Автор: Родопуло А.К.
Теги: виноделие энология виноградные вина пищевое производство пищевая промышленность
Год: 1983
Текст
АКРоЭопупо
ОСНОВЫ
БИОХИМИИ
ВИНОДЕЛИЯ
А.К.РоЭопупо
ОСНОВЫ
БИОХИМИИ
ВИНОДЕЛИЯ
Издание 2-е переработанное и дополненное
МОСКВА
«ЛЕГКАЯ И ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»
1983
ББК 36.87
Р 61
УДК 663.2.001.577.1
Родопуло А. К. Основы биохимии виноделия. — М.:
Легкая и пищевая пром-сть, 1983.—240 с.
В книге приведены сведения о химическом составе винограда,
сусла и вина, рассмотрены основы биохимических процессов, проте-
кающих при переработке винограда, ферментации сусла, технологи-
ческой обработке и выдержке виноматериалов для вин различных ти-
пов. Обобщены результаты работ советских и зарубежных авторов,
теоретически и практически обосновывающих биохимические процес-
сы при изготовлении вин.
Книга предназначена для работников научно-исследовательских
организаций и специалистов винодельческой промышленности.
Табл. 21 Ил. 2 Библиогр. 183 назв.
Рецензенты: акад. АН БССР, заслуженный деятель науки
и техники БССР, д-р биол. наук, проф. А. С. Вечер; инж. Л. Ф. Шай-
туро (начальник Упрвино, Минпищепром СССР)
2908000000—003
-------------2___S3
044(01)—83
© Издательство «Легкая и пищевая
промышленность», 1983.
ОТ АВТОРА
После выхода в свет первого издания монографии «Биохимия
виноделия» прошло более 10 лет. За это время появилось много
работ по биохимии виноделия как в Советском Союзе, так и за
рубежом.
Разработаны новые методы технологии вина и выдержки ор-
динарных и марочных виноматериалов, появились современные
способы производства сухих малоокисленных вин, а также десерт-
ных и крепких, широко применяются непрерывные способы бро-
жения сусла и способы ускорения созревания вин.
В связи с этим в отличие от первого издания книга коренным
образом переработана, в ней обобщены новейшие биохимические
исследования.
Книга состоит из двух частей. В первой части приводятся но-
вейшие исследования в области образования, роли и превраще-
ний углеводов, органических кислот, ферментов и других веществ
винограда. Подробно представлен химический состав эфирных
масел винограда, особенно терпеноидов, от которых зависит
аромат винограда и вина. Впервые приводятся данные о содер-
жании терпеноидов и липидов в винограде.
Во второй части книги рассматриваются процессы при фер-
ментации и переработке винограда, обосновывается возможность
их регулирования для получения качественного сусла. Глубоко
излагается химизм алкогольного брожения, образование вторич-
ных и побочных продуктов. Впервые освещается биосинтез и ме-
таболизм карбонильных соединений, а также рассматривается
влияние отдельных видов и рас дрожжей на образование ве-
ществ, положительно влияющих на качество вина.
Особенно большое внимание уделяется современному механиз-
му окислительно-восстановительных процессов при технологии ви-
на. Впервые описана роль супероксида (ОГ| в окислительно-вос-
становительных реакциях, а также в образовании перекиси водо-
рода. Монография завершается рассмотрением химической приро-
ды веществ, обусловливающих букет и вкус вина.
Кроме того, в книгу включены материалы, характеризующие
липиды винограда, их биосинтез и метаболизм в процессе при-
готовления вина, показано также влияние различных видов и рас
дрожжей на образование букетобразующих веществ, приведена
современная теория окислительно-восстановительных процессов и
химическая природа веществ, обусловливающих вкус и букет вина.
Все замечания и пожелания читателей будут приняты автором
с благодарностью по адресу издательства: 113035, Москва, М-35,
1-й Кадашевский пер., 12.
3
ВВЕДЕНИЕ
В нашей стране за последнее время достигнуты большие успе-
хи в улучшении качества ординарных и марочных вин, шампан-
ского и коньяков.
Еще большего внимания требует производство красных столо-
вых вин из винограда сортов Саперави и Каберне, а также
красных игристых, обладающих р-витаминной активностью, бла-
годаря повышенному содержанию в них фенольных соединений,
в том числе и антоцианов. Эти вина характеризуются высокой
биологической ценностью, и их следует выпускать в больших ко-
личествах.
Задача биохимии заключается в том, чтобы дать производству
такие рекомендации по специфической обработке винограда и ре-
гулированию ферментативных процессов, которые бы позволили
получить готовый продукт высокого качества и повышенной пи-
щевой ценности.
Биохимия вина изучает сущность ферментативных процессов,
происходящих при изготовлении вина. Знание сущности этих про-
цессов позволит рационализировать технологию. Основываясь на
биохимических реакциях, можно регулировать технологические
процессы получения разных типов вин. Так, при быстром отделе-
нии сусла от мезги и сульфитации можно получить легкие столо-
вые вина и шампанские виноматериалы. При выдержке сусла на
мезге и брожении с мезгой получают кахетинские вина. При не-
дображивании сусла путем спиртования получают десертные и
крепкие вина. При вторичном брожении виноматериалов на спе-
циальных расах дрожжей получают шампанское и херес.
Таким образом, зная сущность биохимических реакций, про-
текающих в процессе формирования и образования вина, и умея
управлять ими, можно получить высококачественные вина.
Очень важным является организация контроля за ходом тех-
нологических процессов, качеством сырья и готовой продукции.
Этот контроль можно осуществить при использовании современ-
ных физико-химических методов анализа.
За последние 20 лет методами газожидкостной хроматографии
и масс-спектроскопии идентифицировано большое число компонен-
тов в винограде и вине.
В процессе спиртового брожения некоторые из этих веществ
претерпевают изменения и превращения, в результате чего возни-
кают новые вещества.
Основоположники технической биохимии А. И. Опарин и
Н. М. Сисакян дали начало развитию биохимии виноделия в на-
шей стране. Под их руководством проводились систематические
4
исследования винограда и продуктов его переработки. Вскрыты
многие закономерности ферментативных процессов, протекающих
во время брожения, выдержки вин, шампанского и коньяка.
Исследования А. И. Опарина и Н. М. Сисакяна дали основное
направление развитию в области биохимических основ виноделия
и привлекли к этим работам многих исследователей.
Существенный вклад в развитие технологии и химии вина
внесли советские ученые М. А. Ховренко, В. Е. Таиров, А. М. Фро-
лов-Багреев, Н. Н. Простосердов, М. А. Герасимов, Г. Г. Ага-
бальянц, А. А. Егоров, А. С. Вечер, С. В. Дурмишидзе, Н. Ф. Са-
енко, П. Н. Унгурян, Л. М. Джанполадян, И. А. Егоров,
Е. Л. Мнджоян, Л. Н. Нечаев, Н. Г. Саришвили и др.
Разработанные ими положения легли в основу технологии из-
готовления вин различных типов. П. Н. Унгурян и А. Е. Орешки-
на разработали способ получения малоокисленных вин путем ре-
гулирования окислительно-восстановительных процессов.
Исследования А. М. Фролова-Багреева, Г. Г. Агабальянца,
А. А. Мержаниана, С. А. Брусиловского позволили создать про-
грессивный метод непрерывной шампанизации. В развитии непре-
рывного способа производства в потоке важное значение имело
внедрение биологического метода обескислороживания вина, пред-
ложенного А. К. Родопуло.
В настоящее время этот метод усовершенствовал Н. Г. Сари*
швили.
В работах М. А. Ховренко, А. М. Фролова-Багреева, Н. Ф. Са-
енко удалось вскрыть биологическую природу хересной пленки,
которая, как оказалось, представляет собой пленкообразующие
сахаромицеты, а не микодерму.
Выделение чистой культуры хересных дрожжей и изучение фи-
зиологических и биохимических процессов позволили М. А. Гера-
симову и Н. Ф. Саенко разработать и внедрить технологию полу-
чения хереса резервуарным методом. За последнее время
А. А. Мартаковым разработан и внедрен в производство глубин-
ный метод хересованид вина вщотоке.
Крупным достижением в теории и практике виноделия для ста-
билизации вина и улучшения его качества стали исследования
М. А. Герасимова и 3. Н. Кишковского* которые показали роль
термического воздействия (тепла и холода) на вино. Разработа-
ны режимы обработки вина холодом и теплом, а также приемы и
методы термического воздействия, которые имеют большое прак-
тическое значение и широко применяются как в нашей стране,
так и за рубежом.
В чем же состоит сущность биохимических процессов, которые
обусловливают улучшение вкуса и аромата вина? Эти процессы
очень сложны. К ним относятся: ферментативные процессы, при-
водящие к образованию спиртов, простых и сложных высокомо-
лекулярных эфиров, лактонов, фуранонов и терпеноидов при дей-
ствии ферментов винограда и дрожжей, а также при выдержке
вина.
5
Переработка винограда и вина в анаэробных условиях позво-
ляет получать неокисленные белые сухие и шампанские винома-
териалы брожением сусла в непрерывном потоке. Внесение фер-
ментных препаратов в ходе вторичного брожения, полученных из
дрожжей с применением холода под.высоким давлением, ускоряет
синтез ароматобразующих веществ, обеспечивающих улучшение
качества шампанского.
Усиление окислительных процессов при получении кахетинских
вин, мадеры, портвейна и хереса ускоряет сахароаминные реак-
ции, что способствует увеличению количества альдегидов, ацета-
лей, лактонов и фуранонов, благоприятно влияющих на качество
этих вин.
Ухудшают качество вин окислительные процессы, приводящие
к окислению фенольных соединений с образованием хинонов. Хи-
ноны являются катализаторами в дегидрировании аскорбиновой,
диоксифумаровой и других оксикислот, а также спиртов, терпено-
идных соединений и др. Образующиеся окислы этих соединений
приводят к ухудшению качества сухих и мускатных вин. Реакция
конденсации пировиноградной кислоты с активным уксусным аль-
дегидом и образование ацетомолочной кислоты приводит к появ-
лению в аэробных условиях ацетоина и диацетила. Последний
ухудшает качество сухих и игристых вин. При анаэробных усло-
виях из ацетомолочной кислоты образуются изобутанол и валин,
которые не так вредны для вина, как диацетил.
Процесс окислительного дезаминирования аминокислот, проте-
кающий при аэробиозе, также оказывает вредное влияние на ка-
чество вина. Аналогичное действие оказывает и окислительное
декарбоксилирование аминокислот. С другой стороны, восстанови-
тельные процессы, протекающие при дезаминировании и декар-
боксилировании, способствуют улучшению качества вина.
Таким образом, регулирование окислительно-восстановитель-
ных процессов в ходе изготовления вин имеет первостепенное зна-
чение для виноделия.
Часть I
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ
ВИНОГРАДА, СУСЛА И ВИНА
В ягодах винограда содержатся сахара, главным образом
глюкоза и фруктоза, ферменты, витамины, микроэлементы, орга-
нические кислоты, азотистые, дубильные и другие весьма важ-
ные для здоровья человека вещества. С производственной точки
зрения виноград используют для приготовления вин различных
типов.
Изучение химического состава виноградного сока издавна при-
влекало внимание многих исследователей.
За последнее время в связи с развитием техники газожидкост-
ной хроматографии, масс-спектроскопии, ядерно-магнитного резо-
нанса, а также изотопных методов исследования был проведен
ряд работ по изучению химического состава виноградного сока
и вина. В винограде было найдено более 400 компонентов и еще
больше в вине. Более глубоко изучен состав эфирных масел, ор-
ганических кислот, фенольных соединений, углеводов, азотистых
веществ, витаминов и других, обусловливающих качество вино-
града и вина.
Рассмотрим состав этих соединений, а также их значение в
биохимии технологических процессов при производстве вин раз-
личных типов.
Глава 1
УГЛЕВОДЫ ВИНОГРАДА,
ИХ ОБРАЗОВАНИЕ И ПРЕВРАЩЕНИЕ
Главной составной частью лозы и. ягод винограда являются уг-
леводы. Содержание их в некоторых сортах достигает 90% [51].
В винограде соотношение сахара и кислот является главным кри-
терием для определения качества винограда и вина. В процессе
брожения сахара претерпевают глубокие изменения. Из них об-
разуется главный продукт спиртового брожения — этанол, а так-
же вторичные продукты брожения, имеющие важное значение'для
формирования вкуса и букета вина.
Фотосинтез
В винограде углеводы образуются в результате усвоения угле-
кислоты зелеными частями виноградной лозы под действием энер-
гии солнечного света, поглощаемой хлорофиллом. Этот процесс
называется фотосинтезом. Благодаря фотосинтезу в природе не-
7
прерывно происходит круговорот углерода. Процесс фотосинтеза
можно представить в виде следующей реакции:
hv
6СО2+6Н2О —> CgHi2O^+6O2.
Эта реакция, как и большинство суммарных уравнений в био-
химии, не отражает промежуточных продуктов фотосинтеза и по-
казывает лишь его конечные продукты. В результате фотосинтеза
образуется одна молекула гексозы и 6 молекул кислорода.
На самом деле процесс протекает гораздо сложнее. Механизм
процесса фотосинтеза можно объяснить следующим образом. При
фотосинтезе происходит фоторазложение воды, при этом водород
идет на восстановление углеродистых веществ, что приводит к об-
разованию органических соединений.
Как предполагал А. Н. Бах [6], выделяющийся при фотосин-
тезе молекулярный кислород является кислородом воды. Это бы-
ло экспериментально доказано в 1947 г. методом изотопов
А. П. Виноградовым.
Фотосинтез имеет огромное биологическое значение. Благодаря
фотосинтезу ежегодно на нашей планете связывается около
100 млрд, тонн органического вещества и выделяется в атмосферу
необходимый для жизнедеятельности живых организмов свобод-
ный кислород.
Процесс фотосинтеза осуществляется в растительной клетке
при помощи особых биологических структур — хлоропластов.
В этих хлоропластах содержатся пигменты, среди которых наи-
большее значение имеют хлорофиллы.
Состав хлорофилла был изучен в начале XX в. методом хро-
матографического анализа (М. Цвет, 1914). При этом было уста-
новлено, что зеленая окраска растений состоит из смеси пигмеи*
тов: хлорофилла а и б, ксантофилла и каротина. Еще в начале
XX в. К. А. Тимирязев впервые высказал предположение, что
хлорофилл является сенсибилизатором процесса фотосинтеза.
Впоследствии было доказано, что фотосинтез представляет собой
цепь окислительно-восстановительных реакций. Это подтверждено
А. А. Красновским [50] путем обратимого восстановления хлоро -
филла аскорбиновой кислотой, являющейся донатором водорода.
Как показали исследования А. Н. Теренина (1961—1965 гг.)>
при обратимом фотовосстановлении хлорофилла возникают сво-
бодные радикалы. Появление их в процессе фотосинтеза доказы-
вается возникновением сигналов электронного парамагнитного ре-
зонанса (ЭПР). Функционирование хлорофилла ' в реакционных
центрах фотосистем связано с образованием свободных радика-
лов. Свободные радикалы, образующиеся при функционировании
хлорофиллов в реакционных центрах фотосистем, обусловливают
появление характерных спектров ЭПР.
Советские и зарубежные исследователи изучали продукты, об-
разующиеся при окислительно-восстановительных превращениях
изолированных фотосинтетических пигментов, а также свободные
8
радикалы при фотоокислении и фотовосстановлении хлорофилла
и других пигментов методом инициирования цепной полимери-
зации [50]. При этом установлено, что увеличение степени агре-
гации радикалов приводит к снижению фотохимической активно-
сти агрегированных форм пигментов.
Биосинтез углеводов
Исследования М. Кальвина (1962), проведенные радиоактив-
ным углеродом, показали, что соединение, к которому акцепти-
руется СО2, является рибулозодифосфатом. Последний в присут-
ствии воды гидролизуется с образованием двух молекул фосфо-
глицериновой кислоты. Эта кислота восстанавливается водородом
воды и образует фосфоглицериновый альдегид, который, частично
изомеризуясь, дает фосфодиоксиацетон. Под действием альдолазы
фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон соединяются
и образуют молекулу фруктозодифосфата, из которого синтези-
руется сахароза.
Процесс образования фосфоглицериновой кислоты из рибуло-
зодифосфата и СО2 имеет циклический характер и называется
циклом Кальвина.
В основном фотосинтез углеводов виноградной лозы осущест-
вляется в зеленых листьях. Зеленые ягоды, содержащие хлоро-
филл, также могут синтезировать углеводы. Однако основная мас-
са углеводов образуется в листьях и оттуда мигрирует в ягоды,
как это полагал А. С. Фоминцын еще во второй половине XIX в.
С. В. Дурмишидзе и Т. В. Бериашвили [28] изучали процесс
перемещения ассимилятов из ягод винограда в листья и побеги
лозы. В период роста и в начале созревания непосредственно в
ягоды винограда сорта Ркацители они вносили С14О2 и 1—6С14
глюкозу. Соединения, образовавшиеся из этих меченых атомов уг-
лерода в ягодах винограда, активно передвигались к другим ор-
ганам лозы как в нисходящем, так и в восходящем направлении.
Среди соединений, переместившихся из грозди в побеги и листья,
высокую радиоактивность имели глюкоза, фруктоза и сахароза.
Кроме них, радиоактивными оказались яблочная, гликолевая, ас-
парагиновая, глутаминовая кислоты и др.
Радиоактивных веществ из листьев мигрирует в 4—б раз боль-
ше, чем из грозди. По мнению авторов, лист винограда усваивает
в 5—7 раз больше С14О2, чем ягода. '
Среди соединений, перешедших из ягод в другие части лозы,
наряду с глюкозой высокой радиоактивностью обладали сахароза
и фруктоза. Следовательно, глюкоза превращается во фруктозу
и сахарозу.
Превращение углеводов
В последнее время проводятся исследования по изучению свя-
зи между метаболизмом органических кислот и углеводов в про-
цессе роста и созревания ягод винограда. Первоначальный распад
9
органических кислот и аккумуляция сахара происходят одновре-
менно в начале созревания. Обычно это длится 6—7 недель после
цветения; этот процесс интенсифицируется в середине срока соз-
ревания ягод винограда.
Показано, что в ранний период созревания винограда большая
часть атомов меченого углерода С14 включается в органические
кислоты. В фазе, близкой к созреванию, основная масса С14 вклю-
чается в углеводы [161].
На основании этого можно заключить, что органические кис-
лоты в процессе созревания ягод винограда участвуют в образо-
вании углеводов.
В. М. Клиевер (1964) установила, что относительное количест-
во С14 в глюкозе зеленых ягод значительно увеличивается, а в
органических кислотах уменьшается.
Первоначальный распад органических кислот и аккумуляция
сахара происходят одновременно в начале созревания ягод. Не-
которые кислоты, например яблочная, могут быть превращены в
глюкозу й фруктозу. Путь превращения яблочной кислоты в глю-
козу лежит через щавелевоуксусную и фосфоэнолпировиноградную
кислоты.
Это было доказано тем, что меченый углерод (С14) в положе-
нии 2—3 в яблочной кислоте, введенный в ягоды винограда, в
относительно короткий срок включается в молекулу сахара в том
же положении. Единственный энзим, участвующий в образовании
сахара из яблочной кислоты, это фосфоэнолпируваткарбоксики-
наза [161]. В ягодах винограда сорта Пино черный интенсивное
превращение яблочной кислоты в сахар происходит при 20° С [161].
По данным Т. В. Бериашвили и Т. Д. Чиквинадзе (1968) в пе-
риод завязывания ягод винограда С14 в основном включается в
органические кислоты, а в период созревания С14 включается в
углеводы — в глюкозу и фруктозу.
Состав сахаров -винограда
В ягодах винограда встречаются различные углеводы, их насчи-
тывается до 81 [166]. К ним относятся полисахариды, олигосаха-
риды и моносахариды. Полисахаридами называют углеводы, мо-
лекула которых при гидролизе распадается с образованием мо-
лекул моносахаридов.
В зависимости от молекулярной массы и свойств полисахари-
ды делятся на две группы: олигосахариды — низкомолекулярные
полисахариды, молекула которых при гидролизе образует неболь-
шое число молекул моносахаридов (от 2 до 10), и высшие поли-
сахариды— высокомолекулярные вещества малорастворимые и
совсем нерастворимые в воде; в большинстве случаев они не кри-
сталлизуются и не обладают сладким вкусом.
В ягодах винограда содержатся также пентозаны, целлюло-
за, пектины и камеди.
ю
По данным Е. Н. Датунашвили и др. [25], полисахариды ко-
жицы винограда состоят из легко- и трудногидролизуемых фрак-
ций полисахаридов. Количество последних составляет 24—25%, а
легкогидролизуемых 16—20%. Полисахариды в ягоде винограда
представлены сложными сочетаниями кислых и нейтральных ге-
терополисахаридов: галактоарабиногалактана, арабиноглюкана,
галактоглюкоманнана и глюкана.
Е. Н. Датунашвили считает, что все полисахариды в разной
степени связаны между собой, а также с лигнином, белком и фе-
нольными соединениями.
Работами В. И. Зинченко и др. [40] показано, что в виногра-
де найдены щелочерастворимые полисахариды, гемицеллюлоза и
целлюлоза, а также гетерополисахарид, состоящий из гексоз, пен-
тоз и уроновых кислот.
Гексозы в винограде встречаются в свободном состоянии в
больших количествах. d-Глюкоза, или виноградный сахар, хоро-
шо растворима в воде, в спирте, плохо и совсем нерастворима в
эфире. При слабом окислении она образует глюконовую, а при
сильном — сахарную кислоту. При нагревании глюкозы с мине-
ральными кислотами она превращается в оксиметилфурфурол, ко-
торый затем разлагается на левулиновую и муравьиную кислоты.
Винные дрожжи лучше сбраживают глюкозу, чем фруктозу,
так что после окончания брожения последняя частично остается
в вине. Как и глюкоза, фруктоза восстанавливает фелингову жид-
кость. При слабом окислении фруктозы образуются гликолевая и
оксимасляная кислоты, при дальнейшем окислении из гликолевой
кислоты образуются муравьиная и щавелевая. Восстановление
фруктозы приводит к образованию d-маннита и d-сорбита.
После цветения и формирования ягод винограда в начале в
основном появляется глюкоза, а затем фруктоза. В начале созре-
вания отношение глюкозы к фруктозе в ягоде приближается к 1.
В стадии технической зрелости в ягодах преобладает фруктоза.
Объясняется это тем, что к этому времени активность гексозофос-
фатизомеразы значительно увеличивается, вследствие чего часть
глюкозы превращается в фруктозу и ее количество возрастает.
Согласно данным А. *М. Фролова-Багреева и Г. Г. Агабальян-
ца (1951) в европейских сортах винограда отношение глюкозы к
фруктозе' составляет от 0,9 до 1,3, а по Амерайну — от 0,71 до
1,45 [97].
По данным Н. М. Сисакяна (1948), сахароза появляется в пе-
риод созревания винограда.
Для установления степени зрелости винограда, идущего на из-
готовление столовых, шампанских и десертных вин, большое зна-
чение имеют содержание сахара и титруемая кислотность во вре-
мя сбора.
По мере созревания содержание сахаров увеличивается, а тит-
руемая кислотность уменьшается и при этом глюкоацидиметриче-
ский показатель возрастает. Для шампанских виноматериалов он
составляет 18—20, для столовых — 23—25, а для десертных — 35.
11
Пентозы
В незначительном количестве они встречаются в винограде и
вине. В основном пентозы представлены Z-арабинозой, ксилозой, а
также рибозой, рамнозой, дезоксирибозой и мелибиозой [181].
В винограде содержатся и пентозаны. Они преобладают в греб-
нях, кожице и семенах в количестве от 1,05 до 4,5%, а в винах
количество пентозанов колеблется от 0,003 до 0,15%.
Считают, что потенциальным источником пентоз в вине яв-
ляются глюкопротеины, полисахариды, пектины, аминосахара,
пигменты винограда и экстрактивные вещества древесины бочки.
Исследования Е. Пауля (1967) показали, что в процессе бро-
жения сусла эти соединения подвергаются гидролизу, в результа-
те чего пентозаны появляются в свободном состоянии и поддают-
ся хроматографированию.
Большое биологическое значение имеют d-дезоксирибозы и d-
рибоза, которые входят в состав нуклеиновых кислот как биоло-
гически активные вещества.
Содержание пентоз в красных кахетинских винах больше, чем
в винах европейского типа. Объясняется это тем, что красные и
кахетинские вина выдерживают на мезге, вследствие чего проис-
ходит экстракция пентоз из твердых частей ягод, гребня и кожи-
цы, которые содержат значительное количество пентоз. Кроме то-
го, при таком способе приготовления вина происходит гидролиз
пентозанов и вино обогащается пентозами.
Пентозы обладают всеми характерными реакциями моносаха-
ридов. Они восстанавливают фелингову жидкость. Поэтому при
определении сахаров по методу Бертрана пентозы обусловливают
завышенные результаты. С фенилгидразином пентозы образуют
озазоны, при восстановлении дают пятиатомные спирты (ксилит и
арабит), дрожжи не способны их сбраживать, этим пентозы и от-
личаются от гексоз.
При нагревании с минеральными кислотами пентозы теряют
3 молекулы воды и образуют фурфурол, что характерно для них.
За последнее время благодаря применению различных методов
хроматографии глубоко изучен химический состав винограда и
вина.
При этом, помимо глюкозы и фруктозы, идентифицированы
еще сахароза, рафиноза, стахиоза, галактоза, рамноза, ксилоза,
арабиноза, мальтоза, лактоза, d-глицepo-d-мaннooктyлoзa,- манно-
гептулоза, альтрогептулоза^ а также маннан и глюкан. Источни-
ком последних могут служить винные дрожжи при их автолизе,
между собой 1,4-эфирными связями:
Пектиновые вещества
Это высокомолекулярные углеводные соединения. В состав пек-
тиновых веществ входит более 200 до некоторой степени метокси-
лированных остатков галактуроновой кислоты, которые соединены
между собой 1,4-эфирными связями:
12
В пектиновые вещества кроме d-галактуроновой кислоты вхо-
дят еще d-галактоза, d-ксилоза, d-рамноза и /-арабиноза. В неко-
торых пектинах содержатся d-глюкоза и /-фукоза.
До настоящего времени нет четкой классификации пектиновых
веществ. Согласно физико-химическим свойствам они разделяют-
ся на ряд фракций. В пектиновые вещества входят протопектин,
растворимый пектин, пектиновая и пектовая кислоты и их соли —
пектаты.
Протопектин нерастворим в воде. Он входит в состав первич-
ных клеточных стенок. Но после обработки органическими кисло-
тами или под действием протопектиназы переходит в раствори-
мый пектин.
' Протопектиназа не была выделена в чистом виде и до сих пор
не включена в классификацию ферментов.
В протопектин входят полигалактуроновые кислоты, которые
связаны с крахмалом, целлюлозой и арабаном. Химическая при-
рода протопектина полностью еще не изучена, поскольку он не
выделен из растений в нативном состоянии.
Пектин представляет собой растворимые пектиновые кислоты.
Он содержится во всех частях растительных клеток, особенно
много его в клеточном соке. Пектин легко извлекается водой.
В твердом состоянии в зависимости от степени его очистки был
выделен из растений в виде порошка от белого до серо-коричне-
вого цвета. Пектин — гидрофильный коллоид с отрицательным за-
рядом. Согласно данным О. Т. Хачидзе, полученным в 1955 г., мо-
лекулярная масса пектина колеблется от 5350 до 6500D, другие
считают, что его молекулярная масса гораздо выше и достигает
200000D. На желеобразующую способность пектина влияет моле-
кулярная его масса, а также метоксильное число. Пектиновые рас-
творы обладают высокой вязкостью, вследствие чего при повы-
шенном содержании его в виноградном соке обработка затруд-
няется, в связи с чем большое значение имеет обработка сока или
сусла пектолитическими ферментами.
Изучением механизма действия пектолитических ферментов
занимались многие исследователи. Мы подробно остановимся на
содержании пектиновых веществ в ягодах и изменениях в процес-
13
се переработки винограда, брожения сусла, а также при примене-
нии пектолитических ферментов в виноделии для увеличения вы-
хода сусла.
Первые исследования по изучению пектолитических ферментов
были проведены в 1935 г. В. Крюссом, затем Е. Пейно, А. А. Мар-
таковым, Л. Ф. Моисеенко, X. С. Абдуразаковой. Более подроб-
ные сведения приводит Н. А. Мехузла (1968).
Среди пектолитических ферментов главную роль играют пек-
тинэстераза и эндополигалактуроназа. При гидролизе пектина под
действием пектинэстеразы выделяется метанол, увеличение со-
держания которого нежелательно. Содержащиеся в сусле пекти-
новые кислоты тормозят действие пектинэстеразы. Фенольные сое-
динения также ингибируют действие пектолитических ферментов.
В начале созревания винограда пектиновые вещества из твер-
дых частей ягоды частично переходят в сок. При технической зре-
лости содержание их в соке колеблется от 1 до 2 г/л (О. Т. Хачид-
зе, 1955). Виноградный сок, полученный из недозрелого виногра-
да, не содержит пектиновых веществ.
Исследованиями М. А. Амерайна и В. Крюсса, проведенными
в 1963 г., показано, как изменяется содержание пектиновых ве-
ществ при переработке винограда. В процессе прессования коли-
чество пектина в зависимости от фракции сусла увеличивается.
Так, в сусле первой фракции количество пектиновых веществ со-
ставляет 0,05%, во второй 0,06%, а в третьей 0,2%. Следователь-
но, сусло последних фракций содержит больше пектиновых ве-
ществ, чем сусло первой и второй фракции. Поскольку пектин яв-
ляется гидрофильным коллоидом с отрицательным зарядом, то
сусло и полученное из него вино плохо осветляются.
Работы, проведенные в 1963 г. Л. Уссельо-Томассом и С. Та-
рантола, показали, что в процессе переработки винограда пектин
претерпевает глубокие изменения, особенно в процессе брожения.
В винограде содержится пектинметилэстераза, которая приводит
к деметоксилизации пектиновых кислот, в результате чего сусло*
обогащается метанолом. В винограде также содержится, полига-
лактуроназа, но она менее активна. Под действием пектолитиче-
ских ферментов, содержащихся в самих ягодах винограда, пектии
начинает распадаться и количество его уменьшается.
При спиртовом брожении происходит дальнейший распад пек-
тина под действием ферментов дрожжей, среди которых имеются
и пектолитические. В дрожжах была найдена полигалактуроназа.
В связи с этим в вине пектина остается очень мало, а в выдер-
жанных винах обнаруживается в следах. Если в исходном сусле
пектина содержится от 0,59 до 0,75 мг/л, то после брожения и
формирования вина его остается примерно в 10 раз меньше.
Активность пектолитических ферментов в винограде гораздо
меньше, чем плесневых грибов Aspergillus niger, Aspergillus awa-
mory, Aspergillus orysae, Botrytis cinerea и других, из которых в
настоящее время получают пектолитические ферментные препа-
раты. При использовании этих препаратов для гидролиза пекти-
14
новых веществ в гидролизатах были обнаружены, помимо моно-
меров tZ-галактуроновой кислоты, еще арабиноза, ксилоза, галак-
тоза, рамноза и другие моносахариды.
За последнее время С. Оуг и Н. Берг [141] испытали два пек-
тинрасщепляющих ферментных препарата при переработке бело-
го и красного винограда для получения белых, розовых и красных
вин. Различия между действием этих двух ферментных препара-
тов обнаружено не было. Выход сока из белого винограда в сред-
нем составляет 7,1%, а из красного винограда около 6,7%. Сусло
из винограда, обработанного ферментными препаратами, фильтро-
валось лучше и легче осветлялось, содержало сухих веществ до
17%, в контроле до 11%.
Качество опытного вина мало отличалось от контрольного.
Известно, что пектиновые вещества не оказывают влияния на ка-
чество вина, но продукты превращения пектиновых веществ, в
частности образуемый из них фурфурол, может изменить вкус и
букет вина и особенно коньяка.
Пектиновые вещества являются основным источником фурфу-
рола в вине. Образование фурфурола из пектиновых веществ про-
текает по следующей схеме: *
луроновые кислоты
Пектиновые вещества^ 'хФУРфурол*
^пентозаны '
По данным Е. Н. Датунашвили [26], вина, приготовленные из
винограда, обработанного пектолитическими ферментами, более
экстрактивны и обладают более хорошим вкусом.
Более глубоко были изучены высокомолекулярные соединения
сусла и вина итальянскими учеными Тарантола и Уссельо-Томас-
сом (1963). Они установили, что в сусле и вине присутствуют че-
тыре группы веществ, которые различаются между собой электро-
форетической способностью. Пектиновые вещества и белки имеют
ч высокую подвижность, а декстрины и пентозаны — низкую. Поль-
зуясь этим свойством, они разделили пектиновые вещества и пен-
тозаны и показали, что эти соединения между собой химически не
связаны. Известно, что мякоть и кожица винограда богаты пекти-
ном и бедны пентозанами и галактанами. В мякоти ягоды вино-
града содержится до 40% растворимых коллоидов, а в кожице и
семенах около 30%. Коллоиды мякоти состоят в основном из пек-
тинов, арабана и галактана, 50% коллоидов мякоти и кожицы и
25% коллоидов семян состоят из пектинов, 5% коллоидов мякоти
и 10% коллоидов кожицы приходятся на арабан, а содержание
галактанов с гемицеллюлозой не превышает 15%.
Общее количество коллоидов в вине составляет 300 мг/л.
В сусле их примерно в 2 раза больше, чем в вине [59]. При бро-
жении сусла и выдержке вина количество коллоидных веществ
уменьшается, главным образом за счет исчезновения групп с вы-
сокой электрофоретической подвижностью, т. е. пектинов и белков.
15
Л. Н. Нечаев (1951) определял количество коллоидов в вине
осаждением их спиртом и эфиром. Он нашел в винах коллоидов
от 3,6 до 9,7 г/л, в соках значительно больше. Н. А. Мехузла счи-
тает, что к коллоидам вина относятся протеины, нуклеиновые кис-
лоты, полисахариды, растворимые фенольные полимеры, которые
влияют на качество вина (цвет, прозрачность, вкус и аромат), его
фильтрацию и стабильность [59].
Глава 2
АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА
Азотистые вещества винограда состоят из органических и ми-
неральных форм азота. К первым относятся белки, аминокислоты,
полипептиды, амины, амиды и другие азотистые вещества, ко вто-
рым — нитраты, нитриты органических оснований и аммиачных
солей. В винограде и в вине преобладает органическая форма
азотистых веществ. Основная доля из них приходится на амино-
кислоты и полипептиды, что составляет от 38 до 78% от общего
азота. Остальные формы органического азота составляют 8—13%.
На долю минеральной формы азота приходится всего от 5 до 15%.
Аминокислоты
Аминокислотой называют жирную кислоту, в которой водород
в a-положении заменен аминной группой NH2:
R—CH—СООН
I
NH2
Природных аминокислот, которые входят в состав белков, из-
вестно не больше 22. Они выделены в кристаллической форме,
имеют /-конфигурацию. Природные аминокислоты горькие или
безвкусные.
Виноградная лоза и все высшие растения способны ассимили-
ровать аминокислоты и белки. По представлению А. Н. Баха [6],
нитраты восстанавливаются в аммиак согласно схеме
HNO3 HNO2 -> (HNO)2 NH2OH -> NH3.
Нитрат Нитрит Гипонитрит Гидроксил- Аммиак
амин
Под действием специфического фермента в результате фермен-
тативного восстановления нитраты вступают в реакцию с кето-
кислотами. Реакция взаимодействия аммиака с кетокислотами
протекает в две стадии: вначале образуется вода и иминокислота,
которая затем посредством никотинамидадениндинуклеотида
(HAD-H2) восстанавливается в аминокислоту по схеме
R—СО—COOH+NH3-^ R—С—СООН+Н2О,
II
NH
Иминокислота
16
R—С—СООН+НАД-Н2 -> R—С—СООН+НАД.
NH NH2
Аминокислота
В. Л. Кретович [51] показал, что в растительном организме
интенсивно протекают реакции переаминирования между глута-
миновой кислотой и кетокислотами.
Главный путь образования аминокислот лежит через фермен-
тативное превращение углеводов по следующей схеме:
С6Н12О6 СН3—СО—СООН 4- СН3—СОН
Глюкоза Пировиноградная Уксусный альдегид
кислота
I СНз
Ф II.
СН3—СО—С—СООН
I
он
Ацетомолочная кислота
СН3 СН3 СН3 СН3
^сон 'сн
I I
СО -----> CHz-NH2
I I
СООН снон
а-Кетоизовалериановая Валин
кислота ;
Существуют и другие пути образования аминокислот в расте-
ниях. Это ферментативное превращение одной аминокислоты в
другую. Из глютаминовой кислоты образуются аргинин, орнитин,
пролин. Путем декарбоксилирования она дает у-аминомасляную
кислоту. Пролин окисляется в оксипролин. Аспарагиновая кисло-
та может превратиться в серин, треонин, метионин и др.
Биосинтез аминокислот в органах виноградной лозы впервые
в 1960 г. был показан С. В. Дурмишидзе и О. Т. Хачидзе. Иссле-
чдования этих авторов доказали, что в начале сокодвижения в рас-
тении усиливается ферментативный гликолиз углеводов и создают-
ся условия для биосинтеза аминокислот. В пасоке виноградной
лозы были идентифицированы все аминокислоты, которые встре-
чаются в виноградном соке и корнях. На основании того что со-
став аминокислот как в корнях, так и в пасоке одинаковый,
С. В. Дурмишидзе пришел к заключению, что биосинтез аминокис-
лот осуществляется в корнях.
Первые определения по изучению азотистых веществ в вино-
градном соке были проведены в 1942 г. К. Хеннигом. Он показал,
что количество общего азота составляет около 1075 мг/'л, белко-
вого 40 мг/л, содержание аминокислот и пептидов превышает со-
держание других форм азота.
Исследования французских энологов Е. Пейно, С. Лафон-Ла-
фуркарда и Г. Гимберто показали, что в процессе созревания
ягод винограда количество общего азота увеличивается, а амми-
17
ачного уменьшается, содержание отдельных аминокислот нарас-
тает и особенно много накапливается пролина.
Болгарские исследователи Л. И. Деков и И. Б. Бенчев в соке
винограда методом хроматографии на бумаге обнаружили цистин,
аспарагиновую и глутаминовую кислоты, аланин, аргинин, серин,
гликокол, а также пептиды.
Нарастание количества аминокислот в процессе созревания ви-
нограда сорта Рислинг впервые показал в 1963 г. Ф. Драверт.
В ранний период созревания, когда кислотность очень высокая, в
ягодах мало аминокислот. В процессе созревания винограда на-
блюдается уменьшение титруемой кислотности и увеличение коли-
чества аминокислот.
Ф. Драверт показал, что в начале созревания в заметном ко-
личестве в ягодах винограда накапливаются аргинин, серин, ала-
нин, глютаминовая и аспарагиновая кислоты. Видимо, эти кисло-
ты участвуют в образовании других метаболитов и аминокислот.
Так, например, аспарагиновая и глютаминовая кислоты участ-
вуют в переаминировании аминокислот с кетокислотами. Аланин,
дезаминируясь, превращается в пировиноградную кислоту, кото-
рая занимает центральное место в метаболизме углеводов, жиров
и белков. Из аспарагиновой кислоты образуются серин, треонин
и метионин, а из глютаминовой кислоты — орнитин, цитруллин,
аргинин. В ягодах винограда в наибольшем количестве содержат-
ся пролин, аргинин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты.
В процессе созревания винограда в нем появляются глицин,
валин, метионин, лейцин, изолейцин, а также циклические амино-
кислоты — пролин, тирозин и фенилаланин.
Ф. Драверт также установил, что в процессе созревайия вино-
града планомерного увеличения аминокислот не наблюдается.
В начале созревания (до 5 сентября) содержание аминокислот
увеличивается до 2619,9 мг/л, к 12 сентября — уменьшается до
2277,8 мг/л, а затем опять резко увеличивается до 3464,1 мг/л. Та-
кое явление можно объяснить тем, что в этот период происходит
энергичное расходование аминокислот на биосинтез белков. Это
хорошо согласуется с данными Н. М. Сисакяна, И. А. Егорова,
Б. Л. Африкян (1948), которые считают, что белковый азот в яго-
дах винограда появляется в начале созревания винограда.
Согласно данным О. Т. Хачидзе [91], в грузинских сортах ви-
нограда содержится следующее количество аминокислот: в Ркаци-
тели 1296 мг/л, в Мцване 1138,4, в Саперави 1519,3 и в Каберне
1438,5 мг/л.
Содержание аминокислот в винограде сорта Рислинг в опытах
Ф. Драверта почти в 3 раза больше, чем в грузинском сорте Рка-
цители. Видимо, Ф. Драверт определял аминокислоты вместе с
пептидами.
В табл. 1 приведено содержание аминокислот в сусле по- дан-
ным исследователей разных стран.
Из табл. 1 видно, что сорта винограда, произрастающего в
разных странах, значительно различаются между собой содержа-
18
нием аминокислот. Большинство аминокислот встречается во всех
сортах. Количество пролина превалирует над содержанием дру-
гих аминокислот. Однако, И. Кэстор не смог обнаружить его в ка-
лифорнийском винограде.
После пролина в разных сортах винограда встречается значи-
тельное количество аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кис-
Таблица 1
СОДЕРЖАНИЕ АМИНОКИСЛОТ (В МГ/Л) В СУСЛЕ ВИНОГРАДА
КРАСНЫХ И БЕЛЫХ СОРТОВ ПО ДАННЫМ РАЗНЫХ ИССЛЕДОВАТЕЛЕЙ
Аминокислота О. Т. Хачидзе С. Лафон-Лафур- карда И.Кэстор Ф. Драверт
в сусле винограда сорта
Саперави (СССР) Ркацители (СССР) Мцване (СССР) Каберне Совиньон (Франция) Совиньон (США) Рислинг (ФРГ)
Аланин 90,8 73,0 76,0 — — 302,0 Аргинин ' 132,5 147,0 153,2 130,0 203,0 2020,0 Аспарагиновая кисло- 134,4 135,0 194,5 — 52,0 94,5 та у-аминомасляная кис- 43,4 66,4 47,0 — — — лота Валин 53Д 45,0 44,0 — 60,0 10,5 Гистидин. 45,6 59,6 49,0 10,0 92,0 45,0 Глицин 18,4 21,8 14,0 27,0 7,0 + Глютаминовая кисло- 97,0 88,4 79,0 160,0 687,0 370,0 та Изолейцин — — — — 66,0 22,3 Лейцин 56,6 61,2 51,4 18,0 62,0 56,3 Лизин 57,0 65,2 70,4 — 16,0 + Метионин 37,0 27,6 33,6 — 14,0 59,2 Пролин 504,0 292,0 202,0 364,0 — 505,0 Серин 103,2 84,2 ~ 98,0 65,0 — 517,0 Треонин 44,4 33,0 48,1 218,0 — 101,0 Триптофан — — — 41,и 47,0 Следы Тирозин 46,4 292,0 202,0 — 20,0 4- Фенилаланин 48,0 48,6 32,0 — 51,0 120,3
лот. Цйстин, глицин, триптофан и некоторые другие аминокисло-
ты содержатся в незначительном количестве.
Колебания в содержании аминокислот можно объяснить раз-
личными климатическими условиями произрастания, а также сор-
том винограда и способом приготовления сока. Некоторые сорта
винограда — Каберне, Саперави, Совиньон, Мальбек — имеют по-
вышенное содержание азотистых веществ, другие — Мерло, Се-
мильон — бедны ими. Сок, полученный самотеком, содержит мень-
ше аминокислот, чем сок, полученный под давлением.
Аминокислотный состав виноградного сока меняется в зависи-
мости от внесения отдельных элементов удобрений. По мнению
Д. Н. Прянишникова, улучшение минерального питания является
19
не только средством повышения урожайности, но влияет на хими-
ческий состав растений. Среди факторов внешней среды, дейст-
вующих на размер и качество урожая винограда, первое место
принадлежит условиям почвенного питания.
По данным А. С. Арутинова, Л. М. Джанполадяна, А. М. Сам-
веляна, А. Л. Хачатуряна, с помощью химического состава удоб-
рения можно регулировать питание виноградной лозы и получить
виноград, соответствующий определенному типу вина. Применение
азотистых удобрений приводит к увеличению содержания амино-
кислот в ягодах, что полезно при производстве десертных вин и
нежелательно при приготовлении сухих, столовых и шампанских
виноматериалов.
Исследования Д. М. Гаджиева показали, что аминокислотный
состав винограда меняется в зависимости от его сорта, почвы,
удобрений, микроэлементов почвы, климатических условий, агро-
техники и других факторов. Так, например, сорт Ркацители резко
отличается по аминокислотному составу от сортов винограда Баян
ширей и Тавквери. В ягодах винограда сортов Ркацители и Ма-
траса содержится наименьшее количество моноаминокислот и мно-
го ароматических и гетероциклических аминокислот (фенилала-
нин, тирозин, пролин) и совсем нет лейцина, изолейцина, серина и
треонина. В таких сортах, как Баян ширей и Тавквери, содержит-
ся много моноаминокислот и диаминокислот. Этим, вероятно, мож-
но объяснить лучшее качество вин из винограда сортов Ркаците-
ли и Матраса, чем из Баян ширея и Тавквери.
Полипептиды
Эти соединения состоят из аминокислот, связанных между со-
бой пептидными связями. Молекулярная масса полипептидов со-
ставляет не более 10 000 D. Они осаждаются сульфатом аммония,
фосфоровольфрамовой кислотой, как белки, но отличаются от бел-
ков тем, что не задерживаются целлофановой мембраной при диа-
лизе. Ди- и трипептиды не осаждаются этими реактивами.
Многие полипептиды встречаются в растениях и дрожжах,
имеют важное значение как промежуточные продукты в обмене
веществ и как физиологически активные вещества.ч Примером мо-
жет служить глутатион. Он состоит из остатков трех аминокис-
лот: гликокола, цистеина и глютаминовой кислот. Глютатион в
значительном количестве содержится в дрожжах, откуда он и был
выделен Ф. Гопкинсом.
Важная роль глутатиона в обмене веществ заключается в том,
что он является сильным восстановителем и очень легко окисляет-
ся. При этом окисляется сульфгидрильная группа (—SH). Две
молекулы глутатиона соединяются дисульфидной связью
(—S—S—) и образуют молекулу окисленного глутатиона.
Работами О. Т. Хачидзе [91] установлено, что полипептиды
виноградного сока состоят из аланина, аргинина, валина, гистиди-
20
на, глицина, глютаминовой и аспарагиновой кислот, лизина, трео-
нина и серина.
В ягодах винограда полипептиды образуются в результате рас-
пада белков и путем синтеза из аминокислот.
По данным Ч. Пу и А. Урнака (1970), количество аминокислот,
входящих в полипептиды, составляет от 70 до 90% от общего азо-
та. Глицин, лизин, аспарагиновая кислота являются главными
компонентами полипептидов.
Белки
В растениях белков содержится меньше, чем углеводов. Одна-
ко они играют большую роль в биологических процессах. Белко-
вые вещества составляют основную массу протоплазмы. Все фер-
менты являются белками.
По химическому составу белки отличаются от углеводов тем,
что они в своей молекуле, кроме углеродного скелета, содержат
язот и серу, а некоторые и фосфор.
Методом рентгенографии установлено, что белки между собой
различаются не только аминокислотным составом, но и формой
молекулы. По этому признаку белки могут быть разделены на
фибриальные (нитевидные) и глобулярные (шаровидные). К гло-
булярным белкам принадлежи^ большинство белков, содержа-
щихся ц растениях и дрожжах.
При определенных условиях белковые растворы превращаются
в гели. В гелях вода находится в гидратационном состоянии. Вы-
сушенный гель теряет воду. При помещении такого геля в воду
белок впитывает большое количество воды. Этот процесс назы-
вается набуханием геля. Процесс, обратный набуханию, т. е. от-
дача воды, называется синерезисом. Процесс набухания белков
играет большую роль в пищевой промышленности, особенно в
хлебопечении и в кондитерском производстве.
При нагревании белковых растворов, а также при действии
кислот и щелочей, ионов тяжелых металлов, органических раство-
рителей и др., белки денатурируются. Денатурированные белки
теряют ферментативную активность. В начале денатурация имеет
обратимый характер, позднее становится необратимой. Обычно
денатурация сопровождается понижением растворимости, сверты-
ванием и выпадением белка в осадок. Этот процесс называется
коагуляцией. При этом он не сопровождается разрывом ковалент-
ных связей в молекуле белка.
Денатурация вызывает нарушение вторичной, третичной и чет-
вертичной структур белка и изменяет его биологические и физико-
химические свойства. Денатурированные белки теряют способ-
ность реагировать с другими веществами, а также растворяться
в воде.
Явление денатурации белков имеет важное значение в пи-
щевой промышленности, в частности в виноделии. При нагревании
21
вина белки свертываются и вино приобретает стойкость к белко-
вым помутнениям.
Белки осаждаются ацетатом свинца, гидроксидом меди, суль-
фатом аммония, вольфраматом натрия, а также танином.
Белки характеризуются следующими реакциями окрашивания:
ксантопротеиновой, биуретовой, миллоновой и реакцией Адамке-
вича. Эти реакции характеризуют белковую молекулу, содержа-
щую определенные химические группировки. Так; например, биу-
ретовая реакция характеризуется наличием группы у [ , ксан-
О Н
топротеиновая — бензольных колец, реакция Адамкевича харак-
теризуется наличием индольных групп, миллоновая реакция зави-
сит от наличия фенольных группировок.
Белки, подобно аминокислотам, содержат как карбоксильные,
так и аминные группы, поэтому они обладают амфотерными свой-
ствами. Они могут диссоциировать и как кислоты, и как основа-
ния. В кислой среде они образуют катионы, а в щелочной — анио-
ны. Исходя из этого, при электрофорезе молекула белка в щелоч-
ном растворе будет двигаться к аноду, а в кислой — к катоду.
Величина pH, при которой степень диссоциации кислых и ще-
лочных групп одинакова, называется изоэлектрической точкой.
В этой точке белки обладают наименьшей растворимостью.
В большинстве случаев изоэлектрическая точка находится в кис-
лой среде при pH 4—6, при этом белок обладает наименьшей рас-
творимостью и осаждение его происходит очень легко.
Молекулы белка представляют собой длинные полипептидные
цепи, образованные различными аминокислотами. Полипептидные
цепи состоят из аминокислот, как структурных единиц, или из мо-
номеров, которые объединяются в полимерную молекулу белка.
Около 22 природных аминокислот входят в состав белков. Из
22 аминокислот можно сделать огромное число сочетаний и по-
строить бесчисленное количество разнообразных белков.
Биосинтез белка является одной из важнейших проблем со-
временной биохимии, которая привлекает внимание многих хими-
ков, биохимиков и физиков. Эта проблема имеет огромное теоре-
тическое и практическое значение. Биосинтез белков осуществ-
ляется в рибосомах с помощью информационной РНК.
Белки состоят из остатков аминокислот, соединенных между
собой пептидными связями и образующих полипептидные цепи.
Впервые на наличие пептидной связи (—СО — NH2) в молекуле
белка указал русский ученый Л. Я. Данилевский.
В 1961 г. Э. Фишер осуществил синтез аланилаланина и пока-
зал, как связаны аминокислоты между собой в молекуле дипеп-
тида:
НООС—НС—СН3 =НООС—НС—СН3 +Н2О.
HNH4-OHOC— НС—СН3 HNOC—НС—СН3
nh2 nh2
22
Однако наибольшие успехи в определении структуры полипеп-
тидов белков были достигнуты за последние годы, когда были
установлены структуры нескольких белков разной молекулярной
массы.
По данным Л. Полинга и Р. Кори, полипептидные связи рас-
полагаются в белковой глобуле белка в виде спирали, отдельные
цепи которых соединены между собой водородными связями, бла-
годаря чему сохраняется спиральная сс-структура. Помимо водо-
родных связей, существуют дисульфидные, ионные, а также гид-
рофобные, которые располагаются в пространстве. При этом они
имеют соответствующую конформацию. В зависимости от харак-
тера связей и степени спирализации полипептидной цепочки и
расположения ее в пространстве различают первичную, вторич-
ную, третичную и четвертичную структуру белковой молекулы.
Под первичной структурой следует понимать число и последо-
вательность остатков аминокислот, связанных пептидными связя-
ми. В белках с большей молекулярной массой имеются и другие
факторы, приводящие к образованию вторичной, третичной и чет-
вертичной структур, в значительной степени влияющих на хими-
ческие и физические свойства. Вторичная структура белка харак-
теризуется водородными связями между полипептидными цепоч-
ками, в результате возникает спиральная структура молекулы.
Третичная структура основана на дисульфидных связях, т. е. на
связях между двумя половинами остатков цистина. В четвертич-
ной структуре содержится несколько полипептидных связей, сое-
диненных между собой водородными, ионными или солевыми свя-
зями — это так называемые гидрофобные связи.
Структура белковой молекулы определяет биологические свой-
ства белка — его ферментативную активность.
Белки делят на две группы: протеины, или простые белки, и
протеиды — сложные белки. В состав протеинов входят только
остатки аминокислот. К ним относятся альбумины, глобулины,
чглютамины, проламины, глютелины, гистоны. Протеиды являют-
ся сложными соединениями протеинов с другими веществами не-
белкодой природы. Обычно небелковый компонент называют
простетической группой, и в зависимости от ее химического соста-
ва различают следующие протеиды: гликопротеиды (в состав про-
стетической группы входит углевод), липопротеиды (простетиче-
ская группа является жироподобным веществом), нуклеопротеи-
ды (белок связан с нуклеиновой кислотой, играющей важную
роль в жизнедеятельности организма, в частности в явлениях на-
следственности) .
Следует считать, что к протеидам относятся и ферменты ви-
нограда, которые имеют большое значение в биохимии и техно-
логии вина.
Белки винограда и вина в основном представлены протеидами,
большинство которых обладает ферментативной активностью.
К числу таких протеидов относятся гликопротеиды, в углеводную
23
фракцию которых входят глюкоза, фруктоза, манноза, ксилоза, га-
лактоза, рамноза и фукоза.
Исследования, проведенные в последние годы, показали, что в
белковую молекулу ягод винограда входят 18 аминокислот [98].
В табл. 2 приведено содержание аминокислот в гидролизатах
белка пяти сортов винограда.
Таблица 2
КОЛИЧЕСТВО АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКАХ ВИНОГРАДА РАЗНЫХ СОРТОВ
\ (В МГ/КГ)
Аминокислота Каберне Гричнолино Мальвазия Рислинг Семильон
а-Аланин 10,4 9,7 7,8 10,1 11,7
р-Аланин 3,8 2,9 3,7 1,9 1,5
Аргинин 1,1 0,7 0,9 0,6 0,9
Аспарагиновая 15,8 17,6 18,0 15,7 18,3
кислота
Цистеин 2,9 2,5 2,2 1,7 1,5
Глютаминовая кис- 10,5 10,0 9,7 11,2 11,0
лота
Глицин 9,5 8,6 8,3 8,0 8,9
Гистидин 1,1 0,7 1,0 0,6 7,0
Изолейцин 2,2 2,1 1,4 2,4 2,0
Лейцин 4,2 4,3 4,1 5,0 6,1
Лизин 1,6 1,8 0,9 1,3 1,4
Метионин 0,2 0,2 0,2 0,6 0,6
Фенилаланин 2,7 2,9 2,8 4,3 4,7
Пролин 3,3 3,4 6,9 7,8 3,4
Серин 13,4 14,6 15,4 6,9 7,5
Триптофан 4<7 8,6 9,2 12,0 12,0
Тирозин 4,4 4,3 4,1 5,6 4,4
Валин 3,3 3,6 3,2 4,3 3,4
В белках винограда в наибольшем количестве встречаются а-
аланин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты, серин и трипто-
фан, в наименьшем — аргинин, гистидин и метионин.
Белковые вещества винограда довольно разнообразны и со-
держат несколько фракций. Первые исследования по изучению ге-
терогенности белков винограда были проведены В. Димайером и
И. Кохом методом электрофореза в 1962 г. Согласно их данным,,
белки состоят из нескольких фракций, причем две из них являют-
ся главными, по отношению к теплу одна фракция является ла-
бильной.
Р. Моретти и X. Берг (1965) методом электрофореза на поли-
акриламидном геле в присутствии трисглицеринового буфера е
pH 8,3 разделили белок виноградного сока на пять фракций. Мо-
лекулярная масса выделенных фракций колебалась от 18 000 до-
2300015, изоэлектрическая точка белка варьировала от pH 3,5 до-
pH 3,7.
Более глубокие исследования были проведены Е. Н. Дату-
нашвили и Н. М. Павленко [23]. Они осаждали белки сульфатом
24
аммония, а затем фракционировали на колонке с сефадексом. Из
виноградного сока были выделены фракции, обладающие фермен-
тативной активностью. Исследования показали, что белок, выде-
ленный из винограда, гетерогенен. При электрофорезе на геле
агара он делится на 4—5 фракций, а в геле полиакриламида —
на 7—16. Показано также, что в препарате белка сорта Мускат
александрийский содержится 6% протеина, связанного с гексо-
зой, а в препарате белка сорта Семильон— 12,5%.
Методом электрофокусировки белков в полиакриламидном ге-
ле были определены изоэлектрические точки отдельных фракций
белков винограда сорта Мускат александрийский. В большинстве
случаев изоэлектрическая точка находится в зоне pH от 3,0 до 7,1.
Согласно данным Е. Н. Датунашвили и др., белки винограда
имеют относительно невысокую молекулярную массу. Низкомоле-
кулярные фракции обладают молекулярной массой около 10 000,
а более высокомолекулярные от 24 000 до 47 000D [26].
При переработке винограда содержание белковых веществ из-
меняется в зависимости от технологии. Сусло, полученное прессо-
ванием, содержит больше белков, чем сусло, полученное само-
теком.
Тепловая обработка виноградного сока и вина вызывает неко-
торое уменьшение белкового азота. Наши исследования показали,
что обработка вина бентонитом значительно снижает содержание
бел’ков. При брожении сусла содержание белков заметно умень-
шается.
Нуклеиновые кислоты
Известно, что в живой клетке существует два вида нуклеино-
вых кислот. Одна из них — рибонуклеиновая кислота (РНК) —
находится в клеточной цитоплазме, другая — дезоксирибонуклеи-
новая кислота (ДНК)—локализована в ядре или в ядерной об-
ласти. Химически они отличаются друг от друга тем, что РНК со-
держит рибозу, а ДНК — дезоксирибозу и тимин. Биологическая
£оль РНК заключается в том, что существует прямая связь меж-
ду количеством цитоплазматической РНК и интенсивностью син-
теза белка в клетке. Установлено, что роль нуклеиновых кислот
сводится к регуляции синтеза белка и передаче наследственных
признаков. В последовательности передачи нуклеотидов ДНК со-
держится наследственная информация. Расшифровка механизма
передачи наследственных свойств является одним из важнейших
открытий XX в.
Нуклеиновые кислоты представляют собой полимерные соеди-
нения, главными строительными блоками которых являются ну-
клеотиды.
Было доказано, что рибосомы являются структурными части-
цами, в которых происходит непосредственный синтез белка. Это
позволило А. Н. Белозерскому и А. С. Спирину предположить
(1957) существование особого вида клеточной РНК, которую они
25
назвали информационной. Согласно этой гипотезе, они считали,
что информация с определенного участка молекулы ДНК перепи-
сывается (транскрибируется) в нуклеотидную последовательность
молекулы информационной РНК. Эта РНК перемещается в цито-
плазму, связывается с рибосомами, содержащими собственную
рибосомальную РНК, и уже с информационной РНК в рибосоме
осуществляется перевод (трансляция) генетической информации
в определенную последовательность аминокислотных остатков мо-
лекулы белка.
Было показано; что рибосомальная и транспортная РНК так-
же транскрибируется с определенных участков ДНК-матрицы.
Изучение механизма транскрипции показало, что в качестве ма-
трицы активна только одна нить двухцепочечной ДНК. Фермент,
катализирующий синтез информационной РНК на ДНК-матрице,
был обнаружен в 1960 г. и назван ДНК-зависимой-РНК-полиме-
разой.
В клетке одной нити РНК рибосомы могут прикрепляться од-
на к другой последовательно, в результате чего РНК-матрица ис-
пользуется для одновременного синтеза сразу нескольких поли-
пептидных цепей.
Комплексы, образуемые молекулой и РНК, расположенными на
рибосомах, называются полисомами.
Исследования по биосинтезу белка позволили раскрыть су-
щественные стороны этого сложного многоступенчатого процесса
и выявить участие в нем различных клеточных структур и мета-
болитов. Однако механизм образования многих его звеньев все
еще остается невскрытым.
. В последнее время большое внимание уделяют нуклеиновым
кислотам и белкам виноградной лозы и ягод винограда.
Р. М. Саакян и Л. М. Карапетян установили, что основная
масса нуклеиновых кислот в листьях винограда и семенах ягод
представлена РНК. Содержание РНК в листьях колеблется от
0,32 до 4,52%, а в семенах от 1,2 до 2,9%. Авторам не удалось в
течение вегетационного периода обнаружить в лозе ДНК. Однако
С. Стоян, Н. Теодор и В. Карбо нашли ДЙК в семенах виногра-
да в количестве от 7,54 до 16,2 мг%, а РНК в количестве от 45,37
до 204,44 мг%.
Исследования плавучей плотности ядерных ДНК винограда
североамериканской группы вида Vitis labruska, V. riparia, V. ru-
pestris, восточноазиатской группы Vitis amurensis и евразиатской
группы Vitis vinifera показали, что, несмотря на независимое раз-
витие этих видов, в течение долгого периода в различных усло-
виях внешней среды не произошло какого-либо значительного из-
менения нуклеотидного состава ядерных ДНК [9].
А. Бурде (1958) разделил 21 и идентифицировал 19 нуклеоти-
дов, среди которых обнаружены нуклеотид-3-монофосфат, нуклео-
тид-5-монофосфат.
Содержание азота, по данным других авторов, в нуклеотидах в
вине составляет 14% от общего азота [147].
26
Амины и амиды
В результате исследований винограда и вина наряду с амино-
кислотами и белками в сусле и вине были обнаружены и другие
азотистые вещества. Было установлено, что амины составляют
примерно 1—5% общего количества азотистых веществ, которые
образуются путем энзиматического расщепления аминокислот.
Одним из путей образования аминов является декарбоксилирова-
ние аминокислот по схеме:
R—CH—NH2— СООН
Аминокислота
Декарбоксилаза
---------------> R_CHNH? + СО2
Пиридоксаль Амин"
В литературе имеется лишь несколько работ, свидетельствую-
щих о наличии аминов в сусле и вине.
Ф. Драверт [109] с помощью газожидкостной, тонкослойной и
бумажной хроматографии идентифицировал в вине 10 аминов:
метиламин, этиламин, н-пропиламин, изопропиламин, н-бутила-
мин, изобутиламин, н-амиламин, изоамиламин, р-фенилэтиламин,
пиролидин.
В вине также были найдены гистамин, диэтиламин, диметила-
мин. Содержание гистамина в белых винах колеблется от 0,3 до
5,5 мг/л. Он образуется в результате действия молочнокислых
бактерий, так как дрожжи не способны синтезировать гиста-
мин [122].
В винах были идентифицированы гексиламин, бензиламин,
путресцин и кадаверин. Установлено, что некоторые амины, осо-
бенно гистамин, являются биогенно активными веществами и
имеют большое физиологическое значение.
3. Н. Кишковский с сотрудниками [44] газохроматографите-
ским (методом обнаружил около 78 летучих азотистых оснований
в хересных винах, из них 46 впервые были найдены в вине.
Амиды играют важную роль в азотистом обмене веществ
В винограде в основном встречаются амиды аспарагиновой и глю-
таминовой кислот: аспарагин и глутамин.___
Содержание амидов в винограде составляет от 3 до 5%, а в
винах от 1 до 2%- В винах идентифицированы следующие амидыг
N-этилацетамид, N-2-метилбутилацетамид, Ы-(2-фенилэтил)-ацет
амид, N-[3-(метилтио)-пропил]-ацетамид и др. [165].
Среди амидов особое значение имеет ацетамид, который при
дает вину «мышиный тон». Ацетамид образуется при аминоаце
талазной реакции:
СН3—COSCoA + R—NH2 СН3—СО—NH—R4-C0ASH.
В винах содержатся также гексозамин (8,7—29,2 мг/л) и ме
ланоиды, количество которых колеблется в зависимости от типа
вина (5—75 мг/л).
Глава 3
ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ И ИХ МЕТАБОЛИЗМ
Органические кислоты широко распространены в раститель-
ном мире и играют важную роль в обмене веществ растений. Они
в значительных количествах содержатся в ягодах винограда и
представлены главным образом винной и яблочной кислотами.
Лимонной, янтарной, гликолевой, глиоксалевой, щавелевой и дру-
гих кислот в винограде значительно меньше. Благодаря создавае-
мой ими кислотности в сусле подавляется развитие болезнетвор-
ных микроорганизмов и создаются благоприятные условия для
деятельности винных дрожжей. Органические кислоты находятся
в определенных соотношениях с сахарами и этим обусловливают
приятное вкусовое ощущение.
Образование и превращения органических кислот
Органические кислоты образуются в процессе дыхания расте-
ний и являются продуктами неполного окисления сахаров и ами-
нокислот. Вместе с этим они могут служить исходным материа-
лом для биосинтеза углеводов, аминокислот, белков и эфиров.
Ниже приведена схема, которая показывает связь между угле-
водами, органическими кислотами и белками (цикл трикарбок-
сильных кислот).
В цикл трикарбоксильных кислот фактически входят и дикар-
боксильные кислоты. Следовательно, справедливо его назвать
циклом ди- и трикарбоксильных кислот. В этом цикле последова-
Пировиноградная
Углеводы
кислота
Аланин
Фосфоэнол-
пировиноградная
кислота
Ацетил-КоА
Лимонная кислота
\\
Днс-аконитовая кислота
Аспарагиновая
кислота
Щавелево-
уксусная
кислота
Изолимонная кислота
Щавелево-янтарная
кислота
Яблочная
кислота
Фумаровая
кислота
Сукцииил-
' КоА
а-Кетоглютаровая
кислота
Глутаминовая
кислота
28
тельно протекают окислительно-восстановительные реакции, в ко-
торых происходит перенос электронов, (водорода) под действием
специфических дегидрогеназ.
Вначале возникает фосфоэнолпировиноградная кислота из уг-
леводов, которая карбоксилируется в щавелевоуксусную кислоту
под действием фермента фосфоэнолпируваткарбоксилазы при уча-
стии аденозинтрифосфата (АТФ).
СН2=СОР—СООН+СО2 + АТФ ZT НООС—СН2—COz—СООН4-АДФ+2Ф.
Второй этап — это образование ацетил-КоА из пировиноград-
ной кислоты:
СН3—СО—COOH+HS ~ КоА+НАД ->СН3—СО ~ 5КоА+НАДН24-СО2.
Затем происходят конденсация ацетил-КоА со щавелевоуксус-
ной кислотой и образование лимонной кислоты. Эта реакция ка-
тализируется ферментом, который носит название энзима конден-
сации.
Лимонная кислота под действием фермента аконитазы превра-
щается в ццс-аконитовую кислоту, а ^ис-аконитовая — в изоли-
монную. Последняя кислота превращается в щавелевоянтарную в
присутствии фермента изоцитрикодегидрогеназы и НАДФ. Щаве-
левоянтарная кислота действием соответствующей карбоксилазы
декарбоксилируется в а-кетоглутаровую кислоту. Здесь происхо-
дит' переход от трикарбоксильных кислот к дикарбоксильным.
Очень сложным процессом является превращение а-кетоглута-
ровой кислоты в сукцинил-КоА, а затем в янтарную кислоту.
Сукцинил-КоА образуется при окислении а-кетоглутаровой кисло-
ты. Затем сукцинил-КоА превращается в янтарную кислоту. Для
этого требуются гуанизиндифосфат (ГДФ) и фосфор:
Сукцинил — КоА + ГДФ + Ф Сукцинат + ГТФ.
Г уанизинтрифосфат
Янтарная кислота под действием сукциндегидрогеназы превра-
щается в фумаровую. Последняя гидратируется в яблочную (в
присутствии фумаразы). В заключительной реакции яблочная
кислота дегидрируется в щавелевоуксусную. под действием мали-
кодегидрогеназы. На этом цикл замыкается. При каждом обороте
происходит отщепление трех молекул СО2 и пяти пар водородных
атомов, которые передаются цитохромоксидазной системе для
окисления в воду, при этом клетка получает энергию.
Суммарный итог окисления пировиноградной кислоты пред-
ставляется в следующем виде:
СН3 — СО — СООН + ЗН2О 4- 50 -> ЗСО2 + 5Н2О.
При окислении одной молекулы пировиноградной кислоты че-
рез цикл Кребса выделяется свободная энергия, равная
889,5 кДж/моль.
С помощью каталитического действия цикла Кребса осущест-
вляется окисление не только продуктов распада углеводов, но
также жиров и белков. Как видно из цикла ди- и трикарбоксиль-
29
ных кислот, образующиеся продукты распада белков — амино-
кислоты — входят в этот цикл. В результате прямого аминирова-
ния или переаминирования из кетокислот (пировиноградной, ща-
велевоуксусной, ос-кетоглутаровой) образуется целый ряд амино-
кислот (аланин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты, гисти-
дин, аргинин, тирозин, фенилаланин и др.).
Таким образом, при превращении отдельных органических кис-
лот образуются различные продукты, т. е. углеводный и белко-
вый обмен связываются в одно целое.
Почти все кислоты ди- и трикарбоксильных циклов встречают-
ся в винограде, за исключением ^нс-аконитовой и щавелевоянтар-
ной, которая в растительном мире еще не обнаружена.
Ф. Драверт и Г. Стефан (1965) исследовали биохимические и
физиологические процессы при созревании винограда. Они изуча-
ли превращения введенных меченых соединений С14-глюкозы,
С14-винной, С14-яблочной, С14-уксусной, С14-глютаминовой кислот
и С14О2 в созревающих ягодах винограда. Этим они установили
превращение винной и яблочной кислот. Винная кислота расхо-
дуется главным образом на дыхание, а яблочная, кроме дыхания,
идет еще и на образование сахаров, органических кислот и ами-
нокислот. Из глютаминной кислоты и глюкозы образуются вин-
ная и уксусная кислоты, уксусная потом превращается главным
образом в яблочную по циклу Кребса через ацетил-КоА.
Эти авторы считают, что количество яблочной кислоты в про-
цессе созревания значительно уменьшается.
Ф. Драверт и Г. Стефан (1966) вводили в виноград яблочную
кислоту, меченую в 3—С14, в начале его созревания и после 64 ч
выдержки в темноте нашли 25% меченого сахара.
До 1970 г. было проведено много работ дю изучению органи-
ческих кислот в процессе созревания винограда. К ним относятся
работы Н. М. Сисакяна, И. А. Егорова, Б. Л. Африкян; В. В. Виль-
ямса, В. М. Лозы и Е. Е. Елецкого; Л. Женевуа; Е. Пейно и
А. Мурье; Ж. Риберо-Гайона, М. Амерайна и А. Уинклера,
Ж. Карль и М. Ламазу-Бетбедера, 3. Никовой и др.
Исследования, проведенные в 1957 г. А. К. Родопуло на шам-
панских сортах, произрастающих в Грузинской ССР, показали,
что содержание органических кислот и углеводов в процессе соз-
ревания винограда изменяется (табл. 3).
Так, титруемая кислотность с 35,7 (20/VII) уменьшается к 5/Х
до 6,5 г/л7 В винограде, собранном 20/VII, в наибольшем количе-
стве содержатся винная и яблочная кислоты, а лимонная, янтар-
ная, щавелевая и пировиноградная кислоты — в незначительном
количестве.
В процессе созревания винограда количество винной и яблоч-
ной кислот значительно уменьшается, особенно яблочной. Очевид-
но, она сильнее, чем винная, окисляется и интенсивнее участвует
в окислительных процессах. Незначительно уменьшается содер-
жание янтарной и щавелевой кислот. Количество лимонной кис-
лоты в процессе созревания винограда все время увеличивается,
30
хотя это увеличение небольшое. При технической зрелости вино-
града (к 20/IX) содержание лимонной кислоты увеличивается и
достигает максимума, тогда как количество всех остальных кис-
лот уменьшается.
На основании полученных данных можно предположить, что
превращение органических кислот протекает по циклу ди- и три-
карбоксильных кислот.
Нами в винограде были найдены и дегидрогеназы яблочной,
лимонной и янтарной кислот, а также пировиноградная, щавеле-
воуксусная и а-кетоглутаровая кислоты.
Таблица 3
СОДЕРЖАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ
20/VII 2,3 35,7 13,9 15,58 0,256 0,250 0,180 0,0165 3,5 0,0
5/VIII 2,5 25,3 11,5 9,76 0,350 0,188 0,165 0,0170 25,6 0,2
20/VIII 2,8 15,9 8,22 6,37 0,325 0,168 0,125 0,0150 65,4 0,5
20/IX 3,0 10,5 6,35 3,23 0,365 0,123 0,105 0,150 145,6 7,4
5/X (стадия 3,2 6,5 4,2 1,85 0,260 0,065 0,055 0,012 157,6 8,4
физиологиче-
ской зрелости)
При физиологической зрелости винограда (к 5/Х) наблюдает-
ся уменьшение количества винной, яблочной, янтарной и щаве-
левой кислот, содержание лимонной также уменьшается. Следует
отметить, что по динамике накопления лимонной кислоты можно
определять техническую и физиологическую зрелость винограда.
Соотношение количества винной и яблочной кислот меняется в
ходе созревания. У незрелого винограда это соотношение состав-
ляет примерно единицу, а в процессе созревания оно увеличи-
вается. При технической зрелости соотношение между винной и
яблочной кислотами меньше 2, а при физиологической — боль-
ше 2.
М. Амерайн наблюдал, что в незрелом винограде соотношение
между винной и яблочной кислотами составляет от 0,7 до 1,2, а в
зрелом винограде больше 2 [97].
В последнее время изучались [92] функции отдельных кислот
в сусле и вине. При этом установили, что большое значение
имеет яблочная кислота. Другие исследователи считают, что при
созревании винограда и приготовлении вина имеет значение вин-
ная и яблочная кислоты. Содержание винной кислоты мало зави-
сит от климатических условий. Она микробиологически более ус-
31
тойчива и как наиболее сильная регулирует в вине соотношение
кислот и солей и, следовательно, концентрацию водородных
ионов, что и определяет ее значение при производстве вин. Яб-
лочная кислота имеет большее значение при созревании виногра-
да, чем при приготовлении вина, она играет важную роль в об-
мене веществ растения.
Т. Джонсон, С. Нагель [123] изучали содержание органиче-
ских кислот винограда сорта Фоси, Либерге, Конкорд, Шардоне
и Мюллер-Тургау, произрастающих в США. Результаты их иссле-
дований приведены в табл. 4.
Таблица 4
СОДЕРЖАНИЕ НЕКОТОРЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И ТИТРУЕМАЯ КИСЛОТНОСТЬ
В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ ВИНОГРАДА СОРТА ШАРДОНЕ
Дата анализа pH Масса ягод, г Кислота, г/100 г Титруемая кислотность, г/л
яблочная винная
11/VII 2,81 0,58 1,61 1,41 2,51
18/VII 2,90 0,65 1,79 1,54 2,49
25/VII 2,91 0,78 1,91 1,37 2,73
1/VIII 2,92 0,80 2,01 1,32 2,61
8/VIII 2,94 0,76 2,12 1,38 2,75
15/VIII 3,0 0,85 1,82 1,21 2,48
22/VIII 3,22 1,06 1,25 1,09 1,71
29/VIII 3,35 1,15 0,94 0,91 1,27
5/IX 3,44 1,27 0,93 0,925 1,20
12/IX 4,56 1,26 0,71 0,93 0,98
19/IX 3,60 1,31 0,68 0,95 0,88
Эти исследователи проводили анализы в ранней стадии завя-
зывания ягод (11/VII) и смогли показать, что в процессе роста
винограда содержание яблочной и винной кислот увеличивается.
Для сорта Шардоне это увеличение продолжается до 8/VIII, а
для сорта Мюллер-Тургау до 25/VII, после чего количество обеих
кислот уменьшается, при этом интенсивность падения неодинако-
ва. Количество яблочной кислоты уменьшается более интенсивно,
чем винной. Отмечено также, что в сорте Мюллер-Тургау умень-
шение количества яблочной кислоты происходит более интенсив-
но, чем в сорте Шардоне. Это свидетельствует о том, что сорт
Шардоне более кислотоустойчив, чем сорт Мюллер-Тургау, поэто-
му из него получаются высококачественные шампанские винома-
териалы. Сорт Мюллер-Тургау менее кислотоустойчив и из него
получаются хорошие крепленые марочные вина.
Титруемая кислотность также быстрее уменьшается у сорта
Мюллер-Тургау, поэтому в момент его созревания она меньше,
чем у сорта Шардоне.
Изменение содержания органических кислот зависит от сорта
винограда и экологических условий.
Таким образом, определяя скорость уменьшения количества
32
яблочной и винной кислот, а также изменение титруемой кислот-
ности, можно определять хозяйственную пригодность данного
сорта винограда для выбора типа приготовляемого из него вина.
Т. Джонсон и С. Нагель [123] изучали также содержание ли-
монной кислоты. Ее количество в винограде не превышает 2%, а
остальных кислот — 0,5% от общей кислотности. В процессе со-
зревания винограда pH увеличивается в зависимости от содержа-
ния в нем свободных кислот и их солей.
Из работ Ж. Риберо-Гайона, а также В. Клиевера и др. [126]
следует, что в районах с жарким климатом в винограде превали-
рует винная кислота, а в холодных, северных и высокогорных
районах накапливается яблочная кислота.
Влияние температуры на образование органических кислот и
углеводов долгое время оставалось неясным. Однако с примене-
нием изотопного ‘метода удалось этот вопрос разрешить. Вино-
градная лоза в процессе созревания ягод подвергалась действию
СВ * * * * * 14О2 и культивировалась как в темноте, так и на свету при тем-
пературе от 10 до 37°С. Было отмечено, что при низкой темпера-
туре (10—15°С) количество С14, входящего во фракцию органиче-
ских кислот, было в 2—3 раза больше, чем в ягодах, созревших
при температуре 30—37°С. Увеличение температуры с 10 до 25°С
приводит к накоплению Ci4 в винной и лимонной кислотах, но
при температуре 30—37°С количество его уменьшается, так как
накопление этих кислот идет медленнее.
Содержание яблочной кислоты в зеленых ягодах мало воз-
растает с повышением температуры от 10 до 25°С. Дальнейшее
повышение температуры вызвало уменьшение ее количества. Низ-
кие температуры ночью стимулируют образование органических
кислот, а высокие (30°С и выше) уменьшают. В зеленых ягодах
винограда углерод С14 преобладает в основном в органических
кислотах, в созревших ягодах около 80% его входит во фракцию
углеводов.
. Исходя из полученных данных можно заключить, что в зеле-
ных ягодах при температуре 10—15°С ночью происходит синтез
органических кислот, а при высокой температуре (30—37°С)
днем — синтез углеводов.
Винная кислота
В виноградной лозе и в ягодах винограда преобладает d-вин-
ная кислота. /-Винная кислота присутствует в значительных ко-
личествах в листьях Beuchina retuculata (до 50 г на 1 кг). Из
листьев можно получить довольно большие количества ее. Мезо-
винная кислота в растениях не встречается. Она образуется из
всех изомеров винной кислоты при кипячении их со щелочью.
По данным Ж. Риберо-Гайона, в молодых листьях и стеблях
виноградной лозы концентрация винной кислоты достигает 3,7%
на сухую массу. В зрелом винограде количество винной кислоты
2—993 33
колеблется от 0,2 до 1%. Виноград является единственным источ-
ником получения винной кислоты в промышленном масштабе.
По химическим свойствам все формы винной кислоты одинако-
вы, но отличаются рядом физических свойств (температурой плав-
ления, растворимостью и др.). Так, например, d- и /-винные кис-
лоты имеют температуру плавления 170°С, виноградная 240—
246° С, а мезовинная 140° С. Растворимость d- и /-винной кислот в.
воде выше, чем виноградной.
Поскольку винная кислота является двухосновной, она дает
два рода солей — кислые и средние. Кислая соль калия винной
кислоты (КНС4Н4О6) труднорастворима в воде и даже в вине,
вследствие чего в значительном количестве выпадает из вина в
осадок. Средняя соль калия винной кислоты (К2С4Н4О6), а также
средняя соль натрия хорошо растворимы в воде. При действии
едкой щелочи на кислую калийную соль винной кислоты обра-
зуется сегнетова соль (KNaC4H4O6-4H2O).
Растворимость солей винной кислоты (винный камень) в вине
зависит от содержания некоторых аминокислот (глицин, лейцин,
фенилаланин, аспарагиновая кислота) и особенно белковых ве-
ществ. Согласно данным С. Мончева, неодинаковая раствори-
мость винного камня в отдельных винах объясняется различием
в составе и количественном отношении аминокислот. Поэтому ви-
на, выдержанные на дрожжах, обладают большей стабильностью
к помутнениям.
Винная кислота и ее соли являются главным компонентом сус-
ла и вина. Значение их в том, что, обладая кислым вкусом, в со-
четании с сахаром они создают определенную вкусовую гар-
монию.
Винная кислота и ее соли создают кислую реакцию сусла и
вина и препятствуют развитию ряда микроорганизмов, портящих
вкус и аромат. С другой стороны, кислая среда способствует раз-
витию винных дрожжей, которые обладают более высокой кис-
лотовыносливостью и при pH 2,8—3,8 способны сбраживать
сахар.
Ж. Риберо-Гайон и П. Риберо-Гайон исследовали механизм
синтеза винной кислоты в листьях и ягодах винограда сорта Ка-
берне Совиньон. Ими было установлено, что при введении глю-
козы, меченой в разных положениях С14, меченая винная кислота
образовывалась только в ягодах, но когда вводили С14С>2 на свету,
то меченая винная кислота образовывалась и в ягодах и в
листьях.
К. Иамада, Т. Кодама, Т. Обата и Н. Такахаши [182] изуча-
ли механизм образования винной кислоты из глюкозы микробио-
логическим путем с помощью glucono bacterium Suboxidans. Вна-
чале глюкоза окисляется в глюконовую кислоту, которая затем
превращается в 2-кетоглютаровую и 5-кетоглютаровую. Послед-
няя распадается на винную и гликолевую кислоты.
По схеме Ж. Риберо-Гайона и др. из глюкозы образуется ке-
то-5-глюконовая кислота, которая превращается в альдегид вин-
34
ной кислоты, а затем окисляется в винную кислоту. При этом из
кето-5-глюконовой кислоты, кроме альдегида винной кислоты, об-
разуется еще гликолевый альдегид.
Впоследствии выяснилось, что 5-кетоглютаровая кислота обра-
зует винную и гликолевую кислоты, а 4-кетоглютаровая кислота
превращается в претартариковую кислоту, которая распадается
на винную и гликолевую, как это показано на схеме:
GOOH
н—С—ОН
,но—с—н
I
с=о
I
с=о
I
СН2ОН
СООН
н—С—ОН
но—i—н
с=о
н—с—он
сн2он
СООН
I
н—с—ОН
но—с—н
СООН
Винная кислота
4-Кетоглюконовая
кислота
Претартариковая
кислота
сно -
I
СН2ОН
Гликолевый
альдегид
СООН
I
СН2ОН
Гликолевая
кислота
Как видно из этой схемы, претартариковая кислота имеет
эфирную связь и легко гидролизуется с образованием винной
кислоты и гликолевого альдегида.
X. Руффнер и Д. Раст [162] показали другой путь образова-
ния винной кислоты в листьях и ягодах винограда. Они вводили
в листья и ягоды кроме меченой С14-глюкозы еще меченую С14-
глцколевую кислоту в отдельности. В случае применения меченой
С14-глюкозы была выделена’равномерно меченая винная, а при при-
менении меченой С14-гликолевой кислоты была получена винная
кислота, меченая с одним атомом углерода. В листьях винограда
меченая глюкоза была превращена через глюконат, в претартарико-
вую кислоту [1,2-диоксиэтил-/( + )-винная кислота], которая рас-
щепляется между С-4 и С-5, в результате, как было показано вы-
ше, образуются Z-винная и гликолевая кислоты.
В 1965 г. Ж. Риберо-Гайон установил наличие в ягодах вино-
града эфиров фенольных соединений с винной кислотой: моно-
каффеил, моно-р-кумарил и эфир феруил-й-винной кислоты.
В листьях винограда впервые был обнаружен моноэтиловый
эфир винной кислоты [174]. Этот эфир очень лабильное соедине-
ние и легко превращается в винную и яблочную кислоты.
С. Нагель и др. идентифицировали методом жидкостной хро-
матографии из винограда сложные эфиры оксикоричной и винной
кислот, а также кофейной, кумариновой и конифериловой кис-
лот [138].
2* 35
Винная кислота играет важную роль в ягодах винограда, а
также при технологии вина. Она участвует в дыхании и в обмене
веществ виноградной лозы. Винная кислота образует комплекс-
ную соль виннокислого железа, которая катализирует окисли-
тельно-восстановительные процессы, необходимые для созревания
вина. Первым продуктом окисления винной кислоты является
диоксифумаровая кислота. Она обладает восстанавливающими
свойствами, благодаря чему ускоряется созревание вина.
Диоксифумаровая кислота образуется также в винограде в
результате дегидрирования винной кислоты специфической дегид-
рогеназой винной кислоты в присутствии НАД.
Наши исследования показали, что в винограде содержится
оксидаза диоксифумаровой кислоты, которая окисляет ее в дике-
тоянтарную кислоту. Последняя легко декарбоксилируется в ме-
зоксалевую кислоту.
В дальнейшем мезоксалевая кислота путем окислительного
декарбоксилирования превращается в глиоксалевую. Все эти пре-
вращения винной кислоты можно представить по следующей
схеме:
Щавелево-уксусная Альдегид мезокеалевей
кислота
кислоты
Яблочная кислота
Мезоксалевая кислота
Ацетил-КоА
Глиоксалевая
кислота
Превращение винной кислоты
Слабой стороной этой схемы является восстановление щаве-
левоуксусной кислоты в мезовинную, хотя некоторые исследова-
тели считают, что такой путь возможен.
36
По представлению И. Вольфа, Т. Беннет-Кларка, К. Тимана
и С. Боннера органические кислоты возникают из углеводов, а
при созревании, наоборот, образование углеводов происходит за
счет реутилизации органических кислот. Однако вследствие низ-
кого уровня восстановленности винной кислоты (0,625) такой
прямой переход представляется очень сомнительным.
Винная кислота может превратиться в углеводы при дегидри-
ровании ее в диоксифумаровую. Последняя, декарбоксилируясь,
образует гликолевый альдегид. Согласно реакции Фантона, гли-
колевый альдегид обладает более высоким уровнем восстановлен-
ности (1), чем винная кислота.
Известно, что гликолевый альдегид может полимеризировать-
ся в углеводы.
Яблочная кислота
Эта кислота широко распространена в растительном мире, Со-
держание ее в незрелом винограде достигает 15—20 г/кг. В про-
цессе созревания оно быстро уменьшается и при технической зре-
лости снижается до 4, а при физиологической зрелости до 2 г/кг.
Объясняется это тем, что она очень лабильна.
Яблочная кислота участвует в дыхательных процессах, глав-
ным образом в обмене веществ винограда, и служит промежуточ-
ным продуктом при синтезе многих веществ, в том числе и угле-
водов. Яблочная кислота гйгроскопична, хорошо растворима в
воде, плохо — в спирте и еще хуже в диэтиловом эфире. Как дву-
основная она образует кислые и средние соли, из которых труд-
норастворима средняя кальциевая соль.
Темновую фиксацию углекислоты в яблочную могут осущест-
вить три энзиматические системы.
Маликоэнзим катализирует синтез яблочной кислоты согласно
реакции:
I
НАДФН2 + Мп2+
СН3 — СО — СООН + со2--------------> соон — СН2 — СНОН — соон.
Пировиноградная Маликоэнзим Яблочная кислота
кислота
Маликоэнзим приводит к образованию яблочной кислоты из
пировиноградной кислоты и углекислоты в ягодах винограда без
образования промежуточных продуктов [76].
Фермент фосфоэнолпируваткарбоксилаза катализирует карбок-
силирование энолпировиноградной кислоты в щавелевоуксусную.
Синтетаза яблочной кислоты катализирует конденсацию аце-
тил-К.оА и глиоксалевой кислоты в яблочную кислоту по схеме:
СООН — СОН + СН3 — GO ~ SKoA + Н2О -> СООН — СН2 — СНОН СООН •
Глиоксалевая Ацетил-КоА Яблочная кислота
кислота
37
Таким образом, в процессе созревания винограда яблочная
кислота дегидрируется маликодегидрогеназой в присутствии НАД
в щавелевоуксусную кислоту, которая декарбоксилируется в пи-
ровиноградную.
Обе эти кислоты были найдены в винограде в незначительном
количестве [76].
Совсем недавно К. Такимато и др. [174] с помощью меченых
атомов показали, что в ягодах винограда винная кислота превра-
щается в яблочную: сначала винная кислота распадается до
энолпировиноградной, которая легко карбоксилируется в щавеле-
воуксусную кислоту, а последняя восстанавливается в яблоч-
ную.
Механизм синтеза яблочной кислоты обнаружен в листьях и
ягодах винограда. В период завязывания ягод С14 в виде СО2
включается главным образом в яблочную и фумаровую кислоты.
В процессе роста и созревания ягод уменьшается удельная радио-
активность в органических кислотах и соответственно увеличи-
вается радиоактивность в углеводах. В период завязывания и
роста ягод основным продуктом фиксации С14О2 в темноте яв-
ляется яблочная кислота.
Ж. Риберо-Гайон исследовал механизм синтеза и превраще-
ния яблочной кислоты в зеленых ягодах винограда. Было показа-
но, что меченый С14О2 фиксируется в яблочной кислоте через кар-
боксилирование фосфоэнолпировиноградной кислоты. В этом про-
цессе участвует маликоэнзим [128]. При уменьшений яблочной
кислоты во время созревания винограда происходит деградация
этой кислоты, что сопровождается увеличением радиоактивности
углерода в глюкозе.
Таким образом, в незрелых ягодах наблюдается увеличение
фотосинтезирующего меченого углерода в органических кислотах,
при приближении к созреванию большинство. меченого углерода
включается в углеводы ягод.
Первоначальный распад органических кислот и аккумуляция
сахара происходят одновременно обычно через 6—9 недель после
цветения винограда, примерно в середине процесса созревания
ягод.
С увеличением температуры с 10 до 25°С в основном увеличи-
вается количество радиоактивного углерода в винной и лимонной
кислотах, а при высокой температуре (35°С) радиоактивность
этих кислот уменьшается. Относительная активность яблочной
кислоты в зеленых ягодах с повышением температуры мало уве-
личивается.
Исследования X. Руффнера и В. Клиевера [163] показали, что
синтезированные яблочная и фумаровая кислоты, меченные во
2-м и 3-м положении С14 и введенные в ягоды винограда, в отно-
сительно короткий срок включаются в глюкозу в том же поло-
жении.
Существует связь между циклом ди- и трикарбоксильных кис-
лот и глиоксалатным циклом, как это показано ниже:
38
Глиоксалевая
кислота
Яблочная
кислота
Фумаровая
кислота
Янтарная кислота
Ацетил-КоА
а-Кетоглютаровая
кислота
Щавелево-янтарная
кислота
щ авелево-
уксусная
кислота
Пировиноградная
кислота
Лимонная
кислота
Ацетил-КоА
Изолимонная кислота
Аконитовая
- кислота ;
Центральное место в этом цикле занимает щавелевоуксусная
кислота, которая, с одной стороны, конденсируется с ацетил-КоА
и образует лимонную кислоту, превращающуюся по циклу Креб-
са, а, с другой стороны, щавелевоуксусная кислота декарбокси-
лируется и образует пировиноградную кислоту. Она превращает-
ся в ацетил-КоА, который конденсируется с глиоксалевой кисло-
той и дает яблочную. Последняя дегидрируется в щавелевоуксус-
ную кислоту.
Лимонная кислота
Это трехосновная кислота. Она хорошо растворима в воде, ху-
же в спирте и эфире. Лимонная кислота встречается во многих
растениях, особенно много ее в плодах цитрусовых. Содержание
ёе в ягодах винограда достигает 0,5 мг/кг. Лимонная кислота бы-
ла найдена на всех стадиях созревания винограда (от 0,2 до
0,4 г/кг). При технической зрелости винограда количество ее до-
стигает максимума, а при физиологической зрелости опять умень-
шается.
Биосинтез лимонной кислоты осуществляется ферментом цит-
ратсинтетазой. В синтезе участвуют ацетил-КоА и щавелевоук-
сусная кислота и при конденсации образуется лимонная кислота:
О ОН
J I
СООН — СН2 — СО — СООН 4- HSCH2 — С ~ SKoA + н2о -> сн2 — сн — сн2.
Щавелевоуксусная Ацетил-КоА I I |
кислота СООН СООН СООН
Лимонная кислота
Это единственный путь образования лимонной кислоты. При
производстве ее из сахарозы используются специальные штаммы
Aspergillus niger.
39
Янтарная кислота
Это двухосновная кислота. Она хорошо растворима в спирте и
воде, хуже — в диэтиловом эфире; в бензоле, бензине и хлоро-
форме нерастворима. При нагревании до 150°С теряет воду и
превращается в ангидрид.
Янтарная кислота содержится в винограде в незначительном
количестве (от 0,2 до 0,4 г на 1 кг винограда). В незрелом ви-
нограде ее больше. В процессе созревания количество ее умень-
шается. Видимо, янтарная кислота участвует в дыхании вино-
града в процессе его созревания. Она участвует в переносе во-
дорода в сукциноксидазной системе. Существует много путей
синтеза янтарной кислоты. Раньше предполагали (Т. Тунберг),
что янтарная кислота образуется путем дегидрирования и кон-
денсации двух молекул уксусной кислоты.
В настоящее время считают, что для того чтобы уксусная кис-
лота вступила в реакцию, она должна быть активирована дейст-
вием коэнзима-А. Образованный ацетил-КоА может конденсиро-
ваться в янтарную кислоту в присутствии АДФ, неорганического
фосфора и НАД. Реакция протекает следующим образом:
2СН3 — СО ~ SKoA + АДФ 4- Ф + НАД + Н2О д:
ХСООН — СН2 — сн2 — СООН 4- 2HS — КоА 4- 2АТФ 4- НАД• Н2.
Янтарная кислота
Янтарная кислота также может образовываться из глутамино-
вой и а-кетоглютаровой в результате окислительного дезамини-
рования.
Янтарная кислота очень устойчивое соединение, она не под-
вергается окислению даже царской водкой, однако легко дегид-
рируется сукциндегидрогеназой с образованием фумаровой кис-
лоты.
Фумаровая кислота
Эта кислота образуется путем дегидратации яблочной и дегид-
рированием янтарной кислот. В первом случае участвует фермент
фумараза, а во втором — сукциндегидрогеназа. Фумаровая кисло-
та была найдена в незрелом винограде.
Методом бумажной хроматографии мы показали, что она при-
сутствует в винограде и вине. Вместе с янтарной кислотой фума-
ровая кислота образует окислительно-восстановительную систему,
которая снижает редокспотенциал в винё.
Диоксифумаровая кислота
Эта кислота образуется из винной путем ее дегидрирования.
Реакция протекает в присутствии НАД и дегидрогеназы винной
кислоты, а также в присутствии двухвалентного железа:
соон — СНОН — СНОН — СООН 4- НАД Г
z СООН — СОН = СОН — СООН 4- НАД • Н2.
40
Диоксифумаровая кислота существует в двух формах: в эноль-
ной и кетоформе в зависимости от применяемого реактива. Эти
формы находятся в равновесии:
СООН — СОН = СОН — СООН СООН — СО — СНОН — СООН.
Диэнольная форма Кетоформа
Диэнольная форма обладает сильными восстановительными
свойствами и имеет низкий редокспотенциал. Это свойство харак-
терно для редуктонов. Диоксифумаровая кислота — неустойчивое
соединение, в водных растворах даже при комнатной температу-
ре распадается на СО2 и Н2. Распад усиливается в присутствии
железа и меди. В вине она появляется в результате окисления
винной кислоты солями тяжелых металлов, но быстро распадает-
ся в аэробных условиях, поэтому ее трудно обнаружить в вине.
Диоксифумаровая кислота участвует в обмене веществ при
созревании винограда. В молекуле диоксифумаровой кислоты со-
держатся две вторичные оксигруппы (“СОН = СОН-), которые
могут окисляться и восстанавливаться. Следовательно, эта кисло-
та может функционировать в роли переносчика водорода. Дио-
ксифумаровая кислота может служить промежуточным переносчи-
ком водорода с субстрата на кислород воздуха, выполняя такую
же функцию в биологическом окислении, как аскорбиновая кис-
лота.
Диоксифумаровая кислота в винограде содержится в незначи-
тельном количестве. Она служит катализатором окислительно-вос-
становительных процессов. Диоксифумаровая кислота легко окис-
ляется оксидазой диоксифумаровой кислоты. Поэтому в виногра-
де содержатся продукты ее распада: мезоксалевая, гликолевая и
глиоксалевая и щавелевая кислоты, как это было показано нами
в 1957 г.
Диоксифумаровая кислота играет важную роль в восстанови-
тельных процессах в виноделии. Она легко дегидрируется, отда-
вай два водорода для восстановления веществ, обусловливающих
букет вина, при этом вкус и букет вина улучшаются.
Гликолевая кислота
Эта оксикислота впервые была выделена в 1866 г. из зеленого
винограда Эрленмейером. Она была идентифицирована нами ме-
тодом хроматографии на бумаге в сортах винограда Чинури и Го-
рули Мцване. Гликолевая кислота образуется из диоксифумаро-
вой кислоты через оксипиройиноградную кислоту.
Гликолевая кислота легко окисляется оксидазой гликолевой
кислоты с образованием глиоксалевой кислоты и Н2О2 (П. А. Ко-
лесников, 1948). Образовавшаяся перекись водорода участвует в
окислительно-восстановительных процессах, в частности окисляет
глиоксалевую и щавелевую кислоты в муравьиную, углекислоту
и воду. Все продукты окисления глиоксалевой кислоты были най-
дены в винограде и вине.
41
Глиоксалевая кислота
Впервые была найдена в винограде в 1891 г. М. Ордоно. Она
образуется из винной путем глубокого окисления через диокси-
фумаровую кислоту. Последняя легко окисляется оксидазой диок-
сифумаровой кислоты в дикетоянтарную, которая, декарбоксили-
руясь, окисляется и образует глиоксалевую кислоту через альде-
гид мезоксалевой кислоты и мезоксалевую кислоту.
Глиоксалевая кислота в присутствии железа окисляется в ща-
велевую:
СООН — СОН 4- 1 /2О2 -> СООН — СООН.
Щавелевая кислота
Эта кислота кристаллизуется из воды в виде бесцветных бе-
лых кристаллов с двумя молекулами воды. Хорошо растворима в
воде и диэтиловом эфире, нерастворима в хлороформе. Щавеле-
вая кислота содержится в клеточной ткани незрелого винограда в
виде кристаллов. Некоторые ученые считают, что она не перехо-
дит в сусло, так как она плохо растворима в разбавленных рас-
творах органических кислот. Однако А. К. Родопуло показал, что
щавелевая кислота содержится в сусле в количестве от 0,05 до
0,1 г/л. Она не участвует в синтезе углеводов в растениях и на-
капливается в виде кристаллов.
В вине при интенсивном проветривании винная кислота распа-
дается до щавелевой через диоксифумаровую, дикетоянтарную,
мезоксалевую и глиоксалевую.
Щавелевая кислота в присутствии оксидазы щавелевой кисло-
ты легко окисляется до углекислоты и воды.
Пировиноградная кислота
Это бесцветная жидкость, имеющая запах уксусной кислоты.
В винограде встречается в незначительном количестве от 0,12 до
0,16 г/л. Как показали исследования И. А. Егорова и Н. Б. Бори-
совой в 1956 г., количество пировиноградной кислоты в вине и
шампанском значительно больше, так как она является промежу-
точным продуктом алкогольного брожения. В бордоских винах
она содержится в количестве от 20 до 70 мг/л.
а-Кетоглутаровая кислота
Образуется из глютаминовой кислоты, а также через цикл
трикарбоновых кислот. И. А. Егоров и Н. Борисова нашли а-кето-
глутаровую кислоту в шампанском в количестве от 15 до 40 мг/л.
И. Блуин и Е. Пейно показали, что количество а-кетоглутаро-
вой кислоты во французских винах колеблется в широких преде-
лах (от 2 до 341 мг/л).
42
Глава 4
ФЕРМЕНТЫ
Энзимология — наука о ферментах, так называемых биологи-
ческих катализаторах белковой природы, которые образуются в
любой живой клетке и обладают специфической способностью
активировать различные химические реакции.
Энзимы имеют большое практическое значение во многих от-
раслях промышленности и особенно в пищевых: винодельческой,
спиртовой, пивоваренной, производстве органических кислот, ви-
таминов и др. Свойства энзимов и механизм их действия привле-
кают к себе внимание химиков и технологов для разработки но-
вых технологических процессов при производстве различных пище-
вых продуктов. Для осуществления этих процессов необходимо
широко применять ферментные препараты.
В последнее время в США, ФРГ, СССР и других странах соз-
даны фирмы, выпускающие около 200 видов высококачественных
ферментных препаратов и кристаллических чистых ферментов.
Коферменты
Получение высокоочищенных ферментов дало возможность ус-
тановить, что многие из них являются двухкомпонентными и со-
стоят из белка и простетической группы, представляющей собой
производное ряда витаминов — это так называемые коэнзимы.
История коферментов начинается в начале XX в. Так, напри-
мер, А. Гарден и В. Юнг в 1905 г. обнаружили термостабильный
небелковый фактор, необходимый для брожения, получивший на-
звание козимазы.
Спустя 30 лет в лаборатории О. Варбурга была расшифрова-
на химическая природа коэнзима зимазы. Оказалось, что она со-
стоит из двух коэнзимов: НАД (никотинамидадениндинуклеотид)
и1 НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Действующим
началом в них является никотинамидное кольцо, участвующее в
окислительно-восстановительных реакциях.
Большое число дегидрогеназ, катализирующих важные процес-
сы метаболизма в живой клетке, содержат НАД и НАДФ. Эти
два кофермента участвуют в активном центре дегидрогеназ.
Анализ структуры коферментов и данные относительно их
взаимодействия со специфическими белками позволяют выделить
две функциональные группы: первая — ответственная за связыва-
ние с белком, т. е. с ферментом, вторая — обладает каталитиче-
ской активностью.
Специфичность и механизм действия ферментов
Специфичность ферментов в отличие от неорганических ката-
лизаторов огромна. Энзимы катализируют строго специфические
реакции. Если энзим катализирует превращение одного субстрата
43
то говорят, что он обладает абсолютной специфичностью. Если
фермент действует на ряд веществ, имеющих одинаковые атомные
группировки в молекуле субстрата, то такое действие называют
групповой специфичностью.
Например, пируватдекарбоксилаза, катализирующая декарбок-
силирование пировиноградной кислоты в уксусный альдегид и уг-
лекислоту, способна декарбоксилировать кетокислоты с более
длинной углеродной цепочкой (а-кетомасляную, а-кетовалериано-
вую и др.), но с меньшей скоростью. Пируватдекарбоксилаза дей-
ствует на одну и ту же группу субстратов, поэтому ее относят к
ферментам с групповой специфичностью.
Если фермент катализирует определенные типы реакций, то
считают, что он обладает специфичностью по отношению к опре-
деленным типам реакций. Примером могут служить эстеразы, ко-
торые катализируют распад сложных эфиров с образованием
жирной кислоты с более короткой углеродной цепочкой, в то вре-
мя как другие липазы быстрее катализируют распад сложных
эфиров, содержащих остатки жирных кислот с более длинной уг-
леродной цепью.
Если фермент катализирует превращение только одной стерео- -
химической формы субстрата, т. е. если он действует на опреде-
ленный оптический изомер одного и того же вещества, то это на-
зывают стереохимической специфичностью. Примером может слу-
жить дегидрогеназа молочной кислоты, которая дегидрирует лишь
/-молочную кислоту и не действует на ее d-форму.
В последнее время исследование структурных и функциональ-
ных основ энзиматического катализа, т. е. химической динамики
активных центров, является одной из новых и наиболее интерес-
ных областей современной молекулярной биологии. Недавно ста-
ло известно, что каталитические свойства ферментов обусловлены
молекулярно-физическими и химическими закономерностями, ко-
торые проявляются в особых условиях: в очень сложных структу-
рах макромолекул глобулярных белков.
Для полного изучения молекулярного механизма действия того
или иного фермента необходимо установить химическую топогра-
фию активного центра самого фермента и образуемых им проме-
жуточных комплексов. Наиболее точную информацию о структуре
активных центров ферментов дает рентгеноструктурное исследова-
ние кристаллов ферментов и комплексов, образуемых ими с суб-
стратоподобными ингибиторами.
По вопросу механизма действия ферментов известно, что вна-
чале образуется комплекс фермент—субстрат. Хотя это соедине-
ние лабильное и быстро распадается, все же благодаря примене-
нию специальной методики, при которой спектры поглощения ав-
томатически записываются, удалось за очень короткий промежу-
ток времени проследить за его образованием.
Японские биохимики К. Яги и Т. Озава получили кристалличе-
ский препарат комплекса фермента-субстрата для оксидазы а-
аминокислоты.
44
Для того чтобы установить как осуществляется каталитическое
действие ферментов, необходимо изучить различные функциональ-
ные группы и сопоставить полученные данные с результатами ис-
следования первичной, вторичной и третичной структуры фермент-
ных белков. Это даст возможность иметь представление об актив-
ном центре фермента.
Главной составной частью активного центра фермента являет-
ся так называемый каталитически активный участок, который
вступает в непосредственное взаимодействие с субстратом и об-
разует соединение фермент—субстрат.
Таким образом, действие фермента заключается в образовании
в активном центре комплекса фермент—субстрат и последующем
распределении электронов в этом комплексе, приводящем к фер-
ментативной реакции.
Для примера рассмотрим механизм действия пируватдекар-
боксилазы, которая содержится в дрожжах и играет важную роль
в образовании углекислоты в процессе алкогольного брожения.
В декарбоксилировании пировиноградной кислоты принимает уча-
стие тиаминпирофосфат, который состоит из пиримидинового ком-
плекса, тиазолового комплекса и остатка пирофосфорной кислоты.
ТиаминпирОфосфат участвует в декарбоксилировании пировино-
градной кислоты под действием пируватдекарбоксила'зы. Пирови-
ноградная кислота взаимодействует с тиазоловым компонентом
тиаминпирофосфата и образуется комплекс фермент—субстрат.
В дальнейшем происходит распределение электронов в этом ком-
плексе, и он становится лабильным и легко распадается с обра-
зованием углекислоты. После этого образуется новый комплекс
юксиэтилтиаминпирофосфат, который распадается на уксусный
^альдегид и на тиаминпирофосфат.
Для отделения молекулы уксусного альдегида от кофермента
лируватдекарбоксилазы необходимо разорвать довольно стабиль-.
ную ковалентную связь С—С. Главным в этом механизме являет-
ся 1 освобождение протона а-оксигруппы, что способствует отщеп-
лению альдегидного фрагмента. Скорость всей ферментативной
реакции зависит непосредственно от кислотности а-оксигруппы
или от способности последней отдавать свой протон.
Оксиэтилтиаминпирофосфат является активным ацетальдеги-
дом, который взаимодействует с липоевой кислотой в процессе
окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и
других кетокислот. Активный ацетальдегид участвует в конденса-
ции пировиноградной кислоты с образованием ацетомолочной кис-
лоты. Последняя, путем внутримолекулярной перегруппировки,
превращается в высшие спирты и аминокислоты.
Некоторые энзимологи сравнивают специфичность ферментов и
субстратов с ключом и замком. Так, например, Э. Фишер считает,
что фермент подходит к своему субстрату совершенно так же, как
ключ к замку. Он полагал, что фермент имеет строго определен-
ную структуру: если субстрат не подойдет к этой структуре, то в
этом случае фермент не действует.
45
Не так давно было высказано предположение, что конформа-
ция молекулы фермента и его активного центра могут изменять-
ся под влиянием коэнзима и субстрата, так как присоединение их
к ферменту может вызвать изменение конформации молекулы
фермента, а следовательно, его физико-химических свойств.
С другой стороны, считают, что действие ферментов обуслов-
лено снижением энергии активации, необходимой для протекания
данной энзиматической реакции. Например, разложение перекиси
водорода на кислород и воду (2Н2О2->2Н2О+О2) осуществляется
без фермента с затратой 18 тыс. малых калорий на 1 г-мол, а в
присутствии фермента каталазы — всего лишь до 1500 малых ка-
лорий. Из этого примера ясно, что фермент снижает энергию
активации.
Известно, что, для того чтобы молекулы действующих масс
вступили в реакцию, они должны быть активированы. Одним из
способов их активирования является повышение температуры.
При этом число молекул увеличивается, они находятся в актив-
ном состоянии и скорость реакции при этом повышается. Ско-
рость реакции можно поднять до оптимальной величины. При вы-
сокой температуре (выше 50°С) происходит снижение скорости
ферментативной реакции в результате разрушения белка, т. е.
происходит его денатурация. Исходя из этого, важным показате-
лем, характеризующим отношение белка к температуре, является
его термостабильность.
Известно, что для действия фермента необходима какая-то
определенная химическая группировка, которая бы характеризо-
вала его активность. Для действия фермента также может быть
необходима не одна активная химическая группировка, а несколь-
ко специфических групп, расположенных строго определенным об-
разом в молекуле фермента.
Для того чтобы узнать, какие специфические, и функциональ-
ные группы фермента участвуют в проявлении каталитического*
действия фермента, необходимо применить ингибиторы. Для ин-
гибирования окислительно-восстановительных ферментов, которые
содержат в своей молекуле железо и мёдь, применяют синильную
кислоту. Она ингибирует окислительные ферменты — каталазу,,
пероксидазу и цитохромоксидазу, — которые содержат в просте-
тической группе железо. Специфическим ингибитором является
диэтилдитиокарбамат. Ингибирующее действие оказывает на фер-
мент о-дифенолоксидаза, содержащая в своей молекуле медь.
Другим способом изучения активных функциональных групп
ферментов является химическая модификация: окисление функ-
циональной группы, замещение карбоксильной группы на эфир-
ную и др. Применяют также блокировку активных функциональ-
ных групп специфическим реактивом. Так, например, для блоки-
рования SH-группы ферментов применяется п-хлормеркурибен-
зоат. Например, лактатдегидрогеназу, которая содержит SH-rpyn-
пу, постепенно можно ингибировать, применяя различные дозы
/z-хлормеркурибензоата. Алкогольдегидрогеназа ингибируется п-
46
хлормеркурибензосульфонатом, так как содержит около 28 сво-
бодных SH-групп.
Таким образом, главным фактором эффективности и специфич-
ности ферментативного катализа является сложная структура
белковой молекулы фермента со свойственным ей многообразием
.активных функциональных групп.
Известно, что клетка имеет сложную структуру и содержит
разнообразные органеллы: ядра, митохондрии, пластиды, рибосо-
мы, лизосомы и др. При исследованиях, проведенных с помощью
электронного микроскопа, выяснено, что эти органеллы имеют
весьма сложную структуру. В живой клетке ферменты действуют
в сложной гетерогенной среде и значительная часть их связана
€ мембранами. Еще в 1947 г. А. И. Опарин впервые высказал
предположение, что действие ферментов зависит от структурной
организации протоплазмы. Согласно этой теории, ферменты в жи-
вой клетке частично находятся в свободном (растворенном) со-
стоянии, частично адсорбированы на поверхности протоплазмен-
ных структур. От состояния данного фермента в клетке зависит
направленность ферментативных процессов в организме.
В винограде и вине содержатся оксидоредуктазы и гидрола-
зы. К оксидоредуктазам относятся анаэробные и аэробные дегид-
рогеназы.
о-Дифенолоксидаза
Этот фермент (О2 = оксидоредуктаз а К.Ф. 1.10.3.1) является
одним из наиболее активных, встречающихся в ягодах винограда.
Фермент обладает способностью катализировать окисление не
только катехинов, но и других фенольных соединений, содержа-
щих 1-2- и 1-3-оксигруппу (ОН), пирокатехин и пирогаллол, а
также группу NH2 (ароматические аминокислоты и амины).
о-Дифенолоксидаза представляет собой белок, в простетиче-
ской группе которого содержится от 0,2 до 0,3% меди. Исследо-
вания показали, что медь, входящая в состав о-дифенолоксидазы,
сохраняется в закисном состоянии, как в отсутствии субстрата
при доступе кислорода, так и в присутствии субстрата (пирока*
техина) в атмосфере аргона и СО2.
Так, в 1965 г. Д. Картез показал, что медь в о-дифенолокси-
дазе находится в восстановленной форме как в ходе фермента-
тивной реакции, так и в состоянии покоя. Однако другие авторы
считают, что основное действие о-дифенолоксидазы состоит в об-
ратимом окислении одновалентного атома Си+ в двухвалентный
Си2+. Окислительное действие о-дифенолоксидазы заключается в
дегидрировании орто-дифенолов с образованием орто-хинонных
форм.
Характерной особенностью о-дифенолоксидазы является спо-
собность катализировать две реакции — окисление дифенолов и
гидроксилирование монофенолов. Следовательно, о-дифенолокси-
даза является не единственным ферментом, обладающим смешан-
47
ними функциями. Таким же свойством обладает риболозодифос-
фаткарбоксилаза.
В реакции гидроксилирования ОН-группа вводится в молекулу
субстрата в орто-положении. Этот процесс необходим для того,
чтобы превратить монофенолы в дифенолы, так как о-дифенолок-
сидаза окисляет дифенолы.
О механизме реакций, осуществляющих орто-гидроксилирова-
ние монофенолов, существует несколько мнений. Д. Картез счит
тает, что превращение монофенолов в орто-дифенолы осущест-
вляется с участием свободных ионов Си2+, не связанных с белком,
причем в роли активного гидроксилирующего агента выступает
хинон, согласйо схеме:
о-Дифенол -> о-Дифенолоксидаза -> о-Хинон;
о-Хинон + Монофенол + Н2О -> о-Дифенол.
По мнению Э. Мэзона (1966), о-дифенолоксидазная активность
определяется ионами меди, находящимися в окисленной форме
Си2+, т. к. проявление крезолазной активности не обусловлено
наличием восстановленной формы меди Си+. Это подтверждается
тем, что процесс внедрения второй оксигруппы в молекулы моно-
фенолов осуществляется, как правило, действием о-дифенолокси-
дазы в присутствии восстановителей (аскорбиновая кислота,
НАД-Н2 и НАДФ-Н2).
о-Дифенолоксидаза ингибируется диэтилдитиокарбоматом; это
свидетельствует о том, что фермент содержит в простетической
группе ион меди. Медь вступает в химическое соединение с ди-
этилдитиокарбоматом, который блокирует активную группу фер-
мента, в связи с чем сам фермент теряет активность. Однако, ди-
этилдитиокарбомат ингибирует также аскорбатоксидазу, поэтому
их трудно различить. Исходя из этого, для идентификации о-дифе-
нолоксидазы применяют купреин, который является специфическим
только для о-дифенолоксидазы. Этот фермент также ингибируется
дихлордифлюрометаном.
В виноделии для прекращения окислительных процессов о-ди-
фенолоксидазу обычно ингибируют введением сернистого ангидрида
или нагреванием.
Впервые о-дифенолоксидаза была выделена из картофеля
Ф. Кубовице, а затем из листьев чайного куста М. А. Бокучавой
и др., а из винограда С. В. Дурмишидзе и А. К. Родопуло. Не-
давно М. Кидрон, Е. Харель и А. Мауер [124] выделили о-дифе-
нолоксидазу из винограда. Этот энзим был очищен 334 раза с вы-
ходом 30%. Его молекулярная масса 80 000D определена методам
седиментации. Содержание меди не превышает одного атома на
одну молекулу фермента. о-Дифенолоксидаза в большом коли-
честве содержит аспарагиновую кислоту, затем глютаминовую,
пролин и аланин.
о-Дифенолоксидаза найдена в хлоропластах и митохондриях
48
листьев винограда. Удельная активность ее в хлоропластах в
4 раза больше, чем в митохондриях [70].
Механизм инактивации о-дифенолоксидазы все еще не выяс-
нен. Одни авторы считают, что в результате действия фермента
на полифенолы образуются хиноны, которые являются токсичны-
ми веществами, потому что дубят белки, и фермент, являясь бел-
ком, инактивируется. Другие считают, что о-дифенолоксидаза
быстро окисляет пирокатехин и инактивируется продуктами его
окисления. Некоторые утверждают, что механизм инактивации
заключается в том, что хиноны взаимодействуют со свободными
аминогруппами фермента и он при этом инактивируется.
Исследования X. Робертса и Ф. Вуда, проведенные в 1955 г.,,
показали, что при действии о-дифенолоксидазы на пирокатехин
количество поглощенного кислорода составляло до двух атомов
на одну молекулу.
На основании этого можно было считать, что реакция окисле-
ния пирокатехина протекает следующим образом:
сбн4 (ОН)2 + 02 -> сбн4о2 + н202.
Между тем известно, что перекись водорода не образуется. Исхо-
дя из этого можно утверждать, что реакция протекает по схеме
Iй S
НС^ ^с—ОН +1/2О2 нс >5=0
11 I -----------* II I
нс. ^сн нс^сн
сн СН
Пирокатехин о-Хинон
Как видно, эта ферментативная система является одной из
главных окислительных систем, катализирующих конечный этап
оксибиотического процесса.
За последнее время многие ученые отрицают роль о-дифенол-
оксидазы как терминальной дыхательной системы. Одним из ар-
гументов того, что этот фермент не участвует в нормальном про-
цессе дыхания, является отсутствие его сопряжения с системой
запасания энергии. Так, при окислении НАД-Н2 в о-дифенолокси-
дазной системе макроэргические связи не образуются и клетки
теряют эту энергию. Исходя из этого считают, что в дыхании рас-
тений завершающим ферментом является цитохромоксидаза.
Наиболее подробно активность о-дифенолоксидазы изучали
Н. М. Сисакян, И. А. Егоров и Б. Л. Африкян (1948), С. В. Дурми-
шидзе [29], А. К. Родопуло [75]. Эти авторы нашли в армянских
и грузинских сортах винограда о-дифенолоксидазу, активность
которой в процессе вегетации виноградной лозы и созревания ягод
винограда увеличивается.
4$
В настоящее время известно, что большинство ферментов су-
ществуют в одном и том же организме в виде молекулярных
форм, т. е. в виде изоэнзимов. Этому явлению придают большое
биологическое значение. о-Дифенолоксидаза является полиморф-
ным ферментом с двойной функцией. Она катализирует ортогид-
роксилиро*вание монофенолов и окисление орто-дифенолов.
С. В. Дурмишидзе, О. Т. Хачидзе, Г. И. Пруидзе [30] методом
диск-электрофореза в полиакриламидном геле исследовали изо-
ферментный состав о-дифенолоксидазы в разных органах вино-
градной лозы. Интересным является изменение состава изофер-
ментов о-дифенолоксидазы по фазам развития гроздей. Так, на-
пример, при завязывании ягод сорта Ркацители было обнаружено
3, а в гребнях 6 изоферментов. В фазе роста в семенах и кожи-
це изоферментный состав меняется. В кожице винограда появи-
лись новые изоферменты.
Для изучения субстратной специфичности о-дифенолоксидазы
были выделены фракции и испытаны на окисление фенолов. Вто-
рая фракция окисляет хлорогеновую и кофейную кислоты, (+)
катехин и пирокатехин с большей скоростью, чем остальные фрак-
ции. Выделенные фракции изоферментов о-дифенолоксидазы не
катализируют окисление /г-фенилендиамина, Z-тиразина, п-крезо-
ла, т. е. С. В. Дурмишидзе и его сотрудники показали, что о-ди-
фенолоксидаза встречается во всех органах виноградной лозы в
виде разных изоферментов.
В. Вольф [180] исследовал изоэнзимы о-дифенолоксидазы в
зеленых и спелых ягодах винограда сорта Каберне Совиньон. Им
было найдено шесть изоферментов, обладающих разной фермен-
тативной активностью.
Также показано, что с момента появления ягод до полного их
созревания активность о-дифенолоксидазы и количество феноль-
ных соединений быстро уменьшается в течение одного месяца, т. е.
с того момента, как масса ягод и сахаристость увеличиваются.
Аскорбатоксидаза
Этот фермент (О2-оксидоредуктаза К.Ф.1.10,3.3) широко рас-
пространен в растениях. Он относится также к медепротеидам.
Ферментативное окисление аскорбиновой кислоты было изуче-
но довольно детально, особенно в растительных объектах. В на-
стоящее время утверждают, что хотя существование специфиче-
ской аскорбатоксидазы можно считать доказанным, но все же,
кроме нее, имеются и другие ферментативные и неферментатив-
ные системы, каталитически окисляющие аскорбиновую кислоту.
При ферментативном окислении аскорбиновая кислота обратимо
окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту в присутствии аскор-
батоксидазы, образуя еще и воду. Аскорбиновая кислота легко
дегидрируется, отдавая два атома водорода. При вторичном окис-
лении за счет веществ, возникающих при окислении полифенолов
под действием о-дифенолоксидазы, возникают хиноны, которые
50
катализируют дегидрирование аскорбиновой кислоты. Поэтому ас-
корбиновая кислота окисляется не только аскорбатоксидазой, со-
держащейся в винограде, но и в основном хинонами (табл. 5).
ОКИСЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ Таблица 5 КИСЛОТЫ АСКОРБАТОКСИДАЗОЙ И ХИНОНАМИ
Состав смеси Количество О2 (в мкл), поглощенного через
15 мин 30 мин 60 мин 90 мин
Фермент, осажденный ацетоном 0,5 0,8 1,02 v 1,5
Фермент 4- аскорбиновая кис- лота ; 20,9 48,2 50,0 57,6
Фермент 4- пирокатехин 136,0 256,0 345,8 —
Фермент 4- пирокатехин 4- ас- корбиновая кислота 324,0 646,0 997,8 —
Виноградный сок 15,8 24,0 38,5 45,5
Виноградный сок 4- аскорбино- вая кислота 95,7 185,5 240,0 320,5
Растертый виноград 4- аскорби- новая кислота Г50,5 250,3 325,6 435,7
Растертый виноград 4- пирока- техин 4- аскорбиновая кисло- та 355,6 625,8 950,9 1250,8
Во всех опытах pH среды было 3,2. Фермент, осажденный аце-
тоном, почти не поглощает кислорода, но при добавлении к нему
аскорбиновой кислоты количество поглощенного кислорода за
-90 мин достигает 57,6 мкл.
Фермент + пирокатехин еще больше поглощает кислорода, так:
как осажденный фермент содержит не только аскорбатоксидазу, но
и о-дифенолоксидазу. При добавлении к этой системе аскорбиновой:
кислоты поглощение кислорода увеличивается почти в 3 раза,
т. е. в этом случае аскорбиновая кислота окисляется и аскорба-
токсидазой, и хинонами.
Виноградный сок поглощает за 90 мин до 45,6 мкл кислорода»
но при добавлении к нему аскорбиновой кислоты количество по-
глощенного кислорода увеличивается во много раз. Растертый
виноград еще больше поглощает кислорода, чем виноградный сок.
При добавлении к нему аскорбиновой кислоты поглощение кисло-
рода увеличивается примерно в 1,5 раза. При добавлении к этой
системе пирокатехина количество поглощенного кислорода увели-
чивается почти в 3 раза, т. е. и в этом случае аскорбиновая кис-
лота окисляется и аскорбатоксидазой, и хинонами.
Интересно отметить, что в системе растертый виноград + пиро-
катехин + аскорбиновая кислота поглощение кислорода сильно
возрастает. Объясняется это тем, что аскорбиновая кислота вос-
станавливает хиноны в полифенолы, поэтому при повторном их
окислении количество поглощенного кислорода увеличивается.
51
Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что очень незна-
чительное количество аскорбиновой кислоты окисляется фермен-
том аскорбатоксидазой.
Таким образом, наибольшее ее количество разрушается под
действием ферментативной системы о-дифенолоксидаза + полифе-
нол + хинон.
Помимо этой системы, существуют еще две системы: перокси-
дазная и цитохромоксидазная, которые также окисляют аскорби-
новую кислоту.
Впервые А. Сцент-Дьердьи высказал предположение, что ас-
корбиновая кислота обладает окислительно-восстановительными
свойствами и участвует в дыхании растений. Но это не нашло
подтверждения, пока Ф. Гопкинс и Е. Морган не установили, что
глютатион в присутствии редуктазы восстанавливает дегидроас-
корбиновую кислоту.
Позднее Л. Мансон подтвердил, что в растениях содержится
редуктаза глютатиона, которая переносит водород с глютатиона на
дегидроаскорбиновую кислоту.
Исследования X. Биверса показали, что в высших растениях
содержится энзим, который способен перенести электрон от
НАДФ-Н2 к монодегидроаскорбиновой кислоте, но не дегидроас-
корбиновой кислоте. Таким образом, аскорбиноксидаза не способ-
на непосредственно окислить глютатион, но в присутствии редукта-
зы дегидроаскорбиновой кислоты происходит непрерывное окисле-
ние глютатиона, при этом количество аскорбиновой кислоты не
уменьшается. Это продолжается до тех пор, пока не окислится весь
глютатион.
Равновесие системы: дегидроаскорбиновая кислота^глютатион
далеко сдвинуто в сторону восстановления. Следовательно, ско-
рость восстановления дегидроаскорбиновой кислоты в аскорбино-
вую гораздо выше, чем ее окисление..
Молочная, винная и гликолевая кислоты в присутствии- их де-
гидрогеназ также могут восстанавливать дегидроаскорбиновую
кислоту, но гораздо слабее, чем глютатион.
Дегидроаскорбиновая кислота присоединяет воду и превра-
щается в 2,3-дикетогулоновую кислоту, которая затем распадает-
ся на щавелевую и /-треоновую кислоты.
Совсем недавно М. Вильямс, К. Сайто, Ф. Лоусон [178] показа-
ли, что /-аскорбиновая кислота, меченная в положениях с|4
и С14 г 9
и Ч превращается в ягодах винограда в /-винную кислоту,
меченную в положениях С}4 и G^4, т. е. в гидроксильные груп-
пы, а также в щавелевую кислоту, меченную в положении С24»
как это показано в схеме превращения /-аскорбиновой кислоты.
Исследования П. Вильяма и С. Даусона, а также М. Лее и
С. Даусона [130] показали, что в простетическую группу аскор-
батоксидазы входит медь в двух формах — Си+ 75% и Си++ 25%.
Общее содержание меди в этом ферменте колеблется (0,46 +
+ 0,06%).
52
При каталитическом действии фермента происходят обратимые
изменения в структуре белковой части и переход Си++ в Си+ об-
разование этих комплексов не снижает активности фермента.
Было показано, что атомы Си+ находятся в той части фермен-
та, которая участвует в образовании перекиси водорода, возни-
кающей в результате вторичной неэнзиматической реакции. Пере-
кись водорода ингибирует аскорбатоксидазу, при этом голубая
окраска теряется.
нсхх—
носн
хххсн2он
I-Аскорбиновая кислота
2
о
хсоон
неон
НОСН
ххсоон
I “Винная кислот
соон
хххсоон
Щавелевая кислота
М. Лее и С. Даусон считают, что перекись водорода ингиби-
рует какие-то функциональные группы фермента, в результате
чего происходят изменения в его белковой части во время ката-
литического действия. При окислительно-восстановительных реак-
циях у аскорбатоксидазы валентность меди обратимо меняется.
При выдержке вина, сульфитированного из расчета 30 мг/л,
количество аскорбиновой кислоты в нем сохраняется до тех пор,
пока сернистая кислота присутствует в вине. После окисления
сернистой кислоты в серную аскорбиновая кислота начинает де-
гидрироваться в дегидроаскорбиновую киелрту. При долгой вы-
держке вина аскорбиновая кислота окисляется полностью, однако
продукты ее превращения в анаэробных условиях, такие, как, на-
пример, фурфурол, несколько улучшают его качество. Окисление
при доступе кислорода способствует накоплению перекиси водо-
рода, усиливающей окислительные процессы, ухудшающие каче-
ство вина.
Оксидаза диоксифумаровой кислоты
Диоксифумаровая кислота играет важную роль в биологиче-
ском окислении, так как в ее молекуле содержатся две вторичные
оксигруппы —СОН = СООН—, которые могут обратимо окис-
ляться и восстанавливаться. Поэтому диоксифумаровая кислота
может функционировать в роли переносчика водорода.
53
©ксидаза диоксифумаровой кислоты катализирует реакцию
окисления диоксифумаровой в дикетоянтарную кислоту.
Мы выделили оксидазу диоксифумаровой кислоты из свежего
виноградного сока осаждением сульфатом аммония или ацетоном.
Затем осажденный фермент диализовали против дистиллирован-
ной воды. Активность оксидазы диоксифумаровой кислоты опре-
деляли по количеству поглощенного кислорода в респирометрах
Варбурга. Результаты анализа приведены в табл. 6.
Из данных, приведенных в табл. 6, видно, что один фермент
не поглощает кислород. Кипяченый фермент с диоксифумаровой
Таблица 6
АКТИВНОСТЬ ОДСИДАЗЫ ДИОКСИФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ В ВИНОГРАДЕ
Состав смеси Количество 02 (в мкл О2 на 500 мг сухого вещества), поглощенного через
15 мин 30 мин 45 мин
Фермент 0 0 0
Кипяченый фермент + диоксифумаро- 133,0 182,0 205,0
вая кислота Диоксифумаровая кислота 129,0 175,0 202,0
Фермент + диоксифумаровая кислота 288,0 400,0 425,0'
То же + КСМ 325,0 508,0 —
кислотой за 45 мин поглощает 205 мкл кислорода. Примерно
столько же кислорода поглощает одна диоксифумаровая кислота
без фермента. Эта кислота в водных растворах неустойчива и
легко самопроизвольно окисляется.
Система фермент + диоксифумаровая кислота за 45 мин по-
глощает примерно в 2 раза больше кислорода, чем одна диокси-
фумаровая кислота. Эти данные свидетельствуют о том, что в;
винограде содержится оксидаза диоксифумаровой кислоты.
Этот фермент у некоторых растений ингибируется цианидом
калия. Однако наши данные противоречат этому. Так, например,,
оксидаза диоксифумаровой кислоты, выделенная из винограда, не
чувствительна к цианиду калия, который не ингибирует этот фер-
мент, а, напротив, стимулирует поглощение кислорода. Так, си-
стема фермент + диоксифумаровая кислота + цианид калия
(КСМ) поглощает больше кислорода за 30 мин (508 мкл), чем
система фермент + диоксифумаровая кислота (400 мкл). Оказы-
вается, что продукты окисления диоксифумаровой кислоты — гли-
колевый альдегид и глиоксалевая кислота — вступают в реакцию
с цианидом калия и образуют циангидриды, поэтому фермент и
не ингибируется.
Диоксифумаровая кислота подвергается самоокислению при
pH 6, Мп2+ катализирует окисление при действии супероксида
с образованием Мп3+. Окисление диоксифумаровой кислоты
также катализирует Си2+ при pH 6.
54
Опыт, проведенный с супероксидом дисмутазой и каталазой»
позволяет предположить, что здесь имеют место два типа окис-
ления: энзиматическое, зависящее от присутствия перекиси водо-
рода при пероксидазном окислении, и неэнзиматическое окисле-
ние, включая окисление диоксифумаровой кислоты под действием
о2-\
Влияние супероксида О2 ’ на окисление диоксифумаровой кис-
лоты наводит на мысль, что эта кислота восстанавливает О2 до
оГ’, который затем более легко реагирует с диоксифумаровой кис-
лотой по следующей схеме:
НООС — СОН = СОН — СООН + О2 [X] • + 07’;
2Н ч- 07 + НООС — СОН = СОН — СООН -> [X] • + Н2о2;
[X] • + 02 -> НООС — СО — СО — СООН 4- 07’,
где [X]- является свободным радикалом, образованным при по-
тере электрона диоксифумаровой кислотой [120].
Супероксид дисмутаза полностью восстанавливает соглас-
но схеме 2О7* + ->Н2О2, а каталаза разлагает перекись водо-
рода до воды и кислорода, благодаря этим процессам живые
клетки предохраняются от избыточного окисления.
Раствор диоксифумаровой кислоты при pH 6 содержит неко-
торые количества °7 и Н2О2. Поэтому диоксифумаровая кислота
в аэробных условиях легко подвергается самоокислению.
Цитохромоксидаза
I
Этот фермент (О2-оксидоредуктаза — 1.9.3.1) считается глав-
ным ферментом при дыхании растений, а цитохромоксидазная си-
стема — преобладающей и даже единственной окислительно-вос-
становительной системой, которая завершает дыхательный про-
цесс у животных, растений и дрожжей. Эта дыхательная система
способна синтезировать аденозинтрифосфат (АТФ), благодаря че-
му живая клетка приобретает энергию.
Цитохромоксидазная система сосредоточена в митохондриях,
которые являются «силовыми станциями» для аэробных клеток,
где образуется аденозинтрифосфат — «биологическое горючее».
При окислении одного моля НАД-Н2 через флавопротеин-ци-
тохромную систему происходит образование около трех молей
АТФ и клетка приобретает энергию, необходимую для ее жизни.
Исходя из этого, многие исследователи считают, что цитохромо-
ксидаза является терминальным ферментом дыхательной цепи.
Цитохромоксидаза и цитохромы были найдены во многих рас-
тениях, а также в органах виноградной лозы. Н. М. Сисакян и
55
И. И. Филонович обнаружили цитохромоксидазу в листьях вино-
града, О. Т. Хачидзе нашел активную цитохромоксидазу в пасоке
виноградной лозы, а также в молодых листьях и соцветиях. В ви-
ноградной ягоде она не обнаружена.
Ингибитором цитохромоксидазы является цианид калия.
Гликолатоксидаза
Этот фермент (гликолат: О2-оксидоредуктаза 1.1.3.1) найден в
зеленых листьях и появляется в этилированных растениях после
освещения и опрыскивания их глиоксалевой кислотой. Этот фер-
мент относится к флавиновым оксидазам и в качестве кофермен-
та содержит флавинмононуклеотид.
Впервые (в 1941 г.) гликолатоксидаза была выделена из зеле-
ных листьев растений П. А. Колесниковым. Она не ингибируется
цианидом и азидом натрия, а ингибируется йодистым ацетатом и,
следовательно, относится к флавиновым ферментам. Свойства
этих ферментов заключаются в том, что они переносят электроны
с субстрата непосредственно на молекулярный кислород с обра-
зованием перекиси водорода.
Ж. Боннер рассматривает окисление гликолевой кислоты по
следующей схеме:
Глиоксалат
Глиоксалат
В начале дегидрогеназа восстанавливает НАД+ в НАД-Н2г
затем редуктаза глиоксалевой кислоты восстанавливает глиокса-
левую кислоту в гликолевую и, наконец, оксидаза гликолевой
кислоты окисляет гликолевую кислоту в глиоксалевую с образо-
ванием перекиси водорода. В присутствии каталазы перекись во-
дорода разлагается на водород и кислород. В этой системе могут
окисляться этиловый спирт, нитриды и другие вещества. Гликоле-
вая кислота подвергается дальнейшему окислению до муравьиной
кислоты и углекислоты.
В зеленых листьях и ягодах винограда гликолатоксидаза была
найдена П. А. Колесниковым (1954). В зеленых листьях растений
гликолатоксидаза участвует в фотосинтезе. Совместное действие
этой оксидазы со специфической редуктазой глиоксалевой кисло-
ты позволяет предположить, что гликолатоксидаза выполняет роль
одной из терминальных оксидаз в биологическом окислении.
56
Глюкозооксидаза
Этот фермент (p-d-глюкоза: О2-оксидоредуктаза 1.1.3.4)
был найден в плесневых грибах, главным образом в Aspergillus
niger. Еще в 1904 г. Н. А. Максимов из мицелия этого гриба вы-
делил бесклеточный ферментный препарат, который легко окислял
глюкозу в глюконовую кислоту. Глюкозооксидаза получена в кри-
сталлическом виде, имеет молекулярную массу 186 000D, содер-
жит две молекулы флавинадениндинуклеотида.
Глюкозооксидаза катализирует окисление p-d-глюкозы с обра-
зованием p-d-глюконо-б-лактона; последний присоединяет воду и
спонтанно- превращается в глюконовую кислоту.
Механизм окисления глюкозы глюкозооксидазой был установ-
лен с помощью меченой воды. Было показано, что при окислении
P-d-глюкозы глюкозооксидазой образующаяся глюконовая кисло-
та не содержит меченого кислорода, это свидетельствует о том,
что сначала происходит дегидрирование p-d-глюкозы с образова-
нием p-d-глюконо-б-лактона и восстановление ФАД и ФАДН2.
Затем ФАДН2 присоединяет меченый кислород и образует пере-
кись водорода.
Глюкозооксидазу применяют в виноделии для связывания мо-
лекулярного кислорода в вине, что предупреждает окисление ком-
понентов. Однако появляющаяся при окислении глюкозы перекись
водорода вызывает переокисленность вина, и качество его ухуд-
шается. Добавление каталазы также не дает положительных ре-
зультатов, так как в той системе, где присутствуют флавиновый
фермент и каталаза, последняя действует как пероксидаза и окис-
лительные процессы усиливаются. При этом окисляются не толь-
ко альдегиды и спирты, а также фенольные соединения, вино
приобретает бурый цвет [142].
Исследования показали, что сернистая кислота легко реаги-
рует с перекисью водорода, при этом образуется серная кислота
и вода. Вторичные окислительные процессы, ухудшающие вкус и
букет вина, не возникают.
Таким образом, для регулирования окислительных процессов в
вине при применении глюкозооксидазы необходимо одновременно
добавлять небольшие дозы сернистой кислоты (не более 30 мг/л),
так как большие дозы ее могут инактивировать глюкозооксидазу.
Глюконовая кислота была обнаружена в калифорнийских ви-
нах [142]. Она образуется при применении винограда, заражен-
ного плесенью.
Пероксидаза и каталаза
Эти ферменты широко распространены в растительном и жи-
вотном мире.
Пероксидаза (Н2О2-оксидоредуктаза ЕС 1.11.1.7) каталй-
зирует в присутствии перекиси водорода окисление различных
57
органических соединений, фенолов, аминов, а также аскорбиновой
и диоксифумаровой кислот. Особенно активная пероксидаза со-
держится в корнях хрена, откуда и была выделена в кристалли-
ческом виде.
Активность пероксидазы была изучена основоположником эн-
зимологии в нашей стране А. Н. Бахом, который впервые разра-
ботал и применил метод определения активности пероксидазы.
Этот метод основан на окислении пирогаллола и последующем
количественном определении образующегося пурпурогаллина. Ис-
точником активного кислорода служит перекись водорода и ор-
ганические перекиси.
Разложение перекиси водорода осуществляется пероксидазой
по схеме:
Пероксидаза
Н2О2--------->н2о + о.
Выделяющийся при этой реакции активный кислород способен
окислять ряд органических и неорганических веществ. Перокси-
даза с перекисью водорода образует комплексное соединение, в
результате чего перекись активируется.
В винограде и в процессе его переработки активность перокси-
дазы проявляется в присутствии перекиси водорода, которая об-
разуется в результате действия флавопротеиновых ферментов.
В процессе ферментации сусла вначале действуют о-дифенолокси-
даза, аскорбатоксидаза, а затем флавопротеиновые ферменты —
гликолатоксидаза, а также оксидаза аминокислот. Два последних
фермента способны образовывать перекись водорода и подготав-
ливать среду для действия пероксидазы.
Каталаза (ЕС 1.11.1.7) обладает как каталазной, так и
пероксидазной активностью. Раньше полагали, что функция ката-
лазы ограничивается только разложением перекиси водорода до
О2 и Н2О. Б настоящее время установлена и другая важная
функция каталазы, заключающаяся в катализе окисления донато-
ров водорода перекисью водорода [72]. Так, например, каталаза
окисляет метанол, этанол и другие спирты, а также альдегиды
перекисью водорода. Каталаза действует пероксидативно при низ-
кой концентрации перекиси водорода [72] и при непрерывном по-
ступлении донаторов водорода.
Согласно данным Н. М. Сисакяна и его сотрудников (1948),
в винограде содержится активная пероксидаза. Ее активность в
период формирования листьев до цветения лозы увеличивается, в
начале созревания винограда уменьшается, а в период физиоло-
гической зрелости вновь возрастает.
Наши исследования показали, что активность пероксидазы и
каталазы в процессе брожения уменьшается. Оба фермента в ви-
не полностью инактивируются.
58
Анаэробные дегидрогеназы
К этой группе относятся ферменты, которые не способны не-
посредственно передавать водород кислороду, а отдают водород
какому-нибудь промежуточному переносчику, как, например, НАД,
НАДФ или другим.
Анаэробные дегидрогеназы являются двухкомпонентными фер-
ментами и легко диссоциируют при диализе, распадаясь на более
активные коферменты. Коферментами являются никотинамидаде-
ниндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат
(НАДФ). Эти коферменты очень реакционноспособны в окисли-
тельно-восстановительных системах. Они играют важную роль в
процессе алкогольного брожения.
В процессе последнего этапа алкогольного брожения в резуль-
тате декарбоксилирования пировиноградной кислоты и образова-
ния уксусного альдегида под действием алкогольдегидрогеназы в
уксусный альдегид передается водород от НАДН2 и образуется
этиловый спирт.
Пиридиновые дегидрогеназы, содержащие в качестве кофер-
ментов НАД и НАДФ, дегидрируют яблочную, молочную, изоли-
монную кислоты, глюкозу, различные спирты и другие соеди-
нения.
А. К. Родопуло [76] показал, что в ягодах винограда содер-
жатся активные дегидрогеназы яблочной, янтарной, лимонной и
винной кислот. В винограде действуют две ферментативные си-
стемы, которые приводят к синтезу и превращению яблочной кис-
лоты. В зеленых ягодах винограда содержится более активный
маликоэнзим (ЕС 1.1.1.40), синтезирующий яблочную кислоту из
пировиноградной и углекислоты. В более зрелых ягодах превали-
рует дегидрогеназа яблочной кислоты, которая дегидрирует эту
кислоту в щавелевоуксусную. В ягодах винограда также содер-
жатся декарбоксилаза пировиноградной и щавелевоуксусной кис-
лот [76].
Еще в 1962 г. мы показали, что в процессе созревания вино-
града яблочная кислота дегидрируется в щавелевоуксусную в при-
сутствии дегидрогеназы яблочной кислоты. Затем щавелевоуксус-
ная кислота декарбоксилируется в пировиноградную. Последняя
в виде фосфорных соединений превращается в углеводы [76].
Более глубокие исследования в этом направлении были про-
ведены А. Лаксо и В. Клиевером [128] и А. Руффнером и др.
[163, 146], которые также показали, что в ягодах винограда содер-
жатся два фермента: фосфоэнолпируваткарбоксилаза (ЕС. 4.1.1.31)
и фосфоэнолпируваткарбоксикиназа (ЕС. 4.1.1.32). Активность
первой сравнительно высока в течение всего периода созревания
винограда и достигает максимума через месяц после завязывания
ягод. Причем активность фосфоэнолпируваткарбоксилазы в 3—
4 раза выше, чем у фосфоэнолпируваткарбоксикиназы. Послед-
няя участвует в превращении щавелевоуксусной и пировиноград-
ной кислот в глюкозу и фруктозу [163].
59
Гидролазы
Эти ферменты катализируют реакцию гидролиза сложных сое-
динений на более простые. Это обширный класс ферментов, ко-
торый может быть подразделен на ряд подгрупп: эстеразы, про-
теазы, пептидазы, карбогидразы, fj-фруктофуронозидаза и др.
В винограде из гидролаз наиболее активны эстеразы. Ферменты,
катализирующие гидролиз пектиновых веществ, разделяются на
две группы: пектинметилэстеразы, катализирующие разрыв эфир-
ных связей в молекуле метоксилированных пектинов, и полигалак-
туроназы, которые расщепляют а-1,4-^-галактуроновые связи, сое-
диняющие остатки галактуроновой кислоты.
Согласно существующей номенклатуре ферментов, пектинэсте-
раза (ПЭ) называется пектингидролаза (3.1.1.11), а полигалак-
туроназа (ПГ) —полигалактуронидглюканогидролаза (3.2.1.15).
В начале действий протопектиназы * происходит расщепление
связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и
связанным с ней арабаном. При этом образуется свободная мето-
ксилированная полигалактуроновая кислота, так называемый рас-
творимый пектин.
Под действием пектинметилэстеразы происходит гидролитиче-
ское отщепление метоксильных групп от растворимого пектина с
образованием полигалактуроновой кислоты и метилового спирта.
Схема строения растворимого пектина и его ферментативного
гидролиза приведена ниже.
Арабан---------Метоксидированная полигалактуронс!.. _
кислота
Действие протопектиназы
Полигалактуроназа
не действует
Действием протопектиназы на арабан образуется метоксилиро-
ванная полигалактуроновая кислота, которая под действием пек-
тинметилэстеразы гидролизуется на метанол и полигалактуроно-
* До настоящего времени не была выделена в чистом виде, поэтому она не
входит в классификацию ферментов.
60
вую кислоту. Последняя под действием полигалактуроназы рас-
щепляется на остатки d-галактуроновой кислоты.
Механизм действия этих пектинрасщепляющих ферментов под-
робно изучен А. Демейном и X. Фаффбм, И. Блуемом и И. Барте,.
Л. Уссельо-Томассом и С. Тарантола, Е. Негре и Г. Марто и др.
Пектолитические ферменты имеют большое, значение в виноде-
лии, благодаря их действию выход сусла при прессовании вино-
града значительно увеличивается, ускоряется его осветление^
улучшается фильтрация вина.
В винограде содержатся пектолитические ферменты, но для
усиления гидролиза пектиновых веществ в практике применяют
ферментные препараты, получаемые из различных плесневых
грибов.
Р-Фруктофуранозидаза [ (p-d-фруктофуранозидфруктогидрола-
за, 3.2.1.26), ранее ее называли инвертазой, или сахарозой] ката-
лизирует расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу, при этом
разрывается связь, находящаяся у -р-глюкозидного углеродного
атома остатка фруктозы.
Наличие этого фермента в винограде было доказано исследо-
ваниями Н. М. Сисакяна, И. А. Егорова, Б. Л. Африкян еще
в 1948 г.
Наряду с гидролитической функцией р-фруктбфуранозидаза
обладает и синтетическим действием. Так, А. И. Опарин [66]
установил, что этот фермент способен синтезировать из фруктозы
и этилового спирта этилфруктозид. С. X. Абдуразакова [1] также
определила, что p-фруктофуранозидаза способна образовывать
гликозиды не только с этанолом, но и с другими спиртами. Ею и
сотрудниками были получены следующие алкилфруктозиды: бу-
тил, изобутил, амил, изоамилфруктозид, которые, как они счи-
тают, играют роль в формировании букета вина [1].
К гидролазам относится карбоксилэстераза (гидролаза эфиров
карбоновых кислот, ЕС 3.1.1.1) • катализирующая гидролиз слож-
ных эфиров карбоксильных кислот до спирта и кислоты, а также
осуществляющая и их синтез. Этот фермент широко распростра-
нен в микроорганизмах, в частности в дрожжах,и в растениях.
Наибольшей синтезирующей способностью обладает ацетатэстера-
за, которая содержится в активном состоянии в уксусных бакте-
риях и дрожжах.
p-d-Глюкозидглюкогидролаза (3.2.1.21) гидролизует p-d-глико-
зиды на d-глюкозу и спирт. Она найдена в винограде и вине, со-
держится также и в дрожжах.
К гидролитическим ферментам относятся также протеолитиче-
ские ферменты, которые гидролизуют пептидные связи. В виногра-
де эти ферменты не очень активны. Активность несколько воз-
растает в вине за счет выделения этих ферментов из дрожжей
при выдержке. Обычно протеолитические ферменты делят на про-
теиназы, гидролизующие белок до пептидов, и пептидазы, рас-
щепляющие пептиды .до аминокислот. Дрожжи содержат карбо-
ксипептидазу (3.4.2.3), катализирующую пептиды с С-концевыми
61
остатками глицина или лейцина. В своей молекуле карбоксипеп-
тидаза содержит Zn2+ и является металлсодержащим ферментом.
Протеолитические ферменты имеют большое значение в вино-
делии, так как гидролизуют белки и предотвращают белковые по-
мутнения. Учитывая это, для удаления белковых веществ вина
необходимо обрабатывать протеолитическими ферментами при на-
гревании до 40°С.
Исследования М. В. Гернета, В. Л. Яровенко, 3. Н. Кишков-
ского и Н. А. Мехузла (1967 г.) показали, что для гидролиза
белковых веществ лучше применять кислую протеиназу из Asper-
gillus flavus, так как она эффективно снижает содержание белка
в вине при pH 2—3.
Недавно Е. Н. Датунашвили и сотрудники [25] нашли в яго-
дах винограда р-1,4-эндоглюконазу. Действие этого фермента, не-
видимому, связано с метаболитической подвижностью глюкана.
За последнее время в винограде были найдены также карба-
моилфосфат [/-орнитинкарбамоилтрансфераза (2.1.3.3), Z-аргинин-
уреогидролаза (3.5.3.1)]; /-цитруллин [/-аспартатлигаза (6.3.45)] и
пектаттрансэлиминаза (4.2.99.3) [159, 160]. Последний фермент
относится к классу лиаз, он разрывает а-1,4-связи в молекуле
пектина не гидролитическим путем.
Глава 5
ВИТАМИНЫ
Кроме ферментов — биологических катализаторов — в приро-
де еще существуют органические соединения, присутствие кото-
рых даже в незначительных количествах влияет на самые важные
жизненные функции. Эти вещества называются витаминами. Бёз
них невозможен обмен веществ в организме, следовательно, не
может быть и жизни. !
Заслуживают внимания исследования, касающиеся изучения
биохимических свойств витаминов, их связи с ферментами, в част-
ности с функцией коферментов, участвующих в механизме обмена
веществ. Известно, что рибофлавин, амид никотиновой кислоты,
аскорбиновая и липоевая кислоты участвуют в окислительно-вос-
становительных процессах. Флавиновые коферменты [флавинаде-
ниндинуклеотид (ФАД) и флавинмононуклеотид (ФМД)] являют-
ся производными рибофлавина (витамин В2). Фермент пируват-
декарбоксилаза в качестве кофермента содержит витамин Bi (тиа-
мин). Известно, что в процессе декарбоксилирования принимает
участие не сам витамин Вь а тиаминпирофосфат (ТПФ), который
содержится в винных дрожжах и участвует в декарбоксилирова-
нии пировиноградной кислоты в уксусный альдегид и углекислоту.
К коферментам нуклеотидов относятся НАД+ и НАДФ+. НАД+
играет важную роль в окислительно-восстановительных процессах
и имеет большое значение в процессе спиртового и молочнокисло-
«2
го брожения. Эти коферменты активируют целый ряд дегидро-
геназ.
В ряд ферментов в качестве кофермента входит биотин, ко-
торый катализирует реакции активирования и переноса углекис-
лоты, т. е. реакции карбоксилирования пировиноградной кислоты
с образованием щавелевоуксусной.
Витамин В6 входит в состав различных ферментов в виде пи-
ридоксальфосфата. Кофермент пиридоксаль и его производные
входят в состав аминотрансфераз, которые переносят аминогруп-
пы из одного соединения в другое, т. е. участвуют в реакции пере-
аминирования.
Кобамидные ферменты содержат в качестве коферментов про-
изводные витамина Bi2.
Физиологическая ценность винограда зависит главным образом
от содержания в нем различных витаминов, большого количества*
глюкозы, а также органических кислот. Виноградное вино в этом
отношении занимает особое место среди пищевых продуктов. В ви-
нограде и виноградном вине содержится почти весь витаминный
комплекс, в котором нуждается человеческий организм. Связь
диетических свойств виноградных вин с их химическим составом
и содержанием витаминов описана Н. Н. Простосердовым еще
в 1944 г.
Витамин Bi (тиамин)
Впервые этот витамин был выделен в кристаллическом виде
из шелухи риса (1926 г.). Витамин Bi содержится также в дрож-
жах и был открыт, как действующее вещество. Витамин Bi легко
растворим в воде и разрушается щелочами.
В дрожжах содержится фосфоферраза, которая катализирует
перенос фосфатной группы с АТФ на тиамин, превращающий его
в тиаминпирофосфат. Помимо этого, тиаминпирофосфат участвует
в декарбоксилировании пировиноградной кислоты при алкоголь-
ном брожении и в превращении пировиноградной кислоты в аце-
тил-Ко А.
Растения и дрожжи способны синтезировать тиаминпирофос-
фат, а в организме человека он не синтезируется. Человек должен
получать этот витамин с пищей.
Исследования показали, что содержание витамина Bi в процес-
се созревания винограда увеличивается до 0,450 мг/кг.
Тиамин играет важную роль в алкогольном брожении, так как
служит коферментом пируватдекарбоксилазы, катализирующей
декарбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием
уксусного альдегида, который затем восстанавливается НАД-Н^
при действии алкогольдегидрогеназы.
По данным Н. М. Сисакяна, И. А. Егорова и Н. А. Пучковой
(1950 г.), количество витамина Bi в сусле колеблется от 0,175 до
0,266 мг/л, а после сбраживания и формирования вина — умень-
шается. Аналогичные данные были получены и А. Хэллом. Объяс-
63
няется. это тем, что большая часть витамина В! ассимилируется
дрожжами. При выдержке вина на осадке происходит автолиз
дрожжей и высвобождение витаминов, которые и накапливаются
в вине.
Исследования, проведенные нами совместно с Н. М. Сисакя-
ном, И. А. Егоровым, В. В. Агаповым и Н. Г. Саришвили (1961),
показали, что внесение дрожжей при шампанизации в резервуа-
рах способствует накоплению витаминов Bi и В2, количество ко-
торых увеличивается и достигает в опыте 0,74 мг/л, хотя, в кон-
троле их всего 0,12 мг/л.
Таким образом, при переработке винограда и выработке вино-
материала количество витамина Bi значительно уменьшается, а
при выдержке вина на дрожжах снова увеличивается.
Витамин В2 (рибофлавин)
Рибофлавин называют 6,7-диметил-9- (d-1 -рибитол) -изоаллок-
сазином, т. е. он является диметилизоаллоксазином, 4 к которому
в положении 9 присоединен многоатомный спирт — рибитол.
Флавинадениндинуклеотид (ФАД) является одним из перенос-
чиков водорода в дыхательной цепи. Центром, осуществляющим
перенос водорода, является флавинная часть молекулы.
Рибофлавин является окислительно-восстановительным аген-
том, редокспотенциал которого £о=О,185В при pH 7 и темпера-
туре 20°С.
Этерифицирование рибофлавина происходит в спиртовой груп-
пе рибитола. Эта фосфорилированная форма является физиоло-
гически активным веществом, которое действует в качестве коэн-
зима и в соединении со специфическим белком приобретает свой-
ства окислительно-восстановительного фермента (аэробной дегид-
рогеназы) .
Восстановленный флавин" (лейкофлавин) бесцветный, а окис-
ленный флавин окрашен в желтый цвет, поэтому Варбург назвал
его желтым ферментом.
Содержание витамина В2 в дрожжах значительно больше, чем
в винограде, соответственно 30—40 мкг/г и 0,136—92 мкг/кг.
Исследования Н. М. Сисакяна, И. А. Егорова и др. (1950 г.)
показали, что в армянских сортах винограда содержится от 0,136
до 0,18Гмг/кг витамина В2, а в винах, приготовленных из этих
сортов, — еще меньше (от 0,043 до 0,166 мг/л). По данным'
Б. А. Кудряшовой содержание витамина В2 в винограде колеб-
лется от 0,2 до 92 мг/кг. М. Смит нашел в винограде от 0,06 до
0,22 мг/л витамина В2. Работами Е. Пейно и С. Лафуркарда
установлено, что содержание рибофлавина в белых винах Бордо
достигает 0,152 мг/л, в красных — 0,362 мг/л. В процессе броже-
ния количество его несколько снижается, а при выдержке вина на .
дрожжах опять увеличивается. В выдержанных винах со време-
нем количество витамина В2 уменьшается.
64
Исследование 5 образцов белых и 8 красных калифорнийских
вин на содержание в них витаминов группы В показало, что в
красных винах витаминов больше, чем в белых; так, количество
рибофлавина, тиамина и ниацина в красных винах достигает со-
ответственно 370, 950 и 1100 мг/л [175].
(Витамин Be (пиридоксин)
Молекула витамина Вб состоит из пиридинового кольца, заме-
щенного метильной, гидроксильной и двумя оксиметильными
группами.
К витамину В6 относятся также пиридоксаль и пиридоксамин,
которые в живой клетке легко превращаются одно в другое и
участвуют в реакциях переаминирования, т. е. в реакциях превра-
щения аминокислот и кетокислот. Пиридоксальфосфат в качестве
кофермента участвует в процессе рацемизации аминокислот, а
также в декарбоксилировании аминокислот с образованием ами-
на и СО2.
Все эти реакции играют важную роль в обмене веществ в ор-
ганизме человека. Так, при недостатке витамина В6 начинается
шелушение кожи и появляется специфический дерматит.
Растения, в том числе и виноградная лоза, способны синтези-
ровать витамин Вб. Но больше всего витамина содержится в
дрожжах.
Исследования Е. Пейно и С. Лафуркада, проведенные в
1955 г., показали, что количество витамина В6 в процессе созре-
вания винограда возрастает, а при полной его зрелости умень-
шается. В виноградном соке содержится от 0,16 до 0,53 мг/л ви-
тамина В6. В процессе брожения количество его несколько умень-
шается, а затем начинает увеличиваться в результате автолиза
дрожжей. В винах содержание витамина В6 колеблется от 0,12
до 0,67 мг/л.
Витамин Вх (пантотеновая кислота)
Этот витамин широко распространен в растительном и живот-
ном мире, а также содержится в дрожжах. Пантотеновая кислота
входит в кофермент А. В состав кофермента А входят три моле-
кулы фосфата, две из которых образуют пирофосфат, а третья
соединена с рибозой.
Кофермент А является активным переносчиком остатков кис-
лот в виде ацетил ~ SKoA при синтезе лимонной кислоты.
Исследования Е. Пейно и С. Лафуркарда показали, что в яго-
дах винограда содержится от 0,5 до 1,38 мг/кг пантотеновой кис-
лоты, а в бордоских винах — от 0,5 до 1,24 мг/л. А. Хэлл и его
сотрудники находили в калифорнийских винах от 0,29 до 0,37 мг/л.
Н. И. Бурьян и Л. В. Тюрина показали, что количество панто-
теновой и никотиновой кислот, а также тиамина в столовых су-
хих винах зависит от технологии. При выдержке вин на дрожжах
3—993 65
количество витаминов в них увеличивается. Однако при долгой
выдержке без дрожжей содержание пантотеновой кислоты умень-
шается.
Витамин РР (никотиновая кислота)
Никотиновая кислота и ее амид являются антипелларгическим
витамином, обычно его называют пеллаграмин.
Никотиновая кислота устойчива к действию повышенной тем-
пературы и ряду других факторов. В живом организме она обра-
зуется из триптофана. В организме человека никотиновая кисло-
та легко превращается в ее амид. Оба эти вещества обладают ви-
таминной активностью.
В состав коферментов многих дегидрогеназ витамин РР вхо-
дит в форме динуклеотида, поэтому эти коферменты называют
пиридиндинуклеотидами. Они играют важную роль в окислитель-
но-восстановительных процессах.
В работах Е. М. Поповой и М. Г. Пучковой показано, что ко-
личество никотиновой кислоты в винах колеблется от 0,59 до
0,90 мг/л. Так, в шампанском, приготовленном бутылочным мето-
дом, содержится 1,27—1,48 мг/л витамина РР, а в резервуар-
ном— 0,72—0,91 мг/л. Объясняется это тем, что при трехгодич-
ной выдержке шампанского на дрожжах количество этого вита-
мина увеличивается в результате автолиза дрожжей.
Исследования И. Кэстера показали, что в калифорнийском ви-
нограде содержание никотиновой кислоты колеблется от 6,79 до
3,75 мг/кг. Никотиновую кислоту и ее амид исследовал С. Лафур-
кад в процессе созревания винограда и при брожении сусла, при-
готовленного из бордоских сортов винограда. При этом установ-
лено, что количество витамина РР в ходе созревания увеличивает-
ся на 15—20% и колеблется от 0,86 до 2,56 мг/кг; в среднем для
20 образцов винограда оно составляет 1,2 мг/л. Связанного вита-
мина РР всегда, немного больше, чем свободного. В процессе бро-
жения наблюдается уменьшение содержания никотинамида на
25—80%. По-видимому, дрожжи адсорбируют этот витамин. Осо-
бенно резко количество его уменьшается при проветривании вина,
так как в присутствии кислорода витамин РР быстро окисляется.
Несмотря на то что дрожжи способны синтезировать никотина-
мид, содержание его в винах никогда не достигает первоначаль-
ного уровня, т. е. содержания его в винограде и в сусле.
С. Лафуркад исследовал 82 образца вин. В белых винах со-
держание витамина РР колеблется от 0,44 до 1,32 (в среднем
0,82 мг/л), а в красных от 0,79 до 1,73 (в среднем h26 мг/л).
Аналогичные результаты были получены А. Хеллом и его сотруд-
никами.
Согласно другим данным, количество витамина РР при вы-
держке вйн не уменьшается (так, в 50-летних винах витамина РР
столько же, сколько в молодых).
66
Витамин М (фолиевая кислота)
Этот витамин состоит из молекулы птеридина, Л-аминобензой-
ной и глутаминовой кислот.
Фолиевая кислота участвует в перемещении одноуглеродистых
соединений, в синтезе нуклеиновых кислот и в реакции трансокси-
метилирования. Метильные группы необходимы для образования
многих биологически активных соединений, например, метионина,
тиамина, бетаина, холина и др.
Фолиевая кислота была обнаружена в винограде А. Н. Андрее-
вой и В. Н. Букиным в количестве 2,38 мг/кг. В вине ее содержит-
ся от 0,38 до 0,5 мг/л, а в шампанском 0,43 мг/л. В процессе вы-
держки шампанского на дрожжах, по-видимому, происходит обо-
гащение его фолиевой кислотой.
Витамин С (аскорбиновая кислота)
В 1928 г. А. Сцент-Дьердьи выделил из коры апельсинов ве-
щество, которое обладало значительной редуцирующей способ-
ностью. Он назвал это вещество гексуроновой кислотой. В 1932 г.
впервые была установлена идентичность витамина С с гексуро-
новой кислотой. Позднее А. Сцент-Дьердьи и Хеворт заменили
название гексуроновой кислоты на аскорбиновую.
Аскорбиновая кислота существует в природе в /-форме. Она
легко окисляется как ферментативным, так и неферментативным
путем. К таким ферментам относятся аскорбатоксидаза, перокси-
даза, о-дифенолоксидаза и цитохромоксидаза. Первая непосредст-
венно окисляет /-аскорбиновую кислоту в дегидроаскорбиновую.
Другие же ферменты окисляют ее через вторичные продукты
окисления. Так, например, о-дифенолоксидаза и пероксидаза вна-
чале окисляют полифенолы в хинон, а затем хинон дегидрирует
аскорбиновую кислоту в дегидроаскорбиновую, а сам восстанав-
ливается в полифенол.
При окислении аскорбиновой кислоты медью и железом обра-
зуется дегидроаскорбиновая кислота и перекись водорода. Дегид-
роаскорбиновая кислота восстанавливается глютатионом.
Аскорбиновая кислота легко отдает 2 атома водорода и дей-
ствует как переносчик водорода. На основании этого Ж. Тиль-
манс разработал методику определения аскорбиновой кислоты с
помощью титрования ее 2,6-дихлорфенолиндофенолом.
Первые определения аскорбиновой кислоты были проведены в
винограде А. А. Мержанианом и М. А. Герасимовым. Согласно
данным Н. М. Сисакяна, И. А. Егорова и Б. Л. Африкян, содер-
жание аскорбиновой кислоты в армянских сортах винограда ко-
леблется от 22,1 до 48 мг- %.
Исследования К. С. Попова показали, что в крымских сортах
винограда аскорбиновой кислоты содержится от 2 до 10,6 мг-%.
Еще меньше ее в югославских сортах винограда (от 2,2 до
3*
67
9,63 мг-%). Примерно столько же ее и в американских сортах
винограда.
Содержание аскорбиновой кислоты в ягодах винограда зави-
сит от условий ее определения. Так, если определение проводили
сейчас же после раздавливания винограда, то содержание аскор-
биновой кислоты было выше. Если же раздавленный виноград и
сок долго оставался на воздухе, то количество аскорбиновой кис-
лоты быстро уменьшалось вследствие окисления.
Наши исследования показали, что при раздавливании вино-
града в аэробных условиях под действием о-дифенолоксидазы из
полифенолов образуются хиноны, которые дегидрируют аскорби-
новую кислоту в дегидроаскорбиновую.
В процессе брожения сусла дегидроаскорбиновая кислота не
восстанавливается, поэтому содержание аскорбиновой кислоты в
молодом вине не превышает 5—10 мг/л, а в выдержанном — все-
го 2—3 мг/л. Из 45 исследованных бордоских вин только 3 содер-
жали от 5 до 10 мг/л аскорбиновой кислоты.
Аскорбиновая кислота является прекрасным средством для
предупреждения окисления. Поэтому весьма перспективно вводить
ее в вино в кристаллической форме в анаэробных условиях, как
это предложили А. С. Вечер и В. М. Лоза (1975 г.).
Витамин В12 (корриноиды)
Действие витамина Bi2 связано с образованием дезоксирибо-
нуклеозидов и нуклеотидов. При отсутствии этого витамина их
синтез в организме человека тормозится. Витамин Bi2 участвует
и в азотистом обмене. Он стимулирует усвоение растительных
белков, богатых глицином, лейцином, глутоматом и другими ами-
нокислотами. Витамин Bi2 необходим для действия многих фер-
ментных систем и связан с белками.
Согласно литературным данным, витамин Bi2 не синтезируется
растениями, а образуется при действии метановых и пропионово-
кислых бактерий.
По данным Е. Пейно и С. Лафуркарда, И. Кэстора и А. Хелла
в винограде содержится около 0,05 мкг/л витамина Bi2. Это сви-
детельствует о том, что виноградная лоза способна синтезировать
витамин Bi2. В процессе брожения и формирования вина количе-
ство витамина Bi2 увеличивается от 0,05 до 15 мкг/л. Значит,
дрожжи также способны синтезировать его в процессе своей жиз-
недеятельности. Однако следует учесть, что этй авторы определя-
ли витамин Bi2 микробиологическим методом и могли ошибиться.
Витамин Р (биофлавоноиды)
Под названием «биофлавоноиды» в настоящее время объеди-
няют такие вещества, как флавон, цитрин, рутин, гисперидин и др.
К флавоноидам относятся соединения, содержащие в своей
молекуле группу С6—С3—С6. Главным представителем является
68
флавон, в котором два шестичленных кольца А и В соединены
тремя атомами углерода, т. е. пироновым кольцом.
В природе встречается около ста различных флавоноидов. Они
существуют обычно в виде гликозидов. Многие флавоноиды спо-
собны при окислении образовывать хиноны, которые обладают
высокой реакционной способностью и участвуют в окислительно-
восстановительных процессах растительных организмов.
Из биофлавоноидов важное значение имеет рутин, который
был выделен из листьев чайного куста А. Л. Курсановым и
М. Н. Запрометовым, а из вина и коньячного спирта К. Хеннин-
гом и В. И. Личевым [55J. Рутин применяется в медицине.
Еще в 1936 г. А. Сент-Дьердь впервые обратил внимание на
то, что одна аскорбиновая кислота не оказывает излечивающего
эффекта при геморрагическом диатезе.
Исследования А. Л. Курсанова, В. Н. Букина и их сотрудни-
ков показали, что фенольные соединения, выделенные из листьев
чайного куста, обладают капилляроукрепляющей активностью.
Флавоноиды предохраняют аскорбиновую кислоту от окисле-
ния; комплекс аскорбиновая кислота — биофлавоноиды положи-
тельно влияет на состояние капилляров, повышает их выносли-
вость и улучшает работоспособность мышц.
Флавоноиды усиливают действие аскорбиновой кислоты и они
дополняют друг друга. Аскорбиновая кислота предохраняет фла-
воноиды от окислительного инактивирования и вместе с тем фла-
воноиды ингибируют действие аскорбатоксидазы и этим сохра-
няют аскорбиновую кислоту от окисления.
С. В. Дурмишидзе и В. Н. Букин установили, что катехины
винограда обладают такой же физиологической активностью.
С. В. Дурмишидзе объясняет это тем, что (+) -катехин содержит
два гидроксила, а (—)-галлокатехин — три гидроксила, которые
обладают биологической активностью. Но если эти гидроксилы
заменить метильной группой, то капилляроукрепляющая актив-
ность теряется.
При производстве кахетинских вин сусло сбраживается на
мезге и выдерживается на ней продолжительное время, при этом
вино обогащается катехинами, обладающими высокой физиоло-
гической активностью.
Мезоинозит
Это шестиатомный циклический спирт, является производным
циклогексана. Еще в 1901 г. было найдено вещество, которое
стимулировало рост дрожжей. Оно было названо «биосом». Среди
изомеров инозита биологической активностью обладает мезоино-
зит, который, соединяясь с шестью молекулами фосфорной кис-
лоты, образует инозитфосфорную кислоту. Эта кислота в виде
кальций-магниевой соли носит название «фитин». Фитин встре-
чается во многих растениях, в том числе и в винограде.
Согласно данным Е. Пейно и С. Лафуркарда, количество ме-
зоинозита в процессе созревания винограда увеличивается, в то
69
время как содержание биотина уменьшается. При брожении сус-
ла по кахетинскому способу (на мезге) количество мезоинозита
увеличивается в 2 раза. В белых винах инозита содержится в
среднем 497, а в красных 590 мг/л. При яблочно-молочном броже-
нии инозит полностью потребляется молочнокислыми бактериями.'
Каротиноиды
В природе существуют три вида каротина: а, р и у, которые
являются провитаминами А. В молекуле p-каротина имеется два
кольца и они расположены так, что молекулу каротина можно
расщепить на две равные половины, каждая из которых является
витамином А. Окислительное расщепление p-каротина происходит
под действием каротиназы.
Источником ретинола является р7каротин, молекула которого
распадается на две молекулы ретинола. В дальнейшем он может
окислиться до соответствующего альдегида (ретиналь), который
содержится в сетчатке глаза (ретине), отсюда и4 происходит его
название «ретинол». Восстановление ретиналя в ретинол в сет-
чатке глаза осуществляется ферментом ретинолредуктазой в при-
сутствии кофермента НАД-Н2.
Каротиноиды в небольшом количестве содержатся в винограде
и винах. В. Н. Букин (1940) нашел каротиноиды в винограде от
0,25 до 1,25 мкг/100, И. К- Мурри — от 20 до 300 мкг/100 г,
М. Шен с сотрудниками обнаружил их в винах (около 5 мкг/100 г).
Витамин Bis (пангамовая кислота)
В последнее время в дрожжах была найдена пангамовая кис-
лота. В ней содержится большое количество метильных групп,
она является их донатором и участвует в синтезе метионина, адре-
налина и S-PKK. Пангамовая кислота (витамин В15) относится к
витаминам группы В.
А. Урнак [144] отметил, что при снятии вина с дрожжевого
осадка сразу после брожения количество витаминов группы В в
нем очень незначительно, а при выдержке вина на дрожжевом
осадке содержание их (особенно витамина Bi) значительно увели-
чивается. Эти работы подтвердили эффективность витаминизации
вина при выдержке его на дрожжах.
* *
*
Виноград и полученное из него вино содержат небольшое ко-
личество витаминов и не могут полностью обеспечить ими чело-
веческий организм. Однако витамины являются биокатализатора-
ми, которые входят в состав ферментов, активизирующих биохи-
мические процессы, и присутствие их даже в незначительном ко-
70
личестве способствует усвоению других питательных веществ. По-
этому вино можно рассматривать не только как алкогольный на-
питок, но и как полезный продукт с учетом его физиологического
действия.
Глава 6
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
Фенольные вещества широко распространены в растительном
мире, они встречаются в самых различных органах растений.
Химическая природа фенольных соединений долго оставалась
нераскрытой и только благодаря работам X. Фишера, К- Фрей-
денберга и П. Каррера удалось установить строение катехинов.
По химическому строению они весьма разнообразны, поэтому
их трудно классифицировать.
К. Фрейнденберг делит фенольные вещества на две группы —
гидролизируемые и конденсированные. К первой группе он отно-
сит гидролизирующие дубильные вещества, у которых бензольные
ядра соединены в комплекс посредством атомов кислорода в фор-
ме сложных эфиров или гликозидных связей. Вторую группу со-
ставляют конденсированные фенольные соединения, у которых мо-
лекулы соединены одна с другой углеродными связями.
В настоящее время фенольные соединения делят на три груп-
пы по их углеродному скелету. К первой группе относятся про-
стейшие фенольные соединения, имеющие общую формулу: С6—Сь
К этим соединениям относятся фенольные кислоты: н-оксибензой-
ная, протокатеховая, галловая, ванилиновая, салициловая, генти-
зиновая и др., а также соответствующие альдегиды и спирты.
Во вторую группу входят фенольные соединения со структу-
рой С6—С3, они состоят из одного ароматического ядра и трехуг-
леродной боковой цепи, как показано ниже:
К ним относятся производные оксикоричной кислоты: п-окси-
коричная, n-кумаровая, синаповая, кофейная, феруловая, а также
соответствующие спирты. Относящиеся ко второй группе веществ
фенольных соединений конифериловый, n-кумаровый и синаповый
спирты образуют полимерные соединения типа лигнина.
71
к третьей группе относят фенольные соединения со структурой
С6—С3—Сб, имеющие следующее строение:
Это фенольное соединение состоит из двух ароматических ядер
(А и В), соединенных между собой трехуглеродным фрагментом.
(С). Эти соединения называют флавоноидами.
Третья группа наиболее распространенная. В зависимости от
окисленности или восстановленности трехуглеродного фрагмента
(С) получаются различные подгруппы фенольных соединений: ка-
техины, лейкоантоцианы, флавононы, флавононолы, антоцианы,
флавоны, флавонолы.
При обработке флавоноидов кислотами происходит конденса-
ция и дальнейшее укрупнение молекул. Эти конденсированные
соединения называют флобафенами.
Катехины
Катехины представляют собой наиболее восстановленные, а
флавонолы — наиболее окисленные соединения. Взаимное превра-
щение одной группы флавоноидов в другую происходит посредст-
вом окисления и восстановления. Катехины и лейкоантоцианы
легко подвергаются окислению и восстановлению, а также спо-
собны к легкой полимеризации.
Катехины, лейкоантоцианы, флавононы и флавонолы — бес-
цветные вещества, флавоны и флавонолы окрашены в желтый
цвет, антоцианы имеют разнообразные оттенки красного, синего и
фиолетового цветов.
Химическая формула катехинов была установлена К- Фрей-
денбергом. Он также показал, что катехины при нагревании в
водных растворах претерпевают эпимеризацию. При нагревании
ему удавалось превращать (+)-галлокатехин в (—)-галлокате-
хин, (+)-катехин в (—)-катехин. Некоторые авторы считают, что
в растениях существуют одна и две формы катехинов, а в про-
цессе выделения эти формы подвергаются эпимеризации.
Биосинтез и метаболизм фенольных соединений. В 50-х годах
была сделана попытка установить биосинтез фенольных соедине-
ний. Было показано, что эти вещества синтезируются в растениях
из углеводов через промежуточное соединение миоинозита. Но
внедрения меченого С14 миоинозита в состав фенольных соедине-
ний растений не было обнаружено.
Позднее А. Л. Курсанов (1952) впервые показал, что при ва-
куум-инфильтрации раствора хинной кислоты в листьях чайного
растения через некоторое время наблюдается образование рядо-
вых полифенолов (катехины и галовая кислота).
72
С. П. Костычев (53] считал, что в растениях хинная кислота
легко превращается в галловую и гидрохинон и является связы-
вающим звеном между углеводами и фенольными соединениями.
Шикимовый путь образования фенольных соединений. Шики-
мовая кислота является как бы первой ступенью при переходе от
алициклических соединений к ароматическим. X. Фишеру удалось
осуществить превращения хинной кислоты в шикимовую. Обра-
зование шикимовой кислоты является первым этапом на пути
перехода алициклических соединений к ароматическим.
Исследования М. Н. Запрометова [38] также показали, что
при введении в молодые побеги чайного куста меченого радиоак-
тивного углерода в виде растворов глюкозы, фруктозы, шики-
мовой кислоты и ацетата натрия через 6—24 ч наблюдается
удельная радиоактивность отдельных катехинов. Наилучшим
предшественником является шикимовая кислота, промежуточное
место занимает ацетат натрия и значительно хуже используются
углеводы. Эти опыты позволили установить, что радиоактивная
шикимовая кислота включается в галловые и пирокатехиновые
фрагменты молекул катехинов.
Полученные данные свидетельствовали о том, что биосинтез
фенольных соединений в растениях совершается в основном дву-
мя путями — через шикимовую кислоту и через ацетат натрия в
виде ацетил-КоА и малонил-КоА. Через ацетат осуществляется
синтез ж-полифенолов, а через шикимовую кислоту — о- и п-за-
мещенных полифенолов.
Роль фенольных соединений в окислительно-восстановительных
процессах. Фенольные вещества играют важную роль в обмене
веществ растений. Но еще недавно существовало мнение, что фе-
нольные соединения представляют собой конечные продукты ме-
таболизма высших растений. А между тем экспериментальные
работы последних лет показали, что фенольные вещества не толь-
ко синтезируются высшими растениями, но и подвергаются в них
разнообразным превращениям: участвуют в.дыхании, фотосинте-
зе; предполагают, что они играют роль в образовании иммунитета
и др.
В последнее время особое внимание уделяют специфическим
окисленным полифенолам — хинонам (убихинонам). Убихиноны
(витамин К), сосредоточены в митохондриях растений и являют-
ся звеньями дыхательной цепи. Они занимают промежуточное
место между флавопротеинами и цитохромами.
На конечных этапах дыхательного процесса хиноны являются
акцепторами водорода. Присоединяя водород, хиноны восстанав-
ливаются и вновь окисляются о-дифенолоксидазой в хиноны. Ис-
ходя из этого, А. И. Опарин (1927 г.) считал, что полифенолы
служат связующим звеном между водородом дыхательного суб-
страта и кислородом воздуха.
Дегидрирование фенольных соединений типа полифенол или
гидрохинон, но Михаэлису, протекает в две стадии. При этом об-
разуется промежуточный продукт с непарным числом электронов:
73
он
о
о
Гидрохинон Семихинон Хинон
Методом ЭПР было показано, что при ферментативном окис-
лении полифенолов устанавливается равновесие между полностью
восстановленной (катехол) и полностью окисленной (хинон) фор-
мами.
На первом этапе окисления один электрон от катехола пере-
дается атому меди полифенолоксидазы. На втором этапе две моле-
кулы семихинона неферментативно дисмутйруют с образованием
гидрохинона и хинона.
Как ферментативное действие о-дифенолоксидазы, так и ауто-
ксидация сопровождаются поглощением кислорода и выделением
углекислоты. При этом на 1 моль катехина расходуется 1 моль
кислорода.
Выделение углекислоты свидетельствует о расщеплении исход-
ных молекул катехинов.
Исследования Б. В. Вартапетяна и А. Л. Курсанова (1955) по-
казали, что при неферментативном окислении катехина в щелоч-
ной среде в состав продуктов окисления включается как атмос-
ферный кислород, так и кислород воды, а при ферментативном —
только кислород воды. Основываясь на полученных результатах,
авторы пришли к заключению, что могут существовать различные
механизмы ферментативного и аутоксидабельного окисления ка-
техинов.
Превращение фенольных соединений. Фенольные соединения
очень легко подвергаются окислению, особенно при действии эн-
зимов. Ферментами, катализирующими окисление фенольных сое-
динений, являются о-дифенолоксидаза и пероксидаза. Скорость
окисления зависит от pH среды. При pH 2 катехины образуют
димеры со светлой окраской с сохранением пирогалловых и фло-
роглюциновых ядер.
При pH от 4 до 8 аудоксидация катехинов сопровождается об-
разованием флобафенов с красной окраской. При pH выше 8
аутоксидация катехинов приводит к образованию соединения типа
меланинов или гуминовых кислот.
А. В. Богатский, Ю. Л. Жеребин, С. Ю. Макан [11] при под-
щелачивании вина выделили из него меланины. Но pH вина ко-
леблется от 2,7 до 4,5 и выше этих значений pH не бывает, по-
этому они пришли к выводу, что меланины в вине не об-
разуются.
По данным С. В. Дурмишидзе [29], в винограде также не бы-
ли найдены флобафены.
74
1 Считают, что фенольные кислоты являются предшественника-
! ми дифенолов, которые затем полимеризуются в так называемые
\ таниды [154]. В процессе созревания винограда имеет место и
деградация фенольных соединений с образованием более простых
фенолов.
Окислительная конденсация фенольных соединений имеет мес-
то как при ферментативных реакциях, так и при аутоксидации
катехинов и других производных. Примером могут служить ду-
бильные вещества, проантоцианидины, лигнин и др. Инициатора-
ми конденсации фенольных соединений являются о-дифенолокси-
даза и пероксидаза.
Образованные при ферментативном окислении фенольные сое-
динения, хинонные формы или свободные радикалы в дальнейшем
неферментативно взаимодействуют с неокисленными формами ка-
техинов и образуют димеры. Последние вновь подвергаются фер-
ментативному окислению с образованием тримеров.
При окислительной конденсации катехинов молекулярная мас-
са увеличивается примерно в 2 раза. Исходя из этого, А. Л. Кур-
санов, К. М. Джемухадзе и М. Н. Запрометов составили схему
конденсации катехинов, которая предусматривает предварительное
окисление катехинов в соответствующие хиноны, так как конден-
сируются не сами катехины, а их хинонные формы без разрыва
пиранового кольца:
Аналогичную схему дает и Е. Робертс. За последнее время бы-
ли выделены продукты конденсации катехинов в виде димерных
соединений.
Механизм конденсации катехинов, несомненно, более сложный,
чем предполагают эти исследователи, поскольку при окислении
катехинов происходит не только поглощение кислорода, но и вы-
деление углекислоты.
К. Фрейденберг считает, что конденсация катехинов происхо-
дит и без предварительного окисления за счет размыкания пира-
нового ядра одной молекулы (+)-катехина и образования С3—С6,
связанного со второй молекулой (+)-катехина.
Помимо конденсации и укрупнения молекул фенольных соеди-
нений существуют процессы окислительного расщепления флаво-
ноидов. Раньше считали, что этот процесс осуществляют только
75
микроорганизмы и в первую очередь грибы, которые способны ис-
пользовать в качестве единственного источника углерода расщеп-
ление фенольных соединений. Расщепление бензольного ядра осу-
ществляется специальными железосодержащими ферментами, так
называемыми оксигеназами-кислородтрансферразами. Для этого
необходимо, чтобы предварительно происходило гидроксилирова-
ние бензольного ядра и образовывались две оксигруппы.
Раньше господствовало представление о том, что высшие рас-
тения способны только синтезировать фенольные соединения. Од-
нако давно было показано, что растения способны усваивать фе-
нолы и его гомологи через листья и корни.
С. В. Дурмишидзе [32] с помощью меченых атомов доказал
способность к расщеплению бензольного кольца фенольных сое-
динений виноградной лозы. Он вводил в листья и корни растения
меченые 1—6 С14-фенол и бензол и наблюдал образование мече-
ных органических кислот, а также меченых аминокислот. Среди
аминокислот метка фенола включается в лейцин, аланин, метио-
нин, валин и в другие соединения нефенольной природы.
Физико-химические свойства фенольных соединений. Феноль-
ные вещества хорошо растворимы в спирте, эфире, ацетоне; не-
растворимы в хлороформе и бензине. Исходя из этих свойств, был
разработан суммарный метод выделения фенольных соединений.
Из растительных объектов они извлекаются этилацетатом и осаж-
даются безводным хлороформом. С железом дают зеленое окра-
шивание, с ванилином и концентрированной соляной кислотой —
красное окрашивание. Фенольные соединения осаждаются ацета-
том свинца, хуже кожным порошком и желатином.
Молекулярная масса суммарного препарата дубильных ве-
ществ в начале созревания винограда колеблется от 450 до 500,
а при физиологической зрелости она выше 500D. Видимо, проис-
ходит окисление катехинов с последующей конденсацией.
В. Димайр и А. Полстер (1958) разделили дубильные вещест-
ва вина с помощью сефадекса на две фракции с молекулярной
массой от 5000 до 10 000D. По данным этих авторов, основная
фракция дубильных веществ вина состоит из сильно полимеризи-
рованных фенольных соединений с высокой молекулярной массой.
По-видимому, дубильные вещества связаны с белками.
Фенольные вещества винограда и вина. В винограде феноль-
ные вещества встречаются главным образом в виде катехинов и
продуктов их конденсации, которые и называются дубильными
веществами.
Первые исследования по изучению дубильных веществ в яго-
дах винограда и вине были проведены Н. М. Сисакяном, И. А. Его-
ровым, Б. Л. Африкяном (1948), С. В. Дурмишидзе [29], а за
рубежом — К. Хеннигом, К. Керманом, П. Риберо-Гайоном (1968)
и др.
Н. М. Сисакян, И. А. Егоров и Б. Л. Африкян (1948) устано-
вили существенные колебания количества фенольных соединений
в различных органах виноградной лозы в процессе вегетации.
76
В условиях Армении в процессе созревания винограда содержание
фенольных соединений постепенно нарастает и достигает макси-
мума к началу созревания. Затем количество их в мякоти не-
(сколько уменьшается, а в семенах увеличивается, что связано с
\их превращением и оттоком в семена.
I Н. М. Сисакян и его сотрудники также установили, что часть
катехинов прочно связана с компонентами винограда, возможно
с белками. Эти катехины выделяются при гидролизе щелочью.
«Количество щелочерастворимых катехинов увеличивается в про-
цессе созревания винограда. Позднее это подтвердилось и было
доказано, что фенольные соединения вступают в реакцию с бел-
ками за счет группы=N—СО белковой молекулы и гидроксиль-
ной группы фенольных соединений, вследствие чего молекулярная
масса их увеличивается.
Пользуясь методом фракционирования ацетатом свинца и
этилацетатом, а также методом распределительной хроматогра-
фии на бумаге, С. В. Дурмишидзе и Н. Н. Нуцупидзе выделили
из винограда (—)-галлокатехин, (-(-)-галлокатехин, (±)-катехин,
(—) -эпикатехин, (±)-эпикатехингаллат.
Н. Н. Гелашвили и К. М. Джемухадзе [19] показали, что се-
мена и гребни содержат значительно больше катехинов. В семенах
преобладают (+) -катехин и (—)-эпикатехин; в гребнях и кожи-
це— (+)-катехин и (—)-галлокатехин; в мякоти винограда этих
катехинов значительно меньше. В более заметном количестве в
ней содержатся (+) -катехин и (+)-галлокатехин, в меньшем
(—)-эпикатехин и эпикатехингаллат — в следах.
По данным М. А. Бокучавы, Г. Г. Валуйко и А. М. Филиппо-
ва [12], в винограде идентифицировано пять катехинов: (—)-эпи-
галлокатехин, (+)-галлокатехин, (—)-катехин, (-|-)-катехин и
(—) -эпикатехингаллат.
Исследования С. В. Дурмишидзе и А. Г. Шалашвили [31] по-
казали, что при созревании винограда происходит превращение
С14 (+) -катехина в продукты метаболизма. Эти продукты вклю-
чаются в основные группы органических кислот, а также в углево-
ды и аминокислоты.
Таким образом, в ягодах винограда происходит окислительное
расщепление (+)-катехина и через оксибензойные кислоты он
участвует в биосинтетических процессах.
Флавонолы
Представителями флавонолов являются кемпферол, кверцетин
и мирицетин.
Методом хроматографии в тонком слое целлюлозы из виногра-
да были выделены два гликозида и два агликона. В процессе
созревания винограда их количество колеблется от 13 до 20 мг
на 100 г ягод, затем к моменту созревания количество флавоно-
лов достигает 18—24 мг на 100 г ягод, в винах их содержится от
37 до 97 мг/л.
77
П. Риберо-Гайон из кожицы черного винограда выделил четы-
ре флавоновых гликозида кемпферол-3-моноглюкозид 5, кверце-
тин-З-моноглюкозид 50, мирицетин-3-моноглюкозид 15, кверцетин-
3-моноглюкоуронозид 30% от общего количества [153]. ,
В кожице белого винограда эти флавоновые гликозиды найде-/
ны в меньших количествах, за исключением мирицетин-3-моноглю-,'
козида, который отсутствовал. В красных винах через несколько
месяцев хранения вследствие гидролиза флавоновых гликозидов
образуются свободные аглюконы: кемпферол, кверцетин и мири-
цетин в количестве не больше 15 мг/л. В белых нинах, приготов-
ленных по европейскому способу, флавонолов не обнаружено.
Исследования М. А. Бокучавы, Г. Г. Валуйко, 3. Ш. Стуруа
[13] показали, что в винограде сорта Ркацители был найден один
агликон (кверцетин) и два гликозида (изокверцетин и кверцит-
рин), в сорте Саперави было обнаружено два свободных флаво-
нола (кверцитрин и миристин) и три глюкозида (изокверцитрин,
кверцитрин и мирицетин-3-глюкозид). Наиболее богаты флавоно-
лами гребни.
Флавонолы в винограде встречаются в основном в виде глико-,
зидов. Кроме того, они, как и катехины, могут находиться в виде
ацилированных производных.
Флавоны
Представителями флавонов являются: апигенол, лютеолол и
хризол. Они окрашены в светло-желтый цвет.
В винограде эти вещества найдены в виде гликозидов и агли-
конов. В виде гликозидов встречаются с присоединением сахара
к углеродному атому в положении 3 и 7. Апигенол найден в ви-
нограде сорта Изабелла. В винограде были найдены следующие
флавоновые соединения: витексин, изовитексин, ориентин и изо-
ориентин.
Фенолкарбоновые кислоты
К ним относятся ароматические кислоты бензойного и корич-
ного ряда. К бензойным относятся н-оксибензойная, протокатехо-
вая, ванилиновая, галловая, сиреневая, салициловая и гентизино-
вая; к коричным — н-кумаровая, кофейная, ферулевая и сина-
повая.
П. Риберо-Гайон [154] исследовал кожицу как белых, так и
красных сортов винограда, а также вин, приготовленных из этих
сортов. Он установил, что количество фенолкарбоновых кислот в
красном винограде сорта Каберне Совиньон этих кислот больше,
чем в белом сорте Семильон. Большая часть фенолкарбоновых кис-
лот находится в связанном состоянии в виде сложных эфиров.
Интересно отметить, что в кожице красного винограда содер-
жится больше кислот бензойного и коричного рядов, чем в ко-
жице белого.
78
По данным П. Риберо-Гайона [154], в красных винах количе-
ство их колеблется от 50 до 100 мг/л, а в белых — от 1 до 5 мг/л.
Исследования К. Хеннинга, Р. Бурхардта и К. Керремана об-
наружили в винограде и вине хлорогеновую, изохлорогеновую,
галловую, эллаговую, протокатеховую, хинную, шикимовую и цис-
трпнс-кумаровые кислоты. Ф. Драверт и др. [109] нашел в бе-
лых винах хинную, кумариновую, кофейную, феруловую, хлороге-
новую и оксисинаповую кислоты.
Антоцианы
Это красящие вещества ягод, плодов и цветочных лепестков,
а также листьев некоторых растений. Первые исследования по
изучению химического строения антоцианов были проведены
Р. Вилынтеттером, П. Каррером и В. Робинсоном.
Антоцианы широко распространены в растительном мире. Ос-
новными представителями их являются следующие агликоны: циа-
нидол, дельфинидол, петунидол, мальвинидол и пеларгонидол.
Ниже приведена структурная формула дельфинидола.
о’ / /—
( У-ОН.
ОН GH
В винограде, в зависимости от его рода и вида, было найдено
от семи до семнадцати веществ, являющихся моно- и дигликози-
дами, а также — ряд веществ в виде ацилированных гетерозидов,
которые соединены с ароматическими кислотами, такими как, на-
пример, n-оксибензойная, n-оксикоричная, п-кумаровая.
В гликозидах антоцианидинов остаток сахара присоединяется
в случаях моногликозидов к углеродному атому в положении 3,
а в случае дигликозидов — в положении 5. Из сахаров, входящих
в молекулу антоцианов, главным образом встречается глюкоза,
реже рамноза, арабиноза и галактоза.
Красящие вещества ягод винограда находятся как в свобод-
ном состоянии — это, так называемые антоцианидины, так и в
связанном с сахарами в виде гликозидов,— это антоцианы. Анто-
цианы содержат в гетероциклическом кольце четырехвалентный
кислород (оксоний) и благодаря этому легко образуют соли, на-
пример хлориды.
Цвет антоцианов зависит от природы металла, который входит
в их комплекс. С железом антоцианы дают синюю, с молибденом
фиолетовую, с никелем белую, с кальцием пурпурную окраску.
Цвет антоцианов также зависит от pH среды, в зависимости от
которого появляется окраска, образуемая псевдооснованиями. Так,
например, при подкислении антоцианы окрашиваются в красный
цвет, а при подщелачивании приобретают голубоватый, а в силь-
79
но щелочной среде зеленоватый цвет. Это явление имеет важное
значение в виноделии. Образование псевдооснования обусловли-
вает интенсивность окраски красных вин в зависимости от их pH.
Антоцианы в основном распределены в кожице винограда. Они
находятся в третьем или четвертом слое гиподермы, а в мякоти
под гиподермой. Внутри клеток антоцианы концентрируются в ва-
куолях в виде гранул. Цитоплазма и стенки клеток их не содер-
жат. Но когда клетка погибает, то в результате диффузии окра-
шивается вся ткань [105].
Известно, что при сульфитации красных вин интенсивность их
окраски уменьшается. Объясняется это тем, что антоцианы спо-
собны образовывать псевдооснования. Это явление обратимо. Так,
если к обесцвеченному вину добавить уксусный альдегид, то оно
вновь приобретает окраску. Известно^ что сернистая кислота свя-
зывается с уксусным альдегидом и образует альдегидсернистую
кислоту.
П. Риберо-Гайон [155] показал, что под влиянием сернистой
кислоты в антоцианах происходят следующие структурные моле-
кулярные изменения:
При действии SO2 трехуглеродистый фрагмент С размыкается
и SO2 присоединяется ко второму и третьему углероду, образует
дисульфосоединение, в результате чего и происходит обесцвечива-
ние среды.
Дигликозиды проявляют большую стойкость к обесцвечиванию,
чем моногликозиды, но дигликозиды склонны к покоричневению,
вызываемому окислением. Мальвидол, пеонидол более устойчивы,
а дельфинидол менее устойчив к окислению. Присутствие танина
защищает антоцианы от разрушения под действием ультрафиоле-
товых лучей, n-бензохинон способствует обесцвечиванию антоциа-
нов.
В последнее время из белого винограда сорта Мюллер-Тургау
методом жидкостной хроматографии было выделено до 300 мг/л
процианидинов. На сефадексе LH-20 были разделены фракции
процианидинов, состоящие из смеси двух стереоизомерных форм, —
тримеров (триэпикатехин и катехин-эпикатехин), галлокатехина и
катехингаллата [129].
Биосинтез антоцианов. Биосинтез антоцианов в растениях схо-
ден с биосинтезом флавонолов, при этом флороглюциновое коль-
цо образуется из ацетил-КоА, т. е. из активированного ацетата, а
пирокатехиновое и пирогаллоловое кольца — через шикимовую
кислоту.
80
Биосинтетический путь антоцианов и флавонолов протекает
вначале одинаково. С помощью меченого С14 фенилаланина пока-
зано, что это соединение включается как в антоцианы, так в лей-
коантоцианы и флавонолы. В отличие от других флавоноидов об-
разование антоцианов происходит на свету. Но существует и дру-
гое мнение, что антоцианы синтезируются только в темноте, а при
действии света происходит их распад. По мнению других исследо-
вателей, в темноте образуются лейкоантоцианы, которые при ос-
вещении переходят в антоцианы. Согласно данным С. В. Дурми-
шидзе [29], антоцианы синтезируются как на свету, так и в тем-
ноте, но на свету их образуется в 2 раза больше. Интенсивность
освещения листьев винограда влияет на скорость образования ан-
тоцианов.
Биологическая роль антоцианов еще мало изучена. Одни счи-
тают, что они служат защитой от ультрафиолетового излучения,
другие связывают появление антоцианов с заболеванием расте-
ний, третьи полагают, что они обусловливают иммунитет растений.
Было высказано предположение, -что антоцианы играют определен-
ную роль в холодостойкости растений.
Антоцианы винограда и вина. По данным П. Риберо-Гайона
(1964), в зависимости от вида и рода виноградной лозы было най-
дено от шести до семнадцати антоцианов, являющихся моногли-
козидами, дигликозидами и гетерозидами. Согласно его исследо-
ваниям дигликозиды антоцианов никогда не встречаются в ягодах
европейских сортов винограда вида Vitis vinifera, содержатся
только в гибридах вида Vitis riparia и Vitis rupestris. Исследуя
европейские сорта, культивируемые во Франции, он не смог об-
наружить в них антоциановые дигликозиды.
Основываясь на этом, П. Риберо-Гайон хроматографическим
методом исследовал вина, приготовленные из винограда европей-
ских сортов (как не содержащие дигликозидов), и вина, приго-
товленные из гибридного винограда (как содержащие диглико-
зиды).
Некоторые исследователи подтвердили данные П. Риберо-Гай-
она и также установили, что в европейских сортах винограда,
произрастающих не только во Франции, но и в других странах, не
содержатся дигликозиды.
С. В. Дурмишидзе, А. Н. Сапромадзе (1960) показали, что в
винограде некоторых европейских сортов (Алеатико, Морастель,
Португизер, Оберлен и др.), произрастающих в Грузии, содер-
жатся дигликозиды антоцианов. С. В. Дурмишидзе и его сотруд-
ники методом хроматографии на бумаге изучили состав антоциа-
нов винограда около 100 сортов, культивируемых в Грузии в раз-
ных экологических условиях. Эти исследования показали, что в
кожице винограда в большинстве случаев содержатся моноглико-
зиды дельфинидола, петунитола, пеониодола и мальвинидола, ко-
торый преобладает. В некоторых сортах также были найдены ди-
гликозиды петунидола и мальвинидола. Так, в сорте Асуретули
Шави содержится до 17% дигликозидов петунидола и мальвини-
81
дола, в сортах Саперави и Каберне Совиньон урожая 1961 г. — ?
6,6%, а винограде 1962 г. отсутствуют. Наименьшее количество ;
этих дигликозидов было найдено в винограде сорта Алеатико — /
всего 2%. j
С. В. Дурмишидзе с сотрудниками (1960) исследовал также ;
состав антоцианов в кожице винограда. На основании получен-
ных данных он пришел к заключению, что между европейскими
сортами винограда и гибридами, произрастающими в Грузии, нет
резкого различия в содержании антоцианов.
Л. Дибнер и М. Бурцо установили, что дигликозиды в гибрид-
ных сортах винограда локализированы в кожице, вследствие чего
при переработке винограда по белому способу в винах невозмож-
но обнаружить дигликозиды.
Установлено, что динамика накопления фенольных соединений,
в частности антоцианов, в период созревания винограда происхо-
дит медленно, а при перезревании наблюдается уменьшение их
количества. Накопление антоцианов по мере созревания винограда
протекает параллельно с накоплением сахаров и продолжается в
течение двух недель, а затем начинает уменьшаться.
По данным П. Риберо-Гайона [156], в период формирования
ягод и в начале созревания винограда первым появляется циани-
дол, затем происходит его метоксилирование с образованием пео-
нидола. Из цианидола образуется дельфинидол, а из него путем
метоксилирования получается петунидол и мальвинидол.
В количественном отношении антоцианы в ягодах красных сор-
тов винограда распределяются следующим образом: мальвинидол-
3-моноглюкозид 49,8%, пеонидол-3-моноглюкозид 36,9%, циани-
дол-3-моноглюкозид 8,75%, петунидол-3-моноглюкозид 4,05%. Най-
дены также коффенилмальвидол-3-гликозид, и-кумароил-мальви-
дол-3-глюкозид. Недавно был найден в красных сортах винограда
моногликозид пеларгодин [158]. Некоторые авторы считают, что
в винограде содержится система энзимов, которая способна раз-
лагать антоцианы. При этом разложение осуществляется только
в присутствии пирокатехина. Исходя из этого, Р. Каррено и Р. Ди-
аз (1969) предположили, что речь идет о связанной системе энзи-
мов. Оптимальное значение pH при разложении антоцианов вино-
града сорта Каберне Совиньон лежит при 5,2—5,4. Как показали
исследования В. Сегаля (1969), энзиматическому окислению спо-
собствует п'олифенолоксидаза, которая в присутствии пирокатехи-
на энергично расщепляет антоцианы.
По нашему мнению о-дифенолоксидаза окисляет пирокатехин
с образованием о-хинонов, которые усиливают окислительные про-
цессы, приводящие к разрушению антоцианов.
Г. Г. Валуйко и А. И. Иванютина (1967) изучали ингибирую-
щее действие антоцианов (как гликозидов, так и агликонов) на
жизнедеятельность винных дрожжей и установили, что наиболее
активным действием обладает пеонидин как моноглюкозид, так и
его агликон. Мальвинидин, петунидин и дельфинидин, по данным
этих авторов, менее активны.
82
Лейкоантоцианы
Эти флавоноиды винограда исследованы меньше, чем другие.
Первые исследования по изучению лейкоантоцианов были прове-
дены М. С. Цветом еще в 1914 г. хроматографическим адсорбци-
онным методом. Он обрабатывал спиртовые вытяжки из белого
винограда, яблок и груш соляной кислотой в присутствии уксус-
ного альдегида. Это позволило ему выделить лейкоантоцианы и
описать их свойства. М. С. Цвет показал, что при окислении лей-
коантоцианы образуют соответствующие антоцианидины. Кроме
того он установил, что они широко распространены в растениях.
Это открытие М. С. Цвета подобно разработанному им хромато-
графическому методу анализа оказалось забытым. До настоящего
времени многие исследователи за рубежом первооткрывателем
лейкоантоцианов считают Розенгейма.
Основное свойство лейкоантоцианов — при нагревании с ми-
неральной кислотой в присутствии кислорода превращаться в ан-
тоцианы, как показано ниже:
Лейкоцианидол
Цианидол
Содержание лейкоантоцианов и антоцианов и их гликозидов в
процессе созревания винограда увеличивается. В ранней стадии
созревания винограда фенольные вещества постепенно превра-
щаются в лейкоантоцианы, а затем при полном созревании лейко-
антоцианы переходят в другие фенольные соединения.
М. Джосли с сотрудниками (1967) выделил из винограда че-
тыре фракции лейкоантоцианов. Из кожицы был выделен лейко-
цианидол, из семян — лейкоантоциан аглюкон. Эти лейкоантоциа-
ны оказались высокомолекулярными соединениями. Лейкоанто-
цианы, выделенные из кожицы, более полимеризованы, чем выде-
ленные из семян. Молекулярная масса 750—800D. При нагрева-
нии в кислородной среде лейкоантоцианы превращаются в катехи-
ны и антоцианы.
В ягодах винограда чаще встречается лейкоцианидол, затем
лейкодельфинидол и редко — лейкопеларгонидол [29].
Э. Ш. Стуруа, М. А. Бокучава, Г. Г. Валуйко, А. Н. Сапромад-
зе (1973) выделили из винограда сорта Саперави, Матраса и Рка-
цители три лейкоантоцианидола: лейкоцианидол, лейкодельфини-
дол и лейкопеларгонидол.
При брожении сусла и формировании вина исчезают лейко-
мальвинидол и лейкопетунидол. В процессе брожения от 50 до
91% лейкоантоцианов претерпевают изменения вследствие поли-
83
меризации. По данным П. Риберо-Гайона, свободные лейкоанто-
цианы в белых выдержанных винах отсутствуют, а конденсирован-
ные, входящие в группу танинов, содержатся. >
В настоящее время считают, что окислительное побурение бе- /
лых вин зависит от окислительной конденсации лейкоантоцианов.
Количество конденсированных антоцианов в белых винах состав-
ляет 13,5—16 мг/л, в винах, приготовленных по кахетинскому спо-
собу, 54—96 мг/л.
Таким образом, чем больше в белых винах лейкоантоцианов,
тем больше их склонность к окислению и побурению. Поэтому
предлагается белые вина подвергать обработке 2,5 г/л найлона,
что снижает содержание лейкоантоцианов.
Танины
Танины винограда и вина представляют собой полимеры глав-
ным образом из катехинов и лейкоантоцианов. Они обладают
способностью реагировать с белками. Молекулярная масса тани-
нов меняется в зависимости от продолжительности выдержки вин. .
Согласно данным П. Риберо-Гайона (1971), для молодых вин она,
равна 500—800, для старых — 3000—4000D, для очень старых вин
молекулярная масса уменьшается и приближается к молекулярной
массе молодых вин вследствие выпадения в осадок наиболее кон-
денсированных форм. Структура танина в процессе созревания и
старения вина сильно меняется.
Танины в значительной степени влияют на стойкость красных
вин. Впервые на это обратил внимание Н. Н. Простосердов, ко-
торый высказал мнение, что дубильные вещества защищают анто-
цианы от окисления.
Как показали исследования М. А. Бокучавы, Г. Г. Валуйко и
А. М. Филиппова [12], присутствие танинов в красных винах уси-
ливает их окраску вследствие образования комплексных соедине-
ний антоцианов с дубильными веществами, обладающими интен-
сивной окраской. Эти соединения более устойчивы к окислению.
Дубильные вещества (танины) играют важную роль в окисли-
тельно-восстановительных процессах при изготовлении кахетинских
вин, мадеры, токайских и др. Танины участвуют в реакциях с азо-
тистыми веществами, в частности с белками, образуя танаты, ко-
торые способствуют осветлению вин. Этот процесс используется
для оклейки вин.
Глава 7
ЭФИРНЫЕ МАСЛА
Эфирные масла широко распространены в растительном мире.
Они образуются в железах и железистых волосках, чешуйках,
в цветках и других органах растений.
84
Эфирные масла обладают определенным, ароматом, которым и
обусловлен запах растений и цветов. Этот аромат специфичен для
каждого вида растений.
Эфирные масла придают винограду своеобразный аромат, яВ'
ляющийся важным показателем его качества. Содержание аро-
матобразующих веществ в винограде имеет большое практическое
значение, особенно при переработке его на вино, так как эфир-
ные масла переходят из винограда в сусло, а затем в вино и
участвуют в образовании букета.
Эфирные масла в основном сосредоточены в кожице винограда
и во внешних слоях мякоти. Исследования Е. Н. Датунашвили
показали, что кожица винограда содержит их в 2 раза-больше,
чем мякоть. Вещества, выделенные из эфирного масла винограда,
представлены углеводородами, спиртами, терпеноидами, карбо-
нильными соединениями, жирными кислотами, сложными эфира-
ми и др.
Содержание эфирных масел в винограде
Начиная с 1970 г., в связи с развитием техники газожидкост-
ной хроматографии был проведен целый ряд работ, посвященных
изучению эфирных масел винограда. Для успешного решения
проблемы наряду с газожидкостной хроматографией применялись
хроматография на бумаге, в тонком слое адсорбента и на колон-
ках; масс-спектроскопия, ИК- и УФ-спектроскопия и резонансные
методы.
Важной стадией анализа компонентов эфирных масел являет-
ся подготовка пробы для анализа. Для этого используется целый
ряд методов: экстракция растворителями и газами, улавливание
душистых веществ на адсорбентах или конденсирование их в ох-
лажденных ловушках, вымораживание эфирных масел и др. При
раздавливании винограда в качестве ингибитора применяют фто-
ристый натрий, а в качестве антиоксиданта — аскорбиновую кис-
лоту.
Впервые в 1955 г. Р. Кордонье в сортах винограда Мускат
александрийский и Мускат Фронтиньян идентифицировал лина-
лоол, гераниол, терпениол и лимонен.
П. Гарди [117] изучал изменения летучих соединений в вино-
граде Мускат александрийский во время его созревания. Он сле-
дил за содержанием линалоола, 2-гексенола, гексаналя в экстрак-
тах винограда в процессе созревания. Линалоол в ягодах появил-
ся через две недели после накопления сахара, его содержание по-
стоянно увеличивалось и при технической зрелости достигало
0,3 мг/л; количество 2-гексеноля и гексаналя достигло максимума
через 2—4 недели после накопления сахара, затем постепенно
уменьшалось.
В 1966 г. Ф. Драверт показал, что предшественниками 2-гексе-
наля, гексанала, ^rzc-3-гексанала и транс-2-гексаналя являются
линолевая и линоленовая кислоты, которые при действии фермент-
85
ной системы распадаются с образованием 2-гексеналя и гексаналя.
В настоящее время известно, что этот распад осуществляется
липооксигеназой. Этот процесс протекает главным образом при
раздавливании винограда. В процессе брожения эти ненасыщен-
ные альдегиды восстанавливаются в гексанол.
Ц. Байнов и Р. Кор донье [102] изучали мускатный аромат
винограда сорта Мускат александрийский в процессе созревания.
Они установили, что максимум содержания терпеновых спиртов,
в том числе и линалоола, соответствует зрелому винограду при
сахаристости ,222 г/л и титруемой кислотности 7,2 г/л. При пере-
зревании винограда количество ароматобразующих веществ умень-
шается. Эти авторы также установили предшественников терпе-
ноидов. В винограде терпены находятся как в свободном, так и в
связанном состоянии в виде гликозидов, p-геранилгликозидов, ко-
торые можно гидролизовать с помощью р-глюкозидазы. Этот фер-
мент содержится в винограде.
А. К. Родопуло, И. А..Егоров, А. А. Беззубов, К. П. Скуинь
[77] исследовали состав эфирных масел мускатных сортов вино-
града, а также сорта Саперави и его гибрида Саперави северный,
произрастающих в условиях Армении и Крыма.
В эфирных маслах мускатных сортов винограда обнаружили
спирты как алифатического ряда (от С2 до Сю), так и ароматиче-
ские — бензиловый и р-фенилэтиловый, а также терпеновые спир-
ты — линалоол, гераниол, а-терпинеол и нерол, сложные эфиры,
образованные этими спиртами и кислотами Ci—Сю, карбонильные
соединения (от С2 до Сю) и углеводороды терпенового и аромати-
ческого ряда. В мускатных сортах винограда общее число раз-
личных компонентов составляло 87. Общая масса эфирных масел,
выделенных экстракцией пентаном и диэтиловым эфиром из 1 кг
винограда, составляла в крымских сортах 58,83 мг/кг, а в сортах,
произрастающих в Армении, 44,29 мг/кг. В мускатных сортах ви-
нограда, культивируемых в Крыму, содержится больше эфирных
масел, особенно терпеновых спиртов (табл. 7), чем в тех же сор-
тах, произрастающих в Армении. Это влияет на аромат армянских
мускатных вин [77].
В результате исследований были выявлены вещества, которые
ответственны за мускатный аромат винограда и получаемого из
него вина. К этим веществам в первую очередь относится лина-
лоол.
При исследовании винограда сорта Саперави северный, выра-
щенного как в Армении, так и в Крыму, обнаружено, что он со-
держит в 2 раза меньше эфирных масел по сравнению с сортом
винограда Саперави, произрастающего в тех же условиях. Это яв-
ляется главной причиной снижения качества вина, получаемого
из гибрида (выведен путем скрещивания винограда сорта Сапе-
рави вида Vitis vinifera с видом Vitis amurensis).
Исследования П. Риберо-Гайона, Д. Буадрона и А. Терриера
[157] показали, что аромат винограда мускатных сортов зависит
от наличия таких терпеноидных соединений, как линалоол, гера-
86
Таблица 7
СОДЕРЖАНИЕ ТЕРПЕНОВЫХ СПИРТОВ В ЭФИРНЫХ МАСЛАХ
МУСКАТНЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА (В МГ/КГ)
№ пиков Компонент эфирных масел Мускат десертный •. Мускат белый
из Армении из Крыма из Армении из Крыма
18 Мирцен 0,15 0,08 1,14 0,52
21 Лимонен 0,09 0,07 0,11 0,08
45 Линалоол 1,70 2,65 1,85 3,25
52 а-Терпинеол 0,75 0,55 1,15 0,75
55 Неролилацетат 1,10 4,42 1,20 2,40
56 Геранилацетат 0,75 0,49 0,80 0,55
57 Нерол 1,75 2,50 2,25 3,80
60 Гераниол 0,10 0,85 0,48 0,75
ниол, нерол, а-терпинеол, двух фурановых и пирановых окислов
линалоола. Общее количество терпеноидов в соке составляет
3 мг/л.
Как установлено А. К. Родопуло, И. А. Егоровым, А. А. Без-
зубовым и К. П. Скуинем, в винограде терпенов больше, чем в
соке. Определение порога концентрации терпеноидов показало, что
больше всего содержится линалоола и гераниола (от 100 до
132 мкг/л), затем а-терпинеола (230 мкг/л), а потом нерола
(400 мкг/л). Окислы линалоола имеют высокую пороговую кон-
центрацию (около 3000—5000 мкг/л), они возникают при прессо-
вании винограда в присутствии кислорода и при изготовлении ви-
на в аэробных условиях, при этом мускатный тон в винах умень-
шается [157].
В работе П. Шрайера, Ф. Драверта, А. Джункера и Л. Райне-
ра исследовались терпеноидные соединения винограда сортов Ру-
ландер, Траминер, Морио-Мускат, Рислинг, Мюллер-Тургау и
Шоуреб. Наибольшее количество линалоола было обнаружено в
последнем сорте и в Морио-Мускате; в Траминере, Рислинге и
Мюллер-Тургау количество а-терпинеола было больше, чем в дру-
гих^ В этих же сортах были обнаружены также оксиды терпенои-
дов, такие как, например, линолоолоксид (пираноксид), неролок-
сид, цис- и транс-линолоолоксиды. Среди летучих веществ этих
сортов винограда П. Шрайер и Ф. Драверт определили 225 аро-
матобразующих компонентов, причем из них 81 компонент был
впервые ими идентифицирован [166]. При идентификации этих ве-
ществ для разделения эфирных масел по классам применяли газо-
жидкостную и колоночную хроматографию, а также масс-спектро-
скопию.
Они установили в винограде наличие 81 углеводорода, 48 кис-
лот, 31 спирта, 23 альдегидов, 18 кетонов, 11 эфиров, 13 веществ
не было идентифицировано. Из 81 углеводорода 19 были обнару-
жены впервые. Из спиртов были обнаружены 10 соединений, в том
87
числе: З-метил-2-бутен- 1-ол, 1 -пентен-3-ол, траяс-2-пентен-1 -ол,
транс-2-октен-1-ол, 3-октанол; из терпенов — а-кадинол и трие-
нол; из альдегидов — 2-метил-2-бутеналь, цис- и транс-2-пента-
наль, транс-2,4-гексадиеналь, транс-, чис-2,4-гексадиеналь, 1-окта-
наль, 1-деканаль; из кетонов — З-метил-2-бутанон, 1-пентен-З-он,
2-гексанон и др.; из жирных кислот — ^ш?-3-гексеноик, /г-октано-
икмиристиновая, олеиновая, линолевая, арахидовая и др. [166].
Мы в совместной работе с И. А. Егоровым, А. А. Беззубовым
и др. [33] исследовали эфирные масла винограда сорта Рислинг
рейнский и Каберне Совиньон. При этом общее количество эфир-
ных масел в процессе созревания в обоих сортах увеличивается.
В сорте Рислинг рейнский количество сложных эфиров увели-
чилось с 17,8 до 22,5 мг/кг, а в сорте Каберне Совиньон — с 26,8
до 61,9 мг/кг. В Каберне Совиньон это происходит за счет этил-
капроната, p-фенилэтилкапроната, линалилацетата и этиллинолеа-
та. Увеличение содержания спиртов в обоих сортах винограда про-
исходит за счет н-бутанола, гексанола и р-фенилэтанола.
Количество терпеноидных соединений в эфирном масле вино-
града сорта Каберне в процессе созревания увеличивается за счет
линолилацетата, р-ионона и т/дшс-фарнизола до момента наступ-
ления физиологической зрелости. В винограде сорта Рислинг со-
держание терпенов увеличивается до наступления технической зре-
лости, а затем начинает уменьшаться в основном за счет умень-
шения количества линалоола. Поэтому для сохранения сортового
аромата при производстве вин виноград сорта Рислинг следует
собирать раньше, т. е. при достижении технической зрелости, а
сорт Каберне Совиньон — при физиологической.
Нами совместно с А. А. Беззубовым, И. А. Егоровым и А. Н. Не-
чаевым [7] исследованы два гибридных сорта винограда, выве-
денных Я. И. Потаповым путем скрещивания европейско-азиат-
ского вида с диким амурским виноградом.
Содержание сложных эфиров, терпеноидов, спиртов и произ-
водных бензола в обоих сортах винограда приведено в табл. 8.
Виноград сорта Фиолетовый ранний имеет тонкий аромат ро-
зы, благодаря содержанию в нем терпеновых соединений (лина-
лоола и его эфира линалилацетата, гераниола и цитронеллола), а
также соединений ароматического ряда (р-фетилэтанола и бензо-
фенона). Общее содержание терпеноидных соединений в ягодах
составило 7,45 мг/кг, что вполне достаточно для придания этому
сорту нежного мускатного тона.
Ягоды винограда сорта Выдвиженец содержали значительно
меньше терпенов (1,88 мг/кг).
После раздавливания ягод и растирания мезги с кожицей в
аэробных условиях в винограде сорта Фиолетовый ранний была
обнаружена окись линалоола (до 1,35 мг/кг). По-видимому, при
доступе воздуха происходит окисление линалоола.
Усиление окислительно-восстановительных процессов при раз-
давливании винограда вызвало также образование альдегидов
(табл. 9).
88
Таблица 8
СОСТАВ И СОДЕРЖАНИЕ (В МГ/КГ) КОМПОНЕНТОВ
В ГИБРИДНЫХ СОРТАХ ВИНОГРАДА
№ пиков Компонент Фиолетовый ранний Выдвиженец
Сложные эфиры
4 Метилформиат 1,1 2,3
5 Этилацетат 1,0 0,9
1 Изопропилацетат 0,6 0,0
10 Этилизовалериат 0,45 0,4
13 Изобутилвалериат 1,9 2,1
15 Этилкапронат 1,5 3,81
18 Изобутилкапронат 0,6 1,6
22 Изоамилкапронат 0,7 1,1
23 Октилацетат 0,6 0,9
26 Изоамилкаприлат 1,4 1,2
33 Гексилкаприлат 1,1 15,0
40 Изоамилсалицилат 7,1 17,3
42 Диэтилмалат 8,14 0,97
47 Этилмиристат 1,9 1,18
50 Изобутилмиристат 2,15 0,72
56 Этиллинолеат 0,8 2,94
57 Дибуталфталат 1,7 54,92
Терпеноиды
20 Окись линалоола-1 1,35 0,38
24 Линалоол 2,44 0,6
25 Линалилацетат 0,4 0,0
27 Гераниол 2,1 0,5
32 Цитронеллол 1,2 0,4
Спирты
6 Этанол 8,6 8,4
3 н-Пропанол 0,6 0,7
9 Метил-2-пропанол-1 0,8 0,6
12 Метил-З-бутанол-1 0,6 0,5
16 Гексанол 1,7 0,8
17 Ц wc-гексен-З-ол-1 0,8 0,4
38 2,3-Бутиленгликоль 6,3 10,6
Производные бензола
(соединения ароматического ряда)
11 Этилбензол 4,9 7,1
35 Р-Фенилэтанол 2,1 0,74
40 Бензофенон 1,73 0,82
89
Таким образом, при прессовании винограда сорта Фиолетовый
ранний окислительные процессы усиливаются, вследствие чего уве-
личивается содержание таких альдегидов, как гексиловый и энан-
товый.
А. Рапп и X. Гастриш [149]
Таблица 9
СОСТАВ И СОДЕРЖАНИЕ (В МГ/КГ)
АЛЬДЕГИДОВ В ГИБРИДНЫХ СОРТАХ
ВИНОГРАДА
Альдегиды Фиолетовый ранний Выдвиже- нец
Фурфурол 0,33 0,46
Формальдегид 0,17 0,33
Уксусный 10,6 16,3
Пропионовый 2,86 0,96
Изомасляный 0,18 0,18
Изовалериановый 0,15 0,17
Гексиловый 4,8 0,00
Энантовый 2,32 0,00
, пользуясь растворителем фреон-11
для экстракции эфирных масел
винограда сортов Рислинг, Силь-
ванер и Марио-Мускат, на газо-
жидкостном хроматографе с при-
менением капиллярной колонки
получили при исследовании экст-
ракта около 300 пиков. К сожале-
нию, авторы не занимались иден-
тификацией выделенных компо-
нентов. Они показали только, как
изменяется содержание эфирных
масел в процессе созревания ви-
нограда (по изменению размеров
пиков).
Недавно А. Рапп и В. Книп-
сер [150] нашли терпеноид 3,7-ди-
метил-окта-1.5-диен-3,7-диол в ви-
нограде сортов Рислинг и Форра.
Биосинтез эфирных масел
Еще в 1950 г. С. Д. Львов считал, что исходными веществами
для синтеза эфирных масел являются продукты анаэробного рас-
пада углеводов и белков. Как показал С. П. Костычев, превраще-
ние углеводов в растениях тесно связано с анаэробным дыханием
(или брожением) — с одной стороны, с аэробным дыханием — с
другой. Исходя из этого, углеводы могут превращаться по пути
спиртового брожения с образованием уксусного альдегида, пиро-
виноградной кислоты и ацетона, которые способны участвовать в
образовании спиртов. При конденсации пировиноградной кислоты
с активным уксусным альдегидом (оксиэтилтиаминпирофосфат)
образуется ацетомолочная кислота, которая путем внутримолеку-
лярной перегруппировки превращается в а-кетоизовалериановую
кислоту, а она, декарбоксилируясь, — в изомасляный альдегид.
Под действием алкогольдегидрогеназы в присутствии НАД-Нг изо-
масляный альдегид превращается в изобутанол.
Исследования А. Р. Гусевой и В. А. Пасешниченко (1966) по-
казали, что биосинтез р-фенилэтилового спирта в растениях осу-
ществляется с помощью равномерно меченого фенилаланина, аце-
тата натрия-2С14, а также глюкозы-С14 и сахарозы-С14. Из всех
радиоактивных предшественников только фенилаланин сообщал
значительную метку р-фенилэтиловому спирту. Ацетат-2-С14 очень
мало включался в этот спирт. Фенилаланин, меченный 2-С14, не
включается в молекулу р-фенилэтанола. Видимо, фенилаланин
90
превращается путем переаминирования в фенилпировиноградную
кислоту, которая участвует в биосинтезе этого спирта.
Такой путь превращения в растениях впервые показал
В. Л. Кретович [51].
Важное значение для биосинтеза терпеноидов имеет мевало-
новая кислота, которая представляет собой р-6-диокси-£-метилва-
лериановую кислоту:
нон2с — СН2—СОН — СН2 — СООН.
СН3
После открытия мевалоновой кислоты в 1956 г. в ряде стран
был произведен биосинтез терпенов при применении меченой 2-С14
мевалоновой кислоты.
В растениях мевалоновая кислота синтезируется в результате
конденсации ацетил-КоА с ацетоацетил-КоА с образованием р-ок-
си-р-глутарил-КоА, который восстанавливается НАДФ-Н2 в мева-
лоновую кислоту. Этот процесс катализируется ферментом р-окси-
p-метилглутарил-КоА-редуктазой. Затем происходит фосфорилиро-
вание мевалоновой кислоты с АТФ с образованием 5-фосфомева-
лоновой кислоты, которая декарбоксилируется с последующей де-
гидратацией и образует изопентенилпирофосфат. Из него обра-
зуется диметилалилпирофосфат. При взаимодействии последнего
с новой молекулой изопентенилпирофосфата возникает герани л пи-
рофосфат.
Этот процесс осуществляется ферментом изопренилтрансфера-
зой, или синтетазой.
СН3 СН3
\ I
,С = СН — СН2ОРР + сн2 = С — СН2СН2ОРР ->
ррл Диметил а лил- Изопентенил-
u 3 пирофосфат пирофосфат
СН3 СН3
->С = СН — СН2 — СН2 — С = СН — СН2ОРР.
| Геранил-
СН3 пирофосфат
При взаимодействии геранилпирофосфата с новой молекулой
изопентенилпирофосфата образуется фарнезилпирофосфат:
СН3 СН3 СН3
/С = СН — СН2 — СН2 — С = СН — СН2ОРР 4- СН2 = С1— СН2 — СН2ОРР
Геранилпирофосфат Изопентилпирофосфат
СН3 СН3 СН3
-> ^С = СН — СН2СН2 — С = СН — СН2 — СН2 — С = СН — СН2ОРР.
Фарнезилпирофосфат
Геранилпирофосфат и фарнезилпирофосфат легко разлагают-
ся с образованием гераниола и фарнезола.
91
Глава 8
ДИПИДЫ ВИНОГРАДА
Липиды, как и эфирные масла, оказывают влияние на качест-
во винограда. Некоторые жирные кислоты как, например, капро-
новая, каприловая, каприновая, энантовая и их этиловые эфиры
влияют на букет вина. Липиды также участвуют в окислительно-
восстановительных реакциях при переработке винограда и выра-
ботке виноматериалов.
Липиды содержатся в восковом налете ягод винограда. Около
0,32% из них входят в кожицу и 0,10% содержатся в мякоти ви-
нограда.
Растительные липиды являются как бы внутриклеточным за-
пасом энергии и участвуют в метаболизме компонентов структур-
ных клеток. Большинство исследований касается липидов виногра-
да с точки зрения виноградного масла. Содержание в нем лино-
левой кислоты доходит до 73%, олеиновой до 21%, остальных от
0,4 до 8,14% [135].
Гликолипиды составляют от 53 до 66,9%, нейтральные липиды
24—40%, а фосфолипиды 6—8,3% от общего количества липидов,
содержащихся в кожице и мякоти винограда [121].
В кожице винограда главными жирными кислотами нейтраль-
ных липидов являются стеариновая, пальмитиновая, арахиновая;
линолевая и пеларгиновая кислоты превалируют в гликолипидах;
в фосфолипидах преобладают пальмитиновая, линолевая и лино-
леновая кислоты. с
В мякоти винограда в значительном количестве присутствуют
пальмитиновая и стеариновая кислоты.
Состав липидов в винограде
Первые исследования по изучению химического состава ягод
винограда, в частности липидов, были проведены еще в 1916 г.
в США. В настоящее время мы располагаем лишь несколькими
работами по этому вопросу.
А. Холлеи, Б. Стоила, а также Дж. Ван-Вик, А. Уэбб и Р. Кен-
нер установили в ягодах винограда сорта Конкорд наличие паль-
митиновой, стеариновой, олеиновой и линолевой кислот.
Более глубокие исследования/ были проведены П. Хиггинсом и
А. Пенгом [121], Д. Бауманов и др. [101], а также И. Галлан-
дером и А. Пенгом [115]. Эти авторы изучали состав липидов в
винограде сорта Конкорд.
П. Хиггинс и А. Пенг пользовались следующей методикой:
200 г замороженной кожицы или мякоти перемешивали в течение
3 мин с Юг препарата «Хифло супер гель», 20г кремниевой кис-
лоты и 200 мл дистиллированной воды в специальном смесителе.
Смесь экстрагировали реагентом Фолша, состоящим из хлорофор-
ма и метанола (2:1), в течение 3 мин при комнатной температуре
92
в том же смесителе. Затем экстракт фильтровали через воронку
Бюхнера. Осадок вновь экстрагировали тем же растворителем,
фильтровали и промывали 2 раза растворителем и 25 мл хлоро-
форма.
Таблица 10
СОСТАВ И СОДЕРЖАНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В КОЖИЦЕ
И МЯКОТИ ВИНОГРАДА СОРТА КОНКОРД
Жирная кислота Число углеро- дов и связей Содержание, мг/100 г
в кожице в мякоти
нейтраль- гликолипи- фосфо- ных лов липидов нейтраль- гликоли- фосфоли- НЫХ ПИДОВ • ПИДОВ
Капроновая 6:0 — 2,0 Следы 0,7 0,8 0,04 Каприловая 8:0 — 0,4 „ 0,3 0,5 0,01 Пеларгоновая 9:0 9,4 38,5 1,5 1,5 14,3 0,2 Каприновая 10:0 2,5 Следы Следы Следы Следы 0,1 Ундекановая 11:0 1,2 — » 0,2 — 0,06 Лауриновая 12:0 4,2 4,9 0,2 0,7 1,5 0,06 Додецекановая 12:1 2,7 3,8 0,4 7,0 1,4 0,2 Тридекановая 13:0 1,7 0,9 Следы 0,1 0,7 Следы Миристиновая 14:0 5,2 2,8 0,7 1,0 1,1 0,2 Миристолеиновая 14:1 0,4 4,0 0,1 0,5 1,4 0,03 Тетрадекадиенова$ 14:2 7,6 1,0 0,2 1,5 1,1 0,1 Пентадекановая 15:0 0,3 Следы 0,2 Следы 0,5 0,1 Пальмитиновая 16:0 19,9 10,6 6,1 5,6 7,7 1,8 Пальмитолеиновая 16:1 3,4 0,9 0,7 0,9 1,1 0,4 Гептадекановая 17:0 1,8 0,5 0,2 0,4 0,5 0,2 Гептадеценовая 17:1 5,5 0,9 0,5 — — — Стеариновая 18:0 21,6 3,5 1,1 2,5 2,3 0,5 Олеиновая 18:1 3,4 2,1 1,2 1,1 1,6 0,7 Нондекановая ' 19:0 Следы Следы — Следы — — Линолевая 18:2 „ 1,2 1,9 0,3 1,2 1,0 Арахидоновая 20:0 19,0 0,5 0,7 0,9 0,4 0,2 Линоленовая 18:3 — 80,6 2,3 1,1 21,6 0,3 Экозеновая 20:1 8,2 Следы 0,3 0,4 Следы 0,2 Эйэкозановая 20:0 8,4 0,9 1,1 0,9 0,4 0,4 Эйэкозеновая 21:1 Следы °, 9 0,7 Следы 0,1 0,3 Бегеновая 22:0 3,7 0,8 0,4 0,6 0,7 0,5 Трикозановая 23:0 Следы 1,0 9,1 Следы Следы 0,1 Трикозеновая 23:1 — — Следы „ „ Следы Лигноцериновая 24:0 1,3 11,6 0,2 „ 2,7 0,3
Сырой экстракт липидов был разделен с помощью колоночной
хроматографии с силикагелем на нейтральные липиды, гликолипи-
ды и фосфолипиды. Растворителем служила смесь хлороформ —
ацетон — метанол — уксусная кислота — вода в соотношении
65:25:10:10:3. Для идентификации отдельных жирных кислот ис-
пользовали метиловые эфиры и применяли газожидкостный хро-
матограф фирмы «Беккер». Результаты опытов приведены в
табл. 10.
Общее количество липидов в 100 г кожицы винограда 325,4 мг
(0,32%). В кожице превалируют гликолипиды (53,6%), затем
93
нейтральные (40,2%) и наименьшее количество составляют фос-
фолипиды (6,2%).
Главной составной частью классов липидов в мякоти также
являются гликолипиды (66,9%), затем нейтральные (24,8%) и
фосфолипиды (8,3%). Высокое содержание гликолипидов харак-
терно для фотосинтетической ткани зеленых растений.
Липиды кожицы винограда содержат больше насыщенных жир-
ных кислот в классах нейтральных и фосфолипидов. Липиды мя-
коти также содержат больше насыщенных жирных кислот.
Преобладание пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линоле-
вой и линоленовой кислот свидетельствует о том, что эти кислоты
характерны для растительных липидов.
Ч Таблица 11
СОСТАВ ЛИПИДОВ В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ ВИНОГРАДА
СОРТА КОНКОРД
Дата взятия образцов pH Общая кислот- ность , г/л Сырые липиды, % Фракции липидов, %
нейтральные полярные
19/VIII 3,0 1,69 "0,26 56,0 44,0
26/VIII 3,06 0,94 0,21 60,0 39,0
3/IX 3,08 0,62 0,21 44,0 56,0
9/IX 3,22 0,47 0,21 68,0 31,4
В другой работе Д. Баумана, И. Галландера и А. Пенга [101]
проводились исследования по определению состава липидов и
жирных кислот в винограде сорта Конкорд, но в процессе его соз-
ревания. Нейтральные липиды имеют тенденцию к увеличению,
тогда как количество полярных липидов уменьшается в процессе
созревания (табл. 11).
Изменение состава жирных кислот в нейтральных и полярных
липидах в процессе созревания винограда приведено в табл. 12.
Количество нейтральных липидов в процессе созревания не-
сколько уменьшается, затем заметно увеличивается, достигая
100,9 мг/100 г сырой массы. Доминирующими жирными кислота-
ми в нейтральных липидах являются пальмитиновая, пентадека-
новая, стеариновая и миристиновая.
Содержание жирных кислот в полярной фракции винограда до
24 сентября увеличивается и достигает 81 мг/100 г сырой массы.
К первому октября уменьшается до 59,4 г. Главными жирными
кислотами в полярной фракции являются пентадекановая, тетра-
декадиеновая, эйэкозеновая, стеариновая и миристиновая.
При сборе винограда концентрация сырых липидов не превы-
шает 0,20%, из которых приблизительно 67% составляют ней-
тральные и 33% полярные липиды. Из жирных кислот в обеих
фракциях доминируют миристиновая, пальмитиновая, стеариновая
и линолевая.
94
По другим данным, общее содержание жирных кислот в вино-
граде равно 4,9%, из них 11,1% насыщенные и 88,9% ненасы-
щенные. В состав насыщенных кислот входят пальмитиновая
(7,5%), пальметинолеиновая (0,6%), стеариновая (3,6%); в со-
став ненасыщенных — олеиновая (17,6%), линолевая (10,1) и ли-
ноленовая — в следах.
Недавно И. Галандер и А. Пенг [115] исследовали 6 сортов
винограда. Общая масса липидов в среднем была 0,16—0,23% от
Таблица 12
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ В НЕЙТРАЛЬНЫХ И ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДАХ
ПРИ СОЗРЕВАНИИ ВИНОГРАДА
Жирная кислота Содержание, мг/100 г, в зависимости от даты анализа
28/VIII 4/IX 24/IX i/x 281VIII 4/IX 24/IX i/x
Нейтральные липиды Полярные липиды
Пеларгоновая 5,7 6,6 7,1 3,6 — 1,2 4,7 3,2
Лауриновая 3,8 2,0 3,5 4,5 2,0. 1,4 1,7 1,6
Тридекановая 6,1 3,0 3,4 6,1 1,5 0,7 3,6 2,4
Миристиновая 8,6 4,5 5,0 8,7 4,4 2,8 4,3 5,0
Тетрадекадиеновая 3,8 1,4 3,2 5,0 1,5 0,8 — 1,7
Пентадекановая 7,6 3,6 3,2 6,7 2,7 1,9 6,7 3,1
Пальмитиновая 1,5 6,7 15,9 16,9 7,8 23,3 22,2 12,9
Гептодекановая 8,0 7,3 2,7 6,8 3,3 1,4 3,8 4,3
Стеариновая 14,6 2,5 6,7 10,1 4,7 8,0 7,1 7,3
Олеиновая 2,6 2,6 0,3 1,0 1,2 4,9 1,0 2,4
Нондекановая 4,4 0,8 1,2 3,3 3,3 — 1,9 1,9
Линолевая 1,3 1,8 0,3 — 0,2 7,1 2,7 —
Арахидоновая 6,6 2,0 1,3 2,1 1,5 1,8 2,3 2,2
Линоленовая 1,3 3,3 — — 0,7 1,5 1,7 1,1
Эйэкозановая 1,7 2,7 9,3 1,9 1,0 12,5 2,5 1,8
Эйэкозеновая 3,0 3,8 3,4 5,5 3,1 3,5 3,6 2,1
Бегеновая 1,0 4,6 2,2 1,2 2,7 2,6 4,4 0,6
Бразидиковая 2,9 — — 3,3 — — — —
Трикозеновая 2,5 6,7 4,9 7,5 4,8 2,9 2,8 2,7
Лигноцериновая 2,7 5,8 4,6 6,7 6,0 2,5 4,4 3,1
сухой массы. В липиды винограда вида Vitis Labrusca и гибридов
входит до 60% нейтральных и 40% полярных фракций. В состав
преобладающих жирных кислот входят пальмитиновая, стеарино-
вая, арахидоновая, бегеновая, линолевая и линоленовая.
95
Часть II
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ
ПРИ ПОЛУЧЕНИИ СУСЛА И ВИНА
Известно, что процесс образования вина состоит из следующих
стадий: переработка винограда на прессах, ферментация сусла и
мезги, спиртовое брожение, формирование, созревание и старение
вина (М. А. Герасимов, 1939). Какие же биохимические и хими-
ческие процессы протекают на этих стадиях образования вина?
Виноградное вино является продуктом биохимических и физи-
ко-химических превращений веществ, содержащихся в ягодах ви-
нограда.
В зависимости от характера происходящих процессов стадию
образования вина на первом этапе его приготовления можно раз-
делить на два этапа: первый — процесс дробления и прессования
винограда, получение сусла на мезге для получения красных и
белых вин кахетинского типа, второй — брожение сусла или сусла
на мезге.
Период от начала переработки винограда и получения сусла до
его брожения является особым этапом в виноделии. Этот период
характеризуется интенсивностью протекания ферментативных про-
цессов и называется ферментацией сусла [75]. Знание характера
протекания биохимических процессов при ферментации сусла дает
возможность регулировать их.
Скорость протекания биохимических процессов при переработ-
ке винограда и получения сусла зависит от активности окисли-
тельных ферментов, от присутствия в среде неорганических ката-
лизаторов (железа, меди и др,), а также от степени разрушения
ткани ягод винограда, способов дробления и прессования мезги,
условий выдержки сусла и от температуры окружающей среды.
Глава 9
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ
РИНОГРАДА
Согласно теории А. И. Опарина (1927) при раздавливании
ягоды винограда на прессах координированная связь между ее
отдельными частями нарушается. При разрушении растительных
тканей кислород воздуха проникает непосредственно в мезгу и
вступает в контакт с соком и твердыми частицами ягод. При этом
окислительные процессы усиливаются и нарушается равновесие
окислительно-восстановительных систем. Окислительные процессы
усиливаются в результате действия окислительных ферментов, со-
держащихся в ягодах.
96
Самая мощная ферментативная окислительная система — о-ди-
фенолоксидазная. Под действием ее происходит первичный про-
цесс — ферментативное окисление катехинов в хиноны и вторич-
ный — дегидрирование аскорбиновой кислоты, оксикислот и ами-
нокислот. Этот окислительный процесс можно представить в сле-
дующем виде:
Катехины 4-1/2 024-о-Дифенолоксидаза^хиноныЧ-Н20, (1)
Хиноны4-аскорбиновая кислота-жатехины4-дегидроаскорбиновая кислота, (2)
Хиноны->окра шейные продукты конденсации. (3)
Но этот процесс не заканчивается дегидрированием аскорби-
новой кислоты, а идет гораздо глубже.
В ягодах винограда аскорбиновой кислоты и других восста-
навливающих веществ содержится не столько, сколько надо на
постоянное восстановление хинонов в катехины. Поэтому, когда
все восстанавливающие вещества дегидрируются, появляющиеся
хиноны в присутствии воды образуют оксихиноны, которые кон-
денсируются, образуя темноокрашенные продукты, являющиеся
конечными продуктами в этих окислительных реакциях.
Возникающие при этом биохимические и окислительно-восста-
новительные процессы предопределяют качество будущего вина.
Изучение закономерностей, протекающих при дроблении виногра-
да, прессовании, а также при ферментации сусла и мезги, дало бы
возможность виноделу управлять этими процессами для получе-
ния того или иного типа вина.
Исходя из этого мы остановимся более подробно на окисли-
тельно-восстановительных процессах, происходящих при выработ-
ке вин.
Окислительно-восстановительные процессы
Еще в 1950 г. нами было показано, что действием о-дифено-
локсидазы фенольные соединения сусла окисляются, что сопро-
вождается поглощением кислорода воздуха с образованием окра-
шенных продуктов. В результате ферментативного окисления ка-
техинов, содержащихся в соке и мезге, под действием о-дифенол-
оксидазы и пероксидазы образуются хиноны, которые катализи-
руют дегидрирование легкоокисляющихся веществ [75]. К этим
веществам относится в первую очередь аскорбиновая кислота, ко-
торая содержится в винограде в количестве 15—45 мг/'кг. При этом
витаминная ценность будущего вина теряется. К другим легкоокис-
ляющимся веществам относится диоксифумаровая кислота, которая
возникает при окислении винной кислоты под действием ионов
железа.
Для выяснения роли о-дифенолоксидазы в окислении феноль-
ных соединений в процессе ферментации сусла до брожения мы
исследовали эти процессы в свежем сусле. Для этой цели мы опре-
4—993
97
деляли общее количество фенольных соединений, возникающих
при их окислении (хинонов), а также количество аскорбиновой
кислоты, растворенного кислорода и окислительно-восстановитель-
ный потенциал в момент раздавливания винограда и получения
сусла через 1, 3, 6 и 12 ч. Анализы показали, что при фермента-
ции сусла в аэробных условиях происходит заметное снижение
количества фенольных соединений, аскорбиновой кислоты; коли-
чество хинонов при этом увеличивается с одновременным увели-
чением редокспотенциала и кислорода воздуха.
При выдержке сусла в аэробных условиях в течение 12 ч со-
держание фенольных веществ заметно уменьшается, при этом ко-
личество хинонов все время увеличивается и достигает 10 мг/л.
В этих условиях аскорбиновая кислота полностью окисляется в
дегидроаскорбиновую кислоту. При этом редокспотенциал увели-
чивается и достигает 475 мВ.
За это время в аэробных условиях цвет сусла изменяется от
зеленоватого до интенсивно коричневого цвета. Появление этих
окрашенных продуктов обусловливается окислением фенольных
соединений сусла и появлением в сусле хинонов, которые конден-
сируются, образуя окрашенные продукты [75].
Исследования С. В. Дурмишидзе [29] показали, что при раз-
давливании винограда в бескислородной среде редокспотенциал
составляет около 283 мВ, а в присутствии кислорода он увеличи-
вается до 395 мВ. (+)-Катехин в бескислородной среде имеет
редокспотенциал не выше 289 мВ, а в присутствии кислорода ре-
докспотенциал увеличивается до 411 мВ. Эти данные свидетельст-
вуют о том, что увеличение редокспотенциала при ферментации
сусла зависит от возникновения хинонов при окислении катехинов,
в результате чего образуется окислительно-восстановительная си-
стема полифенол^хинон с редокспотенциалом около 715 мВ.
Присутствие этой окислительно-восстановительной системы вызы-
вает увеличение, редокспотенциала в ферментированном сусле.
Еще в 1950 г. мы показали, что носителем окислительных фер-
ментов являются твердые части винограда — мякоть и кожица.
Центрифугат, полученный при раздавливании винограда, вместе
с пирокатехином поглощает в респирометрах Варбурга за 90 мин
от 176 до 178 мкл О2, в то время как суспензия винограда с твер-
дыми частицами и с пирокатехином поглощает от 377 до 431 мкл
кислорода. Как видно, в суспендированных твердых частицах вино-
града поглощение кислорода протекает весьма интенсивно, т. е.
твердые частицы винограда являются носителями окислительных
ферментов.
Исследования С. В. Дурмишидзе показали, что при раздавли-
вании винограда окисление дубильных веществ сопровождается
уменьшением флороглюцинового числа. Если в момент раздавли-
вания винограда содержание дубильных веществ составляет
550 мг/л, а флороглюцидное число 3,55%, то после 70 ч выдержки
количество дубильных веществ уменьшается до 33,6 мг/л, а фло-
роглюцидное число до 1,8% [29].
98
С. В. Дурмишидзе также показал, что при окислении (+)-ка-
техина в течение 2 ч выделения углекислоты не наблюдается, а
в последующие 2 ч вследствие выделения углекислоты коэффи-
циент газообмена доходит до 0,25. При совместном окислении раз-
личных фенольных соединений процесс окисления их сильно ме-
няется. Это дало возможность С. В. Дурмишидзе считать, что при
окислении фенольных соединений винограда происходит взаимо-
действие между продуктами окисления катехинов.
Это хорошо было показано М. Н. Запрометовым [38] при сов-
местном окислении эквимолекулярных количеств (—)-эпикатехи-
на и (—)-эпикатехингаллата о-дифенолоксидазой. В этом случае
окисление протекает со значительной скоростью, заканчивается в
течение 1 ч и сопровождается поглощением 1 моля кислорода на
1 моль катехина. Отличительной особенностью совместного окис-
ления катехинов является более интенсивное поглощение кислое
рода и значительное выделение углекислоты. Источником выде-
ляемой углекислоты при окислении катехинов являются продукты
распада пирокатехиновых, пирогалловых и флороглюцидных бен-
зольных ядер.
По сравнению с катехинами антоцианы и антоцианиды окис-
ляются слабее. Еще в 1932 г. А. Н. Бах показал, что эфиры поли-
фенолов окисляются очень медленно. Он объясняет это тем, что
при метилировании полифенола окислительная способность его
падает. Скорость окисления фенольных соединений зависит от при-
сутствия в пирокатехиновых и пирогалловых ядрах свободных
гидроксильных групп. Если они метилированы, то окисление их
сильно замедляется.
Во вторичные процессы вовлекаются, помимо аскорбиновой и
диоксифумаровой кислот, аминокислоты и оксикислоты.
Исследования С. В. Дурмишидзе (1965) показали, что при
окислении (+)-катехина о-дифенолоксидазой в присутствии гли-
цина, аланина, аспарагиновой и глютаминовой кислот, а также
молочной и яблочной кислот поглощение кислорода и выделение
углекислоты значительно увеличивается по сравнению с окисле-
нием одного катехина.
В опытах, проведенных этим же автором (1965), с мечеными
1-С14 аланином, 1-С14 аспарагиновой и 1-С14 яблочной кислотами,
внесенными в раздробленный виноград, происходит интенсивное
поглощение кислорода и выделение углекислоты. Выделение угле-
кислоты при ферментации виноградной мезги с яблочной, аспара-
гиновой кислотами и аланином свидетельствует о том, что в ви-
нограде содержатся декарбоксилазы этих соединений [76].
С другой стороны, работами С. В. Дурмишидзе (1965) показа-
но, что продукты окисления (+)-катехина вызывают уменьшение
выделения углекислоты из яблочной кислоты на 70%, из а-кето-
глутаровой на 60%, а из пировиноградной кислоты на 10%. Это
подтверждается и нашими опытами, что при растирании виногра-
да катехины окисляются в хиноны, последние тормозят декарбок-
силирование пировиноградной и щавелевоуксусной кислот [76].
4*
99
Нами были найдены в винограде декарбоксилазы пировино-
градной и щавелевоуксусной кислот. Следовательно, в процессе
ферментации мезги происходит дезаминирование аланина и аспа-
рагиновой кислоты, в результате образуется пировиноградная и
щавелевоуксусная кислоты. При декарбоксилировании последней
образуются пировиноградная кислота, которая, декарбоксируясь,
превращается в уксусный альдегид. Этот альдегид был найден в
винограде. В сортах винограда Рислинг и Каберне Совиньон бы-
ли идентифицированы в виде 2,4-динитрофенилгидразонов му-
равьиный, изовалериановый и капроновый альдегиды [109].
По данным П. Шрайера, Ф. Драверта [166], в винограде Рис-
линг, Траминер, Мюллер-Тургау было найдено 23 альдегида. Они
могли возникнуть при раздавливании винограда и выдержке мез-
ги или сусла в аэробных условиях. Они также могли образовы-
ваться в результате реакции, которую открыл еще в 1932 г.
А. Н. Бах [6]. По этой реакции при окислении аминокислот ак-
цептором водорода являются хиноны, при этом выделяется аммиак
и углекислый газ:
Р _ СН — NH2 — СООН + 1 /2О2 -> R — СНО 4- NH3 + СО2.
Впервые эту реакцию осуществили М. А. Бокучаева и В. Р. По-
пов (1954) при добавлении аминокислот в ферментированный
чайный лист. При этом резко возросло количество альдегидов.
Весьма возможно, что при растирании ягод винограда за счет
вторичных окислительных процессов возникают новые вещества,
которые не присущи винограду.
П. Риберо-Гайон, Ж. Буадрон и А. Тернер [157] показали, что
при раздавливании ягод винограда часть терпеновых спиртов (ли-
налоол) окисляется, образуя оксиды линалоола, так называемые
фурановые и пирановые оксиды.
А. Раппом и X. Гастричем и др. [151] методом экстракции
фреоном-11 с помощью газожидкостной хроматографии в виногра-
де было обнаружено около 300 компонентов. Весьма возможно,
что при дроблении винограда в аэробных условиях и воздействии
окислительных ферментов могли возникнуть (в результате проте-
кания вторичных реакций) новые компоненты, которые отсутст-
вуют в нетронутой виноградной ягоде.
Таким образом, при переработке винограда протекают слож-
ные биохимические процессы, от которых зависит получение того
или иного типа вина. Следовательно, винодел должен обращать
особое внимание на способы дробления винограда, ферментации
и брожения сусла.
Для получения вин кахетинского типа требуется усиление окис-
лительных процессов в мезге путем тщательного дробления вино-
града при продолжительной выдержке и перемешивании. Для по-
лучения вин европейского типа и шампанских виноматериалов не-
обходимо проводить быстрое прессование целых гроздей виногра-
100
да с быстрым отделением сусла от твердых частей с последующей
сульфитацией и выдержкой сусла в атмосфере СО2 или инертных
газов.
Регулирование окислительно-восстановительных
процессов
Свежее сусло, а также полученное из него вино как биологи-
ческие среды обладают определенным механизмом, регулирую-
щим скорость протекания окислительно-восстановительных процес-
сов в зависимости от содержания в них биокатализаторов.
При переработке винограда наступают физико-химические и
биохимические изменения, которые предопределяют ход дальней-
ших превращений.
Переработка винограда машинами связана с разрушением
твердых частиц мякоти, кожицы и гребней, при этом сусло обо-
гащается ферментами, дубильными, красящими и другими веще-
ствами, нарушается последовательность окислительно-восстанови-
тельных процессов.
Какие же биохимические и химические процессы протекают
при изготовлении кахетинских, красных столовых и десертных
вин?
Производство кахетинских и красных вин складывается из сле-
дующих операций: дробление винограда, загрузка его в бродиль-
ные резервуары, брожение мезги, прессование мезги и отделение
от нее молодого вина [20]. В зависимости от требований, предъяв-
ляемых к винам, а также от сорта виноград перерабатывают раз-
личными способами. В одних случаях мезга состоит из раздав-
ленных гроздей, включая гребни и семена, в других — гребни
частично удаляются. Главное значение этих твердых частиц за-
ключается в обогащении сусла красящими, дубильными и други-
ми веществами при настаивании на мезге. Так как в кожице и
мякоти содержатся более активные окислительные ферменты, чем
в сусле, то при ферментации мезги с суслом окислительные про-
цессы усиливаются благодаря окислению фенольных соединений,
аскорбиновой и органических кислот, аминокислот и других ве-
ществ под действием о-дифенолоксидазы, пероксидазы, аскорбато-
ксидазы, а также флавиновых оксидаз и дегидрогеназ.
При действии флавиновых оксидаз в присутствии молекуляр-
ного кислорода образуются перекиси:
ФПН2 + О2 -> ФП -и Н2О2,
ФПН2 — восстановленный, а ФП — окисленный флавопротеид.
При появлении в среде перекиси водорода окислительные процес-
сы усиливаются за счет действия пероксидазы. Исходя из этого,
некоторые авторы рекомендуют нагревать грозди винограда или
мезгу до 70° С (для ингибирования окислительных ферментов) или
сульфитировать мезгу.
101
По данным Г. Г. Валуйко [15], технологический запас дубиль-
ных и красящих веществ до переработки винограда составляет от
20 до 30% от общего их содержания. В процессе брожения на
мезге от 20 до 40% фенольных соединений, извлеченных из мезги,
теряется вследствие обратимой адсорбции на мезге, а также окис-
ления их о-дифенолоксидазой, конденсацией и выпадением их в
осадок.
Для интенсификации ферментативных процессов при выработ-
ке катехинских вин в сусло до брожения добавляют ферментиро-
ванную мезгу (Г. И. Беридзе, 1950), при этом вино получается
мягким во вкусе и с более выраженным букетом.
Весьма возможно, что при этом происходит ферментативное
превращение фенолкарбоновых (феруловой, ванилиновой и п-ку-
маровой) кислот с образованием летучих фенолов (крезол, этил-
4-фенол, гваякол, винил-4-гваякол, этилванилин и др.) [НО].
Таким образом, в процессе ферментации сусла с мезгой и бро-
жения на ферментатированной мезге при выдержке получаются
хорошие столовые вина кахетинского типа, густоокрашенные пол-
ные и бархатистые на вкус.
Для приготовления белых столовых и шампанских виномате-
риалов виноград лучше прессовать целыми гроздями [89] и быст-
ро отделять сусло на гидравлическом или пневматическом прессе.
Содержание фенольных и азотистых веществ, а также окислитель-
ных ферментов в высококачественных виноматериалах должно
быть минимальным.
Во избежание усиления окислительных процессов сусло *надо
быстро сульфитировать из расчета 50—75 мг/л SO2 и ферменти-
ровать в течение 12—15 ч. Лучше сусло подвергать центрифуги-
рованию для удаления твердых частиц, которые являются носите-
лями окислительных ферментов; при этом требуется вводить мень-
ше сернистого ангидрида и проводить брожение на чистой куль-
туре дрожжей [133].
За рубежом проводятся исследования по дроблению, прессова-
нию винограда и ферментации сусла с пектолитическими фермен-
тами в атмосфере углекислоты. В Калифорнии построен завод
первичного и вторичного виноделия производительностью по ви-
нограду 100 т/сут. Здесь усовершенствованы дробилки-гребнеотде-
лители (частота вращения уменьшена до 300 об/мин), для прессо-
вания применяются гидравлические прессы. При технологических
операциях регулируют температуру, брожение проводят на чистых
культурах дрожжей [137].
' В последнее время у нас в стране проводятся исследования по
изучению качества сусла и вина, полученных на линиях с центро-
бежными и валковыми дробильно-гребнеотделяющими машинами
и стекателями ВССШ-20 [24]. Для ускорения отстаивания сусла
применяли промышленный ферментный препарат Пектоваморин
ШОх в количестве до 1%. Было установлено, что вина, получен-
ные из сусла с дробилок ЦДГ-20, подвержены большему побуре-
нию, чем сусло после прессования целыми гроздями. Обработка
102
сусла SO2 и бентонитом позволяет получить вина менее окислен-
ные. Однако бентонитовая суспензия вызывает изменения химиче-
ского состава сусла.
Исследования К. С. Попова [68] показали, что лучшее качест-
во белых столовых вин достигается при прессовании винограда
целыми гроздями, чем при дроблении на ударно-центробежных
дробилках или на гребнеотделяющих машинах и стекателях. Раз-
ница в дегустационных оценках 0,7 балла. Было отмечено также,
что при прессовании винограда целыми гроздями получаются вина
с цветочными тонами в букете и большей свежестью.
Механическая уборка винограда сопряжена с нарушением це-
лостности ягод, при этом возникает немедленное и необратимое
окисление сусла еще до начала прессования. Вино получается с
окисленными тонами во вкусе и букете.
За рубежом проводятся исследования по изучению различных
систем прессов для получения качественного сусла. Так, сусло, по-
лученное на непрерывных шнековых прессах (НШП) фирмы «Ко-
ка и Пера» [131], имеет повышенное содержание фенольных сое-
динений и низкий выход прессовых фракций (15—20% сусла пер-
вого давления и 3—5% сусла второго давления), что делает влия-
ние этих фракций на качество всего объема сусла незначитель-
ным.
Новый тип шнекового пресса, выпущенного во Франции в
1978 г., отличается от существующих тем, что в момент прессова-
ния шнек вращается и вносит свежую партию мезги в прессовую
камеру. Этот тип пресса дает сусло с меньшим содержанием взве-
сей и пониженной концентрацией фенольных веществ [131].
Таким образом, для производства неокисленных вин и шампан-
ских виноматериалов необходимо проводить прессование виногра-
да целыми гроздями и быстро отделять сусло. Полученное сусло
лучше центрифугировать, чем прессовать. При этом требуется
меньше сернистой кислоты, чем при ферментации сусла. Жела-
тельно все операции с получением сусла проводить в атмосфере
углекислоты.
От интенсивности протекания окислительных процессов в сусле
зависит и качество вина. При интенсивном протекании окислитель-
ных процессов, т. е. при окислении фенольных соединений, обра-
зуются хиноны, которые дегидрируют аскорбиновую, диоксифума-
ровую кислоты и другие вещества, играющие важную роль в вос-
становительных процессах. При интенсивном протекании фермен-
тативных процессов окислительные процессы идут так глубоко,
что окисляются даже аминокислоты, спирты, в частности терпено-
вые спирты. Например, линалоол, образует оксиды линалоола и
букет вина заметно ухудшается. Вино из переокисленного сусла
теряет фруктовый аромат.
С другой стороны, при быстром отделении сусла от мезги не
происходит обогащения сусла эфирными маслами, в частности
терпеноидами, от содержания которых во многом зависит качест-
во вина.
103
Е. Н. Датунашвили с сотрудниками [25] и В. И. Зинченко с
сотрудниками [41], показали, что при выдержке сусла с мезгой
в течение нескольких часов происходит гидролиз высокомолеку-
лярных коллоидных веществ под действием ферментов ягоды ви-
нограда. Это облегчает сокоотделение, за счет чего увеличивается
выход сусла. Кроме того, это способствует обогащению вина экс-
трактивными и ароматобразующими веществами [95].
Согласно нашим представлениям при выдержке сусла с мезгой,
помимо гидролиза гемицеллюлоз и других высокомолекулярных
соединений, происходит распад гликозидов и высвобождение тер-
пеноидных соединений, главным образом линалоола, гераниола,
нерола и а-терпинеола. Для этого процесс необходимо проводить
в анаэробных условиях. Прессование винограда и выдержку сусла
на мезге надо проводить в атмосфере углекислоты или азота.
Роль сернистой кислоты
Сернистую кислоту с давних пор применяют в виноделии на
всех этапах приготовления вина, благодаря ее антисептическому
и антиоксидантному действию.
Сернистая кислота в сусле и вине образует 4 формы: газооб-
разный сернистый ангидрид — SO2, сернистую кислоту — H2SO3,
которая быстро диссоциирует с образованием ионов бисульфита
HSOj“ и сульфита .
Антисептическую роль приписывают недиссоциированной фор-
ме сернистой кислоты H2SO3 и в меньшей степени $02 и HSO^.
Этих активных форм в сульфитированном сусле и вине очень ма-
ло. Содержание их зависит от pH и температуры среды. В вине,
содержащем 50 мг/л свободной S02 » при pH 2,8 в активной фор-
ме находится около 4 мг/л, при pH 3,3—1,5 мг/л, а при pH 3,7 —
всего лишь 0,6 мг/л.
Таким образом/антисептическое действие зависит главным об-
разом от pH среды. Вино и сусло с более высокой кислотностью
лучше защищаются сернистой кислотой от развития в них вред-
ных микроорганизмов, а также от окисления.
Антисептическое действие связано со свободной сернистой кис-
лотой, пока она является недиссоциированной.
Ее действие против культурных дрожжей вида Sacch. vini зна-
чительно слабее, чем против диких дрожжей и бактерий, поэтому
она непригодна для стабилизации полусладких и сладких десерт-
ных вин, содержащих большое количество сахара. Для задержа-
ния брожения необходимы высокие дозы сернистой кислоты (до
450—500 мг/л). Известно, что такие дозы вредны для человече-
ского организма.
Действие сернистой кислоты заключается в том, что в ее при-
сутствии протекает чистое брожение на культурных дрожжах. Из-
вестно, что микроорганизмы обладают различной устойчивостью
к сернистой кислоте. Наиболее чувствительны к ней уксусные и
104
молочнокислые бактерии, малоустойчивы плесени, а также Sacch.
apiculatus, микодерма и другие дикие дрожжи. Sacch. vini выно-
сят довольно большие количества сернистой кислоты от 170 до
200 мг/л, a Sacch. torula — до 400 мг/л. По другим данным (Шан-
дерль, 1967), Sacch. vini выносят до 500 мг сернистой кислоты.
Токсическое действие сернистой кислоты зависит от физиологи-
ческого состояния дрожжей. В стадии почкования и брожения они
более устойчивы, старые и голодающие дрожжи погибают даже
при низкой ее концентрации.
Сернистая кислота оказывает защитное действие против энзи-
матических окислений. Она ингибирует действие оксидаз, в част-
ности о-диффенолоксидазу; в этом заключается ее основная роль
как антиоксиданта. Кроме того, она потребляет часть растворен-
ного кислорода для собственного окисления в серную кислоту.
Этот процесс усиливают соли тяжелых металлов (ионы железа).
Поэтому удаление железа из вина желтой кровяной солью спо-
собствует сохранению сернистой кислоты в вине. Сернистая кис-
лота значительно снижает редокспотенциал в молодых винах (на
60—65 мг), так как обладает восстановительными свойствами.
В присутствии сернистой кислоты в сусле и вине образуется, окис-
лительно-восстановительная система: сульфит^сульфат с потен-
циалом около 200 мВ.
Сернистая кислота действует и как акцептор кислорода, вслед-
ствие чего происходит уменьшение количества кислорода в среде,
что препятствует развитию аэробных микроорганизмов.
Дрожжи Sacch. vini также испытывают недостаток кислорода.
Однако они переходят к анаэробному обмену веществ, т. е. к
брожению.
Механизм антисептического действия сернистой кислоты еще
окончательно не установлен. Большинство исследователей счи-
тают, что эта кислота способна блокировать некоторые энзимы,
особенно окислительные ферменты, как, например, дегидрогеназы.
Сернистая кислота парализует клеточную функцию дрожжей. По
данным Ж. Риберо-Гайона и др. [74], 100 mf/л сернистой кисло-
ты блокирует дыхание дрожжей на 40%. Антисептическое дейст-
вие сернистой кислоты заключается в том, что она предохраняет
сусло от самопроизвольного забраживания в резервуарах для ос-
ветления и очищения от мути и слизистых веществ. В процессе
отстаивания взвешенные частицы оседают на дно и увлекают с
собой постороннюю микрофлору — дикие дрожжи, бактерии и
плесени. Технологическое значение сернистой кислоты состоит в
том, что благодаря ее присутствию вся микрофлора сусла поги-
бает и брожение сусла осуществляется на чистой культуре дрож-
жей.
Считают, что сернистая кислота стимулирует алкогольное бро-
жение (Кордонье, 1959). Объясняется это тем, что, во-первых, эта
кислота разрушает некоторые вещества, которые ингибируют спир-
товое брожение, подавляет рост бактерий и других микроорганиз-
мов, которые ассимилируют витамины и другие вещества, стиму-
105
лирующие размножение дрожжей. При сульфитации сусла эти
вещества сохраняются и используются культурными дрожжами.
Во-вторых, возможно, что сера, входящая в сернистую кислоту и
сульфиты, образует сульфгидрильные соединения — цистеин и
глютатион, которые активируют алкогольдегидрогеназу и другие
дегидрогеназы, участвующие в активации алкогольного брожения.
Сернистая кислота не только как антисептик, но как ингиби-
тор подавляет действие окислительных ферментов и препятствует
образованию окрашенных продуктов, портящих вкус и букет сто-
ловых вин.
Сторонником применения сернистой кислоты в СССР является
М. А. Герасимов (1955). Его первые исследования показали, что
использование сернистой кислоты при отстаивании сусла имеет
ряд преимуществ. Сусло очищается от вредных микроорганизмов,
улучшается качественный состав вина, повышается количество
глицерина, экстрактивных веществ и понижается содержание ле-
тучих кислот. С помощью сернистой кислоты можно регулировать
алкогольное брожение.
Помимо антиоксидатного и антисептического действия, серни-
стая кислота обладает еще и другими ценными свойствами. При
добавлении в сусло она способствует его осветлению вследствие
коагуляции отрицательно зараженных коллоидов, повышает кис-
лотность, а также увеличивает извлечение красящих веществ из
кожицы винограда.
Главным свойством сернистой кислоты в винах является свя-
зывание ее с карбонильными соединениями, в частности главным
образом с уксусным альдегидом и. диацетилом, которые портят
вкус и букет вина. Сернистая кислота как бы очищает вино от
посторонних веществ и при этом яснее чувствуются характерные
цветочно-фруктовые тона.
В сусле и вине сернистая кислота находится еще и в соедине-
нии со многими важными компонентами, а именно с альдегидами,
кетокислотами, красящими веществами и сахарами. Главнейший
из них — это альдегидсернистая кислота.
Реакция образования альдегидсернистой кислоты следующая:
Ю /SO3H
СН3 — С + HSO3H Z сн3 — С—он.
хн
Исходя из молекулярных масс, 64 мг сернистой кислоты свя-
зывают 44 мг уксусного альдегида. Хотя константа диссоциации
альдегидсернистой кислоты незначительная (2,4 -10-6), количеств
во свободной сернистой кислоты в присутствии уксусного альде-
гида в вине не превышает 1—3%. Однако все же при выдержке
вина (вследствие уменьшения количества свободной сернистой
кислоты) происходит частичный распад альдегидсернистой кисло-
ты и освобождается небольшое количество сернистой кислоты.
Повышение температуры до 35°С заметно не изменяет константу
диссоциации.
106
Скорость связывания ацетальдегида с сернистой кислотой за-
висит главным образом от pH вина. При pH 1,0 реакция проте-
кает интенсивно и заканчивается за 24 ч; при pH 3,3 она проте-
кает на 98% за 90 мин и заканчивается за 5 ч, а при pH 7 свя-
зывание происходит за несколько минут.
При выдержке вина вследствие постепенного уменьшения со-
держания свободной сернистой кислоты происходит распад аль-
дегидсернистого соединения и освобождение новых порций серни-
стой кислоты, которые расходуются на другие процессы.
Таким образом, введенная в сусло и вино сернистая кислота
частично окисляется в серную, большая часть вступает в соедине-
ние с компонентами вина, а остальная часть находится в свобод-
ном состоянии. Причем свободная сернистая кислота находится в
равновесии между связанными и свободными ее формами.
Главными соединениями, которые связывают сернистую кисло-
ту, являются уксусный альдегид, пировиноградная и а-кетоглута-
ровая кислоты. Образование этих трех соединений зависит от ви-
да применяемых дрожжей. Исходя из этого, были изучены дрож-
жи вида Sacch. cerevisiae и Sacch. oviformis при ферментации вино-
градного сусла. Установлено, что дрожжи вида Sacch. oviformis
образуют больше уксусного альдегида и кетокислот, которые свя-
зывает значительные количества сернистой кислоты.
В 1964 г. И. Боцило было проведено изучение содержания ук-
сусного альдегида и сернистой кислоты более чем в 100 образцах
белых и красных вин Югославии. Анализы показали, что накоп-
ление уксусного альдегида в вине прямо пропорционально кон-
центрации сернистой кислоты, введенной в сусло. Исходя из этого,
автор рекомендует сульфитировать сусло минимальными количест-
вами сернистой кислоты до начала брожения. При введении боль-
ших количеств сернистой кислоты происходит накопление альдеги-
дов и дикетонов (главным образом диацетила), портящих вкус и
букет вина, т. е. накопление альдегидов и кетонов зависит от со-
держания сернистой кислоты в бродящем сусле.
Способность дрожжей к образованию сернистой кислоты стала
известна в науке в последнее двадцатилетие, когда Г. Шандерль
[96] показал, что винные дрожжи способны восстанавливать
сульфаты и тиосульфаты в сульфиты.
Источником образования сульфитов может служить элементар-
ная сера, применяемая для опрыскивания виноградников (112].
Восстановление сульфатов в сульфиты зависит от штамма дрож-
жей, как Sacch. baynus образует в молодом вине значительно боль-
ше сернистой кислоты, чем Sacch. cerevisiae [ИЗ].
Образование дрожжами сернистой кислоты в процессе спирто-
вого брожения было изучено на 123 штаммах дрожжей. Установ-
лено, что только небольшая часть штаммов (около 2%) заметно
повышает количество сернистой кислоты в процессе брожения
(свыше 50 мг/л); 5% штаммов — до 21—50 мг/г, а 15% —до 11—
20 мг/л. Остальные 78% штаммов дрожжей образуют незначитель-
ное количество сернистой кислоты (от 1 до 10 мг/л) [107]. Дрож-
107
жи Carlsbergensis образуют наибольшее количество/ сернистой
кислоты при алкогольном брожении. Превращение сульфатов в
сульфиты было показано меченой серой [118].
Винные дрожжи в облигатно-анаэробных условиях способны
восстанавливать сернистую кислоту в сероводород и даже до эле-
ментарной серы по реакции: 2H2S + SO2-^3S + 2Н2О.
- При прохождении этой реакции запах сероводорода исчезает
и элементарная сера выпадает в осадок.
Недавно были выделены анаэробные бактерии, которые восста-
навливают сульфат до сероводорода при одновременном окисле-
нии уксусной кислоты [177] по реакции: СНзСООН+5О4->-
->2HCO3 + H2S. Полагают, что это процесс не энзиматический и
что эту реакцию стимулируют восстановленные вещества, такие,
например, как цистеин [167].
Многие исследователи считают, что образование сернистой кис-
лоты и сероводорода является восстановительным процессом и в
реакции участвуют следующие метаболиты: восстановление суль-
фатов в сульфиты протекает через аденозин-5-фосфосульфат (APS)
и З-фосфоаденозин-5-фосфосульфат (PAPS) [112]. Для восстанов-
ления сернистой кислоты до сероводорода необходим НАДФ-Н2,
цистеин может быть предшественником сероводорода. Так, дрож-
жи способны разложить цистеин до сероводорода, пировиноград-
ной кислоты и аммиака. Метионин ингибирует образование серо-
водорода. Образование сероводорода зависит от недостатка в
дрожжах пантотената и пиридоксина, что связано с восстановле-
нием сернистой кислоты в сероводород.
Медико-гигиеническое действие сернистой кислоты
В настоящее время широко обсуждается вопрос о токсичности
сернистой кислоты, особенно в больших дозах.
Многими исследователями было установлено, что сернистая
кислота, попадая с вином в желудок человека, через стенки же-
лудка и кишечника быстро всасывается и поступает в кровь.
В кровеносной системе сернистая кислота окисляется кислородом
гемоглобина и кровь обедняется кислородом, при этом нарушает-
ся кислородное питание, что приводит к головным болям.
Не только свободная сернистая кислота оказывает вредное
влияние на организм человека, но и связанная сернистая. Послед-
няя попадает в тонкий кишечник, где под влиянием щелочной ре-
акции распадается. Освобожденная сернистая кислота попадает
в кровь и отнимает кислород от гемоглобина (Шандерль Г., 1967).
Таким образом, как свободная, так и связанная сернистая кис-
лота оказывает вредное влияние на организм человека. Ж. Рибе-
ро-Гайон и Е. Пейно считают, что количество сернистой кислоты,
которое обычно применяется в виноделии, не оказывает отрица-
тельного влияния на организм человека. Они не рекомендуют вво-
дить в вино большие количества сернистой кислоты и из-за ухуд-
шения его качества.
108
Считаю\, что доза сернистой кислоты, потребляемая. человеком
вместе с пиццей, не должна превышать 20—30 мг в день.
Некоторый исследователи (К. Вушерпфенниг и Г. Бретхауер,
1970) считают; что при введении чистой разводки дрожжей в бро-
дящее сульфитйрованное сусло получается вино худшего качества,
чем вино, полученное при спонтанном брожении. При сбражива-
нии виноградного сусла на естественных дрожжах получалось су-
хое вино более высокого качества, чем вино, полученное при сбра-
живании на чистой культуре дрожжей.
Напротив, М. А. Герасимов считает, что внедрение в виноделие
для сбраживания ферментированного сусла чистой культуры се-
лекционированных дрожжей с применением сернистой кислоты
является одним из крупнейших достижений науки за последнее
время. Из зарубежных исследователей Т. Кастели также является
активным сторонником применения чистых культур дрожжей в
виноделии.
В связи с тем что повышенное количество сернистой кислоты
может оказывать вредное физиологическое действие на организм
человека и придавать неприятные вкусовые ощущения, возник во-
прос о замене ее другими веществами.
На некоторых международных конгрессах по виноградарству
и вину были приняты рекомендации об ограничении добавляемых
в вино доз сернистой кислоты. Вместе с этим во многих странах
проводятся многочисленные исследования с целью изыскания ее
заменителей.
Следует указать, что найденные и испытанные антибиотики
пока не применяются в виноделии из-за того, что они действуют
на ферментные системы организма человека, и в виноделии их не
разрешается применять.
Некоторые заменители сернистой кислоты
До настоящего времени не было пока, найдено полного замени-
теля сернистой кислоты, хотя имеется ряд веществ, в комплексе
до некоторой степени обладающих свойствами сернистой кислоты.
Используют их главным образом не с целью полной замены сер-
нистой кислоты, а для частичного снижения ее доз. К этим веще-
ствам относятся сорбиновая и аскорбиновые кислоты, а также ди-
этиловый эфир пироугольной кислоты. Недавно испытана 5-нитро-
фурилакриловая кислота (5НФА). Обычно применяют ее натрие-
вую соль (Д/а-5НФА) в количестве от 5 до 10 мг/л [114].
Сорбиновая кислота. В последнее время в СССР, а также за
рубежом для консервирования фруктовых соков и вин применяет-
ся сорбиновая кислота. Эта кислота более интенсивно ингибирует
развитие, дрожжей, чем сернистая. Так, например, 200 мг/л сорби-
новой кислоты задерживает брожение, как 300 мг/л сернистой
кислоты.
Сорбиновая кислота слабее действует на микрофлору виноград-
ного сусла и не действует на молочнокислые и уксуснокислые бак-
109
терии. Антисептическое действие ее зависит от содержания спирта,
от концентрации водородных ионов, возраста дрожжей и темпе-
ратуры вина. Сорбиновая кислота при pH 2,8 заметно уменьшает
дыхание дрожжей, а при pH 3,6 слабо влияет list их дыхание.
В кислой среде она быстрее диффундирует в кл^ку дрожжей и
сильнее ингибирует дыхание. При pH 2,8 она блокирует энзимы,
содержащие SH-группы, например алкогольдегйдрогеназу, фума-
разу и энолазу. !
Сорбиновая кислота имеет две двойные связи, вследствие чего
легко распадается в водных растворах, а также и в винах. Обна-
ружено, что при хранении вина с сорбиновой кислотой в течение
6—7 месяцев она распадается на карбонильные соединения, ко-
торые выделены с помощью 2,4-динитрофенилгидразина. Для не-
которых микроорганизмов сорбиновая кислота является источни-
ком углеродного питания. В результате действия микроорганизмов
содержание ее в вине уменьшается и создаются благоприятные
условия для развития других микроорганизмов [108].
Кроме того, сорбиновая кислота не обладает антиоксидантным
действием. Поэтому ее рекомендуют применять совместно с серни-
стой кислотой. Е. Пейно рекомендует брать 200 мг/л сорбиновой
кислоты и не более 50 мг/л сернистой. Доза сорбиновой кислоты
не должна превышать 300 мг/л, так как повышенное ее количест-
во ухудшает вкус вина.
Рекомендуют также применять сорбиновую кислоту совместно
с диэтиловым эфиром пироугольной кислоты или с витамином Кб-
" Диэтиловый эфир пироугольной кислоты. Недавно было пока-
зано, что в качестве вещества, подавляющего деятельность не
только дрожжей, но и других микроорганизмов, можно применять
диэтиловый эфир пироугольной кислоты, который в количестве
160—200 мг/л подавляет рост дрожжей.
При повышенной спиртуозности доза может быть уменьшена до
50 мг/л. Ингибирующее действие диэтилпирокарбоната заключает-
ся в том, что он способен реагировать с аминогруппами дыхатель-
ных ферментов дрожжей.
Диэтилпирокарбонат — очень неустойчивое соединение, в винах
с pH 3,3 через 2 ч распадается на этиловый спирт и углекислоту
на 50%, а через 10—12 ч полностью разрушается, теряя антисеп-
тические свойства.
С увеличением кислотности гидролиз диэтилпирокарбоната уси-
ливается.
Исследования показали, что диэтилпирокарбонат, содержащий
меченый углерод (С14), способен связываться с компонентами
вина.
Наряду с распадом диэтилпирокарбоната протекают и побоч-
ные реакции, в результате образуются карбоксиэтилпроизводные
аминокислот, пептидов, гликозидов. В винах эти побочные реак-
ции составляют 5—6% первоначальной активности. Сравнительно
сильно реагируют продукты распада диэтилпирокарбоната с гид-
роксильными группами и аминогруппами, содержащимися в ами-
110
нокислотах\ С повышением pH реакция обмена С14 подавляется,
и наоборот. \
Диэтилпир^карбонат как ингибитор задерживает брожение
слабоалкогольных вин с несброженным сахаром. Лучшие резуль-
таты получаются при совместном применении 200 мг/л диэтилпи-
рокарбоната и не более 50 мг/л сернистой кислоты. При этом эф-
фективность действия препарата увеличивается на 60%.
Для достижений стерилизации рекомендуется обрабатывать ви-
но перед розливом в бутылки диэтиловым эфиром пироугольной
кислоты, который следует диспергировать в вино посредством азо-
та или нейтральных газов или — в виде спиртового раствора. Пе-
ремешивание вина надо производить в атмосфере азота.
Диэтилпирокарбонат обладает легким фруктовым ароматом и
не искажает естественный букет и вкус вина. Кроме того, при
распаде диэтилового эфира пироугольной кислоты образуется не-
значительное количество этилкарбоната, который обладает фрук-
товым запахом.
Диэтилпирокарбонат не токсичен и представляет собой бесцвет-
ную прозрачную жидкость. Растворимость его в воде 0,6%, хо-
рошо растворим в этиловом спирте.
Испытан также диметилдикарбонат, который, гидролизуясь в ви-
не, образует метанол, поэтому непригоден для виноделия.
Аскорбиновая кислота. Установлено, что эта кислота обладает
большим антиокислительным действием, чем сернистая. При сов-
местном действии эффективность значительно увеличивается. В при-
сутствии сернистой кислоты антисептическое действие аскорби-
новой увеличивается, поэтому ее применяют совместно с серни-
стой кислотой не только для предупреждения окисления, но и для
предохранения от развития микроорганизмов.
Аскорбиновая и сернистая кислоты ведут себя различно. Если
сернистая кислота, окисляясь, акцептирует кислород воздуха или
кислород перекиси водорода, то аскорбиновая, дегидрируясь, от-
дает два водорода и восстанавливает окисленные вещества, как
например, хиноны. При неферментативном окислении, т. е. иона-
ми меди и железа, она образует дегидроаскорбиновую кислоту и
перекись водорода.
Последняя в присутствии следов тяжелых металлов окисляет
компоненты вина, например, винную, яблочную кислоты, аминокис-
лоты, а также сернистую.
Первый продукт окисления аскорбиновой кислоты — это моно-
дегидроаскорбиновая кислота, которая также обладает окисли-
тельной способностью.
Таким образом, аскорбиновая кислота не может быть рекомен-
дована для совместного введения с сернистой кислотой в сусло и
вино в присутствии кислорода. Кроме того, первый продукт окис-
ления аскорбиновой кислоты — дегидроаскорбиновая кислота —
легко распадается в треоновую и щавелевую кислоты, портящие
вкус и букет вина. При избытке кислорода в вине аскорбиновая
жислота, окисляясь, образует перекись водорода; последняя в при-
111
сутствии тяжелых металлов настолько усиливает окислительные
процессы, что может появиться мышиный тон. /
Так, продукты распада аскорбиновой кислоты вызывают ката-
литический распад не только компонентов вина, но и сернистой
кислоты, введенной извне. Согласно данным Е/ Кильхофера и
Г. Вюрдига, содержание сернистой кислоты в /вине за 15 дней
уменьшается на 22—25 мг/л, а в присутствии Ажорбиновой кис-
лоты сернистая окисляется в 5 раз быстрее и/ составляет за это
время до 100 мг/л. Это свидетельствует о том, что аскорбиновую
кислоту не рекомендуется применять в аэробных условиях.
Исходя из этого, А. С. Вечер и В. М. Лоза (1957) удачно при-
менили аскорбиновую кислоту в производстве шампанского. При
шампанизации вина как бутылочным, так и резервуарным методом
протекают восстановительные процессы вследствие вторичного бро-
жения, вызываемого дрожжами, поэтому аскорбиновая кислота
сохраняется в шампанском при отсутствии кислорода.
Аскорбиновая кислота снижает редокспотенциал в вине, она
восстанавливает окисленные вещества, которые участвуют в обра-
зовании букета, поэтому вкус и букет шампанского намного улуч-
шаются, а шампанское приобретает свежесть.
Несмотря на сильное восстановительное действие, аскорбино-
вая кислота не может полностью заменить сернистую кислоту в
виноделии, так как не обладает антисептическими свойствами.
Она частично может заменить сернистую кислоту как сильный вос-
становитель.
Исходя из этого, аскорбиновую кислоту применяют совместно
с сернистой в анаэробных условиях для предупреждения вин от
окисления и от микробиальных заболеваний. Оптимальная доза
аскорбиновой кислоты 50—70 мг/л при содержании 15—20 мг/л
SO2 без доступа кислорода воздуха.
Таким образом, равноценные эффективные заменители серни-
стой кислоты до настоящего времени не найдены.
Сернистая кислота пока является единственным средством, об-
ладающим как антисептическим, так и антиоксидантным дейст-
вием. ..
Глава 10
БРОЖЕНИЕ ВИНОГРАДНОГО СУСЛА
Первые попытки вскрыть природу химизма образования этило-
вого спирта из сахара были предприняты в начале XIX в. К этому
времени А. Лавуазье и Л. Гей-Люсак сформулировали суммарное
уравнение, основываясь на определении спирта и углекислоты:
C6Hi2O6 -> 2С2Н5ОН + 2СО2.
Однако в то время существовали различные мнения по вопросу,
какие реакции происходят при превращении сахара в спирт и уг-
112
лекислот}\ В связи с этим в середине XIX в. между Ю. Либихом
и Л. Пастером возник спор, в котором были затронуты основные
философский проблемы биологии.
Ю. Либих выдвинул химическую теорию процесса брожения,
вызываемую белковыми веществами дрожжей, которые, разла-
гаясь, приводят^ к молекулярным колебаниям, при этом сахар рас-
падается на спирт и углекислоту.
Одновременно\Л. Пастер убедительными опытами доказал, что
сбраживание сахара происходит только в присутствии микроорга-
низмов, являющихся возбудителями алкогольного брожения, так
называемых дрожжей. Этим Л. Пастер сумел установить живую
природу дрожжей и обосновать взгляд на брожение как на ре-
зультат жизнедеятельности дрожжей и доказать несостоятельность
теории Ю. Либиха.
Л. Пастер считал, что дрожжи, способные существовать без
кислорода, приобретают энергию из сахара при разложении его
на спирт и углекислоту.
Способность дрожжей к анаэробному брожению соответствует
выходу спирта согласно уравнению разложения сахара на этанол
и углекислоту. Но если их культивировать в аэробных условиях, то
выход спирта уменьшается, так как часть сахара расходуется на
дыхание.
Впервые Л. Пастер делает вывод, что выход спирта по отно-
шению к израсходованному сахару значительно ниже.
Угнетение брожения дыханием О. Варбург назвал пастеровским
эффектом.
Хотя некоторые исследователи выступили с критикой в отно-
шении эффекта Пастера, но все же было установлено, что кисло-
род благоприятствует размножению дрожжей, при этом выход
спирта значительно уменьшается.
В аэробных условиях дрожжи переключаются с брожения на
дыхание.
Это оправдалось в опытах С. П. Костычева, который установил,
что в присутствии кислорода дрожжи не прекращают брожения
и сбраживают 2/3 сахара с одновременным его окислением на 7з-
Для выявления механизма эффекта Пастера были проведены
многочисленные исследования. Считают, что эффект Пастера яв-
ляется результатом взаимодействия между различными энергети-
ческими путями, существующими у дрожжей. Одним из проявле-
ний такого взаимодействия является концентрация аденозиндифос-
фата и неорганического фосфата между процессами субстратного
фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фос-
форилирования в дыхательной цепи.
Л. Пастер установил связь между жизнедеятельностью дрож-
жей и процессом брожения, но какова была эта связь и как про-
исходит процесс брожения, на это он ответить не смог.
Пролить свет на эти жизненно важные вопросы удалось только
Э. Бюхнеру, который впервые показал, что спиртовое брожение
является энзиматическим процессом.
113
Для выделения энзимов брожения Бухнер применил ^пособ ме-
ханического разрушения живых клеток под высоким давлением.
Исследования показали, что дрожжевой сок, полученный при
прессовании дрожжей, кроме зимазы содержит еще/ряд фермен-
тов. /
Впоследствии было выяснено, что зимаза является смесью эн-
зимов. /
В результате многочисленных биохимических/исследований бы-
ло установлено, что процесс превращения глюкозы в этанол и уг-
лекислоту очень сложный и протекает через ряд промежуточных
соединений с участием различных энзимов.
В этих работах принимали участие такие выдающиеся ученые,
как А. Н. Лебедев, С. П. Костычев, К. Нейберг, Г. Эмбден, О. Мей-
ергоф и др., которые выявили отдельные этапы спиртового бро-
жения.
Химизм алкогольного брожения
В дрожжевой клетке содержится множество ферментов, кото-
рые осуществляют разные биохимические процессы, в том числе
и алкогольное брожение.
Подготовительный этап брожения углеводов заключается в об-
разовании фосфорных эфиров гексоз. Первые шаги в этом направ-
лении были сделаны советскими учеными Л. А. Ивановым и
А. Н. Лебедевым, которые обнаружили участие фосфатов в син-
тезе фосфорных гексоз.
Затем это подтвердили зарубежные исследователи А. Гарден и
В. Юнг.
Исследования Л. А. Иванова и А. Н. Лебедева показали, что
если к свежему дрожжевому соку добавить глюкозу, то скоро
начинается брожение, которое затем постепенно замедляется, но
которое можно восстановить прибавлением неорганического фос-
фора.
Выделенный ими из бродящей среды фосфорный эфир ока-
зался фруктофуранозо-1,6-дифосфатом. Более глубокие Исследова-
ния этих ученых показали, что фосфорные эфиры гексоз состоят из
равновесной смеси глюкопиранозо-6-фосфата и фруктофуранозо-6-
фосфата.
Фосфолирование глюкозы является необходимым процес-
сом для перевода ее в лабильное метаболитически активное сое-
динение.
Действием фермента гексокиназы происходит перенос одного
остатка фосфорной кислоты от аденозидтрифосфата (АТФ) на
глюкозу, при этом образуется глюкопиранозо-6-фосфат и адено-
зиндифосфат (АДФ). Затем'действием фермента гексозофосф ати-
зомеразы глюкопиранозо-6-фосфат превращается в фруктофура-
назо-6-фосфат. Все эти реакции образования фосфорных эфиров
гексоз на первой стадии брожения изображены в следующей
схеме:
114
^0 \
<f-H
СНОН СНОН
снон 4<Г^ксокин аз а СНОН + Гексозофосфат-
нон 4-АТФ СНОН изомераза
1 СНОН СНОН
сн2он сн9о[7]
Глюкоза СН2ОН Глюкозо-6-фосфат сн,о[р]
с=о - с=о
СНОН ь Фосфофрукто- СНОН 1
СНОН киназа + АТФ СНОН
СНОН СНОН 1
- сн2о[р] сн2о[р]
фруктозо-6-фосф{ 1Т Фруктозо-1,6-дифосфат
Образованием фруктозо-1,6-дифосфата заканчивается подгото-
вительный этап, который заключается в превращении глюкозы в
лабильную форму, способную к дальнейшему превращению.
А. Н. Лебедев первым показал, что фруктозо-1,6-дифосфат рас-
щепляется на глицериновый альдегид и диоксиацетон. Позднее это
было подтверждено Г. Эмбденом и О. Мейергофом. Под действием
фермента альдолазы фруктозо-1,6-дифосфат распадается на 3-фос-
фоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон:
СН2о[р]
с=о
СНОН
I
(piOH
СНОН
сн2о[р]
Альдолаза
СН2ОР
н—с—он +
сон
З-Фосфоглицери-
Фруктофуранозо-
1,6-дифосфат
новый альдегид
СН2ОР'
СО
I
СН2ОН
Фосфодиокси-
ацетон
115
Эти два триозофосфата способны к взаимному превращению
под действием фермента триозофосфатизомеразы. /
В дальнейшем 3-фосфороглицериновый альдегид присоединяет
еще один остаток фосфорной кислоты, за счет неорганического
фосфата и образует 1,3-дифосфоглицериновый альдегид, который
в присутствии (НАД) окисляется в 1,3-дифосфоглйцериновую кис-
лоту. ; /
В этой реакции принимает участие фермент триозофосфатдегид-
рогеназа.
Образованная 1,3-дифосфоглицериновая кислота под действием
фермента фосфоглицерокиназы отщепляет один остаток фосфор-
ной кислоты и передается на АДФ с образованием АТФ и 3-фос-
фоглицериновой кислоты. Последняя в присутствии фермента
фосфоглицеромутазы изомеризуется в 2-фосфоглицериновую кис-
лоту.
Эти реакции можно представить в следующем виде:
сн2о[р]
снон
с^о—н
+ Рн-*-НАД
Фосфоглицери-
сн2о[р]
СНОН + НАД -Н2
С^О~[р]
новая кислота
сн2о[р|
снон
+ АДФ + Фосфо-
глицераткиназа
СООН
СНОН + АТФ
сн2о[р]
СООН
| + Фосфоглицеромутаза
снон--------------------
СН2О0
(jtoOH
сноГЛ
сн>он
2-Фосфоглицери-
новая кислота
Под действием фермента фосфопируватдегидрогеназы 2-фосфо-
глицериновая кислота превращается в фосфоэнолпировиноградную
кислоту, а затем в присутствии фермента фосфотрансферазы фос-
фоэнолпировиноградная кислота переходит в энолпировиноград-
ную кислоту.
Эти реакции можно изобразить в следующем виде:
116
СН2ОН
нс—00
Фосфопиру ват-
дегпдрогеназа
СООН
АДФ
СООН
«г-фосфоглпцери-
яовая кислота
сн2
И
с—он
соон
"3
АТФ
СН.
соон
Пировиноградная
кислота
Фосфоэнолпи- Энолпирови-
ровиноградная ноградная
кислота кислота
Реакция образования пировиноградной кислоты является един-
ственным необратимым процессом во всей цепи биохимических
превращений.
Образовавшаяся в процессе брожения пировиноградная кисло-
та может подвергаться различным превращениям в зависимости
от наличия анаэробных и аэробных условий, а также от присут-
ствия различных ферментативных систем. При алкогольном бро-
жении пировиноградная кислота действием фермента карбоксила-
зы декарбоксилируется с образованием уксусного альдегида и уг-
лекислого газа:
Декарбоксилаза
сн3 — со — соон--------------------> сн3сно + со2.
И, наконец, последним этапом алкогольного брожения является
восстановление уксусного альдегида в этанол.
В этом процессе участвует фермент алкогольдегидрогеназа, ко-
торый переносит водород с восстановленного НАД-Н2 на уксус-
ный альдегид и образуется этанол.
НАД • Н,
НАД
Восстановление НАД в НАД-Н2 происходит ранее при окисле-
нии фосфоглицеринового альдегида в фосфоглицериновую кис-
лоту.
При молочнокислом брожении пировиноградная кислота не де-
карбоксилируется из-за отсутствия декарбоксилазы у молочно-
кислых бактерий.
В этом случае она в присутствии лактикодегидрогеназы и
НАД-Н2 восстанавливается в молочную кислоту.
117
сн,
I ”
снон-
соон
НАД
Так образуется молочная кислота при молочнокислом броже-
нии и при гликолизе в мышцах животного.
В аэробных условиях пировиноградная кислота участвует во
многих синтетических процессах; она превращается в ацетил-КоА,
который включается в цикл ди- и трикарбоновых кислот, в синтез
жирных кислот и аминокислот.
Таким образом, пировиноградная кислота занимает централь-
ное место в системе реакций, происходящих при анаэробной и
аэробной диссимиляции углеводов — в процессе брожения и ды-
хания.
Энергетический баланс при алкогольном брожении следующий:
на каждые 2 моля усвоенного неорганического фосфата образует-
ся 2 моля АТФ при разложении 1 моля сахара.
Глюкоза 4- 2Ф + 2АДФ 2этанола 4- 2АТФ 4- СО2 4- 2Н2О.
При этом выделяется 117,6 кДж/моль энергии, за счет которой
и происходит жизнедеятельность дрожжей.
Дрожжи очень экономно используют энергию при сбражива-
нии глюкозы. В продуктах ее распада остаётся большая часть сво-
бодной энергии, которая может быть использована в других био-
логических процессах при дальнейшем расщеплении этих веществ.
При дыхании глюкоза разлагается до воды и углекислоты по
уравнению
С6Н12Об -> 6Н2О 4- 6СО2 4- 2851 кДж/моль.
Большую роль сыграли работы С. П. Костычева, посвященные
выявлению зависимости между брожением (анаэробным дыхани-
ем) и аэробным дыханием. Эта зависимость выражена следующей
схемой:
Глюкоза —СдН120б
4
Промежуточные продукты брожения и дыхания
। !
Брожение и анаэробное Аэробное дыхание 6СО2Ч-6Н2О
дыхание растений
О связи между брожением или анаэробным дыханием и аэроб-
ным дыханием свидетельствует то, что в растениях найдены те
118
же промежуточные продукты, которые образуются дрожжами при
спиртовом брожении. Это подтверждается тем, что в винограде
были найдены этанол, высшие спирты, сложные эфиры, кислоты
(пировиноградная кислота) и альдегиды, в том числе и уксусный
альдегид. Пировиноградная кислота и уксусный альдегид являют-
ся важными продуктами спиртового брожения.
Спиртовое брожение можно регулировать в сторону образова-
ния глицерина, как это было показано еще в начале XX в. К. Ней-
бергом при введении в бродящую жидкость бисульфита натрия,
который связывает ацетальдегид (поэтому последний не может
служить акцептором водорода). Место уксусного альдегида зани-
мает 3-фосфоглицериновый альдегид, который получает водород от
НАД-Н2, образуя глицеринофосфорную кислоту. В результате
действия энзима фосфотрансферазы глицеринофосфорная кислота
гидролизуется с образованием глицерина и фосфорной кислоты,
поэтому вместо этанола в среде накапливается глицерин, уксус-
ный альдегид и углекислота.
Этим и объясняется, что при брожении сусла в присутствии
сернистой кислоты образуется значительное количество глицерина
и уксусного альдегида.
Активность энзимов дрожжей при спиртовом брожении вино-
градного сусла меняется [134]. Активность глюкозидазы возрас-
тает с первого дня брожения до пятого, затем падает. Гексокина-
за проявляет максимальную активность на третий день брожения.
Фосфофруктокиназа и фосфоглюкозоизомераза обнаруживают мак-
симум активности на пятый день, затем их активность падает.
Альдолаза, глицеринальдегид-3-фосфатдегидрогеназа, фосфо-
глицераткиназа и фосфоглицератмутаза имеют максимальную ак-
тивность на четвертый день, затем активность их уменьшается, а
потом вновь увеличивается.
Кокарбоксилаза (тиаминдифосфат) представляет собой фер-
мент для декарбоксимерования пировиноградной кислоты в ацет-
альдегид. Она усиливает скорость алкогольного брожения.
Энолаза, пируватдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа дости-
гают максимума активности на четвертый и пятый день после на-
чала брожения. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 6-фосфоглюкон-
атдегидрогеназа и малатдегидрогеназа проявляют максимум ак-
тивности между пятым и шестым днями брожения. Активность
лактатдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы уменьшается на
четвертый день, а затем начинает возрастать [134]. В этой работе
описана методика определения указанных ферментов.
Алкогольдегидрогеназа непосредственно участвует в образова-
нии этанола. Она была выделена из дрожжей в кристаллическом
виде; молекулярная масса ее 150 000D, содержит четыре моля
НАД, четыре атома цинка и приблизительно 36 свободных SH-
групп. Алкогольдегидрогеназа ингибируется йодуксусной кислотой.
Одни авторы считают, что дрожжевые клетки содержат три ал-
когольдегидрогеназы: одна локализована в митохондриях, две дру-
гие — в цитоплазме. Другие полагают, что в дрожжах имеются
119
две алкогольдегидрогеназы: одна находится в митохондриях, дру-
гая — в цитоплазме [176].
Энзиматическое окисление этанола в уксусный альдегид осу-
ществляется митохондриальной алкогольдегидрогеназой. Наоборот,
цитоплазматическая алкогольдегидрогеназа в присутствии НАД-Н2
способна восстанавливать уксусный альдегид в этанол. При аэроб-
ном окислении этанола дрожжами выделяются ионы водорода
(Н+), это сопровождается поглощением из среды эквивалентного
количества ионов калия (К+). При этом из этанола образуются
эквивалентные количества уксусной кислоты и уксусного альдеги-
да. Установлено, что феназинметасульфат ингибирует поглощение
калия (К+) при окислении этанола.
Еще в самом начале XX в. Г. Виланд показал, что дрожжи Sacch.
cerevisiae окисляют этанол в аэробных условиях в уксусный аль-
дегид, а затем в уксусную кислоту. При интенсивной аэрации
дрожжи окисляют уксусную кислоту до углекислоты и воды, при
этом расход спирта на 20% больше, чем образующихся конечных
продуктов. Объясняется это тем, что значительные количества эта-
нола используются дрожжами для синтеза биомассы углеводов и
липидов. Дрожжи способны дегидрировать и другие высшие спир-
ты. Это свидетельствует о том, что в вине присутствуют высшие
альдегиды алифатического ряда.
Образование вторичных и побочных продуктов
спиртового брожения
Химизм алкогольного брожения за последнее время достаточно
хорошо изучен, но вместе с тем в процессе образования этанола
и углекислоты из сахара возникает множество других соединений,
которые называются вторичными продуктами брожения. Однако
наряду с этим образуются и побочные продукты, источником ко-
торых являются белки, главным образом аминокислоты и другие
соединения.
Как показал Р. Дюпюи [111], при сбраживании 180 г сахара
образуются 83,6 г углекислоты, 87,4 г этанола, 0,4 г сивушных
спиртов, 6 г глицерина, 0,5 г 2,3-бутандиола, 0,8 г янтарной кис-
лоты, 0,3 г молочной кислоты и 0,1 г уксусного альдегида.
Позднее другие исследователи заметили, что в ходе алкоголь-
ного брожения возникают многочисленные продукты, такие, как
уксусная кислота, пировиноградная кислота, ацетоин, диацетил,
высшие спирты, сложные эфиры, лимонная кислота и еще целый
ряд других веществ. Роль этих компонентов в формировании вку-
са и букета вина велика.
Химизм образования вторичных продуктов спиртового броже-
ния выяснен еще не полностью, но для большинства из них изве-
стен. Как указывалось выше, образование глицерина можно объяс-
нить по второй формуле брожения К. Нейберга, согласно которой
одна молекула сахара распадается на глицерин и пировиноград-
ную кислоту. Последняя, декарбоксилируясь, образует уксусный
120
альдегид и углекислоту. При этом типе брожения появление каж-
дой молекулы глицерина сопровождается образованием одной мо-
лекулы уксусного альдегида. Ж. Риберо-Гайон и Е. Пейно назвали
такой тип брожения глицерино-пировиноградным.
Исследования В. 3. Гваладзе (1936) показали, что при дегид-
рировании и конденсации уксусной кислоты образуется янтарная
кислота. М. Лафон экспериментально показала, что при внесении
в бродящую среду уксусной, кислоты, содержащей меченый угле-
род С14 в метильной группе, образовавшаяся янтарная кислота
содержала радиоактивный углерод. Эти исследования подтверди-
ли теорию В. 3. Гваладзе, что янтарная кислота образуется при
дегидрировании и конденсации двух молекул уксусной кислоты.
Известны и другие пути образования янтарной кислоты. Так,
М. Лафон (1955), добавляя в бродящий виноградный сок глюта-
миновую кислоту, установила, что только небольшое количество ее
превращается в янтарную. Этим она доказала, что основное ко-
личество янтарной кислоты (примерно 90%) образуется из саха-
ра, а не из аминокислот по механизму Эрлиха.
Исследования А. К. Родопуло (1959) показали, что при одно-
временном внесении в среду пировиноградной кислоты и радиоак-
тивного бикарбоната натрия наблюдается образование винными
дрожжами уксусной, гликолевой, молочной, янтарной, яблочной и
лимонной кислот. Причем последние четыре оказались мечеными.
Это говорит о том, что дрожжи содержат p-карбоксилазу, которая
карбоксилирует пировиноградную кислоту в щавелевоуксуснукх
Последняя по циклу Кребса образует лимонную, янтарную и яб-
лочную кислоты.
Работами К. Нейберга с сотрудниками доказано, что ацетоин
образуется, если к бродящей жидкости добавить уксусный альде-
гид. Затем ацетоин согласно реакции Канницаро при восстанов-
лении дает 2,3-бутиленгликоль, а при окислении — диацетил. Дей-
ствительно, было показано, что диацетил образуется с первых
дней брожения, затем содержание его уменьшается до 0,7—
0,5 мг/л. При этом количество 2,3-бутиленгликоля в процессе бро-
жения увеличивается.
Известно, что винные дрожжи в нейтральной среде накапли-
вают пировиноградную и молочную кислоты.
Исследованиями С. В. Дурмишидзе (1937) установлено, что
молочная кислота является вторичным продуктом нормального
спиртового брожения и образуется ее около 1 г/л, как в аэробных,
так и анаэробных условиях. Источником ее образования является
глюкоза.
Е. Пейно и Г. Гимберто (1962) экспериментально показали,
что изобутиловый и изоамиловый спирты образуются не только
из аминокислот по схеме Ф. Эрлиха, но еще и из сахара.
Исследования С. В. Дурмишидзе с радиоактивным углеродом
позволили установить, что из уксусного альдегида образуются
почти все вторичные продукты спиртового брожения: этиловый
спирт, уксусная, янтарная, фумаровая, гликолевая кислоты, 2,3-
121
бутиленгликоль и глицерин. Все эти продукты образуются также
из меченого С14 уксусной кислоты.
По данным С. В. Дурмишидзе (1965), уксусная кислота при
брожении в основном превращается в янтарную, фумаровую и гли-
оксалевую кислоту, а также в глицерин. В меньших количествах
образуется этанол, 2,3-бутиленгликоль и уксусный альдегид. Гли-
церин превращается в молочную, уксусную и гликолевую кислоты,
2,3-бутиленгликоль, этанол и уксусный альдегид. Из молочной кис-
лоты главным образом получаются глицерин, этанол и уксусная
кислота.
Янтарная кислота при брожении переходит преимущественно
в фумаровую, яблочную и уксусную кислоты, а также в этанол,
2,3-бутиленгликоль и ацетальдегид. Это свидетельствует о том, что
в дрожжах содержатся все необходимые ферменты для образова-
ния этих веществ.
Хотя и много было сделано для распознавания продуктов ал-
когольного брожения, но все же механизм образования вторичных
продуктов брожения еще не совсем ясен.
Для большинства из этих продуктов источником образования
является уксусный альдегид, который возникает в процессе спир-
тового брожения.
Согласно теории алкогольного брожения не весь уксусный аль-
дегид восстанавливается в этиловый спирт, небольшое количество
его остается в бродящей среде. Известно также, что большое ко-
личество уксусного альдегида тормозит брожение. Под действием
дрожжей он превращается в продукты алкогольного брожения.
Эти вторичные продукты менее вредны для дрожжей, чем уксус-
ный альдегид.
Впервые В. 3. Гваладзе (1936) высказал мысль, что вторичные
продукты спиртового брожения образуются из уксусного альде-
гида.
В. 3. Гваладзе вывел уравнение, выражающее соотношение
между глицерином и другими вторичными продуктами алкоголь-
ного брожения: Г=3,07 (у+я) б + 2,09 ац (в аэробных услови-
ях) , где Г — глицерин, у — уксусная кислота, я — янтарная кис-
лота, б — 2,3-бутиленгликоль, ац — ацетоин.
Л. Женевуа (1936) также предложил уравнение, которое пока-
зывает соотношение между глицерином и другими вторичными
продуктами брожения, выраженное в молях: Г=5я+2у4-д+б+
+ 2ац + 9л + Зи + Зиз-|-п, где Г — глицерин, я — янтарная кислота,
у — уксусная кислота, а — ускусный альдегид, б — 2,3-бутиленгли-
коль, ац — ацетоин, л — лимонная кислота, и — изоамиловый
спирт, из — изопропиловый спирт, п — пировиноградная кислота.
В. 3. Гваладзе не включал изоамиловый и изопропиловый спир-
ты в свои уравнения, так как они могут образовываться также и
из аминокислот.
Многочисленные балансовые опыты показали, что основными
членами уравнения являются глицерин, уксусная и янтарная кис-
122
лоты, уксусный альдегид, 2,3-бутиленгликоль (б), ацетоин, пиро-
виноградная кислота и лимонная кислота.
В этом случае уравнение принимает следующий вид: Г^5я +
-Ь2у+а + б + ац+пн-9л.
. Л. Женевуа считает, что экспериментальные данные, получен-
ные при различных условиях брожения, подтверждают последнее
уравнение.
В настоящее время за рубежом пользуются в основном этой
формулой.
Установлено, что образование вторичных продуктов брожения
во многом зависит от вида и расы дрожжей.
Изменение количества продуктов брожения также зависит от
условия проведения брожения, главным образом от температуры и
pH среды.
Исследования показали, что сумма вторичных продуктов бро-
жения находится в большинстве случаев в определенных количест-
венных соотношениях с глицерином (было установлено работами
В. 3. Гваладзе и Л. Женевуа), но количество отдельных компо-
нентов под влиянием различных факторов довольно сильно ме-
няется и это отражается на качестве получаемого вина.
Следовательно, путем подбора определенных видов и рас дрож-
жей, а также изменением температуры, аэрации, pH среды и зна-
чения редокспотенциала, можно регулировать превращение и на-
копление вторичных продуктов брожения в нужном направлении
для получения качественного вина.
Механизм образования сивушных спиртов
До первой половины XX в. господствовало мнение, что сивуш-
ные спирты образуются только из продуктов гидролиза белков,
главным образом из аминокислот согласно механизму, предложен-
ному Ф. Эрлихом.
В настоящее время доказано, что сивушные спирты образуют-
ся как из аминокислот, так и из сахаров.
Рассмотрим вначале образование сивушных спиртов
из'аминокислот.
Работами Эрлиха было показано, что при добавлении в бродя-
щий сахарный раствор лейцина образуется 80—87% изопентанола
и пентанола, а при введении в бродящую среду фенилаланина и
тирозина возникают р-фенилэтанол и тиразол.
Согласно теории Эрлиха образование высших спиртов осу-
ществляется двумя путями. Первый путь — это декарбоксилиро-
ванные аминокислоты с образованием амина с последующим его
дезаминированием и гидратированием в соответствующий спирт.
Второй путь — это гидролитическое дезаминирование аминокисло-
ты, в результате чего образуется оксикислота и аммиак. Затем
оксикислота, декарбоксилируясь и восстанавливаясь, переходит в
соответствующий спирт. Оба процесса можно представить в сле-
дующем виде:
123
СООН
_NH ? CH,OH
iNM2 +H2O | 2
R R
Амин Спирт
2НС—NH2
-nh2+.h2o
Второй путь
R
Амино-
GOOH
I " C°2
н—COH -------
R
Оксикислота
CH2OH
i
Спирт
кислота
Из углеродного скелета аминокислоты образуется спирт, содер-
жащий на один атом углерода меньше, чем исходная аминокис-
лота.
О. Нейбауэр и К. Фромхерц изменили первую часть последне-
го уравнения. Они считают, что первым промежуточным продук-
том окислительного дезаминирования является кетокислота, кото-
рая, декарбоксилируясь, образует углекислоту и альдегид (послед-
ний восстанавливается в спирт):
СООН СООН
| 4-1/2О2 — NH2 | - СО2 + Н2
НС —nh2------------>со-------------> СН2ОН.
I I I
R R R
Аминокислота Кетокислота Спирт
Так образуются сивушные спирты из продуктов гидролиза бел-
ков, в частности из аминокислоты.
Исследования Н. М. Сисакяна, И. Я. Веселова и Л. Женевуа,
а также других ученых показали, что путь образования сивушных
спиртов из аминокислот не является единственным. Эти исследо-
вания указали на то, что теоретические расчеты между ассими-
ляцией аминокислот дрожжами и образованием сивушных спир-
тов находились в несоответствии с результатами эксперименталь-
ных данных. В конце брожения количество сивушных спиртов
всегда больше, чем должно было быть по теоретическим расчетам.
Это несоответствие объясняется тем, что сивушные спирты могут
образовываться и из сахаров. Это подтвердилось в работах Е. Пей-
но и Г. Гимберто, Ж. Риберо-Гайона и Е. Пейно, Т. Аираппа,
И. Кэстора и И. Гимона. Эти исследователи установили, что ами-
нокислоты ассимилируются дрожжами из среды раньше, чем по-
являются сивушные спирты. Количество аминокислот быстро
уменьшается в первые 18—35 ч брожения. Рост и размножение
дрожжей продолжается до 45—50 ч, тогда как основное количест-
во сивушных спиртов обнаруживалось лишь после прекращения
роста дрожжей И. Кэстор и И. Гимон объясняют это явление об-
124
разованием кетокислот, согласно теории О. Нейбауера. При этом
авторы нашли, что к концу брожения выход сивушных спиртов
в 2,5 раза больше теоретического.
Таким образом, теория Эрлиха не может объяснить, почему не
получается баланс между количеством ассимилируемых дрожжа-
ми аминокислот и содержанием образовавшихся сивушных спир-
тов.
Согласно данным Ф. Драверта (1963 г.), содержание в вино-
граде лейцина около 56 мг/л, изолейцина 22,3 мг/л, а виноград-
ном соке еще меньше — до 32 мг/л лейцина и 16 мг/л изолейцина.
Таблица 13
ОБРАЗОВАНИЕ ЛЕТУЧИХ КОМПОНЕНТОВ В МОДЕЛЬНЫХ ОПЫТАХ
С САХАРОМ И РАЗЛИЧНЫМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ АМИНОКИСЛОТ
Аминокислоты, мг/л Количество соответствую- щего амино- кислотам азота, мг/л Продукты брожения, мг/л
Этанол Пропанол-1 Изобутанол Пентанол Сумма спиртов
72,0 12,0 15,0 5,0 31,0 270,0 306,0
216,0 36,2 13,0 5,0 43,0 235,0 283,0
366,0 60,0 13,0 7,0 52,0 198,0 257,0
723,0 121,0 14,0 8,0 50,0 163,0 221,0
1445,0 242,0 10,0 18,0 84,0 157,0 259,0
3612,0 603,0 11,0 16,0 96,0 134,0 246,0
Следовательно, по механизму Эрлиха в винах в среднем мо-
жет образовываться около 23—25 мг/л изрпентанола и 10—12 мг/л
активного пентанола. Что касается образования изобутанола, то
его количество должно быть еще меньше, так как содержание ва-
лина не превышает 10—15 мг/л в виноградном соке.
А между тем в виноградных винах количество сивушных спир-
тов достигает до 300—350 мг/л. Следовательно, по теории Эрлиха
можно объяснить образование только одной десятой части сивуш-
ных спиртов, получающихся из аминокислот в процессе алкоголь-
ного брожения.
Таким образом, нет прямой зависимости между содержанием
аминокислот в виноградном соке и количеством образовавшихся
сивушных спиртов в вине.
Исследованиями А. Раппа и X. Франка [152] установлено, что
концентрация аминокислот лишь до определенных количеств уве-
личивает содержание сивушных спиртов. Образование пропанола,
изобутанола, изопентанола и активного пентанола во время спир-
тового брожения по-разному зависит от концентрации амино-
кислот.
В табл. 13 приведены данные, показывающие, как изменяется
количество образовавшихся сивушных спиртов с изменением кон-
центрации сахара (по А. Раппу и X. Франку).
125
Из данных, приведенных в табл. 13, видно, что из 72,0 мг/л
аминокислот образовалось 306,0 мг/л сивушных спиртов. Это сви-
детельствует о том, что в основном сивушные спирты возникают
из сахара. При увеличении количества аминокислот общее содер-
жание сивушных спиртов уменьшается за счет уменьшения пента-
нолов, в то время как концентрация изобутанола значительно уве-
личивается.
Таким образом, с увеличением концентрации аминокислот со-
отношение между образовавшимися высшими спиртами меняется.
Количество пропанола и изобутанола растет, а содержание пен-
танолов падает. Было показано также, что нет прямой зависимо-
сти между содержанием аминокислот в сусле и образованием выс-
ших спиртов [152]. Наоборот, существует мнение о прямой зави-
симости между концентрацией сахара и образованием фенилэта-
нола в процессе алкогольного брожения. Образование этого спир-
та из сахара было показано С. Саписом и Ж. Риберо-Гайоном.
Некоторые ученые считают, что сивушные спирты образуются
в результате переаминирования аминокислот с кетокислотами. В
1958 г. С. Антониани с сотрудниками показал, что треонин, трип-
тофан, тирозин, цистеин и глютатион увеличивают выход сивуш-
ных спиртов, а метионин, цистин, а-аминомасляная кислота задер-
живают их образование.
И. Я. Веселов (1964 г.) установил, что при добавлении к обед-
ненной азотистыми веществами среде а-аминомасляной кислоты
в результате брожения выход сивушных спиртов увеличивается в
5—7 раз, а при внесении а-аланина — в 2 раза; р-аланин, у-ами-
номасляная кислота, серин, тирозин и глицерин не оказывают зна-
чительного влияния на образование сивушных спиртов.
Е. Пейно и Г. Гимберто показали, что при брожении таких
аминокислот, как цистеин,, глицин, гистидин, пролин, серин, трео-
нин, образуются значительные количества изобутанола и изопен-
танола.
Они объясняют это явление реакцией трансаминирования кето-
кислот дрожжами.
А. К. Родопуло, И. А. Егорова и Н. Т. Саришвили (1963) об-
наружили, что при брожении аминокислот, за исключением лей-
цина и изолейцина, на синтетической среде образование сивуш-
ных спиртов протекает не по схеме Эрлиха. Так, из глицина, ала-
нина, треонина аспарагиновой и глютаминовой кислот образуются
сивушные спирты с более длинной углеродной цепью, чем у ис-
ходной аминокислоты.
Механизм образования изобутилового спирта из глицина сле-
дующий: вначале глицин превращается в аланин, а последний —
в валин, который образует изобутанол.
Изопентанол образуется из глютаминовой кислоты по следую-
щей схеме: глютаминовая кислотааланин-> валин-> лейцин->
изопентанол.
н-Пропанол образуется из треонина через а-аминомасляную
кислоту.
126
Основными продуктами брожения исследуемых аминокислот
были изопентанол, изобутанол и н-пропанол. В этих исследовани-
ях показана связь между синтезом сивушных спиртов из низко-
молекулярных аминокислот и теорией Эрлиха.
Важное значение при этом придается аланину, через который
наращивается углеродная цепочка других аминокислот. Аналогич-
ное явление наблюдал И. Я. Веселов: при введении в сборожен-
ную среду пировиноградной кислоты увеличивалось накопление
сивушных спиртов^ И. Я. Веселов (1961) считал, что участие в
биосинтезе сивушных спиртов пировиноградной кислоты и амино-
кислот свидетельствует о неразрывной связи углеводного и азоти-
стого обмена веществ в дрожжевой клетке, т. е. можно считать,
что в присутствии пировиноградной кислоты образование сивуш-
ных спиртов протекает в дрожжевой клетке двумя путями. Пер-
вый путь — это реакция переамирования аминокислот сусла и
дрожжевой клетки с кетокислотами (главным образом с пирови-
ноградной кислотой) и дальнейшее образование высших спиртов
по схеме Ф. Эрлиха или О. Нейбауэра. Реакцию переаминирова-
ния можно представить в следующем виде:
Переаминирование
1) СНз — СН—СООН + R— CHNH9=COOH ( ------>•
Пировиноградная кислота Аминокислота
СН3 — CHNH2 — СООН + R — СО — СООН;
Аланин Кетокислота с более
длинной
углеродной цепью
Декарбоксилаза
2) R — СО — СООН ------------:----> R — СНО 4- СО2;
Кетокислота Альдегид
Алкогольдегидрогеназа
3) R — СНО 4----------------------> RCH2OH
Альдегид НАД.Н2 Спирт
И. Я. Веселов считает, что если количество азотистых веществ,
необходимых для аминирования или переаминирования, недоста-
точно, то кетокислоты накапливаются в среде до тех пор, пока
дрожжи щереобразовывают их в соответствующие сивушные спир-
ты. Таково мнение и П. Бидана [103].
Второй путь образования сивушных спиртов из пировиноград-
ной кислоты можно рассматривать, как биосинтез спиртов из уг-
леводов. Известно, что в начале сахар распадается до пировино-
градной кислоты, затем, по схеме К. Иошицава и других, эта кис-
лота конденсируется с уксусным альдегидом или с ацетил-КоА,
образуя ацетомолочную кислоту, которая превращается в а-кето-
изовалериановую кислоту. Последняя, декарбоксилируясь, дает
изомасляный альдегид, который в присутствии НАД-Н2 и алко-
гольдегидрогеназы восстанавливается в изобутанол.
Образование изопентанола можно рассматривать как конден-
сацию а-кетоизовалериановой кислоты с ацетил-КоА, при этом
получается а-кетоизокапроновая кислота, которая, декарбоксили-
127
руясь, превращается в изовалериановый альдегид. Последний в
присутствии НАД-Н2 и алькогольдегидрогеназы образует изопен-
танол. Процесс проходит по следующей схеме.
СН3СНО--------- или ---------СН3СО = КоА
Уксусный альдегид у у Ацетил-КоА
СН3 —СО —СООН
Пировиноградная кислота
СНз
СН3 СН3 СН3
I \/
_СО —С —ОН-> сн
соон со
Ацетомолочная |
кислота СООН
СН3 СН3 СН3 СНз
СНО СН2ОН
Изомасляный Изобутанол
альдегид
а-Кетоизв-
валериановая
кислота
СН3 СН3 СН3 СН3 СН3 СН3 СН3 СН3
''сн . ''сн 'сн 'сн
| +СН3СО = КоА-> I —СО2 | НАД.Н2 |
СО сн2 —> сн2----------------> сн2
СООН do сон СН2ОН
а-Кетоизо- I Изовалериановый Изопентанол
валериановая СООН альдегид
кислота
а-Кетоизо-
капроновая
кислота
Таким образом синтезируются изобутанол и изопентанол из
пировиноградной кислоты, вернее, из углеводов. Этот механизм
впервые был выдвинут К. Иошицава и М. Ямада (1966). В послед-
нее время он все больше получает экспериментальное подтверж-
дение.
Исследования Т. Аираппа [99] показали, что при добавлении
к бродящей среде меченого С14 лейцина образуется только радио-
активный 3-метилбутанол, а в присутствии меченого С14 валина
радиоактивными становятся и бутанол, и 3-метилбутанол.
Это свидетельствует о присутствии в бродящей среде валина,
лейцина и изолейцина, сивушные спирты образуются по схеме
Ф. Эрлиха. Этот автор также показал, что при низкой концентра-
ции аминокислот большая часть р-фенилэтанола.образуется из фе-
нилаланина, а при повышенной концентрации аминокислот 0-фе-
нилэтанол синтезируется из сахара.
Известно, что если дрожжи облучать ультрафиолетом, то они
теряют способность синтезировать лейцин, изолейцин и валин. По-
лученные мутанты дрожжей также теряют способность синтези-
ровать изопентанол, активный пентанол и изобутанол.
При сбраживании глюкозы мутантным штаммом дрожжей с
уксусной кислотой, меченой в положении в 1-С14 и 2-С14, она ак-
тивно включается в н-бутанол. Наоборот, при сбраживании глю-
128
козы исходным немутантным штаммом дрожжей меченая уксус-
ная кислота в основном включается в изопентанол. Добавление
норвалина при сбраживании глюкозы мутантным штаммом при-
водит к образованию как н-бутанола, так и н-пнетанола. В при-
сутствии норлейцина в качестве источника а-кето-н-капроновой
-кислоты в среде увеличивалось образование н-пентанола.
Таким образом, можно считать, что н-пропанол образуется в
основном из а-кето-н-масляной. кислоты, н-бутанол — из а-кето-н-
валериановой кислоты, а н-пентанол — из а-кето-н-капроновой кис-
лоты, т. е. образование высших н-спиртов происходит по следую-
щей схеме:
СН3 — СН2 — СО — СООН + СН3 — СО — KgA
а-Кето-н-масляная Ацетил-КоА
кислота I 1
* I
н-Пропанол у
СН3 — СН2 — СН2 — СО — СООН 4- СН3СО ~ КоА
а-Кето-н-валериановая I
кислота |
н-Бутанол у
СН3 — СН2 — СН2 — СН2СО — соон
а-Кето-н-капроновая кислота
н-Пентанол
Регулирование образования сивушных спиртов при брожении
Многие исследователи считают, что повышенное количество си-
вушных спиртов вызывает сивушный привкус в вине и особенно
в коньяках. Поэтому регулирование образования сивушных спир-
тов имеет большое значение для получения качественных сухих
вин и коньяков.
Известно, что при добавлении аммонийных солей к бродящему
суслу наблюдается значительное снижение образования сивушных
спиртов. Это свидетельствует о том, что часть сивушных спиртов
образуется из аминокислот, т. е. если в среде имеются различные
формы азота, легко ассимилируемые дрожжами, то образуется
меньше сивушных спиртов.
Эрлих показал, что если в бродящий раствор сахара добавлять
лейцин, изолейцин, фенилаланин и тирозин, то из них возникают
изопентанол, пентанол, р-фенилэтанол и тиразол, выход этих спир-
тов составляет 80—85%. Показано также, что эти спирты не об-
разуются из указанных выше аминокислот при отсутствии саха-
ра. Количество высших спиртов сильно снижается, если к бродя-
щей среде добавить соли аммония.
Объясняется это тем, что дрожжи в присутствии аммонийных
солей не используют аминокислоты для азотистого питания, поэто-
му из них не образуются сивушные спирты. Наоборот, дрожжи в
присутствии солей аммония синтезируют недостающие аминокис-
лоты из углеводов и аммония для конструктивного обмена и об-
разования биомассы. В этих условиях синтез сивушных спиртов
5—993 ‘ 129
происходит главным образом из углеводов, поэтому количество их
значительно ниже, чем при нормальном спиртовом брожении.
Наши исследования показали, что аммонийные соли изменяют
реакцию среды, так как при использовании дрожжами аммиака
от аммонийных солей в среде остается кислотный остаток. Поэто-
му мы рекомендуем вместо аммонийных солей для регулирова-
ния образования сивушных спиртов применять мочевину. Однако,
винные дрожжи быстро разлагают мочевину на аммиак и угле-
кислоту, которая в процессе брожения выделяется, а аммиак быст-
ро используется дрожжами для построения биомассы.
Образование сивушных спиртов при алкогольном брожении за-
висит еще и от многих других факторов. Особо важное значение
среди них имеют состав среды, и раса дрожжей, концентрация
водородных ионов (pH среды), температура и концентрация кис-
лорода при брожении сусла. В нормальных условиях сивушных
спиртов образуются от 162 до 366 мг/л (в среднем 250 мг/л).
По данным Е. Пейно и Г. Гимберто (1968), в красных бордоских
винах содержится в среднем 394 мг/л, в белых винах 309 мг/л;
Радлер нашел в немецких винах от 81 до 543 мг/л сивушных
спиртов.
Е. Пейно и Г. Гимберто исследовали влияние аэрации на обра-
зование сивушных спиртов и установили, что при аэробиозе ко-
личество их увеличивается. В анаэробных условиях сивушных
спиртов образуется в среднем 214 мг/л, а в аэробных 150 мг/л.
Однако, работами А. Г. Канна и И. М. Грачевой, было показано,
что количество сивушных спиртов зависит от средней интенсивно-
сти аэрации.
Исследованиями К. Иошицава (1966) установлено, что опти-
мум образования изобутанола и изопентанола лежит при концен-
трации кислорода 7-10-2 г-моль/мин. Выше этой концентрации
количество спиртов уменьшается.
Наши исследования, проведенные совместно с Н. Д. Чичашви-
ли и А. В. Кавадзе [78], также показали, что наибольшее коли-
чество высших спиртов образуется при средней интенсивности
аэрации и что во всех случаях переключение обмена веществ с
брожения на дыхание влечет за собой уменьшение образования
сивушных спиртов на единицу биомассы дрожжей.
Было показано, что один и тот же вид дрожжей и даже одна
и та же раса образует разное количество сивушных спиртов в за-
висимости от концентрации растворенного кислорода в бродящей
жидкости. Так, дрожжи Sacch. vini в анаэробных условиях обра-
зуют больше изобутанола и изопентанола, чем в аэробных; Sacch.
oviformis в аэробных условиях синтезируют больше изопентанола
и активного пентанола, чем при анаэробиозе, т. е. четкой картины
нет, и ни один из исследователей не дает объяснения, почему при
проведении брожения в аэробных условиях образуется больше
сивушных спиртов, а в анаэробных условиях меньше, и наоборот.
Во-первых, это зависит от состава среды: если сусло содержит
значительные количества лейцина, изолейцина, валина, треонина,
.130
то образование сивушных спиртов из этих аминокислот протекает
по схеме Эрлиха; в этом случае нет необходимости в присутствии
кислорода [21]. Если же этих аминокислот мало, то образование
высших спиртов в основном происходит из сахара. В этом случае,
как показано выше, биосинтез высших спиртов происходит через
ацетил-КоА, который образуется в аэробных условиях. На обра-
зование ацетил-КоА не требуется больших количеств кислорода.
А при избытке кислорода образовавшийся изомасляный альдегид
не восстанавливается в изобутанол и процесс протекает в сторону
образования ацетоина и диацетила.
Объяснением того, почему при аэрации бродящего сусла коли-
чество изобутанола увеличивается, а количество пропанола умень-
шается является следующее\ синтез изобутанола из сахара про-
текает через ацетил-КоА, для образования которого требуется
кислород, а для синтеза пропанола он не нужен, так как пропа-
нол в основном образуется из а-кетомасляной кислоты и при этом
ацетил-КоА не требуется.
. Многие исследователи считают [16], что оптимальной темпе-
ратурой для образования сивушных спиртов является 20—25°С,
т. е. температура, совпадающая с оптимальной температурой раз-
множения дрожжей.
Е. Пейно и Г. Гимберто (1962) исследовали образование спир-
тов в процессе брожения при температуре от 15 до 35°С и уста-
новили, что максимальное образование изобутанола и изопентано-
ла происходит при 20—25°С.
И. Я. Веселов, И. М. Грачева и др. показали, что брожение
сусла при температуре 8—20° С приводит к накоплению сивушных
спиртов и количество их увеличивается примерно в 1,8 раза; при
дальнейшем повышении температуры до 30°С содержание их
уменьшается в 2,6 раза, в основном за счет изопентанола [16].
Работами Б. Ренкаина (1967 г.) установлено, что влияние тем-
пературы на образование сивушных спиртов зависит от вида и
расы дрожжей. Автор исследовал 11 рас винных дрожжей, сбра*
живающих сусло при температуре от 15 до 25°С. При этих усло-
виях дрожжи образуют 24% изобутанола и активного пентанола,
около 39% изопентанола и 17% н-пентанола. При 25°С количест-
во изопентанола и изобутанола продолжает увеличиваться, а ко-
личество н-пропанола уменьшается. Брожение, проведенное при
38°С, приводит к образованию значительно больших количеств
этанола, пировиноградной и а-кетоглутаровой кислот, чем броже-
ние при 25°С. Это объясняется замедленным дыханием дрожжей,
что увеличивает выход спирта.
Известно, что существует зависимость между ростом и размно-
жением дрожжей и количеством образующихся сивушных спиртов.
Так, если рост и размножение дрожжей ограничивать различными
способами, то высших спиртов образуется гораздо меньше. При
медленном брожении высших спиртов образуется больше, чем при
интенсивном. При непрерывном брожении размножение дрож-
5*
131
жей очень ограниченно, высших спиртов образуется меньше, а ка-
чество вина получается лучше, чем при периодическом.
Известно также, что при непрерывном культивировании дрож-
жей метаболическая активность изменяется в зависимости от их
скорости роста и размножения. Количество сахара в среде влияет
на скорость размножения дрожжей и, следовательно, на дыхание.
При низких дозах сахара дыхание подавляет брожение, а при вы-
соких брожение подавляет дыхание. Это было показано Н. Г. Са-
ришвили и др. [86].
Особое значение имеет брожение под давлением СО2, который
способствует перестройке обмена веществ дрожжей. При этом
преимущественно получаются вина высокого качества с низким
редокспотенциалом, меньшим содержанием кислот и высших спир-
тов с сохранением фруктовых тонов в букете и аромате. Этот спо-
соб получил широкое применение в ФРГ (Geiss, 1950).
Концентрация водородных ионов также, влияет на количество
образовавшихся высших спиртов в процессе спиртового брожения.
Так, например, по данным Е. Пейно и Г. Гимберто, при pH 2,6
наблюдается минимальное образование сивушных спиртов, а при
pH 3—5 количество их увеличивается. При pH>5,0 количество
их заметно уменьшается.
Аналогичные результаты были получены и Б. Ренкаином.
Биосинтез простых эфиров
Обычно простые эфиры называют ацеталями. Они образуются
в результате конденсации гидратов альдегидов со спиртами.
/ОН 4 /OR!
R — С—ОН + 2R1OH R — С—ORi -к Н2О.
ЧН ХН
Участвуют ли в реакции образования ацеталей энзимы, пока
неизвестно. Существует мнение, что ацетали образуются в присут-
ствии минеральной кислоты при pH 2—4. В винах, согласно за-
кону действующих масс, основным фактором, влияющим на обра-
зование ацеталей, является концентрация спиртов и альдегидов.
В соответствии с этим в винах со спиртуозностью 10—12% об. со-
держание ацеталей не превышает 1 % от количества свободных
альдегидов. Ацетали устойчивы по отношению к щелочам, но в
кислой среде они быстро распадаются на альдегид и спирт.
Некоторые исследователи считают, что ацетали не содержатся
в винах. Так, например, Ф. Пауль, Дж. Гимон и Е. Гровель не
обнаружили в сухих и крепленых, а также в старых крепленых
винах ацеталей. А между тем многие энологи определяют замет-
ные количества ацеталей (до 50 мг/л) в сухих винах и 500—
600 мг/л и в хересе. Это можно объяснить несовершенством мето-
дов анализа ацеталей. Установлено, что метод, которым пользуют-
ся многие исследователи, дает завышенные результаты. Это объяс-
132
няется еще и тем, что в условиях кислого гидролиза вин альде-
гиды могут высвобождаться не только из ацеталей, но и из дру-
гих соединений.
В. И. Нилов и другие [64] считают, что ацетали являются
комплексным соединением и включают в себя ряд веществ, обра-
зующихся из альдегидов. Важнейшими из них являются сахаро-
аминные соединения, которые появляются при выдержке, особен-
но при термической обработке. Он также считает, что ацетали
могут возникнуть при взаимодействии альдегидов с полифенолами
и другими соединениями, имеющими спиртовую группу, но коли-
чество их незначительно и они не могут влиять на букет вина.
Ацетали образуются в значительных количествах в коньяках с’
высокой концентрацией ^этилового спирта. Помимо этилацеталя, в
хересе были найдены этилизоамилацеталь, этиламилацеталь, ак-
тивный амилацеталь, диамилацеталь, этилфенилацеталь и изо-
амилфенилацеталь. Это свидетельствует о том, что херес содержит
повышенное количество альдегидов, поэтому вполне возможно об-
разование истинных ацеталей.
Что касается сухих вин и шампанского, то они содержат мало
альдегидов и поэтому присутствие в них ацеталей незначительно.
Реакция образования ацеталей играет важную роль в смягче-
нии во вкусе и букете вйн резких тонов свободных сивушных спир-
тов и альдегидов. Ацетали в количестве от 10 до 100 мг/л при-
дают винам приятный фруктовый аромат.
Биосинтез сложных эфиров
Сложные эфиры образуются в основном в процессе брожения,
в результате так называемой биологической этерификации, проис-
ходящей под действием эстераз, содержащихся в дрожжевых клет-
ках. Они также образуются и в процессе выдержки вина путем
химической этерификации.
Реакция этерификации протекает при взаимодействии спирта
с органической кислотой:
R-C^0 +HO-R1->Rf° +Н2О.
ХОН ХО—Ri
Исследования М. Бертло показали, что этерификация, которая
происходит между кислотами и спиртами, протекает очень мед-
ленно и ограниченно. Действительно^ как показали опыты, при
взаимодействии уксусной кислоты с этиловым спиртом по истече-
нии времени раствор постепенно становится менее кислым вслед-
ствие нейтрализации кислоты спиртом. В результате реакции обра-
зуются этилацетат и вода. При этом между этиловым спиртом и
уксусной кислотой, с одной стороны и этилацетатом и водой — с
другой, наступает равновесие:
СН3 — СН2ОН 4- СН3 — СООН СН3СООС2Н5 4- Н2О.
Выход этилацетата зависит от количества реагирующих ве-
ществ.
133
Скорость этерификации зависит от свойств и количества реаги-
рующих кислоты и спирта. Как показали исследования Т. Шуно-
гава и Дж. Шимицу {170], скорость этерификации колеблется от
0 до 24,6%. Для столовых сухих вин: для уксусной и молочной
кислот — от 6 до 16%, для янтарной и яблочной кислот — от 0,3
до 3,6%, для винной кислоты — 0,1%. Для хересных вин скорость
этерификации самая высокая, она в 1,6—6 раз выше, чем для су-
хих. Поскольку в вине концентрация этанола и уксусной кислоты
наиболее высока, то среди образовавшихся эфиров преобладает
этилацетат.
Е. Пейно определил, что отношение количества эфиров, обра-
зующихся в винах согласно формулам М. Бертло, варьирует в
пределах от 0,34 до 0,75.
М. А. Герасимов (1939) показал, что наряду с этерификацией
при выдержке вина происходит деэтерификация, а также реакция
переэтерификации. В реакции деэтерификации важную роль иг-
рает вода:
сн3 — СООС2Н5 + Н2О X СНзСООН 4- СН2Н5ОН.
Реакция деэтерификации протекает также очень медленно и
зависит от температуры. При этом не весь этилацетат распадает-
ся на уксусную кислоту и этанол.
При выдержке вина наряду с этерификацией происходит так-
же реакция переэтерификации. При избытке аммиака в вине, часть
эфиров реагирует с ним и образует амиды. Примером может слу-
жить этилацетат, который может легко вступить в реакцию с ам-
миаком, образуя ацетамид. Последний вызывает мышиный тон в
вине.
Исследования К. Нордстрема (1964) показали, что сложные
эфиры образуются также при взаимодействии ацетил-КоА и спир-
та. Ацетил-КоА получается при активации уксусной кислоты с
АТФ или с кетокислотой при ее окислительном декарбоксилиро-
вании.
Образование сложных эфиров происходит по следующей схеме:
R—СООН
В первой реакции образуется ацетил-КоА из пировиноградной
кислоты при действии коэнзима А и участии НАД и АТФ, как это
показано в следующей реакции:
134
СН3 — СО — СООН + HS ~ КоА 4- НАД 4- АТФ
-> СН3 — СО ~ КоА + НАДН2 + АМР + РРХ 4- СО2.
Во второй реакции ацетил-КоА взаимодействует со спиртом и
образует эфир и коэнзим А.
R —СО —S~KoA 4-Ri —OH->R —С < 4-SH-KoA.
xORi
Если в этой реакции участвует более высокомолекулярная кисло-
та, то возникает ацил-КоА:
R — СН2 — СН2 — СО — СООН 4-HS ~ КоА 4-
4-АТФ->Р—СН2— СН2—СО~КоА-ЬАМР4-РР1.
При взаимодействии ацил-КоА со спиртами образуются более
высокомолекулярные сложные эфиры.
По данным Ж. Риберо-Гайона [74], количество этилацетата в
вине колеблется от 30 до 200 мг/л. Известно, что большое коли-
чество этого эфира ухудшает качество вина.
В связи с этим надо предотвращать накопление уксусной кис-
лоты за счет окисления этанола кислородом, поэтому вина необ-
ходимо выдерживать в анаэробных условиях.
Сравнительно в больших количествах при брожении образуют-
ся моно- и диэтиловые эфиры винной, яблочной и янтарной кислот
[125]. Количество этиллактата. зависит от протекания в вине яб-
лочно-молочнокислого брожения и может достигать 100—200 мг/л.
Что касается сложных эфиров жирных кислот от С4 до С20, то их
содержание незначительно, так как этих кислот в винах очень
мало.
Высшие спирты, содержащиеся в винах, несомненно участвуют
в процессах эфирообразования. Однако содержание этих эфиров го-
раздо меньше, чем этиловых.
Наши исследования, проведенные совместно с И. А. Егоровым,
А. Ф. Писарницким, А. А. Беззубовым (1969), показали, что в ви-
нах и шампанском содержатся бутиловые, амиловые, гексиловые
и гептиловые эфиры уксусной кислоты и жирных кислот, но со-
держание их очень незначительно.
М. Бертло высказал предположение, что содержание эфиров
находится в прямой зависимости от качества вина. Однако
М. В. Щербаков считает, что количество эфиров не имеет никако-
го отношения к качеству вина. Ординарное вино может иметь зна-
чительно больше эфиров, чем марочное старое вино хорошего ка-
чества. Е. Пейно также считает, что эфиры жирных и многооснов-
ных кислот не играют роли в образовании букета. По мнению это-
го автора, букет выдержанных вин не определяется количеством
сложных эфиров, а зависит от содержания в них неомыляемых ве-
ществ. М. А. Герасимов [20] и Н. Н. Простосердов [69] считают,
что в состав букетистых веществ, помимо неомыляемых соедине-
ний, входят ещё сложные эфиры. Они придают вину цветочный
135
тон. С развитием техники газожидкостной хроматографии, мас-
спектрометрии и других методов анализа стало возможным опреде-
лять в вине все больше сложных эфиров, особенно высококипящих.
Исследавания, проведенные нами совместно с И. А. Егоровым
и Т. А. Кормаковой [80], показали, что эфиры алифатических тер-
пеновых спиртов обладают цветочным запахом. Наибольшее зна-
чение из них имеют эфиры уксусной кислоты (линалилацетат, ге-
ранилацетат, терпенилацетат). Эти эфиры были найдены в вин-
ных сортах винограда и в мускатных винах [77].
Сложные эфиры, образованные из алифатических кислот и
спиртов, как правило, имеют фруктово-ягодный запах. Интерес-
ным цветочно-фруктовым ароматом обладают также сложные эфи-
ры муравьиной и уксусной кислот с ароматическими спиртами.
Этилацетат имеет слабый и простой фруктовый тон.
Этиловые эфиры масляной кислоты и ее гомологов; а также
эфиры высших спиртов с различными кислотами имеют фрукто-
во-цветочный запах.
К подобным эфирам относятся изоамилбутират, изоамилацетат,
этилкапронат, этилкаприлат, этилкапринат и др.
Особый интерес представляют эфиры фенилуксусной кислоты,
которые обладают медовым запахом. Бензилацетат при сильном
разбавлении имеет запах жасмина, фенилэтилацетат имеет запах
розы, этиллинолеат — цветочные тона и придает шампанскому
особый букет.
Эти эфиры найдены в эфирных маслах винных сортов вино-
града, которые переходят в вино. Они также образуются в процес-
се брожения.
Накопление эфиров в винах зависит от содержания органиче-
ских кислот. При выдержке вина в бутылках наблюдается увели-
чение количества сложных эфиров. Длительная выдержка сухих
вин (более 10—12 лет) приводит к уменьшению в них содержания
эфиров [43].
При изучении влияния жирных кислот на образование слож-
ных эфиров дрожжами установлено, что в процессе брожения ко-
личество эфиров возрастает до максимума на третий день броже-
ния, а затем падает [183]. Добавление к среде насыщенных жир-
ных кислот (Си—Ci8) стимулирует образование сложных эфиров,
а ненасыщенных (Cis-1 и Cis-г) подавляет.
Аналогичное воздействие оказывают Tween-80 и моноглицериды,
которые также вызывают уменьшение количества сложных
эфиров.
Эти данные показали, что прирост биомассы дрожжей, а так-
же количество сложных эфиров этилацетата* изоамилацетата и
этилкаприлата было вызвано действием пальмитиновой, олеиновой,
линолевой и линоленовой кислот.
При этом также было выявлено, что количество образовавших-
ся сложных эфиров, как и высших спиртов, зависит от прироста
биомассы дрожжей.
136
Глава 11
БИОСИНТЕЗ И МЕТАБОЛИЗМ
КАРБОНИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
К карбонильным соединениям относятся альдегиды, кетоны,
дикетоны и оксикетоны (диацетил и ацетоин).
Альдегиды характеризуются наличием в молекуле карбониль-
ной группы, связанной с одним углеродным остатком: R —С<^ ,
а кетоны в отличие от альдегидов содержат карбонильную груш
л®
пу, связанную с двумя остатками углеродной цепи: R — .
'Ri
Альдегиды и кетоны возникают из углеводов и аминокислот.
Образование альдегидов происходит через кетокислоты с после-
дующим декарбоксилированием в альдегид. Биосинтез альдегидов
и кетонов протекает и на пути синтеза высших спиртов и амино-
кислот. Так, например, синтез изомасляного альдегида осущест-
вляется через а-кетоизовалериановую кислоту; последняя путем
конденсации пировиноградной кислоты с активным альдегидом
превращается в а-кетомолочную кислоту. В результате внутримо-
лекулярной перегруцпировки ацетомолочная кислота превращается
в cz-кетоизовалериановую. При конденсации ацетил-КоА с а-кето-
изовалериановой кислотой образуется а-кетоизокапроновая кисло-
та, которая также декарбоксилируется в изовалериановый альде-
гид. Так происходит наращивание углеродной цепи с образовани-
ем более высокомолекулярных альдегидов.
Альдегиды образуются также и при окислении спиртов как фер-
ментативным, так и неферментативным путем. Ферментом, участ-
вующим в окислении спиртов, является алкогольдегидрогеназа,
требующая кофермента НАД.
Свойства альдегидов и кетонов
Альдегиды являются более реакционноспособными соединения-
ми, чем кетоны. Температура кипения их намного ниже, чем у
соответствующих спиртов. Так, например, если этанол кипит при
78?С, то уксусный альдегид — при 20,8°С. Альдегиды с низкой мо-
лекулярной массой (до С5) хорошо смешиваются с водой; альде-
гиды, начиная с С6 и выше, плохо растворяются в воде; высшие
альдегиды (С^—С22) являются твердыми веществами и в воде не
растворяются. Альдегиды хорошо растворимы в этаноле и эфире.
Одним из характерных свойств всех альдегидов и кетонов являет-
ся то, что они легко реагируют с сернистой кислотой. Их бисуль-
фитные соединения представляют собой нелетучие кристалличе-
ские вещества, легко растворимые в спирте и нерастворимые в во-
де. Альдегиды и кетоны легко реагируют с 2,4-динитрофенилгид-
разином и дают в кислой среде 2,4-динитрофенилгидразоны. По
137
точке плавления гидразонов альдегиды и кетоны идентифицируют.
Альдегиды легко присоединяют воду и образуют гидраты.
В винах альдегиды содержатся в виде гидратов, поэтому они не
поглощают свет в ультрафиолетовой области спектра. В органи-
ческих растворителях альдегиды поглощают свет при длине вол-
ны 280 нм.
Характерными свойствами альдегидов является то, что они лег-
ко образуют ацетали со спиртами и вступают в реакцию с феноль-
ными соединениями.
Состав альдегидов и кетонов в винограде и вине
В винограде и вине встречаются альдегиды как алифатическо-
го, так и ароматического ряда. К алифатическому ряду относятся
формальдегид, уксусный альдегид и его гомологи. В чистом виде
уксусный альдегид обладает острым запахом. С увеличением мо-
лекулярной массы и с разбавлением водой острота уменьшается
и появляется фруктовый тон.
В винограде общее содержание алифатических альдегидов до-
стигает 1—6 мг/л, в основном превалирует уксусный альдегид и
его гомологи (пропиловый, масляный, валериановый), а также
гексеналь, гексаналь, цис- и траяс-гексеналь. В мускатных сортах
винограда найден цитраль, содержание которого достигает
1 мг/л; он участвует в создании мускатного тона.
В процессе брожения количество алифатических альдегидов и
кетонов значительно увеличивается. При проведении брожения в
естественных условиях образуется незначительное количество ук-
сусного альдегида. Большая часть его восстанавливается в этанол;
незначительная часть подвергается дальнейшему превращению во
вторичные продукты.
В винах с незаконченным циклом брожения (десертных, креп-
ких и полусладких) количество альдегидов более высокое. Объяс-
няется это тем, что в процессе спиртового брожения в первые дни
и особенно при интенсивном брожении количество уксусного аль-
дегида заметно увеличивается, и примерно в этот же момент пре-
кращают брожение холодом или спиртованием.
В сухих винах в небольшом количестве встречаются альдегиды
с более высокой молекулярной массой. Они придают букету пло-
довые оттенки. При выдержке количество их увеличивается. Осо-
бенно много альдегидов в крепких винах типа мадеры и хереса.
В последнем количество их достигает 600 мг/л. В данном случае
хересные дрожжи культивируют в аэробных условиях. Они дегид-
рируют этанол в присутствии алкогольдегидрогеназы и НАД в ук-
сусный альдегид: _
Алкогольдегидрогеназа
СН3 — СН2ОН +-------——---------> СН3 — GHO + НАД-Н2.
НАД
В некоторых винах, которые были получены кахетинским спосо-
бом, а также в винах при выдержке в бочковой таре содержатся
138
и ароматические альдегиды (ванилин, сиреневый, синаповый, ко-
нифериловый), которые извлекаются из древесины дубовой клеп-
ки, при контакте вина с твердыми частями винограда, особенно
с косточками.
Впервые эти альдегиды были обнаружены в коньяках И. А. Его-
ровым (1957), а затем И. М. Скурихиным в коньяках и мадере
(1967).
В винах встречаются также фенилацетальдегид, п-оксибензаль-
дегид и коричный альдегид, которые образуются в процессе бро-
жения из углеводов, а также и из фенилаланина. Эти альдегиды
имеют более низкий порог концентрации и могут влиять на букет.
В винограде и винах встречаются и альдегиды фуранового ря-
да (фурфурол, метилфурфурол и оксиметилфурфурол). Они полу-
чаются из пентоз (рамнозы) и гексоз (фруктозы). Фурановые аль-
дегиды обладают высокой реакционной способностью, в чистом
виде быстро полимеризуются и придают вину бурую окраску. Эта
реакция усиливается в присутствии других карбонильных соедине-
ний и аминокислот. При выдержке десертных и крепких вин, осо-
бенно при нагревании, вследствие реакций меланоидинообразова-
ния и деградации углеводов образуется значительное количество
фурановых альдегидов.
Как показали исследования И. М. Скурихина (1967), при со-
держании фурановых альдегидов до 10 мг/л они не влияют на
аромат и вкус вина. Количество их находится ниже пороговых
концентраций. В десертных и крепких винах, а также в виномате-
риалах, подвергавшихся тепловой обработке, количество фурано-
вых альдегидов может достигнуть 50 мг/л и больше. Эти альде-
гиды влияют на вкус и букет. К. К. Алмаши считает, что важную
роль в создании специфического тона и аромата для токайских
вин играют альдегиды алифатического ряда с числом углеродных
атомов в молекуле Сз—С5 [5].
Кетокислоты наряду с альдегидами во многом определяют ход
биохимических реакций, протекающих в процессе брожения, при-
готовления и выдержки вина. Они участвуют в реакциях аминиро-
вания и переаминирования с аминокислотами, а также в биосин-
тезе высших спиртов, альдегидов и аминокислот.
Исследования И. А. Егорова и Н. Б. Борисовой (1956) пока-
зали, что в Советском шампанском содержание кетокислот колеб-
лется: пировиноградной от 15 до 18,5 мг/л, а а-кетоглутаровой от
30 до 34 мг/л.
По данным А.-С. Вечера и И. Ф. Рудомановой [18], повышение
давления углекислоты при сбраживании виноградного сока приво-
дит к уменьшению количества пировиноградной кислоты и увели-
чению содержания а-кетоглутаровой кислоты. По данным других
авторов, содержание пировиноградной кислоты в различных винах
колеблется от 11 до 460 мг/л, а а-кетоглутаровой — от 2 до
341 мг/л.
Установлено, что различные виды и расы дрожжей образуют
различные количества кетокислот.
139
На образование кетокислот влияют также витамины, которые
являются коферментами. Присутствие тиамина (витамин BJ уси-
ливает активность пируваткарбоксилазы, которая декарбоксили-/
рует пировиноградную кислоту. Поэтому количество пировиноград-/
ной кислоты зависит от активности пируваткарбоксилазы, содеру
жащейся в дрожжах. /
Показано также влияние pH на образование пировиноградной
кислоты и альдегидов в процессе брожения. При pH 4—5 и выше
количество кетокислот больше, чем при pH 2—3, и достигает
340 мг/л.
Из кетонов в винограде и вине наиболее часто встречаются —
ацетоин, диацетил, ацетон, а- и р-ионон.
Два последних имеют запах фиалки и влияют на букет вина
(А. Ф. Писарницкий, 1966).
Помимо этих кетонов, в винограде и вине в небольшом коли-
честве встречаются 2-бутанон, 2-пентанон, 3-пентанон, 2,3-бута-
дион, 2-гептанон, метилэтилкетон, ацетофенон, бензофенон и др.
а-Дикетоны и оксикетоны в вине
Многие исследователи занимались: биосинтезом 2,3-бутандиона
(диацетила) и З-окси-2-бутандиона (ацетоина) при спиртовом и
молочнокислом брожении.
Первые исследования были проведены К. Нейбергом и Е. Реин-
фуртом в 1923 г., которые показали, что ацетоин образуется во
второй фазе спиртового брожения в результате конденсации двух
молекул уксусного альдегида:
X)
СН3 — c<f + >С — СН3->СН3 — СО — СНОН — сн3.
ХН Oz
Эта реакция получила название ацетоиновой конденсации двух
уксусных альдегидов.
Другие авторы считают, что ацетоин продуцируют микроорга-
низмы путем конденсации двух молекул пировиноградной кис-
лоты:
2СН3 — СО — СООН -> СН3 — СО — СНОН — СН3 + 2СО2.
Более детально механизм образования ацетоина и диацетила
был изучен лишь в последние 15—20 лет. Наиболее подробно был
рассмотрен биосинтез ацетоина и диацетила дрожжей и молочно-
кислых бактерий.
В настоящее время считают, что ацетоин и диацетил, образуют-
ся из ацетомолочной кислоты.
140
Биосинтез ацетомолочной кислоты
Большинство исследований по изучению путей ферментативно-
э синтеза ацетоина и диацетила позволяют придти к следующей
бщей схеме образования этих соединений микроорганизмами:
СНз—СО—СООН
Пировиноградная кислота + MgCl2
+
*Трр
I
ТРР
СНз—с—он
н
Оксиэтиламинпирофосфат
СНз—СО—С—СООН
он
а-Ацетомолочная кислота
-С°2 I НАД+
сн.ч—со—снон—СНз; '^снзсо—со—СНз
над-н2
Ацетоин
•Диацетил
Как видно из схемы, исходными продуктами для синтеза аце-
на и диацетила являются пировиноградная кислота и тиамин-
шрофосфат (*ТРР), при конденсации которых образуется а-ацето-
иолочная кислота. Последняя является Предшественником ацетои-
на и диацетила.
Для биосинтеза ацетомолочной кислоты необходимы две моле-
кулы пировиноградной кислоты, из одной образуется оксиэтилтиа-
минпирофосфат, а также ионы Мп2+ или Mg2+. Ферментативный
механизм образования ацетомолочной кислоты следующий: внача-
ле действием пируватдекарбоксилазы пировиноградная кислота
превращается в оксиэтилтиаминпирофосфат, который под дейст-
вием фермента а-ацетолактатсинтетазы образует с другой моле-
кулой пировиноградной кислоты ацетомолочную кислоту. Послед-
няя под действием фермента ацето лактатдекарбокси л азы декар-
боксилируется в ацетоин [119].
Ацетомолочная кислота участвует в биосинтезе аминокислот, в
частности валина, который оказывает ингибирующее действие на
образование ацетомолочной кислоты и диацетила [106]. В данном
случае валин, видимо, является аллостерическим регулятором син-
теза ацетомолочной кислоты и действует как ингибитор по прин-
ципу обратной связи на а-ацетолактатсинтетазу [54].
Имеется ряд работ, указывающих и на другой путь биосинтеза
диацетила, и ацетоина дрожжами, не связанный с образованием
ацетомолочной кислоты, по схеме:
141
сн3—СО—СООН 2 [СНз-СН-ТРР] +Е1
[ 1 Г Г J Г, I
ОН
Оксиэтилтиаминпирофосфат + энзим
(комплекс)
^СНзСНО
СНз
СНз СН3 I
| —Н2 | НО—С—Н
СО -----СНОН ------------ I
Г I [СН3—С—ТРР]4-Е1
СО СО Энзимацетоин-ТРР (комплекс).
СНз СНз
Ди ацетил Ацетоин
Из схемы видно, что в начале синтеза из пировиноградной кис-
лоты образуется оксиэтилтиаминпирофосфат, который с новой мо-
лекулой уксусного альдегида образует комплекс энзимацетоинтиа-
минпирофосфат, превращающийся затем в ацетоин. Последний, де-
гидрируясь, дает диацетил.
Отличительной чертой в этом синтезе является то, что не сама
пировиноградная кислота реагирует с оксиэтилтиаминпирофосфа-
том, а последний с новой молекулой уксусного альдегида образует
ацетоин. Эта реакция аналогична реакции ацетоиновой конденса-
ции двух молекул уксусных альдегидов. В этой реакции К. Ней-
берг рассматривал процесс декарбоксилирования также связанным
с образованием комплекса фермент—уксусный альдегид, который
затем переносится на свободный уксусный альдегид, образуя в
результате ацетоин.
Существует и другой путь биосинтеза диацетила, заключаю-
щийся в том, что дрожжи в присутствии НАД+ превращают одну
молекулу пировиноградной кислоты в ацетил-КоА. Затем ацетил-
КоА конденсируется с другой молекулой пировиноградной кисло-
ты, образуя ацетомолочную кислоту, с последующим декарбокси-
лированием ее в ацетоин по схеме:
СН3—СО—СООН+СНз—CO~S-KoA->
Пировиноградная Ацетил-КоА
кислота
СН3 О ОН О О
I -со2 || | -Н2 II II
->СН3—СО—С—СООН----->СН3—С—СН—СНз—►СП,—С—С СН3.
| Ацетоин Диацетил
ОН
Ацетомолочная кислота
Рассматривая схемы биосинтеза ацетоина и диацетила можно
считать, что наиболее правдоподобной является схема конденса-
ции оксиэтилтиаминпирофосфата со свободным уксусным альдеги-
дом с образованием энзимацетоин-ТРР-комплекса и распадом это-
го комплекса в ацетоин. Эта схема имеет место при алкогольном
брожении,,; когда образуется значительное количество^ уксусного
альдегида при декарбоксилировании пировиноградной кислоты.
142
\ Если ацетоин и диацетил образовывались бы из ацетомолочной
кислоты, то валин должен был бы ингибировать их образование,
так как эти соединения появляются на пути его синтеза. Как по-
казали наши исследования [79], валин почти не ингибирует обра-
зования диацетила и ацетоина при алкогольном брожении.
\ Многие исследователи считают, что диацетил образуется из аце-
тоина, который является промежуточным продуктом. Ацетоин в
присутствии ацетоиндегидрогеназы и НАД+ превращается в диа-
цетил по схеме
\ ° °
СН3—СО—СНОН—СН3 Ацетои-—рогеназа + НАД1 СН3—С—С—СНз4-НАДЧ-Н2.
Ацетоин ' Диацетил
Однако диацетил легко восстанавливается в ацетоин под дей-
ствием диацетилредуктазы в присутствии НАД-Н2 по схеме
О О О
СН3—С—С—СН3 Д£?цетилредуктаза + НАД • н* сн3с—ОН—СНз+НАД.
I
ОН
До недавнего времени существовало мнение, что диацетилре-
дуктаза содержится только в бактериях [100]. Недавно нами сов-
местно с А. В. Кавадзе [42] было показано, что диацетйлредую
таза содержится и у винных дрожжей. Этот фермент участвует в
восстановлении диацетила в ацетоин при дображивании виномате-
риалов и получении неокисленных вин.
Ацетоин в присутствии - бутиленгликольдегидрогеназы и
НАД-Н2 восстанавливается в 2-3-бутиленгликоль по схеме
О ОН
СНз-С-СН СНзБ^илеНглиКольдегиДРогеназа + НАД - И, CH3-CHOH-CHOH^
Ацетоин 2,3-Бутиленгликоль
—СНз+НАД.
Эти соединения образуют в биологических средах, в частности
в винах, окислительно-восстановительную систему:
СН3 СН3
СНОН Бутиленгликоль- Д_
|Пи дегидрогеназа + НАД+
снон - +НАД.Н2 —СНОН
сн3 СН3
2,3-Бутилен- Ацетоин
гликоль
Ацетоиндегидро- ,1
геназа + НАД~*~
Ацетоинре- СО
дуктаза 4- НАДН, |
СН3
Диацетил
В зависимости от активности действующих в этой системе фер-
ментов превалируют те или иные продукты его превращения. По
данным А. С. Вечера и Л. А. Юрченко [17], если в вине превали-
руют восстановительные процессы, то накапливается 2,3-бутилен-
гликоль. Наоборот, в аэробных условиях окислительные процессы
усиливаются и в вине увеличивается количество уксусного альде-
143
гида, диацетила и этилацетата, что приводит к ухудшению качеу
ства вина. /
Нами совместно с А. В. Кавадзе и И. А. Егоровым [43] было
показано, что определение дикетонов на газовом хроматографе
«Газхром 11-09» с детектором по захвату электронов дает более
точные результаты, чем спектрофотометрирование. При отгоне
Таблица 15
СОДЕРЖАНИЕ ОКСИКЕТОНОВ (В МГ/Л)
В СУХИХ ВИНАХ
£ 'к а о а ей 3 — о X
К S а
Вино -2-б: аце' сА к ей ей
s S LQ О С
к а 1
О 2 О
со R со оГ
Белые сухие марочные
Таблица 14
СОДЕРЖАНИЕ ДИКЕТОНОВ (В МГ/Л)
В СУХИХ ВИНАХ
Белые сухие марочные
Цинандали 0,17 0,02 — 9,5 Цинандали 8,03 0,45 — —•
Тибаани 0,17 0,02 — 9,2 Тибаани 12,04 0,45 460,0 7,0
Гуржаани 0,27 0,04 0,08 9,0 Гуржаани 10,03 0,62 — —
Цицка 0,31 0,04 0,05 8,8 Цицка 11,04 0,60 380,0 6,0
Цоликоури 0,42 0,08 0,02 8,7 Цоликоури 15,00 0,75 500,0 9,0
Красные сухие марочные Красные сухие марочные
Напареули 0,50 0,12 0,02 9,1 Напареули 20,27 1,80 — —
Телиани 0,65 0,14 0,02 9,0 Телиани 21,83 1,64 680,0 18,0 ’
Кварели 1,90 0,20 — 8,6 Кварели 36,18 2,70 — —
Саперави 2,92 0,28 0,05 8,0 Саперави 30,10 2,6 — —
(ординарное) (ординарное)
дикетонов, в частности диацетила, происходит распад а-ацетоок-
сикислоты и увеличивается содержание диацетила и пентандиона.
Определение 2,3-бутандиола и 2,3-пентандиола в винах основы-
валось на их окислении бромом сначала до оксидикетонов (по ме-
тоду Лемуана, 1928 г.), а затем (по методике окисления) до ди-
кетонов [179]. Пользуясь этим методом, А. В. Кавадзе определял
содержание дикетонов и оксикетонов в „грузинских винах. Резуль-
таты анализа приведены в табл. 14 и табл. 15.
Из данных табл. 14 и 15 видно, что в наибольшем количестве
в винах содержится 2,3-бутандиол, затем З-окси-2-бутандион (аце-
тоин) и 2,3-пентадиол, наименьшее количество — 2,3-бутандиона
(диацетила) и 2,3-пентандиона. В процессе алкогольного броже-
ния ацетоин в результате протекания восстановительных процес-
сов восстанавливается в 2-3-бутандиол, поэтому он и накапливает-
ся в больших количествах (до 680 мг/л).
Содержание ацетоина в винах колеблется от 8,03 до 36,18мг/л>
а диацетила — от 0,17 до 2,92 мг/л.
144
2,3-Бутандион, З-окси-2-бутандион и 2,3-бутандиол — соедине-
ния с 4 углеродными атомами в цепи, они, как показано, состав-
ляют окислительно-восстановительную систему в винах. Ана-
логичные три соединения, но с 5 углеродными атомами, были най-
дены нами в винах [43]. Содержание 2,3-пентадиола колеблется
от 0,6 до 18 мг/л, З-окси-2-пентанона от 0,45 до 2,80 и 2,3-пентан-
диона от 0,02 до 0,28 мг/л.
Винные дрожжи в процессе алкогольного брожения способны
восстанавливать 2,3-пентандион и образовывать значительное ко-
личество 2,3-пентандиола.
Полученные данные^ свидетельствуют о том, что в винах су-
ществует окислительно-восстановительная система соединений с
5 углеродными атомами, аналогичная окислительно-восстанови-
тельной системе из соединений с 4 углеродными атомами в цепи.
СН3 СН3 СН3
<4н2 сн2 1 сн2
1 -н» 1 -н2 1
СНОН . - СНОН ч ш со
1 / +Н2 1 +Н2 1
СНОН СО со
СН3 1 СНз 1 СНз
2,3-Пентандиол З-Окси-2-пентанон 2,3-Петандион
Данные табл. 14 показывают, что чем меньшее количество 2,3-
бутандиона (диацетила) и 2,3-пентандиона в винах, тем выше их
дегустационная оценка.
Красные марочные вина обычно содержат больше 2,3-бутандио-
на и 2,3-пентандиона, чем белые, и дегустационная оценка их за-
метно ниже. Видимо, красящие вещества связывают эти карбо-
нильные соединения. Так, вина Напареули и Телиани содержали
соответственно 0,50 и 0,65 мг/л 2,3-бутандиона и оценены 9,0 и
9,1 балла, а вино Кварели с 1,9 мг/л получило при дегустации
только 8,6 балла.
. Известно, что в винах, подвергшихся яблочно-молочному бро-
жению, количество 2,3-бутандиона значительно увеличивается и
достигает 2,8—4,3 мг/л. При проветривании вин количество его
также увеличивается. Этому способствует содержание в винах
ионов железа и меди, которые катализируют окисление З-окси-2-
бутанона в 2,3-бутадион.
Большие количества диацетила в белых (выше 0,8—0,9 мг/л)
и красных винах (больше 1,8 мг/л) придают вину окисленный тон,
при концентрации выше 2 мг/л окисленный тон переходит в мы-
шиный привкус.
Наши исследования, проведенные еще в 1952—1957 гг., пока-
зали, что сухие вина после окончания брожения не рекомендуется
подвергать аэрации. Окисленные шампанские виноматериалы сле-
дует обескислороживать биологическим методом, а потом шампа-
низировать. При этом активные дрожжи быстро восстанавливают
145
диацетил в ацетоны, а качество получаемого шампанского улуч-
шается.
Н. Г. Саришвили, А. Е. Орешкина и С. А. Брусиловский [85]
разработали способ ускоренного биологического обескислорожи- /
вания шампанских виноматериалов при тепловой обработке и J
шампанизации в непрерывном потоке.
В последнее время в США, Англии и других странах диацетил
из пива удаляют активными дрожжами или ферментными препа-
ратами типа редуктаз, полученными из дрожжей или из бактерий
[179]. Процесс проводят быстро, нагревая пиво в течение 4 мин
при 80°С или 15 мин при 60°С с одновременным введением актив-
ных дрожжей и кизельгура [Ю4].
Таким образом, содержание диацетил^ может подвергаться
регулированию путем проведения того или иного технологического
приема, что позволяет улучшать качество выпускаемого продукта.
Глава 12
ОБМЕН АЗОТИСТЫХ ВЕЩЕСТВ ПРИ БРОЖЕНИИ
Для развития, размножения и осуществления алкогольного
брожения винным дрожжам необходимы азотистые вещества. Они
способны усваивать аммиачный азот и азот органических соеди-
нений, главным образом аминокислот. Что касается окисленных
форм азота (нитриты, нитраты и др.), то они должны быть вос-
становлены до аммиака.
Из органических форм азота дрожжи потребляют в основном
/-формы аминокислот, а также мочевину. Но вместе с тем дрожжи
весьма энергично используют в качестве источника азота серно-
кислый и фосфорнокислый аммоний, а также аммиачные соли ян-
тарной, уксусной и молочной кислот. Для дрожжей аммиачные соли
являются главным предшественником органического азота. Пеп-
тиды могут быть использованы при непосредственном дезаминиро-
вании за счет свободных аминогрупп. Они также сначала подвер-
гаются гидролизу до составных аминокислот, а потом дезамини-
рованию.
Для потребления неорганического (аммонийных солей) и орга-
нического азота (аминокислот и амидов) винным дрожжам необ-
ходимо присутствие витаминов. Благоприятное влияние оказывают
биотин, тиамин (Bi), пиридоксин (В6), пантотеновая кислота и др.
Пиридоксинфосфат и тиаминпирофосфат (декарбоксилаза) иг-
рают важную роль в обмене аминокислот, в частности в декар-
боксилировании, переаминировании и других процессах.
Ферментативное расщепление аминокислоты
Винные) дрожжи расщепляют аминокислоты двумя путями,
один из которых связан с декарбоксилированием, а другой — с де-
заминированием. В этих процессах участвуют различные фермен-
146
тативные системы. Характер превращения в значительной степени
зависит от реакции среды. Дрожжи в зависимости от pH среды
способны декарбоксилировать или дезаминировать аминокислоты.
В кислой среде декарбоксилаза более активна и процесс протекает
более интенсивно по схеме
R—СН—NH2—СООН ДекаРбоксилаз^ R—CHNH2 + СО2.
Аминокислота Пиридоксаль Амин
Эта реакция имеет биологическое значение, так как образую-
щиеся амины нейтрализуют кислоты.
В щелочной среде увеличивается активность дезаминаз и при
этом усиливается процесс дезаминирования аминокислот.
Реакция окислительного дезаминирования, наиболее широко
осуществляемая в процессе жизнедеятельности дрожжей,, проте-
кает по уравнению
R—CHNH2—СООН-Ь1 / 202 R—СО—СООН—NH3.
Как видно из уравнения, окислительное дезаминирование со-
провождается образованием а-кетокислоты и аммиака.
Существуют и другие пути дезаминирования. Так, при восста-
новительном дезаминировании из аминокислоты получается жир-
ная кислота и аммиак:
R—CHNH2—СООН 4-2H->R—CH2—СООН -J-NH3.
Г идролитическое дезаминирование аминокислоты сопровож-
дается образованием аммиака и соответствующей оксикислоты:
R—CHNH2— СООН+H2o->R—СНОН—СООН H-NH3.
По представлению Ф. Эрлиха процесс дезаминирования яв-
ляется основным источником азота для использования аминокис-
лоты дрожжами.
Было также установлено, что смесь двух аминокислот повы-
шает прирост биомассы и усиливает алкогольное брожение по
сравнению с одной аминокислотой. Исходя из этого, возможен и
другой путь дезаминирования согласно реакции Л. Стикленда,
который считает, что дезаминирование происходит в результате
сопряженного окисления и восстановления пары аминокислот,
одна из которых окисляется, а другая восстанавливается. К окис-
ленным аминокислотам, т. е. донаторам водорода, относятся ала-
нин, валин, серин, лейцин, аспарагиновая и глутаминовая кисло-
ты. Восстанавливаемыми аминокислотами являются глицин, про-
лин, орнитин, аргинин и др.
- Одна из аминокислот в процессе окисления дезаминируется
в кетокислоту, которая затем в результате реакции окислитель-
ного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту. Об-
разовавшийся в результате окисления аминокислоты НАД-Н2 ак-
цептируется восстанавливающейся аминокислотой. Сопряженные
реакции окисления и восстановления можно представить двумя
реакциями:
147
R—CH—NH2—СООН4-2Н2О+2НАД->К—COOH-bNH34-CO24-2HAA4-H2,
2R—CH—NH2—СООН4-2НАД.Н2->2К—CH2—COOH4-2iNH3.
При таком механизме дезаминирования, где участвуют не-
сколько аминокислот, питательная ценность сред для дрожжей
повышается.
Как показали исследования Р. Торне, по сравнению с отдель-
ными аминокислотами смесь двух аминокислот ускоряет размно-
жение и рост дрожжей на 20%, смесь трех аминокислот — на
28%, а смесь восьми аминокислот — на 50% [48]. Это подтверж-
дается тем, что наилучшей питательной средой для дрожжей яв-
ляется смесь аминокислот, содержащаяся в автолизатах.
Работами С. А. Коновалова показано, что дрожжи способны
ассимилировать непосредственно аминокислоты. Позднее это бы-
ло подтверждено Р. Торне.
Следует указать, что винные дрожжи в отличие от некоторых
других гетеротрофных микроорганизмов способны синтезировать
все аминокислоты, входящие в состав их белков, непосредственно
за счет неорганических азотистых соединений, главным образом
из аммиачных солей. Для построения углеродной цепочки амино-
кислот дрожжи используют продукты распада углеводов, кото-
рые образуются в процессе брожения и дыхания. Винные дрож-
жи способны синтезировать аминокислоты и белки за счет неор-
ганического азота и углеводов. Они могут употреблять углекис-
лоту для синтеза углеродного скелета аминокислоты. Так, напри-
мер, дрожжи способны карбоксилировать пировиноградную кис-
лоту с образованием щавелевоуксусной с последующим аминиро-
ванием ее в аспарагиновую.
Первым продуктом биологической ассимиляции неорганиче-
ского азота является аминокислота. Синтез аминокислот из их
кетоаналогов дрожжи осуществляют путем восстановительного
аминирования, катализируемого дегидрогеназой по схеме
R—СО—COOH+NH3-r НАД • H2->R—СН—NH2—СООН+НАД+Н2О.
Кетокислота Аминокислота
С. П. Костычев [53] считал, что прямое аминирование кето-
кислот аммиаком имеет большое значение как связывающее зве-
но между обменом углеводов, с одной стороны, и азотистым об-
меном — с другой.
Аналогичная связь осуществляется и при реакции фермента-
тивного переаминирования:
х / Глутаминовая кислота 4- щавелевоуксусная кислота
а-кетглутаровая кислота 4- аспарагиновая кислота
Аминокислота передает свои аминогруппы кетокислоте; по-
следняя аминируется в аминокислоту, а аминокислота превра-
щается в соответствующую кетокислоту.
Известно, что если дрожжи при размножении не обеспечивать
смесью всех аминокислот для биосинтеза белков, то они способ-
ны ассимилировать их без предварительного дезаминирования.
148
Наоборот, если в среде отсутствует несколько необходимых ами-
нокислот, то дрожжи часть их дезаминируют, чтобы получить ам-
миак для синтеза недостающих аминокислот.
Виноградное сусло является наилучшей питательной средой
для роста и размножения винных дрожжей. Многочисленные ис-
следования показали, что они интенсивно потребляют содержа-
щиеся в виноградном соке азотистые вещества, в первую очередь
аммиачные соли, а затем аминокислоты.
Исследования С. Фланзи, М. Фланзи и Ч. Пу показали, что
дрожжи при брожении виноградного сока ассимилируют весь ам-
миачный азот и около половины аминокислот, а также и пептиды.
Выделение азотистых веществ в процессе
алкогольного брожения и при выдержке вина на дрожжах
Исследования Н. Н. Иванова, проведенные в 1919 г., показа-
ли, что дрожжи не только ассимилируют азотистые вещества в
процессе своей жизнедеятельности, но и выделяют их в окружаю-
щую среду. Этот вопрос был изучен рядом авторов и было уста-
новлено, что наряду с потреблением азота из среды происходит и
выделение его дрожжами в среду. Было показано, что скорость
усвоения азота постепенно падает в процессе брожения, а ско-
рость выделения его к концу брожения заметно увеличивается.
Исследования по изучению выделения аминокислот винными
дрожжами после брожения и формирования вина были проведе-
ны Н. М. Сисакяном и Э. Н. Безингер. Методом бумажной хро-
матографии они выделили 12 аминокислот. Из них были иденти-
фицированы аланин, валин, глицин, серин, треонин, аспарагино-
вая и глутаминовая кислоты. Аналогичные работы были проведены
Е. Пейно и С. Лафон-Лафуркардом, а также К. Хеннигом.
Таким образом, было установлено, что спиртовое брожение
сопровождается выделением из дрожжевых клеток во внешнюю
среду азотистых соединений винной природы. Это выделение
нельзя рассматривать только как процесс распада белка в ре-
зультате автолиза, так как оно может происходить и при нали-
чии синтеза.
Выделение азотистых веществ обусловлено повышением про-
ницаемости оболочки дрожжей при брожении. Значительная
часть выделенного азота является хорошим питательным мате-
риалом, на котором дрожжи растут лучше, чем на чистых амино-
кислотах.
Азотистые соединения, выделяемые дрожжами, состоят из
свободных аминокислот, полипептидов, аминов, амидов и амми-
ачных солей. В протеинах дрожжей присутствуют 22 аминокис-
лоты. В дрожжах обнаружены также различные пептиды, состоя-
щие из глютаминовой кислоты, глицина, аланина, показано нали-
чие цистеина и глютатиона, а также в большом количестве —
РНК и в меньшем ДНК- Дрожжи содержат кислоторастворимые
пуриновые и пиримидиновые основания.
149
Баланс азотистых веществ (аминный, амидный, аммиачный,
пептидный и белковый азот) составляет всего 40—50%. Осталь-
ной азот пока не поддается определению. Аминный азот состав-
ляет 32—48% от общего азота, аммиачный — до 3,3%, амид-
ный — от 3 до 7%.
Исследования Ч. Пу, С. Фланзи и М. Фланзи показали, что
выдержка вина на дрожжевом осадке в течение одного месяца
приводит к обогащению его органическим азотом на 30% по
сравнению с контрольным, через два месяца на 65%, а через три
месяца на 67%. При этом появляются следы аммиачных солей.
Самым важным показателем является увеличение содержания
аминокислот.
В табл. 16 приведены данные аминокислотного состава сусла
и молодого вина.
ТАБЛИЦА 16 СОСТАВ АМИНОКИСЛОТ В СУСЛЕ ДО И ПОСЛЕ БРОЖЕНИЯ (В МГ/Л)
Аминокислота Сусло Вино Аминокислота Сусло Вино
Аланин 31,0 3,8 Лейцин 14,0 8,1
Аргинин 114,0 2,3 Лизин 4,4 4,7
Аспарагиновая кис- 7,6 4,0 Метионин 0,7 1,5
лота Фенилаланин 28,0 4,3
t Валин 17,0 4,8 Пролин 216,0 180,0
Глютаминовая 69,0 21,0 Серин . 43,0 33,0
кислота Треонин — 2,3
Глицин 7,1 10,0 Тирозин 7,5 4,3
Гистидин 12,8 2,5 Триптофан 3,9 2,5
Изолейцин 8,8 5,4
Количественный анализ аминокислот до и после брожения по-
казал, что дрожжи в процессе брожения усваивают больше по-
ловины аминокислот. Если в сусле до брожения было 575,8 мг/л
аминокислот, то в молодом вине их осталось 294 мг/л.
Дрожжи в процессе брожения сусла интенсивно ассимили-
руют аргинин, аланин, изолейцин, гистидин, фенилаланин и глу-
таминовую кислоту. Сравнительно хорошо усваиваются аспара-
гиновая кислота, изолейцин, серин, тирозин, а также пролин и
триптофан. Совсем не ассимилируются глицин, лизин и метионин.
В процессе брожения дрожжи выделяют их больше, чем содер-
жатся в сусле.
Это говорит о том, что не все аминокислоты ассимилируются
дрожжами и подвергаются превращению, часть их остается в ви-
не. Хотя после окончания брожения дрожжи и выделяют неко-
торые аминокислоты, но количество их никогда не достигает пер-
воначального количества азота, которое было в сусле до бро-
жения.
Исследования Ч. Пу, С. Фланзи и М. Фланзи показали, что
выдержка на дрожжах в течение одного месяца оказывает благо-
150
приятное влияние и вино приобретает гармоничность. При более
длительной выдержке качество вина больше не улучшается. Это
противоречит данным А. М. Фролова-Багреева, который показал,
что оптимальная выдержка шампанских виноматериалов на
дрожжевом осадке — не менее 3 месяцев. Было также установ-
лено, что и после 2-месячной выдержки количество аминокислот
увеличивается в 2 раза. . Это важно, так как часть аминокислот
возвращается обратно в вино (около 70%).
По интенсивности метаболизма аминокислот дрожжами они
были разделены на три группы. К первой группе относятся ами-
нокислоты сусла, потребляемые во время брожения, которые не
возвращаются в вино в процессе автолиза, — это аргинин, фени-
лаланин, гистидин. Ко второй группе относятся аминокислоты,
употребляемые во время брожения, но затем возвращающиеся в
среду, — это пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты,
лейцин, изолейцин, валин, серин, тирозин и триптофан. К третьей
группе относятся аминокислоты, которые не усваиваются дрож-
жами, но в процессе выдержки вина количество их увеличивает-
ся— это глицин, лизин и метионин.
Следует указать, что различные расы дрожжей неодинаково
усваивают и выделяют аминокислоты в окружающую среду.
После окончания брожения часть азотистых веществ выпа-
дает в осадок, главным образом белки, которые осаждаются та-
натами и спиртом. Увеличение концентрации спирта при сбражи-
вании сусла обусловливает плохую растворимость кислого винно-
кислого калия, который выпадает в осадок в виде кристаллов.
Эти оба процесса очень длительны.
Поскольку азотистые вещества играют важную роль в фор-
мировании, созревании и старении вина, регулирование их коли-
чества для получения различных типов вин имеет большое зна-
чение.
В этом направлении В. И. Ниловым и Г. Г. Валуйко были
проведены исследования, которые показали, что регулирование
количества азотистых веществ при сбраживании сусла и форми-
ровании вина можно осуществить изменением температуры бро-
жения и степени аэрации бродящего сусла. Эти исследования по-
казали, что наименьшее количество азотистых веществ полу-
чается при выбраживании сусла при температуре 15—20°С. На-
оборот, брожение сусла при более низких температурах (от 5 до
12°С), а также при температуре выше 20°С обычно сопровож-
дается увеличением содержания азотистых веществ в вине. Это
можно объяснить тем, что при низкой температуре брожение
протекает медленно, дрожжи меньше ассимилируют азотистых
веществ, поэтому они переходят в вино. Наоборот, при повыше-
нии температуры (более 20°С) дрожжи размножаются интенсив-
нее, происходит накопление биомассы, ускоряется процесс авто-
лиза в конце брожения, вследствие чего происходит обогащение
вина азотистыми веществами.
151
Следует указать, что скорость брожения виноградного сусла
прямо пропорциональна температуре в пределах от 10 до 28°С,
которая является оптимальной. При температуре выше макси-
мальной (28°С) дрожжевые клетки угнетаются, брожение замед-
ляется.
Скорость брожения зависит также от первоначальной саха-
ристости, pH среды и от первоначального содержания азотистых
веществ.
При брожении сусла в условиях аэрации происходит более
интенсивная ассимиляция азотистых веществ, накапливается био-
масса дрожжей, что приводит к увеличению азота в вине вследст-
вие автолиза дрожжей.
Полученные результаты имеют теоретическое и практическое
значение, так как содержание азотистых веществ можно регули-
ровать, изменяя условия брожения, и этим улучшать качество
вина. Г. Г* Валуйко и В. И. Нилов рекомендуют для получения
высококачественных сухих столовых виноматериалов брожение
сусла проводить при температуре 14 —18°С. Дрожжи, оставаясь
в контакте с вином, после окончания брожения при спиртуозно-
сти выше 10% и pH 3,0—3,2 угнетаются и отмирают, особенно
при повышенной температуре. При этих условиях ферменты
дрожжей остаются активными, вследствие чего начинается авто-
лиз и обогащение вина азотистыми веществами, особенно амино-
кислотами.
Состав аминокислот разных типов вин изучали многие ученые
в разных странах мира (табл. 17).
Из данных табл. 17 видно, что состав и количество аминокис-
лот зависят от способа приготовления и типа вина.
Так, например, наибольшее количество аминокислот содер-
жится в красных винах, достигая 1377,6 мг/л; в белых сухих ви-
нах их 600—767 мг/л; приблизительно такое же количество ами-
нокислот содержится в шампанском, а наименьшее — в игристом
вине Асти спуманте, что объясняется предварительным биологи-
ческим снижением их в виноматериале.
Количественное содержание отдельных аминокислот резко ко-
леблется. Многие аминокислоты являются общими для всех вин,
несмотря на разное происхождение. Особенно много в винах про-
лина, затем глутаминовой кислоты, аргинина, валина, треонина,
гистидина, аспарагиновой кислоты, фенилаланина и др. Реже
встречаются у-аминомасляная кислота, метионин, триптофан.
Помимо аминокислот, в вине встречаются пептиды и полипеп-
тиды, а также амины и амиды. Пептиды имеют важное значение
в качестве промежуточных продуктов обмена и являются физио-
логически активными веществами. К числу таких соединений от-
носятся цистеин и глютатион.
Они участвуют в окислительно-восстановительных процессах,
оказывают влияние на активность многих энзимов, особенно на
дегидрогеназы, а также на ферменты, связанные с превращением
белков.
152
Исследования Ч. Пу и А. Урнака (1970) показали, что в со-
став полипептидов входят главным образом глицин, лизин, трео-
нин, валин, аланин, лейцин, серин, изолейцин, аргинин, тирозин,
гистидин, фенилаланин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты.
Известно, что у-аминомасляная кислота не входит в полипепти-
ды. Эти авторы считают, что аминокислоты, входящие в состав
пептидов вина, составляют от 70 до 90% от общего азота, а сво-
бодные аминокислоты вина — всего 20—30%.
Таблица 17
СОДЕРЖАНИЕ АМИНОКИСЛОТ (В МГ/Л) В ВИНАХ
(ПО ДАННЫМ РАЗЛИЧНЫХ АВТОРОВ)
Аминокислоты Белые вина Красные вина Шам- панское Асти сп ум ан- те Мускат
Бернер, Вагнер Лафон- Лафуркард Бурде- Херард Лафон- Лафуркард Родопуло, Писарницкий Кишковский
Аланин у-Аминомасляная кислота 27,8 — 67,0 31,0 54,0 1,0 3,0 67,0 50,0
Аргинин 38,2 46,0 84,0 46,0 108,0 9,0 124,0
Аспарагиновая кислота 28,2 38,0 76,0 24,0 22,0 4,0 15,0
Валин 31,2 36,0 19,0 45,0 28,0 1,5 14,0
Глицин 23,0 26,0 12,0 26,0 8,8 9,0 4,0
Глютаминовая кислота 65,0 200,0 334,0 221,0 36,0 7,0 31,0
Гистидин 19,4 14,0 34,0 14,0 3,2 + +
Изолейцин — 26,0 — 29,0 4,0 3,0 24,0
Лейцин 23,2 36,0 — 19,0 13,6 — —
Лизин 6,0 40,0 43,0 47,0 48,0 2,0 *4,0
Метионин — 4,0 28,0 5,0 1,8 — —
Пролин 296,0 201,0 513,0 201,0 296,0 106,0 126,0
Серин 15,0 54,0 9,0 49,0 12,8 4,0 24,0
Треонин 7,0 11,0 27,0 187,0 6,8 2,0 25,0
Триптофан 14,0 — — 25,0 — — —
Тирозин — 13,0 32,0 11,0 8,0 1,о 7,0
Фенилаланин 11,8 16,0 22,0 19,0 8,4 + 2,0
Цистин — 25,0 10,6 25,0 5,5 15,0 34,0
Проведенные за последние годы исследования показали, что
наряду с аминокислотами, пептидами и белками в сусле и вине
содержатся и другие азотистые вещества. Установлено, что часть
неаминокислотного азота приходится на амины.
В литературе появилось достаточно работ, доказывающих на-
личие в вине аминов. Ф. Драверт в 1965 г. методом газожидкост-
ной, тонкослойной и бумажной хроматографии идентифицировал
10 аминов. Рек обнаружил в вине следующие биогенные амины:
метил-, этил-, н-пропил-, изобутил-, н-бутил-, изопептил-, н-пен-
тил-, н-гексил-, р-фенилэтиламин, тирамины, путресцин, када-
верин.
15:
В литературе имеется несколько работ о наличии аминов в
вине (от 10 до 20 мг/л).
Как показали исследования 3. Н. Кишковского и сотрудников
[44], особенно много аминов в хересных винах.
Ацетамиды образуются при аминоацетилазной реакции по
схеме
СН3-СО- SKoA-J-R—NH2->CH3—СО—NH—R4-SH. КоА.
Ф. Драверт и его сотрудники, применяя газожидкостную хро-
матографию и масспектроскопию, идентифицировал вторичные
амиды: N-этилацетамид, бутилацетамид, М-(2-метилбутил)-ацета-
мид, М-(З-метилбутил)-ацетамид.
Превращение аминокислот дрожжами
Одновременно с углеводами под действием ферментов дрож-
жей подвергаются изменению и азотистые вещества виноградно*
го сока.
Дезаминирование аминокислот с образованием соответствую-
щих а-кетокислот было впервые установлено Нейбауером. Реак-
цию окисления /-d-изомеров аминокислот оксидазами аминокис-
лот (флавопротеинами) можно выразить следующей схемой:
R—СН—NH2COOH4- ФАД*
Аминокислота
-R-.C—СООН1+ФАД-Н2
fl
NH
Иминокислота
R—С—СООН] +H2O^R—СО—COOH4-NH3.
II
NH
При действии этих оксидаз от молекулы аминокислоты отни-
маются два атома водорода и при взаимодействии с молекуляр-
ным кислородом образуется перекись водорода, как это показа-
но ниже:
ФАД *H2-J-O2—>ФАД + Н2О2.
Образовавшаяся перекись водорода катализирует окисление
а-кетокислоты с образованием соответствующей карбоновой кис-
лоты и СО2 по схеме
R—СО—СООН4-H2O2->R—СООН+СО2+Н2О.
При наличии в этой системе каталазы возникающая при окис-
лении аминокислот перекись водорода также способна окислять
этанол.
R—СН—NH2—СООН4-О24-СН3—CH2OH-^R—СО—COOH+CH3CHO4-NH34-H2O.
Эта реакция является типичным примером пероксидазных ре-
акций, катализируемых каталазой.
* Флавинадениндинуклеотид.
154
Дегидрогеназа глютаминовой кислоты дегидрирует /-глутами-
новую кислоту по схеме
СООН СООН
сн2 сн2
СН2+НАД+Н2О-> СН24-НАДН24-НН3.
I I
chnh2 со
I I
соон соон
Предполагают, что в качестве промежуточного продукта обра-
зуется иминокислота, как это имеет место при окислении амино-
кислот оксидазами (флавопротеинами).
Глутаматдегидрогеназа специфична в отношении /-глутамино-
вой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты и у-метилглута-
миновой кислоты.
Дрожжи содержат также аланиндегидрогеназу, которая де-
гидрирует аланин в присутствии НАД по схеме
Z—СН3—СНМН2-^СООН+НАД+Н2О->СН3—СО—СООН4-ННз+НАДН2.
Известно, что при декарбоксилировании аминокислот обра-
зуются амины, но этот процесс может протекать так, что могут
возникнуть и новые аминокислоты. Так, например, при декарбок-
силировании а-карбоксильной группы образуется р-аланин:
СООН СООН
I > I
9^2 Декарбоксилаза ^^2
СН—NH2 Пиридоксаль CH2NH2
| Р-Аланин
СООН
/-Аспарагиновая
кислота
При декарбоксилировании /-аспарагиновой кислоты в р-кар-
боксильной группе образуется /-аланин:
СООН СН3
(>Н2 Декарбоксилаза СН»Н2
CH-NH2 Пиридоксаль с00Н '
| /-Аланин
СООН
/-Аспарагиновая
кислота
Дрожжи также способны дегидрировать аспарагиновую кис-
лоту в щавелевоуксусную, которая гидрируется в яблочную кис-
лоту, а последняя дегидратируется в фумаровую и таким обра-
зом по циклу дикарбоксильных кислот приводит к образованию
янтарной и уксусной кислот.
155
При декарбоксилировании некоторых аминокислот образуются
амины, а при дезаминировании и декарбоксилировании возни-
кают спирты.
Из ароматических и гетероциклических аминокислот обра-
зуются следующие соединения: из фенилаланина — р-фенилэта-
нол, р-фенилэтиламин, фенилпировиноградная кислота; из тиро-
зина — п-оксифенилэтанол (тиразол) и 3,4-диоксифенилэтиламин;
из гистидина — р-имидазол, гистамин; из триптофана — трипто-
фол, р-индол, пировиноградная кислота и триптамин.
Возможен и другой путь превращения аминокислоты: дезами-
нирование без последующего декарбоксилирования. В этом слу-
чае из лейцина образуется а-кетокапроновая кислота, из вали-
на — а-кетоизовалериановая, а из аланина — пировиноградная
кислота. Кетокислоты декарбоксилируются в альдегиды.
Таким образом, в результате действия ферментативных систем
дрожжей из аминокислот возникает ряд веществ: высшие спирты,
органические кислоты, альдегиды, амины и другие соединения.
Нами совместно с Н. М. Сисакяном, И. А. Егоровым и
Н. Г. Саришвили (1963) проведены исследования превращений
аминокислот винными дрожжами. Показано, что из глицина вин-
ные дрожжи способны синтезировать около двенадцати амино-
кислот, т. е. добавление одной аминокислоты приводит к своеоб-
разным процессам обмена веществ у винных дрожжей, в резуль-
тате чего в среде накапливается определенный набор аминокис-
лот, гораздо более богатый по составу, чем состав аминокислот
в контрольном опыте (без добавления аминокислоты). В этой ра-
боте впервые было установлено, что винные дрожжи из фенила-
нина и тирозина образуют р- и n-фенилэтиловый спирт, играю-
щий важную роль в образовании букета вина.
Видимо, биосинтез аминокислот происходит вначале по глиок-
салатному циклу. Из глицина образуется глиоксалевая кислота,
которая конденсируется с ацетил-КоА и образует яблочную кис-
лоту. Последняя дегидрируется в щавелевоуксусную, которая
конденсируется с ацетил-КоА по циклу трикарбоксильных кис-
лот. Это позволяет объяснить образование аланина, серина, фе-
нилаланина, аспарагиновой, глутаминовой и других аминокислот.
Дикарбоксильные кислоты (^пировиноградная, щавелевоук-
сусная и а-кетоглутаровая) в свою очередь могут вступить в ре-
акцию переаминирования с другими аминокислотами и образо-
вать новые аминокислоты.
Таким образом, путем переаминирования происходит образо-
вание аланина, аспарагиновой и глутаминовой кислот из соот-
ветствующих кетокислот.
Дрожжи для роста и размножения не нуждаются в полном
наборе аминокислот. Они способны синтезировать из неполноцен-
ных аминокислот полноценные. Так, из глицина в начале синте-
зируется аланин, а из него образуется валин.
С. Ямада наблюдал синтез дрожжами изолейцина, лейцина из
а-амино-н-масляной кислоты или из треонина.
156
Дрожжи способны синтезировать целый ряд незаменимых
аминокислот из неполноценных аминокислот.
Глицин, цистеин и глютаминовая кислота участвуют в обра-
зовании глютатиона. Этот трипептид играет большую роль в
окислительно-восстановительных процессах при созревании и ста-
рении вина, является сильным восстановителем и очень легко
подвергается окислению. Он может существовать в восстановлен-
ной и окисленной форме, в виде дисульфида, широко распрост-
ранен в природе, впервые выделен из дрожжей Ф. Гопкинсом
еще в 1921 г.
В дисульфиде глютатиона окисляется сульфгидрильная груп-
па SH, при этом выделившийся водород восстанавливает окис-
ленные ароматобразующие вещества, вкус и букет вина улуч-
шаются. Аналогичную роль играет и цистеин.
Таким образом, в процессе брожения виноградного сусла, а
также при выдержке молодого вина на дрожжевой гуще проис-
ходят превращения аминокислот и накапливаются различные ве-
щества. Возникающие при этом ароматобразующие соединения
оказывают определенное влияние на вкус и букет вина.
Глава 13
МЕТАБОЛИЗМ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ ДРОЖЖАМИ
ПРИ БРОЖЕНИИ
Органические кислоты являются продуктами диссимиляции
углеводов, аминокислот и жиров микроорганизмами. Сущест-
вуют два пути превращения углеводов: аэробно-пентозофосфат
ный и анаэробно-гликолитический.
В результате углеводного и азотистого обмена у дрожжей в
процессе алкогольного брожения образуется целый ряд веществ,
играющих важную роль в формировании вина. Среди этих ве-
ществ на одном из первых мест стоят органические кислоты, ко-
торые играют определенную физиологическую роль, в значитель-
ной степени определяют внутренние условия среды (pH) в дрож-
жевой клетке и регулируют внутреннюю интенсивность и направ-
ленность биохимических реакций.
В зависимости от соотношения свободных и связанных в соли
кислот находится актуальная кислотность и концентрация водо-
родных ионов.
Биосинтез органических кислот
Основные представления о путях превращений органических
кислот в растениях и микроорганизмах изложены в работах
С. П. Костычева, В. С. Бутуевича, М. В. Федорова, Т. Кшонца,
К. Бергауэра, X. Кребса и В. Джонсона, X. Корберга и X. Креб-
са, Д. Девиса и др.
157
С. П. Костычев [53] на заре развития биохимии считал, что
образование лимонной кислоты немыслимо без синтетических ре-
акций. Впоследствии это было подтверждено советскими и зару-
бежными исследователями.
Позднее было доказано, что синтез лимонной кислоты проте-
кает по циклу Кребса посредством конденсации щавелевоуксус-
ной кислоты с ацетил-КоА. Был выделен фермент, который ка-
тализировал конденсацию щавелевоуксусной кислоты с ацетил-
КоА, поэтому этот фермент был назван конденсирующим эн-
зимом.
Образование лимонной кислоты из глюкозы — сложный био-
химический процесс. Вначале из глюкозы образуется пировино-
градная кислота, но этот процесс чрезвычайно сложен.
,Изучение анаэробного распада углеводов привело к установ-
лению следующих промежуточных продуктов: углеводы + фос-
форная кислота —э- гексозофосфат —триозофосфат + фосфо-
глицериновая кислота —> фосфопировиноградная кислота. Даль-
нейшее превращение пировиноградной кислоты в зависимости от
наличия ферментативных систем у дрожжей протекает различно.
Известно, что пировиноградная кислота является исходным
продуктом для синтеза целого ряда важнейших веществ, опреде-
ляющих направление обмена в живой клетке.
Дрожжи способны декарбоксилировать пировиноградную кис-
лоту в уксусный альдегид, они также способны непосредственно
превращать пировиноградную кислоту в уксусную посредством
окислительного декарбоксилирования.
При спиртовом брожении пировиноградная кислота через ук-
сусный альдегид образует этанол, а при гликолизе под действи-
ем лактикодегидрогеназы и НАД-Н2 она превращается в молоч-
ную. Пировиноградная кислота участвует в реакциях переамини-
рования, она легко аминируется в аланин.
Пировиноградная кислота участвует в синтезе кислот по цик-
лу Кребса. Но прежде, чем она будет вовлечена в циклы ди- и
трикарбоксильных кислот, она должна, с одной стороны, карбок-
силироваться в щавелевоуксусную кислоту, а с другой — в при-
сутствии коэнзима А превратиться в ацетил-КоА. Эти две реак-
ции можно представить в следующем виде:
СН3—СО—СООН4-СО2+АТФ->НООС—СН2—СО—СООНн-АДФ -НФ ,
СН3—СО—COOH+HS ~ КоА Ч-НАД->СН3—СО—К0А4-НАД • Н2+СО2.
Коэнзим А является переносчиком ацетильной группы, кото-
рая присоединяется к нему через эфирную микроэргическую
связь. Поэтому в микроорганизмах широко распространены аце-
тилфосфаты, которые принимают участие в биохимических реак-
циях, связанных с выделением энергии. Роль коэнзима А в био-
логических окислениях и синтезах стала более интенсивно иссле-
доваться после препаративного приготовления его, осуществлен-
ного Ф. Линеном и Е. Рейхертом. Была установлена взаимная
связь между изменением содержания коэнзима А в дрожжевых
158
клетках и скоростью окисления уксусной кислоты. Доказано, что
при недостатке коэнзима А дрожжи слабо окисляют уксусную
кислоту.
Ацетил-КоА образуется не только из пировиноградной кисло-
ты, но и из уксусной кислоты и уксусного альдегида. Источником
образования щавелевоуксусной кислоты являются яблочная и
аспарагиновая кислоты, а также путь карбоксилирования пиро-
виноградной кислоты.
Дрожжи обладают всеми ферментативными системами для
образования щавелевоуксусной кислоты из указанных соединений,
они содержат также коэнзим А и способны образовывать ацетил-
КоА из пировиноградной и уксусной кислот.
С помощью изотопного углерода в виде NaHC14O3 нам в
1959 г. удалось доказать, что винные дрожжи способны карбок-
силировать пировиноградную кислоту с образованием щавелево-
уксусной кислоты. Последняя реагирует с ацетил-КоА и образует
лимонную кислоту по схеме
СНг—CUOOH
С1Ю0Н—СН2— СО—СООНЧ-СНз— СО- • КоА4-Н20-^С(ОН)—COOH+HS-KoA.
СН2—СООН
Методом бумажной хроматографии из культуральной жидко-
сти дрожжей были выделены радиоактивная лимонная кислота,
молочная, яблочная и янтарная.
Винные дрожжи способны превращать лимонную кислоту по
циклу трикарбоксильных кислот и образовывать янтарную и гли-
оксалевую кислоты, последняя конденсируется с ацетил-КоА и
образует яблочную кислоту по глиоксалатному циклу.
Кроме^ того, винные дрожжи также способны синтезировать
лимонную кислоту из глютаминовой кислоты и аланина путем
дезаминирования их в соответствующие кетокислоты и в даль-
нейшем превращать их по циклу Кребса.
Во-первых, винные дрожжи способны карбоксилировать пиро-
виноградную кислоту в щавелевоуксусную. Они также способны
превращать пировиноградную кислоту в ацетил-КоА. Последний
конденсируется с щавелевоуксусной кислотой и образует лимон-
ную кислоту.
Во-вторых, дрожжи путем окислительного декарбоксилирова-
ния превращают пировиноградную кислоту в уксусную. Послед-
нюю они способны конденсировать в янтарную кислоту через аце-
тил-КоА, янтарную кислоту они превращают в щавелевоуксусную
через фумаровую и яблочную. Щавелевоуксусная кислота кон-
денсируется с ацетил-КоА и образуется лимонная кислота.
В работе С. В. Дурмишидзе (1965) было показано, что мече-
ная уксусная кислота превращается в янтарную, фумаровую и
гликолевую кислоты. По данным автора процесс ассимиляции и
превращения уксусной кислоты протекает на всех стадиях алко-
гольного брожения. Известно также, что уксусная кислота в виде
159
ацетил-КоА через цикл ди- и 1рикарооновых кислот окисляется
до СО2 и воды.
Генезис уксусной кислоты при алкогольном брожении долгое
время оставался неясным и только благодаря работам С. П. Ко-
стычева стало известно, что дрожжи превращают уксусный аль-
дегид и в этанол и уксусную кислоту по следующей схеме:
СН3СНО Н2 СН3—СН2ОН
+ 1 ->
СН3СНО О СНз—соон.
По современным представлениям эта реакция протекает в два
этапа: на первом уксусный альдегид присоединяет кислород во-
ды и окисляется до уксусной кислоты, при этом водород воды
восстанавливает НАД, который участвует в этой реакции:
СН3СНО+Н2О-ЬНАД->СН3СООН+НАД. н2.
Образовавшийся НАД-Н2 восстанавливает вторую молекулу
уксусного альдегида в спирт: СН3СНО-ЬНАД-Н2->СН3—СН2ОН.
Исследования Е. Пейно показали, что в начале брожения ко-
личество летучих кислот, в частности уксусной, заметно возрас-
тает, затем процесс замедляется, количество летучих кислот ста-
билизируется и в конце брожения начинает убывать. Этот автор
считает, что в период интенсивного размножения дрожжей их
восстановительная способность высока/ поэтому и происходит
восстановление уксусной кислоты в этанол. '
Известно, что при усилении восстановительных процессов про-
исходит максимальное накопление этанола. Однако трудно по-
нять непосредственное восстановление уксусной кислоты в этило-
вый спирт, как это понимает Е. Пейно.
Е. Пейно использовал способность дрожжей восстанавливать
уксусную кислоту в этанол в анаэробных условиях для исправле-
ния вин с высоким содержанием уксусной кислоты/ как это было
сделано Н. Ф. Саенко для лечения больных вин хересными дрож-
жами.
Образование уксусной кислоты в процессе спиртового броже-
ния сусла зависит от pH среды и от температуры брожения. При
брожении в менее кислой среде (pH 6) вначале образуется зна-
чительное количество уксусной кислоты, затем скорость образо-
вания уменьшается. При pH 7,5 она образуется равномерно в те-
чение всего периода, а при pH 2,5 она в вине не накапливается.
Е. Пейно исследовал 32 расы дрожжей на способность обра-
зовывать летучие кислоты в присутствии кислорода и без него.
Среднее количество образующихся при брожении в аэробных ус-
ловиях летучих кислот составляло 0,52 г/л, а в анаэробных усло-
виях — 0,69 г/л.
Г. Г. Валуйко также наблюдал, что в присутствии кислорода
летучих кислот образуется меньше. Известно, что аэробиоз по-
давляет образование летучих кислот. Объясняется это тем, что
при сбраживании сусла в аэробных условиях уксусная кислота
окисляется в ацетил-КоА через цикл Кребса.
160
В основном уксусная кислота образуется не только в процессе
брожения, но и при ферментативном окислении спирта. Это про-
исходит при выдержке виноматериалов с дрожжевым осадком.
Процесс усиливается при аэробных условиях, т. е. если бочки не
доливать вином до шпунта.
Уксусная кислота образуется также при (3-окислении высоко-
молекулярных жирных кислот. При этом окисление происходит у
того углеродного атома, который находится в p-положении по от-
ппе: -(СН2)Л СН2-СН2—СН2-СООН.
7 Р а
В результате разрыва цепочки жирной кислоты между а- и
(3-углеродными атомами образуется уксусная кислота; новая вы-
сокомолекулярная кислота будет содержать на 2 атома углерода
ношению к карбоксильной гру
меньше, чем исходная жирная кислота.
Известно, что при более высоком pH среды образуется мень-
ше 2,3-бутиленгликоля и ацетоина и значительно больше — гли-
церина, летучих кислот и янтарной кислоты. Процесс образова-
ния янтарной кислоты очень сложный. Превращения уксусной
кислоты начинаются с образованием ацетил-КоА. Конденсируют-
ся не две молекулы уксусной кислоты, а активные ацетильные
группы в виде ацетил-КоА, которые и образуют янтарную кис-
лоту.
2СН3—СО ~ S—Ко А + А Д Ф+Ф + НАД+Н2О->
->СООН—СН2—СН2—СООН4-2Н8~КоА+АТФ+НАД.Н2.
Как показали исследования В. 3. Гваладзе, при брожении
сусла в анаэробных условиях количество янтарной кислоты бы-
вает незначительно, а в аэробных условиях увеличивается.
Янтарная кислота образуется также при расщеплении изоли-
монной кислоты при действии изоцитратазы по схеме:
СООН
I
онсн сн2—соон
НС—СН2СООН Изоцитраза сн2—соон
| Янтарная
СООН кислота
СОН
СООН.
Глиоксалевая
кислота
Изолимонная
кислота
Глиоксалевая кислота, согласно глиоксалатному циклу, всту-
пает в реакцию с ацетил-КоА и образует яблочную кислоту по
схеме
СООН
(!ноч-сн3—CO^SKoA4-H2O^CHOH—COOHH-HS-KoA.
СН2 —СООН
Эти три кислоты были найдены в винограде и вине.
В вине была обнаружена а-метиляблочная кислота, Или ли-
монно-яблочная. Она образуется в результате конденсации пиро-
виноградной кислоты с ацетил-КоА (Ж. Карл, 1969):
6—993
161
СНз—СО—S- КоА
СН3СО—СООН
СН2—СООН
4- Н2О ->СН3—С— СООН + SH • КоА •
ОН
а-Метиляблочная кислота
Существует и другой путь образования ос-метиляблочной кис-
лоты — это конденсация глиоксалевой кислоты с пропионилом-
КоА с образованием а-оксиглутаровой кислоты. Последняя в ре-
зультате внутримолекулярной перегруппировки превращается в
метиляблочную кислоту по следующей схеме:
СООН
СОН4-Н2О
+
СНз—СН2—СО — SKoA
Пропионил-КоА
СООН
СНОН
CH24-HS-KoA
СН2
соон
а-Оксиглутаровая кислота
а-Оксиглутаровая кислота легко распадается на а-метиляблоч-
ную кислоту, а последняя — на пировиноградную и уксусную кис-
лоты:
СООН 1
СНОН СООН СН3 СН3 1
1 сн2 - сн3—сон -СО + соон
1 СН2 сн2 соон
соон 1 соон
а-Оксиглу- а-Метиляб- Пировино- Уксусная
таровая лочная градная кислота
кислота кислота кислота
а-Метиляблочная
лировании лимонной
кислота образуется также при декарбокси-
кислоты винными дрожжами по схеме
СН2—СООН СН2—СООН
ОН—С—СООН —со2-------> СНз—С—соон.
СН2СООН он
Лимонная кислота а-Метиляблочная кислота
Исследования показали, что а-метиляблочная кислота не со-
держится в винограде. Она образуется при алкогольном броже-
нии из сахара в количестве от 70 до 180 мг/л. Концентрация ее
прямо пропорциональна содержанию спирта и зависит от условий
брожения, в частности от метаболитической активности дрожжей.
Количество а-метиляблочной кислоты зависит также и от pH
среды: при pH 3,9 ее накапливается до 80, а при pH 3,2 до
282 мг/л. Количество а-метиляблочной кислоты в белых винах
162
колеблется от 65 до 147 мг/л и в красных — от 91 до 187 мг/л.
Содержание ее значительно увеличивается при выдержке вина.
В вине найдены 2,3-диоксивалериановая, диметилглицерино-
вая, или 2-метил-2,3-диоксимасляная кислоты. Последняя обра-
зуется в результате конденсации пировиноградной кислоты с ук-
сусным альдегидом:
СН3—СО—СООН СН3 СН
+ С=О+НАД-Н2^ Н—С—ОН
сн3—сно сн3—С—ОН сн3—с—он
соон , соон
Ацетомолочная 2-Метил-2,3-диокси-
кислота масляная кислота
Образованная ацетомолочная кислота восстанавливается в
присутствии НАД-Н2 в 2-метил-2,3-диоксимасляную кислоту.
Установлено, что содержание а-метиляблочной, диметилглице-
риновой и 2-метил-2,3-диоксимасляной кислот зависит от расы
дрожжей и их метаболитической активности. Накопление двух
последних кислот в винах зависит также от условий проведения
брожения. Так при анаэробиозе количество их уменьшается.
В винах были найдены гликолевая, глиоксалевая, фумаровая,
пировиноградная, щавелевоуксусная, глюконовая, галактуроно-
вая кислоты. Что касается глюкуроновой кислоты, то, по мнению
одних авторов, в обычных винах ее нет. Она встречается в винах,
приготовленных из винограда, пораженного грибом Ботритис ци-
нерея, при этом количество ее достигает 1 г/л и больше. Она об-
разуется в результате окисления глюкозы ферментами этого гри-
ба. По мнению других, глюкуроновая кислота встречается в бор-
доских сухих винах в количестве 100—200 мг/л.
В выдержанных винах содержится диоксифумаровая кислота.
В аэробных условиях она быстро распадается на мезоксалевую,
глиоксалевую, гликолевую и щавелевую кислоты.
Согласно данным П. Риберо-Гайона, содержание ароматиче-
ских кислот (n-оксикоричной, п-оксибензойной и салициловой) в
красных винах составляет от 50 до 100, а в белых — до 5 мг/л
[154].
По данным этого же автора, в винах встречаются следующие
фенольные кислоты: шикимовая, хинная, ферулевая, галловая,
кофейная и протокатеховая. Биосинтез фенольных соединений
был показан ранее.
В наибольшем количестве в винах встречаются жирные кис-
лоты. Они находятся в свободном состоянии, в виде сложных
эфиров, а также в виде солей. Низшие жирные кислоты (от Ci до
С9) при обычных условиях являются жидкими. Обычно, начиная
с масляной кислоты до С9, они представляют собой маслянистые
жидкости и легко растворяются в воде в определенных концен-
трациях. Высшие жирные кислоты (от Сю и выше) являются
твердыми веществами.
6* 163
Дрожжевая клетка содержит все ферменты, катализирующие
синтез и распад жирных кислот. Основными жирными кислотами
вина являются уксусная, н-капроновая1, н-каприловая, н-каприно-
вая и дециловая. В меньшем количестве встречаются муравьиная,
пропионовая, изомасляная, а-метилмасляная, 2-метилдиоксимас-
ляная, изовалериановая, 2-оксикапроновая и н-пеларгоновая.
Из высокомолекулярных кислот в винах содержатся лаурино-
вая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая и др.
Роль органических кислот при технологии
и выдержке вина
Истинная кислотность вина, которая колеблется от 2,5 до 3,7,
совместно с концентрацией этилового спирта предохраняет его от
бактериальных заболеваний.
В интенсивности протекания окислительных реакций заметную
роль играет кислотность вина. В кислой среде, какой является ви-
но, окислительные процессы протекают гораздо медленнее, чем в
нейтрально-щелочной. В кислой среде двухвалентное железо сла-
бо окисляется в трехвалентное, что препятствует образованию
танатов железа, вызывающих железный касс. Высокая кислот-
ность придает вину устойчивость к феррофосфатным помутне-
ниям.
П. Н. Унгурян (1960) отметил, что существует определенная
закономерность возникновения феррофосфатных помутнений, свя-
занных с количественным содержанием в вине железа, фосфора
и титруемой кислотностью. Таким образом, чем выше титруемая
кислотность и чем меньше железа и фосфора в вине, тем оно
устойчивее к феррофосфатным помутнениям.
Активная кислотность винограда имеет важное значение при
выработке вина. При низких значениях pH (2,9—3,7) окислитель-
ные ферменты (о-дифенолоксидаза, пероксидаза и аскорбатокси-
даза) менее активны. Поэтому окислительные процессы при об-
работке винограда и получении сусла протекают слабее, вследст-
вие чего вино получается менее окисленным.
Работами М. А. Герасимова, В. 3. Гваладзе, Н. М. Сисакяна
и др. установлено, что между активной и титруемой кислотностью
в виноградном соке и вине нет прямой зависимости. Так, вина
с равной титруемой кислотностью отличаются концентрацией во-
дородных ионов. Это понятно, потому что титруемая кислотность
определяет не только фракцию свободной недиссоциированной
кислоты, но и половину фракции одновалентных ионов у двухос-
новных кислот.
Активная кислотность и щелочность вина обусловлены нали-
чием ионов и ОН~. Исходя из этого, С. Серенсен предложил
характеризовать кислотность и щелочность в биологических сре-
дах посредством pH, т. е. отрицательным логарифмом концентра-
ции водородных ионов,
164
Кислотность и щелочность определяются величиной, обозна-
ченной pH, причем РН=—Ig (H+)=Ig . Так, в кислом рас-
творе, в котором (Н+) равно 10~3, pH равно 3, а в нейтральном
растворе, где (Н+) равно 10-7, pH равно 7. По степени кислот-
ности сумма ионов (Н+) и ОН- меняется, только в нейтральной
точке она минимальная. Б этой точке число ионов Н+ равняется
числу ионов ОН~.
Сила кислоты характеризуется ее константой диссоциации и
обозначается буквой /С. ’Отрицательный логарифм константы дис-
социации обозначается рК. У сильных кислот рК — около 1, у
слабых — 3—6 и выше. Сильные кислоты, например соляная и
серная, нейтрализуются при pH 7,0, в то время как слабые кис-
лоты — в щелочной зоне. Уксусная кислота нейтрализуется при
pH 8,4.
По константам диссоциации органические кислоты, встречаю-
щиеся в виноградном сусле и вине, характеризуются следующи-
ми данными: винная 9,7-10~4, лимонная 8,2-10~4, яблочная
3,95-10-4, янтарная 6,65-10-5, молочная 1,4-10-4 и уксусная
1,8-5. Из этих данных видно, что наиболее сильными кислотами
являются винная и лимонная.
Активная кислотность зависит главным , образом от содержа-
ния в вине наиболее сильно диссоциированных кислот.
Органические кислоты в вине имеют важное значение для его
вкуса. Одни авторы считают, что вкусовая кислотность зависит
от концентрации водородных ионов, состава органических кислот,
от буферности, другие утверждают, что относительная вкусовая
кислотность больше зависит от молекулярных концентраций кис-
лот, чем от pH.
Некоторые органические кислоты имеют свой собственный ха-
рактерный вкус и аромат. Так, лимонная кислота придает вину
свежесть, янтарная кислота имеет необычный солено-горький
вкус, в то время как большое количество яблочной кислоты вы-
зывают зеленый привкус.
Т. Мунц считает, что яблочная кислота проявляет различные
вкусовые оттенки в зависимости от концентрации этанола, ду-
бильных кислот, сахаров, ароматических и минеральных веществ.
Путем количественного изменения соотношения .указанных ве-
ществ можно достичь во вкусе различной гармоничной кислот-
ности.
В создании буферности участвуют больше всего ионы калия,
наряду с ними в небольших количествах — ионы Са++, Mg++ и
Na+. В шампанских винах кислотная гармоничность регулирует-
ся количеством сахара и углекислоты.
Исследования Л. Усселио-Томасса (1963) показали, что до-
бавлением в вино кислотопонижающих веществ (К2СО3 и СаСО3)
и кислотоповышающих (винная кислота) нельзя добиться урегу-
лирования буферной силы. Установлено, что при понижении кис-
лотности дозами 2,58 г/л СаСО3 и 3,58 г/л К2СО3 pH вина повы-
165
шается от 2,98 до 3,98 и титруемая кислотность снижается от
13,57 до 12,41 г/л.
В низкокислотных винах из-за высокой буферной силы для
понижения pH требуются высокие дозы винной кислоты (в 2,5 ра- '
за превышающие рассчитанное количество минеральной кисло-
ты). Так, чтобы понизить pH от 3,8 до 3,3 в вино потребовалось
добавить 4,2 г/л винной кислоты. Это повысило титруемую кис-
лотность от 5,2 до 9,22 г/л, т. е. выше допускаемых норм.
В связи с этим интересно отметить, что значение pH буферной
смеси, которое как раз достигает порогового значения кислого
вкуса, лежит значительно выше (приблизительно pH 6), чем зна-
чение pH соответственно чистых растворов кислоты. Добавление
сахара к раствору кислот уменьшает кислый вкус. Известно так-
же, что соль может влиять на кислый вкус напитка. Этиловый
спирт значительнее уменьшает ощущение кислого вкуса вина, чем
сахара и соли.
Этиловый спирт подавляет диссоциацию кислот. Для осущест-
вления регулирования вкусовой кислотности вина рекомендуется
применять ионообменные смолы.
Продукты взаимодействия органических кислот со спиртами
(эфиры), а также продукты их распада (например, промежуточ-
ные продукты разложения винной кислоты) играют важную роль
в формировании органолептических свойств вина.
В виноделии известно, что качество вина зависит не только от
сорта винограда, почвенно-климатических условий, но и от биохи-
мических процессов, протекающих при технологии. Для получе-
ния качественной продукции важно установить время сбора ви-
нограда, при этом основными показателями зрелости являются
содержание сахара и кислотность.
Отношение количества сахара к общей кислотности, выражен*
ной в граммах на 1 л, называется глюкоацидометрическим пока-
зателем.
Н. Н. Простосердов считает, что глюкоацидометрический по-
казатель является индексом созревания винограда [69]. Он опре-
деляет время сбора винограда и указывает степень зрелости его,
необходимую для получения различных типов вин. Для приготов-
ления столовых сухих вин глюкоацидиметрический показатель
равен 25, для десертных 35, а для шампанских 20.
При повышении глюкоацидиметрического показателя, помимо
увеличения содержания сахара и уменьшения титруемой кислот-
ности, увеличивается также количество фенольных и азотистых
соединений (особенно белкового азота). При полной физиологи-
ческой зрелости содержание фенольных и белковых веществ
уменьшается.
Известно, что органические кислоты накапливаются в ягодах
винограда до момента, когда начинается налив ягоды и концен-
трация сахара заметно возрастает. При этом заметно уменьшает-
ся накопление органических кислот, титруемая кислотность резко
падает.
166
\ Изменение содержания органических кислот и сахаров в про-
цессе созревания винограда и в период алкогольного брожения
показано в табл. 18.
Из приведенных в табл. 18 данных видно, что при сбражива-
нии сусла с высокой титруемой кислотностью (11,25 г/л) по
окончании брожения наблюдается уменьшение кислотности до
9,9 г/л, при этом количество винной и яблочной кислот умень-
шается, а количество лимонной и янтарной кислот увеличивают-
ся. Наблюдается образование молочной кислоты, которая отсут-
ствует в винограде. Полученное вино при такой высокой кислот-
ности имело кислый привкус и было малогармоничным.
Вино, приготовленное из винограда технической зрелости, по
вкусу было мягче, гармоничнее предыдущего. Интересно отме-
тить, что при сбраживании сусла с более низкой кислотностью
(6,5 г/л) по окончании брожения кислотность увеличилась (до
7,5 г/л). Винные дрожжи как бы регулируют кислотность среды.
В сусле с высокой кислотностью содержится сравнительно
большое количество винной и яблочной кислот, которые придают
вину резкий вкус, называемый «зеленой кислотностью».
В процессе сбраживания содержание яблочной кислоты умень-
шается быстрее, чем винной. Вероятно, титруемая кислотность
уменьшается главным образом за счет яблочной кислоты, но все же
она остается еще достаточно высокой, чтобы придать вину при-
вкус зеленого винограда. Уменьшение винной кислоты обусловле-
но ее меньшей растворимостью в спиртовой среде, вследствие че-
го она частично выпадает в осадок. Содержание, лимонной и ян-
тарной кислот все время увеличивается, а щавелевой умень-
шается.
В процессе брожения содержание яблочной кислоты умень-
шается, количество лимонной увеличивается, однако эквивалент-
ного образования лимонной кислоты не наблюдается. Видимо, яб-
лочная кислота расходуется на окислительные процессы, особен-
но при аэробиозе.
Наши исследования показали, что особенно заметно количест-
во яблочной кислоты убывает при высокой кислотности сусла
(на 1,2 г/л), в то время как при низкой кислотности — всего на
0,5 г/л.
Молочная кислота в сусле с меньшей кислотностью появляет-
ся в гораздо большем количестве (0,550 г/л), чем в сусле с высо-
кой кислотностью (0,320 г/л). Она образуется при спиртовом
брожении из сахара и является побочным продуктом при нор-
мальном алкогольном брожении как в анаэробных, так и аэроб-
ных условиях. Молочная кислота может образовываться также и
из аминокислот, в частности из аланина, а также при яблочно-
молочнокислом брожении.
Нами было показано, что вкус вина зависит главным образом
от отношения винной кислоты к яблочной. При соотношениях
этих кислот около 2 и ниже вино получается негармоничным, с
кислым привкусом. Вино с лучшим вкусом и букетом получается
167
Таблица 18
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ (В Г/Л) В ПРОЦЕССЕ
БРОЖЕНИЯ И ФОРМИРОВАНИЯ ВИНА ИЗ ВИНОГРАДА СОРТА АЛИГОТЕ
Сусло и вино, при- готовленное при раз- личной кислотности рн Титруемая кислот- ность, г/л Винная Яблочная Отношение винной кислоты к яблочной Лимонная Янтарная Молочная Щавелевая Сахар, г/л Спирт (этанол), % об. Характеристика вина
Сусло, приготов- ленное при кислот- ности винограда 11,05 г/л 3,1 11,25 6,75 4,2 1,60 0,410 0,115 — 0,095 149,7 — —
Вино из этого сус- ла 3,2 9,9 6,05 3,0 2,72 0,450 0,550 0,320 0,055 ' 2,2 9,1 Малогармо- ничное
Сусло, приготов- ленное при кислот- ности винограда 8,7 г/л (техниче- ская зрелость) 3,2 8,7 5,2 2,3 2,3 0,510 0,100 0,045 165,0 -
Вино из этого сус- ла 3,3 7,6 4,5 1,5 3,0 0,550 0,600 0,350 0,040 1,8 9,6 Гармонич- ное
Сусло, приготов- ленное при кислот- ности винограда 6,5 г/л (физиологи- ческая зрелость) 3,3 6,6 4,3 1,60 2,7 0,350 0,090 0,035 210,0
Вино из этого сус- ла 3,3 7,5 4,2 1,40 3,0 0,860 _ 0,650 0,550 0,030 2,3 12,1 Гармонич- ное, с выра- женным вку- сом и буке- том
при отношении винной кислоты к яблочной 3 и выше. Несколько
иные данные были получены М. Амерайном [97]. Он рекомен-
дует собирать виноград при отношении винной кислоты к яблоч-
ной от 1,3 до 2,4.
Глава 14
ПРЕВРАЩЕНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
ПРИ БРОЖЕНИИ СУСЛА И ФОРМИРОВАНИИ ВИНА
Фенольные вещества различно влияют на органолептические
качества вина. Для столовых и красных кахетинских вин, а так-
же для виноматериалов, идущих на приготовление мадеры, необ-
ходимо большое количество фенольных соединений.
Для европейских столовых вин желательно иметь сусло с не-
большим содержанием дубильных и красящих веществ. Что ка-
сается шампанских виноматериалов, то здесь количество феноль-
ных соединений должно быть минимальным. Избыток дубильных
веществ придает вину терпкость. Для кахетинских вин — это
характерный признак высокого качества. Для шампанского терп-
кость является недостатком.
Исследование фенольных соединений в винограде и вине на-
чалось в последние 30 лет. Полученные сведения значительно
расширили представления о химическом составе и свойствах фе-
нольных соединений, носящих общее название «дубильные и кра-
сящие вещества». Результаты этих работ внесли новое в приемы
переработки винограда и способы получения вина высокого ка-
чества.
Влияние фенольных соединений на брожение
Небольшое содержание фенольных соединений (до 5 г/л) в
виноградном сусле, по данным С. В. Дурмишидзе [29], не оказы-
вает влияния на брожение, а большое их количество угнетает
развитие дрожжей и тормозит спиртовое брожение.
Исследования С. Фланзи показали, что большое количество
антоцианов в винограде, особенно в гибридных сортах, вызывает
прекращение размножения дрожжей и задерживает брожение.
Объясняется это тем, что они отлагаются на поверхности оболоч-
ки клетки, задерживая диффузию питательных веществ. По исте-
чении некоторого времени брожение окрашенного сусла возобнов-
ляется и доходит до конца. Показано также вредное влияние фе-
нольных кислот и альдегидов на рост и размножение дрожжей.
Исследования Г. Г. Валуйко [15] показали, что антоцианы в
количестве 300 мг/л и выше замедляют жизнедеятельность вин-
ных и даже пленчатых дрожжей. Наиболее сильное ингибирую-
щее действие оказывают пеонидин и его моноглюкозид, менее
сильное — мальвидин, дельфинидин и петунидин.
169
Превращение фенольных соединений при. формировании вина
Фенольные соединения сусла и вина вступают в реакцию с
белками и в виде танатов выпадают в осадок. Продукты окис-
ления фенольных соединений — хиноны — ступают в реакцию с
аминокислотами, в результате окислительного дезаминирования
образуются соответствующие альдегиды. Некоторые из них имеют
важное значение в формировании вкуса и букета вина.
С момента прессования винограда и до начала брожения в
сусле протекают окислительно-восстановительные процессы. В ре-
зультате ферментативных окислительных процессов фенольные
соединения окисляются и частично изменяется их химический со-
став. По данным А. Л. Курганова, наиболее способными к окис-
лению группировками полифенолов являются оксигруппы, кото-
рые в значительной степени определяют круг превращений. Окси-
группы, находящиеся в //г-положении (1, 3, 5) более устойчивы
к окислению и мало поддаются действию окислительных фермен-
тов. Наоборот, оксигруппы рядового (1, 2, 3) и о-(1,2)-положения
легко окисляются о-дифенолоксидазой и пероксидазой с образова-
нием хинонов и продуктов их глубокого окисления. Эти оксигруппы
способны медленно окисляться кислородом воздуха.
Фенольные соединения обладают также и антиоксидантными
свойствами. Это объясняется их способностью образовывать ком-
плексные соединения с ионами тяжелых металлов, в частности с
железом, и этим связывать ^активирующий окислительный агент.
В результате протекания ^ферментативных процессов катехи-
ны окисляются в хиноны, которые конденсируются с образована
ем димеров согласно теории А. Л. Курганова. При этом происхо-
дит уменьшение числа оксигрупп рядового расположения, что
связано с увеличением молекулярной массы в 2 раза.
Антоцианы окисляются значительно медленнее, чем катехины.
Объясняется это тем, что антоцианы представляют собой эфиры
полифенолов. Например, моноглюкозид энин является диметило-
вым эфиром дельфинидина, в котором два водорода гидроксиль-
ных групп замещены метилами. Такие эфиры окисляются гораздо
медленнее. А. Н. Бах еще в 1932 г. писал, что окисление пиро-
катехина сильно замедляется при замещении метилом хотя бы
одного гидроксильного водорода.
Наши исследования показали, что в момент раздавливания
винограда сок имеет сравнительно низкий редокспотенциал
(325,6 мВ), что связано с содержанием в винограде аскорби-
новой кислоты [76].
Превращение дубильных веществ при ферментации сусла про-
исходит ферментативно в .присутствии кислорода и неорганиче-
ских катализаторов в аэробных условиях. По мере его окисления
на воздухе редокспотенциал постепенно увеличивается и после
выдержки и аэробных условиях в течение 10—12 ч достигает
475 мВ. Этот окислительно-восстановительный потенциал харак-
терен для системы полифенол хинон,
170
Еще в 1950 г. нами было показано, что при прессовании вино-
града и отстаивании сусла до начала интенсивного брожения в
нем имеется мощная ферментативная окислительно-восстанови-
тельная система.
Скорость протекания ферментативного окисления сусла зави-
сит от следующих факторов: скорости и степени дробления вино-
града, прессования мезги, температуры, а также от условий и вре
мени настаивания на мезге и степени аэрации. Эти факторы в ос-
новном и обусловливают концентрацию фенольных веществ в
сусле.
При брожении сусла, особенно при интенсивном, и усиленном
выделении углекислоты окисления фенольных соединений не на-
блюдается. Наоборот, образующиеся в это время хиноны восста-
навливаются и их нельзя обнаружить химическим методом.
Для того чтобы выяснить, какие вещества восстанавливают
хиноны, мы определяли один из наиболее сильных в процессе бро-
жения восстановителей — глютатион. При выдержке сусла в
аэробных условиях в течение 12 ч полифенолы окисляются в хи-
ноны и накапливается их до 3,0 мг/л. Затем к этому суслу мы
добавляли винные дрожжи расы Кахури 7 и через определенные
интервалы определяли содержание хинонов и глютатиона, а так-
же редокспотенциал. До внесения дрожжей сусло содержало
2,8 г/л хинонов, редокспотенциал был равен 455,6 мВ.
Как и следовало ожидать, после внесения дрожжей наблюда-
лось заметное падение количества хинонов (до 1,5 г/л) и появле-
ние окисленного глютатиона, при этом редокспотенциал умень-
шился до 407,5 мВ. Когда сусло начало бродить, в нем не обна-
ружили ни хинонов, ни окисленного глютатиона, а редокспотен-
циал стал равен 215,7 мВ.
Цвет сусла изменился от интенсивно коричневого до светло-со-
ломенного.
Эти опыты убедительно показали, что при наличии хинонов в
сусле присутствует окисленный глютатион и как только хиноны
восстанавливаются, в среде появляется восстановленный глюта-
тион. Известно, что глютатион функционирует как переносчик во-
дорода в окислительно-восстановительных реакциях. Восстанов-
ленная его форма отдает два водорода и восстанавливает хиноны
в полифенолы, но после восстановления хинонов в бродящем сус-
ле появляется и восстановленный глютатион. Следует отметить,
что дрожжи содержат глютатионредуктазу, которая и восстанав-
ливает окисленный глютатион [52].
Наши исследования показали, что при брожении сусла ре-
докспотенциал уменьшается, редокспотенциал системы хинона
^полифенол значительно выше (699 мВ), а окислительно-восста-
новительный потенциал системы окисленный глютатион восста-
новленный глютатион гораздо ниже (40 мВ). Поэтому после вне-
сения дрожжей, содержащих восстановленный глютатион, он рас-
ходуется на восстановление хинонов. В процессе брожения дрож-
жевая глютатионредуктаза обратно восстанавливает окисленный
171
глютатион и он сохраняется в бродящем сусле, так как окисли-
тельные ферменты в процессе брожения инактивируются.
М. А. Бокучава, Г. Г. Валуйко и др. [13] изучали баланс фе-
нольных соединений в процессе спиртового брожения. Они пока-
зали, что из мезги в виноматериал переходит 82,1—84,3% фе-
нольных веществ. В процессе выдержки виноматериала на мезге
их содержание уменьшается на 27,5—28,9%. При этом степень
полимеризации значительно увеличивается. С. В. Дурмишидзе
[29] считает, что превращение фенольных веществ в основном
происходит в начале и в конце брожения при доступе кислорода.
Таким образом, в процессе брожения фенольные соединения
претерпевают большие изменения как в количественном, так и в
качественном отношении.
В конце брожения в сусле, как показал П. Дебуа [ПО], появ-
ляются летучие фенолы: о-крезол резорцин, n-крезол, фенольные
кислоты, шикимовая, феруловая и синаповая. Наряду с поли-
меризацией и осаждением фенольных веществ протекает их дест-
рукция и они под действием кислорода, окислительных фермен-
тов и дрожжей превращаются в более простые фенолы.
Следовательно, при приготовлении вин кахетинского типа
большое значение имеет брожение сусла на мезге. При этом в
вино переходят экстрактивные, фенольные, красящие, минераль-
ные и другие вещества. Эти вещества придают вину цвет, полно-
ту, терпкость, разнообразие оттенков аромата, свойственных ка-
хетинским винам.
Связывание дубильных и красящих веществ
уксусным альдегидом
При алкогольном брожении в связи с повышением спиртуоз-
ности среды увеличивается экстракция дубильных и красящих ве-
ществ, и количество их заметно увеличивается. Образующийся
уксусный альдегид связывает антоцианы, которые выпадают в
осадок.
Исследования X. Берга показали, что в ходе брожения окра-
шенного сусла происходит снижение количества антоцианов на
40%. Максимум снижения бывает в начале и конце брожения
(при спиртуозности 3—9—12% об.). В середине брожения содер-
жание антоцианов почти не изменяется. Уменьшение количества
антоцианов происходит главным образом за счет конденсации ук-
сусного альдегида с красящими веществами.
Осаждение антоцианов уксусным альдегидом впервые наблю-
дал М. Трилант. Этот процесс происходит и без доступа кислоро-
да. П. Н. Унгурян считает, что альдегиды и ацетали образуют
нерастворимые соединения с антоцианами вина. Г. Г. Валуйко на
модельных опытах показал, что при внесении уксусного альдеги-
да в красное вино дубильные и красящие вещества быстро осаж-
даются, при этом удаляется только определенная фракция [15].
С. В. Дурмишидзе считает, что соединения уксусного альдегида
172
с красящими веществами вина обладают различной раствори-
мостью в зависимости от степени окисления этих фенолов [29].
Введение сернистой кислоты при раздавливании винограда [29]
все же несколько увеличивает интенсивность окраски сусла, так
как при этом происходит разрушение клеточной структуры ягод
и выделение из них антоцианов, хотя сернистая кислота несколь-
ко обесцвечивает окраску сусла вследствие связывания антоциа-
нов.
Реакция обесцвечивания антоцианов сернистой кислотой про-
текает по следующей схеме [105]:
Образующееся при этом соединение антоцианов с SO2 нестой-
ко. Образующийся в процессе брожения уксусный альдегид свя-
зывает сернистую кислоту, и окраска восстанавливается.
Дубильные и красящие вещества связывают небольшое коли-
чество уксусного альдегида, поэтому он может служить акцепто-
ром водорода. Место уксусного альдегида занимает 3-фосфогли-
цериновый альдегид, который восстанавливается НАД-Н2 в гли-
церин, поэтому в кахетинских винах значительно больше глице-
рина, чем в других.
Одновременно с извлечением красящих и дубильных веществ
в процессе брожения сусла на мезге происходит и их выделение
из вина в виде осадков. С. В. Дурмишидзе считает, что осажде-
ние красящих веществ — прежде всего явление коллоидальное и
не зависит от присутствия кислорода. В сусле и вине антоцианы
находятся преимущественно в растворенном состоянии, но они
легко адсорбируются на коллоидных частицах и осаждаются
вместе с коллоидами.
Ферментативное и неферментативное окисление
антоцианов
Часть антоцианов, находящихся в растворенном состоянии,
подвергается действию кислорода, конденсируется и выпадает в
осадок при выдержке. Здесь играют роль и альдегиды, которые
конденсируются с антоцианами и превращаются в лейкоформу.
Однако основной путь осаждения антоцианов — это окисление.
В сусле антоцианы и таниды окисляются ферментативным путем
под действием о-дифенолоксидазы и пероксидазы.
Из грибов Aspergilus niger, Oryzae fumigatus и Penicilium ja-
vanicum был выделен фермент антоцианаза, катализирующий
окисление антоцианов. В вине же эти процессы протекают ауто-
оксидабельно или посредством неорганических катализаторов.
173
ж. Карл с сотрудниками (1961) считает, что при разложении
антоцианов микроорганизмами (при хранении виноматериала)
главными продуктами являются флороглюцин, галловая кислота,
пирокатеховая, уксусная и муравьиная кислоты, метиловый спирт
и углекислота. Продукты полного окисления красящих и дубиль-
ных веществ горькие, и, возможно, именно они вызывают прогор-
кание вина.
Е. Байер и К. Вегман (1957) наблюдали, что сок из листьев
Coleus Hybridus в присутствии кислорода превращает антоцианы
в желтоокрашенные продукты. Фермент, катализирующий этот
окислительный процесс, назвали цианиноксидазой. Он действует
при pH 7,0—7,5 на антоцианы, содержащие два гидроксила, при-
чем метаоксипроизводные не окисляются. Окислительное дейст-
вие цианиноксидазы прекращается ингибиторами, которые яв-
ляются типичными для о-дифенолоксидазы, содержащей в про-
стетической группе медь. Активность цианиноксидазы теряется
при длительном диализе, добавление пирокатехина реактивирует
фермент.
На основании этих исследований авторы приходят к заключе-
нию, что цианиноксидаза представляет собой ферментный комп-
лекс из о-дифенолоксидазы и активирующего ее о-дифенола, по-
добного пирокатехину.
Е. Байер и К. Вегман приготовили модель, состоящую из
о-дифенолоксидазы и пирокатехина, окисляющих антоцианы, как
в соке, выделяемом из листьев Coleus Hybridus.
Пленчатые дрожжи также окисляют красящие и дубильные
вещества вина. Так, например, за 6 месяцев инкубации в крас-
ном вине они разрушили от 174,4 до 3,3 мг/л антоцианов, а со-
держание дубильных веществ за три месяца стало вместо 640
240 мг/л. В результате этих превращений фенольных соединений
цвет и вкус вина резко изменился (П. В. Ивлева, 1967).
При окислительном распаде антоциана мальвидина, содержа-
щегося в винах, приготовленных из гибридов прямых производи-
телей, образуется флуоресцирующий пигмент неизвестного строе-
ния. Он найден в вине в значительном количестве при годовой
выдержке. В естественных условиях этот процесс может иметь
место вследствие действия перекиси водорода, возникшей при
окислении аскорбиновой кислоты.
При выдержке и старении вина количество антоцианов сильно
уменьшается.
Ингибирование окислительных ферментов
при сбраживании сусла
Наши исследования показали, что в процессе алкогольного
брожения активность о-дифенолоксидазы, пероксидазы и катала-
зы постепенно уменьшается и при интенсивном брожении они
полностью инактивируются [75].
174
Экспериментально мы доказали, что винные дрожжи действи-
тельно адсорбируют около 20% о-дифенолоксидазы, остальные
80% инактивируются в процессе брожения.
Ингибирование окислительных ферментов наблюдал и
С. В. Дурмишидзе, который объяснил это тем, что ткани расте-
ний и дрожжевые клетки частично их адсорбируют.
Дальнейшие исследования показали, что в процессе алкоголь-
ного брожения дрожжи выделяют восстанавливающие вещества
(цистеин и глютатион), которые инактивируют окислительные
ферменты (М. Пауль и др., 1969).
При добавлении к виноградному соку цистина и глютатиона
наблюдается торможение активности о-дифенолоксидазы и через
10—15 ч инактивирование достигает 70% [76]. Впоследствии вы-
яснилось, что сульфидгидрильные группы, которые содержатся в
цистеине и глютатионе, связывают тяжелые металлы (железо и
медь), входящие в простетическую группу фермента, вследствие
чего о-дифенолоксидаза, пероксидаза и каталаза инактивируют-
ся. Реакция между SH-группой и тяжелыми металлами проте-
кает очень медленно, поэтому для связывания металлов требует-
ся время. М. Пауль и Дж. Ьалрадт подтвердили наши данные.
Применение детергентов и гельфильтрации через сефадекс по-
зволяет выделить окислительные ферменты из вина в чистом ви-
де и восстановить их активность.
Таким образом, окислительные ферменты из винд не исче-
зают, а находятся в инактивированном состоянии ~и их можно
снова активировать.
Инактивирование окислительных ферментов благоприятно
влияет на качество вин европейского типа и на шампанское. Что
касается кахетинских вин и мадеры, то в них присутствие окис-
лительных ферментов необходимо. Поэтому брожение проводят
на мезге. При этом в бродящем сусле ферменты инактивируются,
а на твердых частях грозди остаются активными, за исключе-
нием каталазы, которая инактивируется полностью. Инактивация
этого фермента способствует усилению окислительных процессов,
так как при этом не происходит разложения перекиси водорода,
образованной при действии флавиновых ферментов (гликолаток-
сидаза, глюкозооксидаза и др.).
Исследования С. В. Дурмишидзе [29] показали, что при бро-
жении сусла на мезге, которая погружена в бродящее сусло, пе-
роксидаза может действовать за счет ранее образованных пере-
кисей. В том случае, когда мезга всплывает на поверхность и со-
прикасается с воздухом, продолжает действовать и о-дифенолок-
сидаза. Адсорбированные на поверхности твердых частиц мезги
окислительные ферменты остаются активными.
Таким образом, при проведении брожения сусла на мезге и
долгой выдержке окислительные ферменты остаются активными
и окислительные процессы продолжаются.
Благодаря этому вина, приготовленные кахетинским способом,
быстрее созревают.
175
Изменение редокспотенциала при брожении сусла
В момент отжатия винограда в бескислородной среде редок-
спотенциал сусла равен примерно 280 мВ, в присутствии кисло-
рода воздуха он бывает 320, а при раздавливании винограда в
аэробных условиях и выдержке в течение нескольких часов до-
стигает 400 мВ и больше. Повышение редокспотенциала объяс-
няется тем, что под действием о-дифенолоксидазы катехины
окисляются в хиноны и при этом образуется окислительно-вос-
становительная система с редокспотенциалом 699 мВ.
Величина редокспотенциала зависит от способа приготовления
сусла. Так, при прессовании винограда в корзиночных гидравли-
ческих или пневматических процессах (получение сусла по шам-
панскому способу) редокспотенциал колеблется от 355 до 388 мВ,
а после измельчения на дробилке и прессования редокспотенциал
сусла равен 388—405 мВ; при пропускании мезги через пресс не-
прерывного действия редокспотенциал поднимается до 500 мВ.
Такое сусло богато фенольными веществами и пригодно для
приготовления виноматериалов, идущих на мадеру.
Растворение кислорода воздуха в сусле зависит также от спо-
соба приготовления. Чем продолжительнее виноград прессуется и
чем дольше мезга с суслом находится в соприкосновении с воз-
духом, тем больше оно поглощает кислорода. Так, 1 л сусла,
приготовленного по шампанскому способу, поглощает до 3,9 мг,
по способу столового виноделия — до 5,5 мг, а для мадеры — до
7,9 мг/л кислорода.
Окислительные процессы особенно усиливаются в присутствии
тяжелых металлов, поэтому при раздавливании мезги винтовым
корзиночным прессом отмечался всегда высокий редокспотен-
циал.
Исследования, проведенные нами, показали, что в начале бро-
жения сусла в бочках (или крупных резервуарах) наблюдается
быстрое падение величины редокспотенциала с одновременным
уменьшением количества растворенного кислорода. Это зависит
главным образом от логарифмической фазы размножения дрож-
жей и от температуры. На этой стадии развития дрожжей про-
исходит максимальное потребление ими растворенного кислоро-
да, редокспотенциал уменьшается с 479 до 216 мВ, что связано
с быстрым размножением дрожжевых клеток и выделением вос-
станавливающих веществ (глютатиона и цистеина).
В процессе брожения редокспотенциал все время уменьшает-
ся и при интенсивном брожении доходит до 135,5 мВ. Затем он
начинает возрастать и концу брожения достигает 255,6 мВ.
При брожении сусла в герметически закрытых сосудах ре-
докспотенциал был 65,2 мВ. А между тем М. Джослин (1947)
наблюдал падение величины редокспотенциала при брожении в
бочках до — 10 мВ.
По данным Ж. Риберо-Гайона (1953), редокспотенциал во
время брожения при 30° С не падал ниже 100 мВ, в то время как
176
при температуре 20°С он был 160 мВ. Мы наблюдали уменьше-
ние величины редокспотенциала сульфитированного сусла до
135 мВ. По данным И. Коха (1958), при брожении сусла с аскор-
биновой и сернистой кислотами редокспотенциал несколько сни-
жался и вино получалось лучшего качества, чем контрольное.
Для виноделия важно установить, при каких условиях надо
проводить брожение, чтобы получить высококачественное вино.
Наши исследования показали, что количество кислорода около
4,0 мг/л вполне достаточно для нормального брожения. Ж. Рибе-
ро-Гайон и Е. Пейно наблюдали, что введение небольшого коли-
чества кислорода в процессе брожения сусла не усиливает роста
и размножения дрожжей. Брожение протекало нормально и без
введения кислорода.
Мы показали еще в 1948 г., что при проведении брожения в
анаэробных условиях вино получается более гармоничным и аро-
матным, чем в аэробных условиях.
Глава 15
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ И ИХ РОЛЬ
В ВИНОДЕЛИИ
Липиды — группа органических соединений, в которой объе-
динены различные по своей химической природе вещества.
.Липиды относятся к органическим веществам, которые нерас-
творимы в воде, но растворимы в жирорастворителях (эфире,
хлороформе, бензоле, спиртах, ацетоне и т. д.). Следует указать,
что некоторые липиды неодинаково растворяются в разных орга-
нических растворителях и на этом основано их разделение для
изучения химического состава.
Для отделения нейтральных липидов от фосфолипидов внача-
ле растворяют все липиды в эфире, а затем добавляют ацетон,
при этом фосфолипиды выпадают в осадок. Для более глубоких
исследований химической природы липидов пользуются методом
экстракции по Фолча и др., разделением липидных экстрактов на
отдельные фракции тонкослойной хроматографией, а также газо-
жидкостной хроматографией и масс-спектроскопией.
Одни авторы делят липиды на простые и сложные, омыляе-
мые и неомыляемые группы. Другие считают целесообразным де-
ление липидов на три класса: простые, сложные и их производ-
ные. к простым липидам относятся нейтральные жиры и воска, к
сложным — фосфолипиды, сульфолипиды, к производным — жир-
ные кислоты, высшие спирты, углеводороды и жирорастворимые
витамины D, Е и К. Существует и четвертый класс липидов, пред-
ставляющий собой комплекс липидов с белками, углеводами и
другими органическими соединениями. Этот класс соединений
имеет биохимическое и физиологическое значение в функциональ-
ной деятельности ферментных систем.
7—993
177
Особый интерес в виноделии представляют производные липи-
дов. Это жирные кислоты и их эфиры. На химические и физиче-
ские свойства липидов влияет состав жирных кислот, который
можно разделить на группы: насыщенные и ненасыщенные; по-
следние делятся на соединения с одной двойной связью (моноос-
новные), насыщенные с двойными связями (диеновые), ненасы-
щенные с тремя и более двойными связями (полиеновые).
Липиды дрожжей
В липиды дрожжей из насыщенных жирных кислот в основ-
ном входят пальмитиновая и стеариновая. Помимо этих кислот,
дрожжи содержат соединения с углеродной цепью от С4 до Ci8.
При культивировании дрожжей в определенных условиях могут
образоваться жирные кислоты с нечетным числом углеродных
атомов. Жирные кислоты с разветвленной цепью у дрожжей не об-
наружены.
Ненасыщенные жирные кислоты делят на несколько подгрупп:
олефиновые кислоты в свою очередь делятся на жирные кислоты
олеинового и полиолефинового ряда. Олефиновые кислоты обла-
дают двумя пространственными конфигурациями молекул: цис- и
транс-изомерии. При наличии нескольких двойных связей в одной
кислоте могут быть пространственные изомеры смешанного типа.
Так, например, одни двойные связи соответствуют цис-, а другие
транс-форме.
Липиды дрожжей, в которые входят полиолефиновые кисло-
ты, обычно имеют ^нс-конфигурацию. К этим кислотам относят-
ся линолевая и линоленовая кислоты. В них содержатся изоли-
рованные этиленовые двойные связи, как, например, —CH —СН—
—СН2—СН = СН—. Линолевая кислота по структуре является
цис-12,13-октадека диеновой кислотой, имеет две изолированные
связи в цнс-конфигурации; линоленовая — 9,12,15-октадекатрие-
новой кислотой, имеет изолированные связи в цис-конфигурации.
Особый интерес представляет р-каротин, который входит в
группу углеводородов, так называемых каротиноидов. В дрожжах
были обнаружены а-каротин, p-каротин, фитофлуин, фитоин и др.
Биологическая роль каротиноидов зависит от р-ионового коль-
ца при определенной длине углеродной цепи, имеющей не менее
пяти конъюгированных двойных связей. При распаде р-каротина
образуется р-ионон, который участвует в образовании аромата
вина.
Биологическая роль липидов
Раньше считали, что липиды, особенно нейтральные липиды,
представляют собой как бы запасной энергетический материал,
который можно заменить другими калорийными веществами.
Первыми исследованиями, проведенными Д. Бурром в 1929 г.,
установлено, что липиды являются физиологически активными
178
веществами, необходимыми для живого организма. К этим веще-
ствам относятся полинепредельные жирные кислоты, такие, как
линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты.
X. Томсоном (1955) было показано, что биологической актив-
ностью обладают непредельные жирные кислоты, которые содер-
жат две двойные связи в 6-м и 7-м, а также в 9-м и 10-м поло-
жении, считая от СН3-группировки.
В. Нордгейм в 1965 г. исследовал физиологические свойства
дрожжей Sacch. carlsbergensis и показал, что при длительном
анаэробном культивировании в дрожжевых клетках наступает
аноксибиотический анабиоз, дрожжевые клетки теряют способ-
ность размножаться, а также теряют бродильные свойства. Что-
бы восстановить их способность к размножению и к бродильной
способности, необходимо добавить к культуральной жидкости не-
насыщенные жирные кислоты, фосфатиды и каротиноиды. При-
сутствие ненасыщенных жирных кислот в липидах делает их био-
логически активными соединениями. Из ненасыщенных жирных
кислот в основном обнаружены линолеат, у-линолеат, арахидонат.
В дрожжевой клетке липиды находятся в свободном состоя-
нии или в виде комплексов, хорошо видных под микроскопом;
связанные в комплексы липиды играют важную роль в биологи-
ческих функциях.
Исследования Н. С. Гельман, М. А. Лукьяновой и Д. Н. Ост-
ровского (1966) показали, что основная роль липидов заключает-
ся в том, что они связаны со строением и функцией дыхательной
цепи в митохондриальных мембранах. При удалении липидов пу-
тем экстракции происходит ингибирование дыхательной цепи.
При внесении липидов активность дыхательной цепи вновь вос-
станавливается.
В дрожжевой клетке содержится около 30% липидов. Липи-
ды, входящие в мембраны митохондрий, почти целиком состоят
из фосфолипидов.
Работами Д. Грина в 1961 г. было показано, что проводника-
ми электронов также являются липиды митохондриальных мем-
бран, которые содержат два подвижных окислительно-восстано-
вительных агента, например коэнзим Q и цитохром С. Последний
является водорастворимым белком, легко реагирует с липидами
и образует жирорастворимый комплекс. Ненасыщенные жирные
кислоты в митохондриях активируют аденозинтрифосфатазу, что
способствует быстрому расщеплению АТФ и образованию более
высокой концентрации АДФ и неорганического фосфата. Послед-
ний активирует глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу и повы-
шает интенсивность брожения.
Липиды, входящие в дрожжевую клеточную мембрану, играют
большую роль в клеточной проницаемости оболочки. Обработка
дрожжевых клеток органическими растворителями увеличивает
их проницаемость.
При неблагоприятных условиях культивирования дрожжей на-
блюдается усиление накопления жиров, особенно при облучении
7* 179
рентгеном. В этом случае в дрожжевой клетке образуется замет-
ное количество легкоокисляемых липидов. Исходя из этого, мож-
но предположить, что липиды могут регулировать окислительно-
восстановительный режим в дрожжевой клетке и повышать ее
устойчивость к лучевым повреждениям. Интересно отметить, что
положительное влияние на радиоустойчивость оказывают нена-
сыщенные жирные кислоты, которые, легко окисляясь, могут пре-
дохранять от окисления компоненты дрожжевой клетки.
Таким образом, можно заключить, что липиды играют важную
биологическую роль в жизнедеятельности дрожжей. Они участ-
вуют в регулировании окислительно-восстановительных процессов
при дыхании; входят в состав как митохондрий, так й микросом;
с белками образуют липопротеидный комплекс, входящий в со-
став протоплазмы. Липопротеидные и липонуклеопротеидные
комплексы участвуют в ферментативных процессах, связанных с
брожением виноградного сусла и в образовании вина.
Ферменты, осуществляющие синтез и гидролиз липидов, мож-
но разделить на несколько групп: ферменты синтеза нейтральных
липидов, ферменты синтеза фосфолипидов, ферменты синтеза ли-
пидоподобных веществ (стериды и стероиды) и ферменты, вызы-
вающие гидролиз эфирных связей в липидах.
Основные пути метаболизма липидов в живых организмах хо-
рошо изучены А. Гринбергом (1962), который показал механизм
их биосинтеза. Однако сведения, касающиеся метаболизма липи-
дов в дрожжевой клетке, ограничены. Б последнее время прове-
дены исследования Ф. Линеном [132], К. Гунтером и А. Розе
(1971) и другими исследователями, показавшими главные пути
биосинтеза и распада липидов.
Биосинтез липидов
Основные пути метаболизма липидов микроорганизмами до-
вольно хорошо изучены. Исследования, проведенные А. Гринбер-
гом и опубликованные в 1968 г., представляют собой основную
информацию об этих путях. Однако данные, касающиеся дрож-
жей, ограничены, поэтому мы приведем общий взгляд на пути
синтеза и распада липидов в дрожжах.
Исследования, проведенные с помощью 1-С14, показали, что
некоторые фракции митохондрий дрожжевых клеток способны
синтезировать различные классы липидов. Именно в митохонд-
риях и происходят основные процессы, например цикл трикарбок-
сильных кислот, окислительное фосфорилирование и цитохромные
изменения.
Значительную роль в синтезе липидов играют и микросомы
дрожжевой клетки.
Исследования Ф. Линена [132] показали, что образование
жирных кислот осуществляется цитоплазматическим ферментным
комплексом, а исходным субстратом при синтезе служит ацетил-
КоА.
180
Лимитирующей стадией биосинтеза жирных кислот является
ацетил — КоА-карбоксилазная реакция, в результате которой из
ацетил-КоА при участии АТФ под действием фермента образует-
ся малонил — КоА. Удлинение цепи жирных кислот при их био-
синтезе происходит за счет приращения ацетильных остатков —
малонил — S-АПБ (ацетилпереносящий белок) к карбоксильной
группе ацетил — S-АПБ. Так, при образовании одной молекулы
пальмитиновой кислоты взаимодействуют одна молекула активи-
рованного ацетила и семь молекул активированного малонила.
Как показали исследования Линена [132] и др., синтез жир-
ных кислот с длинной цепью осуществляется дрожжами с помо-
щью устойчивого мультиэнзимного комплекса (с молекулярной
массой 2,ЗХЮ6) в присутствии ацетил-коэнзима и малонил-КоА
согласно реакции
Ацетил КоА + п (малонил '-КоА) 4- 2 п (НАДР • Н2) 4- 2 п
->СН3—(СН2—CH2)/z—С—S—КоА +2п НАДР++« KoASH-hn Н7О.
li
О
Дж. Ступс изолировал из высокоактивных дрожжей синтетазу
жирных кислот в присутствии ингибитора протеаз. Ингибитор он
применил для выделения нативного энзима, и этим исключил воз-
можность деградации белковой молекулы энзима. С помощью
электрофореза на полиакриламидном геле было показано, что
выделенный энзим дает два пятна, молекулярная масса которых
соответствует 212 000 и 203 000D.
М. В. Залешко и Г. А. Салохина [39] показали, что дрожжи
как продуценты липидов в большей степени определяются соста-
вом жирных кислот. Присутствие в липидах дрожжей значитель-
ного количества ненасыщенных жирных кислот свидетельствует
о том, что липиды дрожжей имеют сходство с растительными ли-
пидами, причем в них доминируют триглицериды (до 80%). Они
содержат также моно- и диглицериды, фосфолипиды, стерины и
их эфиры.
Образование липидов дрожжами в значительной степени зави-
сит от дыхательной активности. Следует отметить, что интенсив-
ность аэрации оказывает положительное влияние только до опре-
деленного предела, после чего излишняя аэрация даже вредно
сказывается на синтезе липидов. Дрожжи, культивируемые при
недостаточной аэрации среды, синтезируют значительное количе-
ство свободных жирных кислот, фосфолипидов и сравнительно
мало образуют триглицеридов. При аэрации среды содержание
ненасыщенных липидов возрастает.
Влияние температуры выращивания, pH среды и интенсивно-
сти аэрации существенно отражается на способности энзимов син-
тезировать липиды. По существу, эти факторы в известной степе-
ни управляют синтезом липидов.
Как показали исследования В. В. Залешко и Г. А. Салохиной
[39], некоторые расы дрожжей способны образовывать наряду с
интрацеллюлярными и экстрацеллюлярные липиды. Свойством
181
дрожжей синтезировать экзолипиды обладают почти все виды
дрожжей. Синтез экзолипидов протекает в периплазматическом
пространстве клеток, а затем эти Липиды выделяются в окружаю-
щую среду.
Роль липидов в виноделии
С. П. Авакянц [3] исследовал состав липидов винных дрож-
жей и вина в процессе алкогольного брожения и при выдержке.
Было показано, что в состав липидов входят шесть фракций:
моно-, ди- и триглицериды, фосфоглицериды, свободные жирные
кислоты и стеролы. Из липидов в дрожжах превалируют фосфо-
глицериды. Примерно такой же состав липидов и в вине, т. е.
дрожжи обогащают вино жирными кислотами.
В состав липидов винных дрожжей и вина входят от Ci2 до
С24 углеродных атомов жирных кислот, причем на долю насы-
щенных жирных кислот приходится 39—55%, а на долю ненасы-
щенных 45—61%. В ненасыщенных жирных кислотах содержится
30—59% моноеновых, 1—10% диеновых и 1—9% полиеновых
кислот. Главными жирными кислотами в дрожжах и винах яв-
ляются пальмитиновая, пальмитолеиновая, стеариновая, олеино-
вая.
С. П. Авакянц изучал также превращение липидов в процессе
вторичного брожения при шампанизации. Было установлено, что
содержание липидов в дрожжевых клетках уменьшается, а в вине
значительно увеличивается. К концу брожения в шампанизиро-
ванном вине количество липидов увеличивается в 4 раза по сравт
нению с исходным.
В -процессе брожения изменяется и качественный состав высо-
комолекулярных жирных кислот: количество ненасыщенных жир-
ных кислот увеличивается, а насыщенных уменьшается.
При выдержке на дрожжах в анаэробных условиях содержа-
ние насыщенных жирных кислот уменьшается, а количество не-
насыщенных (диеновых и полиеновых) значительно увеличи-
вается.
И. А. Егоров, А. К. Родопуло и Р. X. Егофарова [34] изучали
химический состав липидов винных дрожжей методом тонкослой-
ной хроматографии. Установлено, что в состав липидов входят
лецитин, цереброзид, пальмитиновая кислота, стеариновая кисло-
та, трипальмитат, тристеарат, пальмитоксидиглицерид и несколь-
ко неидентифицированных веществ.
Методом газожидкостной хроматографии в составе липидов
были обнаружены сложные эфиры жирных кислот: гексилкапро-
нат, этиллаурат, изоамилпеларгонат, гексилкаприлат, |3-фенил-
этилкапронат, этилпальмитат, гексиллаурат, изоамилмиристат,
гексилмиристат, этиллинолеат.
В работах Н. А. Мехузла и др. [60], а также Р. И. Размадзе,
Н. И. Бурьян, Б. А. Филиппова [71] была показана корреляцион-
ная зависимость между содержанием липидов и физико-химиче-
скими свойствами вина. Ими отмечено также, что при нараста-
182
нии количества липидов при выдержке тиражированного кюве на
дрожжах игристые и пенистые свойства шампанского значитель-
но усиливаются. Высокомолекулярные насыщенные жирные кис-
лоты, их глицериды и другие липиды при выдержке вина выпа-
дают в осадок.
А. В. Богатский и др. [10] показали, что липиды являются
антиоксидантами вина.
Исследования [34, 81] показали, что этиловые эфиры линоле-
вой и линоленовой кислот улучшают букет и вкус шампанского.
При этом появляется подсолнечный тон.
Р. И. Размадзе, Н. И. Бурьян и Б. А. Филиппов [71] также
показали, что шампанское, сброженное на селекционированных
расах дрожжей, содержит больше липидов и качество вина зна-
чительно лучше, чем сброженного на производственных расах.
Глава 16
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ И РАС ДРОЖЖЕЙ
НА ОБРАЗОВАНИЕ БУКЕТОБРАЗУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ
Развитие тонкого букета и вкуса вина зависит не только от сорта вино-
града, условий его произрастания, технологии вина, но и от вида и штамма
винных дрожжей.
За последнее время многими исследователями было показано, что неко-
торые виды и штаммы дрожжей способны синтезировать ароматобразующие
вещества.
Н. М. Сисакян наблюдал, что при перегонке коньячных виноматериалов
с хересными дрожжами получается коньячный спирт с более богатым содер-
жанием веществ, создающих аромат, чем коньячный спирт, полученный обыч-
ным способом.
Исследования, проведенные нами [61] с хлебными, винными и хересными
дрожжами, показали, что при перегонке виноматериала с хересными дрожжами
получается коньячный спирт, более богатый спиртами, альдегидами, а также
энантовым эфиром.
X. Суомалайнен и др. [172] также показал, что при дистилляции вина
с дрожжами Sacch. cerevisiae содержание изоамилацетата, этилакапроната,
этилкаприлата, этилкаприната и этиллаурата гораздо больше, чем в контрольном
образце.
Образование ароматобразующих веществ дрожжей
И. А. Егоров, А. К. Родопуло и Р. X. Егофарова [34] изучали образова-
ние и накопление сложных эфиров, спиртов, а также терпеноидных соеди-
нений при разном возрасте винных дрожжей. Показано, что в 5-суточной куль-
туре гораздо больше ароматобразующих веществ, чем в 2-суточной. Для
выделения ароматобразующих веществ пользовались методом В. И. Любимова
и Н. Н. Львова, заключающимся в том, что дрожжи подвергали прессованию
под давлением до 15-10~9 МПа при —70° С. Раздробленные дрожжи экстра-
гировали пентаном и диэтиловым эфиром и анализировали ароматобразующие
вещества в газожидкостном хроматографе. Результаты анализов приведены
в табл. 19.
Дрожжи вида Sacch. vini содержат 40 и более ароматобразующих ком-
понентов общей массой 37,68 мг на 1 кг сырых дрожжей. Из этого количества
алифатические спирты составляют 67,8, сложные эфиры 13,40, терпеноиды
16,0 мг на 1 кг сырых дрожжей.
183
Таблица 19
СОДЕРЖАНИЕ СПИРТОВ, ЭФИРОВ И ТЕРПЕНОИДОВ В ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКЕ
№ п/п Компонент Количество, мг/кг № п/п Компонент Количество, мг/кг
1 Уксусный альдегид 1,44 22 Гексилкапронат 0,08
2 Пропионовый альде- 1,00 23 Изоамилпеларгонат 0,12
гид 24 Неизвестный +
3 Этилформиат 1,06 25 Гексилкапронат 0,11
4 Этилацетат 1,Н 26 р-Фенилэтанолкапро- 0,72
5 Этанол 2,30 нат
6 Изопропанол 3,00 27 Р-Ионон 0,03
7 Пропилацетат 0,58 28 Диэтилмалат 0,40
8 Этилизобутират 0,06 29 Уксусная кислота 0,08
9 Пропанол 0,7 30 Этилпальмитат 0,56
10 Изобутанол 0,18 31 Изобутилмиристат 0,56
11 Бутанол 0,23 32 Гексиллаурат 0,1
12 Изопентанол 0,84 33 Неизвестный +
13 н-пентанол 0,16 34 Этилстеарат 0,11
14 Изоамилбутират 0,32 35 Изоамилмиристат 0,08
15 Гептанол 0,55 36 Днс-фарнезол 7,08
16 Этилкаприлат 0,57 37 Транс-фарнезол 9,00
17 Этиллактат 0,97 38 Гексилмиристат 0,90
18 Этилсукцинат 0,22 39 Этиллинолеат 5,30
19 Изобутиллактат 0,08 40-41 Неизвестный +
20 Изоамиллактат 0,03
21 Нонилацетат 0,04
В дрожжах найдены высококипящие сложные эфиры жирных- кислот —
этиллинолеат, этилмиристат, этилстеарат, этилпальмитат, а из терпеноидов —
Р-ионон. Цис- и транс-фарнезол найдены впервые. Многие ученые исследовали
влияние различных рас дрожжей на образование эфиров, спиртов, жирных кис-
лот и других соединений при сбраживании сахара и аминокислот.
Нами совместно с Н. М. Сисакяном, И. А. Егоровым и Н. Г. Саришвили
показано, что винные дрожжи способны из аланина, а затем из валина, син-
тезировать этанол, пропанол, изобутанол, изопентанол; из фенилаланина, ти-
розина, триптофана и гистидина — соответствующие спирты (1907—1909 гг.,
Эрлих). Однако наши исследования показали, что, помимо р-фенилэтанола,
тирозола, триптофана и гистидола, винные дрожжи из ароматических и гете-
роциклических аминокислот образуют еще н-пропанол, изобутанол и изопен-
танол.
И. Парк и А. Бертран [145] наблюдали, что большие количества эфиров,
главным образом этилацетата и этиловых эфиров высших жирных кислот,
синтезируют дрожжи Sacch. cerevisiae. Hanseni aspora образует очень мало эфи-
ров, за исключением этилацетата.
Sacch. ludwisii продуцируют значительное количество н-бутанола, этилбу-
тирата и этилпропионата;
Р. kluyveri и Н. anomalia в анаэробных условиях образуют большие
количества этилацетата, этилпропионата, этилметил-2-пропионата и метилбу-
тилацетата.
Torulopsis, Nadsona и Candida . синтезируют незначительное количество
эфиров. В анаэробных условиях количество эфиров возрастает, за исключе-
нием этилацетата. Эти авторы считают, что во время алкогольного брожения
эфиры образуются независимо от того, присутствует или отсутствует в среде
184
соответствующая кислота и синтез каждого эфира осуществляется специфи-
ческой ферментной системой. В различных системах брожения не наблюдается
корреляционной зависимости между образующимися эфирами и накоплением
биомассы (К. Нордстром, 1968).
В. Шпонхольц и X. Дитрих показали, что Hansenula anomala и Candida
Krusei образуют больше этилацетата, чем Sacch. cerevisiae. Парфеи и др.
сообщали, что Hansenula anomala и Candida Krusei продуцируют меньше эти-
ловых ЭфИрОВ ЖИрНЫХ КИСЛОТ С8—С12-
Л. Никаанен и И. Никаанен [139] изучали образование изоамилацетата,
|3-фенилэтилацетата и этиловых эфиров С6—Сю жирных кислот в процессе
брожения сахара в полуанаэробных условиях в 56 штаммах Sacch. cerevisiae
и трех штаммов Sacch. uvarum (carlsbergensis). Показано, что S. cerevisiae
образует больше сложных эфиров, чем S. uvarum. Основным компонентом
является изоамилацетат. Среди других этиловых эфиров в основном содер-
жатся этилкапронат, этилкаприлат и этилкапринат и Р-фенилэтилацетат. Sacch.
cerevisiae на среде, содержащей 80 г/л сахарозы и 6—7 г/л пептона Дифко
при pH 5, образует до 0,32 мг/л изоамилацетата; в этой же среде S. uvarum
в анаэробных условиях продуцируют 0,1 мг/л его. Sacch. cerevisiae образует
этилкаприлат 0,13 мг/л, a Sacch. uvarum — 0,06 мг/л. Для этилкапроната —
соответственно 0,11—0,03 мг/л.
По данным А. Бертрана (1968), Sacch. oviformis образуют больше эфиров
за счет значительного количества синтезируемого этилацетата, в то время как
Sacch. vini выделяет больше этилкапроната и этилкаприлата.
В последнее время появились работы по исследованию ароматобразую-
щих веществ различных видов и рас дрожжей. Было изучено 4 штамма дрож-
жей низового брожения (хлопьевидных и пылевидных), обуславливающих
аромат пива.
Хлопьевидные дрожжи выделяют больше ацетальдегида, высших ароматиче-
ских спиртов, в частности Р-фенилэтанола, сложных эфиров, а также уксусной
и молочной кислот [148].
В работе Г. И. Мосиашвили и А. М. Мамулаишвили ,[63] показано, что в
вине, сброженном" культурой Sacch. vini, образуются 12 эфиров; Sacch.
oviformis и D. globosus—10, a Sacch. chodati и Sacch. paradoxus — 11 слож-
ных эфиров; из этих культур наибольшее количество эфиров синтезирует Sacch.
paradoxus, а самое меньшее Sacch. chodati.
Н. И. Бурьян и др. [14] изучали образование сивушных спиртов и лету-
чих кислот различными расами винных дрожжей. Исследования показали, что
наибольшее количество изопентанола синтезируют расы Кахури 7 и Берегово-4-1
и наименьшее — расы Туркестанская 36/5, Романешты-46 и Судак-У1-5. Зна-
чительное количество жирных кислот образуют расы Туркестанская 36/5, Пи-
но-14 и Романешты-46.
Н. Д. Чичашвили [93] исследовал влияние дрожжей различных видов и
рас на образование спиртов и эфиров при брожении виноградного сусла. Ис-
следования показали, что Sacch. vini при брожении виноградного сусла накап-
ливает наибольшее количество сложных эфиров, в то время как Sacch. uvarum
образует их сравнительно меньше. При брожении сусла на Sacch. oviformis
наблюдается максимальное количество сивушных спиртов. Участие в брожении
виноградного сока Z. fermentati, Z. baili, Н. apuculata, D. globosus вместе с
Sacch. vini снижает количество спиртов и эфиров, за исключением этилкапри-
ната.
Г. И. Мосиашвили также считает целесообразным применение смешан-
ных дрожжей в виноделии [62], так как в результате брожения на смешан-
ных дрожжах получается вино лучшего качества.
Изучение влияния дрожжей на накопление ароматобразующих веществ и
качество шампанского [94] показало, что расы 31 и 81 Sacch. vini образуют
меньше сивушных спиртов и легколетучих кислот и больше высококипящих
эфиров, особенно этиллинолеата, а также цис- и т/яшс-фарнезола, чем расы
21 и 30 Sacch. oviformis.
Следует признать преимущество дрожжей Sacch. vini расы 39 и 81 для про-
изводства более высококачественного шампанского, чем дрожжей Sacch. ovifor-
mis расы 21 и 29.
185
Влияние анаэробиоза на образование сложных эфиров
Дрожжи содержат множество ферментов и в зависимости от условий
культивирования могут синтезировать различные компоненты. Винные дрожжи,
как факультативные анаэробы, обладают двумя противоположными свойства-
ми. При культивировании в аэробных условиях у них появляются активные
окислительные ферменты (цитохромоксидаза, пероксидаза, липооксигеназа и др.),
которые катализируют окисление многих веществ, содержащихся в дрожжах
и в сусле [81]. В аэробных условиях у дрожжей появляются цитохромы, ко-
торые непрерывно окисляются цитохромоксидазой и восстанавливаются элек-
тронами от водородного атома, выделяющегося при действии дегидрогеназы
на субстрат в присутствии НАД-Н2 или НАДФ-Н2. В присутствии кислорода
воздуха у дрожжей активируется липооксигеназа, которая окисляет полинена-
сыщенные жирные кислоты (линолевую и линоленовую) и их эфиры с образо-
ванием гидроперекисей.
С появлением перекисей создаются условия для работы пероксидазы, кото-
рая активируется в присутствии гидроперекисей [81].
Таким образом, винные дрожжи содержат эстеразы, которые в анаэроб-
ных условиях синтезируют сложные эфиры, в частности эфиры линолевой и
линоленовой кислот, а при аэробиозе действием липооксигеназы эти эфиры окис-
ляются с образованием гидроперекисей, которые в дальнейшем усиливают окис-
лйтельные процессы, приводящие к ухудшению качества вина и шампанского.
В условиях анаэробиоза дрожжи выделяют восстанавливающие вещества,
как, например, глютатион и цистеин [52], которые восстанавливают окислен-
ные вещества и этим снижают редокспотенциал. В этих условиях усиливает-
ся действие анаэробных дегидрогеназ, участвующих в алкогольном брожении.
Исследования, проведенные К. Нордстремом в 1964 г., показали, что до-
бавление жирных кислот при брожении способствует образованию эфиров, ко-
торые распределяются между дрожжевыми клетками и жидкой фазой, так что
эфиры с более длинной углеродной цепью остаются внутри дрожжевой клетки.
Л. Никаанен и X. Суомалайнен [140] изучали распределение эфиров, об-
разованных в процессе брожения, между дрожжевой клеткой и средой. Они ис-
следовали 5 штаммов Sacch. cerevisiae и 3 штамма Sacch. uvarum. Изоамил-
ацетат и р-фенилэтилацетат находятся в среде вместе с низшими этиловыми
эфирами жирных кислот. Этилкапронат почти весь переходит в среду, эпилка-
прилат на 54—68%, этилкапринат — на 8—17%, этиллаурат и высокомолеку-
лярные эфиры почти все остаются в дрожжевой клетке. Эти авторы показали,
что наибольшее количество образованных эфиров остается в клетках дрожжей
вида Sacch. uvarum, а не Sacch. cerevisiae.
В другой работе X. Суомалайнен и М. Лентонен [173] наблюдали, что
мембрана дрожжевой клетки регулирует поступление метаболитов из клетки
в среду. Скорость проникновения кислот через мембрану зависит от лиофиль-
ной природы мембраны и молекулярной массы кислот, т. е. большинство аро-
матобразующих веществ содержится в дрожжевых клетках. Исходя из этого,
X. Суомалайнен и его сотрудники показали, что при дистилляции коньячного
виноматериала с дрожжами количество изоамилацетата, этилкапроната, этил-
каприлата, этилкаприната, этиллаурата, а также р-фенилэтилацетата значи-
тельно увеличивается по сравнению с перегонкой виноматериала без дрожжей.
Полученный коньячный спирт при перегонке виноматериала с дрожжами имел
более тонкий и приятный аромат.
Для улучшения качества шампанского мы добавляли в тиражную смесь
раздробленные винные дрожжи, полученные замораживанием при высоком дав-
лении [34]. Преимущество этого способа перед способом применения автоли-
затов, полученных при нагревании, заключается в том, что ферменты дрожжей
при низкой температуре остаются активными и соединения, обусловливающие
аромат, не подвергаются распаду. При автолизе дрожжей, полученных нагре-
ванием, гидролизу подвергаются не только углеводы, жиры и белки, но и эн-
зимы, которые сами являются протеидами. Хотя при применении' автолизатов
дрожжей, полученных нагреванием, также получаются хорошие качественные
вина, но все же при применении деструктированных дрожжей получается боль-
ший эффект.
186
Таким образом, дрожжи способны синтезировать целый ряд веществ, участ-
вующих в образовании букета. Для получения хороших результатов надо учи-
тывать специальные способы применения дрожжей.
Глава 17
БАКТЕРИАЛЬНОЕ БРОЖЕНИЕ
Ягоды винограда при их созревании обильно обсеменены не только дрож-
жевыми клетками, но и бактериями. Однако развиваются бактерии в сусле
и вине очень ограниченно из-за высокой активной кислотности этих сред, осмо-
тического давления углеводов в сусле и спирта в вине.
Благодаря этим бактерицидным свойствам вино имеет большую гигиени-
ческую ценность, так как в нем подавляется жизнедеятельность большинства
бактерий и наблюдается даже частичная их гибель. Поэтому в сусле и вине
могут развиваться бактерии, которые выдерживают pH 2,6—4 и спиртуозность
12—16% об.
Бактерицидное действие вина усиливается с повышением концентрации
спирта и водородных ионов. Бактерии туберкулеза, тифа, холерные вибрионы
и кишечная палочка погибают в нем, причем в белом вине бактерии погибают
быстрее (за 15—20 мин), чем в красном (2—4 ч).
В вине могут развиваться лишь немногие бактерии, которые вызывают яб-
лочно-молочнокислое, молочнокислое, уксусное, маннитное и некоторые другие
виды брожения.
Но в вине имеются и такие бактерии, которые в большинстве случаев спо-
собны вызвать его заболевание. Эти бактерии изменяют химический состав на-
столько, что искажают вкус и букет вина.
Из всех видов бактериального брожения единственное, которое в некото-
рых случаях положительно влияет на изменение химического состава, а иногда
даже улучшает качество, — это молочнокислое брожение.
Яблочно-молочное брожение
Молочнокислые бактерии известны с глубокой древности. Они благоприятно
влияют на изменение микрофлоры кишечника человека при употреблении мо-
лочнокислых продуктов. Но с другой стороны, молочнокислые бактерии при-
носят вред, вызывая скисание пищевых продуктов, содержащих сахар, — соков,
вин, пива и др.
В виноделии с помощью молочнокислых бактерий можно регулировать
кислотность вина путем разложения яблочной кислоты до молочной.
В последнее время многими исследователями показано, что из вин, под-
вергавшихся яблочно-молочному брожению, выделены различные виды молоч-
нокислых бактерий как гомоферментативные, так и гетероферментативные.
Химизм молочнокислого брожения
В процессе яблочно-молочнокислого брожения образуется /-молочная кис-
лота, а при сбраживании сахара образуется d-молочная кислота. Образование
молочной кислоты из сахара протекает по гликолитическому пути по схеме
Эмбдена и Мейергофа до образования пировиноградной кислоты, которая не
декарбоксилируется в уксусный альдегид, а превращается в молочную кислоту
при действии лактикодегидрогеназы согласно реакции:
СН3—СО—СООН Лактикодегидрогеназы СН3—СНОН—СООН+НАД.
Пировиноградная ~ ~ * Молочная кислота
кислота НАД • Н + • Н+
Превращение яблочной кислоты в молочную осуществляется двумя путями.
Е. Пейно считает, что яблочная кислота при непосредственном действии мо-
лочнокислых бактерий декарбоксилируется в молочную кислоту по схеме:
187
СООН—СН2—СНОН—СООН-> С Н3—СНОН -СООН4-СО2.
Известно, что декарбоксилируются только кетокислоты. Поэтому вначале
яблочная кислота в присутствии малатдегидрогеназы превращается в щавеле-
воуксусную, а затем под действием декарбоксилазы она превращается в пиро-
виноградную кислоту, которая в присутствии лактикодегидрогеназы и
НАД-Н+-Н+ восстанавливается в молочную кислоту согласно реакции-
Малатдегидрогеназа
СООН—СН2—СНОН—СООН-----------------------* СООН—СН2 -СО—соон.
Яблочная кислота Щавелевоуксусная
кислота
Декарбоксилаза
СООН—СН2—СО—СООН -------------------------- СНз—СО-соон.
Пировиноградная кислота
Лактикодегидрогеназа
СН3—СО—соон------------------------------> СНз—СООН—СООН-рНАД.
НАД • Н + • н+ Молочная кислота
Другой путь образования молочной кислоты из яблочной более вероятный,
так как при дегидрировании яблочной кислоты акцептором водорода является
НАД. Восстановленный при этом НАД под действием лактикодегидрогеназы
отдает два водорода для восстановления пировиноградной кислоты в мо-
лочную.
При составлении баланса продуктов, образованных в процессе яблочно-
молочного брожения, установлено, что нет количественного соотношения между
разложившейся яблочной кислотой и образовавшейся молочной. Теоретически
из 1 г-мол яблочной кислоты образуется 1 г-мол молочной кислоты и 1 гмол
углекислоты, т. е. из 134 г яблочной кислоты образуется 90 г молочной и
44 г СО2. В действительности молочной кислоты получается - всегда меньше.
При этом образуется ряд побочных продуктов, а именно уксусная кислота и
диацетил.
Таким образом, в результате превращения двухосновной яблочной кисло-
ты в одноосновную молочную уменьшается титруемая кислотность и несколько
увеличивается pH. При этом происходят некоторые изменения в диссоциации
органических кислот и буферности вина. Показано, что разложение яблочной
кислоты ведет к увеличению степени диссоциации винной кислоты и поэтому
незначительно влияет на изменение концентрации водородных ионов.
Однако при разложении яблочной кислоты имеет место и другой процесс.
Образовавшаяся молочная кислота связывает только 7з катионов, ранее свя-
занных яблочной кислотой. Освободившиеся 2/з катионов фиксируются винной
кислотой, что увеличивает содержание винного камня, который выпадает в
осадок и, следовательно, снижает содержание свободной винной кислоты в
вине. В результате протекания обоих процессов понижается кислотность вина.
Известно, что энергетический потенциал молочной кислоты выше, чем яб-
лочной, поэтому процесс превращения яблочной кислоты в молочную сопро-
вождается поглощением энергии, и молочнокислые бактерии, 'вызывающие яб-
лочно-молочнокислое брожение, должны располагать другим источником энер-
гии. Одни ученые считают, что эту энергию бактерии получают при полном
окислении яблочной кислоты до углекислоты и воды. Другие полагают, что
молочнокислые бактерии получают эту энергию за счет разложения сахара, ко-
торый всегда содержистя в вине.
Ф. Радлер (1963) показал, что для разложения 1 г яблочной кислоты в
синтетической среде необходимо 0,1 мг глюкозы. Было показано также, что
при молочнокислом брожении в вине уменьшается содержание некоторых ами-
нокислот: аланина, аргинина, глицина, глютаминовой, аспарагиновой и у-амино-
масляной кислот.
У. Кунш, А. Темперли и К. Майер [127] показали, что в процессе яблочно-
молочнокислого брожения в красном вине с помощью Leuconostoc oenos проис-
ходит стехиометрическое превращение аргинина в орнитин по следующей схеме:
188
Аспарагиновая
кислота
Аргинин
Цитруллин
Орнитин
О
Моче виг а
H2N-C—NH2+ 2NH3 + C02
Вначале аргинина в вине было 816 мг/л, через 16 недель весь аргинин пол-
ностью превратился в орнитин, содержание которого достигло 632 мг/л. Одно-
временно с этим увеличилось количество аммиака с 5 до 151 мг/л. Молекуляр-
ное соотношение орнитина к аргинину было 0,98, а аммиака к орнитину—1,83.
Из этого можно заключить, что при полном завершении яблочно-молочно-
кислого брожения в красных винах аргинин полностью превращается в орнитин
и в молекулярном соотношении составляет 1:1. Стехиометрически установлено,
что превращение аргинина в орнитин происходит через цикл мочевины.
Гетероферментативные бактерии вызывают молочнокислое брожение в креп-
ких и десертных винах, которое сопровождается уменьшением количества са-
хара, при этом происходит увеличение содержания летучих кислот (главным
образом уксусной кислоты), а также диацетила.
Е. И. Квасников [47] показал, что в условиях Средней Азии молочнокис-
лые бактерии хорошо развиваются в десертных винах с высоким содержанием
сахара (16%) и спирта (16 об.%|). При этом образуется молочная кислота
(до 4 г/л) и летучие цислоты (до 3,7 г/л). Болезнь вина сопровождается выде-
лением углекислоты. Но не все виды и штаммы молочнокислых бактерий вы-
зывают это заболевание. К этим штаммам относятся Lactobacterium (L.|) breve,
L. fermentii, выделенные из сухих и десертных вин, а также L. plantarum, вы-
деленные из шампанского, приготовленного резервуарным методом.
Заболевание развивается в зависимости от состава вина, его спиртуозности,
pH, температуры и др. Хотя процесс протекает очень медленно, тем не менее
происходят глубокие химические изменения, которые портят вкус и букет вина.
К- Майер [136] считает, что к нежелательным последствиям яблочно-молоч-
нокислого брожения относится появление интенсивной окраски вина, сопровож-
дающееся увеличением количества диацетила. При брожении на бактериях вида
Pediococus, кроме диацетила, в вине накапливаются биогенные амины (гиста-
мин, путресцин, ацетил-холин, фенилэтиламина). Lactobacillus brevis, L. plantarum
обусловливают появление посторонних тонов в вине (квашеной капусты и мы-
шиного тона).
Таким образом, яблочно-молочнокислое брожение вызывает не только по-
нижение кислотности вина, но и появление трудно устраняемых посторонних за-
пахов.
Известно, что в красных винах при биологическом разложении оксикислот
происходит уменьшение интенсивности окраски. Проведенные У. Ветчем и X. Лю-
ти в 1964 г. исследования показали, что уменьшение окраски прямо пропорцио-
нально бактериальной массе, определенной спектрометрически (в мг/л) в ходе
распада яблочной и молочной кислот.
Бывают случаи, что вино теряет окраску на 50% от первоначальной, но
через некоторое время происходит заметное ее восстановление. Однако никогда
она не достигает исходной. Максимальное уменьшение окраски совпадает с ис-
чезновением лимонной кислоты. У. Ветч и X. Люти объясняют механизм обес-
цвечивания тем, что при распаде лимонной кислоты выделяется водород, кото-
рый благодаря энзиму переносится на красящее вещество, и вино обесцвечи-
вается.
Установлено, что бактерии, которые не разлагают лимонную кислоту, не
обесцвечивают вино. К таким относится Bacterium gracile.
189
Регулирование кислотности молочнокислыми бактериями
Для яблочно-молочнокислого брожения особенно благоприятно наличие бак-
терий Leuconostoc oenos. Эти микроорганизмы хорошо развиваются при pH 3,0—
3,3 и чувствительны к сернистой кислоте, поэтому, дозируя SO2, можно регу-
лировать брожение. Leuconostoc oenos образует незначительное количество диа-
цетила и не изменяет букета вина.
Для прекращения яблочно-молочнокислого брожения вино надо снимать с
дрожжевой гущи, вводить SO2 из расчета до 30 мг/л и затем выдерживать при
температуре ниже 15°С.
Хорошим ингибитором яблочно-молочнокислых бактерий является фумаро-
вая кислота, которая при дозе 150 мг/100 мл ингибирует их рост и размно-
жение [143]. При совместном введении фумаровой кислоты и SO2 получается
лучший эффект.
Молочнокислые бактерии можно использовать для снижения кислотности
высококислотных вин.
Еще в 1924 г. А. Остервальдер выделил культуру Shizosaccharomyces, кото-
рая расщепляла яблочную кислоту до этанола и углекислоты.
В 1941 г. Д. К. Чаленко выделил чистую культуру Schizosaccharomyces aci-
dodevoratus, которая в первые дни брожения снижает кислотность плодово-
ягодных соков за счет сбраживания яблочной кислоты, причем в анаэробных
условиях она превращает яблочную кислоту в этиловый спирт и СО2.
Баллони и др. в Италии и Дж. Калландер в США выделили штамм Schizo-
saccharomyces pombe, который способен почти полностью разлагать только яб-
лочную кислоту в этанол и углекислоту. При этом кислотность вина уменьшает-
ся на 30—34%. Эта культура хорошо развивается при температуре 16—18°С и
pH 2,9—3,1.
Из продуктов распада яблочной кислоты, помимо этанола и СО2, Schizo-
saccharomyces pombe образует еще очень незначительное количество летучих
кислот и янтарную кислоту.
С биологической точки зрения понижение кислотности вина с помощью
Schizosaccharomyces pombe лучше, чем молочнокислыми бактериями, так как.
первые разлагают яблочную кислоту до этанола и СО2 практически без образо-
вания вторичных продуктов брожения. Молочнокислые бактерии наряду с яб-
лочной кислотой разлагают лимонную, винную, глицерин и другие важные ком-
поненты, при этом образуются уксусная кислота, диацетил, пентадион и другие
вещества, ухудшающие вкус и букет вина.
Уксуснокислое брожение
Уксуснокислые бактерии Acetobacter aceti хорошо развиваются на синтети-
ческой среде с этиловым спиртом и минеральными солями, главным образом ам-
монийными. Особенно они нуждаются в пантотеновой и параминобензойной
кислотах и никотинамиде. Это облигатные аэробы, которые без кислорода воз-
духа не развиваются. Они нашли широкое применение в производстве уксуса
немецким способом.
Acetobacter aceti способен окислять этанол при pH 2,5—3,0 и образовывать
до 11% уксусной кислоты.
Окисление этилового спирта уксуснокислыми бактериями связано с дегид-
рированием этанола пиримидиновыми дегидрогеназами при участии НАД с об-
разованием альдегида по следующей схеме:
^Алкогольдегидрогеназа
СН3—СН2ОН-----------------------------СН3—СНО+Н А Д • Н2.
НАД
Образовавшийся уксусный альдегид дегидрируется дегидрогеназой уксусной
кислоты.
190
он
I Дегидрогеназа
СН3—СНОЧ-НОН^СНз— С —ОН----------------->СН3—СООН+НАД.Н2.
| НАД
н
Существует и другой путь окисления уксусного альдегида при участии ок-
сидазы уксусного альдегида. Такой путь существует у уксусных бактерий, ко-
торые, образуют перекиси водорода. Окисление альдегида оксидазой осу-
ществляется флавиновым ферментом по схеме
СН3—СНО — । . ФМН^— |->Н2О2
СН3—СООНч-1 1->ФМН.Н2—। I—О2
В результате действия альдегидоксидазы уксусный альдегид окисляется в
уксусную кислоту, а флавинмононуклеотид (ФМН|) восстанавливается в
ФМН-Н2, последний реагирует с молекулярным кислородом и образует пере-
кись водорода. Известно, что перекись водорода является ядом для уксусных
бактерий, поэтому она разлагается каталазой. Такой путь окисления осуществ-
ляется только для тех уксусных бактерий, которые способны синтезировать
каталазу.
Энергетический баланс при уксуснокислом брожении следующий: при окис-
лении 1 г-мол этанола высвобождается около 489 кДж. При недостатке этано-
ла они окисляют уксусную кислоту до СО2 и Н2О.
Уксуснокислые бактерии, кроме этанола, окисляют и другие одноатомные
спирты в соответствующие кислоты, но с меньшей интенсивностью. Они способ-
ны окислить также и многоатомные спирты, так, например, глицерин окисляют
в диоксиацетон, маннит — во фруктозу, сорбит — в сорбозу. Сахара они окис-
ляют в соответствующие кислоты: глюкозу — в глюконовую, галактозу — в га-
лактоновую, ксилозу — в ксилиновую. Фруктозу окисляют только некоторые
виды уксуснокислых бактерий с образованием койевой кислоты. Некоторые виды
уксуснокислых бактерий способны превращать молочную кислоту в ацетоин.
Винная, янтарная, яблочная и другие органические кислоты могут служить этим
бактериям источником углеродистого питания.
Развиваясь в вине в присутствии кислорода, уксуснокислые бактерии могут
вызвать его заболевание. Они попадают в вино вместе с воздухом при провет-
ривании, при открытом хранении в неполных емкостях. Уксуснокислые бактерии
быстро развиваются при брожении на мезге в присутствии кислорода воздуха,
поэтому брожение следует проводить без доступа кислорода воздуха в боль-
ших закрытых емкостях под подушкой углекислоты. Молодые вина следует
хранить без доступа воздуха при температуре ниже 15°С [88].
При обнаружении в вине уксуснокислых бактерий его необходимо немед-
ленно пастеризовать при 60°С в течение 2—3 мин и сульфитировать из рас-
чета 50—75 мг/л SO2. Для заболевших вин рекомендуется на поверхности вино-
материала (метод Н. Ф. Саенко) культивировать хересную пленку. Хересные
дрожжи интенсивно употребляют уксусную кислоту, и качество вина значитель-
но улучшается.
Вино является благоприятной средой для развития уксуснокислых и мо-
лочнокислых бактерий. Молочнокислые бактерии используют сахара, яблочную
кислоту, лимонную, а также глицерин, а уксуснокислые бактерии — в основном
этанол. При этом образуются уксусная кислота, диацетил, легколетучие эфиры
и уксусный альдегид, которые портят вкус и букет вина.
Маннитное брожение
Возникает в виноградных и плодово-ягодных винах с малой кислотностью.
Богатые кислотами вина северных районов устойчивы к этой болезни.
Вино, подвергшееся заболеванию, мутнеет, на вкус становится кисло-слад-
ким, в нем накапливается уксусная' кислота.
191
Возбудителем маннитного брожения является Bact. mannitopoeum, которая
обладает способностью образовывать значительное количество маннита, этот
многоатомный спирт образуется из фруктозы в нейтральной среде. Возбудители
маннитного брожения являются факультативными анаэробами, в винах они мо-
гут развиваться без доступа кислорода воздуха. Кроме молочной кислоты, они
образуют еще и уксусную.
Для борьбы с этой болезнью рекомендуется сульфитировать вино сернистым
ангидридом, а также проводить брожение при низкой температуре. Исследова-
ние возбудителей заболеваний виноградных и плодово-ягодных вин были про-
ведены Мюллер-Тургау и Остервальдером в 1919 г. и Е. И. Квасниковым
в 1960 г.
Глава 18
СОВРЕМЕННАЯ ТЕОРИЯ
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
Биологические Окислительно-восстановительные процессы, которые протекают
во всех биологических средах, являются одной из главных проблем биохимии.
Окисление органических соединений молекулярным кислородом является
единственным источником энергии, необходимой для жизнедеятельности орга-
низма. В связи с этим проблема биологических окислительно-восстановительных
процессов с давних времен привлекает к себе внимание многих исследователей.
В настоящее время установлено, что использование энергетических ресурсов
в процессе окисления происходит не самопроизвольно. Это связано с перекис-
ной теорией А. Н. Баха [6], согласно которой в молекуле кислорода два атома
прочно связаны между собой, и прежде чем они вступят в реакцию, эту связь
необходимо разорвать. Для этого нужно 497 кДж/моль. Необходимо также
затратить энергию и на активирование субстрата окисления, так, например, для
разрыва связи С—Н требуется от 75 до 420 кДж/моль.
По этому вопросу возникла дискуссия между О. Варбургом и Г. Виляндом
относительно того, активируется ли при биологическом окислении водород
субстрата или молекулярный кислород? Эта проблема была разрешена после
обнаружения в растительных и животных тканях системы перемещения элек-
тронов в дыхательной цепи.
Перенос электронов в дыхательной цепи
Для окисления органического вещества необходимо, чтобы, с одной сторо-
ны, происходила активация водорода субстрата с помощью дегидрогеназ, а с
другой — активация кислорода с помощью терминальных оксидаз, к которым
относится цитохромоксидаза.
Переносчиками, осуществляющими транспорт водорода (электронов) от суб-
страта на молекулярный кислород, являются четыре окислительно-восстанови-
тельных фермента: дегидрогеназы, зависящие от пиридиновых коферментов.
(НАД и НАДФ|); дегидрогеназы, содержащие в простетической группе флави-
новые нуклеотиды (ФМН и ФАД); убихинон, или кофермент Q; цитохромы и
цитохромоксидаза.
НАД и НАДФ зависимых дегидрогеназ переносят по два водорода от суб-
страта к окисленной форме кофермента.
ФМН и ФАД в качестве простетических групп содержат флавиновые ну-
клеотиды, связанные белковой молекулой фермента. Окислительно-восстанови-
тельные свойства этих флавиновых дегидрогеназ, обусловлены способностью изо-
алоксазинного кольца рибофлавина к обратимому переходу из окисленного в
восстановленное состояние путем присоединения к кольцу двух атомов водо-
рода.
192
Убихинон способен к обратимому окислению и восстановлению также путем
присоединения двух атомов водорода. Он функционирует в дыхательной цепи
на участке между флавопротеинами и цитохромами.
Цитохромы вместе с цитохромоксидазой принимают участие на заключи-
тельном этапе процесса в цепи переноса электронов, которые передают элек-
троны на молекулярный кислород с образованием воды.
Последовательность расположения переносчиков электротранспортной цепи
представлена на схеме
АДФ —АДФ —АДФ
Восстановительный
субстрат----Н4АД ’->АТФ->Ф п->р->Цит. b '->АТФ->С1->С->аН-#з 1->АТФ->02.
Цепь переноса водорода (электронов) состоит из большого числа промежу-
точных переносчиков, осуществляющих электронный транспорт с субстратов на
молекулярный кислород. Переносчики, находящиеся ближе к окислительному
субстрату (НАД или ФАД), более восстановлены, а переносчики, расположен-
ные ближе к молекулярному кислороду (цитохромы более окислены.
При изучении последовательности функционирования переносчиков электрон-
ной цепи большое значение имели опыты с применением ингибиторов. Так, на-
пример, амитол (производное барбитуровой кислоты) ингибирует перенос элек-
тронов на участке дыхательной цепи от НАД к цитохрому. Антимицин А (ан-
тимицин) блокирует перенос электронов от цитохрома к цитохрому Циани-
стый калий и окись углерода подавляют конечный этап переноса электронов
от цитохрома а3 к молекулярному кислороду.
От пиридиновых и флавиновых дегидрогеназ до кофермента Q происходит
перенос атомов водорода, а далее водород расщепляется на электроны (е) и
протоны (Н+|). Электроны переносятся через ряд цитохромов. Протоны в даль-
нейшем транспорте не принимают участие.
В последнем этапе цитохромоксидаза катализирует перенос электронов на
молекулярный кислород и образование воды.
Известно, что в молекуле цитохромоксидазы содержится простетическая
группа, в которую входит железо. В окислительно-восстановительных реакциях
валентность железа меняется, как это показано в приведенных ниже реакциях:
4Fe2+ +02->4Fe3+ +2O2-; 2О2--|-4Н+->2Н2О.
Как видно, в образовании воды участвуют четыре электрона, которые пе-
реносятся на молекулу кислорода.
В некоторых местах дыхательной цепи происходит сопряжение транспорта
электронов с фосфорилированием, т. е. синтезом АТФ из АДФ и неорганиче-
ского фосфора. Оно, как известно, является основным механизмом консервации
энергии окисления.
В настоящее, время известно, что использование энергетических ресурсов
(глюкозы, органических кислот и др.) при брожении, дыхании и фотосинтезе
связано с переносом электронов по дыхательной цепи, состоящей из ферментов,
коферментов и субстратов, способных к обратимому окислению и восстановле-
нию. В результате этих реакций освобождающаяся на отдельных участках ды-
хательной цепи энергия трансформируется в химическую энергию в виде фос-
фатных связей АТФ [87]. Молекулярный механизм фосфорилирования пока не
выяснен. Однако известно, что синтезу АТФ предшествует образование высоко-
энергетических соединений, химическая природа которых пока остается неиз-
вестной. Синтез этих соединений сопряжен с использованием энергии, которая
освобождается при электронном транспорте.
В связи с этим были выдвинуты различные гипотезы по выяснению меха-
низма фосфорилирования, а именно: химическая, механо-химическая и электро-
химическая. Последняя гипотеза была выдвинута Р. Митчеллом. Она является
наиболее правдоподобной и обоснована экспериментальными данными. Согласно
теории Р. Митчелла в результате функционирования дыхательной цепи во внут-
реннем митохондриальном пространстве образуются ион ОН-, а во внешнем —
Н+, что приводит к связыванию Н+ с ОН- и нейтрализации зарядов в обе
стороны мембраны, возникших при транспорте электронов [90].
193
Таким образом, при фосфорилировании используется электрическая энергия,
т. е. мембранный потенциал, образующийся в процессе транспорта электронов
по дыхательной цепи.
Такого рода окислительно-восстановительные реакции происходят в живых
клетках дрожжей и растений, что касается окислительных реакций, протекаю-
щих в вине, то в этом случае признана перекисная теория А. Н. Баха.
Перекисная теория окисления
Перекисная теория, сформулированная А. Н. Бахом в 1897 г., в сущности
была первой теорией биологического окисления. Согласно этой теории механизм
биологического окисления рассматривается следующим образом: при активации
в молекуле кислорода разрывается одна из связей, удерживающих атомы. В ре-
зультате образуется перекисная группа —О—О—, которая присоединяется к окис-
ляющемуся соединению, образуя перекись.
При воздействии на эту перекись фермента пероксидазы окислительный по-
тенциал значительно увеличивается вследствие отщепления от перекиси актив-
ного кислорода, который способен вызвать окисление более трудноокисляемого
соединения.
А. Н. Бах объяснял механизм биологического окисления с позиции теории
перекисного окисления, согласно которой молекулярный кислород присоединяет-
ся к ненасыщенному, легкоокисляемому веществу, названному оксигеназой. Ме-
ханизм окисления с помощью оксигеназы и пероксидазы показан ниже:
/°
Оксигеназа-}-О2->А< I ;
ХО
А/ | 4-субстрат 4-пероксндаза-нжислительный
ХО
субстрат 4- оксигеназа
Не так давно О. Хаяши (1964) и Г. Мезон (1957) сообщили, что в расте-
ниях и микроорганизмах содержится фермент типа оксигеназ, который активи-
рует кислород воздуха, делая его способным вклиниваться в окисляемые ве-
щества.
Мезон назвал этот фермент «трансферазой кислорода», а О. Хаяши пред-
ложил баховский термин «оксигеназы». Существуют высокомолекулярные фер-
менты, так называемые монооксигеназы и диоксигеназы.
Открытие нового фермента «оксигеназы», активирующего молекулярный кис-
лород и прямо внедряющегося в субстрат, подтвердило правильность перекис-
ной теории биологического окисления А. Н. Баха.
За последнее время особое значение придают супероксиду [иону (02'" |)] в
окислительно-восстановительных процессах [120]. является высокоактивным
ионным радикалом, который образуется при одноэлектронном восстановлении
молекулярного кислорода, а также при энзиматическом аэробном метаболизме.
Этот супероксид обладает как окислительными, так и восстановительными свой-
ствами в зависимости от условий проведения реакции (pH среды). Это не про-
тиворечит правильности перекисной теории А. Н. Баха, так как в данном слу-
чае мы также имеем активирование кислорода.
Однако наряду с теорией перекисного окисления, которая предусматривает
активирование кислорода, была выдвинута теория дегидрирования, т. е. отнятия
водорода в процессе биологического окисления. Впервые теорию дегидрирова-
ния выдвинул В. И. Палладии (1912), который считал, что для завершения био-
логического окисления наряду с активированием кислорода необходимо и акти-
вирование водорода субстрата.
Г. Виланд подтвердил более раннее представление В. И. Палладина, кото-
рый считал, что в процессе биологического окисления главная роль принадле-
жит лабилизации водорода органического вещества, переходящего затем в ак-
цептор кислорода, дающий с водородом воду.
194
Согласно теории Г. Виланда, специфичность фермента проявляется только
лишь по отношению донатора водорода, акцепторная специфичность им отри-
цалась.
В. И. Палладии впервые показал, что дыхание в растениях осуществляется
при помощи особых посредников дыхания. К посредникам относятся полифено-
лы, которые окисляются кислородом под действием оксидаз, приобретая ту или
иную окраску и превращаются в пигменты, так называемые хромогены.
Этот исследователь также показал, что хромоген активирует не только
кислород, а также водород дыхательного субстрата в присутствии дегидрогеназ.
В. И. Палладии заменил дыхательные хромогены на водородные акцепторы. Он
объединил процесс окисления и восстановления при непосредственном участии
воды. Так, например, водород воды восстанавливает дыхательнйй пигмент и
превращает его в хромоген, а кислород воды окисляет хромоген в пигмент.
В. И. Палладии придавал особое значение участию воды в процессе дыхания,
считая, что в образовании СО2 участвует кислород воды, а не кислород атмо-
сферы. Это было доказано экспериментально с помощью изотопа кислорода
Б. Б. Вартапетяном и А. Л. Кирсановым (1955).
Теория В. И. Палладина хорошо объясняет жизнь анаэробных микроорганиз-
мов, которые в своей жизнедеятельности обходятся без кислорода. В этом слу-
чае акцептором водорода при дегидрировании органического вещества является
не кислород воздуха, и следовательно, вода не образуется. Акцептором водо-
рода при алкогольном брожении может служить уксусный альдегид, который
восстанавливается в этанол, а при молочнокислом брожении акцептором водо-
рода является пировиноградная кислота, которая также восстанавливается в
молочную кислрту. В ацетобутиловом брожении акцептором водорода является
масляный альдегид, который восстанавливается в бутанол.
О роли редокспотенциала в виноделии
Сусло и вино как биологические среды обладают определенным уровнем
окислительно-восстановительного потенциала в зависимости от присутствия в них
ферментативных и неферментативных катализаторов. Последние ускоряют хи-
мические реакции и делают окислительно-восстановительные системы обратимы-
ми. Равновесие между окисленными и восстановленными компонентами вина
имеет место только в обратимых системах. Так, например, необратимо окис-
ленное вещество — окисленный глютатион, хотя и оказывает влияние на потен-
циал электрода, но не образует обратимой окислительно-восстановительной си-
стемы. Такая система образуется в том случае, если к окисленному глютатиону
прибавить его редуктазу. При этом образуется обратимая окислительно-восста-
новительная система глютатион окисленный^глютатион восстановленный с
редокспотенциалом 40 мВ.
А. А. Мержаниан [58] показал, что при использовании платинового элек-
трода в вине измеряется не равновесный потенциал, а предельный. При замене
платинового электрода на золотой можно избежать этой ошибки и установить
в вине состояние равновесия между окисленной и восстановленной формами.
Большинство энологов считают, что величина редокспотенциала вина имеет
важное значение при его созревании и старении. При низком редокспотенциале
вино созревает быстрее; выдержанное в герметически закрытых бутылках всегда
имеет низкий редокспотенциал. При выдержке в бутылках образуются редукто-
ны, которые снижают редокспотенциал благодаря огромной восстановительной
способности. Редуктоны — это органические вещества, обладающие функцией ди-
—С=О- — С—С—
энола | | , которые быстро окисляются в дикетон || , при этом
ОН ОН о о
теряют свои восстановительные свойства.
К диэнолам относятся аскорбиновая и диоксифумаровая кислоты, которые
также снижают редокспотенциал вина. Аскорбиновая кислота в процессе техно-
логии вина окисляется, и ее необходимо вводить без доступа кислорода возду-
ха, как это делали А. С. Вечер и В. М. Лоза (1957|). Вкус и букет вина при
этом намного улучшались.
195
Такую же роль играет диоксифумаровая кислота, которая возникает из
винной кислоты, но при доступе кислорода окисляется и быстро распадается.
В вине присутствует множество редокссистем, имеющих редокспотенциал от
—140 до +714 мВ.
Наши исследования показали [76], что главную роль в образовании ре-
докспотенциала вина играют продукты окисления винной кислоты. Если в рас-
твор винной кислоты добавить сернокислое закисное железо, то образуется ди-
оксифумаровая кислота, которая дает с четыреххлористым титаном розовое
окрашивание. При взбалтывании этого раствора на воздухе окрашивания не про-
исходит. Аналогичный опыт был поставлен и О. Варбургом. Он показал, что
0,1 н. раствор винной кислоты с 0,01 н. двухвалентным железом способен вос-
станавливать дихлорфенолиндофенол, как аскорбиновая кислота, т. е. при окис-
лении винной кислоты образуется редуктон, который был идентифицирован как
диоксифумаровая кислота. При проветривании этот раствор не восстанавливает
дихлорфенолиндофенола.
Наши исследования [76] показали, что при добавлении диоксифумаровой
кислоты в вино или шампанское редокспотенциал уменьшается до 140—150 мВ,
а при проветривании вина увеличивается до 300—350 мВ.
Так как вино содержит большое количество винной кислоты, а также же-
лезо (несколько мг на 1 л), то этого вполне достаточно для окисления винной
кислоты в диоксифумаровую; при этом образуется окислительно-восстанови-
тельная система: НООС—СНОН—СНОН—СООН^НООС—СОН = СОН—СООН.
Эта система снижает редокспотенциал вина до 200 мВ и ниже; при проветрива-
нии редокспотенциал увеличивается.
В зависимости от условий выдержки и от способов переливок вина диокси-
фумаровая кислота непрерывно возникает и исчезает. При незначительном до-
ступе кислорода воздуха она образуется в вине, а при переводе его в анаэроб-
ные условия хранения редокспотенциал уменьшается. При доступе кислорода
диоксифумаровая кислота окисляется и редокспотенциал опять увеличивается,
поэтому диоксифумаровая кислота как бы регулирует редокспотенциал в вине.
Ферментативные окислительно-восстановительные
процессы и их биологические катализаторы
Несмотря на многочисленные исследования по изучению активности фермен-
тов, до настоящего времени не было установлено существования в вине окси-
даз и пероксидаз. Оксидазы, поступающие в сусло из винограда, в процессе
алкогольного брожения инактивируются [75]. Гидролазы и другие ферменты,
переходящие главным образом при брожении и при автолизе дрожжей, после
обработки виноматериалов оклеивающими веществами (рыбьим клеем, танином,
бентонитом, поливинилполипиролидоном и др.) также подвергаются большим
изменениям, выпадают в осадок и удаляются из вина. Поскольку ферменты яв-
ляются протеидами, то, естественно, они удаляются из вина при оклейке. Сле-
довательно, активность ферментов зависит от тех или иных технологических
операций, проводимых при получении различных типов вин. Десертные вина,
полученные при неполном алкогольном брожении, содержат некоторые окисли-
тельные ферменты, хотя активность их несколько падает. Кахетинские вина со-
держат о-дифенолоксидазу и пероксидазу, так как они при брожении на мезге
сохраняются и переходят в вино.
Наиболее богаты ферментами вина, которые подвергаются вторичному бро-
жению, — это шампанские и херес. Известно, что в шампанских винах, осо-
бенно бутылочного способа приготовления, после вторичного брожения проис-
ходит контакт с дрожжами до трех лет. Это связано с автолизом дрожжевых
клеток и переходом ферментов дрожжей в шампанизируемое вино. Кроме того,
шампанские вина не подвергаются жестким режимам обработки, которые могли
бы привести к осаждению или инактивации ферментов.
Первые исследования по изучению активности ферментов в процессе техно-
логии шампанского бутылочным методом, проведенные А. И. Опариным,
А. Л. Курсановым, Н. Ф. Саенко, Э. Н. Безингер (1947), показали, что в ре-
зультате вторичного брожения дрожжи адсорбируют из вина большинство
196
ферментов. По истечении трех месяцев большинство дрожжевых клеток отми-
рает и благодаря автолизу происходит переход ферментов в вино. При этом
активность пероксидазы, протеазы, p-фруктофуранозидазы и других увеличи-
вается.
После одного года выдержки происходит инактивация ферментов и насту-
пает затухание биохимических процессов.
Наши исследования, проведенные совместно с И. А. Егоровым и Т. А. Кор-
маковой [49], подтвердили данные, полученные А. И. Опариным и сотрудни-
ками. Действительно, активность ферментов (алкоголь-, малат-, лактат-дегидро-
геназ, а также протеиназ}) увеличивается через один месяц и теряется после
одного года выдержки на дрожжах.
С. П. Авакянц. [2] показал, что активность протеиназ при нагревании не-
сколько уменьшается, а при обработке холодом увеличивается.
Хересные вина, которые получаются при долгом контакте вина с дрожжа-
ми, также содержат более активные ферменты, чем сухие вина. Согласно дан-
ным Н. М. Сисакяна и его сотрудников, у хересных дрожжей после двухмесяч-
ной выдержки, когда часть пленки опускается в жидкость, количество эстераз,
дегидрогеназ, особенно пероксидаз, значительно увеличивается. Именно на этой
стадии выдержки наступает автолиз дрожжей, что совпадает с повышением
активности ферментов.
Таким образом, активность ферментов в винах зависит от тех технологиче-
ских процессов, которые происходят в винах при их формировании. Поэтому
в различных типах вин активность ферментов разная.
В одних типах вин применяют такую технологию, при которой активность
окислительных ферментов усиливается. Так получают кахетинские вина, херес
и мадеру. Наоборот, для получения сухих столовых вин европейского типа, а
также шампанских виноматериалов применяют такую технологию, при которой
активность окислительных ферментов минимальная. Для этой цели лучше про-
водить обескислороживание виноматериалов дрожжами [76] или пропускать
виноматериалы через ферментеры, наполненные кольцами Рашига, задерживаю-
щими на себе дрожжевые клетки и увеличивающими поверхность соприкоснове-
ния вина с дрожжами [85]. Эти способы обогащают вино эстеразами, протеа-
зами, дегидрогеназами и редуктазами, которые участвуют в биохимических про-
цессах, вызывающих ускорение созревания.
Автолиз дрожжей
Дрожжевые клетки содержат большой запас ферментов, питательных ве-
ществ и множество ароматобразующих веществ, по, прежде чем эти соедине-
ния поступят в вино, необходимо, чтобы наступил автолиз дрожжевых клеток.
При автолизе дрожжей нарушается клеточный метаболизм. Под действием
р-1,3-глюконазы и протеолитических ферментов гидролизуются глюкан и маннан,
а также протеиды клеточной оболочки, она становится пористой и проницае-
мой, при этом содержимое клетки диффундирует в окружающую среду.
В результате изменения внутриклеточного pH активность лизирующих фер-
ментов увеличивается. Протеазы вызывают распад белковых ферментов, поэто-
му они инактивируются. При этом нарушается координационная связь между
ферментами и их клеточной регуляцией. Разрушаются субклеточные структуры,
распадается также цитоплазматический комплекс белков, липидов и полисаха-
ридов. Следовательно, ферменты также инактивируются, так как они являются
протеидами.
В автолизатах, полученных путем нагревания дрожжей, происходит само-
переваривание дрожжевых клеток, при этом инактивируются все ферменты. Ис-
пользование таких автолизатов не столь благоприятно для улучшения качества
вина и шампанского, хотя вкус и букет несколько улучшаются за счет аромат-
образующих веществ находившихся в самой дрожжевой клетке.
При получении автолизатов с помощью механического разрушения клеток
холодом при высоком давлении ферменты дрожжей полностью сохраняются.
Полученные таким способом автолизаты усиливают биохимические процессы при
созревании вина.
197
В присутствии ферментов дрожжей в вине усиливаются синтетические про-
цессы, в результате образуются сложные эфиры и внутренние эфиры, так на-
зываемые лактоны, а также ароматические спирты. Эстеразы усиливают син-
тез высокомолекулярных эфиров, линолевой, линоленовой кислот, терпеновых
эфиров, линалилацетата, геранилацетата, терпинилацетата, а также энантовых
эфиров.
Синтезируются ароматические спирты: f-фенилэтиловый спирт и его ацетат-
ный эфир, тиразол и триптофол. При обработке дрожжей холодом сохраняются
терпеноидные соединения, как цис- и транс-фарнезол. Все эти вещества усили-
вают букет и вкус вина.
Большую роль играет восстановительный фермент глютатион-редуктаза, ко-
торая восстанавливает окисленный глютатион и образует окислительно-восста-
новительную систему окисленный глютатион восстановленный глютатион. Эта
система снижает редокспотенциал вина, при этом происходит восстановление
окисленных букетистых веществ, которые улучшают аромат вина.
Неферментативные окислительно-восстановительные
(процессы и их катализаторы
При отсутствии биологических катализаторов (ферментов) такую роль в
окислительно-восстановительных процессах играют тяжелые металлы. Для акти-
вирования кислорода воздуха большое значение имеют неорганические катали-
заторы— железо и медь. При взаимодействии этих катализаторов с перекисью
водорода или с другими органическими перекисями выделяется активный кис-
лород, который способен окислить углеводороды, углеводы, аминокислоты и
жиры.
Согласно теории Ж. Риберо-Гайона [73], процесс окисления вина представ-
ляется следующим образом. Молекулярный кислород не может непосредственно
реагировать с компонентами вина. Он реагирует с нестойкими веществами и
образует так называемые промежуточные окислители, обладающие большой
окислительной способностью. Эти промежуточные окислители, снабженные кис-
лородом, и производят окисление компонентов вина. Ж. Риберо-Гайон считает,
что процесс окисления вина протекает в две фазы: первая фаза состоит из
присоединения кислорода воздуха к нестойким веществам вина, а во второй
фазе нестойкие соединения, нагруженные кислородом, способны окислить труд-
ноокисляемые соединения вина.
Эта теория окисления вина по Ж. Риберо-Гайону аналогична перекисной
теории А. Н. Баха. Однако разница заключается в том, что у А. Н. Баха в ка-
честве окислителя служит оксигеназа, а у Ж. Риберо-Гайона — промежуточные
окислители.
Согласно современным представлениям, тяжелые металлы также способны
активировать молекулярный кислород. Каталитическое действие двухвалентного
железа на окисление элементов вина можно представить следующим образом.
Инициирование цепных реакций происходит только в присутствии Fe2+ моле-
кулярным кислородом: Fe2+4-O2->Fe3++O2~. При этом образуется супероксид
(О’2— ), который является продуктом одноэлектронного восстановления молеку-
лярного кислорода. Супероксид (0%") в кислой среде, какой является вино,
присоединяет протон, и переходит в супероксидный радикал НО2 , участвующий
в реакциях гидроксилирования.
При взаимодействии ионов двухвалентного железа с перекисью водорода
возникают радикалы НО - и ОН-. Образование свободных радикалов способст-
вует дальнейшему разложению перекиси водорода, при этом возникают длин-
ные цепи реакции
Fe2++HOOH4-HOOH->Fe3+4-(OH)-4-H2O4-O2H.
Эти реакции можно представить в виде последовательного присоединения
электронов к кислороду, если в биологической системе присутствуют Fe2+ и О2;
198
Ог -н!о-+°н+.
Радикал НО 2 теоретически может образовываться при действии терми-
нальных оксидаз и оксигеназ, поскольку они являются продуктами одноэлек-
тронного восстановления молекулярного кислорода. Образование этих радика-
лов при окислений органических соединений молекулярным кислородом катали-
зирует пероксидаза.
Перекисное окисление органических соединений происходит в присутствии
ионов двухвалентного железа.
Еще в 1951 г. мы показали, что двухвалентное железо интенсивно окис-
ляет винную кислоту, при этом образуется диоксифумаровая кислота, которая
восстанавливает трехвалентное железо в двухвалентное [76]:
СООН—СНОН—СНОН—COOH+Fe2+-^COOH—СОН=СОН—COOH+Fe3+ +Н2О,
СООН— СОН=СОН—COOH+Fe3+ ->СООН—СО—СО—COOH+Fe2+ +2Н.
Восстановление двухвалентного железа обусловливает истинный каталити-
ческий процесс.
Восстановление трехвалентного железа в двухвалентное происходит также
в присутствии аскорбиновой кислоты, восстановленного глютатиона и цистеина.
Эти соединения могут непосредственно реагировать со свободными радикалами.
Установлено, что образовавшийся в результате реакции инициирования сво-
бодный радикал (R’|) обладает высокой реакционной способностью. Он активно
реагирует с молекулярным кислородом с образованием перекисного радикала
(Эмануэль и др., 1965).
К2
R*-}-02 >RO2
Константа скорости (К2) этой реакции очень велика (107—108 моль/с), а
энергия активации практически равна нулю, поэтому при концентрации кисло-
рода в системе выше 10-6 MR’ превращается в перекисный радикал RO2. Этот
радикал в свою очередь взаимодействует с новой молекулой окисляющегося
соединения и превращается в гидроперекись (ROOH|), при этом вновь обра-
дуется радикал R*:
RO24-R1H--->ROOH+Ri.
При восстановлении гидроперекиси (ROOH) в присутствии восстановленного глю-
татйона образуется спирт (ROH).
В дрожжевой клетке этот процесс происходит при участии фермента глю-
татионредуктазы. Интересно отметить, что восстановленный глютатион и ци-
стеин оказывают на перекисное окисление комбинированное действие, выступая
одновременно как восстановитель трехвалентного железа и гидроперекисей, а
также как ингибитор свободных радикалов.
Способностью активировать молекулярный кислород обладают органические
оксикислоты с непредельной связью, как, например, диоксифумаровая и аскор-
биновая кислоты [120]. Реакция активирования кислорода протекает по сле-
дующей схеме:
Диоксифумарат Ч-О2->[х]*+О2~;
2Н+4-О’—-|-диокси фумарат->[х]’+Н2О2;
(х] *+02->д иоксис укцинат+О2
Правильность этих реакций подтверждают следующие наблюдения: если
спектр ЭПР [хр, возникающий при анаэробных условиях, немедленно исчезает,
то в реакцию вступает кислород. Следовательно, диоксифумаровая кислота в
199
присутствии кислорода активирует его вначале в О2 , затем в перекись водо-
рода. [х] • — свободный радикал, образованный при потере одного электрона
из диоксифумаровой кислоты.
Медь также катализирует окисление диоксифумарата посредством различ-
ных механизмов. Однако стимулирование этого процесса происходит посредст-
вом Мп2+, так как Мп2+ реагирует с О2~, образуя комплекс, обладающий
большой каталитической способностью:
О2~~-f- Мп2+4-2Н+->Мп3+4-Н2О2
Мп3+ 4- диоксифу марат->Мп2+ 4- [х]
Реакция [02—4-Мп2+] обладает гораздо большей каталитической активно-
стью, чем реакция [диоксифумарат 4-02->, [х]*4-02~]. При добавлении пер-
оксидазы скорость окисления диоксифумарата намного увеличивается. Это уве-
личение зависит главным образом от присутствия супероксида [120].
Супероксиддисмутаза (О2——О2"^ оксидоредуктаза) и каталаза (Н2О2 окси-
доредуктаза) играют важную роль для защиты от токсических форм кислорода
(О2“, *ОН«ОН—НО2 и Н2О2\ Действие супероксиддисмутазы на О2— превращает
его в перекись водорода (О2—4-О2“4-2Н+->Н2О24-О2). Затем действие катала <ы
приводит к разложению перекиси водорода до воды и кислорода.
Таким образом, функционирование этих двух ферментов обеспечивает жи-
вой клетке достаточно надежную защиту от наиболее токсических форм кис-
лорода.
Для ингибирования протекания окислительных процессов в вине необходи-
мо удалить ионы железа и меди. Это удается осуществить с помощью оклейки
вина желтой кровяной солью. Лучшим ингибитором является ЭДТА (этилендиа-
минтетрауксусная кислота|), которая образует неактивный комплекс с ионами
железа.
К неферментативным процессам относятся и процессы меланоидинообразо-
вания.
Меланоидины образуются при неэнзиматической реакции путем взаимодей-
ствия аминокислот с сахарами, что связано с потемнением вина. В процессе
деградации углеводов, а также в результате сахароаминной реакции в кислой
среде накапливается большое количество этих веществ. Меланоидины содержат
гидроксильные, карбоксильные и карбонильные группировки, а также эфирные
связи. Молекулярная масса их колеблется от 2 до 13 тыс.
Многие исследователи изучали реакцию Майяра на различных объектах и
выделили производные фурана, пирана, пиррола, пиразина, карбонила и других
гетероциклических и ароматических соединений.
Главной реакцией при взаимодействии сахаров с аминокислотами является
образование темноокрашенных продуктов — меланоидинов. При этой реакции
появляется специфический запах, увеличивается кислотность, выделяется угле-
кислота и повышается восстановительная способность. Появление редуктонов
связано с окислением сопряженной диендиоловой структуры, которая способна
полимеризироваться с образованием меланоидинов.
Исследования Е. Ходжа (1953) показали, что сахароаминная реакция про-
текает в три стадии: на первой стадии происходит конденсация аминокислоты
с углеводом с образованием N-гликозиламина. При нагревании N-гликозиламин
претерпевает внутримолекулярную перегруппировку Амадори и изомеризуется
r амин-1-дезокси-2-кетозу.
На втором этапе происходит дегидратация амин-1-дезокси-2-кетона и его
распад'на более низкомолекулярные соединения: оксиметилфурфурол, фурфурол,
диацетил, ацетоин, альдегиды, ацетон, фуран, оксифуран, левулиновую кислоту
и другие вещества, участвующие в побурении вина.
По литературным данным, в результате сахароаминной реакции образуется
более 50 веществ. На втором этапе сахароаминной реакции происходит распад
аминокислот по Штеккеру с образованием альдегидов. Таким образом, один из.
200
путей .деградации амин-1-дезокси-2-кетоз сопровождается образованием альде-
гидов, кетонов, спиртов, редуктонов. Альдегиды и редуктоны могут взаимодей-
ствовать с аминокислотами, образуя меланоидины с различным химическим
строением.
Так, по данным В. Л. Кретовича и Р. Р. Токаревой (1948), при мелано-
идиновой реакции были выделены с помощью бумажной .хроматографии фур-
фурол, оксиметилфурфурол, альдегиды (уксусный, пропионовый, изомасляный,
изовалериановый, коричный, сиреневый, ванилин, параоксибензальдегид, кони-
фериловый).
3. Н. Кишковский [45] среди летучих веществ сахароаминной реакции иден-
тифицировал метанол, этанол, ацетон и альдегиды (уксусный, пропионовый и
масляный)).
Исследования И. А. Егорова, В. Н. Ломинадзе, А. Ю. Скрипника [35] по-
казали, что в состав вновь образующихся веществ при нагревании до 190°С в
течение 2 ч водных растворов сахарозы без добавления аминокислот входят
формальдегид, уксусный и масляный альдегиды, ацетон и фурфурол. В присут-
ствии аминокислот эта реакция ускоряется во много раз и количество возни-
кающих продуктов увеличивается. Эти же авторы в другой работе [36] уста-
новили, что при нагревании сахарозы с аланином образуются метиловый, эти-
ловый, пропиловый и изобутиловый спирты, а при нагревании сахарозы с фе-
нилаланином, кроме указанных спиртов, возникает еще р-фенилэтиловый.
На конечном этапе меланоидинообразования происходит альдольная конден-
сация безазотистых соединений с образованием низко- и высокополимерных сое-
динений и альдегидаминная реакция с возникновением гетероциклических сое-
динений.
А. Спарк считает, что потемнение различных насыщенных и ненасыщенных
альдегидов с аминокислотами приводит к образованию пигментов, не содержа-
щих азота. Монокетозамины являются промежуточными продуктами, включая
аминный азот. Они определяют ход реакции при потемнении альдозаминных си-
стем. А. Спарк показал, что наиболее быстро с аминокислотами реагирует кси-
лоза, затем манноза, галактоза, глюкоза, сорбоза, фруктоза; сахароза и маль-
тоза почти не реагируют.
Помимо сахаров, в реакции меланоидинообразования принимают участие
органические кислоты, альдегиды, кетоны, фенольные соединения и другие ве-
щества. Кроме аминокислот, в этой реакции участвуют амины, пептиды, белки.
Методом гельфильтрации на сефадексе G-75 3. Н. Кишковский, Н. А. Ме-
хузла, Т. А. Сахарова (1966) из конечных продуктов меланоидиновой реакции
выделили различные фракции. Было показано, что эти фракции не содержат
свободных альдегидов и аминных групп и не реагируют с нингидрином.
В. И. Личев [56] с помощью гельфильтрации на сефадексе разделил про-
дукты меланоидиновой реакции на низкомолекулярные и на полимеры.
А. Спарк приводит схему меланоидинообразования, где показаны пути взаи-
модействия альдоз и аминокислот, включая образование из дикетозаминов раз-
личных дезоксиозонов и карбонильных соединений, которые затем дегидрируют-
ся и конденсируются в полимеры.
Более подробную схему образования меланоидинов приводит и Е. Ходжа,
которая подробно описана в книге 3. Н. Кишковского и И. М. Скурихина [46].
С. Б. Давидянц [22] предложил гипотетическую схему сахароаминной реак-
ции, которая протекает в четыре этапа. На каждом этапе образуются побочные
продукты, чередующиеся хиноидными связями, затем они стабилизируются, пре-
вращаясь в ароматические и гетероциклические соединения.
Несмотря на то что до настоящего времени проведено много работ по изу-
чению химического состава меланоидинов, до сих пор еще не установлена их
химическая природа.
Меланоидины в виноделии, по мнению М. А. Герасимова (1951), имеют
важное значение.
Крепким и десертным винам (кагору, мадере и токайским) меланоидины
придают специфический вкус и аромат.
Отдельные аминокислоты и продукты деградации сахаров, участвующие в
меланоидинообразовании, играют важную роль в формировании специфических
тонов и оттенков аромата и вкуса.
201
В сахароаминной реакции участвуют продукты, возникающие в результате
окислительного дезаминирования аминокислот и деградации сахаров в процессе
нагревания. В. Л. Кретович и Р. Р. Токарева (1948[) показали на модельных
опытах, что когда в растворах присутствуют лейцин и валин, то образуются
специфические тона «корки ржаного хлеба».
Таким образом, при меланоидиновой реакции образуются не только высоко-
молекулярные соединения — меланоидины, но и низкомолекулярные летучие ве-
щества различного строения. Эти летучие вещества участвуют в формировании
вкуса и букета вина.
Глава 19
ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ВЕЩЕСТВ,
ОБУСЛОВЛИВАЮЩИХ БУКЕТ ВИНА
Букет и аромат вина образуются из эфирных масел винограда, из вторич-
ных продуктов алкогольного брожения, а также из веществ, возникающих в
процессе выдержки и старения. Различают букеты по происхождению (первич-
ный букет) и образованию (букет брожения, выдержки и старения).
Первичный букет образуется из эфирных масел винограда; он связан с сор-
том и характеризует букет молодого вина, обладающего фруктовым ароматом,
часто исчезающим при выдержке.
Букет брожения, или вторичные букетистые веществ», возникает во время
алкогольного брожения и связан главным образом с превращением углеводов
и аминокислот под воздействием винных дрожжей.
Букет выдержки образуется при хранении вина вТдубовых бочках, а букет
старения — при выдержке в бутылках или герметически закрытых эмалирован-
ных цистернах. Букет старения связан с протеканием окислительно-восстано-
вительных процессов. Это последняя стадия развития вина, при которой оно
достигает особой тонкости.
Вещества, образующиеся в процессе
алкогольного брожения
Процесс алкогольного брожения сопровождается многими биохимическими
реакциями, в результате которых образуются различные вещества. Специфич-
ность этих реакций обусловлена наличием в среде ферментативных систем, ко-
торые предопределяют ход и направление биохимических процессов в ходе бро-
жения. В связи с этим важная роль в формировании качества вина принадле-
жит не только главному продукту брожения — этиловому спирту, но и вторич-
ным и побочным продуктам брожения. Химизм образования вторичных побоч-
ных продуктов алкогольного брожения изучали многие ученые.
В. 3. Гваладзе (1936) и Л. Женевуа (1936|) считают, что основным соеди-
нением, которое участвует в образовании вторичных продуктов, является ук-
сусный альдегид, от наличия которого зависит как образование этилового спир-
та, так и вторичных продуктов. С. В. Дурмишидзе (1963) показал, что из
меченого уксусного альдегида образуются кислоты цикла Кребса: уксусная, ян-
тарная, фумаровая, яблочная, лимонная, а также гликолевая кислота, глицерин,
2,3-бутиленгликоль.
Под воздействием дрожжей в среде образуются высшие спирты и летучие
кислоты алифатического ряда, которые в присутствии эстераз этерифицируются
с образованием сложных эфиров, обладающих фруктовым ароматом. Превра-
щение аминокислот в высшие спирты протекает не только путем окислительного
дезаминирования, но и путем переаминирования аминокислот с кетокислотами.
Дрожжи из аминокислот способны образовывать целый ряд соединений. Аспа-
рагиновую кислоту они превращают в пропиловый цпирт, глютаминовую — в а-
кетоглютаровую и янтарную кислоты, изолейцин — в активный пентанол, лей-
202
цин — в изопентанол, серин — в этиленгликоль, аргинин — в янтарную кислоту
и 2,3-бутиленгликоль, фенилаланин — в 0-фенилэтанол, тирозин — в тиразол,
триптофан — в р-индол и триптофол, гистидин — в р-имидазолэтанол.
Нами было показано, что р-фенилэтанол и п-оксифенилэтанол оказывают
влияние на букет вина, в частности на букет шампанского.
Известно, что большая часть ароматических веществ вина возникает при
брожении из имеющихся в виноградном соке углеводов, аминокислот и органи-
ческих кислот.
В процессе алкогольного брожения некоторые компоненты эфирного масла
остаются нетронутыми, но большинство из них подвергается изменению под
действием дрожжей. К этим веществам относятся углеводороды, терпены, кар-
бонильные соединения, а также вещества, содержащие двойные связи.
В винограде было найдено 25 углеводородов, а в вине не было обнаруже-
но ни одного. Видимо, дрожжи их ассимилируют или же подвергают их транс-
формации. При брожении сока ненасыщенные альдегиды гексаналь и гексеналь,
а также цис- и транс-гексен-2ол-1 превращаются в гексанол. Количество послед-
него при брожении сусла и формировании вина увеличивается.
Подвергаются изменению также линалоол, гераниол, нерол и а-терпинеол.
Дрожжи частично превращают их в эфиры. Так, например, из линалоола они
образуют линалилацетат, из гераниола — геранилацетат. Эфирные масла вино-
града в процессе брожения превращаются в другие вещества, обладающие силь-
ным специфическим букетом.
Дрожжи в процессе алкогольного брожения синтезируют значительные ко-
личества новых веществ, часть которых сходна с соединениями, содержащими-
ся в винограде. К ним относятся в первую очередь высшие спирты и основные
компоненты сивушных масел. Они образуются как из аминокислот, так и из
углеводов.
Известно, что бутиловый и амиловый спирты составляют 85% всего ком-
плекса сивушных масел, формирующих букет вина и коньяка (Е. Пейно, 1959).
Содержание сивушных масел в винах колеблется от 100 до 630 мг/л. Очень
большое количество их придает вину грубость. Следовательно, происходящие
при созревании и старении вина реакции этерификации облагораживают резкий
запах сивушных масел за счет накапливающихся сложных эфиров.
Кроме того, в вине накапливаются свободные и этерифицированные альде-
гиды (ацетали|), кетоны, спирты терпенового ряда (цис- и транс-фарнезол), лак-
тоны и фураноны, циклические и алициклические вещества, играющие важную
роль в образовании букета вина.
Зависимость между строением органических соединений
'и их букетом и вкусом
Существует определенная связь между химической структурой вещества и
«го вкусом и ароматом. Хотя бывают случаи, когда одно и то же соединение с
однородной химической структурой обладает разными запахами, и наоборот —
вещества, имеющие одинаковые запахи, отличаются химическим строением. Ис-
ходя из этого, все попытки классифицировать запахи, построенные на химиче-
ском строении пахучих веществ, были неудачными.
По химическому строению и запаху пахучие вещества делятся на три
группы:
вещества, имеющие сходную химическую структуру и обладающие одинако-
выми запахами. Примером может служить у-валеролактон и 6-валеролактон;
вещества, обладающие сходной структурой, но по запаху различные. К этой
группе веществ относятся гераниол и нерол, обладающие цис- и транс-изоме-
рией, но отличающиеся запахом;
вещества, обладающие разной химической структурой, но имеющие одина-
ковые запахи. К этому классу веществ относится цитраль и р-фенилвалериано-
вый альдегид, оба обладают лимонным запахом.
Различают следующие запахи: цветочный, фруктовый, запах мускуса, ли-
монный, мятный и др. Запахи обычно редко бывают чистыми, они очень разно-
203
образны, и для определения их пользуются субъективными ощущениями. Даже
когда запахи сходны их можно различать по оттенкам.
Еще в начале XX в. было высказано предположение, что вещества, вызы-
вающие ощущение запаха, действуют своими осмофорными группами на рецеп-
торы, расположенные в обонятельных клетках носовой полости человека. Для
того чтобы почувствовать запах, необходимо, чтобы душистое вещество вошло
в соприкосновение с обонятельными рецепторами.
В последнее время имеется подтверждение наличия осмофорных групп в
молекуле пахучего вещества, которые делают его душистым (А. И. Бронштейн,
1950, Р. М. Мазитова, 1966). Таких групп насчитывается около 18. В винах
встречаются алкогольная, альдегидная, кетонная, сложноэфирная, кислотная,
лактонная, фенольная и аминная функциональные группы.
Известно, что химические соединения в концентрированном и в разбавлен-
ном состоянии пахнут различно. Примером может служить индол (триптофол),
обладающий очень неприятным запахом в больших концентрациях, а при раз-
бавлении и в сочетании с другими веществами, приобретающий очень тонкий
приятный аромат. Объясняется это тем, что химические соединения в разбав-
ленном и концентрированном состоянии воспринимаются органами чувств раз-
лично. Длительность ощущения будет тем больше, чем медленнее пахучее ве-
щество поступает в органы обоняния и чем больше времени требуется для вос-
приятия запаха. Из концентрированного раствора насыщенные пары пахучего
вещества поступают в органы обоняния в больших концентрациях, быстро на-
сыщают первичные осмоцепторы и вступают в реакцию со вторичными осмо-
цепторами. Этим можно объяснить, почему многие соединения в концентриро-
ванном и разбавленном состоянии пахнут различно (Н. М. Сисакян, 1963).
Большое значение придают химической структуре пахучего вещества аро-
матических спиртов, у которых гидроксильная группа расположена в боковой
цепи. Эти спирты- имеют более приятный аромат, чем алифатические. Так, Р-фе-
пилэтанол и гг-оксифенилэтанол характеризуются запахом розы.
Алифатические спирты содержат гидроксильные группы, которые распола-
гаются в молекуле следующим образом: у первичных спиртов —СН2ОН; у вто-
ричных >СНОН; у третичных —> СОН. В зависимости от положения гидро-
ксильных групп вторичные и третичные спирты отличаются по запаху от нор-
мальных и изомерных первичных спиртов. Так, например, первичный бутиловый
спирт отличается от вторичного бутилового, или метилэтилкарбинола менее ин-
тенсивным запахом. Спирты только с одной гидроксильной группой обладают
запахом, в то время как спирты с двумя и тремя гидроксильными группами
не имеют запаха. Примером могут служить этиленгликоль и глицерин.
Следует отметить, что с увеличением алифатической углеродной цепи спир-
тов запах становится приятнее. Известно, что бутиловые и амиловые спирты и
их изомеры обладают неприятным резким запахом. Спирты с более длинной
цепочкой как, например, гексиловый, гептиловый, октиловый, нониловый и де-
циловый имеют аромат сравнительно более приятный, с цветочным запахом при
сильном разбавлении. Разбавленные растворы октилового, нонилового и деци-
лового спиртов приобретают -запах розы, фиалки, апельсиновых и мандарино-
вых корок.
Значительное влияние оказывает разветвление углеродной цепи, особенно
наличие третичных атомов углерода. Альдегиды с разветвленной цепью агомов
углерода обладают более сильным и приятным запахом, чем альдегиды с пря-
мой цепью, например, миристиновый альдегид имеет очень слабый запах, в то
время как его изомер с тремя третичными атомами углерода обладает шрият-
ным свежим и сильным запахом.'
Большое значение придают наличию ненасыщенных соединений, т. е. на-
личию двойных и тройных связей в цепи, а также их расположению. Например,
акролеин (—СН = СН—CHQ) обладает чрезвычайно острым запахом. С увели-
чением молекулярной массы острый запах уменьшается, кротоновый альдегид
(СН2—СН = СН—СНО) обладает менее резким запахом, чем акролеин.
Алифатические альдегиды низших гомологов от С] до С5 в неразбавленном
виде обладают острым удушающим запахом. При разбавлении водой удушаю-
щий запах исчезает за исключением уксусного альдегида. У муравьиного, про-
пионового, масляного и валерианового альдегидов при разбавлении появляется
204
приятный оттенок, особенно у изовалерианового альдегида. Альдегиды с угле-
родными атомами С6—С8 обладают более интенсивным запахом. Смесь альде-
гидов жирного ряда имеет фруктовый аромат и приятный оттенок.
По мере возрастания молекулярной массы у алифатических альдегидов по-
являются цветочные тона при сильном разбавлении. Примером служат децило-
вый и ундециловый альдегиды. Присутствие двойных связей вызывает усиление
запаха, примером может служить коричный альдегид.
Известно, что эфирная связь усиливает фруктовый аромат. Высокомолеку-
лярные эфиры обладают более приятным фруктовым запахом, чем низкомолеку-
лярные. Из этиловых эфиров высших жирных кислот носителем аромата яв-
ляются этилкапронат, этилкаприлат, этилкапринат, этилпеларгонат.
Сложные этиловые эфиры высших жирных кислот с двумя химическими
связями обладают очень нежным ароматом. Например, этиловые эфиры лино-
левой и линоленовой кислот придают шампанскому подсолнечный тон [80] _
Эфиры сивушных спиртов — бутилацетат, амилацетат, гексилацетат, гексилбути-
рат, гептилацетат, изоамилкапронат, изоамилкаприлат, изобутиллаурат, изоамил-
лаурат, гексиллаурат, гексилмиристат — также обладают фруктовым и цветоч-
ным ароматом. Эфиры, образованные из фенольных кислот, пахнут сильнее, чем
эфиры алифатических кислот. Так, эфиры антраниловой кислоты — метилан-
транилат и этилантранилат — имеют характерный запах цветков апельсинового
дерева.
Особенно приятно пахнут терпеноидные соединения и их эфиры, которые
встречаются в мускатных винах. В качестве примера можно указать на лина-
лоол и гераниол. Эти два терпеновые спирта отличаются расположением одной
спиртовой группы, а также оптической активностью вследствие чего обладают
различным ароматом. Линалоол имеет запах ландыша, а гераниол — розы.
Помимо химических свойств, пахучие вещества обладают и физическими
свойствами: летучестью, растворимостью, сорбционностью, а также диффузией.
Сторонником адсорбционной теории обоняния является Б. Манкриф (1961).
Влияние химической структуры вещества на обоняние лучше изучено, чем
влияние на вкусовые ощущения. Причем вкусовые ощущения менее разнообраз-
ны, чем запахи. Различают четыре основных ощущения: сладкое, кислое, горь-
кое и соленое. Бывает вкус и смешанным — сладко-кислый, горько-соленый.
Различают и дополнительный привкус — острый, металлический, щелочной и
вяжущий. Последним часто обладают вина, которые содержат большое коли-
чество дубильных веществ.
Кислый вкус, присущий сухим винам, обусловливается как органическими
и неорганическими кислотами, так и их солями. Активная кислотность зависит
от присутствия иона Н+. Существует определенная зависимость между концент-
рацией водородных ионов и степенью ощущения кислотности. Бывают и такие
соединения, которые обладают кислым вкусом, хотя и не содержат ионов Н+,
как, например, барбитуровая кислота. Она имеет кислый вкус, благодаря на-
ходящимся по соседству с Н+-атомом отрицательным группам.
Аминокислоты, хотя и содержат карбоксильную группу, не обладают кис-
лым вкусом. Исключение составляют аспарагиновая и глутаминовая кислоты,
СООН
когда —СН -группа соединена с кислым радикалом —СН2—СООН.
I
nh2
На вкус вещества заметное влияние оказывает оптическая изомерия. На-
пример, /-триптофан имеет горький вкус, d-триптофан — безвкусный, а смесь
d- и /-триптофана обладает сладким вкусом, d-лейцин сладкий, /-изолейцин
имеет горьковатый привкус. Аминогруппа придает соединению сладкий привкус,
когда она находится близко к карбоксильной группе. Примером могут служить
/СООН
«-аминокислоты
XNH2 .
Сладким вкусом обладают и такие соединения, которые содержат (ОН)-
группы. Примером может служить глицерин, 2,3-бутиленгликоль, этиленгликоль,
сахара и др.
205
Присутствие фенильной группы в глицерине придает ему горький вкус.
Некоторые исследователи считают, что вкус появляется при увеличении моле-
кулярной массы.
Эфиры с фруктовым ароматом часто бывают сладкими (этилбутиратф. Слад-
кий вкус обычно связан с наличием следующих атомных групп:
zNH2
(ОН)Х; >С< ; —N< [[ ; =N—ОН; —CN.
ХСООН XN
По аналогии с запахом соответствие между вкусом и химической структу-
рой разных веществ наблюдается далеко не во всех случаях. С этой точки зре-
ния и вкусовые вещества можно разделить на следующие три группы:
вещества, сходные между собой как по химическому строению, так и по
вкусу. Одинаковым сладким вкусом обладают d- и /-аланин;
вещества, имеющие неодинаковую химическую структуру, но обладающие
одинаковым вкусом. Сладким вкусом обладают гликоль и глицерин;
вещества, имеющие одинаковую химическую структуру, но обладающие раз-
личным вкусом. J-Валин имеет слабый горький вкус, /-валин — сладкий.
Таким образом, вкус определяется не только наличием химической структу-
ры, но и пространственным расположением атомов в молекуле.
Вещества, характеризующие букет
(различных типов вин
Наши знания о химической природе букета вина очень ограничены. Этот
вопрос с давних времен привлекает внимание химиков и энологов. Первые ис-
следования относятся к началу XIX в. Так, Ю. Либих выделил энантовый эфир
из вина. Позднее было установлено, что это соединение очень сложное по хи-
мическому составу, состоит-из ряда жирных кислот: капроновой, каприловой,
каприновой, энантовой и др. Энантовый эфир обладает резким неприятным вку-
сом и характерным запахом вина. По мнению Ю. Либиха, этот эфир придает
ему специфический запах, но не обусловливает букет.
В середине XIX столетия М. Бертло высказал предположение, что содер-
жание эфиров находится в прямой зависимости от качества вина. По мнению
этого автора, в образовании букета участвуют нейтральные летучие эфиры, в то
время как кислые эфиры оказывают влияние на улучшение вкуса и обусловли-
вают гармоничность.
При исследовании экстракта вин М. Бертло нашел следующие классы сое-
динений: сивушные и эфирные масла, состоящие из энантового эфира, амило-
вого спирта, органических кислот и нейтральных веществ. По мнению М. Берт-
ло, эти вещества играют важную роль в образовании букета и вкуса вина.
Несмотря на то что с тех пор как были опубликованы работы М. Бертло про-
шло более 100 лет, у нас в стране и за рубежом цитируют его. Недавно вышла
работа Усселио-Томасса, в которой приводятся формулы М. Бертло для опре-
деления уровня этерификации при установлении возраста вин по содержанию
эфиров, а также — сведения об органолептической роли этилацетата.
В 1903 г. У. Гайон считал, что общее количество эфиров в вине не соот-
ветствует их качеству. Он также считал, что если какой-нибудь эфир и оказы-
вает положительное влияние на органолептические свойства вина, то все эфиры
такого действия оказать не могут. Наблюдения этого автора показали, что вина,
наиболее богатые эфирами, менее качественные.
Такое же мнение у В. М. Щербакова, который утверждает, что количество
эфиров не имеет никакого отношения к качеству вина. Он считает, что орди-
нарные вина могут содержать гораздо больше эфиров, чем марочные старые
вина хорошего качества.
Е. Пейно на основании проведенных им опытов пришел к заключению, что
никакой определенной зависимости между качеством вина и содержанием в
нем эфиров, как общих, так и средних, не наблюдается. Единственный эфир,
который оказывает влияние на вкус вина, — это уксусноэтиловый, он придает
вину неприятный запах и кислый вкус.
206
По мнению Е. Пейно, букет выдержанных вин не определяется количеством
эфиров, а зависит только от содержания в них неомыляемых веществ. Этим
Е. Пейно отверг существовавшее до 1937 г. мнение о влиянии эфиров на каче-
ство вина. Но вместе с тем он не смог определить, какие же вещества обус-
ловливают букет и вкус вина.
Исследования М. А. Герасимова (1939), по содержанию эфиров в старых и
молодых образцах коллекционных вин (урожая 1929—1941 гг.) показали, что
в старых бутылочных винах эфиров содержится больше, чем в бочечных моло-
дых винах. Исходя из этого М. А. Герасимов и Н. Н. Простосердов [69] счи-
тают, что в состав букетистых веществ, помимо неомыляемых эфиров, входят
еще несложные эфиры, которые придают вину цветочные тона.
С развитием газожидкостной хроматографии и других новых методов ана-
лиза стало возможно открывать в вине все больше и больше сложных эфиров,
особенно высококипящих. Так, А. К. Родопуло, Т. А. Кормакова и И. А. Егоров
[80] нашли в шампанских винах около 28 сложных эфиров. В состав этих
эфиров входят, помимо этиловых, еще изобутиловые, бутиловые, изоамиловые,
амиловые, гексиловые и другие сложные эфиры высших спиртов. Эти эфиры
обладают приятным фруктовым запахом и, возможно, что некоторые из них
участвуют в образовании букета вина.
Е. Пейно в своих исследованиях определял только общее количество эфи-
ров, а также средние и кислые эфиры. Конечно, суммарное определение, как
и средние величины, не дает возможности раскрыть все особенности и специ-
фику вина.
Нами [80] показано, что не все сложные эфиры участвуют в образовании
букета. Букет шампанских вин обусловливают высококипящие сложные эфиры,
особенно этиллинолеат.
В процессе выдержки вина в бочках соотношение между низкокипящими и
высококипящими эфирами меняется. Содержание низкокипящих эфиров умень-
шается, а высококипящих увеличивается. При выдержке вина происходит эте-
рификация с образованием высокомолекулярных эфиров. Эти эфиры обладают
интенсивным ароматом.
Принимая во внимание многообразие взаимодействий, возможных м*ежду
различными спиртами и кислотами, можно представить себе пути образования
многих эфиров.
Действительно, в вине встречается большое число эфиров, но содержание
отдельных эфиров очень незначительно. Как это было показано в нашей ра-
боте [80], содержание в вине некоторых сложных эфиров очень мало (от 0,01
до 4,4 мг/л), особенно эфиров сивушных спиртов и кислот. Исключение состав-
ляют этилацетат, этилмалат, этилсукцинат и этиллактат. Количество последнего
иногда достигает 200 мг/л. По нашему мнению, содержание больших количеств
этого эфира в вине портит его вкус и букет.
В настоящее время особое внимание обращают на лактоны. Это внутренние
эфиры, в образовании которых участвуют оксикислоты.
А. Уэбб, П. Риберо-Гайон, Ж. Буадрон (1963|) нашли в выдержанных бор-
доских винах у-бутиролактон. Это вещество очень приятно пахнет и является
результатом жизнедеятельности дрожжей. Эти авторы считают, что бутиролак-
тон участвует в образовании букета вина. Особенно много лактонов было най-
дено в хересных винах. Этим соединениям приписывают специфический херес-
ный тон.
В настоящее время особое внимание обращают на цис- и транс-Р-мегил-у-
октолактон, который встречается в коньячных спиртах [116]. Некоторые иссле-
дователи считают, что эти соединения участвуют в образовании букета
коньяков.
Несмотря на то что многие исследователи интересовались химической при-
родой букетистых веществ, долгое время эта проблема оставалась неразрешен-
ной. Объясняется это тем, что вещества, обусловливающие букет вина, содер-
жатся в очень незначительных количествах и обычными химическими и физиче-
скими методами их очень трудно определить.
В связи с этим немецкие исследователи (К. Хенинг, 1942; А. Фрей и Б. Ваг-
нер, 1942), используя 360—1000 л вина, выделили значительное количество аро-
матообразующих веществ. Идентификацию проводили колориметрическими и
207
микрохимическими методами. В составе душистых веществ вина Мюллер-Тур-
гау присутствовали: уксусный и коричный альдегиды, ацетон, ванилин, мета-
нол, изопропанол, изопентанол, а-терпинеол, а также муравьиная, уксусная,
пропионовая, н-масляная, капроновая, каприловая, каприновая и лауриновая
жирные кислоты.
Е. Байер и К. Раутер (1957) идентифицировали эфиры этих кислот в виде
гидроксамовых кислот. Известно, что этим методом можно определять эфиры
только по кислотному остатку. Установлено, что жирные кислоты, особенно ва-
лериановая и ароматические кислоты, влияют на качество вина.
Р. Икеда и др. (1956), А. Уэбб и др. (1966), подвергнув дистилляции на
специальной колонке большие количества виноградного сока и вина (1000—
1500 л), выделили 120 л сивушного масла.
Из этого сивушного масла после фракционной перегонки (в пределах од-
ного градуса) в специальной автоматической колонке получили 108 фракций.
Во фракциях были идентифицированы по точке кипения и химическим путем
следующие соединения: из спиртов — метанол, н-пропанол, метил-З-пропанол-1,
метил-З-бутанол-1, метил-2-бутанол-1, н-бутанол, н-пентанол, н-гексанол; из
эфиров — этиловые эфиры капроновой, каприловой, лауриновой, пеларгоновой
и миристиновой кислот, амиловые и изоамиловые эфиры капроновой и капри-
ловой кислот, а также р-фенилэтилацетат.
Несмотря на то что эти исследователи определили в винах много компо-
нентов, они не смогли установить, какие именно вещества участвуют в обра-
зовании букета.
Примерно такие же результаты были получены К. Меске и др. (1960|). Они
также не смогли установить связи между составом букета и качеством вина.
При исследовании букетистых веществ важным является подготовка пробы.
В этом случае пользуются экстракцией растворителями, вакуумной перегонкой
с паром, дистилляцией, улавливанием душистых веществ на адсорбентах или
конденсированием их на охлаждаемых ловушках и т. д.
Следует указать, что растворители по-разному экстрагируют ароматообра-
зующие вещества. Так, например, пентан хорошо извлекает высшие спирты и
плохо — этанол, эфиры и кислоты; диэтиловый эфир хорошо экстрагирует эфи-
ры и кислоты. Последние хорошо извлекаются метиленхлоридом. Исходя из
этого, мы пользовались смесью пентан—эфир (1:1). При использовании таких
смесей могут быть искажения результатов, если не удалять из экстракта кис-
лоты, так как в их присутствии могут этерифицироваться спирты. Более быст-
рый и удобный способ — это прямой ввод пробы вина или коньячного спирта
(или их паров) в газовый хроматограф с капиллярной колонкой. Но сущест-
вующие хроматографы не столь чувствительны, чтобы регистрировать полный
химический состав исследуемого вещества. При прямом вводе вина в аэрограф
фирмы «Вариан-1800» (США) мы получили 13—15 пиков, а коньячного спир-
та — 33—35. Эти же образцы при экстракции дают более 100 пиков.
А. Рапп и др. [151] использовал для извлечения эфирных масел из вино-
града фреон-11; полученный экстракт при хроматографировании давал около
300 пиков.
При вакуумной дистилляции происходят большие потери эфирных масел
из-за неполного улавливания летучих веществ ловушками. Многие исследова-
тели отказались от этого метода.
СУХИЕ СТОЛОВЫЕ ВИНА
В сухих винах сбраживание сахара протекает полностью, поэтому в них
образуется значительное количество вторичных и побочных продуктов броже-
ния. Показано [67], что в аромате сухих столовых вин важное значение имеет
количество не только сивушных спиртов и сложных эфиров, но и терпеноидных
соединений.
А. Уэбб и др. (1964), исследуя бордоские вина из одного района, но раз-
ных годов урожая, наблюдали, что с возрастом качество вина улучшается и
одновременно увеличивается содержание у-бутиролактона, этиллактата и этил-
208
ацетата. При этом количество изопентанола уменьшается. Они считают, что бу-
тиролактон и этиллактат улучшают качество бордоских вин.
С. Мюллер и др. (1971) из сухих столовых вин Каберне Совиньон и Ка-
берне рубиновое выделил 58 компонентов, в том числе 3-метилтиопропанол,
имеющий запах сырого картофеля. Добавление в сусло метионина при сбражи-
вании увеличивало количество 3-метилтиопропанола, прибавление же глютами-
новой кислоты способствовало увеличению 4-оксимасляной кислоты и у-бутиро-
лактона. Возможность образования этих соединений по схеме Эрлиха и Стик-
ланда отрицается. Предполагается, что синтез 4-оксимасляной кислоты и у-лак-
тона протекает по схеме Торна. В вине из винограда сорта Каберне были най-
дены 5-эндоксидигидро-2-(ЗН)-фуранон и 6-метилдигидро-2,5-(ЗН)-пирандион.
Дж. Ван-Вик, Р. Кепнер и А. Уэбб (1967|), исследуя букет столового вина
Рислинг, выделили 55 компонентов. Основные из них следующие: спирты — н-
пропанол, 2-метилпропанол-1,2-метилпропанол-1, 2-метилбутанол-1, 3-метилбута-
нол-1, н-гексанол, лево-2,3-бутандиол и р-фенилэтанол, в небольших количествах
присутствовали 3-метилпентанол, 4-метилпентанол, мезо-2,3-бутандиол и лина-
лоол; эфиры — этилацетат, изоамилацетат, н-гексилацетат, этил-н-капронат,
1,3-пропандиолмоноацетат и Р-фенилэтилацетат.
В небольших количествах присутствовали н-пропилацетат, изобутилацетат,
2-метилбутилацетат, лево-2,3-бутандиолмоноацетат, этиллактат, этил-3-оксибути-
рат, этил-2-оксиизокапронат, этил-н-капринат, диэтилсукцинат, диэтилмалат,
диэтилфталат, диметилфталат и у-бутиролактон.
Кроме спиртов и эфиров, еще были найдены уксусный альдегид, диэтилаце-
таль и N-этилацетальамид.
Эти же исследователи идентифицировали в значительных количествах уксус-
ную, н-капроновую, н-каприловую, н-каприновую и янтарную кислоты, в не-
больших количествах присутствовали: муравьиная, пропионовая, изомасляная,
молочная, 2-оксиизокапроновая, пеларгоновая, яблочная, 2-метилмасляная, изо-
валериановая. Они также считают, что капроновая, каприловая и каприновая
кислоты и их эфиры улучшают качество столового белого вина Рислинг, а 2-3-
бутандиол придает ему бархатистость.
Д. Штерн и др. [171] исследовали качественный состав летучих веществ
вина Цинфандель. Анализы проводили методом газожидкостной хроматографии
и масс-спектроскопии пентановых экстрактов, полученных из молодого вина и
после выдержки в течение двух лет.
Интересно отметить, что молодое вино содержало 53 компонента, через
3 мес выдержки количество компонентов уменьшилось до 24, а после 6 мес
хранения увеличилось до 59; затем после 9 мес хранения снова несколько
уменьшилось и, наконец, после двухгодичной выдержки содержание летучих ве-
ществ увеличилось до 66 компонентов. Увеличение происходило главным обра-
зом за счет эфиров и ацеталей.
Еще в 1971 г. нами [8] было показано, что при выдержке мадеры коли-
чество сложных эфиров и ацеталей значительно увеличивается.
Д. Штерн и его сотрудники впервые обнаружили в вине Цинфандель цик-
логексилацетат, метилэтилсукцинат, дипропилсукцинат, этил-3-метилтиопропио-
нат и этилакилтиопропионат.
Другие исследователи [164], применяя аналогичную методику для опреде-
ления и идентификации нейтральных компонентов, обусловливающих аромат
вина Кариган, нашли следующие соединения: этил-2-окси-З-фенилпропионат,
этил-3-бутират, 2,3-бутандиолмоноацетат, диэтилсукцинат, диэтилмалат, у-бути-
ролактон, 4-карбэнтокси-4-оксимасляной кислоты-у-лактон, 4,5-диоксигексоновой
кислоты-у-лактон, а также 3-окси-4-фенилбутан-2-оне.
Путь образования трех лактонов лежит через глютамат и 2-кетоглутарат.
В винных и особенно в хересных дрожжах содержится энзиматическая си-
стема, которая катализирует превращение глютамата и 2-кетоглютарата в соот-
ветствующие лактоны.
Р. Симпсон [168] исследовал вино Рислинг в течение 10 лет, начиная с
1967 по 1977 гг., и показал, как изменяются ароматобразующие вещества при
выдержке. Он установил, что содержание диметилсульфида, гексанола, фурфу-
рола, оксилиналоола и нерола, бензальдегида, этилкапроната, 1,1,6-триметил-
1,2-дигидронафталина уменьшается. Количество изоамилацетата, гексилацетата,
<8—993
209
уксусной кислоты, этил-н-каприната, этил-н-лаурата и ₽-фенилэтанола в процессе
выдержки увеличивается.
При исследовании нами [82] букетобразующих веществ сухих вин Каберне
и Рислинг установлено, что количество сложных эфиров жирных кислот, по-
явившихся в процессе брожения, при выдержке уменьшается, а количество-
сложных эфиров уксусной, молочной и дикарбоксильных кислот (янтарной и
яблочной) увеличивается. Содержание метил-2-бутанол-1 и метил-З-бутанол-1
уменьшается. В вине Рислинг найдены а-терпинеол и гераниол, а в Каберне^
кроме них, идентифицирован Р-ионон. Количество этих веществ в процессе вы-
держки также уменьшается.
Основную роль в образовании букета сухих вин играют не только указан-
ные выше кислоты и их эфиры, а также вещества, обладающие органолепти-
ческими свойствами и только в восстановленной форме.
Таким образом, для столовых сухих вин важное значение имеет интенсив-
ность протекания окислительно-восстановительных процессов при их выработке
и выдержке.
ИГРИСТЫЕ ВИНА (ШАМПАНСКОЕ)
Шампанское — малоокисленное вино. Еще А. М. Фролов-Багреев указывал,
что технология этого игристого вина требует большой осторожности в отно-
шении поступления в него кислорода воздуха, поэтому все технологические
операции следует проводить в анаэробных условиях [89].
А. Бертран (1968 г.) и С. П. Авакянц (1970 г.) считают, что душистые ве-
щества, содержащиеся в надвинном пространстве, определяют букет шампан-
ского. Среди этих веществ основное количество приходится на легколетучие ве-
щества — этанол, этилацетат, изопентанол, изобутанол, метанол, альдегиды,
пропанол, этилформиат, изоамилацетат и др. Авторы считают, что эти вещества
обладают определенной упругостью пара; аромат, который ощущает дегустатор,
создается летучими веществами, перешедшими из вина в газовое пространство.
Мы считаем, что эти летучие вещества не могут полностью охарактеризовать
качество вина и его букет.
Из литературных источников, а также на основании наших исследований
химического состава шампанских вин видно, что эти легколетучие вещества со-
держатся во всех винах. Ординарное вино может их содержать даже больше,
чем выдержанное.
Согласно нашим представлениям, букет вина, в частности шампанского,
зависит главным образом от содержания в нем высококипящих компонентов
(Родопуло и др., 1965|). Нами в 1975 г. были исследованы вещества, обуслов-
ливающие букет шампанского, приготовленного бутылочным способом на заво-
дах «Абрау-Дюрсо», Тбилисском, Артемовском, а также приготовленного резер-
вуарным способом на Московском, Ташкентском, Харьковском и Киевском за-
водах шампанских вин. В качестве эталона пользовались французским шам-
панским фирм «Реймс» и «Айла» [80]. На рис. 1 и 2 приведены газожидкост-
ные хроматограммы этих образцов.
Во всех образцах содержатся легколетучие вещества, которые, как указы-
вают А. Бертран и С. П. Авакянц, участвуют в образовании букета, а качест-
во образцов шампанского резко отличается между собой.
Рассматривая эти хроматограммы, можно видеть, что характер пиков в на-
чальной части (легколетучие вещества) почти везде одинаков. В хвостовой
части характер пиков меняется и они различаются между собой в зависимости
от качества образца. Чем выше качество шампанского, тем больше число и
величина последних пиков, следовательно, и количество компонентов больше.
Так, в шампанском фирм «Реймс», «Айла» и завода «Абрау-Дюрсо» количество
и величина хвостовых пиков больше, чем в других образцах, и качество их
наивысшее.
В шампанском Московского завода количество хвостовых пиков на хро-
матограмме гораздо меньше, качество его несколько хуже, чем шампанского
завода «Абрау-Дюрсо». Что касается шампанского Харьковского, Киевского и
Артемовского заводов, то у них на хроматограммах хвостовые пики отсутст-
210
вуют или они очень малы. Качество этих образцов значительно хуже, чем пре-
дыдущих. В хвостовые пики (с 59 до 64) входят цис- и транс-фарнезол, гек-
силмиристат и этиллинолеат. Остальные пики неидентифицированы. У шампан-
ского фирмы «Реймс» содержание ifwc-фарнезола высокое. Источником этого
соединения являются дрожжи. При выдержке на дрожжах в течение трех лет
я больше в результате автолиза дрожжей в шампанском появляются сесквитер-
пеновые соединения (цис- и транс-фарнезол), которые усиливают аромат. Осо-
бо важное значение имеет этиллинолеат. Он придает шампанскому характерный
рис. 1. Газожидкостная хроматограмма спиртов, сложных эфиров, альдеги-
дов и терпеноидных соединений в образцах резервуарного шампанского раз-
ных заводов:
а — Московского; б — Ташкентского; в — Харьковского; г — Киевского
подсолнечный тон. Во французском шампанском фирмы «Реймс» содержание
/{нс-фарнезола и этиллинолеата достигает 8,8 мг/л.
Согласно нашим данным, качество шампанского в основном зависит от этих
веществ. Нами установлено, что подсолнечный тон, который характеризует ка-
чество шампанского, зависит от содержания в вине этиллинолеата. Так, шам-
панское фирмы «Реймс» содержало его до 8 мг/л, Советское шампанское за-
вода «Абрау-Дюрсо» — 2,5 мг/л. Эти образцы имели выраженный подсолнеч-
ный тон,, особенно шампанское фирмы «Реймс».
Экспериментально установлено, что при добавлении к ординарному шам-
панскому до 3 мг/л этиллинолеата появляется явный подсолнечный тон и ка-
чество намного улучшается.
8*
211
Нельзя игнорировать значения и других легколетучих веществ, которые при-
сутствуют во всех образцах шампанского. В небольших количествах они соз-
дают общий фон, в присутствии которого проявляются другие специфические
оттенки.
Образцы Московского, Артемовского, Тбилисского, Ташкентского, Харьков-
ского и Киевского заводов шампанских вин содержали от 0,1 до 0,2 мг/л или
совсем не содержали этиллинолеата и не обладали подсолнечным тоном.
Рис. 2. Газожидкостная хроматограмма спиртов, сложных эфиров, альдегидов
и терпеноидных соединений в образцах бутылочного шампанского разных за-
водов:
а — Тбилисского; б — «Абрау-Дюрсо»; &— Артемовского; г — фирмы «Реймс»; д — фирмы
«Айла»
212
Что касается этиллактата, то мы не смогли установить какую-либо зависи-
мость между количественным содержанием этого эфира и качеством шампан-
ского. Так, например, шампанское лучшего качества (фирм «Реймс», «Айла», за-
водов «Абрау-Дюрсо» и Московского!) содержит от 68 до 100 мг/л этиллактата,
а низкокачественное шампанское—от 114 до 192 мг/л (Харьковский и Арте-
мовский заводы), хотя А. Уэбб, П. Риберо-Гайон и Ж. Буадрон (1963) придают
этому эфиру особое значение в усилении вкуса и аромата бордоских вин.
Рассмотрим влияние отдельных классов соединений на вкус и букет шам-
панского.
Из всех исследованных образцов наибольшее количество сложных эфиров
содержится в шампанском Артемовского и Харьковского заводов (245 и 193 мг/л
соответственно).
Эти же образцы содержат наибольшее количество легколетучих эфиров
(224,5 и 189,0 мг/л) [80].
Наименьшее количество легколетучих эфиров содержится в шампанском
фирм «Реймс» (81,3), «Айла» (118 мг/л) и в шампанском заводов «Абрау-Дюр-
со» (ИЗ мг/л) и Ташкентского (111 мг/л).
Наибольшее количество высококипящих эфиров содержится в шампанском
фирмы «Реймс» (43,9 мг/л), затем завода «Абрау-Дюрсо» (19,7 мг/л) и наимень-
шее— в шампанском Артемовского, Киевского и Харьковского заводов (10,3 —
10,7 мг/л).
Если сравнить дегустационные оценки с содержанием легколетучих и высо-
кокипящих сложных эфиров в образцах, то отмечено, что чем меньше легко-
кипящих и больше высококипящих эфиров, тем лучше качество шампан-
ского.
Так, например, шампанское фирмы «Реймс» и завода «Абрау-Дюрсо» содер-
жало наименьшее количество легкокипящих и наибольшее количество высоко-
кипящих эфиров и оценено 9,5 балла. Советское шампанское Московского, Тби-
лисского и Ташкентского заводов содержало среднее количество легколетучих
и высококипящих эфиров и получило оценку 9 баллов. Шампанское Артемов-
ского, Харьковского и Киевского заводов содержало наибольшее количество
легколетучих эфиров, мало высококипящих и оценено в среднем 8,7—8,8 балла.
Таким образом, качество шампанского коррелирует с содержанием в нем
легкокипящих и высококипящих сложных эфиров.
Качество шампанского находится в обратной зависимости от содержания в
нем сивушных спиртов. Так, например, в шампанском фирм «Реймс» и «Айла»
и заводов «Абрау-Дюрсо», Московского и Ташкентского количество сивушных
спиртов наименьшее (198—242 мг/л), оно получило наилучшую дегустационную
оценку (9,0—9,5 балла), а образцы Харьковского, Киевского и Артемовского
заводов содержали от 323 до 487 мг/л и оценены гораздо ниже.
Что касается терпеновых соединений и их эфиров, то они также оказывают
положительное влияние на качество шампанского. Наибольшее количество их
обнаружено в образцах фирм «Реймс» и «Айла», среднее — в шампанском за-
водов «Абрау-Дюрсо», Московского и Тбилисского, наименьшее — в образцах
Артемовского и Киевского заводов, что согласуется с их качеством.
Таким образом, наши исследования показали, что чем больше в шампан-
ском высококипящих эфиров, терпеноидов и чем меньше легкокипящих эфиров
и сивушных масел, тем лучше качество шампанского.
Интересно отметить, какие именно факторы влияют на качество шампан-
ского. Как показали наши исследования [83], особо важное значение имеют
экологические условия культивирования виноградной лозы и технология, при
которой особое место занимают дрожжи.
Нами совместно с И. А. Егоровым и Р. X. Егофаровой [34] в зависимости
от возраста дрожжей и условий экстракции было выделено от 40 до 56 веществ
из дрожжевой клетки. Идентифицировано 7 алифатических спиртов и один аро-
матический р-фенилэтанол, 25 эфиров жирных кислот, 3 терпеноидных соедине-
ния и 2 альдегида. Значительное количество высококипящих эфиров составляют
гексилкаприлат, этилсукцинат, этилмалат, гексиллаурат, р-фенилэтилкапронат,
этилстеарат, изоамилмиристат, гексилмиристат и этиллинолеат. Последний при-
дает шампанскому подсолнечный тон. Усиливают также аромат шампанского
цис- и транс-фарнезол.
213
ДЕСЕРТНЫЕ ВИНА (МУСКАТ, КАГОР, ТОКАЙ)
Среди десертных сладких и полусладких вин, свойства которых зависят
главным образом от сорта винограда, ведущее место занимают мускаты. Им
присущи многие изящные эпитеты, характеризующие высокие вкусовые досто-
инства.
Отличительным свойством мускатов является специфический аромат. Этот
аромат обусловливается эфирными маслами самой ягоды винограда.
Р. Кепнером и А. Уэббом (1961) переработано около 1 т винограда сорта
Мускат александрийский и получено 554 г мускатной эссенции. Эту эссенцию
разделяли на низкокипящие и высококипящие фракции. Каждую фракцию ис-
следовали методом газогжидкостной хроматографии и химическим анализом.
Низкокипящие компоненты составляют 85%, а высококипящие 15% от общего
количества эфирных масел. В составе низкокипящей фракции были обнаружены
н-пропанол (0,7%|), метилпропанол-1 (4,9%), З-метилбутанол-1 (75,9%), 2-ме-
тилбутанол-1 (14,3%) и следы н-бутанола. В составе высококипящей фракции
выделены жирные кислоты (уксусная, изовалериановая, капроновая, каприловая
и пеларгоновая) и их эфиры — этилкапронат -(25%), этилкаприлат (13%j), этил-
лаурат (13%), этилпальмитат (3%1), этилмиристат (1,5%), этилпеларгонат (2%)
и этилпентадеканат (следы), р-фенилацетат (12%), изоамилкапронат (4%|), изо-
амиллаурат (3%), изоамилкаприлат (2%|) и в виде следов были найдены изо-
бутилкаприлат, активный амилкаприлат, активный амилкапронат и активный
амиллаурат. К высококипящим соединениям относится и гексанол.
Р. Кепнер и А. Уэбб изучали также вина, приготовленные из винограда
Мускат александрийский. В результате исследований методом газожидкостной
хроматографии было найдено 35 компонентов, из которых 24 идентифицирова-
ны. Большинство этих соединений было найдено в эфирном масле винограда
(спирты, жирные кислоты и их этиловые и изоамиловые эфиры).
Эти авторы считают, что некоторые соединения возникают в процессе алко-
гольного брожения, среди них следующие: сивушные масла (2-метилпропанол-1,
З-метилбутанол-1, цис-3-гексанол, Р-фенилэтанол) и карбонильные соединения
(уксусный альдегид, н-гексаналь, 2-гексаналь, 2-бутанон, 2-пентанон1). Эти ис-
следователи в сивушном масле не нашли Р-фенилэтанола. Они также не смог-
ли найти терпеновых соединений как в винограде, так и в вине. Это они объяс-
няют тем, что эти вещества разлагаются при дистилляции нагреванием.
В 1955 г. Р. Кордонье в мускатных сортах винограда впервые обнаружил
терпеноиды (линалоол, а-терпинеол, гераниол и лимонен), а в 1967 г. — еще
и нерол.
Дальнейшие исследования А. Уэбба, Р. Кепнера и Л. Магиора показали,
что различные мускатные сорта винограда и полученные из них вина содержат
разное количество терпеноидных соединений. Так, например, Мускат оранжевый
и его разновидность Р-20-59 содержат значительные количества линалоола; Му-
скат ранний и сорт Q-26-39 занимают промежуточное место между Мускатом
оранжевым и Мускатом гамбургским, Мускатом александрийским и Алеатико
Содержание линалоола в винограде имеет важное значение для букета мускат-
ных вин. Различные нюансы в аромате мускатных вин объясняются содержа-
нием различных количеств линалоола.
Методом газожидкостной хроматографии мы исследовали вещества, обус-
ловливающие букет в выдержанных десертных марочных винах Мускат белый
и Кагор [84] (образцы получены из Всесоюзного научно-исследовательского ин-
ститута виноделия и виноградарства «Магарач»). Результаты анализов приве-
дены в табл. 20.
Содержание изобутанола, н-бутанола и изопентанола в образцах Муската
белого и Кагора значительно меньше, а альдегидов и терпеноидов больше, чем
в сухих винах. Объясняется это тем, что для прекращения брожения вводят
до 16% об. спирта-ректификата. Поэтому изобутанола и изопентанола образует-
ся меньше. Но с другой стороны, количество свободных альдегидов и терпенов
значительно больше. Известно, что максимальное количество альдегидов об-
разуется при интенсивном брожении.
Десертные вина характеризуются тем, что получаются при незаконченном
брожении, поэтому и содержание терпеноидов в них более высокое, чем в су-
214
хих винах, так как при торможении брожения дрожжи не успевают их асси-
милировать или подвергнуть превращениям. Что. касается сложных эфиров, то
содержание их в десертных винах тоже небольшое (в Мускате белом всего
66,8, а в Кагоре 47,5 мг/л). Это также объясняется тем, что при незаконченном
брожении эфиров образуется меньше.
В процессе выдержки виноматериала для Муската белого в бочках в те-
чение 2—3 лет происходит окисление спиртов, особенно терпеноидных; в буке-
те появляется тонкий смолистый тон. При этом происходят некоторые потери
Таблица 20
СОДЕРЖАНИЕ АЛЬДЕГИДОВ, СПИРТОВ И ТЕРПЕНОИДОВ (В МГ/Л)
В ДЕСЕРТНЫХ ВИНАХ
Компонент вина Мускат Кагор Компонент вина Мускат Кагор
Альдегиды н-Пентанол 0,34 0,2 н-Гексанол 0,3 0,4 Уксусный 21,3 26,4 н-Нонанол 0,9 0,3 Пропионовый — 2,8 1,3-Пропандиол 2,8 0,9 Масляный 1,8 1,2 2,3-бутандиол 12,6 12,2 Изовалериановый 0,8 1,3 Р-Фенилэтанол 7,0 9,2 Валериановый —_ 3,2 Диацетил 1,5 4,0 Терпеноиды Спирты Линалоол 2,25 0,14 Линалилацетат 1,5 0,12 Изопропинол 2,6 4,3 а-Терпинеол 0,33 0,14 н-Пропинол 3,6 4,3 Гераниол — 0,28 Изобутанол 4,6 3,3 Днс-фарнезол 0,1 0,22 н-Бутанол 4,4 1,6 Транс-фарнезол 0,23 0,2 Изопентанол 39,6 11,0
первичных букетистых веществ винограда. В результате появляется яркий
аромат и букет в сочетании с сортовым ароматом винограда и тонкими смоли-
стыми тонами выдержки, напоминающий запах листьев эвкалиптового дерева.
Исследования [157] показали, что, помимо указанных выше терпеноидных
соединений, в мускатных сортах винограда найдено два фурановых и пирано-
вых окисла и лактоны. В процессе выдержки количество этих соединений уве-
личивается и появляются смолистые тона.
' В Кагоре мало терпеноидных соединений, поэтому его букет отличается от
букета Муската. Согласно технологии Кагора, сусло с мезгой сбраживают с
постоянным добавлением спирта, который извлекает эфирные масла из косточек
и кожицы винограда, вследствие чего вино получается ароматным.
Для извлечения красящих веществ при изготовлении виноматериалов при-
меняют нагревание мезги без доступа кислорода воздуха. В этих условиях
в вине уменьшается количество летучих кислот, аминокислот, спиртов и увели-
чивается содержание альдегидов и ацеталей. Несомненно также, что при изго-
товлении Кагора сахароаминная реакция имеет большое значение [65].
Токайские вина получаются при выдержке виноматериалов в неполных боч-
ках в течение нескольких лет при сравнительно низкой температуре (8—12ОС-).
При таких условиях окислительное дезаминирование аминокислот в вине про-
текает медленно, в результате чего накапливаются альдегиды.
Исследования К. К- Алмаши и др. (1964) показали, что в токайских винах
содержатся следующие альдегиды, мг/л: уксусный (54—88), фурфурол (1,9—3,6),
пропионовый (0,7—0,9)), изомасляный (0,4—0,75) и изовалериановый (0,6—0,78).
Букет высококачественных токайских вин характеризуется наличием в них тона
ржаной корочки хлеба. Этот тон винам придают альдегиды, особенно изомас-
215
ляный и изовалериановый. Не исключено также, что в образовании этих альде-
гидов участвует меланоидины [65].
Весьма возможно, что в возникновении тона ржаной корочки участвуют
фурановые окислы терпеновых соединений, которые окисляются при длитель-
ной выдержке вина в аэробных условиях.
КРЕПКИЕ ВИНА (ПОРТВЕЙН, МАДЕРА, ХЕРЕС)
Современную технологию приготовления портвейна с изучением биохими-
ческих процессов разработали М. А. Герасимов, А. А. Преображенский,
П. FL Унгурян, А. А. Мартаков и др.
П. Н. Унгурян показал, что при нагревании вина без доступа кислорода
воздуха оно приобретает вкус портвейна. Он отметил, что в этих условиях про-
исходит снижение редокспотенциала, химические реакции идут с накоплением
альдегидов и наблюдается возникновение во вкусе своеобразного тона портвей-
на, этот процесс он назвал портвейнизацией.
Исследования М. А. Герасимова и Т. К. Политовой (1950) показали, что при
нагревании вина при 50—60°С без доступа кйслорода количество летучих кис-
лот, дубильных веществ, сахаров, общего азота уменьшается, редокспотенциал
снижается. Количество летучих эфиров, альдегидов и ацеталей увеличивается.
Мы совместно с И. А. Егоровым и А. А. Беззубовым (1970) изучали со-
держание спиртов, сложных эфиров и альдегидов в исходном виноматериале и
в выдержанном портвейне методом газожидкостной хроматографии. Анализы по-
казали, что при выдержке на солнце в бочках количество спиртов уменьшается,
а количество альдегидов увеличивается.
В процессе портвейнизации количество сложных эфиров увеличивается, а
кислот уменьшается.
Р. Е. Симпсон [169] исследовал летучие ароматобразующие вещества в
портвейне 20- и 100-летней выдержки. Методом газовой хроматографии и масс-
спектрометрии он идентифицировал: энтокси-1-(3-метилбутокси)-этан, 1,1-диэнто-
ксипропан-2-оне, Г(ис-5-окси-2-метил-1,3-диоксан и г(цс-4-оксиметил-2-метил-1,3-
диоксан.
Если в молодом вине в значительном количестве содержатся этиллактат,
диэтилсукцинат и диэтилмалат, то в старом обнаружено повышенное количество
продуктов деградации сахаров (в мг/л): фурфурол (341), 5-метилфурфурол и
транс-р-метил-у-окталактон(2,2). Последний является продуктом экстракции ду-
бовой клепки.
При старении вина особенно заметно увеличивается количество эфиров
(этилацетата, этилкапроната, этилкаприната, этилмалата и этилмиристина),
уменьшается содержание спиртов и легкокипящих эфиров, а также летучих
кислот, в том числе уксусной.
Вино херес со своеобразным букетом и вкусом получается в результате вы-
держки виноматериала под пленкой хересных дрожжей. В процессе такой вы-
держки происходит автолиз дрожжевых клеток. Особую роль в образовании
хереса играет алкогольдегидрогеназа.
Состав ароматобразующих веществ вин типа херес глубоко изучен американ-
скими и советскими учеными.
А. Уэбб и Р. Кепнер (1962|) с применением газожидкостной хроматографии
в сочетании с ИК-спектроскопией выделили из вина типа херес около 28 ком-
понентов. В большом количестве найдены р-фенилэтанол и диэтилсукцинат, об-
наружено среднее количество З-метилбутанола-1, диэтилмалата, Р-фенилэтилаце-
тата и небольшое количество 2-метилбутанола-1, н-гексилового спирта, этиловых
эфиров масляной, капроновой, каприловой и молочной кислот, изоамиловых эфи-
ров уксусной, капроновой и каприловой кислот, а также бутилацетат, Р-фенил-
этилкапронат и у-бутиролактон. В виде следов найдены изобутанол, этилацетат,
изобутиловые эфиры изомасляной, изовалериановой и капроновой кислот, ами-
ловые эфиры изовалериановой, капроновой и каприловой кислот, активный амил-
ацетат и изоамил-2-метилмасляной кислоты.
Херес характеризуется большим содержанием уксусного альдегида, коли-
чество которого достигает 700 мг/л и больше [57].
216
А. Уэбб и Р. Кепнер считают, что специфическими продуктами метаболизма
хересных дрожжей являются этиловые эфиры изомасляной и каприловой кис-
лот, изоамиловые эфиры изовалериановой, уксусной, капроновой, каприловой
кислот, диэтилсукцинат, диэтилмалат, гексилацетат, р-фенилэтилацетат, Р-фенил-
этилкапронат.
Этиловые эфиры капроновой и каприловой кислот несомненно участвуют в
букете хереса.
В. Галлето, А. Уэбб и Р. Кепнер (1966) в хересе идентифицировали ацета-
ли: диэтилацеталь, диамилацеталь, активный амилацеталь, этилфенилацеталь,
изоамилфенилацеталь, этиламилацеталь, этилизоамилацеталь, активный ди-
амилацеталь. Хотя эти авторы раскрыли природу ацеталей, они все же не могли
показать, что эти вещества придают хересу специфический букет.
Н. Ф. Саенко (1947) и Н. М. Сисакян (1948) считают, что именно ацетали
и альдегиды участвуют в образовании специфического букета хересных вин.
Они установили, что когда отношение уксусного альдегида и ацеталя прибли-
жается к единице, то херес приобретает специфический тон каленого грецкого
ореха и вино готово к розливу в бутылки.
А. К. Родопуло и И. А. Егоров (1960|) исследовали ароматобразующие ве-
щества отечёственного хереса как поверхностного (пленочного), так и глубин-
ного методов производства. Анализы показали, что херес, приготовленный пле-
ночным методом, содержит больше компонентов, особенно этиллактата. Содер-
жание Р-фенилэтанола в процессе хересования пленочным способом уменьшает-
ся, а при хересовании глубинным способом увеличивается.
В процессе хересования вина обоими способами содержание спиртов умень-
шается, а количество эфиров увеличивается. Особенно увеличивается содержа-
ние этиллактата, этилкапроната, гексилацетата, этилкаприлата, изоамилбутира-
та, изоамилкаприлата и Р-фенилацетата. Эти сложные эфиры участвуют в об-
разовании аромата хереса.
Применяя методы газожидкостной хроматографии и спектрометрии, С. Мюл-
лер, Р. Кепнер и А. Уэбб идентифицировали лактоны, которые играют важную
роль в образовании букета хереса.
Эти авторы считают, что найденные ими у-масляный лактон, у-валериано-
вый лактон и у-лактон оксикапроновой кислоты, а также 5-ацетилдегидро-2-ЗН-
фуранон имеют важное значение для интенсивности аромата, но влияют и на
физиологические свойства вина.
3. Н. Кишковский с сотрудниками [44] провел газохроматографические ис-
следования летучих азотистых оснований хересных виноматериалов. Было иден-
тифицировано около 85 веществ, из которых 78 были летучие азотистые осно-
вания. Среди них обнаружены не только первичные, вторичные и третичные али-
фатические амины, пиридиновые и пипиридиновые основания, но и пиразины, ди-
амины, аминоспирты, ароматические амины и М-моноалкилацетамины, а также се-
росодержащие азотистые основания. Появление первичных аминов, диаминов
(путресцина и кадаверина) и аминоспиртов (этаноламина и 1-аминопропанола-2)
авторы объясняют реакцией декарбоксилирования соответствующих свободных
аминокислот.
3. Н, Кишковский и сотрудники считают также, что образование первичных
аминов из альдегидов возможно при ферментативном трансаминировании с ами-
нокислотами. Наличие большого количества органических азотистых оснований
авторы объясняют весьма сложным метаболизмом азотистых соединений в про-
цессе хересования и образованием промежуточных продуктов, которые оказы-
вают влияние на качество хереса.
Следовательно, изучение органических азотистых оснований интересно, с
одной стороны, для расширения существующих представлений о химическом со-
ставе хереса, а с другой — как критерий глубины протекания биохимических
процессов и формирования органолептических качеств вина [44].
Мадера — очень окисленное вино. Можно считать, что все остальные типы
вин по этому показателю могут быть расположены между мадерой и шампан-
ским. Согласно классификации вин по окисленности мадера содержит наиболь-
шее количество уксусного альдегида [4].
Мадера и портвейн мало изучены в отношении букетистых веществ. Пока-
зано [8], что в процессе мадеризации количество альдегидов и сложных эфи-
217
ров увеличивается, а спиртов уменьшается. Особенно заметна уменьшается со-
держание этанола, изопентанола, изобутанола и н-пропанола и соответственно
увеличивается количество уксусного, пропионового, изомасляного и изовалериа-
нового альдегидов и фурфурола. При мадеризации в значительном количестве
образуется диацетил. Из сложных эфиров особенно увеличивается содержание
этилацетата, изоамилвалериата, этиллактата, этилкаприлата и изоамилвалериата. Последние диэтилмалата, диэтилсукцината, шесть эфиров несомненно участ-
вуют в образовании букета
Т а б л.и ц а 21 мадеры.
СОДЕРЖАНИЕ АЛЬДЕГИДОВ, СПИРТОВ В процессе мадеризации
И ТЕРПЕНОИДОВ (В МГ/Л) В КРЕПКИХ ВИНАХ протекают в основном окисли-
тельные процессы, в результа-
Порт- вейн
те которых часть спиртов окис-
Компонент вина Мадера Херес ляется в альдегиды, а часть — этерифицируется с образовани-
ем значительных количеств
Альдегиды сложных эфиров. Они в соче- ‘ тании с уксусным альдегидом
Уксусный 27,9 81,8 450,0 и диацетилом обусловливают
Пропионовый 0,92 — 3,3 букет мадеры.
Масляный 1,32 7,0 2,5 Нами совместно с
Изовалериановый ' 1,2 10,2 5,5 И. А. Егоровым и Т. А. Кор-
Валериановый — 4,4 3,2 маковой [84] были проведены
Диацетил 25,0 10,5 26,0 исследования ароматобразую- щих веществ крепких вин
Спирты (портвейн, херес и мадера). Результаты анализов приведе-
Изопропанол н-Пропанол 6,2 6,4 14,0 14,5 10,6 ны в табл. 21. Наибольшее количество
Изобутанол 12,4 52,0 83,5 альдегидов, особенно уксусно-
н-Бутанол 5,6 10,5 2,3 го, содержится в хересе (450 мг/л). Согласно данным
Изопентанол 100,0 Н2,0 309,0
н-Пентанол 0,6 1,7 0,5 А. А. Мартакова [57] дрожжи
н-Гексанол 0,7 — 0,5 Sacch. ovfformis способны
н-Октанол — — 0,5 окислять этанол и образовы-
н-Нонанол 1,3 2,3 •— вать много уксусного альдеги-
1,3-Пропандиол 2,5 9,6 85 да в аэробных условиях.
1,2-Бутандиол 13,5 13,5 11,3 Хересные дрожжи в при-
р-Фенилэтанол 25,0 56,0 13,7 сутствии избытка кислорода способны окислить значитель-
Терпеноиды ное количество этанола даже в присутствии сахара.
Линалол 0,2 0,1 — Сравнительно большие ко-
Линалилацетат 0,12 0,7 — личества альдегидов содержат-
а-Терпинеол 0,34 1,8 — ся и в мадере (113,9 мг/л), но
Дас-фарнезол 0,34 0,4 0,8 в отличие от хереса, альдегиды
Транс-фарнезол 0,44 0,6 1,3 мадеры образуются не биоло- гическим путем, а окислением
кислорода воздуха как этило- вого спирта, так и аминокис- лот [65].
Альдегиды по теории А. И. Опарина образуются, когда активированный кис- лород под действием о-дифенолоксидазы окисляет фенольные соединения в хи-
ноны; последние дегидрируют аминокислоты и спирты.
При окислении фенольных веществ в мадере роль полифенолоксидазы иг-
рают тяжелые металлы (железо и медь).
Содержание спиртов в крепких винах зависит от способа их приготовления.
Согласно технологии спиртование виноматериалов для портвейна начинают,
когда сахаристость бродящего сусла достигает 10%, для мадеры — 7—8%, а
хересные виноматериалы сбраживают досуха [20].
Это согласуется и с данными по содержанию спиртов в этих крепких ви-
218
нах. Так, в хересе наибольшее количество спиртов — 380,4 мг/л, а в мадере и
портвейне оно соответственно 286,1 и 173,6 мг/л. Следовательно, чем больше
сброженного сахара в сусле, тем больше образуется спирта.
Наибольшее количество терпеноидов в мадере (3,5 мг/л) и наименьшее в
портвейне (1,4 г/л]). В хересе значительно больше цис- и транс-фарнезола, ко-
торые выделяются дрожжами при автолизе клеток.
Что же касается сложных эфиров, то количество их прямо пропорциональ-
но количеству сброженного сахара. В соответствии с этим в наших опытах наи-
большее количество эфиров было в хересе (350 мг/л), затем — в мадере
(158,4 мг/л) и наименьшеев портвейне (90 мг/л).
Следует отметить, что из эфиров в наибольшем количестве образуются
этиллактат, диэтилсукцинат и диэтилмалат. В хересе и мадере в заметных ко-
личествах образуется также этилацетат. Остальные эфиры встречаются в не-
значительном количестве.
Образование больших количеств сложных эфиров в хересе объясняется тем,
что они синтезируются главным образом дрожжами^ так как вино долго на-
ходится под пленкой.
Е. С. Дрбоглав и Н. Н. Глонина [27] исследовали превращение С14 яблоч-
ной кислоты в вине при хересовании. С14 яблочной кислоты был обнаружен в
изолимонной, в а-кетоглутаровой, в глиоксалевой кислотах, а также в аспара-
гиновой, валине и лейцине.
В настоящем литературном обзоре была рассмотрена природа химических
веществ, которые характеризуют букет различных типов вин. Считают, что ка-
чество вин зависит не от абсолютной величины аналитических показателей, т. е.
от составных ароматобразующих компонентов, а от соотношения между ними.
Мы считаем, что связь между качеством вина и его букетом определяется
несколькими компонентами, порог концентрации которых выше остальных, при-
сутствующих в вине.
В этой связи необходимо остановиться на работах И. М. Скурихина, про-
веденных в 1963 г., которые показали, что пороговые концентрации аромата
большинства высших спиртов от С4 до Сю находятся в пределах 10—100 мг/л,
а спиртов выше Сю — до 5 мг/л. Из альдегидов наиболее интенсивным запахом
обладают изовалериановый и энантовый, пороговая концентрация которых рав-
на 0,1 мг/л, затем следуют альдегиды с числом углеводных атомов С8—Ci2 —
до 1 мг/л.
* К. К. Алмаши и Е. С. Дрбоглав [5] считают, что цветочный запах обуслов-
ливают фенилацетатальдегид и Р-ионон в количестве 0,04 мг/л, пряный запах —
коричный альдегид и фурфурол (4 мг/л|), плодовый — изоамилацетат (0,8 мг/л),
смолистый — мирцен (0,1 мг/л) и камфара. В зависимости от количественного
преобладания того или иного вещества вино получает преобладающий запах.
Мы считаем, что на фоне всех ароматобразующих веществ, присутствующих
в вине, 2—3 компонента с более высокой концентрацией обусловливают букет
вина. Действительно, если анализировать химические вещества, которые, состав-
ляют букет, то можно увидеть, что все типы вин имеют почти одинаковый хи-
мический состав, с той лишь разницей, что в каждом из них содержится не-
сколько компонентов, концентрация которых выше остальных. Эти же компо-
ненты в сочетании со всеми другими химическими веществами и обусловливают
букет вина. Те компоненты, которые содержатся в незначительном количестве,
т. е. в подпороговых концентрациях, хотя в отдельности и неощутимы, но в
сочетании с другими обладают тонким букетом. Эти вещества могут оказывать
косвенное влияние на аромат вина согласно известному синергическому эффекту.
Усиление запаха одних веществ способствует проявлению других.
* *
*
Качество отдельных типов вин зависит от происхождения ароматобразую-
щих веществ, которые можно разделить на три группы-: эфирные масла вино-
града; продукты алкогольного брожения, ароматобразующие вещества, появляю-
щиеся при изготовлении и выдержке.
219
Так, при выработке мускатных вин брожение останавливают спиртованием,
сохраняя этим эфирные масла винограда, главным образом линалоол, придаю-
щий мускатный тон.
При выработке сухих вин брожение доводят до конца, так как такие про-
дукты сбраживания углеводов и аминокислот, как сложные и простые эфиры
(ацетали), альдегиды, кетоны (ацетоин)), лактоны, а также а-терпинеол, (3-ионон,
у-бутиролактон и этиллактат, характерны для высококачественных сухих вин.
При выработке мадеры, хереса, токайских вин, а также шампанского ста-
раются сохранить ароматобразующие вещества, появляющиеся при брожении
и выдержке.
Характерный для хереса тон каленого грецкого ореха по, мнению одних ис-
следователей обусловливается соотношением альдегидов и ацеталей (Н. Ф. Са-
енко, 1947, Н. М. Сисакян, 1948), по мнению других — присутствием фуранов
и лактонов (у-валерианового, у-масляного и у-оксикапронового{), а также ами-
нов (3. Н. Кишковский [44]).
Для вин типа мадеры большое значение имеют алифатические альдегиды,
главным образом уксусный альдегид в сочетании с этиловыми, и изоамиловыми
эфирами капроновой, каприловой, янтарной и яблочной кислот. Они придают
вину мадерный тон. Особо важное значение имеет выдержка вин типа мадеры
в дубовой таре, когда появляются продукты гидролиза лигнина с образованием
ароматических альдегидов (ванилин, сиреневый, синановый, конифериловый) и
цис- и транс-изомеры Р-метил-у-октолактонов, экстрагируемых из дубовой бочки
[116, 37].
Специфическйй тон токайрких вин обусловливается наличием изомасляного
и изовалерианового альдегидов [5].
При изготовлении шампанского главную роль играют восстановительные
процессы, связанные с автолизом дрожжевой клетки и выделением этиловых
эфиров линолевой и линоленовой кислот ,[34, 80], а также цис- и транс-фарнезо-
ла. Эти вещества на фоне других легколетучих веществ обусловливают букет
шампанского.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абдуразакова С. X., Соломов X. Т., Фомичева Т. М., Илья-
сов Т. М. Изучение активности ферментов в бродящей среде в условиях уп-
равляемого культивирования дрожжей. Прикладная биохимия и микробиология.
1975. т. II, в. 3, 341—345 с.
2. Авакянц С. П. Биохимические основы технологии шампанского. — М.:
Пищевая промышленность, 1980. — 351 с.
3. Авакянц С. П. Метаболизм липидов у винных дрожжей в анаэробных
условиях. Тезисы докладов по биосинтезу и метаболизму липидов у микроорга-
низмов.— Сб. II Всесоюзной конференции. — М.: Изд-во Наука, 1979, с. 133—
136.
4. Агабальянц Г. Г. Избранные работы по химии и технологии вина,
шампанского и коньяков. — М.: Пищевая промышленность. — 1972. — 615 с.
5. А л м а ш и К. К-, Дрбоглав Е. С.. Дегустация вин. — М.: Пищевая
промышленность, 1979. — 152 с.
6. Б а х А. Н. Собрание трудов по химии и биохимии. — М.: Изд-во
АН СССР. 1950. —647 с.
7. Б е з з у б о в А. А., Р о д о п у л о А. К., Егоров И. А., Нечаев Л. Н.
Ароматообразующие вещества гибридных сортов винограда. — Прикладная био-
химия и микробиология. 1980, т. XVI, № 1, с. 120—126.
8. Б е з з у б о в А. А., Р о до п ул о А. К., Егоров И. А. Исследование
ароматобразующих веществ Мадеры. — Виноделие и виноградарство СССР,
1971, № 1, с. 14—17.
9. Беридзе Т. Г., Дурмишидзе С. В., ХачидзеО. Т. Определе-
ние плавучей плотности ядерных ДНК некоторых представителей рода vi-
iis L. — Вопросы биохимии винограда и вина, 1977, с. 68—71.
10. Богатский А. В., Жеребин Ю. Л., Колесник А. А., Тю-
рин С. Т. Липиды — эндогенные антиоксиданты вин. — Садоводство, вино-
градарство и виноделие Молдавии, 1979, № 11, с. 30—36.
11. Богатский А. В., Жеребин Ю. Л., Макан С. Ю. Меланины в
вине. — Виноделие и виноградарство СССР, 1979, № 3, с. 52—54.
12. Бокучава М. А., Валуйко Г. Г., Филиппов А. М. Катехины
винограда и красных столовых вин. — Прикладная биохимия и микробиология.
1970, т. VI, вып. 3.
13. Бокучава М. А., Валуйко Г. Г., С туру а 3. Ш. Определение
флавонолов в винограде и вине. — Прикладная биохимия и микробиология,
1971, т. VII, № 4, с. 503—506.
14. Высшие спирты, летучие жирные кислоты, образуемые различными
расами винных дрожжей при брожении виноградного сусла / [Н. И. Бурьян,
О. В. Разуваева, Н. М. Павленко, А. Н. Патрушев] — Вопросы биохимии ви-
нограда и вина, 1975, с. 223—226.
15. Валуйко Г. Г. Биохимия и технология красных вин.—М.: Пищевая
промышленность, 1973. — 296 с.
16. Веселов И. Я., Грачева Й. М. Влияние температуры брожения
на образование высших спиртов. — Микробиология. 1970, т. 39, № 2, с. 332—336.
17. Вечер А. С., Юрченко Л. А. Производство слабоалкогольных яб-
лочных напитков и вин. — Минск: Наука и техника, 1974. — 104 с.
18. В е ч е р А. С., Р у д о м а н о в а И. Ф. Образование кетокислот при
сбраживании яблочных соков. — ДАН БССР. 1974, т. 18, с. 72.
19. Гелашвили Н. Н., Джемухадзе К- М. Состав катехинов ви-
нограда Ркацители. Сообщения АН Груз. ССР, 1970, т. 58, № 1, с. 201—204.
20. Герасимов М. А. Технология вина. — М.: Пищевая промышленность,
1964. —639 с.
221
21. Грачева И. М., Бабаева С. А., Веселов И. Я. Влияние со-
держания аминного азота в среде в процессе брожения дрожжами Sacch. Cars-
bergensis. — Прикладная биохимия и микробиология, 1966, № 6, с. 661.
22. Д а в и д я н ц С. Б. Темное царство меланоидинов. — Химия и жизнь,.
1980, № 3, с. 44—48.
23. Датунашвили Е. Н., Павленко Н. М. Белковый состав сусла
различных сортов винограда. — Прикладная биохимия и микробиология, 1968у
т. IV, № 4, с. 472—475.
24. Д а т у н а ш в и л и Е. Н., С е й д е р А. И., Р и в к и н В. Л. Влияние
конструкции дробилок на качество белых столовых вин. — Садоводство, вино-
градарство Молдавии, 1974, № 11, с. 36—39.
25. Д а т у н а ш в и л и Е. Н., Т юр ин а Д. С., Б у т о в а Ф. М. Ферменты;
виноградной ягоды, гидролизирующие высокомолекулярные углеводы. — Физио-
логия растений, 1977, т. 24, № 2, с. 285—290.
26. Д а т у н а ш в и л и Е. • Н. Ферментные препараты в пищевой промыш-
ленности.— М.: Пищевая промышленность, 1975. 307 с.
27. Д р б о г л а в Е. С., Г л о н и н а Н. Н. Превращение яблочной кислоты
в вине при хересовании. — Изв. вузов, Пищевая технология. 1979, № 6„
с. 59—61.
28. Дурмишидзе С. В., Бериашвили Т. В. Передвижение асси-
милятов из грозди в побеги и листья виноградной лозы. — Физиология расте-
ний, 1978, т. 25, № 1, с. 49—54.
29. Д у р м и ш и д з е С. В. Дубильные вещества и антоцианы виноградной:
лозы и винограда. — М.: Изд. АН СССР, 1955. — 324 с.
30. Д у р м и ш и д з е С. В., Хачидзе О. Т., Пруидзе Г. И. Некото-
рые особенности изоферментного состава о-дифенолоксидазы в различных ор-
ганах виноградной лозы. — Физиология растений, 1974, 21, вып. I, с. 75—81.
31. Дурмишидзе С. В., Шалашвили А. Г. Превращение (+|)-кате-
хина в ягодах винограда. — Сообщения АН Груз. ССР. 1978, т. 9.1, № 2,
с. 449—451.
32. Д у р м и ш и д з е С. В. Метаболизм некоторых загрязнителей атмосфер-
ного воздуха в растениях. — Тбилиси: Изд-во Мецниереба, 1977. — 47 с.
33. Е г о р о в И. А., Р о д о п у л о А. К., Беззубов А. А., С к р ы п-
н и к А. Ю., Нечаев Л. Н. Исследование эфирных масел в некоторых сортах:
винограда в процессе созревания. — Прикладная биохимия и микробиология..
1978, т. XIV, № 1, с. 135—139.
34. Е г о р о в И. А., Р о д о п у л о А. К., Е г о ф а р о в а Р. X. Исследова-
ние ароматобразующих веществ у винных дрожжей. — Прикладная биохимия if
микробиология, 1975, т. XI, № 5, с. 697—703. °
35. Е г о р о в И. А., Л о м и н а д з е В. Н., С к р ы п н и к А. Ю. Деграда-
ция сахарозы при нагревании аминокислот на процесс пиролиза. — Прикладная:
биохимия и микробиология, 1974, т. X, № 5, с. 681—685.
36. Е г о р о в И. А., С к р ы п н и к А. Ю., Ломинадзе В. Н. Образо-
вание спиртов при нагревании сахарозы с аминокислотами. — Прикладная био-
химия и микробиология, 1975, т. 11, № 2, с. 250—253.
37. Е г о р о в И. А., П и с а р н и ц к и й А. Ф., Зинкевич Э. П., Гав-
рилов А. И. Исследование некоторых летучих компонентов древесины дуба.—
Прикладная биохимия и микробиология. 1976, т. XII, вып. I, с. 108—112.
38. 3 а п р о м е т о в М. Н. Биохимия катехинов. — М.: Изд-во «Наука»,..
1964. — 296 с.
39. 3 а л е ш к о М. В., С а л о х и н а Г. А. Интра- и экстрацеллюлярные-
липиды дрожжей. — Тезисы докладов по биосинтезу и метаболизму у микро-
организмов.— Сб. II Всесоюзной конференции. М.: — Наука, 1979, с. 8—11.
40. Зинченко В. И., Гранатская Т. А., Кешишев а Г. М., Я з -
л о в е ц к и й И. Г. Полисахариды виноградной ягоды. Вопросы биохимии ви-
нограда. — М.: Пищевая промышленность, 1975, с. 88—92.
41. Зинченко В. И., Гранатская Т. А., Архипова В. Н. Влия-
ние процесса гидролиза гемицеллюлозы винограда на сокоотделение. — Садо-
водство, виноградарство и виноделие, 1972, № 5, с. 26—28.
42. К а в а д з е А. В., Р о д о п у л о А. К., Шапошников Г. Л. Выде-
ление, очистка и изучение некоторых свойств диацетил-(ацетоин)-редуктазы у?
222
овинных дрожжей. — Известия АН СССР (Серия биологическая), 1979, № 3,
с. 435—447.
43. К а в а д з е А. В., Р о д о п у л о А. К., Е г о р о в И. А. Исследования
дикетонов и а-оксикетонов в винах. — Прикладная биохимия и микробиоло-
гия. — 1977, т. XIII, № 2, с. 199—244.
44. Кишковский 3. Н., П а л а м а р ч у к Л. Ф., Головня Р. В., Жу-
равлева И. Л. Исследование летучих азотистых оснований хересных вино-
материалов методом газовой хроматографии. — Прикладная биохимия и мик-
робиология, 1980, т. XVI, вып. 3, с. 446—459.
45. Кишковский 3. Н. Влияние продуктов меланоидинообразования на
.качество вин. — М.: ЦИНТИПищепром, 1967. — 30 с.
46. Кишковский 3. Н., С к у р и х и н И. М. Химия вина. — М.: Пище-
вая промышленность, 1976, с. 311.
47. Квасников Е. И. Биология молочнокислых бактерий. — Ташкент:
Изд-во АН Узб.ССР, I960. —350 с.
48. К о н о в а л о в С. А. Биохимия дрожжей. — М.: Пищепромиздат,
1962. —269 с.
49. К о р м а к о в а Т. А., Р о д о п у л о А. К., Е г о р о в И. А. Изменение
^активности протеолитических и окислительно-восстановительных ферментов в
.шампанском при выдержке его на дрожжах. — Прикладная биохимия и микро-
биология, 1979, т. 15, вып. 1, с. 140—142.
50. Красновский А. А., Умрихина А. В., Бубличенко Н. В.
Свободные радикалы при фотохимических реакциях хлорофилла. — В сб. Спек-
троскопия фотопревращений в молекулах. — Л.: Наука, 1977, с. 106—131.
51. Крет о вич В. Л. Основы биохимии растений. — М.: Высшая школа,
1980. —445 с.
52. К р е т о в и ч В. Л., Попов М. П., Щербаков С. С. Выделение
сульфгидрильных соединений различными расами дрожжей в процессе броже-
ния. — Микробиология, 1974, т. 43, вып. 4, с. 728—729.
53. К о с т ы ч е в С. П. Избранные труды по физиологии и биохимии мик-
роорганизмов.— М.: Изд-во АН СССР, 1956. — 510 с.
54. Ленинджер А. Биохимия. — М.: Мир, 1976. — 957 с.
55. Л и ч е в В. Вчрху съдържание то на рутин в конячия спирт. — Лозар-
ство и винарство, 1962, № 5, с. 28—38.
56. Л и ч е в В., Б ъ ч в а р о в Л., Динков Д. Относно производство на
карамел за конячното производство с намалено съдържание на высокополимер-
на съединения. — Лозарство и винарство, 1972, № 4, с. 22—24.
57. М а р т а к о в А. А. Биологическое старение вин. — Изд-во Наука Ка-
зах. ССР, 1972, с. 175.
58. М е р ж а н и а н А. А. О действии водорода в вине и сусле. — Известия
высшей школы. Пищевая технология. 1967, № 3, с. 92—93.
59. Мехузла Н. А. Коллоиды сусла и вина. — М.: ЦИНТИПищепром,
1968. — 25 с.
60. М е х у з л а Н. А. Количественное определение липидов в сусле и ви-
нах. — Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии, 1978, № 5,
с. 33—35.
61. Мнджоян Е. Л., Родопуло А. К., Беззубов А. А. Влияние
автолизатов на качество коньячных спиртов. Биохимические основы коньячного
производства.—М.: Наука, 1972, с. 156—169.
62. М о с и а ш в и л и Г. И. Применение эфирообразующих и пектиноразла-
гающих дрожжей в виноделии. — Виноделие и виноградарство СССР, 1958,
№ 2, с. 6—9.
63. Мосиашвили Г. И., Мамулаишвили А. М. Превращение аро-
матических веществ в процессе брожения виноградного сока. — Вопросы- био-
химии винограда и вина, 1975, с. 323—327.
64. Нилов В. И., Налимова А. А., Ефимов Б. Н. Об ацеталях в
вине. — Виноделие и виноградарство СССР, 1971, № 8, с. 6—8.
65. Н и л о в В. И., С к у р и х и н И. М. Химия виноделия. — М.: Пищевая
промышленность, 1967. — 442 с.
66. О п а р и н А. И. Природа и механизм действия дрожжевой инвертазы. —•
М.: Изд-во АН СССР, 1955, с. 22.
223
67. П и с а р н и ц к и й А. Ф., Р о д о п у л о А. К., Егоров И. А. О ве-
ществах, обусловливающих типичный аромат вин. — Виноделие и виноградарст-
во СССР, 1980, № 3, с. 30—32.
68. П о п о в К. С. Основы производства Советского шампанского и игри-
стых вин. — М.: Пищевая промышленность, 1970. — 205 с.
69. Простосердов Н. Н. Основы виноделия. — М.: Пищепромиздат^
1955, —244 с.
70. П р у и д з е Г. Н. Изучение локализации о-дифенолоксидазы в листьях
виноградной лозы. — В сб.: Сообщ. АН Груз.ССР, 1972, т. 66, № 3, с. 676—678.
71. Размадзе Р. И., Бурьян Н. И., Филиппов Б. А. Влияние
дрожжей на содержание липидов и азотистых веществ в шампанском. — Вино-
делие и виноградарство СССР, 1980, № 3, с. 28—30.
72. Р о г о в и н В. В., Пи р узя н Л. А., Муравьев Р. А. Пероксидазо-
сомы.— М.: Наука, 1977. — 270 с.
73. Риберо-Гайон Ж. Виноделие. Преобразование вина и его обработ-
ка.— М.: Пищевая промышленность, 1956. — 584 с.
74. Риберо-Гайон Ж., Пейно Е., Риберо-Гайон, Сюдро ГС
Теория и практика виноделия. — М., Пищевая промышленность, 1979. — 352 с.
75. Р о д о п у л о А. К. Окислительные ферменты шампанских сортов вино-
града и сусла. — Биохимия виноделия, 1950, сб. 3, с. 43.
76. Ро допу л о А. К. Об окислительных процессах в виноделии. — Мл
Пищепромиздат, 1962. — 179 с.
77. Р о допу л о А. К, Егоров И. А., Беззубов А. А., Скуинь К- П_
Исследование веществ, обусловливающих аромат винограда. — Прикладная био-
химия и микробиология, 1974, т. 10, № 2, с. 280—287.
78. Р о д о п у л о А. К., Чичашвили Н. Д., К а в а д з е А. В. Исследо-
вание накопления вторичных продуктов алкогольного брожения. — Прикладная
биохимия и микробиология, 1978, т. 14, № 1, с. 75—92.
79. Р о д о п у л о А. К., Ершова Т. К. Роль диацетила в плодово-ягод-
ном виноделии. — Виноделие и виноградарство СССР, 1975, № 1, с. 52—53.
80. Р о д о п у л о А. К., К о р м а к о в а Т. А., Егорова И. А. Исследо-
вание ароматообразующих веществ шампанского. — Прикладная биохимия и;
микробиология, 1975, т. 11, с. 107—114.
81. Родопуло А. К. Влияние анаэробиоза на качество шампанского.—
Виноделие и виноградарство СССР. 1980, № 8, с. 30—31.
82. Р о д о п у л о А. К., Беззубов А. А., Егоров И. А., Неча-
ев Л. Н. Исследование ароматообразующих веществ столовых вин. — При-
кладная биохимия и микробиология. 1979. т. 15, вып. 2, с. 309—313...
83. Р о д о п у л о А. К., Е г о р о в И. А., К о р м а к о в а Т. А., С а р и ш-
в и л и Н. Г. Исследование ароматообразующих веществ шампанских вино-
материалов. — Виноделие и виноградарство СССР, 1980, № 1, с. 19—22.
84. Р о д о п у л о А. К., Е г о р о в И. А., К о р м а к о в а Т. А. Исследова-
ние ароматобразующих веществ в десертных и крепких винах. — Прикладная
биохимия и микробиология, 1978, т. 14, с. 441—445.
85. Саришвили Н. Г., Орешкина А. Е., Брусиловский С. А.
Исследование процесса ускоренного биологического обескислороживания купа-
жа.— Виноделие и виноградарство СССР, 1972, № 1, с. 15—17.
86. Саришвили Н. Г., К в а с и к о в Е. И., Ковалева Н. В. Дрожжи?
в шампанском производстве и принципы регулирования их жизнедеятельно-
сти.— М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1975. — 43 с.
.87 , Скулачев В. П. Трансформация энергии в биомембранах. — Мл
Наука, 1972. — 299 с.
88. Т ю р и н С. Т. Технология хранения виноматериалов в атмосфере*
инертных газов. — Виноделие и виноградарство СССР, 1979, № 7, с. 59—61.
89. Фролов-Багреев А. М. Советское шампанское. — М.: Пищепром-
издат, 1948. — 268 с.
90. Ф и н е а н Дж., КолмэнР., Митчелл Р. Мембраны и их функции
в клетке. — М.: Мир, 1977.—199 с.
91. Хачидзе О. Т. Азотистые вещества виноградной лозы. — Тбилиси^
Изд-во Мецниереба, 1976.— 195 с.
224
92. Ц а к о в Д., Спиров Н. Влияние яблочной кислоты на способность
к шампанизации и вкус. — Лозарство и винарство, 1971, № 7, с. 28—32.
93. Ч и ч а ш в и л и Н. Д. Исследования влияния дрожжей различных рас
на образование спиртов и эфиров. — Прикладная биохимия и микробиология^
1979, т. XV, № 6, с. 909—914.
94. Чичашвили Н. Д., Родопуло А. К., Гуджеджиани Г. Д._
Влияние дрожжей на накопление ароматообразующих веществ шампанского. —
Виноделие и виноградарство СССР, 1981, № 4, с. 48—49.
95. Ш у л ь ц Е. П. Повышение качества виноградных вин. — Виноделие
и виноградарство СССР, 1976, № 7, с. 12—14.
96. Шандерль Г. Микробиология соков и вин. — М.: Пищевая промыш-
ленность, 1967. — 359 с.
97. Amiraine М., Acids of Grapes and their characteristics. — Amer. Jour
Enology and Viticulure. 1964, v. 15, № 2, p. 106—109.
98. A n e 11 i G. The proteins of must. — Amer. Jour. Enology and Viticulture.
1977, v. 23, № 4, p. 203—217.
99. Ayrappaa T. Formation of higher alcohols from C14 labelled valine and
leicine. — Journ. Institute of Brewing. 1967, v. 73, № 1, p. 17—20; 1971, N 3,
p. 266—270.
100. Baker D., Kirsop B. A rapid procedure for reducing the diacetil
of Beer. — Jour. Instit. of Brewing. 1973, v. 79, № 1, p. 43—46.
101. Bauman J., Callander J., Peng A. Effect of maturation on the
lipid content of Concord Grapes. — Amer. Jour. Enology and Viticulture. 1977,
v. 28, № 4, p. 241—244.
102. BayonoveC., CordonnierR. Recherches sur e’arome du muscat.—
Ann. Technol. agric. 1970, v. 19, № 2, p. 79—93.
103. В i d a n P. Relation entre la teneur des vins en alcools superieurs et
la teneur des mouts en Substances azotees en particular en acides amines. —
Bull, OJV. 1975, v. 48, № 538, p. 843—849.
104. BrynK., Hetland O., StounerF. The reduction of diacetyl and
acetoin in aerobacter aerogenes. — Eur. Journ. Bichem. 1971, v. 18, p. 116—120.
105. Bourzeik Miochel. Le colorants du raisin et du vin. — Rev. Franc,
oenol. 1973, v. 14, № 49, p. 15—17; 19—23; 25—29.
106. Chuang L., Collins E. Inhibition of diacetyl sinthessis by valine.—
J. Microbiol. 1972, v. 72, p. 201—205.
107. Datt V., Michael Heinze 1. Sulfite formation by wine yeast. —
Arch. Microbiol. 1977, v. 112, № 3, p. 283—285.
108. D e u k T., No v ak E. The assimilation of sorbic acid by yeast. — Acta
alim. Acad. Sci. Hung. 1972, v. 1, p. 87—90.
109. Drawert F., Leupold G. Gaschromatographische Bestimmung der
Inhaltsstoffe von Garungsgetranken. — Zts. Lebensmittel-untersuchung und For-
schung. 1976, Bd. 162, № 4, S. 407—414.
110. D u b о i s P., В r u 1 e G. Etude des phenols vollatils deux vins rouges.—
Ann. Technol. 1970, v. 20, № 2, p. 24—31.
111. Dupuy P. La chemie du Vin. La Recherche. 1979, № 49, p. 837—843.
112. Eschenbruch K. Sulfite and Sulfide formation during winemaking—
a review. — Aner. Journ. Enology and Viticulture. 1974, v. 25, N 3, p. 157—161.
113. Eschenbruch K. On the metabolism of Sulfate and Sulfide during
fermentation of grape Must by Sacchar. cerevisiae. — Arch. Microbiology. 1973,
v. 93, p. 259—263.
114. Farkos Jan. 5-nitrofurylacrilsaure ein neus konservierungsmittel fur
die Kellerwitsschaff Mittelungen Reben und Wein. -— Abstanund Fruchteverwert.
1975, Bd. 25, № 4, S. 279—284.
115. G a 11 a n d e r J., P e n g A. Lipid Composition of Grapes. — Amer.
Journ. Enology and Viticulture. 1980, v. 31, p. 24—26.
116. G u у m о n J., G г о w e 11 E. A. Changes in some volative Constituents
of Brendy during aging. — Amer. Journ. Enology and Viticulture. 1977, v. 28,
№ 3, p. 152—158.
117. Hardy P. Changes in volatiles of muscat grapes during ripening.—
Phyto-chemistry. 1970, 29, № 4, p. 709—715.
225
118. Hartnell P. Spedig Uptake and metabolism of S35 Sulfate by Wine
yeast. Vitis. 1979, Bd. 18, № 4, S. 307—315.
119. Haukeli A., Lie S. Production of diacetyl, 2-acetolactate and ace-
toin by yeasts during fermentation. — Journ. Institute Brew. 1972, v. 72, № 3,
p. 229—233.
120. H a 11 i w e 11 B. Generation of Hydrogen Peroxide, Superperoxide and
Hydroxil Radicals during the oxidation of dihydroxylfumaric acid by peroxidase. —
Biochemical Journ. 1977, v. 163, № 3, p. 441—448.
121. Higgins P., Peng A. Lipid composition of concord grapes.— Amer.
Jour. Enology and Viticulture. 1976, v. 27, № 1, p. 32—35.
122. Jakov L. Einige erganzende. Feststellungen zum Gehalt an Histamin
in Wein. — Weinwirtsch (Neustadt Wstr.). Bd. 114, 1978, S. 126—127.
123. Johnson T., Nagi. C. Composition of central Washington grapes
during maturation. — Americ. Journ. Enology and Viticulture. 1976, v. 21, № 1,
p. 15—20.
124. Kidron M., Herel E., Mayer A. Katechol oxidase activity in grape
and vine. — Amer. J. Enology and Viticulture. 1978, v. 29, № 1, p. 30—35.
Phytochemistry 1977, v. 16, p. 1050—1051.
125. Killian E., Ough C. Fermentation esters — formation and reten-
tion as affected by fermentation temperature. — Amer. Jour. Enology and Viti-
cilture. 1979, v. 30, № 4, p. 301—305.
126. К1 i e w e r W., L i d e r Z. Effect of day temperature and light intensity
on growth and composition of vitis vinifera fruits. — Americ. Journ. Soc. Hort.
Sci. 1970, v. 95, p. 766—769.
127. KuenschU., Temperli A., Mayer K- Conversion of Arginine to
ornithine during Malo-lactic fermentation in Red Swiss Wine. — Amer. Journ.
Enology and Viticulture. 1974, v. 25, № 4, p. 191—195.
128. Lakso A., KI i ewer W. Physical properties of phosphoenolpyruvate
carboxylase and malic enzyme in grape berries. — Americ. J. Enology and Viti-
culture. 1975, v. 25, № 2, p. 75—77.
129. The procyanidins of white grapes and Wines. — Amer. J. Enol,
and Vit. / [Lea Andrew G. H., Bridle P., Timberlake C., Singleton Vernon.]. 1979,
v. 30, № 4, p. 289—300.
130. Lee M., Dau son C. The specific activity value based on the pro-
sthetic cupper of ascorbatoxidase. — Arch. Biochemistry and Biophysics. 1978,
v. 1, № 1, p. 119—124.
131. Lemperle E., Kerner E. Untersuchungen zur qualitatsbeeinflussung
der Moste durch traubenpressen. — Weinber und Keller. 1979, № 1, S. 24—40.
132. Lynen F. Enzyme Systems for Fatty acid Synthesis. — Bioch. Jour.
1972, v. 128, № 1, p. 1—9.
133. Madrid Vicente Antonio. Influencia de la centrifugation de
mostis у vinas. — Agricultura (Esp.). 1975, v. 44, № 523, p. 889—891.
134. The enzyme activity during fermentation caused by yeast./[Mandi B.,
Wullingen F., Awan J., Piendl A.]. — Branwissenschaft. 1970, v. 23, № 11,
p. 409—412.
135. Mattick L., Rice A. Fatty acid composition of grapes. — Amer.
Jour. Enology and Viticulture. 1976, v. 27, № 2, 88—90.
136. Mayer K. Die Bedeutung des biologische Saure Abbauns und sein
einfluss auf den Schweflige Saure Bedarf der weine. — Weinewirtsschaft. 1979,
Bd. 115, № 9, S. 223—226.
137. Mongabu R. M. Winemaking Surges ahead. — Food Eng. 1971, v. 43,
№ 2, p. 52—62.
138. Nagel С., В ar ano w sky S. Hydroxycinamic acid ester content of
must and grape. — Amer. Jour. Enology and Viticulture. 1979, v. 30, № 3,
p. 198—201.
139. Nykanan La. Nykanan U. Production of esters by different yeast
Straines in sugar fermentations. — Journ. of Institute of Brewing. 1977, v. 83,
p. 30—31.
140. Nykanene L., Suomalainen H. Distribution of esters produced
226
during Sagar fermentation between the yeast cell and the medium. — Journ. of
Institute of Brewing. 1977, v. 83, p. 32—34.
141. О ugh C.. Berg H. The effect of two commercial pectic enzyme on
grape must and Wines. — American Journ. Enology and Viticulture. 1979, v. 25y
№ 4, p. 208—211.
142. О u g h C. Further investigation with glucose oxidase — catalase enzyme
systems for use with wine. — Amer. Journ. Enology and Viticulture. 1975, v. 26,
p. 36—38.
143. Ough C., Kunкее R. The effect of fumaric acid on malolactic fer-
mentation in wines from areas. — Amer. Jour. Enology and Viticulture. 1974,
v. 25, № 4, p. 188—190.
144. О u r n a c A. Les Vitamines du vin. — Annales de la nutrition et de
1’alimentation. 1970, v. 24, № 3, p. 339.
145. Park Y., Betrand A. Etude des Produits Volatils forms au groupes
de la formation par les lenores. — Connais vigne et vin. 1971, v. 8, № 4,
p. 343—347.
146. Peruffo A., Pallavicini. Enzymatic changes assosiated with ri-
pening in grape berries. — Jour. Sci. Food Agric. 1976, v. 26, p. 559—566.
147. P e n о 11 a t M., Morfauy J. Les nucleotides du Win. — Connais de
la vigne et vin. 1976, v. 10, № 1, p. 33—36.
148. P1 e n d 1 A. Uber die Ausscheidung einiger Aromastoffe der Heff. —
Brauwelt. 1979, Bd. 119, № 43, S. 1554—1560.
149. R a p p A., H a s t r i c h H. Gaschromatographische untersuchungen uber
die Aromastoffe von Weinbeeren. — Vitis. 1978, Bd. 17, № 3, p. 288—298.
150. Rapp A., KnipserW. 3,7-demethyl-octa-l,5-dien-3,7-diol eine neue ter-
penoide verbindung des Trauben — und Weinaroma. — Vitis. 1979, Bd. 18, № 3,
S. 229—333.
151. Rapp A., Hastrich H., Engel L. Gaschromatographische untersu-
chungen uber die Aromastoffe von Weinbeeren. I. Anreicherung und Kapillarchro-
matographische Auftrennuhg. — Vitis. 1976, Bd. 15, № 1, S. 29—36.
152. Rapp A., Franck H. Uber die Bildung von Atanol und einigen Aro-
mastoffen bei Modellganversuchen in Abhiingigkeit von der aminosaurenkonzctra-
tion. — Vitis, 1971, Bd. 9, № 4, S. 299.
153. Ribereau-Gayon P. Les composes phefioliques des vegetaus. Pa-
ris, 1968. — 254 p.
154. Ribereau-Gayon P. Les acides-phenols et les catechines du raisin
du vin — Connais. de la Vigne et du Vin. 1971, № 1, p. 115—117.
155. Ribereau-Gayon P. On the nature of the 1’anhydride sulfureux.—
Bull. OJV, 1973, v. 46, № 507, p. 406—408.
156. Ribereau-Gayon P. Evolution des composes phenoliques au cours
de la maturation du raisin. — Connais. — de la Vigne et du Vin. 1971, № 2,
p. 241—261.
157. Ribereau-Gayon P., Boidron J. N., Terrier A. Aroma of
muscat grape varieties. — Jour, of Agricultural and Food Chemistry. 1975, v. 23,
№ 6, p. 1042—1047.
158. Rocco C. Identificazione di derivat: della pelargonidina in precipitate*
provemient de un mosto infermentazione. — Riv. Viticolt e enol. 1979, v. 32, № U
p. 18—21.
159. Roubelakis K-, Kliewer W. Il Orginosuccinate Synthetase and
lyase. — Phaut Physiol. 1978, v. 62, № 3, p. 340—343.
160. Roubel aki s K-, Kliewer W. Ornithine carbamoyltransferasa —
isolation and some properties. — Plant Physiol. 1978, v. 62, № 3, p. 337—339;
p. 344—347.
161. Ruffner H., Koblet W. Gluconegenese in reifenden Beeren von Vi-
tis Vinifera. — Vitis. 1975, Bd. 13, S. 319—328.
162. Ruffner H., R a st D. Die Biogenese von tartrata der Wein reibe. —
Zts. Pflanze physiol. 1974, Bd. 73, p. 45—55.
163. Ruf n er H. P., Kliewer W. Phosphoenolpyruvatecarboxylase acti-
vity in grape berries. — Plant Physiol. 1975, v. 56, № 1, p. 67—71.
227
164. Some neutral aroma components of wines of v. vinifera variety Gari-
ghane. / [Sakato K., Hoekman M., Kepner P., Webb A., Muller J.]. — Amer. Jour.
Enolog. and Viticult 1975, v. 26, № 2, p. 70—74.
165. Schreier P., Drawert F., Junker A. Gaschromatiographisch-
massenspektrometrische Nachweis Sekundarer Amide in Weine. — Zts. Lebensm.
Untersuchung und Forsch. 1975, Bd. 157, № 1, S. 34—37.
166. Schreier P., Drawert F. Identification of volatile constituents from
grapes. — Journ. Agric. Food Chemistry. 1976, v. 24, № 2, p. 231—236.
167. Schutz M., Kunkel R. Formation of hydrogen Sulfide from ele-
mental Sulfur during fermentation by wine yeast. — Amer. Journ. Enology and
Viticulture. 1977, v. 28, p. 137—144.
168. Simpson R. Aroma composition of bottle aged white wine. — Vitis,
1979, Bd. 18, № 2, S. 148—154.
169. Simpson R. Volatile aroma components of Australian Port-Wines.—
Journ. Sci. Food and Agric. 1980, v. 30, № 2, p. 214—222.
170. Shunohava T., Shumizu J., Shumizu Y. Esterification rates
on main Organic Acids in Wines. — Agric. Biol. Chem. 1979, v. 43, № 11,
p. 2351—2358.
171. Stern D., Pnadagni D., Stevens K. Aging of wine. — Amer.
Jour. Enology and Viticulture. 1975, v. 26, № 4, p. 208—213.
172. Suomalainen H., Lehtonen M. Some features of the aroma com-
pounds of alcoholic beverage. — Kenia-Kemi. 1976, v. 3, № 2, p. 69—77.
173. Suomalainen H., Lentonen M. The production of aroma com-
pounds by yeast. — Jour. Institute of Brewing. 1972, v. 85, № 3, p. 149—156.
174. T a ki m a to K-, Saito K-, Kasai Z. Conversion of tartrate to ma-
late and monoethyltartrate in grape leaves. — Phytochemistry, 1978, v. 16, № 11,
p. 1641—1645.
175. Voigt V., Eitemmiller, Powers R., Ware G. Water soluble
vitamin content of some California wines. — Journ. Food Sci. 1978, v. 43, № 4,
p. 1071—1073.
176. W e n g e r J., В e r n о f s к у C. Mitochondria alcohol dehydrogenase
from Saccar. cerevisiae. — Biochem et Biophis. acta. 1976, v. 222, № 3,
p. 479—482.
177. W i d d e 1 F., P f e n n i g N. A new anaerobic sporing, acetate oxidizing
sulfatereducing bacterium. Desalto maculum (emend) acetooxidans. — Arch. Micro-
biology, 1977, v. 112, № 1, p. 119—121.
178. Wiliams M., Saito K-, Loewus F. Ascorbic acid Metabolism
in Geranium and Grape. — Phytochemistry. 1979, v. 18, p. 955—956.
179. White F., W a i n r i g h t T. Analysis of diacetyl and related compounds
in fermentations. — Journ. Institute of Brewing. 1975, v. 81, p. 37—42.
180. W о 1 f e W. Identification of grape varieties by isozyme banding Pat-
terns. — Americ. J. Enology and Viticulture. 1976, v. 27, № 2, p. 68—72.
181. U s s e g 1 i о - T о m a s s e d L., Amer io G. Pentosi, ramnosio. galac-
tosio nei vini. — Vini Ital. 1978, v. 29, № 112, p. 27—33.
182. Mi cr о bi a 1 formation of Tartaric acid from glucose. / [Yamada K-,
Kadama T., Obata T. and Takahasci N.J. — Jour, of Fermentation Technology,
1971, № 2, p. 85—88.
183. Yo shi z a w a K. Effects of hinger fatty acids on the formation of
esters by yeasts. — Jour. Agric. Chem. Soc. Japan. 1976, v. 5, № 3, p. 115—119.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
А
Автолиз дрожжей 64, 66, 67, 70, 148,
149, 197
Аденозиндифосфат (АДФ) 40, 113,
114, 116, 179
Аденозинтрифосфат (АТФ) 29, 40,
55, 63, 91, 114, 116, 117, 134, 179
Азотистое питание дрожжей 129, 146
Азотистые вещества винограда 7, 16,
17, 84
Аконитаза 29
Аконитовая кислота 28, 39
Активность:
р-витаминная 4, 66, 69
гексозофосфатизомеразы 11
о-дифенолоксидазы 48, 50, 53, 119,
173
каталазы 58
пероксидазы 58
ферментативная 14, 21, 23, 25, 61,
119, 173
Активный центр фермента 44—47
Аланин 18, 19, 20, 24, 30, 76, 99, 126,
147, 150, 155
Алкогольдегидрогеназа 46, 59, 63, 90,
106, 110, 117, 119, 127, 137, 138,
190
Альдегиды (см. также по названиям)
35, 36, 42, 71, 80, 90, 100, 106, 119,
121, 124, 133, 137, 140, 172
Альдолаза 115, 119
Альтрогептулоза 12
Амиды 27, 62, 146
н-Амиламин 27
Аминоацеталазная реакция 27
Аминокислоты 16, 17, 18, 20, 27, 28,
34, 45, 97, 120, 124, 146, 149, 155
Аминосахара 12
Амины 27, 147
Аммиак 16, 123
Аммонийные соли 129, 145
Антоцианаза 173
Антоцианидины 79, 83
Антоцианы 4, 72, 79, 83, 99, 169, 172
Арабан 43, 60
Арабиноза 12, 13, 15, 79
Арабит 12
Арахиновая кислота 92
Аргинин 17, 18, 19, 20, 24, 30, 147,
150, 189
Аскорбатоксидаза 50, 58, 67, 69, 101
Аскорбиновая кислота (витамин С)
50, 51, 62, 67, 69, 85, 97, 101, 109,
111, 177
Аспарагин 27
Аспарагиновая кислота 17, 18, 19, 21,
24, 28, 30, 34, 99, 147, 155, 189
Ассимиляция аминокислот дрожжами
149
— углеводов 9
Ацетали 132, 133, 138, 172
Ацетамид 27
Ацетат натрия 73
— свинца 22, 76, 77
Ацетатэстераза 61
Ацетил-КоА 28, 29, 36, 37, 38—39, 63,
65, 73, 80, 91, 118, 127, 131, 134
Ацетоин 121, 137, 140, 142
Ацетомолочная кислота 17, 128, 140,
163
Б
Белки 15, 16, 18, 21, 34, 43, 120
Белковые помутнения 22, 62
Бензиламин 27
Бензойные кислоты 78
Бетаин 67
Биологическое обескислороживание 5,
145, 146
Биосинтез:
аминокислот 147, 148, 156
антоцианов 80
белка 22, 25—26, 28, 148
229
витаминов 62
высших спиртов 127, 139
липидов 180
органических кислот 39, 157
фенольных соединений 72, 73, 77
эфирных масел 90
эфиров 132, 133
Биотин 63, 69, 146
Биофлавоноиды (витамин Р) 68
Брожение сусла 112, 120, 171
Букет вина 61, 84—85, 92, 102, 1П,
120, 135, 138, 182, 202
н-Бутанол 88, 129
н-Бутиламин 27
2,3-Бутиленгликоль 121, 143 ;
В
Валин 17, 18, 19, 20, 24, 76, 125, 126,
147
Ванилин 139
Ванилиновая кислота 71, 78
Винная кислота 28, 31, 32, 33, 34, 35,
36, 53, 97
Винный камень 34
Витамины 7, 62, 140
Водородные связи 23
Вольфрамат натрия 22
Вторичные продукты брожения 120—
123
Высшие спирты 123, 135
Г
Галактан 15
Галактоза 12, 15, 24, 79
Галактуроновая кислота 12, 15
Галловая кислота 71, 73, 78, 163
Галлокатехин 69, 77, 80
Гексаналь 85
Гексанол 85, 88
Гексенол 85
Гексиламин 27
Гексозамин 27
Г ексозофосфатизомераза 11, 115
Гексозы винограда 11, 139
Гексокиназа 114, 119
Гемицеллюлоза И
Гентизиновая кислота 71, 78
Геранилацетат 86
Геранилпирофосфат 91
Гераниол 85, 86, 91
Гетерополисахариды винограда II
Гидроксид меди 22
Гидроксиламин 16
Гидролазы 47, 60
Гидрофобные связи 23
Гидрохинон 73
Гисперидин 68
Гистамин 27
Гистидин 19, 20, 24, 30, 126, 150
Гистоны 23
Гликокол 18, 20
Гликолатоксидаза 56
Гликолевая кислота 11, 28, 34, 35,
41, 121
Гликолевый альдегид 35, 37, 54
Гликопротеиды 23
Глиоксалатный цикл 38—39, 56, 156,
161
Глиоксалевая кислота 28, 36, 37, 39,
41, 42, 54, 56, 122, 161, 163
Глицерин 120, 126, 173
^-Глицеро-^-маннооктулоза 12
Глицин 18, 19, 21, 24, 34, 99, 126, 147,
150
Глобулины 23
(Глутамины 23, 27
Глухаминовая кислота 17, 18, 19, 20,
‘ 21, 24, 28, 30, 40, 99, 121, 147, 150
Глутатион 20, 52, 106, 171, 176
Глюкан 12, 13
Глюкоацидиметрический показатель
11, 166
Глюкоза 10, 11, 13, 17, 24, 34, 57, 59,
79, 114, 115
Р-Глюкозидаза 86, 119
P-d-Глюкозидглюкогидролаза 61
Глюкозооксидаза 57, 175
Глюконовая кислота 11, 34
Глюкуроновая кислота 168
Глютелины 23
Гуанизиндифосфат (ГДФ) 29
Гуанизинтрифосфат 29
д
Дегидрогеназы 31, 43, 44, 58—59, 66,
155
230
Дезаминирование кислот 40, 100, 123,
154
Дезоксирибоза 12, 25
Дезоксирибонуклеиновая кислота
(ДНК) 25, 149
Декарбоксилаза 27, 100, 117, 147, 155
Декарбоксилирование кислот 27, 42,
63, 65, 100, 123, 134, 142, 146
Дельфинидин 169
Дельфинидол 79, 80, 82
Денатурация белков 21, 46
Диализ 20
Диацетил 106, 121, 137, 140, 190
Дикетоянтарная кислота 36, 42, 54
Диметиламин 27
Диоксифумаровая кислота 36, 40—41,
54, 97, 99, 163
Диссоциация белков 22
Дисульфидная связь 20, 23
о-Дифенолоксидаза 46, 47, 67, 73, 74,
82, 97, 99, 101, 173, 176
Диэтиламин 27
Диэтиловый эфир 37, 40, 86, 109, 110
Диэтилтиокарбамат 46, 48
Дрожжи 113, 128, 179, 183
Дубильные вещества 7, 71, 75, 76, 84,
98, 101, 172
Ж
Желеобразующая способность пекти-
на 13
3
Заменители сернистой кислоты 109
И
Изоамиламин 27
Изоамиловый спирт 121
Изобутиламин 27
Изобутиловый спирт 121, 125, 126
Изовалериановый альдегид 100, 128
Изолейцин 18, 19, 24, 125, 150
Изолимонная кислота 28, 39, 161
Изомасляный альдегид 128
Изомерия ферментов 50
Изопентанол 123, 125, 126, 128
Изопропиламин 27
Изоцитратдегидрогеназа 119
Изоэлектрическая точка белка 22,
24—25
Иминокислота 16, 154, 155
Инактивация о-дифенолоксидазы 49,
175
Ингибиторы 14, 22, 45—46, 54, 56,
69, 82, 85, 105, НО, 119, 169, 172
Инозит 69
Ионные связи 23
0-Ионон 88
К
Кадаверин 27
Камеди 10
-Каприловая кислота/92
Каприновая кислота 92
Капроновая кислота 92
Капроновый альдегид 100
Карбогидразы 60
Карбоксилэстераза 61
Карбоксипептидаза 61
Каротин 8
Каротиноиды (провитамин А) 70
Каталаза 46, 56, 57, 58, 175
Каталитические свойства ферментов
43—47, 53, 61
Катехингаллат 80
Катехины 47, 49, 50, 69, 71, 72, 74—
75, 77, 84, 97, 99, 170, 176
Кахетинские вина 4, 12, 69, 70, 84,
100, 102, 138, 169, 172, 175
Кверцетин 77
Кемпферол 77
а-Кетоглутаровая кислота 28, 34, 39,
40, 42, 99, 139
Кетоизовалериановая кислота 17
Кетокислоты 16, 17, 44, 124, 128, 129
Кетоны 137, 140, 144
Кислотность винограда и вина 164
Кислоты винограда 11
Коагуляция белков 21, 106
Кокарбоксилаза 119
Коллоиды винограда 15
Конифериловая кислота 35
Конифериловый альдегид 139
Конформация 23, 45
Коричный альдегид 139
Коричные кислоты 78
Корриноиды (витамин Bi2) 68
231
Кофейная кислота 35, 71, 78, 79, 163
Коферменты 43, 62, 65, 66, 70
Ксантофилл 8
Ксилит 12
Ксилоза 12, 13, 15, 24
Кумариновая кислота 35, 79
Кумаровая кислота 71, 78, 79
Купреин 48
Л
Лактатдегидрогеназа 46, 117, 119
Лактикодегидрогеназа 187, 188
Лактоза 12
Левулиновая кислота 11
Лигнин 71, 75
Лизин 19, 21, 24, 150
Лейкоантоцианы 72, 81, 83
Лейкофлавин 64
Лейцин 18, 19, 24, 34, 76, 123, 125,
128, 147, 150
Лимонен 85, 86
Лимонная кислота 28, 29, 31, 33, 39,
65, 121, 162
Линалилацетат 88
Линалоол 85, 86, 100
Линолевая кислота 85, 92—93, 179
Линоленовая кислота 92—93, 179
Липазы 44
Липоевая кислота 62
Липиды винограда 3, 92, 177
— дрожжей 178
Липооксигеназа 85, 186
Липопротеиды 23
М
Малатдегидрогеназа 119
Маликодегидрогеназа 29, 37
Маликэнзим 37, 38
Малонил-КоА 73
Малоокисленные вина 5, 102, 103
Мальвидин 169
Мальвидол 80
Мальвинидол 79, 82
Мальтоза 12
Маннан 12
Маннит 11
Маннитное брожение 191
Манногептулоза 12
Манноза 24
Мевалоновая кислота 91
Мезовинная кислота 33, 36
Мезоинозит 69
Мезоксалевая кислота 36, 41, 42
Меланины 74
Мёл а нои ды 27
Мелибиоза 12
Метаболизм:
аминокислот 150, 151
органических кислот 9, 28
углеводов 9
фенольных соединений 72, 76—77
Метанол (метиловый спирт) ' 13
Метиламин 27
Метилфурфурол 139
Метиляблочная кислота 161
Метионин 17, 18, 19, 24, 67, 76, 108,
126, 150
Метоксильное число 13
Механизм действия ферментов 43—
47, 114—120
— Эрлиха 121, 123, 126, 127, 147
Микроэлементы винограда 7
Миристиновая кислота 94
Мирицетин 77
Мирцен 86
Молочная кислота 117, 121
Молочнокислое брожение 187
Монокаффеил 35
Моно-р-кумарил 35
Моносахариды винограда 10
Моноэтиловый эфир винной кислоты
35
Муравьиная кислота 11, 41
Муравьиный альдегид (формальде-
гид) 100, 138
Н
Нерол 86
Неролилацетат 86
Никотина мида денин динуклеотид
(НАД) 16, 40, 43, 48, 59, 70, 1164
127, 134, 138, 147
Никотинамидадениндинуклеотидфос-
фат (НАДФ) 43, 48, 59, 91
Никотинамидное кольцо 43
Никотиновая кислота (витамин РР)
66
232
Нитраты 16
Нитриты 16
5-Нитрофурилакриловая кислота
(5НФА) 109
Нолевая кислота 85
Нуклеиновые кислоты 12, 16, 25—26,
67
Нуклеопротеиды 23
О
Обработка сусла ферментными пре-
паратами 13, 15, 62, 102
Озазоны 12
Окислительно-восстановительные про-
цессы (системы) 3, 8, 20, 28, 36, 40,
41, 43, 49, 51—52, 54, 55, 64, 69,
72, 73, 83, 92, 96, 98, 101, 103, 108,
111, 164, 170, 176, 192
Оксибензойная кислота 71, 78, 79
Оксиглутаровая кислота 162
Оксидазы кислот:
гликолевой 41
глиоксалевой 56 у 4
диоксифумаровой 41, 42, 53
щавелевой 42
Оксидоредуктазы 47
Оксикоричная кислота 35, 71, 79
Оксимасляная кислота 11
Оксиметилфурфурол 11, 139
Оксипролин 17
Оксиэтилтиаминпирофосфат 45
Олеиновая кислота 92, 94
Олигосахариды винограда 10
Органические кислоты (см. также по
названиям) 7, 8, 10, 28, 63, 101,
124, 157, 165
Орнитин 17, 147, 189
Осаждение антоцианов 172
П
Пальмитиновая кислота 92—93, 94,
178
Пангамовая кислота (витамин Bi5)
70
Пантотеновая кислота (витамин Вх)
65, 146
Пектаттрансэлиминаза 62
Пектаты 13
Пектинметилэстераза 14, 60
Пектиновая кислота 13
Пектиновые вещества 10, 12, 13, 14,
15^ 18, 60
Пектинэстераза 13, 60
Пектовая кислота 13
Пектолитические ферменты 13, 62
Пеларгонидол 79
Пеларгиновая кислота 92
Пентадекановая кислота 94
Пентан 86
Пентанол 123, 125
Пентозаны 10, 12, 15
Пентозы 12, 139
Пеонидол 80, 82
Пептидазы 60
Пептидные связи 22, 23
Переаминирование аминокислот 36,
65, 126, 127, 139, 146
Пероксидаза 46, 57, 67, 74, 97, 101,
173
Петунидин 169
Петунидол 79, 82
Пиридоксаль 27, 63, 65, 147, 155
Пиридоксин (витамин В6) 65, 146
Пировиноградная кислота 17, 18, 28,
37, 39, 42, 44, 59, 62, 63, 99, 117,
139, 161
Пирогаллол 47, 58, 80
Пирокатехин 47, 49, 50, 80, 82
Пиролидин 27
Пирофосфат 65
Пируватдегидрогеназа 119
Пируватдекарбоксилаза 44, 45, 63
Полигалактуроназа 14, 60
Полигалактуроновые кислоты 13
Полипептиды 16, 20, 22, 23
Полисахариды винограда и вина 10,
12, 16
Полифенолоксидаза 74, 82
Полифенолы 73
Превращения:
аминокислот дрожжами 154, 156
винной кислоты 36
фенолкарбоновых кислот 101
фенольных соединений 170
Претартариковая кислота 35
Проламины 23
Пролин 17, 18, 19, 24, 126, 147, 150
233
Пропанол 125, 126
н-Пропиламин 27
Пропионил-КоА 162
Простетическая группа 23, 43
Протеазы 60, 61
Протеиды 23
Протеины 16, 23
Протокатеховая кислота 71, 78, 79,
163
Протопектин 13
Протопектиназа 13
Псевдооснования 79—80
Путресцин 27
Р
Рамноза 12, 13, 15, 24, 79, 139
Рафиноза 12
Реакции окрашивания белков 22
Реакция Канницаро 121
Редокспотенциал 40, 41, 98, 105, 112,
170, 176, 195
Ретина ль 70
Ретинол 70
Ретинолредуктаза 70
Рибоза 12, 25, 65
Рибонуклеиновая кислота (РНК) 25,
149
Рибосомы 25
Рибофлавин (витамин В2) 62, 64
Рибулозодифосфат 9
Рутин 68, 69
С
Салициловая кислота 71, 78, 79, 163
Сахароза 9
Серин 17, 18, 19, 24, 147, 150
Сернистая кислота 80, 100, 102, 104—
109, 173
Сефадекс 25, 76, 80, 175
Синаповая кислота 71, 78, 79, 172
Синаповый альдегид 139
Синерезис 21
Синтез:
аминокислот 16, 156
антоцианов 80—82
белков 22, 25
витаминов 63, 65, 66
липидов 120
234
нуклеиновых кислот 67, 68
органических кислот 28, 33, 37, 40,
59, 65
полипептидов 21
сивушных спиртов 129, 133
углеводов 9, 33, 120
фенольных соединенйй 72
фосфорных гексоз 114
эфирных масел 90
Синтетазы 37, 91
Сиреневый альдегид 139
Сорбиновая кислота 109
Сорбит 11
Специфичность ферментов 43—47
Стабильность к помутнениям 35
Стахиоза 12
Стеариновая кислота 92, 94, 178
Степень зрелости винограда 11, 31,
88, 166
Структура белка 21—25
Сукцинатдегидрогеназа 29, 40
Сукцинил-КоА 28
Сульфат аммония 20, 22, 25, 54
Сульфгидрильная группа 20
Супероксид (0) 3, 55
Т
Таниды 75
Танин 22, 80, 84
Термообработка 5, 25, 101, 139, 146
Терпеноиды винограда 3, 85, 86
а-Терпинеол 86
Тиамин (витамин BJ 62, 63, 65, 67,
146
Тиаминдифосфат 119
Тиаминпирофосфат 45, 63
Тимин 25
Тирозин 18, 19, 24, 30, 123, 150
Треонин 17, 19, 126, 150
Триозофосфатизомераза 116
Триптофан 19, 24, 66, 150
У
Убихинон (витамин К) 73
Углеводы винограда 7, 9, 10, 17, 28,
73
Удобрение (питание) винограда 19
Уксусная кислота 30, 44, 121, 162
Уксуснокислое брожение 190
Уксусный альдегид 17, 80, 138, 172
Уроновые кйслоты винограда 11
Ф
Фарнезол 91, 184
Феназинметасульфат 120
Фенилаланин 18, 19, 24, 30, 34, 81,
123, 139, 150
Фенилгидразин 12
р-Фенилэтиламин 27
р-Фенилэтиловый спирт 86, 88, 90,
123, 126, 128
Фенолкарбоновые кислоты 78, 101
Фенольные соединения 13, 35, 47, 49,
57, 71, 73, 83, 97, 101, 169
Ферментативные процессы 4, 5, 96
Ферментация мезги 99
— сусла 96, 102
Ферментные препараты 14, 43, 61,
102
Ферменты 7, 43, 61, 113
Феруловая кислота 71, 78, 163
Фитин 69
Флавинадениндинуклеотид (ФАД)
62, 64
Флавиновые оксидазы 101
Флавоноиды 69, 72
Флавонолы 72, 77, 81
Флавоны 68, 72, 78
Флавопротеины 73
Флобафены 72, 74
Флороглюциновое кольцо 80
Фолиевая кислота (витамин М) 67
Фосфоглицераткиназа 116, 119
Фосфоглицериновая кислота 9, 116
Фосфоглицериновый альдегид 9, 115
Фосфоглицеромутаза 116, 119
Фосфодиоксиацетон 9, 115
Фосфолипиды 177
Фосфоровольфрамовая кислота 27
Фосфоферраза 63
Фосфофруктокиназа 115, 119
Фосфоэнолпировиноградная кислота
28—29, 38, 116
Фосфоэнолпируваткарбоксикиназа 10,
59
Фосфоэнолпируваткарбоксилаза 28,
37, 59
Фотовосстановление хлорофилла 8
Фотосинтез углеводов 7, 8, 38, 56,
73
Фракционирование:
антоцианов 80
белков 23—25
липидов 177
фенольных веществ 77
Фруктоза 7, И, 13, 24, 59, 139
Фруктозодифосфат 9
Р-Фруктофуранозидаза 60, 61
Фтористый натрий 85
Фукоза 24
Фумараза 29, 40, 110
Фумаровая кислота 28, 29, 38, 39, 40,
155
Фурфурол 12, 15, 139
X
Херес 4, 5, 216—219
Химизм брожения 114—123
Химический состав винограда 7
Хинная кислота 72, 73, 79, 163
Хиноны 47, 49, 50, 67, 69, 73, 82, 97,
170, 176
Хлорогеновая кислота 78
н-Хлормеркурибензоат 46
Хлоропласты 8 ?
Хлорофиллы 8
Холин 67
Ц
~ Целлюлоза 10
Цианид калия 56
Цианидол 79, 82, 83
Цикл глиоксалатный 38—39, 56, 156,
161
— Кальвина 9
— Кребса 29, 121
— трикар боксильных кислот 28, 156
Цистеин 20, 24, 106, 108, 126, 176
Цистин 17, 19
Цитохромоксидаза 46, 49, 55, 67, 73
Цитратсинтетаза 39
Цитрин 68
Цитруллин 18, 62, 189
235
ш
Шампанизация 5, 64, 112, 146, 182
Шампанские виноматериалы 4, 6, 32,
66, 100, 102, 169, 212
Шикимовая кислота 73, 79, 80, 163
щ
Щавелевая кислота 10, 28, 41, 42, 52,
53, 163
Щавелевоуксусная кислота 10, 28, 36,
37, 39, 59, 63, 155
Щавелевоянтарная кислота 28, 39
Э
Экстрактивные вещества 12
Электронный парамагнитный резо-
нанс (ЭПР) 8, 74
Электрофокусировка белков 25
Электрофорез 22, 24—25, 50
Электрофоретическая способность ве-
ществ 15
Эллаговая кислота 79
Энантовая кислота 92
Эндополигалактуроназа 13
Энергия активации 46
Энзим конденсации 29
Энин 170
Энолаза 110, 119
Энолпировиноградная кислота 37,
116
Эпикатехин 77
Эстеразы 44, 60
Этанол 112, 122, 125
Этерификация 133
Этиламин 27
Этилацетат 77, 133
Эфирные масла винограда 7, 84
Эффект Пастера 113
Я
Яблочная кислота 10, 28, 31, 32, 36,
37, 39, 99, 121, 155, 161
Яблочно-молочное брожение 187
Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР)
7
Янтарная кислота 28, 31, 40, 121, 155,
161, 190
ОГЛАВЛЕНИЕ
От автора............................................................ 3
Введение ............................................................ 4
ЧАСТЬ I. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ВИНОГРАДА, СУСЛА И ВИНА 7
Глава 1.. Углеводы винограда, их образование и превращение ... 7
Фотосинтез................................................... 7
Биосинтез углеводов ......................................... 9
Превращение углеводов........................................ 9
Состав сахаров винограда.....................................10
Пентозы......................................................12
Пектиновые вещества..........................................12
Глава 2. Азотистые вещества . 16
Аминокислоты.................................................16
Полипептиды..................................................20
Белки У......................................................21
Нуклеиновые кислоты..........................................25
Амины и амиды -. . . . •....................27
Глава 3. Органические кислоты и их метаболизм......................28
Образование и превращения органических кислот .... 28
Винная кислота...............................................33
Яблочная кислота.............................................37
Лимонная кислота........................................... 39
Янтарная кислота.............................................40
Фумаровая кислота............................................40
Диоксифумаровая кислота......................................40
Гликолевая кислота ......................................... 41
Глиоксалевая кислота ....................................... 42
Щавелевая кислота............................................42
Пировиноградная кислота .................................... 42
а-Кетоглутаровая кислота....................................42
Глава 4. Ферменты........................................ . . . 43
Коферменты ..................................................43
Специфичность и механизм действия ферментов..................43
о-Дифенолоксидаза............................................47
Аскорбатоксидаза ........................................... 50
Оксидаза диоксифумаровой кислоты.............................53
Цитохромоксидаза.............................................55
Гликолатоксидаза ............................................56
Глюкозооксидаза.................................... , . 57
Пероксидаза и каталаза ..................................... 57
Анаэробные дегидрогеназы.....................................59
Гидролазы....................................................60
Глава 5. Витамины.................................................. 62
Витамин Bi (тиамин)..........................................63
Витамин В2 (рибофлавин)).....................................64
237
Витамин Вб (пиридоксин).................................... 65
Витамин Вх (пантотеновая кислота)........................... 65
Витамин РР (никотиновая кислота)..............................66
Витамин М (фолиевая кислота!).................................67
Витамин С (аскорбиновая кислота) . . . ..... 67
Витамин В12 (корриноиды)......................................68
Витамин Р (биофлавоноиды).....................................68
Мезоинозит................................................69
Каротиноиды...............................................70
Витамин Bis (пангамовая кислота!) 70
Глава 6. Фенольные соединения.....................................71
Катехины..................................................72
Флавонолы.................................................77
Флавоны...................................................78
Фенолкарбоновые кислоты...................................78
Антоцианы.................................................79
Лейкоантоцианы............................................83
Танины....................................................84
Глава 7. Эфирные масла............................................84
Содержание эфирных масел в винограде......................85
Биосинтез эфирных масел...................................90
Глава 8. Липиды винограда.........................................92
Состав липидов в винограде ................................... 92
ЧАСТЬ II. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ПРИ
ПОЛУЧЕНИИ СУСЛА И ВИНА............................................96
Глава 9. Биохимические процессы при переработке винограда ... 96
Окислительно-восстановительные процессы...................97
Регулирование окислительно-восстановительных процессов . . 101
Роль сернистой кислоты...................................104
Медико-гигиеническое действие сернистой кислоты . . . . 108
Некоторые заменители сернистой кислоты . ..... 109
Глава 10. Брожение виноградного сусла...................... . . . 112
Химизм алкогольного брожения.............................114
Образование вторичных и побочных продуктов спиртового бро-
жения .......................................................120
Механизм образования сивушных спиртов....................123
Регулирование образования сивушных спиртов при брожении 129
Биосинтез простых эфиров ....................................132
Биосинтез сложных эфиров.................................133
Глава 11. Биосинтез и метаболизм карбонильных соединений . . . 137
Свойства альдегидов и кетонов............................137
Состав альдегидов и кетонов в винограде и вине . . . . 138
а-Дикетоны и оксикетоны в вине...........................140,
Биосинтез ацетомолочной кислоты..........................14F
Глава 12. Обмен азотистых веществ при брожении...................146
Ферментативное расщепление аминокислоты..................146
Выделение азотистых веществ в процессе алкогольного броже-
ния и при выдержке вина на дрожжах . . . - . . . . 149
Превращение аминокислот дрожжами.............................154
238
Глава 13. Метаболизм органических кислот дрожжами при брожении . 157
Биосинтез органических кислот.................................157
Роль органических кислот при технологии и выдержке вина . 164
Глава 14. Превращение фенольных соединений при брожении, сусла
и формировании вина...................................................169
Влияние фенольных соединений на брожение......................169
Превращение фенольных соединений при формировании вина . 170
Связывание дубильных и красящих веществ уксусным альдегидом 172
Ферментативное и неферментативное окисление антоцианов . . 173
Ингибирование окислительных ферментов при сбраживании сусла 174
Изменение редокспотенциала при брожении сусла . ... 176
Глава 15. Метаболизм липидов и их роль в виноделии....................177
Липиды дрожжей.............................................. 178
Биологическая роль липидов.................................. 178
Биосинтез липидов.............................................180
Роль липидов в виноделии......................................182
Глава 16. Влияние различных видов и рас дрожжей на образование
букетобразующих веществ ..............................................183
Образование ароматобразующих веществ дрожжей . . . . 183
Влияние анаэробиоза на образование сложных эфиров . . . 186
Глава 17. Бактериальное брожение..................................187
Яблочно-молочное брожение.................................187
Химизм молочнокислого брожения................................187
Регулирование кислотности молочнокислыми бактериями . . 190
Уксуснокислое брожение....................................190
Маннитное брожение........................................191
Глава 18. Современная теория окислительно-восстановительных процессов 192
Перенос электронов в дыхательной цепи.......................192
Перекисная теория окисления ................................. 194
О роли редокспотенциала в виноделии.......................195
Ферментативные окислительно-восстановительные процессы и их
биологические катализаторы................................196
Автолиз дрожжей..........................................197
ч Неферментативные окислительно-восстановительные процессы и
их катализаторы...........................................198
Глава 19. Химическая природа веществ, обусловливающих букет вина 202
Вещества, образующиеся в процессе алкогольного брожения . 202
Зависимость между строением органических соединений и их
букетом и вкусом..........................................203
Вещества, характеризующие букет различных типов вин . . 206
Сухие столовые вина...................................208
Игристые вина (шампанское)............................210
Десертные вина (мускат, кагор, токай})................214
Крепкие вина (портвейн, мадера, херес)................216
Список использованной литературы....................................221
Предметный указатель..................................................229
,,»ександр Константинович Родопуло
ОСНОВЫ БИОХИМИИ ВИНОДЕЛИЯ
Редактор М. С. Рыжова
Художественный редактор В. А. Чуракова
Художник Л. В. Брылев
Технический редактор Н. В. Черенкова
Корректоры А. И. Г у р ы ч е в а, Н. П. Б а г м а
ИБ № 1395
Сдано в набор 20.10.82. Подписано в печать 11.02.83. Формат 60Х90,/1б- Бумага типографская № 2.
Литературная гарнитура. Высокая печать. Объем 15,0 п. л. Усл. п. л. 15,0. Усл. кр.-отт. 15,0.
Уч-изд. л. 18,47. Тираж 3 800 экз. Заказ 993. Цена 3 р.
Издательство «Легкая и пищевая промышленность», 113035,
Москва, М-35, 1-й Кадашевский пер., д. 12.
Московская типография № 8 Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам
издательств, полиграфии и книжной торговли. Хохловский пер., 7.