Kuyucak, S. and Chung, S.-H. (2000). Tests of continuum theories as models
of ion channels. I. Poisson-Boltzmann theory versus Brownian dynamics. Biophys. J., 78,
2349-2363.
Myers, J.K. and Pace, C.N. (1996). Hydrogen bonding stabilizes globular proteins. Biophys. J., 71,
2033-2039.
Nakajima, Y, Nakajima, S. and Inoue, M. (1988). Pertussis toxin-insensitive G protein mediates
substance P-induced inhibition of potassium channels in brain neurons. Proc. Natl. Acad. Sci.,
85, 3643-3647.
Nakatani, H. and Dunford, H.B. (1979). Meaning of diffusion-controlled association rate con-
stants in enzymology. J. Phys. Chem., 83, 2662—2665.
Neher, E. and Steinbach, J.H. (1978). Local anesthetics transiently block currents through single
acetylcholine-receptor channels. J. Physiol., 277, 153—176. [Cited in Chapter 9. This is a strik-
ing example of the power of single-channel kinetics in the analysis of mechanisms of drug ac-
tion.]
Nelsestuen, G.L and Martinez, M.B. (1997). Steady state enzyme velocities that are independent
of [enzyme]: an important behavior in many membrane and particle-bound states. Biochemistry,
36, 9081-9086.
Nolte, H.-J., Rosenberry, TL. and Neumann, E. (1980). Effective charge on acetylcholinesterase
active sites determined from the ionic strength dependence of association rate constants with
cationic ligands. Biochemistry, 19, 3705—3711.
Noskov, S.Y, Berniche, S. and Roux, B. (2004). Control of ion selectivity in potassium channels by
electrostatic and dynamic properties of carbonyl ligands. Nature, 431, 830—834.
Obaid, A.L. and Salzberg, B.M. (1996). Micromolar 4-aminopyridine enhances invasion of a ver-
tebrate neurosecretory terminal arborization. J. Gen. Physiol., 107, 353—368.
Oberhauser, A.E and Fernandez, J.M. (1995). Hydrophobic ions amplify the capacitance currents
used to measure exocytotic fusion. Biophys. J., 69, 451—459.
O’Mara, M., Barry, P.H. and Chung, S.-H. (2003). A model of the glycine receptor deduced from
Brownian dynamics studies. Proc. Natl Acad. Sri., 100, 4310—4315.
O’Neil, K.T and DeGrado, W.F. (1990). A thermodynamic scale for the helix-forming tendencies
of the commonly occurring amino acids. Science, 250, 646—651.
Oosawa, F. (1971). Poly electrolytes. New York: Marcel Dekker, Inc.
Overbeek, J.Th.G. (1952). The electrochemistry of the double layer. In Colloid Science, Vol. 1, ed.
H.R. Kruyt. Amsterdam: Elsevier Publishing Company, pp. 115—193.
Overbeek, J.T.G. and Wiersema, P.H. (1967). The interpretation of electro-phoretic mobilities. In
Electrophoresis, ed. M. Bier. New York: Academic Press, pp. 1—52.
Pace, C.N. (1992). Contributions of the hydrophobic effect to globular protein stability J. Mol.
Biol., 226, 29-35.
Литература
535
Papazian, D.M.,Timpe, L.C., Jan, Y.N. and Jan, L.Y. (1991). Alteration of voltage-dependence of
Shaker potassium channel by mutations in the S4 sequence. Nature, 349, 305—310.
Parsegian, V.A. (1969). Energy of an ion crossing a low dielectric membrane: Solutions to four rel-
evant electrostatics problems. Nature, 221, 844—846. [Cited in Chapters 2 and 14. This is an
early study that defined the basic energetic parameters of permeation.]
(1973). Long-range physical forces in the biological milieu. Ann. Rev. Biophys. Bioeng, 2, 221 —
255.
Patlak, C.S. (1960). Derivation of an equation for the diffusion potential. Nature, 188, 944—945.
Perkel, D.H., Mulloney, B. and Budelli, R.W. (1981). Quantitative methods for predicting neuro-
nal behavior. Neuroscience, 5, 823—837.
Perutz, M.F., Wilkenson, A.J., Paoli, M. and Dodson, D.D. (1998). The stereo-chemical mecha-
nism of the cooperative effects in hemoglobin revisited. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Structure, 27,
1—34. [Cited in Chapter 5. This contains a clear and thorough discussion of the evidence favor-
ing a two-state description of hemoglobin.]
Peters, R. and Cherry, R.J. (1982). Lateral and rotational diffusion of bacterio-rhodopsin in lipid
bilayers: experimental test of the Saffman-Delbriick equations. Proc. Natl Acad. Sri., 79, 4317—
4321.
Piek,T. (1975). Ionic and electrical properties. In Insect Muscle, ed. P.N.R. Usherwood. New York:
Academic Press, pp. 275—336.
Plowman, K.M. (1972). Enzyme Kinetics. New York: McGraw Hill.
Pokarowski, P., Kolinski, A. and Skolnick, J. (2003). A minimal physically realistic protein-like
lattice model: designing an energy landscape that ensures all-or-none folding to aunique native
state. Biophys. J., 84, 1518—1526.
Poland, D. and Scheraga, H.A. (1970). Theory of Helix-Coil Transitions. New York: Academic
Press.
Privalov, P.L. (1979). Stability of proteins. Adv. Protein Chem., 33, 167—241.
(1982). Stability of proteins: Proteins which do not present a single cooperative system. Adv.
Protein Chem., 35, 1 — 104. [Cited in Chapters 2 and 3. This reference presents thorough reviews
of the thermodynamics of thermal transitions in proteins.]
Prod’hom, B., Peitrobon, D. and Hess, P. (1987). Direct measurement of proton transfer rates to
a group controlling the dihydropyridine-sensitive Ca2+ channel. Nature, 329, 243.
Pumphrey, R.J. and Young, J.Z. (1938). The rates of conduction of nerve fibres of various diame-
ters in cephalopods. J. Exp. Biol., 14, 453—466.
Putnam, S.J., Coulson, A.E, Farley, I.R., Ridd Leston, B. and Knowles, J.R. (1972). Specificity
and kinetics of triose phosphate isomerase from chicken muscle. Biochem.J., 129, 301—310.
Raleigh, D.P. and DeGrado, WF. (1992). A de novo designed protein shows a thermally induced
transition from a native to a molten globule-like state. J. Amer. Chem. Soc., 114, 10079—10081.
Rail, W. (1959) Branching dendritic trees and motoneuron membrane resistivity. Exp. Neurol, 1,
491—527. [Cited in Chapter 15. This provides a remarkable insight into how to simplify the ca-
ble analysis of dendrites.]
(1967). Distinguishing theoretical synaptic potentials computed for different soma-dendritic
distributions of synaptic input. J. Neurophysiol, 30, 1138—1168.
(1969). Time constants and electrotonic length of membrane cylinders and neurons. Biophys. J.,
9, 1483—1508. [Cited in Chapter 15. A thorough and clear exposition of practical aspects of ca-
ble analysis.)
(1977). Core conductor theory and cable properties of neurons. In Handbook of Physiology. The
Nervous System. Cellular Biology of Neurons, ed. J.M. Brookhart and V.B. Mountcastle. Bethes-
da: American Physiological Society, pp. 39—97.
Rail, W, Burke, R.E., Smith, T.G., Nelson, P.G. and Frank, K. (1967). Dendritic location of syn-
apses and possible mechanisms for the monosynaptic EPSPs in motoneurons. J. Neurophysiol,
30,1169-1193.
536
Литература
Ramachandran, G.N. and Sasisekharan, V. (1968). Conformation of polypep-tides and proteins.
Adv. Protein Chem., 23, 284—437.
Ramachandran, G.N., Venkatachalam, C.M. andKrimm, S. (1966). Stereochemical criteria for
polypeptide and protein chain conformations. 3. Helical and hydrogen-bonded polypeptide
chains. Biophys. J., 6(6), 849—872.
Rand, R.P. (1981). Interacting phospholipid bilayers: measured forces and induced structural
changes. Ann. Rev. Biophys. Bioengin., 10, 288—314.
Rapp, M., Yarom, Y. and Segev, I. (1996). Modeling back propagating action potentials in weakly
excitable dendrites of neocortical pyramidal cells. Proc. NatlAcad. Sci., 93, 11 985—11 990.
Rashin, A.A. and Honig, B. (1985). Reevaluation of the Born model of ion hydrationj. Phys.
Chem., 89, 5588-5593.
Record, M.T (1975). Effects of Na+ and Mg++ ions on the helix-coil transition of DNA. Biopoly-
mers, 14, 2137-2158.
Record, M.T, Mazur, S.J., Melancon, P., Roe, J.-H., Shaner, S.L. and Unger, L. (1981). Double
helical DNA: conformations, physical properties, and interactions with ligands. Ann. Rev.
Biochem., 50, 997-1024.
Redman, S. and Walmsley, B. (1983). The time course of synaptic potentials evoked in cat spinal
motoneurons at identified group la synapses. J. Physiol, 343, 117—133.
Reed, A.E. and Weinhold, E (1991). Natural bond orbital analysis of internal rotation barriers and
related phenomena. Isr. J. Chem., 31, 277—285.
Rees, D.C, DeAntonio, L. and Eisenberg, D. (1989). Hydrophobic organization of membrane
proteins. Science, 245, 510—513.
Richard, J.P. (1998). The enhancement of enzymatic rate accelerations by Bronsted acid-base ca-
talysis. Biochemistry, 37, 4305—4309.
Rigler, R. and Elson, E.L. (eds.) (2001). Fluorescence Correlaton Spectroscopy: Theory and Applica-
tions. Berlin: Springer.
Rogawski, M.A. (1985). The А-current: how ubiquitous a feature of excitable cells is it? Trends
Neurosci., 8, 214—219.
Rose, G.D., Gesolowitz, A. R., Lesser, G.J., Lee, R.H. and Zehfus, M.H. (1985). Hydrophobicity
of amino acid residues in globular proteins. Science, 229 (4716), 834—838.
Roseman, M.A. (1988). Hydrophobicity of the peptide С = О H-N hydrogen-bonded group.
J. Mol. Biol., 201, 621-623.
Rosenthal, L, Rabolt, J.F. and Hummel, J. (1982). An investigation of the conformational equilib-
rium of n-butane in a solvent using Raman spectroscopy. J. Chem. Phys., 76, 817—820.
Rothberg, B.S. and Magleby, K.L. (2001). Testing for detailed balance (microscopic reversibility)
in ion channel gating. Biophys. J., 80, 3025—3026.
Roux, B. and MacKinnon, R. (1999). The cavity and pore helices in the KcsA K+ channel: electro-
static stabilization of monovalent cations. Science, 285, 100—102.
Roux, B., Bemiche, S. and Im, W. (2000). Ion channels, permeation, and electrostatics: insight
into the function of KcsA. Biochemistry, 39, 13295—13306.
Rushton, W.A.H. (1951). A theory of the effects of fibre size in medullated nerve. J. Physiol., 115,
101-122.
Saffman, P.G. and Delbruck, M. (1975). Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl.
Acad. Sri., 72, 3111-3113.
Sanchez, I.C. (1979). Phase transition behavior of the isolated polymer chain. Macromolecules, 12,
980-988.
Saxton, M.J. and Jacobson, K. (1997). Single-particle tracking: applications to membrane dynam-
ics. Ann. Rev. Biophys. Biornol. Struct., 26, 373—399.
Scatchard, G. (1949). The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann. N. Y. Acad.
Sri.,5\,tf&-61\.
Литература
537
Schafmeister, С.Е., LaPorte, S.L., Miercke, L.J.W. and Stroud, R.M. (1997). A designed four helix
bundle protein with native-like structure. Nature Struct. Biol., 4, 1039—1046.
Scheer, A., Fanelli, E, Costa, T, De Benedetti, P.G. and Cotecchia, S. (1997). The activation pro-
cess of the oiB-adrenergic receptor: potential role of protonation and hydrophobicity of a highly
conserved aspartate. Proc. NatlAcad. Sri., 94, 808—818.
Schirmer, T. and Evans, P.R. (1990). Structural basis of the allosteric behavior of phosphofructo-
kinase. Nature, 343, 140—145.
Schoppa, N.E., McCormack, K., Tanouye, M.A. and Sigworth, F.J. (1992). The size of the gating
charge in wild-type and mutant Shaker potassiumchannels. Srience, 255, 1712—1715. [Cited in
Chapter 1. This is an excellent synthesis of the charge and steepness in a voltage-induced pro-
tein transition.]
Schultz, P.G. and Lerner R.A. (1995). From molecular diversity to catalysis: Lessons from the im-
mune system. Srience, 269, 1835—1842.
Schumaker, M.F. and MacKinnon, R. (1990). A simple model for multi-ion permeation: single va-
cancy conduction in a simple pore model. Biophys. J., 58, 975—984.
Segev, I. (1990). Computer study of presynaptic inhibition controlling the spread of action poten-
tials into nerve terminals. J. Neurophys., 63, 987—997.
Segev, I., Fleshman, J.W. and Burke, R.E. (1989). Compartmental models of complex neurons.
In Methods in Neural Modeling, ed. C. Koch and I. Segev. Cambridge: MIT Press, pp. 63—
96.
Serrano, L, Matouschek, A. and Fersht, A.R. (1992). The folding of an enzyme HI. Structure of
the transition state of barnase analysed by a protein engineering procedure. J. Mol. Biol., 224,
805-818.
Setlow, R.B., and Pollard, E.C. (1962). Molecular Biophysics, chapter 6. Palo Alto: Addison-Wes-
ley Publishing Co. Inc. [Cited in Chapter 2. This forgotten text contains a lucid presentation of
molecular forces.]
Shi, Z., Krantz, B. A., Kallenbach, N. and Sosnick, TR. (2002a). Contribution of hydrogen bond-
ing to protein stability estimated from isotope effects. Biochemistry, 41, 2120—2129.
Shi, Z., Olson, C.A. and Kallenbach, N.R. (2002b). Cation- interaction in model a-helical pep-
tides. J. Amer. Chem. Soc, 124, 3284—3291.
Shi, Z., Olson C.A., Rose, G.D., Baldwin, R.L. and Kallenbach, N.R. (2002c). Polyproline II
structure in a sequence of seven alanine residues. Proc. Natl Acad. Sri., 99, 9190—9195.
Shoup, D., Lipari, G. and Szabo, A. (1981). Diffusion-controlled bimolecular reaction rates.
Biophys. J., 36, 697-714.
Sigworth, F.J. (1994). Voltage gating of ion channels. Q. Rev. Biophys., 27, 1—27.
Silverman, D.N. (2000). Marcus rate theory applied to enzymatic proton transfer. Biochim.
Biophys. Acta, 1458, 88—103.
Silverman, D.N., Tu, C, Chen, X., Tanhauser, S.M., Kresge, A.J. and Laipis, P.J. (1993). Rate-
equilibria relationships in intramolecular proton transfer in human carbonic anhydrase III. Bio-
chemistry, 32, 10757-10761.
Silverman, J.A., Balakrishnan, R. and Harbury, P.B. (2001). Reverse engineering the (/3ja)s barrel
fold. Proc. Natl Acad Sri., 98, 3092-3097.
Sine, S.M., Claudio, T. and Sigworth, F. (1990). Activation of Torpedo acetylcholine receptors ex-
pressed in mouse fibroblasts. J. Gen. Physiol, 96, 395—437.
Spolar, R.S. and Record, M.T (1994). Coupling of local folding to site-specific binding of proteins
to DNA. Science, 263, 777—784. [Cited in Chapter 4. This is a study that considers many dif-
ferent contributions to the free energy of association.]
Spolar, R.S., Livingstone, J.R. and Record, M.T. (1992). Use of liquid hydrocarbon and amide
transfer data to estimate contributions to thermo- dynamic functions of protein folding from the
removal of nonpolar and polar surfaces from water. Biochemistry, 31, 3947—3955.
538
Литература
Steinberg, I.Z. (1987). Relationship between statistical properties of single ion channel recordings
and thermodynamic state of the channels. J. Theor. Biol., 124, 71—87.
Steinberg, I.Z. and Scheraga, H.A. (1963). Entropy changes accompanying association reactions
of proteins. J. Biol. Chem., 238, 172—181.
Stigter, D. and Dill, K.A. (1990). Charge effects on folded and unfolded proteins. Biochemistry, 29,
1262-1271.
Stillinger, F.H. (1980). Water revisited. Science, 209, 451—457. Stockbridge, N. (1988). Etiology of
the supernormal period. Biophys. J., 54, 777—780.
Stuart, G.J. and Sakmann, B. (1994). Active propagation of somatic action potentials into neo-
cortical pyramidal cell dendrites. Nature, 367, 69—72.
Stuart, G., Spruston, N. and Hausser, M. (2000). Dendrites. Oxford: Oxford University Press.
Stuehmer, W, Conti, E, Suzuki, H. etal. (1989). Structural parts involved in activation and inacti-
vation of the sodium channel. Nature, 339, 597—603.
Sukharev, S., Blount, P., Martinac, B. and Kung, C. (1997). Mechanosensitive channels of Esche-
richia colt the MscL gene, protein, and activities. Ann. Rev. Physiol, 59, 633—657.
Sukharev, S., Durell, S.R. and Guy, H.R. (2001). Structural models of the MscL gating mecha-
nism. Biophys. J., 81 (2), 917—936.
Sussman, J.L, Harel, M., Frolow, E et. al. (1991). Atomic structure of acetylcholinesterase from
Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein. Science, 253, 872—879.
Swadlow, H.A., Kocsis, J.D. and Waxman, S.G. (1980). Modulation of impulse conduction along
the axonal tree. Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9,143—179.
Szabo, A. and Karplus, M. (1972). A mathematical model for structure-function relations in he-
moglobin. J. Mol. Biol., 72, 163—197. [Cited in Chapter 5. This is an important theoretical ef-
fort to relate ideas of allosteric regulation to a more detailed picture of protein structure.]
Tainer, J.A., Getzoff, E.D., Richardson, J.S. and Richardson, D.C. (1983). Structure and mecha-
nism of copper, zinc superoxide dismutase. Nature, 306, 284—287.
Tanford, C. (1955). Hydrogen ion titration curves of proteins. In Electrochemistry in Biology and
Medicine (ed. T. Shedlovsky). New York: John Wiley & Sons, pp. 248—265.
(1961). Physical Chemistry ofMacromolecules. New York: John Wiley & Sons.
(1968). Protein denaturation. Adv. Protein Chem., 23, 121—282.
(1970). Protein denaturation Part C. Theoretical models for the mechanisms of denaturation.
Adv. Protein Chem., 24, 1—95.
Tauc, L. (1962). Site of origin and propagation of spike in the giant neuron of Aplysia. J. Gen. Phy-
siol, 45, 1077-1097.
Terada, S., Kinjo, M. and Hirokawa, N. (2000). Oligomeric tubulin in large transporting complex
is transported via kinesin in squid giant axons. Cell, 103, 141 — 155.
Tian, F. and Cross, T. A. (1999). Cation transport: an example of structural based selectivity. J. Mol.
Biol., 285, 1993-2003.
Tidor, B. and Karplus, M. (1994). The contribution of vibrational entropy to molecular associa-
tion: the dimerization of insulin. J. Mol. Biol., 238, 405—414.
Tucek, S. (1997). Is the R and R* dichotomy real? TIPS, 18, 414—416.
Tytgat, J. and Hess, P. (1992). Evidence for cooperative interactions in potassium channel gating.
Nature, 359, 420-423.
Ussing, H.H. (1949). The distinction by means of tracers between active transport and diffusion.
Acta Physiologica Scand., 19, 43—56.
Van Kampen, N. (1981). Stochastic Processes in Physics and Chemistry. New York: North Holland.
Wallace, B.A. (1990). Gramicidin channels and pores. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 19,
127-157.
Wang, W, Donini, O., Reyes, C.M. and Kollman, P.A. (2001). Biomolecular simulations: Recent
developments in force fields, simulations of enzyme catalysis, protein-ligand, protein-protein,
Литература
539
and protein-nucleic acid noncovalent interactions. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 30,
211-243.
Waxman, S.G. and Swadlow, H.A. (1977). The conduction properties of axons in central white
matter. Progress Neurobiol, 8, 297—324.
Warshel, A. and Levitt, M. (1976). Theoretical studies of enzymatic reactions: dielectric, electro-
static and steric stabilization of the carbonium ion in the reaction of lysozyme. J. Mol. Biol, 103,
227—249. [Cited in Chapter 10. A seminal paper using computational methods to investigate
the energetics of enzyme catalysis.)
Weiner, M.C. and White, S.H. (1992). Structure of a fluid*dioleoylphosphati- dylcholine bilayer
determined by joint refinement of x-ray and neutron diffraction data III. Complete structure.
Biophys. 434-447.
Weiner, S.J., Kollman, P.A., Nguyen, D.T and Case, D.A. (1986). An all atom force field for simu-
lations of proteins and nucleic acids. J. Comput. Chem., 7, 230—252.
Weinhold, E (1997). Nature of H-bonding in clusters, liquids, and enzymes: an ab initio, natural
bond perspective. ]. Mol. Struct. (Theochem)., 398—399, 181 — 197.
Wells, TN.C. and Fersht, A.R. (1986). Use of binding energy in catalysis analyzed by mutagenesis
of the tyrosyl-tRNA synthetase. Biochemistry, 25, 1881.
Wess, J., Gdula, D. and Brann, M.R. (1990). Site-directed mutagenesis of the m3 muscarinic re-
ceptor: identification of a series of threonine and tyrosine residues involved in agonist but not
antagonist binding. EM BO J., 10, 3729—3734.
Wilson, E.B., Decius, J.C. and Cross, P.C. (1955). Molecular Vibrations, chapters. New York: Do-
ver Publications, Inc.
Wu, N., Mo, Y, Gao, J. and Pai, E.F. (2000). Electrostatic stress in catalysis: structure and mecha-
nism of the enzyme orotidine monophosphate decarboxylase. Proc. NatlAcad. Sci., 97(5),
2017-2022.
Yue, K., Fiebig, K.M., Thomas, P.D., Chan, H.S., Shakhnovich, E.I. and Dill, K.A. (1995). A test
of lattice protein folding algorithms. Proc. NatlAcad. Sci., 92, 325—329.
Zeltwanger, S., Wang, F., Wang, G.-T, Gilles, K.D. and Hwang, T.-C. (1999). Gating of the cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channels by adenosine triphosphate hy-
drolysis: quantitative analysis of a cyclic gating scheme. J. Gen. Physiol., 113, 541—554.
Zerangue, N. and Kavanaugh, M.P. (1996) Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Na-
ture, 383, 634-637.
Zhang, S.J. and Jackson, M.B. (1995). Properties of the GABAa receptor of rat posterior pituitary
nerve terminals. J. Neurophysiol, 73, 1135—1144.
Zhong, W, Gallivan, J.P., Zhang, Y, Li, L, Lester, H.A. and Dougherty, D.A. (1998). From ab in-
itio quantum mechanics to molecular neurobiology: a cation-л binding site in the nicotinic re-
ceptor. Proc. NatlAcad. Sci., 95, 12088—12093.
Zimm, B.H. and Bragg, J.K. (1959). Theory of the phase transition between helix and random coil
in polypeptide chains. J. Chem. Phys., 31, 526—533.
Предметный указатель
Курсивом даны номера страниц в тех случаях, когда ссылка относится к рисунку;
подчеркнуты номера страниц, на которых ссылка относится к таблице.
Аддитивность 151
- на макроуровне 151
- на микроуровне 153
Аденозиндифосфорная кислота, ADP 153
Аквапорин 407
Аккомодация 485
Аксон омара 444
Аксоны, морфология и проводимость 492-494
- расширения 492-494
- рефлексия 493
- скорость проведения импульса и размеры
488, 489
- супернормальное состояние 486
Активный транспорт 386-388
Аланин 20, 21, 25, 54, 100, 105, 141
- параметр продолжения спирали 101
Аллостерические взаимодействия 133
— аддитивность на макро- и микроуровне
151-153
— аллостерический переход 133-137
— гемоглобин 148, 149, 161-164
— лиганд-зависимые каналы 156, 157
— межсубъединичные взаимодействия 157-
161
— модель Моно-Уаймена-Шанже 145-148,
318
---------ферменты 287, 288
---------энергетика перехода 150, 151
— модель Сзабо-Капласа 161-165
— один связывающий участок 134-137
— ответный конформационный сдвиг 137,
138
— рецепторы, сопряженные с G-белками
140-143
— связывающих участков 143-145
— фосфофруктокиназа 153, 154
— энергетический баланс 138-140
- регуляторы 155, 156
- ферменты 153—156, 287, 288
-эффекторы 149, 156
Альбумин 188
Аминокислотные последовательности, хорошо
свертывающиеся 104
Аминокислоты, параметры продолжения спи-
рали 100, 101
- торсионные движения боковых цепей 299,
301
- энергия образования спирали 100
у-Аминомасляная кислота 209, 266, 410
Аргинин 30, 64, 100, 141, 280, 317
Аррениуса график 195
- уравнение 194
Аспарагин 100
- параметр продолжения спирали 101
Аспартат 22, 58, 141, 233, 280, 281, 304
Ацетилхолин 50, 140-142
- связывание 140
Ацетилхолиновые рецепторы 50, 157, 219, 264,
272, 398,410
— скорость связывания лиганда 232
— структурные параметры каналов и прово-
димость 407, 410
Ацетилхолинэстераза 50, 234
- скорость связывания субстрата 232, 233
Бактериородопсин 235
Белки, аллостерические 134
- внутреннее движение 299, 300
- внутренние гидрофобные взаимодействия
64, 65
— электростатические взаимодействия 64
- вращение остова 87-90
- время укладки 92
— денатурация 25-27
- ионизация 317-319
- каналообразующие, 84-сегменты 30-32
- конформационные состояния 13
- кооперативность укладки 106-108
- макропереходы 13, 14, 213-219
— макросостояния 13—16, 212
Предметный указатель
541
- мембранные 71
- микросостояния 14, 15, 212
- нативная конформация 63, 92, 102
- нативное состояние 63, 90, 102, 105
- пластичность состояния 35-38
- потенциал-индуцированные переходы 27-
30, 32, 33
- прогнозирование структуры 68, 69
- равновесие макросостояний 17, 18
- свободная энергия 14, 18, 213
- свойства случайного клубка 87
- связывание с мембраной 130, 131
- силовые поля 67-69
- р-складки (Р-слои) 66, 87-90, 216
- скорость связывания лигандов 231-235
- а-спирали 66, 67, 92-94, 100, 101
- стабилизирующие силы 63-67
— структура наподобие капли масла 106
----картинки-головоломки 106
-температуроиндуцированные переходы 18,
19
- тепловая денатурация 18-25, 90-92
- укладка 63-65, 90, 92, 102-106
- флуктуации в ионизации 353, 354
— флуоресценции 367-370
— энергии 352
- функция распределения 14, 15
— хорошо свертывающиеся аминокислотные
последовательности 104
Белковая инженерия, мутантные белки 218,
219
Биномиальное разложение 147, 164, 179, 507
- распределение 178, 180, 273, 345, 355
Больцмана постоянная 16
- распределение 14, 15, 17, 48, 75, 186, 205, 208,
291, 310, 343, 349, 398,415
— координата реакции 205
— энергия активации 194
- уравнение 30, 36, 328, 480, 499
Бора эффект 149, 164
Борна энергия 42-44
Бренстеда графики 300—303
- уравнение 199
Бриггса-Холдейна механизм 284
Броуновское движение 166, 178-184, 283, 371
— гауссово распределение 181
— и кинетика множественных состояний 275—
277
— и связывание молекул с мембранными ре-
цепторами 238
Бутан 74-76
Буферы 301
Вант-Гоффа уравнение 23
Валин 22, 54, 100, 101
- параметр продолжения спирали 101
Взаимодействие катион-л-электроны 49-51,
64
Винера-Хинчина теорема 359-362, 366
Вода, водородные связи 57, 58, 101, 102
- диэлектрическая проницаемость 41
— энергия гидратации 43, 412
- энтальпия сольватированных ионов 42
- энтропия сольватированных ионов 42
Водородные связи 56-60, 69
— белки 65, 66, 101, 102
— вода 57, 58, 101, 102
— ДНК 69
— силовая постоянная 61, 292
— сильные 304-306
— энергия 56, 57, 101, 102
Волновое уравнение 487
Воротная частица 479
Воротный ток 32, 33
Восстановление флуоресценции после фото-
обесцвечивания 189
Вырожденность 75, 95, 104, 162
Вязкое сопротивление 330, 331
Газовая постоянная 16
Р-Галактозидаза 303, 304
Гармонические потенциалы 36, 61-63
Гармонический осциллятор 36, 61, 62, 121, 124,
125
Гауссово распределение, броуновское движе-
ние 181-184
— вероятности расстояния между концами
молекулы 84
Гауссовы интегралы 519, 52
Гельмгольца—Смолуховского уравнение 331
Гемоглобин 89, 90, 148, 149, 161-165, 188, 299,
354
— аллостерические взаимодействия 148, 149,
161-164
- зависимость состояния от pH 164
- линейное соотношение свободных энергий
199
— связывание кислорода 113
- связывающие кислород участки 161
Геометрическая прогрессия 507, 508
542
Предметный указатель
Гиббса—Гельмгольца уравнение 23
Гигантский аксон кальмара 444,476,480,482,483
-----проведение импульса 495, 496
-----скорость проведения импульса и размеры
488, 489
-----частота ответа 495
Гидратная оболочка ионов 315
Гидрофобные взаимодействия, укладка белков
64, 65,92, 103-106, 219
- поверхности, контакт 71
Гиперболические функции 521
Гиппокамп 467, 468
Гистидин 100, 279, 280, 281, 297, 304-307
- параметр продолжения спирали 101
Глаз, восприятие света 347-349
Глицин 54,100, 105
- параметр продолжения спирали 101
- рецепторы 410
Глутамат 100, 105, 233, 303, 304, 317, 327, 391
Глутамин 31, 100, 105
Гольдмана-Ходжкина-Катца уравнение для
потенциала 385, 388-390, 396, 425
-----для тока 384, 394-401, 409
Грамицидин А 410, 415, 416, 421, 431
- структурные параметры канала и проводи-
мость 407
Граничные условия 173, 446, 447
— отражающие 174, 241
— поглощающие 173, 210, 225, 236, 241
Гуанин-цитозин-пары, водородные связи 69
Гуи-Чапмена теория 319-322, 329, 331, 337
-----поправки Штерна 322-325
— уравнение 321
Двойной электрический слой 321
Де Бройля тепловая волна 120, 205
Дебаевский радиус 311, 312, 317, 321, 323, 332
Дебая-Хюккеля предельный закон 314
— теория 312, 315, 316, 319, 333-336
Дельта-функция 169, 461, 517
Денатурация 213-216
Денатурирующие агенты 26, 65, 213-219
Дендриты 456
- интегративные свойства. См. Интегративные
свойства дендритов
- потенциал действия 502
Десенситизация 157
Детальное равновесие 139, 196-201, 256-258,
267-270
Дзета-потенциал 331, 332
Дипикриламин 405
Диполи 46-49, 51, 66
- взаимодействие с зарядами 46-48, 434
- индуцированные 48, 49
- ионные каналы 433, 434
Диполь-дипольные взаимодействия 48, 66, 67,
434
Дипольный момент 41, 47, 51, 66, 67
Дисперсионная сила 70
— в липидных бислоях 71
Диффузия 166, 167
- гауссово распределение 181
- закон Стокса 187, 188
- законы Фика 166, 167
- источник 175
- латеральная в мембранах 189, 190
- макромолекул, коэффициенты диффузии 188,
189
- на микроуровне 184, 185
- решение уравнения 167, 168
---граничные условия 172-174
---граница раздела 170-172
---одномерная диффузия из точки 168-170
---трехмерная диффузия из точки 170
- стационарное состояние 174-178
---длинная трубка 175
---малое отверстие 176, 177
---пористая мембрана 177, 178
- и трение 185-187, 299, 300, 371
- уравнение 84, 184, 185
- через энергетический барьер 206-208
Диффузионно-зависимая диссоциация ком-
плексов 228, 229
Диффузионно-зависимое образование ком-
плексов 224-227
Диффузный слой 323, 325
Диэлектрическая проницаемость 41, 45, 46, 48,
51, 64, 68, 305, 309, 321, 404, 440, 444
ДНК 69, 81
- кинетика связывания белков 242, 243
- межплоскостные взаимодействия 69
- механизм образования двойной спирали 70
- образование кольцевой формы из линейной
85
- параметры гибкости 81
- плавление 338-341
- поведение случайного клубка 87
- связывание нуклеотидов 114, 134
— электростатическое отталкивание зарядов 333
Доннановский потенциал 377-379, 381
Предметный указатель
543
Единицы кооперативности 24, 30, 98, 99, 146,
339
Емкость ионных слоев 325
- мембраны 440, 444, 466, 467, 486-489, 492
- электрической цепи 364
Жесткие и эластичные молекулы 26, 81, 82, 86,
87
Зеленый флуоресцирующий белок 89, 90
Идеальные растворы, отклонения от 312, 314,
390
— случай бесконечно большого разведения
314
— цепи, модели 82
Изоклины нулевого смещения 501, 502
Изолейцин 21, 22, 100
Ингибитор трипсина 299
Ингибитор-2 химотрипсина 218, 219
Инсулин 125
Интегративные свойства дендритов, аналити-
ческие модели 460-465
---компартмент-модели 467-470
---ответ на стимул 461-463
---реальные синаптические входы 463-465
Ионизация белков 317-319
— модель Линдерстрем-Ланга 317
Ионная атмосфера 312, 314
Ионные каналы 356, 357, 362-364
— активация 477
— анализ пачек открываний 262-265
---воротный ток 32, 33
— грамицидин А 407, 410, 415, 416, 421, 431
— и теория Крамерса 481
------скоростей реакций 416—421
— инактивация 479
— кооперативность перехода 33-35
— лиганд-зависимые 156, 157
— мультибарьерные 416-421
— одноместные 421-427
— однорядные 407, 427-431, 434
— омическая модель 406-408, 413, 421
— переходное состояние 219
— подсчет числа состояний 265, 266
— потенциал-зависимые 28-32, 476-486
---воротный ток 32, 33
— проницаемость 433, 434
— распределение времени жизни закрытого
состояния 211-212, 264-267
-------открытого состояния 209-212, 258-
267, 358
— ряды селективности 410-412
— свойство выпрямления 410
— селективность 430, 435
— структура 403
— структурные параметры и проводимость
407
— энергетические барьеры 407-410
Ионы и противоионы 309, 310
— и плавление ДНК 338-341
— ионный коэффициент активности 312—
317, 390
— конденсация противоионов 336-338
— поверхностный заряд мембраны 319—322,
324-328, 397,398
-------и проводимость каналов 325-328
-------поправки Штерна к теории Гуи-Чап-
мена 322-325
-------регуляция каналов потенциалом 328,
329
— экранирование заряда 333-336
-------вклад в потенциальную энергию меж-
ионного взаимодействия 313, 314
— уравнение Пуассона—Больцмана и дебаев-
ский радиус 310-312
— электрофоретическая подвижность 329—
333
Кабельная теория 438
— анализ нейронов 455-460
— модель ответвлений, постоянные времени
453-455
-------стационарное состояние 452, 453
— ответвления и цилиндры как модель 450-
455
Кабельное уравнение 441-444, 491
Кабельные свойства нейронов 444
Калиевые каналы 160, 326, 327, 329, 386, 473-
478, 495-498
— мотив треонин-валин-глицин-тирозин-
глицин 432, 435
— А-ток 495—498
— KcsA 90,431-436
Кальмодулин, скорость связывания лиганда
232
Кальциевые каналы 235, 430, 494, 499
Кальция хлорид, коэффициент активности ио-
нов 314
Карбамоилхолин 140-142
544
Предметный указатель
Карбоангидраза 203, 307,391
Карбоксипептидаза 300
Каталаза 188
Квантовая механика 56, 119-122, 205, 206, 296
Квантовые эффекты 16, 350
Кинетика множественных состояний 245
----корреляции состояний канала 270—272
-----модель системы с тремя состояниями
245-247, 254, 255, 258-261
-----мультисубъединичные белки 272-275
-----начальные условия 248, 249
-----общее решение уравнений 251-254
-----одиночные каналы 262—265
-----разделение временных шкал 249, 250,
262-265
-----случайное движение и растянутая кине-
тика 275—277
-----стационарность, консервативность и де-
тальное равновесие 256-258
-----сходство кинетики одиночного канала с
кинетикой макросистем 266, 267
-----утрата стационарности, консервативно-
сти и детального равновесия 267—270
- растянутая (стретч-кинетика) 275-277
— реакций связывания 221
-----бимолекулярные комплексы 221, 222
-----небольшие возмущения 222-224
-----перенос протонов 235, 236
----связывание белков с ДНК 242, 243
-----связывание белок-лиганд 231-235
-----с мембранными рецепторами 236-240
-----связывающие участки 229—231
-----уменьшение числа измерений 240-242
Кинетические процессы 192
— диффузия через энергетический барьер
206-208
— кинетика одиночных каналов 209—212
— координата реакции для макропереходов
212-219
-----и детальное равновесие 196—201
— линейное соотношение свободных энергий
198-201
— потенциал-зависимые константы скорости
201-203
— релаксация по экспоненте 192-194
— соотношение Маркуса для свободной энер-
гии 203, 204
— теория Эйринга 204-206
— энергия активации 194, 195
Кирхгофа закон 442
Кислотно-основный катализ 300—304
— 0-галактозидаза 303, 304
— общий кислотный катализ 301
— общий основный катализ 301
Кислые фосфатные группы в нуклеиновых ки-
слотах 70, 338
Кластеризация молекул 190
Клубки, коэффициенты трения 189
- поведение 86, 87
- случайные 92, 93, 128, 129, 189
- статистика 78-80,
- упругость 86, 87
Колебания связей 14
— кинетическая энергия 16
— нормальные моды 62, 124, 125
Колебательная энергия связей, нормальные
моды 62, 124, 125
Колебательные уровни 14
Коллаген 188
Компартмент-модели 465-470, 487
Конденсация противоионов 336-338
Консервативность, сохранение общего числа
молей 257, 267-270
Конфигурационный интеграл 15, 63, 336
Конфигурация, свободная энергия 116, 128,
150, 151
Конформации белков, минимум потенциаль-
ной энергии 89
— расплавленная глобула 102
- и-бутан, транс- и гош-конформации 74-76
- макромолекул 74
— вращение остова 87-90
— макропереходы. См. Макропереходы
— неидеальные цепи и тета-растворители 82,
83
— образование петель 85
— параметры гибкости 81
----продолжения спирали для аминокислот
— переход спираль-клубок 92, 93
— распределение вероятности 83—85
— статистика случайных клубков 78-80
— теория спираль-клубок 98, 99
— укладка белков 92, 102—106
— упругость случайных клубков 86, 87
— функции распределения конфигураций
76-78
— характеристики случайного клубка 86, 87
— энергия флуктуаций 351-353
— энтропия денатурации белков 90-92
— эффективная длина сегментов 80-82
Предметный указатель
545
Конформационные переходы. См. Макропере-
ходы
Кооперативность в системах, аллостерические
переходы 146
-----ферменты 153-155
— водородные связи 59
— молекулярные комплексы 111
-----взаимодействие соседних участков 114,
115
-----последовательное связывание 113, 114
-----согласованное связывание 111-113
— переход с пираль-клубок 70, 98, 99
— потенциал-зависимые переходы 33-35
— температурозависимые переходы 33—35
— укладка белков 91, 106-108
-----ферменты 153-155
Координата реакции 196-201, 212-219, 231,
290-292
— макропереходы 212-219
Корреляционная функция 357-359, 366, 368-370
Коэффициент активности иона 312—317, 390
- пропускания 206
— распределения ионов 404
Крамерса теория 206-208
— ферменты 290, 291, 300
Кратный вклад 121
Креатинкиназа 369, 370
Кулона закон 40, 411
Кулоновский потенциал. См. Электростатиче-
ский потенциал
р-Лактамаза, скорость связывания субстрата 232
Лактоглобулин 188
Ланжевена уравнение 371, 434
Лапласа оператор (лапласиан) 167, 170, 319, 523
- уравнение 41
Лейцин 54, 105
- параметр продолжения спирали 100
Лиганд-зависимые каналы 156, 157
Лиганды 229-231
- скорость связывания 231
- уменьшение числа измерений при связыва-
нии 242
- частота связывания с рецепторами 240
Лизин 25,31,64, 105, 280, 317
- параметр продолжения спирали 100
Лизоцим 90, 180, 188, 295, 296
- денатурация 20-22, 25
- коэффициент диффузии 180
Линейные преобразования матриц 509, 510
Липидные бислои 28, 37, 45, 52, 55, 56, 70-72,
190, 327, 403-406
— силы гидратации 55, 56
Лондона силы. См. Дисперсионная сила
Лоренциан 363
Макросостояния белков 13-17, 212
— переходы 18, 19, 25-30, 213-219
----аллостерические 133-137,144, 145, 199
-----потенциал-зависимые 27-30
-----кооперативность 33-35
-----фактор крутизны 30
— пластичность 35-38
— равновесие 17, 18
— свободная энергия 14—17, 213
— функция распределения 15, 16
Макропереходы 13, 17, 20, 24, 25, 27, 30, 33
- подсчет числа путей 270-272, 425
— потенциал-зависимые, константы скорости
201-203
Марковские процессы 185, 210
Маркуса теория 203
— ферментативный катализ 306, 307
Матричная алгебра 62, 63, 96, 97, 252, 253, 509—
512
— линейные преобразования 509, 510
— положительно полуопределенные матрицы
63-67
— собственные векторы и диагонализация
512-514
— определители 510-512
— собственные значения 512-514
Мембранный(-е) потенциал(-ы) 374, 379-382
— соотношение потоков ионов по Уссингу и
активный транспорт 386-388
— влияние транспорта Na+ и К+ 382-385
— и белки-переносчики 391-394
— и двухвалентные ионы 396, 397
— и ионные помпы 390, 391
— и поверхностный заряд 394, 398
— и теория скоростей реакций 398-401
— клеточный 379-382
-----мышцы 381, 382
-----нейроны 380, 381, 385, 386
— уравнения для тока и потенциала 388-390,
392-401
Мембраны 129, 130
- белки 71
- белки-переносчики 391-394
- деполяризация 472
546
Предметный указатель
- ионные помпы 390, 391
- латеральная диффузия белков 189, 190
- плавление 72
- поверхностный заряд 319-322, 324-328, 397,
398
- связывание белков 129, 130
— молекул с рецепторами 236-240
- сопротивление 439, 440
- ток 439
- трансмембранный потенциал 27. См. также
Мембранный потенциал
Метионин, параметр продолжения спирали 100
Метод восстановления флуоресценции 189
Миелин 489-492
Микросостояния белков 14, 15
— и тепловая денатурация 18
— функция распределения 15, 16
— энтропия 14
Миозин 188
Митохондрии 391
Михаэлиса-Ментен уравнение 111, 282-284
Модель Кошланда-Немети-Филмера 157-161
- Моно-Уаймена-Шанже 145-148, 160, 318
------гемоглобин 148, 165
------фосфофруктокиназа 153-156
------энергетика перехода 150, 151
------ферменты 287, 288
- Морриса-Лекара 498, 500
- Неера-Стейнбаха 264
- Сзабо-Калласа 146, 161-165
- Ходжкина-Кейнеса 427, 429
Молекулярные комплексы 109
— кооперативность образования 111-115
— образование 109-111
------в мембранах 129, 130
------связей 116
— свободная энергия вращательного движе-
ния 122, 123
------колебательного движения 123-126
------конфигурации 128, 129
------поступательного движения 119-122
— статистическая механика образования 117
— термодинамика образования 115
— эффекты сольватации 126, 127
- силы 40
— взаимодействия заряд-диполь 46-48, 434
------катион-л-электроны 49-51, 64
— внутрибелковые 63-67
------силовые поля 67-69
— водородные связи 56-60
— гидрофобное взаимодействие 52, 53
— дисперсионная сила 51,52
— изгибание связей и гармонические потен-
циалы 61-63
— индуцированные диполи 48, 49
— сила гидратации 55, 56
----отображения 44-46, 317, 399, 406, 407,
413,416, 434
— стабилизирующие силы в нуклеиновых ки-
слотах 69, 70
— стерическое отталкивание 60, 61
— электростатическая собственная энергия
42-44, 203, 314, 317
— электростатические взаимодействия 40-
44,317
Моно—Уаймена—Шанже модель. См. Модель
Моно-Уаймена-Шанже
Мышечное волокно рака 498, 500
Найквиста теорема 367
Напряженное (Т-) состояние 134, 135, 138
— гемоглобин 149
Натриевые каналы 527, 473, 476-478
Неидеальные свойства растворов электролитов
312, 314, 390
- цепи, модели 82
Нейромедиаторы 50, 109, 140, 210, 233, 266,
386, 391,431,460,494
Нейроны 455-460. См. также Аксоны, Дендриты
- модель эквивалентных цилиндров 450-455
- гиппокампа 444, 467, 468
- компартмент-модели 465-467
- мембранные потенциалы 380, 381, 385, 386
- ритмическая активность 495-498
Нейтрофилы 391
Нернста потенциалы 374-376, 379, 382, 392-
394, 401
- уравнение 375, 392
Нернста-Планка уравнение 187
Нуклеиновые кислоты, стабилизирующие взаи-
модействия 69, 70
Нуль-клины 501, 502
Ньютона уравнение 68, 434
Овальбумин 188
Овертона теория 403, 404
Оксикарбениум 296
Ома закон 384, 395, 408, 442
Омические каналы 406-408, 413, 421
Оротидин-5'-фосфат-декарбоксилаза 298, 299
Предметный указатель
547
Парадокс Левинталя 92
Параметр инициации спирали 95
- продолжения спирали 95
Парсеваля теорема 361
Пассивное распространение сдвигов потенциа-
ла 438
Паули принцип исключения 60
Пептид S 129
Перенос протонов 235, 236
Переход спираль-клубок 70, 78, 92-97, 107,
114, 338
----математический анализ 94-97
----способность аминокислотных остатков к
образованию спирали 100-102
----среднее число спиральных остатков 95
----характеристики 98
Переходное состояние 194, 213—219
— комплементарность активному центру фер-
мента 295-299
Пероксидаза хрена, скорость связывания суб-
страта 232, 234
Персистентная длина 70, 81, 82, 333
Плавление ДНК 338-341
Поверхностный потенциал мембраны 321, 325,
326, 397, 398
Поворотные изомеры, модель 80
Полиаланин, параметры гибкости 81
Полимерные цепи, и центральная предельная
теорема 84
— идеальные 82
— неидеальные 82
— функция распределения конфигурации
76-78
Полипептидный остов белков, минимум по-
тенциальной энергии 89
Полипролин 89
Полиэтилен 78
Поляризуемость молекул 49-51
Полярные и сферические координаты 522, 523
Пороговый стимул 472
Последовательное связывание 113, 114
Постоянная времени для мембраны 443
— максвелловская 440
- длины кабельная, X 443
Потенциал действия 472
— зависимости ток—потенциал и пороги 483—
486
— и миелин 489-492
— и разнообразие каналов 494, 495
— интеграция сигналов в дендритах 502—504
— колебания 498-502
— метод фиксации напряжения 476-478
— морфология аксона и проводимость 492-
494
— определение 471-476
— распространение 486-489
— ритмическая импульсация и А-ток 495-498
— уравнения Ходжкина-Хаксли 478-484
- Леннард-Джонса 60, 68, 116
- перехода 30
- покоя 379
Потенциал-зависимые каналы, дендриты 502-
504
— макропереходы, константы скорости 201 —
203
— 84-сегмент 30—32
Потенциал-чувствительные субъединицы ка-
налообразующих белков 479
Поток(-и) 225, 227, 228, 237, 382-385
- ионов 382
— математическое выражение 387
— соотношение по Уссингу 386-388,
Проводимость мембраны 34, 384, 406, 407, 426,
439, 466, 473, 476
Программа NEURON 468
Продольное удельное сопротивление 439, 444
Пролин 101, 281, 296
- параметр продолжения спирали 100
Проницаемость ионного канала 433, 434
- мембраны 478
— для ионов 374, 382, 403. См также Ионные
каналы
---в отсутствие каналов 403-406
---взаимодействия внутри ионных каналов
413-415
---доннановский потенциал 377-379
---потенциалы Нернста 374-376
---соотношение проницаемостей 385-388,
396, 398, 425-427, 473
Пространственная постоянная (X) 443
Противоионы. См. Ионы и противоионы
Прохождение ионов через каналы, и теория
скоростей реакций 414
Пуассона уравнение 41, 310, 333, 395, 440
- распределение 344-347
— флуктуации концентрации 344—349
— среднеквадратичное отклонение 347
Пуассона—Больцмана уравнение 310—312, 316,
319, 320
---равномерно заряженный цилиндр 333
548
Предметный указатель
----линеаризованная форма 312, 316, 317
----мембраны 319, 320
Равнораспределения энергии принцип 37, 125
Развертывание белковой молекулы 20, 26
----переходное состояние 214
----лизоцим 20-22, 25
----скорость 213, 218, 219
----энтропия 91, 92
Рамачандрана графики 88-90
Ранвье перехваты 490
Растворители 66, 83, 404
Растворы, бесконечное разбавление 314
- отклонение от идеальности 312, 314, 390
- полиэлектролитов 333-338
Рацемаза пролина 296
Релаксированное (R-) состояние 134, 135, 138,
148, 149
Рецепторы ацетилхолина 219
— глицина 410
- сопряженные с G-белками 140-143
Рибонуклеаза 129, 188, 219, 354
- бактериальная 106, 218, 219
РНК, связывание нуклеотидов 114
Родопсин 348
Ролла модель нейрона 456, 459, 460
- правила для ветвления дендритов 450-452,
455,456
Сальтаторное проведение потенциала 490
Саффмана—Дельбрюка уравнение 190
Световосприятие 347-349
Свободная энергия, влияния 35, 36
— вращательного движения 123
— изменение 17
----ионизация белков 317
----переходы, индуцированные давлением 25
----тепловая денатурация белков 18
----электростатическая составляющая 27
— колебательного движения 125, 152
— конфигурации 116, 128, 150, 151
— линейное соотношение величин 198—201,
214-217
— макросостояния белков 14-17, 213
— Маркуса соотношение 203, 204
— молярная 17
— перенос липида в воду 54
— переходного состояния 213
— поступательного движения 119-122,291,294
— свободно сочлененных цепей 79
— стандартные условия 115
— трение,закон Стокса 187, 188
----коэффициент 188
----флуктуационно-диссипативная теорема
371-373
----фермент-субстратные комплексы 299, 300
----электрофоретическая подвижность ионов
329
— цепей со свободным вращением 76
Связи С—С 61, 293
Селективный фильтр 411, 432—435
Сенсор потенциала 30-32
Серин 25, 100, 141, 279, 281, 304, 305
Сериновые протеазы 279-281, 304-306
Серотонин 431
Сетчатка глаза 348
Сила гидратации 55, 56
-отображения 44-46, 55, 317, 399, 407, 408,
413,416, 434
Силовое поле, ионные каналы 434
Силовые поля, гибридные 296
— внутрибелковые 67-69
Синапс(-ы) 210, 504
- модели интеграции в дендритах 460-463,
467-470
- ответы на стимул 461-463
- реальные синаптические входы 463-465
- синаптический ток 212
р-Складки (слои) в белках 66, 87-90, 216
Собственная энергия (энергия Борна) 42-44,
203, 314, 317
Собственные векторы 253, 512-514
— модель трех состояний 253
- значения 62, 252, 274, 275, 512-514
Согласованное связывание 111-113
Сольватация, влияние на связывание 126, 127
Спектр мощности флуктуаций 361, 363, 364
Спектральная плотность 361
а-Спирали, белки 66, 67, 92-94, 100, 101
- кэппинг101
- математический анализ 94-97
- стабильность 93
Спирты как денатурирующие агенты 65
Среднее время захвата 242
Среднеквадратичная длина молекулы 76, 78
- скорость молекулы 180
Среднеквадратичное расстояние между конца-
ми молекулы 83-85
- смещение (отклонение) 37, 169, 179, 180, 185,
346,347
Предметный указатель
549
Стабилизирующие силы в белках 63-67
Статистика, световосприятие глаза 347—349
- случайный клубок 78-80
Статистический вес по Больцману 14, 48, 75,
95, 117
Стационарное состояние в случае кабеля ко-
нечной длины 444—446
Стационарность 256
- отсутствие 267-270
Стереоспецифические взаимодействия 61
Стерическое отталкивание 60, 61
Стирлинга аппроксимация 182
Стокса закон 187-189, 332
Стокса—Эйнштейна соотношение 188, 226,
230, 370
Ступенчатые сдвиги напряжения в кабеле ко-
нечной длины 444—449
— тока 449, 450
Супероксидцисмутаза, скорость связывания
субстрата 232, 234
Сферические и полярные координаты 522, 523
Сцепление 145
Танфорда число рТ 214
Тейлора ряды 506
Температура макроперехода 18-23, 339-341
Термодинамика образования молекулярных
комплексов 115
Тета-растворители 83
Тирозил-тРНК-синтаза 58, 59, 297
Тирозин 50, 58, 141, 233, 297, 299, 432
— параметр продолжения спирали 100
Ток одиночных каналов, и проводимость мем-
браны 156, 209-212, 356, 357, 406-408, 414,
415,427,477-480
- через мембрану и цитоплазму 439-441
А-Ток 495-498
Трансмембранный потенциал 27, 374. См. так-
же Мембранный потенциал
Трение 185-187
- закон Стокса 187,188
- коэффициенты для макромолекул 188
- фермент-субстратные комплексы 299, 300
-флуктуационно-диссипативная теорема 371—
373
- электрофоретическая подвижность ионов 329
Треонин 20-22, 25, 100, 101, 141, 297, 432, 435
- параметр продолжения спирали 101
Триозофосфатизомераза, скорость связывания
субстрата 232
Трипсин 179, 281
Триптофан 50, 64, 233, 280
- параметр продолжения спирали 100
Тропомиозин 188
Тубулин 369, 370
Уабаин 391
Удельное сопротивление мембраны 439, 444
Укладка белков 216
— время 92
— гидрофобные взаимодействия 64, 65, ЮЗ-
106
— кооперативность 106-108
— нативное состояние 63, 90, 102—106
------подобие капле масла 106
------картинке-головоломке 106
------расплавленная глобула 102
— решеточная модель 103, 104, 106
— хорошо свертывающиеся аминокислотные
последовательности 104
Улитка Anisidoris 496, 497
Уменьшение числа измерений 129, 130, 240-
242
Уравнение в приближении постоянного поля 388
------расширенное 397, 398
Уреаза 188
Уссинга уравнение 387, 395
Фактор крутизны перехода 30
Фенилаланин 50, 54, 58, 100, 141, 233
Ферментативный катализ 278
— аллостерические ферменты 287, 288
— аппроксимация к стационарному состоя-
нию 284-286
— использование энергии связывания 288—
290
— кинетика Михаэлиса-Ментен 282-284
------предстационарного состояния 286, 287
— комплементарность переходного состоя-
ния активному центру 295-299
— кислотно-основный катализ 300-304
— перенос протона в карбоангидразе 307
— сближение групп и энтропия поступатель-
ного движения 291—294
— сериновые протеазы 279-281, 304-306
— скорости гидролиза 281
— теория скоростей реакций Крамерса 290,
291
— трение в фермент-субстратном комплексе
299, 300
550
Предметный указатель
— энтропия вращательного движения
— эффективность 283
Ферменты, К-системы 288
- V-системы 288
Фибриноген 188
Фика законы 166, 167
Фиксированный слой 323, 325, 329
Флуктуации 343
- ионизация белков 353, 354
- отклонения от среднего 343, 344
- принцип равнораспределения энергии 349,
350, 365
- распределение Пуассона 344-347
- системы с двумя состояниями 354-356
------корреляционная функция 357-359
- статистика восприятия света глазом 347-
349
- теорема Винера-Хинчина 359-362, 366
- ток через одиночный канал 356, 357
- трение и флуктуационно-диссипативная тео-
рема 371-373
- флуоресцентная корреляционная спектро-
скопия 367-379
- шум ионных каналов 362-364
— электрического контура 364-367
- энергия макромолекул 351-353
Флуоресцентная корреляционная спектроско-
пия 189, 367-370
Флуоресцентно меченные белки 369, 370
Фосфофруктокиназа 153, 154
Фоторецепторные клетки 348, 349
Фруктозо-1,6-дифосфат 153
Фруктозо-6-фосфат 153
Функция распределения конфигурации 76-78
— вклад поступательного движения 121
— микросостояния белков 15, 16
— полимеры и мономеры 77
— реакции связывания 117
— сумма величин элементарного статистиче-
ского веса 76-78
— цепи из N остатков 95
Фура-2 223, 224
Фурье анализ 515-518
- интеграл 359, 461
- преобразование 168, 173, 174, 359, 360, 362,
363,447,448,461,517
— и аддитивный шум 359, 360
— и флуктуации 359-362
— лоренциан 363
— обратное 362, 517
Характеристическое отношение 81
— заряд-дипольные взаимодействия 46-48
- уравнение матрицы 252, 273, 513
Хилла график 112, 113
-коэффициент 113, 114, 148
— последовательное связывание 114
-уравнение 112, 148, 159
Химотрипсин 279, 281, 287, 289, 304, 305
- скорость реакции 281
- скорость связывания субстрата 232
Химотрипсиноген 188
Хлорный канал 386
Ходжкина-Хаксли уравнения 478-484, 486
Холин 326, 477, 478
Центральная предельная теорема 84, 181
Цилиндр как модель нервного волокна 450, 451
--------постоянные времени 453-455
--------стационарное состояние 452, 453
Цистеин, параметр продолжения спирали .100
Цитоплазма, вязкость 377, 444
- проводимость 439-441
- сопротивление 439
Частота столкновений 224-227
Число оборотов фермента 283
Штерна поправки к теории Гуи-Чапмена 322-
325
Шум джонсоновский 367
- каналов 212, 357, 358, 362-364
- электрического контура 364-367
Щелочная фосфатаза 239, 240
Эйзенмана теория селективности 410-412
Эйлера формула 517
Эйнштейна уравнение для диффузии и трения
186-188
Эйринга теория 204—206
Экранирование зарядов по теории Дебая-
Хюккеля 333—336
Эластаза 279
Электрогенные мембранные помпы 390
Электролиты 309, 310, 312
- ионный коэффициент активности 312-317,
390
- осмолярность растворов 312
Электронейтральность 322, 378, 382
Электростатическая собственная энергия 42-44
Предметный указатель
551
Электростатические взаимодействия 47, 48,
203, 233, 434
Электростатический потенциал 41, 42, 47, 309,
312-314, 333, 336-338, 411
— стресс 299
Электростатическое взаимодействие, вклад в
потенциальную энергию межионного взаи-
модействия 313
Электрофорез 329-333
- подвижность ионов 330
- сила вязкого сопротивления 330, 331
— сдвига 330
- скорость движения ионов 329
Элементарный статистический вес 75, 95
----и функция распределения 76-78
Энергетический барьер 212, 213
Энергия активации 194, 195, 296-298, 307
— гидратации ионов 42—44, 413
- связывания, ферменты 288-290
Энтальпия 18, 19, 53, 54, 58
- Вант-Гоффа 23, 107
- гидратации 43
- и закон Кулона 41, 42,
- ионы в воде 42
— тепловая денатурация белков 22—25, 92, 107
Энтропия 18, 19, 53, 54
-^клад вращательного движения 294, 295
— поступательного движения 291—294
- денатурация белков 90-92
- ионы в воде 42
- конфигурации 90-92, 129
— электростатические взаимодействия 41,42
Эритроциты 391
Эффект исключенного объема 61, 82, 83, 89, 91,
315
--тета-растворители 83
Эффективная длина сегмента макромолекулы
81