pMMWtvWMCHfHOrO
Теория и практика иммуноферментного анализа
А
ББК 30.16 ТЗЗ
УДК 573.6
Рецензенты:
кафедра биотехнологии Московского института тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (зав. кафедрой проф. В. И. Швец); акад. В. И. Покровский (НИИ эпидемиологии Минздрава СССР).
Рекомендовано к изданию
Государственным комитетом СССР по народному образованию
Теория и практика иммуноферментного анализа./ Т 33 А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, Е. М. Гаврилова — М.: Высш, шк., 1991. — 288 с.: ил.
ISBN 5-06-000644-1
В учебном пособии рассмотрены основные физико-химические закономерности взаимодействия антигеи — антитело, лежащие в основе методов имму-ноферментиого анализа (ИФА). Даны классификация методов, характеристика н способы получения реагентов, используемых в ИФА. Обсуждаются возможности, достоинства и области практического использования различных вариантов ИФА.
Приведены крнкретиые примеры проведения иммуноферментного определения ряда модельных биологически активных соединений различной структуры и молекулярной массы.
1903010000(4309000000)—175	ББК30.16
001(01)—91	~	605
Учебное издание
Егоров Алексей Михайлович, Осипов Александр Павлович, Дзантиев Борис Борисович, Гаврилова Елизавета Михайловна.
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Редактор М. М. Пенкина. Младшие редакторы Е. В. Бурова, Е. И. Попова. Художник В. Н. Хомяков. Художественный редактор Т. А. Колеикова.
Технический редактор 3. В. Нуждина. Корректор С. К. Завьялова.
ИБ № 8179
Изд. № Е-585. Сдано в набор 01.10.90. Подп. в печать 24.01.91. Формат 60Х88'/и. Бум. офс. № 2. Гарнитура литературная. Печать офсетная. Объем 17,64 усл. печ. л. 17,64 уел. кр.-отт. 19,32 уч.-изд. л. Тираж 4 I экз. Зак. № 627. Цена 1 р. 50 к.
Издательство «Высшая школа», 101431 Москва, ГСП-4, Неглннная ул., д. 29/14.
Московская типография № 8 Государствен!!' комитета СССР по печати, 101898, Москва, Хохлов, й пер., 7.
ISBN '5-06-000644-1
© Коллектив авторов, 1991
Предисловие
Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии как в нашей стране, так и за рубежом. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность им-мунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом (вплоть до 10~21 молей в образце). Высокие результаты достигаются благодаря использованию неограниченных возможностей ферментбв — биокатализаторов, которые позволяют создавать каскадные системы усиления различных химических сигналов.
Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, биологическую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования. Применение ИФА в различных областях научней и практической деятельности ставит перед исследователем задачу: освоить основные приемы, необходимые для самостоятельной разработки метода и его эффективного использования. Что же необходимо для этого знать? Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физикотхимичесцих закономерностей реакции антиген — антитело, а также на основные принципы аналитической химии. Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а так,же необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количества вариантов этого метода, в результате чего становится все труднее и труднее ориентироваться в потоке информации и данном методе.
Другая особенность ИФА, с которой сталкивается начинающий разработчик этого метода, является кажущаяся простота изготовления реагентов и выбора оптимальных условий его проведения. Так как метод высоко чувствителен, а измерения носят количественный характер, то исключительно высокие требования предъявляются к качеству реагентов, которые во многих случаях исследователь готовит самостоятельно. В настоящее время накоплен большой опыт в создании реагентов для ИФА, известны критерии, которым они должны удовлетворять, чтобы достичь необходимой чувствительности, изучены основные закономерности реакции антиген— антитело в растворе и на твердой фазе, что позволяет целенаправленно оптимизировать условия проведения анализа.
3
Высокая чувствительность ИФА достигается также благодаря использованию различных физических методов регистрации ферментативной активности: фотометрических, флуориметрических, а в последние годы био- и хемилюминесцентных. В ряде случаев, особенно связанных с решением технологических задач, успешно применяются электрохимические и микрокалориметрические датчики. Поэтому необходимо хорошо ориентироваться в тех возможностях, которые определяются особенностью тех или иных методов регистрации.
Как всяций аналитический метод ИФА имеет свои ограничения, связанные, прежде всего, с «шумом», который становится все более значимым по мере того, как растет чувствительность детектирующих систем. Этот «шум» обусловлен биологической природой молекулы детектора (антитела), усилителя (фермента). Изучение природы этих «шумов» и способов их подавления составляет один-из необходимых этапов разработки высокочувствительных методов ИФА.
В данной книге рассмотрен широкий круг теоретических и практических вопросов, связанных со свойствами антител и ферментов, способов получения реагентов, оптимизации условий проведения анализа, необходимых как разработчикам методов ИФА, так и тем, кто использует готовые реагенты. Она рассчитана на очень широкий круг исследователей, которые могут избирательно относиться к отбору необходимого для них материала, выполняя роль и учебного и справочного пособия.
Авторы выражают благодарность за участие в написании отдельных глав книги сотрудникам кафедры химической энзимологии МГУ им. М. В. Ломоносова Н. В. Сорокиной (гл. 5) и С. А. Еремину (гл. 7) и Института биохимии им. А. Н. Баха. АН СССР Т. В. Чередниковой (гл. 6) и Д. Н. Юрьеву (гл. 9, 10).
Авторы
Введение
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами (в гл. 1 будет введено точное определение термина «антиген», однако здесь мы будем понимать под ним идентифицируемое вещество, против которого выработаны соответствующие антитела) протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса состава 1:1. Вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания для поливалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложных комплексов с различным соотношением в нем компонентов.
Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и, кроме того, в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гаптенов), например гормонов, лекарственных соединений, эти методы непригодны.
Индикация образовавшегося комплекса антиген — антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Для достижения высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимости, экспрессности и автоматизации иммунохимических анализов принципиально возможным является использование только первой стадии простого иммунохимического взаимодействия. Так как процесс комплексообразования пары анализируемое соединение (антиген)—специфическое антитело происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося
5
иммунохимического комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена.
Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген — антитело прочно иммобилизовать (связать) на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. Возможность прочного связывания на носителе антител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов дали мощный импульс для развития новых подходов в иммуно-химических методах анализа.
Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченых реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток.
Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологиче-ский анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 1251, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Иалоу и С. Берсон в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии.
Наряду с несомненными достоинствами РИА имеет и определенные недостатки, к которым можно отнести следующие: 1) ограниченный срок жизни радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов; 2) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности; 3) возможность радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, что вызывает необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала. Именно эти трудности послужили исходным моментом для поиска методов, альтернативных РИА, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и экспрессность.
В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффектив
6
но осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10~12 М и ниже).
На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа (Е. Engvall and Р. Perlmann, 1971; В. К Van Weemen and A. Schuurs, 1971).
Эти методы наиболее распространенные и используются для определения широкого круга как низкомолекулярных; так и высокомолекулярных соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, фармакологических препаратов, вирусных и бактериальных антигенов, пестицидов и т. д.
Особую значимость для широкого рнедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полисти-рольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах РИА. Введение в практику ИФА полистирольных плат позволило значительно увеличить число'проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы.
В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в имму-нохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.
Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически активных со
7
единений, нашедшие широкое применение в химической токсикоз логии, фармакологии, эндокринологии.
Внедрение гомогенного варианта ИФА, получившего название EMIT-анализа, в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов количественного определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях, что дало возможность изучить их фармакокинетику и метаболизм в организме.
• Большим преимуществом метода EMIT-анализа является возможность использования малых объемов анализируемого образца (5—50 мкл) и отсутствие стадии его предварительной обработки.
Развитие гомогенного ИФА начиналось с разработки методов определения низкомолекулярных соединений, затем появились новые модификации, позволяющие определять и высокомолекулярные антигены — альбумин, иммуноглобулины и т. д.
Одна из важных задач, решаемых в настоящее время в ИФА,— это поиск подходов, позволяющих значительно сократить время-проведения анализа при сохранении высокой чувствительности. Один из них — это перевод анализа в кинетический режим. Методически этот подход реализуется созданием автоматических устройств, основанных на проведении реакции в проточных системах.
Широкие возможности в ИФА открывает использование моноклональных антител, специфичных строго к определенному антигенному участку анализируемого соединения. Путем подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные имму-нохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга.
Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых ферментов, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.
Структура и свойства антигенов и антител
Иммунология развивается как комплексная медико-биологическая дисциплина. Одновременно ряд направлений исследований получил ярко выраженный прикладной характер и сформировался в самостоятельные научные направления. Одной из таких ветвей иммунологии является иммунохимиче-ский анализ, использующий иммунологические принципы для выявления и количественного определения различных веществ. В связи с комплексностью иммунологии как научной дисциплины многие термины и понятия стали настолько многозначны, что требуется дополнительное уточнение их смысла в зависимости от области исследований. В данной книге будут использованы такие значения терминов, которые максимально приближены к иммунохимическому анализу.
§ 1. Основные иммунохимические понятия
Генетически чужеродные вещества, попадая в организмы высших животных и человека, способны вызывать в них ряд специфических процессов, направленных на их удаление из организма. Система организма, выполняющая эту функцию, называется иммунной системой, а сами процессы — иммунологическими. К важнейшим из них следует отнести образование специфических белков крови— антител (иммуноглобулинов). Вещества, способные вызвать специфические иммуно
9
логические реакции в организме, в том числе биосинтез специфических антител, получили название антигенов (от латинского anti — против и genos — род). Способность антигенов вызывать иммунный ответ называется иммуногенностью, а способность образовывать комплексы с антителами — антигенностью. В иммунологии антигенность часто называют серологической активностью.
• К антигенам относятся белки, полисахариды, липополисахариды, нуклеиновые кислоты как в очищенном виде, так и в виде структурных компонентов различных биологических структур (клеток, тканей, вирусов и т. д.).
На поверхности молекулы сложного антигена можно выявить функциональные группы или остатки, обусловливающие антигенную специфичность, называемые антигенными детерминантами или эпитопами. Число эпитопов на поверхности молекулы определяет валентность антигена.
Низкомолекулярные вещества, не способные вызывать образование антител, но после конъюгирования с высокомолекулярными носителями приобретающие иммуногенные свойства, называются гаптенами. К гаптенам относится очень широкий круг природных соединений: пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты, например антибиотики, барбитураты, а также олигосахариды и олигонуклеотиды.
В настоящее время синтезирован ряд высокомолекулярных соединений, не имеющих аналогов в природе (например, полимеры поливинилпиридина с боковыми функциональными группами), которые обладают- способностью вызывать образование антител. Такие вещества получили название искусственных антигенов. К ним относятся также и другие синтетические вещества, которые являются либо аналогами природных соединений, либо состоят из сополимеризованных природных мономеров (аминокислоты, сахара, нуклеотиды).
Биологическая функция антител заключается в защите организма от чужеродных веществ путем образования прочных специфических иммунных комплексов с соответствующими антигенами и последующего удаления их из организма. Способность антител образовывать высокоспецифичные прочные комплексы с различными веществами и возможность получения антител в необходимых количествах являются основой иммунохимических методов анализа.
§ 2. Биосинтез антител
Иммунная система, ответственная за биосинтез антител, состоит из ряда органов, основными из которых являются тимус, селезенка и периферические лимфоидные струк
10
туры, в которых формируются три основных типа клеток: Т- и В-лимфоциты и макрофаги.
Антитела вырабатываются В-лимфоцитами, на поверхности которых уже имеются рецепторы, специфически связывающие антиген. В этот же комплекс включаются Т-лимфоциты и макрофаги. В результате межклеточной кооперации происходит активация В-лимфоцитов и их трансформация в плазматические клетки. Большая часть образовавшихся плазматических клеток синтезирует антитела, аналогичные по специфичности рецепторам на поверхности В-лимфоцитов, и секретирует их в кровь. Другая часть превращается в клетки «иммунологической памяти», способные выделять антитела при повторном введении антигена.
Каждый В-лимфоцит содержит на поверхности около 100 тыс. рецепторов одинаковой специфичности. Антиген, встречаясь в кровотоке с комплементарным рецептором, проводит отбор (селекцию) соответствующего В-лимфоцита, который затем, трансформируясь в плазматическую клетку и многократно делясь, образует клон клеток. Эта теория биосинтеза антител, впервые сформулированная П. Эрлихом (1897), а затем модифицированная в соответствии с уровнем развития науки Ф. Бернетом (1941), получила название клонально-селекционной. Важно отметить, что каждый клон плазматических клеток секретирует гомогенные по своей структуре антитела. Однако так как антиген активирует в крови сразу несколько типов В-лрмфоцитов, которые содержат рецепторы различной степени специфичности по отношению к исходному антигену,, такой иммунный ответ называется поликлональным, а антитела — поликлональными.
Сыворотку животного, содержащую специфические к данному антигену антитела, называют антисывороткой. При этом обычно указывают, против какого антигена она выработана. Например, когда говорят об антисыворотке кролика против эритроцитов человека, подразумевают, что в ответ на введение в кровь кролика эритроцитов человека образуются специфические к ним антитела. • Принципиально важным является то, что поликлональные антитела даже против одной-единственной антигенной детерминанты гетерогенны как по структуре активного центра, так и по физико-химическим свойствам. В том случае, если антиген поливалентен, например белок, то в сыворотке крови образуются антитела, направленные против каждой индивидуальной детерминанты (эпитопа), что еще более усложняет состав антител. Состав антител зависит от вида животного, а также стадии иммунного процесса.
Все перечисленные выше факторы влияют на гетерогенность антител и обусловливают определенные трудности как в изучении их структуры, так и в получении воспроизводимых стандартных препаратов антисывороток. Работы Келера и Милыптейна (Kohler G. and Milstein С., 1975) по гибридизации животных клеток открыли принципиально новый путь получения антител. Сущность метода
11
заключается в том, что из организма иммунизированного животного выделяются лимфоциты, которые специальным образом «сливаются» (гибридизируются) с миеломными клетками. Образующиеся клетки получили название гибридом.
Особенностью таких клеток является их способность размножаться и продуцировать антитела в искусственных условиях вне организма. С помощью специальных методов клонирования можно выделить одну гибридную клетку, которая, размножаясь, будет секретировать в неограниченных количествах антитела только одного вида — моноклональные антитела. Подчеркнем, что моноклональные антитела гомогенны как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам. Вопросы, связанные с получением поликлональных и моноклональных антител для иммунохимического анализа, подробно рассмотрены в гл. 5, 6.
§ 3. Структура и специфичность антигенов
Понятие антигенная детерминанта включает в себя последовательность образующих ее химических функциональных групп и их пространственное расположение.
Белки. В молекулах белков антигенная детерминанта образуется совокупностью аминокислотных остатков. Размер антигенной детерминанты белков может варьировать от 5—7 до 20 аминокислотных остатков (а. о.). В случае длинных антигенных детерминант, по-видимому, только часть из них включается в собственно антигенную структуру, а остальные ответственны за' ее конформацию.
Антигенные детерминанты белков бывают двух типов — секвенциальные, т. е. представляющие из себя последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, и конформационные, образованные аминокислотными остатками из различных частей белковой цепи, но сближенные в пространственной конфигурации белковой глобулы. Оба типа антигенных детерминант-имеют важное значение для характеристики «иммунного .портрета» белков. Во многих случаях единичная замена аминокислоты в структуре антигенной детерминанты или изменение конформации белковой глобулы являются достаточными для изменения антигенной специфичности макромолекулы.
Термин «специфичность антигена» используется в двух смыслах: во-первых, как способность избирательно реагировать со специфическими антителами, во-вторых, поскольку белковые антигены поливалентны, как набор определенных антигенных детерминант. Если два антигена имеют только часть одинаковых антигенных детерминант, их называют перекрестно реагирующими антигенами. Примерами таких антигенов являются гомогенные белки (например, альбумин) близкородственных видов животных.
12
Некоторые антигенные детерминанты у белков с четвертичной структурой могут быть образованы фрагментами полипептидных цепей различных субъединиц, как, например, в иммуноглобулинах и гемоглобине. Как уже указывалось выше, антигенная детерминанта белков образована группой аминокислотных остатков, среди которых можно выявить иммунодоминантную группу. Примером такой группы является С-концевой аргинин декапептида белка вируса табачной мозаики.
Наиболее характерно эффект иммунодоминантной группы выявляется при модификации отдельных аминокислотных остатков химическими соединениями, например динитрофенильной группой. Антитела, образующиеся в такой модифицированной антигенной детерминанте, способны реагировать не только с ней, но и с другими аминокислотными остатками, к которым будет «пришита» динитрофенильная группа. Более того, если в раствор, содержащий модифицированный белок и антитела, добавить свободный динитрофенол, то он будет ингибировать образование комплекса антиген — антитело. Это явление, которое впервые было описано и детально изучено К- Ландштейнером, послужило основой для получения антител против различных гаптенов.
Существенный вклад в понимание структуры антигенных детерминант внесли работы по изучению антигенности синтетических пептидов. Классическим примером являются работы по синтезу пептидной петли лизоцима, которая является самостоятельной антигенной детерминантой (остатки 64—82). Было показано, что эта петля, содержащая внутреннюю дисульфидную связь, взаимодействует с антителами, получаемыми как против лизоцима, так и самой петли, однако образование комплекса не происходит, если дисульфидная связь восстанорлена. Это свидетельствует о том, что структура антигенной детерминанты и ее специфичность зависят как от аминокислотной последовательности, так и от конформации данного фрагмента. Общим для антигенных детерминант является то, что они, как правило, находятся на поверхности белковой глобулы и образованы жесткими а-спиральными участками.
В работах М. Села (1968) было показано, что гомополимеры, состоящие из одинаковых аминокислот, не обладают антигенной структурой, в то время как гетерополимеры содержат антигенные детерминанты, причем чем сложнее состав полипептида, тем больше различных антигенных детерминант он образует. Важными здесь являются два фактора: жесткость конформации полипептид-ной глобулы и ее аминокислотный состав.
Существует несколько путей исследования структуры антигенных детерминант. Один из них основан на искусственном синтезе фрагментов первичной структуры, в которых проводятся замещения отдельных аминокислот. Другой путь — изучение влияния избирательной модификации отдельных аминокислотных остатков. Еще один способ — сравнение между собой гомологичных антигенов
13
(например, инсулин разных видов животных, для которых точно известна последовательность аминокислот и их различия). Эффективным методом является также использование ограниченного протеолиза и выявление фрагментов, содержащих антигенные детерминанты. Хотя ни один из этих путей не дает однозначных результатов, однако совокупность данных позволяет построить «антигенный портрет» данного белка.
Исключительную важность знания такого «портрета» для иммунохимического анализа можно продемонстрировать на примере изучения антигенных детерминант раково-эмбрионального антигена (РЭА) и антигенно родственных ему белков. РЭА представляет гликопротеид с Мг= 180 000, который содержит по массе около 50% углеводов. Он имеет 9 различных эпитопов, большинство из которых конформационно зависимые пептидные детерминанты. В сыворотке крови содержится еще целая группа белков, перекрестно реагирующих с РЭА, что затрудняет использование этого антигена для диагностических целей. В настоящее время с помощью моноклональных антител выделены три антигенные детерминанты, которые являются абсолютно специфичными для РЭА.
Знание антигенной специфичности является исключительно важным условием для создания диагностических иммунохимиче-ских наборов, так как позволяет проводить определение данного вещества в присутствии близкородственных соединений.
В роли антигенов могут выступать и сами иммуноглобулины (антитела). В этом случае организм вырабатывает антитела, которые часто называют вторичными. Например, при иммунизации кролика иммуноглобулинами другого вида животного вырабатываются вторичные (антивидовые) антитела. В иммуноферментном анализе существует большая группа методов (в том числе так называемый «метод двойных антител»), в которых используют меченные ферментом вторичные антитела.
О Обобщая данные о структуре антигенной детерминанты белков, можно выделить ее следующую характерную особенность: жесткий участок поверхности белковой глобулы, образованный одним или несколькими фрагментами полипептидной цепи, содержащими иммунодоминантную группу.
Йуклеиновые кислоты. Структура антигенных детерминант нуклеиновых кислот остается до сих пор малопонятной. Это обусловлено тем, что сами по себе нуклеиновые кислоты практически не иммуногенны, но в комплексе с белками к ним могут быть получены антитела. Как и в случае белков, важную роль играет жесткость структуры полинуклеотида. В состав антигенной детерминанты входят три- и тетрануклеотиды. Они могут быть образованы как двуспиральными, так и односпиральными участками. Понимание структуры антигенных детерминант имеет важное значение не только в плане иммунохнмнческой диагностики различных 14
патологических процессов, но и в связи с активным развитием гибридизации ДНК, в которых антитела выступают в роли детектирующих систем.
Полисахариды. Полисахариды — весьма сложная по своему составу и строению группа антигенов, входящая в структуру стенок микроорганизмов и многих других клеток (например, эритроцитов) и определяющая их специфичность. Полисахариды входят в состав многих белков (гликопротеидов) и также играют роль антигенных детерминант. В большинстве случаев полисахаридные антигены представляют собой длинную цепь, к которой присоединены боковые короткие олигосахариды, содержащие 4—6 остатков сахаров, фактически являющиеся антигенными детерминантами. В одних случаях олигосахаридные группировки идентичны и тогда весь полисахаридный комплекс представляет собой чередующиеся антигенные детерминанты (аналогично гаптенам, присоединенным к белковой глобуле). В других случаях боковые цепи могут сильно различаться между собой. Как правило, в антигенную детерминанту входят остатки сахаров, расположенные на конце боковых цепей, содержащие заряженную группу (например, N-ацетил-глюкозамин), которая является иммунодоминантной группой.
На специфичность олигосахаридных антигенных детерминант в структуре белков оказывает влияние ближайшее окружение по-липептидиой цепи белка-носителя и тип связи между сахарами.
В случае полисахаридных гомополимеров, таких, как декстран, антигенная детерминанта может состоять из фрагментов, содержащих до восьми остатков.
Липиды, входящие в состав комплексов со многими полисахаридами, не обладают антигенной специфичностью, по-видимому, из-за высокой конформационной подвижности.
• Таким образом, структура полисахаридных антигенных детерминант представляет собой олигосахаридные цепи длиной 4—6 остатков, специфичность которых определяется химическим составом, типом гликозидных связей и остатками, находящимися в ближайшем окружении.
Гаптены. Гаптены — это вещества, которые сами не вызывают иммунного ответа, но, будучи конъюгированы с носителями (чаще молекулами белков), обладают способностью стимулировать синтез против них антитела. Обычно принято считать, что гаптены — это низкомолекулярные соединения, однако это не совсем верно. Например, нуклеиновые кислоты, полипептиды D-амино кислот имеют высокую молекулярную массу, но антитела против иих возникают только после коНъюгирования их с белками. В этом случае гаптены в конъюгатах с белком выступают в роли иммунодоминантной группы и поэтому в дальнейшем могут взаимодействовать с антителами независимо от белка носителя.
Структура и антигенная специфичность гаптенов определяется целым рядом факторов. В качестве гаптенов могут выступать са
15
Л
мые разнообразные органические вещества с Л1Г> 100. С практической точки зрения важными являются стероидные и пептидные гормоны, широкий круг лекарственных соединений (антибиотики, сердечно-сосудистые препараты, антиэпилептики), пестициды, различные продукты промышленного органического синтеза, обладающие аллергенным действием.
Антигенная специфичность гаптенов сильно зависит от их химической структуры. Так, введение дополнительных групп может сильно исказить «антигенный портрет» того или иного соединения. Например, тироксин и трийодтиронин отличаются только одним остатком I, чего вполне достаточно, чтобы антитела против этих гормонов сильно различались перекрестной реактивностью. Классическими примерами стали исследования с пара-, орто- и мета-аминобензойной кислотами, которые практически не дают перекрестных реакций при сопоставимых концентрациях.
Важным моментом является стереоспецифичность гаптенов; антитела против олигопептидов из D-аминокислот не реагируют с олигопептидами из L-аминокислот.
На антигенную специфичность сильное влияние оказывают аминокислотный остаток белка носителя, к которому пришит гаптен, а также молекулярные размеры гаптена. Так, в длинных олигопептидных гаптенах замена аминокислотных остатков, которые расположены близко к белку-носителю, оказывает меньшее влияние, чем в коротких. Напротив, замены в удаленных от носителя аминокислотных остатках оказываются драматическими для антигенной структуры независимо от размеров гаптена. Аналогичны з-акономерности для олигосахаридов.
Антигенная специфичность гаптенов зависит не только от их химической структуры, но и от способа пришивки к белку-носителю, в частности от того, какая функциональная группа гаптена была использована для конъюгирования. Часто, при получении конъюгатов для иммунизации гаптены пришивают не непосредственно к молекуле белка-носителя, а через пространственную «ножку», содержащую обычно 4—6 углеродных атомов. В этом случае сама «ножка» в комплексе с гаптеном выступает в качестве составной антигенной детерминанты и образующиеся антитела могут обладать меньшей эффективностью связывания с нативным гаптеном, чем с таким связанным через «ножку» гаптеном.
В некоторых видах иммуноферментного анализа в качестве одного из реагентов используют гаптен, меченный ферментом. Если связывание в таком конъюгате аналогично способу пришивки в конъюгате гаптена с белком-иосителем для получения антител, то говорят, что в анализе используют гомологичные антитела. Если же структура «ножки» и способ пришивки гаптена в обоих случаях различны, то говорят о гетерологичных антителах. Применение того или иного вида антител или конъюгатов в иммунофер-16
ментном анализе может весьма сильно сказываться на его чувствительности и некоторых других характеристиках.
Весьма существенным фактором для специфичности является химическая структура «.ножки-», в частности ее длина и ближайшее окружение гаптена. Все эти моменты крайне важно учитывать при разработке методов иммунохимического анализа гаптенов.
Сильное влияние различных факторов на антигенную структуру и специфичность гаптенов, по-видимому, объясняется их ограниченными размерами и особенностями структуры активных центров антител.
• Знание антигенной структуры и специфичности гаптенов имеет важное значение для создания методов иммунохимического определения различных физиологически активных соединений, так как многие из них претерпевают различные биохимические превращения, в результате чего образуется группа близкородственных метаболитов.
§ 4. Общая структурная характеристика молекул иммуноглобулинов
Антитела в организме выполняют две основные функции. Первая — это распознавание и специфическое связывание соответствующих антигенов, вторая — эффекторная, заключающаяся в индукции важнейших физиологических процессов, направленных на уничтожение антигена: лизис чужеродных клеток через активацию системы комплемента, стимуляция специализированных иммунокомпетентных клеток, выделение фармакологически активных веществ и т. д.
Развитие иммунохимии в течение последних 25 лет позволило установить строение антител, выявить стереохимические основы их функционирования. Особое внимание было уделено изучению структуры активных центров антител, что привело к созданию полицентровой модели связывания антигена. Исследования динамических структурных свойств иммуноглобулинов способствовало установлению характера связи между антигенсвязывающими и эффекторными функциями.
Иммуноглобулины по своей химической структуре относятся к большому классу природных соединений — гликопротеидам, высокомолекулярным соединениям, состоящим из последовательности L-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. .Кроме аминокислот в структуру иммуноглобулинов включены олигосахариды. Общая структурная формула аминокислоты имеет вид:
17
H2N\ /СООН CH
Отдельные аминокислоты отличаются между собой боковыми заместителями R. В состав белков, в том числе иммуноглобулинов, входят двадцать аминокислотных остатков (табл. 1.1).
Последовательность аминокислотных остатков, в полипептидной цепочке определяет собой первичную структуру белковой молекулы:
NH С NH С NH С
• • • Х	Х'СН/
I	I	1	I	I
Rj	R2	R3	R4	Rj
Полипептидная цепочка за счет образования ’водородных связей между карбонильным атомом кислорода и атомом водорода аминогрупп отдельных аминокислотных остатков способна определенным образом укладываться в пространстве, образуя так называемые а-спиральные участки и ^-структуру. Такая локальная упорядоченная конформация отдельных участков полипептидной цепи получила название вторичной структуры.
В целом вся полипептидная цепь образует компактную трехмерную структуру — третичную структуру; В одном растворе молекула белка сворачивается так, чтобы неполярные, или гидрофобные, боковые цепи аминокислотных остатков находились во внутренней, малодоступной для молекул воды области, а полярные, или ионизированные, группы образовывали внешний контактирующий с водой слой. Такое расположение аминокислотных остатков полипептидной цепи является термодинамически наиболее выгодным состоянием, причем следует отметить, что это сворачивание пептидной цепи является высокоспецифичным и обусловлено первичной структурой молекулы.
Помимо рассмотренных причин сворачивания белков, обусловленных так называемыми гидрофобными взаимодействиями, определенный вклад в‘ стабилизацию трехмерной структуры вносят дисперсионные силы Лондона, возникающие в результате комплементарного распределения электронных облаков отдельных, рядом расположенных атомов. Энергия этого типа взаимодействий сильно зависит от расстояния между атомами и максимальна при так называемом ван-дер-ваальсовом расстоянии контакта, равном сумме ван-дер-ваальсовых радиусов взаимодействующих атомов.
Дополнительный вклад в поддержание трехмерной структуры молекул белков дают водородные и электростатические связи между боковыми группами аминокислот, а также ковалентные
18
Таблица 1.1. Основные аминокислоты, входящие в состав белков
Аминокислота	Латинское обозначение остатка аминокислоты	Боковая цепь R -
Глицин	Gly	H—
Алании	Ala	H3C—
Валин	Vai	H,C\ i "'CH— H3cz
Лейцин	Leu	H3C\ 3 ^CH—СН,— H3CZ
Иэолейции	He	H,c—CH,4 3	2 ^CH— н3с/
Фенилаланин	Phe	
Тирозин	Tyr	ho—Cl^—
Триптофан	Tip		С—CH,CH,— !'П,
		H
Серии	Ser	HO—CH2—
Треонии	Thr	HOV ''CH— н3с/
Цистеин	Cys	HSCHj—
Метионин	Met	CH3SCH2CH2—
Аспарагин	Asn	H2NXC_CH_ 0
Глутамин	Gin	ch,ch3—
* Аспарагиновая кислота	Asp	H0\ J.C—СН,— G
Глутаминовая кислота	Glu	H0\ 'с—CH2CH2—
Лизин	Lys	H2N(CH2)4—
Продолжение табл. 1.1
Аминокислота
Латинское обозначение остатка аминокислоты
Боковая цепь R
связи между отдельными частями полипептидной цепочки, напри-мер дисульфидные, или S—S-связи, возникающие между двумя остатками цистеина.
Некоторые молекулы белков состоят из несвязанных между собой ковалентно отдельных субъединиц. Такая пространственная организация получила название четвертичной структуры белков.
Несмотря на огромное разнообразие антител и их гетерогенность, все они обладают некоторыми общими структурными элементами, обеспечивающими выполнение их основных функций.
По своим антигенным, эффекторным свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgM, IgG, IgA, IgD и IgE (Ig обозначает иммуноглобулин).
Общей структурной единицей всех иммуноглобулинов является комплекс из четырех полипептидных цепей — двух идентичных между собой легких цепей с молекулярной массой 23000 каждая (L-Цепи, от английского слова light — легкий) и тяжелый с молекулярной массой по 53000 (Н-цепи, от английского heavy — тяжелый) (рис. 1).
Каждая из лёгких цепей прочно соединена с МНг-концевыми участками тяжелых цепей благодаря наличию межцепочечных дисульфидных связей и множеству слабых гидрофобных, электростатических и других межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. В целом структура такого комплекса напоминает латинскую букву «Y» или «Т» и характерна для иммуноглобулинов классов IgG, IgD и IgE.	1
При действии протеолитического фермента папаина молекула
20
IgG распадается на три фрагмента, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антигены (так называемые Fab-фрагменты, от английского fragment, antigen binding) и третий, способный к кристаллизации (так называемый Fc-фрагмвнт, от английского fragment cristalline). Именно Fc-фрагмент ответствен за эффекторную функцию антител — связывание белка ком-
Рис. 1.. Схематическое изображение строения основного структурного фрагмента молекул иммуноглобулинов
племента Clq, транспорт через мембраны, взаимодействие с мембранными рецепторами и т. д.
Другой протеолитический фермент пепсин ^разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи, от S—S-связи между Н-цепями в Fc-фрагменте. В результате образуются так называемый pFc'-фрагмент, представляющий собой остатки тяжелых цепей, и соединенные дисульфидными связями два Fab-фрагмента, обозначаемые как F (ab') 2-фрагмент. Последний также сохраняет способность к связыванию антигенов.
21
Антигенсвязывакиций центр расположен в МН2-концевых частях Н- и L-цепей. Таким образом, каждая молекула IgG, а также F(ab')2-фрагменты содержат по два антигенсвязывающих центра, а Fab-фрагмент — один.
Необходимым условием для использования антител в имму-ноферментном анализе является сохранение их способности специфически взаимодействовать с соответствующими антигенами.
22
Поэтому часто используют не целые молекулы антител, а только их фрагменты F(ab')2 или Fab, полностью сохраняющие эту способность. Такой подход позволяет в некоторых случаях устранить неспецифические реакции, обусловленные, в частности,' взаимодействием Fc-фрагментов антител с поверхностями носителей.
Молекулы антител имеют большое число S—S-связей, которые можно разделить на 3 категории: межцепочечные связи, образуемые внутри структурной единицы между Н- и L-цепями и между Н- и Н-цепями, внутрицепочечные S—S-связи, возникающие в пределах одной и той же легкой или тяжелой цепи (обычно 2 в легкой и 4 в тяжелой цепи), и связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов, обусловливающих образование полимерных молекул — IgM и IgA.
Структура иммуноглобулинов различных классов обусловлена числом и расположением S—S-связей в молекулах, а также количеством четырехцепочечных элементов. На рис. 2 приведено схематическое изображение молекул иммуноглобулинов различных классов.
IgM присутствует в сыворотке в виде пентамера четырехцепочечных комплексов, соединенных S—S-связями между Н-цепями. Некоторое количество IgA сыворотки также присутствует в виде димерной и тетрамерной формы. Полимерные IgA и IgM содержат Небольшую полипептидную цепь с Мг=14 000—15000, которая, по-видимому, стабилизирует полимерную структуру. Кроме того, в димерный IgA входит секреторный компонент—большой гликопротеид с Мг=80000.
Легкие цепи иммуноглобулинов бывают только двух типов —Л или х, и являются общими для всех пяти классов, в то время как тяжелые цепи обладают структурными, иммунологическими и химическими особенностями, характерными для каждого класса иммуноглобулинов.
Для обозначения тяжелых цепей, относящихся к классам IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, используют соответствующие греческие буквы— у, |х, п, 8 и 8. На основании различий в химическом строении Н-цепей в пределах класса можно выделить подклассы иммуноглобулинов: 4 — для IgG, 2 — для IgA и 2 — для IgM. В молекуле иммуноглобулина любого класса легкие цепи относятся только к одному типу.
§ 5.	Первичная структура Н-и L-цепей иммуноглобулинов
При исследовании аминокислотной последовательности • былр обнаружено, что все легкие и тяжелые цепи имеют одну принципиальную структурную особенность: они состо
23
ят из двух частей — вариабельной (V) и константной (С) (рис. 3). Вариабельные части легких цепей сильно отличаются друг от друга у всех исследованных иммуноглобулинов, а константные имеют близкую аминокислотную последовательность в пределах одного класса как легких, так и тяжелых цепей.
Постоянная или константная часть легких цепей (С) для каждого из х- или %-типов цепей включает 107 а. о. СООН-концевого участка. Исключение составляют различия в нескольких аминокислотных остатках, например в положении 191 и 153 в х-цепях человека или в положениях 190 и 152 в %-цепях, обусловленные генетическими вариантами.
С-концевая^ часть [
CL
VH

L
H H-концеВая часть
H
L
Рис. 3. Схема расположения константных и вариабельных областей молекулы иммуноглобулина
Оставшаяся последовательность аминокислотных остатков в ЫН2-концевой половине легких цепей образует так называемую вариабельную область (Vl). Частота замен отдельных аминокислот в вариабельных областях легких цепей иммуноглобулинов зависит от положения аминокислотного остатка в полипептидной цепи и максимальна около аминокислот в положениях 30, 50 и 95. Эти участки, получившие название гипервариабельных, принимают непосредственное участие в связывании антигена и входят в состав антигенсвязывающего центра.
Вариабельная область (Ун) Н-цепей в ЫН2-концевой части несколько длиннее соответствующей области L-цепей и включает 118—124 а. о. Гипервариабельными участками являются четыре аминокислотные последовательности: 31—37, 51—68, 84—91 и 101—ПО, также непосредственно контактирующие с антигеном в антигенсвязывающем центре. Последовательности аминокислотных остатков вариабельных областей Н-цепей (за исключением гипервариабельных участков) различных иммуноглобулинов по степени гомологии могут быть разделены на три подгруппы, внутри каждой из которых эта величина составляет 80—90%.
Константная область тяжелой цепи приблизительно в три раза (или в четыре, в случае IgM. и IgA) длиннее вариабельной.
24
§ 6.	Трехмерная структура иммуноглобулинов
В каждой из легких цепей молекул антител существуют две внутрицепочечные дисульфидные связи, число таких связей в тяжелых цепях различно (4—6). Каждый из внутри-цепочечных дисульфидных мостиков образует петлю из 55—70 а. о.
Рис. 4< Схема расположения внутрицепочечных дисульфидных связей в легких и тяжелых цепях молекулы IgG человека
На рис. 4 приведено схематическое изображение расположения дисульфидных связей вдоль тяжелых и легких цепей IgG человека с указанием среднего числа аминокислотных остатков в составе каждой из петель. По данным рентгеноструктурного анализа, участки пептидных цепей вблизи петли образуют, глобулу, в которую включается примерно ПО а. о. Такие глобулы получили называние доменов. МН2-концевые домены тяжелых и легких цепей относятся к вариабельным частям, а СООН-концевые домены — к константным частям. Было установлено, что аминокислотные последовательности константных доменов из тяжелых цепей в пределах одного класса являются весьма сходными между собой.
МН2-концевой домен тяжелой цепи обозначают как Ун, а три последующих в константной области тяжелой цепи — как Сн1, Сн2 и СнЗ. а и у-Тяжелые цепи содержат по 3 константных домена, обозначаемых как Са1, Са2, Са3 для IgA и Cvl, Cv2, Ст3 для IgG, а более длинные ц- И е-цепи — по четыре (Сй1, Сй2, Сн3 и Си4 для IgM й Се1, Се2, Се3 и Се4 для IgE).
Рентгеноструктурный анализ, выполненный для нескольких белков — димера Х-цепей, двух димеров И-областей х-цеп$й, Fab-фрагментов IgG и IgA, а также Fc-фрагментй IgG, позволил
25
установить пространственное расположение отдельных участков полипептидных цепей и доменов. Домены L- и Н-цепей представляют собой полусферы, соединенные вдоль одной цепи линейными полипептидными отрезками, доступными растворителю и действию протеолитических ферментов (рис. 5). Их основным структурным элементом являются два почти параллельных [5-слоя, один из которых состоит из четырех линейных антипараллельных отрезков цепи, второй — из трех. В состав этих 0-слоев входит около 60%
6
Рис. 5. Схематическое изображение укладки полипептидных цепей V-домеиа (а) и С-домеиа (б) (Edmudson et al., 1975):
антипараллельные сегменты fxl — fx4 (не заштрихованы) и fyl — fy3 (заштрихованы) образуют два практически параллельных слоя ₽-склаДчатой структуры. Между ними лежат сегменты (в1—вб), образующие изгибы цепи, спирали н т. п.; V- и С-домены отличаются частью сегментов el—вб (зачерненные линии); V-домен имеет добавочную петлю В; черный прямоугольник соответствует внутрицепочечной дисульфидной свяан
26
всех аминокислотных остатков области. Боковые заместители гидрофобных аминокислот образуют плотно упакованное ядро между 0-слоями. Дисульфидная связь между 0-слоями, являющаяся существенным элементом жесткости структуры доменов, находится в самом гидрофобном ядре и поэтому в водных растворах недоступна для восстанавливающих агентов.
Участков с а-спиральной конформацией в структуре доменов практически не содержится. По сравнению с С-доменами У-обла-сти несколько длиннее и содержат дополнительную петлю Е. В V-областях образующие ядро аминокислотные остатки с гидрофобными боковыми заместителями, а также остатки в изгибах по-липептидной цепи, обеспечивающие ее необходимый поворот, являются консервативными или полуинвариантными. Гипервариабельные остатки располагаются на изгибах цепи таким образом, что оказываются пространственно сближенными.
Взаимодействие между Н-цепями в Fab-фрагменте обеспечивается множественными контактами между парами доменов Fl и. Ун, Cl и Сн1. При ассоциации’Cl и Сн1 домены обращены друг к другу четырехцепочечными 0-слоями и взаимодействуют вдоль обширной зоны,свободной от растворителя. В контактах, имеющих в основном гидрофобный характер, участвует около 30 а. о. Наоборот, Vl и Уи-домены ориентированы друг к другу трехцепочечными 0-слоями. Основную роль в стабилизации образующейся структуры играют взаимодействия между консервативными и полуинвариантными аминокислотами с гидрофобными боковыми заместителями. Гипервариабельные участки Vl и Ун-областей сближены и образуют доступную растворителю относительно плоскую область связывания антигена.
В Fc-фрагменте IgG Сн2-домены тяжелых цепей ориентированы друг к другу трехцепочечными 0-слоями, но непосредственно друг с другом не контактируют из-за ограничений, накладываемых наличием межцепочечных дисульфидных связей в Л/Н2-конце Ст2-доменов; между ними находятся углеводные фрагменты, ковалентно связанные с остатками Asn-297 каждой Ц-цепи. Они состоят главйым образом из остатков глюкозы, глюкозамина, фруктозы и сиаловой кислоты. Содержание углеводов и состав существенно отличаются у разных классов. Их присоединение является постсинтетическим процессом и происходит упорядоченно во время внутриклеточного транспорта молекулы иммуноглобулина. До сих пор биологическая роль углеводного компонента не ясна.
СуЗ-домены соседних Н-цёпей IgG обращены друг к другу четырехцепочечными 0-слоями, и характер их взаимодействия аналогичен связи между CV1 и Cl- Небольшая область контакта между Cv2 и СуЗ-доменами охватывает около 12 остатков.
В молекулах IgM взаимодействие Су2-доменов, по-видимому, происходит по типу Fab—С, т. е. Cv2-домены сближены и кон
27
тактируют четырехцепочечными (J-слоями. Наличие дисульфидного мостика на С-конце Сц2-домена способствует тесному сближению N-концов СцЗ-доменов, в результате чего непосредственного контакта между СцЗ-доменами не происходит.
Между Сц1 и Сц2-доменами Н-цепей IgG и IgA и между Сн2 и СнЗ-доменами тяжелых цепей иммуноглобулинов других классов расположен так называемый «шарнирный-» участок, создающий высокую степень подвижности между двумя Fab- и Fc-фраг-ментами. Длина «шарнирного» участка иммуноглобулинов разных классов и подклассов варьирует от 15 до 65 а. о. Степень гомологии последовательности «шарнирных» участков составляет 60— 70%. Имеется зависимость между строением «шарнирного» участка и подвижностью Fab-фрагментов подклассов IgG-человека. Наибольшей гибкостью обладает молекула IgG3, у которой «шарнирный» участок, состоящий из ,65 а. о., представляет довольно жесткий стержень с гибкими концами, примыкающими к Fab-фрагмен-там. У IgM4, обладающего наиболее жесткой структурой, «шарнирный» участок содержит всего 13 остатков, среди которых 5 остатков Pro и 2 — Cys, образующих межцепочечные дисульфидные связи, IgGl и IgG2 занимают промежуточное положение.
§ 7.	Антигенсвязывающие центры антител
Согласно рентгеноструктурным исследованиям комплексов Fab-фрагментов с антигенами связывание антигена происходит в доступной растворителю щели активного центра, образованной вариабельными доменами в N-концевой части легкой и тяжелой цепей. Длина щели антител варьирует от 0,4 до 3,4 нм, а средние размеры области связывания для полимерных антигенов различной природы (углеводы, полипептиды, полинуклеотиды) составляют [(2,5—3,6) (10—17) (0,6—0,7)] нм. С антигеном частично контактируют гипервариабельные участки Н- и L-це-пей, расположенные в местах изгибов полипептидной цепи, а также некоторые из аминокислотных остатков, более глубоких внутренних областей цепи (рис. 6). Особую роль в построении анти-генсвязывающего центра антител играет третий гипервариабельный участок Н-цепи, включающий от 1 до 20 а. о. Длина этого участка и контактирующего с ним первого гипервариабельного участка L-цепи во многом определяют размеры активных центров антител.
Способностью связывать антигены с той же эффективностью, что и нативные молекулы антител, обладают Fab- и Р(аЬ')2-фраг-менты иммуноглобулинов. Изолированные Н- и L-цепи имеют весьма низкое сродство к антигену, однако способность к специфическому узнаванию соответствующих антигенов у них сохраняется.
28
Во взаимодействии с антигеном участвует большое количество аминокислотных остатков обеих цепей молекулы антител, хотя, как правило, большая функциональная нагрузка приходится на Н-цепи.
Рис. 6. Укладка тяжелой полипептидной цепи Ci-домена белка NEW (Poljak et at., 1973)
* Основным принципом организации антигенсвязывающих центров иммуноглобулинов является полицентровая структура. Малые антигенные детерминанты связываются иа ограниченном участке активного центра, комплементарном данной детерминанте. Большие детерминанты могут занимать практически всю область связывания.
Убедительные доказательства существования пространственно разделенных участков связывания антигена были получены для белка миеломы мыши IgA МОРС 460, конкурентно взаимодействующего с 2,4-динитрофенолом (2,4-ДНФ) и 2-метил-1,4-нафтохи-ноном (менадионом):
29
В антигенсвязывающем центре антител расположена сульфгидрильная группа, модификация которой приводит к потере иммуноглобулином способности связывания с менадионом, но никак не сказывается на эффективности взаимодействия с ДНФ. Антиген-связывающие свойства белка меняются после его частичной денатурации'в растворе гуанидингидрохлорида и последующей ренатур ации. С использованием флуоресцентных зондов было определено расстояние между подцентрами связывания менадиона и ДНФ, составившее 1,2—1,4 нм. Этот результат был подтвержден в экспериментах по сорбции IgA на носителях, содержащих связанные через «ножки» различной длины ДНФ и менадион.
С помощью рентгеноструктурного анализа комплекса миеломного белка IgGl человека (NEW) с оксипроизводным витамина Кь состоящего из нафтохиноновой группировки и гидрофобной фитильной цепи, установлено, что молекула антигена локализована в полости, образованной вариабельными областями легкой и тяжелой цепей (рис. 7). В ней можно выделить два подцентра связывания отдельных частей молекулы KiOH. В подцентр связывания нафтохиноновой части входят аминокислотные остатки Туг-90, Gly-29, Asn-30 L-цепи, пептидная связь и боковой заместитель Cys-104 Н-цепи. Менадион, представляющий собой часть молекулы KiOH без фитильного хвоста, а также орцеин и уридин взаимодействуют с IgG (NEW) именно в этом подцентре. Фитильная цепь KiOH, изгибаясь, контактирует с пептидной связью между остатками 29 и 30, а также Ser-93 и Leu-94 L-цепи и константным Тгр-54 Н-цепи.
В пользу полицентровой организации антигенсвязывающего центра свидетельствуют данные по рентгеноструктурному анализу димеров Х-цепей белка Бенс-Джонса Мс, характеризующихся наличием, по крайней мере, трех участков связывания. По своей структуре антигенсвязывающий центр представляет коническую впадину глубиной 1,7 нм с диаметром у поверхности 1,5 нм, а у основания 0,6 нм и полости на дне размером 0,8X1,0 нм. Два участка находятся на стенках конической впадины, а третий — на дне полости. В первом участке связываются ДНФ-лиганды, е-дан-силлизии, колхицин, 1,10-фенантролин. Во втором центре связываются также ДНФ-лиганды, метадои, морфин, кофеин, теофиллин. Бис (ДНФ) лизин своими динитрофеиильными кольцами одновременно взаимодействует с первым и вторым участками, что свиде-30
тельствует о наличии в них общих структур. Третий центр связывает менадион, производные пиримидина, фенилртуть и нитрофенилфосфохолин.
Рис. 7. Схема расположения молекулы витамина KiOH в области связывания миеломного белка NEW человека (Amzel et al., 1974)
* Исключительная физиологическая значимость полицентровой организации антигенсвязывающего центра антител определяется, по-видимому, следующими причинами. Во-первых, взаимодействие больших антигенных детерминант одновременно с несколькими подцентрами резко повышает прочность связывания. Так, энергия связывания KiOH с IgG (NEW) (29 кДж/моль) почти на 12,5 кДж/моль превышает- энергию связывания менадиона, что обусловлено наличием в молекуле KiOH дополнительного фитильного остатка. Во-вторых, если бы, молекула антитела обладала бы только оДной антигенной специфичностью, то благодаря чрезвы-
31
чайно большому числу разнообразных антигенных детерминант лимфоидных клеток оказалось бы недостаточно для выработки антител, направленных исключительно против данного антигена. Поэтому благодаря специфичности резко сокращается объем генетического материала, кодирующего вариабельные части L- и Н-цепей иммуноглобулинов. В-третьих, синтез антитела, связывающего несколько неродственных антигенов, может индуцироваться любым из них, благодаря чему лишь одна антигенная детерминанта обеспечивает сохранение комплементарности к целому ряду неродственных антигенов. Такая «память» антитела повышает готовность организма к иммунному ответу сразу на большое число различных антигенов.
Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело
Реакцию взаимодействия антиген — антитело можно рассматривать как частный случай связывания лигандов с макромолекулярными рецепторами. В основе- первичного взаимодействия лежат общие принципы любой бимолекулярной реакции. Однако, так как в данном случае продуктом бимолекулярной реакции является комплекс антиген— антитело, иммунная реакция является обратимой и описывается теми же кинетическими и термодинамическими параметрами, что и любой процесс комплексообразования. В данной главе будут рассмотрены теоретические вопросы связывания антигенов с антителами и некоторые экспериментальные подходы, позволяющие следить за ходом взаимодействия и рассчитывать его количественные характеристики.
§ 1. Иммунологическая специфичность
Антитела, образуемые в ответ на введение в организм антигенов, специфически взаимодействуют с этими антигенами. Образование специфического комплекса антиген — антитело обеспечивается гидрофобными, ионными и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, а также водородными связями. Наиболее существенную роль играют силы гидрофобного взаимодействия. Неполярное (гидрофобное) связывание возникает в результате стремления гидрофобных групп в водном растворе к ассоциации друг с другом, что сопро
33
2—627
вождается стабилизацией всей системы (уменьшением ее свободной энергии при одновременном увеличении энтропии). Эффективность таких взаимодействий возрастает с повышением температуры.
Меньший вклад в связывание антигена с активным центром антитела вносят водородные и ионные взаимодействия. Водородные связи образуются при взаимодействии атома водорода, ковалентно связанного с каким-либо отрицательно заряженным атомом, с неподеленной парой электронов другого отрицательно заряженного атома. В реакции антиген — антитело в качестве таких групп обычно выступают аминогруппы и гидроксильные группы/ Электростатические силы возникают при взаимодействии сильно заряженных ионизированных групп, таких, как ионизированная аминогруппа (—NH3+) и ионизированная карбоксильная группа (СОО-).
Степень соответствия между антигенной детерминантой и анти-генсвязывающей областью активного центра антитела (иммунологическая специфичность) определяется химической и пространственной комплементарностью, которая обусловлена, с одной стороны, взаимодействием электронных облаков реагирующих химических групп, с другой — стерическими силами отталкивания. Если структуры антигена и активного центра не соответствуют друг другу, то их притяжение будет слабым, а отталкивание сильным. Важным моментом в образовании прочных специфических комплексов является наличие множественных контактов, позволяющих, несмотря на слабость отдельных единичных взаимодействий, прочно удерживать антиген в активном центре. Замена отдельных атомов или групп в молекуле антигена или в антигенсвязывающих центрах приводит к ухудшению связывания.
Вполне понятно, что один и тот же антиген могут узнавать антитела, имеющие комплементарные ему структуры, но несколько отличающиеся по составу аминокислотных остатков в антигенсвя-зывающем центре. Например, антигенсвязывающая область анти-декстраноього антитела человека в одном случае представляет собой неглубокий «желобок», в который укладывается до 6 остатков изомальтозы, в другом — состоит из глубокой полости, куда помещается 1—2 остатка, и более мелкой выемки для 2—4 остатков изомальтозы.
С другой стороны, антигенсвязывающий центр молекулы антитела определенной специфичности обладает способностью связывать антигены, отличные по структуре от основного. Можно представить себе, что в таком случае в связывании принимают участие как часть общих аминокислотных остатков в антигенсвязывающих центрах, так и отличающихся по своей локализации и природе.
С количественной стороны специфичность взаимодействия антиген— антитело характеризуется через аффинность антител или 34
равновесную константу образования иммунокомплекса. В простейшем случае взаимодействие одного центра связывания антитела с моновалентным антигеном может быть представлено схемой
*,
АгАт^тг^ Аг-Ат,	(3.1)
*-i
где Аг — свободный антиген; Ат — свободное антитело; Аг-Ат — комплекс антиген — антитело; kj и k-t — константы скоростей ассоциации и диссоциации комплекса соответственно.
С учетом закона действующих масс в условиях равновесия можно записать
£1 [Аг] [Ат] = А-1 [Аг-Ат],	(3.2)
где [Аг], [Ат], [Аг-Ат]—равновесные концентрации Аг, Ат и комплекса Аг-Ат, соответственно, или при переходе к константе равновесия или внутренней аффинности (Ка)-
kr _ [Аг-Ат]
*-1	“	[Аг]. [Ат]
Равновесная константа образования Ка иммунокомплекса имеет размерность [л/моль]. На практике часто используют равновесную константу диссоциации комплекса Kd, связанную с Ка простым соотношением
Kd=\fKa	(3.4)
и имеющую размерность [моль/л]. Очевидно, что чем меньше Kd (или же, наоборот, больше Ка), тем прочнее образующийся иммунокомплекс.
Константа комплексообразования является термодинамическим параметром, характеризующим изменение свободной энергии взаимодействия антиген — антитело ДА, которое может быть рассчитано по следующей формуле:	'
ДА = -/?7Чп/Сд,	„(3.5)
где К — газовая постоянная; Т — абсолютная температура.
Общее изменение свободной энергии при комплексообразовании складывается из двух термодинамических величин — изменений энтальпии и энтропии:
kF—hH — T&S.	(3.6)
Определение КН можно провести эксперимейтально — либо с помощью прямых калориметрических измерений, либо из зависимости равновесной константы комплексообразования от температуры, описываемой законом Вант-Гоффа:
d(l/D • К ‘	'
2*	35
АН рассчитывают из температурной зависимости логарифма константы равновесия от обратной температуры (тангенс угла наклона прямой равен — AHJR).
Зная изменения энтальпии равновесного процесса АН и свободной энергии AF, при данной ^^мпературе изменение энтропии находят из соотношения
AS=(AH —&F)/T.	(3.8)
Реакция антиген — антитело.протекает с выделением теплоты, но, как правило, изменение энтальпии невелико и составляет около 40 кДж/моль. Изменение энтропии в большинстве случаев положительно, так как активные центры антител в свободном виде доступны растворителю и гидратированы, а при взаимодействии с антигеном из них высвобождаются связанные молекулы воды, что приводит в целом к уменьшению упорядоченности системы. • Таким образом, говоря об иммунологической специфичности антител, мы всегда проводим сравнительную оценку эффективности взаимодействия антиген—антитело, которое характеризуется константой равновесия или изменением свободной энергии системы при комплексообразовании.
Можно оценивать как специфичность данного антитела по отношению к различным антигенам, так и данного антигена по отношению к различным системам. Если одна и та же популяция антител взаимодействует с двумя различными антигенами Ап и Аг2 с константами комплексообразования соответственно Ki и Кг (Кт^>Кг), то говорят, что данные антитела являются высоко специфическими по отношению к Ап и менее специфическими к Аг2. Аналогично, если константа комплексообразования антигена с популяцией антител Ап много больше, чем с антителами Ат2, то первые являются специфическими по отношению к антигену, а вторые нет. Еще раз подчеркнем, что понятие специфичности является относительным. Например, если для одной и той.же популяции антител взаимодействие с антигеном Ап по сравнению с Аг2 является специфическим, то при наличии третьего антигена Агз, для которого	эти антитела будут менее специфичны
к АГ], чем к Аг3.
На практике часто условно подразумевают, что если константа равновесия процесса комплексообразования больше, чем 108 л/моль, то антитела являются высокоаффинными.
Обычный диапазон изменения аффинности антител составляет 105—1011 М~’, что соответствует изменению свободной энергии связывания в области —24-i—52 кДж/моль. Максимальные значения констант связывания характерны для антигенов, обладающих ярко выраженными гидрофобными свойствами или же взаимодействующих с активным центром антитела достаточно большой областью молекулы. Наименьшей эффективностью взаимодейст-36
Вия характеризуются антитела против углеводов (2Св<10®— Ю8 л/моль).
• Таким образом, количественно специфичность можно оценить, измеряя изменение свободной энергии связывания или внутреннюю аффинность. В практических целях иногда очень важно провести сравнение специфичности взаимодействия ряда антигенов с антителами, индуцированными одним из этих антигенов. Относительная специфичность в этих случаях может быть выражена как отношение внутренних аффинностей взаимодействия с антителами рассматриваемого антигена и антигена, индуцировавшего антитела.
Подобного рода проблемы очень часто возникают, например, при разработке методов иммуноферментного анализа лекарственных препаратов, стероидных и белковых гормонов. В зависимости от способа получения антисыворотки антитела могут быть специфичны либо только к одному лекарственному препарату (гаптену), либо к целой группе близких по структуре химических соединений. В этих случаях распространен способ оценки специфичности, основанный на сравнении связывания антител в данной концентрации (или в определенном разведении иммунной сыворотки) одного и того же количества гомологичного и гетерологичного гаптена. При этом концентрация образовавшегося иммунного комплекса для гомологичного гаптена принимается равной единице, а связывание всех гетерологичных гаптенов оценивается как доля от соответствующего связывания гомологичного гаптена.
Представляет большой интерес и оценка специфичности различных популяций антител, например различных типов моноклональных антител, продуцируемых разными клонами клеток. Такое сравнение может быть проведено на основании сопоставления значений внутренней аффинности: антитела с более высокой специфичностью характеризуются более высоким значением константы внутренней аффинности.
§ 2. Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител
Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия антиген — антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула антитела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами молекулы антигена, то такая характеристика образования иммуно-химического комплекса является весьма упрощенной.
Для описания более сложного реально существующего процесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным ан
37
тигеном введен термин авидность, или функциональная аффинность (функциональное сродство). В этом случае простые моновалентные взаимодействия характеризуются «внутренним сродством», или «внутренней аффинностью». С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты.
Процесс образования комплекса антиген — антитело состава 1:1, в котором реализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и может быть охарактеризован константой комплексообразования. С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Например, было показано, что IgG-антитела с внутренней аффинностью к 2,4-динитрофенольному (ДНФ) гаптену 107 л/моль имеют функциональную аффинность по отношению к комплексу ДНФ — фаг 4-174—1010 л/моль, т. е. бивалентные взаимодействия являются в 1000 раз более прочными, чем моновалентные.
Ранее полагалось, что присутствующие в системе антитела характеризуются одинаковой константой ассоциации с антигеном или же одинаковой энергией связывания. В. качестве такой субпопуляции может выступать субпопуляция антител, продуцируемых одним клоном антителпродуцирующих клеток,— моноклональные антитела. '	,	•
Синтезируемые в живом организме антитела гетерогенны по физико-химическим свойствам. Общая популяция антител иммунной сыворотки включает в себя антитела с различными значениями изменения свободной энергии взаимодействия с гаптеном, т. е. антитела различной аффинности; Схему взаимодействия- антигена с общей популяцией антител, представляющей совокупность субпопуляций, мож^ёт быть представлена в следующем виде: Аг-}- ATt	Аг - Атх К\— (Аг'АТ11.. ;
Т 1	11	[Аг]-[АТ1]
Аг+Ат2^Аг.АТ2 АГ2=7^г;	(3.9)
Аг-|- Ат, “ А г  Ат, К=	
|ЛГ]-[АТП]
Для общей характеристики такой популяции антител по аффинности взаимодействия с антигеном используют некоторое среднее значение аффинности Ко для л-го числа субпопуляций (методы расчета Ко приведены ниже). Как правило, истинная форма распределения антител по значениям констант взаимодействия неиз-
38
подбор реагентов для анализа.
У
вести а и обычно определяемая тем или иным способом равновесная константа взаимодействия является некоторым эффективным параметром.
При разработке методов иммунохимического анализа, базирующихся на реакции антиген — антитело, знание физико-химических характеристик специфических взаимодействий очень важно, поскольку позволяет оценить чувствительность и специфичность метода, осуществить правильный
Так как образуемые в ответ на введение в организм антитела являются гетерогенными по константам связывания, средняя аффинность Ко — это, в действительности, некоторое среднее значение для неизвестного распределения частных констант Ki (1 i и), где число п — неизвестно. Для характеристики получаемой антисыворотки . целесообразно ввести некоторую функцию распределения антител по аф
финности. Простейшее приближение — нормальное распределение, описываемое функцией Гаусса:
 <ЗЛ0>
§ 56 §26 §6 Ко §6 §*26 §*56 К
Рис. 8. Графическое представление функции Гаусса
где стандартное отклонение
\/~ S^-^o)2
)
характеризует гетерогенность антител (рис. 8).
В иммунохимии распределение антител по константам часто описывают одним из приближений нормального распределения, предложенного Сипсом. Приближение Сипса отклоняется от нормального при Ко±сг, и значительные отклонения наблюдаются при Ко±2а. Широкое распространение этой функции для описания распределения антител по константам связывания обусловлено его сходством с обычно используемыми простыми методами обработки результатов иммунохимических равновесий.
Функция Сипса применительно к взаимодействию антигена с антителом валентности п позволяет получить соотношение
[Аг. Ат] _	(^[Аг])0	,	.
л[Ат]0 I -Ь (АГо [Аг])“ ’
39
где Ко— средняя аффинность; а — индекс гетерогенности (О^а^ ^1, гомогенность соответствует а=1).
Распределение Сипса является симметричным и унимодальным и может быть полностью охарактеризовано средней константой аффинности Ко и индексом гетерогенности «а». Произвольное предположение о симметричном распределении антител по аффинности имеет свои ограничения. Истинная форма распределения остается неизвестной. Часто все же на практике используют распределение Сипса для описания гетерогенной популяции антител. В действительности распределение антител по /С бывает несимметричным и мультимодальным, поэтому, строго говоря, распределение антител по аффинности нельзя аппроксимировать распределением Сипса.
В частности, например, описаны распределения, сильно смещенные в сторону антител с низкой аффинностью. . Вследствие этого представление всей популяции антител как популяции, взаимодействующей с одной средней аффинностью (Ко) или даже как бимодальной (Ко высокоаффинная и Ко'—низкоаффинная), не всегда точно отражает распределение антител по аффинности.
В предположении об отсутствии внутри- и межмолекулярных взаимодействий Муккур с сотрудниками ввели понятие об общей константе аффинности Kt, представляющей собой сумму произведений равновесных констант каждой из пг субпопуляций антител на множители, учитывающие концентрационный вклад каждой из фракций в общей популяции антител:
.[Ач1о Кг ,	(3.12);
2 [АтПо ' i=i
т. е. общая константа аффинности для гетерогенной популяции является средневесовым параметром и представляет собой сумму средневесовых аффинностей m-субпопуЛяций в реакционной смеси. Концентрацию антигена, связанного в комплексы с антителами, можно представить в виде
В== V.IАг Атг] = - ^[-г1 - [AtJo-^[-г1—[Ат2]0
П 1+КНАг] 1	1+К2[Аг] 1 2Jor
/=1
(3.13)'
Можно показать, что предельное значение функции Q([Ar]), являющейся формальным выражением для константы равновесия,
 __ уч [Ат,)о Kt _____уч
‘ Й (АтЬ
Кт [Аг] .. i 1 + Кт [АГ] 1 'nJ°'
([Ат]0 - В) [Аг]
40
при концентрации [Аг]->0 приближается к Kt:
(3.15) [Аг]-*0
Для гетерогенной популяции антител Q зависит от равновесной концентрации [Аг] в системе, а графически зависимость IgQ от [Аг] имеет вид кривой с отрицательным наклоном. Экстраполируя экспериментальную зависимость IgQ от [Аг] к нулевой концентрации [Аг]=0, можно получить предельное значение Q1, равное Kt. Для гомогенной популяции Q| не зависит от [Аг] и представляет собой истинную константу связывания Ко-
§ 3. Методы определения аффинности антител
Определение аффинности (или константы связывания) антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами.
Во-первых, гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе по сродству к антигену. Во-вторых, сложностью определения общего количества антител, а также отдельных фракций. В-третьих, в случае поливалентных антигенов возможностью образования комплексов сложного состава, в том числе циклической структуры, в которых проявляется кооперативность взаимодействия активных центров антител. Все это не позволяет применить традиционные методы для расчета истинных значений констант связывания. Более надежные данные могут быть получены для моноклональных антител и их Fab-фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.
Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия • антиген — антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител.
Рассмотрим принципиальные подходы к определению констант равновесия. Из уравнения (3.3) следует, что для расчетов необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют антигены, меченные маркером, который с высокой чувсти-тельностью может быть определен одним из доступных физико-химических методов.
Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие
41
группы. К первой относятся методы, в которых стадия разделёния свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания (иммобилизации) или гельфильтрации. Если реагенты достаточно сильно различаются своими молекулярными массами и размерами, то процедура разделения существенно упрощается. В случае корпускулярных антигенов оставшиеся несвязанные антитела могут быть отделены либо центрифугированием, либо пропусканием смеси через фильтр, задерживающий антиген. Для низкомолекулярных антигенов (гаптенов) используется равновесный диализ.
Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов (или меток, связанных с антигеном) при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.
Равновесный диализ — наиболее распространенный метод изучения реакции антиген — антитело. Метод основан на различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемые мембраны. Раствор каждого реагента известной концентрации в одром и том же растворителе с одинаковой ионной силой и значением pH помещают по разные стороны мембраны. Молекулы гаптена диффундируют в раствор антител и связываются с ними. При достижении равновесия концентрация свободного гаптена выравнивается по обе стороны мембраны. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно рассчитать количество гаптена, связанного с антителами, и определить по уравнению (3.3) константу связывания.
• Как правило, метод равновесного диализа применяется для низкомолекулярных соединений (гаптенов) с Afr<3000. Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода. К недостаткам метода надо также отнести относительно большое время достижения равновесия (более 24 ч) и необходимость учета эффектов, вызываемых присутствием мембраны (не-Специфическая адсорбция реагентов на поверхности мембраны), в результате чего необходимо работать с достаточно высокими концентрациями реагентов, что значительно понижает чувствительность определения константы связывания.
Методы фракционного осаждения используются для разделения комплексов антиген —- антитело и несвязавшегося антигена. Они основаны на способности высокомолекулярных комплексов антиген—антитело избирательно осаждаться различными реагентами (полиэтиленгликолем, сульфатом аммониЯ( этанолом, вторичными антителами). При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации^ при которой комплекс антиген—антитело и несвязавшиеся антитела становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
42
Методы, не включающие фазовое разделение вступившего и не вступившего в реакцию антигена, относятся к группе гомогенных методов.
Флуоресцентные методы основаны на способности остатков триптофана в молекулах белков флуоресцировать (330—360 нм) при возбуждении УФ светом (280 нм). Взаимодействие ряда антигенов с антителами приводит к изменению интенсивности флуоресценции, что может быть использовано для оценки количе-
Таблица 2.1. Методы определения аффинности антител
Методы	Используемые антигены
Равновесный диализ Осаждение глобулиновой фракции сульфатом аммония	Гаптены, диализуемые антигены Гаптены, антигены, растворимые при 50%-ном насыщении сульфатом аммония
Осаждение углем, модифицированным декстраном Осаждение антиглобулинами Гельфильтрация, разделение по молекулярной массе Тушение флуоресценции	Гаптены Гаптены, белки, полисахариды Гаптены, белковые полисахариды Гаптены и антигены со специфическими флуоресцентными свойствами
Усиление флуоресценции Поляризация флуоресценции Спектральные методы Тушение биолюминесценции	Гаптены, белки Гаптены, белки Гаптены, связанные с красителем Гаптены, белки
ства антигена, вступившего в реакцию с антителами. В зависимости от химической структуры антигена (или гаптена) может •наблюдаться как усиление, так и гашение флуоресценции. Степень гашения (или усиления) интенсивности свечения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации образовавшихся специфических комплексов. Методы флуоресценции просты, не занимают много времени (10—20 мин) и имеют высокую чувствительность, что сокращает расход реагентов.
Метод деполяризации флуоресценции основан на измерении поляризации флуоресценции антигена, меченного красителем, до взаимодействия с антителами и после комплексообразования. Поляризация флуоресценции определяется молекулярным объемом частицы и степенью ее асимметрии. Комплексообразование антигена с антителом сопровождается резким изменением поляризации флуоресценции красителя (например, дансила), который играт роль метки антигена или антитела. Предел обнаружения антигена этими методами достаточно мал (10“9—10-10 М).
• Недостатками методов, основанных на измерении флуоресценции, являются необходимость работы с препаратами очищенных
43
антител и строгие требования к структуре изучаемых антигенов. Вследствие этого флуоресцентные методы не являются универсальными и могут быть применены для ограниченной группы антигенов.
Методы тушения биолюминесценции основаны на использовании в качестве маркера АТР, пришитой к молекуле антигена. В составе такого комплекса молекула АТР сохраняет активность в реакции биолюминесценции, катализируемой светлячковой люциферазой. При добавлении антител образуется комплекс с антигеном, в котором молекула АТР становится недоступной ферменту, в результате чего ингибируется реакция биолюминесценции. Указанный метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет измерять константы ассоциации до 10~12 М.
Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген — антитело приведен в табл. 2.1.
§ 4. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген — антитело
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Этот наиболее простой случай реализуется, например, при связывании гаптена с Fab-фрагментами моноклональных антител и описывается простейшей схемой (3.1).
Из системы уравнений материального баланса
( [Ат]0=[Ат] 4-[Аг-Ат]
I [Аг]0=[Аг]-]-[Аг- Ат]	* ’
с учетом (3.3) для константы равновесия комплексообразования можно легко получить выражения равновесной концентраций образовавшегося комплекса
[Аг-Ат]=-А[^[—L.	'	(3.17)
1	1	1+/С[Аг]	V ’
1.	Один из часто используемых способов расчета константы состоит в исследовании зависимости образующегося комплекса от общей концентрации антигена [Аг]о. Если при достаточно больших концентрациях антигена в системе выполняется условие [Аг]о^>[Ат]о, то (3.17) принимает вид
[Аг-Ат]=—.............	(3.18)
1	1 + К [Аг]0	V '
Эта зависимость (рис. 9) является аналогом изотермы адсорбции Лэнгмюра в теории адсорбции или уравнения Михаэлиса—Ментен в ферментативной кинетике. Из выражения (3.18) следует, 44
что при предельных значениях концентрации [Аг]0 концентрация комплекса [Аг-Ат] стремится к общей концентрации центров связывания [Ат]0. Для вычисления К определяют концентрацию антигена [Аг]'о, при которой половина антител находится в виде комплекса с антигеном ([Аг-Ат]=[Ат]о/2). С учетом выражений (3.16) и (3.17) можно получить
[Аг]5=— +-^-.	(3.19)
К 2
Из выражения (3.19) следует, что [Аг]'о = 1//< при условии 1//(^>[Ат]о (т. е. либо антитела являются низкоаффинными; либо их концентрация мала). При обратном соотношении (1//(<^[Ат]о) данный метод определения К неприемлем.
Рис. 10. Графическое определение константы связывания в двойных обратных координатах
Рис. 9. Зависимость концентрации образующегося комплекса [Аг-Ат] от общей концентрации антигена в растворе [Аг] о
2.	Иногда для вычисления константы связывания К используют представление экспериментальных данных зависимости (3.19) концентрации комплекса от концентрации свободного ацтигена в системе двойных обратных координат:
---!---.=-----!------!---1---1_.	(3.20) [Аг-Ат] к [Ат]о [Аг] [Ат)о	V
При постоянной концентрации антител в системе варьируют начальную концентрацию антигена и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс антигена.
График в двойных обратных координатах представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона -------------, отсекающую
/С [Ат]о
на оси ординат отрезок 1/{Ат]0 (рис. 10). В условиях избытка антигена ([Аг]3>[Ат]0) анализ проводят в координатах 1/[АгХ ХАт]-М/[Аг]о.
45
3.	Наиболее часто для анализа комплексообразования используют метод Скэтчарда, основанный на исследовании зависимости отношения равновесной концентрации комплекса [Аг-Ат] к концентрации свободного антигена [Аг] от концентрации комплекса.
Аналитический вид уравнения Скэтчарда легко получить из выражения для константы комплексообразования (3.3) и уравне-
координатах
координатах
константы связывания в Скэтчарда
константы связывании в Хилла
В литературе часто эти координаты обозначают в символах B/F-^-B (В — от английского слова bound — связанный, F — free — свободный). Зависимость Скэтчарда имеет вид прямой с тангенсом угла наклона — К, отсекающей на оси ординат отрезок К [Ат]о, а на оси абсцисс [Ат]0 (рис. 11). Графическая обработка экспериментальных данных в координатах Скэтчарда позволяет вычислить не только равновесную константу связывания, но и концентрацию активных центров антител [Ат]0 в системе.
На практике при нахождении константы данным способом проводят серию опытов по определению равновесной концентрации свободного антигена (или комплекса) при различных начальных концентрациях антигена и постоянной концентрации антител в системе.
4.	В качестве еще одного преобразования уравнений (3.3) и (3.16) используют следующее:
------[Аг,Ат]-----[Аг].	(3.22)
([Ат]0 — [Аг-Ат])
Разделив числитель и знаменатель части равенства на концентрацию антител [Ат]0 и логарифмируя выражение, получаем
||АГиТ11‘им,Т ='gK+lglArl.	(3.23)
1 — [Аг-Ат]/[Ат]0
46
В координатах 1g д ^д^д^дат]-----H's[Ar], называемых коор-
динатами Хилла, должна получаться прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке IgK (рис. 12).
Взаимодействие одной субпопуляции антител с поливалентным антигеном. Рассматриваемый ниже случай может реализоваться, например, при связывании Fab-фрагментов моноклональных антител с клетками, вирусными частицами и т. д., имеющими на своей поверхности большое число одинаковых центров связывания. Выражение для константы равновесия взаимодействия антитела, имеющего по п эпитопов, записывается следующим образом:
________[Аг Ат]_____
(п [Аг]0 — [Аг-Ат]) [Ат]
Уравнение Скэтчарда в этом случае принимает вид
-Ц^--=Ап[Аг]0-А[Аг-Ат].	(3.25)
[Ат]
Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации [Аг]о, можно определить константу комплексообразования А и число мест связывания 6 антигене п.
Так как молекулы антител обладают, по крайней мере, двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным поблизости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает; в частности, эффективная константа комплексообразования для молекулы IgG может в 103 раз и более превышать Ко одиночных связей. Частота образования таких связей зависит от концентрации реагентов и может колебаться от нуля до максимальной, соответствующей общему количеству молекул IgG в Системе.
Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена (гаптена) с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя — высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования — Kt и Kz. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает часто. Знание численных значений этих параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения имму
47
ноанализа с целью достижения требуемой чувствительности определения антигена и специфичности анализа.
В условиях равновесия рассматриваемая схема взаимодействия
Дг-^-Атх^ Ar-ATt
АгЦ-Ат25^ Аг-Ат2	(3.26)
описывается системой следующих алгебраических уравнений: rs- _ [Аг-Ат;] .	„ __ [Аг-Атг] ,	м
[Аг] [АтД ’	2	[Аг][Ат2] ’	’
1 Аг ]0=[Аг] [Аг • AtJ + [ Аг • Ат2];
1Ат1]0=[Ат1]-|-[Аг-Ат1]; [Ат2]0=[Ат2[-[-[Аг-Ат2].	(3.28)
Опуская алгебраические преобразования (читатель может найти детальное описание аналогичной системы, например, в книге Варфоломеева С. Д. Зайцева С. В.), дадим окончательное выражение зависимости, описывающей связь параметров системы в координатах Скэтчарда:
-^=Y[/ri(lAT11Q_j5)+/r2([AT21o_jS)+
+Ж1([Ат1]0-Д)4-/С2([Ат2]0-В)]24-4^2В([Ат1104-[Ат210-В)],
(3.29), где В = В]-)-В2=[Аг-Ат1]+[Аг-Ат2]; Г=[Аг]. Графическая зависимость B/F от В имеет вид гиперболы (рис. 13). Таким образом, получаемая при анализе зависимости связывания неизвестной популяции антител с антигеном в координатах Скэтчарда вогнутая кривая может свидетельствовать о существовании двух фракций антител — высокоаффинной и низкоаффинной. (Следует указать, что аналогичные зависимости могут наблюдаться и в более сложных случаях существования трех и более популяций антител, а также при отрицательной кооперативности связывания поливалентного антитела с лигандом.)
Для определения четырех неизвестных параметров —- Ki, Къ, [Ат1]0 и [Ат2]о можно воспользоваться одним из следующих методов.
1.	Параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат (рис. 13). Для построения асимптот используют следующий прием. По концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант Xi и А2 (tga==/C'i; tg рдаК'г). Путем параллельного перемещения прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат, была равна соответствующим
48
отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривой при экстраполяции ее к осям координат:
OC—ON-\-OP~,
OA=OMA-OQ.
(3.30)
Отрезки на оси абсцисс ОМ и оси ординат ON дают оценочные значения для [AtJo и [Ат2]о соответственно. Подставляя оценочные значения Ki, Kz, [Ati]q и [Ат2]0 в выражения для Bi и В2
В	1Ат11о[АгИ1	.
1	1+^[Аг]	’
в —
2	1+Кг[Аг]	’
Рис. 14. Графический способ нахождения асимптот для расчета констант связывания двух еубпопуляцнй антител с моновалентным антигеном
Рис. 13. Определение констант связывания двух субпопуляций антител с ионоваЛентным антигеном
находят приближенные параметры Bi и В2 и B=Bi-|-B2 при различных концентрациях Аг.
С использованием полученных значений строят теоретическую зависимость B/F от В, сравнивают ее с экспериментальной и подбирают новые оценочные параметры до наилучшего совпадения теоретической и экспериментальной кривой.
2.	Для нахождения асимптот гиперболы можно воспользоваться чисто графическим методом, заключающимся в построении двух прямых PQ и NM (рис. 14), для которых выполняется соотношение
О$=ОЪ + О1Ъ,	(3.33)
т. е. отрезок О/?, соединяющий начало координат с любой точкой R, находящейся на гиперболе, равен сумме отрезков ORi и ORz,
49
соединяющих начало координат с точками пересечения отрезка OR с асимптотами.
3.	Для оценки параметрон Ki, Кг, [Ati]0 и [Ат2]0 часто используют следующий метод, основанный на анализе графической зависимости B/F от В. Из экспериментально полученной кривой связывания (рис. 13) путем экстраполяции находят точки пересечения кривой с осями абсцисс и ординат (А и С соответственно). Проводят касательные в Этих точках к кривой до пересечения их с осями абсцисс и ординат в точках D и Е„
Можно показать, что численные значения искомых параметров определяются по следующим алгебраическим формулам:
к2=—
2	2
ОС	.	ОЕ	(ОС .	ОЕ у	4	ОС-ОЕ
OD	О А	У \ OD +	Ok J	ОА2
ОС	.	ОЕ	_ /( ОС ,	ОЕ \2	ОС-ОЕ
. OD ‘ ОА У V OD О А )	О А2
ОС— О А* Кг
Ki-Кг
[Ат2]0 =
ОА-К1—ОС Кг-Кг
(3.34)
(3.35),
(3.36)
(3.37)

[AtJo^
§ 5. Кинетические закономерности реакции взаимодействия антиген — антитело
Образование комплекса антиген—антитело является обратимым процессом, т. е. равновесная константа связывания (аффинности) данного комплекса определяется отношением константы скорости ассоциации ki к константе скорости диссоциации £_!(/(=——]. Исследование кинетики процесса ком-\	k—1 /
плексообразования антигенов с центрами связывания антител в широком диапазоне концентраций, включая избыточные концентрации каждого из реагентов, позволяет определить значения кинетических констант скоростей ассоциации и диссоциации, рассчитать время, необходимое для достижения системой равновесия.	-
Реакция антиген—антитело в диапазоне таких концентраций реагентов (антигена и антител), которые регистрируются обычными физико-химическим н методами (спектрофотометрическими, нефелометрическими и др.), протекает очень быстро, что затрудняет ее изучение с помощью традиционных кинетических методов. 50
При высоких концентрациях реагентов лимитирующим фактором является время смешивания растворов, так как равновесие устанавливается за время, которое не позволяет определять изменения концентраций реагентов.
Для нахождения кинетических констант реакции антиген—антитело могут быть применены два экспериментальных подхода. Первый из них состоит в использовании специальных приемов для изучения быстрых реакций — метода температурного скачка и метода остановленной струи. Второе направление связано с применением реагентов, позволяющих следить за реакцией комплексообразования в области ультранизких концентраций реагентов. Переход к низким концентрациям реагентов (<10~9 М) дает возможность значительно понизить скорость'реакции и использовать для расчетов традиционные кинетические методы.
Основная часть кинетических экспериментов, приведенных в литературе, выполнена, для взаимодействия гаптенов, главным образом ДНФ-лигандов. Лишь очень небольшое количество работ посвящено кинетическому исследованию взаимодействия антител с антигенами белковой природы. Это связано с тем, что кинетические данные, полученные в опытах со сложными антигенами, трудно интерпретировать.
Как для белковых антигенов, так и для гаптенов установлены достаточно высокие значения констант скоростей ассоциации, приближающиеся к диффузионно контролируемому пределу (107—10s М-1-с-1)- В случае белковых антигенов их значения приблизительно на 2 порядка меньше и колеблются от 5-Ю5 до 5-Ю6 М-1-с-1, что объясняется более сложной структурой антигенной детерминанты белковых антигенов.
• Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что наблюдаемые различия в аффинности антител обусловлены, в основном, значениями константы скорости диссоциации. Это было наглядно продемонстрировано в экспериментах с серией гомологичных гидрофобных ДНФ-лигандов, в которых десятикратное увеличение константы аффинности для двух перекрестно реагирующих лигандов обусловлено различием в константах скоростей диссоциации, а не ассоциации. Эти и другие результаты показывают, что именно константа скорости диссоциации определяет сродство антитела к гаптену. Этот вывод, однако, нельзя считать окончательным, поскольку количество экспериментальных данных, полученных к настоящему времени, ограничено.
Экспериментальные методы определения кинетических констант. Метод температурного скачка. Этот метод является одним из релаксационных методов, основанных на принципе зависимости времени достижения нового равновесного состояния системы, обусловленного быстрым внешним воздействием, от констант скоростей прямой и обратной реакций. Можно показать, что если в начальном состоянии система
51
k,__
Ar -f- Ат *- -у—- Аг • Ат
(3.38)
находится в равновесии, то после быстрого изменения температуры (происходящего, например, при пропускании через раствор разряда высоковольтного конденсатора) кинетика реакции достижения нового положения равновесия описывается дифференциальным уравнением, решение которого представляет собой экспоненту, в которой показатель экспоненты связан с элементарными константами скоростей реакции уравнением
г«=МАгЖАт])+Ц.	(3.39).
Величина т называется временем
Рнс. 15. Определение кинетических констант взаимодействия моновалентного антигена с субпопуляцней антител по методу температурного скачка
релаксации. Анализ зависимости в координатах 1/т4-4-([Аг]+[Ат]) позволяет найти по тангенсу угла наклона прямой значение ki, а по отрезку, отсекаемому на оси ординат, k-i (рис. 15).
Определение констант скоростей комплексообразования с использованием меченых реагентов. Этот метод, нашел большое применение в связи с развитием высокочувствительных методов иммуноанализа,
основанных на использовании меченых реагентов: радиоим-мунологического, иммунофер-ментного и других -методов.
Кинетические закономерно-
сти простейшей схемы (3.38) взаимодействия антиген — антитело (моноклональные антитела — одновалентный антиген) описывает система дифференциальных уравнений:
[Аг] [Ат]—[Аг-Ат];
~^~ёГ]	1Аг11Ат1 + k~i [Аг-Ат];	(3.40)
~Г~= [Аг] [Ат] + k-x [Аг - Ат].
С учетом уравнения материального баланса [Ат]0=[Ат]4-[Аг-Ат]; [Аг]0=[Аг]+[Аг-Ат] ,	(3.41)
н начальных условий (/=0, (Аг-Ат]=0) можно получить решение системы
52
[Аг • Ат]=-^±^)(^~е.У.
1 а 4- b
е"2»*' а — b
где а = -^-([Аг]0 _|_[Ат1о 4-A-i/^i);
(3.42)
I^bJtIAl]o±^iMi_\2_[Ar]o [Ат1о<
(3.43)
2
Весьма существенным параметром в нммуноферментном анализе является время установления равновесия в системе. Если считать, что t равн определяется условием
[Аг.Ат] - [Аг.Ат]равн
[Аг.Ат]равн
= е,
(3.44)
(3.45)
то время установления равновесия можно найти по формуле
/равн= —— I" [fl И---'l (
₽авн 2Wi [А 1 {а - b) s Д а 4- b
Так как для вычисления времени необходимо точное значение констант скоростей k\ и k-i, которые часто неизвестны, то это уравнение обычно используют лишь для самой грубой оценки времени установления равновесия.
Определение константы скорости ассоциации. 1. Наиболее простой метод основан на регистрации начальной скорости Vo образования комплекса Аг* Ат, тогда
^^([АтИАгЬ.	'	(3.46)
Однако метод недостаточно точен, так как определение [Ат]0 н Vo обычно производится с большой ошибкой. Для повышения точности при расчетах используют несколько начальных концентраций реагентов.
' 2. Для нахождения ki иА-i эксперимент проводят в условиях избыточной концентрации одного из реагентов. В случае применения меченого антигена используют большой избыток соответствующих антител. Выражение (3.42) для концентрации Комплекса в этом случае принимает следующий вид:
[Аг.Ат1 = МАг]о[Ат]О . —(*.[ATjo+*_1) n J МАтЫ-А-чЛ
Как видно из этого выражения, зависимость равновесной концентрации комплекса от времени описывается моноэкспоненциальной кривой с предэкспоненциальным множителем
А^АДАт^-М-!,	(3.48)
соответствующим эффективной константе скорости ассоциации.
53
(3,47)
Спрямляя зависимость (3.47) одним из известных способов, например, в координатах [Аг-Ат]. .
1п-----------------------г t
[Аг-Ат]от — [Аг-Ат]
по тангенсу угла прямой вычисляют k' при заданной концентра-
(3.49)
Рис. 16. Определение кинетических характеристик взаимодействия моновалентного антигена с субпопуляцией антител в условиях избытка начальной концентрации антител [Ат]0
ЦИИ [Ат]0.
Откладывая графически k' от концентрации [Ат]0 (рис. 16),получаем прямую, тангенс угла наклона которой дает ki, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, k-i. Данный способ расчета пригоден, когда k-i сравнима с &1[Аг]0. В противном случае A'^JAtIq,	(3.50)
что позволяет определить по тангенсу угла наклона только бимолекулярную константу скорости ki.
Определение константы скорости диссоциации. Обычно константу скорости диссоциации находят путем прямого измерения скорости процесса диссоциации. комплекса в условиях его необ-- ратимости. Для этого используют один из следующих подходов. 1. После установления равновесия в системе проводят разбавление системы большим избытком буфера. Так как скорость образования комплекса пропорциональна произведению концентраций каждого из реагентов, а скорость диссоциации комплекса — его концентрации в первой степени, то при сильном разбавлении "Чине ^ас-
В этом случае процесс диссоциации комплекса Аг-Ат будет описываться экспоненциальной кривой. Спрямлением ее в логарифмических координатах можно получить константу скорости k-i.
2. В систему вносят вещества, способные быстро и полностью связывать или удалять свободный лиганд. Если скорость удаления свободного лиганда будет существенно больше скорости диссоциации комплекса, то наблюдаемая скорость распада комплекса описывается реакцией первого порядка с k-i.
3. После установления равновесия в системе антитела — меченый антиген в нее вводят избыток свободного немечённого антигена. В этих условиях процесс изменения концентрации комплекса [Аг*-Ат] также описывается кинетикой первого порядка, константа скорости которого соответствует k-i.
Ферменты как метки в иммуноанализе
Ферменты представляют собой белки, ка-тализирующие реакции, протекающие в живых организмах. В гл. 1 рассмотрены основные структурные характеристики белков, ниже остановимся на кратком обзоре структурных особенностей молекул ферментов.
§ 1. Основные физико-хим ич еские и каталистические свойства ферментов
Структура ферментов. В активном центре фермента, образованном сближенными и определенным образом ориентированными в пространстве участками полипептидной цепи, происходит связывание субстрата и его химическое превращение. Иногда в состав таких центров входят так называемые кофакторы — низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или неорганические ионы.
Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой {апоферментом) и остающийся в неизменном состоянии после каталитического акта, называют простетической.. группой.
Примером такой простетической группы может служить молекула гема (проТогема-тина IX), принимающая участие, Например, в катализе пероксидазой:
55
В некоторых случаях кофактор менее прочно удерживается в активном центре и химически изменяется в результате протекания каталитической реакции. Такие специализированные для данного класса ферментов субстраты получили название коферментов. К наиболее распространенным из них относятся АТР (аденозинтрифосфат):
и NAD+ (никотинамидадениндинуклеотид):
56
Отметим, что эти двд кофермента нашли также самостоятельное использование в качестве меток в иммуноанализе (цммуноко-факторный анализ).
В результате целого набора взаимодействий между отдельны-•ми частями полипептидной цепи, в которых определенную роль играет и растворитель, фермент принимает специфическую активную конформацию и способен эффективно осуществлять превращение субстрата' Однако, если условия окружающей среды изменяются таким образом, что часть из этих взаимодействий нарушается или отсутствует, нативная конформация молекулы существенно меняется, при этом способность фермента осуществлять каталитическое превращение субстрата падает. Такой процесс называют денатурацией. Факторами, вызывающими денатурацию, могут являться повышение температуры, изменение pH, введение химических агентов (мочевины, солей гуанидина и др.), механическое воздействие. В более широком плане можно говорить об инактивации ферментов, т. е. потери ими каталитической способности, которая может быть обусловлена как денатурацией, так и химической модификацией отдельных функциональных групп молекул фермента.
В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела. При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, SH-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модификация ие должна затрагивать функциональных групп активного
57
центра, а также влиять на каталитически активную конформацию всей ферментной глобулы.
Каталитические свойства ферментов. Общую схему ферментативной реакции обычно записывают следующим образом;
Si4-S2 -Р^Рг,
где Si и S2— субстраты; ₽! и Р2 — продукты ферментативной реакции; Е — фермент.
Для многих ферментов в качестве одного из субстратов выступает вода, поэтому, ввиду того, что ее концентрация велика и постоянна в ходе ферментативной реакции, часто такие реакции рассматривают как псевдомоно су б ст ратные. Для целых классов ферментов , вторыми специализированными субстратами являются молекулы коферментов.
Весьма важной и часто используемой на практике характеристикой препаратов является каталитическая активность фермента.. За единицу каталитической активности (1 каталь) любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в 1 с в реакционной системе при определенных условиях. Наиболее удобным для практических целей является нанокаталь (10-9 кат). Однако до сих пор часто употребляется старое обозначение каталитической активности, известное как «международная единица» (£/), определенное как количество фермента, катализирующее превращение 1 ммоль субстрата в 1 мин. Соотношение между этими единицами следующее: 1 нкат=10~9 кат=0,06£7,
Для сравнительной оценки различных препаратов фермента часто используют удельную каталитическую активность, т. е. каталитическую активность, отнесенную к единице массы белка.
Согласно приведенному выше определению каталитическая активность не тождественна понятию скорости ферментативной реакции, которая определяется как количество субстрата, превращаемого ферментом за единицу времени в единице объема системы, в которой протекает реакция (размерность [моль-л-1 X ХС-1]). На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются температура, природа буфера и pH, субстраты, коферменты, ингибиторы й другие эффекторы, а также количество белка в системе.
Температура. Влияние температуры (Т) на скорость (0) обычных химических реакций описывается зависимостью Аррениуса:
ln'V=lnv9—Ea/RT.	,	(4.1)
В случае ферментов температурные зависимости скорости имеют более ^ложный вид, что обусловлено как термолабильностью белковых глобул, так и влиянием температуры на Константы
58
Михаэлиса, константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение pH-оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа Аррениуса. Срёднее значение эффективной энергии активации для ферментативных процессов обычно близко к 40 кДж/моль. Как правило, зависимость скорости ферментативных реакций имеет температурный оптимум, обусловленный тепловой денатурацией фермента.
Буфер и pH. Все ферменты характеризуются определенным pH-оптимумом активности. Этот диапазон максимальной активности может иметь весьма узкий интервал. pH-Оптимум активности зависит от ионной силы, вида используемого буфера и меняется с температурой. Например, для щелочной фосфатазы рН-оптимум при температурах 37, 30 и 25°С составляет 9,9; 10,1 и 10,3 соответственно.
Субстраты. Определяемая каталитическая активность фермента сильно зависит от используемого субстрата. Субстраты данного фермента могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. Например, фермент 0-1>-галактозидаза гидролизует синтетические субстраты 2-нитрофенил-р-Н-галактозид и 4-нитрофенил-р-7)-га-лактозид' соответственно в 7 и 17 раз быстрее, чем естественный субстрат лактозу.
Эффекторы. К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, т. е. вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. Эффекторы могут вноситься в реакционную среду как с растворами реагента, так и анализируемого обра’зца.. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может приводить к нежелательному отклонению от линейной зависимости наблюдаемой скорости ферментативной реакции от количества фермента в системе.
Экспериментальные методы определения ферментативной активности. В иммуноферментном анализе наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции.
. Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400—700 нм. При прохождении пучка света через кювету раствора толщиной d (см) интенсивности прошедшего света I по сравнению с начальной интенсивностью /о связана законом Бугера—Ламберта—-Бера:
59
/=/0-10~,rfC, где e— постоянная для данного вещества в определенном растворе величина, называемая молярным коэффициентом поглощения (размерность [моль”1-л-см-1]); С — концентрация вещества, поглощающего свет (моль/л). На практике часто измеряют оптическую плотность (4), которая связана с I и 1о следующим простым соотношением;
Л=1ё-^-.	(4.2)
Таким образом, если поглощение света подчиняется закону Бугера—Ламберта—Бера, то оптическая плотность раствора в определенном диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества.
В последнее время в иммуноферментном анализе получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбужденное. Возбужденная молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдет в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбужденного состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Как отмечалось выше, оптическая плотность раствора определяется следующим соотношением:
A=^C=\S	(4.3)
Долю молекул, перешедших из возбужденного состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход <р. При условии, что e.dC<0,1, предыдущее уравнение принимает вид -^=-^-^2,ЗеС<Д	(4.4)
Интенсивность флуоресценции (F) пропорциональна. количеству света, адсорбированного образцом	н так как /~/о, можно
записать, что
F «2,Зе/0<рСг/.	(4.5)
Таким образом, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества С н абсолютному значению начальной интенсивности света /о, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности I и /0. Этот факт позволяет на 1—2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрически^ методом по сравнению с фотометрическим.
60
В качестве детектирующих систем в иммуноферментном анализе нашли также применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — реакции био-и хемилюминесценции. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемилюминесценции) катализируется пероксидазой хрена (см. гл. 4).
В последние годы распространение получают электрохимические способы определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют проводить определение скорости ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек.
Основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций. В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации (количества) фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата — концентрации (количества) субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркера (он ковалентно связан с молекулой антигена или антитела), во втором — детектора (свободный фермент). Оптимизация условий каталитической реакции (выбор pH, оптимальных концентраций фермента и субстратов) осуществляется в соответствии с используемой модификацией ИФА.
Рассмотрим основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций и принципы, на которых базируется употребление ферментов в качестве меток в ИФА.
После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию (или количество) меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, т. е. определить каталитическую активность фермента. Для этого в систему добавляют соответствующие субстраты фермента и измеряют скорость ферментативной реакции. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркера в системе. Очевидно, что для этого необходимо наличие пропорциональности между концентрацией фермента и измеряемой скоростью ферментативной реакции, т. е. выполнение соотношения
(4.6)
Следует отметить, что так как ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, то требование пропорциональности скоро-
61
ста и концентрации является скорее желательным, чем обязательным для разработки конкретного метода ИФА. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Однако выполнение условия пропорциональности в определенном диапазоне концентраций обеспечивает, как правило, большую точность эксперимента и, кроме того, позволяет построить теоретическую модель и провести математическое описание метода с целью его оптимизации.
В простейшем случае односубстратных ферментативных реакций, подчиняющихся кинетике Михаэлиса—Ментен, зависимость начальной скорости от концентраций субстрата и фермента в стационарном режиме описывается уравнением
<и_ [S]q ______ ^кат [Е]о [S]o	(4 71
*m + [S]o Am + [S]0	1 ’
(где — максимальная скорость; [S]o — начальная концентрация • субстрата; Кт — константа Михаэлиса; k кат — каталитическая константа скорости; [Е]о — начальная концентрация фермента), которое отражает пропорциональность между наблюдаемой скоростью ферментативной реакции и концентрацией фермента в растворе. Чтобы снизить ошибку в определении скорости ферментативной реакции, ее ведут обычно в условиях, когда [S]oS-~^>Кт, т. е. находят максимальную скорость, ферментативной реакции (Утах).
• На практике при проведении ферментативной реакции на последней стадии нммуноферментного анализа обычно измеряют не скорость ферментативной реакции, а оптическую плотность или флуоресценцию продукта через определенный фиксированный промежуток времени. Для того чтобы такое измерение было эквивалентно определению скорости реакции, необходимо, чтобы кинетические зависимости накопления продукта реакции от времени имели вид прямых во всем временном диапазоне. В таком случае оптическая плотность раствора (или интенсивность флуоресценции продукта реакции), измеренная через фиксированный интервал времени после начала ферментативной реакции, будет реально отражать концентрацию фермента в системе. Так как скорость реакции, согласно уравнению (4.7), сильно зависит от концентрации субстрата, проводить ее следует на такую глубину, чтобы можно было пренебречь расходованием субстрата в ходе ферментативной реакции (т. е. выполнялось условие [SJ0~const). В противном случае ввиду уменьшения концентрации субстрата в системе скорость ферментативной реакции будет постепенно падать, а следовательно, измеряемая через фиксированный промежуток времени оптическая плотность не будет отражать истинную концентрацию фермента в растворе.
62
§ 2. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток
‘	Принципиальная возможность применения
ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычдйно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Нижний предел регистрации ферментативной метки можно легко оценить, воспользовавшись выражением для максимальной скорости ферментативной реакции:
^-=Акат1Е]0.	(4.8)
За время At концентрация образующегося продукта будет равна:
[Р]=Акат[Е]0ДЛ	(4.9);
Из уравнения (4.9) можно вычислить минимальную определяемую концентрацию фермента [Е]о. Если принять &Кат~103с-1 (хотя для многих ферментов она значительно больше), время реакции ~15 мин (~103 с) и считать, что обычными спектрофотометрическими (или флуорометрическими) методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации* 10~6— 10~7 моль/л, то концентрация фермента [Е]о составит: lElo==~lS"~ 10~13 М0ЛЬ/Л‘	(4‘10)
Таким образом, даже такой простой расчет показывает возможность детекции ферментов в очень малых количествах. Причем принципиально осуществимым является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счет увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образующегося продукта. В этой связи к перспективным относятся люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции («каскады»).
• К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:
а)	высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;
б)	доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата, с антителами или антигенами;
в)	. стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
63
г)	простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
В следующей главе будет дана подробная классификация методов ИФА. Здесь же следует отметить, что все методы ИФА можно отнести к двум различным категориям — гетерогенным и гомогенным. В гетерогенных методах используются иммобилизованные (т. е. прочно связанные) на поверхности твердых носителей реагенты, а в гомогенных — все стадии ИФА проводят в водном растворе. В гетерогенных методах фермент играет роль обычного маркера антигенов или антител, в то время как в гомогенных методах фермент выступает как составная часть иммунохи-мической реагентной системы и должен обладать рядом весьма специфических свойств. В табл. 3.1 и 3.2 приведены основные свойства ферментов, используемых соответственно в гетерогенных и гомогенных методах, и способы регистрации их активности.
Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и p-D-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА.
Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NADP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAD определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. ^-D-Галактозидаза является также широко исйользу-емым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА.
64
Таблица 3.1. Ферменты, используемые в гетерогенном ИФА
Метод регистрации активности фермента	« •S Э »s	’S	*S •s	w « ® »s ®	»®	£ ®	Й 2	® ЕГ	®	5 wE.tiS'oEQ	Р «и	®	о	я	а>	®	а>	Е s’ . Я*	я	S	в*	Р*	s’	5 S	HSSbjF-'	аа	я 2	Л)	Я	Я	±	4>	Я	н е	s	s	м	e-s	е	s О	Я	2	2	4>	S	Я	Р . s	о,	ч	°-,	s	о.	s	£?ч О	О	я	S	О	О	о	То о	ч" § ч О ч	о	*	*	* Ж н е е х m ее е	z S ч л
Индикаторная система	Я Я	Ч	6	,	6 я я о. 2	2	о	я	и о я Ч g	g	•©•	а	'О •©ч я §	е-	- 5	5	§2 6 5® ®	ч	Й §.	2 —'oJ2	о	-е-о	л	'	® ч ян S	*я	иХ	Q	ч 3 2® о	е	о я	ш.	я 5 = «<§•	§	"чч	ч	5	g*	~ ёю2"я®	я о	я	о	gg	В lo»S	S S	4>	S	о «	5. о,® З-в*	2	оч	о	о.	'	S "	к я 2 s я ч	as	g.	х	5®	Я S М О яI	н н	н	•	я О	о с? Я Я Н z-^ь-	Я 4>	я	НО	w	я О я к о о О-a Hg  ЖчО	So	О	о Х£осяж3	CM g Ж	<g	Ж < ч ч я Ж	•&	и	я
Е к	s	a	sg^x's	яяО.	s Й	О	F-«	В2 С!	—.	со 2	О	ч	Ж	со О	CQ	О> sf	СО .«	си
рН-опти-мум	О Ь*	о	оо	Ь*	00	0000 1	1	Т	1	1	1	II ю	00	00	CO	Tfr	ь-	со	ь*
№ СО >	. И ® А и с( со « >>	о	о	о	о	о	о	о С	ОООО'ОО 04	О	СО	04	О	04 -н	—<	О Ю \
Молекулярная Mateca	О	о	о	о	О	о	л о	о	о	о	о	о	О о	О	О	О	О	О	.	О О	О	о	С©	О	О“; чг	с	тг	оо	со	ю	£2 1©	—»	04	04	со
Фермент	S'	я© •й	©	Я я Ж т	8	з	«ж я'-'	сц-	’О	1Л S	8	”	S” 1	« Я ”	«	2-	aS© &	-g-ё	5	2	8	g о я	z?	га	г,	т.	*вs— О й	S	ef	ж	о	2 м	лЛ	п	м	2	В	W 5	х о»	о	и	£	. СП Ь п	f Н	1— »"'Ч Ч	я	/*ч AJ К S.	н-	я со ®	la	с© ef е; S-	W	^^2	о	га	s <и S	я	2	М	2_Г	® н оР	og^	S	«	5^	23 |ж .	Sr о” 2	S ® . 4>	•	нт» СО	, А	Ч	ии	«а,	Ч и - кж	В 5” оУ* И.	< 5 -	а» *	со	* а
3—627
65
Таблица 3.2. Ферменты, используемые в гомогенном ИФА
од регистрации мости фермента	{диметрический с	•S •s s S № * flj СТ v s S ль si s s О Си	А	1	1	1
5; а	Тур 61	Фол Флус			
Индикаторная система	Клеточные генки бактерий	NAD/NADH	А	1	1	1
	Q				
		ОЗ Q -е- 5 о	(NAD)		
к		Sg-e- , «, «? 1 । о оо со	ю-4 М L-малат О-4 М	1	J	1
1		• W <4^.2 С© ч			
					
рН-[тимум	,5—5,5	7—8,5 [7, 8)	.5—9,5	I	I	]
о	’Ф		ОО		
5 „ « д ь <р л р >> Л И		550	1100	1	1	]
Молекулярная масса	14 500	110 000	о о о о	1	.1	. 1
Фермент	Лизоцим белка куриных яиц (КФ 3.2,1.17)	Глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназа (КФ 1.1.1.49)	Малатдегидрогеназа сердца свиньи (КФ 1.1,1.37)	P-D-Галактозидаза ♦ Е. coll Пероксидаза хрена *	Ацетилхолииэстераза *
См. табл. 4.1.
66
Другие ферменты, перечисленные в табл. 3.1, находят гораздо меньшее практическое использование в гетерогенных методах ИФА. Ацетилхолинэстераза обладает высокой удельной активностью и низким значением Ат; активность можно измерять как с помощью pH-электрода, так и фотометрически. Каталаза имеет наивысшую каталитическую активность, однако недостатком является необходимость слежения за реакцией в УФ области, что
Т а блица 3.3. Минимальные определяемые количества ферментов фотометрическим и флуориметрическим методами
Фермент	Субстрат	Нижний предел обнаружения фермента в пробе (амоль)	
		флуорнмет-рнческая регистрация	фотометрн- • ческая регистрация
Пероксидаза хрена P-D-галактозндаза Е. coll Щелочная фосфатаза кншечннка теленка Г люкозооксндаза	о-Фениленднамнн л-Окснфенилпропноновая кислота о-Ннтрофеннл-(Щ)-галактозид 4-Метнлумбеллнфернл-Р-В-га-лактозид л-Ннтрофеннлфосфат 4 - Метнлумбеллнфернл фосфат л-Окснфеннлуксусная кислота	1 0,03 J7 8	4 170 1700
• См. табл. 4.1.
не всегда возможно. Существуют теоретические методы определения ее активности, однако они недостаточно чувствительны. В случае уреазы имеются некоторые проблемы со стабильностью конъюгатов, возможно связанные с окислением сульфгидрильных групп фермента, приводящим к инактивации. Наиболее распространенным среди гомогенных методов в настоящее время является так называемый EMIT-анализ, в, котором в качестве метки молекул антигенов использована глюкозо-6-фосфатдегидро-геназа. Высокая активность фермента по NAD позволяет использовать его при анализе гемолизированных образцов крови, в которых возможно присутствие фермента, имеющего специфичность по NADP. Малатдегидрогеназа — очень активный фермент, однако он имеет ограниченное применение — только в анализе мочи. В гомогенном ИФА лизоцим имеет лишь историческое значение.
Чувствительность многих вариантов иммуноферментных методов анализа может быть ограничена наименьшей регистрируемой концентрацией ферментативной метки в растворе, поэтому чем в более низкой концентрации возможно определение меченного з*	ет
ферментом антигена или антитела, тем лучшими характеристиками будет обладать данный метод ИФА.
В табл. 3.2 даны предельные значения (в амолях, 10-18 моль) количества ферментов, детектируемых в растворе или на носителе при регистрации ферментативной активности в течение 1 ч фотометрическим или флуориметрическим методами.
Для сравнения отметим, что удельная активность обычно используемого в радиоиммунологическом анализе радиоизотопа 12SI, имеющего период полураспада 60,2 дня, составляет 4,8 распада в 1 мин на 1 амоль.
• Таким образом, из данных таблицы следует, что флуориметри-ческий метод регистрации каталитической активности р-Р-галак-тозидазы позволяет выявлять значительно меньшие количества метки, чем радиоизотопный. Для других ферментов эти величины являются сравнимыми, а следовательно, по своей чувствительности иммуноферментные методы анализа не должны уступать радиоиммунологическим.
При разработке конкретного варианта ИФА перед исследователем встает проблема выбора фермента в качестве метки. Для правильного выбора следует учитывать многие факторы: например, в гомогенном ИФА в исследуемом образце должны отсутствовать свободный фермент-метка, или фермент, имеющий сходную с ним специфичность, ингибиторы или активаторы фермента и т. д. Выбор фермента может быть обусловлен также и целями ИФА. Например, при одновременном анализе очень большого числа образцов, выполняемого в течение довольно длительного времени, необходимо для уменьшения ошибки анализа использовать более стабильные субстраты. Гидролитические ферменты, например щелочная фосфатаза и p-D-галактозидаза, имеют более стабильные субстраты, чем оксидоредуктазы, такие, как пероксидаза и глюкозооксидаза, поэтому последние менее предпочтительны в случае реакции с продолжительным периодом инкубации, но могут быть с успехом использованы в быстрых методах иммуноанализа.
§ 3. Характеристика ферментов, используемых ,в ИФА
Пероксидаза хрена (КФ 1-11.1.7)
Структура. Пероксидаза хрена представляет собой глобулярный белок Л4г=40 000, диаметр молекулы 5,0 нм. Молекула состоит из апофермента (белковой части, содержащей около 18% нейтральных и аминоуглеводных остатков) и простетической группы — гемина.
Ионообменной хроматографией пероксидаза разделяется на
68
7 изоферментов, обозначаемых как А-1, А-2, А-3, В, С, D и Е, которые отличаются по аминокислотному и углеводному составу. В коммерческих препаратах пероксидазы в основном содержится изофермент С. В состав молекулы изофермента С входит 308 а. о. и 8 нейтральных углеводных остатков, связанных с остатками аспарагиновой кислоты, стабилизирующих фермент относительно воздействия протеолитических ферментов. Эти углеводные остатки имеют также существенное значение при синтезе иммуноперок-сидазных конъюгатов методом перйодатного окисления. Молекула изофермента С имеет шесть остатков лизина, содержащих свободные аминогруппы, четыре из которых находятся вблизи поверхности белковой глобулы и легко доступны для модификации.
В состав активного центра молекулы пероксидазы входит феррипротопорфирин IX (гемин), образующий с апобелком очень прочный комплекс (константа диссоциации при 20°С pH 7,0 и ионной силе 0,1 составляет 3,7-10-12 М). Степень чистоты препаратов пероксидазы характеризуется величиной RZ (Reinheits Zahl), которая соответствует отношению оптических плотностей при %=403 и 275 нм (А^оз/Агта). Хорошо очищенные препараты пероксидазы имеют RZ 2^3,0.
Часто для приближенной оценки концентрации пероксидазы (в мг/мл) в водном растворе pH б—7 используют следующее соотношение:
С=А4оз-О,44,
где Л4оз — оптическая плотность раствора пероксидазы (толщина кюветы 1 см) при Х=403 нм.
Специфичность. Фермент катализирует двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода (реже органических гидроперекисей). На первой стадии взаимодействие фермента Е с перекисью приводит к образованию промежуточной окисленной формы Ei. На второй стадии происходит одноэлектронное восстановление Ej вторым субстратом АНа, являющимся донором водорода, с образованием второй промежуточной формы фермента Еп, которая после взаимодействия со второй молекулой донора переходит в нативный фермент:
Е + НА^Е,
Е1+АН2-ЕП + -АН
E„+AH2-e+-AH
2(—АН)—> А-[~АН2
Фермент обладает широкой специфичностью по второму субстрату и способен окислять замещенные фенолы, анилины, о-фе-нилендиамины, о-дианизидин, люминол, n-аминобензойную кислоту и целый ряд других органических и неорганических соединений.
69
Измерение активности. Для измерения каталитической активности пероксидазы могут быть использованы следующие методы: фотометрический, флуориметрический, хемилюминесцентный, электрохимический.
Среди хромогенных субстратов наибольшее распространение получили о-фенилендиамин (ОФД), 5-аминосалициловая кислота и диаммониевая соль 2^'-азино-ди[3-этил-2,3-дигидробензотиазо-лин-6-сульфоновой кислоты] (АБТС). Во флуориметрическом методе в качестве субстрата используют л-оксифенилпропионовую или гомованилиновую кислоту.
• Флуориметрический метод регистрации активности пероксида* зы обладает некоторыми преимуществами по сравнению с ^фотометрическим: более чувствителен, низкая фоновая реакция, интенсивность флуоресценции образующегося продукта стабильна по крайней мере в течение 4 ч. Раствор субстрата может быть приготовлен заранее и храниться в течение длительного времени в замороженном состоянии при —20°С, в то время как рабочие растворы хромогенных субстратов должны быть приготовлены непосредственно перед измерением активности.
Принцип работы электрохимического датчика для определения активности пероксидазы основан на известной реакции окисления йодид-ионов перекисью водорода, катализируемой пероксидазой. Обычно регистрируют либо скорость изменения тока, либо предельный ток, проходящий через электрод за определенный промежуток времени.
Определение каталитической активности пероксидазы с использованием в качестве субстрата о-фенилендиамина (ОФД). Метод основан на фотометрической регистрации продукта окисления о-фенилендиамина, имеющего, максимум спектра поглощения при 435 нм. Так как иммуноферментный анализ обычно проводят с большим количеством образцов, то Часто для остановки ферментативной реакции используют так называемый стоп-реагент, например концентрированную H2SO4. При добавлении в реакционную смесь равного объема 0,1 М H2SO4 максимум спектра поглощения сдвигается на 50 нм в длинноволновую область, поэтому в этом варианте регистрацию оптической плотности следует проводить при 490 нм. pH-Оптимум каталитической активности пероксидазы при использовании в качестве субстрата-о-фенилендиамина равен 5. В анализе следует использовать свежеприготовленный раствор субстрата и избегать воздействия на него сильного освещения.
6 мг о-фенилеидиамииа растворяют в 15 мл 0,02 М. фосфатцитратиого буфера pH 5, добавляют 10 мкл концентрированной (30%-иой), перекиси водорода, вносят раствор фермента (или разливают в лунки микроплат, содержащие специфически сорбированные коиъюгаты Ат или Аг с пероксидазой) и регистрируют изменение оптической плотности при 435 им (или после добавления H2SO4 при 490 им),
70
Определение каталитической активности пероксидазы с использованием 5-аминосалициловой кислоты. Этот субстрат обычно применяется в случае визуальной детекции результатов ИФА, поскольку при его окислении образуются нерастворимые продукты, имеющие яркую коричневую окраску. К сожалению, в настоящее время в литературе отсутствуют данные по механизмам окисления этого субстрата, составу образующихся продуктов реакции, поэтому его использование для точных измерений в области низких концентраций фермента может быть сопряжено с большими ошибками. о-Фенилендиамин позволяет регистрировать пероксидазу спектрофотометрическим методом в диапазоне от 0,4 до 100 нг/мл, а 5-аминосалициловая кислота — от 5—10 до 800 нг/мл.
В 10 мл кипящей воды растворяют 8 мг 5-амииосалициловой кислоты. Раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят pH до 6,0 с помощью 1 М. NaOH и добавляют 1 мл раствора Н4О2 с концентрацией 10-4 М [концентрированный 30%-ный раствор (9,8 М) разводят приблизительно в 100 000 раз]. Затем добавляют-в лунки микроплат по 0,2 мл субстратного раствора и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Измерение оптической плотности растворов проводят при 495 нм.
Определение активности пероксидазы с использованием диам-мониевой соли 2,2'-азино-ди-[3-этил-2,3-дигидробензотиазолин-6-сульфоновой кислоты] (АБТС). Метод основан на фотометрической регистрации катализируемой пероксидазой химической реакции:
В присутствии пероксидазы и Н2О2 при избытке АБТС при нейтральных значениях pH образуется стабильный катион-радикал, имеющий в растворе интенсивную зелено-голубую окраску (коэффициент молярного поглощения в максимуме спектра при длине волны 420 нм равен 43,2-103 М-1-см-1, при длине волны 405 нм — 18,6-103 М"1 -см-1).
Готовят 0,02 М. раствор АБТС (растворяют 1,1 г АБТС в 100 мл 0,067 М. фосфатного буфера, pH 6,0, 0,144 г Na2HPO4-2H2O+0,798 г КН2РО4 в 100 мл воды) и 0,01 М. раствор Н2О2 (концентрацию перекиси водорода контролируют спектрофотометрически, используя коэффициент молярного поглощения при длине волны 230 им е2бо=72,4 М^-см-1. Концентрированный 30%-иый раствор перекиси водорода (9,8 М) разводят приблизительно в 1000 раз, В реакционную кювету, содержащую 2 мл раствора образца, вносят 0,2 мл 0,02 М раствора
71
АБТС и 0,2 мл 0,01 М. раствора Н2О2. Измеряют увеличение оптической плотности при длине волны 405 или 430 нм,
Флуориметрический метод определения каталитической активности пероксидазы с использованием п-оксифенилпропионовой кислоты.
Растворяют 0,25 г очищенной n-оксифенилпропионовой кислоты в 50 мл 0,1 М. фосфатного буфера, pH 8,0 (pH раствора смещается до 7,0). Приготовленный раствор субстрата добавляют в лунки микроплат (по 0,25 мл), содержащие на стенках специфически сорбированные конъюгаты пероксидазы, инкубируют 5 мии при 30 °C и инициируют реакцию добавлением 0,05 мл 0,03 %-ной Н2О2. Через 10—60 мии инкубации при 30 °C реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 0,1 М. глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции образцов (X. возбуждения 320 нм, испускания — 405 им).
Хемилюминесцентные способы определения каталитической активности пероксидазы.
1. В полистирольную пробирку, содержащую специфические сорбированные иа стенках конъюгаты Ат или Аг с пероксидазой, добавляют 10 мкл 3,6 мМ раствора Р-люциферина в 0,0,1 М трис-HCl буфере, pH 8,0, и 1 мл смеси, содержащей 1,25 мМ люминола и 2,7 мМ перекиси водорода. Пробирку помещают в кювету люмииометра и измеряют интенсивность хемилюминесценции через 30 с.
2. В полистирольную пробирку, содержащую связанный со стеиками конъюгат фермента, добавляют 20 мкл 10~3 М раствора люминола (1,8 мг люминола растворяют в 10 мл 0,1 NaOH) и 960 мкл 0,21 М NaOH, перемешивают, цнку-бируют 10—15 мии, после чего реакцию инициируют добавлением 20 мкл 5-10-2 М. растнора Н2О2.
Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4)
Структура. В качестве метки в иммуно-ферментном анализе обычно используют глюкозооксидазу из Aspergillus niger. Фермент представляет собой гликопротеин, содержащий 16% углеводных групп, молекулярная масса 160 000, в состав входят 2 молекулы связанного флавинадениндинуклео-тида. Коэффициент молярного поглощения фермента при длине волны 450 нм —1,41-10* М-1-см-1. В нативном состоянии сульфгидрильные группы в молекуле фермента не обнаруживаются, однако после денатурации в 8 М мочевине титруются 1—2 SH-группы на молекулу белка. Фермент обладает высокой стабильностью и сохраняет активность при хранении в течение нескольких лет в замороженном виде в концентрации 10 мг/мл.
Специфичность. Фермент катализирует реакцию окисления P-D-глюкозы кислородом с образованием перекиси водорода:
P-D-глюкоза + Н2О + О2-Э-Н2О2+Р-глюконо-6-л актон.
2-£>-арабиноза, 2-дезокси-Р-глюкоза и ионы Ag+, Hg2+, Cu2+ являются ингибиторами, pH-оптимум ферментативной активности равен 5,5.
Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации продукта реакции — перекиси водорода с помощью пероксидазы хрена.
72
Фотометрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием о-фенилендиамина.
100 мг D-глюкозы растворяют в 10 мл 0,01 М. фосфатного буфера pH 5,5, раствор выдерживают в течение часа, чтобы полностью прошла мутаротация глЮкозы. К полученному раствору добавляют 1 мг пероксидазы хрена и 2,5 мл (1 мг/мл) о-феиилеидиамина. В кювету, содержащую специфически сорбированные иа стейках конъюгаты глюкозооксидазы с Ат или Аг, приливают 1 мл приготовленного раствора. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,1 мл концентрированной H2SO4. Регистрируют изменение оптической плотности при длине волны 490 им,
Флуориметрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием п-оксифенилукусной кислоты.
В 50 мл 0,05 М. ацетатного буфера pH 5,0 растворяют 50 мг п-оксифеиил-уксусиой кислоты, доводят pH до 5,0 с помощью 10 М. NaOH и добавляют 1 мг пероксидазы. К 0,25 мл полученного раствора добавлиют 10 мкл раствора глюкозооксидазы в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,0, содержащем 0,1 М NaCl и 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, и смесь инкубируют при 30°С в течение 5 мии. Ферментативную реакцию инициируют и проводят обычно в течение 10—60 мин при 30°С. Для остановки реакции добавляют 2,5 мл 0,1 М. глиции-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения 320 им, испускания — 405 им).
Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1)
Структура. Продажными препаратами щелочной фосфатазы являются фермент из кишечника телят и из Е. coll. В качестве метки в иммуноферментном анализе обычно используют первый из них, так как он обладает более высокой удельной каталитической активностью. Молекула щелдчной фосфатазы представляет собой димер с Мг~ 100 000. В состав каждой из субъединиц входят два сильно связанных атома цинка, один из которых существен для поддержания структурной целостности молекулы, а второй входит в состав активного центра и принимает участие в каталитическом акте.
Специфичность. Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз различных ортофосфатных эфиров, в том числе первичных и вторичных спиртов, сахарных спиртов, циклических спиртов и фенолов:
моноэфир ортофосфорной КИСЛОТЫ Ч-НгО-”спирт-}-РО43_ Ионы Mg2+ являются сильными активаторами фермента. Фосфатной и хелаты двухвалентных металлов, например ЭДТА, ингибируют фермент. На активность щелочной фосфатазы значительное влияние оказывает электростатическое окружение (ионная сила, растворитель).
В сухом виде или в суспензии (3,2 М раствора сульфата аммония), pH 7, содержащего 1 мМ MgCh, щелочная фосфатаза стабильна в течение нескольких месяцев при 4°С.
73
Фотометрический метод определения каталитической активно-сти щелочной фосфатазы с использованием 4-нитрофенилфосфата.
Растворяют 1,1 г 4-иитрофеиилфосфата (дииатриевая соль X 6Н2О) в 4 мл воды и доводят объем до 5 мл. В кювету спектрофотометра вносят 3 мл ОД М глицин-NaOH буфера, pH 10,5, содержащего 1 мМ MgCl2 и 0,1 мМ ZnCl^. Кювету термостатируют при 30°С в течение 5 мин и добавляют 20 мкл раствора фермента. Реакцию инициируют добавлеииемЗО мкл раствора 4-нитрофенилфосфата. Следят за увеличением оптической плотности при длине волны 405 нм (коэффициент молярного поглощении п-нитрофенолят-и'оиа 18 500 М-1 см-1).
Флуориметрический метод определения ферментативной активности с использованием 4-метилумбеллиферилфосфата.
Готовит 0,3 мМ раствор субстрата, растворяя 2,6 мг 4-метилумбеллиферилфосфата в 33,3 мл 0,1 М глиции-NaOH буфера, pH 10,3. В кювету, содержащую специфически сорбированный иа стенках конъюгат фермента с Аг или Ат, добавляют 0,1 мл 0,1 М глиции-NaOH буфера, pH 10,3, содержащего 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ZnCl2, 0,5 г/л NaNs и 250 мг/л альбумина. Раствор инкубируют лри 30 °C в течение 5 мин и инициируют реакцию добавлением 50 мкл раствора субстрата. Через 10—60 мин реакцию останавливают добавлением 2,5 Мл 0,5 М К2НРО4-КОН буфера, pH 10,4, содержащего 10 мМ ЭДТА. Измеряют интенсивность флуоресценции раствора (длина волны возбуждения 360 нм, испускания 450 нм).
р-£)-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23)
Структура и специфичность. p-D-галакто-зидаза из Е. coll имеет молекулярную массу около 540 000, молекула содержит значительное число SH-групп.. (количество титруемых SH-групп зависит от качества препарата и может составлять 20—24). Коэффициент молярного поглощения при длине волны 280 нм равен 1,13-106 М-1-см-1. Фермент катализирует гидролиз p-D-галактозидов, обладает достаточной стабильностью; в кристаллической суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония (pH 6) сохраняет активность при 4°С в течение нескольких меся-. цев. Ионы Na+ являются ингибиторами фермента.
Фотометрический метод определения каталитической активности с 4-метилумбеллиферил-$-£)-галактозидом. 
10 мг 4-метилумбеллифернл-Р-В-галактозида растворяют в 2 мл диметил-формамида при встряхивании в течение 4—5 ч и добавляют 98 мл деионизованной воды. В реакционную ячейку, содержащую фермент, добавляют 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCl2, ||!	0,05—1 г/л бычьего сывороточного альбумина и 1 г/л азида натрия. Раствор
инкубируют при 30 °C в течение 5 мин и инициируют реакций добавлением I	50 мкл раствора субстрата. Через 10—60 мин реакцию останавливают добавле-
।	иием 2,5 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуо-
I i	ресценции (длина волны возбуждения 360 нм, испускания—450 им).
Глюкозо-6-фосфатдеГидрогеназа
;	(КФ 1-1-1-49)
Структура. Фермент широко распространен и может быть выделен как из тканей млекопитающих, так и из бактерий. Молекула состоит из двух субъединиц, каждая из 74
которых содержит вблизи активного центра реакционноспособный остаток лизина. В иммуноферментном анализе часто используют бактериальную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу из Leuco-nostos mesenteroideS. Фермент не содержит SH-групп и обладает высокой стабильностью (стабилен более года при 4°С).
Специфичность. Фермент катализирует реакцию окисления глюкозо-6-фосфата с образованием 6-фосфо-£>-глюконата:
глюкозо-6-фосфат + 1МАПР+->-6-фосфо-.О -глюконат -f- NADP -f- Н+
В отличие от фермента из млекопитающих бактериальная глю-козо-6-фосфатдегидрогеназа (из Leuconostoc mesenteroides) эффективно использует в качестве кофермента не только NADP+, но и NAD+. Большинство двухвалентных ионов металлов являются ингибиторами фермента. Mg2+ в концентрации до 10 мМ активирует, но при высоких концентрациях также ингибирует его. Инги-бирующий'дффект оказывают фосфат-ионы.
Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации образующейся в реакции восстановленной формы кофермента (коэффициент молярного поглощения NADPH при длине волны 340 нм равен 6,22-103 М-1-см-1).
Фотометрический метод регистрации каталитической активности глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназы.
В кювету спектрофотометра к 2,5 мл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 7,8 (или 0,1 М триэтаиоламинового буфера), содержащего 0,03 М MgClj, добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора NAD+ и 0,2 мл 0,15 М раствора натриевой соли глюкозо-6-фосфата. Кювету термостатируют и затем вносят 50 мкл фермента (в концентрации порядка 40 мкг/мл) или его конъюгата. Фиксируют скорость изменения оптической плотности раствора при длине волны 340 нм.
Малатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.37)
Структура. В гомогенном иммуноферментном анализе обычно используют малатдегидрогеназу из сердца свиньи. Молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по 35 000. Каждая из субъединиц имеет центр связывания молекулы кофермента NAD+ и обладает каталитической активностью при диссоциации молекулы на субъединицы. Изоэлектрическая точка 6,2. Молекула содержит 14 SH-групп, две из которых существенны для связывания субстрата в активном центре. Фермент достаточно стабилен и сохраняет активность в течение года при 4°С в виде суспензии под сульфатом аммония.
Специфичность. Малатдегидрогеназа катализирует реакцию восстановления оксалоацетата до малата под действием NADH:
оксалоацетат + NADH -}-Н+ -> L-малат + N AD+
75
Каталитическую активность измеряют по скорости уменьшения оптической плотности восстановленной формы NADH при длине волны 340 нм. Активаторами фермента являются фосфат, Zn2+, малат; ингибиторами — оксалоацетат, 8-оксихинолин, AMP, ADP, АТР, сульфит, тироксин, фенолы.
Фотометрический способ определения ферментативной активности малатдегидрогеназы.
В кювету спектрофотометра к 2,58 мл 0,1 М К-фосфатного буфера, pH 7,4, добавляют 0,2 мл 4,5 мМ раствора оксалоацетата в том же буфере и 0,2 мл 3 мМ раствора NADH. Кювету термостатируют и затем вносят 20 мкл раствора фермента (с концентрацией 1 мкг/мл) и регистрируют изменение оптической плотности раствора в течение 5 мин при длине волны 340 нм.
Методы иммуноферментного анализа
К настоящему времени разработано большое число различных вариантов проведения ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Опубликованы обзоры, в которых подробно рассмотрены методы ИФА. Однако единая четкая классификация всего многообразия методов ИФА в литературе отсутствует, что затрудняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной оценки возможностей различных методов. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения всех методов на гетерогенные и гомогенные, т. е. по принципу проведения всех стадий анализа — с участием твердой фазы или же только в растворе. В данной главе с учетом сложившейся в литературе терминологии дана общая классификация всех методов ИФА.
§ 1. Классификация методов ИФА
Первичным процессом в иммуноферментном и в любом другом иммунохимическом анализе является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования им-мунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов.
77
В случае анализа антигенов для проведения такой оценки суще* ствует два подхода: 1) прямое измерение концентрации образовав^ шихся иммунохимических комплексов; 2) определение концентрации оставшихся свободными, т. е. не вступивших в реакцию комплексообразования с антигеном антител. Очевидно, что в этом случае число образовавшихся иммунных комплексов определяется по разности общего числа добавленных антител и числа оставшихся свободными антител (схема 4.1). При анализе антител эти подходы остаются аналогичными, но в схеме 4.1 симметрично меняются местами Ат и Аг, при этом также определяются либо сами комплексы, либо оставшиеся свободными, не связанные в комплекс антигены:
Тип!
Определение специфических комплексов
Тип II Определение ► свободных центров связывания Ат
Схема 4.1
При крайне низких концентрациях компонентов образование простого бинарного комплекса антиген-антитело не может быть зарегистрировано ни визуально, ни простыми инструментальными методами, что вызывает необходимость усложнения аналитической системы. Одним из путей «визуализации» образования комплекса является использование меченых соединений, в которых метка мо-л$ет легко детектироваться в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого соединения. Как правило, от типа метки зависит название анализа — радиоиммунологический анализ, флуоресцентный иммуноанализ, иммунокофакторный анализ, иммуноферментный анализ и т. д.
Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитической активностью, позволяющей с применением соответствующих субстратных систем регистрировать ферменты в растворе на уровне Ю~15 М и ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимологии принципиально решена проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент ;	легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди-
нениями с целью получения соответствующих конъюгатов.
Второй общей стадией любого метода ИФА является формиро-tj; вание связи меченного ферментом соединения со специфическим
78
h'
комплексом или свободными центрами связывания. В некоторых схемах\конкурентный анализ) образование комплекса с меченным ферментрм соединением может проходить одновременно с первой стадией «узнавания» антителами специфических антигенов. И, наконец, последним обязательным процессом в ИФА является «трансформация» ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый различными физико-химическими методами (спектрофотометрическими, флуориметрическими, люминесцентными и т. д.), что достигается путем проведения реакции фермента с субстратами.
Во всех методах ИФА может измеряться ферментативная активность меченого соединения, находящегося в специфическом иммунном комплексе или же в комплексе со свободными, не вступившими в реакцию центрами связывания. Именно этот принцип может быть положен в основу классификации всех методов ИФА. В первой группе методов ИФА (тип I, схема 4.1) ферментная метка находится в образовавшемся специфическом комплексе анализируемого антигена и антитела, поэтому очевидно, что возрастание концентрации определяемого соединения будет сопровождаться увеличением концентрации образующегося специфического иммунохимического комплекса, а следовательно, более высоким регистрируемым сигналом. Очевидно, что в этом случае калибровочный график, представляющий собой зависимость регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения, должен описываться возрастающей функцией.
Во второй группе методов (тип II, схема 4.1) с помощью ферментной метки выявляются-оставшиеся свободными центры связывания. Следовательно, калибровочная кривая описывает уменьшение регистрируемого сигнала от максимального значения, соответствующего нулевой концентрации антигена до определенного уровня, характеризующего концентрацию исследуемого антигена.
Проведение количественной оценки образовавшихся в первичном процессе «узнавания» анализируемого соединения комплексов или же оставшихся свободными мест,специфического связывания может осуществляться в один или несколько этапов.
Очевидно, что в анализе типа I количество образовавшихся специфических иммунных комплексов может быть намного меньше, чем общее количество центров связывания, так как измерение активности проводится от нулевого уровня (в отсутствие неспецифических взаимодействий). Для достижения максимальной чувствительности определения исследуемого соединения необходимо иметь избыток центров связывания, так как в этом случае концентрация образующегося специфического комплекса будет максимальна.
В анализе типа II концентрация образовавшихся на первой стадии иммунохимических комплексов вычисляется по разности начальной концентрации центров специфического связывания и измеряемой экспериментально концентрации оставшихся свободными
79
центров специфического связывания. Для достижения достаточной точности разности необходимо, чтобы количество образующихся иммунных комплексов было сравнимо с количеством оставшихся свободными центров специфического связывания. Очевидно, что такой подход в проведении анализа налагает более жесткие требования как на соотношение концентраций используемых в анализе реагентов, так и на константу связывания и-концентрацию определяемого соединения.
В литературе иногда можно встретить классификацию методов ИФА, основанную на том, находится ли определяемое соединение в избытке или недостатке по отношению к центрам связывания. Однако этот подход не однозначен, так как лимитирующим является не только соотношение между концентрациями компонентов реакционной системы, но и концентрациями и равновесной константой комплексообразования специфического иммунохимического комплекса. Поясним сказанное на примере. Если концентрация определяемого антигена [Аг]о = 1О~10 М, а концентрация добавленных специфических антител [Ат]о=10-8 М, то при равновесной константе, равной 108 М-1, только 50% антигена (0,5-10-10 М) окажется связаннным в иммунохимический комплекс. При обратном соотношении компонентов ([Аг]о=Ю-8 М, [Ат]о=10~10 М) и той же константе равновесия концентрация комплекса останется той же самой, а следовательно, можно провести ее прямое определение одним и тем же способом. Однако по такой классификации, несмотря на проведение анализа одним и тем же способом, следует отнести его к двум различным типам, что, очевидно, нецелесообразно.
• В соответствии с вышеизложенным за основу классификации всех методов ИФА (а в более общем случае любого иммунохимического анализа с мечеными соединениями) следует принять разделение концентрации специфических комплексов анализируемого соединения с центрами связывания —прямое его определение (тип I) или нахождение по разности общего числа мест связывания и числа оставшихся свободными центров связывания (тип II, схема 4.1).
Классификация методов ИФА может быть осуществлена также по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если на первой -стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным.
Для неконкурентного анализа типа I оптимальным является соотношение компонентов, при котором концентрация .центров связывания значительно превышает концентрацию определяемого соединения. Действительно, в этом случае при повышении концентрации центров связывания равновесие в системе (схема 4.1) будет смещаться в сторону образования иммунохимических комплексов, концентрация комплексов возрастает, а следовательно, прямое оп-80
\
ределение концентрации комплексом можно осуществлять с лучшей чувствительностью и точностью.
Необходимым условием для неконкурентного анализа типа II является соблюдение соотношения избытка или сравнимой концентрации определяемого соединения (Аг) и мест специфического связывания, так как в этом случае определяется разность общего числа мест связывания и числа образовавшихся иммунных комплексов. Если концентрация, иммунных комплексов мала по сравнению с общим числом возможных мест связывания, то она будет определяться как разность двух близких чисел, каждое из которых находится с определенной ошибкой и потому не Имеет достаточную точность.
Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога, так как в противном случае каждый из процессов образования иммунокомплексов может происходить независимо от другого, а следовательно, определяемая экспериментально концентрация метки не будет зависеть от концентрации анализируемого соединения в растворе.
Следующим принципом классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохими-ческих стадий реакций. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы — гомогенные и гетерогенные. Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. В нем отсутствует стадия разделения образующихся иммунохими-ческих комплексов от свободных, не вступивших в реакцию компонентов. Определение концентрации исследуемого соединения основано на эффекте изменения каталитической активности фермента-метки,-возникающем при комплексообразовании с исследуемым лигандом или центрами специфического связывания.
Гетерогенный ИФА объединяет методы, ₽ которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения. Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения свободного и образовавшего специфический комплекс меченого соединения, которые находятся в разных фазах *.
!	* Известим работы, которые можно отнести к безраздельным гетерогенным
методам, основанным на эффектах сближения меченного ферментом соединения и специфического иммуиокомплекса иа твердой фазе, Подробнее они будут рассмотрены ниже,
‘	V 81
I ••
К гетерогенным относятся методы, в которых разделение свободного и связанного в иммунохимический комплекс меченого/реагента осуществляется как с помощью твердой фазы с иммобилизованным реагентом, так и путем осаждения иммунокомплексор, осуществляемого введением в систему дополнительных растворимых компонентов (соли, полиэтиленгликоль, спирт, вторичные антитела, белок А и др.). Однако мы не будем останавливаться на рассмотрении всех этих подходов, а ограничимся только методами, в которых для разделения меченых компонентов используют твердую фазу с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, так как в настоящее время они являются наиболее распространенными.
В целях удобства классификации целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру проведения первой стадии «узнавания», которая является определяющей для всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии, а следовательно, формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ, solid phase assay). Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гетерогенные.	х
Таким образом, классификация методов ИФА может быть
Схема 4.2
82
представлена схемой 4.2, из которой следует большее многообразие анализов типа II и отсутствие конкурентных и гомогенно-гетерогенных методов типа I.
• На сегодняшний день разработано более тридцати вариантов различных методов ИФА, различающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных стадий. Такое множество вариантов анализа обусловлено в основном различными способами модуляции ферментативной активности в гомогенных методах и использованием различных комбинаций меченных ферментами и иммобилизованных на носителе реагентов (антигенов и антител) в гетерогенном ИФА.
Однако все эти методы могут быть классифицированы согласно приведенной выше системе. Более детальную классификацию известных методов гетерогенного и гомогенного анализов можно осуществить с учетом схемы 4.2 и типа используемых в анализе меченных ферментами реагентов — антигентов, антител и вторичных антител.
В связи с различиями в последовательности проведения отдельных стадий анализа целесообразно раздельно рассматривать методы определения антигенов и антител в гетерогенном и гомогенном ИФА.
§ 2. Классификация гетерогенных методов ИФА
Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов—антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохи-мических комплексов от несвязавщихся компонентов. Поэтому принцип разделения гетерогенных методов может быть представлен схемой 4.3.
Схема 4.3
83 ‘
В соответствии с таким делением в табл. 4.1 указаны варианты гетерогенных методов ИФА антигенов, основанные на определении специфических иммунных комплексов (т. е. относящихся котипу I), в табл. 4.2 — варианты гетерогенных методов ИФА антител типа I, в табл. 4.3 — гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического свя-
Таблица 4.1. Гетерогенные методы ИФ4 антигенов, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I)
Меченый реагент		Иммобилизованный реагент	Неконкурентные		Конкурентные	
			твердофазные	гомогенно-гетерогенные	твердофазные	гомогенно-гетерогенные
Антитела	Специфичестсое ентнтело	Антиген	||—(2)				
		Антитела Ц—	Есть			
		Ангивидовое антитело	Есть			
	Ангивидовое антитело	Антиген	—(2)				
		Антитело	Есть			
		Ангивидовое антитело				
Антиген» Q”®		Антигеи				
		Антитело				
		Ангивидовое антитело				
зывания (т. е. относящихся к типу II), и в табл. 4.4 — гетерогенные методы ИфА антител типа II. Для наглядности таблицы имеют одинаковые графы, соответствующие максимальному количеству схем ИФА, хотя количество схем для данного типа анализа, естественно, меньше. Схемы, представленные в этих таблицах, достаточно полно отражают Известные в настоящее время методы ИФА, но не затрагивают деталей, как, например, использование не целых антител, а только их Fab-фрагментов, типа носителя, способа получения иммуносорбента и т. д. Остановимся на более подробной характеристике каждого метода в порядке расположения в табл. 4.1—4.4.
Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные иа определении специфических иммунных комплексов (тип I). К этой группе могут быть отнесены только три метода (см. табл. 4.1), причем все они являются неконкурентными.
Методы с использованием меченых антител и иммобилизованных антител. Один из наиболее распространенных на практике методов основан на применении меченных ферментом специфических антител и иммобилизованных антител. Схема метода:
84
5) определение ферментативной активности
Условные обозначения, используемые на этой и последующих схемах:
— антиген, специфические и антивидовые антитела соответственно
— компонент, в который введена ферментная метка
— иммобилизованный компонент
К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется специфический комплекс антиген—антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich). Часто,в литературе встречается и другое его название — двухцеитровой метод ИФА (англ, two—site assay). Как следует из описания метода, он может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней
85
Таблица 4.2. Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I)
Меченый реагент		Иммобилизованный реагент	Неконкурентные		Конкурентные	
			твердофазные	гомогенно-гетерогенные	твердофазные	гомогенно-гетерогенные
Антитела	Специфическое антитело	Антиген				
		Антитело				
		Антнвидовое антитело |				
	Антнвидовое антитело	Антиген	—(2)	Есть			
		Антитело				
		Антнвидовое антитело				
Антиген		Антиген |	&ть'			
		Антитело				
		Антнвидовое антитело |	Есть			 	
Таблица 4.3. Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического связывания (тип II)
Меченый реагент		Иммобилизованный реагент	Неконкурентные		Конкурентные	
			твердофазные	гомогенно-гетерогенные	твердофазные	гомогенно-гетерогенные
Антитела	Специфическое антитело	Антиген	Есть		Есть	
		Антитело				
		Антнвидовое антитело				
	Антнвидовое антитело	Антигеи	(^)			<	
		Антитело				
		Антнвидовое антитело j|—				
Антиген	(2)—®		Антиген				
		Антитело				
		Антнвидовое антитело				
86
мере, две антигенные детерминанты, а для анализа большого числа моновалентных антигенов (например, стероидные гормоны, лекарственные соединения, пестициды) он неприемлем.
9 Данная схема проведения анализа требует затраты большого времени, так как состоит из нескольких последовательных операций, однако обладает рядом существенных достоинств, обусловли-
Таблица 4.4. Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении оставшихся -незанятыми мест специфического связывания (тип II)
Меченый реагент		Иммобилизованный реагент	Неконкурентные		Конкурентные	
			твердофазные	гомогенно-гетерогенные	твердофазные	гомогенно-гетерогенные
Антитела	Специфическое антитело	Антиген	||—(2)		Есть	Есть	
		Антитело				
		Антнвидовое антитело Ц				
	Антнвидовое антитело	Антиген	—£)		Есть	Есть	
		Антитело				
		Антнвидовое антитело				
Антиген О--®		Антиген				
		Антитело	Есть		Есть	
		Антнвидовое антитело				
вающих ее широкое применение. Основным из них является высокая чувствительность метода, превышающая возможности других схем ИФА. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от равновесной константы связывания реакции антиген — антитело и концентрации компонентов. При данной константе связывания, характеризующей используемые в конкретном эксперименте антитела, и при крайне низких концентрациях антигена рассматриваемый метод дает возможность сдвигать равновесие в сторону образования специфических комплексов за счет использования избытка (по сравнению с Концентрацией антигена) иммобилизованных и меченных ферментом антител.
Максимальная чувствительность достигается при проведении Каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что и определяет длительность анализа, которая в среднем составляет 4—6 ч. Если не учитывать возможность неспецифических взаимодействий на стадии выявления специфических иммунокомплексов с помощью ферментного конъюгата, то предел обнаружения антиге
87
нов данным методом зависит от чувствительности регистрации ферментной метки на носителе. При использовании высокочувствительных систем детекции ферментативной активности предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого соединения.
• Так как перед стадией регистрации ферментативной активности проводят отмывку носителя от компонентов исследуемых жидкостей, то метод исключает влияние на ферментативную активность и, следовательно, на результаты анализа присутствующих в анализируемой пробе эффекторов.
«Сэндвич»-метод методически упрощается, если анализируемый антиген и меченые антитела добавлять к иммуносорбенту одновременно. Схема метода:
3) определение ферментативной активности
Иногда в литературе эта схема Называется одностадийным «сэндвич»-анализом. Как и в предыдущем случае, на носителе образуется тройной комплекс с участием меченых антител, концентрация которого пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена.
Однако чувствительность одностадийной схемы ниже, чем двухстадийной, а контакт фермента с анализируемой средой может неблагоприятно отражаться на результатах анализа. Данная схема налагает также дополнительные требования на соотношение концентраций меченых и иммобилизованных антител с целью исключения их конкуренции за связывание с ограниченным числом антигенных детерминант на молекуле антигена. В этой связи целесообразным является использование В'анализе моноклональных антител, специфичных к различным антигенным детерминантам на мцлекуле антигена. Следует подчеркнуть, что данный метод анализа не может быть отнесен к конкурентному типу, так как формирование комплекса антигена с мечеными иди иммобилизованными антителами не
88
исключает возможности образования тройного «сэндвича-комплекса.
б. Метод с использованием меченых антивидовых антител и иммобилизованных специфических антител. Схема метода:
4) отмывка
6) отмывка
7) определение ферментативной активности
Метод является усложненным вариантом обычного двухцентро-вого или «сэндвича-анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных «анТивидо-выха конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д.
89
• Для того чтобы меченые антивидовые антитела не связывались с иммобилизованными на поверхности, необходимо использовать при образовании «сэндвич»-комплекса антитела, полученные от разных видов животных (на схеме такие антитела обозначены как
н }— • Несмотря на многостадийность и длительность прове
дения, достоинством метода является универсальность антивидового конъюгата, который может быть применен для анализа различных антигенов.
Описанными методами ограничивается число возможных анализов антигенов по типу I. В табл. 4.1 для наглядности оставлены пустые графы, соответствующие конкурентным твердофазным методам, а также схемам с мечеными антигенами.
Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I). Так же, как в случае анализа антигенов, все методы определения антител, относящихся к данному разделу, являются неконкурентными (табл. 4.2).
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованных антигенов. Схема метода:
К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов
90
выявление специфических иммунокомплексов проводят с помощью меченных ферментом антивидовых антител. Измеряемое на носителе содержание ферментной метки пропорционально концентрации специфических антител в сыворотке.
Данная схема является одной из наиболее распространенных-в ИФА антител, так как обладает всеми достоинствами «сэндвич»-метода, но отличается универсальностью меченого реагента, что дает возможность выявлять антитела к разным антигенам. Данный подход позволяет решать проблемы серодиагностики заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, используя ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного антигена. Схема метода':
Исследуемую пробу инкубируют с иммобилизованным антигеном, после отмывки несвязавшихся компонентов для выявления образовавшегося специфического комплекса проводят инкубацию с меченным ферментом антигеном. Выявление образовавшихся на первой стадий имМунохимических комплексов происходит за счет взаимодействия свободных центров связывания с добавляемым в избытке меченным ферментом антигеном.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антивидовых антител. Схема метода:
91
На первой стадии иммобилизованные антивидовые антитела связывают из раствора все антитела соответствующего вида. Наличие антител определенной специфичности в образовавшихся им-мунохимических комплексах выявляют титрованием антигенсвязы-вающих центров конъюгатом соответствующего антигена с ферментом. Метод основан на выявлении из множества связавшихся с иммуносорбентом антител молекул только одной специфичности, поэтому возможность его эффективного применения снижается при способности меченого антигена к неспецифическому связыванию с иммобилизованными на носителе белками или адсорбировавшимися на них после первой инкубаций иммуноглобулинами.
Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического связывания (тип II). Схематично эта группа методов представлена в табл. 4.3. По сравнению с анализом типа I эти методы многочисленные и включают в себя как неконкурентные, так и конкурентные подходы, причем каждый из них в зависимости от использования на Первой стадии иммобилизованного реагента делится на твердофазный или гомогенно-гетерогенный. Рассмотрим каждый метод с учетом типа?меченого и иммобилизованного реагента.
92
Неконкурентные методы
Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена. Иммуноферментометрический метод. Метод является гомогенно-гетерогенным. Схема метода:
На первой стадии анализируемый образец смешивают с рас-, твором, содержащим фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и обр'азования специфических иммунокомплексов в систему вводят избыток иммобилизованного антигена, который сорбирует оставшиеся несвязанными меченные антитела. После отмывки определяют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна содер-
• жанию исследуемого антигена в образце. В литературе метод можно встретить под названием иммуноферментометрический.
9 Следует отметить, что с иммобилизованным антигеном могут связываться не только свободные меченые антитела, но и антитела, провзаимодействовавшие с определенным антигеном только одним активным центром. Вероятность такого взаимодействия возрастает с уменьшением размеров антигена, что следует учитывать при определении конкретных соединений. Разделение компонентов на иммуносорбенте целесообразно проводить в кинетическом режиме, поэтому эта стадия не лимитирует время анализа в целом. Недо-статкбм метода является контакт ферментной метки с анализируемым образцом, что может вызвать изменение ферментативной активности.
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованного антигена. Метод также является гомогенно-гетерогенным и имеет сходные черты с вышеописанным нммуноферментомет-
 рическим анализом. Отличие его заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а образующийся на твердой фазе комплекс выявляют с использованием
• меченых вторичных антител. Схема метода:
93
т
• Метод более длителен в проведении по сравнению с предыдущим, однако в нем исключается контакт исследуемой жидкости с ферментной меткой и можно использовать, одий и тот же антивидо-вой конъюгат для анализа различных антигенов.	,
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антител (последовательного насыщения). Так как на первой стадии используется твердая фаза с иммобилизованными антителами, метод относится к твердофазным. Схема метода:
5) определение ферментативной активности
Иммобилизованные антитела инкубируют с раствором, содержащим определяемый антиген. После отмывки к носителю добавляют меченный ферментом антиген, который взаимодействует со свободными антигенсвязывающими центрами антител.
• Длительность всего анализа обусловлена в основном временем первой стадии, которую целесообразно проводить в равновесном режиме. Метод позволяет предотвратить влияние биологической жидкости на активность фермента, так как вторая реакция проводится после отмывки иммуносорбента.
Конкурентные методы
Метод с использованием, меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют раствор определяемого антигена и раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и отмывки несвязавшихся с носителем компонентов определяют ферментативную активность на носителе. Метод является твердофазным, так как носитель с иммобилизованным антигеном используют на первой стадии анализа, включает лишь одну равновесную стадию инкубации, поэтому время анализа определяется в основном продолжительностью этой стадии, однако не дает возможности избежать контакта фермента-маркера с анализируемой средой. В связи с этим ограничения его применения могут возникать при необходимости анализа биологических жидкостей (сыворотка
95
крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), способных оказывать ингибирующее или активирующее воздействие на фермент или содержащих эндогенный фермент.
Так как определяемый антиген приводит к снижению количества сорбированных на носителе меченных ферментом антител, что вызывает уменьшение регистрируемой ферментативной активности, в литературе данная схема иногда встречается под названием «ингибиторный ИФА».
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
Метод также является твердофазным и формально имеет сходные черты с вышеописанным «ингибиторным» анализом. Отличие заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а для выявления образующихся на носителе специфических иммунохимических комплексов вводят в него ферментативную метку с помощью реакции с меченными ферментом вторичными антителами.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антител. Схема метода:
.96
3) определение ферментативной активности
К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена. Максимальная чувствительность достигается при проведении анализа в равновесном режиме. При проведении анализа следует стремиться к уменьшению концентрации иммобилизованных антител до значений, позволяющих достоверно регистрировать связавшийся с ними меченый антиген.
• Преимуществом метода является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ, а к недостаткам следует отнести сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных конъюгатов, особенно в случае низкомолекулярных антигенов, возможность ухудшения эффективности взаимодействия меченых антигенов с соответствующими антителами и, наконец, возможное влияние на ферментативную активность компонентов анализируемой биологической жидкости.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизован* ных вторичных антител. Схема метода:
97
V/.- ..
4—627
Метод относится к гомогенно-гетерогенным, так как первая стадия взаимодействия антител с определяемым и меченым антигеном проходит в растворе. После установления в системе равновесия в раствор вносят носитель с иммобилизованными вторичными антителами, которые сорбируют образовавшиеся на первой стадии специфические иммунохимические комплексы. Часто отделение образовавшегося комплекса достигается за счет образования преципитата в присутствии растворимых антивидовых антител, необходимая для полноты осаждения концентрация которых предварительно должна быть точно подобрана. После проведения стадии отмывки несвязав-шихся компонентов определяют ферментативную активность на носителе или в преципитате. В литературе этот подход часто называют методом двойных антител (англ, double antibody assay).
Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении оставшихся незанятыми мест специфического связывания (тип II). К этой группе относятся два метода (см. табл. 4.4), один из которых является неконкурентным, а второй конкурентным.
Неконкурентные методы
Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
98
5) определение ферментативной активности
Схема по существу аналогична рассмотренному ранее методу последовательного насыщения для определения антигенов. К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют анализируемый раствор. После установления равновесия в системе и частичного связывания анализируемых антител с носителем несвязавшиеся компоненты отмывают и добавляют меченные ферментом антитела той же специфичности. Таким образом, оставшиеся иа носителе несвязанными с антителами антигены после первой стадии инкубации оттитровываются мечеными антителами.
Конкурентные методы
Метод с использованием.меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
К иммобилизованному антигену добавляют анализируемый раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом антител. После установления в системе равновесия отмывают несвязавшиеся компоненты и определяют ферментативную активность на носителе. Необходимым условием проведения анализа является нахождение иммобилизованного антигена в недостатке по отношению к суммарному количеству свободных и меченых антител в растворе так же, как для всех конкурентных методов не исключается контакт ферментной метки с компонентами биологической жидкости, что накладывает дополнительные условия на выбор фермента.
4*
99
§ 3. Сравнительная оценка различных схем проведения гетерогенного ИФА
Как видно из предыдущего изложения, различные схемы проведения гетерогенного ИФА имеют как достоинства,так и недостатки. Несмотря на большое многообразие методов, в настоящее время невозможно выделить какой-либо из них, чтобы рекомендовать в качестве «универсального» для определения любых соединений. Выбор схемы анализа зависит от многих факторов, из Которых основными являются молекулярная масса и валентность антигена, длительность анализа, состав среды, в которой необходимо определять антиген, свойства фермента, используемого в качестве маркера, и т„ д.
Все рассмотренные методы, гетерогенного ИФА основаны на использовании меченных ферментом антигенов или антител. При наличии меченого антигена проводят анализ с использованием малостадийных конкурентных схем. Если метка введена в высоко-’ очищенный антиген, то на конечной стадии можно измерить активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет исключить этап отмывки иммуносорбента и делает анализ удобным для автоматизации.
С другой стороны, анализ на Основе меченых антигенов сопряжен с рядом сложностей. Разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов препятствует созданию универсальных методов получения антигенферментных конъюгатов. Схема введения метки в один антиген часто оказывается неприемлемой при переходе к другому. По существу, синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой самостоятельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена.
Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значительном количестве, что осуществимо далеко не всегда.
100
Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соединений. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их Fab-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий.
Несмотря на универсальность методик введения ферментных меток в молекулы антител, многообразие антигенов затрудняет получение меченых специфических антител в количествах, обеспечивающих потребности массовых анализов. Кроме того, на ряд антигенов трудно получить высокоаффинные антитела, а дополнительная их модификация при связывании с ферментом может приводить к дальнейшему снижению способности взаимодействовать с антигеном.
В связи с этим применение в анализе меченых антивидовых антител упрощает процедуру получения реагентов для анализа, так как позволяет, используя одни и те же конъюгаты, осуществлять определение разных антигенов и антител различной специфичности. Кроме того, чувствительность анализа ряда антигенов в этом случае может быть выше, чем при применении меченых специфических антител, вследствие возможности связывания не одной, а нескольких меченых молекул. Однако такой подход методически усложняет проведение анализа из-за введения дополнительных стадий инкубации и промывки носителя.
Те же задачи, что и с применением меченых антивидовых, антител, могут решаться при использовании конъюгатов фермента с белком А стафилококка, способного образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулинов. Схемы ИФА при этом аналогичны рассмотренным выше для меченых антивидовых антител. Белок А (ЛГг=42 000) стабилен в растворимом и лиофилизованном состоянии, что позволяет на его основе получать коммерческие «универсальные» конъюгаты с пероксидазой и щелочной фосфатазой. Ограничение ? применении меченого белка А связано с тем, что он с различной эффективностью взаимодействует с IgG разных млекопитающих и не реагирует с IgG птиц.
• При сравнении конкурентных и неконкурентных методов можно отметить следующее. Во-первых, как вытекает из теоретического
101
анализа, конкурентные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, — только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные антитела, что не всегда достижимо на практике.
Вторым общим недостатком конкурентных методов ИФА является возможность влияния различных эффекторов, содержащихся в анализируемых биологических жидкостях (сыворотка крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), на каталитические свойства ферментной метки. Во многих случаях подобный эффект может быть устранен путем многократного разведения исходного образца. Однако возможность его разведения зависит от содержания исследуемого соединения, что должно быть учтено при выборе схемы ИФА.
При выборе твердофазных схем определения следует учитывать, что скорость достижения равновесия в системе иммобилизованный реагент — анализируемое соединение зависит не только от концентрации компонентов, но может снижаться за счет микро-диффузионных эффектов. На анализ в таких системах, как правило, затрачивается время не менее нескольких часов. Переход к гомогенно-гетерогенным методам, в которых реакция образования первичного специфического иммунокомплекса протекает в растворе, значительно снижает время достижения равновесия на первой стадии. При этом сокращается и время анализа в целом, так как для разделения компонентов используется избыток иммобилизованных вторичных антител. Осуществление стадии «узнавания» в гомогенной фазе повышает также и точность анализа, которая определяется точностью дозирования компонентов. В тех случаях, когда анализируемая среда содержит эндогенный фермент, кофактор или эффектор, твердофазные неконкурентные методы являются наиболее эффективными.
§ 4. Методы гетерогенного ИФА, основанные на нековалентном способе введения ферментной метки
Рассмотренные выше методы гетерогенного иммуноанализа основаны на использовании ковалентных конъюгатов фермента с антителами или антигенами. В настоящее время этот 102
путь является основным в ИФА. Однако в ряде случаев химическая модификация фермента невозможна без ухудшения его каталитических свойств, а антигена (антитела) —без снижения способности образовывать прочный иммунохимический комплекс. В связи с этим существенный интерес представляют методы ИФА, в которых ферментная метка вводится в процессе анализа нековалентно.
• Можно выделить следующие наиболее эффективные подходы: 1) использование комплекса фермент—антитело против фермента; отин.
3) введение ферментной метки через комплекс авидин — биотин.
Введение ферментной метки через комплекс со специфическими антителами против фермента наиболее часто применяется при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. Этот анализ встречается в литературе под названием ЛАП-метода (ПАП—пероксидаза—антипероксидаза).
В качестве примера приведем схему определения кроличьих антител против какого-либо антигена ПАП-методом. К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую пробу. После инкубации и отмывки несвязавщихся компонентов к носителю добавляют анти-видовые антитела (например, сыворотку крови осла, иммунизированного IgG кролика). Проводят повторную инкубацию, отмывку и вводят в систему антитела кролика против пероксидазы. Смесь инкубируют, носитель отмывают и на последней стадии добавляют пероксидазу, образующую специфический комплекс с соответствующими антителами, который выявляют обычными методами. Одним из вариантов схемы является добавление на стадии 5) не антител против пероксидазы, а заранее приготовленного ПАП-комп-лекса. Схема метода:
103
Отметим, что ПАП-метод может быть формально отнесен к классифицированным ранее методам с использованием меченых антивидовых антител, только в данном случае используется не ковалентный конъюгат антивидовое антитело — фермент, а последовательно получаемый комплекс антивидовое антитело — антитело к пероксидазе — пероксидаза. Недостатком ЦАП-метода* является удлинение схемы анализа, частичное ингибирование пероксидазной активности при образовании комплекса с антителами, возможность диссоциации комплекса антитело—фермент при разведениях, промывках, изменениях pH и ионной силы среды.
Процедура анализа несколько упрощается по сравнению с ПАП-методом при использовании комплекса фермента с так называемыми гибридными антителами. Схема получения гибридных антител имеет вид
104
В результате ферментативного гидролиза получают (Fab') 2-фрагменты антител против определяемого антигена и используемого фермента. Смешивают продукты гидролиза и подвергают их воздействию восстанавливающего агента (например, меркаптоэтанола), вследствие чего (Fab')2-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента происходит рекомбинация Fab-фрагментов, в результате чего наряду с исходными образуются гибридные (Fab')2-фрагменты, один активный центр которых специфичен к детерминантам антигена, а второй — фермента.
При добавлении фермента образуется комплекс (Fab') 2-фермент, который может применяться для определения антигена в рассмотренных выше методах ИФА с использованием меченых специфических антител (например, в «сэндвич»-методе). При необходимости ферментная метка может вводиться после взаимодействия гибридного антитела с определяемым антигеном. Хотя этот подход был предложен около 20 лет назад и привлекает своей «элегантностью», он не нашел практического применения из-за трудоемкости получения реагентов.
Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, Л4г = 66000, компонент яичного белка) и биотина (витамин, Мг=228), образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания Ю15 М-1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме (см. с. 106).
Иммобилизованный антиген инкубируют с пробой, содержащей антитела, отмывают и добавляют антивидовые антитела, ковалентно связанные с биотином. Затем вносят авидин, образующий прочный комплекс с биотином, отмывают избыток белка и добавляют фермент с ковалентно пришитым биотином, который взаимодействует с другим центром связывания авидина. (Другим путе^ является использование антивидовых антител, ковалентно связанных с авилином, что упрощает анализ и сокращает его длительность.
• Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимического комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа.
105
Недостатками метода являются многостадийность, необходимость предварительной модификации как антител, так и фермента и наличие достаточно высокого уровня неспецифического связывания у молекулы авидина, так как, являясь по своей природе гликопротеидом, этот белок имеет высокую изоэлектрическую точку и способен к комплексообразованию с другими белками. Последний из недостатков может быть устранен использованием в качестве специфического к биотину белка не авидина, а стрептавидина. Молекула стрептавидина обладает также четырьмя высокоаффинными центрами связывания биотина, но имеет изоэлектрическую точку, близкую к нейтральной, и в меньшей степени склонна к неспецифическому связыванию с антителами.
• Еще один метод нековалентного введения ферментной метки основан на применении конъюгатов антител с лектинами — растительными белками, способными специфически связываться с углеводными остатками, входящими в состав биомолекул. В связи с этим лектины применяются для очистки и выделения гликопротеидов.
Одним из широко используемых для этой цели лектином является конканавалин А из бобов конавалии (Л/г = 96 000). Ковалентный конъюгат антител с лектином получают с помощью глутарового альдегида. Выделенные конъюгаты могут использоваться для определения антигенов и антител. Одна из возможных схем проведения ИФА антител на основе конъюгата фермента с лектином имеет вид
4) отмывка
107
6) отмывка
7) определение ферментативной активности
где —— лектин,
фермент, содержащий углеводный компонент
Исследуемые антитела взаимодействуют с иммобилизованным антигеном. После промывки добавляют конъюгат антивидовых антител с лектином в присутствий избытка специфического для лектина углевода (например, метил-0-£)-маннозида в случае конканава-лина А) для предотвращения связывания лектина с углеводным компонентом антител и иммобилизованного антигенд.
После инкубации отмывают избыток конъюгата и углевода и добавляют фермент, имеющий углеводную часть, способную специфически взаимодействовать с лектином (например, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу из Aspergillus tiiger). На последней стадии определяется концентрация метки на твердой фазе, которая пропорциональна исходной концентрации исследуемых антител.
Необходимо отметить, что отсутствие углеводного компонента на молекуле фермента-метки не является непреодолимым препятствием для применения этого фермента в анализе на основе лектина. Так, авторами метода была показана возможность использования 0-.О-галактозидазы, у которой отсутствует углеводный компонент, предварительно ковалентно связанной через глутаровый альдегид с глюкозооксидазой, способной взаимодействовать с. лектином. Такой подход, конечно, приводит к усложнению анализа, но вместе с тем позволяет использовать ферменты, обладающие высокой каталитической активностью, что повышает чувствительность опреде-
§ 5. Твердофазный ИФА в проточных системах
Решение ряда задач, стоящих перед медициной и биотехнологией, требует развития методов «экспресс»-определения биологических соединений. В связи с этим актуальной проблемой является максимальное сокращение длительности анализа. В рассмотренных методах ИФА длительность всего анализа.в основном определяется временем проведения одной или нескольких последовательных иммунохимических реакций. Известно, что максимальная чувствительность анализа достигается при проведении стадии взаимодействия определенного вещества с соответствующими специфическими центрами связывания в равновесном режиме. При переходе в кинетическую область время анализа существенно снижается, но при этом происходит и потеря чувствительности.
Однако при анализе соединений, находящихся в исследуемой пробе в концентрациях, значительно превышающих предел его обнаружения, длительность ИФА можно существенно уменьшить за счет проведения иммунологической и ферментативной реакций в кинетических режимах, сокращая время контакта компонентов с часов до нескольких минут.
Методически такой анализ наиболее удобно проводить в проточных реакторах, время контакта компонентов в которых регулируется скоростью потока. Одним из вариантов такого анализа является следующий. Через колонку с иммуносорбентом в течение 1 мин прокачивают смесь меченного ферментом и анализируемого антигенов, которые конкурируют за центры связывания иммобилизованных антител. Затем колонку промывают, пропускают субстрат и измеряют на выходе оптическую плотность продукта ферментативной реакции, которая пропорциональна ксжцентрации определяемого антигена:
Полный цикл определения составляет 10 мин. После удаления связавшегося свободного и меченого антигена действием pH, растворов солей или этанола колонка с иммуносорбентом может вновь использоваться для анализа.
. Необходимым условием для получения воспроизводимых результатов анализа в кинетическом режиме является постоянство таких параметров, как время контакта реагентов, температура, объем анализируемой пробы.
В этой связи весьма перспективно сочетание принципов ИФА и проточного инжекционного анализа. Один из возможных вариантов основан на применении анализа с вытеснением связанного в комплекс с иммобилизованным антителом мёченного пероксидазой антигеца.
109
Отличием такого подхода от уже рассмотренных схем является определение ферментативной активности не на носителе, а в растворе путем введения в соответствующий канал субстратов фермента и последующей регистрации продукта ферментативной реакции в проточной кювете спектрофотометра.
•	Большинство методов ИФА основано на фотометрическом, флу-ориметрическом, люминесцентном или электрохимическом определении продукта ферментативной реакции. Обычно в равновесных анализах стадия регистрации ферментативной активности занимает относительно длительный промежуток времени (от 30 мин и более). При сокращении длительности ИФА за счет проведения реакции антиген — антитело в кинетическом режиме необходимо применять быстрые методы детекции ферментной метки, иначе время осуществления ферментативной реакции будет лимитировать время анализа в целом.
Обычно в таких случаях измеряют начальную скорость ферментативной реакции, что при применении современных анализаторов занимает 0,5—2 мин.
Другой путь проведения ИФА в проточных реакторах основан на регистрации теплового эффекта реакции фермент — субстрат с помощью термистера. Определяемый экспериментально тепловой эффект зависит от количества связанного с иммуносорбентом ферментного конъюгата, которое в свою очередь зависит от начальной концентрации исследуемого соединения. На примере человеческого сывороточного альбумина с использованием его конъюгата с каталазой показана возможность определения белка в концентрации 0,1 мМ в течение 10 мин.
Активность многих ферментов (пероксидаза, каталаза, глюко-зооксидаза) может быть измерена электрохимическим путем. В связи с этим значительный интерес представляют иммунофер-110
ментные электроды, которые являются еще одним аппаратурным решением для твердофазного ИФА в кинетическом режиме.
Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ‘ ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— 10 мкг/мл. Возможно в качестве меток применять другие ферменты (щелочная фосфатаза, дегидрогеназа и др.), которые образуют электрохимически активные продукты реакции, определяемые в проточных системах.
•	Иммуноферментные электроды просты и удобны в работе. Их применение целесообразно для быстрого анализа соединений, не требующего высокой чувствительности.
§ 6. Новые подходы . в гетерогенном ИФА
Применение в ИФА антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях, дает возможность эффективно разделять компоненты аналитической системы перед стадией определения концентрации ферментной метки. Такой подход универсален и может применяться для широкого круга соединений — от гаптенов до микробных клеток. Однако нерастворимые иммуносорбенты имеют и некоторые отрицательные стороны, а именно: 1) возможность неспецифического связывания компонентов с носителем; 2) значительное время анализа (до нескольких часов) из-за длительности реакции антиген — антитело, определяемое низкой концентрацией иммобилизованного агента- (например, при использовании непористых сорбентов — полнстирольных плат или пробирок) или диффузионными затруднениями при использовании пористых сорбентов (сефароза, пористое стекло, силохром и т. д.); 3) методические сложности, связанные с трудностями точного дозирования и промывок иммуносорбентов па основе пористых носителей; 4) существенное влияние неоднородности сорбциоииых свойств полимерных носителей (микроплаты и пробирки из полистирола, поливинилхлорида, полиметилметакрилата и т. д.) на точ-;	ность и воспроизводимость результатов анализа.
S	111
i . .		
Большинство этих недостатков устраняется при переходе к гомогенным видам анализа, основанным на эффекте модуляции активности фермента при образовании комплекса антиген — антитело. Однако на сегодняшний день эти методы в совершенстве разработаны в основном для анализа низкомолекулярных антигенов. В связи с этим представляют интерес методы ИФА, позволяющие анализировать различные по молекулярной массе соединения без применения твердых носителей.
Одним из подходов является проведение стадии «узнавания» определяемого соединения специфическими антителами в растворе и дальнейшее разделение компонентов путем перевода образовавшегося специфического комплекса в нерастворимое состояние. По приведенной выше классификации такие методы относятся к гомогенно-гетерогенным. 'Разделение компонентов чаще всего достигается с помощью образующих преципитат антивидовых антител. Возможно использование в качестве осадителя полиэтиленгликоля и других соединений. Недостатком метода является длительность процесса разделения, в ряде случаев лимитирующего время всего анализа, и необходимость тщательного подбора условий осаждения.
Перспективный метод ИФА основан на применении антител, иммобилизованных на водорастворимом полимере. Принцип анализа состоит в следующем. К раствору иммобилизованных на полианионе антител добавляют определяемый и меченный ферментом антиген и проводят реакцию конкурентного связывания. Для разделения свободного и связавшегося в комплексе конъюгата вносят поликатион, который быстро и количественно образует с полианионом нерастворимый поликомплекс. После разделения жидкой и твердой фаз регистрируемая в надосадочном растворе или осадке ферментативная активность дает информацию о начальной концентрации исследуемого антигена. Для удобства измерения активности полученный осадок может быть вновь легко растворен при увеличении ионной силы.
• Достоинствами данной модификации ИФА являются: 1) отсутствие твердой фазы; 2) быстрота разделения компонентов реакционной системы (I тип); 3) экспрессность при сохранении высокой чувствительности (время определения IgG человека в концентрации 10~10 М не превышает 10 мин); 4) возможность быстрого анализа антигенов с различной молекулярной массой. К основным недостаткам, снижающим универсальность метода, относятся возможность неспецифической сорбции соединений на полианионе или поликатионе и необходимость стадии промывки нерастворимого поликомплекса при определении ферментативной активности в осадке.
Маттиассон с сотрудниками предложили новый путь разделения компонентов при проведении иммуноанализа, не сопровождающийся изменением агрегатного состояния системы. Суть метода 112
состоит в создании на стадии разделения связанного в иммунокомплексе и свободного компонента быстро расслаивающихся жидких двухфазных систем. При этом в одной фазе концентрируется несвязанный с антителами меченый антиген, а в другой — комплекс меченого антигена с антителами.
Количественной мерой в данном методе является коэффициент разделения компонентов, равный отношению концентраций меченого соединения в верхней и нижней фазах. В ряде случаев эффективность разделения может быть существенно увеличена при использовании связывающего агента (антитело, лектин, белок А стафилококка), предварительно модифицированного монометоксиполиэтиленгликолем. Метод может быть применен для анализа гаптенов, макромолекулярных антигенов и целых клеток.
•	Достоинством является экспрессность и возможность определения различных по молекулярной массе и природе антигенов. Основной недостаток заключается в необходимости индивидуального выбора оптимальных условий разделения для каждой пары лиганд-связывающий агент и предварительной модификации компонентов для увеличения эффективности перераспределения веществ в разных фазах.
В последние годы появился ряд гетерогенных методов ИФА, в которых не требуется проведения стадии разделения свободных и связанных в иммунохимический комплекс меченых соединений. Иногда в литературе такие подходы не вполне корректно относят к гомогенным методам, хотя все они основаны на использовании твердой фазы и иммобилизованных на ней компонентов. Правильнее их называть безразделительными методами (англ, non separation assay).
Рассмотрим один из подходов, получивших в зарубежной литературе сокращенное название ECIA (англ, enzyme channeling immunoassay), т. е. «туннельный» иммуноферментный анализ. Его принцип основан на ускорении протекания двух последовательных ферментативных реакций при пространственном сближении двух ферментов (Ei и Е2). При этом Е2 катализирует реакцию с участием субстрата, являющегося продуктом первой ферментативной реакции. Определяемый антиген ковалентно связывают с ферментом Еь Этот конъюгат конкурирует за ограниченное число центров связывания антител, иммобилизованных на твердом носителе совместно со вторым ферментом Е2. Общая наблюдаемая скорость появления в растворе второго продукта Р2 зависит от концентрации свободного антигена в системе. При ее увеличении в растворе количество конъюгата, сорбированного на носителе, уменьшается, что приводит к уменьшению регистрируемой скорости появления продукта Р2. Для уменьшения фонового сигнала в растворе в отсутствие определяемого антигена в систему добавляют третий фермент Е3, который играет роль «ловушки» продукта Pi в растворе, превращая его в неактивный продукт Q:
113
На этом принципе основан биолюминесцентный ИФА прогестерона, позволяющий выявлять до 10 пг гормона в пробе.
•	В заключение раздела еще раз подчеркнем, что основными достоинствами гетерогенных методов ИФА является высокая чувствительность, возможность определения соединений с различной молекулярной массой (от гаптенов до целых клеток), возможность анализа образцов, содержащих ингибиторы и активаторы фермента-маркера. Развивающиеся в настоящее время кинетические методы твердофазного ИФА, а также ИФА на основе водорастворимых полимеров открывают возможность «экспресса-анализа исследуемых веществ.
Оценивая состояние проблемы на сегодняшний день, следует отметить, что гетерогенные методы ИфА активно используются в иммунохимическом анализе, а появление новых, усовершенствованных модификаций свидетельствует о том, что интерес к этому направлению в ближайшие годы будет возрастать.
§ 7. Гомогенные методы ИФА
К гомогенным относятся методы ИФА, осуществляемые в однофазной системе и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Эти методы, ; в основном, базируются на эффекте модуляции антителами актив- ; ности фермента (или кофактора), используемого в качестве метки.
Все известные в настоящее время схемы проведения гомогенно- j го ИФА относятся к типу II приведенной в начале гл. 4 классифи- i кации, т. е. во всех схемах регистрируется концентрация не обра- I зующегося специфического комплекса антитело — антиген, а остав- j шихся свободными центров специфического связывания. Однако, ) в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая фермен- ] тативная активность, соответствующая концентрации незанятых ] мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и j увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия j связывания лигандов на ферментативную активность.
Так же как и в случае гетерогенных методов, разнообразие го- J могенных вариантов анализа обусловлено возможностью введения s метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кро- I 114.	. ’ 1
ме того, по сравнению с гетерогенным ИФА гомогенный оперирует более широким кругом соединений, используемых в качестве метки. Кроме ферментов в нем применяют компоненты или эффекторы ферментативных реакций, такие, как кофакторы, ингибиторы, про-стетические группы, субстраты. Таким образом, схематическое разделение гомогенных методов может быть представлено следующим образом (схема 4.4):
Схема 4.4
Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах ИФА. Эти методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохи-мического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.
Необходимым условием гомогенного ИФА является изменение наблюдаемой ферментативной активности при взаимодействии меченого антигена с антителами. Механизмы модуляции активности могут быть различными. К основным из них относятся следующие:
1)	исключение субстрата из ферментативной реакции вследствие стерйческого затруднения взаимодействия субстрата с ферментом, возникающего при образовании иммунохимического комплекса меченого антигена с антителами;
2)	индуцируемое антителами конформационное изменение структуры молекулы фермента-метки, приводящее к изменению ферментативной активности;
3)	модуляция антителами способности кофакторов, субстратов, ингибиторов и других соединений участвовать в ферментативной реакции.
Методы анализа антигенов, основанные на использовании меченных ферментом антигенов. Стерическое исключение субстрата. На этом принципе был основан первый гомогенный метод ИФА, разработанный в 1972 г. н вошедший в литературу под названием
115
«EMIT» (англ, enzyme multiplied immunoassay technique). Суть его состоит в следующем. Низкомолекулярный антиген ковалентно связывают с ферментом лизоцимом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. Схема метода может быть представлена следующим образом:
При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной. реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга наркотических и лекарственных средств.
• Существенным достоинством EMIT-анализа является экспресс-ность определения, которая составляет 2—5 мин. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.
Принцип стерического исключения субстрата был использован также для разработки метода определения макромолекулярных антигенов, таких, как альбумин, иммуноглобулины G и М. В анализе используют конъюгат антигена с p-D-галактозидазой Е. coll. После образования комплекса с антителами активный Центр фермента становится недоступным для взаимодействия с искусственно синтезированным макромолекулярным субстратом о-нитрофенил-Р-£>-гатактозидом, ковалентно связанным с водорастворимым полимерным декстраном. В присутствии антигена «степень ингибирования» фермента уменьшается пропорционально концентрации исследуемого соединения. Метод позволяет измерять IgG в микро-граммовых количествах в течение нескольких минут.
Индуцируемое антителами изменение активной конформации фермента. Известно, что в результате комплексообразования антител с антигенами в молекулах реагирующих соединений могут про
116
исходить конформационные изменения. Такие же структурные из-' менения в молекулах ферментов могут наблюдаться при связывании антител с конъюгатами антиген — фермент. Если в результате такого взаимодействия фермент переходит в другую конформацию, при которой его каталитическая-активность сильно меняется, то это явление может быть положено в основу методов гомогенного ИФА.
На практике данный подход был реализован на примере многих низкомолекулярных антигенов и других ферментов—малатдегидрогеназы печени свиньи и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, и также известен под названием «EMIT». Используют конъюгаты ферментов с гаптенами, которые незначительно отличаются по активности от нативного фермента. При взаимодействии с антителами против гаптена в молекуле фермента происходят конформационные изменения, затрагивающие структуру активного центра, в результате чего ферментативная активность сильно -падает. Введение в реакционную систему свободного антигена приводит к уменьшению концентрации комплексов конъюгат—антитело, а следовательно, измеряемая активность при увеличении концентрации анализируемого соединения также возрастает.
Схема метода аналогична случаю с исключением субстрата, только механизм изменения каталитической активности в иммуно-химическом комплексе с конъюгатом имеет другую природу.
• Для некоторых гаптенов (тироксин и трийодтиронин) оказалось, что их ковалентное связывание с ферментом приводит к полному падению его каталитической активности, обусловленному относительной подвижностью находящегося в непосредственной близости от активного центра фермента гаптена и возможным ингибирующим его действием на связывание субстрата. В свободном состоянии конъюгат неактивен, но его связывание с антителами приводит к реактивации фермента и степень реактивации однозначно связана с концентрацией определяемого гаптена в растворе.
. На основе EMIT-анализа разработаны коммерческие наборы для определения широкого круга лекарственных соединений в сыворотке крови—дигоксина, теофиллина, метотрексата, тиобрамици-на и др. Для анализа обычно требуется менее 50 мкл сыворотки, время определения 15—45 с.
ИФА, основанный на использовании антител против активного центра фермента. При использовании сывороточного альбумина человека как модельного антигена разработан гомогенный ИФА, основанный на конкурентном связывании с конъюгатом фермент — антиген двух типов антител: специфических антител против определяемого антигена и антител против фермента, вызывающих при связывании полную потерю его каталитической активности. Вследствие стерических затруднений связывание с конъюгатом антител против антигена приводит к потере способности взаимодействия антител второй специфичности с ферментом. В присутствии определяемого антигена доля специфических антител, Связанных с конъю-
117
гатом, уменьшается, что приводит к возрастанию концентрации ферментативно неактивных комплексов конъюгата с антителами против фермента и снижению экспериментально регистрируемого сигнала. Ниже приведена схема метода:
где >____ н )— - антитела против определяемого антигена и фермента-метки. 
Были синтезированы конъюгаты сывороточного альбумина человека с аденозиндезаминазой — ферментом, катализирующим гидролиз аденозина с образованием инозина и аммиака. Для регистрации ферментативной активности использовали чувствительный к аммиаку ионселективный электрод. Метод прост и. позволяет определить белок в концентрации ~ 1 мкг/мл.
ИФА, основанный на эффекте ингибирования субстратом фермента-метки. В качестве метки антигена используют пероксидазу хрена. Принцип метода основан на значительном отличии ферментативной активности исходного конъюгата и конъюгата в комплексе со специфическими антителами при детекции метки в присутствии 35 мМ перекиси водорода, которая является субстратом пероксидазы. Пероксидаза нативная и в конъюгате с антигеном в значительной степени ингибируется уже при концентрации перекиси 10 мМ, но сохраняет активность в конъюгате при связывании с соответствующими антителами. Новый подход апробирован на примере а-фетопротеина, ферритина, 02-микроглобулина, дигоксина, иммуноглобулина Е. При длительности 20—30 мин метод позволяет определять до 10 нг/мл а-фетопротеина, что сопоставимо с чувствительностью гетерогенного ИФА.
Методы ИФА антигенов, основанные на использовании нефер-меитных меток. И ммунокофакторный анализ. Среди этой группы гомогенных методов наиболее известны варианты с применением в качестве метки АТР и NAD. Суть обоих подходов заключается в следующем. Синтезируют ковалентные конъюгаты АТР и NAD с определяемым антигеном. Получаемые конъюгаты сохраняют свои коферментативные свойства в реакциях с участием соответствующих ферментов. В присутствии антител против определяемого антигена конъюгаты, образуя специфический комплекс с анти-118
телами, теряют свои коферментативные свойства, очевидно, вследствие стерического экранирования объемной молекулой антитела молекулы кофактора, который уже не может взаимодействовать с активным центром фермента. При увеличении концентрации определяемого антигена в растворе доля свободного конъюгата возрастает, что приводит к увеличению регистрируемого параметра ферментативной реакции. Схема метода:
неактивен как кофактор
где (к) - кофактор; Е, S, Р - фермент, субстрат и продукт реакции.
В случае метки АТР в качестве фермента используют люциферазу светляков. За активностью следят по реакции биолюминесценции, регистрируя возникающее в процессе ферментативной реакции свечение. Метод был применен для анализа ряда модельных соединений, в том числе инсулина. Достоинствами метода являются экспрессность и высокая чувствительность, обусловленная возможностью люминесцентной регистрации метки в крайне низких концентрациях. В случае метки NAD для определения концентрации не связанного в комплекс с антителами конъюгата используют двух- или одноферментную систему регенерации кофактора, позволяющую регистрировать метку в концентрации*до 10~f0 М. Метод так же, как и предыдущий, позволяет осуществлять анализ в течение нескольких минут, однако имеет более низкую чувствительность.
ИФА, основанный на использовании в качестве метки эффектора фермента. В зарубежной литературе, метод получил сокращенное название EMMIA (англ, enzyme modulator mediated immunoassay). Принцип его основан на способности связанного с антигеном модулятора (активатора или ингибитора) влиять на активность фермента в растворе. Конъюгат эффектора и антигена конкурирует с определяемым антигеном в растворе за связывание с антителами. При комплексообразовании с антителами эффектор в конъюгате теряет способность влиять на каталитическую активность индикаторного фермента. Поэтому увеличение в растворе концентрации определяемого антигена приводит к увеличению содержания свободного, не связанного в комплекс с антителами
119
конъюгата антиген — эффектор и, следовательно, к изменению регистрируемой ферментативной активности. Схема метода:
конъюгат антиген-эффектор
ИФА, основанный на использовании в качестве метки простети-ческой группы. В зарубежной литеоатуре метод встречается под аббревиатурой PGLIA (англ, prosthetic group labelled inmmuno-asay). Получают ковалентный конъюгат определяемого антигена с простетической группой — флавинадениндинуклеотидом (FAD). Такой конъюгат в свободном состоянии способен взаимодействовать с апоферментом (неактивной глюкозооксидазой, лишенной простетической группы), что приводит к образованию каталитически активной нативной формы фермента. Комплексообразование конъюгата с антителами против антигена вследствие стерических затруднений препятствует реконструкции каталитически активного холофермента. Присутствие в такой системе анализируемого антигена смещает равновесие в сторону образования свободного конъюгата, что приводит к увеличению регистрируемого параметра ферментативной реакции. Схема метода:
На основе данного подхода было осуществлено определение
конъюгат антиген-FAD
120
низко- и высокомолекулярных антигенов, таких, как теофиллин, фенитоин, иммуноглобулин G человека.
ИФА, основанный на использовании в качестве метки субстрата, превращающегося в флуоресцентный продукт. В методе, получившем в литературе название SLFIA (англ, substrate labelled fluorescent immunoassay), используют меченный нефлуоресцентным субстратом антиген, способный ферментативно превращаться в продукт, обладающий сильными флуоресцентными свойствами. При связывании конъюгата с антителами против определяемого антигена субстрат становится недоступным ферменту и образования флуоресцирующего продукта в системе не ^происходит. При повышении в растворе концентрации определяемого антигена равновесие между компонентами сдвигается в сторону накопления свободного конъюгата субстрат—антиген, что приводит к увеличению наблюдаемой флуоресценции. Схема метода:
Таким образом, в данной системе конъюгат выступает в роли как аналога антигена, способного эффективно конкурировать за центры связывания антител, так и субстрата фермента. Очевидно, что концентрация определяемого этим способом антигена должна быть сравнима с концентрацией конъюгата в растворе, поэтому чувствительность анализа в данном случае невелика и лежит в микромолярной области концентраций. Метод был использован для определения ряда лекарственных соединений, иммуноглобулинов G и М человека.
' ИФА, основанный на использовании в качестве метки электронного медиатора. На примере определения тироксина предложен гомогенный метод, основанный на способности иммунодимически активного конъюгата тироксина с производным ферроцена функционировать в качестве медиатора электронного переноса между оксидоредуктазным ферментом и электродом. При связывании с антителами против тироксина конъюгат утрачивает медиаторные свойства. Для проведения анализа инкубируют анализируемую
121
пробу с конъюгатом и антителами, после чего вносят в раствор глюкозооксидазу и глюкозу и измеряют активность фермента с помощью электрохимического датчика.
Анализ с использованием липосом. В рассмотренных ранее методах фермент является меткой, перераспределение которой в ходе анализа зависит от концентрации определяемого соединения. Новым направлением ИФА являются системы, основанные на том, что появление фермента в растворе есть следствие специфического взаимодействия антиген — антитело.
Один из путей создания таких систем — заключение фермента внутрь липосом, на внешней поверхности которых иммобилизован антиген. Если в такую систему добавить субстрат, то он не превращается ферментом, так как разделен с ним стенками липосомы. При добавлении в систему специфических антител и комплемента на поверхности липосомы образуется комплекс антиген — антитело — комплемент, который лизирует ее стенки, вследствие чего фермент переходит во внешний раствор. Добавление определяемого антигена ингибирует процесс лизиса из-за присоединения к липосоме меньшего количества молекул антител и комплемента. Измеряемая скорость ферментативной реакции служит характеристикой начальной концентрации антигена.
Данный подход в принципе позволяет проводить количественное определение как антигенов, так и антител. Длительность анализа невелика; так, время определения алкалоида теофиллина с использованием липосом с пероксидазой составило 15 мин при пределе обнаружения 4-Ю-9 М. Метод приведен в данном разделе, так как антиген связан с липосомой, которую формально можно рассматривать как неферментную метку.
Гомогенные методы, основанные на использовании меченых антител. Второй группой в гомогенном ИФА являются методы, основанные на использовании меченных молекулами ферментов антител. В противоположность первой, в которой все схемы относились к конкурентному типу, в данном случае анализ может быть и неконкурентным.
ИФА, основанный на ингибировании активности конъюгата антитело— фермент. Схема разработана на примере определения IgG человека и получила название ЕПА (англ, enzyme inhibition immunoassay). Синтезируют конъюгат антител кролика против IgG человека с фосфолипазой С. Ферментативная активность конъюгата ингибируется при образовании иммунохимического комплекса с IgG человека. В качестве субстрата используют фосфолипиды, являющиеся, компонентами мембран эритроцитов. Формально их можно рассматривать как низкомолекулярный субстрат, иммобилизованный на микроносителе. Причиной модуляции ферментативной активности конъюгата в комплексе с соответствующим антигеном является стерическое исключение субстрата. Увеличение концентрации анализируемого соединения в растворе сопровождается 122
возрастанием концентрации иммунохимического комплекса и снижением параметра, характеризующего каталитическую активность фермента.
ИФА, основанный на «усилении» ферментативной реакции. Метод разработан на примере определения IgG и С-реактивного белка и имеет в литературе аббревиатуру EEIA (англ, enzyme enhancement immunoassay). Используют меченные 0-галактозидазой антитела против определяемого поливалентного антигена и антитела той же специфичности, обработанные янтарным ангидридом (сукцинил ирова иные антитела). Субстратом р-галактозидазы является о-нитрофенил-0-галактозид, ковалентно связанный с высокомолекулярным декстраном. В присутствии определяемого белка, вследствие образования иммунохимических комплексов ограниченного числа меченых и избытка сукцинированных антител с поливалентным антигеном, фермент, находясь в области микроокружения с отрицательным зарядом, образует вторую светорассеивающую среду, в то время как в отсутствие комплекса продукт ферментативной реакции остается растворимым. За протеканием ферментативной реакции следят фотометрически по увеличению мутности раствора.
• В заключение раздела отметим, что гомогенный ИФА является перспективной и быстро развивающейся областью анализа, имеющей много различных подходов для его проведения. Основным достоинством этого направления является возможность экспресс-ана-лиза биологически активных соединений.
Иммуноферментные наборы, основанные на принципе EMIT, в настоящее время являются наиболее эффективным средством для быстрого определения наркотиков и лекарственных соединений. Если ранее широкое применение гомогенного ИФА сдерживалось возможностью определения только низкомолекулярных антигенов, то разработанные в последние годы подходы позволяют проводить быстрый количественный анализ макромолекулярных белковых антигенов и антител. К ограничениям применения гомогенных методов следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (исключением являются системы с биолюминесцентной детекцией), и сложность анализа биологических сред, содержащих в значительной концентрации эффекторы или кофакторы фермента.
§ 8. Люминесцентный иммуноанализ
В последние годы интенсивное развитие получили методы люминесцентного иммуноанализа (ЛИА), основанные на использовании в качестве меток антигенов и антител компонентов реакций хеми- и биолюминесценции (в том числе ферментативных), протекающих с излучением света. Интенсивность испускаемого света может быть зарегистрирована с высокой сте
123
пенью чувствительности, что позволяет проводить определение метки в чрезвычайно низких концентрациях и, следовательно, разрабатывать на их основе высокочувствительные иммунохимические методы анализа. В связи с быстрым развитием данного направления в иммуноанализе и перспективами его практического использования целесообразно посвятить его рассмотрению специальный раздел. В отличие от флуоресцентных методов при проведении люминесцентных методов не требуется дополнительного источника возбуждения, из-за чего существенно упрощается постановка эксперимента и устраняется фоновое рассеяние.
Реакции хеми- и биолюминесценции являются окислительно-восстановительными реакциями, механизм которых сложен и для большинства систем недостаточно изучен. В процессе реакции образуется большое количество нестабильных короткоживущих продуктов, одним из которых является продукт, находящийся в электронно-возбужденном состоянии. Переход этого продукта в основное состояние сопровождается излучением видимого света. Квантовый выход люминесцентных систем определяется эффективностью образования электронно-возбужденного продукта и квантовым выходом его флуоресценции. Значение его измеряется отношением количества излученных фотонов к количеству прореагировавших молекул исходных соединений.
Интенсивность излучаемого света, являющаяся основным регистрируемым параметром, пропорциональна скорости реакции и квантовому выходу люминесценции. Вследствие этого наибольшую чувствительность обеспечивает применение в анализе реакций с высоким квантовым выходом и высокой скоростью протекания, которая достигается с помощью катализаторов.
Наиболее высокочувствительными являются системы на основе реакций биолюминесценции, квантовый выход которых составляет 0,9, и реакций хемилюминесценции с квантовым выходом около 0,015. Оба типа реакций являются высокоэффективными каталитическими реакциями.
В аналитических работах измеряется либо значение пика световой интенсивности, либо интегральная характеристика свечения. При определенных условиях регистрируемая интенсивность свечения пропорциональна концентрации определяемого компонента реакции. Кроме того, люминесцентные реакции позволяют определять ряд соединений, участвующих в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами.
• Преимуществом люминесцентных систем является возможность регистрации интенсивности излучения в широком диапазоне значений, что соответствует большому интервалу концентраций определяемых веществ. Регистрация излучения производится с помощью ; фотоумножителей, кремниевых фотодиодов, фотопленок, что Делает простым и доступным аппаратурное оформление люминесцентных методов.
124
Все указанные достоинства люминесцентных систем позволили рассматривать их как эффективную систему детекции в иммуно-химическом анализе. Соединение люминесцентного анализа с методами йммуноферментного анализа обеспечило быстрое развитие нового направления — люминесцентного иммуноанализа (ЛИА).
Методы ЛИА используют в качестве маркеров антигена или антитела вещества, участвующие в люминесцентной реакции (субстраты, кофакторы, катализаторы и ферменты). Общая схема ЛИА включает специфическую реакцию взаимодействия антиген — антитело, один из компонентов которой (Аг или Ат) ковалентно связан с маркером, детектируемым в люминесцентной реакции:
Ат + Аг — Л	Ат • Аг — Л -> hv,
где Ат-—интитело; Аг — антиген; Л — люминесцентная метка.
Первые работы по люминесцентному иммуноанализу относятся к 70-м годам, когда была показана возможность использования люминесцентных маркеров для определения антигенов и антител. К настоящему времени в литературе описано большое количество различных модификаций ЛИА, многие из которых нашли практическое использование.
Методы ЛИА можно разделить на две большие группы, биолю-минесцентные и хемилюминесцентные, отличающиеся по типу реакции, используемой в качестве Детектирующей системы.
Биолюминесцентный иммуиоанализ. Перспективными в плане использования в иммуноанализе являются биолюминесцентные реакции, катализируемые люциферазами светляков и бактерий:
АТР + люциферин + О2 лю^иФеРаза светляков ДМР
+ оксилюциферин-I-2PP,-]-/iv (560 нм)
NAD (Р)Н + Н+ + FMN оксиредуктаза КДО (р) + _]_ FMNH2
FMNH2 + Ог + RCHO Л1°чиФеРаза бактерий ( PMN 4- RCOOH -|-
+ Н2О + hv (490 нм)
где RCHO и RCOOH — длинноцепочечный жирный альдегид и соответствующая кислота.
Важным свойством биолюминесцентных систем является их абсолютная специфичность по отношению к АТР (или NADH). Высокий квантовый выход этих реакций обеспечивает высокую чувствительность детекции ферментов и кофакторов —0,1 пмоль для АТР и 1 пмоль для NADH, и обусловливает возможность использования люминесцентных систем в качестве систем детекции антиген-антительных взаимодействий.
Молекулы кофакторов и ферментов, участвующих в биолюминесцентных реакциях (либо в реакциях, сопряженных с ними), могут быть модифицированы и ковалентно связаны с молекулой
125
антигена или антитела. Поэтому признаку методы биолюминесцёнт-ного иммуноанализа делятся на две группы — методы, использующие в качестве метки кофактор (люминесцентный иммунокофак-торный анализ, ЛИКА), и методы, основанные на ферментном маркере (люминесцентный иммуноферментный анализ, ЛИФА). -
Таблица- 4.5. Люминесцентный иммунокофакторнын анализ
Меченое соединение	Маркер	Определяемое соединение	Детектирующая система	Предел обнаружения в пробе
Бнотин-2,4-	Производное	Бнотнн-2,4-	СгНцОН/алко-		 1
ДНФБ	NAD	ДНФ	гольдегндрогена-за 4- бактериальная люцифераза	
2,4-ДНФБ	Производное	(2,4-ДНФ)-0-	Люцнфернн, лю-	0,5 нмоль
	АТР	аланин	цнфераза светляков	0,05 нмоль
Инсулин	Производное АТР	Инсулин	То же	0,05 нмоль
Антитела к инсулину	Производное АТР	Антитела к инсулину		0,05 нмоль
Тироксин	Производное АТР	Тироксин	- »	,1,0 нмоль
Миоглобин	Производное АТР	Миоглобин		2,5 нмоль
Эстрнол-16-	Производное	Эстрнол-16-	Глюкозо-6-фос-	—
глюкороннд	NAD	глюкороннд	фатдегндрогеназа, бактериальная люцифераза То же	
Прогестерон	Производное NAD	Прогестерон		—
Люминесцентный иммунокофакторный анализ (ЛИКА). В методе ЛИКА используют в качестве маркеров антигенов молекулы кофакторов (АТР и NAD). Первые публикации по. ЛИКА показали принципиальную возможность использования такого подхода для определения модельных антигенов — 2,4-динитрофениллизина (2,4-ДНФ-лизин) и биотина (табл. 4.5).
Метод основан на свойстве конъюгатов гаптена (антигена) с кофакторами (АТР и NAD) сохранять антигенную активность по отношению к антителам и коферментативную в реакциях с люциферазами (светляков и бактерий). Антитела к гаптену при взаимодействии с конъюгатом стерически блокируют его, делая недоступным для взаимодействия с активным центром люциферазы, вследствие чего комплекс гаптен — кофактор — антитело утрачивает коферментативную активность. Концентрация образовавшегося комплекса может быть определена по снижёнию интенсивности излучения. Введение в эту систему свободного гаптена приводит к сдвигу
1?в
равновесия,., высвобождению связанного конъюгата, восстановлению интенсивности излучения, которая пропорциональна концентрации свободного гаптена.
Описанный метод является гомогенным, поскольку не требует стадии разделения прореагировавшего и непрореагировавшего конъюгата.
Эффект стерического исключения кофактора наблюдается не только для низкомолекулярных гаптенов, но и для более сложных по структуре молекул, например белкового гормона инсулина.
• Гомогенный тип и простота метода ЛИКА позволяют использовать его для экспресс-анализа антител, оценки связывающей способности иммунных сывороток. Действительно, Степень ингибирования светового излучения конъюгата кофактор — антиген гомологичной иммунной сывороткой пропорциональна концентрации в ней антител и определяется их константой связывания. Анализируя ряд сывороток в одних и тех же разведениях, можно достаточно быстро оценить и сравнить их связывающую способность.
Установлено, что ковалентное связывание АТР с инсулином не изменяет его антигенных свойств, что, по-видимому, объясняется как небольшими размерами самого маркера, так и его удаленностью от молекулы антигена. Это обстоятельство обеспечило возможность использования ЛИКА для решения ряда проблем: сравнительного изучения физико-химических свойств растворимых и иммобилизованных антител, исследования физико-химических характеристик антител на разных стадиях иммунного ответа, изучения структуры иммунных комплексов при разных соотношениях концентраций компонентов реакции антиген — антитело. Большой интерес к использованию этого подхода объясняется возможностью проведения реакций в растворе без введения твердой фазы, высокой чувствительностью метода, позволяющего работать в области физиологических концентраций инсулина.
Наряду с гомогенным вариантом ЛИКА на основе конъюгатов АТР — антиген известны гетерогенные модификации. Описано применение ЛИКА для количественного определения тироксина и миоглобина. Способ проведения анализа в этом случае включает стадии' взаимодействия конъюгата с иммобилизованными антителами и отмывки. Затем связь между антигеном и АТР гидролизуется слабой кислотой, молекула интактного АТР поступает в раствор, где ее определяют с помощью люциферазы светляков.
Системы детекции, использующие бактериальную люЦ-иферазу, основаны на применении конъюгатов производных NAD и гаптенов (антигенов) (табл. 4.5).
Биотин и 2,4-ДНФ связывали ковалентно с аминогруппой никотинамид-6 (2-аминоэтиламино) пуриндинуклеотида (AENAD) для получения ферментативно активных конъюгатов—биотин AENAD и 2,4-ДНФ — AENAD. После восстановления кофактора в реакции с этанолом, катализируемой алкогольдегидрогеназой:
127
2,4-ДНФ — AENAD + этанол алкогольдегидрогеназа , 2,4 ==
=ДНФ — AENADH + ацетальдегид
AENADH определяли в реакции с бактериальной люциферазой из Photobacterium fisheri. Интенсивность светового излучения биотин — AENAD и 2,4-ДНФ — AENAD ингибировалась специфическим связыванием с авидином и антителами к 2,4-ДНФ соответственно. Высокая чувствительность детекции кофактора в этой системе достигается благодаря использованию сопряженных ферментативных реакций, осуществляющих регенерацию NAD. Модифицированный NAD нашел использование в качестве метки при определении стероидов. Конъюгат для проведения анализа получали ковалентным связыванием активированного карбоксильного производного стероида с AENAD с последующей очисткой методом высоковольтного электрофореза. Коферментативная активность, определенная в реакции с люциферазой бактерий, составила 5—10 % от активности интактного кофактора. Антигенные свойства стероидов при взаимодействии с гомологичными антителами сохранялись.
Для определения эстриол-16 а-глюкоронида (Эз-16а-Г) разработан гомогенный биолюминесцентный метод, основанный на использовании конъюгата Эз-16 а-Г — NAD. Для восстановления метки применяли глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, катализирующую реакцию превращения глюкозо-6-фосфата в D-глюконо-б-лактон-б-фосфат:
D-глюкозо-б-фосфат + Эз-16а-Г —
— AENAD гл1°козо-6-фосфатдегидрогеназа’ , О-ГЛЮКОЗО-б-ЛаКТОН-6-фосфат +
+ Э3-16а-Г —AENADH
Концентрацию конъюгата определяли с помощью люциферазы бактерий. Однако использование этого метода для установления Э3-16а-Г в моче встретило ряд ограничений, связанных, прежде всего, с влиянием других комп'онентов мочи на биолюминесцентную систему. Включение в схему анализа стадии взаимодействия с иммобилизованными антителами с последующей отмывкой комплекса антиген — антитело от несвязавшихся компонентов образца и введение агентов, расщепляющих комплекс антиген — антитело для перевода восстановленного кофактора в раствор, существенно улучшили чувствительность метода.
• Недостатки гомогенного метода ЛИКА — это недостатки, присущие любому гомогенному варианту иммуноанализа. К ним следует прежде всего отнести влияние на результат анализа эндогенных примесей в образце и в самих реагентах. Использование АТР и NAD в качестве маркера требует удаления примесей этих кофакторов из препаратов антител (иммунных сывороток) и из образца. Для удаления АТР может быть использована обработка образца биологической жидкости раствором NaIO4 в течение 10—15 мин, 128
что является достаточным для модификации АТР таким образом, что кофактор теряет субстратную специфичность к светляковой люциферазе. Гетерогенные методы ЛИКА позволяют пренебречь влиянием эндогенного АТР на определение интенсивности излучения.
При использовании систем на основе бактериальной люциферазы необходимо принимать во внимание ее многокомпонентность. Условия проведения эксперимента должны быть выбраны таким образом, чтобы примеси дегидрогеназ, оксидоредуктаз, имеющиеся в образцах и реагентах, не оказывали влияния на детектирующую систему, не нарушили концентрационных соотношений в сложной полиферментной системе бактериальной биолюминесценции.
В последнее время предложен очень интересный подход, позволяющий обойти недостатки, связанные с многокомпонентностью систем. Суть его состоит в том, что полиферментная система, используемая в качестве детектирующей, соиммобилизуется на одном носителе, вследствие чего скорость реакции в такой системе существенно возрастает по сравнению со скоростью этой же реакции в растворе. Этот эффект объясняется повышением концентрации реагирующих соединений на носителе и уменьшением диффузионных затруднений, которые важны при проведении реакции в растворе и значительно снижаются при соиммобилизации всей ферментативной системы на носителе. Предложенный подход позволяет значительно повысить эффективность работы детектирующей системы по сравнению с полиферментной системой, присутствующей в образце (растворе). Такой вариант метода получил название «туннельного». Вклад химического «шума», Вносимого образцом, в таком случае пренебрежимо мал.
Использование метода ЛИКА на основе светляковой люциферазы в существенной мере ограничено труднодоступностью самого препарата фермента. В этой связи большой интерес представляют исследования по генной инженерии люциферазы светляков. Разработка и внедрение новой технологии получения препарата люциферазы с субстратной специфичностью к АТР обеспечит возможность широкого практического использования этой высокочувствительной гомогенной модификации иммуноанализа.
Биолюминесцентный иммуноферментный анализ (БИФА). В этой группе методов можно выделить методы, основанные на -использовании в качестве меток люцифераз (светляков и бактерий) и методы с маркерами — ферментами, участвующими в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами. В табл. 4.6 приведены имеющиеся модификации БИФА ряда антигенов.
Несмотря на высокую чувствительность, достигаемую в БИФА, существуют трудности синтеза конъюгатов, связанные с инактивацией фермента. Процесс синтеза требует пристального внимания к деталям эксперимента, защиты активного центра фермента в процессе его ковалентного связывания с антигеном, что существенно 5—627	129
ограничивает использование люцифераз в качестве маркеров. В этой связи большой интерес представляет подход, основанный на возможности обратимой инактивации фермента, достигаемой модификацией существенного «особого» аминокислотного остатка активного центра фермента. Для осуществления обратимой инак-
Таблица 4.6. Биолюминесцентные иммуноферментные методы анализа
Определяемое соединение	Конъюгат	Источник люциферазы	Предел обнаружения в образце
2,4-ДНФ-лей-цин тринитро-	2,4-ДНФТНТ/люцнфераза светляков	Светляки	. 2,5 пмоль 1,0 пмоль
толуол (ТНТ)	2,4-ДНФТНТ/глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназа	Бактерии	0,01 пмоль
2,4-ДНФ-леЙ-цнн	2,4-ДНФ/люцифераза светляков 2,4-ДНФ/люцифераза бактерий Метотрексат/люцифераза светляков Метотрексат/люцифераза бак-	Светляки Бактерии	10 пмоль 15 пмоль
Метотрексат		Светляки Бактерии	2,5 пмоль 2,5 пмоль
Инсулин	терий Инсулин/люцифераза бактерий Эстриол/люцифераза бактерий Тироксин/пнруваткиназа	« »	0,5 пмоль
Эстриол		 »	50 пг
Тироксин		Светляки	10 пмоль
тивации люциферазы бактерий предложено использование метил-алкантиосульфонатов. Схема анализа в общем виде может быть представлена следующим образом:
О
(активная форма) ’	||	(неактивная форма)
люцифераза —SH-j-CH3—S—S—(СН2)„ — антиген	люцифераза —
О
(активная форма) 4 — S — S —(СН2)Я— антиген восстанавливающий-ЛЮЦИферЭЗЭ — SH
агент
Модифицированный метил алкантиосульфонатом антиген инактивирует люциферазу, связываясь с цистеиновым остатком (Суз 106 а-субъединицы) активного центра. На определенной стадии иммуноанализа, требующей количественного определения маркера, S — S-связь между модифицированным антигеном и активным центром фермента восстанавливается действием тиоловых агентов, при этом реактивированный фермент выходит в раствор, где его активность легко измеряется.
130
Заслуживает внимания еще один подход, когда в качестве маркеров антигена или антитела используют ферменты, катализирующие реакции с образованием АТР и NAD. Использование биолю-минесцентных систем для регистрации генерируемого в процессе реакции кофактора значительно повышает чувствительность определения фермента-маркера и, следовательно, чувствительность соответствующего метода анализа. Общая схема детектирующей системы может быть представлена следующим образом:
АТР, NAD-генерирующие ферменты
субстрат
АТР, NAD-завнсимые биолюминесцентные системы светляков или бактерий
В научной литературе имеется описание исследований возможности использования в качестве маркеров фосфокиназ — ферментов, катализирующих реакции с образованием АТР.
Рассмотрено три типа ферментативных реакций. •
1.	Пируваткиназы из мышц кролика:
фосфоенолпируват —” пируват + АТР
Реакция протекает в присутствии Mg2+ и К+, рН-оптимум 7,0.
2.	Ацетаткиназы (из Е. coli):
ацетилфосф ат + ADP •—” ацетат + АТР
Для реакции необходим Mg2+ или Мп2+, рН-оптимум 7,4.
3.	Аденилаткиназы (из мышц кролика):
ADP—* АТР + АМР
Реакция протекает в присутствии Mg2+, рН-оптимум 6,7.
Исследования показали, что конъюгаты на основе ацетаткина-зы и аденилаткиназы практически полностью утрачивают ферментативную активность, в то время как пируваткиназа, ковалентно связанная с антителами, сохраняет каталитические свойства. .
В качестве метки достаточно широко применяют глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназу, катализирующую реакцию с образованием восстановленной формы кофактора — NADH. Использование для детекции NADH биолюминесцентной системы бактерий позволяет повысить предел обнаружения гаптена до 10~14 М. Описаны и более сложные полиферментные системы с многоступенчатой системой усиления сигнала (продукт первой реакции является субстратом для второй, продукт второй реакции — субстратом для третьей и т. д.). Примером такой системы может служить полиферментная система на основе галактозодегидрогеназы, р-галактозидазы и систем бактериальной люминесценции. Оптимизация условий протекания ферментативных реакций на каждой из стадий позволяет достигать значительного усиления сигнала.
5*	131
Теоретически рассчитанная чувствительность такого метода очень высока, но практически всегда приходится сталкиваться с одновременным усилением не только полезного сигнала, но и фонового, обусловленного как химическим, так и иммунологическим шумом. Примеси кофакторов, дегидрогеназ в реагентах и образце, неспецифическое связывание конъюгата Являются причиной достаточно высоких сигналов, часто нивелирующих преимущества систем с многократным усилением. В этом плане очень интересен вариант «туннельного» ЛИФА, когда антитела к определяемому соединению соиммобилизованы на носителе с FMN-оксидоредуктазой и бактериальной люциферазой. Маркером антигена в этом способе является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, генерирующая NADH, который при связывании антигена с антителами прямо используется FMN-оксидоредуктазной системой фермента бактериальной люминесценции. NADH, выходящий в раствор, быстро окисляется без излучения света. Различие в скоростях реакций в растворе и на носителе позволило значительно снизить интерферирующее влияние дегидрогеназ сыворотки крови и проводить определение в 25 мкл плазмы. Метод использован для определения прогестерона, а-фетопротеина, хорионического гонадотропина человека и пролактина.
Несмотря на то что методы БИФА пока не нашли еще широкого практического распространения, они обладают рядом преимуществ, что говорит о перспективности их разработок.
• К основным преимуществам этих методов следует отнести высокою чувствительность и возможность разработки высокочувствительных гомогенных методов экспресс-аналйза.
Благодаря последним достижениям в области изучения структуры и функции ферментов, значительно снижены ограничения, обусловленные труднодоступностью и нестабильностью люцифераз. Получены препараты иммобилизованных биолюминеоцентных систем, которые могут быть использованы в иммуноанализе, базирующемся на реакциях светляковой и бактериальной люцифераз.
Хемилюминесцентный иммуноанализ. Хемилюминесцентные реакции, подобно реакциям биолюминесценции, обладают высокой чувствительностью определения веществ, участвующих в- реакции, что и обусловливает возможность их применения в качестве маркеров при разработке высокочувствительных методов иммуиоана-лиза.
В литературе описано использование в иммуноанализе реакций окисления аминофталгидразидов (АФГ) в присутствии катализаторов, реакций перекисного окисления эфиров акридина, пероксидазного окисления пирогаллола (ПР) и других полифенолов:
АФГ окИслн*ель--!- аминофталат + hX (X = 425 нм) катализатор
эфиры акридина и»Р« _> метилакридон + hh (X = 470 нм)
IIP окислитель^ ПрОдукты _|_ М = 480 НМ) катализатор
132
Квантовые выходы в хемилюминесцентных реакциях ниже, чем в биолюминесцентных, однако чувствительность определения веществ (субстратов и катализаторов) сравнима с биолюминесцент-ными системами, что обусловливается, прежде всего, наличием специфических для каждого метода фоновых реакций, накладывающих ограничения на его чувствительность.
Наиболее широко используемой в иммуноанализе хемилюминесцентной реакцией является реакция окисления АФГ. При окислении АФГ образуется ион аминофталата, который при переходе в основное состояние излучает свет (Лтах=425 нм). Реакция окисления АФГ протекает как в органической, так и в водной среде. Для протекания реакции в органических растворителях (диметилсульфоксиде, диметилформамиде) необходимы только основание и кислород, в то время как в водной среде окисление АФГ происходит в присутствии окислителя и катализатора.
Особенно большой интерес в последнее время вызывают реакции пероксидазного окисления люминола. Помимо пероксидазы (ПХ) в качестве катализатора может выступать фрагмент цитохрома С — гемин с 11 аминокислотными остатками, получивший название микропероксидазы (МПХ).
В литературе описано большое количество модификаций иммуноанализа с маркерами, детектируемыми в хемилюминесцентных реакциях. Классификация их, как правило, осуществляется в соответствии с типом метки. Маркером в методах хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (ХИФА) является катализатор-фермент, в методах хемилюминесцентного иммуносубстрат-ного анализа (ХИСА) — молекулы субстратов.
Хемилюминесцентные методы иммуноферментного анализа. Использование катализаторов в качестве маркеров в люминесцентном иммуноанализе является наиболее перспективным направлением, поскольку относительно катализатора реакции квантовый выход гораздо выше, чем относительно субстрата, и, следовательно, этот подход принципиально позволяет повысить чувствительность метода.
В' последнее время изучен ряд хемилюминесцентных реакций, имеющих достаточно низкое фоновое свечение, что позволяет использовать их для разработки простых и практически удобных модификаций ИФА, с помощью которых осуществляют регистрацию, основанную на накоплении хемилюминесцентного сигнала. Первые работы по ХИФА базировались на применении конъюгатов с пероксидазой, детекцию которой осуществляли в реакциях окисления люминола нли пирогаллола.
• Интерес к изучению этого фермента в качестве маркера в ХИФА можно объяснить: 1) доступностью фермента в очищенном виде; 2) относительной простотой методов получения конъюгатов пероксидазы с антителами и антигенами различной структуры;
133
3) высокой чувствительностью детекции пероксидазы в хемилюминесцентных реакциях окисления АФГ (10-12 М).
Данные по применению пероксидазы в качестве маркера и детектирующей системы, основанной на реакциях окисления люминола и пирогаллола, представлены в табл. 4.7.
Реакция окисления пирогаллола проводится при близких к нейтральным значениях pH (pH 6,5), квантовый выход реакции составляет 10-5—10~6%. Чувствительность определения фермента этим методом составляет около 10~9 М. Исследования по люминесцентному ИФА, основанные на реакции окисления люминола, можно разделить на две основные группы: 1) определение фермента проводится в слабощелочной среде; 2) реакция окисления люминола НгО2 проводится в щелочных условиях (pH 12—13).
Таблица 4.7. Хемилюминесцентный иммуноферментный метод
на основе реакции окисления люминола Н2О2
Определяемое соединение	Предел обнаружения, М.	Конъюгат/люмннесцентная система
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) Анти-ЧСА-антитела IgG кролика Иммуноглобулины лимфоцитов Кортизол Антиген бактериальных клеток Бактериальный энтеротоксин Вирусные антигены	5-Ю-9 10-9 5-Ю-9 1 -10-»» 10-9	ПХ * — Ат/люминол/перборат ПХ — Ат/алюминол/перборат Протогемин —Ат/люминол/перборат ПХ-Ат/люмииол/НгОг ПХ — Аг/люмииол/НгОг ПХ — Ат/пирогаллол/НгОг ПХ — Аг/пирогаллол/НгОг ПХ/Ат/пирогаллол/НгОг
• ПХ — пероксидаза.
Важным вопросом является выбор оптимальных условий реакции окисления люминола Н2О2 в присутствии пероксидазы, обеспечивающих высокую чувствительность определения фермента.
Сравнительное изучение катали тических свойств пероксидазы и гемина показало, что гемин является более эффективным катализатором, чем пероксидаза, и его каталитическая активность возрастает в. щелочных условиях (pH 11—12). Вследствие этого наиболее высокие значения интенсивности хемилюминесценции в случае катализатора ПХ также наблюдаются при значениях pH 12— 13, так как в этих условиях осуществляется диссоциация пероксидазы на гемин и апофермент. Однако при этом наблюдается достаточно сильное фоновое окисление люминола, катализируемое 134
ионами металлов. Максимальная разница между значениями сигнала и фона достигается в растворах pH 11—12. Для достижения высокой чувствительности определения фермента необходим строгий контроль чистоты используемых реагентов. Предел обнаружения пероксидазы в оптимальных условиях составляет 10~12 М.
В слабощелочной среде уровень фоновых реакций значительно ниже, однако значительно ниже каталитическая активность фермента.
Точность и воспроизводимость ХИФА существенно определяется степенью диссоциации пероксидазы на гемин и апофермент, т. е. важным фактором, повышения чувствительности и точности метода является выбор условий для полной диссоциации ПХ на гемин и апофермент. Даже в сильнощелочных растворах процесс диссоциации осуществляется в течение 5—10 мин. Возможно использование додецилсульфата натрия, разрушающего белковую глобулу фермента, вследствие чего скорость диссоциации фермента увеличивается в 3 раза и улучшается воспроизводимость результатов. Этот подход был применен для определения тироксина и вируса X картофеля.
Еще одно направление развития люминесцентного анализа связано с использованием в качестве маркеров непосредственно самого гемина, родственных ему соединений и металлофталоцианинов.
Достоинством гемина и других металлопорфиринов является их высокая стабильность по сравнению с ферментами. Надо отметить, что структурные особенности маркеров этого класса (высокая гидрофобность) создают определенные трудности при получении их конъюгатов с веществами небелковой природы — гормонами, лекарственными соединениями. Критерием возможности использования таких конъюгатов в анализе является сохранение антигенных свойств определяемого соединения, что удается достичь не во всех случаях.
Сравнительно недавно Кришка с соавторами (1983) опубликовали данные об открытии новой хемилюминесцентной реакции совместного окисления люминола и люциферина перекисью водорода, катализируемого пероксидазой. В этой системе обнаружен эффект усиления интенсивности хемилюминесценции в слабощелочных растворах (pH около 8,0). Незначительный уровень, фонового свечения в этих условиях и высокая интенсивность полезного сигнала позволяют детектировать в данной реакции до 5-10-1® молей пероксидазы. Изучение влияния ряда производных бензотиазола на интенсивность хемилюминесценции люмцнольной реакции пероксидазного окисления показало, что некоторые из них также реагируют как усилитель (табл. 4.8). Наибольшее практическое использование нашел эффект усиления в присутствии n-йодфенола. Применение в качестве второго субстрата га-йодфе-нола представляет большой практический интерес, связанный с
135
тем, что выше рассмотренные усилители (люциферин и родственные ему соединения) синтезируются по сложным методикам и их стоимость высока.
Таблица 4.8. Влияние производных бензотиазола на интенсивность хемилюминесценции в реакции пероксидазного окисления люминола Н2О2 (Thorpe G. Н. G. et al, 1985)
	R		R	Интенсивность хемилюминесценции, мВ		Усиление	
		'1	n2	Время, с			
				30	60	30	60
Производное бензотиазола		H	H	10	8	—	—
		H	OH	5950	7340	372	667
ХХь		H	0CH3	13	10	—	—
	nh2		OH	8	8	—	—
	nh2		0CH3	’ 9	6	—	-
	OH		OH	 5	5	—	—
		Cl	OH	600	750	38	68
	,N-|	Cl /СООН	och3	. 3	2	—	—
			OH*	7240	6990	453	636
							
	,N—	/СООН	OH**	2480	2460	155	224
	I ,N—	ГООН		•			-
		1	OCH2CH3	5	4		
* синтетический люцнфернН
** светлячковый люциферин
Оптимизация условий проведения двухсубстратных реакций показала, что скорость реакции линейно зависит от концентрации люминола в диапазоне 10_6—-10-5 М и достигает предельного значения при концентрации порядка 5,9-10—3 М. Для перекиси водорода область линейной зависимости от концентрации наблюдается
136
в диапазоне 10~5—10-3 М и предельное значение скорости реакции при концентрации выше 10~3 М. Использование концентраций перекиси, значительно превышающих насыщенную, не представляется целесообразным, так как в этом случае происходит возрастание фонового сигнала и, кроме того, увеличивается время, затрачиваемое на достижение максимальной интенсивности.
Зависимость скорости реакций от концентрации и-йодфенола и люциферина также имеет вид кривых с насыщением. Насыщающие концентрации составляют 5,0-10-5 М в случае и-йодфенола и 6,0-10—5 М в случае люциферина. В системе индивидуального окисления люминола при слабощелочных условиях нижняя граница определения пероксидазы равна 10-10 М. Добавление люциферина (или и-йодфенола) позволяет снизить предел детекции фермента на два порядка.
• Таким образом, реакция окисления люминола перекисью водорода в присутствии второго субстрата позволяет определять фермент в очень низких концентрациях 10-12—5-10~13 М. Такая же чувствительность достигается и в спектрофотометрических методах анализа, но в случае спектрофотометрической детекции необходима инкубация субстрата с ферментом в течение довольно длительного времени (около 30 мин). Кроме того, отношение сигнала к фону на всем диапазоне калибровочной кривой равно 20—60, в то время как для спектрофотометрических методов оно не превышает 3—5. Это преимущество системы двухсубстратного окисления является основным, обеспечивающим эффективность ее использования в иммуноанализе. Не менее важное достоинство реакции двухсубстратного окисления — длительный диапазон стационарной скорости реакции (постоянство интенсивности излучения в течение 20—30 мин).
Кинетика светового излучения определяется главным образом чистотой используемых реагентов, т. е. зависит от наличия в препарате люминола примесей аминофталата. Предложены методики очистки, позволяющие получать препарат люминола с практически постоянным излучением в течение 20—30 мин. Значение этого факта для иммуноанализа трудно преувеличить. Постоянство сигнала во времени обеспечивает высокую точность, улучшает воспроизводимость результатов, значительно снижает требования к сопряжению действия дозирующих устройств и измерительной аппаратуры при работе в автоматическом режиме. В этом варианте метод ЛИФА (пероксидаза как маркер) является полностью альтернативным методу РИА.
На основе реакции двухсубстратного (люминол и люциферин) пероксидазного окисления разработаны твердофазные иммуиомет-рические методы для определения антител к вирусу краснухи человека и конкурентный метод определения дигоксина. Чувствительность этих анализов была сопоставима с соответствующими вариантами фотометрических методов ИФА. Твердофазный метод
137
для определения иммуноглобулина Е человека имеет нижний предел детекции в этой" системе 2,6 IU/мл (для фотометрического варианта 3,6 Ш/мл) и коэффициент вариации —3,9—13% (табл. 4.9).
В настоящее время реакция двухсубстратного пероксидазного окисления использована во многих вариантах твердофазного ИФА с применением различных носителей и фотодетекторов (фотоумножителей, кремниевых фотодиодов). Показано, что удовлетворительные результаты могут быть получены с применением очень
Таблица 4.9. ИФА на основе реакции усиленной хемилюминесценции пероксидазного окислении люминола Н2О2 в присутствии второго субстрата
Определяемое соединение	Конъюгат	Второй субстрат (усилитель)	Предел обнаружения
Антитела к вирусу краснухи	Ат-ПХ *	Люцнфернн		
IgE	Ат-ПХ	»	10 Ш/мд
		л-Иодфенол	10 Ш/мл
Дигоксин	Аг-ПХ	Люцнфернн	0,5 нг/мл
	Аг-ПХ	л-Иодфенол	0,3 нг/мл
Раковоэмбрнональный анти-	Ат-ПХ	»	3 нг/мл
ген			
Хорионический гонадотропин	Ат-ПХ		5 Ш/мл
Фактор VIII	Ат-ПХ		0,2 Ш/мл
• ПХ — пероксидаза.
простых устройств, позволяющих регистрировать световое излучение на фотопленках. Большое внимание уделено изучению геометрии носителей, обеспечивающих удовлетворительную регистрацию светового излучения по конечной точке. На основе твердофазного ИФА на нитроцеллюлозных дисках разработан быстрый метод обнаружения антител с регистрационной системой на поляроидной пленке. Метод применяется для определения антител к малярии, цитомегаловирусу. Продолжительность определения около 30 мин.
Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные позволяют считать, что хемилюминесцентная система, основанная на совместном окислении люминола и второго усиливающего субстрата перекисью водорода, может рассматриваться как Одна из наиболее перспективных систем детекции взаимодействия антиген — антитело.
Хемилюминесцентный иммуносубстратный анализ. Другим направлением в ХИА является использование в качестве маркеров субстратов хемилюминесцентных реакций — аминофталгидразидов (АФГ). Эти соединения детектируются на уровне цикомолей в течение очень небольших промежутков времени (0,3—2 с), отлн-138
чаются стабильностью и могут быть использованы для разработки как гетерогенных, так и гомогенных методов ИФА.
Нижний уровень детекции производных-изолюминола составляет 1—5 пмоль. Как правило, производные изолюминола, конъюгированные с антигенами и антителами, имеют более низкий квантовый выход, что приводит к снижению чувствительности детекции. Люминол, изолюминол, производные люминола и изолюминола используются в качестве маркеров широкого круга соединений: белков, белковых ~и стероидных гормонов, лекарственных соединений и др.
9 Почти все методы иммобилизации хемилюминесцентных меток включают следующие три основные стадии: 1) химическую активацию хемилюминесцентного маркера; 2) химическую модификацию белка или гаптена; 3) ковалентное связывание с помощью бифункционального реагента.
Общая структура обычно используемых хемилюминесцентных конъюгатов со стероидами и белками имеет вид
Известно большое количество методов для получения конъюгатов с лУоминолом. Часть методов вк'лючает стадию образования активных альдегидных групп при окислении углеводных остатков и гаптенов перйодатом натрия. Активные альдегидные группы на молекуле белка реагируют с ароматической аминогруппой с образованием основания Шиффа. Для ковалентного связывания люминола с модифицированными белками и гаптенами используют также глутаровый альдегид и карбодимиды.
Квантовый выход хемилюминесценции люминола, связанного с белковой глобулой в реакции окисления перекисью водорода, катализируемой гемином (pH 13,5), составляет 0,3%. Данные по использованию люминола в качестве метки приведены в табл. 4.10.
Значительно более широкое применение в качестве маркеров получили производкые изолюминола. Описано использование конъюгатов с производным изолюминола—[М-аминоб«/тил-(Ь1-этнл)-
139
изолюминолом (ABEI)] для определения белков, ряда белковых гормонов — хорионического гонадотропина человека, лютеинизирующего гормона, фолликулстимулирующего гормона и пролактина. Определение ведется с помощью методов иммуноанализа, основанных на применении: 1) меченых антигенов в конкурентном анализе; 2) меченых вторых антител {универсальный реагент в конкурентном варианте); 3) меченых первых антител («сэндвич»-модификация).
Таблица 4.10. Использование конъюгатов на основе люминола
в хемилюминесцентном иммуноанализе
Определяемое соединение	Предел обнаружения,	Конъюгат/люмннесцентная • система
Тестостерон	io-9	Люминол-Аг/Си-ацетат/НгОг
IgG кролика	5-Ю-9	Люминол-Ат/КаОС1/Н2О2
IgG человека	5-Ю-8	Люминол-Аг/гемии/Н2О2
Дигоксин	8-Ю-11	Л юм нио л-Аг/гемогло бин/Н2О2
Инсулин	210-9	Люмииол-Аг/1МаОС1/Н2О2
Тироксин	7-Ю-9	Диазолюмииол-Ат/МПХ/Н2О2 *
Тироксинсвязывающий глобулин Ферритин	io-8	Диазолюминол-Аг/МПХ/Н202
	io-7	Диазолюминол-Ат/МПХ/Н2О2
С-реактивиый белок	ю-6	Диазолюминол-Ат/МПХ/Н2О2
• МПХ — мнкропероксидаза.
Конкурентный иммуноанализ применен для количественного определения хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови и моче и лютеинизирующего гормона в моче. Описан «сэнд-вич»-метод для определения антител к иммуноглобулину человека. В качестве твердой фазы использовали 96-луночные микропланшеты из поливинилхлорида, регистрация результатов реакции осуществлялась автоматически.
• Преимущества метода — сокращение времени регистрации (до 5 с) по сравнению со спектрофотометрическим вариантом ИФА, высокая чувствительность—1 нг/мл. Производные изолюминола ковалентно связываются с белком с помощью бифункциональных реагентов (водорастворимых) и водонерастворимых карбодиимидов. Очень часто химически модифицируют с получением активированного эфира ABEI, который затем ковалентно связывается с молекулой белка.
ABEI как маркер потенциально обладает рядом преимуществ, позволяющих на основе этого маркера разрабатывать высокочувствительные методы иммуноанализа. Данные по использованию изолюминола как маркера приведены в табл. 4.11.
Большинство модификаций хемилюминесцентного анализа относятся к твердофазным методам иммуноанализа. Для разделения 140
прореагировавшего и непрореагировавшего конъюгатов используют полибтирольные микропланшеты и пробирки, полиакриламидные шарики, нитроцеллюлозные мембраны, гельфильтрацию на сефадексе G-25 и т. д.
В литературе описан также гомогенный вариант ХИА с использованием конъюгатов биотин — изолюминол. При взаимодействии этого конъюгата с авидином в двух окислительных систе-
Таблица 4.11. Использование производных изолюминола в хемилюминесцентном иммуноанализе
Определяемое соединение	Предел обнаружения, пг	Конъюг а т/л ю м ни ес цен тн а я система
Прогестерон	4,0	АВЕ1-Аг/Н2О2-М1Х *
Эстриол-16-глюкоронид	17,6	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
Эстрнол-16-глюкоронид	15	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
Метаболиты стероидов мочи	30,0	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
Эстрадиол	1,5	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
Тестостерон	1,0	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
Лютеинизирующий гормон	0,2	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
IgG	500	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ АВЕ1-Ат/Н2О2-МПХ
Кортизол	3	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
	20	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
Ферритин	10	АВЕ1-Ат/Н2О2-МПХ	•
Церулоплазмин	10	АВЕ1-Аг/Н2О2-МПХ
• АВЕ1-Н-аминобутил-(Ы-этнл)нзолюминол; МПХ — микропероксидаза.
мах: 1) окисление Н2О2, катализируемое лактопероксидазой при pH 8,4 и 2) окисление супероксиданионом в диметилформамиде — наблюдается усиление интенсивности свечения. Увеличение квантового выхода является следствием внутримолекулярных механизмов, обусловленных специфическими взаимодействиями. Этот же эффект обнаруживается при окислении конъюгата биотин-изолю-минол — НгО2 в присутствии микропероксидазы в диапазоне значений pH 8,6—13,0. Нижний предел обнаружения биотина конкурентным методом составляет ~50 нМ,
Производные изолюминола широко используются при количественном определении стероидов методами как гомогенного, так и гетерогенного иммуиоанализа.
Процесс получения конъюгатов стероидов с хемилюминесцентным маркером включает два основных этапа: 1) модификацию стероида — введение в молекулу стероида карбонильной группы, ее активацию в присутствии карбодиимида и N-оксисукцинимида с образованием активированного эфира; 2) реакцию активированного эфира стероида с аминогруппой производного изолюминола
141
при щелочных значениях pH с образованием пептидной связи. Для очистки конъюгата используют тонкослойную хроматографию и характеризуют его либо спектрофотометрически, либб с помощью масс-спектрометрии.
В основе гомогенного хемилюминесцентного иммуноанализа стероидов лежит эффект усиления интенсивности хемилюминесценции при взаимодействии конъюгата стероид — изолюминол с антителами. Введение в эту систему свободного стероида ингибирует излучение, которое пропорционально концентрации добавленного стероида. Указанный принцип использован при разработке методов определения прогестерона, эстриол-16-глюкоронида, эстриола. Несмотря на то что чувствительность этих методов сопоставима с РИА (5—10 мг), в ряде случаев собственная неспецифическая хемилюминесценция образца (плазмы или мочи) ограничивает возможности метода, затрудняет определение низких концентраций.
В гетерогенных методах ХИ А стероидов для разделения свободной и связанной фракций конъюгата применяют вторичные антитела или уголь, активированный декстраном. Однако в этом случае так же, как и при постановке гомогенных методов ХИА, на результаты анализа влияет неспецифическая фоновая хемилюминесценция образца.
Наиболее простой способ снятия неспецифического фонового излучения состоит в использовании твердофазных вариантов метода. В качестве твердой фазы берут пдлистирольные пробирки, микропланшеты, полиакриламидные шарики. Иммобилизация антител (моноклональных или поликлональных) на полистироле осуществляется методом нековалентной физической адсорбции, а в случае полиакриламидных частиц — ковалентным связыванием. Различие в способах иммобилизации обусловливает некоторые различия в свойствах иммобилизованных антител. Из. всех перечисленных носителей полиакриламидные шарики, как правило, обеспечивают .повышенную стабильность и иммунореактивность иммобилизованных антител, более быструю кинетику специфического взаимодействия, что улучшает точность анализа и его воспроизводимость.
Коэффициенты корреляции данных, полученных для стероидных гормонов методами ХИА и РИА, достаточно высоки (л= = 0,94—0,98). Точность и воспроизводимость результатов иммуноанализа в существенной мере определяются конечной стадией регистрации излучения и сильно зависят от формы детектируемого сигнала.
• Таким образом-, использование производных изолюминола в качестве меток имеет ряд преимуществ: простота получения меченых соединений, высокое отношение полезного сигнала к фоновому, высокая точность и воспроизводимость результатов измерения.
142
Использование в качестве маркера в ХИА акридиновых эфиров. Одним из перспективных направлений ХИА является применение в качестве маркеров антигенов и антител эфиров акридина, в том чиёле с производными фенола. В процессе окисления перекисью водорода происходит разрыв сложной эфирной связи и образование соединения III, дальнейшее превращение которого приводит к возникновению электронно-возбужденного N-метилакри-дина (соединение IV):
(D	(П)
(IV)	(III)
•	Преимущество данного механизма окисления состоит в том, что переход в электронно-возбужденное состояние и излучение света происходит после разрыва эфирной связи, вследствие чего исключается влияние молекулы антигена или антитела на хемилюминесцентную реакцию и достигается высокая чувствительность определения маркера (10-17—10-18 моль в образце).
К недостаткам метода следует отнести нестабильность конъюгата, обусловленную наличием легко гидролизуемой основной формы акридиновых эфиров. Вследствие этого накладываются ограничения на применение растворов со значением pH, превышающим 6,3.
Схемы ХИА на основе эффекта переноса энергии. Впервые эффект переноса энергии в растворе описал Ферстер (1949), который наблюдал тушение флуоресценции трипофлавина родамином.
143
Позднее им было показано, что этот эффект передачи фотона от донора к акцептору проявляется в тех случаях, когда расстояние между ними не превышает 7 нм. Эффективность процесса переноса энергии определяется диполь-дипольным резонансом /и обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором.	/
Важным фактором является расстояние между максимумами спектров хемилюминесцентного излучения донора и флуоресцентной адсорбции акцептора, при этом эффект переноса/ энергии выражается в смещении максимума спектра флуоресцентного излучения акцептора. При увеличении площади перекрывания спект'-ров эффективность процесса переноса энергии возрастает.
Известно, что радиус Стокса молекул IgG с Mr=150000 составляет около 4 нм, а расстояние до активных центров около 5,5 нм. Таким образом, если на поверхности белковой глобулы расположить 4—12 молекул флуоресцеина, то среди них найдется по крайней мере одна, которая будет акцептором энергии молекулы донора, связанной с активным центром антитела. Для того чтобы эффект переноса энергии между IgG и флуоресцеином наблюдался в растворе, необходимо, чтобы концентрация флуорохрома была не ниже, чем 1—10 мМ. Если принять во внимание, что концентрация антител при проведении иммуноанализа составляет 0,01 пмоль, то очевидно, что перенос энергии может наблюдаться только внутри комплекса антиген — антитело и отсутствует между несвязанными молекулами. Этот факт положен в основу гомогенных методов иммуноанализа, базирующихся на эффекте переноса энергии.
•	Основные требования к выбору реагентов: 1) хемилюминесцентное соединение, являющееся донором энергии, должно иметь высокий квантовый выход в хемилюминесцентной реакции; 2) флуорохром, используемый в качестве акцептора, должен обладать высоким квантовым выходом флуоресценции; 3) расстояние между максимумами спектров излучения донора и акцептора (стоксовский сдвиг) должно быть достаточно большим.
Сравнительное изучение свойств различных соединений, используемых в качестве маркеров в ХИА и флуорохромов, позволило выбрать для проведения иммуноанализа в качестве хемилюминесцентного маркера антигенов — ABEI и флуорохромной метки антител— флуоресцеина (длина волны возбуждения 495 нм, излучения 525 нм).
При образовании комплекса антиген—антитело наблюдается снижение интенсивности излучения в диапазоне 460—487 нм и увеличение при 525 нм, регистрируемое с помощью двухволнового люминометра.
Гомогенный иммуноанализ на основе переноса энергии описан для определения ряда антигенов с Мг от 312 до 150 000. Отношение интенсивности хемилюминесценции уменьшалось приблизи-144
\
тельно на 50—70% при связывании меченого антигена с мечеными антителами.
Гомогенный анализ разработан для определения циклического АМР из эритроцитов цыплят и IgG сыворотки крови. Корреляция полученных результатов с данными обычных гетерогенных методов удовлетворительна (для сАМР коэффициент корреляции г=0,91, для IgG — 0,96). Основное преимущество систем с детекцией, основанной на определении отношения интенсивности излучения при двух длинах волн, — это возможность устранения влияния образцам
Подход а использованием систем с переносом энергии только начинает разрабатываться в иммуноанализе и, безусловно, найдет применение как один из вариантов гомогенных методов иммуноанализа. (
•	Приведенной обзор данных по применению био- и хемилюминесцентных реакций в иммуноанализе позволяет заключить, что детектирующие системы на их основе обладают большими потенциальными возможностями в плане повышения точности и чувствительности методов иммуноанализа, разработки новых вариантов экспресс-определения, создания систем автоматического определения.

Получение / антисывороток / и поликлональных антител	/
Процесс введения животному антигена по разработанной схеме называется иммунизацией, а сыворотка крови иммунизированных животных — антисывороткой. В литературе описано большое разнообразие способов иммунизации, зависящих от структуры антигена, его доступных количеств, вида животного и т. д. По этим причинам условия получения йммунных сывороток подбираются эмпирически. Тем не менее имеются общие закономерности,, которые позволяют выбрать условия получения высокоактивных антисывороток.
§ 1. Иммуногенность антигенов
Иммуногенность антигена—это способность  ь в ооагнизме иммунизированного животного образование антител. Иммуногенность как биологическое свойство антигена является более сложным, чем антигенность. Антигенности того или иного вещества недостаточно, чтобы вызвать образование антител. В качестве примера можно привести гаптены, которые приобретают иммуногенность только после конъюгирова-ния с соответствующим носителем.
Иммуногенность веществ сильно зависит от их молекулярной массы: чем выше молекулярная масса, тем выше иммуногенность. Отсюда вытекает важное практическое следствие — сшивка биополимеров (белков, полисахаридов) между собой и другими белками повышает иммуноген
ность. Зависимость иммуногенности от молекулярной массы, по-видимому, определяется следующими причинами: во-первых, увеличение)^ времени пребывания антигена в организме при возрастании его молекулярной массы; во-вторых, у высокомолекулярных антигенов» существенно возрастает способность взаимодействовать с макрофагами, в-третьих, с увеличением молекулярной массы в антигене увеличивается как общее количество антигенных детерминант, так и их разнообразие, что повышает эффективность взаи-модействия\ антигенов как с В-, так и с Т-лимфоцитами.
Плотность расположения и количество антигенных детерминант на поверхности антигенов также имеет важное значение: по мере увеличения этих показателей иммуногенность в начале растет, а затем начинает уменьшаться. Так, например, для динитро-фенильной гаптеновой группы было показано, что из конъюгатов, содержащих 3, 16 и 28 групп на молекулу бычьего альбумина, максимальной антигенностью обладал конъюгат, содержащий 16 молекул гаптена. Одной из причин такого эффекта, по-видимому, является сложность межклеточной кооперации. В частности, показано, что в иммунном ответе против антигенов, имеющих повторяющиеся антигенные детерминанты (полисахариды, искусственные антигены), участвуют только В-лимфоциты; такие антигены называются Т-независимыми. Для этих антигенов, например полимеров D-аминокислот, также характерно снижение скорости метаболизма в организме.
Очень важным является понятие «чужеродность» иммуногена. Установлено, что чем более антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность. Например, инсулины человека и многих видов животных имеют близкую первичную структуру и поэтому для них инсулин человека малоиммуногенен. Однако между инсулином человека и морской свинки имеются достаточные отличия, что позволяет использов.ать этих животных как продуцентов соответствующих антисывороток (рис. 17).
 Однако это правило нельзя считать абсолютным. Так, например, гормон тироксин имеет одинаковую структуру у всех животных, тем не менее, будучи конъюгированным с подходящим белком, он становится хороЩим иммуногеном. В данйом случае антигенная детерминанта состоит не только из гормона, но и «ножки» и части белковой глобулы, что в целом создает «чужеродную» структуру. Именно на этом принципе основано получение антител Против различных низкомолекулярных физиологически активных веществ.
«Чужеродность» зависит от генетических особенностей иммунизируемого животного, поэтому часто иммуногенность связывают с генетической чужеродностью антигена. Из «чужеродности» следует, что иммуногенность — это не абсолютное свойство антигена по отношению к данному виду животного, а иногда даже к ин-
147
А-цепь		В-цепь
2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415161718192021	1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415161718192021222324252627282930
н
а.
Н
tx. tx. О at w О
И---О
>
W >
X
<z> W <z>—о
_1 X О X
tx,
<
<	<	< со
. X	"
О----<Л I I
X	"
щ	. ,
О	'
5-
U	О
<Z>	' '
<Z>--U	‘ •
>—<	> >
<Z>	'	>
н	'
U—-<Z>	'	I
<Z>—U	'	>
O'	'
W		I
> о
о
> О
9 i c:
£
3 и
о о
X
Рис, 17, Аминокислотная последовательность молекул инсулинов человека и различных животных (L. F, Smith, 1972)
дивидуальному организму. Необходимо иметь в виду, что иммунная система организма сама находится под жестким генетическим контролем, который определяет как биологическую активность различных участников иммунного процесса, так и многообразие специфичностей рецепторов, а значит, и специфичностей антител. Именно видовая и индивидуальная вариабельность организмов требует внимательного выбора вида животного. Чем менее «чужеродный» антиген, тем большее количество животных следует брать для иммунизации. Так, например, для получения антисывороток против инсулина наиболее иммунореактивными являются морские свинки, при этом в среднем только одна из семи морских свинок дает удовлетворительную для целей анализа антисыворотку. Даже в случае получения антисывороток против достаточно «чужеродных» антигенов необходима большая группа животных, так как в этом случае нивелируются индивидуальные различия. Смесь антисывороток против данного антигена от разных животных одной группы называют пулом.
Из лабораторных животных чаще всего берут для иммунизации кроликов, морских свинок или мышей в зависимости от количества имеющегося антигена, доступности животного и т. д. Возможность использования группы лабораторных животных позволяет решить проблему отбора из них наиболее иммунореактивных. Иммунизировать удобнее самцов, так как у них иммуногенный ответ менее подвержен влиянию гормональных циклов. Для получения антител против вирусов эффективными оказались куры, у которых антитела накапливаются в яйцах. Большие количества антисывороток получают иммунизацией крупных . животных: козлов, баранов, ослов, лошадей.
Для получения специфических антисывороток важное значение имеет гомогенность (чистота) антигена. Это обусловлено тем, что примеси чужеродных антигенов могут обладать большей иммуногенностью, чем основной антиген, в результате чего, несмотря на небольшое количество примеси, против нее может образоваться достаточное количество антител. Так, например, вирусные антигены, выделенные из культуры ткани животных, содержат примесь тканевых антигенов, против которых вырабатываются антитела, дающие ложноположительные реакции в иммунохимическом анализе.
Степень иммунного ответа также зависит от количества введенного антигена. При определенных концентрациях антигена, как высоких, так и низких, наступает торможение гуморального иммунного ответа, называемое толерантностью. Это обусловливает необходимость выбора оптимальной дозы в каждом конкретном случае, с учетом чистоты препарата и его иммуногенности. Доза иммуногена для одной инъекции кролику или морской свинке составляет в среднем 100—300 мкг на 2 кг массы. Доза, необходимая для крупных животных, не увеличивается пропорционально
149
их массе. Так, для овец достаточна доза, равная 0,25—5 мг иммуногена на инъекцию, для осла — 0,5—10 мг. В случае использования в качестве иммуногена конъюгата гаптен-носитель доза зависит от молекулярной массы конъюгата.
Способ введения антигена (подкожно, внутривенно, в лимфатический узел, внутрибрюшинно) и периодичность введения влияют на иммунологическую активность антисывороток. Так как иммунный ответ формируется в организме постепенно, принято различать первичный ответ (после первого введения антигена) и вторичный ответ (после повторных инъекций антигена). Первичные и вторичные антисыворотки отличаются по составу антител и их специфичности. Обычно высокоактивные антисыворотки получают после нескольких циклов иммунизации. Однако очень длительные иммунизации могут'привести к снижению специфичности из-за постепенного увеличения титра антител к примесным антигенам.
В процессе иммунизации изменяется также аффинность и соотношение между различными фракциями антител. Такая вариабельность качества антисывороток по специфичности антител, их физико-химическим свойствам и концентрации является следствием популяционной природы иммунного ответа. В связи с этими обстоятельствами на практике необходимо вести непрерывный контроль за качеством получаемых антисывороток.
§ 2. Получение иммунных антисывороток
Адъюванты — это соединения, которые при введении в организм вызывают не специфическое усиление иммунного ответа и тем самым повышают способность организма реагировать на любой иммуноген. Адъювантными свойствами обладают масла, липосомы, клетки бактерий, полимеры и др. Адъюванты, введенные в организм вместе с иммуногеном, выполняют две функции. Во-первых, они способствуют более медленному освобождению иммунргена из участков инъекции, что замедляет его поступление в кровоток, в результате чего увеличивается вероятность встречи иммуногена с иммунокомпетентными клетками, а также резко снижается его токсичность. Во-вторых, адъюванты вызывают сильное воспаление в месте введения иммуногена, при этом активируется фагоцитоз и стимулируется местная циркуляция лимфоцитов, происходит неспецифическая стимуляция иммунокомпетентных клеток. Для усиления такой неспецифической иммуностимуляции в состав адъювантов дополнительно включают препарат бактериальных клеток рода Bacillus pertussium.
В настоящее время для целей иммунизации широко применяется коммерческий препарат полного адъюванта Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и 150
убитые микобактерии (при отсутствии последних адъювант называется неполным). Препарат адъюванта можно приготовить в лабораторных условиях, тщательно смешав три части минерального масла, одну часть безводного ланолина, четыре части 0,15 М К-фосфатного буфера и препарат микобактерий до конечной концентрации 10 мг/мл так, чтобы частички микобактерий равномерно распределились по всему объему. Адъювант смешивают с водным раствором иммуногена в отношении 2:1 до образования нерасслаивающейся эмульсии, в которой водный раствор иммуногена находится в мицеллах (вода в масле).
• Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. После введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие животных, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного. В случае ухудшения самочувствия очередную инъекцию пропускают и лишь после выздоровления животного продолжают иммунизацию.
Способы иммунизации. Введение иммуногена приводит к активации лимфоидных клеток, расположенных вблизи от места инъекции. Наиболее эффективно вводить иммуноген малыми порциями в большое количество точек. Введение иммуногена можно осуществлять различными способами.
Внутрикожное введение. На очищенном от шерсти участке кожи животного делают острым'скальпелем несколько царапин, а затем втирают в это место раствор иммуногена (25 мкл). Применение этого способа позволяет получать высокий иммунный ответ уже после однократного введения, в результате чего значительно сокращается расход иммуногена. Однако описанный способ трудоемок в исполнении и обычно вызывает сильные болевые ощущения у животного от обширных участков изъязвлений в местах введения иммуногена.
Подкожная иммунизация. В точки, расположенные вдоль позвоночника животного, вводят 5—6 порций раствора иммуногена объемом приблизительно 2 мл.
Внутримышечное введение. Одновременно часть иммуногена вводят в мышцу задних ног животного и небольшими порциями.
Внутрибрюшинное введение. Этот способ используют для иммунизации мелких лабораторных животных, таких, как мыши или морские свинки.
Прямое введение иммуногена в лимфатические узлы. Иммуноген инъецируют в лимфоидные узлы, расположенные в подколенной ямке задних ног кролика, что позволяет уменьшить его количество до 10—50 мкг, а объем вводимого раствора — до 25 мкл. Этот способ является сложным в техническом исполнении, по-
151
скольку включает в себя разрез кожи, поиск лимфоузла и введение иммуногена без его повреждения.
Внутривенное введение. Этот способ обычно применяется для повторных инъекций, после которых проводят отбор крови у животного. Раствор иммуногена вводят непосредственно в кровоток (в вену уха кролика, в яремную вену барана или козы). Адъювант в этом способе введения антигена не применяется, поскольку он оказывает токсический эффект и животное может погибнуть.
Более редко используются такие способы иммунизации, как введение иммуногена в подушечки лап или в конъюнктиву глаза, которые вызывают сильные болевые ощущения у животного. Иммунизацию начинают введением животному иммуногена в смеси с полным адъювантом Фрейнда, а для повторных инъекций применяют неполный адъювант Фрейнда. Перед отбором крови за 7— 9 дней проводят 1—3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. Число инъекций и интервалы между ними чаще всего подбираются экспериментально для конкретного иммуногена.
В процессе иммунизации у животных отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов (белков, полисахаридов и т. д.) достигается через 40—60 дней после первой инъекции. В том случае, когда иммуногеном являются клетки микроорганизмов, максимально высокий уровень антител наблюдается гораздо раньше (через 12—20 дней). После окончания первого цикла иммунизации животному в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию (2-й цикл иммунизации), включающую 1—3 внутривенные инъекции. Ниже приводятся схемы иммунизации морских свинок и кроликов инсулином и конъюгатом тироксин — бычий сывороточный альбумин (БСА).
Для получения антисывороток морских свинок к инсулину свиньи (крупного рогатого скота) проводят многоточечные инъекции инсулина подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинно по следующей схеме: 1, 8, 15-й день — 200 мкг инсулина в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда и вводят животному. После 30 дней отдыха животному в течение 3 дней ежедневно вводят антиген путем многоточечных инъекций по схеме: 45, 46, 47-й день — 150 мкг инсулина в 0,7 мл физиологического раствора. Отбор крови проводят через 7—9 дней из сердца.
Второй цикл иммунизации осуществляется после месячного отдыха животных по схемам 45, 46 и 47 дней.
Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4—5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7— 9-й день после последней инъекции.
Иммунизацию кроликов конъюгатом тироксин — БСА (Tt — БСА) проводят многоточечными инъекциями вдоль позвоночника и внутримышечно в область микроузлов задних лап по следующей схеме: 1-й день — 1—2 мг конъюгата 152
Т« — БСА в 0,7 мл физиологического раствора смешивают с 0,7 мл адъюванта Фрейнда и полученную эмульсию вводят животному; 31, 32, 33 или 45, 46, 47-й дни — внутривенно вводят 0,7—1 мл физиологического раствора, содержащего 1—2 мг Т4—БСА.
Кровь берут из сердца на 7—9-й день после последней инъекции. Через месяц цикл внутривенной иммунизации,повторяют.
Отбор крови и получение антисыворотки. Иммунизированное животное используется в качестве донора иммунной сыворотки в течение 5—7 мес, за это время удается провести 5—6 циклов иммунизации. Животных, прошедших несколько циклов иммунизации, называют гипериммунными. Кровь у животных отбирают из вены уха (кролик) или непосредственно из сердца путем кардиальной пункции (кролик, морская свинка) в объеме 50—70 мл у кролика и 5—10 мл у морской свинки в стерильные пробирки, промытые стерильным буферным раствором.
Кровь, лишенная клеточных элементов, называется плазмой. В плазме содержится фибриноген, приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который осторожно удаляется центрифугированием при 1000—2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение. 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность. Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения (гемолиза) эритроцитов. Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сыворотке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа. Это замечание касается прежде всего использования антисывороток в гомогенных методах.
Хранение антисывороток. Нативную иммунную сыворотку можно хранить 3—6 мес без потери иммунологической активности в замороженном состоянии при —20°С, предварительно разливая ее во флаконы по 0,5—1 мл. Отмораживание-замораживание ведет к снижению иммунологической активности сыворотки, поэтому лучше замораживать ее небольшими порциями для одноразового употребления.
Удобно хранить антисыворотку в лиофилизованном состоянии в ампулах под вакуумом. В сухом виде антисыворотка сохраняет иммунологическую активность при комнатной температуре в течение 1—2 лет.
Размороженную или разведенную сухую сыворотку в растворе можно хранить при +4°С в течение недели, предварительно добавив в нее консервант — хлороформ (1:10 по объему), 0,1% азида натрия или 0,01% мертнолата. Следует иметь в виду, что консерванты могут быть ингибиторами ферментов-маркеров в иммуно-феремнтном анализе (например, азид натрия для перокси-дасы).
153
§ 3.	Выделение и очистка антител
Для увеличения относительного количества антител обычно используют у-глобулиновую или IgG-фракции иммунной сыворотки. Наиболее полное выделение у-глобулиновой фракции без снижения ее иммунологической активности достигается при осаждении сульфатом аммония (30% от насыщенного раствора), после чего осадок длительно диализуется с частой сменой буферных растворов.
Другим широко распространенным способом является осаждение полиэтиленгликолем с ЛЪ=4000—6000. В 10%-иом растворе полиэтиленгликоля происходит агрегация всех белков с Мг> >-150 000, в результате чего осаждаются белки у-глобулиновой фракции, а белки меньшей молекулярной массы остаются в растворе. (Обычно используют двухкратное осаждение 20%-ным раствором полиэтиленгликоля.) Этот метод позволяет очень быстро получить препарат у-глобулиновой фракции антисыворотки. Способ достаточно эффективный, если препарат не подвергается хранению при низких температурах. Длительное хранение полученного препарата с сохранением иммунологической активности возможно после предварительного тщательного диализа.
Антитела в большей части антигенов относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. С целью повышения чувствительности и специфичности анализа во многих случаях полезно использовать для сорбции на твердой фазе и для получения конъюгатов IgG-фракцию нативной сыворотки. Наиболее простой и доступный способ выделения IgG — метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе или ДЭАЭ-целлюлозе.
Выделение IgG-фракции кроличьей антисыворотки.
1.	10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl, добавляют 6,26 г (NH4)2SO4, перемешивают и инкубируют 12—16 ч при 4°С.
2.	Выпавший осадок удаляют центрифугированием (3000 об/мин, 10 мии), растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре.
3.	После удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку (1ХЮ см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером.
4.	IgG-фракцию определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 им, концентрацию рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения 8=1,5 г~'-л-см~'.
Приготовление фосфатного буфера.
Для выделения IgG кролика используют 50 мМ фосфатный буфер (pH 8), содержащий 20 мМ ЭДТА. 8 г Na2HPO4-2H2O н 7,4 г ЭДТА-Na растворить в 900 мл воды, довести pH до 8 1М NaOH и затем добавить воды до 1 л.
Выделение антител методом иммуиосорбции. Специфичность сыворотки проверяется в реакциях с используемым для иммунизации препаратом антигена и с набором близких ему по структуре химических соединений. В случае недостаточна очищенного антигена возможны неспецифические реакции, обусловленные наличи-154
ем антител к применяемым антигенам. Перекрестные реакции с другими соединениями могут наблюдаться при наличии у них химических структур, близких к структуре антигенных детерминант иммуногена.
Удаление неспецифических антител из антисыворотки обычно осуществляют с помощью метода адсорбции на соответствующем неспецифическом антигене. Адсорбция неспецифических антител в реакции преципитации с растворимой фракцией путем центрифугирования может привести к появлению в антисыворотке или растворимых комплексов Ат—Аг, или избытка добавленного Аг, присутствие которых влияет на способность антисыворотки реагировать со сцецифическим антигеном в ИФА. Наиболее удобно для адсорбции антисыворотки использовать антиген, иммобилизованный на твердой фазе. Добавляя такой иммуносорбент в антисыворотку или пропуская антисыворотку через колонку с иммуносорбентом, можно быстро освободиться от перекрестно реагирующих антител.
Метод аффинной хроматографии на иммуносорбентах используется для получения препаратов очищенных антител. Наиболее широкое распространение получили иммуносорбенты на основе CNBr-активированной сефарозы (фирма «Farmacia», Швеция). Выпускаемая в нашей стране CNBr-активированная агароза по своим основным параметрам (удельной емкости, отсутствию неспецифической сорбции) не уступает зарубежному аналогу.
Основные операции, используемые для получения иммобилизованных на CNBr-агарозе антигенов или антител, приведены в табл. 5.1.
Следует отметить, что при работе с иммуносорбентами на основе CNBr-активированной сефарозы нельзя использовать буфер, содержащий аминогруппы (например, трис-буфер).
Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена — Fab-фрагментом. Обусловлено это прежде всего тем, что Fc-фрагмент молекулы, ответственный за эффекторные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов.
Получение Р(аЬ/)2-фрагментов.
1.. Раствор антител (10—20 мг/мл) диализуют против 0,1 М Na-ацетатиого буфера, pH 4,5, при +5 °C.
2.	Затем в раствор антител.вносят пепсин из расчета 0,2 мг на 10 мг IgG.
3.	Смесь инкубируют при 37°С в течение 15—24 ч. Длительность инкубации
155
Таблица 5.1. Ковалентное связывание с CNBr-активированной сефарозой
Операция	Условия
1„ Взвесить требуемое количество CNBr-активированиоп сефарозы 2.	Промыть на стеклянном фильтре и дать набухать гелю 3.	Растворить в буфере белок (антиген) 4.	Смешать белковый раствор с суспензией геля 5.	Блокировка оставшихся активных групп 6.	Отмывка от иесвязавшегося антигена	1 г высушенного препарата дает около 4,5 мл геля Использовать для промывки раствор 1 мМ НС1, а затем для уравновешивания и набухания — боратный или гидрокарбонатный буфер Использовать гидрокарбонатный или обратный буфер Гидрокарбонатный буфер: 0,1 М NaHCO3 (pH 8,3), содержащий 0,5 NaCl Раствор должен содержать 5—10 мг антигена Два часа при комнатной температуре или ночь при +4 °C Гель промывается буфером, содержащим блокирующие соединения (16 ч при 4 °C или 2 ч прн комнатной температуре). Используются 1М этаиоламин или 0,2 М глицин, pH 8,0 Используется буфер, в котором осуществлялось ковалентное связывание (боратный или гидрокарбонатный), затем 0,1 М ацетатный буфер, pH 4, содержащий 0,5 М NaCl, после, чего гель опять уравновешивается боратным или гидрокарбонат-ным буфером
зависит от препарата пепсина и вида животного, от которого получена антисыворотка.
4.	pH рйствора доводят IM NaOH до 8.
5.	Затем раствор IgG в буфере pH 8,0, обработанный пепсином, наносят на колонку с сефадексом G-150 (либо ультрагелем АсА-44). При объеме смеси 1,0— 1,5 мл используют крлоику 1,5X45 см, а при 2,0—2,5 мл — 2,0X45 см. Колонку предварительно уравновешивают 0,1 М Na-боратным буфером, pH 8,0. Гельфильтрация на АсА-44 приводит к более четкому отделению Р(ав')2, чем сефадекс G-150. Для IgG овец, морских свинок, козла и, возможно, Некоторых других животных гельфильтрацию следует проводить в буфере pH 6—7, а не 8, поскольку изоэлектрическая точка этих белков близка к 8. Добавление в буфер для элюции БСА позволяет снизить уровень неспецифической сорбции в случае использования низких концентраций IgG.
' 6. Концентрацию Р(аЬ')2-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения £р(аь')я = I >48 г~!-л-.см—L
Получение Fab-фрагментов
1.	Готовят раствор, содержащий 0,1—3 мг F(ab') 2-фрагмента в 0,45 мл 0,1 М Na-фосфатиом буфере, pH 6,0. •
2.	Добавляют 0,05 мл 0,1 М 2-меркаптоэтанола в том же буфере, содержащем 5 мМ ЭД ТА.
3.	Смесь инкубируют при 37 °C в течение 1,5 ч,
156
4.	Освобождаются от солей на колонке (0,9X15 см) с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М Na-фосфатным буфером, pH 0,6 с 5 мМ ЭДТА.
5.	Разделение Р(аЬ')г- и Fab-фрагментов проводят гельфильтрацией на колонке (0,9X30 см) с ультрагелем АсА-22, уравновешенной тем же буфером.
6.	Концентрацию Fab-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения eFab = 1,48 г~1-л-см-1.
§ 4. Тестирование антисывороток
Антисыворотки, полученные даже от одного животного, значительно различаются по своей способности связывать антиген. Для сравнительной характеристики и оценки качества антисывороток проводят их тестирование, которое позволяет решить следующие две важные задачи: во-первых, произвести отбор именно тех сывороток, которые по своим свойствам (специфичности, аффинности, авидности и концентрации присутствующих в них специфических антител) удовлетворяют требованиям иммунохимического. анализа; во-вторых, осуществить стандартизацию антисывороток при их промышленном .производстве для иммуноферментных наборов.
Первичный отбор антисывороток проводят на основании нахождения их титра, который представляет собой интегральный параметр, характеризующий взаимодействие с антигеном. Более детальные сведения о сыворотке получают, определяя аффинность и концентрацию антител. Следующий этап — это установление антигенной специфичности антител, т. е. возможности взаимодействовать со структурно сходными антигенами.
Принципиальное различие этих этапов заключается в следующем: при определении титра исследуют связывание выбранной концентрации антигена при различных разведениях антисыворотки. При определении аффинности и концентрации антител исследуют связывание антисыворотки (в определенном разведении) с различными концентрациями меченого антигена. При изучении специфичности антисывороток в соответствующем разведении и при постоянной концентрации меченого антигена добавляют различные концентрации перекрестно реагирующего антигена.
Во всех случаях используют концентрации антигена либо близкие к минимально детектируемым в данном виде анализа, либо в том диапазоне, который соответствует их концентрации в образце.
Определение титра антисыворотки. Титр — это эффективная величина, характеризующая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Абсолютное значение титра также зависит от метода и условий проведения эксперимента (температуры, времени, pH и т. д.) и от начальной концентрации свободного антигена.
Количественно титр находят как предельное разведение сыворотки, при котором еще наблюдается положительный регистри
157
руемый данным методом эффект взаимодействия антисыворотки с антигеном. Например, если титр устанавливают методом преципитации свободного антигена в геле и для первой сыворотки образование преципитата наблюдается при разведении в 2т раза, а для другой — в 2" раз (т>л), то титр первой сыворотки равен 2т, а второй — 2", причем вторая антисыворотка менее активная, чем первая. Иногда оперируют понятием «5О°1о-ный титр», подразумевая под этим, соответственно, разведение сыворотки, вызывающее 50%-ное связывание антигена. «Рабочим титром» называют то начальное разведение сыворотки, которое используют непосредственно в эксперименте.
Таблица 5.2. Схема тестирования сывороток
Этап исследования	Условия	Цель
Титр	[Аг *] — постоянна [Ат] —варьирует	Отбор высокоактивных иммунных антисывороток, определение конечного и рабочего титра
Аффинность	[Ат] — постоянна (рабочий титр) [Аг *] — варьирует	Оценка аффинности и концентрации фракции высокоаффиниых антител
Специфичность	[Ат] — постоянна [Аг] *] — постоянна [ Аг2] — варьирует (перекрестный)	Определение специфичности антител
где [Ат], [Аг *] и [Ага] — соответственно концентрации антител, меченого антигена и иерекрестио реагирующего антигена
Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого для тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная.
При разработке методов ИФА обычно пользуются значением титра антисыворотки, определенным в непрямом методе, в котором на стенках лунок микроплаты первоначально сорбируют ан-158
тиген и затем изучают связывание с ним иммунной сыворотки в последовательных разведениях. Связывание исследуемых антител с иммобилизованным антигеном регистрируют с помощью антиви-дового конъюгата к иммуноглобулиновой фракции сыворотки жи
вотного, используемого для иммунизации.
Результаты в этом случае обычно оценивают с помощью понятия «50 % -ный титр». На рис. 18 приведены кривые титрования антисывороток к инсулину, полученных иммунизацией морских свинок. Максимальный сигнал, регистрируемый по оптической плотности Л продукта реакции окисления перекисью водорода 5-аминосалициловой кислоты, составляет ~1,4 оптических единиц. За титр сыворотки принимается ' такое разведение, при котором оптическая плотность, регистрируемая в ИФА, имеет значение, близкое к 0,7.
Обычно такой подход
Рис. 18. Титрование антисывороток (1 — 4) к инсулину методом непрямого твердофазного ИФА:
используется в качестве 1-го этапа оценки качества полученных иммунных сывороток и позволяет ото-
по оси абсцисс — разведение разбавленное в 100 раз сыворотки (п), по оси ординат — оптическая плотность при 430 им продукта пероксидазного окисления 5-амииосалициловой кислоты перекисью водорода. В качестве контроля (JV) использована сыворотка крови ие-иммуиизироваииого животного
орать высокоактивные
иммунные сыворотки. Однако для более глубокой оценки полученных антител проводят определение их аффинности. При разработке методов ИФА ряда антигенов, присутствующих в биологических жидкостях в низких концентрациях порядка 10~10—10й М (например, инсулин и другие полипептидные гормоны), должны быть использованы антисыворотки, имеющие не только высокий титр, но и достаточное содержание антител, обладающих высокой константой связывания (высокоаффинных антител).
Аффинность антител. Традиционные методы определения аффинности антител, позволяющие вычислять константу равновесия,
основанные на изучении связывания меченого антигена с антителами, были изложены в гл. 2, § 3. В основном в таких экспериментах применяются иммобилизованные антитела и антигены, ме-
159
ченные радиоактивной меткой (не вносящей существенных изме- ' нений в структуру антигена).
При использовании ферментных меток химическая структура меченого антигена может существенно отличаться от немеченого (так, например, могут быть получены конъюгаты с различным мольным соотношением антиген/фермент). В этих случаях полу
Рис. 19. Связывание конъюгата инсулин — пероксидаза (Инс — ПХ) с адсорбированными на полистирольном планшете антителами против инсулина,
ченные значения констант связывания характеризуют, как правило, взаимодействие в дан-ной конкретной системе, вследствие” чего иммунная сыворотка, обладающая высокой аффинностью в реакции с конъюгатом одной структуры, может иметь значительно более низкие значения константы связывания с конъюгатом, полученным другим способом.
Если исследователь имеет дело с разработкой конкурентных методов ИФА, т. е. располагает набором иммунных сывороток и конъюгатом антиген-фермент, то важным этапом создания тест-системы яв-
выделенными из разных сывороток:
по оси ординат — оптическая плотность А при 490 нм продукта пероксидазной реакции окисления о-феннленднамнна перекисью водорода. Константы связывания антител из сывороток 1 и 2 (в М—1) равны 1010 и 109 соответствен-
ляется выбор пары антитело— конъюгат, характеризующейся необходимой константой взаимодействия. Для проведения
у-глобулииовую
но; N — контрольная нормальная сыворотка СКрИНИНГЭ
фракцию каждой антисыворотки иммобилизуют на поверхности микропланшета и изучают ее связывание с имеющимся набором конъюгатов. Эффективное значение Кевяз является величиной, обратной значению концентрации конъюгата, при которой связывается 50% активных центров на
носителе.
На рис. 19 приведены кривые связывания иммобилизованных
на полистироле антител к инсулину с конъюгатом инсулин — пероксидаза. Исследуемые сыворотки различаются по значениям эффективных констант равновесия. Для количественного определения инсулина могут быть использованы антисыворотка и конъюгат, эффективная константа связывания которых ~109 М-1. Для других тест-систем допустимое значение К3ф будет определяться требованиями, предъявляемыми к чувствительности и точности разрабатываемого метода.
Описанная процедура скрининга иммунных сывороток, как отмечалось выше, применима при наличии конъщгата антиген — фер-
160
мент. Получение такого конъюгата для широкого круга антигенов представляется непростой задачей. Более универсальным реагентом (коммерческим) являются антитела, меченные ферментом, поэтому остановимся на более общем подходе к определению аффинности антител в сыворотке или асците, основанном на твердофазном ИФА. Этот метод, предложенный Б. Фриге, позволяет определять константу связывания антител с антигеном (немечен-ным) при их взаимодействии в растворе.
Постановка метода включает две основных стадии: 1) проведение реакции антиген — антитело в растворе; 2) определение концентрации антител после установления равновесия с помощью метода твердофазного ИФА. Схема реакции в растворе в общем случае имеет вид
Аг-ф Ат	Аг Ат.	;
Обозначим равновесную концентрацию связанных антител как ВР, а концентрацию свободного антигена как Ер, тогда можно записать следующее выражение (известное как уравнение Клотца):
Вр = [Ат]0 — 1Ат];
Fp=[Ar]0-Bp.
(5.1)
(5-2)
(5-3)
Если концентрации антител [Ат]0 и [Ат] определять методом непрямого твердофазного ИФА, то при определенных условиях проведения эксперимента .будет выполняться соотношение [Ат]/ [Ат]о=А/Ао, где А и Ао — значения оптических плотностей, регистрируемых в ИФА, соответствующие концентрациям антител [Ат] и [Ат]0. Уравнение Клотца при этом условии может быть приведено к виду
Таким образом, для определения Кд описанным выше методом необходимо знание начальной концентрации антител [Ат] о. Однако практически нахождение Кд проводится в иммунных сыворотках, или асцитах, где точная концентрация антител [Ат]о неизвестна. Если проводить реакцию комплексообразования в избытке антигена, то количество связавшегося антигена незначительно по сравнению с исходным и его концентрация после установления в системе равновесия будет близка к исходной т е. [Аг]о«Ер. Если эксперимент проводится так, что выполняется условие [Аг] о >10[Ат] о, то
[Ат1,^5^-«1Аг1„ л0
6—627
(5.5)
161
ченные радиоактивной меткой (не вносящей существенных изме- ' нений в структуру антигена).
При использовании ферментных меток химическая структура меченого антигена может существенно отличаться от немеченого (так, например, могут быть получены конъюгаты с различным мольным соотношением антиген/фермент). В этих случаях полу
Рис. 19. Связывание конъюгата инсулин — пероксидаза (Инс — ПХ) с адсорбированными на полистирольном планшете антителами против инсулина,
ченные значения констант связывания характеризуют, как правило, взаимодействие в дан-ной конкретной системе, вследствие” чего иммунная сыворотка, обладающая высокой аффинностью в реакции с конъюгатом одной структуры, может иметь значительно более низкие значения константы связывания с конъюгатом, полученным другим способом.
Если исследователь имеет дело с разработкой конкурентных методов ИФА, т. е. располагает набором иммунных сывороток и конъюгатом антиген-фермент, то важным этапом создания тест-системы яв-
выделенными из разных сывороток:
по оси ординат — оптическая плотность А при 490 нм продукта пероксидазной реакции окисления о-феннленднамнна перекисью водорода. Константы связывания антител из сывороток 1 и 2 (в М—1) равны 1010 и 109 соответствен-
ляется выбор пары антитело— конъюгат, характеризующейся необходимой константой взаимодействия. Для проведения
у-глобулииовую
но; N — контрольная нормальная сыворотка СКрИНИНГЭ
фракцию каждой антисыворотки иммобилизуют на поверхности микропланшета и изучают ее связывание с имеющимся набором конъюгатов. Эффективное значение Кевяз является величиной, обратной значению концентрации конъюгата, при которой связывается 50% активных центров на
носителе.
На рис. 19 приведены кривые связывания иммобилизованных
на полистироле антител к инсулину с конъюгатом инсулин — пероксидаза. Исследуемые сыворотки различаются по значениям эффективных констант равновесия. Для количественного определения инсулина могут быть использованы антисыворотка и конъюгат, эффективная константа связывания которых ~109 М-1. Для других тест-систем допустимое значение К3ф будет определяться требованиями, предъявляемыми к чувствительности и точности разрабатываемого метода.
Описанная процедура скрининга иммунных сывороток, как отмечалось выше, применима при наличии конъщгата антиген — фер-
160
мент. Получение такого конъюгата для широкого круга антигенов представляется непростой задачей. Более универсальным реагентом (коммерческим) являются антитела, меченные ферментом, поэтому остановимся на более общем подходе к определению аффинности антител в сыворотке или асците, основанном на твердофазном ИФА. Этот метод, предложенный Б. Фриге, позволяет определять константу связывания антител с антигеном (немечен-ным) при их взаимодействии в растворе.
Постановка метода включает две основных стадии: 1) проведение реакции антиген — антитело в растворе; 2) определение концентрации антител после установления равновесия с помощью метода твердофазного ИФА. Схема реакции в растворе в общем случае имеет вид
Аг-ф Ат	Аг Ат.	;
Обозначим равновесную концентрацию связанных антител как ВР, а концентрацию свободного антигена как Ер, тогда можно записать следующее выражение (известное как уравнение Клотца):
Вр = [Ат]0 —[Ат];
Fp=[Ar]0-Bp.
(5.1)
(5-2)
(5-3)
Если концентрации антител [Ат]0 и [Ат] определять методом непрямого твердофазного ИФА, то при определенных условиях проведения эксперимента .будет выполняться соотношение [Ат]/ [Ат]о=А/Ао, где А и Ао — значения оптических плотностей, регистрируемых в ИФА, соответствующие концентрациям антител [Ат] и [Ат]0. Уравнение Клотца при этом условии может быть приведено к виду
Таким образом, для определения Кд описанным выше методом необходимо знание начальной концентрации антител [Ат] о. Однако практически нахождение Кд проводится в иммунных сыворотках, или асцитах, где точная концентрация антител [Ат]о неизвестна. Если проводить реакцию комплексообразования в избытке антигена, то количество связавшегося антигена незначительно по сравнению с исходным и его концентрация после установления в системе равновесия будет близка к исходной т е. [Аг]о«Ер. Если эксперимент проводится так, что выполняется условие [Аг] о >10[Ат] о, то
[Ат1,^5^-«1Аг1„ л0
6—627
(5.5)
161
тогда уравнение Клотца преобразуется к виду
Ад _ J I Кц
Ад —А	[Аг]0 •
(5-6)
Если представить экспериментальные данные в координатах А о/ (Л о—А) 4-1/[Аг] о, то по тангенсу угла наклона прямой можно рассчитать Кл.
Рис. 20. Определение константы диссоциации (ла) комплекса пероксидаза — антитела к пероксидазе в координатах Клотца: кривые 1 и 2 соответствуют значениям 1,1 * 10-9 и 2,2 • 10-9 М
Рис. 21. Кинетика связывания моноклональных антител с инсулином, адсорбированным иа полнстирольном планшете для ИФА из раствора концентрации I мкг/мл. Комплекс инсулин — антитело выявлен меченными пероксидазой антимышиными IgG: по оси ординат •— оптическая плотность А при 405 им продукта пероксидазного окисления ABTS перекисью водорода
Таким образом, для практического осуществления' описанного метода необходимо, прежде всего, установить наличие линейной зависимости между концентрацией определяемых непрямым методом ИФА антител и регистрируемым значением оптической плотности. Для этого готовят серии разведений исследуемой иммунной сыворотки и изучают их связывание в непрямом методе ИФА. Обычно эти зависимости имеют, вид кривых с насыщением. Для проведения эксперимента выбираются разведения антисыворотки, лежащие в линейном диапазоне кривой. Для установления равновесной константы диссоциации комплекса Аг-Ат концентрацию антигена варьируют в диапазоне от 10~6 до 10-8 М. На рис. 20 приведен график для определения Кл комплекса ПХ-Ат. Однако вычисленные этим методом значения констант диссоциации комплекса Ат- Аг являются эффективными, поскольку при выборе уравнения не учитывается влияние взаимодействия антител с антигеном, сорбированным на твердой фазе, на равновесие в растворе.
Экспериментально контроль влияния иммобилизованного антигена на равновесие в реакции Аг—Ат в растворе осуществляется 162
сравнением сигналов, полученных на стадии твердофазного ИФА в двух соседних рядах лунок. Для этого содержимое лунок одного ряда переносится во второй свободный, обработанный аналогично первому, после чего сравнивают значения сигналов. Если наблюдаемые различия не превышают 10% (что обычно достигается при проведении измерения в кинетическом режиме через 5— 15 мин), то можно полагать, что влияние иммобилизованного антигена на равновесия Аг—Ат в растворе незначительно.
Более точная оценка общего случая с учетом влияния иммобилизованного антигена может быть дана в рамках модели связывания лиганда с несколькими независимыми центрами связывания:
п	п
Аг-|-^ Ат;^2 Bi (на носителе);	(5.7)
i=l	1=1
Аг -}-Ат В (в растворе)	(5.8)
Если Д'* —константа связывания антител с иммобилизованным центром связывания (Аг), а [Ат*]г- — концентрация различных субпопуляций антител, связывающихся с иммобилизованным антигеном, то нетрудно показать, что в этом случае окончательное выражение уравнение Клотца будет иметь вид
.	/л	\
_лт=1+к^+2к;1АТ.1^.	(5.9)
п
Обозначим (1+2к*/1Ат*]Ог) как С. Параметр С для реакций ряда /=1
антигенов был найден экспериментально, значение его не превышает 2—2,5. При этом оценка С получена в предположении, что реакция антител с иммобилизованным антигеном достигает равновесия. Кинетика этого процесса представлена на рис. 21, из которого видно, что время установления равновесия значительно больше используемого в эксперименте при определении константы. Поэтому полученное значение С является максимальным и максимальная ошибка, которая допускается при определении Кд, составляет 200—250%.
Метод может быть использован для вычисления констант связывания как поликлональных, так и моноклональных антител.
6*
Моноклональные антитела
и их применение в анализе
6
§ 1. Получение гибридом
Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гиб-ридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Мильштейном в результате соматической  гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном. К настоящему времени отобраны такие варианты миелом (например, линии Х63-А8.6.5.3, р2/0-А и др), которые не способны синтезировать собственные иммуноглобулины, и вся «гибридомная продуктивность» выражается и синтезе огромного количества моноклональных антител с интересующей исследователя специфичностью.
Другой особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфори-бозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК- Этот фермент обеспечивает запасный путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора — аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-сре-да), такие миеломные клетки размножаться не способны. Вторым партнером для слияния служат иммунные лимфоидные клетки селезенки или лимфоузлов, которые сами по себе нежизнеспособны в культуре. Сомати
ческая гибридизация клеток миеломы и лимфоцитов может осуществляться спонтанно, однако выход гибридом возрастает в присутствии 40—50% полиэтиленгликоля с ЛГг=4000 и 7,5% диметилсульфоксида. Высокий выход гибридом может быть получен в приборе для электрослияния.
Гибридомы отбирает по их свойству размножаться на НАТ-сре-де. Присущая миеломным клеткам способность к быстрому размножению восстанавливается за счет привнесения клеткам селезенки генов, ответственных за синтез предшественников ДНК по запасному пути. Селекция на НАТ-рреде позволяет избавиться от миеломных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).
Далеко не все клетки, растущие на НАТ-среде, являются гибри-домами — продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важнейшим этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Содержание антител в культуральной жидкости на этих стадиях роста клеток составляет 10—100 нг/мл.
Однако выявленные на этой стадии антитела необязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Клонирование осуществляют двумя основными способами — в полужидком агаре и методом предельных разве* дений.
При клонировании по первому методу клетки высевают иа питательную среду с агаром. Из каждой клетки в течение 8—10 дней вырастают колонии, видимые под микроскопом. Колонии могут быть отобраны из агара пастеровской пипеткой и перенесены в жидкую питательную среду для микротитрования таким образом, чтобы одна клетка попадала в каждые 3—6 лунок. Клоны, синтезирующие антитела нужной специфичности, сначала переносят в лунки больших размеров, а затем наращивают в специальных флаконах для культивирования. Важной особенностью клонирования является то, что оно позволяет не только избавиться от клеток, потерявших способность синтезировать антитела, ио и позволяет отобрать клоны нужной специфичности со стабильными наследственными свойствами. Основным критерием моноклональности
165
гибридомных антител является постоянство положения соответствующих моноклональным антителам белковых зон на изоэлектрофореграммах после многократного клонирования.
Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5—10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа «Биосилон», выпускаемых фирмой Нунк, количество антител увеличивается до 100 мкг/мл.
• Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миеломных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15 мг антител на 1 мл асцитной жидкости.
Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило одним из стимулов для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антигенсвязывающих центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой — к ферменту, используемому в качестве метки. Можно ожидать, что гибридные моноклональные антитела окажутся ценным терапевтическим средством, поскольку одновременно позволяют вводить в организм лекарственные соединения и осуществлять их направленный транспорт.
Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропином, были успешно использованы для изучения локализации соматотропина в клетке.
В настоящее время в основном получают гибридомы, синтезирующие моноклональные антитела мышиных или крысиных изотипов. Выбор животных определяется наличием соответствующих миеломных линий. Однако мышиные моноклональные антитела не всегда можно применять в медицинских целях. Для получения изотипов человека были сделаны попытки гибридизации крысиных миелом с 166
человеческими лимфоцитами. Однако практического значения такие гибридомы не нашли из-за генетической нестабильности. Более успешным оказались эксперименты, в которых для слияния используют лимфоциты периферической крови человека и человеческие опухолевые клетки. Такие гибридомы синтезируют моноклональные антитела к антигенам, участвующим в возникновении аутоиммунных заболеваний.
Получение моноклональных антител с более низкой антигенностью по отношению к человеку может быть осуществлено с помощью генноинженерных методов. Моноклональные антитела, созданные с помощью этого подхода («химерные»), включают активный центр из иммуноглобулина мыши, а остальную часть молекулы, Fc-фраг-мент, — из иммуноглобулина человека.
Методы по получению моноклональных антител постоянно развиваются и совершенствуются. Это позволило расширить границы их применения в практических целях и сделать целый ряд открытий теоретического характера в области молекулярной биологии и иммунохимии.
Получение гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела к инсулину. Материалы.
1.	Полная среда Дульбекко в модификации Игла (ДМЕМ-среда): 450 мл ДМЕМ; 5 мл пирувата натрия (100 мМ); 5 мл пенициллина и стрептомицина (10 000 ед. в 1 мл); 5 мл L-глутамина (200 мМ); 0,25 мл 2-меркаптоэтаиола (0,1 М); 50 мл фетальной сыворотки теленка.
2.	НАТ-среда и НТ-среда. Содержат 1  10~4 М гипоксантина, 1,6-10~5 М тимидина, 4-10~7 М амииоптирина в полной ДМЕМ-среде.
3.	Солевая среда, содержащая глюкозу (автоклавируется или стерилизуется фильтрованием): 8 г NaCl; 0,4 г КС1; 1,77 г Na2HPO4X2H2O; 2 г глюкозы; 0,01 г фенолового красного; вода до 1 л.
4.	«Сшивающий» раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ): 50% ПЭГ, Л1г = 4000; 45% солевой среды, содержащей глюкозу; 5% диметилсульфоксида.
5.	Замораживающая среда: 9 мл сыворотки (фетальной или лошадиной); 1 мл диметилсульфоксида.
Иммунизация мышей. 30—50 мкг инсулина растворяют в 0,1 мл 0,15 М раствора NaCl, pH 7,4; смешивают с равным объемом адъюванта Фрейнда и вводят мышам внутрибрюшинно. Через 4—5 недель повторно вводят 30 мкг инсулина в неполном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно. За 3—4 дня до слияния вводят 20 мкл инсулина без адъюванта внутрибрюшинно и 10 мкг внутривенно.
Слияние клеток. Селезенку иммунизированной мыши измельчают в стеклянном гомогенизаторе, заполненном солевой средой с глюкозой. 108 селезеночных клеток и 2-107 миеломных клеток мыши промывают солевым раствором с глюкозой, центрифугируют 10 мин при 200g. Надосадочную жидкость осторожно удаляют пипеткой. К осадку в течение 1 мин по каплям добавляют 0,5 мл «сшивающего» раствора ПЭГ, разбивая осадок. Суспензию оставляют стоять 10 мин, после этого разбивают комки клеток пропусканием через пипетку. Клетки суспензируют в 50 мл НАТ-среды и разливают по
167
100 мкл в 96-луночные микроплаты, содержащие 15 000 перитональ-ных макрофагов на лунку.
Клетки выращивают в увлажненном термостате при 37°С в атмосфере 5% СО2. Через первые 3 дня, а затем дважды в неделю >/з среды удаляют пастеровской пипеткой и заменяют свежей НАТ-средой. Через 7—10 дней НАТ-среду заменяют НТ-средой. Когда растущие на селективной среде клетки занимают 10—20% площади лунки, недостаточную , культуральную жидкость тестируют на наличие специфических антител.
Тестирование гибридом. Пипеткой удаляют по 50 мкл среды из каждой лунки платы для культивирования и переносят среду в лунки полистирольных плат, на поверхности которых сорбирован антиген. Инкубируют 1 ч при 37°С и отмывают непрореагировавшие компоненты 0,01 М фосфатом натрия, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20 (ФБРТ). В лунки добавляют 50 мкл конъюгата кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой, растворенного в фосфатном буфере с тритоном (ФБР), содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, инкубируют 1 ч при 37°С, после чего промывают лунки ФБТ 3 раза. Для определения ферментативной активности лунки заполняют 0,2 мМ раствором ABTS в 0,05 М цитратном буфере pH 4,0, содержащем 0,1 мМ Н2О2. Результаты реакции учитывают через 30 мин, проводя измерения на фотометре при 412 нм.
Клонирование гибридом методом предельных разведений. Содержимое лунок, показавших положительный результат при тестировании, изучают под микроскопом и оценивают, содержат ли они одну или большее число гибридом. Клетки разводят до концентрации 3 клетки/мл и распределяют по 0,2 мл в 96-луночные микроплаты, в которых содержится 5-104 филерных клеток (макрофагов или тимоцитов) на лунку. Отдельные клоны клеток, выросшие в лунках через 10 дней, тестируют методами иммуноферментного анализа, как описано выше.
Наращивание гибридом. Клоны, которые оказались положительными, наращивают, пока они не займут 2/3 поверхности 96-луночной платы. После этого их переносят в лунки 24-луночных плат, содержащих по 1 мл ростовой среды. Через несколько дней клетки из нескольких лунок этих плат объединяют и переносят в 50 мл флаконы для культивирования. Оптимальная для роста плотность клеток — 500 тыс. на 1 мл. После этого клетки могут быть помещены в сосуды для культивирования объемом 250 мл и более.
Наращивание гибридом в виде асцитов. Мышам линии Balb/c 2—3-месячного возраста внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекана). Через 7 дней мышам вводят 106—107 клонированных гибридомных клеток в 0,5 мл ДМЕМ-рос-товой среды. Клетки должны находиться в экспериментальной фазе роста. На 14—21-й день отбирают 4—5 мл асцитной жидкости.
Замораживание гибридомных клеток. Замораживание необходи
168
мо осуществлять на всех стадиях получения гибридом. Скорость снижения температуры 1° в 1 мин. В специальные стерильные ампулы для замораживания, охлажденные до 0°С, помещают 107 клеток, суспензированных в фетальной сыворотке, содержащей 5% диметилсульфоксида. Ампулы помещают на ночь в холодильник (—70°С). На следующий день ампулы переносят в жидкий азот.
Размораживание клеток проводят быстро, помещая пробирки в водяную баню с /=37°С. Размороженные клетки разводят 10 мл гиб-ридомной среды и осаждают центрифугированием. Осадок ресус-пензируют в ростовой гибридомной среде до плотности 4- 10s кле-ток/мл и помещают по 0,2 мл в 96-луночные микроплаты. Только что размороженные клетки хорошо растут при концентрации сыворотки в среде 20%. После того как начался рост, концентрацию сыворотки уменьшают до 5—10%.
Хранение моноклональных антител. Моноклональные антитела могут быть сохранены в виде лиофильно высушенной культуральной жидкости, однако при этом часто происходит потеря иммунологической активности. Культуральная надосадочная жидкость хорошо хранится в течение 1 г при 4°С в присутствии 0,1% азида натрия. Она может быть сохранена неопределенно долго при замораживании (/=70°С); при этом необходимо избегать повторного замораживания и оттаивания.
Асцитная жидкость полностью стабильна при хранении в стерильном состоянии при 4°С. В течение долгого времени моноклональные антитела могут храниться при 4°С в 50%-ном сульфате аммония.
§ 2. Использование моноклональных антител в иммуноанализе
Основным достоинством моноклональных антител является возможность их получения в неограниченных количествах с идентичными от партии к партии физико-химическими характеристиками. Это позволяет создавать на их основе стандартные диагностические реагенты.
Хотя сам процесс получения гибридом достаточно трудоемок и дорог, тем не менее, после того как гибридома получена, крупномасштабное производство моноклональных антител стоит довольно дешево и все затраты на получение гибридом себя оправдывают. В качестве недостатка моноклональных антител часто указывают на нестабильность гибридом и возможную потерю ими продукции. Однако большинство гибридом достаточно стабильно, если их ре-клонировать 1—2 раза в год.
• Большим преимуществом использования гибридом является то, что в процессе клонирования и отбора исследователь может выбрать гибридомы с желательными для него свойствами в отношении специфичности взаимодействия, констант аффинности, физико-хими-
169
ческих свойств, влияющих на возможности их использования в анализе. Получить поликлональные антитела с нужными свойствами из сыворотки животных значительно труднее.
Все моноклональные антитела имеют одинаковую специфичность, одинаковы по аффинности, относятся к одному классу и подклассу. Поскольку моноклональные антитела являются нормальным компонентом иммунного ответа организма, то ойи могут распознавать общие эпитопы на разных антигенах или полиморфные формы одного и того же эпитопа. Однако моноклональные антитела могут распознавать только одну из полиморфных форм эпитопа и могут не распознавать другие полиморфные формы молекулы антигена.
В очень редких случаях может наблюдаться перекрестная реактивность моноклональных антител по отношению к неродственным антигенам. Это связано со сходным пространственным распределением зарядов, полярности и гидрофобности на отдельных участках таких молекул. Подобная ситуация реализуется, например, при взаимодействии эндорфинов и алкалоидов с одними и теми же клеточными рецепторами. Однако по отношению к моноклональным антителам перекрестная реактивность подобного рода наблюдается крайне редко. Размеры структур, распознаваемых моноклональными антителами, меньше, и распознаются они точнее, чем структуры, распознаваемые смесью поликлональных антител. Учитывая то, что антигенсвязывающий центр антител имеет полицентровую структуру, необходимо помнить, что направленность моноклональных антител к одному эпитопу и высокая специфичность не исключает возможности их перекрестной реактивности с эпитопами схожей химической структуры, хотя при этом обычно наблюдается различие констант связывания.
Высокая специфичность моноклональных антител позволяет создать иммуноферментные диагностикумы для определения антигенов, которые имеются в ограниченных количествах или же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом может быть использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген необходим на стадии тестирования гибридом; однако при наличии высокочувствительного метода определения нужные количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. После получения гибридомы антиген может быть выделен методом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в Вы-сокоочищенном состоянии в значительных количествах антиген в дальнейшем может быть использован в составе иммуноферментных диагностикумов.
Специфичность моноклональных антител. Основным свойством, на котором основано применение моноклональных антител в иммуноанализе, является высокая специфичность взаимодействия. Поликлональные антисыворотки часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным 170
их использование в иммуноанализе. Такая ситуация реализуется при дифференциальной диагностике гипофизарных гормонов: человеческого гонадотропина, фолликулстимулирующего, лютеинизирующего и тиреотропного гормонов. Эти гликопротеины состоят из двух субъединиц а и 0. а-Субъединица имеет первичную структуру, идентичную для всех гормонов, а 0-субъединица — различную. Использование поликлональных антисывороток, содержащих антитела к обеим субъединицам, делает невозможным количественное определение этих гормонов в крови из-за высокой перекрестной реактивности. Однако если в качестве аналитических реагентов применять моноклональные антитела к 0-субъединице, каждый гормон может быть определен с высокой степенью точности. Более того, использование пары моноклональных антител, одно из которых направлено к 0-субъединице и иммобилизовано на нерастворимом носителе, а другое — к а-субъединице и помечено ферментом, позволяет определять концентрацию физиологически активных форм гормонов. В крови присутствуют как физиологически активные а, 0-димеры,. так и неактивные а и 0-мономеры. Поликлональные антисыворотки, выработанные к изолированной 0-субъединице, выявляют в крови неактивную 0-субъединицу, что приводит к ошибкам при диагностическом определении.
Использование моноклональных антител впервые дало возможность со 100%-ной специфичностью определять раковоэмбриональный антиген, который представляет собой гликопротеин с Мт= =200 000, несущий на своей поверхности множество эпитопов. Часть этих эпитопов является общей с другими белками, кроме того, на поверхности гликопротеина имеется еще нескодько антигенов, отличных от раковоэмбрионального, которые входят в состав незлокачественных опухолей и здоровых тканей.
Иммунизация животных высокоочищенным раковоэмбриональным антигеном приводит к выработке антител, не способных в диагностических тестах различать злокачественные и незлокачественные опухоли. Однако на поверхности раковоэмбрионального антигена находится специфическая антигенная детерминанта, отсутствующая на других антигенах. На основе этого было предложено применять двухцентровой моноклональный диаг-ностикум, где одно из антител было направлено к уникальной антигенной детерминанте и иммобилизовано, а другое антитело было помечено р-галактозидазой и использовано для выявления антигена в «сэндвич»-модификации анализа. С помощью диагности-кума должно обнаружить 0,5 мкг/л раковоэмбрионального антигена; кроме того, этот диагностикум обладает повышенной специфичностью.
Использование моноклональных антител, направленных к двум различным антигенным детерминантам на антигене («сэндвич»-мо-дификация иммуноанализа), позволяет сократить время анализа. При употреблении поликлональных антисывороток иммуноанализ
171
осуществляется в две стадии. Вначале к иммобилизованным на твердом носителе антителам добавляют антиген, инкубируют с ним, затем отмывают от его избытка и на второй стадии добавляют антитела, меченные ферментом. Такая последовательность связана с тем, что ферментный конъюгат, как правило, добавляют в значительном избытке по сравнению с концентрацией антигена и иммобилизованных антител. В этих условиях конъюгат конкурирует с иммобилизованными антителами за связывание с антигеном и искажает, а иногда и делает невозможным определение. Использование же пары неконкурирующих моноклональных антител, направленных к различным антигенным детерминантам, позволяет одновременно добавлять к иммобилизованным антителам анализируемый антиген и иммуноферментный конъюгат, что существенно сокращает время проведения анализа.	(
Отбор моноклональных антител по специфичности взаимодействия с антигеном. Для того чтобы оценить возможности моноклональных антител в иммуноанализе, необходимо в первую очередь выявить их способность перекрестно реагировать с другими соединениями. Поскольку процесс получения гибридом длителен и трудоемок, определение специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном желательно проводить на как можно более ранних этапах после их получения.
Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением TSP-планшетов. TSP-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов TSP-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку TSP-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью.
Количественная оценка степени перекрестной реактивности антигенов. В ряде случаев трудно бывает достичь абсолютной специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном, но такие антитела, тем не менее, могут быть использованы в иммуноанализе при условии, что концентрация перекрестно реагирующих антигенов в анализируемых образцах невелика.
172
Для некоторых целей бывает необходимо получить моноклональные антитела с максимально широким спектром перекрестной реактивности. Количественная характеристика перекрестной реактивности определяется по степени ингибирования связывания моноклональных антител с иммобилизованным агентом в присутствии растворимого перекрестно реагирующего антигена. Степень перекрестной реактивности исследуемых антигенов характеризуют индексом «/50», представляющим собой концентрацию конкурирующего антигена, которая достаточна для ингибирования на 50% процесса связывания фиксированного количества моноклональных антител с иммобилизованным антигеном, использованным для получения моноклональных антител.
Полуколичественная оценка /50 на ранних стадиях культивирования гибридом может быть осуществлена методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки платы для микротитрования, покрытые антигеном, использованным для получения моноклональных антител, помещают по 25 мкл растворенного в фосфатно-солевом буфере с тритоном перекрестно реагирующего антитела, концентрацию которого варьируют от 1 • 10~6 до 1 • 10-10 М. Затем в каждую лунку добавляют 25 мкл среды культивирования гибридом, разведенной в 2 раза буфером, содержащей моноклональные антитела. Аналогичным образом параллельно титруют исходный антиген, к которому были получены моноклональные антитела. В качестве контроля титрование сходного и перекрестно реагирующего антигенов осуществляют в присутствии 25 мкл разведенной в 2 раза среды культивирования гибридом, не содержащей моноклональных антител. Контрольные и опытные образцы инкубируют 1 ч при 37°С, а затем обрабатывают планшеты по методике для проведения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.
• Оценивая значение оптического поглощения раствора субстрата после внесения его в лунки микроплаты, выявляют те концентрации конкурирующих антигенов, которые ингибируют на 50% связывание моноклональных антител с иммобилизованным на полистироле антигеном. Степень перекрестной реактивности оценивают отношением /5о перекрестно реагирующего антигена к /50 исходного: чем оно больше, тем меньше степень перекрестной реактивности.
Отбор моноклональных антител, связывающихся с различными эпитопами на антигене. Для высокоспецифического выявления ряда антигенов наиболее удобной является «сэндвич»-модификация твердофазного иммуноферментного анализа. Использование в таком типе анализа двух моноклональных антител, взаимодействующих с разными эпитопами, позволяет сократить время анализа. Кроме того, такие пары моноклональных антител в ряде случаев обладают большей авидностью по сравнению с аффинностью каждого отдельного антитела. Для выявления антител, связывающихся с различными центрами на антигене, обычно используют три метода.
173
Первый заключается в химическом или ферментативном расщеплении взаимодействия с моноклональными антителами.
Второй метод основан на формировании преципитатов в случае, когда все молекулы антител связываются одновременно. Этот метод очень прост, однако обладает низкой чувствительностью.
Третий метод состоит в приготовлении моноклональных антител, меченных ферментом или радиоизотопом, и определении возможности меченых и немеченых моноклональных антител конкурировать за одни и те же центры связывания на антигене. Этот метод обладает высокой точностью, однако требует введения метки в каждый вид антител и оценки конкуренции для каждой пары. Этот метод не применяется, если необходимо проанализировать моноклональные антитела большого количества гибридом. Необходимо иметь в виду, что на ранних стадиях получения гибридом количество имеющихся в наличии моноклональных антител ограничено. Это делает невозможным их отбор рассматриваемым методом.
Наиболее простым и чувствительным способом выявления антител, способных одновременно связываться с антигеном, является тест на аддитивность связывания. Предварительная очистка и введение метки в моноклональные тела в этом случае не нужны. В основе метода лежит оценка числа антигенных центров, одновременно доступных для пары антител. Определение осуществляется методом непрямого твердофазного иммуноферментногб анализа. Основным условием при этом является полное насыщение антигена обоими типами антител. Поэтому на первой стадии Эксперимента необходимо получить кривые насыщения антигена аСцитлой или культуральной жидкостью, содержащей анализируемые антитела, и затем определить максимальную оптическую плотность в иммунофермент-ном тесте, достигаемую при насыщении.
Для того чтобы проверить, действительно ли антиген насыщен антителами и выход кривой титрования на плато достигается не за счет низких концентраций иммуноферментного конъюгата, эксперимент повторяют с удвоенной концентрацией последнего. Если оптическая плотность при этом существенно не изменяется по сравнению с предыдущим экспериментом, считают, что насыщение достигнуто.
Затем в каждую лунку покрытого антигеном планшета для микротитрования добавляют растворы, содержащие количества моноклональных антител, определённые в предыдущих экспериментах. Если оптическая плотность, полученная при инкубации антигена с парой антител, близка к сумме оптических плотностей, полученной для каждого моноклонального антитела в отдельности при насыщении, то это означает, что два антитела связываются с антигеном одновременно. Если же оптическая плотность близка, к достигаемой, каждым раствором антитела по отдельности, то они конкурируют за связывание с одним и тем же центром на антигене. Количественно полученные результаты выражают с помощью ин-174
дексЬ, аддитивности (ИА):
At + А2 ai+2 ---------
ИА =----------------------
Ai -4- Аз
(А1 + А2) —	-
100%,	(6.1)
где Ль Л2 и Лц-2 — оптическая плотность, измеряемая в непрямом твердофазном иммуноферментном тесте с первым антителом в отдельности, вторым антителом в отдельности и двумя антителами вместе.
Если два антитела связываются с одним и тем же центром, то А14-2= (Ai + A2)/2, и ИА=0. Если же два антитела связываются независимо с различными участками, Ai4-2= (Ai + A2) и индекс аддитивности должен быть равен 100%.
Отбор моноклональных антител по константам связывания с антигеном. Для количественного определения антигенов, содержащихся в биологических жидкостях в низких концентрациях, необходимо иметь моноклональные антитела с высокими константами аффинности. При этом для отбора соответствующих' гибридом на сравнительно ранних стадиях их получения важно, чтобы применяемые методы определения констант не зависели от больших количеств антител. Достаточно удобным для этих целей является ранее описанный выше метод Фрикста.
/ /
Методы получения конъюгатов для иммуноферментного анализа
7
В ИФА используются конъюгаты антигенов (гаптенов) и антител с различными белками, синтетическими полимерами, ферментами и их субстратами и кофакторами.
• Отметим основные задачи ИФА, связанные с необходимостью синтеза конъюгатов:
1)	получение специфических антисывороток к низкомолекулярным соединениям— гаптенам;
2)	получение меченных ферментом или субстратом антигенов (гаптенов) и антител;
3)	получение иммобилизованных на твердой фазе гаптенов через конъюгат гаптен-носитель (белок, полимер).
Разработка высокочувствительных и специфических методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов, обладающих определенными характеристиками.
• В этой связи можно сформулировать основные требования, которым должны удовлетворять методы синтеза различного рода конъюгатов:
1)	должны сохраняться ферментативные, иммунологические или антигенные свойства конъюгата;
2)	конъюгат должен легко выделяться из реакционной смеси при использовании соответствующих методов очистки;
3)	выход конъюгата должен быть достаточно высоким;
4)	конъюгат должен быть определенного состава;
5)	иолученный конъюгат должен быть стабильным при хранении.
 \
\	§ 1. Синтез конъюгатов гаптенов
с носителями для получения антител
Для того чтобы гаптен обладал иммуногенными свойствами, необходимо получить конъюгат гаптена с высокомолекулярным носителем. В качестве носителей обычно используют бычий сывороточный альбумин (БСА), альбумин сыворотки человека, овальбумин, тироглобулин и синтетические пептиды типа полилизина. Особых преимуществ у какого-либо носителя не отмечено и поэтому чаще всего им является наиболее доступный белок — БСА. Для хороших иммуногенных свойств конъюгата важно число молекул гаптена, конъюгированных с носителем. Показано, что слишком малое и слишком большое количество молекул гаптена, пришитых к носителю, ухудшает иммуногенные свойства. Для конъюгирования с БСА, по-видимому, наиболее оптимально вводить 10—20 молекул гаптена на молекулу носителя.
Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен.
Кроме количества молекул гаптена, конъюгированных с носителем, важно также, через какую группу связывается гаптен с носителем. Специфичность иммуногена будет тогда выше, когда функциональные группы гаптена (антигенные детерминанты) удалены от места связывания с носителем. Этот факт необходимо учитывать, например, при получении конъюгатов стероидов с носителем.
Методы конъюгирования гаптенов с носителями чаще всего основаны на образовании ковалентной пептидной связи между карбоксильной группой гаптена и аминогруппой носителя или, наоборот, аминогруппой пептида с СООН-группой носителя. Если же гаптен не содержит активной функциональной группы, то ее «вводят» различными химическими способами.
В данном разделе схематично будут рассмотрены методы получения конъюгатов гаптен-носитель для иммунизации.
177
Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Наиболее широко распространен метод сме-шанных ангидридов, который состоит в простом эквимолярном смешивании гаптена (Г) и БСА (Б) с изобутилхлорформиатом и основанием (N-метилморфолин, трибутиламин, триэтиламин): (?)—СООН + С1СОСН2СН(СН3)2—СОО—СОСН2СН(СН3)2—^~^”2 -
5	о
---- (D- C0NH—(б) + с02 + НОСН2СН(СН3)2
где (7^ - гаптен; - белок
Этим методом получаются конъюгаты, содержащие 15—30 молекул гаптена.
Синтез конъюгата №-ацетил-№'-суксиниленвиомицин— БСА.
Раствор 100 мг (0,11 ммоль) №-ацетилвиомицииацетата в 50%-ном диоксане добавляют к раствору 12 мг (0,12 ммоль) янтарного ангидрида в 6 мл диоксана и перемешивают при комнатной температуре. В течение реакции раствор немного подщелачивают 0,1 н NaOH. Через 4 ч диоксаи отгоняют в вакууме и смесь хроматографируют на колонке с сефадексом SH-20 (2,5X95 см), используя в качестве элюента дистиллированную воду. Фракции 29—35 (по 10 мл), содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 56 мг №-ацетил-М'-ге-мисукцииилвиомицина в виде белого аморфного порошка. 50 мг (45 мкмоль) модифицироваииого гаптеиа, содержащего СООН-группу, растворяют в 5 мкл диметилсульфоксида, добавляют при —5 °C при перемешивании 5,5 мкл (50 мкмоль) N-метилморфолина и затем 6,6 мкл (50 мкмоль) изобутилхлорфор-миата. Через 10 мии реакционную смесь добавляют к 50 мг (0,75 мкмоль) БСА, растворенного в 10 мл 50%-ного диоксаиа, и перемешивают 4 ч при 4°C. Во время реакции поддерживают pH 8,5—9,0, добавляя 0,1 н. NaOH, реакционную смесь хроматографируют иа колонке с сефадексом SH-20 (2,5X95) см, уравновешенной дистиллированной водой. Собирают фракции 26—34 (по 10 мл) и лиофилизуют. Получают1 43 мг конъюгата Й6-ацетил-№-сукцинилеивиомицин—БСА в виде белого аморфного порошка.
Конъюгаты могут быть получены и с помощью водорастворимых карбодиимидов, таких, как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид или 1-циклогексил-3- (2-М'-метилморфолино-этил) карбодиимид-га-толуолсульфонат:
(г)—СООН + RN=C=NR'-----Я- бг'У-COOCNR'H ^Z-NH2>-
^11
NR
178
Реакция протекает при комнатной температуре, pH 5, за время от 30 мин до 1 дня.
Если гаптен плохо растворяется в водных растворах, то проводят реакцию в водно-органической среде (диметилформамид, диоксан, тетрагидрофуран).
Синтез конъюгата трийодтиронина—БСА.
к раствору 50 мг БСА в воде добавляют при перемешивании 30 мг водорастворимого карбодиимида и затем 20 мг трийодтиронина в 5 мл диметил-формамида, pH раствора поддерживают при 5,5. Через 30 мии добавляют еще 10 мг водорастворимого карбодиимида и перемешивают 18 ч при комнатной температуре. Раствор диализуют против 0,01М фосфатного буфера в течение 1 дня при 4°С. Хранят при —20°С. К молекуле белка пришивается 13 молекул гаптена.
Другой разновидностью этого способа является метод с использованием N-оксисукцинимида. На первой стадии карбоксильная группа гаптена активируется дициклогексилкарбодиимидом в органическом растворителе и взаимодействует с N-оксисукцинимидом с образованием сукцинимидного эфира. На второй стадии активированный эфир реагирует с аминогруппами носителя с образованием пептидной связи:
1. ГР)—СООН + C,H..N=C=NC,H.,-COO—CNHC,H..  •-
V*oil	oil	xLx	|| oil
C6HnN
co—ch2
HO—n'	I
Vo—CH 2
.co—CH2
COO-N
Vo---CH 2
co—ch2
+ HO—/	|
Vo—ch2
Синтез конъюгата простагландина E% — БСА.
К раствору 100 мг простагландина Ег в 1 мл диметилформамида добавляют 60 мг дициклогексилкарбодиимида и 70 мг N-оксисукцинимида. Смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мии, отфильтровывают выпавший осадок замещеииой мочевины и фильтрат добавляют к раствору 250 мг БСА и 10 мл 0,1М гидрокарбоиата натрия. Реакционную смесь инкубируют при 4°С и течение 2 ч, диализуют протии 0,05 М фосфатного буфера, pH 8,0, и хранят при —20 °C. С каждой молекулой БСА сказывается 15 молекул гаптена.
 Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими аминогруппу. Гаптены с доступной для модификации аминогруппой можно разделить на две группы по способам их конъюгирова-
179
ния с носителями. К первой группе относятся ароматические амины. Аминогруппа этих соединений превращается в диазониевуцэ соль под действием нитрита натрия и серной кислоты, а затем вступает в реакцию с белками при pH 9:
(?>-NH2 -У-2 > (r>-N==N	(f)-N=N-<B)
Реакция протекает по гистидиновому, тирозиновому или триптофановому остаткам белка-носителя. Для гаптенов, содержащих ароматические нитрогруппы, например хлорамфеникол, используют этот же метод получения конъюгатов, причем в данном случае нитрогруппу гаптена предварительно восстанавливают до аминогруппы.
Ко второй группе относятся гаптены, содержащие алифатические аминогруппы. Их конъюгаты получают с помощью водорастворимых карбодиимидов. С помощью другого способа такие амины превращают в n-нитробензоиламиды, которые затем восстанавливают до производного, содержащего ароматическую аминогруппу, и конъюгируют с белком через диазониевую соль:
Гаптены с алифатическими НН2-группами могут быть также конъюгированы с е-аминогруппами белков-носителей через гомоби-функциональные реагенты, такие, как глутаровый диальдегид или толуол-2,4-диизоцианат.
Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими гидроксильную или карбонильную группу. К гаптенам этого класса относятся различные спирты, фенолы, кетоны, сахара, полисахариды, нуклеозиды, а также такие биологически важные соединения, как стероиды. Обычно эти соединения не используют непосредственно для получения конъюгатов, а превращают их в какие-либо производные, содержащие СООН-группу, которые затем конъюгируют с белками, уже описанными способами.
Соединения, включающие ОН-группу, такие, например, как стероиды, обычно превращают в производные с СООН-группой с помощью реакций:
180
1)	этерификации с ангидридами дикарбоновых кислот (например, янтарный ангидрид или малеиновый ангидрид):
/С0Ч
(г)—ОН + Rv	► ©—О—СО—R—СООН
хс(х
где R = —СН2—СН2— (гемисукцииат) или —СН=СН— (гемималеат)
2)	карбоксиметилирования с бром- или иодуксусной кислотой:
Q-OH + хсн2соон —— 0-о—сн2соон
X = Br, I
3)	взаимодействия с фосгеном с образованием хлоркарбонатов:
0—ОН + С0С12 —«- 0—о—СО—С1
Синтез гемисукцината 11 а-оксипрогестерона.
Растворяют в минимальном объеме пиридина 1 la-оксипрогестерон, добавляют 5-кратный избыток янтарного ангидрида и кипятят в колбе с обратным холодильником 20 ч. Раствор выливают в холодную воду и экстрагируют эфиром. После промывки эфирных вытяжек водой продукт экстрагируют раствором гидрокарбоната и осаждают 10%-ным раствором НС1. Вещество переосаждают из CH2CI2 гексаном.
Альдегиды и кетоиы, а также стероиды, содержащие СО-группу, модифицируют с помощью О-(карбоксиметил)гидроксиламина (другие названия этого соединения— карбоксиметоксиамин или аминооксиуксусная кислота). В результате реакции получаются так называемые карбоксиметилоксимы, содержащие СООН-группу, по которой проводят пришивку гаптена к белку-иосителю:
С=0 + NH,—О—СН9СООН —»-
0— C=N
R
О-
сн2соон
R
Синтез 6-0-карбоксиметилоксима 17 ст радиола.
Смесь 0,5 г 6-кето-17р-эстрадиола и 0,5 г О-(карбоксиметил)гидроксиламингидрохлорида растворяют в смеси 60 мл 20%-ного метанола и 40 мл 1 М натрийацетат буфера. Инкубируют реакционную смесь в течение ночи при комнатной температуре и упаривают до 20 мл. Доводят pH раствора до 8,5 с помощью 2 н. NaOH и, раствор экстрагируют 4 раза по 200 мл этилацетатом. Объединенные органические вытяжки промывают 2 раза по 300 мл 0,1 и. NaOH и 2 раза по 500 мл воды. Собирают все водные вытяжки, подкисляют их раствором НС1 до pH 3,0 и экстрагируют 4 раза по 500 мл этилацетатом. Из этих органических вытяжек отгоняют растворитель и вещество перекристаллизовывают из ацетона,
В соединении с фенольными ОН-группами, такими, например, как резерпин, Д7-тетрагидроканнабинол, 17р-эстрадиол и др., кар
181
боксильная группа может вводиться через диазотированную п-ами-нофенилуксусную кислоту:
§ 2. Получение конъюгатов фермент — белок
Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок—фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким, требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок — фермент состава 1 : 1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. В то же время при уменьшении числа молекул фермента, связанных, с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецнфических взаимодействий конъюгата.
Из реакционной смеси конъюгаты выделяют, диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.
В химических методах получения конъюгатов белок-фермент можно выделить две группы по типу сшивающих реагентов — гомо-бифункциональных и гетеробифункциональных. Кроме того, для получения конъюгатов белков с пероксидазой хрена широко используется перйодатный метод. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белок-фермент, основанные на образовании иммунологической связи антиген-антитело.
Перйодатный метод (метод Накане). Этот метод был впервые предложен японскими исследователями Накане и Каваои (1974) и с тех пор наиболее употребим для получения конъюгатов антител или белков с пероксидазой хрена. Суть метода состоит в модификации пероксидазы хрена с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами антител с образованием основания Шиффа. Альдегидные группы в пероксидазе возникают при окислении перйодатом натрия углеводных компонентов фермента, аминогруппы которого предварительно или блокированы 1-фтор-2,4-динитробензолом или протонированы: 
182
Для стабилизации основания Шиффа конъюгат иногда обрабатывают боргидридом натрия. Однако наряду с увеличением стабильности конъюгата при обработке NaBH4 ферментативная активность уменьшается приблизительно на 20%.
Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG по методу Накане.
К-раствору, содержащему 4 мг пероксидазы хрена (/?Z-3,0) в 1 мл воды, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора NaIO4 и перемешивают 20 мии при комнатной температуре. Полученный раствор диализуют против 0,001 М натрия ацетатного буфера, pH 4,4, в течение ночи при 4 °C или хроматографируют на колонке (1X10 см) с сефадексом G-25. К модифицированной пероксидазе хрена добавляют 20 мкл 0,2 М натрий карбонатного буфера pH 9,5, и сразу же 8 мг IgG в 2 мл того же буфера. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, добавляют 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH4 (4 мг/мл) и перемешивают 2 ч при 4 °C. Полученный конъюгат или осаждаю'# насыщенным раствором (NH4)2SO4 и затем диализуют, или хроматографируют иа колонке (1,6X35 см) с сефадексом G-200, собирая фракции, относящиеся к первому пику. Для стабилизации конъюгата, добавляют БСА (1 %),,мертиолат (0,02%) или глицерин (50%) и хранят в небольших порциях при 4 °C.
Получение конъюгатов с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов. Весьма удобным в качестве сшивающего реагента оказался глутаровый альдегид, который взаимодействует с е-аминогруппами лизиновых остатков антител и фермента. Механизм реакции глутарового альдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продукта, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакций можно записать в следующем виде:
183
1 Nh2 + O=CH(CH2)3CH=O -----•- (E)—N=CH(CH2),CH=O
2. (Ё)—N=CH(CH2)3CH=O + NH,—(Ar)-•-
(e)— N=CH (CH2)3CH=N—(At)
Были разработаны одностадийный и двухстадийный методы синтеза. В одностадийном методе глутаровый альдегид добавляют к смеси фермента и белка, а в двухстадийном на первой стадии глутаровым альдегидом обрабатывают только фермент, удаляют избыток альдегида, а затем уже к модифицированному ферменту добавляют белок.
Синтез конъюгатов с применением глутарового альдегида разработан в основном для пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и глюкоамилазы. Недостатком метода является невысокий выход конъюгата (1—10%) и поляризация белков, в результате чего теряется иммунологическая активность. К достоинствам метода относится его простота и то, что качество получаемого конъюгата удовлетворяет необходимым требованиям.
Синтез конъюгата тиротропина с щелочной фосфатазой.
100 мкл суспензии щелочной фосфатазы (концентрация ~5 мг/мл) в 2,6 М (NH4)2SO4 центрифугируют и осадок фермента растворяют в 150 мкл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,8. К 100 мкл этого раствора, содержащего 330 мкг фермента, добавляют 100 мкл тиротропина в ,100 мкл фосфатного буфера и 12 мкл 1,5%-ного раствора глутарового альдегида. После инкубации при 25°C в течение 3 ч реакционную смесь диализуют в течение ночи в 200 мл фосфатного буфера.
Синтез конъюгата IgG с щелочной фосфатазой с помощью глутарового альдегида (одностадийный метод).
К 5 мг щелочной фосфатазы добавляют 0,85 мл раствора IgG (2 мг/мл) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,4, и диализуют в течение ночи при 4 °C против того Же буфера для удаления солей аммония. Разбавляют раствор буфером до 1 мл и добавляют 10 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают реакционную смесь 2 ч при комнатной температуре и диализуют в течение ночи при 4°С против того же буфера и затем против 0,01 М трис-буфера, pH 8,0. Полученный раствор конъюгата разбавляют до 4 мл трис-буфером, добавляют БСА до 1% и NaN3 до 0,02%, фильтруют на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм и хранят при 4 °C.
Синтез конъюгата IgG с пероксидазой хрена с помощью глутарового альдегида (двухстадийный метод) .
Растворяют 10 мг пероксидазы хрена (RZ-3,0) в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера,- содержащего 0,15 М NaCl и 1,25%-ного глутарового альдегида, pH 6,8, и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Удаляют избыток глутарового альдегида диализом против 0,15 М раствора NaCl или хроматографированием на колонке (1X10 см) с сефадексом G-25. Разбавляют до 1 мл 0,15 М NaCl, добавляют 1 мл раствора IgG (5 мг/мл), содержащего 0,15 М NaCl и 0,1 мл 1 М карбонатного буфера, pH 9,5. Инкубируют 24 ч при 4 °C, затем вносят 0,1 мл 0,2 М раствора лизина для остановки реакции. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре и диализуют в течение ночи в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,2. Конъюгат осаждают эквивалентным объемом насыщенного раствора (NH4)2SO4 и растворяют в 1 мл фосфат-184
ного буфера. Раствор диализуют или хроматографируют на колонке (1X10 см) с сефадексом G-25 в фосфатном буфере. Раствор центрифугируют при 10 000 g в течение 30 мин, удаляют осадок, добавляют БСА до 1 % и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный конъюгат хранят при.—20°C или при +4 °C с добавлением эквивалентного объема глицерина.
Известно несколько примеров получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и р-Л-галактозидазой с применением в качестве гомобифункциональ-ного сшивающего реагента п-бензохинона. Метод основан на реакции n-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда n-бензохиноновое производное белка получают при pH 6, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Одна из возможных схем реакции следующая:
Конъюгаты получаются с невысоким выходом, гетерогенны и имеют невысокую активность. Метод в настоящее время применяется все реже.
Для получения конъюгатов антител или их фрагментов с р-Р-га-лактозидазой применяется N, N'-o-фенилендималеимид — гомоби-функциональный сшивающий реагент, содержащий две малеимид-ные группы:
Малеимидные группы быстро реагируют с тиогруппой и медленно с другими функциональными группами белка. Конъюгаты с помощью N, N'-o-фенилендималеимида получают для белков и ферментов, содержащих SH-группы.
Однако дималеимидный метод может быть применен для получения конъюгатов и с другими белками. SH-группы могут быть введены в молекулы белков несколькими методами, в том числе путем частичного восстановления дисульфидных связей 2-меркаптоэтила-мином:
185
Синтез конъюгата Fab-фрагмента с f>-D-галактозидазой с помощью N, N'-o-фенилендималеимида.
К раствору 1,6 мг (3,0 нмоль) P-D-галактозндазы в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,0, добавляют 6 мкл (1200 нмоль) 0,2 М (53,6 г/л) N, N'-o-феннленднмаленмида в диметилформамиде и перемешивают 20 мин при 30 °C. Реакционную смесь хроматографируют на колонке (1X45) см с сефадексом G-25 в фосфатном буфере, содержащем 1 г/л БСА с SH-группами, блокированными N-этилмаленмидом. К модифицированному ферменту добавляют 1,4 мг (15 нмоль) Fab в фосфатном буфере, содержащем 1 мМ ЭДТа, и инкубируют 20 ч при 4 °C. Добавляют 1/Д00 объема раствора NaN3 (100 г/л) н 1 иМ 2-меркаптоэта-нола для блокирования свободных малеимидных групп. Хроматографируют на колонке (1,5X45 см) с сефарозой 6 В в 0,01 М фосфатном буфере pH 6,5, содержащем 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 г/л NaN3 и 1 г/л БСА.
Иногда, используют N, N'-оксидиметилендималеимид для получения конъюгатов дималеимидным методом, но этот реагент не имеет особых преимуществ перед N, N'-о-фенилендималеимидом и, кроме того, он менее доступен. Дималеимидный метод может проводиться при pH не выше 6,0—6,5, так как малеимидные группы нестабильны при высоких pH.
• Конъюгаты, полученные этим методом, практически не теряют ферментативную активность, дают низкое неспецифическое связывание и не образуют полимерных частиц.
Получение конъюгатов с помощью гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Первым из гетеробифункциональных сшивающих реагентов для получения конъюгатов был применен N-оксисукцинимидный эфир м-малеимидобензойной кислоты (MBS). В 1976 г. с помощью этого реагента впервые был описан синтез конъюгата инсулина с ’P-D-галактозидазой. Метод заключается во введении малеимидных групп в молекулу белка при взаимодействии N-оксисукцинимидной группы сшивающего реагента с ЫНг-группой белка с образованием пептидной связи, которые затем уже реагируют с SH-группами фермента:
186
Конъюгаты по этому методу получаются с высоким выходом, без образования каких-либо еще полимерных продуктов и имеют обычно состав 1:1. Ферментативная активность в конъюгате полностью сохраняется.
Синтез конъюгата дигоксин — уреаза с помощью MBS.
К 0,4 мл раствора IgG (10 г/л) в 0,05 М фосфатом буфере, pH 7,5, содержащем 0,1 мМ NaCl (PBS) добавляют 100 мкл 8 мМ раствора MBS в диметнл-формамиде, перемешивают 30 мин при комнатной температуре н хроматографируют на колонке (1ХЮ см) с сефадексом G-25, уравновешенной PBS. К 3 мл раствора, содержащего модифицированный IgG, добавляют 13 мг уреазы и перемешивают 30 мин. Полученный конъюгат диализуют в течение ночи против PBS и хранят при —20 °C с добавлением 50% глицерина.
Другим широко используемым гетеробифункциональным сшивающим реагентом является ^-оксисукцинимидный эфир (4-карбокси-циклогексилметил)малеимид, который более стабилен, чем MBS.
Синтез конъюгатов этим методом проводят при pH 7. При более низких pH реагенты малореакционноспособны, а при более высоких pH конъюгаты менее устойчивы.
Малеимидные соединения, применяемые для получения конъюгатов, недостаточно хорошо растворимы в водных растворах и иногда выпадают в осадок во время проведения реакций. Для определения наиболее реакционноспособных, растворимых и стабильных сшивающих реагентов были проанализированы различные N-оксисукцинимидные и N-сульфосукцинимидные эфиры малеимидных соединений. Было показано, что конъюгаты Fab-фрагментов с пероксидазой хрена лучше всего получаются с использованием N-оксисукцинимидных эфиров 3-малеимидопропионовой или 5-ма-леимидомасляной кислоты:
187
(и = 3,5)
К гетеробифункциональным сшивающим реагентам относится и N-оксисукцинимидный эфир 4-йодацетил аминовензойной кислоты (SIAB). Этот реагент аналогичен по действию MBS и основан на способности йодопроизводных реагировать с SH-группой с образованием тиоэфиров:
SIAB дает конъюгаты с большим выходом и высокой специфичностью, однако пока не нашел широкого применения.
Синтез конъюгата кроличьих антител против IgG-овцы с $-D-галактозидазой с помощью SIAB.
К раствору 3 мг (2,6-10~8 М) кроличьих антител против IgG-овцы в 3 мл 0,05 М фосфатного буфера, pH 7,0, добавляют 30 мкл раствора SIAB (3,6 мг/мл в тетрагндрофуране) н инкубируют в темноте в течение ночи при комнатной температуре. К раствору добавляют 30 мкг (4,5-10-2 М) глнцнна для разложения избытка SIAB н инкубируют в темноте 3 ч при комнатной температуре. Затем к охлажденному до 4 °C раствору добавляют ЫО-9 М р-Р-галактозида-зы, доводят pH реакционной смеси до 7,8 и Поддерживают его таким в течение 2 дней. Далее к реакционной смеси добавляют 4- 10—а М 2-меркаптоэтанола для удаления непрореагнровавшнх веществ и инкубируют 3 ч при комнатной температуре. Полученный конъюгат разбавляют глицерином (50%).
К гетеробифункциональным сшивающим реагентам относится также N-оксисукцинимидный эфир 3(-2-пиридилдитио) пропионовой кислоты (SPDP). С помощью SPDP 2-пиридилдисульфидные группы вводятся как в молекулу IgG, так и в молекулу пероксидазы хрена. Затем 2-пиридйлдисульфидное производное IgG восстанавливается дитиотреитолом с образованием1 SH-производиого, которое далее реагирует с модифицированным ферментом путем дисульфидного обмена;
188
Синтез конъюгата пероксидазы хрена с IgG с помощью SPDP.
К раствору 10 мг ПХ в 2 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH -7,5, содержащего 0,1 М NaCl, добавляют по каплям при перемешнваннн 400 мкг SPDP, растворенного в 0,5 мл этанола..Смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мии н затем хроматографируют на колонке с сефадексом G-25 (1,6x25 см), уравновешивают фосфатно-солевым буфером (PBS) и собирают фракции, соответствующие первому пику. Аналогичным образом проводят реакцию 10 мк IgG и 10—15 мкг SPDP. Модифицированный фермент обрабатывают днтиотрентолом (25 мМ) н вновь хроматографируют на колонке с сефадексом G-25. Смешивают растворы пероксидазы, содержащей SH-группы, н IgG, содержащего 2-пнрнднл-сульфндные группы, н ннкубнруют при 4 °C в течение 18 ч. Реакционную смесь хроматографируют на колонке с Со-А-сефарозой в PBS. Конъюгат элюируют PBS, содержащим 10 мМ метил-D-маннознд, н затем снова хроматографируют иа колонке с сефакрилом S-200 (42Х95 см) в PBS н собирают фракции, обладающие ферментативной активностью. Конъюгат разбавляют в отиошеннн 1 ; 2 в 60 %-ном глицерине в боратном буфере, добавляют мертнолат и хранят в маленьких порциях.
Другая группа исследователей предложила использовать несколько других реагентов для введения пиридилдисульфидной группы: 3-(4-дитиопиридил)пропириимидат или имидаты с 4,4'-дитиоди-пиридииом:
189
Модифицированный белок с 4-пиридилдисульфидной группой далее реагирует с ферментом, который или содержит, или в него предварительно вводят SH-группу. Удельная активность пероксидазы в конъюгате с IgG, полученным этим способом, сохраняется на 74%.
В связи с развитием методов синтеза конъюгатов белок—фермент с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов возникла необходимость в простых и эффективных способах введения SH-групп в молекулы белков или ферментов. В настоящее время применяют три метода введения SH-групп с помощью: a) SPDP; б) метил-4-меркаптобутиримидата в присутствии 4,4'-дитиодипиридина; в) S-ацетилмеркаптоянтарного ангидрида:
(б)—NHCOCHCHj соон
SH
Введение SH-группы в пероксидазу хрена.
К раствору 2 мг пероксидазы хрена в 0,25 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,5, добавляют 1,8 мг S-ацетилмеркаптояитариого ангидрида (200-кратиый избыток) в 10 мкл диметилформамида и перемешивают 30 мин при 30 °C. Затем в реакционную смесь добавляют 50 мкл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 7,0, б мкл 0,1 М раствора ЭДТА и 100 мкл 1 М раствора гидроксиламина и инкубируют 5 мин при 30 °C. Полученную модифицированную пероксидазу хроматографируют иа колонке (1x45 см) с сефадексом G-25 в 0,1 М фосфатном буфере, pH 6,0, содержащем 4 мМ ЭДТА.
Нековалентные методы. Все описанные методы синтеза конъюгатов белок—фермент основаны на образовании ковалентной связи между молекулами белка и фермента. Но не менее перспективным направлением для получения конъюгатов является путь с использованием высокоспецифических иммунологических связей антиген — антитело или межмолекулярных связей белок—белок.
Для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза—антитела 190
к пероксидазе, PAP). Аналогичный комплекс может быть получен и для щелочной фосфатазы:
(Ат) + IgGE----(Ат) .. . IgG. (Ат). .. IgGE ...(e)
Еще один метод, основанный на образовании иммунологической связи, получил название метода «гибридных антител». Смесь F(ab') 2-фрагментов молекул антител против определяемого антигена и фермента обрабатывают меркаптоэтанолом. При этом F.(ab')2-фрагменты обратимо диссоциируют на Fab-фрагменты. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, в результате образуются гибридные молекулы антител, специфичные к антигену и ферменту. При добавлении к гибридным молекулам фермента образуется конъюгат антитело—фермент:
(F(ab-)j .„
z2JArl HSCH2CK2OH
РИ21Е ]
1Fab]Ar]	©
<	> —— lF(ab')2]ArE FlabOj. . ..(e)
[раЬ]Е j
Способность белка А стафилококка образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом антител используют для получения конъюгатов, в котором фермент, предварительно сшитый каким-либо химическим способом с белком А, соединяется с Fc-фрагментом антител через белковую «ножку»:
Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин — биотин, который образуется сЮ15 М~> по схеме
Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат. * Все описанные выше некоцалентные методы синтеза конъюгатов имеют следующие преимущества: 1) они просты в проведении; 2) в конъюгате практически полностью сохраняется ферментативная и иммунологическая активность; 3) метод позволяет получить универсальный реагент для ИФА различных антигенов.
191
Синтез конъюгата антител с щелочной фосфатазой через авидин-биотиновый комплекс.
а.	К 250 мкл раствора (1 мг/мл в диметилсульфоксиде) сукцинимидного эфира биотина, полученного из биотина, оксисукцинимида н дициклогексилкар-бодиимида, добавляют 250 мкл раствора (10 кг/мл) IgG и 750 мкл карбонатного буфера (pH 9,2). Разбавляют смесь 3,5 мл PBS, инкубируют 3 ч при комнатной температуре и диализуют 3 дня против PBS.
б.	К 15 мг щелочной фосфатазы добавляют 100 мкл раствора авнднна (10 мг/мл) и диализуют в течение ночи против PBS. Добавляют 10 мкл глутарового альдегида до концентрации 0,2% в конечном объеме, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, разбавляют до 1 мл PBS н диализуют в течение ночи против PBS.
в.	Разбавляют конъюгат антител с биотином в соотношении 1/10 000 в PBS, содержащем 0,05% твин-20 и 2% сыворотки лошади, и добавляют равный объем конъюгата авидина с щелочной фосфатазой в разбавлении 1/500 в PBS. Смесь инкубируют 1 ч при 37 °C. Полученный комплекс сТабилеи При 4 °C ие менее недели.
§ 3. Получение конъюгатов гаптен — фермент
Синтез конъюгатов гаптенов с ферментами основаны в принципе на тех же методах, что и синтез конъюгатов белков с ферментами. Однако есть ряд особенностей, которые необходимо учитывать при проведении синтезов. Во-первых, многие гаптены плохо растворимы в водных растворах и поэтому получение конъюгатов приходится проводить в водно-органической среде, что сказывается на ферментативной активности конъюгата. Во-вторых, бывает очень сложно очистить конъюгат от свободного фермента, а это приводит к высоким фоновым реакциям, а поэтому синтез должен быть выполнен с высоким выходом. В-третьих, для сохранения иммуногенных свойств гаптен должен быть пришит к ферменту через углеводородную «ножку», содержащую 5—6 атомов цепи.
Кроме того, должно быть тщательно выбрано место пришивки гаптена к ферменту, так как это влияет на специфичность анализа. Показано, что специфичность анализа для гаптенов выше, если конъюгат фермент—гаптен получен способом, отличным от метода синтеза конъюгата гаптен—носитель, используемым для иммунизации.
Если при получении конъюгатов гаптен—носитель для иммунизации животных стараются пришить ~ 10 молекул гаптена на молекулу белка, то конъюгат гаптен—фермент должен отвечать составу 1 : 1. Поэтому для синтеза конъюгатов гаптен—фермент в настоящее, время в основном используют методы с применением гетеробифункциональных реагентов.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Самыми распространенными методами син-192
теза конъюгатов гаптен — фермент являются методы, основанные на образовании пептидной связи между аминогруппой фермента и карбоксильной группой гаптена, предварительно активированной каким-либо реагентом:
г)—с—Z + NH,—(Е) - - ©—С—NH—(Е
'И	Z
Метод смешанных ангидридов. При взаимодействии гаптенов, содержащих СООН-группу, с изобутилхлорформиатом в безводном органическом растворителе при пониженной температуре легко получаются смешанные ангидриды, которые без выделения затем взаимодействуют с МН2-группами лизиновых остатков фермента:
~	R3N
г)—СООН + С1СООСН,СН(СН7)7 ------—•
з х —НС*
г)—соосоосн2сн (СН3)2
NH2— (г)— CONH—(е) + со2 + НОСН2СН(СН3)а
Этим методом получают конъюгаты большинства гаптенов. Однако даже при 20—30-кратном избытке гаптена относительно фермента выход конъюгата не превышает 20—30%. Реакцию обычно проводят с добавлением основания (триэтиламин, трибутиламин) для удаления образующейся НС1.
Для разрушения слабой сложноэфирной связи, которая побочно возникает между активированной карбоксильной группой гаптена и тирозиновым остатком фермента, а также для удаления избытка непрореагировавших реагентов реакционную смесь после завершения реакции обрабатывают гидроксиламином.
Синтез конъюгата о-(карбоксиметил)морфина с малатдегидрогеназой.
8 мг малатдегндрогеназы нз митохондрий выделяют центрифугированием из суспензии фермента в насыщенном растворе (NH4)2SO4. Осадок растворяют в 0,25 мл воды, диализуют 18 ч при 0°С против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,5, и доводят объем раствора фермента до 1 мл буфером, содержащим 0,1 М фосфата натрия н 0,05 М карбоната натрия, pH 9,0. К суспензии 514 мг (1,5 ммоль) о-карбоксиметилморфниа в 15 мл безводного дйметилформамида при —5 °C медленно добавляют 196 мкл (1,5 ммоль) изобутилхлорформиата и перемешивают 60 мнн. Этот раствор добавляют небольшими порциями к раствору фермента, поддерживая pH 8,8—9,0. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 0°С и 30 мнн при комнатной температуре, затем диализуют 2 дия при 0°С против буфера, содержащего 4,1 М фосфата натрия н 0,05 М карбоната натрия, pH 9,0.
Карбодиимидный метод. Активацию карбоксильной группы проводят в этом методе с помощью водорастворимых карбодиимидов:
7—627
193
гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида или п-толуолсульфоната - 1-циклогексил-3-(2-Ы-метилморфолиноэтил) -карбодиимида:
СООН + RN=C=NR'
--(г)—CONH—@
+ HRNCNHR'
где RN=C=NR': или CH3CH2N=C=NCH2CH,CH2N(CH3)2-НС1;
СН3
Реакцию проводят обычно при pH 5,5—6 в течение нескольких часов. Недостатком метода является побочное протекание внутри-и межмолекулярной сшивки молекул фермента.
Синтез конъюгата эстрадиола с ^-D-галактозидазой.
К раствору 0,5 мг 6-карбоксиметилоксима эстрадиола в 1 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 6,7, охлажденного до 12°, добавляют 1 мг гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил.) карбодиимида в твердом виде. Через 30 мин добавляют раствор 20 мг P-D-галактозидазы в 1 мл того же буфера. После перемешивания в течение 16 ч при 4 °C реакционную смесь диализуют в течение ночи при 4 °C в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCl, 0,01 М MgCl2, 0,1% NaN3 и хроматографируют на колонке (2,5X40) см с сефадексом G-25, уравновешенной тем же буфером.
Разновидностью метода является способ с применением N-окси-сукцинимида и дициклогексилкарбодиимида в органической среде:
7^-СООН + C6HnN=NC6Hn —•- (г)— COOCNHC6Hn
NC6Hn
/СО—CH 2
HO—N	|
'со—сн2
/СО—сн2
\о—сн2
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими аминогруппы. Метод с применением гомобифункциональных сшивающих реагентов. Самый простой способ получения конъюга-194
тов ферментом с гаптенами, содержащими активные ЫН2-группы, состоит в простом смешении в щелочной среде фермента, гаптена и сшивающего реагента — глутарового альдегида или диметил-адипимйдата:
ГЧ—NH, + O=CH(CH2)3CH=O + NH2—Qe)—(jy—N—CH(CH2)3CH=N—Qe
2. Qr}— NHj + СН3О—С(СН2)4С—осн3 NH HCl NH HCl
r}-NH—с—(сн2)4—с—осн3 NHHCl NHHCl
Г/— NH—С—(CH2)4— C—NH—<E
NHHCl NHHCl
Однако выход конъюгата этим методом невелик и значительно падает его ферментативная активность. Лучшие результаты были получены при проведении реакции в 2 стадии. Сначала обрабатывают гаптен сшивающим реагентом, а затем уже добавляют его к раствору фермента.
Синтез конъюгата щелочной фосфатазы с тироксином.
Суспензию 2Q0 мкг щелочной фосфатазы в 200 мкл буфера центрифугируют и осадок растворяют в 500 мкл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,8. Растворяют 2 мг тироксина в 4 мл диметилформамида и 100 мкл этого раствора добавляют к раствору фермента. Затем приливают 10 мкл 1,5%-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают 2,5 ч при 25 °C. Конъюгат очищают хроматографированием на колонке (1X10) см с сефадексом (G-100) в 0,1 М фосфатном буфере.
Метод с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Для получения конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими NH2-группы, в последнее время чаще всего используют гетеробифункциональные сшивающие реагенты, например N-оксисукцинимидный эфир л-малеимидобензойной кислоты (MBS) и другие:
Этим методом получают конъюгаты в основном с p-D-галакто-зидазой, которая содержит ~10 активных SH-групп й не теряет
7*	195
свою ферментативную активность в конъюгате, а также и с другими ферментами, содержащими SH-группы.
Синтез конъюгата бластицидина-S с ^-D-галактозидазой.
к
Приведем пример ускоренного способа без выделения промежуточных веществ и нх очистки. К раствору бластицидина — Sb 0,02 М. фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCl и 0,001 М MgCl2, pH 7,0, добавляют в 10 раз меньшее количество N-окснсукцнннмидиого эфира у-малеимндомасляной кислоты н перемешивают 30 мин при 30 °C. Затем добавляют раствор фермента и еще инкубируют некоторое время. Реакционную смесь хроматографируют на колонке с сефадексом G-100 в том же буфере и собирают фракцию, имеющую ферментативную активность.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими углеводные остатки. Такие гаптены, как дигоксин, аденозин и другие, имеющие в своей структуре углеводные группировки, могут быть легко конъюгированы с ферментами путем их окисления перйодатом натрия до производных с альдегидной группой и последующим взаимодействием с ЫНг-группами фермента:
§ 4. Получение конъюгатов антигенов (антител) с субстратами
Конъюгаты антигенов (антител) с субстратами нашли широкое применение в хеми- и биолюминесцентных системах детекции.
• Хемилюминесцентные реакции детекции имеют следующие преимущества: отсутствие фоновых реакций, низкий предел обнаружения, высокое отношение полезного сигнала к фоновому (>50)
196
и др. В качестве меток используют чаще всего люминол, изолюминол или их производные. Синтезы их конъюгатов с антителами (антигенами) проводят в мягких условиях, чтобы сохранить их иммунологические свойства. Для конъюгирования применяют реакционноспособные производные субстратов, которые получают обычными методами тонкого органического синтеза. Ниже будут приведены лишь схемы и методики получения таких конъюгатов.
Люминол и изолюминол диазотируют в мягких условиях, и полученное диазопроизводное взаимодействует с тирозиновыми и триптофановыми остатками антител:
Синтез конъюгата антител с люминолом.
К охлажденной до О °C суспензии 1 ммоля люминола в 5 мл 1 н. НС1 добавляют по каплям при перемешнванин в течение 15—20 мни 1,5 ммоля KNO2 в 1 мл воды. Прн этом цвет раствора изменяется от желтого до оранжевого. Избыток нитрующей смеси удаляют добавлением нескольких капель 1 М мочевины. К раствору IgG (15 г/л) в PBS прн охлаждении до 4“С добавляют раствор диазолюминола, доводят pH раствора до 9,0 1 М К?СО3 н перемешивают 24 ч прн 4 °C. Полученный конъюгат очищают на колонке (30X2,5) см с носителем Ultragel А4 в PBS.
Для получения конъюгатов часто применяют коммерчески доступное производное изолюминола — М-(4-аминобутил)-Ы-этил-изолюминол (ABEI). Это соединение содержит аминогруппу, участвующую в связывании с белком. Известно два способа модификации: 1) с помощью тиофосгена или 2) через активированный ге-мисукцинимидный эфир по схемам: Способ 1
/СЛ
\ch2)4nhcsg
ABEI
197
Способ 2
Синтез конъюгата антител с ABEI.
К раствору 18,5 мг (50 мкмоль) гемисукцинимидного производного ABEI в 800 мкл диметилформамида добавляют 5,75 (50 мкмоль) N-оксисукцинимида и затем. 30,9 мг (150 мкмоль) дицнклогекснлкарбодиимида в 200 мкл диметилформамида. Реакционную смесь инкубируют в темноте 20 ч, удаляют осадок и добавляют 100 мкл этого раствора к 1 мл раствора IgG (15 г/л) в PBS. Инкубируют смесь 24 ч при 4 °C в темноте, удаляют образовавшийся осадок и хроматографируют на колонке (30X2,5) см с носителем. Ultragel А4 в 0,05 М трис-HCl буфере, pH 8,0.
Синтез конъюгата антител с производными изолюминола.
К суспензии 100 мг ABEI в 15 мл смеси вода — хлороформ (2 : 1) при 0°С добавляют 2 мл CSC12 в хлороформе (1 : 19). Смесь перемешивают 6 ч при 4 °C, отделяют органическую фазу и упаривают под азотом. Остаток растворяют в СНС13, фильтруют и снова упаривают под азотом. Раствор 2,67 мг полученного производного изолюминола в 100 мкл диметилформамида добавляют к 1 мл IgG (10 г/л) в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,5, и инкубируют 12 г при 4 °C. Конъюгат диализуют или хроматографируют на колонке (30 ХД) см с сефадексом G-50 в PBS.
В люминесцентном иммунокофакторном анализе (ЛИК.А) используются конъюгаты антигенов и антител с кофакторами АТР и NAD. Общая схема синтеза конъюгатов состоит в модификации кофактора введением СООН-группы с последующим ковалентным связыванием ее с молекулой антигена (или антитела). Ниже при-198
ведена схема модификации АТР по методу Мосбаха и получения его конъюгата с инсулином:
199
Синтез конъюгата АТР с инсулином.
5 г АТР (8,3 ммоля) добавляют к 100 мл водного раствора монойодуксусной кислоты (15 г, 80 ммолей), который предварительно нейтрализуют 2 М LiOH до pH 6,5. Смесь инкубйруют при 30 °C в течение 7 дней в темноте, поддерживая pH 6,5' с помощью LiOH. Получившееся N'-карбоксиметильное производное АТР (ATP-N'-CM) осаждают при —20°С добавлением 800 мл этанола, отфильтровывают, промывают спиртом и. высушивают н вакууме.
100 мл раствора ATP-N'-CM прогревают пр’и 90 °C в течение 1,5 ч, поддерживая pH 8,5 с помощью LiOH. Полученный продукт охлаждают, нейтрализуют 1 М НС1 до pH 2,75 и наносят на колонку (2,5x60) см с DOWEX 1X2 (С1~). Примеси элюируют 0,3 М LiCl, pH 2,75, а конечный продукт — линейным градиентом растворов 2 л 0,3 М LiCl, pH 2,75, и 2 л 0,5 М LiCl, pH 2,0. Фракцию, содержащую ATP-N'-CM, нейтрализуют 1 М LiOH, концентрируют на роторном испарителе до 50 мл объема, осаждают 500 мл охлажденной до 4 °C смесью ацетон — этанол (1:1) и высушивают в вакууме. Выход составляет 50—60%.
10 мг инсулина растворяют в 2,6 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4, добавляют 30 мг солянокислого гексаметилеидиамина и 15 мг водорастворимого карбодиимида и 25 мг N-оксисукцинимида. Смесь инкубируют 1 ч при 4°С. Реакционную смесь диализуют 4 ч против 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4.
К полученному раствору инсулина с гексаметиленовой «ножкой» добавляют 30 мг ATP-N'-CM, 15 мг водорастворимого карбодиимида, 25 мг N-оксисукцинимида и инкубируют 12 ч при 4°С. Реакционную смесь диализуют. Выход продукта определяют спектрофотометрически.
Расчет мольного соотношения инсулина и АТР в конъюгате проводят по формуле
г\ _280 г\ _267
__	^267Еинс.	^260еинс.
П П	п 1280	>
М280ЕАТР — ^267еАТР
где £>280, £>267, е280, е267— оптические плотности конъюгата АТР-инсулин и коэффициенты молярного поглощения для индивидуальных веществ при длинах волн 280 и 267 нм соответственно.
Содержание белка в конъюгате АТР — инсулин также определяют по методу Луори. Препарат конъюгата хранят при —20°С. Коферментативную активность определяют биолюминесцентным методом со светляковой люциферазой.
Получение и свойства иммобилизованных антител и антигенов
Гетерогенные методы ИФА включают стадию разделения свободного меченого компонента от образовавшегося комплекса со связывающим агентом. Задача разделения эффективно решается при использовании антител (или антигенов), иммобилизованных на нерастворимых носителях. Методы, основанные на данном подходе, известны под названием твердофазных методов ИФА.
Получение антигенов и антител, связанных с йосителем, является одной из существенных процедур при разработке твердофазного ИФА, так как от степени сохранения стабильности и активности иммобилизованных препаратов зависят количественные характеристики метода и возможность его практического применения. Другой важной областью применения иммунот сорбентов для целей ИФА является очистка антигенов и антител для последующей метки ферментом или использования в качестве стандартного образца.
В связи с интенсивным применением иммобилизованных ферментов в биотехнологии методы получения различных нерастворимых производных соединений белковой и небелковой природы хорошо разработаны. Многие из них могут быть эффективными и для получения-иммобилизованных препаратов антител и антигенов (иммуносорбентов). Чаще всего для целей твердофазного ЙФА приготовление иммуносорбентов осуществляют либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией вещества на поверхности носителя.
§ 1. Носители, применяемые в иммуноферментном анализе
* Используемые в ИФА носители должны соответствовать ряду требований, обусловленных спецификой метода: 1) быть нерастворимыми при условиях, в которых проводится анализ; 2) обладать достаточной для аналитических целей емкостью (т. е. количеством иммобилизованного белка на единицу массы или площади поверхности носителя); 3) обеспечивать прочное необратимое связывание белка с носителем и стабильность препарата при хранении; 4) обладать минимальной способностью к неспецифическому связыванию компонентов, находящихся в анализируемых биологических жидкостях; 5) быть удобным для анализа в методическом плане, т. е. легко и точно дозироваться, быстро осаждаться, без потерь подвергаться процедурам промывки и т. д.
Перечисленным требованиям соответствуют многие носители, в том числе и широко используемые в биохимических лабораториях для очистки и разделения белков. В связи с этим первоначально в гетерогенных методах ИФА применялись такие носители, как целлюлоза, сефароза, сефадекс, биогель, силохром, пористое стекло, оксиды металлов. Эти материалы обладают высокой емкостью, легко подвергаются химической модификации,' имеют хорошие гидродинамические свойства. Неорганические носители (силохром, пористое стекло) не подвержены воздействию микрофлоры, что позволяет использовать иммобилизованные, на них антитела длительный срок без применения консервантов. Одним из немногих (но существенных) недостатков гранулированных носителей является сложность их точного дозирования и трудность промывок без потерь используемых в анализе микроколичеств иммуносорбента. Особенно остро эти вопросы встают при необходимости проведения не единичных, а массовых анализов.
• С начала 70-х годов в практику ИФА вошли методы, основанные на иммобилизации антител и антигенов цепосредственно на стенках посуды, в которой проводится анализ. В основном для такого анализа используют пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов —полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата и т. д. Многие вещества (белки, полисахариды, пеп- : тидные гормоны, липополисахариды, денатурированная ДНК ит. д.) могут быть адсорбционно связаны с поверхностью таких полимеров, что значительно упрощает процедуру иммобилизации, i В настоящее время этот подход является одним из основных в практике твердофазного ИФА. Широкое применение метода обус- : ловлено его простотой и возможностью автоматизации за счет то- : го, что каждая пробирка или лунка планшета является отдельным • реактором, в котором проходят все стадии анализа, начиная с ; иммобилизации антител (или антигена) и кончая измерением фи- ; 202	j
зико-химического параметра ферментативной реакции. К недостаткам данного подхода относится невысокая емкость непористых материалов и возможность элюции части адсорбированного белка с подложки в процессе инкубаций и промывок, вследствие чего ухудшаются чувствительность, точность и воспроизводимость результатов анализа.
Основным фактором, обусловливающим возможность проведения анализа и корректной интерпретации его результатов, является однородность сорбционных свойств пробирок или планшетов для ИФА. В связи с этим производство данных материалов требует специально отлаженной технологии, включающей строгий контроль качества изготовляемой продукции.	'
• Другой подход основан на использовании материалов в форме шариков, дисков нли трубочек, каждый из которых предназначен для проведения одного анализа. Процедура переноса носителя из пробирки в пробирку, отмывки и т. д. осуществляется с помощью пинцета или вакуумной присоски. Иммобилизация материала может осуществляться адсорбционно или ковалентно. Данный путь позволяет увеличить количество иммобилизованного белка за счет увеличения поверхности, но сохранить при этом методическую простоту операций. Примером подобных носителей могут служить полимерные шарики, нитроцеллюлозные диски, силиконовые трубки, пленки из полимерных материалов и т. д. Кроме этого, антитела (или антигены) могут быть связаны с активированной бумагой или нитроцеллюлозными мембранами, на поверхности которых проводят анализ многих проб.
В выпускаемых коммерческих наборах антитела (или антигены), как правило, находятся в иммобилизованном состоянии, и .задачей является их правильное использование в соответствии с прилагаемой инструкцией. Но при разработке анализа какого-либо соединения методом твердофазного ИФА с необходимостью иммобилизации сталкивается все исследователи. Поэтому ниже будут рассмотрены методы иммобилизации антител и антигенов с применением доступных материалов и свойства получаемых препаратов.
§ 2. Иммобилизация антител
Ковалентная иммобилизация антител. Ко-валентное связывание антител с носителями осуществляют главным образом за счет свободных амино- и карбоксильных групп, Находящейся на поверхности глобулы макромолекулы. Для связывания антител могут использоваться многие методы, разработанные для иммобилизации белков и ферментов на носителях органической и неорганической природы. Эти методы различны ио степени сложности синтеза и доступности реагентов. Многие из йих могут быть корректно осуществлены только специалистами в области органической и биоорганической химии.
203
Так как в различных лабораториях часто возникает потребность получения иммуносорбентов, остановимся на нескольких простых, малостадийных методиках, для. проведения которых имеются готовые активированные носители или легко доступные полупродукты.
Иммобилизация антител на силохроме, макропористом силикагеле и пористом стекле. Силохромы — неорганические пористые носители на основе кремнезема, выпускаются отечественной промышленностью для целей хроматографии. Различные марки сило-хромов отличаются диаметром пор (35—250 нм) и удельной поверхностью (25—130 м1 2 3/г). Для иммобилизации антител чаще всего используют силохром, предварительно модифицированный у-аминопропилтриэтоксисиланом (у-АПТЭС) и глутаровым альдегидом. Схема реакции:
О он т (c2h5o)3s>-(ch2)3_nh2 — |- о—s -(Снд, Whz(|-nh2)
кремнезем	'рАПТЭС
+ н—с—сн,—сн?—си,—с—н —1 -н =сн- СИ,-Г 2	2	2 Ц 1
О	о
глутаровый альдегид
-снг--ен2— CHj— с—н + NHX- (Ат о
N=CH—си2—сн2—СН,—C№N—@
Для увеличения прочности связывания белка с носителем двойная связь может быть восстановлена боргидридом натрия.
Методика.
1. 10 г силохрома кипятят в течение 2 ч в 60 мл безводного толуола в присутствии 2 мл 'у-амииопропилтриэтоксисилана. Промывают силохром 0,5 л толуола и сушат 5 ч при 50 °C и затем 5 ч при 1.20 °C в вакуумной сушилке при 3990 Па (30 мм рт. ст.). Аминированный силохром может длительное время храниться при комнатной температуре.
2. К 1 г аминированного силохрома добавляют 10 мл 1%-иого раствора глутарового альдегида в холодной дистиллированной воде, инкубируют при медленном перемешивании 4 ч при 4 °C и отмывают носитель от избытка альдегида водой. В процессе активации носитель изменяет цвет с белого иа красноватый. Полноту отмывки альдегида контролируют спектрофотометрически при 1= ==280 им. Полученный сорбент может быть использован для иммобилизации немедленно или длительно храниться в высушенном состоянии.
3. К 1 г активированного силохрома в 10 мл 0,01 М К-фосфориого буфера (pH 7,4), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05% тритона X-1Q0, добавляют IgG-фракцию антисыворотки или аффинно выделенные антитела. Инкубируют при комнатной температуре и мягком перемешивании. Процесс связывания белка с носителем контролируют спектрофотометрическн при 1=280 им. После прекращения изменения оптической плотности надосадочного раствора (рис. 22) (обычно реакция проходит за 2—3 ч) отмывают носитель 1 М раствором К.С1, затем 0,01 М К-фосфатным буфером с 0,1 М NaCl и хранят в том же буфере при +4 °C,
204
Количество связавшегося с носителем белка определяют по разности начального количества белка и его содержания и промывных водах. В зависимости от удельной поверхности силохрома с 1 г связывается от 20 до 50 мг белка. Для удобства отбора проб гранулы иммуносорбента целесообразно гомогенизировать до образования однородной суспензии,
которая легко может дозироваться автоматическими пипетками и лабораторными дозаторами.
Таким же путем может осуществляться иммобилизация антител на макропористых силикагелях и пористых стеклах, также используемых для целей ИФА, механизм активации которых аналогичен рассмотренному.
Иммобилизованные на кремнеземных носителях антитела длительное время сохраняют способность специфически взаимодействовать с антигеном.
Иммобилизация антител на сефадексе, сефарозе, целлюлозе. Широко используемые в биохимических лабораториях носители сефадекс G-200, сефароза 4В, карбоксиметилцеллюлоза
Рис. 22. Кинетика ковалентного связывания глобулиновой фракции антител с 0,5 г силохрома G = 20 М, активированного глутаровым альдегидом, 20 °C, pH 7,4
могут успешно использоваться для иммобилизации антител. Чаще всего полисахаридные носители активируют бромцианом. Схема реакции:
/О—C—N RC 'он
'он
инертный карбонат
xoconh2
/ОН a)	+ BrCN----
'ОН
полисахарид	r/“''c=NH
активный
имидокарбонат
(1)
(2)
О)
(4)
(5)
205
Взаимодействие полисахарида с бромцианом приводит к образованию нереакционноспособных эфиров карбаминовой кислоты (1) и активных имидокарбонатов (2). Последние в слабощелочной среде быстро реагируют с аминогруппами белка, образуя N-замещенные имидокарбонаты (3), производные изомочевины (4) и N-замещенные эфиры карбаминовой кислоты (5).
Методика.
1. 200 мг сефадекса G-200 выдерживают в течение 20 ч в 12 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 4 мл водного раствора, содержащего 200 мг BrCN. (Соблюдать осторожность! Реагент обладает раздражающим н сильным токсическим действием.) Раствор доводят до pH 11 1 М NaOH и поддерживают это значение pH на автоматическом титраторе. Суспензию размешивают при 23—26 °C. Активированный гель переносят на стеклянный фильтр, отсасывают и промывают 300 Мл холодного 0,1 М гндрокарбойата натрия и 0,3 М раствором гидробикарбоната калия.
Аналогичным или модифицированным способом активируют сефарозу.
2. К 1 г активированного носителя добавляют IgG-функцию антисыворотки или выделенные антитела в 0,1 М NaHCO3 (коммерческий препарат BrCN-сефарозы предварительно замачивают в 10 мМ НО и промывают 0,1 М NaHCO3). Инкубируют в течение суток при мягком перемешивании при комнатной Температуре. Промывают иммуносорбент последовательно 1 М этаноламином (2 ч для блокировки свободных активных групп носителя), 0,5 М NaHCO3, 0,2 М ацетатным буфером (pH 4,0), а затем 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl (или другим буфером, который впоследствии будет использован в анализе). Хранят иммуносорбент в том же буфере при +4“С.
Сочетание адсорбции и ковалентного связывания при иммобилизации антител на пластиковых планшетах и пробирках для ИФА. Наиболее широко применяемыми носителями в твердофазном ИФА являются 96-луночные планшеты и пробирки из оптически прозрачного полистирола, поливинилхлорида или других полимерных материалов, с внутренней поверхностью которых связываются антитела. Как отмечалось ранее, в большинстве случаев иммобилизацию проводят адсорбционно, что упрощает процедуру, но снижает прочность связи белка с носителем. Увеличение прочности связывания может быть достигнуто при ковалентном закреплении антител на пластике.
Существующие способы ковалентной иммобилизации белков и ферментов на полистироле и его производных в основном 'разработаны для макропористых носителей и полистирольных гелей, используемых в ионообменной хроматографии. Сложность ковалентной пришивки для целей ИФА состоит в том, что модификации должно подвергаться готовое штампованное изделие из оптически прозрачного непористого полистирола (или другого полимера). При этом оптические свойства носителя в процессе активации не должны ухудшаться, так как. На конечной стадии анализа Лунки планшета или пробирка служат кюветой для фотомётриро-вания продукта ферментативной реакции. С другой стороны, условия модификации должны исключать изменение однородности поверхности носителя (частичное растворение «набухание» полимера
206
и т. д.), вызываемое многими органическими растворителями. В связи с этим используемые подходы для ковалентного закрепления антител на оптически прозрачных полимерных носителях для ИФА весьма ограничены.
• Наиболее простой метод заключается в предварительной обработке планшетов или пробирок из полистирола или поливинилхлорида водным раствором глутарового альдегида. Добавляемые затем антитела ковалентно связываются с активированным носителем. Механизм активации пластика альдегидом детально не изучен. Не исключено, что глутаровый альдегид, в основном существующий в форме олигомеров, просто прочно адсорбируется на поверхности полимера. Это согласуется с данными о минимальной фиксирующей способности мономерной формы альдегида. В связи с этим употребляемый в литературе в данном случае термин «ковалентная иммобилизация» является некорректным, так как ковалентная связь образуется только между белком и сшивающим антигеном, но не между белком и носителем. Однако экспериментально показано, что прочность связывания антител с полимером в результате подобной процедуры возрастает. Например, при адсорбции антител против HBs-антигена на планшетах из поливинилхлорида в процессе инкубации с сывороткой крови десорбируется до 43%, а при связывании через глутаровый альдегид— до 12% антител соответственно.
Методика.
В лунки планшетов для ИФА из поливинилхлорида вносят по 100 мкл раствора 2%-ного глутарового альдегида в К-фосфатном буфере, pH 5,0. Инкубн-пуют 2 ч при комнатной температуре и трижды промывают луики 0,01 М К-фосфатным буфером с 0,1 М NaCl, pH 7,0. Затем вносят в лунки по 100 мкл IgG-фракции антисыворотки к HBs-антигент в концентрации 30 мкг/мл в 0,1 М Na-карбонатом буфере, pH 9,5, и инкубируют в течение ночи при 4 °C. После 3-кратной промывки фосфатным буфером с 0,1 М NaCl, pH 7,0, планшеты готовы для применения в ИФА.
Другим доступным реагентом для активации полистирола и полипропилена является толуол-2,4-диизоцианат (ТЦ). При использовании для иммобилизации на полистирольных пробирках высоких концентраций IgG (1 мг/мл) в случае активации ТЦ связывается белка в 2,7 раза больше,.чем при активации глутаровым альдегидом, и в 1,7 раза больше, чем при простой адсорбции. Однако при концентрациях IgG 0,1 и 0,01 мг/мл количество белка, связавшегося через глутаровый альдегид, в 1,3 раза выше, чем через ТЦ. Аналогичные закономерности сохраняются при связывании IgG с полипропиленом.
Предположительно эффект связывания ТЦ с твердой фазой основан на присоединении (сорбции?) реагента иа поверхности полистирола, модифицированной органическим растворителем. Затем изоцианатная группа реагента взаимодействует с аминогруппами лизина IgG, образуя ковалентную связь.
207
Методика.
В полистирольиые (или полипропиленовые) пробирки добавляют 0,5 мл 0,5%-иого ТЦ, раствореииого в четыреххлористом углероде, и быстро отсасывают раствор (чтобы ие допустить существенного растворения полимера). Оставляют пробирки на 3 ч при комнатной температуре для высушивания остатков растворителя. Вносят в пробирки IgG в 0,5 мл 0,01 М N-а-фосфатиого буфера (pH 7,2), содержащего 0,14 М NaCl и 0,1% NaN3. Инкубируют 20 ч, отсасывают раствор и добавляют в пробирки 0,6 мл 1%-иого БСА в том же буфере для блокировки активных групп ТЦ. Инкубируют 2 ч и трижды промывают пробирки фосфатным буфером.
Рис. 23. Изотерма адсорбции меченных пероксидазой антител в лунках полисти-рольиого планшета для ИФА, pH 7,4 (а); и кинетика адсорбции конъюгата АТ—ПХ (21 пмоль) в лунке полиетирольиого планшета для ИФА; pH 7,4 (б): а — по оси абсцисс—начальное количество меченных пероксидазой антетел (АТ—ПХ); по оси ординат — количество антител, связавшихся с твердой фазой; б — по оси абсцисс — время, мни
Последний из применяемых подходов основан на предварительной сорбции на пластике поли-£-лизина, который адсорбируется на поверхности практически необратимо. Далее с помощью глутарового альдегида (или другого агента) с полимером могут быть связаны антитела, антигены, целые бактериальные клетки. Процедура сорбции поли-А-лизина включает добавление его в лунки планшета для ИФА в концентрации 0,1 мг/мл в 0,15 М. фосфатном буфере (pH 7,4), инкубацию в течение 30—60 мин и промывку лунок буфером.
Подходы, основанные на комбинации методов адсорбции и ковалентного связывания, все шире используются в ИФА, обеспечивая улучшение воспроизводимости результатов анализа.
Адсорбционная иммобилизация антител. Этот метод наиболее распространен в ИФА, что обусловлено, в основном, крайней простотой процедуры иммобилизации, не требующей применения каких-либо активирующих агентов.
При добавлении раствора антител в лунки планшетов или пробирки из полимерных материалов часть молекул адсорбируется на поверхности носителя за счет ионных и гидрофобных взаимодей-208
ствий, а также образования водородных связей. Количество сорбированного белка определяется природой полимера, площадью поверхности, временем контакта, концентрацией белка, pH и ионной силой буфера, температурой. На рис. 23 приведены зависимости количества связанного на носителе конъюгата от его содержания в растворе и времени инкубации. Насыщение центров сорбции полистирола достигается при концентрации белка, равной 2— 5 мкг/мл. При этом с поверхностью лунки (3« 1,6 см2) связывается около 60 нг белка. Длительность процесса адсорбции при 4°С и pH 7,4 составляет около двух часов, но 60% сорбированного белка связывается за первые 30 мин.
Полной корреляции данных по сорбционным свойствам полистирола в литературе не наблюдается. В известной степени это может быть объяснено тем, что в экспериментальных работах применяли носители разных фирм, которые могут отличаться составом и сорбционными свойствами полимера. Другая причина может заключаться в том, что в разных опытах использовались IgG различных животных, которые отличаются по свойствам. Так, при исследовании адсорбции IgG быка на полистирольных пробирках показано, что на площади 6,5 см2 связывается около 1,8 мкг белка (или 280 нг/см2). На полистирольных пробирках (LKB, Швеция) сорбируется 100 нг IgG человека на 1 см2.
• Как отмечалось ранее, адсорбционная связь белка с поверхностью менее прочна, чем ковалентная, что является одним из основных недостатков данного способа иммобилизации. Например, при сравнительном изучении десорбции БСА с активированной бромцианом бумаги и полистирольных кювет (фирмы Labsystems, Финляндия) показано, что в случае ковалентной пришивки и адсорбции в процессе анализа с подложки смывается 13 и 37% белка соответственно.
Методика адсорбции антител.
Для адсорбции могут быть использованы IgG-фракции антисыворотки либо антитела, выделенные известными методами.
В лунки планшетов для ИФА вносят по 0,2 мл раствора белка в 0,01 М К-фосфатиом буфере (pH 7,4) с 0,1 М NaCl (PBS) с концентрацией 5 мкг/мл. Планшеты накрывают крышками и выдерживают ночь при +4 °C*. Удаляют'белок и промывают луики 3—4 раза раствором ФБ, содержащим 0,05% детергента твии-20 или тритон Х-100. Подготовленные таким образом планшеты готовы для , проведения ИФА. При необходимости длительного хранения планшеты высушивают на воздухе и хранят при +4 °C (в герметически закрытых пластиковых пакетах в присутствии осушителя). При соблюдении правил хранения адсорбированные антитела могут использоваться для анализа в течение нескольких месяцев.
* Проведение адсорбции в течение ночи является удобным в методическом плане с точки зрения планирования времени анализа. Как указывалось ранее, при данной концентрации белка длительность процесса адсорбции можно ограничить несколькими часами,
209
Аффинная иммобилизация антител. Выделение специфических антител из сыворотки включает стадию их адсорбции на иммобилизованном антигене и последующую элюцию путем разрушения связи антиген — антитело при сильно кислых или щелочных значениях pH либо концентрированными растворами солей (например, NH4CNS). Выделение в столь экстремальных условиях может неблагоприятно сказываться на аффинности антител, а последующее ковалентное или адсорбционное закрепление молекул на носителе в ряде случаев приводит к дальнейшему снижению способности эффективно связывать антиген.
Рис. 24. Схема получения иммобилизованных антител:
а — через связь аитигеи — антитело; б — дополнительно ковалеитио связанных с антигеном глутаровым альдегидом
Отсюда определенный интерес представляет использование в анализе иммуносорбентов, полученных путем аффинного связывания специфических антител с иммобилизованным на носителе антигеном. Связь антиген — антитело обратима, поэтому для предотвращения смывания антител с сорбента разработаны пути последующего ковалентного закрепления молекул, образовавших специфический комплекс на носителе. Для стабилизации комплекса эффективно применяются обычные сшивающие агенты: глутаровый альдегид, диазиды, изоцианаты. Процедура иммобилизации включает инкубацию связанного с носителем антигена с антисывороткой, отмывку носителя, проведение реакции с сшивающим антигеном и заключительную отмывку для удаления избытка (рис. 24). Процесс может проводиться как в реакторах перемешивания, так и в колоночном режиме. Данный подход детально изучен на примере иммобилизации антител против сывороточного альбумина человека на сефарозном сорбенте. В результате такого связывания по крайней мере половина активных центров иммобилизованных антител способна принимать- участие в последующих реакциях с антигеном, что является недостатком метода. Однако
210
возможность быстрого получения «чистых» иммобилизованных антител делает его перспективным для целей ИФА.
Иммобилизация антител на магнитных носителях. Ранее отмечалось, что одним из недостатков применения для целей анализа иммуносорбентов на основе гранулированных носителей являются методические сложности, связанные с точным- дозированием, центрифугированием, потерями при промывках и т. д. Многие сложности могут быть устранены при использовании носителей, обладающих магнитными свойствами.
Наиболее распространены носители на основе оксидов железа и феррита бария. Магнитный носитель также может быть получен на основе полиакриламида и агарозы путем добавления Fe3O4 в смесь мономеров при полимеризации. Последующая иммобилизация антител на магнитных носителях может проводиться одним из описанных ранее методов. Магнитные носители позволяют проводить разделение компонентов анализируемой смеси во многих образцах одновременно без применения центрифугирования, исключить потери сорбента при промывках и в значительной степени автоматизировать процедуру анализа.
• Изменяющиеся устройства для проведения анализа с магнитными носителями позволяют одновременно анализировать несколько десятков образцов с быстрым переносом и промывкой частиц сорбента, а также одновременную для всех проб остановку ферментативной реакции, что существенно для получения хорошей воспроизводимости результатов ИФА.
Иммобилизация антител на водорастворимых полимерах. Новым подходом в иммунохимическом анализе является применение антител, иммобилизованных на обратимо растворимых иммуносорбентах, что позволяет проводить анализ в растворе, а затем быстро разделять компоненты путем перевода носителя в нерастворимое состояние. Данный путь дает возможность сочетать чувствительность твердофазного анализа с быстротой гомогенного. В качестве водорастворимого носителя может быть использован альгинат натрия и полиметакриловая кислота (ПМАК).
Методика получения водорастворимого иммуносорбента на основе ПМАК.
Используют полученную радикальной полимеризацией ПМАК с Мг=2600. Раствор ПМАК с концентрацией 10 мг/мл доводят до pH 5,0 2 М КОН. Добавляют 15 мг водорастворимого карбодиймида и 10 мг N-оксисукциннмида. Смесь инкубируют 30 мин при 20 °C при перемешивании, поддерживая значение pH 5,0. Затем 1 М КОН доводят pH до 7,8—8,0 и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мг IgG в 0,01 М К-фосфатном буфере (pH 7,8), содержащем 0,1 М NaCl, инкубируют 2 ч при комнатной температуре и перемешивают, контролируя и поддерживая pH 7,8—8,0. Затем диализуют в течение ночи против 0,1 М Na-фосфаТного буфера (pH 5,5) с 0,42 М NaCl. Несвязав-Щийси IgG отделяют гельфильтрацией на колонке (2X100) см с ультрагелем АсА-44, уравновешенным 0,1 М Na-фосфатиым буфером (pH 55) с 0,4 М NaCl, Выход компонентов регистрируют спектрофотометрически при л*=280 нм, Объе-
211
диияют фракции первого пика (иммуносорбент) и диализуют против 0,01 М К-фосфатиого буфера (pH 7,4) с 0,1 М NaCl в течение ночи при 4 °C.
Выделенный иммуиосорбент при хранении при 4-4 °C может быть использован для анализа в течение нескольких месяцев.
Иммобилизация антител микрокапсулированием. При ковалентной или адсорбционной иммобилизации часть активных центров антител может снижать или полностью утрачивать способность взаимодействовать с антигеном. Эффективным путем сохранения нативной структуры антител является иммобилизация микрокапсулированием, широко используемая для получения препаратов ферментов, антигенов (для обеспечения пролонгированного эффекта при иммунизации) и лекарств для достижения их направленного транспорта в организме.
Принцип разделения компонентов в анализе с применением микрокапсулированных антител основан на том, что продиффун-дировавший внутрь капсулы и связавшийся с антителами меченый антиген теряет способность переходить обратно в раствор вследствие ограниченного размера пор. Как следует из принципа разделения, микрокапсулирование для целей анализа не является универсальным подходом. Эффективное применение таких препаратов антител возможно только при использовании в анализе низкомолекулярных антигенов, меченных небольшими по размерам метками (изотоп, кофактор), что обеспечивает свободную диффузию конъюгата антиген — маркер внутрь капсулы.
§ 3. Иммобилизация антигенов
Как и антитела, антигены могут быть ковалентно связаны с носителем либо адсорбированы на нем. Многообразие соединений, которые могут являться антигенами, затрудняет выработку каких-либо единых рекомендаций. Выбор метода связывания антигена с носителем зависит от структуры и молекулярной массы соединения.
Адсорбционная иммобилизация антигенов. Многие макромолекулярные антигены — пептидные гормоны, белки, ферменты, липополисахариды, денатурированная ДНК н т. д., а также целые вирусные частицы, компоненты клеток (например, рибосомы) и целые клетки “Могут быть связаны с поверхностью полимерных н неорганических носителей путем адсорбции в условиях, идентичных описанным для иммобилизации антител. Различия чаще всего относятся к оптимальным значениям pH, которые могут изменяться от нейтральных до щелочных (pH 6,8—9,6) в зависимости от заряда сорбируемой молекулы. Длительность процесса адсорбции и максимальное количество связанного с поверхностью антигена являются характеристиками, индивидуальными для каждого процесса и зависящими от гидрофобности, заряда и молекулярной массы Молекулы. Однако для многих антигенов время, необ-212
ходимое для^ связывания, например с поверхностью непористого полистирола, не превышает 2—4 ч и уменьшается при повышении температуры от 4 до 37°С.
В ряде случаев прямая адсорбция антигена на поверхности полимерных носителей невозможна или нежелательна. Чаще всего с подобной ситуацией приходится встречаться, когда антигенами являются низкомолекулярные соединения, имеющие одну антигенную детерминанту, например лекарственные препараты, пестициды, некоторые стероидные и тироидные гормоны и т. д.
•	При адсорбции таких молекул могут возникать следующие сложности: 1) в силу своих свойств гаптен не сорбируется на пластике; 2) гаптен водонерастворим и может быть адсорбирован только из органического растворителя, растворяющего полимер и приводящего к ухудшению оптических свойств; 3) гаптен адсорбируется в мягких условиях, но его детерминанта становится стери-чески недоступной для последующего взаимодействия с антителами,
В указанных случаях гаптен целесообразно адсорбировать, предварительно ковалентно связав с макромолекулярным белком-носителем, который впоследствии прочно связывается с полимером.
•	При получении такого конъюгата необходимо: 1) исключить возможность модификации групп, образующих антигенную детерминанту; 2) использовать в качестве белка-носителя другой белок, а не тот, который применялся при синтезе конъюгата гаптен-носитель при иммунизации; 3) по возможности стремиться применять сшивающий реагент, отличный от используемого при получении конъюгата для иммунизации с целью избежания связывания адсорбированным конъюгатом антител, специфичных не к гаптену, а к участку связывания гаптена с белком-носителем.
Ковалентное связывание. Иммобилизацию антигенов путем ковалентного связывания проводят, используя подходы, разработанные для получения нерастворимых производных антител и ферментов. Выбор сшивающего агента и метода связывания необходимо проводить с учетом доступных функциональных групп, модификация которых не снижает способность агента эффективно взаимодействовать с антителами.
§ 4. Неспецифическое связывание с иммуносорбентом
Важной задачей при проведении анализа с применением иммуносорбентов является максимальное снижение связывания меченного ферментом соединения и других компонентов с поверхностью носителя и пробирок, в которых проводится измерение. При определении микроколичеств веществ интерпретация результатов анализа прн значительной неспецифической сорбции (связывание в отсутствие специфических антител) край
213
не затруднительна. Способностью к адсорбции соединений различной природы в условиях проведения иммунохимического анализа в большей или меньшей степени обладают все применяемые в ИФА носители. Причина связывания зависит от природы сорбента и может быть обусловлена захватом антигенов или антител в поры носителя, а также образованием ионных, гидрофобных и других связей.
Наиболее эффективным путем подавления связывания с носителем является проведение анализа в буфере, содержащем неионные детергенты (твин-20, тритон Х-100, Х-305 и др.), а также белки, обладающие высоким сродством к центрам сорбции носителя
Рис. 25. Изменение активности конъюгата IgG — пероксидаза в растворе (начальная концентрация 4,3 иМ) в фосфатном буфере, содержащем 0,05% тритона Х-100 (I) и в том же буфере без детергена (2)
Рис. 26. Связывание конъюгата инсулина (Инс — ПХ) со специфическими (I) и иеспецифическимп (2) антителами морской свинки, адсорбированными на полистирольном планшете для ИФА:
по оси ординат — оптическая плотность А при Х=49О им продукта пероксидазной ре-акции окисления о-фенилендиамииа перекисью водорода; по оси абсцисс — концентрация конъюгата в лунках планшета
(0,1% БСА, 10% сыворотка крови и т. д.). На рис. 25 приведены зависимости, отражающие изменение связывания конъюгата IgG-пероксидаза с поверхностью полистирольных Пробирок в присутствии тритона Х-100.
Предотвращение связывания белков с поверхностью кремнеземных носителей (силохром, пористое стекло) успешно достигается при их модификации поливинилпирролидоном. Используется Также предварительная блокировка центров сорбции носителя после иммобилизаций антител или антигена инертными белками (альбумин, у-глобулин и др.), которые следует выбирать с учетом возможности йх связывания с анализируемым антигеном. Например, альбумин способен эффективно адсорбировать эстрадиол. Очевидно, что блокировка носителя альбумином при анализе эстрадиола может привести только к увеличению Вклада неспецифических взаимодействий.
214
Как правило,, при проведении ИФА интерес представляет знание неспецифицеского связывания компонентов не с нативным носителем, а с иммуносорбентом — модифицированным носителем с иммобилизованными антителами (антигеном). В ряде случаев сама процедура модификации приводит к снижению степени связывания. Например, активированный - у-аминопропилтриэтоксисила-ном силохром в меньшей степени адсорбирует IgG, чем исходный носитель, что, по-видимому, связано с частичным экранированием отрицательного заряда и увеличением гидрофобности поверхности за счет присоединения молекул силана.
После иммобилизации антител (антигена) часть центров сорбции носителя экранируется связанным белком и становится недоступным для взаимодействия с компонентами анализируемой пробы и ферментным конъюгатом. В связи с этим наиболее ценную для анализа информацию дает сравнение эффективности сорбции меченного пероксидазой инсулина на двух иммуносорбентах, один из которых содержит иммобилизованные специфические антитела, а другой — антитела неиммунизированного животного* (рис. 26). Подобный эксперимент позволяет учесть суммарное неспецифическое связывание с носителем и иммобилизованными иммуноглобулинами, но не дает возможность различить эти два эффекта.
Неспецифическое связывание меченого соединения в значительной степени обусловлено его концентрацией, концентрацией иммуносорбента и временем их контакта. Оптимальные соотношения этих факторов в каждом конкретном случае надо выбирать экспериментально. Однако очевидно, что уменьшение концентрации меченого соединения и проведение анализа в кинетическом режиме должно способствовать уменьшению неспецифического связывания. Реально возможность его снижения таким путем зависит от требуемой чувствительности анализа и соотношения-констант скоростей образования специфического и неспецифического комплексов.
Механизм неспецифических эффектов в ИФА в настоящее время изучен' далеко не полностью. Несмотря на существование перечисленных выше действенных путей подавления неспецифического связывания с иммуносорбентом, отнюдь не .всегда понятно, за счет чего достигнут требуемый эффект. В связи с этим оптимизация этого важного для анализа параметра чаще всего проводится. эмпирическим путем и подходы подавления неспецифического связывания, эффективные для одного объекта, не гарантируют аналогичных результатов при переходе к другому даже в том случае, когда в качестве твердой фазы применяется, один и тот же носитель.
* При этом желательно, чтобы животные были из одной популяции и содержались в одних условиях,
215
Например, одна из широко реализуемых схем ИФА («сэндвич»-метод) основана на использовании иммобилизованных антител, которые связывают определяемый антиген, после чего он выявляется конъюгатом антител с ферментом. Этот метод можно применять в том случае, если в отсутствие антигена концентрация меченых антител, неспецифически связавшихся с иммуносорбентом,
Рис. 27. Взаимодействие меченных ПХ антител с комплексом антиген-поликлонЗльные антитела, предварительно адсорбированные в различных концентрациях Ат на полистирольных планшетах для ИФА:
на носителе и в конъюгате против HBs — антигена (/) и инсулина (2), 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,1 М NaCl и 0,1% тритона Х-100, pH 7,4
значительно меньше, чем в его присутствии. С формальной точки зрения, при условии постоянства носителя, методов получения и концентраций реагентов, а также условий проведения анализа регистрируемый параметр «фоновой» реакции (иммобилизованные антитела + меченые антитела) для антител, специфичных к разным антигенам, должен быть одинаков. Реально эта величина колеблется в достаточно широких пределах, а в некоторых случаях аномально зависит от концентрации компонентов. Иллюстрирующие последнее поло
жение зависимости приведены на рис. 27. Как видно из графика, уменьшение эффективности связывания меченых антител против инсулина наблюдается только при значительном уменьшении концентрации антител на фазе. Использование рекомендуемых обычно концентраций антител при адсорбции («5 мкг/мл) приводит к существенному увеличению регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной ре-
акции, что делает невозможным чувствительное определение анализируемого антигена. Экспериментально подтверждающего объяснения подобного аномального «средства» иммобилизованных и меченых молекул антител пока не найдено. Не исключено, что в некоторых случаях данный эффект может быть связан с наличием в сыворотке антиидиотипических антител (антител к специфическим антителам), которые вместе с другими IgG метятся ферментом. Один из путей снижения неспецифического связывания конъюгата в «сэндвич»-методе—использование для адсорбции и метки анти
тел разных видов животных.
• Выяснение механизма и поиск путей максимального (и универсального) снижения неспецифического связывания является одной из насущных задач ИФА, так как этот параметр в значительной степени определяет чувствительность анализа. Например,
216
теоретическая чувствительность «сэндвич»-метода, без учета неспецифических взаимодействий, лимитируется только пределом обнаружения метки. Увеличивая концентрацию иммобилизованных и меченых антител, в идеальном случае можно значительно снижать нижний предел детекции антигена. Однако реально возрастающий при этом вклад неспецифических взаимодействий делает этот путь неосуществимым.
§ 5. Некоторые свойства иммобилизованных антител
Применение в ИФА иммуносорбентов позволяет проводить определение любых соединений, независимо от их валентности, размеров, структуры и молекулярной массы. Однако возможности твердофазных систем анализа (ниЗкний предел обнаружения антигена, время, воспроизводимость) в значительной степени определяются такими величинами, как концентрация, аффинность и стабильность иммобилизованных антител. В связи с этим ниже дана краткая информация об этих параметрах и путях их определения на примере наиболее распространенных пористых и непористых носителей.
Концентрация иммобилизованных антител. Эта величина является одним из основных параметров, варьированием которого можно оптимизировать чувствительность и длительность анализа. Для успешной разработки метода ИФА знание точного значения этой концентрации необязательно. В большинстве случаев экспериментатор оперирует понятиями «количество, или концентрация иммуносорбента» (при использовании гранулированных носителей) или «концентрация белка при адсорбции» (для непористых полимерных материалов). Точное знание концентрации необходимо в тех случаях, когда ставится задача изучения физико-химических характеристик взаимодействия антиген — антитело либо получения исходных данных для оптимизации схемы ИФА на ЭВМ.
Определение концентрации иммобилизованных антител методически довольно сложно. Чаще всего для связывания с носителем используют IgG-фракцию иммунной сыворотки, точное содержание антител в которой неизвестно. Поэтому простое определение концентрации связавшегося с носителем белка не дает нужной информации. При иммобилизации аффинно выделенных антител, определив убыль белка из исходного раствора в процессе связывания и учтя количество антител, десорбировавшихся в результате промывок сорбента, можно найти суммарное количество молекул, присоединившихся к носителю. В результате подобных экспериментов может быть установлена емкость носителя, т. е. количество молекул антител, которое при данном методе иМ
217
мобилизации связывается с единицей массы или площади носителя (например, мг/г или мг/см2).
Однако в большинстве случаев интересуются не общим количеством связанных антител, а антителами, сохранившими способность к взаимодействию с антигеном после иммобилизации. Часть молекул антител Может утратить эту способность в результате присоединения к носителю антиген-связывающими центрами, сте-рического экранирования или других причин. Абсолютное число активных антител можно определить методом титрования активных центров антител антигеном. Существующие подходы позволяют проводить исследование с использованием как высоких, так и низких концентраций антигена и иммуносорбента. В первом случае иммуносорбент инкубируют с избытком антигена, затем диссоциируют специфический комплекс при pH 2—2,2 или раствором с высокой концентрацией солей (2—5 М) и определяют количество выделившегося антигена. Этот подход требует больших количеств сорбента и допускает возможность значительных ошибок вследствие смывания антител с носителя при экспериментальных значениях pH или ионной силы.
Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как’в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного.	х
В ИФА титрование активных центров антител часто проводят конъюгатом антиген — фермент, в котором часть детерминант может быть экранирована маркером. В этом случае следует учитывать, что из числа доступных активных центров определяется концентрация только тех, которые специфичны к неэкранировай-ным антигенным детерминантам конъюгата.
В табл. 8.1 приведены количества иммобилизованных антител против IgG человека, определенные методом титрования иммуносорбентов конъюгатом IgG—пероксидаза. Иммуносорбенты получены с использованием носителей и методов иммобилизации, ши
218
роко применяемых в ИФА. Данные таблицы иллюстрируют значения концентраций доступных центров связывания, которые могут быть получены при ковалентной и аффинной иммобилизации антител на пористых носителях органической и неорганической природы и адсорбционном связывании с непористым полистиролом.
Для упрощения сравнения в .таблице приведена суммарная концентрация иммобилизованных антител без деления на концентрации центров, обладающих большим и меньшим сродством к антигену. На сорбентах 1—3 иммобилизована IgG-фракция антисыворотки; на сорбенте 4 — аффинно выделенные антитела.
Таблица 8.1
Носитель	Метод иммобилизации	Количество иммобилизованных антител
1.	Силохром G-20 мк, активированный глутаровым альдегидом 2.	Сефароза 4В, активированная BrCN 3.	Сефароза с иммобилизованным IgG 4.	Лунка планшета из прозрачного полистирола	Ковалентный » Аффинный Адсорбционный	(9,2±1,8)  10-н моль/мг сухого сороента (2,6±0,4) • 10-11 моль/мг (2,8±0,5)  10~н моль/мг (0,2±0,1) • К)-12 моль/см2
Константа связывания антигена с иммобилизованными антителами. Степень сродства антител к антигену, количественно выраженная константой связывания, является основным параметром, определяющим чувствительность иммунохимического анализа. Процедура иммобилизации в ряде случаев может приводить к снижению константы связывания, что является одной из отрицательных сторон твердофазного анализа. Так, при сравнительном изучении антител к инсулину показано, что константа связывания антигена с иммобилизованными антителами в 20 раз ниже, чем в растворе. Экспериментально значения констант связывания получают из опытов по титрованию активных центров антител (рис. 28).
Антитела, вырабатываемые организмом против антигенных детерминант, представляют неоднородную популяцию. Поэтому в случае поликлональных антител определяемое значение константы связывания является эффективной величиной, характеризующей образование иммунного комплекса с антителами, активные центры которых обладают различным сродством к антигену (см. гл. 2, § 2, 4). В связи с этим данные титрования в координатах (B/F-^--т-В), как правило, представляют криволинейную зависимость, которую можно аппроксимировать двумя прямыми (рис. 28, б), вы-
219
• делив из гетерогенной смеси антител две популяции, средние значения констант связывания антигена которых значительно отличаются.
Концентрация фракции антител с высоким эффективным значением константы связывания, как правило, значительно ниже, чем с низким. Для разработки суперчувствительных систем детекции бывает необходимо выделять наиболее высокоаффинную фракцию и использовать в анализе только ее. Это может достигаться путем адсорбции антител на иммобилизованном антигене и последующей их элюцией линейным или ступенчатым градиентом pH, что
Рис. 28. Титрование активных центров иммобилизованных антител против IgG-человека конъюгатом IgG — ПХ (а) и представление результатов в координатах Скэтчарда (б):
а — по оси ординат — оптическая плотность А при %в490 им продукта пероксидазной реакции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода, соответствующая количеству активных центров на носителе; по оси абсцисс — концентрация конъюгата в растворе
обеспечивает последовательное смывание с колонки молекул по мере увеличения их сродства к антигену. Последними при наиболее кислых значениях pH элюируются антитела, обладающие максимальным значением константы связывания. Ниже приведена одна из возможных методик на примере фракционирования антител против инсулина.
Методика. .
Сорбент получают на основе активированной бромцианом сефарозы 4В, С которой связывают инсулин ковалентно. К 2 г активированного носителя добавляют 50 мг инсулина в 30 мл буфера 0,1 М NaHCO3 (pH 8,3), содержащего 0,5 М NaCl. Инкубируют при осторожном перемешивании. Контроль за связыванием белка осуществляют спектрофотометрически при Л=280 нм. После окончания связывания отмывают сорбент тем же буфером. Сорбцию антител сорбентом осуществляют в проточной замкнутой системе, состоящей из колонки с сорбентом (0,4X5) см, перистальтического иасоса, увикорда и пробирки с раствором IgG-фракции антисыворотки. На колонку с 1 мл сорбента с пришитым инсулином наносят 60 мг IgG-фракции и выдерживают 2 ч. Затем удаляют избыток белка и промывают колонку 45 мин 0,05 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим 0,1 М NaCl,.За полнотой отмывки следят по показаниям увикорда, 220
Элюцию антител проводят с использованием ступенчатого градиента в интервале pH от 4 до 2. Градиент pH создают смешением двух буферных растворов: 1—0,2 М К2НРО4 — лимонная кислота (pH 4,0); 2 — 0,2 М раствор лимонной кислоты. Условия элюции: время градиента 4 ч, скорость элюции 0,2 мл/мин, число ступеней градиента 6*.
При данных условиях с колонки элюируется несколько фракций антител (рис. 29) с разными значениями констант связывания инсулина (численные значения констант определены гомогенным методом биолюминесцентного иммуно-кофакторного анализа с использованием инсулина, меченного АТР). Значениям pH элюции 3,8; 3.3; 2,5; 2,2; 2 соответствовали фракции с константами связывания 10-6; 3-10-7; 8-Ю-8; 3-10~10 М,
Рис. 29. Профиль элюции антител против инсулина с иммуносорбента на основе сефарозы-4В ступенчатым градиентом pH 4,0—2,0 (время элюции 4 ч; скорость элюции 0,25 мл/мин)
Стабильность иммобилизованных антител при хранении. Постоянство концентрации и сродства иммобилизованных антител является необходимым условием для получения воспроизводимых результатов твердофазного ИФА. Изменение этих характеристик может происходить за счет десорбции или разрыва химической связи антител с носителем и денатурации связанного белка. Экспериментально изменение концентрации или свойств иммобилизованных антител проявляется в уменьшении степени связывания в стандартных условиях' фиксированной концентрации меченого антигена.
В ИФА стабильность антитела определяется интервалом времени, в течение которого остается постоянной их способность связывать антиген. В иммуноферментных наборах, укомплектованных готовыми иммуносорбентами, период стабильности антител явля-
* Необходимо следить за тем, чтобы элюируемые с колонки антитела быстро переводились в раствор с нейтральным значением pH,
221
ется одним из основных параметров, определяющих срок годности диагностикума.
При правильном соблюдении условий хранения иммобилизованные антитела стабильны в течение достаточно длительного периода времени. Адсорбированные на полистирольных планшетах или пробирках препараты могут храниться до применения при +4°С более года. Обязательным условием является отсутствие влаги, для чего после иммобилизации необходимо тщательно высушить препарат при комнатной температуре, а затем хранить его в герметически закрытой таре в присутствии осушителя. При комнатной температуре адсорбированные антитела стабильны в течение 1,5—2 мес, что дает возможность осуществлять транспортировку готовых наборов на большие расстояния.
Стабильность иммобилизованных антител при хранении в растворе, как правило, менее высокая, что связано со смыванием белка с носителя, действием микрофлоры и т. д. Срок хранения составляет в большинстве случаев несколько месяцев.
Стабильность антител в значительной степени определяется свойствами поверхности носителя, что необходимо учитывать при выборе твердой фазы в ИФА.
Ag + Ab К1 ^К2 Ад : АЬ : ,|Ц|‘и < । ——— "1|1^
Теоретические основы иммуноферментного анализа
В данной главе будут рассмотрены основные количественные закономерности четырех наиболее распространенных в ЙФА схем: конкурентной, метода последовательного насыщения, «сэндвич»-метода и метода определения антигенов с использованием меченых антивидовых антител.
Прежде всего дадим краткую характеристику некоторых часто используемых в анализе понятий: предел обнаружения, длительность, точность и специфичность. В зависимости от задач разрабатываемого анализа эти параметры могут варьироваться в достаточно широких пределах. Как и все иммунохимические методы, ИФА основан на реакции взаимодействия антиген — антитело, закономерности которой в значительной степени обусловливают возможность достижения необходимых значений перечисленных параметров. Каждая схема ИФА представляет определенную комбинацию иммунологических реакций, проходящих одновременно или последовательно. В связи с этим различные методы ИФА имеют свои особенности и в большинстве случаев описываются разными уравнениями. В этом разделе сначала будут кратко даны сведения об основных характеристиках ИФА, а затем более детально рассмотрены закономерности нескольких наиболее широко используемых схем анализа. Основное Вх.амаьие при этом будет уделено закономерностям иммунохимических стадий анализа, что представляет интерес как для
Рис. 30. Калибровочный график определения антигена:
по осн абсцисс — начальная концентрация антигена [Аг]0; по осн ординат — концентрация комплекса антител с меченым антигеном; [Аг]0.т1п — минимально определяемая концентрация антигена, соответствует уменьшению концентрации связанного меченого соединения прн отсутствии в системе определяемого антигена (В* прн Аго=О) на величину, превышающую ошибку ее измерения (S*B*)
ИФА, так и других иммунологических методов, основанных на использовании меченых соединений.
Предел обнаружения. Под пределом обнаружения в ИФА следует понимать минимальную достоверно определяемую концентрацию исследуемого вещества. Часто в литературе под этим термином подразумевают чувствительность анализа. При представлении экспериментальных данных наиболее корректно выражать эту величину в концентрационных единицах (моль/л, нг/мл и т. д.). Часто встречающееся выражение в массовых единицах (например, «метод позволяет определить 1 пмоль белка», или «0,1 нг белка в пробе») затрудняет реальную оценку этого параметра, а в отсутствие указаний конечного объема анализируемой смеси де-ляет это невозможным.
При проведении ИФА можно выделить два этапа. Первый — перераспределение компонентов реакционной смеси в ходе имму-нохимических реакций, число и последовательность которых определяется выбранной схемой. Второй — выявление меченого соединения при проведении ферментативной реакции. Оба этапа влияют на предел обнаружения анализируемого соединения, который зависит от константы, связывания используемых антител,
соотношения концентраций при анализе и условий проведения реакции (температура, pH, концентрация детергента, природа буфера и т. д.). Чувствительность на втором этапе определяется активностью фермента и чувствительностью метода детекции продуктов ферментативной реакции.
Мы определили чувствительность как минимальную концентрацию, достоверно регистрируемую в данном анализе. Под термином «достоверно» подразумевается то, что параметр ферментной реакции (начальная скорость реакции, оптическая плотность продукта за фиксированный промежуток времени и т. д.), регистрируемый в присутствии «минимальной» концентрации анализируемого соединения, превышает параметр «фоновой» реакции (т. е. реакции в отсутствие антигена) на величину, большую, чем ошибка измерения (рис. 30).
224
Таким образом, экспериментально нижний предел обнаружения может быть установлен только на основе построения доверительных интервалов для «фоновой» и начальных точек калибровочного графика, при этом каждая точка должна дублироваться статистически достоверное число раз. Ширина доверительного интервала зависит от разброса показаний в параллельных пробах; поэтому высокая чувствительность при плохой воспроизводимости результатов достигнута быть в принципе не может.
Следовательно, предел обнаружения или чувствительность ИФА определяется физико-химическими параметрами иммунологических и ферментативных реакций, соотношением компонентов и ошибками при измерении параллельных проб на начальном участке калибровочного графика.
Точность анализа. Это параметр, с помощью которого устанавливают различия между параллельными (или последовательными) результатами анализа одной и той же пробы. Количественно точность характеризуется коэффициентом вариации, представляющим стандартное отклонение, выраженное в процентах от среднего значения. На точность анализа влияют многие факторы, в первую очередь постоянные и случайные ошибки, возникающие в ходе анализа, качество регистрирующей аппаратуры, квалификация персонала. Подробный анализ этих факторов дан в книге «Радиоимму-нологические методы» (Чард, 1980), которая может быть рекомендована всем желающим более детально ознакомиться с этим вопросом.
Среди известных биологических соединений антитела обладают уникальными свойствами распознавать антиген, против которого они получены. Но это не означает, что антитела способны связываться только с ним. Используемые в анализе антитела могут взаимодействовать с компонентами исследуемой пробы, которые близки по структуре, с антигеном или даже несут одинаковые антигенные детерминанты. В связи с этим одной из характеристик иммунохимического анализа является- специфичность, отражающая степень достоверности выявления анализируемого ^вещества по сравнению с другими компонентами пробы. Качественно специфичность может быть охарактеризована при изучении перекрестных реакций с близкими по структуре антигенами.
При проведении конкурентного анализа перекрестно реагирующее соединение будет, подобно антигену, препятствовать связыванию с антителами меченого антигена. .Один из путей оценки специфичности сводится к построению калибровочных кривых для антигена (А) и перекрестно реагирующего соединения (Б) отдельно. Если 50%-ное (или любое другое) ингибирование связывания меченого антигена достигалось при концентрации А, допустим, 10 ед/мл, а в случае Б— 100 ед/мл, то при параллельности калибровочных кривых можно считать, что перекрестная реакция с Б составляет 1О°/о- Влияние перекрестно реагирующих соедине-8—627	225
ний на ход анализа необходимо оценивать, исходя из их содержания в анализируемом образце. Допустим, в связи с данной чувствительностью метода необходимо анализировать пробу в разведении, обеспечивающем содержание А в концентрации 10 ед/мл. Если Б при этом также находится в концентрации 10 ед/мл, то его присутствие практически не отразится на результатах анализа. Если же Б находится в коцентрации 1000 ед/мл, то достоверное определение А на его фоне невозможно.
Время проведения. Длительность ИФА при наличии готовых реагентов и методики складывается из времени, затрачиваемого на реакцию антиген — антитело, промывку и дозировку компонентов, а также времени проведения и регистрации ферментативной реакции. При осуществлении твердофазного ИФА лимитирующей по времени стадией является доведение реакции антиген — антитело до равновесного состояния. Так как взаимодействие антитела с антигеном формально представляет обратимую реакцию второго порядка, то время приближения к равновесию возрастает с уменьшением концентрации определяемого антигена. Фактором, определяющим время достижения равновесия, является константа скорости образования комплекса антиген — антитело.
§ 1. Теоретические закономерности конкурентного иммуноферментного анализа
Принцип конкурентного ИФА состоит в одновременном добавлении определяемого и меченного ферментом антигена к антителам, доведения системы до равновесия и последующего измерения ферментной метки в комплексе с антителами или в несвязанном меченом антигене.
• Проанализируем некоторые закономерности конкурентного анализа, исходя из следующих допущений: 1) образование комплекса антиген — антитело происходит в соотношении 1:1; 2) все молекулы антител обладают одинаковым сродством к антигену; 3) меченный ферментом и определяемый антигеи взаимодействуют с антителами с разными константами связывания; 4) измерение ферментативной активности проводится после установления в системе
равновесия.
Модель, основанная на этих допущениях, конечно, не отражает всех свойств реальной системы, но дает возможность оценки влияния ряда параметров на результаты анализа.
В соответствии с принятыми условиями распределение компонентов в ходе анализа может быть представлено следующей схемой:
Ат-|-Агч^ АтАг	(9.1)
АтАг* Ат Аг*
(9.2)
226
которая при равновесии описывается системой уравнений: [Ат]0=[АтЦ-Л'[Ат] [Аг] + /<* [Ат][Аг*]	(9.3)
[Аг*]—[Аг*]Ц-7< [Ат] [Аг*]	(9.4)
[Аг]0=[Аг]-[-АГ[Ат][Аг]	(9.5)
где [Ат], [Аг] и [Аг*]—равновесные молярные концентрации соответственно антител, определяемого и меченого антигенов; [АтАг] и [АтАг*] —равновесные концентрации специфических комплексов антиген — антитело; [Ат]0, [Аг]о и [Аг*]о — начальные концентрации компонентов; К и К*— константы связывания антител с определяемым и меченым антигенами.
Если ферментом помечен высокоочшценный антиген, то на заключительной стадии анализа возможно измерение как несвязанного с антителами Аг*, так и связанного (АтАг*) меченого антигена. В первом случае процедура твердофазного анализа упрощается, так как не требуется отмывка иммуносорбента, предшествующая измерению метки. Если метка вводится в неполностью очищенный препарат антигена, то определение ее ферментативной активности возможно в комплексе АтАг* только после его отделения, так как в несвязанном с антителами состоянии в этом случае кроме меченого антигена находятся и меченые примесные компоненты.	1
В ходе анализа антиген образует комплекс со специфическими антителами. Если бы образовавшийся комплекс или оставшиеся свободными центры связывания антител могли регистрироваться непосредственно, то анализ мог бы проводиться без участия меченого антигена. Но в настоящее время регистрация этого процесса при крайне низких концентрациях компонентов весьма затруднительна. Поэтому использование меченых соединений является высокочувствительным средством «визуализации» образовавшегося комплекса антитело — антиген. В рассматриваемом случае определяемый и меченый антиген вводятся одновременно и конкурируют за центры связывания антител.
Об образовании комплекса антитела с определяемым антигеном свидетельствует изменение концентрации свободных центров связывания, доступных для взаимодействия с меченым антигеном, которое и регистрируется в ходе анализа. В рамках введенных нами обозначений концентрация комплекса [АтАг*] убывает с ростом концентрации антигена, а концентрация [Аг*] возрастает.
Проанализируем схему, считая, что в ходе анализа определяется концентрация метки в комплексе с антителами [АтАг*].Тогда калибровочный график соответствует зависимости [АтАг*] = =/([Аг]0) и при арифметическом масштабе абсциссы имеет гиперболический вид, как на рис. 31, Каково предельное положение этой кривой, соответствующее условию достижения минимально детектируемой концентрации антигена? Мысленно представим, что 8*	227
с одинаковыми реагентами и в одинаковых условиях получают два калибровочных графика — без и с использованием меченого антигена. Первый график фактически является кривой титрования активных центров антител антигеном и описывается зависимостью [Ат]=/([Аг]о), где [Ат] — концентрация свободных активных центров антител) по форме, совпадающей с зависимостью для второго графика [АтАг*] =/(Аго). Кривая титрования и является тем пределом, к которому должен стремиться реальный калибровочный график при необходимости достижения предельно возможной чувствительности. При оптимизации метода сравнение соответствия теоретической кривой титрования и калибровочной кривой целесообразно проводить в нормированных координатах, в которых масштаб ординат для разных зависимостей выбирается таким образом, что их амплитуды на графике совпадают.
Теоретически при соблюдении условия [АтАг*] =7? [Ат] (7? — коэффициент пропорциональности), т. е. при наличии строгой пропорциональности между концентрациями связанного меченого антигена и свободными активными центрами антител, оба графика в нормированных координатах должны совпадать. На практике, в силу различных причин, пропорциональность может значительно нарушаться. В связи с этим задачей оптимизации метода является выбор условий, приводящих к максимальному соответствию калибровочной кривой и кривой титрования. Проведем оценку этих условий, учитывая введенные ранее допущения. Выразив [Ат] из уравнения (9.3), перепишем уравнения (9.3) — (9.5) в виде
[Аг]0=[Аг]+-------К[АтЫАг]-------	(9.6)
1	10	1	1 ' 1 + К [Аг] + К* [Аг*]	’	• '	’
[Аг*]0=[Аг*Ц-----[Лт]о[Лг!1-----(9.7)
1	Т I + А [Аг] 4- К* [Аг*]
Вычислив из (9.7) значение [Аг], подставив его в (9.6) и заменив [Аг*]0—[Аг*] на [АтАг*], получим в неявном виде зависимость концентрации связанного с антителами меченого антигена от начальной концентрации определяемого антигена:
К* [Ат]0[Аг*]0	1 А* [Ат]0
К [АтАг*] К
---1 + А* [Аг*] [_ jAtj-----[АтАг*]	[Ат Аг*].	(9.8) К	ю Д’* [Аг*]-1	'
В соответствии со схемой анализа максимальная концентрация комплекса [АтАг*] (а следовательно, и максимальный регистрируемый сигнал) образуется в отсутствие определяемого антигена ([Аг]о=О).
Таким образом, за нижний предел обнаружения антигена следует принимать его концентрацию, способную вызывать достоверно регистрируемое изменение сигнала (рис. 30), где В* — концеи-
228
трация комплекса [АтАг*] в отсутствие определяемого антигена; S* — фактор, характеризующий относительную ошибку определения величины В*, [Аг]о мип—минимально детектируемая концентрация антигена или предел обнаружения.
Если калибровочная кривая имеет гиперболический вид, как на рис. 31, то начальный участок кривой при малых значениях [Аг]о' можно считать линейным. Для установления предела обнаружения необходимо проанализировать на этом участке произ-д [АтАг*]
водную4тхйг:
[Аг]Омни—5*В*^^АтАг	==s*B*-[Ar]o I	. (99)
<^[Аг]о при [Ат]0-о	[Аг*] ICAr*]-[Аг*]0-В* '  '
С учетом выражения (10.8) получаем
[Аг]Омни=S*B*( 1-------------------------?-----+
1 J	( К Т К* ([Аг]0 — В*)2 т
К* [Аг*]0 [Ат]0 _I)
А	(В*)2 J ’	( • 1
При отсутствии определяемого антигена ((Аг]о=0) из уравнения (9.3) следует:
[Аг*] - [АтЬ —[Ат] _ [Ат]р-[Ат]р = _В*__
1	1	а:* [Ат]	А*[Ат]р К* [Ат]р ’	' ' '
где [Ат]р=[Ат]0—В* — концентрация свободных центров связывания антител при достижении равновесия в отсутствие определяемого антигена.
Подставляя из (9.11) значение [Аг*] в уравнение (9.4), получаем
Л	R*
IAr,1"=^W+B’-	(912)
Подставляя полученное выражение (9.12) в уравнение (9.10), после несложных преобразований будем иметь:
IAr]01fM=sJ[AT]04-l.	+/<•[At]f+W[At]?1 .	(9.13)
Минимальное значение правой части уравнения (9.13), равное S/А и соответствующее предельной чувствительности для кривой титрования, достигается при выполнении следующих условий: [At]0«_L; -^-^1; [At]f/<*«1; W[At]2p«1, Л lATJp
так как [At]f=[At]0—В*, то условие [At]0«[At]f адекватно условию В*«с[Ат]0, a [Ат]гК*<С1— условию [Ат]0<^-^-
229
• Таким образом, для максимального приближения калибровочной зависимости к -кривой титрования концентрация центров связывания должна быть меньше констант диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигенами, а степень заполнения антител меченым антигеном должна быть крайне низкой. Последнее положение логически понятно, так как влияние . меченого антигена на связывание определяемого антигена должно быть пренебрежимо мало. Однако реально это требование трудно выполнимо из-за сложности достоверной регистрации изменения концентрации метки в комплексе с антителами при варьировании концентрации определяемого антигена. Если считать достаточно малыми такие значения параметров, при которых нижний предел детекции антигена увеличивается вдвое по отношению к минимальному и составляет 2//С, то рассмотренные выше условия следует записать в виде
1Ат]0<±; [Ат]0<^;	(9.14)
• Таким образом, начальная концентрация центров связывания должна быть меньше значения константы диссоциации комплекса антиген — антитело (если эти значения для меченого и определяемого антигенов различны, то минимальной из них), а концентрацию меченого антигена следует выбирать такой, чтобы при достижении равновесия в отсутствие определяемого антигена им заполнялось не более половины центров связывания антител.
Из рассмотрения изотермы связывания меченого антигена с антителами следует, что условия В*<[Ат]0/2 и [Ат]0<1/Л* могут выполняться одновременно только при [Аг*]0< 1/А*. Если популяция антител гетерогенна по аффинности к антигену, то концентрацию меченого антигена следует выбирать такой, чтобы условие В*<[Ат]о/2 выполнялось для высокоаффинной фракции антител, определяющей чувствительность анализа.
В ^зависимости от структуры и молекулярной массы антигена при введении ферментной метки его константа связывания с антителами может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. Увеличение эффективного значения константы связывания может быть обусловлено образованием в результате химической модификации олигомеров меченого антигена, формирующих при взаимодействии с антителами сложные по составу комплексы. Уменьшение сродства может наблюдаться при экранировании ферментом части антигенных детерминант либо в результате конформационных изменений, возникающих из-за образования ковалентных связей.
Следует отметить, что в идеальном случае, при котором предполагается наличие молекул антител строго одной аффинности и отсутствие неспецифических взаимодействий, одинаковая чувствительность может быть достигнута при любых соотношениях меж-230
ду константами связывания меченого (7(*) и определяемого (К) антигенов. Для этого следует выбирать соотношение концентраций компонентов, соответствующее условиям (9.14). Иллюстрация этого положения приведена на рис. 31.
Рйс. 31. Теоретические калибровочные графики при отсутствии в системе неспецифического связывания (начальные условия: [Ат]о=0,3 нМ; К= = 10» М—: 1 — [Аг*]о=0,5 нМ; Д*= =109 М-1; 2 — (Аг*]о=4 нМ; К* = 10« М-1; 3 — [Аг*Ь=0,03 нМ; К* = 10Ю М-4
Рис. 32. Теоретическая иллюстрация изменения положения калибровочного графика прн снижении константы связывания меченого антигена и наличии в системе низкоаффинных центров неспецифического связывания (или низкоаффинной фракции антител) :
[Аг*]о=1 нМ; [Ат,]о=О,3 нМ; Х: = 109 М-Ц [Ат2]0=2,7 нМ; Д2=1О7 М-<: / — К*=
= 109 М-1; 2 — Д*=10? М-1; IAtiI, и [Ат2]о — концентрация высоко- н ннзкоаф-фннных центров связывания антител
В реальных системах, в которых имеются центры специфического и неспецифического связывания, снижение константы связывания меченого антигена может приводить к возрастанию вклада неспецифических вазимодействий, проявляющегося в изменении положения калибровочного графика (рис. 32). Поэтому уменьшение способности антигена к связыванию с антителами вследствие введения ферментной метки крайне нежелательно.
После рассмотрения общих закономерностей конкурентного анализа проиллюстрируем теоретическими графиками влияние констант связывания и концентраций реагентов на положение калибровочных кривых (рис. 33), построенных путем решения уравнений (9.3) — (9.5) на ЭВМ.
231
Сравнение графиков показывает, что чувствительность определения антигена зависит от константы связывания и улучшается с ее увеличением. За параметр, характеризующий возможность измерения данной концентрации антигена, удобно принимать отношение равновесных концентраций связавшегося с антителами меченого антигена в отсутствие и в присутствии определяемого антигена (В*/[АтАг*]). Близкие к единице значения этого параметра
tgMr0] , [м]
Рнс. 33. Теоретические калибровочные графики при разных значениях константы связывания реакции антиген — антитело:
[Аг*]о=О,4 нМ; [Ат]о"О,12 нМ: значения К—К* и для кривых 1 — 4 соответственно равны 106, 10®, ЮЮ, Ю12 м-1
Рнс. 34. Изменение теоретических калибровочных зависимостей в конкурентном .методе при ' варьировании начальной концентрации антител: ([Аг*]п=0,4 нМ; К=К* = 108 М->): для кривых 1 — 4 [Ат] • 10» соответственно равна 0,6; 1^5; 2,5; 5,0 М
указывают на то, что достоверное измерение антигена маловероятно. Однако реальный предел возможности определения может быть установлен только с учетом ошибки метода регистрации ферментативной активности. Однако, как видно из графиков, площадь, которая заключена между соседними кривыми, уменьшается с ростом констант связывания. Нетрудно убедиться, что при фиксированной концентрации меченого антигена существует предельное значение константы связывания, превышение которого сопровождается минимальным дальнейшим увеличением чувствительности. Этот эффект будет проявляться при близкой к 100% степени насыщения центров связывания, антител меченым антигеном в отсутствие определяемого антигена. Так, кривая 4 (рис. 34)
232
(степень насыщения антител 99%) при увеличении константы связывания до 1013 М-1 и выше не изменяет своего положения. Дальнейшее увеличение чувствительности может быть достигнуто только снижением начальной концентрации меченого антигена, кото
рое ограничено чувствительностью регистрации метки.
Теоретические калибровочные графики при различных концентрациях антител приведены на рис. 34. Как следует из проведен-
ного математического анализа, максимальная чувствительность (кривая 1) наблюдается при концентрациях антител, не превышающих значений констант диссоциации комплекса антиген — антитело.
• Возможность использования для анализа больших или меньших количеств меченого антигена определяется степенью сохранения ферментом каталитической активности после ковалентного связывания и чувствительностью регистрации продуктов ферментативной реакции. Из данных (рис. 35) следует, что при К=108 М-1 варьирование концентрации меченого антигена иа два порядка при практически неизмеииой концентрации антител не влияет на положение калибровочного графика, что обусловлено низкой степенью насыщения центров связывания. Это означает, что при константах связывания 108 М-1 и ниже уменьшение
Рнс. 35. Влияние начальной концентрации меченого антигена и констант связывания на нижний предел обнаружения антигена в конкурентном методе:
1ля кривых 1, 2	К=К*=108 М—*;
[Аг*]о=4.4 и 0,44 нМ; для кривых 3,
4, 5 K=K’ = 10'° М-‘; [Аг*]о=4,4; 0,44;
концентрации ферментной метки За0,04 нМ соответственно;
*	т г	этложена величина
счет увеличения активности фермен- ного антигена в %
по оси ординат связывания мече-
та не должно приводить к изменению нижнего предела обнаружения антигена.
• При увеличении константы связывания до 1010 М-1 наблюдается уменьшение нижнего предела детекции при снижении концентрации меченого антигена. Теоретически при возможности бесконечного уменьшения концентрации ферментной метки и антител и бесконечного увеличения константы связывания чувствительность определения антигена не имеет нижнего предела. На практике такое условие, естественно, невыполнимо, что приводит к ограничению чувствительности анализа.
Регистрируемой величиной в иммуноферментном анализе является концентрация продукта ферментативной реакции. Скорость его образования пропорциональна каталитической активности в системе и определяется по изменению какого-либо ее параметра
233
(оптическая плотность, интенсивность люминесценции или флуоресценции ит. д.).
Проводя анализ конкурентным методом по рассмотренной схеме, определяют снижение равновесной концентрации связанного с антителами меченого антигена при наличии в системе определяемого соединения по отноше
Рис. 36. Теоретические калибровочные зависимости в конкурентном анализе при различных соотношениях констант связывания для меченого и определяемого антигенов:
[Ат]о=12,5 иМ; [Аг*]о — 0,4 нМ; для кривых 4, 2, 3 К*=10» м-1; К=10ю, 109, юз м-1;
для 4 К=108 М-1; К* = 109 М-1
нию к этому же параметру в отсутствие антигена. В условиях пропорциональности концентраций продукта реакции и фермента регистрируемые физические параметры от фоновой и «рабочей» равновесных концентраций Ат * также будут отличаться. Пределом обнаружения определяемого антигена [Аг] 0 мин в данном случае будет та его концентрация, при которой различие между регистрируемыми сигналами при [Аг]о мии и при [Аг]о=О превышает ошибку измерения прибора. При данной каталитической активности фермента возрастание абсолютного значения измеряемого параметра можно достичь путем увеличения времени проведения ферментативной реакции.
• Применение высокоактивных фрементов или подбор условий, приводящих к увеличению эффективного значения АКат, позволяет
уменьшать начальную концентрацию меченого антигена при сохранении абсолютного значения регистрируемого прибором параметра. Это делает анализ более эко-
номичным, а при высоких значениях констант связывания, как отмечалось выше, приводит к увеличению чувствительности опреде-
ления.
Влияние константы связывания меченого антигена на положение калибровочного графика. При рассмотрении теоретических основ радиоиммунологического анализа, как правило, предполагается равенство констант связывания с антителами нативного и меченного изотопом антигена. В ИФА это предположение может соблюдаться в отдельных случаях, но его нельзя считать общим. Сохранение иммунологической активности антигена, связанного с ферментом, в значительной степени зависит от соотношения их размеров и расположения антигенных детерминант на поверхно-
234
Рнс. 37. Теоретические калибровочные графики в отсутствие и в присутствии ннзкоаффинных антител:
кривая 1—[Ат]о=О,3 иМ;
= 109 М-1; кривая 2 —к высокоаффин-иым антителам «добавлены» иизкоаф-финные с К=К*=>107 М-1 н концентрацией 2,7 нМ; [Аг*]о=1 нМ для обоих графиков
сти молекулы. Поэтому представляет интерес проанализировать случай конкуренции за активные центры антител молекул антигена, обладающих различными константами связывания.
На рис. 36 приведены теоретические калибровочные графики, построенные при различных соотношениях констант связывания нативного и меченого антигенов /С и /С*. Из сравнения зависимостей следует, что при неизменных концентрациях реагентов наклон начального участка кривых возрастает при увеличении отношения KJK*, т. е. из нескольких .перекрестно реагирующих антигенов с наилучшей чувствительностью будет определяться тот, у которого константа связывания в максимальное число раз превосходит константу связывания меченого антигена.
Анализ связывания антигена при гетерогенности активных центров антител. Неоднородность по константам, связывания присуща большинству популяций антител. В общем случае процесс связывания осуществляется множеством центров, обладающих различным сродством к антигену, что крайне .осложняет математическое описание модели. Однако даже при значительном различии констант связывания иммобилизованные антитела экспериментально трудно дифференцировать более чем на два типа центров. Поэтому практический интерес представляет анализ модели с двумя
типами центров, характеризующимися различными эффективными значениями констант связывания антигена.
При различии констант связывания меченого и определяемого антигенов с активными центрами антител данная система в равновесии описывается следующими уравнениями:
[AtJ+АГ, [Ат,] [Аг] +АГ?[Ат,] [Аг*]=[Ат,]0	(9.15)
[Ат2] + К2 [Ат2] [Ar]+tf£[ Ат2] [ Аг*] = [ Ат2]0	(9.16)
1Аг]+^[Ат,][Аг]+ЛГ2[Ат21[Аг]=[Аг]о	(9.17)
[ Аг]+АГ? [Ат,] [Аг*]+/G* [Ат2] [ Аг*]=[ Аг*]0	(9.18)
235
где Ki, и Лг, Ki* — константы связывания определяемого и меченого антигенов с активными центрами антител Atj и Ат2 со-
ответственно.
Анализ данной модели позволяет оценивать влияние добавки в систему низкоаффинной фракции антител на результаты определения антигена (рис. 37). Из решения системы уравнений (9.15—9.18) на ЭВМ следует, что вклад низкоаффинных анти-
[Аг* Ат- Аг*]- 10е, М [Аг, Ат, Ат- Аг]-ИЛ,М
Рис. 38. Теоретические кинетические кривые изменения концептра-
тел в основном проявляется в сдвиге калибровочного графика вверх по оси ординат и увеличению фонового сигнала.
Время проведения анализа по конкурентной схеме определяется, в основном, временем приближения реакции антиген — антитело к равновесному состоянию. Это время, в свою очередь, зависит от констант скоростей реакции образования и диссоциации комплекса антиген — антитело, а также от начальных концентраций компонентов. Так как значения констант скоростей Ki и /(_! обусловлены природой реаги-
ции компонентов при конкурентном рующих веществ, диапазон концен-аиалнзе:	трации определяемого антигена —
[Ат]о=50 нМ; [Аг]о=30 нМ; Ат*]о= г	г
=4,4 нм; *,=*,*=10' м-'-с-ь *_,= его содержанием в исследуемой
=fe*_1=5 • ю-s с-1	пробе, а меченого — чувствитель-
ностью метода регистрации ферментативной активности, время достижения равновесия практически
можно снижать только увеличением концентрации антител *. В связи с этим при проведении конкурентного анализа уменьшение времени инкубации компонентов за счет увеличения концент-
рации антител возможно лишь в тех случаях, когда концентрация антигена в растворе значительно превосходит нижний предел чувствительности метода, определенный при оптимальной концентра-
ции антител.
При условии равенства констант скоростей образования и диссоциации специфического комплекса для определяемого и меченного ферментом антигена время достижения равновесного состояния в реакции с антителами одинаково. Текущая и равновесная концентрации меченого компонента в данном случае могут быть
* Следует учитывать, что увеличение концентрации антител можно проводить лишь до определенного предела, чтобы антитела находились в недостатке по отношению к концентрации антигена и имели место конкуренции свободного и меченого антитела за связывание с активными центрами антител,
236
определены с учетом начального мольного соотношения антигенов в реакционной смеси. Эти положения иллюстрируются теоретическими кинетическими кривыми изменения концентрации компонентов при конкурентном анализе (рис. 38).
§ 2. Метод последовательного насыщения
В отличие от конкурентного ИФА рассматриваемый метод основан на последовательном взаимодействии антител сначала с определяемым, а затем с меченным ферментом антигеном. Проведение анализа возможно двумя путями. В первом случае меченый антиген добавляется непосредственно в инкубационную смесь, содержащую антитела и исследуемый образец. Во втором случае (возможном только при применении твердофазного ИФА) иммуносорбент после первой реакции отмывают от несвязавшихся компонентов, а затем вводят меченый антиген. В методическом плане второй путь часто предпочтительней, так как позволяет избежать возможное ингибирующее влияние компонентов исследуемой биологической жидкости на фермент-маркер (см. гл. 4, § 2).
Концентрация связавшегося с антителами конъюгата пропорциональна начальной концентрации антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.
• Проведем рассмотрение схемы, исходя из следующих условий: 1) комплекс антиген — антитело образуется в стехиометрическом соотношении 1:1; возможность образования комплексов более сложного состава не учитывается;
2)	реакция антител с антигеном на первой стадии проходит до установления равновесия;
3)	антитела взаимодействуют с определяемым и меченым антигенами с разными константами связывания;
4)	в ходе анализа регистрируется концентрация меченого антигена, связавшегося с антителами;
5)	перед добавлением меченого антигена комплекс антитело — антиген отделяется от несвязавшихся компонентов;
6)	в процессе инкубации с меченым антигеном связавшийся на первой стадии определяемый антиген способен диссоциировать из комплекса с антителами.
Модель, основанная на этих допущениях, не отражает всей сложности реальной системы, но дает возможность оценить влияние наиболее существенных параметров на результаты анализа.
Анализ метода последовательного насыщения упрощается, если рассматривать две его стадии раздельно. На первой стадии фактически происходит титрование антител антигеном и количество свободных центров связывания антител уменьшается с увеличе
237
нием начальной концентрации антигена. Этот процесс описывается зависимостью [АтСвободные]=/([Аг]о) и является определяющим для анализа в целом.
Как и в рассмотренном конкурентном ИФА, при возможности прямого определения свободных антител . (или образовавшихся комплексов антиген — антитело) анализ мог бы быть ограничен одной стадией. Необходимость во второй стадии возникает только из-за отсутствия методов регистрации первого процесса в области низких концентраций антигена. В связи с этим во второй стадии появляется возможность регистрировать информацию, заложенную в систему на первой стадии, а именно концентрацию оставшихся свободными центров связывания антител. Следовательно, задача оптимизации условий проведения второй стадии состоит в передаче этой информации с минимальными искажениями, что достигается при наличии линейной пропорциональности регистрируемого сигнала количеству оставшихся свободными активных центров антител. Тогда, базируясь на той же логике рассуждений, что и для конкурентного анализа, можно заключить, что задачей оптимизации метода последовательного насыщения в целом является выбор условий, приводящих к максимальному соответствию результирующей калибровочной кривой и кривой титрования, получаемой на первой стадии.
При разработке современного аналитического метода, как правило, стремятся к достижению высокой чувствительности и экспрессности. В связи с этим проведем качественную оценку параметров, в наибольшей степени влияющих на нижний предел обнаружения антигена и длительность анализа.
При рассмотрении будем использовать те же обозначения, что и в конкурентной схеме. Кроме того, обозначим константы скоростей образования и диссоциации комплексов антител с определяемым и меченым антигеном соответственно k[ и k[* (М-1-с-1); k-i и k*-i (с-1); Т — время инкубации с меченым антигеном. В рамках принятой модели первая стадия анализа проходит по схеме
к
Ат-]-Аг-.—- АтАг; К [Ат] [Аг] — [АтАг].	(9.19)
Обозначим через п долю центров связывания антител, заполненных после установления равновесия с антигеном, т. е. п[Ат]о= =[АтАг]=[Ат]0—[Ат] или п=1—[Ат]/[Ат]0. Выразив в уравнении (9.19) [АтАг] через ([Ат]о и представив равновесную концентрацию свободных центров связывания антител и антигена как разность начальной концентрации и концентрации комплекса, получим
[Аг]0=л [Ат]0+—- -L	(9.20)
1 — п л
238
Возможность определения данной начальной концентрации антигена в методе последовательного насыщения зависит от степени насыщения антител. Если при взаимодействии с антигеном заполняется очень малая часть центров связывания, то после добавления меченого антигена регистрируемый сигнал в пределах ошибки изменения не будет отличаться от сигнала в отсутствие
определяемого антигена. Учитывая точность, характерную для проведения анализа, можно приближенно принять, что достоверное определение концентрации антигена будет осуществляться как минимум при 10%-ном заполнении центров связывания (п= = 0,1) и максимум при 90 %-ном заполнении (п=0,9). Характерная кривая титрования приведена на рис. 39. Соответствующие этим степеням заполнения начальные концентрации антигена [Аг] мин и [Аг] макс, по существу, являются минимально и максимально определяемыми для данного метода, причем [Аг]мин фактически отражает нижний предел обнаружения антигена.
Подставляя численные значе-чения п в выражение (9.20) и округляя, получаем:
[Аг]мин — 0,1 ([Ат]о-[-—j ; [Аг]иакс«[Ат]0+^-.
Рнс. 39. Характерная кривая титрования, получаемая в результате проведения первой стадии ИФА по методу последовательного насыщения: по оси абсцисс — концентрация определяемого антигена; по оси ординат — концентрация свободных центров связывания антител; ArmIn и Агтах — концентрации определяемого антигена, при которых степень. заполнения антител антигеном (л) составляет 10 и 90% соответственно
(9.21)
(9.22)
Выражение (9.21) иллюстрирует логически понятное положение о необходимости использования для детекции низких концентраций антигена высокоаффинных антител. Из этого же выражения следует, что для снижения абсолютного значения [Аг]мпя (т. е. для повышения чувствительности) необходимо снижать концентрацию [Atjo до примерно равной обратной константе связывания 1/К. Дальнейшее снижение [Ат]0 нецелесообразно, так как в пределе может привести только к двукратному уменьшению [Аг]Мии, что в большинстве случаев непринципиально. В то же время возможность уменьшения [Ат]о лимитируется чувствительностью детекции Метки, концентрация которой в комплексе с антителами, очевидно,
239
не может превышать [Ат]о. С уменьшением [Ат]0 будет также возрастать и время достижения равновесия на первой стадии.
На практике часто возникает необходимость измерения концентраций антигена, значительно превышающих значение 1//G В этом случае целесообразно проводить первую стадию в кинети7 ческом режиме, что существенно снижает и длительность анализа в целом, или же прибегать к разведениям исследуемых образцов.
Сравнивая (9.21) и (9.22), нетрудно заметить, что при изменении [Ат]0 значительно меняется ширина рабочего диапазона. Если при малых концентрациях ([Ат]0<С 1/К) она составляет два порядка (0,1/10/К), то при больших — только один (0,1[Ат]о-г-[Ат]о). В ряде случаев (в зависимости от изменения содержайия антигена в биологической жидкости) увеличение рабочего диапазона определяемых концентраций может быть целесообразным. Но следует учитывать, что это приводит к некоторому увеличению относительной погрешности вычисления концентрации антигена за счет уменьшения крутизны калибровочной кривой.
Качественно рассмотрев некоторые закономерности анализа на первой стадии, перейдем к анализу ситуации, возникающей после удаления несвязавшихся компонентов и добавления в систему меченого антигена. При этом в рамках принятой модели идут два процесса: связывание меченого антигена свободными активными центрами антител и диссоциация образовавшегося на первой стадии специфического комплекса по следующей схеме:
Ат-ф Аг* <--Ат Аг*	(9.23)
АтАт«—-—Ат-f-Ar	(9.24)
Схема описывается системой уравнений:
^[АтА1~] =^jAT]IAr]_^jATAr]	(9 25)
dt
^АтАг*] jAtj lAr#J _ £*_1{АтАг*1	(9.26)
dt
[Ат]о=[АтАг*]-|-[АтАг]4-[Ат]	(9.27)
TV=[Аг]-[-[Ат Аг]	(9.28)
[Аг*1о=[Аг*] + [АтАг*]	(9.29)
с начальными условиями; [АтАг*]=0; [АтАг]=7У, где /V— молярная концентрация антигена, оставшегося в комплексе с антителами после удаления несвязавшихся компонентов.
Возможности аналитической системы на второй стадии в основном определяются временем инкубации и концентрацией меченого 240
антигена. Как и для первой стадии, проведем качественную оценку влияния этих параметров.
Время инкубации. Скорость связывания в каждый момент времени пропорциональна концентрации свободных центров связывания антител. Поэтому наилучшее соответствие кривой титрования и калибровочной кривой (т. е. соблюдение условия строгой пропорциональности между концентрациями связанного меченого антигена и свободных центров связывания) должно достигаться при
Рис. 40. Теоретические кривые титрования (/) и калибровочные графики (2), полученные при временах проведения второй стадии ИФА по методу последовательного насыщения /=10 мин (а) и t=2 ч (б):
[Ат]о=О,2 нМ, [Аг*]0=1 нМ; А(=А*1=5  10-5 М-1  с-1; А1-Л*_1-10-4 с-1
крайне малом времени проведения реакции. При возрастании времени инкубации пропорциональность может существенно ухудшаться прежде всего за счет диссоциации образовавшегося на первой стадии специфического комплекса. С наибольшей силой этот эффект должен проявляться в правой части калибровочного графика, где на первой стадии достигается значительное заполнение центров связывания. Образование свободных центров связывания вследствие диссоциации в концентрации k-ЛАт]0 (в линейном приближении) должно приводить к сдвигу правой части калибровочного трафика вверх относительно кривой титрования за счет связывания меченого антигена с освободившимися центрами. Для нивелирования этого эффекта достаточно, чтобы количество образующихся таким образом свободных центров связывания не превышало величину порядка 10% от [Ат]о, для чего время прове-
241
дения второй стадии следует выдерживать примерно
На рис. 40 приведена графическая иллюстрация этого положения. Из рисунка следует, что при правильном выборе длительности инкубации с меченым антигеном калибровочный график и кривая титрования в нормированных координатах практически совпадают.
Рис. 41. Экспериментальные (а) и теоретические (6) калибровочные графики определения инсулина:
время инкубации с меченым антигеном для кривых / — 4 соответственно равно 5, 10, 20, 80 мин; теоретические кривые построены прн следующих значениях: (Ат]о=О,3 нМ; [Аг*]0=1 нМ; А1=^*1=5 • 105	i=
= 10-4 С-1
На рис. 41 приведены теоретические и экспериментальные калибровочные графики определения инсулина, полученные при различных временах инкубации с меченым антигеном. Из сравнения теоретических кривых, полученных при значении k-1 = 10~4 с-1 (0,1/k-1~ 17 мин), следует, что при увеличении времени проведения второй стадии существенно выше 15 мин (кривые 3, 4) отношение между значениями ординат, соответствующими минимальной и максимальной концентрациям определяемого антигена, стремится к единице, что делает невозможным проведение анализа. Экспериментальные зависимости удовлетворительно коррелируют с теоретическими, что дает основание использовать расчетные данные для оптимизации реальной аналитической системы.
Концентрация меченого антигена. Практическим критерием выбора концентрации меченого антигена является возможность до-242
стбверной регистрации сигнала от метки, связавшейся с антителами. При выполнении этого условия концентрация [Аг*]р в методе последовательного насыщения не является строго ограниченной' Однако возможны случаи, когда выбор неоптимального зна-ченйя [Аг*]0 может существенно отражаться на результатах анализа. Допустим, что в опыте используются поликлональные антитела, молекулы которых обладают различным сродством к антигену (такие антитела могут быть экспериментально разделены на высоко- и низкоаффинную фракции, для которых известны концентрации и константы связывания).
Рис. 42. Теоретические калибровочные графики для гетерогенной популяции антител:
[Аг*] о для кривых (а) и (б) соответственно равны 1 н 10 нМ; популяция антител с общей концентрацией [Ат]о=О,3 нМ считается состоящей на 30% из высокоаффннных связывающих центров (Al— ki*— 10е М-’-с-1; k_l=k*_i = 10-< с-1) и на 70% из ннзкоаффцнных (Ai= =Ai*=105 М-’-с-1; А_1-^*_1=10—3 с-1); время /=10 мин
Если значения концентраций и констант связывания двух функций антител значительно отличаются, то возрастание [Аг*]0 может приводить к возрастанию фонового сигнала, что проявляется в сдвиге правой части калибровочного графика вверх по ординате. Это объясняется тем, что при достижении полного заполнения высокоаффинных центров связывания дальнейшее возрастание [Аг*]о ведет к увеличению связывания конъюгата только с низкоаффинной фракцией, дающей вклад в калибровочную кривую в виде практически не меняющегося в необходимом диапазоне концентраций [Аг]0 сигнала. Расчетные кривые приведены на рис. 42. Для получения теоретической иллюстрации этого эффекта в модель были введены соответствующие усложнения, позволяющие считать популяцию антител состоящей из двух фракций с различным сродством к антигену.
243
Аналогичный эффект наблюдается и при наличии процесса неспецифического взаимодействия, который обусловлен связыванием меченого антигена избытком центров, обладающих меньшей константой связывания, чем антитела. Для подавления роста вклада неспецифического связывания (или влияния низкоаффинных антител) можно рекомендовать использовать в анализе концентрацию меченого антигена, при которой связывающие центры антител заполняются не более чем на 60—70% или, в линейном приближении, [Аг*]о^ 1/(&1*Т) (при выбранном оптимальном времени Т).
Рис. 43. Теоретические калибровочные кривые при концентрациях меченого антигена 0,3 нМ (а) и 3 нМ (б):
Ат0=2 нМ; **j=2 • 106 м-1 • с-1;	= 10—4 с-1; /=20 мии
Возможна также и ситуация, в которой уменьшение [Аг*]о также может привести к искажению калибровочной кривой. Допустим, что в анализе используются высокоаффинные антитела (/(*^> 1ДАт]0). Тогда при низких значениях [Аг*]0 меченый антиген может практически полностью связаться с антителами даже при условии, что концентрация свободных центров связывания существенно меньше [Ат}0. Это приведет к тому, что рост концентрации свободных центров связывания’ не будет сопровождаться увеличением связывания меченого антигена, следствием чего будет появление плато в начальной части калибровочной кривой, т. е. нижний предел обнаружения антигена повысится. Улучшить чувствительность в такой ситуации можно увеличением [Аг*]0 до значений, равных или превосходящих [Ат]0 (рис. 43).
В большинстве случаев применяемые в ИФА антитела двухвалентны и процессы последовательного связывания первого и 244
второго антигенов могут характеризоваться разными кинетически-
ми и равновесными константами.
При наличии отрицательной кооперативности, т. е. когда свя
зывание антигена одним активным центром антитела приводит к затруднению второго взаимодействия, поведение системы, очевид-
но, близко к рассмотренному случаю гетерогенной популяции ан
тител, состоящей из одновалентных фракций с константами, равными константам первого и второго взаимодействий.
Большой интерес для метода последовательного насыщения представляет анализ эффекта положительной кооперативности. В этом случае на калибровочной кривой может наблюдаться плато или даже «колокол» в области низких концентра
Рис. 44. Теоретический калибровочный график при наличии эффекта положительной кооперативности в связывании антигена двухвалентными антителами: [Ат]о=О,1 иМ; [Аг*]0=1 иМ; /=10 мин; константы для первого связывания: &i=£i*= = 106 М-1-с-1;	• 10-4 с-1; для
второго: А1 = Л*1 = 105 М—1 • с—1; ^_1 = ^*_1=ЗХ Х10-4 с-1
ций определяемого антигена (рис. 44).
Чтобы объяснить этот эффект, рассмотрим изменение скорости связывания меченого антигена в течение времени. В отсутствие кооперативности эта зависимость описывается кривой,
монотонно убывающей к нулю по мере заполнения активных центров антител. При наличии положительной кооперативности, проявляющейся в изменении константы скорости взаимодействия, ско-
рость связывания антигена антителами, прореагировавшими с одним активным центром, оказывается выше в расчете на одну молекулу, чем полностью свободными антителами. Следовательно, по мере связывания антигена на начальном участке рассматриваемой зависимости будет наблюдаться подъем.
Соответственно в методе последовательного насыщения связывание меченого антигена в отсутствие определяемого будет некоторое время происходить с меньшей скоростью, чем при частичном предварительном заполнении антител определяемым антигеном, следствием чего может являться увеличение концентрации связавшегося меченого антигена на начальном участке калибровочной кривой. На рис. 45 представлена расчетная калибровочная кривая, полученная при условии, что константа скорости комплексообразования для второго взаимодействия в 10 раз больше, чем для первого.
245
• Избежать «колокола» на калибровочной зависимости можно, очевидно, увеличением времени инкубации на второй стадии или увеличением концентрации меченого антигена.
§ 3. «Сэндвич»-метод
«Сэндвич»-метод основан на использовании иммобилизованных и меченых специфических антител и является одним из наиболее распространенных подходов для анализа поливалентных антигенов. Метод существует в нескольких модификациях. Наиболее широко распространенная включает две стадии. На первой определяемый антиген взаимодействует с иммобилизованными антителами, затем иммуносорбент промывают и добавляют меченые ферментом антитела, степень связывания которых со свободными детерминантами пропорциональна начальной концентрации антигена. Вторично промывают носитель, добавляют субстрат и регистрируют количество метки, связавшейся с иммуносорбентом (см. схему гл. 5, § 2).
В основе схемы лежат две последовательные реакции антиген-антитело. При этом теоретически предел обнаружения антигена в «сэндвич»-методе в меньшей степени зависит от константы связывания антител, чем в ранее рассмотренных схемах. Это объясняется тем, что сдвиг равновесия в сторону образования специфического комплекса даже при крайне низких концентрациях антигена может достигаться за счет избытка антител на каждой стадии анализа. Поэтому формально предел обнаружения антигена данным методом лимитируется только пределом детекции метки. Но реально значительное увеличение концентрации антител приводит к возрастанию вклада неспецифических взаимодействий, которые и ограничивают нижнюю границу определения содержания антигена.
Как и в предыдущих случаях, проведем теоретический анализ некоторых закономерностей схемы для выявления параметров, которые целесообразно оптимизировать.
На первой стадии анализа происходит связывание антигена антителами, которое для определения низких концентраций [Аг]0 целесообразно проводить в равновесном режиме. Используя ранее введенные обозначения, эту стадию можно записать в виде
Ат Аг--------АтАг	(9.30)
*-1
После установления равновесия несвязавшиеся с антителами компоненты удаляют чаще всего путем промывания носителя с иммобилизованными антителами. В процессе промывки часть связавшегося антигена может диссоциировать и удаляться из системы. Количество адсорбированного антигена пропорционально времени 246
контакта промывающего раствора с сорбентом, из чего следует, что отмывку следует проводить по возможности быстро.
На второй стадии к иммобилизованному комплексу антитело—• антиген добавляют раствор, содержащий меченные ферментом антитела, после чего становится вероятным прохождение следующих процессов:
1)	диссоциация связавшегося антигена в раствор:
АтАг Ат 4- Аг	(9.31)
2)	связывания меченых антител с антигеном в специфическом комплексе на носителе:
АтАг -f- Ат* ч--АтАгАт*	(9.32)
ft-2
3)	диссоциация образовавшегося комплекса по связи с первыми антителами:
АтАгАт* ....- Ат 4-АгАт*	(9.33)
4)	связывание отделившегося комплекса (АгАт*) в растворе с мечеными антителами:
АгАт* 4-Ат* ч---- Ат*АгАт*	(9.34)
*-4
5)	взаимодействие связавшегося на первой стадии, а затем перешедшего в раствор антигена с мечеными антителами:
Аг 4-Ат*-—-АгАт*	(9.35)
*-5
Данные процессы описываются следующей системой уравнений:
£[AtAi ] jAt] [Аг]4-Л-2[АтАгАт*1 — k -ДАтАг] — dt
— Л2 [АтАг] [Ат*]	(9.36)
- [АтАгАт*]==Л2[АтАг] [Ат»]4-МАт] [АгАт*] —
-(£_2+Л_3)[АтАгАт*]	(9.37)
—[Ат*АгАт*] = Л4 [АгАт*] [Ат*] - Л_4 [Ат*АгАт*]	(9.38)
[^А-1 - = [Ат*] [Аг] 4-Л-з [АтАгАт*] Д-Л-4 [Ат* Аг Ат*] -
247
— k-5 [АгАт*] — k4 [АгАт*] [Ат*] — k3 [АгАт*] [Ат]	(9.39)
[ Аг]0=[ Аг] 4" [АтАг] +[ Ат*Аг] -[- [Ат*АгАт] [Ат*АгАт*] (9.40) [Ат]0=[Ат] [АтАг] + [АтАгАт*]	(9.41)
[Ат*]0 = [Ат*] -[- [Ат* Аг] 4- [ Ат*АгАт] 4- [ Ат*АгАт*]	(9.42)
где [Ат*]о — начальная концентрация меченых антител, [Аг]0 — концентрация определяемого антигена, связанного с иммобилизованными антителами после отмывки носителя.
В начальный момент времени на второй стадии [Аг]=0; [Ат* Аг]=[Ат* Аг Ат]=[Ат* Аг Ат*]=0.
Приведем в качестве иллюстраций теоретические графики, полученные путем точного решения данной системы уравнения на ЭВМ.
При наличии антител данной аффинности и необходимости определять антиген в фиксированном диапазоне концентраций величинами, которые может варьировать экспериментатор, являются концентрации иммобилизованных и меченых антител и времена инкубации на первой и второй стадиях.
Как отмечалось выше, на первой стадии целесообразно проводить реакцию в равновесном режиме, выбирая максимально возможную концентрацию антител, не приводящую к значительному увеличению вклада неспецифических взаимодействий. (Отметим, что в ряде модификаций ИФА концентрация антител не может варьироваться в широких пределах. Например, при использовании в качестве сорбента полистирольных планшетов или пробирок эта величина лимитируется площадью поверхности носителя.)
Больший интерес представляет рассмотрение второй стадии.
Длительность реакции с мечеными антителами. После удаления несвязавшегося антигена и добавления меченых антител равновесие, установившееся на первой стадии, смещается ц происходит диссоциация комплекса антитело — антиген. Наибольшая степень диссоциации, очевидно, будет иметь место при значениях [Аг]о, приводящих к образованию специфического комплекса в концентрации, приближающейся к начальной концентрации антител, т. е. влияние диссоциации будет сильнее сказываться в правой части калибровочного графика. Кроме того, степень диссоциации зависит от соотношения концентрации и константы связывания антител. Например, при значении К«1/[Ат]о и при [Аг]0«[Ат]0 после диссоциации в связанном с антителами состоянии остается примерно половина первоначально образовавшегося комплекса антигена ([Аг]0/2). При К^>1/[Ат]о влияние процесса диссоциации будет пренебрежимо мало. Но при работе в диапазоне 1/[Ат]о^>К время инкубации может значительно влиять на концентрацию молекул меченых антител, связавшихся в комплекс АтАгАт*, т. е. в конечном итоге на регистрируемый в ИФА сигнал. Иллюстрирую-248
щая это положение теоретическая зависимость приведена на рис. 45.
При увеличении времени инкубации концентрация связанных меченых молекул сначала возрастает, а затем резко снижается. Эффект снижения может быть вызван тем, что продиссоциировав-ший из комплекса антиген связывается избытком меченых антител, что сдвигает равновесие в сторону дальнейшей диссоциации (отметим, что при выбранных начальных условиях степень заполнения антител антигеном на первой стадии близка к 100%. При меньших степенях заполнения эффект будет менее резко выражен). При данных условиях требуется строгая оптимизация длительности второй стадии анализа. Общей рекомендацией в подобном случае является уменьшение времени до T^i/k_h при котором влияние процесса диссоциации будет незначительно.
Рис. 45. Теоретическая зависимость образования тройного комплекса в «сэндвич»-методе от длительности инкубации с мечеными антителами: [Ат]о=О,1 ИМ; [Аг]о=О,1 иМ; [ЛтЧь= =3 нМ; *,=*i*=10" М-‘-с-'; 4_i= с-1
Рис. 46. Экспериментальная кинетическая зависимость в «сэндвич»-методе а-амилазы:
по оси абсцисс — время инкубации с меченными пероксидазой антителами; по оси ординат — оптическая плотность А прн Л=450 нМ продукта пероксидазной реакции; концентрация антигена для кривых 1 и 2 85 и 15 иг/мл соответственно
Экспериментальный график, подтверждающий возможность перегиба на кинетической кривой связывания меченых антител, приведен на рис. 46. Перегиб наблюдается на графике с высокой начальной концентрацией антигена (кривая 1) и отсутствует при низкой (кривая 2), что может быть обусловлено разной степенью заполнения антител на первой стадии анализа. Из сопоставления кривых 1 и 2 следует, что при неоптимальном времени инкубации с мечеными антителами (более 90 мин) регистрируемые сигналы при разных концентрациях антигена практически одинаковы, что
249
дает экспериментатору неверную информацию. При правильном выборе времени инкубации на второй стадии анализа («50 мин) определяемые концентрации соответствуют истинным. Следует отметить, что случай, подобный рассмотренному, наиболее вероятен при иммобилизации антител на непористых носителях, когда даже при высоких константах связывания соотношение 1/[Ат]0>/С соблюдается из-за крайне малых количеств белка на твердой
Рис. 47. Теоретическая колоколообразиая калибровочная кривая в «сэндвич»-методе (а) и экспериментальный график определения а-амилазы «сэндвич»-методом ИФА на полистирольных планшетах (б):
для а— [Ат]о=о,1 нМ; [Ат*]о=О,1 нМ; ft1=*_1==A*_1 = 10-3 с-1
Начальная концентрация меченых антител. Вторую стадию анализа целесообразно проводить в условиях, приводящих к высокой степени заполнения связанного в комплекс антигена молекулами меченых антител, что способствует достоверному выявлению низких концентраций анализируемого вещества.
Степень заполнения можно регулировать начальной концентрацией меченых молекул. На практике не следует стремиться к насыщению конъюгатом более 90% молекул связанного антигена, так как дальнейшее увеличение практически не влияет на регистрируемый «специфический сигнал», в то время как вклад неспецифических эффектов может расти пропорционально концентрации меченого соединения.
Очевидно, что для достижения высоких степеней заполнения при любых начальных концентрациях антигена концентрация меченых антител должна быть много больше [Ат]о. При работе в диапазоне концентраций меченых антител меньше [Ат]о на кали-250
бровочном графике при увеличении концентрации антигена может наблюдаться колоколообразная зависимость, известная в литературе под названием «хук»-эффект (англ, «hook») (рис. 47). Одной из причин наличия максимума на графике может являться блокировка меченых антител продиссоциировавшим антигеном. Если перегиб обусловлен этим, то эффект должен уменьшаться при возрастании концентрации меченых антител.
§ 4. Конкурентный метод с использованием меченых антивидовых антител
Данный подход находит широкое применение на практике, так как позволяет определять разные антигены (как моно-, так и полидетерминантные) с использованием одних и тех же меченых антител. Анализ проводят следующим образом. К иммобилизованному на носителе антигену добавляют определяемый антиген и специфические антитела. В процессе инкубации иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. В результате на носителе образуется комплекс антиген — антитело, концентрация антител в котором пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. После удаления избытка несвязавшихся компонентов к носителю добавляют меченые ферментом антивидовые антитела, образующие комплекс со специфическими антителами. После удаления избытка меченых антител регистрируют концентрацию метки на носителе (см. схему гл. 4, § 2).
В методе сочетаются принципы конкурентного и «сэндвич»-анализа, количественные закономерности которых рассмотрены ранее. В связи с этим, не останавливаясь на математических расчетах, .кратко суммируем основные рекомендации для оптимизации первой и второй стадий анализа.
На первой стадии иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. Используя введенные ранее обозначения для данного случая [см. уравнение (9.13) ], можно записать:
[Аг]Омин=5*{[Ат]о + у(-^- +*'/ [At]f + KKt [Ат]р2)} ,	(9.43)
где [Аг]о мин — минимально определяемая концентрация антигена; Ki— константа связывания с антителами иммобилизованного антигена; [Ат]г — равновесная концентрация свободных центров связывания антител в отсутствие определяемого антигена.
Для приближения к предельной чувствительности следует выполнять условия (см. с. 230):
251
’A-tIo
[Ат]0 C-±_;
t\i
В
2
где В, — равновесная концентрация антител, образующих комплекс с иммобилизованным антигеном в отсутствие определяемого антигена ([Ат]о=В/-|-[Ат]р).
Рис. 48. Влияние концентрации иммобилизованного антигена иа калибровочные графики в методе ИФА с использованием меченых аитивидовых антител: а — теоретические графики: для кривых 1 и 2 концентрация иммобилизованного антигена составляет 10 и 1 нМ; остальные условия аналогичны: [Ат]0—0Л иМ; (At*]i«10 нМ (начальная концентрация меченых аитивидовых антител); £i“£i*=3-106 М-’• с-1; £_i = 1=Ю“4 с—1 (где Л* и Л*! — константы скорости связывания специфических антител с ииА.оспЛкзоваииым антигеном н меченых аитивидовых антител с комплексом); время инкубации с конъюгатом Г=20 мин; б — экспериментальные графики определения тестостерона данным методом ИФА с использованием меченных пероксидазой аитивидовых антител: концентрация конъюгата тестостерон — белок при адсорбции на полистирольиые планшеты для кривых 1 и 2 составляет 0,5 н 0.05 мкг/мл соответственно; по осн ординат — оптическая плотность продукта пероксидазной реакции
Физический смысл третьего условия состоит в том, что иммобилизованный антиген может значительно смещать равновесие реакций, проходящих в растворе (и тем самым существенно ухудшать калибровочную кривую по сравнению с кривой титрования), только в случае, если он способен связывать значительную часть антител, за которые идет конкуренция. С другой стороны, теоретически выгодное значительное снижение концентрации комплекса на носителе (В,<;[Ат]о) может приводить к трудности его детекции, осуществляемой с помощью меченых аитивидовых антител, что лимитируется чувствительностью регистрации метки.
252
•	При некоторых значениях К выполнение условия В,^[Ат]о/2 может достигаться изменением начальной концентрации иммобилизованного антигена или антител.
Неоптимальный выбор концентрации антигена на носителе может привести к тому, что антитела практически полностью будут связываться с ним в отсутствие определяемого антигена. В этом случае снижение концентрации иммобилизованного антигена будет существенно влиять на чувствительность анализа. Теоретически (см. уравнение (9.43)] снижение за счет этого В, с 0,99 [Ат]о до О,9[Ат]о не должно приводить к заметному изменению амплитуды калибровочной кривой, но предел обнаружения антигена может снизиться в 10 раз, благодаря изменению отношения [Ат]о/[Ат]Р со 100 до 10 (рис. 48):
Степень связывания антител можно оценить экспериментально, сравнивая регистрируемый сигнал, получаемый при измерении иммобилизованного комплекса антиген—антитело после однократной инкубации и вторичного инкубирования раствора с несвязав-шимися антителами с новой дозой иммуносорбента. Если степень связывания велика, то регистрируемый сигнал во втором случае будет значительно меньше, чем в первом, что свидетельствует о необходимости снижения концентрации иммобилизованного антигена.
•	Максимальная чувствительность в данной схеме достигается при проведении первой стадии в равновесном режиме. Но значительно на чувствительность влияет лишь степень приближения к равновесному состоянию реакции определяемого антигена с антителами. Так как эта реакция проходит в растворе, то скорость приближения ее к равновесию может быть значительно выше, чем процесса образования комплекса на носителе. В этом случае для сокращения времени анализа в целом целесообразно увеличивать концентрацию иммобилизованного антигена и проводить реакцию образования комплекса на твердой фазе в кинетическом режиме. Увеличение концентрации иммобилизованного антигена необходимо для образования комплекса в достаточном количестве для последующего его выявления мечеными антителами. Но при этом также следует соблюдать соотношение В:^{Ат]0/2, чтобы не допускать значительного влияния иммобилизованного компонента на реакцию антител с определяемым антигеном в растворе.
Быстрое разделение компонентов возможно в одной из модификаций данной схемы с использованием меченых специфических антител, что устраняет необходимость второй стадии и приводит к значительному сокращению длительности анализа в целом. Однако следует иметь в виду, что эффективное увеличение концентрации антигена на твердой фазе возможно не во всех случаях. Например, при использовании в качестве носителя широко распространенных планшетов и пробирок из непористого полистиро-
253
ла возможность увеличения концентрации лимитируется площадью поверхности материала.
Вторая иммунохимическая стадия анализа включает взаимодействие меченых антивидовых антител со специфическим комплексом антиген — антитело, сформированном на носителе. Основные требования к этой реакции аналогичны рассмотренной ранее второй стадии «сэндвич»-метода анализа. Очевидно, что оптимальными являются условия, обеспечивающие линейную пропорциональность между концентрациями специфических антител в комплексе (которая изменяется от нуля до значения концентрации иммобилизованного антигена) и связавшихся с ними меченых антивидовых антител при минимальном фоновом сигнале.
• Для этого можно рекомендовать следующие меры:
1)	концентрацию меченых антивидовых антител следует выбирать больше концентрации иммобилизованных антител (в том числе и неспецифических, оставшихся в системе в результате отмывки после первой стадии). В противном случае на рассматриваемой зависимости может наблюдаться плато или колоколообразный эффект, что приводит к s-образной форме калибровочного графика с загибом в области малых концентраций определяемого антигена (рис. 47);
2)	длительность проведения второй стадии не должна существенно превышать время достижения равновесия реакции меченых антител со специфическими антителами. Инкубация после достижения этого равновесия может привести к уменьшению регистрируемого сигнала за счет диссоциации комплекса антител с иммобилизованным антигеном, что особенно существенно в условиях, когда начальная концентрация антигена много меньше 1//G Кроме того, неспецифическое связывание антивидового конъюгата при увеличении длительности инкубации будет возрастать, приводя к увеличению фонового сигнала;
3)	уменьшение относительного уровня фонового сигнала, обусловленного неспецифическим связыванием конъюгата, может достигаться также путем тщательной отмывки носителя после проведения второй стадии анализа. Так как прочность связи неспецифически адсорбированного конъюгата относительно невелика, то его отмывка должна происходить с большей скоростью и приводить к уменьшению его относительного вклада в результирующий сигнал. Однако следует учитывать, что для избежания потерь за счет диссоциации значительной части специфически связавшегося конъюгата промывки не должны быть длительными.
• Проведенное рассмотрение четырех широко используемых схем ИФА не претендует на полноту изложения, так как в качестве исходных предпосылок были взяты довольно простые приближения. Усложнение схем требует оперирования более громоздким математическим аппаратом. Целью этого раздела явилась попытка сконцентрировать внимание исследователей на моментах, прин-254
ципиально важных для разработки и оптимизации методик анализа. Известную долю неудовлетворенности у читателей может вызывать тот факт, что оценка этих параметров проведена с использованием значений кинетических и термодинамических констант реакции антиген — антитело, значения которых в большинстве случаев неизвестны и требуют для их вычисления достаточно сложных экспериментов.
Несомненно, оптимизация любого метода ИФА может быть проведена (и в большинстве случаев проводится) чисто эмпирическим путем, так как ни одна теоретическая модель не может универсально описывать процесс взаимодействия различных молекул с антителами и учитывать множество факторов (pH, ионная сила, природа буфера и т. д.), реально на него влияющих. Но знание основных теоретических закономерностей позволяет правильно спланировать эксперимент и избежать многих ошибок при интерпретации его результатов.
10
Методы представления и обработки экспериментальных данных
На заключительной стадии проведения ИФА осуществляется измерение каталитической активности ферментной метки. При наличии отработанной методики анализа регистрируемый при этом параметр однозначно соответствует начальной концентрации измеряемого соединения и служит характеристикой его содержания. Единицы, в которых выражается регистрируемый сигнал, могут быть различны и зависят от метода определения ферментативной актив-сти (например, спектрофотометрический, флуориметрический, электрохимический, люминесцентный и т. д.). На основании полученных данных оператор должен сделать вывод, присутствует ли анализируемое соединение в пробе, и если да, то в какой концентрации. Этот этап является крайне ответственным, и для того чтобы максимально снизить возможность субъективных оценок результатов анализа, современные регистрирующие приборы для проведения ИФА оснащены микропроцессорами, с помощью которых рассчитывают концентрацию определяемого соединения в соответствии с заданной программой. Но пока что в большинстве случаев количественная интерпретация результатов зависит от опыта сотрудника, проводящего анализ.
Методами ИФА можно определять антигены и антитела. Методология представления результатов при этом отлична, поэтому рассмотрим эти случаи отдельно.
§ 1.	Анализ результатов определения антигена
Количественную интерпретацию результатов определения антигена, как правило, проводят на основе калибровочного графика, по оси абсцисс которого откладывают концентрацию антигена в стандартном препарате, а по оси ординат — экспериментально регистрируемый в ИФА параметр. Очевидно, что правильность результатов зависит от качества стандарта и, в первую очередь, от точности определения в нем концентрации антигена.
Используемый для калибровки стандартный препарат представляет собой раствор очищенного антигена определенной концентрации в той биологической жидкости, которая подлежит анализу. В тех случаях, когда это возможно, применяемая для приготовления стандарта биологическая жидкость (Например, сыворотка крови) предварительно должна быть очищена от эндогенного антигена. Способ очистки зависит от природы антигена. Многие гормоны могут быть удалены из сыворотки адсорбцией на угле. Более универсальным путем, пригодным для удаления из сыворотки любых антигенов, является иммуноадсорбция. После приготовления стандарты чаще всего лиофилизуют и хранят до использования при низкой температуре.
Стандарты бывают международные и внутренние. Внутренний стандарт может быть приготовлен в любой лаборатории. Но при этом следует помнить, что значения концентрации антигена в одном и в том же образце, измеренные в лабораториях, использующих разные внутренние стандарты, могут существенно отличаться. Для получения в разных местах сопоставимых результатов под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) утверждаются и создаются Международные стандарты, которые рассылаются в заинтересованные организации. Международный стандарт может быть получен в ограниченном количестве, поэтому при представлении такой возможности его используют для калибровки большой партии внутреннего стандарта, с которым и проводят дальнейшие исследования.
Анализ на основе калибровочных зависимостей сопряжен еще с одним нуждающимся в учете эффектом. Очевидно, что концентрации будут правильно измерены только в том случае,, если антиген в образце и стандарте связывается антителами идентично. В качестве примера представим, что при проведении анализа «сэндвич»-методом комплекс антител со стандартным антигеном Ari образуется с большей константой связывания, чем с исследуемым Аг2. Тогда одинаковый по величине сигнал будет регистрироваться при концентрации [Аг2] большей, чем [Ari], т. е. опре-деленно.е по калибровочному графику значение концентрации исследуемого антигена будет меньше истинной величины.
9—627	257
Неидентичность в свойствах антигенов может проявляться из-за видовых или тканевых различий, а также при существовании в исследуемой пробе нескольких форм антигена (например, молекула-предшественник, антиген-метаболит), каждая из которых обладает различным сродством к антителам. Эти вопросы следует анализировать в каждом конкретном случае отдельно с целью выбора правильной стратегии в приготовлении стандарта и интерпретации результатов анализа.
Форма представления калибровочного графика. На конечной стадии получения калибровочной зависимости экспериментатор в своем распоряжении имеет абсолютные значения регистрируемого параметра, соответствующие начальной концентрации антигена в стандарте. В дальнейшем форма графика, наглядность и удобство работы с ним зависят от того, что и в каком масштабе откладывается по осям.
Масштаб диапазона концентраций антигена в стандарте по оси абсцисс может быть выбран арифметическим или логарифмическим, что скажется на форме графика (рис. 49). Арифметический масштаб целесообразен при изменении концентрации определяемого соединения лишь в узком диапазоне. В широком диапазоне график имеет нелинейный вид, что затрудняет определение низких концентраций антигена, так как-начальный его участок сильно «сжат». В тех случаях, когда концентрация антигена в стандарте изменяется более чем на один порядок, лучше использовать логарифмическую шкалу.
Рис. 49. Вид калибровочного графика при логарифмическом (а) и арифметическом (б) масштабе абсциссы:
[Аг]о — концентрация определяемого антигена. А — регистрируемое в ИФА значение оптической плотности продукта ферментативной реакции
258
На оси ординат в ИФА также могут быть отложены различные величины. Чаще всего это непосредственно регистрируемый сигнал (например, при спектрофотометрическом методе детекции им обычно является оптическая плотность продукта ферментативной реакции, образовавшегося в системе за определенный интервал времени). Такая графическая интерпретация наиболее наглядна и позволяет быстро оценивать воспроизводимость результатов.
Возможность других способов представления ординаты зависит от методики анализа. Если при проведении ИФА используется меченый антиген, все молекулы которого обладают способностью взаимодействовать с антителами, то ордината графика может быть выражена в величинах, широко используемых в ра-диоиммунологическом анализе, а именно как процент связанной метки от начальной (или отношение концентрации связанной метки к свободной, свободной метки к связанной, связанной метки к исходной). Наиболее удобными для практических целей являются графики в двух первых координатах. Их форм-a сходна между собой и с графиками, приведенными на рис. 48. Однако в отличие от рис. 48 в этих случаях по оси ординат откладывается не экспериментальная, а расчетная величина и степень достоверности графика зависит от корректности расчета. Так, отношение концентраций связанного с антителами меченого антигена к свободным (B/F) может быть получено двумя путями: экспериментальным измерением F и вычислением В по разности [Аг*]0—F и, наоборот, экспериментальным измерением В и определением F по разности [Аг*]0—В.
При проведении РИА оба эти пути теоретически равноценны, так как реально регистрируемый сигнал (распад/мин), полученный от одной и той же концентрации связанной или свободной метки, одинаков. При проведении же ИФА теоретически не исключена вероятность, что активность фермента в комплексе иммобилизованное антитело — антиген-фермент будет отлична от его активности в несвязанном конъюгате. В этом случае регистрация одного и того же сигнала на твердой фазе и в растворе не может служить однозначным свидетельством о равном перераспределении начального количества конъюгата. Другими словами, экспериментально определив F и вычислив значение В как разность, получим истинное соотношение В/F, но, экспериментально измерив В (исходя из неизменности каталитической активности фермента в комплексе) и вычислив F, можно получить значение B/F, не отражающее реального перераспределения меченого антигена. Предположение об изменении активности фермента может быть подтверждено или отброшено только на основе проведения дополнительных экспериментов. Наиболее простым из них является одновременно определение В экспериментально и как разность ([Аг*]0—F). Совпадение полученного и вычисленного значения В
9*	259
свидетельствует в пользу неизменности активности фермента в иммобилизованном комплексе.
Эти же рассуждения правомерны и при откладывании по ординате значения В в процентах от начальной концентрации конъюгата. Недостатком последних графиков является отсутствие информации об абсолютном значении реально регистрируемого физического параметра. Например, масштаб ординаты графиков (B/F-?[Ar]0) может быть в диапазоне (0—1) как в случае, когда максимальное значение регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции составляет 1 оптическую единицу (о. е.), так и 0,05 о. е., хотя получение достоверных результатов анализа по второму графику практически невозможно. Та же ситуация возникает при представлении результатов в координатах (% Вч-[Аг]о), если авторы не указывают, какому реально
измеряемому значению соответствует процент максимального свя-
зывания.
Аналогичное представление данных возможно и в тех случаях, когда ИФА проводят с использованием высокоочшценных полнили моноклональных антител, либо их Fab-фрагментов.
Иная ситуация возникает, когда в ИФА применяют меченную ферментом глобулиновую или IgG-фракцию, содержание антител в которых точно неизвестно и может варьировать в довольно широких пределах. Как правило, более 80% меченых IgG в таких конъюгатах неспецифичны к определяемому антигену. В этих слу-
чаях возможна детекция только тех меченых молекул антител, которые в ходе анализа образовали специфический комплекс с антигеном на твердой фазе. На ординату калибровочного графика при этом наносят регистрируемый параметр, пропорциональной концентрации ферментной метки на носителе (например, о. е., о. е./мин и т. д.).
Калибровочные кривые в широком диапазоне концентраций антигена в стандарте, как правило, имеют нелинейный вид. При логарифмическом масштабе на оси абсцисс графики приобретают сигмоидную форму, при арифметическом — гиперболическую. В некоторых случаях целесообразно перестраивать калибровочный график в координатах, в которых он имеет линейный вид. Чаще всего это необходимо при машинной обработке результатов анализа, которая проводится на простых ЭВМ. Сложный вид графика при этом может приводить к значительному увеличению времени счета. Наиболее простым подходом для линеаризации сиг
моидных кривых является представление данных в координатах (logit y-?log[A]o), где У— регистрируемый или расчетный пара-
метр, изменяющийся пропорционально начальной концентрации антигена; функция logit У=1п—-—. Отметим, что спрямление в
этих координатах наблюдается во многих, но не во всех случаях. При ручной обработке результатов искусственная линеаризация
260
не является необходимой, так как при переходе от одних координат к другим реальная точность и чувствительность анализа, естественно, не меняется, но их визуальная (по графику) оценка затрудняется, ибо утрачивается связь с измеряемым физическим параметром.
§ 2.	Определение антител
В плане интерпретации результатов определение антител представляет более сложную задачу, чем определение антигенов.
Ответить на вопрос, какая концентрация антител, специфичных к данному антигену, находится в исследуемом образце, можно только на основе графика, откалиброванного по некоторому стандарту антител. При получении такого «стандартного» препарата возникает ряд сложностей. Во-первых, антитела необходимо выделять в высокоочищенном состоянии, чтобы иметь возможность охарактеризовать концентрацию препарата. Для этого используют метод иммуноадсорбции, что, в свою очередь, определяется доступностью очищенного агента в количестве, необходимом для приготовления иммуносорбента.
Кроме того, приготовление стандарта зависит от того, какой класс антител необходимо измерять в ходе анализа. Далее встает проблема наличия свободной от антител сыворотки для приготовления разведений стандарта, которая далеко не во всех случаях может быть решена просто.
Помимо технических существуют сложности и другого рода. Как уже отмечалось в предыдущем разделе, использование калибровочной зависимости правомерно лишь в тех случаях, когда соединения в стандарте и образце идентичны по способности к связыванию. Выделение же чистых антител иммуносорбцией, проводимое чаще всего при экстремальных значениях pH или ионной силы, может приводить к изменению их константы связывания с антигеном. Таким образом основное условие применения калибровочной зависимости может нарушаться.
Допустим, что эта проблема также решена и константа связывания антител в процессе выделения не изменилась. И в этом случае еще нет оснований считать результаты, полученные по калибровочному графику, истинными. Как известно, иммунный ответ организма на антиген индивидуален. Поэтому даже в том случае, если для приготовления стандарта использовался большой пул сывороток, велика вероятность, что среднеэффективная константа связывания антител в измеряемой сыворотке будет отлична от этой величины для стандарта, что опять будет приводить к неправильному определению концентрации. В связи с изложенным вопрос о точном определении концентрации антител является весьма проблематичным и на практике он ставится крайне редко.
261
Большее значение для практических целей имеют ответы на два вопроса: 1) как соотносится уровень антител в пробе со средним уровнем нормы и патологии; 2) какова динамика изменения уровня антител. Эта информация важна как для целей диагностики и контроля эффективности терапии заболевания, так и для характеристики иммунного ответа при получении антител.
Определение антител чаще всего проводят методом твердофазного ИФА, основанным на инкубации сыворотки с иммобилизованным антигеном, с последующим выявлением связавшихся специфических антител препаратом аитивидовых антител, меченным ферментом.
Построение кривой титрования. Результаты эксперимента представляют в виде, графика, по ординате которого отложен регистрируемый в ИФА сигнал, а по абсциссе — разведение (или титр) исследуемой сыворотки (рис. 50). За титр исследуемой сыворотки принимается максимальное разведение, при котором данным методом анализа достоверно определяется наличие антител, т. е. в отличие от концентрации титр антител для данного образца не является постоянной величиной-, а зависит от чувствительности и точности метода анализа. (Например, титр сыворотки в ИФА больше, чем в реакции преципитации.) Так как регистрируемый в ИФА сигнал обусловлен как специфическими, так и неспецифическими взаимодействиями, обычно параллельно с исследуемой
сывороткой титруют контрольную
Рис. 50. График титрования сыворотки со специфическими антителами (Г) и нормальной (2): стрелкой показано максимальное разведение сыворотки (литр), при котором значения регистрируемого сигнала для двух сывороток различаются статистически достоверно; п — разведение сыворотки.
сыворотку той же видовой принадлежности, но заведомо не содержащую антител. Тогда за титр исследуемой сыворотки следует принимать максимальное разведение, при котором регистрируемый сигнал статистически достоверно отличается от сигнала в случае контрольной сыворотки.
При исследовании динамики изменения содержания антител в сыворотке методом титрования удобнее сравнивать не максимальные разведения, а разведения, соответствующие серединам кривых титрования на ординате. Сдвиг этой точки по абсциссе вправо свидетельствует об увеличении титра. При этом следует учитывать, что изменение титра сыворотки может быть обусловлено изменением как концен
262
трации, так и аффинности антител. Дискриминация этих эффектов требует проведения дополнительных экспериментов по титрованию активных центров антител.
9 Построение полной кривой титрования для каждой исследуемой сыворотки является довольно трудоемкой процедурой, требующей значительного расхода реагентов. В связи с этим часто целесообразнее использовать другой путь. В ИФА антител на основе статистической обработки кривых титрования многих сывороток определяют разведение, при котором значения регистрируемого параметра с известной вероятностью попадают на средний участок кривой титрования, где измерение наиболее достоверно. Это дает в дальнейшем возможность анализировать исследуемые сыворотки в одном разведении.
Определение соотношения Р/N. При использовании ИФА в клинической практике необходимо стремиться к методической простоте и однозначности трактовки результатов анализа. В связи с этим широкое применение находит путь, основанный на измерении исследуемой сыворотки в одном разведении. Параллельно в том же разведении измеряют входящие в состав набора положительную и отрицательную контрольные сыворотки. В качестве критерия наличия антител используют отношение регистрируемых параметров для исследуемой (Р) и контрольной отрицательной (N) сыворотки. Р/N, превышающее единицу, свидетельствует о наличии специфических антител. С учетом ошибок анализа и регистрирующего прибора обычно исследуемую сыворотку считают положительной при P/N^2. Относительный уровень содержания антител оценивают по приближению Р/N к соответствующей величине положительного контроля.
§ 3.	Анализ экспериментальных данных
В этом разделе рассмотрим основные критерии, характеризующие степень достоверности, полученных результатов анализа.
Если в результате N измерений некоторой величины, имеющей истинное значение Лист, за счет случайных ошибок получен ряд экспериментальных значений Xlt...,XN, то на их основе можно вычислить набор статистических коэффициентов, стандартным образом характеризующих измерительный процесс.
Нормальное распределение (распределение Гаусса). . При достаточно большом числе измерений N можно построить кривую частот повторений (или вероятностей появлений) отдельных значений измеряемой величины: на оси абсцисс откладываются экспериментальные значения Ль Х2,..., на осй ординат — вероятность их появлений. Получают кривую нормального распределения (кривая Гаусса)' (рис. 51). При N->oo кривая описывается уравнением
263
/ (X -ХИСт)2
=----7=r- exp I — -—a-2^—
а /2ла \	2a2
(10.1)
Из вида кривой следует, что отклонения от истинного значе-
ния Хист
У
в большую и меньшую сторону равновероятны и что малые отклонения более вероятны, чем большие. Площадь под кривой между значениями Х\ и Х2 имеет смысл ве-
Рис. 51. Кривая нормального
распределеиия с доверительными интервалами
роятности показания при отдельном измерении экспериментального значения в интервале от Xi до Х2, следовательно, площадь под всей кривой равна 1.
Стандартное отклонение. Коэффициент о, входящий в виде параметра в уравнение нормального распределения, носит название дисперсии, среднеквадратичной ошибку, или стандартного отклонения.
При ограниченном наборе экспериментальных значений Х\,...,Хя стан-
дартное отклонение оценивается по формуле
(Ю.2)
где за Хист берегся среднее значение:
(10.3)
Таким образом, стандартное отклонение о имеет смысл среднего отклонения отдельного измерения от Хист.
Стандартная ошибка. Если серии по N измерений повторить достаточное количество раз, то получаемые в каждой серии средние значения Хср будут также нормально распределены вокруг истинного значения ХИст. Дисперсию этого распределения в отличие от стандартного отклонения называют стандартной ошибкой, она равна: S£=о/ 'КА/, т. е, при увеличении количества измерений их среднее значение будет приближаться к истинному значению Хист. Стандартная ошибка SE— среднеквадратичное отклонение .среднего значения Хср от истинного значения ХИ(.т. При наличии ограниченной выборки (Xi,...,Хц) SE вычисляется по формуле
264
/2 (Xi-X,p)3
Коэффициент вариации. Если стандартное отклонение или ошибку выразить в процентах от среднего значения Хср, то эта величина будет называться коэффициентом вариации или относительной средней квадратичной ошибкой:	:
— 100%.
Лср
Доверительный интервал. Если отложить на кривой Гаусса (см. рис. 51) по оси абсцисс ХИСт±сг, ХИст+2о, Хист+3о, то можно увидеть, что в интервал ХИСт±о попадает примерно 67% площади кривой, т. е. в 67 случаях из ста ошибка измерений будет меньше а, а 33 — больше. В интервалы ХИст+2о и ХИст±Зсг попадает, соответственно, 95 и 99,7% измерений. Другими словами, если получено экспериментальное значение Хо, то с надежностью (вероятностью) 0,670 истинное значение будет лежать в интервале Ло±сг, а с надежностью 0,950 и 0,997 — в интервалах Ло±2сг и Ло±3сг.
Интервалы Ло±сг, Х0±2о, Х0±3о называют доверительными интервалами для отдельного измерения с уровнями надежности 0,670; 0,950; 0,997. Для среднего значения ХСР доверительные интервалы будут равны соответственно Хср±а; ХсР±2о; ЛсР±Зсг, однако, имея только ограниченную выборку из N значений, точное значение о определить нельзя. Поэтому доверительные интервалы расширяются из-за этой неопределенности. Доверительный интервал при определенном уровне надежности а и числе измерений АГ равен:
*ср ± i.,NSE=Xct ± iatN ,	(Ю.5)
где коэффициенты приводятся в таблицах распределения Стьюдента.
• Доверительный интервал — интервал вокруг экспериментального значения, в который истинное значение попадает с заданной уровнем надежности вероятностью.
11
Методические рекомендации
В данной главе приведены методики определения антител и некоторых антигенов наиболее широко используемыми методами ИФА. Цель раздела — дать информацию о наиболее распространенных методических подходах при проведении анализа. Следует отметить, что оптимальные условия анализа (концентрация реагентов, длительность инкубаций, время детекции ферментной метки и т. д.) должны определяться для каждого соединения индивидуально, так как они зависят от количественных закономерностей взаимодействия данного антигена с антителами.
§ 1. Приготовление основных буферных растворов
для проведения ИФА и растворов субстратов для измерения ферментативной активности
1.	0,01 М фосфатный буфер (pH 7,4) с 0,1 М NaCl (ФБ). Исходные растворы: а) 1 М К2НРО4Х ХЗН2О —228 г на 1 л Н2О; б) 1 М КН2РО4 — 136 г на 1 л Н2О.
К 40 мл раствора (а) добавляют 10 мл раствора (б) и 29 г NaCl, затем доводят объем до 5 л дистиллированной водой.
2.	ФБ, содержащий 0,05% детергента твин-20 (ТФБ).
В 5 л ФБ растворяют 2,5 г твии-20.
3.	0,01 М Nа-карбонатный буфер (pH 9,6). К 13 мл 0,2 М. раствора Na2CO3 добавить 50 мл 0,2 М раствора NaHCO3 и довести объем до 4 л дистиллированной водой.
4.	0,05 М фосфат-цитратный буфер, pH 5,0.
Д 10,3 мл 0,2 М раствора Na2HPO4-2H2O добавляют 9,7 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты и доводят объем до 1 л дистиллированной водой. (0,2 М раствор готовят растворением 35,61 г Na2HPO4-2H2O в 1 л Н2О, а 0,1 М раствор — растворением 21,01 г лимонной кислоты в 1 л Н2О)
5.	0,05 М трис-HCl буфер, pH 8,5.
К 6,05 г три-(оксиметил)-амииометаиа добав
ляют 275 мл 0,1 М раствора НС1 и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
6.	0,05 М веронал-мединаловый буфер, pH 8,6.
2,19 г мединала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, затем в этот же раствор добавляют 0,35 г веронала. После полного растворения доводят объем до 1 л дистиллироваииой водой.
Приготовление растворов субстратов
для определения пероксидазной активности
1.	Фотометрическое определение с 5-аминосали-циловой кислотой (5-АС). Готовят раствор концентрацией 0,8 мг/мл путем растворения 5-АС в горячей (70°С) дистиллироваииой воде. Затем охлаждают раствор и доводят pH до 6,0 1 М раствором КОН. 30%-иую перекись водорода разводят в 20 раз холодной дистиллироваииой водой. Полученный 0,5 М раствор используют в качестве запасного и хранят при 4-4°С в непрозрачной пластиковой посуде.
Перед измерением активности разводят 0,5 М Н2О2 в 34 раза холодной дистиллированной водой и смешивают с раствором 5-AQ в объемном соотношении 10:1.
2.	Фотометрическое определение с о-фенилендиамином. В 10 мл фосфат-цитратного буфера (pH 5,0) растворяют 4 мг о-феиилеидиамииа и добавляют 10 мкл раствора 30°/о-иой перекиси водорода.
3.	Хемилюминесцентное определение с люминолом. 9 мг люминола растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 10 мл 0,05 М трис-НС1 буфером (pH 8,5). 9 мг л-йодфеиола растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 10 мл трис-HCl буфером.
Исходный 30%-ный раствор Н2О2 разбавляют в 1000 раз дистиллироваииой водой (оптическая плотность при Х=230 им полученного 0,01 М раствора должна быть 0,74). Для приготовления 10 мл субстратной смеси к 9,4 мл 0,05 М трис-HCl буфера (pH 8,5) добавляют по 200 мкл каждого раствора. Субстратная смесь может храниться сутки при 4°С.
§ 2. Определение антител
против вируса гриппа А у людей, вакцинированных гриппозной вакциной '
Знание уровня антител против вируса гриппа дает возможность контролировать качество противогриппозных вакцин, оценивать эффективность вакцинации против гриппа и, в ряде случаев, может служить диагностическим критерием заболевания. Основные результаты, положенные в основу данных методических рекомендаций, приведены в работах, посвященных разработке иммуиофермеитного метода определения антител против вируса гриппа А (Н. В. Бабикова и др., 1984; Т. Ю. Стерикова и др., 1986).
В основу метода положена наиболее распространенная схема определения антител, включающая адсорбцию вируса гриппа в луиках-полистирольных планшетов, последовательную инкубацию иммобилизованного вируса с исследуемой сывороткой крови (или другим препаратом, содержащим антитела) и с меченными пероксидазой антителами против иммуноглобулинов человека и определение активности фермента в образовавшемся специфическом комплексе на носителе,
267
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа * Очищенный препарат вируса гриппа А, конъюгат антител против иммуноглобулинов человека с пероксидазой (АТ-ПХ), компоненты для приготовления субстратной смеси на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), полистирольные планшеты для ИФА, автоматические пипетки, спектрофотометр.
Выделение специфических антител против IgG человека
1. Специфические антитела против IgG человека выделяют методом аффинной хроматографии на колонке с иммуносорбентом (бромциан сефароза с иммобилизованным IgG человека).
 2. Колонку (1ХЮ см) заполняют иммуносорбентом, промывают 100 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,4, с 0,1 М NaCl (ФБ).
3.	Вскрывают 3 ампулы коммерческой моноспецифической сыворотки, содержащей антитела к IgG-человека, растворяют содержимое каждой ампулы в 1 мл дистиллированной воды, растворы объединяют и наносят на колонку с иммуносорбентом. Раствор пропускают через иммуносорбент со скоростью ~ 1 капля в 10 с.
4.	Иммунорорбент промывают ФБ с той же скоростью до исчезновения белка иа выходе из колонки. Белок определяют спектрофотометрически при 1=280 им. Общий объем буфера для промывки—-200 мл.
5.	Сорбированные на колонке с иммуносорбентом специфические антитела к IgG-человека элюируют 0,1 М глициновым буфером, pH 2,5, с 0,1 М NaCl фракциями по 3 мл. Элюированный раствор быстро подщелачивают до нейтральных значений pH.
6.	Количество белка во фракциях определяют спектрофотометрически. Фракции, содержащие максимальное количество ’ белка, объединяют, диализуют против ФБ в течение 14—18 ч при 4°С.
7.	Специфичность и титр выделенных специфических антител проверяют реакцией иммунопреципитации.
8.	Выделенные специфические антитела используют для получения иммуноферментного конъюгата.
Концентрацию антител (С, мг/мл) в растворе определяют спектрофотометрически при 1=280 нм по формуле С=Д28о/1,3.
Получение конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ)
1. Синтез конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодатным методом (см. гл. 7, § 2).
2. Конъюгат используют в рабочем разведении — 500 иг пероксидазы в 1 мл ТФБ. Расчет концентрации пероксидазы в конъюгате производят по формуле С=А4оз-О,44 (мг/мл), где /Поз—оптическая плотность раствора при 403 нм.
Очистка вируса гриппа А(Н^Л2) и A(HiNi)
1. В работе используют вирусы А/Лен/54/1 (HiNi)P и А/Лен/385/80 (H3N2)P, очищенные и сконцеитрироваииые методом адсорб
* Перечислены реагенты, материалы и оборудование, необходимое только для проведения анализа. Реагенты и оборудование для получения антител и очищенных препаратов антигенов, указаны далее в соответствующих разделах методических рекомендаций.
268
ции—элюции иа формалинизированных эритроцитах и хроматографией на пористом стекле.
2. Вирусы концентрируют центрифугированием в течение 1,5 ч при 20 000 об/мин.
3’. Вирусный осадок разводят в минимальном объеме.
4. Содержащую вирус жидкость разливают порциями по 0,5 мл во флаконы и хранят при —54—10°С.
Определение изменения уровня антител у людей, вакцинированных гриппозной вакциной
1.	В лунку полистирольного планшета вносят по 100 мкл вируса гриппа A (H3N2) или A(HiNi), разведенного до концевой концентрации белка — 5 мкг/мл.
2.	Планшеты оставляют для адсорбции иа 18—24 ч при 4°С.
3.	Содержимое лунок сливают, отмывают от несвязавшегося вируса 3-кратно по 3 мин ТФБ.
4.	Высушенные планшеты могут храниться в течение 2 месяцев при 4°С или 6 месяцев при —5-i—10°С.
5.	Исследуемые сыворотки крови людей до и после вакцинации гриппозной вакциной разводят в 500 раз ТФБ.
6.	В первые лунки вносят по 100 мкл раствора ТФБ (контроль без сыворотки). В остальные лунки — по 100 мкл исследуемых парных сывороток (ие менее 3 повторов на образец).
7.	Планшеты оставляют на 2 ч при комнатной температуре.
8.	Содержимое лунок сливают, отмывают 3 раза ТФБ и подсушивают на фильтровальной бумаге.
9.	В лунки вносят по 100 мкл раствора конъюгата Ат-ПХ в ТФБ с концентрацией 500 нг/мл по пероксидазе.
10.	Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, затем отмывают три раза ТФБ.
11.	В лунки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстратного раствора иа основе 5-АС (см. § 1 этой главы). .
12.	Планшеты оставляют на 40 мии при комнатной температуре и фото-метрируют продукт ферментативной реакции при Х=450 им.
Интерпретация результатов
1.	Вычисляют разность (ДА) между оптической плотностью сывороток после вакцинации и до вакцинации и среднеквадратичную ошибку а (см. гл. 10, § 3).
2.	Иммунный ответ на вакцину считают положительным, если величина ДА равна или превышает трехкратную ошибку метода.
§ 3. Определение поверхностного антигена вируса гепатита
В (HiBsAg)
HBsAg — один из основных белковых маркеров вируса гепатита В. Анализ иа наличие и динамику изменения концентрации этого белка необходим для контроля крови, предназначенной для переливания и приготовлении препаратов иммуноглобулинов, а также для дифференциальной диагностики заболевания гепатитом и проведения массовых эпидемиологических обследований.
В основу описываемой ниже методики положены результаты работы по созданию ИФА HBsAg (С, А, Аракелов и др., 1984) и регламент по производ
269
ству иммуноферментных наборов иа HBsAg, выпускаемых Горьковским НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР.
Определение проводится «сэидвич»-методом ИФА, включающим адсорбцию антител против HBsAg иа полнстирольных планшетах и последующее взаимодействие антигена сначала с иммобилизованными, а затем с меченными пероксидазой специфическими антителами. Регистрируемая иа носителе ферментативная активность пропорциональна начальной концентрации антигена и служит характеристикой его содержания.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Антитела против HBsAg; положительный н отрицательный стандарты; специфические антитела, меченные пероксидазой (Ат-ПХ); компоненты для приготовления субстратной смеси иа. основе о-фенилеидиамииа; ФБ; ТФБ; полистирольные планшеты для ИФА; автоматические пипетки; спектрофотометр.
Выделение антител против HBsAg
Для выделения антител используют высокоактивные антисыворотки с титром не менее 1 :500 по реакции преципитации в геле (РПГ^, ие содержащие антитела к белкам нормальной сыворотки человека
1.	Готовят колонку 2X15 см, заполняют ее DEAE-сефадексом А-50 и промывают 15—20 объемами 0,01 М фосфатного буфера, pH 8,0.
2.	К 100 мл сыворотки, содержащей специфические антитела, добавляют 15 г (NH4)2SO4 и оставляют иа ночь при 20°С.
3.	Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мии и растворяют в 25 мл Н2О. Полученный раствор диализуют при 4°С дважды по 12 ч против Н2О и дважды по 17 ч против 0,01 М фосфатного буфера (pH 8,0).
4.	Раствор осветляют при 5000 об/мин в течение 30 мин и наносят иа колонку с DEAE-сефадексом. Элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 8,0).
5.	Собирают фракции по 5 мл и определяют содержание в них белка спектрофотометр ическн при /.= 280 им.
6.	Фракции, содержащие максимальное количество белка, объединяют, диализуют против физиологического раствора и спектрофотометрически определяют концентрацию белка.
Концентрация белка должна быть 8—12 мг/мл. При меньшей концентрации необходимо довести ее до указанных значений, дл'я чего удобно использовать прибор для ультрафильтрации.
7.	Полученный препарат должен обладать удельной активностью ие менее 0,1 мг/мл на единицу титра по РПГ.
8.	Препарат разливают по ампулам и хранят при —20°С.
Очистка HBsAg из сыворотки крови
1.	Для получения очищенного HBsAg отбирают плазму с титром 1 :8 и выше по реакции встречного иммуиоэлектрофореза (ВИЭФ), разводят в 2 раза физиологическим раствором и разливают во флаконы по 200 мл. Флаконы помещают в водиную баню с температурой 80±2-°С и прогревают в течение 1 ч, затем флаконы охлаждают в холодной, воде.
270
2.	Образовавшийся во флаконе сгусток разделяют иа мелкие части стеклянной палочкой и переносит в стакан гомогенизатора, где разрушают при 2000 об/мин в течение 1 мии.
3.	Полученную суспензию центрифугируют при 18 000 об/мин в течение 30 мии и затем собирают иадосадок.
4.	К надосадочиой жидкости добавляют физиологический раствор до объема, в 2 раза превышающего объем исходной плазмы. Затем к полученной смеси добавляют 50%-иый раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ; Л4г=6000) в физиологическом растворе до конечной концентрации 15%. Добавление необходимого количества ПЭГ производят небольшими порциями при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Смесь инкубируют 12—14 ч при +40С.
5.	Сформировавшийся осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок сливают, а осадок растворяют в дистиллированной воде до 1/10 объема исходного материала. Растворение производят иа магнитной мешалке при -J-4°C.
6.	Диализуют полученный раствор против Н2О дважды по 12 ч.
7.	Раствор доводят до pH 2,3 добавлением 1 М. НС1 и вносят кристаллический пепсин из расчета 100 мкг на 1 мл раствора. Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 12—18 ч и нейтрализуют 1 N раствором NaOH до pH 7,2—7,4.
8.	К полученному раствору добавляют 20%-ный водный раствор твии-80 до концентрации 2% и инкубируют 4—6 ч при комнатной температуре.
9.	Полученный раствор промывают двухкратным объемом физиологического раствора иа аппарате «Amicon» с фильтром ХМ-100 и концентрируют до 1/20 объема исходного материала.
10.	Материал наслаивают по 2—3 мл на линейный градиент плотности сахарозы (от 15 до 30% в физиологическом растворе) в стаканах емкостью 35 мл. Центрифугируют при 23 000 об/мин в течение 14—18 ч. Затем градиент фракционируют и отделяют фракции первого белкового пика, определяемого на спектрофотометре при >.=280 им, содержащие HBsAg.
11.	Полученные фракции объединяют и диализуют против физиологического раствора 24—48 ч при +4ОС с последующим концентрированием до содержания белка 0,1—0,2 мг/мл.
12.	Собранный материал разливают в ампулы и хранят при —20°С.
13.	Полученный препарат очищенного HBsAg контролируют: а) иа специфическую активность по ВИЭФ, величина которой должна быть ие ниже 5 мкг на единицу титра; б) на полноту очистки по РПГ. Полученный препарат не должен давать линий преципитации с антисывороткой к белкам плазмы человека. 
Приготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ)
Для работы используют ПХ с .RZfAwa/Aaeo) = =2,94-3,3.
1. Получение конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодатным синтезом по методике, описанной в гл. 8, § 2.
2. Конъюгат выделяют гельхроматографией иа колонке (1,6X100) см с сефадексом G-200, уравновешенным ФБ, при температуре -f-4°C. Скорость элюции 0,2—0,3 мл/мии. Измеряют оптическую плотность собранных фракций (по 3 мл) на спектрофотометре при длинах 280 нм и 403 им. Объединяют фракции конъюгата, имеющие значение коэффициента связывания (К=А4оз/А2во) от 0,4 до 0,6; при А4оз определяют концентрацию по ПХ, разливают небольшими порциями и хранят при —20°С,
271
Адсорбция иммуноглобулинов на нерастворимом носителе
1. В качестве твердой фазы используют полисти-рольные планшеты, в лунки которых вносят по 0,2 мл раствора 1 gG-фракции, разведенной ФБ до конечной концентрации 20 мкг/мл. Инкубируют в течение ночи при 4°С и отмывают ТФБ.
2. Планшеты сушат на воздухе и хранят при —20°С в герметически закрытых пакетах с осушителем.
Постановка иммуноферментного анализа
для определения HBsAg
1.	В лунки планшетов с адсорбированными антителами вносят по 0,2 мл исследуемой сыворотки или плазмы и инкубируют 2 ч при 37°С. После завершения инкубации отмывают пробы пять раз ТФБ,
2.	В лунки вносят по 0,2 мл раствора конъюгата в ТФБ с концентрацией по ПХ ”2 мкг/мл, содержащего 1 % нормальной сыворотки крови человека. Инкубируют 2 ч при 37°С. Затем отмывают пять раз ТФБ.
3.	Вносят в лунки по 0,1 мл раствора субстратной смеси иа основе о-феии-лендиамина (см. § .1 этой главы) и инкубируют 40 мин в темноте при комнатной температуре.
4.	После инкубации останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 2N H2SO4 в каждую луику и измеряют оптическую плотность проб'на спектрофотометре при Х=492 нм.
5.	К каждому опыту ставится положительный контроль в трех повторах и отрицательный — в семи. Положительным контролем является сыворотка или плазма человека, содержащая стандартное количество HBsAg. Отрицательным контролем является сыворотка или плазма человека, не содержащая HBsAg и антител против HBsAg.
Интерпретация результатов
1.	Определяют средине значения оптической плотности положительных и отрицательных проб. Отношение этих величии должно Превышать 10, в противном случае результаты не считаются значимыми.
2.	Содержание HBsAg в исследуемых пробах определяется по отношению оптической плотности этих проб к среднему значению оптической плотности отрицательных контролей, умноженной на 2,1. Если оптическая плотность исследуемого образца выше этого значения, то он считается положительным на содержание HBsAg, если ниже — то отрицательным.
3.	Пример. Среднее значение оптической плотности отрицательных контролей: Ак=0,075. Нижняя граница положительных результатов: АКХ2,1=0,158, Оптическая плотность исследуемых проб:
Ао	Содержание
HBsAg
0,165............................ +
0,568 ........................... +
0,093 ........................... —
0,107............  .	. .	—
4.	Все положительные результаты должны быть подтверждены нейтрализацией. Для этого раствор конъюгата делят иа две части и добавляют к одной сыворотку, содержащую антитела к HBsAg в высоком титре, а в другую — соответствующую нормальную сыворотку в той же концентрации. После параллельной инкубации двух проб положительного по предварительным данным об-272
разца вносят в одну из них конъюгат с нейтрализующей (иммунной) сывороткой, а в другую — с нормальной.
Далее проводят анализ как описано выше.
Если оптическая плотность пробы с нейтрализующей сывороткой в два раза и более ниже, чем с нормальной, то наличие HBsAg в данном образце считается доказанным.
При постановке реакции нейтрализации ставится три положительных и семь отрицательных коитролей (те же, что и в обычной реакции). Оптическая плотность стандартных положительных проб после инкубации с конъюгатом, содержащим нейтрализующую сыворотку, должна быть в два раза и более ниже, чем с нормальной сывороткой, и приближаться к уровню отрицательных конт-ролей. Оптическая плотность отрицательных стандартных проб с нейтрализующей и нормальной сывороткой не должна статистически различаться. В противном случае нейтрализация считается иеспецифической, а результаты — недостоверными,
§ 4. Определение ротавируса и специфических антител
Заболевания молодняка крупного рогатого скота (к.р.с.), вызываемые ротавирусом, наносят значительный ущерб животноводству. Одной из мер борьбы является диагностика заболевания на ранних стадиях, для чего необходимы высокочувствительные методы детекции вируса.
В основу этого раздела положены результаты работы по созданию ИФА ротавируса, обобщенные в методических рекомендациях (Г. Ф. Коромыслов и др., 1984), утвержденных отделением ветеринарии ВАСХНИЛ.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Ротавирусный антиген, специфические антитела против ротавируса (АТ), конъюгат специфических антител с пероксидазой (Ат-ПХ), аитивидовые антитела против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой (Ati-ПХ), положительные и отрицательные стандарты для выявления ротавируса и специфических антител, компоненты для приготовления субстратов на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), полистирольные планшеты, микропипетки, спектрофотометр,
Получение ротавирусного антигена
1.	Ротавирусный специфический антиген — вируссо-держащая суспензия, полученная путем размножения ротавируса в культуре клеток МА-104, концентрированная полиэтиленгликолем (Л1,=6000) и отцентрифугированная при 6000g. Антиген проверен на специфичность с эталонной антиротавирусной сывороткой в РДП. Антиген лиофилизован в ампулах по 1 мл. Срок годности 1 г. (может быть продлен после проверки в реакции ИФА). В качестве контроля используют нативную или лиофилизованную суспензию иеиифицированных клеток МА-104.
Получение антител
1.	Сыворотка специфическая аитиротавирусиая получена гипериммуиизацией кроликов вирусом, очищенным в градиенте плотности хлорида рубидия, Лиофилизована в ампулах по 1 мл, Срок годности сухой сыворотки 3 г.
273
2.	Иммуноглобулины выделены из гипериммуииой аитиротавирусной сыворотки высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония с последующей иоиообмеииой хроматографией иа колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Лиофилизованы в ампулах по 1 мл. Срок годности лиофилизованного препарата 1 год (может быть продлен после проверки в ИФА). В качестве контроля используют иммуноглобулины, выделенные по аналогичной методике из сыворотки крови, не содержащей антител к ротавирусу.
3.	Антисыворотку кролика против иммуноглобулинов быка получают гипер-иммуиизацией по стандартной методике. IgG-фракцию антисыворотки выделяют как описано в п. 2.
Получение конъюгатов антител с пероксидазой
1. Синтез конъюгатов Ат-ПХ и АтгПХ осуществляли перйодатным методом согласно методике, описанной в гл. 7. Выделение, характеристику и хранение конъюгатов проводили аналогично описанным ранее методикам.
Испытуемый материал и его отбор
1. Определение ротавируса проводят в материале от больных и павших телят (фекалии, тонкий отдел кишечника). Пробы фекалий отбирают в стерильные флаконы. Для исследования используют жидкую часть фекалий или супернатант 20—30%-ной суспензии фекалий или кишечника. При приготовлении суспензии кусочек кишечника измельчают и растирают в ступке до образования однородной массы. Суспензию промораживают в течение 18— 20 ч при —10°С, осветляют цеитрифугироваиием при 3000 g в течение 20 мии и иадосадочиую жидкость используют для исследования в ИФА.
2. Сыворотки получают от животных в количестве 5—6 мл, хранят в замороженном состоянии. Допускается их консервирование мертиолатом (1 : 1000) или добавлением антибиотиков. Сыворотку молозива или молока получают по общепринятой методике путем обработки их сычужным ферментом.
Положительные и отрицательные контроли (стандарты) для выявления ротавирусного антигена и антител
1.	Количественное определение вируса или антител н исследуемом материале проводят при использовании калибровочных зависимостей оптической плотности продукта пероксидазной реакции от содержания вируса или антител в положительных и отрицательных стандартных пробах. При необходимости определения концентрации вирусных частиц в исследуемой пробе положительный стандарт получают путем внесения известного количества очищенного вируса в материал (фекалии, фрагменты тонкого отдела кишечника) от здоровых животных, не содержащий ротавируса. Этот же материал используется в качестве отрицательного стандарта.
2.	Если для целей исследования достаточным является знание относительного содержания вируса, то в качестве положительного и отрицательного стандарта используется материал от заведомо больного и достоверно здорового животного.
3.	При определении антител в качестве положительного и отрицательного стандартов используется пул сывороток крови и молозива от больных и здоровых животных,
274
Методика проведения ИФА для выявления ротавирусного антигена
1.	В луики полистирольиых планшетов вносят по 0,2 мл раствора специфических иммуноглобулинов в ФБ в концентрации 5 мкг/мл и инкубируют в течение 18 ч при 4°С или 2 ч при 37°С. Затем удаляют раствор белка и 3—4 раза отмывают луикн ТФБ.
2.	В лунки с иммобилизованными иммуноглобулинами вносят по 0,2 мл специфического (положительного), контрольного (отрицательного) и исследуемых антигенов в разведении 1 : 50. Одновременно проводят титрование положительного и отрицательного антигенов. Пробы разводят ТФБ. Тщательно перемешивают в течение 5—7 с и инкубируют в термостате 1,5—2,0 ч при 37°С. Затем трижды отмывают луики от несвязавшихся антигенов ТФБ. При качественной постановке реакции (ответ «есть» или «нет») постановку осуществляют аналогично, ио материал ие титруют, а ставят не менее трех повторных опытов с разведением 1 : 50.
3.	В отмытые луики вносят по 0,2 мл раствора конъюгата Ат-ПХ в ТФБ с концентрацией 2000 иг фермента в 1 мл, инкубируют 1,5 ч при 37°С и отмывают луики ТФБ. Затем добавляют 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС.
4.	Через 40 мии реакцию останавливают внесением в каждую лунку по одной капле 5N. НС1. Оптическая плотность образующегося продукта реакции пропорциональна содержанию антигена в исследуемых пробах.
Методика проведения ИФА для выявления антиротавирусных антител
1.	В лунки планшетов вносят по 0,2 мл раствора специфического антигена (см. с. 273) в ФБ с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют в течение 18 ч при 4°С. Затем удаляют раствор антигена и 4— 5 раз- отмывают луики ТФБ.
2.	В луики с адсорбированным антигеном вносят по 0,2 мл стандартных — положительной и отрицательной и испытываемых сывороток в разведении 1 :30. Для количественного определения антител в сыворотках их титруют последовательным двукратным разведением в ТФБ, начиная с разведения 1 :30. Тщательно перемешивают в течение 5—7 с и инкубируют в термостате 1,5—2 ч при 37°С. Затем 4—5 раз луики отмывают от несвязавшихся антител ТФБ. При качественной постановке реакции (ответ «есть» или «нет») постановку осуществляют аналогично, ио сыворотки ие титруют, а ставят ие менее трех повторных опытов с разведением 1 :30.
3.	В отмытые лунки вносят по 0,2 мл раствора конъюгата (АтгПХ) в ТФБ в концентрации 2000 иг фермента в 1 мл, инкубируют 1,5—2,0 ч при 37°С и отмывают луики тем же раствором. Затем добавляют 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС.
4.	Через 30 мии реакцию останавливают внесением в каждую лунку по одной капле 5N НС1 и измеряют оптическую плотность.
Интерпретация результатов
Инструментальная регистрация результатов анализа проводится спектрофотометрически при к=450 им.
При отсутствии необходимости строгого количественного определения содержания вируса или антител учет результатов ИФА может проводиться визуально, по цветовой шкале зависимости интенсивности окраски продукта пероксидазной реакции от содержания исследуемого соединения.
1.	При определении концентрации антигена значение оптической плотности, полученное при анализе исследуемой пробы, сравнивается с калибровочными графиками титрования положительного и отрицательного стандартов, Концен
275
трация вируса в исследуемом материале определяется умножением значения, полученного по калибровочному графику, иа разведение пробы при анализе.
Для большей достоверности результатов исследуемый материал рекомендуется анализировать в нескольких разведениях, а искомую концентрацию вируса определять как среднее.
2.	При качественном определении вируса (ответ «есть» или «нет») его наличие считается доказанным, если регистрируемая оптическая плотность продукта ферментативной реакции в случае испытуемой пробы более чем в 2 раза превышает среднее значение оптической плотности отрицательного стандарта.
3.	Исследуемая иа содержание специфических антител сыворотка считается сероположительиой, если среднее значение регистрируемой оптической плотности продукта пероксидазной реакции превышает соответствующее значение для отрицательного стандарта (Л) ие менее чем в 3 раза среднеквадратичную ошибку определения А (см. гл. 10, § 3).
4.	При визуальной оценке результатов реакции интенсивность окраски продукта пероксидазной реакции, измеренная при анализе исследуемого материала, сравнивается с интенсивностью окраски, полученной для положительного и отрицательного стандарта в тех же разведениях. Качественную оценку наличия вируса или антител в образце удобно проводить по цветной шкале:
+++Н------интенсивное коричневое окрашивание;
4—|-4---коричневое окрашивание;
-j—j--светло-коричневое окрашивание;
----окрашивание отсутствует или находится иа уровне отрицательного контроля.
§ 5. Определение вирусов картофеля
Своевременное выявление вирусов в посевном материале и выбраковка зараженных растений являются одним из способов борьбы с заболеваниями картофеля, приводящими к значительному снижению урожайности этой культуры.
В основе этого раздела лежат данные по разработке ИФА вирусов картофеля (А. Ф. Бобкова и др., 1983; Н. М. Напвлишвили и др., 1985), обобщенные в методических рекомендациях (И. Г. Атабеков и др., 1985), утвержденных отделением защиты растений ВАСХНИЛ.
Идентификация вирусов проводится «сэидвич»-методом ИФА, включающим последовательное взаимодействие вируса с адсорбированными иа полистироле антителами, а затем с конъюгатом антител с пероксидазой. Измеряемая активность фермента иа твердой фазе пропорциональна начальной концентрации вируса и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Вирусы картофеля (X, Y, М, S); специфические антитела против вирусов; конъюгат специфических антител с пероксидазой; положительный и отрицательный стандарты; субстратная смесь для определения пероксидазной активности иа основе 5-АС (см. § 1 дайной главы); полисти-рольиые планшеты; автоматические пипетки; спектрофотометр.
Получение высокоочищенных вирусных препаратов
1. X, Y, М, S вирусы картофеля (ХВК, YBK, МВК н SBK соответственно) выделяют из специально зараженных растений. Схема Выделения включает гомогенизацию листьев, осветление экстракта центрифуги-
276
роваиием и встряхиванием с четыреххлористым углеродом. К осветленному Экстракту добавляют ПЭГ-115, отделяют полученный осадок центрифугированием и трижды экстрагируют 0,005 М боратным буфером, pH 7,5. Дальнейшая очистка вирусов проводится ультрацеитрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученный осадок дважды экстрагируют буфером и концентрируют вирус дифференциальным центрифугированием при 80—100 тыс. g.
Выделяемые таким образом препараты вирусов не содержат пигментов растения-хозяина и характеризуются типичным для нуклеопротеидов спектром поглощения в ультрафиолетовом свете (максимум при 7.= 260—265 им, минимум при Х=247 им). Соотношение Е26о/Е28о составляет для ХВК 1,2; УВД—1,15— 1,20; МВК и SBK—1,2—1,25. Коэффициент седиментации в зависимости от вируса и растворителя находится в пределах 115—200 S. Очищенный препарат не должен реагировать с антисывороткой, приготовленной к экстракту из здоровых растений; в электронном микроскопе должны обнаруживаться в препаратах только нитевидные вирионы.
Препараты вирусов хранятся в течение длительного времени при —20°С в присутствии 50%-иого глицерина.
Получение антисывороток к вирусам картофеля
1.	Первая инъекция: 1 мг антигена вводится кролику внутривенно.
2.	Вторая инъекция (через 4 недели): 1 мг антигена в смеси с полным адъювантом Фрейнда вводится подкожно в несколько точек иа спине животного.
3.	Третья инъекция (через 2 недели): 1 мг вируса в смеси с адъювантом Фрейнда вводят подкожно в несколько точек иа спиие животного или в мышцы обеих задних йог.
4.	Кровь собирают в период между 2-й и 4-й неделями, считая от последней-инъекции. Через 4 недели проводят реиммуиизацию. Для этого 1 мг вируса в смеси с полным адъювантом Фрейнда вводят подкожно в несколько точек или внутримышечно в две точки.
Титры сывороток, полученных nd предлагаемой схеме, достигают в среднем 2,5-10~2—5-Ю-2 в методе капельной преципитации и 10~5—10~6 в методе ИФА.
Для работы используют моноспецифические антисыворотки-, в которых отсутствуют антитела к компонентам клетки здорового растения. Нарушение этого условия приводит к значительному увеличению ложно положительных результатов при проведении анализа.
Выделение иммуноглобулинов
Иммуноглобулины выделяют из антисывороток по • следующей схеме:
1.	2 мл антисыворотки разводят 1 : 1 дистиллированной водой п добавляют равный объем 20%-иого водного раствора полиэтилеигликоля (ПЭГ) с Afr= = 6000.
2.	Центрифугируют при 8000 об/мии в течение 15 мии, осадок растворяют ' в 4 мл ФБ,
3.	К 4 мл растворенного осадка добавляют 4 мл 20%-иого водного раствора ПЭГ и центрифугируют вторично при 8000 об/мии в течение 15 мии.
4.	Осадок растворяют в 1 мл ФБ и диализуют против этого же буфера в течение ночи.
5.	Концентрацию иммуноглобулинов определяют спектрофотометрически по формуле АыяХфактор разведения-0,77=С[мг/мл], где А2во—оптическая плотность раствора при 1=280 нм; С — концентрация иммуноглобулинов в растворе,
277
6.	Хранят иммуноглобулины либо в 50%-ном глицерине, либо при —20°С в растворе с конечной концентрацией белка 1 мг/мл. Перед связыванием с пероксидазой иммуноглобулины прогревают при 56°С в течение 30 мин для увеличения стабильности конъюгата при хранении.
Получение конъюгата иммуноглобулинов с пероксидазой (Аг-ПХ)
1.	Синтез конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодатным методом по методике, описанной в гл. 7, § 2. Выделение, характеристику и хранение конъюгата осуществляют как описано ранее.
Методика проведения анализа
1.	Адсорбция антител: адсорбционную иммобилизацию антител проводят из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в ФБ. В лунки планшета вносят по 0,2 мл раствора. Затем планшеты закрывают крышками и инкубируют в течение ночи при +4ОС. На следующий день содержимое лунок сливают1 и планшеты промывают ТФБ 3—4 раза, тщательно встряхивая после последней промывки. Связанные антитела после высушивания планшетов иа воздухе могут храниться при —20°С в течение нескольких месяцев без потери способности взаимодействовать с вирусом.
2.	Добавление исследуемых образцов. При использовании в качестве исходного материала листьев картофеля исследуемый экстракт может быть разведен в 10—50 раз, в случае клубневого материала допускается разведение растительного экстракта в 5—10 раз. Отбор листьев для анализа следует проводить с учетом особенностей локализации вируса в растении в зависимости от фазы развития. Так, например, листовой материал на зараженность Y-внрусом картофеля следует брать из средней и нижней частей растения. М-внрус картофеля в молодых растениях обнаруживается лучше в нижних листьях, а в зрелых растениях верхние листья содержат больше вируса, чем средние и нижние. В клубневом материале для определения вирусов наиболее эффективным является экстракт из глазковой части и проростков клубня.
Все анализируемые пробы вносят в лунки планшета в объеме 0,2 мл в ТФБ и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Для каждого тестируемого образца проводят 2—3 параллельных измерения. В качестве контрольных препаратов используют растительные экстракты из здоровых растений; при тестировании очищенных препаратов вируса контролем служит препарат гетерологического вируса.
В качестве положительного стандарта используют пул экстрактов листьев (или клубней) здоровых растений, в который добавлен соответствующий вирус в известной концентрации. Эта же биологическая жидкость без добавленного вируса служит отрицательным стандартом.
3.	После окончания инкубации с антигеном содержимое луиок сливают и отмывают от несвязавшихся компонентов 4 раза ТФБ. Конъюгат к соответствующему вирусу разводят ТФБ до концентрации 14-2,5 мкг/мл по пероксидазе (изменение концентрации конъюгата зависит от аффинности используемых антител) и добавляют в лунки по 0,2 мл раствора. Инкубируют планшеты при 37°С в течение 1 ч и отмывают 4 раза ТФБ.
4.	После отмывки вносят в лунки по 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), инкубируют при комнатной температуре в течение 30—40 мин. Результаты ИФА регистрируют визуально или спектрофотометрически при Х=450 нм.
Интерпретация результатов анализа
На основании статистической обработки результатов анализа за нижний предел обнаружения данным методом принимают концентрацию вируса (или разведение анализируемого экстракта), при котором регистрируемая оптическая плотность продукта фермеитатиЬиой реакции в два раза
278
превышает аналогичный показатель для гетерологичного вируса или отрицательного стандарта.
При анализе растительного материала за отрицательный уровень принимают усредненное значение оптической плотности продукта пероксидазной реакции, полученное при анализе смеси экстрактов от здоровых растений. Например, среднее значение оптической плотности для отрицательных контрольных проб составляет 0,07 о. е. Нижней границей положительных результатов будет 0,07-2 = 0,14 о. е. Образцы, дающие оптическую плотность выше этой величины, считаются вируссодержащнми.
Количественная оценка содержания вируса в исследуемом материале проводится иа основании калибровочной кривой, отражающей изменение оптической плотности продукта ферментативной реакции при возрастании концентрации вируса в положительном стандарте.
При достаточности получения информации типа «да» или «нет» может проводиться визуальная оценка. В этом случае интенсивность окраски в измеряемых пробах сравнивается с иитеисивностью для отрицательного и положительного стандарта. При разбивке цветовой шкалы в этом диапазоне цветов результаты анализа могут фиксироваться условными обозначениями:
----вирус отсутствует;
Н---материал заражен;
-|—|—- материал сильно заражен.
§ 6. Определение инсулина в сыворотке крови человека
Количественное определение инсулина является одной из мер, необходимых для диагностики и контроля эффективности лечении диабета.
Рассматриваемый ниже ИФА инсулина проводится методом последовательного насыщения (см. гл. 4, § 2), включающим связывание иммобилизованными антителами сначала определяемого инсулина, а затем конъюгата инсулина с пероксидазой и измерение ферментативной активности на носителе, величина которой пропорциональна начальной концентрации гормона.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Антитела к инсулину; стандартные растворы с известной концентрацией инсулина; конъюгат инсулина с пероксидазой (Иис-ПХ); реагенты для фотометрического или хемилюминесцентного определения активности ПХ иа основе о-фенилеидиамииа или люминола (см. § 1 этой главы); полистирольиые планшеты (оптически прозрачные или непрозрачные в зависимости от способа детекции ПХ); автоматические пипетки; спектрофотометр или люмииометр.
Получение антител
Используется IgG-фракция антисыворотки морской свиикИ против инсулина, выделенная полиэтилеигликолем по описанной ранее методике (с. 277).
Получение конъюгата инсулина с пероксидазой (Инс-ПХ)
1. Конъюгат Иис-ПХ получают перйодатным методом (см. гл. 8, § 2). Выделение конъюгата из реакционной смеси осуществляют ионообменной хроматографией на жидкостном хроматографе высокого разрешения (FPLC),
279
Методика проведения анализа
1.	В лунки полистирольного планшета вносят раствор IgG-фракции антител в ФБ с концентрацией 5 мкг/мл. Инкубируют 3 ч при. 37°С, затем отмывают лунки ТФБ. Адсорбированные антитела могут храниться до использования при 4°С в течение 6 мес.
2.	В первые ряды лунок вносят по 0,2 мл стандартных растворов, содержащих инсулин, в различных концентрациях, а в остальные анализируемые образцы-= разведенные в два раза ТФБ. Каждую точку дублируют трижды.
3.	Инкубируют при 4°С в течение 12—16 ч, затем тщательно отмывают лунки ТФБ и вносят в них по 0,2 мл раствора конъюгата Иис-ПХ и ТФБ.
4.	Инкубируют 15 мин при 37°С (или 1 ч при 4°С), промывают лунки ТФБ и вносят субстратную смесь (см. § 1 этой главы).	z
5.	При проведении спектрофотометрической детекции реакцию проводят в течение 20 мин, затем останавливают добавлением 50 мкл 4 М. H2SO4 и регистрируют оптическую плотность продукта пероксидазного окисления о-фенилен-диамина при 1=492 нм.
При хемилюминесцентной детекции активности ПХ в луики планшета вносят по 0,2 мл субстратной смеси на основе люминола и л-йодфеиола. Планшет помещают в кювету люмииометра и регистрируют интенсивность светового излучения в условных единицах.
Интерпретация результатов
1. На основании результатов измерения стандартных растворов строят калибровочный график и определяют по нему концентрацию инсулина в исследуемых образцах.
§ 7. Определение тироксина
Определение тироксина (Т4) необходимо при проведении эндокринологических обследований для оценки функции щитовидной железы, а также для контроля эффективности • терапии ряда заболеваний.
В данном разделе рассмотрен конкурентный метод определения тироксина, основанный на одновременном связывании определяемого (Т4) и меченного пероксидазой Т4 (Т4-ПХ), адсорбированными иа полистироле специфическими антителами.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Антитела к тироксину; конъюгат Т4-ПХ; реагенты для спектрометрической (с о-фенилеидиамином) или хемилюминесцентной детекции ПХ; стандартные сыворотки, содержащие Т4 в известной концентрации (от 0 до 400 нм/л); полистирольные планшеты (прозрачные для спектрофотометрического и непрозрачные для хемилюмииесцеитиого способа определения ПХ; микропипетки; спектрофотометр или люминометр.
Получение антител
В анализе используют у-глобулииовую фракцию антисыворотки кролика к конъюгату Т4 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), выделенную по стандартной методике,
28Q
Получение конъюгата Т4-ПХ
К раствору N-трифторацильного производного тироксина (40 мг) в 250 мкл диметилформамида добавляют 6 мг N-оксисукцини-мида и 10 мг дициклогексилкарбодиимида в 250 мкл диметилформамида. Реакционную смесь перемеривают при комнатной температуре 1 ч и добавляют порциями по 100 мкл к раствору 20 мп пероксидазы (RZ = 3,1) в 1 мл 0,1 М. карбонатного буфера и 0,5 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4°С и затем очищают путем хроматографирования иа колонке с сефадексом G-50 в фосфатном буфере.
Методика проведения анализа
1. В лунки полистирольного планшета вносят раствор у-глобулииовой фракции антисыворотки в ФБ с концентрацией белка 5 мкг/мл. Инкубируют 12—16 ч при 4°С, аатем удаляют раствор и трижды промывают лунки ТФБ.
2. В первые ряды планшета вносят по 20 мкл стандартных сывороток, содержащих известное количество Т4 и 200 мкл раствора конъюгата Т4-ПХ с концентрацией 50 нг/мл по ПХ. Конъюгат разводят в веронал — медииаловом буфере (см. § 1 этой главы), содержащем 0,2 г БСА и 0,2 г анилинонафталин-сульфокислоты. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, затем тщательно отмывают луики ТФБ.
-3. В лунки, в зависимости от выбранного способа детекции ПХ, добавляют по 0,2 мл субстратной смеси для фотометрического или хемилюминесцентного определения и проводят измерение аналогично описанному в § 6, п. 5 раздела Методика проведения анализа.
Интерпретация результатов
По данным измерения стандартных растворов строят калибровочный. график, по которому определяют концентрацию тироксина в исследуемых образцах,
§ 8. Определение тестостерона
Определение содержания стероидного гормона тестостерона (ТС) в сыворотке крови необходимо для диагностики ряда эндокринных заболеваний. Данные об уровне тестостерона в крови и ее следах также могут использоваться в судебно-медицинских исследованиях для идентификации половой принадлежности.
' В данном разделе.рассмотрен конкурентный метод ИФА, включающий конкуренцию адсорбированного на полистироле и определяемого тестостерона за центры связывания специфических антител, С последующим выявлением специфического комплекса иа твердой фазе меченными пероксидазой антивидовымн антителами (А. В. Захарычев и др., 1987).
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Антитела против тестостерона; конъюгат тестостерона с соевым ингибитором трипсина (ТС-СИТ); меченные пероксидазой аитиви-довые антитела; стандартные растворы с известной концентрацией ТС; реагенты для приготовления субстратной смеси иа основе о-феийлендиамииа; полнсти-рольные планшеты для ИФА; автоматические пипетки; спектрофотометр,
281
Получение конъюгата ТС-БСА и ТС-СИТ
Конъюгаты ТС-БСА и ТС-СИТ получены при связывании ТС-2-(о-карбоксиметилоксим) с белками методом смешанных ангидридов (см. гл. 7, § 1).
Антитела к тестостерону
Антисыворотки к тестостерону получают иммунизацией кроличьим конъюгатом ТС-БСА, в котором с молекулой белка связано не менее 20 молекул гормона. Отбор пригодных для анализа антисывороток проводят стандартным методом ИФА, используя планшеты с адсорбированным конъюгатом ТС-СИТ и меченные ПХ антикроличьи антитела. Используют антисыворотки, имеющие в ИФА титр 10~4—10-5. За титр принимают максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором регистрируемое значение оптической плотности продукта ферментативной реакции достоверно отличается от значений, полученных для . нормальной сыворотки в том же разведении. В качестве нормальных используют кроличьи сыворотки, взятые до иммунизации.
Методика проведения анализа
1. В лунки полистирольных планшетов для ИФА добавляют по 0,2 мл раствора конъюгата ТС-СИТ в ФБ с концентрацией 1 мкг/мл. Инкубируют в течение ночи при 4°С, затем отмывают лунки водопроводной водой и ТФБ.
'2. Для построения калибровочной кривой в отмытые лунки вносят по 0,1 мл стандартных растворов ТС в метаноле с известной концентрацией гормона (от 0 до 50 нг/мл) и по 0,1 мл специфической антисыворотки в разведении 1:10 000. В другие лунки вносят по 0,1 мл экстракта из препарата крови и 0,1 мл антисыворотки в этом же разведении. В контрольные лунки добавляют по 0,1 мл нормальной сыворотки в аналогичном разведении. Инкубируют 18 ч при 4°С, затем отмывают лунки ТФБ.
3. Добавляют в лунки по 0,2 мл раствора конъюгата аити-ТдС-кролика с пероксидазой в ТФБ, с концентрацией по ПХ 1—2 мкг/мл. Инкубируют 1 ч при 37°С, отмывают ТФБ и добавляют по 0,2 мл субстратной смеси иа основе о-феиилендиа мииа.
4. Через 30 мин останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 2 М. H2SO4 и регистрируют оптическую плотность раствора при N = =490 им.
Интерпретация результатов
По данным измерения стандартных растворов строят калибровочный график и определяют по нему концентрацию тестостерона в экстракте,
Экстракция тестостерона из сыворотки крови
Используемый в п. 2 раздела методики экстракт получают следующим образом. К 0,5 мл образца плазмы' (сыворотки) добавляют 10-кратиый избыток серного эфира (по объему), встряхивают 10—15 мни, затем помещают пробирку в морозильную камеру. После замерзания осадка иадоса-дочиую жидкость (эфирная фракция) сливают и упаривают в водной бане при 40—45°С досуха. Сухой остаток разводят ТФБ до начального объема образца и используют для дальнейшего анализа,
Заключение
Первые работы по иммуноферментному анализу появились в начале 70-х годов. За это время данное направление стало одним из ведущих в области количественного и качественного определения антигенов и антител ИФА, с помощью которого детектируют химические и биологические соединения различной природы и молекулярной массы — от гаптенов до бактериальных клеток.
Методы ИФА постоянно совершенствуются. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методики самого анализа. Это приводит к тому, что анализ упрощается, сокращается его время, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск возможности использования в качестве маркеров все новых и новых ферментов. Все большее влияние на развитие ИФА оказывают влияние химия высокомолекулярных соединений и техника полупроводниковой микроэлектроники. Использование достижений клеточной и генной инженерии способствует принципиальному изменению технологии получения реагентов для ИФА.
В техническом плане дальнейшее развитие ИФА связано с автоматизацией всех стадий анализа, что особенно актуально при проведении массовых обследований. С целью максимального упрощения использования ИФА в практике сегодня разрабатываются так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анализа необходимо только нанести образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вследствие образования продукта ферментативной реакции.
В настоящее время ИФА все шире используется в различных областях медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. Основными направлениями его применения являются ранняя диагностика заболеваний человека, сельскохозяйственных животных и растений, проведение массовых эпидемиологических обследований, контроль качества продукции, выпускаемой медицинской, микробиологической и пищевой промышленностью, контроль донорской крови на станциях переливания крови и т. д.
Анализ данных по практическому использованию разработанных и созданных новых иммуноферментных аналитических систем позволяет предположить, что в ближайшие годы роль ИФА в научных и практических исследованиях будет неуклонно расти.
Литература
I.	Петров Р. В. Иммунология. — М.: Высшая школа, 1983.
2.	Иммуноглобулины /Под ред. Г. Литман, Р. Гуд. — М.: Мир, 1981.
3.	Структура и функция антител/Под ред. Л. Глинн, М. Стьюард. — М.: Мир, 1983.
4.	Введение в иммунологию/Л. В. Ирвинг, Е. X. Лерой, Б, В. Уильям.— М.: Высшая школа, 1983.
5.	Иммунологические методы исследований / Под ред. И. Лефковитса, Б. Пер-ниса. — М.: Мир, 1988.
6.	Иммуноферментный анализ / Под ред. Г. Г. Нго, Г. М. Леикофф. — М.: Мир, 1988.
7.	Моноклональные антитела / Под ред. Р. Г. Кеннет, Т. Дж. Мак-Керн, К. Б. Бехтол. — М.: Медицина, 1983.
8.	Неизотопные методы иммуноанализа//Итоги науки и техники. — М.: ВИНИТИ, 1987. Сер. Биотехнология. Т. 3.
9.	И. В. Березин, К. Мартинек. Основы физической химии ферментативного катализа. — М.: Высшая школа, 1977.
10.	И. В. Березин, А. А. Клегов, Практический курс химической и ферментативной кинетики. — М.: Изд-во МГУ, 1976.
11.	Л. А. Остерман. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуиоэлектрофорезом и радиоизотопными методами. — М.: Наука, 1983.
12.	С. Д. Варфоломеев, С. В. Зайцев. Кинетические методы в биохимических исследованиях. — М.: МГУ, 1982.
13.	Биотехнология/Пор ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 8. Инженерная энзимология. — М.: Высшая школа, 1987.
14.	Antigens and Antibodies. In: Methods of Enzymatic Analysis / Eds. H. U. Bergmeyer. — Weinheim Federal Republic of Germany VCH Verlagsqe — sellshaft MGH, 1986. V. XI,
15.	P. Tijssen. Practice and Theory of Enzyme Immunoassay. New York. Elsevier Sci., Publishing Co., 1985.
16.	Immunoassays for the 80s/Eds. A. Voller, A. Barflett, D. Bidwell.— Baltimore; Univ. Park Press, '1981.
17.	Complementary immunoassays / Ed. W. P. -Collins. J. Wiley and Sons. Ltd, 1988.
18.	Alternative immunoassays/Ed. W. P. Collins. J. Wiley and Sons. Ltd, 1985.
Предметный указатель*
Авидин 105—107, 128, 192
Авидность 38, 157, 173
Адъювант Фрейнда 150, 152, 153, 167, 277
2,2,-Азиио-ди13-этилбензотиазолнн-(6)-суль-фоновая кислота] (АБТС) 70, 71
Алкогольдегидрогеназа 127, 128
5-Аминосалициловая кислота (5-АС)	70,
71, 267
Аминофталгидразид (АФГ) 132, 133
Аитиген(ы) бактериальных клеток 134*
—	вирусные 134*
—	искусственные 10
—	перекрестно реагирующие 12
—	раковоэмбриональный 138*. 171
Антнтела антивидовые 14, 89, 91, 92, 101, 104, 112, 223, 251, 252*. 254, 261, 273, 281 — аитиидиотипнческие 216 —, изотерма адсорбция 208* — высокоаффиниые 36, 48, 101, 102, 239, 243*, 244 — гибридные 104, 105 — иммобилизованные 210 — моноклональные 12, 37, 38, 41, 44, 47, 52, 163—167, 169, 170—174, 259 — низкоаффинные 45, 48, 235*. 243* — поликлональные 11, 163, 170, 219, 243 Антисыворотки 11, 37, 146, 147, 150, 153— 158, 159*, 160,	171, 176, 204 209, 210,
219, 270 , 271, 274, 277, 279, 281, 282
Апофермент 55, 120, 134, 135
Аффинность 34, 37, 38, 40, 41, 44, 51, 77, 101, 102, 150, 157, 158*, 160, 170, 173, 175, 210, 217, 230, 262, 278
Ацетилхолниэстераза 65*, 66*, 67
Белок А 101, 191
— С-реактивйый 123, 140*
Биотин 105—107, 191, 192
Вирус X картофеля 135
Галактозодегидрогеназа 131 p-D-Галактозидаза 64, 65*, 66*, 67*, 68, 74, 108, 116, 123, 131, 171
Гаптены 5, 10, 15—17, 37, 42—44, 47, 51, 100, 111, ИЗ, 117* 127, 131, 146, 176, 177, 179, 180, 192, 193, 213, 283
Гемин 134, 135, 139
Гибридомы 12, 164—170, 173—175
Глобулин тнрокси-нсвязывающий 140*
Глюкоамилаза 184
Глюкозооксидаза 64, 65*, 67*, 68, 72, 73, 108, 110, 120, 122
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеиаза 66*, 67, 74, 75, 128, 131, 132
Гонадотропин хорионический человека 132, 138*, 140, 171
Гормон(ы) гипофизарный 171 — лютеинизирующий 140, 141* Группа иммуиодомииаитиая 13, 15 Детерминанты антигенные (эпитопы) 10, 12—14, 47, 147, 155, 170—172, 177, 218
Диализ равновесный 42, 43
Дигоксин 117, 118, 137, 138*, 140*
Инсулин 126*, 140*, 148, 149, 152, 216, 219, 220, 221*, 242*
Иммуногенность антигена 146, 147, 149 л-Иодфенол 135, 137, 267 280
Каталаза 65*, 67, НО
Классы иммуноглобулинов 20, 23
* Звездочкой обозначены страницы с рисунками, таблицами, формулами.
Клон(ы) 11, 37, 164, 165, 168 Конъюгат(ы) 70, 130 — альбумина сывороточного человека с аденозиндезамииазой 118 ------каталазой ПО — антигена с глюкозо-6-фосфатом 107 ------ пероксидазой 70, 72 ------ферментом 97, 100 — антиген-эффектор 120 — антител кроличьих против IgG-овцы с p-D-галактозидазоЙ 188
----IgG-человека с фосфолипазой 122 ----с биотином 105, 191 ----р-£)-галактозидазой 185 ----глюкозооксидазой 185 ----глюкозо-6-фосфатдегидрогеиазой 75 ----лектином 107 ----люминолом 197 ----пероксидазой хрена 70, 72, 138*, 190, 208*, 268—271, 273—276, 278 ----производными изолюминола 198 ----фосфатазой щелочной 74, 184» 185, 192
— бластициднна-S с B-D-галактозидазой 195
— гаптена с высокомолекулярным носителем 177
— дигоксин — уреаза 187 — инсулин — пероксидаза 160, 279 ----/P-D-галактозндаза 188
— о-(карбоксиметил)морфина с малатде* гидрогеназой 193
— пероксидаза хрена с IgG 183—185, 189, 190, 214, 218, 220*
— простагландина F2 — БСА 179
— с производными изолюминола 139 — стероидов с носителями 177 — тиротропина с щелочной фосфатазой 184
------соевым ингибитором трипсина 281, 282
— трипсин — бычий сывороточный альбумин 152
----производный ферроцена 121 — тироксин — пероксидаза хрена 280, 281 ----с бычьим сывороточным альбумином
(БСА) 280
— трийодтнронни — БСА 179 — фермента с авидином 191 ------гаптенами и? — фосфатаза щелочная с тироксином 195 — Fab-фрагмент с p-D-галактозидазой 186 ------ пероксидазой хрена 187 — эстрадиол с З-Р-галактозидазой 194 — АТР с антигеном 118, 100 — NAD с антигеном 118
— Кв-ацетил-К1-сукциннлеивиомицен — БСА 178
Кривая Гаусса 263*, 264
Координаты Хилла 46*, 47
Кортизол, определение 134*, 141* Кофактор(ы) 55, 56, 115, 119» 123, 125, 127-129, 131, 132
Коферменты 55, 57, 58
Лектин 107, 108
Люминол 69, 72, 133, 135, 137, 139, 140*. 267
Люцифераза 61, 119, 126—130. 132, 135— 137, 200
285
Люциферин 136—138*
Малатдегидрогеиаза 66*. 67, 75, 76
4--Метилумбеллиферил-р-£>-галактозид 67, 74
Метод(ы) аффинной хроматографии иа иммуиосорбеите 156
— биолюмииесцентиые 4, 61, 63, 125, 126, 128—130*, 132, 221
—	двойных антител 98
—	дималеимидиый 185, 186
—	иммуиосорбции 154
— нммунофермеитиый анализ (ИФА), гетерогенный 66. 81—83*, 84*, 85*, 86*—88, 90, 98, 100, 102, 1I3—H6, 118, 123, 139, 141, 142., 158, 201, 202
—-------гомогенный 66—68, 81—83*, 113—
115, 117, 121 — 123, 139, 141, 142, 144, 145, 158
—-------конкурентный 81, 95, 99,	101,
115, 122, 140, 160, 223, 225, 226, 233*, 234, 236—238, 280 , 281
--------неконкурентный 80, 93—95, 98, 99, 101, 122
— —— твердофазный 82, 95, 96, НО, 114, 138, 140, 159*, 161, 163, 172—174, 201— 203, 221, 226, 237, 261
•-------«туннельный» 113, 129
— иммуиофермеитометрический 93
— карбодиимидиый 193
— люминесцентный иммуиокофакториый анализ (ЛИКА) 126*—129, 198
— —нммунофермеитиый анализ (ЛИФА) 123—126, 132, 134, 137, 234, 256, 279, 280
— Накане 182, 183
— ПАП 103, 104
— последовательного насыщения 241*
— радиоиммуиологнческого анализа (РИА) 6, 52, 68, 78, 137, 234, 258, 259
— смешанных ангидридов 178, 193
— Скэтчарда 46*—48
— спектрофотометрический 50,	71, 137,
256 , 258, 268, 270, 272, 273, 276, 277, 279—281
— флуоресцентные 43, 44, 123, 234
— флуориметрические 4, 60, 63, 68, 70, 72, 73, 256
— фотометрические 4, 59, 64, 68, 70, 71, 73, 74, 267, 281
— хемилюминесцентного иммуиоаиализа 4, 61, 63, 70, 72, 132—134*, 136, 140—144, 267, 280, 281
— электрохимические 70, 256
— EMIT анализ 8, 67, 115—117, 123
02-Микроглобулии 118
Микропероксидаза хрена 133, 140*, 141
Миоглобин 126*, 127
о-Нитрофеиил-р-Р-галактозид 67*
/г-Нитрофенилфосфат 67*, 74
Носители 177
—	магнитные 211
— планшеты пластиковые 206—208*. 209, 214, 216, 219, 222, 250, 252*, 253, 270, 275, 279—281
—	полимерные 213
—	полимеры водорастворимые 211
— пробирки 72, 206, 207, 214, 253
—	сефадекс 141, 178, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 194—196, 202—205, 206, 270, 281
*	- силикагель макропористый 204, 205
— силохром 204, 214, 215, 219*
— синтетические пептиды 177
— стекло пористое 204, 205, 214
— целлюлоза 205, 274
Оксидоредуктаза 132
п-Оксифенилпропиоиовая кислота 67*, 72
n-Оксифенилуксусная кислота 67*, 73
Определение константы связывания 45*, 46*. 49*
Пероксидаза хрена 55, 61—64—72, 101, 103, 108—110, 118, 122, 133—135, 137, 138, 153, 162*, 166, 182—184,	188, 215, 252, 267,
268, 270, 275» 276, 282
Полиэтилеигликоль (ПЭГ) 167, 271, 273, 277, 279
Предел обнаружения антигена 224
Прогестерон 126*, 132, 141*, 142
Простетическая группа 55
Реагенты сшивающие 210
---- п-беизохииои 185
----глутаровый альдегид 210
----диазиды 210
----N, N'-оксидиметилеидималеимид 186
----N-оксисукцииимидиый эфир 4-йода-цетил аминобеизойной кислоты 188
----N-оксисукцииимидиый эфир (4-кар-боксициклогексилметил) малеимид 187
----N-оксисукцииимидиый эфир л-ма-леимидобеизойиой кислоты 186, 187
----N-оксисукцииимидиый эфир 3-(2-пи-ридилдитио) пропионовой кислоты 188
----N, N'-o-феиилеидималеимид 185, 186
Способы иммунизации 151, 152
Среда HAT 166, 167
— НТ 167
Стоп-реагеит 70
Стрептавидин 107
«Сэндвич»-метод 85, 89, 91, 105, 140, 171, 173
Теофиллин 117, 121, 122
Тестостерон, определение 140*, 141
Тироксин 121, 126*, 127, 135, 140*, 195
Уравнение Клотца 161—163
— Михаэлиса — Меитеи 62
Уреаза 67
Фактор VIII 138*
о-Фенилендиамин (ОФД) 67*, 69—71 73, 220, 267, 270, 280, 281
Ферментов активность 58, 61, 70
— каталитические свойства 58
— структура 55—58, 68, 69
Фосфатаза щелочная 64, 65*. 67, 68, 73, 74, 101, 111, 134, 191, 192*, 195
Ферритин 118, 140*, 141*
а-Фетопротеин 118, 132
Флуорохромы 144
Фрагменты Fab 21—23, 27, 28, 41, 44, 47, 101, 105, 156, 157, 191, 259
— (Fab'h, получение 156, 157, 191
— Fc 21, 23, 27. 167, 191
Функция Гаусса 39
— Сипса 39, 40
Церулоплазмин 141*
Электрофорез 177
Энтеротоксин бактериальный 134*
Эстрадиол, определение 141*, 142
Эстриол- 16а-глюкоронид (Э3-16а-Г)	128,
141*, 142
Эффекторы 58, 59, 102, 123
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие .......................................................... 3
Введение ............................................................  5
Глава 1. Структура и свойства аитигеиов и антител..................... 9
§ 1.	Основные	иммуиохимические понятия ........................ 9
§ 2.	Биосинтез	антител................................. 10
§ 3.	Структура	и специфичность антигенов........................ 12
§ 4.	Общая структурная характеристика молекул иммуноглобулинов 17
§ 5.	Первичная структура Н- и L-цепей иммуноглобулинов......... 23
§ 6.	Трехмерная структура иммуноглобулинов..................... 25
§ 7.	Аитигеисвязывающие центры антител......................... 28
Глава 2. Физико-химические закономерности взаимодействия антиген — антитело............................'................................ 33
§ 1.	Иммунологическая специфичность............................ 33
§ 2.	Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител........... 37
§ 3.	Методы определения аффинности антител..................... 41
§ 4.	Способы расчета коистаит комплексообразования реакции антиген — антитело................................................   44
§ 5..	Кинетические закономерности реакции взаимодействия • антиген — антитело . . . .	................................ 50
Глава 3. Ферменты как метки в-иммуиоаиализе.........................  55
§ 1.	Основные физико-химические и каталитические свойства ферментов .........................................................   55
§ 2.	Ферменты, используемые в ИФА в качестве	меток............ 68
§ 3.	Характеристика ферментов, используемых в ИФА	......	77
Глава 4. Методы иммуноферментного анализа............................ 77
§ 1.	Классификация методов ИФА................................. 83
§ 2.	Классификация гетерогенных методов ИФА....................100
§ 3.	Сравнительная оценка различных схем проведения гетерогенного ИФА......................................................... 102
§ 4.	Методы гетерогенного ИФА, основанные иа иековалеитиом способе введения ферментной метки................................. 109
§ 5.	Твердофазный ИФА в проточных системах.....................111
§ 6.	Новые подходы в гетерогенном ИФА........................  114
§ 7.	Гомогенные методы ИФА.................................... 123
§ 8.	Люминесцентный иммуиоанализ ............................  146
Глава 5. Получение антисывороток и поликлональных антител ....	146
§ 1.	Иммуногенность аитигеиов . . ............................
§ 2,	Получение иммунных антисывороток . , . ...............  ,	150
‘	287
§ 3.	Выделение и очистка антител	154
§ 4.	Тестирование антисывороток	............... 157
Глава 6. Моноклональные антитела и их применение в анализе ....	164
§ 1.	Получение гибридом....................................  ,	164
: §	2. Использование моноклональных антител в иммуиоаиализе . .	169
Глава 7. Методы получения конъюгатов для иммуиофермеитиого анализа	176-
§ 1.	Синтез конъюгатов гаптенов с носителями для получения антител ................................................. 1771
§ 2.	Получение	конъюгатов	фермент—белок	.........	182]
§ 3.	Получение	конъюгатов	гаптен — фермент...............1921
§ 4.	Получение	конъюгатов	антигенов (антител) с субстратами . .	.196]
Глава 8.	Получение	и свойства	иммобилизованных	антител и антигенов	201 1
§ 1.	Носители, применяемые в иммуиофермеитиом анализе ....	202,
§ 2.	Иммобилизация антител .................................    203
§ 3.	Иммобилизация антигенов...................,.................212	j
§ 4.	Неспецифическое связывание с иммуиосорбеитом ......	213
§ 5.	Некоторые свойства иммобилизованных антител ......	217
Глава 9. Теоретические основы иммуиофермеитиого анализа..............223
§ 1.	Теоретические закономерности конкурентного иммуиофермеитиого анализа..................................................    226
§ 2.	Метод последовательного насыщения . ;......................237
§ 3.	«Сэидвич»-метод ...........................................246
§ 4.	Конкурентный метод с использованием меченых аитивидовых антител.....................................................    251
Глава 10. Методы представления и обработки экспериментальных данных 256’
§ 1.	Анализ результатов определения антигена ....... . 257
§ 2.	Определение антител ........................................261
§ 3.	Анализ экспериментальных данных...........................  263
Глава 11. Методические рекомендации....................................266
§ 1.	Приготовление основных буферных расгворов для проведения ИФА и растворов субстратов для измерения ферментативной активности.......................................................266
§ 2.	Определение антител против вируса гриппа А у людей, вакцинированных гриппозной вакциной ............................ ...	267
§ 3.	Определение поверхностного антигена вируса гепатита В
§ 4.	Определение ротавируса и специфических антител . . . . ч.	273
§ 5.	Определение вирусов картофеля..............................  276	j
§ 6.	Определение инсулина в сыворотке крови человека ....	279 ’
§ 7.	Определение тироксина......................................28ft	j
§ 8.	Определение тестостерона...................................281
Заключение..........................................................283
Литература..................................................      .	284
Предметный указатель.............................'...............285