metody-v-molekulyarnoy

Введение. Молекулярная биология в начале ХХI века: от ансамбля-к одиночным молекулам

Комплементарность физических методов исследования

Часть А. Биологические макромолекулы и физические инструменты

Глава А 2. Макромолекулы как физические частицы

А 2.2. Биологические молекулы и поток генетической информации

Глава А 3. Понимание макромолекулярной структуры

А3.2. Основные физические и математические инструменты

А3.3. Динамика и структура, кинетика, кинематика, релаксация

Б.3. Ионы в электрическом и магнитных полях
Б.4. Методы ионизации

Приложение 1. Разрешение и точность определения массы

Б.6. Перечень ключевых идей
Литература для дальнейшего чтения

Глава Б.2. Структурно-функциональные исследования

Б2.5. Субклеточные комплексы и opганеллы

Б2.7. Macc-спектрометрическая визуализация изображений

Приложение 1. Вычисление молекулярной массы белка из eгo масс-спектра

Приложение 2. Вычисление нуклеотидной последовательности

Б2.8. Перечень ключевых идей
Литература для дальнейшего чтения

Глава В 1. Термодинамическая стабильность и взаимодействие макромолекул

Глава В 2. Дифференциальная сканирующая калориметрия
В2.2. Основы теории
В2.3. Экспериментальные подходы

Глава В 3. Изотермическая калометрия титрования
В3.2. Экспериментальные подходы и основные уравнения

Глава В 4. Биосенсеры и поверхностный плазмонный резонанс

В4.2. Измерение поверхностного связывания

В4.3. Взаимодействие между молекулой и поверхностью

В4.5. Перечень ключевых идей
Литература для дальнейшего чтения

Глава Г1. Биологические макромолекулы как гидродинамические частицы

Г.1.2. Гидродинамика при низких числах Рейнолдса

Г.1.4. Определение фрикционных свойств частиц

Г.1.5. Вычисление фрикционных свойств частиц

Г. 2.5. От приближения «Гидродинамически эквивалентная сферa»- к приближению «целое тело»

Приложение 1. О корректности уравнения Кирквуда- Райзмана

Г.3.2. Коэффициент поступательной диффузии

Г.3.5. Экспериментальные методы определения коэффициентов диффузии

Г.3.6. Предсказание коэффициентов диффузии глобулярных белков

Г.3.7. Трансляционное трение и диффузионные коэффициенты

Глава Г4. Аналитическое ультрацентрифугирование

Г.4.2. Оборудование и инновационная техника

Г.4.4. Решение уравнения Ламма для различных граничных условий

Г.4.6. Вычисление молекулярной массы по данным седиментации и диффузии

Г.4.9. Седиментация в градиенте плотности

Г.4.10. Форма молекул по данным скоростной седиментации

Г.5.2. Введение в биологические проблемы

Г.5.3. Электрофоретические эксперименты
Г.5.4. Макромолекулы в электрическом поле

Г.5.5. Электрофоретические методы в отсутствие поддерживающей среды: свободный электрофорез

Г.5.6. Электрофоретические методы в присутствии поддерживающей среды: зональный электрофорез

Глава Г6.Ориентация макромолекул электрическим полем

Г.6.2. Макромолекулы в электрическом поле

Г.6.3. Теоретические основы измерений двойного лучепреломления

Г.6.4. Измерения электрического двойного лучепреломления

Г.6.5. Глобальная структура и гибкость белков

Г.6.6. Глобальная структура и гибкость нуклеиновых кислот

Глава Г7. Ориентация молекул гидродинамическим полем

Г.7.2. Введение в биологические проблемы
Г.7.3. Стационарное динамическое двойное лучепреломление

Г.7.5. Осцилляторное двойное лучепреломление в потоке

Г.7.6. Ориентации макромолекул в потоке как динамическое явление

Г.7.7. Перечень ключевых идей
Литература для дальнейшего чтения

Глава Г8. Деполяризованная флуоресценция

Г.8.2. Введение в биологические проблемы

Г.8.3. Теория деполяризованной флуоресценции

Г.8.5. Деполяризованная флуоресценция и броуновское движение

Г.8.6. Деполяризованная флуоресценция и молекулярные взаимодействия

Г.9.2. Введение в биологические проблемы
Г.9.3. Измерение вязкости

Г.9.4. Вычисление характеристической вязкости белков из их атомных координат
Г.9.5. Определение конформации макромолекул из характеристической вязкости

Г.9.6. Конформационные изменения в белках и нуклеиновых кислотах
Г.9.7. Перечень ключевых идей

Г.10.2. Введение в биологические проблемы

Г.10.3. Динамическое рассеяние света как спектроскопия очень высокого разрешения

Г.10.4. Динамическое рассеяние света в условиях гауссовой статистики

Г.10.5. Динамическое рассеяние света в условиях негауссовой статистики

Глава Г11. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия

Г.11.2. Введение в биологические проблемы

Г.11.4. Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия

Похожие

Методы в молекулярной биофизике Структура. Функция. Динамика. Учебное пособие Т.1

Биологические мембраны, методы

Нуклеиновые кислоты. От А до Я

Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии

Текст

И. Сердюк
Н. Заккаи
Дж. Заккаи
Структура. Функция. Динамика
Учебное пособие
Том I

ПРЕДИСЛОВИЕ
Эту книгу авторы посвящают женам
Ольге, Бринде и Мисси, которые
помогли осуществить задуманное
предисловие редактора русского перевода
Предлагаемая российскому читателю книга является переводом с английского
книги И. Н. Сердюка (I. N. Serdyuk) Джузеппе Заккаи (J. Zaccai), Натана Заккаи (N. Zac-
cai), «Methods in Molecular Biophysics. Structure, Function, Dynamics», вышедшей в
издательстве Cambridge University Press (Кембридж, Англия) в 2007 году.
Основная задача, которую ставили перед собой авторы, состояла в том, чтобы
«собрать под одной крышей» физические методы исследования структуры
биологических макромолекул, ставшие уже классическими, а также появившиеся
относительно недавно. К первым мы отнесли методы гидродинамики и оптики, малоугловое
рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов, рентгеноструктурный и нейтроност-
руктурный анализ, ядерный магнитный резонанс и электронную микроскопию. Для
более полного охвата в книгу включены термодинамические методы (сканирующая
и титрующая микрокалориметрия), которые обычно отсутствуют в классических
учебниках по структуре макромолекул. При описании методов авторы исходили из
принципа их равной значимости, не отдавая предпочтения ни одному из них.
Излагая фундаментальные основы физических методов, мы старались выбрать
наиболее яркие результаты, полученные с их помощью. Так, в книге описаны
впечатляющие успехи в исследовании структуры и функции биологических
макромолекул с применением масс-спектрометрии, новые возможности капиллярного
электрофореза в геометрии «песочных часов», возрождение метода
аналитического ультрацентрифугирования, реконструкция одиночных молекул с помощью
электронной микроскопии, оптическая активность с применением синхротронных
источников, методы, основанные на явлениях поверхностного плазменного и
магнитного резонанса в магнитном поле Земли, преодоление классического светового
дифракционного барьера, составляющего, как известно, половину длины волны
падающего излучения. Не остались без внимания и фантастические достижения
рентгено-структурного анализа и ядерного магнитного резонанса,
обеспечивающие сегодня основной поток структурных данных атомарного разрешения для
белков, нуклеиновых кислот и комплексов между ними. Набирает силу нейтронно-
структурный анализ, обладающий уникальными возможностями по локализации
атомов водорода в молекулах.

Особое внимание в книге уделено физическим методам, которые фактически
открыли новую страницу в исследовании структуры биологических
макромолекул. К ним мы отнесли, в первую очередь, методы детектирования и
манипулирования одиночными молекулами с применением оптических и магнитных
ловушек (твизеров). На их основе совершен принципиальный переход от исследования
макромолекул в больших объемах (доли миллилитра) к исследованию
макромолекул в предельно малых объемах (доли аттолитра), что дает возможность
перейти от описания свойств макромолекул в ансамбле к описанию их свойств иа
одиночном уровне. Не сбылось предсказание великого Шредингера о том, что мы
никогда не сможем работать с одиночными электронами, атомами и молекулами.
Сегодня с помощью конфокальной микроскопии и микроскопии ближнего поля
можно детектировать флуоресцентно меченые одиночные молекулы, с помощью
микроскопии силового поля визуализовать одиночные молекулы, с помощью
оптических и магнитных ловушек растягивать, расстегивать, скручивать, раскручивать
биологические макромолекулы. В результате применения этих методов появилась
уникальная возможность визуализации и описания работы линейных и роторных
биологических моторов в терминах сил (пиконьютоны) и расстояний (нанометры),
сопровождающих каждую фазу их рабочего цикла. Все это привело к появлению
нового термина «сила» для описания механики биологических молекул. В
повседневную практику вошли такие величины как ammo- и зептомоль, составляющие
10"18 и 10"21 моля, соответственно, которые ранее на практике не использовались.
Физика — быстро развивающаяся наука. Следствием такого развития является
появление двумерной инфракрасной спектроскопии, которая может
рассматриваться как аналог двумерного ядерного магнитного резонанса в оптической
области, и флуоресцентной корреляционной спектроскопии, которая является
развитием метода динамического рассеяния света для случая негауссовой статистики
(малое число частиц).
Излагая новые методы, авторы сохранили фундаментальные результаты, которые
получены около 50 лет назад и вошли в «золотой» фонд молекулярной биологии.
Среди них: открытие П. Доти с сотр. (1956) переходов «спираль-клубок» в полипептидах,
обнаружение практически полного разворачивания белков в 6М гуанидингидрохло-
риде Ч. Тенфордом с сотр. (1968), доказательство непрерывности рибосомных РНК
А. Спириным (1963), получение X. Блумом и X. Шуллери (1955) спектра этанола на
частоте 60 МГц, открывшее метод ЯМ Р для химиков. И, конечно же, разработка М. Пе-
рутцем и Дж. Кендрю (1957 г.) метода рентгеновской кристаллофафии, с помощью
которого структуры первых белков с атомарным разрешением были расшифрованы,
получение Р. Франклин и Р. Гослингом (1953) рентгеновских структур волокон ДНК,
приведшее к открытию Дж. Уотсоном и Ф. Криком (1953) двойной спирали ДНК. И,
наконец, подтверждение полуконсервативного механизма редупликации ДНК в
блестящих экспериментах М. Месселсона и Ф. Сталя, (1958) методом аналитического
центрифугирования в фадиенте плотности.
В книге мы попытались донести до читателя тесную взаимосвязь всех
физических методов и их комплементарность. Например, понятие корреляционных
вращательных времен, лежащее в основе ряда гидродинамических методов, принципиально
важно для понимания метода ядерного магнитного резонанса, а понятие поступа-

тельной диффузии необходимо для понимания метода флуоресцентной
корреляционной спектроскопии. Анализ возможностей методов, имеющихся сегодня в нашем
распоряжении, свидетельствует о том, что не существует одного единственного
метода, обеспечивающего всю необходимую информацию о макромолекулах и их
взаимодействиях и только их совокупность дает видение системы в пространстве и во
времени. Именно комплементарность является основополагающей идеей,
оправдывающей существование на практике всех физических методов.
Поскольку физики и биологи часто «разговаривают» на разных языках, книга
снабжена комментариями, предназначенными как для биологов, так и для
физиков. Главная их задача служить подсказками для тех и других.
Каждая глава, посвященная тому или иному методу, начинается с истории его
возникновения, вклада отдельных групп ученых в становление и развитие того или
иного физического метода. Заканчивается глава изложением ключевых идей, в
которых сформулированы основные достоинства и ограничения каждого метода.
В русское издание включены дополнительно ссылки на некоторые русские
источники, с тем чтобы сделать пользование литературой более доступным для
нашего читателя.
Издание книги на русском языке в двух томах привело к некоторому ее
переформатированию, на что мы обращаем внимание читателя, знакомого с
однотомным английским вариантом книги.
Авторы выражают искреннюю благодарность Генеральному директору
Компании «Базовый Элемент» О. В. Дерипаске и Генеральному директору
Благотворительного фонда «Вольное Дело» Т. Д. Румянцевой за финансовую помощь в
создании макета книги.
Моя личная, искренняя признательность коллеге по лаборатории Г. А. Енину за
оформление рисунков и иллюстраций, вклад которого в книгу трудно переоценить.
Особая признательность А. Ю. Хмельницкому, О. П. Сердюк, И. И.
Проскурякову и Ю. Н. Шарпинской за перевод книги, без большого труда которых не могло
бы состояться ее издание книги на русском языке.
Я благодарен Издательству «Книжный Дом "Университет"» и его ведущему
редактору М. С. Климкин за творческое отношение к делу.
Отдельная глубокая благодарность моим коллегам, взявшим на себя труд
прочесть отдельные главы русского издания книги: В. В Филимонову, В. Д.
Васильеву, О. М. Селивановой (Институт белка РАН), В. В. Волкову (Институт
кристаллографии РАН), А. М. Балагурову (Лаборатория нейтронной физики ОИЯИ),
С. Н. Рязанцеву (Калифорнийский университет, США). Особое признание
Т. А. Хмельницкой за редактирование некоторых глав книги.
Написание книги такого объема с неизбежностью ведет к некоторой доле ошибок
и неточностей (надеемся не очень большой), за которые мы заранее приносим
извинения нашим читателям. Мы с благодарностью примем любые замечания и пожелания.
Профессор И. Н. Сердюк,
Пущино, 1 июш 2008 г.

Об авторах
Наше знание биологических макромолекул и их взаимодействии базируется на
применении физических методов в широком диапазоне -- от классической
термодинамики до недавно разработанных техник детектирования и манипуляции
одиночными молекулами. Описанные в этой книге методы включают в себя масс-
спектрометрию, гидродинамику, микроскопию, дифракцию и кристаллографию,
электронную микроскопию, молекулярную динамику и ядерный магнитный
резонанс. Каждый из них имеет своп преимущества и ограничения.
Предлагаемый учебник, объединивший эти подходы, дает описание и
примеры использования ключевых физических методов в современной биологии. Это
бесценный ресурс для студентов и аспирантов, изучающих молекулярную
биофизику в научных и медицинских высших учебных заведениях, а также для
исследователей, которым требуется знание основ методик, лежащих за пределами
их специальности. В соответствии с междисциплинарным подходом, которому
следовали авторы книги, в ней присутствуют короткие отступления
(комментарии), объясняющие физические аспекты биологам и биологические аспекты
физикам.
Игорь Сердюк родился в Одессе (Украина) и обучался физике в Одесском
государственном университете. В 1969 г., после окончания аспирантуры на факультете
физики полимеров в Ленинградском институте высокомолекулярных соединений,
он защитил кандидатскую диссертацию. Затем, будучи научным сотрудником
Института белка Академии наук СССР в Пущино, занимался исследованием
физики белков. Здесь же впоследствии он возглавил свою исследовательскую группу
по физике нуклеопротеидов и получил степень доктора физ.-мат. наук в 1981 г.
С тех пор он возглавляет лабораторию физики нуклеопротеидов в Институте
белка в Пущино. Степень профессора Игорь Сердюк получил в Московском
государственном университете в 1981 г., а 1985 — награжден Государственной премией
СССР в области науки и техники. На протяжении последних 25 лет он читает курс-
лекций по применению физических методов в структурной биологии на
биологических факультетах Московского и Путинского государственных университетов.
Известен своими работами в области структурной нейтронографии биологических
макромолекул.
Натан Заккаи получил начальное образование во Франции, затем поступил
в Эдинбургский университет и в 1997 г. окончил его со степенью бакалавра
физики. В 2001 г. ему присуждена степень доктора философии в области биохимии
в Оксфордском университете. Потом он занимался проблемами иммунологии,
вирусологии и структурной биологии, специализируясь на рентгеноструктурном
анализе. Его первая работа касалась структурных исследований рецепторов
клеточной поверхности в иммунной системе. По программе структурной геномики в
Оксфорде Натан Заккаи занимался изучением вирусов герпеса и гриппа. В
настоящее время он является научным сотрудником университета в Кембридже и
работает над созданием вакцины против человеческого папиломавируса.

Джозеф (Джузеппе) Заккаи родился в Александрии (Египет), учился в
английской школе сначала там, а затем в Риме, после чего поступил в Эдинбургский
университет, где получил сначала степень бакалавра (1968), а затем доктора философии
(1972) в области физики. Работа в национальной лаборатории Брукхэвэна в Нью-
Йорке пробудила у него интерес к биофизическим исследованиям биологических
мембран и разработке методов нейтронного рассеяния в биологии. Он продолжил
эту работу и после возвращения в Европу — сначала в Институте Лауэ-Ланжевена
в Гренобле, ведущем институте по нейтронному рассеянию. С 1992 г. он
возглавляет лабораторию молекулярной биофизики Института структурной биологии
(Гренобль) Национального центра научных исследований Франции. В настоящее
время научные интересы профессора Заккаи связаны с исследованиями в области
экзобиологии, а также динамики белков, их структуры и стабильности в
организмах, живущих в экстремальных условиях — при высокой концентрации солей,
высокой температуре и давлении. Джозеф Заккаи имеет большой опыт преподавания
биологии физикам и физики — биологам. Он первым ввел эти курсы в программу
для студентов и аспирантов в университете Гренобля в 1980-х гг.
Предисловие от Д. М. Энгельмана
С первого взгляда может показаться, что эта книга — очередной обзор методов
биофизики, и, как обычно полагают, область этой науки определяется простым их набором.
Однако тщательно разработанное содержание учебника демонстрирует нам более
глубокое представление о предмете обсуждения. Методы, описанные здесь, определяют
то, что мы знаем о мире биологических молекул, а биофизика предстает областью
знаний, которая объединяет фрагменты информации, с тем чтобы наполнить
содержанием наше толкование биологии в терминах макромолекулярного пространства и
времени: структуры, взаимодействия и динамики. Две взаимосвязанные идеи, которые
используют биофизики, — это структурно-функциональная гипотеза и эволюция.
Структурно-функциональная гипотеза обсуждается в прозрачно-понятном
введении: идея заключается в том, что каждая закодированная в геноме молекула обладает
функцией, которую можно понять, рассматривая химическую структуру
макромолекул, изучая их взаимодействия и динамику. Эволюция лежит в основе этого подхода,
поскольку функция является фундаментом естественного отбора. Таким образом,
биофизические методы исследования дают нам представление - в пределах той
информации, которую они способны предоставить, — о функции и эволюции. Особая надежда,
как награда за достигнутые успехи, заключается в том, что понимание каких-то
частных случаев приведет к основополагающим идеям — например, спаривание оснований
в нуклеиновых кислотах, связывание кислорода гемом или самосборка липидов.
Эта книга учит методам и создает надежный интеллектуальный каркас для
систематизации наших знаний, что позволяет ей быть путеводителем в данной
области. Предыдущие работы — Кона и Эдселла, Тэнфорда, Эдселла и Ваймана, а также
Кантора и Шиммела — выполняли эту исключительно важную роль в прошлом.
Но время не стоит на месте, и технологии, описанные в их классических трудах,
несколько утратили свою актуальность в процессах обучения и в практике. Поэтому

можно только приветствовать ясно написанный, вдумчивый и современный текст,
который сослужит хорошую службу как на специальных курсах, так и в качестве
справочника. Авторы описали каждый метод, исходя из фундаментальных
принципов и предпосылок, успешно охватив впечатляющий диапазон исследований.
И за это они будут вознаграждены вниманием аудитории, которая так жаждет
новых фундаментальных текстов по молекулярной биофизике.
Иельский университет,
Нью-хейвен, США
Предисловие от Пьера Жолио
Как написали во введении авторы книги, идеальный биофизический метод мог бы
предоставить возможность наблюдать структуры биологических молекул и их
динамику на атомном уровне в физиологичной для них среде, т. е. in г/го. Конечно,
такого метода не существует, и, возможно, никогда не будет существовать из-за
бесчисленных технических ограничений, поэтому для характеристики структурных
и функциональных свойств биологических макромолекул необходимо применять
целый арсенал комплементарных методов. Мы должны, однако, заметить, что на
практике многие высокопродуктивные группы молекулярных биофизиков
сконцентрированы на какой-либо одной технике, из которой они стараются «выжать»
все, что возможно. Эти исследователи разрабатывают, в сущности,
методологический подход, с помощью которого стараются охарактеризовать как можно большее
число биологических молекул. Примером такого подхода может служить
высокопроизводительная кристаллография или структурная геномика. Тут цель одна —
дать точную информацию для базы трехмерных белковых структур, аналогично
базам данных по первичным структурам геномных последовательностей, которые
широко используются всеми биологами.
Другой подход в решении трудной биологической задачи — мультидисцип-
линарный, и ему в молекулярной биофизике принадлежит ведущая роль. Здесь
цель иная — как можно более точно определить функциональные, структурные
и динамические свойства молекул, участвующих в физиологических процессах, а
также их взаимодействия. Именно такой подход поддерживает эта книга, которая
дает важный и исчерпывающий обзор современных методов исследования, а
также обсуждает преимущества и недостатки каждого. Обычно первым шагом бывает
изучение каждой молекулы в очищенном виде. Для большинства биофизических
исследований требуются образцы, состоящие из большого числа идентичных
молекул (в 1 мг белка с молекулярным весом 60 000 содержится 10ш молекул), что
позволяет достигнуть необходимой чувствительности измерений при
минимизации повреждений, нанесенных самим экспериментом (например, излучением).
Следовательно, эти молекулы изучают в условиях, которые отличаются от
естественных. Следующий шаг — наблюдение за ассоциацией молекул и в особенности
за надмолекулярными структурами, которые, как сейчас считают, присутствуют в
клетке. Там, где невозможно организовать эти комплексы в упорядоченные двух- и

трехмерные структуры, их можно наблюдать только с низким пространственным
разрешением.
Эта книга содержит также главы, посвященные новым многообещающим
направлениям, например детектированию одиночных молекул и манипуляциям с ними.
Последний шаг, который все еще трудно сделать, связан с исследованием молекул и
комплексов in vivo. В этом контексте нужны не только новые технические подходы,
но и новые способы мышления, даже если в результате будет разработано всего
несколько биофизических методов, способных давать информацию о молекулах в их
клеточном окружении. Применяя функционально-структурный подход в
дополнение к традиционному структурно-функциональному, ученые получают возможность
изучить, какие структурно-организационные модели совместимы с
функциональными свойствами ансамбля молекул. Например, благодаря термодинамическому и
кинетическому анализу реакций переноса электрона в фотосинтетическом аппарате
теперь известно, что мобильные носители, составляющие фотосинтетическую цепь
переноса электрона, объединены в домены. Эти домены могут быть как небольшими
мембранными компартментами, изолированными друг от друга, так и
суперкомплексами, сформированными в результате ассоциации нескольких больших мембранных
белков, которые захватывают мобильные носители. Во многих случаях мембраны,
также как и цитозоль, выглядят высоко компартментализованными системами.
Определение надмолекулярной организации в этих компартментах, несомненно, будет
одной из главных задач современной биофизики.
Институт биологической и физической химии,
Франция
От авторов
Андре Гинье, чьи фундаментальные исследования внесли большой вклад в
развитие методов, основанных на дифракции рентгеновских лучей и которые
составляют основу современной структурной молекулярной биологии, умер в Париже в
начале июля 2000 г. — всего лишь через несколько недель после того, как в прессе
было объявлено о завершении проекта по секвенированию человеческого генома.
Вскоре ушли из жизни Макс Перутц, Френсис Крик и Дэвид Блоу, самый
младший из первых исследователей в области кристаллографии белка. С их именами
было связано рождение молекулярной биологии и с их уходом совпало открытие
новой эпохи, которую называют постгеномным секвенированием. В ней
физические методы исследования играют все более важную роль в понимании
биологической функции на молекулярном и клеточном уровне.
Классические учебники по молекулярной биофизике, опубликованные в
предыдущих десятилетиях, во многом устарели, но не только вследствие
значительного развития методов, вызванного, например, приходом синхротронных источников
для рентгеновской кристаллографии или мощных сверхпроводящих магнитов для
ЯМР. Родились совершенно новые методы, такие как масс-спектрометрия,
манипуляции с одиночными молекулами и их детектирование, флуоресцентная корел-

ляционная спектроскопия. В соответствующих главах мы описали, как
классические, так и самые «продвинутые» техники, основанные на масс-спсктрометрин,
термодинамике, гидродинамике, спектроскопии, микроскопии, радиационном
рассеянии, электронной микроскопии, молекулярной динамике и ЯМР. Однако
быстрый прогресс в этой области, который происходил также и в течение тех
нескольких лет, которые понадобились нам для написания и подготовки книги, а также
желание сохранить книгу в разумном объеме означает, что некоторые методы были
опущены по этим причинам, либо потому, что некоторые из них устарели.
Ключевое слово в молекулярной биофизике — комплементарность. Для нашей
области метафорой может служить индийская история о шести слепых и слоне.
Каждый слепой прикасался к различной части животного и на основании своих
ощущений делал вывод о его природе. «Большая змея», — сказал человек, который
прикоснулся к хоботу. Бивни казались копьями, бок — стеной, хвост — кисточкой,
уши — опахалами, а ноги — стволами деревьев. Мы могли бы добавить еще и
седьмого, очень близорукого человека, который видел бы целого слона как туманное
серое облако, чтобы проиллюстрировать дифракционные методы. На самом деле,
повторяем, идеального метода в молекулярной биофизике не существует. Мы не
только не можем следить за положением атомов в молекулах in z'iro, но и не
способны увидеть их движение, и конформационные изменения, которые происходят
в процессе химических реакций, связанных с их биологической функцией, —
причем на любой временной шкале. Ни одна экспериментальная техника не способна
дать такую информацию. Каждая обладает ограниченным полем зрения, со своими
четкими участками, выступающими из глубокой тени. Физические методы XXI
в. должны справиться со множеством сложных биологических проблем, решение
которых будет зависеть от их способности переносить структурную и
функциональную информацию из масштабов одной клетки на клеточный уровень, а затем
и на весь организм. Величие и невероятная сложность задачи не заставят ученых
отступиться, вызов времени будет принят.
Мы благодарны профессору Дону Энгельману из Иельского университета
(США) и профессору Пьеру Жолио из Института биологической и физической
химии (Франция), которые согласились написать предисловия к нашей книге.
Выдающиеся ученые и педагоги, они одновременно участники биофизических
исследований и наблюдатели развития современной биологии. Не можем ни сказать
слова благодарности коллегам-экспертам за критичное обсуждение различных
методов: Мартине Блэкледжу и членам лаборатории ЯМР, Кристине Эбель, Дику
Уэйду, Хью Лорта-Жакобу, Патрисии Амара, сотрудникам лаборатории масс-спек-
трометрии, всему Институту структурной биологии (Гренобль, Франция), Регине
Виллумайт, Национального центра нейтронных исследований GKSS (Гиестхахт,
Германия), Виктору Аксенову из Объединенного института ядерных
исследований (Россия), Лесли Грин, Кристине Редфилд, Гиллому Стюарт-Джонсу, Ивон-
не Джонс и Дэвиду Стюарту из Оксфордского университета (Англия),
Джонатану Рупрехтанду и Ричарду Хендерсону из Лаборатории молекулярной биологии
(Англия), Симону Хэнслип и Роберту Фалконеру из Кембриджского
университета (Англия), Владимиру Филимонову из Института белка РАН.

Мы признательны также Бринде Мутузаме, которой принадлежит идея
фронтисписа, Ольге Сердюк, которая на протяжении всех лет активно участвовала в
поиске литературных источников, их техническом оформлении, Миссии Заккаи,
помогавшем"! в редактировании отдельных мест текста. Л также признательны
сотрудникам Института белка РАН: Александру Тимченко, Маргарите Шелестовой,
Маргарите Ивановой, Татьяне Кувшинкиной и Альбине Овчинниковой за
техническую помощь.
Выражаем также глубочайшую признательность за финансовую поддержку
фонду Радульфа Обертюра (Бавинкель, Германия), Институту структурной
биологии и Институту Лауэ-Ланжевена (Гренобль, Франция), Лаборатории
нейтронной физики ОИЯИ (Дубна, Россия), Институту белка РАН (Пущино, Россия),
Путинскому центру научных исследований в лице Вячеслава Корнилова (Пущино,
Россия), компании «Кирилл Сердюк>> (Украина). Наконец, без теплых слов
благодарности мы не вправе оставить наших коллег, друзей, членов своих семей, а также
команду Издательства Кембриджского университета — всех тех, кто поддерживал
нас своим терпением, пониманием и одобрением нашего скромного труда.

Введение
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
В НАЧАЛЕ XXI В.: ОТ АНСАМБЛЯ -
К ОДИНОЧНЫМ МОЛЕКУЛАМ
Краткая история и перспективы
Рождение молекулярной биологии связано с созданием модели двойной
спирали ДНК, обеспечившей элегантное объяснение механизма сохранения и передачи
генетической информации (рис. I). Модель Уотсона и Крика, а также
параллельные дифракционные исследования М.Вилкинса, А. Стокса и Х.Вилсона, а также
Р. Франклина и Р. Гослинга (М. Wilkins, A. Stokes & Н. Wilson, and R. Franklin &
R. Gosling), опубликованные в серии статей в апреле 1953 г. в Nature, явились
триумфом использования физических методов в биологии. Модель Уотсона и Крика
только частично базировалась на дифракционных диаграммах рентгено-структур-
ного анализа волокон ДНК. Спиральные молекулы с постоянным шагом и
диаметром небыли однозначным подтверждением точности предлагаемой модели.
Гениальной догадкой в этом открытии было предположение об одинаковых размерах
пар оснований А-Т и G-C, что предопределило постоянный диаметр и шаг в
звеньях цепи двойной спирали.
а б в г
Рис. \. а — химическая формула одиночной цепи ДНК; б — схематическое изображение двух
спаренных цепей ДНК в виде двух лент, состоящих из остатков фосфорной кислоты и Сахаров.
Горизонтальные черточки, обозначают пары оснований нуклеотидов, удерживающих цепи
вместе. Вертикальная линия обозначает ось молекулы ДНК; я - химическая формула спаренных
цепей ДНК. Водородные связи обозначены линиями, состоящими из точек; / — дифракция нити
В-формы ДНК в рентгеновских лучах. Рисунки скопированы из оригинальных работ Уотсона
и Крика (1953), Франклина и Гослинга (1953)

С точки зрения «дифракционной физики» разнообразные спиральные
модели согласуются с дифракционными диаграммами волокон ДНК. Одной из таких
альтернативных моделей была модель «спина к спине» («side-by-side model»),
состоящая из двух спаренных одиночных спиралей ДНК. Несмотря на то, что такая
модель впоследствии оказалась неверной, она ясно показала, что для
дальнейшего становления молекулярной биологии очень важно уметь определять структуру
биологических молекул с более высоким пространственным разрешением, чем это
возможно из дифракционных методов на волокнах.
Для определения расстояний между атомами в кристаллах наиболее
подходящим является метод рентгено-структурного анализа, разрешающая способность
которого около 1А (0,1 нм). Однако при этом основной проблемой остается
получение высококачественных кристаллов, что существенно для точного определения
положения всех атомов в макромолекуле и решения фазовых проблем.
Первые кристаллы белков были получены уже в 1930-е гг. Однако только
к 1957 г. Макс Перутц и Джон Кендрю (Max Perutz и John Kendrew) нашли путь к
решению фазовых проблем в кристаллографии, используя производные с
тяжелыми атомами. Это позволило получить детальную трехмерную структуру миоглоби-
на. Проблемы, связанные с кристаллизацией белков (всего несколько
исследователей в мире умели это делать), и тяжелый труд кристаллографических исследований
сам по себе (это была докомпьютерная эра и все вычисления выполнялись руками
аспирантов) обрекали белковую кристаллографию на получение информации о
трехмерной структуре очень немногих биологических макромолекул. Тем не
менее «структурщики» продолжали развивать и улучшать методы, хотя полностью и
не обеспечивающие желаемого разрешения на атомном уровне, но имеющие свои
преимущества при изучении макромолекулярных структур. Эти методы,
увязывающие между собой термодинамику и структуру, уже играли важнейшую роль в
столетии, предшествующем созданию модели двойной спирали. Открытие
биологических макромолекул само по себе тесно переплеталось с приложением
физических концепций и методов к биологии (молекулярной биофизике).
Использование физики для решения инструментальных проблем в биологии
определенно происходило раньше, чем появился сам термин «биофизика». В
британской энциклопедии предполагается, что изучение биолюминесцении Атанаси-
усом Киршером (Athanasius Kircher) в XVII в. может считаться одним из первых
биофизических исследований. Им было показано, что экстракт, полученный из
светлячков, не может быть использован для домашнего освещения.
Установление связи между биологией и тем, что впоследствии станет
известно как электричество, принадлежит физикам. Исаак Ньютон (Isaac Newton)
в заключительном параграфе своих Principia (1687), отмечает, что «...все чувства
есть результат возбуждения, при котором каждая частица животного организма
движется но команде воли, что проявляется в вибрации духа, и его
распространении вдоль твердых нервных волокон от внешних органов чувств к мозгу и от мозга
к мускулам. Однако это те вещи, которые не могут быть объяснены несколькими
словами, или обоснованы надежными экспериментами, которые необходимы для
точного определения и демонстрации законов, по которым этот электрический
и эластичный дух действует».

Столетием позже Луиджи Гальвани и Алессандро Вольта (Luigi Galvani,
Alessandro Volta) провели эксперименты на лапках лягушки, что привело к
изобретению электрической батарейки. Эти эксперименты стали фундаментом для
становления электрофизиологии как науки, хотя опыты по возбуждению с
применением электрических батареек стали возможны только в XIX в., п были
впоследствии продолжены известным ученым Эмилем Генрихом Дюбуа-Реймондом
(Emil Heinrich Du Bois-Reymond), исследовавшим животное электричество.
Другая ветвь биофизики XIX столетия, связанная с исследованиями диффузии и
осмотического давления в растворе и, частично совпадающая с физической химией,
имеет более непосредственное отношение к открытию и изучению биологических
макромолекул. Публикация первой статьи в Zeitschrift fur Physikalische Chemie
(1887), о реакциях в растворе, была обусловлена тем, что биологические процессы
внутри живущей клетки, в основном, происходят в водной среде.
Тепловое движение частиц в растворе (броуновское движение) было открыто
Робертом Броуном (Robert Brown) в 1827 г. Аббе Ноллет (Abbe Nollet),
профессор экспериментальной физики, впервые описал осмотическое давление в
начале XIX столетия, используя в эксперименте мембраны животных для разделения
спирта и воды. Дальнейшее изучение и обозначение названия этого феномена
принадлежит доктору медицины и физиологу Рене Дютроше (Rene J. H. Dutrochet)
(1828), который осознал важность осмотического давления в живых системах и
предположил, что основные биологические процессы могут быть объяснены в
терминах физики и химии. Теория осмотического давления была развита Джоном
Вант-Гоффом (1880) (J. Van't Hoff).
Георг Габриель Стоке (George Gabriel Stokes) в середине XIX столетия
установил важнейший закон движения частиц в вязкой среде. Закон диффузии в
градиенте концентрации был описан Адольфом Фиком (Adolf Fick) в 1856 г., но
аналогии с законами, действующими для описания потоков тепла. Во второй
половине XIX столетия были также сделаны открытия двойного лучепреломления в
потоке Джеймсом Клерком Максвеллом (James Clerk Maxwell) и электрического
двойного лучепреломления в растворе Джоном Керром (John Kerr). Оба эти
феномена проявляются, как правило, только при достаточно большой асимметрии
растворенных частиц.
Большинство макромолекул хотя и являются большими молекулами, но они
намного меньше, чем длина световой волны. Они не могут быть обнаружены
прямым наблюдением в микроскопе, хотя при его помощи можно разглядеть клетки в
биологических тканях и структуры внутри клетки, такие как хромосомы (в
переводе с греческого — «окрашенные тела»). Постепенно накопленные данные,
полученные Эмилем Фишером (Emil Fischer) (1882) из его экспериментов на
растворах, показали, что биохимическая активность белков, на самом деле, обусловлена
обособленными макромолекулами. В 1908 г. Жан Перрен (Jean Perrin) приложил
теорию Альберта Эйнштейна (Albert Einstein) (1905) к броуновскому движению
для вычисления числа Авогадро. Теория макромолекул, основанная на концепции
Германа Штаудингера (Hermann Staudinger) (1920), позволила Вернеру Куну
(Werner Kuhn) в 1930 г. утвердить представления о макромолекулах как о
дискретных частицах. Открытие рентгеновских лучей Вильгельмом Конрадом Рентгеном

(Wilhelm Conrad Rontgen) (1895) и их приложение к атомистической
кристаллографии в 1910-х гг. в исследованиях Петера Эволда, Макса фон Лауэ, X. Уильяма
и В. Брэгга (Peter Ewald, Max von Laue, H. William и W.Laurence Bragg)
заложили основы для работ но атомной организации структуры макромолекул.
Теодор Сведберг (Theodor Svedberg) (1925) впервые определил молярную
массу белковой макромолекулы, используя созданный им метод аналитического
центрифугирования. В эти годы теория атомного строения вещества становится
признанным фактом. Методы дифракции рентгеновских лучей и
кристаллографии, атомная спектроскопия быстро прогрессировали. Неизвестные ранее
инструментальные методы, применение которых стало возможно благодаря новому
пониманию взаимодействия радиации и вещества, тщательно оттачивались, с тем
чтобы исследовать биологические структуры на молекулярном и атомном уровнях.
Физики, вдохновленные примером Макса Дельбрюка (Max Delbruck), который
выбрал в 40-х гг. прошлого века для изучения генетики бактериофаги
(бактериальные вирусы) как наиболее простые модели, и книгой Эрвина Шрёдингера «Что
такое жизнь?» (1940), в которой поднимался вопрос о том, возможно ли обойтись
известными законами физики при описании биологических процессов, принялись
за решение биологических проблем самым активным образом.
К концу XX в. в биофизике доминировали два метода исследования, рентге-
но-структурный анализ и ЯМР, которые играли ключевую роль в определении
трехмерной структуры биологических макромолекул с высоким пространственным
разрешением. Но, даже если представить, что все белковые структуры в различных
геномах были бы определены, все равно оставались бы невыясненными ключевые
вопросы: что происходит со структурой и какова динамика каждой макромолекулы
при соприкосновении живой клетки с окружающей средой; как меняется структура
при проявлении биологической активности; как макромолекулы взаимодействуют
друг с другом в пространстве и во времени? Эти вопросы могут быть разрешены
только при комбинированном и адекватном использовании практически всех
биофизических методов. Масс-спектрометрия может определять макромолекулярную
массу с изумляющей точностью. Высокочувствительный метод
микрокалориметрического сканирования и титрования может быть использован для определения
термодинамики разворачивания макромолекулы, ее стабильности и, при объединении
с биосенсорной техникой, для исследования взаимодействий при связывании белка
с лигандом (партнером). Наблюдается возрождение метода аналитического
центрифугирования с приходом новых высокоточных и автоматизированных инструментов.
Его комбинация с методами малоуглового рентгеновского и нейтронного рассеяния
обеспечивает новый виток исследования структуры макромолекул, их
взаимодействия в растворе и роли гидратации. Кинетика быстротекущих процессов методом
оптической спектроскопии исследуется в шкале фемтосекунд. Световой микроскоп
в комбинации с флуоресцентными зондами позволяет локализовать одиночные
молекулы внутри клетки. Методом сканирующей микроскопии силового поля
можно определить профиль поверхности макромолекулы и его изменения во времени.
Электронная микроскопия с ее разрешением, близким к атомарному, скорее всего
явится мостом, соединяющим исследования на молекулярном и клеточном уровнях.
Нейтронная спектроскопия обеспечивает информацией о динамике функциониро-

вания белков внутри живой клетки. Метод кругового дихроизма с использованием
синхротронного излучения может быть использован в исследованиях электронных
переходов в полипептидном остове.
Вплоть до конца 70-х гг. прошлого века биофизика и биохимия имела дело только
с большими молекулярными ансамблями, для которых законы термодинамики легко
применимы. Так, 100 микролитров раствора гемоглобина с концентрацией 1 мг-см '
содержат 1018 молекул белка, атипичный белковый кристалл содержит порядка 1015
макромолекул. В природном окружении биологические молекулы действуют в виде
десятков копий, что вызывает необходимость в развитии новых методов,
позволяющих исследовать молекулы на одиночном уровне. Для детектирования и
манипуляции с одиночными молекулами разработаны методы сверхчувствительной
флуоресцентной спектроскопии. Применение механических зондов в микроскопии
силового поля позволяет растягивать или скручивать одну молекулу и придавать ей
новую конформацию. При переносе энергии в опытах по флуоресценции может быть
измерено расстояние между донором и акцептором внутри единичной молекулы, in
vitro или в живой клетке. Оптическая микроскопия ближнего поля применяется для
идентификации и исследования динамики единичных молекул в конденсированной
фазе. История развития каждого биофизического метода, упомянутого выше, будет
более детально представлена в соответствующих главах книги.
Языки и инструментальные средства
По-гречески физика — «physike» имеет происхождение от «physikos» — природное.
Физика является наукой, наблюдающей и описывающей природу. Во времена,
когда один из авторов (Джо Заккаи) был студентом Эдинбургского
университета, физика изучалась на кафедре натурфилософии. Слово «философия» —
«любовь к мудрости» — буквально передает суть научного процесса, когда мудрость
«наблюдателя» приводит его к познанию нового. Этому способствует
использование «наблюдателем» в эксперименте специального оборудования и языка для
описания полученных им результатов. Современная наука охватывает так много
различных областей познания, что невозможно овладеть знанием всех
используемых инструментальных средств и языков. Для студентов-биофизиков не
представляет трудность язык общения с «чистыми» физиками или «чистыми» биологами
из-за десятка изучаемых ими в университетах междисциплинарных курсов.
Следует отметить, что каждой дисциплине соответствует богатство и глубина,
выражающиеся в своем собственном специфическом языке и развивающие свой
собственный набор инструментальных методов исследования. Ясно, что физики и биологи
«разговаривают» на разных языках, однако важно понимать, что и внутри каждой
дисциплины также имеются различные языки. Эти языки влияют на развитие
инструментальных методов, которые в свою очередь вносят вклад в описание
концепций языков. Биофизики владеют языками физиков и биологов и могут адекватно
«переводить» с одного на другой. Иногда это трудная и непосильная задача даже
для очень хорошего «переводчика», поскольку каждый язык имеет свою
собственную специфику и неповторимость.

Молекулярная биофизика изучает в большинстве случаев структуру, динамику
и взаимодействие макромолекул. Что такое биологические макромолекулы? Их
биологическая активность описывается на языке биохимии и молекулярной
спектроскопии, они были открыты с использованием гидродинамических и термодинамических
свойств, они визуализируются по их способности рассеивать рентгеновские лучи.
Таким образом, физические частицы вырисовываются как картины с разноцветным
орнаментом. Каждому языку соответствует набор инструментальных средств,
оборудования и методов экспериментального наблюдения. Успехи в изучении и
понимании биологических макромолекул несомненно базируются на развитии методов
исследования. Физические методы исследования, приводящие к правильным и
точным результатам, требуют параллельного применения биохимических методов (часто
имеющих основу физических методов, например, электрофорез или хроматография)
для обеспечения эксперимента со «значимыми» образцами. Слово «значимый»
является ключевым в предыдущем предложении. Оно отражает значимость и
уважительное отношение к исследованиям в области биологии (с греческого bios — «жизнь», а
logos — «слово», «причина»), т. е. биофизика ставит своей целью привести нас к более
полному пониманию процессов жизни. Молекулярную биофизику следует отличать от
биологической физики, которая имеет дело со свойствами биологического материала,
с целью создания наноустройств, например, на основе ДНК.
Шкалы длин и времени в биологии
Биологические явления происходят в широком диапазоне шкал длин и времени — от
ангстрем для расстояний между атомами до размера Земли в масштабе экосистемы, от
фемтосекунд, за которые происходят перестройки в электронных оболочках атомов
в первичных реакциях фотосинтеаза до 109лет эволюции. Инструменты для
наблюдений за процессами развивались и адаптировались к различным шкалам времени
и длин. Клетка представляет собой центральный, отправной пункт в биологических
Рис. 2. «Реалистическая» картина бактерии
Escherichia coli, представленная на основе
экспериментальных данных. Жгутик бактерии,
представляющий двойную мембрану, и
ассоциированные с ней белки и гликопротеины
представлены на рисунке зеленым цветом;
рибосомы и другие белки и нуклеиновые
кислоты, являющиеся цитоплазматическими
компонентами, обозначены фиолетовым и голубым;
набор полипептидных цепей — белым; ДНК и
ассоциированные с ней белки окрашены в
желтый и оранжевый цвета. Размер бактерии на
рисунке равен около 1 мкм, что соответствует
толщине двойного слоя мембраны около 10 нм
(http://w\vw. scripps. edu/mb/goodsell/)

10 т Земля как экосистема
10--
10" --
1.0"
10""
10 --
ю---
Кит
Человек
Длина ДНК в геноме человека
10 ■■ Нематода
Растительная клетка
Животная клетка
Бактериальная клетка
Вирус
Рибосома
Белок
исследованиях (рис. 2). Имея размеры от
1 до 10 микрон, клетки могут быть
рассмотрены в световом микроскопе. То же
и со скоростями клеточных процессов,
протекание которых лежит в интервале
времени от секунд до минут, что дает
возможность достаточно легко их измерять.
Если бы мы смогли взглянуть внутрь
эукарпотической клетки через ее
плазматическую мембрану, то увидели бы и
другие мембранные структуры,
разделяющие различные компартменты,
такие как ядра и митохондрии, большие
макромолекулярные ансамбли, такие
как хроматин, рибосомы, шапероны или
мультибелковые комплексы.
Рассматривая все меньшие и меньшие
структуры, мы обнаружили бы молекулы РНК
и белков, затем пептиды и другие малые
молекулы, молекулы воды и ионы, и,
наконец, атомы, составляющие их (рис. 'Л).
Наименьшие длины и наиболее
короткие промежутки времени более
трудны для изучения и требуют
использования более сложного оборудования
и методов исследования.
Фемтосекунды (Ю-15 сек) —
наиболее короткое время, представляющее
интерес для молекулярной биологии,
соответствующее преобразованиям
электрона в светочувствительной молекуле
ретиналя при поглощении им фотона.
Этот интервал времени может быть
измерен методом лазерной спектроскопии
(за одну фсек свет покрывает расстояние
3 х 10"7м, или 300 нм, около половины
длины волны видимого света).
Тепловые колебания находятся в пикосекунд-
ном интервале (Ю-12 сек), сворачивание
ДНК в микросекундном, скорости эн-
зиматического катализа равны порядка
1000 реакций в секунду, синтез белка
происходит за десятые доли секунды и т. д. Наиболее протяженное время, представ
ляющее интерес для молекулярной биологии, — геологическое время, соответству
ющее тысяче миллионов лет молекулярной эволюции (рис. 1).
ю"
Ю10-L Атом
Шкалы длин в биологии
Молекулярная эволюция
1.0 ■-
ю-3--
10" --
10"
10'"-L
Синтез белка
Катализ ферментов
Ю"8-- Разворачивание ДНК
Тепловое движение макромолекул
Колебания связей
Электронные перестройки при фотосинтезе
'не. 1. Шкалы времен в биологии

...■ ;'p«-iCfyjHO-функциональные гипотезы
Эта книга описывает применение классических и новых физических методов для
наблюдения за биологическими структурами, динамикой и взаимодействием на
молекулярном уровне. Интенсивные исследования в течение 50 последних лет
подчеркнули фундаментальную значимость биологической активности на этом
уровне. Структурно-функциональные гипотезы являются фундаментом
молекулярной биологии. Одна из них сводится к утверждению, что, если какой-либо
белок в данный момент существует в организме, то это связано с выполнением им
определенной биологической функции и его структура была отобрана
эволюцией. Открытие и исследование нуклеиновых кислот и белков как макромолекул с
четко определенными структурами позволили дать беспрецедентное понимание
таких процессов, как хранение и передача генетической информации, регуляция
экспрессии генов, ферментный катализ, иммунный ответ или передача сигнала.
В параллель стало очевидной возможность управлять биологическими
процессами, воздействуя па макромолекулярные структуры, и, в связи с этим, мощные
инструментальные средства стали развиваться не только для дальнейшего
фундаментального научного понимания процессов, но и для приложения этих знаний
к биотехнологии или разработки лекарств в фармакологии.
Понятие «структура» должно рассматриваться в широком смысле.
Трехмерная структура белка не абсолютно жесткая. Она адаптируется к своему лиганду
(партнеру) в соответствии с гипотезами «конфигурационной адаптивности» или
«индуцированной подгонки». Многие белки в клетке не обладают уникальной
третичной структурой в изолированном состоянии, хотя и имеют при этом четкую
функцию при физиологических условиях. Такие белки получили название белков
с природной или внутренней неупорядоченностью. Доля неупорядоченных
областей в таких белках может быть разной, начиная от последовательности в
несколько аминокислот и заканчивая полностью неупорядоченной последовательностью
длиной в десятки, а иногда и в сотни аминокислот. Главное отличие этих белков
от структурированных (глобулярных) белков состоит в том, что они не имеют
уникальной третичной структуры в изолированном виде, а приобретают ее после
взаимодействия с лигандами. Их конформация в комплексе определяется партнером
по взаимодействию, а не только с собственной аминокислотной
последовательностью, как это характерно для структурированных (глобулярных) белков. Белки с
внутренней неупорядоченностью, как правило, нолифункциональны, т. е. кроме
основной функции имеют дополнительные функции. Они получили название
белков «по совместительству».
Большинство событий, измеряемых на шкале длин в ангстремах и шкале
времен в пикосекундах, имеют глубокие последствия для жизни клетки, организма,
всех путей, определяющих взаимоотношения между организмами и их
окружением во времени и пространстве. Недавнее появление высокопроизводительного
оборудования для определения последовательностей целых геномов и их анализа
(биоинформатика), для идентификации всех белков, присутствующих в клетке
(функциональная протеомика) и их ответа на внешние условия (динамика
белков), для определения структуры белков (структурная протеомика) открыло но-

вую эру в молекулярной биологии, чьи революционные последствия еще
предстоит оценить.
Биологические макромолекулы, представляемые на рисунках, предстают как
статические структуры. Более правильно определять их как структуры,
«усредненные по ансамблю и по времени». Атомы в макромолекулярной структуре
поддерживаются в своих усредненных позициях балансом различных сил. При
воздействии тепловой энергии атомы могут отклоняться от этих позиций. Динамика
с греческого «Suvauia» обозначает прочность как эквивалент понятию «сила». Это
общепринятое понятие в биофизике. Однако для разделения понятий
«структура» и «динамика» первое соизмеряют со шкалой длины (например, конфигурация,
усредненная по времени), а второе со шкалой времени (например, энергия и
флуктуация). Разделение на два отдельных понятия обосновывается тем фактом, что
методы для исследования структуры и динамики обычно совсем разные и
специализированные. Современные эксперименты, однако, часто направлены на
исследование усредненной структуры и на ее изменений во времени.
Комплементарность физических методов исследования
О существовании макромолекул мы знаем только благодаря методам, с помощью
которых их можно наблюдать. Однако не существует единого метода,
обеспечивающего всю необходимую информацию о макромолекулах и их взаимодействии. Каждый
метод дает свое видение системы в пространстве и во времени: методы —
комплементарны. Биологические макромолекулы становятся активными структурами
только в подходящем растворителе. Стабилизирующие их силы слабы (порядка кТ, где
к — константа Больцмана, а Г— абсолютная температура) и возникают они частично
при взаимодействии с растворителем. Исследования биологических макромолекул,
следовательно, не могут проводиться без изучения окружающих их водных
растворов. Макромолекулы исследуются обычно в разбавленных пли концентрированных
растворах, в липидном окружении мембран или в кристаллах. Молекулы белков и
нуклеиновых кислот в кристаллах окружены значительным количеством молекул
воды. Исходя из выбранного экспериментального метода исследования мы будем
рассматривать биологические макромолекулы в растворе как «физические частицы»
(масс-спектрометрия, детектирование отдельных молекул), «термодинамические
частицы» (измерение осмотического давления, калориметрия), «гидродинамические
частицы» (вискозиметрия, диффузия, седиментация) или «частицы, рассеивающие
излучения» (спектроскопия, дифракция, и микроскопия).
Достигаемое пространственное разрешение, перечень используемых при этом
приборов и требуемая для их применения масса образца для некоторых
биофизических методов приведены на рисунке 5.
Термодинамика
Из классической термодинамики следует, что многие свойства растворов, такие как
температура кипения или замерзания, а также осмотическое давление зависят от

IJi ic. 5. Количество биологического
материала, необходимое для определения его
структуры при использовании в эксперименте
различных физических методов и оборудования
с определенной разрешающей способностью.
Сокращения: г — граммы; N — число молекул
(при допущении, что их молекулярный вес
равен около 100 000); PC — рассеяние света;
ГД — гидродинамика; МУРР, МУРН —
малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и
нейтронов, соответственно; ЯМР — ядерный
магнитный резонанс в растворе; Н-крист —
нейтронная кристаллография; Р-крист —
рентгеновская кристаллография; ЭМ —
электронная микроскопия; ДОМ — детектирование
одиночных молекул
концентрации растворенного вещества. При постоянной массовой концентрации
эти термодинамические параметры чутко реагируют на изменения его
молекулярной массы. Поэтому, например, массы и взаимодействия макромолекул впервые
были определены с помощью измерения осмотического давления.
Само сворачивание макромолекул и стабилизация биологически активных
структур строго следуют термодинамическим правилам, в которых свойства
растворителя играют определяющую роль. Тонкие калориметрические
измерения теплоемкости как функции температуры очень четко показывают, что
стабилизационная свободная энергия достигает максимума при температуре,
близкой к физиологической, а стабильность свернутой частицы падает как при
понижении, так и при повышении температуры. Существует следующая
интерпретация этого явления. Поведение цепи, окруженной растворителем, гораздо
сложнее, чем в вакууме. Энтальпия может вырастать, падать или даже не
меняться после сворачивания, потому что связи способны образовываться с
одинаковым успехом как внутри макромолекулы, так и между отдельными цепями
и компонентами раствора. То же самое справедливо и для энтропии: потеря
конфигурационной свободы белковой цепи после сворачивания может с избытком
компенсироваться потерей степеней свободы у молекул растворителя вокруг
несвернутой цепи, к примеру, через обеспечение доступа молекулам воды
неполярных групп. Находясь в растворе, молекула воды способна образовывать
водородные связи с соседними молекулами во всех направлениях. Неполярные
группы не обладают такой способностью, поэтому вблизи них молекулы воды
частично теряют возможность образовывать водородные связи, что
сопровождается снижением энтропии.
В белковом растворе теплоемкость почти целиком определяется водой и лишь
в незначительной степени — макромолекулами. Для проведения экспериментов
с такими растворами потребовалось создание прецизионных калориметров. Ран-
Шкала длин
ю-3-
1°*Н
Материал
о о
ю--
ю'8-
\Аяг.гя г \
10
I
I
10 000
-ю,5[
-ю'2
-ю9
-ю6
-ю3
-1
ю-
I
I
1000
СР.ГД
МОП
fiKVnl
10° 10'9 10""
I I I
I I I
100 10 1
1 мурр'; "W 1
МУРН |
, Н-крист
Р-крист|
ЭМ !
! дом
(м)
(А)

ние же калориметрические исследования биологических макромолекул были
сконцентрированы на сравнительно больших эффектах, таких как переходы
под действием температуры, что, тем не менее, все же позволило понять основы
энергетики белкового сворачивания. В настоящее время в этой области
достигнут значительный прогресс. Созданы не только чувствительнейшие нанокалорп-
метры, но и программы анализа для обработки термодинамической информации
и соотнесения ее со структурными данными. Энергетика внутримолекулярных
конформационных изменений, процесса формирования комплексов и
взаимодействий с соседними молекулами белков и нуклеиновых кислот теперь может
быть детально исследована. Однако мы должны всегда помнить, что
калориметрия (как и все методы, основанные на применении термодинамических законов)
пригодна для измерения среднего по ансамблю очень большого числа частиц
(обычно порядка 1013), даже если результаты описываются в терминах поведения
одной частицы.
Гидродинамика
Первые намеки на существование биологических макромолекул как отдельных
частиц появились из наблюдений их гидродинамического поведения. Язык макро-
молекулярной гидродинамики — это язык динамики жидкостей в особых условиях
низкого значения числа Рейнолдса. Число Рейнолдса представляет собой
безразмерный параметр, выражающий относительную величину действия сил инерции
и вязкости па тело, движущееся сквозь жидкость. Тела с одинаковым числом
Рейнолдса демонстрируют одинаковое гидродинамическое поведение. Поэтому
возможно, к примеру, определить поведение крыла самолета из опытов, проведенных
в гидродинамической трубе с помощью уменьшенной модели. Числа Рейнолдса
кита и маленькой рыбки равны 10й и 105 соответственно.
Для биологических макромолекул и их комплексов в водных растворах -- от
небольших белков до больших вирусных частиц и даже бактерий — они очень
малы. Например, для бактерии, плывущей со скоростью 10 •'' емсек ', число
Рейнолдса составляет 10~5. В таких условиях силы инерции пренебрежительно малы
и движение частицы в жидкой среде определяется исключительно силами,
действующими на нее в данный момент. Роль такой силы выполняют силы
броуновского движения. Диффузия частиц в жидкой среде под воздействием градиента
концентрации или электрического поля, а также процесс осаждения в поле
ультрацентрифуги под действием гравитационной силы могут быть описаны с
помощью сравнительно простых уравнений в терминах молекулярной массы частиц,
их коэффициентов трения, зависящих от формы и размеров. Разрешение
определяет, насколько детально описывается структура частицы. Гидродинамические
методы описывают биологические макромолекулы с очень низким разрешением,
например, в виде двух- или трехосного эллипсоида, но при этом они также очень
чувствительны к гибкости частицы и к взаимодействиям частиц друг с другом.
Современная гидродинамика содержит ряд новых экспериментальных методов.
В дополнение к классическим подходам, таким как аналитическое
ультрацентрифугирование — для определения коэффициента седиментации и динамическое

рассеяние света, для измерения коэффициента диффузии, в настоящее время
разработан ряд новых: свободный электрофорез — для измерения явлений переноса
в растворе под действием электрического поля, метод восстановления красителя
после фотовыцветания — для наблюдения за подвижностью отдельных молекул
в живых клетках, метод деполяризованной флуоресценции и электрического
двойного лучепреломления — для определения коэффициентов вращательной
диффузии, а также флуоресцентная корреляционная спектроскопия — для
измерения макромолекулярной динамики ансамбля, состоящего из небольшого числа
частиц.
Рассеяние излучения
Мы видим окружающий мир благодаря тому, что он рассеивает свет, который
попадает нам в глаза и анализируется мозгом. В экспериментах с дифракцией волны
излучения, рассеянные различными объектами, интерферируют, создавая
различимый рисунок, с помощью которого может быть установлено относительное
расположение (или структура) этих объектов.
Интерференционная картина возникает тогда, когда длина волны излучения
совпадает с расстоянием между объектами или меньше его. В некоторых случаях
волны, формирующие такой рисунок, можно собрать с помощью линзы, чтобы
получить непосредственный образ объекта. Длина атомных связей близка к одному
ангстрему (10~10мили 0,1 нм), поэтому для исследования структуры макромолекул
с помощью дифракционных экспериментов на практике используют три типа
излучения: рентгеновские лучи с длиной волны около 1 А, электроны с длиной волны
примерно 0,01 А и нейтроны с длиной волны от 0,5 до 10 А. Рассеяние
видимого света с длинами волн в районе 400-800 нм позволяет получать информацию о
больших макромолекулярных ансамблях и их динамике. Рентгеновские же лучи,
поскольку с их помощью возможны исследования структуры на атомном уровне,
дали возможность заложить тот фундамент, на котором структурная биология
была построена и развивается и сегодня.
Исследования биологических мембран, волокон, макромолекул и их
комплексов в кристаллах и растворах с помощью нейтронной дифракции стали возможны
в 70-х гг. прошлого столетия с разработкой методов, максимально использующих
особые свойства нейтронов.
Вслед за ограничениями, накладываемыми техникой окрашивания, была
разработана криоэлектронная микроскопия, позволяющая наблюдать субклеточные
и макромолекулярные структуры с высоким разрешением.
Свет, рентгеновские лучи и нейтроны слабо рассеиваются материей,
поэтому требуются образцы, содержащие большое количество частиц, чтобы получить
приемлемое соотношение сигнал-шум. Такие эксперименты дают усредненные
по ансамблю данные о структуре. В последнем десятилетии XX в. создание
высокоинтенсивных синхротронных источников произвело революцию в
макромолекулярной кристаллографии, значительно повысив скорость определения
молекулярных структур. Были разработаны эффективные методы модификации белков,
кристаллизации, сбора данных и анализа. Чрезвычайно высокая скорость в самом

процессе сбора данных позволила изучать кинетические интермедиа™ ферментов
с помощью кристаллографии, разрешенной во времени. Параллельно развивалась
электронная микроскопия с применением электронных пушек с полевой эмиссией,
которая позволила исследовать одиночные молекулы и восстанавливать их
трехмерную структуру. Значительно повысить скорость сбора данных в нейтронной
дифракции обещают мигающие источники для нейтронного рассеяния.
Спектроскопия
В спектроскопии излучение обменивается частью своей энергии с образцом через
эффекты поглощения или излучения вследствие внутренней или глобальной
динамики частицы, что отражается в изменении длины волны (частоты или цвета)
исходящего луча по отношению к падающему. Поскольку поглощение зависит
от расположения атома в структуре, определенные типы спектроскопических
экспериментов могут также использоваться для изучения самой структуры.
Разрешение такого чувствительного спектроскопического метода, как ядерный
магнитный резонанс, приближается к атомному. Частота поглощенного излучения
может быть измерена как функция времени с точностью выше, чем одна
миллионная. Точная природа сигнала зависит от химического окружения ядра, что
позволяет получать структурную информацию. В технике построения
изображения с помощью магнитного резонанса (томография) миллиметровое разрешение
достигается с помощью излучения метровой длины волны, когда исследуемое
тело помещается в градиент магнитного поля, и излучение на ядре
фокусируется в определенном химическом окружении. В этих условиях резонансное
поглощение соответствует определенной величине поля и, как следствие этого, дает
точное положение исследуемого вещества. Что касается дифракции, где длина
волны соответствует требуемому разрешению, то его энергия для спектроскопии
выбирается таким образом, чтобы разность, возникающая из-за возбуждения или
поглощения в образце, могла быть измерена без задержки. Поэтому излучение
различной длины волны используется в основном для дифракционных и
спектроскопических экспериментов.
Когерентная спектроскопия, где применяется излучение с одной и той же
фазой, обеспечила беспрецедентные возможности для изучения динамики и
изменения структур во времени. Когда когерентные лазеры стали доступны, метод
«спинового эха» в приложении к ЯМР и нейтронной спектроскопии был
дополнен методом «фотонного эха». Двумерная спектроскопия, сначала разработанная
для ЯМР, позволяет теперь измерять сопряжение в системе колебательных мод.
Недавно данный метод был применен в инфракрасном диапазоне для
определения структуры небольших молекул. Наиболее захватывающим аспектом
двумерной инфракрасной спектроскопии можно назвать ее чувствительность к структуре
и временное разрешение вплоть до фемтосекунды.
Если взять в качестве примера электромагнитное излучение, то для атомной
дифракции наиболее пригодна длина волн рентгеновских лучей, тогда как для
изучения внутримолекулярных колебаний требуются длины волн инфракрасного
диапазона (рис. 6).

Электромагнитное излучение
\(м) Ю-15 Ю-12 Ю-9 Ю-6 Ю-3 1 103
v(ceiO 1024 1021 10'8 1015 1012 109 106
US S ■& 3 3 ° О
5 § fc Р- i & 3 08
S=I E h; 5 ■& 5 я e
oj S x .д g ^ « cj3
s& £ & ^ds§ 1 §
Е(эв) Ю9 106 103 1 Ю-3 Ю-6 Кг9
E/*(°K) 1013 1010 107 104 10 10-2 lO"5
Нейтроны
Х(м) 10-'°-10-9
у(мсек') 4000-400
Е(эв) ЗхКЯ-ЗхЮ"4
E/*(°K) 400-4
Рис. 6. Длина волны, энергия и частота электромагнитного и нейтронного излучения.
Шкалы на рисунке представляют приблизительные порядки значений. Точные значения констант
получены из равенств: v\ = с, где v и X — частота и длина волны электромагнитного
излучения, соответственно, и с — скорость света (3 х 108м-сек-1); Е = hv (где Е — энергия и h —
константа Планка (6,626 = 10"34 Дж-сек = 4,136 х 10 15 эВсек); температурный эквивалент энергии,
1 эВ/k = 11604,5 К, где k — константа Больцмана. В случае нейтронного излученияД= й/яш (где
и мсек ' — скорость нейтрона), и Е = 1Лти2, где т — масса нейтрона (1,6726 х 10"27кг)
В ЯМР спектроскопии падающее электромагнитное излучение находится
в радиочастотном диапазоне, что соответствует метровой длине волн. Надо
заметить, что нейтронное излучение с длиной волны примерно 1 А (что соответствует
межатомным расстояниям и амплитудам колебаний) обладает энергией примерно
1 мэВ (что соответствует энергиям атомных колебаний), поэтому дифракционные
и спектроскопические эксперименты могут проводиться одновременно, давая
информацию об атомных амплитудах и частотах движения макромолекул.
Молекулярная шкала времени, соответствующие энергии и температуры для разных
биофизических методов, показаны на рисунке 7.
Детектирование одиночных молекул
До 90-х гг. прошлого века биохимические и биофизические исследования
биологических макромолекул проводились с очень большим количеством частиц, тогда
как в условиях in vivo макромолекулы функционируют как одиночные частицы в
динамическом гетерогенном окружении. Структура, динамика и взаимодействия
наблюдались и измерялись как средние по ансамблю, и такое положение дел в
основном сохраняется до сих пор. Более того, энзиматические, сигнальные реакции,
а также реакции связывания носят преимущественно стохастический характер, по-

сек-
мсек
g_ мксек-
со
нсек
псек
фсек
Энергия (ее)
10
—i—
10
—i—
10'
—I—
10
—I—
10"
—I—
10 1 10 10 10
Температура (°К)
10
104
Рис. 7. Соответствие шкал времен, энергии и температуры в различных биофизических методах.
Направления стрелок совпадают с направлением прерывистой черной диагонали, которая
смещена в горизонтальном направлении для наглядности. Цифрами обозначены: 1 - динамическое
рассеяние света; 2 - ядерный магнитный резонанс; 3 - электрическое двойное лучепреломление;
4 - двойное лучепреломление в гидродинамическом потоке; 5 - деполяризованная
флуоресценция; 6 - нейтронная спектроскопия; 7 - одномерная инфракрасная спектроскопия: 8 - лазерная
спектроскопия; 9 - двумерная инфракрасная спектроскопия
этому измерения активности, к примеру белков, также «спрятаны» в средних
значениях по ансамблю, когда измерения происходят в большой популяции молекул,
даже если реакция запускается одновременно для всего образца.
Раньше отдельные макромолекулы можно было наблюдать с помощью
электронной микроскопии в высоком вакууме, и лишь в последнем десятилетии
появились методы, позволяющие проводить наблюдения макромолекул в их
естественном состоянии. Более того, развитие техники детектирования отдельных
молекул (ДОМ) дает возможность не только наблюдать их, но и манипулировать
с ними. Техника манипулирования одиночными молекулами (MOM) основана на
двух ключевых технологиях: визуализация одиночных молекул в нашивных
(естественных) условиях и наноманипуляция. Сигналы отдельных молекул с
приемлемым соотношением сигнал-шум получаются с помощью флуоресцентных меток,
которые можно наблюдать с помощью флуоресцентной оптической микроскопии.
Благодаря применению техники полного внутреннего отражения и стоячих волн,
разрешение в этом методе может быть в несколько раз выше дифракционного
предела, накладываемого длиной волны света. Техника MOM включают в себя: захват
молекулы с помощью стеклянной пипетки или шариков, притягивающихся
сфокусированным лазерным лучом (оптический пинцет). Величины молекулярных сил
исследуются методами микроскопии силового поля. Они находятся в пиконыотон-

Энтропийная сила "ом Диапазоне, что сравнимо с
тепловыми силами, стабилизирующими актив-
Тшшчной энергией для макромо- ную макромолекулярную структуру,
лекул является их тепловая энергия: Выдающийся ученый Эрвин Шре-
К„Т - 4 х Ю » Дж. Поскольку ...кала длин да писал R ig52 ^ чт() мы „икогда
для биологических макромолекул порядка
1 не сможем проводить эксперименты с
1 мм, шкала сил находится в пределах ни-
коиыотонов (10 » II). Следовательно, энт- 0ДИИМ электроном одним атомом или
ронпиная сила может быть вычислена как одиоп молекулой. Однако изобретение
кмТ/(1нм).чторавно/.м11при300К. Г.Биннингом и Х.Рорером
сканирующей туннельной микроскопии в 1980 г.
радикально изменило взгляд ученых
на этот предмет. Стали возможны эксперименты по измерению пиконьютонных
сил, структурирующих макромолекулы i :,i;\!v,r:i i;i;,ii,'i ; ). В этих экспериментах
используется один или два оптических пинцета (твизера), позволяющих
растягивать биологические макромолекулы и измерять прикладываемую при этом
силу (рис. <S а).
В инструменте, называемом магнитным пинцетом (рис. 8 и), один конец
молекулы прикрепляется к стеклянной пипетке, в то время как другой — к магнитному
шарику, на который действует постоянное магнитное поле. Затем измеряется
растяжение или вращение молекулы как функции приложенной силы. В
микроскопии силового поля один конец молекулы прикрепляется к поверхности, а другой —
к кронштейну (консоли). Когда поверхность сдвигается, отклонение кронштейна
(консоли) отслеживается с помощью отраженного лазерного луча (рис. N в).
Эти эксперименты позволяют получить новый структурный параметр для
одиночной молекулы: силу ( i.i.\i. I ). Верхний предел измерения силы в микромани-
пуляционных экспериментах — это прочность ковалентной связи (в пределе эВ/А
или около 1000-2000 nil). Предел наименьшей измеряемой силы устанавливается
силой Ланжевена (около 1 фН), которая ответственна за броуновское движение
сенсора (размер порядка 1 мкм).
Стоит заметить, что диапазон сил в пи <. ■ 11 n ! покрывает всего лишь три
порядка величины. До того как стала доступна техника работы с единичными
молекулами, информация о стабильности белковых молекул могла быть получена только с
помощью измерения потери структуры в денатурирующих условиях (используя
температуру, химические агенты и рН), откуда рассчитывалась свободная энергия
сворачивания для молекул. Свободная энергия, однако, не снабжает нас прямой
информацией о механической стабильности. Для определения последней
важно знать изменение полной энергии как функции пространственных координат.
С целью определения силы, необходимой для разворачивания одиночной
молекулы, было исследовано несколько белков. Эксперименты показали очень большой
разброс данной величины (достигая множителя порядка десяти) для различных
белковых доменов, чья температура плавления очень схожа. Эти результаты
демонстрируют, что механическая стабильность белковой молекулы не коррелирует
напрямую с ее термодинамической стабильностью. Можно ожидать, что анализ
механических свойств макромолекул заложит фундамент новой области
исследований — механохимической биохимии.

Таблице! 1. Шкала сил для биологических макромолекул
Разрыв коналентных связей 1000-2000 nil
Деформация сахарного кольца 700 иН
Разрыв двойной спирали ДНК 400- 580 пН
Сила связи между авидином м биотипом 140- 180 пН
Структурный переход в двусппралыюй ДНК при растяжении 60-80 пН
Структурный переход двусппралыюй ДНК при торзионном скручивании -20 пН
Разрушение индивидуальных нуклеосом 20-40 пН
Разворачивание тройной спирали спектрпна 25-35 пН
Сила, необходимая для остановки мотора РНК-полимеразы 14-27 пН
Структурный переход в рнбозимпой шпильке РНК при растяжении -14 пН
Разделение комплементарных цепей ДНК (Т = 20 "С, 150 мМ NaCl)
(зависит от конкретной нуклеотидной последовательности) 10-15 пН
Сила, необходимая для остановки мотора миозина 3-6 пН
Сила, генерируемая при полимеризации белка в растущих микротрубочках 3-4 пН
Лазерный пучок
<Р
«9
Лазерный пучок
Стеклянная пипетка
t
Шарике Стеклянная подложка
ДНК j /
Основание-подложка
б
Рис. 8. Схематическое изображение трех основных способов, используемых при манипуляции
с одиночными биологическими молекулами: а — оптический пинцет (tweezer); б — магнитный
пинцет и в — атомный силовой микроскоп

Часть А
БИОЛОГИЧЕСКИЕ
МАКРОМОЛЕКУЛЫ
И ФИЗИЧЕСКИЕ ИНСТРУМЕНТЫ

Глава А1
МАКРОМОЛЕКУЛЫ И ИХ ОКРУЖЕНИЕ
A'i .1. Исторический обзор
Исследования биологических
макромолекул тесно переплетаются с
историей физической химии, которая
формально возникла в 1887 г., когда вышел
журнал Zeitschrift fur Physikalische Che-
mie, основанный Жакобом Вант-Гоф-
фом (Jacobus Van't Hoff) и
Вильгельмом Оствальдом (Wilhelm Ostwald).
Интересно, что первые выпуски были
посвящены реакциям в растворах,
поскольку биологические процессы
внутри живой клетки протекают в водном
окружении.
Исследования в XIX в. свойств
растворов привели нас к познанию свойств
биологических макромолекул, о чем мы
писали во Введении. Стоит также
упомянуть Франсуа-Мари Рауля (Francois-
Marie Raoult) (1886), химика из
Гренобля, который сформулировал закон
понижения (повышения) температуры
замерзания (кипения) раствора при
увеличении концентрации растворенных в
нем молекул, что легло в основу
развития метода определения
молекулярного веса растворенных веществ, а также
Ганса Гофмайстера (Hans Hofmeister)
(1895), доктора медицины и физиолога,
который, изучая эффекты мочегонных и
слабительных солей, классифицировал
их в соответствии с влиянием на
растворимость белков в водных растворах.
Позже серии Гофмайстера были
приняты в качестве порядка ранжирования
ионов по эффективности «высаливания»
или осаждения. Гилберт Ньютон Льюис
(Gilbert Newton Lewis) ввел понятия
активности в 1908 г. и ионной силы вместе
с Мерлом Ренделом (Merle Randall) в
1921 г. В1911 г. Фредерик Джордж Дон-
нан (Frederick George Donnan)
опубликовал статью о мембранном потенциале,
возникающем во время диализа
электролитов. Питер Дебай (Peter Debye)
и Эрих Хюккель (Erich Huckel) (1923)
предложили теорию растворов
электролитов. Наконец, в последние десятилетия
новые методы, такие как динамическое
рассеяние света и нейтронное рассеяние
под малыми углами, разработанные для
изучения полимеров — в основном
полиэлектролитов, — внесли весомый вклад в
наше понимание свойств биологических
макромолекул в растворе.
В настоящее время растет интерес
к поведению белков в неводных
растворах и даже в вакууме, в основном
для выяснения вопроса: необходима ли
вода для жизни или нет? Однако белки
как биологически активные частицы
возникли в присутствии воды, и
практически не могут рассматриваться
отдельно от своего водного окружения.
Можно вспомнить, что даже кристаллы

биологических макромолекул содержат
ощутимое количество воды, и поэтому
должны рассматриваться как
организованные макромолекулярные растворы.
А1.2. Растворы макромолекул
Раствором является гомогенная на
молекулярном уровне смесь двух или
более компонентов. Компонент,
присутствующий в наибольшем количестве,
называется растворителем, а
остальные — растворенными веществами. Мы
будем иметь дело преимущественно с
водными растворами макромолекул, где
растворитель — вода, а растворенные
вещества — макромолекулы и другие,
меньшие по размеру молекулы, такие
как простые соли.
А1.2.1. Концентрация
Концентрация растворенного
вещества может быть выражена несколькими
Комментарий А1.1. Единицы
молекулярной массы i
Молярная масса выражается в граммах
на моль или, в системе единиц СИ, кг на
моль.
Относительная молекулярная масса,
; или молекулярный вес — безразмерная
величина, определяемая как отношение мае- ;
сы молекулы к 1/12 массы изотопа углеро- |
! да 12С. Молярная масса |2С очень близка к
12 г/моль. Поэтому молярная масса (в кг
на моль) может быть преобразована в мо- j
лекулярный вес делением на 10~3 г на моль i
; (тот же результат получим, умножив на
1000 и отбросив единицы измерения).
Биохимики пользуются молекулярной j
i массой, выраженной в дальтонах — Да.
Один Да = одной атомной единице массы =
= 1/12 массы одного атома ,2С (см. также
j Главу Б1).
способами. Весовая, или массовая
концентрация, — это масса растворенного
вещества на единицу веса растворителя
(или на 100 весовых единиц
растворителя, если она выражена в процентах).
Обычной единицей молекулярной
массы в биохимии является дальтон (кл:
мен npnii Л 1.1).
Молярностъ — это количество
молей растворенного вещества на литр
раствора. Выражение концентрации в
молях на литр имеет то преимущество,
что оно более уместно при описании
коллигативных свойств раствора (т. е.
свойств, зависящих только от
количества частиц растворенного вещества,
а не от его массы и свойств. См. также
параграф Л1.2.3).
Моляльность — это количество
молей растворенного вещества на
килограмм растворителя.
Преимущество выражения концентрации в таких
единицах заключается в том, что
моляльность получается взвешиванием
растворенного вещества и
растворителя, тогда как молярность зависит от
объема раствора. Массы инвариантны,
в то время как объем раствора является
функцией температуры и давления.
Понятия молярной доли и объемной
доли сходны с понятием весовой доли,
но при этом равны количеству молей
или объему растворенного вещества на
количество молей или полный объем
раствора. Стандартные способы
измерения концентраций растворов белков
и нуклеиновых кислот обсуждаются
в комментарии А I.'-.
А1.2.2. Парциальный объем
Парциальный объем растворенного
вещества равен изменению объема
раствора после добавления растворенного

! Коммсн i арий А1.2. Измерение концентраций белков и нуклеиновых кислот
Концентрацию белка или нуклеиновой кислоты нельзя определить простым
взвешиванием материала, находящегося в растворителе. Порошки белков и нуклеиновых кислот,
полученные в результате лиофилизации или осаждения, всегда содержат какое-то количество гид-
ратированной воды и ионов соли, необходимых для поддержания их активной конформации.
, Более того, для многих экспериментальных методов достаточно крайне малой концентрации
| белка или нуклеиновой кислоты. Однако точное взвешивание нескольких микрограммов, а
| тем более еще меньшего количества материала сопряжено с относительно большой
погрешностью. На практике концентрации белков определяют с помощью колориметрического ана-
; лиза (окрашиванием по Брэдфорду), в котором индикатор химически взаимодействует с
полипептидом, или с помощью спектрофотометрии, где количество растворенного материала
пропорционально поглощению света при определенной длине волны. Поглощение при 280
им особенно чувствительно к присутствию аминокислотных остатков триптофана, тирозина
( и цистенна и для большинства белков оно составляет величину порядка одной оптической
1 единицы поглощения для раствора с концентрацией 1 мг-мл"1 и длиной оптического пути в
: 1,0 см. Величина поглощения зависит от количества таких остатков в белке. Нуклеиновые
кислоты демонстрируют сильное поглощение при 260 нм (одна оптическая единица
поглощения соответствует примерно 40 мг-мл1). Поглощение при этой длине волны используется
для определения концентрации ДНК и РНК в растворе. Колориметрические и спектрофо-
тометрнческие измерения дают относительные значения по сравнению с калибровочным
образцом. Когда требуются значения концентрации для конкретной макромолекулы, напри-
| мер, для интерпретации данных малоуглового рассеяния (Глава Е2) или вязкости (Глава Г9),
колориметрические и спектрофотометрические данные должны быть калиброваны с учетом
аминокислотного или нуклеотидного состава образца.
вещества. Парциальный объем — это
не просто объем, занимаемый
добавленным веществом, поскольку его
присутствие может также приводить к
изменению объема растворителя.
Парциальные объемы заряженных молекул
в водных растворах служат интересной
иллюстрацией эффектов
растворителя. Молекулу воды можно представить
в виде небольшого электрического
диполя. Причем в жидкой фазе вода
представляет собой малоупорядоченную
структуру, удерживаемую
водородными связями. В присутствии ионов
молекулы воды группируются вокруг
зарядов, занимая при этом меньший
объем. Такой эффект носит название
электрострикции. Поэтому
парциальный объем растворенных заряженных
ионов может быть отрицательным, как
в случае ионов Na* и Mg2+. Для этих
ионов уменьшение объема вследствие
электрострикции больше того объема,
который они реально занимают в
растворе. Парциальный объем иона К+
слегка положителен, поскольку элек-
трострикция недостаточно
компенсирует занимаемый ионом объем.
Следует заметить, что величину изменения
объема раствора при добавлении
нескольких солей нельзя предсказать из
соответствующих величин для каждой
соли.
Парциальный удельный объем
растворенного вещества равен изменению
объема раствора при добавлении
одного грамма вещества. Парциальный
моляльный объем растворенного
вещества равен изменению объема раствора
при добавлении одного моля вещества.
Парциальные объемы ионов
приведены в KOMMi'impiiii \\3, а парциальные
удельные объемы биологических
макромолекул обсуждаются в секции Г4.8.

A ' Л Парциальные моляльные объемы ионов
ион
Na" в воде
NV в морское воле (-0,725 моляльный NaCl)
К' в воде
К* в морской воде (-0,725 моляльный NaCl)
Mg*" в воде
Mg** в морской воде (-0,725 моляльный NaCl)
С1" в воде
С1" в морской воде (-0,725 моляльный NaCl)
ИзМШегоЕТ. (1969).
парциальный моляльный
объем (мл. моль1)
- 5,7
-4,4
4,5
5,9
-30,1
-27,0
22,3
23,3
А1.2.3. Коллигативные свойства
Коллигативные свойства растворов (от
латинского ligare — связывать) — это
свойства, зависящие только от
количества молекул растворенного вещества
в объеме, а не от их массы или
природы. Открытие этих свойств сыграло
существенную роль на заре физической
химии, потому что позволило точно
определить молекулярный вес, который,
в свою очередь, послужил
доказательством самого существования атомов и
молекул. Закон Рауля утверждает, что
в идеальном растворе при постоянной
температуре парциальное давление
компонента в жидкой смеси
пропорционально его мольной доли. Коллигатив-
ными свойствами, описывающимися
законом Рауля и применимыми к
разбавленным растворам нелетучих
молекул, являются повышение температуры
кипения и понижение температуры
замерзания раствора. Разница значений
температуры идеального раствора и
чистого растворителя в каждом случае
пропорциональна количеству молекул
растворенного вещества. Этот закон
может быть применим и к неидеальным
растворам, если ввести понятия
химического потенциала и активности.
А1.2.4. Химический потенциал
и активность
Рассмотрим сосуд, показанный на ри-
сушчч- .41.1, — с перегородкой,
разделяющей растворы с двумя различными
молярными концентрациями: Сх и Св.
Если мы проделаем отверстие в
перегородке, возникнет поток молекул
растворителя из области с высокой в
область с низкой концентрацией. Он
похож на поток воды, текущей вниз в
градиенте потенциала тяготения.
Такой потенциал можно связать с
концентрацией растворенного вещества.
Химический потенциал, ц,
растворенного вещества равен выигрышу
свободной энергии после добавления в
раствор одного моля вещества (см.
также Главу В1):
• • •
• • •
цСА > цСв
Рис. Л 1.1. Химический потенциал (см. текст)

u - AG/
V- /AC
Разница свободной энергии двух
растворов с концентрациями С, и С
(в молях на литр раствора) в
термодинамике выражается:
GA-GH = AG = -RT\n^-, (A1.1)
где R — газовая константа, Т—
абсолютная температура. Выражение получено
в результате интегрирования
уравнения Больпмана, которое описывает
распределение молекул идеального газа
согласно величинам свободных энергий
при постоянной температуре:
- = L'xp(-£7?Ftl <A1-2>
гд,с р , pti — величины давления при
постоянном объеме (пропорциональные
молярной концентрации), связанные
с состояниями свободных энергий G4
и GB. После простого преобразования
уравнение А 1.2 становится:
AG = \i(CA-Ce) = -RT\n^-. (А1.3)
Выражение этой зависимости в
терминах разности свободной энергии или
химического потенциала, а не в
абсолютных величинах, позволяет обойти
необходимость определения
стандартной свободной энергии или
химического потенциала (к примеру, связанных с
идеальным раствором при данной
концентрации, температуре и давлении).
Такие уравнения применимы к
идеальным растворам, т.е. в которых
молекулы растворенного вещества ведут себя
как точечные частицы и не
взаимодействуют ни друг с другом, ни с сосудом.
В 1908 г. Г. Лыоис ввел понятие
активности, чтобы объяснить отклонения
в поведении растворов от идеального.
Переписав выражение А1.3 в терминах
активности, получим:
AG = -RT\n^-. (МЛ)
ап
Активность растворенного
вещества А дается выражением
ал=Ул Сл-
где ул — коэффициент активности,
равный единице для идеального
раствора. Коэффициенты активности
получаются экспериментально, например, из
наблюдений за отклонением от закона
Рауля.
Уравнения для идеальных
растворов на практике могут быть
использованы для реальных растворов при замене
в них концентрации на активность.
А1.2.5. Температура
Повышение температуры кипения и
понижение температуры замерзания
растворов, обусловленные присутствием
растворенного вещества, на самом деле,
дают мало полезной информации при
изучении свойств таких
биологических макромолекул, как белки и
нуклеиновые кислоты. Во-первых, потому,
что мольная доля таких молекул даже
в самом концентрированном
растворе чрезвычайно низка (комментарии
.А 1.1). Во-вторых, биологические
макромолекулы, как правило,
нестабильны в чистой воде, поэтому данный
эффект будет обусловлен в основном
буферным веществом и ионами. И
наконец, белки и нуклеиновые кислоты
обычно нестабильны при
температурах кипения и замерзания воды. В
процессе эволюции они приобрели
способность приобретать стабильную
и активную конформацию в весьма

'■..•;.\;.:C:\ ij).::1 '\: ! Значения мольной доли и молярности обычных растворов
биологических макромолекул
Мольная доля макромолекул с массой 30 кДа при концентрации 300 г-л ' в водном растворе
составляет 1/4000; молярность этого раствора равна ЮмМ. Такая концентрация считается
высокой для большинства биофизических экспериментов и схожа с концентрацией белков
в цитоплазме. Мольная доля макромолекул, растворе, при концентрации 3 мгмл ' является
обычной концентрацией для многих биофизических экспериментов и равна 1/400 000;
молярность раствора составляет 100 мкМ.
ограниченных условиях,
касающихся состояния растворителя, а также в
узком диапазоне таких
термодинамических параметров, как температура
и давление (см. Часть В). Интересно
отметить, однако, что существуют
организмы, называемые экстремофила-
ми (любители крайностей), которые
адаптировались к различным
экстремальным условиям окружающей
среды, включая температуру ( mwmi'P ki-
А1.2.6. Осмотическое давление
Осмотическое давление является кол-
лигативным свойством, которым обла-
А' .5. Экстремофилы
Микроорганизмы адаптировались к различным экстремальным условиям окружающей
среды, включая очень высокие и очень низкие значения рН (алкалофилы и ацидофилы),
высокие концентрации солей (галофилы, см. Секцию А1.3), высокое давление в глубоких
океанских впадинах (барофилы), температуры близкие к 0 °С в полярных или ледниковых водах
(психрофилы, от греческого психро - прохладный; приставка крио, что значит холод, обычно
применяется для температур ниже нуля), температуры около 70 °С в термальных
источниках, показанных на картинке (термофилы), и даже температуру 113 "С (максимальную для
известных сегодня живых организмов) для Methanococcus jannaschi, которая обитает в
глубоководных морских гидротермальных источниках (гипертермофилы). Структура белков экс-
тремофильных организмов чрезвычайна схожа со структурой белков у мезофилов (живущих
при температуре около 37 °С). Сдвиг их оптимума стабильности и активности в зависимости
от условий окружающей среды обусловлен аминокислотными заменами, которые изменяют
внутренние стабилизирующие силы (см. Главу В2)

дают как небольшие молекулы
растворенного вещества, так и макромолекулы
(рис. Л1.2).
Важность данного свойства для
биологических процессов была
оценена с самого момента его открытия.
Осмос, названный так от греческого
осмос, — импульс, представляет собой
явление, возникающее, когда два
раствора разной концентрации отделены
полупроницаемой мембраной,
пропускающей молекулы растворителя
(воды), но не пропускающей
молекулы растворенного вещества.
Осмотическое давление представляет собой
гидростатическое давление
растворителя, которое образуется на мембране
со стороны более концентрированного
раствора в результате того, что вода
движется в область с более высокой
концентрацией из области с более
низкой, с тем чтобы уравновесить свой
химический потенциал. Давление
возникает со стороны более высокой
концентрации, поскольку объемы отсеков
постоянны. Осмотическое давление 11
дано в выражении
TIV = NRT, (A1.5)
где R — газовая константа, Т—
абсолютная температура, а N — количество
молей растворенного вещества в объеме V.
Массовая концентрация С и молярная
масса М растворенного вещества связа-
хт и N С
нысЛ'и V отношением — = —.
V М
Разница осмотических давлений
в двух отсеках, показанных на
рисунке Л 1.2, равна pgh, где р — плотность
растворителя, ag — ускорение
свободного падения:
(Пл-Пв)=Сл~Св11Т. (А1.5а)
Случай, когда только один отсек
сосуда содержит растворенное вещество
(концентрация Св равна нулю),
позволяет точно измерить молярную массу,
что широко используется при
исследовании полимеров.
Надо заметить, что очевидное
математическое сходство уравнения А1.5
с уравнением идеального газа,
выраженного в молярных единицах, не
имеет под собой физического основания.
Как мы указывали выше, осмотическое
давление П представляет собой
гидростатическое давление растворителя, а
не молекул растворенного вещества,
которые, подобно молекулам газа,
«толкают» мембрану со стороны высокой
концентрации.
Когда в растворе присутствует
более одного вида молекул
растворенного вещества, уравнение А1.5
преобразуется в:
nV = ^NjRT, A1.6)
где суммируются все недиффундирую-
щие растворенные вещества, для которых
мембрана непроницаема. Реальное
осмотическое давление зависит и от свойств
мембраны по отношению к различным
растворенным веществам. Например,
чтобы подсчитать осмотическое давление,
действующее на мембрану, отсекающую
молекулы с молекулярной массой свыше
h
С. > С.
Рис1. Л 1.2. К определению осмотического
давления (см.текст)

10 кДа, мы используем уравнение Л1.5,
но учитываем только молекулы с
молекулярной массой, превышающем"! 10 кДа.
А1.2.7. Вириальные коэффициенты
Уравнения А1.5 и Л1.6 предполагают,
что мы имеем дело с идеальными
растворами, в которых частицы
растворенного вещества не взаимодействуют друг
с другом. Их можно считать хорошим
приближением, когда растворы сильно
разбавлены. Хотя межмолекулярные
взаимодействия можно описать с
помощью химических потенциалов, более
широкое распространение при
исследовании макромолекулярных растворов
получило использование
коэффициентов активности, основанных на вири-
альных коэффициентах (от латинского
vires — ыиы). Теперь мы перепишем
уравнение А1.5 для неидеального
раствора, осмотическое давление
которого выражается с помощью разложения
концентрации в степенной ряд:
где Av Аъ — второй, третий и
последующие вириальные коэффициенты.
Они определяются экспериментально
и дают ценную информацию о
взаимодействиях частиц. Коэффициенты
могут быть положительными, что
говорит об отталкивании между
частицами, либо отрицательными,
указывающими на их притяжение.
А 1.3. Макромолекулы,
вода \л соли
Растворы солей оказывают значительное
влияние на стабильность конформации
макромолекул. Белки экстремальных га-
дофилов (1и>\1.\и-!1.":-1>:.i"i A \ .ii! в процессе
эволюции выработали особый
адаптационный механизм, позволяющий им
оставаться стабильными, растворимыми
и активными даже при высоких
концентрациях соли, свойственным
цитоплазме этих организмов. Связывание ионов
макромолекулами приводит к
специфическим солевым эффектам, зависящим
от конкретного типа солей и
макромолекул. Например, для образования
стабильной конформации тРНК в растворе
необходимо присутствие попов магния,
а также калия или натрия — в
небольших концентрациях. При 0,1М NaCl и
1мМ MgCl, протпвопоны Na и Mg"
нейтрализуют отталкивание между
фосфатными группами основной цепи
нуклеиновых кислот, тем самым позволяя
им принять компактную конформацию.
Данный эффект не является целиком
электростатическим и включает также
стерпческие взаимодействия. Если в
качестве соли используется N(CH.1),C1
(хлорид тетраметпламмонпя), тогда
противоион N(0-1.,); не дает тРНК
свернуться правильно, по всей вероятности
из-за того, что ион тетраметпламмонпя
занимает слишком большой объем.
Специфическое ионное связывание
играет ключевую роль в механизмах
регуляции активности и стабилизации
некоторых белков, таких как калмо-
дулин, амилазы или парвальбумпны,
которые связывают Са". Неснецифи-
чеекпми называют солевые эффекты,
схожие для всех макромолекул, хотя
они и могут сильно зависеть от
природы ионов. Сюда относятся, например,
эффекты, связанные с ионной силой
при низких концентрациях солей. Соли
также способны оказывать влияние на
макромолекулы, изменяя структуру
воды, что становится очевидным при
их высоких концентрациях.

кемлп'мдрип Л! (S Экстремальные галофилы
S^.1
Экстремальными галофилами являются археи п бактерии (см. Главу А2), способные жить
исключительно в местах с высокой концентрацией соли, таких как соленые озера, наподобие
Мертвого моря, Великого Солевого озера и Розового озера в Сенегале (показано на картинке),
а также естественные и искусственные солончаки. Эти организмы содержат каротеноиды,
благодаря которым среда их обитания приобретает розовый цвет. Кроме того, каротеноиды
включаются в пищевую цепь, в результате чего в розовый цвет окрашиваются такие животные
организмы как фламинго и лосось. Экстремальные галофилы отличаются от умеренных галофилов
и галотолерантных организмов тем, что для компенсации высокого осмотического давления
окружающей среды, вызванного концентрацией NaCl, близкой к насыщающей, они вынуждены
использовать высокие цитоплазматнческие концентрации КС1. Таким образом,
биохимические реакции протекают в условиях, которые пагубно сказываются на стабильности и
растворимости белков. Однако белки галофилов способны адаптироваться к экстремальным условиям
среды. Вместо того чтобы «защищать», как вполне можно было бы ожидать, свою структуру от
соли, — к примеру, окружая себя прочно связанной водной оболочкой, — они, наоборот,
включают в нее большое количество ионов соли и молекул воды, которые стабилизируют их
структуру и поддерживают растворимость.
В биохимии для осаждения и
кристаллизации белков часто используют
сульфат аммония. Ионы сульфата
уменьшают растворимость неполярных
(гидрофобных) групп, влияя на структуру воды.
Так, на заре биохимии белки делили на
глобулины или альбумины в
соответствии с концентрацией сульфата аммония,
необходимой для их высаживания.
А1.3.1. Ионная сила
и теория Дебая-Хюккеля
Открытие диссоциации сильных
электролитов на отдельные ионы в водном
растворе оказало огромное влияние
на последующее развитие физической
химии. Из-за электростатического
взаимодействия между зарядами
растворы ионов далеки от идеальных, даже
когда они сильно разведены. Понятие
активности (см. выше) было введено
для сильных электролитов. Для учета
влияния ионов различных
валентностей Лыоис и Ренделл предложили
считать, что средняя активность полностью
диссоциировавшего электролита в
разбавленном растворе зависит только от
ионной силы раствора /':
ilc,t
(А1.8)

где С, z. — молярная концентрация и
заряд иона у соответственно. Значение /',
рассчитанное для 1 мМ раствора NaCl,
составляет 1мМ. Значение / для 1мМ
раствора MgCl., — 2,5 мМ.
Конечно, ионная сила может быть
рассчитала для растворов любой
концентрации, и, к сожалению, некоторые
исследователи пишут о ионной силе растворов
с концентрацией 1 М и даже выше. Мы
говорим «к сожалению», потому что
нельзя забывать о том, что понятие ионной
силы применимо только к сильно
разбавленным растворам, для которых
позволительно пренебречь «природой» ионов
и их взаимодействием с водой, чтобы
рассматривать их как точечные заряды.
Комментарий А1.7. Уравнение
Пуассона
Линейное дифференциальное
уравнение в частных производных первого
порядка, названное в честь физика XIX в. Симо-
на-Дени Пуассона, возникает при решении
проблем электростатики. Закон
электростатики Гаусса утверждает, что поток
электрического вектора Е через поверхность
равен 4л величины заряда, окруженного этой
поверхностью. Это может быть записано
в следующем виде:
■ 4ко,
(А)
дЕх дЕу Э£.
Э.г ду dz
где Е. — компоненты Е и и — плотность
заряда в (х, у, z).
Теперь Е можно записать в виде
производной потенциала и, взятой со
знаком минус:
ди _ ди
'ду'' г__Э^
Уравнение Пуассона получается
подстановкой выражения (Б) в (А). Оно
связывает потенциал с плотностью заряда:
Е =-^;£ =■
х дх у
(Б)
д2и д2и д2и ,
(В)
Строго говоря, расчет ионной силы
должен ограничиваться концентрациями
в миллимолярном диапазоне.
Теория Дебая—Хюккеля была
развита для понимания поведения
разбавленных растворов электролитов. Она
базируется на уравнении Пуассона
(KOMMi'ii rapiiii A 1.7), наиболее общей
форме закона Кулона из
электростатики и статистической механике и служит
для расчета электростатического
потенциала в определенном месте раствора в
терминах концентрации и
распределения зарядов ионов, а также
диэлектрической константы растворителя.
Теория устанавливает соотношение между
ионной силой и коэффициентом
активности раствора электролита при низких
значениях ионной силы, т. е. когда это
понятие действительно уместно. Она
предсказывает уменьшение
коэффициента активности с повышением ионной
силы, что находит экспериментальное
подтверждение. При высоких
значениях ионной силы (когда данное понятие
уже ошибочно) коэффициент
активности растет и в некоторых случаях
может достигать значений, превышающих
единицу. При разработке подхода, с
использованием теории, похожей на
теорию Дебая—Хюккеля, и включающего
в себя область высоких концентраций,
должны учитываться специфические
свойства ионов, такие как
взаимодействие растворенного вещества с водой
(сольватация).
А1.3.2. Полиэлектролиты и эффект
Доннана
Полиэлектролиты представляют собой
макромолекулярные ионы. К примеру,
ДНК в виде высушенного порошка
является нейтральной солью, поскольку
отрицательно заряженные фосфатные

группы молекулы нейтрализованы
положительными
противоионами,например Na*. Противоионы и
макромолекулы диссоциируют в растворе, образуя
отрицательно заряженные полиионы
(пли макроионы) и «свободные» ионы
Na*. Распределение противоиоиов в
электростатическом поле макроионов
может быть рассчитано при низкой
ионной силе с помощью теории Де-
бая—Хюккеля.
Рассмотрим эксперимент с
диализом на рисунке Л 1.3. Здесь показан
разбавленный раствор NaCl в сосуде,
разделенном на два отсека мембраной,
которая полностью проницаема для
воды и ионов Na' и С1 . тРНК длиной
70 нуклеотидов в виде натриевой соли
находится в левом отсеке (красный
эллипсоид). В этих условиях
макромолекула диссоциирует на полиион
тРНК с 70 отрицательными зарядами
и на 70 ионов Na* (отмечены красным).
Полиионы не проходят через
мембрану. Раствор содержит три
электронейтральных компонента: 1 — вода; 2 —
макромолекула в виде натриевой соли
тРНК; 3 — NaCl. Область
отрицательных зарядов в компоненте 2
ограничена левым отсеком, и для сохранения
электронейтральности с обеих сторон
мембраны в этом отсеке должно быть
больше положительных ионов (Na*),
чем несвязанных отрицательных (С1").
Поскольку на одну макромолекулу
- ♦ + Ь
I
Риг. А 1 ..'$. Эффект Доинана (см. текст)
приходится 70 положительных
противоиоиов, то в результате будет
происходить отток компонента 3 из левого
я отсека в правый. Это явление называет -
>i ся эффектом Доинана. Распределение
>i ионов по обе стороны от мембраны, не-
в обходимое для достижения равновесия
в химического потенциала между левой
1 и правой частями сосуда, называется
распределением Доннана.
А1.3.3. Взаимодействия
между макромолекулами
и растворителем
1 Давайте снова рассмотрим два раство-
\ ра, разделенные диализной мембраной
i (рис. Л 1.1). Слева находится раствор,
\ состоящий из трех компонентов: воды
(1), макромолекулы (2) слишком боль-
i шой, чтобы проникать через диализ-
i ную мембрану и небольших молекул
растворенного вещества (3), например,
соли, которые свободно проникают
через мембрану. Раствор в правой
части сосуда не содержит макромолекул,
i Вода и диффундирующие молекулы
растворенного вещества
перемещаются между отсеками, уравновешивая
i химические потенциалы ц, и ц3. Мак-
i ромолекула будет специфически вза-
0
1'пс. А 1.1. Растворитель, состоящий из
компонентов 1 (вода) и 3 (соль), показан
светло-голубым. Макромолекула (компонент 2)
изображена красным эллипсоидом, а ее соль-
ватационная оболочка, состоящая из
связанной воды и соли, — темно-синим

имодействоватьс водой и небольшими
молекулами растворенного вещества
в основном через гидратацию,
связывание ионов и/или эффект Доннана.
Возникает вопрос, как вес эти
взаимодействия влияют на распределение
компонентов (1) и (3) с обеих сторон
мембраны?
Уравнение А1.9 определяет
увеличение плотности раствора с левой
стороны мембраны из-за присутствия
макромолекул с концентрацией С,
'-^-1 = ^ (А1.9)
\дс, с,
где р'п р- плотности растворов в
левой и правой частях, соответственно.
Такое увеличение плотности
является свойством всего объема раствора
в целом и может быть точно измерено
с помощью денситометра путем
взвешивания данного объема раствора при
постоянной температуре. Присутствие
макромолекул приводит к изменению
свойств окружающего их
растворителя. Например, если макромолекула
связывает соль и воду в соотношении,
отличном от такового в растворителе,
тогда результатом будет отток или
приток воды или соли в данный диализный
отсек — для компенсации и поддержки
химического потенциала
диффундирующих компонентов по обе стороны
мембраны. Приращение массовой
плотности выражает увеличение массовой
плотности на единицу концентрации
макромолекул. Оно учитывает не
только присутствие самой макромолекулы,
но и ее взаимодействие со способными
к диффузии компонентами
растворителя. Эта величина может быть выражена
следующим образом:
(др/дС.^ = (1 + U - Ро( v 2 + 4, v ,), (А1.10)
где индекс ц. условно обозначает
константы \л{ и ц,, а £,, — параметр
взаимодействия в граммах воды на грамм
макромолекул, тЗ х — парциальный удельный
объем (в мл на г) компонента .v.
Параметр £,, представляет воду, не
«связанную» с макромолекулами, а
заполняющую диализный объем, с тем
чтобы скомпенсировать изменение в составе
растворителя, вызванное связыванием
(или, наоборот, отталкиванием) воды и
небольших молекул растворенного
вещества с макромолекулой. Изменение
плотности представляет собой разность
в массах между объемом одного грамма
макромолекул и <;, граммов воды с
одной стороны и тем же объемом основной
массы растворителя с другой.
Уравнение, похожее на
уравнение А1.10, может быть получено в
терминах величины £,.,, выраженной
в граммах молекул растворенного
вещества на грамм макромолекул; {;, и
^связаны соотношением ^, = -£,.^/icv
где а»3 — молялыюсть растворителя
в граммах компонента (3) на грамм
воды. Параметры предпочтительного
взаимодействия £,, и Ь,Л являются
термодинамическим выражением
взаимодействий макромолекулы с
растворителем в данных условиях.
А1.3.4. Вода, соль
и гидрофобный эффект
При очень низких концентрациях солей
(без учета специфических эффектов,
связанных со свойствами различных
ионов) понятие ионной силы вполне
обосновано. Однако при высоких
концентрациях это не так. Структура воды
в жидкой фазе и ее специфические
взаимодействия с растворенным веществом
играют ключевую роль при описании
поведения макромолекул в растворе.

Несмотря на многочисленные
попытки молекулярного
моделирования для объяснения обширных
термодинамических данных в отношении
воды и растворов, структура воды па
молекулярном уровне остается до
конца непонятой. Мы даем лишь
качественное описание ее характерных черт,
подразумевая, что оно основано на
тщательно измеренных
экспериментальных термодинамических величинах.
Жидкая вода представляет собой
крайне динамичную спетому направленных
водородных связей.
Каждая молекула может
принимать участие в образовании четырех
таких связей, и мы можем
рассматривать ее как маленькое «тело» (атом
кислорода) с двумя «руками» (атомы
водорода), вытянутыми под
фиксированным углом по отношению друг
к другу (рис. Л1.л). Водородная связь
молекул воды носит электрическую
природу. Это прямо следует из того,
что температуры кипения легкой и
тяжелой поды близки, тогда как
массы ядер отличаются в два раза.
Заряды па полярных атомах появляются в
результате того, что
электроотрицательные атомы кислорода оттягивают
электронные облака от соседних
водородных атомов. В результате па первых
появляется отрицательный заряд, а на
последних — небольшие
положительные заряды. Электронная оболочка
атома водорода очень мягкая, и она
легко деформируется при сближении
с атомом кислорода. При таком
сближении и появляется водородная связь.
Напомним, что энергия водородной
связи составляет около 5 ккал/моль
( к'о.ммем Kipnii Л I .М).
Молекулы воды в жидкой фазе
постоянно меняют положение в
пространстве, образуя водородные связи с
разными партнерами, подобно челове-
Коммпнтарии Л 1.8. Энергия
водородной связи
Эта оценка получается из сравнения
экспериментальных теплот испарения
веществ, состоящих и:; одинаковых атомов,
из которых одно может образовывать
водородные связи, а другое нет. Классический
пример —днмети.човый эфир (H.jC-O-CH.,).
теплота испарения которого -5 ккал/моль
и этиловый спирт (СИ ,-01,-01-1).
теплота испарения которого в два раза больше,
около 10 ккал/моль. Причина различия
проста - молекула спирта может
образовывать водородную связь (одну), тогда
как диметн.товый эфир — ни одной.
Поэтому цена одной водородной связи —
5 ккал/моль.
jot
Of
9 «
© о°о°о
°о°о6о
00°оо0о0ооО
о°о<)ллоо0
о о
о о
°о°о0 ° о~ ~°° о
а 6 в /
l'ii \ I..). Структуры поды: а -одиночная молекула воды, большой темный атом кислород,
два светлых атома атомы водорода: 6 — направленные водородные связи вокруг одной
молекулы, образуют тетраэдр: а двумерная модель упорядоченной структуры воды пли льда: /
двумерная модель неупорядоченной структуры воды. Рисунки любезно предоставлены
профессором Джоном фнппн (J()hii l'iniiev)

Pin. Л 1.6. Трехмерная модель воды. Данная
структура высоко динамична благодаря
водородным связям, которые постоянно
образуются, разрушаются и восстанавливаются уже
в других положениях. В макрообъеме воды
каждая молекула обладает конфигурационной
свободой образования таких связей во всех
направлениях, которая не сохраняется в
присутствии растворенного вещества. Рисунок
любезно предоставлен профессором Джоном Фннни
(John Finney)
ку, стоящему в центре толпы: каждое
мгновение он соприкасается с
людьми вокруг себя, тогда как они сами
вынуждены ощущать чужие
соприкосновения (рис. А 1.6). В
термодинамических терминах образование
водородной связи приводит к уменьшению
энтальпии (отрицательной АН), в то
время как конфигурационная
свобода образования связей с
различными партнерами вызывает повышение
энтропии (положительной AS). Оба
эффекта способствуют уменьшению
свободной энергии (AG = АН — TAS) и
поэтому являются термодинамически
выгодными (см. Часть В).
Что произойдет со структурой
воды в присутствии растворенного
вещества? Его молекула изменит
динамику молекул воды, находящихся с
ним в контакте. Если вещество
полярно (т. е. несет заряд), либо нейтрально,
но способно образовывать водородные
связи, оно может упорядочивать
окружающие ее молекулы воды. Мы видели
в разделе, посвященном парциальному
объему, как небольшой заряженный
ион (Li* пли Na') «тянет» на себя
молекулы воды, вызывая электрострикцию
(см. параграф А 1.2.2). Если вещество
неполярно (т. е. не обладает
свойствами иона и не способно образовывать
водородные связи), оно все равно
будет приводить к изменению структуры
воды, поскольку находящиеся вблизи
него молекулы будут иметь меньше
возможностей образовывать
водородные связи. Молекулы теряют
конфигурационную свободу образования
таких связей во всех направлениях, и их
энтропия падает. По этой же причине
неполярные вещества плохо
растворяются в воде. Более того при
температуре, близкой к комнатной, они обладают
аномальной кривой растворимости,
т. е. их растворимость падает с
повышением температуры (рис. .41.7). И
тогда термодинамику системы
определяют эффекты, связанные с влиянием
растворенного вещества на энтропию
растворителя (уменьшение конформа-
ционной свободы или числа
возможностей образования водородных
мостиков).
Явление, называемое
гидрофобным эффектом, обусловлено низкой
растворимостью неполярных веществ
в воде. Вследствие того, что контакт
между растворенным веществом и
водой не выгоден с точки зрения
энтропии (см. Часть В),
неполярные вещества склонны к агрегации
для минимизации поверхности,
взаимодействующей с окружающими
молекулами воды и приводящей к

возникновению гидрофобной
(буквально — «боящейся воды») силы,
соединяющей их вместе.
Соли изменяют структуру
окружающей их воды в соответствии со
специфическими ионными свойствами, в
особенности такими, как заряд и объем.
При высоких концентрациях солей
такое воздействие испытывает большая
часть молекул воды ( коммги прим Л I.!).
Л 1.10), что, в свою очередь, влияет на
растворимость других растворенных
веществ. Ионы, еще сильнее понижающие
растворимость ненолярных веществ в
воде, называются высаливающими.
Добавление таких солей приводит к
высаливанию неполярных веществ, т.е. к их
осаждению. Поверхность
биологических макромолекул (белков и
нуклеиновых кислот) гетсрогенна и содержит
различные заряженные и неполярные
участки, что обусловливает их сложные
взаимодействия при гидратации,
сворачивании и растворении (см. также Часть
Комментарий AI .9. Моляльность солей и воды
Килограмм воды в жидкой фазе содержит около 55 молей данного компонента. Таким
образом, э-моля.тьный раствор NaCl состоит из 10 молей ионов соли и 55 молей воды. Учитывая,
что в среднем каждый ион окружен шестью молекулами воды, становится ясно, что такой
раствор не содержит молекул воды свободных от контактов с ионами.
Комментарий А1.10. Хаотропы и космотропы
; Структура воды в жидком фазе представляет собой высокодинамичное образование
направленных водородных связей (см. выше). В соответствии с воздействием на нее ионы де-
; лят на космотропы и хаотропы. Космотропы - это «организаторы» водной структуры. Сюда
относятся в основном небольшие ионы с высокой плотностью заряда (например, Na\ Li*, F"). ,
Хаотропы - это большие ноны - «разрушители» водной структуры. К ним относятся Rb*,
' Br. Cs' и I. Ионы К' и Cl с трудом вписываются в эту категорию. Существует сложная
взаимосвязь между способностью попов к упорядочиванию водной структуры и их высаливающи-
: мм и всаливаюшпмп свойствами. Вспомним, что серии Гофмайстера имеют феноменологиче-
' ский характер. Космотропные свойства ионов коррелирует с их высаливающими эффектами.
В случае же с катионами, чей сложный характер связывания со свернутыми и развернутыми
I макромолекулами смазывает картину, взаимосвязь высаливающих и всаливающих явлений
прослеживается не столь отчетливо.
7.50
7.60
X
с
7.70
7.80
Рис. А 1.7. Растворимость неполярного
вещества в воде на примере бензола. X означает
растворимость, выраженную через мольную
долю. Свободная энергия переноса Гиббса
представлена как RT In X. (Franks F., Gent M.,
Johnson H.H., 1963)
В). Сериями Гофмайстера называют
классификацию ионов согласно их
способности стабилизировать нативную

Tno.'ini.ui Л1. l. Серии Гофмайстера
Серии Гофмайстера для катионом и анионом. Среди катионом высаливающие смойстма
наиболее выражены у фосфата, тогда как хлорид м этом отношении нейтрален, а тионпанпд неа-
лпвает. Что касается анионом, то аммонии, калин и натрии нейтральны, а кальций и магний
более нсалнваюшие, чем литий.
катионы:
фосфат > сульфат > ацетат > хлорид < бромид < хлорат < тионпанпд
анионы:
аммонии, калии, натрий < литии < кальции, магний
Комментарий А1.11. Буферные
растворы
Все эксперименты с белками и
нуклеиновыми кислотами проводятся в
буферных растворах, подчеркивая тот факт, что
макромолекулы поддерживают натпвную
конфор.мацию только в определенном
окружении. Буфер представляет собой набор
химических веществ, которые способны
поддерживать рН в относительно узком
диапазоне. Другим компонентом
буферного раствора может служить определенная
соль в соответствующей концентрации.
Иногда добавляется восстанавливающий
агент для защиты SH-rpyiin (дитиотрейтол,
или меркаптоэтанол).
структуру и снижать растворимость
белков в водных растворах ( пи'), i. Л I.! ).
Эти серии были установлены
экспериментально и верны для многих
самых разнообразных процессов, от
растворимости белков до переходов
«спираль-клубок» некоторых
полимеров и стабилизации свернутой или
развернутой формы макромолекул.
Явление всаливания заключается в
А1.4. Перечень ключевых идей
увеличении растворимости
макромолекул при добавлении соли. Сильные
всаливающпе ионы в высоких
концентрациях дестабилизируют свернутую
структуру, предположительно из-за
того, что развернутая цепь
предоставляет больше возможностей для
связывания. Порядок ионов в сериях
Гофмайстера не является строгим и может
варьировать для разных белков. Тем
не менее классификация анионов как
стабилизирующих (высаливающих) и
дестабилизирующих (всаливающпх)
ионов в общем верна (см. mimvu и м
pnii \I.IO).
Эффекты влияния солей на
биологические макромолекулы широко
используются в биохимии и биофизике, как
важнейшая часть набора методов
фракционирования, солюбилнзацни,
кристаллизации и т.д. Но ключевую роль
растворителя в поддержании
целостности активных биологических
макромолекул нельзя преувеличить. В биохимии
очень важно работать в четко
охарактеризованном, буферном растворителе
(;,'ii\!Mc!i i apiiii A I. I I ).
• Биологические молекулы как биологически активные частицы не могут
рассматриваться отдельно от своего водного окружения.

• Концентрация растворенного вещества в растворе может быть выражена
как масса па объем (весовая концентрация) или как число молекул на объем
(молярность пли моляльностъ).
' Коллигативпые свойства растворов зависят от количества молекул
растворенного вещества.
• Парциальный объем растворенного вещества равен изменению объема раствора
после добавления вещества.
• Закон Рауля утверждает, что в идеальном растворе при постоянной температуре
парциальное давление компонента в жидкой смеси пропорционально его
мольной доли.
• Следствием закона Рауля является понижение температуры замерзания
(или повышение температуры кипения) раствора по сравнению с чистым
растворителем, пропорциональное молярной концентрации растворенного
вещества.
• Химический потенциал растворенного вещества представляет собой свободную
энергию, создаваемую при его добавлении в раствор.
• Понятие активности учитывает отклонение поведения растворов от идеальных;
активность растворенного вещества равна концентрации, помноженной на
коэффициент активности, который для идеального раствора равен единице.
" Законы, выраженные в терминах концентрации и полученные для идеальных
растворов, остаются действительными и в неидеальных условиях, если
концентрация заменяется на активность.
• В неидсальных растворах осмотическое давление может быть выражено
разложением концентрации в степенной ряд, коэффициенты разложения
которого называются вириальными коэффициентами.
• Биологические макромолекулы активны и имеют нативную конформацию в узком
диапазоне условий, касающихся свойств растворителя, температуры и давления.
° Экстремофилы — это организмы, живущие в экстремальных условиях,
связанных со свойствами растворителя, с температурой или давлением.
• Осмотическое давление представляет собой гидростатическое давление,
оказываемое на полупроницаемую мембрану со стороны более высокой
концентрации вещества.

• Осмотическое давление является коллигативным свойством; при комнатной
температуре оно пропорционально разности молярных концентраций
растворов с обеих сторон мембраны.
• Соли оказывают значительное воздействие на стабильность и растворимость
макромолекул в растворах, в соответствии с их концентрацией и химической
природой; влияние солей обусловлено их взаимодействием с водой или
прямым связыванием с макромолекулами.
• Понятие ионной силы верно только при очень низких (миллимолярных)
концентрациях солей, когда учитываются только концентрация и валентность
ионов, но не их конкретная природа.
• Теория Дебая-Хюккеля позволяет рассчитать электростатический потенциал
в любом месте раствора электролита в терминах концентрации и
распределения зарядов ионов и диэлектрических констант; она применима для
растворов с низкой концентрацией ионов, когда понятие ионной силы еще остается
верным.
• Структура воды в жидкой фазе и ее взаимодействия с небольшими молекулами
растворенного вещества играют ключевую роль в определении поведения
макромолекул в растворе.
• Вода в жидкой фазе представляет собой высокодинамичную систему
направленных водородных связей.
• Гидрофобный эффект обусловлен низкой растворимостью неполярных групп
в воде ввиду невозможности образования ими водородных связей; он
является результатом действия гидрофобной силы, соединяющей вместе неполярные
группы в водном растворе.
• Растворенные соли влияют на гидрофобный эффект в соответствии со своей
природой и концентрацией.
• Космотропные ионы, «созидатели» водной структуры, представляют собой
небольшие ионы с высокой плотностью заряда, повышающие растворимость
неполярных групп в воде; хаотропные ионы, «разрушители» водной структуры,
усиливают гидрофобный эффект.
• Сериями Гофмайстера называют феноменологическую классификацию
ионов в соответствии с их способностью стабилизировать нативную структуру
и осаждать белки и нуклеиновые кислоты в растворах.

Литература для дальнейшего чтения
Von Hippel P., Schleich Г. The effects of neutral salts on the structure and
conformational stability of macromolecules in solution./In: S.N. Timasheff, G. D. Fasman ed.
Structure of Biological Macromolecules. N. Y.: Marcel Dekker Inc., 1969. P. 417-575.
Эта глава из книги, несмотря на то, что ей уже около 40 лет, до сих пор является
прекрасным источником информации об эффектах воздействия солей на
макромолекулы.
Финкелыитейн А.В. Физика белка. М.: Изд-во «Книжный дом «Университет»,
2007.

Глава А2
МАКРОМОЛЕКУЛЫ
КАК ФИЗИЧЕСКИЕ ЧАСТИЦЫ
. .- :;::: ■'•:ic::/!Vi обзор
:'.!<)-.ч
Р. Бойль (R.Boyle) подверг
сомнению химическую теорию, принятую в
его времена, и утверждал, что настоящей
задачей химии является определение
состава веществ.
А.-Л. Лавуазье (A.-L. Lavoisier)
пришел к верному пониманию
процесса окисления. Он продемонстрировал
количественное сходство между
химическим окислением и дыханием у
животных. Лавуазье считается отцом
современной химии.
,':)-л
Дж. Пристли (J.Priestley), И.Ин-
генхауз (J.Ingenhousz) и Ж.Сенебье
(J.Senebier) установили, что
фотосинтез представляет собой процесс,
обратный дыханию.
Несмотря на сильное
противодействие виталистов, считавших, что
трансформация веществ в живых организмах
не подчиняется законам химии и
физики, а является результатом действия
живительной силы, развитие
органической химии привело к рождению
биохимии. В 1828 г. Ф. Вёлер (F. Wohler)
произвел первый лабораторный синтез
органической молекулы — мочевины.
В 1840 г. И.Ф. Либих (J.V. Liebig)
заложил прочный фундамент для
развития органической химии и описал
наиболее значимые природные
химические циклы. В 1869 г. из клеток гноя
было выделено вещество, названное
нуклеиновой кислотой. Благодаря
экспериментам по трансформации Рпеи-
mococcus О.Авери (O.Avery) в 1944 г.
представил веские доказательства того,
что нуклеиновая кислота является
хранителем генетической информации.
В 1860-х г.г. Л. Пастор,
считающийся отцом бактериологии, доказал, что
микроорганизмы вызывают брожение,
гниение, а также инфекционные
заболевания, и разработал химические
методы их изучения. В 1877 г.
пастеровские ферменты были
переименованы в энзимы (от греческого эн «в»
и зим «дрожжи»). В 1897 г. Е. Бюхнер
(E.Buchner) обнаружил, что
ферментация может происходить в
препарате дрожжей, лишенных клеточной
стенки. Наконец, в 1882 г. Е. Фиш
(E.Fisch) показал, что белки
представляют собой очень большие
молекулы, состоящие из аминокислот. Он

открыл также феномен стереоизоме-
рии углеводов.
Дж. Б. Самнер (J.B. Sumner)
выявил, что уреаза — фермент, впервые
закристаллизованный в чистом виде, —
является белком.
lis'(О
Ф.А. Липман (F.A. Lipmann)
предположил, что аденозин трпфосфат
(ЛТФ), впервые выделенный из
мышечной ткани в 1929 г., представляет собой
молекулу, выполняющую роль
переносчика энергии во многих типах клеток.
Дж. Д. Уотсон и Ф. Крик (J. D.
Watson и F. Crick) опубликовали структуру
двойной спирали ДНК, полученную
благодаря «химической интуиции» и данным
Р. Франклин и М. Уилкинса (R. Franklin
и М. Wilkins) по дифракции на волокнах.
Работы этих ученых были удостоены
Нобелевских премий.
I !>Г>.)
Ф.Сэнгер (F.Sanger) определил
аминокислотную последовательность
инсулина, доказав тем самым, чтобслки
представляют собой линейные
аминокислотные полимеры. Это достижение
было отмечено Нобелевской премией.
Его дальнейшие исследования
привели к разработке эффективного метода
определения нуклеотидных
последовательностей ДНК и РНК. За эту
работу Сэнгер получил вторую
Нобелевскую премию, разделив ее с П. Бергом и
В. Гилбертом (P. Berg и W. Gilbert).
! :)(i()-e
М. Перутц п Дж. Кендрью (М. Ре-
rutz и J.Kendrew) получили
молекулярные структуры гемоглобина и
миоглобина методом рентгеновской
кристаллографии, доказав тем
самым, что белки имеют вполне
определенную строго упорядоченную
пространственную структуру, за что
были награждены Нобелевской
премией.
1970-е
К. Вуз (С. Woese), основываясь на
анализе нуклеотидной
последовательности рибосомной РНК (рис. Л2.1),
разделил все живые организмы на три
домена: Бактерии, Археи и Эукариоты.
Правильность этой классификации
была подтверждена и уточнена, когда
стали доступны данные о
последовательностях многих белков.
1980-е
С.Альтман (S.Altman) выделил
рибонуклеазу Р — фермент, состоящий
из белка и РНК-компонентов, —
положив начало целому ряду открытий
других типов каталитических РНК.
Он был награжден Нобелевской
премией. В 1986 г. В. Гилберт (W. Gilbert)
ввел в обиход понятие РНКового мира,
обозначающее гипотетическую стадию
в эволюции жизни, за существование
которой уже высказывались такие
ученые, как К. Вуз, Ф.Крик и JI. Е. Ор-
гель (С. Woese, F. Crick и L. E. Orgel).
В этом мире РНК сочетала роль
хранителя информации с каталитическими
свойствами, необходимыми для
саморепликации. Гипотеза существования
РНКого мира способствовала
возрождению интереса к изучению
происхождения жизни.
Впечатляющее развитие
молекулярной биологии сопровождалось не
менее впечатляющим прогрессом в
методах определения структуры био-

Бактерии
Purple Bacteria
Cyanobacteria.
Flavobacterfa
Thermotogales
Aquifex
Рис. Л2.1. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа последовательности ри-
босомальной РНК, отображает три Надцарства. Результаты дальнейших исследований
позволяют предположить, что его корни находятся где-то между доменами Бактерий и Архей, про-
кариотическими одноклеточными организмами, чей генетический материал располагается не в
ядре. Археи были названы так потому, что они считаются ближайшими родственниками первых
живых организмов. Они имеют как свои специфические характеристики, так и те, которые они
разделяют с Бактериями и Эукариотами. Большинство известных организмов экстремофилов
(см. Главу А1) относятся к Археям. Некоторые из них, как, например, анаэробные метаногены,
найденные в кишечнике коров и болотах, распространены очень широко
логических макромолекул и изучения
их взаимодействий. Эти методы как
раз и составляют содержание данной
книги и поэтому не будут обсуждаться
в этой главе. Здесь мы опишем
структурные компоненты и организацию
биологических макромолекул.
А2.2. Биологические
молекулы и поток
генетической информации
Ген представлен четко определенной
нуклеотидной последовательностью в
клеточной ДНК. В ДНК существуют
четыре разновидности нуклеотидов.
Генетический код соотносит
шестьдесят четыре возможных нуклеотидных
триплета (кодона) с двадцатью
аминокислотами, найденными в белках.
Одной и той же аминокислоте могут
соответствовать несколько триплетов,
что обеспечивает белкам стабильность
в отношении мутаций на уровне ДНК.
Существуют также кодоны,
соответствующие сигналам «стоп», которые
отмечают конец цепи. В белковом синтезе
генетическая информация сначала
переписывается в нуклеотидную
последовательность матричной РНК в процессе
транскрипции, а затем уже переводится
в аминокислотную последовательность
белка на рибосоме (трансляция), в
соответствии с центральной догмой
молекулярной биологии:
ДНК <-» ДНК <-» РНК -> белок.

Первая стрелка обозначает
репликацию материнской ДНК с
образованием идентичных дочерних молекул,
вторая — транскрипцию ДНК, в
результате чего образуется РНК, и обратную
транскрипцию РНК -> ДНК,
обнаруженную у ретровирусов, а последняя
стрелка обозначает трансляцию.
Схема показывает поток
информации, а не последовательность эволюции
макромолекул, поскольку конечный
продукт этой схемы — белок —
необходим на каждом этапе. Все эти процессы
катализируются и регулируются
белковыми транскрипционными
факторами, белковыми ферментами, такими
как полимеразы, белковыми
трансляционными факторами и рибосомами,
которые сами состоят из белков и РНК.
Конечным результатом этого процесса
является белок, имеющий
аминокислотную последовательность
(первичную структуру); он один в один
соответствует гену, его кодирующему.
Перед тем как приобрести
биологическую активность, белок должен
претерпеть процесс сворачивания в
результате межцепочечных
взаимодействий и взаимодействий с
растворителем. Его вторичная структура
организована локальными конфор-
мациями, такими как а-спирали или
В-слои, скрепленными внутри- и
межцепочечными водородными связями.
Третичная структура формируется
за счет элементов вторичной
структуры, образующих компактную
трехмерную укладку, тогда как
четвертичная структура получается в результате
объединения в комплекс разных
белков или копий одной и той же
белковой молекулы.
Часто при обсуждении структуры
ДНК используется терминология из
области полимеров. Объясняется это тем,
что ДНК состоит из линейной цепочки
повторяющихся структурных единиц,
нуклеотидов. Каждый нуклеотид
образован фосфатрибозной группой,
связанной с одним из четырех азотистых
оснований: аденин (А), гуанин (Г), ци-
тозин (Ц) и тимин (Т). ДНК однако
отличается от обычных синтетических
полимеров тем, что она способна
формировать специфические структуры
в соответствии со своим окружением
и взаимодействиями с белками,
непосредственно связанными с ее
биологической функцией.
Зачастую удобно определять
физический объект, описывая, чем он не
является. Белок, вероятно, даже в
большей степени, чем ДНК, не является
классическим полимером (рис. Л2.2).
Данное утверждение может
показаться противоречивым, поскольку белок
часто описывают как полимер из
аминокислотных остатков. Между тем его
биологическая активность наделяет
белковую молекулу специфическими
свойствами, отличными от тех,
которыми обладают классические полимеры.
Их изучение привело к формулировке
законов науки о полимерах. Отметим,
что химики уже занимаются синтезом
полимеров со свойствами,
специфичными для белков.
Укажем несколько свойств,
которые отличают белки от классических
полимеров.
Во-первых, различие в составе и
молекулярной массе. Обычная
полимерная цепь состоит из небольшого числа
различных элементов, повторяющихся
много раз. Типичный образец состоит
из цепей различной длины, поэтому
молекулярная масса определяется как
среднее статистическое значение
распределения цепей по длинам (см.
пример в параграфе Г.4.71). Белковая цепь

Белок Обычные гомополимеры
Длина цепи (молекулярная масса)
N
Определено с точностью лучше,
чем один аминокислотный остаток
Двадцать аминокислот
Статистическое распределение
Состав
Повторяющиеся блоки
Цепь в растворе
Уникальная трехмерная
структура при
физиологических
условиях
Разупорядоченная
структура при
денатурирующих
условиях
Гауссов клубок
Рис. Л2.2. Белок не является классическим полимером
имеет совершенно конкретные начало
(N-конец) и конец (Оконец), ее
первичная структура четко обозначена
(например, все 1013 молекулярных цепей в
одной десятой миллиграмма белка имеют
идентичную массу с точностью,
ограниченной только естественной изотопной
вариабельностью). Эти свойства,
экспериментально подтвержденные с
помощью масс-спектрометрии (см. пример в
параграфе Б2.2.1), следуют из
структуры гена, кодирующего белок.
Во-вторых, говоря о конформации
белка в растворе, стоит обратить
внимание на то, что классическая полимерная
цепь принимает в растворе конформа-
цию, которая зависит от
растворителя и, опять-таки, может быть описана
как среднее значение в распределении
различных конформации. Напротив,
водорастворимые и мембранные
белковые цепи сворачиваются в присутствии
растворителя, в котором они активны,
и формируют строго определенные
компактные структуры. Эти структуры
в основном идентичны для всех
молекул в чистом препарате белка.
Кристаллографические и ЯМР исследования
белков (образцов, также содержащих
около 1015 молекул) позволяют
разрешать структуры, где позиции атомов
можно определить с точностью лучше
1 ангстрема.
В физиологических условиях
белковая цепь принимает определенную
третичную и четвертичную структуру,
которая разворачивается в
денатурирующих условиях (при повышенной

температуре или, например, в
растворах, содержащих мочевину или гуани-
дингидрохлорид). Денатурированный
белок принимает конформацию,
похожую на таковую гомоиолимеров
(гауссов клубок). Однако
неорганизованные белковые структуры не
обязательно должны быть биологически
неактивны. Доступные в настоящее
время полные геномные
последовательности указывают на то, что
большая часть генов кодирует длинные
аминокислотные последовательности,
и они остаются несвернутыми в
физиологических условиях (см. примеры
в параграфе Г9.5.4). Это утверждение
особенно справедливо для эукариоти-
ческих организмов.
Кроме ДНК, РНК и белков,
клетка содержит еще два больших класса
молекул — углеводы и липиды. Они
играют важнейшую структурную и
функциональные роли. Углеводы и
липиды не кодируются непосредственно
в геноме, а являются субстратами и
продуктами белковых ферментов и
синтезируются в сложных
метаболических цепях.
А2.3. Белки
Все молекулы живых организмов
представляют собой в основном либо белки,
либо продукты деятельности белков. За
исключением рибозимов, образующих
небольшой класс РНК-молекул, все
ферменты (биохимические
катализаторы метаболических реакций) являются
белками. Некоторые гормоны
(молекулы, осуществляющие регуляторные
функции через взаимодействие с
белковыми рецепторами), сами белки, в
то время как другие — лишь белковые
составляющие, такие как одиночные
аминокислоты или небольшие
пептиды. Два больших класса гормонов
представлены стероидами и аминами.
Белки могут выполнять также
и транспортные функции (например,
гемоглобин — переносчик кислорода в
красных клетках крови). Они
составляют основу мышечной и
соединительной ткани, поддерживающей структуру
тела животных, а также кожи и волос.
Белки являются компонентами
удивительно продуманных механизмов
распознавания и сигнальных путей, как,
например, в иммунной системе, а также
в разнообразных клеточных ответах на
внешние раздражители или стимулы,
которые могут быть как химическими,
так и физическими, как в случае с
фотонами в зрительном процессе или в
фотосинтезе. Из белков состоят
мембранные насосы и каналы,
устанавливающие электрохимические градиенты,
необходимые для биоэнергетики
клетки. Они играют важную роль в
передаче нервных импульсов, но этим список
биологических функций,
выполняемых белками, не исчерпывается.
Как мы указывали, в состав
белков входят в основном 20 разных
аминокислот, объединенных в линейную
цепь с помощью пептидных связей. Их
биологическая активность — результат
организации более высокого уровня,
которую формирует цепь в
физиологических условиях. Белок
определяется как объект, обладающий
биологической активностью, тогда как понятие
полипептид указывает на его
химический состав. С белком может быть
связана простетическая
неаминокислотная группа, необходимая для его
активности. В качестве примера можно
привести кислород-связывающиегемо-
вые группы гемоглобина, миоглобина
и некоторых белков дыхательной цепи,

ретиналь, который обеспечивает
световую чувствительность родопсина —
белка, имеющего отношение к зрению,
и хлорофилл в белках растений,
связанный с фотосинтезом. На самом деле,
поскольку природные аминокислоты
бесцветны (они поглощают в основном
в ультрафиолете), цвет белка всегда
обусловлен простетической группой:
красный — гемом, пурпурный — рети-
налем, зеленый — хлорофиллом.
Наличие таких светопоглощающих групп
позволяет исследовать связанные с
ними белки спектроскопическими
методами.
А2.3.1. Химический состав
и первичная структура
Общая структура аминокислот и ее
изменение при образовании пептидных
связей в составе полипептидной цепи
показана на рисунке А2.3. Первичная
структура белка представляет собой
последовательность аминокислот в
составе полипептида. Боковые цепи
двадцати основных природных
аминокислот и их свойства показаны на
рисунке А2.1.
Аминокислоты, за исключением
глицина, могут существовать в двух
энантиомерных формах, зависящих
от положения альфа-углерода, с
которым связана боковая цепь. Природные
аминокислоты находятся в D (декстро,
или правосторонней) форме, в
соответствии с направлением поворота
плоскости поляризации света (см. Гла-
ву 35).
А2.3.2. Структуры высших порядков
Структура белка может быть
изображена различными способами.
Изображения на рисунке А2.;~> базируются на
одной и той же структурной модели,
полученной с помощью
кристаллографических данных. Каждая
подчеркивает различные аспекты структурной
организации белковой молекулы.
В нашем примере белок
представляет собой фермент метаболизма, ма-
лат дегидрогеназу, из «галофильного»
(живущего в среде с высокой
концентрацией соли) организма Haloarcula
marismortui.
Вторичная, третичная и
четвертичная структуры белка показаны в верхней
части рисунка А2.5 а, где
полипептидная укладка дана в ленточном
представлении. Вторичные структуры — это
разрешенные локальные конформации
цепи, возникающие вследствие
химических и стерических ограничений.
и и
н-%
H-N-H
Н
Н' VH
Хсн' "Nw
H2N
N-конец
о
\ Л
Jh
„KH
-с'
1
С-конец
Рис. A'1.3: a — аминокислота в нейтральной форме и в виде иона, несущего двойной заряд (цвит-
терион). Обе формы встречаются в растворах. R — вариабельная боковая цепь; б —
полимеризация аминокислот при образовании полипептидной цепи сопровождается потерей одной
молекулы воды на каждую вновь образованную пептидную связь; в — цепь имеет N- и С-концы.
Направление от N-конца к С-концу соответствует направлению, в котором идет транскрипция
гена и синтез полипептидной цепи на рибосоме

нзсу^он
NH„
NH2
H2N+i^NH"
OH
NH„
О NH„
Алании Ala A
Аргинин Arg R
Аспарагин Asn N
О NH„
и О О
-^Аон o-U^^srAoH
Аспарагиновая
кислота Asp О
NH„ О
hs" у ^он
NK
Цистеин Cys С
О
Глутаминовая
кислота Glu E
О
ОН
Ну^он
NH„
Глутамин Gin Q
сн3 о
нзс^А^Аон ^у-у^1
H2N
Глицин Gly G
О
ОН
NH
N+H
ОН
NH„
Гистидин His H
О
H3N
ОН
NH„
Изолейцин Не I
н3с
СН3 NH2
Лейцин Leu L
ОН
NH„
НО
Метионин Met M
ОН
Фенилаланин Phe F
NH2
Лизин Lys К
Н °
•"-Лом
Пролин Pro Р
но
NH„
сн3 о »
Ан, W nh2
Серии Ser S
HO" ^" 2
Тирозин Туг Y
Треонин Thr T
сн3 о
h3c^Y^oh
Валин Val V
NH "2
Триптофан Тгр W
Рис. \'2Л. Двадцать основных природных аминокислот. Под каждой указан соответствующий
трех- и однобуквенный коды. Основная цепь показана темно-красным, неполярные боковые
цепи — черным, нейтральные полярные — зеленым, положительно заряженные (основные) —
синим, отрицательно заряженные (кислые) — красным. Гистидин изображен в заряженной форме
(значение рН ниже 6,0). Рядом с написанием каждой аминокислоты дано ее трех- и однобуквен-
ное обозначение и английской транскрипции

A- IK (A* i* *"W
t
Gty3«(D)
On in (A) , - --
*4 2«(pj
14<Ш(А) '■ f /лц20>ЧЛ)
<ф ,Л. Л/ »\ Ач,2И<А)
A,,J11(D)\ « ! Г \ Ф
1щ 205(D)
« О
Рис. А2.5. Разные способы изображения одной и той же белковой структуры используются для
того, чтобы подчеркнуть ее различные особенности: а — верх: ленточная схема показывает
организацию элементов вторичной структуры (закрученные ленты обозначают а-спирали,
стрелки — р-листы) в третичную структуру, каждой из четырех субъединиц, которые все вместе
образуют тстрамерную четвертичную структуру; низ: шарики и палочки — «лупа» атомных размеров,
увеличивающая область контакта димеров друг с другом, с тем чтобы показать сложную картину
организации солевых мостиков между ионами в этом месте белковой структуры; 6 — атомное
представление — наполнение пространства белка атомами; отрицательно заряженные атомы
поверхности белка изображены красным, положительно заряженные атомы — синим
Альфа-спирали и бета-слои (см. ниже)
являются наиболее
распространенными белковыми структурами, они
показаны, соответственно, как ленточные
спирали и стрелки. Представленный
белок — тетрамер. Его третичная
структура представляет собой трехмерную
конформацию субъединицы, а
четвертичная структура этого белка
образуется за счет объединения субъединиц
в тетрамер.
Увеличенный фрагмент
белковой структуры, детально
иллюстрирующий взаимосвязи различных
химических групп, показан в представлении
шарики-палочки в нижней части
рисунка А2.5 а. Подобные
иллюстрации часто используются, например,
для демонстрации взаимодействий в
активном центре фермента. В нашем
случае картина состоит из
множества солевых мостиков (ионных связей
между заряженными
аминокислотами) и ионных связей с солями
растворителя, от которых зависит
стабильность белка в присутствии высокой
концентрации соли.
В атомном представлении на
рисунке А2.56 вокруг каждого атома
нарисована ван-дер-ваальсовая сфе-

'он
Pin-. A2.(i. Плоские пептидные группы полипептиднои цепи
ра — для более наглядного
отображения белковой поверхности.
Отрицательно заряженные атомы показаны
красным, а положительно
заряженные — синим цветом. Поверхность
данного белка имеет суммарный
отрицательный заряд, что, по-видимому,
характерно для белков тех
организмов, которые адаптированы к высокой
концентрации соли.
Вторичная структура
Атомы в основной полипептидной цепи
(N — Са — С — N -...) не могут
находиться на прямой линии или свободно
вращаться, что обусловлено
свойствами связи между ними. В особенности
это касается атомов пептидной связи в
ОН
- C-N-
группе, которые лежат в одной
плоскости, что ограничивает гибкость цепи
(рис. А2.(>).
Конформация цепи может быть
задана значениями углов ф и \|/,
между плоскостью пептидной связи и Са
атомами с каждой из сторон. Угол ф
соответствует вращению NH-группы
относительно С атома и отсчитыва-
и
ется против часовой стрелки, если
смотреть с позиции альфа-углерода.
А угол \|/ соответствует вращению СО-
группы также относительно С атома
и отсчитывается по часовой стрелке,
если смотреть с той же позиции.
Постоянные значения ф и \|/ углов
придают цепи регулярную спиралеобразную
конформацию. Картой Рамачандрана
называют двумерное отображение пар
углов ф—\|/ и соответствующих им
вторичных структур (см. секцию Е3.5).
Некоторые из этих структур, например
а-спираль, стабилизируются за счет
внутрицепочечных водородных связей
и относятся к энергетически выгодным
(рис. А2.7). «Прямая» цепь с
чередующимися но обе стороны боковыми
группами аминокислот называется
Р-слоем. р-листы состоят из р-слоев,
скрепленных вместе водородными
связями. Они могут быть параллельными
Рис. Л2.7. а-спираль. Карбоксильная группа
j основной цепи связана водородной связью
с NH-группой аминокислоты / + 4

0 R н О R н О
R IH У R ." I R
О R 'н О R н О
R А I R А I к
Рис. Л2.8. Параллельный (верх) п
антипараллельный (низ) р-лнсты
и антипараллельными (рис. А2.8). В то
же время а-спирали и р-слои
являются наиболее распространенными
вторичными структурами, если судить по
содержимому банков данных белковых
структур, находящихся в Интернете
( комментарии А2.1 ).
Вторичные структуры
асимметричны не только вследствие
направленности основной цепи, но также
из-за асимметричного расположения
Комментарий А2.1. Аллостерия
Термином «аллостерия» обозначают
вызванное эффектором изменение
структуры, способствующее определенной
активности, например, связыванию субстрата
с ферментом. В качестве примера возьмем |
гемоглобин, белок — переносчик кислорода :
в крови. Гемоглобин является тетрамером,
с которым связаны четыре гемовые
группы. Субъединица может принимать либо
релаксированную (R), либо напряженную
(Т) конформацию. Кислород действует как I
аллостерический эффектор, одновременно i
являясь и субстратом. Когда он
связывается с одной из субъединиц, это вынуждает
остальные субъединицы принять R-koh-
формацию, которая имеет высокое
сродство к кислороду.
цени боковой группы аминокислот
относительно альфа-углерода (за
исключением глицина). Следует
напомнить, что природные аминокислоты
имеют D- (правостороннюю) энан-
тпомерную конфигурацию, поэтому
в правосторонней альфа-спиральной
конфигурации боковые группы будут
направлены наружу, а боковые цепи
бета-слоя направлены наружу
поочередно вверх и вниз. Таким образом,
бета-слой, в котором чередуются
полярные и неполярные аминокислоты,
будет иметь полярную и неполярную
стороны.
Третичная структура
Третичная структура белка является
результатом слабых (нековалентных,
за исключением дисульфидных
связей между двумя цистеинами)
взаимодействий между аминокислотами в
полипептидной цепи. Она лежит в
основании структурно функциональной
гипотезы. Интересно отметить, что ее
общие черты в пределах одного
белкового семейства могут быть высоко
консервативны, даже если первичные
структуры этих молекул сильно
варьируют. Большинство белков структурно
схожи с другими белками. Изучение
этих общих черт важно не только для
понимания и установления
эволюционного и функционального родства, но
также для структурного анализа нук-
леотидных последовательностей,
получаемых в геномных проектах.
Третичные структуры белковых
субъединиц можно разделить на одно-
доменные и мулътпидоменные.
Например, дегидрогеназы — ферменты
метаболизма имеют общий динуклеотидный
кофакторный домен, названный в честь
его открывателя укладкой Россмана.

а б
Рис. Л2.9: я — ленточная модель димера дифтерийного токсина (DT), демонстрирующая трех-
доменную структуру (С, Т, R). Один мономер показан серым, другой — белым. Данный димер
является иллюстрацией феномена доменного обмена {domain swopping), где мономеры
обмениваются доменами R. Каждый домен связан с определенной функцией токсина. Домен бета R (по
третичной структуре похожий на домены иммуноглобулина) отвечает за распознавание
рецептора на первой стадии проникновения токсина в клетку. В процессе эндоцитоза DT переносится
в эндосому. Домен альфа Т (но третичной структуре похожий на трансмембранные белки)
позволяет токсину проникать через мембрану эндосомы для высвобождения каталитического
домена С в цитоплазму после расщепления полипептидной цепи между С и Т. Альфа-бета домен С
представляет собой фермент, катализирующий летальную для клетки реакцию. Интересно, что
активный центр домена С скрыт за доменом R, поэтому целостный белок не активен. Подобным
образом и димер по время проникновения в клетку менее активен, поскольку домены R
закрывают друг друга; б — ленточная модель «открытого» мономера (Bennet et al., 1994)
Белковая субъединица дифтерийного
токсина поразительно четко делится на
три домена, каждый из которых имеет
характерную организацию, связанную
с его функцией (рис. Л2.9).
Доменные структуры
классифицируют но группам или семействам, в
соответствии с анализом белковых
структур по базам данных. Они доступны на
веб-страницах банков белковых
структур. САТН классификация белковых
структур представляет собой
иерархическую программу доменной
классификации, состоящей из пяти уровней:
класса (уровень С), архитектуры
(уровень А), топологии семейства укладки
(уровень Т), надсемейства гомологов
(уровень Н) и семейства
аминокислотных последовательностей (уровень S).
Последние два уровня предназначены
для белков, имеющих общего предка, и
основаны на сравнении
последовательностей и структур.
Класс определяется в соответствии
с составом вторичной структуры и
укладкой внутри домена. Насчитывается
четыре больших класса: а)
преимущественно альфа, куда входят домены, чья

вторичная структура в основном
представлена альфа-спиралями; б)
преимущественно бета, который включает
домены, организованные бета-листами; в)
альфа-бета, состоящий из
чередующихся альфа и бета вторичных структур; г)
этот класс состоит из доменов с низким
содержанием вторичных структур.
Архитектура описывает общую форму
домена, определяемую ориентацией
элементов вторичной структуры.
Топология зависит как от общей формы, так
и от связи вторичных структур между
собой (см. параграф. 35.7.4).
SCOP (структурная классификация
белков) представляет еще одну
классификацию доменных организаций,
основанную на сравнении всех известных
структур. Уровнями иерархии SCOP
являются виды, белки, семейства,
укладки и классы.
Четвертичная структура
Организация белковых субъединиц на
уровне четвертичной структуры была
отобрана эволюционно ввиду ее
функциональных преимуществ, начиная от
простой стабилизации — как в случае с
олигомеризацией ферментов из
гипертермофильных организмов,
сохраняющих стабильность при температурах,
близких к 100 °С (см. Главу А1) — и
тонкой регуляции активности — как
в случае с аллостперией (от
греческого — «другая структура» (см.
комментарии Л1.1 ), — до тщательно
согласованных сложнейших реакционных
механизмов — как в случае с большими
структурами в клетке, такими как
рибосомы, протеосомы, термосомы (см.
Главу Ж2) и шаперонные комплексы.
Большие организованные структуры,
состоящие из различных белковых
молекул, подобные тем, что найдены
в мышцах п микротрубочках, тоже
могут рассматриваться как четвертичные
структуры.
А2.4. Нуклеиновые кислоты
Нуклеиновые кислоты
подразделяются на два основных класса — дезокси-
рибонуклеиновую кислоту (ДНК) и
рибонуклеиновую (РНК). Как и
белки, имеющие полипептидную
первичную структуру, нуклеиновые кислоты
представляют собой полинуклеоти-
ды, неразветвленные полимеры
субъединиц определенного химического
типа — нуклеотидов. ДНК — это
хранилище генетической информации, и
в клеточных хромосомах она связана
с белками.
Структура ДНК преимущественно
двухцепочечная и имеет спиральную
организацию. РНК обладает целым рядом
биологических функций (до сих пор
открываются новые) и еще большим
числом структурных организаций. Обычно
она состоит из одной цепочки, которая,
изгибаясь и взаимодействуя сама с
собой, образует замысловатые вторичные
структуры. Матричная РНК (мРНК)
считывается с ДНК и переносит
генетическую информацию дальше — на
рибосому. Транспортная РНК (тРНК)
представляет собой семейство небольших
молекул РНК, состоящих примерно из
семидесяти нуклеотидов. Каждый тип
тРНК переносит одну специфическую
аминокислоту на рибосому, действуя
как адаптер между мРНК и растущей
полипептидной цепью. Сами рибосомы
состоят из больших и маленьких
молекул РНК, называемых рибосомными
РНК(рРНК).
С тех пор как был выделен фермент
РНКаза П, состоящий из РНК и белка,

было найдено множество
каталитических молекул РНК. Сюда относятся так
называемые рпбозимы и часть рРНК,
играющая важную каталитическую
роль в трансляции, а также siPHK,
небольшая молекула РНК, вовлеченная
в процесс молчания генов через РНК-
интерференцию с мРНК.
РНК-интерференция стала крайне популярной
темой современных исследований в
связи с ее возможным применением
в терапии рака и вирусных инфекций.
Удивительной молекулой является
тмРНК, так как сочетает в себе
функции тРНК и мРН К.
Молекулы малой ядрышковой РНК
локализованы в ядрышках эукариоти-
ческих клеток и участвуют в биогенезе
рРНК, определяя сайты модификации
нуклеотидов.
Геном некоторых вирусов состоит
не из ДНК, а из двуспиралыюй РНК.
Такие вирусы называются ретровиру-
сами. Примером может служить вирус
иммунодеффицита человека (ВИЧ),
который имеет механизм ретротранс-
крипции вирусной РНК, приводящий
к образованию ДНК, способной встра-
ваться в генетический материал
инфицированной клетки.
А2.4.1. Химический состав
и первичная структура
нуклеиновых кислот
Как и аминокислоты, нуклеотиды
состоят из постоянных и вариабельных
частей. Постоянная часть формирует
основную цепь полинуклеотида и
состоит из нуклеозидов, которые
образованы двумя ковалентно связанными
группами: дезоксирибозной (в ДНК)
или рибозной (в РНК) и фосфатной
группой. Вариабельная часть
представлена азотистым основанием, связанным
с сахарным остовом. В природной ДНК
встречается в основном четыре
разновидности азотистых оснований: аденин,
тимин, гуанин и цитозин. Такой же
набор оснований характерен и для РНК,
за исключением тимина, который
заменен на урацил.
В определенных молекулах могут
встречаться химически
модифицированные формы оснований (пример —
метилированная ДНК или более сложные
модификации в транспортной РНК).
Как правило, химическое
модифицирование имеет важное биологическое
значение для взаимодействий нуклеиновых
кислот с другими молекулами.
Вспомним, что клетки разных типов одного
организма содержат один и тот же набор
молекул ДНК. Разница в природе этих
клеток определяется тем, что в каждом
их типе транскрибируются свои гены.
Считается, что метилирование ДНК, т. е.
добавление метильной группы к
определенному остатку цитозина в цепи ДНК,
участвует в ингибировании
транскрипции в клетках позвоночных. Причем с
каждым типом клеток связана своя
схема метилирования. Нуклеотиды, а также
элонгация полинуклеотидной цепи
показаны на рисунке А2.10.
А2.4.2. Структуры высших
порядков
ДНК
ДНК в основном двухцепочечное
образование, и ее вторичная и третичная
структуры являются результатом спаривания
оснований. По Уотсону-Крику
классическими парами являются А-Т, G-C,
откуда возникает правило А + С = Т + G,
которому подчиняется состав ДНК.
Важное стереохимическое свойство,
которое в свое время способствовало от-

ДНК
о
он А;
Р&
НО-Р-0
Ai
н Иу
ОН ТимимТ
HOt°W
Сед
>*<1
W*N«,
HO-p'-O—. „ IL
Ah >°y
Ao
OH rywmf
РНК
Ан
0
o5 »fv&
Ун *""*"*
ho-p'-o-, x
АнОН УР»иипУ
HO-p'-O
Ah
AhAh г>»н"нГ
ОН \T Y
NK,
он Ан Цигоян ц
5' конец
о
и
но-р-о-сн2о ЧМЛС
\
он
w
Рис. Л2.10: а — химические структуры нуклеотидов. Синим показана постоянная часть,
состоящая из дезоксирибозы (в ДНК) и рибозы (в РНК) и фосфотной группы, связанной с 5'-углеродом
сахара (углероды молекулы сахара нумеруются по часовой стрелке -Г, 2' и т.д., начиная справа
от атома кислорода в кольце). Четыре природных азотистых основания представлены черным.
Соединение, состоящее из азотистого основания и сахара, называется нуклеозидом; б —
элонгация цепи идет через потерю молекулы воды и присоединение кислорода при З'-атоме углерода к
фосфатной группе следующего нуклеотида в цепи. Полинуклеотидная цепь имеет 5' и 3' концы.
Ген читается в направлении 5' — 3', которое также является направлением роста цепи во время
репликации и транскрипции
крытию двойной спирали, заключается
в том, что размер пары А-Т, соединенной
двумя водородными связями, такой же,
как у пары G-C с ее тремя водородными
связями. Поэтому обе пары могут
образовывать одну регулярную двуспираль-
ную структуру (рис. А2.11).
Существуют белки, способные
специфически узнавать нуклеотидную
последовательность ДНК за счет
наличия у спирали большой и малой
канавок (рис. А2.12).
В зависимости от нуклеотидного
состава и гидратации ДНК может
принимать форму различных двуспираль-
ных третичных структур (рис. А2.13).
Существуют и искусственные двусии-
ральные структуры ДНК, получаемые
растяжением В-формы ДНК (S-ДНК)
или скручиванием (Р-ДНК) (см.
секцию Д5.3).
РНК
Геном некоторых РНК вирусов
представлен двухцепочечными
молекулами. Однако в случае с РНК правило

I'm'. Л2.1 I. Уотсон-Криковские пары
оснований, А-Т и Г-Ц. Обратите внимание на
одинаковый размер этих структур, делающий
возможным формирование регулярной двойной
спирали
Рис. Л2.12. Рисунок двойной спирали ДНК,
показывающий большую и малую канавки,
благодаря которым основания (серый цвет)
доступны для взаимодействий с другими
молекулами
А-ДНК В-ДНК
Правая Правая
11 пар оснований 10 пар оснований
на виток на виток
Шаг = 28,2 А Шаг = 34 А
Z-ДНК
Левая
12 пар оснований
на виток0
Шаг = 43 А
Рис. Д2. \'.]. Различные структуры ДНК и соответствующие им дифракционные картины.
Закрученная вправо А-ДНК переходит в В-ДНК при повышении влажности с 75 до 92 %; Z-ДНК
представляет собой закрученную влево спираль, наблюдаемую у поли-GC последовательностей
при высоких концентрациях соли (Fuller et al., 2004)

23S РНК
Домен II
Домен IV
Домен V
5SPHK
Домен VI
Вид спереди
Вид сзади
Р11С. Л2.14. Вторичная и третичная структуры рРНК из 50S субъединицы рибосом (Ramakrishnan
and Moore, 2001)
А + Ц = У + Г чаще всего не
выдерживается, поскольку ее структура в
основном одноцепочечная. Тем не менее
за счет изгибов цепи полинуклеотиды
могут взаимодействовать друг с другом
в так называемых шпильках, формируя
участки АУ и ГЦ пар, чем
обусловлено большее разнообразие вторичных и
третичных структур РНК по сравнению
с ДНК.
Для семейства тРНК характерна
вторичная структура клеверного
листа и L-образная третичная структура.
Очень часто вторичные и третичные
структуры РНК бывают крайне
сложными, как в случае с молекулами рибо-
сомной РНК (рис. Л2.11). В результате
предсказывается целый набор
вторичных структур. Опыт показывает, что
третичная структура РНК трудна для

изучения из-за своей относительной
нестабильности.
А2.5. Углеводы
Общую формулу семейства молекул
углеводов можно выразить формулой
Сх(Н.,0)х с некоторыми более или менее
значимыми модификациями. Углеводы
живых организмов служат
структурными компонентами, источником энергии и
углерода, сигнальными молекулами,
медиаторами межклеточных
взаимодействий и взаимодействий между разными
организмами. Сахариды (от латинского
sacchamm, ведущего начало от
греческого «сахарон», что значит «сахар»)
являются основными элементами крайне
сложных молекул углеводов, изучаемых
гликобиологией (термин, принятый в
1988 г. для обозначения области знаний,
которая сочетает традиционную
биохимию углеводов с современным
пониманием роли сложных Сахаров в клеточной
и молекулярной биологии).
Биологические углеводороды
делятся на моносахариды (единичные
сахара, пример — глюкоза, от греческого
glycys — «сладкий» и -оза — принятое в
номенклатуре родовое окончание
моносахаридов), дисахариды (две ковален-
тно связанные сахарные субъединицы,
пример — сахароза), олигосахариды
(несколько ковалентно связанных
Сахаров) и полисахариды («множество»
ковалентно связанных Сахаров). Отметим,
что черта, разделяющая олиго и
полисахариды, довольно размыта.
Целлюлоза, представляющая собой
большой линейный полимер,
состоящий из мономеров глюкозы, является
основным структурным компонентом
растений и наиболее распространенным
природным полисахаридом. Гликоген
(от «сладкий» и корня gennaein,
«производить» или «рождать») — сложный
разветвленный полисахарид из
глюкозы, запасающийся в клетках печени и
мышц в качестве источника энергии. Из
смеси линейных и разветвленных
полисахаридов состоят гранулы крахмала
(от старого английского слова stercan,
что значит «затвердевать»),
выступающие в роли основного запасаемого
источника энергии у растений.
Во всех типах клеток и у многих
биологических макромолекул
встречается множество олигосахаридных
цепей, называемых гликанами, которые
могут существовать и по отдельности.
Большинство гликанов связаны с экс-
кретируемыми макромолекулами, а
также с белками и липидами,
находящимися на внешней стороне клетки,
окруженной особой богатой
углеводами оболочкой, называемой гликокалик-
сом (от греческого kalyx — покрытие, а
не от латинского calix — чашка). Глика-
ны участвуют в механизмах узнавания
клетка-клетка, клетка-макромолекула,
и во взаимодействиях между
разными организмами, например между
паразитом и хозяином. Эти механизмы
интенсивно исследуются в связи с
участием гликанов в заболеваниях — через
иммунный ответ или разрастание
опухоли, к примеру. Гликаны иммуноген-
ны, поэтому специфически узнаются и
связываются молекулами антител.
Полипептиды и полинуклеоти-
ды — это линейные цени, каждая из
которых содержит один тип связи
между составляющими их
аминокислотами или нуклеотидами. Гликаны,
с другой стороны, являются
результатом огромного числа связей между
сахарами, которые могут создавать
бесконечно сложные разветвленные
полимерные структуры. Между дву-

мя молекулами моносахаридов,
образующими полисахарид, существуют
два типа связей, называемых а и р.
Легко представить себе, насколько
возрастают возможности образования
различных структур с увеличением
числа мономеров. К счастью,
встречающиеся в природе гликаны
содержат сравнительно небольшое число
разновидностей Сахаров, поэтому
набор комбинаций структур ограничен.
Если бы это было не так, то
структурные исследования гликанов, которые
и без того чрезвычайно затруднены,
были бы почти невозможны.
А2.5.1. Химический состав
и первичная структура углеводов
Химические структуры моносахаридов
впервые описаны в конце XIX в.
Е.Фишером, который также обнаружил их
стереоизомерию. К примеру глюкоза,
фруктоза и галактоза (вспомним, что
суффикс -оза характерен для
номенклатуры углеводородов; например,
молекулы, имеющие пять и шесть атомов
углерода, называются пентозами и
гексозами) являются стереоизомерами.
Они имеют одинаковый химический
состав (С6Н1206) и отличаются
структурной организацией атомов, которая
обусловливает их специфические свойства
и характеристики. Вообще,
биологические системы очень чувствительны к
стереоизомерии (мы уже отмечали, что
все природные аминокислоты
находятся в D энантиомерной форме),
поскольку узнавание молекул в активном
центре фермента зависит, например, от
точного расположения атомов.
Моносахариды делятся на два
класса — алъдозы и кетозы, в зависимости
от того, содержат они альдегидную (-
СН=0) или кетогруппу (>С=0). Далее
они подразделяются на подклассы в
соответствии с числом атомов углерода:
альдотриозы (3 углерода), альдотстро-
зы (4), кетотриозы, кетотетрозы и т.д.
Открытые и замкнутые (циклические)
формы глюкозы, маннозы и галактозы
показаны на рисунке А2.15.
Проекционные формулы Фишера
и Хеуорта точно отражают ориентацию
групп, но являются обманчивыми в том
смысле, что на самом деле кольцо не
плоское, а может принимать различные
конформации типа «кресло», как
показано на рисунке.
Наиболее распространенные
моносахариды, найденные в гликанах
высших организмов, приведены в i.m-
.niiu' \'1.\. Эти молекулы
преобладают у высших животных, несколько
других типов найдены в организмах
низших животных, растениях и
микроорганизмах. Химические
модификации гидроксильных, карбоксильных и
аминогрупп еще больше увеличивают
структурное разнообразие и
обогащают биологическую функциональность
полисахаридов.
В растворе большинство молекул
Сахаров формируют пяти- или шестичлен-
ные кольцевые структуры, не имеющие
свободных альдегидных или кетогрупп.
Замыкание в кольцо способствует
дальнейшему образованию центра
асимметрии у исходного карбонильного
углерода, называемого аномерным, за счет
чего D-глюкоза, например, может
существовать в двух формах — а и р. Очень
часто гликаны находят связанными с
неуглеводным компонентом, обычно с
белком или липидом. Такие соединения
носят название гликоконьюгатов и
определяются согласно типу связи между
элементами. Белок или липид,
образующий гликоконьюгат, называют глико-
зилированнъш.

D - Глюкоза
D - Манноза
н-
но-
н-
н-
-он
-н
-он
-он
чон
но-
но-
н-
н-
-н
-он
-он
чон
D - Галактоза
f
н-
но-
но—
н-
-он
—н
—н
-он
^он
P-D-Глюкопираноза p-D-Маннопираноза p-D-Галактопираноза
но-
н-
но-
но-
н-
-он
-н
-н
сн2он
он
но J—орн
н
но
но
он
он
он,
н он
110 'V ' \- AlP
Ho\jiJpv.oH
но
н
но
он
он
но^°уОН
ho"^v^Soh
••V. ^°^ -»он
ho*^v^ "'он
SH "И 6Н
I'lU'. ALU.). Ряд 1 — открытая форма трех альдогексоз. Замкнутые формы показаны в различных
проекциях в следующих рядах: ряд 2 — проекция Фишера, ряд 3 — проекция Хеуорта, ряд 4 —
проекция «кресла», ряд 5 — стереопроекция
.-..'•щи.. А■" 1 Наиболее распространенные моносахариды
Пентоза: пятиуглеродный сахар ксилоза (Xyl)
Гексозы: нейтральные сахара, включающие глюкозу (Glc), галактозу (Gal) и маннозу (Man)
(см. рис. .\2.1.">).
Гексозамнны: гексоза со свободной либо N-ацетнлнрованной аминогруппой при втором
атоме углерода, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), N-ацетилгалактозамин (GalNAc).
Дезоксигексозы: гексоза без гидроксильной группы при шестом атоме углерода, фукоза
(Fuc).
Уроновые кслоты: гексоза с карбоксилированным углеродом 6, глюкуроновая кислота (GlcA),
идуроновая кислота (IdА).
Сиаловые кислоты (Sia): девятиуглеродные кислотные сахара, в основном N-ацетилнейрами-
новая кислота (Neu5Ac, NeuNAc, NeuAC или NANA).

Микрогетерогенность,
обусловленная тем, что один и тот же сайт
гликозилирования может содержать
различные гликаны, делает исследование
гликозилирования белков особенно
трудным.
Определенные первичные
структуры углеводородов помещаются в
компьютерные базы данных. Ветвление
молекул приводит к существенному
усложнению их первичных структур, и
для их анализа было разработано
специальное программное обеспечение.
А2.5.2. Структуры высших
порядков
Целлюлоза представляет собой гомопо-
лимер, образованный из глюкозы,
организованной в структуру, которая была
определена методами электронной
микроскопии и дифракции (рис. A2.1(i).
Гомо- и гетерополисахариды,
связанные с белками или липидами, также
образуют конструкции, выполняющие
структурную роль в соединительной
ткани или клеточных стенках.
Структуры белковых гликоконью-
гатов, полученные с высоким
разрешением и показывающие природу связи
и трехмерную атомную организацию,
определяются с помощью
рентгеновской кристаллографии и ЯМР. Более
предпочтительным является
использование техники ЯМР в растворе,
поскольку олигосахариды, в отличие от
моно- и дисахаридов, представляющих
собой сравнительно жесткие молекулы,
проявляют некоторую гибкость, что
затрудняет их кристаллизацию.
Рис. Л2.16. Структура целлюлозы и схема водородных связей. Атомы углерода, кислорода,
водорода и дейтерия представлены черным, красным, белым и зеленым цветами, соответственно.
Водородные связи показаны пунктирной линией (Nishiyama et al., 2002)

Инфицированиеорганизма
бактериями, паразитами и вирусами часто
сопровождается специфическим связыванием
микробных белков с гликанами
поверхности клеток хозяина. Так, холерный
токсин — это белок, который связывается
с клеточным олигосахаридом.
Структура связанного с сахаром белка холерного
токсина, определенная с высоким
разрешением при помощи рентгеновской
кристаллографии, является хорошей
иллюстрацией взаимодействий между
атомами сахара и белка (рис. А2.17).
в клетке. Соответственно, биохимия
липидов достаточно богата: липидные
молекулы служат источниками
энергии, участвуют в сложных процессах,
таких как формирование кровяных
сгустков, тромбов, без них
невозможно нормальное функционирование
нервной системы. Что касается структуры
и динамики макромолекул, то здесь нас
интересует прежде всего структурная
роль липидов в биологических
мембранах, а также их взаимодействие с мемб-
раносвязанными белками.
А2.6. Липиды
Если давать липидам широкое
определение, то это класс молекул, чьи
свойства обусловлены водонерастворимым
компонентом. Они составляют
весьма разнообразную группу структур,
выполняющих множество функций
А2.6.1. Химический состав липидов
В упрощенном представлении основные
липидные компоненты биологических
мембран состоят из водорастворимой
заряженной или полярной головки и во-
донерастворимых неполярных
углеводородных цепей. Обобщенные
структуры фосфоглицерида или фосфолипида
Рис. \2.17. Сравнение рецептор-снязынающих сайтов семейств холерного СТ и тифозного SIIT
токсина. Связанные с белком молекулы сахара изображены в виде представления
шарик-палочка: а — СТ пентамер показывает 5 связывающих участков в ганглиозидных олигосахаридах;
6 — SHT пентамер показывает 15 связывающих участков в ганглиозидах (три на мономер,
обозначенными I, II и III (Fan et al., 2000)

а б в
Рис. Л2.18. Фосфатидилэтаноламин (а),
фосфатидилхолин (б) и кардиолипин (в) (см.
текст)
даны на рисунке Л2.18. Цепи
образованы жирными кислотами (окрашено
черным), которые могут быть
насыщенными (содержащими только единичные
связи углерод-углерод) или
ненасыщенными (содержащими одну двойную
связь или более). Они находятся в
сложной эфирной связи с группой
глицерина (окрашено красным). Головные
группы показаны синим.
В биологических мембранах
присутствует большое количество
различных липидов. К примеру, в дополнение
к фосфатидилэтаноламину и фосфати-
дилхолину мембраны организмов
высших животных содержат значительное
количество сфинголипидов, а также
холестерин (рис. Л2.19). Принадлежащий
Рис. Л2.19. Холестерин
к стероидам холестерол встраивается
между цепями жирных кислот, изменяя
текучесть мембранной структуры.
Неполярные цепи липидов не обязательно
должны быть производными жирных
кислот. Например, углеводородные цепи
в мембранах архей — это производные
изопрена, которые похожи на фитольные
цепи хлорофилла растений, содержащие
чередующиеся двойные и одинарные
связи углерод-углерод, а также метальные
группы по всей длине цепи. Другое
химическое отличие липидов мембран архей
от липидов мембран эукариот и бактерий
заключается в том, что их цепи
соединены с глицерольной группой эфирной, а не
сложноэфирной связью.
Интересно, что некоторые архей
содержат «двойные» молекулы
липидов, с двумя головками с обеих сторон
углеводородных цепей. Эти глицерол-
диацил- глицерол тетраэфиры
впервые были обнаружены в
гипертермофильных организмах, в которых, как
полагают, они способствуют
повышению стабильности мембран при очень
высоких температурах. Совсем
недавно подобные структуры были
обнаружены в археях, живущих в довольно
прохладных условиях — ниже 20 "С
(см. Главу А1).
А2.6.2. Структуры высших порядков
Молекулы липидов в водных
растворах склонны к спонтанному
объединению для изоляции своих неполярных
гидрофобных компонентов от
термодинамически невыгодных контактов с
молекулами воды. Как следствие этого
существует целый ряд структурных фаз
в смеси липид-вода, которые зависят
от липидного состава, соотношения
компонентов, температуры и давления
(рис. Л2.20).

Ламеллярный кристалл - Lc Ламвллярный жидкий кристалл - Lu 60
Кубическая упаковка - РпЗт Кубическая упаковка - Ia3d £
-20
О 10 20 30 40 50 60
Состав (% воды по весу)
Кубическая упаковка - Im3m
Обращенная гексагональная
упаковка - Н„
60
Жидкая изотропная упаковка - FI
10 20 30 40 SO
Состаа (% воды по весу)
Рис. А2.20. Структурные фазы схематически показаны слева, а справа — диаграммы фаз
смесей моноолсин-вода. Моноолеин это липид, имеющий одну углеводородную цепь, который не
встречается в природных мембранах, но широко используется при кристаллизации мембранных
белков. Жидкая ламсллярная двуслойная фаза (L) соответствует состоянию большинства
природных мембран (Caffrey, 2000)
В биологических мембранах
наиболее вероятны ламеллярные
двуслойные образования в жидкой фазе (La) с
неупорядоченными углеводородными
цепями, играющие роль эффективного,
имеющего плоскую структуру,
проницаемого барьера, который, тем не менее,
позволяет мембраносвязанным белкам
сохранять функциональную гибкость
и способность диффундировать в
мембранной плоскости. В естественных
мембранах образованию La фазы
способствуют: наличие в смеси липидов
ненасыщенных углеводородных цепей,
воды, а также высокая температура.
Интересно, что, когда организм
подвергается воздействию низкой
температуры, структура его липидных мембран
адаптируется к ней для поддержания
жидкой двуслойной структуры. У
гипертермофильных архей «двуслойную»
структуру образует обнаруженный в
этих организмах монослой липида с
двумя полярными головками.
Предполагается (но не доказано), что для
некоторых природных мембран возможно
существование кубической фазы (см.
рис. А2.20).

A2.6.3. Липиды и мембранные
белки
Мембранные белки тесно связаны
с лшшдами. Они гидрофобны, что
затрудняет их исследование обычными
биохимическими методами. По этой
причине исследования мембранных
белков отстают от исследований
водорастворимых белков. Развитие
методов, в которых применяются
детергенты, позволило выделить активные
мембранные белки и даже
закристаллизовать некоторые из них. Получение
первой структуры мембранного белка
с высоким разрешением при помощи
рентгеноструктурного анализа
кристаллов, содержащих детергент,
отмечено Нобелевской премией. В 1988 г.
ее получили М. Хармут (совместно с
II. Дайзенхофером и Р. Хубером) за
определение трехмерной структуры фо-
тосннтетического реакционного
центра. Однако и по сей день получение
кристаллов мембранных белков
представляет собой сложнейшую задачу.
Диаграмма фаз, изображенных на
рисунке А2.20 была изучена в контексте
биофизики мембранных белков. Было
обнаружено, что моноолеин в
кубической фазе способствует кристаллизации
мембранных белков, необходимой для
получения структур с высоким
разрешением.
А2.7. Перечень ключевых идей
Все живые организмы согласно анализу их геномных последовательностей
делятся на три Домена (Царства): Эубактерии, Археи и Эукариоты.
Поток генетической информации в организмах идет от ДНК через РНК к
белку; эта схема является результатом длительной эволюции, поскольку на каждом
ее этапе — от репликации ДНК, транскрипции РНК и обратной транскрипции
до трансляции — требуется участие конечного продукта-белка, выполняющего
сложно регулируемые каталитические функции.
Несмотря на то что биологические макромолекулы представляют собой
последовательность структурных единиц, в процессе эволюции они «научились»
выполнять специфические функции и приобрели свойства, отличные от тех,
которыми обладают классические полимеры.
Белки состоят из особым образом свернутых полипептидов, которые
построены из аминокислотных остатков, и могут включать простетические группы,
имеющие специфические свойства (как, например, гем, связывающий
кислород).
Цвет белков (например, красный цвет гемоглобина или зеленый хлорофилл-
связывающих белков) обусловлен простетической группой, поскольку
аминокислоты поглощают в УФ-диапазоне.

5 В природных белках встречается двадцать разных аминокислот с различными
химическими характеристиками. Аминокислоты могут быть кислыми и
основными, полярными и неполярными, алифатическими и ароматическими.
" Первичная структура — это последовательность аминокислот в
макромолекуле; вторичная структура представляет собой упорядоченную локальную
конформацпю цепи, возникающую вследствие химических и стерических
ограничений; третичная структура является трехмерной организацией макромо-
лекулярной цени, заданная координатами ее атомов; четвертичную структуру
образуют несколько одинаковых или разных цепей, организованных в макро-
молекулярный комплекс.
•' Вторичные структуры белков могут быть представлены на карте Рамачандра-
на в терминах углов вращения пептидной плоскости в цепи вокруг так
называемого альфа-углерода, с которым связана боковая группа аминокислот.
0 Основными вторичными структурами, найденными в белках, являются
альфа-спирали и бета-листы.
3 Третичная структура возникает в результате слабых, нековалентных (за
исключением дислульфидной связи между двумя цистеинами) взаимодействий
между аминокислотами в полипептидной цепи.
Белковые домены делят на группы или семейства по уровням, в соответствии
с их архитектурой, топологией, гомологией и аминокислотной
последовательностью.
* Организация белков в четвертичную структуру — результат эволюционного
отбора вследствие функциональных преимуществ в отношении стабильности
аллостерического контроля и координации сложных реакционных механизмов
большими молекулярными клеточными комплексами, такими как рибосомы,
протеосомы, термосомы и шапероны.
° ДНК является хранилищем генетической информации, ее структура
преимущественно двухцепочечная и имеет спиральную организацию, конформация
которой зависит от окружения.
* РНК выполняет множество биологических функций и образует целый ряд
структур.
с Молекула РНК чаще всего одноцепочечная структура, тем не менее, она может
формировать сложные вторичные структуры — за счет поворотов и внутрице-
почечных взаимодействий между основаниями.

• Рибозимы — это молекулы РНК, обладающие каталитической активностью,
чье открытие в какой-то степени подтверждает гипотезу о существовании
РНКового мира — примитивных форм жизни, использующих РНК для
хранения генетической информации и катализа биологических реакций.
• ДНК представляет собой полинуклеотидную цепь, состоящую в основном из
четырех нуклеотидов: аденина, тимина, гуанина и цитозина; в РНК тимин
заменен урацилом.
• Основания могут иметь химические модификации, связанные с биологической
активностью, такие как метилирование в ДНК или другие более сложные
модификации, найденные в тРНК.
• Углеводы живых организмов служат структурными компонентами,
источником энергии и углерода, сигнальными молекулами и медиаторами
межклеточных взаимодействий, а также взаимодействий между разными организмами.
• Полисахариды могут представлять собой линейные или более сложные
разветвленные цепи одинаковых или разных ковалентно связанных моносахаридных
субъединиц.
" Все типы клеток и многие биологические макромолекулы образуют гликоко-
ньюгаты через гликозилирование — связывание сложных олигосахаридных
цепей, называемых гликанами.
• Гликаны иммуногенны, узнаются и специфически связываются молекулами
антител.
• Моносахариды могут существовать в различных структурных формах,
называемых стереоизомерами.
• Инфицирование организма паразитами, бактериями и вирусами
сопровождается специфическим связыванием между микробными белками и гликанами
поверхности клеток хозяина.
0 Липиды — основные составляющие биологических мембран, обеспечивающие
их пассивную проницаемость.
° Основные липидные компоненты биологических мембран можно
схематически представить состоящими из водорастворимой заряженной или полярной
головки и нерастворимой неполярной углеводородной цепи.
3 Молекулы липидов в водном растворе склонны спонтанно объединяться для
того, чтобы изолировать свои неполярные гидрофобные группы от
термодинамически невыгодных контактов с молекулами воды.

• Воднолипидные смеси, в зависимости от липидного состава, соотношения воды
с молекулами липидов, а также от температуры и давления, могут
демонстрировать ряд специфических структурных фаз.
• Для естественных биологических мембран особенно характерна так
называемая Ьафаза, в которой углеводородные цепи липидов находятся в текучем,
жидкокристаллическом состоянии. Так называемые кубические фазы, полученные
в искусственных условиях, оказались чрезвычайно полезными для
кристаллизации мембранных белков.
Литература для дальнейшего чтения
Нуклеиновые кислоты
Woese С. (1967). The Genetic Code. New York, Harper and Row.
Crick F.H. С (1968). The origin of the genetic code J. Mo/. Biol, 38, 367-379.
OrgelL. E. (1968). Evolution of the genetic apparatus,/Mo/. Biol, 38, 381-393.
Gilbert W. (1986). The RNA World, Nature, 319, 618.
Hirao I. and Ellington A. D. (1995). Re-creating the RNA World, Curr. Biol, 5, 1017-
1022.
Dykxhoorn D. M. and Novina С D. (2003). Killing the messenger: short RNAs that
silence gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 4,457-467.
Белки
Dickerson R. and Geiss I. (1969). The Structure and Action of Proteins. Menlo Park:
Benjamin Cummings.
Branden С and ToozeJ. (1999). Introduction to Protein Structure. New York: Garland
Science.
Углеводы
Varki A., Cummings R. et al. (eds) (1999). Essentials of Glycobiology. New York:
CSHL Press.
Langan P., Nishiyama Y. and Chanzy H. (1999). A revised structure and hydrogen
bonding system in cellulose II from a neutron fibre diffraction analysis./. Am. Chem Soc,
121, 9940-9946.
Merrit E. A., Sarfaty S. et al. (1994). Crystal structure fo cholera toxin B-pentamer
bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Sci. 3, 166-175.
Липиды
Caffrey M. (2000). A lipid's eye view of membrane protein crystallization in meso-
phases. Сип: Opin. Struct. Biol, 10, 486-497.
Schouten S., Hopmans E. C, Pancost R. D. and DamsteJ.S. S. (2000). Widespread
occurrence of structurally diverse tetraether membrane lipids: Evidence for the ubiquitous
presence of low-temperature relatives of hyperthermophiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
97,14421-14426.

Глава A3
ПОНИМАНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЙ
СТРУКТУРЫ
А3.1. Исторический обзор
Ричард Фейнман, один из
выдающихся физиков прошлого столетия, считал
Пифагора (с 500 до н. э.)
первооткрывателем численных соотношений в
природе. Открытие великого древнего
мыслителя, которое привело его к
основанию философско-религиозной
школы с мистической верой в силу чисел,
заключалось в том, что одновременное
звучание двух одинаковых струн
различной длины приятнее для слуха, если
длины этих струн относятся друг к
другу как небольшие целые числа. Сейчас
мы говорим, что отношение 1:2
соответствует октаве, 2:3 — квинте и т. д. Все
эти интервалы считаются гармонически
звучащими аккордами.
Согласно Фейнману это открытие
имеет три составляющие: основано на
экспериментальном наблюдении,
математика используется как метод для
понимания природы явления, и оно
имеет эстетическое начало («приятность»
звука). Фейнман писал, что если бы
Пифагор был более всего впечатлен
силой экспериментального наблюдения,
физика как наука началась бы гораздо
раньше.
С помощью эксперимента мы
узнаем о существовании макромолекул и
пытаемся понять их с биофизической
точки зрения, при этом мы используем
математический аппарат не только для
подготовки эксперимента и анализа его
результатов, но и для описания самого
объекта исследования. Вполне
вероятно, что основы эстетики до сих пор
остаются такими же загадочными, как
и во времена Пифагора. Несомненно,
однако, что «красота» двойной спирали
ДНК и то, каким элегантным образом
она дала объяснение хранению и
передаче генетической информация,
послужили основным источником вдохновения
в развитии современной молекулярной
биологии. Точно также эстетичны и
красочные иллюстрации структурных
моделей белков. Конечно, они играют
важную роль в понимании и принятии
этих моделей биологами, которых
могла бы оттолкнуть чисто математическая
интерпретация тех же данных, пусть
и более точная.
Эксперименты с биологическими
макромолекулами трудны как для
постановки, так и для осмысления их
результатов. Материал образца хрупок,
нестабилен и поэтому хороший
биофизический опыт должен покоиться на
прочном биохимическом фундаменте.
Биологические макромолекулы гораздо
меньше длины волны света и их нельзя
«увидеть». Мы получаем информацию
об их структуре и динамике, облучая

образец электромагнитным или другим
излучением и анализируя то, что
получается на выходе. Образец поглощает и
рассеивает излучение. Разность энергий
падающего и выходящего излучения
анализируется с помощью
спектроскопии, тогда как в дифракционных
экспериментах, где нет разности энергий,
анализируется зависимость
интенсивности рассеянного излучения от угла
рассеяния. Интерпретация таких
экспериментов целиком и полностью
основана на физике и математике волн и их
взаимодействий, будь то классическое
описание в терминах интерференции
рассеянных волн, применяемое в
кристаллографии, или квантово-химическое
описание, необходимое для
электромагнитной спектроскопии. Работа Жозефа
Фурье Ooseph Fourier) (1768-1830)
по волновому описанию процессов
теплопередачи привела к появлению
замечательного набора математических
инструментов для описания
взаимодействий излучения с веществом.
Один из плодотворных подходов
к исследованию структуры
макромолекул заключается в поиске сил
стабилизирующих ее структуру, т. е. таких,
которые поддерживают атомы в положениях,
соответствующих правильно свернутой
активной конформации молекулы. Если
мы добьемся этого понимания, то
сможем узнать, за счет чего атомы в ее
структуре двигаются, сохраняя свои средние
положения. Выражаясь языком физики,
наша цель состоит в достижении
достаточно ясного представления о том, что
собой представляет силовое поле, или
какова функция потенциальной энергии
вокруг каждого атома в структуре
молекулы. Это позволило бы моделировать
ее молекулярную динамику.
В 1975 г. Дж. А Мак Кэммон,
В.Р.Гелин и M.Kapiuiioc(J.A.McCam-
mon, В. R. Gelin и М. Karplus)
впервые опубликовали свои результаты
моделирования молекулярной динамики
(МД) движения атомов
биологической макромолекулы, небольшого
белка, трипсинового ингибитора из
поджелудочной железы теленка (BPTI),
структура которого к тому времени
была определена с высокой
точностью с помощью рентгеноструктурного
анализа. Несмотря на недостаточную
вычислительную мощность тех лет
(моделирование было ограничено
периодом времени менее 10 пикосекунд)
эти исследования вместе с первыми
экспериментами К. Линдерстрёма-Лан-
га (К. Linderstrom-Lang) (1955) и его
сотрудников по водородному обмену
подтвердили представление о белках
как динамичных структурах, чьи
внутримолекулярные движения играют
важную роль в их биологической
активности.
В последующие десятилетия после
публикации модели трипсинового
ингибитора аналогичные расчеты были
сделаны для более крупных белков и
для более длительных периодов, по мере
того как становились доступны новые
структуры с высоким разрешением и все
более мощные компьютеры.
Параллельно развивались экспериментальные
подходы, предоставляющие информацию о
макромолекулярных энергиях и
внутримолекулярных движениях,
необходимых для обоснования таких моделей.
Сюда можно отнести
микрокалориметрию (Часть В), анализ температурных
факторов в кристаллографии (Часть Е),
ЯМР (Часть К), неупругое нейтронное
рассеяние (Часть И), инфракрасную
спектроскопию с фурье-преобразовани-
ем (Часть 3) и различные методы
измерения быстрой кинетики с
использованием лазерных импульсов для запуска

реакций. Были установлены синерге-
тические отношения между расчетами
молекулярной динамики и ЯМР и
рентгеновской кристаллографией, с
использованием минимизации энергии при
уточнении макромолекулярной
структуры. Динамические переходы в белках
были открыты благодаря Мессбауэровс-
кой спектроскопии (Ф. Парак (F. Parak)
с сотр.) и неупругому нейтронному
рассеянию (В. Достер (W. Doster) с сотр.).
X. Фраунфельдер (Н. Frauenfelder)
опубликовал модель конформационно-
го подсостояния (КП) белков,
послужившей физической основой для
понимания макромолекулярной структуры и
динамики.
Начиная с 2000 г. моделирование
молекулярной динамики применяется
на надмолекулярном и даже клеточном
уровне. Экспериментальные методы
постоянно совершенствуются и
возникают новые, такие как
кристаллография в реальном времени и
кинетическая криокристаллография, в которой
промежуточные структуры
каталитического ферментного цикла
замораживаются и исследуются по отдельности.
A3.2. Основные физические
и математические
инструменты
Практически все экспериментальные
методы анализа биологических
макромолекул (за исключением
калориметрии и методов классической
физической химии растворов, таких как
определение осмотического давления,
вязкости и т. д.) полностью или
частично основаны на наблюдении их
взаимодействия с излучением. Это наиболее
очевидно для тех из них, которые
основаны на дифракции и спектроскопии
Рис. А3.1. Образец представляет
собой «черный ящик», в который
попадает излучение с известной длиной волны:
а — дифракционный эксперимент:
интенсивность рассеянного излучения измеряется
как функция угла; б — спектроскопия:
анализируется энергия выходящего излучения
(кристаллография и ЯМР), но также
справедливо и для гидродинамических
методов, таких как аналитическое
ультрацентрифугирование или
динамическое рассеяние света, где присутствие
макромолекул в растворе
детектируется благодаря их поглощению или
рассеянию света. В большинстве случаев
образец представляет собой «черный
ящик», через который мы пропускаем
излучение с известными свойствами
и анализируем то, что получается на
выходе (рис. А3.1). Для исследования
взаимодействий между излучением и
веществом нам потребуется некоторое
знание математических средств
описания волн, а также квантовой механики,
где рассматриваются корпускулярные
свойства излучения и волновые
свойства движущихся частиц.
АЗ.2.1. Волны
Синусы и косинусы
Свойство периодичности волн проще
всего описать с помощью функций
синуса или косинуса (рис. A3.2). Кроме того,

волна может быть охарактеризована еще
несколькими параметрами. Ее
амплитуда А является мерой максимального
отклонения функции от среднего значения;
интенсивность волны равна квадрату ее
амплитуды. Длина волны X представляет
собой расстояние, на котором
совершается одно полное колебание; ее частота
/равна числу полных колебаний,
совершаемых в единицу времени. Таким
образом, скорость распространения волны и
(расстояние, покрываемое точкой цикла
за единицу времени) равна ее частоте,
помноженной на длину волны
u=fk. (A3.1)
Значения функций sin X и cos X
изменяются с периодом, равным 2л (см.
рис. A3.2).
Рассмотрим сначала аргументе для
случая стоячей или
распространяющейся волны, наблюдаемой в определенный
момент времени. Выражая X в
терминах длины волны как kx = (2п/1)х, где
х — расстояние, можно описать волну
с помощью выражения
Y = coskx
или (А3.2)
Y = sin&r,
где для простоты амплитуда принята за
единицу.
Волновой вектор к, с абсолютным
значением k = (2к/Х), указывает
направление распространения волны.
Теперь рассмотрим случай,
когда параметр X описывает время. Здесь
волновые колебания уже будут иметь
временную зависимость и
совершаться в определенной точке пространства.
Учитывая, что период колебаний равен
2л, мы можем записать Х= a>t = 2nft, где
Рис. A3.2. Волны, описываемые следующими функциями: а — Y=AsinX; б— Y = AcosX; в
Г = (Л/л/2) (cosX-sinX)^- Y = (A/2)(cosX-j3sinX)\d- Y = (A/2)(yf3cosX-sinX)

t — время. И опять, принимая
амплитуду равной единице, опишем волну как:
Y = cos cor
или (АЗ.З)
Y = sinco£.
Величина со = 2я/ называется
угловой частотой.
Разность фаз 5 показывает
насколько две волны с одной частотой
и длиной не совпадают друг с другом
(см. рис. A3.2). Например, если одна из
них описывается функцией coscot,
тогда другая — функцией cos(cot + 5).
Волны с разными фазами представляются
функциями cos(co£ + a,), cos(co£ + а,),
cos(co£ + а3) и т. д. Стоит заметить, что
функции синуса и косинуса
соотносятся друг с другом через разность фаз 5 =
я/2 (см. рис. A3.2 а, 6).
Вспомним, что в тригонометрии
cos(co£ + 5,) =
* (А3.4)
= coso, coscof. -sin5, sinatf.
Поскольку cos 5, и sin 5, константы,
то мы можем записать:
cos(ctf + 5,) =
' . (А3.5)
= a,coscor + o1sincor.
Другими словами, волна с данной
частотой и фазой может быть
представлена суммой косинуса и синуса,
помноженных на соответствующие
коэффициенты ах и Ьу
Волна, описываемая функцией
(cosX — sinX) отстает по фазе на
величину 5 = я/4 от волны,
описываемой функцией cosX (см. рис. A3.2 6.
и). Это можно также рассчитать из
уравнения A3.4: sin5 = cos5 =1/V2
для 5 = я/4 (45°). Точно также,
волны, различающиеся по фазе от cosX на
я/3 и я/6, описываются функциями
(cosX-VIsinA: и (^cosX-sinX) (см.
рис. A3.2 л ()).
Таким образом, сумму волн
одинаковой длины и частоты, но с разными
амплитудами и фазами можно выразить
математически как сумму функций
синуса и косинуса с соответствующими
коэффициентами. На рисунке АЗ.З
показаны два крайних случая: в
результате сложения двух волн с разностью фаз
«я, где п — ноль или любое целое
четное число, возникает конструктивная
интерференция, сложение двух волн с
разностью фаз «'я, где п' — целое
нечетное число, приводит к деструктивной
интерференции.
Интерференция волн различной
частоты порождает более сложную
картину. Рассмотрим две волны с
одинаковыми амплитудами и разными
угловыми частотами со, и со.,. Применяя
математическое правило косинусов, их
сумму можно представить следующим
образом:
cosco,£ + cosco,r =
" (А3.6)
= 2cosj^(co, + co2)tx
xcosj^(co, -co2)t.
Сумма волн с разными частотами
и амплитудами А и А2 описывается
выражением
A cosco.r + A, cosco,,£ =
(A3 7)
= cos^(co, +co2)t[A,cos>2X
х(со, -co2)t +A2cos/(co, -со2)Г].
Сумма таких волн, но с
одинаковыми амплитудами, показана на
рисунке A3.А. В очень хорошем
приближении можно считать среднюю частоту
результирующей волны, равной '/2(00, +
+ со2), а амплитуду, осциллирующую с
более низкой частотой, равной '/^(со, -
- со2). Говорят, что итоговая волна
модулируется колебаниями с более
низкой частотой.
Феномен биений возникает, когда
значения со, и со2 достаточно близки

Рис. A'A.'.V. a — конструктивная интерференция двух волн, находящихся в фазе (или с разностью
фаз 2 л, 4 л, 6л и т.д.)
Д cos X + Д cos( X + пк) = (Л, + А2 )cos X,
где п равно нулю или целому четному числу; б — деструктивная интерференция двух волн,
имеющих разные фазы (разность фаз п'п, где п' — нечетное целое число)
/1, cosX + A,cos(X + п'п) = (Д - A.2)cosX

wwwwvw
Рис. A.'J.I. Две волны (я) и (б) с небольшой
разностью частот и их сумма (в).
Изменение интенсивности (квадрата амплитуды)
результирующей волны на относительной
шкале (г)
(~со), например, когда мы слышим
звучание двух струн с немного разным
натяжением во время настройки гитары.
Частота звучания ноты равна -со, но
ее интенсивность будет пульсировать
с гораздо меньшей частотой (со, - со2),
которая в два раза больше частоты
осцилляции амплитуды, поскольку
интенсивность равна квадрату
амплитуды (см. рис. Л3.1). Феномен биений
можно наблюдать в экспериментах с
динамическим рассеянием света, где
волны света с несколько различными
частотами интерферируют после
рассеяния молекулами, движущимися с
разными скоростями (эффект
Доплера, см. параграф Г10.4.4).
Скорость волны, описанная в
уравнении А3.1, соответствует скорости
распространения точки постоянной фазы
(например, гребня волны) и называется
фазовой скоростью волны. Используя
определения волнового вектора и
угловой частоты, мы можем переписать
уравнение A3.1 как:
u = a/k, (A3.8)
где и фазовая скорость.
Когда мы наблюдаем
суперпозицию волн с различными значениями со
и k, бегущих в одном направлении, как
на рисунке \'Л.\, то групповая скорость
ur vn результирующей волны равна
скорости распространения модуляции.
Можно показать, что:
Соотношение между значениями со
и k называют дисперсионным
соотношением. Понятно, что фазовые и
групповые скорости равны в случае волн, у
которых со пропорционально k.
Для того, чтобы рассчитать
групповую скорость результирующей волны
на рисунке Л3.1, мы прежде всего
должны учесть в уравнении А3.7 колебание
в продольном направлении .г:
Л, cos(co,£ - k{ x) + A, cos х
х(со2£ - k2x) = cosy2 х
х[(со1+со2К-(^1+^)х]х
x^cos^Ko^-co.,)?-
-(kt -k2)x] + A.2cosy2 x
х [(со,-со2Х-(*,-£2)•*•]}■
Члены выражения, обозначающие
время и расстояние, имеют разные
знаки потому, что гребень волны,
находящийся в определенной точке, в
предыдущий временной период был позади
нее на расстоянии одной длины волны.

Модуляция описывается функцией
косинуса в фигурных скобках в правой
части уравнения A3.10, а ее скорость
равна mmiu = (со, -ю2)/(А, -&,). Если
частоты и волновые векторы двух волн
отличаются незначительно, тогда и
равна групповой скорости, описываемой
уравнением А3.9.
Комплексные экспоненты
Комплексные числа были изобретены
для решения некоторых уравнений,
таких как, например х? = -1, но благодаря
своим уникальным свойствам они стали
мощным математическим
инструментом, позволяющим решать множество
физических задач.
Комплексное число а имеет вид:
х + iy,
где г равно квадратному корню из -1;
л" называют «действительной» частью
комплексного числа, а у — «мнимой».
Конечно, с математической точки
зрения ничего мнимого в этой части нет!
Суммы и произведения комплексных
чисел сами являются комплексными:
(x + iy) + (x'+iy') =
= (x + x') + i(y + y'),
(x + iy)(x'+iy') =
= (хх'- уу') + i(xy'+ х' у).
а* = x-iy
(A3.ll)
аа*
■х2+у'.
Число а* называют комплексно
сопряженным с а числом.
Комплексное число а можно
представить на плоскости через координаты .г и
у как радиальную линию длиной А,
называемую амплитудой, и образующую с
осью х угол ф, называемый фазой. В этом
У"
9-
55
Acosy
Рис. Л.'!..). Комплексное число а = х + iy,
выраженное геометрически на плоскости ху. Оно
может быть записано также как а = Лехрг'ф, где
А называют амплитудой, а ф фазой.
.V " /ICOS ф
у = /Isin ф
A = i(S+y>).
случае ось х является «действительной»,
а ось у — «мнимой» (рис. Л3.;1).
Такой график называют
диаграммой Аргана. Из рисунка видно, что А =
= ^{х? + у2), и комплексное число может
быть записано как а = А (соэф + z'sin ф).
Из математики известно, что
комплексную экспоненту можно выразить как:
е'ф = cos0 + z'sin0, (A3.12)
поэтому а = Лехрг ф.
Фейнман называл формулу A3.12
«самой замечательной в математике,
нашей жемчужиной»! Формула связывает
алгебру (комплексные числа) и
геометрию (синусы и косинусы,
определяемые отношением сторон треугольника).
Удивительным является то, насколько
ее свойства позволяют упростить
соответствующие математические
операции. Основное из этих свойств:
e'<*.+*>=e'V=. (A3.13)
Умножая экспоненту на комплексно
сопряженную с ней, мы получим:
e'V
„к>„--*> _е» _ J
Таким образом, комплексное число
может быть записано в виде
действительной и мнимой частей как х-- iy, или

koMMOiiKipui; A3. I. Сложение комплексных экспонент
Уравнение A3.7 может быть записано простым образом через комплексные экспоненты:
Д ехр/ф, + Л., схр/ф,, =
(А)
: ЛехР'^(Ф, +Ф, +Ф, -Ф,) + А,схр/-(ф, +ф, -ф, +ф,) =
ехр/-(ф,+ф,)][Дехр/-(ф,-ф,) + А,ехр-/-(ф1-ф,)
Действительная часть выражения (А) соответствует уравнению A3.7, полученному
ранее с использованием правил косинуса и синуса. Однако вывод последнего намного более
сложен.
в терминах амплитуд и фазовых углов
в комплексной экспоненте как Аехр/ф.
Обратите внимание, что квадрат
амплитуды комплексной экспоненты
получается не возведением экспоненты в
квадрат, а умножением ее на
комплексно сопряженную:
аа* = Аехр/фАехр-/ф = А2. (A3.14)
Поскольку с математической точки
зрения с экспонентами работать проще,
чем с суммами синусов и косинусов,
описание волн через комплексные
экспоненты обладает большим
преимуществом (коммун Kipnii \.\.\ ).
Волна в пространстве с амплитудой
А и волновым вектором с абсолютной
величиной Q записывается как AexpiQx.
Волна, осциллирующая во времени
с амплитудой А и угловой частотой со
записывается как Аехр-/со£.
Волну, осциллирующую во
времени и пространстве, можно выразить как
Аехр/ (kx-(ot).
Опять мы видим, что член
выражения, зависящий от времени, имеет
отрицательный знак, потому что гребень
волны, находящийся в определенной точке, в
предыдущий период времени отставал от
нее на расстояние одной длины волны.
Две волны с амплитудами Л, и А2
и фазами ф, и ф2 могут быть
представлены на диаграмме Аргана как а, = А,ехр/ф:
и а., = А,ехр/ ф, очень просто рассчитать.
Их сумма Аехр/ф может быть записана
алгебраически или геометрически, если
рассматривать а, и а., как векторы на
плоскостиху (рис. A3.(i).
Аехр/ф = А, ехр/ф, + А, ехр/ф,. (A3.15)
Рис. A3.6: а — две волны, представленные
в виде комплексных чисел а, и а,2 на диаграмме
Аргана и б — их сумма а, выраженная как
векторная сумма а, и аг Обратите внимание, что
а, а, и а2 обозначают комплексные числа, а не
длины отрезков, которые обозначены как Л, и
Лт Фазы ф, и ф, соответствуют векторам а, и аг
соответственно разность фаз равна 5 = ф, — ф,

Рис. Л,'!.7. Распространение плоскополяризованной электромагнитной волны. Электрическое
поле Е осциллирует вдоль оси у. Магнитное поле Н осциллирует вдоль оси .г. Волна
распространяется вдоль оси z
Приравнивая действительные
части, получим /4cosc|) = Дсояф, -ьДсоэф.,,
а приравния мнимые части /Ыпф =
= Дятф, + Дятф.,.
Свойства результирующей волны
выводятся с помощью анализа,
описанного в i.'ummcii Kipnii A.'!. I.
Теперь запишем две волны в
терминах разности их фаз 5 = ф2 — ф, и найдем
амплитуду результирующей волны:
а = я, + а2 = Д ехрг'ф, +
+Дехрг'(ф, +5),
аа* = [ Д схр г'ф, + Д ехр г х
х (ф, + 5) 1 [ Д ехр- гф, +
+Д ехр- г'(ф, + 5) =
= ехрг'ф, ехр- г'ф,[Д +
+Д ехр г'5] [ Д + Д ехр- г'5] =
= Д2 + Д2 + ДД(ехрг'5 +
+ехр-г'5) =
= Д2 + Д2 + 2Д Д cos5.
Из формулы A3.16 видно, что
амплитуда результирующей волны равна
7д2 + Д2 + 2Д Д cos 5.
В качестве еще одной
иллюстрации преимущества использования
комплексных экспонент отметим, что
последняя строчка формулы A3.16 — это
просто правило косинусов, применен-
(А3.16)
ное к треугольнику со сторонами а,, а2
и а (см. рис. A3.6).
Поляризация
Электрические и магнитные поля
электромагнитной волны осциллируют вдоль
оси, перпендикулярной направлению
распространения волны (рис. A3.7).
Изображенная на рисунке волна
называется линейно- или
плоскополяризованной, поскольку оба поля колеблются
вдоль прямых линий (оси хну). В общем
случае электрическое или магнитное поле
излучения описывается осциллирующим
вектором, который может иметь любое
направление, при условии, что оно
перпендикулярно направлению
распространения излучения. Другими словами, если
волна распространяется вдоль оси г,
вектор электрического поля Е может иметь
компоненты £v и Е вдоль осей х и у.
Волна будет линейно- или плоско-
поляризована, когда Ех, £ осциллируют
в фазе. Примеры различных значений
амплитуды каждого компонента поля
показаны на рисунке A3.iS.
Когда Ех и Е осциллируют с
разностью фаз 5, такая волна называется
эллиптически поляризованой. Частным
случаем является круговая поляризация,
когда 5 = +тг/2 или -л/2. Конец вектора

У,
У.,
Уь
-у°-1г /('
0\ Г 0\ х
а 6 в г О с
'i:c. X.'i.v'*». Линейно поляризованная волна: компоненты электрического поля осциллируют
в фазе вдоль осей .v и у с разными амплитудами: а - Е = 1, Et = 0: б — Е = 1, Ег
г~Е=0.Е = \;д-Е = \,Е = -\;е-Е=-\,Е = \"
/,\в-Е = \,Е = 1:
' ' II ' Д
Рис. A ■>.'). Волна, имеющая линейную, эллиптическую и круговую поляризацию. Считается, что
Е% и £ имеют одинаковые амплитуды и осциллируют с фазами com cor + 5: а — 5 = 0; б — 5 = л/4;
в — 5 = тг/2; г — 5 = Зп/4; д — 5 = л; е — 5 = 5п/4; ж — 5 = Зл/2; з — 5 = 7л/4. В примерах and волна
поляризована линейно; в случаях в и ж — по кругу. Во всех остальных случаях волна
поляризована эллиптически
электрического поля описывает либо
эллипс, либо круг (рис. A3.9).
Используя функцию косинуса или
комплексную экспоненту и принимая значение
амплитуды, равное единице, получим:
Е = coswtnmi 1,
Е = cos(co£ + 5) или ехрг'5.
Конец вектора электрического поля
поворачивается по часовой стрелке,
если фазовый угол 0 < 5 < тг и против
часовой стрелки, если тг < 5 < 2тг. Волна
будет линейно- или плоскополяризо-
ванной, если 5 =0 или тт.
A3.2.2. Простые гармонические
колебания
Простой гармонический осциллятор
Раскачивающийся маятник или масса
на пружине, двигающаяся
периодически вверх и вниз, — это механические
системы, являющиеся хорошими
примерами простых гармонических
колебаний. Рассмотрим движение тела
« Смещение у ►
Рис-. А.'!. К). Диаграмма потенциальной
энергии простого гармонического колебания
(гармонический осциллятор)

с массой т, прикрепленное к пружине
(рис. Л.Ч.10).
Тело испытывает простые
гармонические колебания в одном измерении,
описываемые уравнением движения:
F = -ky = m^-, (A3.17)
dr
где F — сила, приложенная к грузу,
вызывающая растяжение пружины,
^/-отклонение пружины от
положения равновесия и k — константа,
которая зависит от жесткости пружины.
Отрицательный знак указывает, что
F — возвращающая сила. Эта сила про-
порцианальна смещению и действует в
противоположном направлении,
стремясь вернуть груз в первоначальное
положение. Уравнение A3.17
является выражением закона Гука,
утверждающего, что для эластичного тела
растяжение (деформация) пропорционально
нагрузке. Решением уравнения (A3.17)
будет выражение, описывающее
периодическое движение:
y = Acos(oj, (A3.18)
гдесош — собственная колебательная
угловая частота движения груза и А —
максимальное отклонение от
положения равновесия — амплитуда
движения. Разумеется, мы можем записать
то же выражение через комплексные
экспоненты.
Чтобы найти соотношение между
сош и константой k мы должны получить
вторую производную у по времени
(ускорение) в уравнении A3.18 и
подставить ее в уравнение движения (A3.17).
Тогда это соотношение будет выглядеть
как:
<am = 4Um. (АЗ-19>
Мы произвольно приняли значение
потенциальной энергии Есистемы,
равной нулю, когда масса находится в
положении равновесия. В то время, когда
пружина сжимается или растягивается,
Е увеличивается на величину, равную
работе, необходимой для перемещения
массы:
dE=-Fdy. (A3.20)
Комбинируя это уравнение с
уравнением A3.17 и интегрируя, мы получим
следующее отношение для
потенциальной энергии осциллятора как функции
смещения массы:
E=Viky\ (A3.21)
Полученное уравнение имеет вид
параболы (см. рис. АЗ. 10).
Потенциальная энергия максимальна, когда
пружина сжата или растянута до
значения, равного амплитуде А, и она
уменьшается до нуля в положении
равновесия.
Полная энергия системы равна
сумме ее потенциальной и кинетической
энергий. Обратите внимание, что в
отличие от потенциальной, кинетическая
энергия достигает максимума, когда
масса проходит положение равновесия
и обращается в ноль при у = +А и у =
= -А, где груз останавливается, меняя
направление движения. Полная энергия
осциллятора Е все время колеблется
между потенциальной и кинетической
энергиями и постоянна во всех фазах
движения:
^м=УМг- (АЗ-22>
Для описания поведения системы,
состоящей из двух масс mt и т.,,
соединенных пружиной в отсутствии
гравитации (рис. A3.1 I ), необходимо вместо
т подставить приведенную массу тх.;.

Рис. Л.Ч.1 I. Две массы, соединенные
пружиной с константой упругости к
Колебательная угловая частота
системы теперь дается выражением:
со„
т,
k(m{ +m2)
.(А3.24)
Нормальные моды в одном измерении
Периодические движения масс,
соединенных пружинами, или простые
гармонические потенциалы, как тот, что
представлен на рисунке A3.10, следует
рассматривать как суперпозицию
основных колебаний, называемых
нормальными модами.
Анализ нормальных мод линейной
цепи атомов при определенных
граничных условиях показан на рисунке A3.12.
Согласно этим условиям, концевые
атомы не движутся, подобно концам
гитарной струны. Также как и у звучащей
гитарной струны основные моды
соответствуют набору волн в линии атомов,
концы которой неподвижны.
Продольные или поперечные
волнообразные смещения атома s даются
выражением:
us = sin sQa, (A3.25)
где Q — волновой вектор (мы не
обозначили его как вектор, поскольку наш
пример ограничен одним измерением;
О-г
-• • • • у i
s=0 1 2 s=n
Рис. A3.12. Линейная цепь из N+\ атомов. Граничным условием является неподвижность
атомов при s = 0 и s = N и — смещение атома, а — расстояние между атомами
длина волны смещения атомов равна
X = 2tz/Q). Первое граничное условие
(г/( = 0 для s = 0) автоматически
удовлетворяется в уравнении A3.25. Второе
граничное условие (us = 0 для s = N)
устанавливает предел значениям Q,
равный:
Q = A—,—...,—• (А3.26)
Na Na Na Na
Стоит заметить, что при
максимальном значении Q (Q = л/а) решением
уравнения A3.26 является us = 0 для
всех атомов. Таким образом,
существует N - 1 нормальных мод для линии
атомов при данных граничных условиях.
Каждая нормальная мода определяется
своим вектором Q и соответствует
стоячей волне, описываемой уравнением:
ы, = u(0)cxp(-№Qt)s'msQa, (A3.27)
где и (0) — начальная амплитуда, coQ —
угловая частота моды и t — время.
Вспомним, что математическое
отношение между со и Q называется
дисперсионным соотношением. Для нашего
примера дисперсионное соотношение
выражается формулой:
JVa , „ к _. тг
Юл =— 4; О — <Q<-,
(А3.28)
2л
coQ = 0 в любом другом случае.
Нормальные моды в трех измерениях
Уравнение простого гармонического
колебания массы m в одном измерении
дается выражением A3.17. Применяя наш
анализ к системе N гармонически
связанных масс, движущихся в трех изме-
Зафиксировано
Зафиксировано
—т^

реипях, мы заменим т и k на две 3N* 3N
матрицы эффективных масс и констант
упругости между всеми парами масс, а
у — на вектор, имеющий 3N координат.
По аналогии с уравнением A3.18
решение для трехмерного случая
составляет набор 3N периодических функций.
Однако шесть из них соответствуют
поступательным и вращательным
степеням свободы всего тела целиком,
когда массы не смещаются
относительно друг друга, поэтому система будет
иметь 3N - 6 нормальных мод. Можно
показать, что если массы составлены
в линию (как в нашем примере) число
нормальных мод равно 3N - 5.
Для двухатомной молекулы число
3N соответствует шести степеням
свободы < рис. A3.1.3), из которых три
соответствуют поступательным движениям
(вдоль осей .г, у, и г), две -
вращательным модам (вокруг осей у и г), и только
одна — колебательной моде
(растяжение связи между атомами).
В гармоническом приближении
колебания атомов в макромолекуле явля-
-:->.. :&;'
О—
t
А
V
А
V
+
А
V
о
У
+
О
—о
t
А
W
А
V
+
А
+
0
W
—о
х-трансляция
у-трансляция
z-трансляция
у-вращение
z-вращение
растяжение
Рис. A3.13. Внутренние степени свободы
двухатомной молекулы. Ось z
перпендикулярна плоскости страницы. Поскольку атомы
рассматриваются как точечные, вращение вокруг
оси .г отсутствует
ются результатом суперпозиции
нормальных мод. Совокупные движения
атомов, рассчитанные с использованием
гармонических потенциалов, для двух
низкочастотных мод небольшого
белка — трипсинового ингибитора подже-
"Ы-::^ \
а б
Рис. A3.1 \. Коллективные смещения атомов для двух низкочастотных нормальных мод,
рассчитанные для трипсинового ингибитора. Частоты мод равны 3,56 нсек ' (а) и 0, 21 псск' (б) (Go et
а!., 1983)

лудочнои железы теленка показаны на
piH'\iiki' А'АА i. Обратите внимание на
относительно большие смещения
некоторых атомов. В каждой моде все атомы
движутся с одинаковой фазой, т. е. они
достигают максимума и минимума и
проходят через точки равновесия
одновременно.
A3.2.3. Анализ Фурье
Периодические функции, ряды Фурье
и преобразования Фурье
Выше мы продемонстрировали, что
периодическая функция может быть
представлена суммой синусов и
косинусов. Па самом деле, согласно теореме,
сформулированной Фурье, любая
периодическая функция может быть
представлена суммой синусов и косинусов,
известной как ряд Фурье (уравнение
А3.29):
y(t) = aQ +fl,cosror + /;, sinrof +
+ а2 cos2co£ + b2 sin2cctf +
+ a3cos3(at + b3sm3(at + (A3.29)
+ ... = ^(ai;cos«cot + bnsmno3t).
Синусы и косинусы описывают
волны с возрастающими частотами,
кратными целым числам «со с базовой
частотой со, и амплитудами ап и bn. Мы также
можем записать ряд Фурье, используя
комплексные экспоненты:
-к»
y(t) = X Л,ехршсо£, (АЗ.ЗО)
где А — амплитуда волны с частотой
«со, при этом « может принимать все
целочисленные значения —
отрицательные и положительные, поскольку это
необходимо для тождественности
между уравнениями А3.29 и АЗ.ЗО. В
качестве иллюстрации соотношения между
рядами в виде комплексных экспонент
и функций синуса п косинуса
рассмотрим простую косинусоидальную волну:
1){Г) = rtCOSCOr = ^(«„ COS «СО/ + />,, Sill «СОГ).
Очевидно, что в этом случае о,=а,
а все остальные значения а и b равны
нулю. Выражение, переписанное в
терминах комплексных экспонент:
//(/) = я cos cof = ^ Д ехрн/со/,
М--<"
имеет два члена при « = ±1, поэтому
синусы, составляющие мнимую часть,
сокращаются:
у{Т) = flcoscor = Д, ехр(-/'соО +
+Д exp(+/cor) = 2/lcoscor
где Д, = Д = А, и а = 2А. Другой способ
описания разложения функции у (г) в
ряд заключается в рассмотрении
каждого компонента волны, имеющего свою
амплитуду Ап и соответствующую
частоту «со, по отдельности. Мы получим
набор слагаемых, называемых фурье-
компонентами, амиплитуда каждого из
которых называется коэффициентом
Фурье, а функция ДДмсо) — фуръе-пре-
образованием у (t).
К примеру, фурье-преобразованпе
волны, описываемой формулой /lcosco,f,
содержит компоненты с амплитудой А
при «со = ±со . Волна, полученная в
результате сложения двух функций
косинуса, как в уравнении A3.7, имеет
фурье-компоненты с «со = ±со,, ±со,,
амплитудами Д и А2 (рис. Л3.1Г)).
Из рисунка А.З.1.") а видно, что
результатом фурье-преобразования
постоянной функции y(t) = В
является одиночная линия в точке начала
координат («со = 0), т. е. постоянный
уровень можно описать как волну

y(t)\
о
О +(,),
-со, 0 +со,
А,
-(02 -(О, ° +СО,+С02
Рис. Л.'). I.). Волны и соответствующие им фу-
рье-преобразования: а — полна, описываемая
функцией 2/10-08(0/, осциллирующая возле
нуля; 6 - волна, описываемая функцией В +
+ 2/lco.sco/, осциллирующая в пределах
значений, равных В; в — волна, описываемая
функцией 2А^аш^ +2A,cos<o,f, осциллирующая
около нуля
с нулевой частотой или с бесконечной
длиной волны.
Анализ Фурье подобен
спектральному аналшу, где свет разлагается призмой
I'iic. .\.'{. I (i. Периодическая функция у (t) и ее
фурье-преобразование А (пи>). Каждая точка
Р на кривой у (t) задана всем набором Ап (исо)
компонентов, а каждый компонент Q
полностью определяется периодической
структурой у (О
или дифракционной решеткой на
частотные компоненты, или анализу
гармонического состава музыкального звука. Он
также эквивалентен анализу сложных
колебаний нескольких масс,
соединенных пружиной из закона Гука (см. выше)
в терминах нормальных мод.
Ж. Фурье разработал
математический метод определения значений
коэффициентов Апи рассчитал, что:
2 Т
An=-jy(t)exp-in(Mdt, (A3.31)
' о
где 7"= 2ясо 'представляет собой период
основного колебания с частотой со, т. е.
периодически повторяющееся значение
переменной t.
Поскольку интегрирование
эквивалентно суммированию функции с очень
маленькими интервалами, очевидная
симметрия уравнений A3.30 и А3.31
достаточно примечательна. Она говорит
нам о том, что с одной стороны,
каждый фурье-компонент полностью задан
функцией у, а с другой стороны,
значение у в каждой точке Г само
определяется всем набором фурье-компонентов
(рис. A.'J.Ki).
Отметим еще одно важное свойство
преобразований Фурье. Если у
является функцией времени t, тогда ее фурье-

преобразование — функция частоты,
т. е. параметра пропорционального 1/Г.
Анализ Фурье находит широкое
применение в различных областях
физики. Для волны, распространяющейся
в пространстве, ее фурье-иреобразова-
ннем будет функция волнового вектора
с абсолютной величиной Q,
пропорциональной l/.v. Уравнение, аналогичное
АЗ.ЗО записывается как:
у(х) = £ Д, expinQx. (A3.32)
П=-оа
Вследствие этого взаимного
соотношения пространство, выраженное через
значения х иногда называют
действительным пространством, а
пространство величины Q, в котором описывается
фурье-преобразование, называют
пространством волновых векторов или об-
ратиым пространством.
очень узкая
Л ►
Площадь = 1
очень высокая
Рис. A3.17. Дельта-функция Дирака. Она
бесконечно узка — ее «полуширина» равна 1/А
(А—>°°) и бесконечно высока — высота А—>°°,
а интеграл по всем ее значениям равен 1
Дельта - функция Дирака
Линии, обозначающие коэффициенты
Фурье на рисунке A3.15, имеют
определенную высоту, пропорциональную
их величине. Хотя такое изображение
довольно наглядно и приятно для глаза,
математически оно неверно. На самом
деле, каждая линия соответствует
бесконечно тонкой кривой, которая, тем не
менее, имеет площадь, равную значению
фурье-коэффициента. Математическая
функция, называемая делыпа-функци-
ей Дирака, описывает такую кривую
единичной площади. Дельта-функция
Дирака в позиции х = .v' обозначается
как S(.v-.v'). Функция обладает
следующими свойствами:
если.V = л',тогда 8(.v-.v') = °°;
если х * х\ тогда 8(.v - л') = 0 ;
площадь, ограниченная кривой, равна
единице, поэтому Г8(х-x')dx = 1.
Поскольку ширина функции крайне
мала, не обязательно определять интеграл
на всем промежутке от -°° до +°°,
достаточно взять небольшой участок х вокруг
.г'(Р1|(л A3.17). Можно показать, что:
5(.r-.v')= Jexp/Q(.v-.v'y/Q, (A3.33)
где Q — абсолютная величина
волнового вектора, описанная выше. Нетрудно
заметить поразительное сходство между
уравнениями А3.32 и АЗ.ЗЗ. Кажется, что
уравнение АЗ.ЗЗ тоже является рядом
Фурье. Однако на этот раз члены ряда
отделяют не целые значения
приращения п, а очень маленькие интервалы dQ.
Интеграл Фурье и непрерывное
фурье-преобразование
Уравнение АЗ.ЗЗ описывает интеграл
Фурье. Оно показывает, что анализ
Фурье не ограничен функциями перио-

дического характера. Вспомним, что
любая периодическая функция может
быть представлена суммой волн с
частотами, значения которых увеличиваются
на целый множитель. Теперь, обобщая
это утверждение, можно сказать, что
любую функцию у (х) можно
представить в виде интеграла Фурье в
терминах суммы волн с постоянно
уменьшающимися длинами (или с постоянно
увеличивающимися частотами (если х
заменить на t)):
y(x) = j-JF(Q)expiQxdQ,
^Г (А3.34)
y(t) = — \ F(a>)exp;'(ofr/(D,
2л ^
где 1/2я — множитель, возникший
вследствие замены суммирования
интегрированием.
В соответствующих фурье-преобра-
зованиях вместо коэффициентов А
теперь стоят непрерывные функции F(Q)
(или F(co)):
F(Q)=[//(r)exp(-/Qr>/r,
J (A3.35)
F(<o) = \y(t)cxp(-i<ot)dt.
Уравнение A3.35 называют
обратным фурье-преобразованием F (Q).
Фурье-преобразования некоторых
непериодических функций показаны на
рисунке A3.IS.
Колоколообразные функции
Гаусса и Лоренца очень часто встречаются в
молекулярной биофизике.
Статистическое распределение данных,
полученных на большом числе молекул
(ансамбле), описывается гауссовой кривой.
Почти все явления, имеющие
временную зависимость, могут быть описаны
как экспоненциальное затухание во
времени: динамическое рассеяние света
(Глава ПО) и квазиупругое нейтронное
рассеяние (Глава И2), поступательная
диффузия (Глава ГЗ),
деполяризованная флуоресценция (Глава Г8) и
электрическое двойное лучепреломление
(Глава Г6).
Фурье-преобразование
экспоненциальной функции представляет собой
кривую Лоренца, поэтому явления, имеющие
временную зависимость, могут быть
описаны с помощью Лоренциана в терминах
частот или энергий.
Фурье-преобразование в трех
измерениях записывается с использованием
векторов:
F(Q) = Jy(r)exp(-iQ-r)dr. (A3.36)
Свертка (конволюция)
В решении различных задач теории
дифракции находит широкое
применение операция свертывания функций.
Сверткой или конволюцией называется
результат распределения одной
функции/,^) по закону, задаваемому другой
функцией f2(x). Проще всего понять эту
операцию, рассмотрев сначала
некоторые свойства 8-функции. Интеграл от
произведения какой-либо функции с
8-функцией «вырезает» значение этой
функции при х = 0. Если 8-функция
задана не в точке х = 0, а в точке х = х\
то такой интеграл «вырезает» значение
функции f(x) при х = х\ Если в таком
интеграле рассматривать х' как
переменную величину, то он осуществляет
«перевод»/^) в пространство аргументах'.
Рассмотрим функции,
представленные на рисунке A3.19. Функция С (х) на
рисунке A3.19 в математически связана
с функциями А (х) и В (х),
показанными на рисунках A3.19 а и A3.19 6, с
помощью операции свертки. С (х) есть
продукт свертки А (х) и В (х).

Прямое пространство Обратное пространство
f(x) = К ехр(-х2)
F(Q)= exp(-—L^Q2)
4яК
f(x) = 1 для |х| < а
f(x) = 0 для |х| > а
f(x)= exp(-a|x|)
F(Q) = aSinOa
F(Q)=
a2+Cf
f(x) = 1 для |х| < R
f(x) = 0 для |х| > R
F(Q) = JttRO(QR), где
3(sinQR - QRcosQR)
O(QR) =
(QR)
Flic. A3.18. Некоторые непериодические функции и их фурье-иреобразования (ФП):
а — ФП гауссиана шириной 1/К само является гауссианом шириной К;
б— ФП щели шириной 2а есть осциллирующая функция с интенсивным центральным
максимумом Q, шириной 2л/а и вторичными быстро затухающими максимумами;
в — ФП экспоненты является колоколообразная кривая, называемая функцией Лоренца;
г — ФП сферы радиуса R представляет собой функцию, обладающую сферической симметрией
и называемую функцией Бесселя, которая имеет интенсивный центральный максимум Q
шириной 2л/R и слабые осцилляции с обеих сторон от него

Математически свертка двух
одномерных функций / (х) и g (x)
записывается как:
f(x)®g(x) = jf(u)g(x-u)du, (A3.37)
где ® — значок свертки. Операция
свертки показана на рисунке Л.3.20 для двух
простых функций с центрами в точках х
= О и Л"'. На рисуйке A3.20 « вы видите
один из членов интеграла при х = х' и и
= и'. Функция g (x — и) имеет конечное
значение, поскольку она была смещена
и теперь ее центр находится в точке и';
однако мы видим, что в этой точке f {и')
равна нулю, поэтому данный член
интеграла тоже будет равен нулю. Понятно,
что он будет отличаться от нуля, только
если обе функции g (х — и) и / (и)
отличны от нуля. Такая ситуация может
возникнуть лишь в том случае, если зна-
I-*iit". A3.19. Функция (в) является
результатом свертки функции (а) и набора
дельта-функций (б).
чение х близко к х\ иначе g будет равна
нулю, и если и принимает значения при
которых g перекрывается с/ (и), т. е. и"
близка к нулю (рис. A3.20 /). В
результате операции свертки мы имеем функцию
в которой каждая точка — это точка фун-
f(x)"
к
g(x'-u')
g(x'-u")
'ПС.
X X
. Л.'>.20. Иллюстрация операции свертки. На рисунке а и б представлены две функции,
чьи продукты свертки необходимо получить. Рисунки виг демонстрируют члены интеграла
в уравнении A3.37 для х = х', и = и' и и". Рисунок д показывает, что операцию свертки можно
рассматривать как умножение каждой точки функции g на функцию/. Рисунок е отображает
результат свертки

Kuinig, помноженной на/(рис. A3.20 с).
Если центр/(х) находится не в нуле, а в
х = х", центр свертки разместится в
точке л-' + .г". Можно показать, что/(.г)®£
(.v)=g(.r)®/(.v).
Процедура свертки играет очень
важную роль в физических
измерениях. Рассмотрим спектроскопический
эксперимент с образцом, поглощающим
в очень узком диапазоне длин волн.
Измерительный инструмент всегда сам
обладает чувствительностью к
определенным длинам волн, которая может быть
шире полосы поглощения
исследуемого образца. В результате измерений
мы получим продукт свертки функции
формы полосы поглощения и функции
разрешения инструмента.
Продукт свертки в трех измерениях
записывается в векторной форме:
/(r)®g(r)= J/(u)g(r-u)rfu.(A3.38)
Фурье-преобразование продукта
свертки приводит к чрезвычайно
важному результату, для простоты
показанному в одном измерении:
Л
®
ААААА
/T[/(.v)®g(.r)| =
= FT[f(x)\xFT[g(x)), <A3-39>
где FT обозначает операцию фурье-пре-
образования. Уравнение А3.39 говорит
о том, что для выполнения фурье-пре-
образования продукта свертки двух
функций мы просто умножаем друг на
друга независимо полученные фурье-
преобразования каждой из них.
Используя понятия действительного
пространства и пространства волновых
векторов, мы можем сказать, что
свертка в реальном пространстве приводит
к перемножению в пространстве
волновых векторов и наоборот.
Проиллюстрируем результат
применения уравнения А3.39 примером из
кристаллографии (рис. Л3.21).
Кристаллическая решетка описывается набором
дельта-функций Дирака. Помещение
одной из функций в узловую точку решетки
можно рассматривать как продукт
свертки решетки и функции (левая часть
рисунка). В правой части рисунка показаны
соответствующие фурье-преобразования.
Фурье-преобразование i ювторяющейся
х
-=Л
Рис. А3.21. Левая панель: свертка функции (красная кривая) и решетки, представленной
набором дельта-функций. Правая панель: фурье-преобразование повторяющейся функции
равнозначно фурье-преобразованию красной кривой, умноженной на фурье-преобразование решетки

функции получается умножением сру-
рье-преобразоваиия функции (широкая
красная колоколообразная кривая) на
фурье-иреобразование решетки (набор
дельта-функций, разделенных при nQp
где п — целое число, a Q7 = 2n/d, где d
показывает повторение решетки в данном
одномерном примере). Конечное
преобразование обозначено набором красных
линий (дельта-функций с
уменьшающимися амплитудами) в нижней правой
части рисунка.
A3.2.4. Квантовая механика
Квантово-мсхаиические понятия
необходимы для описания взаимодействий
между излучением и материей на
атомном уровне. Развитие квантовой
механики в значительной степени
подстегивалось необходимостью интерпретации
данных спектроскопических
наблюдений, в особенности дискретных линий
в атомных спектрах, и она необходима
для описания многих методов, которые
приводятся в настоящем издании.
Однако здесь мы дадим лишь обзор
ключевых понятий квантовой механики.
Константа Планка, квант энергии
и фотоны
В квантовой механике энергия может
передаваться в течение
определенного времени от одной системы к другой
только дискретными порциями,
кратными некой минимальной величине.
Эта величина — константа Планка
(h = 6,626 х Ю :,1Дж-сек) может
рассматриваться как неделимый пакет энергии,
умноженный на время. В квантовой
механике волна с частотой v,
осциллирующая соответственно v раз в секунду,
несет порцию энергии hv, которая
называется квантом. Энергия волны
описывается двумя компонентами. Первый
компонент — энергия кванта, полностью
определяемая ее частотой. Второй же
зависит от числа квантов, передаваемых
в единицу времени, и пропорционален
интенсивности волны.
Квант волны электромагнитного
излучения называется фотоном. Энергия
кванта видимого света зависит от его
цвета. Квант красного света обладает
меньшей энергией по сравнению с
квантом синего цвета, однако более
интенсивный красный луч все же может нести
больше энергии. Связанная с фотоном
длина волны обратно пропорциональна
ее частоте — X = c/v, где с — скорость
света. Таким образом, энергия кванта
электромагнитного излучения
полностью определяется частотой (hv) или
длиной волны (hc/X).
Корпускулярно-волновой дуализм
При анализе излучения его удобно
представлять в виде потока частиц
(корпускул) или волны. Поскольку все
события с участием излучения
включают временные периоды и расстояния
гораздо меньшие тех, что мы способны
осознать с помощью повседневного
опыта, вопрос «Так из чего же состоит
луч света — волн или частиц?» следует
считать бессмысленным. Достаточно
сказать, что электромагнитное
излучение можно описать двумя способами.
А поскольку оба описания должны быть
самосогласованными, существуют
правила их связывающие. Так, импульс
и энергия, выраженные в терминах
массы и скорости частицы,
соотносятся через уравнение, содержащее
константу Планка с волновым вектором
и частотой волны. Эти соотношения
даны в ..>■': .ц. i Л ;.! для трех случаев:
потока нейтронов (частиц с массой тп,

Частицы и волны * (добавить синусоиду)

Интенсивность
Момент
Энергия
Частицы
Поток
(число частиц в единицу времени)
Нейтроны: р = тпи
т и
f-%
Фотоны = p = fik = (h/X)u
Нейтроны:
1- 1 2*2/ 2
Е = -ти --р ти
Электроны:
„ 1 2 . , mil1
"'' if%]
Фотоны: E = hv = ha-hc/X
Волны
Квадрат амплитуды
(Л2)
Нейтроны: р = Лк = (h /Х)и
Электроны: р = Лк = (h/X)u
Фотоны: р = hk = (h/X)u
Нейтроны:
с , . fr Trlr
Е = hv = tw = —г,— =
2Х-т„ 2тп
Электроны:
Е -hv = h(u- —7.— =
2X2mr 2m,
Фотоны: E = hv = tw = hc/\
*) Уравнения, описывающие соотношения интенсивности, импульса и энергии с волновой
и корпускулярной точек зрения для нейтронов («классических» частиц), электронов
(«релятивистских» частиц) и фотонов (частиц с нулевой массой покоя). Уравнение Де Бройля соотносит
длину волны X с импульсом р; и — единичный вектор в направлении распространения волны: к —
волновой вектор (k=2n/X); h с черточкой h - константа Планка, деленная на 2л; та и mt — массы
нейтрона и электрона, соответственно. Остальные символы сохраняют свои обычные значения
летящих «медленно» со скоростью и),
потока электронов (частиц с массой т^
движущихся со скоростью, близкой к
световой), и потока фотонов (частиц
с массой покоя, равной нулю и
движущихся со скорость света).
Соотношение Де Бройля
утверждает, что длина волны, связанная с
движущейся частицей, обратно
пропорциональна ее импульсу, с константой
пропорциональности, равной константе
Планка — X=h/p. Таким образом,
быстрые частицы ассоциируются с короткой
длиной волны и наоборот. Отметим, что
из-за своей большой массы нейтрон
обладает уникальными свойствами для
исследования материи. Если мы выразим
кинетическую энергию нейтрона через
температуру, нейтроны при комнатной
температуре (так называемые
тепловые нейтроны) будут иметь длину
волны между 1 и 2 ангстремами, холодные
нейтроны (около 10К) будут обладать
длиной волны близкой к 10 ангстремам,
тогда как для горячих нейтронов длина
волны составит доли ангстрема.
Принцип неопределенности
Гейзенберга
Для того чтобы определить
положение, импульс или энергию частицы или
волны мы так или иначе на нее
воздействуем. Это вмешательство во время
измерения не может быть сколь угодно
малым, и его минимальное значение ог-

раничено константой Планка, которой
на атомном уровне нельзя пренебречь.
Следствием этого является принцип
неопределенности Гейзенберга.
Выраженный в двух неравенствах, он
соотносит координаты пространство-импульс
и энергия-время:
АрАх > h,
AEAt>_h, <A3-40>
где .V — пространственная координата.
Принцип неопределенности
утверждает, что для того чтобы увеличить
точность определения положения частицы
на атомном уровне (т. е. сделать Ах как
можно меньше) мы должны
пожертвовать знанием ее импульса и наоборот.
Другими словами, можно надеяться на
то, что мы узнаем либо скорость
движения частицы, либо ее положение, но мы
не можем рассчитывать на получение
всей информации одновременно.
Иллюстрацией принципа
неопределенности является волновое
описание материи. Из раздела по анализу
Фурье мы помним, что
непериодическая функция может быть
представлена суммой волн с различными
длинами. Таким образом, частицу,
локализованную в пространстве, можно
представить суммой волн. Поскольку
длина этих волн лежит в некотором
диапазоне, мы можем определить ее
импульс лишь с большой степенью
неопределенности. Теперь рассмотрим
частицу, чей импульс известен точно.
В этом случае она становится волной
совершенно определенной длины,
например, одиночной синусоидальной
волной. Но такая волна простирается
в пространстве до бесконечности,
поэтому мы не можем определить где эта
частица находится.
Аналогичные аргументы
справедливы и для измерения пары энергия-время.
Принцип неопределенности также
можно проиллюстрировать на
примере условий, определяющих
разрешение в кристаллографии (см. Главу ЕЗ и
рис. ;\'.'>.2'2). Из взаимного соотношения
между структурой кристалла и волнами,
которые он рассеивает (в
действительности представленными ее фурье-пре-
образованием), следует, что
наименьшее расстояние d , которое можно
разрешить кристаллографически,
соотносится с максимальным наблюдаемым
значением величины вектора рассеяния
О через выражение:
2я
"»'■"-О ' (А3.41)
где
О. = к -к.,
"^-макс- макс О'
где к0 и к — волновые векторы
падающего и дифрагированного лучей.
Из '■ •■ ' ■■'■■' ■'■ \'-'> ! видно, что импульс
волны выражается через ее волновой вектор,
поэтому Q^ можно рассматривать как
величину, пропорциональную
разности импульсов двух лучей — падающего
и дифрагированного. Пространственное
А*
к '
Рис. Л.Ч.22. Мы можем «видеть»
расположение атомов в кристалле, если знаем,
каким образом они рассеивают излучение. Луч,
описываемый волной с вектором к0, падает на
кристалл (обозначенный прямоугольником),
и расстояние между атомными плоскостями
измеряется посредством определения
интенсивности рассеянных волн как функции
волнового вектора к,. Вектор рассеяния Q
находится как разность к, и к0

разрешение dwm можно рассматривать
как минимальное расстояниеДл', которое
определяется экспериментально:
Ах' = 7Г~- (А3.42)
поэтому
Д/)Лг' = Л.
Подходы Шредингера и Дирака
Следствием принципа
неопределенности является то. что результаты кван-
тово-механических расчетов
(например, решение уравнений движения
системы атомов) выражаются в виде
вероятностей, а не точных величин.
Поэтому, если различные
вероятностные траектории рассчитаны для
потока частиц, падающих на экран через
небольшую щель, то профиль
вероятности будет соответствовать
экспериментально наблюдаемым
дифракционным полосам. В волновой механике
Шредингера плотность вероятности
для потока частиц до и после
попадания в щель изображается в виде
квадрата амплитуды волновой функции.
В подходе Дирака описываются
вероятности различных конечных
состояний, при данном начальном
состоянии, выраженных в виде дискретных
элементов математической матрицы.
Энергетические уровни
Фундаментальная концепция
квантовой механики заключается в том, что
энергия систем, таких как атомное ядро
или электроны квантована и разбита на
уровни, которые заполнены в
соответствии с определенными
статистическими законами. В основе всех
спектроскопических экспериментов (см. Часть 3)
лежит гот факт, что переход на более
высокие уровни может происходить за
счет поглощения излучения, а
испускание излучения происходит при
переходе системы на более низкий уровень.
Квант энергии hv, поглощенный или
излученный, соответствует в точности
разности уровней энергии.
Энергетические уровни электрона
в атоме характеризуются
орбитальными и спиновыми квантовыми
состояниями или числами. Пользуясь
классической аналогией, можно сказать, что они
могут быть описаны как дискретные
энергетические состояния электрона,
вращающегося вокруг ядра и своей осп
одновременно. Эта аналогия, однако,
не должна уводить нас слишком
далеко, поскольку самой сутью квантовой
механики является невозможность ее
описания в классической манере.
Заполнение электронных уровней
определяется строгими правилами. Например,
уровень с определенным орбитальным
и спиновым квантовыми числами
можно заполнить только одним электроном.
Состояние с наименьшей энергией
называется основным состоянием, а
состояния с большими квантовыми числами
называются первым, вторым и т. д.
возбужденными состояниями.
Атомы, связанные друг с другом
в молекулах, колеблются и вращаются
подобно шарикам, соединенным
пружинками. Такую систему мы
рассматривали выше в разделе, посвященному
простым гармоническим колебаниям.
В квантовой механике эти колебания и
вращения также будут иметь
дискретные уровни энергии с
соответствующими квантовыми числами. «Пружинки»
атомных связей образованы общими
электронными парами, чьи
энергетические уровни сами находятся под влия-

пнем колеоатслыюн п вращательной
анергии молекулы (рис. А.Ч.2.Ч).
Низшее (основное) и первое
возбужденное электронные состояния молекулы
изображаются в виде потенциальной
ямы относительно коиформацпоипых
координат, где электроны колеблются
п вращаются вместе со всей молекулой.
В отличие от классического случая, в
квантовой механике только дискретные
уровни могут быть замяты в данной
потенциальной яме. Обратите внимание
на большое пространство между
электронными уровнями но сравнению с
колебательными и вращательными
переходами, и на разницу между
колебательными энергетическими уровнями,
которая больше промежутка между
вращательными уровнями.
Атомные колебания в молекуле
можно в первом приближении
рассматривать как простые гармонические
колебания. Выше мы уже получили функцию
потенциальной энергии классического
простого гармонического осциллятора.
Квантовая механическая потенциальная
энергия такого осциллятора, состоящего
из двух связанных атомов с приведенной
массой от,.,, имеет вид:
Е = \ и + - I Лео,
где
(Л3.43)
ю=
к
т\:>
Здесь п — колебательное квантовое
число, которое может принимать только
положительные целые значения,
включая ноль, h — это константа Планка,
деленная на 2л;, к — силовая константа, а
mv, — приведенная масса (сравните с
уравнением Л3.24). В отличие от
классической механики, где колеблющаяся
система может принимать любые зна-
r v e
Конформационная координата
Рис. Л.Ч.2.Ч. Диаграмма потенциальной
энергии низшего {SJ п первого возбужденного (5,)
электронных состояний в молекуле, г, г\ ив —
вращательные, колебательные и электронные
переходы
чения потенциальной энергии,
квантовые системы обладают вполне
определенными дискретными энергиями (см.
рис. Л.Ч.23). Переходы между
энергетическими уровнями могут
осуществляться через поглощение излучения,
при условии, что его энергия в точности
равна разности энергий Д£двух
квантовых состояний.
Однако описание потенциальной
энергии электронных колебаний связи
между двумя атомами с помощью
гармонической модели не является полным.
Например, когда два атома сближаются,
кулоновское отталкивание между двумя
ядрами действует в том же направлении,
что и восстанавливающая сила связи,
поэтому можно ожидать, что
потенциальная энергия будет расти быстрее, чем это
предсказано с помощью гармонического
приближения. При этом кривые
потенциальной энергии принимают
негармоническую форму, показанную на
рисунках Л'А.'2'Л и A3.21. Эти кривые в разной
степени отклоняются от гармонических,

OJ
с;
го
■з
х
ш
I-
о
с:
Энергетический уровень/
колебательное
квантовое число
■> Межатомное расстояние г — -►
Рис. \\\.'2 \. Диаграмма потенциальной энергии. Кривая 1 — гармонический осциллятор. Кривая
2 — негармонический осциллятор. Обратите внимание: гармоническая и негармоническая
кривые почти совпадают при низкой потенциальной энергии. Энергия диссоциации — это энергия,
необходимая для разрыва «пружины» между атомами
в зависимости от природы атомов и
образованной ими связи.
АЗ.З. Динамика и структура,
кинетика, кинематика,
релаксация
Понятие динамики часто используется
при описании временных зависимостей
(или движения), в отличие от
структуры, которая описывает статичную
или, точнее, усредненную по времени
картину. Греческий корень этого
слова 8uva|iig — сила. Динамика является
разделом физики, где рассматривается
движение объектов и сил, которые
приводят их в движение.
Динамика в свою очередь делится
на кинетику (от греческого kineein,
двигать), которая занимается
установлением соотношений между движущимися
объектами, их массами и силами на них
действующими, и кинематику, где
рассматривается только движение
объекта, без учета сил. Кинематика и слово
кино имеют один и тот же греческий
корень — kinema, движение.
В химии кинетика относится к
изучению скоростей химических реакций.
Релаксация означает возврат
системы из возмущенного состояния в
равновесное. Простейший процесс
релаксации может быть описан как
экспоненциальное затухание:
Л(О = Л(0)ехр(-*/т). (А3.44)
Параметр A (t) отражает
отклонение свойств системы от равновесных в
момент времени t. Он равен А в момент
времени 0 и затухает до нуля при
бесконечном значении времени. Время
релаксации т — это время, при котором
величина А затухает в 1/е раз (примерно
в 1/2,7 раза) от первоначального
значения А (см. Главы Г6 и Г8).
В этой главе мы обсудим
понимание структуры биологических
макромолекул в терминах действующих сил.
Тем самым мы сконцентрируемся на

внутренней (атомной) динамике
правильно свернутой макромолекулы, а не
на динамике движущейся жесткой
частицы. Последняя обсуждается в
Части Г, посвященной гидродинамике.
АЗ.3.1. Силы, стабилизирующие
макромолекулы
В настоящее время известны силы,
удерживающие атомы на своих местах
в биологически активных
макромолекулах (см. Главу В). Они являются
результатом ван-дер-ваальсовых
взаимодействий, водородных связей,
электростатических и гидрофобных
взаимодействий, а также S-S связей между
остатками цистеина (рис. Л'А.2')).
Стабилизационная энергия макро-
молекулярной структуры — это
разность свободных энергий свернутой
и развернутой форм молекулы. Кова-
лентные связи, крайне стабильные в
отношении температурных условий,
обычно не разрушаются при
разворачивании макромолекулы, поэтому они
(за исключением S-S связей) не вносят
вклад в стабилизационную энергию
третичной и четвертичной
структуры макромолекулы. Биологические
макромолекулы являются достаточно
«мягкими», поскольку энергии
стабилизирующих сил у них слабы — в том
смысле, что они составляют величину,
сравнимую с тепловой энергией при
физиологической температуре. Такая
мягкость не кажется удивительной,
поскольку стабилизационные силы
сильно зависят от окружения,
несмотря на то, что кристаллографические
и калориметрические исследования
показывают, что белки образуют
компактные структуры, составляющие
ядро с плотноупакованными атомами
и учитывая, что электростатическое
(кулоновское) взаимодействие между
двумя зарядами достаточно сильное
и действует на относительно больших
расстояниях, a S-S связи являются ко-
валентными.
Электростатические
взаимодействия в биологических макромолекулах
Водородные связи в ct-спиралях и (3-плоскостях
Соленые мостики
между АСП и АРГ
остатками в
контактируемых
субъединицах
Связанные ионы
растворителя и
молекулы воды
Гидрофобные и ван-дер-ваальсовы
взаимодействия в белковом ядре
Рис. Л.Ч.2;). Взаимодействия, стабилизирующие свернутую форму тетрамера малат дегидро-
геназы из галофнльной бактерии архей Halobacterium marismortui. Белок не содержит остатков
цистеина. Его физиологическое окружение представляет собой среду, содержащую КС1 в
концентрации, близкой к насыщающей. Такая высокая концентрация соли необходима для того,
чтобы белок оставался правильно свернутым и стабильным. Слабые электростатические
взаимодействия приводят к специфическому связыванию ионов растворителя, которые участвуют в
стабилизации белка. Ионы хлора представлены в виде шариков между субъединицами (Richard
et al., 2000)

экранированы олагодаря
диэлектрическим свойствам воды и противо-
ионам растворителя. S-S связи легко
разрушаются в восстанавливающей
среде, образуя SI1 группы. Водородные
связи различной прочности
образуются как между донорными и
акцепторными группами самой
макромолекулы, так и между макромолекулой и
му моделирование должно иметь под
собой прочное экспериментальное
основание.
A3.3.2. Шкала длины и времени
в молекулярной динамике
Амплитуды атомных колебаний в
макромолекулах при комнатной темпера-
ионами растворителя. Гидрофобные туре (-300 К) находятся в диапазоне
от 0,01 А до 5 А для временных
периодов 10 |Г'-10:! секунд (от фе.мтосекун-
взаимодеиствия по определению
зависят от окружения, поскольку они
связаны с низкой растворимостью
определенных химических групп в воде
(см. Часть В). Даже ван-дер-ваа.тьсовы
взаимодействия, которые проявляются
при плотной упаковке атомов, зависят
от окружения, поскольку некоторые из
ды для электронных переходов до
примерно 20 мин при сворачивании белка
пли его денатурации) u;uu \:. :.').
Для различных временных периодов
и расстояний существуют свои
биофизические методы (см. Введение).
атомов упакованы плотнее, чем другие. Лазерная оптическая спектроскопия
Они, как считается, являются важной в наше время может достигать
субдвижущей силой сворачивания белков фемтосекундного разрешения при
(см. Часть В). измерении кинетики продолжнтельно-
Моделирование молекулярной ди- стью несколько минут, что составля-
намики отражает наше теоретическое ет диапазон в 18 порядков величины
знание о макромолекулах как о физи- временной шкалы. ЯМР чувствителен
ческих частицах. Несмотря на то что
известны все разновидности макромо-
лекулярных стабилизационных сил,
наше представление о
соответствующих соотношениях далеко не полно,
в основном из-за сложности
эффектов, связанных с окружением. Поэто-
к динамике от пикосекунды и более.
Нейтронное рассеяние способно
разрешать времена в районе от 10 9 до
10 п сек и чувствительно к
расстояниям от 1 до 5 А.
Гаи/инк. A3.2. Времена и расстояния в молекулярной динамике
Тип
Электронные переходы
Колебания связанных атомов
Движения боковых цепей
Вращения боковых групп в белковых структурах
Движения доменов в белках
Сворачивание белка, образование комплексов, конфор-
мационные изменения
Расстояние (А)
0,01
0.01-0.1
1
5
15
1-5
Время (сек)
К) 1!i
10 " 10 "
10 '-- 10 ''
10 '-1
10 !) 1
10,;-10:'

A3.3.3. Физическая модель
динамики белков
Наше понимание белковой динамики
основано па результатах
экспериментов с использованием разнообразных
биофизических методой, в
особенности оптической спектроскопии,
разрешенной во времени, нейтронной и
мсссбауэровской спектроскопин, ЯМР
и кристаллографии, которые будут
обсуждаться в основном в Главе К.
Белок представляет собой плотно
упакованный объект, в котором атомы
занимают некие усредненные места,
соответствующие патпвной структуре.
Н результате действия на атомы
значительных удерживающих сил
молекулярная динамика белка напоминает
динамику аморфного твердого тела.
Поэтому только в первом
приближении белок можно рассматривать как
эластичную сплошную среду, где движения
боковых цепей аминокислот и доменов
подчиняются закону Гука ( коммсп к:
• Г.: \ к'.' ).
Конформационные подсостояния
на картине энергии и специфические
движения в белках
Модель конформациониых подсостоя-
Ш1 и (КП) была предложена для белков
после экспериментов со связыванием
моноокепда углерода с гемовой
группой МПОГЛобнНа ( i,i'M\i,-:| ,,!|)iii; Л.''..'''!.
Анализ кинетики повторного
связывания указывает на гетерогенность
белковой популяции при низкой температуре
(ниже 200 К). При более высоких
температурах лигапд преодолевает несколько
энергетических барьеров на пути к
повторному связыванию, и характер этого
процесса позволяет предположить, что
белок колеблется между несколько раз-
Коммешарий A3.2. Закон Гука
Закон Гука гласит: растяжение
(деформация) упругого тела пропорционально
приложенной силе. Этот закон справедлив
в случае сравнительно небольших
растяжении.
личающимися конформациями.
Схематическая картина энергии модели КП
показана на рисунке A."i.2(>.
При температуре ниже 200 К белок
остается в состоянии с низким
значением минимума энергии — в одном из КП
(нижняя панель на рис. A.'5.2(i).
Разница в структурах между двумя
КП может быть очень небольшой,
например, в положении одной боковой
группы аминокислотной цепи. С
повышением температуры наступает
момент, когда макромолекула уже
приобрела достаточно тепловой энергии,
чтобы преодолеть барьер, отделяющий
одно КП от другого. Соответствующие
движения белковой молекулы были
названы специфическими {protein specific
Конформацирнная координата КК
б КК
Риг. .\.'>.2(>. Картина одномерного
профиля потенциальной свободной энергии белка
для набора (а) и одного n:i подсостояипй (и).
Конформационная координата обозначена КК
(I-'rauenleldereta!.. 1988)

•чомк'онгарии АЗ.З. Флэш-фотолиз миоглобина при низкой температуре
Миоглобин представляет собой небольшой связывающий кислород белок с
молекулярной массой около 17 кДа, найденный в мышцах. Это один из первых белков наряду
с гемоглобином, родственным белком — переносчиком кислорода красных кровяных
телец, чьи структуры были разрешены с помощью рентгеновской кристаллографии. За эти
исследования Макс Перутц и Джон Кендрыо получили Нобелевскую премию.
Кристаллографические исследования гемоглобина и миоглобина пролили свет на функционально
важные структурные различия между несвязанным (дезокси) состоянием и различными
состояниями, в которых белок связан с лнгандом. Миоглобин содержит простетнческую
гемовую группу с атомом железа, отвечающую за связывание молекулы кислорода.
Сродство миоглобина к моноокепду углерода выше, чем к кислороду, и в этом кроется
причина токсичности монооксида, поскольку он блокирует кислород, связывающий сайт. Его
способность к связыванию СО сыграла важную роль в изучении белка. Оно оказывает
влияние на спектр поглощения белка в видимой области. В экспериментах с
флэш-фотолизом наблюдают кинетику повторного связывания после того, как связь между СО и
гемом разрушена лазерным импульсом. При низких температурах (ниже 200 К) СО не
покидает белок. В результате флэш-фотолиза СО переходит из позиции Л, где он был связан,
в позицию В в гемовом кармане белка.
Вопреки ожиданиям, навеянным простой моделью релаксации (уравнение Л3.34), было
обнаружено, что кинетика повторного связывания не соответствует кривой, описываемой
одной экспонентой, а представляет собой сумму быстрого и медленного процессов. Это можно
объяснить одним из следующих способов: либо белок составляет гомогенную популяцию с
несколькими В-сайтами в каждом, например, «быстрый» и «медленный» сайты повторного
связывания либо белок составляет гетерогенную популяцию, где разные молекулы имеют
разные сайты. На рисунке справа внизу «быстрые» и «медленные» сайты изображены
буквами /и s соответственно
Выбор одной из моделей был осуществлен благодаря экспериментам с импульсами разной
длины. Ожидалось, что для моделей гомогенного связывания (два сайта на белок в
гомогенной популяции) и гетерогенного связывания (один сайт на белок в гетерогенной популяции),
поведение миоглобина будет различаться. В результате экспериментов с импульсами разной
длины было установлено, что последняя модель является верной. Таким образом, популяция
белка при низких температурах состоит из молекул с несколько отличной структурой,
отражающей различные конформационные подсостояния (КП). При более высоких температурах
повторное связывание СО описывается одной экспонентой, когда гомогенная белковая
популяция колеблется между различными КП (Frauenfelderet al., 1988).

motions). Другими словами, КП
представляет собой «статическую»
неупорядоченность белковой структуры при
низкой температуре, когда каждая
молекула в популяции обладает
несколько отличной структурой, например, в
одной молекуле боковая группа
находится в конформации А, в то время как
в другой — в конформации Б, а при
высокой температуре эта
неупорядоченность имеет динамический характер,
например, когда в одной и той же
молекуле боковая группа колеблется между
коиформациями А и Б.
Тщательный анализ повторного
связывания СО показывает, что
картина энергии белка представляет собой
сложную иерархию, где каждое КП,
имеющее свою потенциальную яму, в
свою очередь делится на дальнейшие
КП. Модель КП получила
подтверждение благодаря разнообразным
экспериментальным методам, включая анализ
температурной зависимости факторов
0,25
0,20
0,15
^ 0,10
0,05
0,00
Дебая-Валлера в рентгеновской
кристаллографии, которая ясно
демонстрирует статическую неупорядоченность
популяции кристаллов.
Динамический переход и средние
эффективные константы упругости
Эксперименты с рассеянием
нейтронов приводят к выводу, что среднее
квадратичное колебание <и2> атомов
миоглобина зависит от температуры,
как показано на рисунке A3.27.
Обратите внимание, что величина
колебаний составляет доли ангстрема.
Излом кривой при 180 К называют
динамическим переходом.
Поскольку колебания атомов в
белках являются результатом тепловой
энергии, ось графика, на которой
отложена температура, отображает
энергию системы. Ниже 180 К (93 °С) <и2 >
растет линейно с повышением энергии,
и экстраполируется к абсолютному
-
-
и о^^>
1.1.
к' = 0.3 н/м
и'
Л
А
А
А
/ к = 2 н/м
к = 3 н/м
i ■
40
80
320
120 160 200 240 280
Температура (К)
I'm-. А'5.27. Величина среднего квадратичного колебания атомов как функция абсолютной
температуры, измеренная с помощью нейтронного рассеяния (см. часть И) для миоглобина в воде
(Д) и растворе трегалозы (о). Эффективные константы упругости k и k' были рассчитаны для
разных участков кривой, как это описано в тексте (Zaccai, 2000, Doster et al., 1989; Cordone et al.,
2000)

Комментарий A3.-!. Точка нулевой
энергии
В простом гармоническом колебании
величина среднего квадратичного
отклонений линейно зависит от температуры и
экстраполируется до значения, равного нулю
при температуре абсолютного нуля.
Однако из-за квантовых эффектов ожидается,
что такая зависимость на практике не будет
иметь места в области абсолютного нуля.
Это следствие принципа неопределенности
Гейзенберга (см. параграф АЗ.2.4),
поскольку любые измерения при абсолютном нуле
приведут к возмущению системы, и
температура равняться нулю уже не будет.
нулю ( ko.vmi'h raniiii Л.'!, i). Линейную
зависимость от температуры можно
объяснить с помощью модели, в которой
атомы движутся в простых
гармонических потенциалах, для которых
возвращающая сила пропорциональна
смещению относительно среднего положения.
Энергия гармонических осцилляторов
пропорциональна
среднеквадратичному отклонению с константой <к>,
равной средней константе упругости или
константе пружины (параграф АЗ.2.2).
Следовательно, <А'> можно рассчитать
из обратной величины наклона кривой
зависимости <«-> от Г (см. рис. A3.27).
Среднюю константу упругости,
поддерживающую атомы в структуре мпог.то-
бина можно рассчитать, если перевести
Т в энергию, умножив ее на константу
Больцмана. Эта константа упругости
оказывается равной 2 Н-м ', что
соответствует таковой для достаточно
жесткой, но эластичной ленты ( иимм.ч: i.
pun A.')..i).
Существует природный дисахарид,
называемый трегалозой, который
синтезируется некоторыми организмами,
живущими в пустыне, помогая им
переносить засуху. Трегалоза покрывает
и защищает клеточные структуры этих
организмов пока их метаболизм
замедлен в ожидании лучших, более
влажных времен. Миоглобнн, заключенный
в оболочку из трегалозы (кривая на
рис. A3.27, обозначенная кружками)
Комментарий A3.о. Константы упругости эластично связанных атомов
Эффективная константа упругости, равная примерно 2 Н-м ', позволяет удерживать атомы
в структуре миоглобина при низкой температуре. Эластичная пружина с такой константой
упругости растянется на один сантиметр под действием веса в 2 грамма. Сила, прилагаемая
таким весом, составляет 0,002 х 10 Н

имеет большую жесткость, чем белок
и воде, его <к> раина 3 Н-м '.
Чтобы избежать применения
термина «жесткость», который часто
употребляется при качественном
описании, среднюю эффективную константу
упругости, полученную из данных по
температурной зависимости среднего
квадратичного колебаний атомов,
иногда называют эластичностью структуры.
Отсутствие динамического перехода в
присутствии трегалозы ведет к
предположению, что защитный эффект этого
сахара обусловлен «замораживанием»
макромолекулы в определенном
энергетическом состоянии вплоть до
достаточно высоких температур.
Рассуждая в терминах модели КП,
можно сказать, что атомы белка,
находясь ниже динамического перехода,
осциллируют в гармонической
потенциально]'! яме. Тогда динамический
переход на картине потенциальной
энергии соответствует колебаниям атомов
между различными потенциальными
ямами КП. Данные на рисунке A3.27
получены в результате использования
модели двух потенциальных ям (двух
КП) для всех атомов белка, окруженных
водой (рис. A3.28). Такая модель
является слишком большим упрощением,
поскольку различные атомы обладают
разной потенциальной энергией. Тем не
менее данный подход является хорошей
иллюстрацией связи между
динамическим переходом и КП моделью. Даже
несмотря на то, что на участке кривой
выше динамического перехода
движения атомов не являются простыми
гармоническими колебаниями, вполне
законно применение полугармонического
приближения для расчета эффективной
феноменологической константы
упругости из обратной величины наклоны
кривой зависимости <и2> от Т. Это
значение для миоглобина равно 0,3 Н-м-1,
что в десять раз меньше, чем для белка
при низкой температуре.
Динамические переходы
наблюдаются для многих других белков, и,
по-видимому, являются общей чертой
их молекулярной динамики. Значения
амплитуд среднего квадратичного
колебаний и эффективных констант уп-
а б
Рис. A3.2N: а - кривые свободной потенциальной анергии G атомов белка. На практике такой
потенциал означает, что боковые цепи колеблются между двумя разными локальными
энергетическими минимумами; б - аффективную константу упругости можно рассчитать с помощью
квазнгармопнческого приближения по формуле <к ' > -AG/2d1

Комментарий A3.6. Пурпурная мембрана и бактериородопсин
Пурпурная мембрана (ИМ) экстремального галофила Halobacterium sal'marum (см. Главу
А1) образована специфическими липидамп на высокоорганизованном двумерном каркасе.
Наличие такого каркаса сделало возможным кристаллографические исследования
естественных мембран с высоким разрешением с помощью электронной микроскопии (см. Главу
Ж2). Белок ПМ назван бактериородонсином (БР), поскольку он связывает молекулу хро-
мофора-ретиналя, который придает мембране пурпурный цвет. До этого открытия ретиналь
был найден только в зрительном белке животных. У Н. salinatvm БР выполняет функцию
активируемого светом протонного насоса, откачивающего один протон из клетки против
градиента его потенциала на каждый поглощенный ретиналем фотон. Связанный с активностью
протонного насоса миллисекундный фотоцикл, который сопровождается изменением цвета,
позволяет исследовать структурно функциональные соотношения в ПМ
спектроскопическими методами (см. Главу 32).
ругости скорее всего специфичны для
каждого белка и связаны с его
стабильностью и активностью.
Эксперименты по криокристал-
лографии (см. Главу ЕЗ) показали, что
рибонуклеаза А не способна
связывать субстрат при температурах ниже
динамического перехода. Если же
провести связывание с субстратом при
более высокой температуре, а затем
белок охладить до низкой
температуры, то субстрат остается связанным.
Динамическая гибкость белка
позволяет отбирать состояния с различной
энергией, которые по всей
вероятности необходимы для ферментной
активности. Доказательства
корреляции между динамическим переходом
и активностью были получены для
мембранного белка бактериородопси-
на (БР), функционирующего как
управляемый светом протонный насос
(коммгп lapm'i A3.(i. рис. A3.29).
Динамические переходы в белках
напоминают стеклование аморфных
материалов, но эти два процесса
нельзя считать полностью
аналогичными. Белки — это сложные,
гетерогенные структуры, чья динамика является
результатом эволюции и служит для
выполнения специфических
функций. На рисунке A3.29 показано, что
для бактериородопсина величины
средних квадратичных колебаний и
эффективные константы упругости
отличны для разных аминокислотных
групп. Активное ядро протонного
насоса располагается вокруг ретиналя,
который остается связанным с
остатком лизина через так называемое
шиффовое основание, и погружается
в мембрану на глубину примерно в
половину ее толщины. Во время
фотоцикла БР (CM. :,nVV 'i .!;'!!,i \.!.!.),
протон шиффового основания меняет
ориентацию: если раньше он был
доступен с внеклеточной стороны
мембраны, то теперь — с внутриклеточной.
Таким образом, ретиналь выполняет
роль насосного клапана, обеспечивая
одностороннюю передачу протона.
Эксперименты показали, что
активное ядро белка имеет более низкие
значения среднего квадратичного
колебания и более высокую
эффективную константу упругости, чем белок в
среднем (рис. A3.30). Предполагается,
что такая жесткость ядра необходима
для регуляции функции клапана рети-
наль-связывающего сайта.

2J -i
2.0 -j
<м.о -j
0J -
0.0 -f
^^
^^'
100 200 300
Температура (°K)
2J n
2.0 -ш
1J -
St
sT 1.0 -
3
OJ -
0.0 -
•' 1 1-
50 100
A
/
/ ♦'
#*$*♦**
150 200 250 300
Температура (°K)
ОЛ -
I I I •' ' I I ' t I I 11 ' I I I ' • ' I I
100 200 300
Температура (°К)
2J -
2Л -.
OJ -;
0Л -j
4МЙММ
50
*M<
100
*f*
|ртжт
150
4
^
200 250 300
Температура ("К)
g . 1 г
Piic. A3.29. Динамика бактериородпсина, измеренная с помощью нейтронного рассеяния (см.
Главу И). Величина среднего квадратичного колебания отложена против температуры для на-
тивных (А) и меченых дейтерием (0) мембран. Приведенные данные соответствуют движениям
специфических аминокислот и ретиналя в белковом ядре. Панели а, б, в и г соответствуют
разным величинам гидратации, полученным при относительной влажности 0, 75, 86, 93% (Lehnert.,
Thesis 2002)
Эффекты растворителя, гидратация
мембран и белков
Если смотреть с позиции динамики,
структура белка не может
рассматриваться независимо от его окружения.
Поразительным является влияние,
оказываемое трегалозой на динамику миог-
лобина (см. рис. A3.27). Как мы
отмечали (см. рис. A3.29), величина среднего
квадратичного колебания у БР сильно
зависит от гидратации при температуре
выше динамического перехода (около
150 К). Гидратацию регулировали,
помещая образец в среду с
контролируемой влажностью (комментарий A3.7).
При температуре выше 150 К и
меченый и нативный образцы с повышением
влажности имели большие амплитуды
колебаний.
Интересно, что пурпурные
мембраны выделяют из экстремального га-
лофила, живущего при концентрации
соли, близкой к насыщающей (см.
Главу А1). Насыщенные растворы NaCl и
КС1 соответствуют значениям
относительной влажности 75 и 86%. Поэтому
влажность на рисунке А3.29 (панели б

<\( Jo
Рмс. A.i ,'i(). Схематическое представление пурпурной мембраны. Молекула БР отображена в
виде ленточной диаграммы, а липиды показаны синим. Две липпдные молекулы и меченые группы
представлены в виде шариков и палочек (см. рис. Л.Ч.Г)). Превращая энергию света в химическую
энергию, БР откачивает из клетки один протон на каждый поглощенный фотон. Ядро и
внеклеточная часть БР (внутри красного эллипса), которые действуют подобно насосному клапану,
обладают большей жесткостью (менее эластичны), чем вся мембрана в целом (Zaccai, 2000)
и «) очень близка к физиологическим
условиям для пурпурных мембран.
Образцы последних в экспериментах по
нейтронному рассеянию состояли из стопок
чередующихся мембран и водных слоев
(рис. А3.31 а). Фотоцикл протонного
насоса пурпурных мембран,
исследованный на таких образцах, ингибирует-
ся при значениях влажности менее 75%,
при которых в мембранных стопках
присутствует всего лишь один водный слой.
По-видимому, такой уровень гидратации
A3, i Соли и относительная влажность
Парциальное давление водяного пара над насыщенным раствором соли является
постоянной величиной при данной температуре и давлении. Таким образом, в экспериментальных
условиях относительную влажность (ОВ) можно контролировать, помещал образец в закрытый
термостатируемый сосуд в присутствии подходящего насыщенного раствора соли. К
примеру, при 25 °С и нормальном давлении относительная влажность над насыщенным LiCl равна
15%; для NaCl — 75%, для КС1 — 86%, для KNO,— 93%. Преимущество использования этих
солей состоит в том, что соответствующие значения ОВ не слишком чувствительны к
небольшим температурным отклонениям. Значения относительной влажности 0 % («сухое») и 100 %
(«влажное») поддерживать гораздо труднее. «Сухая» атмосфера может быть получена при
помощи силикагеля, но еще более сухих условий можно достичь, создавая вакуум над
двуокисью фосфора Р205.100 % ОВ в принципе может быть получена над чистой водой, однако даже
небольшие температурные градиенты в стенках сосуда приведут к конденсации и колебанию
относительной влажности.

минимален для обеспечения активности
белка и мембране. Аналогичный вывод
получен и для лизоцима и других
растворимых ферментов. Сегодня общепринято,
что для активности глобулярного белка
достаточно одного гидратапионного слоя
средней толщиной 1,2 А, что
соответствует величине гидратации 0,3 грамма воды
на грамм белка (см. Главу Г1).
Экспериментально показано, что плотность этого
стоя воды на 10% больше плотности воды
в основном объеме (рис. АЗ.З 1 6).
Видеоизображение промежуточных
структур
Кинетическая кристаллография
детально обсуждаемая в Главе ЕЗ более всего
похожа на видеоизображение
макромолекул. Этому методу больше подходит
название кинематической
кристаллографии. Кристаллография макромолекул
дает красивые изображения структур с
атомной детализацией, и вполне
логичным было бы использовать этот метод
для получения изображений структуры
как функции времени. Очень высокая
ннтенеч iвность рентгеновского iкзлуче-
нпя в широком волновом диапазоне,
получаемого в синхротроне и возможность
добиться импульсного излучения с
продолжительность несколько пикосекунд
сделали кристаллофафию, разрешенную
во времени вполне достижимой целью.
Однако кристалл содержит
примерно 1013 молекул, а информация о
положении атомов является результатом
усреднения не только по времени, по и по
всему набору молекул в кристалле.
Поэтому, чтобы наблюдать структурные
изменения во времени, все молекулы
должны колебаться в фазе, т. е.
синхронно. Синхронность реакции может быть
достигнута благодаря использованию
очень короткого лазерного импульса,
б
Рис. Л3.31: а -- образцы пурпурных
мембран для нейтронного рассеяния состоят из
упорядоченных стопок мембран и водных
слоев с периодичностью чередования равной
d. Толщина мембраны d постоянна и
равна примерно 50 А; толщина водного слоя dn
изменяется вместе с относительной
влажностью от одного водного слоя (толщина
около 3 А) при 75% относительной влажности
до трех слоев при 93%; б — схематическое
изображение водной оболочки (голубая)
вокруг молекулы лизоцима (красная). Толщина
оболочки соответствует примерно одному
молекулярному слою, его плотность
приблизительно на 10% выше плотности воды в
основном объеме (Weik et al, 2004); Svergun et
al.. 2001; см также Главу Е2)
который запускает процесс
фотоактивации в светочувствительных молекулах
(например гем в гемоглобине и миогло-
бине, см. ком.мгп глрнг Л.'!..'!, или рети-
наль в родопсине и бактериородопсине,
см. комме!! lapm'i A3.(i). Если молекула
не имеет природного хромофора, то
используют внешний (подсаженный)
хромофор. Связывание его блокирующей
химической группыссубстратомспособ-
ствует эффективному экранированию
последнего и заметно снижает сродство
к ферменту и препятствует проведению
реакции. Если блокирующая группа об-

ладает светочувствительной связью, то
диффундирующий в кристалл
хромофор может быть освобожден с помощью
лазерного импульса подходящей длины
волны, что приводит к одновременному
и быстрому запуску реакции.
Кристаллография в реальном
времени позволяет получать
видеоизображение работающих светочувствительных
белков с наносекундным разрешением.
Однако по различным техническим
причинам, большинство
кристаллографических исследований ферментных реакций
с использованием внешних хромофоров,
опубликованных к середине 2004 г.,
ограничивались секундным и даже минутным
разрешением, и только одно было
сделано с миллисекундным разрешением.
Более обещающий подход к
получению видеоизображений белков
основан на замораживании структурных
интермедиатов при криотемпературах.
Этот подход оказался очень
плодотворным для изучения природных
светочувствительных белков и в исследованиях
с использованием внешних
хромофоров. Достигаемое временное
разрешение обусловлено выбором температуры.
С помощью кристаллографии в
реальном времени при комнатной
температуре или криокристаллографии
различные авторы исследовали структурные
интермедиа™, когда связанный с мио-
глобином монооксид углерода (СО)
диссоциирует и отделяется от
белковой молекулы. Результаты этих работ
запечатлены на видеоролике.
Внимательный просмотр этих кадров дает
хорошее представление о некоторых
общих свойствах белковой динамики,
связанных с биологической
функцией. Первый кадр фильма соответствует
СО-миоглобину, последний кадр
отражает структуру несвязанного миогло-
бина(:'.м. комментарии А.'}.3).
Рентгеновская кристаллография
дает информацию о распределении
электронной плотности в структуре.
Структурные изменения в реальном
времени выглядят как пики положительной
электронной плотности, указывающие
на присутствие новых атомов в этом
положении, или, наоборот, отрицательной,
которая говорит о том, что атомы были
удалены из этой позиции. Короткий
лазерный импульс запускает диссоциацию
СО. Самые первые изменения —
перемещение атома железа и изменение
кривизны плоскости молекулы гема
происходят слишком быстро, чтобы их
можно было увидеть в видеоролике с
таким временным разрешением. Затем
следуют изменения в структуре
кристалла, происходящие в интервале
между 1 нсек и 1 мсек. На этой временной
шкале колебания в структуре белка
открывают путь для диффузии
молекулы СО, которая выходит наружу из
связывающего кармана, делая
остановки в нескольких специфических
«стыковочных» местах, где она
взаимодействует с боковыми группами некоторых
аминокислот. Были найдены четыре
потенциальных стыковочных места,
которые способны связывать ксенон.
Они обозначены как Xel, Xe2, ХеЗ, Хе4
(рис. Л3.32 а).
Попутно структура белка меняется
в сторону конформации несвязанного
белка. Эти изменения затрагивают
боковую цепь Leu89, способствующую
связыванию СО в сайте Xel. Кадры,
зафиксировавшие изменения интегральной
положительной электронной плотности
в Xel связывающем сайте и
интегральной отрицательной плотности Leu89,
показаны на рисунке Л3.32 а. На рисунке
Л3.32 6 показаны пики,
соответствующие разностной электронной плотности
при 362 нсек.

10' 10' 10"
Время (сек)
а б
Рис. ЛЛ.Л2: а — временные изменения интегральной положительной электронной плотности в Xel
связывающем сайте и интегральной отрицательной электронной плотности в Leu89. Для
сравнения показаны такие же изменения для трех других Хе связывающих сайтов — Хе2, ХеЗ и Хе4. Они
указывают на то, что на данной временной шкале сайты не заняты СО; б — карта разностной
электронной плотности в области сайта Xel при 362 нсек. Положительная плотность в Xel сайте
обозначена символом X, в то время как положительные и отрицательные плотности, указывающие на
движения боковой цепи Leu89, обозначены как L1 и L2 и соответствуют двум конформационным
подсостояниям. Структуры СО- и дезоксимиоглобпна представлены в виде красных и синих
шариков и палочек. Положительная и отрицательная разности электронной плотности изображены
синей п красной решеточной конструкцией. Гем с атомом железа (Fe) в его центре и ноложение
связанного СО можно увидеть в верхней части структуры (Srajer et al., 2001)
Вспомним, что структура,
полученная в кристаллографических
экспериментах, соответствует структуре,
принимаемой значительным числом молекул в
кристалле. Поэтому кадры видеоролика
отображают специфические интермедиа-
ты (или энергетически выгодные
состояния КП) в процессе релаксации между
структурами СО- и дезоксигемоглобина.
В кристаллографических роликах нельзя
увидеть непрерывные изменения в
положениях атомов между двумя интермедиа-
тами, что указывает на то, что отдельные
молекулы в кристалле пересекают
потенциальный барьер разными путями. Такая
картина хорошо вписывается в гипотезу
о том, что большое число колебательных
движений на наносекундной временной
шкале приводит к гораздо более
медленным конформационным изменениям
между интермедиатами и образованием
коридора для выхода молекул СО.
На рисунке A.'L'W можно видеть
другой тип кристаллографических
видеороликов. Он отображает временные
изменения, протекающие под
действием освещения двух участков структуры
фермента, называемого ацетилхолинэ-
стеразой, который участвует в
переносе нервного импульса. Боковые цепи
аминокислот в начальной структуре
показаны в виде шариков и палочек, а
наблюдаемая электронная плотность
изображена синей решеткой.

Рис. Л.1.33. Видеоролик радиационного повреждения боковой цепи глютаминовой кислоты
(верхняя панель) и связи цпстепн-цистсин (нижняя панель) в ацетнлхолшгхтеразе при 100 К
(Weik er а!., 2000)
Температура ниже температуры
динамического перехода
Лизин в одном из двух
лданформационных состояний
Температура выше температуры
динамического перехода
Ангармонические движени:
атомов, флуктуирующих mj
CS конформациям!
Компактный интерьер,
закрытый гидратационной оболочкой
Менее плотно упакованная
,♦ поверхность, взаимодействующая
ф с растворителем
Лизин флуктуирует
между двумя
конформерами
Гидратационная оболочка,
в которой вода имеет более
высокую плотность, чем в растворе
l-'iic. A'/>.'M. Схематическая диаграмма, иллюстрирующая характерные черты физической
модели белковой динамики

В порхнем части показано последова- ство остатков, включая расположенные
тельное декарбоксплирование боковом в активном центре, что свидетельствует
цепи ivnoTaMHHOBoii кислоты, вследствие о том, что боковые цепи способны при-
радиационного повреждения, а в нижней нимать различные конформации при бо-
отображопо разрушение S-S связи меж- лее высокой температуре,
ду двумя цистеинами. Все данные были Основные характеристики совре-
получены при 100 К. При 150 К повреж- менпой физической модели белковой
дение затрагивает еще большое колпче- динамики приведены на рисунке A'A.'Ai.
A3.4. Перечень ключевых идей
• Молекулярная биофизика является экспериментальной наукой, в которой
даже теоретические подходы, такие как моделирование молекулярной
динамики, должны основываться па наблюдении.
• Практически все эксперименты в молекулярной биофизике, за исключением
калориметрии и классических методов физической химии растворов, таких как
определение осмотического давления, вязкости и т. д., целиком основаны на
наблюдении за взаимодействием излучения с макромолекулами.
• К необходимым математическим инструментам относятся те из них, которые
имеют дело с общими свойствами волн, комплексными экспонентами, простым
гармоническим колебанием, нормальными модами и анализом Фурье.
° Эксперименты в молекулярной биофизике проводятся в пространстве
измерения, которое соотносится с действительным пространством через
математическое преобразование; например, пространство волновых векторов в
кристаллографии соотносится с действительным пространством через преобразования
Фурье.
• Понятия квантовой механики необходимы для описания взаимодействий
между материей и излучением на атомном уровне.
• Динамика — раздел механики, который имеет дело с движением объекта и
силами, приводящими его в движение. Динамика делится на кинетику, которая
занимается соотношениями между движущимися объектами, их массами и
действующими на них силами, и кинематику, в которой исследуют исключительно
движение объектов без учета действующих на них сил.
• В химии термин кинетика относится к изучению скоростей химических
реакций.
" Релаксация означает возвращение возмущенной системы в состояние равновесия.

* Свернутые нативные структуры биологических макромолекул
поддерживаются водородными связями, солевыми мостиками или экранированными
электростатическими взаимодействиями, гидрофобными и ван-дер-ваальсоиыми
взаимодействиями.
* Амплитуды движений атомов в макромолекулах при температуре окружающей
среды лежат в диапазоне от 0,01 А до 5 А для временных периодов от 10 |Г> до
10:i секунд (от одной фемтосекунды для электронных переходов до примерно
двадцати минут для сворачивания белка пли для денатурации).
* Наше понимание белковой динамики базируется на результатах
спектроскопических и кристаллографических исследований структур и их интермедпатов,
усредненных по времени.
* При низкой температуре, ниже 200 К, белок находится в одном
относительно мало отличающихся по свойствам конформационных подсостояний (КП);
выше 200 К белок флуктуирует между несколькими разными КП. Переход от
низкотемпературного колебательного режима, где белок заморожен в одном из
КП, к высокотемпературному режиму, где белок флуктуирует между
различными КП, называется динамическим переходом.
* Ниже динамического перехода средняя амплитуда атомных флуктуации,
измеренная нейтронным рассеянием, увеличивается линейно с температурой, как и
ожидается в случае простого гармонического осциллятора; средняя константа
упругости может быть вычислена из зависимости обратной величины <и- > от
температуры.
* Выше динамического перехода эффективную константу упругости можно
рассчитать, используя квазигармоническое приближение. Ниже динамического
перехода константы упругости белков составляют величину порядка
нескольких Н-м1; выше динамического перехода эти константы порядка 0,1 Н-м '.
* Белковая динамика чувствительна к окружающему растворителю; измеряемые
амплитуды флуктуации и константы упругости свидетельствуют об
увеличении гибкости молекулы при повышении влажности среды.
* Для сохранения биологической активности белковой молекулы необходим по
крайней мере один окружающий ее водный слой; заключенный в трегалозную
оболочку белок сохраняет большую жесткость при высоких температурах, что
защищает его от разворачивания.

Часть Б
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ

Глава Б1
МАССА И ЗАРЯД
Б1.1. Исторический обзор
I N97
Дж. Дж. Томсон (J. J. Thomson)
первым произвел измерения и рассчитал
отношение массы к заряду для
элементарных частиц — «корпускул», которые
позднее стати известны как электроны.
Это событие с полным нравом можно
считать рождением масс-спектромет-
рип.
I9IN 1919
A. Демпстер и Ф. Астон (A.
Dempster и F. Aston) разработали первые
масс-спектрографы. В качестве детектора
использоваласьфото графическая
пластина. Прибор применяли для определения
относительного содержания изотопов.
1951
B. Паули п X. Штайнведель
(W. Pauli and H. Steinwedel)
описали созданный ими квадрупольный
масс-спектрометр. Четыре стержня, к
которым прикладывали постоянное и
переменное радиочастотное
напряжения, служили разделителями масс, где
с постоянной амплитудой
осциллировали только попы, чья масса
укладывалась в определенный диапазон. Затем
эти ионы собирались анализатором.
1959
К. Биеман (К. Biemann) применил
электронно-ионизационную
масс-спектрометр! но для анализа пептидов.
Позднее было показано, что для определения
аминокислотной последовательности
пептиды должны быть фрагментированы
перед анализом.
1968-1970
М. Доле (М. Dole) был первым, кому
удаюсь перевести синтетические и
природные полимеры в газовую фазу при
атмосферном давлении. Эксперимент
проводился путем распыления раствора
образца из маленькой трубки в сильном
электрическом поле в присутствии
потока горячего азота, который
способствовал десольватации. Первые же опыты
показали, что лизоцим способен
приобретать множественный заряд.
1974
Д. Торгерсон (D. Torgerson) ввел
в научную практику плазменную десорб-
ционную масс-спектрометрию, когда для
десорбции больших молекул
используются осколки от деления ядра -3-Cf. Это
была первая методика, показавшая
возможность получения молекулярных
ионов белка в газовой фазе из твердого
образца с помощью элементарных частиц.

1971
Б. Мамырин (В. Mamyrin) сделал
наиболее значительный вклад в
развитие время-пролетной (ВП) масс-спек-
трометрии. Он сконструировал так
называемый рефлектрон, ранее
предложенный С. Алихановым (S. Alikhanov)
в 1957 г. Прибор позволил значительно
улучшить разрешающую способность
ВП масс-спектрометрии.
1978
Н. Комисаров и А. Маршалл
(N. Comisarow и A. Marshall)
применили фурье-преобразование к
спектрометрии с ионно-циклотронным резонансом
и построили первый инструмент
подобного типа с фурье-преобразованием.
С тех пор интерес к этой технике рос
экспоненци&тьно, так же как и число
таких инструментов.
1981
М. Барбер (М. Barber) открыл бом-
бардировкубыстрыми атомами (ББА):
новый источник ионов для
масс-спектрометрии. Масс-спектр нефрагментированного
пептида из одиннадцати остатков — Мет-
Лиз-брадикинина (Met-Lys-bradykinin)
(М = 1318) был получен бомбардировкой
маленькой капли глицерина, содержащей
несколько микрограммов пептида, с
помощью пучка атомов аргона с энергией
в несколько кэВ. Эта техника совершила
революцию в масс-спектрометрии и
открыла ее для биологии.
1981
Р. Виллубай (R. Willoughby) и,
независимо от него, М. Александров
(М. Aleksandrov) предложили
объединить жидкостную хроматографию и
масс-спектрометрию для анализа
материалов с большими молекулярным
весами в жидкой фазе.
1988
Дж. Фенн (J. Fenn) и, независимо от
него, М. Ямашита (М. Yamashita)
осуществили перевод биологических
макромолекул в газовую фазу при атмосферном
давлении. Они предложили новый тип
ионизации, названной ионизацией элек-
трораснылением (ИЭР), для получения
нативных биологических молекулярных
ионов при помощи распыления сильно
разбавленного раствора через кончик
иглы сквозь электростатическое поле
с градиентом в несколько киловольт.
1988
М. Карас (М. Karas) и Ф. Хиллен-
камп (F. Hillencamp) и, независимо от
них, К. Танака (К. Tanaka) разработали
новую технику ионизации, названную
методом ионизации лазерной
десорбцией в матрице (ИЛДМ). Было
показано, что белки с молекулярной массой
вплоть до 60 кДа могут быть ионизованы
при облучении лазерным лучом, если их
предварительно поместить в УФ-погло-
щающую матрицу. Масс-спектрометрия
с использованием техники ИЛДМ (МС-
ИЛДМ) обладает высоким разрешением,
точностью измерения,способностью
захватывать ионы, что позволяет получать
информацию не только о молекулярной
массе, но также и о структуре различных
пептидов и олигонуклеотидов. В 2002 г.
К. Танака получил Нобелевскую
премию по химии за вклад в
масс-спектрометрию.
1992-1999
Молекулярнаяспецифичностьи
чувствительность МС-ИЛДМ породила
новую технологию прямого
картирования и получения изображений
распределения биологических макромолекул
в клетках и тканях. Благодаря
сканированию образца ионным лучом и сбору

масс-спектра по точкам, откуда десорби-
рованы ионы, удалось «увидеть»
распределение молекул по массе на клеточной
поверхности или в образце ткани.
2000 и по настоящее нре.мн
Масс-спектрометрия стала
важнейшим аналитическим инструментом
в науке о жизни. Методы мягкой
ионизации, такие как ББА, ИЭР и ИЛДМ,
превратили в рутинную еще недавно
недоступную процедуру по измерению
масс белков и нуклеиновых кислот с
высокой точностью и разрешением.
Масс-спектрометрия как один из
самых мощных экспериментальных
методов дает возможность для прямого
наблюдения биологических
комплексов в газовой фазе, их сборки и
разборки в реальном времени. В последние
годы данные по масс-спектрометрии
все чаще совмещаются с таковыми по
изотопному и аффинному мечению и
данными геномной информации.
Совершенно очевидно, что фаза
быстрого роста в развитии биоаналитической
масс-спектрометрии еще не
достигла своего пика. Несомненно, в
следующем десятилетии
масс-спектрометрия будет развиваться невероятными
темпами и из области структурной
Комментарий Б1.1. Термин |
«масс-спектроскопия»
Нам хотелось бы предостеречь читателя
против использования термина «масс-спек-
| троскопия». Он неверный, поскольку не
I имеет отношения к настоящим спектро- ;
[ скопическнм методам, описанным в Частях ,
3 и К. Масс-спектр в значительной степени i
зависит от стабильности ионов, полученных :
и собранных во время эксперимента. Ста- !
билыгасть, в свою очередь, зависит от
условий опыта, поэтому предсказать масс-спектр
вещества практически невозможно.
биологии шагнет в область медицины
и терапии.
Б1.2. Введение
в биологические проблемы
В течение последних двух
десятилетий масс-спектрометрия (кпммеша-
pniilil.l) стала важнейшим
аналитическим инструментом в структурной
биологии. Этому способствовало
развитие методов получения интактных,
высокомолекулярных ионов различных
биологических макромолекул в газовой
фазе. Некоторые техники ионизации,
такие как бомбардировка быстрыми
атомами (ББА), ионизация лазерной
десорбцией в матрице (ИЛДМ), и
электрораспыление (ИЭР) произвели
революцию в масс-спектрометрии и
открыли ее для биологии. Были разработаны
новые методы характеристики белков,
основанные на спектрометрии с ионно-
циклотронным резонансом фурье-пре-
образования (МС-ИЦР-ФП), имеющие
предел детектирования 30 зептомолей
(30 х 10~21 молей) для белков с
молекулярной массой от 8 до 20 кДа.
Используя эту технику, можно выделить
отдельные ионы — от полиэтиленгликоля до
ДНК с массой свыше 108 Да ( коммун i;i-
|>1ш lil.2и 1)1.3).
Разрешение и точность определения
массы с помощью масс-спектрометрии
обсуждаются в Приложении Б1.
Комментарий Б1.2. Абсолютная
и относительная массы
Масс-спектрометр не измеряет
абсолютную массу М, поэтому инструмент должен
быть калиброван с помощью стандартных
веществ, чьи значения М известны с боль-
| шой точностью. Чаще всего используется
! углеродная шкала. Масса |2С = 12,000000.

Kor.:ve!!7apiO Б 1.3. Молекулярная
масса и молекулярный вес
Когда Л/г используется для обозначения
относительной молекулярной массы, может
возникнуть некоторая путаница. М являет -
ся относительной безразмерной ветчиной.
Однако но абсолютной величине М равна
Л/, которая имеет размерность, - в
частности, для биологических макромолекул она
выражается в дальтонах. Надо заметить, что
молекулярный вес, который есть сила, а не
масса, в этом случае термин неправильный.
В настоящее время масс-снектромет-
рия стала основным методом в
исследованиях структуры биологических
макромолекул: в определении молекулярных масс-
белков и нуклеиновых кислот с высокой
точностью и в широком диапазоне, в
пептидном и нуклеотидном секвенировании,
при идентификации посттрансляционных
модификаций белков, в исследованиях
изменений белковой структуры, фолдинга
(сворачивания) и динамики, в
идентификации субпикомольных количеств белкой
в двумерном электрофорезе, при
идентификации изотопного мечения.
В последнее время масс-спектромет-
рия позволила охарактеризовать
полностью функциональные биологические
субклеточные комплексы и органеллы,
а также интактные бактерии. Были
открыты большие перспективы для
приложений этого метода в протеомике,
таксономии бактерий и медицине.
Б1.3. Ионы в электрическом
и магнитных полях
Ускоряющийся ион, покидая источник,
приобретает кинетическую энергию
F = zuB = —, (Б1.1)
г
где г- это заряд иона, V —ускоряющая
разность потенциалов, т масса иона,
а и — его скорость. В однородном
магнитном поле В, перпендикулярном его
траектории, ион испытывает действие
силы Лоренца F ( кпммем r.uuiii Ы. i),
которая перпендикулярна как В, так и и
(рис. Ы.1 а). Результирующая
траектория иона в магнитном поле представляет
собой окружность с радиусом /\
поскольку сила Лоренца просто уравновешивает
центробежную силу:
Величина отношения массы к
заряду т/г дается выражением:
Из уравнения Б 1.3 следует, что
самые легкие ионы имеют траекторию с
наименьшим радиусом, который
увеличивается в ростом массы нона и
напряженности электрического поля
(рис. Ы.1 6).
Б1.4. Методы ионизации
Б1.4.1. От ионов в растворе
к ионам в газовой фазе
Переход ионов из газовой фазы и раствор
процесс естественный. В присутствии
молекул растворителя, таких как 11,0,
i Комментарий Б1.4. Сила Лоренца
Сила Лоренца (F) - это сила,
испытываемая анионом с зарядом (г), движущимся в
: электромагнитном поле. F — z(E + их В), '
где Е — напряженность электрического
поля, а их В — векторное произведение
напряженности магнитного поля В и
скорости иона и.

ДВИЖеНИе ooooooooooooq
частицы Возрастание массы ►
а б
1\н'. I) 1 1: а сила Лоренц», действующая на заряженную частицу в магнитном поле; б —
заряженные частицы в электрическом и магнитном полях. В обоих случаях магнитное поле
направлено перпендикулярно плоскости рисунка
«голые» (дегидратированные) ионы
в газовой фазе, например Na',
спонтанно образуют молекулярные кластеры
ион-растворитель — Na'(H.,0)n. Если
давление паров растворителя несколько
больше давления насыщенного пара, эти
кластеры вырастут до размеров
небольших капель.
Перенос ионов из раствора в газовую
фазу представляет собой процесс десоль-
ватации, требующий затрат энергии
(эндотермический процесс), и поэтому не
происходит спонтанно. Например, для
переноса ионов Na' из водной фазы в
газовую требуется большая свободная
энергия — около 98 ккал/моль. В большинстве
методов аналитической масс-спектро-
метрип для переноса в газовую фазу
требуется очень большая энергия, которая
обеспечивается за счет каскадов высоко
энергетических столкновений или
сильно локализованного нагрева.
Ионы можно получать тремя
разными способами. Во-первых, отрывая
электрон от молекулы с образованием
положительно заряженного катиона,
который может быть ускорен в
растущем градиенте отрицательного поля,
либо в понижающимся градиенте
положительного поля. Во-вторых,
добавляя электрон, получая при этом анион.
В этом случае ускоряющие поля прямо
противоположны тем, что
используются для катионов. В-третьих, удаляя или
добавляя протон. В этом случае масса
результирующего иона будет
отличаться на 1 от исходного нейтрального иона.
Ниже мы опишем наиболее часто
используемые пути для получения ионов
в масс-спектрометрах.
Б1.4.2. Электронная ионизация
Электронная ионизация (ЭИ) —
наиболее часто используемая техника в
масс-спектрометрии. Она является
относительно простой иллюстрацией общего
принципа ионизации при электронной
бомбардировке. Энергия электронов, по-
Комментарий Б I .'о. Электронвольт
(эВ) и джоуль (Дж)
Электронвольт (;-)В) — это единица
энергии, равная кинетической энергии
электрона, приобретенной им вследствие прило-
'■ женной разности потенциалов в 1 В:
j 1 эВ= 1,6 х 10-19Дж.
! Джоуль (Дж) — стандартная единица
; энергии в системе СИ. 1 Дж = 1 ньютон на
; метр.

лученных в результате нагревания нити,
находящейся в источнике ионов, обычно
составляет 70 эВ ( mimmi-h upih'i 1 >!.,">).
Под воздействием таких электронов
газообразная молекула может терять или
приобретать один электрон. Возможные
последствия этого описаны ниже.
Ковалентные связи образуются
спариванием электронов. При образовании
катиона в результате ионизации
происходит потеря электрона с образованием
связи с одним неспаренным
электроном. Тогда:
М (нейтральная) + е -» М'г + 2е ,
где М'+ — это положительно заряженный
молекулярный ион. В случае захвата
электрона образуется анион через добавление
неспаренного электрона и поэтому:
М (нейтральная) + е-—» М'~,
где М'" обозначает отрицательно
заряженный молекулярный ион. В
условиях электронной бомбардировки такие
ионы относительно нестабильны и
образуют серии дочерних ионов, которые
и регистрируются в виде спектра.
Б1.4.3. Ионизация полем
Для ионизации полем (ИП) образец
должен находиться в газовой фазе.
Молекулы подвергаются действию
электрического поля высокой
напряженности порядка 107-108 В-см-1. Такая
напряженность достигается
использованием металлической (Pt, W) иглы
с радиусом 100-1000 нм, к которой
прилагается напряжение около 5 кВ.
В этих условиях электроны внешней
оболочки испытывают действие сил,
достаточных для образования
молекулярных катионов.
Б1.4.4. Бомбардировка быстрыми
атомами
В масс-спектрометрии с
использованием бомбардировки быстрыми атомами
(МС-ББА) ионизация происходит при
бомбардировке поверхности образца
пучком атомов Аг или Хе,
разогнанных до энергии в несколько кэВ. В этом
случае первичные частицы способны
вызвать каскад столкновений в
небольшом объеме.
Образец помещается в жидкую
матрицу (обычно глицерин) для
поддержания относительно постоянной
концентрации молекул в поверхностном слое, за
счет того, что на смену испарившимся
молекулам приходят молекулы из
основного объема. Эта процедура
позволяет получать стабильный масс-спектр
в течение продолжительного времени
(около одного часа).
В ББА-ионизации капли образца
бомбардируются атомами Аг или Хе,
обладающими кинетической энергией от
8-10 кэВ. При такой энергии
изначально заряженные молекулы образца будут
десорбированы, тогда как формирование
протонированных молекулярных ионов
(М+Н)+ при получении
положительных ионов и (М-Н) — при получении
отрицательных ионов происходит
вследствие перехода молекул в газовую фазу
и химических процессов в растворе.
Основной недостаток техники ББА
(очень высокая концентрация
органической жидкой матрицы) преодолевается за
счет использования проточной ББА,
когда раствор образца постоянно подается к
месту бомбардировки с небольшой
скоростью до 10 мкл-мин '. В этом случае
требуется меньше органической матрицы, в
результате чего отношение сигнал-шум
возрастает. На рисунке IS 1.2 показаны
основные элементы техники ББА.

.>-'
О Растворитель
© С+
Рис. Iil.2. Механизм десорбции в процессе ББА-ионизации. А" — отрицательно заряженный
ион. С — положительно заряженный ион. Капля бомбардируется атомами Хе или Аг,
обладающими большой энергией (Caprioli and Suter, 1995)
Самым большим преимуществом
метода ББА является его простота.
Спектры легко интерпретируются. В настоящее
время ББА-МС широко используется
для анализа компонентов с
молекулярной массой ниже 5 кДа.
Б1.4.5. Плазменная десорбция
В масс-спектрометрии с плазменной
десорбцией образец наносится на
металлическую поверхность и бомбардируется
осколками ядер радиоактивного
изотопа. В этом контексте термин «плазма»
означает атомные ядра, лишенные
электронов. В результате спонтанного
распада ядер 2"'2Cf возникают две атомные
частицы с большой кинетической энергией
(80 МэВ) U4Cs и 108Тс, которые летят в
противоположных направлениях. Такая
энергия позволяет частицам проникать
сквозь тонкую металлическую фольгу и
ионизировать биологический материал,
нанесенный с обратной стороны.
Деление ядра — это дискретное
событие, происходящее с частотой (1-
5) х Ю3 сек ', результатом которого
является поток ионов, пульсирующий
с той же частотой. По этой причине
в методе целесообразно использовать
время-пролетный масс-спектрометр
(параграф Б 1.5.5). Измеряя время
полета вторичных ионов и зная их
энергию и траектории, можно
преобразовать время-пролетный спектр иона в
масс-спектр. На рисунке Б 1.3
показаны основные характеристики техники
МС-ПД с время-пролетным масс-ана-
лизатором.
Метод МС-ПД обладает хорошей
чувствител ьностью для пептидов и отно-
сительно небольших белков (7-20 кДа).
Для определения молекулярной массы
этим методом обычно требуется около
10 пМ материала. Разрешение при этом
составляет около 1000.
Б1.4.6. Ионизация лазерной
десорбцией при содействии
матрицы
При ионизации лазерной
десорбцией лазерное излучение очень большой
плотности фокусируется на маленьком
участке, что приводит к крайне
высокой скорости нагрева. В результате
формируется локализованный лазер-

Детектор
Фрагменты деления
Площадь возбуждения
(100 нм-)
Десорбированные ионы
Фольга
образца
(+} Фрагментарные
®ъ ионы
®> MB"
Ускоряющая Молекулярный g^ H'
решетка ион ©.
Детектор
десорбированных
Рис. lil.H. Схема метода МС-ПД с источником -52Cf и время-пролетным масс-анализатором
(Caprioli and Suter, 1995)
ный «факел» испарившихся молекул
из адсорбированного материала или из
самого твердого субстрата.
Непосредственная ионизация интактных
биологических молекул без использования
матрицы ограничена молекулярными
массами около 1 кДа. Для преодоления
этого ограничения используется
ионизация лазерной десорбцией в матрице
(ИЛДМ).
ИЛДМ отличается от прямой
лазерной десорбции тем, что здесь
используется специальный материал,
смешанный с образцом, который называют
матрицей. С этой точки зрения такая
техника ионизации похожа на технику
Лазерный импульс
Молекула образца
-УФ-поглощающая
матрица
Рис. 131.1. Схема механизма ИЛДМ с использованием лазера: а — поглощение излучения
матрицей; 6 — диссоциация матрицы, переход в фазу сверхсжатого газа н перенос заряда на
молекулы образца; в — увеличение объема матрицы со сверхзвуковой скоростью с вовлечением молекул
образца в расширяющийся «факел» и переносом заряда на молекулу

ББА, которая также использует
жидкую матрицу для мягкой ионизации.
На практике ИЛДМ обеспечивает еще
более мягкую ионизацию, чем ББА, что
позволяет анализировать большие
молекулы с массой вплоть до 1000 кДа при
минимальной фрагментации.
Детальные механизмы превращения
энергии, десорбции образца и ионизации
до сих пор полностью неизвестны. Общее
представление механизма дано па
рисунке 1И.1. Энергия лазерного луча
поглощается хромофором в матрице, которая
очень быстро переходит в газовую фазу,
унося с собой молекулы образца.
Ионизация происходит за счет переноса
протона от возбужденных молекул матрицы
к молекулам образца, скорее всего еще в
твердой фазе, а также через соударения
молекул в расширяющемся «факеле».
Матрица •- ключевой компонент
техники ИЛДМ. Она действует как
поглотитель энергии, увеличивая время
жизни образца- Анализируемый
материал смешивается с избытком матричного
материала, который поглощает лазерное
излучение. В качестве такого материала
обычно используют ароматические
вещества, содержащие функциональные
карбоксильные группы. Ароматические
кольца матричного материала играют
роль хромофора, поглощая лазерное
излучение и способствуя переходу его
молекул п молекул образца в газообразное
состояние. Матрица не только повышает
выход ионов образца, но и
предотвращает их излишнюю фрагментацию.
Для десорбции биологического
материала более всего подходят два типа
лазеров: инфракрасный, который
способен возбуждать колебательные моды,
и ультрафиолетовый лазер,
возбуждающий электронные моды в
ароматических молекулах. Используют импульсы
длительностью 100 нсек и меньше для
обоих диапазонов волн, поскольку
более длительное воздействие излучения
сопровождается нагревом, способным
привести к пиролитическому
разрушению биологических молекул.
Поскольку большинство лазерных
источников импульсные, с ИЛДМ чаще
всего используют время-пролетные
масс-спектрометры с ионно-циклотрон-
ным резонансом и фурье-преобразо-
ванием (ИЦР-ФИ-МС) (раздел Б1.6).
В настоящее время точность измерения
массы в благоприятных условиях
составляет ±0,01% (±1 Да при молекулярной
массе 10 кДа). Если позволяют условия,
возможно разрешение индивидуальных
пиков изотопов углерода (секция Б2.1).
Техника ИЛДМ находится в процессе
развития и постоянно улучшается.
Б1.4.7. Ионизация
электрораспылением
Ионизация электрораспылением (ИЭР)
дает возможность получать интактные
ноны из молекул образца, находящихся
в растворе при атмосферном давлении
( коммун lapm'i l> !.(>). Ионы образуются
при подаче напряжения в 1-5 кВ к
раствору образца, выходящего через
капилляр с низкой скоростью (1-20 нл-мин ').
Большой электрический потенциал,
приложенный между концом
капилляра и противоположным электродом,
расположенным на небольшом
расстоянии, вызывает превращение жидкости,
выходящей через кончик капиллярной
трубочки, в аэрозоль, состоящий из
заряженных капель (рис. HI.Л). Раствор
испаряется но мере того, как капли
перемещаются из области ионизации с
атмосферным давлением в вакуумную
камеру, где располагается масс-анализа-
тор. Испарению способствует встречный
ток осушающего инертного газа либо

Ионизация
распыленного потока
Распад на мелкие
капли
Распад на ионы в
камере соударений
Анализ массы
© о °0 ©
©0®0®0°0©00©°®Л*Л
о° ®°
О
Атмосферное давление
1 е" -1 е' мбар
Рис. I) I..">. Схематическое изображение траекторий ионов от иглы электрораспылителя до
детектора масс-спектрометра. Раствор белка, обычно 1-2 мкл с концентрацией 5 мкМ, помещается
в очень тонкий капилляр с диаметром примерно 10 мкм. К позолоченной игле
прикладывается напряжение в несколько кВ, вызывая электрораспыление маленьких капель.
Положительно заряженные капли электростатически притягиваются, десольватируются и фокусируются
в масс-спектрометре для детектирования (Rostom, 1999)
нагрев трубки, через которую капли из
источника ионов попадают в вакуумную
камеру анализатора. Заряд полученных
ионов определяется полярностью
приложенного к капилляру напряжения.
Привлекательным свойством
методики ИЭР является образование
молекулярных ионов, несущих
множественный заряд, при условии если данные
молекулы могут принимать более
одного заряда (см. комментарии Ы.6).
Это свойство позволяет детектировать
ионы с большой массой в низком
диапазоне величин m/z. Сдвиг шкалы
делает возможным детектирование
тяжелых ионов с высоким разрешением,
поскольку разрешение обратно
пропорционально отношению m/z (см. пример
в разделе Б2.7). Точность определения
молекулярной массы с помощью
техники ИЭР и масс-спектрометрии с фурье-
преобразованием достигает примерно
Комментарий Б1.6, Число присоединяемых протонов !
Как правило, максимальное число протонов, которое может присоединить пептид или белок '
в условиях ИЭР, хорошо коррелирует с количеством основных аминокислот (Apr, Лиз, Гис)
плюс N-концевая аминогруппа, если, конечно, она не ацилирована. Однако важным фактором
в этом процессе является еще и доступность этих протон-связывающих участков. Поэтому I
распределение зарядов зависит от рН, температуры и присутствия денатурирующих агентов '■
в растворе. Такое распределение можно использовать для исследования конформационных |
изменений в белке. Например, наиболее распространенный ион бычьего цитохрома с несет 10 .
положительных зарядов во время электрораспыления при рН 5,2 и 16 зарядов при рН 2,6.
Похожий эффект наблюдается при восстановлении дисульфидных связей. Максимум
распределения зарядов ионов лизоцима куриного яйца с четырьмя дисульфидными связями находится в
области 12 положительных зарядов (12+), но после восстановления при помощи дитиотрейтола
(АТТ) этот максимум смещается в область 15* (см. комментарий в секции Б2.9).

0,001 0,005%. В благоприятных
условиях можно разрешать индивидуальные
пики изотопов углерода (раздел Б1.8).
Наконец, надо отметить, что ИЭР —
один из самых мягких методов
ионизации, доступных сегодня, поскольку он
не приводит к молекулярной
фрагментации. Техника ИЭР также как п
техника ИЛДМ активно развивается.
Ci i .О. i/; i-«C"( p'*71v';vi: JT-v
Первый масс-спектрометр был
построен в 1913 г., когда Дж. Дж. Томпсон
предложил использовать постоянные
магнитные и электрические ноля для
разделения двух изотопов
благородного газа Ne, используя различие в
поведении заряженных частиц с разным
импульсом и энергией в электромагнитном
поле. В любом масс-спектрометре ионы
сначала переводят в газовую фазу, затем
разгоняют до определенной скорости
в электромагнитном поле, разделяют в
масс-анализаторе, а затем детектируют
и получают масс-спектр. Поэтому все
масс-спектрометры состоят из пяти
основных частей: впрыскивателя образца,
ионизационной камеры, масс-анализа-
тора, детектора ионов и блока
обработки данных (|НК'. I) ].()).
Система введения образца
состоит из устройства, осуществляющего
впрыск раствора, зондов для
инъекции малолетучих жидкостей и
различных хроматографических
приспособлений. Ионы, образованные разными
способами в ионизационной камере
(раздел Б 1.5), анализируются в
соответствии с отношением масса-заряд
в масс-анализаторе.
В настоящее время
используются пять типов масс-анализаторов: маг-
Инжектор
образца
Ионизационная
ячейка
Анализатор
массы
Р
Детектор
ионов
Обработка
данных
Масс -
спектр
Рис. Ы.(>. Схема основных блоков
масс-спектрометра
нитный сектор, квадрупольный масс-
фильтр, квадрупольная ионная ловушка,
время-пролетные и ионно-циклотрон-
ные резонансные устройства.
Детектирование ионов после масс-анализа может
осуществляться с помощью
деструктивных и недеструктивных методик (см.
ниже). Современные
масс-спектрометры полностью управляются
компьютерами, а для обработки и интерпретации
данных используются специальные
программы.
Б1.5.1. Масс-спектрометры
с одиночной и двойной
фокусировкой
В инструментах с одним фокусиро-
вочным сектором ионы с массой т,
зарядом z и определенной
кинетической энергией помещаются в магнитное
поле В. Как следует из уравнения Б 1.3,
при заданных значениях В, Vnz ионы с
различными массами будут двигаться по
траекториям с различными радиусами г.
Смеси ионов с большим диапазоном
масс будет соответствовать траектории
с разными радиусами. Поэтому
определение масс-спектра такой смеси
потребовало бы большого числа детекторов.
На практике проблему можно решить,
если заставить все ионы следовать по
траекториям с одинаковым радиусом.
Этого можно добиться двумя способами.
В электромагнитном анализаторе (ЭМА)
используются электромагниты,
позволяющие изменять магнитное поле В таким

Магнит
E+dE
Источник ионов
Рис. Ы./. Общая схема масс-спектрометра с одной фокусировкой, основанного на принципе
электромагнитного анализатора (а) и электростатического анализатора (б) (Caprioli and Suter,
1995)
образом, чтобы ионы с разными массами,
но с одинаковой скоростью, следовали по
заданному радиусу (рис. 151.7 а). В
электростатическом анализаторе (ЭСА)
ускоряющее напряжение V изменяют так,
чтобы разгонять ионы с разными
массами до различных конечных скоростей и
(рис. 131.9). Отметим, что
масс-спектрометр с одиночной фокусировкой
обладает ограниченным массовым диапазоном
и низким разрешением.
В масс-спектрометрах с двойной
фокусировкой используется комбинация
ЭСА и ЭМА (рис. 131.8). В таком
приборе обе траектории линия А и линия Б
пересекаются в одной точке.
Инструменты с двойной фокусировкой
обладают намного большим разрешением.
Б1.5.2. Квадрупольный
масс-фильтр
Разделение масс в квадрупольном масс-
фильтре основано на достижении
стабильной траектории для ионов с
определенными значениями m/z в быстро
меняющемся электрическом поле.
Идеальный квадрупольный масс-фильтр
состоит из четырех цилиндрических
стержней круглого сечения, как показано на
рисунке Ы.!). К одной паре диагонально
расположенных стержней прилагается

Магнит
Источник ионов
Щель детектора
I'lii'. I> I .S. Общая схема масс-спектрометра с двойной фокусировкой (Caprioli and Suter, 1995)
постоянное отрицательное напряжение
(-(1с) и переменное радиочастотное
напряжение (if). К другой паре
прикладывается постоянное напряжением с
противоположной полярностыо (+dc) и
переменное //-напряжение с разностью
фаз в 180". Фильтрация масс происходит
при изменении постоянного и
переменного напряжений, при сохранении
постоянства отношения dc к //. При данных
характеристиках поля только траектории
ионов с определенными массами будут
Нить накала
Электронный
затвор
Кольцевые
электроды --..
Умножитель
электронов
Электронная
линза
Верх и низ
концевых
электродов
цоколя
► К усилителю
(I О
Рис. I i I.'): а схема квадруполыюго масс-фпльтра. В идеальной ситуации используются
стержни с гиперболическим сечением. Для сканирования значении т/г от 1 до 500, постоянное
напряжения варьируют между 0 и 300 В, а переменное — от 0 до 1500 В. Частота переменного поля rf
находится в мегагерцовом диапазоне; б - продольное сечение квадруполыюп ионной ловушки.
Ионы образуются благодаря радиальной ппжекцпп электронов через отверстия в кольцевом
электроде или с помощью аксиальной пнжекцпн через наконечник. При данных значениях т/г
ноны удерживаются на постоянных орбитах, если правильно подобраны амплитуды и частоты
сигналов, приложенных между наконечником н кольцом (Gordon, 2000)

Лазер
К детектору
Капилляр
Ионная
ловушке
Отсекатель „ Октапольное
Квадрупольное устройство
устройство
Образец
Рис. [) 1.10. Схематическое изображение ИЭЛДМ-масс-снектрометра с ионной ловушкой
стаоильными, они и попадут в детектор.
Ионы с нестабильными траекториями не
пройдут сквозь стержни, поэтому такое
устройство и называется фильтром.
Одно из преимуществ квадруполь-
ного масс-фильтра заключается в
низком напряжении, прилагаемом к
источнику ионов — 5-20 В по сравнению с
несколькими кВ в ЭСА-приборах.
Низкое напряжение к тому же делает
более простым соединение инструмента
с жидкостным хроматографом.
Б1.5.3. Квадрупольная ионная
ловушка
Квадрупольная ловушка
первоначально была разработана физиками, которые
были заинтересованы в увеличении
времени наблюдения в спектроскопических
исследованиях элементарных частиц.
Она основана на том же принципе, что
и квадрупольный масс-фильтр, за тем
исключением, что квадрупольное поле
здесь генерируется в трехмерном
устройстве, состоящем из кольцевого
электрода и двух электродов-наконечников,
как показано на рисунке Ы.9 6.
Кольцевой электрод представляет собой одно-
полостный гиперболоид. Такой электрод
похож на тор, за исключением того, что
сечение кольца представляет собой не
окружность, а гиперболоид. Ионы,
образованные в ловушке или во внешнем
источнике, остаются в ней же. По мере
повышении напряжения г/"-траектории
ионов с различными значениями m/z
постепенно становятся нестабильными.
Прошедшие через ловушку ионы
детектируются электронным умножителем.
В этом состоит отличие принципа
действия ионной ловушки от квадрупольного
фильтра, где детектируются ионы со
стабильными траекториями. Схематическое
изображение масс-спектрометра с
ионной ловушкой и ИЭЛДМ при
атмосферном давлении показано на piicviikc l>l.l().
Б1.5.4. Масс-спектрометр
с использованием ионно-
циклотронного резонанса
Масс-спектрометрия с использованием
ионно-циклотронного резонанса (МС-
ИЦР) основана на захвате ионов и этим
отличается от техники, в которой для
разделения масс используется
пропускание ионов (KoMMcmnpiiii Ы .7).
В И ЦР ионы, захваченные магнитным
и электрическим нолем, детектируются

в том случае, когда частота
приложенного //-поля приходит в резонанс с
частотой ЦИКЛОТрОНа ( l.mivrr UMlil 1)1.N).
Резонансная частота со прямо
пропорциональна напряженности магнитного ноля
(обычно от 3 до 7 Тесла) и обратно
пропорциональна отношению m/z ионов:
а>. = —. (Б1.4)
т
Ионы, однажды образованные
в ячейке анализатора МС-ИЦР,
вынуждены двигаться по круговым
орбитам с радиусом гравным:
, = ™. (Б1.5)
zB
Их подвижность ограничена
плоскостью, перпендикулярной
магнитному полю (плоскость ху) (рис. Ы.11).
Захват ионов вдоль оси z достигается
приложением электростатического
потенциала к двум пластинам на концах
ячейки. Захваченные ионы могут нахо-
•м^ -м.ч'! .ip:iii Ь. 1.7. Принцип
работы ионного циклотрона
В 1932 г. Е. Лоренс (Е. Lawrence) н С. Ли-
впнгстон (S. Livingstone) продемонстрпро-
b;uii. что траектория заряженной частицы,
движущейся перпендикулярно
однородному магнитному нолю, ограничена круговой
орбитой, где угловая частота ее движения не
зависит от радиуса орбиты частицы и
выражается уравнением циклотрона Б 1.4. Лоренс
открыл, что частица в циклотроне может
двигаться но большей орбите, если
приложить поперечное переменное электрическое
поле, чья частота равна циклотронной
частоте частицы. Важность открытия
заключалась в том, что оказалось возможным
сообщить частице очень большую кинетическую
энергию, используя довольно умеренную
напряженность электрического поля. За счет
неременного напряжения в 1 кВ после 1000
циклов частица может быть разогнана до
кинетической энергии в 1 МэВ.
диться в ячейке несколько часов, при
условии поддержания высокого вакуума
(10 8-10 9 Торр) для уменьшения
числа дестабилизирующих столкновений
между ионами и остаточными
нейтральными молекулами. Захваченные ионы,
имеющие определенные значения m/z,
■ Коиыешьрии Б 1.8. Циклотронные
частоты ионов
Из уравнения Б 1.4 следует, что ионы
с разными значениями m/z будут иметь
уникальные циклотронные частоты. При
напряженности магнитного поля в 6 Т ион
с отношением т/г = 36 имеет циклотронную
частоту 2.6 MHz, тогда как нон с т/г = 3600
будет обладать циклотронной частотой
26 kHz. Уравнение Б1.5 также показывает,
что линейное увеличение магнитного поля
приводит к линейному увеличению
циклотронной частоты ионов, что делает ионы с
большими массами более легкими для
детектирования в низкочастотном (кГц)
диапазоне. Еще одним преимуществом повышения
напряженности магнитного поля, является
увеличение разрешающей способности
прибора, а также расширение верхнего предела
измеряемых масс. Надо отметить, что
уравнение Б 1.4 не учитывает присутствие
электрического поля, образуемого двумя
захватывающими пластинами, и поэтому может
считаться приближенным.
Единицы напряженности магнитного
поля и давления
Тесла(Т)
Стандартная единица плотности потока
магнитного ноля в системе СИ
1 Т= 1 кгсек2х А '
Торр
Единица давления. Один Торр равен
давлению, необходимому для
поддержания столбика ртути с высотой в 1 мм при
температуре 0 °С и стандартной величине
тяготения.
1 Торр равен 133.322 Паскалей
Паскаль (Па)
Стандартная единица давления в
системе СИ. 1 Па = 1 кг • м ' • сек -.

ФП
U.
Масс-спектр
Плоскость-ловушка
Рис. Ы.11. Ячейка ИЦР-ФП-масс-споктрометра. Показаны захватывающие, передающие
и принимающие пластины, также указано направление магнитного поля В (Buchanan and
Hcttich, 1993)
Ки.-.к -интарим ь 1.9. Сходства
и различия между ЯМР и ИЦР
Ядерная магнитная резонансная
спектроскопия (ЯМР) это техника, которая
позволяет напрямую измерять
растепление Зеемана вырожденных энергетических
уровней ядра, обладающего магнитным
моментом (см. Главу К1). В ЯМР резонансная
частота ядра дается выражением
ш = уВ(\-а),
(Л)
где со — резонансная частота в рад • сек ',
а у — гиромагнитное отношение,
характерное для конкретного ядра,В— приложенное
магнитное поле, а — параметр химического
сдвига, который характеризует химическое
окружение ядра.
Заметьте, что в уравнении А, как и в
уравнении Б1Л, угловая частота
пропорциональна приложенному продольному
магнитному полю В. Однако ширина линий в
ЯМРи ИЦРсовершенноразная. Например,
для 'Н ЯМР в жидкой фазе при магнитном
поле в 2,3 Т все 'Н ЯМР частоты
укладываются в очень узкий диапазон 100 MHz ±
5 kHz. Тогда как при 2.3 Т диапазон масс
15-1500 Да покрывает область ИЦР-час-
тот в 20 kHz — 2 MHz для ионов, несущих
один заряд.
ооладают одинаковой циклотронной
частотой, но располагаются в ячейке
случайным образом, поэтому их
движение не приводит к образованию сигнала
на принимающих пластинах МС-ИЦР
ячейки. Для детектирования
циклотронного движения к МС-ИЦР ячейке
прикладывается возбуждающий импульс с
тем, чтобы собрать ионы в когерентно
движущийся пакет. Результатом
когерентного движения ионов является
образование на принимающих пластинах
сигнала, имеющего временную
зависимость.
Масс-спектрометрияионно-цикло-
тронного резонанса с фурье-иреобра-
зованием (ИЦР-ФП-МС) —
результат дальнейшего развития техники
ИЦР. Сигналы, регистрируемые как
функция времени, оцифровываются и
подвергаются фурье-преобразованию,
в результате чего получается сигнал
в частотной области, который потом
преобразуют в масс-спектр (параграф
Б1.6.6). Преимуществами ИЦР-ФП-
МС являются: более высокое
разрешение, широкий диапазон одновременно
детектируемых значений m/z, возмож-

ность изучения ион-молекулярных
реакций при низком давлении. В м>\;
: :. ii': 'i проводится параллель
между ИЦР и Я MP.
Б1.5.5. Время-пролетная
масс-спектрометрия
Анализ масс во время-пролетном масс-
спектрометре основан на том, что ионы
с разными значениями m/z обладают
одинаковой энергией, но разными
скоростями, приобретенными в результате
ускорения. Отсюда следует, что время
прохождения ионов через
время-пролетную базу будет различным для
частиц с разной массой: легкие ионы
долетят до детектора быстрее тяжелых.
Из уравнения Б 1.1 мы получаем
выражения для скорости и иона с массой т
и зарядом z:
(2zV...
и =
\'Л
т
(Б1.6)
и для времени t, необходимого для
преодоления базового расстояния L
t =
т
2zV,
(Б1.7)
угк J
Уравнение Б 1.7 говорит нам о том,
что при ускоряющем напряжении 20 кВ
и L равным 1 м, ион с одним зарядом и
массой 1кДа будет иметь скорость
около 6 х 10" м-сек ', а время, необходимое
для прохождения через пролетную базу,
составит 1,4 х 10 s сек.
Очевидно, что для
время-пролетного масс-анализатора наиболее
подходящими техниками получения
ионов будут те из них, которые работают
в импульсном режиме: использование
осколков деления ядра 2n2Cf и лазерный
импульс подходящей частоты. При
введении ионов из постоянных источников
(ИЭ, ЭР, ББА и т. д.) необходимо
импульсное отражение пучка ионов или
экстракция импульсов из источника.
Метод по времени пролета
обладает рядом преимуществ по сравнению с
технологиями, использующими
последовательное сканирование спектра,
ввиду «неограниченного» диапазона масс,
высокого пропускания
(детектируется большинство ионов, попадающих в
анализатор), высокой скорости (весь
спектр масс детектируется
одновременно в течение нескольких микросекунд)
и потенциально большего
коэффициента заполнения (процент детектируемых
ионов). Между тем большим
недостатком метода является его низкое
разрешение. Из уравнения Б 1.7 следует,
что величина m/z пропорциональна f,
откуда получаем выражение для
разрешения: R = -^- = i— . Для стандартных
Am 2 At
линейных ВП-инструментов оно
составляет не более 1000.
Значительного улучшения
разрешения при ВП-методе можно добиться,
используя электростатическое зеркало
или «рефлектрон» и ортогональный
время-пролетный масс-спектрометр (о-
ВП-МС).
В основе работы рефлектронного
время-пролетного масс-спектрометра
лежит тот факт, что ионы с большой
энергией проникают глубже в
отражающее электрическое поле, находясь там
дольше низкоэнергетических ионов.
Поскольку при этом они вынуждены
преодолевать большее расстояние, ионы
с высокой энергией достигнут
детектора в то же самое время, что и ионы с
низкой энергией. Применение рефлек-
трона позволяет увеличить разрешение
ВП-МС до 6000.'

Радиочастотное
возбуждение
n/wvrz:
Выходной
сигнал
Преобразование
Фурье
i I
Время
i i i г
Частота
а о
I'm . I) 1.1 'l.a общая схема движения возбужденных попов в ПЦР-ФП ячейке; б -■ полученный
временной сигнал в результате фурье-нреобразовання трансформируется в частотный сигнал, из
которого получают масс-спектр
Характерной чертой о-ВП-МС
является параллельное расположение
детектора к оси ионного пучка. Под
действием короткого электростатического
импульса (10-100 нсек),
направленного строго перпендикулярно исходному
потоку, ионы будет испытывать
ортогональное ускорение. Ионы отклоняются
под углом 90" и попадают на детектор,
работающий в режиме времени
пролета. Такая геометрия спектрометра имеет
ряд преимуществ, главное из которых
состоит в возможности использования
небольшой начальной скорости
ионного пучка и как следствие этого —
использование метода электрораспыления
для получения исходных ионов. Все это
приводит к повышению разрешающей
способности и высокой линейности
спектрометра. Разрешение таких
инструментов составляет примерно 4000.
Б1.5.6. Масс-спектрометрия
с фурье-преобразованием
В большинстве масс-спектрометров
ионы детектируются благодаря
электрическому току, который они вызывают
при столкновении с поверхностью
устройства, такого как электронный
умножитель (деструктивный метод). Хотя
такой подход широко применяется и
обладает высокой чувствительностью,
его недостатком является разрушение
детектируемых ионов. Другими
словами, сигнал иона может быть измерен
только один раз. Метод детектирования
в масс-спектроскопии с
фурье-преобразованием работает по другому
принципу: сильное магнитное поле
захватывает ионы внутри ячейки анализатора,
а электрические сигналы, образуемые
за счет их циклотронного движения,
детектируются парой электродов,
подсоединенных к усилителю с большим
внутренним сопротивлением
(импедансом) (рис. 131.12).
Данный метод детектирования
позволяет «чувствовать» число ионов, не
удаляя их из ячейки анализатора и не
уничтожая их (недеструктивный
метод). Сигнал от одного и того же иона
может быть измерен несколько раз.
Такое детектирование подобно таковому
в методе ЯМР (см. MiMMi'ii ;i;>ii!i Ы.Ми
Главу Б1.9). МС-ФП дает возможность
детектировать несколько тысяч ионов
для получения полезного сигнала,
который содержит полную информацию
о частотах и относительном
содержании всех ионов, захваченных в ячейке.
Поскольку частота может быть
измерена с высокой точностью, то массу иона
можно определить с точностью до
одной миллиардной или еще точнее. Надо
отметить, что разрешение в ИЦР-МС с
фурье-преобразованием зависит от
массы, поэтому сверхвысокое разрешение
достигается при ее низких значениях
(параграф Б2.1.1).

Р|. В}. P2<
Р4.П»
MS 1 <
F^—
P3—
P —=
4 I
p5_.^
cc
P4 +
^V ^2' ^3'
MS 2 1
F2-
F3-
Ffi-
I'nc Ы . I!{. Пршщинтандемной масс-спектромстрии. MCI и МС2 — первый и второй
масс-спектрометры. КС — камера столкновений. Смесь пяти пептидов сканируется для получения
спектров пяти (М + Н)' ионов, обозначенных на рисунке как (Р -Р5). После сканирования только один
отобранным ион (Р,) проникает в камеру столкновений. Фрагменты (F|-F6), полученные в
результате деструкции нона предшественника Р, (часть молекул которого сохраняет целостность),
затем анализируются с помощью МС2 для записи спектра ионного продукта (Biemann, 1992)
Чувствительность ИЦР-ФП-МС
настолько высока, что данный метод с
успехом применяется для
исследования одиночных макроионов, несущих
множественный заряд.
Б1.5.7. Тандемная
масс-спектрометрия
Для получения структурной
информации с помощью масс-спектрометрии
молекула должна претерпеть
фрагментацию одной или нескольких связей с
образованием ионов, значения m/z
которых может быть соотнесено со
структурой. Вспомним, что методы «мягкой»
ионизации, такие как ББА, ИЭЛДМ и
ИЭР, производят одиночные
молекулярные ионы, энергии которых
недостаточно для фрагментации. Однако
фрагментация становится достижимой при
использовании специальной камеры
столкновений в тандемной
масс-спектрометрии (МС-МС).
Самым типичным экспериментом
в МС-МС является полное
сканирование ионных продуктов. Ионы с
определенным значением m/z отбираются
в первом масс-спектрометре (МС1,
рис. 1)1. l.'i). Затем они попадают в
камеру столкновений (КС), обычно
наполненную гелием, аргоном или ксеноном.
Ионы активируются в результате
столкновений и фрагментируются. Ионные
продукты фрагментации
анализируются вторым масс-спектрометром (МС2),
который рассчитан на сканирование
определенного диапазона масс.
Поскольку для записи всего спектра требуется
всего лишь 1-2 мин, можно настроить
МС1 на регистрацию следующего иона
предшественника и получить его спектр
столкновений и т. д.
Существуют два типа таких
инструментов. Первый представляет собой
два масс-спектрометра, работающих в
тандеме. Часто используются
комбинации двух квадрунолей для масс-анали-
за или двух магнитных анализаторов,
либо комбинации из одного
магнитного и одного квадрупольного
спектрометра. С этой точки зрения связка
магнитного и электрического секторов
может рассматриваться как тандемная
масс-спектрометрия (МС с двойной
фокусировкой).
Инструменты второго типа
состоят из анализатора, который способен

хранить ионы: масс-спектрометры
с ионно-циклотронным резонансом и
квадрупольной ионной ловушкой. Эти
устройства позволяют отбирать
определенные ионы, выбрасывая из
ловушки все остальные. Далее происходит
возбуждение отобранных ионов и их
фрагментация в течение
определенного времени, после чего фрагменты
ионов можно наблюдать в масс-спектре.
Этот процесс может быть повторен,
чтобы проанализировать фрагменты
фрагментов.
Альтернативный подход
заключается в использовании тройной
квадрупольной схемы (рис. Ы.11 и
параграф Б 1.5.2), которая, несмотря на
низкую чувствительность и узкий
диапазон масс, является гораздо более
дешевой. Первый квадруполь QI
используется в качестве
масс-спектрометра, отобранный пик вводится в
камеру столкновений (КС), а продукты
деструкции анализируются во втором
квадруполе QIT.
В заключение упомянем
«гибридные» инструменты, называемые так
потому, что в них сочетаются магнитные
сектора, квадруиоли и
время-пролетные инструменты в линейной и
ортогональной проекциях.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Разрешение
и точность определения
массы
Разрешение определения массы
Способность к разделению масс
определяется разрешающей способностью
масс-спектрометра. Разрешение R здесь
определяется как R = т/Ат, где Am —
разность масс двух соседних пиков т и
т + Am с равной интенсивностью и
перекрыванием сигналов в 10%.
Разрешение, равное 100000, позволяет отличить
ион с массой 100000 Да от иона с
массой 100001 Да, т. е. с точностью одной
стотысячной.
D
q (камера столкновений)
-Vdc + VrfCOS cot
+Vdc + VrfCOs cot
Рис. Б1.11. Схема тройной квадрупольной системы. QI и QII — первая и вторая квадрупольные
системы. Третий квадруполь q используется в качестве камеры столкновений (коллизионная
ячейка). S — источник; D — детектор; rf — радиочастота. Такая конфигурация имеет название
Q,qQ2 (Gordon, 2000)

Поскольку пики в масс-спектрах
имеют вполне определенную ширину и
форму, необходимо определить степень
перекрывания двух соседних пиков для
оценки разрешения. Существуют два
общепринятых способа определения
перекрывания, и необходимо знать,
какой из них используется, когда
ссылаются на разрешение в реальном
масс-спектре (рис. Л). Первый — это
так называемый критерий 10%-ного
перекрывания, когда каждый из двух
смежных пиков вносит 5%-ный вклад
в область перекрывания. Второй — это
критерий «полуширины на половине
максимума». Разрешение в этом
случае равно массе пика в Да, деленной на
ширину в Да, измеренную на половине
высоты пика.
Полезно запомнить, что величина
разрешения, определенная с помощью
критерия полуширины на половине
максимума, примерно в два раза
больше величины, полученной при
использовании критерия 10%-ного
перекрывания. Разрешение, равное 1000 при
использовании критерия
полуширины на половине максимума, примерно
равно 2000. Надо отметить, что
обнаружение изотопов в протежированном
спектре возможно лишь при очень
высоком разрешении с использованием
ИЦР-ФП масс-спектрометров
(параграф Б 1.6.6).
Точность измерения массы
Точность измерения массы
определяется как разность между измеренной и
расчетной массами иона. Она
выражается в процентах от измеренной
массы (например, молекулярная масса =
= 10000 ± 0,01 %) или в долях на
миллион (например, молекулярная
масса = 10000 ± 100 миллионных долей).
По мере увеличения массы абсолютная
ошибка в процентах или в миллионных
долях также будет пропорционально
увеличиваться.
Обычно для точного измерения
массы не требуется максимального
разрешения, при условии, что
наблюдаемый сигнал при данной массе связан
только с одним типом молекул.
Основным фактором, ограничивающим эту
точность для больших биологических
макромолекул, является перекрывание
пиков. При использовании ИЛДМ
получаются следующие пики: [М + Н]\
[М + Na]" и [М + матрица]*. Однако
в подходящих условиях, когда ионы
образца полностью отделены от фоновых
ионов, измерения, сравнимые по
точности, могут быть сделаны и при более
низком разрешении
Моноизотопная масса
В большинстве химических
элементов присутствуют природные изотопы,
каждый из которых обладает
уникальной массой и природным уровнем
обогащения. Моноизотопная масса — это
масса наилегчайшего стабильного
изотопа элемента. Например, сущест-
т т+1
Рис. А. Два определения разрешающей
способности в масс-спектрометрии (подробности
см. в тексте) (Carrand Burlingame, 1996)

вуют два основных изотопа углерода:
|2С и 13С, с массами 12 000 000
(моноизотопная) и 13003355 и природным
содержанием каждого 98,9% и 1,1%,
соответственно. Аналогично есть два
природных изотопа азота
4N и 15N, с
массами 14 003074 (моноизотопная) и
15 000 109 и их соотношением 99,6% и
0,4 %, соответственно. Моноизотопный
пик означает, что все атомы углерода
в молекуле являются атомами 12С, все
атомы азота — 14N, все атомы
кислорода — ,60 и т. д. Моноизотопная масса
молекулы, следовательно, получается
сложением моноизотопных масс всех
ее элементов.
Измеренная масса
Когда измерения проводятся набольших
статистических ансамблях молекул, то
они, как правило, содержат не только
наилегчайшие изотопы элементов, но
также один или более атомов тяжелых
изотопов. Вклад пиков тяжелых изотопов в
молекулярный ионный кластер зависит
от суммы значений содержание-вес для
каждого элемента. Теоретическая
вероятность появления кластеров этих
изотопов может быть точно вычислена с
помощью следующего выражения:
(а + Ь)'".
(Л)
Разрешение = 25 000
Максимальная масса = 2530,91
Средняя масса = 2531,67
Моноизотопная масса
2624 2525 2528 2527 2526 2529 2530 2531 2532 2533 2534 2535 2535 2537 2535 2539
Рис. Ь. Кластер молекулярных ионов дляокисленнойр-цепиинсулина(формулаС,)7Н1-|Ы2-04(.8)),
показанный с различным разрешением. Асимметрия кластера становится менее очевидной по
мере уменьшения разрешения, при этом масса наибольшего пика и средняя масса становятся
практически идентичными (Carrand Burlingame, 1996)

где а — это процентное естественное
содержание легкого изотопа, b — процент-
нос естественное содержание тяжелого
изотопа, am — число атомов элемента
в молекуле. Вычисления показывают,
что для небольших молекул, таких как
w-бутан (С^Н,,,), существует некоторая
вероятность (-4 %), что одна молекула
природного «-бутана будет содержать
атом 13С. Вероятность нахождения двух
или трех таких атомов в одной
молекуле пренебрежительно мала. Для
биологических макромолекул, состоящих
пз нескольких сотен атомов углерода
и азота, распределение изотопов
становится крайне сложным, однако может
быть рассчитано с помощью
коммерческих программ.
Средняя масса
Средняя химическая масса
элемента — это просто сумма масс всех его
стабильных изотопов с учетом содержания
(например, 98,9% для 12С и 1,1% для
13С дадут среднюю массу 12,011 для
углерода). Таким образом, средняя масса
молекулы равна сумме средних
химических масс ее элементов.
Соотношения моноизотопной,
средней массы и массы наибольшего пика
показаны на рисунках 1> и В для белков
с массами 2500 и 25000. Важным
следствием вклада пиков тяжелого изотопа
является то, что для пептидов с массой
больше чем 2000 Да, пик,
соответствующий моноизотопной массе, более не
Разрешение = 25000
Максимальная масса = 25579.04
Средняя масса = 25579.58
25610 25615
I'ik . И, Молекулярный ионный кластер белка вируса иммунодиффнцита человека HIV-p24
(формула Cu.„JH|(t(1.,N.|||.Sll), показанный с различным разрешением. Положение моноизотопной
массы обозначено стрелкой (Carrand Burlingamc, 1996)

является преобладающим в изотопном малым (см. рис. И). Использование
кластере (см. рис. В). той или иной массы для характеристп-
С повышением молекулярной мае- ки образца зависит от массы вещества
сы самый большой пик сдвигается и разрешающей силы масс-спсктро-
по отношению к пику моноизотоп- метра. Отметим, что при очень высо-
ной массы. При значениях масс выше ком разрешении становятся впдпмы-
8000 Да вклад моноизотопной массы в ми сателлптные пики (см. параграф
спектр становится пренебрежительно Б2.2.1).
51.6, Перечень ключевых идей
0 Масс-спектрометр не измеряет абсолютную массу. Инструмент должен быть
калиброван с помощью стандартных веществ, чьи значения массы известны
с большой точностью.
* Техника ионизации с электрораспылением (ИЭР) позволяет получать интакт-
ные ионы из образца в растворе при атмосферном давлении путем распыления
очень разбавленного раствора из тонкой иглы в градиенте электростатического
поля с напряжением в несколько кВ.
' Уникальным свойством процесса ИЭР является образование молекул с
множественным зарядом. ИЭР — наиболее мягкий метод ионизации, не
приводящий к фрагментации молекул.
d Техника ионизации лазерной десорбцией в матрице (ИЛДМ) дает возможность
получать интактные ионы из образца, смешанного со специальным материалом
матрицы, который поглощает лазерное излучение.
Литература для дальнейшего чтения
Исторический обзор
Griffiths I. W. J. J. Thomson — the centenary of his discovery of the electron and his
invention of mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectr, 1997,11, 2-16.
Comisarow M. B. and Marshall A. G. The early development of Fourier transform ion
cyclotron resonance (FT-ICR) spectroscopy. J. Mass Spectr., 1996, 31, 581-585.
Методы ионизации
Smith D. R., Loo J. A., Loo R. R. 0., Busman M. and Udseth H. R. Principles and practice
of electrospray ionization — mass spectrometry for large polypeptides and proteins. Mass
Spectr. Rev., 1991.10, 359-451.
Muddiman D. C., Gusev A. I. and Hercules D. M. Application of secondary ion and
matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry for the
quantitative analysis of biological molecules. Mass Spectr. Rev., 1995.14,383-429.

Gordon D. В. Mass spectrometric techniques. In Principles and Techniques of
Practical Biochemistry, Ch. 11., ed. K. Wilson and J. Walker Cambridge University
Press, 2000.
Инструменты и передовые технологии
Caprioli R. M. and Suter M. J.-F. Mass Spectrometry, Ch.4. In Introduction to
Biophysical Methods for Protein and Nucleic Research, Ed. Academic Press.
Amster I.J. Fourier transform mass spectrometry. J. Mass Spectr., 1996. 31,
1325-1337.
Hofmann E. Tandem mass spectrometry: a primer. J. Mass Spectr., 1996, 31,
129-137.
Dienes Т., Pastor J. S., Schurch S., Scott J. R., YaoJ., Cui S. and Wilkins C. L. Fourier
transform mass spectrometry — advancing years (1992 — mid.1996). Mass Spectr. Rev.,
1996,15, 163-211.
Guilhaus M., Mlynski V. and Selbi D. Perfect timing: time-of-flight mass spectrometry.
Rapid Commun. Mass Spectr., 1997,11, 951-962.
Belov M. E., Gorshkov M. V., Udeseth H. R., Anderson G. A. and Smith R. D. Zeptomole-
sensititivity electrospray ionization — Fourier transform ion cyclotron resonance mass
spectrometry proteins. Anal. Chem., 2000. 72, 2271-2279.
Guilhaus M., Selby D. and Mlynski. Orthogonal acceleration time-of-flight mass
spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2000,19, 65-107.

ГЛАВА Б2
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
52. i. Структура и функция
белкое
Ионизация электрораспылением (ИЭР)
и ионизация лазерной десорбцией в
матрице (ИЛДМ) находят все большее
применение в масс-спектрометрии
белков. Эти два метода ионизации широко
используются для изучения процесса
сворачивания белков, картирования
их функций, описания нековалентных
белковых комплексов и многих других
приложений (комментарий Б2.1).
Б2.1.1. Определение массы
Благодаря методам ИЭР и ИЛДМ
анализ масс-белков превратился в
рутинную процедуру. По ряду причин
пептиды и белки особенно подходят для
этих методов ионизации, которые были
впервые разработаны и
продемонстрированы на молекулах именно этого
типа. На рисунке Ь2.1 приведен участок
масс-спектра цитохрома с и миоглобина
лошади, полученных с помощью ИЭР-
ФП-масс-спектрометрии.
Концентрация образца составляла 0,4 нМ. Общее
; ',-.' ■ -,!:\.:i Ь2 I Масс-спектрометрия и рентгеновская кристаллография
До проведения рентгеноструктурных исследований полезно снять масс-спектр
образца. В самом деле, определение структуры белка с атомным разрешением требует
значительных затрат (см. Главу ЕЗ). Масс-спектрометрия позволяет осуществить быструю
проверку того, насколько точно была определена первичная структура белка, а также
определить чистоту препарата с высоким разрешением. Такая информация особенно
полезна для белков, полученных с помощью рекомбинантных техник, где существует большое
число источников ошибок, включая непредвиденные мутации, модификации, термина-
цию и протеолитическую деградацию. Простое измерение массы сберегает время и
является настолько информативным, что имеет смысл получать спектр масс почти каждого
белка перед применением рентгеновской кристаллографии. Это особенно важно для тех
из них, которые содержат особые аминокислотные остатки, например, селен-мстионин,
для рентгеновской кристаллографии, 13С и/или l5N для ЯМР и 2Н, для нейтронной
кристаллографии и малоуглового нейтронного рассеяния. В последнем случае доля
включения дейтерия в биологические макромолекулы, как правило, определяется с помощью
масс-спектрометрии.

[M+17H]'7+
[М+ 15H]i5+
990.3
992.47
I'll
Участки масс-спектра цитохрома с (а) и миоглобмна лошади (б), полученных с
помощью ПЭР-ИЦР-ФП-масс-спектро.метрии (Belov et al. 2000)
число исследованных молекул
равнялось 135 зсптомолей, что составляет
примерно 80000 молекул i -..>.\i\i■•-;.
;ui!i I >"J i.
Ha рисунке 1)2.2 приведен ИЛДМ-
масс-спектр [Arg8]-Ba3onpeccnHa с
высоким разрешением. Основной пик при
m/z =1084,446 — это «моноизотопный»
пик (см. Приложение Б1) мнтактного
протонированного пептида. Три
больших пика, каждый из которых
отличается от соседнего на 1 Да, соответствуют
природным редким изотопам углерода,
присутствующим в молекуле в
количестве одного или нескольких, среди
которых наибольший вклад вносит 13С
с содержанием 1,108%.
Пример вычисления молекулярной
массы белка из его масс-спектра дан
в Приложении 1 этой главы.
!\;>;.;кп.ч iwipin: o_
к зептомолям
От наномолей
Напоминаем доли молей веществ,
которые используются в сегодняшней масс-
спектроскопии
10 !' нано п
10 12 нико р
10 '' фе.мто f
jq is аттоа
10" 21 3CIITOZ.

100 -i
1084.4
50-
1085.4
1086.4
P,
1083
1084
100-1
0
i 50-
о
X
1-
O
О-1
1087.4
_JL_
I I I I 1 1
1085
i i i i | i i i i | i
1086
m/z
1084.4
ii,,,
1087
11 '' ' ' I '' ' ' I m
1088 1089
Am = 0.001 u
1084.39
1084.41
■■■■■■I
1084.43
I""!""!1
1084.45
1084.47
m/z
-"не. Б2.2. ИЛДМ-масс-спектр [Arg8]-Ba3onpeccnHa, полученные с высоким разрешением:
а — узкие полосы в диапазоне m/z от 1080 до 1090 и б — одна из полос в растянутом диапазоне,
с тем чтобы продемонстрировать разрешение (1/100000) (Li et al., 1994)
Б2.1.2. Нековалентные комплексы
Нековалентные взаимодействия,
высокоспецифичные в биологических
макромолекулах, представляют
фундаментальный интерес для исследования
структурно-функциональных
отношений. Физиологически активные формы
многих белков являются мультимера-
ми, где активный центр часто
располагается в области контакта субъединиц.
Сила нековалентных взаимодействий
обычно обусловлена множеством
сравнительно слабых связей и может
широко варьировать. Она выражается
константой диссоциации (KD), которая
зависит от растворителя. Очевидно, что
для детектирования слабосвязанных и
чувствительных к температуре
комплексов необходимы самые мягкие
условия, которые можно достичь только
с помощью ИЭР ( комментарии Г>2..'5).
В настоящее время для нескольких
нековалентных комплексов показано,

что они остаются пптактнымп в ИЭР-
МС экспериментах. К ним относятся
металлы, гемовые группы п пептиды,
связанные с белком, а также мультимерные
белковые комплексы, олигонуклеотиды,
комплексы фермент-субстрат, рецеитор-
лигаид и большие комплексы РНК-
белок.
Одной из наиболее впечатляющих
иллюстраций ИЭР-МС стало
наблюдение очень прочных комплексов
между белками и другими молекулами.
ИЭР-спектр человеческого цитонлаз-
матического рецептора (FKBP)
демонстрирует наличие (М + 7Н)7' иона
при m/z =1688.7 (рис. 1)2.3 а). После
добавления лекарства — иммуносупрессо-
ра (М = 804 Да) появляется новый пик
при m/z = 1803.1, соответствующий
комплексу FKBP-FK506 (1:1) с зарядом Т
(рис. Ii2.3 о). Тот же эффект
наблюдается с рапамицином (М = 913 Да). В этом
случае появляется возможность
оценить отношение их констант
связывания из относительной величины пиков
при добавлении в смесь рапамицина в
соотношении 1:1 (рис. 1)2.3 и). Кроме
того, в обоих случаях детектировались
значительные количества свободного
FKBP в масс-спектрах. Используя эту
методологию, удалось наблюдать за
гидролизом reKca-N-ацетилглюкозами-
на лизоцимом куриного яйца.
Б2.1.3. Сворачивание и динамика
белков
Скорость, точность и высокая
чувствительность ИЭР и ИЛДМ
использовались в разработках различных
подходов к изучению процесса
сворачивания белков, их динамики и
функционального картирования,
основанных на масс-спектрометрпи. Во многих
случаях масс-спектрометрпя позволяла
i Комментарий Б2.3. Детектирование
, слабосвязанных комплексов
В большинстве случаен свойства раство-
I ра, необходимые для поддержания интак-
i тных комплексов, не являются
оптимальными для ИЭР. Поэтому для достижения
максимальной чувствительности при ана-
j лнзе нолипеитидов берут раствор с pi I 2-4
| для положительной и рН 8-10 для
отрицательной ионизации. Многие белковые
. комплексы денатурируют в растворе со
; значениями рН, лежащими вне диапазона
. рН 6-8. То есть совершенно очевидно, что
растворы белков для ИЭР-МС должны
поддерживаться в условиях, близких к фи-
'. зиолошческим с нейтральным рН и при
соответствующий температуре, для того
чтобы белки оставались в состоянии, близ-
: ком к нативному. Однако для ИЭР-МС с
[ растворами белка, имеющими
нейтральный рН, требуются масс-спектрометры с
увеличенным диапазоном m/z по сравне-
: нию с инструментами для работы в тради-
: дпонных условиях.
До сих пор не совсем понятно, какие
из известных слабосвязанных комплек-
; сов, существующих в растворе, можно
наблюдать с помощью ИЭР-МС п какая
минимальная связывающая сила в этих
комплексах достаточна для этого.
Литературные данные дают право полагать, что
ИЭР-МС наблюдения таких
слабосвязанных систем в некоторой степени отражает
природу взаимодействии в
конденсированной фазе. Однако результаты ИЭР-МС
экспериментов показывают, что каждая
биомолекулярная система обладает
своими характерными экспериментальными
чертами, и опыт, полученный при иссле- '■
дованип одного белкового комплекса, не
; обязательно будет полезен при псследова-
| нии свойств другого.
получать данные о функциональных
свойствах белка в дополнение к тем,
что были получены с помощью
традиционных техник, таких как круговой
дихроизм, ядерный магнитный
резонанс и флуоресцентная спектроскопия.

IMiiirtimfc*^*—AtLW WnJ
m/z
a
IOCS
£ 73-
8 :
I !
(FKBP*fK»6.7H)
1Ю3.1
-. Ли
I9C0
m/z
в
Рис. 152.3: a — масс-спектр, полученный
с помощью ионизации электрораспылением
белка, связывающегося с человеческим ци-
топлазматическим рецептором (FKBP)
циклоспорина при рН 7,5. Молекулярная масса
FKBP равна 11 812 Да. Этот массив ионов,
несущих множественный заряд,
простирается от (М + 6Н) 6' до (М + 8Н) 8тдля FKBP;
б — ионизация распылением FKBP с
веществом FK506 (М = 804 Да); в — конкурентное
связывание FKBP с FK506 и рапамицином
(RM)(Ganemetal., 1991)
Кроме того, относительная быстрота
и легкость, с которыми ИЭР и ИЛДМ
могут быть использованы для
получения очень точной информации о
молекулярной массе очень ограниченного
количества исследуемого материала,
сделали возможным применение этих
методов там, где не так-то просто
добыть необходимые сведения с помощью
других методов.
Свернутые и развернутые состояния
В начале 1990-х гг. исследователи
пришли к заключению, что свернутые и
развернутые белки проявляют разнос
распределение зарядов в ИЭР-спектрах.
В спектрах нативных белков,
полученных электрораспыленнием из
растворов, это распределение обычно
наблюдается в достаточно узком диапазоне
и с низким суммарным зарядом, тогда
как белки, находившиеся до ионизации
в денатурирующих условиях, обладают
более широким распределением заряда
в спектре (рис. 1)2.4).
Считается, что разница в
распределении зарядов связана с доступностью
способных к ионизации групп. Вполне
возможно, что в развернутом состоянии
основные аминокислоты (остатки Apr,
Лиз, Гис) легче аккумулируют заряд
(см. рис. 152.4).
Свернутое состояние белка в
растворе можно наблюдать через
распределение зарядов во время ИЭР. Так, в
случае с разворачиванием цитохрома с
(М = 12 360 Да) при низком значении
рН наблюдаемые изменения
отчетливо указывают на высокую коопера-
тивность этого процесса (рис. 132.5 а).
И наоборот, разворачивание апо-миог-
лобина (М = 16951,5 Да), миоглобина,
потерявшего группу гема,
сопровождается постепенным сдвигом максимума

Свернутый белок
ЭСИ-МС
Развернутый белок
ЭСИ-МС
m/z
m/z
+ +
Рис. Г)2.1. Распределение зарядов в свернутом и развернутом белке при использовании ИЭР
(Winston and Fitzgerald, 1997)
о
5
s:
о
со
к
га
х
х
о
X
(D
(2)
(4)16*
1_J L
О)
■llll ь . 1 Л
Ш1и > 1
рНв.5
A It
в* рН3.2
рН2.7
рН2.в
(5)16*
JL
рН2-0
1200
—1
1900
m/z
а б
Рис. Ь2.Гг. а - ИЭР масс-спектры цитохрома с, записанные при различных рН: (1) рН 8,5, (2) рН
3,2, (3)рП 2,7, (4)рН 2,6 и (5) рН 2,0. Величина рН регулировалась добавлением гндроксида
аммония и/или уксусной кислоты; 6— ИЭР-масс-снектры апо-миоглобина, записанные при различных
рН: (1) рН 8,5,(2) рЫ В2Д (3) рН В2Д (4) рН 2,9 и (5) рН 2,5. Величина рН регулировалась
описанным выше способом (Konermann and Douglas, 1998)

600 800 1000
1200 1400 1600
m/z
1800 2000
Рис. Б2.6. Иллюстрация ИЭР-МС
разрешенной во времени денатурации миоглобнна в
кис.:ых условиях. hMbll — свернутый
комплекс, ЬМЬ20 — частично развернутый интерме-
диат гем-миоглобина, Amb20 — развернутый
миоглобин. Затухание интенсивности пика,
принадлежащего интермедиату, происходило
примерно за 0,4 сек, что хорошо коррелирует
со временем жизни, определенным в растворе
(Konerman and Douglas, 1998)
наблюдаемого распределения зарядов
(рис. Б2.5 б). Эти результаты
свидетельствуют, что ИЭР-МС можно
рассматривать как общий метод для
оценки кооперативности переходов белка
в свернутое состояние.
Интересно, что с помощью ИЭР-МС
удалось наблюдать процесс,
напоминающий сворачивание и разворачивание
цитохрома с в вакууме, что заставляет
поднять вопрос о роли воды в
сворачивании белков.
Интермедиаты процесса
сворачивания белка
Тот факт, что распределение зарядов
зависит от укладки белка, дал
исследователям основание предложить
новый подход для изучения процесса
сворачивания, использующий ИЭР-
МС с разрешением во времени. Метод
применялся для наблюдения
процессов сворачивания цитохрома с и
миоглобнна с временным разрешением
0,1 сек. Конформационные
интермедиаты между свернутым и
развернутым состояниями в случае цитохрома
с обнаружены не были. Напротив,
эксперимент с миоглобпном показал
присутствие интермедиатов во время
денатурации в кислых условиях (рис. 152.6).
Результаты этих опытов дают только
качественную информацию.
Извлечение количественной информации из
ИЭР-масс-спектров стало возможным
после разработки процедуры деконво-
люции распределения зарядов. Ниже
мы кратко ее опишем.
ИЭР-масс-спектр любого белка
можно представить линейной
комбинацией различных распределений зарядов,
называемых «базисными функциями»,
которые могут быть
аппроксимированы с помощью гауссова распределения.
Изменения интенсивности
выражаются через средневзвешенные
коэффициенты, которые учитывают
относительный вклад в суммарное распределение
зарядов. Таким образом, наблюдаемый
ИЭР-масс-спектр можно рассматривать
как сумму вкладов каждой из белковых
конформаций (конформеров).
Рисунок 152.7 отображает ИЭР-масс-спект-
ры холо-миоглобина (/zMb) и апо-миог-

• +9
.
*—
.+8
■ , , ■
, t ,
a
• +9
:
:
«—
• +8
L
б
, Л. , -Ли
»5 .+9
+ П
D-"D +9
D D
•+S
+s
. Jill 11,,, M» kK~ ,t L
И5
+9
+8
LI
4U1
i+S
(-J5
-«-S
(-Г5
+9
+8
L_L
k75
+9
+S
LU
ж
3+2>n||
n+15
—I ■ \ K- , lb».
(■Г5
J_L
1,1.,
•"llC.
1000 1500 2000 2500 rtl/Z 100° 1500 200° 2500 m/Z
• 2.7. ИЭР-масс-спектры положительных ионов холо-миоглобина (/n\lb) (а-д)
и апо-миоглобина (яМЬ) (е-к), полученные при рН 7,4 (а, е), 4,5 (б, ж-), 4,0 (в, .?), 3,5 (г,
г/) и 2,5 (д, к). Пики интактного иона /zMb обозначены сплошными квадратиками (Dobo and
Kaltashov, 2001)
лобина (аМЬ) в большом диапазоне рН
2,5-8,6.
При рН 4,5 и выше спектры /zMb
проявляют распределение зарядов в
очень узком диапазоне. Спектр
содержит только два пика зарядовых
состояний: +8 и +9. Понижение рН раствора
до значения 4 приводит к масштабным
конформационым изменениям,
заключающимся в появлении сильно прото-
нированных (с низким значением m/z)
ионов белка и частичной диссоциации
гемовой группы (line. 152.7 в).
Дальнейшее понижение рН до 2,5 приводит
к повышению среднего заряда ионов
белка и исчезновению ионов комплекса
гемм-белок.
В отличие от /zMb, спектр я Mb
имеет мультимодальный характер даже
при нейтральных рН (рис 152.8 с).
В дополнение к ионам с зарядами +9
и +8 в спектре заметно наличие пиков
других ионов с зарядами от +10 до +23
(рис. 152.7).

&S 120-
л
X
5 вон
X
0)
|
BODE
«
* «-
X
О о-
1 б
■
Л /Ч,л1 л
Щг/ \ ( Л
Я 1 ^\
Д/^ийЙЬ^ч _—--'"'~^~~^!Ь>т-_
-Г- 120-
5?
Л
В 100-
вно
я *•
X
f «.J
s
ОС
га
£ 20-
о
о
X
О и
О' х -
а^*££-——~.-^
/\
\
V.
в
Число заряженных состояний (п)
120-
100-
80-
604
40-
20-
V
-_=-
&'
^
А
/
\.
9*h
е
Число заряженных состояний (п)
Рис. b2.cS. График кривых аппроксимации распределения зарядов положительно заряженных
ионов в ИЭР- масс-спектре /гМЬ (а-в) и аМЬ (г-е), полученных при рН 7,4 (а, г), 4,0 (б, д) и 2,5
(в, е). Экспериментальные точки показаны квадратиками (■ для интактных ионов /гМЬ и □ для
ионов аМЬ). Гауссовы кривые представляют средневзвешенные базисные функции,
использованные для анализа кривой (зачернены для /гМЬ). Толстыми сплошными линиями обозначены
суммы средневзвешенных базисных функций (Dobo and Kaltashov, 2001)
При рН 2,5 спектр аМЬ неотличим
от /гМЬ, что полностью согласуется с
ожиданиями, основанными на том, что
любые взаимодействия между гемовой
группой и дестабилизированным
кислотой белком будут минимальны.
Результаты аппроксимации
некоторых распределений зарядов с
использованием базисных функций показаны
на рисунке Н2.8. Только одна базисная
функция использовалась для
аппроксимации спектра /zMb при рН 4,5 и выше,
тогда как для анализа данных,
полученных в диапазоне рН от 4,5 до 3,5,
необходимы три такие функции.
Наконец, чтобы проанализировать данные,
полученные при низких значениях рН
для /zMb и аМЬ, придется добавить
четвертую базисную функцию. Эти четыре
основные функции приписывают че-

тырем различным копформационным
состояниям белка (в порядке его
разворачивания): нативному (N), так
называемому «рН 4-интермедиату» (/),
растянутой конформации (Е) и развернутому
состоянию (£/). Все характерные черты
спектра ИЭР, интерпретируемые как
линейная комбинация ионных вкладов
N, I, Е и U, полностью согласуются с
картиной разворачивания в кислых
условиях, полученной с помощью многих
других экспериментальных методов.
Эти эксперименты являются
прекрасной иллюстрацией возможностей
ИЭР-масс-снектрометрии для
наблюдения за интермедиатами сворачивания.
Б2.1.4. Секвенирование белков
Отсутствие фрагментации белков при
мягкой ионизации очень полезно для
точного определения молекулярной
массы, но не дает структурной
информации, что является ее большим
недостатком. Сначала эту проблему решали
с помощью техники ББА, которая, к
сожалению, применима для
исследования относительно коротких пептидов и
требует большого количества образца
(2-50 нМ).
Наиболее подходящей техникой
для секвенирования белков оказалась
тандемная масс-спектрометрия
(параграф Б2.6.7). С помощью МС-МС
можно определять не только все 20
основных аминокислот, по и
неизвестные модифицированные аминокислоты
в соответствии с их массой. МС-МС
характеризуется высокой скоростью,
чувствительностью и позволяет
напрямую анализировать смеси пептидов.
Был разработан ряд масс-спектро-
метрических подходов для
секвенирования больших пептидов и белков.
К ним относятся: тандемные МС под-
Ком; и :i:,>;uim :''.' •' Деградация по
Эдману
В 1950 г. П. Эдман предложил
химический метод для последовательного
отщепления аминокислотных остатков от
N-копца полипептида или белка. Серия
химических реакций, известных как
деградация по Эдману, до сих пор остается
наиболее эффективной техникой
секвенирования полипептидов. Для ее
применения необходимо наличие свободной
аминогруппы naN-конце. Пептиды, чья концевая
аминогруппа блокирована (например фор-
милпрована, или ацилирована), должны
быть расщеплены энзиматически, либо
химически. Деградация по Эдману
проводится в автоматическом анализаторе. Сегодня
для определения аминокислотной
последовательности требуется совсем немного
белка — от 10 до 100 нг.
ходы, комбинируемые с энзиматиче-
ской и химической деградацией для
образования олигопептидов (<3 кДа) на
первом этапе и с масс-спектрометрией
полученного продукта на втором или
использование ИЭР-ФП-МС в
качестве первого этапа деградации в
комбинации классической деградации по
Эдману (kiiMMni .www 1>" . i с тандемной
масс-спектроскопией.
Вычисление аминокислотной
последовательности белка
Для получения структурной
информации с помощью масс-спектрометрии
изучаемая молекула должна
претерпеть фрагментацию одной или более
связей с образованием ионов.
Полученные в результате этого пептиды
обладают следующими характеристиками:
их линейный скелет образован только
повторяющимися связями а-амино-
кпелота-амид, и замещающие группы
каждого а-углерода представляют со-

Таблица Б2.1. Массы аминокислотных остатков [-NH-CHR-CO-]
Аминокислота
Глицин
Алании
Серии
Пролин
Валин
Треонин
Цистеин
Изолейцин
Лейцин
Аспарагин
Аспарагиновая кислота
Глютамин
Лизин
Гл ютам и но вал кислота
Метионин
Гистидин
Фенилаланин
Аргинин
Тирозин
Триптофан
Буквенный код
трех
Gly
Ala
Ser
Pro
Val
Thr
Cys
He
Leu
Asn
Asp
Gin
Lys
Glu
Met
His
Phe
Arg
Tyr
Trp
одно
G
A
S
P
V
T
с
1
L
N
D
Q
к
E
M
H
F
R
Y
W
Масса (Да)
57
71
87
97
99
101
103
ИЗ
113
114
115
128
128
129
131
137
147
156
163
186
бой 20 естественных аминокислот. При
использовании методов «мягкой»
ионизации образуются одно- или поли-
протонированные молекулярные ионы,
у которых недостаточно энергии для
фрагментации. Однако фрагментация
достижима, если воспользоваться
специальной камерой столкновений в тан-
демной масс-спектрометрии (параграф
Б 1.5.7) или прибегнуть к
бомбардировке образца быстрыми атомами Аг или
Ne (параграф Б1.4.4).
Несмотря на то что фрагментация
может происходить по-разному,
существуют зоны предпочтительного
расщепления пептидной связи.
Единовременная потеря одного аминокислотного
остатка сопровождается образованием
пиков в спектре, которые отличаются
друг от друга на массу одной
аминокислоты минус Н,,0 (так называемая масса
остатка — табл. Г>2.1). Это различие в
массе каждых последующих пиков
является точным отражением первичной
структуры пептида.
Фрагментация идеального
пептида представлена на рисунке 152.9.
Расщепление связей в точках, указанных
на рисунке, приводит к образованию
фрагментов с массами а , b и с , если за-
ряд остается на N-концевом фрагменте.
Исключение составляет ион с , к массе
п
которого нужно добавить два Дальтона,
поскольку он сохраняет исходный
протон и присоединяет еще один с другой
стороны пептидной связи.

хэ Уз z3 x2 y2 z2 x, y, z.
+2H
H2N-CH+C+NH-
+2H
a, b, c.
+2H
CH+C+NH-
+2H
a2 b2 c2
CH
+2H
--NH-
CH-C02H
+2H
a3 b3 c3
'lie. 1)2.Я. Фрагментации идеально протежированного пептида (Biemann, 1992)
Попы .ги, уп и гп образуются, когда
заряд остается на С-конце с двумя
атомами водорода, добавленными к иону
и , аналогично случаю с ионом с . Имея
одну последовательность ионных
фрагментов, мы можем рассчитать
аминокислотную последовательность пептида,
за исключением лейцина и изолейцина,
а также лизина и глутамина, которые
нельзя отличить таким образом. Обычно
получается не одна серия ионов, а набор
перекрывающихся N- и С-терминальных
ионов, они и используются для
определения полной последовательности.
Процесс фрагментации
протежированных пептидов в настоящее время
настолько понятен и воспроизводим, что
был выработан набор следующих
эмпирических правил.
1) Пик с наибольшей массой
в ББА-спектре представляет (М + Н)'.
2) Разность масс (Д) между
последовательными ионами отражает массу
аминокислотного остатка (ао).
3) Сумма всех аминокислотных
остатков должна давать полную
молекулярную массу.
Ниже показано приложение этих
правил в случае с ББА-МС пептида со
значениями т/г, равными 128; 185; 299;
396 и 528.
Самый большой пик в ББА-спектре
имеет т/г = 528, отсюда М = 527. С
помощью набора т/г данных можно
получить пептидную последовательность
следующим образом:
т/г 128 185 299 396 527
Д57 114 97 131
ао Gly Asn Pro Met.
Ион с наименьшей массой т/г = 128
является лизином (Lys), отсюда
последовательность пептида с N-конца будет
следующая:
Met-Pro-Asn-Gly-Lys.
Совокупная масса аминокислотных
остатков равна 527 Да, что соответствует
масс-спектрометрическому значению М.
Б2.1.5. Идентификация белков
в двумерном электрофорезе
Двумерный гель-электрофорез (2-ГЭФ)
дает возможность разделять белки в
соответствии с их химической структурой.
В 1970-х гг. идентификация белков в геле
проводилась на основе коэлектрофореза
известных очищенных белков или при
помощи иммунного окрашивания
(связывания белков на электрофореграм-
ме с антителами и последующее
специфическое окрашивание комплекса).
Позднее 2-ГЭФ был усовершенствован

Изолированный
пептид
••ООООООООФ
ь> ь,
Его фрагменты
ОФ + Ой' + М.
База данных
141.10 5
169.102
175.112
240.137
288.205
935.471
141.10 5 а,
169.102 Ь2
175.11 2 у,
240.137 Ьэ
288.205 у2
935.471 М,
[А,Р]
[А,Р]
R
[А,Р] А
IR
Рис. 152.10. Принцип «концевого секвенирования». Очищенные пептиды фрагментируются.
Массы легких ионных фрагментов, таких как у,, у2, Ь2и Ь3, плюс точно определенная масса ин-
тактного пептида, используются для «концевого секвенирования». Положение фрагментов и
молекулярная масса позволяют идентифицировать пептид в базе данных (Nielsen et al., 2002)
до такого уровня, что позволяло
разрешать до 10000 белковых пятен на одном
геле благодаря окрашиванию серебром
и увеличению размера геля (см. Главу
Г5). Разделенные таким способом пятна
идентифицировались при помощью
«молекулярной дактилоскопии» на уровне
фемтомолей посредством ИЛДМ-ВП-
масс-спектрометрии или ИЭР-тандем-
ной масс-спектрометрии.
Высокая чувствительность и
пропускная способность системы,
основанной на ортогональной ИЛДМ
тандемной масс-спектрометрии
(параграф Б1.5.7), обеспечивает
автоматическое распознавание фрагментов,
соответствующих N- и С-концевым
аминокислотным остаткам.
Импульсный характер работы инструментов
позволяет улучшить разрешение в
области низких значений масс
примерно на порядок. Эта область в спектре
очень легко интерпретируется, когда
наблюдаемый легкий фрагмент
состоит из всего несколько аминокислот.
Как правило, можно определить
сумму масс второго N-концевого иона (Ь.,
ион), третьего N-концевого иона (Ь.,
ион) и двух С-концевых фрагментов
пептида (у, и у2). Учитывая точность
определения массы в нижнем
диапазоне, достаточно концевого
секвенирования одного или двух трипти-
ческих пептидов для идентификации
белка в образце геля из области,
слабо окрашенной серебром (несколько
нанограммов белка на полосу).
Рисунок 152.10 иллюстрирует принцип
«концевого секвенирования».
Рисунок 152.1 1 позволяет судить об
анализе окрашенных серебром и
вырезанных из двумерного геля фрагментов
с помощью ортогональной
время-пролетной МС. Изучение масс-спектра пят-

100%!
Ji
kit
1000
к
ттшФяЛ^
AaLw
iilouk.
Л"- ■ '
m/z
^ OS,
;._..!. -..A.LJk
Ll^lJL^J
I'lic. I>2.ll. Анализ окрашенного серебром фрагмента, вырезанного из двумерного геля,
с помощью о-ИЛДМ: а — увеличенная область геля. Вырезанное пятно отмечено стрелкой;
б — масс-спектр пептидов, полученных из пятна; в — тандемный масс-спектр области низких
значений масс наиболее интенсивного иона-предшественника с m/z =1298,762. Расчетные трип-
тические массы пептидов этого белка отмечены звездочкой (Nielsen et al., 2002)
на из геля (см. рис. Ь2.11 6) показывает,
что полученная пептидная карта не
позволяет найти соответствие в базе
белковых данных. Поэтому был выделен
ион-предшественник с т/г = =1298,762
и получен его тандемный масс-спектр
(см. рис. 1)2.1 1 в). Комбинация N- и С-
концевого секвенирования позволила
однозначно идентифицировать пептид
как VHLVGIDIFTGK (Val-His-Leu-
Val-Gly-Ile-Asp-Leu-Phe-Thr-Gly-Lys),
а белок — как 5А эукариотический
фактор инициации трансляции.
Б2.2. Функциональная
протеомика
В отличие от генома, протеом крайне
динамичен и сильно зависит не только

&
&
Sfr
Клетка или образец ткани
Экстракт клеточных белков
Л
Расщепление трипсина
Пептиды
Заряд
Расщепление трипсина
Пептиды
Жидкостной
хромотограф
Масс-спектрометр
Рис. 152.12. Две стратегии в анализе протеома образцов клеток и тканей: слева — двумерный
гель. Белки разделяются и визуализируются с помощью гель-электрофореза. Индивидуальные
белки выделяются из геля, фрагментируются трипсином и анализируются масс-спектрометри-
чески; справа — жидкостная хроматография. Вся белковая смесь обрабатывается трипсином,
разделяется с помощью жидкостной хроматографии и анализируется масс-спектрометрическн
(Godovach-Zimmermann and Brown, 2001)
от типа клетки, но и от ее состояния.
Протеом определяется как совокупное
множество клеточных белков,
представляющих экспрессию генома с
посттрансляционными модификациями. В эру
постгеномного секвенирования одной
из принципиальных задач науки о
жизни является понимание живых систем
на геномном и протеомном уровнях.
Б2.2.1. Роль масс-спектрометрии
В отличие от геномики, где вклад
масс-спектрометрии был достаточно
ограничен, ее роль в изучении протеома
является поистине ключевой. Обычно
используют две основные стратегии для
высокопроизводительного анализа
протеома (рис. Б2.12). В первой (на
рисунке слева) двумерный гель-электрофорез
служит для разделения и
количественного анализа белков. Идентификация
пятен в геле чаще всего производится
через их вырезание, фрагмснтированис
белка трипсином, экстракцию
пептидов и анализ фрагментов с помощью
ИЛДМ-ВП и/или ИЭР-масс-спектро-
метрии.
Во второй стратегии (на рисунке
справа) фрагменты из белковой смеси,
обработанной трипсином, разделяются
путем жидкостной хроматографии,
после чего пептиды напрямую попадают
в масс-спектрометр.

Недостаток использования
двумерных гелей заключается в том, что
данный метод предполагает
денатурацию белка с сопутствующим
разрушением белок-белковых
взаимодействий. Более тщательное исследование
белков, обычно идентифицируемых
в протеомных исследованиях,
показывает, что комбинацию двумерного
геля и масс-сиектрометрии нельзя в
действительности назвать
всеобъемлющей техникой. Некоторые классы
белков — например, очень кислые или
основные, а также чересчур большие
или слишком маленькие, отсутствуют
в геле, а белки с низким
относительным содержанием в клетке вообще не
детектируются.
Новая стратегия визуализации и
анализа протеома с помощью масс-спектро-
метрии была разработана в начале этого
века. Она основана на масс-спектромет-
рическом анализе поверхностей гелей,
полученных в результате изоэлектри-
ческого фокусирования, и называется
«виртуальным двумерным гелем».
Такой подход, когда вместо разделения
белков в геле по размеру, используется
масс-спектрометрия, обладает
преимуществом в разрешении и точности по
сравнению с классическим двумерным
гель-ЭФ, и, кроме того, он может быть
легко автоматизирован.
Классический двумерный
электрофорез в полиакриламидном геле
(ПААГ) включает в себя изоэлектри-
ческое фокусирование (ИЭФ) в первом
направлении и разделение в
соответствии с размером молекул в
присутствии додецил сульфата натрия во
втором направлении (Глава Г5).
Аналогичным образом в методе
сканирования поверхности геля,
основанного на масс-спектрометрии, белки
десорбируются непосредственно из
ИЭФ-геля. При этом аналитические
данные представляются в виде
картинки, похожей на ту, что получается
в результате окрашивания
двумерного геля. Рисунок 152.13
демонстрирует детектирование белков с помощью
сканирования поверхности ИЭФ-геля
клеточного лизата Е. coli и ИЛДМ-
масс-спектр, соответствующий
указанным позициям.
В соответствии с особенностью
двумерного геля, когда при каждом
значении рН наблюдаются белки во всем
массовом диапазоне, в масс-спектре
на рисунке 132.13 6 можно увидеть 33
белка. Белки с маленькой массой,
которые необходимы для экспрессии
небольших открытых рамок считывания
или процессинга, очень часто теряются
при разгонке во втором направлении в
классическом двумерном геле, но легко
детектируются с помощью масс-спект-
рометрического сканирования
поверхности ИЭФ-геля. Из рисунка 152.1.3 <)
и с, где разрешаются белки с массами
82.1 и 84.6 кДа, а также восемь белков
от 30 до 50 кДа, становится совершенно
очевидным превосходство данного
метода в разрешении и точности по
сравнению с СДС-ПААГ. Метод позволяет
анализировать белки с массой свыше
100 кДа, а также маленькие
полипептиды (<8 кДа), которые очень часто
теряются при разгонке во втором
направлении в СДС геле, если не
созданы специальные электрофоретические
условия.
Технологии сочетания двумерного
геля и масс-спектрометрии в
настоящее время стали движущей силой про-
теомики и, скорее всего, останутся ею
в ближайшем будущем. Однако,
когда-нибудь новые подходы, основанные
на применении антител и белковых
чинов, смогут бросить им вызов.

и н—I 1 1 1— j ■ T—, .--
1—I—I—I— I ]---f-
10 000 25 000 40 000
100 000
1 i I I I T Г
10 000 30000 50 000 70 000 90 000
Молекулярная масса (Да)
10 000 30 000 50 000 70 000 90 000
Молекулярная масса (Да)
Рис. Б2.1 'А. Окрашенный ИЭФ-гель клеточного лизата Е. coli (центр) и ИЛДМ масс-спектр,
полученный непосредственно из неокрашенного высушенного геля-дубликата, соответствующий
указанным позициям: а-е — ионы, несущие один и два заряда, наблюдаемые в различных
позициях (pi) геля-дубликата. По оси Y отложена относительная интенсивность полос ионов. Ось X
отображает молекулярную массу. Масс-спектры получены в следующих положениях: (а) 3 мм от
основной кромки геля (pi 6.6); 6—15 мм (pi 6.4); в — 22 мм (pi 6.3); г — 30 мм (pi 6.2); д — 55 мм
(pi 5.8). В диапазоне свыше 20 кДа, ось Y расширена в 4 раза; (е) 71 мм (pi 5.6). В диапазоне
свыше 20 кДа, ось Y увеличена в 3 раза. Белки для отмеченных пиков 1, 3, 5-9 подтверждены
деградации по Эдману и идентифицированы как: 1 — yi/E, 2 - ригЕ, 3 — art), 4 — yeaD or gutQ,
5 — oppA, 6 — ptsH, 1 —ygaU, 8 — ppiB, 9 - mdh, 10 — metG or yjcQ (Ogorzalek Loo et al., 2001)
1.,-i.o. ,-;y.-;/ici/iновые кислоты
Исследование нуклеиновых кислот с
помощью ' масс-спектрометрии отстает от
изучения белков. Основная причина
заключается в высоком сродстве
нуклеиновых кислот к ионам натрия, которые
резко снижают эффективность
ионизации. Более того, получение интактных
молекулярных ионов олигомеров,
содержащих более двух нуклеотидов,
становится затруднительным, если применять
классические техники ионизации, такие
как электронная и химическая
ионизация, ввиду высокой полярности
нуклеиновых кислот и склонности их ионов к
фрагментации. В 1982 г. была
продемонстрирована способность ББА техники по-

лучать интактпые ионы иуклеотидов, на
основе которой вскоре было предложено
ультраскороспюе секвсч111 рова!1не оли го-
пуклеотидов. Внедрение ИЭР и ИЛДМ
значительно расширило диапазон масс
в анализе нуклеиновых кислот. Затем
последовал заметный прогресс в секвениро-
вании олнгопуклеотндов, анализе смесей,
исследовании некоиалентиых комплексов
и манипуляции с микрообразцами.
Б2.3.1. Анализ смеси
олигонуклеотидов
Казалось, что комбинация жидкостной
хроматографии и техники ионизации
электрораспылением в масс-спектро-
метрип должна быть очень
информативной в анализе нуклеотидных смесей.
Однако дальнейшее развитие показало
ограниченность такого подхода
ввиду несовместимых требований двух
методов. Анионно-обменная и
обратно-фазная хроматография
используют солесодержашую подвижную фазу
для эффективного разделения, которая
ухудшает качество масс-спектра.
Решение последнем"! проблемы было
найдено добавлением специальной добавки
(гексафлуро-2-пропанол) в подвижную
фазу. Потенциал нового метода был
продемонстрирован на синтетическом
гомополимере тимидпна длиной до 75
оснований, для фрагментов плазмиднои
ДНК pBR322 и фосфотиоэфирах анти-
смысловых олнгопуклеотндов.
Оказалось, что техника наиболее подходит
для характеристики ДНК зондов, ГЩР
праймеров, причем для тестирования
достаточно менее 10 пМ материала.
Б2.3.2. Нековалентные комплексы
Благодаря тому, что ИЭР достаточно
мягкий способ ионизации, становится
возможным переводить олигонуклеоти-
ды и их комплексы с белками в газовую
фазу без нарушения структуры. Очень
точное измерение массы
ДНК-белковых комплексов дает возможность
определить идентичность и стехиометрию
(эквимолярность) составных
компонентов. Так например, известны результаты
ряда измерений, проведенных набелок-
нуклеотидных комплексах, в которых
использовались два белка: белок гена
V (молекулярная масса 9688 Да) и
бычий сывороточный альбумин
(молекулярная масса 66497 Да). Как оказалось,
результаты таких экспериментов
сильно зависят от условий их проведения,
поэтому вопрос о том, отражают ли эти
измерения реальную структуру макро-
молекулярных комплексов в растворах,
остается открытым.
Б2.3.3. Большие и очень большие
нуклеиновые кислоты
Попытки анализа больших
нуклеиновых кислот с помощью 11ЛДМ-МС с
лазерным излучением в
ультрафиолетовой области имели весьма
умеренный успех. Верхний предел
измеряемых масс находился в районе 90 кДа
для ДНК и 150 кДа для РНК, и был
ограничен в основном фрагментацией
ионов.
Оказалось, что использование
инфракрасного лазера и глицериновой
матрицы представляет собой наиболее мягкую
комбинацию для ннтактной десорбции и
ионизации нуклеиновых кислот в
большом диапазоне от небольших
олнгопуклеотндов до макромолекул длиной
в 2000 нуклеотидов. Так, для
синтетической ДНК длиной в 21 нуклеотид
(молекулярная масса 6398 Да) разрешение
составило 1200, что сходно с разрешением
для белков, имеющих сравнимую массу.

Для детектирования очень
больших молекул ДНК наиболее
подходящим является метод ИЦР-ФП, когда за
один проход можно провести более 450
повторных измерений одного и того же
иона. Это позволило значительно
повысить отношение «сигнал — шум» и
точность измерения массы и заряда очень
больших ионов. На рисунке Ii2.11 а
приведен масс-спектр 2.88-МДа ионов ДНК,
120
100
несущих более 250 зарядов, полученный
с низким разрешением - около 25.
На первый взгляд, для пнтактной
десорбции больших нуклеиновых
кислот ПЭР более подходит, чем ИЛДМ.
Но точность отнесения отдельных
инков к определенным значениям массы в
этом случае очень невелика и
неопределенность достигает около 10%. Самые
большие нуклеиновые кислоты, детек-
3, 80
60
Ф 40
I
S
20
■«=&£
AfW,
\ЫС£
Лч>У|
SifWi
* Ъ-
|»М-*^-
ЬтчД»-
0 12 3 4 5 6
Масса (МДА)
9 10
g.80,0-
ф
i
га
Ё.60,0-
ф
о
о 40,0-
8 20,0-
i
0,0-
а
2000,0
2500,0
3000,0
m/z
3500,0
4000,0
4500,0
Рис. В2.14: а - гистограм.ма средней массы, полученная для образца ДНК. Ochobhoi'i пик при
2.88 МДа соответствует ионам натриевой соли бактериальной плазмиды pBR322, а гораздо
меньший пик при 5,85 Мда — ионам димера pBR322 (Benner, 1997); б — ИЦР-ФП-спектр иона с т/
z =2883, полученный для ДНК Т4 бактериофага. Расчетная молекулярная масса примерно равна
90,9 (± 9,1) 10е Да (Smith et al., 1996)

тированные с помощью ИЭР-МС
имели массу около 40 кДа.
Комбинирование ИЭР и ИЦР-ФП
в масс-спектрометрии даст
возможность анализа отдельных
макроионов, несущпхе множественный заряд.
Рисунок 152.11 6 показывает ИЦР-
ФП-спектр, полученный для ДНК
бактериофага Т4 (ожидаемая молекулярная
масса примерно 111,5МДа). Отметим,
что сигнал индивидуальных ионов этой
ДНК регистрировался под давлением
<1,0 х 10 9 Торр через 1,5 часа после
первоначального возбуждения.
Б2.3.4. СеквенированиеДНК
Для секвенирования ДНК необходима
техника ионизации, способная
получать ионы, содержащие несколько
тысяч оснований, с достаточным
разрешением и точностью для идентификации
пиков, соответствующей разнице в одно
основание пли еще выше. С
методологической точки зрения, масс-спектро-
метрическис подходы подразделяются
на две группы, в соответствии с
получением информации о нуклеотидной
последовательности непосредственно из
фрагментов в газовой фазе, либо путем
измерении массы продуктов
расщепления цепи, образованных в
конденсированной фазе (масс-анализ продуктов
реакции секвенирования по Сэнгеру
(|,'п\!\|г|! lapini I VI ,7ч и |,:>,(i).
Масс-спектроскопическое
ступенчатое секвенирование включает
последовательное ферментативное
отщепление нуклеотидов от цепи с
сопутствующей регистрацией изменений ее
массы. В этом процессе
предъявляются более строгие требования к
разрешению и точности измерения массы,
чем метод Сэнгера. Для того чтобы
отличить Л от Т с помощью ступенчатого
секвенирования, необходимо уловить
разницу в 9 Да, тогда как для
секвенирования по Сэнгеру достаточно найти
массовую разность в -300 Да (один
нуклеотид) для определения
нуклеотидной последовательности.
В методах фрагментации в
газовой фазе весь процесс секвенирования
проводится в масс-спектрометре через
идентификацию ионных фрагментов,
полученных в результате диссоциации,
вызванной столкновениями.
Потенциально он является более быстрым по
сравнению с методами, основанными не
на масс-спектрометрическпх методах.
KoMMoiimpiui G2.5. Секвенирование по Сэнгеру
Существует несколько распространенных не масс-спектрометрических методов
секвенирования ДНК, принятых в молекулярной биологии. Для крупномасштабного
эксперимента предпочтительным является метод С;-шгера. ДНК, комплементарная интересующей
цепи, синтезируется с помощью праймера, меченого с З'-конца каждого нук.теотнда. Затем
реакционная смесь разделяется на четыре а.тпквоты, куда добавляются 2',3'-дндезоксинук-
леозпд трифосфаты (d(INTP). Когда трпфосфат включается в растущую цепь вместо своего
дезокси аналога, отсутствие гпдроксп.тьной группы с З'-конца молекулы приводит к тер-
мпнацип цепи. Каждый нуклеотид метится радиоактивной пли флуоресцентной меткой.
Идентификация производится разделением различных фрагментов с использованием
электрофореза в нолпакриламидном геле. Визуализация полос достигается либо
радиоактивным подсчетом в случае с радиоактивно мечеными праймерами или детектированием его
флуоресценции, если используется соответствующая метка. Для секвенирования по
Сэнгеру обычно требуется 1,0 пМоль ДНК, а длина определяемых фрагментов может достигать
1000 нуклеотидов или более.

комментарий Б2.6. Проект «Геном человека»
В этом проекте ДНК-секвенпроваппе производилось путем злектрофоретического
разделения фрагментом, полученных методом Сзнгера. Четыре смеем реакционных продуктом
наносились на четыре дорожки и разделялись и соответстмпи с их злектрофоретической
подвижностью - свойством, которое зависит в основном от длины фрагмента ДНК (ем.
Главу Г5). В зависимости от длины геля, разделение может занимать до нескольких часов. Время
ожидания можно компенсировать, проводя несколько анализом параллельно.
Автоматические секвенаторы, использующие одновременно 96 дорожек, работали днями и ночами — в
результате все 3 миллиарда основании были идентифицированы напрямую из геля. В начало
проекта «Геном человека» масс-сиектрометрпсты полагали, что они внесут основной вклад
в секвеннронание ДНК. Но когда проект был завершен, все 3 миллиарда оснований были
определены напрямую из геля без использования масс-спектрометрни. Ключевым
преимуществом ееквенировапия с помощью электрофореза стала возможность анализа ДНК длиной
около 1200 нуклеотпдов. Такие длины недоступны для метода масс-спектрометрни, который
ограничен 100 основаниями. МС более всего подходит для быстрого и точного определения
массы коротких фрагментов ДНК. Тем не менее многие масс-спектрометрпсты продолжают п
сегодня считать, что масс-спектрометрическое секвеипрование ДНК обладает солидным
потенциалом и в будущем все-таки заменит злектрофоретичеекпй метод.
Однако каждый подход имеет свои
преимущества и недостатки. Так, с
экспериментальной точки зрения, прямое
секвенирование путем фрагментации в
газовой фазе является более простым,
но зато оно ограничено цепями длиной
-80 нуклеотпдов. Это следствие того,
что разрешение ИЛДМ быстро падает
с ростом молекулярной массы и очень
трудно разделить два нуклеотида,
которые отличаются лишь па одно
основание, если размер молекулы ДНК
превышает 80 оснований. Непрямые методы
секвестрования требуют для
применения масс-спектрометрии
достаточно сложной обработки образца, но при
этом способны определять длину цепи
-100 нуклеотпдов. Правда, в некоторых
случаях качество секвенирования
ограничено отсутствием специфических
сайтов энзиматического расщепления.
Б2.4. Углеводы
Биологические углеводы
составляют разнообразную группу полимеров,
выполняющих множество функций
в клеточных процессах — от запасания
энергии (гликоген) или структурной
функции (целлюлоза, хитин) до
передачи сигналов, адгезии и модификации
белков. Они могут быть простыми
моносахаридами и мегадальтонными го-
мополимерами, строго
структурированными сигнальными олигосахаридами и
сложной смесью
углеводно-модифицированных белков и липидов.
Основная сложность в
структурной идентификации углеводных оли-
гомеров состоит в большом числе
изомеров, возникающих как вследствие
вариаций в позиции образования связи
между остатками мономера, так и
ввиду возможности образования
множественных связей с одним остатком
(ветвление). Например, для структурной
идентификации прямой олигомерной
цепи требуется знание
последовательности и типов гликозильной связи,
т. е. места образования связи и аномер-
ная конфигурация (параграф А2.5.1),
а также последовательность
мономерных остатков.

Многие биологические углеводы,
интересные со структурной точки
зрения, являются коиъюгатамп с белками,
лпиидами или теми и другими вместе —
гликопротепны, гликолппиды пли гли-
колипопротеины и т. д. Л конъюгация
представляет дополнительное
измерение в структурной изомерии в
соответствии со специфическим положением
углеводавгл п кокоиыогате. Комбинация
конъюгации и изомерической
структурной сложности препятствовала
развитию стандартных методик секвенирова-
ния углеводов, подобных тем, что давно
уже существовали для полипептидов и
нуклеиновых кислот.
По сравнению с современными
методами секненироваппя белков и
нуклеиновых кислот, методы анализа
гликанов более разнообразны, по все
еще находятся в начальной фазе
развития. Ниже мы приведем два
примера исследований углеводов с помощью
масс-спектрометрии.
Б2.4.1. Олигосахариды
По сравнению с пептидами, натнвные
олигосахариды трудно поддаются
ионизации. В литературе описаны различных
стратегии ионизации, включая нермети-
лирование. Перметплированные
олигосахариды претерпевают специфическую
перекрестную фрагментацию, которая
позволяет определить типы связей,
встречающиеся в кольцевой структуре
углевода. В результате расщепления
гликозидной связи образуются
фрагменты, которые легко отличить друг от
друга благодаря разнице в массе,
обусловленной метилированием.
Линейные олигосахариды и смеси
олигосахаридов (рис 132.1Г)),
присоединенные к N-концу белка,
успешно исследовались с помощью ИЭР-
масс-сиектрометрпп с квадрупольной
ионной ловушкой.
Тандемная масс-спектрометрия с
порядком свыше двух (параграф Б1.5.7)
предлагает несколько путей для
улучшения МС-спектров (рис. 1)2.l(i).
Активация нерметилированных молекулярных
ионов олигосахаридов через
столкновения в тандемном масс-спектрометре,
показанная на примере мальтогептаозы
(см. рис. 132.16), приводит к образованию
большого количества фрагментов после
расщепления гликозидной связи. На
рисунке показан состав и
последовательность продуктов перекрестно-кольцевого
расщепления, указывающие на
специфические связи внутри олигосахарида.
Путем захвата и дальнейшей диссоциации
этих фрагментов в МСХ можно
подтвердить наличие данных продуктов и их
относительное содержание.
Метилирование позволяет также
установить характер ветвления данного
сахара. Поскольку оно происходит
только в незанятых сайтах образованной
связи, степень метилирования связана
обратной зависимостью с количеством
ветвлении данного моносахарида.
Б2.4.2. Гликопептиды
Множество ядерных и цптоплазматиче-
ских белков модифицируются путем
присоединения одиночного остатка
УУ-ацет11 л гл ю козам и на к п i дроке 11 л у
боковой цепи серима пли треонина (О-
GlcNAc). Считают, что эта поеттраис-
Glcpi — 4Glcpi— 4G!cpi— 4Glcpi— 4Glcpi— 4Glcpi— 4Glc
Рис. I32.IT). Структура мальтогептао.чы. Примеры сокращений названии моносахаридов даны
u iai'i. i. V.!.!

<d100-i
* 80-
a:
S
8 60-
5 40-
20-
б 0-
Y2
463.4
667.3
В3
649J
Y<
871.6
В,
853,5
'l>l|>llt|llll|"^'|'t'llfl<'^|4ll<|lll>|flMM"|4^|lirfl^r4l^
Y5
1075.5
В5
1057.5
If! Hf|'lff iy
1000
m/z
Y,
1279.6
1261.7
m^ifiVmp^l
Ц
-OCHj
1465.5
i*i<iirriii>pfiifAn|
'HII^II ll|MII I
800
1200
1400
1600
1497.8, [M+Na]+ >
1279.6, [M+Na]+>Y6>
Ys_ J^_ Y-
CH20R
CH20R
1075.5, [M+Naf > Y6 > Y5 >
Y, Y,
CH2OR
CH2OR
Рис. Б2.16. МС2 спектр нерметилпрованноГ! мальтогептаозы, [M+Na] = т/г 1497.8: (а) схема
ионных фрагментов, полученных в результате МС'2 (б), МС:|, (о) и МС (г). Используемая .здесь
номенклатурная система предложена Домоном и Кастелло в 1987 г. (Weiskopfet al„ 1997)

iv.!v,\;V':.i.!p!i!i i-'.!. Л Щелочная
[3-элиминация
Щелочная р-:>.п|минацпя ■- один из
наиболее распространенных методом для
отщепления глпканон от белком и нентпдон,
соединенных ()-сия.чьк>. 13 результате iviii-
ко.ш.шрованные остатки сернна и
треонина пренращаются в аланип и 2-аминомас-
ляную кислоту.
ляциониая модификация выполняет
регуляторную функцию, наподобие фос-
форилирования, поскольку она быстро
реагирует в ответ на внешний клеточный
стимул и связана с клеточным циклом.
Современный метод картирования
сайтов, который включает мочение га-
лактозилтрансферазой, образование
гликопентидов через протеолиз, очистку
с помощью высокоэффективной
жидкостной хроматографии в несколько
циклов, а также секвенирование в
газовой фазе и методом Эдмана, очень
трудоемок и требует около 10 пикомолей
чистого меченого гликопептида.
Для избирательного детектирования
гликопентидов и идентификации точных
сайтов гликозилирования на пикомоль-
ном уровне разработай чувствительный
ИЭР-МС метод. Были получены
синтетические глпкопентиды (рис. 1)2.17),
которые использовались для демонстрации
того, что O-GlcNAc-модифицированные
пептиды можно быстро
идентифицировать в сложных смесях с помощью
скомбинированной с ВЭЖХ-ИЭР-масс-спек-
трометрией благодаря частичной потере
связанного О-глпкана (М = 204) при
умеренной напряженности электрического
поля. Полученные масс-спектры
представлены на рис. 152.18. После удаления
O-GlcNAc с помощью щелочной р-эли-
минации ( иоммсп i;n>Mi I >2.7) сайт
гликозилирования был напрямую
идентифицирован путем диссоциации, вызванной
Туг - Ser - Pro - Thr - Ser - Pro - Ser - Lys
a
HNAc \
О
Туг - Ser - Pro - Thr - Ser - Pro - Ser - Lys
б
HO 04 ,°H
HO "NAc \
Tyr - Ser - Pro - Thr - Ser - Pro - Ser - Lys
в
Рис. 1)2.17. Структуры трех синтетических
гликопентидов: а — пептид O-GlcNAc; б —
пептид O-GalXAc; е -- пептид LacNAc (Greis et al.,
1996)
столкновениями в коллизионной камере
(параграф Б2.6.7) гликопептида.
Превращение гликозилсерина в
2-аминопропионовую кислоту (см.
структуры на рис. Б2.17) через р-эли-
минацию одновременно уменьшает
массу гликопептида на 222 единицы
молекулярной массы. Такой результат
доказывает, что описанный метод
способен стать мощным инструментом для
определения сайтов O-GlcNAc
модификации белков, численность которых
в клетке невысока — например,
транскрипционных факторов п онкогенов.
52.5. Су б к р. е то ч к ы е
комплексы \л органеллы
Б2.5.1. Рибосомы, рибосомные
субъединицы и рибосомные белки
Исследование рибосомы является
хорошим примером, демонстрирующим

100
75
so
и
|М>Н|' -1070
IM*2H|"-S35
204
251
2*0
m/z
4 Id
" - - •'
400
616
«00
И4 Ml Ml 44* U4 U) TJi Ml
YWTMP№
S66
S19
t
Э-GICNAc *»
107»
1000
_ 100
I 75
Ш
X
4
ф
i 50
25
535
[M+H|* -1070
|M+2H]"-535
251
410
IjltLLu
j_i.il
b_l
616
Mi TO» «M 111 4* 131 234 147 -^ У
0-43aMAc
1070
SI9
. i
200
m/z
600
800
1000
100
§ »
50
I »
8
о
I
6 0
616
[М+НГ -1232
|M*2H]"=6I6
2*4
2(H)
m/z
3*6
535
liL
4 тммнипшм
I »M «И 111 4« Ш 234 147 -^
О
G*l|l1.40lcNAc
1232
,-L-
400
600
I04M
1200
Mi
Рис. Б2.18. ПЭР-масс-спектры очищенных с помощью ВЭЖХ глнконеитидов получены
методом тройной квадруполыюй масс-спектрометрпи: а - пептид O-GlcNAc: б - пептид O-GalNAc;
в — пептид LacNAc. Вставки представляют расчетные Ь- и //-ионные фрагменты каждого глп-
копептнда. Номенклатура та же, что и для белков. Расчетные средние массы для
глнконеитидов равны 1069 Да для O-GlcNAc и O-GalNAc глнконеитидов и 1231 Да для О-LacNAc пептида.
Масс-спектры гликоиептндов O-GIcNAc (рис. I>2. lSr/)n O-GalNAc (рис. \V1.18 6) соответствуют
ожидаемым для пиков с отношением т/г, равным 535 и 1070. Эти пики соответствуют двум- и
однопротонированным формам гликоиептндов. Другие заметные пики при 866 и 204
(соответствующие дсгликозплированным пептидам, O-GlcNAc пли O-GalNAc), а также со значениями
819, 616 и 251 были получены в результате фрагментации гликозидных и пептидных связей (см.
вставку для расчетной схемы фрагментации). Масс-спектр О-пептида LacNAc имеет те же
характеристики (Greis et al., 1996)

возможности масс-спектрометрии. 70S
рибосомы Е. coli в буфере, содержащем
5 мМ Mg-', переводили в газовую фазу в
масс-спектрометре с помощью техники
нанопотока в ИЭР (рис. 1)2.19 а). Было
обнаружено, что при снижении
концентрации Mg-' в растворе, частицы
диссоциируют на30S и 50S субъеднницы (рис.
152. И) 6. см. также рис. ГО). Разрешение
зарядовых состояний в спектре 30S
субъединицы позволило определить ее массу
равной 852187 ± 3918 Да — значение,
лежащее в пределах 0,6% от массы,
рассчитанной из значений химической
структуры ее белков и 16S РНК. Дальнейшая
диссоциация на меньшие комплексы и
отдельные белки может быть индуцирована
столкновениями частиц в газовой фазе с
высокой энергией. 55 из 56 белков в этих
комплексах наблюдались в интактном
состоянии (без фрагментации) и было
найдено множество различных
посттрансляционных модификаций. Интересно
отметить, что самый большой белок (S1,
М = 61 кДа) детектирован не был.
Похожее исследование с
использованием другого подхода было
выполнено на дрожжевой рибосоме. Все белки
этого макромолекулярного
комплекса были выделены, денатурированы,
расщеплены трипсином и обессолены.
Далее пептидная смесь разделялась
хроматографически и анализировалась
с помощью ИЛДМ-ВП-масс-спектро-
метрип. Из 78 предсказанных белков в
рибосомном комплексе только три не
были идентифицированы.
Б2.5.2. Бактерии и бактериальная
таксономия
Таксономическая идентификация
бактерий, основанная на анализе белковых
компонентов, представляет собой
логическое развитие методов, разработанных
для исследований бактериальной про-
теомики. В идеале, этот подход должен
быть быстрым и основываться на
достаточно большой группе белков, например
фингер- (пальцевых) белков, чтобы
получить уникальный масс-спектр
организма или штамма.
На рисунке Б2.20 показаны
спектры, полученные для четырех штаммов
Е. coli. Они типичны для «цельных» или
«интактных клеток» с большим числом
пиков между m/z 3000 и 10000.
Различные штаммы Е. coli имеют множество
общих пиков, а также свои уникальные
черты. Важно отметить, что подобные
100 \ 7°S
%
0 *—1 1 1 1 1 1 1—1 1 1 г-1 1 г-
12 000 16 000 20 000 24 000
а
—i 1 1 1 1 1 1 1 г—i 1 1 1 1 ^
12 000 16 000 20 000 24 000
б
Рис. 152.19. ИЭР-масс-спектры 70S рибосом-
ных частиц: а — в присутствии 5 мМ Mg2* и
б — после трехкратного разведения раствора
(Rostometal.,2000)

UyubUjUiJL^
JaJwJuLix^A-J^
llUJjjik^^^
JilLuLjLJL^jJLJ^
Jl.
4000 5000 6000 7000 8000 9000
Масса (ДА)
Рис. 1)2.20. ИЛДМ-ВП-масс-спектры
клеточных суспензии четырех штаммов К. coli:
а - BLR; о - XL1 blue; в - RZ1032 и г - CSH23,
показывающие типичный «клеточный»
профиль в интервале m/z от 3000 до 10000 (Lay,
2001)
спектры зависят от фазы роста клеток.
Бактерии очень быстро реагируют на
изменения в окружающей среде,
поэтому производство стрессовых белков,
когда клетки хранятся, подвергаются
манипуляциям или культивируются в
течение различных периодов времени,
приводит к тому, что ооразпы далеко
не идентичны. Это нужно учитывать,
когда ИЛДМ-ВП-МС применяется для
идентификации бактерий.
Б2.6. Масс-спектрометрия
в медицине
Ряд проблем клинической химии,
связанных с анализом белков и
нуклеиновых кислот, могут решаться с помощью
масс-спектрометрии. Этот метод уже
заменяет электрофорез при анализе
продуктов во время рутинных молекулярно-
биологических процедур, таких как
определение размеров амплифицированной с
помощьюГЩРДНК( i.'i'MMi'M upnii [>:'> i,
секвенирование коротких олигонук-
леотидов, детектирование генетических
изменений и мутаций и многие другие.
Разработаны технологические
платформы для полного сравнительного анализа
ДНК, основанные на производстве
коротких диагностических продуктов и точном
измерении их массы с помощью ИЛДМ-
ВП. Они представляют собой первые
шаги в иредклинических и клинических
испытаниях лекарств, которые движутся
в направлении от подходов, основанных
на статистике к нестатистическим
подходам, позволяющим получать профиль
ответа на уровне индивидуального
пациента для каждого лекарства-кандидата.
Комментарий Б2.8. Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для амплификации фрагментом ДНК
из сложной смеси исходного материала, который обычно называют ДНК-матрпцей. Метод
требует частичного знания последовательности ДНК, находящейся у концов амплнфпцн-
руемого фрагмента. На основе этой информации химически синтезируют два олигонуклео-
тпдных праймера, каждый из которых комплементарен небольшому участку на З'-концс
ДНК-матрицы — по одному олигонуклеотиду на каждую цепочку ДНК. ПЦР состоит из трех
этапов. На первом двухцепочная ДНК-матрица подвергается денатурации. На втором
происходит гибридизация двух олпгонуклеотидиых праймеров со своими комплементарными
концевыми последовательностями. На третьем этане идет синтез ДНК с помощью иолпмеразы.

Другим потенциальным
приложением масс-спектрометрип может стать
ранняя диагностика некоторых
разновидностей рака, который возникает
вследствие постепенного накопления
генетических изменений в одпоп-
единственной клетке. Были
идентифицированы несколько мутаций,
связанных с раком, такие как точечные
мутации в K-ras и р53 генах. Зачастую
образцы раковой ткани содержат
всего несколько мутированных клеток,
окруженных большим количеством
здоровых Поэтому
прикладываются большие усилия для разработки
масс-спектрометрпческого метода
детектирован пя злокачественных
клеток на ранней стадии.
Б2.6.1. Клиническая онкология
ИЛДМ-ВП-масс-спектрометрия дает
возможность быстрого детектирования
и наблюдения отклонении в
экспрессии онкобелков ( ко.ммсм rapiiii I >'.!.!•>.
Она использовалась, например, для
исследования белкового профиля
человеческих клеток по мере
превращения нормального эпителия молочной
железы в полностью злокачественную
ткань. Рисунки Н2.21 а и б показывают
НЛДМ-ВП-масс-сиектры лизатов
злокачественных п нормальных клеток,
соответственно. В масс-спектре лпза-
та раковых клеток молочной железы
доминируют несколько белковых
пиков, специфически связанных с
канцерогенезом (рис. Б2.21 а). Напротив, в
масс-спектре лизата нормальных
клеток лишь небольшое число белковых
пиков выбивается из общего фона (см.
рис. Б2.21).
Е2.7. Масс-
спе!<трометрическгя
визуализация изображений
Несмотря на то, что обычными
методами создания изображений
биологических образцов служат трансмиссионная
и растровая электронные микроскопии,
они, как правило, дают только
морфологическую информацию (см. Часть
Ж). В настоящее время молекулярная
специфичность и чувствительность
ИЛДМ-МС используется для
разработки новой технологии прямого
картирования и визуализации
биомакромолекул в отдельной клетке или в срезах
тканей.
Б2.7.1. Клетка
Биологические образцы, полученные
в результате
замораживания-оттаивания, представляют собой наилучший
материал для их молекулярного
описания с помощью визуализационной
ИЛДМ-ВП-масс-спектрометрии.
Потенциал метода был
продемонстрирован на клетках Paramecium, которые
Коммошарии Б2.9. Онкогены и онкобелки
Онкогены иреде тлвляют собой мутированные формы нормальных геном, которые
участвуют н регуляции клеточной пролиферации н/илп дифференциации. Онкобелки, кодируемые
онкогенами н генами опухолевой супрессии, выполняют ключевую роль в контроле
нормального и злокачественного роста через регуляцию различных сложных путей сигнальной тран-
сдукцпн. Потеря контроля зачастую оборачивается неконтролируемой клеточной
пролиферацией. Возможность ПЛДМ-ВП масс-спектрометрип детектировать отклонения в экспрессии
онкогенов и следить за ними была продемонстрирована Чоигом и сотрудниками в 1998 г.

20000
40000
60000
80000
100000
m/z
70000 80000
1 ' Г
90000 100000
I'm . IS2.2I. ИЛДМ-ВП масс-спектры: а — лизата злокачественных иб — нормальных клеток
молочной железы из клеточной линии MCF-10. Аббревиатуры: c-H-Ras — трансформирующий
белок H-ras-1, int-2 — белок-предшественник протоонкогена Int-2, p53 — ядерный фосфопротепн,
c-myc — MYC-протоонкогенный белок, THR beta-2 — рецептор гормона щитовидной железы
beta-2 (Chong et al., 1998)

прошли процедуру размораживание/
оттаивание и были помещены в ВП-
ионный масс-спектрометр.
Одноклеточные организмы являются идеальным
объектом, поскольку их большой
размер (-180-310 мкм в длину) позволяет
точно расположить индивидуальную
клетку прямо на пути пучка первичных
ионов. Были получены изображения
распределений молекул на клеточном
срезе с помощью субмикронного пучка
ионов. Также удалось получить
изображения распределений диметилсульфок-
сида и кокаина, добавленных к клеткам
Paramecium.
Б2.7.2. Ткань
Существует несколько способов
приготовления образцов ткани для
визуализации распределения молекул с помощью
масс-спектрометрии. Типичная
процедура включает в себя нанесение
замороженного среза ткани на пластину из
нержавеющей стали, покрытой матричным
раствором, который затем высушивают и
вводят в вакуумный вход
масс-спектрометра. Молекулярные изображения
получаются сканированием по
поверхности образца лазерным лучом диаметра -25
мкм (рис. Б2.22). При частоте лазерных
импульсов 20 Гц на сканирование одной
точки уходит примерно 2,5 сек, включая
сбор данных и передачу их в компьютер,
а также обработку информации и
изменение положения образца. Типичный
набор данных состоит из 1000-30000
пятен, в соответствии с требуемым
разрешением. Изображение формируется
из значений интенсивностей ионов, де-
Замороженный
wJUvXuUmJ*
4000 6000
8000' 10 000
Рис. 1)2.22. Схематическое изображение методики, разработанной для анализа ткани с
помощью ИЛДМ-МС. Замороженный срез помещается на металлическую пластинку, покрывается
УФ-иоглощающсй матрицей и устанавливается в масс-спектрометр. Импульсный УФ-лазер
десорбирует и ионизирует молекулы ткани, а ВП-аналпзатор определяет значения m/z. После
сканирования ткани и измерения интенсивностей пиков на тысячах участках получают
спектрометрические изображения распределений молекулярных масс по срезу ткани (Stoeckli et al.,
2001)

Рис. [52.23. Масс-спектрометрнческис изображения среза мозга мыши: а оптическое
изображение среза, нанесенного на позолоченную пластину: 6 — область с m,z - 8528 коры голонного
мозга и пшпокамна: в — область с m/z =- 6716 черной субстанции и медиального коленчатого
тела: г — m/z 2564 — зона среднего мозга (Stoeckli et al„ 2001)
сороированных из каждого пятна в
диапазоне от 500 Да до 80 кДа.
Рисунок Б2.23 демонстрирует МС-
изображение среза мозга мыши. Хотя
сигналы многих белков расположены
по всей поверхности, некоторые из
них являются высокоспецифичными
для данной области мозга. К примеру,
белок с m/z = 8528 (см. рис. Б2.23 б)
присутствовал в коре головного
мозга и гиппокампе; белок с m/z = 6716
локализовался в черной субстанции
и медиальном коленчатом теле;
пептид с m/z = 2564 находился в среднем
мозге. Идентификацию белков можно
проводить через экстракцию,
фракционирование с помощью жидкостной
ЖХВД хроматографии, протеолиза,
масс-спектрометрического
фракционирования одного или более
фрагментов и поиска в базе данных по белкам.
Потенциал новой технологии был
продемонстрирован на примере
идентификации специфических опухолевых
маркеров в пролиферирующей ткани.
Приложение 1. Вычисление
молекулярной массы белка
мз его масс-спектра
Масс-спектр — это график зависимости
интенсивности сигнала от отношения
масса-заряд. Пик с наибольшей
интенсивностью называется базовым пиком.
Как правило, спектр нормируется по
высоте базового пика, чтобы получить
значения относительных интепсивноетей.
Молекулярную массу белка
легко рассчитать из масс-спектра белка
(рис. А) при помощи математических
формул, приведенных ниже. При этом
нужно помнить, что значения z всегда
целые. Подразумевается, что ноны
представляют собой продукт взаимодействия
нейтральной молекулы и протонов.
Молекулярная масса нейтральной
молекулы М может быть найдена из
значений регистрируемых масс т и т,,
(что эквивалентно значениям m/z) и
числа добавленных зарядов или
протонов пх и /?,:

М = п.,(т.2 -1),
(Л)
где //, =/;., + 1 и п., --
т
т., - т
Можно рассчитать п., и,
следовательно, Л/, если брать пики регистрируемых
масс попарно.
Применяя формулу (А) для
расчета молекулярной массы цитохрома с с
использованием двух соседних пиков с
/н, = 952,3 и т., = 1031,3, получим для п2
следующее значение:
«■> =
т.
■1
951,3
т.,-т. 1031,3-952,3
- = 12,04
или Z= 12.
Это означает, что 12
положительных зарядов ассоциированы с
относительной массой, равной 1031,3.
Молекулярная масса в этом случае
рассчитывается как М-п2{т2-\) и
равна 12 363,6.
Рассматривая следующие два пика
с относительными массами /и, = 884,3 и
т.2 = 952,3, мы получим:
иг, -1
883,3
; 12,989
L m2-ml 952,3-884,3
или Z = 13, т. е. 13 положительных
зарядов ассоциированы с
относительной массой 952,3. Рассчитанная из
этих пиков молекулярная масса равна
12366,9.
Продолжая процедуру для других
пар пиков, получаем:
из двух пиков с относительными
массами т] = 825,5 и т.2 = 884,3,
молекулярную массу 12 366,2;
100
90
80
я> 10-]
s
i
со
X
&60J
о
о
$ 50-1
40
30
20
10
0-
IMH
16'
773,9
|/ИН,7Г
688,1
fMH14]"'
884,3
1/ИН,5)
825,5
„,iiii I... Ж) Jm,i, ..
700
800
Теоретическая масса = 12 366
Измеренная масса = 12 366,2
1/ИН,3Г*
952,3
886,9
[МН12Г2*
1031,3
1057,0
900
1000
1100
m/z
Рис. Л. Масс-спектр цптохрома с (16 951,5 Да), несущего множественным заряд от ч-12 до +18,
полученный с низким разрешением при помощи ионизации электрораспыленнем (Gordon, 2000)

-H 2407
2174
1885
1581
1292
963
650
346
; но
Т
1
1
1
' 0
II
OPOj
| "Н
он:
i
i
*
OHi
1
1
/
/
—/
/8
Yv4
он;
i
i
/
—/
; о
/ и
i^opo.
ОН;
/ о
/ II
ГОРО:
I >
он!
О
II
Ь^ОРО: ^ОРО
| >1 П
ОН:
О
II
ОН
-ОН
ззо
619
923
1212
1541
1854
2158
Н 240 7
l'i 1с. Б. Схематическая структура октамерного олигодезоксирибонуклеотида d (A-C-T-C-G-A-T-
G), с отмеченными точками разрыва связей, в результате которых образуются основные ионные
фрагменты. Пунктиром отмечены основные фрагменты с указанием массы: сверху — фрагменты,
соответствующие ионам с 5'-фосфатными концами (5' — Р), снизу — ионы с З'-фосфатпымп
концами (3' -Р) (Grotjahn et al„ 1982)
из двух пиков с относительными
массами т{ = 773,9 нт2 = 825,5,
молекулярную массу 12 367,5;
из двух пиков с относительными
массами mi = 825,5 ит2 = 884,3,
молекулярную массу 12 366,4.
Отсюда мы можем заключить, что
наблюдаемая средняя молекулярная
масса, рассчитанная из пяти пиков,
равна 12 366,1. Теоретическая масса ци-
тохрома с равна 12366.
Приложение 2.
Вычисление нуклеотидной
последовательности
На рисунке Б схематически
представлена структура олигодезокси-рибону клео-
тида d (A-C-T-C-G-A-T-G), на которой
отмечены связи, расщепление которых
приводит к образованию основных
ионных фрагментов.
Ниже показан пример определения
последовательности олигодезоксири-
бонуклеотида с помощью ББА-МС из
следующей серии данных:
m/z (5' - Р): 2407, 2174, 1885, 1581,
1292,963,650,346;
т/г (3' - Р): 330, 619, 923, 1212,
1541,1854,2158,2407.
Правила состоят в следующем:
1. Разность масс (Д) в значениях m/z
между последующими ионами
представляет собой массу нуклеотидного остатка.
Следовательно, набор m/z данных может
быть преобразован в олигонуклеотидную
последовательность следующим образом:
(5' - Р) Д 233* 289 304 289 329 313
304;
m/z 2407 2174 1885 1581 1292 963
650 346*;
нуклеотиды ACTCGATG.
Первый нуклеотид — А.
Молекулярная масса - 233 + 96 (РО(Н) - 17
(ОН) + 1 (Н) = 313. Последний
нуклеотид — G. Молекулярная масса = 346-17
(ОН) = 329.
Получаем последовательность
d (A-C-T-C-G-A-T-G).
Читатель может проверить
последовательность нуклеотидов, применяя
те же правила для ряда значений m/z
для (3' — Р) конца.

2. Наибольший пик в ББА-спектре Сумма нуклеотидов дает 2470 Да,
т/г- 2407, который представляет (М — что соответствует масс-спектрометри-
Н)~. Отсюда М= 2408 + 96 (РО^Ы) — 34 ческому значению М.
(20Н) = 2470.
Б2.8. Перечень ключевых идей
• Самые разнообразные биологические молекулы - от пептидов и олигонуклео-
тидов до субклеточных комплексов и органелл - могут быть переведены в
газовую фазу без фрагментации техникой ионизации с электрораспылением (ИЭР)
или техникой ионизации лазерной десорбцией в матрице (ИЛДМ).
• Масс-спектрометрия с использованием метода ИЭР наиболее подходит для
получения информации о молекулярной массе, структуре различных пептидов
и олигонуклеотидов.
• Масс-спсктрометрия с использованием метода ИЛДМ благодаря своей
скорости, точности и чувствительности широко используется для исследования
функции, структуры и динамики белков; она позволяет проводить прямое
картирование и визуализацию распределения биологических макромолекул в
одиночной клетке или тканях млекопитающих.
• Объединение двух технологий — двумерного геля электрофореза и тандемной
масс-спектрометрии — стало основой современной протеомики на субпико-
мольном уровне.
• Особенно большие перспективы открываются для использования
масс-спектрометрии в бактериальной таксономии и медицине.
• В следующем десятилетии ожидается развитие масс-спектрометрии
гигантскими темпами и ее широкое применение в разных областях науки — от
структурной биологии до медицины.
Литература для дальнейшего чтения
Структура и функция белков
Chait В. Т. Mass spectrometry — useful tool for protein X-ray crystallographer and
NMR spectroscopist. Structure, 1994, 2, 465-467.
Winston R. L. and Fitzgerald M. С Mass spectrometry as a readout of protein structure
and function. Mass Spectr. Rev., 1997.16, 165-179.
Rostom A. A. and Robinson С V. Disassembly of protein complexes in the gas phase.
Curr. Opin. Struct. Biol., 1999. 9. 135-141.

Mil anker A. D. Protein complexes and analysis of their assembly by mass spectrometry.
Curr. Opin. Struct. Biol., 2000. 10, 601-606."
DoboA. and Kaltaslwr LA. Detection of multiple protein conformational ensembles
in solution via deconvolution of charge-state distribution in ПЭР MC. Anal. Chem.,
2001.73,4763 477B2.
Nielsen M. I., Benner K. L, Larsen В., Monniate M. and Mann M. Peptide end sequencing
by orthogonal ИЛДМ tandem mass spectroscopy. J. Proteome Res., 2002.1, 63-71.
Link A. J., EngJ., Scliieltz D. A/., Carmack £.,' Mize G.J., Morris D. R., Gaivic В. М.,
Yates, J. R. III. Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature
Biotechnol., 1999.17, 676-682.
Функциональная протеомика
Jungbliir P. and Thiecle, B. Protein identification from 2-P3gels by ИЛДМ mass
spectrometry. Mass Spectr. Rev.. 1997. 16, 145-162.
Godorach-Zimmermann J. and Brozcn L. R. Perspectives for mass spectrometry and
functional proteomics. Mass Spectr. Rev., 2001. 20, 1-57.
Ogorzalek Loo R. R., CavalcoliJ. D., Van Bogelen R. A.. Mitchell С LooJ. A., Moldover B.
and Andrews P. C. Virtual 2-D gel electrophorII3Ps: visualization and analysis of the I:,
colt proteome by mass spectrometry. Anal. Chem., 2001. 73, 4063-4070.
Нуклеиновые кислоты
h'ordhoff E., Kirpekar E. and Roepstorff P. Mass spectrometry of nucleic acids. Mass
Spectr. Rev., 1996.15,67-138.
Mutraij K. K. DNA sequencing by mass spectrometry. J. Mass Spectr., 1996. 31,
1203-1215.
Berkenkamp S., Kirpekar F. and Hillenkamp F. Infrared ИЛДМ mass spectrometry of
large nucleic acids. Science, 1998. 281, 260-262.
Grain P. E. and MccloskayJ.A. Application of mass spectrometry to the characterizat ion
of oligonucleotides and nucleic acids. Curr. Opin. Biothechnology, 1998. 9, 25-34.
Углеводы
Karlsson K. A. Animal glycosphingolipids as membrane attachment sites for bacteria.
Annu. Rev. Biochem., 1989.58, 309-350.
Solouki Т., Reinhold В. В., Costello С E., O'malley M., Guan Sh. and
Marshall A. G. Electrospray ionizatio and matrix-assisted laser desorption/ionisation
Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry of permethylated
oligosaccarides. Anal. Chem., 1998. 70, 857-864.
Субклеточные комплексы и органеллы
Rostom A., Fucini P., Benjamin D.,Juenmann R., Nierhaus K., Haiti F., Dobson С
and Robinson C. Detection and selective dissociation of intact ribosomcs in a mass
spectrometer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000. 97, 5185-5190.
Lay J. O. ИЛДМ-TOF mass spectrometry of bacteria. Mass Spectr. Rev., 2001. 20,
172-194.
Масс- спектрометрия в медицине
Guo В. Mass spectrometry in DNA analysis. Anal. Chem., 1999. 71, 333-337R.
Масс-спектрометрическая визуализация
PacholskiM.L. and WinogradN. Imaging with mass spectrometry. Chem. Rev., 1999.
99, 2977-3005.

Часть В.
ТЕРМОДИНАМИКА

Глава В1
ТЕРМОДИНАМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ
И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ
В 1.1. Исторический обзор
Термин термодинамика происходит
от греческого thernie (тепло) и dynamis
(сила). Эта наука берет свое начало в
XIX в., когда были поставлены первые
эксперименты по исследованию
соотношения между теплотой и работой,
определены понятия температуры и энергии,
а также четко сформулированы ее первые
и вторые законы. В последующие годы
термодинамика обобщила понятие
работы, включив в нее кроме механической
работы все остальные формы энергии,
такие как электрическую, магнитную,
химическую и энергию излучения.
Применимость термодинамики была
установлена для всех типов систем — от идеального
газа до термоядерной плазмы, включая
магнитные системы, системы
«жидкость-пар», растворы макромолекул,
химические реакции и т. д. В этой главе
мы будем иметь дело в основном с
приложениями классической и статистической
равновесной термодинамики для
исследования биологических макромолекул,
их растворов и взаимодействий.
Начало WII и.
Галилео Галилей (Galileo Galilei)
и его последователи сконструировали
первые термометры, позволяющие
делать воспроизводимые измерения
температуры. Основателем калориметрии
считается Джозеф Блэк (Joseph Black)
(1728-1799), который сделал первый
калориметр. Его измерения привели к
созданию калорической теории, или
теории калорической жидкости,
обладающей весом и связанной с температурой.
I7S0
Антуан-Лоран Лавуазье (Antoine-
Laurent Lavoisier) впервые применил
калориметрические измерения в
биологии. Он изучал энергетический обмен у
животных (хотя понятие энергии тогда
еще не было сформулировано), помещая
морскую свинку в ледяной калориметр,
разработанный вместе с П. С.
Лапласом (P. S. Laplace). Выделение тепла
измерялось с помощью оценки
скорости таяния льда. Тепловой баланс был
рассчитан из разности между теплом,
выделенным экскрементами, и теплом,
поступившим с пищей.
1 N07
Томас Янг (Thomas Young) ввел
в обиход понятие энергии (от
греческого еп «в» и ergon «работа»), однако
в то время четкого различия между
силой и энергией еще не было. Сади
Карно (Sadi Carnot), военный ин-

женер, ввел в науку концепцию
цикла тепловой машины, которая была
опубликована в его мемуарах «Sur la
puissance mot rice du feu»
(«Размышления о движущей силе огня») (1824).
Своп результаты он интерпретировал
с точки зрения все тон же
калорической теории.
1S-12
Юлиус Роберт фон Майер (Julius
Robert von Mayer) доктор медицины
заявил о равнозначности тепла н
механической энергии. В 1845 г. он
опубликовал численное значение эквивалента
теплоты.
184 Г)
Джеймс Прескотт Джоуль (James
Prescott Joule) — пивовар н ученый-
любитель из Манчестера, предъявил
убедительные экспериментальные
доказательства того, что теплоту можно
перевести в работу и обратно.
IS 19
Лорд Кельвин (Вильям Томсон)
(Lord Kelvin (William Thomson))
указал на несоответствие
результатов Джоуля калорической теории.
Проблема была решена Рудольфом
Юлиусом Клаузиусом (Rudolf Julius
Clausius) (1850), который установил
первый и второй законы
термодинамики. Его работа означала рождения
новой науки — термодинамики. Клау-
зиус определил свойства энтропии
(от греческого еп (в) и tropos
(превращать)), которая использовалась в
значении трансформации, т. е. энтропия
имела трансформационное
содержание. Понятие энергии было
определено Кельвином. Кроме того, он
предложил температурную шкалу, позже
названную его именем.
IS(if> LS7f>
Джеймс Клерк Максвелл (James
Clerk Maxwell) определи;!
математические соотношения между
термодинамическими параметрами, которые
теперь носят его имя. Дж. Уиллард
Гиббс (J. Willard Gibbs) (1873, 1874)
опубликовал три выдающиеся работы,
в которых математическое описание
условий равновесия было настолько
элегантным, что они стали основой
современной классической термодинамики
и физической химии.
I91S
Вальтер Нернст (Walther Nernst)
установил третий закон
термодинамики, тем самым придав ей законченную
форму. Статистическая
термодинамика, основанная на соотношении между
теплом и движением атомов и молекул,
развивалась параллельно с
классической термодинамикой, в основном
благодаря работам Германа Людвига
Фердинанда фон Гельмгольца, Клаузиуса,
Максвелла, Людвига Больцмана и Гиб-
бса (Hermann Ludwig Ferdinand von
Hemholtz, Clausius, Maxwell, Ludwig
Boltzmann and Gibbs).
1930-c
Калориметрия была изобретена в
XX в. для изучения физической
химии растворов. Джон Т. Эдсалл (John
Т. Edsall) впервые измерил
термодинамические параметры растворов
аминокислот и других органических
соединений в воде. Кристиан Анфинсен
(Christian Anfinsen) в 50-х гг. XX в.
осуществил эксперименты с рпбонукле-
азой и выдвинул «термодинамическую
гипотезу». Согласно ей, вся
информация, необходимая для правильного
сворачивания белка в свою активную
в физиологических условиях структу-

ру, содержится в его аминокислотной
последовательности. За свое
открытие Анфинсен совместно с С. Муром и
У. Стайном в 1972 г. был удостоен
Нобелевской премии по химии.
10/0-е
11ервый высокочувствительный
калориметр для исследования белковых
растворов был построен в 70-х it. прошлого
века Петром Приваловым (P. Privalov)
и его сотрудниками. В последующие
десятилетия дифференциальная
сканирующая калориметрия, — а позже п
калориметрия изотермического
титрования применялась для исследования
процесса сворачивания белка и
взаимодействий в процессе межмолекулярного
связывания. Точность измерений
термодинамических параметров возросла с
изобретением еще более чувствительных
калориметров — микрокалориметров, а с
наступлением 2000 г. и нанокалоримет-
ров (приставки микро и нано говорят о
степени точности измерения тепла в этих
приборах). Фундаментальные работы
по калориметрии белков были
выполнены Петром Приваловым, Джулианом
Стюртевантом, Ернесто Фрейре (Julian
Sturtevant, Ernesto Freire) и их
сотрудниками.
1$ H)5)0-e
Появились чувствительные бно-
сенсоры для измерения констант
связывания молекул с
иммобилизованными лигапдамн в растворе, получившие
впоследствии широкое
распространение во многих биохимических
лабораториях.
2000 п но iiacioiiiiu'i' время
Открываются большие перспективы
для современных термодинамических
исследований в биофизике, основанные
на комбинации структурном
информации, полученной с высоким
пространственным разрешением (см. Часть Е) и
методов молекулярной биологии.
Например, стабильность белка можно
изменять путем направленного введения
мутаций в область функционального
центра и последующего изучения кон-
формациоиных переходов при
сворачивании и разворачивании молекулы.
Поэтому для термодинамики, так же как и
для многих других биофизических
методов, структура с высоким разрешением
является скорее отправной точкой для
исследований, чем конечной целью.
Неравновесная термодинамика
лежит вне поля зрения данной книги, но она
должна быть упомянута в нашем кратком
историческом обзоре, благодаря
важности ее применения во многих областях,
включая экспериментальную физику,
химию реакций, биологию, экологию и
даже социологию. Необратимая
термодинамика неравновесных процессов
интенсивно развивается с конца 1950-х гг.,
в основном, в работах Ильи Пригожина
(I. Prigogine) и его сотрудников. Он ввел
термин диссипативные. структуры для
определения открытых систем, которые
могут поддерживаться в состояниях,
далеких от равновесных, благодаря
притоку энергии и вещества извне. Интересно,
что впечатляющие примеры
самоорганизации в биологии, такие как клеточное
деление, дифференциация и морфогенез,
можно смоделировать в терминах дисси-
пативных структур.
В заключение заметим, что
термодинамика не рассматривает величины и
свойства энергетических тепловых
барьеров, которые должны быть
преодолены, прежде чем реакция начнет
протекать самопроизвольно. Скорости и
механизмы реакций являются
привилегией специального раздела физической

Комментарии В1.1. Термодинамика ;
и математика
Пытаться объяснять термодинамику '■■
без использования математики -- значит
вводить читателя в заблуждение. Триумф
и полезность термодинамики объясняется ;
тем. что она сформулирована в
нескольких законах, имеющих вид математических
уравнений, которые устанавливают точные ,
отношения между измеряемыми
величинами. Дифференциальные уравнения в
частных производных, которые сами следуют :
определенным математическим правилам,
являются простым и элегантным способом
выразить изменения экспериментального ■
параметра, например, давления газа, когда
меняется другой, например, температура,
в то время как третий параметр остается .
неизменным, например, объем. Уравнения
говорят нам не только о том, что давление
вырастет, как мы и ожидали интуитивно, но
и о точной величине этого изменения для
данного температурного сдвига. Наш
пример — просто иллюстрация, однако похожие
предсказания можно сделать в гораздо более :
сложных ситуациях, таких как химические
реакции или процесс сворачивания белка.
химии, называемого кинетикой,
которая в этой книге не рассматривается.
В1.2. Законы термодинамики
Несмотря на свою сложность, язык
классической и статистической
термодинамики является чрезвычайно полезным
(на самом деле без него просто нельзя
обойтись). Он необходим для
понимания экспериментальных данных об
энергетике определенных систем — от
больших ансамблей частиц до
одиночных молекул. Работая над этой главой,
авторы не пытались дать ничего, кроме
краткого описания принципов, лежащих
в основе этого языка. Мы приветствуем
его тщательное изучение, благо на
данную тематику написано множество
хороших книг, поскольку термодинамика
играет фундаментальную роль в развитии
и приложении биофизических методов.
Классическая термодинамика
представляет собой феноменологическую
науку, занятую точным описанием
определенных систем, например, растворов
макромолекул. Статистическая же
термодинамика старается объяснить
происходящее в терминах движения частиц
системы, например, молекул раствора и
растворенного вещества.
В данной главе дан лишь беглый
обзор законов классической
термодинамики. Мы обсудим наиболее важные
параметры и математические соотношения
между ними, необходимые прежде всего
для понимания экспериментов по
калориметрии в исследовании связывания,
сворачивания/разворачивания и
взаимодействия биологических макромолекул
(к'оммсн lapnii RI.I). Представленные
здесь основные принципы также
пригодны и полезны для изучения
макромолекул в растворе (Часть А), для
гидродинамических экспериментов (Часть Г),
экспериментов по рассеянию (Часть Е),
опытов по спектроскопии (Часть 3) и
изучения одиночных молекул (Часть Д).
Мы ограничим описание равновесной
термодинамикой, которая обеспечивает
соответствующую базу для исследований
биологических макромолекул и их
взаимодействий в основном in zitro.
В1.2.1. Основные определения
и нулевой закон термодинамики
Адиабатические и изотермические
системы, а также понятие равновесия
Мы рассматриваем систему как материю,
отделенную от внешнего мира стенками, с
которыми она не взаимодействует хими-

чески. Адиабатическая (от греческого «не
позволяет проходить») стенка полностью
изолирует систему от внешнего
воздействия. Неадиабатические стенки
называют диатермическими (от греческого dia
«сквозь» и theime «тепло»). Две системы,
отделенные такой перегородкой,
являются изотермическими. Условие, в котором
находится система, называется ее
состоянием. Свойства конкретного состояния
можно определить из
экспериментальных измерений. Два состояния
одинаковы, когда все измеренные значения,
характеризующие их свойства, одинаковы.
Система, заключенная в адиабатический
сосуд, со временем достигает состояния,
в котором ее свойства перестают
меняться. Тогда говорят, что система пришла в
равновесие. Обратите внимание, что
равновесие обозначает статичность условий
(их неизменность) только в отношении
макроскопических свойств системы. Газ
или раствор, находящиеся в равновесии,
представляли бы собой
высокодинамичные системы, если бы мы наблюдали
броуновское движение молекул или частиц
растворенного вещества. Именно о таких
системах идет речь в Главе ПО,
посвященной динамическому рассеянию света.
Нулевой закон термодинамики
Нулевой закон термодинамики был
установлен после первого и второго.
В основном он определяет понятие
температуры. Поскольку он важен для
понимания других законов, его называют
нулевым. Он утверждает, что если два
тела А и Б находятся в равновесии с
третьим телом В, тогда А и Б находятся
в равновесии друг с другом.
Следствием данного закона является
существование некоторой эмпирической
функции состояния системы —
температуры, которая принимает одинаковые
Комментарий В1.2. Температура
; То, что мы сегодня называем темпера-
\ турой, по сути дела есть мера средней ки-
| нетической энергии молекул некоего тела.
Вполне ясные статистические понятия
температуры и тепла были осознаны далеко не
сразу. Существовавшие ранее представле-
| ния о температуре было основано на опре-
| деленных свойствах тела, находящихся в
! равновесии. Тепло рассматривалась как
невидимая калорическая жидкость —
теплород, которая перетекает от более нагретого
тела к холодному, находящемуся в контак-
i те с первым, и это приводит к изменению их
| температуры. Нулевой закон термодинами-
\ ки может быть сформулирован через
понятие температуры и теплового равновесия:
«Две системы, находящиеся в тепловом
равновесии с третьей, находятся в
тепловом равновесии друг с другом».
значения для различных систем в
равновесии (комментарий В1.2).
Функции состояния и сопряженные
переменные
Наблюдаемый параметр, значение
которого зависит только от состояния
системы, а не от способа, которым оно
достигнуто, называется функцией
состояния. Температура является такой
функцией. Внутренняя энергия,
энтропия, давление и объем представляют
собой другие примеры функций
состояния. Параметр, который зависит от
размера системы, называется экстенсивной
переменной, в то время как параметр,
зависящий от условий, но не от размера
системы, называется интенсивной
переменной. Объем, внутренняя энергия
и энтропия — все это экстенсивные
переменные. Давление, температура или
значение рН раствора — интенсивные
переменные.

Комментарий В 1.3. Обозначения
для термодинамических функций
В этой главе мы будем использовать
следующие обозначения, необходимые для
записи уравнений, в которых фигурируют
теплота и другие формы анергии.
Приведенные ниже символы отражают следующие
термодинамические функции: {/ -
внутренняя энергия, // — энтальпия, S - энтропия,
G — свободная энергия Гиббса, F --
свободная энергия Гельмгольца, W работа. Q —
теплота. Функции U, Н. G. Wu Q имеют
размерность энергии и чаще всего выражаются
в калориях. Функция S выражается в
калориях или в джоулях, деленных на градусы.
К сожалению, в мировой литературе не
наблюдается однозначности в этих символах,
за исключением энтальпии и энтропии.
Комментарий В 1.4. Определение
теплоты
Уравнение В 1.1 определяет теплоту спс- ■
темы. Для системы, окруженной
адиабатическими стенками, изменение внутренней
энергии дается выражением AU = AW,
поэтому значение величины Q — это мера того, ■
насколько стенки неадпабатны и тепло сно- |
собно поступать в систему снаружи. Можно
! показать, что Q обладает свойствами, кото-
! рые мы обычно ассоциируем с теплотой:
— добавление тепла к системе изменяет |
ее состояние:
— тепло передается от одной системы
к другой благодаря проводимости,
конвекции или излучению: !
— в калориметрическом эксперименте I
I с адиабатной системой тепло сохраняется.
В уравнениях термодинамики,
которые описывают отношения между
различными функциями состояния, его элементы
(члены) выражаются в единицах энергии
(комментарий В1..Ч). Когда такой член
выражения содержит два параметра, эта пара
состоит из так называемых сопряженных
переменных. Давление и объем, а также
энтропия и температура представляют
собой сопряженные неременные (в качестве
примера см. уравнение В1.5).
В1.2.2. Первый закон и энергия
Первый закон термодинамики
формулировали по-разному. По существу, он
утверждает, что «количество работы,
необходимое для изменения состояния
системы от начального до конечного,
зависит исключительно от самого
произведенного изменения, а не от способа,
которым проделана работа, и не от
промежуточных состояний, через которые
система могла пройти».
Первый закон определяет
внутреннюю энергию (U) как свойство
начального и конечного состояний системы,
чье значение изменяется под действием
произведенной над ней работы.
Сохранение энергии
Сохранение энергии, безразлично
какой — механической, химической,
тепловой или любой другой, является
следствием первого закона
термодинамики. Интересно, однако, что сам этот
закон нельзя получить из утверждения
о сохранении энергии.
В соответствии с первым законом,
изменение внутренней энергии
системы AUдается уравнением:
AU = AQ + AW, (B1.1)
где W- количество механической
работы (или химической, пли любой другой,
не имеющей форму тепла),
произведенной над системой, a Q — добавленное к
системе тепло ( коммш глрмп В I. i).
Химический потенциал
Химический потенциал растворенного
вещества ц — это энергия, необходимая

для того, чтобы добавить одну молекулу
(или один моль молекул, в зависимости
от определения термина) в раствор. Мы
можем разложить работу W в
уравнении 131.1 на два вклада — химический
потенциал и механическую работу
Д[/=Д<2 + цДл -PAV, (B1.2)
где An — это разность в количестве
молекул растворенного вещества между
начальным и конечным состояниями
(в зависимости от используемой
шкалы, данная величина может быть
выражена и в молях). Механическая работа
представлена в терминах давления Р и
изменения объема AV. Химический
потенциал - это интенсивная переменная.
Сопряженней! с ней концентрация —
экстенсивная переменная. Для изменений
при постоянном давлении член,
содержащий химический потенциал, связан с
функцией, называемой свободной
энергией Гиббса (параграф В1.3.1).
В1.2.3. Второй закон и энтропия
Прямым следствием понятия
равновесия является то, что многие тины
изменений, которые удовлетворяют первому
закону, на практике произойти просто не
могут. Наблюдаемый факт — движение
изолированной системы к равновесию,
например, стремление молекул
растворенного вещества равномерно заполнить
сосуд после удаления стенки,
ограничивавшей их в отсеке, исключает обратный
путь (и нашем примере движение
молекул обратно в отсек сосуда)' если даже
он и не нарушает первый закон.
Второй закон
Мы можем выразить направленность
определенных термодинамических
изменений в терминах субъективных понятий —
горячее и холоднее. Существует четкая
тенденция перетекания тепла от более
горячего тела к более холодному.
Формулировка второго закона, сделанная Клаузиу-
сом, включает следующее определение:
«Невозможно создать машину, которая,
работая циклично, способна произвести
другой эффект кроме переноса тепла от
горячего тела к холодному».
Обратимость
Благодаря своим экспериментам Кар-
но продемонстрировал, что кратчайший
путь к превращению теплоты в работу
заключается в использовании машины, в
которой каждый процесс обратим. Обмен
тепла в таком идеальном устройстве
происходил бы между телами с почти
одинаковой температурой (рис. Bl.l). Если мы
слегка охладим одно тело, тепло потечет
к нему от другого; если же мы немного
нагреем его, тепло потечет в обратную
сторону. Этот процесс обратим. Точно
таким же обратимым образом мы можем
произвести работу над объемом газа, изо-
I'-и■, lil.l. Обратимый перенос тепла между
двумя телами

t
Q
A
1
Г
Рис. 151.2. Работа, совершаемая над объемом
газа в обратимой манере
термическим со своим окружением при
температуре Т, очень медленно двигая
поршень в отсутствие трения в одном или
другом направлении, заставляя тепло
Q покидать газ или попадать в него, в то
время как его температура оставалась бы
очень близкой к Т( рис. В 1.2).
Энтропия
Клаузиус выразил тенденцию
изолированной системы, которая не
обменивается энергией или веществом со своим
окружением, к достижению
равновесия через определение
функционального состояния — энтропии S, которая
■ Комментарий В1.5. Энтропия
и вероятность |
I Связь между энтропией и вероятностью
! легко просматривается исходя из нашего
житейского опыта о наиболее вероятных
событиях. Связь между энтропией и
вероятностью описывается уравнением S = I
= А lnp+В, гдер — вероятность события, А и '
В — постоянные. Логарифмическая форма
I этого уравнения следует из того, что для .
| получения вероятности конечного события ,
I вероятности надо перемножить, а энтропии i
1 отдельных событий надо сложить.
растет со временем, пока не достигнет
максимума в состоянии равновесия
Д5>0. (В1.3)
Равенство (нулевое изменение
энтропии) соблюдается в пределах
обратимых изменений, во время которых
система считается находящейся очень близко
к равновесию.
Изучая следствия второго закона,
было найдено, что энтропия
соотносится с членом, содержащим теплоту
в уравнении В1.1 как:
AS = AQ/T. (B1.4)
Уравнение В1.4 определяет единицы,
в которых выражается энтропия, в
терминах энергии и температуры. Теперь
мы можем переписать уравнение В 1.2:
MJ = T&S + р&п - PAV. (В1.5)
Энтропия и беспорядок
Наш пример, в котором молекулы
двигались так, чтобы заполнить весь
доступный объем по мере достижения системой
равновесия, есть отражение простого
факта — равновесное состояние — это
максимально неупорядоченное
состояние. Ее компоненты «пробуют» все
возможные из доступных им
конфигураций. Больцман в своей трактовке
статистической термодинамики выразил
эту мысль количественно и соотнес
энтропию S с числом всех доступных
системе конфигураций р через уравнение:
S = kB\np, (B1.6)
где kB — универсальная константа Боль-
цмана ( i.'ommcii трип М 1 .."> и Ml .(i).
В отличие от внутренней энергии (U)
и энтальпии (Я) энтропия имеет
размерность энергии, деленной на температуру,

так как она представляют собой тепловую
энергию, рассеянную при определенной
температуре, или сумму энергетических
потерь, приходящихся на градус в данном
температурном интервале. Поскольку
S имеет размерность энергии, деленной
на температуру, для получения энергии,
надо умножить ее на Т, и, следовательно,
TS имеет размерность энергии.
Уравнение В 1.6, объединенное
с уравнением второго закона
термодинамики В 1.3, показывает, что при
равновесии число доступных системе
конфигураций максимально. При рассмотрении
уравнений В 1.4 и В 1.6 мы приходим к
выводу, что TS — это «распределенная»
тепловая энергия системы, необходимая
для того, чтобы перебрать все
конфигурации р при температуре Т, выраженной
в единицах Кельвина. Ниже, в
параграфе В 1.3.1, мы увидим, что эта энергия не
является «свободной энергией», т. е. с ее
помощью нельзя произвести работу.
Второй закон термодинамики —
закон статистический, он соблюдается
только тогда, когда мы рассматриваем
большое число событий. Когда в
каком-то макрообъеме содержится
несколько молекул газа, то вполне
вероятно, что в какой-то момент времени
они соберутся у одной стенки. Однако,
если в объеме очень много молекул, то
их распределение будет случайным и
практически однородным. Если
рассматриваемый объем сильно
уменьшить, то в какой-то данный момент
времени в двух маленьких объемах будет
содержаться разное число молекул (см.
ГлавыПОиГН).
В1.2.4. Третий закон
и абсолютный нуль
Тепловая теорема Нернста, известная
также как третий закон термодинами-
Комментарий В 1.6. Константа
Болыдмана и определение
температурной шкалы
Константа kB имеет ту же размерность,
' что и энтропия: Ав= 1,3806503 х 10"23 Дж-К1.
На молекулярном уровне энергия, связан- !
ная с одной степенью свободы и темпера-
: турой Г (в единицах Кельвина), равна (И>)
I kgT. Число Авогадро (число частиц на один
I моль) NA = 6,02214199 х Ю^моль1. Это
число, умноженное на константу Больцмана,
равно газовой константе R, R = N^kB. R = i
' = 8,34624 Дж-К'моль1. Заметим, что раз-
! личие между k и R только в одном: k упот-
■ ребляют, когда говорят об одной частице, а
R — о моле частиц.
ки, утверждает, что «энтропия любого
тела равна нулю при нулевой
температуре на абсолютной шкале».
Классическая формулировка не
содержит утверждения о нулевой
энтропии (или температуры) — там
определяется только разность этих величин
между двумя состояниями. Третий
закон дает нам нулевую точку на
абсолютной шкале энтропии. Поскольку
было показано, что не существует
процесса, результатом которого была бы
нулевая энтропия, альтернативная
формулировка третьего закона звучит так:
«Не существует такой конечной серии
процессов, с помощью которой можно
достичь абсолютного нуля». Другими
словами, когда температура стремится
к нулю, величина изменения энтропии
в любом обратимом процессе тоже
стремится к нулю.
Абсолютная температура
Третий закон определяет абсолютный
нуль на абсолютной шкале. В ней
абсолютная температура выражается в
единицах Кельвина и растет с шагом в один
градус, который определяется как одна

Комментарии В1.7. Закон |
Шарля-Гей-Люссака и шкала
Кельвина
Шкала Кельвина вытекает и.ч закона |
Шарля-Гей-Люссака. В современном виде
этот закон гласит: в процессе охлаждения
газа при постоянном давлении на каждый
градус Цельсия его объем V0 уменьшается I
на 1/273,15 того объема, который он
занимает при О "С. Математически это выража- |
t ',
ется уравнением Vr = V.,+ xV„ (при
г о 2узл5 о
постоянном давлении). Это уравнение
показывает, что при понижении температуры до
-273,15 "С газ должен вообще не занимать
никакого объема. Ясно, что этот закон не
может выполняться точно. В качестве
нижнего предела температурной шкалы, которая !
получила название абсолютной
температурной шкалы, была принята температура
-273,15'С, ставшая в ней нулем. Позднее \
эту шкалу стали называть шкалой Кельви- ;
на, в честь лорда Кельвина, обосновавшего
ее важное теоретическое значение в
термодинамике.
сотая разности температур замерзания
и кипения воды при атмосферном
давлении ( комментарий В1.7).
Третий закон выполняет важную
роль в физической химии.
Устанавливая нулевую точку энтропии и
абсолютную температурную шкалу, он
позволяет рассчитать константы
равновесия из тепловых свойств реагентов
(параграф В 1.3.2) и
калориметрической полной внутренней энергии
(параграф В1.3.3).
В1.3. Основные понятия
и уравнения
Фундаментом классической
термодинамики является набор простых с
математической точки зрения уравнений,
которые устанавливают то, как различные
переменные соотносятся друг с другом.
Эти уравнения можно записать и в
терминах переменных с помощью правил
дифференциальной геометрии. К
примеру, уравнения Максвелла соотносят
друг с другом изменения давления Р,
объема V, энтропии 5 и температуры Т
жидкой системы. Здесь мы
сосредоточимся на нескольких концепциях из
химического приложения классической и
статистической термодинамики,
которые помогут нам понять биологические
макромолекулы и их взаимодействия.
В1.3.1. Свободная энергия
и родственные понятия
Энтальпия
Энтальпия системы //определяется как
H-U + PV. (B1.7)
Термин «энтальпия» в переводе с
греческого означает «теплый внутри».
При постоянном давлении — условии,
характерном для растворов
биологических молекул, энтальпия системы при
температуре Т отражает полную
энергию, необходимую для нагрева системы
от абсолютного нуля до Т.
Уравнение В1.7 есть не что иное, как
просто полезное определение,
характеризующее Н как функцию состояния.
Поскольку абсолютные значения U и //
неизвестны, то это уравнение лучше
использовать на языке приращений:
АН = AU + A(PV). (B1.7a)
Подобно AU, величина АН, зависит
только от начального и конечного
состояний. Уравнение В1.7 имеет характерную
особенность. Поскольку при
постоянной температуре объем идеального газа
изменяется обратно пропорционально

давлению, все члены PV равны друг
другу и A(PV) = 0. Следовательно, в данном
случае энтальпия и внутренняя энергия
изменяются одинаково. Если газ
расширяется или сжимается против внешнего
давления, то АН = AU + PAV. В этом
выражении — PAV — это работа системы,
расширяющейся при постоянном
давлении. Поэтому, если PAV = W, то АН =
= Q, поскольку AU= Q + W. Поэтому для
этого случая АН = Q]t где Qp означает
количество тепла, поглощенного при
постоянном давлении. Соответствующей
величиной для процесса, протекающего
при постоянном объеме, будет Qv
Изменение энтальпии АН во время
химической реакции — это тепло,
поглощенное или освобожденное при
разрушении и образовании связей. В
калориметрии АН — экспериментально
измеряемая величина.
Свободная энергия Гиббса
Свободная энергия Гиббса G
определяется как:
G = U + PV-TS = H- TS. (B1.8)
G представляет собой ту часть
энергии системы, которая не используется
различными энтропийными
конфигурациями. Отсюда следует, что, поскольку
энергия Гиббса не вовлечена в процесс
теплового переноса, она может быть
трансформирована в полезную работу,
отсюда и ее название — свободная
энергия ( коммси rapm'i li 1.N).
Понятие свободной энергии Гиббса
привлекательно потому, что дает
практический критерий
самопроизвольности данного процесса. Приращение
свободной энергии при постоянной
температуре равно AG = АН — TAS. Иными
словами, как уменьшение энтальпии,
так и увеличение энтропии способ-
; Комментарий В1.8. Свободная
: энергия Гиббса и свободная
энергия Гельмголыда
К понятию свободной энергии пришли :
независимо друг от друга Гиббс и Гель- |
мгольц. Свободная энергия по Гельмголыду
есть F= U — TS. На практике измеряется не
: изменение внутренней энергии U
изучаемого вещества, а измененное его энтальпии
j U + PV. Для большинства биологических
i макромолекул при атмосферном
давлении величину PV можно игнорировать,
поскольку она намного меньше, чем тепловая
энергия тела. Поэтому представляется
несущественным различие между свободной
энергией Гиббса и свободной энергией по
Гельмголыду. И то и другое целесообразно
именовать просто свободной энергией.
ствуют уменьшению свободной
энергии, от чего зависит самопроизвольное
протекание реакции. Отрицательный
или положительный знак AG позволяет
судить, может ли реакция происходить
самопроизвольно или нет. Существуют
три общих правила для систем,
функционирующих при постоянном
давлении и постоянной температуре: если
AG <0, то реакция может протекать
самопроизвольно, если AG >0, то реакция
не может протекать самопроизвольно,
если AG =0, то система находится в
равновесии.
Химическая реакция включает в себя
создание и разрушение различных типов
связей между атомами. В этом смысле
сворачивание биологических
макромолекул и их взаимодействия с лигандом
во время связывания являются
химическими реакциями (рис. \U.'A).
Энергия ковалентных связей составляет
величину порядка \0лквТ, ван-дер-ва-
альсовые, водородные и
электростатические связи в водных растворах, а
также так называемые гидратационные
и гидрофобные связи являются слабы-

vl
v/ ^ v л i^
Свернутая< > Развернутая
«= 4
P + L
PL
б — Белок + Лиганд <=> Белок * Лиганд
Рис. В 1.3. Разворачивание белков (а) и их взаимодействие с лнганлами во время
связывания (б)
ми, поскольку их энергия составляет
величину порядка квТпри температуре
Т, близкой к комнатной — 300 К. Сколь
ни мала энергия этих связей в
макромолекуле, она оказывается
достаточной для того, чтобы противостоять
нарушению структуры, которое могут
вызывать столкновение с другими
молекулами при комнатной температуре.
Однако по мере повышения
температуры возрастающая сила
молекулярных столкновений и возрастающая
энергия внутримолекулярных
колебаний вызывает разрыв и водородных и
неполярных связей, что служит
причиной тепловой денатурации
биологических макромолекул. Разворачивание
(рис. И 1.3 а) и взаимодействие с ли-
гандом (рис. 131.3 6) могут включать в
себя формирование и разрушение как
нескольких ковалентных, так и
множественных слабых связей.
Обсуждение относительных вкладов ван дер
ваальсовых сил, водородных связей,
гидратационных и гидрофобных
взаимодействий в структуру белка и его
разворачивание будет обсуждаться
в Главе В2. При этом, как мы увидим
ниже, важнейшую роль играет
взаимодействие с растворителем.
Обратимую мономолекулярную
химическую реакцию можно записать как:
А<±В.
(В1.9)

При постоянной температуре, когда
система находится в изотермическом
контакте с большим объемом с
постоянной температурой, как, например, в
случае с молекулами в разбавленном
растворе, свободная энергия,
высвобождаемая в реакции, дается
выражением
AG = AH- TAS.
(В1.10)
Второй закон утверждает, что
система будет изменяться, с тем чтобы
максимизировать свою энтропию.
Аналогично система, которая обменивается
энергией со своим окружением, тоже
изменяется, чтобы максимизировать
свою свободную энергию. Поэтому
реакция В 1.9 будет идти в том
направлении, для которого AG < 0. Когда два
состояния системы находятся в
равновесии, разность их свободных энергий
равна нулю (AG = 0).
Картина свободной энергии
и распределение Больцмана
Когда системе доступны несколько
состояний с различными уровнями
энергией, они заселяются в разной
степени в зависимости от температуры
(рис. ВЫ).
Вероятность того, что состояние
со свободной энергией G при
температуре Т будет заселено, можно
представить Больцмановским
распределением:
Cfcxp-G/RT, (Bl.lla)
так что
Gj=-RT\nCj. (B1.116)
Отсюда следует, что вероятность
состояния с энергией 2RTбудет
относиться к таковой с энергией RT, как
о.
I
m
о:
со
i
%
ю
о
m
О
Конформация
Рис. В1.1. Диаграмма свободной энергии
системы как функции ее коиформацин. В нашем
примере показаны два состояния,
разделенные разностью свободных энергий AG.
Избыток свободной энергии, или энергетический
барьер Е*, называют энергией активации двух
состояний
Функция распределения
(статистическая сумма)
Функция распределения Q
определяется как сумма статистических
вкладов всех доступных системе
состояний:
Определяя состояние^' = 0 какрепер-
ное, по отношению к которому
термодинамические переменные выражаются
как избыточные величины, уравнение
В 1.12 можно переписать:
Q = l + Xexp(-AG;//?7) (B1.12a)
Заселенность / состояния Р. дается
соотношением статистического
вклада этого состояния к сумме
статистических вкладов всех состояний,
доступных системе:
P,=exp(-AG,//?r)/Q. (B1.126)

Заметим, чтоУ^Р, = 1. a P0=l/Q.
В общем случае, средние
экспериментальные значения свойства а
системы выражаются как
(а) = £р,а,, (В1.12в)
где ее — значение а, относящееся к
состоянию/.
Уравнение В1.12 (в) является
основой для теоретических или модельных
расчетов величины <а>, проводимых
для сравнения с экспериментальными
наблюдениями.
Средняя свободная энергия системы
<AG> = <G -- G0> записывается как:
(ДС) = £/>/;, =-/?rlnQ. (В1.12г)
Средняя избыточна>1 энтальпия
выражается как:
(ДЯ) = УР,Д#, =
^ ' % (В1.12д)
= RT2(d\nQ/dT),
а средняя избыточная энтропия дается
выражением
Х ' Р J ' (В1.12е)
= RT(dlnQ/dT)+R\nQ.
Уравнения В 1.12 (г-е) применимы
к любому свойству системы.
Химический потенциал
Из обсуждения уравнения В 1.2 мы
помним, что химический потенциал ц
растворенного вещества — это энергия,
требуемая для добавления одной
молекулы в раствор. На самом деле такая
энергия является свободной энергией,
поэтому химический потенциал может
быть приравнен к изменению
свободной энергии в результате добавления
одного моля растворенного вещества
в раствор. Химический потенциал пли
изменение свободной энергии в
результате растворения вещества до конечной
концентрации N. (в молях на объем)
дается формулой
ЛГ.ц,. = ДС, = -/?Г1пЛГ(. (В1.12ж)
Заметьте, что сравнивая уравнения
Bl.ll (б) и В1.12 (ж), мы приходим
к выводу об эквивалентности N. и С.
Иными словами, раствор с
концентрацией N. представляет собой состояние
С системы.
Для раствора, содержащего
несколько различных веществ:
ДС = -/?Г£1пЛг, =
= -RT\nNiN.2N:i...= (В 1.13)
= -RT)nUNr
Свободная энергия связана с
химическим потенциалом ц простым образом:
u = G/N
Если в этой формуле N означает
число молекул, то химический потенциал
относится к одной молекуле. Если же
N означает число молей, то химический
потенциал относится к молю молекул.
Биологическое стандартное
состояние
Поскольку мы имеем дело с разностью
потенциалов или уровней энергий,
полезно определить стандартное
состояние, по отношению к которым они
измеряются. Если не определено иначе,
температура Т принимается равной
298,15 К (25 °С). Для газов принято
парциальное давление в 1 атмосферу.

Концентрация вещества в водных
растворах равна 1М. Если в реакции
участвуют протоны, биологическое
стандартное состояние имеет рМ 7.
Химические реакции
Запишем реакцию В 1.9 в виде
Л, +А2 + А, +... <г-> В, + В, + Я, +...
где Л — реагенты, a Bt — продукты.
Используя уравнение В 1.13, рассчитаем
изменение свободной энергии реакции,
идущей слева направо, в терминах
концентраций реагентов и продуктов по
формуле:
АС = -ЯЛп ПВ- /?Лп ПЛ =
= -/?Лпх(ПВ/ПЛ) = (В1.14)
= -RT\nK,
(rjicK=[Bl]lB,J}\B.i].../[Al]\A.,}[A.i}...).
Как следует из нашего определения,
в стандартных условиях К=1.
Стандартная свободная энергия AG" определяется
как изменение свободной энергии, когда
реакция начинается со значения К = 1 и
приходит к равновесию при К = /С^иш, где
нет различий в свободной энергии
между продуктами и реагентами:
AG" = -RT\uKv (В 1.15)
Теперь запишем изменение
свободной энергии для реакции,
начинающейся с любого значения К
AG = AG"-(-RT]nK) = /D. ._ .
v (B1.16a)
= AG" + RT\nK
или
дс = -/?ЛпА'|Ш,н/а:. (bi.166)
Обратите внимание, что AG" равно
нулю только если К = 1 (т. е. когда
раин v
произведение концентраций В,В.,ВГ.. =
^А^^А^.у
Если К > 1, AG отрицательна и
реакция протекает спонтанно в стандартных
условиях. Если К < 1, AG положительна
и реакция требует затрат энергии для
протекания в тех же условиях.
Анализ Вант-Гоффа
Уравнение В 1.15 является основой
анализа Вант-Гоффа для систем с двумя
состояниями (Л <-» В). Здесь стандартная
свободная энергия и, соответственно,
энтальпия и энтропия рассчитываются,
исходя из полученных значений
равновесных концентраций двух состояний.
Напомним, что стандартная
свободная энергия, энтальпия и энтропия
связаны уравнением В 1.10:
АС"=ДЯ"-ГА5".
Комбинируя его с уравнением В 1.14,
получим:
1п/С11а1ш =-Д#"/RT + AS"/R, откуда
и найдем уравнение Вант-Гоффа:
мв.г^ = 1гт2д\пкр /?т. (В1.17)
В1.3.2. Изучение связывания
Константы связывания и сродства
(афинности)
Если молекула А связывается с
молекулой В, формируя комплекс ЛВ,
термодинамическая равновесная константа
диссоциации /С, определяется в терминах
равновесных концентраций отдельных
компонентов — [А], [В] и [АВ] и равна:
*<■№ <В118)
Здесь мы следовали условиям,
принятым для экспериментов по изучению
связывания, и записали равновесную

константу как константу диссоциации.
Глядя на уравнение В1.14 и учитывая,
что Kd = 1/К , приходим к выводу, что
константа ассоциации Krmt — это мера
«силы» связывания или сродства
взаимодействия.
Константа Кл соотносится с
химической константой скорости
ассоциации А и В, k , и константой скорости
диссоциации комплекса АВ, k , через
уравнение В 1.19 ( кимми; трип П I.!)):
К =k /k . (B1.19)
a дпес' асе v '
Связывание со многими сайтами
Если молекула А имеет более одного
сайта для связывания с молекулой В, то
существует несколько условий
связывания для В. Говорят, что оно
кооперативно, если заполнение одного сайта
способствует связыванию с другим. Если же,
наоборот, происходит снижение
аффинности другого сайта, то связывание анти-
кооперативно. Все эти процессы можно
идентифицировать и проанализировать
Комментарий В 1.9. Константы
равновесия и скорости
Рассмотрим одноступенчатую реакцию
связывания: ;
Л+В<->АВ.
Скорость прямой реакции, которая
превращает А н В в АВ, равна
К, [А] [В].
Скорость реакции, превращающей АВ
обратно в А и В, равна
k [АВ].
лиге l J
Равновесие достигается, когда эти две
скорости равны и
*аГЛА][В] = £л„сДАВ].
' Перестановка даст нам
^,Arr=[A][B]/[AB] = K„.
экспериментально. В том случае, когда
сайты идентичны и независимы,
константа диссоциации для каждого из них
одинакова и не зависит от того, занят другой
сайт или нет. Если молекула А имеет п
идентичных и независимых сайтов для
лиганда В, то среднее число лигандов п ,
действительно связанных с молекулой А,
дается выражением
«[В]
(В1.20)
*,,+[В1
где [В] — это равновесная
концентрация свободного лиганда. Используя
подход Скэтчарда перепишем это
уравнение как
п
Гв]
п
п
Ж,'
(В1.21)
Среднее число связанных лигандов
п, также как значение концентрации
свободного лиганда [В], получают из
экспериментов по связыванию в
равновесном состоянии. Откладывая на
графике — как функцию от п, получим
1
прямую линию с наклоном —— , пере-
K,i
секающую ось х в точке п, которая дает
число сайтов. Пример графика
Скэтчарда можно найти в Главе В4.
Свободная энергия связывания
Зная Kd, нетрудно вычислить
энергетику взаимодействия между лигандом и
рецептором. Разность свободной
энергии Гиббса между связанным и
несвязанным состояниями можно приписать
различным химическим и физическим
факторам. Вспомним уравнение В 1.10
AG = АН — TAS, а также то, что реакция
протекает спонтанно в направлении

убывания свободной энергии, т. е.
когда AG < 0. Энтальпия АН отражает
изменения свободной энергии системы,
сопровождающие
внутримолекулярные взаимодействия при связывании.
Энтропия А5 дает описание степеней
свободы компонентов, участвующих в
реакции связывания. Произойдет ли
между ними взаимодействие —
зависит от AG, а не от каждого члена по
отдельности. Поэтому при связывании
не исключены значительные
отрицательные (невыгодные) изменения
энтропии, если они компенсируются
соответствующими изменениями
энтальпии, которые, в свою очередь,
могут отражать формирование выгодных
взаимодействий, таких как солевые
мостики и водородные связи.
Поскольку для подавляющего большинства
биологических макромолекул реакции
происходят в водной среде, то
очевидно, вода с ее уникальными свойствами
(см. Главу А2) должна вносить
фундаментальный вклад в такие
взаимодействия (параграф В 1.3.4 и секция В2).
Расчет стандартных изменений
энтальпии и энтропии после
связывания
Вспомним, что для стандартной
свободной энергии реакции уравнение имеет
вид:
bG°=-RT\nKIK
а в терминах Kt
AG" = /?'/'In К,,. (В1.22)
Переписав уравнение В1.10, мы
получим:
1пК,=-^1 + ^. (В1.23)
'' RT R v '
Таким образом, график зависимости
In KA от 1/Т(график Аррениуса) даст
прямую линию с наклоном,
пропорциональным изменению стандартной энтальпии
после связывания. Сопутствующее
изменение стандартной энтропии можно
определить из уравнений В1.10 и В1.22.
Авидность
Когда процесс связывания обусловлен
другими менеезначительными
событиями, происходящими в месте контакта
двух молекул, совокупная сила
связывания называется авидностью и, также
как аффинность, она измеряется через
константу равновесия. То есть
авидность получается в результате учета
аффиниостей для различных сайтов, и
она больше суммы всех аффиниостей
(комментарии И 1.10).
Важным следствием взаимосвязи
между стандартной AG и авидностью
Комментарий В1.10. Авидность
I Стандартная свободная энергия связы-
. вания ряда слабых независимых сайтов
дается выражением:
к
AG = £ AG„ = AGl + AG., + AG,...
n-i
и
AG = £(-/?74nK,„) = I
n=\ .
= -RT-lnKdl-RT-\nKJ3-
-RT InKtl3...
где K(li — равновесная константа
диссоциации связывания /'.
Совокупная А', называется авидностью
реакции. Она получается произведением
(но не суммированием) отдельных
аффиниостей:
Kli = Kll,xKd.,xKiL,x...

является то, что лаже неоолыиое
изменение в одном из сайтов этой цепочки
способно привести к очень большим
изменениям в совокупной константе
равновесия.
В1.3.3. Термодинамика
и связывание
Полный набор термодинамических
уравнений, описывающих систему, можно
получить из функциональной зависимости
энтальпии от температуры, которую, в
принципе, могут дать
калориметрические измерения.
Сканирующая калориметрия
измеряет тепловой обмен в системе при
изменении температуры. Температура (Г)
и энтальпия (Я) - это сопряженные
экстенсивные п интенсивные переменные
(параграф В1.2.1). Когда изменение в
системе, например, сворачивание белка
или связывание лпганда, происходит в
результате изменения температуры, то
соответствующим образом изменяется и
энтальпия. Тепло поглощается (АН > 0),
если реакция вызвана повышением
температуры, или выделяется (АН< 0), если
она результат понижения температуры.
Теплоемкость
В калориметрии макромолекулярных
растворов измеряется величина,
представляющая собой теплоемкость при
постоянном давлении С)
Ср={дН/дТ)р. (В1.24)
Функции, соответствующие
энтальпии и энтропии, Н (Т) и S (Т) получают
интегрированием С, no
температурному диапазону:
т
Н= H(T0) + \CV(T)dT.(В 1.25 а)
S = S(Ti) + j(Cv(T)/T)dT. (B1.25 6)
/;
Мы с вамп видели в параграфе В 1.3.1,
что стандартная температура 7^ в физике
равна абсолютному нулю, поэтому при
постоянном давлении энтальпия
системы при температуре Т отражает
полную энергию, которая необходима для
нагрева системы от абсолютного нуля
до Т. Однако в биофизике обычно
стандартную температуру Г принимают
равной комнатной температуре (298,15 К).
В случае протекания реакции,
члены Н и S в этих уравнениях заменяют
на АН и AS, которые соответствуют
изменениям во время реакции.
Изменение теплоемкости в результате
реакции при температуре Г дается
выражением
\(с1АСР1.
АСТ = АСРТ + J pydT \dT, (B1.26)
где подстрочные индексы указывают
температуру и давление.
Влияние температуры на связывание
Из указанных выше уравнений и
выражения В 1.15, которое соотносит
константу диссоциации с изменением
стандартной свободной энергии, получим
для последней уравнение:
Air;. +TAS; +
ас; =
+ТАС;{\-
1
+-ТТ
2 ■
т,
'Т
,„(%
(dAC;
(В1.27)
v/r
/Т-Т/Т +21п Т/т
Если в данном температурном
диапазоне теплоемкость постоянна,
выражение упрощается до выражения:

ас;. = ah:;. +тхas; + гхас; х
( т / , (t /w (BL28)
которое является формой уравнения
Banm-Гоффа. All'; , AS';, и АС')'
оценивают с помощью нелинейной
аппроксимации AG)', измеренной при разных
температурах.
В1.3.4. Термодинамика переноса
неполярных групп в воду
Рассмотрим характерные
термодинамические эффекты переноса в воду
простых алифатических соединений
на примере типичной пеполярной
молекулы бутана. Для молекулы бутана
величина AG для такого переноса
равна +6 ккал на моль при 25 °С. Как мы
видели ранее, положительная
величина AG означает низкую растворимость
бутана в воде. Однако из этого не
следует; что низкая растворимость
бутана в воде связана с неблагоприятными
изменениями энтальпии. При 25 "С
величина АН невелика (около 0,8 ккал
на моль), что должно
благоприятствовать переходу в вод}'. Однако
перенос сопровождается очень
большим уменьшением энтропии (Д5 =
= 22 кал-град '-моль '), которое
перевешивает с лихвой небольшое
отрицательное значение АН, что, в конечном
счете, приводит к положительному AG
и не дает бутану растворяться в воде.
Напоминаем, что энтропия входит в
свободную энергию со знаком минус
(уравнение В1.10).
Причина сильного падения
энтропии проста: молекула бутана
экранирует своей пеполярной поверхностью
часть водного пространства и
частично «замораживает» примыкающие
к ней водородные связи. Это и приво-
A(j^—— /
^^ /
АН/
/ /
/ /
/ /
/ TAS/
/ /
/ /
+8
+6
+4
+2 'л
0 1
-2 |
-4
-6
-8
0 50 100 150
Температура (°С)
Рис. В1.5. Зависимость свободной энергии
АО' и ее составляющих А// и AS от
температуры для переноса пентана и воду. Величины
даны в ккал в расчете на моль переносимых
молекул пентана (Privalov and Gill, 1988)
дит к сильному энтропийному эффекту
( комментарий 1! 1.1 1 ).
Гидрофобный эффект сильно
зависит от температуры. На рисунке HI.5
показана термодинамика переноса другой
неполярной молекулы, пентана в
широком интервале температур. Как видно,
AG растет с ростом температуры,
достигает своего максимума в точке, где
AS = 0. Особенно сильно температура
Комментарий В 1.1 1. Гидрофобность
и доступная поверхность
Анализ характерных
термодинамических параметров переноса неполярных ,
групп в воду показывает, что AG растет с
размером пеполярной труппы. Под
размером пеполярной группы следует понимать
доступную для воды поверхность полярных
групп. Та же закономерность имеет место
: для аминокислотных остатков, если
только считать только ту доступную для воды
поверхность, которая создается истинными
неполярными атомами.

Интермедиат с
высокой энергией
Начальное
состояние ^Q
Конечное состояние
*■
Конформационная координата
Рис. Bl.(). Профиль свободной энергии
реакции или конформационного изменения.
Е* — это энергия активации или энтальпия
активации, в зависимости от используемой
теории (см.текст)
леть. Конформационное или другое
изменение зависит значения
равновесного состояния AG, которое должно быть
меньше нуля, однако скорость
протекания реакции обусловлена высотой
энергетического барьера (рис. 151.6).
Наблюдаемые при различных
температурах временные константы
реакции или изменения являются мерами
соответствующих термодинамических
параметров.
Зависимость константы скорости k
от температуры дается уравнением Ар-
рениуса:
& = /lexp
'11
[RT )
(В1.31)
сказывается на величине и знаке
компонент свободной энергии. Если при
низкой температуре гидрофобный эффект
создается энтропией, то при
повышении температуры все большую роль
начинает играть энергия разрушающихся
водородных связей. При температуре
свыше 140 "С, когда большинство
связей разрушено, гидрофобный эффект
выходит на плато.
Температурная зависимость,
представленная на рисунке В1.5, играет
важную роль в понимании
гидрофобного эффекта в глобулярных белках,
поскольку перенос неполярной
группы в воду моделирует разворачивание
белковой глобулы, при котором часть
гидрофобных аминокислотных
остатков оказывается в водном окружении
(см. секцию В2.4).
В1.3.4. Термодинамика и активация
Термодинамический путь реакции
(конформационное изменения в
молекуле) часто включает энергетический
барьер, который необходимо преодо-
где А — константа. В статистической
термодинамике А включает в себя
вероятность изменения (например,
вероятность столкновения двух партнеров
по взаимодействию), а Е* является
энергией активации. В теории
переходного состояния А зависит от энтропии
активации, а Е* от энтальпии
активации. Величина А определяется кванто-
во-механпческой моделью переходного
состояния Эйринга как:
knT (AS'
А = -
-ехр
R
(В1.32)
где kB — константа Больцмана, h —
константа Планка, a AS* — энтропия
активации. Комбинируя уравнения В 1.31 и
В1.32 и подставляя энтальпию
активации Е* = АН*, получим
In
— = ln
Т
ku\ AS
h ) R
AH*
RT
.(B1.33)
Энтальпию и энтропию активации
можно получить из наклона и точки
пересечения линии In (k/T), отложенной
против \/Т (график Эйринга).

B1.4. Перечень ключевых идей
в Классическая термодинамика — это феноменологическая наука, которая
занимается описанием систем в определенных условиях; растворы макромолекул
можно считать термодинамическими системами.
• Адиабатическая система идеально изолирована от внешних воздействий;
изотермическая система находится в тесном тепловом контакте со своим
окружением.
• Две системы пребывают в одинаковых состояниях, когда все измеренные
величины, характеризующие их свойства, одинаковы.
• Заключенная в адиабатический сосуд система со временем достигнет
состояния, в котором ее свойства больше не будут меняться; тогда говорят, что
система находится в равновесии.
• Нулевой закон термодинамики утверждает, что если два тела А и В по
отдельности находятся в равновесии с третьим телом В, тогда А и В тоже находятся
в равновесии друг с другом.
• Первый закон термодинамики гласит, что величина работы, требуемой для
изменения системы от начального до конечного состояний, зависит
исключительно от производимого изменения, а не от промежуточных состояний, через
которые система может пройти.
• Согласно второму закону, невозможно создать машину, которая, работая
циклически, произведет другой эффект кроме передачи тепла от горячего тела
к холодному.
• Третий закон термодинамики гласит, что энтропия любого тела равна нулю
при нулевой температуре на абсолютной шкале.
" Третий закон устанавливает нулевую точку для энтропии и абсолютной
температурной шкалы (шкалы Кельвина) и позволяет рассчитать константы
равновесия, исходя из тепловых свойств реагентов и полной внутренней энергии,
определяемых калориметрически.
' Энтропия системы — это функция состояния, которая растет со временем, пока
не достигнет максимума в состоянии равновесия; энтропия напрямую зависит
от числа различных доступных системе конфигураций, т. е. является мерой
беспорядка в системе.
• Энтальпия системы при температуре Т отражает полную энергию,
необходимую для того, чтобы нагреть тело от абсолютного нуля до Г; изменение энталь-

ппп во время химической реакции обусловлено поглощенным или выделенным
теплом при разрыве или образовании связей.
• Свободная энергия Гиббса — это часть энергии системы, которая не
расходуется на заселение различных энтропийных конфигураций; если система
обменивается энергией со своим окружением, то она будет изменяться для того, чтобы
максимизировать свою свободную энергию.
• Когда два состояния системы находятся в равновесии, разность их свободных
энергий равна нулю.
• Все термодинамические переменные системы можно записать в терминах
функции распределения, которая определяется как сумма статистических вкладов
всех доступных системе состояний.
• Химический потенциал растворенного вещества — это свободная энергия,
необходимая для добавления одного моля или одной молекулы этого вещества
в раствор.
• Стандартное биологическое состояние определяется при температуре 298,15 К
(25 °С), парциальном давлении газов в 1 атмосферу, концентрации вещества
в водном растворе 1 М и рН 7.
• Константа равновесия химической реакции равна математическому
произведению концентраций продуктов реакции, деленному на произведение
концентраций реагентов, когда свободные энергии тех и других равны.
• Уравнение Вант-Гоффа соотносит изменение энтальпии с константой
равновесия химической реакции.
• Константа равновесия реакции ассоциации является мерой силы связывания
или аффинностью взаимодействия.
• Связывание называют кооперативным, если заполнение одного сайта
способствует связыванию с другим; если же, наоборот, происходит снижение
аффинности другого сайта, то оно антикооперативно.
• В том случае, когда сайты идентичны и независимы, константа диссоциации для
каждого из них одинакова и не зависит от того, занят другой сайт или нет.
• График Скэтчарда соотносит число сайтов связывания с константой
диссоциации и концентрацией свободных лигандов.
• Термодинамические равновесные параметры можно получить из графика Ар-
рениуса, который соотносит константы диссоциации с температурой.

• Когда процесс связывания обусловлен взаимосвязью других менее
значительных событий, происходящих в месте контакта двух молекул, совокупная сила
связывания называется авидностью, которая также как аффинность
измеряется через константу равновесия.
• Калориметрия растворов макромолекул основана на измерении теплоемкости
при постоянном давлении.
• В калориметрии соответствующие функции энтальпии и энтропии получают
интегрированием теплоемкости, деленной на температуру, по всему
температурному диапазону эксперимента.
• Скорость реакции или конформационного изменения зависит от высоты
энергетического барьера активации на пути между состояниями с большей и
меньшей свободной энергией; термодинамические параметры активации можно
получить из графика Эйринга, который соотносит константы скорости с
температурой.
Литература для дальнейшего чтения
Feynman R. P., Leighton R. В., Sands M. The Feynman lectures on physic,
Volume 1. Addison Wesley, Reading Massachusetts, 1963.
Price N. C, Dzaek R. A., Ratclijfe R. C, Wormald M. R. Principles and problems in
physical chemistry for biochemists. Oxford University Press. 3rd Edition. Oxford, 2001.
Литература, добавленная редактором русского перевода
Финкелыитейн А. В. и Птицын О. Б. Физика белка: курс лекций. М.: КДУ,
2007.

Глава В2
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ
КАЛОРИМЕТРИЯ
82.1. Исторический обзор
Исследования белков с помощью
дифференциальной сканирующей
калориметрии берут свое начало в середине
1960-х гг., когда инструменты,
обладающие достаточной чувствительностью,
были разработаны независимо друг от
друга Петром Приваловым и Стенли
Гиллом (Peter. Privalov, and Stanly
Gill). К этому времени в биофизике
накопилось множество проблем, которые
нельзя было решить без измерения
небольших тепловых эффектов в
относительно разбавленных растворах. В
последующие десятилетия с развитием все
более чувствительных калориметров
стали возможны эксперименты по
определению термодинамических
переменных с все более высокой
точностью. Появились микрокалориметры,
а с наступлением нового тысячелетия
сделаны заявки на нанокалориметры
(приставки микро и нано указывают на
точность, с которой можно измерять
тепловые эффекты этими приборами).
82.2. Основы теории
Полное количественное
термодинамическое описание макромолекулы
в растворе в данном температурном
диапазоне можно получить из
измерения зависимости ее парциальной
удельной теплоемкости при
постоянном давлении Ср от температуры
методом дифференциальной
сканирующей калориметрии. Из Главы В1 мы
помним, что
MI = JACP(T)dT, (B2.1a)
AS = jACp(T) dT, (B2.16)
где ДСр — это изменение теплоемкости
вследствие определенного макромо-
лекулярного процесса (например,
разворачивания белка), а АН и Д5 —
соответствующие изменения энтальпии
и энтропии.
В2.3. Экспериментальные
подходы
В2.3.1. Инструменты
Общие требования к
дифференциальному сканирующему калориметру для
исследования биологических
макромолекул можно сформулировать
следующим образом: высокая чувствитель-

ность и точность, работа в диапазоне
отрицательных и положительных
температур, возможность работы в режиме
как повышения, так и понижения
температуры.
В настоящее время существуют
коммерчески доступные инструменты
различных производителей. Согласно
их характеристикам, на одно измерение
требуется около 50-500 мкг материала,
температурный диапазон составляет
от -10 °С до 130 "С, чувствительность
приближается к 10 мкДж • градус1.
Измерения при температурах более 100 °С
требуют повышенного давления. Все
калориметры оснащены компьютерным
управлением.
Обратимость процессов плавления
должна контролироваться
сканированием вниз и вверх по температурной
шкале. Вследствие возможных
вторичных эффектов, таких как
агрегация или химическая деградация при
высокой температуре, необходимо
соблюдать определенную
предосторожность.
Калориметрические измерения
в водных растворах вплоть до -10 °С
(в переохлажденных растворах) менее
распространены. Однако они имеют
особый интерес, так как позволяют
отслеживать некоторые процессы,такие
как холодовая денатурация, полное
сворачивание а-спирали или одноце-
почечного олигонуклеотида.
Измерения свыше 100 °С сегодня рутинны,
поскольку разработаны специальные
ячейки для работы под давлением.
Измерения при высокой температуре,
вплоть до 130 °С (выше этой отметки
происходит быстрая химическая
деградация биологических
макромолекул), важны для исследования белков
и комплексов гипертермофильных
организмов и мутантов, которые
остаются стабильными и активными при
температуре свыше 100 "С.
В2.3.2. Чувствительность
приборов и точность измерения
теплоемкости
На практике в калориметре
измеряется тепловая мощность, которую следует
подать в одну из ячеек калориметра, с
тем чтобы разность температур между
ячейками калориметра
поддерживалась равной нулю. Следует различать
чувствительность и точность, последняя
определяется, в основном,
воспроизводимостью базовой (нулевой) линии
прибора. Последняя особенно важна при
исследовании небольших белков.
Переменная Ср (Т) набп,
определяемая методом дифференциальной
сканирующей калориметрии, — это
температурная зависимость разности
теплоемкости между раствором
макромолекул и тем же объемом чистого
растворителя при постоянном
давлении. Если теплоемкость растворителя
выше теплоемкости раствора того же
объема, то разность будет
отрицательной. Она соотносится с парциальной
удельной теплоемкостью
макромолекулы как:
Ц'М )на6л ~
= Ср(Г)М0,/п(ГХ,01.- (В2.2)
где С; (Y) — это парциальная удельная
теплоемкость, т. е. теплоемкость на
единицу массы растворенных
макромолекул при температуре Т, m (^)MI)1 — масса
макромолекул в измерительной ячейке
при температуре Т, С (Т) —
парциальная удельная теплоемкость
растворителя при температуре Т, a Am (Г) чсти —
это масса растворителя, вытесненного

объемом макромолекул. Массу
вытесненного растворителя можно
подсчитать исходя из парциальных удельных
объемов макромолекулы и
растворителя v (Т) и v (Т)
4 ' мол. v ' р;ктн
Комбинируя уравнения В2.2 и В2.3
и подставляя типичные значения этих
параметров, мы увидим, что наблюда-
Комментарий В2.1. Вклады
парциальной теплоемкости
В экспериментах по дифференциальной ,
сканирующей микрокалориметрпи бел- I
ковых растворов требуется очень высокая
чувствительность и точность, поскольку
наблюдаемый сигнал очень мал. Рассчи- !
таем с помощью уравнения В2.2 величи- .
ну избыточной теплоемкости для белка и '
растворителя в водном растворе объемом
1 см3, содержащего 1 мг макромолекул.
Парциальная удельная теплоемкость бел- ■
ка взята равной 2 Дж-К'т1, а парциаль- *
ный удельный объем белка — 0,73 см3-г'.
Парциальная удельная теплоемкость воды
равна 4,2 Дж-К'т'1 (1 калория на градус на j
грамм), а ее парциальный удельный объем i
равен 1 см3т"'. !
СР(Т) тп(Т) =2хЮ-! Дж-К'1
Р v ' МОЛ *• ' МОЛ. ^
CJT) Am(T) =
Р v ' раств. v x расти.
= 4,2 хЮ3х 0,73 Дж-К'1 !
Ср(Т)иа6л = -1х\01Цж-К-. |
Теплоемкость, измеренная для 1 см3
раствора, будет равна -4 Дж-К '-г1.
Следовательно, разность теплоемкостей,
, обусловленная присутствием макромо-
I лекул, — это -10 :i от теплоемкости
растворителя. Для измерений с точностью в 0,1 % ;
чувствительность инструмента должна '
быть порядка 10"6.
емая разность теплоемкости раствора
и растворителя очень мала
(комментарии В2.1).
В2.3.3. Требования к образцам
Образцы растворов макромолекул для
калориметрических измерении должны
быть чистыми, гомогенными и
содержать не более 5% посторонних
примесей. Абсолютная концентрация должна
быть известна с точностью до
нескольких процентов, макромолекулы
должны оставаться растворимыми во всем
температурном диапазоне
эксперимента. Раствор должен быть тщательно
диализован против растворителя, а для
снижения риска агрегации —
достаточно разбавленным.
На первых этапах развития метода
дифференциальной сканирующей
калориметрии, когда разрабатывались
фундаментальные основы термодинамики
процессов разворачи ваш ш/с ворач 11 ва-
ния белков, измерительные ячейки
имели объем порядка одного см:!, стандартная
концентрация макромолекул составляла
1 мгсм_), что требовало 1 мг белка. С тех
пор характеристики инструментов
заметно выросли за счет аппаратных и
программных новшеств и теперь в
благоприятных случаях возможны измерения
образца белка в количестве 50-200 мкг.
В2.4. Теплоемкость белков
В2.4.1. Зависимость теплоемкости
от температуры
Типичная кривая зависимости
теплоемкости от температуры, полученная
для небольшого белка с помощью
дифференциальной сканирующей
калориметрии, показана на рисунке В2.1.

Натпвпому состоянию чаще всего
приписывается статус эталонного, по
отношению к которому
рассчитываются все термодинамические параметры
системы (см. Главу В1), поэтому столь
важный параметр как ДС,, может быть
определен непосредственно из кривой
на рисунке 132.1. Вклады в ДС,, можно
разделить па две составляющие:
<АС"(П>= (В2.4)
= 8C,.(7-)„+5C„<7V
Первая относится собственно к
избыточном теплоемкости системы,
тогда как вторая описывает сдвиг базовой
линии (сигмоидальная кривая
между двумя пунктирными линиями на
рис. B2.I).
В2.4.2. Анализ кривой
теплоемкости с помощью функции
распределения
Согласно аналитическому подходу,
описанному в Главе В1, усредненное
значение термодинамической
переменной <а> выражается в виде
суммы вкладов различных состояний
системы, которые, в свою очередь, можно
представить в терминах функции
распределения (уравнения Bl.ll е, Bl.ll б
в главе В1):
.V
Pj=ex[>(-AG,/RT)/Q.
где Q — функция распределения, Р —
величина относительной
заселенности, а а. — термодинамическая
переменная, связанная с состоянием j. Если
состояниеу'=0 (как правило нативнос)
принять за эталонное состояние и
суммирование производить оту = 1 до
N, то <а> = <ДЯ> будет представлять
О 20 40 60 80 100
Температура (°С)
Рис. В2.1. Молярная теплоемкость белка Ср
как функция температуры С ии С и—
молярные удельные теплоемкости развернутого и
нативного состояний. АС — это изменение
р
теплоемкости, связанное с переходом. Если
при температуре выше основного перехода
существует множество состояний, то
избыточная теплоемкость выражается как среднее по
всем этим состояниям <ДСр>
собой избыточную энтальпию,
связанную с заселением других
энергетических уровней, отличных от нативного.
Надо отметить, что, строго говоря, все
величины, представленные на
рисунке В2.1 и в уравнении В2.4 следует
заключить в скобки <> (усреднить),
поскольку может существовать целый
ансамбль нативных и
денатурированных состояний для данного белка.
По определению теплоемкости
можно записать
< Д Ср > = < С - С, п > =
v " '"' (В2.5)
= (Э<ДЯ>/Э7")Р.
По аналогии с уравнением В2.4
разложим правую часть уравнения В2.5 и
выразим его члены как суммы
различных состояний:
<ДСР> = ХДЯ,(ЭР,/ЭГ)|> +
'"' (В2.6)
+£/>AC[v = 5c;r+5c;;".

Первый член называется
избыточным теплопоглощением и относится к
энергии, которую нужно затратить,
чтобы изменить распределение молекул по
состояниям, а второй член называется
собственной теплоемкостью и отражает
распределение молекул по состояниям
с разными теилоемкостями.
Анализ кривой с помощью функции
распределения является общепринятым
и применяется к любой (чаще всего
мономерной) системе в равновесии,
независимо от механизмов перехода и от числа
промежуточных состояний. Под
мономерной системой понимается система,
в которой число молекул в растворе не
меняется в ходе разворачивания.
В2.4.3. Кооперативность плавления
Денатурация небольших белков
является кооперативным переходом с
одновременным достаточно резким «5-об-
разным» изменением практически всех
характеристик молекулы (см. например
рисунок Г9.11). «5-образность»
экспериментальных кривых доказывает, что
соответствующие характеристики
молекулы меняются от тех, которые
характерны для нативного белка, до тех,
Комментарий В2.2.
Денатурирующие агенты
Денатурировать белок можно разными i
способами: добавлением в раствор
денатурирующих агентов типа гуанидингидлохлори-
да или мочевины, нарушающих водородные
связи в белке или додецилсульфата натрия,
гидрофобные хвосты которых проникают в {
■ молекулу белка и разрушают его ядро. При '■■
этом молекулы белков принимают
специфические конформации, обсуждаемые в
соответствующих главах этой книги (параграфы
Г4.10.5, Г5.6.1, Г9.5.3). Кроме того, сильное ;
изменение рН также может вызывать кис- j
лую или щелочную денатурацию белка.
которые характерны для
денатурированного белка, а узость кривых
свидетельствует о том, что она охватывает
сразу много аминокислотных остатков
в белке (icn.MMi'ii lapini l^.l!). Однако в
отличие от истинного фазового
перехода, наблюдающегося, например, при
плавлении кристаллов, «5-образность»
перехода имеет не нулевую, а конечную
ширину. Последнее означает, что этот
переход охватывает не всю
макроскопическую систему, а только ее часть.
Главный вопрос, который здесь
возникает, прост: «Какую часть молекулы
затрагивает такой переход?» и можно ли
получить ответ на него из данных
сканирующей микрокалориметрии.
В2.4.4. Конформационные
переходы, при которых
калориметрическая энтальпия
и энтальпия Вант-Гоффа равны
между собой
Первые исследования небольших
однодоменных белков с помощью
дифференциальной сканирующей
калориметрии установили, что
разворачивание их структуры под
воздействием температуры можно
удовлетворительно описать в рамках
модели кооперативного перехода
между двумя состояниями. Это
означает, что заселенности всех
промежуточных состояний крайне малы. Такой
переход получил название «все или
ничего».
Моделирование процесса
перехода основано на сравнении
калориметрической энтальпии перехода,
полученной интегрированием кривой
плавления, с величиной,
вычисленной согласно уравнению
Вант-Гоффа (см.Главу В1). Если оба значения
совпадают, то считается, что переход

происходит только между двумя
состояниями, а вклад интермедиатов
пренебрежительно мал.
Экспериментальная
калориметрическая энтальпия перехода дается
выражением
АЯ11,,.,К,.„=|ДС,,„,Р1К(,,(ГУГ, (В2.7)
где АС,, (Г) — это величина пика
^ Р, пер, :»!«•][ ^ '
перехода над экспериментальной
базовой линией ДСр ы 11Х,(Г) (см. уравнение
В2.4ирпс. В2.1).'1ХР
Уравнение Вант-Гоффа соотносит
энтальпию и константу равновесия
между двумя состояниями
(комментарии И2..Ч):
RT2d\nKe/dT. (B2.8)
АН.,
Из уравнения видно, энтальпия
перехода равна наклону кривой
зависимости In К от обратной температуры
1/RT.
Мы помним из Главы В1, что для
одностадийного перехода А <-» В
константа равновесия при температуре Т
выражается как:
[В(Г)]
К(Т) =
[А(Г)]'
(В2.9)
где [5(Г)] и [Л(Г)] — равновесные
концентрации состояний. Таким образом,
константу равновесия К(Т) можно
измерить в любом эксперименте,
который дает отношение [В(Т)]/[А(Т)] как
функцию температуры. Например, К( Т)
можно рассчитать из спектров
кругового дихроизма, если состояния А и В
значительно различаются, как в случае
с разворачиванием белков.
Предполагая существование только
двух состояний, можно получить
отношение значений их заселенностей
непосредственно из формы кривой
плавления.
Комментарий В2.3. Константы
равновесия и термодинамические
переменные
Мы помним из раздела В1.3.1, что
AG = -RT\nK.
Комбинируя это выражение
с фундаментальными соотношением
AG = АН-Т AS,
мы получим
\nK = -AH/RT + AS/R.
I Из него получается уравнение Вант-
■ Гоффа:
\ AH,n=RT2d\nK/dT.
! Величина ДН вычисляется из наклона
кривой зависимости In К от обратной
температуры \/RT.
На рисунке В2.2 а показана
избыточная кривая теплоемкости белка бар-
назы, а на рисунке В2.2 б ее интеграл
<АН (Т)>. Как видно из рисунка В2.2 б
калориметрическое значение
теплового эффекта находится из амплитуды
функции <АН (Т)>. С другой стороны
значение Вант-Гоффовой энтальпии
определяется из производной в точке
Т но формуле:
г<аср(7;)>
<АЯ(ГИ)>
, (В28.а)
где <АС (Т )> — значение теплоемкости
при температуре перехода Тт, а ДНт —
полное тепло, поглощенное в этой точке.
Следует отметить, что Вант-Гоффо-
ва энтальпия может быть определена из
производной температурной
зависимости любой функции состояния
(например, вязкости или оптической плотности)
в предположении об одностадийное™
перехода. Однако только калориметрия
позволяет одновременно определить оба
значения энтальпии и, в случае их
равенства, сделать заключение о
справедливости модели двух состояний.

600
.—.
о
Е
т 400
л
Р
jg- 200
^
V
0
I
i I
лН1
i
,<TJ
1 1
*
1'
It
,m i
tg(")
1 i '
-<\C„(TJ> ;
— -
.
-
.
.
-
;
:
i , -
310 320 330 340
T(K)
a 6
Pin-. 152.2. Пахожденнезнталыши Вант-Гоффа n:i формы Kpniioii плавления: а — температурная
зависимость теплоемкости бариазы при рЦ-=4,5 (Martinez et al.. 1994); 6 интеграл функции
<\C > = C\(T) — С, (Г)- Т (середина перехода) соответствует условию \(7(7" ) = 0
Более современный подход заклю-
чается в подгонке экспериментальной
кривой теплоемкости по формулам,
записанным для модели двух состояний с
помощью минимизационных алгоритмов.
В2.4.5. Конформационные
переходы, при которых
калориметрическая энтальпия и
энтальпия Вант-Гоффа не равны
между собой
Для мономолекулярной одностадийной
реакции кривая плавления,
определяемая с помощью дифференциальной
сканирующей калориметрии, отражает
действительное изменение тепла,
связанное с конформационным переходом
при денатурации моля макромолекулы,
а расчетная энтальпия Вант-Гоффа
соответствует количеству тепла, связанному
с плавлением одного моля
кооперативной единицы в макромолекуле.
Поэтому, когда кооперативный домен меньше
молекулы, как в случае с мультидомен-
ными белками, то энтальпия
Вант-Гоффа меньше калориметрической. Если же
энтальпия Вант-Гоффа больше
калориметрической, то это указывает на то, что
в случае ооратимости кооперативный
домен больше молекулы, т. е. является
доказательством присутствия
межмолекулярных взаимодействий, таких как
олпгомеризация (рис. В2.3).
Во всех случаях, когда эти
энтальпии не равны, переход идет через
промежуточные состояния
В2.4.6. Интермедиаты в процессе
сворачивания
Мультидоменные белки
Уравнения функции распределения,
полученные в секции В 1.3, используются
для расчета модельных функций
теплоемкости переходов в тех случаях, когда
заселено более двух состояний. Анализ
экспериментальных кривых с помощью
таких функций является эффективным
подходом для детального анализа
термодинамических данных
дифференциальной сканирующей калориметрии.
Точность сегодняшних калориметров
такова, что позволяет наблюдать и
интерпретировать достаточно малые
различия между модельной и
экспериментальной кривыми (рис. 152.1).

A^vth - A/-/tr
AHv,^ = 0.5A/-/tr
= 2AHtr
Рис. 152.А. Калориметрическая :>нталышя и энтальпия Вант-Гоффа для однодоменных, двухдо-
мениых макромолекул и их димероп
Ли.чоцим куриного яйца является
двухдоменным белком, и как
свидетельствуют данные, представленные на
рисунке- В2.4, температурная денатурация
обоих его доменов происходит не совсем
кооперативно. В родственном белке — ли-
зоциме лошади, независимость процесса
разворачивания обоих доменов
выражена еще больше (см. рис. В2.8).
Существуют ли заселенные
интермедиаты сворачивания
в однодоменных белках?
В настоящее время считается, что
процесс сворачивания небольших
однодоменных белков должен проходить по
крайней мере через одно переходное
состояние, энергия которого выше, чем
у нативпого и денатурированного
состояний. В качестве такого интерме-
диата была предложена расплавленная
глобула, которая, как считают некоторые
исследователи, может наблюдаться и в
определенных равновесных условиях.
Она может образоваться в результате
быстрого сворачивания цени в
компактную жпдкообразную структуру, которая
затем переходит в пативное состояние.
Существование такого состояния
позволило бы разрешить парадокс Ле-
винталя (к'пммгн lapiiii П2.1), значи-
телыюсужая поиск конфигурационного
пространства. Однакосвойства
расплавленной глобулы и само ее
существование ДОВОЛЬНО СПОРНЫ (l>'i.\:\|r|ir;ipii:"|
1)2.Г)). Различные авторы определяли
по-разному ее динамику и структуру.
Так П. Привалов, анализируя
калориметрические данные в поиске интерме-
диатов процесса сворачивания, сделал
вывод, что эти промежуточные
состояния представляют собой либо
неправильно свернутые формы,
образующиеся в неблагоприятных условиях, либо
частично развернутые структуры,
которые сохранили правильно свернутые
участки молекулы. Эти участки
обладают всеми характерными чертами
кооперативно сворачивающихся доменов.
Комментарий В2.4. Парадокс
Левинталя
Скорость сворачивания полипептпдной
цепи в уникальную трехмерную
белковую структуру, определяемую
аминокислотной последовательностью, исключает
вероятность того, что этот процесс имеет
стохастическую природу, где молекула
перебирает огромное число всевозможных
конформацпи. Это утверждение известно
как парадокс Левинталя.

Комментарий 2.5. Расплавленная
глобула
Свойства расплавленной глобулы
достаточно противоречивы. Так, в ней
существует развитая вторичная структура,
практически в том же количестве, как и в
нативном белке. Она слегка менее
компактна - ее гидродинамический объем всего на
30 °о больше, чем объем в нативном
состоянии. Зато в ней почти полностью
отсутствует упорядоченность боковых групп,
являющаяся характерной для натнвного белка,
а довольно высокая скорость водородного
обмена в расплавленной глобуле
свидетельствует о том, что некоторое количество
молекул растворителя могут свободно
проникать вглубь нее. Эти противоречия, в
известной степени, примиряются
предположением о неоднородности расплавленной
глобулы, а именно, введением
представления о более или менее нативоиодобного
ядра и опушенной оболочки. Но даже этой
простой модели противоречат некоторые
эксперименты по круговому дихроизму и
ядерному магнитному резонансу (Фин-
кельштейн, 2007).
Свободная энергия промежуточного
состояния выше нативного состояния,
или денатурированного, или их обоих,
поэтому его заселенность всегда мала.
В2.4.7. Влияние мутаций в белках
на кривые плавления
Замена одного или двух
аминокислотных остатков в белке может приводить
к значительным различиям в
экспериментальных кривых плавления (см.
рис. В2.4). Так и хочется приписать эн-
тальпийный или энтропийный вклад
замен аминокислотных остатков
изменению белковой стабильности. Однако
делать это нужно с величайшей
осторожностью, поскольку изменение
стабильности может с таким же успехом быть
результатом изменения кооперативное -
30 40 50 60 70 S0
Температура (°С)
Рис. В2.-1. Экспериментальные и модельные
кривые плавления лизоцима куриного яйца.
Кривые, полученные экспериментально при
рН 2,5, показаны сплошными линиями.
Пунктирные линии — результат компьютерного
моделирования: вверху переход с двумя
состояниями, внизу переход с тремя состояниями
(Privalovetal., 1995)
ти процесса разворачивания. Такое
изменение стабильности может указывать
на то, что аминокислотная замена
существенно влияет на междоменные
взаимодействия внутри белка. Обратите
внимание на то, как замена серина на аланин в
лизоциме Т4 не только дестабилизирует
белок (он разворачивается при более
низкой температуре, чем белок дикого
типа), но и увеличивает полуширину
перехода, тем самым указывая на
снижение кооперативности (рис. В2.5).
В2.4.8. Сложные мультидоменные
белки
Кривую зависимости теплоемкости от
температуры для белков со сложной

структурой можно разделить на
составляющие кривые, которые
соответствуют переходам между различными
состояниями. Такое разделение
делается без всяких априорных посылок,
используя специальные компьютерные
алгоритмы. Надежность данного
анализа (некоторые авторы называют его «де-
конволюцией», но это не деконволюция
в строгом смысле слова, а
аппроксимация) зависит от точности определения
экспериментальной кривой плавления
и, следовательно, от
микрокалориметра. В идеале каждый компонент
кривой соответствует переходу между
двумя состояниями со своими
термодинамическими параметрами.
Компоненты кривой плавления могут быть
соотнесены со структурными
единицами при обработке модельной
информации о белке или с помощью
исследования его фрагментов. Информацию о
структурной связи между фрагментами
можно получить из данных по
взаимозависимости температуры и энт&чьпии
отдельных компонентов кривой при
изменении условий, например рН. Этот
метод с успехом применялся для муль-
тидоменных белков, комплексов белок-
белок и белок-нуклеиновая кислота,
а также для фибриллярных белковых
структур, таких как мышечные белки и
коллагены. Калориметрический анализ
процесса плавления миозина в качестве
примера показан на рисунке В2.6.
Как видно из этого рисунка,
сложность кривой плавления нарастаете
увеличением длины фрагмента от LF-3 до
LMM. Все кривые могут быть
разложены на сумму пиков, каждый из которых
описывается переходом между двумя
состояниями. Затем каждому пику
приписывается отдельная кооперативная
единица в структуре путем
приблизительной оценки размера кооперативного
160-
140 -
Температура (°С)
Рис. 132.5. Кривые плавления лизоцима фага
Т4. Сплошной линией обозначены данные,
полученные при рН 2,8; 3,0; 3,5; 3.7. Кружками
показаны данные для мутанта белка S44A при
pH4,0(Carraetal., 1996)
блока из энтальпии перехода, принимая
значение удельной энтальпии
плавления постоянной по всей длине
молекулы. Наименее стабильный
кооперативный блок (компонент 1) лежит близко к
середине молекулы. Примечательно, что
блок, соответствующий компоненту 4,
отделен от других блоков эластичными
областями (легко расщепляемыми про-
теазами и заштрихованными на рисунке
В2.6), которые не принимают участие в
процессе плавления. Для более точной
структурной интерпретации
результатов деконволюции весьма желательно
использовать дополнительные,
например оптические, данные.
В2.4.9. Влияние растворителя
на кривые плавления белков
Растворитель играет важную роль
в стабилизации конформационных (на-
тивное п свернутое) состояний белка
(см. Главу В1), а также в определении
природы перехода между ними. Взаи-

t-^TMM S-1-»
-« — тмм *J
J I I I I I I I I I l_
30 40 50 60 70 30 40 50 60 70
Температура (°С)
Рис. В2.6. Калориметрический анализ миозина.
Верхняя панель: схематический вид молекулы миозина. Заштрихованные места подвержены
полному нротеолизу. ЛММ и ТММ (легкий п тяжелый меромиозпн) являются основными
фрагментами после обработки трипсином или пепсином. Фрагмент ЛММ далее расщепляется
паиаином, как это показано на рисунке. Там же можно наблюдать фрагменты дальнейшего
расщепления ЛММ с помощью трипсина. Пронумерованные фигурные скобки обозначают
обнаруженные с помощью калориметрического анализа кооперативные блоки, которые показаны на
нижней панели.
Нижняя панель: кривые плавления фрагментов миозина в 25 шМ калий фосфатном буфере, рН
6,5 и 0,5 М КС1:
я — фрагмент ЛММ после трппсинового расщепления;
б — фрагмент ЛММ после пепсинового расщепления;
в — фрагмент LF-3;
г — нефрагментрированная молекула миозина ТР.
Пики переходов между двумя состояниями пронумерованы согласно возрастанию стабильности
блоков и приписаны различным элементам структуры, как показано на верхней панели
(Privalov, 1982)

модействия белок-растворитель могут
быть специфическими, как в случае
со связыванием ионов с отдельными
участками, пли более общими, которые,
в свою очередь, влияют па гидратацию
полярных и неполярных групп белка.
Стабилизация структуры через
связывание низкомолекулярных
лигандов
Лпзоцим лошади состоит из двух
доменов, которые разворачиваются квазп-
независимо и дают два пика на кривой
плавления. Стабильность одного из
доменов изменяется благодаря
связыванию попов кальция, поэтому положение
соответствующего пика (первого), его
высота и ширина зависят от
концентрации СаС1.,в растворителе (рис. 132.7).
Влияние рН
Температура разворачивания барназы
(Гп) возрастает от 20 °С при рН 1,8 до
55 "С при рН 5,5 (рис. В2.8).
Вспомним, что знание функции
<ДСр (Т)> обеспечивает нам полную
характеристику термодинамики
перехода. Однако чистое нативное и
развернутое состояния обычно реализуются в
узких температурных диапазонах,
поэтому температурные зависимости Сt n
и Сt u можно оценить только
экстраполяцией или с помощью модельных
расчетов (в качестве примера см.
пунктирные и пунктирно-точечные линии на
рис. В2.7 п В2.8). Протоны также
являются лигандами, и они сильно влияют
на стабильность белка (7*), если в пос-
ледпем есть группы с аномальным
значением рК. Вариации рН, сдвигая пик
теплопоглощения, позволяют получить
семейство кривых, как это показано на
рисунке В2.8, и таким образом опреде-
50 -л
: №
: ОЬ^4
40 : //
"20 :
10 1 . . i , |
260 300 340 380
Температура (°К)
Рис. В2.7. Кривые плавления .шзоцпма
лошади при рН 4,5 в присутствии
различных концентрации CaCI.,: кривая 1) 0,00 мМ,
2) 0,10 мМ, 3) 0,75 мМ, 4) 1,50 мМ.
Пунктирная линия функция теплоемкости от
температуры, рассчитанная для несвернутого
пептида, а линия пунктир-точка — для нативного
состояния, полученная линейной
экстраполяцией с использованием величины наклона,
характерного для нативных глобулярных белков
(см. параграф В2.4.8) (Griko et al., 1995)
лить температурные зависимости
термодинамических параметров перехода.
В2.4.10. Расчет теплоемкости
из структурных данных
Теплоемкость макромолекул
обусловлена в основном внутренними
колебательными и вращательными модами, а
также взаимодействием с
растворителем. Надежные предсказания величин
свободном энергии являются
обязательными в подходах к дизайну белков
и лигандов. Невозможно, однако,
предсказать теплоемкость сложной
системы путем умозаключений (cib initio).
Поэтому были разработаны методы
для расчета теилоемкостей белков в
различных состояниях, основанные на
кривых плавления, полученных мето-

Температура (°С)
Рис. В2.8. Кривые плавления барназы в растворах с различными рII, величины которых
указаны над каждой кривой. Пунктирная линия и линия пунктир-точка показывают парциальные
молярные теплоемкости нативного и развернутого белков. Вставка: сплошная линия
показывает зависимость теплоемкости от температуры для необратимо денатурированного белка,
полученная с помощью нагревало 100 °С; пунктирная линия — теплоемкость развернутого белка,
рассчитанная суммированием теплоемкостей отдельных аминокислотных остатков (Privalov
and Makhatadze, 1992; Griko et al., 1994)
дом дифференциальной сканирующей
калориметрии, с привлечением данных
о модельных соединениях.
Расчет теплоемкости нативных
и развернутых белков
Теплоемкость развернутого белка при
постоянном давлении можно очень
точно и с высокой надежностью
рассчитать, суммируя теплоемкости
отдельных аминокислот. В качестве
примера см. пунктирную линию на рисунке
В2.6 и вставку на рисунке В2.8. Однако
аналогичный расчет для нативного
состояния гораздо более сложен.
Теплоемкость нативного или
развернутого белка в водном растворе
можно рассматривать как сумму
вкладов, каждый из которых относится либо
к внутренним химическим свойствам
макромолекулы, либо к влиянию
растворителя. Результаты
многочисленных работ на модельных органических
соединениях подтверждают, что эти
вклады в теплоемкость аддитивны.
Поэтому теплоемкость белка может быть
записана как
С„ = Cv +Cn.+Cv + Cv
Р Р. а Р. Ь Р. с P, лругис
.(B2.10)
где Ср л называется первичной
теплоемкостью, обусловленной вкладами
атомов и ковалентных связей, и
зависящей исключительно от
аминокислотного состава макромолекулы. С,, b
содержит вклады нековалентных
связей в свернутом белке. Ср (., в основном,
есть результат гидратации или
взаимодействий белок-растворитель. Ср
вызвана другими вкладами, например,

протежированными состояниями
аминокислотных групп с ионизуемыми
боковыми цепями, такими как гистидин,
аспарагииовая кислота, глютаминовая
кислота, аргинин и лизин. Обычно
последний вклад мал по сравнению с
другими вкладами в уравнение В2.10, и мы
будем пренебрегать им в последующем
обсуждении.
Энергия полипептидной цепи
и первичная теплоемкость
Первичная теплоемкость С,, л — это
теплоемкость безводного несвернутого
полипептида. Ее можно точно рассчитать
суммированием вкладов отдельных
аминокислот (табл. 152.1) и процесса
образования пептидной связи
(комментарий 152.6).
Внутренние белковые взаимодействия
и теплоемкость безводного
свернутого белка
Как следует из уравнения В2.10,
теплоемкость безводного свернутого белка
равна С,, + С,, ь. Теплоемкости
различных растворимых белков, отнесенные
к единице массы, оказываются
довольно близкими: 1,17 кДж-кг-1 для
теплоемкости, рассчитанной из первичной
последовательности; 1,21 кДж-кг1 для
экспериментального значения безвод-
Комментарий В2.6. Теплоемкость
образования пептидной связи
Средний вклад процесса образования
пептидной связи в теплоемкость после
освобождения молекулы воды может быть
рассчитан из разности между
экспериментальными теплое.мкостямн дппептидов и
составляющих его отдельных аминокислот
в безводном состоянии. Эта величина
теплоемкости равна 39,2 ±0,74 Дж • К"' моль1.
ного состояния при 25 °С; 1,46 кДж-кг-1
для свернутого состояния в растворе
и 1,96 кДж-кг"1 для развернутого
состояния в растворе. Обратите внимание,
что измеренные теплоемкости
безводных белков очень близки к расчетным
значениям первичной теплоемкости.
Это говорит о том, что основная часть
абсолютной теплоемкости обусловлена
первичной последовательностью. В
случае с безводным белком Ср составляет
97,5% от экспериментальной
теплоемкости (см. также кп.ммсп rapiiii 152.6).
Заметим, что теплоемкость
безводных белков растет линейно с
температурой — с наклоном, равным 4,10 х
х 10"3Дж-К-1 г-1, который практически
постоянен для всех исследованных
белков.
Теплоемкость нативного белка
в растворе
В соответствии с уравнением В2.10
теплоемкость нативного белка в растворе
равна Сп + С„, + С,. . Это значение
г Р, а Р, [) Р, г, матин
выше такового для безводных белков
(табл. 152.2), поскольку вклад
гидратации Ср с, в основном, имеет
положительную величину. При 25 "С вклад
гидратации составляет около 15 % от
совокупной теплоемкости нативного
белка в растворе. Гидратация также
отвечает за более выраженную температурную
зависимость, наблюдаемую для этой
теплоемкости (6,80 х 10 3Дж-К~'-г') по
сравнению с безводным свернутым
состоянием (4,1 х 10~3Дж-К"' • г ').
Вклад гидратации варьирует в
зависимости от состава поверхности
макромолекулы и ее взаимодействия с
растворителем, которое в первую очередь
определяется доступностью полярных
и неполярных групп для растворителя.
Вклад гидратации каждой группы, ус-

Таблица В2.1. Экспериментальные
значения теплоемкости аминокислот
Аминокислота
Ала
Apr
Ас и
Ас и
Цис
Гли
Глю
Гли
Гпс
Иле
Лей
Лиз
Мет
Фен
Сер
Тре
Три
Тир
Вал
с/
(Дж-К'-моль1)
122,7
234.4
160,9
155,8
163,0
184,9
175,7
99,5
216,2
189.0
201,7
205,4
290,6
203,7
136,1
147,8
239,0
217,1
169,5
*) Значения для безводных аминокислот
при 25 °С взяты из Hutchens (1970).
Hutchens JO in «Handbook of Chemistry
and Selected Data for Molecular Biology» (ed.
Sober H. A., Cleveland OH, Chemical Rubber
Co., 1970).
Теплоемкости аминокислотных остатков
в растворе приведены в Makhatadze G. I. and
Privalov P(1990); Privalov P. Land Makhatadze
(1990); Privalov P. L. and Makhatadze G. I.,
«Physical Properties of Polymers Handbook»
(E. Mark, ed.) AIP Press, Woodbury, New York,
1996
тановленный на основе исследований
модельных соединений,
пропорционален площади ее поверхности, которая
доступна для растворителя.
Теплоемкость гидратации полярной группы
имеет отрицательное значение, тогда
как в случае с неполярной группой она
положительна. Таким образом, более
высокое значение теплоемкости иатнв-
ных белков в растворе но сравнению
с безводным свернутым состоянием
объясняется тем, что в среднем 55%
поверхности растворимых белков
состоят из ненолярных групп.
Теплоемкость развернутого пептида
в растворе
Теплоемкость развернутого пептида в
растворе равна С,, t + С,, г niii, где вклад
гидратации С,, представляет собой
сумму соответствующих значений для
отдельных аминокислот в белковой
последовательности, а также для N и С
концевых групп. Парциальные
теплоемкости аминокислотных остатков в
растворе очень точно измерены и
хорошо известны в температурном
диапазоне от 5 до 125 "С (см. глбл. Г.1'.1).
Теплоемкость развернутого
состояния в растворе примерно на 0.4 ДжКг '
больше ее теплоемкости в нативном
состоянии (габл. В2.1!и м>\!\',|-ц i:i|iiii' IV_'./).
Преобладающий вклад в теплоемкость
вносит гидратация, в результате которой
возникают контакты неполярных групп
с растворителем. Однако в отличие от
нативного состояния в растворе,
зависимость от температуры теплоемкости
развернутого состояния в растворе
имеет нелинейный характер. В диапазоне
0-100 °С она хорошо аппроксимируется
с помощью полинома второго порядка.
Глобальная аппроксимация
теплоемкости с помощью одной
математической функции
Для зависимости теплоемкости белков
в разных состояниях от температуры

ТаОлица В2.2. Параметры,
наилучшим образом описывающие
термодинамическую базу данных по
теплоемкости белков

Параметр
?'
ГС
Р
Ц
".
я.,
"л
''■
к.
Ь,
Значение(единицы)
1,18 (Дж-К"' г ')
41,0 х Ю '(Дж-К 2т ')
36,5 х к) ЧДжК 'мо.чь 'А"-)
27,0 х К) '(Дж-К 'моль 'А 2)
1,89(Дж-Дж 'моль"'А-)
П.Ох ю '(Дж-К 2-моль 'А -)
-17,6 х Ю ЧДж- К '-моль 'А -)
-1,11 (Дж-К 'моль 'А2)
12,0 х Ю '(Дж-К 2-моль 'А -)
18,1 х К) -'(Дж-К '-моль 'А -)
(Gomez et а!.. 1995)
была получена одна математическая
функция, основанная на уравнении
В2.9. Исключая последний член из
уравнения В2.9, получим
С..= С|..а+С1.Ь+С1,1- (В2Л1)
Выражая каждую из теилоемкостей
с правой стороны в виде набора
некоторого числа параметров: v, ic,p, q,a,b\\
структурных свойств белка: молекулярной
массы М, полной площади поверхности
молекулы, недоступной для
растворителя Д ,,..„„.,. и площадей неполярных и
полярных групп, доступных
растворителю—Л и Л следующие равенства:
Л1]П.1Я|) IIO.'Uip ^ '
Cv л = \v + ic(T-25) }М, (В2.12)
С, и= \p + q(T-25) ]Аш.^, (В2.13)
с,.., -»<Т) А + И7)л,„„1ф,(В2.1/о
где
а(Т) = а +а,(Т-25) +
' - (В2.14а)
+ а.1(Т-25)2,
b (Г) = b1+b2(T-25) +
+ Ь.ЛТ-25Г. <В214б>
Эти уравнения были сопоставлены
со всей доступной
термодинамической базой данных. Лучшие значения,
найденные для этих параметров, даны
в 'lauinnr H2.2.
Полученный набор параметров
позволяет в большинстве случаев хорошо
предсказывать не только измеренную
теплоемкость данного состояния белка,
но и ее зависимость от температуры.
Хотя средние значения параметров,
представленные в i;iuiiihi' Wl.'l,
являются хорошим приближением, нужно
признать, что в действительности гидра-
Комментарий В2.7. Значения
теплоемкости
Средняя экспериментальная
теплоемкость безводных свернутых белков, выра-
. женная в единицах на грамм, составляет
; 1,22 Дж-К ' г ', а их средняя теплоемкость,
рассчитанная из первичной структуры,
равна 1,19 Дж-К ' г' (■ \:. ;.;,■.;. 1!'.:.'..! >.
Соответственно, вклад нековалентных взаимо-
| действий составляет всего лишь около 0.03
' Дж-К 'г '.
Теплоемкости нативного и
развернутого состоянии в растворе больше значений,
; соответствующих безводным состояниям.
Из-за положительного вклада теплоемко-
стей неполярных групп значения варьиру-
' ют в зависимости от состава поверхности \
для нативного состояния или
аминокислотного состава для развернутого состоя-
. ния. Разность теилоемкостей развернутого
и нативного состояний в растворе лежит в
диапазоне 0,4-0,7 Дж-К ' г '.
Расчеты теплоемкости для макромоле-
! кул, основанные на знании состава,
значений гидратации и структурных параметров,
таких как доступные для растворителя
поверхности различных групп, производились
! в основном группами Фрейре (Freire, 1995)
: и Привалова (Privalov and Privalov, 2000).

тационный вклад в теплоемкость
зависит от конкретной химической группы.
Поэтому несколько лучшую
аппроксимацию можно получить, если разделить
неполярные группы на алифатические
и ароматические, так как последние, на
самом деле, имеют слегка полярный
характер. Соответствующие средние
параметры при 25 °С равны 2,14 Дж-К" '-моль
'•А-2 для алифатических групп и 1,55
Дж-К~'-моль '-А-2 для ароматических,
поэтому параметр а, (который дан выше
как среднее для обеих групп) можно
разделить на два вклада.
Разворачивание белка сопровождается
изменением теплоемкости
Разность теплоемкости между
развернутым и нативным состояниями белка в
растворе обусловлена в основном
различиями в гидратационной теплоемкости:
ДСР
Р, разв-натив
где ДСЦ и обозначает такую раз-
Р. разв-натив J i
ность.
Вклад ДСр с в суммарную АСр при 25 °С
составляет более 90%. В среднем вклад
гидратации неполярных групп
уменьшается наполовину с повышением
температуры — от 1,89 Дж-К '-моль-1-А-2 при
25 °С до 0,96 Дж-К"1-моль"1-А"2 при 100 "С,
тогда как гидратация полярных групп
уменьшается с 1,11 Дж-К"'-моль"1-А"2 при
25 °С почти до нуля при 100 °С (табл.
В2..Ч и уравнение В2.14). Значение ДСр ь
отрицательно, поскольку нековалентные
взаимодействия разрушаются при
переходе от нативного состояния к
развернутому. Оно меньше теплоемкости,
обусловленной гидратацией, и увеличивается
с температурой до среднего значения -
0,25 Дж-К~'-А~2 на моль недоступной
поверхности при 100 "С. Результирующее
влияние, оказываемое гидратацией и
нековалентными взаимодействиями на
температурную зависимость АС,, при
разворачивании исчезает по мере
приближения температуры к значению 120 °С (см.
рис. B2.S).
Достоверность расчетов
Из-за важности предсказания
свободной энергии для дизайна белков ил иган-
дов чрезвычайно полезными являются
расчеты теплоемкости, основанные на
знании детальной структуры белка.
Достаточно точно их можно произвести
для белка, полностью развернутого в
растворе (когда все аминокислоты
доступны для растворителя),
основываясь на знании его последовательности
и табличных значениях теплоемкости
отдельных аминокислот. Между тем
теплоемкость нашивного белка в
растворе нельзя рассчитать из его
последовательности, поскольку она зависит от
поверхности макромолекулы и других
свойств белка. Однако, когда структура
нативного белка известна, описанный
выше параметризированный подход
может служить хорошим приближением
(см. рис. В2.8), если белок принадлежит
к тому же структурному семейству, что
и белки в базе данных, используемые
для получения этих параметров. Такие
расчеты, однако, необходимо
воспринимать с осторожностью, поскольку
теплоемкости индивидуальных химических
групп могут существенным образом
отличаться от значений, полученных для
белков в базе данных. Ожидается, что
разность в теплоемкости,
обусловленная динамикой цени, между нативным
и развернутым состояниями должна
быть мала, поэтому вычисленные
значения разности теплоемкости нос-

ле разворачивания более надежны по
сравнению с расчетами для нативного
состояния, поскольку последние в
основном обусловлены гидратационным
вкладом ( комлк'и Lipin'i li2..S). Вклад в
теплоемкость гидратации данной
группы пропорционален ее площади,
которая доступна для растворителя. В
развернутом состоянии подразумевается,
что группа доступна растворителю
полностью, тогда как в нативном белке ее
доступная площадь может быть точно
определена из структурных координат.
Комментарий В2.8. Соотношения l
между АН, AS, и АСР |
Вспомним, что члены энтальпии и
энтропии рассчитываются с помощью
измерений теплоемкости в соответствии с уравне- i
ниями В2.1 !
AH = JACp(T)dT.
АСР(Г)
(В2.1а)
AS
-У-
dT. (B2.16)
Из уравнений следует, что АСр может
быть найдена из наклона кривых
зависимостей АН и AS от температуры.
В2.4.11. Силы, стабилизирующие
нативную структуру белка
Силы, стабилизирующие нативную
структуру белка, возникают из-за
конкуренции между различными
взаимодействиями, такими как белок-белок и
белок-растворитель. Они поддерживают
свернутую структуру в данном
температурном интервале. Калориметрические
исследования внесли
фундаментальный вклад в наше понимание этих сил.
Как мы уже видели выше, ДСр между
свернутым и развернутым состояниями
обусловлена в основном гидратационны-
ми взаимодействиями. На рисунке В2.9
приведена зависимость этой величины
от температуры для небольших однодо-
менных белков, а также ее стремление к
маленьким значениям при высоких
температурах. Первый возникающий
вопрос: «Какие силы определяют процесс
сворачивания белка?»
Сворачивание цепи в вакууме
Прямой анализ термодинамики
сворачивания белка в вакууме (или в
условиях, когда влиянием
растворителя можно пренебречь) представлен на
рисунке. В2.9. Цепь поддерживается в
10000
8000
6000
4000
X
—. 6000
'а
С 4000
о
5
*~~ 6000
о
I —4-
Убиквитин -
2<Г 40 So" ' 80 100 120
Температура (°С)
['иг. [Y2M Расчетные (линии) и измеренные
теплоемкости развернутого (верхняя кривая
на каждой панели) и нативного состояний
(нижняя кривая) различных растворимых
белков. Вычисления произведены на основе
параметров, приведенных в ..'..; !'..''.'.
Точки кривой для нативного состояния выше
50 °С были экстраполированы. В случае с
развернутым многлобином квадратиками
обозначены расчетные значения, взятые из Privalov
and Makhatadze (1990) и из Freire (1995)

своей свернутой конфигурации
благодаря внутренним силам, таким как
водородные связи, ван-дер-ваальсовы или
электростатические взаимодействия.
Их разрушение ведет к независимому от
температуры росту внутренней энергии,
поэтому при разворачивании величина
АН положительна и постоянна при
любой температуре. Что касается энтропии,
то очевидно, что развернутое состояние
обладает большим числом степеней
свободы, чем свернутое, поэтому AS в
процессе разворачивания также будет
положительна. Следовательно, изменение
свободной энергии (AG = АН - TAS) во
время этого процесса будет уменьшаться
с повышением температуры и иересека-
> АН: +; AS: +
Рис. 132.10. Термодинамика процесса
сворачивания белка в вакууме: а — схематическое
представление равновесия; б — изменения
энтальпии (АН), энтропии (AS) и свободной
энергии (AG) в процессе разворачивания. 7jn —
температура плавления цепи
ет пуль при Т , как показано на рисунке
132.10. Свернутое состояние
поддерживается при температуре выше Тш,
развернутое, наоборот, — ниже этой величины,
поэтому Т можно рассматривать как
температуру плавления цепи.
Влияние растворителя на процесс
сворачивания белка
С помощью тщательных
калориметрических измерений было установлено,
что простая картина сворачивания,
показанная на рисунке 132.10, не
применима к белкам в естественном окружении.
С помощью анализа калориметрических
кривых теплоемкости было выяснено,
что температурная зависимость АН, AS,
а, следовательно, и AG для данного
процесса имеет сложный характер. Это
свидетельствует о том, что влиянием
растворителя на сворачивание белка нельзя
пренебречь.
Общие кривые
термодинамических функций, полученные из
калориметрических данных для миоглобина
(рис. В2.11), довольно типичны для
небольших глобулярных белков, хотя
они могут быть и сдвинуты по величине
теплоемкости пли температуре в
соответствии с природой каждого белка (см.
комментарии В2.7).
Нативноесостояниесуществуетв
достаточно узком температурном
диапазоне благодаря положительной
свободной энергии разворачивания, которая
достигает максимума при температуре,
близкой к комнатной, и падает при ее
повышении или понижении.
Интересно, что максимальная стабилизирующая
свободная энергия неожиданно мала.
К примеру, ее значение 50 кДж -моль-1
соответствует выигрышу энтальпии в
результате разрушения двух или трех
водородных связей в интерьере белка

( :;u'>. i, \YJ..:\), тогда как впутрибелковые
взаимодействия и взаимодействия
между белком и растворителем
характеризуются энергией в тысячи кДжмоль '
(см. рис. 152.10 и i;uVi. Hi!..'!). Для
сравнения, энергия ковалентной связи
составляет около 300 кДж -моль '. За
исключением S-S связей, которые могут
образовываться между боковыми
цепями цпстепна в невосстанавливающих
условиях, ковалентные связи не
принимают участие в стабилизации нативиой
укладки белка. Связи, вовлеченные в
эту стабилизацию, являются слабыми,
обладают энергиями,
соответствующими нескольким кТ.
Гидрофобный эффект
Стабилизацию нативного состояния
белка можно описывать в терминах
растворимости. Белок сворачивается,
чтобы «спрятать» как можно больше
«нерастворимых» неполярных групп цепи
от контакта с растворителем. С этой
точки зрения, тот факт, что свободная
энергия разворачивания имеет
максимум около 30 °С, есть следствие
аномальной температурной зависимости
растворимости иеполярных
компонентов (см. рис. Л 1.7).
Растворимость неполярных
компонентов в воде минимальна при
температуре, близкой к комнатной, что
соответствует максимуму свободной
Таблш ул В2.3. Энергии сил стабилизирующих белок
Связь
Электростатическая
Водородная
Гидрофобная
Ван-дер-ваальсова
Энергия
(кДж -моль ')
-20
-4-25
-4
-0,5
л
о
s
*
э о
<1
^^^
-О
О
5
*
%
СП
э о
<
(-
I
э о
<
160
120
80
40
О
-40
:
750
500
250
0
-250
\
\
Г\д6'
SaG \
1 \
■ ill
*
ДН'
t^s. — — /
~~ """" Jr
Аг
J^
f\ I ...X 1
-
-
S Л
£-——.
_
_
i
О 50 100
Температура (°С)
V
Н2.1 I. Температурная зависимость
термодинамических функций в процессе
разворачивания миоглобина. Разности энтальпии,
энтропии и свободной энергии,
сопровождающие разворачивание, были рассчитаны,
исходя из характера зависимости
теплоемкости от температуры. Пунктирные линии
соответствуют функциям, которые были бы
получены в отсутствии растворителя, поэтому
5AG представляет собой результат
взаимодействий белка с растворителем (Privalov and
Khechinashvili. 1974)

Рис. 132.12. Разворачивание белка в
растворителе. Внутренние белковые контакты
разрушаются при разворачивании и заменяются
на контакты с растворителем. Изменения
энтальпии и энтропии при разворачивании
могут быть положительными и отрицательными.
Выигрыш в конфигурационной энтропии цепи
может компенсироваться потерей
конфигурационной свободы молекулами растворителя
энергии переноса. При такой
температуре доминирует большое
отрицательное изменение энтропии, которое, как
считают, обусловлено
упорядочиванием молекул воды вокруг неполярных
групп (см. главу В1). Структура
жидкой воды характеризуется большой
энтропией благодаря конфигурационной
свободе образования водородных
связей у каждой ее молекулы с
ближайшими соседями во всех направлениях (см.
Главу А2). Но эта свобода уменьшается,
когда молекула находится рядом с
неполярной группой, которая не дает ей
возможности образования водородных
связей. Данное явление называется
гидрофобным эффектом.
Система будет меняться таким
образом, чтобы исключить
термодинамически невыгодный контакт
неполярных групп с водой. Гидрофобный
эффект собирает вместе неполярные
молекулы в водном растворе для
минимизации поверхности их контакта с
водой. Если спрятать СН, СН2 или СН3
группу от контакта с ней, произойдет
потеря около 4 кДж-моль-1 свободной
энергии (см. табл. f32..'3). Хотя в
гидрофобном эффекте доминирует
отрицательное изменение энтропии при
гидратации неполярных групп, нельзя
пренебрегать и вкладом энтальпии от
ван-дер-ваальсовой упаковки
неполярных молекул в ядре. Считается, что
гидрофобный эффект является
основной движущей силой в стабилизации
белка. Тщательный анализ
калориметрических данных, приведенных на
рисунке В2.12, позволил дать
количественную оценку его роли в
стабилизации нативной укладки белка.
Энтальпия и энтропия стабилизации
нативного состояния белка:
гидратация неполярных и полярных
групп и компактность их упаковки
Из кривых, изображенных на
рисунке В2.10, мы видим, что при температуре,
близкой к комнатной, соответствующие
изменения энтальпии и энтропии
вследствие взаимодействий между белком и
растворителем, в значительной степени
компенсируют изменения энтальпии,
обусловленные динамикой внутренних
связей белка, и энтропии, связанными
с конфигурационной свободой цепи.
При разворачивании молекулы при
максимальном значении AG, AS равно
нулю, поэтому нативный белок
стабилизируется за счет небольшого вклада
энтальпии. При более низких
температурах AS отрицательно и стабилизация
обусловлена энтропией, тогда как при
более высоких температурах
доминирует энтальпия. Обратите внимание на
то, что на рисунке В2.10 АС —
свободная энергия стабилизации в отсутствие
взаимодействий с растворителем всюду
выше AG и что их разность стремится к
нулю с повышением температуры.
Следовательно, гидрофобный эффект и
взаимодействия с растворителем делают

нативное состояние менее стабильным
относительно состояния в вакууме.
Дальнейший анализ еще более
подчеркивает роль гидратации полярных
групп, которой нельзя пренебречь.
Из параграфа В2.4.8 мы знаем, что в
отличие от положительного вклада
гидратации неполярных групп, гидратация
полярных групп вносит отрицательный
вклад в ЛСр который исчезает при очень
высокой температуре. Вспомним что ЛСр
определяется из наклона кривой
зависимости энтропии от температуры.
Наличие полярных и неполярных групп в
зоне контакта с водой приводит к
упорядочиванию ее молекул, хотя их действие
прямо противоположно: неполярные
группы упорядочиваются потому, что не
могут образовывать водородные связи,
а полярные, наоборот, дают молекулам
воды такую возможность. При
температуре, приближающейся к комнатной,
энтропии гидратации обеих групп
отрицательны и близки по значению. Но
энтропия гидратации полярных групп
имеет отрицательный наклон и понижается
еще сильнее с повышением
температуры, тогда как та же величина для
неполярных групп обладает положительным
наклоном и приближается к нулю выше
100 "С. Необходимо подчеркнуть, что
«общие» значения, принятые для тепло-
емкостей гидратации тех и других групп
для расчетов в параграфе В2.4.8,
являются, в лучшем случае, лишь хорошими
приближениями. На самом деле они
зависят от природы конкретной группы,
и, как мы с вами уже видели в случае с
семейством неполярных боковых цепей,
значение и температурная зависимость
теплоемкости гидратации существенно
отличаются для алифатических и
ароматических групп.
Анализ калориметрических
данных после учета влияния гидратации
показал, что плотная ван-дер-вааль-
сова упаковка внутри белка играет
существенную роль в стабилизации его
нативной укладки. С точки зрения
гидрофобного эффекта, мы должны
ожидать, что как можно большее
число неполярных групп будет
группироваться вместе, прячась таким образом
от воды. Однако гидрофобный эффект
в основном является результатом
ненаправленного влияния энтропии, а оно
не может служить основой
механизма специфических взаимодействий.
В случае с находящимися в воде
углеводородами агрегация неполярных
молекул приводит к формированию
жидкой фазы. С внутренней частью белка
этого не происходит. Она, как показали
исследования тысяч структур белковых
кристаллов, скорее похожа на
компактное аморфное тело или апериодический
кристалл. Отдельные ван-дер-ваальсо-
вы взаимодействия крайне слабы им.
км.I. I)!.'..')). Однако сумма их энергий,
как результат специфической упаковки
всех групп внутри белка, довольно
значительна и вполне способна быть
определяющей движущей силой, стоящей за
стабильностью нативной укладки.
Для описания энергетики процесса
стабилизации белка и более полной
интерпретации калориметрических
данных требуется детальный анализ
структуры поверхности макромолекулы и
плотности ее внутренней упаковки.
Значительные усилия были посвящены
развитию методов для такого анализа
белков, структуры которых были
получены с помощью кристаллографии или
ЯМР ( кпммп'глпш! И-!.Я).
В2.4.12. Холодовая денатурация
С приближением к
низкотемпературному концу кривой AG доминирует эн-

Термодинамика и структура белка
Пространственно заполненная модель
белковой структуры, полученной с
помощью рентгеновской кристаллографии.
Обратите внимание на компактную упаковку
атомов. Красные и синие шарики на
поверхности белка отображают отрицательно и
положительно заряженные боковые цепи
аминокислот. Укажем основные процессы,
обусловливающие разность в стабильности
между нативным и развернутым
состояниями. Первое — гидратация групп на
поверхности. Она пропорциональна площади
каждой группы, доступной растворителю,
которую можно рассчитать из структуры
в нативном состоянии, а в развернутом
состоянии ее принимают равной всей
теоретически доступной площади цепи.
Второе — детальная упаковка внутренней
части белка. Ее можно проанализировать, зная
трехмерную структуру.
тропия сольватации неполярных групп.
Это ведет к дестабилизации нативной
укладки белка по мере снижения
температуры, которая была названа холодовой
денатурацией ( к<>.\;\u i; mpini IVI. Id).
Причина холодовой денатурации
состоит в том, что гидрофобные
взаимодействия, компактизирующие белок,
сильно растут с повышением
температуры и, следовательно, так же сильно
падают с ее понижением. В результате теплота
плавления белка сильно падает с
понижением температуры. Ее уменьшение
настолько велико, что может изменить знак
при низких температурах. На рисунке
В2.1 'Л а показано изменение удельной (на
грамм белка) разности энергий натпвно-
го и денатурированного состоянии белка
с температурой для пяти белков. Из
рисунка видно, что при температурах выше
комнатной более упорядоченная
структура (нативный белок) имеет более
низкую энергию, чем менее упорядоченная
(денатурированный белок), но при
низких температурах (ниже 20 °С) энергия
упорядоченной структуры может быть
выше, чем денатурированной. Этот
эффект особенно выражен для миоглобина,
обратимая холодовая денатурация
которого показана на рисунке 152.1,5 6. После
холодовой денатурации (нижняя кривая)
наблюдается ренатурация белка (верхняя
кривая), которая имеет два пика. Левый
ник относится к собственно к ренатура-
ции, а правый пик - к обычной тепловой
денатурации.
Полная холодовая денатурация
белка не наблюдается в обычных
физиологических растворителях, поскольку она
может происходить лишь при
температуре ниже нуля. Однако она отмечалась
также в некоторых денатурирующих
'<<)■■:■; ;<>м\::)■.;■' В2.10. Дестабилизация
белковых комплексов при низкой
температуре
Механизмы холодовой денатурации
действительны и в случае с белковыми
комплексами. Хорошо известно, что
некоторые из них диссоциируют, если раствор
поместить в холодную комнату.
Р^АТФаза, растворимая часть
связанной с мембранной F|F0-ATOa3bi, является
примером такой чувствительной к холоду
структуры. Можно заключить, что
гидрофобные силы доминируют над
белок-белковыми взаимодействиями внутри комплекса.

О 20 40 60 80 100 И0 10 30 50 70
Температура (°С) Температура (°С)
а б
I'iic. 132. КЗ: я —зависимость удельной разности энергий нативного и денатурированного
состояния для пяти белков: 1 — РНКаза; 2 — лизоцим; 3 — а-химотринсин;4 — цитохромс;5 — миогло-
бин (Griko et al., 1974); б — денатурация апо.миоглобина при понижении температуры (нижняя
кривая). Верхняя кривая показывает обратимость процесса. Стрелки показывают направление
изменения температуры. Концентрация белка 9,5 мг-см'3 (Griko et al., 1988)
растворителях, таких как
концентрированный раствор гуанидин
гидрохлорида, который сдвигает
термодинамические кривые в сторону более высоких
температур.
В2.5. Нуклеиновые кислоты
и липиды
Те аргументы и аналитические
подходы в дифференциальной
сканирующей калориметрии, которые были
описаны выше для анализа
стабилизации укладки белков, полностью
применимы к другим макромолекулам,
например, таким как нуклеиновые
кислоты (рис. 132.11), а также к
взаимодействиям, участвующим в
образовании комплексов макромолекул и
между макромолекулами и меньшими
по размеру лигандами.
Изучение структуры олигонуклео-
тидов привело к пониманию
энергетики образования двойной спирали ДНК.
Остаточная структура олигонунуклео-
тидов оявляется, когда температура
снижается до 80 °С. Это диффузный
процесс с достаточно небольшой
энтальпией образования, который
заканчивается при температуре ниже О °С,
требуя отрицательных температур для
наблюдения.
12г
II -
-10 10 30 50 70 90
Температура (°С)
Рис. I32.1-1. Зависимость теплоемкости от
температуры для одноцепочечного дезокси-
олигонуклеотида 5'-GCGAACAATCGG-3' с
концентрацией 1,88 мгмл'. Полная
энтальпия разворачивания в диапазоне от -10 °С до
80 °С равна 77 кДжмоль"1 (Privalov & Privalov,
2000)

Дифференциальная сканирующая ношения вода/липид. Энергетика таких
калориметрия является также важным систем исследуется посредством измере-
инструментом для изучения образования ния температурной зависимости тепло-
мембран в смеси воды с липидами. При емкости для каждой фазы и связанных с
этом получают сложные фазовые дна- переходами пиков. Ссылки на обзоры по
граммы как функции температуры и соот- данной тематике даны в разделе В2.7.
В2.6. Перечень ключевых мдей
в Полное количественное термодинамическое описание макромолекулы в
растворе в заданном температурном интервале можно получить из измерения
зависимости ее парциальной удельной теплоемкости от температуры при
постоянном давлении с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.
• Характерными чертами современного дифференциального сканирующего
калориметра являются: использование менее 50-200 мкг материала на одно
измерение, возможность использования температурного диапазона от -10°С до
130 "С, чувствительность около 10 мкДж-градус-1 и возможность сканирования
вверх и вниз по температурной шкале для контроля обратимости процесса.
• Нативному состоянию макромолекулы чаще всего приписывают статус
эталонного и по отношению к нему определяют все термодинамические
параметры системы.
• Анализ кривой теплоемкости с помощью функции распределения применим
к любым мономерным (когда число присутствующих в растворе частиц не
меняется после сворачивания) системам в равновесии, независимо от механизма
перехода и промежуточных состояний.
• Калориметрическая энтальпия и энтальпия Вант-Гоффа равны, когда вся
молекула представляет собой один кооперативный домен, и переход происходит
по принципу «все или ничего»; в остальных случаях, когда эти две энтальпии
не равны, переход происходит через промежуточные состояния.
• Когда кооперативный домен меньше молекулы, как в случае с мультидомен-
ными белками, энтальпия Вант-Гоффа меньше калориметрической; если же
кооперативный домен больше молекулы, то энтальпия Вант-Гоффа больше
калориметрической, что служит доказательством межмолекулярных
взаимодействий, таких как олигомеризация.
3 Не существует калориметрических доказательств того, что расплавленная
глобула является интермедиатом при разворачивании небольших однодоменных
белков.

Различие в стабильности между нативным белком и его мутантом может быть
следствием как изменения вклада энтальпии и энтропии при замене одних
аминокислотных остатков на другие, так и следствием изменения кооперативности
разворачивания.Кривую зависимости теплоемкости от температуры для белков
со сложной структурой можно разбить при помощи компьютерных программ на
несколько кривых, соответствующих переходам различных состояний системы.
v Данные по дифференциальной сканирующей калориметрии белка и
модельных соединений дают возможность рассчитать теплоемкость белка в
различных состояниях.
Теплоемкость безводного развернутого полипептида называется первичной
теплоемкостью и может быть точно рассчитана суммированием вкладов
отдельных аминокислот с учетом формирования пептидных связей; таким же
образом можно рассчитать теплоемкость свернутых безводных белков.
1 Теплоемкость развернутого пептида в растворе складывается из первичной
теплоемкости и гидратационных вкладов тех же аминокислот с учетом N и С
концевых групп.
0 Поскольку гидратационный вклад в теплоемкость положителен, то
теплоемкость нативного белка в растворе выше, чем у безводного свернутого белка.
° Вклад гидратации зависит от взаимодействия поверхности белка с
растворителем и, особенно, от величины площади доступной поверхности полярных и
неполярных групп.
" Теплоемкость нативного состояния белка в растворе зависит линейно от
температуры, теплоемкость же развернутого состояния в растворе хорошо
аппроксимируется полиномом второго порядка в диапазоне температур 0-100 "С.
1 Теплоемкость нативного белка в растворе зависит от свойств поверхности
макромолекулы и особенностей свернутой структуры, поэтому ее нельзя
рассчитать непосредственно из его аминокислотной последовательности; для этих
целей разработан специальный параметризированный подход.
* Для описания энергетики стабилизации белка и более полного использования
калориметрических данных необходим детальный структурный анализ
поверхности макромолекулы и ее интерьера.
° Гидрофобный эффект в водном растворе приводит к объединению неполярных
групп в гидрофобное ядро для минимизации поверхности их контакта с водой.
" Энтропия сольватации неполярных групп вызывает дестабилизацию нативной
укладки белка по мере понижения температуры. Этот процесс называют холо-
довой денатурацией.

Литература для дальнейшего чтения
Tristram-Nagle S., Nagle J. F. Lipid bilayers: thermodynamics, structure, fluctuations,
and interactions. Chem. Phys. Lipids. 2004.127,3-14.
Weber P. C, Salemme F. R. Applications of calorimetric methods to drug discovery and
the study of protein of protein interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 2003.13,115-121.
Privalov G. P. and Privalov P. L. Problems and prospects in microcalorimetry of
biological macromolecules in «Energetics of biological macromolecules», Methods in
Enzymology 31-62, 2000.
Privalov P. L. Scanning microcalorimeters for studying macromolecules, Pure &
Appl. Chem., 1980. 52, 479-497.
Martinez]. C, elHarrousM., Filimonov V. V., Mateo P. L. &Fersht,A. R. A calorimetric
study of the thermal stability of barnase and its interaction with 3'GMP. Biochemistry,
1994.33,3919-3926.
Финкелыитейн А. В. и Птицын О. Б. Физика белка: курс лекций. М.: КДУ,
2007.

ГЛАВА ВЗ
ИЗОТЕРМИЧЕСКАЯ КАЛОРИМЕТРИЯ
ТИТРОВАНИЯ
ур-'х ■' I/ .-.-,• .^ом'-еэск'^й обзор
, ;'N i
Р. Б. Спокан и С. Дж. Гилл
(R. В. Spokane and S. J. Gill) описали
первый микрокалориметр для
измерения теплоты титрования реагентов на
уровне наномолей.
Т. Вайсман, С. Уиллистон, Дж.
Ф. Брандтс и Л. Н. Лин (Т. Wiseman,
S. Williston, J. F. Brandts and L. N. Lin)
опубликовали работу под названием
«Быстрое измерение констант и теплот
связывания с использованием нового
калориметра титрования».
Е. Фрейре (Е. Freire) с коллегами
ввели термин «изотермическая
калориметрия титрования» (ИКТ). В 1990-
2000 гг. был опубликован ряд важных
обзоров по основам метода ИКТ,
результатов его применения и перспектив
дальнейшего развития.
2000 !; но ижтоянкч' ирсмп
Уникальность метода заключается
в том, что он дает возможность
определять не только величину изменения
энтальпии после связывания, но
также, если позволяют условия
эксперимента, значения аффинности
связывания и величины изменения энтальпии.
Поскольку эти параметры полностью
определяют энергетику процесса
связывания, изотермическая
калориметрия титрования играет все более
важную роль в детальных исследованиях
белок-лигандных взаимодействий и в
подходах по конструированию новых
лекарств.
S3.2. Экспериментальные
подходы и основные
уравнения
ВЗ.2.1. Проведение измерений
и требования к образцам
Реакционная ячейка в приборе для
изотермической калориметрии титрования
имеет объем около 1 мл и содержит один
из реагентов. Небольшой объем другого
реагента (1-10 мкл) впрыскивают в
ячейку и перемешивают. Калориметр
измеряет мощность (в мкДж-сек"1 или в
микроваттах), требуемую для поддержания
постоянной разности температур между
реакционной и эталонной ячейками.
Тепло, поглощенное или выделенное в
результате химической реакции, определя-

3000 4000 5000 «000
Время (сек)
10 IS 20
Число инъекций
а б
Рис. ИЗ. 1. Экспериментальные кривые ИКТ связывания циклического монофосфата с РНКа-
зой Л: а - мощность, требуемая для поддержания постоянной разности температур между
измерительной и эталонной ячейками, выраженная как функция времени. Каждый пик соответствует
одному впрыскиванию; б - интегральный тепловой эффект связывания как функция в каждой
точке впрыскивания (Privalov and Privalov, 2000)
ется интегрированием кривой мощности
за время эксперимента (рис. 133.1).
В эксперименте по
изотермическому титрованию, показанному на
рисунке 133.1 а, калориметрическая
ячейка объемом 0,6 мл заполнялась
раствором белка (68,8 мкМ
панкреатической РНКазы А), а раствор лиганда
(0,5 мМ циклической монофосфатазы)
добавлялся в объеме 5 мкл с помощью
шприца, который служил также и для
перемешивания раствора. По оси у
отложена временная зависимость мощности,
требуемой для поддержания постоянной
разности температур между
измерительной и эталонной ячейками. Каждый пик
соответствует одной инъекции, а
интеграл мощности (после вычитания фона,
вызванного растворением лиганда,
механическим эффектом смешивания и
т. д.) — теплу, ассоциированному с
величиной связывания (q. в уравнении В3.1).
Величина пика с каждой
последующей инъекцией уменьшается,
поскольку все меньше свободного белка
остается для связывания. Когда белок
насыщен лигандом, высота пика
отражает фоновый уровень. График
интегральной величины теплового эффекта
связывания как функция числа
инъекций показан на рисунке 133. i 6.
ВЗ.2.2. Связывание: энтальпия
и теплоемкость
Величина тепла q, поглощенного или
выделенного в результате
^'-впрыскивания (см. pitc-. 133.1), равна:
?, = Ух ДЯхД [!._,], (В3.1)
где V — это объем реакционной ячейки,
a A[L. . ] — изменение концентрации
связанного лиганда после ^'-инъекции.
Поэтому q. пропорциональна
количеству лиганда VA[L tiiiJ, который связан
с белком. Константа
пропорциональности в уравнении В3.1 — это
изменение энтальпии АН на моль связанного
лиганда. Величину изменения
теплоемкости процесса можно определить
повторным титрованием при разных
температурах (уравнение В3.2)
АС„=дАН/дТ.
(В3.2)

30
25
5 15
10
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Температура (°С)
Рис. 133.2. Энтальпия связывания и теплоемкости. График энтальпии связывания как функции
температуры для взаимодействий белок-ДНК (HMG-бокс белка Sox-5 с ДНК-дуплексом из 12
пар оснований, содержащего сайт узнавания). Теплоемкость связывания дается начальным
наклоном линии (-6 кДж-моль'-К'1) при низких температурах. При более высокой температуре
заметно небольшое отклонение от прямой, вызванное перестройкой комплекса (см. также
параграф ВЗ.2.3).
На рисунке 133.2 показан пример
такого титрования для белка HMG-
box-DNA (комментарии 13.3.1 ).
Если количество добавленного
лиганда мало по сравнению с
аффинностью реакции (см. параграф В 1.3.2),
можно предполагать, что он будет весь
связан и величину изменения
энтальпии можно получить из уравнения
В3.1. Более того, если константа
ассоциации реакции Ка известна из других
измерений (таких как флуоресцентное
титрование или поверхностный плаз-
монный резонанс (параграф В4.2.2),
то изменение свободной энергии AG, a
следовательно и изменение энтропии
AS реакции можно рассчитать из AG и
АН, используя классическое уравнение
ВЗ.З. Тогда термодинамика реакции
будет полностью определена:
AG = -ЯГInK„ =AH-TAS. (ВЗ.З)
В зависимости от числа сайтов
и других особенностей модели связыва-
| Комментарий ВЗ. i. HMG-box-DNA
Английскаяабревиатура HMG-box-DNA
означает белок, способный
взаимодействовать с ДНК. N-конец белка содержит
множественные белковые последовательности.
Структурно эти последовательности
содержат консервативный мотив Trp-Asp (так
называемый WD-40 повтор). Эти повторы
j обнаруживаются во многих эукариотиче-
ских белках и могут функционировать как
адапторные и регуляторные модули в
сигнальных путях трансдукции, процессинга
пре-мРНК и в образовании цитоскелета.
I На С-конце HMG-box-DNA белок
содержит группу высокой подвижности (так
называемый HMG-box). HMG-box
обнаруживается во многих эукариотических
белках, вовлеченных в процессы сборки
хроматина, транскрипции и репликации.
Его молекулярная масса может достигать
126 кДа (у человека).

-0.2"
-0.4'
CM_ -0.6-
х -0.8-
? -1.0-
s
-1.2-
-1.4-
-1.6-
-rr^r-^г'гг^рппп^^
Ка=10*М'
с = 50
"ГГГГгггг-Г-
к„ = ю'м-'
с = 5x10'
-'Г|г-Ггггу-
Ка= Ю'-'М'
с=5*10'
0 20 40 60 60 100 120 0 £0 «О 60 60 100 120 0 20 40 60 60 100 120
Время(мин)
Рис. W.i.'.i. ИКТ-кривые для различных констант аффинности. Здесь приведены три
искусственные кривые ИКТ для иллюстрации эффектов возрастающей аффинности связывания. Для
моделирования были использованы следующие параметры:
[Р] = 0,05 мМ; [L] = 0,6 мМ; All = -42 кДж моль '; К и с показаны на рисунке, где с = К\Р\.
Аффинность связывания устанавливается только в случае, изображенном на первой панели
(с <1000), где величина пиков последовательно уменьшается. Если же аффинность слишком
велика для экспериментальных условий (с > 1000), тогда можно оценить только ее минимальное
значение. Напомним, что микрокалории в секунду можно перевести в микроватты умножением
на 4,2 (Leavitt and Freire, 2001)
ния, математическое выражение,
которое связывает константы аффинности с
уравнением В3.1, может быть
достаточно сложным.
qj = V(AH)P,mx
( К.Щ} K.[L]h
\ + K.[L\ 1 + K„[4_
Ч
(В3.5)
ВЗ.2.3. Константы сродства
(аффинности)
В самом простом случае, когда белок Р
имеет один сайт для лиганда L, можно
записать:
P + L-^^PL,
[PL]
К =
= [P] + [PL].
= [L] + [PL],
(В3.4)
где Робщ и Lu(j — совокупные
концентрации белка и лиганда, а квадратные
скобки обозначают молярные
концентрации. Комбинируя уравнения В3.1
и В3.4, получим:
где [L]. — это концентрация свободного
лиганда послед-титрования.
Данный анализ также применим
для реакций с числом сайтов более
одного с одинаковыми или разными
константами связывания. В этом
случае уравнение В3.5 принимает более
сложный характер и для его решения
требуются дополнительные данные,
поскольку количество параметров
становится велико.
В тех случаях, когда энтальпия
реакции недостаточно большая для того,
чтобы ее можно было измерить во всем
диапазоне концентраций лиганда, сама
константа может быть определена с
помощью серии титрования (рис. 13.0).
Для соотнесения константы
связывания с условиями эксперимента вводят
дополнительный параметр с, равный:

c = K[P].
(В3.6)
Значение с должно быть <1000 для
Кл реакции, чтобы эту константу можно
было определить с помощью
калориметрии титрования. На практике
данное соотношение устанавливает
верхний предел в 10к-10!1 М ' для константы
связывания (см. рис. 133.3).
Реакции с высокими константами
связывания
Когда значения с превышают 1000,
кривые калориметрического титрования
теряют свою характерную форму и больше
не содержат информацию о константах
связывания (см. рис. ВЗ.З). Это
становится существенным ограничением в
применении метода ИКТ для конструирования
лекарств, поскольку «лидирующие
компоненты» должны иметь наиомолярные
или даже более высокие значения
аффинности (см. об этом ниже). Тем не менее в
рамках метода изотермической
калориметрии титрования разработан протокол,
позволяющий определять высокие
константы связывания с помощью
конкуренции лигандов. Для этого производят три
титрования раствора белка. В первом
определяют термодинамические параметры
связывания для слабого лиганда, во
втором для сильного, а в третьем,
вытесняющем титровании, белок, заранее
связанный с более слабым лигандом, титруется
лигандом с высокой аффинностью.
Рисунок В3.4 демонстрирует применение
данного метода на примере ингибиторов
О 20 40 60 80 100
Рис. B3.L Вытесняющее титрование для определения высоких констант аффинности связывания
(см. текст). Эксперименты по исследованию взаимодействия ингибиторов (Acaet, KNI-764) с HIV-1
протеазой проводили при 25 "С в 10мМ ацетате, рН 5,0,2% диметилсульфоксида (Velazquez-Campoy
etal.,2001)

HIV-1 протеазы, которая исследуется с
целью создания лекарств в борьбе против
СПИДа.
Энтальпия связывания при
взаимодействии ингибитора с HI V-1 протеазой
может быть точно измерена с помощью
ИКТ (см. рис. 133.4, верхняя правая
панель, ось у здесь в мкал-М-1) в
противоположность константе ассоциации
ингибитора Ка, которая слишком велика,
чтобы ее можно было определить
данным методом. Кажущуюся константу
связывания К (см. рис. В3.4, нижняя
каж ^ ' '
панель) определяют в присутствии
слабого ингибитора (вытесняющее
титрование) ацетил-пепстатина с константой
связывания Ка w(c.m. рис. В3.4, верхняя
левая панель). Выбор слабого
конкурентного ингибитора с энтальпией
связывания, имеющей противоположный
знак, позволяет увеличить
чувствительность эксперимента. Ка может быть
определена из Ккаж с помощью уравнения:
К - Ка
™'1+к,г[х]"
где [X] — концентрация слабого
ингибитора, которую можно довести до
необходимого К . Величины конс-
каж
тант аффинности оказались равными:
К =2,4xl06M-1и^iC=3,lxl010M-,.
a, w ' а '
Конструирование (дизайн)
лекарственных препаратов
Знание трехмерных структур
ферментов, участвующих в метаболических
реакциях при заболевании, помогает
созданию высокоаффинных ингибиторов,
которые могут стать потенциальными
фармацевтическими агентами. Чтобы
лекарство было пригодным для
лечения, его аффинность должна лежать в
наномольном диапазоне (константы
диссоциации порядка 10"9 М). Если
описывать кратко, то конструирование
лекарственных препаратов включает в
себя несколько шагов. После того как
выбран целевой белок, ведется
комбинаторный поиск из сотен тысяч
агентов, которые могут взаимодействовать
с его активным сайтом. Многие из них
представляют собой природные
молекулы, получаемые из растений. Иногда
структуры таких ингибиторов настолько
сложны, что их трудно вообразить.
Примером такой структуры может служить
таксол (паклитаксел), антимитотичес-
кий препарат, получаемый из коры тиса.
Перспективные комплексы белок-
ингибитор характеризуют различными
методами, включая метод ИКТ, который
дает информацию об энергетике
связывания. Затем идет химическое
моделирование для нахождения структурных
вариантов, способных повысить аффинность
ингибитора к белку. Такие
модифицированные ингибиторы синтезируются и ис-
пытываются, затем процесс повторяется
до тех пор, пока не будет найден
удовлетворительный фармацевтический агент.
ВЗ.2.4. Изотермическая
калориметрия титрования
и дифференциальная
сканирующая калориметрия
Температурную зависимость энтальпии
связывания можно интерпретировать
как теплоемкость этого процесса только
в том случае, когда изменение
температуры не вызывает перестройку
компонентов реакции. Если же теплоемкость
изменяется с температурой, как в
реакции, изображенной на рис. ИЗ.2, то это
означает, что изменения компонентов
под действием температуры могут иметь
место. В этом случае целесообразно
использовать сочетание изотермической
калориметрии титрования и дифферен-

циальной сканирующей калориметрии,
которое позволяет исследовать
теплоемкость каждого компонента реакции в
подходящем температурном диапазоне.
Здесь мы вернемся к примеру с HMG
box-DNA (см. mimmcii i;i|niii I >.'!. I),
температурная зависимость энтальпии
связывания которого была показана на pi icy и кс
83.2. Функции молярной парциальной
теплоемкости компонентов реакции,
определенные посредством
дифференциальной сканирующей калориметрии,
представлены на рисунке В3.5.
Очевидно, что интерпретация
изменения теплоемкости в процессе
связывания существенно затруднена
разворачиванием белка (точечная линия на рис.
ИЗ.5) и частичной диссоциацией
комплекса (сплошная линия) в исследуемом
температурном диапазоне. Реакции
взаимодействия HMG с ДНК были
выражены как набор равновесных уравнений
наподобие уравнения В3.4, а все
термодинамические параметры системы были
оценены с помощью аппроксимации
наблюдаемых функций теплоемкости
комплекса и его свободных компонентов.
Анализ показал, что в изменениях
комплекса, вызванных температурой,
присутствуют две стадии (сплошная
линия на рис. 133.5). На первой стадии
происходит постепенное увеличение
теплоемкости, отражающее накопление
тепловой энергии. На второй
наблюдается диссоциация комплекса с
сопутствующим разворачиванием одного из
компонентов — белка.
83.3. ПРИЛОЖЕНИЯ МЕТОДА
ВЗ.3.1. Конструирование лигандов
Как видно из уравнения ВЗ.З, одну
и ту же константу связывания можно
.т—
Is
о
ь
*
#
О
120-
100-
80-
60 -
40-
20 "
0 -
Температура (°С)
Рис. ИЗ.5. Парциальные молярные
теплоемкости компонентов взаимодействия HMG
box DNA. Линия пунктир-точка обозначает
дуплекс ДНК из 12 пар оснований, точечная
линия — белок Sox-5 HMG, а сплошная — их
комплекс (Privalov and Privalov, 2000)
получить путем различной
комбинаций вкладов энтропии и энтальпии.
Энтальпия связывания отражает
конкуренцию между взаимодействиями
белок-лиганд при образовании связи
между ними (например, ван-дер-вааль-
совой и водородной) с одной стороны,
и взаимодействиями
белок-растворитель и лиганд-растворитель с другой.
Энтропия процесса отражает в
основном динамику энтропии сольватации,
например, через экранирование
гидрофобных групп от контакта с
растворителем и изменения в конформационных
энтропиях белка и лиганда.
Оптимизация вкладов энтальпии
и энтропии
Оптимизация аффинности связывания
включает различные тактические
подходы, в зависимости от того,
достигается ли она за счет изменения вкладов
энтальпии или энтропии. Сверхвысокая
аффинность требует благоприятной
энтальпии и энтропии связывания.
Высокой энтропии связывания способствует

koMi.ichi.ipiii-. t'33.2. Возбуждение
ВИЧ-инфекции, цитокины
и хемокины
ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)
является причиной заболевания под
названием СПИД (синдром приобретенного
иммунодефицита). Инфицирование
начинается со специфического взаимодействия
между внешним гликопротеином оболочки
вируса (gpl20), мембранным клеточным
рецептором (CD4) и облигатными
рецепторами хемокинов (CCR5 или CXCR4).
Связывание вирусного белка с CD4 запускает
конформационные изменения в оболочке
вируса, которые приводят к его узнаванию
рецепторами хемокинов и впоследствии —
к слиянию ВИЧ с клеточной мембраной
и его проникновению в клетку.
Хемокины — разновидность цито-
кинов, противовоспалительных белков,
ответственных за хемотаксис клеток
иммунной системы. Они являются
необходимыми компонентами фагоцитарной
реакции; предполагается их участие в
элиминации опухолевых клеток, повреж- i
денных при цитотоксической терапии, i
В 1996-1997 гг. опубликованы
результаты комплексных исследований, которые
вскрыли уникальную роль в развитии .
инфекции вирусом иммунодефицита че- ,
ловека рецепторов молекулярных аттрак-
тантов — хемокинов. Выяснилось, что для
инфицирования клеток первичными
штаммами ВИЧ, т. е. штаммами, выделенными ■
непосредственно от больного и не адапти- |
рованными к размножению в культурах пе- '
ревиваемых лимфоцитов, необходимо
присутствие на поверхности клеток не только
известных ранее рецепторов CD4, но и
рецепторов для хемокинов — CCR-5 (CKR-5). i
Только при наличии этих рецепторов в ин- I
тактном состоянии возможно заражение
чувствительных клеток первичными мак-
рофаготропными вариантами ВИЧ.
дизайн конформационно ограниченных
(напряженных) лигандов, имеющих
высокую степень гидрофобности. Именно
такими свойствами обладают
ингибиторы протеазы IIIV-1 (см. рис. В3.1),
которые одобрены для клинического
использования.
Жесткость лигандов обеспечивает
их высокую специфичность в
отношении белка-цели. Однако эта
специфичность делает лигаид малоэффективным
в отношении родственных или
мутированных целевых белков, что может
приводить к лекарственной устойчивости.
Иногда желательно, чтобы лигаид
обладал определенной гибкостью. Тогда
более низкая аффинность,
обусловленная снижением энтропийного фактора
связывания, должна быть
скомпенсирована другими энергетически
выгодными взаимодействиями. Стоит также
отметить, что гидрофобность лигапда
будет влиять и на сто растворимость.
Поэтому выбор определенного
соотношения между энтропией и энтальпией
определяет не только аффинность
связывания, но и более общие свойства
самого лиганда.
Соотношение между энергией
связывания и структурой
Знание энтальпии связывания
несомненно оказывает большую помощь для
дизайна лигандов. К сожалению, ее
интерпретация далеко не однозначна,
поскольку самые разные процессы вносят
почти равноценные вклады в
энтальпию связывания. Структурное
исследование комплексов белков с
низкомолекулярными лигандами показало, что
сайты связывания в свободных белках
характеризуются низкой структурной
стабильностью. Их стабилизация после
присоединения лиганда отражается в
термодинамике процесса как конфор-
мационный энталъпийный вклад
связывания. Несмотря на присущие этой
проблеме трудности, сегодня предпри-

ни.маются попытки параметризовать
энтальпию связывания в терминах
структурных характеристик, как это
было сделано в сканирующей
калориметрии (см. параграф В2.4.9).
Изотермическая калориметрия
титрования в комбинации с другими
биофизическими методами
В качестве примера комплексного
подхода в изучении белок-белковых
взаимодействий опишем исследование
энергетики реакции связывания
комплекса гликопротеина внешней
оболочки вируса иммунодефицита человека
(gpl20) и мембранного клеточного
рецептора CD4 (к<>\:мг:| i;:p,:n [!.';.!!).
Здесь использовались различные
физические методы, включая масс-спек-
трометрию и аналитическое
ультрацентрифугирование для определения
масс белков и комплексов в растворе,
изотермическую калориметрию
титрования для характеристики энергетики
процесса и аффинностей связывания,
поверхностный плазмонный резонанс
для характеристики кинетики
связывания и круговой дихроизм (Глава Е6)
для идентификации структурных
перестроек в ходе связывания.
Термодинамика взаимодействия
при связывании определялась с
помощью изотермической калориметрии
титрования. На рисунке В3.6
представлены графики тепловой
мощности и интегральной энтальпии
титрования белком CD4 зрелого а и исходного
о gpl20. Растворимые формы двух
белков были получены путем
экспрессии в клетках яичников китайского
хомячка и клеточной линии
дрозофилы. Белок gpl20 был получен в двух
формах: как полноразмерный глико-
зилированный белок и как исходный
gpl20, с некоторыми
аминокислотными делециями и без сахарных групп.
Молекулярные массы CD4 и
исходного gpl20 по отдельности и в
комплексе между ними оказались равными
45 кДа, 38 кДа и 83 кДа,
соответственно. Линии аппроксимации показаны
для значений энтальпий связывания,
равных 63 и 62 ккал на моль белка
CD4 для полноразмерного и
исходного белка gpl20. Равновесные
константы диссоциации KD для двух
белков оказались равны 5 нМ и 190 нМ
соответственно. Рисунок В3.6 «
отображает температурную зависимость
энтальпии связывания CD4 для
полноразмерного (пустые кружки) и ко-
рового (закрашенные кружки) gpl20.
Наклоны линий аппроксимации дают
значения теплоемкостей связывания,
равные 1,2 и 1,8 ккал-моль^К-1.
В приведены
термодинамические параметры,
рассчитанные с помощью данных, показанных
на рисунке В3.6. Стоит отметить, что
'-.'-■ Термодинамические параметры взаимодействия CD4
с белком др120 при 37°С
Молекула^---^^
полноразмерный
gP120
коровый
gpl20
AG"
(ккал-моль1)
-11,8 ±0,3
-9,5 ±0,1
АН"
(ккал-моль1)
-63 ±3
-62 ±3
-TAS°
(ккал-моль1)
51,2 ± 3
52,5 ± 3
АО
(ккал-моль-1)
-1,2 ±0,2
-1,8 ±0,4
(нМ)
5±3
190 ±30

Время (мин)
10 20
0 0.5 1 1.5 2
Малярное отношение (CD4/gp120)
, 0.0
5-0 2
-0.4
mm
-0.6
-20
I -40
-ео'
Время (мин)
20 40
60
yttwHtfr
0 0.5 1 1.5 2
Молярное отношение (CD4/gp120)
-20-
; "
Л
С
| -40-
(кк
X -60-
<
-80-
ч
v
N
v
**/} **
^*sr\ **
ЛЛ>>^ v
^S£^
^j^
г——г—i 1 1
^sNv
1 1
10
20 30 40
Температура (°С)
50
Рис. В3.6. Изотермическая калориметрия титрования gpl20 белком CD4; а) графики тепловой
мощности (вверху) и интегральной энтальпии (внизу) титрования полноразмерного гликолизи-
рованного белка gpl20 белком CD4; б) то же для исходного белка; в) температурная зависимость
энтальпии связывания для белков двух типов (Myszka et al„ 2000); г) рентгеновская
кристаллографическая структура комплекса gpl20 (красный) с CD4 (желтый) при разрешении 2,5 А. В
этой проекции видно, что остаток Phe 43 белка CD4 находится в «кармане» белка gpl20.
Площадь контакта между двумя белками составляет около 800 А2 (Kwong et all., 1998)
эти параметры для полноразмерного и
корового gpl20 в основном схожи, что
указывает на общий механизм
связывания. Большая разность между
значениями констант диссоциации (5 нМ
и 190 нМ) соответствует разности
свободной энергии связывания, равной
всего лишь 2 ккал-моль-1, что меньше
энергии образования одной
водородной связи.
Термодинамика процесса
связывания для комплекса CD4-gpl20 качест-

венно отличается от других комплексов
белок-белок, для которых характерны
небольшие положительные значения
АН или -TAS. Однако она похожа на
термодинамику взаимодействий между
антителом и антигеном, а также
между рецептором Т-клеток и пептидом
главного комплекса гистосовместимо-
сти (МНС). Благоприятная энтальпия
связывания CD4 с gpl20 поразительно
велика (Л#, ~ -63 ккал-моль"1), тогда
энтропийный вклад данного
процесса (-7А5о - 52 ккал-моль ') хотя тоже
очень большой, но неблагоприятный.
Таким образом, образование комплекса
CD4 — gpl20 включает большое число
взаимодействий при связывании,
таких как водородные связи и ван-дер-
ваальсовы взаимодействия, а также
существенную потерю степеней свободы.
Как показывают кристаллографические
данные, такое уменьшение энтропии
объясняется значительными конфор-
мационными перестройками белков,
а не захватом молекул воды. Большие
значения энтальпийного и
энтропийного вкладов в связывание
уравновешивают друг друга и дают в результате
низкие значения констант диссоциации
и свободной энергии, похожие на
соответствующие показатели для других
комплексов.
Теплоемкости связывания в
данном случае (см. i;i■'). i. Ii.'S. i )
значительно выше значений, обычно
наблюдаемых для комплексов белок-белок (от
-0,2 до -0,7 ккал-моль-1 К). Исходя из
структурной интерпретации
изменений теплоемкости, обсуждаемой в
разделе ВЗ.З, можно предположить, что
после образования комплекса CD4 —
gpl20 обширная неполярная площадь
Время (сек)
т
50
100 150 200
Время (сек)
б
п
250
Рис. H.i.7. Кинетики связывания CD4 с gpl20, полученные методом поверхностного
плазменного резонанса: (а) нормированные сигналы связывания CD4 (1мкМ) с полноразмерным gpl20
(черная кривая), глнкозилированным коровым белком (красная кривая), негликозплированным
коровым белком gpl20 (синяя кривая) и немодифинированным сенсором (серая кривая); (б)
кинетика связывания корового gpl20 с поверхностью белка CD4 при различных концентрациях —
от 975 нМ (верхняя черная кривая) до 36 нМ (вторая нижняя черная кривая). Также показана
базовая линия для концентрации 0 нМ. Данные аппроксимированы (красные линии) с помощью
модели взаимодействия с одним сайтом (Myszka et al., 2000)

Комментарий ВЗ.З. Структурное
моделированиетермодинамических
параметров
Сполар Р. С. и Рекорд М. 'Г, независимо
от подхода Фрейре и его сотрудников,
соотнесли термодинамические параметры с
количеством остатков, которые подвергаются
реструктуризации во время связывания, на
основе анализа структуры, полученной с
высоким пространственным разрешением
(Spolarand Record, 1994).
поверхности белков становится
недоступной для растворителя.
В другом подходе, основанном на
моделировании (комментарий В,'5..'■>),
теплоемкость и энтропия связывания
интерпретировали в терминах числа
остатков, которые подвергаются
реструктурированию во время связывания.
Применение данного подхода для
комплекса CD4 — gpl20 дало значение числа
таких остатков, близкое к 100. Это одно
из самых больших значений для
взаимодействий белок-белок.
Кинетика связывания CD4 — gpl20
была проанализирована также методом
поверхностного плазмонного
резонанса (см. рис. В3.7 и Главу В4).
Полученные константы скорости ассоциации
для полноразмерного и корового
белка gpl20 оказались малыми и
близкими по значениям: 6,72 х Ю4 М'Чек-1 и
6,27 х Ю1 М_1сек-1 соответственно, что
характерно для больших структурных
перестроек во время связывания.
Различные значения
равновесных констант диссоциации (I'M. I.1U.I.
li.'i.l) согласуются с данными,
полученными с помощью изотермической
калориметрии титрования. Они
возникают в результате различных
констант скоростей диссоциации,
возможно, из-за потери термодинамически
выгодных контактов в коровом белке
gpl20. В то же время влияние глико-
зилирования на кинетику связывания
оказалось минимальным.
Гибкость белка gp 120, а также
маскирование его рецептора и сайтов
связывания хемокинов могут способствовать
тому, что свободные мономеры этого
белка из вирусной оболочки будут
вызывать появление в основном антител,
которые неспособны к его
нейтрализации, и, следовательно, плохо
стимулируют образование нейтрализующих
антител. Такая стратегия-ловушка может
помогать вирусу избегать гуморального
иммунного ответа.
Комбинация результатов
гидродинамических, термодинамических,
спектроскопических и кристаллографических
исследований комплекса CD4 — gpl20 дает
нам захватывающую картину его роли в
биологии ВИЧ-инфекции. Как пишут
авторы исследования, которое мы
цитировали в разделах ВЗ.5-3.7: «Конфор-
мационная гибкость gpl20 служит
привлекательной гипотезой для понимания
иммунной невосприимчивости вируса и
механизма его проникновения в клетку».
В3.4. Перечень ключевых идей
В изотермической калориметрии титрования мощность, необходимая для
поддержания постоянной разности температур между реакционной ячейкой и
эталонной, измеряется калориметром; тепло, поглощенное или выделенное в результате
химической реакции, находится интегрированием кривой мощности по времени.

• Изменение теплоемкости связывания в процессе реакции можно определить
повторным титрованием при разных температурах, в тех случаях, когда энтальпия
реакции слишком велика для измерения в диапазоне концентрации лиганда.
• Перспективные комплексы компонент-белок для конструирования
лекарственных препаратов можно охарактеризовать с помощью изотермической
калориметрии титрования, которая дает информацию об энергетике связывания.
• Одинаковую константу связывания можно получить различными
комбинациями вкладов энтропии и энтальпии.
• Энтальпия связывания отражает конкуренцию между взаимодействиями,
обусловленными образованием связи белок-лиганд с одной стороны и
взаимодействиями белок-растворитель и лиганд-растворитель с другой.
• Энтропия связывания прежде всего говорит об изменениях в энтропии
сольватации и конформационных энтропиях белка и лиганда.
• Для получения как можно более полного описания энергетики и структурных
изменений во время реакции связывания целесообразно комбинировать
изотермическую калориметрию титрования с другими биофизическими методами.
• В реакциях, где теплоемкость компонентов реакции может меняться с
температурой, целесообразно использовать изотермическую калориметрию
титрования совместно с дифференциальной сканирующей калориметрией.
Литература для дальнейшего чтения
Spokane R. В and Gill S.J. Titration microcalorimeter using nanomolar quantities of
reactants. Rev. Sci. Instrum., 1981. 52, 1728-1733.
SeeligJ. Thermodynamics of lipid-peptide interactions. Biochim. Biophys. Acta,
2004.1666, 40-50.
Velazquez-Campoy A., Leavitt S. A., Freire E. Characterisation of protein-protein
interactions by isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol., 2004. 261, 35-54.

Глава В4
БИОСЕНСОРЫ И ПОВЕРХНОСТНЫЙ
ПЛАЗМОННЫЙ РЕЗОНАНС
В4.1. Исторический обзор
и введение в биологическую
проблематику
1S01
Томас Янг (Thomas Young) открыл,
что что при помещении светового пучка
двух щелей на экране наблюдается
интерференционные полосы. Это явление
лежит в основе современных
интерферометров для измерения взаимодействия
лиганд-рецепторов.
1902
Р. В. Вуд (R. W. Wood) впервые
наблюдал явление поверхностного
плазмонного резонанса (ППР). Позже
это явление легло в основу простого и
чувствительного метода, который
позволил регистрировать малые
изменения коэффициента преломления,
происходящие вблизи поверхности тонкой
металлической пленки.
1 9()<S
Е. Кречманн и X. Ц. Рэтзер
(Е. Kretschmann и Н. Z Raether)
предложили схему сенсора, основанного на
принципе поверхностного плазмонного
резонанса с оптической системой,
содержащей призму, соединенную с
реакционной ячейкой.
Б. Лидберг (В. Liedberg) с
сотрудниками выяснили потенциал явления
поверхностного плазмонного
резонанса для исследований связывания
макромолекул. Они обратили внимание
на то, что изменение коэффициента
преломления вблизи поверхности
тонкой металлической пленки зависит от
свойств молекул, локализованных на
поверхности металла и впервые
детектировали связывание индивидуальных
специфических иммуноглобулинов с
антителами, пришитыми к поверхности
золотой пленки.
1<)<S() !!)!)(>-(-
В эти годы было создано несколько
коммерческих биосенсоров,
основанных либо на явлении
интерферометрии, либо на явлении поверхностного
плазмонного резонанса для простого и
быстрого, а главное, не требующего ме-
чения анализа биологических
макромолекул, таких как белки, ДНК и
другие молекулы.
!!)!).'!
С. Дэвис (S. Davies) с коллегами
продемонстрировали биосенсор,
основанный на явлении поверхностного
плазмонного резонанса для анализа

слабых взаимодействий, на примере
связывания рецепторов клеточной
поверхности.
\'\Н){) а но :i:ic i ojiincc itpi'.wji
Были разработаны различные
оптические схемы биосенсоров с
высокой чувствительностью и
избирательностью для одновременного анализа
взаимодействий между тысячами
молекул, для исследования
внутримолекулярных взаимодействий с разным
уровнем аффинности в самых
различных температурных и химических
условиях. Использование
биосенсоров делает их особенно удобными для
быстрого перебора предполагаемых
лигандов. За последние несколько лет
эти инструменты стали важнейшими
в изучении протеома. Используемые
в комбинации с другими
биофизическими приборами, такими как
калориметр изотермического титрования,
аналитическая ультрацентрифуга и
масс-спектрометр, они позволяют
проводить очень точный
термодинамический анализ процесса связывания, а
также характеризовать и
идентифицировать партнеров. К преимуществам
использования бисенсоров по
сравнению с другими методами относятся:
использование небольшого
количества материала (в нанограммовом
диапазоне), возможность исследования
разнообразных систем (от молекул с
массой от 200 Да до одноклеточных
организмов), отсутствие мечения и
низкие требования к чистоте
препарата (можно исследовать связывающие
свойства даже клеточного экстракта).
Их несомненным достоинством
является также возможность изучения
кинетика связывания в реальном
времени.
3 4-.. ;'•'-:. М з м е р е н и е
поверхностного связывания
В4.2.1. Биосенсор как инструмент
исследования взаимодействий
между молекулами
Для исследования взаимодействий
между биологическими макромолекулами
разработаны различные типы
биосенсоров. Биосенсор как инструмент
включает в себя проточную кювету,
присоединенную к оптическому устройству.
Буфер и анализируемое вещество
входят в кювету и покидают ее, а об их
биохимическом взаимодействии
судят по изменению коэффициента
преломления, которое происходит из-за
изменения концентрации вещества
в кювете.
Для измерения показателя
преломления в кювете используются два
способа. Первый основан на поверхностном
плазмонном резонансе, а другой — на
высокочувствительной разностной
интерферометрии. Биохимические
параметры связывания, такие как
равновесная константа диссоциации, константа
скорости реакции (см. Главу В1)
можно рассчитать напрямую из изменений
коэффициента преломления раствора,
зависящих от времени.
Эксперименты по изучению
поверхностного связывания обычно
включают иммобилизацию первой молекулы
(лиганд) на поверхности и
наблюдение за ее взаимодействием со второй
молекулой в растворе (анализируемое
вещество). Преимущество такой
схемы заключается в том, что она служит
моделью многих биологических
процессов узнавания, таких как, например,
взаимодействия между клеточными
рецепторами и растворимыми
сигнальными белками.

B4.2.2. Биосенсор на основе
поверхностного плазмонного
резонананса
Биосенсор, работающий с
использованием поверхностного плазмонного
резонанса, завоевал большую популярность
прежде всего благодаря простоте и
высокой чувствительности. Сначала
рассмотрим само явление поверхностного
плазмонного резонанса.
Явление поверхностного плазмонного
резонанса
Прежде всего вспомним хорошо
известное явление в оптике — явление
полного внутреннего отражения. Оно
происходит на границе раздела между
двумя прозрачными средами с
разными коэффициентами преломления и
детально описано в параграфе ДЗ.3.3.
Когда свет падает на поверхность
раздела таких сред под углом, который
превышает некий критический угол, почти
весь свет полностью отражается.
Однако некоторое количество света все же
проникает в среду с более низким
коэффициентом преломления в виде
электрического поля, называемого стоячей
волной.
Если поверхность раздела двух сред
покрыть тонким слоем металла, то
стоячая волна, поляризованная в плоскости
падения и отражения лучей (р-поляри-
зованныйсвет, мшмсп mpnii I! i.l),
проникнет в слой металла (рис. В1.1). При
определенном угле падения такой свет
возбуждает делокализованные
электроны поверхности металла, названные
плазмонами, что приводит к сильному
увеличению амплитуды стоячей волны
(отсюда возникает резонанс). В этом
угле интенсивность отраженного
света резко падает в результате передачи
энергии плазмонам. Такой угол
падения луча называют углом резонанса.
Плазмонная волна
Металлическая
пленка
Раствор с показателем
преломления(nj
Область
резонанса
Падающий
р-поляризованный
свет
Рис. В4.1. Стоячая волна, поляризованная в плоскости падения и отражения (р-поляризацня),
проникает в слой металла и возбуждает электроны в поверхностном слое металла.
Поляризованный свет падает под углом 6) к поверхности золотой пленки. к|юв -- это волновой вектор
поверхностного плазмона, а к — волновой вектор падающего луча. Компоненты кх и kv — параллельны
и перпендикулярны поверхности, соответственно

Условия для возбуждения
поверхностных плазмонов на границе между
металлом и раствором выполняются
при совпадении проекции волнового
вектора падающего света в
направлении границы раздела (kt) и волнового
вектора (£,„„) осцилляции
поверхностного плазмона:
*,=*„„,, (В4.1)
где kx=-^envK№axsmQ,
у __ [.металл ^ячгмка (ТЛА 0\
С V Е + £
\ MtTiLl.'l ячейка
п sine = Г'"'1'"-1 X£'""ito,
""""' '' ve +e ..
К металл ячеика
где со — угловая частота падающей
волны, с — скорость света, а е — зависящая
от длины волны комплексная
диэлектрическая проницаемость. Угол падающего
света и, соответственно, отраженного
света 0 , который удовлетворяет условиям
поверхностного плазмонного резонанса,
зависит, таким образом, от
коэффициента преломления материала с
неосвещенной стороны металла (проточная ячейка
в нашем случае). Любые локальные
изменения показателя преломления приводят
к изменению интенсивности света,
попадающего на детектор.
На рисунке 131.2 схематически
показан биосенсор, работающий на основе
принципа поверхностного плазмонного
резонанса. Две среды в биосенсоре
образованы стеклянной призмой и проточной
кюветой, в которой проходит
биохимическая реакция. Их разделяет тонкая
металлическая пленка. В диапазоне длин
волн видимого света условия резонанса
выполняются всего для несколько
металлов, из которых наиболее подходящими
являются золото и серебро (м >ммгп i ;ipi i ii
131.-). Сигнал, измеренный в резонан-
Комментарий В4.1. s- и р-волны в |
явлениях отражения и преломления I
'п ., I
I При изучении закономерностей поляри- ;
зации света в результате отражения и
преломления естественного света последний
удобно рассматривать как совокупность
одинаковых по интенсивности линейно по- :
I ляризованных волн двух типов: s- и р-волп
(рис. 1 а п б). Согласно представлениям ;
классической электронной теории обра- i
зование отраженной волны обусловлено :
вторичными волнами, которые излучают
молекулы — осцилляторы отражающей
свет среды. Волне s-тииа соответствуют
осцилляторы (колеблющиеся электрические
; диполи), оси которых перпендикулярны к
j плоскости падения. Эти осцилляторы по-
: казаны на рисунке /i зелеными стрелками.
Волне р-типа соответствуют осцилляторы,
оси которых лежат в плоскости падения
. и перпендикулярны преломленному лучу.
! 1'пг 1: а — р-нолярпзованный свет: осцил- |
ляторы электрического поля (синие стрел- |
ки) лежат параллельно плоскости, образо- I
ванной падающим и отраженным лучами i
(красные стрелки); б — ^-поляризованный :
свет: осцилляторы электрического ноля
(зеленые стрелки) лежат
перпендикулярно плоскости, образованной падающим и
отраженным лучами, поэтому параллельны
. поверхности раздела сред.
сных единицах (РЕ), пропорционален
количеству белка, связавшегося у
поверхности (обычно 1000 РЕ = 1 нг
связанного белка на квадратный миллиметр).
Результаты обычно представляются в виде
сенсограммы, которая отражает измене-

Коммен;;1:)пи. i'3-I.L'.
Распространение поверхностных
плазмонов
Плазмоны, распространяющиеся по
поверхности металла, постепенно затухают
из-за потерь, вызванных поглощением.
Величина затухания зависит от
диэлектрической проницаемости металла при данной
частоте осцилляции плазмона. Золото и
серебро являются самыми
предпочтительными кандидатами на роль металлических
пленок в диапазоне видимого света. Хотя
серебряная пленка дает более четкий сигнал,
на практике она не используется ввиду ее
химической нестабильности. Поэтому для
биосенсоров лучший выбор — золото.
ния резонансного сигнала как функции
времени (см. рис. В1.2 «)■
В заключение отметим одно
интересное явление, связанное с явлением
поверхностного плазмонного резонанса.
На его основе созданы светящиеся
частицы фантастической яркости, во много
тысяч раз превосходящую таковую всех
известных флуорофоров. Так,
сферические частицы диаметром 100 нм имеют
яркость, эквивалентную яркости 100000
флуоресцентным молекулам. Вдвойне
интересно, что форма частиц оказывает
сильное влияние на спектральные
характеристики частиц (рис. В4.3).
Интенсивность
Падающий поляризованный
свет
Отраженный свет
(I) (И)
Угол Сенсограмма
а б в
Рис. В4.2: а — общий принцип детектирования биомолекулярных взаимодействий с помощью
поверхностного плазмонного резонанса. Увеличившаяся концентрация образца на поверхности
сенсорного чипа вызывает рост коэффициента преломления, который изменяет резонансный угол;
б — такое изменение регистрируется положением детектора для минимума интенсивности
отраженного луча (из позиции I в позицию II); в — изменение резонансного сигнала от времени.
о. :
600 690 600 690
Длина волна (нм)
а б
Рис. В \ .3: а — сферические частицы излучают преимущественно голубое свечение (415-490 нм),
пентагонные частицы светят зеленым цветом (480-600 нм, а треугольные частицы излучают
красное излучение (620-720 нм); б — зависимость интенсивности светящихся частиц от длины
волны (Shultz, 2003)

Б4.2.3. Биосенсоры на основе
интерферометров
В интерферометре с двойным ходом
лучей лазерный луч движется по двум
параллельным путям — А и Б, один из
которых — А — содержит образец (рис.
134.А). Напомним, что скорость света в
среде с коэффициентом преломления п
дается выражением
со г
с = — л/е,
п
(В4.3)
где со — это угловая частота волны света,
а е — диэлектрическая проницаемость
среды. Поскольку образец имеет свой
коэффициент преломления, он
изменяет скорость света, приводя к появлению
разности фаз лучей А и Б.
Две волны интерферируют, давая
классическую интерференционную
картину Янга. Любые изменения
показателя преломления будут влиять на
скорость распространения лазерного луча и
вызывать сдвиги в интерференционной
картине. Величину сдвига калибруют
по известным значениям коэффициента
преломления. Оптическая
конфигурация биосенсора, основанная на интерфе-
рометрическом принципе, показана на
рисунке ВЛЛ.
В таком биосенсоре образец
представляет собой проточную ячейку,
в которой происходят молекулярные
реакции. Рецепторы прикреплены к
клеточной поверхности, а
анализируемые вещества обтекают их. В отличие
от биосенсора, основанного на
принципе поверхностного плазмонного
резонанса, такой эксперимент
чувствителен к изменениям коэффициента
преломления по всему объему ячейки.
В4.2.4. Лиганды и поверхность
В биосенсорах лигандами,
присоединенными к поверхности проточной
ячейки, служат в основном белки, но
могут использоваться и другие
разнообразные молекулы. Их длительное и
высокостабильное связывание с
поверхностью позволяет проводить
эффективное измерение и контроль
количества связанного анализируемого
вещества.
Белки могут быть присоединены
к поверхности благодаря своим
гидрофобным участкам или ковалентно
пришиты через свои амино-,
карбоксильные или сульфгидрильные группы.
При таком связывании лиганды,
вероятнее всего, принимают случайную
ориентацию на поверхности, и их
место связывания не всегда будет
доступно для анализируемого вещества. Это
оказывает влияние на максимальную
Волновой фронт Б
^VX~VWWV./TVX"
Волновой фронт А
Проточная кювета
' Поток
Разность
фаз
Рис. Н1.1. Биосенсорная интерферометрия (см. текст)

емкость связывания, но не на
измеряемые константы скорости и
диссоциации (см. ниже).
Для пришивания лиганда к
поверхности часто используют тэги (от
английского tag— ярлык, конец). При
правильной подборке они могут придать
белку положение, которое является для
него естественным на поверхности
клеточной мембраны. Специально
разработаны элементы биосенсоров (чипы),
способные связывать биотин, глута-
тион S-трансферазу и полигистидино-
вые тэги. Разработаны также и более
близкие к природным системы,
включающие лиганды, погруженные в липид-
ный слой и обладающие латеральной
подвижностью.
Биосенсорный чип можно
использовать много раз подряд, поскольку
после каждого эксперимента лиганд-
ную поверхность регенерируют, чтобы
тщательно удалить оставшееся
анализируемое вещество.
В4.3. Взаимодействие между
молекулой и поверхностью
В4.3.1. Термодинамика
взаимодействий с поверхностью
Вспомним из главы В1, что
термодинамическая равновесная константа
диссоциации для связывания молекул А и В
дается выражением
k
*„ =
[Л][В]
В случае биосенсоров под k.Ki.
понимают скорость связывания
анализируемого вещества с поверхностью, а под
k — скорость, с которой оно уходит
оттуда. Типичный диапазон значений
этих констант: Кй= 10"7-109М, k.m, =
= КР-ЮШ-'сек-'и* -10°-10"6 сек1.
лисе
Типичная сенсограмма показана
на рисунке 131.;">. Биосенсор
калиброван таким образом, что сигнал R
пропорционален концентрации свя-
Jl
/7
/i
/ о
1 *г
♦
Равновесие
♦
- ^^
^-
Время
Рис. В4.5. Сенсограмма представляет собой график зависимости сигнала от времени.
Увеличение числа резонансных единиц по сравнению с начальной базовой линией отражает связывание
молекул. Плато показывает стационарную фазу взаимодействия, когда ассоциация
уравновешена диссоциацией молекул комплекса. Дальнейшее уменьшение сигнала указывает на удаление
анализируемого вещества из ячейки

занного анализируемого вещества.
Сигнал будет меняться со временем в
соответствии с концентрацией
молекул в растворе и с тем, как быстро
молекула ассоциирует и диссоциирует
с рецептором, который пришит к
поверхности проточной ячейки.
В4.3.2. Измерение константы
равновесия
Равновесная константа диссоциации Kd
определяется из равновесной величины
сигнала. Стандартное уравнение для
изменения сигнала со временем, при
стехиометрии взаимодействии 1:1
дается выражением
dR (t)/dt = k C(t)x
(B4.4)
x[R -R(t)]-k R(t)
L макс \ ' J дна- ч '
для концентрации анализируемого
вещества С. R — это максимальная ве-
макс
личина сигнала. Равновесный сигнал
Rrmn достигается, когда dR (t)/dt =0.
Таким образом, предыдущее уравнение
можно переписать как
R =(!/(£ /k +C))*CR . (В4.5а)
раин v / \ диге' асе 7/ макс- v 7
Или, используя константу
равновесия К = k /k ,
и лисе7 аа
R =CR (1/(К. + С)).(В4.5б)
раим макс v/v-ii / / \ /
что подобно изотерме Ленгмюра
(комментарий 151..'$). Равновесная
константа диссоциации Кл рассчитывается из
кривой зависимости равновесного
сигнала в точке на плато от концентрации
анализируемого вещества.
Стандартный метод оценки Kd состоит в
измерении равновесного сигала R для
1 ' раин
различных концентраций лиганда Ск.
Преобразовав предыдущее уравнение
в линейную форму, получим:
= (-1/К,)Д„ (Ck)+ (B4.6)
+ (1/K.)R .
v ' Q' макс
Анализ Скэтчарда основан на
определении сигнала связывания в
равновесных условиях и соответствующих
концентраций анализируемого
вещества (см. Главу В1). Прямая ЯШ1Ш/Ск,
отложенная против R , имеет наклон,
равный -1 /Kd, и пересекает ось х в
точке RmKC/Kd (пример графика приведен
на рис. 13-1.6). Надо отметить, что
уравнение В4.6 позволяет рассчитать Kd и
R из значений равновесных сигна-
макс J
лов при различных концентрациях,
не достигая насыщения лигандов
поверхности анализируемым веществом.
На самом деле, при низкой
аффинности взаимодействий, когда Kd лежит в
диапазоне 0,1-500 мМ, насыщение
поверхности сенсора достигается очень
редко.
Комментарий В4.3. Изотерма
Ленгмюра
Изначально изотерма Ленгмюра была
предложена для описания состояния
равновесия газа, находящегося в контакте
i с твердой средой:
| Г-Г^С/ia + C) (А),
, где 1\па. — максимальная величина
адсорбции газа, а а — отношение скоростей
десорбции и адсорбции (аналогично отношению
распада и образования комплекса), С —
равновесная концентрация, остающаяся в
растворе. Соотношение (А) называют
изотермой, поскольку оно справедливо только
при постоянной температуре. Уравнение
(А) носит название адсорбционной изотер-
: мы Ленгмюра и характеризует состояние
! термодинамического равновесия при
равенстве скоростей адсорбции и десорбции
на адсорбенте.

Ответ системы
'25°С
9Л
1
CD8c
19 ^_
I I I
HLA-A2-1IU
Контроль
иг (мкмоль)
76
п
1
52
1 i
/"
1
508
> —
i
\
i
200
300
400
500 600 700
Время (сек)
800
900
О 600 1200
Связанный (RU)
О 200 400 600
CD80UX (мкмоль)
б
Рис. В4.6. Анализ связывания между белком CD8aa (лиганд) и молекулой HLA-A2
(анализируемое вещество): а — серия последовательных разбавлений дает уменьшение сигнала: б —
сигнал при связывании и график Скэтчарда (вставка) (Wyer at al., 1999)
Во время эксперимента
анализируемое вещество обычно разбавляют
для достижения стократного диапазона
концентраций (см. рис. В4.6).
Стандартная свободная энергия связывания AG"
рассчитывается из константы
диссоциации, как это описано в Главе В1.
Вклады стандартной энтропии и энтальпии
можно определить из температурной
зависимости AG0 с помощью
нелинейной аппроксимации уравнения В 1.28.
В4.3.3. Определения констант
скоростей взаимодействия
Когда концентрация анализируемого
вещества в проточной ячейке падает до
нуля, то связавшиеся молекулы не
находят замены, и сигнал начинает
возвращаться к своему начальному значению со
скоростью, определяемой силой
связывания (см. рис. ГШ>). Скорость диссоциации
k можно вывести, исходя из характера
уменьшения сигнала R со временем t
R(t) = R(t0)exp[-kvm.(t-ta)]. (ВАЛ)
Время t указывает на момент
начала падения сигнала, когда большее
число молекул покидает лиганд, чем
связывается с ним.
В фазе ассоциации сигнал растет
быстро, со скоростью, которая зависит от
концентрации С анализируемого
вещества. Уравнение В4.4 можно переписать как

^l--(k xC+k )x
dt - ^„сХЧ + ^cjx (B4g)
а константу скорости &асс определить
из графика линейной регрессии dR
(t)/dt от R (t) в фазе ассоциации.
Однако быстрые скорости процесса
делают такую оценку неточной, поэтому
&асс лучше устанавливать с помощью
выражения
^асс ~ Kd х «днсс.
Процессы активации
Зависимость скорости реакции от
температуры дает информацию о
термодинамических параметрах
активации. Вспомним уравнение В1.31
(Глава В1):
In
AS* АН*
ln| -f- 1 + .
h R RT
В эксперименте по изучению
связывания константа скорости k в
уравнении равна k для диссоциации и
С"&асс для реакции ассоциации, где
С0 — это стандартная концентрация
(1 М). Тогда значения энтальпии и
активации могут быть вычислены из
угла наклона кривой зависимости In
(k/T) от 1/Г на графике Эйринга, а
энтропию в точке ее пересечения (см.
параграф В 1.3.4).
В4.4. Экспериментальный
анализ
В4.4.1. Диапазон анализируемых
веществ
В первых экспериментах биосенсоры
использовали преимущественно для
анализа достаточно больших молекул
(>5 кДа), поскольку локальная
величина коэффициента преломления
зависит от массы. Биосенсоры могли
идентифицировать штаммы Е. coli в
соответствии с типом связываемых
лигандов и измерять аффинность
связывания между вирусными частицами.
Чувствительность современных
биосенсоров позволяет определять
вещества с массой до 200 Да. Еще меньшие
молекулы можно охарактеризовать с
помощью конкурентного ингибирова-
ния (см. параграф ВЗ.2.3).
В4.4.2. Экспериментальный
контроль и «подводные камни»
На практике применение биосенсоров
сопряжено с необходимостью
особенно тщательного контроля за ходом
эксперимента. В частности
неспецифичное связывание определяют с
помощью клеток, не содержащих лиганд.
При построении экспериментальных
кривых наподобие графика Скэтчар-
да предполагают, что максимальная
теплоемкость связывания рецептора с
лигандом постоянна во времени.
Однако лиганд может менять свою
теплоемкость в результате денатурации
или деградации, поскольку обычно
эксперименты проводят при
комнатной температуре. Для оценки степени
деградации лиганда опыт должен быть
повторен при схожей концентрации
анализируемого вещества.
Слишком высокие концентрации
лиганда или анализируемого вещества
способны вызывать стерические помехи
и препятствовать связыванию молекул
из-за их избытка у поверхности
проточной ячейки. Вследствие этого диффузия
вещества из основного объема раствора
к поверхности может быть затруднена,

и оценка скоростей реакции будет
ложной. Такие связанные с массопередачей
эффекты можно идентифицировать с
помощью варьирования скорости
протока вещества через ячейку. Очень
высокая скорость связывания приводит к
конкуренции лиганда за ограниченное
число молекул анализируемого
вещества и повторному связыванию, а
вследствие этого и к занижению константы
диссоциации.
Измерение связывания с высокой
аффинностью компонентов может
быть затруднено из-за низкой
скорости диссоциации. Например, веществу,
константа диссоциации k которого
равна 10 6сек \ потребуется около трех
часов (104 сек) на диссоциацию только
1 % его молекул. Для подтверждения
результатов наблюденных величины
аффинности, крайне желательно
поменять местами лиганд и анализируемое
вещество.
Заметим, что биосенсоры не
подходят для исследования некоторых типов
молекулярных взаимодействий.
Например, когда присоединение
лиганда к поверхности меняет его
связывающие свойства, или когда связывание
прекращается из-за значительных кон-
формационных изменений лиганда.
В.4.4.3. Межклеточные
взаимодействия
Биосенсоры успешно применяются
в исследованиях межклеточных
взаимодействий, поскольку иммобилизация
лиганд, которые в естественных
условиях связаны с мембраной, в проточной
ячейке в определенной степени
воспроизводит ситуацию in vivo.
Узнавание антигена Т-клетками,
представляющее собой ключевой
механизм контроля адаптивного
иммунного ответа, интенсивно изучалось с
помощью биосенсоров. Рецептор Т-
клеток узнает антигены, которые
несут молекулы главного комплекса гис-
тосовместимости (МНС). Антигеном
обычно является пептид, полученный
в результате клеточного белкового
синтеза. Т-клетки всегда «проверяют»
наличие необычных пептидных
антигенов, поскольку это указывает на
какие-то отклонения от нормы.
Например, они распознают и уничтожают
клетки, имеющие вирусный антиген.
Взаимодействие между комплексом
МНС-пептида и рецептором Т-клеток
определяет судьбу клетки, несущей
МНС. Измеренная аффинность при
этом обычно мала (X,-0,1-500 мкМ)
вследствие медленной ассоциации и
быстрой диссоциации. Большое
значение К (-0,01-5 сек1), соответ-
лиге v ' 7'
ствующее периоду полураспада 70-0,1
сек, указывает на то, что сформирован-
-20-
-10-
10-
20 J
Рис. I34.7. Сравнение усредненных
термодинамических параметров тридцати
взаимодействий белок-белок и взаимодействия
рецептора Т-клеток с пептидом МНС (Willcox ct al.,
1999)

I
f
I
I
■Ц—■—i—■—i' i""! .--^'-т'-г i" i—■ i i"
о iooo тою mo
-1—^
zm
Время (сек)
б
Рис. M1.N. Связывание саквинавира и индинавира протеазой HIV-1: а - масс-спектр,
полученный методом ИЛДМ-ФП, показывающий элюированные с поверхности саквинавир (670 Да) и
индинавир(613 Да);б— смоделированная с помощью данных масс-спектрометрии сенсограмма
диссоциации саквинавира и индинавира с поверхности чипа. Вертикальная линия обозначает
время, при котором соотношение между двумя ингибиторами должно быть 0.4, что
соответствует отношению концентраций между двумя молекулами в масс-спектре. Пунктирная линия
соответствует смеси саквинавира с индинавиром, линия с длинным пунктиром - саквинавиру,
линия точка-пунктир - индинавиру (Mattei et al., 2004)
ный комплекс рецептор Т-клеток-пеп-
тид-МНС более стабилен, чем другие
комплексы, участвующие в
межклеточном узнавании. Измерения
связывания при различных температурах с
помощью биосенсора, основанного на
явлении поверхностного плазмонного
резонанса, показали, что оно
характеризуется необычно выгодными
изменениями энтальпии и крайне
невыгодными — энтропии (рис. В 1.7).
Исследование ряда других
комплексов МНС-пептида с рецептором Т-
клеток обнаружило корреляцию
между соотношением аффинность/время
полураспада и функциональным
эффектом. Полагают, что
взаимодействия по схеме «рецептор Т-клеток-пеп-
тид-МНС» определяют длительность
связывания. Более продолжительное
взаимодействие дает возможность
другим молекулам Т-клеток
собраться в месте контакта двух клеток и
инициировать гибель той, которая
несет антиген.
В4.4.4. Поверхностный плазмонный
резонанс и масс-спектрометрия
Сочетание биосенсора с
масс-спектрометром дает возможность проводить
одновременно анализ связывания
анализируемого вещества, его кинетику и
идентификацию молекул. Биосенсор
позволяет выделить партнеров по
связыванию для рецептора из клеточного
лизата. Интересующие исследователей
молекулы вылавливают из общего
экстракта благодаря тому, что они
удерживаются лигандом в проточной ячейке.
Затем анализируемое вещество элюи-
руют и идентифицируют с помощью
масс-спектрометрии.
В качестве примера на рисунке В4.8
показаны результаты конкуренции
между двумя лекарствами (саквинавир и
индинавир) за поверхность сенсора,
содержащую иммобилизованную HIV-1
протеазу. Масс-спектрометрический
анализ позволил установить вклад каждого
ингибитора в процесс диссоциации.

... ■■■ . \, :'■;.•;.:■ о-::ii-ib ;^;;очевь!х идей
• Явление поверхностного плазмонного резонанса возникает, когда
монохроматический р-ноляризованный свет отражается от тонкой металлической пленки,
находящейся на границе двух сред с различными коэффициентами преломления.
0 Эксперимент по связыванию с помощью биосенсора включает иммобилизацию
молекулы на поверхности (лиганд) и наблюдение ее взаимодействия со второй
молекулой в растворе (анализируемое вещество).
° Об изменении локальной концентрации макромолекул в биосенсоре судят по
изменению коэффициента преломления.
° Изменение коэффициента преломления в биосенсоре можно измерить с
помощью поверхностного плазмонного резонанса или двухлучевой
интерферометрии.
0 Кривая, отражающая процесс связывания во времени, называется сенсограммой.
* Для точного измерения термодинамических параметров используют серию
последовательных разведений анализируемого вещества в стократном
диапазоне концентраций.
"" Скорость диссоциации k нсс рассчитывают из кривой, показывающей затухание
сигнала связывания, а скорость ассоциации вещества с лигандом кмс из фазы
ассоциации, используя различные концентрации анализируемого вещества.
u График Эйринга — зависимость In — от V> гДе ^ — эт0 kWt. или ^"^w, ~ п0~
зволяет определить значения энтропии и энтальпии реакции активации.
° Диапазон анализируемых веществ в биосенсоре варьирует от молекул с массой
в несколько сотен дальтон до целых клеток.
с Комбинация биосенсора с масс-спектрометром позволяет совместить
термодинамический анализ связывания с идентификацией анализируемого вещества.
° Применение биосенсоров требует тщательного экспериментального контроля
специфичности связывания.
j'.vrre-ратура для дальнейшего чтения
Mullet W. M., Lai E. О. С. and Yeung J. M. Surface Plasmon Resonance-Based
Immunoassays, Methods, 2000. 22, 77-91.
Schultz D. A. Plasmon resonant particles for biological detection, Current opinion in
biothechology, 2003.14, 13-22.
Barnes W. L., Dereux A., Ebbesen, Surface Plasmon Subwavelength Optics, Nature,
2003. 424, 824-830.

Часть Г
ГИДРОДИНАМИКА

Глава П
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАКРОМОЛЕКУЛЫ
КАК ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ЧАСТИЦЫ
Г1.1. ИСТОРИЧЕСКИЙ
ОБЗОР И ВВЕДЕНИЕ
В БИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРОБЛЕМЫ
В традиционном представлении
гидродинамика изучает поведение тел в
жидкостях, и в частности, какие силы
действуют на тела при их движении
в среде с определенной вязкостью и
плотностью. Многие выдающиеся
ученые-физики, такие как Исаак Ньютон,
Джеймс Клерк Максвелл, лорд Рэлей
(Дж. У. Струтт) и Альберт Эйнштейн
(Isaac Newton, James Clerk Maxwell,
Lord Rayleigh (J. W. Strutt) and Albert
Einstein) начинали свои карьеры
исследованиями в области
гидродинамики и внесли фундаментальный вклад в
науку. Следует отметить, что хотя эти
открытия сделаны давно, однако они до
сих пор сохраняют свое
фундаментальное значение и продолжают
стимулировать развитие этой области знаний.
1731
Гидродинамика как наука была
впервые описана в классической книге
Дениэла Бернулли (Daniel Bernoulli)
«Гидродинамика», которая содержала
изложение законов о давлении и
вязкости в несжимаемых жидкостях, а также
их многочисленные следствия. В
следующем веке фундаментальный вклад
в эту область внес сэр Гораций Лэмб
(Sir Horace Lamb), опубликовавший
в 1879 г. другую классическую книгу,
также названную «Гидродинамика».
1821
Ботаник Роберт Броун (Robert
Brown) описал беспорядочное тепловое
движение маленьких растительных
частиц, суспендированных в воде, явление,
которое позже получило название
броуновского движения. В 90-х гг.
следующего столетия метод усовершенствованной
видеомикроскопии позволил
непосредственно наблюдать броуновское
движение макромолекул в мембране, меченых
коллоидным золотом.
18Г)Г)
Адольф Е. Фик (Adolf E. Fick)
опубликован феноменологическое
описание поступательной диффузии и
вывел фундаментальные законы
транспорта частиц в растворах.
tsi<;
Дж. Л. М. Пуазель (J. L. M. Poise-
uille) создан теорию движения
жидкости в капилляре. На базе этой
теории Вильхельм Оствальд (Wilhelm

Ostwald) изобрел вискозиметр и ввел
его в физическую и химическую
практику. Позднее прибор был назван его
именем.
1 S.Ki
Сэр Георг Стоке (Sir George
Stokes) показал, что коэффициент
поступательного трения частицы зависит
от ее линейных размеров. Описание
гидродинамического поведения частиц
в терминах радиуса эквивалентной
сферы (радиус Стокса) вошло в физико-
химическую практику. В 1880 г. Стоке
проанализировал также вращательное
трение для частиц сферической формы
и пришел к выводу о связи
коэффициента вращательного трения сферы с ее
объемом. В 1930-х гг. Франсуа Перрен
(Francois Perrin) расширил
применение формулы Стокса на случай
трехосного эллипсоида вращения.
1856
Джеймс Клерк Максвелл (James
Clerk Maxwell) обнаружил, что
некоторые жидкости в гидродинамическом
потоке становятся двулучепреломля-
ющими. В 1960-1970-х гг.
Виктор Цветков и Роже Серф (Victor
Tsvetkov и Roger Cerf)
разработали детальный метод для измерения
двойного лучепреломления в потоке
макромолекулярных растворов.
Эффективность метода была
подтверждена в исследованиях эластичности
и оптических свойств синтетических
полимеров и биологических
макромолекул, не имеющих фиксированной
жесткой структуры.
1887
Осборн Рейнолдс (Osborne
Reynolds) обратил внимание на то, что
отношение сил инерции и вязкости (позже
названное числом Рейнолдса) является
ключевым для понимания
особенностей движения частиц в вязкой среде.
В 1970-х гг. Ховард Берг и Эдвард Пар-
селл (Howard Berg and Edward Purcell)
рассчитали это число в случае движения
различных объектов (от молекул до
живых организмов) в разных средах. Было
найдено, что при движении частиц в
растворителе с молекулярными размерами
10-10 000 А число Рейнолдса очень мало.
Это означает, что биологические
макромолекулы «живут» в мире без инерции.
В таком мире решающее влияние на их
поведение оказывает броуновское
движение и вязкость среды.
188!
Альберт Видеманн (Albert
Wiedemann) предложил термин
«люминесценция», с тем чтобы подчеркнуть различие
между тепловым равновесием и
неравновесным испусканием излучения. Среди
неравновесных процессов он исследовал
эмиссию света молекулами при
комнатной температуре, вызываемую падающей
радиацией. В 1945 г. Сергей Вавилов
(Serguei Vavilov) предложил способ
определения гидродинамического объема
частиц из экспериментальных данных по
поляризованной флуоресценции.
18!)(i
Джон Керр (John Kerr) обнаружил,
что некоторые растворы становятся дву-
лучепреломляющими под действием
электрического поля. После этого
открытия измерение электрического двойного
лучепреломления стало способом
получения информации о природе диполь-
дипольных взаимодействий и гибкости
макромолекул, обладающих как
постоянным, так и индуцированным диполь-
ным моментом. Введение импульсного
режима измерения в практику элект-

рического двойного лучепреломления
и развитие основ теории для
макромолекул позволило Генри Бенуа (Henri
Benoit) в 1950 г. изучать биологические
молекулы в растворе методом
электрического двойного лучепреломления.
Альберт Эйнштейн (Albert Einstein)
разработал теорию броуновского
движения. Он количественно
охарактеризовал движение молекул в
растворителях и газах. Годом позже он получил
уравнение, связывающее коэффициент
диффузии макромолекул в
растворе с коэффициентом поступательного
трения, а также показал, что удельная
вязкость суспензии жестких сфер
пропорциональна их объемной доле и не
зависит от их радиуса.
И)'<()
Роберт Симха (Robert Simha)
получил уравнение для вязкости растворов
эллипсоидов вращения, а в 1981 г. Стефан
Хардинг и Артур Рове (Stephen Harding
and Arthur Rowe) получили уравнение
для вязкости трехосного эллипсоида.
1920
Теодор Сведберг (Theodor Sved-
berg) изобрел высокоскоростную
центрифугу, открывшую эпоху
аналитического и препаративного
ультрацентрифугирования. Он предложил метод
совместного использования
коэффициентов седиментации и диффузии для
вычисления молекулярных масс частиц.
В1929 г. Отто Ламм (Otto Lamm) вывел
основное уравнение, описывающее
поведение движущейся границы в поле
ультрацентрифуги, которое, как оказалось
впоследствии, не имеет аналитического
решения. Появление в 90-х гг. прошлого
века нового поколения полностью
автоматизированных аналитических
ультрацентрифуг фирмы Beckman (Optima
XL), а также развитие численных
решений уравнения Ламма способствовали
возрождению метода аналитического
ультрацентрифугирования.
1«).'57
Альберт Тизелиус (Albert Tiselius)
использовал различия в зарядах
макромолекул для их разделения на фракции
методом электрофореза, что привело
к его широкому применению в
биохимии. В 1950 г. Оливер Смитис (Oliver
Smithies) показал, что электрофоре™ -
ческое разделение белков по принципу
молекулярного сита обладает гораздо
большей разрешающей способностью,
чем электрофорез в свободном растворе.
197Г)
Патрик О'Фаррелл (Patrick O'Far-
rell) развил метод двумерного
электрофореза, который привел к революции
в биохимии белков и настоящее время
интенсивно используется в протеомике.
Впоследствии на смену электрофорезу в
геле пришел капиллярный
электрофорез.
i 9(i2
Бруно Зимм (Bruno Zimm)
предложил оригинальную модель
ротационного вискозиметра, с помощью которого
можно было проводить измерения при
очень низких градиентах скорости.
Такой прибор оказался незаменимым для
измерения вязкости асимметричных
структур, таких как ДНК,
фибриллярные белки и палочкообразные вирусы.
ПИН
Герман 3. Каммингс (Herman
Z. Cummings), исходя из теории
Роберта Пекоры (Robert Pekora), опуб-

Комментарии Г1. I. Единицы силы
и вязкости в гидродинамике
Поскольку гидродинамика является
наукой, развиваемой на протяжении
десятилетии, вычисления в ней традиционно
делаются в сгс единицах. Дина есть единица
силы в этой системе. Одна дина есть сила,
которую надо приложить к частице массой
один грамм, для того чтобы она получила
ускорение один см-сек"-
дина = гем-сек1'.
Все жидкости сопротивляются
изменению их формы. Это свойство жидкости
называется вязкостью. Единица
вязкости есть пуаз. Один пуаз определяется как '
тангенциальная сила на единицу площади
(днн-см -), которая требуется, чтобы
жидкость приобрела скорость 1 емсек"' между
двумя параллельными плоскостями,
находящимися на расстоянии 1 см
1 пуаз = 1 дпна-сек-см ' = 1 г- емсек '.
ликовал первую экспериментальную
статью, в которой показал, что
коэффициент диффузии частиц латекса в
растворе может быть получен из спектров
динамического рассеяния света при
использовании лазера в качестве
источника излучения. Эта работа
подтвердила блестящее теоретическое
предсказание Леонида Мандельштама (Leonid
Mandelstamm), сделанное в 1923г.,
относительно модуляции интенсивности
рассеяния света броуновским
движением частиц. С этого момента метод
динамического рассеяния света стал
общепризнанным методом быстрого и
точного определения коэффициентов
диффузии макромолекул.
1967 1985
За эти годы были развиты новые
теоретические подходы для вычисления
гидродинамических свойств
биологических макромолекул (Виктор Блюм-
филд, Гарсиа де ла Торре, Стюарт
Аллисон) (Victor Bloomfield, Garcia
de la Torre, Stuart Allison). Было
показано, что гидродинамические свойства
макромолекул могут быть вычислены
при заполнении всего объема частицы
набором сфер (шариков) одинаковых
или разных радиусов. В другом
подходе поверхность частицы моделируется
набором равных маленьких сфер (метод
бусинок) или набором маленьких
треугольных пластинок (метод чешуек).
Альтернативный подход был предложен
Стефаном Хардингом и Артуром Рове
(Stephen Harding and Arthur Rowe).
выдвинувшими концепцию описания
биологической макромолекулы в
рамках сфероида (трехосного эллипсоида)
и обосновавших принципиальную
возможность экспериментального
определения параметров такого эллипсоида из
гидродинамических данных.
1993
Джозеф Хаббард и Джек Дуглас
(Joseph Hubbard and Jack Douglas)
обратили внимание на существование
математического подобия между
уравнениями гидродинамики и электростатики.
Это открыло новые возможности
вычислений гидродинамических параметров
частиц разной формы на основе формул
электростатики, расчеты по которым
оказались гораздо менее трудоемкими
(Хуан-Ксианг Жу (Huan-Xiang Zhou)).
1990 2000
Впечатляющий прогресс в
расшифровке структур белков и нуклеиновых
кислот с высоким пространственным
разрешением методами рентгенострук-
турного анализа и ЯМР стимулировал
развитие новых подходов для
вычисления гидродинамических параметров
биологических макромолекул. Было
показано, что фрикционные свойства белков,

структура которых известна с атомарным
разрешением, могут быть вычислены с
точностью около 1-3% при условии
корректного учета вклада гидратации.
2000 и но настоящее иремя
Современная гидродинамика
находится в стадии расцвета, являясь наукой
с четкими подходами для определения
размеров, формы, эластичности и
динамики биологических макромолекул.
Она включает много новых
экспериментальных физических методов, как,
например, восстановление флуоресценции
красителя после фотовыцветания,
разрешенная во времени деполяризованная
флуоресценция, флуоресцентная
корреляционная спектроскопия. Однако,
несмотря на все эти достижения, мы всегда
должны помнить, что гидродинамика
относится к методам, дающим структуру
биологических макромолекул с низким
пространственным разрешением (ком
.Mciiiapnii I'l.l). Эта структура
описывается всего несколькими параметрами:
одним — в случае сферы, двумя — в
случае эллипсоида вращения и тремя — в
случае трехосного эллипсоида. Для
определения последних требуется
комбинация нескольких (трех или более)
гидродинамических методов.
П.2. Гидродинамика
при низких числах реинолдса
При конструирования обоснованных
физических моделей тел, движущихся в
жидкой среде, включающих
биологические частицы, необходимо пользоваться
многочисленными упрощениями. В
данной секции делаются два основных
допущения. Первое допущение состоит в том,
что ноток является ламинарным, и
второе, что он достаточно «медленный», с
тем чтобы инерционными эффектами
можно было пренебречь. Эти
допущения оправданы, поскольку
интересующие нас биологические системы состоят
из очень малых частиц и, хотя частицы и
движутся быстро но отношению к стенке
сосуда, как, например, в методах
вискозиметрии и гидродинамического
двойного лучепреломления, они движутся
медленно по отношению к окружающей
их жидкости.
П .2.1. Число Реинолдса
Рассмотрим объект, движущийся с
какой-либо скоростью в растворителе с
определенной плотностью и вязкостью.
Для описания относительного вклада
эффектов инерции и вязкости более
чем сто лет назад Рейнолдсом был
предложен безразмерный параметр R:
Число Реинолдса =
плотность ж ид кости
= х
вязкость
скорость ._. ..
х х (Г1.1)
1 '
размер частицы _ _
х i =
_ рхг/х/
ч
Как видно из формулы Г1.1, этот
параметр будет мал для частиц малых
размеров и, следовательно, при их
движении должны доминировать силы
вязкости. Напротив, для частиц больших
размеров будут доминировать силы
инерции (ком.мгн npini \'\.'2).
П .2.2. Движение при низких
значениях числа Реинолдса
Вычислим число Реинолдса для вируса
диаметром 500 А (5 х 10 "см),
перемещающегося в воде со скоростью порядка

Коммешарии П .2. Движение
различных частиц в водной среде
Бактерия
Э. Парсел был первым, кто провел
расчеты чисел Рейнолдса для бактерий
(Purcell E. М., 1977). Пусть бактерия
имеет диаметр 1x10"' см и плывет со
скоростью около 1x10 •' смсек'. Принимая |
р= 1 гсм ' и г)0 = 10 2гсм 'сек ', получаем для >
этого случая число Рейнолдса равное 10 -\
т. е. очень маленькое. Отсюда мы
заключаем, что бактерия живет в мире, в котором
инерционные силы не действуют.
Рыбка
Те же вычисления для рыбки, имеющей
размеры / =10 см и движущейся в воде со j
скоростью около 100 смсек-1, дают число, i
равное 105. Такой случай в гидродинамике
называется гидродинамикой при высоких
числах Рейнолдса. Отсюда мы заключаем,
что рыбка живет в среде, где вклад
инерционных сил весьма существенен.
Кит
Для кита, имеющего размеры 10 м
(1000 см), движущегося со скоростью
3,6 кмчас"' (100 смсек-') в воде, число
Рейнолдса равно 108. Поэтому плавание кита
определяется очень большими инерционными
силами.
Коммешарии Г 1.3. Определение
движения при очень низких числах i
Рейнолдса j
Наилучшее определение движения при
низких числах Рейнолдса принадлежит |
Э. Парселу: «То, что вы делаете в данный ,
момент полностью определяется силами ;
действующими на вас в этот момент, но
никак не силами, действующими в про-
; шлом» (Purcell E. М., 1977).
10"3 см-сек-1. Учитывая, что р = 1 г-см 3,
а г) = 10"2 г-см ' сек-1 мы получим
число Рейнолдса равным 5 х Ю-7, т. е. это
число для вируса пренебрежимо мало.
Маленькое число означает, что
молекула вируса должна остановиться
немедленно при исчезновении действия
силы. Однако поскольку частица
вируса постоянно испытывает соударения с
другими молекулами растворителя, то в
действительности она никогда не
останавливается.
Вычисления показывают, что для
крупных биологических образований,
например, бактерий в воде, значение
числа Рейнолдса также мало (см. кпм-
\irii r;ipiii"i I \.'l). Таким образом, все
биологические макромолекулы от
небольших белков до больших бактерий
живут в «мире без инерции», где
доминируют силы вязкости. Напротив, для
больших биологических объектов это
число велико и для таких объектов
гораздо более важными становятся силы
инерции (см. ком\iriмармii Г! ..'>).
Г 1.3. ГИДРАТАЦИЯ
В гидродинамических экспериментах
биологические макромолекулы
перемещаются с определенным количеством
связанной воды. Такую гидратирован-
ную частицу можно представить
состоящей из ядра (собственно материал
частицы) и оболочки (связанная вода).
На рисунке П.1 видно, что гидратация
может рассматриваться как увеличение
размера или объема ядра. Объем
частицы в гидратированном состоянии, V ,
больше, чем объем «сухой» частицы, Vvs,
который можно рассчитать из
молекулярной массы белка, М, и его
парциального удельного объема частицы, гЗ.
Vcyx = Mv/NA. (Г1.2)
Гидратация белка, б (г/г),
выражается через отношение массы связанной
воды к массе сухого белка
~ грамм (воды)
грамм (белка)

Если р — это плотность
растворителя, тогда мы имеем:
«-(Упи/Кух-^Рй. (П.4)
Возможны две трактовки значения
величины 5. Первая трактует эту
величину как изоморфное расширение всего
белка (рис. II.2). Она берет начало из
классического представления о
глобулярных белках как эллипсоидальных
частицах с небольшой степенью вытяну-
тости. Для частицы произвольной
формы изоморфное расширение
предполагает, что линейные размеры, /, частицы
увеличиваются на константу, h, равную
А = ы /и , (Г1.5)
ni.l' сух' х '
так что
Л3 = V /V . (Г1.6)
гид' сух v '
Из этого следует, что константа h
связана с параметром 8 как:
/г = (1 + 8/й р)1'3. (Г1.7)
Рис. I 1.1. Схематическое представление
жестких гидратиронанпых частиц. Гидратация
влияет на общую форму белка, сглаживая
некоторые структурные детали, такие как
углубления или полости. Темным цветом
изображен сухой объем частицы. Серым - связанная
с ним вода (Garcia de La Torre. 2001)
Комментарий f 1.4. Однородное
расширение для компактных
и вытянутых частиц
Принимая значения р =1 см^г1, тЗ =
= 0,73 гем ' и 5 = 0,3 гг', типичные для
глобулярных белков, получаем величину
для h = 0,12, которая соответствует
расширению, равному 12% в линейных размерах и
41 % в объеме. Для очень вытянутых частиц
с размерами 20 А в диаметре и 200 А в длину
такая величина гидратации ведет к
увеличению диаметра частицы на 2 А, а в длину на
40 А. Очевидно, что для вытянутых частиц
однородное расширение ведет к аномальной
гидродинамической модели частицы.
Изоморфное расширение
применимо для компактных частиц, но не
годится для очень удлиненных или
палочкообразных частиц (ком чем lapnii I 1.1).
Вторая трактовка значения 8
базируется на предположении, что негид-
ратированное ядро молекулы
покрыто (одето) водной оболочкой, которая
Рис. П.2. Иллюстрация трактовки значения
5 как единообразное расширение для
глобулярных белков. При такой трактовке
частица увеличивает свои размеры (расширяется)
в разной степени (Garcia de LaTorre. 2001)

Рис. ГО. Иллюстрация к интерпретации
значения 5 как толщины единообразной гпд-
ратированной оболочки; th — усредненное
значение толщины гидратированной оболочки
(Garciade La Torre, 2001)
имеет постоянную толщину d,
измеряемую в перпендикулярном направлении
по отношению к поверхности белка
(рис. П.З). Гидратированная оболочка
рассматривается как свойство,
присущее всем белкам (Глава ГЗ).
Прежние интерпретации данных
по гидратации белков привели к пред-
Комментарий П.5. Вычисление I
величины гидратации
i Вычисления гидратации из
гидродинамических свойств белков весьма чувстви- '
тельны к ошибкам измерений, поскольку i
; величина гидратации вычисляется как «ма- I
! ленькая разность двух больших величин»
между гидратированным и негидратиро-
ванным (сухим) объемом частицы
(уравнение ГЛ.4). Как было отмечено (Garsia de la !
j Torre, 2001), основной источник ошибок в I
величинах гидратации кроется в ошибках в
определении гидродинамических
параметров. Большинство литературных данных
для белков базируется на опытах почти 50- :
летней давности и очевидно, что для
точной оценки гидратации требуются более
точные гидродинамические данные. ,
ставлению о том, что неличина
гидратации может варьировать от белка к
белку. Эти результаты были получены
при моделировании белков в виде сфер
или эллипсоидов вращения и
базировались в основном на экспериментальных
данных по диффузии и
характеристической вязкости.
Использование моделей белков,
структура которых была получена
из данных по кристаллографии или
ЯМР, привело к величине
гидратации от 0,3- 0,4 грамма воды на грамм
белка, что соответствует менее
одному гидратационному слою воды в
гидратационной оболочке. Развитие
такого рода вычислений (Глава ГЗ)
позволило сопоставить их с
экспериментальными данными таких методов
как ЯМР, инфракрасная
спектроскопия, калориметрия, малоугловое
рентгеновское и нейтронное рассеяние.
В результате такого сопоставления
унифицированная картина
гидратации для белков представляется
следующим образом. Белок содержит
определенное количество связанной воды
в среднем (0,3 г-г '). Такое количество
связанной воды соответствует
толщине его гидратационной оболочки
около 1,2 А. Локальная плотность воды
в оболочке приблизительно на 10%
выше, чем плотность воды в
растворе. По современным представлениям,
если в гидродинамическом
эксперименте вычисленное значение
величины гидратации сильно отличается от
величины 0,3 г-г ', то это, скорее
всего, является показателем того, что
используемая гидродинамическая
модель ошибочна ( комментарий П .Г>).
Молекулы РНК и ДНК благодаря
наличию суммарного отрицательного
заряда содержат гораздо больше ассо-
циированой воды, что приводит к зна-

чению гидратации около 0,6 ± 0,2 гт '.
Для гликозилпрованных белков и кар-
богидратов значение гидратации
составляет 0,5 г-г '.
Г1.4. Определение
фрикционных свойств частиц
Г1.4.1. Граничные условия: «полное
прилипание» — «свободное
скольжение»
В классической теории гидродинамики
взаимодействие частицы с
растворителем обычно рассматривается при двух
граничных условиях: «полное
прилипание» и «свободное скольжение» (м>м-
Mi'iirapnii I l.fi). В случае «свободного
скольжения» молекулы растворителя
не взаимодействуют с поверхностью
частицы, и частица перемещается или
вращается в нем независимо от
молекул растворителя (рис. Г1.1 а). Другой
крайний случай представлен «полным
прилипанием», при котором первый
слой растворителя примыкает к
поверхности частицы и перемещается
(вращается) вместе с ной (рис. Г1.-1 о).
Коммешарий П .6. Математическое
определение условий «свободного
скольжения» и «полного прилипания»
Строгая математическая трактовка
условий «свободного скольжения» и «полного
прилипания» представляет собой сложную
математическую задачу. Читатель,
интересующийся этой проблемой, отсылается к
специальной литературе (Ни and Zwanzig,
1974).
Важно отметить, что значения
констант в уравнениях, связывающих
измеренные величины с вычисляемыми
гидродинамическими параметрами,
сильно зависят от выбора граничных
условий (см. ниже, уравнения Г1.1, П.2,
Г1.4-Г1.6).
В литературе можно найти
утверждения, что для молекул белков с
молекулярной массой 2000 Да и менее в
болыпей степени приемлемы граничные
условия свободного скольжения, тогда
как для молекул белков с молекулярной
массой 5000 Да и больше более
обоснованы условия полного прилипания.
Этот вопрос носит принципиальный
характер, поскольку связан с нижней
границей применения гидродинамических
СО = С00
Рис. I 1.1. Гидродинамическое представление условий «свободного скольжения» (я) и
«прилипания» (б): со частота вращения.

уравнений и будет обсужден подробно
в параграфе ГЗ.7.5).
П.4.2. Гидродинамические
эксперименты
Эксперименты в гидродинамике можно
разделить на четыре группы. В первую
группу входят эксперименты, в которых
измеряется стационарная скорость
движения частиц под действием некоторой
силы. Если движущей силой является
градиент концентрации макромолекул,
то такое явление называется
трансляционной диффузией. Когда действующая
сила имеет гравитационную природу,
то такое явление называется
седиментацией. Если на частицу действуют силы
электрической природы, то явление
называется электрофорезом.
Вторая группа включает
эксперименты, в которых вращение частиц
осуществляется под действием на них пары
сил. Если градиент скорости в
растворителе играет роль ориентирующей силы,
то такое явление известно под
названием эффекта Максвелла или двулучепре-
ломления в гидродинамическом потоке.
Если ориентирующая сила имеет
электрическую природу, то явление
называется эффектом Керра или двулучепрелом-
лением в электрическом поле.
Третья группа представлена
экспериментами, измеряющими потерю
энергии, обусловленную трением
молекулы в растворе. Это явление
называется вязкостью.
К четвертой группе мы относим
явления, в которых на частицу не
действуют никакие внешние силы и
их перемещение и вращение
происходят только под влиянием теплового
воздействия, связанного с броуновским
движением. Поведение частиц в
экспериментах по флуоресценции и
динамическому рассеянию света имеет
такую природу.
В .т.ими- I 1.1 собраны
гидродинамические методы, используемые в
настоящее время (первая колонка), а также
представлены параметры, которые могут
быть вычислены на их основе (третья
колонка). Измеряемые величины
представлены во второй колонке. В первой
колонке в скобках приведены также главы, в
которых каждый метод описан в деталях.
Следует заметить, что несмотря на
разнообразие представленных методов, в
конечном счете, только три параметра могут
быть определены из гидродинамических
опытов: коэффициенты поступательного
и вращательного трения, а также
характеристическая вязкость.
В ;,u'u::ni' I 1.1 приведен также
метод, который мы называем методом
гидродинамического моделирования.
В этом методе определяют
фактический коэффициент трения частицы,
наблюдая за движением ее
макроскопической модели в растворителе с
высокой вязкостью, с тем чтобы обеспечить
измерения при маленьких числах Рей-
нолдса. Следует отметить, что в таких
экспериментах коэффициент трения
модели определяют прямым способом,
без каких-либо промежуточных
уравнений или вычислений. Краткое описание
метода и некоторые результаты
приведены в Главе Г2.
П.4.3. Гидродинамические
параметры
Гидродинамические методы,
представленные в i; и'), ниц ГI. i, позволяют
вычислить коэффициенты поступательного и
вращательного трения, а также
характеристическую вязкость биологических
макромолекул. Эти параметры в свою
очередь зависят от вязкости растворите-

l.iomiiui l l. Современные гидродинамические методы, используемые
в структурной биологии
Экспериментальный метод
Трансляционная диффузия
(Глава ГЗ)
Скоростная седиментации
(Глава Г4)
Электрофоретическая
подвижность
(Глава Г5)
Флуоресцентная
корреляционная
спектроскопия
(Глава П1)
Восстановление свечения
красителя после выцветания
(Глава ГЗ)
Прямые гидродинамические
модельные эксперименты
(Глава Г2)
Ориентация молекул
в электрическом поле
(эффект Керра)
и в гидродинамическом
потоке (эффект Максвелла)
(Главы Гб и Г7,
соответственно)
Деполяризованная
флуоресценция
(Глава Г8)
Динамическое рассеяние
света
(Глава ПО)
Вязкость
(Глава Г9)
Измеряемые величины
Коэффициент
трансляционной диффузии
Коэффициент седиментации
Электрофоретическая
подвижность
Время диффузии
Время диффузии
Прямое определение
коэффициента
поступательного трения
Угол ориентации и величина
двойного лучепреломления
Коэффициент
деполяризации
Корреляционная функция
и флуктуации числа частиц
Удельная вязкость
Вычисляемые параметры
Коэффициент
поступательного трения
Коэффициент
поступательного трения
Коэффициент
поступательного трения
Коэффициент
поступательного трения
Коэффициент
поступательного трения
Коэффициент
вращательного трения
Коэффициент
вращательного трения
Коэффициенты
поступательного и/или
вращательного трения
Характеристическая
вязкость
ля, а также от структуры частиц (размеры
и форма) и взаимодействия между ними.
Коэффициент поступательного трения
Поступательное трение лежит в основе
явлений диффузии, скоростной
седиментации и электрофоретической
подвижности. В каждом явлении на
частицу действует сила F, которая заставляет
ее ускоряться. Перемещение частицы
массой т, обусловленное этой силой,
описывается в механике вторым
законом Ньютона:
F = т du/dt,
(П.8)

I'm-. П.Л. Линии, изображающие поток
вокруг сферы. Сфера движется слева направо
с постоянной скоростью и в потоке вязкой
жидкости
Комментарии П.7. Размерности
гидродинамических величин
В системе сгс размерность
коэффициента поступательного трения — гсек'.
Размерность коэффициента вращательного
трения — сек'1. Удельная вязкость — вели- !
чина безразмерная.
. Комментарий Г 1.8. Время,
необходимое для достижения
молекулой постоянной скорости
Вычисления на основе уравнения П. 10
показывают, что время, которое
необходимо для достижения равновесия очень
мало. Так для белка из 300 аминокислот- ■
ных остатков с молярной массой около '
33000 гмоль1 величина константы
поступательного трения равна 5 х 10 "гсек1, а т
равна 5 х 10 20г. Конечная скорость для него .
достигается за время не более 10 '2 сек (1
пикосек). Эти времена очень малы и близки
к временам тепловых вибраций молекул.
где т — масса частицы, и — скорость,
t — время.
В вязком растворе движение
частицы тормозится растворителем.
Молекула будет ускоряться до тех пор, пока
приложенная сила не уравновесится
силой вязкого сопротивления среды. Сила
трения, /■"„„■ пропорциональна
скорости частицы, и направлена и сторону,
противоположную приложенной силе
(рис. II.;")). Коэффициент
поступательного трения, /, определяется как
константа пропорциональности в уравнении:
F
->■
(П.9)
Знак минус означает
направленность силы в сторону,
противоположную направлению скорости ( кпммеп m
р 11 i i ГI. / ).
Когда эти две силы становятся
равными по величине, частица будет
двигается с постоянной скоростью и согласно
уравнению
ii=F//, (П. 10)
Г|Х'НИН
где F — значение силы, когда F = -F
Уравнение П.10 соотносит эту
константу с коэффициентом трения и
суммарной величиной двух, действующих
в противоположном направлении, сил.
Это уравнение является основой для
экспериментального определения
коэффициентов поступательного трения
(см. lau I. Ill ). Из уравнения Г1.9
следует, что чем большим трением
обладает частица, тем большую силу
требуется приложить к частице, с тем чтобы
она двигалась с постоянной скоростью.
Если отношение силы к коэффициенту
трения F/f будет большим, то
необходимая устойчивая скорость будет очень
велика и недостижима в эксперименте.
Однако, если отношение F/f будет
малым, то конечная скорость достигается
почти мгновенно после приложения
силы ( комментарии II .М).
В своей классической работе Стоке
установил связь между коэффициентом
трения сферы и ее радиусом R0 для двух
крайних случаев взаимодействия с моле-

кулами растворителя. В случае «полного
прилипания» уравнение имеет вид:
f = 6nr\QR0. (П.11)
Тогда как это уравнение для случая
«свободного скольжения» выглядит как:
/=4яп0Д0. (П.12)
Как видно из этих уравнений
изменение граничных условий не меняет их
физическую сущность —
пропорциональность коэффициента трения сферы ее
радиусу, а лишь меняет коэффициент.
Коэффициент вращательного трения
Вращательное трение лежит в основе
эффекта Керра, эффекта Максвелла
и деполяризованной флуоресценции.
По аналогии с поступательным
движением мы можем определить
коэффициент вращательного трения. Если
постоянный вращающий момент F
1- —. —. пращ
приложен к частице, находящейся в
вязкой среде, то частица будет иметь
постоянную угловую скорость, со, через
короткий интервал времени (рис. Г 1.6).
Коэффициент вращательного трения, 9,
определяется как константа
пропорциональности в уравнении
F =0(0.
пращ
(П.13)
Уравнение П. 13 аналогично
уравнению Г1.4. Уравнение П.13 лежит в
основе определения коэффициентов
вращательного трения методами,
представленными в l ли ill не 111.
Согласно Стоксу для сферической
частицы в случае «полного прилипания»
связь между коэффициентом
вращательного трения и ее объемом V имеет вид:
Q = 8n\]0V. (П.14)
Отметим, что для сферической
частицы в случае «свободного скольже-
Рис. I l.(). Линии, изображающие поток
вокруг сферы. Сфера вращается вокруг оси,
перпендикулярной к плоскости страницы с
постоянной угловой скоростью со
Рис. П./. Линии потока вокруг сферы,
движущейся в жидкости
ния» коэффициент вращательного
трения равен нулю.
Характеристическая вязкость
При измерении вязкости
определяются потери локальной энергии на
трение, которые происходят, когда
большие частицы движутся в
растворителе, состоящем из маленьких
молекул (рис. I 1.7). Обозначим вязкость
растворителя в отсутствие частиц как

Гемоэритрин
а
Арабинозо -
связывающий
белок
б
Рис. i 1.8: (а) Гидродинамическим
эквивалентом белка гемоэритрина является сфера;
(б) гидродинамическим эквивалентом белка,
связывающего арабинозу, является эллипсоид
вращения с отношением осей 2:1
П0, а в их присутствии с определенной
концентрацией как г\. Если раствор
содержит монодиснерсную
суспензию сферических частиц, то
уравнение Эйнштейна для удельной вязкости
(П — ц0)/ц0, в случае «полного
прилипания», имеет вид:
(П-По)/П0 = 2,5а, (Г1.15)
где D. — объемная доля сферических
частиц в растворе.
Для случая «свободного
скольжения» удельная вязкость также
пропорциональна объемной доле сферических
частиц в растворе
(ц-ц0)/ц0=Ш. (Г1.16)
Важно отметить, что значение
радиуса частицы не входит в уравнения
П.15, П.16. Последнее ведет к важным
физическим следствиям, обсуждаемым
в параграфе Г9.5.2.
П.4.4. Гидродинамически
эквивалентные тела
Обычно уравнения П.11, П.14 и
П.15 используются при работе с
относительно большими
биологическими макромолекулами (более, чем
несколько кДа, см. дискуссию в Главе
ГЗ). Они позволяют выразить
измеряемые значения коэффициентов
трения и характеристической вязкости
через радиус гидродинамически
эквивалентной сферы R , обычно
называемый радиусом Стокса. Понятие
гидродинамически эквивалентных сферы
может быть распространено и на
другие гидродинамически эквивалентные
формы (рис. П.8).
Необходимо ясно себе
представлять, что описание частиц на основе
гидродинамических эквивалентов не
учитывает их конкретную форму, а
только одинаковые гидродинамические
свойства. Несмотря на то, что такое
приближение является достаточно грубым,
однако оно во многих случаях
оказывается очень близким к поведению частиц
в реальных экспериментах.
В случае жестких сфер только один
параметр (объем сферы или ее радиус)
необходим для полного описания их
гидродинамических свойств. Для
описания эллипсоида вращения (форма
мяча в регби) необходимо определить
два параметра — объем и соотношение
осей. Для того, чтобы описать вращение
эллипсоида в трех плоскостях (осях),
требуются три параметра — его объем
и отношение осей в двух измерениях.
(Глава Г2).
Методы, представленные в
тмб.nine II отличаются по их относительной

а б в
Рис. II. 9. Сфера (а) и два эллипсоида вращения (б и в) с равными объемами. Вытянутый
эллипсоид (б) имеет сигарообразную форму, образуемую при вращении эллипса вокруг его
короткой полуоси Ь. Сплюснутый эллипсоид (в) имеет дискообразную форму волчка, образуемую при
вращении эллипса вокруг его длинной полуоси а. Для каждого вида эллипсоида отношение осей
(/;) определяется как отношение а/b — длинной и короткой полуосей. Ближний правый октант
каждого эллипсоида вырезан, чтобы продемонстрировать длинную (а) и короткую (Ь) оси
чувствительности к этим параметрам.
Так, все методы, базирующиеся на
поступательном трении,
чувствительны к линейным размерам частицы в
первой степени, тогда как методы,
базирующиеся на вращательном трении,
чувствительны к линейным размерам в
кубе, или, иными словами, к объему
частицы.
П.5. ВЫЧИСЛЕНИЕ
ФРИКЦИОННЫХ СВОЙСТВ
ЧАСТИЦ
Современная гидродинамика позволяет
вычислять коэффициенты трения
биологических макромолекул различной
формы. Процедура вычисления зависит
от конкретной формы макромолекулы.
П .5.1. Частицы «правильной»
округлой формы
Многие биологические
макромолекулы, как, например, глобулярные
белки или сферические вирусы, имеют
округлую форму В этом случае они
хорошо аппроксимируются
гидродинамически эквивалентной сферой или
гидродинамически эквивалентным
двухосным или трехосным
эллипсоидом (рис. П.9). Гидродинамические
свойства таких частиц могут быть
вычислены аналитически (Глава Г2).
П.5.2. Частицы «правильной»
граненой формы
Другие биологические макромолекулы
в первом приближении могут
моделироваться как палочки или цилиндры.
Такими молекулами являются
маленькие жесткие мономеры, олигомеры
ДНК, а-спиральные полипептиды,
палочкообразные белки и вирусы.
Трудность всех гидродинамических теорий,
а б
Рис. П. К). Частицы «ломаной» формы
имеют резко очерченные края. К ним относятся —
куб (а) и круговой цилиндр (б). Их
фрикционные свойства могут быть вычислены только
приблизительно

а б
I'm с. II. 1 1. Примеры частиц произвольной формы: тРНК (с/) и иммуноглобулин (6). I Ix
фрикционные свойства могут быть вычислены только приблизительно
му с четкими гранями и углами, — одна
из трудноразрешимых проблем
гидродинамики (рис. П.10). По мере
перехода от куба к параллелепипеду эффект
концов становится все менее заметным.
Аналогичный эффект имеет место и для
кругового цилиндра.
Г1.5.3. Частицы произвольной
сложной формы
Детальное описание частиц
произвольной формы требует определения
гораздо большего числа параметров, чем мы
можем получить из
гидродинамических измерений. Концепция
гидродинамически эквивалентных тел в данном
случае работает плохо (рис. П.11).
В настоящее время разработано
несколько подходов для вычисления
фрикционных свойств таких частиц.
В первом подходе все пространство
частицы заполняется сферами
одинакового или разного диаметра, с тем чтобы
максимально правдоподобно описать
ее форму. Во втором подходе только ее
поверхность заполняется маленькими
в которых предпринимается попытка
описать фрикционные свойства таких
молекул, возникает из-за эффекта
концов палочкообразной молекулы.
Описание трения куба, который имеет фор-
Рпс. I 1.12. Структура молекулы лизоци.ма
с разрешением на атомном уровне.
Фрикционные свойства молекул с таким разрешением
могут быть предсказаны с точностью около
нескольких процентов

сферами (метод бусинок) или
маленькими панельными элементами (метод
чешуек). При определенных условиях
такие подходы позволяют вычислять
свойства трения частиц произвольной
формы с хорошей точностью (Глава Г2).
П .5.4. Частицы с известной
трехмерной структурой
Впечатляющий прогресс в
расшифровке структур белков и нуклеиновых
кислот с высоким пространственным
разрешением методами рентгенострук-
турного анализа (Глава ЕЗ) и ЯМР
(Глава КЗ) стимулировал развитие
новых подходов для вычисления
гидродинамических параметров таких молекул.
На рисунке II. 12 в качестве примера
приведена структура лизоцима в
атомарном разрешении. Для таких
структур предложены различные алгоритмы
вычисления их гидродинамических
свойств, а именно: атомы в С -положе-
а
нии заменяются сферами
соответствующего диаметра, поверхностные атомы
моделируются маленькими сферами
или треугольными панельными
элементами (Глава Г2). Сравнение расчетов с
экспериментом показало их хорошее
совпадение: с точностью около 1 % для
поступательного трения (Глава ГЗ) и
около 2-3% для характеристической
вязкости (секция Г2.4). Специальные
подходы предложены для расчетов
молекул ДНК (Глава Г2).
Г1.6. Перечень ключевых идей
• Безразмерный параметр, число Рейнолдса, характеризует соотношение сил
инерции и вязкости, действующих на частицу в вязкой среде.
° Движение биологической частицы с молекулярными размерами 10-10000 А
описывается гидродинамикой при «низких» числах Рейнолдса, когда силы
вязкости преобладают над силами инерции.
• Коэффициенты в уравнениях, описывающих зависимость гидродинамических
параметров от вязкости растворителя и размеров частиц, зависят от граничных
условий, два из которых называются «свободным скольжением» и «полным
прилипанием».
• В методах, основанных на поступательном трении, измеряется стационарная
скорость движения частицы под действием сил разной природы:
гравитационной, в случае скоростного ультрацентрифугирования, градиента осмотического
давления, в случае поступательной диффузии и электрического поля, в случае
электрофореза.
" В эффекте Максвелла (двойное лучепреломление в потоке) или эффекте Керра
(электрическое двойное лучепреломление) измеряют скорость вращения
частицы под действием нары сил.
• В экспериментах по вязкости определяют локальные потери энергии на
трение, обусловленные движением частиц в вязкой среде.

• В экспериментах по флуоресценции и динамическому рассеянию света
измеряют движение и вращение частиц только пол действием собственно
броуновского движения (без воздействия внешних сил).
• Результаты всех гидродинамических методов могут быть описаны в терминах
только трех гидродинамических параметров — коэффициентов
поступательного и вращательного трения, а также характеристической вязкости.
• Гидродинамические свойства частиц «правильной» округлой формы (сферы,
двух- и трехосные эллипсоиды) могут быть вычислены аналитически.
• Гидродинамические свойства частиц «правильной» граненой формы (кубы,
круговые цилиндры) могут быть рассчитаны только приблизительно из-за
концевых эффектов.
• Гидродинамические свойства частиц произвольной формы могут быть
вычислены методами бусинок или чешуек с хорошей точностью.
• Гидродинамические свойства глобулярных белков с известной атомной
структурой могут быть вычислены различными способами с точностью около 1-3%,
при условии корректного учета толщины гидратационной оболочки (около 1 А)
для всех белков.
Литература для дальнейшего чтения
Гидродинамика при низких числах Рейнолдса
PurcellE. M. Life at low Reynolds number. Am. J. Phys., 1977. 45, 3-11.
Гидратация
Kuntz I. D. and Kauzmann W. Hydration of proteins and polypeptides. Adv. Prot.
Chem., 1974. 28, 239-345.
Finny J. L. Overview lecture. Hydration processes in biological and macromolecular
systems. Faraday Discuss. Chem. Soc, 1996.103, 1-395.
Wutrich K., Billeter M., Guntert P., Luginbuhl P., Reik R. and Wider G. NMR studies
of the hydration of biological macromolecules. Faraday Discuss. Chem. Soc, 1996.103,
245-253.
De la Torre G. Hydration from hydrodynamics. General consideration and applications
to bead modelling to globular proteins. Biophys. Chem., 2001. 93, 159-170.
Zhou H.-X. A unified picture of protein hydration: prediction of hydrodynamic
properties from known structures. Biophys. Chem., 2001. 93, 171-179.
Perkins S.J. X-ray and neutron scattering analyses of hydration shells: a molecular
interpretation based on sequence predictions and modelling fits. Biophys. Chem., 2001.
93, 129-139.

Engelsen S. В., Monteiro С, Heme de Penhoat C. and Perez S. The dilute aqueous
solvation of carbohydrates as inferred from molecular dynamics simulations and NMR
spectroscopy. Biophys. Chem., 2001. 93, 103-127.
Экспериментальное определение фрикционных свойств частиц
HappelJ. and BrennerH. Low Reynolds number hydrodynamics. 2nd edn. Noordhoff
Int., Groningen, Leyden. 1973.
Harding S. E. The intrinsic viscosity of biological macromolecules. Progress in
measurement, interpretation and application to structures in dilute solution. Prog.
Biophys. Mol. Biol., 1998. 68, 207-262.
Ни C.-M. and Zwanzig R. Rotational friction coefficients for spheroids with the
slipping boundary conditions. J. Chem. Phys., 1974. 60, 4354-4357.
Расчет фрикционных свойств частиц
Brune D. and Kim, S. Predicting protein diffusion coefficients. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1994. 90, 3835-3839.
Zhou H-X. Calculation of translational friction and intrinsic viscosity. II. Application
to globular proteins. Biophys J., 1995. 69, 2298-2303.
De la Torre G., HuertasM. L. and Carrasco B. Calculation of hydrodynamic properties
of globular proteins from their atomic-level structure. Biophys J., 2000. 78, 719-730.
Allison S. A. Boundary element modelling of biomolecular transport. Biophys. Chem.,
2001.93,197-213.

ГЛАВА Г2
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ТЕОРИЯ
Г2.1. ИСТОРИЧЕСКИЙ ОБЗОР
! S i ,1
Г. Стоке (G. Stokes) показал, что
поступательное трение сферы
пропорционально ее радиусу и вязкости
окружающего ее растворителя. В 1856 г.
он нашел, что ее вращательное трение
при малых угловых скоростях может
быть охарактеризован единственным
параметром, который
пропорционален кубу линейных размеров, т. е. ее
объему.
189.4
Д. Эдварде (D. Edwardes)
рассчитал два коэффициента трения
эллипсоида вращения: один для вращения
вокруг малой оси, а другой для вращения
вокруг большой оси. В 1906 А.
Эйнштейн (A. Einstein) показал, что
вращение сферы в приближении Стокса
можно охарактеризовать одной
константой, которая имеет размерность
времени. В 1928 г. Р. Ганс (R. Gans)
использовал коэффициенты трения
для эллипсоида вращения,
рассчитанные Эдвардсом, с тем чтобы вычислить
отношение релаксационных времен
эллипсоида ко времени релаксации
сферы равного объема.
Ф. Франсуа Перрен (F. Froncois
Perrin) получил уравнения, которые
содержали три коэффициента
вращательного трения и три времени релаксации
как функции осей трехосного
эллипсоида. Эти уравнения не могли быть
выражены в значениях элементарных
функции. В 1960 г. Л. Д. Фавро (L. D. Favro)
показал, что коэффициент диффузии,
относящийся к вращательному
движению частицы как целого, включает пять
времен релаксации; в случае, когда два
коэффициента диффузии равны,
число времен релаксации уменьшается до
трех. В 1977 г. Е. Смолл и И. Айзенберг
(Е. Small and I. Isenberg) решили
уравнения Перрона для вращательной
диффузии обобщенного эллипсоида, используя
методы численного интегрирования.
Коэффициенты вращательной диффузии,
вращательные времена релаксации и пять
экспоненциальных вкладов в
флуоресцентную анизотропию были
табулированы как функции отношения осей
эллипсоида. В 1981 г. П. Хагерман и Б. Зимм
(P. J. Hagerman and В. Н. Zimm)
разработали подход для анализа вращательной
диффузии червеобразных цепей методом
Монте Карло. Была установлена
количественная взаимосвязь между продольным
(наибольшим) вращательным временем

релаксации линейного полимера и его
эластичностью (персистеитной длиной).
А. Эйнштейн впервые исследовал
вязкость суспензии жестких
сферических частиц, которые по своим размерам
были намного больше размеров молекул
растворителя. Он показал, что удельная
вязкость раствора пропорциональна
объемной доле раствора, занимаемой
частицами, и не зависит от диаметра сферы.
В 1945-1951 it. В. Кун и Г. Кун,
Дж. Кирквуд и П. Ауэр (W. Kun and
Н. Кип, J. J. Kirkwood and P. L. Auer)
завершили теорию характеристической
вязкости для длинных палочек и
эллипсоидов.
В 1967 г. В. А. Блумфилд, В.
Дальтон и К. Ван Холде (V. A. Bloomfield,
W. Dalton and К. Е. Van Holde)
разработали метод «оболочек» или «бусинок»,
который с теоретической точки зрения
должен был стать идеальным решением
для строгих вычислений вязкости
макромолекул. Однако его применение на
практике было сильно затруднено тем, что
требовалось использование очень
большого числа бусинок для построения
точных моделей структур и, соответственно,
очень длительного времени вычислений.
В 1970-1977 гг. несколько
независимых групп К. Тсуда, Дж. МакКам-
мон и Дж. Дейтч, X. Накаджима и
И. Вада, Гарсиа де ла Торре и В.
Блумфилд (К. Tsuda, J. A. McCammon and
J. M. Deutch, H. Nakajima and Y. Wada,
J. Garcia de la Torre and V. A. Bloomfield)
развили общую теорию вычисления
характеристической вязкости жестких
макромолекул произвольной формы.
Во всех этих исследованиях форма
макромолекулы задавалась расположением
в ее пространстве относительно малого
количества сферических бусинок.
В 1981 г. С Хардинг, М. Демпье и
А. Рове (S. Harding, M. Dampier and
A. Rove) решили задачу вычисления
вязкости для трехосного эллипсоида.
! Ь'27
С. Озеен (С. Oseen) рассчитал
гидродинамический тензор трения,
описывающий гидродинамическое
взаимодействие между фиксированными в
пространстве источниками трения.
В 1932 г. Дж. Бюргере (J. Burgers)
применил тензор Озеена к объектам
различной геометрии. В 1953 г. Дж. Кирквуд
(J. Kirkwood) дат гидродинамическое
описание цепных макромолекул,
состоящих из ансамбля равновеликих сфер,
и предложил простую форлгулу,
базирующуюся на оригинальном тензоре Озеена,
для вычисления усредненно-ориентиро-
ванного поступательного трения частиц.
В 1963 г. Дж. Хирст (J. E. Hearst)
применил формализм Кирквуда для
описания вращательного трения гибких и
полужестких макромолекул, что открыло
путь к исследованию ДНК различными
гидродинамическими методами.
В 1967 г. В. Блумфилд (V.
Bloomfield) предложил способ вычисления
гидродинамических свойств частиц
произвольной формы, получивший название
метода оболочек. При этом поверхность
частицы описывалась большим
количеством маленьких сфер пли бусинок.
В конце 1960-х гг. Дж. Ротне и
С. Прагер (J. Rotne and S. Prager) и,
независимо, X. Иамакава (Н. Yamakawa)
предложили новый улучшенный
подход для изучения гидродинамических
взаимодействий.
ИШ
X. Штаудингер (Н. Staudinger)
предложил использовать
характеристическую вязкость для определения молеку-

лярных масс полимеров. Он обнаружил,
что зависимость характеристической
вязкости [ц] от молекулярной массы М
для гомологичной серии полимеров
может быть выражена простой формулой
типа [г|] = Ма. Как позже было
выяснено Г. Марком, Р. Хаувинком, В.
Куном и X. Куном (Н. Mark, R. Houwink,
W. Kuhn and H. Kuhn) константа а
непосредственно связана с молекулярной
конформацией макромолекул в растворе.
Ф. Перрен (F. Perrin)
аналитически решил проблему
гидродинамического движения твердого эллипсоида
вращения. Он получил уравнения,
которые давали три коэффициента
поступательного трения как функции
размеров трехосного эллипсоида. Эти
уравнения включали набор
эллиптических интегралов и не могли быть
выражены в виде элементарных
функций.
В 1977 г. Е. Смолл и И. Айзенберг
(Е. Small and I. Isenberg) решили
уравнение Перрена методом численного
интегрирования. В начале 1980-х гг.
С. Хардинг и А. Рове (S. Harding and
A. Rowe) ввели в практику трехосный
гидродинамический эллипсоид как
более реалистическую модель по
сравнению с двухосным эллипсоидом для
описания структуры биологических
макромолекул.
1936
А. Петерлин (A. Peterlin) ввел
понятие коэффициента вращательной
диффузии для описания интенсивности
броуновского движения. Он вычислил
функцию распределения для ориентации
главных осей эллипсоида при заданном
значении градиента скорости, принимая
во внимание энергию диссипации,
обусловленную только вращением частиц в
гидродинамическом поле.
В 1940 г. Р. Симха (R. Simha)
расширил териго Петерлина, принимая во
внимание полную энергию диссипации
при броуновском движении. Он
получил уравнение для вязкости раствора
эллипсоидов вращения для
предельного случая, когда частицы имеют
случайную ориентацию, и следовательно
вращаются с постоянной угловой
скоростью. Позже результаты, полученные
Симха, были строго воспроизведены
Н. Сайто (N. Saito) для различных
граничных условий.
1 *М 1
Дж. Онсли (J. L Oncley) сделал
первую попытку решить проблему
вычисления степени гидратации для белков. Он
показал, что всегда существует выбор
между вытянутым и сплюснутым
эллипсоидом, каждый из которых имеет свое
соотношение осей, даже тогда, когда
предполагается разумная степень гидратации.
В 1953 г. X. Шерага и Л. Мандель-
керн (Н. A. Sheraga and L. Mandelkern),
пытаясь преодолеть неоднозначность
при решении проблемы
объем-отношение осей, предложили объединить
коэффициенты трения и характеристической
вязкости. Однако эта первая
объем-независимая функция оказалась мало
чувствительной к отношению осей и могла
быть использована только для того,
чтобы отличить вытянутый эллипсоид от
сплюснутого при очень большой
степени асимметрии последних. В
дальнейшем была предложена целая серия
комбинаций различных гидродинамических
параметров: коэффициентов регрессии
седиментации и характеристической
вязкости (М. Валес и К. Ван Хольде,
1954) (М. Wales and К. Е. Van Holde,
1954), коэффициента поступательного

трения и среднего гармоничного времени
вращательной релаксации (П. Сквайер,
1970) (P. Squire), регрессии
седиментации и характеристической вязкости
(А. Рове (A. Rowe, 1977),
коэффициента трения и операционалистически
определяемого молекулярного ко-объема
(П. Джефри с сотр., 1977) (P. Jeffrey
with colleagues); гармонического
значения времени вращательной релаксации
и характеристической вязкости,
характеристической вязкости и
молекулярного ко-объема (С. Хардинг, 1980-81);
(S. E. Harding). Некоторые из этих
комбинаций привели к функциям, с
помощью которых можно было различить
вытянутые и сплюснутые эллипсоиды
даже при относительно небольших
степенях вытянутости.
1960
С. Броерсма (S. Broersma) был
первым, кто исследовал фрикционные
свойства круглого цилиндра. Из
полученной им формулы следовало, что
поперечный (наименьший) коэффициент
вращательной диффузии обратно
пропорционален кубу длины. Позже однако
было обнаружено, что его формула
корректна только для длинного цилиндра.
В 1965 г. X. Бреннер (Н. Brenner)
внес существенный вклад в
гидродинамику жестких частиц. Он получил
аналитические решения
характеристической вязкости для эллипсоидов,
длинных цилиндров и гантелей. Он
также показал, что поступательное и
вращательное движение жестких
макромолекул, погруженных в вязкую
жидкость, сопряжено, если частица
имеет сложную форму.
1975
Г. Йонгрен и А. Акривос (G. Youn-
gren and A. Acrivos) разработали
метод граничных элементов и применили
его для описания поверхности частиц.
В 1992-1995 г. Д. Бруне, С. Ким и
Н.-Х. Чжоу (D. Brune, S. Kim and
Н.-Х. Zhou) использовали эту
технику для вычисления фрикционных
свойств белков, а в 1996 г. С. Аллисон
(S. Allison) — для моделирования
свободного электрофореза в растворе для
коротких фрагментов ДНК.
1978
Д. Теллер (D. Teller) впервые
опубликовал метод вычисления
коэффициентов трения белков по их атомным
координатам. Р. Венейбл и П. Пастор
(R. Venable and R. Pastor)
вычислили коэффициенты поступательного
трения белков, используя детальную
картину распределения аминокислот в
белках, а Гарсиа де ла Торре (J. Garsia
de la Torre) произвел аналогичные
вычисления для нуклеиновых кислот.
В 1995-1999 гг. ряд авторов
предложили улучшенные алгоритмы для
конструирования гидродинамических
моделей биологических макромолекул на
основе их атомных координат.
Специальные подходы были разработаны для
моделирования фрикционных свойств
коротких фрагментов и замкнутых
кольцевых ДНК.
1982
С. Хардинг и А. Рове (S. Harding
and A. Rowe) предложили новый метод
моделирования биологических
макромолекул, основанный на использовании
трехосного эллипсоида. Параметры этого
эллипсоида находили из графического
пересечения линий трех
гидродинамических функций, включающих значения
характеристической вязкости,
седиментации и временного спада
электрического двойного лучепреломления. Годом

позже эти же авторы предложили
альтернативный метод, с использованием
характеристической вязкости,
седиментации и гармонического значения
времени релаксации. В 1997 г. они же и Гарсиа
де ла Торре ввели новую концепцию для
описания биологических макромолекул
в растворе с использованием
универсальных функций формы. В настоящее
время для пользователей доступны
различные компьютерные программы ELLIPS
(Хардинг с сотр.) и SOLPRO (Гарсиа де
ла Торре с сотр.) для оценки трехмерных
размеров биологических макромолекул,
исключающие вычисления значений
гидратации и объемов.
И)!).")
Дж. Дуглас и Дж. Хаббард (J.
Douglas and J. Hubbard) обнаружили
взаимосвязь между гидродинамикой и
электростатикой, что открыло новые
возможности для гидродинамических вычислений.
На этой основе в 1995 г. Н.-Х. Чжоу
(Н.-Х. Zhou) вычислил коэффициенты
фения для различных белков. Он также
предложил алгоритм для вычисления
характерней гческой вязкости частиц
произвольной формы и глобулярных белков.
200!) м но ;>;>.;' толшее прем:1
Гидродинамические свойства
биологических макромолекул могут быть
вычислены с хорошей точностью при
моделировании их поверхности
большим числом маленьких бусинок или
маленьких треугольных элементов
(чешуек). Предложены автоматизированные
методы такого моделирования на основе
кристаллографических данных для
нуклеиновых кислот и белков. Трехмерные
модели биологических макромолекул
без предварительных вычислений
значений их гидратации и объемов могут быть
рассчитаны из комбинации различных
гидродинамических параметров.
Г2.2.1. Частицы правильной формы
Сфера
В простейшем случае сила трения в
жидкости возникает из-за притяжения между
ее молекулами. Движение твердого
объекта в жидкости сопровождается
перемещением молекул растворителя (рис. I 2.I).
Молекулы растворителя, находящиеся
вблизи движущейся частицы,
испытывают большее возмущение, чем молекулы,
находящиеся вдаш от нее. На больших
расстояниях это возмущение падает до
нуля. Для вычисления силы трепня мы
должны вычислить силу, необходимую
для сохранения скорости возмущенных
молекул растворителя. Эта сила связа-
I'iic. I2.I. Линии потока вокруг сферы
радиусом Rtl, движущейся слева направо мере:;
несжимаемую вязкую жидкость с постоянном
скоростью ил. Чист на линях потока в каждой
точке при 0 & -90" выражено в единицах ил.
Даже на самых дальних линиях потока,
показанных на рисунке, соответствующих
расстоянию, равному диаметру сферы, поток
движется па 30'% быстрее, чем движется сфера.
Беспорядочное движение .молекул
растворителя, обусловленное броуновским движением,
не принимается во внимание

на со свойством жидкости, называемым
вязкостью. При движении сферических
частиц нам необходимо найти уравнение,
которое связывает коэффициент
поступательного трения частицы/и вязкость
жидкости п|Г Получение этого
уравнения связано с большими трудностями,
поскольку необходимо точно вычислить
как движение сферы деформирует
градиент скорости. В соответствии с законом
Стокса поступательное трение сферы
пропорционально ее радиусу, R(), и
вязкости растворителя, \, через который
движется частица:
Следует отметить, что уравнение
Стокса справедливо при трех
допущениях. Первое, коэффициент (6л) в
уравнении (Г2.1) зависит от граничных
условий и в данном случае
соответствует условию полного прилипания (см.
параграф П.4.1). Второе, с
математической точки зрения подход Стокса
корректен, когда растворитель можно
считать неструктурированной средой.
Очевидно, что последнее верно, если
размеры сфер гораздо больше
размеров молекул растворителя. Считается
общепринятым, что движение белков с
молекулярной массой, превышающей
5000 Да (так называемые «большие»
молекулы), можно рассматривать как
движение сквозь бесструктурную среду.
Верность такого утверждения — какие
частицы в этом смысле можно считать
«большими», а какие «малыми» —
обсуждается в Главе ГЗ. Третье,
уравнение Г2.1 было получено с допущением,
что взаимодействие между самими
частицами отсутствует. Па практике это
условие реализуется экстраполяцией
к сильно разбавленным растворам.
Поскольку силы трения напрямую
связаны с площадью поверхности
изучаемой частицы, а сфера имеет из всех
геометрических объектов наименьшую
поверхность при равном объеме, то
можно прийти к выводу, что трение для
сферических частиц будет наименьшим
по сравнению с таковым для
несферических частиц такого же объема.
Эллипсоид вращения
Влияние асимметрии частиц на их
гидродинамические свойства может быть
строго учтено, если они
моделируются эллипсоидами вращения
(сплюснутыми или вытянутыми). Из общих
соображений следует, что сила трения
асимметричных частиц зависит от их
ориентации по отношению к
направлению движения потока. Так, вытянутые
частицы имеют наименьшее трение,
когда они ориентированы по направлению
движения потока, и наибольшее, когда
они ориентированы перпендикулярно
потоку. В усредненном случае имеем:
fr6n%R0F(p). (Г2.2)
Теоретически вычисленные
значения функции Перрена .F(p) для
вытянутых и сплюснутых эллипсоидов
вращения представлены на рисунке Г2.2. Три
важных заключения можно сделать
исходя из вида этой функции. Первое,
при увеличении аксиального отношения
численные значения функции Перрена
увеличиваются относительно медленно.
Например, функция Перрена изменяется
всего на 4%, если форма частицы
меняется от сферической к эллипсоидальной
с аксиальным отношением 2. В то же
самое время для такого эллипсоида
функция, описывающая вращательное трение
и характеристическую вязкость,
изменяется приблизительно на 12% (см. ниже).
Второе, при том же аксиальном
отношении, коэффициент поступательного тре-

F(P)
Вытянутый
Сплюснутый
20 40 60 80 100 120
Отношение осей (р или 1/р)
Рис I 2.2. Функция Перрена/7(р) для
сплюснутых и вытянутых эллипсоидов вращения.
N. В. В настоящее время нет необходимости
использования таблиц для функций Перре-
на. Необходимые гидродинамические
функции для частиц разной формы читатель
может найти из базы компьютерных программ
(Harding etal., 1977)
ния для вытянутого эллипсоида всегда
больше, чем для сплюснутого. Третье,
для асимметричной частицы
коэффициент поступательного трения зависит от
двух параметров: ее объема,
выраженного через радиус эквивалентной сферы, и
отношения осей. Следовательно,
вычисленный коэффициент поступательного
трения частицы может быть всегда
интерпретирован в терминах сферической
частицы соответствующего объема или
в терминах асимметричной частицы
меньшего объема (комментарии 12.1).
Круговой цилиндр
Разнообразные биологических
макромолекулы, включающие как короткие
фрагменты ДНК, так и
палочкообразные вирусы, подобные вирусу табачной
мозаики, существуют в виде длинных
вытянутых молекул, имеющих
постоянную толщину. Для описания таких
макромолекул наиболее подходящей
моделью является круговой цилиндр с
Коммошарий Г2.1. Трехосный
гидродинамический эллипсоид
В начале 1980-х гг. Хардинг и Рове
предложили использовать трехосные
гидродинамические эллипсоиды как модели
структуры биологических макромолекул. Эти
модели гораздо более правдоподобно
описывают глобулярные белки, чем модели на
основе двухосных эллипсоидов. Более
подробное описание поступательного трения
для трехосных эллипсоидов можно найти
в литературе (Harding and Rowe, 1982).
плоскими концами. Для цилиндра
длиной L, радиусом г и отношением L/r = р
усредненный по всем ориснтациям
коэффициент трения/равен:
f=6m\eL/(2lnp + y), (Г2.3)
где у является функцией р, зависящей
от краевых эффектов.
Для относительно короткого
цилиндра:
у(р) = 1,65-4(1/1пр-0,43)2
-8(1/1пр-0,30)2.
(Г2.4)
Уравнение (Г2.4) справедливо
только в том случае, когда р^-°°.
Исследования последних лет показали, что
предельное значение для у равно:
у = 0,386, когда р->°°, (Г2.5)
а в интервале 2 < р < 20 хорошим
приближением для у(р) является выражение:
у(р) = 0,312 +0,561/р + 0,100/р2. (Г2.6)
Г2.2.2. Жесткие частицы
произвольной формы
Рисунок Г2.3 показывает структурные
модели различных биологических
макромолекул, полученные методом рентгено-
структурного анализа. Из него видно, что

с помощью сфер и эллипсоидов вращения
можно описать форму многих
биологических макромолекул, а с помощью
модели трехосного эллипсоида можно хорошо
передать реальную форму большинства
глобулярных белков. Однако многие
биологические молекулы, например, тРНК,
иммуноглобулины, фосфоглицератмута-
за, форма которых далека от сферической
или эллипсоидальной (см. рис. Г2.3),
требуют более сложных моделей для их
описания и, следовательно, для вычисления
их гидродинамических свойств.
В течение последних трех
десятилетий был предложен ряд методов для
описания гидродинамического поведения
частиц сложной формы. В методе
«бусинок», который берет свое начало из
пионерской работы Кирквуда и Райзмана,
частица заполняется сферами
(бусинками) равного или неравного диаметра.
В модельном подходе «оболочек»,
который впервые был предложен в
работах Блумфилда, поверхность
частицы заполняется малыми
равновеликими сферами. Формально
модельные подходы «бусинок» и «оболочек»
тесно связаны фундаментальной
гидродинамической единицей — сферой.
В модельном подходе «граничных
элементов», разработанном Йонгреном и
Акривосом, поверхность частиц
моделируется набором панельных
элементов. В этом случае фундаментальной
гидродинамической единицей является
пластинка, обычно треугольной формы
(чешуйка). Рассмотрим каждый из трех
упомянутых методов но отдельности.
Моделирование целой частицы
набором сфер (метод «бусинок»)
В общих чертах модель «бусинок»
представляет собой частицу, объем
которой заполнен сферическими
элементами (бусинками), каждая из которых
обладает своим, индивидуальным, в
соответствии с законом Стокса,
коэффициентом трения. Первая ключевая
проблема при конструировании такой
модели состоит в том, как учитывать
гидродинамическое взаимодействие
между различными сферическими
элементами. Для этого имеются два
подхода: строгий, тензорный метод, и
приближенный метод двойных сумм.
Вторая ключевая проблема
состоит в построении модели таким образом,
чтобы ее размер и форма были наиболее
близки к таковым у реальной частицы.
При таком построении всегда возникает
конфликтная проблема: получение
высокого разрешения требует увеличения
числа сфер, описывающих модель, что
в свою очередь сильно увеличивает
расчетное компьютерное время
(комментарии I 2.2). Ниже мы кратко опишем
возможности для решения этих проблем.
Начнем с первой. Решая ее, Дж. Кир-
квуд предложил простую модель для
описания гидродинамических свойств
гибких молекул: он моделировал
линейные и клубкообразные полимеры
набором одинаковых сфер, соединенных в
цепочку. Все бусинки в модели имели
идентичные радиусы и, следовательно,
одинаковые фрикционные свойства.
Гидродинамическое взаимодействие
между бусинками учитывалось по
методу Озеена-Бюргерса.
Рисунок 12.4 схематически
показывает гидродинамическое
взаимодействие между двумя сферами
макромолекулы, фиксированными
в пространстве. В соответствии с
подходом Озеена-Бюргерса скорость
растворителя а в положении сферы i есть
сумма невозмущенной скорости и и
вклада возмущенной скорости,
который возникает при гидродинамиче-

■ W ■ c
I
Липидный слой
ОО^Оч^\^>^
ДНК
Нейротоксин Эрабутоксин b u-Кобратоксин bdsi
скорпиона
Гирудин Мелитин Актиноксантин
Цитохром Ь5бг \^оаУ Цитохром Ьъ Флаводоксин Азурин
Ферредоксин
Цитохром с'
Высокопотенциальный
железосодержащий Пластоцианин Цитохром с Цитохром с3 Цитохром с. Цитохром с„,
белок
Лейцин- Галактоза-
1зывающ
белок
связыаающии сбывающий Ара6иноза-
связывающий
белок
Интерлейкин 1р Интерлейкин 8
Миоглобин Леггемоглобин Эритрокруанин Тропонин с
'Г/1 А> *■ "Г-i Л^
Кальций- Кальций-
Утероглобин связывающий связывающий Калмодуш
парвальбумин белок
Преальбумин
HIV-1 Протеаза \>v". Г '
Фосфолипаэа А; „ Ч< *
Ген 5 ДНК
связывающий Иммуноглобулин Аглютинин из Субтилизин Карсберга:
[S Трипсин-
Ингибитор трипсина
из поджелудочной железь
зародыша пшеницы Еглин с Лизоцим Карбоксипептидаза А
Рис. Y'1'Л. Формы различных биологических молекул, полученные методом рентгеиоструктурного
ция каждой молекулы выбрана таким образом, чтобы подчеркнуть своеобразие ее формы (Gooclseli

Цитратсинтаза Фосфоглицератмутаэа
d-Глицералдегид-З-фосфатдегидрогенаэа
Триптофан си нтетаза Тирозин- тРНК-синтетаза
Глютаминсинтетаза
анализа (увеличение 4 х 1011). При таком увеличении каждый атом имеет диаметр 1-2 мм. Орпента-
and Olson, 1993)

kouivH"-парии. Г'2.2. Классический
и строгий расчет модели «бусинок»
При строгом расчете моделей «бусинок»
должно быть использовано тензорное
уравнение, поскольку скорость пертурбаций не
всегда параллельна силам, их вызывающим.
В этом случае силы трения получаются в
результате решения системы 3JV линейных
уравнений. Соответственно, необходимое
для вычисления компьютерное время
пропорционально N\ и быстро увеличивается
с ростом N. Это противоречие возникает
из-за необходимости использовать
большое количество «бусинок», для получения
структуры объекта с высоким разрешением.
В классической теории Кирквуда
Райзмана приближения, сделанные при трактовке
гидродинамических взаимодействий,
приводят к простым уравнениям, в которых
гидродинамические свойства вычисляются
из двойной суммы обратных расстояний.
Это требует операций порядка N2, так что
компьютерное время для вычислений при
большом значении N намного меньше, чем
при строгом расчете.
ском взаимодействии с другими
сферами. Возмущение сферы / зависят от
сил трения F, производимых всеми
другими сферами j (в нашем
конкретном случае это вторая сфера) через
гидродинамическое взаимодействие
тензоров:
u^u-TxF. (Г2.7)
Тензор гидродинамического
взаимодействия Т. по Озеену-Бюргерсу
Т=(1/8пПпг)(1 + г.г/г^),(Г2.8)
где I является единичным тензором,
а г. — вектор расстояния между
взаимодействующими сферами i и j.
Выражение коэффициента
поступательного трения частиц, состоящих из
iV-сфер, каждая из которых обладает
коэффициентом трения %, имеет простой
вид ( к'оммен I'apnii l'1'..'i):
f
Щ
6Ю1„ЛГУЙ '
(Г2.9)
Рис. Г2.1. Схематическое изображение
гидродинамического взаимодействия между
двумя фиксированными в пространстве
сферами, каждая из которых является источником
трения. Две сферы движутся со скоростями
иии.г есть расстояние между сферами. При
движении через жидкость каждая сфера
изменяет скорости потока вблизи себя (Cantor and
Schimmel, 1980)
Уравнение Г2.9 может быть просто
интерпретировано с физической
точки зрения. При отсутствии
гидродинамического взаимодействия между
сферами коэффициент трения
частицы является суммой N коэффициен-
Комментарий Г2.3.
Взаимодействие между бусинками
по Озеену-Бюргерсу
Основными характерными чертами
гидродинамического взаимодействия между
бусинками по методу Озеена-Бюргерса
являются: (1) каждая бусинка
является источником трения; (2) только парное
взаимодействие между этими источниками
принимается во внимание. В результате в ,
уравнении Г2.9 всегда содержится двойная !
сумма расстояний между частицами.

то в трения сфер, Щ, в то время как
в присутствии гидродинамического
взаимодействия между сферами
коэффициент трения частицы меньше, чем
Щ,. Это происходит потому, что
каждая сфера, в среднем, является
объектом взаимодействия с растворителем,
и, следовательно, имеет меньшее
трепне. В этом случае гидродинамическое
взаимодействие учитывается дважды,
что и отражено в формуле Г2.9 в виде
двойной суммы.
Простота уравнения Г2.9 очень
привлекательна. Она позволяет
производить необходимые вычисления для
малого числа сферических субъединиц
вручную. Следует однако помнить, что
простота уравнения Г2.9 очень
иллюзорна (<>'. И .ill. I. :-,',!-||, ,■ ! ).
В дальнейшем тензор
гидродинамического взаимодействия Озеена-Бюр-
герса был модифицирован, с целью
устранения двух основных недостатков
подхода Кирквуда: 1) источники трения
считались точечными, несмотря на то
что сферы имели конечные размеры,
2) гидродинамические взаимодействия
учитывались как поправка первого
порядка для невозмущенных сил. В
модифицированном варианте в случае сфер
равного размера с радиусом /?0 тензор
гидродинамического взаимодействия Т..
имеет вид:
Т, =
1
вшу;,
( г г \
г
(Г2.10)
« /
2Л
■i(
V )
Тензор (уравнение Г2.10)
называется но имени их создателей тензором
Ротне-Прагера-Ямакавы, пли
модифицированным тензором Озеена-Бюргер-
са. Имеется также вариант уравнения
12.10 для случая сфер разных радиусов,
ст. и ст.,
1 J
1
( гг.. ^
1 + -Ч-
\
(Г2.11)
■>\( ■
(<*;+<)
г-
3
Чч
ч )
Заметим, что уравнение Г2.11
действительно, если расстояние между
частицами больше, чем сумма радиусов
Г.. > G. + СТ..
и 1 j
Сейчас мы подведем итоги
обсуждения проблемы учета
гидродинамического взаимодействия между различными
сферическими элементами при
построении модели, концентрируя
внимание только на поступательном трении.
Вращательное трение и вязкость будут
обсуждаться позже.
Когда частица произвольной
формы движется со скоростью и через
жидкость, сила трения, производимая
потоком, зависит от и, и выражается
через тензор поступательного трения
Е. как:
F = Е и.
(Г2.12)
Трансляционная динамика трения
частиц, описываемая при помощи
тензора поступательной диффузии D{, равна:
BrkT/Ei, (Г2.13)
где k — это константа Больцмана, а Г —
температура по Кельвину.
Уравнение Г2.13 является строгим
в отсутствие эффекта сопряжения
поступательного движения и вращения
-. 1..'\'\. .-!' : ! '.''.. Е II D( ЯВЛЯЮТСЯ
симметричными тензорами, комионен-

ты которых зависят от ориентации
частицы ПО ОТНОШеНИК) К ОСЯМ ( М'ЧЧ,"''.:
ли! I 1!."о. След матрицы D( является
однако инвариантным, так что
коэффициент поступательной диффузии может
быть определен как:
D = l/3tr(D). (Г2.14)
Поэтому ориентационно-усредпен-
ное сопротивление поступательному
движению может быть выражено через
скалярную величину — коэффициент
поступательного трения, /, который
связан с коэффициентом диффузии
уравнением Эйнштейна.
Как мы указывали выше, кроме
проблемы учета гидродинамического
взаимодействия при моделировании
имеется вторая ключевая проблема,
Комментарии! Г2.4. Частицы
произвольной формы
Для частиц произвольной формы
гидродинамическое сопротивление выражается
6 х G тензором трения Е. Подобно этому
броуновская диффузия выражается 6x6
диффузионной матрицей D. которая связана с Е
зависимостью Эйнштейна D -= &ГЕ'. И Е, и
D Moiyr быть разделены па 3 х 3 блока,
каждый из которых соответствует
поступательному движению, вращению и сопряжению
движение—вращение (Navarro et al., 1995).
Комментарий Г2.5. Тензор
поступательной диффузии
Отметим, что тензор поступательной
диффузии строго поддается интерпретации
только тогда, когда соотнесен со специфической
точкой, так называемым центром диффузии.
Последний совпадает с центром симметрии
для центросимметричных частиц. Во всех
других случаях теоретическое обоснование
гидродинамических вычислений может быть
найдено в специальной литературе (см.,
например, Navarro et al., 1995).
связанная с построением самой
модели из сферических элементов.
Очевидно, что при ее решении мы должны
одновременно стремиться к решению
двух задач. Первая связана с объемом
частицы, который должен быть
максимально близким к реальному. Вторая
связана с формой частицы, которая
должна быть нередана с
максимальным правдоподобием. Схема такого
моделирования для гипотетической
двумерной частицы представлена на
рисунке Г2..~>. Очевидно, что модель,
показанная на рисунке Г2..~> 6, более
точно передает реальные объем и
форму частицы, чем модель, показанная на
рисунке Г2.Г) а, однако ее расчет
потребует намного большего
компьютерного времени. В заключение заметим,
что при моделировании удлиненных
структур, таких как эллипсоид или
палочка, важными критериями является
совпадение длины и объема у частицы
и модели.
Моделирование поверхности частицы
набором малых равных сфер (метод
«оболочек»)
У компактной твердой частицы
гидродинамическое трение фактически
происходит на ее поверхности. Это
справедливо для многих биологических
макромолекул и, в первую очередь, для
глобулярных белков, поскольку
внутренняя часть белка недоступна
растворителю. Дажеесли вмолекулеесть поры,
пропускающие растворитель, жидкость
захватывается, движется вместе с ней,
становясь частью гидродинамической
частицы.
В методе «оболочек»
макромолекула окружена оболочкой, состоящей из
JVмаленьких сфер радиусом /'(рис. Г2.Г>
« и /). При этой процедуре большое чис-

а б в г.
Рис. I 2.7). Схематическое представление двумерной частицы: а — модель бусинок, составленная из
неравных по размеру сфер; б - модель бусинок, составленная из равновеликих сфер; в — идеальная
оболочсчпая модель; / — приближенная оболочечная модель (Carrasco and Garcia do la Torre, 1999)
ло сфер или бусинок расположены на
поверхности и плотно упакованы.
Поступательное трение ансамбля бусинок
вычисляется при использовании
модифицированного тензора Озеен-Бюр-
герса. Процедура расчета повторяется
несколько раз с использованием все
меньших размеров бусинок. В конечном
итоге, трение вычисляется
экстраполяцией к предельно большому количеству
бусинок бесконечно малого размера.
Процедура моделирования
относительно проста для тел, имеющих ось
вращения, подобную таковой эллипсоидов
или цилиндров, для которых бусинки
могут быть расположены параллельно
замкнутой кривой, которая
определяется плоскостью, перпендикулярной к
оси симметрии. Таким образом, методом
наложения бусинок на кольца с
различными радиусами мы можем построить
гладкую оболочечную модель
эллипсоида. Пример такого построения
представлен на рисунке Г2.(>.
Рис. I 2.(>. Оболочечная модель для
эллипсоида вращения с отношением осей р = 2 (Carrasco
and Garcia de la Torre, 1999)
Моделирование поверхности частиц
набором малых панельных элементов
(метод «панелей» или «чешуек»)
В методе «панелей» поверхность
молекулы описывается как iV
взаимосвязанных малых трехгранных панелей.

a 6
I'не. I 2.7: a — сфера диаметром п 20 А моделируется 256 треугольными пластинками; б —
закрытый цилиндр, моделирующий ДНК с 20 парами оснований, иредстанлен 96 треугольными
пластинками (Allison, 2001)
На рпсункч' ["2.7 с/ и 6, соответственно,
представлены примеры сфер и
закрытых с концов цилиндров. Как и в
предыдущем случае, процедура расчета
повторяется несколько раз с
использованием все меньших размеров панелей.
В конечном итоге трение вычисляется
экстраполяцией к предельно большому
количеству панелей бесконечно мало-
f
\
\
\
\
X
/
/
/
/
Рис. 12.8. Пример дискретизации вируса
табачной мозаики. Поверхность вируса с
приблизительно цилиндрической формой поделена
на п призм, число которых в процессе расчета
увеличивалось. Уже при п = 36 результаты
компьютерных вычислений коэффициента
диффузии для вируса табачной мозаики находились в
хорошем соответствии с его
экспериментальными значениями (Brune and Kim, 1993)
го размера. Метод «панельных
элементов» одинаково хорошо работает как
в условиях полного прилипания, так
и свободного скольжения (naparpacj)
Г1.4.1).
Для белков, поверхности которых
нерегулярны, процедура
дискретизации нетак проста и требует применения
специальных программ для расчета
коэффициентов трения исходя из
координат атомов (см. ниже). Для больших
макромолекул не обязательно знать
точное положение каждого атома, с тем
чтобы дискретизировать поверхность.
Например, вирус табачной мозаики
является достаточно большой частицей
(3000 А х 180А) и по этой причине сто
мелкие нерегулярности поверхности
не влияют на его гидродинамические
свойства. Поэтому этот вирус может
моделироваться цилиндром,
поделенным на относительно небольшое
количество панелей (рис. Г2.8).
Г2.2.3. Коэффициент
поступательного трения
и электростатическая емкость
Традиционно коэффициент трения
частиц с произвольной формой вычисли-

ется методами, описанными в
предыдущем"! секции. Эти методы требуют особой
тщательности и большого времени для
получения адекватных результатов.
Электростатические вычисления
более простые и имеют длинную историю
и богатые традиции.
Электростатическая емкость
многочисленных геометрических форм,
включая камень преткновения
гидродинамики — куб, хороню известна ( ,< \-
\:i■ ■ 11:11 ч = i'■ I :\ы. Взаимосвязь между
гидродинамикой и электростатикой была
установлена в 1993 г. и сразу же были
предложены простые и точные методы
вычисления поступательного
гидродинамического трения. Коэффициент
поступательного трепняУ частицы соотносится
с ее электростатической емкостью с как:
/=6ттг|„с. (Г2.15)
Это отношение точно выполняется
для сферы и двух- и трехосного
эллипсоидов ( :.' >\: -И ii 1.:|ч.|, ' '.'" ';.
Уравнение (Г2.15) открывает
простой способ вычисления
гидродинамического трения частицы произвольной
формы через электростатическую
емкость с. Важно подчеркнуть, что для тел
произвольной формы обычно намного
проще вычислить его емкость с, чем
компоненты тензора трения. Точность
таких вычислений весьма велика, она
составляет 1 % для случаев, когда
аналитическое решение известно.
Г2.2.4. Частицы с известной
структурой
Моделирование белков
по координатам атомов
Доступность баз данных, содержащих
атомные координаты большого числа
Электростатическая емкость
Электрический заряд ц генерирует на
теле электростатически ii потенциал U,
пропорциональный (/:
U = q/c. (А)
Константа пропорциональности в этом
уравнении обратно пропорциональна с, где
с есть электростатическая емкость тела, с
имеет размерность длины и раина заряду,
требуемому для поддержания единицы
электростатического потенциала тела по
отношению к бесконечности, или иначе,
с является эквивалентом
электростатической емкости частицы в единицах, равных
радиусу сферы.
' ■ ■■•■: т .•.'• г~? ,'. О сходстве
уравнений, описывающих
свойства сферы в кинетических,
электростатических и
гидродинамических явлениях
Интересным является тот факт, что
математические уравнения, описывающие
свойства сфер в электростатических и
гидродинамических явлениях сходны. В самом
деле уравнение, описывающее скорость
частиц в диффузионно-контролпруемых
реакциях с константой диффузии /А
движущихся по направлению к абсорбирующей сфере
(Глава ГЗ), приведено ниже:
k = -inDRu. (A)
В электростатике емкость с
электропроводящей сферы равна:
<=Я„. (Б)
Коэффициент поступательного трения
/ сферы в растворителе с вязкостью г)(1,
при граничных условиях «полного
прилипания» в соответствии с законом Стокса
(уравнение Г2.1) равен:
/=6ппЛ- (В>
Как видно, нее три величины
пропорциональны радиусу сферы.
белков, позволяет конструировать
гидродинамические модели на основе этих
координат. Моделирование каждого
атома белков приводит к получению

слишком оолыпого количества
центров трения и трудновыполнимым
вычислениям. С целью уменьшения
количества этих центров было предложено
несколько подходов: моделирование
белков набором бусинок (известный
как метод кубиков) и моделирование
поверхности белков набором
панельных элементов.
Моделирование белков сферами
(бусинками)
Программа «от А к Б» — «от атомных
координат к белку» разработана для
конструирования бусинками
сплошных моделей с различным
пространственным разрешением из атомных
Разрешение цюю
(,\) бусинок
Плоскость наблюдения
J^L
-2L-
30
20
15
10
26
67
125
319
1103
Рис. 12.9. Пример конструирования белка
альдолазы на базе программы «от А к Б» - «от
атомных координат к белку» с разным
пространственным разрешением (5-30 A) (Byron,
1997)
координат. Принцип работы
программы «от А к Б» состоит в следующем.
Пространство, занимаемое молекулой,
делится на маленькие кубы. В каждом
из них содержится бусинка, размер и
положение которой определяется
положением всех атомов в этом кубе.
Такой подход позволяет точно
регулировать размер куба, который и определяет
пространственное разрешение модели.
Реальная форма макромолекулы
диктует необходимый уровень разрешения.
Для более округлых глобулярных
частиц используются модели с большими
размерами бусинок. На рисунке Г2.9
приведен пример моделирования для
альдолазы. Модели, построенные по
атомным координатам на основе
программы «от А к В», имеют регулируемое
разрешение от 5 до 30 А. Как видно из
этого рисунка, разрешение от 10 до 20 А
является приемлемым для построения
модели, имеющей достаточное
сходство с оригинальной кристаллической
структурой. При меньшем разрешении
важные структурные детали могут быть
утрачены.
Моделирование поверхности белков
панельными элементами — метод
«чешуек»
При моделировании поверхности
молекул методом «чешуек» также
используются атомные координаты.
Рассмотрим такое моделирование на
примере молекулы лизоцима.
Поверхность этой молекулы при высоком
пространственном разрешении
демонстрирует большое число малых впадин
и выступов (рис. 12.10 а). На уровне
континуумной гидродинамики
(размеры объекта намного больше
размеров молекул растворителя) наличие
небольших участков нерегулярности

на поверхности белка слабо
сказывается па конечном результате, однако
значительно увеличивает время
вычислении. Для получения поверхности
белки, которую можно использовать
для гидродинамических вычислений
методом панельных элементов, мелкие
нерегулярные участки сглаживаются
обкаткой пробной сферы радиусом 3 А
(см. рис 12.10 а). Затем поверхность
белка делится па граничные элементы
(см. трехгранные поверхности на рис.
Г2.10 в). Коэффициент диффузии
может быть впоследствии вычислен при
использовании техники граничных
элементов, описанной ранее.
Моделирование структуры ДНК
Большинство динамических свойств
длинных молекул ДМК определяется
ее контурной длиной и гибкостью, в
то время как толщина и, еще в
большой степени, детали ее
поверхностной структуры не являются важными.
Напротив, для динамических свойств
коротких фрагментов ДНК структура
ее поверхности становится
определяющей. Для моделирования
гидродинамических свойств ДНК
используются два разных подхода. В первом из
них акцент делается на ДНК молекуле
как на спирали, параметры которой
могут быть заданы геометрией
расположения бусинок, тогда как во втором
координаты атомов молекулы ДНК
используются для локализации тех же
бусинок.
Моделирование ДНК как спиральной
структуры методом «бусинок»
При моделировании ДНК методом
«бусинок» ДНК моделируется как двойная
спираль, в которой каждый нуклео-
тид представлен отдельной бусинкой
ii.i-vv •■ .ipri: 12л). Радиус спирали
рассматривается как подгоночный
параметр. На рисунке I 2.1 1 показаны две
двойные спирали, в которых на один
оборот приходится 15 бусинок,
радиус спирали и ее шаг в обеих моделях
одинаковы (А = 10 А, Р = 34 А). Первая
спираль симметрична (ф =180°), с
двумя равными бороздками, в то время как
другая (ф = 120°) имеет две бороздки
разной толщины. При ф = 120° модель
описывает В-форму ДНК.
а о в
Рис. 1*2.10. Поверхность молекул лизоннма: a -- при атомном разрешении: б после обкатки
поверхности пробным шаром радиусом 3 А: в — поеле дискретизации поверхности на составные
треугольные элементы (Bruneand Kim, 1993)

Ъ4
1'ис. I 2.1 1. Аппроксимация двойной спирали
моделью «бусинок», в которой каждый нук-
леотпд представлен одной бусинкой. Модель
c.iena приближенно онисынает В-форму ДНК
(Garcia de la Torre etal., 1994)
Моделирование ДНК методом
«бусинок» по атомным координатам
При моделировании ДНК методом
«бусинок» по атомным координатам бусинки
располагаются в геометрических центрах
групп атомов (от 10 до 30 атомов), с тем
чтобы обеспечить сходство с реальной
формой поверхности молекулы.
Схематический вид фрагмента ДНК из 20 нук-
леотидов, описывающий ее бусинковую
модель представлен на рисунке Г2.12 а.
Наилучшее согласие с
экспериментальными данными обнаружено при радиусе
бусинок 7,3 А. В двойной бусинковой
модели (pi 1С. Г2.12 о), в которой нуклеотиды
разделены на две группы атомов (одна
содержит основания, другая — сахара и
фосфатные остатки) наилучшее согласие
с экспериментальными данными
достигается при радиусе бусинок 5,6 А.
Использование второй сферы
целесообразно только при моделировании коротких
фрагментов ДНК.
Моделирование ДНК по атомным
координатам методом «пластинок»
Пример разбиения
гидродинамической поверхности фрагмента ДНК, со-
1 f' . .' ■ Геометрия ДНК
Геометрия одиночном спирали может
быть описана следующим набором
параметром: Л, радиус спирали; Р, ее шаг; н,
число ниткой (не обязательно целочисленное).
Kc.ni ось спирали направлена вдоль оси z.
тогда параметрические уравнения спирали
будут иметь нпд:
Л"Ч-1 cos (г + ф).
1'= A sin (г + ф).
Z=Pt/2n.
(П.19)
где значение фа:юного угла ф может оыть
произвольным, а / есть параметр, который
находится н пределах от t =- 0 до / -2mir Дне
сплетенные нити двойной спирали могут
быть описаны с помощью этого же
уравнения, если задать разные значения фазоного
угла для каждой нити. В спирали ДНК
бусинки радиусом Rtl помещаются вдоль
линии контура спирали и располагаются так.
чтобы бусинки соприкасались. Два подхода
при моделировании структуры ДНК
описаны в тексте.
стоящего из 20 пар оснований, на 352
треугольные пластинки приведен на
рисунке Г2.13 с/. Применение этого
подхода не ограничивается только такими
относительно малыми фрагментами.
На рисунке Г2.13 6 показана торзионно
напряженная суперскрученная
кольцевая ДНК, состоящая из 375 пар
оснований с 4 зацеплениями. Молекула
сплетается в закольцованный кабель с
радиусом 10 А, покрытый 640
треугольными пластинками. Контурная длина
такой ДНК составляет 1275 А.
Г2.2.5. Жесткие частицы
с сегментальной подвижностью
При гидродинамическом описании
клубкообразных молекул необходимо
принимать во внимание как
растворитель внутри клубка, движущий-

а б
Рис. \'1.\'1: а — одиночная буспнковая модель фрагмента ДНК длиной 20 нуклеотидов. Атомы
ирслстанлены 1па|)пками, а свя:ш между ними — палочками; б — эти же атомы встроены в
двойную бупшконую модель (Banachowicz et al., 2000)
с я вместе с ним, так и растворитель,
свободно протекающий через клубок.
Кроме того, необходимо также
учитывать статистическое распределение
элементов трения внутри клубка.
Вычисления гидродинамических свойств
таких молекул, базирующиеся на
теории Кирквуда-Райземана,
методах Монте-Карло и молекулярной
динамики, представляют
специальную ветвь гидродинамики и здесь не
рассматриваются. Однако в биологии
существуют промежуточные
структуры, когда молекула может
рассматриваться как жесткая структура с
определенной подвижностью ее сегментов.
К ним относятся иммуноглобулины, и
некоторые глобулярные
белки,например калмодулин. Структурная
подвижность таких молекул напрямую
связана с их функцией, поэтому
изучение их гидродинамических свойств
представляет большой интерес.
Наиболее простой и широко
изученной моделью, имитирующей
сегментальную подвижность, является
жесткая палочка, состоящая из двух ветвей,
соединенных шарниром под углом а
(рис. Г2.11). Вычисления, основанные
на простом усреднении всех возможных
конформаций такой модели,
показывают, что коэффициент поступательного
трения такой палочки изменяется
всего на 3%, по сравнению с таковым для
жесткой палочки такого же размера и
мало зависит от места положения
шарнира. Поскольку экспериментальная
ошибка при использовании этих
методов в лучшем случае равна 1-2 %, то это
означает, что экспериментальное изуче-
а б
Рис. VI. \'.\: а пластинчатая (чешуйчатая) модель фрагмента ДНК из 20 пар оснований ДНК
(pd (A) pel (Т) ,(|) и виде 352 плоских треугольных пластинок; б — чешуйчатая модель
кольцевой ДНК, состоящая из 375 пар оснований с 4 зацеплениями. Модель состоит из 640
взаимосвязанных чешуек (Allison, 2001)

Рис. I 2.1 1. Палочка, сломанная под углом а,
моделируется набором бусинок
стунателыюй диффузии изогнутой
палочки, вычисленный из динамических
экспериментов, например,
динамического рассеяния света, должен зависеть
от времени. Это означает, что
автокорреляционная функция, описывающая
временную зависимость флуктуации
рассеянного света от ансамбля таких
частиц, должна состоять, по крайней
мере, их двух экспонент (Глава ПО).
Подобные временные эффекты
обнаруживаются и в явлениях электрического
двойного лучепреломления. Читатель
может найти обсуждение
экспериментальных исследований с применением
этих методов в Главе Гб.
Модель червеобразном цепи
(рис. Г2.15, см. также рис. 1 (>. I I), в
которой гибкость распределена но всей
длине цепи, представляет особый
интерес с точки зрения изучения
гидродинамики, поскольку она хорошо описывает
поступательное п вращательное трение
молекул ДНК. Сравнение этих моделей
с моделями изогнутых палочек
показывает, что их равновесные усредненные
конформации очень близки, но их
динамические свойства, выраженные
через спектр времен релаксации, заметно
отличаются. Динамические свойства
молекул ДНК будут обсуждаться в
параграфе Г6.7.1.
Рис. 12.15. Плавно изгибающаяся
полужесткая цепь может быть уподоблена червяку.
Отсюда название — червеобразная цепь
ние равновесной подвижности
сегментов у частиц с такой структурой
методами седиментации или поступательной
диффузии вряд ли имеет смысл.
Однако гибкость влияет гораздо сильнее на
динамические свойства частицы.
Расчеты показывают, что коэффициент по-
Г2.2.6. Экспериментальные методы
исследования коэффициента
поступательного трения
В i>'i. мл, Г.!.1 приведены
экспериментальные методы, используемые в
настоящее время для определения
коэффициентов поступательного трения,
/, биологических макромолекул
(первая колонка), их измеренные величины
(вторая колонка), и области
измеряемых значений (третья колонка). Четвер-

Минина \"2.1. Современные методы, используемые для определения
коэффициента поступательного трения, f, биологических макромолекул
Экспериментальный
метод
Расширяющаяся
граница
(Глава ГЗ)
Скоростная
седиментация
(Глава Pi)
Электрофорстпче-
ская подвижность
(Глава Г5)
(флуоресцентная
корреляционная
спектроскопия
(Глава Г11)
Восстановление
свечения красителя
после фотовыцве-
таипя
(Глава ГЗ)
Метод ядерного
магнитного
резонанса
(Глава КЗ)
Гидродинамическое
моделирование
(ГлавГ2)
Измеряемое значение
Коэффициент
посту нательной
диффузии D
Коэффициент
седиментации
(в единицах
Сведберга)
Электрофоретиче-
ская/подвнжность ц
Коэффициент
поступательной
диффузии D
Коэффициент
поступательной
диффузии D
Коэффициент
поступательной
диффузии D
Прямое определение
коэффициента
поступательного
трения/
Область
измеряемых
значений
5х 10 л- 5х Ю |2
(с.\1--сек ')
0,5-200000
(10 ,:)сек)
1x10s - 5 х Ю-4
(cmWcck')
5х Ю '-5х Ю-12
(см--сек ')
5х Ю •"'- 5х \0-"
(см2-сек ')
5х Ю5-5х Ю 7
(см2-сек-1)
Область применения
Макромолекулы
различной формы
и размеров
Макромолекулы
различной формы
и размеров
В основном молекулы
ДНК
Флуоресцентно
меченые
макромолекулы различной
формы и размеров
Флуоресцентно
меченые
макромолекулы различной
формы и размеров
Белки,
ДНК
Макромолекулы
квазисферической формы
I Комментарий Г2.9. Прямое определение коэффициентов поступательного
| трения гидродинамическим моделированием
i
Стандартный аппарат состоит из стеклянного цилиндра (с внутренним диаметром
приблизительно 10 см и высотой 100 см), погруженного в термостат. Два круглых маркировочных
знака приблизительно на расстоянии 7-10 см от каждого конца цилиндра показывают расстояние,
которое должна пройти частица за расчетное время. Жесткие молекулы конструируются из
шаров различного материала. Диаметр шаров колеблется от 0,25 см до 1 см. Частица из многих
I сфер конструируется склеиванием подобранных шаров. Стационарные скорости для несфери-
чеекпх частиц (цилиндры, дпмеры и тетрамеры молекул) определяются в двух ориентациях
в жидкостях различной вязкости с числом Рейнолдса в интервале значении 0,0001-0,01.
Для каждой мультпеферноп частицы интересующее нас значение трения будет равно
отношению скорости одной сферы к скорости многосфернон частицы. На отношение не должны
, влиять условия эксперимента, особенно краевые эффекты и размеры частицы. Такой простой
' эксперимент па макроскопической модели позволяет определить свойства поступательного
| трения микроскопической частицы произвольной формы. Теоретически полученные
значения совпадают с экспериментальными при минимальной ошибке (0,1 %) во всех случаях,
когда известен аналитический результат.

тая колонка включает ооласть размеров
и формы макромолекул, в которых
применение каждого метода наиболее
целесообразно. Главы, где каждый метод
описывается в деталях и обсуждается
область его применения, даны в скобках
в первой колонке.
Особое место в \;п>. пин- I '.\.\
занимает гидродинамическое моделирование,
в котором поступательное трение
жестких микроскопических частиц
определяется наблюдением скоростей
осаждения их макроскопических моделей в
очень вязких растворителях при низких
числах Реинолдса (Глава Г1). Описание
типичного эксперимента для ансамблей
жестких сфер дано в i."V\i,v ■■r'i!] ' "-'•
Г2.3, ВРАЩАТЕЛЬНОЙ
ТРЕНИЕ
Г2.3.1. Вращательное движение
в одном измерении
Броуновское движение включает в себя
не только поступательное движение
молекул, но также и их вращательное
движение. Классическое утверждение, со-
/
я.
4
\
/
&
1
9}?
/
^
—»-
Рис. Г2.16. Одномерное вращение. Все
палочки лежат в ху плоскости. Вращение
происходит вокруг z-оси, которая перпендикулярна
плоскости ху. Вращательное движение
палочки может быть описано одним параметром,
углом 6
держащееся во всех учеоипках, гласит:
«Броуновское движение частиц само по
себе нельзя наблюдать, за исключением
частиц настолько больших, что они
становятся видимыми в оптический
микроскоп, однако о его присутствии
можно судить по физическим свойствам
раствора». Сегодня его можно считать
устаревшим, поскольку впечатляющий
прогресс в течение последних 10 лет
позволяет визуализовать единичные
молекулы в растворе и на поверхности
(см. Главу Д4).
Мы начинаем этот параграф с
обсуждения вращательной диффузии в
одном измерении, поскольку это
позволит провести нам аналогию с явлением
поступательной диффузии.
Вращательное движение частицы
может быть описано как движение в
одном измерении, если движение каждой
точки частицы есть простое вращение
вокруг одной оси, которая проходит
через центр тяжести частицы (рис. Г2.К)).
Движение такого типа может быть
описано одним углом 9 между
соответствующими осями частицы (в нашем случае
это линия, проходящая через длинную
ось палочки) с любой другой
подходящей осью в пространстве (в нашем
случае это горизонтальная линия).
Изменение 9 во времени может быть
выражено в терминах угловой скорости
со = dQ/dt.
Теперь введем переменную
величину р(9), таким образом, что число частиц
в 1 см:! раствора, обладающих
ориентацией между углами 9 and 9 + dQ будет
равно р(9) dQ. Физический смысл этой
величины очень прост. В равновесном
состоянии все значения угла 9 будут
равновероятны и величина р(9) будет
постоянной. В неравновесном
состоянии под влиянием вращающего момента
некоторые ориентации становятся пред-

почтительными и значение р(9)
становится зависимым отО. Если вращающий
момент, производящий ориентацию
молекулы, удалить, то система постепенно
теряет преимущественную ориентацию
и, и конце концов, p(G) снова
становится постоянной. Этот процесс называется
вращательной диффузией.
Трактовка одномерной
вращательной диффузии подобна трактовке
одномерной поступательной диффузии
(Глава ГЗ). Если мы определим J (9) dt как
суммарное число молекул в 1 см', которое
за время dt проходит через угол
ориентации 9 в направлении положительного 9,
то феноменологический закон,
аналогичный первому закону Фика (уравнение
Г3.7), может быть записан в виде:
Л0) = -©[</р(9)Л/е],. (Г2.16)
В этом уравнении 0 называется
вращательным коэффициентом диффузии.
Второй закон Фика может быть
описан аналогично уравнению (Г3.9):
dP(Q)/dt = Qd2p(Q)/dQ2. (Г2.17)
Продолжая аналогию с
поступательным движением, мы можем
определить коэффициент вращательного
трения С. Вращательный момент F
1 ~ • пращ
действующий на любую частицу в ху
плоскости (см. рис. Г2.К)) в
направлении положительного угла 9, приведет к
ее угловому ускорению. В вязкой среде
этому ускорению противостоит трение
между частицей и молекулами
растворителя. Сила, обусловленная этим
трением, F , пропорциональна угловой
скорости (о. Константа
пропорциональности определяется как коэффициент
вращательного трения С;.
F =£оо. (Г2.18)
![)СМ11Я ~ V '
В равновесном состоянии эти две
противоположные по направлению
силы равны по величине, ускорение при
этом становится равным нулю, и
макромолекулы вращаются с постоянной
угловой скоростью, равной:
co = F/t;. (Г2.19)
Это уравнение эквивалентно
уравнению П.10. Оно является основой для
определения коэффициента
вращательного трения во многих
экспериментальных методах, представленных в i;!Л. 111 -
in Hi. I. Связь между коэффициентами
вращательного трения и
коэффициентом вращательной диффузии подобна
таковой в уравнении (Г3.24):
0 = кТД. (Г2.20)
Г2.3.2. Вращательное движение
в трех измерениях
Вращение молекулы в пространстве
должно в общем случае состоять не
из одного, а трех независимых видов
вращения, рассмотренных в
предыдущем разделе. Кроме того, эти три вида
не могут быть описаны с помощью
обычной прямоугольной системы
координат, а требуют специальной
системы координат, в качестве которой
выбираются углы Эйлера.
Необходимое рассмотрение сделано в
большинстве учебников по механике и здесь не
описывается. Скажем, что для
определения ориентации молекулы в общем
случае требуются три параметра и что
вращательное трение для трехосного
эллипсоида описывается тремя
коэффициентами вращательного трения
относительно каждой из его
принципиальных осей. Экспериментально
определяемые коэффициенты
вращательной диффузии и коэффициенты
вращательного трения даются
следующими соотношениями:

е = (ех + е.2 + е3)/з, (Г2.21а)
или
0 = кТ(1Д,+ 1/С,+1/С()/3.(Г2.21б)
Для двухосного эллипсоида
вращения два параметра являются
идентичными
(0, = 03) и 0 = (0, + 202)/3, (Г2.22в)
или
0 = kT(l/C, + 2/Q/3. (Г2.226)
Г2.3.3. Вращательное движение
и время релаксации
Часто описание вращательного трения
удобнее рассматривать при помощи
представления о времени релаксации,
которое мы сейчас определим.
Предположим, что у нас есть набор
макромолекул в растворе и некоторое выделенное
направление, жестко связанное с
молекулой. Поскольку молекулы
распределены в растворе хаотически, то все
возможные направления равновероятны
(рис. Г2.17 а). Допустим, что за какое-то
короткое время мы сможем
сориентировать макромолекулы в заданном
направлении, используя, например, силу
электрического поля (рис. 112.17 б).
После выключения поля и,
следовательно, исчезновения действия
ориентирующей силы через короткое время
наступит частичное нарушение
ориентации как показано на рисунке Г2.17 ч.
Для того, чтобы охарактеризовать
стадии бив мы введем угол, 8, который
будет характеризовать связь между
исходной ориентацией молекулы в положении
б и новым направлением в положении в.
Среднее значение косинуса этого угла
<cos8> может служить мерой
ориентации молекулы; <cos8> равен единице,
когда все молекулы полностью
ориентированы и стремится к нулю, когда
ориентация беспорядочная (рис. 12.17 /).
Время, необходимое для перехода системы
от состояния б к состоянию г называется
временем релаксации системы. Итак,
время релаксации, т, которое
определяется уравнением
<cos8> /<cos8>
\ (Г2.23)
является временем, неооходпмым для
того, чтобы значение <cos8>
уменьшилось до 1/е от его начальной величины.
^
а б в г
Рис. I 2.17. Различные состояния макромолекул в растворе: а все молекулы расположены
случайным образом; б - все молекулы ориентированы вертикально; в — некоторые молекулы
частично разориентированы; г - полная (случайная) разориептапия. Примечание: интервал
времени между состояниями бив — короткий, временной интервал между в и г — длинный по
отношению к вращательным свойствам макромолекул

Как указано и главах, посвященных
различным экспериментальным
методам, таким как электрическое двойное
лучепреломление (Глава Г6),
деполяризованная флуоресценция (Глава Г8)
наблюдаемые эффекты всегда
описываются мультиэкспопенциальными
функциями, содержащими до пяти времен
релаксации < мл* ^м ирнм i .'.. I и ).
Однако выделение пяти времен релаксации
и соответствующих им пяти амплитуд
из экспериментально измеренного
времени спада невозможно. Причина
этого лежит в том, что с математической
точки зрения разложение такого рода
относится к некорректно
поставленным или плохо обусловленным задачам
(Глава ПО). Упрощение этой проблемы
приводит к двум временам: к «среднему
времени релаксации», которое
определяется как взвешенное арифметическое
среднее из пяти времен релаксации и
к «начальному времени релаксации»,
которое определяется как взвешенное
гармоническое среднее всех
релаксационных времен (другие времена
релаксации обсуждаются в параграфе Г6.4.2).
Г2.3.4. Жесткие частицы
регулярной формы
Вращение твердого объекта в вязкой
жидкости сопровождается также
вращением молекул растворителя
относительно друг друга. Молекулы растворителя,
находящиеся вблизи вращающейся
частицы, оказываются возмущенными
в наибольшей степени. Это возмущение
исчезает при удалении молекул
растворителя от частицы. На рисунке Г2.18 а
линии потока обозначены
прерывистыми линиями вокруг сферы радиусом
/?0, вращающейся с постоянной угловой
скоростью со. Линии потока в данном
случае представляют собой окружности
Комментарий \~2. 10. Форма тела
и времена релаксации
Вращение трехосного эллипсоида
может быть описано тремя временами
релаксации, в то время как вращение так
называемой «полной жесткой частицы
произвольной формы» — пятью
временами релаксации. Из этих пяти времен
релаксации три очень близки и в
эксперименте проявляются как одно. Поэтому в
большинстве случаев может наблюдаться
только три времени. Поскольку к тому же
два из них взаимозависимы, на практике
наблюдаются только два времени
релаксации (Small and Isenberg, 1977).
(рис. Г2.18 6). У поверхности сферы
молекулы растворителя движутся вместе
со сферой, в соответствии с граничными
условиями полного прилипания. На
рисунке Г2.18<7 показаны также линии
потока (непрерывные линии) вокруг
сферы, когда она движется в потоке слева
направо в плоскости страницы. Видно,
что возмущение линий потока при
поступательном движении уменьшается
относительно более медленно, чем
возмущение при вращательном движении.
Сфера
Напоминаем (параграф П.4.3), что
вращательный коэффициент трения С,
сферы радиусом R0 в граничных условиях
полного прилипания равен:
^=8;гппД03. (Г2.24)
или
С0 = 6л0У. (Г2.25)
С учетом закона Стокса
вращательный диффузионный
коэффициент 0 и вращательное время
релаксации т0 равны:
e0 = kT/8m\0R03 = kT/6x\0V, (Г2.26)

47П1,Л/' = ч^ Г22?)
кТ
Рис. 12. IS. Сравнение вращательного и
поступательного потоков. На рисунке показан
профиль вычисленных скоростей потока,
вызываемый сферическими макромолекулами,
подчиняющимися приграничным условиям
полного прилипания. Прерывистыми линиями
представлены линии потока для сферы,
вращающейся вокруг нормали оси в плоскости
страницы. Сплошными линиями обозначены
линии потока для сферы, движущейся
слева направо в плоскости страницы. В каждом
случае лабораторная система координат была
выбрана таким образом, чтобы сфера была
стационарной. Показан только один квадрант,
находящийся в поле наблюдения. Радиус сферы
равен Л0, а расстояние выражается в единицах
R0. Вверху показано поперечное сечение
потоков, совпадающее с центром сферы; рисунки б
и в показывают профиль скоростей (линии
потока) для случая чистого вращения и
поступательного движения, соответственно (Kuntz and
Kauzman, 1974)
Сравнение формул Г2.30 и Г2.31
покалывает, что вращательное трепне
гораздо более чувствительно к размеру
частицы, чем поступательное. Причина
этого лежит в том, что величина С0
пропорциональна кубу линейных размеров
молекулы, тогда как величина /зависит
от линейных размеров в первой степени
(см. уравнения Г10.11, П0.12).
Вращательные коэффициенты
диффузии пекоторыхбиологических молекул
(от грамицидина до ДНК из
бактериофага Т4) представлены в ...
Интервал их значений составляет восемь
порядков, что во много раз превосходит
таковой для коэффициентов
поступательной диффузии или
коэффициентов седиментации (см. и ,. ).
Причина этого с физической точки
зрения проста: поступательное трение
пропорционально линейным размерам
частицы, а вращательное — кубу линейных
размеров (объему).
Эллипсоид вращения
Для эллипсоида вращения с осями
a, b = с существует не один, а два
коэффициента трения: один С,а — для
вращения вокруг полуоси а, а второй C,h — для
Константы вращательной диффузии некоторых макромолекул
в воде
Макромолекулы
Грамицидин(днмер)
Л изо цим
Кинезин (349)
Фрагмент ДНК (104 и.о.)
Т7 бактериофаг
Вирус табачной мозаики
ДНК бактериофага Т7
ДНК бактериофага Т4
0(сек')
60 000 000
16700000
5000000
172000
5290
330
5,2
0,41

вращения вокруг полуоси Ь. На
практике очень трудно измерить величины С,а
и C,h независимо. Поэтому обычно
вычисляют среднее значение
коэффициента вращательного трения С, и среднее
значение коэффициента вращательной
диффузии 0 по уравнениям:
S = br\0V/J(p), (Г2.28)
® = kTJ(p)/6^V, (Г2.29
где \/J(p) функция Перрена, которая
зависит от отношения осей
эллипсоида вращения. Теоретическое значение
WJ(p) представлено в виде графика на
рисунке 12.19. Сравнение зависимостей
вращательного трения, представленных
на рисунке Г2.19, с таковыми для
поступательного трения (см. рис. Г2.2) ясно
показывает, что вращательное трение
гораздо более чувствительно к форме
молекулы, чем поступательное трение
( коммун nipuii I 2. И ).
Для вытянутого эллипсоида
вращения с полуосями анЬ(а>5Ь), вращение
вокруг одной b оси хорошо описывается
уравнением:
3*71(21п(2Д/6)-1]
1б7СТ10<3
из которого видно, что малая ось b
появляется под знаком логарифма.
Отсюда следует, что ее вклад в величину 0
относительно мал и, следовательно,
константу вращательной диффузии
следует использовать для вычисления
длинной, а не короткой оси эллипсоида.
Круговой цилиндр
Напоминаем, что круговой цилиндр
относится к телам, для которых константа
вращательного трения (пли диффузии)
не может быть представлена в
аналитическом виде. Причина этого —
наличие краевых эффектов, которые мы
обсуждали ранее (секция П.5).
Поэтому константа вращательной диффузии
круговых цилиндров (палочек) обычно
выражается как:
чат
0 = _(ln(I/rf)-Y), (Г2.31)
jrn0L
где г)0 — вязкость растворителя; kT —
тепловая энергия; L — длина палочки;
d — ее диаметр и у — фактор трения,
который зависит от способа учета краевых
эффектов.
Как и в случае эллипсоида
вращения диаметр палочки, d, появляется в
уравнении (Г2.31) только под знаком
логарифма и поэтому константу
вращательной диффузии следует
использовать в первую очередь для вычисления
длины кругового цилиндра.
Все существующие сегодня теории
согласуются с функциональной формой
уравнения (Г2.31) и отличаются только
фактором трения у и его зависимостью от
параметрар = 1/й?(комментарии Г2.12).
Для очень длинных цилиндров
(р = L/d > 30) может быть использова-
Вытянутый/
20J- V
^ ■ Сплюснутый
6 <Г "ЙГ "И 'То
Отношение осей (р или 1/р)
Piii'. I2.I9. Зависимость усредненного но
ориентациям коэффициента
вращательного трения С, от отношения осей вытянутого и
сплюснутого эллипсоидов. Эта
гидродинамическая функции вычислена с помощью
компьютерной программы (Harding et al., 1997)

Комментарий Г2.1 1. Коэффициенты
вращательного трения и граничные
условия
Коэффициенты вращательного трения
более чувствительны к изменениям
граничных условии. Так, при переходе от условий
скольжения к условиям прилипания
поступательное трение изменяется только в
1.5 раза (см. уравнения Г1.11, Г. 12). Однако
при таком же переходе при вращательном
движении имеет место другая ситуация, о
которой мы упоминали для случая сферы
(уравнение П.14). Для вытянутого
эллипсоида в условиях скольжения пет
сопротивления при вращении его вокруг длинной
оси, а для сплюснутого — вокруг короткой.
Вычисления вращательных свойств
макромолекул различной формы при разных
граничных условиях можно найти в
литературе (Allison, 1999).
Комментарий Г2.12. Теоретическая
трактовка вращательного трения
правильного кругового цилиндра
Имеется, по крайней мере, пять
теоретических подходов, относящихся к расчету
коэффициента вращательной диффузии пра-
. вильногокругового цилиндрасопределенной
длиной и диаметром. Для длинных
цилиндров большинство из них дают практически
одинаковые результаты, но для коротких
цилиндров каждая теория дает свои результаты
(Elias and Eden, 1981; Lu et al., 2002).
на усовершенствованная формула Бро-
ерсма:
7 = 0,757-7
1
\r\2p
0,27 . (Г2.32)
Для относительно коротких
цилиндров (2 < /7 < 30) наиболее приемлемой
является формула Тирадо Гарсиа де ла
Торре:
7 = 0,667-
0,917 0,05
Р Р2
(Г2.33)
В заключение следует упомянуть, что
имеются две формулы, описывающие
длинные (в рамках червеобразной
модели) и короткие (в рамках модели слабо
скрученной палочки) молекулы ДНК.
Однако эти формулы слишком
громоздки, чтобы воспроизводить их здесь.
Применение уравнений Г2.32—Г2.34 для
исследования молекул ДНК в интервале
пар оснований длиной от 8 до 120
миллионов будет обсуждено в Главе Г7.
Короткие цилиндры
Понимание гидродинамических свойств
коротких цилиндров представляет
особый интерес, поскольку такие
цилиндры хорошо моделируют короткие
олигонуклеотиды ДНК. Для коротких
цилиндров (р - 2) существует
практический способ определения размеров
цилиндра, основанный на комбинации
поступательного и вращательного
коэффициентов трения D и 0.
Объединяя уравнения Г2.3 и Г2.31, определим
функцию \i(p), как:
иЫ^Гд
kT
lnp + ф
(ln/> + 7)'
0'
(Г2.34)
Функция ц(р), приведена на
рисунке Г2.20. из которого видно, что
она обладает достаточно высокой
чувствительностью к асимметрии
частицы, особенно в области малых
асимметрий р. Таким образом, уравнение
Г2.34 открывает возможность
прямого определения асимметрии короткой
палочки, если коэффициенты
поступательного и вращательного трения
определяются экспериментально,
например методом динамического
рассеяния света (Глава ПО).

Г2.3.5. Частицы произвольной
формы
Техника моделирования, используемая
для вычисления вращательного
трения частиц произвольной формы с
использованием набора бусинок, такая же
как и для вычисления поступательного
трения (параграфы Г2.3.1 —Г2.3.3).
Однако, для того, чтобы вычислить
коэффициент вращательного трения
частицы произвольной формы, необходимо
знать истинную ось вращения. На этой
оси находится центр трения. Для
некоторых частиц, таких как сферы,
палочки или кольца, центр трения совпадает
как с геометрическим центром, так и с
центром масс. Для структур с меньшей
симметрией, таких как бактериофаги,
это обычно не так. Очевидно, что
молекула вращается таким образом, чтобы
при этом растрачивать минимум
энергии на трение с растворителем. Таким
образом, подлинной осью вращения
является та, которая дает минимальное
значение для величины С, или
максимальное значение для величины D.
Другое важное различие между
вращательной и поступательной
диффузией связано с вкладом в трение
дополнительных масс. Так, добавление массы
в центр частицы мало сказывается на
ее вращательных свойствах, тогда как
ее добавление на периферию частицы
оказывает гораздо большее воздействие
(ком Mel i ri'pi li'i \"1.13).
Г2.3.6. Экспериментальные методы
для измерения коэффициентов
вращательного трения
Экспериментальные методы для
измерения коэффициентов вращательного
трения подразделяются на две группы.
К первой группе относятся эксперимен-
4 8 12 16 20
Отношение осей р
Рис. I 2.20. График функции ц(р) от/?.
Сплошная линия построена по уравнению (Г2.38);
прерывистая линия — то же самое, но при
наложении относительной ошибки, равной ±1 %
в D и ±3 % в 0 (Garcia de la Torre and Martinez,
1984)
ты, в которых определяется скорость
вращения частицы под действием пары
сил. Если градиент скорости в
растворителе играет роль ориентирующей силы,
то явление называется двойным
лучепреломлением в потоке, или эффектом
Максвелла. Если сила имеет
электрическую природу, явление называется элек-
Комментарий Г2.13. Метод
граничных элементов для
вычисления вращательного трения
Альтернативный подход вычисления
вращательных свойств частиц базируется
на методе граничных элементов. В
настоящее время алгоритм для вычисления
константы вращательной диффузии является
доступным. В случае, когда их
вращательные свойства известны, точность алгоритма
| весьма высока и составляет несколько
процентов (Allison, 1999).

\^ Методы определения коэффициентов вращательного трения

Экспериментальный
метод
Электрическое
двойное
лучепреломление
(Глава Г6)
Двойное
лучепреломление
в потоке
(Глава Г7)

Деполяризованная
флюоресценция и

фосфоресценция
(Глава Г8)
Динамическое
рассеяние
света
(Глава ПО)
Ядерный
магнитный
резонанс
(Глава КЗ)
Измеряемый
параметр

Релаксационное время,
т
Угол
ориентации,
X

Релаксационное время,
т

Корреляционная
функция или

коэффициент
деполяризации

Релаксационное время,
т
Интервал
измеряемых
коэффициентов
диффузии
0 в сек'1
1,7 х 10fi-0,3
5х 104-1,7
50 х Ю6-1,7х106
50 х Ю°-0,17
50 х 106-1,7хЮ6
Интервал
измеряемых
релаксационных
времен
т в сек
100 нсек — 500 м-сек
3 цсек — 100 мсек
3-100нсек
1 нсек — 1 сек
3-100 нсек
Область
применимости
метода
Большие
асимметричные молекулы,
такие как ДНК
и РНК
Большие
асимметричные молекулы
Малые
сферические молекулы
Малые квазисфе-
рическне
молекулы
или большие
и очень
асимметричные молекулы
Маленькие
квазисферические
молекулы
трическим двойным лучепреломлением
или эффектом Керра. Ко второй группе
относятся явления, в которых внешние
силы не воздействуют на частицу и ее
вращение связано только с броуновским
движением. Поведение частицы при
флуоресценции и динамическом
рассеянии света относится к этому типу.
В iao. :ii:;r Г-..'i приведены пять
методов для определения коэффициентов
вращательного трения. В ней
перечислены экспериментальные методы
(первая колонка), измеряемые параметры
(вторая колонка), доступные
интервалы экспериментальных значений
вращательных коэффициентов диффузии
(третья колонка), времена релаксации
(четвертая колонка) и области
применимости каждого метода. В таблице
также указаны главы, в которых
детально описаны экспериментальные методы
и их применение.
Следует заметить, что
исследователи, работающие в разных областях,
часто используют различные
определения времени релаксации. Так, при
описании экспериментальных данных,
полученных с помощью эффекта
Керра или эффекта Максвелла,
предпочитают пользоваться вращательным

релаксационным временем,
обозначаемым как р, тогда как при описании
аналогичных данных ЯМР и
деполяризованной флюоресценции обычно
пользуются вращательным
корреляционным временем, обозначаемым как ф .
Эти времена связаны между собой как
ф = - . Их связь с вращательными
диффузионными коэффициентами имеет
1 1 D
вид: ф = — , р = —. В этой книге т оз-
Ьи IU
начает вращательное реалаксационное
время, а тс. означает вращательное
корреляционное время.
i /., ".-. !''У*..'.":;ч"»-^>* '"j';'.:-i
Г2.4.1. Вязкость как локальные
потери энергии
Внутреннее трение или вязкость
жидкости проявляется тогда, когда она
находится в состоянии потока с
отличным от нуля градиентом скорости.
Самым простым примером
является ламинарный поток с постоянным
градиентом скорости G = dujdy под
прямым углом по отношению к
потоку (рис. Г2.21 и :л\">м i !.,,'■ ■ ! :'. I '•■).
Скорость жидкости и находится из
выражения:
I■*iit". I 2.21. Скорость п градиент
распределения скорости в ламинарном потоке в
бесконечно малом зазоре между цилиндрами
: • ;'.:;.;•. -ч 'iij i.:i: I 2 i4. Ламинарный
и турбулентный потоки
Когда жидкость, наблюдаемая в
эксперименте, течет медленно между двумя
параллельными поверхностями, то такое
течение называется ламинарным. В этом
случае г|0 не зависит от G и такой поток по
своим вязкостным свойствам называется
ньютоновым. При достаточно высокой
скорости свойства потока начинают
изменяться. Такой ноток называется турбулентным.
В этом случае ri0 начинает зависеть от G и
такой поток называется неньютоновым.
В цилиндрических трубах переход от
ламинарного потока к турбулентному
происходит, когда число Рейнолдса достигает
2000. Поток жидкости в узких капиллярах
или протекающий между двумя медленно
вращающимися цилиндрами,
расположенными близко друг к другу', является
ламинарным потоком при любых скоростях,
необходимых для измерения вязкости.
и = и= Gu,
(Г2.35)
иц = и. - 0.
Вязкость жидкости является мерой
внутреннего трения, которое
определяет значение тангенциальной силы F,
необходимой для поддержания
градиента скорости G между плоскостями
жидкости. Чем большим внутренним
трением обладает жидкость, тем
большую силу надо приложить к ней с тем,
чтобы поддерживать в потоке заданный
градиент скорости G. Эта связь
выражается формулой Ньютона:
F = Fx=T\/-^ = r\fi. (Г2.36)
ay
Константа пропорциональности
г|0 называется коэффициентом
вязкости или просто вязкостью жидкости.
Ее размерность — дина-сек_1-см~2 или
эргсм :!-сек '. Таким образом, вязкость
может быть определена как потери энер-

»т
-г/ /Щ
Рис. I2.22. Ламинарный поток (объяснения
в тексте)
гни на единицу объема за единицу времени
в потоке с единичным градиентом
скорости. Для поддержания градиента
скорости G в жидкости должна быть затрачена
энергия. Чтобы вычислить ее, рассмотрим
два слоя — 1 и 2, разделенных третьим,
толщиной dy над участком поверхности
ху и площадью 1 см2 (рис. 12.22). За время
t смещение слоя 2 относительно слоя 1 в
.r-направлении будет равно:
dx = t(dux /dy) - tgdy.
Таким образом, в слое толщиной dy
и площадью 1 см2 проделанная работа
будет равна: dA = Fdx = F Gtdy для
объема жидкости, равного dy-см2. При этом
количество проделанной работы для
преодолении трения на единицу объема
равно: А = FGt. Подставляя Fm
уравнения (Г2.36), получаем выражение для
проделанной работы за единицу
времени на единицу объема, обусловленной
направленным потоком:
Е = ^ = т]0С2. (Г2.37)
Это выражение является
центральным в обсуждении вязкости
макромолекул.
Г2.4.2. Относительная, удельная
и характеристическая вязкость
Вязкость чистого растворителя
обозначается как г) Добавление
макромолекул будет увеличивать вязкость до
новой величины г). В результате вязкость
раствора макромолекул всегда больше,
чем чистого растворителя
(комментарии Г2.1Г>). Отношение вязкости
раствора к вязкости чистого растворителя
называется относительной вязкостью
Л,„„ = Л/По- (Г2.38)
Значение, на которое повышается
вязкость, называется удельной
вязкостью и выражается:
П,,= ч/п()-1=п11П1-1- (Г2.39)
При достаточно низкой
концентрации, С, г| , пропорционально С. мы
можем определить характеристическую
вязкость [ л ] как значение, на которое
увеличивается вязкость раствора при
внесении одного грамма макромолекул
(комментарий Г2.1П). Абсолютная величина
характеристической вязкости зависит от
того, в каких единицах выражена
концентрация растворенного вещества. Так,
если концентрация выражена в мг-мл ',
то характеристическая вязкость
глобулярного белка [г|] будет равна 3 мл-мг '.
Если же концентрация выражена в%
; Комментарий Г2.15. Отрицательное I
значение характеристической j
вязкости
На практике вязкость раствора может
быть ниже вязкости чистого растворителя.
Явление отрицательной вязкости было от- j
крыто давно на примере простых жидких I
j смесей, таких как бензол в этаноле, изобу-
тилен в бензоле. Это явление возникает в
результате специфического
взаимодействия между растворяемым веществом и рас- ,
творителем, при котором жидкая структура j
растворителей некоторых видов
нарушается вблизи растворяемой молекулы. Такой
результат не может обсуждаться в рамках
классической гидродинамики.

(мг-децилитр"'), то аналогичное значение
вязкости будет равно 0,03 децилитр.-мг1.
Общепринятое выражение для
характеристической вязкости обычно имеет вид:
Л-Ло
1л1 =
ПП1-
(Г2.40)
л„с
С->0,
отражающий факт необходимости
экстраполяции получаемых величин к
нулевой концентрации растворенных
макромолекул.
Г2.4.3. Частицы правильной формы
Сфера
В ламинарном потоке, определяемом
уравнением (Г2.35), сферические
частицы движутся в слоях жидкости с
различными скоростями. Поэтому силы
трения со стороны растворителя,
обтекающего частицу, приводят ее не
только в поступательное, но и также во
вращательное движение (рис. 12.23).
Когда сумма всех вращательных
моментов, действующих па частицу, равна
нулю, то угловая скорость сферических
частиц будет постоянной:
2
(Г2.41)
На рисунке Г2.23 изображен
невозмущенный ламинарный поток до
введения в него частиц в системе
координат, начало которых совмещено с
центром сферической частицы и
которые движутся поступательно вместе с
нею в потоке. Нетрудно видеть, что в
выбранной системе линейные скорости
в точках а, Ь, с и d поверхности частицы
направлены по касательным к ней и по
абсолютной величине равны и0 = ш/?0 =
'/г х GR{), где R{) — радиус сферической
частицы. Скорости невозмущенного
Комментарий Г2.16. Термин
«характеристическая вязкость»
Термин «характеристическая вязкость»
был предложен Кремером в 1938 г. Строго
говоря, использование термина «вязкость»
для г|шн, r|vi и [г|] является некорректным,
поскольку эти величины являются просто !
числами и не имеют размерности вязкости. !
В 1957 г. Международный союз чистой |
и прикладной химии предложил
переименовать характеристическую вязкость [г|]
в «предельное число вязкости». Последнее
четко отражает размерность термина.
Однако предложенный термин так и не стал
общепринятым.
потока и в системе этих координат
различны в разных точках. Так, в точках с
и d скорость и = 0, в то время как в
точках а и b абсолютное значение скорости
равно GR0 (т. е. вдвое больше скорости
частицы), а направление скорости
совпадает со скоростью поверхности
частицы. Таким образом, в точках a, b, с,
и d скорость невозмущенной жидкости
I'm-. Г2.23. Сферические частицы в
ламинарном потоке (Цветков, 1989)

отличается от скорости
соприкасающихся участков частицы на величину
И» х GR{). В других точках поверхности
частицы относительная скорость
невозмущенного обтекающего растворителя
отличается от значения М> x GRQ, но
также пропорциональна GR0.
В присутствии частицы
распределение истинной скорости несколько
отличается от таковой, приведенной на
рисунке Г2.21, поскольку частица
возмущает поток растворителя.
Изменение скорости точек среды на величину
'/2 х G7?()npn переходе от частицы к
растворителю совершается на ее границе
не скачкообразно (как в точках а, Ь, с,
и </рис. Г2.23), а непрерывным образом в
некотором слое жидкости, окружающем
частицу. На самой же границе раздела
скорость частицы совпадает со
скоростью прилегающего возмущенного
растворителя. Однако для оценки потерь на
трение это не имеет принципиального
Рис. Г2.21. Направления скоростей
невозмущенного растворителя по отношению к
поверхности сферической частицы в ламинарном
потоке. Линии потока показывают значение
относительной скорости и-и0 в ху плоскости
(Цветков, 1989)
значения. На рисунке 1 2.21 показан
невозмущенный поток растворителя в ху
плоскости по отношению к поверхности
частицы. Из диаграммы видно, что сумма
вращающих моментов, обусловленная
силами вязкости, равна нулю. Однако
результатом проделанной этими силами
работы является дополнительная
потеря энергии и, следовательно, увеличение
вязкости раствора.
Качественная оценка
рассматриваемого эффекта показывает, что
скорость растворителя по отношению к
поверхности сферы всегда
пропорциональна произведению GR(), что
эквивалентно вращению частицы в
растворителе с относительной угловой
скоростью,равной:
(o0=aG. (Г2.42)
Уравнение Г2.42 имеет
универсальный характер. Для частиц различной
формы коэффициент
пропорциональности а имеет различные значения, но
пропорциональность между со0 и G
всегда сохраняется.
На рисунке Г2.2;1 показано
истинное распределение скоростей для чисто
вращательного движения и движения
в потоке. Здесь ясно прослеживается
основное различие между ними:
изменение профиля скоростей в потоке
происходит более быстро, чем при чистом
вращении. Заметим, что в потоке
молекулы растягиваются при движении
вдоль одного направления и
сжимаются при движении вдоль другого
направления. Этот эффект очень выражен
для гибких молекул и будет рассмотрен
в секции Г7.6.
Для вращения твердых частиц,
форма которых отлична от сферической, в
вязком растворителе работа,
проделанная в единицу времени по преодолению
трения, равна:

W = co(1Q, (Г2.43)
где Q — вращательный момент,
связанный с коэффициентом вращательного
трения частицы, С, в соответствии с
зависимостью:
Q = S«V
(Г2.44)
Если 1 см:| раствора содержит
Л^частиц, тогда потеря энергии, Д£, в единицу
времени, обусловленная вращательным
трением, будет равна WN0. Используя
уравнения (Г2.42—Г2.44), находим:
АЕ =d1G1 gv„, (Г2.45)
где Д£ обозначает разность между
потерей энергии, обусловленной трением в
растворе и в растворителе. Таким
образом, из уравнения (Г2.45) следует:
Д£ = г,С7--г,иС72, (Г2.46)
где г| является вязкостью раствора.
Приравнивая уравнения (Г2.41) и (Г2.42),
получим значение для удельной
вязкости раствора:
п« =
ч-Чи _а"ХС
(Г2.47)
Чо Чо
Уравнение Г2.47 носит общий
характер и для частиц разной формы
отличается только значением
коэффициента а2. Для сферических частиц 6а2 =
2,5 и с учетом уравнений Г2.47 и
уравнения Стокса 0=6 nr|(lV получаем
Tiyj = 2,5WV0, (Г2.48)
Уравнение Г2.48 известно как
уравнение Эйнштейна. Напоминаем, что
NQ =CNyM, где С — это концентрация
раствора в граммах на кубический
сантиметр, N^ — это число Авогадро, а М —
молекулярная масса частицы. Из
уравнения Г2.48 следует, что:
[ч1 = 1п11
'О
Рис. I 2.2.1. Сравнение чисто вращательного
потока и потока в градиенте скорости. Профиль
скорости жидкости был вычислен для
сферических макромолекул, находящихся в
приграничном состоянии прилипания. Прерывистые
линии представляют собой линии потока для
сфер, вращающихся вокруг оси
перпендикулярной к плоскости страницы. Сплошные
линии представляют линии градиента скорости
потока. Радиус сферы равен R0, а расстояние
выражено в единицах R0. Возмущенный поток,
обусловленный присутствием сфер, является
функцией скорости компонентов потока вдоль
трех осей. Эта формула слишком громоздка и
не может быть воспроизведена здесь.
Читатели, интересующиеся математическими
деталями, отсылаются к специальной литературе
(Kuntzand Kauzmann, 1974)
где [г|] — это характеристическая
вязкость раствора макромолекул, а V —
гидродинамический объем частицы.
Для жестких несферических частиц
из уравнения Г2.47 следует:
[ч] =
г,0М
(Г2.50)
:2,5WV„, (Г2.49)
Используя уравнение Г2.20, мы
имеем:
RT
[ч] = сс
Чо©М'
(Г2.51)

Коммошпрни Г?. \ 7.
Альтернативное выражение
для характеристической вязкости
Для эллипсоидных частиц уравнение
(Г2.51) для характеристической вязкости
при низких градиентах скорости может
быть записано в виде:
[Л] =
RT F(p)
ц0вМ 6 '
(Л)
где F(p) — фактор формы и р — отношение
осей эллипсоида. Для р > 10 функция F
(р) изменяется очень слабо и произведение
[г|]ОЛ/оказывается практически
независящим от р. При р -> °°, F(p) = 0.8 по велпчи-
. нам [г|] и М можно вычислить 0 (Цветков
и др., 1971).
Уравнение Г2.51 отражает тот
факт, что характеристическая вязкость
раствора, независимо от модельных
свойств частицы, во всех случаях
является мерой потерь энергии, вызванной
вращением частицы в растворе. Именно
40
1 5 10 15 20
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. Г2.26. Зависимость функции Симха
v(p) от отношения осей для вытянутого и
сплюснутого эллипсоидов вращения. Для
сферы v(p) = 2,5. Табулированные значения этой
и многих других гидродинамических функций
можно получить, используя компьютерные
программы (Hurding et al., 1997)
поэтому значение характеристической
вязкости зависит от вращательной
подвижности, т. е. от величины 0, что
видно из формулы Г2.51.
Эллипсоидальные частицы
Для растворов несферических частиц
ситуация более сложная и физическая
картина может быть качественно
описана следующим образом. Оценка потери
энергии базируется на предположении,
что раствор эллипсоидальных частиц в
ламинарном потоке находится в
равновесном состоянии, зависящем от двух
действующих противоположно
направленных сил. Одна сила возникает из-за
тенденции градиента скорости потока
ориентировать частицы в направлении
линий его движения, а другая
обусловлена броуновским движением,
имеющим тенденцию обеспечивать
случайную ориентацию. Таким образом,
полная потеря энергии, обусловленная
трением, является суммой двух
составляющих. Первая определяется чисто
гидродинамическими потерями, о
которых шла речь в предыдущем параграфе,
а вторая обусловлена броуновским
вращением частиц. Относительные роли
этих двух составляющих зависят от
отношения градиента скорости к
коэффициенту вращательного трения, G/Q.
При малом значении этого отношения
асимметрия функции углового
распределения полностью устраняется
броуновским вращением. В этих условиях
каждая асимметричная частица
вращается с постоянной угловой скоростью
со = G/2. Уравнение Г2.49 для вязкости
эллипсоида вращения для предельного
случая, когда отношение G/Q
стремится к нулю, имеет вид:
[r\] = v(p)NAV/M, (Г2.53)

где NA — число Авогад|ю, М —
молекулярная масса и Vuri—
гидродинамический объем макромолекулы (ком.мси i а-
|)in"i I 2.1 7).
Функция v(/;), называемая
функцией Симхадля вытянутых и сплюснутых
эллипсоидов вращения, представлена на
рисунке1 "2.2(5. Из рисунка видно, что эта
функция гораздо более чувствительна
к форме частицы, чем функция Перре-
иа (см. рис. Г2.2). Для отношения осей
больше 15, функция Симхадля
вытянутых эллипсоидов может быть
представлена асимптотическим уравнением:
Из уравнения Г2.53 следует, что для
вычисления формы макромолекулы в
рамках эллипсоида вращения нет
необходимости знать молекулярную массу
макромолекулы.
Палочкообразные частицы
В 1951 г. Кпрквуд и Ауэр вычислили
характеристическую вязкость
палочкообразной частицы как функцию
отношения осей. В этой модели палочка
рассматривалась как набор линейно
расположенных сфер, состоящих из п
звеньев диаметром d и длиной L=nd.
Асимптотическая форма уравнения для
характеристической вязкости имеет
вид:
[ ) = kNJ^[ (Г2.54)
где Nx — число Авогадро и М —
молекулярная масса мономера.
Это уравнение идентично
уравнению Симха для вытянутых
эллипсоидов с очень большой длиной полуоси
1/2. Если выразить М(| как npb2L/3n и
вспомнить, что для больших значений
a/b In {2a/b) = ln2 +ln (a/b) = In (a/b),
то выражение для характеристической
вязкости принимает вид:
24 п2
9000р 1пр
Это уравнение можно использовать
для определения отношения осей
палочкообразных частиц, а если
молекулярная масса частицы известна, то можно
вычислить и ее длину.
Характеристическая вязкость молекул другой формы
обсуждается в ком чип арии Г2.Ь\
Г2.4.4. Частицы произвольной
формы
Возможности для вычисления значений
характеристической вязкости для частиц
произвольной формы более ограничены,
чем при вычислении коэффициентов
вращательной диффузии и, особенно,
коэффициентов поступательной
диффузии. Во-первых, это связано с
необходимостью экстраполировать величину [л]
к нулевому градиенту скорости и
усреднять ее по всем ориентациям частицы.
Во-вторых, для несферических молекул
величина [ц] зависит от выбора центра
частицы, называемого в данном случае
«центром вязкости», который может
отличаться от «центров» поступательной
или вращательной диффузии для частиц
произвольной формы.
При вычислении
характеристической вязкости частиц произвольной
формы используются три подхода для
моделирования, два из которых
(моделирование с помощью бусинок и
треугольных пластинок) аналогичны
таковым, используемым в вычислении
поступательной или вращательной
диффузии (ком чип арии Г2.|!м. В
первом из них жесткая молекула
моделируется iV сферическими элементами соот-

Характеристическая вязкость
частиц специфической формы
Трехосные эллипсоиды
Значение вязкости трехосного
эллипсоида равно v = |л!/К = Y (<?• Ь, с), где [г|| —
характеристическая вязкость, выраженная
в с.м:1 на грамм, К — удельный объем в см:)
на грамм и У (я, Ь, с) — эллиптические
интегралы, которые могут быть вычислены
численным интегрированием. При данных
значениях величин (я/Л, Ь/с) они
однозначно фиксируют значение функции v,
но при заданном значении функции v, она
будет иметь линейное решение по
отношению к значениям двух осей (а/b и Ь/с).
К сожалению, пересечение этих двух линий
имеет место только при больших
значениях отношений а/Ь и Ь/с, а не при их малых
значениях. Последнее представляло бы
наибольший практический интерес (Harding
and Rowe, 1982).
Сфероидно-цилиндрические молекулы
В литературе имеются данные по
характеристической вязкости цилиндров, концы
которых аппроксимированы разными
формами (полусфера, полуэллипсоид). Эти
данные выявляют влияние краевых эффектов
на значение характеристической вязкости.
Как и следовало ожидать, сильные краевые
эффекты наиболее выражены для
относительно коротких цилиндров. Примечательно,
что эти эффекты не так сильно сказываются
на значении коэффициента поступательной
диффузии (Yoshizaki and Yamakawa, 1980).
Молекулы в виде гантелей
Известны значения характеристической
вязкости для гантелевидных частиц,
которые можно представить в виде двух
одинаковых сфер, находящихся на различном
расстоянии друг от друга (Wakia, 1971).
ветствующего радиуса. Размер и форма
модели должны быть как можно ближе
к таковым реальной макромолекулы
(см. рис. Г2.5 а). Гидродинамическое
взаимодействие между сферами
учитывается классическими
гидродинамическими методами. К сожалению, все
теории характеристической вязкости
'■■.-.■ ' Использование
моделей оболочек при вычислении
характеристической вязкости
Подход, основанный на модели
оболочек, теоретически должен быть
идеальным решением для вычисления вязкости
макромолекул. В этой процедуре большое
число бусинок располагается на
поверхности объекта как можно ближе друг к
другу (см. рис. 11!.7). Поэтому
вычисление характеристической вязкости при
экстраполяции к нулевому размеру
бусинок должно давать самое точное
значение. К сожалению, такая процедура
требует так много расчетного времени, что на
практике не используется.
дают хорошие результаты только для
случая сильно асимметричных частиц
и приводят к относительно большим
погрешностям в случае одной сферы или
нескольких сфер.
Второе приближение основано на
моделировании поверхности частицы
набором треугольных пластинок.
Характеристическая вязкость такой
модели вычисляется для ряда структур
с экстраполяцией числа пластинок к
бесконечности. Основное
преимущество такого подхода состоит в том, что
он применим для вычислений
характеристической вязкости при разных
граничных условиях, а также при
действии различных сил, действующих на
окружающую частицу жидкость.
Точность таких вычислений достаточно
велика. Так для эллипсоидов
вращения, где аналитическое решение
известно, точность составляет около 1 %.
Для палочкообразных частиц
удовлетворительные результаты получены в
интервалер от 2,04 до 17,0, что
соответствует фрагментам ДНК длиной от
12 пар оснований (р = 2,04) до 100 пар
оснований (р = 17,0).

: ■ ,'■ -i ''■'."''' Кпониманию
формулы Г2.56
В формуле Г2.56 С измеряется в
единицах численной плотности, а
характеристическая вязкость — в единицах объема.
Третий подход базируется на
корреляции между характеристической
вязкостью [г\] молекулы и ее
поляризуемостью а. Основываясь на прямом
сравнении [г\] и а в случае эллипсоидов
и гантелей, Дуглас и Хаббард
предложили следующее выражение для сферы:
[л]=Нт^1 = 0,79а. (Г2.56)
Ориентационное усреднение
тензора Озеена дает несколько другое
отношение:
[Л] = 3/4 а, (Г2.57)
отличающееся на 5% от предыдущего
( л--.^ :';':■!'■ Г'.:'"!. Оба соотношения
однако отличаются от точного значения,
ожидаемого для сферы. Для нее
поляризуемость равна а = 3 V. Тогда
характеристическая вязкость, предсказанная
уравнением (Г2.57), равна [г\] = 9/4 х V,
которое отличается от точного
результата Эйнштейна [г\] = 5/2V на 10%.
Поэтому Дуглас и Хаббард предложили
добавить константу в правую часть
уравнения Г2.57, с тем чтобы иметь
возможность его использовать для глобулярных
белков. Это приводит к следующей
эмпирической зависимости между
характеристической вязкостью частицы [г|],
ее поляризуемостью а и объемом V'.
[г)1 = 3/4 а + % Vp. (Г2.58)
Применение этого соотношения к
телам, имеющим форму эллипсоидов,
цилиндров, гантелей дает значения
величин [г)] с точностью 3%.
•У.5, i"'nj поы6пtv>*-'&:-.['• <?.
Г2.5.1. Функции формы, зависящие
от объема для двухосного
эллипсоида
Для двухосного эллипсоида вращения
каждая гидродинамическая функция
зависит от его объема и отношения осей
(уравнения Г2.2, Г2.26 и Г2.53). В '
суммированы все
экспериментальные гидродинамические функции,
каждая из которых нормирована на
сферу, с тем чтобы высветить только вклад
отношения осей. Эти функции
называются «функциями формы, зависящими
от объема». Такое название они
получили, с тем чтобы отличать их от
«функций формы, не зависящих от объема»,
когда различные гидродинамические
функции комбинируются между собой
путем исключения входящего в них
гидродинамического объема. Различные
комбинации таких функций
рассматриваются в следующем параграфе. Главная
их цель — найти такую комбинацию
гидродинамических функций, которая
позволила бы решить классическую
проблему «объем — отношение осей» для
двухосного эллипсоида вращения.
Г2.5.2. Функции формы,
не зависящие от объема
для двухосного эллипсоида
Первая попытка решить проблему
«объем — отношение осей» для двухосного
эллипсоида были предприняты Онсли в
1941г. Он вычислил значения
отношения осей и гидратации для эллипсоида
вращения при различных значениях ко-

".kv;l;l;^ Г 2 А. Экспериментально измеряемые функции формы, зависящие
от объема
Функция формы
Экспериментальный параметр
Экспериментальный
метод
1. Отношение коэффициента
поступательного трения
частицы к таковому для сферической
частицы равного объема ///„
(для сферы ///,, = 1)
(Главы ГЗ и Г4)
/_А/(1-цр„)
/ kT
Лж
3VC
/„ 6тгп„£>
ЗК,.
Седиментация
Диффузия
2. Отношение коэффициента
вращательного трения частицы
к таковому для сферической
частицы равного объема О,/©,,
(для сферы 0/0() = 1)
(Главы 17, Г8 и ПО)
в„
М^р
kT
0, (i = a, b)
Динамическое
рассеяние света.
Эффекты Максвелла
и Керра.
Деполяризованная
флуоресценция
3. Фактор формы
характеристической вязкости v (для сферы
v = 2,5) (Глава Г9)
[ц\М
Вязкость
N, К,.
4. Приведенный исключенный
объем V (ко-объем)*)
(для сферы ViipiiB = 8)
2А.М1
V„.
v..
где V„
исключенный макромо-
лекулярный объем, а Л, — второй
вириальный коэффициент
Концентрационная
зависимость
осмотического давления,
статического
рассеяния света и
равновесной седиментации
5. Отношение гармонического
среднего релаксационного
времени к таковому для
сферической частицы равного объема т0
(для сферы xh/x0 = 1)
(Главы Г6 и КЗ)
кТ
1
*о (т0/тя) + (2т0/т») Зп„ %
Равновесная
деполяризованная
флюоресценция.
Ядерный магнитный
резонанс
6. Отношение
корреляционного времени частицы к таковому
для сферической частицы
равного объема т0
(для сферы т/т =1) (Глава Г6)
kT 1
: Зть Т' К„
Ч) "'К) 'пир
i = 1-5 для общего тела;
i = a, b для эллипсоида вращения
Временной спад
деполяризованной
флуоресценции.
Электрическое
двойное лучепреломление
7. Коэффициент регрессии,
k^ зависимости константы
седиментации от концентрации
(Глава Г4)
sc=s0(\-ksC) =
\ + k,C
где sc и ,s0 — коэффициенты
седиментации при конечной и
экстраполированной к нулевой
концентрации, соответственно
Концентрационная
зависимость
коэффициента
седиментации
*) Исключенный объем представляет собой сумму гидродинамического объема, под которым
всегда понимается объем, занимаемый одной частицей в растворе, и дополнительного объема,
который является следствием взаимодействия между молекулами. Чем более асимметрична
частица, тем больше ее взаимодействие с другими молекулами и тем больше ее исключенный
объем, иногда называемый ко-объемом. Молярный ко-объем для системы макромолекул может
быть получен из термодинамического второго вириального коэффициента Л,, после устранения
электростатических взаимодействий

эффициентов трения и вязкости и
представил данные этих исследований в виде
очень наглядных контурных карт. Этот
результат четко показал, что всегда
существует проблема выбора между
моделью вытянутого и сплюснутого
эллипсоида, каждый из которых будет иметь свое
отношение осей даже в том случае, когда
выбрана приемлемая степень гидратации.
В дальнейшем неоднократно
предпринимались попытки комбинации различных
гидродинамических параметров с целью
найти такую, которая позволяла бы
отличить вытянутый эллипсоид от
сплюснутого не только при больших степенях
вытянутости, но и при малых. Ниже мы
очень кратко опишем такие комбинации.
Коэффициент поступательного трения
и характеристическая вязкость
(р -функция)
В 1953 г. Шерага и Манделькерн
предложили исключить объем из уравнений
3.0 |
э
/Ьытянутый
2.5 - /
Сплюснутый
2.0i 1 1 1-J
0 10 20 30
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. Г2.27. Комбинация коэффициента
поступательного трения и характеристической
вязкости (р-функция). Для сферы величина
Р = 2,12 (Sheraga and Mandelkcrn, 1953)
для коэффициента поступательного
трения/(уравнение Г2.2) и
характеристической вязкости (уравнение Г2.53).
Эта попытка оказалась не совсем
удачной, поскольку результирующая
Р-функция оказалась практически
нечувствительной к отношению осей,
особенно для сплюснутого
эллипсоида (рис. Г2.27). Однако это свойство
функции позволило авторам
рекомендовать ее использовать (зафиксировав
ее значение) для определения
молекулярной массы макромолекул со слабой
степенью вытянутости. Долгое время
такая комбинация использовалась для
определения молекулярной массы
глобулярных белков.
Коэффициент вращательного трения
и характеристическая вязкость
(Ъ-функция)
Комбинирование коэффициента
вращательного трения (уравнение Г2.24а) и
характеристической вязкости (уравнение
Г2.45), предложенная этими же авторами,
дало в результате функцию, которая
оказалась несколько более чувствительной
к отношению осей особенно при малых
значениях последних (рис. Г2.28).
Однако практического использования эта
функция так и не получила, поскольку
к тому времени измерение
коэффициентов вращательной диффузии для белков
было нелегкой задачей.
Коэффициент регрессии
седиментации и характеристическая
вязкость (R-функция)
В 1954 г. Уолес и Ван Холде
предложили совместно использовать
коэффициент регрессии седиментации ks
(параграф Г4.5.4) и характеристическую
вязкость. Они нашли, что эксперимен-

О 5 10 15 20
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. I 2.28. Комбинация коэффициента
вращательного трения и характеристической
вязкости ( 8 -функция). Для сферы 8 = 2,50
(Sheragaand Mandelkern, 1953)
.
1
Сплюснутый/
1 ' 1
-
IR
ll.5
—ll.O
-1.б\
Вытянутый
. . . . i
1/50 50
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. I"2.29. Комбинация коэффициента
регрессии седиментации и характеристической
вязкости (R-function) (Rowe, 1977)
тальное значение отношения &ч/|г||.
очень близко к величине 1,6. Анализ
значений этого отношения у самых
разных по форме макромолекул
показал, что у глобулярных белков они
находятся в интервале 1,5-1,7, в то время
как у более вытянутых частиц они
значительно меньше.
На основании анализа
концентрационной зависимости транспортных
процессов Рове предложил R-функ-
цию, которая является отношением
коэффициента регрессии
седиментации к характеристической вязкости.
Эта функция представлена на рисунке
Г2.29. Видно, что она изменяется
достаточно сильно при низких значениях р и,
в принципе, обеспечивает точный
метод вычисления отношения осей частиц
с малой степенью вытянутости.
Важно, что при вычислении R-функции не
требуется знания значения абсолютной
концентрации, поскольку она
отсутствует в отношении &,/[г|]-
Среднее гармоническое время
вращательной релаксации
и коэффициент поступательного
трения (^-функция)
Комбинирование гармонического
среднего времени вращательной релаксации
т /т0 и коэффициента поступательного
трения/дает в результате Ч'-функцпю,
зависимость которой от аксиального
отношения сплюснутого и вытянутого
эллипсоидов представлена на рисунке
12.30. Видно что Ч^-функция
практически нечувствительна к отношению осей
частиц с малой асимметрией (р < 5).
Она подобна 8-функции и может быть
использована для того, чтобы отличить
вытянутый эллипсоид от сплюснутого
для очень асимметричных частиц.

Характеристическая вязкость
и среднее гармоническое время
вращательной релаксации
(А-функция)
Комбинирование характеристической
вязкости и среднего гармонического
времени вращательной релаксации, дает
Л-функцию, которая представлена на
рису 11 ке Г2.31. Эта функция несколько более
чувствительна к отношению осей, чем *¥-
функция. Основная проблема в ее
применении на практике, особенно для частиц с
небольшой асимметрией (р < 3), связана с
трудностью определения величины т ) с
высокой точностью (см. Главу Г6).
Коэффициент поступательного трения
и молекулярный ко-объем
(\j/ -функция)
Теоретическая зависимость Ч'-функции,
основанной на комбинации
коэффициента поступательного трения и
молекулярного ко-объема, от отношения осей у
вытянутого и сплюснутого эллипсоидов
представлена на рисунке Г2.32. Из
рисунка видно, что функции *Р может быть
использована для обнаружения
различий между моделями двух видов
эллипсоидов при большем отношении осей
аппроксимирующего эллипсоида.
Характеристическая вязкость
и молекулярный ко-объем (Г\-функция)
Комбинирование ко-объема и
характеристической вязкости дает в результате
функцию, представленную на
рисунке» Г2.33. Сравнение П- и ^-функции
показывает, что первая должна быть
более чувствительна для определения
отношения осей вытянутого эллипсоида.
В таб. in не I "2.7) суммированы
экспериментально измеряемые объем-незави-
10 20 30
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. Г2.30. Комбинация коэффициента
поступательного трения и среднего
гармонического времени вращательной релаксации
( *Р -функция) (Squire, 1970)
симые функции формы для двухосного
эллипсоида вращения. Из нее видно, что
явления, основанные на вращательном
трении, более чувствительны к форме
частицы, чем таковые, основанные на
поступательном трении (комментарий Г2.21).
23456789
Отношение осей (р или 1/р)
10
Рис. Г2.31. Комбинация характеристической
вязкости и среднего гармонического времени
вращательной релаксации (Harding, 1980)

5.6
5.4 -
5.2
5.0
4.8
4.6 -
4.4 -
4.2 -
4.0
3.8
1
/
1 1 1 1
1
1 1
^^Сплюснутый
\ Вытянутый
1 1
20
5 10 15
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. I"2..'52. Комбинация коэффициента
поступательного трения и молекулярного ко-
объема, *Р-функция (Jeffrey et al., 1977)
1.8
10
1 2 3 4 5 6 7 8
Отношение осей (р или 1/р)
Рис. 12..'j.'5. Комбинация
характеристической вязкости и молекулярного ко-объема,
П-функция (Harding, 1981)
koMMiMii.ipi:!': Г Г ? !. Объем-
зависимые и объем-независимые
- функции
Необходимо отметить, что вес
объем-независимые функции формы,
представленные в ■ ! " ', менее чувствительны
к форме, чем объем-зависимые функции,
представленные в .. -и . i " >.
Однако платой за эту чувствительность
являются трудности, возникающие как
при выполнении точных измерений
коэффициентов вращательного трения, так
и при извлечении необходимых
параметров из экспериментальных данных.
Для измерения коэффициентов
вращательной диффузии глобулярных белков
(или эквивалентных им коэффициентов
ремени релаксации вращения)
электрическое двойное лучепреломление и спад
флуоресцентной анизотропии
деполяризации остаются основными методами.
К сожалению, оба метода на практике
имеют некоторые важные ограничения
(см. Главы 17 и Г9). Более того, эти
методы сопряжены с проблемой
разложения много-экспоненциальных кривых
на составляющие их экспоненты (см.
параграф Г10.3.3). Заключая анализ всех
представленных в i;u'>.мше I 2.Г> функций
отметим, что четыре функции, 6 (?», 0), R
(v, ks), A (v, тл/т0) и П (v, VlipiM) достаточно
чувствительны к отношению осей и
могут быть использованы на практике.
Г2.5.3. Функции формы для
трехосного эллипсоида,
не зависящие от его объема
В 1936 г. Перрен получил точное
выражение коэффициента поступательного
трения для трехосных эллипсоидов, а
в 1981 г. Хардинг, Дампье и Рове
получили аналогичное выражение для
вязкости. Эти два результата открыли путь

Тгюлица Г2.5. Не зависящие от объема экспериментальные функции формы
частицы
Не зависящие от объема
функции формы
р-фуикция (v,///„)
(Sheraga - Mandelkern, 1953)
5-function (v, 0/0 )
(Sheraga - Mandelkern, 1953)
ft-функция (v, k )
(Rowe, 1977)
¥- функция (///„, thi /т„)
(Squire, 1971)
Л-фуикцмя (v, т /т0)
(Harding, 1980)
^-функция (///, V )
Geffrey et al., 1977)
П-функция (v, V )
(Harding, 1981)
Комбинация методов
Вязкость п трансляционное
трение
Вязкость и вращательное
трение
Вязкость и коэффициент
регрессии в седиментации
Трансляционное трение
и среднее гармоническое
вращательное
релаксационное время
Вязкость и среднее
гармоническое вращательное
релаксационное время
Трансляционное трение
и ко-объем
Вязкость и ко-объем
Чувствительность к форме
Плохая во всем интервале
осей
Хорошая при малых
аксиальных отношениях
Хорошая при малых
аксиальных отношениях
Плохая во всем интервале
осей
Хорошая за исключением
очень маленьких
аксиальных отношений (р < 2)
Плохая
Хорошая за исключением
очень маленьких
аксиальных отношений (р < 3)
получения объем-независимых функций
формы в рамках трехосного эллипсоида.
Для этих функций характерно одно
общее свойство: при данных
гидродинамических свойствах они имеют линейное
решение для всех возможных значений
отношений осей (а/b, Ь/с)
(комментарии VI.'1'1). На рисунке Г2.31
представлены линейные решения для двух
функций v и ///„, гипотетических трехосных
эллипсоидов с отношениями осей (а/Ь,
Ь/с) = (2.0, 2.0). Из рисунка видно, что
Комментарий Г2.22. Нахождение
единственного решения
Заданные значения осей (а/b. Ь/с) фик-
! сируют значение отношения ///„ (/;), но
; заданным значениям///,, (/;) соответствует
! ряд «линейных решений», со своими
значениями осей (а/b, Ь/с). Уникальное
решение для этих двух отношений осей может
■ быть найдено в точках пересечений двух
или более этих «линейных решений».
кривые пересекаются под очень малым
углом, что затрудняет нахождение
точного решения. Очевидно, что мы долж-
Истинные отношения осей:
(а/b, Ь/с) = (2.0, 2.0)
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Отношения осей а/Ь
Рис. 12..51. Графики заданных значений
функций Симха \'(j>) и Перрена F (р) (а/Ь,
Ь/с) — в плоскости, соответствующей
гипотетическому эллипсоиду с осями (а/b, Ь/с) =
= (2.0, 2.0) (Harding, 1995)

(a/b,b/c)=(4.0,1.0)
Димеры нейрофизина
а б
Рис. Г2.35. Графики функций R и Л (а/b, Ь/с) — в плоскости для мономеров нейрофизина
(а) и его димеров {б). Мономеру соответствует вытянутая модель, в которой отношения осей
приблизительно равны (а/b, Ь/с) = (4.0, 1.0), в то время как у димера, являющегося более
компактной частицей, отношение (а/b, Ь/с) приблизительно равно (2.8, 2.5). Это указывает на то,
что образование димера происходит скорее всего по принципу «спина к спине», а не по типу
«хвост к хвосту» (Harding, 1995)
ны найти такие две объем-независимые
функции формы, пересечение которых
является как можно более
ортогональным. Наилучший результат был найден
для комбинации двух функций (R и Л),
включающих вязкость, коэффициент
регрессии седиментации и среднее
гармоническое время релаксации вращения.
На рисунке Г2.35 показана зависимость
функций R и Л (а/b, Ь/с) для
мономеров нейрофизина (а) и его димеров (б).
Такая комбинация линейных решений
была использована для нахождения
наиболее вероятного типа димеризации
этого белка.
В заключение отметим следующее.
Проблема, поставленная еще Онсли —
сделать выбор между удлиненным и
сплюснутым эллипсоидом при
низком значении отношения осей,
характерном для большинства глобулярных
белков, — на сегодняшний день все

еще далека от своего решения в силу
специфики гидродинамических
уравнений и существующей на сегодня
точности измерений.
Г2.5.4. Приближение «целого тела»
и моделирование тела «бусинками»
Из изложенного выше следует, что в
сегодняшней гидродинамике имеются
два основных подхода для определения
структуры биологических
макромолекул. Один из них, моделирование
структуры с помощью бусинок с последующим
вычислением ее гидродинамических
параметров — характеристической
вязкости, поступательной и вращательной
диффузии. Затем эти экспериментально
определенные параметры сравниваются
с таковыми, теоретически
рассчитанными для модели. Впоследствии модель
совершенствуется, с тем чтобы ее реальные
параметры совпали с рассчитанными.
Недостатком такого подхода является
то, что обнаруженным параметрам
может соответствовать не одна, а
несколько моделей. На практике предлагаемая
модель используется в качестве
стартовой модели с целью определения в
дальнейшем ее структуры с более высоким
пространственным разрешением.
Второй подход базируется на
вычислении структуры в соответствии
с известными гидродинамическими
свойствами. В этом подходе,
получившем название метода «целого тела»,
жесткая частица представляется в
виде трехосного эллипсоида с
тремя различающимися но длине
полуосями. Уникальная структура может
быть предсказана из комбинации трех
соответствующих
экспериментальных измерений, чтобы исключить
проблему, связанную с определением
гидродинамического объема
(молекулярная гидратация) и подобрать пару
отношений осей, соответствующих
трехосному эллипсоиду. Основным
препятствием при таком подходе
является недостаточная
чувствительность объем-независимых функций
при малых значениях отношений осей
и недостаточная точность
экспериментальных измерений.
Несмотря на значительные успехи
в развитии гидродинамических
методов, особенно в области моделирования
структур биологических макромолекул,
их основным недостатком всегда будет
низкая разрешающая способность.
Поскольку гидродинамические методы не
требуют особых затрат и относятся к
«неразрушающим» методам, то они
могут быть использованы для получения
моделей низкого разрешения,
предваряющих применение методов высокого
разрешения, таких как рентгеновская
кристаллография и Я MP.
Г2.6. Гомологичные ряды
На рисунке Г2.36 приведены три
типичных гомологичных ряда биологических
макромолекул. Первый ряд —
сферические частицы, сохраняющие свою
форму с ростом молекулярной массы,
второй — палочкообразные частицы с
длинной осью, увеличивающейся
пропорционально молекулярной массе, в то
время как длина поперечной оси
сохраняется постоянной, и третий пример —
гауссовы клубки, асимметрия которых
постепенно повышается с увеличением
молекулярной массы.
Зависимость коэффициента
поступательного трения от молекулярной
массы М в гомологичных рядах обычно
выражается уравнением Куна-Марка-
Хаувинка (сокращенно КМХ):

о О О
I I " г^
'* о? <Ъ£
Pni'. 1 2.3(i. Гомологичные ряды макромолекул различной формы: а сферы; 6 — палочкообразные
молекулы, присоединяющиеся друг к другу по типу «голова-хвост»; в — модели гауссовых клубков
f=kfi4x.
(Г2.59)
где k и X — константы. Как будет
показано ниже, величина степенного
множителя Xзависит от формы макромолекул
в гомологичных рядах.
В соответствии с законом Стокса для
ряда сферических частиц их константа
Комментарий Г2.23. Острогой
интерпретации показателя степени
1/з в гомологичных рядах
При работе с гомологичными рядами
сферических частиц удобно представить
коэффициент трения в форме /0 = 6пт|0
(ЗУА/4п)''3. Отсюда следует, что
коэффициент трения для сферических частиц со
сходными величинами гидратации и
парциального удельного объема пропорционален
М1/3. Однако обратное неверно. Величина
показателя степени 1/3 для гомологичных
серий частиц не означает, что изучаемые
макромолекулы действительно имеют
сферическую форму. Так, например, в гомологичном
ряду эллипсоидов с фиксированным
значением отношения осей показатель X также
равен 1/3. Строго говоря, показатель степени
1/3 означает только одно: частицы в
гомологичном ряду сохраняют свою форму.
поступательного трения
пропорциональна молекулярной массе в степени 1/3
(коммен lapnii Г2.2Л). Для гомологичного
ряда палочкообразных частиц величина
степенного множителя X в уравнении
Г2.59 равна приблизительно 0,85.
Для гомологичных рядов гауссовых
клубков в «идеальном» растворителе
показатель X равен 0,5, а в «хорошем»
растворителе он увеличивается до 0,8.
Поскольку коэффициент поступательного
трения может быть определен с помощью
экспериментально измеренных констант
седиментации и диффузии, то уравнение
(Г2.59) можно использовать для
предсказания их зависимости от молекулярной
массы для различных гомологичных
рядов. Примеры использования уравнения
Г2.59 для определения формы различных
биологических макромолекул будут
приведены в Главах ГЗ и Г4.
По аналогии с поступательным
трением зависимость коэффициента
вращательного трения от молекулярной
массы М в гомологичных рядах может
быть представлена в виде степенной
зависимости типа:
® = квМ)
(Г2.60)

где k и Y — константы, как и в случае
поступательного трения, зависящие от
формы макромолекулы. В
соответствии с формулой Перрена
(уравнение Г2.2) для ряда сферических частиц
их константа вращательного трения
пропорциональна молекулярной массе
в степени, равной 1. Для
гомологичного ряда непроницаемых гауссовых
клубков в «идеальном» растворителе
Y = 1,5. Для гомологичных рядов
бесконечно тонких (L » d)
палочкообразных частиц Y = 3,0. Таким образом,
как и в случае поступательного трения,
чем быстрее растет асимметрия с
ростом молекулярной массы, тем больше
величина показателя степени в
уравнении Г2.60.
Коэффициент вращательного
трения частицы может быть определен из
экспериментально полученных
коэффициентов вращательной диффузии
или вращательных времен релаксации.
Поэтому уравнение Г2.60 можно
использовать для предсказания зависимости
этих коэффициентов от молекулярной
массы для различных гомологичных
рядов. Примеры определения формы
различных биологических
макромолекул с помощью уравнения Г2.60
приведены в Главах Г6 и Г8.
Г2.6.1. Характеристическая
вязкость
Зависимость характеристической
вязкости от молекулярной массы в
гомологичном ряду также может быть
представлена уравнением типа:
[т,]-*|п|М°, (Г2.61)
где k и а — константы. Из уравнения
Г2.56 следует, что жесткие эллипсоиды
или палочкообразные частицы,
например такие, которые имеют постоянное
значение V/M в гомологичном ряду,
будут иметь зависимость [л] от М,
подобную зависимости v (р) от М (уравнение
Г2.52). Например, если масса и,
следовательно, размеры частиц увеличиваются
так, что их форма остается постоянной,
то v (р) = константа, [л] = константа
и, следовательно, показатель степени
а в уравнении (Г2.61) равен нулю,
независимо от формы частиц. С другой
стороны, для палочкообразных частиц
(цилиндров), длинная ось L которых
увеличивается пропорционально М, в
то время как диаметр d остается
постоянным, величина асимметрии р
увеличивается пропорционально М и,
соответственно, зависимость [л] = / (М)
совпадает с зависимостью v = / (р).
Для таких молекул, при больших р,
зависимость, приведенная в уравнении
Г2.56, совпадает с зависимостью
уравнения Г2.51.
Для гомологичных рядов
вытянутых эллипсоидов, которые имеют
одинаковую короткую ось, уравнение Г2.55
может быть аппроксимировано
уравнением:
v = 0,233p169820<p<100
или (Г2.62)
v = 0,207 р173220<р<300.
Таким образом, v должно
увеличиваться с ростом молекулярной массы
или длины частицы в степени 1,7.
Если, однако, при увеличении
массы частиц увеличивается их диаметр
b при постоянной длине L, тогда а
будет < 0. Таким образом, как и в первых
двух случаях, чем быстрее растет
асимметрия с ростом молекулярной массы,
тем больше величина показателя
степени в уравнении Г2.61. Примеры
определения формы различных биологических
макромолекул с помощью уравнения
Г2.61 будут даны в Главе Г9.

Приложение 1. О корректности
уравнения Кирквуда-
Райзмана
В основу уравнения Г2.9 положено
представление о сферах как источниках трения
при гидродинамическом взаимодействии.
Это действительно для случаев, когда
размеры этих сфер значительно меньше, чем
расстояния между ними. Для
большинства изучаемых биологических структур
это условие не выполняется. Оно не
выполняется также и для четырех бусинок,
в классическом примере в уравнении
Г2.9, где размер каждой из них
приблизительно равен расстоянию между ними.
Возможно несколько простых вариантов
упаковок: линейная, тетраэдральная и
квадратно-плоская. Ниже представлены
вычисления для первых двух.
Линейный тетрамер
^R.T 2R,j
. 4R« .
4
2R,
R.
6R.
В этом случае набор расстояний между
сферами есть 2RQ, ARQ, 6RQ. Расчет по
формуле Г2.9 дает
4 х 6щ0Кд
/ =
1+.б7СТ1ЛЛ^ + ^г + ^)"
4х6ю1,Л 2^0 ARo 6Ro
Поскольку/о = 6nr\0R0, то
/ 4
/о 1+^(1 +±+-L) 1+
4 v/?0 Ro Щ'
26
24
1,92
Результаты компьютерных
вычислений поступательного трения для
линейных тетрамеров при использовании
оболочечной модели (см. ниже) с
экстраполяцией к бесконечно малому
диаметру бусинки (при этом число
бусинок на поверхности частицы стремится
к бесконечно большому числу)
показывают, что вычисления по формуле Кир-
квуда дают ошибку около 6 %.
Тетраэдрический тетрамер (тетраэдр)
В этом случае все расстояния равны 2R0.
Расчет по формуле Г2.9 дает:
4х6лт)0/?0
/■
1 +
бтгпД,
&
/о = 6k%Ro'
L
/о
1 +V^ )
4 K2R0)
= 1,6
1 + -
Результаты компьютерных
вычислений поступательного трения для
тетраэдра при использовании
оболочечной модели с экстраполяцией к
бесконечно малому диаметру бусинки
(при этом число бусинок стремится
к бесконечно большому числу)
показывают, что вычисления по формуле
Кирквуда дают еще большую ошибку,

около 12%. Эти результаты
показывают, что вычисления по формуле Кирк-
вуда являются наименее точными при
малых расстояниях между сферами и
тесном контакте частиц (наиболее
плотная упаковка — это тетраэдрическая
упаковка). При увеличении расстояния
между сферами можно ожидать
улучшения точности при применении
формулы Кирквуда.
В заключение заметим, что
уверенное суждение о типе упаковки частицы
может быть сделано в двух случаях: в
случае наиболее компактной тетра-
Г2.7. Перечень ключевых идей
• Коэффициент поступательного трения сферы пропорционален ее радиусу
и вязкости растворителя, в котором она движется.
• Коэффициент поступательного трения двухосного эллипсоида вращения
зависит от его объема и отношения осей.
• Поступательное трение частиц с «ломаной» поверхностью (различные типы
круговых цилиндров, кубы...) может быть вычислено только приблизительно.
• Для моделирования гидродинамического трения жестких частиц произвольной
формы применяются три различных, но родственных подхода: в методе
«бусинок» целая частица аппроксимируется с помощью «бусинок» (сфер) одного
или разных размеров; в модельном подходе «оболочек» поверхность частицы
аппроксимируется набором малых равновеликих сфер; в модельном подходе
«граничных элементов» поверхность частицы моделируется набором
элементов из малых треугольных панелей (чешуек).
• Связь между гидродинамикой и электростатикой обеспечивает простой и
точный способ вычисления коэффициента поступательного трения жестких
частиц произвольной формы.
• Коэффициент поступательного трения слабо чувствителен к сегментальной
подвижности; для ломаной палочки (две жесткие палочки, связанные
шарниром) он изменяется всего на 3 % от такового для жесткой палочки того же
размера и слабо зависит от положения шарнира.
эдрической упаковки, когда
коэффициент трения наименьший, и в случае
наиболее вытянутой линейной
упаковки, когда коэффициент трения
наибольший. Во всех остальных случаях,
включая плоско-квадратичную, сделать
однозначный вывод о типе упаковки не
представляется возможным.
Обратите внимание на то, что в этих
вычислениях полученные числа
являются отношением трения частиц к
трению сфер равного объема.
Следовательно, ///0 следует разделить на константу
4"3= 1,5873.

• Прямое вычисление коэффициента поступательного трения жестких
микроскопических объектов можно определить из движения их
макроскопических моделей в растворителе с высокой вязкостью при низких числах Рей-
нолдса.
• Вращение сферы в приближении Стокса может быть охарактеризовано одной
константой, которая имеет размерность времени.
• Коэффициент вращательного трения двухосного эллипсоида вращения
зависит от его объема и отношения осей.
• Поступательное трение коротких частиц «ломаной» формы (цилиндры, кубы
и т. п.) может быть вычислено только приблизительно.
• Вращательное трение гораздо более чувствительно к размерам частицы, чем
поступательное трение.
• Для длинных вытянутых частиц из константы вращательной диффузии можно
вычислить длинную ось молекулы.
• Вязкость растворов биологических макромолекул, г|, всегда больше вязкости
чистого растворителя, г|0. Доля увеличения вязкости называется удельной вязкостью
и обозначается как г\ - г|/г|0 -1 = г|()тм -1, где г|ш11 есть относительная вязкость.
• Характеристическая вязкость [г|] определяется как увеличение вязкости
раствора, обусловленное добавлением 1 грамма макромолекул; она может быть
получена экспериментально при экстраполяции \ /С к нулевой
концентрации и имеет размерность — кубический сантиметр на грамм или децилитр на
грамм.
• Удельная вязкость раствора сфер пропорциональна объемной доле частиц и не
зависит от абсолютного их размера.
• Характеристическая вязкость двухосного эллипсоида вращения зависит от его
объема, отношения осей и описывается уравнением Симха.
• Характеристическая вязкость белков может быть вычислена с хорошей
точностью, исходя из их атомных координат при корректном учете гидратации.
• Связь между гидродинамикой и электростатикой обеспечивает простой метод
вычисления характеристической вязкости частиц правильной и неправильной
формы.
• Характеристическая вязкость белков и коротких фрагментов ДНК может быть
наиболее просто вычислена с использованием моделей «бусинок» или «чешуек».

• Гидродинамические параметры макромолекул (характеристическая вязкость,
коэффициенты поступательной и вращательной диффузии) зависят от их
формы и гидродинамического объема (включая гидратацию); отсюда следует, что
определить форму или объем измерением одного гидродинамического
параметра невозможно.
• Комбинированием разных гидродинамических параметров можно получить
семь (р, 8, R , У , Л, \j/ и П) объем-независимых функций формы, каждая из
которых имеет различную чувствительность к отношению осей
аппроксимирующих их эллипсоидов.
• Все объем-независимые функции формы менее чувствительны к форме, чем их
объем-зависимые предшественники.
• Для трехосного эллипсоида наилучшая комбинация двух объем-независимых
функций формы (R и Л) приводит к наилучшим результатам при вычислении
всех его осей.
• Для гомологичного ряда сферических частиц коэффициент поступательного
трения пропорционален их молекулярной массе в степени 1/3, а для
палочкообразных частиц — в степени 0,85.
• Для гомологичного ряда сферических частиц коэффициент вращательного
трения пропорционален их молекулярной массе в степени, равной 1, а для
тонких палочкообразных частиц — в степени равной 3. Аналогичная степень для
гауссовых клубков равна 1,5.
• Для гомологичного ряда сферических частиц характеристическая вязкость не
зависит от их молекулярной массы, тогда как для гомологичного разряда
палочкообразных частиц она зависит от молекулярной массы в степени, равной
1,7-1,8.
• Несмотря на значительные успехи в развитии теории гидродинамических
методов, они остаются методами низкого пространственного разрешения.
Литература для дальнейшего чтения
Частицы правильной формы
Harding S. Е. On the hydrodynamic analysis of macromolecular conformation.
Biophys. Chcm., 1995. 55, 69-93
Garcia de la Tone J., Carrasco B. and Harding S. E. SOLPRO: theory and computer
program for the prediction of SOLution PROperties of rigid macromolecules and
bioparticles. Eur Biophys J., 1997. 25, 361-372.

Garcia de la Torre J. and Bloomfield V. A. Hydrodynamic properties of complex, rigid,
biological macromolecules: theory and applications, Quart. Rev. Biophys., 1981. 14,
81-13Г2.
Garcia de la Tone J. Hydrodynamic properties of macromolecular assemblies. In
Dynamic Properties of Biomolecular Assemblies/eds. S. E. Harding and A. J. Rowe,
1988. p. 3-31. Nottingham: The Royal Society.
Частицы произвольной формы
Swanson E., TellerD. С. and de Haen С The low Reynolds number translation friction
of ellipsoids, cylinders, dumbbells, and hollow spherical caps. Numerical testing of the
validity of the modified Oseen tensor in computing the friction of objects modelled as
beads on a shell. J. Chem. Phys., 1978. 68, 5097-5102.
Carrasco B. and Garcia de la Tome J. Hydrodynamic properties of rigid particles:
comparison of different modelling and computational procedures. Biophys. J. 1999. 75,
3044-3057.
Allison S. A. Boundary element modelling of biomolecular transport. Bioph. Chem.,
2001.93,197-213.
Трансляционное трение и электростатическая емкость
Hubbard]. В. and DouglasJ. F. Hydrodynamic friction of arbitrarily shaped Brownian
particles. Phys. Rev., 1993. 47, 2983-2986.
Zhou H.-X. Calculation of translational friction and intrinsic viscosity. I. General
formulation for arbitrarily shaped particles. Biophys. J., 1995. 69, 2286-2297.
Частицы с известной трехмерной структурой
Venable R. M. and Pastor R. W. Frictional models for stochastic simulations of
proteins. Biopolymers, 988. 27, 1001-1014.
Garcia de la Torre J., Huertas M. L. and Carrasco B. Calculation of hydrodynamic
properties of globular proteins from their atomic level structure. Biophys. J., 2000. 78,
719-730. Rigid particles with segmental mobility.
Garcia de la Torre J. Hydrodynamics of segmentally flexible macromolecules. Eur.
Biophys. J., 1994. 23, 307-322.
Определение формы молекул из трансляционного трения: гомологичные
ряды
Tsvetkov V. N. Rigid-chain polymers. Hydrodynamic and Optical Properties in
Solution. New York: Consultants Bureau. 1989.
Hearst J. E. Rotary diffusion constants of stiff-chain macromolecules. J. Chem. Phys.,
1963.38,1062-1065.
Garcia de la Torre, J. and Bloomfield, V. A. Hydrodynamic properties of complex,
rigid, biological macromolecules: theory and applications. Quart. Rev. Biophys., 1981.
14,81-139.
Hagerman P. J. and Zimm B. Monte Carlo approach to the analysis of wormlike
chains. Biopolymers, 1981.20, 1481-1502.
Harding, S. E. On the hydrodynamic analysis of macromolecular conformation.
Biophys. Chem., 1995. 55, 69-93.
Garcia de la Torre J. Hydrodynamics of segmentally flexible macromolecules. Eur.
Biophys. J., 1994. 23, 307-322.
Allison S. Low Reynolds number transport properties of axisymmetric particles
employing stick and slip boundary conditions. Macromolecules, 1999. 32, 5304-5312.

Глава ГЗ
МАКРОМОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИФФУЗИЯ
ГЗ. 1. Исторический обзор
1850
Т. Грэхэм (Т. Graham) обнаружил,
что яичный альбумин диффундирует в
водных растворах гораздо медленнее,
чем такие распространенные вещества,
как соль или сахар. В 1861 г. он применил
диализ для разделения смеси медленно
и быстро диффундирующих
растворенных веществ и количественно измерил
диффузию у многих соединений. На
основе полученных данных он
классифицировал вещества как коллоиды или
кристаллоиды.
1 «;1Л
А. Фик (A. Fick), в уравнениях,
известных как его первый и второй законы,
ввел понятие коэффициента диффузии
D для описания потока растворенных
веществ вдоль их градиента концентрации.
Дж. Стефан (J. Stefan) в 1879 г. и Л. Бо-
льцман (L. Boltzmann) в 1894 г.
представили второй закон в интегральной форме,
тем самым открыв путь для
экспериментального определения коэффициентов
диффузии различными методами.
1 «)0Г) -ИМИ)
А. Эйнштейн, В. Сазерленд и
М. ван Смолуховский (A. Einstein,
W. Sutherland and M. von Smoluchow-
ski) обнаружили, что решения
уравнения Фика для стационарных условий
аналогичны решениям для потоков
тепла вдоль температурного
градиента и установили взаимосвязь между
коэффициентами диффузии частиц и
их трением в броуновском движении.
В 1905 г. Сазерленд использовал
значение коэффициента диффузии,
вычисленное Дж. Стефаном (J. Stefan)
по данным, собранным Т. Грэхэмом, и
получил значение молекулярной массы
для яичного альбумина, равное 33 кДа
(истинное значение — около 45 кДа).
1926
Л. Мандельштам (L. Mandelshtam)
пришел к пониманию, что коэффициент
поступательной диффузии
макромолекул может быть определен из спектров
рассеяния света. Однако отсутствие
пространственной когерентности и не
монохроматическая природа обычных
источников света предопределили
невозможность проведения таких
экспериментов вплоть до 1964 г., пока Г. Кам-
мингс, Н. Кнабль и Й. Йе (Н. Cummins,
N. Knable and Y. Yeh) не использовали
лазер в методе оптического смешения,
с тем чтобы определить спектральный
состав света, рассеянного раствором

латексных сфер. В 1967 г. С. Дубин,
Дж. Луначек и Г. Бенедек (S. Dubin,
J. Lunacek and G. Benedek) измерили
коэффициенты поступательной
диффузии бычьего сывороточного альбумина,
лизоцима, вируса табачной мозаики
и ДНК.
1927
Т. Сведберг (Т. Svedberg) показал,
что молекулярная масса белка может
быть вычислен, исходя из его
константы седиментации,парциального
удельного объема и коэффициента
диффузии. Это стимулировало развитие
новых усовершенствованных методов
и экспериментального оборудования
для исследования процесса диффузии
как такового.
1938 I960
За эти годы были разработаны
различные экспериментальные методы для
измерения коэффициентов диффузии
малых и больших биологических
макромолекул (метод шкалы Ламма, метод
шлирена Филпота и Свенссона, интер-
ферометрические методы Жамена, Гуи,
Рэлея и Лебедева).
1972-197/.
Д. Магде, Л. Элсон и В. В. Вебб
(D. Magde, L. Elson and W. W. Webb)
математически обосновали процессы
в методе флуоресцентной
корреляционной спектроскопии, подчеркнув
его широкие возможности для
измерения коэффициентов диффузии.
В 1990 г. Р. Риглер (R. Rigler) с
соавторами впервые осуществили
детектирование одиночных молекул,
объединив метод флуоресцентной
корреляционной спектроскопии с
методом конфокальной флуоресцентной
микроскопии.
Середина 1970-х
Для измерения коэффициентов
диффузии флуоресцентно- меченых
молекул был развит метод восстановления
флуоресценции красителя после
фотовыцветания, который впоследствии
оказался идеальным инструментом
для определения двумерной
латеральной подвижности молекул в мембранах
и в индивидуальных живых клетках.
2000 и но настоящее время
Наряду с экспериментальными
методами, перечисленными выше,
современная гидродинамика позволяет
предсказать с высокой точностью
коэффициенты диффузии биологических
макромолекул с известной структурой.
Г3.2. Коэффициент
поступательной диффузии
Коэффициент поступательной
диффузии, Dmm., может быть определен
различными способами. Исторически
сложилось так, что первое
определение коэффициентов диффузии было
проведено методом расширяющейся
границы. В этом методе наблюдают
за изменением концентрации
молекул в макроскопическом объеме под
действием градиента осмотического
давления (рис. 13.1). Такой
коэффициент диффузии получил название
D . Позже появились другие спосо-
бы определения коэффициентов
поступательной диффузии. Один из них
получил название коэффициент
следовой диффузии, D . Он вычисляет-
ся из наблюдения за одной частицей в
микроскопическом объеме (рис. 1.3.2).
Экспериментально D определяется
методами флуоресцентной
корреляционной спектроскопии (Глава Г11),

Рис. I '5.2. Диффузия как хаотическое
движение одной частицы
Рис. ГЛ.1. Диффузия как макроскопическое
изменение концентрации вещества
нановидной микроскопии
(параграф ГЗ.5.2) и флуктуации числа
частиц (параграф Г.10.5.1). Другой
коэффициент диффузии получил название
коэффициента взаимной диффузии
D поскольку описывает взаимное
движение частиц в микроскопическом
объеме (рис. ГЗ.З). Экспериментально
D определяется методом динами-
ческого рассеяния света в условиях
Гауссовой статистики (большое число
частиц) (параграф ПО.3.3).
В том случае, когда частицы не
взаимодействуют, все три типа измере-
/ / •
^ I -/
/
\
/1
Рис I 'Л.'Л. Диффузия как совместное
движение частиц в ансамбле
ний дают один и тот же коэффициент
поступательной диффузии, который
исторически получил название DnocT,
с тем чтобы отличать его от
коэффициента вращательной диффузии, D
В i;i'i. lime I".
гидродинамические
личные
враш
представлены раз-
методы,
Таблица 13.1. Методы, используемые для определения коэффициентов
диффузии биологических макромолекул
Способ наблюдения
Наблюдение среднего
микроскопического движения частиц
в ансамбле.
Прямое наблюдение
диффузионного движения одиночной
флуоресцентной частицы.
Стохастическое появление и
исчезновение частиц в малом
объеме.
Стохастическое появление и
исчезновение частиц в очень малом
объеме
Взаимное движение частиц в
ансамбле
Макроскопическое изменение
концентрации частиц
Метод
Восстановление флюоресценции
красителя после выцветания
(Секция Г3.5).
Конфокальная
флуоресцентная микроскопия
(Секция Д4.6.1).
Флуктуация числа частиц в методе
динамического рассеяния света
(Секция Г10.5).
Флуоресцентная корреляционная
спектроскопия
(Секция Г. 11.3)
Динамическое рассеяние света
(Секция Г. 10.3)
Метод расширяющейся границы
(Секция Г3.5)
Диффузионный
коэффициент
Следовый
D
след
Следовый
D
след
Следовый
D
след
Следовый
D
след
Взаимный
D
B.UI1M

Трансляционный
D
пост

используемые для определения
коэффициентов поступательной диффузии.
В ней приведены обсужденные выше
подходы, экспериментальные мето-
Комментарий ГЗ. 1.
, Среднеквадратичная скорость
'■ частиц при броуновском движении
При абсолютной температуре Т
средняя кинетическая энергия частицы,
приходящаяся на одну степень свободы,
равна kT/2, (где k — константа Больцмана).
; Частица с массой m и скоростью и имеет
кинетическую энергию ти2/2. В среднем
<ти2/2> = kT/2, где < > обозначает усред-
1 нение по времени или по ансамблю. Из
этого выражения мы можем вычислить сред- j
, неквадратичную скорость, равную: j
<u2> = kT/m (A) '
и корень квадратный из ее значения
<ux2>1/2 = (kT/m)i2. (Б)
Комментарий ГЗ.2. Диффузия j
j и скорость I
Из уравнения (А) комментария Г3.1
можно вычислить скорость, которую имеет
| в данный момент маленькая частица. При- j
ведем два примера.
Сахароза в вакууме
У сахарозы молекулярная масса
равна 342 Да. Это масса одного моля или
6,02хЮ23 молекул; масса одной
молекулы равна т = 5,7х10~23г. Значение kT
при комнатной температуре, 293 К, рав- j
но 4,04 х 10"м гсм^сек2. Следовательно, |
<u 2>i/2 = 8,3х103см-сек-1. При отсутствии I
столкновений молекулы сахарозы будут
пересекать большое помещение типа
плавательного бассейна приблизительно за
1 сек. В соответствии с уравнением (Б)
комментария Г3.1, скорость частицы
обратно пропорциональна корню
квадратному из ее молекулярной массы.
Биологические макромолекулы
Для бел ков с молекулярной массой 2,0* 104
Даскорость равна 1,09 хЮ3смсек'. Для ДНК
с молекулярной массой 9хЮ8 Да скорость i
равна 33 см-сек '.
ды и типы коэффициентов диффузии.
Приведены также главы и секции, где
можно найти детальное описание
методов и их применение. Как мы уже
отмечали, для невзаимодействующих
частиц три коэффициента, D , D
"•г t V ^ » ivk'.l |и;шм
и Diukt, эквивалентны друг другу.
ГЗ.З. Микроскопическая
теория диффузии
Диффузия макромолекул в растворе
может быть представлена как явление,
связанное с броуновским движением.
Тепловая энергия молекул в растворе
обеспечивает их постоянное
хаотическое движение (комментарий l.'i. 1).
Как было показано Эйнштейном
в случае одномерной диффузии
среднеквадратичное смещение <х2>
пропорционально времени V.
<x2> = 2Dlt (Г3.1)
и
<Y2>./2 = (2/Э,Г)' 2. (Г3.2)
Уравнения (Г3.1) и (Г3.2)
показывают, что из величины
среднеквадратичного смещения <х2> можно
определить коэффициент диффузии Z), и
наоборот. Будем считать, что движения
в трех направлениях — х, у и z являются
независимыми. Если <x*> = 2D^t, тогда
<у>> = 2D2t, <z>> = 2D./. Квадрат
расстояния от начала координат до точки (х,
у) в двумерном случае равен i* = х2+у2,
и,следовательно:
<r?> - ADt, (ГЗ.З)
где D есть среднее значение
коэффициентов диффузии Z), и D2 для двумерного
беспорядочного движения.
Для трехмерного случая г2 = х2 +
+ у2 + z2, и среднеквадратичное
смещение равно:

<r>> - 6Dt, (Г3.4)
где D есть среднее значение (Dv+ D2 +
+ D3) коэффициентов диффузии для
трехмерного беспорядочного движения.
Опять же, знание величины <гг>
достаточно для определения коэффициента
диффузии D и наоборот.
Примеры вычислений скорости
диффузии и зависимости диффузии
от времени даны в киммсп iapi:;i\ \".\.'.l
иг:а
Г3.4. Макроскопическая
теория диффузии
ГЗ.4.1. Первое уравнение Фика
Первое уравнения Фика гласит, что
суммарный поток Jx всегда
пропорционален первой степени градиента
концентрации растворенного вещества
Коммешарий ГЗ.З. Диффузия и время
Из уравнения (Г3.2) можно вычислить постоянную скорость диффузионного движения
малой частицы. Рассмотрим несколько примеров таких частиц, диффундирующих в водной
i среде. I
Мочевина >
Коэффициент диффузии мочевины в воде равен 118 см2сек"' (\:\C>.\. Г.Ч..Ч). Частица с таким '
коэффициентом диффузии диффундирует на расстояние .г = 10 А см за время t =xL/2D = 5хЮ~4
I сек, или около 0,5 мсек. На расстояние х = 1 см она диффундирует за время 5х105сек, или около
| 14 часов. Очевидно, что диффузионное перемещение частицы на большое расстояние занимает \
■ гораздо большое время. i
Глобулярный белок
Коэффициенты диффузии D порядка 10 6см2сек'' соответствуют небольшим глобулярным
i белкам (i;n'i. I. 1','i.H). Такие белки диффундируют на расстояние Л" = 1 х 10 ' см за время t= 5
I х Ю"'сек, или около 5 мсек. Для диффузии на расстояние.v = 1 см это время составит 5 х 105 .
! сек, или около 138 часов.
Вирус табачной мозаики
Вирус табачной мозаики имеет коэффициент диффузии, равной 0,44 х 10 7с.м2сек ' и диф-
I фундирует очень медленно. Так, расстояние.г = 0,5 см он будет проходить за время t =106 сек,
i или около 700 часов. Этот факт объясняет, почему метод расширяющейся границы, в котором
минимально необходимое для измерения диффузии расстояние равно приблизительно
нескольким миллиметрам, никогда не используется для измерения коэффициентов диффузии
i таких больших молекул.
Рис. 1.3.1. Поток молекул справа налево
обусловлен градиентом концентрации. Поток
возникает из-за того, что число частиц слева
меньше числа частиц справа
dC/dx, где D — константа
пропорциональности:
Jx~-D[dC/dx]. (Г3.5)
Если частицы распределены
равномерно, то наклон кривой градиента
концентрации равен нулю, т. е. dC/dx =
= 0 и система находится в равновесии.
Если наклон является постоянным,
т. е. dC/dx = константа,^.также постоя-

J/v, /;
s
Площадь А
J.vf.v+5, /;
.Y -V+5
I'иг. I .')..">. Поток через поверхность тонкого
бокса, имеющего размеры от.гдол-г б. Площадь
каждом поверхности равна Л (Berg, 1983)
С = 0
Риг. Г3.6. Диффузия молекул из объема
жидкости, изначально содержащего частицы в
концентрации Си (внизу слева) в объем жидкости,
изначально не содержащем частиц (вверху
слева). Распределение молекул но
прошествии определенного времени (справа)
нен. Случай, когда С является линейной
функцией х, показан на рис. 1X1.
его справа. Число частиц на единицу
объема в боксе, следовательно,
увеличивается на:
1/т|С(1+т)-С(т)] =
= -1/t\JJx+&)-Jx(x))At/A& =
= -l/S\Jr(x+8)-Jt(x)].
При условии 5н>0 и т-»0 это
означает, что:
dC/dt = -dJJdx (Г3.6)
или, если использовать первый закон
Фика (уравнение Г3.5), то:
dC/dt = Dd'C/dx2. (Г3.7)
Из уравнения Г3.7 следует, что
скорость изменения концентрации за
единицу времени, dC/dt,
пропорциональна второй производной концентрации
раствора, d'C/dx-', где D есть константа
пропорциональности. Для диффузии в
трех измерениях концентрация
изменяется во времени как:
dC/dt = DV2C. (Г3.8)
где V2 — трехмерный Лапласиан, d2/dx2 +
+ d2 dy2 + d2/dz2.
Для сферически симметричного
случая поток будет радиальным:
Jr = -DdC/dr, (Г3.9)
и
dC/dt = D (l/t*)d(H dC/dr)/dr (Г3.10)
ГЗ.4.2. Второе уравнение Фика
Второе уравнение Фика следует из
первого при том условии, что общее
число частиц в системе постоянно,
т. е. они не возникают и не
разрушаются. На рисунке Г3.5 рассматривается
бокс объемом А. За период времени т,
Jr (x) хАт частиц будут входить в объем
А слева, ajx (x+5) х Ах будут покидать
ГЗ.4.3. Нестационарные решения
уравнения Фика
Предположим, что диффузия
происходит из объема жидкости изначально
содержащего частицы в концентрации
С0 (внизу слева) в объем жидкости
изначально не содержащий частиц (рис.
Г3.6). В этом случае начальные условия
имеют вид: С = CQ для х > О, С = О для х

s
=г
га
о.
т
ш
=г
X
о
О
\ \
\ X
\ \
\\
„ts_ _3
1о
\
\\
\ \
\ \
V \
V \
\ \
\ \
\ \
\ \
\ ч.
ч ч^
-^- - —ОО X=Q +00 ^- -^ —ОО w=Q +OO - -^-
Расстояние а Расстояние б
Рис. I .4.7: с/ — концентрация как функция расстояния за время t = tn, t = t t = t.,. Начальная
концентрация частиц в период времени Справна Са. Через бесконечное время концентрация
выравнивается и становится pauiioii C0/2; б — производная по концентрации как функция расстояния
за время f = f(l, I = tt,t = Л, для такого же процесса, что и в а
< 0 и уравнение (Г3.8) будет иметь
решение:
С(л-.0 = —
2
л/2 {!)!)'
$ exp(-y7)dy
(Г3.11)
ГЗ.4.4. Стационарные решения
уравнения Фика
Для стационарного случая, когда
dC/dt = 0, уравнение (Г3.8) может быть
записано как:
V2C - О,
(Г3.13)
Интеграл в уравнении (Г3.11)
известен как интеграл вероятности. Он
является функцией х/2 (Dt)1 - и
изменяется от 0 до У2. Уравнение (Г3.11)
в графическом виде представлено на
рис. Г3.7 а. Взяв производные от С (х,
t) по х или t, мы получим:
dC/dx = CQ/(inDt) ' 2 х
х exp (-x2/ADt). (Г3.12)
Графическое изображение
процессов, описываемых уравнением Г3.12,
приведено на рисунке Г3.7 6. Уравнение
показывает, что максимальное значение
dC/dx достигается при х = О, и будет
равно С0/(4л^01/2.
которое в случае сферической
симметрии уравнение имеет вид:
l/rd(>2dC/dr)dr=0. (Г3.14)
Особый интерес представляет
случай, связанный с процессом диффузии
на адсорбирующей сфере.
Предположим, что такая сфера имеет радиус /?0 и
находится в бесконечном объеме, как
показано на рису и ке Г3.8. Каждая частица,
достигающая поверхности сферы,
захватывается так, что концентрация частиц
па поверхности сферы при /" = 7?0 равна
0. При /•= оо эта концентрация равна С0.
В таких граничных условиях уравнение
(Г3.13) имеет следующее решение:
C(r) = CJ\- RJr). (Г3.15)

j при Г — со
I
I
I
Рис. I "3.8. Адсорбирующая сфера радиусом R0,
находящаяся в среде бесконечного объема,
содержащего частицы с исходной концентрацией С0.
Прерывистые линии обозначают линии потока
Тогда поток частиц согласно
уравнению Г3.9 равен:
JT(r) = DCaR0/f. (Г3.16)
Если мы определим диффузионный
поток / как 1= An r1Jr (г), тогда
/ = 4п.Ш?0С0. (Г3.17)
В уравнении Г3.17 концентрация
С0 выражена как число частиц в
кубическом сантиметре, а диффузионный
поток / — как количество частиц в секунду.
Как видно из уравнения Г3.17 этот поток
/ пропорционален не величине
поверхности сферы, а ее радиусу. Это
проистекает из того факта, что когда радиус
сферы R0 увеличивается, то ее поверхность
растет как R02, но при этом градиент
концентрации, которому пропорционален
поток, уменьшается как 1 /R0.
Важно заметить, что уравнение
(Г3.13) аналогично уравнению Лапласа
для электростатического потенциала в
незаряженном пространстве. Это
означает, что диффузионный поток,
направленный в сторону изолированного
поглотителя какой-либо формы и
размера, может быть описан как:
/=4п£>сС0, (Г3.18)
где с — электроемкость
изолированного проводника той же формы и размера,
которая в системе сгс выражается в
сантиметрах (см. кчммси Mi'iiii Г!'./ ).
Подобие уравнений Г3.17 и ГЗ. 18 очевидно.
Уравнение Г3.18 имеет большое
значение на практике, поскольку
электроемкость тел различной формы либо
известна, либо легко может быть вычислена.
Последнее обстоятельство позволяет
заменить трудоемкие гидродинамические
вычисления частиц разной формы более
легкими вычислениями
электростатических аналогов. Примеры таких
вычислений были даны ранее в параграфе Г2.2.3.
Г3.5. Экспериментальные
методы определения
коэффициентов диффузии
ГЗ.5.1. Метод расширяющейся
границы
В методе расширяющейся границы
первоначально устанавливается резкая
граница между раствором определенной
концентрации и чистым растворителем.
Концентрация, С, измеряется как
функция расстояния, х, которое пройдено
от границы за данное время
(уравнение ГЗ. 11). Значение коэффициента
диффузии D за каждый промежуток
времени t вычисляется из
распределения С (х).
Альтернативный подход базируется
на уравнении Г3.12, которое описывает
зависимость dC/dx от „г (см. рис. Г3.7 и).
В этом случае максимальная высота
кривой, Яшкс, равна kCQ/(4nDt)i/2, а
площадь, А, под кривой равна kC. Тогда
коэффициент диффузии вычисляется по
простой формуле:
(Л/Яакч.)2 = 4п^. (Г3.19)

Выцветание
Восстановление
•"не. Г.'З.У. Восстановление флуоресценции красителя после фотовыцветания.
Флуоресцирующие молекулы в малом объеме (белый кружок) выцветают под действием кратковременной
лазерной вспышки высокой интенсивности. Восстановление флуоресценции, обусловленное
диффузией частиц, не подвергшихся выцветанию, измеряется как функция времени (Bastiaens
and Pepperkok, 2000)
ГЗ.5.2. Метод восстановления
флуоресценции после выцветания
красителя
В методе, называемом восстановлением
флуоресценции после выцветания
красителя (ВКПВ), наблюдение ведется за
частицами, мечеными флуоресцентным
красителем.
Метод прост как концептуально,
так и практически. Малый (по
сравнению с общим) избранный объем,
содержащий подвижные
флуоресцентные молекулы, подвергается действию
короткого мощного светового
импульса, с тем чтобы обеспечить
разрушение флуорофора, присоединенного к
молекуле (рис. Г3.9). После этого в
объем натекают флуоресцирующие
молекулы из оставшегося объема, не
подвергшегося действию лазерного
импульса.
В результате последующего обмена
между выцветшими и не выцветшими
флуоресцирующими популяциями
молекул в объеме происходит
восстановление уровня свечения объема
практически до исходного. Построение
графика зависимости восстановления
относительной интенсивности
флуоресценции как функции времени
позволяет вычислить коэффициент
диффузии меченых молекул (рис. ГЗЛОа).
Важно отметить, форма кривой ВКПВ
может быть также использована для
анализа характера подвижности
молекул в исследуемом объеме, поскольку
существует четко выраженное
различие в ходе кривых для хаотического и
направленного движения (рис. Г3.10 б).
Если разные частицы мечены
разными красителями, то их коэффициенты
диффузии могут быть получены
отдельно наблюдением за каждым из них.
Метод восстановления
флуоресценции после выцветания красителя
наиболее широко используется для
исследований латеральной диффузии на
плоскости, соответствующей
обширным областям цнтоплазматических
мембран, реконструированных
мембран и тонкослойных растворов. Этим
методом было показано, что различные
поверхностные белки и гликопротеиды
могут перемещаться латерально
внутри мембраны. Были проведены прямые
экспериментальные измерения
коэффициентов диффузии различных
мембранных белков in situ. Полученные
значения находились в пределах от 5 х 10"9
см2-сек ' для родопсина в фоторецеп-
торных мембранах до 1 х 10 12 см2сек~'

Неподвижная доля
1.0
0.5
/
-
ч
■'<
ч
//
(/
/7
//
У
Is
1
/£'
**
Поток
•^ Поток + Диффузия
^-^ Диффузия
1 1 _-.
t. t, t,
t/т.
I'ис. I ,'i. К): а - идеализированный график зависимости интенсивности флуоресценции /от
времени, демонстрирующий количественную сторону ВКПВ метода. Начальная интенсивность
выделенного объема 1п измеряется до действия световой подсветки небольшой интенсивности.
Затем объем подвергается действию короткого мощного импульса длительностью (tt — 10). Начиная
с времени ta рост интенсивности восстановленной флюоресценции измеряется до тех пор, пока
она не выйдет на плато и не достигнет значения / . Кажущийся коэффициент диффузии DhbK
может быть определен разными методами, включающими в себя как метод определения того
времени, при котором интенсивность достигает половины значения интенсивности / , так п метод
полной подгонки кривой (сплошная линия) (Bastiaens and Pepperkok, 2000); б — теоретические
кривые восстановления флуоресценции /ь (/) для трех разных случаев: чистая диффузия,
направленный поток и суперпозиция первых двух (Koppel, 1979)
для флуоресцентно меченых белков на
поверхности эритроцитов человека.
Величины 1 х 10" см2-сек ' были
обнаружены для флуоресцентно меченого кон-
кавалина А рецепторного комплекса на
мембране из культивированных миоб-
ластов крысы.
ГЗ.5.3. Метод привязки золотых
кластеров(«нановидная
микроскопия»)
В 1988г. М. Шитс (М. Sheets)
разработал метод определения
коэффициентов диффузии биологических
макромолекул с использованием малых
коллоидальных частиц золота,
присоединенных к исследуемой молекуле.
За траекторией таких молекул можно
следить при помощи светового
микроскопа. Метод получил название
«лаповидной микроскопии» (микроскопии
с разрешением на уровне нанометра).
Годом позже он применил этот метод
для исследования подвижности
некоторых белков на поверхности живой
клетки (лектин, конканавалпн А),
наблюдая их с помощью за движением
частиц коллоидного золота диаметром
40 им (рис. П.] 1).
В заключение отметим, что
коэффициенты диффузии макромолекул,
определяемые методами
восстановления флуоресценции после выцветания
красителя и нановидной микроскопии,
строго говоря не имеют прямого
отношения к размерам и форме меченой
молекулы. Они чаще всего характеризуют

—5
fJ^L^rs^/\ j
I
/
0 2b
—■ 0 20
1
_ 0 15
МСД
ось
/
jf
У
У
s/* д--Ь-^г1*Г5!Г*ГТГ2^ЛЛЛ Л
ГЦ Л 1 1 I 1 1 I
% 0 33
Свобод
(Эн диффузия плюс/
□яннан серость
^г Свободна
у' диффузия
Диффузия в
офаниченном
обьеме
(1 МКМ X 1 МКМ)
1 1 1 ^-
15 20 25 30 35 40 45
Интервал (сек)
а б в
Рис. I.'j.l I. (лева. Визуализация следов диффузионного движения частицы при направленном
движении (а) и при беспорядочном движении частицы (б). В цент ре. Зависимость среднее-квадратичного
отклонения частицы от времени для диффузионного направленного движения и для
беспорядочного движения, построенная поданным (а) п (б). (Ирана. Теоретическая зависимость
средне-квадратичного отклонения частицы от времени для трех случаев: свободная диффузия плюс направленное
движение (а), чисто свободная диффузия (б) и диффузия в ограниченном пространстве (в)
подвижность молекул в специальных
условиях, например при очень высоких
концентраций окружающих молекулу
других белков как в случае первого
метода или привязки тяжелой частицы,
как в случае второго метода.
Г3.6. Предсказание
коэффициентов диффузии
глобулярных белков
Гидродинамическое поведение белков
определяется различными
факторами: их размером, неровностью
поверхности, поверхностной гидратацией
заряженных и полярных групп.
Существуют две стратегии предсказания
коэффициентов диффузии для белков,
трехмерная структура которых
известна с высоким пространственным
разрешением из кристаллографических
или ЯМР данных. Первая включает
детальный учет констант трения всех
атомов белка, доступных действию
растворителя. При таких
вычислениях необходимо учитывать не только
атомы молекулы белка, но и молекулы
воды, ассоциированные с ней. Во
второй стратегии вода, ассоциированная
с белком, представлена в виде водной
оболочки с толщиной, одинаковой для
всех белков (секция Г1.3).
В настоящее время разработаны
автоматизированные методы обращения
координат атомов в дискретные
центры трения, в роли которых выступают
либо бусинки, либо треугольные
пластинки. Детали такого моделирования
представлены в Главе Г2. Сравнение
предсказанных таким моделированием
констант диффузии с
экспериментально измеренными для различных белков
представлено в 'п'ппц- I'.'-l.l!. Из нее
видно, что имеющиеся сегодня
алгоритмы, позволяют предсказывать
коэффициенты диффузии с точностью
до 1-2%. Особо примечательным
является тот факт, что «окружение» всех
глобулярных белков тонкой оболочкой
воды(1 ± 0,1 А) с одинаковой толщиной
также приводит к хорошему согласию
между предсказанными и
экспериментальными данными. Плотность воды в
окружающей оболочке для диффузии
не имеет значения.

Таблица Г3.2. Предсказанные и экспериментальные значения коэффициентов диффузии глобулярных белков
и вируса табачной мозаики
Частица
Бычий трипсиновый
ингибитор
Рибонуклеаза А
Рибонуклеаза Л
Лизоцим
Лизоцим
Лизоцим
Профилин
Миоглобин
Целлюлаза
Химотрипсиноген
Инсулин
Нитрогеназа
Вирус табачной мозаики (ВТМ)
Код белка
в Банке
белковых структур
4ptl
ЗгпЗ
7rsa
61ys
llz3
611ys. brk
lpne
lmbo
leng
2cga
laio
avl
Круговой
цилиндр
(2800 Ax 180 A)
Молекулярная
масса
(кДа)
6,4
13,6
13,7
14,3
14,0
14,0
14,8
17,2
22,0
25,66
34
220
40,000
Метод
конструирования
Пара бусинок**
Пара бусинок **
Емкость***
Емкость***
Пара бусинок**
Дискретизацтя****
Пара бусинок**
Емкость***
Пара бусинок **
Емкость***
Пара бусинок **
Одна бусинка *
Дискретизация на
многоугольники
Предсказанный
(ед. Фика)
14,4
11,1
11,1
11,2
11,3
11,7
11,0
10,4
9,7
9,2
8,0
4,33
0,44
Измеренный
fl2»w
(ед. Фика)
14.4
11,2
11,2
11,2
11,1
11,1-11.2
10,6
10,3
9,8
9,1-9.5
7,9
4,0
0,44
*) В этом методе одна бусинка (одна сфера) с радиусом 6,6 А располагается на месте С1' атомов каждой аминокислоты (Baranowicz et
al., 2000).
**) В этом методе пара бусинок (идентичные и частично перекрывающиеся сферы) каждая с радиусом 4,5А располагается на месте Ск
атомов каждой аминокислоты (Baranowicz et al., 2000).
***) Диффузионные коэффициенты белков вычислены методом электростатической емкости с допущением, что однородная гидрата-
ционная оболочка имеет толщину 0,9 A (Zhou, 1995).
****) Для конструирования подходящей модели для гидродинамических вычислений сфера радиусом 3 А прокатывается по
поверхности частицы, с тем чтобы избавиться от мелких шероховатостей поверхности. Сглаженная поверхность затем разделяется на
многоугольники, составленные из треугольных пластин.

Г3.7. Трансляционное
трение и диффузионные
коэффициенты
ГЗ.7.1. Уравнение
Эйнштейна—Смолуховского
Кинетическая теория диффузии,
представленная выше, позволяет вычислять
значения коэффициентов диффузии
частиц путем определения скорости, с
которой они движутся под действием
внешней силы. На практике эта скорость
пренебрежимо мала, по сравнению с
среднеквадратичной скоростью, приведенной
в уравнении (А) коммситрия I'.'i.l. Это
значит, что частицы диффундируют
быстрее, чем при отсутствии поля, но с малым
направленным смещением вдоль оси, как
показано на рисунке Г3.12.
Сейчас мы выведем уравнение,
связывающее коэффициент диффузии
частицы D с ее коэффициентом трения, /,
используя подход Берга, названный им
«беспорядочным блужданием со
смещением». Рассмотрим частицу массой
т в положении х, на которую действует
внешняя сила, приложенная в
направлении +х. В соответствии с
определением, коэффициент поступательного
трения является коэффициентом
пропорциональности в уравнении:
Fx=fux, (Г3.20)
где F является силой, действующей в
направлении х, а их есть среднее
значение скорости в этом направлении. С
другой стороны, в соответствии со вторым
законом Ньютона, сила заставляет
частицу двигаться слева направо с
ускорением а = FJm. В соответствии с
подходом беспорядочного блуждания частица
делает один скачок за время т вправо при
начальной скорости +их или влево, с
начальной скоростью — их.
т
О
I I I
х+5. х х+5+
Рис. Г.Ч.12. Частица массой т, находящаяся
под действием внешней приложенной силы
Fx и испытывающая одномерное блуждание
вдоль оси х
Частицы, начинающие свое
движение из положения х с начальной
скоростью +их, пройдут за время т
расстояние, равное 8+= их + а х2/2, в то время
как частицы, начинающие свое
движение из положения х, с начальной
скоростью -их, за время т пройдут расстояние
8 = -их + а т2/2. Поскольку шаги вправо
и шаги влево равновероятны, то среднее
смещение за время т будет равно а х2/2,
а средняя скорость частицы при
движении слева направо будет:
их =1/2 ах = 1/2 Fx х/т. (Г3.21)
В модели беспорядочного
блуждания / = 2тп/х. Умножая числитель
и знаменатель уравнения Г3.21 в виде
мг=^//на(5/т2) и вспоминая, что и% = 8/т
и D = 82/2 мы получаем, что/= mux/D.
Но согласно уравнению (А)
комментария Г3.1 mux = kT; поэтому/ = kT/D,
или
D = kT/f. (Г3.22)
Этот результат известен как
уравнение Эйнштейна-Смолуховского (i,-
мен i;ipim'i Г.'!. i). иявляется
принципиально важным для гидродинамики. Важно
подчеркнуть, что уравнение не зависит
от каких-либо допущений, сделанных
относительно структуры частицы или
деталей ее движения. Частица всегда

Коммешарт'; I 3.4. К выводу
уравнения Г3.22
Как указывается в книге Берга,
вывод уравнения (Г3.22) не имеет
строгого физического обоснования. Конечно,
в действительности частицы не делают
шаги с фиксированными интервалами и
с фиксированной скоростью.
Существует перераспределение интервалов шагов,
направлений их движения, и скоростей в
силу обмена энергии между молекулами.
Однако конечный результат оказывается
тот же самый. Это происходит потому,
что в результате приложения внешних
сил частицы ускоряются, но поскольку
прилагаемые силы малы (см. параграф
П.2.2), то при обмене молекулами
анергией это ускорение нивелируется. Это и
есть реальное движение молекул при
низких числах Рейнолдса, когда силы
инерции малы (Berg, 1983)
I Комментарий Г3.5.
Концентрационная зависимость
, коэффициентов диффузии
Концентрационная зависимость
коэффициентов диффузии может быть охарак-
i тсризована коэффициентом kD в уравне-
' НИИ ]
DC = D0(1-*DQ. (A)
Для низких концентраций растворенных |
веществ коэффициент kn является суммой
двух вкладов — «исключенного объема» и
эффективного гидродинамического тре- :
ния и является аналогом коэффициента
i k, который описывает концентрационную
зависимость коэффициента седиментации ,
• (коммсп lapm'i I i.lM). И хотя в величины I
kD и ^вносятся оба вклада, однако их
суммарный результат разный, поскольку в яв- i
i лении седиментации они входят с одинако- I
выми знаками, а в явлении диффузии --- с
разными. Поэтому константа ku обычно
; мала но сравнению с константой k. !
движется через жидкость со скоростью
пропорциональной силе, приложенной
извне. В случае диффузии константа
пропорциональности равна D/kT. В
случае седиментации эта константа равна
s/m (1 — v5 p0) (Глава Г4). В случае
электрофореза эта константа равна u/'Q, где
ц — электрофоретпческая подвижность
частицы, a Q — ее заряд (Глава Г5).
Уравнение Эйнштейна—Смолухов-
ского показывает, что измерение
коэффициента диффузии D позволяет
вычислить коэффициент трения /,
который дает нам информацию о размере
и форме молекулы.
ГЗ.7.2. Диффузионные
коэффициенты биологических
макромолекул
Коэффициенты диффузии
макромолекул зависят от вязкости растворителя и
температуры, при которой выполнены
измерения. Считается общепринятым
приводить измеренные коэффициенты
диффузии к стандартным условиям, в
качестве которых выбирается
температура 20 "С и вязкость чистой воды при
20°' W
D20„ = D"(293/D(V Т/Л„,(,)- (Г3.23)
В этом уравнении В.щ w является
константой диффузии в чистой воде при
20 "С, Т — абсолютная температура,
nw.,0 — вязкость воды при
температуре 20"С, а л .,. — вязкость реального
раствора при измеренной температуре
Т. Следует отметить, что уравнение Г3.23
не имеет какой-либо теоретической
основы и базируется в основном на
феноменологических соображениях. Следует
отметить, что величина D20 u может быть
вычислена даже в том случае, если
биологическая макромолекула не может
существовать в чистой воде при 20 °С.

Коэффициенты диффузии
биологических макромолекул обычно
вычисляются при конечной концентрации и
должны быть экстраполированы к
нулевой концентрации (коммпиарпп I .'!..">).
ГЗ.7.3. Зависимость
коэффициентов диффузии
глобулярных белков
от молекулярной массы
Для сферических частиц комбинация
уравненияЭйнштейна—Смолуховского
(Г3.2) и уравнения Стокса (Г2.1)
открывает возможность вычисления радиуса
сферы R0, исходя из экспериментально
измеренных коэффициентов диффузии
D и вязкости растворителя г|0:
Ru = kT/6nr\0D. (Г3.24)
Из D и т]() можно вычислить RQ,
и если плотность частицы р известна,
то ее масса будет равна:
т = 4/3 п Я()3р, (Г3.25)
а молекулярная масса М:
М = 4/3 п Я03р ЛГА. (Г3.26)
Сравнение уравнений Г3.24 и Г3.26
показывает, что коэффициент диффузии
обратно пропорционален корню
кубическому из молекулярной массы
сферических частиц (см. также секцию Г2.6):
D~M~[i. (Г3.27)
На рисунке ГЗ. 13 показана
зависимость экспериментальных значений
коэффициентов диффузии от
молекулярной массы, построенная по данным
i;h">.пщы I'3.3, для глобулярных белков,
начиная с тетрадеканептида (соматоста-
тин) и кончая большими белками (оли-
гомерный белок глутаматдегидрогеназа
из печени быка) в двойной
логарифмической шкале.
10'
110,|_ ^ч^
-inV^ л
-|0° ' 1—i---Li-iil .1 i.i-iniil i_-i~i-i-iuil i i_i.i_i.iiij
103 104 105 10е 10'
Молекулярная масса (Да)
Рис. ГЗ. 13. Записимость экспериментальных
значений коэффициентов диффузии от
молекулярной массы для глобулярных белков в
двойном логарифмическом масштабе,
построенная НОДаННЫМ : i'i 111111.! I ').'!
Наклон прямой, проведенной через
экспериментальные точки, равен 0,336,
что хорошо согласуется с наклоном 1/3,
предсказываемым уравнением Г3.27 для
сферических частиц.
ГЗ.7.4. Зависимость
коэффициентов диффузии ДНК
от молекулярной массы
На рисунке Г3.11 показана зависимость
коэффициентов диффузии от
молекулярной массы ДНК в В-форме,
построенная по данным iauniiu.i I 3.1. Для
молекул ДНК размером от 70 пар оснований
(молекулярная масса -46 кДа) до 6000
пар оснований (молекулярная масса
~4 МДа) эта зависимость описывается
одной прямой линией:
D = 276M°72. (Г3.28)
Значение показателя степенной
зависимости (0,72) близко к теоретическому
значению, ожидаемому для
гомологичного ряда палочкообразных частиц
конечной толщины (см. секции Г2.6, Г4.10.3
и Г6.7.1). Интересным является также
то, что гидродинамические свойства

Таблица ГЗ.З. Коэффициенты диффузии и молекулярные массы белков*)
Белок
1. Стоматостатин (тетрапептид)
2. Грамицидин(димер)
3. Бычий трипсиновый ингибитор
4. Липаза
5. Рибонуклеаза А (бычья нанкреотическая)
6. Рибонуклеаза Л
7. Цитохром с
8. Лизоцим
9. Лизоцим
10. Профилин
11. Миоглобин
12. Целлюлаза
13. Химотрипсиноген Л
14. Химотрипсиноген А
15. Инсулин
16. Карбоксипептидаза В
17. ос-Лактоглобулин
18. Овальбумин
19. Сывороточный альбумин
20. Гемоглобин
21. Цитратсинтетаза
22. Лактатдегидрогеназа
23. Глицератофосфат дегидрогеназа
24. Альдолаза
25. Нитрогеназа
26. Катал аза
27. Апоферритин
28. Уреаза
29. Глютаматдегидрогеназа
Молекулярная
масса (Да)
1,636
2,500
6,400
6,669
12,640
13,690
13,370
13,930
14,320
14,800
17,190
22,000
23,240
25,660
34,400
34,280
35,000
45,000
68,600
68,000
97,938
133,000
136,800
156,000
220,000
250,000
467,000
482,700
1015 000
Коэффициент
диффузии D°,0ji
(в ед. Фика)
24,5
18,4
14,4
14,5
13,1
11,2
11,4
11,2
11,2
10,6
10,3
9,8
9,5
9,0
7,9
8,2
7,2
7,8
6,4
6,9
5,8
5,1
5,0
4,8
4,5
4,1
3,6
3,5
2,5
*) Диффузионные коэффициенты взяты из разн
(2000); 2) Banachowicz et al. (2000); 3) Zhou (2001);
6) Garcia de la Torre (2001); 7) Byron (1997); 8) Brune
ых источников: 1
4) Hellweg et al.
and Kim (1993)
) Zipper and Durchshlag
(1997); 5) Smith (1970);
коротких фрагментов ДНК (12-20 пар
оснований) сходны с таковыми для
глобулярных белков соответствующей
молекулярной массы (см. рис. Г.3.14).
В то же время эти свойства очень
отличаются от таковых у молекул большого
молекулярного веса. Этот факт отражает
принципиальные различия между двумя
гомологичными рядами. В ряду
глобулярных белков асимметрия с
увеличением молекулярной массы остается
постоянной, в то время как в ряду фрагментов
ДНК асимметрия растет с ее
увеличением. Читатель может обнаружить это же
явление в секции Г4.10.3, в которой
обсуждаются седиментационные свойства
молекул ДНК.
ГЗ.7.5. Предел применения закона
Стокса: «малые», «средние»
и «большие» молекулы
На рисунке Г3.15 показана зависимость
коэффициентов диффузии от молекуляр-

Таблица Г3.4. Диффузионные коэффициенты гомогенных молекул ДНК
в В-форме
Частица
8 п. о.
12 п. о.
20 и. о.
89 и. о.
104 п. о.
124 п. о.
2311 и.о.
ДНК -pUC19
ДНК-pDSl
ДНК (Mvv/Mn< 1.15
Молекулярная
масса (Да)
5304
7956
13260
59007
68952
82212
1532193
1829880
2538637
3730000
Диффузионный
коэффициент
(ед. Фика)
15,26
13,41
10,86
4,27
3,88
3,41
0,46
0,35
0,29
0,223
Данные взяты из: Eimer and Ресога (1991); Tirado et al., (1984); Sorlie et al. (1988); Seils and
Dorfmuller (1991); Jolly and Eisenberg(1976)
ной массы для разнообразных веществ,
начиная от молекул газов до больших
макромолекул в двойной логарифмической
шкале на основе данных, представленных
в t;h').iiiu;i\ I'.'{..'{. Г,']. 1 и Г,'}..!. Как видно
из рисунка, зависимость
подразделяется на три различные области. Область I
описывает зависимость коэффициентов
диффузии глобулярных белков от их
молекулярной массы в широких пределах
(параграф ГЗ.7.3). Напоминаем, что
наклон прямой в этой области равен 0,336.
Область II представляет
аналогичную зависимость для аминокислот и
Сахаров в интервале значений
молекулярных масс от глицина (М = 75 Да) до
рафинозы (М = 504 Да). Наклон этой
прямой равен 0,47. И наконец, область III
(2Да — 100 Da) описывает движение
газов и малых молекул в воде: от
молекулы водорода Н2 (М = 2 Да) до глицерина
(М = 92 Да). В этом случае зависимость
не является монотонной функцией
М. Проведенная прямая в этой области
имеет наклон, равный 0,42.
Мопеяулярмая месса (Da)
Рис. 13.11 Зависимость коэффициентов
диффузии от молекулярной массы для
глобулярных белков (•) и для молекул ДНК в В —
форме (О) в двойном логарифмическом масштабе.
Для последних интервал молекулярных масс
простирается от 8 пар оснований до 6000 пар.
Данные взяты из ;;и> :in. Г."...'! и I.'!. i, принимая
парциальные удельные объемы ДНК и
белка равными 0,56 см3г' и 0,73 см3г',
соответственно
Три различных области I—III на
рисунке Г3.15 соответствуют трем
различным типам диффузионного
движения в жидкостях. Область I
соответствует движению «больших» мо-

ю2
10
1
:
-
i
Е~
»—
•N. ш
Решеточная диффузия
Атомы и
молекулы
1 III I II
Две моды диффузии в жидкостях
Диффузия в потоке
fc ^>s4» D =
n >4 n = 6 ^*-
*■* Л""."™^Г" >■« Пептид ы и белки
| | "1 i i 1 1 1 i ill
КТ .
f "
ml
КТ
6nil0Ro
1 1 1
►
►
11II
1
10
10'
10'
10"
10'
10э 104
Молекулярная масса (Da)
Рис. I.'}. 1.1. Зависимость коэффициентов диффузии от молекулярной массы Л/ для различных
веществ в двойной логарифмической шкале. Данные взяты из мЛ. иы I'.''...".. I.'i.ui i-'.'i
лекул в растворителе в режиме
«потока», когда последний рассматривается
как континуум. Для молекул таких
размеров их движение описывается
при низких числах Рейнолдса (см.
примеры в KoMMcii i;ipii!i\ Г'>.,"> и l.'>.i).
В этом случае движение молекул
подчиняется закону Стокса с
граничными условиями полного прилипания
(уравнение П.11). Отклонение от
линейности начинается в районе 1000
Да. Это означает, что закон Стокса
применим к молекулам с
молекулярной массой 1000 Да и более (см. рт.-.
Г3.15). Такие молекулы мы отнесем к
категории «больших» молекул.
Таблица Г3.5. Диффузионные коэффициенты аминокислот и Сахаров в водных
растворах
Молекула
Глицин
Алании
Пролин
Пентаэритриол
Фенилаланин
Глюкоза
Маннитол
Сахароза Рафиноза
Краситель Алеха
Молекулярная масса
(Да)
75
89
97
136
147
180
182
324
504
600
Коэффициент диффузии D"(1;(.
(в ед. Фика)
94,3
81,0
78,1
67,8
62,7
59,8
58
46,3
38,6
30
Данные взяты из: 1) Longsworth, 1953 и пересчитаны на стандартные условия; 2) Nir and Stein,
1970; 3) Kelly et al„ 1942

лил: ma I 3.6. Коэффициенты диффузии некоторых газов и малых молекул
Молекула
11,
Не
Н.,0
Ne
N,
о",
Лг
СО,,
CI,"
Мочешша
Глицерин
Молекулярная масса
(Да)
2
4
18
20
28
32
40
44
71
60
92
Коэффициент диффузии D2n u.
(ед. Фика)
510
540
220
250
190
201
190
177
122
118
83
Данные взяты iwNir n Stein (1971)
Область III относится к
«решеточной» моде движения «малых» молекул
в жидкости. В этом случае молекулы
движутся в среде, состоящей из частиц,
сходных с ними по размеру (случай
самодиффузии). В таком
растворителе молекулы перемещаются способом
«прыгни и жди». Следовательно,
молекулы «не ощущают» растворитель как
непрерывную среду. Значение
коэффициента диффузии, вычисленное из
уравнения Эйнштейна—Смолуховско-
го, будет гораздо больше, чем значение,
предсказанное законом Стокса. Такие
молекулы мы будем называть
«малыми» молекулами. Их молекулярная
масса не более 100 Да.
Область II — это переходная область
между двумя модами диффузии в
жидкостях. Здесь молекулы передвигаются
через растворитель по смешанному
механизму. Область II постепенно
переходит в область III с переломом в районе
1000 Да (см. рис. Г3.15). Молекулы с
массой в интервале значений от 100 до
1000 Да мы определим, как молекулы
«среднего» размера.
Для молекул «среднего»
размера в условиях «полного скольжения»
уравнение Г3.24 является наиболее
приемлемыми, однако на практике оно
не используется.
Из изложенного строго следует, что
истинные гидродинамические размеры
частицы могут быть определены только
для молекул «большого» размера, что
соответствует молекулярным массам
1000 и более Дальтон.
Г3.8. Перечень ключевых идей
Коэффициент диффузии, определяемый из стохастического движения одной
частицы, называется коэффициентом следовой диффузии Dciii|.
Коэффициент диффузии, определяемый из взаимного движения частиц в
ансамбле, называется коэффициентом взаимной диффузии D

" Коэффициент диффузии, определяемый по макроскопическим изменениям
концентрации молекул, называется коэффициентом поступательной диффузии D .
с Для невзаимодействующих между собой броуновских частиц все три
коэффициента диффузии, D ,D \\D являются идентичными.
—, г-> -г-г J 7 С1СД В.ШИМН МОСТ
J Согласно первому уравнению Фика общий поток макромолекул
пропорционален наклону градиента концентрации с константой пропорциональности D.
0 Согласно второму уравнению Фика скорость изменения концентрации во
времени пропорциональна градиенту концентрации с константой
пропорциональности D.
3 Решение уравнения Фика в стационарных условиях аналогично решению
уравнения Лапласа для электростатического потенциала в незаряженном
пространстве; отсюда следует, что диффузионные свойства макромолекул могут
быть вычислены с использованием методов электростатики.
3 Метод расширяющейся границы позволяет определить коэффициенты
поступательной диффузии биологических макромолекул.
• Метод восстановления флуоресценции красителя после выцветания наиболее
подходит для исследований латеральной диффузии в цитоплазматических и
реконструированных мембранах, а так же в тонкослойных растворах и в
цитоплазме.
• Коэффициенты диффузии макромолекул обычно приводятся к «стандартным
условиям», в качестве которых используется чистая вода при 20 "С.
• Коэффициенты диффузии глобулярных белков могут быть вычислены из их
атомных координат с точностью 1-2% при правильном учете гидратации.
• Зависимость коэффициентов диффузии глобулярных белков от молекулярной
массы в двойной логарифмической шкале является прямой линией с наклоном
0,336, что совпадает с теоретическим значением, равным 1/3 для сферических
частиц.
9 Молекулы с молекулярной массой >1000 Да в гидродинамических
экспериментах могут рассматриваться как «большие»; такие молекулы движутся в
растворителе, который для них является континуумом.
° Молекулы с молекулярной массой < 100 Да называются «малыми»
молекулами; такие молекулы двигаются способом «прыгни и жди» и растворитель для
них не является континуумом.

• Молекулы с молекулярной массой от 100 до 1000 Да называются «средними»
молекулами; они двигаются в растворе по механизму смешанного типа
«движение» — «прыжок-ожидание».
• Уравнение Эйнштейна—Смолухонского—Стокса применимо к биологическим
молекулам, имеющим молекулярную массу 5И000 Да.
Литература для дальнейшего чтения
Коэффициенты диффузии
Gosting L.J. Measurement and interpretation of diffusion coefficient of proteins.
Adv. Prot. Chem., 1956.11, 429-554.
Микроскопическая теория диффузии
Einstein A. Investigations on the Theory of the Brownian Movement, ed. R. Furth,
transl. by A. D. Cowper. New York: Dover Publication, Inc. 1956.
BergH. C. Random Walks in Biology. Princeton: Princeton University Press, 1983.
Макроскопическая теория диффузии
BergH. С. Random Walks in Biology. Princeton: Princeton University Press. 1983.
Экспериментальные методы определения коэффициентов диффузии
Gosting L.J. Measurement and interpretation of diffusion coefficient of proteins.
Adv. Prot. Chem., 1956.11,429-554.
Axelrod D., Koppel D. E., Schlessinger J., Ebon, E. and Webb W. W. Mobility
measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophvs. J.,
1976.16,1055-1069.
Kucik D. F., Elson E. and Sheetz M. P. Forward transport of glycoproteins on leading
lamellipoda in locomoting cells. Nature, 1989. 340, 315-316.
Lee G. M., Ishihara A. andjacobson K. A. Direct observation of Brownian motion of
lipids in a membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991. 88, 6274-6278.
Концентрационная зависимость коэффициента диффузии
RozoeA J. The concentration dependence of transport processes: A general description
applicable to the sedimentation, translation diffusion, and viscosity coefficients of
macromolecular solutes. Biopolymers, 1977.16, 2595-2611.
Harding S. E. and Johnson P. The concentration dependence of macromolecular
parameters. Biochem. J., 1985. 231, 543-547.
Предсказание коэффициентов диффузии для белков и сравнение с
экспериментом
Teller D., Swanson E. and Haen С. The translation friction coefficients of proteins.
Meth. Enzymol., 1979.61, 103-124.
Venable R. M. and Pastor R. W. Frictional models for stochastic simulations of
proteins. Biopolymers, 1988. 27, 1001-1014.
Garcia De la Tone J. Hydration from hydrodynamics. General consideration and
applications to bead modelling to globular proteins. Biophys. Chem., 2001. 93, 159-
170.

Zhou H.-X. A unified picture of protein hydration: prediction of hydrodynamic
properties from known structures. Biophys. Chem., 2001. 93, 171-179.
Коэффициенты диффузии и молекулярная масса
Gosting L. J. Measurement and interpretation of diffusion coefficient of proteins.
Adv. Prot. Chem., 1956.11, 429-554.
Einstein A. Investigations on the theory of the Brownian movement, ed. R. Furth,
transl. by A. D. Cowper. New York: Dover Publication, Inc., 1956.

ГЛАВА Г4
АНАЛИТИЧЕСКОЕ
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Г4.1. Исторический обзор
А. Думанский (A. Dumansky)
предложил использовать аналитическое
ультрацентрифугирование (АУЦ) для
определения размеров коллоидальных частиц.
1923
Т. Сведберг и Дж. Б. Николе
(Т. Svedberg and J. В. Nichols)
сконструировали первую центрифугу с
оптической системой для наблюдения за
частицами в поле центрифуги,
приводимую в действие сжатым воздухом.
Годом позже они наблюдали уменьшение
поглощения во время
центрифугирования раствора гемоглобина.
192(>
Т. Сведберг провел первые
измерения молекулярных масс белков
(гемоглобин, овальбумин) методом
I Комментарий Г4.1. Сведберг
I и Нобелевская премия
Интересно отметить, что Теодор Свед- -
I берг получил Нобелевскую премию за его !
работу по коллоидальным системам, а не
за изобретение аналитической центрифуги
и становление и развитие метода
аналитического центрифугирования.
равновесного центрифугирования, а в
1927 г. определил молекулярную массу
гемоглобина сочетанием методов
седиментации и диффузии. Эти пионерские
работы привели его к пророческому
выводу, что белки являются
макромолекулами, состоящими из большого числа
атомов, соединенных ковалентными
связями (комментарии П. I ).
1929
О. Ламм (О. Lamm) вывел
основное уравнение, описывающее поведение
движущейся границы в поле
центрифугирования. Точное решение уравнения
представляло собой серию интегралов,
которые можно было вычислить
только при помощи численного
интегрирования. Позже уравнение Ламма было
решено аналитически для
специальных граничных условий (X. Факсен,
В. Арчибалд и X. Фуджита) (Н. Faxen,
W.J. Archibald and H. Fujita).
19.40
Шлиреновская оптическая
система была изобретена Дж. Филпотом
и X. Свенсоном (J. St. L. Philpot and
Н. Svenson), и независимо Л. Г. Лонг-
свортом (L. G. Longsworth). Она
позволила получить зависимость
градиента концентрации (или более точно,

градиента показателя преломления),
как функцию расстояния в ячейке
центрифуги. С помощью этой системы были
поставлены первые эксперименты по
седиментации белков для вычисления
их коэффициентов трения в терминах
формы и гидратации. В этом
десятилетии важным достижением в области
исследования структуры молекул было
предсказание формы и размера вируса
табачной мозаики из седиментацион-
ных измерений до того, как эта
палочкообразная частица была визуализова-
на в электронном микроскопе.
1940-е
Для проведения экспериментов
в лаборатории была сконструирована
и стала коммерчески доступной
аналитическая центрифуга Spinco, модель Е,
приводимая в действие электрическим
мотором. В 1942 г. В. Дж. Арчибальд
(W. J. Archibald) предложил новые
подходы для определения молекулярной
массы макромолекул по данным АУЦ.
В 1943 г. Е. Кон и Дж. Эдсалл (Е. J. Cohn
and J. T. Edsall) показали, что
парциальный удельный объем белков может
быть успешно вычислен из
парциальных удельных объемов, составляющих
их аминокислотных остатков. Первый
учебник, посвященный
аналитическому центрифугированию, который
назывался «Ультрацентрифуга» Т. Свед-
берга и К. Педерсена (Т. Svedberg and
К. О. Pedersen), появился в 1942 г. Эта
монография стала Библией
аналитического ультрацентрифугирования.
1950-е
Эта декада отмечена как начало
широкого применения метода
седиментации. Много блестящих достижений
в молекулярной биологии связано с
использованием метода АУЦ. М. Ме-
сельсон и Ф. Сталь (М. Meselson and
F. W. Stahl), используя метод
центрифугирования в градиенте плотности и
изотопные метки, доказали
полуконсервативный механизм удвоения ДНК, а
эксперименты А. Тиссиера и Дж. Уот-
сона (A. Tissier and J. D. Watson,
1958), а также Ф. Чао и X. Шахмана
(F.-C. Chao and H. K. Schachman, 1959)
привели к открытию рибосом. Второй
учебник по ультрацентрифугированию
«Ультрацентрифугирование в
биохимии» X. Шахмана был опубликован в
1959 г. и стал на многие годы настольной
книгой для многих исследователей.
19ti0-e
Развиваются первые сканирующие
фотоэлектрические абсорбционные
оптические системы. В этот период
ультрацентрифуга стала широко
использоваться для изучения белков, рибосом, ДНК и
вирусов. Существенный вклад в теорию
и практику аналитического
ультрацентрифугирования внесли Дж. Уильяме,
К. ВанХольде, X. Шахман, Д. Ифантис,
X. Фуджита (J. W. Williams, К. Е. van
Holde, H. К. Schachman, D. A. Yphantis
and H. Fujita).
1970-е
Эти годы были золотыми для метода
аналитического
ультрацентрифугирования. К началу 1980-х гг. во всем мире
имелось около 2000 аналитических
ультрацентрифуг. Включение монохроматора
в абсорбционную оптику позволяло
исследовать очень разбавленные растворы.
Рэлеевская интерференционная оптика
позволяла получать высокоточные
результаты для непоглощающих
растворенных веществ и использовалась в основном
для определения молекулярной массы
методом равновесного
центрифугирования. В 1971г. введение дифференциаль-

kiUvKvionIарии Г4/Л «Второе
рождение аналитического
ультрацентрифугирования»
X. Шахман в статье, названной «Второе
рождение аналитического ультрацентри-
фугнрования», писал:
«...Но к 80-м гг., несмотря на неистовую
активность, связанную с конструированием
новых аналитических ячеек, разработкой
новых оптических систем, развитию новых
подходов к интерпретации
экспериментальных данных применение метода
ультрацентрифугирования для решения разнообразных
и множественных проблем биологии, резко
сократилось и метод стал терять свою по-
! пулярность. Что случилось? Получили ли
| развитие более надежные и универсальные
методы, которые могли быть использованы
вместо метода ультрацентрнфугирования?
Или у исследователей, занимающихся
химией белка и молекулярной биологией в
80-е гг. возникли вопросы, на которые не мог
ответить метод АУЦ? Молекулярные
биологи в начале 80-х, которые интересовались
молекулярными взаимодействиями между
различными белками или между белками и
нуклеиновыми кислотами, стали
удовлетворяться ответом "да" или "нет" и перестали ,
! интересоваться константами равновесия и ;
изменениями свободной энергии. Для них
использование фильтров, колонок с сефадек-
сом, полпакриламидных гелем обеспечивали
желаемую информацию. Сейчас, однако, с
; появившейся возможностью синтезировать
j сотни белков методом сайт-направленного ■
! мутагенеза, вновь появилась необходимость :
в прецизионной технике для
физико-химических исследовании» (Schachman, 1989).
ного метода седиментации открыло путь
для обнаружения небольших различий в
коэффициентах седиментации (М. Кир-
шнер и X. Шахман) (М. W. Kirschner
and H. К. Schachman). В 1978 г. были
развиты новые методы анализа данных,
которые позволяли исключать вклад
диффузии в скоростную седиментацию,
и давали в результате интегральное
распределение коэффициентов
седиментации (К. Ван Хольде и В. Вайшейт) (К.
Е. van Holde and W. О. Weischet).
Третий фундаментальный учебник по
ультрацентрифугированию «Основы анализа
ультрацентрифугирования» X. Фуджита
(Н. Fujita) появился в 1975 г.
ПЖО-о
В начале 1980-х гг. метод
седиментации начал терять популярность среди
биохимиков. Для этого было две
причины: первая — развитие методов гель-
электрофореза и гель-хроматографии,
для которых требовалось малое
количество исследуемого материала; вторая
состояла в том, что хотя процесс
ультрацентрифугирования и фиксировался
на компьютере, возможности быстрого
обсчета данных были весьма
ограничены. Кроме этого, обработка данных
была весьма трудоемким процессом,
поскольку сводилась к обработке
фотографий образца (KOMMciiiapini П.2).
1990-е
Ситуация драматически изменилась
с появлением нового поколения
автоматизированных ультрацентрифуг фирмы
Beckman XL. Она содержит две
оптические системы детектирования:
ультрафиолетовую (УФ) абсорбционную
систему, которая дает возможность
исследовать белки и нуклеиновые кислоты
при очень низкой концентрации (вплоть
до 2-3 мкг-см ') и рэлеевскую
интерференционную систему, с помощью которой
можно исследовать мало поглощающие
или вовсе неноглощающие
макромолекулы. Шлиреновская оптическая система,
но всей видимости, ушла в прошлое,
поскольку зависимость инкремента
показателя преломления от расстояния в ячейке
ультрацентрифуги может быть получена
путем компьютерного дифференцирова-

ния шшм-ральных кривых зависимости
показателя преломления от расстояния.
Стати доступны новые программы
обработки данных, обеспечивающие
численные решения уравнения Ламма для
сложных (многокомпонентных) систем.
С 2000 по настоящее время
В настоящее время метод АУЦ
находится в состоянии возрождения. Он
может применяться для определения
молекулярных масс молекул от сотен до
десятков миллионов Дальтон. Метод АУЦ
является признанным методом для
точного определения чистоты, массы,
формы, самоассоциации и других свойств
молекул в растворе. На сегодняшний
день все это опять определяет
востребованность метода в лабораториях.
Г4.2. Оборудование
и инновационная техника
Ниже мы кратко опишем основные ха-
рактерныечерты современной
аналитической центрифуги, обращая основное
внимание на центрифугу фирмы Beckman,
Optima XL( koMMcinapiiii Г1.Л).
Введение в практику в 1990-х гг.
этой центрифуги существенно
увеличило точность измерений и объем данных,
которые могут быть получены в
эксперименте. Это стало возможным
благодаря наличию в ней микропроцессорного
контроля за экспериментальными
параметрами и оптики высокого качества.
Кроме оптики поглощения она
оборудована рэлеевскои интерференционной
системой, которая позволяет выполнять
измерения растворов макромолекул
с низким оптическим поглощением.
Основными частями центрифуги
являются: ротор, находящийся в
охлаждаемом вакуумном пространстве ее корпуса,
Коммешарий Г4.3. Техника
препаративного и аналитического
центрифугирования
Техника центрифугирования н
молекулярной биологии представлена двумя
основными типами — препаративным и
аналитическим. Процедура препаративного
центрифугирования состоит нз стадий
разделения, выделения и очистки
биологического материала (клеток, органелл,
нуклеиновых кислот и т. и.) и его
последующего исследования биохимическими
и физическими методами.
Коммешарий Г4.4. Сила
и ускорение при центрифугировании
Гравитационное поле, образующееся
1 при центрифугировании (g). равно
квадрату угловой скорости ротора (со в радианах в
! сек) и радиальному расстоянию (г, в
сантиметрах) частицы от оси вращения, и
выражается уравнением:
I g=wV. (A)
Поскольку один оборот ротора равен 2л
радиан, то его угловая скорость в радианах
в секунду может быть выражена в об-мин '
и общее уравнение, выражающее скорость
вращения ротора, будет равно:
со=2л(об-мпн ')/60. (Б)
Тогда гравитационное поле g,
выраженное в об/мин, равняется:
g = 4л2 (об-мин ') V/3600. (В)
Значение g обычно выражается в
единицах гравитационного ноля Земли (g =
= 981 см-'Сек"'), т. е. отношение веса
частицы в ноле центрифуги к весу этой же
частицы в ноле с искусственной гравитацией
и является относительным центрифужным
полем, g1, или множителем npiig.
g = 4л2 (об-мин"1)2 //3600 х 981 (Г)
или в сокращенном виде:
I g = (1,118 х Ю-5) (об-мин ')V.
i При скорости 60000 обмин ' g - 300000.
i

1,5 см
II
6 см
Противовес
10 см
■'Ш
Кювета
Рис. 1-1.1. Типичный ротор аналитической центрифуги и двухсекторная ячейка для образца
оптическая система для наблюдения за це во время центрифугирования, а также
распределением концентрации в образ- система накопления и обработки данных.
Граница
Кювета с
растворителем
Кювета с
образцом
Кювета с
растворителем
Рис. 11.2. Два тина ячеек, используемых
в методе ЛУЦ: а — двухсекторная ячейка;
б — ячейка, для формирования границы
непосредственно в ультрацентрифуге. В последней
имеются два маленьких канала, соединяющих
между собой компартменты ячейки.
Движение раствора или растворителя
осуществляется через нижний канал и происходит только
при вращении ячейки с определенной
скоростью (обычно 6-8 тысяч оборотов в минуту).
Верхний канал служит для возврата потока
воздуха
Г4.2.1. Роторы и ячейки
Аналитические роторы должны
выдерживать сильные гравитационные поля.
При 60000 об/мин типичный
ультрацентрифужный ротор создает поле в
ячейке, которое в 300000 раз
превышает гравитационное поле Земли (ким-
мгн lapnii П. i). В этих условиях масса
в 1 г имеет вес 300 кг.
Схематическое изображение ротора
и ячейки для седиментации приведено
на рисунке Г4.1. Металлический ротор
содержит несколько отверстий, куда
вставляются кюветы с образцом. Самый
простой тип ротора состоит из двух
ячеек: аналитической и контрольной,
которые изображены на рисунке Г1.1.
Материалом для верхних и нижних окошек
ячейки служит оптический кварц или
синтетический сапфир. Объем ячеек
составляет от 0,2 до 1,0 см3. Секторная
форма ячейки принципиально важна для
экспериментов по скоростной
седиментации, поскольку осаждаемые частицы
двигаются вдоль радиальных линий. В
ячейке с параллельными боковыми стенками
осаждаемые молекулы на периферии бу-

дуг соприкасаться со стенками и
вызывать конвекцию. В седиментационной
практике обычно используется двухсек-
торная ячейка, которая позволяет
учитывать поглощение отдельных
компонентов в растворителе (рис. YA.'la). Кроме
нее иногда используется двухсекторная
ячейка, позволяющая формировать
границу между раствором и растворителем
непосредственно в кювете (рис. Г-12 б)
при вращении ротора с умеренно
медленной скоростью. Эти ячейки удобны для
получения четкой границы при
определении коэффициента диффузии белков
методом расширяющейся границы
(параграф ГЗ.5.1), или при исследованиях
малых молекул, для которых скорость
седиментации недостаточна, чтобы
образовалась четко движущаяся граница
Г4.2.2. Системы оптического
детектирования
В зависимости от типа используемой
оптической системы различают два
способа для определения седиментационных
свойств молекул: наблюдение за
изменением концентрации вещества или за
изменением его градиента вдоль ячейки.
Для этих целей используются три типа
оптических систем. Шлиреновская
оптическая система выявляет движение
границы в виде зависимости
градиента показателя преломления от радиуса,
рэлеевская — в виде зависимости
показателя преломления от радиуса,
абсорбционная оптическая система — в виде
зависимости поглощения от радиуса.
Шлиреновская оптическая система,
доминировавшая над другими в
течение 70 лет, ушла в историю
(комментарий \~\~-)). Многие блестящие работы,
включая открытие рибосом, были
сделаны при использовании этой оптики
(рис. Г4.3). Ультрацентрифуга Beckman
| Комментарий Г4.5. Шлиреновская \
■ оптическая система |
Изобретение этой простой системы
Филпотом и Свенсоном было главным до-
I стижеинем в разработке метода
аналитического центрифугирования, без которого
i этот метод, возможно, никогда не стал бы
таким полезным. Система иногда
именуется шлиреновскоп оптической системой ]
(от немецкого слова schlieren, означающего |
i «полоса пли щель»). Если на пути пучка !
! света есть вещество с градиентом
показателя преломления, которое как призма
отклоняет проходящие через него лучи света,
то в этом месте изображение горизонталь-
| ной щели сместится и через наклонную
| щель пройдет выше или ниже оптической
| оси, получив при этом смещение вправо
или влево на расстояние, определяемое
углом наклона щели. Чем резче граница и ,
чем больше наклон щели, тем более острый |
| максимум получается па градиентной кри- |
| вой. Высота максимума пропорциональна :
i величине dn/dr и тангенсу угла наклона
щели. Таким образом, шлиреновская
оптика обеспечивает измерение градиента
показателя преломления, dn/dr, как функцию
| радиального расстояния, г, непосредствен-
j но в кювете. Заметим, что если бы не было
I наклонной щели, то изображение кюветы
не зависело бы от наличия градиента.
XL содержит только две оптические
детекторные системы: оптику для
поглощения в ультрафиолетовой (УФ)
области и рэлесвскую интерференционную
оптику. Шлиреновский профиль
седиментации (зависимость градиента
показателя преломления от радиуса ячейки)
может быть получен прямым
дифференцированием зависимости показателя
преломления, либо оптической
плотности от радиуса (комментарий П.(>).
Абсорбционные оптические
системы основаны на пропорциональности,
существующей между концентрацией
растворенного вещества и его
оптической плотностью. Большинство био-

а б
Рис. Г1..Ч. Профили седиментации («) 70S
рибосом Е. coli и (6) 30S и 50S рибосомных
субчастиц, полученные с. помощью шлиреновской
оптической системы
логических макромолекул поглощают
свет в ближней УФ области.
Нуклеиновые кислоты имеют пик поглощения в
области спектра 258-260 нм, в то время
как белки характеризуются
поглощением около 280 нм (Глава 31). На
рисунке YA.A показан типичный профиль
седиментации, измеренный с помощью
абсорбционной оптической системы.
Интерференционная оптическая
система базируется на рэлеевском
интерферометре ( коммеп rnpnii П.7).
Система может быть использована
для макромолекул, которые слабо
поглощают в УФ и в видимой областях.
На рисунке Г4.5г/ показан ход лучей
от образца, полученный с помощью
этой оптики, а на рисунке Г4.5 6 —
зависимость показателя преломления
как функция радиуса, вычисленная с
помощью программного обеспечения
ультрацентрифуги Optima XL.
Значительно более высокую
чувствительность можно ожидать при
использовании флуоресцентного
детектора, так как необходимая в этом
случае концентрация вещества на
несколько порядков ниже, чем при
использовании УФ — абсорбционной
оптики. Более того, молекулы с
различными флуорофорами могут быть
зарегистрированы селективно, даже
если они присутствуют как
минорные компоненты в смеси соединений.
Профиль седиментации бычьего
сывороточного альбумина (БСА),
измеренный для двух его концентраций
флуоресцентной системой
детектирования, приведен на рисунке Г4.6.
Наименьшая концентрация (6,5 нг-мл"1)
на 4 порядка ниже чем та, которую
можно зарегистрировать с помощью
УФ-абсорбционной оптики для этого
белка ( коммеп i apnii Г i.tt ).
Расстояние от центра вращения (см)
Рис. 14.1. Типичный профиль седиментации, полученный с помощью абсорбционной
оптической системы ультрацеитрнфуги Beckman XL

Комментарий Г4.6. Седиментация в поле переменной гравитации
В 1972 г. детектор, измеряющий светорассеяние от образца, был встроен в
ультрацентрифугу для наблюдений за изменениями концентрации полимерных молекул в ячейке (Scholtan
and Lange, 1972). В дальнейшем этот метод был модифицирован с целью получения
распределения полимерных молекул по размерам с более высоким разрешением (Machtle, 1999).
Характерной чертой модификации метода является седиментация в иоле переменной гравитации
за счет постепенного экспоненциального увеличения скорости ротора от 0 до 40 000 об мин ' в
течение 1 часа. Эта инновация позволила изучать дисперсионные свойства полимеров в
широком интервале размеров (от 10 до 3000 нм) без их фракционирования (см. параграф Г4.5.3
для дальнейшей дискуссии).
Коммешарий Г4.7. Интерферометр Рэлея
Интерференция света в интерферометре Рэлея происходит при расщеплении луча
когерентного света (на практике от одного источника) на два, каждый из которых проходит оба
сектора двухсекторной ячейки. После прохождения ячейки два луча смешиваются, образуя
интерференционную картину. Если оба сектора содержат идентичные растворы,
интерференционная картина представляет собой прямые полосы. Однако, когда один сектор содержит
растворитель, а другой — раствор макромолекул, полосы искривляются пропорционально
разности концентраций между образцом и растворителем. Образуется интерференционная
картина, каждая интерференционная полоса которой является кривой зависимости
показателя преломления от расстояния.
Комментарий Г4.8. Прототип флуоресцентного детектора для аналитической
i ультрацентрифуги Beckman XL-I
Прототип флуоресцентного детектора для аналитической ультрацентрпфуги Beckman
XL-I недавно был испытан в опытах по скоростной и равновесной седиментации. Его
чувствительность такова, что он способен определить флуоресцентную метку в концентрации
меньшей, чем 300 пМ. Радиальное разрешение детектора сравнимо с таковым для
абсорбционной системы (MacGregor et al., 2004).
Г4.2.3. Накопление и обработка
данных
С введением аналитической
ультрацентрифуги Optima XL получение
экспериментальных данных и их
обработка стали полностью
автоматизированными. Компьютерные
программы сегодняшнего дня преобразуют
экспериментальные данные в
графические изображения для получения
интегральных распределений
компонентов. Высокое качество исходных
седиментограмм позволяет получить
дополнительную информацию о
коэффициентах диффузии и парциальных
концентрациях компонентов и, в
некоторых случаях, определить константу
ассоциации ( комчш upnii I i.!>).
Г4.3. Уравнение Ламма
Уравнение Ламма описывает
транспортные процессы в центрифуге. Оно
может быть получено при введении
параметра смещения в уравнение
диффузии Фика. Как было отмечено в па-

Комментарий Г4.9. Домашняя
' страница для аналитического
ультрацентрифугирования в сети
, Internet
| В настоящее время имеются три
домашних страницы на веб-сайте, где в режиме
on-line можно найти полегшую
информацию об инновациях и экспертные оценки
в области ультрацентрифугированпя.
Домашняя страница Beckman home page
(http://vvvvvv.beckman.com) кроме этого
содержит информацию о коммерческой
продукции фирмы, характеристики
инструментов XL-A и XL--I, а также представляет
основные научные статьи.
Сайт RASMB (reversible association
in structural and molecular biology) был
создан как сервер электронной почты,
позволяющий осуществлять связь
между научными группами (http://vvvvvv.eri.
harvard.edu).
Во Demeler's XL-A and RASMB/Analytical
Ultracentrifugation page является гииерсвя-
зью через RASMB (http://bioc02.uthsca.edu).
Сайт имеет программное обеспечение,
доступное для пользователей RASMB, и
дополнительно предоставляет адреса
электронной почты для коммуникации,
сотрудничества, сервисной информации.
• у / .' S ■ -~ «** »■——
Рис. П..">. Типичный профиль седиментации,
измеренный интерференционной оптикой:
а — интерференционная картина получена при
помощи интерферометра Рэлея. Различие в
показателе преломления (An) для двух точек
ячейки может быть вычислено исходя из числа
полос, N, пересекающих эти точки зависимости
N = а(Ап)/\, где а — это толщина ячейки, а X —
длина волны используемого света. Поскольку
показатель преломления пропорционален
концентрации вещества, то число полос может быть
использовано для определения концентрации
как функции радиуса в ячейке; б — графическое
представление интерференционных полос как
функции радиуса, полученное при помощи
программного обеспечения XL-I центрифуги
/
Радиус
Время
Рис. Г1(). Два седпментационных профиля бычьего сывороточного альбумина (БСА),
полученные с помощью флуоресцентной детектирующей системы. БСА был помечен флуоресцирующей
меткой FITC (Флуоресцеин-изотиоцианат): а — наибольшая концентрация, 65 нг-м.т1; б —
наименьшая концентрация 6,5 нгмл
направление осей в опытах с флуоресцирующей
оптикой. Флуоресцирующая детектирующая систе.ма разработана для аналитической центрифуги
Spinco модель Е и инсталлирована на место стандартной шлиреновской оптики (Schmidt and
Reisner, 1992)

раграфе ГЗ.4.1, поток пропорционален
градиенту концентрации с константой
пропорциональности, равной
коэффициенту диффузии, D (уравнение Г3.5).
Если предположить, что все частицы в
ячейке движутся в направлении +л\ со
скоростью и, тогда поток в точке х
должен увеличиваться на значение иС (х),
где С(х) — локальная концентрация.
Тогда первое уравнение Фика
принимает вид:
У, = -D\dC/dx\ + иС{х). (Г4.1)
Помня, что и = sa>'Jx, мы получаем:
X = -D[dC/dx] + scoltC(.t). (Г4.2)
Первый и второй члены с правой
стороны уравнения Г4.2 соответствуют
переносу вещества в процессе
диффузии и седиментации, соответственно.
Уравнение (Г4.2) было
получено для идеальной бесконечно
длинной ячейки без стенок и не является
строго корректным для описания
процессов седиментации — диффузии
в реально существующих условиях
эксперимента. Поперечное сечение
секторной ячейки пропорционально
г, поэтому уравнение непрерывности
будет иметь вид
{%}•-№■ <™>
Объединяя уравнения (Г4.2) и
(Г4.3), мы получаем следующее
уравнение, известное как уравнение Ламма:
= -1-\4-WrisC-Dr<{d-f\tlt.
г [dr\_ \dr) JJ
Уравнение Ламма описывает
диффузию со смещением в секторной
ячейке аналитического центрифугирования
в реально существующих
экспериментальных условиях.
Г4.4. Решение уравнения
Ламма для различных
граничных условий
Г4.4.1. Точные решения
Основное решение уравнения Г4.4
представляет собой бесконечную серию
интегралов и не существует в аналитическом
виде. Его решения могут быть получены
только методами численного
интегрирования. Однако точное решение
уравнения Г4.4 возможно при двух следующих
условиях: «отсутствие диффузии» или
«отсутствие седиментации».
Отсутствие диффузии
В отсутствие диффузии уравнение
Ламма для растворов гомогенных
макромолекул имеет следующее точное решение:
С2 (х, 0 = 0, если i; < х < х, (Г4.5)
С2(х, t) = C0exp(-2.swY) если .г <x<xh,
где С0 — исходная концентрация, а .г = лм
exp(soA)- В графическом виде
уравнение представлено на рисунке Г1.7.
Концентрация молекул изменяется резко от
нуля до значения, которое не зависит от
х в любой момент времени. Ступенчатая
функция определяет границу. Область
х> х называется плато. Уровень плато
понижается со временем из-за
разбавления раствора в секторной ячейке (см.
рис. Г4.7). Положение ступенчатой
функции изменяется во времени как
следствие седиментации вещества.
Отсутствие седиментации
При таком ограничении уравнение
Ламма Г4.4 имеет простой вид:

Рис. I 4.7. Графическое представление
уравнения Г4.5. В отсутствие диффузии
формируется четкая граница, которая переметается
вдоль ячейки в течение времени
(dC/dt) r = -DicPC/dr3),, (Г4.6)
а уравнение для градиента
концентрации:
{dC/dr)t =
= -С0/2 {nDt)v> exp (-x?/4Dt). (Г4.7)
Решение этих уравнений обсуждалось
в секции Г3.2. Коэффициент диффузии
может быть определен при измерении
стандартного отклонения гауссовой
функции по отношению к функции границы,
которая равна {2Dt)Vl. На практике
кривая фадиента концентрации измеряется
как функция времени, в соответствии с
процедурой, описанной в секции ГЗ.4.3
для чистой диффузии (см. рис. Г3.7 а и 6).
Комментарий Г4.10. Аналитические
решения уравнения Ламма в
различных граничных условиях
Решение Факсена: центрифужная
ячейка имеет бесконечные размеры,
диффузия мала (D/a>2sx «1) и рассматривается
только начальное время седиментации
(co^«i;(Faxen, 1929).
Решение Арчибальда: s и D являются
постоянными (Archibald, 1938).
Решение Фуджита: расширенное
решение Факсена для случая, когда D
постоянно, а 5 зависит от концентрации как s =
= s(l(l-£4C)(Fujita, 1956)
Использование этого подхода к
определению коэффициентов диффузии
макромолекул в ультрацентрифуге
обосновано, если значение выражения,
описывающего поток седиментации
(oVi'C, существенно меньше потока
для диффузии D[dC/dx]. На
практике эти условия выполняются для
небольших глобулярных белков с
константой седиментации около 25 при
низкой скорости вращения ротора
(3000-6000 об-мин-1) в ячейке с
предварительным образованием границы.
Зависимое от времени распределение
границы измеряется после
наслаивания (или подслаивания) буфера на
раствор макромолекул.
Г4.4.2. Аналитические решения
Аналитические решения уравнения
Ламма при специфических граничных
условиях известны с 1930г.
(комментарии П. 10). В настоящее время
современные компьютерные
программы позволяют решать это уравнение
в условиях, более приближенных к
эксперименту. Для этой цели
предложены два метода, каждый из которых
дает возможность одновременного
определения коэффициентов
седиментации и диффузии и, как
следствие, молекулярной массы. Выбор
метода зависит от соотношения
вклада диффузии и седиментации в
движущуюся границу.
Первый метод назван по имени
авторов (Ван Хольде и Вайшета) и
базируется на том факте, что седиментация
пропорциональна времени, в то время
как диффузия пропорциональна
корню квадратному из времени (сравните
уравнения Г4.18 и Г3.12). Отсюда
следует, что экстраполяция к
бесконечному времени должна исключать вклад

диффузии в форму границы. Метод
состоит из следующих основных
шагов.
На первом шаге расстояние между
базовой линией и плато для каждого
скана подразделяется на N (обычно
несколько десятков) горизонтальных
сечений N и кажущиеся коэффициенты
седиментации, s*, вычисляются как:
s* = In ((r/rJ/аЧ), (Г4.8)
где г, гм — радиусы сечения и мениска,
соответственно. На втором шаге
значения s* откладываются как функция
корня квадратного из времени для
каждого скана. Пересечение с г/-осью,
которое соответствует бесконечному
времени, дает величину 5,
поправленную на диффузию. Для гомогенных
образцов все линии должны сойтись
к одной точке — одному значению
константы седиментации s. Для
негомогенного образца линии не сходятся
в одной точке и среднее значение при
пересечении с у-осью используется
для вычисления средне-весового
значения коэффициента седиментации,
sk. Затем результаты представляются
в виде графика доли общего седимен-
тирующего материала как функции
s. Такой график характеризует
качество образца. На рисунке Г-1.8 показаны
седиментационные профили
(вставки а, г) и анализ методом Ван Холь-
де-Вайшета для гомогенных (вставки
а, б) и гетерогенных (вставки г—с)
образцов биологических макромолекул
( коммен i ;i|)iiii Г i. I I ).
Второй метод по имени автора
носит название метода Стаффорда и
иногда называется методом временных
производных. В нем распределение
коэффициента седиментации
вычисляется из производной по времени профиля
скорости седиментации. Кажущийся
коэффициент седиментации (т. е. не
6.2 6.4 6.6 6.8 7.0
Радиус (см)
115 120 125 130 135 140 145 150
Константа седиментации S
Рис. I 1.8. Анализ скорости границы седиментации по методу Ван Хольде-Вайшета: а-в —
данные и анализ для белка капсиды II бактериофага Т7 MLD; г-е — данные и анализ для того же
препарата, но в котором к белку добавлено некоторое количество субгеномной ДНК. Скорость
вращения 10000 обмин-1 (Hansen et al., 1994)

К()мм(!1и;1|шй Г4.1 I. Метод
Ван Хольде-Вайшета
При практическом применении метод
требует ярко выраженной области плато и
симуляции данных, которая должна быть
использована для демонстрации
достоверности полученных значений. Метод Ван
Хольде-Вайшета использован Демелером
в программном обеспечении ULTRASCAN
(http://www.canma.uthscsa. edu//),
которое существует в трех коммерческих
версиях в зависимости от операционной
системы.
Метод временных
производных
0.35
0.30
Радиус(см)
1_
п
<1>
(О
9
0)
О
■з
с.
га
0.25
0.20
0.15
Л 0.10
Радиус (см)
< оо
V
0.05
-0.05
s (ед. Сведберга)
поправленный на диффузию), g*(s)t
может быть вычислен из (dc/dt)r согласно
уравнению:
g*(s)r(dC/dt)mip(l/C0)
х (оА2/1п (rjf) (r/r,)2),
(Г4.9)
где 5 — коэффициент седиментации;
со — угловая скорость ротора; CQ —
исходная концентрация; г и гм —
текущий радиус и радиус мениска,
соответственно. В этом методе константы
седиментации получаются следующим
g(s*) анализ mAb + партнер
For mAb
S20 w = 6.85 S
D20,W=4.33F
Ms/D = 144 kDa
Mms = 146 kDa
/ Для mAb +
партнер
s20,w =7.31 S
Ms/D
Mms :
= 2.71 F
= 245 kDa
= 237 kDa
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
s*(efl. Сведберга)
io.c
Рис. I 1.9. Иллюстрация метода Стаффорда (я—в см. текст). Типичный результат представлен
в г в виде функции g (s*) для моноклональных антител (mAb) и их комплекса с белком.
Молекулярная масса для mAb определена методом комбинации констант s и D и оказалось равной
144 кДа с ошибкой в 1,4%. Масса этого же белка, определенная с помощью масс
спектрометрии равна 146 кДА. Для комплекса mAb с белком молекулярная масса в 245 кДа была
вычислена из комбинации констант s and D, с ошибкой 3,8%. Масса того же белка, определенная с
помощью метода масс-спектрометрии, равна 237 кДа. Высокая точность метода АУЦ связана с
тем, что были проанализированы все данные из 40 сканов, каждый из которых содержал около
1000 точек (Hensley, 1996). Отметим, что улучшенная коммерческая версия метода Стаффорда
(DCDTPLUS) доступна на сайте Philo (http://www. jphilo. mailway. com)

способом (рис. П.9<7). Близко
расположенные две седиментационные
кривые вычитаются друг из друга,
давая дифференцированную кривую
(отсюда название «метод
производных») как показано на рисунке \'\.\)6.
Каждый седиментационный профиль
будет иметь гауссову форму, похожую
на таковую, получаемую при
использовании шлиреновской оптики (dC/dr)
(см. рис. Г-1.3). Затем кривые
нормализуются на время и накладываются друг
на друга. На последнем этапе они
нормализуются на концентрацию.
Результирующий пик имеет гауссову форму,
положение и ширина которого связаны
с константой седиментации и
диффузии, соответственно (рис. I-19 ч).
Г4.4.3. Численные решения
Использование численных решений
уравнения Ламма для прямого анализа
данных аналитического
ультрацентрифугирования известно уже около 30 лет.
Однако относительно недавно, в
основном благодаря возросшей мощности
компьютеров, они стали
использоваться для анализа данных аналитического
скоростного
ультрацентрифугирования. Главное преимущество численных
решений состоит в том, что с их
помощью можно учесть практически все
граничные условия, накладываемые
конечной длиной центрифужной ячейки
и эффектами диффузии.
Г4.5. Скоростная
седиментация
В аналитическом
ультрацентрифугировании имеются два
комплементарных метода с различными
экспериментальными протоколами, но
с использованием одного и того же
оборудования: скоростная
седиментация и равновесная седиментация
(r;io.I. I'l.l). В первом из них
используется высокая скорость ротора и
длинные ячейки, с тем чтобы получить
максимальное разрешение, обеспечить
информацию о размере и форме
молекул, а также их взаимодействиях. При
равновесной седиментации, напротив,
используется низкая скорость ротора
и короткие ячейки, с тем чтобы свести
к минимуму время, необходимое для
установления равновесия и обеспечить
информацию о молекулярной массе,
константах ассоциации и
стехиометрии. На рисунке П. 10 приведены
типичные данные экспериментов по
скоростной седиментации (часть а) и по
равновесной седиментации (часть б).
Г4.5.1. Макромолекулы в сильном
гравитационном поле
Стандартным способом определения
массы частицы является сравнение ее
относительного ускорения под
действием силы известной величины с
ускорением частицы-стандарта с известной
массой. Наиболее удобно использовать
силы на макроскопической шкале, т. е.
под действием силы тяжести Земли.
Однако действие этой силы на
биологические макромолекулы настолько
мало, что перевешивается силами,
возникающими от соударений между
молекулами в результате их хаотического
движения.
Простые вычисления показывают,
что на молекулярном уровне тепловая
энергия намного превосходит
гравитационную потенциальную энергию и,
следовательно, направленное движение
молекул в фавитационном поле Земли
невозможно (ко.м.меп lapuii П. 12). Од-

Г;п>лм!1,-| I ■'!. 1. Два типа экспериментов в аналитической ультрацентрифуге
Обсуждаемая характеристика
Угловая скорость
Тип анализа
Тип измерения
Вычисляемые параметры
Скоростная седиментация
Большая (как правило);
выбирается согласно седи-
ментацпонным свойствам
частицы
Концентрация как функция
времени и расстояния в
течение нескольких часов
Наблюдение за движением
границы
Размеры и конформация
частиц
Равновесная седиментация
Небольшая (как правило);
выбирается согласно седи-
ментационным свойствам
частицы
Концентрация как функция
расстояния после
достижения равновесия (24 часа
и более)
Наблюдение за
распределением концентрации молекул
в ячейке
Молекулярная масса
иполидисперсность
ним из способов обойти эту трудность
является повышение эффективной
гравитационной потенциальной энергии
до значений больше, чем kT, путем
перенесения частиц в ячейку,
вращающуюся с высокой скоростью.
Рассмотрим частицу массой т и
плотностью р0, находящуюся в
секторной ячейке, которая находится в роторе,
вращающемся вокруг z — оси, с угловой
скоростью со, и движущуюся через рас-
Скорость седиментации
Мениск \
раствора
Базовая пиния
творитель с плотностью р0 (коммпп-;.
pirn I'i.!.'!). На молекулу действует три
силы: гравитационная F,
выталкивающая, Fh, и сила сопротивления среды, Fd
(рис. П. 11). Гравитационная сила в
ультрацентрифуге пропорциональна массе
частицы т и ее линейному ускорению
F = ты2г,
(Г4.10)
Седиментационное равновесие
Мениск
растворителя
Радиальное расстояние (г) Радиальное расстояние (г)
а б
Рис. I"1.10: а — вид границы в экспериментах по скоростной седиментации. На рисунке
воспроизведены восемь следующих друг за другом седиментационных профилей. Образец — олигонук-
леосомы в ингжосолевом буфере. Скорость вращения 20 000 об/мин. Направление седиментации
слева направо. Сканирования проводились через 8 минут (самое первое сканирование
обозначено как tt; последнее зарегистрированное сканирование как rs). Базовая линия регистрируется по
поглощению растворителя. Центрифужная кювета состоит из двух секторов; б — данные
равновесной седиментации этого же образца, полученные после центрифугирования при 1600 обмин '
в течение 72 часов. Радиальное положение границы раздела фаз воздух — растворитель в секторе
отмечено как «мениск образца» (Hansen et al., 1994)

Комментарий Г4.12. Сравнение гравитационной потенциальной и тепловой
энергий
Вычислим разницу в значении гравитационной потенциальной энергии между двумя
точками, отделенными друг от друга вертикально расстоянием И для молекулы с молекулярной
массой М.
Пример1.Л/= 10:'Дан/; = 1 см. Тогда М = 10r'/(6.03.102G) = 1.610 "кг(при использовании
числа молекул в кг-молях). Ускорение, обусловленное гравитацией Земли, равно 10 мсек -, а
разница потенциальной энергии, Et, будет равна: Е t = mgh =1.6-10 22-10-10 - = 1.6-10м Джоуля
(J). Тепловая энергия -£Г(где Т — абсолютная температура) и при комнатной температуре
она будет равна: kT= 1.38-10 2:iJ/°K 293°K = 400-10"-^. Отсюда следует, что гравитационная
потенциальная энергия меньше тепловой энергии в 250 раз, и, следовательно,
экспериментальное определение седиментации такой частицы, обусловленное гравитацией поля земли,
невозможно.
Пример 2. М = 109 Да и h = 100 см. Аналогичные вычисления для такой молекулярной
массы и такого расстояния показывают, что в этом случае гравитационная потенциальная
энергия больше тепловой энергии в 400 раз и, следовательно, экспериментальное
определение константы седиментации такой частицы при использовании естественной гравитации,
, в принципе, возможно.
где г — расстояние от оси вращения.
Под влиянием этой силы частица будет
двигаться в окружающей ее среде по
направлению от оси вращения.
Выталкивающая сила равна по величине весу
Комментарий Г4.13. Механический
и термодинамический подходы
Исследования процессов седиментации в
этой главе обсуждается в терминах простых
механических моделей. Такая постановка !
вопроса сопряжена с некоторыми
неоднозначностями при интерпретации, которые
можно избежать только при строгом термо- .
динамическом подходе. ',
Гравитационная сила: Fc = mco r
Выталкивающая сила: Fb = -m0co r
Сила трения: Fd = - fu
г
и
Рис. I А. 11. Три силы, действующие на частицу в ячейке центрифуги (см. текст)
жидкости, вытесняемой частицей ( кпм
Mi'ii lapiiii П. I i)
Fh = -m°a2r. (Г4.11)
Результирующая суммарная
«гравитационная» сила равна:
F + F' = (тп - тп°) со2г =
(Г4.12)
= тгаа>-г(1 -р0/р).
Выражая величину плотности
частицы, р, ее обратной величиной,
парциальным удельным объемом, х> (см.
секцию Г4.8) мы получаем:
- угловая скорость
-расстояние от центра вращения
• скорость молекул

I Комментарий Г4.14. Архимедова
сила: макроскопический и
микроскопический подходы
Принцип Архимеда гласит: «на тело,
плавающее и жидкости, действует сила, рав-
ная весу жидкости в объеме, вытесненном
телом». Хорошо известно, что закон был
сформулирован для макроскопических тел,
■ находящихся в жидкости. В этой связи воз-
| пикает вопрос: может ли микроскопическое
'■ тело (в нашем случае молекула, помешенная
в жидкость) считаться физическим телом,
помещенным в эту же жидкость? Имеется
строгое определение архимедовых сил,
действующих на индивидуальные молекулы: «на
тело, помешенное в жидкость, действует
выталкивающая сила, равная весу жидкости в :
таком объеме, который становится недоступ- ;
ным его молекулам». Под недоступным объ- ;
емом в данном контексте понимается исклю- j
ченнып объем или ко-объем (см. параграф
Г2.5.1) (Luboshitzand Podgoretskii, 1991).
F. +Fb = ma2r(l - v p0). (Г4.13)
И, наконец, третья сила, сила
трения, действующая на частицу, зависит
от ее скорости, и, и коэффициента тре-
п\\я/Ftl=fu (уравнение Г1.9).
Частица достигнет постоянной
скорости, когда суммарная сила, действующая
на частицу, станет равной нулю, т. е.
седиментации большинства
биологических частиц очень малы, и для удобства
за единицу константы седиментации
принимается 1 х Ю 13 сек. Такая
единица называется 1 сведберг (IS) в память
фундаментального вклада Тео Сведберга
в теорию и практику метода
аналитического ультрацентрифугирования.
Г4.5.2. Определение
седиментационных и диффузионных
коэффициентов из данных
скоростной седиментации
i Простые системы: метод средней точки
В стандартном эксперименте по
скоростной седиментации ячейка
центрифуги вначале содержит раствор,
концентрация которого постоянна по всей ее
длине. В процессе центрифугирования
частицы движутся под действием
гравитационной силы, мениск осветляется
и формируется движущаяся граница
(рис. 11.12). За скорость движения
границы и стандартно принимается из-
dr
F+F +F, = 0,
(Г4.14)
mco2r (1 — vp0)=fu. (Г4.15)
Умножая уравнение Г4.15 на число
Авогадро и помещая экспериментально
измеряемые параметры в левую часть
уравнения, а молекулярные параметры
частицы в правую, мы получаем:
s = w/coV = M(l - vp0)/Nj. (Г4.16)
Отношение измеренной скорости
частицы к ее центрифужному ускорению
называется константой седиментации —
5. Ее размерность — секунда. Константы
менение радиальной координаты
dt
в средней точке. Значение скорости и
d,'cP 2
можно представить как и - —*- = со rs,
где со — угловая скорость; s — константа
седиментации.
После интегрирования получаем
Чр('о)
= <B-s(t-t„). (Г4.17)
Построение зависимости In
';Р(0
'с Со)
от (t~ta) позволяет вычислить
константу седиментации макромолекул.
Заметим, что этот метод применим
только для «идеальных» растворов, т. е.
для растворов, содержащих одинаковые

Мениск
Граница
CJ>
со
/• = 0
s = ( l/co:)dlnrb/dt
Радиус (см) Время (сек)
Рис. 11.12. Гипотетическая граница седиментации, показывающая мениск, эквивалентный
положению границы, плато и базовую линию. Традиционное рутинное определение константы
седиментации базируется на графическом представлении логарифма радиального положения
средней точки границы седиментации от времени
и невзаимодействующие
макромолекулы. В случае смеси, содержащей два типа
макромолекул, которые имеют большие
молекулярные массы (100 кДа и более)
и достаточно сильно различаются
между собой по молекулярной массе, можно
вычислить две константы седиментации,
характеризующие каждый тип молекул
по отдельности. Однако в общем случае,
когда молекулярно-весовое
распределение заранее неизвестно, применение
метода «средней точки» может приводить
к большим ошибкам и в современной
практике аналитического
центрифугирования не используется. Кроме того, в
качестве обязательного условия метод
требует наличия на седиментограмме
четкого плато и базовой линии, что
затрудняет его применение к белкам с
молекулярной массой меньше 30 кДа.
Заметим, что для грубой
характеристики полидисперсных систем
наиболее подходящим является метод
вторых моментов, дающий седимента-
ционный коэффициент весового
усреднения 1 |>с>\1\ц": i.'iL'M I';. i "i >.
Сложные системы: комплексный
анализ седиментационной границы
Анализ данных скоростной
седиментации сложных систем требует более
трудоемких подходов для анализа
параметров по сравнению с методом средней
точки. В случае очень больших частиц,
для которых разделение достигается в
течение времени эксперимента, анализ
с высоким разрешением может быть
выполнен рутинным методом средней
точки. Рисунок 113 является хорошим
примером такого случая, когда константы
седиментации двух рибосомных
субчастиц (50S и 30S) легко вычисляются из
седиментационного профиля в их смеси.
Однако для малых частиц
диффузионное расширение создает большие
трудности в решении задачи о
распределения компонентов, делая невозможным

; i ,': 'i ■:.■■.,.; "•'1 ! Метод вторых
моментов
Метод вторых моментов является очень
удобным методом для точной оценки рас-
' пределения коэффициентов седиментации
■ в случае слабо асимметричной популяции
в смеси. Его использование позволяет
вычислить положение гипотетической
границы. По скорости перемещения положения
этой границы можно найти средневесовой
коэффициент седиментации. Метод
второго момента наиболее удобен в применении
к данным, полученным из кривых dC/dx от
х (шлнреновская оптическая система), по
которым вычисляется положение эквива-
■ лентной границы (второй момент кривой
градиента показателя преломления):
<г2>=^ . (А)
Однако, когда данные получены из
кривых С отх (интерференционная оптика или
оптика поглощения), то удобнее вычислять
эквивалентное положение границы по
следующему уравнению:
}r2rfc
</-2>=^ . (Б)
\dc
разделение компонентов, отличающихся
по константе седиментации в таком же
отношении, как и для рибосомных
частиц. Методы Стаффорда или Ван Холь-
де—Вайшета, описанные ранее в этой
главе (параграф Г4.4.2), являются очень
удобными для работы в этих режимах.
Хотя каждый из них имеет свои
достоинства и недостатки, однако главная их
особенность очевидна: они являются
безмодельными, т. е. не требуют
никакого априорного знания о параметрах
седиментирующих компонентов.
Однако, если допустить, что имеются
заранее известные сведения о параметрах
компонентов в смеси (такой подход мы
будем называть модельным), то такой
анализ может обеспечить гораздо более
высокую точность в распределении, хотя
математическая обработка при этом
гораздо более сложная, чем в методах
Стаффорда или Ван Хольде- Вайшета.
Суть проблемы коротко сводится
к следующему. В отсутствие
взаимодействия между макромолекулами
экспериментально наблюдаемый профиль
непрерывного распределения масс может
быть описан суперпозицией профилей с
(М), молекулярная масса которого
располагается между М и М + dM. Если L
(М, г, t) обозначает седиментационный
профиль монодисперсного вещества с
массой М, находящегося на расстоянии г
в момент времени t, то задача сводится к
решению уравнения Фредгольма первого
рода в условиях реального эксперимента:
s(r,t) = jc(M)L(M,r,t)dM,(T4A8)
где s (r, t) обозначает экспериментально
наблюдаемый сигнал, получаемый с
некоторой ошибкой. Заметим, что задачи
такого рода часто встречаются в ряде
областей физики. Типичным примером
является метод динамического
рассеяния света (Глава ПО).
В случае скоростного
ультрацентрифугирования разбавленных
растворов ядро L (M, r, t) уравнения Г4.18 есть
решение уравнения Ламма, которое
теперь имеет вид:
1нгл 11 (Г4Л9)

где s(M) и D(M) есть седиментационные
и диффузионные коэффициенты
частицы, соответственно. Они оба сильно
зависят от молекулярной массы (параграфы
ГЗ.7.3 и Г4.10.1) и связаны между собой
уравнением Сведберга (смотри ниже).
Программа SEDFIT П. Шука (P. Schuck)
для анализа частиц, имеющих
непрерывное распределения по размерам,
доступна на сайте http://\vww. analyticalultrace
ntrifugation. com.
В программе SEDFIT проблема
устойчивости достигается наложением
физически разумного ограничения на
решение — положительностью
получаемых величин. Кроме того, в уравнение
Г4.18 добавляется стабилизирующий
член, называемый регуляризационным.
Проблема однозначности требует
введением априорного знания
парциального удельного объема гЗ и
гидродинамической формы частицы, вычисляемой
как отношение ее реального
коэффициента трения к минимальному /// ■
Для сферической белковой частицы
с общепринятой величиной
гидратации (0,3 грамма воды на грамм белка)
это отношение равно 1,2. Для
большинства глобулярных белков это
отношение равно 1,25-1,35, свидетельствуя об
их малой асимметрии. Поскольку для
белков парциальный удельный объем
можно достаточно точно рассчитать из
аминокислотной последовател ьности
(см. секцию Г4.8), то именно
отношение /// „ чаще всего используется как
подгоночный параметр. Заметим, что
отношение/// , не тождественно
отношению///,, которое отражает
геометрический эффект отличия формы
частицы от сферы. Для сферической частицы
///о" 1-0-
На рисунке Г4.13 приведено
несколько примеров, описывающих
применение программы SEDFIT для
исследования изолированных оелков и их
смесей. Из него видно, что с помощью
программы SEDFIT можно разрешать
дискретные компоненты смеси,
отличающиеся но молекулярной массе в два
раза и больше. В том случае, если это
отношение меньше двух (смесь оваль-
бумина и бычьего сывороточного
альбумина, отношение молекулярных масс
этих двух белков равно 1,55), программа
SEDFIT не разделяет компоненты смеси,
кроме визуализации димеров БСА, как и
в предыдущих случаях (рис. 1113,
нижняя правая четверть). Основный пик
является сложным, его параметры близки к
средним значениям для двух
компонентов смеси. Следует заметить, что во всех
экспериментах, проведенных на смесях,
исследованные белки имеют близкие
величины парциальных удельных объемов
и не взаимодействуют друг с другом.
Г4.5.3. Очень гетерогенные
системы
В стандартных экспериментах по
скоростной седиментации используется
только одна заранее выбранная
скорость ротора. Это сразу ограничивает
область исследуемых молекул но
константам седиментации. Так, при
скорости вращения ротора 50000 обмин ' и
обычном значении ускорения ротора,
400 об-сек ', частица, которая пройдет
путь, равный половине длины ячейки,
будет иметь константу седиментации
280S. Тем самым выбор одной угловой
скорости сильно ограничивает
интервал доступных наблюдению констант
седиментации. Этот интервал может
быть существенно расширен
варьированием скорости ротора — от
относительно маленькой скорости, позволяющей
вести наблюдение за самыми большими
частицами, и до самой большой скоро-

lit
Т1Д"""'
Расстояние от центра вращения, (см)
Коэффициент седиментации. (S)
Расстояние ot центра вращения, (см)
Коэффициент седиментации, (S)
Расстояние от иентра вращения, (си)
Расстояние от иентра вращения, (см)
в г
Риг. П. 1.4. Примеры применения программы SEDFIT для исследования изолированных белков
и их смесей.

Верхняя левая четверть, а — седиментограмма бычьего сывороточного альбумина.
Молекулярная масса, рассчитанная из первичной структуры, составляет 66,413 кДа. Концентрация
С = 1,5 мрсм \ V) = 0,733 см'г ', угловая скорость «ращения ротора со = 40 000 обмин '.
температура 7"= 20 "С. Сканирование: 20 сканов через 240 сек, оптическая плотность по измерению в
ячейке АУЦ равна 1,0 о. е. 6, в — восстановленные распределения в координатах с (л) от .у и с (Л7)
от Л/, соответственно. Верхняя правая четверть. Седиментограмма смеси из двух белков,
состоящем"! из бычьего сывороточного альбумина и бычьей карбоангидразы. Концентрация БСЛ равна
2,0 мг-см ', карбоангидразы — 0,7 мг-см '. Угловая скорость вращения ротора со = 50 000 обмин ',
температура Т= 20 °С. Сканирование: 30 сканов через 240 сек. оптическая плотность по
измерению в ячейке АУЦ равна 1,3 о. е. б, в — восстановленные распределения в координатах с (х) ot.s- и
с (Л/) от М, соответственно. Нижняя левая четверть. Седиментограмма смеси из трех белков,
состоящей из бычьего сывороточного альбумина, карбоангидразы и апоцитохрома. Концентрация
БСА равна 2,4 мг-см \ карбоангидразы — 1,1 мг-см ■', апоцитохрома — 1,4 мг-см :|. Угловая
скорость вращения ротора со = 50.000 обмин1, температура Т= 20 "С. Сканирование: 45 сканов через
480 сек, оптическая плотность по измерению в ячейке АУЦ равна 1,5 о. е. б, в — восстановленные
распределения в координатах с (s) от s и с (М) от М, соответственно. Нижняя правая четверть.
Седиментограмма смеси двух белков, состоящей из бычьего сывороточного альбумина (БСА) и
яичного овальбумина. Буфер: 50 мМ Трис IIC1, 100 мМ NaCl (pll 7,6). Концентрация БСА равна
2,8 мг-см'-1, овальбумина — 2,4 мг-см '. Угловая скорость вращения ротора со = 50 000 об/мин,
температура Т= 20 °С. Сканирование: 21 скал через 480 сек, оптическая плотность по измерению
в ячейке АУЦ равна 1,8 о. е. б, в — восстановленные распределения в координатах с (s) от s и с
(М) от М, соответственно. Прерывистой линией указано положение молекулярных параметров
для индивидуальных белков (Сердюк и Евсеева, 2006)
Условные обозначения к рисунку Г4.13
сти — для выявления самых маленьких
частиц. Данные, полученные для
каждой скорости, объединяются в одну
непрерывную функцию распределения.
Протокол такого эксперимента,
позволяющего наблюдать частицы в
интервале значений s от 200 000S до 2,0S,
приведен в пи'иппг I \.'1. При каждом
разгоне на установление скорости
уходит до 600 сек. На конечной скорости
50000 об-мин-1- центрифугирование
продолжается до тех пор, пока
наименьшие частицы не достигнут середины
пути до дна кюветы. На рисунке П. 11
показано применение этого протокола
к раствору гемоцианина. В
соответствии с методом Стаффорда (параграф
Г4.2.2) построены графики значений
sxg(s*) от ln(s*). Как видно из этого
рисунка, в образце гемоцианина
выявляются четыре компонента со
значениями констант седиментации s: 5, 16, 40
и 60S, соответствующими мономерам,
гексамерам, 24-мерам и 36-мерам. Этот
результат показывает, что при
использовании вышеописанного протокола,
можно исследовать очень гетерогенные
СИСТеМЫ ( ki'MMi'l! i;:;>ilii I i. l(i).
Г4.5.4. Коэффициенты
седиментации биологических
макромолекул
Коэффициенты седиментации
биологических макромолекул обычно
измеряют в буферных растворах, вязкость
и плотность которых может
отличаться от таковых у воды. Коэффициенты
седиментации могут измеряться также
при различных значениях
температуры. Поэтому принято приводить
реальные данные к «стандартным условиям»,
в качестве которых выбирается чистая
вода при 20 °С:

Гаолица 14 2. Типичный протокол выбора скоростей для анализа очень
гетерогенных систем. Радиус мениска взят равным 5,9 см (Stafford etal., 2004).
Скорость (об/мин)
0-6000
6000
9000
13 000
18 000
25 000
35 000
50 000
50 000
50 000
50 000
50 000
Время на каждой скорости
(сек)
15
600
600
600
600
600
600
3600
3600
3600
3600
3600
s* (при 6,5 см)
(в Сведбергах)
500 000
4220
1300
550
250
125
62
31
7,6
4,4
3,0
2,3
S*(6,5 см) = ln(6,5/5/9)J"((oVt)
S20.ir ~ 5схр
1 "р211"' Л"р , (Г4.20)
i-UPcxp П20,
где s.m к — коэффициент седиментации
молекулы в воде при 20 °С; s.ki. —
экспериментально полученный
коэффициент седиментации молекулы; г|экс —
вязкость растворителя при заданной
температуре Т (°С); r|20 w. — вязкость
воды при 20 "С; р20 — плотность воды
при 20 °С; v — парциальный
удельный объем молекулы. Отметим, что
величина s... может быть вычислена
20. w
! Коммешарии Г4.16. Седиментация
с переменной скоростью вращения
ротора
Техника седиментации с переменной
скоростью ротора была впервые
предложена Д. Ифантисом с сотрудниками в
1981 г. В 1984 г. Мачтле ввел термин «гра-
j внтационное качание» для описания
экспериментов с переменной угловой скоростью
( I'M. |.п\|\|| и | ;:|Щ ."■ I '■■ .(i).
7.0
6.0
6.0
1"
3.0
2.0
1.0
'
'
t
1
i
j.
\ •
\ :
V
:
.-• .
>".'ч.
-
■
:
■
1.000 2.000 3.000 4.000 6.000 6.000 7.000 8.000
И»*)
Рис. I'1.1 i. Зависимость sxg(s*) от ln(s*)
для раствора гемоцианина Limulus polyphemus
в концентрации 2 мг-см"3. Логарифмическая
шкала по оси абсцисс выбрана ввиду
большого интервала значений s. Выбранные скорости:
12 000, 18 000, 25 000,35 000 и 50 000 об-мин"1.
От 50 до 90 сканов выполнены при каждом
значении скорости ротора в течение 20 мин за
исключением самой высокой скорости. На ней
вращение продолжалось в течение 3-х часов.
Точки, полученные при каждой скорости,
обозначены различными цветами. Площади
под пиками равны концентрациям молекул в
зоне границы и соответствуют распределению
каждого пика (Stafford and Braswell, 2004)

даже в случае, когда их седиментаци-
онные характеристики не могут быть
измерены в воде при 20 °С. В
заключение заметим, что коэффициенты
седиментации биологических
макромолекул обычно получаются при
какой-либо конечной концентрации и
поэтому должны быть
экстраполированы к нулевой концентрации (м>м
мгм i;i[);iII I i.! 7 ).
Коэффициенты седиментации
биологических макромолекул
охватывают очень широкую область значений.
Для малых пептидов, глобулярных
белков они лежат в интервале значений от
0,45до1008;длярибосомныхРНК-от48
до 30S; для рибосом и полисом — от 20S
Комментарий Г4.17.
Концентрационная зависимость
коэффициента седиментации
Считается общепринятым, что
концентрационная зависимость коэффициента
седиментации 5 выражается формулами:
s = s°(\ + k'C)-\ (A)
s = s°(\ + k"C), (Б)
где s° — величина при бесконечном
разведении, а к' и к" — эмпирические константы,
выраженные в см3-г~'. Обычно их значения
положительны, т. е. s понижается при
повышении концентрации. Эти уравнения
эквивалентны при малых концентрациях
макромолекул, но расходятся при больших
концентрациях. Уравнение (А) лучше ис- |
пользовать для компактных частиц, а урав- j
нение (Б) — для синтетических разверну- ;
тых полимеров и высоко-асимметричных ;
частиц. В некоторых случаях наблюдается
увеличение s с возрастанием С. Это
характерно для слабо взаимодействующих
макромолекул. Эмпирические константы к' и
к" зависят от формы молекул. Это означает,
что они могут использоваться как
гидродинамические параметры для вычисления ,
молекулярной асимметрии частиц (см. па- j
раграф Г2.5.2). j
до 100S; для вирусов — от 40S до 1000S;
для лизосом — от 4000S; для мембран от
100 000S; для митохондрий - от 20 000S
до 70000S; и для ядер - от 4 000000S
до 40000000S. Обычно, чем больше
частица, тем большим значением s она
обладает. Очень большие молекулы
могут осаждаться в гравитационном поле
Земли (гч. |>ч"млн-;i трип I i.l'i). В i;ii">-
.ii11 =.«.■ 1 !.'' представлены значения
констант седиментации, s,,0 w, парциальных
удельных объемов, гЗ и молекулярных
масс М некоторых представителей
наиболее типичных биологических
макромолекул — начиная от самых маленьких
синтетических пептидов (пептида I,
молекулярная масса 2 кДа) и заканчивая
большими олигомерными белковыми
комплексами (гемоцианин,
молекулярная масса около 9 МДа). В i;,i'uin;i I i.i
представлены аналогичные данные для
нативных ДНК и ее фрагментов.
Обсуждение данных, представленных в
этих таблицах, будет дано позже
(секция Г4.10).
Г4.5.5. Дифференциальная
седиментация
Неопределенность, обусловленная
скоростью и температурой ротора,
является причиной ошибок при измерении
коэффициентов седиментации. Их можно
избежать, если поместить образцы в
одну и ту же двухсекториую ячейку в
одном и том же роторе. В первых
экспериментах была использована шлире-
новская оптика и двухсекторная ячейка.
Одна из ячеек была оснащена
устройством, обеспечивающим возможность
получения двух отдельных шлиренов-
ских пиков на одном снимке. В
дальнейшем для этой цели использовалась
интерференционная оптика. Каждое
отделение в двухсекторной ячейки за-

ТаПлица Г4.3. Молекулярные массы М, константы седиментации s20ki ,
парциальные удельные объемы ь , пептидов и белков в водных растворителях. Красным
цветом отмечены белки, не имеющие в растворе глобулярной конформации
Пептиды и белки'*
(данные взяты из различных
литературных источников)
Синтетический пептид I
Синтетический пептид II
Синтетический пептид III
Липаза
Инсулин (дпмер)
Цитохром С
Рибонуклеаза Л
Лижщим
а-Лактальбумин
Мпоглобин
Папани
а-Химотрипсин
Химотрипсиноген Л
Эластаза
Субтнлизин
Карбоангидраза
Рибофлавин связывающий белок
Карбоксипептидаза
Пепсин
(З-лактоглобулин, (димер)
/Домен кинезина (конструкт) К366
Яичный альбумин
Бычий сывороточный альбумин
Гемоглобин
Антакс (защитный антиген)
TpiiiuiMiin.iiin
Лактатдегндрогеназа
(З-лактог.чобулни А, (октамер)
Апо-глицералифосфатдегпдрогеназа
Альдолаза
Малатспитетаза
Каталаза
Глюта.матдсгндрогепаза

Молекулярная масса
(Да)
2049
2777
3505
6669
11466
12 400
13 683
14 305
14 180
17 836
23 350
25 000
25 767
25 900
27 537
30 000
32 500
34 472
34 160
36 730
41404
44 000
66 300
64 500
85 000
!).'{ 000
138 320
146 940
142 870
156 000
170 000
248 000
312 000
Константа
седиментации
с»
Л20.,г
(ед. Сведберга)
0,37
0,45
0,52
1,14
1,60
1,80
1,78
1,91
1,92
1,98
2,42
2,40
2,58
2,60
2,77
3,0
2,76
3,2
2,88
2,87
3,25
3,6
4,50
4,60
5,01
2.(i
7,54
7,38
7,60
7,40
8.25
11,3
11,4
Парциальный
удельный
объем Ь
(см3-г')
0,706
0,715
0,720
0,7137
0,744
0,707
0,696
0,702
0,704
0,741
0,723
0,736
0,736
0,73
0,731
0,735
0,720
0,725
0,725
0,751
0,733
0,74
0,735
0,749
0,762
0,71
0,741
0,751
0,737
0,742
0,735
0,730
0,749

Продолжение таблицы Г4.3
Пептиды и белки*'
(данные взяты из различных
литературных источников)
ФпмрШКНЧ'Н
Апоферритин
Уреаза
Мио:(1Ш
Глутаматдегидрогеназа
Гемоглобин улитки
Гемоцианин

Молекулярная масса
(Да)
.4.40 000
467 000
482 700
570 000
1015 000
3 500 000
8 950 000
Константа
седиментации
Л20м-
(ед. Сведберга)
7,6
17,6
18,6
6.-1.Ч
26,6
58,9
105,8
Парциальный
удельный
объем V
(см3-г"')
0,706
0.750
0,742
0,728
0,73
0,747
0,72
* данные взяты из различных литературных источников.
Таблица Г4.4. Коэффициенты седиментации ДНК в форме двойной спирали
Образец
Фрагменты, полученные
разрезанием фага ДНК РМ2
рестрикционной нуклеазой
Нае III (KovacicetaL, 1972)
Нативная ДНК:
0Х 174RF
XDNA
T4DNA
T2DNA
Длина молекулы
(в парах оснований)
12
20
50
94
117
145
160
263
288
322
498
592
642
794
854
1310
1606
1735
5386
39 937
48 502
168 903
172 000
Коэффициент седиментации
s°0(r (ед. Сведберга)
1,86;'
2,54'
3,51
4,58
4,92
5,20
5,41
6,24
6,37
6,70
7,62
7,89
8,03
8,59
8,72
9,99
10,67
10,78
14,3
32,0
34,4
62,1
64,5

Образец
ДНК, тщательно
фракционированная гсль-хроматогра-
фпеп;
отношение Мп/Мп
не более 1,1
Длина молекулы
(в парах оснований)
3681'
2891'
172ь
136ь
133ь
1111'
68ь
Коэффициент седиментации
52°о,« (еД- Сведберга)
7,2
6,3
5,7
5,4
5,4
4,7
3,92
а) седиментационные коэффициенты фрагментов длиной 12 и 20 пар оснований вычислены
из их диффузионных коэффициентов (i \i. i.n'u. I i. i) согласно уравнению Сведберга
(уравнение Г.4.22);
б) отношение Mw/Mn, равное 1,1, означает весьма узкое распределение по молекулярной
массе (■ ч .< >\ivi '■ i .:;■>: 111 I i '' ]
полняется двумя растворами. Если два
раствора идентичны по седиментиру-
ющим свойствам, то
интерференционное изображение будет состоять из
серии прямых полос, параллельных
друг другу. Если граница одного
раствора движется более медленно, чем
другого, разница в интерференционных
картинах даст результирующую
картину, сходную с таковой, наблюдаемой с
помощью шлиреновской оптической
системы. Заметим, что такой подход
аналогичен дифференциальной
спектроскопии (Главы 31 и 32).
Очень малые изменения в
значениях коэффициентов седиментации
могут быть обнаружены методом
дифференциальной седиментации. Метод
был оттестирован на примере вируса
карликовой кустистости томата.
Различия в величинах констант
седиментации имитировались добавлением в
буфер определенного количества
тяжелой воды. Результаты показали, что
как чувствительность, так и точность
метода дифференциальной
седиментации равны 5 % даже для значений As/s
ниже, чем 0,002.
Г4.6. Вычисление
молекулярной массы
по данным седиментации
и диферузии
Заменяя в уравнении Г4.15
коэффициент трения частицы на ее коэффициент
диффузии мы получаем для отношения
s/D следующее выражение:
s = М(1-цр„)
D RT
(Г4.21)
Его можно переписать и получить
первое уравнение Сведберга, которое
позволяет вычислить молекулярную
массу комбинацией седиментации
и диффузии (u'oMMri: i;i|)ii!i I i.lN и
I i.l'i).
RT
M =
(Г4.22)
D (l-up0)
Заметим, что при выводе уравнения
Г4.22 предполагается, что
поступательное трение одинаково проявляет себя
в явлениях диффузии и седиментации.
Иными словами величины /d и /.
являются идентичными. Такое
предположение является строго корректным

Комментарии Г4.18. Молярная масса
Использование единиц системы СИ в уравнении Сведберга (Г4.22) приводит к получению
значения М, обозначаемого, как молярная масса, в единицах кгмоль '. Мы напоминаем, что
(см. Главу Б1) относительная молекулярная масса или относительный молекулярный вес
являются безразмерными относительными величинами, определяемыми как отношение массы
молекулы к 1/12 изотопа массы углерода '-С (очень близкое к значению li-моль ').
Молярная масса (кгмоль1) может быть переведена в молекулярный вес делением на 10 '
гмоль ' (что эквивалентно умножению на 1000 и устранению размерности). Биохимики
продолжают использовать молекулярную массу, выражая ее в дальтонах (Да) или в единицах
атомной массы (1 дальтон = 1 единице атомной массы, которая является эквивалентом '/,., массы
одного атома углерода |2С).
Комментарий Г4.19. Вычисление молекулярной массы
Для примера вычислим молекулярную массу макромолекулы, которая имеет парциальный
удельный l5 = 0,74 см3/г и движется в воде при температуре 20 °С; ее коэффициент
седиментации s°20w равен 14.2S, а коэффициент диффузии равен £)",,(1" 5,82 х 10 7 см-сек '.
В соответствии с уравнением Г4.20 имеем:
м = ^_ДГ_ = 14,2x10-3(8,31x10^)293 =
Dim 1-iJPo 5,82xl(T7(l-0,74x0,998)
только с теоретической точки зрения.
В реальности, /d и /. измеряются в
разных экспериментальных условиях: /,
под действием слабых или близких к
нулю термодинамических сил, а /. под
действием сильных гравитационных
полей. Такие поля могут
деформировать эластичную молекулу или
ориентировать асимметричную молекулу.
Экстраполяция величины 5 к нулевой
угловой скорости позволяет устранить
этот эффект. Полученное таким путем
/. должно быть идентично fd.
Г4.7. Равновесная
седиментация
Г4.7.1. Молекулярная масса
Если центрифугировать долгое время
раствор, содержащий макромолекулы
разной молекулярной массы, то через
некоторое время самые большие
молекулы осядут на дно центрифужной
кюветы, а макромолекулы средней или
малой молекулярной массы
распределятся недалеко от дна кюветы и их
положение не будет меняться во
времени, поскольку установится равновесие
между гравитационными и
диффузионными силами.
В экспериментах но равновесной
седиментации объем изначально
однородного раствора макромолекул
центрифугируется при низкой угловой скорости
по сравнению со скоростью, которая
необходима для проведения эксперимента
по скоростной седиментации (киммси-
lapiii] П.20). Начавшемуся процессу
седиментации противостоит процесс
диффузии. После определенного
периода времени достигается равновесие, в
котором концентрация макромолекул
повышается экспоненциально по
направлению к дну кюветы, по тому же
принципу, как и концентрация газов
распределяется в атмосфере под дей-

ствием гравитационного поля Земли.
Поэтому молекулярная масса
осаждающихся молекул может быть
вычислена по распределению их концентрации
на разных длинах ячейки.
Уравнение, описывающее
распределение концентрации молекул при
равновесной седиментации, получается
приравниванием к нулю суммарного
потока в уравнении Г4.13, поскольку
при равновесии не происходит
изменения концентрации во времени:
т-
= --|—U2r2sC-Dr< (Г4.23)
г [drL
и,следовательно:
D(dC/dr)i-(a2rCs = Q.
Перегруппировывая и подставляя
D из уравнения Сведберга (уравнение
Г4.22), получаем:
d\n(C) 1 dC co2c _
<^-2/2)% dr D ~ (Г424)
М(1-гЗр)(о2
RT
Распределение макромолекул по
концентрации между точками .мениска
а и точкой г подчиняется
экспоненциальному закону:
С (г) =С(а)ехр х
х{со2М(1 -гЗ р)х (Г4.25)
х (г' - dJ)/2RT).
Зависимость In [С (г)] от г'/2
представлена на рисунке П. 15 а для мо-
нодисперсного раствора, а на рисунке
П. 15 6—для полидисперсного раствора.
Комментарий Г4.20. Время
достижения равновесия |
Время, необходимое для достижения
равновесия, пропорционально квадрату
длины столба раствора в радиальном
направлении. Если раствор в столбе длиной
6 мм достигнет равновесия через 72 часа, то
тот же раствор в 3 мм столбе — за 24 часа.
В первом случае угол наклона прямой
линии пропорционален молекулярной
массе. В полидисперсных растворах,
содержащих макромолекулы различной
молекулярной массы, каждая из них
будет распределяться в соответствии
с уравнением Г4.25. Макромолекулы с
наибольшей молекулярной массой
концентрируются у дна ячейки, а с малой
молекулярной массой — у поверхности,
и поэтому кривая зависимости 1п[С(г)]
от ?2/2 имеет изгиб направленный
вверх (см. рис. Г4.156).
Тангенциальный наклон в каждой точке кривой дает
среднее значение молекулярной массы
в соответствующей точке ячейки (
комментарии 1 1.2! ).
В уравнение Г4.25 не входит форма
молекулы. В этом особенность метода
седиментационного равновесия.
Форма макромолекулы действует только
на скорость, с которой
устанавливается равновесие, а не на конечный
результат.
Уравнение Г4.25 может быть
использовано для оценки скорости вращения
ротора, необходимого для установления
равновесия. Со стандартными оптическими
системами точное измерение может быть
выполнено, когда концентрация
понижается в два раза на 1 мм длины образца
я.Еслимолекулярнаямассачастицыравна
50000Да,я = 6см,и гЗ =0,75см3-г \тогда
со = ЮООрадиан-сек ' или 10 400 об-мшг1.
На рисунке 11.16 приведены оптималь-
ныескорости для достижения равновесия,

1.0
0.0
-1.0
-2.0
-ПО
Наклон = M(1
. 1 ... I
пр„)<о'/ЯГ Я
. . 1 . . . 1 . . . 1 . . .
г72
а б
Рис. II. 1 ~r. a — кривая зависимости логарифма равновесной концентрации от квадрата радиуса
для монодисперсных растворов макромолекул. Наклон кривой пропорционален молекулярной
массе макромолекулы; б — кривая логарифма равновесной концентрации против квадрата
радиуса для раствора полидисперсных макромолекул
если молекулярная масса или
коэффициент седиментации образца
приблизительно известен.
Г4.7.2. Константы связывания
Измерение концентрационной
зависимости среднего значения
молекулярной массы является очень полезным
при описании ассоциативных явлении,
например, для определения
количества мономеров, димеров и олигомеров.
Для системы гетерогенных ассоциаций
вида А + В <-> А*В равновесное седи-
ментационное распределение
описывается тремя экспонентами, одна для
каждого сорта ассоциации (экспоненты
в сжатой форме обозначены как ст.):
0.25
100
Приближенный коэффициент седиментации (ед.Сведберга)
I I I I I I I II
1 2 3 4 5 6 10 20 30
е ю
о
а.
о
ю
О
1.0
' ^^5sl
1.0
10 100
Молекулярная масса (кДа)
1000
JIK\
i. 16. Рекомендуемая оптимальная скорость, при которой достигается равновесие, для
молекул с известными молекулярной массой или константой седиментации

C(r) = C„(r)a,,+
+Св(г)ав+Слв(г)аЛ1).
(Г4.26)
Предэкспоненциальные множители
для А*В-ассоциации могут быть
представлены в терминах концентраций А, В, и
константы равновесной диссоциации, КА^.
С(г) = СА(г)ал +
САСВ (Г4.27)
+Св(г)ов+-^алв,
КАП
а из закона действующих масс следует:
С(г)лС(г)в
Клв = ■
И С(Плв =
С(г)лв
С(г)АС(г)в
. (Г4.28)
Равновесные константы
диссоциации могут быть прямо определены из
равновесных седиментационных
данных, согласно уравнению Г4.28.
В качестве примера на рисунке П. 17
показаны данные и анализ равновесных
констант для двух ассоциирующих
белков, образующих обратимо
ассоциированную систему типа мономер-димер-
тетрамер. Величины, определенные для
К]2 и K2i оказались равными 8,3 х 10~6М
и 2,0 х 10"6М, соответственно. На
рисунке Г-Н 7 о показана аппроксимация
данных суммой трех экспонент, а на
рисунке YAM а показана разность между
экспериментальными и расчетными
данными. Зависимость вычисленных
относительных концентраций мономеров,
димеров и тетрамеров представлена на
рисунке П. 17 6 как функция общей
концентрации мономеров. Отметим, что в
экспериментах по равновесной
седиментации можно исследовать
макромолекулы в широком диапазоне концентраций
(10 3-КИМ).
Во втором примере на рисунке II. 18
показана зависимость среднего молеку-
Коммонтарий Г4.21. Среднее
значение молекулярной массы
Вычисление среднего значения
молекулярной массы для полидисперсных
растворов базируется на разном способе
подсчета суммарной массы разных компонентов.
Если вычисление основано на численном
I усреднении, то такой тип среднего
значения известен как средне-численная
молекулярная масса, Мп:
M^ZNm/ZNrZnm, (A)
, где п. есть численная доля молекул с моле-
| кулярной массой т..
! Средне-весовая молекулярная масса Mw
: определяется как
M„=ZNm\/ZNm=Zwm, (Б) '
где wi есть массовая доля молекул с массой т{. \
■ Например, для смеси из двух молекул с мае- \
! сами 10000 Да и 100000 Да М = 55000 Да, а
■ Mw= 91818 Да. Очевидно, что отношение
Afw /M является мерой полидисперсности
системы. Если это отношение меньше 1,1,
то это означает, что молекулы в смеси
имеют близкие молекулярные массы.
лярного веса Мп, для карбоангидразы от
концентрации последней, в интервале
значений, перекрывающих три порядка.
Сплошная линия описывает равновесие
тример-гексамер, а прерывистая —
равновесие димер-тример. Очевидно, что
данные исключают вариант равновесия
димер-тетрамер. Данные коррелируют
с данными кристаллографии,
показывающими димеризацию двух тримеров в
гексамер путем ассоциации N-концов
шести мономеров в шести цепочечную
структуру с гидрофобной центральной
частью.
Г4.8. Парциальный удельный
объем
Определение молекулярной массы
макромолекул методом равновесной седи-

9" 1.5
1.0
Тетрамер
0.5
0.0 -
6.85 6.90
10"
6.95 7.00 7.05 7.10 10-lu 10_а 10 ~° Ю-' 10"° Ю~° 10"
Радиус (см) Суммарная концентрация мономера (М)
а б
I'm-. П. 17: я — данные равновесной седиментации для мутанта V, (легкая вариабельная цепь
иммуноглобулина) и домена REI (белок Бенс-Джонса), анализируемые в терминах мономер-димер-
тетрамер модели (см. текст); б — утолщенная часть кривой показывает область концентраций, при
которых был выполнен анализ. Утонченная часть кривом получена экстраполяцией (Hensley, 1996)
лении одного грамма сухого вещества
(см. Главу Г1).
Стандартная экспериментальная
процедура определения величины
парциального удельного объема гЗ обычно
базируется на серии точных измерений
плотности раствора, содержащего
растворенные вещества различной весовой
концентрации, w:
0.01 0.1 1 10
Концентрация (мгмМ1)
Рис. 14.18. Концентрационная зависимость
молекулярного веса Mw для карбоангидразы из
Methanosarcina thermophila. Сплошная линия
описывает равновесие тример-гексамер (Belhke
and Ristau, 1997)
ментации (секция Г4.6) или
сочетанием методов седиментации и диффузии
(секция Г4.7) требует точных знаний
об их парциальном удельном объеме гЗ.
Для простых двухкомпонентных систем,
содержащих один тип растворенного
вещества в одном типе растворителя (в
нашем случае буфер), гЗ есть
термодинамическая величина, определяемая как
увеличение объема раствора при добав-
p = p0+zc(\-p0v), (Г4-29>
где р и р0 есть плотности раствора
и растворителя, соответственно.
Значения v получаются из зависимости р
от w. Для разбавленного раствора
макромолекул v не зависит от
концентрации макромолекул, а зависимость р от
w представляет собой прямую линию.
Парциальный удельный объем, х>,
обычно выражается в см3-г '. Анализ
уравнения Г4.29 показывает, что для
получения значение гЗ с приемлемой
точностью необходима очень высокая
точность измерений плотности. Так,
для получения точности в 1 % в
величине v, что соответствует точности
3-4 % в определении молекулярной

массы, плотности растворов должны
быть измерены с точностью более, чем
0,000001 часть при концентрации
растворенного вещества 1мг-мл '. Такую
точность очень трудно получить с
помощью стандартной техники, которая
включает пикнометры, магнитные
денситометры, электровесы с
маятниками, вибрационные денситометры
и аналитическое
ультрацентрифугирование в растворителях переменной
плотности. К тому же такие измерения
очень трудоемки.
Еще в 1950 г. Кон и Эдсалл
высказали предположение о том, что
парциальный удельный объем белков и
карбогидратов может быть вычислен с
необходимой точностью по их
аминокислотному или моносахаридному
составу, соответственно, при допущении
аддитивности объемов их остатков
S-Z^W./E.W, (Г4.30)
где W. и гЗ. есть весовые доли и
парциальные удельные объемы,
соответственно, i остатков. Объемы остатков
приведены в чаи.тис II.Л для аминокислот,
a lan.inur n.(i для карбогидратов.
За прошедшие годы было предпри-
нятомногопопытокулучшить
изначальный подход Кона и Эдсалла, например,
учитывать разницу в объемах остатков в
зависимости от их расположения
внутри или снаружи молекулы. Однако все
они не привели к улучшению конечного
результата и на сегодня стало
общепринятым считать, что именно метод Кона
Таблица Г4.5. Парциальные удельные объемы при 25 °С, v
и молекулярные массы М аминокислотных остатков белков*
Аминокислота
Глицин
Алании
Серии
Треонин
Валим
Лейцин
Изолейцин
Пролин
Метионин
Фенилаланин
Цистеин
Триптофан
Тирозин
Гистидин
Аргинин
Лизин
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Глутамин
Аспарагин
М(Да)
57
71
87
101
99
ИЗ
113
97
131
147
103
186
163
137
156
128
115
129
128
115
V (см3-г')
0,64
0,74
0,63
0,70
0,86
0,90
0,90
0,76
0,75
0,77
0,61
0,74
0,71
0,67
0,70
0,82
0,60
0,66
0,67
0,60
* Данные взяты из Colin and Edsall (1965)

Таил и на Г4.6. Парциальные удельные объемы при 25 °С, v и молекулярные
массы, М, Сахаров*
Карбогидрат
Фруктоза
Фу коза
Галактоза
Глюкоза
Гексоза
Сахароза (0.05 М)
Сахароза (0.15 М)
Сахароза (1 М)
Рафиноза
М
180
164
180
180
180
342
342
342
486
v (см3-г')
0,614
0,671
0,622
0,622
0,613
0,613
0,616
0,620
0,608
* Данные взяты из Chervenka (1969)
Таблица Г4.7. Приблизительные значения парциальных удельных объемов и,
для основных типов биологических макромолекул
Макромолекулы
Белки
Карбогидраты
РНК
ДНК
V (см3-г')
0,73 (0,70-0,75)
0,61 (0,59-0,65)
0,54 (0,47-0,55)
0,57 (0,55-0,59)
и Эдселла дает результаты, наиболее
близкие к экспериментальным
значениям (коммсшпрпп \'\У2). Типичные
значения величин гЗдля основных
типов биологических макромолекул
перечислены в r;u'i.nine I 1.7.
Г4.9. Седиментация
в градиенте плотности
Метод седиментации в градиенте
плотности в исследовании нуклеиновых
кислот и белков имеет длительную
историю и сегодня находит широкое
применение в различных областях — от
определения состава генома до
характеристики взаимодействий
белок-детергент, белки-нуклеиновые
кислоты, белки-липиды. Ниже мы опишем
классический подход, базирующийся
на аналитическом скоростном
зональном центрифугировании и равновесной
седиментации в градиенте плотности
( KOMMi'irupilil П.''.'!).
Г4.9.1. Метод скоростного
зонального центрифугирования
Образец раствора, содержащий смесь
частиц, наслаивается на поверхность вещест-
Коммешарии Г4.22. Предсказание
величины парциального удельного
объема
Парциальный удельный объем в
настоящее время вычисляется по
химическому составу белков с помощью программы
, SEDNTEP(Harpazetal., 1994).

ва, создающего градиент повышающейся
плотности (рис. П. 19 а). При
центрифугировании частицы проходят через
градиент, образуя зоны в соответствии
с их скоростью седиментации.
Центрифугирование прекращается прежде чем
частицы, разделенные на зоны, осядут
на дно ячейки (рис. I'll9 о).
Максимальная плотность градиента выбирается так,
чтобы она не превышала ту плотность,
при которой частица находит свою зону.
Плотность и вязкость градиента среды, а
также скорость центрифугирования
влияют на разделение. Растворы сахарозы и
глицерина наиболее часто используются
для создания фадиента при скоростном
зональном центрифугировании.
Линейный фадиент 5-20 % сахарозы является
традиционным выбором для
определения коэффициентов седиментации
белков и нуклеопротеидов. Методом
скоростного зонального центрифугирования
можно разделить смесь молекул по их
: Комментарии Г4.23. Динамический
градиент плотности
Недавно было предложено еще одно
понятие градиента плотности, получившее
название динамического градиента
плотности для осаждающихся растворенных
веществ. Оно основано на численном
решении уравнения Ламма с конкретными
пространственными и временными вариа- j
циями плотности и вязкости локального '
растворителя. Его описание выходит за i
рамки этой книги, и читатель отсылается |
к соответствующей литературе (Schuck, :
2004).
коэффициентам седиментации, которые
определяются их размером, формой и
плавучей плотностью, а также
определить относительную молекулярную
массу (к'пммсп lapiifi Vi.'l'i). Глобулярные
белки с большей молекулярной массой и
большей плотностью осаждаются ближе
к дну пробирки, а таковые с меньшими
размерами и плотностью остаются ближе
Градиент плотности
^ )
Смесь
молекул
• •
О4^'
• " •
Фракция 1
—Фракция 2
—Фракция 3
—Фракция 4
а б
Рис. II. 19. Скоростное зональное разделение смеси частиц в градиенте плотности: а — образец
содержит смесь частиц различного размера, формы и плотности, который наслаивается на
поверхность вещества, создающего градиент. Плотность увеличивается по направлению к дну
пробирки; б — в результате частицы разделяются в зависимости от их размера, формы и плавучей
плотности. Поделенные на фракции молекулы отбираются из различных зон градиента
У

Коммсшарий Г4.24. Получение
коэффициентов седиментации
методом скоростного зонального
центрифугирования
Коэффициенты седиментации,
получаемые методом зонального
центрифугирования в градиенте сахарозы, могут быть
ошибочными для белков с обратимой са-
моассоциацней или взаимодействующих
с другими макромолекулами. Источником :
ошибки является молекулярный эффект
уплотнения, обусловленный высокой кон- ,
; центрацией сахарозы, из-за чего сдвигается
равновесие в пользу ассоциированных
макромолекул. В этом случае рекомендуется
использовать классический метод АУЦ для
точного определения коэффициентов
седиментации (см. секцию Г.4.5).
к поверхности пробирки. Для
иллюстрации метода на рисунке Г4.20 показано
разделение 22S рибонуклеопротеидных
(РНП) частиц методом
центрифугирования в градиенте сахарозы. Пик I
соответствует 22S РНП. Анализ этих частиц дан
ниже в параграфе Г4.10.4.
Г4.9.2. Метод равновесной
седиментация в градиенте
плотности
Большие силы, которые генерируются
при центрифугировании, могут быть
использованы для создания естественного
градиента плотности, образованного
небольшими растворенными молекулами.
Такой градиент может быть достаточно
просто реализован на практике при
использовании солей растворов тяжелых
металлов, таких как цезий хлор (CsCl)
или рубидий хлор (RbCl). В поле
такого градиента исследуемые
макромолекулы будут распределяться по
соответствующим правилам. Рассмотрим
молекулярный раствор, состоящий из
трех компонентов: молекулы
растворителя (компонент 1), исследуемые
макромолекулы (компонент 2), и
низкомолекулярные растворенные вещества (CsCl
и RbCl) (компонент 3).
Из уравнения Г4.23 следует, что
низкомолекулярные растворенные
вещества будут распределяться в
ячейке таким же образом, что и большие
молекулы. Для частиц с малой
молекулярной массой (компонент 3), мы
можем удержать только первые члены
разложения экспоненты в ряд в
уравнении Г4.23 и тогда оно примет вид:
^ = 1 + М:,(1-йр0)сгх
СЛа) (Г4.31)
г' —а'
х——.
2RT
Уравнение Г4.29 показывает, что
в ячейке распределение концентрации
компонента 3 подчиняется
параболическому закону. Поскольку плотность
растворителя является линейной функцией
концентрации компонента 3, то при
равновесии достигается градиент плотности,
который в виде параболы представлен на
рисунке I 121. Если плотность, р,
компонента 2 располагается между двумя зна-
25 г
I
Л
20 • I \
< ! \
10 • / \ II
■ 1 \
00
0 4 S 1? II' -"
Фракционное число
Рис. П.20. Выделение 22S
рибонуклеопротеидных частиц методом центрифугирования в
градиенте сахарозы 5-20%, при 50000 обмин ',
в течение 3 час, при температуре 20 "С, в роторе
SW55(Ulitinetal., 1997)

1.70
1.70
1.70
а б
Рис. Г4.21. Равновесное центрифугирование ДНК в градиенте CsCl: a — распределение
градиента плотности в начале эксперимента; б — параболический градиент плотности при равновесии
чениями крайних плотностей
растворителя, то макромолекула будет устремляться
в ту область ячейки, где ее плавучая
плотность равна нулю, т. е. р = р0. Ширина
полосы компонента 2 является функцией
макромолекулярной массы и крутизны
градиента локальной плотности. Для
молекул с большими молекулярными
массами полосы будут очень узкими из-за
их маленького коэффициента диффузии.
Нативная ДНК, например, дает такие
узкие полосы, что меченая по 15N
(тяжелый азот) молекула четко отделяется от
природной молекулы, 14N (легкий азот)
при равновесном центрифугировании в
градиенте плотности CsCl (комментарии
I \:i7i). Напротив, для веществ с
маленькими молекулярными массами ушире-
ние полос настолько велико, что метод
практически неприменим для
глобулярных белков.
Наиболее удивительным свойством
модели двойной спирали ДНК Уотсона и
Крика является комплементарность двух
цепей ДНК, по принципу которой и
происходит удвоение цени. В результате
появляются две дочерние дуплексные
молекулы ДНК, одна из которых является
родительской цепью ДНК. Этот процесс
получил название полуконсервативного
механизма репликации и показан на
рисунке Г4.22. Для экспериментального
доказательства этого механизма Меселсон
и Сталь поставили опыты, суть которых
кратко состоит в следующем. Они
вырастили клетки Е. coli на среде, содержащей
в качестве источника тяжелого азота,
'"'N хлорид аммония. Затем меченые 15N
азотом клетки Е. coli были перенесены
на среду с обычным азотом 14N для
продолжения их роста. Образцы отбирали
через определенные интервалы времени.
Затем из клеток экстрагировали ДНК,
плавучую плотность которой определяли
методом центрифугирования в градиенте
плотности CsCl. После первого деления
выделенная ДНК шла одной полосой в
градиенте плотности, положение кото-
Комментарий Г4.25. 15N (тяжелые)
и 14N (легкие) изотопы
При равновесной седиментации в CsCl,
различие в плотности молекул ДНК,
содержащих l5N п "N изотопы равно 0,014 гем 3.
Результатом этого является тот факт, что
расстояния в стандартной
ультрацентрифужной ячейке между полосами
таких образцов равны 0,5 мм при скорости
40000 об-мин '. Именно эти изотопы были
использованы в опытах Меселсона и Сталя
по исследованию механизма репликации
ДНК (Messelson and Stahl, 1957).

рой было между зонами ДНК с тяжелым
и обычным азотом (рис. Г1.23»). После
двух делений на 11N среде выделенная
ДНК давала две полосы, одну с
плотностью, равной легкой ДНК, другую с
промежуточной плотностью, равной гибридной
ДНК, наблюдаемой после одного
деления (рис. П.2.'5/). После трех делений
в 11N среде ДНК давала еще две полосы,
подобные тем, которые наблюдались
после двух делений (рис. VA.23 0). Именно
такой результат — наличие полосы с
промежуточной плотностью после первого и
последующих делений, и ожидался при
полуконсервативном механизме деления
ДНК.
Г4.10. Форма молекул
по данным скоростной
седиментации
Уравнение Г4.21 соотносит
коэффициент седиментации, s, с такими
параметрами молекулы, как М, D и v . Как мы
указывали ранее, коэффициент
седиментации зависит от объема и формы
частицы. Он обычно выражается в
понятиях радиуса эквивалентной сферы
(радиус Стокса), но в равной степени
может соответствовать различным
комбинациям «объем-форма».
Например, удлиненная частица малого
объема может иметь тот же радиус Стокса,
что и сферическая частица, но
большего объема (параграф Г2.2.1). Отсюда
следует, что прямое определение
формы молекул по величине
коэффициента седиментации невозможно.
Как мы уже указывали ранее,
молекулы одинаковой формы, но различной
молекулярной массы, образуют
гомологичные ряды (см. секцию Г2.6). В этом
случае соотношение между s и М
следует из уравнения Г2.64:
Рис. 14.22. Полу консервативный механизм
репликации ДНК. Каждый вновь
образованный дуплекс на первой стадии деления (F,)
содержит одну родительскую цепь. I la второй
стадии (F2) генерация состоит из двух
гибридных ДНК и двух полностью новых ДНК.
Вновь реплицированная цепь обозначена
серым цветом, родительская — черным
s = K,Ma, (Г4.32)
где величина экспоненты, а, зависит от
формы молекул в гомологичном ряду
(секция Г2.6). Практическая польза
анализа экспоненты, а, для различных
гомологичных серий
проиллюстрирована ниже (коммгн гарпи Г i.l'(i).
Г4.10.1. Гомологичный ряд
квазисферических частиц:
глобулярные белки в воде
Как следует из изложенного ранее
(параграф Г2.2.1), коэффициент трения, /0,
сферы радиусом, R0, в растворителе
вязкостью, г|0, выражается законом Стокса:
/0 = бпг|0 R0 (уравнение Г2.1). Радиус
сферы связан с ее объемом, V0, как:
4/ЗлД03 = VQ = Mv /NA. (Г4.33)

Рис. I 4.23 Схематическое представление результатов экспериментов Меселсона и Сталя:
а — контроль: смесь тяжелой (15N) и легкой (14N) ДНК; б — исходное деление начинается с
родительской тяжелой ДНК; в — ДНК после первого деления на l4N среде; г — ДНК после двух
делений па UN; д — ДНК после трех делений на 14N среде
Поэтому:
/0 = 6пл0(ЗМй /4л NA)U3. (ТАЗА)
Подставляя этот результат в
уравнение (Г4.16), мы получаем после
перегруппировки:
5-=4,,u1/3/(i- гЗр) =
= M2/3/6ni\0NA2'3 (3/4л)1/3.
(Г4.35)
Таким образом, теоретическая
зависимость s" от М в двойной
логарифмической шкале для ряда сферических
молекул должна быть прямой линией с
наклоном 2/3. Когда s°2ti!i выражается
в единицах Сведберга, а все другие
параметры в системе СГС, то уравнение
(Г4.33) принимает вид:
s* = 12,0xl0"3M2/3. (Г4.36)
Экспериментальная зависимость s" от
М в двойном логарифмическом масштабе
приведена на pi icy икс Г4.24 для
глобулярных белков в широком диапазоне
молекулярных масс по данным, приведенным
в ma mac I i.i. Она хорошо
аппроксимируется прямой линией с параметрами:
5*= 9,1х10-3 М065, (Г4.37)
которые указывают на то, что реальные
глобулярные белки действительно
образуют гомологичный ряд.
Сравнение уравнений Г4.36 и Г4.37
показывает, что хотя экспоненты в этих
уравнениях совпадают, коэффициенты у
них различны. Уравнение Г2.1
предсказывает, что малые отклонения от совер-

шенной сферической формы и
существование гидратационной оболочки меняют
соотношение между радиусом Стокса и
парциальным удельным объемом без
изменения величины показателя степени.
Из этого факта мы приходим к
заключению, что белки по форме очень близки к
сфере и гидратированы приблизительно
в одинаковой степени.
B;;u'.ii!ii\ I i.'i включены три белка,
(тропомиозин, фибриноген, миозин),
которые не подчиняются уравнению
Г4.37. Они отмечены в таблице
красным цветом. Их коэффициенты
седиментации меньше, чем таковые для
глобулярных белков такой же
молекулярной массы (см. рис. Г1.21). Имеются
две предпосылки для такого поведения:
развернутость молекулы или
удлиненная (палочкообразная) форма. Особый
интерес представляет молекула
коллагена, структура которого и его
фрагментов, полученная ультразвуковой
обработкой, обсуждается в коммсп u-
рпн Г1.117.
Г4.10.2. Гомологичный ряд
клубкобразных молекул: белки
в 6М гуанидингидрохлориде или
в8М мочевине
Большинство белков диссоциируют на
отдельные пептидные цепи и
разворачиваются в 6М гуанидингидрохлориде
или в 8М мочевине, содержащих 0,1 М
меркапоэтанола. На рисунке Г4.25
показана зависимость s°20!l, /(1 — v р0) от
п, для белков в 6М
гуанидингидрохлориде в двойной логарифмической
шкале (п — число аминокислотных остатков
в полипептидной цепи, а х> —
кажущийся парциальный удельный объем).
Эта зависимость представляет собой
хорошую прямую линию, которая
соответствует уравнению:
koMM<4i;;ijniM T-l-.^ii. Уравнения
Куна-Марка-Хаувинка (КМХ)
Как мы обсуждали в секции Г2.6, для
гомологичных серим частиц нерпы
следующие уравнения:
hi-К ,„,*/». (Л)
s=KM", (Б)
d = kum ■': (В)
Взаимосвязь между константами а, а и
Ь, выражается как:
Ь + а=1, (Г)
Ь"(1+о)/3. (Д)
Таким образом, для гомологичных
серий должны выполняться следующие
соотношения.
Для жестких палочкообразных частиц:
а= 1,7; а = 0,15; Ь = 0,85. (Е)
Для жестких сферических частиц:
а = 0;а = 2/3;й = 1/3. (Ж)
Для гауссовых клубков в «идеальных»
растворителях:
а = 0,5; а = 0,5; b = 0,5. (3)
Для гауссовых клубков в «хороших»
растворителях:
а = 0,8; я = 0,4; ft = 0,6. (И)
s°/(l - х> р0) = 0,286 и0-47. (Г4.38)
Величина показателя степени а
в уравнении Г4.37 близка к таковой,
свойственной клубкообразным
полимерам в растворителях, близких к
«идеальным» (см. уравнение И кпммш i;:|ч:■;
I i.!!(i и i,i >\!\i( и i;i|)in'i I i.;'N).
Г4.10.3. От коротких жестких
палочек к гибким клубкам:
конформация ДНК
Исследование молекул ДНК является
хорошим примером того, как получить
сведения о форме молекулы по дан-

10'
10'
ю -
1
10э
-
:
;
-
г
-
г
-
S0 -и"3
1-ОРо
^т Фибриноген
^S Миозин
jf Тропомиозин
•
Синтетические пептиды
I 1 1 1 1 Mil 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2/3
i i i ii ill i
i i i i i и
10'
10'
10°
10= 10"
Молекулярная масса (Да)
Рис/. II.21. Зависимость s°,0ri. V>' :'/(1 -Т5р0) от М в двойной логарифмической шкале для
белков в широком интервале значений молекулярных масс, построенная по данным
■ ;;.! I \.'!. Для глобулярных белков наклон прямой, проведенной через экспериментальные
точки, равен 2/3, который типичен для квазисферических частиц. Исключением из этого правила
являются частицы, форма которых отлична от сферической: небольшие синтетические пептиды
(развернутые цепи), тропомиозин, фибриноген, миозин (палочкообразные частицы)
ным седиментации. Уже в 60-70-х гг.
прошлого столетия было известно, что
зависимость константы седиментации
от молекулярной массы для
препаратов ДНК в двойной логарифмической
шкале не описывается одной прямой
линией в широком интервале значений
молекулярных масс. Так, для ДНК в
интервале молекулярных масс Зх 10-'
до 4 х 10° Да зависимость седиментаци-
онных коэффициентов
аппроксимировалась уравнением:
0,116 М032\
.V,,
,Жк „,_.„ , (Г4.39)
а выше 4xlOfi Да — уравнением:
.." Л АО/ Я ^ 0.10Г» (Г4.40)
.у;,,,, 0,034 М01
Следует оговориться, что эти
данные были получены на препаратах
ДНК, каждый из которых не был го-
Комментарий Г4.27. Коллаген
и его фрагменты
При обработке растворов коллагена
кожи теленка ультразвуком получаются
фрагменты разной длины, которые
сохраняют исходную спиральную структуру.
Зависимость коэффициента седиментации от
молекулярной массы может быть описана
как:
4, =0,232 М<
(А)
Небольшая величина экспоненты в
уравнении (А) является неоспоримым
аргументом в пользу того, что коллаген и его
фракции представляют собой
гомологичную серию очень жестких палочкообразных
молекул, для которых асимметрия растет
по принципу «голова к хвосту» (Nishihara
and Doty, 1958). Только такой способ роста
асимметрии молекул обеспечивает малую
величину показателя степени в уравнении
(А) и. напротив, большую величину
показателя степени в уравнении Г2.60.

2.0 2.5 3.0 3.5
Log n (число остатков в цепи)
Рис. Г4.25. Зависимость s20ri,/(l - Ьр0)отп,
для белков в 6 М GuHCl в двойной
логарифмической шкале (я — число аминокислотных
остатков в полипептидной цепи, а V есть
кажущийся парциальный удельный объем)
(Tanfordetal., 1967)
Комментарии Г4.28. «Идеальные»,
«хорошие» и «плохие» растворители
Термин «идеальный» или «тета»
растворитель в полимерной химии означает ра-
1 створитель, в котором второй вириальный
коэффициент равен нулю (см. секцию
А1.2). Иными словами, в таком
растворителе контакты полимер-полимер будут
тождественны контактам
«полимер-растворитель». Термин «хороший»
растворитель означает растворитель, в котором
второй вириальный коэффициент
положительный. В таком растворителе контакты
«полимер-растворитель» будут
предпочтительны контактам «полимер-полимер».
В этом случае молекула набухает и ее
i размеры будут всегда больше размеров
в идеальном растворителе. И, наконец,
в «плохом» растворителе контакты «по- ,
лимер-полимер» предпочтительнее
контактов «полимер-растворитель». В таком >
растворителе молекула поджимается и при
. определенных условиях может выпасть
в осадок (Цветков и др. 1975).
могенен. Большинство препаратов
были получены ультразвуковой
деструкцией исходных нативных ДНК.
В настоящее время имеется
возможность получать гомогенные фрагменты
двуспиральных ДНК и вычислять их
молекулярную массу из нуклеотиднои
последовательностям, что даст
возможность получения более детальных
данных о зависимости коэффициентов
седиментации от молекулярной
массы (рис. П.26). По новым данным для
ДНК в интервале молекулярных масс
от 3 х 105 до 4 х 10е Да, зависимость се-
диментационных коэффициентов
аппроксимируется уравнением:
s2°0„. =0,116M027:\ (Г4.41)
а выше 4 х 106 Да — уравнением:
= 0,034 Мс
(Г4.42)
Сравнение величин вновь
полученных степенных показателей (уравнения
Г4.42) и Г4.41) с ранее полученными
(уравнения Г4.39 и Г4.40) обнаруживает,
что новые данные лучше выявляют
характер как клубкообразного (увеличение
а от 0,405 до 0,440), так и
палочкообразного состояния (а уменьшается от 0,325
до 0,273).
Интересно отметить, что седимен-
тационные свойства коротких
фрагментов ДНК (12-20 пар оснований)
близки к таковым для глобулярных белков
соответствующей молекулярной массы
(рис. Г4.27). В то же самое время эти
свойства очень отличаются для
больших молекулярных масс. Этот факт
отражает принципиальные различия
между этими двумя гомологичными
рядами. В ряду глобулярных белков
асимметрия остается постоянной при
повышении молекулярной массы, а в
ряду ДНК асимметрия наиболее
быстро растет в ряду относительно коротких
фрагментов. Темп этого роста
замедляется по мере увеличения молекулярной
массы и для очень больших
молекулярных масс темп роста асимметрии
приближается к таковому, характерному

ю2
10
1
s°
°20,W
1-DPo
-
i i
^*^027
1 l l M l 1
•^^^
1 l l 1 l
,
/"Л 0.44
'ill 1
10* 103 10 105
Число пар оснований
Рис. I 4.2(5. Зависимость5°20 п от молекулярной массы (длины оснований) в двойной
логарифмической шкале для фрагментов ДНК. Данные взяты из iin'i :.■.:■!.: i I \
10'
S° -и1'3
1-OPo
Глобулярные белки
фрагменты ДНК
10
10'
Молекулярная масса (кДа)
10°
Рис. П.27. Зависимость величины s°20 и, поправленной на Архимедов фактор плавучести (1 —
V) р0), от молекулярной массы М в двойной логарифмической шкале для глобулярных белков и
для РМ2 Нае III фрагментов ДНК. Данные взяты из ;■'■ I , _'и i ■, соответственно.
Коэффициенты седиментации для фрагментов длиной 12 и 20 пар оснований вычислены из
экспериментальных значений их коэффициентов диффузии: 13,4 и 10,9 единиц Фика, соответственно. При
таком расчете парциальный удельный объем ДНК принят равным 0,56см3г'

для гауссова клубка (см. также
дискуссию в секции Г6.6).
Г4.10.4. Рибосомные РНК,
рибосомные частицы
и рибонуклеопротеидные
комплексы
Исследования седиментационного
поведения рибосомных частиц и их
компонентов (рибосомные РНК, рибосомные
белки и комплексы между ними)
представляют особый интерес, поскольку
часто дают ответы на многие вопросы
их структурной организации.
Например, что общего между конформацией
рибосомных частиц и глобулярных
белков? Как мы сейчас покажем, ответ на
этот вопрос можно получить
достаточно просто, если сравнить между собой
зависимости седиментационных
коэффициентов от молекулярной массы для
этих двух типов биологических
молекул.
На рисунке Г4.28 приведена
зависимость константы седиментации,
поправленной на Архимедов фактор, для
рибосомных частиц и их субчастиц в
двойном логарифмическом масштабе.
10' 10' 1°4
Молекулярная масса (кДа)
Рис. I 4.28. Зависимость константы
седиментации, поправленной на Архимедов фактор,
для рибосомных частиц и их субчастиц, в
двойном логарифмическом масштабе. Данные
взяты из • '■
Данные взяты из !;п\ :hi;:.; I i.!!. Как
видно из рисунка, зависимость хорошо
аппроксимируется прямой линией с
параметрами:
4»,,/(1 " г>р0) = /СМ"-6В. (Г4.43)
Наклон этой прямой равен 0,66,
который, как мы видели ранее, типичен
для компактных квазисферических
частиц (секция Г4.10.1). Таким образом,
величины показателей степени в
уравнениях Г4.35 и Г4.41 совпадают. Разнятся
только коэффициенты /С.. Отсюда
следует, что глобулярные белки и рибосомные
частицы сходны по компактности, но
отличаются по гидратации.
Другой вопрос, ответ на который
также представляет интерес: «Что
общего между конформапиями
рибосомных РНК в безмагниевом буфере
и белков в 6М гуанидингидрохлори-
де?». Ответ на него следует из
построения зависимости константы
седиментации, поправленной на Архимедов
фактор, для рибосомных РНК и их
фрагментов в двойной
логарифмической шкале в буфере без ионов Mg"
(рис. П.29) и комментарии Г 1.2!).
Данные взяты из мй.ипи.! Г i.i1. Эта
зависимость аппроксимируется прямой
линией:
4„/(1-^Р)=^^,,7.(Г4.44)
наклон которой совпадает с наклоном
прямой для глобулярных белков в 6М
гуанидинхлориде (уравнение Г4.37).
Это совпадение свидетельствует о том,
что, несмотря на принципиальные
различия в химическом составе и конфор-
мации рибосомных РНК в буфере без
ионов Mg"+ (молекулы РНК
сохраняют элементы вторичной структуры)
и белков в буфере, содержащем
денатурирующий растворитель, их грубая

100
50
10
q0
°20,W
1-OPo
I I 1.1
>^N,0.47
i i i i 1 i
i i i i i i i 1 i i i i i i i i
10
104
10' 10J
Молекулярная масса (кДа)
I'nc. II.29. Зависимость величины s°,0 , поправленной на Архимедов фактор плавучести
(1 — Ъ рп), от молекулярной массы М в двойном логарифмическом масштабе для различных ри-
босомных РНК (•) и их фрагментов (°) поданным i.Vi. ;;:п:,; I 1л. Парциальный удельный объем
РНК и ее фрагментов принят равным \) =0,537 см3-г'
конформация описывается как
развернутое состояние, напоминающее
гауссов клубок.
В заключение заметим, что
сравнение характеристик седиментации РНП-
Комметарии Г4.29. Фрагменты 16S
1 рибосомной РНК
Фрагменты 16S рибосомной РНК из
Т. thermophilus, представленные 3' доменом
(нуклеотиды 890-1515), 5' доменом (нук-
I леотиды 1-539) и центральным доменом
(нуклеотиды 547-895), были получены
методом транскрипции in vitro. Инкуба-
; цией этих фрагментов с 30S рибосомными
! белками Т. thermophilus получены
специфические рибонуклеопротеидные комплексы
(Agalarov et al., 1999).
комплексов, моделирующих три
основных домена, с таковыми для природных
рибосомных частиц показывает, что
комплексы имеют ту же компактность,
что природные частицы (рис. Г4.30).
Это следует из того факта, что
константы седиментации для всех РНП-комп-
лексов лежат на продолжении прямой,
полученной для рибосомных частиц и
их субчастиц (рис. Г4.31). Этот
результат позволяет предположить, что
каждый из трех доменов 30S субъединицы
Т.thermophilus способен к
самоорганизации in vitro, независимо друг от друга, а
22S РНП-комплекс может
рассматриваться как компактное
«обезглавленное» производное 30S рибосомной
частицы.

'';-1бл;чы I 4.8. Константы седиментации, молекулярные массы и парциальные
удельные объемы рибосомных частиц, их субчастиц и РНП комплексов*
Частица
Т4 РНП комплекс Е. coli
ТЗ РНП комплекс Е. coli
Центральный домен 30S Т. th. (547-895)
5'-домен Т. th. (1-539)
3'домен Г. г/г. (890-1373)
«Безголовая» 30S субчастица Т. th
30S субчастица Е. coli
50S субчастица Е. coli
70S частица Е. coli
80S частица дрожжей
80 S частица Anemia salina
80S частица Euglena gracilis

Молекулярная
масса
(Да)
70000
93000
195000
242000
280000
427000
910000
1550000
2650000
3700000
3800000
4400000

Коэффициент
седиментации, 4,,г
(ед. Свед-
берга)
5,8
6,1
12,0
13,0
15,4
22S
30,8
50,0
70,0
80,0
81,0
86,0

Парциальный
удельный
объем, V
(bcmV)
0,63
0,64
0,61
0,58
0,61
0,59
0,612
0,597
0,610
0,630
0,630
0,630
Ссылка
1
1
2
3
4
6
5
5
5
5
5
5
'Данные взяты из: 1) Agalarov and Williamson (2000); 2) Agalarov et al. (1999); 3) Agalarov et al.
(1998); 4) Selivanova et al. (неопубликованные данные); 5) Ulitin et al. (1997); 6) Serdyuk et al. (1999)
Таблица Г4.Э. Рибосомные РНК и их фрагменты в безмагниевом буфере,
содержащем 100 мМ KCI
Частица
5S RNA хлорпластов
5S RNA E. coli
5S RNA крысы
З'-фрагмент (1000-1542) 16S РНК Е.
coli
5'-фрагмент (1-530) 16S РНК Е. coli
З'-фрагмент (535-1542) 16S РНК Е. coli
5'-фрагмент (1-996) 16S РНК Е. coli
16S РНК Е. coli
16S РНК хлорпластов
16S РНК Т. thermophilic
18S РНК дрожжей
23S РНК Е. coli
28S РНК крысы
РНК вируса табачной мозаики
Число
аминокислотных остатков в цепи
100
120
160
542
530
1007
996
1542
1490
1515
1789
2904
4750
6363
Коэффициент
седиментации s20li.
(ед. Сведберга)
4,5
5,0
5,8
9,0
9,5
12,0
12,0
16,0
16,0
16,0
18,0
23,0
28,0
31,0
Данные по рибосомным РНК взяты из Spirin A. S in «Ribosomes» Kluwer academic/Plenum
Publishing, USA, 1999. Данные по фрагментам РНК получены И. II. Сердюком (неопублико-
вано).

3' домен
ВО
Центральный
домен
3' минорный
домен
а б в
Рис. I 1.,'М: аиб— три основных домена 16S РНК малой рибосомной субчастицы. 5'домен (нук-
леотиды 1-563), соответствует центральному телу 30S субъединицы, центральный домен (нук-
леотиды 564—915) участвует в формировании бокового выступа или платформы, в то время как
3' основной домен (нуклеотиды 919-1396) локализован в головке субъеднницы; имеется
также дополнительный 3' минорный домен (остаток 1397-1542) (Ramakrishnan and Moore, 2001);
в — «обезглавленная» 30S рибосомная субчастица (см. рис. П.21) соответствует 5' концевому и
центральному доменам 16S РНК Т. thermophilus. Процедура получения последней основана на
разрезании олигодезоксирибонуклеотида в белок-дефицитной производной 30S рибосомной
субъединицы с помощью рибонуклеазы Н (Serdyuk, et al., 1999)
10 V
10' г
10
1
_
-
г
-
S°
°20.W
1-E>P0
1 1 1
l i i i i 1 i
«Обезглавленная»
рибосомная 30S
субчастица
1 i t t i i
_
^-
-
;
i i i
10
104
10 10J
Молекулярная масса (кДа)
Рис. Г1..Ч I. Зависимость величины s°20 ^поправленной на Архимедов фактор плавучести (1 — V р0),
от молекулярной массы М в двойной логарифмической шкале для различных рибосомных частиц,
их субчастиц (О), и РНП частиц (•) с использованием данных, представленных в ■.'.' i i.'1

Г4.11. Перечень ключевых идей
• Внедрение в практику в 1990-х гг. новой ультрацентрифуги Beckman
Instruments, Optima XL, открыло новую эпоху и аналитическом ультрацептрифуги-
роваиии (АУЦ).
• В АУЦ используются два комплементарных метода: скоростная седиментация
и равновесная седиментация.
• Метод скоростной седиментации обеспечивает информацию о размере,
форме макромолекул и взаимодействии между ними; высокая скорость вращения
ротора и длинные центрифужные ячейки используются для улучшения
разрешения.
• Равновесная седиментация обеспечивает информацию о молекулярной массе,
константах ассоциации и стехиометрии; низкая скорость вращения ротора и
короткие центрифужные ячейки используются для уменьшения времени
достижения равновесия.
• Отношение измеренной скорости частицы к ее ускорению в ультрацентрифуге
называется коэффициентом седиментации, 5. За единицу константы
седиментации s принимается единица Сведберга = 10'13 секунды, обозначаемая как IS.
• Поведение макромолекул в ячейке аналитической ультрацентрифуги
описывается уравнением Ламма, которое не имеет аналитического решения.
• Метод «средней точки», долгое время использовавшийся в качестве основного
способа вычисления констант седиментации, в современной практике АУЦ не
используется.
• Применение современных компьютерных программ дает возможность
решения уравнения Ламма в различных граничных условиях методами численного
интегрирования; они позволяют существенно улучшить разрешающую
способность АУЦ при исследовании белков и их смесей.
• Метод Ван Холде-Вайшета базируется на том, что скорость седиментации
пропорциональна времени, тогда как скорость диффузии - корню квадратному из
времени; поэтому экстраполяция к бесконечному времени позволяет
исключить вклад диффузии в форму седиментационной границы.
• В методе Стаффорда распределение коэффициентов седиментации
вычисляется из производной по времени профиля седиментационной кривой; этот метод,
как и метод Ван Холде-Вайшета, дает возможность одновременного
определения коэффициентов диффузии и седиментации и, следовательно,
молекулярных масс исследуемых макромолекул.

• Парциальный удельный объем белков и карбогидратов можно вычислить из их
химического состава по методу Кона и Эдселла.
• Молекулярная масса макромолекулы может быть определена из уравнения
Сведберга из ее коэффициентов седиментации и диффузии или методом
равновесной седиментации.
• Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является мощным
техническим приемом для разделения макромолекул по плавучей плотности.
• Метод дифференциальной седиментации позволяет уловить очень небольшие
различия в коэффициентах седиментации.
• Глобулярные белки в водном растворе образуют гомологичный ряд
квазисферических частиц с показателем степени в уравнении КМХ, равным 2/3; такой
же ряд образуют в буфере с ионами Mg рибосомные частицы и их субчастицы,
«обезглавленная» 30S субчастица и РНП-комплексы, моделирующие три
основных домена 30S субчастицы.
• Белки в 6М гуанидингидрохлориде образуют гомологичный ряд рыхлых
клубков с показателем степени в уравнении КМХ, равным 0,47; такой же ряд
образуют рибосомные РНК и их фрагменты в буфере без ионов Mg.
• Молекула коллагена и продукты его фрагментации ультразвуком образуют
гомологичный ряд жестких палочкообразных частиц; показатель степени в
уравнении КМХ для такого ряда равен 0,20.
• Зависимость s от М в двойном логарифмическом масштабе для молекул ДНК
в широком интервале молекулярных масс не описывается одной прямой
линией, что свидетельствует об изменении ее структуры.
• Для ДНК в интервале молекулярных масс 1,3 х 104 < М <3,5 х Ю6 Да
показатель степени в уравнении КМХ равен 0,273; такая величина характерна для
относительно жестких, палочкообразных структур.
• Для ДНК в интервале больших молекулярных масс (>3,5 х Ю6 Да) показатель
степени в уравнении КМХ равен 0,440; такая величина характерна для гибких
структур, близких к гауссовому клубку.
Литература для последующего чтения
Исторический обзор
Schachman H. К. Analytical ultracentrifugation reborn. Nature, 1989. 341, 259-260.

Schachman H. К. Is there a future for the ultracentrifuge? In Analytical
Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science/eds. S. E. Harding, A.J. Rowe
and J. C. Horton. Cambridge: Royal Society of Chemistry. 1992.
Инструменты и инновационная техника
Schachman H. К. Ultracentrifugation in Biochemistry. New York: Academic Press,
1959.
Ralston G. Introduction to Analytical Ultracentrifugation. Fullerton, CA: Beckman
instruments. 1993.
GeibelerR. The Optima XL-A: A new analytical ultracentrifuge with a novel precision
absorption optical system. In Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and
Polymer Science, eds. S. E. Harding, A.J. Rowe and J. C. Horton. Cambridge: Royal
Society of Chemistry, 1992.
Van Holde K. E.Johnson W. C. and Ho S. P. Principles of Physical Biochemistry.
New Jersey: Prentice Hall. 1998.
Скоростная седиментация
Van Holde К. E. Sedimentation analysis of proteins. In The Proteins, third edition.,
eds. H. Neurath and R. I. Hill, Volume VI, pp. 225-291. New York: Academic Press.
1975.
Perkins S.J. Protein volumes and hydration effects: the calculation of partial
specific volumes, neutron scattering matchpoints and 280 nm absorption coefficients
for proteins and glycoproteins from amino acid sequences. Eur. J. Biochem., 1986. 157,
169-180.
Harding S. E., Rowe A.J. and Horton J. С (eds.) Analytical Ultracentrifugation in
Biochemistry and Polymer Science. Cambridge: The Royal Society of Chemistry. 1992.
Stafford, W. F., III. Boundary analysis in sedimentation velocity experiments.
Methods EnzymoL, 1994. 240, 478-501. '
HardingS. E. Determination of macromolecular homogeneity, shape, and interactions
using sedimentation velocity analytical centrifugation. In Methods in Molecular
Biology, eds. C.Jones, B. Mulloy and S. Thomas A. H., volume 22. Microscopy, Optical
Spectroscopy, and Macroscopic Techniques. Totowa, NJ: Humana Press. 1994.
Hansen J. C, LebowitzJ. and Demeler B. Analytical utracentrifugation of complex
macromolecular systems. Biochemistry, 1994. 33, 13155-13163.
Hensley P. Defining the structure and stability of macromolecular assemblies in
solution: the re-emergence of analytical ultracentrifugation as a practical tool. Structure,
1996. 4, 367-373.
Laue T. M. and Stafford W. F., III. Modern application of analytical ultracentrifugation.
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1999. 28, 75-100.
Carruthers L. M., SchirJ V. R., DemellerB. and Hansen J. С Sedimentation velocity
analysis of macromolecular assemblies. Methods Enzymol., 2000. 321, 67.
Schuck P. Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity
ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophys. J., 2000. 78, 1606-1619.
Равновесная седиментация
Cantor С. and Schimmel P. Biophysical Chemistry. Part II. Technique for the Study
of Biological Structure and Function. San Francisco, CA: W. H. Freeman and company.
1980.

OberfelderR. W., ConslerT. G.andLeeJ. С Measurement of changes of hydrodynamic
properties by sedimentation. Meth. Enzymol., 1985.117, 21-АО.
Schuster Т. М. and Laue Т. М. Modern Analytical Ultracentrifugation. Boston, MA:
Birkhauser. 1994.
Laue Т. М. Sedimentation equilibrium as thermodynamic tool. In Methods in
Enzimology, eds. G. K. Ackers and M. L. Jonson V, pp. 427-452. New York: Academic
Press. 1995.

Глава Г5
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Г5.1. Исторический обзор
1920-е
М. Смолуховский и Е. Хюккель
(М. Smoluchowski and E. Huckel)
первыми разработали теорию электрофореза
для тонких и толстых бислоев. Д. С.
Генри (D. С. Henry) расширил теорию
электрофореза сферических полиионов для
слоев произвольной толщины. В
модели Генри распределение зарядов
внутри сферы предполагалось сферически
симметричным, а релаксацией ионов
пренебрегали. В 1950-х гг. ряд
исследователей — Дж. Т. Овербиик, Ф. Бут,
П. Ч. Виерсма (J. Th. G. Oberbeek, F.
Booth, P. H. Wiersma) изучили влияние
эффекта релаксации ионов на электро-
форетическую подвижность
сферических частиц, содержащих центросиммет-
ричное распределение зарядов.
1930
А. Тизелиус (A. Tiselius)
предложил новую технику для изучения элек-
трофоретических свойств белков. Он
показал, что резкая электрофоретиче-
ская зона передвигающихся
ионизованных молекул может быть получена
с использованием U-образной трубки,
а границы движущихся белков могут
быть визуализованы в
ультрафиолетовом свете. Тизелиус наблюдал при
электрофорезе несколько зон,
соответствующих сывороточным альбуминам,
а-, р-, и у-глобулпнам.
1940-е
Т. Виеланд и Е. Фишер (Т. Wieland
and E. Fischer) предложили
использовать бумажные фильтры в качестве
носителей при электрофорезе. Простота
оборудования, компактность,
относительная дешевизна и небольшое, менее
1 мг, количество белка, необходимого
для анализа, сделали электрофорез на
бумаге очень популярным методом
исследования.
1950-е
О. Смитис (О. Smithies) получил
хорошее разрешение белковых зон в
целлюлозных гелях. Использование
электрофореза на основе
молекулярных сит давало гораздо большее
разрешение, чем в свободном растворе.
В это десятилетие были
предложены такие носители для
электрофореза, как ацетатцеллюлоза и агароза.
В 1959 г. С. Раймонд и Л. Вайнтрауб
(S. Raymond and L. Weintraub)
доложили о первых результатах,
полученных методом электрофореза в полиак-
риламидном геле (ПААГ).

I %<)-<■
А. Л Шапиро, Е. Винуела и
Дж. В. Майзел (A. L. Shapiro, E. Vinuela
and J. V. Maizel) обнаружили
взаимосвязь между электрофоретической
подвижностью белков и их молекулярной
массой при использовании гомогенного
ПААГ в присутствии додецилсульфата
натрия (ДСН). Электрофорез в ПААГ в
присутствии ДСН начинает широко
использоваться для определения чистоты
и молекулярных масс белков.
Возможность разделения нуклеиновых кислот
и нуклеотидов была
продемонстрирована на примере ДНК и даже хромосом
при использовании метода
импульсного электрофореза в агарозном геле.
1975
П. О'Фаррелл и Дж. Клозе
(P. O'Farrell and J. Klose) развили метод
двумерного электрофореза. При
движении в одном направлении белки
делились по заряду, а во втором — по массе.
Уже в первых экспериментах удалось
разделить таким образом 1100 белков из
Е. coli. В это время молекулярные массы
белков в геле определяли, сравнивая их с
известными массами очищенных белков.
В 1977 г. Н. Г. Андерсен и Н. Л.
Андерсен (N. G. Andersen and N. L. Andersen)
начали автоматизировать метод
двумерного электрофореза и разработали
различные коммерческие аппараты. Методы
идентификации белков были
существенно улучшены, благодаря применению
мембран, позволяющих определять
аминокислотную последовательность белков
cN-конца. Нижний количественный
предел определения белков достиг 1 пмоль.
Благодаря увеличению размеров геля и
применению способа окрашивания
белковых зон серебром удалось увеличить
разрешающую способность двумерного
электрофореза до 10000 пятен.
1981
Дж. В. Йоргенсен и К. Д. Лукас
(J. W. Jorgensen and К. D. Lukas)
провели электрофоретическое разделение
аминокислот в капилляре с высокой
эффективностью, которая ранее могла быть
достигнута только в газовой фазе. При
разделении белков в капилляре
электрическое поле приблизительно в 50 раз
больше, чем в традиционном
пластинчатом геле, что привело к разделению
белков в течение нескольких минут. На
основе капиллярного электрофореза были
созданы полностью
автоматизированные, высокочувствительные
инструменты, способные анализировать до одного
нанолитра сложного образца. Появились
фирменные приборы, объединяющие
методы разделения и секвенирования
белков и пептидов и хорошо
сочетавшиеся с оборудованием для масс-спектро-
метрического анализа.
1990
Принципиальный шаг в развитии
капиллярного электрофореза был сделан
в группе Б. Л. Каргера (В. L. Karger),
создавшей линейный полиакриламид-
ный матрикс, который мог быть
использован для разделения ДНК в капилляре
с высокой разрешающей способностью.
В этом же году X. Свердлов и Р. Гестеланд
(Н. Sverdlow and R. Gesteland) описали
способ еще более быстрого разделения
ДНК в капилляре из плавленого силика-
геля с внутренним диаметром 75 мкм и
с большей эффективностью разделения,
чем в простом линейном пластинчатом
геле. В1993 г. X. Камбара и С. Такахаши
(Н. Kambara and S. Takahashi)
сконструировали устройство, объединившее
капилляр, сканирующий детектор и
конфокальный микроскоп.
Усовершенствование электрофоретического разделения
и визуализации нуклеиновых кислот

и нуклеотидов сделало возможным
быстрое и эффективное картирование генов,
что способствовало ускорению решения
исторической программы «Геном
человека».
2000 и по настоящее время
Электрофоретические методы
являются наиболее широко
используемыми при аналитическом и
препаративном разделении макромолекул.
Они внесли бесценный вклад в науки
о жизни — биохимию, молекулярную
биологию, генетику, генную
инженерию и медицину.
Г5.2. Введение
в биологические проблемы
Сутью электрофореза является
перемещение заряженных частиц,
растворенных или суспендированных в
электролите. В 1791г. М. Фарадей (М. Faraday)
сформулировал два фундаментальных
закона электролиза, что дало название
указанному выше явлению. Фарадей
ввел такие понятия как электролит,
электролиз, анод и катод (для
положительных и отрицательных электродов),
и анион и катион (для ионов,
мигрирующих к соответствующим электродам).
В 1897 г. Ф. Кольрауш (F. Kollraush)
сформулировал первую теорию,
объясняющую поведение передвигающихся
частиц в электрическом поле.
В 1926 г. Сведберг предложил
своему ученику Тизелиусу тему
исследований, связанную с использованием
электрофореза. При электрофорезе и
ультрацентрифугировании можно было
наблюдать перемещение зон белков и
регистрировать их, однако ни один из этих
методов не обладал достаточным
разрешением для полного разделения смеси
молекул. Уже через четыре года Тизелн-
ус представил свою докторскую работу о
перемещении электрофоретической
границы белков, которая положила начало
использования этого метода в биологии.
После работы Тизелиуса развитие
метода электрофореза пошло по двум
направлениям. В первом, названном
свободным электрофорезом, для разделения
использовались среды без геля. До
недавнего времени этот метод широко не
применялся как структурный метод,
поскольку сложные взаимодействия
между заряженными молекулами,
растворителем, подвижными солями и внешним
электрическим полем очень затрудняли
интерпретацию полученных данных.
Другое направление объединяло
различные электрофоретические методы
в поддерживающей среде из различных
носителей. Двумерный электрофорез в
полиакриламидном геле обеспечивает
самое высокое разрешение в белковом
анализе и, следовательно, является
основным методом в «протеомике». Метод
капиллярного электрофореза (КЭФ)
получает все большее применение как
аналитический метод в различных областях
исследований. Привлекательной чертой
этого метода является короткое время
анализа, высокая разрешающая
способность, возможность работы в реальном
режиме времени и автоматическое
введение образца в минимальном (мкл)
объеме. Метод капиллярного электрофореза
позволил приблизить окончание работ по
проекту «Геном человека» на 3-5 лет.
В 2003 г. М. Пленерт и Дж. Б. Шир
(М. L. Plenert and J. В. Shear)
использовали для электрофореза капилляр
необычной геометрии, в форме песочных
часов, для увеличения напряженности
электрического поля в локальной
области разделения белков и совместили его
с оптической приставкой для быстрого

введения образца. Все это позволило
делить образцы в течение нескольких
микросекунд и тем самым открыло путь
для изучения короткоживущих интер-
медиатов.
Появился также новый метод для
разделения макромолекул, капиллярная
электрохроматография (КЭХ), который
является гибридом методов
высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ) и капиллярного фореза. Метод
КЭХ сочетает лучшие свойства каждого
из них. Как в ВЭЖХ он делит
незаряженные частицы, как в КЭ он
обеспечивает высокоэффективное разделение
заряженных частиц без использования
системы насосов высокого давления.
В этой главе мы сначала обсудим
метод свободного электрофореза в
растворе. Недавние инновации в этом методе
вселяют надежду на его использование
для разделения относительно больших
и сильно заряженных биологических
макромолекул. Затем мы вернемся к
обсуждению различных типов
оборудования для электрофоретического
разделения макромолекул, уделив особое
внимание капиллярному
электрофорезу и их применению для решения
различных аналитических проблем.
Г5.3. Электрофоретические
эксперименты
Имеются три способа получения
информации о структуре частиц,
находящихся в электрическом поле ( mo. i. Л. i ).
Первый базируется на измерении их
подвижности в постоянном
электрическом поле. Абсолютное значение элек-
трофоретической подвижности может
быть измерено ио перемещению элект-
рофоретической границы, т. е. методом
свободного электрофореза. Этот метод
подобен методу скоростной
седиментации (секция Г4.5).
Второй базируется на электрофо-
ретическом прохождении тонкого слоя
или зоны макромолекулярного раствора
через среду. Среда действует по
принципу молекулярного сита и обеспечивает
стабильность против конвекции.
Процесс подобен таковому при делении
методом зонального центрифугирования
в градиенте сахарозы (секция Г4.9).
Третий базируется на измерении
ориентации, которая возникает, когда
молекулы, имеющие асимметричное
распределение заряда, помещаются в
переменное электрическое поле.
Вращающий момент стремится
ориентировать молекулу по направлению поля.
Ориентация частиц под влиянием
электрического поля называется эффектом
Керра (Глава Г6). Этот процесс подобен
двойному лучепреломлению в потоке,
когда ориентирующей силой является
гидродинамическое поле (Глава Г7).
В iaunim l.'i.l представлены
методы электрофореза, используемые в
настоящее время в научных
исследованиях (колонка 1). В ней приведены
также условия эксперимента (колонка 2),
вычисляемые параметры (колонка 3) и
аналогичные явления, встречающиеся
в гидродинамике (четвертая колонка).
Г5.4. Макромолекулы
в электрическом поле
Г5.4.1. Заряд молекулы и ее
электрофоретическая подвижность
Заряд — фундаментальное свойство
молекул, которое тесно связано с их
структурой, растворимостью, стабильностью
и с характером взаимодействия с
другими молекулами.

Таблица Г 5.1. Современные методы электрофореза
Экспериментальный
метод
Подвижная элек-
трофоретическая
граница
Одномерный
капиллярный
электрофорез
Равновесный
электрофорез
Изоэлектрофокуси-
ровка в геле
Зональный
одномерный
электрофорез в геле
Зональный
двумерный
электрофорез в геле
Условия
эксперимента
Свободным
электрофорез
Свободный
электрофорез
Аналитический
электрофорез в
пространстве,
ограниченный мембраной
Градиент рН
Додецил сульфат
натрий (ДСН)
Градиент рН
(первое
направление) + ДСН
(второе
направление)
Вычисляемые
параметры
Электрофоретнче-
ская подвижность
Электрофоретичс-
ская подвижность
Коэффициент
диффузии, заряд
Изоэлектрическая
точка, в которой
подвижность молекулы
равна нулю
Разделение в
соответствии с
фрикционными свойствами
(массой)
Разделение в
соответствии с зарядом
(первое
направление) и
фрикционными свойствами
(масса (второе
направление))
Аналогия с
гидродинамическими
методами
Скоростная
седиментация
Скоростная
седиментация
Диффузия
с использованием
ультрацентр!
кружной ячейки,
формирующей границу
Равновесное
центрифугирование
в градиенте
плотности
Равновесное
центрифугирование
в градиенте
плотности
Равновесное
центрифугирование
в градиенте
плотности
Наиболее прямой способ оценки
заряда макромолекулы — получение
ответа на прилагаемое электрическое поле.
Если частица имеет заряд Q, и
находится в электрическом поле Е, то в
результате на нее будет действовать сила F:
F = QE.
(Г5.1)
Комментарий Г5.1. Единица
электрофоретической подвижности
Электрофоретическая подвижность д
имеет размерность в системе СГС см2сек 'В '.
~~1
Через короткое время после
приложения электрического поля частица
приобретает постоянную скорость и, с
которой она движется по направлению
к одному из электродов. При этой
скорости, силы трения равны и
направлены против приложенной силы:
u-QE/f,
(Г5.2)
где / — коэффициент поступательного
трения макромолекулы.
Транспорт заряженной частицы под
действием электрического поля назы-

Fnc. 17). 1. Макромолекулы в.электрическом поле: а — при отсутствии электрического поля.
Маленькие ионы растворителя образуют атмосферу вокруг макромолекул, в которой ионы имеют
заряд, противоположный заряду молекулы; б — в присутствии электрического поля. Ионная
атмосфера искажается полем и движением макромолекул (Cantor and Shimmel, 1980)
вается электрофоретической
подвижностью (комментарии Г.1.1). Электрофо-
ретическая подвижность и может быть
определена как скорость на единицу
электрического поля:
ц = и/Е (Г5.3)
и, следовательно,
<2 = м/-
(Г5.4)
Такое простое описание
электрофоретической подвижности справедливо
только для идеального случая и не
соответствует реальной действительности.
В самом деле трудности возникают уже
при введении понятия суммарный заряд.
В растворах всегда имеются
противоионы. Часть из них тесно
ассоциирована с макромолекулами, другие — нет
(рис. 15.1). Чтобы ослабить
взаимодействие между разноименно
заряженными ионами, в раствор добавляется
некоторое количество
поддерживающего электролита.
Поскольку электролит образует
атмосферу вокруг макромолекулы, уравнение
Г5.2 может быть представлено в форме:
u = Q>uE/J\ (Г5.5)
где Q является эффективным
зарядом (макроионы плюс противоионы)
«одетой» макромолекулы.
Несмотря на принципиальную
важность понятия заряда, его измерение
сопряжено с большими трудностями.
К настоящему времени отсутствуют
экспериментальные методы, которые
определяют эффективный заряд,
независимо от других свойств макроионов.
Недавние инновации в методах
стационарного и капиллярного электрофо-
резов показали возможность их
применения для исследования молекул,
подобных ДНК (см. ниже параграфы
Г5.5.2 и Г5.7.2).
Г5.4.2. Моделирование
электрофоретической
подвижности
Для электрофоретической
подвижности, ц, наиболее часто используется
уравнение Хюккеля
ц = Ze/f,
(Г5.6)
где Z — число зарядов; е — заряд
электрона;/— коэффициент трения
заряженной макромолекулы. Как и в случае
коэффициента седиментации, ц является
отношением скорости движения
частицы к силе прилагаемого поля (сравните
с уравнением Г4.16). Если частицы
имеют сферическую форму, то, применяя
закон Стокса, можно записать:

Комментарий Г5.2. Влияние заряда
на константы седиментации
и диффузии
Эффекты заряда влияют также и на
константы седиментации, диффузии и на
j удельную вязкость, даже тогда, когда не
присутствует внешнее электрическое ноле.
Понять это можно на примере фрагмента :
I осаждающейся высокозаряженной
полиионной ДНК. Текущий поток растворителя
искривляет ионную атмосферу, в резуль- i
j тате чего возникает дополнительное вязко-
; стное торможение, так называемое
«электролитное трение». Электролитное трение
увеличивает константы седиментации и
j диффузии. Подобно этому ион релаксации '
повышает характеристическую вязкость
суспензии растворенных веществ жестких
| полиионов, помещенных в градиентный |
поток поля, и это явление называется «пер- |
внчным электровязкостным эффектом».
: С более полным описанием этих явлений
' читатель может ознакомиться в
специальной литературе (Schmitz, 1993). Эффект ;
заряда на седиментацию и диффузию будет
| меньше или равен нулю для слабо
заряженных полиионов в высоко солевых рас- ;
творах, но проявление эффекта становится j
более ощутимым при повышении заряда
полииона или при понижении
концентрации соли.
li-Ze/6m\0R0, (Г5.7)
где R0— радиус частицы, a г)0 — вязкость
растворителя.
Уравнение Г5.7 может быть
обобщено, если принять во внимание
гидратацию и отклонение от сферической
формы, как в случае седиментации и
диффузии. Однако для заряженных
частиц, двигающихся с постоянной
скоростью в электрическом поле,
необходимо принимать во внимание
искажение ионной атмосферы от ее
равновесного состояния (к'оммсч пари и Г .1.2).
Этот эффект «ионной релаксации»
будет важен для слабо заряженных
макромолекул. Описание транспорта
заряженной частицы по сути является
гораздо более трудной проблемой, чем
незаряженной и до недавнего
времени классическая теория применялась
только к наиболее простым модельным
структурам.
Модели, используемые в
классической теории электрофореза, подобны
гидродинамическим, описанным в
Главе Г2. В них принимается во внимание
распределение заряда и ионная
атмосфера. Развитие новых методов
моделирования в гидродинамике сложных
систем на основе электростатики (параграф
Г.2.2.3) позволило пересмотреть теорию
свободного электрофореза. Проблема
полиионных частиц произвольной
формы и распределения заряда была решена
введением в практику техники
граничных элементов, описанной в параграфе
Г2.2.1. В ней приведен пример разбиения
гидродинамической поверхности
фрагмента ДНК из 20 пар оснований на 352
треугольные чешуйки (см. рис. Г2.15 а).
Кроме того, в этой модели каждой
чешуйке можно приписывать разный
заряд, что иллюстрируется на этом же
рисунке каркасной моделью треугольников
с числом элементов, равным от 5 до 9 над
одной из чешуек. Тем самым создается
возможность вариации напряженности
поля в каждой чешуйке при сохранении
общего числа чешуек.
Г5.5. Электрофоретические
методы в отсутствие
поддерживающей среды:
свободный электрофорез
Различные методы электрофореза
пока широко не используются в
качестве зонда структуры. Причина проста:
сложные взаимодействия между ио-

нами, растворителями, солями, гелем
(если последний присутствует) и
внешнее электрическое поле усложняют
интерпретацию электрофоретической
подвижности. Однако при отсутствии
геля, в методе электрофореза в
растворе, который мы в дальнейшем будем
называть свободным электрофорезом
(СЭФ), интерпретация данных может
быть более однозначной. Развитие
аналитического электрофореза в
мембранной геометрии (см. параграф Г5.5.2) и
капиллярного электрофореза (секция
Г5.7) показало, что метод СЭФ может
эффективно применяться для
исследований относительно больших и сильно
заряженных биологических
макромолекул. СЭФ также является
эффективным методом для разделения
макромолекул (см. к'оммгм i;i|inii I'.")..'!).
Г5.5.1. Метод движущейся границы
В электрофоретическом
эксперименте на частицу действуют четыре силы
(рис. Г5.2). Первая это
электростатическая сила/7, = QE.
Вторая — гидродинамическая сила
трения F2=fmKu, где/|ккт -
коэффициент поступательного трения, а и
скорость частицы.
Третья сила F3 возникает в
результате тенденции макроионов быть
окруженными противоионами, в результате
чего поток противоионов движется в
направлении, противоположном их
движению. По этой причине макроионы всегда
движутся против потока так, что их
скорость по отношению к их
непосредственному окружению будет выше, чем
таковая в лабораторной системе координат.
И наконец, четвертая сила, Fv
возникает при искажении ионной атмосферы
(эффект асимметрии поля). Эта сила
обусловлена дипольным моментом,
Коммешарий Г5.3. Свободный
I электрофорез в потоке
В так называемом свободном
электрофорезе в потоке, переносящий вещество
буферный раствор заключен между двумя
вертикальными пластинами, находящимися на
i близком расстоянии друг от друга. Элек-
трическое поле прилагается
перпендикулярно переносящему потоку, в то время
как раствор образца вводится непрерывно
в переносящий буфер в виде узкой полосы.
Компоненты образца впоследствии
разделяются в электрическом поле в поперечном
направлении в соответствии с их элект-
i рофоретической подвижностью, и затем
I отбираются на выходе. Этот метод очень
| хорош для работы с белками и клетками,
поскольку в нем не используются
органические растворители, высокие
концентрации солей или поддерживающие среды.
который возникает при
перераспределении противоионов под воздействием
внешнего электрического поля.
В результате общий заряд Q
макромолекулы можно определить из ее
подвижности под действием всех четырех сил:
F2 + F3+FA = Fx=fu=QJE. (Г5.8)
Тогда подвижность равна: |i = и/Е =
= С2//,фф. гДе/зфф - эффективный
коэффициент трения, производимый силами
F F w.F
1 2' 3 П * 4-
Электрофоретический метод
движущейся границы наиболее часто
применяется для определения общего заряда на
ДНК олигонуклеотидах. Скорость пере-
.f. f,_
-^ »-
-^
Рис. I 5.2. Четыре силы, действующие на
молекулу в опыте по электрофоретической
подвижности (описание сил см. в тексте)

1500-
1000
500
X(CM)
Рис. I75.3. Профиль интенсивности в ячейке,
показывающей границу олигомера DNA (pd
(А) ,0 pd (Т) 20, С = 250 мкгсм-3 в 100 мМ КС1,
20 мМ Tris, pH 8,0, движущуюся слева
направо. Положение мембран, М, обозначено с
каждой стороны ячейки. Данные приведены для
профилей, полученных через 20, 80 и 150 сек
после приложения поля (Е = 3,0 Всм ') (Laue
etal., 1996)
мещения границы фиксируется
аппаратурой, приспособленной для измерения
аналитического электрофореза и диффузии в
реальном режиме времени. Рисунок Г5.3
показывает профиль интенсивности в
ячейке при движении границы ДНК оли-
гомеров (pd(A)20-pd(T)20. Изданных,
представленных на этом рисунке вычисленная
электрофоретическая подвижность ц для
(pd (A)20 pd (T)20 оказалась равной 2,9910"
4см2-В"1-сиг1 при 20 "С.
Г5.5.2. Метод стационарного
электрофореза
В противоположность свободному
электрофорезу, когда граница перемещается
свободно, в стационарном
электрофорезе макроионы захватываются
небольшими камерами, поверхность и дно
которых закрыты полупроницаемыми
мембранами. Электрическое поле
прилагается вдоль полости камеры, так что
макроионы скапливаются против одной
из мембран. Диффузия образует поток
макроионов в направлении,
противоположном направлению электрического
поля. При наступлении стационарного
состояния эти два потока
выравниваются в каждой точке, и при этом
устанавливается градиент концентрации.
Таким образом, в стационарном
электрофорезе потоки, также как и силы,
сбалансированы (рис. 175.1). В любой точке
ячейки поток, обусловленный
электрофорезом, J ,., равен Сх и', где С — это
концентрация макрополов в точке х, а и'
их скорость. Поток/ является
эффективным потоком, складывающимся под
действием всех сил Ft, F,,, F.t и F,.
Рис. 175.1. Стационарные измерения, в
которых потоки,/ и]и сбалансированы
Поскольку
W'-Q£ <Г5-9)
и
u' = QE/fMW (Г5.10)
мы имеем:
J,Mr(QE/f-,M)c- <Г5-И)
В соответствии с первым законом
Фика (уравнение Г3.7) градиент
концентрации создает поток,
обусловленный диффузией и равный/, = -DdC/dx.
В стационарном состоянии/ +JD= 0,
отсюда:
{QE/fM)C = DdC/dx. (Г5.12)
Решением уравнения Г5.12 будет:
С=С0 ехр [а(х - х0)], (Г5.13)
где С0 — концентрация в точке х0 и
экспонента и = QE/f ,,D ,, включает
^ ' J :k|h|i :>фф

0.16 0.20
Х(см)
'не. 1.1.Г). Зависимость оптического ногло- I
2000 4000 8000
Время (сек)
8000
тения ЛШ) от расстояния х для олигомеров
ДНК (pd (A) 2(| pd (T) 20 в буфере, содержащем
100 мМ КС1, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, после
выключения ноля. Начальным стационарный
градиент (пунктирная линия) был
сформирован приложением поля силой 0,12 Всм ' в
течение более 24 часов (Laue et al., 1996)
D — коэффициент диффузии при
наличии электрического поля. Теперь
а/-м«\Р«м/Е- Предполагая, что
уравнение/, = kT/D применимо для этого
случая, получаем:
Q = <A,„/£- (Г5.14)
Уравнение Г5.14 обеспечивает
простой путь определения эффективного
заряда молекулы непосредственно из
экспериментальных измерений величин и,
Е, и Т, в противоположность
измерениям подвижности, которые требуют
знания f ., илиD ,,.
J .п|к|> :>фф
Стационарный концентрационный
градиент препарата олигомеров ДНК
(pd (A) 20 pd (T) 20 показан на
рисунке ГГ).Г). Коэффициент диффузии в
отсутствие электрического поля можно
получить из значения релаксации
равновесного концентрационного градиента
(рис. Г5.6). Вычисленное из этих данных
значение D оказалось равным 9,6 х 10"7
см2сек~', что находится в хорошем
согласии с таковым (10,86 х 10~7см2-сек '),
не. Г5.6. Определение коэффициента
диффузии для олигомеров ДНК (pd (A) 20 pd(T)20
из спада градиента, показанного на рисунке
17)./). Наклон линии In (А2,ч— А1/3) как функция
времени пропорционален ri2DL2, где А^ Зи А,,3
есть значения оптической плотности при
уровнях последней, равной 2/3 и 1/3, соответственно
(Laue etal, 1996)
полученным методом динамического
рассеяния (см. i;i'u. Г.'5. i). Если
предположить, что уравнение Эйнштейна /D =
kT действительно также и для «одетых»
макроионов, находящихся в
электрическом поле, то методом стационарного
электрофореза можно оценить
эффективный электрический заряд
макромолекулы. Значение Q полученное из
уравнения Г5.14, дает отношение
эффективного заряда к формальному заряду
Q/40 (для двойной спирали ДНК
длиной 20 пар оснований), очень близкое к
предсказанному (0,12), в присутствии
одновалентных солей без учета
поправки на конечную длину макроиона.
Г5.6. Электрофоретические
методы в присутствии
поддерживающей среды:
зональный электрофорез
Первая работа Тизелиуса по
электрофорезу была выполнена в свободном рас-

творе. Однако вскоре выяснилось, что
при использовании этого метода
возникает много проблем, которые могут быть
устранены только при стабилизации
среды. Роль такого стабилизатора
выполняла пористая механическая подложка,
смоченная буфером для электрофореза.
Подложка снижала конвекционые
потоки и диффузию, так что разделенные
компоненты предстали в виде четких
Комментарии Г5.4. Гели
и додецилсульфат натрия '
Агарозные гели
Агароза — линейный природный
полисахарид, выделенный из содержащих
агар морских водорослей. Физические и
химические свойства агарозы, такие как
температура застывания, пористость,
твердость могут варьироваться. Агарозный гель
формируется помещением сухой агарозы в
буфер с последующим нагреванием. После
охлаждения до комнатной температуры на
плоской поверхности образуется
прозрачный студенистый гель. Агарозный гель
используется для электрофореза белков
и нуклеиновых кислот.
Полиакриламидные гели (ПААГ)
Сетчатый ПААГ получают путем
полимеризации акриламидных мономеров в !
присутствиии небольшого количества
сополимера (бисакриламида). Бисакрилами-
ды являются бифункциональными агента- ,
ми, которые ковалентно сшивают соседние :
линейные акриламидные цепи. Мономеры
полимеризуются по принципу «голова-
хвост» в длинные цепи и бисакриламидные |
молекулы (сшивка) встраиваются изредка !
в растущую цепь, в результате чего
образуется место для разветвления цепи.
Акриламидные гели можно полимеризовать в ,
любой концентрации. Этим, а также коли- !
чеством добавленной сшивки, варьируется
размер пор в геле.
Додецилсульфат натрия (SDS или ,
ДСН)
ДСН (СН3-(СН2) l0-CH2OSO3-Na+)
является анионным детергентом.
зон. Ранее используемыми подложками
были фильтровальная бумага и ацетат-
целлюлоза. В течение многих лет они
успешно использовались для разделения
малых молекул, таких как
индивидуальные аминокислоты, пептиды и кар-
богидраты. Однако введение в качестве
подложек различных гелей, таких как
агароза или полиакриламид, привело к
существенному усовершенствованию
электрофореза как метода для анализа
макромолекул ( киммси трип П. i).
Г5.6.1. Разделение по массе:
ДСН — электрофорез
В методе, называемом ДСН-злектро-
форезом, изучаемые белки перед
нанесением на гель прогреваются в буфере
с низкой ионной силой, содержащем в
разбавленном растворе до 2 % додецил
сульфата натрия (ДСН). Эта
процедура разрушает нативную структуру
белка с распадом элементов вторичной,
третичной и четвертичной структуры.
Добавление специального агента, р-
меркаптоэтанола, приводит к разрыву
дисульфидных связей. Такая
обработка разворачивает белковые молекулы
и образует структуры в форме палочек
с включением отрицательно
заряженных молекул ДСН полипептидную
цепь (рис. Г5.7). В среднем, одна
молекула ДСН связывается с двумя
аминокислотными остатками. Природный
заряд нативной молекулы белка,
следовательно, подавляется отрицательно
заряженной молекулой ДСН, поэтому
в присутствии ДСН все белки имеют
сходную структуру, отрицательный
заряд и отличаются только по
молекулярной массе (комментарии \7>.Л).
Разворачиваемые додецилсульфатом
натрия пептиды движутся через гель
по определенной схеме: молекулы с паи-

I'iic. 15.7. Схематическое представление
белка в растворе ДСН. Белок денатурирует и
покрывается «шубой» из молекул ДСН,
приобретая одинаковый заряд на единицу длины.
Собственный заряд белковой молекулы
нейтрализуется. Добавление р-меркаптоэтанола
разрушает все дисульфидные связи
меньшей молекулярной массой
мигрируют быстрее, чем большие молекулы.
На рисунке IV).8 представлен график
подвижности полииептидых цепей в
10% ДСН-геле как функция
молекулярной массы. В первом приближении,
скорость миграции ДСН-комплексов
обратно пропорциональна логарифму
их молекулярных масс. Абсолютная
молекулярная масса белков оценивается
по подвижности полипетидных цепей в
полиакриламидном геле, которая срав-
Комментарий Г5.5. ДСН и заряд
Некоторые белки могут связывать
большее или меньшее количество ДСН, по
сравнению со средним количеством, что делает
их пробег в геле аномальным. Если белок
сам по себе имеет очень большой
положительный или отрицательный заряд, то он
будет нивелировать заряд, приобретаемый
пептидом при связывании с ДСН.
Специфическим примером является гистонный
белок III, который имеет молекулярную
массу около 21 кДа, но ведет себя в элект-
рофоретическом эксперименте в ДСН как
молекула с молекулярным весом в 30 кДа,
поскольку обладает сильным
положительным зарядом.
Комментарий Г5.6. Размер пор геля '■
и молекулярная масса белка
Обычно разделяющий белки акриламид- i
ный гель, имеет концентрацию 15 %. Этой !
концентрации соответствует определен- '
ный размер пор в геле, через которые белки
с молекулярной массой 10 кДа проходят
относительно свободно, в то время как
белки с массой 100 кДа проходят с трудом. Это
означает, что 15 % полиакриламидный гель
пригоден для разделения белков с массами
в интервале 10-100 кДа. Для белков с
молекулярной массой более 100 кДа
используется 10 % или даже 7,5 % гель.
нивается с подвижностью
белков-маркеров с известной молекулярной
массой (к'ом.шчггарим 175.(5).
0.4 0.6 0.8
Подвижность
Рис. 175.8. Относительная подвижность 37
различных полипептидных цепей в 10 % ДСН-
ПААГ, как функция молекулярной массы
(Weber and Osborn, 1969)

Г5.6.2. Разделение по заряду:
изоэлектрическое фокусирование
Изоэлектрическоефокусирование (ИЭФ)
является электрофоретическим
методом для разделения амфотерных
молекул в градиенте рН. Общий заряд
амфотерной молекулы определяется
величиной рН ее локального
окружения (k'ommi'ii 1,'ipnii If).7). Белки
являются наиболее известными примерами
амфотерных молекул, несущих
положительный, отрицательный или нулевой
общий электрический заряд, в
зависимости от рН их окружения. Для
каждого белка имеется свое значение рН,
называемое pi, при котором он не несет
заряда. Следовательно, pi является
характеристическим свойством белка.
Комментарий Г5.7. Амфотерные
молекулы
Амфотерной называется молекула,
которая способна нести положительный,
отрицательный или нулевой заряд, в
зависимости от рН окружения
В градиенте рН белок будет
перемещаться электрическим полем, пока не
достигнет изоэлектрической точки (рис.
Г5.9). Его общин заряд в этой точке
будет равен нулю и электрическое поле
больше на него не будет действовать.
Ситуация сходна с таковой в
экспериментах по равновесной седиментации
в градиенте плотности, когда частица
движется к точке, в которой ее
плотность становится равной плотности
растворителя и где происходит ее
остановка (см. мил. I .">. I п секцию Г4.9).
Метод ИЭФ является идеальным
для разделения белков в соответствии
с их зарядом. Он обладает высокой
разрешающей способностью, что позволяет
разделять белки с разницей в
изоэлектрической точке в 0,01 рН. Наиболее
широко используемой системой в этом
методе является горизонтально
расположенный на стекле гель. Разделение
достигается приложением разности
потенциалов к гелю, содержащему рН
градиент. Стабильный линейный градиент
рП — ключ к успеху в экспериментах по
ИЭФ. Создание такого градиента сопро-
Суммарный
заряд
Рис. 1.1.9. Изоэлектрическое фокусирование. В градиент рН, создаваемый молекулами амфо-
литов под действием электрического поля, помещается молекула белка. Градиент изменяется от
кислого (рН 3) на аноде, до щелочного (рН 10) на катоде. Гипотетический белок общим зарядом
+2, 0 и -2 показан в трех положениях в градиенте рН. В изоэлектрической точке pi, общий
(суммарный) заряд белка равен нулю, что приводит к его остановке в электрическом иоле, т. е.
фокусированию (Garfin, 1995)

вождается введением в гель соединении,
известных как амфолиты (комментарий
1.1.8). Поскольку белки при изоэлект-
рической фокусировке перемещаются
свободно в соответствии с их зарядом
в электрическом поле, то, как правило,
используют низкую концентрацию геля,
чтобы избежать эффекта сита (см.
комментарии Г.">.()). Рисунок Г5.10
демонстрирует высокую степень разрешения,
достигаемую в методе ИЭФ на примере
рибосомного белка S1.
Г5.6.3. Одновременное
разделение по заряду и массе:
двумерный гель-электрофорез
Двумерный электрофорез объединяет
два метода: изоэлектрофокусировку с
ДСН-электрофорезом в полиакрила-
мидном геле. Этот объединенный метод
называется кратко двумерным
электрофорезом и в настоящее время является
наиболее используемым аналитическим
методом для разделения белков. Уже
первые эксперименты по разделению
белков показали колоссальные
возможности метода. Так, 1100 белков из Е. coli
были разделены в одном опыте и было
предсказано, что до 5000 белков могут
быть разделены методом двумерного
электрофореза. Несмотря на эти
выдающиеся возможности и широкое
применение для решения различных задач,
почти 20 лет прошло, пока метод
двумерного электрофореза стал составной
частью протеомики (см. секцию Б2.2).
Способность метода разделять
одновременно большое число белков,
затем идентифицировать индивидуальные
белки, как химическим анализом их
концевых аминокислотных
последовательностей, так и с помощью поиска
этих последовательностей в
компьютерных базах данных, привела к быстрому
70S 30S 70S 30S 50S
В coli E coli Tlh Tlh Tth M
Рис. 1 5.10. Анализ белков рибосом и рибо-
сомных субъединиц из Е. coli и Т. themiophilus
методом ДСН-электрофореза в полиакрила-
мидном геле. М — молекулярная масса
маркеров в кДа. Отчетливо видно присутствие белка
S1 из Е. coli в 70S рибосоме и в 30S
субъединице Т. themiophilu.s и его отсутствие в 50S
субъединице. Содержание белка S1 в препаратах
рибосом из Т. thermophilus обычно ниже, чем
содержание того же белка в стандартных
препаратах рибосом Е. coli (Shiryaev et al., 2002)
Комментарий Г5.8. Амфолиты I
| Амфолиты являются сложной смесью
i синтетических полиамино-поликарбоксиль-
■ ных кислот. Величина рН комплектов ком- |
мерческих амфолитов может варьировать
от 3 до 10 или иметь более узкий интервал
значений, например, от 5 до 6 единиц рН.
Область рН выбирается таким образом,
чтобы значение pi образца находилось внутри ;
выбранного интервала значений р! \.
пополнению наших знаний о белковых
компонентах клетки. Более того, сейчас
с помощью этого метода можно следить
за экспрессией практически всех белков
в клетке и сравнивать информацию,
идущую от «нормальных» и «аномальных»
клеток (см. примеры в параграфе Б2.6.1).
На рисунке ГЛ. 11 представлена типичная
картина двумерного гель-электрофореза
на примере разделения белков из 30S
рибосомных частиц.

«Й--
Рис. Г"). 1 1. Электрофоретическое разделение бслкоп 30S рибосомной частицы из Е. coli (а) из
Т. thermophilus {б). Электрофорез в первом направлении выполняется при кислом значении рН
(5.5). Во втором направлении используется 15% ДСН-ПААГ. Сравнение результатов электро-
форетнческого разделения белков 30S субчастицы из Е. coli и Т. thermophilus в этой системе
показало, что пятно в положении, обозначенном (►) в правой половине рисунка, соответствует пятну
белка S1 из Е. coli в левой половине рисунка (Shiryaev et al., 2002)
Г5.7. Капиллярный
электрофорез
Несмотря на существенный прогресс
в методологии, техническая реализация
электрофореза в гелях является
трудоемким процессом, занимает много
времени и практически недоступна
автоматизации. Капиллярный электрофорез
(КЭФ) выступает в настоящее время
как альтернатива электрофорезу в геле
со всеми преимуществами
современных автоматизированных технологий.
КЭФ-технология может быть
адаптирована и к двумерному электрофорезу.
Г5.7.1. Одномерный
капиллярныйэлектрофорез
Как предполагает название, при
проведении КЭФ образец перемещается в
очень узких капиллярах, внутренний
диаметр которых обычно составляет от
20 до 100 мкм. Капилляры из
плавленого кварца погружаются в резервуар
с электролитом и электродами, на
которые подается напряжение. Электроды,
сделанные из такого инертного
материала как платина, помещаются в
электролитный резервуар. Небольшой объем
образца вводится в капилляр с одного
конца. На рисунке Г 7>. 12 представлена
схема типичного прибора для
капиллярного электрофореза.
Разделенные молекулы
регистрируются детектором, находящимся на конце
капилляра, противоположном тому, куда
вводится образец. Термин «электрофо-
реграмма» представляет собой
графическое изображение ответа детектора.
Теория капиллярного
электрофореза базируется на двух уравнениях.
Первое определяет электрофоретическую
подвижность,^, как:
\y = L'/Vt,
(Г5.15)
где t — время, необходимое для
перенесения образца к детектору (в секундах);

Вход
f
Капилляр
Детектор
Анод
Выход
Электролит
Электролит
Резервуар
Источник
высокого
напряжения
Резервуар
Катод
е
'ПС.
I 5.12. Схематическое изображение аппаратуры для капиллярного электрофореза
L — длина капилляра (в сантиметрах)
и V — прилагаемое напряжение. Второе
уравнение определяет эффективность
разделения в понятиях общего числа
теоретических тарелок, N, как:
N=\iV/2D,
(Г5.16)
где D — коэффициент диффузии
молекулы (комментарии I .1.!)).
Из уравнения Г5.15 следует, что для
получения наилучшего разрешения
необходимо прикладывать наибольшее
напряжение к капилляру минимальной
длины. Однако имеются практические
ограничения для такого подхода. Когда
длина капилляра уменьшается,
количество тепла, которое должно рассеяться,
увеличивается благодаря уменьшению
электропроводности капилляра.
Высокое напряжение вызывает больший ток, и
как следствие этого, большее нагревание.
На практике необходим компромисс при
выборе величины напряжения и длины
капилляра. Возможен вариант
компромисса - это напряжение 20-50 кВ при
длине капилляра 40-100 см. При этом
разделение занимает обычно несколько
минут. Процедура введения образца
показана на рисунке IV). 1.'5. Использование
плавленого кварца в качестве
материала для капилляра позволяет выполнить
определение разделенных компонентов
прямо в капилляре. Часть полиамидного
покрытия удаляется с конца капилляра,
который расположен в освещаемой
части оптического детектора. Количество
вводимого образца (обычно под
давлением) измеряется в нанолитрах.
Скорость прохождения через капилляр
небольших объемов образца мала, около
1 мкл в минуту, что дает возможность
сочетать оборудование КЭФ с ионизиру-
Комментарий Г5.9. Эффективность
разделения
Общее число тарелок или пластин, N, —
термин, используемый в хроматографии, —
является мерой эффективности
разделения. Главным отрицательным эффектом,
снижающим разделение в капиллярном
электрофорезе, является молекулярная
диффузия растворенного вещества внутри
капилляра. Диффузия уменьшается с
ростом молекулярной массы. Следовательно,
теоретически возможно подсчитать число
N для многих белков и нуклеотидов в
методе КЭФ исходя из их коэффициентов
диффузии. Для больших полинуклеотидов
число N может достигать 10 млн.

ютим!! источниками масс-спектрометра.
Важным усовершенствованием метода
КЭФ является использование лазерных
источников для возбуждения лазер-ин-
Давление {Г
ш
Образец
Гидродинамический
Г
Сифонный
Буфер
Образец
зец
Буфер
Электрокинетический
Образец
N „
v
Буфер I I
I'lit"- I.").l.'i. Три способа введения образца
в капилляр, погруженный в сосуд с раствором.
В первом (верхний рисунок) раствор вводится
в капилляр иод внешним давлением. Во
втором (средний рисунок) это давление задается
разницей гидростатических давлений в
высотах столбов раствора и буфера (метод сифона).
В третьем способе введения (нижний рисунок)
капилляр погружается в раствор образца с
последующей подачей напряжения. Если
образец ионизирован и выбрана соответствующая
полярность напряжения, то ионы мигрируют в
капилляр. Этот способ введения образца
называется электрокинетическим
| Комментарий Г5.10. Уровень
! детектирования в КЭФ
При введении образца объемом около
| нанолитра, реальное количество детектиру-
' емого вещества, которое можно определить
методом КЭФ исчисляется в аттомолях
■ (Ю-18 моля) или зептомолях (10 2| моля).
Напоминаем, что объем в 1 зептомоль — это
около 600 определяемых молекул, т. е.
анализируется именно число молекул.
дуцируемои флуоресценции
непосредственно в капилляре для определения.
Этот метод, включающий также
окрашивание молекул, обеспечивает
определение концентрации молекул от 10"" М
и ниже (комментарий 17.10). Помимо
высокой чувствительности,
флуоресцентный анализ обладает высокой
селективностью при введении различных меток в
детектируемую молекулу. Анапиз ДНК
с использованием меченых нуклеотидов
в настоящее время является рутинной
практикой.
В отличие от гель-электрофореза
важной составляющей в капиллярном
электрофорезе является ветчина
электроосмотического потока (ЭОП). Этот
поток перемещается вдоль капилляра,
обычно по направлению к детектору
(рис. Г5.11). Он значительно
сокращает время анализа и может преодолеть
тенденцию ионов передвигаться к
соответствующему его заряду электроду
(комментарий 17). II). Поток
эффективно прокачивает растворенные ионы
вдоль капилляра и может
рассматриваться как «электронасос». Для
устранения ЭОП капилляр внутри
покрывается нейтральными гидрофильными
полимерами. Такое покрытие стенок
повышает вязкость слоев вблизи
стенки капилляра, устраняя явление ЭОП.
Рисунок 17). I.") демонстрирует
пример высокоразрешающей способности
метода КЭФ. Разделение смеси
белков выполнялось в открытой камере в
капилляре со стенками,
предотвращающими адсорбцию образца.
Разделение было быстрым, а пики узкими.
Если адсорбция образца на стенке
капилляра минимальна, эффективность
разделения достигает 10°
теоретических тарелок на метр (мера ширины
пика, см. уравнение Г5.16 и
комментарий 17).9). Этот показатель прибли-

!J
о- o-
o- о- o-
I I I
I
o-
□
o-
J_
I'iic. I 5.11. Схематическое изображение
явления электроосмотического потока. ЭОП
относится к потокам жидкости в разделительной
камере и возникает при взаимодействии
заряженных групп со стенками камеры
Комментарий Г5.11. Поток ионов
и молекул воды вдоль капилляра
Стенки капилляра, состоящие из
плавленого кварца, содержат силанолы, которые
ионизируются при контакте с раствором
электролита с высоким рН. При
диссоциации образуется отрицательный заряд па
стенке капилляра, который нейтрализуется
ионами металла. При подаче напряжения
попы металла и ассоциированные с ними
молекулы воды перемещаются по
направлению к катоду. Это движение ионов с
ассоциированными молекулами воды,
создает поток раствора к детектору.
зительно в 10-100 раз лучше, чем в
жидкостной хроматографии высокого
давления.
Г5.7.2. Сверхбыстрый капиллярный
электрофорез
Как следует из уравнений Г5.15 и Г5.16
для достижения наиболее быстрого раз
деления молекул в методе КЭФ
необходимо максимально увеличить подаваемое
напряжение на капилляр минимальной
длины. Однако этому препятствует ряд
обстоятельств, обсужденных в
предыдущем параграфе и в первую очередь
сопутствующее выделение тепла. Решение
этой проблемы достигается выбором
необычной геометрии капилляра — в форме
песочных часов для повышения локаль-
214 нм
1
.004-
0-
Поглощение
^111
2
1 ,
1
3 4
/
5
X .
—1 г*-
10
12
Время (мин)
). I л. Разделение белков при рН 4,5, методом КЭФ в открытом капилляре. Капилляре па-
Рис. I
раметрами: 50 см х 75 мкм покрыт линейным полиакриламидом. Напряженность электрического
поля — 530 V-см ', лизоцим; 2 — цнтохром, г; 3 — миоглобин; 4 трипсиноген; 5 — а-хнмотрип-
синоген A (Karger et al., 1995)

Вход
Выход
а б
Рис. 1.1.1 (5: а — схематическое изображение фотопроцесса в капилляре для микросекундного
разделения молекул. Два сильно сфокусированных лазерных пучка образуют места
регистрации входа и выхода молекул при их движении в капилляре; б — изображение типичной формы
кварцевого капилляра (29 мкм внутренний диаметр и 320 мкм внешний диаметр) в геометрии
песочных часов. Шкала 250 мкм. На вставке показана центральная область капилляра длиной
=60 мкм, в которой происходит регистрация продуктов разделения (Plenert and Shear, 2003)
ной силы электрического поля в месте
разделения. Комбинация такой формы
капилляра с ультрабыстрым введением
образца дает возможность провести
разделение в течение микросекунд. На
рисунке Г;1.16<7 схематически представлен
узко сфокусированный лазерный пучок
для определения электрофоретически
разделенных компонентов. При
уменьшении поперечного сечения капилляра в
30-40 раз электрическое поле
напряженностью в 0,1 MB см"' может образоваться
на коротком отрезке капилляра при
прикладываемом потенциале в 20 кВ. Об-
800
3 600-
400
5НТ
продукт
5 10 15
Время разделения (мксек)
20
Рис. 1.1.17. Электрофоретическое разделение
фотопродуктов 5НТ и 5НТРП за 10 мкс. Поле
напряженностью в 0,15 MB см"1 (35 кВ) было
использовано для фракционирования
компонентов. Расстояние между оптическими зонами
детектирования 9 мкм (Plenert and Shear, 2003)
разец переносится электрокинетически
внутри капилляра (рис. Г5.1(н1).
Возможности этой системы
продемонстрированы на рисунке Г.1.17.
Область в 0,15 MB см ' была
использована для фракционирования
5-гидрокситриптамина (5НТ) и гид-
рокситриптофана (5НТрп) на
микросекундной шкале времени.
Будущее этой методологии выглядит
многообещающим, особенно для
исследования коротко живущих интермедиатов
(продуктов промежуточных реакций),
которые сегодня традиционно
исследуются методами спектроскопии (часть 3).
Г5.7.3. Электрофоретическая
подвижность молекул ДНК
Электрофоретическая подвижность
макромолекул, наблюдаемая в КЭФ,
отличается от электрофоретической
подвижности в растворе из-за
существования ЭОП (см. выше). На рисунке ll.KS
показано применение метода КЭФ для
измерения подвижности ДНК.
Капилляр покрыт акриламидным
мономером, стабильным при щелочных рН и
устраняющим явление ЭОП,
обусловленный стенками капилляра.
Подвижность ДНК в ТАЭ буфере (трис-ацетат

3.8
и
r's
о
о
X
3.
3.6
3.4-
3.2
д <$•
f—t
I
_J i i i i i il
10"
10°
10 10 10 10
Молекулярная масса (Килопары оснований)
Рис. IVkIcS. Зависимость электрофорстической подвижности от логарифма молекулярной массы
для фрагментов монодисперсной ДНК в буфере, содержащем трис-ацетат ЭДТА (Stellwagen et al.,
1997)
в присутствии ЭДТА) оказалась равной
(3,75 ± 0,04) х Ю"4х см2-В-'-сек-' при
25 "С и не зависела от концентрации
ДНК и напряженности электрического
поля. Как видно из рисунка,
подвижность ДНК не зависит от ее
молекулярной массы в интервале от 48,5 килопар
оснований до 400 пар оснований,
однако монотонно уменьшается при
понижении молекулярной массы. Причина
такого уменьшения пока не ясна.
Г5.7.4. Двумерный капиллярный
электрофорез
Напомним, что в стандартном двумерном
электрофорезе деление, как в первом, так
и во втором направлениях, выполняется в
полосе геля. К настоящему моменту
разработаны приборы, являющиеся
прототипом двумерного гель-электрофореза в
формате капилляра. Они позволяют
провести разделение макромолекул в первом
направлении в одномерном капилляре,
физически разобщенном с капиллярами,
делящими макромолекулы во втором
направлении (рис. Г5.19). После окончания
первого разделения в горизонтальном
направлении, капилляр для деления в
первом направлении физически
соединяется с капиллярами для разделения во
втором направлении представляющем
собой набор параллельных, вертикально
расположенных капилляров.
Использование полидиметилсилоксана для
создания системы таких двумерных текучих
микросред позволило создать реально
работающий прототип прибора для
разделения в капилляре в одном направлении
и обеспечения пути миграции белков к
ортогонально выстроенным капиллярам
во втором направлении.
Г5.7.5. Разделение хиральных
молекул
Многие из широко используемых
сегодня лекарств содержат, по крайней

в
Рис. Го.19. Традиционный гелевый и капиллярный электрофорез в двумерном формате. В
традиционной системе полоска геля (я) используется для разделения в первом направлении, а
двумерная полоса геля (б), называемая иногда слаб-гелем, осуществляет разделение во втором
направлении. В капиллярном формате (в) полоска геля (я) заменяется капилляром (/), а с.таб-
гсль заменяется несколькими параллельно расположенными капиллярами (д). На диаграмме
представлено наиболее простое решение для объединения капилляра, используемого для
первого разделения с упорядоченными в пространстве капиллярами, используемыми для второго
разделения. Эффективность такой системы была продемонстрирована на примере смеси белков,
содержащих карбонангидразу и БСА, меченых флуоресцеином, а также яичный альбумин,
меченый красителем Texas-Red (Chen et al., 2002)
Комментарий Г5.12. Энантиомеры и рацематы
Изомерия химических соединений — явление, заключающееся в существовании веществ,
одинаковых по составу и молекулярной массе, но различающихся по строению пли
расположению атомов в пространстве и вследствие этого по физическим и химическим свойствам.
Такие вещества называются изомерами. Различают два основных вида изомерии:
структурную и пространственную. Пространственная изомерия подразделяется на два вида:
геометрическую и оптическую. Оптическая изомерия свойственна молекулам органических веществ, !
не имеющим плоскости симметрии. Такие асимметричные молекулы обладают двумя фор- I
мами оптической активности (см. Главу 35). Одна форма вращает плоскость поляризации I
влево (/ — форма), а другая — вправо (d — форма). Смесь равных количеств двух форм (двух |
антиподов или энантиомеров) ведет себя как индивидуальное химическое соединение, ли- ,
шенное оптической активности. Такое вещество называется рацемическим соединением или ;
рацематом.

At*
Af+
^С^Щ^"
Aj*
об б
Рис. I 5.20: я — химическая структура р-циклодекстрина (Ward,1994); б - его модель; в — схема
взаимодействия между двумя лекарственными энантиомерами (Ad+ и А1+) и циклодекстрином
при капиллярной хроматографии (с сайта www.ceandcec.com)
мере, один хиральныи центр, и около
80% отмечены как рацематы
(комментарий Г.1.12). Как результат, каждый из
них может содержать примеси в виде
изомеров, не дающих терапевтического
эффекта, и потенциально вызывать
отрицательные побочные эффекты. Так,
наиболее хорошо описанный
кардиологический препарат, являющийся р-ад-
реноблокатором, является рацематным
нропанолом. D-энантиомер пропанола
является в 100 раз более сильным по
воздействию и слабо метаболизируе-
мым, чем L-энантиомер.
На сегодня основным подходом,
позволяющим разделять хиральные
молекулы, является добавление цик-
лодекстринов в разделяющий
электролит и последующее проведение
капиллярного электрофореза
(комментарий Г5.К>). Циклодекстрин является
идеальным хиральным селектором в
капиллярном электрофорезе благодаря
его способности формировать
комплексы но тину «хозяин-гость» со многими
соединениями.
Механизм хиралыюго узнавания
растворенных веществ
циклодекстрином, как в связанном, так и в свободном
состоянии, хорошо описан
Армстронгом с соавторам в 1985 г. и впоследствии
подтвержден рентгеноструктурным
анализом (рис. Гл.20 с/ и 6). Оба энан-
Комментарий Г5.13.
Циклодекстрины
Циклодекстрины относятся к макроцик-
лическим соединениям углеводной
природы, получаемым путем воздействия на
крахмал некоторых ферментов микробного
происхождения и способные образовывать
комплексы включения типа
«гость-хозяин». Циклодекстрины представляют по-
лимергомогический ряд общей формулой
(С6П|0О-), а также его производные. Общее
для них — наличие характерного цикло-
декстриронового макроцикла, структурной
единицей которого является a-D-глюкоза
в пиранозной форме, имеющая конформа-
j цию кресла. Структурные формулы цик-
лодекстринов трех первых членов этого
гомологического ряда, представляющих
собой фрагменты цепей крахмала,
свернутые в компактные кольца, показаны на
рисунке Г.120 а и о. Наибольший
практический интерес представляют три первых
возможных гомолога с п = 6, 7, 8, которые
обладают фиксированной и соответственно
осевой симметрией. Циклодекстрины
принято обозначать в направлении увеличения
длины кольца: а, р, у и т. д. Молекула таких
I циклодекстринов представляют собой усе-
| ченный конус с относительно гидрофобной
| внутренней частью и относительно
гидрофильной внешней.
тиомера цпклодекстрина, продвигаясь
вдоль капилляра, будут
взаимодействовать с молекулами в разной
степени (рис. Г5.20»). Следовательно, более

D-Метионин
15 20
Время (мин)
Рис. Г5.21. Разделение и разрешение пяти
дансил-ОЬ-аминокислот с использованием у-
циклодекстрина и ДСН. Капилляр из
плавленого кварца имел размер 57 см х 75мкм (Ward,
1994)
сильно взаимодействующий энантио-
мер подойдет к детектору быстрее, чем
слабовзаимодействующий.
Стандартно р-циклодекстрин и его химические
производные, такие как диметилиро-
ванные или гидроксипропилированные
циклодекстрины, добавляются к
электролиту в концентрации от 1 до 100 мМ.
На рисунке Г5.21 показано разделение и
энантиоморфное разрешение пяти дан-
сил-ОЬ-аминокислот с использованием
у-циклодекстрина и ДСН.
Г5.8. Капиллярная
электрохроматография
Успехи в капиллярной жидкостной
хроматографии и в капиллярном
электрофорезе ускорили развитие новой
методики, получившей название
капиллярная электрохроматография (КЭХ).
В обычной жидкостной хроматографии
элюент подается иод высоким
давлением механическим насосом. Как мы
обсуждали ранее, подвижная фаза,
однако, может перемещаться и под
действием электрического насоса,
приводимого в действие силами электроосмоса
(параграф Г5.7.1). Жидкостная
хроматография, базирующаяся на эффекте
электроосмоса, называется
электрохроматографией.
По существу, капиллярная
электрохроматография является гибридом
жидкостной хроматографии и
капиллярного фореза и может проводиться в
открытой емкости, а также в капилляре
из традиционных материалов. Как и в
капиллярном электрофорезе,
электрическое поле прилагается поперек
разделительного капилляра, генерируя поток
растворителя, вызываемого
электроосмосом. В капиллярной
электрохроматографии электроосмос используется
как «помпа», перемещающая
растворитель через разделительную колонку,
тогда как в жидкостной хроматографии
поток движется под давлением.
Следует отметить два процесса,
связанные с разделением в КЭХ. Один
включает удерживание растворенных
веществ, основанное на разнице
взаимодействий между подвижной и
стационарной фазами, как в ВЭЖХ. Другой
включает дифференциальную
миграцию, которая характеризуется электро-
форетической скоростью растворенных
веществ, как в КЭХ.
Стационарная фаза может быть
образована на основе шариков кварца,
упакованных внутри капилляра, или
фиксированного на стенках открытой
камеры (рис. IV).22). Подвижная фаза
обычно состоит из электролита, содер-

Стенка капилляра
Силикагель
г©
+■ + + + +
+++
+++
+
0-
Высокое напряжение
Рис. Г.).22. Схематическое представление явления КЭХс использованием упакованного
капилляра (Colon et al. 1997)
мВт
50
n
^
г
с
—A-J
1
>
О
1
А
^W-
i
1
i
с
i
0 2 4 6 8
Время (мин)
Рис. IV).2.4. Разделение пяти небольших пептидов на колонке методом КЭФ. Колонка:
внутренний диаметр колонки 100 мкм, ее длина 25 см, напряжение 25 кВ, поддерживающий электролит
40 мМ NH4Ac-AcOH (рН 4.5; ацетонитрил (1:1 по объему) детектирование при длине волны
214 нм. Обозначения: Т — трнпторелин; Д — десмопрессин; О — оксилоцин; А — пептид A; U
— урацил; С — специальный маркер

жащего водно-органическим раствор,
переносимый через капилляр элек-
тросмотическим потоком, который
генерируется в интерфазе «твердое
тело-жидкость» из кварцевого
материала. Кварцевая поверхность заряжена
отрицательно благодаря депротони-
рованию поверхностных силанольных
групп. Следовательно, раствор в
интерфазе несет общий положительный
заряд (вызываемый ионами в растворе), с
тем чтобы нейтрализовать постоянный
отрицательный заряд на кварцевой
поверхности и образовать двойной
электрический слой.
Положительно заряженный
раствор вблизи поверхности проникает
внутрь подвижной диффузной
области двойного слоя. Под влиянием
электрического ноля сольватировап-
ные катионы движутся к
отрицательному электроду, неся за собой
молекулы растворителя. Так генерируется
ноток вблизи поверхности как у
кварцевых частиц, так и у стенок
капилляра. На макромолекулы, обладающие
зарядом, может также действовать
электрическое ноле, приводящее к
дифференциальной миграции как при
электрофорезе. Поэтому заряженные
и незаряженные частицы могут быть
разделены в соответствии с их
дифференциальной миграцией через колонку
и электрофоретической подвижностью
растворенных частиц. В качестве
примера на рисунке 1,1.23 показано
разделение пяти небольших пептидов на
капиллярной колонке методом КЭХ.
Г5.9. Перечень ключевых идей
° Движение заряженных частиц в электрическом поле называется
электрофорезом; оно происходит под действием кулоновских сил, действующих между
частицей и нолем.
• Стационарная электрофоретическая скорость заряженных частиц на единицу
электрического поля называется электрофоретической подвижностью: в
системе СИ она имеет размерность м2- сек"1- В"1.
* Абсолютное значение электрофоретической подвижности в растворе может
быть измерено методом движущейся электрофоретической границы или
свободным электрофорезом; процесс подобен процессу высокоскоростной
седиментации.
" Эффективный заряд частицы может быть вычислен из измерений ее
электрофоретической подвижности и коэффициента диффузии при использовании
техники электрофореза в мембранной геометрии (стационарный
электрофорез).
Молекулярные массы белков могут быть оценены из относительной
подвижности их полипептидных цепей в ДСН-электрофорезе при сравнении с
подвижностью белков-маркеров, молекулярная масса которых известна.

* Метод изоэлектрической фокусировки является методом разделения белков
по их заряду; метод имеет высокое разрешение при разделении белков с
различными значениями изоэлектрических точек (pi), различающихся не менее,
чем на 0,01 единицы рН.
* Комбинация разделения по заряду и разделения по массе приводит к
возникновению одного из самых эффективных аналитических методов — двумерного
электрофореза в геле, пригодного для разделения белков.
* Одномерный капиллярный электрофорез обладает большой скоростью
разделения и высокой разрешающей способностью; разделение требует небольших
объемов образца (0,1-10 нанолитров), в противоположность слаб-электрофо-
резу, для которого необходим образец в объеме микролитров.
* Использование геометрии песочных часов в методе капиллярного
электрофореза позволяет достичь микросекундного временного разрешения, что
открывает новые возможности в области исследования короткоживущих молекул.
* Двумерный капиллярный электрофорез может рассматриваться как
альтернативный двумерному электрофорезу в геле со всеми преимуществами
современных автоматизированных технологий.
* Циклодекстрины являются идеальными хиральными селекторами в
капиллярном электрофорезе благодаря их способности образовывать комплексы
«хозяин-гость» с широким кругом соединений.
* Метод капиллярной хроматографии сочетает принципы методов
высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза; он не
нуждается в механическом насосе и имеет ряд преимуществ по сравнению с
традиционной техникой, используемой для разделения заряженных макромолекул.
Литература для дальнейшего чтения
Исторический обзор и введение в биологические проблемы
Vesterberg О. A short history of electrophoretic methods. Electrophoresis, 1993.14,
1243-1249.
Cantor С and Schimmel P. Biophysical Chemistry. Part II. Technique for the Study
of biological Structure and Function. San Francisco. A. W. H. Freeman and Co., 1980.
Электрофоретические эксперименты
Van Holde K. E.Johnson W. С and Ho S. P. Principles of Physical Biochemistry. New
Jersey: Prentice Hall, 1998.
Skoog D. A., Holler F.J. and Neiman T. A. Principles of Instrumental Analysis, fifth
edition Philadelphia: Sounders College Publishing, 1998.

Walker J. M. Electrophoretic techniques. In Principles and Techniques of Practical
Biochemistry Ch. 12., eds. K. Wilson and J. Walker Cambridge: Cambridge University
Press, 2000.
Garfin D. E. Electrophoretic methods. In: Introduction to Biophysical Methods for
Protein and Nucleic Acid Research, eds. J. A. Glaser and M. P. Deutscher. San Diego:
Academic Press, 1995.
Макроионы в электрическом поле
Manning G. S. The molecular theory polyelectrolyte solutions with applications to
the electrostatic properties of polynucleotides. Q. Rev. Biophys, 1978.11, 179-246.
Schmitz K. S. Macroions in Solution and Colloidal Suspension. New York: VCH
Publishers, 1993.
AllisonS. A. Boundary element modelling of biomolecular transport. Biophys. Chem.
2001.93,197-213.
Метод свободного электрофореза
Laue Т. M., Ridgeway Т. М., Wool J. О., and Shepard, H. К. Insights into a new
analytical electrophoresis apparatus. J. Pharm. Sci., 1996. 85, 1331-1335.
Stellwagen N. C, Gelfi С and Righetti P. G. The free solution mobility of DNA.
Biopolymers, 1997. 42, 687-703.
Метод зонального электрофореза
Weber К. and Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by
dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis J. Biol. Chem., 1969. 244, 4406-
4412.
O'Farrell P. High-resolution two-dimensional electrophoresis of protein. J. Biol.
Chem., 1975.250,4007-4021.
CelisJ. E. and GromovP. 2D protein electrophoresis: can it be perfected? Curr. Opin.
Biotech. 1999.10,16-21.
Капиллярный электрофорез
Grossman P. D. Free solution capillary electrophoresis. In Capillary Electrophoresis:
Theory and Practice, eds. P. D. Grossman and J. С Colburn. San Diego, CA: Academic
Press., 1992.
KargerB. L., Chu Y.-H. and ForetF. Capillary electrophoresis of proteins and nucleic
acids. Annu. Rev. Biophys Biomol. Struct., 1995. 24, 579-610.
Zubritsky E. How analytical chemists saved the human genome project. Anal. Chem.,
2002. 74, 23A-26A.
Chen X., Wu H., Mao C. and Whitesides G. M. A prototype two-dimensional capillary
electrophoresis system fabricated in poly (dimethylsiloxane). Anal. Chem., 2002. 74,
1772-1778.
Plenert M. L. and Shear J. B. Microsecond electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 2003.100, 3853-3857.
Капиллярная электрохроматография
Colon L. A., Guo Y. and Fermier A. Capillary electrochromatography. Anal. Chem.
News, 1997.69,461A-467A.
linger K. K., Huber M. Walhagen K., Hennessy T. P. and Heam, M. T. W. A cri-
ticalappraisal of capillary electrochromatography. Anal. Chem., 2002. 74, 200A-207A.

Глава Г6
ОРИЕНТАЦИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ
ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ПОЛЕМ
Г6.1. Исторический обзор
и введение в биологические
проблемы
1875 1880
Дж. Керр (J. Kerr) был первым, кто
наблюдал эффект электрического
двойного лучепреломления (ДЛП) при
ориентации молекул электрическим полем.
Он показал, что наблюдаемая величина
двойного лучепреломления
пропорциональна квадрату амплитуды
приложенного поля. Позднее это явление было
названо его именем.
1880 1920
В эти годы для измерения ДЛП
использовался постоянный ток
высокого напряжения. Это очень затрудняло
его применение для исследования
водных растворов из-за их
проводимости. В 1940-1950 гг. несколько групп
исследователей (У. Кайе и Р. Дева-
ни, Н. А. Толстой и П. П. Феофилов,
К. О'Конски и Б. Зимм, и Г. Бенуа,
(W. Kaye and R. Devaney, N. A. Tolstoy
and P. P. Feofilov, С. Т. O'Konski and
В. Н. Zimm and H. Benoit) независимо
друг от друга провели первые
измерения электрического двойного
лучепреломления в коллоидальных системах
с использованием короткого
прямоугольного электрического импульса.
Это существенно уменьшило эффекты
нагревания и поляризации, которые
были наиболее уязвимыми местами в
исследованиях биологических
макромолекул в водных растворах.
1910
Л. Ланжевен (L. Langevin)
разработал первую теорию электрического
двойного лучепреломления, которая
в 1918г. была обобщена М. Борном
(М. Born). Было показано, что
ориентация оптически анизотропных
молекул может быть вызвана ее постоянным
дипольным моментом или
электрической анизотропией, или обоими
сразу. В 1931г. А. Петерлин и Г. Стюарт
(A. Peterlin и Н. A. Stuart)
распространили теорию на случай суспензии
жестких частиц.
19.11
Г. Бенуа (Н. Benoit) развил теорию
переходных явлений в электрических
полях. Он решил уравнение вращательной
диффузии, связанное со скоростью
изменения ориентации аксиально
симметричных жестких макромолекул при
появлении и исчезновении электрического поля.
Он показал, что коэффициент
вращательной диффузии может быть получен

из кривой спада (затухания) ориентации
при выключении ноля, а параметры
электрической ориентации - из кривой
нарастания ориентации при его включении.
Впоследствии он применил эту теорию в
исследованиях водных растворов вируса
табачной мозаики и ДНК.
1959
O'KoHCKH(O'Konski) предложил
метод раздельного определения дипольно-
го момента, анизотропии электрической
поляризуемости и фактора оптической
анизотропии из амплитуды двойного
лучепреломления для аксиально
симметричных жестких макромолекул. Этот
метод был применен к вирусу табачной
мозаики, синтетическим полипептидам
и коллагену. В 1963 г. И. Тиноко
(младший) (I. Tinoco Jr.) распространил
теорию двойного лучепреломления на
другие молекулярные модели и применил ее
для интерпретации данных по
фибриногену. В 1973 г. была опубликована книга
Е. Фредерик и К. Хусьера (Е. Fredericq
and С. Houssier's) «Электрический
дихроизм и электрическое двойное
лучепреломление» — одна из лучших книг,
описывающих явление Керра и его
применение.
1979
В. А. Вегенер (W. A. Wegener)
решил задачу спада кривой двойного
лучепреломления для жестких тел
произвольной формы. Он показал, что в этом
случае временная зависимость
затухания ДЛП является экспоненциальной
функцией, состоящей из пяти
компонентов. В1981 г. Б. Зимм и П. Дж. Хагерман
(В. Zimm and P. J. Hagerman)
представили различные варианты зависимости
между коэффициентом вращательной
диффузии, вычисленной из спада
оптической анизотропии после короткого
импульса электрического ноля и
гибкостью (персистентной длиной)
коротких червеобразных цепей. В 1990-х гг.
П. Дж. Хагерман (P. J. Hagerman) и
его группа внесли существенный вклад
в теорию и применение электрического
ДЛП для исследования макромолеку-
лярной структуры ДНК.
1990 2000
За эти годы в практику ДЛП были
внедрены два новых подхода.
Во-первых, время ответа детектирующих
систем было существенно сокращено (до
1 наносекунды), что позволило
исследовать электрооптпческие и
гидродинамические свойства белков и нуклеиновых
кислот, имеющих небольшие размеры.
Во-вторых, керамика, не проводящая
электричество, но обладающая
превосходной тепловой проводимостью
(нитрид алюминия) была введена в практику
электрического ДЛП. Это позволило
проводить измерения в растворах с большей
концентрацией солей без значительного
при этом выделения джоулевого тепла во
время электрического импульса и,
следовательно, применять его при более
высоких значениях амплитуды и частоты. Все
эти инновации привели к значительной
стабилизации сигнала, более точному
разрешению экспоненциальных
компонентов из кривых ДЛП и открыли новые
пути для исследования конформации и
гибкости РНК и ДНК.
2000 и но настоящее время
На сегодня метод электрического
двойного лучепреломления является
одним из наиболее точных методов
определения коэффициентов
вращательного трения многих биологических
макромолекул и, в первую очередь, ДНК и
РНК. Стоит лишь сожалеть, что полный
прибор для измерения электрического

двоиного лучепреломления коммерчески
недоступен и всякий, кто планирует
заняться исследованиями в этой области,
должен сам сконструировать
необходимый оптический и электрический
тракты. Рекомендации по конструированию
аппаратуры читатель может найти в
литературе (Hagerman, 2000).
Г6.2. Макромолекулы
в электрическом поле
Г6.2.1. Дипольный момент
биологических макромолекул
Наиболее важным понятием для
дальнейшего рассмотрения является
электрический диполь, который состоит из
двух зарядов противоположного знака
(+q и -q), разделенных расстоянием L
(рис. Г6.1). Различные типы
заряженных частиц, такие как ионизированные
группы или группы с асимметричным
распределением заряда, могут
рассматриваться как диполи. В этом случае
говорят, что молекула обладает
постоянным диполънъш моментом
(комментарии I '(>. I ). Дипольный момент/л
задается определенным значением зарядов
и расстоянием между ними:
]i = qL. (Г6.1)
Дипольным моментом обладают
только асимметричные молекулы.
Например, молекула Н20 изогнута и имеет
значение дипольного момента 1,85 де-
бая (D). Молекула CO., симметрична
и не имеет дипольного момента.
Когда молекула, не имеющая
дипольного момента, переносится в
электрическое поле, то оно вызывает
смещение отрицательно заряженного
электронного облака от
положительно заряженного ядра, создавая таким
Рис. Itt.1. Диполь в электрическом поле.
В электрическом поле диполь не
перемещается, поскольку его суммарный заряд равен
нулю. Однако он обладает вращающим
моментом, который имеет тенденцию ориентировать
молекулу в направлении приложенного поля
Комментарий Г6.1. Дипольный
момент
i Значение дипольного момента, ц,
выражается в системе СГС — универсальной
системе, обычно используемой в этой об- ■
ласти физики. Дипольный момент выража-
! ется в единицах дебая, D (ID = 10"18 элект-
1 ростатических единиц заряда, умноженных
на сантиметр). Фактор перехода в систему
СИ ID = 3,33564 х ю-30 кулон-метров.
Комментарий Г6.2. Поляризуемость
Поляризуемость — это скалярная ве-
: личина для изотропных веществ, но она
становится тензорной для анизотропных
веществ. Размерность поляризуемости см3 '
в системе СГС.
образом дипольный момент. В этом
случае говорят, что молекула
обладает наведенным диполънъш моментом.
Он существует до тех пор, пока
присутствует электрическое поле.
Взаимодействие молекул с внешним
полем зависит от их поляризуемости
или способности нейтральных молекул
становиться диполем во внешнем
электрическом поле (коммой lapiii": Viy'l).
Значение дипольного момента, ц,
индуцируемого внешним полем,
пропорционально интенсивности этого поля.
Константа пропорциональности называется
поляризуемостью:

u = aE. (Г6.2)
Очень сложные молекулы могут
быть представлены одним дипольным
моментом, представляющим сумму
моментов индивидуальных диполей
внутри молекулы. Синтетические иолипеп-
тиды в а-спиральной конформации
имеют очень большой дипольный
момент, поскольку все маленькие диполь-
ные моменты аминокислотных
остатков вдоль цепи складываются вместе, в
то время как антипараллельная двойная
спираль ДНК имеет небольшой
постоянный момент, но может приобретать
большой наведенный дипольный
момент.
Г6.2.2. Электрическое двойное
лучепреломление и дихроизм
Некоторые кристаллические структуры
разлагают падающий свет на два
перпендикулярных поляризованных луча,
которые распространяются в среде с
различными скоростями. Это свойство
называется двойным лучепреломлением
или двойной рефракцией. Двойное
лучепреломление среды определяется как
разница показателей преломления этих
двух лучей:
Ап = пх-пу (Г6.3)
и связана с оптическим замедлением 5
(также называемым фазовым сдвигом)
уравнением:
5 = 2тг/^, (Г6.4)
где А — длина волны падающего луча
в вакууме, а / — толщина образца.
Когда два ортогональных
колебания, проходящих через образец,
поглощают по-разному, то говорят, что
образец проявляет дихроизм, который
определяется как разность в
поглощении двух лучей:
АА = Ах-Ая. (Г6.5)
Эти два явления лежат в основе
оптической анизотропии. Они обычно
называются линейным двойным
лучепреломлением или линейным дихроизмом, с тем
чтобы отличать их от кругового двойного
лучепреломления и кругового дихроизма,
которые характеризуют оптическую
активность (Глава 35). Подобно рефракции
и абсорбции, двойное лучепреломление
(если присутствует) может наблюдаться
при любой длине волны, в то время как
дихроизм (если присутствует)
проявляется только в полосе поглощения.
Оптическая анизотропия может
индуцироваться в изотропных растворах
внешними силами, такими как
гидродинамические (двойное лучепреломление
в потоке), электрические
(электрическое двойное лучепреломление) и
магнитными полями (магнитное двойное
лучепреломление). Эти силы создают
ориентацию частиц в растворе: в таких
случаях направление х и у
ортогональных поляризаций выбирается,
соответственно, параллельно и
перпендикулярно по отношению к ориентирующей
силе, и двойное лучепреломление и
дихроизм определяются уравнениями:
Ди = и|[-и1 (Г6.6)
и
AA=A{l-AL (Г6.7)
соответственно.
В зависимости от относительных
значений п.. (Аг|) и nL (AL) двойное
лучепреломление (дихроизм) может быть
положительным или отрицательным.
В принципе электрическое двойное
лучепреломление и электрический
дихроизм дают одинаковую информацию

относительно макромолекулярнои
структуры: идентичный набор релаксационных
времен, одинаковые знаки и амплитуды
двойного лучепреломления,
тождественную информацию относительно
ориентации хромофорных групп внутри
молекулы. Однако на практике измерение ДЛП
дает более точную информацию
относительно набора релаксационных времен,
следовательно является более
приемлемым для исследования формы
макромолекул, в то время как дихроизм является
более точным способом определения
амплитуд и является более удобным в
исследованиях, связанных с определением
внутренней структуры.
В этой главе мы будем
рассматривать только метод двойного
лучепреломления. Мы не будем обсуждать
магнитное двойное лучепреломление,
которое является результатом
появления магнитной и оптической
анизотропии частиц в сильном магнитном поле.
Интересующиеся читатели могут
обратиться к специальной литературе.
Г6.3. Теоретические основы
измерений двойного
лучепреломления
Два основных импульса используют
в измерениях ДЛП (рис. Г(12). Первый
прямоугольный электрический импульс
(рис. Г().2 а). После приложения
импульса величина ДЛП изменяется во времени,
как показано на рисунке Id2 (>. С
помощью этого импульса могут быть
исследованы процессы, связанные с нарастанием
и спадом двойного лучепреломления, а
также с величиной амплитуды
равновесного состояния. Второй прямоугольный
импульс имеет сложную форму: после
достижения величины постоянного
сигнала двойного лучепреломления поле
быстро меняет знак на обратный, как
показано на рисунке \Ъ.2и. После такого
импульса величина двойного
лучепреломления изменяется (рис. \'(i'I/). Эта
форма импульса наиболее полезна при
исследованиях механизма
электрической ориентации.
(+)
(-)
Рис. ГП.2: а — прямоугольный электрический импульс £ как функция времени; б— изменение
величины сигнала двойного лучепреломления Дя в зависимости от времени, показывающее
нарастание сигнала и достижение стационарного значения Ди0; а — инверсионный электрический
импульс. Амплитуда сигнала изменяет свой знак на обратный в середине импульса; г — переходной
сигнал двойного лучепреломления в ответ на инверсию поля

Ниже мы кратко просуммируем
основные теоретические результаты,
полученные для растворов жестких частиц.
Для упрощения изложения мы
предположим, что макромолекулы имеют
общую ось симметрии их
электрических, оптических и гидродинамических
свойств и постоянный дипольный
момент вдоль этой оси. Мы также будем
считать, что раствор разбавлен
настолько, что взаимодействие между
макромолекулами отсутствует.
Г6.3.1. Стационарное двойное
лучепреломление
Зависимость между оптической
анизотропией и величиной электрического
двойного лучепреломления раствора
макромолекул выражается следующим
соотношением:
bn = ^(gx-g2Yb, (Г6.8)
п
где Q — это объемная доля
растворенных макромолекул, п — показатель
преломления раствора в отсутствие
электрического поля. Двойное лучепреломление
пропорционально произведению
фактора оптической анизотропии, g,-g2, на
функцию распределения ориентации,
Ф. При долговременном действии
электрического поля функция
распределения ориентации, Ф, принимает вид:
Ф=4(3(со520)-1), (Г6.9)
где 9 — угол между осью симметрии
макромолекулы и направлением поля, а
(...) означает усреднение по ансамблю.
Когда эффект ориентации,
обусловленный электрическим полем,
уравновешивается эффектом дезориентации,
обусловленным броуновским
движением, то:
Дя = (gi-S2)T7x
п 15
(Г6.10)
kT
-)£2
где а, и а., — избыточная электрическая
поляризуемость вдоль осп симметрии и
продольных осей, соответственно.
Таким образом, двойное лучепреломление
пропорционально квадрату силы поля в
области малых полей. Этот закон
называется законом Керра. Уравнение Г6.10
демонстрирует, что в ДЛП-эксперимен-
тах молекулы имеют тенденцию
ориентироваться в поле через взаимодействие
индуцированных (а, - а,,), и/или
постоянных, ц, диполей с приложенным
электрическим полем.
Константа пропорциональности К
называется константой Керра. Она равна:
г 2tiQ. ч 1
п~ 15
ц2 a,-a
(Г6.11)
'k2T2 ' kT
Как видно из уравнения Г6.11
константа Керра является
произведением двух вкладов, один из которых
оптической природы (g, - g.,), а второй
электрической природы (ц2-& 2-Т2 +
+ (a, -a2)-k Т1). Поэтому определитыш-
дивидуальный вклад каждого в константу
Керра невозможно ( к'имм.ц мрип Г(>..'!).
Г6.3.2. Процесс спада двойного
лучепреломления
При выключении электрического поля
будет происходить дезориентация
макромолекул под действием броуновского
движения, что приводит к спаду
двойного лучепреломления. В этом случае из
кривой спада можно прямо вычислить
время релаксации молекулы т,
поскольку оно описывается формулой:

An = Annexy>(-1 /т), (Г6.12)
где An — значение величины двойного
лучепреломления в любое время t после
начала спада, а Ди0 — начальная
величина двойного лучепреломления в момент
времени t = 0.
Вспомним, что время релаксации
т связано с константой вращательной
диффузии ©(параграф Г2.3.3). Таким
образом, анализ кривой спада двойного
лучепреломления обеспечивает самый
прямой и удобный способ
определения константы вращательной
диффузии, но сравнению с такими методами,
как двойное лучепреломление в потоке
(Глава Г.7) или деполяризация
флуоресценции (Глава Г8). Связь константы
вращательной диффузии 0 с
размерами и формой макромолекулы была
обсуждена нами ранее в параграфе Г2.3.4.
Г6.3.3. Процесс нарастания
двойного лучепреломления
При низких значениях величины поля
зависимость двойного
лучепреломления An от времени t описывается более
сложным выражением:
An A ЗА
= 1-
2(Л + 1)
А-2
ехр(-20г) +
(Г6.13)
2(Л+1)
ехр(-60г),
где Ап() является значением An при t —»°°
и эквивалентно постоянному значению,
приведенному в уравнении (Г6.10).
Параметр Л является отношением вклада
постоянного диполя к вкладу
индуцированного диполя и для стационарного случая
при низком величине поля имеет вид:
Л = -
U"
(a, -a.2)kT
(Г6.14)
Комментарий Г6.3. Эффект «формы»
в двойном лучепреломлении
Если молекулы имеют средний показатель
преломления, отличающийся от такового у
растворителя, то раствор будет проявлять
эффект «формы» в двойном
лучепреломлении. Наилучший способ вычленить вклад
«формы» в двойном лучепреломлении — это
измерить двойное лучепреломление в
растворителях с различным показателем
преломления. Этот эффект исчезнет, когда показатель
преломления растворителя станет равным
таковому у растворенных молекул. Растворы
глицерина и сахарозы в воде
используются как добавки для увеличения показателя
преломления среды и, следовательно, для
изменения вклада формы. Эти же растворы
используются для контрастирования при
рассеянии рентгеновских лучей (см. секцию
Е2.4). Если молекулы оптически
анизотропны, то раствор будет проявлять также и
внутреннее двойное лучепреломление, величина
которого будет определяться внутренней
структурой частицы.
Когда ориентация полностью
обусловлена анизотропией электрической
поляризуемости (т. е. А = 0), уравнение
(Г6.13) сокращается до
— = 1-ехр(-60г). (Г6.15)
Ап0
В этом случае нарастание и спад
кривых симметричны. С другой
стороны, когда ориентация обусловлена
постоянным дипольным моментом
(т. е. А = °°), уравнение (Г6.13)
трансформируется как:
An t 3 / „_ ч
— = 1--ехр(-20О +
Ди„ 2
+|схр(-60г).
(Г6.16)
В этом случае нарастание идет
гораздо медленнее, чем спад, и параметр Л

I'm. I (i..'i. Нормализованные кривые
нарастания ii спада Дл/Дл0в зависимости от времени
(метод площадей)
может быть вычислен из формы кривой
нарастания.
Другой метод определения
параметра А есть метод площадей (рис. Yti.'.V).
Если площадь 5, — площадь под кривой
нарастания, а 5., — площадь под кривой
спада, то эти площади при низких полях
связаны отношением:
5,
4Л + 1
А + \ '
(Г6.17)
Отметим, что отношение S{/S2
равно 1 для А = 0 и равно 4 для А=°°.
Лазер
Поляризатор
Ячейка
Анализатор
| <^ ; Детектор
Время
Рис. 1 (i.l Схема эксперимента по
электрическому ДЛП. При воздействии электрического поля
молекулы в ячейке частично ориентируются и
раствор проявляет двойное лучепреломление.
При использовании стандартной оптической
схемы электрическое поле направлено вдоль х-
оси, которая находится под углом 45° по
отношению к поляризатору и анализатору. Последние
расположены под углом 90° относительно друг
друга (Hagerman, 2000). Для детального
ознакомления с различными оптическими схемами,
используемыми в электрическом ДЛП,
читатель отсылается к соответствующей литературе
(Fredericq and Houssier, 1973)
Г6.3.4. Двойное лучепреломление
в реверсивных полях
Уравнение для случая реверсии в поле
низкой мощности (рис I (>.2 а),
эквивалентно уравнению Бенуа для процесса,
описывающего ход двойного
лучепреломления в нарастающем поле. В этом
случае уравнение Г6.13 имеет вид:
An . ЗА
|ОХГ)(-60М-
(Г6.18)
А«п
= 1-
А + \
-ехр(-20О].
Наиболее характерной чертой
кривой реверсии является наличие
минимума, который достигается за время tMm
с глубиной d (рис. \Ъ.'2/). В соответ-
J мин '
ствии с теорией при использовании
полей низкой мощности t и d не зави-
^ мни мин
сят от мощности поля и, более того, tmm
не зависит от типа диполя.
Г6.4. Измерения
электрического двойного
лучепреломления
Г6.4.1. Оптические схемы
Основная схема эксперимента по ДЛП
приведена на рисунке Ki. 1. Свет из лазер-

ного источника, распространяющийся
вдоль 2-оси, проходит последовательно
поляризатор, ячейку Керра и
анализатор. Луч поляризуется поляризатором,
который располагается под углом 45°
по отношению к электрическому полю,
и затем попадает на ячейку. Когда
раствор после приложения импульса
становится двулучепреломляющим, свет,
выходящий из раствора, оказывается
эллиптически поляризованным. Затем
свет проходит через анализатор,
который расположен под углом 90" по
отношению к поляризатору, и после этого
попадает на детектор. В эксперименте
используются две оптические схемы: без
и с пластинкой в четверть длины волны
( KOMMl'll r;i|)!!l"l I .(). i ).
В простейшем оптическом
приборе без пластинки в четверть длины
волны изменения интенсивности
света, под действием электрического поля
Комментарий Г6.4. Двойное лучепреломление в анизотропных кристаллах,
пластинка в 1Л длины волны
е
rJ. °
М
а б
Рис. а. Явление двойного лучепреломления, которое состоит в том, что луч света, падающий
на поверхность кристалла, раздваивается в нем на два преломленных луча — обыкновенный
о и необыкновенный е. Угол преломления г зависит от того, как ориентирована поверхность
пластинки по отношению к оптической оси кристалла.
1'пс. о. Параллельный пучок света, прошедшего через поляризатор (П), падает нормально
на поверхность плоскопараллельной пластинки, вырезанной из одноосного кристалла
параллельно его оптической оси MN.
В оптически анизотропных кристаллах (а их в природе большинство) наблюдается явление
двойного лучепреломления, которое состоит в том, что луч света, падающий на поверхность
кристалла, раздваивается в нем на два преломленных луча (рис. а). В одноосном кристалле
один из лучей, образующихся при двойном лучепреломлении, подчиняется обычным законам
преломления света и поэтому его называют обыкновенным лучом и обозначают буквой о.
Второй луч обозначают буквой е, так как он не лежит в плоскости падения. Если параллельный
пучок света, прошедшего через поляризатор, падает нормально на поверхность
плоскопараллельной пластинки, вырезанной из одноосного кристалла параллельно его оптической оси MN,
то на входе в кристаллическую пластинку электрические векторы one волн колеблются в
одной фазе (pi к', п). В пластинке owe волны распространяются с разными скоростями, поэтому на
выходе из пластинки толщиной d волны будут колебаться со сдвигом по фазе. В зависимости от
толщины пластинки возможно несколько частных случаев. Один из них соответствует сдвигу
фаз л/2. Такая пластинка называется пластинкой в четверть длины волны.

Направление
Риг. Г().5. Направление оси анализатора Л по
отношению к оси поляризатора Р.
Прикладываемое поле направлено под углом 45° к оси
А и оси Р
1.0
>
i
I
0.1
.01
•*. *л
-
\
2
4
<
1
г»
if 17
• х«
1 >ч
0 2 4 6
Время (мсек)
Рис. Г6.6. Кривая спада двойного
лучепреломления для фрагмента ДНК размером 98
пар оснований в полулогарифмическом
масштабе аппроксимируется одной экспонентой
в области свыше двух порядков спада
интенсивности сигнала. Условия проведения
эксперимента: 2,0 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8,0,
4 °С; длительность импульса 2 мкс,
амплитуда импульса 5 кВсек-1. Вставка: та же кривая,
построенная в линейной шкале по оси ординат
(Hagerman, 1985)
А/8, регистрируемые детектором, можно
выразить уравнением А/6 = /„siir'(5/2),
где 5 — оптическое замедление,
обусловленное электрическим полем, и /() —
интенсивность света, который попадает на
детектор, если поляризатор и
анализатор параллельны, а 5 равняется нулю.
Для 5«1 мы получаем приближенную
формулу Д/6 = /052 /4. Эта схема
обладает тем недостатком, что ее
чувствительность мала при небольших значениях 5
и знак 5 остается неизвестным.
В другом варианте оптическое
устройство включает пластинку в четверть
длины волны, которая расположена
между ячейкой Керра и анализатором
(см. коммгп mpnii l'(i. i). Анализатор
может вращаться на угол а от
крестообразного положения, как показано на
рис. I"().;"). Эллиптически
поляризованный свет, исходящий из двулучепре-
ломляющего раствора, превращается в
линейно поляризованный свет, после
прохождения через пластинку в
четверть длины волны, угол поляризации
которой зависит от величины
оптического замедления 5, обусловленного
электрическим полем. В этой
оптической схеме зависимость между А/6 и 5
для 8 «1 описывается уравнением:
A/6 = /0sin2a(5/2). (Г6.19)
Следовательно, А/6
пропорциональна 5, а не 5 . В этом случае
чувствительность выше, чем без использования
пластинки в четверть длины волны.
Более того, световой сигнал
усиливается при положительном значении 5 и
уменьшается при его отрицательном
значении. Это позволяет определить
знак двойного лучепреломления.
Кривая спада двойного
лучепреломления обычно представляется в
полулогарифмической шкале, как показано на
рисунке !'().(). Если исследуемые молеку-

лы являются жесткими и имеют
одинаковые размеры (монодисперсный раствор),
то зависимость In—-— как функция
Дя(0)
времени является прямой линией с
положительным наклоном, равным 1/т.
Г6.4.2. Интерпретация спада
кривой двойного лучепреломления
Как показывает теория для жестких
частиц произвольной формы спад
кривой двойного лучепреломления состоит
из пяти экспонент (пяти времен), в
зависимости от симметрии частицы
(распределения в ней заряда) и
направления и величины различных оптических
переходов внутри частицы:
Дя(0 = Х с*ехР—• (Г6.20)
Выделение пяти времен релаксации
хк и соответствующих пяти амплитуд
Ск из экспериментально измеренной
одной кривой An(t)ua практике
невозможно по хорошо известной причине:
задачи такого рода относятся к
числу некорректно поставленных задач
(см. koMucii трип I 1.1 2 и I l'i.(i).
В случае трехосных тел, когда
основные оси вращательной диффузии
(0), электрической поляризуемости и
направления электрического вектора
совпадают, тогда только два времени
релаксации ответственны за спад
двойного лучепреломления:
^ = fllexp(^) + flsexp(-), (Г6.21)
где я, и аГ) относятся к самому
длительному и самому короткому времени
релаксации, соответственно. В 1996 г. Гарсия
де ла Торре с соавторами предложили
характеризовать спад в терминах
других релаксационных времен, которые
могут быть определены из
эксперимента. Одно из них является начальным
временем релаксации tia4,
определяемым как:
xum-^[dAn(t)/dt)U, (Г6.22)
так что т||ач-1 является начальным
отрезком кривой An (t). Второе время
является средним релаксационным
временем т. :
Рис. Г()7. Геометрическая интерпретация начального и среднего времен релаксации для трех
электрооптпческих процессов: роста, реверса и спада. Начальное время релаксации для всех
трех процессов обозначено отрезком прямой линии, а среднее время обозначено
заштрихованной площадью А

тгр=/дя'(^, (Г6.23)
о
где An '(£) = An(t) характеризует область
спада, а п '(t) = 1 — An (f) характеризует
область возрастания и область
реверсивного процесса, так что Ди'(0) = 1 и
Ап'(°°) = 0 во всех случаях. Следует
заметить, что значение т — это, факти-
' ср *
чески, площадь под кривой спада An (t).
Геометрический смысл т. и т. иллюст-
г нач ср
рируется на рисунке Г6.7.
Для сферы радиусом R0, все
^времена релаксации (включая тнач и тс )
сводятся к одному значению, т0, которое
равно:
т„=-
60'
(Г6.24)
Г6.5. Глобальная структура
и гибкость белков
Из уравнения Г6.11 следует, что
методом электрического ДЛП можно
определить постоянные и наведенные
дипольные моменты, электрическую
поляризуемость и оптическую
анизотропию макромолекул. Ниже мы
приведем несколько примеров применения
метода ДЛП в исследованиях белков,
а именно домена белка кинезина,
относящегося к классу линейных моторов
(см. секцию Д6.3).
Г6.5.1. Исследование внутренней
структуры «моторного» домена
«Моторные» домены, а именно ncd
домен дрозофилы и домен кинезина
человека, осуществляют транспорт везикул и
органелл вдоль микротрубочек (см.
секцию Д6.3). Укороченная тяжелая цепь
кинезина человека, так называемый ки-
незин 349, имеет молекулярную массу
39200 Да и содержит 349
аминокислотных остатков; тяжелая цепь моторного
домена Drosophila ncd {ncd (335-700))
имеет молекулярную массу 41308 Да и
содержит 366 аминокислотных
остатков. Хотя молекулярные массы двух
моторных доменов отличаются всего
на 5% и имеют высоко гомологичные
последовательности, они проявляют
различные оптические, электрические
и гидродинамические свойства.
Немного меньший по длине домен кинезина
(349) обладает значительно более
продолжительным вращательным временем
релаксации (к тому же зависит от
мощности поля), чем ncd домен. Наиболее
1.6
1.2-
Х0.8
с
ьо
0.4
0.0 -4
100 300 500 700
Время (нсек)
а
900
300 500 700
Время (нсек)
Рис. Г6.8. Сравнение сигнала электрического ДЛП раствора: а — кинезина (349) и б — ncd (335-
700) в присутствии АДФ и Na2HP04 после приложения импульса в течение 520 наносекунд.
Концентрация каждого белка 1,5 мгмл '. Измерения проводились при 4 °С (Eden et al., 1995)

100
8
~* ю
И
Домен
-
- >
.•^Грамицидин
' '
кинезина
'V
I
(335
-70(Г)^
>/Кинезин 349
t i i i i ■ >
10
Молекулярная масса М (кДа)
100
Рис. I (i.9. Зависимость времени вращательной релаксации белков от молекулярной массы
в двойной логарифмической шкале в соответствии сданными i.-i'.. inni.i Id]
интригующим является тот факт, что
два домена имеют противоположные
знаки для сигнала ДЛП. Как показано
на piicупкс Г().8 а знак двойного
лучепреломления для кинезина положителен,
тогда как для tied — моторного
домена — отрицателен (рис. Г6.8 о). Различия
в знаке и значении константы Керра ncd
(335-700) и кинезина (349)
предполагают существенные различия в их
электрических свойствах. Интересно, что оба
моторных домена движутся в разных
направлениях по микротрубочке, хотя
зависимость между направлением и
знаком ДЛП-сигнала не установлена.
Г6.5.2. Гидродинамические
размеры глобулярных белков
Вычисления по формуле Перрена
(уравнение Г2.27) показывают, что
типичные сферические молекулы
радиусом 25 А имеют времена релаксации в
воде при температуре 25 °С около 17
не. Измерение таких маленьких времен
требует приборов с очень высоким
разрешающим временем (2-5 не). В !;ю. |1!-
iu l'(i. 1 приведены времена
вращательной диффузии некоторых глобулярных
белков, полученные в основном с
использованием высокоразрешающего
ДЛП-оборудования. В эту таблицу
включены также данные для димера
грамицидина, коэффициент
вращательной диффузии которого получен
методом динамического
светорассеяния (см. секцию Г10.3). Зависимость
времени вращательной релаксации
для белков от молекулярной массы в
двойной логарифмической шкале
приведена на рисунке Г6.9. Из него видно,
что эта зависимость представляет
собой прямую линию, наклон которой
близок к единице. Отсюда следует, что

Времена релаксации некоторых глобулярных белков
Белок
Грамицидин(димер)
Кинезин (349)
ncd(335-700)
БСА
Молекулярная масса (кДа)
2,5
39,2
41,3
68,0
Вращательное время релаксации
!,,„„. (нсек)
2,7
41
43
78
Коммспарми Г6.5. Персистентная
длина цепи как мера ее гибкости
Расстояние между концами (Л'^черве-
образной цепи может быть вычислено по
контурной длине LK, если известна
персистентная длина, R
(h2) = 2PL(l-P/L.) +
+ P/Lr[exp(-Lr/p)]
и в пределах больших значении Lh (клуб-
кообразная конформация) получаем
уравнение:
(А)
<(А2)/1Л_=2Р.
(Б)
Для малых значений /,к уравнение (А)
приводится к виду для L /Р < 1:
(A2) = I2.[l-l/3(Ir/P) +
+ l/12(Ir/P)2].
(В)
При Lc «P из уравнения (В)
следует, что {h2\ = L'c, т. е. расстояние между
концами равно контурной длине. Это ха- ,
рактерно для палочкообразных моделей. I
Если 1к увеличивается, (h2)<I?c
проявляется эффект кривизны. При очень
высоких значениях /,к действительно
соотношение (h2)ll = 2P/L. , обозначающее, что
х ' /;2\
отклонение значения (я ) от такового для |
палочкообразных молекул определяется
отношением персистентной длины к
контурной длине. I
время вращательной релаксации
пропорционально объему, занимаемому
молекулой белка (см. секции Г2.3 и
параграф Г8.5.3).
Г6.6. Глобальная структура
и гибкость нуклеиновых
кислот
Ранние исследования конформацион-
ных свойств нуклеиновых кислот
проведены с относительно длинными,
фракционированными по размеру,
молекулами. Неоднозначность данных о
длине ДНК ограничивала точность оценки
гибкости по этим измерениям.
Использование метода электрического ДЛП
является более приемлемым для
описания глобальной структуры и гибкости
нуклеиновых кислот по двум причинам.
Во-первых, недавние инновации в этом
методе позволили получать
высокостабильные сигналы и, как следствие этого,
более высокое временное разрешение
экспоненциальных компонент. Во-вторых,
как мы уже упоминали, молекулы ДНК
и РНК можно легко получать
фактически любой последовательности и длины
с точностью до одного основания.
Г6.6.1. Гибкость молекулы ДНК
в В- и А-форме
Нативная ДНК в В-форме обладает
отрицательным дихроизмом в видимой и
в ультрафиолетовой области спектра в
полосе ее поглощения (X = 259 нм)
(Глава 31). Такие же эффекты —
отрицательное ДЛП и дихроизм — имеют
место, когда молекула ДНК ориентируется

гидродинамическим нолем (Глава Г7).
Эти факты привели к двум заключениям
относительно поведения ДН К в
электрическом поле: макромолекула
ориентируется длинной осью в направлении поля
и плоскость оснований пар нуклеотидов
и составляют приблизительно
правильные углы по отношению к длине
молекулы (рис. Г(). 10). Однако величины
приведенных значений дихроизма, которые
измеряются и затем экстраполируются
к бесконечному значению напряжения
поля (полная ориентация), оказались
очень низкими. Основная причина этого
состоит в гибкости цепи ДНК.
Гибкость цепи ДНК удобно
характеризовать персистентной длиной. Это
понятие в 1948 г. было введено Кратки
и Породом в их пионерской работе, в
которой они предложили модель
червеобразной цепи (см. рис. Г2.17). Модель
характеризуется двумя параметрами: ее
полной контурной длиной Lk и
персистентной длиной Р. Последняя
определяет, как далеко гибкая макромолекула
простирается вдоль цепи (рис. ITi.l 1).
Равновесная персистентная длина
Р измерялась на протяжении многих
лет различными методами, которые
чувствительны к равновесным
свойствам макромолекул, включая
статическое рассеяние света, ДЛП в потоке,
седиментацию, характеристическую
вязкость. Проблемы с интерпретацией
некоторых из этих данных и получение
противоречивых результатов, особенно
связанных с зависимостью Рот
концентрации соли, неоднократно обсуждались
в литературе. Однако, несмотря на эти
проблемы, сегодня найден консенсус
относительно ее длины: равновесная
персистентная длина ДНК в В-форме
в буфере с умеренной концентрацией
соли принята равной около 500 А (i. пм -
мен Kipnii i'(i..~)).
Рис. ]'(). 10. ДНК в В-форме
Рис. 1 (i. 1 1. Персистентная длина Р
определяется как проекция вектора г, соединяющего
концы цепи в направлении первой связи при
бесконечной длине цепи. Если длина связи /
становится все меньше и меньше, цепь может
превратиться в нить с плавными изгибами.
Эта абстрактная модель называется моделью
Кратки-Порода

Существующая сегодня техника
получения фрагментов ДНК практически
любой фиксированной длины
позволяет обойти проблему полидисперсности
и получить достоверные равновесные
характеристики молекул ДНК в
огромном интервале молекулярных масс.
Молекулярная масса таких фрагментов
вычисляется из длины цепи и не
требует применения физических методов для
ее определения.
Б '' представлены
времена вращательной корреляции t,0w
В-формы ДНК, начиная с короткого
фрагмента ДНК (8 пар нуклеотидов)
и заканчивая нативнои ДНК плодовой
мушки Drosophila .uelanogaster (около
120 миллионов пар нуклеотидов).
Коэффициенты вращательной
диффузии коротких фрагментов
синтетической ДНК (8, 12, 20 пар нуклеотидов)
измерены методом деполяризованной
компоненты в динамическом
рассеянии света (Глава ПО). Фрагменты
ДНК в средней области значений
молекулярных масс (64-5243 пар нук-
10° 101 102 103 104 105 106 107 108 109
Число пар оснований
Рис-. ГО. 12. Зависимость времени вращательной релаксации от молекулярной массы ДНК
(выраженной в парах оснований) в двойной логарифмической шкале для широкого интервала
молекулярных масс, начиная от коротких фрагментов (8 пар оснований) и заканчивая нативнои ДНК из
плодовой мушки Drosophila Melanogaster (около 120 миллионов пар оснований). Все измерения
выполнены в 1-2 мМ NaCl, pH 6-7. Времена релаксации приведены к вязкости воды при 20 °С.
Данные о препаратах ДНК, имеющих неопределенность молекулярной массе, в данную
зависимость не включены. Кривая спада ДЛП для каждого из фрагментов, имеющих длину более 200
пар оснований, содержит не одну, а две компоненты, быструю и медленную. Здесь во внимание
принята только медленная компонента. Вставка. Демонстрация вклада концевых эффектов во
вращательное трение для олигонуклеотидов ДНК.

1аилица Г6.2 Времена релаксации молекул ДНК: от олигонуклеотида
(8 пар оснований) до нативной из Drosophila melongaster
(119 710 000 пар оснований)
Число пар оснований
8
12
Тридекамер (13)
20
64
80
89
104
124
145
188
192
213
213
213
234
234
267
267
267
410
434
520
587
587
659
782
910
1314
4361
5243
39937
168903
168903
4266814
4639221
119710000
Время релаксации
3,2 нсек
6,4 нсек
1,9 нсек
16,2 нсек
294 нсек
485 нсек
703 нсек
0,97 мксек
1,34 мксек
2,18 мксек
3,44 мксек
3,8 мксек
4,8 мксек
5,01 мксек
5,01 мксек
5,50 мксек
6,2 мксек
8,0 мксек
7,15 мксек
7,15 мксек
20,6 мксек
22,0 мксек
33,8 мксек
42,0 мксек
42,5 мксек
57,0 мксек
90,0 мксек
ПО мксек
280 мксек
1,28 мсек
2,20 мсек
32 мсек
450 мсек
520 мсек
40 сек
65 сек
6012 сек
Источник ДНК")
S
S
S
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
Т7
Т4
Т4
В. subtilus.
Е. coli
Drosophila melongaster
•') Источник ДНК: S — синтетические фрагменты; R — фрагменты, полученные с помощью
рестриктаз; Т7, Т4 — ДНК, выделенные из Т7 и Т4 бактериофагов, соответственно
леотидов) получены с помощью
рестриктаз и их корелляционные времена
измерены методом электрического
ДЛП. Времена вращательной
корреляции нативпых ДНК, выделенных из
различных источников, вычислены из
данных по упруговязкой релаксации
(см. Главу Г9).
На рисунке ["6.12 показана
зависимость вращательных
корреляционных времен т90 w от молекулярной
массы ДНК в двойной
логарифмической шкале, на которой
отражаются две характерные черты поведения
ДНК в растворе. Первая — для ДНК
размером 20-200 пар оснований. Эта

зависимость описывается прямой
линией с наклоном, равным 2,47,
который типичен для гомологичной серии
палочкообразных частиц конечного
диаметра (секция Г2.6). Для случая
очень тонкой палочки (d/L «1)
наклон прямой равен 3 (см. уравнение
Г2.60). Вторая состоит в том, что в
районе 180-200 пар оснований
начинается отклонение в поведении ДНК
от палочкообразного. Область
значений 200-8000 пар оснований
является переходной областью от палочки к
гауссовому клубку. В области 8-4700
килопар оснований зависимость
времени вращательной корреляции
молекулы ДНК от ее молекулярной массы
представляется прямой линией с
наклоном 1,47, который является
типичным для объемных гауссовых клубков
(секция Г2.6).
В заключение остановимся на
коротких фрагментах ДНК. Очевиден
существенный вклад концевых эффектов во
вращательное трение для олигонуклео-
тидов(8и 12 пар оснований) (piic. Гв. 12.
вставка). Шпилько-образная молекула,
состоящая из 13 пар оснований (триде-
камер), вращается быстрее, чем ДНК-
дуплекс, имеющий 8 пар оснований,
благодаря его компактной форме,
близкой к сферической (см. raui. \'().2). Эти
данные демонстрируют торжество
теории описания гидродинамического
поведения коротких круговых цилиндров,
для которых электрическое двойное
лучепреломление выявляет заметный
вклад концевых эффектов во
вращательное трение.
Рисунок Гв. 13 демонстрирует
молекулярную структуру ДНК в
А-форме. Она имеет 11 остатков на виток;
ее диаметр на несколько ангстрем
больше, чем диаметр ДНК в В-форме.
К сожалению, в литературе
экспериментальные данные но исследованию
ДНК в А-формс методом
электрического ДЛИ ограничены всего
несколькими фрагментами, поэтому на рис.
Г().М показана зависимость времени
вращательной корреляции т.,() u от
молекулярной массы (в нарах
оснований) только для четырех фрагментов
ДНК длиной 373, 460, 676 и 917 пар
нуклеотпдов. И хотя угол наклона
прямой линии (2,51) для ДНК в А-
форме близок к таковому для ДНК в
В-форме (2,47), что, как мы указывали,
типично для палочкообразных частиц,
однако имеется одно существенное
различие. В то время как зависимость
времени релаксации от
молекулярной массы для ДНК в В-форме
начинает отклоняться от прямом линии в
районе 180-200 пар нуклеотпдов (см.
рис. Г6.12), аналогичная зависимость
для ДНК в А-форме продолжает
оставаться прямой линией вплоть до
последней измеренной точки (917 пар
нуклеотпдов) (см. рис. Г(}.13). Таким
образом, данные но электрическому
ДЛП подтверждают, что ДНК в А-
форме более жесткая, чем ДНК в В-
форме. Действительно, нерсистентная
длина ДНК в А-форме равна около
1500 А, что в три раза больше, чем
таковая для ДНК в В-форме.
Обсужденные в предыдущих
параграфах экспериментальные данные
относятся к равновесной или
статической гибкости ДНК. Ни одно из этих
измерений не является динамическим
в том смысле, что оно выявляет
зависимость гибкости ДНК от времени.
Динамическая гибкость может быть
получена из начального спада кривой
в экспериментах по электрическому
ДЛП. В таких экспериментах
фрагменты ДНК подвергаются действию
короткого импульса очень сильного

(Г6.25)
электрического поля, до 60 кВ-см ',
с тем чтобы максимально
ориентировать молекулы вдоль поля. Выходные
данные анализируются по данным
экспоненциального спада,
представляемого в виде двух экспонент:
Л(0 = Дехр(-6ЭО-
+A.2exp(-t/x),
где 0 — коэффициент, который
описывает обобщенную вращательную
диффузию, а х — время, которое связано с
динамической жесткостью на изгиб. В слабых
электрических полях доминирует первая
экспонента (АуА.,» 1,0), тогда как с
повышением мощности поля возрастает
относительный вклад амплитуды
быстрой компоненты (Л2/Л,» 1,0),
которая затем выходит на плато. Увеличение
вклада относительной амплитуды
быстрой компоненты с ростом
электрического поля ассоциируется с проявлением
динамических свойств ДНК, а именно,
изгибанием спирали в направлении,
Рис. Г().11-$. Молекулярная структура А-фор-
мы ДНК: 11 пар оснований на виток спирали;
шаг спирали равен 2,55 А
перпендикулярном полю. Оценки
показывают, что динамическая жесткость
молекулы на изгиб в четыре раза боль-
500 600 700
Число пар оснований
900 100С
Рис. I (). II. Зависимость времени вращательной корреляции t20vv от молекулярной массы
(в парах оснований) для ДНК в А-формс в двойной логарифмической шкале. Наклон прямой
линии равен 2,51

*r
Рис. Г6.15. Вид сбоку и в разрезе
пространственной модели двойной спирали ДНК
(слева) и РНК (справа); сахар рибозы выделен
желтым цветом, дезоксирибоза — зеленым.
Нарисованная ленточка (сиреневая) проходит
через атомы фосфора (Р) сахаро-фосфатного
остова. Атомы оснований, экспонированые в
основной желоб спирали, обозначены серым
цветом; другие атомы в нуклеотидах — белым
цветом. А-, В-спирали содержат по 20 пар
оснований)
ше кажущейся статической жесткости,
выведенной из измерений равновесной
персистентной длины для тех же
фрагментов той же длины.
Г6.6.2. Гибкость двуспиральных
РНК
2-гидроксильная группа РНК
стабилизирует двойную спираль в А-форме,
которая отличается от канонической В-
формы спирали тем, что имеет меньшее
число пар на виток и смещенные от оси
спирали пары оснований (рис. Гб. 15).
Времена вращательной корреляции
т20 w двуспиральной РНК длиной от 97
до 317 пар оснований представлены в
км.iiiiu- Hi..'!, а зависимость времени
вращательной корреляции т,0 w от
молекулярной массы в двойной
логарифмической шкале на рисунке Г6.16.
Анализ спада кривой ДЛП дает
персистентную длину спирали РНК,
равную 720 + 70 А, допуская
эффективный гидродинамический диаметр в
26 А и шаг спирали в 2,7 А (в
присутствии ионов Mg2+). В отличие от ДНК
100
300
200
Число пар оснований
Рис. Г6.16. Зависимость времени вращательной корреляции т20 ж от молекулярной массы,
выраженной в парах оснований, для 13 фрагментов РНК в двойной логарифмической шкале
(Kebbekusetal., 1995)

I.nmiii.i ГО.'!. Времена релаксации
молекул РНК
Число пар
оснований
92
109
116
119
132
136
180
186
203
226
243
288
317
Время релаксации
оснований т20 w
(в мксек)
0,44
0,62
0,69
0,75
1,00
1,08
1,90
2,02
2,48
3,46
4,03
6,63
7,31
Данные взяты из Kebbekus et al. (1995)
в В-форме, зависимость времени
вращательной корреляции от
молекулярной массы в логарифмической шкале
для РНК в А-форме может быть
описана прямой линией для всего
интервала значений молекулярных масс с
наклоном прямой, равным 2,47,
который типичен для гомологичной серии
палочко-образных частиц конечного
диаметра (секция Г2.6). Из
сказанного выше можно сделать заключение о
том, что РНК в А-форме является
более жесткой молекулой, чем ДНК в В-
форме, но менее жесткой, чем ДНК в
А-форме.
Г6.6.3. Конформации неспиральных
элементов в РНК
Время спада ДЛП изучаемых молекул
обычно интерпретируется в понятиях
гидродинамических моделей,
параметры которых подбираются таким
образом, чтобы расчетные времена
вращательной диффузии совпали с
экспериментальными. Такая
интерпретация всегда содержит долю
неопределенности, поскольку несколько
моделей с разными параметрами
могут соответствовать одному
измеренному времени вращательной
диффузии (см. секцию Г2.3). В начале 2000-х
годов для исследования конформа-
ционных свойств однонитевой
молекулы РНК в растворе методом ДЛП
был предложен новый подход,
названный т-отношением. На рисунке 16.17
показан принцип этого подхода. При
изучении роли неспиральных
элементов (например, выступов)
конструируются полностью дуплексные
молекулы и гетеродуплексы, содержащие
выступ (рис. Г6.17 а). Оба конструкта
должны совпадать по длине ( ком.\и м-
i;ij)iui 10.0). Затем из профиля спада
ДЛП для двух конструктов
определяются времена релаксации, отношение
Комментарий Г6.6. Выбор длины
РНК в методе «т-отношение»
Выбор длины спирали РНК зависит от
нескольких основных факторов.
Во-первых, спираль должна быть достаточно
короткой, чтобы можно было четко выявить
структуру центрального изгиба и
аппроксимировать спад кривой одной экспонен-
той. Таким условиям соответствует РНК,
по своей длине приблизительно равная
одной персистентной длине (200-250 пар
оснований). Во-вторых, потенциальные
места изгибов должны располагаться в
таком месте спирали, чтобы обеспечить
заметные различия в их конформационных
свойствах. Анализ показывает, что длина
одного плеча спирали должна быть не
менее 70 пар оснований при суммарной длине
полного дуплекса в 250-300 пар оснований
(Hagerman, 2000).

2 4 6
Время (мксек)
10
Рис. 16.17: а — демонстрация основного принципа в исследовании конформацпонных свойств
ДНК и РНК методом т-отношения. Конечное время спада определяется для гетеродуплекса,
содержащего выступ, (т ), и контрольного дуплекса, не содержащего выступ (тЫ11п). Каждый
экспериментальный профиль для гетеродуплекса состоит из двух экспоненциальных компонент —
медленной амо 1 и быстрой а0 ; б — экспериментальное значение отношения двух времен спада
т-отношение = t^/t^J сравнивается с теоретической зависимостью этого же отношения от угла
между плечами модели (Hagerman, 2000)
которых дает количественную оценку
угла между изгибами (рис. Г6.17 6).
Применение этого подхода для
характеристики неспиральных элементов
(например, выступов, внутренних
петель, и т. п.), обычно присутствующих
в РНК, показало, что выступы,
содержащие как адениновые, так и урацило-
вые остатки, монотонно увеличивают
углы изгибов от 10-15° для единичных
остатков в присутствии ионов Mg2+ до
80-90° для шести остатков в отсутствии
этих же ионов. При добавлении ионов
Mg2', вставка шести урацилов, U6,
вызывает примерно двухкратное уменьшение
угла изгиба, в то время как углы для
шести аденинов, А6, остаются неизменными.
Это наблюдение представляет
элементарный пример структурной перестройки в
РНК, специфичность которой связана
как с последовательностью оснований,
так и с валентностью катионов.
Г6.7. Перечень ключевых идей
• Если молекула асимметрична, то она может рассматриваться как диполь, и
тогда говорят, что она обладает постоянным диполъным моментом.

• Если молекула не имеет постоянного динольного момента, но может
приобретать его в электрическом ноле, тогда говорят, что она обладает наведенным
дипольным моментом; последний существует, пока существует электрическое
поле.
• Величина наведенного динольного момента пропорциональна интенсивности
поля; константа пропорциональности называется поляризуемостью.
• Благодаря своей диполыюй природе, биологические макромолекулы в
растворе ориентируются под действием электрического поля, проявляя эффект
двойного лучепреломления.
• Закон Керра гласит, что величина двойного лучепреломления
пропорциональна квадрату интенсивности электрического поля для случая малых интенсив-
костей полей; константа пропорциональности называется константой Керра.
• Оба метода, ДЛП и дихроизм, дают одну и ту же информацию о структуре
макромолекул; однако на практике метод ДЛП в большей степени подходит для
исследования формы макромолекул.
• Скорость спада кривой двойного лучепреломления после прекращения
электрического поля обеспечивает прямое измерение времени релаксации макромолекул.
• Для жестких тел произвольной формы временная зависимость ДЛП
описывается мультиэкспоненциалыюй функцией, которая может содержать до пяти
компонент; на практике из кривой можно извлечь не более двух экспонент.
• Время релаксации сферической макромолекулы пропорционально ее объему.
• Для жесткой палочкообразной частицы время релаксации пропорционально ее
длине; вычисление длины не требует точного знания молекулярной массы.
• Статическая персистентная длина ДНК в В-форме в буфере с повышенной
концентрацией соли равна 500 А; аналогичное значение для ДНК в А-форме
равно 1500 А.
• Молекулы ДНК, имеющие молекулярную массу от 8 пар оснований (олигонук-
леотиды) до 120 миллионов пар оснований {Drosophila melanogaster), образуют
уникальный гомологичный ряд, время вращательной корреляции в котором
находится в пределах от нескольких наносекунд до тысяч секунд (12 порядков).
• В области небольших значений молекулярных масс (8-200 пар оснований)
поведение ДНК подобно поведению жесткой палочки, а в области больших
молекулярных масс (более 8 килопар оснований) подобно поведению гибкого
гауссова клубка.

Литература для дальнейшего чтения
Исторический обзор и введение в биологическую проблему
Fredericq Е. and Houssier С. Electric Dichroism and Electric Birefringence. Oxford:
Clarendon Press, 1973.
Hagerman P. J. Sometimes a great motion: application of transient electric
birefringence to study of macromolecular structure. Curr. Opin. Struct. Biol., 6, 643-
649, 1996.
Макромолекулы в электрическом поле
Belmonte P. A., Martinez С L. and Garcia de La TorreJ. Time course of the orientation
and birefringence of axially symmetric macromolecules upon reversal of an electric field
of arbitrary strength. J. Phys. Chem., 1991. 95, 5661-5664.
Основы теории
Charney E. Electric linear dichroism and birefringence of biological polyelectrolites.
Quart. Rev. Biophys., 1988. 21, 1-60.
Экспериментальные измерения электрического ДЛП
Hagerman P. J. Application of transient electric birefringence to the study of
biopolymer structure, Methods in Enzymol, 1985.117, 199-215.
Глобальная структура и гибкость белков
Kooijman M., Bloemendal M., Van Amerongen #., Traub P. and Van Grondel-
le R. Characterization of multiple oligomeric vimentin intermediate filament units by
transient electric birefringence measurements. J. Mol. Biol., 1994. 236, 1241-1249.
Глобальная структура и гибкость нуклеиновых кислот
Klotz L. С. and Zimm В. Н. Size of DNA determined by viscoelastic measurements:
results on bacteriophage, Bacilus subtilus and Escherichia coli, 1972. 72, 779-800.
Hagerman P.J. and Zimm В. Н. Monte Carlo approach to the analysis of the rotational
diffusion of wormlike chains. Biopolymers, 1981.20, 1481-1502.
Diekmann S., Hillen W., Morgeneyer Wells R. D. and Porschke D. Orientation
relaxation of DNA restriction fragments and the internal mobility of the double helix,
Biophys. Chem., 1982.15, 263-270.
Pecora R. DNA: a model compound for solution studies of macromolecules, Science,
1991.251,893-898.
Kebbekus P., Draper D. E. and HagermanP.J.Persistencelength of RNA. Biochemistry,
1995. 34, 4354-4357.
Hagerman P.J. Transient electric birefringence for determining global conformations
of nonhelix elements and protein-induced bends in RNA. Meth. Enzymol., 2000. 317,
440-453.
Lu Y., Weers В., Stellwagen N. С DNA persistence length revisited. Biopolymers,
2001-2002.61,261-275.
Hagerman P. J. Investigation of the flexibility of DNA using transient electric
birefringence. Biopolymers, 1981. 20, 1503-1535.
Stellwagen N. С Electric birefringence of kilobase-sized DNA molecules. Biophys.
Chem., 1996.58, 117-124.

Глава Г7
ОРИЕНТАЦИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ
ГИДРОДИНАМИЧЕСКИМ ПОЛЕМ
Г7.1. Исторический обзор
1870
Дж. Клерк Максвелл (J. Clerk
Maxwell) впервые описал эффект
двойного лучепреломления (ДЛП) в
потоке, используя в качестве
объекта исследования канадский бальзам.
ДЛП возникало при помещении
канадского бальзама между двумя
концентрическими цилиндрами, один из
которых вращался, а второй был
зафиксирован.
1932
П. Бедер (P. Boeder)
представил первую теории ДЛП в потоке. Он
сформулировал основную проблему
теории — нахождение связи между
углом ориентации и величиной двойного
лучепреломления с размерами молекул
коллоидальных частиц. Между 1938
и 1941 г., А. Петерлин и Г. А. Стюарт
(A. Peterlrin and H. A. Stuart), а
также О. Снельман и Е. Бьйорншталь
(О. Snellman and Y. Bjornstahl) ввели
в рассмотрение важный для описания
процессов ДЛП в потоке
универсальный параметр — отношение градиента
скорости к коэффициенту
вращательной диффузии.
1 !)Л0-с
Г. А. Шерага, Дж. Т. Эдсалл и
Дж. О. Гадд (Н. A. Sheraga, J. T. Edsall
and J. O. Gadd) дали количественную
оценку угла ориентации и величины
двойного лучепреломления как
функции отношения градиента скорости к
коэффициенту вращательной диффузии
в широком интервале значений
градиента скорости. Это открыло возможность
вычисления молекулярных размеров
эллипсоидальных частиц методом ДЛП.
Конец НЖО-х
Г. Б. Тарстон (G. В. Thurston)
предложил способ измерения двойного
лучепреломления в гидродинамическом ос-
цилляторном поле. В то же самое время
Н. Дэвидсон (N. Davidson) разработал
метод определения времен релаксации из
измерений спада дихроизма в потоке.
1970-е
Р. Е. Харрингтон и В. Н. Цветков
(R. E. Harrington and V. N. Tsvetkov)
разработали приборы и оборудование для
измерения величин ДЛП и углов
ориентации в растворах
высокомолекулярных полимеров при низких градиентах
скорости. Это позволили изучать сильно
разбавленные растворы ДНК. В. Кун,
Г. Кун Р. Серф, В. Цветков (W. Кип,

Н. Кип, R. Serf, V. N. Tsvetkov) внесли
существенный вклад в теорию и практику
ДЛП-деформируемых макромолекул, и, в
первую очередь, линейных полимеров.
1980 2000
В начале 1980-х метод ДЛП в потоке
начал терять популярность среди
биофизиков. Причин для этого было две. Первая
была связана с появлением метода
электрического двойного лучепреломления,
который требовал гораздо меньших ко-
Л1гчеств исследуемого материала. Вторая
связана с принципиальными
ограничениями самого метода ДЛП, поскольку с
его помощью можно исследовать только
вытянутые частицы, такие как
палочкообразные вирусы, молекулы ДНК и РНК.
Сегодня, однако, интерес к ДЛП в потоке
вновь возрос в связи с открывшимися
возможностями исследования конформаци-
онной динамики индивидуальных
больших молекул ДНК в реальном режиме
времени. За такой динамикой можно вести
непосредственное наблюдение с
использованием флуоресцентного микроскопа.
Г7.2. Введение
в биологические проблемы
Двойное лучепреломление наблюдается
в жидкости, содержащей
асимметричные частицы, когда в жидкости
устанавливается градиент скорости. Градиент
скорости проще всего достигается, когда
жидкость помещается между двумя
концентрическими цилиндрами при
вращении одного и фиксированном положении
другого. Если приложить внешнее поле
к изначально изотропному раствору, то
он становится двулучепреломляющим.
В случае гидродинамического поля
двойное лучепреломление образуется в
результате действия градиента скорости,
которому подвергается система. Если
растворенные макромолекулы
являются геометрически, и, следовательно,
оптически асимметричными, то двойное
лучепреломление устанавливается как
результат равновесия между эффектами
ориентации, происходящими благодаря
приложенному полю, и беспорядочной
разориентации под действием
броуновского движения. Однако даже для
сферических частиц, которые в отсутствие поля
оптически изотропны, оптическая
анизотропия может возникать, как результат
деформации молекулы вследствие
приложенного градиента скорости.
Следовательно. ДЛП в потоке является методом
получения информации о
геометрических, оптических свойствах и гибкости
биологических макромолекул в растворе.
К сожалению, область применения
метода ДЛП при исследовании
биологических макромолекул относительно узка,
несмотря на его очевидные
потенциальные возможности. Так, его практически
невозможно применять к глобулярным
белкам, поскольку скорость их
вращения очень велика, что делает ориентацию
этих молекул гидродинамическим нолем
очень затруднительной. Наиболее
интересные результаты получены для
растворов больших гибких макромолекул,
особенно для ДНК и РНК, причем в
последнее время особое внимание
уделяется динамическому поведению единичных
флуоресцентно меченых молекул ДНК,
за которыми можно непосредственно
наблюдать в флуоресцентном микроскопе.
Г7.3. Стационарное
динамическое двойное
лучепреломление
Стационарная ориентация в потоке
наиболее легко достигается при поме-

щении раствора, содержащего
суспендированные асимметричные частицы, в
зазор между двумя концентрическими
цилиндрами, один из которых
вращается, а другой зафиксирован (рис. 17.1).
Когда оба цилиндра находятся в
состоянии покоя, как показано на рис. 17.1 а,
частицы и имеют произвольную
ориентацию. Когда один из цилиндров
начинает вращаться, в жидкости
создается ламинарный поток и, как следствие
этого, градиент скорости. В результате
этого частицы ориентируются, как
схематически показано на рис. 17.1 а. Поле
между цилиндрами можно наблюдать
при прохождении света, направленного
параллельно оси цилиндра, через
скрещенные две призмы, представляющие
собой поляризатор и анализатор.
Допустим, что у нас есть набор молекул,
ориентированных таким образом, что их ось
создает угол 0 с осью у (рис. 17.2).
Падающий на молекулы поляризованный
свет с электрическим вектором,
колеблющимся в направлении у-оси,
расщепляется на компоненты Е, и Е±,
поскольку показатель преломления в этих двух
направлениях различен. В этом случае
мы говорим, что ориентированные мо-
а б
Рис. 17.1. Частицы в жидкости
располагаются между двумя концентрическими
цилиндрами: а — схематическое представление частиц
в виде коротких отрезков, показывающих их
оптические оси в состоянии покоя цилиндров;
б — ориентация частиц, вызываемая
вращением внешнего цилиндра
лекулы обладают свойством двулучеп-
реломления. Если обозначить
действующее электрическое поле как Еи, то тогда
Е, = Ео cos0 и Е± = £0sin 0. Свет, который
прошел через ориентированные
молекулы, теперь должен пройти через
анализатор, который располагается таким
образом, чтобы пропускать все колебания,
параллельные 2-оси. Если 0 равно нулю
или 90°, то падающий поляризованный
свет не будет расщепляться на
компоненты. В этом случае падающее на
анализатор поле будет параллельно оси у,
Свет
Поляризатор
Молекула
Рис. 17.2. Относительная ориентация поляризатора, молекулярных осей и анализатора.
Поляризованный свет, падающий на молекулу, может быть разложен на компоненты Е and E±.

Частицы, ориентированные
под углом х к потоку
Рис. 17.3. Схематическая иллюстрация
потока, когда все частицы имеют один и тот же угол
X по отношению к линиям потока. На
диаграмме показано пересечение изоклинов, которые
показывают четыре положения, где
оптические оси частиц являются строго
параллельными к плоскости поляризатора и
анализатора (Tenford, 1965)
и свет не будет проходить. Для всех
других углов ориентации часть света будет
пропускаться анализатором. В
результате действия внешнего поля получаются
четыре темные области, в форме креста,
с перемежающимися светлыми
областями (рис. Г7.3). В темных областях
плоскость колебаний света, передаваемая как
поляризатором, так и анализатором,
параллельна оптической оси раствора.
Одним из ограничений метода ДЛП
при исследовании гидродинамических
свойств и оптического поведения
макромолекул в растворе является его
невысокая чувствительность при
измерении очень низких значений
величина ДЛП и углов экстинкции около
45° (смотри ниже), когда распределение
макромолекул по ориентации
относительно широко.
В стандартном методе для
измерений ДЛП макромолекул используется
оборудование, в котором поток раствора
рассматривается через скрещенные
поляризаторы, а лучепреломление
наблюдается визуально при помощи
оптического компенсаторного оборудования
(см. выше). К сожалению, приемлемый
уровень точности не может быть
достигнут с помощью такого оборудования,
если величина лучепреломления
меньше, чем 10"*. Наилучшим способом
решения проблемы чувствительности
измерений ДЛП является использование
фотоэлектрических детекторов. С их
помощью можно определять ДЛП
макромолекул с очень высокой молекулярной
массой и низкой концентрацией, с
градиентом скорости меньше чем 0,01 сек"1,
когда эффект Максвелла мал. Как и в
случае метода Керра коммерческие
приборы, предназначенные для изучения
макромолекул методом Максвелла, на
сегодняшний день отсутствуют.
Г7.3.1. Угол ориентации
и коэффициент вращательного
трения
В эксперименте по ДЛП жидкий слой
просматривается в направлении
образующей цилиндра. При этом
ламинарный поток, возникающий в зазоре,
можно считать однородным с постоянным
градиентом скорости в направлении
радиуса (рис. Г7.4). Под действием
напряжения сдвига в потоке жидкость
становится оптически анизотропной. При
этом для светового пучка, нормального
направлениям градиента скорости G и
скорости потока и, т. е. параллельного
оси цилиндра, свойства анизотропного
слоя оказываются подобными
оптическим свойствам пластинки кристалла,
главное сечение которого образует
некоторый угол % с направлением потока
и. Этот угол называется углом
ориентации. Угол % ~ одна из двух основных
величин, измеряемых на опыте. Второй
величиной является разность двух глав-

ных показателей преломления An = пх -
п2, жидкости, из которых первый (и,)
соответствует лучу, электрический
вектор которого параллелен главному
сечению анизотропного слоя, второй (п2)
перпендикулярен к главному сечению
(оси) слоя. Величина An
характеризует, в основном, оптические свойства
частиц, тогда как угол % имеет
непосредственное отношение к
гидродинамическим свойствам частиц. В этой главе мы
сосредоточимся на угле х, поскольку,
как будет показано ниже, он связан
непосредственно с коэффициентом
вращательного трения частицы.
Рассмотрим в качестве простого
примера случай вращения жестких
палочкообразных частиц, ограничившись для
простоты двумерным пространством
(рис. 17.5). Такая частица оказывается
под действием двух сил, одна из
которых ориентирующей природы (градиент
скорости), а вторая —
дезориентирующей природы (броуновское движение).
Гидродинамические силы вращают
частицу по часовой стрелке, и очевидно,
что вращающий момент будет
максимальным при угле 0 = 90° по отношению
к линиям потока, и минимальным при
Э = 0°. Молекулы будут двигаться более
быстро в районе первого угла, и более
медленно в районе второго угла,
создавая преимущественную ориентацию
частиц по углам. Этой ориентации
противодействует броуновское движение,
которое способствует случайному
распределению частиц. Равновесная
ориентация достигается при балансе этих двух
сил. Она характеризуется параметром
а = G/Q, где G — градиент скорости, а
0 — коэффициент вращательной
диффузии. Когда а « 1, наиболее вероятный
угол ориентации равен 45°, при котором
гидродинамические и броуновские силы
равны по величине и противоположны
>*~~:
It"" "'"1(с
т^к,
^^г1Г0Г,тти>шшшт,ттггтГгГ7Гг2
Рис. 17.1 Поле градиента скорости в жидком
слое, заключенном между стенками
неподвижного (Ои вращающегося (2) цилиндров,
и-скорость потока, G — направление
градиента скорости, х — Угол ориентации
\^/л/ 4
.$v
yjz)t
*" ~^®
* S's^\
Же
^
-д:
Рис. Г7.5. Силы, действующие на жесткую
палочкообразную частицу в градиенте
скорости. Тангенциальная компонента градиента
скорости показана, как ->, силы броуновского
движения показаны как >
по знаку. Наименее вероятный угол —
135°, в котором силы складываются (см.
рис. Г7.5). В другом случае, когда а » 1,
гидродинамические силы существенно
подавляют броуновское движение, и все
оси располагаются вблизи угла
ориентации, равного нулю. Наименее вероятный
угол будет при 90°.
Зависимость угла экстинкции х от
а для различных значений отношения
осей р эллипсоида вращения показана на

45
s
s
то
1-
| 25
о.
о
с;
о
35
15
5 ■
15 25
Параметр, а
35
I'nc. I 7.(J. Угол орпентацнин х как функция
параметра а для различных значении
отношения осей, р, эллипсоида вращения (Sheraga et
al., 1951)
Комментарии Г7.1. «Внутреннее»
двойное лучепреломление
и двойное лучепреломление «формы»
Большинство макромолекул имеет
показатель преломления п, который отличается
от такового обычных водных растворов.
Поэтому, когда биологические
макромолекулы в растворе ориентируются в
градиенте скорости, раствор становится двулуче-
преломляющим. Иными словами, он имеет
различные показатели преломления,
параллельно и перпендикулярно линиям
потока. Это явление называется двойным
лучепреломлением «формы», и возникает оно
в растворах несферических макромолекул,
показатель преломления которых
отличается от такового у растворителя. Однако,
даже если показатель преломления частиц
равен таковому у растворителя, двойное
лучепреломление может возникать,
когда молекулы сами по себе анизотропны и
имеют различные показатели
преломления, параллельные и перпендикулярные к
их длинной оси. Это явление называется
«внутренним» двойным лучепреломлени- |
ем. Читатель может найти количественные j
характеристики эффектов внутреннего и
формы двойного лучепреломления в
учебниках (см. например, Цветков и др., 1971).
рисунке 17.(i. Из рисунка видно, что для
жестких частиц х приближается к 45°,
когда ориентирующая сила, G,
стремится к нулю. Важно также то, что наклон
прямой при малых значениях параметра
а не зависит от формы частицы.
При малых значениях а угол экс-
тинкции вычисляется как:
/*. { G ,(G
к 120 I©
(Г7.1)
где k — коэффициент, зависящий от
формы макромолекул. Из уравнения Г7.1
следует, что зависимость между х » G
должна быть линейной для малых
значений G, с углом наклона, равным -1/120.
Таким образом, коэффициент
вращательной диффузии может быть
определен непосредственно из измерений при
низких градиентах скорости. Однако
именно в этом случае проявляется один
из главных недостатков метода — низкая
чувствительность при измерениях,
близких к 45° и очень низких градиентов.
Г7.4. Спад дихроизма
в потоке
Если молекулы обладают внутренней
оптической анизотропией
(комментарии 17.1), то ориентацию таких
молекул можно рассматривать как дихроизм
в потоке. Если поток внезапно
остановить, то время релаксации, т. е. время, за
которое система возвращается к своему
равновесному распределению, может
быть определено. В этих условиях
поведение макромолекул описывается как:
■^^ = ехр(-6©0. (Г7.2)
ДЛ(0)
где ДЛ(0) — есть поглощение в нулевой
момент времени; AA(t) — есть его
изменения во времени. Типичный ход кри-

вой для этого процесса представлен на
рисунке I 7.7. Отметим, что уравнение
Г7.2 аналогично уравнению Г6.12.
Г7.5. Осцилляторное двойное
лучепреломление в потоке
Осцилляторное ДЛП в потоке
наблюдается, когда круговой поляризованный
свет пропускается через узкий
гидродинамический зазор между
осциллирующей плоской поверхностью и жестко
закрепленной поверхностью. Затем
определяется величина двойного
лучепреломления и его фаза, по отношению
к градиенту скорости в
гидродинамическом зазоре.
Зависимость осцилляторного
двойного лучепреломления от частоты для
двух образцов ДНК с молекулярными
массами 6 х 103 и 5 х 106 Да приведена
на рисунке 17.8 с/ и 6. Из данных рисунка
видно, что теоретическая кривая
релаксации для жесткой частицы хорошо опи-
0.5
0.4
0.3
• Т4ДНК. М- 125«10
О Т4;2 ДНК. М = 62,5x10*
■ >.Ь,Ь,с ДНК. М-25x10*
0.2 0.3 0.4 0.5
Время (сек)
Рис. I 7.7. График спада сигнала дихроизма
для молекул ДНК с различной молекулярной
массой в полулогарифмических координатах
(Callis and Davidson, 1969)
сывает поведение молекулы ДНК с
молекулярной массой М= 6 х 105 Да (-900
пар оснований), тогда как для молекулы
--240
--220
-200
Рис. 17.8: а — зависимость осцилляторного двойного лучепреломления от частоты
приложенного поля для молекул ДНК (М = 6 х 10:' Да) в 89% растворе глицерина. Штриховые линии —
теоретические кривые релаксации жестких частиц. Частотная шкала, /, для измеряемой частоты,
шкала/' — эквивалент ожидаемой частоты для тех же самых молекул ДНК в водном растворе:
б — то же для ДНК (М =5х 10" Да) в водном растворе (Wilkinson and Thurston, 1976)

*-x
Рис. I 7.9. Растяжение и сжатие гибкой
молекулы при вращении в потоке с градиентом
скорости
ДНК с молекулярной массой 5 х 10G Да
(-7500 пар оснований) уже заметно
проявляется ее гибкость (см. параграфы
ГЗ.7.4, Г4.10.3,Г6.7.1пГ9.5.5).
Г7.6. Ориентации
макромолекул в потоке
как динамическое явление
Двойное лучепреломление в потоке
является динамическимявлением. Как
видно из рисунка Г7.9 макромолекулярная
цепь будет вытягиваться, когда ее концы
находятся в первом и третьем
квадрантах, и сжиматься, когда она находится во
втором и четвертом квадрантах.
Сдвиг
Растяжение
а
Вращение
!1
I
Масло
• .с
■ ^1
*• • »
j •.
Объектив
Регистрирующее
устройство
Ф
4*
-г
Ртутная
лампа
Линза
в
\
Растяжение,
Вращение
Рис. I 7.10: а — сдвиг потока как суперпозиция чисто растягивающего потока и чисто
вращательного потока; б — схематическое представление гибкой макромолекулы, растягивающейся в
потоке. При растяжении молекулы и ее вращении могут возникнуть различные динамические
сценарии; в — схема измерительного прибора. Однородный градиент скорости создается в
гидродинамическом зазоре -50 мкм между двумя параллельными пластинами при перемещении одной
стеклянной пластины относительно другой. Флуоресцентно меченые изолированные молекулы
Х-ДНК (48 502 пар оснований), представленные на рисунке в виде темных точек, визуализуются
в микроскопе с помощью видеокамеры (Smith et al., 1999).

На практике такая деформация
может быть наблюдена в поле сдвига.
Простейшим случаем является сдвиг
между двумя параллельными
пластинами, одна из которых перемещается
параллельно другой. Этот сдвиг потока
можно представить как суперпозицию
чисто вращательного и
растягивающего потоков (рис. I 7.10 а). В
растягивающем потоке можно ожидать
деформацию гибкой молекулы, в то время как
в чисто вращательном потоке
наблюдается только вращение и деформации не
происходит. Когда вклады компонент,
обеспечивающих вращение, и
растяжение близки, молекула находится в
нестабильном конформационном
состоянии. Конформация молекулы
будет изменяться динамически вслед за
изменением гидродинамического поля
(рис. Г7.10 п).
На рисунке 17.11 приведены
примеры, изображающие поведение
трех индивидуальных
изолированных молекул флуоресцентно меченой
ДНК-бактериофага лямбда (Х.-ДНК)
в стационарном градиенте скорости
с числом Вайсенберга Wi = 19 (ки\;
vrii Kipini 17.LM. Первая молекула
ведет себя следующим образом: будучи
клубком, она переходит в растянутое
состояние, возвращается в состояние
клубка и затем вытягивается опять
(рис. 17.1 1 а). На второй молекуле
виден сгусток, который передвигается
вдоль контура частично растянутой
молекулы (рис. 17.1 1 о). И, наконец,
на рисунке 17.11 в показана
молекула, которая вначале имеет Y-образную
форму, затем принимает форму
вытянутого каната, и в конце концов опять
принимает Y-образную, но
перевернутую форму.
Рис. 17.11. Изображение одиночной цепи
X — ДНК бактериофага, меченой
флуоресцентным красителем в вязком растворе
сахара. Молекула Я.-ДНК имеет контурную
длину L, равную около 22 мкм и содержит
около 440 персистентных длин. Каждый ряд
представляет собой серию развернутых во
времени изображений слева направо.
Вертикальная полоса слева вверху равна 5 мкм
(Smith etal., 1999)
Коммешарии Г7 2. Число
Вайсенберга
Число Вайсенберга W. = G/x является
безразмерным параметром,
характеризующим отношение величины приложенного
градиента скорости, G, к скорости
релаксации макромолекул т. Чем больше число
W, тем быстрее флуктуирует молекула по
отношению к ее времени релаксации и до-
I стигает большего растяжения.
Причина столь разного поведения
трех одинаковых молекул не очень ясна.
Предполагается, что такое поведение
отражает «индивидуализм» сложных
биологических макромолекул.

Г7.7. Перечень ключевых идей
• Ориентация макромолекул в гидродинамическом потоке называется двойным
лучепреломлением в потоке или эффектом Максвелла.
• Макромолекула в потоке оказывается под действием двух сил, одна из которых
ориентирующей природы (градиент скорости), а вторая — дезориентирующей
природы (броуновское движение); при равенстве этих сил возникает
равновесная ориентация частиц в потоке.
• Равновесная ориентация описывается параметром а = G/Q, где G — градиент
скорости, а 0 — коэффициент вращательной диффузии макромолекул.
• Измеряемый на опыте угол ориентации частицы, %> непосредственно связан
с ее коэффициентом вращательного трения.
• Вращательный коэффициент диффузии твердых асимметричных частиц может
быть определен непосредственно в эксперименте при низких значениях
градиента скорости или при исследовании релаксации двойного лучепреломления
после резкой остановки потока.
• Вращательные скорости глобулярных белков настолько велики, что их
ориентация в потоке практически невозможна.
• Конформационная динамика флуоресцентно меченых индивидуальных
больших молекул ДНК может наблюдаться в реальном масштабе времени
непосредственно в видеофлуоресцентном микроскопе.
Литература для последующего чтения
Исторический обзор и введение в биологические проблемы
De Gennes P. G. Molecular individualism, Science, 1997. 276, 1999-1992. Steady-
state flow birefringence.
Sheraga H. A., Edsall J. T. and Gadd J. O. Double refraction of flow: numerical
evaluation of extinction angle and birefringence as a function of velocity gradient.
J. Chem. Phys. 1951.19,1101-1108.
Цветков В. Н., Эскин В. Е. и Френкель С. Я. Структура макромолекул в
растворах. М.: Наука, 1964.
Harrington R. E. Measurement of flow birefringence at very low velocity gradients,
Biopolymers, 1970. 9, 141-157.
Спад дихроизма в потоке
Callis P. R. and Davidson N. Hydrodynamic relaxation times of DNA from decay of
flow dichroism measurements. Biopolymers, 1969. 8, 379-390.

Caimey К. L. and Harrington R. E. Flow birefringence of T7 Phage DNA: dependence
on salt concentration. Biopolymers, 1982. 21, 923-924.
Осцилляторное ДЛП
SchragJ. L., GuessJ. F. and Thurston G. B. Shear-wave interference observed by optical
birefringence induced in a viscoelastic liquid. J. Appl. Phys., 1965. 36, 1996-2000.
Wilkinson S. R. and Thurston G. B. The optical birefringence of DNA solutions induced
by oscillatory electric and hydrodynamic fields. Biopolymers, 1976.15, 1555-1572.
Ориентация макромолекул в потоке как динамическое явление
Smith D. Е., Babcock H. P. and Chu S. Single-polymer dynamics in steady shear flow,
Science, 1999. 283, 1724-1727.

Глава Г8
ДЕПОЛЯРИЗОВАННАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ
Г8.1. Исторический обзор
192(>
Е. Гавиола (Е. Gaviola) создал
первый прибор для измерения
флуоресценции, который назвал флуориметром.
А. Яблонски (A. Jublonski) дал
объяснение длительному послесвечению,
наблюдаемому в молекуле при некоторых
условиях. Он постулировал, что помимо
обычного синглетного возбужденного
уровня молекулы имеют некоторый мета-
стабильный, т. е. долгоживущий уровень,
лежащий несколько ниже первого
возбужденного. Физическая природа этого
явления, иногда неправомерно называемого
фосфоресценцией, была дана А. Н. Тере-
ниным (А. N. Terenin) в 1943 г.
1934
Ф. Перрен (F. Perrin) установил
зависимость между деполяризованной
флуоресценцией и броуновским
вращательным движением для сферических
молекул. В 1936г. он распространил эту
зависимость на асимметричные молекулы.
1952
Г. Вебер (G. Weber) впервые
применил теорию Перрена к
биологическим макромолекулам. Он также
выполнил ряд измерений поляризации
флуоресценции в стационарных
условиях при постоянном освещении для
определения значения среднего
гармонического времени вращательной
релаксации. Классический обзор Вебера
о применении поляризованной
флуоресценции в исследовании
макромолекул, и белков в особенности, появился
в 1953 г.
19(И
А. Яблонски предложил
исследовать процесс вращательной релаксации
путем измерения временной
зависимости спада поляризованной
флуоресценции как функцию времени после
действия короткого импульса. Он
обратил внимание на то, что полученная
таким способом анизотропия может
быть более точно интерпретирована,
чем ее усредненное значение,
наблюдаемое при постоянном освещении.
I9(i(i
П. Валь (P. Wahl) и, двумя годами
позже, Л. Страйер (L. Stryer), провели
первые экспериментальные измерения
времени спада поляризованной
флуоресценции меченых глобулярных
белков.

1. Tao (Т. Тао) установил
взаимосвязь между зависимой от времени
анизотропией поляризованной
флуоресценции и броуновской
вращательной диффузией в макромолекулах.
Он показал, что для тел произвольной
формы временная зависимость спада
анизотропии описывается пятью
экспонентами. В 1972 г. аналогичные
результаты были получены двумя
другими группами ученых (Г. Г. Белфорд,
Р. Л. Белфорд и Г. Вебер, Т. Дж. Чу-
анг, К. В. Эйзенталь) (G. G. Belford,
R. L. Belford and G. Weber, Т. J. Chu-
ang, К. В. Eisenthal).
С средина П)9()-х
Несколько групп доложили о синтезе
и спектральных свойствах долгоживущих
металл-лигандных флуоресцирующих
комплексов (Б. А. де Граф и Дж. Н. Дема;
группа Дж. Р. Лаковича (В. A. De Graff
and J. N. Demas, J. R. Lacowicz's group).
С помощью этих очень устойчивых к
выцветанию красителей с микросекундным
временем жизни можно измерять
времена вращательной корреляции до 2 мксек,
что открыло путь к детектированию
вращательного движения больших
биологических макромолекул.
1980 ПМ)Г>
Дж. Р. Лакович и его группа
(J. R. Lakowicz's group) внесли
существенный вклад в теорию и практику
деполяризованной флуоресцентной
спектроскопии. В 1987 г. вышел в свет
фундаментальный учебник Дж. Р.
Лаковича «Основы флуоресцентной
спектроскопии».
2000 и но iiacioiimee иро.мл
Деполяризованная флуоресцентная
спектроскопия является адекватным
методом для исследования
вращательного движения макромолекул в водных
растворах в наносекундном и
микросекундном интервале времен. Она
открыла новые возможности для измерения
вращения во внутримолекулярных
доменах, латеральной диффузии в
мембранах, больших белков и нуклеопроте-
идных комплексов.
Г8.2. Введение
в биологические проблемы
Теоретические основы
флуоресцентной спектроскопии были заложены в
первой половине XX в. такими
учеными-первооткрывателями, как Е. Гавио-
ла, Жан и Франсуа Перрены (отец и
сын), П. Принсгейм, С. Вавилов, Е. Фёр-
стер. В 1961 г. А. Яблонски предложил
измерять спад поляризованной
флуоресценции как функцию времени для
исследования процессов
вращательной релаксации. Однако только с
начала 1980-х стали доступными приборы
для измерения спада флуоресценции
благодаря широкому распространению
лазеров и достижениям в электронике.
Теперь исследователи могли делать
выбор между использованием
временных анализаторов в режиме счета
отдельных фотонов и многочастотным
фазовым флуориметром, и быть при
этом уверенными в получении одних и
тех же результатов.
Значительный экспериментальный
и теоретический вклад в
флуоресцентную спектроскопию, разрешенную во
времени, внесли Дж. Лакович, Д. Мил-
лар, Р. Шерри и их научные группы.
Были предложены два способа
конкретной реализации экспериментов.
Первый способ основывался на из-

мерении спада общей интенсивности
флуоресценции вслед за импульсным
возбуждением; такие измерения
могли быть использованы, как сигнал
о каких-либо событиях (изменения
коиформацпи белков, связывание с
лигандо.м, взаимодействие белков и
нуклеиновых кислот и т. д.). Второй
способ основывался на анализе
величии параметров флуоресценции для
понимания деталей структуры и
динамики флуорофоров и их окружения.
Однако наше неполное знание деталей
фотофизики большинства природных
флуорофоров, таких как триптофан и
тирозин, явились причиной
трудностей в интерпретации данных по
флуоресценции в исследованиях
структуры и динамики белков.
За последние годы большое
распространение получил метод
флуоресценции, разрешенной во времени,
который включает в себя измерения спада
анизотропии поляризации, с тем чтобы
характеризовать вращение
молекулы целиком или ее отдельных частей.
Если ранее большинство измерений
проводилось на наносекуидной шкале
времени, то сегодня можно определять
динамику процессов на
микросекундной шкале. Использование этой шкалы
стало возможным благодаря
применению новых металл-лигандных
комплексов, которые имеют время жизни от
10 нсек до 10 мксек.
В этой главе мы сфокусируем наше
внимание на использовании методов
временного спада анизотропии
флуоресценции, которые обеспечивают
получение гидродинамических данных,
описывающих вращательную диффузию
биологических макромолекул. В секции
Д3.5 мы обсудим передачу энергии
между двумя флуорофорами (эффект Фёр-
стера).
Г8.3. Теория
деполяризованной
флуоресценции
Ниже мы кратко обсудим
теоретические основы флуоресцентной
спектроскопии с целью понимания того, как
коэффициенты вращательного трения
можно определить из измерений
деполяризованной флуоресценции.
Г8.3.1. Флуоресценция
как физическое явление
При возбуждении электрон
переходит на орбитали с высокой энергией.
В большинстве случаев эта энергия
затем переходит в тепло. Такой процесс
называется неизлучающим переносом
энергии. Неизлучающий перенос
энергии проиллюстрирован на рисунке
Г8.1 а. У некоторых молекул электрон
в возбужденном состоянии может
возвращаться на более низкий или
исходный энергетический уровень. Благодаря
различным электронным
конфигурациям возбужденного и основного
состояний, электрон может легко переходить
на более низкие энергетические уровни
вплоть до перехода на самое нижнее
основное состояние с потерей энергии
на каждом этапе перехода. Такой
процесс называется излучающим
переносом энергии и схематически показан на
рисунке Г8.1 б. Новое поглощение
фотона приведет к переходу электрона в
возбужденное состояние и переносу
некоторого количества энергии в
растворитель в виде тепла. Однако наиболее
низкий колебательный уровень
возбужденного состояния все равно
оказывается гораздо выше колебательного уровня
основного состояния, при котором
энергия полностью высвобождается, если не
произойдет новое поглощение фотона.

Рис. Г8.1. Неизлучающий (д) и излучающий перенос энергии (б)
Поглощение и эмиссия света при излу- Акт поглощения света — очень
чающем энергию переходе показана на быстрый процесс, занимающий около
диаграмме (рис. Г8.2). 10~1;> сек. После поглощения света ро-
Поглощение
hvA/
S01
Внутренняя
конверсия
hvA/
Внутренние
переходы
Флуоресценция
\hvF
hv,
./
Фосфоресценция
о-
Рпс. Г8.2. Диаграмма поглощения и эмиссии света (диаграмма Яблонского). Основное первое
и второе электронные состояния обозначаются как 50,5, и 5,, соответственно. На каждом из этих
электронных энергетических уровней существует ряд энергетических колебательных
подуровней, обозначаемых как 0, 1, 2, и т. д. (Lakowicz. 1999). В русской литературе фосфоресценцию
принято называть метастабильным состоянием

исходит ряд процессов. Флуорофоры
обычно возбуждаются до высокого
колебательного уровня, соответствующе-
,\с)м\и!>'ыр'.1и Г8. t. Синглетные
и триплетные состояния
Принцип запрета Паули означает: два
электрона в атоме не могут иметь один и
тот же набор из четырех квантовых чисел.
Это ограничение означает, что не более
двух электронов могут занимать одну ор-
биталь, поэтому эти два электрона
должны иметь спины разных знаков, т. е. быть
спарены. Поскольку спины спарены, то
большинство молекул не проявляет
магнитных свойств и является диамагнети-
ками — т. е. они не притягиваются и не
отталкиваются статическим магнитным
полем. Электронное состояние молекул,
при котором все электронные спины
спарены, называется синглетньш состоянием,
и на этом уровне не происходит
диссоциации энергии электрона. Когда один из
пары электронов возбуждается до более !
высокого энергетического уровня,
возникает синглетное и триплетное состояния.
В возбужденном синглетном состоянии
спин этого электрона еще остается
спаренным с электроном в основном состоянии.
В триплетном состоянии спины двух
электронов становятся не спаренными и
являются, таким образом, параллельными.
Основное Возбужденное Возбужденное
синглетное синглетное триплетное
состояние состояние состояние
Рис. I 8.3. Три различных состояния
электрона. Обратите внимание на то, что
возбужденное триплетное состояние является менее
выгодным энергетически, чем соответствующее
возбужденное синглетное состояние
го сииглетному состоянию 5.,. Обычно
молекулы в конденсированной фазе
быстро релаксируют до низшего спн-
глетного колебательного уровня 5,
( коммам i-.ipnii I'N.i). Этот процесс
называется внутренней конверсией н
происходит обычно за 10"'- сек. Поскольку
время жизни флуоресценции равно
около 10~й сек, внутренняя конверсия
завершается обычно до начала
эмиссии. Поэтому эмиссия флуоресценции
обычно происходит из равновесного
термодинамического состояния.
Молекулы из 5, состояния могут
переходить также в первое триплетное
состояние Т, называемого метастабиль-
ным. Метастабильность уровня означает,
что вероятность перехода 5, —» Гна
много порядков меньше, чем вероятность
перехода 5, —» 5Г Эмиссия из состояния
Tv часто называемая
фосфоресценцией, обычно характеризуется сильным
сдвигом максимума поглощения в
длинноволновую область (с более низкой
энергией). Переход 5, в Г, называется
внутрисистемным переходом. Переход
из состояния Г, в основное состояние
является запрещенным, в соответствии с
правилами квантовой механики, и, в
результате, константа скорости для такой
эмиссии на несколько порядков ниже,
чем при флуоресценции. Различные
молекулярные состояния показаны на
рисунке Г8..3, где стрелками представлены
направления спинов.
Г8.3.2. Время жизни флуорофоров
и время вращательной корреляции
Интервал времени между
возбуждением и эмиссией для большинства малых
молекул в водных растворах равен
приблизительно 10"8 сек, тогда как время их
вращательной релаксации гораздо
короче. Поэтому можно ожидать, что за время

Ткор < 1 нсек
Ткор > 100 нсек
Рис. I НА. Анизотропия флуоресценции и молекулярное связывание. Свободный лиганд,
меченый флуоресцеин-подобным флуорофором (слева), вращается в субнаносекундной шкале
времени (со временем вращательной корелляции т ) и излучает деполяризованную флуоресценцию.
Тот же лиганд, связанный с большой макромолекулой (справа), вращается гораздо медленнее
и, следовательно, сохраняет анизотропию (Sportsman, 2003)
эмиссии молекулы будут ориентированы
случайным образом и флуоресценция
будет иеиоляризоваиной. Однако большие
молекулы, такие как белки, под действием
броуновского движения будут вращаться
гораздо медленнее и, следовательно,
флуоресценция будет частично
поляризованной (рис. Г8.4).
На практике очень немногие белки
обладают природными флуорофорами.
Для большинства белков надо
получать флуоресцирующие производные,
вводя в них флуоресцентные группы,
время жизни которых обычно равно
нескольким наносекундам. В к ".;v,- ;
lapni: rs.l! приведены примеры
некоторых типичных внутренних
(природных) флуоресцирующих молекул,
их синтетические аналоги и внешние
флуоресцентные зонды.
Комментарий Г8.2. Флуоресцентные метки
Флуоресцентные метки подразделяются на три категории: внутренние метки, их аналоги
и внешние метки. Внутренние метки — это природные молекулы, проявляющие
значительную флуоресценцию, которую можно использовать на практике. В эту группу образцов
входят ароматические аминокислоты, в том числе триптофан и тирозин, восстановленный ни-
котинадеииннуклеотид (НАД-Н), и восстановленный флавинадениндинуклеотид (ФАД-Н),
некоторые порфирнны, модифицированные нуклеиновые кислоты (такие как Y-основания
в некоторых тР1 IK) и хлорофиллы.
Аналоги внутренних меток являются их модификациями и проявляют уникальные спек-
трофотометрпчеекпе свойства. Их примером являются 5-гидрокситриптофан и 7-азатрип-
тофан.
Внешние метки называются так потому, что могут быть введены в молекулу-мишень с
образованием комплексов с ковалентнымн или пековалентными связями. Тысячи меток
доступны в настоящее время. Примером нековалентно связанного флуорофора является диме-
тнламино-нафталин сульфонил-хлорид (дансил-хлорид). 8-анилино-1 -нафталин сульфонат,
1,6-днфенпл-1,3,5-гексатрнеп, этидпум-бромпд. изотиоцпанат, эфир сукцинимида, подаце-
тампд, малеимид. Эти п другие соединения являются мишенями для многих биологических
макромолекул.

Г8.3.3. Стационарная
деполяризованная флуоресценция
Вращательные свойства
флуоресцирующих молекул могут быть определены
методом Перрена, суть которого состоит
в следующем. Предположим, что на рас-
Рис. Г8.5. Экспериментальная схема для
измерения деполяризации флуоресценции света.
Углы ф и 6 определяют ориентацию вектора//
по отношению к фиксированным осям.
Поляризация не зависит от угла ф и изменяется с 6,
становясь равной нулю для излучения,
направленного вдоль z-направления (Weber, 1953)
Рис. Г8.6. К определению анизотропии А:
неполяризованный свет, направленный вдоль
оси х, разлагается на у- и z-поляризованные
компоненты. Общая эмиссия находится
суммированием эмиссии, направленной вдоль
трех декартовых осей
твор падает плоско поляризованный свет
(рис. Г8.5) вдоль.v-направления с
вектором поляризации, направленным вдоль
2-оси. Измеряются две компоненты
излучаемого света: / — параллельная
компонента, поляризованная вдоль 2-оси,
и 1Х — перпендикулярная компонента,
поляризованная вдоль.v-оси; ц — диполь
флуоресцентной молекулы.
Анизотропия или поляризация, обозначаемые как
А и Р, соответственно, вычисляются как
разница между значениями компонент,
деленная на их сумму:
А = -
/,,+ 2/,
Р = -
(Г8.1)
(Г8.2)
Знаменатель в уравнении Г8.1
является суммарной интенсивностью света,
которая наблюдалась бы при
использовании неполяризованного света. Если
обратиться к рисунку Г8.6, то можно
видеть, что / и /± распространяются как
вдоль х-оси, так и вдоль г/-оси, но
удвоенная интенсивность 2
^распространяется вдоль г-оси. Общая интенсивность
/пропорциональна сумме всех трех ин-
тенсивностей, распространяющихся во
взаимно перпендикулярных
направлениях, т. е. / = /н + 2/±.
Чтобы вычислить поляризацию
флуоресценции, мы должны вычислить
вероятность возбуждения молекул с
конкретной ориентацией, и затем
подсчитать вероятность, с которой эти
молекулы будут излучать свет,
поляризованный в определенных направлениях.
Начнем с жестких и изотропных
молекул. Молекулы должны быть
достаточно большие, чтобы не было заметного
вращения молекул в шкале времен
флуоресценции (<100 нсек). Вычисления
показывают, что если испускающие и

поглощающие диполи параллельны друг
другу (т. е. относятся к одному и тому же
электронному переходу), тогда I, = 3/5 и
IL = 1/5. Для полностью жестких
молекул Р= 1/2 и А = 2/5, как это следует
из вычислений, основанных на
уравнениях Г8.1 и Г8.2. Когда испускающий
диполь молекулы будет
перпендикулярным поглощающему диполю, то Р = 1/2
и А = 2/5. В общем случае, поляризация
Р0 и анизотропия А0 для жестких молекул
будут равны:
Яо = ^^ (Г8.3)
cos С, + 3
и
Л,=^Д (Г8.4)
где С, — есть угол между поглощающим
и излучающим диполями.
Противоположной является
ситуация, когда диполь вращается достаточно
быстро, чтобы его ориентация стала
хаотичной за время жизни возбужденного
состояния. В этом случае, за время, когда
происходит эмиссия, все сведения о
происхождении фотопроцессов
утрачиваются. /„ = /± и поляризация и анизотропия
становятся равными нулю. Большинство
биологических макромолекул не
попадает в разряд этих двух крайних
случаев; время их вращательного движения
не пренебрежимо мало по сравнению со
шкалой времени флуоресценции и они
не вращаются так быстро, чтобы достичь
беспорядочной ориентации.
Г8.3.4. Деполяризованная
флуоресценция, разрешенная
во времени
Два типа экспериментов могут быть
выполнены с использованием флуо-
! Комментарий Г8.3. Флуоресцентная ■
анизотропия как рациометрическая
величина
Флуоресцентная анизотропия является
рациометрическим измерением, т. е. она не
зависит от концентрации белка, поскольку
определяется как отношение двух компо-
; непт, каждая из которых, сама но себе, про-
i порциональна концентрации белка.
ресцентной техники, разрешенной во
времени. Первый включает измерение
времени спада эмиссии, следующее за
коротким импульсом возбуждения.
Такой тип экспериментов
используется для определения времени жизни
флуорофора, которое отражает среднее
время, в течение которого молекула
остается в возбужденном синглетном
состоянии. Время жизни
флуоресценции строго зависит от молекулярных
свойств окружения флуорофора и
может изменяться от нескольких пикосе-
кунд до десятков наносекунд.
Другой тип экспериментов по
флуоресценции, разрешенной во времени,
базируется на измерении спада
анизотропии флуоресценции. Спад
анизотропии отражает переориентацию эмиссии
диполя во время возбужденного
состояния и дает информацию о локальном
сдвиге флуорофора, сегментальном
перемещении и вращательной диффузии
макромолекул ( кочмсп мри и Vs.'.)).
Предположим, что флуоресцентная
метка жестко прикреплена к
макромолекуле (см. рис. Г8.1). Очевидно, что
наблюдаемая поляризация является некой
промежуточной величиной между
величиной, вычисленной из уравнения Г8.3 и
нулем. Чтобы вычислить это значение,
мы должны проанализировать
относительную скорость эмиссии и
вращательного движения макромолекулы.
Измерения поляризации являются функцией

как времени жизни флуорофора, так
и времени релаксации белков. Эта связь
выражается уравнением Перрена:
Л =
д.
1 + tf/t€.
(Г8.5)
В этом выражении А0 является
стационарной анизотропией, а Ау —
анизотропия флуорофора в отсутствие
вращательного движения. Из уравнения
Г8.5 видно, что если время жизни
флуорофора т[Г много больше, чем время
вращательной корреляции, тк(>), то
анизотропия Л0 равна нулю. Если же время
жизни намного короче, чем
корреляционное время, то анизотропия равна AF
Отсюда следует весьма важный вывод:
анизотропия AQ будет чувствительна
к скорости вращательной диффузии
только в том случае, если тко сравнимо
со временем жизни флуорофора т
Г8.4. Экспериментальная
техника
Два наиболее популярных метода
используются сегодня, чтобы
зафиксировать флуоресценцию, разрешенную во
времени, — это методы гармонического
и импульсного ответа. В методе
гармонического ответа параметры
флуоресценции во временном разрешении
анализируются через ответ эмиссии на
синусоидально модулированное
возбуждение. Модуляторы света и
обработка сигнала, необходимые для этих
измерений, могут быть объединены в виде
стандартного сиектрофлуориметра.
Метод импульсного ответа включает
прямое наблюдение за временем спада
эмиссии, которое следует за коротким
возбуждающим импульсом.
Импульсы возбуждения обычно получают от
лазера с синхронизованными модами
или титан-сапфировых лазеров,
которые производят пикосекундные или
субпикосекундные импульсы и
являются легко настраиваемыми в видимой и
УФ-областях спектра. Профиль спада
эмиссии регистрируется схемами,
работающими по принципу быстрого счета
одиночных фотонов. Использование
такого оборудования позволяет
регистрировать профили спада флуоресценции
с высокой степенью точности и
временным разрешением порядка ппкосекупд
и менее. Измерение флуоресцентной
Рис. Г8.7. Схема измерений анизотропии флуоресценции методом L-формата:
вертикальное и горизонтальное возбуждение

Детектор
Детектор Детектор
Рис. 18.8. Схема измерений анизотропии флуоресценции методом Т-формата: вертикальное
и горизонтальное возбуждение
анизотропии технически является еще
более простым. Обычно используются
два метода. Эти методы обозначаются
как L- и Т-форматы. В методе L-фор-
мата используется один канал эмиссии
(рис. Г8.7). Излучаемая образцом
флуоресценция измеряется под прямым
углом по отношению к лучу возбуждения.
Для быстрых измерений анизотропии
флуоресценции обычно применяются
два фотоумножителя в Т-конфигурации
для одновременного измерения
излучаемой флуоресценции при двух углах,
соответствующих поляризации,
параллельной и перпендикулярной по
отношению к исходящему лучу (рис. Г8.8).
На практике, фактор коррекции,
К, должен вводиться в уравнения Г8.1
и Г8.2, чтобы учесть различия в
чувствительности систем детектирования
в двух поляризующих направлениях
(1>'1>м\н'п I при!': I'S. i).
В упрощенной системе
детектирования используется только один
фотоумножитель без поляризатора. В этом
случае поляризация возбужденного
света изменяется от вертикального (V)
до горизонтального (Н) состояния с
помощью фотоэластического модулятора
(i.o.MMi и'apnii Г<\.~>). Из рисунке Г8.9 а
видно, что при вертикально
поляризованном световом возбуждении
детектируется сумма интенсивностей
излучения IVH и /и,, определяющая \ix- и
ц2-компоненты, соответственно.
Отсюда следует:
Комментарий Г8.4. Фактор
коррекции, К
В реальных измерениях фактор
коррекции, К, вводится в уравнения Г8.2 и Г8.3:
А = -
Р =
h + 2KI±'
i,+ki±-
(A)
(В)
Выравнивание оптических систем
осуществляется с помощью исследования
рассеяния разбавленной суспензии не
флуоресцирующих соединений (например,
гликогена или коллоидального кремния в
воде). Рассеянный свет от таких суспензий
на 100% поляризован, и, следовательно,
измеренная анизотропия должна быть
равна 1,00 (А = 1,00). Выравнивание
оптической системы можно считать законченным,
если измеренное значение Л равно 0,98 или
больше.

Комментарии I 8.5. Фотоэластичный
модулятор
В основе устройства, называемого
фотоэластичным модулятором (ФЭМ) лежит
эффект фотоэластичности. Если образец
из прозрачного, материала сильно сжать
или растянуть, то он становится двулучеп-
реломляющим, т. е. скорость прохождения
света через материал будет разной для
света с разной линейной поляризацией. ФЭМ
может быть использован в каждом из двух
обсуждаемых методов: для получения
заданного состояния поляризации
падающего луча света, или для определения
состояния поляризации прошедшего светового
луча.
А- _ hn + At•
(Г8.6)
Ситуация для горизонтально
поляризованного возбуждения отражена на
рисунке Г8.9 6. В этом случае сигнал,
определяемый для горизонтально
поляризованного возбуждения, равен:
А,=2х/1Я (Г8.7)
и анизотропия вычисляется из /VH и /vv
из результирующего выражения:
А = -
A- ~Ah
Av +0,5xA„
(Г8.8)
Этот метод не требует фактора
коррекции Gd'M. кчммси i;ip;iii IN. i).
Г8.5. Деполяризованная
флуоресценция
и броуновское движение
Г8.5.1. Стационарная
или статическая поляризация
При применении постоянного
освещения измеряется стационарная или
статическая поляризация. В этом случае
выражение для среднего значения
статической поляризации и анизотропии
будет следующим:
Р = , (Г8.9)
1 + 10(1 + тг/т )(3cos4-l)"
А = -
3cos2i;-l
5(1 + т,Лкор)'
(Г8.10)
Если измерения проводятся при
высоком значении х\/Т, при котором
молекулы не способны вращаться в шкале
времени жизни возбужденного
состояния, тогда tf/tciii. = 0, и поляризация
и анизотропия будут равны:
Вертикальное возбуждение
Детектор
Детектор
Горизонтальное возбуждение
а б
Рис. I 8.9. Схема эксперимента по измерению анизотропии флуоресценции: а — вертикальная
поляризация возбуждения; детектирование без поляризатора дает величину /V1, + /vv; б —
горизонтальная поляризация возбуждения; детектирование дает величину /Н|1 +Tnv Последняя равно
2xIVH , если предположить, что образец ориентирован хаотически (Canet et al., 2001)

n_3cos2i;-i
0 cos4 + 3'
7 3cos2i;-i
(Г8.11)
(Г8.12)
Эти значения, называемые
предельной поляризацией и анизотропией,
идентичны таковым, полученным для
жестких систем (уравнения Г8.3 и 8.4).
Используя уравнения (Г8.1) и
(Г8.2) для Р0 и Д, можно переписать
уравнения (Г8.9) и (Г8.10) в удобной
форме, называемой уравнениями Пер-
рена:
р з Ч зЛ xj
= (i_i)(1+ML).
(Г8.13)
i = i(l + ^L) = J.(l + i£*L).(r8.14)
А Л
Л К„лРл
В правой половине уравнения Пер-
рена время вращательной
корреляции тко) выражается через уравнение
(Г2.31)!"
Корректность уравнений (Г8.13)
и (Г8.14) может быть проверена,
построением графика \/Р0 или 1/Д, как
функции Т/г\, который должен быть прямой
линией. По наклону прямой можно
судить о гидродинамическом объеме (Упп,),
если известно время спада
флуоресценции (tf). Значение ординаты при Т/х\ ->0
дает величину предельной анизотропии
или поляризации. На рисунке Г8.10
показан пример графика Перрена для
бычьего сывороточного альбумина (БСА).
Изменение окружающих условий для
молекулы БСА осуществлялось за счет
изменения вязкости среды. Значение
тко), экстраполированное к стандартным
условиям (1 сантипуаза, 273 К),
оказалось равным 40 ± 2 нсек.
0.00
0.02 0.04
цГТ (ПК')
0.06
Рис. 18.10. Время вращательной корреляции
т эритрозин-БСА комплекса в смесях с
различным соотношением глицерин/буфер как
функция г\/Т при постоянной температуре
273 К (•); при сохранении состава глицерина
в смеси глицерин-вода (92% весовых частей
глицерина) за счет температуры (А) (Ferrer et
al., 2001)
Г8.5.2. Время спада анизотропии
флуоресценции
Допустим, что мы возбуждаем молекулы
коротким импульсом поляризованного
света и измеряем временную
зависимость компонент / и 1У Если
излучающий и поглощающий диполи
параллельны друг другу, то первые фотоны, с
высокой долей вероятности, будут 2-по-
ляризованными, поскольку у молекул не
будет времени на переориентацию.
Напротив, последние фотоны будут иметь
беспорядочную поляризацию, поскольку
за это время молекулы испытают
значительное вращательное движение.
Следовательно, если поляризация или
анизотропия измеряются как функция времени
эмиссии флуоресценции, то скорость ее
спада от начальных значений Р0 или А0
до конечных значений, равных нулю, бу-

дет определяться скоростью
вращательного движения молекул.
Как мы видели в параграфе Г2.3.4,
вращательное поведение сферы может
быть описано одним параметром,
вращательным корреляционным временем
тк(1). Если это время определить как:
1 _ К,,.,„По
т-р 60 кт
(Г8.15)
тогда
Л(0 = (2/5К" 3cos^ '.(Г8.16)
Таким образом, спад анизотропии
флуоресценции сферической
молекулы описывается одной экспонентой.
Для жестких эллипсоидов результат
получается более сложным, и спад Л
(t) описывается суммой трех экспонент:
Л (О t
= а.ехр
Ап ' -
-а,ехр-
1кор
t t
+ а., ехр
(Г8.17)
2кор
Зкор
где предэкспоненциальные
множители а зависят только от относительной
]
ориентации моментов электронных
переходов во флуоресцентной метке. Если
белок помечен меткой беспорядочно, то
а, = а2 = а., = 2/5.
Времена вращательной корреляции
тип связаны с коэффициентами
вращательной диффузии эллипсоида Dnn DL
как:
t1mp-(4D. + 2D1)-,
ЪкоР = (6^^)-'.
Зависимость коэффициентов
диффузии от формы молекулы,
температуры и вязкости растворителя может быть
выражена в компактной форме
уравнением Стокса- Эйнштейна- Дебая:
D.
kT
- (»'->||.±). (Г8.18)
где Vni.^ — гидродинамический объем
и п(1 - вязкость растворителя. Фактор
Перрена g. зависит только от
аксиального отношения эллипсоида р = а/Ь
(где а •- ось симметрии) и равен:
Й,
Si = тт
2(/г-1)
3/;(/;-5)'
2(//-I)
(Г8.19)
(Г8.20)
3/;(2/;2-1)5-//
S =(/г-1)-'21п[/; + (/г-1)-12,(Г8.21)
•?„1Л=(1-/>2) ' "arctgx
х|/Г'(1-/г)'2.
(Г8.22)
На практике, однако, точность
данных такова, что кривую спада редко
удается описать больше, чем двумя
экспонентами.
Для жестких вытянутых
эллипсоидов с аксиальным отношением <5 и
некоторых сплюснутых эллипсоидов вид
функции A (t) является очень близким
к простой экспоненциальной функции.
В этих условиях наблюдаемый спад
аппроксимируется функцией со средним
корреляционным временем, равным:
:Ia,T-,
(Г8.23)
Среднее значение т отличается от
гармонического значения, которое
получается из наклона прямой A (t)
функции при t = О (параграф Г2.3.3).
Г8.5.3. Вращательные
корреляционные времена
глобулярных белков
На рисунке IS. 11 приведен пример
одного из самых ранних исследований спада
анизотропии для флуоресцентно мече-

\ Параллельная
-1.4
5"-1.6
О)
о
_j
-1.8
-2.0
0
10 15 20
Время (нсек)
25
Рис. Г8.11
дуальных
кращения
10 15 20
Время (нсек)
а б
- затухание флуоресценции антранилоила-5ег193-а-химотрипсина для индиви-
полярнзованных компонентов; б — анизотропия в логарифмической шкале после пре-
действия импульса возбуждения (Stryer, 1968)
ного а-химотрипсина. Измеренное
время вращательной корреляции
составило около 15 нсек. Измерение константы
спада позволяет вычислить
гидродинамический объем Vnn , если известна
вязкость раствора. Простое вычисление
показывает, что т может быть вычислено
из уравнения (Го. 15):
М
2,55
х10-12сек, (Г8.24)
т. е. если белок имеет приблизительно
сферическую форму, то времени корреляции
тко, равной 1 нсек, соответствует белок с
молекулярной массой 2500 Да с уровнем
гидратации 0,3-0,4 г-г ' (Глава Г1).
Средние значения времен корреляции т
з. ю г
10 100
Молекулярная масса (кДа)
1000
Рис. I'<S. I2. Зависимость времен вращательной корреляции для тридцати одного белка от
молекулярной массы в двойном логарифмическом масштабе. Штрих-пунктирная линия имеет
наклон, равный 1 в соответствии с уравнением Г8.24

Комментарий Г8.6. Вращательное
релаксационное время, трел
и вращательное корреляционное
время, т
^ кор
Отметим, что исследователи, применя-
ющиетот или иной метод, часто используют
два времени для описания вращательного
движения: вращательное релаксационное
время, т и вращательное корреляционное
время, т Они связаны между собой сле-
дующим образом т =т|(,ч/3, тЫ11, = (6D) .
В npocTeiime.M случае жесткой сферы, для
которой А (/) затухает но
экспоненциальному закону:
А{Г) = \е-ш=\е-
(А)
где © — коэффициент вращательный
диффузии, а т есть вращательное
корреляционное время.
10! 10' 10' 10* 10' 10"
Молекулярная масса (Да)
Рис. 18.13. Зависимость затухания
анизотропии от молекулярной массы для флуоро-
форов с разным временем излучения от 4 до
2700 нсек. Для каждой из кривой жирными
линиями выделены участки, определяющие
интервал молекулярных масс белков, у
которых реально могут измерены их времена
релаксации при данном времени жизни флуоро-
фора. Для этих расчетов было использовано
уравнение Г8,5. Объем V белка вычислен
из его молекулярной массы при допущении,
что уровень гидратации равен 20% (Lakovicz
etal.,2000)
белков, определяемые с использованием
метода деполяризованной
флуоресценции, представлены в i:nV imiii' I N. I.
Таблица содержит также значения времен
корреляции для белков, полученные
методом Я MP (секция КЗ.З) и методом
деполяризованного динамического
рассеяния света (Глава ПО).
Зависимость времен вращательной
корреляции для тридцати одного белка от
молекулярной массы изображена
графически в двойной логарифмической
шкале на рисунке 18.12 (кпмчеп lapnii IN.(>).
Прерывистая прямая линия
соответствует данным, предсказываемым уравнением
(Г8.24). Из рисунка Г8.12 видно, что все
белки (за исключением карбоангидразы)
имеют времена вращательной
корреляции несколько большие, чем
соответствующие значения для сферических частиц.
Последнее не удивительно, поскольку
молекулы вытянутой формы вращаются
более медленно. Наклон прямой линии,
проведенной через экспериментальные
точки (сплошная линия),свидетельствует
о том, что в пределах экспериментальных
ошибок вращательное корреляционное
время глобулярных белков
пропорционально их массе в соответствии с
уравнением Г8.24.
Большинство данных,
представленных на рисунке Г8.12, было получено в
наносекундном интервале времени. Такие
условия эксперимента налагают очень
серьезные ограничения на исследуемые
биологические макромолекулы в
отношении их молекулярных масс. Из уравнения
(Г8.7) следует, что макромолекулы с
молекулярными массами в области 10-50 кДа
имеют времена релаксации в интервале
4-20 нсек, т. е. в области, которая
соответствует синглетному времени жизни
большинства органических красителей.
На рисунке Г8.13 показана
теоретическая зависимость анизотропии

Тпопица I 8.1. Времена вращательной корреляции тко (20 °С) для белков,
определенные различными методами
Белок
Грамицидин
Фрагмент белка Zn-пальцев ДНК
Тринснновый ингибитор
Эглнн С
Калбиндин- D9k apo
Убиквптин
Цитохром Ь.
Вастар С/40/82А
'Ггр-репрессор
Рибонуклспза
Азурнн
Л изо ним
Лпзоцим
Стафилококковая нуклеаза
S. aureus нуклеаза В
Интерлеикин-1р
р-лактоглобулин
Фактор лейкемии
Р21-
HIV-1 протеаза
Трипсин
Хпмотрппсин
Савнназа
Карбонангидраза
р-лактоглобулин (димер)
Аноперокспдаза
FU) фрагмент иммуноглобулина G
Бычин сывороточный альбумин
Р-лактоглобулин
Яичный альбумин
Сахароза-изомальтаза

Молекулярная
масса
(кДа)
2,5
2,93
6,16
8,15
8,43
8,54
9,61
10,14
11,89
13,68
13,95
14,32
14,30
15,51
20,00
17,4
18,40
19,1
21,00
21,58
25,00
25,00
26,70
30,0
36,00
40,00
47,50
66,50
18,40
43,5
221,0
Время
вращательной
корреляции ткф
(20 °С) (нсек)
2,8
2,4
4,4
6,2
5,1
5,4
6,1
7,4
23,1
8,3
4,8
8,3
10
13,3
9,9
12,4
9,4
14,9
16
13,2
14,3
Г8,7
12.4
12,4
22,5
28,0
33
40
8,6
30,2
112
Метод
ДРС
ЯМР
ЯМР
ЯМР
ЯМР
ЯМР
ЯМР
ЯМР
ЯМР
ЯМР
нсек-ДПФ
ЯМР
ДРС
ЯМР
ТРП-ДПФ
ЯМР
нсек-ДПФ
ЯМР
нсек-ДПФ
ЯМР
нсек-ДПФ
нсек-ДПФ
ЯМР
нсек-ДПФ
нсек-ДПФ
нсек-ДПФ
нсек-ДПФ
мксек-ДПФ
мксек-ДПФ
мксек-ДПФ
мксек-ДПФ
Ссылки
е)
а)
а)
а)
а)
а)
а)
а)
а)
а)
б)
а)
в)
а)
з)
а)
г)
а)
д)
а)
г)
г)
а)
г)
г)
г)
г)
ж)
з)
з)
з)
Сокращения: (ДРС) - динамическое рассеяние света; (ЯМР) — ядерный магнитный
резонанс; (нсек-ДПФ) - деполяризованная флуоресценция в наноеекундном диапазоне; (мксек-
ДПФ) — деполяризованная флуоресценция в микросскундном диапазоне; (ТРП-ДПФ) —
деполяризованная флуоресценция триптофанового остатка.
Данные взяты из:
а) Garcia de la Torre (2001); г) Ygnerabide et al. (1970); ж) Ferrer et al. (2001);
б) Kroes et al. (1998); д) 1 lazlett et al. (1993): з) Cherry and Schneider (1976)
в) Dnbin et al. (1971); e) Michiclsen et al. (1981):

0.08
s 0.00
40 60
Время (мксек)
Рис. Г8.11. Спад анизотропии
флуоресценции комплекса эритрозина с БСА и
рассчитанная на ее основе моноэкспоненциальная
функция со временем вращательной корреляции
т =16 ±1,5 мксек (92% глицерина по весу в
буфере; температура 18 °С. (Ferrer et al., 2001).
Эритрознн — это 2'4'5',7'- тетраиод-флуорес-
цеин
от молекулярной массы,
построенная в соответствии с уравнением Г8.5
для флуорофоров с разным временем
жизни. Из рисунка видно, что
флуоресценция белка с молекулярной
массой 100 кДа, меченого флуорофором с
временем жизни 4 нсек, будет
полностью поляризованной. Отсюда
следует, что флуораторы, имеющие время
жизни в наносекундном диапазоне, не
могут использоваться для измерения
вращательной диффузии белков с
молекулярной массой больше 40-50 кДа.
Интервал молекулярных масс
существенно расширяется при
увеличении времени жизни флуорофора. Так,
для флуорофора со временем жизни
400 нсек оказывается возможным
изучение белков с молекулярной массой
до 106Да.
В настоящее время можно изучать
флуоресценцию в микросекундной
шкале времени, используя флуорофо-
ры на основе комплексов металл-ли-
ганд со временем жизни до 10 мксек и
более, которое соответствует времени
жизни триплетного состояния. На
рисунке Г.8.14 показано затухание
анизотропии флуоресценции комплекса
эритрозин-БСА в микросекундной
шкале времени в буфере, содержащем
глицерин.
Результаты этих измерений
свидетельствуют об отсутствии
независимого вращения больших сегментов белков
80А
а б в г
Рис. Г8.15: а — вытянутый эллипсоид (140 X 40А), используемый как стандартная модель для
конформации человеческого и бычьего сывороточных альбуминов, представленная во всех
учебниках; б — структура человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в том же масштабе (Банк
белковых структур; файл lbm°; в — оболочечная модель БСА в виде трехгранника с
размерами 80 х 80 х 89 х 30 А; г — модель ЧСА, построенная по данным рентгеноструктурного анализа
(Ferrer et al., 2001)

в растворе во временном интервале от
наносекунд до миллисекунд.
Вычисленное вращательное время
корреляции т для БСА (стандартные условия:
1 сантипуаза, 20 °С) = 40 ± 2 нсек (см.
также рис. Г8.10).
Анализ значений времени
вращательной корреляции (40 ± 2 нсек) и
характеристической вязкости (4,1 см3-г-1)
позволяет сделать выбор между
сердцеобразной структурой Ч С А,наблюдаемой
в кристаллическом состоянии, и хрис-
томатийной гидродинамической
моделью БСА, — сигарообразный эллипсоид
с размерами 140x40 А (рис. Г8.15 а и о).
Расчет коэффициента вращательной
диффузии и характеристической
вязкости БСА с помощью метода
оболочек (параграф Г2.2.2) показал, что обе
модели (одна — треугольная призма,
с размерами 84x84x84x31,5 А и
вторая — кристаллографическая модель)
(рис. Г8.15 « и /) дают близкие
результаты, совпадающие с
экспериментальными значениями. Однако эти значения
сильно отличны от таковых,
полученных для сигарообразной модели.
Отсюда следует, что модель удлиненного
эллипсоида, используемая
десятилетиями в качестве канонической модели
сывороточного альбумина, скорее
всего, не верна.
Г8.6. Деполяризованная
флуоресценция
и молекулярные
взаимодействия
Деполяризованная флуоресценция
может быть использована для изучения
молекулярных взаимодействий,
включая белок-белковые, ДНК-белковые, а
также связывания антигенов с
антителами. Деполяризованная
флуоресценция является уникальным методом
для анализа молекулярного
связывания, поскольку позволяет измерить
отношение меченых связанных форм
к меченым свободным. Большинство
таких измерений может быть
проведено в шкале реального времени, что
позволяет исследовать кинетику
реакций ассоциации и диссоциации. Ниже
мы приведем примеры применения
деполяризованной флуоресценции в
исследованиях белок-белковых
взаимодействий на молекулярном уровне.
Исследования процессов
связывания методом поляризации
флуоресценции включает титрование небольшого
количества флуоресцентно меченого
белка другим белком. При увеличении
фракции белка, связанного с
мечеными атомами, поляризация возрастает.
Константы равновесного связывания
вычисляются по результирующей
кривой связывания (т. е. поляризации как
функции концентрации немеченых
белков). На рисунке Г8.16 показано влия-
0.07 •
0.06
0 0.05
? 0.04
g 0.03"
0.01"
ГА,
гА,
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Log гА2 или гА2 концентрации (нМ)
Рис. 18.16. Влияние активации тромбина на
ассоциацию А- и В-субъединиц фактора XIII
тромбина. Аликвоты гА',, или
тромбин-активированный г А'., были добавлены к раствору
В2. Горизонтальная линия соответствует 50 °о
изменению уровня анизотропии (Checovich
и др. 1995)

Комментарий Г8. /. Фактор XIII коагуляции крови
Фактор XIII коагуляции кропи, пли фибрин - стабилизирующий фактор, является
плазматическим зпмогеном, ответственным за стабилизацию (усиление) процесса свертывания
крови и обеспечение ее устойчивости к лизису. Фактор XIII действует через промотор,
объединяя две различные субъеднницы ЛН в А.,В„ тетрамер. Только Л-субъедпница
модифицируется тромбином через N-концевую активацию пептидов (ЛИ). Гидролитически
расщепленная субьединица обозначается А.
140
ЁГ
§• 150
га
ГО
0.130
т
|ио
90
N*»
j^*"**.*»**^^
70'
10
50
20 30 40
Время (мин)
Рис. Г8.17. Время спада флуоресцеин-мечено-
го казеина при его переваривании трипсином.
Реакция начинается после добавления 5 пи-
комолей казенна, меченого флуоресценном
к смеси: 200 иг трипсина (нижняя кривая);
100 иг трипсина (средняя кривая); без
трипсина (верхняя кривая). По осп ординат значения
поляризация приведены в относительных
единицах (Checovich et al., 1995)
ние активации тромбина на ассоциацию
А и В субъединиц фактора XIII
(комментарии Го\7). Расщепление тромбина
(переход из состояния гА2 в гА',),
приводит к драматическому понижению
аффинности г А., к меченому В., (294 нМ
для гА , против 19 нМ для гА.,)
объясняя таким образом диссоциацию
комплекса А.,В.,.
Другой пример относится к
действию деградирующих энзимов,
таких как протеазы, ДНК-азы, РНК-азы.
Действие таких энзимов проявляется
обычно в изменении молекулярных
размеров, что, следовательно, может
быть зафиксировано методом
деполяризованной флуоресценции. На
рисунке Г8.17 показано затухание трип-
синовой активности с использованием
меченого флуоресценном казеина.
Почти любой субстрат может быть
флуоресцентно помечен и использован для
измерения разных энзимов.
Стандартная кривая для тестирования действия
субстрата на казеин является линейной
по крайней мере в интервале
100-кратного изменения концентрации, а метод
в 10 раз более чувствительным, чем у
широко распространенного метода
преципитации.
Г8.7. Перечень ключевых идей
• Люминесценция является результатом излучения молекулой света,
находящейся в электронно-возбужденном состоянии.
• Эмиссия из синглетного состояния в основное называется флуоресценцией;
временной интервал между возбуждением и эмиссией обычно равен 10 8 сек.

• Эмиссия из триплетного состояния в основное называется фосфоресценцией;
при фосфоресценции интервал между возбуждением и эмиссией может
составлять от микросекунд до секунд.
• На практике немногие белки флуоресцируют; большинство белков и
практически все нуклеиновые кислоты могут быть переведены во флуоресцирующие
производные введением специальной метки.
• Флуоресцирующие метки подразделяются на три категории: внутренние метки
(ароматические группы в белках), их химические аналоги (например, 5-гидрокси
триптофан) и многочисленные внешние метки для белков и нуклеиновых кислот.
• Время вращательной корреляции тко) может быть измерено по спаду
поляризации флуоресценции только в том случае, если вращательное корреляционное
время макромолекулы сравнимо со временем жизни флуорофора.
• Время вращательной корреляции глобулярных белков с молекулярной массой
в районе 10-50 кДа может быть измерено при использовании метки,
излучающей в течение 4-20 нсек.
• Время вращательной корреляции биологических макромолекул с
молекулярной массой в районе 0,5-5 МДа может быть измерено при использовании
метки, излучающей в течение микросекунд.
• Спад анизотропии флуоресценции сферических молекул описывается одной
экспонентой.
• Белок, имеющий приблизительно сферическую форму, с молекулярной массой
25 Да имеет время корреляции т около 10 нсек.
• Для жестких несферических молекул, экспериментальное время вращательной
корреляции всегда больше, чем для сферы; вытянутые молекулы вращаются
медленнее.
• Спад анизотропии флуоресценции жестких тел произвольной формы
описывается многоэкспоненциальной функцией (до 5 экспонент); однако на практике
экспериментальные данные могут быть аппроксимированы не более, чем двумя
экспонентами.
Литература для дальнейшего чтения
Исторический обзор и введение в биологические проблемы
Тао Т. Time dependent fluorescence depolarization and Brownian rotational diffusion
coefficients of macromolecules. Biopolymers, 1969. 8, 609-632.
PrendergastF. G. Time-resolved fluorescence techniques: methods and application in
biology. Сип: Opin. Struct. Biol., 1991. 1, 1054-1059.

Checovich W.J., Bolger, R. E., and Burke T. Fluorescence polarization — a new tool for
cell and molecular biology. Nature, 1995. 375, 254-256.
Теория деполяризации флуоресценции
Weber G. Rotational Brownian motion and polarization of the fluorescence of
solutions. Adv. Protein Chem., 1953. 8, 415-459.
Small E. W. and Isenberg, I. Hydrodynamic properties of a rigid molecule; rotational
and linear diffusion and fluorescence anisotropy. Biopolymers, 1977.16, 1907-1928.
Обоорудование
Cherry R.J. and Schneider G. A spectroscopic technique for measuring slow rotational
diffusion of macromolecules. 2: Determination of rotational correlation times of proteins
in solution. Biochemistry, 1976. 24, 3657-3661.
LakowiczJ. R., Gryczynskil. et al. Microsecond dynamics of biological macromolecules,
Meth. EnzymoL, 2000. 323,473-509.
SportsmanJ. R. Fluorescence anisotropy in pharmacologic screening. Meth. EnzymoL,
2003. 361, 505-529.
LakowiczJ. R., Gryczynskil. et al. Microsecond dynamics of biological macromolecules,
Meth. EnzymoL, 2000. 323, 473-509.
KroesS.J., Canters G. W., Giardi G., Van HoekA. and VisserA.J. W. G. Time-resolved
fluorescence study of azurin variants: conformational heterogenity and tryptophan
mobility. Biophys. J., 1998. 75, 2441-2450.
Деполяризованная флуоресценция и броуновское движение
LakoviczJ. R. (ed.). Principles of Fluorescence Spectroscopy, second edition. New
York: Kluwer Academic/Plenum Publ., 1999.
Cherry RJ. and Schneider G. A spectroscopic technique for measuring slow rotational
diffusion of macromolecules. 2: Determination of rotational correlation times of protein
in solution. Biochemistry, 1976.15, 3657-3661.
Ferrer M. L., Duchowicz R., Carrasco В., Garcia de la Torre J. and Acuna A. U. The
conformation of serum albumin in solution: a combined phosphorescence depolarization-
hydrodynamic modeling study. Biophysical J., 2001. 80, 2422-2430.
Деполяризованная флуоресценция и молекулярные взаимодействия
Millar D. P. Time-resolved fluorescence methods for analysis of DNA — protein
interactions. Meth. EnzymoL, 2000. 323, 442-459.
Hazlett T. L., Moore K.J. M., Lowe P. N, Jameson D. M. andEcclestonJ. F. Solution of
p21ras proteins bound with fluorescent nucleotides: a time-resolved fluorescence study.
Biochemistry, 1993.32, 13575-13583.
Canet D., Doering K., Dobson С. М. and Dupont Y. High-sensitivity fluorescence
anisotropy detection of protein-folding events: Application to a-Lactalbumin. Biophys
/,2001.80,1996-2003.

Глава Г9
ВЯЗКОСТЬ
Г9.1. Исторический обзор
Дж. Л. Пуазейль (J. L. Poiseuille)
разработал теорию потока жидкости
в капилляре. На основе этой теории
В. Оствальд (W. Ostwald) (1933) и
Л. Уббелоде (L. Ubbelohde) (1936)
изобрели вискозиметры и ввели их в
практику физико-химических
исследований. Позднее приборы были названы
их именами.
I (НИ!
А. Эйнштейн (A. Einstein) первым
исследовал вязкость суспензии жестких
частиц, имеющих сферическую форму
и большой размер по отношению к
размерам молекул растворителя. Он
показал, что характеристическая вязкость
раствора пропорциональна объемной
доле, занятой частицами, и не зависит
от размера сферы.
1932
Г. Штудингер (Н. Staudinger)
предложил использовать
характеристическую вязкость для определения
молекулярной массы полимеров. Он
обнаружил, что зависимость
характеристической вязкость [t)J от
молекулярной массы М может быть
выражена простой формулой типа [г\] = Ма.
Позднее из работ Г. Марка, Р. Ха-
увинка, В. Куна и Г. Куна (Н. Mark,
R. Houwink, W. Kuhn and H. Kuhn)
стало ясно, что константа а связана с
конформацией молекул в растворе.
19(>2
Б. Г. Зимм и Д. М. Крозерз
(В. Н. Zimm and D. M. Crothers)
предложили оригинальную конструкцию для
ротационного вискозиметра, который
мог функционировать при низких
градиентах вязкости и который оказался очень
удобен для измерений асимметричных
структур, таких как ДНК, фибриллярные
белки и паточкообразные вирусы.
1985
М. А. Хани (М. А. Напеу) с
коллегами разработал «дифференциальный
вискозиметр», с помощью которого
непосредственно можно измерять
относительную вязкость. Преимущество
такого вискозиметра перед
традиционным стеклянным капиллярным
вискозиметром состояло в увеличении его
чувствительности, точности, скорости
и оперативности, что позволило
измерять вязкость растворов с низкой
концентрацией образца (-1 мг-см 'для
глобулярных белков).

2000 и по настоящее время
Характеристическая вязкость очень
чувствительна к конформации
макромолекул и ее гибкости. Она может быть
измерена легко и с большой точностью
при использовании различных типов
вискозиметров. Однако к настоящему
времени метод вискозиметрии не очень
востребован, поскольку требует
относительно большого количества образца.
Г9.2. Введение
в биологические проблемы
Характеристическая вязкость — один из
наиболее «старых» молекулярных
параметров. Так, Эйнштейн исследовал
характеристическую вязкость
суспензии сферических частиц еще в 1906 г.
Позднее стало ясно, что
характеристическая вязкость очень чувствительна к
конформации биологических
макромолекул и может быть измерена с большой
точностью. Классический обзор Янга
(Yang), посвященный способам ее
измерения и практического применения, в
частности к белкам, был опубликован в
1961 г. В 1997 г. Хардинг (Harding)
опубликовал работу, описывающую прогресс
в измерениях характеристической
вязкости и ее интерпретации в терминах
конформации, гидратации и гибкости
биологических макромолекул в растворе.
Традиционно вязкость растворов
биологических макромолекул
измеряется двумя способами: временем
прохождения жидкости через капилляр
определенной длины и толщины или скоростью
вращения двух цилиндров друг
относительно друга. Хотя измерение вязкости
обоими способами было
полуавтоматизировано или автоматизировано, однако
основные конструкции вискозиметров
оставались прежними со времени
опубликования фундаментальных статей
Янга и Зимма в I960 г. Поэтому ни один
из этих способов не привлекает
внимания исследователей в области биохимии
белка, из-за большого количества
материала, необходимого для проведения
эксперимента — обычно, 1 см;) образца
с концентрацией более 5-6 мг-см :!.
Для развития метода очень важным
было появление прибора, основанного
на другом принципе измерения, и
названного «дифференциальным»
вискозиметром. На этом приборе можно
проводить измерения при более низких
концентрациях (около 1 мг-см ■') и в
малых объемах, что сразу повлекло его
широкое применение в исследованиях
биохимии белка. Однако, даже
несмотря на эти инновации, метод вязкости
до сих пор не имеет той популярности
в исследованиях структуры
биологических макромолекул, которую он имел
несколько десятилетий назад.
Г9.3. Измерение вязкости
Г9.3.1. Капиллярные вискозиметры
Капиллярный вискозиметр или
вискозиметр Оствальда, наиболее широко
применяемый в исследованиях
конформации биологических макромолекул
является простым стеклянным прибором,
помещенным в термостатированные
условия (рис. Г9.1 а). Он состоит из двух
сообщающихся отростков и
функционирует следующим образом. Раствор
вводится в отросток 1 до тех пор, пока
уровень жидкости не достигнет
положения риски С. Раствор всасывается через
отверстие 2, пока уровень жидкости чуть
превысит риску А. Затем измеряется
время t, за которое жидкость пройдет
расстояние между рисками А и В. По-

скольку скорость истечения жидкости
зависит от разности высот столбов в двух
отростках вискозиметра, то разбавлять
раствор белка простым дополнением
растворителя непосредственно в
отросток 1 вискозиметра не представляется
возможным. Для проведения измерений
при различных концентрациях
целесообразно использовать вискозиметры,
называемые вискозиметрами Уббелоде
(рис. Г9.1 6).
Вискозиметр Уббелоде
функционирует следующим образом. Раствор
вводится в отросток 1 до тех нор, пока
жидкость не достигнет уровня С. Отверстие 3
закрывается и всасывание идет через
отверстие 2, пока жидкость не превысит
отметку Л. Затем отверстие 3 открывается и
определяется время t, за которое жидкость
пройдет расстояние между рисками А и
В. Теперь скорость истечения жидкости
из объема Е не зависит от разности высот
столбов в отростках вискозиметра 1 и 2,
поэтому разбавлять раствор белка можно
простым дополнением растворителя
непосредственно в отросток 1. Иногда
вискозиметр Уббелоде называется
вискозиметром с«висячим» уровнем, поскольку
жидкость в процессе измерения течет по
стенкам нижней части отростка 2.
Справедливости ради следует заметить, что в
случае отсутствия вискозиметра
Уббелоде, разбавление можно проводить и в
вискозиметре Оствальда, который в этом
случае требует достаточно трудоемкой
предварительной калибровки на разные
объемы жидкости.
Если вискозиметр Оствальда имеет
капилляр радиусом /" и длиной L, через
который проходит объем жидкости Уза
время г, то вязкость п и среднее
значение градиента скорости G в таком
вискозиметре описываются уравнениями:
а 1_ 2^
Рис. Г9.1. Капиллярные вискозиметры:
Оствальда (о) и Уббелоде (б). Объяснение в тексте
Комментарий Г9.1. Кинематическая
вязкость
; Относительная вязкость, без поправки ;
! на плотность, известна как
«кинематическая» (в противоположность
«динамической») и равна т)от]| = (t/ta). Полученные
из нее параметры: г\' , \г\]' соответствуют
кинематическим величинам. В разумном
приближении при концентрации белка
<1мг-см"3 [г|]' - [г|].
G=8V/3nr3t, (Г9.16)
в которых h — среднее значение высоты
столба жидкости: g — сила тяжести, а
р — плотность жидкости. В точном
вычислении констант h, r и L нет
необходимости, поскольку измерения
нормализуются на растворитель:
П..,11 = арРАоРо)- <Г9-2)
где f) и /() являются временем
истечения раствора концентрации С и
растворителя, соответственно, а р и р0
являются соответствующими
плотностями раствора и растворителя
ц = T\hgptAt/&LX\ (Г9.1а) (коммой lapnii W. I ).

Ось вращения
Зазор —
между двумя
цилиндрами
- Вращающийся
внешний
цилиндр
Вид сбоку
Рис. Г9.2. Вискозиметр Куэтта: внешний
цилиндр вращается, внутренний неподвижен
Термостатирующая рубашка
Исследуемая
жидкость
Стальной
стерженек
Циркулирующая
жидкость
Пластмасса
+ Pb304
Магнит
привода
ЧЭ
1 см
Рис. Г9.3. Вискозиметр Зимма-Крозерса (см.
текст)
Г9.3.2. Ротационные вискозиметры
Вязкость раствора зависит от
ориентации в нем частиц. При больших
градиентах скорости, когда частицы
ориентированы параллельно линиям потока,
можно ожидать меньшего прироста
вязкости, чем при беспорядочной
ориентации частиц. Другими словами, частицы,
ориентированные параллельно в
потоке, демонстрируют нсиыотоноискос
поведение, даже если растворитель
ньютоновский.
Компактные недеформирующие-
ся молекулы (например, глобулярные
белки) всегда проявляют
ньютоновское поведение, и по этой причине нет
необходимости измерять их вязкость
при различных градиентах. Однако для
очень асимметричных молекул (таких
как коллаген), или очень
деформирующихся (таких как ДНК), необходимы
измерения вязкости при разных
градиентах скорости с обязательно]!
экстраполяцией данных к нулевому
градиенту скорости. Для этих целей наиболее
подходящими являются ротационные
вискозиметры.
Один из них, вискозиметр Куэтта,
предназначен для измерений при
низких градиентах скорости. Он состоит
из двух концентрических цилиндров,
разделенных небольшим зазором,
который заполняется раствором (рис. Г9.2).
Один цилиндр фиксирован, другой
вращается. Очевидное
преимущество ротационных вискозиметров перед
капиллярными заключается в
постоянстве градиента скорости в зазоре
между статором и ротором. Однако
регистрация на приборах с вращающимися
цилиндрами значительно сложнее, чем
в капиллярных вискозиметрах.
Другой коаксиальный вискозиметр
Зимма-Крозерса удобен для работы
с водными растворами и не содержит
сложных механических конструкций
(рис. Г9.3). Он отличается
принципиально от вискозиметра Куэтта тем, что
в нем фиксировано напряжение сдвига
и измеряется его градиент, тогда как в
вискозиметре Куэтта фиксирован
градиент сдвига, а измеряется его напря-

жение ( ki>\iM< и трип Г!1.'!). Раствор
располагается между стационарным
внешним цилиндром и
вращающимся внутренним цилиндром, который
поддерживается в жидкости на плаву.
Уровень жидкости (мениск) совпадает
с верхним краем ротора. При таком
заполнении благодаря поверхностному
натяжению обеспечивается
автоматическое центрирование ротора.
Внутренний цилиндр содержит стальной
стержень. Снаружи внешнего
цилиндра находится вращающийся магнит,
который заставляет стержень и,
следовательно, внутренний цилиндр,
вращаться с постоянной угловой
скоростью со. Градиент скорости меняется
при изменении силы приложенного
магнитного поля. На этом
вискозиметре, как и на капиллярном, измеряется
относительная вязкость, определяемая
из отношения числа оборотов ротора
в течение какого-то
фиксированного времени в чистом растворителе и в
исследуемом растворе.
Соответствующие значения вязкости каких-либо
двух растворов могут быть вычислены
просто из равенства ц^/ц2 = (0.,/co,.
Как мы указывали, очень
асимметричные молекулы
(низкомолекулярная ДНК; коллаген) или
сильно деформирующиеся молекулы
(высокомолекулярная ДНК) имеют
тенденцию ориентироваться или
деформироваться при высоком
градиенте скорости. При этом в зависимости
[г)] от G для жестких асимметричных
частиц существенную роль играет
направленная ориентация их осей вдоль
потока. Действительно, при
приближении продольной оси
палочкообразной частицы к направлению потока
скорость, с которой окружающаяся
жидкость обтекает частицу,
уменьшается, что приводит к уменьшению
Комментарии Г9.?. Градиент сдвига
и напряжение сдвига
Мы определили вязкость ti (параграф
Г2.4.1) как силу F, которая необходима для
поддержания в жидкости градиента du/dx,
направленного по нормали к этой силе:
F=x\A (du/dx), (A)
где А — площадь поверхности,
образованной линиями тока. Сдвиговые усилия в
жидкости, развивающиеся внутри
стандартного капиллярного вискозиметра при
поддержании градиента скорости в потоке,
весьма значительны. Напряжение сдвига S
определяют как силу, действующую на
единицу площади в жидкости и возникающую
в результате течения последней. Скорость
сдвига — это градиент скорости,
направленный по нормали к этой силе. Соотношение,
связывающее напряжение сдвига и
скорость сдвига: !
S=F/A = r\(du/dx). (В)
В стандартном капиллярном
вискозиметре для водных растворов S составляет
-10 дин-см2. Гораздо меньшие значения S
можно получить в ротационных
вискозиметрах. Так в вискозиметре Зимма-Кро-
зерса можно проводить измерения при
значениях напряжения сдвига, не
превышающих 0,0006 дин-см 2.
потерь на трение и, следовательно,
и вязкости раствора. Таким образом,
уравнение Г2.40 должно быть
переписано следующим образом:
[г,] = lim (г, - г,0)/г,0 С, (Г9.3)
С->0.
На рисунке Г9.4 приведены
примеры зависимости вязкости для ДНК из
бактерифага Т2 от величины
напряжения сдвига i ■•. ' ). Заметим,
что в случае использования больших
значений скорости сдвига может
происходить даже разрыв молекул ДНК.

C = 10.6
0 0.1 0.2
Напряжение сдвига (дин/см2)
Рис. 19.1. Зависимость удельной вязкости от напряжения сдвига для ДНК из
бактериофага Т2, выраженная как доля соответствующего значения при нулевой величине напряжения
(mv )/(mv ) (;_„едвига. Показана кривая для двух концентраций ДНК. Результаты измерении при
очень малых градиентах сдвига демонстрируются на вставке вверху. Видно, что вязкость
практически перестает зависеть от напряжений сдвига при его значениях, меньших чем 0,001 динсм'-.
Для исследованных препаратов ДНК найденная экспериментальная величина
характеристической вязкости оказалась равной 31 600 см'г ' (Crother and Zimm, 1965)
Г9.3.3. Дифференциальный
балансный вискозиметр
В жидкостном дифференциальном
балансном вискозиметре используется
тот же принцип, что и в хорошо
известном электрическом мостике Уинсто-
на (рис. Г9.5 а). Дифференциальным
он называется так, поскольку в нем
напрямую измеряется относительная
вязкость, а балансным — поскольку
прикладываемое к одному из плечей
давление уравновешивает таковое,
возникающее из-за разности свойств
раствора и растворителя.
Прибор имеет высокую
чувствительность, измерения выполняются
при низких концентрациях
глобулярного белка (~1 мг-мл-1). Когда
растворитель находится во всех четырех
капиллярах R,, R2, R.} и R4, то
дифференциальное давление через мостик
равно нулю. Ситуация подобна
отсутствию тока в мостике Уинстона,
когда все четыре плеча в мостике имеют
одинаковые сопротивления. Когда же
раствор наполняет капилляры R , R., и
Rv то растворитель, поступающий из
накопительного резервуара, остается
в капилляре Rr Различия в вязкости
между растворителем в R( и раствором
в R3 вызывают неравномерное
распределение давления АР в мостике,
которое связано с удельной вязкостью
раствора отношением:
tivi = 4AP/(Pj-2ДР). (Г9.4)
Этот вискозиметр имеет высокую
скорость измерения. Кроме того,
дополнительное количество раствора может
вводиться постепенно через проточную
кювету. Он также может быть совмещен

а б
Рис. 19.5: а — принцип работы дифференциального вискозиметра. Когда во всех четырех
капиллярах вискозиметра Л,—/?, находится растворитель, дифференциальное давление через мост
равно нулю. Когда раствор молекул из колонки наполняет капилляры Rv R2 и R3, в то время как
растворитель, поступающий из задерживающего (накопительного) резервуара (Резервуар В),
остается в капилляре RA, то различие в вязкости раствора и растворителя вызывает
неравномерное распределение давления в мосте, которое пропорционально вязкости раствора образца. При
известном значении концентрации можно вычислить удельную вязкость раствора (Dutta et al.,
1991); б— принцип работы мостика Уинстона. В роли Д,-/?, выступают четыре омических
сопротивления, величина одного из которых (RA) подбирается таким, чтобы уравнять сопротивление
искомою (Д2). При равенстве этих сопротивлений ток в мостике будет равным нулю
в оперативном режиме с детектором
концентраций (базирующемся на
измерении показателя преломления или на
регистрации поглощения в
ультрафиолете) для преобразования
относительной вязкости в удельную вязкость.
Г9.3.4. Вязкоупругая релаксация
Если к ротору в ротационном
вискозиметре, где находится раствор ДНК,
приложить внешний вращающий
момент, то конфигурация цепей ДНК в
среднем изменится, перейдя от конфор-
мации статистического клубка к более
вытянутой. Энергия, которая
затрачивается па этот переход, обеспечивается
вращающим моментом, создаваемым
внешними силами и передается через
градиент скорости в жидкости.
Внутренняя энергия молекул ДНК при этом
увеличивается вследствие изменения
конфигурации цепей. Если убрать
внешний момент, то ротор не остановится
до тех пор, пока не произойдет
релаксация молекул ДНК обратно в состояние
статистического клубка. Те силы,
которые возникли под действием
исходного вращающего момента, вызвавшего
вытягивание клубка, создают теперь в
роторе некоторый момент все то время,
пока происходит релаксация цепей.
Кинетика перехода статистического
клубка, образованного цепями однородного
полимера из возмущенного состояния в
конечное невозмущенное равновесное

Чотн
70
60
50
40
30
20
10
I
1/ f J
2 Y
ill
/ J zJ/
I if/5/
^i—i 1 ъ»
0 100 200 300 400
Концентрация (мг-мл')
Рис. I 9.(i. Зависимость относительной
вязкости r| для пяти глобулярных белков от
их концентрации С: 1 — гемоглобин
человека; 2 — яичный альбумин; 3 — бычий
сывороточный альбумин; 4 — человеческий
сывороточный альбумин и 5 — у-глобул и и человека
(Monkos and Turczynski, 1991)
состояние, представляет собой
сложный процесс. При низких градиентах
сдвига, при которых наблюдается
небольшая деформация цепи в непроте-
каемых гауссовых клубках, наибольшее
время релаксации т цепи равно:
т, =0,423-
RT
(Г9.5)
где [г|] — характеристическая вязкость
молекулы и г|0 — вязкость
растворителя. Для больших молекулярных масс
ДНК времена релаксации очень велики
Г9.3.5. Концентрационная
зависимость характеристической
вязкости
Вязкость частиц в растворе является
сложной функцией концентрации,
поскольку при высоких значениях концен-
трацпн искажения скорости одной
частицы могут подействовать на скорости
соседних частиц. Ожидаемая вязкость
раствора выражается как степенной ряд
по отношению к вязкости чистого
растворителя:
Л = Г10(1=А1С + А,С2+...). (Г9.5)
При таком разложении
коэффициент к{ выражает вклад в суммарную
вязкость индивидуальных молекул,
k., — парный эффект взаимодействия
двух молекул, и т. д. На рисунке Г9.(>
приведен график относительной
вязкости как функция концентрации
для различных глобулярных белков.
Из рисунка видно, что этот эффект
обнаруживается при концентрациях
белка более чем 150 мг см 3.
Для разбавленных растворов
справедливо уравнение Хаггинса:
Цул/с = [ц} + Кц[Цу-с, (Г9.6)
где г) — константа Хаггинса, которая
связана с конформацией макромолекул
в растворе.
Альтернативным уравнением для
концентрационной зависимости
является:
n,,A = h](i+V>' (Г9-7>
где
*„-[п]кп.
(Г9.8)
Концентрационная зависимость
k измеряется в тех же единицах
(мл • г"1), что и эквивалентный
параметр скоростной седиментации, k, из
уравнения (Л) комментария Г4.18, и
поступательной диффузии, &п из
уравнения (А) комментария Г3.6.
Значения k и k связаны как:
k.V.
— >
(Г9.9)

где Vs/v — фактор набухания
макромолекулы в растворе. Фактор
набухания V, /v, который есть не что иное как
отношение гидродинамического объема
к сухому объему частицы может быть
найден из отношения k /k.. Заметим,
что эта процедура не требует знания
конформации частиц.
Г9.4. Вычисление
характеристической вязкости
белков из их атомных
координат
Несмотря на эмпирический характер
уравнения Г2.58, вычисления
характеристической вязкости через
поляризуемость дают хорошие практические
результаты для глобулярных белков.
В uhViiuu' ГО. 1 сравниваются значения
характеристической вязкости,
предсказанной по атомным координатам, с
экспериментально полученными. Эти
данные находятся в хорошем согласии,
если принять, что толщина гидратиро-
ванной оболочки (универсальной для
всех глобулярных белков) равна 0,9 А
(см. также i,m.i. l'.'j.l! для
коэффициентов диффузии).
Г9.5. Определение
конформации макромолекул
из характеристической
вязкости
Г9.5.1. Синтетические
полипептиды
Синтетические полипептиды являются
идеальной моделью для иллюстрации
высокой чувствительности вязкости к
конформационному состоянию
макромолекулы. Еще в 1959 г. Доти с
сотрудниками обнаружили, что синтетический
полипептид поли-у-бензилглутамат
может существовать в виде а-спирали По-
линга-Кори в растворителе со слабыми
водород-водородными связями.
В растворителях с сильными
водород-водородными взаимодействиями
внутримолекулярные водородные
связи спиралей не так стабильны и кон-
формация полипептида соответствует
конформации беспорядочного клубка.
На рисунке Г9.7 представлена
зависимость характеристической вязкости
от молекулярной массы в двойной
логарифмической шкале для поли-у-
бензил-Ь-глутамата в двух типах
растворителей. В дихлоруксусной
кислоте (открытые кружки) полипептиды
Таблица 19.1. Сравнение экспериментальных значений характеристической
вязкости с предсказанными по атомным координатам *)
Белок
РНКазаА
Лпзоцпм
Миоглобин
Химотрнпсиноген
Код белка
7rsa
Glys
1 in bo
2cg
М(кДа)
13,7
14,3
17,2
25,66
[П],1ред(СМ3Т-1)
3,26
2,99
3,14
2,93
[П]измер.(см3т-')
3,30
2,98-3,00
3,15
2,5-3,13
*) Характеристическая вязкость белков вычислена через электростатическую емкость. Толщина
гидратироваппой оболочки в этих вычислениях принята равной 0,9 A (Zhou, 1995)

находятся в форме гауссового клубка.
В этом растворителе [г\\ = 2,78 10"3М"87
и величина экспоненты соответствует
ожидаемой для гауссовых клубков в
«хороших» растворителях. В
растворителях, таких как диметилформамид
или хлороформ (закрытые кружки),
формируется структура, близкая к
палочкообразной. В этих растворителях
[г|] = 2,78 10"3М17. Показатель степени
1,7 полностью согласуется с
теоретическим значением в формуле Симха
для палочкообразных молекул
(уравнение Г2.52).
Интересно, что две прямые на
рисунке Г9.7 пересекаются и
характеристическая вязкость в точке
пересечения (М равно около 70 кДа) остается
неизменной, несмотря на то, что
клубок трансформируется в спираль и
наоборот. Справа от точки пересечения
прямых переход полипептида от
спиральной коиформации к клубкообраз-
ной сопровождается уменьшением
характеристической вязкости, тогда как
такой же переход слева от точки пере-
Таблица Г9.2. Характеристическая вязкость некоторых белков и вирусов
в водных растворах'1
Белок
Рибонуклеаза
Лизоцим
Миоглобин
Химотрипсиноген
Р-лактоглобулин
БСА
Гемоглобин
Катал аза
Вирус карликовой кустистости томата
Тропомиозин
Фибриноген
Коллаген
Миозин
Вирус табачной мозаики
М(Да)
13683
14211
17836
25660
36800
66296
68000
250000
10700000
70000
330000
345000
490000
40000000
[г|] (см3- г ')
3,3
2,7
3,15
2,5-3,15
3,4
3,7
3,6
3,9
3,4
52
27
1150
217
37
Значения [г\] для других белков читатель может найти в литературе (Harding, 1997)
10000 20000 50000 100000 200000 500000 1000000
Молекулярная масса в логарифмической шкале
Рис. 19.7. Зависимость характеристической
вязкости от молекулярной массы для поли-у-
бензил- L-глутамата. Открытые кружки
относятся к коиформации беспорядочного клубка,
заполненные кружки к ос-спиральной
коиформации (Doty et al., 1956)

сечения сопровождается увеличением
характеристической вязкости.
Г9.5.2. Белки в глобулярной
конформации
Экспериментальные значения
характеристической вязкости некоторых
белков представлены в i;in. шпе W.2. Из нее
видно, что в соответствии с значениями
характеристической вязкости белки
можно разделить на две группы. Одна
группа характеризуется значениями [ц]
между 3,0 и 4,0 см3т '. Это глобулярные
белки, форма которых близка к
сферической. Очевидно, что определение
молекулярной массы глобулярных белков
по их характеристической вязкости
невозможно.
Заметим, что сферический вирус
карликовой кустистости томата с
молекулярной массой 10,7 МДа имеет то же
значение характеристической вязкости,
что и рибонуклеаза с молекулярной
массой 13,7 кДа. Это факт объясняется тем,
что объемная доля сферических частиц,
а не их радиус, определяет значение
характеристической вязкости (уравнение
Г2.48).
Вторая группа белков, в отличие от
первой, имеет гораздо большие
значения [Г|].
В эту группу входят асимметричные
белки, форма которых далека от
сферической. Характеристическая вязкость
таких белков в первую очередь зависит
от их асимметрии.
Так, характеристическая вязкость
коллагена (палочкообразная молекула
с аксиальным отношением 100) имеет в
30 раз большее значение величины
характеристической вязкости, чем у
вируса табачной мозаики (палочкообразная
молекула с аксиальным отношением,
равным 18).
4.0
3.5
3.0
У
М М3= 77.3^*» X
/
1 1 1 1
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
log n (n - число остатков)
Рис. I 9.8. Зависимость характеристической
вязкости от длины полипептидной цепи в
двойном логарифмическом масштабе в 6М гу-
нидингидрохлориде при 25 °С. Окисление ди-
сульфидных связей предотвращается
добавлением р-меркаптоэтанолоа (0,15-0,20 мМ)
(Tanford, 1968)
Г9.5.3. Белки в клубкообразной
конформации
Полипептидная цепь, имеющая конфор-
мацию беспорядочного клубка
(лишенная вторичной и третичной структуры),
занимает гораздо больший объем, по
сравнению с тем, который она
занимает, находясь в конформации глобулы, и,
как следствие, в этом состоянии имеет
более высокое значение
характеристической вязкости. Данные по вязкости
[г|] денатурированных белков
приведены в i;h'i.пщг Г!).,'}.
На рисунке Г9.8 приведен график
зависимости [л.]М0 от п в двойной
логарифмической шкале для 16 белков в
гуанидингидрохлориде, где М0 и п
являются значениями массы и числа
аминокислотных остатков белка,
соответственно. На этом же рисунке показано
уравнение прямой линии, проведенной
через экспериментальные точки
методом наименьших квадратов. Из него

Таблица Г9.3. Белки в конформации беспорядочного клубка в 6 М
гуанидингидрохлориде в присутствии 0,15мМ (3-меркаптоэтанола
Белок
Инсулин
Рибопуклеаза
Лизоцим
Гемоглобин
Миоглобин
[З-лактоглобулин
Хнмотрипсиноген
Фосфорнбозил-трансфсраза
Глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназа
Тропомиознн
Альдолаза
Пепсиноген
БСА 66.296
Парампозин
Тироглобулин
Миозин
М(Да)
5 700
13 683
14 211
15 500
17 200
18 400
25 660
35 000
36 300
38 000
40 000
40 000
114 605
100 000
165 000
200 000
М0 (Да)
113
ПО
111
108
112
ИЗ
105
109
ПО
114
107
108
114
114
121
115
и
26
124
129
144
153
162
245
320
331
333
376
370
605
880
1364
1739
(см3-г_|)
6,1
16,6
17,1
18,9
20,9
22,8
26,8
31,9
34,5
33,0
35,5
31,5
52,2
65,6
82
92,6
видно, что величина экспоненты (0,666)
соответствует величине, ожидаемой для
клубков в «хорошем» растворителе.
Г9.5.4. Природно-
неструктурированные белки
До недавнего времени наши
представления о структуре белков исходили из
того, что изначально свернутая
уникальным образом белковая третичная
структура необходима для их
функционирования. Однако за последние
годы было найдено, что многие белки в
клетке не обладают такой структурой в
изолированном состоянии, хотя и
имеют при этом четкую функцию при
физиологических условиях. Такие белки
получили название белков с природной
или внутренней неупорядоченностью.
Доля неупорядоченных областей в
таких белках может быть разной, начиная
от последовательности из нескольких
аминокислот и заканчивая полностью
неупорядоченной
последовательностью длиной в десятки, а иногда и в
сотни аминокислот. Главное отличие
этих белков от структурированных
(глобулярных) белков состоит в том,
что они не имеют уникальной
третичной структуры в изолированном виде,
а приобретают ее после
взаимодействии с партнерами. Их конформация в
комплексе определяется партнером по
взаимодействию, а не только
собственной аминокислотной
последовательностью, как это характерно для
структурированных (глобулярных) белков(см
также секцию КЗ.5).
Убедительные доказательства
существования таких белков были
получены с помощью измерения вязкости
их растворов. В предыдущем
параграфе было показано, что все белки
независимо от их исходной конформации
в растворе, будучи переведенными

.-40
■•-•■^^т^^
I ' ■ ' ■ I ' ' ■ ■ I ■' ■' I ' ■ ' ' I
2 3 4
С (мг мл"')
2 3
С (мгмл')
а б
Рис. Г9.9: а — зависимость удельной вязкости от концентрации для рекомбинантного
фибронектин связывающего домена (rFNBD-A) в физиологическом буфере (О) и 6 М
гуанидннгидрохлориде (•); б — то же для другого домена (rFNBD-B) (House-Pompeo
el al., 1996)
в универсальный растворитель (8М
мочевина или 6М гуанидингидро-
хлорид плюс 0,1 М меркаптоэтанол),
приобретают конформацию, близкую
к таковой гауссового клубка.
Потому сравнение величины
характеристической вязкости белка в нативных
физиологических условиях и в
универсальном растворителе дает прямой
ответ на вопрос о степени его разу-
порядоченности в растворе. Рисунок
ГУ.9 показывает зависимость
удельной вязкости от концентрации для
двух белков в физиологическом
буфере (О) и 6 М гуанидннгидрохлориде
(•). Практически полное совпадение
прямых в двух растворителях строго
доказывает, что рассматриваемые
белки могут быть отнесены к классу при-
родно неструктурированных белков.
В заключение заметим, что данные,
представленные на рисунке Г9.9,
строго говоря не означают, что
рассматриваемые белки не содержат
некоторую долю флуктуирующей вторичной
структуры.
Г9.5.5.ДНК
В lao.iimc ГУ. 1 представлены
значения вязкости пяти препаратов
высокомолекулярных ДНК, выделенных
из фагов. Измерения проводились
при очень малых напряжениях
сдвига с использованием вискозиметра
Зимма-Крозерса. На рисунке Г9.10
показана зависимость
характеристической вязкости от молекулярной
массы в двойной логарифмической
шкале, построенная по данным этой
Таблица Г9.4. Характеристическая вязкость препаратов ДНК, выделенных
из некоторых бактериофагов
Источник
Т2
X
1/4 Т2
Т7
Т7 (узкая фракция)
М(МДа)
115
32
27,2
26,35
3,7
[г|] (см3- г ')
31600
14000
11500
11 100
2590

10 10'
Молекулярная масса (МДа)
Рис. Г9.10. Зависимость характеристической вязкости [г|] от молекулярной массы ДНК,
выделенной из бактериофагов, в двойной логарифмической шкале. Наклон прямой равен 0,73, что
соответствует таковому, ожидаемому для конформацип набухшего гауссового клубка
Комментарий Г9.3. Взаимосвязь
между экспонентами а и а для
молекул ДНК
Мы напоминаем, что для гомологичного
ряда молекул в конформации гауссового
клубка в «хорошем» растворителе
справедливы следующие уравнения КМХ (см.
также комментарий Г4.27):
[ц]-К[ч]М™ (А)
-КМ"
(Б)
L'
Экспериментальные значения экспонент .
для ДНК в области молекулярных масс 4- ]
115 МДа очень близки к ожидаемым. Так, а !
= 0,73 (см. рис. Г9.9), а = 0,44 (см. рис. Г4.28). !
Интересно, что в пределах
экспериментальной ошибки зависимость между а и а
описывается уравнением (Е) в koMMcii lapim П.1_>7.
Это еще раз подтверждает плодотворность
использования уравнений КМХ для анализа
конформации биологических макромолекул.
таблицы. Из рисунка видно, что ДНК
с молекулярными массами в интервале
4-115 МДа описывается прямой с
наклоном а = 0,73, который типичен для
гауссового клубка в «хорошем»
растворителе (комме in арии Г').,'}).
Г9.6. Конформационные
изменения в белках
и нуклеиновых кислотах
При денатурации глобулярных белков
их характеристическая вязкость
увеличивается очень заметно. Масштаб этих
изменений иллюстрируется на
рисунке Г9.11 а для белка (рибонуклеаза Н).
На рисунке Г9.11 6 показано
разворачивание нуклеиновой кислоты (рибо-
сомная 16S РНК).
Г9.7. Перечень ключевых идей
Поток жидкости, медленно движущийся вдоль капилляра или между двумя
параллельными плоскостями, называется ламинарным; в этом случае вязкость

0.5
Луд
0.4
0.3
0.2
0.1
/
i i i
30 40 50 60
Температура (°С)
70
20 40 60 80
Температура (°С)
а б
Рис. 19.1 I: а — зависимость характеристической вязкости [г\] от температуры (температурная
денатурация белка) рнбонуклеазы Н (рН 2) (Van Holde, 1985); о -- зависимость удельной
вязкости [r| j от температуры (разворачивание 16S РНК) (Spirin, 1963)
жидкости г|0 не зависит от градиента скорости, и такая жидкость называется
ньютоновой.
* При достаточно высокой скорости исследуемый поток жидкости возмущается;
в этом случае вязкость жидкости г|0 зависит от градиента скорости; такая
жидкость называется неньютоновой.
Характеристическая вязкость [г|] определяется как увеличение вязкости при
добавлении в него 1 г макромолекул; она имеет размерность см;) • г1.
Очень асимметричные или деформирующиеся молекулы имеют тенденцию
к ориентации или деформации в градиенте скорости потока; для таких молекул
характеристическая вязкость должна экстраполироваться не только к нулевой
концентрации, но и к нулевому градиенту скорости.
Удельная вязкость r\v. раствора сферических частиц пропорциональна их
объемной доле в растворе; nv. не зависит от диаметра сферы.
Характеристическая вязкость белков может быть предсказана с хорошей
точностью по их атомным координатам при корректном учете вклада гидратации.
Глобулярные белки и сферические вирусы образуют гомологичный ряд,
показатель степени в уравнении КМХ для такого ряда равен нулю. Определить
молекулярную массу сферической частицы из измерений ее характеристической
вязкости невозможно.

• Различные белки в 6М гуанндингидрохлориде или 8М мочевине образуют
гомологичный ряд, показатель степени которого в уравнении КМХ равен 0,67.
Такой показатель степени типичен для белков в конформации гауссова клубка
в «хорошем» растворителе.
9 Характеристическая вязкость для гомологичных рядов палочкообразных
частиц пропорциональна их молекулярной массе в степени 1,7-1.8.
9 Молекулы ДНК с большой молекулярной массой (М > 3 х 10" Да) образуют
гомологичный ряд гауссовых клубков; показатель степени в уравнении КМХ
для такого ряда равен 0,73.
Литература для дальнейшего чтения
Исторический обзор и введение в биологические проблемы
Harding S. Е. The intrinsic viscosity of biological macromolecules. Progress in
measurement, interpretation and application to structure in dilute solution. Prog.
Biophys. Mol. Biol. 1997. 68, 207-262.
Сравнение теории и эксперимента
Zhou H.-X. Calculation of translational friction and intrinsic Viscosity. I. General
formulation for arbitrary shaped particles. Biophysical J., 1995. 69, 2286-2297.
Z/гомЯ.-Х Calculation of translational friction and intrinsic Viscosity. II. Application
to globular proteins. Biophysical J., 1995. 69, 2298-2303.
Brenner H. Rheology of a dilute suspension of axisymmetric Brownian particles. Int.
L Multiphase Flow, 1974.1, 195-341.
Allison S. A. Low Reynolds number transport properties of axisymmetric particles
employing stick and slip boundary conditions. Macromolecules, 1999. 32, 5304-5312.
Измерение вязкости
Cantor С. and Schimmel, P. Biophysical Chemistry. Part II Technique for the study of
Biological Structure and Function. San Francisco: W. H. Freeman and Co. 1980.
Dutta R. K., Hammons K., Willibey B. and Honey M. A. Analysis of protein denaturation
by high-performance continuous differential viscometry./ Cromatog. 1991.536, 113-121.
Конформация макромолекул, определяемая по их характеристической
вязкости
Цветков В. Н., Эскин В. Е. и Френкель С. Я. Структура макромолекул в
растворах. М.: Наука, 1964.
Tanford С, Kawahara К. and Lapanije S. Proteins as a random coils. Intrinsic viscosity
and sedimentation coefficients in concentrated guanidine hydrochloride./. Amer. Chem.
Soc, 1967.89,729-736.
Rome A.J. The concentration dependence of transport processes: a general description
applicable to the sedimentation, translation diffusion, and viscosity coefficients of
macromolecular solutes. Biopolymers, 1977. 16, 2595-2611.

Crothers D. M. and Zimm В. Н. Viscosity and sedimentation of the DNA from
bacteriophages T2 and T7 and the relation to molecular weight./ Mol. Biol, 1965. 12,
527-536.
Doty P., Bradbury]. II. and Iloltzer A. M. Polypeptides. IV. The molecular weight,
contigruation and association of poly-y-glutamate in various solvents./ Am. Chem. Soc,
1956.78,947-954.
Природно-неструктурированные белки
Сердюк И. Н. Структурированные белки и белки с внутренней
неупорядоченностью. Молекулярная биология, 1997. 41, 1-17.
Конформационные изменения в белках и нуклеиновых кислотах
YangiJ. Т. The viscosity of macromolecules in relation to molecular conformation.
Adv. Protein. Chem., 1961.16, 323-400.
Tanford С Protein denaturation. Adv. Protein Chem., 1968. 23, 121-282.
Van Holde K. Physical Biochemistry. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall., 1985.

Глава ПО
ДИНАМИЧЕСКОЕ РАССЕЯНИЕ СВЕТА
Г10.1. Исторический обзор
1869
Дж. Тиндаль (J. Tyndall) выполнил
первые эксперименты по рассеянию
света аэрозолями. Он объяснил голубой цвет
неба присутствием пыли в атмосфере.
1871
Лорд Рэлей (Lord Rayleigh) создал
первую теорию рассеяния света
ансамблем невзаимодействующих частиц,
имеющих малые размеры по сравнению с
длиной волны света. По Рэлею, среда
рассеивает свет благодаря колебаниям
молекул около положения равновесия. Он
вывел формулу, которая объясняла голубой
цвет неба преимущественным
рассеянием молекулами атмосферы синих лучей
по сравнению с красными.
1906
Л. Мандельштам (L. Mandelshtam)
вновь поднял вопрос о природе
рассеяния света. Он обратил внимание на
то, что аргументы Рэлея не полностью
объясняют феномен рассеяния света.
По Мандельштаму, рассеяние света
будет происходить только тогда, когда в
объеме порядка X3, где X — длина волны
рассеянного света, в каждый данный
момент времени будет содержаться разное
число молекул. Как следовало из
рассуждений Мандельштама, коэффициенты
поступательной и вращательной
диффузии макромолекул могут быть получены
из анализа спектров рассеяния света.
1921
Л. Мандельштам с коллегами
развил теорию м практические основы
комбинационного рассеяния света, которое
позже в англоязычной литературе
получило название рамановского рассеяния.
Он еще раз подтвердил, что
коэффициент поступательной диффузии
макромолекул может быть получен из спектров
рассеяния света. Однако отсутствие
когерентности и монохроматичности у
традиционных источников света,
используемых в то время, не давало возможности
провести такие эксперименты.
1914
Л. Бриллюен (L. Brillouin)
предсказал дублет в спектре рассеянного света,
обусловленный рассеянием тепловых
звуковых волн в твердых телах. Этот
дублет позже был назван его именем.
В 1932 г. Е. Гросс (Е. Gross) провел
серию экспериментов по светорассеянию
жидкостями. Он обнаружил не только
дублет Бриллюена, но также и
несмещенный центральный пик. В 1933 г.

Л. Ландау и Г. Плачек (L. Landau and
G. Placzek) дали теоретическое
объяснение присутствия центрального пика
с термодинамической точки зрения и
вычислили соотношение интегральной
интенсивности центральной линии и
таковой для дублета.
ИМ 7
Л. Горелик (L. Gorelik) выдвинул
идею спектроскопии оптического
смешения. Он назвал этот метод — методом
демодиляционного анализа рассеянного
света. В 1955 г. А. Форрестер, Р. Гуд-
мунсен и П. Джонсон (A. Forrester,
R. Gudmunsenand P.Johnson)
реализовали эту идею на практике. Они
назвали ее спектроскопией оптических
самобиений в противоположность обычной
спектроскопии. Однако в долазерную
эпоху отношение «сигнал- шум» в этих
опытах было плохим, и метод не
получил тогда широкого применения.
1 Я()/(
Р. Пекора (R. Ресога) показал, что
частотный профиль рассеянного света
уширяется в результате поступательной
диффузии макромолекул. Он создал
теорию, согласно которой из полуширины
центрального пика на половине его
высоты можно вычислить коэффициент
поступательной диффузии. В том же
году Г. Каммингс, Н. Кнабль и И. Йе
(Н. Cammins, N. Knable and Y. Yeh)
использовали метод оптического
смешения в опытах но рассеянию света на
суспензии сферического полистирольного
латекса. Они применили
гелий-неоновый (He-Ne) лазер в качестве
источника света и технику, которая позже была
названа «гетеродинной» техникой
оптических биений. В 1967г. С. Б. Дубин,
Дж. Луначек и Г. Б. Бенедек (В. Dubin,
S. J. Lunacek and G. В. Benedek)
опубликовали первые данные по измерению
полуширин линий Рэлеевского
рассеяния для ряда биологических
макромолекул. Эти пионерские теоретические и
экспериментальные работы обогатили
и разнообразили эту область
исследований. В 1976г. Б. Дж. Берне и Р. Пекора
(В. J. Berne and R. Ресога)
опубликовали свою знаменитую книгу
«Динамическое рассеяние света в приложении к
химии, биологии и физике».
Н)72
Б.Р.ВариВ.Г.Флайгар(В^.\¥аге
and W. H. Flygare) опубликовали
результаты исследований бычьего
сывороточного альбумина методом
динамического рассеяния света в присутствии
статического электрического поля. Они
показали, что при приложении такого
поля молекулы начинают
направленно двигаться со скоростью, которая
пропорциональна электрофоретичес-
кой подвижности, сохраняя при этом
беспорядочное броуновское движении
заряженных частиц. Этот метод был
назван электрофоретическим рассеянием
света.
1976
С. Б. Дубин, Н. А Кларк
и Г. Б. Бенедек (S. В. Dubin and
N. A. Clark, G. В. Benedek) измерили
коэффициент вращательной диффузии
лизоцима, используя сферический
интерферометр Фабри-Перо.
Комбинируя полученные данные с данными по
коэффициенту поступательной
диффузии, они пришли к выводу, что
гидродинамические размеры молекулы
лизоцима в растворе очень близки к таковым
для лизоцима в кристалле. В 1991 г.
Пекора весьма успешно применил этот
подход к исследованию коротких оли-
гонуклеотидов ДНК.

1982
3. Кам и Р. Риглер (Z. Кат
and R. Rigler) использовали
кросс-корреляцию для выделения коэффициента
поступательной диффузии из других
динамических компонентов лазерного
рассеяния света. Они показали, что
вращательная диффузия асимметричных
частиц, конформационная подвижность
беспорядочных клубков, динамика
процессов ассоциации/диссоциации могут
быть определены методом
кросс-корреляции рассеяния света при измерении
интенсивности флуктуации при
различных углах рассеяния.
1997
Р. Бар-Зив (R. Bar-Ziv) с
коллегами предложили метод локализованного
динамического рассеяния света для
исследования динамических свойств
одиночных молекул в нанометровой
шкале. Позже этот метод был применен для
измерения констант биомолекулярных
сил и зондирования
вязкостно-эластичных свойств сложных сред.
2000 и по настоящее нреми
Метод динамического рассеяния
света используется для быстрого
(несколько минут) и точного (1-2%)
измерения в растворе коэффициентов
поступательной диффузии макромолекул
практически любых размеров. Для
молекул, размеры которых сравнимы с
длиной волны света, можно определять
также и коэффициенты вращательной
диффузии. Для малых глобулярных
белков и олигонуклеотидов,
коэффициенты вращательной диффузии
которых очень велики, можно использовать
стандартную спектроскопию очень
высокого разрешения. Метод
динамического рассеяния света незаменим также
для измерения скоростей
направленного движения макромолекул в линейных
и турбулентных потоках.
ПО.2. Введение
в биологические проблемы
В середине 1960-х гг. в молекулярной
биологии начал интенсивно
использоваться новый физический метод,
получивший разные названия, но который
вслед за Р. Пекорой мы будем называть
методом динамического рассеяния
света (ДРС). Его успешное развитие в
последующие 15 лет показало, что
метод добавил к классическому методу
некогерентного статического
рассеяния света новую физическую
размерность — время. За эти годы были
проведены интенсивные исследования по
анализу динамики различных
переходных процессов, которые вносят вклад
во флуктуацию интенсивности
рассеянного света. В процессе
экспериментов было обнаружено влияние
диффузии на уширение спектров рассеянного
света и влияние направленного
движения на сдвиг Допплера для
широкого круга частиц различных размеров,
формы и гибкости. На сегодняшний
день метод ДРС — наиболее
подходящий инструмент для точных
измерений коэффициентов поступательной
диффузии макромолекул в растворе.
В последнее десятилетие появились
новые направления в методе ДРС,
которые в основном связаны с переходом
от исследований свойств макромолекул
в растворе в больших объемах к
исследованиям их индивидуальных свойств
в очень малых объемах. Появилась
новая техника, названная
флуоресцентной корреляционной спектроскопией
(ФКС), которая соединяет методы
световой и флуоресцентной микроскопии.

В этой главе мы опишем два типа
экспериментов по динамике рассеяния света.
В первом — интенсивность
флуктуирует вследствие изменения ориентации и
положений молекул в пространстве
объема порядка -V. Такие эксперименты
мы будем называть экспериментами по
ДРС в условиях гауссовой статистики
(большое число молекул). Во втором —
флуктуация интенсивности
обусловлена флуктуациями числа молекул в
микроскопическом объеме. Этот тип
экспериментов мы будем называть
экспериментами но динамическому
рассеянию света в условиях негауссовой
статистики (малое число молекул).
Метод флуоресцентной
корреляционной спектроскопии может
рассматриваться как дальнейшее развитие метода
динамического рассеяния света. Однако
между ними существует принципиальное
различие. Динамическое рассеяние света
по своей природе - когерентное явление,
тогда как флуоресцентная
корреляционная спектроскопия - некогерентное
явление. Как следствие этого, первое
наблюдается в ансамбле молекул, тогда как
второе- только при небольшом числе
молекул. В идеале, метод флуоресцентной
корреляционной спектроскопии — это
метод для исследования одиночных молекул
в микрообъемах. Его описание
Когерентного явлениябудет дано в Главе П1.
В настоящее время имеется
достаточно много названий техники для
измерения спектрального состава
рассеянного света. Каждое из них
подчеркивает ту или иную сторону метода,
концентрируясь или на способе
детектирования сигнала или на специфике
регистрируемых событий. Приведем
некоторые из них.
1. Динамическое рассеяние света:
это название является
основополагающим. Оно включает в себя все методы
исследования рассеяния света, которые
обеспечивают информацию о динамике
молекул. Противоположное ему —
статическое рассеяние света или любого
другого типа излучения — дает
информацию о массе и геометрии рассеивающих
центров в молекуле (см. секцию Е2.2).
2. Квазиупругое рассеяние света:
это название обращает наше внимание
на то, что в процессе рассеяния
возникает новый спектр длин волн, у
которого центральная частота такая же, как
у падающей световой волны, но
амплитуда и фаза рассеянной волны
модулированы по частоте.
3. Фотонная корреляционная
спектроскопия: это название фокусирует
наше внимание на том, что в этой
экспериментальной технике одиночные
фотоны используются для подсчета
автокорреляционной функции.
4. Оптическая спектроскопия
смешения: этот термин используется, чтобы
подчеркнуть очень высокую
разрешающую способность техники при
определении динамических процессов, которые
описывают подвижность макромолекул в
растворе. Имеется также и много других
названий: спектроскопия флуктуации
интенсивности рассеянного света, рэлеев-
ское уширение и т. д. Мы будем
рассматривать все эти названия как синонимы.
В комментарии l'lO.I будет дана
краткая информация о взаимодействии
света с веществом, которая необходима
для дальнейшего обсуждения.
В заключение укажем, что иногда
употребляемое в литературе название
лазерное светорассеяние никак не отражает
особенности рассматриваемого метода,
и мы его не рекомендуем для
использования. Лазер как источник с успехом
используется в экспериментах по анализу
статической (усредненной по времени)
составляющей рассеянного света.

Комментарии ПО. 1. Свет и вещество
Свет является невозмещаемой субстанцией, которая может быть использована для получения
информации о структуре п динамике молекул. Уравнения Максвелла являются основой для
описания всех электромагнитных явлений. Эти уравнения идентифицируют спет как поперечную
электромагнитную волну, которая колеблется как в пространство, так п во времени, т. е.
направление колебания является перпендикулярным направлению распространения луча (см. рис. A'A.l).
Способ взаимодействия света с материей зависит от электронной структуры вещества,
т. е. от его квантово-мехапичеекпх свойств. Если энергия, присущая фотону (//v, где /;
—константа Планка и v - частота света), равна разнице между двумя энергетическим состояниями
в системе, тогда фотон может быть абсорбирован системой. Поско.чьку электрическое поле
совершает колебания, свет тоже искажает распределение зарядов в спстеме, изменяя их, так
что излучение принимает форму рассеянного света. Если обмен энергией между фотонами и
системой не происходит, тогда частота рассеянного света, viu., равна v(l, и процесс относится
к упругому рассеянию света. Если обмен между фотонами и системой происходит, тогда v
отличается от v0, и процесс относится к неупругому рассеянию света.
Ответ системы на внешнее электрическое поле называется поляризацией системы.
Величина поляризации зависит от амплитуды прилагаемого электрического поля и способности
распределяемого заряда «деформироваться» внешними силами. Способность заряда
деформироваться носит название поляризуемости. Рассеяние света является результатом флуктуации
поляризуемости среды. Если свет поляризован в направлении, перпендикулярном к
плоскости, определяемой источником, рассеивающей кюветой и детектором, тогда процесс относится
к поляризованному рассеянию света и обозначается как Ivv Деполяризованное рассеяние
света, проявляется в его горизонтальной компоненте и обозначается как IVH. Неполяризованный
свет можно представить себе как комбинацию различных поляризованных лучей с
беспорядочной ориентацией вокруг оси их распространения (см также главу 35).
Г10.3. Динамическое
рассеяние света
как спектроскопия
очень высокого разрешения
В соответствии с фундаментальными
законами статистической физики система
из многих частиц никогда не проявляет
полного однообразия. Описывающие
систему термодинамические параметры
постоянно флуктуируют относительно
своих наиболее вероятных значений.
Поскольку эти флуктуации происходят
очень медленно, по сравнению с
частотой световой волны, то для регистрации
таких флуктуации требуется
спектрометры с очень высокой разрешающей
способностью. Требуемое разрешение
столь велико, что традиционная
оптическая спектроскопия не может решать
такого рода задачи и приходится
использовать технику спектроскопии
оптического смешения.
i Комментарий ПО.2. Разрешающая
I способность метода ДРС
На характерных углах рассеяния (-90")
ожидаемая расчетная ширина снектраль- '■
' ной линии (на половине максимальней"!
| высоты), обусловленная флуктуациями
концентрации, которые в свою очередь
возникают благодаря трансляционной t
I диффузии макромолекул растворенно- i
I го вещества, составляет величину около ,
1000 Гц для белка с молекулярной мас-
' сой 50 кДа. Поскольку сам падающий
(видимый) свет имеет частоту около
i 5x10" Гц, то прямое определение формы |
I спектральной линии рассеянного света
требует разрешающей силы, больше чем '
| 10'У10:)= 10".

Лазерный луч, проходящий в среде
рассеяния, может рассматриваться как
«несущая волна», колеблющаяся с
оптической частотой 5 х Юы Гц (рис. ПОЛ а).
Процесс рассеяния создает новую волну
рассеяния, основная частота которой
совпадает с таковой для падающей волны, но
амплитуда и фаза рассеянной волны
модулируются синхронно флуктуациями
среды. Такой модулированный сигнал
показан на рисунке ПОЛ 6). Его ушире-
ние для большинства биологических
макромолекул очень мало (см. ниже). Столь
небольшое уширение вызывает
необходимость использования лазера в
качестве источника света. Очевидно, что для
получения информации, содержащейся в
модуляционном сигнале, его необходимо
демодулировать. Необходимость такой
демодуляции предопределила одно из
первоначальных названий метода — де-
модуляционный анализ рассеянного
света. Очевидно, что при использовании
обычного немонохроматического
источника ширина его линии будет намного
больше полезного сигнала и демодуляция
последнего станет практически нерешае-
мой задачей (комментарии I 10.2).
Демодуляция быстрых
процессов, протекающих в шкале времен
10"и-10"ш сек. осуществляется
спектрометрами с дифракционной решеткой;
для исследования процессов, протека-
\дС0
Рис. ПОЛ: а — сигнал одномодового лазера до
после рассеяния на флуктуациях среды располг
ванный сигнал располагается в радиочастотном
| Комментарий ПО.3. Оптическое !
, и радиочастотное детектирование
! И лазер, и спектрометры оптического
: смешения можно рассматривать как
расширение диапазона устройств и методов,
общепринятых в радиочастотных линиях ,
связи. Для того, чтобы понять, как можно
разрешать узкие спектральные линии в '
оптическом диапазоне, мы должны вспом- j
1 нить, что сходные проблемы возникают в
; радиочастотном диапазоне. В последнем
| случае решение проблемы сводится к при-
; менению «гомодинированных» и «гетеро-
i локированных» приемников. В этих уст- I
ройствах основная частота несущей волны
сдвигается в область более низких частот
с помощью нелинейного смещения. Затем
на этой низкой частоте спектр анализиру- j
ется с помощью узкополосных фильтров. !
Таким образом, тогда как оптический спек- ;
трометр фильтрует на оптической частоте, |
в радиочастотных устройствах фильтра- j
ция осуществляется только после того,
как несущая частота с помощью смесителя
сдвинута до подходящей низкой частоты. ]
! Поэтому спектроскопию оптического сме- :
; шения можно рассматривать как прило-
i жение радиочастотной техники к области :
оптической частоты, где смешивающим :
элементом является фотоумножитель. !
ющих в шкале времени 10 10-10"7 сек,
используются интерферометр Фабри-
Перо. (комментарии ПОЛ) Такие
приборы действуют как оптические фильтры
и, следовательно, не могут быть исполь-
со со - со0 со
в
рассеяния с частотой со0; б — лазерный сигнал
1гается на несущей частоте ш0; о — демодулиро-
дпапазоне со — со0

зованы для разрешения спектральных
компонентов уже, чем -10 МГц
(меньше чем 10"7 сек).
Динамические процессы,
описывающие подвижность биологических
макромолекул в растворе, относятся к
медленным процессам, имеющим ширину
спектральной линии уже, чем 10 Гц, что
на шесть порядков меньше,
регистрируемых оптически, поэтому возникает
необходимость в технике с очень высоким
разрешением. Такая техника называется
спектроскопией оптического смешения
{к'пммги rapiiii ПО.,'}).
П 0.3.1. Флуктуации и временные
корреляционные функции
Для того, чтобы получить информацию
о динамике флуктуирующих систем, мы
должны выбрать один из двух различных,
но близких по физическому смыслу
подходов. Мы можем анализировать
флуктуирующие системы на основе частотных
компонентов с разными амплитудами,
получая спектр частот флуктуации со
свойствами А, <ДЛ- (v)>, где v — это
частота. Однако имеется другой, более
точный метод, в котором измеряется
непосредственно временная корреляционная
функция флуктуации <А (t), A (t + т)>,
где т — корреляционное время,
характеризующее флуктуации в системе.
В этой главе мы будем обсуждать
только эксперименты с использованием
техники временных корреляционных
функций, поскольку она
обеспечивает более высокую точность по
сравнению с техникой спектрального анализа.
Для визуализации результатов мы будем
иногда пользоваться спектром частот.
Корреляционные и кросс -
корреляционые функции
Флуктуирующий сигнал A (£)>
изображенный на рисунке П0.2г/,
обладает следующими свойствами: свойство
А для времени t всегда отлично от
свойства А для времени t+At. Когда время
Mt)u
•<А>=0
Время
~t
а б
Рис. ПО.2: а — изображение некого свойства Л (Г), флуктуирующего во времени относительно
своего среднего <Л>, равного нулю. Временная ось разбивается на ряд дискретных интервалов
At; б —корреляционная функция <Л (0) Л (т)>, описывающая флуктуационный процесс,
изображенный в а. Начальное значение функции равно <Л2>. Для времен значительно больших, чем
корреляционное время процесса тл, корреляционная функция равна <Л>2

т мало но сравнению с типичным
временем флуктуации переменной А (£),
A (t + т) будет близко к величине А (t).
Когда величина т увеличивается,
отклонение A (t + т) от А (?) становится более
вероятным. Таким образом, можно
сказать, что величина A (t + т) коррелирует
с А (?) когда т мало, но эта корреляция
теряется, когда т становится большим
но сравнению с характерным периодом
флуктуации. Мерой такой корреляции
является автокорреляционная функция,
определяемая как:
<Л(0)Л(О> =
= \\m^\A(t)A(t + z)dt. (П0Л)
Если ось времени t разбить, как это
сделано на рисунке 10.2 а на
дискретные интервалы At, так что t =j At, т = п
At, T =NAt, at+x = (j + n)At, = At, то
интегрирование в уравнении Г10.1 можно
заменить суммированием:
<А>=1тДУД, (Г10.2а)
<Л(0)Л(О>=пт^ХЛД+п, (Г10.26)
где А. есть значение свойства в начале
j-ro интервала. Уравнение Г10.26
приближается к уравнению Г10.1, по мере
того как Дг-»0.
Мы ввели дискретизацию в
описание флуктуационного процесса, с тем
чтобы продемонстрировать, как
корреляционная функция меняется со
временем. Из рисунка 110.2 а видно, что
некоторые члены в суммах уравнений
Г10.2а и ПО.26 отрицательны,
например А3 и Аг Следовательно, в этих
суммах часть вкладов будет положительна,
а часть отрицательна. С другой
стороны величина <Л(0) Л(0)> всегда
положительна, так как А2> 0, и ожидается
большой. Таким образом, мы можем
ожидать, что корреляционная функция
будет постоянной, равной
начальному значению для всего отрезка времен
или уменьшаться от максимального
значения <А2> до минимального <А>2
(рис. Г10.2 6).
Отметим, что в большинстве
практических применений корреляционная
функция падает моноэкспоненциально:
<Л(0)Л(т)> = <Л>2 +
+{<Л >-<Л>'}ехр ,
т
кор
где тко) есть корреляционное или
релаксационное время флуктуирующего сигнала.
Корреляционная функция двух
свойств АиВ описывается
кросс-корреляционными функциями:
<Л(0)В(т)> =
If , (П0.4а)
= \lm-\A(t)B(t + x)dt
и
<В(0)Л(т)> =
1г , (Г10.46)
= lim- B(t)A(t + z)dt.K
t->~Tj0
Корреляторы
В лабораторных условиях
превращение флуктуации сигнала в
корреляционную функцию выполняется
с помощью прибора, называемого
коррелятором (рис. Г10.3).
Флуктуирующий сигнал в цифровом виде
передается по двум каналам:
накопительному и общему каналу
коррелятора. Накопитель считает импульсы за
определенный промежуток времени,
At, длительность которого задается
тактовыми кристаллическими
часами. В конце этого промежутка
содержимое переносится в первый регистр

Цифровой
Накопление
прореживание/
пересчет
пч
| | Тактовый генератор
=?
Регистр
сдвига
1 Устройство
Тумножения
Память
1*11С. I 10.3. Схема коррелятора для анализа
флуктуирующих процессов (см. текст)
Рис. I 10.1. Типичная геометрия рассеяния
света. Е0 — амплитуда падающего поля; к0 и
к, — падающий и рассеивающий волновые
векторы; q = k0 — к, — волновой вектор
рассеивания, определяемый углом рассеяния 0 и
длиной волны падающего света X; п —
показатель преломления среды
коррелятора. Затем коррелятор
начинает считать импульсы для второго
идентичного временного интервала.
Этот процесс продолжается в течение
всего эксперимента, так что регистры
коррелятора содержат информацию
о флуктуирующем сигнале за
промежуток времени nxAt, где п — число
регистров коррелятора, a At
называется временем выборки или временем
сэмплирования, которое выбирается,
как правило, в интервале времени от
2 нсек до 1сек. Время выборки должно
соответствовать типичным
корреляционным временам системы.
Очевидно, что для быстрых процессов время
выборки берется малым, а для
медленных процессов — большим.
Корреляционные функции поля
и интенсивности
Для единичной частицы наведенный
диполь р, который является
источником рассеяния, определяется падающим
нолем Е и поляризуемостью частицы а:
р = аЕ. (Г10.5)
Свет, излучаемый всеми
индивидуально индуцируемыми диполями,
собирается на детекторе, где результирующее
электрическое поле зависит от
относительной позиции и ориентации всех
частиц в рассеивающем объеме. Типичная
геометрическая картина рассеяния
света представлена на рисунке ПОЛ
Корреляционная функция рассеивающего
электрического поля, G (1>(т),
называемая корреляционной функцией первого
порядка, определяется, как:
G (1)(т) = <Е (О Е (t +т)>. (Г10.6)
На практике в силу квадратичной
природы детектирования измеряется
корреляционная функция флуктуации
интенсивности. Для интенсивности /,
которая пропорциональна квадрату вектора
электрического поля <Е2>,
нормализованная корреляционная функция, G(2)(t),
называемая корреляционной функцией
второго порядка, вычисляется как:
G(2\t) = <l(t)l(t + x)>. (Г10.7)
Для систем, содержащих большое
количество независимых источников
рассеяния света (гауссово
приближение), связь между G(1,(t) и G(2;(t)
задается соотношением Зигерта:
G(2>(x) = 1 +\G(i>(x)\2. (Г10.8)

Корреляционные функции и частотный
спектр флуктуации
Как было упомянуто выше, частотный
спектр / (v) и корреляционная функция
G (т) полностью эквивалентны при
описании динамического поведения
равновесных систем, поскольку они связаны
фурье-преобразованием:
/(v) = (27r)_1jG(T)expx
x(-2nivt)dz, (Г10-9>
где v — частота в Гц. Так, если / (v)
имеет форму Лорентца на нулевой частоте,
тогда G (т) имеет форму спадающей
экспоненциальной функции с константой
времени, равной обратной величине
полуширины линии Лорентца. Эти
простые функции верны для описания всех
элементарных стохастических
процессов и применимы для интерпретации
поведения большинства систем,
которые будут обсуждаться в дальнейшем.
Простые примеры связи между
корреляционной функцией и частотным
спектром приведены на рисунке ПО.5.
П 0.3.2. Измерение динамической
составляющей рассеянного света
На рисунке Г 10.6 приведены несколько
схем, иллюстрирующих три различных
подхода, используемых в
экспериментах по динамическому рассеянию света:
(а) метод фильтра, (б) метод гомодини-
рования и (в) метод гетеродинирования.
Ниже мы кратко опишем каждый из них.
Техника фильтра
Классическая техника фильтра
используется для демодуляции быстрыхпроцессов
(10-"-10~7сек). В интервале 10-и-10"9сек
применяется дифракционная решетка,
для процессов в шкале времени 10"~10-10 7
сек — интерферометр Фабри-Перо
(комментарии 110.1). Последний может быть
использован для измерения
подвижности небольших глобулярных белков,
поскольку их вращательные времена лежат
в интервале 10 7-10"6 сек (см. r;n'.i. V2.2).
Однако большинство биологических
макромолекул имеет корреляционные
времена, лежащие в интервале от 10"6 до 1
сек (см. ту же табл.) и, следовательно,
техника фильтрации для них не применима.
Техника гомодинирования
и гетеродинирования
В методе динамического рассеяния
света используются две техники —
гомодинирования и гетеродинирования,
Рис. I 10.5. Корреляционные функции и
частотный спектр для трех простейших моделей
флуктуационных процессов: синусоидальная
функция (я): постоянная ((f); простейший
стохастический процесс (в)

Рассеянный
Интерферометр
HZZD—
Фотоумножитель
У
Регистратор
HZZ1
Рассеянный
свет
Фотоумножитель
У
Автокоррелятор
У
Оп.
&&
Фотоумножитель
С
У
Автокоррелятор
41
3-
Регистратор
Регистратор
HZZI
Нис. I
дин (в)
().(). Схемы различных видов техники эксперимента: фильтр (я); гомодпн (б) и гетеро-
каждая из которых имеет свои
достоинства и недостатки. В большинстве
приложений, обсуждаемых ниже,
используется гомодинная техника
(техника самобиений), когда только
рассеянный свет коррелирует сам с собой
(рис. ПО.4 6). Поскольку любой
фотоприемник не реагирует на частоты,
большие чем 10'° Гц, то он будет
регистрировать только частоты колебаний,
обусловленные диффузией
макромолекул в растворе.
В другом экспериментальном
варианте используется техника оптического
гетеродинирования, при котором на
фотокатоде смешиваются поле рассеянного
света и поле гетеродина (опорного
пучка) (рис. Г10.1 в). В качестве
последнего может служить часть первоначально
падающего лазерного луча. Смешение
Комментарий ПО.4. ИнтерферометрФабри-Перо
Интерферометр Фабри-Перо состоит из двух плоскостей зеркального диэлектрика,
выстроенных параллельно. Внутренние поверхности зеркал обладают высокой отражающей
способностью, близкой к 99%. В экспериментах по рассеянию, свет обычно проходит через нормаль
интерферометра к зеркалам, затем отражается обратно и попадает в камеру интерферометра.
Волна, имеющая длину X, сохранится внутри интерферометра, если целое число половин длины
волны будет соответствовать размеру камеры, т. е. т (Х/2) = d, где т — целое число и d —
расстояние между зеркалами. При таком соотношении между т, X и Сбудет иметь место максимум
интенсивности передаваемого света. Если d = 0,1 см и X = 5000 А, тогда т = 2 х10:1. Различия
между последующими длинами волн X, которые могут проходить через интерферометр, для
данного значения d, ДХ составляют около 2,5 А. Соответствующий частотный интервал равен
Ду- 3 х 10" Гц. Таким образом, в соответствии с выбранным я", интерферометр выбирает только
одну частотную компоненту (длину волны) из спектра рассеяния света. Для получения особо
высокого разрешения используется сферическое зеркало вместо плоского, как описано выше.
Сферические зеркала повышают светособирающую способность и дают возможность легко
сканировать спектр.

частот опорного и рассеивающего
пучков приводит к двум важным
следствиям. Во-первых, максимум спектра
сдвигается до значения разностной частоты
v() — v', которая теперь является легко
детектируемой радиочастотой. Во-вторых,
получаемая таким образом
корреляционная функция является
корреляционной функцией поля, которая несет в себе
информацию не только об амплитуде,
но и о фазе сигнала. Недостаток
техники гетеродинирования состоит в
необходимости тщательного согласования
волновых фронтов рассеянного света и
опорного пучка, что само по себе
является нетривиальной задачей.
Фотонная корреляционная
спектроскопия
Техника фотонной корреляционной
спектроскопии используется для
регистрации медленных процессов, чьи
характерные времена лежат в интервале
от 10 6 до 1 сек. В этой технике фильтр
не используется, и свет попадает
непосредственно на фотодетектор.
Аппаратура, необходимая для получения
спектров ДРС, хотя и не является сложной,
но требует выполнения некоторых
условий для получения оптимального
соотношения сигнал-шум и сохранения
когерентности сбора рассеянного света
( kommcii mpin'i ГI ()..->).
Схема типичной
экспериментальной установки показана на
рисунке I" 10.7. Линза L{ фокусирует лазерный
луч в центре рассеивающей ячейки.
Апертурная линза L., и фотоумножитель
располагаются на плече гониометра,
вращающегося вокруг оси, проходящей
через центр ячейки. Положение плеча
определяет угол рассеяния 20.
Расположение элементов на плече
отрегулировано таким образом, чтобы изображение
Коммешарий П0.5. Условия для
когерентного сбора света при
динамическом рассеянии света
При построении спектрометра по
исследованию динамического рассеяния света
одним из принципиальных вопросов
является вопрос о когерентности собираемого
рассеянного света при заданном
разрешении прибора, поскольку он определяет
предельную чувствительность метода.
Сформулированные на сегодня критерии такого
сбора сводятся к нескольким простым
правилам для угла сбора и размера
фотокатода оптического спектрометра. На практике
эти критерии сводятся к выбору размеров
двух точечных диафрагм при заданном
расстоянии между рассеивающим объемом
и фотоумножителем.
рассеивающего объема фокусировалось
на точечной диафрагме. Сигнал
рассеяния анализируется с помощью
коррелятора электронной обработки сигнала.
Рисунок ПО.8 показывает типичный
ход корреляционной функции G(2,(x),
которая всегда состоит из двух частей:
зависящей и не зависящей от времени.
Не зависящая от времени часть,
подставка под корреляционной функцией,
определяется шумами прибора,
статическим рэлеевским рассеянием и
пропорциональна числу частиц в
рассеивающем объеме.
ПО.3.3. Коэффициенты диффузии,
вычисляемые из динамической
составляющей рассеяния света
Как мы указывали ранее (Глава ГЗ).
существует много различных
экспериментальных методов для определения
коэффициентов диффузии
макромолекул, одним из которых и является метод
ДРС. Коэффициент диффузии,
определяемый этим методом, носит название
коэффициента взаимной диффузии.

Точечная диафрагма
V
ui < \фэу
Регистратор Коррелятор
Рис. П0.7. Схема спектрометра по корреляции фотонов, используемого в режиме самобиений.
Оптимальный сигнал получается тогда, когда точечная диафрагма имеет тот же радиус, что и
лазерный луч. Типичное значение расстояния, Z.,, между рассеивающим объемом и щелью
равно около 1м, размер щели, dx перед ФЭУ, равен около 0,1-0,2 мм. Для сохранения
когерентности сбора точечная диафрагма перед ФЭУ должна иметь как можно меньший размер. Однако
ее очень сильное уменьшение приводит к падению регистрируемой интенсивности
Daamt. Этим подчеркивается, что такой
коэффициент определяется из
рассеяния в ансамбле частиц, взаимное
движение которых приводит к биению между
гармониками излучения, исходящего из
разных частиц. Поэтому наиболее
точные результаты по определению Dmim
получаются для разбавленных и
полуразбавленных растворов макромолекул
(высокое отношение сигнал/шум). При
1+f(a)
О)
х (отн. ед.)
Рис. Г!0.8. Типичный вид корреляционной
функции в эксперименте по динамическому
рассеянию света
уменьшении числа молекул в растворе
точность определения D[amsi падает и, в
пределе одной частицы, его
определение становится принципиально
невозможным (см. ниже).
При высоких концентрациях
растворенных молекул можно ожидать
изменений в корреляционной функции,
отражающих два различных
эффекта. Во-первых, изменения константы
диффузии, обусловленные
термодинамическими и гидродинамическими
причинами (см. комментарии I 'i.(i). Во-
вторых, изменения, обусловленные
возможной ассоциацией
растворенных молекул. Корреляционная
функция для последнего случая перестает
описываться одной экспонентой,
поскольку в нее вносятся вклады,
связанные с диффузией мономеров, димеров
и больших агрегатов.
Наличие в растворе частиц разного
размера приводит к задаче о вычислении
распределения частиц по размерам из
сложной многоэкспоненциалыюй кор-

реляционной функции. Подобная задача
нам уже встречалась в параграфе Г4.5.2,
посвященном анализу гетерогенных
систем методом скоростного аналитического
центрифугирования. Как и ранее,
решение такой задачи в методе ДРС приводит
к проблеме решения интегрального
уравнения Фредгольма первого рода:
а
G0,(q,x) = \G(T)cxp(-Gt)dY, (ПОЛО)
о
где G(l)(<?> 0 ~~ нормализованная
временная автокорреляционная функция
электрического поля первого
порядка, G (Г) — функция распределения по
частотам, которая должна быть
определена из экспериментальной функции
G°\q, t) (kt>M\i(.-H lapiiii Г1().()). В том
случае, если экспериментальная
функция G0)(q, t) описывается одной экспо-
нентой, то решение уравнения Г10.6 не
представляет труда и может быть
проведено стандартным методом наименьших
квадратов. Однако анализ мультиэкс-
поненциального сигнала представляет
большие трудности и становится вообще
невозможным, когда константы времени
отличаются на фактор 2 или меньше.
Г10.4. Динамическое
рассеяние света в условиях
гауссовой статистики
При интерпретации G (1)(0 или
G(2)(t) делается несколько
допущений. Предполагается, что движение
молекулы как целого и внутренние
движения в ней (если последние
присутствуют) не зависят друг от друга,
растворы существенно разбавлены, а
все виды релаксаций, включая
поступательное и вращательное движение,
имеют экспоненциальный спад. При
таких упрощениях для корреляциои-
Комментарий Г10.6. Интегральное
уравнение Фредгольма первого
рода
Эксперименты, в которых используется
: метод ДРС, служат примером физических
i экспериментов, в которых функция-след- :
i ствие измеряется с целью определения I
: функции-причины. Для решения такого \
класса задач используется математическая
, модель, основанная на использовании ин-
| тегрального уравнения Фредгольма пер-
| вого рода. Уравнение Г10.6 устанавли-
! вает связь между функцией-следствием
(известной корреляционной функцией
G°\q, f)) и функцией-причиной
(неизвестное распределение экспонент G{Y) в ней).
, Общеизвестно, что решение уравнения
'■ ПО.6 неустойчиво в отношении небольших
| изменений вС1'1 (g, t) и, строго говоря, не
; существует, поскольку измерения функции
Gm{q, t) проводятся в реальных условиях
шума. Эти задачи относятся к классу «не- |
корректно поставленных» задач. Для пере- ]
вода таких задач в корректно поставленные \
■ используются различные подходы,
получившие название регуляризационных.
ной функции первого порядка
справедливо выражение:
G<1)(<?,T) = /lexp(-D,<?2t)[l +
+ ХВ,ехр(-Г/т,)][1+ (Г10.11)
.7
+Сехр(-г/тИф)].
Первый экспоненциальный член
в этом выражении описывает
поступательную диффузию молекул с
коэффициентом диффузии Dt, второй - вращение
вокруг/-й оси молекулы (В есть
соответствующие компоненты анизтропии
поляризуемости). Последний член описывает
спад корреляционной функции,
обусловленный внутренней релаксацией частиц с
характерным корреляционным временем
т . Константы А, В и С суть амплитуды
КР[1
соответствующих флуктуации.

коммешарий Г 10.7. Быстрота
спада корреляционной функции для
больших и малых частиц i
Напомним, что в соответствии с
уравнением Эйнштейна-Стокса (уравнение
Г3.24) D =kT/(6nr\0R0). Отсюда следует,
что для водных растворов коэффициент но- |
ступательной диффузии Dt при комнатной
температуре Dt~2 х 10|3/Я0- Для видимой
области, X - 5000 А, и для угла рассеяния 9
- 90', абсолютная величина вектора рассея- '
■ нияq = (Аттп/\)sin(9/2)(секция Г10.3)рав-
на около 105 см"1. Отсюда следует, что q2Dt
- 10~3//?0, а корреляционное время т
пропорционально ~R0X Ю:1, так что измеренная :
корреляционная функция будет падать
более медленно для больших частиц. Так,
для сфер радиусом 0,01 мкм, тю)) - 10"3 сек.
Предварительная оценка этого времени
полезна для правильного выбора времени j
выборки коррелятора.
Фундаментальной проблемой в
анализе данных ДРС для сложных
систем является разложение уравнения
(Г10.11) на составные части, т. е.
нахождение вкладов индивидуальных
компонентов по измеренным G{i)(t) или G(2,(0-
Эта проблема будет обсуждаться ниже.
П0.4.1. Частицы, размеры которых
малы по сравнению с длиной
волны света
В качестве первого примера
рассмотрим рассеяние света частицами,
малыми по сравнению с длиной волны света.
В этом случае коэффициенты Я и С
равны нулю и в уравнении (ПО.7)
сохраняется только первый член:
G(1)(x) = a1exp(-%2t), (Г10.12)
G <2>(т) = 1 +
(ПОЛЗ)
+ я, ехр (-2Dflh).
Из формул Г10.2 и ПО.З видно, что
по спаду корреляционной функции
G(1)(t) можно вычислить коэффициент
поступательной диффузии, а по спаду
функции G (2)(0 его удвоенное значение
( K'o.MMi'ii Kipuii I'll)./ ).
Когда система состоит из смеси N
частиц с коэффициентами диффузии D.,
G(1) (?) и G(2) (?) становятся суммой
спадов экспонент с параметрами q2D, т. е.
С(1)(т) = Х«(ехр(-Д92т). (Г10.14)
G(2)(t) = constanta +
£ , (Г10.15)
+2,«,ехр(-Д<?-т).
П 0.4.2. Жесткие частицы,
размеры которых сравнимы
с длиной волны света
Если интенсивность рассеянного света
молекулами зависит от их ориентации в
отношении лабораторной системы
координат, то появляется возможность
определения коэффициента вращательной
диффузии 0 молекулы. Для этого
имеются два экспериментальных подхода.
Первый основан на использовании
поляризованного света, тогда как второй — на
использовании деполяризованного света.
Поляризованные компоненты
рассеянного света
Если частица имеет несферическую
форму и размер, сравнимый с длиной волны
света, то интенсивность рассеяния
зависит от ориентации, благодаря эффекту
интерференции между светом,
рассеиваемым различными частями молекулы.
Например, если сравнить интенсивность
света, рассеиваемого в обратном
направлении длинной палочкообразной час-

тицей длиной L, то мы найдем, что при
перпендикулярном положении
молекулы к лучу света, она рассеивает свет в
большей степени, чем при ее
параллельном положении к лучу, поскольку в
первом случае все рассеянные длины волн
находятся в фазе, в то время как во
втором имеется определенное количество
деструктивной интерференции. Теория
показывает, что для простейшего случая,
когда вращательное и поступательное
движение разобщены, корреляционная
функция G(1) (т) будет равна:
G(1)(t)= £ В,ехрх
••— (ПО. 16)
х(-Д<72+/(/ + 1)0)т,
где / имеет значения, равные 0, 2, 4...
а В, зависит от qL, как показано на
рисунке 10.9. Из рисунка видно, что для
малых значений qL, (малые углы
рассеяния) можно определить константы
поступательной диффузии для больших
молекул, причем, только В0 является
значимым коэффициентом. Для
больших значений qL вклад В2 становится
существенным и появляется вторая
экспонента в G(1>(t), из которой можно
вычислить коэффициент вращательной
диффузии 0. Стандартная процедура
анализа данных состоит в
экстраполяции одной экспоненты, полученной
при малых углах, к значениям больших
углов. По мере увеличения угла будет
все более проявляться вклад второй
экспоненты, так что данные по всем углам
могут быть описаны одной экспонентой
с временной константой: Dfl1 + 60.
Деполяризованная компонента
рассеянного света
Этот подход используется, когда
поляризуемость рассеивающей
молекулы зависит от относительной ориента-
1.0
0.8-
^ 0.6 - \\
—' \\
«5 \\
CD \ \
0.4 - \Х
0.2-
2 4 6 8 10
qL
Рис. II 0.9. Относительная амплитуда
компонентов корреляционной функции,
приведенной в уравнении (ПО.12), которая получается
при рассеянии света палочкообразными
молекулами длиной L. Кривая В является суммой
всех Вл и, следовательно, относится ко всей
интенсивности рассеянного света (Ресога, 1968)
ции электрического поля падающего
света и оси молекулы. В этом случае
поляризуемость анизотропна и в
рассеянном свете появляется компонента
(обычно небольшая), поляризованная
в направлении, перпендикулярном к
молекуле. Иными словами свет
становится деполяризованным и его
корреляционная функция первого порядка,
G(1)(x), содержит только одну
экспоненту:
G(U(-c) = exp-(60)T. (Г10.17)
Этот результат примечателен тем,
что позволяет определить 0 из
моноэкспоненциального анализа
деполяризованной компоненты рассеяния света.

Такой анализ проще, чем вычисление 0
из уравнения Г10.16.
К сожалению, деполяризованное
рассеяние обычно является очень сла-
Комментарий ПО.8.
i Деполяризованная компонента для
' вируса табачной мозаики (ВТМ)
I Возьмем в качестве примера вирус та- i
! бачной мозаики. Его деполяризационное *
отношение, определяемое как: pv = HJV%J
■ где Н и Vv обозначают интенсивность рас-
I сеяния горизонтальной и вертикальной ]
составляющей при вертикальной поляри-
I зации падающего света составляет очень
' маленькую величину (-0,0030). Она пока- (
зывает, что степень амплитудной модуля- :
! ции рассеянного света броуновским движе-
I нием составляет приблизительно 1/300 от
общей интенсивности.
60
50 h
0)
*? 30
X
©
20
10
0 5 10 15
Концентрация олигонуклеотидов (мг/мл)
Рис. ПОЛО. Коэффициенты
вращательной диффузии для трех олигонуклеотидов
(приведенные к воде и 20 °С), как функция
концентрации. Обозначения на графике: о =
олигонуклеотиды длиной 20 пар оснований,
• = 12 пар оснований, и □ = 8 пар
оснований (Eimer and Pecora, 1991). Заметим, что
эти значения использованы нами при
построении зависимости коэффициентов
вращательной диффузии ДНК от молекулярной
массы в широком интервале значений
последней (см. таил.П).2).
:—г l 1 1 | I 11 ■ l I l i l l I
А
т
♦
. i i
—■—
—о
1
и
■
п
с
в
о
бым (комментарии I'lO.N). Несмотря
на это, коэффициент вращательной
диффузии вируса табачной мозаики,
полученный с применением этой
техники, 350 сек'"1, находится в хорошем
согласии с другими данными. В случае
лизоцима, его молекулярные размеры,
вычисленные из 0 и Dt, с
использованием формул Перрена Г.2.29 и Г.2.22 для
коэффициентов вращательной и
поступательной диффузии, соответственно,
близки к таковым, полученным из
кристаллографических данных. Анализируя
эти данные, надо помнить, что они были
получены в конце 1960-х гг., с
использованием очень простого волнового
анализатора, дающего частотный спектр
рассеянного света и имеющего намного
меньшую точность, чем современные
цифровые корреляторы.
В начале 1990-х Р. Пекора с
коллегами применил эту технику для
измерений коэффициентов
вращательной диффузии ряда небольших
олигонуклеотидов. Частотный анализ
рассеянного под углом 90' света в VH-
геометрии, где V и Н — вертикальная и
горизонтальная плоскости рассеяния,
соответственно, был проведен при его
пропускании через пьезоэлектрический
интерферометр Фабри-Перо.
Интерферометр был оборудован набором
конфокальных 750 MHz зеркал,
позволяющих анализировать процессы
слабой релаксации с разрешением порядка
наносекунд. Именно в этом временном
интервале находятся коэффициенты
вращательного трения для маленьких
белков (М~ 10 кДа) и коротких нуклео-
тидов. На рисунке ПОЛО показана
концентрационная зависимость
деполяризованной компоненты для трех ДНК
олигонуклеотидов, состоящих из 8, 12,
и 20 пар оснований (см. табл. Г(>.2).
Отметим также, что объединение методов

деполяризованного и поляризованного
ДРС обеспечивает возможность
получения гидродинамических размеров и
асимметрии коротких палочко-образ-
ных частиц (урави. Г2.34).
П 0.4.3. Гибкие частицы, размеры
которых сравнимы с длиной
волны света
Кроме изучения поступательного и
вращательных движений жестких частиц,
обсужденных в предыдущих
параграфах, особый интерес представляет
изучение времен релаксации гибких
молекул, чьи размеры сравнимы с длиной
волны падающего света. Для таких
молекул дополнительный вклад в
значение корреляционной функции вносят
изменения, обусловленные эффектом
интерференции между длинами волн
рассеянного света от различных
сегментов одной и той же молекулы.
В течение последних 30 лет
большой объем исследований был проделан
для получения данных о временах
внутренней релаксации для гибких молекул,
и, в частности, для ДНК методом ДРС.
Сформировались три подхода для
получения такой информации. В первом
их них допускается, что для длинных
молекул (более 200 им)
корреляционная функция описывается двумя
экспоненциальными вкладами:
Gw{x) = Dfl- + 2/Tv (Г10.18)
где т, — время релаксации первой
нормальной моды колебания молекулы
(см. уравнение Г9.5). Как показала
практика, отделение вклада внутренних
движений от вклада поступательного
движения для гибких молекул является
трудной задачей, поскольку
нахождение каждой экспоненты по отдельности
возможно на практике только для очень
Комментарий ПО.9. Разделение
эффектов внутренней релаксации
и поступательного движения j
Прежде всего заметим, что разделение
аффектов внутренней релаксации и
поступательного движения возможно для
монодисперсных образцов с оптимальной моле-
j кулярной массой и только в ограниченной
! области значений q. Дело в том, что линии ■
частот для поступательного и внутреннего
движения становятся шире при высоких
значениях q. С другой стороны, в области
низких значений q амплитуда
внутренних движений довольно мала, что создает i
трудности для вычисления ее значения из j
I корреляционной функции. Например, для
! линейной риС19-ДНК (2760 пар основа-
: ний) при угле рассеяния равном 45' час-
i тоты линий, относящиеся к внутренним i
! движениям, отличаются от линий частот, j
! соответствующих поступательному
движению в 4 раза, тогда как величина амп- !
I литуды внутренних движений составляет
всего 10% от суммарной корреляционной ;
функции. При увеличении угла рассеяния I
до 120° вклад внутренних движений увели- \
■ чивается до 75%, но теперь частоты
отличаются в 1,7 раза. Такое различие в частотах
не позволяет выделить их из суммарной
корреляционной функции никакими
процедурами подгонки. Отсюда следует, что
для р11С19-ДНК (молекулярная масса
1,8 х 10е Да) при ионной силе 0,15 М NaCl '
i (/?, -150 нм) внутреннее движение мож-
i но отличить от поступательного только в
очень небольшой области углов, близких к !
90'. Именно в этой области углов для моле- ;
■ кул таких размеров создаются условия для |
; выделения внутренних движений: разли- ;
чие в частотах составляет около 2,2, а
амплитуда внутренних движений около 60%
(Seils and Dorfmuller, 1991).
ограниченного интервала значений q,
который заранее неизвестен
(комментарии ПО.!)).
Второй подход базируется на
определении значения Dx при низких
значениях q. Тогда экстраполяция к q —> 0

Рис. ПОЛ 1. Зависимость кажущегося
коэффициента диффузии гибкого полимера в ДРС
эксперименте как функция квадрата вектора
рассеяния <72(Langovski et al., 1992)
дает значение наибольшего времени
внутренней релаксации т,.
В третьем подходе кажущееся
значение коэффициента диффузии £>каж
определяется путем аппроксимации
корреляционной функции через
принудительную подгонку данных одной
экспонентой. В этом случае
наблюдается рост величины £>каж с
повышением q (рис. ПО. 11). Область кривой
при низких значениях q соответствует
коэффициенту поступательной
диффузии Dt, область кривой для средних
значений q соответствует вкладу
поступательного и вращательного движения,
в то время как плато, соответствующее
Комментарий ПО. 10. Сдвиг
Доплера
По аналогии со звуковой волной, сдвиг
Доплера на оптической частоте света
равен:
I
Av = -v0,
с
(А)
взятая в качестве эталона, а с — скорость
света для рассеянного света. Если источник
света движется под некоторым углом по
отношению к детектору, то значение сдвига
Доплера уменьшается на фактор sin 0.
области высоких значений q, отражает
движение наименьших по размеру
независимых сегментов полимера. Из
изложенного следует, что для выделения
внутренних мод движения в любом
гибком полимере необходимо выполнение
двух условий. Первое, молекула
должна иметь размеры, равные или большие,
чем длина волны падающего света.
Второе, корреляционная функция должна
быть измерена в максимально большом
интервале углов рассеяния с целью
разделения эффектов движения молекулы
как целого и внутренних мод
движения.
П0.4.4. Электрофоретическое
рассеяние света (ЭРС)
Рассеяние света от движущихся частиц
получило название частотного эффекта
Доплера (комментарии I 10.10):
Av - — q u.
2л
(Г10.19)
Уравнение ПО. 19 показывает, что,
измеряя Av, можно получить значение
скорости частиц и, поскольку значение
вектора рассеяния q определяется
углом рассеяния света.
Электрофоретическое рассеяние света позволяет
измерить скорость электрофоретической
подвижности по сдвигу Доплера
рассеянного света с большой скоростью
(коммснтрмп ПО. 11).
Принципиальным преимуществом этого метода
является его способность
охарактеризовать электрофоретические свойства
многих частиц одновременно. Когда
раствор заряженных частиц находится
в электрическом поле, то частицы
движутся к электродам с
противоположной полярностью, с определенной
скоростью. Эффект электрического поля
как дополнительный член должен быть

включен в уравнение корреляционной
функции, считая, что переориентация
частиц и химические реакции
отсутствуют:
С(т) = Лехр(-Д^)х(П02())
х exp(z'<7u£cos0/2),
где Е — значение приложенного
электрического поля и ц — электрофорети-
ческая подвижность.
Уравнение Г10.20 показывает, что
ширина пика, обусловленного
диффузией, пропорциональна квадрату
амплитуды вектора рассеяния q, в то время
как пик, относящийся к сдвигу
Доплера, линейно пропорционален
абсолютному значению q. Таким образом,
разрешающая способность техники ЭРС
увеличивается при работе под малыми
углами рассеяния, поскольку при таких
углах уменьшается вклад диффузии
в ширину пика.
На рисунке ПО. 12 представлены
теоретический вид корреляционной
функции и результирующий спектр.
Ожидается, что в электрическом поле
корреляционная функция будет про-
модулирована косинусоидальной
функцией, чья частота относится к элект-
Комментарий Г10.11. Скорость
: определения электрофоретической
I подвижности по сдвигу Доплера
1 В типичном ЭРС-эксперименте значе-
: ния сдвига Доплера накладывают ограни-
. чения на продолжительность одного изме-
| рения. Например, если частица находится
I под воздействием достаточно сильного элек-
j трического поля, то определяемый рассеян-
! ный свет от частицы имеет величину сдвига
Доплера около 100 Hz по отношению к
частоте действующего света. Если задаваемая
, точность равна 0,5 % (т. е. 0,5 Hz), то частица
I должна находиться в электрическом поле,
! по крайней мере, 0,5 Hz-1 = 2,0 сек, и, следо-
! вательно, интенсивность рассеянного света
от этой частицы должна быть
зарегистрирована за этот же период времени.
рофоретической подвижности частиц,
а скорость затухания определяется
коэффициентом диффузии. В нулевом
электрическом поле спектральная
функция является Лоренцианом; в
присутствии электрического поля спектральная
функция также является Лоренцианом,
но сильно сдвинутой и асимметричной;
ее ширина подобна ширине
гетеродинного пика, центрированного на нулевой
частоте.
Приложенное
поле
CE(t) = A exp(-DTq )exp(- iquEcos9/2) Q
S(v)=A
DTq
(v - v0 + quEcos6/2)2+ (DTq2)2
Полуширина rjL(2
на половине = яг
максимума
Смещение _ К-У
частоты ~ 2л
Рис. ПО.12. Схематическая диаграмма спектральных форм и корреляционных функций,
наблюдаемых в электрофоретическом рассеянии света

Комментарий ПО. 12. Лазерный
велосиметр Доплера !
В лазерном велосимстре Доплера
падающий спет освещает поток движущихся час- '
тип. На практике, один луч лазера, расщеп- !
ленный на два равных по интенсивности,
фокусируется в одной точке в потоке поля.
Интерференционная картинка формируется I
: в точке пересечения лучей и создает измеря- j
емый объем. Частицы, проходя через такой !
объем, создают вспышки света. Результиру-
j ющая частота, определяемая фотодетекто- |
ром, напрямую связана со скоростью частиц. ;
Экспериментальная геометрия
Экспериментальную ячейку для электро-
форетического рассеяния можно
рассматривать как видоизменение таковой для
лазерного велосиметра Доплера и ДРС
(комментарии ПО. 12). Однако
применение внешнего электрического поля и
относительно медленно перемещающиеся
в ЭРС частицы требуют использования
специальной светорассеивающсй камеры
для образца, отличной от применяемых
в ДРС- экспериментах (рис. ПОЛЗ).
Свет основного луча лазера,
рассеиваемый частицами под некоторым
углом 9, попадает на фотодетектор
одновременно с нерассеянным светом от
опорного луча этого же лазера.
Рассеянный свет имеет смещение по частоте
по отношению к опорному лучу из-за
эффекта Доплера, равное:
Av = — q-u = —sin(9/2). (П0.21)
2л А.,,
Следует заметить, что, когда вектор
и перпендикулярен вектору рассеяния
q, смещение частоты (сдвиг Доплера)
не наблюдается. Область значений
частот Av, с которой мы сталкиваемся
в экспериментах по электрофорстиче-
скому рассеянию равна
приблизительно 100 Hz.
Метод ЭРС может быть применен
в исследованиях электрокинетических
свойств любых заряженных частиц в
растворе, но на практике сто
применение ограничено размерами частиц.
Так, например, этот метод очень
сложно применить к малым глобулярным
белкам, таким как лизоцим, в основном
из-за существенного вклада диффузии
в ширину пиков ЭРС (рис ПО. 11 а).
Разрешающая способность метода
существенно повышается с увеличением
молекулярной массы. Спектр электро-
форетической подвижности
препаратов БСА показан на рисунке ПО. 14 6.
По крайней мере, пять различных
вкладов в электрофоретическую
подвижность различимы на этом графике.
Основной пучок
Пучок сравнения
Детектор
Рис. I 10.13. Геометрия лучей в ЭРС-эксперимеите. Е и и являются векторами, обозначающими
электрическое ноле и скорость частиц, соответственно; 9 — угол рассеяния (Langley, 1992)

0.5 1.0
Подвижность (отн.ед.)
1.5
2.0
а
-1.0 0 1.0
Подвижность (отн.ед.)
б
Рис. ПО.14. Спектральные частоты в ЭРС: а — молекулы лизопима: расширение диффузии
«размазывает» пик, кроме двух наименьших углов рассеяния; б— мультимеры БСА: три
частотных спектра были получены одновременно при трех различных рассеивающих углах в одном
эксперименте. Результаты представлены в виде графика на одной и той же оси подвижности
(Langley, 1992)
Г10.5. Динамическое
рассеяние света в условиях
негауссовой статистики
П0.5.1. Рассеяние малым числом
частиц
Давайте представим, что мы проводим
эксперимент по контролю за числом
частиц в большом объеме. При большом
числе частиц в объеме контролировать
их число наиболее просто по флуктуа-
циям, определяемым методом ДРС.
Поскольку общая интенсивность
рассеянного света, регистрируемая
детектором, является суммой интенсивности
рассеяния от каждой частицы.
Изменения интенсивности, обусловленные
числом флуктуации, обычно малы именно
в силу большого числа частиц в объеме
(к'оммспt;i|iiii"i ПО. \'Л).
Теперь представим, что мы
проводим тот же эксперимент, наблюдая за
концентрацией частиц, растворенных
в малом объеме, находящемся внутри
большого объема образца в растворе,
и что этот объем имеет проницаемые
стенки. Эксперименты такого типа
Комментарий ПО. 13. Флуктуации
В системах, состоящих из сравнительно
небольшого числа частиц, возможны
значительные отклонения некоторых
физических величин, характеризующих системы,
от их средних значений. Такие отклонения
называются флуктуациями.
Термодинамическая теория флуктуации дает величину
таких отклонений в терминах различия
между среднеквадратичным отклонением
<А№> и его средним значением <N>.
Угловые скобки означают, что указанные
величины усреднены по времени. Мерой
флуктуации числа частиц N является средняя
величина квадрата разности AN, которая
называется квадратичной флуктуацией:
<(ДЛР)> = <(N - <N>)2 >. (А)
Абсолютной флуктуацией называется
. величина т[<А№>, также характеризующая
! отклонения N от <N>.
Относительной флуктуацией 5М
называется отношение абсолютной флуктуации
к среднему значению <N>
i<A№>/<N> = 1/VN. (Б)
Из последней формулы видно, что
относительная величина флуктуации обратно
пропорциональна корню квадратному из
числа частиц. При N = N,s — постоянная
Авогадро
10 ,2.
— 5„ имеет величину
порядка

были выполнены в начале XIX в. с
использованием микроскопа. Целью
таких исследований было определение
среднего значения числа частиц <N>
(в этом случае коллоидальных) в
единице объема. Если бы мы могли
получить определенное число «мгновенных
кадров» объема как функции времени,
то обнаружили бы, что число
подсчитанных частиц изменяется во времени
из-за диффузии, имеющей место как
внутри, так и снаружи определяемого
объема.
Для нашего случая важными
являются два вклада во временную
зависимость интенсивности рассеяния.
Один из них связан с входом и
выходом частиц из рассеивающего объема,
что вызывает временные флуктуации.
Другой связан с диффузией частиц
внутри рассеивающего объема на
расстояниях порядка длины волны света,
которая также вызывает временные
флуктуации. Если предположить, что
эти два времени не коррелированы
друг с другом, тогда для гомодинно-
го детектирования нормализованную
корреляционную функцию можно
представить как:
G(,,(T) = /l[JV0exp(-7O +
+BNlexp(-2D!q2t)}.
(Г10.22)
Первый член в правой части этого
уравнения связан флуктуацией
общего числа частиц внутри
рассеивающего объема, а второй обусловлен
вкладом диффузии. В уравнении Г10.22
N0 — это среднее число частиц в
рассеивающем объеме; у — характерное
время, необходимое для
диффундирования частицы через рассеивающий
объем и которое имеет величину
порядка L2/24N0Dx (где L — характерный
размер рассеивающего объема), А и
В — константы.
2 3
Время (мсек)
Рис. ПО. 1л. Корреляционная функция времени интенсивности рассеянного света раствором
вируса птичьего миелобластоза (М = 4 х 108 Да, s = 680S, D = 0,31 х 107см2сек ') в оченышзкой
концентрации (2х107 частиц на см3). Рассеивающий объем равен около 10"3 см3. Присутствие
пологой базовой линии, смещенной по отношению к нулевой линии коррелятора, является мерой
числа флуктуации, ожидаемых при низких концентрациях (Salmeen et al., 1975)

Очевидно, что при высоких
концентрациях второй член в уравнении Г10.22
доминирует и по экспериментально
наблюдаемой константе спада
вычисляется константа диффузии. При очень
низких концентрациях, когда JV0 сравнимо
с BNU2, оба компонента вносят вклад в
наблюдаемую корреляционную
функцию. На рисунке ПО. 15 представлена
корреляционная функция для образца
вируса птичьего миелобластоза, в
которую флуктуации от числа частиц вносит
уже существенный вклад, поскольку в
рассеивающем объеме содержится
всего около 2000 частиц. Однако рассеяние
при такой концентрации и такой
молекулярной массе вируса (М = 4><108Да)
является настолько слабым, что точное
значение коэффициента диффузии
вируса определить не представляется
возможным.
П0.5.2. Кросс-корреляция (метод
двух детекторов).
Как следует из изложенного в
предыдущем параграфе, наблюдение за
флуктуациями числа частиц методом
ДРС, возможно только в том случае,
если когерентная часть рассеяния
существенно уменьшена или устранена
совсем. Такое устранение может быть
достигнуто разными способами. Во-
первых, можно перейти от рассеяния
к флуоресценции, которая по своей
природе является некогерентным
явлением. Такой переход мы будем
обсуждать в Главе Г.11. Другой способ
устранения пространственной
когерентности основан на использовании
двух детекторов и построения кросс-
корреляционной функции (см.
параграф ПО.3.1).
На рисунке II 0.16 с/ показана
кросс-корреляционная функция,
обусловленная вращательным движением
вируса табачной мозаики вокруг его
короткой оси симметрии при
различных углах рассеяния. Видно, что кросс-
коррреляционная функция не зависит
от угла рассеяния. В отличие от
корреляции, обусловленной релаксацией
вращательной диффузии жестких
молекул, измеренная
кросс-корреляционная функция для плазмидной ДНК
E.coli, обусловленная внутренними
степенями свободы, зависит от вектора
рассеяния (рис. ПО. 16 6).
П0.5.3. Рассеяние одной частицей
Основное явление, которое
наблюдается при динамическом рассеянии
света на растворах частиц, связано с
диффузионным уширением. Это дает
возможность определять
коэффициенты поступательной диффузии
частиц с высокой точностью, но не
позволяет судить о динамических процессах
в исследуемой частице. Как следует
из формулы ПО.18, вклад
трансляционной диффузии уменьшается с
уменьшением числа частиц в
рассеивающей системе. Этот вклад
устраняется полностью, если мы переходим
к рассеянию одной частицей. В этом
случае спектр рассеянного света
содержит информацию только о
внутренних процессах, проявляющихся в
изменении форм-фактора или
внутренней динамики частицы. Обычно,
форм-фактор частицы с размерами,
равными или меньшими длины
волны света, слабо флуктуирует
относительно своего среднего значения,
поэтому отношение сигнал-фон в таких
экспериментах невелико. Однако для
частицы микронных размеров такие
исследования становятся
возможными с помощью метода, получившего

15
к
s
=r
ьс
I
>*
■е-
K
CO
x 10
о
s
=r
к
§
a.
a.
о
:£
К
a
X
x лж-
я 0.5
ш
о
ЛИЗ
1
о-
£
0
^а
\
\ ■
\
V »■
\» ^ч
Г т \
Лф •• Nt
\ V, ""ди
Ч A- .^Vp" 60»
\ ^* ^*^и ■
\ X. ■ ■ ■ *-
\ * • г*^..' . #90°
*^V .«г*-—-г-,
!>***
^^*л 4 120°
1 1 1 1 ■ ■ 1 1 1 1 1 1 Ч 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t 1 1
02 04 0.6
т(мсек)
1.5
3"
X
>s
-0-
о: 10
га
X
I
о
§
ГС
с;
<и
о.
о.
о
Ьй
£ 0.5
I
X
S
ализо
О.
О
X
0
ТТТТТТТ 1 1 | II 1 Т'1 I ? 1 ? | 1 ГТТТТ 14 |
■
с ■
« \
\ " ■ ""^t
\ • ■^■"ta. >
\ "**i
l 1 ■аг«4
\ \ ■
\ \"
\ *\_
\ л*
л\ eV
\ ^^в
\ *^ч.
■л . * ^^*%j*
\ ^^*£«*
^с* .
1 ' ' ' ' ■ ■ ' ' [ ' ' ■ 1 ' \ 1 1 1
Т 1 1 I ■ 1 1 1 1
-
.. 60° -
■ • •
^^J* ■
^^**^*
-
90°
20°
1 "' »*■
1
0.4
08
г (мсек)
1.2
а б
Рис. I 10.1 (г. а — кросс-корреляционные функции, измеренные для вируса табачной мозаики.
Подобранное корреляционное время равно 240 мксек и не зависит от угла рассеяния.
Корреляционные функции, измеренные при 90' и 60', сдвинуты для наглядности вдоль
ординаты на 0,25 и 0,5 единиц, соответственно; б - кросс-корреляционная функция рассеяния для
плазмидных ДНК Е. coli. Подобранные времена корреляции равны 400, 120, и 80 мксек при
углах рассеяния 60°, 90° и 120°, соответственно. Корреляционная функция для углов 90° и
60° сдвинута для наглядности вдоль ординаты на 0,25 и 0,5 единиц, соответственно (Кат and
Rigler, 1982).
название метода локализованного
динамического рассеяния света. Его
основной идеей является выполнение
ДРС-эксперимента на одной частице в
сильно неоднородном световом поле,
рассеивающий свет от которой
собирается с помощью микроскопа.
Неоднородность светового поля приводит
к появлению специфической
зависимости интенсивности рассеяния от
угла рассеяния, которая
регистрируется датчиком (тонкое
стекловолокно), через который свет попадает на
фотодетектор для последующего
вычисления корреляционной функции
интенсивности. Такие эксперименты
позволяют вычислить спектр
динамики объекта, флуктуирующего в
широком интервале времен вплоть до
наносекунд. Реальные возможности этого
подхода выявляются при измерении
силовых констант одной бусинки или
пары бусинок, захваченных
лазерными пинцетами (твизерами) (параграф
Д5.2.1).

Г10.6. Перечень ключевых идей
• Все термодинамические величины в растворе флуктуируют относительно
средних значений; поскольку такие флуктуации очень медленны по сравнению
с частотой падающего света, то для их определения требуется спектроскопия
очень высокого разрешения.
• Динамическое рассеяние света относится к когерентным явлениям, в которых
измеряются временные флуктуации интенсивности рассеянного света; этим
оно принципиально отличается от классического статического рассеяния, где
измеряется интенсивность, усредненная по времени.
• Определение коэффициентов трансляционной диффузии биологических
макромолекул требует применения спектроскопии очень высокого разрешения,
которое не может быть обеспечено обычными методами спектроскопии; однако
последние адекватны для определения вращательных диффузионных
коэффициентов небольших глобулярных белков и коротких спиралей ДНК.
• Временная автокорреляционная функция показывает: насколько два значения
флуктуирующего процесса коррелируют во времени; кросс-корреляционная
функция показывает: насколько два флуктуирующих процесса коррелируют
во времени.
• В лабораторных условиях трансформация флуктуирующего сигнала в
корреляционную функцию происходит с помощью приборов, называемых корреляторами.
• Для молекул, малых по сравнению с длиной волны света, подавляющий вклад
в корреляционную функцию вносит трансляционная диффузия; что
обеспечивает быстрый (2-3 мин) и точный (1-2 %) способ определения коэффициентов
поступательной диффузии биологических макромолекул.
• Для молекул, размеры которых сравнимы с длиной волны света, вращательная
диффузия и внутренние движения (для гибких частиц) вносят
дополнительный вклад в корреляционную функцию.
• Фундаментальная проблема анализа данных динамического рассеяния света
состоит в разложении сложной корреляционной функции на индивидуальные
составляющие (экспоненты).
• В стандартном ДРС-экспсрименте молекулы исследуются в макрообъеме,
который содержит большое число молекул и поэтому такие эксперименты носят
название экспериментов в условиях гауссовой статистики (большое число событий).
• Если рассеивающим объем содержит относительно небольшое число молекул
(около 1000), то ДРС-эксперименты носят название экспериментов в условиях

негауссовой статистики (небольшое число событий); в этих условиях наравне
с вкладом диффузии проявляется вклад флуктуации числа частиц в
корреляционную функцию.
• Если рассеивающий объем содержит всего несколько частиц, то основной вклад
в корреляционную функцию вносит флуктуация числа частиц.
Литература для дальнейшего чтения
Исторический обзор и введение в биологические проблемы
Berne B.J. and Pecora R. Dynamic Light Scattering. New York: Wiley. DLS as a
spectroscopy of very high resolution, 1976.
Benedek G. B. Optical mixing spectroscopy in physics, chemistry, biology and
engineering. In Polarization: Matiere and Rayonneraent. Pp. 4-84. Paris: Les Presses
Universitaries de France, 1969.
Dubin S. В., LunacekJ. H. and Benedek G. B. Observation of the spectrum of light
scattered by solutions of biological macromolecules. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1967.
57,1164-1171.
DohertyJ. V. and Clarke H.R. Noisy solutions: a source of valuable kinetic information,
Sci. Prog. Oxf., 1980. 66, 385-419.
Динамическое рассеяние в условиях гауссовой статистики
Спи В. Laser Light scattering. Basic Principles and Practice. San Diego: Academic
Press, 1991.
Wada A., Suda N., Tsuda T. and Soda K. Rotary-diffusing broadening of Rayleigh
lines scattered from optically anisotropic macromolecules in solution. J. Chem. Phys.,
1968.50,31-35.
Dubin S. В., Clark N. A. and Benedek G. B. Measurment of the rotational diffusion
coefficient of lysozyme by depolarized light scattering: configuration of lysozyme in
solution. J. Chem. Phys., 1971. 54, 5158-5164.
Sells J. and Dorfmuller Т. Н. Internal dynamics of linear and superhelical DNA as
studied by photon correlation spectroscopy. Biopolymers, 1991. 31, 813-825.
Langowski J., Kremer W. and Kapp U. Dynamic light scattering for study of
solution conformation and dynamics of superhelical DNA. Meth. Enzymol., 1992.
211,431-448.
Eimer W. and Pecora R. Rotational and translational diffusion of short rodlike
molecule in solution: Oligonucleotides. J. Chem Phys., 1991. 94, 2324-2329.
Ware B. R. and Haas D. D. Electrophoretic light scattering in fast methods in
physical biochemistry and cell Biology, eds. R. I. Sha'afi and S. M. Fernandez, Elsevier
Sci. Publishers, 1983.
Langley К. Н. Developments in electrophoretic laser light scattering and some
biochemical application. In Laser Scattering in Biochemistry, eds. S. E. Harding,
D. B. Sattelle and V. A. Bloomfield. Cambridge: Royal Society of Chemistry.
1992.

Динамическое рассеяние в условиях негауссовой статистики
Bar-Zw R., Meller A. et al. Localized dynamic light scattering: probing single particle
dynamics at the nanoscale. Phys. Rev. Lett., 1997. 78, 154-157.
Meller A., Bar-Z'w R. et al. Localized dynamic light scattering: a new approach to
dynamic measurements in optical microscopy, Biophys. J., 1998. 74, 1541-1548.
Weissman M., Schindler II. and Feher G. Determination of molecular weights by
fluctuation spectroscopy: application to DNA. PNAS, 1976. 73, 2776-2780.
Kam Z. and RiglerR. Cross-correlation laser scattering, Biophys J., 1982.39,7-13.

Глава П1
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ
П 1.1. Исторический обзор
1916
М. вон Смолуховски (М. von
Smoluchowski) создал
термодинамическую теорию флуктуационных
процессов в равновесных диффузионных
системах.
1972-1974
Д. Магде, Л. Элсон и В. В. Вебб
(D. Magde, L. Elson and W. W. Webb)
дали строгое описание метода
флуоресцентной корреляционной
спектроскопии (ФКС), различных вариантов его
практического применения и
предсказали большие возможности метода для
исследования релаксационных процессов.
1990
Р. Риглер (R. Rigler) и соавторы
осуществили серьезный прорыв в
развитии метода флуоресцентной
корреляционной спектроскопии. Скомбинировав
оборудование для ФКС с
конфокальным микроскопом, они существенно
улучшили соотношение «сигнал-шум»
и впервые достигли уровня
детектирования одиночных молекул. Четкой
фокусировкой луча лазера и установкой
точечной диафрагмы в плоскости
изображения они добились существенного
улучшения латерального и аксиального
разрешения.
199 \
М. Эйген и Р. Риглер (М. Eigen and
R. Rigler) продолжили дальнейшее
развитие идей ФКС, предложив метод
двухцветной флуоресцентной
кросс-корреляции. Метод позволил удобно и просто
разделить вклады продуктов, имеющих
«одноцветную метку» от продукта
реакции, имеющего «двухцветную метку», что
привело к существенному повышению
специфичности узнавания продуктов
реакции. В 1997 г. П. Швайль (P. Schwille)
успешно применила этот метод для
наблюдения за реакцией гибридизации
двух меченых различным флуорофорами
олигонуклеотидов, а в 2000 г. К. Г. Хайнц
(К. G. Heinze) — за энзиматическим
расщеплением ДНК эндонуклеазой.
2000 и но настоящее время
Метод ФКС стал базой для
создания ряда родственных методов, в
основе которых лежит принцип
флуоресцентного анализа флуктуации. Метод
двухцветной флуоресцентной кросс-
корреляции обеспечивает простой и
удобный способ слежения за работой
молекулярных ферментов в режиме
реального времени.

И 1.2. Введение
в биологические проблемы
Хотя первое описание флуктуационных
процессов в терминах амплитуд и вре-
Комментарий П 1.1. Определение !
молекулярных масс ДНК методом
ФКС |
В середине 1970-х гг. техника ФКС '
! успешно применялась для определения
молекулярных масс молекул ДНК. Эти
эксперименты выполнялись в
растворах, содержащих около 1000 молекул,
что обеспечивало удовлетворительное
соотношение «сигнал-шум». Переписав
, уравнение (В) в комментарии ПО.12, мы \
I получим:
; <(fb(£b-*- (A\
где С — концентрация молекул. Меньшему i
числу молекул соответствует большая
амплитуда флуктуации. Следовательно, для
i данной концентрации <С> масштаб флук- ;
I туаций повышается с ростом молекулярной j
i массы. Измеряя эти флуктуации через па- I
раметры, чувствительные к концентрации,
! можно из уравнения (А) определить число
I молекул N в данном флуктуационном объ- |
еме V. Зная среднюю концентрацию <С>,
можно определить молекулярную массу по
уравнению:
M = <C>\J£-)VNA. (Б)
С использованием этой формулы были
определены значения молекулярных масс
' для ДНК из различных источников: для
! Т2 фага — 1,14 х 10а Да; реплицирован-
| пая ДНК из Е. coli - 3,9 х 109 Да.
Молекулярные массы ядерных и нндивиду-
, альных хромосомных ДНК из Drosophila
■ melangaster были равны 3 х 10''Да и 4 х
I 1010 Да, соответственно (Weissman et al.,
1976). Найденные молекулярные массы
находятся в разумном согласии с точными
значениями молекулярных масс,
определенными гораздо позже из их нуклеотид-
ной последовательности < ■ ч> ■■'' : I •■. >.
мен затухания было сделано М. Смо-
луховским почти столетие назад, после
этого в течение долгого времени не было
техники с адекватной
чувствительностью для определения флуктуации от
небольшого числа частиц, где эффекты
выражены особенно отчетливо.
Стратегия метода флуоресцентной
корреляционной спектроскопии была предложена
в 1970-х гг. для измерения кинетики
химических процессов и молекулярной
диффузии с использованием анализа
флуктуации концентрации в малых
ансамблях (-1000 частиц), находящихся в
равновесном состоянии. Сильные
стороны этой техники были
продемонстрированы при измерении диффузии
и кинетики связывания
флуоресцирующего соединения, этидиум-бромида,
с молекулой ДНК и с определением
молекулярного веса ДНК гигантских
фагов (комментарий П 1.1). Эти
исследования позволили в дальнейшем дать
математическое описание метода ФСК,
что обеспечило основу для анализа
скоростей процессов диффузии и
процессов химической кинетики.
С недавних пор метод ФКС
претерпел существенные обновления.
Благодаря последним инновациям
(прецизионная фокусировка света в
пространстве, имеющем геометрию
песочных часов, точечная диафрагма
в плоскости изображения) появилась
возможность измерять флуоресценцию
в небольших, менее чем фемтолитр,
микрообъемах (см. Главу Д4). Если
учесть, что при концентрации, равной
1 нМ, в таком объеме будет в среднем
находиться менее одной молекулы, то
появляется уникальная возможность
работы на уровне нескольких молекул.
Это делает метод ФКС крайне
привлекательным для исследования
биологических систем.

И 1.3. Теория и практика
метода
Флуоресцентная корреляционная
спектроскопия может рассматриваться
как ветвь динамического рассеяния в
негауссовых условиях эксперимента,
поскольку флуоресценция является
фундаментально некогерентным
явлением. ФКС является методом, в
котором интенсивность флуоресценции,
исходящая от небольшого числа
флуоресцентных молекул в очень малом
объеме, коррелируется для получения
информации о процессах, которые
вызывают флуктуации флуоресценции.
Одним из важных процессов, который
приводит к стохастическому
появлению и исчезновению флуоресценции в
малом наблюдаемом объеме, является
их броуновское движение.
Относительная амплитуда флуктуации обратно
пропорциональна числу одновременно
наблюдаемых молекул (уравнение (А)
комментарии I N.I). Поэтому
присутствие большого числа молекул в
макроскопической среде, подавляет эффект
таких флуктуации. Этот простой
аргумент показывает, что для ФКС-измере-
ний желательно наличие в микрообъеме
очень небольшого числа интенсивно
светящихся молекул.
Основные принципы метода ФКС
продемонстрированы на
рисунке П 1.1. Флуктуации сигнала
флуоресценции вызываются или
диффузией флуоресцирующих молекул через
объем, или изменением сигнала во
времени из-за химических реакций.
По записанному сигналу
флуктуации флуоресценции (горизонтальные
стрелки) вычисляется
автокорреляционная функция (вертикальные
стрелки). Из функции
автокорреляции могут быть получены среднее
Комментарии П 1.2.
. Автокорреляционные функции
в ФКС
I
Часто в методе ФКС используется
несколько другое определение корреляци- ;
i oiiimii функции, чем н главе ПО. Если мы !
! определим 5.4(/)как |
5Л(0-К0-<Л)>. (Л), :
которое есть отклонение мгновенного зна-
i чения от среднего, то легко показать, что |
<5.-1(0)5Д(т)>= i
(Б) !
= <Л(0)Л(т)>-<Л>"
, и, следовательно:
< 5.4- > = < 6.-1(0)5.-1(0) > = I
(t>) |
= |<Л->-<Л>-|. I
Комбинируя уравнение Г10.3 с урапне-
; ниямн (Б) и (В), получаем:
1 <5Л(0)5Л(т)>= |
s Г' -' (О '
= <5Л >схр . ;
Тм„,
! Величину 5Л(?) принято называть
«флуктуацией», поскольку она онреде- i
ляет отклонение свойства от среднего. ,
Отметим, что корреляционная функция |
j флуктуации имеет более простой вид, чем
' автокорреляционная функция,определя-
' емая уравнением ПОЛ. так как инвариант
<А>- при этом удаляется. I
время жизни (т.) и число молекул
(М) в объеме (см. ниже и
комментарий П \.'2). По этим данным и
размеру флуоресцирующего объема можно
определить коэффициент диффузии
D флуоресцирующей молекулы.
Значение D может быть использовано для
оценки формирования молекулярных
комплексов, поскольку коэффициент
диффузии частицы в изолированном
состоянии (закрашено зеленым) будет
больше, чем коэффициент диффузии
молекулярного комплекса
(закрашено красным и зеленым цветом) (см.
рис. Г11.1).

103 102 101 10° 101 102 103 10"
t сек
I*iit". П l.l. Основные принципы ФКС (см. текст) (Bastiaens and Pepperkok, 2000)
П 1.3.1. Трехмерная и двумерная
диффузия
Если лазерный пучок с гауссовым
профилем используется для возбуждения,
а флуоресценция собирается через
конфокальную точечную диафрагму (см.
параграф Д1.1.2), то генерируемый
объем обладает профилем, который может
быть описан в хорошем приближении
трехмерной гауссовой функцией. Если
/■ и / характеризуют радиальные и
аксиальные размеры объема (т. е. когда
гауссова функция падает до 1/е2 от своего
максимального значения), то отношение
между автокорреляционной функцией А
(т) и временем диффузии тс) равно:
Л(Т) =
N
V
1 + -
l'i' 7
ЧтУ
2 Т
(Г11.1)
qi )
Время диффузии т.) характеризует
среднее значение времени, которое
необходимо для диффундирования
молекулы через радиальную часть
наблюдаемого в микроскоп объема.
Это время зависит от размеров
наблюдаемого объема, от длины волны
лазера и свойств инструментальной
оптики. Взаимосвязь между временем
диффузии и коэффициентом диффузии
выражается как
т..„=—. (Г11.2)
г
4D'
Полное описание трехмерной
диффузии может быть получено при
использовании оптики с двухфотонным
возбуждением (параграф ДЗ.3.2). В этом
случае время диффузии уменьшается
в два раза: r2/8D.
При высоком значении г/1 или
двумерной диффузии уравнение Г11.1
упрощается до:
Л(т) =
N
1 + -
(Г11.3)
П1.3.2. Различные виды движений
Биологические макромолекулы в клетке
находятся в условиях, далеких от
таковых в разбавленных растворах. Поэто-

I — трехмерная диффузия
2- двухмерная диффузия
3- активный перенос
4- аномальная диффузия
Время (мсек)
Рис. I 1 1.2. Модельная автокорреляционная кривая для частиц с различной подвижностью:
(1) трех- и (2) двухмерная диффузия; (3) активный транспорт и (4) аномальная диффузия (см.
текст) (Hausten and Schwille, 2003)
му коэффициенты диффузии,
описывающие их поведение в клетке, сильно
отличны от таковых, рассмотренных
нами в секции Г2.3. Кривые модельных
корреляционных функций,
показывающие различные способы движения
биологических макромолекул, приведены
на рисунке П 1.2. Из рисунка видно, что
корреляционная функция для
активного транспорта имеет самый крутой спад,
в то время как кривая для аномальной
диффузии уменьшается довольно
медленно (сравните с рис. ГЗ. 10). Частицы,
диффундирующие внутри
биологической мембраны, могут демонстрировать
большое разнообразие видов движения,
в зависимости от локального окружения
для каждого индивидуального
хромофора (см. параграф ГЗ.5.2 и рис. П 1.3).
П1.3.3. Динамический интервал
времен
Динамический интервал времен в
методе ФКС простирается от 1
микросекунды до 100 милисекунд. Для более
удобного построения кривых в таком
широком интервале времен обычно
используется логарифмическая шкала времени
(pi ic. Г11.1). В зависимости от состава
окружающей среды величина
диффузионной подвижности молекул может
изменяться на несколько порядков, начиная
от 3 х Ю~й см2 • сек ' для свободного
красителя в водном буферном растворе до
10"10 см2 • сек"1 для больших рецепторов в
клеточной мембране. Отметим, что
коэффициент поступательной диффузии,
определенный методом ФСК, для молекулы
красителя (Alexa 488, М -0,6 кДа) в воде
равен D = 30 х 10"7 см2 • сек1, что очень
близко к коэффициентам диффузии
Сахаров соответствующего молекулярного
веса (см. рис. П 1.1). Это позволяет
отнести этот краситель к категории «средних»
по размерам молекул (параграф ГЗ.7.5).
Напоминаем, что для таких частиц
вычисление гидродинамического радиуса
из коэффициента диффузии может
привести к неверным результатам.

Цитоплазма
Рис. Г1 1.!'). Описание различных видов
динамического движения in vitiv и in гпгю при помощи
корреляционных функций. Фокальный объем,
который приблизительно равен 0,2 фемтолитра,
может быть наблюдаем как вне клетки (в чистом
буфере), так и внутри нее (в цитоплазме или
в плазме клеточной мембраны)
Поскольку временная
разрешающая способность метода ФКС равна
около 100 нсек, то метод ФКС in vivo
лучше всего применим для
исследования медленно протекающих процессов.
При анализе медленно движущихся
молекул, например тех, которые
взаимодействуют с цитоскелетом, для
ядерных ДНК и для мембран, необходимым
условием проведения эксперимента
является отсутствие фотовыцветания
красителя во время их движения через
фокальным объем (параграф ГЗ.5.2).
П1.3.4. Исследование
многокомпонентных систем
В многокомпонентных системах оценка
корреляционных кривых происходит
Т(мсвн>)
Рис. П 1.1. Диффузия различных
биологических макромолекул в разном окружении:
а — маленькая молекула красителя (Alexa 488,
М -0,6 кДа) в воде, D = 3 х 10"6см2 • сек '; б-
зеленый флуоресцирующий белок (eGFP) в
водном растворе (М -27 кДа)Л = 9х 10~7см2-сек');
в — этот же белок в цитоплазме клеток M-HeLa
D = ЗхЮ"7 см- • сек"'; г — большой белковый
комплекс (кальмодулин-зависимая киназа
II и eGFP белок) в цитоплазме клеток линии
НЕК, D = 3x 10"8 см- ■ сек '; д — двумерная
диффузия флуоресцирующего зонда
(длинная цепь карбоцианинового красителя «dif
С18'») в плазме мембраны клеток линии НЕК-,
D = 6 х 10 9 см2 • сек"' (Bacia and Schwille, 2003)
при допущении, что диффузионная
система описывается моделью из двух или
трех компонент, с рутинным подбором
решения методом наименьших
квадратов. Однако для получения
коэффициентов диффузии или соответствующих
других параметров в большинстве
случаев требуются обширные
калибровочные измерения для всех образцов.

Г11.4. Двухцветная
флуоресцентная
кросс-корреляционная
спектроскопия
Двухцветная кросс-корреляционная
схема дает возможность исключить
предварительный этап калибровки, поскольку
в ней используются две флуоресцентные
метки, различимые спектрофотометри-
чески. Это позволяет одновременно
измерять количество изолированных
участников реакции и продукты, полученные
в результате реакции.
В этом методе используются два
отдельных лазера для возбуждения
двух молекул, каждая из которых
имеет метку своего цвета, зеленую и
красную (флуорофоры, испускающие свет в
двух областях спектра) и два
независимых детектора для измерения зеленой
и красной флуоресценции (рис. Г11.5).
Автокорреляция Кросс-корреляция
красных частиц
Затем корреляция сигналов
измеряется между двумя каналами (отсюда
название — кросс-корреляция).
Молекулы, несущие зеленую метку, будут
регистрироваться только детектором,
измеряющим зеленую
флуоресценцию, молекулы, несущие красную
метку, — только детектором, измеряющим
красную флуоресценцию, а продукт
реакции будет регистрироваться
обоими детекторами (см. рис. Г11.5). Таким
образом, величина
кросс-корреляционного сигнала будет мерой количества
продуктов реакции, т. е. мерой комплек-
собразования. В противоположность
методу одноцветной ФКС,
интерпретация данных которого неизбежно
связана с математической обработкой
корреляционной функции, метод
двухцветной ФКС, в принципе, дает ответ
типа «да» или «нет» на вопрос о ком-
плексообразовании между молекулами.
Автокорреляция
зеленых частиц
Детектор зеленого
Излучение лазера
Зеленые частицы
Фокальное пятно
Красные частицы
Рис. Г11.5. Схематическое изображение принципа измерения: «зеленый» и «красный» лазеры
освещают образец, который содержит два сорта диффундирующих частиц, «красные» (К) и
«зеленые» (3), а также комплекс между ними (КЗ). «Красный» фотодетектор регистрирует (К) и (КЗ)
частицы; «зеленый» фотодетектор — (3) и (ЗК) частицы (Haustcin and Schwille, 2003)

т 1 1 1 1 г
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
Время (мсек)
Рис. П 1.(5. Временная зависимость
амплитуды кросс-корреляционной функции,
описывающая энзиматическое расщепление молекулы
ДНК, один конец которой мечен флуорофо-
ром, излучающим в зеленой области, а другой
конец — флуорофором, излучающим в
красной области (Haustein and Schwille, 2003)
На сегодня выполнено большое
количество экспериментов с применением
метода двухцветной ФКС в анализе
реакций между биологическими
макромолекулами. Приведем два примера таких
реакций. Первый связан с энзиматиче-
ским расщеплением ДНК эндонукле-
азой (рис. П 1.6). Концы ДНК были
мечены двумя разными флуорофорами и
за скоростью расщепления наблюдали
по изменению кросс-корреляционной
амплитуды в реальном режиме времени.
Как видно из рисунка, максимальная
амплитуда наблюдается в начале
реакции, которая затем уменьшается с
течением времени прямо пропорционально
количеству расщепленной ДНК.
Другой пример — наблюдение за
протеканием реакции гибридизации
двух комплементарных молекул ДНК
(рис. П 1.7), каждая из которых была
J ' ' ■-■' ' - . Г I"-»
0.001 0.01 0.1 1 10 100
Время (мсек)
\\ \
Рис. I"11.7. Временная зависимость
амплитуды кросс-корреляционой функции реакции
гибридизации ДНК в интервале 8-120 мин.
Один конец ДНК мечен флуорофором,
излучающим в зеленой области, а другой конец —
флуорофором, излучающим в красной
области. Время инкубации: светлые точки — 8 мин;
темные точки — 15 мин; короткие
штриховые — 25 мин; длинные штриховые линии —
60 мин; сплошная линия — 120 мин (Schwille
et al., 1997)
флуоресцентно мечена с одного конца
зеленым родамином, с другого -
красителем CY-5. За кинетикой реакций
гибридизации наблюдали за ростом
амплитуды корреляционной функции в реальном
режиме времени. Как видно из рисунка,
минимальная амплитуда сигнала
наблюдается в начале реакции, которая затем
возрастает прямо пропорционально
концентрации гибридизованной ДНК.
Эти два примера ясно показывают
основные преимущества метода
двухцветной ФКС: кросс-корреляционный
сигнал существует только тогда, когда
в растворе имеются молекулы, несущие
на своих концах оба флуорофора (еще
не все молекулы ДНК разрезаны, как

А.(нм)
Рис. I"1 1 .(S. Эмиссионный спектр родамина
зеленого (1) и CY-5 (2), а также
трансмиссионные характеристики пропускания дихро-
ичного зеркала (3), эффективно отделяющего
один спектр от другого (Schwille et al., 1997)
в первом примере, или часть или вес
молекулы ДНК гибрпдпзованы, как во
втором примере). В случае же, когда все
молекулы ДНК разрезаны или они еще
не вступили в реакцию гибридизации,
такой сигнал отсутствует.
В заключение заметим, что
эффективность метода ФКС сильно зависит
от того, насколько эффективно
спектры флуорофоров разнесены по длинам
волн. Рисунок- Г. 1 1.8 демонстрирует, что
пара флуорофоров (родамин зеленый и
CY-5) наиболее подходит для
реализации возможностей метода двухцветной
флуоресцентной корреляционной
спектроскопии.
И 1.5. Перечень ключевых идей
• В методе флуоресцентной корреляционной спектроскопии анализируется
стохастическое появление и исчезновение флуоресцирующих молекул в
маленьком (микроскопическом) объеме.
• Флуоресцентная корреляционная спектроскопия является некогерентным
явлением и не может быть использована для измерения подвижности в ансамбле
молекул; наилучшие условия ее наблюдения — наличие всего нескольких
молекул в микрообъеме.
9 В методе двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии
используются два отдельных лазера для возбуждения двух молекул, каждая из
которых имеет метку своего цвета, зеленую и красную (флуорофоры,
испускающие свет в двух областях спектра) и два независимых детектора для
измерения зеленой и красной флуоресценции.
В противоположность методу одноцветной ФКС, интерпретация данных
которого неизбежно связана с математической обработкой корреляционной
функции, метод двухцветной ФКС, в принципе, дает ответ типа «да» или «нет» на
вопрос о комплексообразовании между молекулами.

Литература дпя дальнейшего -.тения
Исторический обзор и введение в биологические проблемы
Bastianes P. I. H. and Pepperkok R. Observing proteins in their natural habitat: the
living cell. TIBS, 2000. 25, 631-637.
Elson E. L. and Magde D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis
and theory. Biopolymers, 1974.13, 1-27.
Haustein E. and Schwille P. Ultrasensitive investigations of biological systems by
fluorescence correlation spectroscopy. Methods, 2003. 29, 153-166.
Основные принципы метода ФКС
Magde D., Elson E. L. and Webb W. W. Thermodynamic fluctuations in a reacting
system. Measurement by fluorescence correlation spectroscopy. Phys. Rev. Lett., 1972.
29, 705-708.
Eigen M. and Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and
evolutionary biothechnology. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1994. 91, 5740-5747.
Bacia K. and Schwille P. A dynamic view of cellular processes by in vivo fluorescence
auto- and cross-correlation spectroscopy. Methods, 2003. 2974-85.
Schwille P. and Kettling U. Analyzing single protein molecules using optical methods.
Curr. Opin. Biotech., 2001.12, 382-386.
Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия
Schwille P., Meyer-Almes F.J. and Rigler R. Dual-colour fluorescence cross-correlation
spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. BiophysJ., 1997. 72,
1878-1886.
Koltermann A., Kettling U., StephanJ., Winkler T. and Eigen M. Dual-color confocal
flourescence spectroscopy and its application in biotechnology. In Fluorescence
Correlation Spectroscopy — Theory and Application, eds. R. Rigler and E. Elson.
Heidelberg: Springer — Verlag, 2001.
StephanJ., Dorre K. et al. Towards a general procedure for sequencing single
DNA molecules J. Biotechnol, 2001. 86, 255-267.