Похожие
Текст
к
ТЕННОЛОШЯ
кАФ Киркин
Т ГКэрженевская
Е Н Марко рова
КЛЕТОЧНАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
ушоиоинзюпд
бИОТЕННОЛОГИА
БУОТЕННОЛОГиЯ
ушоиончзюпд
в8-ми книгах
БиОТЕННОЛОШЯ
Под редакцией Н.С Егорова
ВДСамуилова
Р Г Бутенко
МВ. Гусев
А.Ф Киркин
Т. Г Корженевская
ЕНМаркарова
КЛЕТОЧНАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
Москва «Высшая шнола» 1987
БЬК 30.6
Б63
УДК 574.6
Рецензенты:
кафедра микробиологии и общей иммунологии (зав. кафедрой
проф. А. Е. Вершигора), кафедра физиологии растений (зав. кафедрой
ггроф. А. В. Капля) Киевского государственного университета им. Т. Г. Шев-
ченко и д-р биол. наук, проф. Б. В. Громов (Ленинградский государствен-
ный университет им. А. А. Жданова)
Допущено Министерством высшего и среднего специального образо-
вания СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических
специальностей высших учебных заведений.
Биотехнология. Учеб, пособие для вузов. В 8 кн./Под
Б63 ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 3: Клеточная ин-
женерия/Р. Г. Бутенко, М. В. Гусев, А. Ф. Киркин и др. —
М.: Высш, шк., 1987. — 127 с.: ил.
Обсуждены разные приемы клеточно-инженерной технологии на раститель-
ных, животных и бактериальных клетках. Рассмотрены проблемы модификации
протопластов и соматической гибридизации клеток растений, способы получе
ния гибридов и методы идентификации и выделения ассоциаций клеток высших
растений с микроорганизмами.
2910000000(4309000000) —255
Б -------~— ---------------225—87
ББК 30.6 + 28.07
605
001(01)—87
© Издательство «Высшая школа», 1987
ПРЕДИСЛОВИЕ
Традиционные биотехнологии, существующие тысячелетиями,
используют для получения продуктов, необходимых человеку,
организмы животных, растений, микроорганизмы.
Новый этап биотехнологии, развитие которого происходит
в настоящее время, связан не только с интенсификацией и улучше-
нием традиционных технологий, но и с появлением принципиаль-
но новых. Объектами этой новой биотехнологии стали культиви-
руемые ткани и клетки высших многоклеточных организмов —
животных и растений, а также микроорганизмы, созданные
методами генной инженерии.
Данное учебное пособие содержит главы, посвященные
клеточной инженерии. Этот термин применяется либо в очень
узком смысле, предполагая только генетическое конструирование
новых форм жизни при помощи гибридизации клеток (живот-
ных, растений), либо в очень широком, включая сюда как ис-
пользование самих культивируемых клеток, так и различные
манипуляции с ними, с целью создания технологий, позволя-
ющих решать важные для хозяйственной деятельности человека
задачи. Авторы, участвующие в создании данного пособия,
использовали термин «клеточная инженерия» в его широком
значении.
В первой главе разбираются проблемы получения клеточ-
ных культур, их отличия от исходных тканевых клеток целого
растения и различия при разных способах культивирования.
Вторая глава посвящена протопластам растительных клеток,
их выделению и культивированию. Изолированные протопласты
являются удобным объектом для биологического конструирова-
ния. Гибридизация и цибридизация соматических клеток на
основе слияния изолированных протопластов, введение органелл
и бактериальных клеток, хромосом и чужой ДНК — основа
технологии полученная генетически измененных клеток и растений.
В третьей главе понятие клеточная инженерия распростра-
нено на совсем новую и очень перспективную область исследова-
ния, а именно — создание экспериментальных эндо- и экзо-
ассоциативных систем между культивируемыми клетками высших
растений и микроорганизмами. Основное содержание этой главы
составляют новые данные, полученные коллективом авторов
5
на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического
факультета МГУ им. М. В. Ломоносова, касающиеся разработки
и изучения экспериментальных ассоциативных систем между
растительными клетками, а также растениями, регенерированны-
ми из них, и цианобактериями.
В последней, четвертой главе описана одна из самых интерес-
ных и важных для многих областей науки и практики технологий,
а именно технология получения моноклональных антител с по-
мощью гибридомной техники. Глава имеет введение, где кратко
изложены те основы иммунологии и иммунохимии, которые рас-
крывают суть проблемы, а также описаны организация лаборато-
рии, необходимое оборудование, компоненты питательных сред,
выбор экспериментального животного.
Главы данной книги отличаются своеобразием по целям,
содержанию и форме, однако если сравнить отправные положе-
ния, лежащие в основе манипулирования с клетками и изолиро-
ванными протопластами растений и клетками животных, то
несомненно, здесь можно обнаружить как общность биологичес-
ких основ, так и методических приемов, используемых для
создания конкретных клеточных технологий.
Настоящая работа представляет собой первую попытку
суммировать достижения клеточной физиологии и клеточной
инженерии в учебной литературе. Она написана коллективом
авторов биологического факультета МГУ: гл. 1 — чл.-кор.
АН СССР Р. Г. Бутенко, гл. 2 — доц. Е. Н. Маркаровой, гл. 3 —
ст. науч. сотр. Т. Г. Корженевской и проф. М. В. Гусевым,
гл. 4 — ст. науч. сотр. А. Ф. Киркиным.
Авторы выражают искреннюю благодарность рецензентам
проф. Б. В. Громову и проф. А. В. Капле за критический разбор
работы. Они будут признательны читателям за все замеча-
ния и пожелания, которые просим присылать по адресу: Москва
119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет,
кафедра клеточной физиологии и иммунологии.
Авторы
ВВЕДЕНИЕ
В отличие от микроорганизмов, которые издавна используют-
ся в традиционных технологиях (хлебопечение, производство кис-
ло-молочных продуктов и др.), культуры клеток высших организ-
мов являются сравнительно новым объектом биотехнологии. На
их жизнедеятельности может быть основано производство биоло-
гически активных веществ, вакцин, моноклональных антител.
Идея о возможности культивирования клеток вне организма
была высказана еще в конце прошлого века в отношении клеток
растений. Однако впервые удалось ввести в культуры клетки жи-
вотных, что было осуществлено в начале нашего века. Культи-
вировать растительные клетки на искусственных питательных
средах исследователям долго не удавалось. Первые успехи в этой
области относятся к 30-м годам, и бурное развитие нового на-
правления работ с клетками растений и животных происходит
в 60—70-е годы.
Этапным периодом для развития метода культуры клеток
можно считать 70-е годы, когда были сделаны успехи в разра-
ботке способа получения изолированных протопластов растений,
а также открытие гибридизации соматических клеток. Изолиро-
ванные протопласты высших растений и культивируемые клетки
животных стали объектом клеточного конструирования путем
гибридизации или введения в них чужеродного генетического
материала (клеточных органелл, бактерий). Применение методов
клеточного конструирования служит задачам улучшения свойств
клеток-продуцентов в культуре, а в случае растительных клеток
также получению растений с новыми свойствами (в силу тотипо-
тентности растительной клетки).
Большая роль в развитии методов работы с культурами кле-
ток и, в частности, по конструированию новых клеточных систем
принадлежит советским ученым. Работы по соматической гибри-
дизации изолированных протопластов с получением новых сортов
растений ведутся в Институте физиологии растений им. К. А. Ти-
мирязева АН СССР, Институте ботаники им. Н. Г. Холодного
АН УССР, Институтах картофельного хозяйства РСФСР и УССР,
за что в 1984 г. авторский коллектив во главе с чл.-кор. АН
СССР Р. Г. Бутенко был удостоен Государственной премии СССР.
Работы по введению бактерий в культуры растительных клеток
начинались в разных лабораториях страны и в настоящее время
систематически ведутся в МГУ им. М. В. Ломоносова. На основе
гибридомной техники в ряде научно-исследовательских институ-
7
тов налажено получение моноклональных антител ко многим ан-
тигенам; некоторые из этих препаратов нашли применение в ме-
дицинской практике.
Сравнительная молодость и быстрое развитие данного на-
правления исследования определили некоторую произволь-
ность терминологии. Ниже приводится перечень основных терми-
нов, которые часто используются при культивировании клеток
растений и животных, а также при манипулировании с ними.
Определения основываются на списке терминов, принятых при
культивировании животных и растительных клеток Комиссией
по клеточным культурам при Межведомственном совете по фи-
зико-химической биологии и биотехнологии при ГКНТ Совета
Министров СССР и АН СССР.
Время генерации клетки — интервал времени между двумя
последовательными клеточными делениями.
Время удвоения популяции — интервал времени, за который
число клеток в популяциях увеличивается вдвое.
Дедифференциация — переход специализированных, неделя-
щихся клеток к пролиферации.
Дифференциация — комплекс процессов, приводящих к раз-
личиям между дочерними клетками, а также между материн-
скими и дочерними клетками.
Дифференцировка — состояние специализации клеток, отли-
чающее их от других.
Изолированный протопласт — растительная клетка, лишенная
клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или
механическим способом.
Инокулюм (трансплант) — часть суспензионной (каллусной)
культуры, используемая для пересадки в свежую среду.
Каллус — ткань, возникшая путем неорганизованной проли-
ферации клеток органов растений.
Клеточная селекция — метод выделения мутантных клеток
и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.
Клон — культура, возникшая из одной клетки.
Культура каллусных тканей — выращивание в длительной пе-
ресадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации
клеток изолированных сегментов разных органов или самих
органов (пыльники, семяпочки и т. д.) растений.
Культивирование изолированных протопластов — выращива-
ние клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной
среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмо-
тически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для
данного вида концентрации. При регенерации стенок у изоли-
рованных протопластов культура превращается в культуру кле-
ток.
Культура клеток (суспензионная культура) — выращива-
ние отдельных клеток или небольших групп их во взвешенном
состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обес-
печивающей их аэрацию и перемешивание.
8
Культура опухолевых тканей — выращивание в длительной
культуре сегментов, изолированных из растительных опухолей
разного происхождения и освобожденных от патогенов, инду-
цировавших развитие опухоли.
Культура отдельных клеток — выращивание одиночных кле-
ток при низкой плотности высева: 1) на очень богатых питатель-
ных средах, 2) с помощью культуры «няньки» или 3) питающего
слоя.
Культура эксплантов — инкубация в стерильных условиях
на питательных средах, либо вызывающих, либо не вызывающих
пролиферацию сегментов, изолированных из разных органов
растений.
Линия — культура, возникшая из штамма путем селекции
или клонирования, имеющая маркерные признаки.
Популяция клеток — совокупность культивируемых клеток.
Редифференциация — переход специализированных клеток из
одного состояния дифференцировки в другое с предшествую-
щими делениями или непосредственно.
Ростовой цикл — рост популяции клеток в цикле периоди-
ческого выращивания, характеризуется S-образной кривой. Фазы
ростового цикла: латентная, экспоненциальная, замедления рос-
та, стационарная, деградации.
Слияние изолированных протопластов — формирование одной
клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран.
Сомаклональные вариации и варианты — фенотипическое вы-
ражение непостоянства ядерного и органельных геномов расти-
тельных клеток. От истинных генных мутаций отличаются боль-
шей частотой возникновения и комплексностью изменений (изме-
нение в структуре генов, хромосом, геномов).
Соматическая (парасексуальная) гибридизация — система,
вовлекающая в генетическую рекомбинацию хромосомы и гены
ядра и органелл вне сексуального цикла, например, путем слия-
ния изолированных протопластов. Приводит к появлению сома-
тических гибридов-растений и гибридных клеточных линий.
Субкультивирование — перенос клеток в другой культураль-
ный сосуд на свежую пид'ательную среду.
Тотипотентность — свойство соматических клеток растений
полностью реализовать свой потенциал развития, т. е. реализо-
вать омнипотентность ядра с образованием целого организма.
Цикл выращивания — период от помещения инокулюма или
трансплантата в свежую среду до последующего субкультиви-
рования.
Штамм — культура, возникшая после первого субкультивиро-
вания. Состоит из многих клеточных линий, возникших из клеток,
присутствующих в первичной культуре.
Эксплант — фрагмент ткани или органа, инкубируемый само-
стоятельно или используемый для получения первичного каллуса.
In vitro — выращивание живого материала «в стекле», на
искусственных питательных средах, в асептических условиях.
9
[лава
КУЛЬТУРА
КЛЕТОК
ВЫСШИХ
РАСТЕНИЙ
Метод культуры клеток высших растений лежит в основе изу-
чения биологии клетки, существующей вне организма. Популя-
циям растительных клеток, выращиваемым в искусственных ус-
ловиях, присущи специфические особенности: генетические, эпи-
генетические (зависящие от дифференциальной активности ге-
нов) и физиологические. При длительном культивировании гете-
рогенной по этим признакам популяции наблюдается преиму-
щественное размножение клеток, фенотип которых наиболее со-
ответствует данным условиям выращивания, и популяция эво-
люционирует. Изменчивость, наследуемость возникших изме-
нений, адаптивный отбор и эволюция, свойственные культиви-
руемым клеткам растений, позволяют считать, что они являются
новой экспериментально созданной биологической системой,
особенности которой пока еще мало изучены. Однако знать их
очень важно, потому что культивируемые клетки высших рас-
тений широко используются в фундаментальных исследованиях
и в практике. Культивируемые клетки и ткани могут служить
адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции
в клетках и тканях целого растения. Отличия культивируемых
клеток от клеток организма, часто специально усиленные со-
зданием биохимических мутантов, гибд^дных или трансформи-
ронанных клетокг- помогают глубже _ проникнуть_в_механизм
процессов, происходящих в растениях. Простота клеточных мо-
делей, возможность быстро получать достаточную массу в асеп-
тических, контролируемых по многим параметрам условиях вы-
ращивания являются преимуществами такого моделирования.
На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы
технологии для промышленности и сельского хозяйства.
Углубление знаний биологии культивируемых растительных кле-
ток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках прин-
ципиально новых, перспективных для практики технологий.
Возникший немногим более 50 лет назад метод культуры
ю
клеток и тканей растений развивался и продолжает развиваться
очень интенсивно. Совершенствуются и возникают новые методи-
ческие приемы, углубляются знания биологии самих объектов
и понимание механизмов их поведения, множатся технологии,
созданные для практического применения.
Задача этой главы — самое общее введение читателя в об-
ласть культивирования клеток растений и ознакомление с наи-
более характерными особенностями их биологии.
§ 1. Об истории развития метода культуры клеток,
тканей и органов растений
Период с 1892 пр 1902 г. можно считать предысторией раз-
вития метода культуры клеток и тканей растений. В конце прош-
лого, самом начале нашего века немецкие ученые X. Фехтинг
(Н. Vochting, 1892), К. Рехингер (С, Rechinger, 1893), Г. Габер-
ландт (G. Haberlandt, 1902) пытались выращивать изолирован-
ные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Дли-
тельно растущих in. vitro культур они не получили. Однако Ре-
хингер наблюдал процесс образования каллуса сегментами стеб-
ля тополя, корня одуванчика и других и определил минимальней
размер фрагмента, способного образовать каллус. Не достигнув
экспериментальных успехов, эти первые исследователи высказали
ряд идей и гипотез, реализованных значительно позже. Фехтинг
считал, что полярность присуща не только органам растения, но
и отдельной клетке. Габерландт выдвинул гипотезу о тотипотент-
ности любой живой клетки растения.
Период с 1902 по 1922 г. не принес удач ботаникам, работаю-
щим над созданием оптимальных питательных сред, способных
обеспечить существование и длительное размножение in vitro
изолированных тканей и клеток растений. Были получены пер-
вые результаты по культивированию тканей животных на пита-
тельных средах с добавлением сывороток. Однако попытки бота-
ников вырастить изолированные ткани растений на средах с до-
бавлением экстрактов растительной ткани (по аналогии с приме-
нением сывороток крови и эмбриональной для клеток животных)
были неудачны.
В 1922 г. Роббинс и независимо от него Котте показали воз-
можность культивирования на синтетической питательной среде
меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты можно
считать началом применения метода культуры изолированных
органов растений.
1932—1939 гг. — совершенствование метода культуры тканей
и клеток высших растений, начавшееся с работ американского
исследователя Ф. Уайта и французского Р. Готре (1932—1934).
Оба они повторили опыт Роббинса и Котте, показав, что изоли-
рованные корни могут расти в культуре неограниченно долго,
если их кончики периодически пересаживать на свежую пита-
тельную среду. Способность к неограниченному росту при суб-
культивировании была продемонстрирована позже этими автора-
ми для каллусных тканей камбиального и паренхимного проис-
хождения (R. Gautheret, 1934), а также для тканей растительных
опухолей (Р. White, 1939).
В период 1940—1960 гг. увеличилось число видов используе-
мых растений, ткани которых выращивали in vitro. Список, при-
веденный в монографии Р. Готре (R. Gautheret, 1959), включал
уже 142 вида. Длительные пересадочные культуры успешно по-
лучали из разных органов и тканей растения. Были разработаны
составы питательных сред, изучено значение макро- и микроэле-
ментов для поддержания нормальной ростовой активности ткани.
Выявлена потребность культур в витаминах и стимуляторах
роста. Оценено значение натуральных экстрактов типа эндоспер-
ма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для
поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции
процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре
каллусных тканей и клеточных сусцензий. В работе с культурой
ткани открыт новый класс фитогормонов (цитокинины) и показа-
но значение кинетина и других N-6-замещенных аминопуринов
для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого, морфо-
генеза (R. Heller, 1953; Z. Kulescha, 1954; I. Nitsch, 1955; C. Mil-
ler, F. Skoog, 1955; F. Steward, 1958, P. Г. Бутенко, 1958).
Разработан метод получения и выращивания больших масс
клеточных суспензий (L. Nickell, W. Tulecke, 1959), а также метод
культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки, де-
ление которой индуцируется с помощью ткани-няньки (L. Jones
et al., 1960; М. К- Павлова, Р. Г. Бутенко, 1965).
1960—1975 гг. — предложен метод получения изолированных
протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки
их смесью пектолитических и целлюлитических ферментов
(Е. Cocking, 1960). Найдены условия культивирования изоли-
рованных протопластов, при которых они образуют новую клеточ-
ную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способ-
ным в ряде случаев к морфогенезу (I. Takebe et al., 1971). Вместе
с тем изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточ-
ную стенку, были использованы для разработки методов гибриди-
зации соматических клеток путем слияния протопластов с по-
мощью полиэтиленгликоля (ПЕГ) и введения в них вирусных РНК,
клеточных органелл, клеток бактерий. Первые соматические гиб-
риды послужили моделями для изучения поведения ядерного и
цитоплазматических геномов партнеров в гибридных клеточных
линиях и в потомстве соматических гибридов растений, реге-
нерировавших из гибридных клеток (Р. Г. Бутенко, 1979,
Ю. Ю. Глеба, 1980).
Разработан метод культуры меристем, позволяющий получать
тестированные на отсутствие вирусов и других патогенов растения.
С помощью этого же метода безвирусные растения с высоким
12
коэффициентом размножаются. Метод широко используется для
получения оздоровленного посадочного материала многих эконо-
мически важных растений.
Продолжается разработка методов и аппаратуры для глубин-
ного культивирования клеток.
Впервые получены и изучены растения-регенеранты табака,
представляющие сомаклональные варианты исходной формы
(Н. Загорска и др., 1967).
Период 1976—1985 гг. — разработаны метод электрослияния
изолированных протопластов (U. Zimmerman, 1983) и методы
селекции гибридных клеток. С использованием изолированных
протопластов и векторов, созданных на основе Ti-плазмиды
Agrobacterium tumefaciens, создан эффективный способ перено-
са генов для двудольных растений.
Методы мутагенеза и клеточной селекции, получения сома-
клональных вариантов и экспериментальных гаплоидов применя-
ются для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных
растений.
Методы скрининга биохимических мутантов привели к появле-
нию более продуктивных и приспособленных к условиям культи-
вирования клеточных штаммов, используемых в промышлен-
ности. Возникли методы иммобилизации культивируемых клеток
с целью биотрансформации химических соединений.
§ 2. Дедифференцировка и каллусогенез
как основа создания
пересадочных клеточных культур
Основным типом культивируемой растительной клетки явля-
ется каллусная. Значительно реже культивируют клетки опухо-
лей растений разного происхождения. Культуры опухолевых
клеток при поверхностном и глубинном выращивании мало отли-
чаются внешне и на уровне морфологии клеток от культур кал-
лусных клеток. Значительным физиологическим различием между
ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позво-
ляющая им делиться и расти на питательных средах без добавок
фитогормонов или их аналогов. Опухолевые клетки лишены так-
же способности дать начало нормально организованным струк-
турам — корням или побегам в процессе органогенеза и эмбрио-
идам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых слу-
чаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные струк-
туры), нормальное развитие которых дальше не происходит.
Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно
приобрести гормононезависимость. Природа такой гормононеза-
висимости к одному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину),
применяемым при выращивании клеточных культур растений,
может быть генетической (результат мутации) или эпигенети-
ческой (результат экспрессии генов, определяющих гормононе-
зависимость клетки). При генетической гормононезависимости
13
каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпиге-
нетической они теряют признак гормононезависимости в ряду
превращений клетка-*-растение-»-клетка, что и является доказа-
тельством негенетической природы такой приобретенной гормо-
нонезависимости.
Каллусная клетка,—в результате деления которой возникает
каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточ-
ной дифференцировки, присущей высшему растениюГДтпграсте-
ния "каллус является тканью, возникающей в исключительных
обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей не-
продолжительное время. Эта ткань защищает место поранения,
накапливает питательные вещества для анатомической регене-
рации или (и) регенерации утраченного органа.
Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты
тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают
на искусственную питательную среду in vitro в пробирки, колбы,
чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддер-
жание пересадочной культуры требует строго стерильных усло-
вий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный
хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для
лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экс-
планты, тщательно отмывая их затем от употребляемого раство-
ра стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве или фильтрова-
нием через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при
давлении 19,6- 104 Па (2 атм) в течение 1 ч или сухим паром в
шкафах при 160°С в течение 1,5 ч стерилизуют посуду, инстру-
менты, материалы, необходимые для работы. Манипуляции с
культурами проводят в боксах микробиологического типа, облу-
чаемых перед работой ультрафиолетом, или в ламинар-боксах,
где асептика достигается постоянной подачей стерильного воз-
духа в рабочий объем (Р. Г. Бутенко, 1964).
Особенности дедифференцировки клекнс-экслланта и каллусо-
гецеза- зависят, от эпигенетических характеристик соснавляющих
его тканей. Клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стеб-
ля, мезофилла листа и других специализированных тканей,
эксплантированных на питательную среду, содержащую мине-
ральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные
вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структу-
ры, характерные для их специфических функций в растении и
вернуться к состоянию делящейся клетки. На рис. 1 изображены
фазы клеточного цикла и показано, в каких из них клетки могут
выйти из цикла деления (митотического цикла) и перейти в диф-
ференцированное состояние и соответственно вернуться в цикл при
дедифференцировке и индукции их к делению.
В большинстве случаев клетки переходят к.специализации
из фазы Gi, предшествующей 5-фазе, в которой происходит цент-
ральное событие в делении клетки — синтез ДНК, специализи-
рованные клетки возникают редко в результате выхода клеток
из цикла деления после репликации ДНК, в G? -фазе. При изуче-
14
нии молекулярных механизмов
дедифференцировки, действия
гормонов и других факторов,
индуцирующих деление, небез-
различно, в какой фазе клеточ-
ного цикла данная клетка пе-
решла к дифференцировке, т. е.
с какой фазы ей предстоит дви-
гаться повторно по циклу. Час-
то эксплант, используемый для
получения каллуса, является
фрагментом органа и включает
ткани, клетки которых различ-
но дифференцированы. Так,
взятый целиком фрагмент стеб-
ля имеет в своем составе клет-
Рис. 1. Схема клеточного цикла:
S — фаза синтеза ДНК; Gj — пресинте-
гическая; G2 — лостсинтетнческая фаза;
М — митоз; Ri и R2 — фазы покоя; D —
дифференцировка
ки — эпидермальные, первич-
ной коровой паренхимы, кам-
бия и сосудистой системы,
сердцевинной паренхимы. В
разных условиях культивиро-
вания и в зависимости от различий в физиологическом состоя-
нии исходного растения можно наблюдать преимущественную
пролиферацию клеток камбия и его молодых дериватов, коры и
сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение
первичных каллусных клеток является одной из причин гетеро-
генности культуры каллусной ткани, так как некоторые функцио-
нальные особенности исходных дифференцированных клеток пе-
редаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации
или эпигенетически наследуемые признаки.
В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специали-
зированных клеток, в самом начале культивирования могут на-
блюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматиче-
скими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к про-
цессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомен-
довать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в тече-
ние 3—6 сут. Это позволяет исключить не только изменения, свя-
занные с травмой, но и возможное не контролируемое влияние
эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При
соблюдении указанного условия становится ясной роль в индук-
ции клеточного деления фитогормонов группы ауксинов и цито-
кининов, дедифференцировке специализированных клеток и в
поддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приво-
дящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюда-
ются сложные взаимодействия между ауксинами и цитокинина-
ми. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход
специализированной клетки из покоящейся фазы Go к вступлению
в S-фазу клеточного цикла. Однако для завершения фазы
синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход
15
Таблица 1. Процент делящихся клеток на 5-й день
после последовательной обработки протопластов из мезофилла
табака фитогормонами (Н. А. Дмитриева, 1983)
Время экспозиции Последовательность обработки*
с первым гормоном
а-НУК 6 БАП 6 БАП--а-НУК
0 0 0
5 мин 28 0
30 мин 30 0
5 ч 40 0
25 ч 45 0
48 ч 10 0
* а-НУК — а-нафтилуксусиая кислота — синтетический ана
лог ауксниа; 6 БАП — 6-бензиламинопурин— синтетический цито-
кинин.
клеток к митозу и цитокинезу, необходимо добавление к среде
кинетина или другого цитокинина (табл. 1).
В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех
форм РНК (рис. 2), исчезают тканеспецифичные белки-антигены
и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для
каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменени-
ях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедиффе-
ренцировке.
Очень своеобразно проходит процесс дедифференцировки и
каллусогенеза в апикальной меристеме стебля (рис. 3). Сразу
а б
Рис. 2. Активация синтеза РНК при подготовке клеток сердцевинной
паренхимы стебля табака к делению (Н. А. Дмитриева, 1981):
а — через 2 ч после индукции деления на среде с фитогормонамн (ИУК —
0,5 мг/л; кинетин—1 мг/л); б — то же, на среде без фитогормоиов;
пунктир — радиоактивность фракций РНК при включении меченого
14С-урацила. Сплошная линия — оптическая плотность при X = 260 нм;
слева направо — пики, соответствующие порядковому номеру фракции при
элюции иуклеииовых кислот раствором NaCI со скоростью 0,4 мл/мии
с МАК-колоиок
16
Рис. 3. Изменение процента делящихся клеток
в изолированной меристеме стебля томатов
на среде с индуктором каллусогенеза
после помещения на пита-
тельную среду меристемы
стебля томатов наблюда-
лось прекращение мито-
зов, свойственных ткани
in vivo, клетки дедиффе-
ренцнровались, увеличи-
вались в объеме, теряли
характерную для мери-
стематической клетки фор-
му, изменялась структура
ядра и цитоплазмы и
только после этого в них
происходило деление, при-
водящее к формированию
каллусной ткани.
Образование каллуса
не во._всех случаях связа-
но с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть
в результате пролиферации внутренних'тканей экспланта без
связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои
ткани и развивается на поверхности. Примером каллуса, не свя-
занного с травмой, является каллусогенез, наблюдающийся в
культуре изолированного пыльника. Гаплоидная микроспора,
проявившаяся в результате мейоза, при культивировании пыль-
ника in vitro отклоняется в ряде случаев от нормального про-
цесса микроспорогенеза, ее ядро индуцируется к повторным де-
лениям, а сама клетка дедифференцируется и превращается в
каллусную. Образование каллуса при эксплантировании фраг-
мента ткани в условиях in vitro свойственно двудольным и одно-
дольным покрытосеменным и голосеменным растениям, папорот-
никам, мхам, печеночникам.
Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4—6 не-
дель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую
питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта
(переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной
питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы тка-
ни на 30—40 мл питательной среды.
Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования
тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную
каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интакт-
ного растения. Клетки различно дифференцированные (в том
числе и меристематические) переходят in vitro к сложному про-
цессу дедифференцнации, теряют присущую им структурную орга-
низацию и специфические функции и индуцируются к делению,
образуя первичный каллус.
В процессе субкультивирования формируется штамм, характе-
ризующийся индивидуальными генетическими и физиологически-
ми особенностями.
17
$ 3. Некоторые цитоморфологические
и физиологические характеристики каллусных клеток,
культивируемых поверхностно
Культура каллусных тканей выращивается поверхностным
способом на полутвердой агаризованной среде (концентрация
агар-агара 0,6—1%), среде с применением других желирующих
полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги, или
дисках из пенополиуретана, полупогруженных в жидкую пита-
тельную среду. Основными компонентами питательных сред для
культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли
(макро- и .макроэлементы), источник углеродного питания (обыч-
но сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда
в состав питательных сред включают комплексные органические
добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожже-
вой экстракт, экстракты из разных органов растения). В табл. 2
Таблица 2. Состав некоторых питательных сред, применяемых для куль-
тивирования клеток растений
Компоненты Концентрации (мг/л) в средах по прописи
Мурасиге и Скуга (MS) (1962) Гамборга и Эвелега (В = S) (1968) Японская среда Као и Михай- люка* (1975) Уайта (1939)
для роста массы клеток воробейника (ростовая) для син- теза шикоиииа (продук- ционная)
KNO 1900 3000 80 80 1900 81
NH,NO3 1650 —. — — 600 —
Ca(NO3)2 — — -— — — 142
Ca(NO3)2-4H2O — —• 300 694 — —
(NH4)2SO4 — 134 — — — ——
MgSO„- 7H2O 370 500 750 750 300 74
CaCl2-2H2O 440 150 — — — —
KCI — — 65 65 300 65
KH2PO4 170 — — -— 170 12
NaH2PO4-H2O — — 21 19 — -—
NaH2PO4 2H2O — — 200- 1480 -— —
MnSO4- H2O — 10 — 10,00 —~
MnSO4- 4H2O 22,3 — — —. — —
MnSO4- 2H2O — — 5 — — —
ZnSO4- 4H2O 8,6 — — -— 2,00 —
ZnSO4- 7H2O -— 2 3 3 —. —
H3BO3 6,2 3 1.5 1,8 3,60 —
KI 0,83 0,75 0,75 4,5 0,75 —
CuSO4- 5H2O 0,025 0,075 0,01 0,3 0,025 —
Na2MoO4 0,25 0,25 — — 0,25 —
MoO3 -— — 0,001 — —.
CoCl2- 6H2O 0,025 0,025 .—_ — 0,025 —
Fe2 (SO4).4 -— —- 2.5 — 2,46 —
FeSO4-7H2O 27,8 — 1,8 500 —
Na2SO„ — — 200 1480 •— —
18
Продолжение табл. 2
Концентрации (мг/л) в средах по прописи
Компоненты Мурасиге и Скуга (MS) (1962) Г амборга и Эвелега (В= S) (1968) Японская среда Као и Михай- люка* (1975) Уайта (1939)
для роста массы клеток воробейника (ростовая) для сии теза шикоиииа (продук- ционная)
Натриевая соль iNaEDTA) этилен диаминтетрауксус- ная кислота 37,3 1,8 500
Секвестрен 330-Fe .— 28 — —
Сахароза 30 000 20 000 20 000 30 000 125 20 000
Мезо-инозит 100 — — — 100 —
Глицин 2 — 3 — — —
Тиамин-НС1 0,5 — 0,1 — 0,005 —
Пиридоксин-НС1 0.5 — 0,1 — 0,005 —
Никотиновая кислота 0,5 — 0,5 — — —
Р-идолил-З-ук- сусная кислота (ИУК) 1,75 1,75
Кинетин — — 2,15 — — -—
* Среда Као и Михайлюка дополнительно содержит (в мг/л): фруктозы, рибозы,
ксилозы, маннозы, рамнозы, целлобиозы, сорбита по 125; маннита, никотинамида, ас-
корбиновой кислоты по 1; витамина Л 10, витамина D3 0,5; Са-пантотената 0,01; вита-
мина Bi2 0,2, п-аминобензойиой кислоты 0,01; биотина 0,005; холинхлорида 0,5; рибо-
флавина 0,1; 2,4-Д 0,2; зеатина 0,5; ИУК 1; гидролизата казеина 125; кокосового
молока 10; СаС1г 30%-ного 1,5; глюкозы 68 400; пирувата Na 5; лимонной кислоты 10;
яблочной кислоты 10; фумаровой кислоты 10.
представлен состав наиболее часто используемых питательных
сред. Как правило, начиная работать с новым объектом, авторы
модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьи-
руя концентрации и набор органических компонентов. Оптими-
зацию состава среды по многим факторам целесообразно прово-
дить с применением математического планирования эксперимен-
та (В. Н. Максимов, 1980).
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом,
представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных
клеток, не имеющую строго определенной анатомической струк-
туры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым,
красным — пигментированным антоцианами полностью или зо-
нально.
В зависимости от происхождения и условий выращивания
каллусные ткани бывают: 1) рыхлыми, сильно оводненными,
легко распадающимися на отдельные клетки; 2) средней плот-
19
Рис. 4. Структурные особенности:
а — молодой; б — растущей рас-
тяжением; в — старой клетки
женьшеня (электронная микро-
скопия)
ности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
3) плотными с зонами редуцированного камбия и сосудов (в ос-
новном трахеидоподобных элементов).
Как правило, в длительной пересадочной культуре, на средах,
включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина
2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 Д), каллусные ткани
теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.
В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений
проходят обычный для клетки растения онтогенез, они присту-
пают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые
каллусные клетки и наконец деградируют. На электронно-микро-
скопических фотографиях (рис. 4) показана тонкая структура
20
Таблица 3. Химический анализ биомассы культуры ткани
и корня женьшеня
Состав, % Биомасса культуры ткани Корень
Азот общий 4,82 2,73
Азот белковый 1,18 1,68
Липиды 1,61 2,34
Восстанавливающие сахара 2,28 —
Сахароза 1,03 3,07
Крахмал 5,40 19,5
Пектиновые вещества 7,57 15,8
Гемицеллюлозы 4,46 6,03
Целлюлоза 9,84 10,27
Панаксозиды (А — G — сум- 3,21 3,12
марно)
молодой, растущей и старой клетки каллусной ткани женьшеня.
Химический состав каллусной ткани и ткани органа, из кото-
рого она получена, как правило, различаются (табл. 3). Каллус-
ные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто при-
меняют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных
штаммов, линий, мутантов, из них получают суспензии клеток,
культивируемых в жидкой питательной среде, для регенерации
растений.
§ 4. Глубинное культивирование клеток растений
в жидкой питательной среде
(суспензионные культуры)
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой пита-
тельной среде, обычно называют суспензионными культурами.
Термин этот не является строго научным и очень точным, так
как не объясняет основной особенности поведения клеток при
таком выращивании.
Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные
агрегаты (> 50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии
в жидкой среде. Применяют разные аппараты и способы под-
держания их в таком состоянии. Начальный момент получения
суспензионной, клеточной культуры является событием_рандоми-
ческим. Это означает, что только клетки, которые подряду причин
способны к перестройке метаболизма и размножению с высоким
коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного
культивирования, образуют «хорошие» линии. Важными характе-
ристиками таких линий является высокая степень дезагрегации
(5—10 клеток в группе), морфологическая выравненность кле-
ток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная фор-
ма, плотная цитоплазма), отсутствие трахеидоподобных элемен-
тов. На рис. 5 представлены клетки суспензионной культуры
21
Рис. 5. Клетки суспензионной культуры жень-
шеня в экспоненциальной фазе цикла выра-
щивания (световая микроскопия) увелич.
(40 X 10)
женьшеня в экспоненци-
альной фазе роста, удов-
летворяющие полностью
требованиям к «хорошей»
линии.
Выращивание клеточ-
ных суспензий в жидкой
питательной среде имеет
ряд преимуществ перед
выращиванием каллусных
тканей поверхностным спо-
собом. Здесь легче и бо-
лее воспроизводимо вли-
ять на метаболизм и рост
клеточных популяций эк-
зогенными факторами. Они
удобнее для биохимиче-
ских и молекулярно-био-
логических эксперимен-
тов — изучения индукции
ферментов и связи их с
событиями клеточного
цикла, экспрессии и ре-
прессии определенных ге-
нов, изолирования и ха-
рактеристик мутантов.
Клеточную суспензию
получают, помещая кал-
лусную ткань в колбу с
жидкой питательной средой. Эта суспензия перемешивается в
колбах на качалке или в специальных сосудах с помощью ролле-
ров разного типа. Для инициации суспензионной культуры не-
обходимо 2—3 г свежей массы каллусной ткани на 60—100 мл
жидкой питательной среды. Первичную суспензию получают на
круговой качалке, имеющей скорость перемешивания 100—
120 об/мин.
Суспензионную культуру можно получить и из фрагмента орга-
на растения (диски запасающей паренхимы мясистых корней мор-
кови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако этот путь
более трудоемкий и требует большего времени. Клетки эксплан-
та должны при этом образовать первичный каллус, и только
после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жид-
кую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, спо-
собной расти в суспензии.
Рыхлые, оводненные культуры каллусных тканей более при-
годны для перевода в суспензию, чем структурированные, плот-
ные каллусы. Выращивание каллусов на среде с 2,4 Д, исклю-
чение из среды ионов Са24; обработка пектиназой транспланта,
предназначенного для выращивания в суспензионной культуре, оп-
22
тимальны для получения су-
спензии. Первичную суспен-
зию перед субкультивирова-
нием фильтруют через 1 —
2 слоя марли, нейлоновые
или металлические сита, что-
бы избавиться от крупных,
плотных кусков каллусной
ткани, остатков экспланта и
очень крупных агрегатов.
Фильтрование рекомендует-
ся и в нескольких после-
дующих субкультивировани-
ях до приобретения клеточ-
ной суспензией желатель-
ных характеристик. Однако
агрегированность суспензии
зависит не только от харак-
теристик начальной линии,
но и от условий культиви-
рования. На рис. 6 показано
60
1 2-5 6-20 21-50 >50
к-----------------,-----------------J
клеток, шт. в группе
Рис. 6. Различия в агрегированности
суспензионных культур мака снотворного
Papaver somnijerum при выращивании:
а — в колбах на качалке; б — в пневмо-
импульсном ферментере
влияние условий перемешивания
на состав и соотношение различных по агрегированности единиц,
составляющих суспензионную культуру женьшеня и мака.
Способы выращивания, разработанные в микробиологии,
применяются для глубинного культивирования растительных кле-
ток. Используются закрытые или открытые системы в периоди-
ческом или проточном режимах. В закрытой системе при перио-
дическом режиме выращивания клеточная масса (инокулюм)
помещается в определенный объем среды. До конца выращива-
ния система остается закрытой по всем параметрам, кроме газов.
В закрытой непрерывной культуре в систему периодически
подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же
объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего
цикла выращивания.
В открытые проточные культуры периодически (или непрерыв-
но) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не
только старая среда, но и часть урожая клеточной массы. Регу-
ляция этого процесса может осуществляться по принципу турби-
достата или хемостата. В турбидостате подача свежей среды и
отбор суспензии происходят после достижения клеточной популя-
цией определенной заданной плотности. Сигнал на включение
протока поступает от реле, связанного с оптической системой,
определяющей плотность клеток. В хемостате скорость протока
задается экспериментатором и от нее зависит скорость роста
клеточной массы. Для этого питательная среда лимитируется
по одному из наиболее важных для роста факторов, чаще всего
по фосфору, азоту или сахару. Режим хемостата позволяет
с помощью фиксированной скорости разбавления поддерживать
константную скорость деления и плотность клеток в популяции.
23
Изменяя скорость протока, можно переводить популяцию из од-
ного стабильного состояния в другое. Отношения между размно-
жением клеток и скоростью протока выражаются уравнениями:
£=1п2/ц [где g — время генерации клеток; ц— удельная ско-
рость роста); |л = (In х, — In jo,) /А/ (где х, и xt, — биомасса в опре-
деленный промежуток времени); D = [где В — ско'
ростьпротока (разведение); dx/dt = ро — £)д (при ц > D биомасса
растет; при р < D падает; при ц = D (dx) /dt = 0 и биомасса —
постоянная величина (стабильное состояние) ].
При глубинном выращивании растительных клеток принцип
турбидостата практически не применяется. Одной из причин
этого является разрушение части клеток при отводе их к оптиче-
скому прибору.
Выращивание суспензии клеток растений в установках не-
прерывного культивирования по принципу хемостата применяет-
ся как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддержи-
вающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промыш-
ленном выращивании клеточной биомассы с целью получения
экономически важных продуктов. В Японии использовали фер-
ментер объемом 20 000 л для непрерывного культивирования в
течение 3 мес клеток табака по принципу хемостата. Продуктив-
ность была очень высокой и составила 5,58 г/л в сутки сухой
массы клеток.
Однако пока наиболее изученным и распространенным ре-
го
г. сут
Рис 8. Ростовые циклы клеточных
популяций табака Nicotiana tabacum
(голубая линия) н диоскореи делто-
видной D. deltoidea (черная линия)
при глубинном выращивании в колбах
на качалках:
/ — число клеток; 2 — число живых клеток
Рис. 7. Модельная кривая роста в цикле
периодического выращивания
24
жимом глубинного
культивирования кле-
точных суспензий яв-
ляется закрытая перио-
дическая система. В
этом случае для аэра-
ции и перемешивания
суспензии используют
различную аппаратуру:
роллеры, качалки
(обычно "круговые),
ферментеры с механи-
ческими и магнитными
мешалками или феут-
мёнтерьг барботажного
типа, где и^аэрацият и
ным потоком.
Рис. 9. Различия скорости роста популяции
по критериям изменения
перемешивание осуществляются воздуш-
Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение
числа клеток, их сырой и сухой массы. Ростовая кривая (мо-
дельная) имеет S-образную форму. На ней различают (рис. 7)
латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулюма не
наблюдается ни по одному из критериев (/); экспоненциальную
фазу, характеризующуюся ростом с ускорением (2); линейную,
в которой скорость роста постоянна (3); фазу замедленного
роста (4); стационарную фазу (5) и фазу деградации клеток (6).
Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться
продолжительностью фаз от модельной. Это зависит как от гене-
тической характеристики популяции (вида растения), так и от
количества инокулюма и условий выращивания (рис. 8).
Состав среды, температура, начальное значение pH, состав
газовой фазы, скорость перемешивания — факторы, влияющие
на процессы ростового цикла. Из сравнения формы кривых
для разных критериев в одном цикле выращивания вытекает,
что между процессами, определяющими эти показатели, нет
строгой согласованности. Особенно ясно это видно при графиче-
ском изображении ростового цикла в полулогарифмическом
масштабе (рис. 9). Такая разбалансировка по скоростям между
процессами клеточного размножения (число клеток), синтеза
структурных элементов клетки и веществ запаса (сухая масса),
а также увеличение объема и содержимого вакуолей (сырая
масса) отражает не только специфику онтогенеза клетки высше-
го растения, но и асинхронность популяции по времени перехода
клеток из одной фазы в другую.
Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток
растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки ис-
ходных клеток растения и регулируется условиями выращивания.
Генетическая изменчивость клеток, как следствие их культи-
вирования вне организма, исчезновение одних и(появление дру-
гих стойких модификаций, передающихся в ряду клеточных поко
25
лений, адаптивный отбор, идущий в популяциях, приводит к воз-
никновению из первичной каллусной ткани генетически и фено-
типически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать
или создать экспериментально (мутагенез, соматическая гибри-
дизация, трансгенез) линии, сохраняющие биосинтезы, характер-
ные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципи-
ально новые вещества.
В культуре клеток обнаружены традиционные для растений
вещества вторичного метаболизма, а также выявлены новые,
необычные соединения: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, по-
лифенолы, полисахариды, эфирные масла, натуральные красите-
ли (пигменты), камптотецин, харрингтонин и другие антикан-
церогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов).
Культивируемые в суспензии клетки могут применяться так же,
как мультиферментные системы, способные к широкому спектру
биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, вос-
становления, гидроксилирования, метилирования, деметилирова-
ния, гликолизирования, этерификации, изомеризации). Исполь-
зование активных ферментов культивируемых клеток растений
важно для получения более ценного продукта из натурального
или синтетического предшественника. Возможно также приме-
нять биотрансформацию для создания уникальных биологиче-
ски активных продуктов на основе синтетических соединений
или веществ промежуточного обмена растений других видов.
Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной био-
массы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени.
Синтез вторичных продуктов возрастает в фазе замедленного
роста клеточной популяции и достигает максимума в стацио-
нарной фазе. Исключение составляет фаза биосинтеза некото-
рых алкалоидов, которая совпадает по времени с фазой макси-
мальной митотической активности или экспоненциальным рос-
том. Чаще механизмы и условия, блокирующие клеточную про-
лиферацию и активный рост, являются одновременно механиз-
мами активации ферментов вторичного метаболизма. Неспеци-
фические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце
экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синте-
зу вторичных продуктов и увеличивать их выход (А. М. Носов,
1983).
Однако вопрос взаимодействия первичного и вторичного ме-
таболизма на самом деле значительно сложнее. Возраст иноку-
люма, морфология составляющих его клеток, жизнеспособность,
митотическая активность, концентрация вторичных метаболитов
определяют не только рост биомассы (активный первичный ме-
таболизм), но и синтез продукта. Важную и пока малоизучен-
ную роль играет углеродное питание. Глюкоза в ряде случаев
превосходит или равна сахарозе по влиянию на рост биомассы,
но количество вторичных продуктов выше при использовании
сахарозы. Мало изучено влияние азотного питания (форма, кон-
центрация) на активацию ключевых ферментов метаболизма
26
азотсодержащих вторичных соединений и конкурентные процессы,
ведущие к синтезу белка, алкалоидов, фенолпропаноидов. Не-
ясна роль фосфора в продукционную стадию ростового цикла.
То же самое можно сказать о роли экзогенных и эндогенных
гормонов и их ингибиторов. Не изучена роль синтеза предшест-
венников вторичного метаболизма в ростовом метаболизме.
Этот перечень можно продолжить. Ясно одно, что все это
предстоит изучить для успешного использования клеточных куль-
тур в промышленности при получении важных продуктов, исполь-
зуемых в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности.
Кроме того, медленный рост (время удвоения числа клеток
1—3 дн), длительный период выращивания (2—3 недели) в стро-
го асептических условиях, чувствительность к механическим по-
вреждениям, во многих случаях низкое содержание искомого
продукта являются недостатками этого метода, ограничиваю-
щими его применение в промышленности. Это также предстоит
преодолеть исследователям и технологам. Надо помнить, что
кроме генетических подходов к созданию продуктивных, устой-
чивых к стрессам выращивания, быстрорастущих и быстро пе-
реходящих к синтезу продукта линий необходимо знание физио-
логических механизмов репрессии и активации ключевых фермен-
тов различных путей .метаболизма. Правильное сочетание ком-
понентов среды, двухэтапное культивирование клеток на средах
для «роста» и для «продукции» (см. табл. 2) может увеличить
количество продукта в клеточной культуре, полученной из рас-
тения, способного к данным синтезам.
$ 5. Культивирование отдельных клеток
Источниками отдельных (одиночных) клеток являются кле-
точные суспензии, растущие в жидкой питательной среде, ма-
церация тканей растений (например, мезофилла листа), изоли-
рованные протопласты после восстановления ими клеточной
стенки.
Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны
и исследовать генетическую и физиологическую стабильность
или изменчивость при выращивании клонового материала. Важ-
ной научной проблемой служит изучение условий, определяю-
щих возникновения стимулов к делению у таких отдельных
клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или
ткани.
Изолированные из тканей растения или культивируемых кле-
ток протопласты (см. гл. 2) после образования клеточной стенки
являются идеальными отдельными клетками. До образования
стенки их используют для переноса в клетку и (или) растение
молекул (рекомбинантные ДНК), органелл, вирусов, бактериаль-
ных клеток, несущих генетическую информацию. При этом при-
меняют различные методы: микроинъекции, слияния с липосома-
ми, в которые введены информационные макромолекулы, элект-
27
рослияния и использования электрического тока для облегчения
и проникновения макромолекул через внешнюю мембрану про-
топластов.
Отдельные клетки (изолированные протопласты) важны для
кленовой селекции мутантных, гибридных, трансформированных
линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или созда-
ют маркерные признаки для обеспечения селективных условий
отбора. Мацерированные клетки ткани растения являются хо-
рошей моделью для сравнительного изучения физиологических
процессов в ткани и отдельной тканевой клетке. В частности,
сравнение процесса фотосинтеза на уровне отдельных клеток
мезофилла листа и тканевом представляет большой интерес для
изучения фотодыхания.
Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, сти-
мулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют
колонии каллусных клеток. Ниже перечислены ферментные пре-
параты и условия, позволяющие мацерировать ткань мезофилла
листа с получением отдельных тканевых клеток:
Процедура изолирования клеток мезофилла листа табака
1. Поверхностная стерилизация гипохлоритом натрия (0,1%-ный раствор).
2. Промывка стерильной, дистиллированной водой (3 раза).
3. Стерильное удаление нижнего эпидермиса (в ламинар-боксе).
4. Нарезка фрагмента на полоски (ширина 1 мм) и помещение в раствор для
мацерации предварительно на 3 с с вакуум-инфильтрацией.
5. Перенос в свежий мацерирующий раствор и инкубирование в течение 20 мии
на качалке.
6. Фильтрование через слой батиста, сбор и промывка иа нейлоновом фильтре
(40 мкм).
Раствор для мацерации
Компоненты Концентрация, г)л
2- [N-морфолино]-этансульфоновая кис-
лота ..................................... 19,52
Сорбит или маннит............................. 100,00
Поливинилпирролидон (А0=40 000) 20,00
KsSO, ................................ 2,20
Мацераза (полигалактуроназа) Rhizopus . 10,00—30,00
Пектиназа-500 ............ .... . . 10,00—30,00
Отдельные клетки также могут быть изолированы из суспен-
зий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюо-
риметра с сортером или путем последовательных разбавлений.
В последнем методе суспензия готовится разными способами:
1) 1—2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания
основной массы клеток; 2) суспензию фильтруют через фильтры
с уменьшающимся размером пор (нейлоновые сетки или метал-
лические фильтры). Для последовательных разбавлений упо-
требляют платы для микротитрований. Это позволяет микроско-
пически контролировать клеточный состав при последовательных
разбавлениях. Индукция делений отдельных клеток из суспен-
зии изолированных протопластов, отдельных или высеянных при
28
колонии клеток
3
-----5
суспензия клеток
Рис. 10. Схема использования в качестве
«кормящего слоя* суспензии клеток куку-
рузы для индукции делений в отдельных
клетках или изолированных протопластах
кукурузы:
1 — фольга; 2— колба Эрлеимейера; 3 —
фильтровальная бумага; 4—алюминиевая
сетка, 5 — пенополиуретан
экспоненциальной
очень низкой плотности кле-
ток, полученных методом по-
следовательных разбавле-
ний, возможна при примене-
нии очень богатой питатель-
ной среды, например, среды
Као и Михайлюка (см.
табл. 2). При этом объем
среды, в которую помещают-
ся клетки, должен быть ми-
нимальным (микрокапли в
чашке Ку прака, объемом
20 мкл).
Однако при соблюдении
всех этих условий процент
разделившихся клеток оста-
ется очень низким. Более
эффективны методы «кормя-
щего слоя» (рис. 10) или
«ткани-няньки». Для созда-
ния «кормящего слоя» берут
суспензию клеток того же
вида растения, что и одиноч-
ная клетка, или близкого ви-
да. Клеточная суспензия
должна находиться в ранней
цикла. Каллусная культура, служащая «тканью-нянькой», также
должна быть в состоянии активного роста. При достижении коло-
нией, возникшей из отдельной клетки, 0,5—1 мм клон может
быть перенесен для дальнейшего выращивания на агаризованную
питательную среду непосредственно или на фильтр, помещенный
на поверхность агара. Использование «кормящего слоя», «ткани-
няньки» и минимального объема среды, в которую помещается
отдельная клетка, связаны с феноменом, называемым «действие
фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные по-
пытки определить химическую природу веществ (или вещества),
индуцирующих, деление отдельной клетки, и механизм действия
фактора кондиционирования, ясности здесь пока нет. Пожалуй,
уверенно можно сказать только то, что фактор этот химической,
а не физической природы и включает низкомолекулярные вещест-
ва (М. К- Павлова, Р. Г. Бутенко, 1965).
Изучение механизма взаимодействия клеток при размножении
их в популяции — еще одна важная научная проблема, которая
решается на уровне культивирования отдельных клеток.
[лава
е ПРОТОПЛАСТЫ
РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
КАК ОБЪЕКТ БИОЛОГИЧЕСКОГО
КОНСТРУИРОВАНИЯ
$ 1. Получение протопластов
Протопласты (от греч. protos — первый и plastos — вылеп-
ленный, образованный) — ограниченные мембраной цитоплаз-
матические образования, несущие внутриклеточные органоиды
и характеризующиеся структурной целостностью и способностью
осуществлять активный метаболизм, выполнять биосинтезы и
трансформацию энергии. Впервые этот термин использован
Д. Ханстеином (J. Hanstein, 1880). В растительной клетке прото-
пласт выявляется как морфологически обособленное образование
при плазмолизе. Плазмолиз — это отделение пристеночного слоя
цитоплазмы от твердой оболочки растительной клетки. Плазмо-
лиз можно наблюдать, если поместить кусочек растительной
ткани в раствор более концентрированный, чем вакуолярный сок.
В этом случае будет происходить отток воды из клетки. Клеточ-
ная стенка — образование, легко проницаемое для воды, но до-
статочно жесткое по структуре, мало меняет форму при оттоке
воды из клетки. Протопласт же, теряя воду, сокращается в объ-
еме, отделяется от клеточных стенок и сжимается в комок в се-
редине клетки (рис. 11). При этом он остается жизнеспособным
и может быть перенесен в подходящую среду.
Способы выделения протопластов. Впервые. выделение про-
топластов было осуществлено в связи с изучением плазмолиза
Дж. Клеркером в 1892 г. Он плазмолизировал ткани листа водного
растения телорез (Stratiotes aloid.es) и затем удалял клеточную
стенку. При этом происходило выделение протопластов. Приме-
няя подобного рода методику, протопласты можно получить,,
используя тонкие полосы эпидермиса чешуи луковицы. Их вы-
держивают в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока прото-
пласты не сожмутся и не отойдут от своих клеточных стенок.
Если затем разрезать бритвой полоску эпидермиса, протопласты
будут выходить в среду. Такого рода методы выделения прото-
пластов называют механическими.
Плазмолиз в данном случае обеспечивает обособление про-
зе
топластов от клеточной
стенки. В нативной тка-
ни клеточная стенка с
протопластом состав-
ляет довольно тесный
структурно - функцио-
нальный комплекс. Кле-
точная стенка имеет по-
ры, через которые про-
ходят протоплазматиче-
ские тяжи—плазмодес-
мы, молодые клеточные
стенки пронизаны цито-
плазматическими обра-
зованиями — эктодес-
мами. Кроме того, син-
тез компонентов клеточ-
ной стенки осуществля-
ется при участии цито-
плазматических струк-
Рис. 11. Плазмолиз в клетке (по Гэлстон и др.,
1983): л — тургоресцентная клетка; i — плаз-
молизиреваниая клетка:
1 — протопласт прижат к клеточной стейке давле-
нием, создаваемым центральной вакуолью: 2 —
концентрированный раствор; 3 — клеточная стей-
ка; 4 — сжавшийся протопласт; 5 — клеточная
. мембрана
тур (аппарат Гольджи,
эндоплазматический ре-
тикулум, микротрубочки) и ферментных систем, связанных с плаз-
малеммой. Плазмолиз разрушает эту связь; ,при этом, как считают,
происходит частичная разборка поверхностной мембраны прото-
пласта.
Развитие исследований в области изоляции растительных
протопластов приводило к модификации и улучшению механи-
ческого метода. Тем не менее он имеет определенные ограничения:
1) этим методом можно выделить только небольшое число про-
топластов; 2) используются только те ткани, в которых имеет
место экстенсивный плазмолиз; 3) получить протопласты из
меристематической или зрелой ткани трудно; 4) метод длительный
и трудоемкий.
Принципиально отличный метвд получения изолированных
протопластов — энзиматический; в этом случае для удаления
клеточной ci енки~исп0льзуются ферменты. К первым работам
относятся опыты, в которых протопласты из клеток гриба были
изолированы обработкой клеточных стенок желудочным соком
улитки Helix pomatia (J. Giaja, 1919).
В микробиологии для разрушения клеточных стенок бактерий
был применен фермент лизоцим (М. Salton, 1952). Изолирование
протопластов из клеток высших растений с использованием фер-
ментных препаратов впервые было успешно проведено Е. Кокин-
гом (Е. С. Cocking, 1960).
В сравнении с механическим методом ферментативное выделе-
ние протопластов имеет определенные преимущества: if) одно-
временно можно выделить большое количество протопластов;
2) протопласты не подвергаются сильному осмотическому ежа-
31
тию; 3) клетки более интактны и не повреждены; 4) метод
сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используются ферментные
препараты трех типов — целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы.
Действие этих ферментов направлено на разрушение основ-
ных компонентов клеточной стенки. У растений это целлюлоза,
гемицеллюлоза и пектиновые вещества. Целлюлозные моле-
кулы, собранные в микрофибриллы, формируют рыхлый, но проч-
ный структурный остов. Он погружен в аморфный матрикс, сос-
тоящий из гемицеллюлоз, пектиновых веществ, белков.
В первичной клеточной стенке на долю основного структур-
ного компонента — целлюлозы — приходится до 30% от сухой
массы и столько же на пектиновые вещества, белки и липиды;
40% составляют гемицеллюлозы. В клетках разных типов ткани
в зависимости от функциональных особенностей, возраста, на-
личия вторичных утолщений эти соотношения могут варьировать.
Например, в клетках из колеоптилей овса клеточная стенка на
25% состоит из целлюлозы, а в молодых волокнах хлопка она
составляет 50% от общей массы клеточной стенки (по D. Evans,
J. Bravo, 1983). Поэтому комбинации ферментных препаратов и
их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Наиболее
адекватная составу клеточной стенки комбинация обеспечивает
успех выделения протопластов. Так, для получения протопластов
из плацентарной ткани плодов пасленовых, которые, как правило,
имеют высокое содержание пектина, особенно подходящ фер-
ментный препарат пектиназа. Процедура выделения протоплас-
тов из плодов состоит из трех этапов: 1) обработка ферментом;
2) выделение протопластов из обособленных клеточных сте-
нок; 3) отделение интактных протопластов от клеточных
осколков.
Получение протопластов из листьев потребовало дальнейшего
усовершенствования методики применительно к особенностям
этой ткани. Главные отличия методики при работе с листьями
заключаются, во-первых, в том, что листовая ткань освобожда-
ется от эпидермиса, и, во-вторых, что вместе с пектиназой ис-
пользуется целлюлаза — фермент, разрушающий целлюлозные
компоненты клеточной стенки.
В частности, для листьев Nicotiana tabacum И. Такебе раз-
работал следующую технику изоляции протопластов. Полностью
сформировавшийся лист отделялся от здорового растения в
возрасте 60—80 дн, быстро окунался в 70%-ный этанол и поме-
щался после этого на 15—20 мин в 10%-ный раствор гипохлорита
кальция. Затем лист несколько раз промывали в стерильной
дистиллированной воде. Нижний эпидермис аккуратно снимался
с помощью пинцета (рис. 12), и очищенные от эпидермиса листья
разрезались скальпелем на небольшие кусочки площадью при-
мерно 4 см2. Эпидермис будет сниматься сравнительно легко,
если листьям после стерилизации дать немного подвинуть или
если снабжение растений водой будет несколько ограниченным
32
перед тем, как срезать с него
листья. Из очищенной от эпи-
дермиса листовой ткани прото-
пласты извлекались двухсту-
пенчатой энзиматической обра-
боткой. На первом этапе ис-
пользовался фермент пектина-
за, который осуществляет маце-
рацию ткани, и затем, на втором
этапе, клетки обрабатывались
целлюлазой, окончательно раз-
рушающей целлюлозные кле-
точные стенки.
Вместо последовательного
воздействия пектиназой и цел- рис 12. Удаление эпидермиса с листа
люлазой МОЖНО одновременно (по J. Reinert, М. Yeoman, 1982)
обрабатывать смесью этих фер-
ментов (J. Power, Е. Cocking,
1969). Для этого листовую ткань без эпидермиса помещают
непосредственно в ферментативную смесь, содержащую 0,5%
фермента пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе сор-
бита или маннита. Данная смесь ферментных препаратов эф-
фективна, однако не во всех случаях. Например, при полу-
чении протопластов из колеоптилей овса с использованием
целлюлазы добавление пектиназы ингибирует их выделение.
Успешно применяется в этих целях целлюлозно-пектиновый
препарат — ксиланаза. Он включает эндоксиланазу, ксилози-
дазу, 0-1,4-эндоглюканазу, целлобиазу, эндополигалактуроназу,
пектинэстеразу и протеазу. Хорошую активность имеет и целло-
кондин, дополнительно содержащий С|-фермент целлюлазного
комплекса. Ксиланаза эффективна при получении протопластов
из листьев райграса, овсяницы, клевера, люцерны, а также для
клеток культуры ткани табака, картофеля, моркови. Наиболее
подходящая концентрация 2,0—5,0% (Р. Г. Бутенко, 1979).
Оптимальные условия для выделения протопластов очень
индивидуальны для разных тканей. В каждом случае необходи-
ма предварительная работа по подбору состава ферментов, их
концентрации и соотношения, а также времени обработки. Важна
продолжительность обработки клетки и ткани ферментами. Выде-
ляющиеся протопласты должны находиться в контакте с фер-
ментом минимальное время и затем тщательно отмыты от них.
Стерилизацию раствора ферментов производят через бактериаль-
ные фильтры.
Очень важным фактором для успешного выделения жизне-
способных, нативных протопластов является подбор осмотиче-
ского стабилизатора. С наличием клеточной стенки у раститель-
ной клетки связана регуляция ее водообмена. Сосущую силу
формируют не только осмотические свойства клетки, но и тургор-
ное давление. С увеличением количества воды в клетке тургорное
2—44
33
давление возрастает и, следовательно, снижается ее сосущая
сила. Процесс поступления воды в клетку прекращается совсем,
если тургорное давление делается равным осмотическому давле-
нию клетки. Таким образом структурная организация клетки,
включающая протопласт и жесткую клеточную стенку, формирует
саморегуляторный механизм водообмена. Поэтому для изолиро-
ванных протопластов, лишенных клеточной стенки, очень важны
осмотические свойства среды выделения и культивирования.
В качестве осмотических стабилизаторов используются сахара
(глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит); иногда ионные
осмотики — растворы солей СаС1г, КагНРСЦ, КС1. Осмотически
активные вещества применяются в концентрации 0,3—0,8 моль/л.
Точная концентрация осмотиков всегда подбирается для конкрет-
ного вида растения и его физиологического состояния. Среда
должна быть несколько гипертоничной, чтобы протопласты на-
ходились в слегка плазмолизированном состоянии. В этих усло-
виях тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.
Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны
и другие условия. Чаще всего протопласты изолируются в темно-
те или при слабом свете, pH обычно 5,4—6,2. Температурные
условия могут варьировать в широких пределах, например, для
пшеницы оптимальная температура + 14°С, для томатов +27ОС.
Стабильности протопластов способствуют высокие концентра-
ций СаСЬ и MgCh, воздействующих на мембранную систему
клетки.
Обработку листовой ткани раствором ферментов удобно
проводить в чашках Петри. После инкубации листья осторожно
перемешивают стерильным пинцетом, передвигая кусочки листьев
в одну сторону. Чашку Петри при этом держат под углом 15°
(рис. 13). Энзиматическую смесь с протопластами переносят
в центрифужные пробирки. После энзиматической изоляции
протопласты должны быть очищены от остатков неразрушенной
ткани и осколков клеток и отмыты от ферментов. Для этого ис-
пользуются два наиболее распространенных метода — фильт-
рация с центрифугированием и
флотация.
В первом случае неочищен-
ную смесь протопластов про-
пускают через фильтр с разме-
ром пор ~40 мкм. На фильтре
остаются неразрушенные комки
клеток и их большие осколки.
Оставшаяся в водной фазе
Рис. 13. Отделение суспензии прото-
пластов от листовой ткани после
обработки последних смесью фер-
ментов, разрушающих клеточные
стенки (J. Reinert, М. Yeoman, 1982):
1 — кусочки листьев; 2 — суспензия
протопластов
смесь протопластов, мелких ос-
колков клеток и ферментов
центрифугируется так, чтобы
оседали протопласты, а осколки
оставались в супернатанте.
Повторным центрифугировани-
34
ем протопласты отмываются от фермента и могут быть перенесены
в среду культивирования. Этот метод очистки очень эффективен.
Но для ослабленных протопластов этап фильтрации часто бывает
слишком груб.
Метод флотации (О. Gamborg et al., 1981) используется для
хрупких протопластов. Он основан на том, что протопласты
имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки кле-
точных стенок. Неочищенная фракция протопластов смешивает-
ся с раствором сахарозы (концентрацией от 0,3 до 0,6 моль/л)
или сорбита и центрифугируется при соответствующей скорости.
Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно. Скорость
центрифугирования варьирует от 40—80 до 350g.
Для получения протопластов широко используют клеточные
суспении и каллусные культуры. Схема общей процедуры изоля-
ции протопластов та же. Однако в этом случае нет необходимости
в стерилизации исходного материала.
Условия получения жизнеспособных протопластов. Выделение
протопластов технически — хорошо отработанная процедура,
достаточно легко выполняемая. Однако получить жизнеспособные
протопласты непросто. Это зависит от многих факторов — состава
ферментов, их качества, pH среды и выбора осмотического раство-
ра. Большое значение имеет физиологическое состояние расти-
тельного материала, его возраст, условия выращивания. Факторы,
которые активируют рост растения, будут увеличивать вероят-
ность получения жизнеспособных протопластов. Так, например,
для успешного выделения протопластов из Nicotiana tabacum
оптимальными будут следующие условия выращивания растений:
температура 22°С, освещенность 10 000—20 000 лк в течение
15 ч, еженедельная подкормка азотом. Наиболее благоприятный
возраст растения 40—60 сут. Растения Solanum tuberosum по-
лезно перенести на 4—10 сут в условия низкой освещенности
(7000 лк, 6 ч) и уже после этого изолировать протопласты. Для
люцерны исследовался эффект возраста листа на жизнеспособ-
ность выделяемых протопластов. Старые листья требовали более
высокой концентрации ферментов, протопласты были менее жиз-
неспособны. Обнаружено, что жизнеспособность протопластов
можно увеличить, если кусочки листьев без эпидермиса предва-
рительно инкубировать на среде для клеточных культур в течение
36—48 ч.
Для получения протопластов из суспензионных и клеточных
культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической
фазы роста. В этот период клеточные < 1енки легче всего поддаются
энзиматическому разрушению, а протопласты — наиболее жизне-
способны. Выход протопластов зависит от состава среды. Увели-
чение концентрации ауксина и снижение концентрации сахарозы
за 1 сут перед изоляцией протопластов активировало их выход.
Полагают, что эти условия влияют на состав клеточной стенки
и облегчают ее энзиматическое разрушение.
Одно из неудобств применения культивируемых клеток как
35
исходного материала для выделения протопластов состоит в том,
что такие культуры имеют часто нестабильное число хромосом.
Большинство долго культивируемых культур содержат смесь
эуплоидных и анэуплоидных клеток. Обычно последние не спо-
собны к регенерации растений. Это приводит к существенному
снижению частоты регенерации растений из изолированных про-
топластов. И. Эванс и О. Гамборг (Evans Е., Gamborg О., 1982)
разработали метод, формирующий хромосомную стабильность
в используемых для изоляции протопластов клеточных культу-
рах. Три условия являются определяющими: 1. Важен эксплан-
тат, который используется для получения клеточной культуры.
Например, ткани листа или ткани молодых побегов имеют более
высокое содержание диплоидных клеток, чем ткани сердцевины.
2. На число хромосом культивируемых клеток влияет концентра-
ция регуляторов роста. Так, высокие концентрации кинетина
способствуют возникновению полиплоидии. 3. Важно для получен-
ной диплоидной культуры поддерживать селективные условия,
которые благоприятствовали бы доминированию данной попу-
ляции (по Е. Evans, J. Bravo, 1983).
Протопласты, изолированные из стабильной клеточной куль-
туры, с большей вероятностью регенерируют растения и более
полезны для исследования генетической модификации прото-
пластов, особенно их слияния.
§ 2. Культивирование протопластов
Способы культивирования протопластов. Для культивирова-
ния протопластов используются два технических приема: метод
жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензия
протопластов в виде капель помещается в жидкой среде на
пластиковые чашки (Као К. N. et al., 1971).
Метод обеспечивает хороший обмен газами через воздушную
фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов. Кроме
того, легко можно добавить свежий питательный раствор в нужной
концентрации. Однако при культивировании этим способом прото-
пласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они
образуют значительное количество фенольных или других токси-
ческих соединений, что препятствует успешному культивированию.
Этот метод также не удобен, если надо проследить за судьбой инди-
видуальной колонии протопластов.
Другой широко распространенный метод — агаровая культура
(Nagata Т., Takebel., 1971). В этом случае определенный объем
суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают
в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же
самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна
превышать 45°С. Чашки Петри заклеивают парафиллюмом и
держат перевернутыми при температуре около 28°С. Протопласты
фиксированы в одном положении и физически отдалены один
от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно
36
наблюдать для одного конкретного протопласта всю последова-
тельность его развития — формирование клеточной стенки, деле-
ние клеток, рост и развитие растения. Недостаток метода за-
ключается в том, что возможно некоторое повреждение прото-
пластов, когда они смешиваются с теплым агар-агаром.
Вариантом этой техники является использование «кормящих»
протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентге-
новского или гамма-излучения, чтобы блокировать их способ-
ность к клеточному делению. Они смешиваются с жизнеспособны-
ми протопластами и платируются. Можно «кормящие» клетки
пласты располагать в нижнем слое, а жизнеспособные —
в верхнем. Этот метод позволяет культивировать суспензии прото-
пластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необхо-
дима для их роста. Доза облучения выбирается такой, чтобы
клетки утратили способность к делению, но поддерживали и
стимулировали рост других клеток.
Сходным с этим методом является метоп. совместных культур.
Он используется для эффективного культивирования некоторых
протопластов. Протопласты, которые отличаются быстрым рос-
том, смешиваются с протопластами, трудно поддающимися куль-
тивированию. Д. Эванс отмечает, что успех культивирования
такого рода связан с веществами, которые выделяются быстро
растущими видами (D. Evans, 1979).
Удобным вариантом метода жидких капель является культи-
вирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов
(микроизоляция) (Ю. Ю. Глеба, 1978). В микрокаплях, даже
если в них находится только одна клетка, соотношение объема
клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре
плотностью 103 кл/мл.
Условия культивирования протопластов. По питательным
потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клет-
ками. Поэтому питательные среды, применяемые для культивиро-
вания протопластов, подобны таковым для клеточных культур.
Наиболее употребимы среды Мурасиге и Скуга (1962), Нагата
и Такебе (1971) с некоторыми модификациями, среда В 5 (О. Gam-
borg et al., 1968) и среда 8 Р (К- N. Као., М. Michayluk, 1978).
Последняя представляет собой обогащенную витаминами, амино-
кислотами и сахарами среду В 5 Гамборга, иногда с более
сложным составом фитогормонов (К. N. Као, 1977). Все эти
среды содержат минеральные вещества, такие, как N, Р, S, К,
Са, Mg, относящиеся к макроэлементам, а также Zn, Си, Мо,
В, Мп, С1, Со, составляющие группу микроэлементов.
Поскольку Центральная проблема при культивировании рас-
тительных объектов на искусственных питательных растворах —
создание определенной буферной емкости смеси, то обычно ис-
пользуют сопряженные пары солей, в которые объединяют хими-
чески или физиологически кислые и щелочные соли. К основным
сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор.
В среде Мурасиге и Скуга это слабо физиологически щелочная
37
соль KNO3 и слабо физиологически кислая^соль NH4NO3 в соче-
тании с химически кислой солью КН2РО4. В соответствии с этим
реакция среды сравнительно кислая, pH 5,6—5,8. Среды содер
жат железо в хелатной форме (Fe> EDTA) и сахарозу как ис-
точник углеводов, а также витамины и гормоны. Рекомендуется
добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточной стенки,
а также ксилозу, рибозу и др. Это стимулирует образование
клеточной стенки. Состав этих добавок может быть очень специ-
фичным в зависимости от видовых особенностей протопластов.
Для индукции деления протопластов многих видов растений
эффективно добавлять в среду 2,4 Д, НУК, БАП, а также кинетин.
Температура, при которой культивируются протопласты,
варьирует в значительной степени в зависимости от специфики
вида. Так, например, для протопластов одного представителя
семейства злаковых — росички кроваво-красной {Digitaria san-
guinalis), распространенной в черноземной зоне, оптимальной
является температура 30°С, а для пшеницы Triticum aestivum
22°С. Обычно протопласты не выдерживают самого незначитель-
ного отклонения от оптимальной температуры.
Интенсивность света — параметр, достаточно часто обсужда-
емый в литературе. В общем исследователи приходят к выводу,
что свет высокой интенсивности губительно действует на свеже-
выделенные протопласты. Оптимальные значения освещенности
варьируют в широких пределах. Так, люцерна (Medicago sativa)
образует колонии в абсолютной темноте, а для протопластов
Nemesia strumosa оптимальный рост наблюдается при освещен-
ности в 80 000 лк.
Существенным фактором культивирования является плотность
засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты
часто не делятся. С другой стороны, при очень высокой плотности
высева затруднения в культивировании возникают на более
поздних стадиях, когда на рост могут оказывать влияние выде-
ляемые продукты обмена. Оптимальная плотность протопластов
в культуре З-Ю3—1-105 в 1 мл.
Регенерация клеток, клеточных культур и растений из прото-
пластов. Образование клеточной стенки у протопластов в культу-
ре происходит сразу после удаления раствора фермента. Вновь
синтезируемую клеточную стенку можно наблюдать в флуорес-
центный микроскоп, используя как реагент калкофлер белый
(1%-ный раствор). Регенерация клеточных стенок — явление
достаточно распространенное. Гораздо труднее добиться деления
образующихся клеток и еще труднее получить целое растение.
Однако для ряда видов имеются устойчивые шинии клеток и
целые растения (см. Ю. Ю. Глеба, К. М. Сытник, и984). Возмож-
ность регенерации растений из протопластов мс»кет свидетель-
ствовать о тотипотентности протопластов, как это\было показано
для клеток растений (F. Steward, 1970). I
Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез,
либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфо-
38
Рис. 14. Эмбриогенез и образование растений в культуре протопластов моркови:
А — протопласты из культуры клеток моркови; Б — протопласты после образования кле-
точной стенки; D — эмбриоиды из протопластов моркови 3—4-иедельного возраста; Г ~
растение моркови (по Н. Grambow et al., 1972. D. Dudits et al.,1976)
генеза. Так, для моркови (Daucus carota) получен эмбриогенез
при культивировании протопластов, изолированных из суспен-
зионной культуры (Н. Grambow et al., 1972) (рис. 14). Прото-
пласты выращивали на среде с 2,4 Д. Через 8—10 сут они
образовывали группы клеток, которые продуцировали эмбриоиды,
развивавшиеся в крошечные проростки. Их переносили на среду
без 2,4 Д, где и формировались целые растения.
Можно изолировать протопласты из кусочков корня моркови.
Т. Камейа и X. Ушимия (T.Katneya, Н. Uchimiya, 1972) культи-
39
Рис. 15. Регенерация растений из протопластор, выделенных из мезофилла табака
(Т. Nagata, I. Takebe, 1971):
А— В — стадия образования колоний из протопластов на среде с агаром; Г — колонии
пересажены на среду для образования каллусной массы: Д — дифференциация в каллусе;
Е—растение, регенерированное из единичного протопласта
вировали изолированные таким путем протопласты на среде,
содержащей 1 % кокосового молока, НУК или 2,4 Д. Группы
клеток, которые развивались из протопластов, выращивали на
среде, содержащей гидролизат казеина, кокосовое молоко или
кинетин. Через 4—8 недель развивались каллусные массы, в
которых происходила дифференциация эмбриоидов.
Развитие корней, стеблей и эмбриоидов, вырастающих в целые
растения, описано для протопластов Asparagus officinalis, из
класса однодольных. Протопласты выращивали на среде с
НУК, зеатином и глутамином. Оказалось, что глутамин — в данном
случае эффективный индуктор деления изолированных прото-
пластов. Делящиеся протопласты образовывали колонии клеток,
Варьируя уровень гормонов, стимулировали корнеобразование,
формирование побега или эмбриогенез.
Целые растения из протопластов можно получить не только
через эмбриогенез, но и путем последовательного формирования
побегов и корневой системы. Так впервые Т. Нагата и И. Такебе
(Т. Nagata, I. Takebe, 1974) осуществили регенерацию целых
растений из протопластов мезофилла листа Nicotiana tabacum
(рис. 15). Свежеизолированные протопласты платировались в
модифицированной среде Мурасиге и Скруга с 3 мг/л НУК и
1 мг/л БАП. Колонии формировались после 3 недель культиви-
рования. Эффективность образования колоний зависела от плот-
ности засева, условий освещения во время инкубации. Инди-
видуальные колонии извлекались и переносились на среду Сак-
ристан и Мельхерса. Они давали каллусные массы и через
3 недели образовывали много дифференцированных побегов.
Сформированные растения переносили в почву. Регенерацию
растений осуществляли и при культивировании протопластов,
полученных из гаплоидных форм табака.
Еще один представитель пасленовых Petunia обладает доста-
точно высоким регенерационным потенциалом и широко исполь-
зуется в экспериментальных исследованиях. Интересно, что
состав среды, на которой происходит образование проростков
и корней, сходен и у табака, и у петуньи. Формирование каллуса
и регенерация растений получена из протопластов рапа Brassica
napus.
Таким образом, пользуясь арсеналом способов культивирова-
ния клеток in vitro, успешно удается культивировать протопласты
и выращивать целые растения из единичных протопластов. Это
может свидетельствовать о тотипотентности протопластов.
Пролиферативная способность клеток, возникающих из прото-
пластов. Формирование клеточной стенки осуществляется легче,
чем дальнейшая пролиферация клеток. Р. Г. Бутенко (1979—1981)
выделяет следующие факторы, которые определяют пролифера-
тивную способность клеток, возникших из изолированных прото-
пластов: 1. Видовая специфичность и физиологическое состояние
исходной ткани растений. 2. Способ и условия выделения про-
топластов. 3. Плотность высева протопластов. 4. Состав пита-
41
тельной среды, причем это относится не только к гормональным
и витаминным добавкам, но и к. концентрации минеральных
солей и pH.
§ 3. Слияние протопластов
Изолированные протопласты за то короткое время, пока они
не образовали клеточной стенки, могут сливаться между собой.
Слияние может быть спонтанным. Оно происходит чаще при
эдноступенчатом способе выделения протопластов и если исполь-
зуются протопласты, изолированные из молодых тканей или су-
спензионных культур. По мнению Е. Кокинга (1972), спонтанное
слияние осуществляется пассивно путем расширения плазмодесм,
которыми связаны клетки в растительной ткани.
Способы индукции слияния протопластов. Некоторые веще-
ства, добавленные к выделенным протопластам, облегчают и
стимулируют этот процесс. Феномен индукции слияния между
протопластами различных таксонов для создания гетерокариона
был впервые продемонстрирован Е. Коккингом, Д. Поува, С. Кум-
минсом (J. Power et aL, 1970). Они осуществили внутривидовое
и межвидовое слияние протопластов, полученных из кончиков
корней проростков кукурузы и овса. В качестве индуктора
использовали 0,25 М раствор NaNOs, который не влиял на жиз-
неспособность протопластов. После слияния этим методом про-
топластов Nicotiana glauca и N. langsdorffii удалось регенериро-
вать целое растение (Р. Carlson et al., 1972). Скорость слияния
оказалась низкой. Однако работы эти имели значение, так как
они привлекли внимание других исследователей и получили
дальнейшее развитие.
Слияние индуцировали также кальцием в высоких концентра-
циях при щелочном pH. Протопласты инкубировали в течение
30—40 мин при 37°С в 50 мМ-ном глицин — NaOH буфере
(pH 10,5), содержащем 50 ммоль/л СаС1г и 0,4 ммоль/л D-
маннита (W. Keller, G. Melchers, 1973). Этот метод наиболее
подходящ для получения продуктов слияния протопластов мезо-
филла. Протопласты клеток культуры ткани не особенно чув-
ствительны к этой обработке.
Эффективным индуцирующим агентом для слияния протопла-
стов оказался ПЭГ.
Удовлетворительная молекулярная масса ПЭГ 1540—6000.
К смеси протопластов, нанесенной в виде отдельных капель
на стеклянную поверхность, добавляют раствор ПЭГ из расчета
3 капли на 1 каплю суспензии клеток. Раствор ПЭГ готовят,
добавляя 1 г его (молекулярная масса 1540) к 2 мл 0,1 М раст-
вора глюкозы, содержащего 10,5 ммоль/л СаСЬ и 0,7 ммоль/л
КНгРОДрН 5,5). Через 10—15 мин ПЭГ удаляют отмыванием
либо средой культивирования, либо раствором с высоким pH
(10,0—10,5) и высоким содержанием кальция (70 ммоль/л, а в
ряде работ 50—100 ммоль/л) (Ю. Ю. Глеба, К-М. Сытник,
42
1984). В присутствии ПЭГ наблюдается сильная адгёзия прото-
пластов, а после удаления ПЭГ и добавления Са2+ — их слияние.
С использованием этого метода получены гибриды разного типа,
в том числе соматические гибридные клетки между протопла-
стами растений и животными клетками, протопластами растений
и водорослей.
Т. Нагата обнаружил адгезию и слияние протопластов мезо-
филла табака при добавлении поливинилового спирта (ПВС)
(степень полимеризации приблизительно 500). ПВС отмывался
затем буфером с высоким pH и высоким содержанием Са2+.
Слияние происходило со сходной частотой, как и в случае ПЭГ.
Адгезионная сила этого химического соединения слабее, чем
ПЭГ, и оно менее вредно для протопластов. Влияние ПВС на
поверхность протопласта менее понятно, чем в случае ПЭГ, хотя
соединения имеют сходные химические характеристики: являются
слабыми поверхностно-активными веществами и имеют высокую
растворимость в воде. Их химические формулы следующие:
поли этиленгликоль
полквиниловый спирт
Недостаток этой техники слияния протопластов состоит в
том, что одновременно получить большое количество слившихся
клеток очень трудно. У. Циммерман с сотрудниками разработали
физический метод для слияния протопластов, в котором в каче-
стве индуктора использовались импульсы эл. ктрического тока
(U. Zimmermann, Р. Scheurich, 1981). Этот метод был применен
для слияния разных протопластов, животных клеток, липосом.
Схематическое изображение аппаратуры дано на рис. 16. Про-
топласты помещают в камеру, где создается неоднородное, пере-
менное электрическое поле (синусоидальная волна, максималь-
ная напряженность поля 200 В-см-1, частота 0,5 МГц, рас-
стояние между электродами 0,2 мм). В этих условиях на элек-
тродах формируются агрегаты, состоящие из 2—3 протопластов,
либо между электродами образуются мосты из 5—6 протопла-
стов. Это явление известно как диэлектрофорез. К этой системе
дополнительно подается единичный импульс (квадратная волна,
напряженность 750 В*см-1, продолжительность 50 мкс), вызы-
вающий слияние протопластов в агрегате. Все физические пара-
метры подбираются заранее. Характерной и очень важной осо-
бенностью этого метода является синхронное индуцирование.
Слияние проводится при удельной электропроводимости среды
ниже 10-4 См-см-1. Этому условию удовлетворяет 0,5 М раст-
вор маннита, который относится к неэлектролитам: его удельная
электропроводимость 1,4-10—5 См-см_|
43
Рис. 16. Схематическое изобра
жение аппаратуры для электри-
ческой индукции слияния (по
Т. Nagata, 1984):
/ — камера для слияния; 2 — элект-
роды; 3 — генератор-1; 4—генера-
тор-2; 5 — осциллограф
Механизм слияния протопла-
стов. Методы, используемые для
слияния протопластов, эксперимен-
тально разные; тем не менее они
имеют общий конечный эффект.
Для изучения механизма слияния
необходим анализ общих черт в дей-
ствии индукторов на протопласт.
При слиянии протопластов мож-
но выделить два процесса: адгезию
и собственно Слияйие мембран. Ад-
гезия — следствие определенных
свойств поверхности протопласта.
Она редко наблюдается, если прото-
пласты суспендированы в растворе
неэлектролитического осмотика, та-
кого, например, как маннит или
сахароза, без добавления катионов
или с очень низкой концентрацией
последних. Этот факт свидетельст-
вует о том, что поведение протопла-
стов в растворе определяется элект-
рокинетическими свойствами его
поверхности. Заряженное состояние
клеточной поверхности экспериментально можно определить путем
электрофореза клеток. Для этого протопласты помещают в элек-
трическое поле, где они движутся в соответствии с поверхностными
зарядами. Зная1 скорость передвижения, можно рассчитать элек-
трокинетический, или ^-потенциал клеточной поверхности.
Значения g-потенциала в мВ для протопластов Nicotiana
tabacum от —25 до —35, Petunia hybrida —25, Brassica rapa
—23, Vinga unguiculata от —10 до —15 (T. Nagata, 1984).
Основываясь на этих данных, рассчитывают потенциальную
энергию взаимодействия между протопластами. Результаты
расчетов показывают, что адгезия в растворах обычных неэлек-
тролитных осмотиков невозможна. Среды с высоким pH и высо-
ким содержанием Са2+ вызывают снижение g-потенциала, что,
вероятно, связано с нейтрализацией поверхностных зарядов.
Это ослабляет силы отталкивания отрицательных зарядов по-
верхности протопластов и происходит агрегация. Снижение g-
потенциала показано при агрегации протопластов в присутствии
раствора NaNOs.
В настоящее время нет экспериментальных данных по изме-
нению g-потенциала протопластов при наличии ПЭГ, так как его
высококонцентрированные растворы обладают большой вяз-
костью, что затрудняет проведение электрофореза. Однако на
искусственных мембранах показано уменьшение поверхностного
потенциала с увеличением концентрации ПЭГ. Это дает осно-
вание предположить, что и в случае ПЭГ агрегация протопластов
44
Рис. 17. Схематическое изображение
образования цепочки протопластов во
время диэлектрофореза (по Т. Nagata,
1984)
Рис. 18. Схематическое изобра-
жение диэлектрического разрыва
двух противоположных мембран
(по Т. Nagata, 1984)
связана с изменением электрокинетических свойств поверхности.
Агрегация под действием ПЭГ практически необратима, чем
отличается от таковой в присутствии катионов. Считают, что это
связано с дегидратированием поверхности, приводящим к тесно-
му контакту между клеточными мембранами в агрегате.
Агрегация протопластов в переменном негомогенном поле
объясняется исследователями следующим образом. Отрицатель-
ные заряды на поверхности протопластов, как показано на
рис. 17, «маскируются» или нейтрализуются в переменном
электрическом поле. В то же время неоднородность поля индуци-
рует в протопласте диполь, что способствует их агрегации.
Агрегаты перемещаются к участку с более высокой напряжен-
ностью и в зависимости от плотности суспензии протопластов
они либо образуют небольшие скопления, либо формируют
мосты между двумя электродами.
Таким образом во всех методах слияния протопластов на
первом этапе происходит их агрегация, которая объясняется
изменением электрических свойств поверхности. Напомним, что
поверхностный потенциал, или g-потенциал, не следует путать
с мембранным потенциалом. Поверхностный потенциал возникает
за счет фиксированных зарядов поверхности, в то время как мем-
бранный потенциал — результат Донановского распределения за-
рядов через мембрану.
Процесс слияния клеток — явление общее и может быть
индуцировано у животных клеток, протопластов растений и мик-
роорганизмов. Для животных клеток показано, что слияние
мембран, следующее за адгезией клеток, является результатом
увеличения текучести и тесно связано с фазовым разделением
(Д. Мецлер, 1980).
Анализ экспериментальных материалов, касающихся структу-
ры и свойств мембран при воздействии индукторов слияния,
показывает, что в условиях высокого pH, под действием высоких
концентраций Са2+ у растительных протопластов также происхо-
45
дит увеличение текучести мембран. ПЭГ не вызывает увеличения
текучести мембран, а способствует агрегации протопластов.
Собственно слияние мембран происходит только тогда, когда
суспензию отмывают от ПЭГ раствором с высоким pH и высоким
содержанием Са2+, которые существенно увеличивают текучесть
мембран до фазового разделения и слияния (Т. Nagata, 1984).
Электронно-микроскопические исследования с использованием
метода замораживания — травления свидетельствуют о том, что
слияние мембран происходит в местах, свободных от внутримем-
бранных частиц. Эти участки имеют липидную природу и образо-
вались, по-видимому, в результате фазового разделения (Н. Ro-
benek, Е. Peveling, 1978).
Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, можно
объяснить следующим образом. Импульс короткой продолжи-
тельности вызывает диэлектрическое разрушение соприкасаю-
щихся мембран протопластов (рис. 18). Вокруг дырки возможен
обмен липидными молекулами, образование липидных мостов,
что в конце концов приводит к слиянию мембран. Это энергети-
чески более выгодное состояние, чем существование двух повре-
жденных мембран. Процессы, сопровождающиеся обменом липи-
дов, отражают особенности жидкой мозаичной структуры клеточ-
ной мембраны и могут быть связаны с ее текучестью.
§ 4. Гибридизация
соматических клеток
Разработка способов индукции слияния протопластов вместе
с развитием экспериментальной техники культивирования клеток
in vitro, дающей возможность получения изолированных прото-
пластов, их культивирования и образования каллуса и в даль-
нейшем целого растения, сформировало новый очень интересный
и перспективный метод гибридизации растений — парасексуаль-
ную, или соматическую, гибридизацию.
Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что
в качестве родительских используются не половые клетки
(гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют
протопласты. И в отличие от полового скрещивания, где имеет
место одностороннее исключение протоплазмы, при соматической
гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют
более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние
протопластов способствует объединению двух различных цито-
плазм. В большинстве исследований слияние протопластов
высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо
цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих парт-
неров, ядро — одного. Образование растения с гибридной цито-
плазмой и органеллами обоих партнеров, но содержащее в своих
клетках ядро только одного вида, возможно в том случае, если
46
после слияния протопластов не происходит соединения ядер и
одно ядро дегенерирует (Е. Cocking, 1980).
Важным моментом в изучении индуцированного слияния
двух неродственных протопластов является селективный маркер,
используемый для идентификации продукта гетероплазматиче-
ского слияния, так как эффект индуктора не специфичен и
вызывает агрегацию и слияния протопластов одного и того же
вида и различных видов. Для идентификации гетероплазматиче-
ского продукта могут служить пластиды. Например, в случае
индуцируемого ПЭГ слияния протопластов сои и капусты гетеро-
карион получал хлоропласты от капусты и плотную цитоплазму
и неокрашенные пластиды от протопластов сои (К. К- Kartha
et al., 1974). При межродовом слиянии протопластов табака и
моркови как селективные маркеры использовались зеленые
хлоропласты табака и красные, содержащие антоциан, прото-
пласты моркови. Четко различимы были продукты слияния при
межвидовой гибридизации между протопластами двух видов
Torenia. Протопласты Т. fournieri, содержащие антоциан, комби-
нировались с протопластами Т. baillonii, содержащими только
хромопласты или только хлоропласты (I. Potrykus, 1971). Кроме
пластид могут быть использованы биохимические и’гк генетиче-
ские маркеры, такие, как изоэнзимный состав, структура
нуклеиновых кислот, устойчивость к наркотикам, число хромосом,
кариотипы.
Первое сообщение об успешном получении зрелого межвидо-
вого гибридного растения методом соматической гибридизации
было сделано П. Карлсоном с сотр. (Р. Carlson et al., 1972)
Были использованы протопласты двух видов табака: Nicotiana
glauca (2N = 24) и N. langsdorffii (2N=18). Идентификация
гетероплазматического продукта проводилась по способности
протопластов расти на среде Нагата и Такебе. Протопласты
N. glauca и N. langsdorffii хотя и образовывали клеточные
стенки, но не могли осуществить более чем одно деление, в то
время как протопласты амфидиплоидного гибрида повторно де-
лились и формировали каллусную массу. Другая характерная
черта этого гибридного каллуса — его способность активно расти
на среде без добавления гормонов, что дало возможность создать
второй способ селекции.
В этих опытах слияние протопластов N. glauca и N. lang-
sdorffii стимулировалось NaNO3(0,25 моль/л). После этапа сли-
яния популяция, содержащая протопласты обоих родителей и
гетерокарионы, платировалась на среду Нагата и Такебе. На ней
росли только гибридные клетки. Через 6 недель роста было
получено 33 каллуса. Они выращивались на среду без добавле-
ния гормонов. Каллус дифференцировал проростки. Далее было
получено гибридное растение, которое цвело. Растения сомати-
ческих гибридов были идентичны амфидиплоидным половым
гибридам по морфологии, числу хромосом, а также изоэнзим-
ному составу пероксидазы.
47
В успешной работе по созданию межвидового гибрида Petunia
на основе соматической гибридизации Д. Поува с сотр. (J. Po-
wer et al., 1976) использовал две селективные схемы. Первая
основана на различиях в условиях роста, необходимых прото-
пластам, и на неодинаковой чувствительности к антимицину D.
Во второй схеме для селекции гибридов была разработана
альбиносно-комплементарная методика, которая состояла в слия-
нии протопластов альбиносного Р. hybrida с . протопластами
из мезофилла листа Р. parodii. Отбирались зеленые формы как ре-
зультат комплементации и селективного роста. Полученные в итоге
растения классифицировались как соматический гибрид на осно-
ве изоэнзимных спектров пероксидазы, числа хромосом, цвета
венчика, величины и общей морфологии растения. При создании
соматического гибрида Daucus carota и D. capillifolius (D. Du-
dits et al., 1977) протопласты изолировались из культуры кле-
ток альбиносной моркови (£>. carota) и нормально зеленой
D. capillifolius. Слияние индуцировали ПЭГ. Главным признаком
для селекции соматического гибрида было восстановление фото-
синтетической функции.
В ряде случаев для гибридизации используются комплемен-
тарные хлорофиллдефицитные мутанты. Г. Мелхерс и Г. Лабиб
(1974) осуществили слияние протопластов двух хлорофилл-
дефицитных светочувствительных разновидностей N. tabacum
(гаплоид). Гибрид изолировали по чувствительности к высокой
интенсивности света и по нормальной окраске листьев.
Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глеба и К. М. Сытник использовали
пестролистный пластомный мутант табака сорта Самсун и ядер-
ный мутант серного табака сорта Дж. Вильямса. Мезофиль-
ные протопласты белых участков листа первого мутанта сли-
вали с протопластами сеянцев второго. Сеянцы были гомози-
готны по дефектному гену Su. Гибридные продукты восста-
навливали способность к фотосинтезу в результате ядерно-плас-
томной комплементации (Р. Г. Бутенко, 1979).
Г. Малхерс и др. (1978) получили регенерацию соматического
гибрида картофеля и томатов. Протопласты мезофилла Lyco-
persicon esculentum Mill var желто-зеленого мутанта и прото-
пласты, полученные из каллусной культуры диплоидного штамма
Solanum tuberosum L., сливали на первом этапе в присутствии
ПЭГ, а затем — ионов кальция в высокой концентрации. После
слияния протопласты делились, образовывали каллусные массы,
в некоторых из них формировались нормальные зеленые про-
ростки. Их. либо высаживали в почву, либо прививали на ствол
томата.
Исследователями предпринято много попыток парасексуаль-
ной гибридизации и в ряде случаев были получены гибридные
растения. Ю. Ю. Глеба и К. М. Сытник (1984) приводят под-
робный список внутривидовых и межвидовых соматических гиб-
ридов, а также примеры гибридов межродовых и межсемейст-
венных.
48
§ 5. Перенос клеточных органелл
Протопласты — очень подвижные, лабильные образования,
поэтому они стали использоваться для введения в клетку чуже-
родного материала не только методом соматической гибриди-
зации через слияние целых протопластов, но и введением в них
ДНК или органелл других клеток. Однако работы в этом направ-
лении находятся на начальном этапе развития. Тем не менее
поглощение экзогенной ДНК отмечено для протопластов петуньи,
сои, моркови (К. Ohyama et al., 1972; D. Hess et al., 1973;
F. Hoffmann, D. Hess, 1977; P. Г. Бутенко, 1979). Кроме погло-
щения нуклеиновых кислот используется метод генетических ма-
нипуляций — перенос клеточных органелл. Так, И. Потрикус и
Ф. Хоффманн (I. Potrycus, F. Hoffmann, 1973) успешно транс-
плантировали изолированные ядра Р. hybrida в протопласты
Р. hybrida, N. glauca. Ядра изолировали также из протопластов.
Их окрашивали флуоресцирующим красителем. Транспланта-
цию проводили в условиях слабого деплазмолиза протопластов,
используя центрифугирование для слияния клеточных компонен-
тов и обработку лизоцимом, обладающим модифицирующим
действием на мембрану. Свежеприготовленные протопласты сус-
пендировались в изотоническом растворе маннита. Концентрация
протопластов 10е на I мл-1. Изолированные и окрашенные ядра
инкубировались в течение 1 ч в 0,3%-ном растворе лизоцима
в манните при pH 5,8. Раствор делается несколько гипотоничным
по отношению к протопластам. Далее осуществляли попере-
менное осаждение центрифугированием протопластов и ядер.
В результате в центрифужных пробирках формировалось не-
сколько чередующихся слоев. Затем центрифужную пробирку
заполняли маннитом без лизоцима, центрифугировали 30 мин
при 140g и оставляли на 2 ч при температуре 4°С. После этого
осадок ресуспендировали и просматривали под микроскопом.
Ядра, идентифицированные по флуоресценции, обнаруживались
и внутри цитоплазмы, и в вакуоле (рис. 19).
Чтобы изучить судьбу ядер после поглощения, использовали
очень результативную модельную систему — две светочувстви-
тельные комплементарные мутантные линии N. tabacum'. зеленею-
щую и сублетальную. Гены, ответ-
ственные за светочувствитель-
ность в этой системе, являются
ядерными генами. Это создает
систему для скрининга соматиче-
ских гибридов. У растений обоих
видов изолировали протопласты и
выделяли ядра. Изолированные
ядра одной мутантной линии вво-
дили в протопласты другой. Про-
топласты после введения в НИХ пласт клеток высших растений (по
ядер переносились В культуру. I. Potrykus, F. Hoffmann, 1973)
49
Начальное культивирование проводилось при низкой интенсив-
ности света. В этот период происходило деление и образование
клеточных группировок обоих мутантов и гибридных протоплас-
тов. Каллусы, которые при этом развивались, подвергались
селективному воздействию света высокой интенсивности. Толь-
ко гибридные клетки и каллусы, образовавшиеся из них, оказа-
лись устойчивыми к условиям высокой освещенности. Эти ре-
зультаты убедительно свидетельствуют о том, что путем погло-
щения ядра между двумя светочувствительными мутантами
образовались гибридные формы клеток (I. Potrykus et al., 1977).
Однако поглощение ядра не всегда приводит к образованию
гибрида. Так, X. Биндинг (1976) наблюдал проникновение ядер
Petunia в протопласты табака. Но в молодых регенерантах во
время митоза хромосомы Petunia не были обнаружены. Это
может свидетельствовать о потере в клеточном цикле интеграции
между чужеродным ядром и ядром хозяина.
Помимо ядра показана возможность трансплантации хлоро-
пластов. Хлоропласты относятся к группе органелл, которые
имеют собственный генетический материал (ДНК) и рибосомы.
Это ставит их в клетке в положение относительной независи-
мости от ядра и позволяет осуществлять собственный синтез
белков. Этим они отличаются от органелл эндомембранной
системы, таких, как аппарат Гольджи или эндоплазматический
ретикулум. Хлоропласты являются полуавтономными структура-
ми клетки, они могут делиться самостоятельно, независимо от
деления самой клетки. Автономность и самостоятельность хло-
ропластов подтверждается опытами по трансплантации хлоро-
пластов высших растений и водорослей в цитоплазму животных
клеток. Даже в этом случае наблюдается нормальное деление
хлоропластов. И. Потрикус (1979) предложил два метода погло-
щения протопластами этих органелл. Была показана возмож-
ность использования такой же методики, как и для трансплан-
тации ядер, т. е. последовательного центрифугирования прото-
пластов и пластид в 0,03%-ном лизоциме. Кроме того, была
продемонстрирована еще одна возможность введения хлороплас-
тов в протопласт. В этом случае изолированные одиночные
клетки инкубировали с целлюлазой, а затем, когда появлялись
первые протопласты, клетки переносили в суспензию хлороплас-
тов в 2%-ном растворе целлюлазы и 0,2 М растворе NaNOa при
pH 5,4. Инкубация проводилась 15—30 мин на роторе с малой
скоростью вращения. Когда примерно все клетки образовывали
протопласты, суспензию отмывали от хлоропластов, и протопла-
сты просматривали под микроскопом. В случае использования
первой методики и для ядер, и для хлоропластов примерно у
0,5% протопластов обнаруживались чужеродные органеллы в
цитоплазме. Второй метод давал лучшие результаты.
Существенным моментом, свидетельствующим о дальнейшем
развитии в этой экспериментальной области, было успешное
включение в протопласты функционально активных хлоропластов
50
и получение целых растений, содержащих хлоропласты чужого
организма. Эти опыты выполнены П. Карлсоном. Он инкубировал
протопласты из пестролистного мутанта N. tabacum с хлоропласта-
ми зеленого N. suaveolens. В результате культивирования таких
протопластов образовывались зеленые каллусы. Из каллуса было
регенирировано растение. Оно оказалось пестролистным. У расте-
ния-регенеранта анализировалась белковая фракция I, в которую
входит рибулозодифосфаткарбоксилаза (РДФ-карбоксилаза) —
главный растворимый белок хлоропластов. РДФ-карбоксилаза —
ключевой фермент цикла Кальвина. Она состоит из двух типов субъ-
единиц, больших и малых. Большие субъединицы синтезируются
рибосомами хлоропласта при участии генома хлоропластов.
Малые субъединицы собираются на рибосомах цитоплазмы, ко-
дируются ядерными генами. Анализ состава белковой фракции
I растения-регенеранта показал присутствие полипептидов,
характерных для пластид N. tabacum и N. suaveolens.
Эти работы приводят авторов к заключению, что перенос
хлоропластов может использоваться для выведения новых форм
хозяйственно важных сортов растений. Включение, например,
высокоэффективных хлоропластов может способствовать актива-
ции фотосинтеза и повышению продуктивности растения.
Таким образом, техника культуры клеток растений сформиро-
вала методы, используя которые, оказывается возможным полу-
чить своеобразный тип «разборки» клетки. На базе его может
быть осуществлено конструирование клеток с новыми свойства-
ми. Этот метод биологического конструирования на уровне
клетки может оказаться очень полезным и перспективным для
создания клеток, клеточных систем и целых растений, адекват-
ных хозяйственным потребностям человека.
Глава
СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ
АССОЦИАЦИЙ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ВЬСШИХ РАСТЕНИЙ
С МИКРООРГАНИЗМАМИ
$ 1. Искусственные ассоциации с микроорганизмами
как способ модификации
растительной клетки и растения
В последние 15 лет в области клеточной инженерии расти-
тельной клетки выделилось направление по созданию новых кле-
ток и клеточных систем путем введения микроорганизмов в клет-
ку или в популяции культивируемых клеток растений. Экспери-
ментально создаваемые клеточные системы называют ассоциа-
циями по аналогии с ассоциациями, формирующимися в природе
между организмами разных видов. При этом исследования на-
правлены на получение ассоциаций внутриклеточного (эндосим-
биотического) или межклеточного (экзосимбиотического) типа.
В первом случае проводят индуцированное введение микроорга-
низмов в изолированные протопласты высших растений. Во
втором — совместно культивируют клетки или ткани растений
с микроорганизмами. Хотя, как будет видно при дальнейшем
изложении, исходно задаваемая в эксперименте локализация
микроорганизмов — внутри клеток или в межклетниках тканей —
не всегда сохраняется в процессе создания и культивирования
таких систем.
При получении ассоциаций на основе изолированных прото-
пластов или культивируемых клеток высших растений с микро-
организмами предполагается, что клетки или популяции клеток
растений должны приобретать новые свойства, обусловленные
присутствием в них клеток микроорганизмов. Возможность полу-
чения из изолированного протопласта клетки, если она сохра-
нится у протопластов и после введения в них микроорганизмов,
создает предпосылку для модификации клеток. Совместное куль-
тивирование растительных клеток и микроорганизмов позволило
бы получать популяции растительных клеток с новыми свойства-
ми, приобретенными в результате их взаимодействия с клетками
микроорганизмов. И наконец, способность растительной клетки
in vitro дать начало целому растению открывает возможность
направленного изменения растений. Очевидно, последнее осуще-
ствимо при условии, что микроорганизмы, введенные внутрь
52
клеток или в популяции клеток, сохранятся и в растениях, реге-
нерированных из таких клеток.
Цели создания ассоциаций. Искусственные ассоциации клеток
высших растений и микроорганизмов могут быть использованы
для решения следующих фундаментальных научных проблем и
практических задач.
1. Экспериментальная проверка теории эндосимбиотического
происхождения эукариотной клетки, которое происходило, как
полагают, через стадию экзосимбиоза.
2. Реконструирование отдельных стадий эволюционного про-
цесса симбиогенеза. Возникновение ныне существующих симбио-
зов высших растений с микроорганизмами произошло в резуль-
тате длительного и сложного эволюционного процесса. Воспро-
изведение природных симбиозов в лаборатории позволило бы
понять механизмы возникновения и условия для формирования
их заново в природе.
3. Моделирование и изучение на клеточном уровне природных
симбиотических отношений (например, бобовых растений с клу-
беньковыми бактериями), имеющих большое практическое зна-
чение в обеспечении растений связанным азотом в природных
экосистемах и в агрофитоценозах.
4. Повышение продуктивности растительной клетки при выра-
щивании в культуре.
5. Улучшение экономически важных видов растений.
Остановимся более подробно на возможности применения
в биотехнологии искусственных ассоциаций с микроорганизмами,
получаемых на основе культур растительных клеток или регене-
рированных из них растений.
Повышение продуктивности культур растительных клеток.
Растительные клетки в культуре проводят биосинтез (или био-
трансформацию) важных для медицины и ряда отраслей про-
мышленности веществ. Одним из требований рентабельности
производства на основе растительных клеток является возмож-
ность культивирования на простых по составу питательных сре-
дах. Между тем культуры растительных клеток требуют при-
сутствия в среде витаминов, фитогормонов, аминокислот, саха-
розы и других веществ (см. гл. 1).
Серьезным ограничением практического использования куль-
тур растительных клеток является энергетическое обеспечение
процессов биосинтеза. Растительные клетки в культурах гете-
ротрофны или обладают ограниченной способностью к фотосин-
тезу. Представляется маловероятным совместить в культивируе-
мой клетке способность к собственному фотосинтезу и биосин-
тезу видоспецифических продуктов (Р. Г. Бутенко, 1978). Одним
из решений данной проблемы могло бы быть введение в эти
культуры микроорганизмов, синтезирующих субстраты для роста
растительных клеток или предшественники для биосинтеза.
Особое значение при этом, очевидно, имеет введение в гетеротроф-
но растущие клетки или культуры клеток растений фототроф-
53
ных микроорганизмов. Последние могли бы обеспечить расти-
тельные клетки продуктами фотосинтетической фиксации углеро-
да, что позволило бы упростить состав среды.
В литературе отмечается недостаточное использование в био-
технологии принципов организации природных биологических
систем, в частности, основанных на взаимоотношениях организ-
мов разных видов. В микробиологии уже накоплен положитель-
ный опыт смешанного культивирования. В результате изучения
смешанных культур микроорганизмов (выделенных из природы
или созданных искусственно) выяснилось, что можно проводить
более эффективно (по сравнению с монокультурами) накопление
биомассы, кооперативный биосинтез конечных продуктов или
трансформацию в нужном направлении исходного субстрата.
Такие системы находят все большее применение в микробиоло-
гической промышленности и могут быть использованы для
очистки сточных вод, биосинтеза белка (ферментов) и биологи-
чески активных веществ, таких, как ауксины, витамины, антибио-
тики (Н. С. Егоров и др., 1982). Считается, что в биотехнологии
найдут применение смешанные популяции, разнообразные по
своему составу, начиная от комбинаций нескольких штаммов
одного вида микроорганизма и кончая сочетаниями представи-
телей разных царств — животного и растительного (А. А. Во-
робьев, В. И. Коровкин, 1983).
Улучшение сельскохозяйственных растений. Другая возмож-
ность использования в биотехнологии ассоциаций клеток высших
растений с микроорганизмами состоит в получении растений,
способных к фиксации молекулярного азота. Повышение уро-
жайности сельскохозяйственных растений в значительной степе-
ни зависит от обеспечения их связанным азотом. Растения по-
лучают его двумя путями. Один из них — потребление внесенных
в почву химических азотных удобрений, на получение которых
затрачивается огромная энергия. Растения же используют азот-
ные удобрения частично — от 30 до 50% вносимого количества.
Продукты разложения азотных удобрений в почве образуют
токсичные соединения, загрязняющие окружающую среду.
Другим источником является биологическая фиксация моле-
кулярного азота, которую осуществляют многие группы микро-
организмов. Она безвредна для человека и окружающей среды
(в том объеме, в котором она осуществляется в агрофитоце-
нозах и в естественных экосистемах). Большая часть азота в
природе фиксируется симбиотическими азотфиксаторами. Они
используют продукты фотосинтеза макросимбионта для покрытия
энергетических затрат на фиксацию азота и передают связанный
азот растению. Способность формировать азотфиксирующие
симбиозы, однако, приобрели в процессе эволюции только опре-
деленные виды растений и микроорганизмов.
Все это обусловило интерес исследователей к разработке
проблемы повышения доли биологического азота в питании
растений. Практика сельскохозяйственного производства поста-
54
вила вопрос придания способности к азотфиксации экономи-
чески важным видам растений, которым это не свойственно.
В решении этой задачи предлагаются разные подходы.
Растения искусственно инокулируют азотфиксирующими бак-
териями путем введения микроорганизмов в почву и ризосферу.
Однако получаемый при этом эффект повышения урожая расте-
ний во многих случаях связан не с фиксацией бактериями азота,
а с увеличением под влиянием бактерий числа корней и в резуль-
тате более активным поглощением растениями ионов и воды.
Кроме того, отмечается низкая выживаемость и вытеснение
интродуцируемых чистых культур микроорганизмов естественной
почвенной микрофлорой. Поэтому этот подход представляется
бесперспективным.
Другой способ — применение методов генетической инжене-
рии для создания растений, способных к азотфиксации. Пред-
лагается переносить гены азотфиксации (ntf-гены) от микро-
организмов, фиксирующих азот, непосредственно в злаковые
или другие экономически важные виды растений. По мне-
нию специалистов, эта процедура методически вполне осуще-
ствима; nif-ген может быть введен в протопласты растений с
помощью определенных векторов (таких, как плазмиды бакте-
рий, патогенных для растений, или вирусы растений). Последую-
щее культивирование протопластов и их регенерация до целых
растений позволили бы получить особи, которые несли бы введен-
ную генетическую информацию в своих клетках и, возможно,
в последующих поколениях благодаря передаче через семена.
Однако, несмотря на принципиальную возможность примене-
ния такого подхода, привлечение методов генетической инжене-
рии вряд ли позволит в ближайшее время перейти к задаче
создания азотфиксирующих растений. Основные сложности со-
стоят в следующем: требуется разработка методов введения
ra'f-генов в растительную клетку, их репликации и экспрессии
там; у высших растений отсутствуют системы, которые осуществ-
ляли бы энергообеспечение фермента азотфиксации — нитроге-
назы (процесс азотфиксации связан с затратой большого коли-
чества клеточной энергии); растительная клетка не обладает
соответствующими системами транспорта и запасания в высокой
концентрации ионов железа и молибдена, необходимых для син-
теза нитрогеназы; наконец, она не имеет системы защиты нитро-
геназы от инактивации кислородом. Последнее обстоятельство
считают главным лимитирующим фактором в экспрессии nif-re-
нов при введении их в аэробные организмы.
Ограничения указанных двух подходов по приданию расте-
ниям способности к фиксации молекулярного азота могут быть
хотя бы частично преодолены при введении целых клеток азот-
фиксирующих микроорганизмов в растение. Речь идет об аль-
тернативном способе решения обсуждаемой проблемы, связанном с
конструированием новых искусственных ассоциаций. Такие системы
должны быть основаны на симбиотических взаимоотношениях расти-
55
тельного и микробного партнеров. В этих экспериментах должны
учитываться особенности организации природных азотфиксирую-
щих симбиозов, а именно: 1) сохранение целостности обоих
партнеров; 2) интеграция партнеров в пределах организма мак-
росимбионта; 3) относительная обособленность микросимбионта,
компартментация его в специальных структурах (например,
локализация клубеньковых бактерий в клубеньках у бобовых
растений, цианобактерии Anabaena azollae — в полости листа
папоротника Azolla). Азотфиксация в таких искусственно созда-
ваемых системах осуществлялась бы за счет функционирования
азотфиксирующих микроорганизмов в клетках или тканях рас-
тений.
Достижение этой цели возможно с использованием техники
клеточной инженерии. Введение азотфиксирующих бактерий в
клетки или популяции культивируемых клеток небобовых рас-
тений позволяет испытать большое число сочетаний партнеров
и выбрать устойчивые ассоциации на уровне культивируемых
клеток. В процессе культивирования возможна адаптация парт-
неров к совместному существованию, аналогичная тем изменени-
ям, которые приобретают компоненты природных симбиотических
ассоциаций по сравнению со свободноживущими формами.
Последующее получение растения в результате индукции орга-
ногенеза при условии сохранения клеточных взаимодействий,
складывающихся в клеточных системах, позволило бы решать
поставленную задачу — инкорпорирования бактериального сим-
бионта в ткани (клетки) растения, интеграции их в клеточные
ансамбли хозяина при сохранении интактности вводимого сим-
бионта.
Очевидны преимущества введения в клетки и ткани растений
целых клеток азотфиксаторов. Защита нитрогеназы от кислорода,
выделяемого растением и необходимого для его роста, в таком
случае будет осуществляться с помощью механизмов, которыми
обладают бактериальные клетки. Особого внимания заслуживает
использование в экспериментах азотфиксаторов, способных к
фотосинтезу. Такие организмы могли бы обеспечить нитрогеназу
энергией, получаемой в процессе собственного фотосинтеза.
В случае применения гетеротрофных азотфиксаторов остро стоит
вопрос о том, сможет ли растение в ассоциации с бактериями
образовать достаточное количество продуктов фотосинтеза,
чтобы обеспечить энергетические потребности нитрогеназы
симбионта без ущерба для своего роста и ухудшения потреби-
тельских качеств растения (по содержанию углеводов, белка
и т. д.).
Перечисленные возможности решения проблемы биологиче-
ского азота пока имеют теоретическое значение. Они должны
еще получить оценку с точки зрения экономической эффектив-
ности. Более того, требуется научное прогнозирование экологи-
ческих последствий усиления на Земле азотфиксации, которое
может привести к нежелательным для жизни сдвигам в азотном
56
балансе биосферы (пример тому — своевременно не предугаданное
возрастание СОг в атмосфере, вызванное исключительно антропо-
генными факторами — производственной деятельностью человека).
$ 2. Введение микроорганизмов
в изолированные протопласты растений
Партнеры создаваемых ассоциаций. С целью получения
ассоциаций внутриклеточного типа предпринимались неоднократ-
ные попытки вводить микроорганизмы в изолированные прото-
пласты разных видов высших растений (табл. 4), среди которых
представлены злаковые и другие сельскохозяйственные культуры,
не имеющие естественных симбионтов. Протопласты выделяют
из тканей растений или клеток суспензионных культур фермен-
тативным способом (см. гл. 2).
В изолированные протопласты растений вводили микроорга-
низмы разных систематических групп: бактерии, дрожжи, циано-
бактерии (прежнее их название — синезеленые водоросли), орга-
неллы (называемые цианеллами) водоросли Glaucocystis nos-
tochinearum и криптомонадоподобного простейшего Cyanopho-
ra paradoxa. Цианеллы представляют собой эндосимбиотические
цианобактерии с отсутствующей или редуцированной клеточной
стенкой. Используемые в экспериментах микроорганизмы отлича-
лись своими метаболическими возможностями. Зеленые водо-
росли, все цианобактерии и цианеллы осуществляют фотосинтез;
Таблица 4. Использование изолированных протопластов для получения
ассоциаций с микроорганизмами
Источник протопластов Внд микроорганизма Литературный источник
Горох Rhizobium leguminosarum М. Davey, Е. Cocking, 1972 М. Davey, J. Power, 1975
Виноград дикий Дрожжи (клетки, прото- пласты), цианобактерия Апа- cystis nidulans
Кукуруза, табак Цианобактерия Gloeocapsa A. Burgoon, Р. Bottino, 1976; 1977
Просо, сорго Azospirillum brasilense I. Vasil et al., 1977
Ячмень, табак Цианеллы из Cyanophora paradoxa, цианобактерии Nos- toc macrozamia, Gloeocapsa B. Hughes et al., 1978
Табак Цианобактерия Anabaena variabilis J. Meeks et al., 1978
Лук, морковь Цианеллы из Glaucocystis nostochinearum P. Bradley, 1979; 1984
Лук Одноклеточная цианобакте- рия P. Bradley, A. Leith, 1979
Морковь Зеленая водоросль Chlamy- domonas reinhardii (мутант без клеточной стенки) L. Fowke et aL, 1979
Морковь Зеленая водоросль Stigeo- clonium (протопласты) L. Fowke et al., 1981
57
Рис. 20. Введение микроорганизмов в изолиро-
ванные протопласты высших растений (по
L. Fowke, О. Gamborg, 1981): а—поглощение
путем инвагинации мембраны (эндоцитоз); б —
слияние мембран; в — слияние мембраны прото-
пласта с липосомой
бактерии R. legutninosarutn, A. brasilense, цианобактерии Gloeo-
capsa, A. variabilis и /V. macrozamia — азотфиксаторы. Циано-
бактерия A. variabilis — факультативный фототроф и способна
к гетеротрофному росту в темноте. Наряду с диким
штаммом в протопласты вводили также ауксотрофные мутанты
A.variabilis, испытывающие потребность в определенных факто-
рах роста, которые они могли бы получать от растительной
клетки. Такой прием применяют с целью установления возмож-
ной зависимости эндосимбионта от роста и метаболизма клетки
хозяина.
Механизмы проникновения микроорганизмов в протоплас-
ты. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты
растений проводят при воздействии на иих специальными инду-
цирующими факторами. Микроорганизмы могут поглощаться
протопластами или сливаться с ними. Протопласты гороха погло-
щали клетки Rhizobiutn непосредственно в процессе ферментатив-
ного разрушения клеточных стенок клеток мезофилла листа при
получении изолированных протопластов. Во всех остальных
случаях в качестве индуктора поглощения или слияния применя-
ли полиэтилеигликоль (ПЭГ), который известен как агент, по-
вышающий частоту слияния протопластов высших растений
(см. гл. 2).
Поглощение растительными протопластами микроорганизмов
(кроме зеленых водорослей) может происходить путем эндо-
58
цитоза, т. е. с помощью инвагинации плазмалеммы (рис. 20).
При действии ПЭГ микроорганизмы прикрепляются к плазмалем-
ме, образуется инвагинация плазмалеммы вокруг микроорга-
низма с последующим замыканием конца инвагинации путем
слияния плазмалеммы. В результате образования таким образом
везикула с микроорганизмом высвобождается в цитоплазму
протопласта.
Слияние зеленых водорослей (протопластов и мутанта без
клеточной стенки) с протопластами моркови индуцируется ПЭГ
(рис. 20) по аналогии со слиянием протопластов высших расте-
ний (см. гл. 2). В этом случае происходит интеграция цитоплаз-
матических мембран растительных протопластов и водорослей, а
органеллы водорослей высвобождаются в цитоплазму прото-
пластов, но не окружаются плазмалеммой протопласта.
В связи с проблемой сохранения интактности вводимых
в протопласты органелл или микроорганизмов тот и другой спосо-
бы имеют свои недостатки. Поглощение путем эндоцитоза приво-
дит к изолированию вводимых в протопласт объектов в вези-
кулах из плазмалеммы протопласта. Поскольку эти везикулы
могут сливаться с лизосомальным аппаратом растительного
протопласта, существует опасность, что это приведет к разру-
шению вводимого чужеродного материала. При слиянии происхо-
дит интеграция мембраны протопласта растения и микроорганиз-
ма, нарушение целостности микроорганизма и освобождение его
органелл внутрь растительного протопласта. Обнаруженное для
зеленых водорослей слияние с протопластами может рассматри-
ваться, таким образом, как способ введения в растительную
клетку не целых микроорганизмов, а интактных органелл. В каче-
стве альтернативного пути, позволяющего преодолеть недостатки
обоих рассматриваемых способов, предлагается заключать мик-
роорганизмы в искусственные мембраны — липосомы (рис. 20).
Этот прием уже был использован в опытах по введению в прото-
пласты лука одноклеточных цианобактерий, заключенных в липид-
ные капли. Преимущества данного методического приема видятся
в том, что искусственные мембраны будут сливаться с плазмалем-
мой протопласта, освобождая таким образом интактные клетки
микроорганизмов в цитоплазму протопласта.
Помимо использования ПЭГ в качестве индуктора поглоще-
ния протопластами микроорганизмов, можно отметить успешное
применение в этих целях поливинилового спирта (ПВС), кото-
рый также известен как индуктор слияния протопластов (см.
гл. 2). При воздействии ПВС протопласты Vinca rosea поглоща-
ли сферопласты Agrobacterium tumefaciens (S. Hasezama et al.,
1983), клетки и сферопласты Escherichia coli (C. Matsui et al.,
1983) в экспериментах, проводимых с целью генетической транс-
формации протопластов (по этой причине данные работы не были
введены в табл. 4). В этих опытах ПВС не оказывал токси-
ческого эффекта на протопласты, который был отмечен в сравни-
тельных опытах с использованием ПЭГ. Высказывается также
59
предположение о возможности введения клеток азотфиксаторов
в изолированные протопласты растений при индукции поглоще-
ния с помощью электрического поля. Этот метод, также успешно
применяемый для слияния растительных протопластов (см.
гл. 2), имеет то преимущество, что не оказывает сильного
повреждающего воздействия на протопласты по сравнению с
другими индукторами слияния.
Характеристика продуктов поглощения и слияния. Системы,
полученные путем поглощения протопластами микроорганизмов
или слияния с ними, обладали ограниченной способностью к выжи-
ванию или культивированию. В протопластах кукурузы обнаруже-
но быстрое движение цитоплазмы через 14 ч после поглощения ими
клеток цианобактерии, что служит признаком их жизнеспособно-
сти. В некоторых случаях протопласты, содержащие клетки или
органеллы микроорганизмов, в процессе культивирования регене-
рировали клеточные стенки, и только в случае поглощения орга-
нелл С. reinhardii были способны к последующему делению.
Клетки табака с внутриклеточной A. variabilis никогда не дели-
лись и через 5 сут культивирования разрушались.
Есть отдельные данные о сохранении интактности клеток и
органелл микроорганизмов внутри протопластов. В протопластах
гороха в везикулах наблюдали делящиеся клетки Rhizobium,
однако осталось неясным, начали они деление до или после по-
глощения их протопластом. Морфология бактерий свидетельст-
вует об их интактном состоянии. Не происходило деления циано-
бактерии A. variabilis в протопластах табака в процессе их куль-
тивирования, хотя цианобактерии сохраняли видимую интакт-
ность. Ни один из акусотрофных мутантов этой цианобактерии
не имел преимуществ в формировании внутриклеточных систем,
гибель которых происходила с той же скоростью, что и систем,
образуемых с диким штаммом. Органеллы зеленых водорослей
в растительных протопластах в процессе культивирования дегра-
дировали, и только хлоропласты обнаруживались в цитоплазме
клеток моркови через 10 сут.
Не предпринималось, к сожалению, систематических наблюде-
ний за фотосинтетической и азотфиксирующей активностью вве-
денных в протопласты органелл и микроорганизмов. Когда был
проведен контроль за фотосинтезом изолированных цианелл,
выявилась непригодность их к использованию в качестве эндо-
симбионтов в искусственных ассоциациях. Это связано с почти
полной утратой способности к фиксации СОг, которая в изоли-
рованных цианеллах составляли лишь 5% от активности при на-
хождении их в клетке хозяина в природном симбиозе, и неспособ-
ностью к делению экспериментальных клеток, содержащих циа-
неллы (Р. Bradley, 1984). Неудачной оказалась попытка селек-
ции азотфиксирующих ассоциаций, которые могли бы функцио-
нировать за счет азотфиксации цианобактерии A. variabilis в
протопластах табака при культивировании их в среде без свя-
занного азота.
60
Таким образом, жизнеспособных внутриклеточных ассоциаций
с микроорганизмами на основе изолированных протопластов
получено не было. Для успешного продолжения работ этого на-
правления требуется: подбор совместимых сочетаний партнеров;
выбор адекватного способа введения микроорганизма в прото-
пласт; подбор щадящих условий индукции поглощения (слия-
ния) ; отработка условий культивирования получаемых про-
дуктов.
$ 3. Введение микроорганизмов в популяции
культивируемых клеток растений
Партнеры ассоциаций и принципы их создания. При получении
ассоциаций на основе культивируемых клеток и тканей исполь-
зуется разнообразный видовой набор растительных объектов и
микроорганизмов (табл. 5). Культуры клеток (тканей) получали
из бобовых, злаковых, овощных и других экономически важных
растений, в том числе — продуцентов природных веществ. Мик-
роорганизмы представлены в основном азотфиксирующими фор-
мами, среди которых симбиотические (клубеньковые) и свободно-
живущие (Azotobacter, Azospirillum) бактерии, а также несим-
биотические цианобактерии. Кроме того, для получения ассоциа-
ций с каллусными культурами использовали зеленую водоросль
Chlorella и разные виды грибов.
Цели создания ассоциаций с отдельными микроорганизмами
существенно различаются так же, как и критерии, на основе ко-
торых оценивается возникновение ассоциативных взаимодействий
в системах. Общим принципом для создания ассоциаций являет-
ся совместное культивирование клеток и каллусных тканей рас-
тений с микроорганизмами. При этом способы введения микро-
организмов в систему для совместного выращивания могут быть
разными: внесение клеток микроорганизмов непосредственно в
каллусную или суспензионную культуру растения (смешанные
культуры); высев на поверхность агаризованной среды рядом
с каллусом таким образом, чтобы рост микроорганизмов проис-
ходил без соприкосновения (совместные культуры); разделение
бактериальных клеток и клеток суспензионной или каллусной
культуры специальными фильтрами (мембранами), обеспечива-
ющими обмен продуктами метаболизма, но не допускающими
контактов между клетками партнеров.
Ассоциации с клубеньковыми бактериями. Основная задача
при получении ассоциаций с клубеньковыми бактериями перво-
начально состояла в создании упрощенных модельных систем
для изучения симбиотических взаимоотношений бобового расте-
ния с клубеньковыми бактериями.
Впервые каллусная ткань сои (табл. 5) была инфицирована
клетками Rhizobium, вызывающими лигнификацию и дифферен-
цировку растительных клеток. Позже (в 1971 г.) была получена
ассоциация, в которой клубеньковые бактерии формировали
61
Таблица 5. Искусственные ассоциацнн культивируемых тканей н клеток
высшнх растений с микроорганизмами
Культура ткани или клеток растения Вид микроорганизма Литературный источник
Соя Фасоль Люцерна и др. бобовые (горох, донник, люпин, ви- ка, клевер и др.) Костер, пшени- ца, рапс Табак Табак, пшеница и др. небобовые (морковь, петунья, портулак, солерос) Rhizobium I. Velikv, T. LaRue, 1967 R. Holsten et al., 1971 P. Арутюнян и др., 1976 Г. Хайлова и др., 1977
Rhizobium J. Child, 1975 W. Scowcroft, A. Gibson, 1975 Г. Юркова и др., 1976
Морковь Azotobacler vinelandii Р. Carlson, R. Chaleff, 1974
Сахарный трост- ник Azospirillum brasilense I. Vasil et al., 1977 R. Berg et al., 1979, 1980 V. Vasil et al., 1979 1. Vasil et al., 1980
Люцерна, кле- вер, морковь, та- бак, пшеница, рис и др. Azospirillum J. Child, W. Kurz, 1978 W. Kurz, J. Child. 1978
Морковь Chlorella цианобактерии: Plectonema boryanum Anabaena flos-aquae P. Bradley. 1980. 1983 P. Bradley, 1983
Табак Цианобактерии Nostoc, Anabaena В. А. Труханов и др., 1983; V. Kordvurn et al., 1984
Рута Грибы: Rhodotorula rubra Botrytis allii Cochliobolus lunatis и др. B. Wolters. U. Eilert. 1982
подобие инфекционных нитей и бактероиды в каллусных клет-
ках сои. Цитологическое изучение показало сходство процессов
инфицирования в искусственной ассоциации и при формировании
корневого клубенька в целом растении. Бактерии инфицировали
до 10% клеток каллуса, обнаруживаясь в цитоплазме в везику-
лах, образованных, очевидно, плазмалеммой растительной клет-
ки. В клетке они размножались, заполняя цитоплазму и образуя
бактероиды, как и в клубеньке растения. В ассоциации с кал-
лусными клетками клубеньковые бактерии проявляли нитроге-
назную активность* (НГА), которая отсутствует у них в чистой
1 Для определения НГА обычно используют ацетиленовый метод, который
основан на способности нитрогеназы восстанавливать, помимо молекулярного
азота, ряд других соединений, в том числе ацетилен с образованием этилена.
62
культуре. Это свидетельствует об азотфиксации клубеньковы-
ми бактериями в ассоциациях с каллусными клетками, которая
составляла 1 % от активности азотфиксации в клубеньках рас-
тения.
В последующих исследованиях была подтверждена индукция
НГА у клубеньковых бактерий культурами клеток (тканей) бобо-
вых растений. Существенными для понимания взаимодействия
макро- и микроорганизма в природных симбиозах бобовых ока-
зались сообщения об индукции НГА у Rhizobium тканевыми
культурами небобовых растений — костра, пшеницы, рапса, та-
бака и других видов.
Критерием образования ассоциаций клубеньковых бактерий
с культурами клеток и тканей бобовых и небобовых растений
служила индукция растительным партнером НГА у клубеньковых
бактерий, отсутствующая в чистых культурах. Для проявления
этого эффекта не имело значения, происходили культивируемые
клетки из корней или других органов растения. Причем этот
эффект вызывался у Rhizobium присутствием либо раститель-
ных клеток, либо образуемых ими метаболитов. Последнее об-
стоятельство было выяснено при культивировании Rhizobium вне
контакта с растительными клетками, для чего проводили отделе-
ние их друг от друга в процессе культивирования специальными
фильтрами (мембранами). В этих экспериментах было показано
индуцирующее действие кондиционированной растительными
клетками среды на проявление НГА у Rhizobium. Таким образом
было выявлено, что для индукции НГА необходимы факторы, вы-
деляющиеся клетками как бобовых, так и небобовых растений.
Создание азотфиксирующих ассоциаций Rhizobium с культу-
рами тканей (клеток) небобовых растений послужило толчком
к изучению фиксации азота клубеньковыми бактериями в чистых
культурах. Оказалось возможным вызывать у них азотфиксацию
добавлением в среду некоторых химических веществ, в резуль-
тате чего были получены экспериментальные доказательства ло-
кализации генов азотфиксации в клетках Rhizobium.
В ассоциациях с растительными клетками и тканями происхо-
дит интенсивное размножение бактериальных клеток (при отсут-
ствии размножения в чистых культурах на тех же средах). При
этом сильный рост Rhizobium связан не с наличием живых клеток
растений, а с их метаболитами. Клубеньковые бактерии локализу-
ются, как правило, на поверхности растительных клеток, прони-
кают в глубь каллуса по межклетникам и не попадают в здоро-
вые, интактные клетки. Однако в некоторых случаях они обнару-
живаются внутри растительных клеток. Полагают, что проникно-
вение бактерий в растительные клетки может происходить в ре-
зультате индукции клетками Rhizobium целлюлазной активности
у растительных клеток, что было обнаружено в экспериментах
с клетками сои (Т. Ozawa, М. Yamaguchi, 1980). Это приводит
к частичной деградации микрофибрилл целлюлозы клеточных
стенок растительных клеток, что, возможно, и обеспечивает про-
63
никновение бактериальных клеток в цитоплазму растительной
клетки.
Клубеньковые бактерии сохраняют палочковидную форму как
внутри растительных клеток, так и в межклетниках тканей, но в
некоторых случаях отмечали переход их в бактероидную форму,
характерную для клубеньков растения, при локализации их в
искусственных ассоциациях как внутри клеток, так и на их по-
верхности.
Бактериальные клетки, как правило, угнетали рост культиви-
руемых клеток и тканей растений и усиливали их отмирание. Инги-
бирующее действие клубеньковых бактерий связывают с накоп-
лением в среде продуцируемых ими гормонов в супероптималь-
ных концентрациях (Г. Н. Хайлова, 1983). Однако была обнару-
жена (J. Child, Т. J. La Rue, 1974) стимуляция роста каллуса
сои, которая не зависела от проявления бактериями НГА при
совместном росте с каллусом, т. е. она не была связана с бакте-
риальной азотфиксацией. Это явление объясняют влиянием цито-
кининов, которые образуют бактерии. Есть единичные сообщения
о положительном влиянии или об отсутствии повреждающего
действия клубеньковых бактерий на растительные клетки in vitro.
Так, показано (с помощью меченого азота) потребление каллус-
ной тканью портулака азота, фиксированного клубеньковыми
бактериями (D. Hess, В. Lustig, 1981). Кроме того, продемон-
стрирована способность ассоциативных культур к субкультиви-
рованию (Ю. Г. Попов и др., 1985).
Известна единственная, оказавшаяся удачной, попытка регене-
рации растений табака из ассоциации каллусной культуры с
Rhizobium (Г. Н. Юркова, Б. А. Левенко, 1978). К сожалению,
отсутствует информация как о дальнейшей судьбе этих растений,
так и об инфицировании их клубеньковыми бактериями в процес-
се регенерации из каллуса.
Таким образом, получение азотфиксирующих ассоциаций при
взаимодействии клубеньковых бактерий с клетками небобовых
растений приводит к выводу о принципиальной возможности рас-
пространения симбиоза с клубеньковыми бактериями на небобо-
вые культуры. На этом основании различные комбинации эука-
риотных клеток и азотфиксирующих микроорганизмов могут
быть использованы в экспериментах in vitro для выяснения высо-
кой специфичности природных симбиозов и понимания причин,
по которым симбиоз в природе избирательно возник только у не-
которых групп растений.
Ассоциации с азотфиксирующими свободноживущими бакте-
риями. Эксперименты по созданию ассоциаций культур клеток
(тканей) бобовых и небобовых растений с симбиотическими
(клубеньковыми) бактериями послужили основой для полу-
чения ассоциаций с несимбиотическими азотфиксаторами —
бактериями родов Azotobacter и Azospirillum. Эти почвенные
гетеротрофные бактерии встречаются в ризосфере растений и
в некоторых случаях образуют с ними ассоциации, обеспечивая
64
растения связанным азотом. В последние годы бактерии рода Azos-
pirillum привлекают большое внимание исследователей, зани-
мающихся искусственной инокуляцией злаковых культур. Во
многих случаях при этом продемонстирована экономически зна-
чимая стимуляция роста инокулированных растений и содержа-
ния в них азота.
При создании искусственных ассоциаций на основе культур рас-
тительных тканей ставилась задача получить эффективные азот-
фиксирующие системы, растущие на среде без связанного азота,
с перспективой регенерации растений. В этих целях использовали
сочетания культур растительных тканей с бактериями A. vinelan-
dii и A. brasilense. Была обнаружена видовая специфичность рас-
тительных клеток в формировании ассоциаций с этими бакте-
риями. Каллусные культуры табака, проса и Eremochloa ophiu-
roides не выживали при инокуляции их Azospirillum. Каллусные
культуры быстро «обрастали» бактериями, погибая через 4 неде-
ли после инокуляции. Напротив, при инокуляции той же бакте-
рией ткани сахарного тростника была получена ассоциация, ко-
торую удалось субкультивировать на протяжении 18 мес. Ста-
бильная ассоциация формировалась только на среде с низким
содержанием связанного азота или полностью лишенной его.
Бактерии проявляли НГА независимо от того, формировали они
ассоциации с растительными тканями или последние погибали.
Культивируемые растительные клетки вызывают у Azospirillum,
как и у Rhizobium, индукцию или стимуляцию НГА. Это было
показано в сравнительных опытах по влиянию тканей 11 видов
растений на НГА у Rhizobium и Azospirillum (J. Child, W. Kurz,
1978). Индукцию НГА вызывала также культуральная среда,
кондиционированная клетками суспензионных культур проса
(V. Pence et al., 1982). Таким образом, стимулирующий эффект
на нитрогеназу Azospirillum оказывают метаболиты раститель-
ных клеток.
Несмотря на возможность длительного субкультивирования
ассоциации на среде без связанного азота и наличие повышенных,
по сравнению с чистыми культурами, значений НГА у бактерий,
вклад бактериальной азотфиксации в обеспечение роста расти-
тельных клеток в данной системе не доказан. В ассоциации не
было прироста биомассы, превышающего прирост биомассы в
контроле (монокультура сахарного тростника на среде без свя-
занного азота способна к медленному росту).
При инокуляции ткани табака культурой Azotobacter vinelandii
не было получено ассоциации (V. Vasil et al., 1979). При ино-
куляции каллуса моркови культурой этой же бактерии была
установлена взаимная метаболическая зависимость партнеров.
В этих целях использовали ауксотрофный (аденинзависимый)
штамм бактерии, который рос на среде без аденина только в при-
сутствии каллуса. В свою очередь каллус рос на среде без свя-
занного азота только в присутствии живых бактерий; убитые
внесением пенициллина бактериальные клетки не поддерживали
3—44
65
рост каллуса в этих условиях. Очевидно, в этой ассоциации клет-
ки моркови получали связанный азот в результате азотфиксации,
осуществляемой бактериями, которые, в свою очередь, зависели
от клеток моркови, получая от них необходимый для своего роста
аденин. Инокулированный каллус сохранял способность расти на
среде без связанного азота в течение 18 мес.
Как Azotobacter, так и Azospirillum в соответствующих ассо-
циациях были локализованы на поверхности или в межклетниках
каллусной ткани и никогда не проникали в живые растительные
клетки.
Попытка регенерации растений из ассоциации каллуса моркови
с Azotobacter была неудачной. В ассоциации ткани сахарного
тростника и Azospirillum при инкубации на свету были регене-
рированы зеленые побеги, которые не отличались от побегов,
полученных в контрольной каллусной культуре. Они были спо-
собны к формированию корней и росту в почве. Однако ни в побе-
гах, ни в корнях бактериальные клетки не обнаруживались. Не-
возможность проникновения бактерий в побеги в процессе органо-
генеза в смешанной культуре связывают с анатомическими осо-
бенностями каллуса сахарного тростника. Данная каллусная
культура имеет очень уплотненные области, характеризующиеся
отсутствием межклетников. Рост бактерий происходит в поверх-
ностных участках каЬлусных агрегатов, что сопровождается от-
миранием растительных клеток. Благодаря отсутствию межклет-
ников бактерии не проникают в глубь этих агрегатов, где со-
храняется жизнеспособная растительная ткань. Образование
меристемоидов происходит в уплотненных участках каллуса,
лишенных межклетников, что препятствует включению бак-
терий в формирующиеся побеги.
Ассоциация с зеленой водорослью. Инокуляция каллуса мор-
кови одним из штаммов Chlorella и культивирование системы
на дефицитной по азоту среде на свету приводила к выживанию
каллуса в течение нескольких месяцев, в то время как контроль-
ный каллус погибал. Клетки водоросли росли на поверхности
каллуса и проникали в межклетники. В инокулированном кал-
лусе обнаружен высокий процент интактных клеток, и большин-
ство из них, очевидно, были живыми. Клетки другого штамма
водоросли не росли совместно с каллусом, и в их присутствии
обнаружена очень низкая доля интактных клеток моркови. На
основании проведенных экспериментов сделан вывод об обеспече-
нии клеток моркови азотистыми веществами, поступающими от
водоросли, при культивировании системы на среде с дефицитом
азота.
Ассоциации с грибами. Способ совместного культивирования
ткани руты с различными грибами был применен в качестве но-
вого, нетрадиционного подхода к повышению биосинтеза видо-
специфических продуктов, образуемых растительными клетками
in vitro (В. Wolters, L. Eilert, 1982). Совместную культуру полу-
чали таким образом, чтобы каллус и мицелий гриба не соприка-
66
сались, т. е. на биосинтез влияли диффундирующие через агар
выделения гриба.
Различные виды грибов по-разному воздействовали на рост
каллуса руты и биосинтез клетками алкалоидов акридонового
типа. При этом грибы вызывали подавление или усиление роста
каллуса по сравнению с контролем, сопровождающееся повыше-
нием видоспецифических биосинтезов. Стимулирующее действие
на биосинтез оказывала также культуральная жидкость грибов.
В зависимости от вида гриба наибольший стимулирующий эф-
фект вызывался либо мицелием, либо культуральной жидкостью
гриба. Так, в некоторых случаях мицелий Botrytis allii вызывал
увеличение биосинтеза алкалоидов в 10 раз, а культуральная
жидкость — более чем в 50 раз по сравнению с биосинтезом
тканью руты в контроле. Напротив, мицелий Rhodotorula rubra
способствовал увеличению биосинтеза по сравнению с контро-
лем в 30 раз, а культуральная жидкость — только в 2 раза. Ми-
целий некоторых убитых автоклавированием грибов также может
вызывать увеличение на 72% содержания стероидного соедине-
ния диосгенина в культуре ткани диоскореи по сравнению с био-
синтезом в контроле (J. Rokem, 1984).
Можно выделить 3 группы фактов, полученных в результате
изложенных здесь экспериментов, которые важны для развития
работ по конструированию новых клеточных систем. 1. Показана
возможность получения смешанных клеточных систем, растущих
на среде без связанного азота, по-видимому, за счет бактериаль-
ной фиксации молекулярного азота. 2. Выявлен нормальный ход
органогенеза в растительной ткани в. присутствии бактерий, хотя,
к сожалению, в данных опытах бактерии и не включались в рас-
тения. 3. Установлено значительное повышение видоспецифиче-
ских биосинтезов растительными клетками под влиянием микро-
организмов. Разработанные подходы могут быть, таким образом,
использованы для получения систем, моделирующих природные
симбиотические отношения, а также для дальнейшего экспери-
ментирования в целях улучшения свойств растительной клетки
in vitro или целого растения.
§ 4. Цианобактерии в экспериментах
по получению искусственных ассоциаций
Особенности цианобактерий в качестве партнера раститель-
ных клеток в искусственных ассоциациях. В исследованиях по
получению ассоциаций на основе изолированных протопластов
(см. табл. 4) были сделаны попытки введения цианобактерий
в изолированные протопласты. Кроме того, выполнены единичные
работы по совместному культивированию цианобактерий с рас-
тительными тканями (см. табл. 5). При этом было показано сох
ранение интактности клеток каллуса моркови в условиях осве-
щенности на среде, дефицитной по азоту, при совместном
культивировании с азотфиксирующими цианобактериями Апа-
з*
67
baena и Plestonema В смешанной культуре е каллусом табака
выращивали также азотфнкеируюшие цианобактерии A'os/o< и
\nabaena На сред? без азота в отсутствие цианобактерий каллус
табака погибал. Прове юна селекция штаммов цианобактерий,
способных к совместному рост v с каллусом в течение 20 мес:
у цианобактерий зарегистрирована ИГЛ
Таким образом, систематических работ но введению циано
бактерий в клетки и ткани высших растений не предпринималось.
В то же время цианобактерии обладают целым рядом особен
ностей, благодаря которым они могут быть отнесены к числу
наиболее подходящих партеров растительных клеток в искусст
венных ассоциациях. 1. Предполагается роть древних циаиобак
терий в формировании Эукариот пых клеток в процессе эволюции
путем симбиоза с иефотосинтезируютцими организмами. 2 Эти
микроорганизмы чаще, чем другие фототрофы, кроме зеленых
водорослей, вступают в симбиотические отношения с другими
организмами в природе, формируя ассоциации эндоенмбиоти-
ческого или экзосимбиотического типа. 3 Пгг.тнобак>ерии осуще-
ствляют разные метаболические функции и симбиозах с авто-
трофными организмами (водорослями, растениями) они выпол-
няют роль азогфиксирующег о компонента, с гетеротрофными
(простейшими, грибами) их основная функция состоят в обеспе-
чении партнеров продуктами фотосинтеза. ! Цианобактерии
способны выделят в среду разнообразные вещества: углеводы,
пептиды, аминокислоты, витамины, вещества гормональной
природы и др 5. Эти микроорганизмы образуют в процессе фо-
тосинтеза кислород, который является неблагоприятным фактором
для их роста; культивируемые же клетки растений, напротив,
потребляют кислород в процессе дыхания. 6. Цианобактерии
находят практическое применение в улучшении обеспечения рас
гений связанным а югом Азогфикг ирующш- цианобактерии
играют существенную роль в никои гении связанного азота в
почве и могут обеспечивать до 15% потребностей растений в нем.
Симбиоз папоротника lzo//o с Anabaena nzuHue применяется в
сельском хозяйстве в качестве источника связанного азота на
рисовых полях. Кроме того, цианобактерии повышают эффектив-
ность применения бактериальных удобрении (азотобактерина и
нитрагина).
Однако успешное применение цианобактерий в искусственных
ассоциациях с растительными к те г ками не кажется столь оче
видным, если принять ю внимание следующие обстоите иг едва.
1. Из всего многообразия видов цианобактерий только некоторые
из них (представители родов X'osloe и ^tuibuenti} гл гречаются
в природе в ассоциациях г очегп ограниченным числом видов
высших растений, и эти ассоциации отличаются высокой специ-
фичностью 2 Многие виды цианобзчгерий образуют токсины,
известны антагонистические .тпошеиня цианобактерий и высших
растений в природных биоценозах (водоемах/. 3. 11н3г гбактерии
и растительные клетки обладают существенно различными по
6Х
требиостями в факторах среды: оптимумы pH кислые (5,0—5,5)
у клеток высших растений и нейтрально-щелочные (7—10) у
цианобактерий; оптимальные температуры для роста цианобак-
терий 30—40°С и выше, растительных клеток 24—27°С; концен-
трация минеральных солей в среде для выращивания раститель-
ных клеток выше, чем обычно используется для культивирования
цианобактерий; будучи автотрофами, цианобактерии не нужда-
ются в органических веществах в среде, а растительные клетки
требуют внесения сахарозы и других органических соединений.
В последующих разделах настоящей главы приводятся
экспериментальные данные по применению цианобактерий в
искусственных ассоциациях, полученных на кафедре клеточ-
ной физиологии и иммунологии биологического факультета
МГУ.
Цианобактерии в качестве фототрофного компонента ассо-
циаций с растительными клетками. Влияние цианобактерий на
рост растительных клеток. Для проверки способности к совмест-
ному росту растительных клеток и цианобактерий в суспензион-
ных культурах была выбрана среда Мурасиге и Скуга (МС),
используемая для культур растительных клеток, в которой кон-
центрацию всех компонентов уменьшали в 2—4 раза. Для уста-
новления взаимодействия партнеров по продуктам фотосинтеза
цианобактерий выращивание смешанных культур проводили на
свету при низкой концентрации сахарозы, которая составляла
*/i6 часть (1,875 г/л) от нормы, равной 30 г/л в полной среде
МС. Модифицированная среда оказалась неоптимальной как для
роста растительных клеток, так и цианобактерий. Рост на этой
среде разных культур растительных клеток в отсутствие циано-
бактерий, т. е. в монокультурах, был в 2—6 раз ниже их прироста
на полной среде МС. Циа-
нобактерии в монокульту-
рах на этой среде либо не
росли, либо обнаруживали
очень слабый рост.
При совместном куль-
тивировании была выявле-
на видовая специфичность
взаимодействия партнеров
в парах. Она проявлялась
в том, что растительные
клетки и цианобактерии в
разных сочетаниях оказы-
вали различные эффекты
на рост друг друга. На-
блюдали взаимное подав-
Рис. 21. Взаимная стимуляция роста клеток
табака (Г) и A. nidulans (2) в смешанной
культуре (синий цвет):
черным обозначен рост соответствующих моно-
культур
ление роста (клетки ма-
ка—Anabaena variabiHs);
в большинстве случаев вы-
явлено отсутствие влияния
69
Рис. Ti. Скопления клеток С fritschii на поверхности клеток агрегата женьшеня
[сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)]
или слабое стимулирующее (угнетающее) воздействие одного
партнера на другого; наконец, обнаружено стимулирующее влия-
ние цианобактерий на рост растительных клеток табака (рис. 21),
женьшеня и диоскореи.
Клеточные контакты. Рост растительных клеток в смешанных
культурах с цианобактериями может происходить как при нали-
чии, так и в отсутствие контактов клеток партнеров. Например,
часть клеток Chloroglueopsis fritschii всегда адсорбируется на по-
верхности (рис 22) и проникает в глубь агрегатов женьшеня.
4. variabilis (рис 23) и С. fritschii (рис. 24) также образуют
контакты с поверхностью агрегатов и одиночных живых клеток
паслена и проникают в глубь агрегатов. Клетки Anacystis nidu-
lans формировали смешанные агрегаты с клетками табака при
низкой освещенности, проникая по межклетникам в глубь агре-
гатов (рис. 25), но не вступали с ними в контакт при более высо-
кой освещенности. В случае взаимовыгодного роста клеток
70
о
Рис. 23. Контакт цианобактерий A. variabilis с клеткой паслена (световая микро-
скопия)
диоскореи с той же цианобактерией образования смешанных
агрегатов практически не наблюдалось.
Таким образом, в большинстве суспензионных культур фор-
мируются зоны смешанного роста. В этих зонах, очевидно, скла-
дываются особые условия, обеспечивающие, с одной стороны,
изоляцию партнеров от условий среды, исходно неоптимальной
или даже неблагоприятной для их развития, с другой стороны,
способствующие установлению метаболических взаимодействий
партнеров. В некоторых случаях (клетки женьшеня — С. fritschii)B
местах локализации цианобактерий на агрегатах образуется
гомогенная структура в виде слоя — «маития», которая, возмож-
но, аналогична слизям в местах контактов цианобактерий с
растительными клетками в природных ассоциациях. «Мантия»
обволакивает клетки цианобактерий и обеспечивает, очевидно,
структурные связи компонентов ассоциации (рис. 26).
Передача продуктов фотосинтеза цианобактерий растительным
клеткам. При использовании меченного по |4С бикарбоната было
показано, что С. fritsch.it при росте на свету способна к значи-
тельному (до 16%) выделению 14С, фиксированного в процессе
фотосинтеза. Инкубация клеток женьшеня в культуральной среде
после выращивания в ней С. frUschii приводила к включению
метки (до 74% растворенных органических веществ) из среды
в клетки женьшеня. Более того, культуральная жидкость С. frit-
schii, добавленная к полной среде МС, лишенной сахарозы,
71
Рис. 24. Смешанный агрегат клеток паслена и С. fritschii (световая микроскопия)
обеспечивала рост растительных клеток, который сопоставим с
ростом на этой же среде с сахарозой в концентрации около 1%.
Таким образом, была выявлена способность растительных клеток
потреблять продукты фотосинтеза цианобактерий.
Потребление растительными клетками продуктов лизиса циано-
бактерий. В определенных условиях роста смешанных культур
цианобактерии не размножаются, а интенсивно лизируются;
прирост же растительных клеток в присутствии цианобактерий
превышает их прирост в монокультуре (рис. 27). Из этих опытов
следует, что прирост растительных клеток может быть обеспечен
продуктами лизиса цианобактерий.
Таким образом, испытание способности к совместному росту
у большого числа сочетаний партнеров позволило выбрать пары,
в которых цианобактерии оказывали положительный эффект на
рост растительных клеток. Образование ассоциаций происходило
в условиях, не оптимальных для роста каждого из партнеров.
На средах, дефицитных по источнику углерода, показана способ-
ность растительных клеток усваивать продукты фотосинтеза или
72
Рис. 25. A. nidulans в межклетнике агрегата табака (просвечивающая электрон-
ная микроскопия)
лизиса цианобактерий. Последнее обстоятельство может быть
важно при использовании растительных клеток в биотехнологии,
которая настоятельно требует замены сахарозы, применяемой
в пищевых целях, на менее дефицитные сахара.
Биосинтетическая активность растительных клеток в смешан-
ных культурах с цианобактериями. В ассоциациях с цианобакте-
риями была проверена способность клеток-продуцентов к видо-
специфическим биосинтезам.
Клетки диоскореи в смешанных культурах с A. nidulans на
модифицированной среде (1/2 МС) при дефиците сахарозы (‘/щ
нормы) на свету синтезировали до 80% стероидных соединений,
образуемых при выращивании клеток диоскореи в монокультуре
на полной среде.
Ассоциации клеток женьшеня (ауксотрофный по фитогор-
монам штамм) и паслена с С. fritschii, помимо выращивания
на свету, можно культивировать и в темноте благодаря спо-
собности данной цианобактерии к гетеротрофному росту. Куль-
73
Рис. 26. Гомогенная структура — «мантия», окружающая клетки С. fritschii
на поверхности агрегата клеток женьшеня (СЭМ)
Рис. 27. Рост клеток ди-
оскореи (1) и A. nidu-
lans (2) в смешан-
ной культуре (синий
цвет). (Клетки диоскореи
подсевали к предвари-
тельно растущим клеткам
цианобактерии.):
черным обозначен рост соот-
ветствующих монокультур
Рис. 28. Накопление стеринов к алкалоидов в культуре клеток пас-
лена: / — монокультура, среда МС; 2 - монокультура с добавлением
культуральной жидкости (.. fritschii, среда ’/> МС. '/> сахарозы;
3 — смешанная культура клеток паслена е С. fritschii, та же среда
тивирование этих систем в темноте проводили на среде МС,
разбавленной в 4 раза (‘/4 МС) с уменьшением концентра-
ции сахарозы до ‘/г нормы. Клетки женьшеня в смешанной
культуре сохраняли способность к биосинтезу биологически
активных веществ, которые составляли 5- -7% от биомассы
высушенных клеток, как и в монокультуре, выращиваемой
на полной среде М.С.
Совместное выращивание клеток паслена и С. fritschii на
модифицированной (дефицитной) среде вызывало увеличение
стеринов и алкалоидов в клетках паслена по сравнению с их
накоплением в монокультуре паслена на полной среде (рис. 28).
Таким образом, при выращивании суспензионных культур
растительных клеток на среде при значительном снижении кон-
центрации всех компонентов (в 2—4 раза) и сахарозы—от 2
до 16 раз, цианобактерии не препятствуют накоплению в них
видоспецифических продуктов или даже способствуют увеличе-
нию их биосинтеза в расчете на единицу биомассы растительных
клеток. Отсюда возникает вопрос, не выгоднее ли смешанное
культивирование по сравнению с выращиванием монокультуры
на полной среде? В этих целях был вычислен суммарный биосин-
тез алкалоидов- в единице объема среды (в 1 л) при обоих
способах культивирования (в монокультуре на полной среде и в
смешанной культуре на дефицитной) на 2 и 12 сут (табл. 6).
Далее были определены затраты среды МС и сахарозы (в частях
от нормы) на получение единицы продукции. Оказалось, что
получение единицы продукции алкалоидов в смешанной культуре
выгоднее, чем в монокультуре. Причем интересно, что практи-
чески одинаковое количество продукта можно получить в 1 л сре-
ды (27 мг) в монокультуре на 12-е сут и в 2 л среды (26 мг) в
смешанной культуре на 2-е сут. При этом затраты на получение
75
Таблица 6. Расчет затрат среды МС и сахарозы на получение единицы
продукции алкалоидов в культуре клеток паслена при разных способах культи
пирования
Вариант культивирован и я клеток паслена Время культи- вирова- ння. сут Био- масса, г/л Содержание алкалоидов Затраты* на получение единицы продукции алкалоидов
% ОТ сухой массы В 1 л культуры
мг усл. ед
среды МС саха- розы
Монокультура [среда МС, сахаро- 2 4 0,21 8 1 1 1
зы 30 г/л (норма)] 12 16 0,17 27 3,4 0,3 0,3
Смешанная культура [среда '/, МС. 15 г/л 2 4 0,33 13 1,6 0,16 0,31
сахарозы ( '/а нормы)] 12 8 0,22 18 2,2 0,11 0,23
* В частях от нормы на полной среде.
2 л смешанной культуры будут составлять 1 /2 МС и норму саха-
розы, т. е. даже будут ниже, чем на получение 1 л монокультуры
на полной среде. Для получения 2 л смешанной культуры следует
провести 2 цикла выращивания (т. е. 2 раза по 2 сут); в этом
случае получим 3-кратную экономию во времени культивирования
при несколько меньших затратах на производство такого же
количества алкалоидов, что и в монокультуре (на 12-е сут).
Рассчитанная таким образом экономия сырья на производство
единицы продукции, очевидно, может -иметь значение для крупно-
масштабных производств и давать высокий экономический эффект.
С другой стороны, системы с высоким выходом продукта в ран-
ние сроки культивирования могут быть рентабельны в непрерыв-
ном режиме культивирования, внедрение которого составляет
одну из главных задач биотехнологии.
Введение цианобактерий в растения. Искусственные азот-
фнксирующие ассоциации. Введение цианобактерий в побеги
табака. Все попытки вводить цианобактерии непосредственно в
побеги размножаемых черенками растений табака были неудач-
ны. 1. При высаживании черенков в жидкую или агаризованную
среду МС с азотфиксирующей A. variabilis цианобактерии не
проникали в растение ни через поверхности среза, ни через вновь
формирующуюся корневую систему. 2. Они не приживались на
поверхности побегов и не проникали в ткани в местах поранения.
3. Эти микроорганизмы не распространялись по стеблю побега,
если их вводили инъекцией с помощью шприца в стебель. В пос-
ледних двух случаях цианобактерии на поверхности растений не
выживали и спустя некоторое время деградировали. В растении
в ответ на поранение образовывался каллус, причем в каллусе
цианобактерии приживались. Это заставило применить другой
способ введения цианобактерий в растения, включающий в ка-
76
Ряс 29. \ цпрбция ксчк'чки 1 lUii'ibilis (nt- фиы npvioiunfl этот штамм)
на ц<>в<'рМ1'><*>и iipoiomacra табаки (СЭМ)
честве предварительной ста тин получение каллусной смешанной
культуры с последую!ней регенерацией побегов.
Получение смешанных культур. Смешанные культуры ткани
табака с разными штаммами 1 variabiHs были получены двумя
способами. В олпом случае каллу спая ассоциация была получена
при использовании изолированных прогон.ластов табака. Про-
топласты совместно с не фиксирующей азот .1. variabiHs обраба-
тывали ионами кальция индуктором слияния растительных
протопластов (\\ Keller, G Melcheis, 1973). Были подобраны
условия, при которых как протопласты табака, так и цианобак-
терии сохраняли жизнеспособность, при этом до о()% прото-
пластов адсорбировало клетки A. variabiHs (рис. 29). Повышение
% адсорбции с помощью ионов ка )ьцпя но сравнению с другими
индукторами, как следовало ожидать, повышало и частоту попа-
дания цианобактерий в протопласты Полученную смесь прото-
пластов и цианобактерий высевали па среду МС с осмотическим
стабилизатором, что ври последующем культивировании на свету
приводило к образованию смешанной каллусной культуры.
В другом случае использовали каллус, непосредственно выде-
ленный из мезофилла листа, куда подсевали суспензию /1. va-
riubilis (азотфиксиру тощий штамм) Как в том, гак и в другом
случае при выращивании на среде МС на свету были получены
каллусные культуры, сине зеленая окраска которых Обусловлена
Рис. 30. Ассоциация каллусной ткани табака с азотфиксируютей циано-
бактерией Anabaena variabilis:
темные участки - места локализации цианобактерии
присутствием цианобактерий (рис. 30). Цианобактерии растут на
поверхности каллуса или проникают в глубь ткани по межклет-
никам. Кроме того, в каллусе, полученном из протопластов, часть
цианобактерий локализуется внутриклеточно в центральных
вакуолях табака (рис. 31). Это свидетельствует о попадании
цианобактерий в растительные протопласты при обработке иона-
ми кальция и сохранении их внутриклеточной локализации в
процессе размножения клеток каллуса. Особенностью клеток
табака является наличие крупных вакуолей и слабое развитие
цитоплазмы в стационарную фазу роста культуры, когда изучали
локализацию цианобактерий в образцах каллуса. Возможно, с
этим связано отсутствие цианобактерий в цитоплазме клеток
в отличие от локализации эндосимбиотических цианелл в цито-
плазме клетки хозяина в природных ассоциациях.
Каллусные смешанные культуры стабильны и способны к росту
в пересадочной культуре не менее 2 лет, причем не наблюдали
подавления роста одного компонента системы другим.
Введение цианобактерий в растения-регенеранты. В смешан-
ных культурах каллуса табака и цианобактерий на среде МС для
органогенеза формировались побеги регенерантов табака длиной
2—6 см (рис. 32) с участками сине-зеленого цвета — местами
локализации цианобактерий. Цианобактерии образуют-большие
78
Рис. 31. Скопления цианобактерий A. variabilis (не фиксирующий
азот штамм) в центральной вакуоли клетки каллуса табака.
В клетке табака видны клеточная стенка (кс) и очень узкий слой
цитоплазмы (ц) (просвечивающая электронная микроскопия)
скопления и состоят из длинных цепочек, что указывает на их
размножение в побегах. Очевидно, такая анатомическая особен-
ность каллуса табака, как наличие больших межклетников, яв-
ляется определяющей для проникновения цианобактерий в меж-
клетники каллусной ткани и в область меристемоидов и впослед-
ствии — в формирующиеся побеги.
Способность к формированию побегов в смешанных культурах
сохранялась в течение длительного их субкультивирования (на
протяжениии 10—11 пассажей). Более того, из регенерантов
первого поколения, ассоциированных с азотфиксирующими ци-
анобактериями, получен вторичный каллус, а из него — регене-
79
Рис. 32. Побеги табака, полученные при индукции органогенеза в смешанной
культуре каллуса табака и A. variabilis (здесь и далее — азотфиксирующий
штамм):
темные участки — места локализации цианобактерии
ранты второго поколения. Эти побеги, пройдя через циклы расте-
ние — каллус — побег — каллус — побег, сохраняли цианобак-
терии на поверхности и в тканях.
Регенеранты, ассоциированные с азотфиксирующей A. varia-
bilis, получены также при выращивании каллуса люцерны, ино-
кулированного цианобактериями, на среде В5 (О. Gamborg et al.,
1968) для органогенеза без минерального азота.
Локализация цианобактерий в регенерантах. В регенерантах
табака из каллуса, происходящего из протопластов, цианобакте-
рии находятся в стебле и в листьях и имеют внутритканевую
локализацию. В мезофилле листа они иногда встречаются внутри
клеток табака, в которых отсутствует цитоплазма; это указывает
на сохранение внутриклеточной локализации цианобактерий в
процессе органогенеза.
В побегах табака, полученных из исходного каллуса, циано-
бактерии находятся как на поверхности, так и в тканях стебля
80
Рис. 33. Цепочки A. variabilis в углублениях складчатой поверхности стебля
побега табака (СЭМ)
Рис. 34. Скопление цианобактерий на поверхности листа побега табака:
г—гетероцисты (СЭМ)
Рис. 35. A variabilis в устьичной щели и вокруг устьица (СЭМ)
Рис. 36. A variabilis в формирующихся элементах ксилемы у основания формиру
ющегося побега (СЭМ)
Рис. 37. Поперечный срез стебля побега-регенеранта табака. [Зона межклетников
первичной коры между перициклом и эпи термином, заполненных скоплениями
цианобактерий A. canabilis (Г ЭМ).]
Рис. 38. 1. .'uriabilis под слизистой итенкой-«мантией» и на се поверхности:
П цианобактерии, пл - пленка (СЭМ)
Рис. 39. Поперечный срез листа растения регенеранта тюцерны; скопления
A. vuricibilr-. в межклетниках мезофилла листа (('ЭЛА)
и листа. Складчатая поверхность стебля при этом заполняется
цепочками A. variabiHs, покрытыми тонкоструктурированной
пленкой (рис. 33); тяжи, образуемые на поверхности стебля
скоплениями цианобактерий, имеют ориентацию от основания к
верхушке побега. Цианобактерии образуют также скопления на
поверхности листа (рис. 34) и входят в глубь устьиц (рис. 35).
В некоторых случаях они находятся в области проводящей сис-
темы. В процессе органогенеза эти микроорганизмы выявлены
в сосудах ксилемы (рис. 36) у основания формирующихся по
бегов табака. Цианобактерии обнаружены в межклетниках
первичной коры паренхимы стебля (рис. 37). Зоны локализации
микроорганизма на поверхности побегов могут покрываться
слизистой пленкой — «мантией» (рис. 38). Обнаруженная в искус-
ственной ассоциации побегов табака и A. variabiHs «мантия»
идентична слизистой пленке, наблюдаемой в местах локализации
симбиотической цианобактерии A. azollae в полости листа папо-
ротника Azolla (G. Peters, 1977).
В регенерантах люцерны в редких случаях цианобактерии
обнаруживались на поверхности и в ткани стебля и листа (рис. 39).
В подавляющем большинстве растений-регенерантов, полученных
из инокулированного цианобактериями каллуса, цианобактерии
не сохранялись в побегах, но обнаруживали интенсивный рост
на поверхности (рис. 40) и в ткани корня. Инокуляцию корней
84
Рис. 40 Поперечный срез корня растения - регенеранта люцерны; скопления
.4. variabilis на поверхности корня (СЭМ)
люцерны удалось также проводить другим способом — путем
введения цианобактерий в зону корней растений, размножаемых
черенкованием. Цианобактерии закреплялись на поверхности
достаточно прочно: их не удается удалить при энергичном встря-
хивании отделенных от растений корней в жидкой среде.
Рост каллусных тканей и побегов растений в ассоциации с
цианобактериями в условиях дефицита связанного азота. Выяв-
лены преимущества роста ассоциаций с азотфиксирующими
цианобактериями каллусных тканей растений при дефиците или
полном исключении из среды азота. Так, при 20%-ном (от нормы)
содержании в среде МС азота прирост биомассы каллуса табака
в смешанной культуре был на 25—30% выше, чем в монокультуре.
Кроме того, при длительном культивировании без пересадок на
дефицитной по азоту среде жизнеспособными оставались только
участки ткани, соприкасающиеся с зонами роста цианобак-
терий.
При полном исключении из среды В5 связанного азота каллус
люцерны в монокультуре не рос; при совместном его культивиро-
вании с цианобактериями биомасса каллуса в 2,7 раза превыша-
ла биомассу каллуса в монокультуре (рис. 41). В совместной
культуре через 10 сут роста практически все клетки люцерны
(94%) были живыми, тогда как в монокультуре — только 54%.
В данном опыте была использована в отличие от приводимых
85
Рис. 41. Рост каллуса люцерны, рост и НГА A. variabiHs в монокуль-
турах и в совместной культуре на среде В5 без азота:
/ — исходный засев; 2 — монокультура; 3 — совместная культура; цифры
над столбцами соответствуют % гетероцист
ранее смешанных культур совместная культура, в которой каллус
и цианобактерии выращивали на агаризованной среде на рас-
стоянии друг от друга, т. е. вне контакта клеток партнеров,
И наконец, ассоциации растений люцерны и A. variabilis
оказались способны к росту на среде В5 без азота (наблюдение
за ними проводили в течение 4 мес). Неинокулированные расте-
ния в тех же условиях уже через 1 мес обнаруживали признаки
деградации, а через 2 мес у них обесцвечивались и опадали
листья, растения вскоре погибали. Инокулированные растения
продолжали расти в песчаной культуре в отсутствие связанного
азота. Цианобактерии при этом локализовались на поверхности
корней преимущественно в зоне поглощения, в контакте с корне-
выми волосками и распространялись на те участки корней, кото-
рые образовались в ходе их роста после перенесения растений
в песок. Причем ииокулированиые растения и контрольные (не
инокулированные цианобактериями) через 10 сут роста в песча-
ной культуре более чем в 2 раза различались по своей высоте.
Растения, ассоциированные с цианобактериями, росли и в сте-
рильной почве, при этом через 4 мес роста цианобактерии
интенсивно развивались как в непосредственном контакте с кор-
нями, так и в прикорневой зоне почвы.
Таким образом, результаты этих опытов впервые показали,
что азотфиксирующие цианобактерии в искусственных ассоциа-
циях способны обеспечить рост каллуса и целого растения
на среде или в песчаной культуре без связанного азота. Причем
с помощью совместной культуры удалось продемонстрировать,
86
что этот эффект может обеспечиваться, очевидно, за счет продук-
тов азотфиксации, выделяющихся в среду и диффундирующих
через агар.
Рост и НГА цианобактерий в ассоциациях с растительными
тканями. На средах МС и В5 в отсутствие каллуса и растений
(в монокультуре) A. variabilis не растет, имеет очень низкую
долю гетероцист и уровень НГА (рис. 41) и в конечном итоге
деградирует.
В ассоциациях с клетками и растениями цианобактерии ин-
тенсивно размножаются, образуют гетероцисты и проявляют
НГА. Формирование гетероцист, ответственных у данной циано-
бактерии за фиксацию молекулярного азота, и регистрация НГА
свидетельствуют об осуществлении азотфиксации. В специальных
опытах, поставленных с совместной культурой ткани люцерны и
A. variabilis, было показано, что стимуляция роста НГА и обра-
зование гетероцист у цианобактерии (рис. 41) происходят,
очевидно, за счет метаболитов клеток люцерны, диффундирую-
щих через агар. Интересно, что и в природных ассоциациях
высшие растения вызывают стимуляцию образования гетероцист
и НГА у цианобионта. Однако в полученных искусственным
путем системах доля гетероцист не достигала максимально высо-
ких значений, известных для природных симбиозов цианобакте-
рий и высших растений (W. Stewart et al., 1983). Существенной
особенностью цианобактерий в искусственных ассоциациях явля-
ется ее интенсивный рост, который в природных ассоциациях с
растениями, наоборот, подавлен. Таким образом, полученные
в эксперименте системы представляют значительный интерес
для изучения на клеточном уровне механизмов влияния растения-
хозяина на симбиотические цианобактерии.
Потребление цианобактериями продуктов метаболизма расте-
ния. В природных ассоциациях с высшими растениями цианобак-
терии передают растению связанный азот, получая от растения
соединения углерода. Одна из проблем практического использо-
вания искусственных ассоциаций состоит в обеспечении азот-
фиксирующего симбионта органическими веществами без нане-
сения ущерба растению-хозяину. В ассоциации с растениями
люцерны в песчаной культуре и в почве цианобактерии росли без
доступа света, гетеротрофно, что обеспечивалось, очевидно,
корневыми выделениями люцерны. Для этого штамма A. variabilis
установлена способность к гетеротрофному росту в темноте в чис-
той культуре (Р. Wolk, Р. Shaffer, 1976). Растения при этом
имели преимущества в росте по сравнению с растениями, не
ассоциированными с цианобактериями, при исключении связан-
ного азота.
Для выявления возможности передачи цианобактериям
соединений углерода от растения в искусственной ассоциации
были поставлены специальные опыты. Побеги табака предвари-
тельно потребляли меченный по углероду сахар (глюкозу). На
поверхность листьев таких растений наносили клетки цианобакте-
87
рии и подвергали их совместной экспозиции в течение определенно-
го времени. Причем в одном случае это были цианобактерии, взя-
тые непосредственно из чистой культуры (неадаптированные), в
другом случае — выделенные из каллуса, совместно с которым
они выращивались в пересадочной культуре в течение 1,5 лет
(адаптированные). Побеги-регенеранты передавали меченые
соединения углерода цианобактериям как на свету, так и в тем-
ноте, о чем судили по уровню радиоактивности цианобактерий
после смыва их с поверхности меченых побегов. Это указывает
на способность цианобактерий в искусственной ассоциации с
растением переходить на фотогетеро- и хемогетеротрофный тип
питания, что характерно для них и в природных симбиозах.
Интересно, что адаптированные цианобактерии получают от
побегов в 2,5 раза больше меченых соединений углерода как на
свету, так и.в темноте по сравнению с неадаптированными. Су-
ществование разницы при включении меченого органического
вещества в адаптированные и неадаптированные цианобакте-
рии указывает на то, что в условиях ассоциации с каллусной
культурой табака A. variabilis проходит сложный приспособи-
тельный период, сопровождающийся метаболическими перестрой-
ками. Вероятно, это одна из причин того, что ассоциации побе-
гов табака с цианобактериями удается получить только через
стадию смешанной культуры, которая, по-видимому, является
этапом адаптации цианобактерии к новым условиям существо-
вания.
Таким образом, в изложенных здесь экспериментах было
продемонстрировано получение искусственных ассоциаций куль-
тивируемых тканей и растений-регенерантов с цианобактериями.
Удалось получить ассоциации цианобактерий с каллусом и побе-
гами-регенерантами, происходящими из изолированных прото-
пластов. В ассоциациях с азотфиксирующими цианобактериями
культивируемые ткани и растения имеют преимущества в росте
в условиях дефицита или отсутствия связанного азота по сравне-
нию с неинокулированными культурами и растениями, что обу-
словлено фиксацией азота цианобионтом. Показана высокая
стабильность полученных клеточных систем при их субкультиви-
ровании и сохранение ассоциативных взаимодействий в ряду
переходов каллус — побег.
[лава
4
МЕТОДЫ
ПОЛУЧЕНИЯ
МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ
§ 1. История создания метода
Для многих исследований, связанных с изучением биологи-
ческих структур (низкомолекулярные биорегуляторы, гормоны,
макромолекулы, дифференцировочные маркеры клеток и др.),
большую ценность представляют реагенты, способные специфи-
чески взаимодействовать с данной структурой. Универсальным
реагентом, обладающим указанным свойством, считается молеку-
ла иммуноглобулина. Несмотря на то что иммуноглобулины,
являясь антителами, взаимодействуют только с антигеном, т. е.
с молекулой, способной вызвать иммунный ответ, для большин-
ства структур удается подобрать условия, при которых они ста-
новятся антигенами и индуцируют выработку комплементарных
антител (например, при конъюгации с сильными иммуногенами).
Именно этим объясняется большое распространение иммуноло-
гических методов, связанных с использованием антител, в раз-
личных областях биологии и медицины.
Иммунная система вырабатывает специфические антитела на
огромное множество антигенов. В основе такой способности
лежит наличие большого разнообразия клонов лимфоцитов, каж-
дый из которых вырабатывает антитела одного типа с узкой
специфичностью. Общее число клонов у мышей, по оценкам неко-
торых исследователей (N. Sigal, N. Klinman, 1978), равно 107—
10. В ответ на данный антиген в реакцию вовлекается множест-
во клонов, что обусловливает высокую гетерогенность получае-
мых антител. Так, при иммунизации комплексом гаптен — белок
образуется до 8000 различных антител (Н. Kreth, A. Williamson,
1973). Спектр вырабатываемых антител изменяется в ходе им-
мунного ответа, а также при использовании различных животных.
Серьезную проблему при применении антисывороток для иденти-
фикации и количественного определения антигенов в различных
областях исследований представляет неспецифическое связыва-
ние и перекрестная реактивность антител.
Многие'исследователи пытались отыскать способы получения
89
антител с узкой специфичностью. Так, при определенных услови-
ях иммунизации бактериальными полисахаридами удается полу-
чить высокогомогенный препарат антител с узкой специфичностью
(Е. Haber, 1970; R. Krause, 1970). Однако в большинстве случаев
попытки были неуспешными. Интересно отметить, что высоко-
специфические антитела были получены в работе (N. КНпгпап,
J. Press, 1975), в которой антителообразующие клетки переноси-
ли в организм летально облученных животных и из селезенки
извлекали локальные зоны, содержащие очаги пролиферации
только одного клона иммунных лимфоцитов. Эти клоны продуци-
ровали в сущности моноклональные (монофокальные) антитела,
однако их можно было выделить лишь в очень незначительных
количествах. Данные опыты имели чисто теоретическое значение
для оценки числа клонов и не давали препаративного способа
получения моноклональных антител.
В 1975 г. Д. Кёлер и Ц. Милстейн предложили принципиально
иной метод получения гомогенных антител. Они осуществили
слияние плазмацитомы (опухоли, возникшей из антителообразу-
ющей клетки или ее предшественника) с клетками селезенки
иммунизированного животного, получив таким образом гибрид-
ные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток
способность неограниченно размножаться, а от клеток селезен-
ки — синтезировать антитела предопределенной специфичности.
Эта работа известила о наступлении нового этапа в использо-
вании антител в различных областях биологии и медицины.
Метод очень быстро получил широкое распространение во всем
мире, и уже -в 1978 г. собралась представительная конференция,
на которой рассматривались вопросы техники получения и об-
ласти использования моноклональных антител. Вклад Кёлера и
Милстейна в развитие науки был по достоинству оценен мировой
общественностью, и в 1984 г. им была присуждена Нобелевская
премия.
В настоящее время моноклональные антитела находят все
более широкое применение, однако нужно заметить, что вопрос
о выборе между моноклональными антителами и поликлональны-
ми сыворотками должен определяться конкретными задачами
исследования. Например, вследствие высокой специфичности
моноклональных антител они могут не обнаруживать некоторые
антигенные детерминанты у родственных микроорганизмов. Кро-
ме того, моноклональное происхождение антител фактически в
большинстве случаев исключает эффекторные функции, связан-
ные с множественными сшивками антигенов, такие, как фиксация
комплемента и иммунная преципитация. Физико-химические
характеристики моноклональных антител также могут ограничи-
вать их применение вследствие большей, чем поликлональных
сывороток, чувствительности к изменениям pH, температуре и
концентрации солей. Кроме того, полученные моноклональные
антитела могут иметь низкую аффинность, и методические прие-
мы, позволяющие регулировать аффинность вырабатываемых
90
Таблица 7. Сопоставление свойств моноклональных антител и поликло-
нальных антисывороток (М. O'Hare, 1984)
Свойство Поликлональные антисыворотки Моноклональные антитела
Специфичность Потенциально ко всем антигенным детерминантам всех компонентов иммуни- зирующего материала Одна антигенная де- терминанта одного ком- понента
Воспроизводимость со- става Изменяется от животного к животному и в процессе иммунного ответа Постоянная
Перекрестная реактив- Частичная с антигеном, Обычно отсутствует,
ность с другими антиге- несущим общие детерми- редко полная в завнеи-
нами нанты мости от распределения и доступности детерминант на других антигенах
Классы н подклассы Одновременно прнсут- Только одни из всех
присутствующих иммуно- глобулинов ствуют все или большин- ство ВОЗМОЖНЫХ
Способность преципи- тировать антигены Обычно есть Обычно нет
Концентрация специ- фических антител 0,1 —1,0 мг/мл 5—500 мкг/мл (куль- тура) ; 5 мг/мл (асцит)
Концентрация посто- ронних антител 10 мг/мл Нет (культура); 1 мг/мл (асцит)
Физике - химические Определяются пулом ан- Крайне индивндуаль-
свойства тнтел ны, могут быть чувстви- тельны к внешним усло- виям
моноклональных антител, до настоящего времени не разработаны.
Поэтому, несмотря на несомненные преимущества моноклональ-
ных антител перед поликлональными сыворотками благодаря
их высокой специфичности и воспроизводимости получения, в
ряде ситуаций нецелесообразно отказываться и от поликлональ-
ных сывороток, продолжающих находить широкое применение.
В табл. 7 приводится сопоставление основных свойств монокло-
нальных антител и поликлональных сывороток.
Предпосылками для возникновения метода получения гибри-
дом, синтезирующих моноклональные антитела, были разработки
двух методических подходов: 1) получение миелом, адаптация
их к условиям культивирования вне организма и 2) метод сома-
тической гибридизации клеток.
У мышей довольно легко можно получить миеломы (плазма-
цитомы) (М. Potter, 1972). Эти опухоли являются потомками
одной клетки (т. е. имеют моноклональное происхождение) и се-
кретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из которых
могут взаимодействовать с известными антигенами. Опухоли
индуцируют у животных путем внутрибрюшного введения мине-
ральных масел или инертного твердого пластика. Для возникно-
вения миелом большое значение имеет генетический статус жи-
91
вотного, и только у двух линий инбредных мышей (Balb/C и
NIZB) экспериментаторам удалось получить такие опухоли.
Миеломные клетки мыши оказались чрезвычайно удобными
для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов и дали
очень многое для понимания структуры, механизмов секреции
и их функции. Однако миеломная система как источник антител
к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей —
не удавалось иммунизировать животных, а затем получать мы-
шиные миеломы, продуцирующие антитела к иммунизирующему
антигену. Из тысяч миеломных опухолей, индуцированных у
мышей, лишь единичные вырабатывали иммуноглобулины, кото-
рые реагировали с известными антигенами (М. Potter и сотр.,
1977), что было обнаружено путем грубого скринирования с
множеством потенциальных антигенов. Таким образом, мие-
ломные белки оказывались с неизвестной антигенной специфич-
ностью.
Другой предпосылкой возникновения метода получения гибри-
дом явилась техника гибридизации соматических клеток, разра-
ботка которой широко проводилась после открытия феномена
спонтанной гибридизации (G. Barski, S Sorieul, F. Cornefert,
1960). При слиянии плазматических мембран клеток образуются
клетки с двумя или большим числом ядер — гетерокарионы. После
первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набо-
ром хромосом от всех слившихся партнеров — образуется гиб-
ридная клетка. Первоначально метод гибридизации соматиче-
ских клеток использовали для изучения механизма регуляции
дифференцировочных функций (функций «роскоши»), а также
для соматических и генетических подходов к картированию генов
(F. Ruddle, R. Greagan, 1975). Низкую частоту образования
гибридов можно было увеличить, использовав ряд агентов, вызы-
вающих слияние: вирус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль.
Механизмы слияния клеток в значительной степени остаются
неизвестными. В отношении ПЭГ, широко используемого для
получения гибридов, предполагают, что он уменьшает заряд
клеточной поверхности и сорбирует на себе воду, облегчая тем
самым взаимный контакт плазматических мембран соседних
клеток (см. гл. 2).
Даже при использовании агентов, повышающих слияние,
частота образующихся гибридов крайне низка. Для их выделения
необходимы селективные среды, позволяющие расти преимуще-
ственно образовавшимся гибридам. В настоящее время разрабо-
тано несколько принципов селекции гибридных клеток (N. Rin-
gertz, R. Savage, 1976). Одним из наиболее распространенных
является метод, основанный на применении системы, содер-
жащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (система ГАТ)
(J. Littlefield, 1964).
В системе ГАТ используется антагонист фолиевой кислоты —
аминоптерин (рис. 42).
Тетрагидрофолевая кислота является коферментом, необхо-
92
Рис. 42 Схема работы системы ГАТ:
ми но фосфа ты инозина (ИМФ). ксантина (КМФ), гуанина (ГМФ); дезо-
кснмонофосфаты уридина (дУМФ), тимидина (дТМФ); дезокендифосфаты
гуанина (дГМФЛ гнмндина (дТДФ); дезокснтрифосфаты гуанина
(дГ'1Ф), нити 1ина (дЦТФ). аденина (дАТФ) н тимидина (дТТФ)
димым для превращения рибонуклеотида 5-аминоимидазол-4-
карбоксамида (АИКР) в рибонуклеотид формамидоимидазол-4-
карбоксамида (ФАИКР) в биосинтезе пуринов и превращения
ИИМР в НТМР в синтезе пиримидинов. Аминоптерин, аналог
фолиевой кислоты, предотвращает образование тетрагидрофолята,
конкурентно ингибируя гидрофолятредуктазу, и таким образом
блокирует процессы биосинтеза как пуринов, так и пиримидинов
на стадиях, указанных на схеме. В клетках существуют обходные
пути биосинтеза нуклеотидов, в которых происходит реутилиза-
ция гипоксантина и тимидина. Эти пути зависят от двух фермен-
тов: тимидинкиназы (ТК), катализирующей трансформацию ти-
мидина в дезокситимидинтрифосфат, и гипоксантингуанинфос-
форибозилгрансферазы (ГГФРТ), катализирующей трансформа-
цию гипоксантина в инозинмонофосфат и гуанина в гуанозин-
монофосфат. При добавлении в среду гипоксантина и тимидина
клетки могут нормально синтезировать ДНК в условиях, когда
основной путь биосинтеза нуклеотидов блокирован аминоптери-
ном. Если клетка имеет дефект по этим ферментам, то в присут-
ствии аминоптерина она погибает, но способна выжить, если ее
слить с другой клеткой, в которой эти ферменты имеются. Двой-
ной, или полной; селективной системой является такая система,
когда происходит слияние двух клеток, в одной из которых
отсутствует ТК, в другой — ГГФРТ. В гибридах идет взаимная
комплементация этих ферментов, и они выживают в среде ГАТ,
тогда как родительские клетки погибают.
Для получения и отбора мутантных клеток, не имек?щих ТК
или ГГФРТ, используют токсические аналоги пуринов и пирими-
динов, добавляемые на фоне действия мутагенных агентов. Эти
аналоги включаются в ДНК с помощью указанных ферментов.
93
В присутствии токсических аналогов выживают только те клетки,
в которых отсутствует фермент, способствующий включению
этого аналога в ДНК. Так, в присутствии 8-азагуанина или 6-
тиогуанина выживают только клетки, не имеющие фермент
ГГФРТ, а в присутствии 5-бромдезоксиуридина — клетки, не
имеющие фермент ТК. Следует заметить, что у мышей получить
клетки, дефектные по ГГФРТ, довольно не сложно, так как ген
этого фермента расположен на Х-хромосоме. которая в сомати-
ческих клетках млекопитающих присутствует в единственном
числе из-за инактивации другой Х-хромосомы. В связи с этим
в клетках экспрессирована только одна аллель гена ГГФРТ, и
достаточно только одной мутации для его инактивации. Получить
мутанты по ТК значительно труднее, так как ген этого фермента
расположен не на Х-хромосоме и необходимо наличие одновре-
менно двух одинаковых мутаций для полного исчезновения ак-
тивности этого фермента.
С целью изучения механизмов генерации разнообразия анти-
тел и роли в этих процессах соматических мутаций Милстейн
были начаты исследования с использованием линий миеломных
клеток. Из Института Солка им были получены исходные линии
плазмацитом РЗК и РС5, на основе которых он получил мутанты,
дефектные по ферментам ГГФРТ и ТК. С этими линиями были
проделаны успешные опыты по получению гибридов этих клеток
и соответствующей линии миелом крысы (S 210) (R. Cotton,
С. Milstein, 1973; G. Kohler С. Milstein, 1975). Полученные в
этих работах результаты привели к заключению, что иммуногло-
булиновые гены в гибридах экспрессируются кодоминантно и,
следовательно, растворимые репрессоры и (или) активаторы не
принимают участия в регуляции активности этих генов. Если
происходит слияние линии непродуцирующего варианта миелом с им-
муноглобулинпродуцирующей линией, способность вырабатывать
иммуноглобулины не подавляется. Гибрид синтезирует иммуно-
глобулин только продуцирующего родителя.
Убедившись в том, что в гибридах миеломных клеток синте-
зируются иммуноглобулины обеих родительских линий, Келер
и Милстейн предприняли попытку слить миеломные клетки (ре-
зистентные к 8-азагуанину клетки P3/X63-Ag-8) с нормальными
клетками селезенки мышеи, иммунизированных эритроцитами ба-
рана. Некоторые из полученных гибридов продуцировали как
миеломный белок, так и антитела против эритроцитов барана.
Такие гибриды длительно росли в культуре. Следовательно, уда-
лось «обессмертить» продуцентов определенных антител, в дан-
ном случае антител против эритроцитов барана (G. Kohler,
С. Milstein, 1975).
В этих экспериментах была использована так называемая
полуселективная система ГАТ, когда только одна родительская
линия, а именно миелома P3/X63-Ag-8, была химически маркиро-
вана. Селекция гибридов основана на том, что в ГАТ среде ро-
дительские миеломные клетки погибают, а нормальные клетки
94
Таблица 8. Линии миелом мыши и крысы, используемые для образования
гибридом
Название Лини Я-источник Фенотип
иммуно- глобулины устойчивость
Линии мыши
4TQ.2 45.6TG 1.7 IfG2(Z) 6-тиогуанин, оуабаин
P3/X63 — Ag - 8 РЗК IgGI (х) 8-азагуанин
NSl/l.Ag4.1 P3/X63 - Ag- 8 (х), ие сек- ретирует 8-азагуанин,
FOX — NV NS! Нет 8-азагуанин, 2, 4-диаминопурин
SP2/0 — Agl4 Гиб ридом а (РЗ/ /Х63 - Ag- 8Х Bald/C) 8-азагуанин
P3/X63- Ag8.653 P3/X63—Ag—8 8-азагуанин
Линии крысы
2lO.RCY3Ag 1.2.3. 2IO.RCY3.Agl (х) 8-азагуанин
IR938F 21O.RCY3Agl.2.3 Нет 8-азагуанин
селезенки не обладают способностью расти при данных условиях
культивирования, так что выживают и размножаются только
гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток спо-
собность размножаться и синтезировать специфические имму-
ноглобулины.
Одним из препятствий для использования гибридомной тех-
ники являлось то, что в гибридах синтезировались не только
антитела клеток иммунной селезенки, но и иммуноглобулины
родительской миеломной линии, а также гибридные молекулы,
состоящие из полипептидных цепей как миелом, так и селезен-
ки. Эта проблема была преодолена путем использования миелом-
ных клеток, в которых отсутствовала экспрессия цепей иммуно-
глобулинов. Подобные варианты возникают довольно часто, и
разработаны методы отбора таких вариантов.
В табл. 8 приведен список основных линий миеломных клеток
мыши и крысы, широко используемых для конструирования
гибридом. Среди линий клеток мышей наиболее используются
NSI/l.Ag4.1 (NS1), SP2/0—Agl4 (SP2/0 и P3/X63—Ag8.653
(653) (в скобках приведены сокращенные названия линий).
Следует остановиться на одном благоприятном обстоятельст-
ве, способствующем широкому распространению гибридомной
технологии. Как отмечали Кёлер и Милстейн (1975), слияние
приводит как бы к обогащению в отношении антителообразую-
щих клеток. Гибридов получается больше, чем можно ожидать,
исходя из частоты слияния и доли специфических антителообра-
95
зующих клеток в популяции клеток селезенки. В среднем наблю-
дается 10-кратное обогащение. Возможно, это обусловлено из-
бирательным слиянием миеломных клеток с размножающимися
В-клетками селезенки либо связано с образованием продуцирую-
щих антитела гибридов через слияние не образующих антитела
клеток-предшественников или с какими-то другими факторами.
Эта проблема еще не решена, так как в действительности не
установлено, слияние с какими именно клетками, представлен-
ными в популяции клеток из иммунной селезенки, приводит к
формированию нужных гибридов. Скорее всего, это не зрелые
антителопродуцирующие клетки, а их быстроразмножающиеся
предшественники, но какие конкретно, пока не известно.
Гибридомная техника была с успехом использована и для
получения гибридов опухолевых лимфоидных клеток с Т-лимфо-
цитами. Получены гибридомы с сохранением дифференцирован-
ных функций Т-лимфоцитов: киллеры, супрессоры, хелперы. Эти
гибридомы синтезируют разнообразные иммунорегуляторные
факторы, что позволяет выделять и исследовать их структуру.
Получена и макрофагальная гибридома. Исследование этих гиб-
ридом внесло неоценимый вклад в изучение закономерностей
функционирования отдельных популяций Т-лимфоцитов и макро-
фагов, однако их использование не имеет пока биотехнологиче-
ского значения.
§ 2. Подготовительные этапы
перед проведением слияния
Полностью процедура получения моноклональных антител
включает в себя следующие этапы (рис. 43): иммунизация жи-
вотных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирую-
щих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирова-
ние, массовая наработка гибридомных клеток, получение куль-
туральной жидкости или асцита, содержащих антитела, и вы-
деление этих антител. Обычно вся процедура от момента начала
иммунизации до выделения антител занимает 3—4 мес.
Организация работы и оборудование. Для работы по полу-
чению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Экс-
перимент можно проводить и в части большой комнаты, макси-
мально удаленной от входной двери. Это помещение надо ос-
настить следующим оборудованием:
I. Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей сте-
рильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задержи-
вающих частицы крупнее 0,3 мкм.
2. Инкубатор, в котором автоматически поддерживаются влажность, тем-
пература и концентрация СО2(СО2-инкубатор).
3. Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с ох-
лаждением.
4. Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-контрастиым устрой-
ством.
5. Холодильник на +4 и на —20°С.
6. Водяная баня на 37 и 56°С.
96
Рис. 43. Основные этапы получения гибридом, синтезирующих моно-
клональные антитела
Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь мо-
юзильник на —70°С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хра-
тения клеток. Для получения гибридом нужно приобрести также
специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луноч-
ные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы
с площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для про-
ведения иммуноферментного и радиоиммунологического анали-
4—44
97
зов, среды для культивирования, необходимые реактивы, сыво-
ротку плода коровы (СПК).
Приготовление отдельных компонент сред для культивиро-
вания. Одной из частых причин неудач при получении гибридом
является недостаточно высокое качество сред и реактивов.
Поэтому крайне важно перед началом работы обеспечить
постоянное снабжение высококачественными реактивами и
средами.
Основными средами, употребляемыми при получении гибри-
дом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации
Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности среда
Дульбекко в модификации Пскова (эта среда особенно часто
используется при иммунизации in vitro). Среды выпускаются
в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих
порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении
сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при
этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления
сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в
кварцевой посуде вода.
Все среды и растворы стерилизуются путем фильтрации через
мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
Отдельные компоненты среды культивирования и среды се-
лекции готовят следующим образом:
1. 100-кратиый концентрат ГТ (гипоксантин, тимидин): 136,1 мг гипоксан-
тина и 38,75 мг тимидина добавить к 50 мл воды, затем по каплям при постоян-
ном перемешивании прибавлять 0,1 М NaOH до полного растворения реагентов.
Довести объем до 100 мл, профильтровать и заморозить при —20°С.
2. 100-кратный концентрат аминоптерина: 1,76 мг аминоптерина растворить
в 100 мл воды, профильтровать, разлить по порциям и хранить при —20°С.
Раствор амнноптерина необходимо предохранять от света.
3. Выбор сыворотки. Отбору сыворотки необходимо уделять особое внимание.
Сыворотки из различных источников сильно варьируют по свойствам. Надо
проверять также каждую партию сывороток. Наибольшей способностью поддер-
живать рост гибридных клеток обладает сыворотка плода коровы (СПК). Чаше
всего используют неинактивнрованную сыворотку, хотя некоторые исследователи
предпочитают инактивировать ее прогреванием при 56°С в течение 30 мин для
уменьшения возможной токсичности компонентов комплемента. СПК является
одним из самых дорогих компонентов среды культивирования, поэтому с ней
необходимо обращаться весьма экономно. Для культивирования клеток сразу
после слияния, а также для клонирования используют высокую концентрацию
СПК (15—20%). Как только гибридомы отобраны, их можно постепенно пере-
водить иа рост в 10% СПК. Если клетки хорошо адаптировались, то концент-
рацию СПК можно снизить до 5%.
В предварительных экспериментах определяют качество нескольких партий
сывороток н отбирают ту, которая дает наилучшие результаты. Проверку лучше
производить на способность поддерживать рост ранее полученных гибридомных
клеток при низкой плотности посева их в культуру. Если нет в распоряжении
готовых гибридомных клеток, то можно использовать миеломные родительские
клетки. Выполняют процедуру проверки следующим образом (G. Galfre, С. Mil-
stein, 1981): из клеток, взятых на логарифмической фазе роста, готовят четыре
суспензии, содержащие 2000, 1000, 500 и 250 клеток в 1 мл. Помещают по
150 мкл среды, .содержащей 20% тестируемой СПК, в луики I—6 96-луночного
планшета с плоским дном для культивирования. В лунки 7—12 вносят конт-
рольную сыворотку для сравнения. Закапывают по 20 мкл каждой суспензии
клеток в 24 лунки (2 горизонтальных ряда). Планшет помещают в СОг-инку-
98
батор. Через трое суток планшет просматривают и определяют наличие в лунках
живых клеток, а через 7—10 сут оценивают скорость роста.
Сыворотку, обладающую наилучшей способностью поддерживать рост клеток
при низкой плотности посева, употребляют только для роста клеток в критиче-
ских условиях: сразу же после слияния и при клонировании. Для роста клеток
при оптимальной плотности можно применять сыворотку со средней рост-поддер-
живающей активностью.
Отобранные партии сыворотки разливают по 50—100 мл и хранят при
—20°С.
Вместо СПК применяют и другие сыворотки: сыворотку новорожденных
телят, сыворотку коров, лошадиную сыворотку, кроличью сыворотку. Каждую
из этих сывороток необходимо проверить на способность поддерживать рост
клеток при низкой и обычной плотностях посева и употреблять в зависимости
от ее рост-поддерживающих свойств. В качестве одной нз мер экономии СПК
рекомендуют использовать ее в сочетании с другой, менее дорогой сывороткой.
Следует отметить, что в последнее время уделяется большое внимание
разработке бессывороточных (полностью синтетических) сред (S. Wolpe, 1984).
4. Раствор для слияния клеток. Агентом, ускоряющим слияние клеток, яв-
ляется полиэтиленгликоль. Способность ПЭГ индуцировать слияние возрастает
при увеличении его концентрации, однако при тех концентрациях, которые наи-
более эффективны в отношении слияния (35—50%), проявляются токсические
свойства ПЭГ. Способность вызывать слияние н токсические свойства зависит
от марки и партии ПЭГ, поэтому следует протестировать несколько образцов
ПЭГ и выбрать наиболее подходящий. Обычно используют ПЭГ с маркой от
1000 до 4000, причем ПЭГ 1000 более оптимален для слияния в моиослое,
а ПЭГ 4000 — в суспензии.
Важное значение имеет pH раствора ПЭГ. Максимальное число клонов по-
лучается при pH 8,0—8,5 (R. Westerwoundt. 1985). Некоторые авторы рекомен-
дуют проводить последнюю отмывку клеток перед слиянием средой с pH около
8,0. Эффективность слияния повышают, добавляя в раствор ПЭГ 5—15% ди-
метилсульфоксида (R. Westerwoundt, 1985). Для оптимизации процесса слияния
из среды удаляют сыворотку, так как она препятствует адгезии клеток. Сте-
рилизацию раствора ПЭГ часто производят автоклавированием, однако недавно
было показано (J. Kadish, К. Wenc, 1983), что выход клонов увеличивается
при использовании ПЭГ, стерилизованного фильтрацией.
Токсичность ПЭГ можно проверить в предварительных экспериментах. Для
этого обрабатывают раствором ПЭГ миеломные клетки при таких условиях,
в которых будет проводиться слияние, затем засевают обработанные клетки
в культуру при низкой плотности и сравнивают их рост с ростом необрабо-
танных клеток.
Для приготовления раствора ПЭГ берут 2 г ПЭГ 4000, помещают в про-
бирку и расплавляют в водяной бане при 70°С. К расплавленному ПЭГ добав-
ляют 0,4 мл диметилсульфоксида и 2 мл среды PPMI 1640. Пробирку оставляют
открытой иа воздухе до тех пор, пока pH раствора не станет щелочным (8,0—
8,5), о чем можно судить либо по измеиеиию окраски индикатора, присутст-
вующего в среде, либо непосредственным измерением pH. После этого теплый
раствор стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры и держат до опы-
та в термостате при 37°С.
Выбор экспериментального животного. Он определяется на-
личием родительских миеломных линий, возможностью получения
гибридов клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также
способностью к размножению полученных гибридом в организме
животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс.
Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей
и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет
сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих
животных. При иммунизации мышей берут линию Balb/C; это
связана с тем, что все имеющиеся миеломные линии, образую-
99
4*
щие гибридомы, получены от этих мышей. Однако сила иммун-
ного ответа у различных линий мышей может отличаться, и
бывают ситуации, когда необходимо иммунизировать мышей дру-
гой линии. В этом случае полученные гибридомы выращивают
на гибридах F> этой линии и линии Balb/C.
Иммунизация крыс проводится в тех случаях, когда требуется
получить антитела к антигенам мыши, для которых отсутствует
полиморфизм у разных линий мышей. Полученные гибридом-
ные клетки можно выращивать в организме крыс, если при-
менять миеломные клетки крыс, или в организме мышей после
подавления их иммунологической реактивности (см. ниже).
Другие животные практически не используются, хотя недавно
появилось сообщение о получении стабильных гибридов между
лимфоцитами кролика и мышиной миеломой (Кио и сотр., 1985).
При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается
на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого
материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирую-
щих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как
их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возмож-
ности для иммунизации применяют очищенные антигены, по
крайней мере на последних этапах иммунизации. Однако одним
из основных достоинств гибридомной технологии и является как
раз то обстоятельство, что специфические антитела против дан-
ного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочи-
щенный препарат антигена, и употреблять впоследствии эти
антитела для очистки антигена.
Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации со-
стоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих
антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в
функциональное состояние, при котором они способны сливаться
и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Как от-
мечалось выше, до сих пор неизвестно, какие именно клетки
способны гибридизироваться с образованием антителообразую-
щих гибридом. Экспериментально установлено, что для гибриди-
зации необходимо выделять селезеночные клетки животных че-
рез 3—4 сут после последнего введения антигена, т. е. тогда,
когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих
клеток.
Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы
антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности
являются сильными иммуногенами, тогда как большинство раст-
воримых белков — слабые иммуногены. В последнем случае
необходимо применять различные адъюванты, усиливающие им-
мунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение
получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого ис-
пользуют введение антигена, преципитироваиного на квасцах, и
введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis.
Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для раз-
вития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация
100
может иметь обратный эффект — отмечено, что иногда у клеток
гипериммунизированных животных снижается способность обра-
зовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно
и одной иммунизации.
По ходу иммунизации необходимо определять титр антител
к антигену (титр антител — величина, обратная разведению сы-
воротки, при которой степень иммунологической реакции сни-
жается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это
делают перед последней иммунизацией. В опыт отбирают жи-
вотных с высоким титром антител. Не следует ожидать хоро-
ших результатов гибридизации, если при иммунизации животных
нет образования антител или они образуются в низком титре.
Для большинства растворимых антигенов можно использо-
вать следующую схему иммунизации (J. Kearney, 1984).
1. Вводят 1—100 мкг антигена в ПАФ или в виде преципита-
та на квасцах внутрибрюшинно. Если есть возможность, то одно-
временно вводят 2- 109 убитых клеток В. Pertussis.
2.. Через 2—3 недели вводят антиген на физиологическом
растворе внутрибрюшинно или внутривенно. Эту процедуру
можно повторять до появления высокого титра антител.
3. Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 сут
животные забиваются и готовится суспензия клеток для гибри-
дизации.
При применении в качестве иммуногена различных клеток
(опухолевые клетки, чужеродные клетки крови, бактерии, пара-
зиты и т. д.) делают несколько инъекций без адъюванта внутри-
брюшинно с интервалом в 2—3 недели по (1—5) • 107 клеток.
Последнюю инъекцию делают внутривенно и через три дня вы-
деляют клетки селезенки для гибридизации.
Иногда для получения гибридов приходится прибегать к очень
массированным схемам иммунизации. В качестве примера можно
привести схему, предложенную Стели и сотр. (1980). Авторам
не удавалось получить гибридомы против хорионного гонадотро-
пина человека, применяя обычную схему иммунизации, несмотря
на то что титр антител в сыворотках животных был высоким.
Тогда авторы предположили, что для гибридизации важно, чтобы
клетки находились в стадии активной бласттрансформации под
действием антигена. Ими была выявлена высокая степень кор-
реляции между числом больших бластных клеток в популяции
клеток селезенки и образованием специфических антителообра-
зующих гибридов. Максимальный выход гибридов получался при
схеме иммунизации, представленной в табл.. 9.
При такой схеме иммунизации доля положительных клонов
достигала 40% (для сравнения — при иммунизации «сильными»
антигенами доля положительных клонов равна 1 —10%). Оче-
видно, что далеко не всегда можно использовать эту схему,
так как для нее требуется большое количество антигена (не-
сколько миллиграммов).
Заслуживает внимания предложенный недавно метод одно-
101
Таблица 9. Схема иммунизации, предложенная для получения
моноклональных антител против хорионного гонадотропина человека
(С. Stahli н сотр., 1980)
Номер введения антигена* Концентрация антигена, мкг Адъювант Способ введения**
1 50 ПАФ + 109 Подкожно и в/бр
2 50 Неполный адъювант
Фрейнда в/бр
3 10 То же в/бр
4 200 Физиологический
раствор в/в
5 400 То же в/в и в/бр
6 400 » в/в и в/бр
7 400 » в/в
* Интервалы между 1, 2, 3 и 4 введениями не менее 4 недель; интервалы между
4, 5, 6, 7 введениями и постановкой слияния — одни сутки.
** в/бр — внутрибрюшинно, в/в — внутривенно.
кр'атной иммунизации антигеном внутриселезеночно (М. Spitz
и сотр., 1984), при которой расходуется всего 20 мкг белка.
Несмотря на необходимость освоения техники хирургической
операции на животном, этот метод можно рекомендовать в тех
случаях, когда нужно быстро получить гибридомы, имея в рас-
поряжении минимальные количества антигена.
С целью повышения доли специфических антигенреактивных
клеток в популяции лимфоцитов, используемой для гибридиза-
ции, были применены методы адаптивного переноса и индукции
иммунного ответа в культуре вне организма (Р. С. Fox и сотр.,
1982). Постановка опытов заключается в следующем. Мышей
иммунизируют антигеном в ПАФ или в виде преципитата на
квасцах с месячными интервалами и отбирают животных, имею-
щих высокий титр антител в сыворотке. Этим мышам вводят
антиген, через 10 сут забивают и извлекают селезенку. Готовят
суспензию клеток селезенки и либо культивируют их вне орга-
низма, либо употоебляют в адаптивном переносе. Для культи-
вирования 2 • 10г клеток помещают в чашку Петри диаметром
60 мм в присутствии 10 мкг антигена в среде культивирования и
устанавливают на вращающуюся платформу для инкубации при
37°С в атмосфере азота (83%), СОг(10%) и Ог(7%). Через че-
тыре дня клетки собирают и используют для гибридизации.
В адаптивном переносе (25—40)" 106 клеток вводят внутри-
венно сингенным реципиентам, предварительно облученным (за
24 ч) дозой 5,5 Гр. Реципиентам затем вводят внутрибрюшинно
антиген (на физиологическом растворе). Через 4 сут мышей
забивают и выделенные клетки селезенки употребляют для гиб-
ридизации.
102
Несмотря на то что выход клеток после такого культивиро-
вания в несколько раз снижается; доля антигенспецифических
клонов после гибридизации возрастает до 50 раз.
В последнее время активно развиваются методы полной им-
мунизации вне организма с целью получения гибридом (С. Rea-
ding, 1982). Иммунизация in vitro имеет ряд существенных пре-
имуществ: а) укорачивается период иммунизации до 4—5 сут;
б) требуется существенно меньшее количество антигена; в) ко
многим антигенам можно получить более выраженный иммунный
ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и су-
прессии); г) повышается процент отвечающих клеток; д) легко
проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.
Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух
системах культивирования лимфоцитов, разработанных в конце
1960-х годов. Метод суспензионного культивирования (R. Mi-
shell, R. Dutton, 1966, 1967) был первым методом, в котором
иммунизация полностью проходила вне организма. Критическими
факторами в данном методе были низкая концентрация кисло-
рода в атмосфере (7%), высокая плотность клеток, легкое по-
качивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и вы-
бор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритро-
циты барана). Эта система была усовершенствована Р. Кликом
(1972), который предложил добавлять в среду 2-меркаптоэтанол,
предшественники нуклеиновых кислот, инсулин, глутамин, а так-
же дополнительные аминокислоты. При таких условиях иммун-
ный ответ наблюдали в отсутствие покачивания и в атмосфере
с 5% СО2.
Другой основной системой иммунизации in vitro является
метод Д. Марбрука (1967). Клетки культивируют в маленькой
камере на диализной мембране, через которую идет обмен средой
из большого резервуара.
Впервые иммунизацию in vitro с целью получения гибридом
осуществил в 1978 г. Г. Хенгартнер с сотр. Авторы отметили
возрастание частоты появления антигенспецифических гибридом
на порядок. Аналогичные результаты были получены и другими
исследователями. Современные направления в этой области свя-
заны с оптимизацией условий культивирования in vitro путем
подбора заменителей СПК или добавлением кондиционированной
среды. С успехом были использованы кондиционированные среды
от смешанной культуры тимоцитов (С. Reading, 1982), от стиму-
лированных форболмиристатацетатом клеток лимфомы EL-4
(М. Ма и сотр., 1984). Возможно, что действующим началом
в этих кондиционированных средах были различные хелперные
факторы, продуцируемые Т-клетками, и которые необходимы для
пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. Выявление
природы этих факторов и выделение их в чистом виде будет,
несомненно, способствовать развитию этой области.
Одним из основных недостатков иммунизации in vitro являет-
ся большая доля IgM-образующих Клонов. Это связано с тем,
103
что при иммунизации in vivo клетки берут во время вторичного
иммунного ответа, при котором образуются в основном антитела
IgG класса, тогда как in vitro реакция идет по первичному типу,
для которого характерна продукция IgM антител. Эта проблема
может быть преодолена после отработки способов получения
вторичного иммунного ответа in vitro.
$ 3. Приготовление сред для культивирования
и получение клеточных суспензий
Приготовление сред для культивирования.
Полная среда с 10% СПК готовится из следующих компонентов: 1) среда
RPMI 1640 или среда Игла в модификации Дульбекко, однократной концентра-
ции— 450 мл; 2) 5 мл 100 мМ раствора пирувата натрия; 3) 5 мл 100-кратного
раствора антибиотиков; 4) 5 мл 200 мМ раствора L-глутамина; 5) 0,25 мл
0,1 М раствора 2-меркаптоэтанола; 6) 5 мл 1 М буфера HEPES; 7) 50 мл
СПК.
Эту среду используют для культивирования миеломных клеток и при массо-
вом размножении гибридомных клеток. При начальном культивировании гибри-
домных клеток (сразу после гибридизации) и их клонировании концентрацию
СПК увеличивают до 15—20%. При использовании среды Дульбекко в нее до-
бавляют еще глюкозу до конечной концентрации 4,5 г/л.
Среды ГАТ и ГТ приготавливают путем добавления 5 мл соответствующего
100-кратного раствора к 500 мл полной среды.
Подготовка миеломных клеток. При выборе миеломных кле-
ток следует основываться на данных табл. 8. Необходимо учесть,
что клеточные линии изменяются и иногда их способность к слия-
нию падает или же синтез антител гибридными линиями стано-
вится нестабильным. Поэтому лучше иметь не одну какую-то
линию клеток, а по крайней мере три. Первые опыты по слиянию
нужно провести со всеми линиями, и клетки, которые дали наи-
лучшие результаты, заморозить в достаточном количестве.
Успех в получении гибридом в значительной мере определя-
ется правильной подготовкой миеломных клеток. При их культи-
вировании необходимо руководствоваться следующими требова-
ниями:
1. Как только в распоряжении исследователя появились ли-
нии клеток с хорошей способностью образовывать гибридомы,
необходимо размножить их и заморозить достаточное число
ампул.
2. Следует использовать клетки в течение не более одного
месяца после разморозки, так как у них постепенно падает спо-
собность образовывать гибридомы.
3. Клетки для слияния берут при логарифмической фазе рос-
та. До момента слияния клетки должны находиться в этой фазе
по крайней мере одну неделю.
4. Целесообразно периодически культивировать клетки в при-
сутствии токсического аналога нуклеотидов, использованного для
селекции данной линии. В некоторых лабораториях клетки куль-
тивируют в его присутствии постоянно, однако это вряд ли яв-
ки
ляется необходимым, можно добавлять реагент только на 48 ч.
Для большинства линий таким аналогом является 8-азагуанин
(табл. 8). Для приготовления 1000-кратного раствора взве-
шивают 15 мг вещества и растворяют в 1 мл диметилсуль-
фоксида.
5. Клетки обычно адаптируются к одному виду среды и плохо
переносят ее замену. Поэтому при получении клеток из другой
лаборатории необходимо культивировать их в той же среде,
которая использовалась в этой лаборатории. При отсутствии
такой возможности клетки надо постепенно адаптировать к но-
вой среде, для чего на промежуточном этапе используют смесь
двух сред.
6. Ни в коем случае нельзя допускать дорастания культур
до высокой плотности, при которой начинается массовая гибель
клеток. Если превышена плотность 106/мл, то лучше такую куль-
туру отбросить и разморозить новую партию клеток.
Клетки питающего слоя. Техника получения гибридом в сущ-
ности представляет собой выращивание клеточного потомства из
одной клетки, посеянной при очень низкой плотности. Известно,
что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в
значительной степени определяется наличием в среде в доста-
точном количестве различных питательных и стимулирующих
факторов. В связи с этим при получении гибридом часто ис-
пользуют клетки питающего слоя (feeder cells), которые снаб-
жают культуру различными жизненно необходимыми факторами.
Этот эффект будет проявляться тем сильнее, чем менее опти-
мальной является среда культивирования. При использовании
некоторых партий сывороток и сильно обогащенных сред эффект
клеток питающего слоя может и не выявляться.
В качестве клеток питающего слоя используют клетки селе-
зенки, тимоциты, перитонеальные макрофаги, мышиные фибро-
бласты и др. В. Лонг и сотрудники (1986) получили очень хоро-
шие результаты при использовании облученных диплоидных фиб-
робластов легкого человека (линии IMR-90. MRC-5, WI-38).
Чаще всего в качестве клеток питающего слоя используют
перитонеальные макрофаги. Желательно использовать сингенные
макрофаги, так как у аллогенных и ксеногенных макрофагов
величина стимулирующего эффекта обычно ниже, чем у син-
генных (S. Fazekas de St. Groth, D. Scheidegger, 1980; K. Me
Cullough и сотр., 1983). Обычно макрофаги получают от мышей
без предварительного введения им стимулятора из-за опасений,
что активированные макрофаги могут убивать гибридомные
клетки. В некоторых работах тем не менее используют предва-
рительное введение стимулятора: минерального масла (С. Rea-
ding, 1982), липополисахарида (К- McCullough и сотр., 1983).
Клетки питающего слоя можно добавлять либо вместе со
смесью миеломных и селезеночных клеток, обработанных поли-
этиленгликолем, либо за сутки до слияния, либо через сутки
после него.
105
Кондиционированные среды. Использование клеток питающе-
го слоя имеет ряд недостатков: 1) их приготовление трудоемко
и накладывает определенные ограничения по времени на при-
готовление гибридом; 2) они представляют собой потенциальный
источник бактериального загрязнения; 3) они метаболизируют
питательную среду, что создает необходимость часто менять ее;
4) растущие клетки в питающем слое могут перерастать или
убивать гибридомы; 5) клетки питающего слоя препятствуют
визуальной идентификации растущих колоний гибридом.
Всех этих недостатков лишены кондиционированные среды,
представляющие собой супернатанты культур, в которых росли
клетки питательного слоя. Кондиционированные среды в куль-
тивировании клеток используются давно в качестве средства
замены клеток питающего слоя. Для получения гибридом ис-
пользовались среды, кондиционированные эпителием человека
(G. Astaldi и сотр., 1980), клетками эндотелия (С. Pintus и сотр.,
1983), перитонеальными макрофагами (R. Sugosawara, 1985)
и мышинными фибробластами (К. Walker, 1986).
Приготовление среды, кондиционированной перитонеальными
макрофагами, осуществляют следующим образом (R. Sugosawa-
ra, 1985). Забивают взрослых мышей и выделяют перитонеаль-
ные макрофаги промыванием брюшной полости 10 мл полной сре-
ды культивирования с 10% СПК. Клетки отмывают центрифу-
гированием и засевают в пластиковые флаконы при плотности
3,3 • 104 кл/мл. Культуру помещают в СОг-инкубатор. Через
20 ч удаляют среду, содержащую неприкрепившиеся клетки,
добавляют свежую среду и культивируют 3 сут. По окончании
культивирования среду сливают, центрифугируют (1000g,
10 мин), супернатант фильтруют, разливают по порциям и хра-
нят при —20°С до момента использования.
Приготовление суспензии клеток селезенки. Все процедуры
выполняют при комнатной температуре (S. Fazekas de St. Groth,
D. Scheidegger, 1980).
1. Забивают животных, помещая их в камеру с кусочком сужэй угле-
кислоты на дне на 1—2 мин.
2. Погружают животное в 70%-ный этиловый спирт, извлекают, помещают
на препаровальный столик и закрепляют. В стерильных условиях извлекают
селезенку и помещают ее в чашку Петри, содержащую 5 мл среды RPMI 1640
с 2,5% СПК и слегка промывают ее. Ножницами делают несколько надрезов.
3. Переносят селезенку в стеклянный гомогенизатор со слабо притертым
пестиком, добавляют 5 мл среды RPM1 1640 с 2,5% СПК.
4. Осторожными надавливаниями пестиком растирают селезенку.
5. Полученную суспензию переносят в пробирку, дают суспензии отстояться
10 мин, затем надосадочную жидкость переносят в другую пробирку, не взбалты-
вая при этом осевшие комочки ткани.
6. Клетки отмывают два раза центрифугированием в среде без сыворотки.
7. Ресуспендируют осадок после второго центрифугирования в среде без
сыворотки и подсчитывают число живых лимфоцитов в камере для подсчета
клеток крови с помощью метода исключения красителя трипанового синего.
Жизнеспособность полученной суспензии должна быть выше 80%.
8. Обычно из одной селезенки мыши удается выделить около 10® ядерных
клеток.
106
$ 4. Слияние
Существует два основных варианта добавления ПЭГ, ис-
пользуемых в настоящее время. Первый метод заключается в
следующем (V. Oi, L. Herzenberg, 1980). В течение 1 мин добав-
ляют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГ при 37°С с постоянным
перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл
в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего
клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивиро-
вания.
Во втором методе используют более длительную обработку
клеток раствором ПЭГ (М. Gefter и сотр., 1977). К осадку
клеток добавляется 30—35% ПЭГ при комнатной температуре.
Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнат-
ной температуре еще на 5—7 мин. Затем их разводят в большом
объеме среды с сывороткой, отмывают и культивируют.
Иногда проводят обработку клеток полиэтиленгликолем в мо-
нослое (Т. МсКеагп, 1981). Одним из вариантов этого мето-
да является слияние клеток на фильтре (G. Buttin и сотр.,
1978).
Ниже приводится методика слияния на основе метода В. Ои
и Л. Херценберга (1980).
1. Нагреть 80 мл среды культивирования с 15—20% СПК и
20 мл среды без сыворотки до 37°С. Нагреть раствор ПЭГ до
37°С.
2. Приготовить суспензию клеток селезенки, как описано
выше.
3. Приготовить суспензию клеток миеломы, отмыть их один
раз в среде без СПК-
4. Смешать вместе 108 клеток селезенки и 107 клеток миеломы
(точное количество клеток миеломы не очень важно, их отноше-
ние с клетками селезенки может колебаться от 1:10 до 1:1).
Поместить клетки в центрифужную пробирку на 50 мл и
смесь центрифугировать при 400g 10 мин при комнатной темпе-
ратуре.
5. Удалить всю надосадочную жидкость, поместить пробирку
в водяную баню на 37°С и держать ее там в течение всего време-
ни обработки.
6. Через 1 мин с помощью пипетки на 1 мл добавить в тече-
ние 1 мин 1 мл теплого (37°С) раствора ПЭГ. Во время добав-
ления осторожно перемешивать осадок кончиком пипетки.
7. Продолжать перемешивать осадок еще 1 мин.
8. Той же пипеткой добавить 1 мл теплой среды без СПК
(вначале по каплям) в течение 1 мин, постоянно перемешивая
кончиком пипетки суспензию клеток.
9. Повторить этап 8.
10. С помощью пипетки на 10 мл добавить при постоянном
размешивании суспензии клеток еще 7 мл среды без СПК в те-
чение 2—3 мин.
107
И. Центрифугировать суспензию при 400g 10 мин при ком-
натной температуре.
12. Осадок ресуспендировать в 10 мл теплой среды с СПК-
Избегать сильного пипетирования.
13. Суспензию перенести во флакон, содержащий 70 мл теп-
лой среды с СПК-
14. Засеять по 0,2 мл этой суспензии в лунки четырех 96-лу-
ночных планшетов для культивирования клеток. Если в лунки
этих планшетов накануне были засеяны макрофаги (по 2 • 104)
в объеме 0,10 мл, то на этапе 13 суспензию надо разводить в
40 мл и засевать в каждую лунку по 0,1 мл. Макрофаги можно
добавлять и вместе со смесью миеломных клеток и клеток селе-
зенки, объединив их до разливки суспензии по лункам планше-
тов. На четыре планшета необходимо приблизительно 107 макро-
фагов (такое количество обычно удается выделить из 4—5 мы-
шей).
15. Поместить планшеты в СОг-инкубатор.
16. Через 24 ч с помощью пастеровской пипетки, подсоеди-
ненной к вакууму, удалить приблизительно 0,1 мл из каждой
лунки, не взбалтывая при этом клетки, осевшие на дно. Доба-
вить в каждую лунку по 0,1 мл среды ГАТ.
17. Повторить пункт 16 на 2, 3, 5, 8 и 11 сут и дальше через
каждые 3—4 сут.
18. Начиная с 7—10 сут можно просматривать при помощи
инвертированного микроскопа культуры и отмечать в них рост
колоний гибридомных клеток.
19. Через 2—4 недели после слияния из лунок с растущими
клетками отбирают по 0,1 мл надосадочной жидкости для вы-
явления в ней активности антител. Это делают через 3 сут после
замены культуральной среды.
20. Если находят культуру, представляющую интерес, то
клетки ресуспендируют и переносят в лунку 24-луночного план-
шета. В освободившуюся лунку 96-луночного планшета добав-
ляют свежую среду и продолжают инкубацию (запасная куль-
тура). Выращивание в 24-луночных планшетах необходимо вести
в присутствии клеток питающего слоя, в качестве которых
можно снова использовать макрофаги (по 105 клеток на лунку)
или тимоциты (1—2) -107 клеток на лунку) и клетки селезенки
(2-105 клеток на лунку). Начиная с этого этапа клетки куль-
тивируют в среде ГТ, а через неделю — в среде без добавления
нуклеотидов.
21. Культуру подкармливают каждые 2—3 сут, удаляя 1 мл
культуральной жидкости и добавляя 1 мл свежей среды.
22. После достижения клетками стадии слившегося монослоя
проверяют повторно активность антител в культуральной жид-
кости.
23. Если культура продолжает продуцировать интересующие
антитела, клетки клонируют (см. ниже), используя для этого
небольшую часть культуры.
108
24. Оставшуюся часть культуры размножают последователь-
ным переносом клеток в культуральные сосуды большего раз-
мера.
25. После получения достаточного количества клеток их замо-
раживают (по 2 -106 клеток на ампулу).
Как отмечалось выше, вместо клеток питающего слоя можно
использовать кондиционированную среду. Среду, кондициониро-
ванную перитонеальными макрофагами, добавляют к среде куль-
тивирования в соотношении 1:1.
Следует отметить, что многие исследователи предпочитают
добавлять систему ГАТ сразу же после слияния, а культуры
после слияния не трогать несколько дней (даже не открывать
СОг-инкубатор), что объясняется тем, что клетки после слияния
очень чувствительны к изменениям внешней температуры, на-
ступающим при вынимании планшетов из СОг-инкубатора. По-
скольку не проводилось сравнения этих методов в одной работе,
трудно отдать предпочтение какой-либо из этих методик.
$ 5. Клонирование гибридомных клеток
Клонирование осуществляется для выделения стабильных
клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибри-
домных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с
утратой хромосом. При культивировании могут появляться клет-
ки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут
перерастать антителообразующие гибридные клетки.
К основным методам клонирования клеток относятся клони-
рование методом лимитирующих разведений, клонирование в по-
лужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточ-
ного цитофлуориметра.
Клонирование методом лимитирующих разведений. Этот ме-
тод является наиболее распространенным. Если клетки посеяны
в 96-луночные планшеты очень редко, то доля лунок, в которой
наблюдается рост клеток, подчиняется распределению Пуассона
(I. Lefkovitz, Н. Waldmann, 1979):
ЦО) = е~\
где f (0) — фракция лунок, в которых отсутствует рост; 1 — сред-
нее число клеток на лунку.
При Х=1 f(0)=0,37. Другими словами, для того чтобы
получить разумную вероятность только одного клона в лунке,
в более 37% лунок не должно наблюдаться роста клеток. По-
скольку эффективность клонирования редко бывает равной
100%, клетки необходимо засевать при плотности 10, 3 и 0,5
клеток на лунку. В тех планшетах, на которых наблюдается
рост в половине лунок, содержатся изолированные клоны.
При первом клонировании активной, т. е. продуцирующей
антитела, может оказаться только небольшая часть клонов.
109
Необходимо всегда производить повторное клонирование, при ко-
тором доля положительных клонов будет возрастать.
Для клонирования надо применять клетки питающего слоя.
Используются те же виды клеток, что и для начального роста
гибридом. Важно употреблять отобранные, как описано выше,
партии сыворотки и добавлять ее в количестве 15—20%.
Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования
гибридом можно применять полужидкий агар (Р. Coffino и сотр.,
1972). Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Ниж-
ний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культи-
вирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй
слой — мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который вклю-
чаются клонируемые клетки. При использовании клеток питаю-
щего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара,
и среду культивирования удаляют непосредственно перед добав-
лением нижнего слоя агара.
Для приготовления агарового слоя смешивают равные части
среды культивирования двойной концентрации и 0,6% агар-агара
в дистиллированной воде, затем помещают в водяную баню на
43—44°С до употребления. Клетки добавляют в минимальном
объеме и сразу же заливают в чашку Петри, после чего остав-
ляют ее на некоторое время при комнатной температуре до за-
твердевания агара. Чашки помещают в СОг-инкубатор.
Колонии становятся видимыми через 7—14 сут. При помощи
бинокулярной лупы извлекают из агара колонии, пользуясь
пастеровкой пипеткой, и переносят в жидкую культуру. Разра-
ботаны методы выявления синтеза антител in situ путем наслое-
ния на поверхность агара раствора антигена, приводящего к
формированию зон преципитации вокруг положительных колоний
(W. Cook, М. Scharff, 1977).
Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра.
Д. Паркс с сотр. (1979) предложили модификацию проточного
цитофлуориметра, позволяющую осуществлять клонирование ин-
дивидуальных клеток. Для этого приготавливают флуоресцент-
ные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие
шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных
клетках, что позволяет выделять их на этом приборе.
После выделения тем или иным способом положительных
клонов клетки этих клонов размножают в достаточном коли-
честве и образцы их замораживаются.
§ 6. Замораживание и оттаивание
гибридомных клеток
Замораживания клеток. 1. Готовят среду для заморажива-
ния клеток, состоящую из среды культивирования, 20% СПК
и 10% диметилсульфоксида. Полученную среду стерилизуют
через фильтры и хранят при 4°С.
2. Осаждают клетки центрифугированием при 200g, 4°С, к
по
осадку добавляют необходимое количество холодной серы для
замораживания, исходя из количества размораживаемых ампул:
1 мл среды на (2—5) • 106 клеток. Клетки осторожно ресуспен-
дируют в этой среде.
3. Полученную суспензию разливают по 1 мл в стерильные
пластиковые ампулы на 2 мл с завинчивающимися крышками;
при этом следует избегать смачивания верхней части ампулы.
Плотно завинчивают ампулу пробкой.
Замораживание можно производить двумя способами.
1. Помещают ампулы в штатив, который ставят в коробку
из пенопласта с толщиной стенок около 1 см и с крышкой. За-
крытую коробку ставят на 1 сут в морозильник на —70°С,
после чего пробирки переносят в жидкий азот.
2. Клетки можно заморозить в парах жидкого азота. Для
этого изготавливают плотно закрываемую камеру (лучше всего
из пенопласта с толстыми стенками), укрепляют в ней штатив
для ампул на высоте 10—15 см выше дна, а также ампулы с
клетками и наливают на дно жидкий азот (в поставленную на
дно металлическую посуду). Камеру плотно закрывают и остав-
ляют на 1—2 ч, после чего ампулы переносят в жидкий азот.
Очевидно, что устройство камеры (толщина стенок, герметич-
ность) должно быть таким, чтобы за это время весь жидкий азот
не успел испариться.
При отсутствии в лаборатории резервуара с жидким азотом
клетки можно некоторое время (несколько месяцев) хранить при
—70°С (R. Patel et. al., 1984).
Размораживание клеток. Замороженные культуры вынимают
из сосуда с жидким азотом и быстро помещают в водяную баню
на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспен-
зию клеток переносят пастеровской пипеткой в пробирки на
50 мл, содержащие не менее 10 мл холодной питательной среды,
отмывают один раз 20—30 мл холодной среды и подсчитывают
число жизнеспособных клеток. Клетки засевают в разных раз-
ведениях, так как окраска трипановым синим часто не выявляет
значительную долю поврежденных клеток, которые могут погиб-
нуть в первые сутки культивирования.
$ 7. Методы выявления антител,
синтезируемых гибридомными клетками
Какой бы метод детекции антител ни был выбран, его надо
отработать до начала получения гибридом, так как потом на
это не будет времени. Основные требования к методу детекции —
надежность и быстрота. Проверке должно подвергаться сразу
большое число проб. Точное количественное определение титра
антител на данной стадии не требуется.
Первый этап скринирования — стерильный отбор проб, ко-
торый осуществляют с помощью пастеровских пипеток. Однако
при необходимости тестировать несколько сотен культуральных
ill
АНТИГЕН
ТВИН-20,
АЛЬБУМИН
КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ЖИДКОСТИ,
СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА
ДОБАВЛЕНИЕ КОНЪЮГИ-
РОВАННЫХ С ФЕРМЕНТОМ
АНТИТЕЛ ПРОТИВ 1g МЫШИ
Рис» 44. Схема проведения основных этапов иммунофермент-
ного метода
жидкостей используют многоканальные пипетки (Flow Labs, Анг-
лия) или специальные приспособления для переноса надоса-
дочных жидкостей сразу из 96 лунок.
Основными методами скринирования культуральных жидко-
стей с целью выявления антител к иммунизирующему антигену
112
являются иммуноферментный, радиоиммунологический и иммуно-
флуоресцентный методы.
Иммуноферментный метод. В данном методе используют ан-
титела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные фер-
ментом, и о результате реакции судят по появлению цветной
реакции. Принцип метода следующий (рис. 44). Растворимый
антиген или клетки связывают с лунками 96-луночного планшета
для микротитрования, приливают культуральную жидкость, в ко-
торой могут быть антитела, и после инкубации добавляют конъ-
югированные с ферментом антитела против иммуноглобулинов
мыши. После инкубации и отмывки в лунки наливают раствор
субстрата. Если в культуральной жидкости были антитела против
антигена, то они адсорбируются на антигене, на них в свою оче-
редь адсорбируются конъюгированные с ферментом вторичные
антитела и под действием фермента происходит разложение
субстрата и переход его в окрашенный продукт. Таким образом,
по появлению окраски судят о присутствии в культуральной
жидкости антител к иммунизирующему антигену.
В ИФМ используют следующие ферменты: щелочную фосфа-
тазу, 0-галактозидазу и пероксидазу хрена.
Ниже описывается вариант ИФМ с использованием перокси-
дазы хрена. Конъюгат иммуноглобулинов с пероксидазой готовят
следующим образом (L. Hudson, F. Нау, 1980).
Материалы:
иммуноглобулины кролика, 8 мг/мл в карбонатном буфере; 0,1 М перйодат
натрия; 0,001 М натрийацетатный буфер, pH 4,4; 0,1 М натрийкарбонатиый
буфер, pH 9,5; боргидрид натрия: 4 мг/мл в дистиллированной воде; глицерин.
Методика.
1. Растворить 4 мг пероксидазы хрена в 1 мл дистиллированной воды.
2. Добавить 200 мкл свежеприготовленного раствора перйодата и пере-
мешивать осторожно 20 мин при комнатной температуре.
3. Диализовать против натрийацетатного буфера в течение ночи при 4°С.
4. Добавить 20 мкл натрийкарбонатного буфера для доведения pH приб-
лизительно до 9,0—9,5 и сразу же добавить иммуноглобулины. Оставить при
комнатной температуре на 2 ч.
5. Добавить 100 мкл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия
и оставить при 4°С на 2 ч.
6. Диализовать против боратного буфера в течение ночи при 4°С.
7. Добавить равный объем 60%-ного глицерина в боратном буфере и хра-
нить при 4°С.
Конъюгат можно хранить длительное время (до 2—3 лет).
Проведение анализа культуральных жидкостей на содержа-
ние в них антител к иммунизирующему антигену производят
следующим образом.
Материалы:
растворимый антиген; 0,05 М карбонат-гидрокарбонатный буфер, pH 9,6 (ра-
створить в 1 л дистиллированной воды 1,59 г карбоната натрия и 2,93 г гидро-
карбоната натрия); фосфатно-солевой раствор (ФСР), pH 7,2 0,15 М, содержа-
щий 0,1% твин-20 (по объему); пероксид водорода; 0,15 М натрийцитратный
буфер: смешать 49 мл раствора лимонной кислоты (21 г/л) и 51 мл раствора
113
натрия фосфорнокислого однозамещенного (NaaHPOiX 2HjO, 35,6 г/л), довести
pH до 5,0; серная кислота 12,5%-ная; о-фенилендиамин; конъюгат пероксидазы
с IgG кролика против иммуноглобулинов мыши; специальные планшеты для
ИФМ или обычные планшеты на 96 луиок с плоским дном для микротитрования
нз полистирола.
Методика.
1. Развести антиген в карбонат-гидрокарбонатном буфере.
Оптимальную концентрацию необходимо определять для каждого
антигена, но диапазон концентраций 5—10 мкг/мл пригоден для
большинства антигенов.
2. Добавить по 100 мкл растворенного антигена во все лунки
и инкубировать 3 ч при 4°С в увлажненной камере (можно
оставить на ночь).
3. Отмыть лунки от антигена и заполнить их раствором ФСР-
Твин.
4. Инкубировать при комнатной температуре 3 мин и удалить
жидкость, перевернув планшет и встряхнув его над раковиной.
Твии-20 обладает способностью блокировать на пластике участки
неспецифического связывания, тем самым препятствуя адсорб-
ции на пластик белков, которые будут добавляться позднее.
5. Повторить этап отмывки два раза.
6. Добавить культуральную жидкость. Иногда ее разводят в
5—10 раз. Поставить планшет инкубироваться на 2 ч при 37°С
в увлажненной атмосфере.
7. Повторить отмывку так же, как на этапах 3 и 4.
8. Добавить 100 мкл конъюгата, разведенного в ФСР-Твин.
Точное разведение необходимо предварительно подобрать в экс-
перименте. В зависимости от титра исходной кроличьей анти-
сыворотки разведение может колебаться от 1:200 до 1:10 000.
9. Инкубировать при 37°С 2 ч в увлажненной камере.
10. Повторить процедуру отмывки (пункты 3 и 4).
11. Пока планшет инкубируется во время отмывки, необходи-
мо приготовить субстрат. Для этого добавляют 34 мг о-фени-
лендиамина и 50 мкл пероксида водорода к 100 мл натрийцит-
ратного буфера. Раствор субстрата необходимо каждый раз го-
товить свежим и немедленно использовать. До момента разливки
держать в темном сосуде.
12. Добавить 100 мкл субстрата в каждую из лунок и оста-
вить в темноте при комнатной температуре для развития окраски
на 30 мин.
13. Реакцию останавливают добавлением 25 мкл серной кис-
лоты .
14. Учесть результат по появлению окраски субстрата визу-
ально или на фотометре с горизонтальным ходом луча при
492 нм.
Выше описан вариант постановки реакции ИФМ для раство-
римых белков. В случае клеток реакцию проводят аналогично,
связав клетки с пластиком каким-либо способом (R. В. Effros et
al., 1985).
114
Радиоиммунологический метод. Постановку РИМ осуществля-
ют следующим способом. На предварительном этапе готовят
препарат иммуноглобулина кролика против иммуноглобулинов
мыши и метят его радиоактивным иодом. Приготовление мече-
ных вторичных антител проводят следующим образом.
Материалы:
сефадекс G-50 тонкий: сефадексу дают набухнуть в фосфатно-солевом раст-
воре в течение 24 ч; фосфатно-солевой раствор (ФСР), pH 7,2, 0,15 М; хлор-
амин-Т: 0,2%-ный раствор в 0,3 М натрийфосфатном буфере, pH 7,3, приготов-
ленный непосредственно перед использованием; раствор тирозина, насыщенный
в воде; 1%-иый БСА-ФСР: 1%-ный раствор БСА в ФСР, pH 7,3; раствор
меченого иода: иодид натрия, меченный иодом-125, 13—17 мКи/мкг иода;
раствор антител (иммуноглобулинов кролика), 1 мг/мл в ФСР; одноразовая
пластиковая пипетка на 5 мл; стекловата, пленка «Парафильм». стеклянные
пробирки.
Методика.
1. Приготовить колонку из пластиковой пипетки на 5 мл, об-
резав ее на несколько сантиметров выше градуировки, заполнить
ее кончик небольшим количеством стекловаты и укрепить в шта-
тиве. Вместо пластиковой пипетки можно использовать пастеров-
скую пипетку, сделав на ней-ртметку на 5 мл.
2. Заполнить колонку до отметки 5 мл сефадексом G-50 в
ФСР.
3. Пропустить через колонку 3—4 мл 1%-ной БСА-ФСР.
4. Промыть колонку несколькими миллилитрами ФСР, оста-
вить около 0,5 мл ФСР над слоем сефадекса.
5. Закрыть с двух сторон колонку с помощью пленки «Пара-
фильм» и оставить ее в таком виде до момента использования.
6. Добавить в стеклянную пробирку последовательно и быст-
ро: 10 мкл раствора иода-125, 10 мкл хлорамина-Т, 20 мкл раст-
вора антител.
7. Пробирку хорошо встряхнуть и инкубировать 15 с —
2 мин. Добавить 25 мкл тирозина, 50 мкл 1 %-ного,БСА-ФСР и
200 мкл ФСР.
8. С помощью пастеровской пипетки осторожно перенести
полученную смесь на колонку, приготовленную согласно этапам
1—6.
9. Нанести три раза по 0,2 мл ФСР, затем еще 0,5 мл ФСР.
10. Элюат отбросить.
11. Нанести 1,5 мл ФСР. Собрать элюат, содержащий мече-
ный белок.
12. Развести 10 мкл раствора меченых антител в 1 мл ФСР
и отобрать из полученного разведения 10 мкл для просчета на
•у-спектрометре. При стандартной процедуре следует ожидать
счета порядка 5 • 105 импульсов в минуту на 1 мкл колоночного
элюата.
13. Разлить по маленьким порциям и хранить при —20°С.
Полученный препарат можно использовать в течение 1—2 мес.
Перед началом проведения РИМ производят сенсибилизацию’
115
планшетов антигеном. Для белковых антигенов процедуру вы-
полняют следующим образом:
Материалы:
ФСР; раствор белкового антигена: 20—100 мкг/мл в ФСР, содержащий
5 мМ ЭДТА, 0,1%-ный раствор азида натрия; БСА-ФСР: 10% БСА в ФСР;
планшеты для микротитрования: специальные 96-луночные планшеты для микро-
титрования из поливинилхлорида:
Методика.
1. Внести по 50 мкл раствора антигена в лунки планшет.
2. Инкубировать планшеты в течение ночи при 4°С.
3. Удалить раствор антигена. Этот раствор можно собрать
и использовать повторно два-три раза, предварительно проверив
его активность.
4. Заполнить лунки БСА-ФСР и инкубировать планшеты при
комнатной температуре 3—4 ч. На этой стадии планшеты можно
хранить при 4°С до одной недели.
5. Удалить БСА-ФСР.
Раствор БСА используется так же, как и Твин-20, для умень-
шения неспецифической сорбции белков.
Проведение РИМ с целью выявления антител в культураль-
ных жидкостях осуществляют следующим образом (G. Galfre,
С. Milstein, 1981).
Материалы:
ФСР-10% СПК: ФСР, содержащий 10% СПК (или 1% БСА) и 0,1%
азида натрия; меченные иодом-125 вторичные антитела (приготовленные, как
описано выше, и разведенные до 5 • 104 имп/мин • 50 мкл); планшеты для
микротитрования, сенсибилизированные антигеном; вставка для центрифугиро-
вания планшетов (используется для центрифугирования в охлаждаемой центри-
фуге антигена, плохо связывающегося с дном лунок, например клеток); резак
из горячей проволоки (приспособление, содержащее вольфрамовую нить, на-
греваемую электрическим током регулируемой силы. Используется для разрезания
гибких планшетов на отдельные лунки).
Методика.
1. Сенсибилизируют планшеты как описано выше. При ис-
пользовании в качестве антигена клеток их суспендируют в
ФСР-СПК и вносят в каждую лунку по 50 мкл суспензии, со-
держащей от 5 • 103 до 6 • 104 клеток.
2. Добавляют в лунки по 50 мкл исследуемых культуральных
жидкостей. Необходимо поставить отрицательный контроль, ис-
пользуя только среду культивирования. Желательно поставить и
положительный контроль с применением либо сыворотки им-
мунных животных, либо ранее проверенного раствора антител.
3. Перемешать содержимое лунок с помощью встряхивателя
планшетов (10 с).
4. Закрыть планшеты и поставить инкубироваться при 4°С на
45—60 мин.
5. Отмыть лунки: а) при использовании покрытых раствори-
мым антигеном планшетов заполнить каждую лунку 150 мкл
ФСР-10% СПК и удалить содержимое, перевернув планшет и
116
встряхнув его, после чего энергично потрясти его над ракови-
ной. Повторить процедуру два раза; б) для отмывания лунок,
содержащих клетки, планшеты центрифугируют при 4°С 5 мин
при 400g. Жидкость удалрют отсасыванием.
6. Добавить 50 мкл меченых вторичных антител.
7. Закрыть планшет и поставить на встряхиватель на 10 с.
8. Инкубировать при 4ЬС 45—60 мин.
9. Отмыть планшеты, как описано выше, добавив по крайней
мере один добавочный цикл отмывки.
10. Высушить планшет в суховоздушном термостате при 37°С
и разрезать его на отдельные лунки, пользуясь резаком из горя-
чей проволоки. Чтобы не перепутать лунки, целесообразно при-
менить липкую ленту, приклеенную со стороны дна планшета.
11. Пользуясь пинцетом, перенести лунки во флаконы для
счета радиоактивности.
$ 8. Массовая наработка моноклональных антител
После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интере-
сующие исследователя антитела, можно приступить к их массо-
вому наращиванию с целью получения больших количеств моно-
клональных антител. В начале культивирования гибридомные
клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плот-
ность посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо раз-
водить не более чем в 3—5 раз. Ускорению роста клеток может
способствовать добавление клеток питающего слоя. Гибридом-
ные клетки необходимо поддерживать в логарифмической фазе
роста и избегать превышения концентрации клеток выше
0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать как в стационарной
культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культи-
ваторах (ферментерах).
Для получения максимальной продукции моноклональных ан-
тител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой
культуре через определенное время наблюдается гибель гибри-
домных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный
осадок отбрасывается, т. е. не пытаются культивировать дальше
оставшиеся в живых клетки.
При обычных методах культивирования концентрация анти-
тел в культуральной жидкости лежит в пределах 10—100 мкг/мл.
Более высокие концентрации удается получить в ферментерах
при использовании сред с низким содержанием СПК и добавле-
нием определенных препаратов [препараты приматон RL и плу-
роник F-68; (S. Reuveny et al., 1986)] —до 660 мкг/мл. Важ-
ным направлением исследований является подбор бессывороточ-
ных сред, применение которых значительно облегчает последую-
щие этапы очистки моноклональных антител.
Для получения больших количеств антител вводят гибридом-
ные клетки в организм животных и получают от них асцитную
жидкость. Предварительно животным вводят агенты, повышаю-
117
щие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестве
такого агента чаще всего выступает пристан (2, 6, 10, 14-тетра-
метилпентадекан)— 0,5 мл за 10—14 сут до введения клеток,
однако можно вводить и неполный адъювант Фрейнда (U. Muel-
ler, 1986). Асцитная жидкость в этом случае содержит анти-
тела в более высокой концентрации и ее можно собирать не-
сколько раз начиная с 14 сут после введения неполного адъю-
ванта Фрейнда.
Вводимые гибридомные клетки и организм реципиента долж-
ны быть идентичны по антигенам гистосовместимости. Если слия-
ние проводили между мышиной миеломой (линия Balb/C) и
клетками селезенки мышей линии С57В1/6, то реципиентом долж-
ны быть гибриды этих линий — (Balb/CxC57Bl/6)Fi.
Гетерогибридомы, полученные слиянием клеток мышиной мие-
ломы и лимфоцитов другого вида (человек, крыса), можно вво-
дить мышам, у которых подавлена иммунологическая реактив-
ность. Для этого либо используют бестимусных мышей nude, ли-
бо проводят предварительную обработку животных. Д. Вейссман
и сотр. (1985) предлагают следующую схему подготовки мышей:
животным вводят 0,5 мл пристана за 2—10 недель до опыта.
За четыре дня перед введением гибридомных клеток животные
получают внутримышечно 3 мг гидрокортизонацетата, затем че-
рез два дня их облучают в дозе 6 Гр. Гибридомные клетки
вводят внутрибрюшинно в дозе 107 клеток. На таких животных
получается хороший рост гетерогибридом. Однако ксеногибридо-
мы (например, гибриды и миеломных и селезеночных клеток
крысы) на таких животных не растут. Для преодоления транс-
плантационного барьера авторы предложили проводить вторую
гибридизацию, сливая крысиные гибридные клоны с миеломными
клетками мыши. Используя уабаин-резистентный вариант клеток
SP2/o, авторы смогли изолировать новые гибридные клетки на
среде ГАТ-|-уабаин. Полученные гибридомы обладали способ-
ностью расти на иммунодепрессированных мышах.
§ 9. Очистка антител
Для многих целей не требуется очистка антител, и они ис-
пользуются в виде культуральных жидкостей или асцитных
жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую фракцию можно полу-
чить высаливанием белков сульфатом аммония (45% насыще-
ния) с последующим диализом. Если антитела необходимо выде-
лить в чистом виде, то предварительно определяют их класс и под-
класс, так как способы очистки различаются для антител разных
классов. Это можно сделать с помощью метода иммунодиффу-
зии по Ухтерлони. Антитела из культуральной жидкости концент-
рируют в 10 раз, для чего их высаливают сульфатом аммония,
диализуют и разводят в объеме 1/10 от первоначального объема.
Для идентификации класса антител используют набор антисыво-
118
роток, специфических к отдельным классам и подклассам анти-
тел. Эти антисыворотки производятся многими фирмами.
Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуно-
сорбентах, представляющих собой ковалентно сшитый с каким-
либо носителем антиген. Обычно носителем служит сефароза.
Иммуносорбентом являются также и фиксированные клетки —
их применяют для выделения антител к антигенам клеточной
поверхности. При этом методе, однако, есть опасность, что при
фиксации изменяется антигенная структура клеточной поверх-
ности.
Если не удается выделить антитела прямым способом, то по-
лучают иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных
методов аффинной и ионообменной хроматографии. Наиболее
простым методом является хроматография на сефарозе с при-
шитым ковалентно белком А. Белок А — продукт бактериальных
клеток (Staphylococcus aureus), обладающий высоким сродст-
вом к Fc фрагменту антител. На такой колонке можно очистить
IgG мыши (подклассов IgG2a, IgG2b, IgG3). Недавно предло-
жен метод с использованием другого белка бактериального
происхождения — белка G (из стрептококков группы G, штамм
G-148) (В. Akerstrom et al., 1985), который имеет более широ-
кий спектр связывания иммуноглобулинов, в том числе взаимо-
действует с иммуноглобулинами крысы, которые почти не обра-
зуют комплексы с белком А.
§ 10. Моноклональные антитела человека
Моноклональные антитела находят очень широкое примене-
ние, в том числе для диагностики и терапии различных заболева-
ний человека. Например, антитела против опухолевых антиге-
нов, сшитые с токсинами (иммунотоксины), могут быть приме-
нены для селективного убивания опухолевых клеток в организме
человека. Такие антитела несложно получить, используя для им-
мунизации мышей или крыс и последующее конструирование
гибридом. Однако употребление этих антител очень ограничено,
так как при их введении в организм человека (особенно пов-
торном) возникают реакции на гетерологичный белок. Поэтому
крайне желательно получать моноклональные антитела чело-
века.
Человек не может служить экспериментальной моделью, и
поэтому обычные способы получения антител (т. е. с использова-
нием активной иммунизации) невозможны. В связи с этим одним
из направлений исследований является разработка способов им-
мунизации вне организма. Уже имеются сообщения об успеш-
ной иммунизации против ряда антигенов, проведенные пол-
ностью in vitro (N. Yamaura и сотр., 1985; М. Но и сотр., 1985).
Другой сложностью является сама техника получения ста-
бильных антителообразующих линий человека. В настоящее вре-
мя для получения моноклональных антител применяют несколь-
119
ко подходов: а) обработка В-лимфоцитов человека вирусом Эп-
штейна—Барр; б) гибридизация с миеломными клетками;
в) комбинация этих двух методов.
Вирус Эпштейна—Барр является лимфоцитотропным виру-
сом. Он проникает в клетки, адсорбируясь на рецепторе C3d ком-
понента комплемента. Вирус трансформирует клетки, в результа-
те чего у них появляется способность бесконечно размножаться
в культуре, при этом сохраняется продукция 1g, преимуществен-
но IgM класса.
Гибридомы человека получают аналогично гибридомам мыши.
В большинстве случаев сливают с помощью ПЭГ активирован-
ные В-клетки либо с миеломными клетками, дефективными по
ГГФРТ, либо с клетками, у которых нет этого дефекта, при-
меняя в данном случае селективную среду с диэтилпирокарбо-
натом. Для индукции слияния некоторые исследователи исполь-
зуют электрический разряд.
Гибридомы человека секретируют очень низкий уровень анти-
тел (50 нг — 10 мкг/мл) в основном IgM класса. Это может
быть связано с особенностями родительских миеломных линий
человека, выбранных для слияния. Имеющиеся в настоящее вре-
мя линии человека не являются истинными плазматическими
клетками, как в случае миелом мыши, а принадлежат скорее
всего к менее дифференцированным лимфобластоидным клет-
кам.
Вероятно, наиболее перспективным подходом к получению
моноклональных антител служит комбинация методов трансфор-
мации клеток под действием вируса Эпштейна — Барр с сомати-
ческой гибридизацией клеток (см. N. Chiorazzi, 1986). В этом
случае первоначально В-лимфоциты человека стимулируют виру-
сом Эпштейна—Барр, затем выделяются культуры, продуцирую-
щие антитела нужной специфичности, и клетки этих культур гиб-
ридизуются с родительскими линиями, имеющими два маркера:
дефект по ГГФРТ и резистивность к уабаину. Полученные в
результате гибридные клоны более стабильны и характеризуются
более высоким уровнем продукции антител.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время создается новое биотехнологическое на-
правление с использованием свободноживущих клеток много-
клеточных организмов для получения ценных физиологически
активных соединений, используемых в медицине и народном хо-
зяйстве. Одна из задач этой новой области — разработка ме-
тодов, способов, приемов клеточной инженерии, что может спо-
собствовать созданию новых форм продуцентов или формиро-
ванию принципиально новых способов их культивирования.
В настоящей книге нашли отражение разные стороны иссле-
дований в области клеточной инженерии растительных и живот-
ных клеток. Одна из задач клеточной инженерии, как это сле-
дует из представленного в книге экспериментального материала,
состоит в создании клеточных систем с новыми свойствами на
основе клеточных взаимодействий. Были приведены примеры экс-
периментальных решений этих задач, известных в мировой ли-
тературе, а также полученных на кафедре клеточной физиологии
и иммунологии МГУ им. М. В. Ломоносова. Так, в проводимых
на кафедре работах по клеточной инженерии с растительными
объектами и микроорганизмами выявлено большое число видов,
способных формировать искусственные ассоциации разного типа.
Во многих случаях продемонстрировано улучшение ростовых и
биосинтетических параметров культивируемых клеток (тканей)
в присутствии микроорганизмов и способность их к регенерации
растений. Растения при этом способны включать клетки микро-
организмов в свои ткани и иногда — в клетки, получая выгоду от
присутствия симбионта при дефиците источников питания. Все
это представляет интерес сточки зрения перспективы исполь-
зования метода смешанного культивирования на основе расти-
тельных клеток в биотехнологии с целью, во-первых, поиска
новых субстратов для промышленного получения биомассы
культивируемых растительных клеток и удешевления производ-
ства на их основе экономически важных продуктов и, во-вторых,
получения устойчивых ассоциаций растений-регенерантов с азот-
фиксирующими организмами, обеспечивающими рост растений
при дефиците минерального азота.
Выполняемая на кафедре работа по гибридомной технологии
связана с совершенствованием методов иммунизации вне орга-
121
низма и изучением механизмов активации В-лимфоцитов. Это
особенно важно для получения моноклональных антител чело-
века.
Изложенный в книге материал не претендует на исчерпы-
вающее описание тех технологий, которые уже созданы или
могут быть созданы на основе культивируемых клеток. Более
того, в ряде случаев (гл. 1—3) акценты несомненно перенесены
на биологическую характеристику самих этих новых экспери-
ментально созданных биообъектов, а также на^описание методов,
применяемых для выращивания и манипулирования с ними. Та-
кой подход представляется важным для введения читателя в эту
новую область ориентированного на практику исследования.
Для настоящего этапа рассматриваемого направления работ
характерен эмпирический подход в постановке экспериментов по
конструированию новых клеток и клеточных систем. Однако
накопленный экспериментальный материал создает уже теперь
хорошую основу для перехода к целенаправленному, прогнозируе-
мому подбору объектов и способов клеточного конструирования.
Одним из условий дальнейших успехов на пути получения
клеток и клеточных систем с новыми свойствами является уг-
лубление знаний, касающихся фундаментальных основ биологии:
механизмов регуляции процесса клеточной дифференциации,
физиологии протопластов как объекта биологической трансфор-
мации клеток, взаимоотношений клеточных органелл. Сле-
довательно, прогресс в развитии клеточной инженерии и ис-
пользовании получаемых с ее помощью новых, создаваемых
искусственным путем биологических объектов будет в значитель-
ной степени определяться успехами в области клеточной биологии
и клеточной физиологии.
ЛИТЕРАТУРА
Глава 1.
Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза
растений. — М.: Наука, 1964.
Бутенко Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре
клеток растений. — М.: Наука, 1975.
Бутенко Р. Г. Выращивание клеток высших растений в суспензиоииой
культуре // Известия АН СССР. 1977. № 5. С. 697—709.
Культура клеток растений. — М.: Наука, 1981.
Культура клеток растений и биотехнология. — М.: Наука, 1986.
Глава 2.
Бутенко Р. Г. Гибридизация соматических клеток. Молекулярные механизмы
генетических процессов. — М.: Наука, 1979. С. 43—88.
Бутенко Р. Г. Перспективы использования культивируемых клеток растений
в биотехнологии. Биотехнология. — М.: Наука, 1984. С. 139—147.
Бутенко Р. Г., Кучко А. А. Физиологические аспекты получения, культи-
вирования и гибридизации изолированных протопластов картофеля // Физиоло-
гия растений. 1979. Т. 26. Вып. 5. С. ПО.
Глева Ю. Ю., Сытник К- М. Клеточная инженерия растений. — Киев: Науко-
ва думка, 1984. 160 с.
Cocking Е. С., Evans Р. К The Isolation of Protoplasts. Plant Tissue and
Cell Culture. Ed. Street H. E., Oxford, 1973, p. 100—120.
Nagata T. Fusion of Somaric Cells. Cell interact. Berlin e. a., 1984, p. 491 —
507.
Plant Protpplats. Ed. Giles K. L. Intern. Rev. Cytol. V. 16 suppl. N-Y — L.,
1983.
Rao P. S. Protoplast culture. Exp. Embryol. vascular Plant. Berlin e. a., 1982,
p. 231—262.
Глава 3.
Бутенко P. Г. Перспективы использования культивируемых клеток растений
в биотехнологии. Биотехнология. — М.: Наука. 1984. С. 239—247.
Корженевская Т. ГБутенко Р. Г., Гусев М. В. Ассоциации цианобактерий
с культивируемыми клетками н тканями высших растений // Сб. Культура кле-
ток растений и биотехнология. — М.: Наука, 1986. С- 225 — 242.
Юркова Г. И., Левенко Б. А. Искусственные симбиотические азотфиксирую-
щие системы. Молекулярная биология. — Киев: Наукова думка, 1978. В. 19.
С. 63—77.
Fowke L. С., Gamborg О. L. Applications of Protoplasts to the Study of Plant
Cells. Int. Rev. Cytol., 1980. V. 68, p. 9—51.
123
Giles К- L., Vasil I. K- Nitrogen Fixation and Plant Tissue Culture. Int. Rev.
CvtoL, 1980. V. suppl. 11B, p. 81—99.
Stewart W. D. P., Powell P., RaiA.N. Cyanobacteria-Eukaryotic Plant Sym-
bioses. Ann. Microbiol (Inst. Pasteur), 1983. V. 134 B, p. 205—228.
Глава 4.
Моноклональные антитела//Гибридомы: новый уровень биологического ана-
лиза / Под ред. Р. Г. Кеннета, Т. Дж. Мак-Керна, К. Б. Бехтол. — М.: Меди-
цина, 1983.
Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D. Production of monoclonal Anti-
bodies: Strategy and Tactics. — J. of Immunol. Methods, 1980. V. 35, p. 1—21.
Galfre, G., Milstein C. Preparation of Monoclonal Antibodies, Strategies and
Procedures. In “Methods in Enzymology”. N-Y., 1981. V. 73, p. 3—45.
Coding J. L. Antibody Production by Hybridomas. — J. of Immunol. Methods,
1980. V. 39, p. 285—308.
O’Hare M. J. Monoclonal Antibodies of Murine and Human Origin: their
generation, Characterization and Use. — In "Immunogenetics”. Ed. by G. S. Pa-
nayi, C. S. David, Butterworth, London, 1984, p. 296—399.
Westerwoudt R. J. Improved fusion Methods. IV. Technical Aspects. — J. of
Immunol. Methods, 1985. V. 77, p. 181 —196.
ПРЕДМЕТНЫЙ
УКАЗАТЕЛЬ
Антитела 6, 89, 90
— гомогенные 90
— моноклональные 6, 7, 8, 90, 91, 96,
97, 122
--- массовая наработка 117
---получение 6
---.сыворотки поликлональные, со-
поставление свойств 91
--- человека 119
— очистка 118
Ассоциации 52, 73, 77, 85—87
— внутриклеточные 52
— искусственные 52, 53, 55, 60, 62, 65,
67, 84, 86—88
---азотфиксирующие 76
---и цианобактерии 67—69, 73
— межклеточные 52
— партнеры 57, 61
— с азотфиксирующими свободно-
живущими бактериями 64
— с грибами 66
— с зеленой водорослью 66
— с клубеньковыми бактериями 61
— цели создания 53, 61
Биологическое конструирование 51
Биотраисформация 26
Время генерации клетки 8
— удвоения популяции 8
Выбор экспериментального животного
99
Гибрид 46, 48
— соматический 48
Гибридизация соматическая 46—48
---схемы 48
Гибридомная техника 6, 7, 95, 96
— технология 121
Гибридомы 90, 92, 95, 97, 98, 100—103,
106, НО, 119, 120
— культивирование 98
--- приготовление компонент сред 98
методы получения 91
Гибридомные клетки 96, 100, 104, 117
--- клонирование 109
Дедифференцировка 13—17
— клеток экспланта 14
Дифференциация 8, 122
— эмбрионов 41
Дифференцировка 8, 25, 28, 103
Иммунизация 89
— способы 100—104
— схема 102
Иммунная система 89
Иммунный ответ 89
Инокулюм (трансплант) 8
Каллус 8, 11, 15, 38, 46, 47, 50, 62, 64,
66, 77—80, 84—86, 88
— первичный 14,15, 17
Каллусная ткань 19, 21—23, 26
Каллусогенез 13, 14
Клетки 5, 7
— биологическая трансформация 122
— гибридомные 92, 95, 100, 108, 109
— животных и растений 5
------ гибридизация 5
----культивируемые 7
— замораживание 110
каллусные 13, 14, 18. 20. 28
---- характеристика 18
— культивируемые 5, 7, 10
— миеломные 92, 94, 96, 99, 108, 118
---- подготовка 104
— питающего слоя 105
— популяция 9
— размораживание 111
—'растений культивирование 18
----состав питательных сред 18
----на искусственных питательных
средах 7
----повышение продуктивности куль-
тур 53, 54
— слияние 107
— соматические 5, 7, 42, 46
----гибридизация 7, 5, 43, 46, 48
----методы гибридизации 5, 12
— тканевые 5
Клеточная инженерия 5, 52, 121
— селекция 8, 13
Клеточная технология 6
Клеточное конструирование 7
----путем гибридизации 7
Клеточные контакты 70
— органеллы 49
---- перенос 49
— системы 67, 121, 122
125
--- конструирование 67, 122
— суспензии 104
--- получение 104
--- приготовление сред для культи
вироваиия 104
Клонирование 104, 110
Клоповая селекция 28
Клоны 8, 27, 29, 89, 90, 96, 101, 109, 110
Кондиционирование среды 106
Конструирование биологическое 5
— отдельных клеток 27
— способы 5
Культура каллуса 29, 35
— клеток 5, 7, 8, 26, 76, 97
---животных 7
— пересадочная 13
--- тканей и органов растений 11
---—---------методы И
-------------история развития 11 -
13
— меристем 12
— опухолевых тканей 9
— отдельных клеток 9
— смешанная 73, 75, 77—79, 86, 88
--- биосинтетическая активность 73
— суспеизиониая 21, 65
— эксплаитов 9
Линии 9, 26, 94, 95, 104, 105
— гибридные 28
— миеломных клеток 94, 95. 99
— мутантные 28, 49
— родительские 94
— трансформированные 28
Метаболизм 26
— первичный и вторичный 26
Метод(ы) выявления антител 111
— иммунизации 121
— иммунологические 89
— иммуиоферментный 112, 113
— скормящего слоя» 29
— культуры клеток 10, 11
— мутагенеза и клеточной селекции 13
— радиоиммунологический 115
— скрининга биохимических мутантов
13
— <ткани-ияньки» 29
Механизмы проникновения микроорга-
низмов в протопласты 58
Мутагенез 13
Продукты поглощения и слияния 60
-------- характеристика 60
Пролифиративная способность клеток.
возникших из протопластов 41, 42
Протопласты 5, 7, 30, 34, 35, 36, 41, 42.
44—47, 49, 51, 52, 57—60, 122
— изолированные 5, 7, 8, 28, 57
---- введение микроорганизмов 58
----высших растений 7
---- культивирование 8
— растительных клеток 5
— слияние 9, 42
---- механизм 44
----способы индукции 42
— способы выделения 30, 35
---- метод флотации 35
---- механические 30
------ энзиматические 31
—— культивирования 36
— условия культивирования 37
Растения направленное измеиеиие 52
Растения-регенеранты 121
Редиффереициация 9
Регенеранты 79, 80, 84
— первого поколения 79
Ростовой цикл 9
Селективная среда 92, 93
Системы ассоциативные 5, 6
----экспериментальные 6
Слияние 107
Сомаклональные вариации и варианты
9
Соматическая гибридизация 9
Субкультивирование 9, 17, 23, 65, 79,
88
Суспензии клеток 106
---- приготовление 106
Суспензионная культура 23, 75
----ростовой цикл 24, 25
Сыворотки поликлональные 90
Ткани-няньки 9
Тотипотентность 9
— живой клетки растения 11
Фитогормоны (аукснн, цитокинин) 15
Цианобактерии 57, 67—80, 84—87
— введение в растения 76
— передача продуктов фотосинтеза 71,
72
— продукты лизиса 72, 73
Цибрид 46
Цикл выращивания 9
Штамм 9
Эксплант 9, 14, 17
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие........................................................... 5
Введение ............................................................. 7
Глава 1. Культура клеток высших растений............................. 10
§ 1. Об истории развития метода культуры клеток тканей и органов растений 11
§ 2. Дедифференцировка и каллусогенез как основа создания пересадочных
клеточных культур.................................................... 13
§ 3. Некоторые цитоморфологические и физиологические характеристики
каллусных клеток, культивируемых поверхностно ........ 18
§ 4. Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной
среде (суспензионные культуры)........................................21
§ 5. Культивирование отдельных клеток................................27
Глава 2. Протопласты растительных клеток как объект биологического
конструирования.......................................................30
§ 1. Получение протопластов...........................................30
§ 2. Культивирование протопластов.....................................36
§ 3. Слияние протопластов.............................................42
§ 4. Гибридизация соматических клеток.................................46
§ 5. Перенос клеточных органелл.......................................49
Глава 3. Создание искусственных ассоциаций культивируемых клеток
высших растений с микроорганизмами....................................^2
§ 1. Искусственные ассоциации с микроорганизмами как способ модифи-
кации растительной клетки и растения ................................ ^2
§ 2. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты растений . . 57
§ 3. Введение микроорганизмов в популяции культивируемых клеток расте-
ний ..................................................................61
§ 4. Цианобактерии в экспериментах по получению искусственных ассоциа-
......................................................................67
Глава 4. Методы получения моноклональных антител......................89
§ 1. История создания метода.........................................89
§ 2. Подготовительные этапы перед проведением слияния................96
§ 3. Приготовление сред для культивирования и получение клеточных су-
спензий .............................................................104
§ 4. Слияние........................................................107
§ 5. Клонирование гибридомных клеток................................109
§ 6. Замораживание и оттаивание гибридомных клеток..................110
§ 7. Методы выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками . 111
§ 8. Массовая наработка моноклональных антител......................117
§ 9. Очистка антител................................................118
§ 10. Моноклональные антитела человека...............................119
Заключение...........................................................121
Литература ..........................................................123
Предметный указатель.................................................125
127
Учебное издание
БИОТЕХНОЛОГИЯ. В 8-ми кн.
Раиса Георгиевна Бутенко
Михаил Викторович Гусев
Алексей Федорович Киркин
Тамара Георгиевна Корженевская
Елизавета Николаевна Маркарова
КНИГА 3. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Зав. редакцией А. Г. Гаврилов
Редактор М. М. Пеннина
Мл. редакторы И. М. Павлова и Е. И. Попова
Художник С. Ю. Вериченко
Художественный редактор Т. А. Голенкова
Технический редактор Н. А. Битюкова
Корректор С. Г- Завьялова
ИБ № 6667
Изд. № Е-544. Сдано в набор 17.01.87. Подп. в печать 31.03.87. Т-04107. Формат
60Х90‘/16. Бум. кн.-журн. Гарнитура тайме. Печать офсетная. Тираж 30000 экз.
Зак. № 44. Цена 30 коп.
Издательство <Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглииная ул., д. 29/14.
Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете
СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014, Ярославль,
ул. Свободы, 97.
ПРОБЛЕМЫ
И ПЕРСПЕКТИВЫ
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
СОЗДАНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ
ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
АВТОМАТИЗАЦИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
ПРОИЗВОДСТВО
БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОИЗВОДСТВО БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ
ИНЖЕНЕРНАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ